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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
DESENVOLVIMENTO DE DISPOSITIVOS DE IRRADIAÇÃO
UTILIZANDO LED E SUA APLICAÇÃO À FOTOINATIVAÇÃO DE
Staphylococcus aureus E Trichophyton rubrum
LUCAS FERREIRA DE PAULA
UBERLÂNDIA – MG
2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
DESENVOLVIMENTO DE DISPOSITIVOS DE IRRADIAÇÃO
UTILIZANDO LED E SUA APLICAÇÃO À FOTOINATIVAÇÃO DE
Staphylococcus aureus E Trichophyton rubrum
LUCAS FERREIRA DE PAULA*
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação do Instituto de
Química, da Universidade Federal de
Uberlândia, como requisito parcial para
a obtenção do título de MESTRE EM
QUÍMICA.
*Bolsista pelo CNPq
Orientação: Prof. Dr. Carlos Alberto de Oliveira
Uberlândia – MG
2010
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3
FICHA CATALOGRÁFICA
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
P324 d
Paula, Lucas Ferreira de, 1985-
Desenvolvimento de dispositivos de irradiação utilizando LED e sua
aplicação à fotoinativação de Staphylococcus aureus E Trichophyton
rubrum / Lucas Ferreira de Paula. - 2010.
126 f.
Orientador: Carlos Alberto de Oliveira.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Uberlândia, Progra-
ma de Pós-Graduação em Química.
Inclui bibliografia.
1. Fotoquímica
- Teses. 3. Fotoquimioterapia - Teses. I. Oliveira, Car-
los Alberto de. II. Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-
Graduação em Química. III. Título.
CDU: 544.52
Elaborado pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogação e Classificação
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
Instituto de Química
Programa de Pós Graduação em Química - MESTRADO
AlUNO(A): lUCAS FERREIRA DE PAUlA
NÚMERO DE MATRíCULA: 97147
, ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: QUíMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM QUíMICA: NíVEL MESTRADO
TíTULO DA DISSERTAÇÃO:
"Desenvolvimento
de dispositivos de irradiação de LED
e
sua aplicação à fotoinativação de
stepnytococcus
aureus
e
trichophyton
rubrum"
ORIENTADOR(A):
PROF. DR. CARlOS AlBERTO DE OLIVEIRA
• " I- ~
r
_, ( •.1
\.1, ,-,,)~
,.I,
A Dissertação foi APROVADA em apresentação pública realizada no
Anfiteatro do Bloco 1E, no Campus Santa Mônica, no dia 20 de janeiro
de 2010, às 16:00 horas, tendo como Banca Examinadora:
NOME:
ASSINATURA:
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6.l9-º.lv.e\M.
~t?~-
#'
•
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2!Z'M~.
Prof. Dr. Carlos Alberto de Oliveira
\,(IQ~FU;)
J
r
• ", I __ '" {. ••
,i -' '\ ./. .
Prof. Dr. Noboru Hioka
~ '(tJEM) , -
-:» ~ ./
"
'\
.
,
Pref. Dr. Domingos Sávio de Miranda
(IQUFU)
Uberlândia, 20 de janeiro de 2010.
5
Dedico
A Deus, a inteligência suprema, causa primeira de
todas as coisas.
Às pessoas mais importantes da minha vida: Minha
adorável, querida e atenciosa mãe Gislaine Ferreira
de Paula, minha cuidadosa avó Delfina Maria de
Jesus, pelo amor, carinho, atenção, ao meu pai e
companheiro de sempre Apolinário Rodrigues de
Queiroz, à minha querida namorada Renata Oliveira
Santos. Agradeço também ao cuidado que todos vocês
tanto tem por mim.
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha mãe por todo o apoio e ajuda na minha
casa, nesses períodos em que não pude colaborar e nem se quer
ajudar em quase nada nas tarefas de casa.
Ao Dr. Hansen e toda sua equipe por me ajudarem hoje e
sempre.
Ao meu orientador Carlos Alberto de Oliveira, que nunca se
opôs nem pressionou a minha pessoa, sempre me incentivando e
nos agradando, tornando o período de mestrado um momento de
tranqüilidade, condição primordial para o desenvolvimento de um
trabalho de qualidade. Sinto que ainda devo muito ao senhor.
Aos meus colegas de trabalho do dia-a-dia: Erick, Henrique,
João Fernando, Marselha, Vítor, Bruno, Roberto, Alexandre, Flávia,
Diógenes, Jonas. Muito obrigado por vocês terem tido paciência
comigo e me ajudarem em tantas coisas.
Agradeço em especial ao meu amigo Henrique Dantas que
me ensinou, ajudou e fez companhia diversas vezes no laboratório
sobre todos os meus trabalhos desenvolvidos, inclusive neste.
Agradeço ao conhecimento de microbiologia, e aos diversos
métodos que você me passou durante todo esse tempo. Agradeço
também pela sua companhia e força nos momentos de dificuldade.
7
Agradeço aos professores Domingos Sávio de Miranda e Luis
Antonio Ortellado Gómez Zellada por me ajudarem a todo momento
não somente em questões acadêmicas mas foram, juntamente com
meu orientador, amigos de sempre.
Agradeço ao professor João Batista Vieira Junior por ter
confiado em mim e dedicado seu aluno Jonas Reginaldo de Britto
para me ajudar, sou muito grato pelo auxilio e presteza da parte de
vocês.
Não posso me esquecer dos meus fiéis amigos Mauricio,
Leon, Catarina, João Paulo, Lucian, Daniel Caixeta, Diego, Fred,
Marcelo Hayashi, Marcelo Barbosa, Sara, Wanderson, Weyder.
Agradeço a Renatinha, por estar sempre comigo, me
ajudando nos momentos de dificuldade, fazendo-me companhia e
participando das minhas alegrias.
8
Senhor, fazei-me instrumento de vossa paz.
Onde houver ódio, que eu leve o amor,
Onde houver ofensa , que eu leve o perdão,
Onde houver discórdia, que eu leve a união,
Onde houver dúvida, que eu leve a fé,
Onde houver erro, que eu leve a verdade,
Onde houver desespero, que eu leve a esperança,
Onde houver tristeza, que eu leve a alegria,
Onde houver trevas, que eu leve a luz.
Ó Mestre, fazei que eu procure mais
consolar que ser consolado;
compreender que ser compreendido,
amar, que ser amado.
Pois é dando que se recebe
é perdoando que se é perdoado
e é morrendo que se nasce para a vida eterna...
(Oração de São Francisco de Assis)
(Oração de São Francisco de Assis)(Oração de São Francisco de Assis)
(Oração de São Francisco de Assis)
9
SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS....................................................................... I
LISTA DE ABREVIATURAS ...........................................................V
RESUMO........................................................................................VI
ABSTRACT...................................................................................VII
I. INTRODUÇÃO ............................................................................. 8
1.1 Terapia Fotodinâmica ...........................................................................................9
1.2 Histórico da TFD.................................................................................................10
1.3 Fotossensitizadores..............................................................................................12
1.3.1 Porfirinas e Hematoporfirinas – Primeira geração de fotossensitizadores 12
1.3.2 Ácido 1,5-aminolevulínico (ALA).................................................................14
1.3.3 Ftalocianinas .................................................................................................17
1.3.4 Corantes Catiônicos......................................................................................17
1.4 Mecanismos fotodinâmicos .................................................................................18
1.4.1 Mecanismo Tipo I .........................................................................................19
1.4.2 Mecanismo Tipo II........................................................................................20
1.5 Fontes de irradiação ............................................................................................21
1.5.1 LED na Terapia Fotodinâmica.....................................................................24
1.6 Staphylococcus Aureus........................................................................................26
1.7 Onicomicose.........................................................................................................28
2. OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS ................................... 32
10
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................... 35
3.1 Materiais e reagentes...........................................................................................36
3.2 METODOLOGIAS .............................................................................................38
3.2.1 – Construção do Equipamento de lâmpada halógena (PHLS)....................38
3.2.2 – Construção do Equipamento de LED de alto brilho (LED600) ...............39
3.2.3 – Construção do Equipamento de LED de alta potência (AMS-II)
3.2.4 – Preparo das soluções de azul de metileno .................................................40
3.2.5 Ensaios de fotooxidação de DPBF................................................................41
3.2.6 Ensaios microbiológicos de fotoinativação bacteriana ................................41
3.2.7 Ensaios microbiológicos de fotoinativação fúngica .....................................42
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................. 44
4.1 Desenvolvimento dos Equipamentos...................................................................45
4.2 Espectros de emissão dos equipamentos.............................................................52
4.3 Confirmação da presença de oxigênio singlete...................................................52
4.4 Comparação da cinética de Fotooxidação de DPBF ..........................................58
4.5 Inativação fotodinâmica de Staphylococcus aureus............................................61
4.6 Ensaios microbiológicos de Trichophyton rubrum..............................................63
5. CONCLUSÕES ......................................................................... 67
6. REFERÊNCIAS......................................................................... 69
7. TRABALHOS FUTUROS .......................................................... 82
8. APÊNDICE ................................................................................ 84
Protocolo para submissão ao comitê de Ética para pesquisa em seres humanos.
................................................................................................................................85
11
9. ANEXOS ................................................................................. 109
Artigo Aceito para publicação – Proof do artigo enviado ao Journal of the
Brazilian Chemical Society já aceito para publicação. ......................................110
I
Índice de Figuras
Figura 1: Estrutura da porfina, o representante mais simples da classe das porfirinas
(AULER;BANZER, 1942). .....................................................................................12
Figura 2: Hematoporfirina na forma de éter presente na mistura de oligômeros que
compõem a Photofrin
®
(SIMPLICIO et al., 2002) ...................................................13
Figura 3: Biosíntese de Heme – O ALA é precursor e também modulador do
processo (RUTHERFORD et al., 1979)...................................................................15
Figura 4: Rota sintética para obtenção do ALA e o derivado terc-butil éster, a partir
de anidrido succínico (KANG et al., 2005)..............................................................16
Figura 5: Corantes catiônicos empregados como fotossensitizadores ......................18
Figura 6: Equipamento RL-50. O filtro de transmissão é normalmente encontrado
como material de fotografia (TARDIVO et al., 2002)..............................................22
Figura 7: Equipamento Visulas 690
®
(CARL ZEISS, 2009) ...................................23
Figura 8: LASER DIOMED 630 PDT para Terapia Fotodinâmica. O equipamento
possui dispositivo de fibra óptica, tornando versátil a aplicação endógena (DIOMED,
2000).......................................................................................................................24
Figura 9: (A) Aspecto aveludado do crescimento de T. rubrum com 14 dias de
crescimento, cultivado em Agar Sabouraud. (B) Microfotografia do perfil de conídios
de T. rubrum evidenciando a maior presença de microconídeos em detrimento dos
macroconídeos. .......................................................................................................30
II
Figura 10: (A) e (C) representam o acometimento do leito ungueal em um estado
moderado. (B) representa o acometimento no leito ungueal das mãos, num estado
inicial. O agravamento pode manter-se estagnado durante longos períodos de tempo
(PHIL, 2009). ..........................................................................................................30
Figura 11: Esquema demonstrando montagem de PHLS; 1 – Carcaça metálica
acoplada com a lâmpada e o cooler; 2 – Lente de aumento; 3 – Cuba de refrigeração;
4 – Filtro óptico.......................................................................................................38
Figura 12: Equipamento LED600; 1 – Arranjo de LED de alto brilho; 2 – Suporte
móvel transparente para acoplar as amostras; 3 – Níveis de altura para segurar o
suporte. ...................................................................................................................39
Figura 13: Possível estrutura proposta para o equipamento AMS-II, 1 – Arranjo de
LED de alta potência; 2 – Dissipador de calor de processadores soquete 775; 3 –
Suporte com ranhuras para a inserção de amostras...................................................40
Figura 14: Esquema do arranjo de ligação dos LED em série-paralelo....................46
Figura 15: Lâmpada de LED desenvolvida com arranjo série-paralelo que não
aparesenta limitador de corrente no circuito.............................................................46
Figura 16: Fotos do equipamento LED600. A – Desligado. B – Ligado. .................47
Figura 17: Comportamento entre a voltagem e corrente na ligação de um LED ......48
Figura 18: Fotos de AMS-II. A e C – Equipamento em funcionamento. B – Vista
frontal do equipamento............................................................................................50
Figura 19: Esquema de ligação do conversor desenvolvido para ligar o LED de alta
potência (INTERNATIONAL RECTIFIER, 2007)..................................................51
Figura 20: Espectro de absorção para o azul de metileno (
▬
); Espectro de emissão de
PHLS (
―
), LED600 (
⋅⋅⋅⋅⋅
), e AMS-II (----). .................... Erro! Indicador não definido.
III
Figura 21: Degradação de DPBF (A), via reação com oxigênio singlete, formando o
produto incolor 1,2 dibenzoilbenzeno (C)...................... Erro! Indicador não definido.
Figura 22: Oxidação fotoinduzida de DPBF pelo LED600 com uso de azul de
metileno na concentração 5 x 10
-6
mol dm
-3
. (A) - Ausência de NaN
3
; (B) - Presença
de excesso (saturação) de NaN
3
. Cada espectro foi obtido após 5 segundos de
irradiação. ...............................................................................................................57
Figura 23: Oxidação Fotoinduzida de DBPF. Cada espectro foi obtido após 5
segundos de irradiação. (A) – PHLS; (B) – LED600; (C) – AMS-II. A concentração
de azul de metileno utilizada foi aproximadamente 5x10
-6
mol dm
-3
. .......................59
Figura 24: Variação da concentração de DPBF com o tempo.
- PHLS;
-
LED600;
- AMS-II...............................................................................................60
Figura 25: Contagem de bactérias após a fotoinativação. Três tipos de diferentes
concentrações de azul de metileno foram avaliadas: 0,5, 5 e 50 µmol dm
-3
. Soluções
com as mesmas concentrações e não irradiadas foram utilizadas como controle.......62
Figura 26: Crescimento de T. rubrum, em triplicata, após 14 dias. As placas (A), (B)
e (C), foram irradiadas durante 20 minutos, sob concentração de azul de metileno 500
µmol dm
-3
; (D), (E) e (F) correspondem ao controle no escuro; (G) é o controle que
não recebeu luz nem fotossensitizador.....................................................................64
Figura 27: Estrutura da hifa septada de Trichophyton rubrum obtida por
microfotografia óptica .............................................................................................65
Figura 28: Microfotografia óptica com ênfase nos esporos do Trichophyton rubrum
após a coloração com azul de metileno, forte pigmentação é observada. A presença de
estruturas reprodutivas não coradas serve como comparação e sobretudo como
contraste, evidenciando a grande absorção/interação de corante por essas estruturas.
................................................................................................................................65
IV
V
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A – Ampère
ACN – Acetonitrila
ALA – Acido aminolevulínico
AM – Azul de metileno
AMS-II – Nome dado ao dispositivo de LED de alta potência
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
COUT – Capacitor de saída
DC – Corrente contínua
ddp – Diferença de potencial
DEN1 – Diodo de entrada
DPBF – 1,4 Difenilisobenzofurano
FDA – Food and Drug Administration
LED – Light Emitting Diode (Diodo emissor de luz)
LED600 – Dispositivo dotado de uma matriz de 600 LED
mcd – Milicandela
MRSA – Staphylococcus aureus resistente a meticilina
PHLS – Sistema de lâmpada halógena policromática
R – Integral de sobreposição
ROS – Espécies reativas de oxigênio
ROUT – Resistor de saída
ScoA – Succinil Coenzima A
ScoAH – Succinil Coenzima A protonada (reduzida)
TFD – Terapia Fotodinâmica
UFC – Unidades formadoras de colônias
VI
RESUMO
Estudou-se o desenvolvimento e a eficiência de fontes de irradiação baseada em
LED na fotosensitização do azul de metileno. Os equipamentos construídos utilizaram
LED convencional e LED de alta potência. Verificou-se que o sistema que utiliza LED
de alta potência exibe melhores resultados em função de sua maior irradiância. Na
Inativação fotodinâmica de Staphylococcus aureus, in vitro, o LED de alta potência
permitiu inativação de cerca de 99% dos microorganismos em soluções de azul de
metileno de concentrações superiores a 10
-5
mol dm
-3
.
O fungo Trichophyton rubrum, o agente etiológico mais comum no casos das
Onicomicoses, foi também submetido ao protocolo de fotoinativação, desenvolvido in
vitro. Foi observada uma redução drástica na formação de colônias, mesmo com apenas
uma aplicação do equipamento com LED de alta potência.
Descreveu-se também, de forma detalhada, diretrizes para a construção de
sistemas de LED, voltados a terapia fotodinâmica. O sistema que utiliza LED
convencional, também em todos os testes exibiu resultados satisfatórios.
Propõe-se um protocolo para o comitê de ética, visando a aplicação, in vivo, para
o tratamento de onicomicose no Hospital de Clínicas da Universidade Federal de
Uberlândia, utilizando os equipamentos desenvolvidos, haja vista os resultados
satisfatórios e seu baixo custo favorecendo a aplicação em unidades de saúde pública.
Palavras-chave: Construção de dispositivos, Onicomicose, LED, Fotoinativação,
Trichophyton rubrum, Staphylococcus aureus.
VII
ABSTRACT
The construction and efficiency of irradiation sources based on LED applied to
methylene blue photosensitization was studied. Conventional LED and high power LED
was used to building the equipments. It was found that the system that uses high power
LED shows better results due to its higher irradiance. In the Staphylococcus aureus
photoinactivation, in vitro, the high power LED allowed inactivation of about 99% of
the microorganisms in methylene blue solutions of concentrations above 10
-5
mol dm
-3
.
The fungus Trichophyton rubrum, the most common etiologic agent in cases of
Onychomycosis also was submit to the photoinactivation protocol, developed in vitro.
There was a drastic reduction in the colony forming units, even with only one
application of the high power LED.
Is also described in detail, guidelines for the construction of LED systems,
applied to photodynamic therapy. The system that uses conventional LED, also in all
tests, showed satisfactory results.
We propose a protocol to the Ethics Committee, aimed at implementing in vivo
for the treatment of onychomycosis in the Hospital de Clínicas of Universidade Federal
de Uberlândia – the school hospital of this university - using the developed equipments,
given satisfactory results and low cost by encouraging the application in public health
facilities.
Keywords: Construction of devices, Onychomycosis, LED, Photoinactivation,
Trichophyton rubrum, Staphylococcus aureus.
8
I. INTRODUÇÃO
9
1.1 Terapia Fotodinâmica
Terapia fotodinâmica (TFD) é nome de uma modalidade clínica pouco invasiva
aplicada ao combate de diversas doenças cujo crescimento anormal de tecidos mostra-se
preponderante. Das moléstias que exibem essa característica destacam-se o câncer,
degeneração macular da retina, psoríase, artrite reumatóide sistêmica, restenose, micoses
fungóides, verrugas, arteriosclerose, AIDS, infestações de microorganismos, etc.
(SIMPLICIO et al., 2002).
A TFD baseia-se em uma combinação entre luz de um comprimento de onda
específico, um composto atóxico, também chamado de fotossensitizador e oxigênio
molecular (MACHADO, 2000). Esses fotossensitizadores, mediante a presença de luz,
possibilitam a oxidação de diversos substratos orgânicos, inclusive componentes de vírus e
outros microorganismos
(
SHIKOWITZ, 1998).
Frente à métodos cirúrgicos a terapia fotodinâmica mostra-se superior em diversos
aspectos, tais como: menos invasiva; direcionamento muito preciso, permite aplicações
repetitivas, ao contrário de radioterapias; a formação de cicatrizes são muito mais raras ou
inexistentes, após o tratamento (BROWN et al., 2004).
Assim como qualquer modalidade clínica, existem limitações para a TFD. A
terapêutica é restrita a regiões onde ocorra a exposição de luz. Sondas luminosas
específicas para aplicações endógenas são possíveis alternativas que tentam suprir estas
desvantagens (MOAN; PENG, 2003). Portadores de porfirias ou que apresentam alguma
sensibilidade aos fotossensitizadores não são candidatos seguros para a aplicação da TFD.
(MOAN; PENG, 2003).
Thierry Patrice, em seu livro chamado Terapia Fotodinâmica, afirma que não tem
dúvidas que a terapia fotodinâmica será a maior tecnologia médica do futuro (PATRICE,
2003).
10
1.2 Histórico da Terapia Fotodinâmica
As primeiras observações sobre a cura de determinadas moléstias por meio de luz
solar datam mais de 3000 anos atrás, sendo conhecidas dos povos egípcios, chineses e
indianos. Normalmente esse tratamento se realizava pela aplicação dérmica de
determinadas plantas (SPIKES, 1985).
No meio científico, os relatos da terapia fotodinâmica são inicialmente mencionados
por Oscar Raab, em 1900, que observou a mortandade do protozoário Paramecium sp. em
solução de acridina, em contato com a luz solar. Raab observou que no primeiro
experimento o tempo de vida do protozoário era de 1,5 horas, enquanto no segundo
experimento, nas mesmas condições experimentais, o tempo de vida foi próximo de 15
horas. Entretanto, o segundo experimento havia sido realizado durante uma tempestade.
Desta forma, ele começou a relatar que a dose de sol (luz incidente) é a responsável pelo
efeito observado (RAAB, 1900).
O termo “fotodinâmico” foi introduzido no meio científico em 1904 por Hermann
von Tappeiner, professor de Raab e diretor do instituto farmacológico da Universidade
Ludwig-Maximilians, em Munique. Não se sabe exatamente porque o processo é chamado
dinâmico, talvez para não ficar ambíguo aos processos fotográficos que surgiram na mesma
época, tentou-se substituir o termo Terapia Fotodinâmica por Fotoquimioterapia, sem
grandes sucessos (MOAN; PENG, 2003).
Atualmente sabe-se que a excitação eletrônica do fotossensitizador na presença de
oxigênio propicia a geração de um grande número de espécies reativas de oxigênio (ROS),
como por exemplo, o oxigênio singlete (DOUGHERTY, 1998), num processo chamado de
fotosensitização.
As porfirinas foram as primeiras drogas utilizadas com a finalidade de se promover
fotosensitizações. Em 1911 Hausman já relata a aplicação de hematoporfirinas para a
fotosensitização em camundongos (HAUSMAN, 1911). Meyer-Betz (1913) testou a
aplicação de uma hematoporfirina em sua própria pele. As porfirinas normalmente
apresentam um prolongado tempo de vida no organismo humano, principalmente em
função da dificuldade de serem metabolizadas pelo corpo. Como conseqüência, o tempo de
11
fotosensibilidade adquirida na superfície corpórea pelo uso de porfirinas é bastante alto.
Meyer-Betz ainda relata que ficou fotossensível durante cerca de dois meses.
Policard (1924) demonstrou que as porfirinas além de se concentrarem em células
tumorais, apresentam fluorescência. A fluorescência apresentada por estas substâncias é
atualmente empregada para a detecção prévia de determinados tumores (BORISOVA et al.,
2008). Em 1925 Hans Fischer ganha o prêmio nobel por reportar que a uroporfirina
apresenta fototoxicidade muito próxima da hematoporfirina, apresentando como diferencial
uma boa solubilidade em sistemas aquosos (FISCHER, 1925).
Em 1942, relata-se que quando as hematoporfirinas injetadas em cobaias são mais
acumuladas em tumores metastáticos do que nos nódulos linfáticos. Essas cobaias
mostraram-se após a irradiação resultados promissores na regressão dos tumores (AULER;
BANZER, 1942). Sabe-se que os fotossensitizadores podem se associar as lipoproteínas no
plasma e serem transportados às células tumorais com muita facilidade, uma vez que estas
possuem um número exageradamente maior de receptores de lipoproteínas de baixa
densidade, conforme visto por sua demanda por colesterol (MACHADO, 2000). A partir
de 1960 as hematoporfirinas começaram a ser largamente aplicadas nas finalidades
terapêuticas e diagnósticas (LIPSON et al., 1961).
As aplicações conhecidas da TFD em clínica começaram em 1970, utilizando
hematoporfirinas como fotossensitizador, com os trabalhos pioneiros de Dougherty e
colaboradores, os quais conseguiram uma maior purificação dos derivados
hematoporfirínicos (DOUGHERTY et al., 1978). Posteriormente, além das porfirinas,
vários outros fotossensitizadores foram testados, na tentativa de tornar a terapêutica mais
eficiente.
12
1.3 Fotossensitizadores
1.3.1 Porfirinas e Hematoporfirinas – Primeira geração de
fotossensitizadores
As porfirinas, em termos estruturais, são macrociclos caracterizados pela presença
de quatro subunidades de anéis pirrólicos interconectados a seus carbonos alfa por meio de
ligações metínicas (YAO et al., 2009). Elas são aromáticas e possuem um sistema de
inúmeros pares conjugados e como conseqüência, são bastante coloridas. O nome porfirina
vem do grego porphurã e significa púrpura. Alguns desses macrociclos podem ter origem
natural, como as hematoporfirinas, responsáveis pela pigmentação vermelha do sangue. A
porfina é o composto mais simples dessa classe, seus análogos substituídos são chamados
genericamente de porfirinas. A figura 1 exibe a estrutura de uma porfina.
Figura 1: Estrutura da porfina, o representante mais simples da classe das porfirinas (AULER;BANZER,
1942).
Essas estruturas porfirínicas têm como característica uma Banda Soret, trata-se de
uma banda de absorção do espectro eletromagnético bastante forte na região do azul (400 –
420nm). Geralmente, apresentam também quatro bandas de absorção na faixa de 500-600
nm, denominadas de bandas Q.
Historicamente as hematoporfirinas, foram as primeiras espécies fotossensitizadoras
a serem largamente empregadas na terapia fotodinâmica. A literatura aponta que misturas
hematoporfirínicas foram amplamente utilizadas como fotossensitizadores principalmente
13
nos trabalhos executados a partir de 1911 e até meados da década de 70. Inicialmente essas
misturas eram obtidas a partir de sangue dessecado e posterior tratamento com ácido
sulfúrico para a remoção do ferro (SCHERER, 1841).
Esses compostos, no entanto, apresentam efeitos colaterais, tais como um alto
tempo de fotosensibilidade da pele. Essa dificuldade metabólica do organismo não é devida
à hematoporfirina, e sim às várias outras substâncias oligoméricas presentes na mistura de
hematoporfirina, decorrentes, principalmente, do método de preparação (SIMPLICIO et al.,
2002; STERNBERG et al., 1998).
A Photofrin
®
, por exemplo, é uma mistura mais purificada dos derivados de
hematoporfirina. Por medidas espectroscópicas, farmacocinéticas e propriedades
farmacológicas, observa-se que a Photofrin
®
é constituída principalmente de monômeros
(protoporfirina IX, derivados da hematoporfirina, dois isômeros de
hidroxietilvinildeuteroporfirina), dímeros de hematoporfirinas com um éter, um éster ou
uma ligação carbono-carbono, e alguns oligômeros bastante extensos. A Figura 2 mostra
uma dessas estruturas mencionadas.
Figura 2: Hematoporfirina na forma de éter presente na mistura de oligômeros que compõem a Photofrin
®
(SIMPLICIO et al., 2002)
Esses fotossensitizadores, chamados de primeira geração, apresentavam, além disto,
outros aspectos negativos, tais como baixa seletividade pelo tumor e baixa absorção na
região entre 600-750 nm (onde a luz penetra melhor o tecido humano) (PROFIO;
DOIRON, 1981). É claro que uma mistura mais purificada como é o caso da Photofrin
®
14
permite a atenuação de algumas destas desvantagens. A busca por substâncias com
características mais apreciáveis e maior eficiência, culminou na segunda geração de
fotosenstizadores (MOAN; PENG, 2003), apresentados a seguir nos itens 1.3.2; 1.3.3 e
1.3.4.
1.3.2 Ácido 1,5-aminolevulínico (ALA)
O ALA é uma pré-droga, que enzimaticamente se transforma no seu respectivo
fotossensitizador: a protoporfirina IX. O processo ocorre no organismo via síntese de heme
no organismo na qual o ALA é um biomodulador do processo (Figura 3).
A unidade heme é um grupo prostético constituinte da hemoglobina, mioglobina e
dos citocromos. A biosíntese da unidade de heme é descrita na Figura 3. O controle no
organismo para a formação de heme está em função da concentração de ALA, e por isto ele
é um biomodulador do processo. Se a concentração é alta a própria heme atua como
inibidor de transcrição da enzima δ-Aminolevulinato Sintase suprimindo a formação de
ALA. O ultimo estágio da síntese de heme é a ferroquelação enzimática da protoporfirina
IX em heme. Sabe-se que a adição externa de ALA induz a formação preferencial de
protoporfina IX em detrimento do heme, uma vez que existe uma limitada habilidade da
enzima ferroquelatase em formar o complexo heme(RUTHERFORD et al., 1979).
15
Figura 3: Biosíntese de Heme – O ALA é precursor e também modulador do processo (RUTHERFORD et al.,
1979).
16
O ALA pode ser sintetizado em laboratório, dentre outros métodos, pela rota
sintética proposta por Kang e colaboradores (Figura 4) , em condições anidras. Na presença
de água, podem ocorrer reações secundárias de hidrólises e substituições que reduzem
significantemente o rendimento do ALA (KANG et al., 2005).
a) MeOH, em refluxo por 3 horas; b) SOCl
2
à 35ºC por 5 horas; c) CuCN em acetonitrila
à 70ºC por 6 horas; d) Pd/C, H
2
, EtOH por 18 horas; e) 2-metilpropeno, H
2
SO
4
.
Figura 4: Rota sintética para obtenção do ALA e o derivado terc-butil éster, a partir de anidrido succínico
(KANG et al., 2005).
O ALA aplicado em terapia fotodinâmica já liberado pelo FDA e pela ANVISA no
Brasil, possui parecer favorável desde o ano de 2002. O registro foi concedido pela
ANVISA através da resolução RE nº 376, processo nº 25351.015079/01-97. Atualmente o
produto é comercializado pelos Laboratórios Stiefel.
O uso de ALA não se restringe apenas à fotossensitização. Diversos trabalhos
apontam resultados interessantes de sua aplicação como marcador para detecção prévia de
tumores (BAKOS et al., 2003).
17
1.3.3 Ftalocianinas
Relatos de Ben-Hur e colaboradores já descrevem as ftalocianinas como agentes
fotosensitizantes (BEN-HUR; ROSENTHAL, 1985). As ftalocianinas são porfirinas
sintéticas do grupo das azaporfirinas; nelas os grupos pirrólicos são condensados com um
grupo benzênico e uma ligação de nitrogênio substitui a ligação metínica. (SPIKES, 1986)
Essas alterações estruturais resultam em um alto coeficiente de absorção molar (cerca de
10
-5
mol
-1
cm
-1
), principalmente na faixa de 675-700 nm. Por essas razões as ftalocianinas
tendem a ser potentes fotossensitizadores.
Esses compostos podem formar complexos estáveis com metais diamagnéticos
como Zn
2+
, Al
3+
e Ga
3
, que além conferirem maior rendimento na síntese, aumentam o
tempo de vida do estado triplete comparado com as ftalocianinas paramagnéticas. As
propriedades fotofísicas variam de acordo com a presença e natureza do íon metálico no
centro.
Quando não substituídas, as ftalocianinas são insolúveis em água, entretanto
existem diversas modificações, tanto em relação ao metal, quanto ao macrociclo, que
permitem aumentar a hidrofilicidade visando aplicações clínicas mais diretas. Os métodos
atualmente utilizados são sulfonações, tetra e octa substituições, cordenações axiais com
outros metais, acoplamentos à polímeros, na formulação de cremes, inclusão em
lipossomas, nanopartículas, nanomicelas, ligação à albumina de soro bovino, ligação à
colesteróis de estruturas de baixa densidade, etc (MOAN; PENG, 2003).
1.3.4 Corantes catiônicos
Corantes catiônicos fenotiazínicos, fenonaxínicos, como o azul de metileno (Figura
5B) e o alaranjado de acridina (Figura 5D) são reportados como agentes fotosensitizantes.
Sabe-se também que a acridina (Figura 5A) e corantes tiazínicos foram os primeiros
agentes utilizados na TFD antiviral.
18
A B C D
Figura 5: Corantes fenotiazínicos e fenonaxínicos empregados como fotossensitizadores.
O azul de metileno (AM), por sua característica catiônica, apesar de corar
eficientemente as células, normalmente apresenta baixa capacidade de permeação no tecido
epitelial. Deste modo, as aplicações do AM em terapia fotodinâmica é mais comum na area
dermatológica. A literatura aponta diversos trabalhos que evidenciam resultados bastante
satisfatórios nas aplicações tópicas da terapia fotodinâmica com azul de metileno
(TARDIVO et al., 2007b; PERUSSI, 2007; ALMEIDA et al., 2006).
Combinações entre azul de metileno e azul de toluidina (Figura 5C) também são
usadas com o objetivo de aumentar o desempenho do tratamento, uma vez que se promove
uma coloração do exterior da derme (azul de metileno) e interior do tecido (pelo azul de
toluidina) (TARDIVO et al., 2007a). Desta forma, o azul de toluidina atua
complementando a ação do azul de metileno conferindo um tingimento geral e mais
eficiente dos tecidos.
1.4 Mecanismos fotodinâmicos
A ação fotodinâmica fundamenta-se nas reações de fotosensitização em presença de
oxigênio molecular. Os dois principais mecanismos envolvidos são os de transferência de
elétrons ou transferência de energia frequentemente chamados de Tipo I e Tipo II,
respectivamente.
Qualquer um dos dois mecanismos envolve a reação do fotossensitizador em seu
estado triplete:
19
1.4.1 Mecanismo Tipo I
O mecanismo do tipo I tem como característica a geração de um radical ou reação
redox na qual o fotossensitizador, excitado ao estado triplete (
3
S), reage com uma molécula
vizinha (A) por transferência de elétron ou de um átomo de hidrogênio.
+•−•
+→+ ASAS
3
(1)
Uma alternativa, que também pode ocorrer nos mecanismos do Tipo I é descrita nas
equações 2 e 3, onde o fotossensitizador já no estado triplete excitado transfere energia e
elétrons ao oxigênio molecular. Nesta situação tanto o íon-radical oxigênio formado,
quanto o próprio fotossensitizador que já executou a transferência de elétrons, pode reagir
com o substrato A.
−•+
+→+
22
33
OSOS
(2)
+•+
+→+ ASAS
0
(3)
Assim, qualquer um dos produtos gerados são passíveis de promover a oxidação da
molécula. A oxidação pode ocorrer por reação direta entre o radical da molécula vizinha e o
oxigênio molecular (equação 4). Essas oxidações ocorrem pela formação de complexos
excitados. Podem ocorrer desativações dos complexos (equação 4), ou desativação do
fotossensitizador na reação com oxigênio molecular (equações 5 e 6).
oxidados Produtos
2
3
→+
+•
OA
(4)
−•−•
+→+
202
3
OSOS
(5)
oxidados Produtos
2
→+
−•
AO
(6)
20
A ocorrência de S
.-
e A
.+
ou S
.+
e A
.-
dependerá das propriedades redóx de cada
molécula (MACHADO, 2000; KAVARNOS; TURRO, 1986).
1.4.2 Mecanismo Tipo II
O mecanismo do tipo II é designado também por processos de transferência de
energia. O processo mais conhecido pelo mecanismo de tipo II é a oxidação via formação
oxigênio singlete (
1
O
2
):
2
1
0
1
2
33
OSOS +→+
(7)
oxidados Produtos
2
1
→+ AO
(8)
Observa-se que os processos do Tipo II são predominantes, uma vez que os
mecanismos do tipo I tendem a ser muito rápidos devido a sobreposição máxima dos
orbitais envolvidos, durante a formação do complexo excitado. (KAVARNOS; TURRO,
1986).
Oxigênio singlete é nomeclatura dada aos 3 estados eletrônicamente excitados
imediatamente superiores ao oxigênio molecular no estado fundamental. A tabela 2 mostra
essas configurações eletrônicas.
Tabela 1: Possíveis configurações eletrônicas assumidas pela molécula de oxigênio (Machado, 2000).
Estado Orbital molecular antiligante Energia
*
, KJmol
-1
3
Σg
[ ↑ ] π
*
x
[ ↑ ] π
*
y
0
1
∆y
[↑↓] π
*
x
[ ] π
*
y
92,4
1
∆x
[ ] π
*
x
[↑↓] π
*
y
92,4
1
Σg
[ ↑ ] π
*
x
[ ↓ ] π
*
y
159,6
* Relativa ao estado fundamental
21
1.5 Fontes de irradiação
Nas primeiras aplicações da TFD as fontes empregadas na ativação de agentes
fotodinâmicos baseavam-se em radiações policromáticas não-coerentes, como lâmpadas de
arco voltaico (e.g., lâmpadas de arco de xenônio) ou mesmo lâmpadas incandescentes. Por
meio de filtros ópticos, essas lâmpadas são capazes de fornecer radiações no comprimento
de onda apropriado para a maioria dos fotossensibilizadores. Esse tipo de sistema,
infelizmente, exibe um aquecimento relevante, dificilmente permite um controle preciso na
dosagem de luz, e normalmente apresenta baixa intensidade luminosa, na região desejada
(ZHENG-HUANG, 2005). Têm se observado no mercado vários aperfeiçoamentos no
sentido da minimização dessas desvantagens por meio de cuidadosos projetos de
engenharia e design.
Entretanto, no Brasil, é utilizado com bastante sucesso em aplicações in vivo de
TFD um equipamento chamado RL-50, desenvolvido com tecnologia nacional. O
equipamento apesar de ter sofrido diversas alterações, foi concebido acoplando-se uma
lâmpada halógena no interior de uma estrutura cilíndrica rígida dotada de haste, e através
de um filtro óptico acoplado na extremidade, a radiação filtrada foi empregada para
fotosensitização. A Figura 6 exibe o equipamento descrito, retirado dos trabalhos de
Tardivo e colaboradores (TARDIVO et al., 2002).
22
Figura 6: Equipamento RL-50. O filtro de transmissão é utilizado normalmente em fotografia (TARDIVO
et
al
., 2002).
O uso do equipamento de irradiação para TFD depende muito da região do
organismo a ser tratada. Pois, sistemas que empregam luz filtrada, conseguem abranger
uma área de irradiação substancialmente maior do que seus respectivos concorrentes a
LASER. Apesar dos sistemas a LASER ser o mais empregado em TFD, apresenta uma
série de desvantagens. A principal é o seu alto custo, principalmente em países como o
Brasil. Equipamentos de custo elevados não são viáveis para uso em larga escala, como em
sistemas de saúde pública. Outro parâmetro bastante observado para a aquisição de
equipamentos é a intensidade da luz emitida, pois concluí-se que sistemas mais intensos são
normalmente melhores. Na TFD, cada aplicação está envolvida a um protocolo médico,
onde a dose de luz D, equação 9, é normalmente fixa. Onde I é a intensidade da luz emitida,
e t o tempo.
23
tID
⋅
=
(9)
Acerca da dose empregada no tratamento de tumores, Herwig Kostron cita algumas
doses empregadas em diferentes tipos de moléstias, usando diferentes tipos de sistemas de
irradiação. A dose de 240 J cm
-2
em função do tratamento e do fotossensitizador, é
considerada bastante alta (KOSTRON, 2003). Para se ter uma idéia prática do tempo
necessário para se obter essa dose, considerando-se que sistemas que empregam luz filtrada
normalmente apresentam intensidades próximas a 100 mW, nesses dispositivos seriam
necessários 40 minutos de exposição.
A empresa Carl Zeiss produz um sistema de irradiação indicado para o tratamento
oftálmico com verteporfirinas, chamado Visulas 690
®
; este sistema trabalha com um
LASER que emite no comprimento de onda de 689nm, utilizado principalmente para o
tratamento de degeneração macular da retina. A potência do LASER não ultrapassa 400
mW. O equipamento é muito interessante, entretanto devido ao seu elevado custo e seu uso
restrito a aplicações oftálmicas, torna-se inapropriado para ser usado em centros de saúde
pública. A Figura 7 mostra o equipamento Visulas 690
®
.
Figura 7: Equipamento Visulas 690
®
(CARL ZEISS, 2009).
A empresa DIOMED produz o equipamento DIOMED 630 PDT
®
(Figura 7),
adequado para uso com Photofrin
®
, pois opera no comprimento de onda de 630 nm. O
24
equipamento é útil para aplicações endógenas, pois possui sistemas de fibra óptica com
difusor para fazer a transmissão da luz. A potência máxima pode chegar a 2000mW. O
equipamento possui um sistema de refrigeração. No entanto, não apresenta boa área de
irradiação, o que limita a aplicação do equipamento à pequenas regiões. O comprimento de
onda de 630 não é favorável a outros tipos de drogas fotossensitizadoras. Por outro lado o
Photofrin
®
/Photogem
®
não são fotossensitizadores viáveis economicamente no Brasil (75
mg de Photofrin custam aproximadamente U$2.200) (VIA; MAGNO, 2001). A Figura 7
exibe o equipamento DIOMED 630 PDT
®
.
Figura 8: LASER DIOMED 630 PDT para Terapia Fotodinâmica. O equipamento possui dispositivo de fibra
óptica, tornando versátil a aplicação endógena (DIOMED, 2000)
1.5.1 LED na Terapia Fotodinâmica
Diodos emissores de luz (LED) são também empregados em sistemas de irradiação
voltados a TFD. Os LED além de constituírem uma alternativa de baixo custo, possuem
grande homogeneidade luminosa, (PIESLINGER et al., 2006) permitindo que a radiação
seja facilmente dosada e calculada em diversas aplicações. A emissão de um LED é bem
definida e normalmente estreita em um determinado comprimento de onda. Esse fator,
associado à relativa intensidade (como nos modelos chamados de alto brilho), dispensa o
25
sistema de filtragem encontrado nos sistemas de lâmpadas policromáticas. Além destes
fatores, a baixa dissipação térmica, combinada à emissão monocromática de moderada
intensidade, sistemas simples, robustos e de pequeno tamanho, torna-se atraente o uso de
LED em dispositivos para aplicações de TFD (PIESLINGER et al., 2006; JUZENIENE et
al., 2004).
Os LED coloridos convencionais de 3 e 5 mm muito comuns no mercado, operam
normalmente sob corrente média de 20 mA, e possuem baixas taxas de emissão luminosa
(normalmente não superior à 5.000 mcd) (KINGBRIGHT CORP., 2007). No intuito de
suprir essa desvantagem, observa-se duas alternativas: i) a construção de arranjos de LED
que não somente aumentam a área de incidência, como potencializam a intensidade da
radiação emitida; ii) a aplicação de LED de alta potência (HPLED – High Power LED).
Esses últimos, atualmente são confeccionados para o uso em iluminação, são mais potentes
que os anteriores, possuem boas taxas de conversão luminosa - cerca de 33 lm/W para o
HPLED vermelho (PHILLIPS LUMILED LIGHT Co., 2006). Isso indica que gastam
menor quantidade de energia para a emissão da mesma quantidade luminosa em
comparação com outras fontes, além de preservarem as boas características que possuem
seus correspondentes de baixa potência: durabilidade e emissão próxima à monocromática.
Em 2004 foram realizados estudos comparativos in vivo entre sistemas de irradiação
de lâmpadas halógenas filtradas e sistemas dotados de tecnologia LED. O estudo, onde se
empregou o ácido 5-aminolevulínico para aplicação de TFD em níveis dérmicos, revelou,
em diversos aspectos, a superioridade dos sistemas que utilizam LED. Dentre as vantagens,
pode-se citar a maior profundidade de atuação nos tecidos, baixo calor incidente, redução
na intensidade de dor e boa eficiência em inativação de células in vitro (JUZENIENE et al.,
2004). As aplicações de TFD empregando luz emitida por diodos, não são restritas apenas a
aplicações superficiais: relatos demonstram aplicações no tratamento de tumores cerebrais
por meio de sondas de LED ajustados em uma ponta cilíndrica e acoplados num cateter
balão.
Essa sonda, pequena e flexível, emite luz permitindo baixíssimas invasões aos
demais tecidos. Neste sistema o cateter pode ser introduzido em tumores percutâneos
(LUSTIG et al., 2003; CHEN et al., 2002).
Atualmente, espécies reativas de oxigênio são geradas na TFD através,
principalmente, por LASER. As vantagens dos LASER estão no caráter da luz
26
monocromática e na alta intensidade obtida nesse dispositivo (ZHENG HUANG, 2005).
Entrentanto, a coerência de um LASER não é necessária em aplicações na TFD
(JUZENIENE et al., 2004; BOEHNCKE et al., 1996). Esse fator justifica a construção de
fontes não-coerentes, as quais são normalmente muito mais acessíveis econômicamente,
estáveis e versáteis.
1.6 Staphylococcus aureus
Atualmente o gênero Staphylococcus é composto por cerca de 27 espécies sendo
algumas freqüentemente associadas a uma ampla variedade de infecções de caráter
oportunista, em seres humanos e animais. Os principais tipos de estafilococos encontrados
em seres humanos são os Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e
Staphylococcus saprophyticus.
O Staphylococcus são microorganismos Gram-positivos, imóveis, não formadores
de esporos, anaeróbios facultativos e normalmente apresentam 0,5µm a 1,5µm de diâmetro.
São dispostos na forma de cocos, que se dividem em mais de um plano na formação de
estruturas similares a cachos de uva (BAIRD-PARKER, 1990).
A reprodução pode ocorrer em faixas de pH de 4,2 à 9,3, apresentando ponto ótimo
entre 7,0 e 7,5. Em concentrações entre 10 a 20% de NaCl e nitratos os Staphylococcus
mostram-se bastante tolerantes (IGARASHI et al., 1986). A temperatura ideal de
crescimento fica próxima a 30 – 37º C. Já em temperaturas entre 37 – 40ºC os
Staphylococcus começam a produzir toxinas chamadas enterotoxinas. Essas toxinas são
produzidas em alimentos contaminados quando estão em temperaturas acima de 4ºC.
Atualmente, são conhecidas cinco toxinas imunologicamente distintas (A, B, C, D, E).
Algumas evidências sugerem que essas enterotoxinas são superantígenos termoestáveis e,
assim, a intoxicação alimentar pode ser veiculada mesmo por alimentos cozidos, tornando-
se um risco em potencial para a saúde pública (CARMO et al., 2002). A intoxicação
alimentar caracteriza-se por sintomas que incluem câimbra muscular, dor de cabeça,
vômito, hipotensão, cólica abdominal, náusea e, principalmente, diarréia. Casos raros em
crianças e idosos podem levar ao óbito (CARMO, 1997).
27
O Staphylococcus aureus é capaz também de produzir a toxina-1, capaz de
promover a síndrome do choque tóxico. Nesta situação o paciente, geralmente mulher no
período menstrual, apresenta febre alta, diminuição da pressão sistólica, eritema com
descamação da pele, insuficiência renal, diarréia e outras manifestações. Essas
manifestações são atribuídas a uma toxina produzida ao nível da vagina. Embora a grande
maioria dos doentes seja constituída por mulheres em período menstrual, a doença tem sido
registrada em pacientes com infecções de pele, ossos e pulmões (LIMA, 2007).
Além destes fatores, o S. aureus está muitas vezes associado à infecções cutâneas,
nasais, de tecidos moles, tanto em pacientes da comunidade quanto em hospitalizados.
Essas infecções podem atingir desde regiões superficiais até os tecidos mais profundos,
sendo o S. aureus o agente mais comum. Além disto o S. aureus é conhecido por ser o
principal responsável por infecções hospitalares (SANTOS, et al., 2007).
Embora o Staphylococcus aureus possa ser suscetível à ação de várias drogas ativas
contra bactérias Gram-positivas (tais como penicilinas, cesfalosporinas, eritromicina,
aminoglicosídios, tetraciclina e clorafenicol), é também conhecido pela sua elevada
capacidade de desenvolver resistência a diversas delas. Portanto, a antibioticoterapia
adequada para estas infecções estafilocócicas deve ser precedida da escolha da droga com
base nos resultados de testes de suscetibilidade (FREITAS et al., 2004) .
A penicilina é a droga de escolha se a linhagem for sensível. As linhagens
resistentes são produtoras de beta-lactamase (penicilinase), uma enzima que inibe a ação da
droga, e são codificadas por genes plasmidiais
(
NEVES et al., 2007). O emprego de
meticilina e outras penicilinas semi-sintéticas (tais como a oxacilina, nafcilina e
cloxacilina), resistentes à ação das penicilinases, iniciada em 1959, representou uma etapa
significativa na terapia antiestafilocócica
(
NEVES et al., 2007). Porém a resistência a esses
antibióticos foi detectada dois anos após o início da sua utilização.
A resistência à meticilina está relacionada a alterações das proteínas ligantes de
penicilina (penicillin-binding proteins) (TAVARES, 2001). Essas linhagens resistentes a
meticilina (MRSA - Staphylococcus aureus meticilina-resistentes) , muitas vezes são
resistentes a outros tipos de antibióticos. Para essas linhagens a droga de escolha é a
gentamicina e em caso de tratamento de infecções estafilocócicas de caráter grave é
recomendado o uso da vancomicina
(MELO et al., 2005).
28
1.7 Onicomicose
A onicomicose é uma infecção que atinge as unhas, causada por fungos,
correspondendo a cerca de 50% das queixas relacionadas à problemas de unhas. A infecção
total normalmente gera espessamento, descoloração, opacificação, distrofia ungueal,
podendo inclusive alterar a estrutura da unha (GRAY, 2002).
O agente dermatófito mais comum, o Trichophyton rubrum, é responsável por cerca
de 69-92,7% dos casos. Quanto ao segundo agente, a literatura é um pouco confusa,
variando entre o Trichophyton tonsurans e o Trichophyton mentagrophytes var
interdigitale
(HEIKKILÃ; STUBB, 1995; ARENAS, 1990). As drogas sistêmicas
apresentam algumas desvantagens como a possibilidade de indução a reações hepatobiliares
moderadas à severas, baixo espectro de atividade, possíveis interações medicamentosas.
Durante o percurso do tratamento, podem ocorrer recidivas, que normalmente tornam o
tratamento extenso, muitas vezes cansativo e oneroso ao paciente (CAMPANHA et al.,
2007). O tratamento tópico é frequentemente ineficaz na eliminação total da infecção
(RUIZ-ESMENJAUD et al., 2003; ARENAS, 2004).
Os fungos do gênero Trichophytons caracterizam-se pela presença de grande
quantidade de microconídios piriformes (formato de pêra), redondos ou ovalares, dispostos
em acládio ou agrupados e macroconídios claviformes alongados (Figura 9B). Podem ser
observadas ainda estruturas como candelabros fávicos, hifas em espiral e hifas em raquete.
Alguns pesquisadores têm observado infecções invasivas por T. rubrum (GROSSMAN et
al., 1995) e T. mentagrophytes (SALVAT et al., 1998) em indivíduos com deficiência
imunológica.
Esse tipo de micose foi escolhida dentre outras dermatoses por constituir uma
infecção de alta freqüência nos adultos. No Reino Unido tem-se constatado a infecção em
3% da população de adultos (ROBERTS, 1992); a prevalência na Finlândia atinge cerca de
8% (HEIKKILÃ; STUBB, 1995); um estudo realizado nos Estados Unidos demonstra que a
parcela afetada chega a valores próximos a 18,5% (CHARIF; ELEWSKI, 1996). No Brasil,
recentemente, uma estatística realizada na cidade do Rio de Janeiro revelou a presença da
micose em 19,35% da população (ARAÚJO et al., 2003). O maior número de casos na
29
América Latina talvez esteja associado aos fatores climáticos e socioeconômicos (RUIZ-
ESMENJAUD et al., 2003).
A virulência dos dermatófitos está relacionada, principalmente, devido aos
artroconídios (RASHID, 2001), as enzimas proteolíticas, as queratinases, as colagenases e
as elastases (APODACA; MCKERROW, 1989; TSUBOI et al., 1989) e também, a toxinas
(GARETH-JONES, 1994). Esses dermatófitos proliferam-se em condições de escassez ou
ausência de alguns mecanismos naturais de combate aos fungos tais como a estrutura física
e química da pele, a exposição a raios ultravioleta, a condições de umidade e a competição
com bactérias da microbiota autóctone da pele. A epiderme durante processos de
queratinização pode também sofrer infecção, resultando numa perda contínua da camada
mais superior da pele – o extrato córneo (WAGNER; SOHNLE, 1995).
As manifestações clínicas das dermatofitoses são, portanto, decorrentes das reações
do hospedeiro aos metabólitos do fungo, da virulência da espécie infectante e da
localização anatômica (WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995). Os dermatófitos produzem
infecções de
acordo com a área corporal que invadem, sendo denominadas tinha capitis,
tinha barbae, tinha corporis, tinha cruris, tinha pedis, tinha manum e tinha unguium.
O cultivo do Trichophyton rubrum em placas de Petri, em meio apropriado,
apresenta crescimento lento e colônias brancas com textura algodonosa ou aveludada
(Figura 9), com pregas radiais e pigmentação vermelha no lado reverso da colônia, daí o
nome rubrum que significa vermelho rubro (CERVELATTI et al., 2004).
30
A B
Figura 9: (A) Aspecto aveludado do crescimento de
T. rubrum
com 14 dias de crescimento, cultivado em
Agar Sabouraud. (B) Microfotografia do perfil de conídios de
T. rubrum
evidenciando a maior presença de
microconídeos em detrimento dos macroconídeos.
A Figura 10 mostra unhas dos pés acometidas pelo Trichophyton, as unhas
normalmente são os principais alvos de ataque dos dermatófitos, em razão da presença de
queratina, umidade elevada, baixa ventilação e ausência de luz por grandes períodos.
Figura 10: (A) e (C) representam o acometimento do leito ungueal em um estado moderado. (B) representa o
acometimento no leito ungueal das mãos, num estado inicial. O agravamento pode manter-se estagnado
durante longos períodos de tempo (PHIL, 2009).
Além de causar um impacto negativo na qualidade de vida, os casos de onicomicose
costumam apresentar pronunciada resistência ao tratamento convencional. No tratamento
convencional emprega-se drogas antimicóticas tópicas ou sistêmicas. Dentre as drogas
sistêmicas destacam-se o fluconazol, itraconazol, terbinafina e a griseofulvina
(principalmente em crianças)
(TARDIVO et al.,2007a; HEIKKILÃ; STUBB, 1995). A
31
medicação tópica envolve o uso de ciclopiroxolamina 8%, amorolfina 5% e uréia 40% com
bifonazol 1% (RUIZ-ESMENJAUD et al., 2003; GUPTA; SKINNER, 2004).
O custo do tratamento está em função do tempo de remissão. Nos casos mais
comuns fica em torno de 6-12 meses. Nas incidências relativas à onicomicose nos pés,
podendo ser mais ou menos longo em função de sua gravidade (RATIOPHARM, 2009). O
tratamento contínuo por fluconazol 150mg/semana ou Terbinafina 250mg/dia, resulta no
custo médio de R$ 100,00/mês (CONSULTA REMÉDIOS, 2009). Já o tratamento
contínuo com Itraconazol, dose 200mg/dia, o custo mensal aproxima-se de R$ 300,00
(CONSULTA REMÉDIOS, 2009). A administração de Terbinafina, em alguns casos, tende
a apresentar melhoras nos quadros clínicos mais rapidamente, quando comparada com os
demais medicamentos (EVANS; SIGURGEIRSSON, 1999; OUF et al., 2003).
32
2. OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS
33
Um dos maiores obstáculo relativo à disponibilização da terapia fotodinâmica para a
sociedade está no custo atribuído às fontes de irradiação e da droga fotossensibilizadora.
A presente proposta visa a confecção de uma fonte de luz potente e de baixo custo,
empregando LED. Estes semicondutores se mostram promissores não somente pelo baixo
custo associado, bem como por apresentarem diversas propriedades opto-mecânicas
convenientes (e.g., monocromaticidade, robusteza, durabilidade). Como também o uso de
corantes fenotiazínicos, como o azul de metileno (Figura 5B e 5C respectivamente), foram
aplicadas como alternativa ao uso de drogas mais onerosas tais como o ALA e derivados
porfirínicos (Photofrin
®
, Photogem
®
), sem grandes perdas ao processo, conforme
demonstrado por diversos pesquisadores, inclusive do âmbito nacional.
Fontes de irradiação voltadas à sensibilização de drogas normalmente são um dos
pontos críticos para a obtenção de processos foto-oxidativos eficientes. O uso de LASERs
voltados a excitação de drogas, apresentam problemas de aplicação, como reduzida área de
incidência, elevado custo do equipamento e manutenção, limitadas opções de
comprimentos de onda, etc. Neste trabalho pretendeu-se desenvolver fontes de irradiação
que não empreguem o princípio do LASER para emissão de luz. Das fontes propostas, duas
empregam o uso de diodos emissores de luz (LED), a outra emprega lâmpada halógena.
Como modelo de aplicação ao processo fotodinâmico, avaliou-se a eficiência destas forntes
na inativação fotodinâmica de colônias de Staphylococcus aureus e de Trichophyton
rubrum, empregando-se azul de metileno como fotossensitizador.
Foram delimitados os seguintes objetivos específicos, para o presente trabalho:
• Construir equipamentos empregando LED para uso na TFD que permitissem
irradiação apreciável, emissão de comprimentos de onda satisfatórios, fácil
manuseio, custo acessível, utilizar fotossensitizadores comuns como o azul de
metileno, haja vista o custo benefício deste corante frente às demais drogas
disponíveis no mercado. Deve-se também caracterizar o equipamento construído
quanto à suas propriedades físicas (ópticas). A construção deve priorizar o uso
de azul de metileno como fotossensitizador,
• Construir um equipamento, visando maximizar a ação fotodinâmica, e ser
competitivo frente aos modelos comerciais disponíveis;
34
• Utilizar o equipamento aplicado à inibição de Trichophyton rubrum in vitro,
haja vista que este é o dermatófito mais comum em casos clínicos confirmados
de onicomicose. Também são previstos ensaios voltados a fotoinativação de
Staphylococcus aureus, uma bactéria modelo, amplamente estudada, e também é
a principal causa de infecções hospitalares.
35
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
36
3.1 Materiais e reagentes
Os reagentes utilizados nos experimentos, bem como suas respectivas purezas, estão
descritos na Tabela 2.
Tabela 2: Reagentes usados e seus graus de pureza.
Reagentes Pureza
I metanol HPLC
II etanol P.A.
III acetona P.A.
IV Na
2
HPO
4
.7H
2
O >90%
V ácido Sulfúrico P.A.
VI azoteto de sódio >99%
VII dimetilsulfóxido HPLC
VIII NaCl >95%
VIII d-glicose anidra P.A.
IX azul de metileno >99%
X 1,4-difenilisobenzofurano (DPBF) >97%
XI extrato de carne BACTERIOLÓGICO
XII triptona BACTERIOLÓGICO
XIII peptona BACTERIOLÓGICO
XIV meio de cultivo - ágar CLED BACTERIOLÓGICO
XV ágar bacteriológico BACTERIOLÓGICO
XVI ágar-dextrose-batata BACTERIOLÓGICO
Os ensaios microbiológicos foram realizados com Staphylococcus aureus (ATCC
25923), cepa gentilmente doada pelo Laboratório de Microbiologia da Universidade
Federal de Uberlândia. O fungo filamentoso Trichophyton rubrum foi coletado de amostras
37
hospitalares do setor de Micologia do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de
Uberlândia.
A esterilização dos meios de cultura e soluções utilizadas no cultivo e manutenção
das culturas de microrganismos, bem como todo o material necessário para a realização dos
experimentos, foi realizada em autoclave horizontal. As soluções foram autoclavadas por
20 minutos a 120 ºC. O descarte dos meios e do material contendo microrganismos foi
sempre precedido por esterilização em autoclave.
Os espectros de absorção foram obtidos utilizando um espectrofotômetro Shimadzu
UV-1201 de feixe duplo.
Os solventes foram utilizados sem purificação prévia.
A irradiância e os espectros da luz emitida pelos equipamentos desenvolvidos neste
trabalho foram obtidos com o auxílio de um espectrômetro de fibra óptica (marca Ocean
Optics, modelo SD2000) com um tempo de integração de 35 milisegundos. Para a obtenção
das potências ópticas dos equipamentos comparou-se o espectro de emissão dos mesmos
com um LASER à gás, da marca PHIWE de He-Ne que emite no comprimento de onda de
660 nm, de potência óptica de 1mW.
A área integrada do LASER obtida no espectrômetro corresponde à sua potência
padrão (1mW), se medida à distância zero (na ponta de emissão do feixe). Desta forma, a
potência dos equipamentos desenvolvidos foi obtida através da correlação com a área do
LASER de potência padrão. A correlação só é proporcional caso os espectros obtidos sejam
adquiridos no mesmo intervalo de integração (aqui foi utilizado 35 ms.)
O LASER utilizado como padrão limita esta metodologia a comprimentos de onda
próximos à sua emissão (660 nm), pois, em comprimentos distantes deste, a medida deixa
de ser um parâmetro mais quantitativo em função da variação da energia com o
comprimento de onda.
Todos os ensaios e medidas foram realizados na Universidade Federal de
Uberlândia.
38
3.2 METODOLOGIAS
3.2.1 Construção do Equipamento de lâmpada halógena (PHLS)
Uma lâmpada halógena utilizada em retroprojetores (marca OSRAM, modelo
ENH, potência de 250W), foi acoplada a uma caixa metálica proveniente de uma fonte de
alimentação ATX. Nessa estrutura foi inserido um “cooler”. Uma lente de vidro cristal
100% (marca DFV, modelo LL-P100, com 100 mm de diâmetro, 175 mm de foco e
aumento de 1,5 vezes) foi fixada à uma distância de 7 cm fonte luminosa.
A uma distância de 22,5 cm, colocou-se uma cuba de refrigeração retangular de
vidro oca, com 5 cm de percurso. Nas extremidades laterais da cuba, foi soldado um bocal
permitindo a fixação de mangueiras de silicone para circulação de água em seu interior. A
cuba permite a passagem de água visando a refrigeração da região próxima à amostra.
A luz emitida pela lâmpada foi filtrada para a eliminação de comprimentos de onda
desnecessários, através de um filtro óptico vermelho de poliéster. Comercialmente esses
filtros são empregados no controle da luminosidade para uso automotivo e arquitetônico. O
filtro foi acoplado no topo da cuba de vidro e os comprimentos de onda transmitidos são
exibidos na Figura 20. O espectro de emissão dês sistema é exibido na Figura 20.
A montagem completa é exibida na Figura 11. O cooler é alimentado por um
transformador comum 12 V, enquanto a lâmpada é ligada diretamente na tensão alternada.
Figura 11: Esquema demonstrando montagem de PHLS; 1 – Carcaça metálica acoplada com a lâmpada e o
cooler; 2 – Lente de aumento; 3 – Cuba de refrigeração; 4 – Filtro óptico.
39
3.2.2 Construção do Equipamento empregando LED de alto brilho
(LED600)
Sob uma placa de fenolite, fez-se um arranjo para seiscentos (600) LED vermelhos
de alto brilho (marca ZX, 8000 mcd). O arranjo foi organizado em cento e cinquenta (150)
clusters de quatro (4) LED em série, ligados em paralelo.
A placa foi fixada em uma caixa metálica retangular, de 21 cm
2
de área, por 51 cm
de altura. No interior da caixa foi soldado na estrutura metálica, alguns suportes que
permitiram a fixação das amostras. Conforme estudos preliminares da variação da
homogeneidade/intensidade em função da distância observou-se que a distância de 11 cm
entre os LED e a amostra era a mais adequada para a realização dos ensaios.
Todo o arranjo foi ligado a uma fonte de alimentação DC, fornecendo corrente de
2,42 A. A estrutura descrita é mostrada na Figura 12.
Figura 12: Equipamento LED600; 1 – Arranjo de LED de alto brilho; 2 – Suporte móvel transparente para
acoplar as amostras; 3 – Níveis de altura para segurar o suporte.
3.2.3 Construção do Equipamento empregando LED de alta potência
(AMS-II)
Arranjou-se em série (Figura 13) sete (7) LED de alta potência (Edison, modelo IR
Edixeon). Os LED foram ligados através de um conversor construído pelo nosso grupo de
40
pesquisa. O equipamento opera sob tensão 100 – 240 V e mantém fixa a corrente de saída
em 350 mA.
Na realização dos ensaios de eficiência deste equipamento as amostras foram
fixadas a uma altura de 2,5 cm da parte luminosa do sistema, uma vez que essa distância
exibe os melhores resultados de homogeneidade/intensidade.
Figura 13: Protótipo para o equipamento AMS-II, 1 – Arranjo de LED de alta potência; 2 – Dissipador de
calor de processadores soquete 775; 3 – Suporte com ranhuras para a inserção de amostras.
3.2.4 Preparo das soluções de azul de metileno
Soluções de azul de metileno empregadas nos ensaios bacteriológicos (Merck) nas
concentrações 5 x 10
-5
; 5 x 10
-6
; 5 x 10
-7
mol dm
-3
, foram preparadas em capela de fluxo
pela dissolução do corante em soro fisiológico estéril (solução salina de cloreto de sódio
0,9% esterilizada por autoclave) e armazenadas temporariamente em frascos Eppendorf de
2 mL.
Utilizou-se soluções de azul de metileno na concentração 10
-4
mol dm
-3
na
coloração dos fungos para exame microscópico. As microfotografias foram obtidas num
microscópio óptico Olympus, modelo SZ61. As figuras 26 e 27 foram obtidas com lente
objetiva 400x e 1000x respectivamente.
41
3.2.5 Ensaios de fotooxidação de 1,4 Difenilisobenzofurano (DPBF)
Soluções 10
-4
mol dm
-3
de DPBF foram preparadas em metanol absoluto, seguida
da adição de azul de metileno, resultando na concentração final de 10
-6
mol dm
-3
do corante.
As soluções foram irradiadas dentro de uma cubeta de quartzo (Hellma 110-QS)
de 1 cm de caminho óptico aberta, sob agitação, em intervalos de 5 segundos, seguido de
leitura no espectrofotômetro.
Visando uma comparação entre os sistemas propostos, estimou-se a integral de
sobreposição (R) entre a absorção do azul de metileno (ABS
PS
) e a emissão dos
equipamentos (E
EQUIP
) de irradiação (equação 10), conforme o método proposto por
Bonacin e colaboradores (BONACIN et al., 2009).
∫
= dλE ABS R
EQUIPPS
(10)
Uma vez que a intensidade de irradiação não varia com o tempo, (R) possibilita
estimar a fração relativa de fotossensitizador excitada pela luz dos equipamentos propostos,
e portanto, um importante parâmetro para a comparação da eficiência entre os
equipamentos descritos.
Em um dos experimentos foi utilizado azoteto de sódio (NaN
3
), como supressor de
oxigênio singlete.
3.2.6 Ensaios microbiológicos de fotoinativação bacteriana
A cepa bacteriana (Staphylococcus aureus ATCC 25923) foi inicialmente
cultivada em um meio de cultura com a seguinte composição: 1,25% de extrato de carne
‘lab lemco’, 0,50% de triptona, 1,00% de peptona, 0,50% de cloreto de sódio, 0,25% de
hidrogenofosfato dissódico heptahidratado e 2,00% de D-glicose anidra.
A seguir realizou-se um cultivo secundário em ágar Cistina-Lactose-Eletrolito-
Deficiente – CLED (Oxoid), utilizado para crescimento e isolamento de UFCs. A partir
42
desta cultura preparou-se então uma suspensão bacteriana em soro fisiológico estéril. Nos
ensaios bacteriológicos empregou-se uma suspensão bacteriana de 0,1 da escala de
Mcfarland. Essa suspensão estoque foi diluída na proporção de 1:10 o que corresponde à
uma densidade de células de aproximadamente 3 x 10
6
unidades formadoras de colônias
UFC/mL.
As amostras foram incubadas, no escuro, por 30 minutos em uma mistura de
500µL de suspensão bacteriana e 500µL de solução de azul de metileno. Esse ensaio foi
repetido para cada uma das seguintes concentrações de azul de metileno: 5 x 10
-5
; 5 x 10
-6
;
5 x 10
-7
mol dm
-3
. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
Após o período de incubação, as amostras foram irradiadas, por 20 minutos, sem
agitação, outro grupo foi mantido no escuro como controle, em seguida transferiu-se 10uL
da suspensão para uma placa de petri contendo o meio de cultura fundido e mantido em
estufa à 35 ºC. Esse meio foi preparado adicionando-se 2% de agar bacteriológico à
formulação do caldo nutritivo. Após 24h de incubação, realizou-se a contagem de colônias,
através de um contador de colônias PHOENIX (CP 602).
Utilizou-se ainda um terceiro grupo de amostras que foram tratadas na ausência de
luz e de fotossensitizador foram utilizadas como controle geral. Esse controle geral visa
observar o crescimento bacteriano em situações ausentes do efeito fotodinâmico e ausentes
da ação citotóxica do azul de metileno.
3.2.7 Ensaios microbiológicos de fotoinativação fúngica
A amostra de T. rubrum foi suspensa em 10 mL soro fisiológico estéril. Numa placa
com 24 reservatórios foi inserido 500µL de solução de azul de metileno 10
-3
mol dm
-3
e
500µL de suspensão fúngica. O controle foi realizado na ausência de corante substituída
pela adição de 500µL de soro fisiológico.
Durante 20 minutos as amostras foram incubadas no escuro à temperatura ambiente.
As amostras incubadas foram irradiadas por 20 minutos pelo equipamento AMS-II, outro
grupo foi reservado como controle no escuro por igual tempo. Posteriormente, transferiu-se
10µL da soluções para a superfície de placas de Petri que continham previamente agar-
43
dextrose-batata. O Agar foi preparado pela simples dissolução de Agar Dextrose Batata
39g/L, sem demais aditivos.
As placas de Petri foram deixadas para crescimento em temperatura ambiente, e
observadas visualmente a cada dia, durante 14 dias.
44
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
45
4.1 Desenvolvimento dos Equipamentos
Vários LED do mercado foram utilizados, até a obtenção da configuração descrita.
O presente trabalho menciona três equipamentos de irradiação, entretanto foram
construídos diversos outros arranjos de LED até a obtenção dos sistemas descritos. As
diferentes marcas ou modelos de LED tem efeito apenas na intensidade e o comprimento de
onda emitido. Assim, anteriormente à montagem, através de um espectrômetro, visualizou-
se a emissão espectral de todos os LED disponíveis, observando se o pico de emissão do
LED localizava-se próximo ao pico da absorção do azul de metileno (λ ≅ 663nm). Sendo
assim, aquele que mais se aproximava tenderia a ter uma eficiência maior. Essa
metodologia é importante não somente para confirmar as características informadas pelo
fabricante como o λ
máx
mas, também, permite uma estimativa da intensidade de cada LED
ao se comparar a área de emissão dos mesmos à de LASERs de potência padrão.
No mercado, os LED mais comuns e que apresentam brilho suficiente para
aplicações luminosas são os modelos chamados de alto brilho. Apesar do critério não ser
muito bem estabelecido, é definido como LED de alto brilho aquele que apresenta
intensidade luminosa superior a 1 candela, uma vez que normalmente o brilho desses LED
é medido em milicandela (mcd). Na faixa do vermelho (λ
máx
= 640 nm) é possível obter
LED com brilho próximo a 9000 mcd. Os LED vermelhos que apresentam faixa de λ
máx
superior à 640 nm são bastante incomuns uma vez que seu brilho perceptível visualmente é
inferior e portanto é pouco apreciado no mercado. No mercado, observa-se também
modelos que emitem no infravermelho e que apresentam normalmente λ
máx
em 850 ou 940
nm.
Nas primeiras montagens produziu-se pequenas placas com cerca de nove a doze
LED ligados em paralelo. A ligação em paralelo foi escolhida pois assim seria possível
alimentar todos os LED com baterias de 9V. Os LED foram alimentados com a tensão
normal de trabalho deste modelo 2,2V, e a queda de tensão obtida pelo uso de resistores,
conforme a Figura 14.
46
Figura 14: Esquema do arranjo de ligação dos LED em série-paralelo.
Nesse sistema (Figura 15) o número de LED em série foi ajustado para drenar a
ddp da bateria de 9V, não necessitando de resistores, o que torna os sistemas bem mais
práticos. A Figura 15 mostra o dispositivo construído nesta abordagem.
Figura 15: Lâmpada de LED desenvolvida com arranjo série-paralelo que não aparesenta limitador de
corrente no circuito.
O equipamento descrito como LED600 foi desenvolvido com base nesta
abordagem. Neste equipamento, empregou-se 600 LED para a obtenção de uma boa área de
47
irradiação, ligados numa matriz de 100 clusters com 6 LED em cada série. O sistema opera
a 13,2 V e drena 3 A de corrente. Por limitações operacionais (a fonte empregada não
fornece mais que 2A) todos os ensaios realizados neste trabalho foram executados com a
corrente limitada a 2 A. O equipamento é exibido na Figura 16.
A B
Figura 16: Fotos do equipamento LED600. A – Desligado. B – Ligado.
Nas matrizes com LED convencionais, o uso de baterias se mostrou ineficiente,
pois a corrente drenada por estes circuitos é bastante elevado. Nas baterias a redução da
carga implica na redução do brilho dos LED, um efeito bastante indesejável. Assim esses
circuitos foram alimentados em fontes de alimentação covencionais, como as fontes
lineares a venda no comércio..
O sistema LED600, apresenta uma matriz extensa, contendo 600 LED, dentre os
quais, devido a falta de controle de corrente, gerou brilhos desiguais em várias
ramificações. Observou-se com o uso deste equipamento que o arranjo em paralelo implica
em algumas desvantagens, e o uso de sistemas em série tendem a ser muito mais adequados
48
à processos fotoquímicos, haja vista que o fornecimento de intensidade homogênea, de
irradiância fixa e estável, são fundamentais para obter resultados confiáveis. Desta forma o
arranjo em série e o controle na corrente (e não na tensão) fornecida aos LED, foi preferido,
uma vez que:
i) A curva entre a corrente e a voltagem dos LED é muito abrupta: Pequenas
alterações na voltagem traduzem-se em grandes variações na corrente. Uma vez
que a intensidade luminosa dos LED altera-se mais linearmente com a corrente,
sutis alterações na voltagem implicariam em drásticas mudanças na intensidade.
Portanto, entre dois sistemas distintos A e B, o “A” opera em voltagem fixa, e o
“B” em corrente fixa. Observa-se que em “A”, por mais preciso que seja, tende
a oscilar mais o brilho dos LED do que “B”. A razão disto pode ser entendido
analisando a Figura 17, que mostra as alterações de voltagem versus corrente
(brilho) em um LED. Isso indica que “B”, mesmo atuando com sistemas simples
de controle de corrente, tende a garantir menores oscilações da intensidade
luminosa.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
0
200
400
600
800
1000
Corrente (mA)
Voltagem (V)
Figura 17: Comportamento entre a voltagem e corrente na ligação de um LED.
49
ii) Em função da voltagem e do coeficiente negativo de temperatura natural dos
LED, arranjos conectados em paralelo não garantem que a corrente (e assim o
brilho) entre cada LED seja necessariamente igual. Quando dois diodos são
conectados em paralelo e um deles aquece um pouco mais do que o outro, esse
diodo tende a drenar mais corrente, aquecendo-se mais e assim contribuindo
progressivamente através de um efeito cascata que, leva a um superaquecimento
do LED. Uma vez que o LED superaquece, observa-se inexoravelmente a
redução de seu brilho em função da temperatura (eles possuem um coeficiente
negativo de temperatura).
O sistema LED600, infelizmente, por questões práticas, não pode ser arranjado
em série, uma vez que a tensão em componentes em série é cumulativa, e, portanto o
equipamento tenderia a consumir uma tensão próxima a 1320 V (assumindo 2,2 V a tensão
aproximada de cada diodo), inviabilizando o projeto. Na prática foi observado que apesar
do arranjo em LED600 ter sido realizado de forma bastante compacta, a homogeneidade
não foi comprometida, e a limitação de corrente, pelo uso de uma fonte apropriada, reduz
parte dos problemas relacionados aos arranjos em paralelo. Além disto, LED600 possui
inúmeros componentes, caso fosse montado em série e um dos diodos fosse danificado,
abrindo o circuito, toda iluminação do conjunto seria comprometida.
No sentido de evitar todos os problemas práticos observados no sistema LED600,
foi construído o sistema AMS-II, no qual os LED foram associados em série e com controle
de corrente. Desta forma o sistema construído apresentaria todas as características
apreciáveis conforme supramencionado. Outra vantagem na construção de AMS-II é o uso
de LED de alta potência, cuja intensidade luminosa é muito maior. Portanto empregou-se
apenas 7 LED de alta potência em AMS-II. A Figura 18 mostra o equipamento em
funcionamento.
50
A
B C
Figura 18: Fotos de AMS-II. A e C – Equipamento em funcionamento. B – Vista frontal do equipamento.
O controle de corrente dos LED de alta potência foi realizado através do circuito
integrado IRS2541 produzido pela International Rectifier (2007). Esse circuito permite a
regulagem de uma corrente constante para os LED, por meio de realimentação através de
um controle de corrente de saída no seu pino IFB (feedback de corrente). Esse tipo de
controle é muito comum em fontes chaveadas, e permite dentre diversos outros fatores, a
independência da tensão de entrada (110 ou 220V e 60Hz, no Brasil) para regular a corrente
de saída. Portanto o circuito além de apresentar bom controle de corrente é bivolt
automático, evitando assim a queima por ligação em tensão incorreta (uma das maiores
causas de queima de eletroeletrônicos).
No projeto não se utilizou DEN1 (diodo de entrada), COUT (capacitor de saída) e
ROUT (resistor de saída), pois as funções adicionais executada por estes dispositivos não
foram necessárias. Todos os outros componentes utilizados, além de suas características e
51
valores, exibidos na figura 19, foram inseridos da mesma forma que o sugerido na nota de
aplicação do fabricante.
O esquema de montagem de AMS-II foi realizado conforme a nota de aplicação
do circuito integrado descrito, e está descrita na Figura 19.
Figura 19: Esquema de ligação do conversor desenvolvido para ligar o LED de alta potência
(INTERNATIONAL RECTIFIER, 2007).
Cada LED de alta potência foi alimentado com 350 mA de corrente e a tensão de
saída do equipameto era de 22,4V. Um dissipador de calor de corpo em alumínio anodizado
foi fixado na matriz de LED.
Já o equipamento construído e utilizado como comparação entre os dispositivos
que empregam LED é de lâmpada halógena filtrada e foi aqui denominado por PHLS. O
PHLS possui um custo de produção, de no mínimo, duas vezes menos que os demais
dispositivos desenvolvidos. Esse equipamento também é muitas vezes mais acessível que
os equipamentos comerciais análogos (de lâmpadas). A lente empregada reduz muito a área
de radiação homogênea. Todavia, testes realizados com o espectrômetro indicaram um
ganho superior à 50% no valor da intensidade luminosa, quando se usa a lente. Na ausência
de sistemas de refrigeração, a amostra pode atingir temperaturas próximas à 52ºC o que
52
favorece a desnaturação de DNA e proteínas. Desta forma, usou-se uma cuba de vidro que
dissipa eficientemente o calor gerado, garantindo que a temperatura da amostra não seja
elevada a mais do que 3ºC.
Caso a proposta fosse a construção de equipamentos LASER, estes podem ser
construídos, a partir do LASER de gravadores de DVD. Isso porque o LASER de
gravadores de CD emite normalmente na faixa de 780 nm, os LASERs de gravação em
DVD emitem próximos à 650 nm (CLEMENTS, 2006), uma faixa bastante adequada para
alguns fotossensitizadores. Esses LASERs normalmente apresentam potências apreciáveis
(245 mW). A construção de um sistema simples para ligar esse LASER pode ser feita com
um circuito integrado regulador de tensão do tipo LM317 fabricado pela National
Semiconductors. Apesar deste sistema, assim como qualquer outro equipamento a LASER,
tender a apresentar uma área de irradiação limitada (inferior a 0,25 cm
2
), seu custo deve ser
baixo comparando com os dispositivos normalmente utilizados e comercializados com a
tecnologia LASER.
4.2 Espectros de emissão dos equipamentos
O espectro de emissão dos equipamentos desenvolvidos, sobreposto à absorção do
corante empregado está disposto na Figura 20.
53
500 550 600 650 700 750 800 850
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
Absorbância
Contagem de fótons
Comprimento de Onda / nm
Figura 20: Espectro de absorção do azul de metileno (
▬
); Espectro de emisão do PHLS (
―
), LED600 (
.......
), e
AMS-II (----)
O LED600 apresenta uma ampla area de emissão. Cerca de 360 cm
2
, uma razoável
homogeneidade (determinada com auxílio de um espectrômetro na qual o pico de
intensidade não se altera em +-4% em magnitude na região central de incidência de luz) e
baixo aquecimento. Para este equipamento foi observada uma distância de 11 cm, como
ponto de melhor relação homogeneidade/intensidade. Esta distância qual foi utilizada nos
ensaios microbiológicos e na degradação de DPBF. Nos sistemas que usam arranjos de
LED deve-se encontrar a distância de trabalho ideal, uma vez que, o invólucro polimérico
atua como lente. Uma alta proximidade implica que a amostra está muito próxima ao foco,
e, assim, a irradiação deixa de ser uma área definida e passa a ser pontual e intensa,
perdendo-se assim a homogeneidade. Um aumento na distância, tende a melhorar a
distribuição da radiação, mas resulta em perdas na intensidade.
O AMS-II apresentou uma intensidade muito próxima a de LED600, possuindo um
pico de emissão em 652 nm, sendo muito mais próximo ao pico de absorção do azul de
metileno (663 nm). Foi visto que a emissão do AMS-II não é somente mais apropriada para
54
o azul de metileno, como também apresenta ótima homogeneidade conforme visto em
testes adicionais com o espectrômetro. Além disto, a área de emissão de 95 cm
2
do AMS-II
(Tabela 3) podem ser aumentada pela simples adição de mais LED ao arranjo.
A fração útil de luz que excita o corante fenotiazínico é diferente para cada
equipamento, uma vez que os equipamentos apresentam diferentes potências de emissões
em função do comprimento de onda. As informações sobre a área de irradiação com
intensidade homogênea, potência óptica, irradiância, o fluxo fotônico em mol de fótons
(Einstein) por segundo Φ, e R (fração de moléculas excitadas) obtidas com cada
equipamento são resumidas na Tabela 3,
Tabela 3: Potência óptica (P), Área de irradiação (A), Irradiância (Ir) e estimativa da fração excitada de
moléculas do fotossensitizador (R), nas condições empregadas.
Equipamento P (mW) A (cm
2
)
a
Ir (mW cm
-2
)
Φ (Einstein s
-1
)
R
b
PHLS 2,90 132 1,80 1,7 x10
-8
6,33
LED600 20,11 360 12,46 1,6 x 10
-7
18,58
AMS-II 19,69 95 12,21 1,07 x 10
-7
31,36
a
Área de irradiação homogênea. Refere-se apenas à possibilidade de irradiação de maiores números de
amostras ao mesmo tempo. Variação máxima em
±
5% de intensidade
b
Calculado em função do azul de metileno solução 10
-6
mol dm
3
em cloreto de sódio 0,9%.
É interessante ressaltar que a Tabela 3 relaciona a potência em mW de cada
equipamento referente ao pico do máximo de absorção (663 nm) do azul de metileno, o que
não diz a respeito da emissão total fornecida, mesmo porque, a potência efetiva quando se
utiliza azul de metileno é a que se localiza nessa região.
Observa-se que a região de emissão dos LED se enquadra na faixa de melhor
excitação do fotossensitizador, enquanto o PHLS apresenta emissões eletromagnéticas de
baixa magnitude na região de melhor excitação do fotossensitizador (R= 6,33). A região de
melhor emissão do PHLS é apropriada para outros fotossensitizadores, como por exemplo,
a classe das ftalocianinas, uma vez que sua banda Q situa-se na região entre 675-700
(ROSENTHAL, 1991). Essas emissões são dificilmente obtidas com LED convencionais,
pois comercialmente valores nesta faixa não são usuais.
55
Mesmo que as irradiâncias de LED600 e AMS-II, se aproximem, é esperado que
AMS-II tenha maior eficiência em geração de espécies reativas em virtude de sua
irradiação ser capaz de excitar uma maior fração de moléculas do fotossensitizador (R=
31,36) frente aos demais equipamentos.
Foi previsto também que para AMS-II se tornasse bastante versátil para outras
drogas, é possível trocar a cabeça luminosa do equipamento para de outros tipos de LED,
como os azuis que irradiam na região de 415 nm, visando a ativação de cumarinas,
psoralenos e outros derivados. Essa troca da cabeça luminosa permite que o equipamento
trabalhe com módulos, os quais, favorecem a possilidade de irradiação em diferentes
comprimentos de onda. Em função do circuito utilizado, a tensão é readequada
automaticamente a cada nova cabeça, sendo o único fator fixo, a corrente, centrada em
350mA.
Não se realizou um ensaio prévio para observar o photobleaching
(fotobranqueamento) do azul de metileno, isso significa que nas medidas de (R) não está
incluso um parâmetro de correção sobre o fotobleaching do azul de metileno. Entretanto os
ensaios comparativas que se seguem não foram comprometidas por este fator, pois, sabe-se
que a auto-oxidação de azul de metileno é um fenômeno de baixas magnitudes e ainda
assim é um fator que está incluso em todas as medidas. Portanto, em critérios comparativos
este fator não exerce uma influência de impacto.
4.3 Confirmação da presença de oxigênio singlete
O substrato fotooxidável 1,3-difenilisobenzofurano (DBPF) foi empregado para o
monitoramento espectrofotométrico das reações de geração do oxigênio singlete presente
no meio. A banda de absorção mais pronunciada do DPBF é na região próxima à 405 nm.
Sabe-se que o DPBF (Figura 21A) sofre reação específica com oxigênio singlete, formando
um endoperóxido (Figura 21B), incolor, que que se decompõe rapidamente em 1,2-
dibenzoilbenzeno (incolor em 350-450 nm)(Figura 21C).
56
A B C
Figura 21: Degradação de DPBF (A), via reação com oxigênio singlete, formando o produto incolor 1,2
dibenzoilbenzeno (C).
Soluções contendo azoteto de sódio (NaN
3
) podem ser empregadas no intuito de
se evidenciar a participação de oxigênio singlete no processo reacional citado (Figura 21). o
azoteto de sódio é um forte supressor de oxigênio singlete citado na literatura (FOOTE,
1979). Na presença de ânions azoteto, o oxigênio singlete reage rapidamente (na ordem de
10
8
s
-1
em H
2
O) (FOOTE, 1979), liberando radicais azidila, que são formados pela
dissociação de um complexo de transferência de carga formado durante a supressão
(equação 11) (FOOTE, 1979; HARBOUR; ISSLER, 1982).
-
23
-
232
1
3
)(
••••−
+→−−−→+ ONONON
(11)
Os radicais formados podem se recombinar, na formação de oxigênio molecular, e
ânions azoteto.
2
3
3
-
23
ONON +→+
−••
(12)
57
300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Absorbância
Comprimento de onda / nm
300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Absorbância
Comprimento de onda / nm
A B
Figura 22: Oxidação fotoinduzida de DPBF pelo sistema LED600 com uso de azul de metileno na
concentração 5 x 10
-6
mol dm
-3
. (A) - Ausência de NaN
3
; (B) - Em excesso de NaN
3
. Cada espectro foi obtido
em instantes de 5 segundos de irradiação.
Os resultados da Figura 22 foram obtidos para o equipamento LED600, entretanto
todos os equipamentos exibiram características similares. Cada espectro foi obtido após a
cronometragem de 5 segundos de irradiação.
É possível observar através da Figura 22(B), que em presença de NaN
3
, ocorre uma
redução na taxa de oxidação do DPBF. O pico de absorção na região do DPBF situa-se na
região 420 nm e observa-se pela figura, que o mecanismo de oxidação por participação do
oxigênio singlete mostra-se predominante. Em todos os equipamentos foi observada a
geração e supressão de oxigênio singlete pelo azoteto de sódio.
Apesar dos ensaios visarem apenas os aspectos comparativos, medidas mais
precisas poderiam ser obtidas em atmosfera presente e ausente de O
2
, obtida pela inserção
de gás inerte, uma vez que a presença de íons azoteto apenas ocasiona uma competição
inibitória do
1
O
2
tanto por DPBF quanto por N
3
-
. Mesmo assim, concentrações saturadas de
azoteto são suficientes para a observação do fenômeno.
58
4.4 Comparação da cinética de Fotooxidação de DPBF
Quantitativamente é possível expressar a eficiência na geração de espécies reativas
de oxigênio dos equipamentos por meio de um estudo cinético da degradação de DPBF. A
equação 13 mostra a degradação do substrato oxidável pela ação do oxigênio singlete. A
concentração de oxigênio singlete foi considerada como constante uma vez que as soluções
estão abertas e sob constante agitação. Desta forma, é possível incorporar a concentração de
oxigênio singlete (
1
O
2
) à constante cinética k, resultando em uma constante de pseudo
primeira ordem, k'. Desta forma, a cinética resultante é de pseudo primeira ordem
(equações 14 e 15). Após a integração, a equação 16 é obtida para a cinética da reação
promovida (BELL; MACGILLIVRAY, 1974; YOUNG et al., 1973). A obtenção condições
cinéticas na qual o oxigênio se encontra em concentrações ainda mais próximas de à de
uma constante podem ser obtidas pela borbulhação de ar na solução: o ar borbulhado
mesmo que em pequenas quantidades já garante concentrações suficientes para que o
oxigênio dissolvido possa de fato ser considerado como constante.
produtos outros e DBB DPBF
2
1
→+ O
(13)
]DPBF][O[k-
t
[DPBF]
2
1
==
d
d
v
(14)
]DPBF[k'-
t
[DPBF]
=
d
d
(15)
t'k-
[DPBF]
[DPBF]
ln
0
=
(16)
A redução na concentração de DPBF em função do tempo é exibida na Figura 23,
para todos os equipamentos construídos.
59
300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Comprimento de onda / nm
300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Absorbância
Comprimento de onda / nm
300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Comprimento de onda / nm
A B C
Figura 23: Oxidação Fotoinduzida de DBPF. Cada espectro foi obtido após 5 segundos de irradiação. (A) –
PHLS; (B) – LED600; (C) – AMS-II. A concentração de azul de metileno utilizada foi aproximadamente
5x10
-6
mol dm
-3
.
Todos espectros tendem a decrescerem em absorção em virtude da descoloração do
DPBF. Os espectros foram obtidos após 5 segundos de exposição à luz emitida pelos
equipamentos, a variação de tempo em função da absorção é melhor explicitada na Figura
24. Assim, foi observado que para o AMS-II, somente 20 segundos de irradiação (vide o 5º
espectro decrescente da Figura 23 C) já se mostrou suficiente para a redução de 98% da
intensidade da banda de DPBF. Os controles no escuro realizados para este ensaio não
exibiram reduções insignificantes na banda do DPBF.
Uma melhor comparação entre as cinéticas de fotodegradação de DPBF, para os
diversos equipamentos pode ser obtida analisando Figura 24.
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
-4,0
-3,5
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
Tempo / s
Figura 24: Variação da concentração de DPBF com o tempo.
- PHLS;
- LED600;
- AMS-II.
Esses resultados sugerem que AMS-II apresentou o melhor desempenho. Esses
ensaios também estão de acordo com a Tabela 3, uma vez que AMS-II emite radiação
eletromagnética em uma região do espectro mais apropriada para a faixa de absorção do
azul de metileno e consequentemente apresenta maiores valores de R (fração estimada de
moléculas excitadas). Nessas condições experimentais, ainda é possível afirmar que o
sistema AMS-II apresenta o dobro da eficiência do sistema LED600 (k’
AMS
= 0,25532 s
-1
;
k’
LED
= 0,12668 s
-1
). Já PHLS, em virtude da pequena emissão na faixa útil de trabalho,
apresenta uma eficiência bastante reduzida quando comparada aos equipamentos de LED.
61
4.5 Inativação fotodinâmica de Staphylococcus aureus
O azul de metileno, na ausência de luz, apresenta ação bactericida em especial a
Gram-positivos. Esses efeitos são descritos na literatura (LI, et al., 2000; ROHS;
SKLENAR, 2004). O corante catiônico se liga a região polianiônica do DNA. O anel planar
do AM além de poder interagir intermolecularmente com as bases nitrogenadas, pode se
acomodar nas fendas da dupla hélice. A interação é também auxiliada por fenômenos de
solvatação, uma vez que as interações com a atmosfera iônica contribui para a interação
(ROHS; SKLENAR, 2004; ZHAO et al., 1999). Os fenômenos de solvatação e a geração
uma atmosfera iônica podem causar a permeação do corante pela camada de
peptidoglicano, culminando em possíveis danos no DNA (ROHS; SKLENAR, 2004).
Os resultados obtidos na inativação fotodinâmica de S. aureus (Figura 25)
permitem estimar que a aplicação de concentrações superiores a 5 µmol dm
-3
apresenta
forte ação fototóxica no meio, e, desta forma, mostra que a aplicação in vivo de azul de
metileno no controle de bactérias ou fungos, deva ser realizada em soluções ou veiculações
próximas a estas concentrações. O uso de soluções diluídas de mesma concentração de
cloreto de sódio, apesar de não alterarem a eficiência fotodinâmica do processo, reduz a
ação citotóxica do azul de metileno, e, assim, reduz o efeito sinérgico entre esses dois
fenômenos (fotodinâmico e citotóxico).
É interessante ressaltar que soluções o cloreto de sódio na presença de azul de
metileno favorece a formação de auto-agregação do corante, e consequentemente suprimem
em parte o efeito fotodinâmico. Mesmo assim, no sentido da normalização destes erros,
todos os ensaios foram conduzidos em soro fisiológico, na tentativa de se reproduzir a força
iônica dos fluidos corpóreos.
Os resultados referentes à inibição bacteriana mediante a presença e ausência de luz,
são mostrados na Figura 25. As amostras foram irradiadas por 20 minutos.
62
0
50
100
150
200
250
(sem droga)
Unidades Formadoras de Colônias (UFC)
Controle 0,5
µ
µµ
µ
mol dm
-3
5
µ
µµ
µ
mol dm
-3
50
µ
µµ
µ
mol dm
-3
Não irradiado
PHLS
LED600
AMS-II
Figura 25: Contagem de bactérias após a fotoinativação. Três tipos de diferentes concentrações de azul de
metileno foram avaliadas: 0,5, 5 e 50 µmol dm
-3
. As amostras foram irradiadas por 20 minutos.
A inibição do crescimento bacteriano no escuro para a solução mais diluída (0,5
µmol dm
3
), apresenta uma redução aproximada de 50% no número de unidades formadoras
de colônias. Observa-se ainda que, quando a cultura bacteriana foi irradiada com o sistema
AMS-II, ocorre uma inibição próxima a 50% das UFC se comparada ao controle mantido
no escuro para aquela mesma concentração (efeito puramente citotóxico). Esses resultados
sugerem que, efeitos sinérgicos (os fototóxicos e os citotóxicos) de grandezas similares
estão presentes, o que resulta numa inibição final de 75% do crescimento bacteriano na
solução mais diluída quando usado o sistema AMS-II.
Em todas as demais concentrações, o equipamento AMS-II apresenta
fotoinativações superiores à 99%. Os demais equipamentos, LED600 e HPLS apresentaram
também desempenhos satisfatórios em fotoinativações. Na concentração de 50 µmol dm
3
,
após a aplicação de luz, não se observou nenhuma formação de colônia. Portanto, todos os
equipamentos descritos neste trabalho, operam de forma satisfatória na inibição do
63
crescimento de Staphylococcus aureus in vitro, e de modo especial em concentrações
próximas à 50 µmol dm
-3
.
Os resultados obtidos na inativação fotodinâmica concordam proporcionalmente
quando comparados aos resultados anteriores de fotooxidação de DPBF.
4.6 Ensaios microbiológicos de Trichophyton rubrum
Os resultados da inibição do crescimento do T. rubrum in vitro, são mostrados na
Figura 26. Observa-se que somente após a irradiação ocorre uma redução significante no
número de unidades formadoras de colônias. A eficiência observada pode ser atribuída não
somente a fonte de irradiação, mas também ao efeito citotóxico do azul de metileno. As
Figuras 27 e 28 a afinidade que o azul de metileno tem pelas hifas e esporos,
respectivamente, do Trichophyton rubrum.
64
A B C
D E F
G
Figura 26: Crescimento de
T. rubrum
, em triplicata,
após 14 dias. As placas (A), (B) e (C), foram irradiadas
durante 20 minutos, sob concentração de azul de metileno 500 µmol dm
-3
; (D), (E) e (F) correspondem ao
controle no escuro, sob concentração de azul de metileno 500 µmol dm
-3
; (G) é o controle geral que não
recebeu luz nem fotossensitizador.
65
Figura 27: Estrutura da hifa septada de
Trichophyton rubrum
obtida por microfotografia óptica, após a
coloração com azul de metileno, pouca coloração é observada.
Figura 28: Microfotografia óptica com ênfase nos órgãos reprodutivos do
Trichophyton rubrum
após a
coloração com azul de metileno. Forte coloração foi observada. A presença de estruturas reprodutivas não
coradas serve como comparação e sobretudo como contraste, evidenciando a grande afinidade deste corante
por essas estruturas.
Através das Figuras 27 e 28 é possível observar que o corante apresenta alta
afinidade nos esporos e baixa aderência nas hifas, tornando-se, portanto, um excelente
medicamento para inibir o crescimento do fungo após doses de irradiação. A alta coloração
dos órgãos reprodutivos garante um alto potencial inibidor no crescimento fúngico,
66
tornando o fotosenstizador bastante seletivo. A parte reprodutiva é a estrutura mais
comprometida na fotoinativação, pois uma alta impregnação sugere uma grande
concentração de azul de metileno. Como a área do fotoprocesso normalmente fica em cerca
de 10 à 50 nm, (MOAN, 1990; JORI, 1997) a fotooxidação da região mais pigmentada é
máxima.
A fotoinativação de Trichophyton rubrum pode apresentar efeitos fungistáticos, ou
fungicidas em virtude do fotossensitizador (SMIJS et al., 2003). O azul de metileno no
entanto, apesar de exibir grande redução da fração fúngica local, é fungostático em relação
a hifa, entretanto, é fungicida quando se analisa a parte reprodutora. Resultados obtidos da
inativação de Trichophyton rubrum com azul de metileno in vivo obtido por outros
pesquisadores, confirmam a ação fungicida (TARDIVO et al., 2007a). Além disto,
fenômenos puramente fungostáticos podem auxiliar o sistema imunológico a eliminar as
frações remanescentes.
Observa-se que fármacos a base de Itraconazol atuam farmacológicamente
destruindo a camada fúngica de ergosterol (MARICHAL et al., 1999), assim,
possivelmente a inativação fotodinâmica com azul de metileno em pacientes administrados
com Itraconazol deva ser superior, uma vez que a baixa pigmentação das hifas pelo corante
é também atribuída ao ergosterol na estrutura fúngica, que atua como barreira, impedindo a
pigmentação do tecido fúngico.
A ação sinérgica sugerida acima não deve ser prevista em medicamentos como
fluconazol, griseofulvina ou outros cuja farmacocinética indica a atuação em outros
metabolismos do fungo, que não na destruição da barreira de ergosterol. Apesar de uma
ação sinérgica não ser prevista, é possível que seja presenciada a ação de dois módulos
terapêuticos distintos aumentando as chances de erradicação fúngica.
67
5. CONCLUSÃO
68
Todos os equipamentos se mostraram capazes de gerar oxigênio singlete conforme
visto nos resultados de descoloração de DPBF, na presença de azoteto de sódio, na
fotoinativação de Staphylococcus aureus e de Trychophyton rubrum.
O estudo possibilita concluir que o equipamento que utiliza LED de alta potência
apresentou o melhor rendimento na excitação do fotossensitizador, e consequentemente,
exibiu uma pronunciada geração de oxigênio singlete, conforme visto pela magnitude da
cinética de descoloração do DPBF, valores de R e inibição de microorganismos. A razão
para este melhor rendimento destes aparelhos se deve ao comprimento de onda mais
próximo ao desejado, com intensidade apreciável. Já o sistema que utiliza lâmpada
halógena filtrada apesenta baixas emissões fotônicas na região de 660 nm. Poderia-se
utilizar outros filtros ópticos, visando um aprimoramento na excitação eletrônica desta.
A inativação de Staphylococcus aureus e Trychophyton rubrum se mostraram
bastante satisfatórias e como conseqüência do sucesso dessa metodologia, iniciou-se um
processo de aplicação dos equipamentos descritos na inativação in vivo de pacientes
acometidos pela ação do Trychophyton.
A fotoinativação de Trychophyton rubrum mostra-se mais eficiente nas suas
estruturas reprodutivas, o que tende a exibir resultados satisfatórios e progressivos na
inibição do crescimento posterior do fungo, que pode ser também um protocolo
complementar à terapêutica usual.
O circuito integrado (IRS2541) que possibilitou a ligação dos LED de alta potência
em um sistema de ligação bivolt, mostra-se bastante simples, estável, e muito confiável,
além disto, o sistema apresenta tamanho compacto, favorecendo conveniências na
construção de um protótipo industrial.
O sistema que utilizou LED de alta potência mostrou ser mais adequados não só
fotoquimicamente, mas também por serem eficientes, com baixo custo e fácil montagem.
69
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82
7. PROPOSTA DE PESQUISAS FUTURAS
83
Conforme já iniciado, pretende-se submeter ao comitê de ética um protocolo que
permita a aplicação do sistema de irradiação desenvolvido no tratamento de casos clínicos
confirmados de onicomicose. A avaliação da concentração adequada, dose, combinação e
veiculação de drogas visando maximizar o efeito também são parâmetros interessantes.
Trabalhos futuros poderiam comparar a eficiência das fontes desenvolvidas na
inativação fotodinâmica de outras moléstias, principalmente dermatoses, em função de sua
aplicação ser mais simples.
Fontes pulsadas também são interessantes para as aplicações, estudos subsequentes
poderiam avaliar o efeito de luz pulsada de LED sobre a eficiência fotodinâmica nos
microorganismos. Alguns microcontroladores fabricados pela empresa Atmel permitem a
obtenção de pulsos com freqüências de chaveamento na faixa de MHz ou GHz.
Uma pesquisa in vivo bastante simples e interessante é a aplicação de luz de LED na
inativação de Propionibacterium acnes, uma vez que a própria bactéria já produz em seu
metabolismo a Coproporfirina III, um fotossensitizador ativado na região do azul, próximo
a 417 nm.
A síntese de novos fotossensitizadores também sempre são alvos interessantes de
pesquisa, haja vista que muitas apresentam problemas de permeação nos tecidos orgânicos,
ou problemas de solubilidade, ou mesmo apresentam pouco rendimento quântico de
geração de oxigênio singlete.
Por fim, como o enfoque trata de sistemas de irradiação, sistemas LASER que
apresentassem relativo custo benefício são também bastante apreciáveis em paises como o
Brasil, haja vista que os fabricantes que trabalham com esta tecnologia, normalmente
apresentam produtos de altíssimo valor agregado.
84
8. APÊNDICE
85
10.1 Apêndice A – Protocolo para submissão ao comitê de Ética para
pesquisa em seres humanos.
Projeto de Pesquisa
Desenvolvimento e caracterização in vivo/in vitro de uma fonte luminosa
aplicada ao combate de dermatoses através da Terapia Fotodinâmica
Uberlândia, XX de XXXXXX de XXXX (data de envio)
86
1 Antecedentes, Justificativas, Registro
Terapia Fotodinâmica
Terapia fotodinâmica (TFD) é uma nova modalidade no tratamento de diversas
moléstias como o Câncer, Degeneração Macular da Retina, Psoríase, Artrite reumautóide,
Restenose, micose fungóide, infecções bacterianas, Verruga vulgar, Arteriosclerose, AIDS
e Herpes simplex.
1,2,3
.
A terapia fotodinâmica parte de uma combinação entre luz de um comprimento de
onda específico, um composto atóxico, também chamado de fotossensibilizador e oxigênio
molecular, resultando na formação de espécies reativas de oxigênio capazes de induzirem a
inviabilização de determinadas células.
4
Diversos estudos são realizados na tentativa de síntese, caracterização e aplicação de
drogas mais eficientes, visando aplicações em diversas modalidades clínicas.
5
No tocante a fontes de irradiação empregadas em TFD, o intervalo do espectro
eletromagnético mais significante está na região entre 600 e 800 nm, onde a membrana
celular apresenta baixa absortividade. Nesta região é possível magnitudes na penetração da
luz próximas a 3 centímetros em tecidos dotados de baixa pigmentação
6
. Deste modo é
possível evitar destruições desnecessárias causadas às demais organelas presentes no meio
que não possui a droga sensitizadora.
6
Nas primeiras aplicações da TFD as fontes empregadas na ativação de agentes
fotodinâmicos baseavam-se em radiações policromáticas não-coerentes, como lâmpadas de
arco voltaico (e.g., lâmpadas de arco de xenônio) ou mesmo lâmpadas incandescentes. Por
meio de filtros ópticos, essas lâmpadas são capazes de fornecer radiações no comprimento
de onda apropriado para a maioria dos fotossensibilizadores. Esse tipo de sistema,
87
infelizmente, exibe um aquecimento relevante, dificilmente permite um controle preciso na
dosagem de luz, e normalmente apresenta baixa intensidade luminosa
7
. Têm se observado
no mercado vários aperfeiçoamentos no sentido da minimização dessas desvantagens por
meio de cuidadosos projetos na engenharia e design.
Diodos emissores de luz (LED) são também empregados em sistemas de irradiação
voltados a TFD. Os LED além de constituírem uma alternativa de baixo custo, possuem
grande homogeneidade luminosa
8
, permitindo que a radiação seja facilmente dosada e
calculada em diversas aplicações. A emissão de um LED é bem definida e normalmente
específica para um determinado comprimento de onda. Esse fator, associado à relativa
intensidade (como os modelos chamados alto brilho), dispensa o aparato de filtragem
encontrado nos sistemas de lâmpadas policromáticas. Além destes fatores, a baixa
dissipação térmica, combinada à emissão monocromática de moderada intensidade, em
sistemas simples, robustos e diminutos, qualificam atraentemente o uso de LED em
dispositivos para aplicações de TFD
8,9
.
Juzeniene et al
9
, realizaram um estudo comparativo in vivo entre sistemas de
irradiação de lâmpadas halógenas filtradas e sistemas dotados de tecnologia LED. O estudo,
que empregou ácido 5-aminolevulínico para aplicação de TFD em níveis dérmicos, revelou
uma superioridade do sistema LED em diversos aspectos. O sistema apresentava vantagens
como maiores profundidades de atuação no tecido, baixo calor incidente no tecido, redução
na intensidade de dor e boa eficiência em inativação de células in vitro. As aplicações de
TFD empregando luz emitida por diodos, não são restritas apenas a aplicações superficiais:
relatos demonstram aplicações no tratamento de tumores cerebrais por meio de sondas de
LED ajustados em uma ponta cilíndrica e acoplados num cateter balão
10
. Essa sonda,
88
pequena e flexível, emite luz permitindo baixíssimas invasões aos demais tecidos. Neste
sistema o cateter pode ser introduzido em tumores percutâneos
11,12
.
Atualmente, espécies reativas de oxigênio geradas na TFD são ativadas
principalmente por LASER. As vantagens do LASER reside no caráter da luz
monocromática e na alta intensidade obtida nesse dispositivo
7
. Entrentanto, a coerência de
um LASER não é necessária em aplicações na TFD
9,13
. Esse fator, justifica a construção de
fontes não-coerentes, as quais são normalmente muito mais acessíveis, estáveis e versáteis.
Na dermatologia, esse procedimento é aplicado em algumas regiões do território
nacional, bem como no exterior, exibindo resultados promissores. No tocante a aplicações
tópicas, a TFD mostra-se interessante no caso da remissão de melanomas, no tratamento de
onicomicose, minimização de surtos do vírus da herpes simplex, e diversas outras moléstias
cujo tratamento convencional mostra-se ainda pouco eficiente
1
.
Onicomicose
A onicomicose é uma infecção que atinge as unhas, causada por fungos,
correspondendo a cerca de 50% das queixas relacionadas à problemas de unhas. A infecção
total normalmente gera espessamento, descoloração, opacificação, distrofia ungueal,
podendo inclusive alterar a estrutura da unha
14
.
Esse tipo de micose foi escolhida dentre eventuais outras dermatoses por constituir
uma infecção de alta freqüência nos adultos: no Reino Unido tem-se constatado uma
prevalência da moléstia em 3% da população de adultos
15
; a prevalência na Finlândia atinge
cerca de 8%
16
; um estudo realizado nos Estados Unidos demonstra que a parcela afetada
chega a valores próximos a 18,5%
17
. No Brasil, recentemente, uma estatística realizada na
89
cidade do Rio de Janeiro revelou a presença da micose em 19,35% da população
18
. O maior
número de casos na América Latina talvez esteja associado aos fatores climáticos e
socioeconômicos
19
.
Além de causar impacto negativo na qualidade de vida
20
, os casos de onicomicose
costumam apresentar pronunciada resistência ao tratamento convencional. No tratamento
convencional emprega-se drogas antimicóticas tópicas ou sistêmicas. Dentre as drogas
sistêmicas destacam-se o fluconazol, itraconazol, terbinafina e a griseofulvina
(principalmente em crianças)
2,16
. A medicação tópica envolve o uso de ciclopiroxolamina
8%, amorolfina 5% e uréia 40% com bifonazol 1%
19,21
.
O agente dermatófito mais comum, o Trichophyton rubrum, é responsável por cerca
de 69-92,7% dos casos, quanto ao segundo agente, a literatura é um pouco confusa,
variando entre o T. tonsurans e o T. mentagrophytes var interdigitale
16,22,23
. As drogas
sistêmicas apresentam algumas desvantagens como a possibilidade de indução a reações
hepatobiliares moderadas à severas, baixo espectro de atividade, possíveis interações
medicamentosas. Durante o percurso do tratamento, podem ocorrer recidivas, que
normalmente tornam o tratamento extenso, muitas vezes cansativo e oneroso ao paciente
24
.
O tratamento tópico é frequentemente ineficaz na eliminação total da infecção
25
.
O custo do tratamento está em função do tempo de remissão. Nos casos mais
comuns fica em torno de 6-12 meses nas incidências relativas à onicomicose nos pés,
podendo ser mais ou menos longo em função de sua gravidade
26
. O tratamento contínuo por
Fluconazol 150mg/semana ou Terbinafina 250mg/dia, resulta no custo médio de R$
100,00/mês
27
. Tomando por exemplo uma administração de Itraconazol, via tratamento
contínuo, dose 200mg/dia, o custo mensal aproxima-se de R$ 300,00
28
. A administração de
90
Terbinafina, em alguns casos, tende a apresentar melhoras nos quadros clínicos mais
rapidamente, quando comparadas às demais
29,30
.
Objetivo Geral
Um dos maiores obstáculos relativo à disponibilização da terapia fotodinâmica
frente à sociedade está no custo atribuído às fontes de irradiação luminosas e da droga
fotossensibilizadora. O objetivo geral do presente trabalho é a redução de custos na TFD.
Objetivos Específicos e Fotossensibilizadores
A presente proposta visa a confecção de uma fonte de luz potente e de baixo custo,
empregando LED: semicondutores que se mostram promissores não somente pelo baixo
custo associado, mas bem como por apresentarem diversas propriedades opto-mecânicas
convenientes (e.g., monocromaticidade, robusteza, durabilidade). O uso de corantes
fenotiazínicos, como o azul de metileno e o azul de toluidina, serão aplicados como
alternativa ao uso de drogas mais onerosas, sem grandes perdas ao processo, conforme
demonstrado por diversos pesquisadores, inclusive do âmbito nacional. Como controle, será
empregada uma droga padrão: o ácido aminolevulínico (ALA), cuja aplicação em terapia
fotodinâmica já é liberada pelo FDA e pela ANVISA, o qual apresenta o parecer favorável
desde o ano de 2002. O registro foi concedido pela ANVISA através da resolução RE nº
376, processo nº 25351.015079/01-97, datado em 04 março de 2002. Atualmente o produto
é comercializado pelos Laboratórios Stiefel, sob o nome comercial de Levulan Kerastick
®
,
91
liberado pelo processo 25351.150742/2006-20, publicado no suplemento ao nº 198 do
DOU de 16.10.2006.
O corante Azul de Metileno (AM), em uso tópico, já está inserido dentre os
medicamentos pertencentes à farmacopéia brasileira. A isenção de registro do medicamento
é disposta e liberada conforme a legislação atual
31
. O medicamento para uso tópico é
principalmente empregado como anti-séptico
32,33
.
Entretanto, o uso do medicamento não é somente limitado a aplicações tópicas, pois,
observa-se que o azul de metileno parece ser o medicamento de maior eficiência no
tratamento da metemoglobinemia
34
(condição hereditária na qual o ferro presente na
hemoglobina torna-se incapaz de executar o transporte de oxigênio). Nestas situações o
medicamento é administrado, via intravenosa, normalmente em dose única de 1-2
mg/Kg
35,36
.
O azul de metileno, por sua característica catiônica, apesar de corar eficientemente
as células, normalmente apresenta baixa capacidade de permeação no tecido epitelial. Deste
modo, as aplicações do AM em terapia fotodinâmica são mais difundidas no âmbito
dermatológico. A literatura aponta diversos trabalhos que evidenciam resultados bastante
satisfatórios nas aplicações tópicas da terapia fotodinâmica com azul de metileno
2,3,37,38,39
.
A busca no aumento da eficiência desses sistemas, também é alvo de diversas
pesquisas. Por exemplo, a combinação entre azul de metileno e azul de toluidina
possivelmente tende aumentar o desempenho do tratamento, uma vez que se promove uma
coloração do exterior e interior das células do agente dermatófito, conferindo um
tingimento mais eficiente
40
.
O azul de toluidina, solução 1%, é amplamente empregado em exames
citopatólogicos e anatomopatológicos, na determinação de tumores. Apesar de não ser
92
específico para células neoplásicas, o teste do azul de toluidina, é bastante empregado,
proporcionando uma interessante ferramenta para dianóstico preliminar
41
. No tocante a
TFD, o azul de toluidina aplicado na ausência de misturas, também exerce atividade
fotodinâmica favorável
42
.
A ficha de segurança do azul de toluidina demonstra também sua característica
atóxica, principalmente quando aplicada topicamente
43
.
Desta forma, em resumo, os três objetivos específicos do presente trabalho são:
a) Aferir a eficiência de uma nova fonte de luz: disponibilizar um equipamento robusto
e econômico, mais eficiente de que os presentes no mercado (normalmente
apresentam pouca intensidade), aquecimento reduzido (o aquecimento é um
problema muito comum quando se substitui o LASER como fonte de luz);
b) Aplicação comparativa in vivo entre o ALA e o azul de metileno/azul de toluidina:
Visando observar a eficiência na resposta ao tratamento entre as duas drogas em
determinadas dermatoses. Também está previsto a elaboração de um protocolo
médico mais eficiente.
c) Utilizar o ALA sintetizado no laboratório, em pureza apropriada, isento de
eventuais elementos traços nocivos, conforme a exigência legislativa: Esse objetivo
tem por natureza a busca de formas mais eficientes e econômicas na síntese da
droga - buscando metodologias que proponham maiores rendimentos e/ou rotas
sintéticas mais viáveis.
93
Os objetivos de redução de custos, podem ser melhor observados, por uma
comparação ao valor comercial das drogas supracitadas: azul de metileno, solução 1%,
frasco com 30 mL, possui valor médio em R$ 3,00. Valores não distantes são encontrados
para o azul de toluidina. Contudo, o ALA apresenta custo médio aproximado em R$
1.600,00, normalmente disposto em embalagens com quatro ampolas de 1,5 mL.
Pretende-se realizar ensaios in vivo no Hospital de Clínicas da Universidade Federal
de Uberlândia para casos clínicos de onicomicose. As aplicações dermatológicas serão
realizadas através do Dr. José Joaquim Rodrigues, membro da equipe de dermatologia do
Hospital de Clínicas de Uberlândia. Todas as aplicações visam estudos progressivos dos
três objetivos propostos.
2 Material e Métodos, Casuística, Resultados Esperados e Bibliografia
2.1- Material e Métodos
Material Utilizado:
Azul de metileno P.A.
Azul de toluidina P.A.
Cloreto de ácido aminolevulínico P.A.
Algodão hidrófilo, tipo bola, cor branca; ou hastes flexíveis algodonizadas.
Álcool etílico 70º INPM
Água deionizada;
94
Propilenoglicol
Ácido oleico
Removedor de esmalte;
Fonte de irradiação
Formulações do fotossensitizador:
Azul de metileno 2,5% e azul de toluidina 2,5%
45,46
: num balão de 10 mL, dissolver em
água destilada/deionizada 0,25g de azul de metileno P.A. e 0,25g de azul de toluidina.
Completar o volume do balão.
Solução de ALA
47
: num béquer de 1mL, adicionar 20mg de cloreto de ácido
aminolevulínico P.A., e completar a massa de 1g com solução de ácido oléico (10% p/p)
em propilenoglicol.
Metodologia:
O esmalte que eventualmente possa ser encontrado em unhas acometidas, será
removido, para uma melhor aplicação e eficiência do protocolo. O paciente será orientado
previamente sobre essa necessidade. Na ausência de esmalte, será realizada uma limpeza do
local por meio de solução de álcool etílico 70 % (p/p) embebido em algodão hidrófilo.
Será tomado um registro visual da unha infectada de cada paciente: toda seção é
amostrada fotograficamente. Esse arquivo possibilita aferição e comprovação da eficiência
e/ou progresso do protocolo.
95
Será aplicado o fotossensitizador, previamente formulado, na lâmina, no leito
ungueal, e em seu respectivo interstício. A aplicação é realizada com algodão hidrófilo, ou
hastes flexíveis algodonizadas, dispensando o uso de equipamentos mais complexos ou
delicados, como seringas. A aplicação é realizada até que a região alvo assimile bem o
fotossensitizador: no caso do azul de metileno/azul de toluidina. Isso pode ser visto pela
coloração escura da região. Posteriormente a área afetada deve repousar por cerca de 10-15
minutos, visando uma permeação/assimilação mais eficiente do corante pelo tecido afetado.
Após o repouso, deverá se irradiar a unha acometida por um período não superior a
25 minutos (serão estudado tempos de 10, 15, 20, e 25 minutos). O tempo de aplicação será
estudado de forma a se obter um ponto otimizado de maior eficiência/rapidez na seção.
Durante esse tempo os pacientes poderão ouvir música erudita ou assistir a filmes diversos.
Finalizada a aplicação, o paciente é liberado.
As seções se repetirão num intervalo entre 25 dias, até que se obtenha remissões
significativas, ou exceda um limite de 6 aplicações sem resultados satisfatórios.
2.2- Casuística
96
Recentemente, Tardivo et al
2
num estudo preliminar empregando irradiação por luz
policromática filtrada e azul de metileno e azul de toluidina, demonstrou uma eficiência de
85,48% dos pacientes abordados, sem toxicidade.
Aplicações com azul de metileno, envolvendo princípios de sensitização na inibição
do crescimento de diversos fungos foram apreciados por pesquisadores poloneses
46
.
Em casos de líquen plano oral (LPO) a terapia fotodinâmica se mostra simples e
eficiente: o procedimento envolve bochecho de uma solução aquosa 5% de azul de
metileno, durante 5 minutos. Posteriormente, a região afetada é irradiada com LASER
vermelho
45
.
Similarmente ao azul de metileno, o azul de toluidina é também amplamente
empregado em TFD, principalmente em doenças relacionadas ao âmbito odontológico,
inativação de bactérias, etc
46, 48, 49
.
Também são observados diversos estudos do potencial fungicida na TFD,
aplicando-se ALA, inclusive em casos de inibição e controle do Trichophyton rubrum
47
.
Atualmente, um estudo mostra aplicações de ALA em sistemas para entrega de drogas
(drug delivery), no qual a droga é contida em adesivos, os quais, distribuem gradualmente
o composto pela unha
50
.
97
2.3- Resultados Esperados
Espera-se uma redução de custos na terapia fotodinâmica, que hoje se mostra tão
promissora em diversas modalidades clínicas. Essa redução de custos deve ocorrer em
função da elaboração de um novo equipamento e do uso de drogas mais acessíveis. A
população brasileira muitas vezes desconhece essas terapias em virtude de sua baixa
acessibilidade. O presente trabalho, em seu objetivo filosófico, visa a viabilização da
terapia fotodinâmica ao povo brasileiro.
2.4- Bibliografia
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99
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http://www.infarmed.pt/infomed/download_ficheiro.php?med_id=34322&tipo_doc=fi
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100
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101
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3 Análise crítica de riscos e benefícios.
Os riscos envolvidos versam sobre uma possível pigmentação sutil azulada
temporária da unha durante um período máximo de 24 horas. Essa pigmentação no entanto,
nada tem a desfavorecer fora o aspecto estético/social, e é mais facilmente removida pela
limpeza do local com algodão embebido em solução de hipoclorito de sódio comercial
(diluição 1:100). Em alguns casos poderão ocorrer vermelhidões seguidas ou não de
pequenas inflamações locais após a aplicação do protocolo em virtude da inviabilização
celular.
Não se empregará seringas, agulhas, cortes e portanto o método tem perspectivas de
riscos mínimos ao paciente colaborador.
A equipe executora compromete-se com o sigilo absoluto sobre a identidade do
sujeito de pesquisa.
Os sujeito de pesquisa poderão receber benefícios diretos, tais como o usufruto de
terapêutica muito menos tóxica e agressiva que o tratamento convencional. Também são
previstos resultados positivos mais rápidos, que não somente trarão benefícios no tempo da
terapêutica, mas bem como exigirá menor tempo de dedicação à moléstia, em virtude das
poucas aplicações: longo tempo de descanço entre uma e outra aplicação.
102
Os benefícios indiretos são vários, como por exemplo, um maior conhecimento a
respeito da eficiência de fontes de luz por LED na terapia fotodinâmica aplicada a
dermatoses in vivo; contribuição para a elaboração de um protocolo médico otimizado na
aplicação da terapia fotodinâmica com LED e azul de metileno/toluidina. Enfim, pode-se
destacar, a contribuição na redução de custo do tratamento, por meio de sistemas mais
econômicos, preservando entretanto, a mesma eficiência de protocolos já conhecidos e
empregados.
4 Cronograma de execução
Etapa 1: Confecção da fonte.
Etapa 2: Triagem de participantes.
Etapa 3: Aplicação da TFD e desenvolvimento de um protocolo eficaz.
Etapa 4: Otimizações de metodologias; Divulgação de resultados
Ano 2010
Etapas
Jan Fev Mar
Abr
Mai
Jun Jul Ag Set Out Nov
Dez
Etapa 1
Etapa 2
Etapa 3
Etapa 4
103
Eventuais mudanças no cronograma serão previamente comunicadas ao Comitê de
Ética. Os tempos dispostos visam uma previsão e estão super-dimensionados.
Possivelmente as etapas poderão ser concluídas em períodos menores.
O cronograma não será iniciado antes da aprovação do projeto no(s) comitê(s) de
ética submetido. Isso infere que a partir da etapa 2 a conclusão das etapas do projeto ficarão
submissas a aprovação do(s) órgão(s) supramencionado(s).
5 Critérios para suspender ou encerrar, com respeito ao sujeito de pesquisa.
Caso os dados de avaliação sejam insuficientes durante o trabalho este deve ser
suspenso e reavaliado para uma futura realização.
• No caso da TFD com LED e azul metileno/toluidina a ocorrência de efeito adverso
é esperada ser mínima ou inexistente. Já que se trata de uma terapia não invasiva
que se vale de substâncias químicas atóxicas existentes em outras modalidades
sendo que a mesma TFD usando outro fotosensibilizadores (como ALA ou MALA)
tem-se mostrado altamente eficaz e segura.
104
6 Local de Realização
Etapa 1: Laboratório de Eletrônica de Potência – Instituto de Engenharia Elétrica;
Laboratório de Bioquímica e Fotobiologia - Instituto de Química. Av. João Naves de Ávila,
2121, 38400-902 Uberlândia - MG, Brasil
Etapa 2: Hospital de Clínicas de Uberlândia – Faculdade de Medicina; Av. Pará,
1720, 38400-902 Uberlândia – MG, Brasil.
Etapa 2: Hospital de Clínicas de Uberlândia – Faculdade de Medicina; Av. Pará,
1720, 38400-902 Uberlândia – MG, Brasil.
Etapa 4: Laboratório de Eletrônica de Potência – Instituto de Engenharia Elétrica;
Laboratório de Bioquímica e Fotobiologia – Instituto de Química. Ambos lotados no
Campus Santa Mônica; Hospital de Clínicas de Uberlândia – Faculdade de Medicina;
lotado no Campus Umuarama da Universidade Federal de Uberlândia.
7 Infra-estrutura necessária e concordância da instituição.
Os materiais empregados estão detalhados no item 2.1. A concordância da
instituição encontra-se nos documentos anexados.
105
8 Orçamento financeiro
Os equipamentos construídos e os materiais empregados no projeto estão listados
abaixo:
35 LED de alta potência (630/660 nm)............................................ R$15,00 [unit.]
Componentes eletrônicos diversos................................................... R$ 500,00
Confecção de peças (usinagem e fresa)............................................R$ 1000,00
Algodão, hastes flexíveis, soluções do corante, álcool etílico, ácido oléico, propilenoglicol,
hipoclorito de sódio.............................................................................................R$ 200,00
Deste orçamento, já foram adquiridos os LED, algodão, soluções dos corantes azul
de metileno e azul toluidina e álcool etílico. Apenas parte da confecção de peças e de
eventuais futuros componentes eletrônicos serão necessários, conforme melhorias ao
equipamento sejam necessárias.
Os custos oriundos da pesquisa são financiados pelo CNPq/FAPEMIG, cujo
trabalho encontra-se incluso num dos objetivos propostos. Encontra-se anexo a este projeto
de pesquisa uma cópia da primeira página do aditivo.
Os pacientes que utilizam do Hospital de Clínicas serão redirecionados à pesquisa
reduzindo gastos em transporte, tempo do paciente, e tempo de recrutamento. Essa proposta
106
foi criada em virtude de gerar o menor desgaste possível ao paciente colaborador da
pesquisa.
9 Propriedade das informações.
O presente trabalho visa o desenvolvimento de eventuais dispositivos que
necessitam de proteção intelectual. As propriedades intelectuais das tecnologias
desenvolvidas pertencerão, conforme acordo entre os mesmos, aos seguintes colaboradores:
Lucas Ferreira de Paula CPF – 014.810.386-30
Jonas Reginaldo de Britto CPF – 654.554.019-04
Carlos Alberto de Oliveira CPF – 055.433.098-99
João Batista Vieira Júnior CPF – 118.006.661-87
José Joaquim Rodrigues CPF – 302.334.376-49
Luis Antonio Ortellado Gómez Zelada CPF – 434.524.347-53
Douglas Eduardo Soares Pereira CPF – 072.023.906-04
Todos os pesquisadores têm os seus curricula vitae na base de dados lattes do
CNPq
10 Características da população, justificativa de uso de grupos vulneráveis.
A população utilizada está descrita no item 14, e não se fará uso de grupos
vulneráveis no presente trabalho.
107
13 Fontes de material, coleta específica.
Ensaios in vitro serão realizados concomitantemente aos ensaios in vivo
supramencionados. Para a realização destes ensaios, será necessário a coleta da lâmina
ungueal acometida, dos pacientes que se submeterão a pesquisa.
Esse material servirá como amostras para culturas do fungo. As culturas serão
cultivadas no laboratório, visando uma dupla finalidade: a identificação da espécie do
fungo em questão; fonte de microorganismos para aplicações in vitro da TFD, também
chamada IFD (Inativação Fotodinâmica)
14 Planos de recrutamento, critérios de inclusão e exclusão.
Inclusão:
Pacientes adultos (maiores de 18 anos de idade) homens e mulheres que
não estejam que não estejam grávidas ou amamentando e que apresentem onicomicose, em
aproximadamente 6 meses sem qualquer tratamento tópico ou oral, saudáveis ou portadores
de patologias que facilitem processos infecciosos como diabetes melitus, transplantados,
renais crônicos e hepatopatas crônicos.
O projeto como um todo, na intenção de ocupar o menor número de voluntários e ao
mesmo tempo obter resultados representativos e relevantes, optou por recrutar 30 pessoas,
desde que enquadrem nos critérios descritos neste item (14).
108
Os pacientes deverão ter a infecção fungica confirmada por micologia direta e
cultura.
Critério de exclusão:
Crianças e adolescentes menores de 18 anos, mulheres
grávidas ou em amamentação; pacientes portadores de porfiria e outras doenças causadas
ou exacerbadas pela luz como Lupus eritematoso, erupção polimorfa à luz, pessoas em uso
de drogas fotossensíveis como tetraciclinas, cloroquina e derivados trazídicos; pessoas em
comprovada alergia ao azul de metileno/toluidina.
Obs: O controle poderá ser feito através das unhas sãs dos próprios pacientes.
15 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
O Termo de Consentimento Livre e Esclarecido encontra-se anexo a este projeto de
pesquisa.
16 Justificativa de inclusão de sujeitos sadios
Indivíduos não acometidos pela dermatose, se tornam necessários para a formação
de um grupo controle, visando aferir o protocolo, e servir de referência para diversos
estudos envolvidos.
109
9. ANEXOS
110
10.1 Artigo Aceito para publicação – Proof do artigo enviado ao
Journal of the Brazilian Chemical Society já aceito para publicação.
REF.: 399/09V3
To Prof. de Paula, Lucas
Universidade Federal de Uberlândia
Uberlândia, Minas Gerais
I am pleased to inform you that your paper "A COMPARATIVE
STUDY OF IRRADIATION SYSTEMS FOR PHOTOINACTIVATION OF
MICROORGANISMS" [REF.: 399/09V3] has been accepted for
publication.
Please check at EDITOR, Referee and/or Editorial Manager's
Comments if extra corrections and modifications should be
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Watson Loh - - JBCS Editor
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J. Braz. Chem. Soc., Vol. 00, No. 00, 1-7, 2009.
Printed in Brazil - ©2009 Sociedade Brasileira de Química
0103 - 5053 $6.00+0.00
*e-mail: [email protected]
A Comparative Study of Irradiation Systems for Photoinactivation of Microorganisms
Lucas F. de Paula,*
,a
Renata O. Santos,
a
Henrique D. Menezes,
a
Jonas R. de Britto,
b
João B. Vieira Jr.,
b
Paulo P. Gontijo Filho
c
and Carlos A. de Oliveira
a
a
Instituto de Química,
b
Faculdade de Engenharia Elétrica and
c
Núcleo de Imunologia, Microbiologia e
Parasitologia, Universidade Federal de Uberlândia, 38408-100 Uberlândia-MG, Brazil
Estudou-se a construção de sistemas de LED aplicados a processos de fotosensitização.
Visando à obtenção de dispositivos mais eficientes avaliou-se a aplicação de LED de alta potência
(HPLED), que apresenta maior fluxo fotônico, tendendo a excitar uma maior fração de moléculas.
Foram descritos detalhes de construção de 3 diferentes sistemas de irradiação completamente
distintos (lâmpada halógena filtrada, LED convencional, HPLED), utilizando azul de metileno
como fotosensitizador. A comparação entre a eficiência de cada equipamento foi realizada através
da cinética de fotooxidação de 1,3-Diphenylisobenzofuran e inativação de Staphylococcus aureus.
A emissão de luz de cada equipamento, sobreposta à absorção do fotosensitizador, também se
mostrou um importante parâmetro na estimativa da eficiência dos equipamentos. Foi observada uma
inibição bacteriana superior a 99% para concentrações de 5 × 10
-6
mol dm
-3
de fotosensitizador,
no sistema que emprega HPLED. Os equipamentos baseados em LED, apresentaram resultados
satisfatórios além de baixo custo e simples montagem.
The construction of LED systems applied to photosensitization processes was studied. Aiming
to obtain more efficient devices it was evaluated the use of high intensity LED (HPLED), that present
greater photonic flux, tending to excite a greater fraction of molecules. Construction details for 3
different irradiation systems were described (filtered halogen bulbs, conventional LED, HPLED),
using methylene blue as a photosensitizer. A comparison between the efficiency of the equipments
was carried out through the kinetics of photooxidation of 1,3-Diphenylisobenzofuran and
Staphylococcus aureus photoinactivation. The overlap between the light emited from each equipment
and the photosensitizer absorption, was also an important parameter in estimating the efficiency
of the equipment. Bacterial inhibition higher than 99% for concentrations of 5 × 10
-6
mol dm
-3
of the photosensitizer was observed, in the system that uses HPLED. The equipments based on
LED showed satisfactory results, besides their low cost and simple to assembling.
Keywords: high power LED, Staphylococcus aureus, methylene blue, irradiation systems
Introduction
Photodynamic Inactivation (PDI)
1
or Photodynamic
Antimicrobial Chemotherapy (PACT)
2
is the name of a
process, derived from Photodynamic Therapy, that causes
the death of microorganisms under the action of visible
light and a specific drug, also called photosensitizer.
3
The
electronic excitation of the photosensitizer in the presence
of oxygen implies in the generation of a large number of
reactive oxygen species (ROS), as for example, singlet
oxygen,
4,5
in a process known as photosensitization.
Since 1976, the oxidative action of singlet oxygen
and other ROS on tumor cells has been reported in the
medical and scientific communities.
5,6
Around the world,
several research results have been published on the use of
photosensitization to fight diseases caused by fungi, viruses,
bacteria and yeasts.
3,5,7-11
Among the photosensitizers cited in the literature,
12-16
methylene blue (MB), a phenothiazinic dye, has some
convenient characteristics: it presents good photodynamic
activity compared to different substrates,
17-19
is nontoxic
and relatively inert on living organisms.
20
It is also known
for its anti-septic action
21
and has been administrated
intravenously in some clinical cases (e. g., the treatment
of methemoglobinemia).
22,23
The light used in the photoinactivation systems needs
to comply with certain requirements: emission filtered
with low interference (i.e., relative monochromaticity);
A Comparative Study of Irradiation Systems for Photoinactivation of Microorganisms
J. Braz. Chem. Soc.
2
appreciable area of incidence; adjusted spectral emission
(near the drug absorption peak); low heating; appreciable
intensity.
24
Therefore, light emitting diodes (LED) present
some very desirable characteristics such as physical
resistance (they do not have bulbs, they do not break
and they are quite robust); extended duration (useful
lifetime nearly 100,000 hours); spectral emission near to
monochromatic systems; availability in several colors; low
heat emission;
25,26
aside from having lower cost per unit of
power when compared to laser diode systems.
27
In recent years, several publications point out to the use
of LED as a source of irradiation to satisfactorily promote
the excitement of photosensitizers.
28-31
However, the present
work aims at comparing and demonstrating advantages in
the use of high intensity LED, in detriment to conventional
LED, aside from providing guidelines for constructing an
irradiation equipment based on LED arrays. Conventional
colored 3 and 5 mm LED, widely found on the market,
normally operate under a forward current of 20 mA, and
have decreased rates of luminous emission (normally not
exceeding 5,000 mcd).
32
With the intention of making up
for this disadvantage, two alternatives can be used: (i)
the confection of LED arrays that not only increase the
incidence area, but also potentialize the intensity of emitted
radiation; (ii) application of high power LED (AMS-II).
They are more powerful than the previous ones, and have
high rates of luminous conversion - about 33 lm W
-1
for
the red AMS-II.
26
This indicates that they use less energy
to emit the same luminous amount, aside from maintaining
good characteristics as durability and emission close to
monochromatic.
The photodynamic action of MB was explored
in the sense of correlating the efficiency of three
different irradiation sources: (i) an equipment issuing
polychromatic filtered radiation coming from a halogen
lamp called PHLS (Polychromatic Halogen Lamp
System); (ii) matrix of 600 high brightness conventional
LED, called LED600; (iii) irradiation equipment emitted
by high intensity LED, assembled for a better performance
in the methylene blue sensitization and the analogous
ones, denominated AMS-II.
The effective irradiance and the overlap integral with
the absorption band of MB of each equipment were
analyzed. Their efficiencies in ROS generation were
analyzed by means of a kinetic study of discoloration of
1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF), a colorful molecule that
quickly suffers oxidation in the presence of singlet oxygen,
forming o-dibenzoylbenzene (DBB).
33
As a microorganism
model, for implementing and measuring photoinactivation
efficiency, Staphylococcus aureus, which is a pathogenic
gram-positive bacteria widely studied and responsible for
several reports of hospital infection
34
was used.
Experimental
PHLS setup
A halogen lamp used in overhead projectors (OSRAM,
model ENH, 250W) was fitted to a metallic box. A 100%
reading magnifying lens was fixed at a distance of 7 cm
from the light bulb. For refrigeration, a cooler was inserted
in the metallic box, and was fitted to a glass cube near the
irradiation point of the sample being rectangular in shape
for circulating water on the inside.
The light given off by the light bulb was then filtered to
eliminate unnecessary wavelengths using an optic filter. The
filter was obtained commercially and is made of pigmented
polyester. The filter was fitted on the top of the glass box.
A schematic view of this setup is shown in Figure 1A.
LED600 equipment
Under a typical circuit board, the matrix of 600 high
brightness red LED (ZX, 8000 mcd) was made. This
Figure 1. A) Equipment PHLS (1) Metal carcasses with the coupled lamp and cooler, (2) Magnifying glass, (3) Glass box, (4) Optical filter; B) LED600
equipment (1) Arrangement of high brightness LED, (2) Translucent mobile support for sample setting, (3) Height groove, for support setting; C) AMS-II
equipment (1) Arrangement of high power LED, (2) Heat processor dissipater, (3) Groove for support setting for the insertion of the sample.
de Paula et al.
3Vol. 00, No. 00, 2009
array was organized in 150 clusters connected in parallel,
each cluster having 4 LED in series. This entire array
was connected and fed by a DC power supply, providing
2.42 A current.
This circuit board was fixed to a rectangular metallic
box. It was welded onto the metallic structures, on the inside
there are some structures that allow for sample fixation. The
described structure is shown in the Figure 1B.
AMS-II equipment
Seven High Intensity LEDs were assembled in a serial
array (Figure 1C) (Edison, model IR Edixeon). The LED
was driven by a Buck CC/CC converter that delivers an
output voltage of 22VDC and a constant output current
of 350 mA, from a universal input voltage (100-240 V
AC
).
Therefore the total power given off by the LED is about
7.5 W.
Acquisition of irradiance spectra and measurements
The profile of the emitted radiation of the above-
mentioned light sources was obtained with the aid of a
setup based on an Ocean Optics, model SD2000 fiber optics
spectrometer with an integrated time of 35 ms.
The optical power (P) was obtained with the aid of a
power meter Ophir, model Orion, with a photodiode sensor
model PD-300, spectral range of 350-1100 nm.
Aiming at the comparison between the proposed systems,
an integral of overlapping was estimated (R) between the
absorption of the methylene blue (ABS
PS
) and the emission
of the irradiation equipment (E
EQUIP
) (equation 1), according
to the method proposed by Bonacin et al.
31
(1)
Because the irradiation intensity does not vary with
time, it is possible to estimate the relative fraction of
photosensitizer excitement (R) which is an important
parameter for comparing the efficiency between the
equipments described.
Due to the fact that the concentration of dye used is
the same, the greater or lesser values of R are associated
only to the coupled emission with the absorption of the
dye, and represented a magnitude of excitement of the
dye molecules.
Methylene blue
Methylene blue solutions (Sigma) in the concentrations
5 × 10
-5
, 5 × 10
-6
and 5 × 10
-7
mol dm
-3
, have been prepared,
in a laminar flow hood, through the dissolution of the dye
in sterile physiological serum (sodium chloride saline
solution 0.9 wt% sterilized by autoclave) and deposited in
Eppendorf tubes before use.
The methylene blue absorption spectrum in physiological
solution, in a solution 10
-6
mol dm
-3
, was measured using a
Shimadzu UV-2501 spectrophotometer.
DPBF oxidation
Stock solutions (10
-4
mol dm
-3
) of DPBF (Sigma)
were diluted in absolute methanol, resulting in a final
concentration of 10
-5
mol dm
-3
and 10
-6
mol dm
-3
of
methylene blue. All these solutions were prepared at
the moment of use, and protected from light before the
experiments were carried out.
The solutions were irradiated using an open quartz
cuvette (Hellma 110-QS) with a 1 cm optical pathway,
being stirred constantly, at intervals of 5 seconds of
irradiation, and absorption was read at 408 nm, with the
aid of a spectrophotometer.
Sodium azide (Aldrich, 99.99%) was used as a singlet
oxygen quencher in some experiments.
A comparative measure at the number of photons
absorbed by the concentration of oxidable substract was
used as to help estimating the efficiency of each equipment.
Consequently, the equipment that promotes a greater
substract degradation emitting a smaller quantity of photons
tends to be more efficient.
Bacterial suspension
Determined S. aureus strain (ATCC 25923), was
kindly provided by the Laboratório de Microbiologia,
Universidade Federal de Uberlândia. This strain was
transferred to a nutritional medium prepared with the
following composition: 1.25% meat extract ‘lab lemco’
(Oxoid), 0.50% tryptone (Oxoid), 1.00% peptone (Biobrás),
0.50% sodium chloride (Vetec, 99%), 0.25% sodium
phosphate dibasic heptahydrated (Cinética química, 99%),
2.00% D-glucose (Synth, 99.9%).
A secondary culture was carried out in agar Cistine-
Lactose-Electrolyte-Deficient – CLED (Oxoid), used for
the growth and isolation of CFU’s.
From this culture a bacterial suspension was
prepared in sterile physiological serum/saline. In the
bacteriological experiment a concentration of 0.1 in the
McFarland scale was used. This stock suspension was
diluted in a 1:10 proportion, which corresponds to a cell
density of approximately 3 × 10
6
colony forming units
(CFU) mL
-1
.
A Comparative Study of Irradiation Systems for Photoinactivation of Microorganisms
J. Braz. Chem. Soc.
4
Incubation and irradiation
500 mL of bacterial suspension and 500 mL of methylene
blue solution were incubated, in the dark, for 30 min.
This experiment was repeated for each concentration of
methylene blue prepared. All experiments were carried
out in triplicate.
After the incubation period, the samples were irradiated,
for 20 minutes, without agitation, and subsequently 100 mL
of the suspension were transferred to Petri dishes containing
the casting growth medium and kept in the bacteriological
stove at 35 ºC. This medium was prepared by adding 2%
of agar to the nutritional broth formula. After 24 hours of
incubation, colony counting was carried out using a colony
counter PHOENIX (CP 602).
Results and Discussion
Development of the equipment
The LED of the AMS-II equipment was arrayed in
series, because in this way the equipment would be better
adjusted to the photochemical processes (satisfactory
intensity, homogeneous, fixed and steady irradiance).
Arraying series and regulating the current (and not
the tension) through of the LED, is preferred for these
applications, provided: (i) The curve between the current
and LED voltage is very abrupt:
26
Small changes in the
voltage are expressed in great variations of current. Once
the luminous intensity of the LED alternates more linearly
with the current, subtle alterations in the voltage would
imply in drastic changes in the intensity. While simple
systems of current control, tend to ensure greater confidence
in the luminous intensity oscillation. (ii) In regard to the
voltage and the natural negative temperature coefficient of
LED, arrays connected in parallel cannot guarantee that
the current (and thus the brightness) entering each LED
is necessarily equal. When two diodes are connected in
parallel and one of them heats a little more than the other,
this diode tends to drain more current, becoming hotter and
in this way contributes gradually to a cascade effect that
normally culminates in overheating.
LED600, unfortunately, for practical reasons, cannot be
arrayed in series, since the tension in components in series
is cumulative, and, therefore the equipment would tend to
consume a tension of nearly 1320 Volts (assuming 2.2 V
as the approach tension of each diode), making the project
impracticable. In practice it was observed that for the array
in LED600 having been carried in a rather compact form,
the homogeneity is not so compromised, and the current
limitation, for the use of an appropriate source, reduces part
of the problems related to the arrays in parallel. Moreover,
LED600 has innumerable components. If it was mounted
in series and one of the diodes were damaged, opening the
circuit, all illumination of the set would be compromised.
For these and other reasons the AMS-II equipment
was theoretically considered as LED600 improvement,
developed to work in series, with a fixed current.
The production cost of the PHLS is at least twice less
costly than the other devices developed. This equipment
is also much more accessible than analogous commercial
equipment. The lens used greatly reduce the area of
homogeneous radiation, however, tests performed with the
spectrometer indicated a scoring higher than 50% in the
value of light intensity, when in the presence of the lens. In
the absence of refrigeration systems, the sample can reach
temperatures of about 52 ºC, favoring the denaturing of
DNA and proteins. In this way, the glass box gives off the
generated heat efficiently, guaranteeing that the temperature
of the sample is raised at the most 3 ºC.
The emission spectrum of the equipment studied,
superimposed with the photosensitizer absorption used is
shown in Figure 2.
LED600 presents a wide emission area: 360 cm
2
,
sufficient homogeneity (seen with spectrometer) and low
heating. For this equipment we kept the distance of 11 cm
for a better homogeneity/intensity relation, which was used
in the microbiological experiments and in the degradation
of DPBF. The systems based on LED arrays should present
an ideal working distance seeing that, in a LED, the
polymeric pack acts as a lens: a greater proximity means
that the sample is very near to the focus, and, therefore, the
irradiation is not homogeneous; the increase in the distance
Figure 2. Absorption spectrum for methylene blue (
—
); emission
spectrum of PHLS (—), LED600 (
......
) and AMS-II (----).
de Paula et al.
5
Vol. 00, No. 00, 2009
tends to improve the distribution of the radiation, on the
other hand great distances of the light source compromise
the intensity of the light received.
AMS-II, although having intensity very close to
LED600, has the peak of emission at 652 nm, being still
closer to the maximum absorption of the drug (663 nm).
Emission of AMS-II is not only more appropriate for this
drug, as it is also very homogeneous, as seen in additional
tests with the spectrometer. The emission area of 95 cm
2
(Table 1) could be increased by the simple addition of more
LED in the array. This system presented irradiance values
near 43.35 mW cm
-2
. The information on the irradiation
area with homogeneous intensity, optical power, irradiance,
and a fraction of excited molecules obtained from each
equipment is summarized in Table 1.
The useful fraction of light that excites the fenotiazinic
coloring is different for each equipment. It is possible to
observe that the emission region of LED is sufficiently
adjusted for the region of better drug electronic excitement,
since PHLS presents low magnitude in the excitement of the
photosensitizer (R = 6.33), basically in regard to the reduced
photonic emission in the region of the band of absorption
of methylene blue. The PHLS region emitted is sufficiently
appropriate for other drugs, as for example, the class of
phthalocyanines, since the absorption peak of the Q band of
these drugs is located near the region between 675-700 nm.
35
These emissions are normally difficult to be obtained using
conventional LED, because commercially available LED
emission values above 650-660 nm are not usual.
Even though the LED600 and AMS-II are close, it is
expected that AMS-II would have greater efficiency in
generating reactive species due to its irradiation being
capable of exciting a greater fraction of molecules of the
photosensitizer (R = 31.36) compared to the rest of the
equipment. This phenomenon can be explained because of
the emission of this equipment found in the band of greater
light absorption by the photosensitizer.
Confirmation of singlet oxygen presence
Solutions with sodium azide (NaN
3
) were used in order
to give evidence of the participation of singlet oxygen in
the process (Figure 3). Sodium azide is known as a strong
singlet oxygen quencher (10
8
dm
3
mol
-1
s
-1
in H
2
O).
33,37,38
In all the equipments similar profiles of DPBF oxidation
and suppression by azide were observed, Figure 3 shows
the results observed with the LED600 equipment.
It is possible to observe in Figure 3B, that in the
presence of NaN
3
, a reduction in the oxidation speed of
DPBF occurs. The absorption peak in the DPBF region is
found in the 429 nm region and shows the Figure that the
mechanism of oxidation by participation of singlet oxygen
is predominant.
Kinetic comparison of photo oxidation of DPBF
A kinetic study allows the quantification ion of to
express the efficiency in the generation of ROS by emitted
light of equipment built in the photo degradation of DPBF.
Equation 2 expresses the degradation of the oxidable
substract by the action of singlet oxygen. The concentration
of singlet oxygen can be admitted as constant because the
solutions were keeping contact with air and under constant
agitation. Thus, it is possible to incorporate [
1
O
2
] into the
kinetic constant k, resulting in a pseudo-first order constant,
k’. In this way, the resultant kinetics is of pseudo-first
order (equation 3 and 4). After the integration the equation
obtained for the process is express in equation 5.
33,36
Table 1. Optical Power (P), Irradiation Area (A), Irradiance (Ir) and estimated excited fraction of photosensitizer (R), in the conditions used
Equipment P / mW A
a
/ cm
2
Ir / (mW cm
-2
) F / (Einstein s
-1
) R
b
PHLS 2.90 132 1.80 1.7 × 10
-8
6.33
LED600 20.11 360 12.46 1.6 × 10
-7
18.58
AMS-II 19.69 95 12.21 1.07 × 10
-7
31.36
a
Homogeneous irradiation area. Refers only to the possibility of irradiation of greater numbers of samples at the same time. Maximum variation in ±5%
of intensity.
b
Calculated with respect to methylene blue 10
-6
mol dm
-3
in sodium chloride 0.9%.
Figure 3. Photo-induced oxidizing of DPBF in LED600, in the absence
of NaN
3
(A), and in the presence of NaN
3
(B). Each spectrum corresponds
to 5 seconds of irradiation.
A Comparative Study of Irradiation Systems for Photoinactivation of Microorganisms
J. Braz. Chem. Soc.
6
(2)
(3)
(4)
(5)
A reduction in the concentration of DPBF in regard to
time is shown in Figure 4, for all equipments.
Each spectrum was obtained after 5 seconds of exposition
to emitted light by the equipment. Thus, it is observed that for
the AMS-II, only 20 seconds were sufficient for a reduction
greater than 98% of intensity of the DPBF band.
These results suggest that AMS-II presented better
performance. These tests are also in accordance with the
values shown in Table 1. In these experimental conditions, it is
still possible to say that AMS-II presents twice the efficiency
of LED600 (k’
AMS
= 0.25532 s
-1
; k’
LED
= 0.12668 s
-1
).
However, PHLS, in view of the small emission in the useful
working band, presents an efficiency quite reduced when
compared to LED-based equipments.
Photodynamic inactivation
Methylene blue, in the absence and in the presence
of light, presents bactericide action in particular against
gram-positive bacteria. These effects are described in the
literature.
39,40
The results of the bacterial inhibition by the
presence and absence of light, are arranged in Figure 5.
The samples were irradiated for 20 minutes.
The bacterial inhibition in the dark, for the more
diluted solution (5 × 10
-7
mol dm
-3
), presents a reduction,
of approximately 50%, in the number of colony forming
units. In the equipment of greater efficiency, AMS-II,
methylene blue under irradiation photo inactivated 75% of
the bacteria reducing by 50% of the colony forming units
compared with the dark control.
In all the other concentrations, the AMS-II equipment
presented photo inactivation superior to 99%. The other
equipments, LED600 and HPLS also presented satisfactory
performances of photo inactivation. At the concentration
of 5 × 10
-5
mol dm
-3
and after light application, there
was no colony formation. Therefore, all the equipments
described operate satisfactorily against growth inhibition
of Staphylococcus aureus in vitro. The obtained results
in photodynamic inactivation agree proportionally to the
results obtained with the DPBF oxidation and with the
respective R values of each equipament.
Conclusions
All the equipments built proved to be capable of
generating oxygen singlet, as was observed in the
discoloration of the DPBF, in the suppression by NaN
3
and
photo inactivity of Staphylococcus aureus.
The study enables one to conclude that high power
LED equipment proved to be able to excite a more
significant fraction of molecules of the photo synthesizer,
and consequently showed a more significant generation
of oxygen singlet, as was observed more significantly by
the magnitude of the kinetics of discoloration of DPBF,
and bacterial inhibition. The reasons for this are relatively
Figure 4. Kinetics of pseudo-first order corresponding to the degradation
of DPBF induced by irradiation of various equipments developed. ()
PHLS; () LED600; () AMS-II.
Figure 5. Bacteria count before and after the exposure of light, under
three different concentrations of methylene blue: 5 × 10
-5
, 5 × 10
-6
, 5 ×
10
-7
mol dm
-3
. Solutions in the same concentrations and non-irradiated
were used as control.
de Paula et al.
7
Vol. 00, No. 00, 2009
simple: the high powered LED used emits in wavelengths
near to the peak methylene blue absorption aside from
having high fluency. The system that uses a halogen bulb
presents low photonic emissions, even though other optic
filters may be used.
High powered LED are more effective photochemically
aside from showing cost advantages and set up practicality.
Acknowledgments
The authors are indebted to Prof. Dr. Antonio Eduardo
da Hora Machado for his valuable contribution to this
study. To Laboratório de Fotoquímica and Laboratório
de Fotoquímica de Lignocelulósicos from Universidade
Federal de Uberlândia, for the concession of the infra-
structure and materials. To CNPq, FAPEMIG and Nanobrax
(www.nanobrax.com) for research support.
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Acta 1999, 394, 337.
Received: June 6, 2009
Web Release Date: December 21, 2009
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