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UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA – UDESC
CENTRO DE CIÊNCIAS AGROVETERINÁRIAS – CAV
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
SUSAN EHLERT CHRISTEN
AMPLIFICAÇÃO DO GENE DA CHAPERONINA HSP10 DO
Trypanosoma evansi
LAGES, SANTA CATARINA
2010
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SUSAN EHLERT CHRISTEN
AMPLIFICAÇÃO DO GENE DA CHAPERONINA HSP10 DO
Trypanosoma evansi
Trabalho de dissertação apresentado ao
curso de Pós-graduação em Ciência
Animal como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Ciência
Animal.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Cláudio Miletti.
LAGES, SANTA CATARINA
2010
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Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária
Renata Weingärtner Rosa – CRB 228/14ª Região
(Biblioteca Setorial do CAV/UDESC)
Susan Ehlert Christen
Amplificação do gene da Chaperonina HSP10 do Trypanosoma
evansi / Susan Ehlert Christen – Lages, 2010.
60 p.
Dissertação (mestrado) – Centro de Ciências Agroveterinárias /
UDESC.
1. Trypanosoma evansi. 2. HSPs. 3. Relação parasito-hospedeiro.
4. PCR. I. Título.
CDD – 636.08969
SUSAN EHLERT CHRISTEN
AMPLIFICAÇÃO DO GENE DA CHAPERONINA HSP10 DO
Trypanosoma evansi
Dissertação apresentada ao curso de Pós-graduação em Ciência Animal, como
requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.
Banca Examinadora:
Lages, Santa Catarina, 20/10/2010
AGRADECIMENTOS
Inicialmente gostaria de agradecer aos meus queridos pais, por permitirem
que eu pudesse iniciar e concluir mais uma etapa da longa jornada que é a vida...
por não me deixarem abater perante as dificuldades e me mostrarem que somente
com muito esforço e dedicação é que se consegue o sucesso.
Agradeço as minhas irmãs por tudo que fizeram e ainda fazem por mim...
A todos os demais familiares que sempre me apoiaram e incentivaram.
Agradeço a Deus que me deu forças e acima de tudo muita paciência para
que eu não desistisse nos momentos de maior dificuldade... pois, aprendi, que o
Senhor não nos dá fardos maiores que possamos carregar.
Aos meus amigos, pelos momentos de alegria e incertezas que passamos
juntos. Pelo incentivo e apoio que vocês passaram para mim, pelos momentos
agradáveis de convivência, por estarem presentes nos momentos que mais precisei.
Sei que sempre poderei contar com vocês.
Obrigado ao meu Orientador, pela oportunidade que me foi concedida, pela
confiança, paciência e amizade.
Às pessoas do Laboratório de Bioquímica de Hemoparasitas e Vetores, pelo
companheirismo e espírito de equipe, pelas discussões, sugestões e pelas técnicas
que me foram ensinadas.
Aos professores que foram fundamentais para minha formação.
Agradeço também a Universidade pela infra-estrutura e a oportunidade de
realização deste trabalho.
Aos animais utilizados no experimento gostaria de lembrar com respeito, pois
sem estes esta pesquisa não poderia ter sido realizada.
Ao CNPq, pelo apoio financeiro.
E, finalmente, a todos que se envolveram neste trabalho direta ou
indiretamente meu carinho e reconhecimento.
RESUMO
CHRISTEN, Susan Ehlert. Amplificação do gene da chaperonina HSP10 do Trypanosoma
evansi. 2010. 60 f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal – Área: Produção Animal) –
Universidade do Estado de Santa Catarina. Programa de Pós-graduação em Ciência
Animal, Lages, 2010.
A tripanossomíase é uma enzootia ocasionada por diversas espécies do gênero
Trypanosoma. Este é um hemoflagelado amplamente distribuído e de grande importância
veterinária, pois infecta uma grande variedade de mamíferos. O Trypanosoma evansi é o
agente causador da doença denominada popularmente como surra, que possui grande
importância econômica na África, Ásia e América do Sul. Estes protozoários possuem ciclos
de vida digenéticos. Quando os parasitos passam do vetor para o hospedeiro estes acabam
sofrendo um choque térmico. As HSPs são encontradas em uma variedade de patógenos,
onde o choque térmico é um evento natural de sua biologia. A resposta de choque térmico é
um mecanismo homeostático que protege as células dos efeitos deletérios do estresse
ambiental. As HSPs possuem um papel fundamental no trabalho intracelular como
replicação de DNA, divisão celular, transcrição, tradução, funções nas membranas,
transporte de proteínas, além de darem assistência correta ao enovelamento de proteínas
nascentes e desenoveladas pelo acúmulo de estresse. Este trabalho teve como intuito
amplificar o gene da HSP10, para que seja possível futuramente observar sua expressão
nos tripanosomatídeos. Ratos Wistar foram infectados com T. evansi, os parasitos foram
purificados, efetuou-se a extração de DNA e RNA, além da transcrição reversa, PCR,
transformação em E. coli DH5α e o seqüenciamento dos clones. As bandas que
corresponderam ao tamanho do gene HSP10 foram selecionadas para clonagem. As
construções dos insertos selecionados foram submetidos ao sequenciamento a fim de
verificar a construção correta dos clones. A análise do seqüenciamento demonstrou que a
sequência obtida possui uma homologia de 40% correspondente a HSP10 hipotética de T.
brucei. Este é um dos primeiros trabalhos que buscam identificar um gene da família das
HSPs em T. evansi, que poderá ser usado como alvo quimioterápico.
Palavras chave: Trypanosoma evansi. HSPs. relação parasito-hospedeiro. PCR.
ABSTRACT
CHRISTEN, Susan Ehlert. Gene amplification of chaperonin HSP10 of Trypanosoma evansi.
2010. 60 f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal – Área: Produção Animal) –
Universidade do Estado de Santa Catarina. Programa de Pós-graduação em Ciência
Animal, Lages, 2010.
The trypanosomiasis is enzootic caused by several species of the genus Trypanosoma. It is
a hemoflagellate widely distributed and of great veterinary importance, because infects a
wide variety of mammals. Trypanosoma evansi is the causative agent of disease popularly
known as “surra”, which has great economic importance in Africa, Asia and South America.
These protozoa possess digenetic life cycles. When the parasites move from vector to host
they suffer a heat shock. The HSPs are found in several pathogens, where the heat shock is
a natural event of their biology. The heat shock response is a homeostatic mechanism that
protects cells from the deleterious effects of environmental stress. The HSPs have a key role
in intracellular work such as DNA replication, cell division, transcription, translation, functions
in membrane transport proteins as well as providing assistance to correct protein folding
nascent and unfolded by stress accumulation. This work aimed to amplify the HSP10 gene,
to be able, afterwards, to observe its expression in trypanosomatids. Rats Wistar were
infected with T. evansi, the parasites were purified, the DNA and RNA extraction was made,
beyond the reverse transcriptase, PCR, transformation into E. coli DH5α and sequencing of
clones. The bands that corresponded to the size of HSP10 gene were selected for clone.
The constructions of the inserts selected were subjected to sequencing to verify the correct
construction of the clones. The sequencing analysis showed that the sequence obtained has
a homology of 40% corresponding to HSP10 hypothetical T. brucei. This is one of the first
papers that attempted to identify a gene family of HSPs in T. evansi, that should be used as
a chemotherapeutic target.
Key words: Trypanosoma evansi. HSPs. Parasite-host relationship. PCR.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES E TABELAS
Figura 1: Desenho esquemático representando os estádios de diferenciação do
tripanosoma. ............................................................................................. 17
Figura 2: Foto de sangue corado com Panótico de um rato infectado com
Trypanosoma evansi ................................................................................ 18
Figura 3: Desenho esquemático do ciclo de vida do Trypanosoma evansi .............. 20
Figura 4: Desenho esquemático da ação das chaperonas durante o transporte de
proteína .................................................................................................... 28
Figura 5: A estrutura por raio X do complexo da chaperonina HSP60-HSP10-(ADP)
7
na E. coli ................................................................................................... 31
Figura 6: Desenho esquemático demonstrando o funcionamento do complexo
GroEL-GroES na E. coli ........................................................................... 32
Figura 7: Purificação das formas tripomastigotas de T. evansi através da coluna de
DEAE-Celulose. ........................................................................................ 43
Figura 8: Gel de agarose 1% corado pelo brometo de etídeo revelando os perfis de
HSP10 obtidos a partir de formas tripomastigotos de T. evansi ............... 44
Figura 9: Gel de agarose 1% corado pelo brometo de etídeo, testando diferentes
concentrações de Cloreto de Magnésio. .................................................. 45
Figura 10: Gel de agarose 1% corado pelo brometo de etídeo revelando a PCR de
colônia ...................................................................................................... 46
Figura 11: Sequência obtida a partir dos clones de E. coli seqüenciados ................ 48
Tabela 1: Classificação das proteínas de choque térmico. ....................................... 27
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADP: Adenosina Difosfato
Ágar LB: Ágar Luria Bertani
ATP: Adenosina Trifosfato
ATPase: Enzima que Catalisa a Hidrólise do ATP
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool
C
α
: Carbono Alfa
cDNA: Ácido Desoxirribonucleico Complementar
DEAE-Celulose: Dietilaminoetil-Celulose
DEPC: Dietilpirocarbonato
DNA: Ácido Desoxirribonucléico
E. coli: Escherichia coli
EDTA: Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Ácido Etilenodiamino Tetracético)
g: Gravidade
HEPES: (4- (2-Hydroxyethyl) - Acid 1-Piperazineethanesulfonic )
HSE: Heat Shock Element (Elemento de Choque Térmico)
HSF: Heat Shock Factor (Fator de Choque Térmico)
HSPs: Heat Shock Proteins (Proteínas de Choque térmico)
HSR: Heat Shock Response (Resposta ao Choque Térmico)
IPTG: Isopropil β-D-1-Thiogalactopyranoside
kDa: Quilodalton
kDNA: Ácido Desoxirribonucléico Cinetoplasmático
kV: Quilovolts
L. donovani: Leishmania donovani
mg: Miligrama
MgCl
2
: Cloreto de Magnésio
ml: Mililitro
mM: Milimolar
mRNA: Ácido Ribonucleico Mensageiro
NaCl: Cloreto de Sódio
ng: Nanograma
nm: Nanômetro
PBS: Phosphate Buffered Saline (Tampão Fosfato Salino)
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
pmol: Picomol
RNA: Ácido Ribonucleico
RNAi: Ácido Ribonucleico Interferente
RNAse: Ribonuclease
RT-PCR: Transcripsase Reversa seguida da Reação em Cadeia da Polimerase
SDS: Sodium Dodecyl Sulfate (Dodecil Sulfato de Sódio)
SOC: Super Optimal Broth com Catabolic Repressuion
spp.: Espécies
S. ratti: Strongyloides ratti
S. stercoralis: Strongyloides stercoralis
T. brucei brucei: Trypanosoma brucei brucei
T. brucei gambiense: Trypanosoma brucei gambiense
T. congolense: Trypanosoma congolense
T. cruzi: Trypanosoma cruzi
T. equiperdum: Trypanosoma equiperdum
T. evansi: Trypanosoma evansi
T. vivax: Trypanosoma vivax
U: Unidade
µg: Micrograma
µl: Microlitro
UTR: Região Não Traduzida
X-GAL: 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside
%: Porcentagem
º: Graus
ºC: Graus Celsius
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 14
1.1 CARACTERÍSTICAS DO GÊNERO Trypanosoma ............................................. 14
1.1.1 O Trypanosoma evansi .................................................................................... 18
1.2 AS PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO NA RELAÇÃO PARASITO-
HOSPEDEIRO .......................................................................................................... 23
1.3 CONSIDERAÇÕES SOBRE AS PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO ............ 26
1.4 A CHAPERONINA HSP10 .................................................................................. 30
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 34
2.1 OBJETIVO GERAL.............................................................................................. 34
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 34
3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 35
3.1 O T. evansi .......................................................................................................... 35
3.1.1 Infecção experimental para obtenção dos parasitos ........................................ 35
3.1.2 Purificação da forma tripomastigota de T. evansi ............................................. 35
3.2 EXTRAÇÃO DE DNA .......................................................................................... 36
3.3 EXTRAÇÃO DE RNA .......................................................................................... 37
3.4 DOSAGEM DO DNA E RNA ............................................................................... 38
3.5 REAÇÃO DA TRANSCRIPTASE REVERSA ...................................................... 39
3.6 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR) E LIGAÇÃO AO VETOR .... 40
3.7 TRANSFORMAÇÃO DOS PLASMÍDEOS RECOMBINANTES EM E. coli DH5α
.................................................................................................................................. 41
3.8 SEQÜENCIAMENTO DOS CLONES .................................................................. 42
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 43
4.1 PURIFICAÇÃO DA FORMA TRIPOMASTIGOTA DE T. evansi .......................... 43
4.2 ANÁLISE DO HSP10 AMPLIFICADO PELA PCR ............................................... 44
4.3 TRANSFORMAÇÃO DOS PLASMÍDEOS RECOMBINANTES EM E. coli DH5α
.................................................................................................................................. 46
4.4 SEQUENCIAMENTO DOS CLONES .................................................................. 47
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 49
CONCLUSÃO ........................................................................................................... 52
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 53
14
1 INTRODUÇÃO
1.1 CARACTERÍSTICAS DO GÊNERO Trypanosoma
O Trypanosoma encontra-se no filo Protozoa, inserido na classe
Zoomastigophora, ordem Kinetoplastida e família Trypanosomatidae (REY, 2001).
Os membros desse gênero localizam-se na circulação sangüínea e nos tecidos de
vertebrados de todo o mundo. Algumas espécies possuem maior importância por
causarem enfermidade e mortalidade tanto em animais como no homem
principalmente nas regiões tropicais (URQUHART, 1998).
Os tripanosomas são constituídos de uma célula alongada, fusiforme, com um
único núcleo situado próximo à metade do seu comprimento. Possui um único
flagelo que se origina próximo de uma grande mitocôndria rica em DNA denominada
cinetoplasto, e se exterioriza na extremidade anterior da célula (BOWMAN, 2006).
Esses parasitos podem ser distribuídos em duas seções: Stercoraria e
Salivaria. Na seção Stercoraria, a infecção do hospedeiro ocorre através do contato
da pele ou das mucosas com as fezes do vetor contaminado. Enquanto na seção
Salivaria, transmissão do patógeno acontece pela saliva dos vetores (HOARE,
1972). A maioria dos tripanosomatídeos que fazem parte da seção estercorária não
são patogênicos, com exceção do T. cruzi. Porém os salivaria são altamente
patogênicos para pessoas e animais (BOWMAN, 2006) e estão distribuídos em três
subgêneros de importância veterinária: Nannomonas (T. congolense), Duttonella (T.
vivax) e Trypanozoon (T. brucei brucei, T. equiperdum e T. evansi).
O T. cruzi, é o agente responsável por causar a doença de Chagas, também
conhecida como tripanosomíase americana (KROPF e MASSARANI, 2009). Esta
doença é considerada endêmica em 21 países, onde se reportam entre 12 e 14
milhões de indivíduos infectados, com uma incidência anual de até 200.000 casos e
milhares de mortes (ORGANIZAÇÃO PAN-AMERICANA DA SAÚDE, 2009). A
doença é extremamente grave tanto na sua fase de parasitemia febril aguda como
em sua fase crônica caracterizada por miocardite, megaesôfago e megacólon
(URQUHART, 1998). A via mais importante de transmissão do T. cruzi para os
15
humanos é a vetorial, através das fezes de insetos triatomíneos (barbeiros)
infectados. Graças a programas de saúde pública, a transmissão vetorial está sendo
controlada em diversos países da América Latina, como é o caso do Brasil (CUNHA
NETO, 1999). A transmissão por transfusão de sangue também é possível, mas há
poucos casos desse tipo, devido ao controle dos bancos de sangue no Brasil,
principalmente a partir dos anos de 1980. A doença de Chagas pode, ainda, passar
da mãe para o bebê, durante a gravidez ou em casos de transplante de órgão
(KROPF e MASSARANI, 2009).
O protozoário T. congolense é um dos patógenos mais importantes no setor
pecuário africano e, por possuir um impacto sobre a saúde e produtividade do gado,
possui também um efeito significativo sobre a saúde e bem estar do ser humano
(MORRISON et al., 2009). A tripanossomíase animal africana é amplamente
difundida afetando 40 países situados em regiões que poderiam ser mais produtivas
(COUSTOU et al., 2010). Os sintomas consistem de febre intermitente e,
principalmente a anemia que se desenvolve. Outros sinais clínicos incluem
alargamento das linfas e imunossupressão com reduzida resistência do hospedeiro
a infecções secundárias (O‟GORMAN et al., 2008). O parasito é transmitido
ciclicamente pelo seu vetor, a mosca tsetse (Glossina spp.) (MASUMU et al., 2006).
Estima-se que 50 milhões de bovinos e 70 milhões de pequenos ruminantes estejam
em risco, custando ao continente africano entre 1,5 e 5 bilhões de dólares por ano
(COUSTOU et al., 2010).
A tripanossomíase denominada “secadeira” é causada pelo T. vivax, um
patógeno de grande importância econômica no continente africano, onde esse
parasito é transmitido ciclicamente pela mosca tsetse para ruminantes (SILVA et al.,
2009). A adaptação à transmissão mecânica por insetos hematófagos, tais como
tabanídeos e Stomoxys spp., permitiu a expansão do T. vivax para a América
Central, América do Sul e Caribe (BATISTA et al., 2008). Além dos bovinos, outros
animais também se encontram susceptíveis à infecção causada por esta parasitose
como os bubalinos, ovinos, caprinos, eqüinos, cães, entre outros (PAIVA et al.,
2000). As estimativas atuais indicam que mais de 11 milhões de cabeças de gado
podem estar sujeitas a infecção pelo T. vivax nas planícies do Pantanal brasileiro e
boliviano, com perdas potenciais superiores a 160.000.000 de dólares (JONES e
16
DÁVILA, 2001). Os principais sinais clínicos atribuídos ao agente são febre, anemia,
inapetência, fraqueza progressiva, emaciação, aborto, síndromes hemorrágicas e
morte (PAIVA et al., 2000).
O T. brucei brucei causa a doença popularmente conhecida como nagana,
que infecta bovinos, caprinos e ovinos, contribuindo para o impacto social destas
doenças (WANG et al., 2008), onde a infecção leva eventualmente à
imunossupressão do hospedeiro (WALLBERG e HARRIS, 2005). Os sintomas desta
enfermidade são semelhantes ao T. vivax.
Os tripanosomas anteriormente descritos são parasitos digenéticos, ou seja,
necessitam de dois hospedeiros para completar seu ciclo de vida, podendo
apresentar formas estruturalmente distintas, denominadas estádios (Figura 1).
Atualmente os estádios possuem a seguinte terminologia: amastigota, corpo
arredondado, sem flagelo livre; promastigota, corpo alongado, com flagelo na
extremidade anterior; epimastigota, o cinetossomo é próximo e anterior ao núcleo e
o flagelo sai livremente, não havendo membrana ondulante; e tripomastigota (o
tripanosoma propriamente dito), o cinetossomo está na extremidade posterior e o
flagelo desloca-se para a extremidade oposta, a anterior, na borda ondulante
(FORTES, 2004). Nos hospedeiros vertebrados, tripomastigotas e ocasionalmente
epimastigotas ocorrem no sangue e nos tecidos corporais, e amastigotas podem
ocorrer dentro das células do hospedeiro (T. cruzi) (HOARE, 1972). As quatro
formas podem ocorrer no hospedeiro invertebrado (vetor) ou em cultura (BARRIGA,
1997).
17
Figura 1: Desenho esquemático representando os estádios de diferenciação do tripanosoma. Sendo:
a – amastigota, b – promastigota, c – epimastigota, d – tripomastigota.
Fonte: FORTES, 2004.
O T. equiperdum provoca a enfermidade durina, ou “mal do coito”
exclusivamente em equinos (LI et al., 2007). Ocorre nas regiões da África, Ásia e
América do Sul e Central (URQUHART, 1998). É o único tripanosoma que não
necessita de hospedeiro intermediário, pois a transmissão se dá diretamente por
contato sexual (BOWMAN, 2006). Uma vez localizada na mucosa urogenital do
macho ou da fêmea, o agente passa para os capilares com a ajuda dos seus
movimentos, exercendo sua ação patogênica no animal então infectado (FORTES,
2004). A sintomatologia clínica consiste em edema abdominal ventral e genital,
placas urticariformes e emagrecimento progressivo. Em muitos casos o sistema
nervoso central está envolvido causando uma paralisia motora ascendente que, por
fim, é fatal (URQUHART, 1998).
18
1.1.1 O Trypanosoma evansi
O Trypanosoma evansi (Figura 2) é o agente etiológico da doença conhecida
como “surra” na África e Ásia e o “mal das cadeiras” na América do Sul (BRUN et al.,
1998). A principal diferença com outros tripanosomatídeos é a falta do cinetoplasto
(kDNA), consequentemente não há desenvolvimento de T. evansi no vetor
(HERRERA et al., 2004), pois alguns genes envolvidos na diferenciação do parasito
estão implicados na presença da mitocôndria.
Muitos sinônimos ainda são encontrados para denominar o Trypanosoma
evansi como: Spirochaete evansi, Trypanosoma equinum, Trypanosoma
soudanense, Trypanosoma hippicum, Trypanosoma venesuelense, Trypanosoma
soudanense Var. Berberum, Trypanosoma cameli, Trypanosoma marocanum,
Trypanosoma ninae Kohl yakmov, Trypanosoma su-auru, entre outros (HOARE,
1972).
Figura 2: Foto de sangue corado com Panótico de um rato infectado com Trypanosoma evansi. As
setas indicam os parasitos.
19
Acredita-se que este parasito tenha sido introduzido nas Américas através de
animais domésticos infectados, importados do Velho Mundo, e que suas cepas
sejam provenientes da África Ocidental (NUNES et al., 1993).
No Brasil, a doença causada pelo T. evansi foi inicialmente observada na Ilha
de Marajó, entre 1827 e 1830, local onde se iniciaram epizootias graves entre
equinos da região. Da Ilha de Marajó a doença se espalhou pela América do Sul,
estendendo-se pelo Brasil, Guiana, Bolívia, Venezuela e Colômbia (HOARE, 1972).
Vários gêneros de dípteros hematófagos têm sido considerados vetores para
este hemoparasito (SILVA et al., 2008). Na América do Sul a transmissão deste
parasito é feita por insetos dos gêneros, Simulium, Tabanus e Stomoxys (SILVA et
al., 2003). O papel de diferentes espécies de moscas na disseminação do T. evansi
parece variar em diferentes condições geográficas. A transmissão mecânica dos
hemoflagelados depende diretamente da sobrevida deles no aparelho bucal dos
insetos vetores, sendo a infectividade maior nos primeiros minutos após a
alimentação. Dessa maneira, a eficiência da transmissão depende do intervalo entre
as alimentações do inseto vetor e, consequentemente, da concentração desses
vetores e hospedeiros vertebrados num mesmo local. (AQUINO, 2007).
Os morcegos hematófagos (Desmodus rotundus) também servem como
vetores e reservatórios (HOARE, 1972), Uma vez que os tripomastigotas
multiplicam-se na corrente circulatória desses animais, os quais podem permanecer
infectados por até um mês, atuando, dessa maneira, como vetor e também
hospedeiro (AQUINO, 2007).
Este parasito é conhecido por ser capaz de infectar diversas espécies de
animais, dentre estes, os camelídeos na África; equinos, bovinos e búfalos na Ásia e
América Central e Sul; e cães, coatis, capivaras e masurpiais na América do Sul
(NJIRU et al., 2007). No Brasil, as capivaras e coatis são reservatórios naturais da
doença. Recentemente, Joshi et al. (2005) relataram o primeiro caso de infecção
humana por T. evansi em um fazendeiro na Índia, sendo considerado curado seis
meses após o tratamento com suramin (JOSHI et al., 2006).
Os métodos de prevenção para esta parasitose são difíceis, pois não há como
imunizar os animais. Todavia aconselha-se a realizar o tratamento dos doentes,
combater os vetores e incinerar as carcaças dos animais mortos (FORTES, 2004).
20
O T. evansi, no Brasil, é transmitido mecanicamente pelos vetores (Figura 3).
O parasito permanece na probóscida sob a forma tripomastigota sendo viável por
oito horas. A inoculação do parasito é feita através da picada dos insetos, atingindo
a corrente circulatória. Seguindo a fase de multiplicação, com um período pré-
patente de quatro a 10 dias, surgindo depois a parasitemia. Considera-se também
que o parasito possa ser transmitido via mucosa e transplacentária (FORTES, 2004).
Figura 3: Desenho esquemático do ciclo de vida do Trypanosoma evansi. O inseto vetor pica o
hospedeiro contaminado, o parasito permanece na probóscida. Quando o inseto
contaminado pica outro animal ocorre a transmissão mecânica da forma tripomastigota.
Fonte: SILVA et al., 2002, modificado por CHRISTEN, 2010.
Existem diferenças consideráveis na severidade das síndromes causadas
pela infecção do T. evansi nas diferentes áreas geográficas de sua ocorrência,
dependendo da virulência da cepa e da susceptibilidade do hospedeiro (HERRERA
et al., 2004).
O mal das cadeiras pode evoluir de maneira aguda ou crônica, dependendo
da velocidade de evolução da sintomatologia (KUBIAK e MOLFI, 1954). A fase
aguda da doença caracteriza-se pelo surgimento de febre intermitente, edema
subcutâneo, anemia progressiva, cegueira, letargia e alterações hemostáticas
(COLPO et al., 2005). Enquanto, nos estádios crônicos, os animais tornam-se fracos
(devido à anemia), as membranas mucosas encontram-se pálidas, há icterícia, os
21
nódulos linfáticos estão superficiais e entumecidos e o último sinal clínico constitui
na incoordenação motora com paralisia dos membros posteriores (CONRADO et al.,
2005). Na forma crônica, a morte do animal ocorre em um período que oscila entre
dois ou mais meses (KUBIAK e MOLFI, 1954).
O diagnóstico da infecção pelo T. evansi ainda é difícil, pelo fato dos sinais
clínicos serem variados e não específicos e, em áreas enzoóticas, os hospedeiros
naturais frequentemente apresentam leves formas crônicas da doença (HERRERA
et al., 2004).
Vários métodos parasitológicos têm sido empregados no diagnóstico da
tripanossomíse equina, porém todos requerem a visualização do parasito (SILVA,
SANCHEZ e DÁVILA, 2003). O método parasitológico mais empregado é o do
microhematócrito ou método de Woo (1969). No entanto, a baixa sensibilidade
destes testes parasitológicos indiretos acaba sendo um fator limitante no diagnóstico
(CAMARGO et al., 2004).
A introdução de novos procedimentos laboratoriais, tais como ELISA,
sequenciamento e a reação em cadeia pela polimerase (PCR), tiveram uma
participação considerável na identificação, caracterização e diagnóstico de precisão
e confiabilidade do tripanosoma (DESQUESNES e DÁVILA, 2002). A reação em
cadeia pela polimerase demonstrou ser uma ferramenta específica e sensível,
aumentando a sensibilidade da detecção de tripanosomas, com grande impacto
sobre os estudos epidemiológicos, principalmente nas áreas críticas onde ocorre a
infecção (HERRERA et al. 2005).
No Pantanal, a economia do estado do Mato Grosso do Sul se baseia na
bovinocultura, onde os cavalos são indispensáveis para o manejo dos rebanhos
(NUNES et al., 1993). Segundo relatos de pecuaristas pantaneiros, geralmente,
ocorrem surtos de tripanossomíase em capivaras precedendo os surtos da doença
em equinos (SILVA et al., 2004). Devido ao grande impacto econômico, estudos
realizados por Dávila et al. (2003) registraram surtos com alta mortalidade em
equinos. Silva et al. (1995) relataram mortalidade de 50,5% em um rebanho de 95
animais e 75% em um rebanho de 40 equinos.
Casos de infecção natural por T. evansi foram descritos também no Rio
Grande do Sul em equinos (CONRADO et al., 2005; RODRIGUES et al., 2005) e em
22
cães (COLPO et al., 2005). Recentemente Silva et al. (2008) descreveram pela
primeira vez a ocorrência de T. evansi em bovinos no Sul do Brasil, no Estado de
Santa Catarina.
O setor pecuário brasileiro sofre ainda hoje com problemas relacionados à
saúde animal, sendo a tripanossomíase uma das causas de perdas econômicas
significativas. A tripanossomíase causada pelo T. evansi é uma enfermidade de
difícil diagnóstico e com tratamento cada vez mais difícil, devido ao fato do
medicamento de eleição (Suramin
®
) não ser mais fabricado.
Portanto, com o intuito de tentarmos reduzir os danos causados por este
patógeno, devemos compreender a relação que há entre o parasito e o hospedeiro.
E para tanto, estudamos o gene de uma proteína muito importante, a HSP10, sendo
esta pertencente a um grupo de proteínas denominadas proteínas de choque
térmico, que influenciam na adaptação do parasito ao hospedeiro como também no
grau de virulência; para que no futuro seja possível desenvolver medicamentos e
vacinas eficazes para a proteção dos animais.
23
1.2 AS PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO NA RELAÇÃO PARASITO-
HOSPEDEIRO
Para a maioria dos organismos vivos, o choque térmico representa uma
situação de estresse incomum, mas para os parasitos que são transmitidos dos
vetores invertebrados para os hospedeiros mamíferos esta é uma ocorrência
fisiológica freqüente (POLLA, 1991). Como muitos patógenos, incluindo os de maior
importância médica e veterinária, experimentam este aumento na temperatura
ambiente em algum estágio durante o seu ciclo de vida (NEWPORT, CULPEPPER e
AGABIAN, 1988), estes têm sido motivo de estudos para verificar a relação entre as
proteínas de choque térmico e sua resposta na relação parasito-hospedeiro.
Muitas investigações visam à correlação da expressão das proteínas de
choque térmico (HSPs) nos organismos e as variações ambientais ou biológicas
(como o nível de estresse ambiental, estágios em desenvolvimento, papéis distintos
no relacionamento parasitário ou simbiótico com outras espécies) com as primeiras
evidências da adaptação e estabilização biológica (FEDER e HOFMANN, 1999). Por
exemplo, os parasitos que alteram seu ciclo de vida entre vetores poiquilotérmicos
(22°-28°C), precisam ajustar-se a temperatura constante dos hospedeiros mamíferos
homeotérmicos (37°C) (MARESCA e CARRATÙ, 1992). Também devem adaptar-se
as diferentes condições como a diferença de pH e a presença ou ausência de
nutrientes e hormônios, além de ter que mudar sua capacidade de proteger-se dos
produtos oxidativos e das enzimas dos hospedeiros (MARESCA e CARRATÙ,
1992).
Devido à conservação das proteínas de choque térmico e ao seu potencial de
imunogenicidade, o papel das HSPs pode estar relacionado a duas perspectivas: a
do hospedeiro e a do parasito (POLLA, 1991). No hospedeiro, as HSPs fazem uma
conexão entre os sistemas imunes inativo e adaptativo, na qual sua presença na
circulação serve como um sinal de perigo ao hospedeiro (TSAN e GAO, 2009). Na
perspectiva do parasito, a síntese das HSPs é um mecanismo de defesa celular que
permite que o parasito viva em diferentes ambientes térmicos através dos ciclos de
vida (FEDER e HOFMANN, 1999).
Segundo Kaufmann (1990), a resposta do hospedeiro também inclui a
produção de HSPs. Os fagócitos precisam se proteger das moléculas nocivas que
24
são produzidas, em particular os metabólitos reativos de oxigênio. Os linfócitos e
macrófagos são ativados pelas interleucinas ou mitógenos, em que uma ampla
variedade de polipeptídeos são produzidos, induzindo o aumento dos níveis de
mRNA das HSPs e como consequência os níveis de proteína. Assim, o sistema
imune pode ter adotado funções conservadas e adaptadas de HSPs para fins mais
especializados. Evidências têm se acumulado de que as HSPs são os antígenos
principais de muitos patógenos, e que, devido a sua abundância, ou talvez por
outras razões, as proteínas de choque térmico tornam-se antígenos proeminentes
que provocam uma grande parte do repertório imune. Estas propriedades permitem
que as HSPs sejam utilizadas em uma nova geração de vacinas profiláticas e
terapêuticas contra o câncer e doenças infecciosas (SRIVASTAVA e AMATO, 2001).
A vantagem do desenvolvimento de vacinas baseadas em HSPs é que não há
necessidade de identificar e purificar antígenos para terapia (ROBERT, 2003).
Muitos patógenos incluindo Schistosoma, Plasmodium, Trypanosoma e
Leishmania sofrem com mudanças de temperatura repentinas durante a transmissão
do vetor para o hospedeiro (KAUFMANN, 1990). E por serem parasitos de grande
importância econômica, pesquisas sobre as proteínas de choque térmico têm se
tornado cada vez mais frequentes nesses patógenos.
Evidências sustentam o papel do choque térmico no Schistosoma mansoni
através de modificações no crescimento ou nas condições ambientais, causando
uma resposta a este choque térmico e induzindo, assim, sua diferenciação (POLLA,
1991).
No gênero Leishmania, a produção aumentada de HSPs está correlacionada
com um aumento da infectividade e patogenicidade, além de ser parte de um
programa desenvolvido para a sobrevivência dentro de um hospedeiro de sangue
quente (NEWPORT, CULPEPPER e AGABIAN, 1988). Para realizar diferenciação
da forma promastigota à amastigota durante o ciclo de vida, a Leishmania
correlaciona o aumento de temperatura durante a transição do inseto para o
mamífero. Experimentos in vitro, onde há o aumento da temperatura de 25° a 37°C,
combinado com a acidificação do meio de cultura, constituem um estímulo suficiente
para induzir a diferenciação de promastigotas em culturas axênicas (GRAEFE et al.,
2002).
25
No T. cruzi, sugere-se que a ubiquitina do parasito pode ser secretada dentro
do citoplasma fazendo com que pequenos peptídeos ou aminoácidos derivados de
proteínas do hospedeiro sejam fornecidos para a sobrevivência do parasito (POLLA,
1991). Com relação ao ciclo de vida, as formas epimastigotas diferenciam-se em
tripomastigotas (ou seja, a forma sanguínea) nos insetos antes de infectarem os
mamíferos. Hipóteses sugerem que a indução das HSPs em tripomastigotas pode
preparar o Trypanosoma para contaminar os hospedeiros, assim como outros
estágios de vida nos vetores (MARESCA e CARRATÙ, 1992). A infecção do T. cruzi
no hospedeiro durante a fase crônica da doença atinge um delicado balanço que
permite a sobrevivência do hospedeiro e do parasito e a possibilidade de
transmissão da doença. A alta expressão constitutiva das HSP85, HSP70 e HSP60
suporta a idéia de que o parasito é capaz de montar uma resposta mediada pelo
estresse sobre a infecção (RONDINELLI, 1994).
Com base nos exemplos mencionados acima, percebe-se que as proteínas
de choque térmico possuem um papel fundamental nos ciclos de vida (ou seja, em
sua diferenciação) dos parasitos já citados. Mas quando analisamos o ciclo de vida
do T. evansi, cuja forma de transmissão é mecânica, a síntese de HSPs não é
ativada, como nos demais patógenos, por não sofrer alterações morfológicas.
Todavia, presume-se que as proteínas de choque térmico, possuam um importante
papel nos mecanismos de defesa do T. evansi contra o sistema imune do
hospedeiro.
Devido à importância que as proteínas de choque térmico desempenham na
virulência e adequação do parasito às novas condições ambientais encontradas no
hospedeiro, será descrito a seguir as características e funções celulares das
proteínas de choque térmico, com o intuito de facilitar e estimular o estudo das
implicações biológicas deste grupo de proteínas.
26
1.3 CONSIDERAÇÕES SOBRE AS PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO
Os seres vivos encontram-se constantemente ameaçados pelas condições
ambientais adversas (BARRAGÁN-VELOZ, 2007), seja o calor, radicais livres, altas
concentrações de sais, entre outros, que podem comprometer suas atividades
biológicas (VIANA, GARROTE FILHO e PENHA-SILVA, 2005). Para sobreviver a
estes diferentes tipos de agressão, os organismos adaptaram-se desenvolvendo
mecanismos complexos de defesa (entre estas, o fator de choque térmico, o
elemento de choque térmico e a resposta ao choque térmico) a estas diferentes
formas de estresse (BARRAGÁN-VELOZ, 2007). Esta resposta, referida como
Resposta ao Choque Térmico (HSR, Heat Shock Response), é caracterizada pelo
aumento extremamente rápido da expressão de um grupo seleto de proteínas,
denominadas Proteínas de Choque Térmico (Heat Shock Proteins, HSPs) (WELCH,
1992).
O primeiro relato das proteínas de choque térmico ocorreu quando Ritosa
(1962) verificou que a exposição das glândulas salivares de Drosophila produzia o
surgimento, em cromossomos, de um novo padrão de espessamento, que
representava sítios específicos de transcrição para a síntese de proteínas (MEYER e
DA SILVA, 1999).
As HSPs são proteínas altamente conservadas filogeneticamente, podendo
ser encontradas desde procariotos até eucariotos superiores. Na presença de
agentes estressantes, as células respondem ao aumento da síntese de membros
destas famílias de proteínas que as protegem dos efeitos deletérios de tais agentes
(RONDINELLI, 1994). Estudos comprovam que uma célula de estresse, em poucos
minutos, expressa cerca de 15-20% das proteínas intracelulares HSPs
(RODRÍGUES e CARO, sem ano).
O dobramento de proteínas é um processo muito importante em biologia, pois
converte cadeias lineares de polipeptídeos em estruturas tridimensionais que
possibilitam que as proteínas exerçam todas as suas atividades vitais (MEYER e
SILVA, 1999). As proteínas de choque térmico desempenham um importante papel
de chaperonas moleculares, que são proteínas cuja função é mediar o
enovelamento de outros polipeptídeos e, em algumas instâncias, sua montagem em
27
estruturas oligoméricas, mas que não são componentes finais destas estruturas
(ELLIS, 2000). São classificadas com base em suas massas moleculares
(FOLGUEIRA e REQUENA, 2007) (Tabela 1) e divididas em duas classes: a
primeira denominada de chaperonas, que constituem de proteínas de massas
moleculares maiores e, a segunda são as chaperoninas que possuem massas
moleculares menores, como por exemplo, a HSP10.
Tabela 1: Classificação das proteínas de choque térmico.
Nome
Tamanho
(k/Da)
Localização
Função
Ubiquitina
8
Citosol/Núcleo
Degradação de proteínas
proteosoma (não
lisossômica)
HSP10
10
Mitocôndria/Cloroplasto
Citosol/Núcleo
Chaperona da HSP60
reguladora de actina
HSP33
33
Citosol
Chaperona, estresse
oxidativo
HSP47
47
Retículo Endoplasmático
Rugoso/Citosol
Chaperona de colágeno
Forma parte do receptor do
hormônio esteróide: se une
a FK506
HSP60
60
Mitocôndria/Cloroplasto
Chaperona molecular
TCP-1
60
Citosol/Núcleo
Chaperona molecular
relacionada a HSP60
HSP72
70
Citosol/Núcleo
Chaperona molecular
induzida
HSP73
70
Citosol/Núcleo
Chaperona molecular
constitutiva
HSP90
90
Citosol/Núcleo
Forma parte do receptor do
hormônio esteróide
Chaperona
HSP104/110
104/110
Citosol/Núcleo
Chaperona molecular
Fonte: BARRAGÁN-VELOZ, 2007.
28
Apesar do alto grau de homologia entre membros de famílias de HSPs
derivadas de procariotos e eucariotos, estudos têm apontado que HSPs de mesma
família, mas de espécies diferentes, podem ter funções diferentes (POCKLEY,
2003).
As proteínas de choque térmico também são necessárias para o
redobramento de proteínas após atravessarem as membranas celulares (DEVLIN,
1998). As chaperoninas estabilizam cadeias polipeptídicas desenoveladas durante o
seu transporte para organelas subcelulares, como por exemplo, durante a
transferência de proteínas para dentro de mitocôndrias a partir do citosol (Figura 4).
Isso ocorre, pois, essas formam estruturas quaternárias longas, cilíndricas, com
subunidades que ligam proteínas não enoveladas em seu estado globular-fundido
dentro de suas cavidades centrais hidrofóbicas. Possuem atividade de ATPase e
hidrolisam ATP enquanto facilitam o enovelamento (DEVLIN, 1998; ENGLAND et al.,
2008).
Figura 4: Desenho esquemático da ação das chaperonas durante o transporte de proteínas. Um
polipeptídeo parcialmente desenovelado é transportado do citosol para a mitocôndria.
Chaperonas citosólicas estabilizam a configuração desenovelada. As chaperonas
mitocondriais facilitam o transporte e enovelamento subseqüente da cadeia polipeptídica
com a organela.
Fonte: COOPER, 2001
29
As HSPs têm sido relacionadas a processos como a replicação de DNA,
divisão celular, transcrição, tradução, enovelamento de proteínas, funções nas
membranas e transporte de proteínas. A expressão de muitas HSPs é regulada pela
ligação de fatores de choque térmico (HSF, Heat Shock Factor), que reconhece uma
sequência de elementos no promotor do gene HSP, chamados de elementos de
choque térmico (HSE, Heat Shock Element) (MAGER e KRUIJFF, 1995). Quando o
HSF une-se ao HSE facilita a transcrição dos genes associados com a resposta.
Esta transcrição está modulada pela fosforilação do HSF, que ao se autofosforilar
une-se ao HSE (BARRAGÁN-VELOZ, 2007).
As HSPs são capazes de mediar a recuperação celular e proteger contra uma
injúria potencialmente letal, e as células respondem a este estresse através da
resposta ao choque térmico (MEYER e SILVA, 1999). A resposta do choque térmico
pode ser vista como um mecanismo homeostático geral que protege as células dos
efeitos deletérios do estresse ambiental (FOLGUEIRA e REQUENA, 2007). Assim,
as funções das chaperonas podem ser vistas como um mecanismo universal que
possibilita que o estado de crescimento celular interior seja compatível com a vida
(ELLIS, 2000).
30
1.4 A CHAPERONINA HSP10
As chaperoninas têm como função dar assistência no processo de
enovelamento de novas traduções ou novas translocações de polipetídeos (XU,
HORWICH e SIGLER, 1997). O termo chaperonina foi sugerido para descrever uma
família de chaperonas moleculares de sequência relacionada encontrada em
cloroplastos e eubactérias como a Escherichia coli (ELLIS e HARTL, 1996). Por isso,
a chaperonina HSP10 é também denominada GroES em E. coli e Cpn10 em
cloroplastos (FERNANDES et al., 2005). Podendo ser considerada uma
cochaperonina por trabalhar em conjunto com a chaperonina HSP60, nomeada
GroEL em E. coli e Cpn60 nos clorosplastos (LLORCA, CARRASCOSA e
VALPUESTA, 2001). Por exemplo, na E. coli, o complexo GroEL/GroES é capaz de
facilitar o enovelamento de 2 a 7% das novas proteínas sintetizadas (ELLIS e
HARTL, 1996).
A proteína HSP10 consiste de um único anel com sete subunidades idênticas
de aproximadamente 10kDa (VOET e VOET, 1995) distribuídas simetricamente ao
redor do eixo central. A HSP10 é vista como uma cúpula que se encaixa no topo de
cada extremidade do cilindro da HSP60 (KARP, 2005), e coordena a atividade de
ATPase da subunidade de HSP60 permitindo a liberação do polipeptídeo ligado de
uma maneira produtiva para o enovelamento (GRAY e FERSHT, 1991).
A cristalografia por raios X tem sido utilizada para determinar a estrutura
tridimensional do complexo formado pelas proteínas HSP60 e HSP10 e as sete
ligações de ATP que participam deste processo (Figura 5) (XU, HORWICH e
SIGLER, 1997).
31
Figura 5: A estrutura por raio X do complexo da chaperonina HSP60-HSP10-(ADP)
7
na E. coli. Dois
anéis de sete subunidades de HSP60 empilham-se para formar um cilindro aberto, coberto
em uma das extremidades por um anel de sete subunidades de HSP10. (a) Uma
representação de preenchimento espacial do complexo visto por baixo de seu eixo de
rotação. O anel HSP10 está representado em dourado; seu anel adjacente HSP60, em
verde; e o anel HSP60 adjunto, em vermelho. (b) Como em a, mas perpendicularmente em
relação ao eixo. Observe as diferentes conformações dos dois anéis HSP60. (c) O
esqueleto C
α
do complexo visto perpendicularmente em relação ao eixo seccionado no
plano do eixo. Os ADPs, ligados na porção inferior de cada subunidade do anel superior de
HSP60, estão mostrados no modelo de preenchimento espacial. Observe a grande
cavidade formada pela cobertura de HSP10 e o anel superior de HSP60 em que um
polipeptídeo pode dobrar-se isoladamente.
Fonte: XU, HORWICH e SIGLER, 1997.
A HSP60 possui regiões hidrofóbicas que se ligam a grupos de proteínas que
se encontram em seu estado não nativo (VOET e VOET, 1995). A proteína não
nativa é capturada por estes contatos hidrofóbicos com as subunidades da
chaperonina e, uma vez no interior da cavidade, estas interagem e o enovelamento
é iniciado (RAMOS, MATIAS e MARQUES, 2008). A mudança conformacional
promovida pela ligação da HSP10 faz com que todos os resíduos hidrofóbicos e
carregados que se expõem na superfície interna da cavidade desapareçam e dêem
lugar aos resíduos hidrofílicos (LLORCA, CARRASCOSA e VALPUESTA, 2001).
Como resultado dessa mudança, o polipeptídeo não nativo que tinha sido ligado à
parede através de interações hidrofóbicas é deslocado para o espaço no interior da
câmara. Uma vez livre, ele pode se dobrar em um ambiente protegido. Após cerca
de 15 segundos, a cúpula de HSP10 dissocia-se do anel de HSP60, e o polipeptídeo
é ejetado da câmara e pode religar-se a mesma ou a outra HSP60, e o processo é
32
repetido (KARP, 2005). A Figura 6 também demonstra o funcionamento do complexo
GroEL-GroES na E. coli.
Figura 6: Desenho esquemático demonstrando a reação do ciclo da chaperonina GroEL e GroES no
enovelamento de proteínas da E. coli: (1) GroEL no complexo assimétrico com um anel
heptamérico de GroES e 14 ADPs (um para cada subunidade de GroEL) ligando-se a um
polipeptídeo desenovelado em sua cavidade central no processo que libera todos os 14
ADPs e liga GroES. (2) GroEL liga 14 ATPs, por meio da interação enfraquecida entre
GroEL e o polipeptídeo desenovelado e causa uma religação de GroES à face oposta de
GroEL. (3) Todos os 14 ATPs são simultaneamente hidrolizadas, através da liberação da
ligação do polipeptídeo com GroEL. Isso permite ao polipeptídeo, provavelmente em seu
estado globular fundido, se enovelar em um microambiente protegido, longe do contato de
outros polipeptídeos parcialmente enovelados que poderiam acabar se agregando. (4) Se o
polipeptídeo foi dobrado na sua conformação nativa, ele é liberado da GroEL. (5) Se,
entretanto, o polipeptídeo não conseguiu atingir completamente seu dobramento nativo,
permanece ligado à GroEL e é reintroduzido ao ciclo de reação a partir da etapa 2 (note
que, ao fazê-lo, o diagrama de GroEL vira em 180º). GroES se liga, mas não hidroliza ATP,
presumivelmente facilita a ligação dos ATPs a GroEL, coordena a hidrólise simultânea e
previne o escape de um polipeptídeo parcialmente enovelado da cavidade de GroEL.
Fonte: VOET e VOET, 1995
33
Como podemos observar as proteínas de choque térmico são componentes
essenciais no enovelamento de proteínas, além de possuir funções vitais na relação
parasito hospedeiro, assim como na patogenia e virulência. Inúmeras pesquisas já
foram realizadas em patógenos humanos. Entretando, em se tratando de
enfermidades animais, os estudos são escassos. Como o T. evansi é responsável
por causar grandes perdas econômicas na pecuária mundial, uma moléstia de difícil
diagnóstico e que não possui tratamento efetivo, este trabalho tem o intuito de
estudar o gene HSP10, para que com sua amplificação, seja possível futuramente
observar sua expressão nos tripanosomatídeos. Pois, observando sua expressão
nos tripanosomatídeos será possível inibir a expressão do gene HSP10 utilizando o
RNA interferente (RNAi) na fase de tradução ou dificultando a transcrição do gene,
permitindo futuramente a geração de medicamento mais efetivos no tratamento da
tripanosomíase e também na criação de vacinas que possibilitando a erradicação
desta doença.
34
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Verificar se o gene da chaperonina HSP10 está presente no T. evansi.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Infectar ratos Wistar com T. evansi para a obtenção dos parasitos.
Purificar dos parasitos para realização da extração de DNA e RNA.
Amplificar do gene da chaperonina HSP10 do T. evansi utilizando amostras
de DNA e cDNA.
Clonar do gene em vetores.
Sequenciar os insertos selecionados.
Analisar a sequência do gene HSP10 do T. evansi através de bioinformática.
Comparar a sequência obtida com as já descritas na literatura.
35
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 O T. evansi
Cepas de T. evansi foram gentilmente cedidas pela Dra. Silvia Gonzalez
Monteiro da Universidade Federal de Santa Maria. Os parasitos estão conservados
em nitrogênio líquido no Laboratório de Hemoparasitas e Vetores do Centro de
Ciências Agroveterinárias da Universidade do Estado de Santa Catarina.
3.1.1 Infecção experimental para obtenção dos parasitos
Fêmeas de ratos (Rattus norvegicus) Wistar de dois meses de idade foram
infectadas com T. evansi criopreservado ou obtidos de outros animais previamente
infectados. A injeção dos parasitas foi realizada por via intraperitoneal. A parasitemia
foi analisada diariamente através de esfregaço do sangue retirado da cauda do
animal. O esfregaço foi corado com corante panótico e as lâminas analisadas ao
microscópio óptico, para contagem dos parasitos.
3.1.2 Purificação da forma tripomastigota de T. evansi
O sangue foi colhido foi misturado com igual quantidade de Percoll a 4ºC
tamponado com HEPES, pH 7,4%, contendo 8,5% de sacarose e 2,5% de D-glicose
(GRAB e BWAYO, 1982). A mistura foi centrifugada a 17.500g por 2 minutos a 4°C.
Os parasitos foram recuperados das camadas superior e mediana do gradiente de
Percoll , sendo então ressuspendidos em PBS contendo 1% de D-glicose. Após
três lavagens com o mesmo tampão, os parasitos foram ressuspendidos em 2ml de
PBS-Glicose. Os parasitos parcialmente purificados foram cromatografados em
coluna de DEAE-Celulose equilibrada com PBS-Glicose. As frações eluidas da
coluna foram analisadas ao microscópio e aquelas que apresentaram os parasitos
foram reunidas e centrifugadas. A recuperação dos tripanossomas foi quantificada
em câmara de Neubauer.
36
3.2 EXTRAÇÃO DE DNA
Para a extração do DNA genômico, os parasitos foram ressuspendidos em
tampão de lise (10mM Tris pH 7,4, 10mM NaCl, 25mM EDTA, 1% SDS),
100µg/ml de Proteinase K e incubados a 42ºC por 12 horas. Após este período
foram realizadas três lavagens com fenol, fenol-clorofórmio (1:1) e clorofórmio
respectivamente, centrifugando-se a 14.000g por 10 minutos e retirando-se o
sobrenadante. O DNA foi precipitado com isopropanol e, logo após, lavado com
etanol 70%. O álcool foi evaporado em estufa a 37ºC por 15 minutos e o DNA
resultante foi eluído em 50µl de água Milli-Q livre de RNAse.
37
3.3 EXTRAÇÃO DE RNA
Para a extração do RNA total, os parasitos foram homogeneizados
vigorosamente em 1ml do reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad) e nele mantidos
por 5 minutos. Em seguida, foi adicionado 200µl de clorofórmio 98%, sendo as
amostras agitadas por 15 segundos e centrifugadas a 12.000g por 15 minutos. A
fase aquosa resultante foi transferida para um novo tubo onde foi adicionado 500µl
de isopropanol 98% (Merck), sendo a fase orgânica desprezada. Após 10 minutos as
amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 12.000g, sendo então o
sobrenadante descartado e o sedimento lavado com 1ml de etanol 75% a partir de
centrifugação a 7.500g por 5 minutos. O sobrenadante foi novamente descartado e o
precipitado contendo o RNA total seco, invertendo-se os tubos sobre papel
absorvente por aproximadamente 10 minutos. O RNA foi então eluído em 200µl de
água ultrapura livre de RNAse. Todas as incubações foram realizadas em gelo para
evitar a degradação do RNA.
A dosagem das amostras, bem como a verificação da qualidade das mesmas,
foram realizadas no espectrofotômetro realizando-se a leitura em 260nm.
Para a obtenção de materiais e soluções livres de RNAse, os mesmos foram
tratados com água contendo 0,1% de Dietilpirocarbonato (DEPC) por 30 minutos,
sendo posteriormente autoclavados para esterilização e inativação do DEPC.
38
3.4 DOSAGEM DO DNA E RNA
As amostras de DNA e RNA obtidas foram quantificadas e avaliadas quanto a
sua pureza em um espectrofotômetro (BioPhotometer - Eppendorf, Germany),
observando-se a absorbância a 260 e 280nm, além das relações 260/280nm e
260/230nm.
39
3.5 REAÇÃO DA TRANSCRIPTASE REVERSA
Aproximadamente 1mg de RNA total do T. evansi foi utilizado para a reação
de transcrição reversa com a PowerScript Reverse Transcriptase (Clontech) a 42ºC
com oligo(dT) primers.
Foram adicionados em um tubo de microcentrífuga estéril: 5µl de RNA total,
2µl de Primer dT
23
VN, 4µl de dNTP Mix e 5µl de água livre de nuclease, obtendo um
volume final de 16µl. O conteúdo do tubo foi aquecido por 5 minutos a 70ºC. Este foi
mexido brevemente e colocado imediatamente no gelo. A etapa seguinte consistiu
no acréscimo de 2µl de tampão RT 10x, 1µl de inibidor de RNase e 1µl de M-MuLV
Transcriptase Reversa ao tubo de microcentrífuga contendo RNA, primer, dNTP,
gerando um volume final de 20µl.
Este material foi incubado a 42ºC durante uma hora, e em seguida, a enzima
foi inativada a 95ºC por 5 minutos. Finalmente a reação foi diluída em 50µl com
água, sendo utilizados 2µl para cada reação da PCR.
Alíquotas (8µl) foram separadas por eletroforese em gel de agarose 1%
contendo brometo de etídeo.
40
3.6 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR) E LIGAÇÃO AO VETOR
Para a realização da técnica de PCR foram utilizadas amostras de DNA e
cDNA seguindo as recomendações de Fernandes et al. (2005), onde primers
específicos, obtidos do alinhamento das sequências gênicas de organismos
correlatos. As sequências de HSP10 utilizadas foram as seguintes: T. cruzi (acesso
GenBank nº. AI077262); T. brucei (acesso GenBank nº. AQ944564); L. donovani
(acesso GenBank nº. AF394959) e L. major (acesso GenBank nº. AQ847907).
Os primers possuiam a sequência de início UTR 5‟ (5‟-
GATTACAAAGCTTGACGGTGGTGCGAACAT-3‟) e de fim UTR 3‟ (5‟-
GTTTAGGGTACCGGCGTGCTGCAAGGCTGA-3‟) da região do gene de codificação
da HSP10.
As condições para os ciclos de amplificação de UTR 5‟ e UTR 3‟ seguiram de
uma desnaturação inicial de 5 minutos a 95ºC, 30 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1
minuto a 55ºC, 2 minutos a 72ºC e uma extensão final de 10 minutos a 72ºC.
As bandas que tiveram o tamanho esperado foram purificadas do gel de
agarose utilizando o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) de acordo com as
instruções do fabricante. O material genético purificado foi ligado ao plasmídeo
pGEM-T Easy (Promega) utilizando-se o seguinte protocolo:
5µl de 2x Rapid Ligation Buffer
1µl do vetor pGEM-T Easy (50ng)
3µl do inserto (produto de PCR purificado)
1µl da enzima T4 DNA ligase (1U)
A reação ocorreu a 4ºC por 12 horas.
41
3.7 TRANSFORMAÇÃO DOS PLASMÍDEOS RECOMBINANTES EM E. coli DH5α
Para a realização da transformação, 3µl do produto de ligação foram
adicionados a 50µl de células competentes E. coli DH5α previamente descongeladas
do nitrogênio líquido. As células foram deixadas por 30 minutos no gelo e o choque
térmico foi realizado a 42ºC por 1,5 minutos. Logo após, as células foram colocadas
por mais 2 minutos no gelo e foram adicionados 200µl de meio SOC (composto de:
bacto-triptona 2%, bacto-extrato de levedura 0,5%, NaCl 10mM, KCl 2,5mM, MgCl
2
10mM, glicose 20mM e água). As células cresceram por 1 hora a 37ºC em agitação
e, em seguida, 50µl foram plaqueadas em meio Ágar LB sólido com ampicilina, X-gal
e IPTG para a formação de colônias azuis/brancas.
A comprovação da presença dos insertos e o tamanho dos mesmos foi
realizada através da amplificação do inserto por PCR diretamente da colônia de
bactérias, utilizando-se iniciadores específicos para o vetor pGEM-T Easy, (5´-
ACGCCAAGCTATTTAGGTGACACTATA-3´) (10pmol/reação de cada iniciador), os
quais possuem seus sítios de ligação nas extremidades do sítio de clonagem que
contém o inserto. Assim, as colônias que se apresentaram positivas para a presença
de inserto através de PCR foram selecionadas para seqüenciamento.
42
3.8 SEQÜENCIAMENTO DOS CLONES
O seqüenciamento dos clones selecionados foi realizado em um equipamento
MegaBace 1000
®
DNA
Analysis System (GE/Amersham Biosciences,
Buckinghamshire). A reação de seqüenciamento foi preparada a partir do DNA
plasmidial e o Kit DYEnamic
®
ET Dye Terminator (GE/Amersham Biosciences,
Buckinghamshire). A reação foi realizada na presença de 5pmol dos iniciadores e
aproximadamente 800ng do DNA plasmidial, nas seguintes condições térmicas:
95°C por 25 segundos, seguidos de 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 15
segundos, ligação dos iniciadores a 55°C por 30 segundos e extensão a 60°C por 80
segundos. Posteriormente, os produtos marcados foram precipitados, utilizando-se
isopropanol 70% e etanol absoluto, para retirada dos nucleotídeos e iniciadores não
incorporados. Os produtos purificados foram eletroinjetados a 2kV por 100 segundos
e eletroeluídos por 150 minutos a 7kV. As seqüências geradas foram analisadas
quanto a sua qualidade utilizando-se o pacote Phred/Phrap/Consed (www.phrap.org)
sendo consideradas somente as seqüências com qualidade Phred>20. A
confirmação da identidade dos fragmentos foi realizada utilizando o programa
BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Todas as etapas de sequenciamento e
análise das seqüências obtidas foram realizadas no Laboratório de Bioinformática da
Universidade Federal de Santa Catarina (www.bioinformatica.ufsc.br).
43
4 RESULTADOS
4.1 PURIFICAÇÃO DA FORMA TRIPOMASTIGOTA DE T. evansi
Nos animais infectados que apresentaram pico de parasitemia (cerca de 100
parasitos por campo) realizou-se uma punção intracardíaca para a retirada do
sangue contaminado, e assim, efetuar a purificação dos parasitos (cerca de 8,5x10
7
parasitos) (Figura 7) e a extração do DNA genômico e RNA dos tripanossomas.
Figura 7: Desenho esquemático da purificação das formas tripomastigotas de T. evansi através da
cromatografia de troca iônica pela coluna de DEAE-Celulose. A cromatografia de troca
iônica depende da ligação iônica de proteínas a um material de matriz inerte, tal como a
celulose, contendo grupos carregados ligados covalentemente. A dietilaminoetil (DEAE) é
positivamente carregada e, portanto, se liga a moléculas carregadas negativamente
(hemácias). A resina é empacotada dentro de uma coluna, e a amostra de sangue com os
parasitos é adicionada. À medida que a coluna é lavada com a solução tampão, os
parasitos (que possuem menos afinidade pelo trocador de íons, pois tem carga positiva)
passam mais rapidamente do que as hemácias que possuem uma afinidade mais elevada.
O fluxo da coluna é coletado em uma série de frações.
A purificação de parasitos através da coluna de DEAE-Celulose é um método
bastante eficaz por permitir que os patógenos apresentem morfologia e motilidade
normais, mantendo-se infectantes para insetos e ratos (SOUSA, 1983), não
danificando, assim, seu DNA e possibilitando uma extração perfeita.
44
4.2 ANÁLISE DO HSP10 AMPLIFICADO PELA PCR
Foram testados 8µl de cada reação de PCR HSP10 de 20µl por eletroforese
em gel de agarose 1%, seguindo-se as recomendações de Fernandes et al. (2005),
que caracterizou o gene e previu a estrutura da proteína da chaperonina
mitocondrial HSP10 do T. cruzi. Inicialmente, amostras de DNA e cDNA de T. evansi
foram empregadas, testando-se diversas concentrações de cloreto de magnésio
50mM (que variaram de 1,5 a 4), com o intuito de verificar a melhor reação, porém
todos os produtos foram negativos.
Houve grande dificuldade na realização da amplificação do gene HSP10 em
virtude do desconhecimento da sequência real em T. evansi, pois os primers foram
desenhados a partir de organismos correlatos, como demonstrado na seção 3.6 do
Material e Métodos. Após os resultados iniciais serem negativos, decidiu-se
aumentar as concentrações dos primers. Com isto, foram obtidos perfis distintos,
com produtos de amplificação que corresponderam ao tamanho da HSP10 conforme
demonstrado na Figura 8.
Figura 8: Gel de agarose 1% corado pelo brometo de etídeo revelando os perfis de HSP10 obtidos a
partir de formas tripomastigotos de T. evansi, onde, M: Marcador 100 pb Ladder (Ludwig
Biotec); 1: DNA; 2: cDNA (ambos com aumento dos primers); 3: cDNA utilizando as
concentrações de Fernandes et al. (2005) e CA: Água usada como controle.
45
Com a presença da banda correspondente ao gene da proteína HSP10, os
ensaios seguintes foram dedicados para verificação da melhor concentração de
cloreto de magnésio a ser aplicada nas amostras de DNA, pois conforme visto na
figura anterior todas as amostras no qual o cDNA foi utilizado temos um “arrasto”.
A Figura 9 demonstra as diferentes concentrações de cloreto de magnésio
empregadas em amostras de DNA. O produto amplificado possui 445 pares de
bases.
Figura 9: Gel de agarose 1% corado pelo brometo de etídeo, testando diferentes concentrações de
Cloreto de Magnésio. Sendo, 1: MgCl
2
1,5mM; 2: MgCl
2
2,5mM e 3: MgCl
2
3,5mM. M:
Marcador 100 pb Ladder (Ludwig Biotec) e CA: Água usada como controle.
46
4.3 TRANSFORMAÇÃO DOS PLASMÍDEOS RECOMBINANTES EM E. coli DH5α
As bandas que corresponderam ao tamanho da HSP10 foram selecionadas
para clonagem. Para a transformação bacteriana foi utilizada uma linhagem
competente de E. coli, DH5α. Após a inserção do plasmídeo, que contém o gene
codificante da HSP10 do T. evansi, foi possível o cultivo das células. Assim que uma
população bacteriana apropriada foi alcançada, a presença do gene foi analisada em
gel de agarose 1%. A figura 10 mostra um PCR de colônia de clones representativos
de uma das bibliotecas geradas.
Figura 10: Gel de agarose 1% corado pelo brometo de etídeo revelando o PCR de colônia. No qual,
M: Marcador 100 pb Ladder (Ludwig Biotec) e CA: Água usada como controle. As canaletas
1 a 7 referem-se a amplificação dos insertos diretamente da colônia de bactérias utilizando
os iniciadores específicos para o vetor pGEM-T Easy.
47
4.4 SEQUENCIAMENTO DOS CLONES
As construções dos insertos selecionados, foram submetidos ao
sequenciamento a fim de verificar a natureza da sequência do gene isolado.
Os resultados da sequência utilizando o BLASTN obteve uma homologia de
89% com três proteínas hipotéticas, sendo uma do T. brucei gambiense e as outras
duas do T. brucei.
A partir do alinhamento das sequências dos genes HSP10 do T. evansi e o T.
brucei realizado pelo programa ALIGN, verificou-se uma homologia de 40% entre as
sequências (Figura 11).
48
Figura 11: Alinhamento entre a sequência hipotética de HSP10 de T. brucei com a sequência
hipotética de HSP10 de T. evansi obtida após a clonagem em E. coli seqüenciados.
49
5 DISCUSSÃO
As técnicas hoje utilizadas na genética molecular têm sido desenvolvidas a
partir da pesquisa acadêmica básica, em diferentes campos da atividade científica,
utilizando uma grande variedade de técnicas para analisar ácidos nucléicos (DNA e
RNA). Os resultados destes ensaios podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico,
determinação da terapia a ser utilizada e até mesmo na avaliação da suscetibilidade
da doença (MOLINA e TOBO, 2004).
O presente trabalho teve como objetivo verificar a presença do gene da
chaperonina HSP10 no T. evansi. Nos últimos anos, devido à importância clínica e
biológica dos homólogos de HSP10, os genes desta proteína têm sido sequenciados
de um grande número de organismos procariotos e eucariotos (GUPTA, 1995).
As pesquisas sobre o parasito e os mecanismos envolvidos na interação
entre o patógeno e o hospedeiro têm despertado bastante interesse entre os
pesquisadores, uma vez que podem oferecer resultados interessantes para a melhor
compreensão da infecção e para a busca de alternativas terapêuticas (YAZDANI et
al., 2006).
Os tripanosomas, T. evansi e T. vivax, constituem um potencial risco para
mais de 500 milhões de bovinos, 100 milhões de búfalos e 12 milhões de camelos,
na América do Sul, África e Ásia (incluindo a China) (SILVA et al., 2004) e, embora
hajam vários trabalhos que descrevam a tripanosomíase no Brasil, inclusive com a
reprodução experimental da doença (RODRIGUES et al., 2005), pouco se sabe
sobre sua biologia e metabolismo. Este é o primeiro trabalho sobre a amplificação do
gene HSP10, nesta espécie.
As análises dos produtos de DNA amplificados de HSP10 de outras espécies
apresentaram perfis distintos. Em organismos da família Trypanosomatidae, o
inserto de cDNA do T. cruzi apresentou 538 pares de bases (FERNANDES et al.,
2005), enquanto o fragmento de DNA amplificado da Leishmania donovani contém
303 pares de bases (ZAMORA-VEYL et al., 2005). Ensaios desta proteína também
foram realizados com o nematódeo Strongyloides ratti, no qual o isolado completo
do cDNA da HSP10 compreende uma sequência de 507 pares de bases (TAZIR et
al., 2009). O gene HSP10 do T. evansi apresentou 445 pares de bases.
50
A análise do seqüenciamento utilizando o BLASTN demonstrou que a
sequência obtida pelos clones em E. coli possuem uma identidade de 40%
correspondente a HSP10 hipotética de T. brucei (conforme indicado na Figura 11).
Visto que o T. evansi não possui cinetoplasto, poder-se-ia especular que a proteína
HSP10 hipotética possa ser citossólica o que explicaria a baixa homologia
encontrada.
Quando Fernandes et al. (2005) caracterizaram o gene da HSP10 do T. cruzi,
agente causador da doença de Chagas, após a análise da sequência dos clones
obtidos a partir do genoma do T. cruzi, mostraram que a região de codificação da
HSP10 do T. cruzi possui 300 pares de bases de comprimento, codificando um
polipeptídeo de 100 aminoácidos com a maior sequência de identidade (83%) para a
HSP10 do T. brucei e a menor (28%) para a HSP10 da E. coli.
Zamora-Veyl et al. (2005) expressaram um estágio específico da
cochaperonina mitocondrial CPN10 da L. donovani. A comparação da sequência
pelo BLAST confirmou que este polipeptídeo putativo está relacionado à
chaperoninas eucarióticas e procarióticas.
O mesmo ocorreu com Tazir et al. (2009), que realizaram a caracterização
molecular e funcional da proteína de choque térmico 10 do S. ratti, onde o
alinhamento dos aminoácidos revelaram uma homologia muito elevada (93%) entre
a HSP10 do S. ratti e a HSP10 do patógeno humano S. stercoralis. A HSP10 do S.
ratti também demonstrou semelhanças à HSP10 de outros nematódeos incluindo,
Caenorhabditis elegans (63%) e Brugia malayi (57%), além de apresentar homologia
com a HSP10 de vertebrados (Homo sapiens, 52%).
O presente trabalho sugere que o T. evansi possui o gene HSP10, sendo o
produto do gene uma proteína muito pequena e com grande importância na proteção
contra o estresse (ZAMORA-VEYL et al., 2005). Enquanto outros tripanosomatídeos
têm sido estudados com intuito de fornecerem informações sobre as implicações das
HSPs nas distintas mudanças desenvolvidas na diferenciação destes parasitos
(FOLQUEIRA e REQUENA, 2007), o T. evansi possui apenas a forma
tripomastigota, e por isso, especula-se que a função da HSP10 deva estar
relacionada aos mecanismos de defesa do parasito.
51
Este trabalho é mais uma contribuição para o conhecimento do metabolismo
do T. evansi, sendo necessário realizar mais estudos para que no futuro possam ser
criados fármacos eficazes para o tratamento desta doença. Pois realizando a
caracterização molecular e funcional dos fatores de virulência do T. evansi poderão
ser desenvolvidas drogas que inibam a expressão de determinados genes do
parasito dificultando a transcrição de genes específicos.
52
CONCLUSÃO
As proteínas de choque térmico estão muito bem conservadas em sua linha
evolucionária, podendo ser encontradas nas mais diversas espécies de organismos.
Essas podem ser expressas tanto em condições fisiológicas como de estresse. No
T. evansi, sugere-se que estas proteínas estejam relacionadas à proteção contra os
mecanismos de defesa do hospedeiro e na virulência. Os resultados obtidos nos
experimentos demonstraram a presença de uma sequência putativa para o gene da
HSP10 do T. evansi, havendo necessidade de mais pesquisas para mostrar o papel
desta proteína em um dos parasitos responsáveis pelas perdas econômicas no
Brasil e em muitos países na América do Sul, África e Ásia.
Perspectivas para o trabalho:
Cabe tentar isolar esta proteína para que seja possível futuramente analisar
bioquímica e estruturalmente, a fim de compará-la com de outras espécies de
tripanosomatídeos.
Verificar a ação destas proteínas em situações nas quais os parasitos se
encontram em condições normais e de estresse.
Caracterizar outras proteínas de choque térmico no T. evansi.
53
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