( PDF ) A influência dos polimorfismos do gene MDR1 na resposta virológica e imunológica no tratamento com Efavirenz durante os seis primeiros meses em pacientes HIV positivos Porto Alegre

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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

Jane Dagmar Pollo Renner

A influência dos polimorfismos do gene MDR1 na resposta virológica e

imunológica no tratamento com Efavirenz durante os seis primeiros meses em

pacientes HIV positivos

Porto Alegre

Outubro, 2010

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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

A influência dos polimorfismos do gene MDR1 na resposta virológica e

imunológica no tratamento com Efavirenz durante os seis primeiros meses em

pacientes HIV positivos

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia Celular e

Molecular como requisito para a obtenção

do grau de Doutor.

Autora

Jane Dagmar Pollo Renner

Orientadora

Profª Drª Virgínia Minghelli Schmitt

Porto Alegre

Outubro, 2010

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iii

AGRADECIMENTOS

Eu quero agradecer a Deus por ter me dado mais uma chance de viver.

Quero agradecer ao meu filho Henrique e a meu marido Daniel por ter acreditado em

mim nesta longa jornada.

Quero agradecer à minha família por nunca me deixar desistir.

Quero agradecer à minha orientadora Virgínia por ser uma excelente orientadora e

acima de tudo uma amiga de verdade.

Quero agradecer a Professora Dra. Clarice Alho que me ajudou e acreditou no nosso

trabalho.

Quero agradecer à minha grande amiga Andréia Rosane de Moura Valim que

acreditou em mim quando eu nem sabia que eu seria Professora.

Quero agradecer a Lia Gonçalves Possuelo por sua amizade e por tudo que eu

aprendi ao seu lado.

Quero agradecer à UNISC, ao Reitor, ao Setor de Recursos Humanos, às

Faculdades de Farmácia e Medicina por acreditarem na minha recuperação.

Quero agradecer o Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular da

Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS) por ter me dado

essa oportunidade.

Quero agradecer aos meus alunos queridos que me apoiaram e me deram muita

força para eu recuperar a minha voz.

RESUMO

Os transportadores de drogas são cada vez mais reconhecidos como importantes na

disposição das drogas e na resposta terapêutica. A P-glicoproteína é um

transportador, codificado pelo gene humano MDR1 (ABCB1), de grande relevância

clínica, pois apresenta ampla especificidade de substrato, incluindo uma variedade

de drogas com diferentes estruturas atualmente em uso clínico. Efavirenz é

substrato para a glicoproteína-P e é metabolizado pelo Citocromo P- 450 (CYP) 2B6.

No presente estudo, foi investigada, de forma prospectiva, a influência do genótipo

para os diferentes polimorfismos do MDR1 (1236C>T, 2677G>T, 3435C>T) sobre a

resposta imunológica e virológica ao tratamento de pacientes infectados pelo HIV,

sem tratamento prévio. O genótipo MDR1 foi analisado em 81 pacientes do Centro

Municipal de Atendimento à Sorologia (CEMAS), em Santa Cruz do Sul (RS, Brasil),

que iniciaram terapia antiretroviral entre 2009 e 2010. Os dados foram obtidos ao

início do tratamento e nas semanas 12 e 24 após o início da terapia. Os genótipos

MDR1 de cada indivíduo foram determinados com a utilização de reação em cadeia

da polimerase, seguida de análise dos fragmentos de restrição (PCR-RFLP).

Durante as primeiras semanas de terapia antiretroviral, o padrão de diminuição da

carga viral foi similar para todos os pacientes após 12 e 24 semanas de tratamento

com Efavirenz. A redução da carga viral em 12 e 24 semanas não se mostrou

associada aos genótipos dos polimorfismos 1236C>T, 2677G>T e 3435C>T do gene

MDR1. O padrão do aumento das células T CD4+ foi similar para todos os pacientes

após 12 e 24 semanas de tratamento com Efavirenz. O aumento no número de

células T CD4+ foi significativamente associado à presença do alelo 3435T, sendo

mais elevado nos homozigotos 3435TT, intermediário em 3435CT e menos elevado

em 3435CC em contrapartida, não se mostrou associado aos genótipos dos

polimorfismos 1236C>T e 2677G>T do gene MDR1. A resposta individual ao

tratamento antiretroviral é um fenômeno complexo que é influenciado por um grande

número de variáveis biológicas. Novos estudos sobre o papel dos polimorfismos do

transportador MDR1 e enzimas envolvidas no metabolismo de drogas são

necessários para elucidar o papel dos efeitos farmacogenéticos na terapêutica para

o HIV.

Palavras chaves: MDR1, polimorfismos, tratamento antiretroviral

ABSTRACT

Drug transporters are increasingly recognized to be important on drug disposition and

therapeutic response. P-glycoprotein, encoded by the human MDR1 (ABCB1) gene,

is of particular clinical relevance in that this transporter has broad substrate

specificity, including a variety of structurally divergent drugs in clinical use today.

Efavirenz is a substrate for P-glycoprotein and is metabolized by cytochrome P-450

(CYP) 2B6. In this prospective study, we investigated the influence of the MDR1

genotype polymorphisms (1236C>T, 2677G>T, 3435C>T) in the virological and

immunological response to treatment of naïve HIV-infected patients. MDR1 genotype

was analyzed in 81 patients attending the Municipal Center for Serology Assistance

(CEMAS) in Santa Cruz do Sul, RS, Brazil) who started antiretroviral therapy

between 2009 and 2010. Data were obtained at baseline and week 12 and 24 post

therapy initiation. MDR1 genotypes were determined by means of polymerase chain

reaction followed by analysis of restriction fragment length polymorphism (PCR-

RFLP). During the first weeks of antiretroviral therapy, the pattern of decrease in viral

load was similar for all patients after 12 and 24 weeks of treatment with efavirenz.

The reduction in viral load at 12 and 24 weeks was not associated with the

genotypes of the polymorphisms 1236C> T, 2677G> T and 3435C> T MDR1 gene.

The pattern of increased CD4 + T cells was similar for all patients after 12 and 24

weeks of treatment with efavirenz. The increase in the number of CD4 + T cells was

significantly associated with allele 3435T, and are higher in homozygous 3435TT,

intermediate in 3435CT and lower in 3435CC however, was not associated with the

genotypes of the polymorphisms 1236C> T and 2677G> T MDR1 gene. Individual

response to antiretroviral treatment is a complex phenomenon that is influenced by a

large number of biological variables. Further studies on the role of polymorphisms of

MDR1 transporter and enzymes involved in drug metabolism are needed to elucidate

the role of pharmacogenetic effects in HIV therapy.

Keywords: MRD1, Polymorphism, antiretroviral therapy

LISTA DE ABREVIATURAS

3TC: Lamivudina

ABC: Abacavir

AIDS: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

APV: Amprenavir

ARV: Antiretroviral

ATV: Atazanavir

AZT: Zidovudina

CCR5: Receptor de quimiocina

CYP (Cytochrome P450 enzymes) Citocromo P450

d4T: Estavudina

DdC: Zalcitabina

DdI: Didanosina

DLV: Delavirdina

DNA: Ácido desoxirribonucleico

EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético

EFV: Efavirenz

HAART: Terapia Antiretroviral Potente

HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana

IDV: Indinavir

ITRN: Inibidor da Transcriptase reversa análogos de nucleosídeos

ITRNN: Inibidor da Transcriptase reversa não análoga de nucleosídeos

IP: Inibidor de protease

LD (Linkage Disequilibrium): desequilíbrio de ligação

LPV/r: Lopinavir/r

µL: microlitro

vii

mL: mililitro

MS: Ministério da Saúde

MTD: Monitorização terapêutica de fármacos

NFV: Nelfinavir

NVP: Nevirapina

OMS: Organização Mundial da Saúde

PCR: Reação da polimerase e cadeia

P-gp: Glicoproteína-P

Primer: Iniciadores

RAM: reações adversas aos medicamentos

RFLP: Análise de restrição de fragmentos polimórficos

RTV: Ritonavir

SNPs (Single-Nucleotide Polymorphisms): polimorfismos de um único nucleotídeo

SQV: Saquinavir

SVS: Secretaria de vigilância sanitária

T CD4: Células T CD4

TDF: Tenofovir

UNAIDS: Programa das Nações Unidas da AIDS/HIV

viii

LISTA DE TABELAS E FIGURAS

Tabela 1: Variantes farmacogenéticas associadas com resposta terapêutica a

Efavirenz em pacientes HIV positivos ...................................................................

Tabela 2: Principais fármacos licenciados em cada classe de antiretrovirais...

Tabela 3:

Efeito do polimorfismo do gene MDR-1 sobre a evolução da infecção

pelo HIV. Estudos em pacientes...........................................................................

Figura 1. Arranjo de proteínas transmembrana de efluxo ABC...........................

Figura 2. Função da P-glicoproteína (P-gp). Este modelo mostra que o

transporte de efluxo P-gp-mediada por substratos de drogas pode ocorrer ao

nível da membrana do plasma ou do compartimento intracelular. ATP,

adenosina trifosfato; ADP, adenosina difosfato; Pi, fosfato inorgânico...............

Figura 3: Esquema da proteína codificada pelo gene mostrando a localização

dos SNPs...............................................................................................................

SUMÁRIO

CAPÍTULO 1- INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ............................................ 10

1.1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 11

1.1.1 Epidemiologia de HIV ......................................................................... 17

1.1.2 Tratamento antiretroviral .................................................................... 20

1.1.3 Avaliação da resposta terapêutica ..................................................... 26

1.1. 4 Efavirenz ............................................................................................ 27

1.4.1 Monitorização terapêutica de efavirenz .............................................. 28

1.5 Efavirenz e Farmacogenética ................................................................ 29

1.2 OBJETIVOS............................................................................................ 44

1.2.1 Objetivo Geral .....................................................................................

1.2.2 Objetivos Específicos ..........................................................................

1.3 HIPÓTESE ............................................................................................. 45

CAPÍTULO 2 - ARTIGO ............................................................................... 46

CAPÍTULO 3 - CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO ......................

3.1 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................... 62

3.2 CONCLUSÕES ...................................................................................... 67

REFERÊNCIAS ............................................................................................

APÊNDICES................................................................................................. 79

ANEXOS....................................................................................................... 85

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

1. INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, o conceito de que variações no genoma humano são

determinantes importantes que influenciam na susceptibilidade a doenças

infecciosas vem se consolidando, sendo responsáveis pela grande variação

interindividual na resposta imune do hospedeiro após infecções, bem como na

resposta terapêutica a diferentes fármacos (HASS, 2005). A existência de grandes

diferenças populacionais, bem como de pequenas variabilidades intrínsecas ao

paciente, é consistente com a possibilidade de a herança genética ser um

determinante na resposta aos fármacos. Estima-se que fatores genéticos sejam

responsáveis por 20 a 95% da variabilidade na biodisponibilidade e efeitos

terapêuticos dos fármacos (EVANS, 2003). Embora muitos fatores não genéticos

possam influenciar as reações adversas aos medicamentos (RAM), tais como idade,

etnia, capacidade funcional de órgãos (fígado e rins principalmente), terapia

concomitante, interações medicamentosas, e a natureza da doença. Existem agora

numerosos exemplos de casos nos quais diferenças individuais na resposta ao

fármaco (eficácia e toxicidade) ocorrem devido a polimorfismos de genes que

codificam enzimas responsáveis pela biotransformação do fármaco, transportadores,

e/ou polimorfismos nos próprios alvos do fármaco (receptores e enzimas) (EVANS,

1999; WILSON, 2001; EVANS, 2003). A identificação de genes que influenciam nas

variações interindividuais, na eficácia ou toxicidade de agentes terapêuticos, e a

aplicação desta informação na prática clínica tem sido o alvo de estudos de

farmacogenômica ou farmacogenética (EVANS, 2003).

Os genes são considerados funcionalmente “polimórficos” quando existem

variantes alélicas de forma estável na população, alterando a atividade da proteína

codificada em relação à seqüência do tipo-selvagem (GOLSTEIN et al., 2003).

Em alguns casos, o polimorfismo genético está associado à atividade

reduzida da proteína codificada, mas existem também estudos demonstrando que a

variante alélica codifica proteínas com atividade melhorada. Desde a clonagem e

caracterização de CYP2D6 (debrisoquina hidroxilase), outros genes humanos

envolvidos em alguns traços farmacogenéticos estão sendo isolados e seus

mecanismos moleculares elucidados, permitindo que a sua importância clínica seja

mais claramente definida (GOLSTEIN et al., 2003).

Diferentes capacidades de metabolização de fármacos são geralmente traços

monogênicos herdados e a influência na farmacocinética e na ação farmacológica

dos medicamentos está associada à velocidade de metabolização dos substratos.

Os efeitos observados podem ser de toxicidade, no caso de medicações que tenham

limitado índice terapêutico e são inativados por uma enzima polimórfica com menor

atividade, ou de reduzida eficácia no caso de medicamentos que requerem ativação

por uma enzima que apresente um polimorfismo genético que afete negativamente a

sua atividade (EVANS, 1999).

Em geral, dois tipos de alterações genéticas são descritas: polimorfismos e

mutações. Mutações são geralmente definidas como alterações no DNA (ácido

desoxirribonucléico) que estão associadas à dano celular, ocorrendo numa

freqüência baixa na população (geralmente menos de 1%). Polimorfismos, por outro

lado, são variantes genéticas mais frequentes, geralmente mais de 1% da população

estudada. A maioria dos polimorfismos ocorre em nucleotídeos individuais, sendo

chamados de polimorfismos de um único nucleotídeo (do inglês Single Nucleotide

Polymorphisms - SNPs). Outros polimorfismos ocorrem como repetições de

dinucleotídeos ou como grandes inserções ou deleções. Estes polimorfismos podem

ocorrer na região codificante dos genes, podendo ou não alterar o aminoácido

codificado, ou nas regiões não codificantes, podendo modular a expressão de genes

individuais (WEINSHILBOUM, 2003).

Mais de 1,4 milhão de SNPs foram identificados no seqüenciamento inicial do

genoma humano, dos quais aproximadamente 60.000 se localizam em regiões

codificantes. Muitos destes SNPs têm sido estudados visando à sua associação com

alterações no metabolismo, com resposta diferenciada a medicamentos, ou

utilizados como indicadores prognósticos da resposta clínica. Na Tabela 1, estão

apresentadas diferentes variantes genéticas que têm sido significativamente

associadas com respostas terapêuticas a Efavirenz em indivíduos HIV positivos.

Tabela 1: Variantes farmacogenéticas associadas com resposta terapêutica a Efavirenz em pacientes HIV positivos.

Referencias

CYP2B6 CYP2D6 CYP3A4 CYP3A5 MDR1 MDR1

516G>T 983C>T *3, *4, *6 *1B/(392ª>G) *1 / (6986ª>G) 3435C>T 2677G>T

Haas et al.

(2004)

TT: altas concentrações

plasmáticas, Toxicidade

do SNC em 1 semana

Não feito Não feito

GG: altas

concentrações

plasmáticas,

(Alguns sujeitos)

GG: altas

concentrações

plasmáticas,

(Alguns sujeitos)

Nenhuma associação

com níveis plasmáticos

Nenhuma

associação

com níveis

plasmáticos

Tsuchiya et

al. (2004)

TT: altas concentrações

plasmáticas

Não feito Não feito Não feito Não feito

Nenhuma associação

com níveis plasmáticos

Não feito

Rotger et al.

(2005a)

TT: altas concentrações

plasmáticas e

toxicidade

neuropsicológica

Não feito Não feito Não feito Não feito Não feito Não feito

Haas et al.

(2005)

TT: altas concentrações

plasmáticas. Nenhuma

influencia na contagem

de CD4 e na carga viral

Não feito

Nenhuma

associação com

níveis

plasmáticos

Nenhuma

associação com

níveis plasmáticos

Nenhuma

associação com

níveis plasmáticos

Nenhuma associação

com níveis

plasmáticos.

Resposta virologica

favorável

Nenhuma

associação

com níveis

plasmáticos

Saitoh et al.

(2006)

TT: altas concentrações

plasmáticas. Nenhuma

influencia na contagem

de CD4 e na carga viral

Não feito Não feito Não feito Não feito Não feito Não feito

Kwara et al.

(2008)

TT: altas concentrações

plasmáticas

CC: Nenhuma

associação com

níveis plasmáticos

Não feito Não feito Não feito Não feito Não feito

Wyen et al.

(2008)

TT: altas concentrações

plasmáticas

CC: altas

concentrações

plasmáticas

Não feito

Cabrera et al.

(2009)

TT: altas concentrações

plasmáticas

Não feito Não feito

Nenhuma

associação com

níveis plasmáticos

Não feito

Nenhuma associação

com níveis plasmáticos

Não feito

A partir do mapeamento genômico de SNPs, uma questão interessante para

estudos genéticos seria a possibilidade de utilizar o desequilíbrio de ligação (LD-

Linkage Disequilibrium

) para identificar genes que possam estar associados a

doenças. O LD descreve uma situação em que algumas combinações de alelos ou

marcadores genéticos ocorrem mais ou menos frequentemente numa população do

que seria esperado pela formação aleatória de haplótipos, com base na frequência

dos alelos. Associações não-aleatórias entre polimorfismos em loci diferentes são

medidos pelo grau de LD e podem refletir haplótipos descendentes de um único

cromossomo ancestral (REICH, 2001). Os haplótipos são combinações particulares

de alelos observados em uma população após o surgimento de uma nova mutação,

sendo esta associação entre cada alelo mutante e o haplótipo ancestral rompida

somente por uma mutação e recombinação em gerações subseqüentes (GABRIEL,

2002). A determinação do haplótipo pode ser utilizada como um poderoso sistema

para encontrar variantes que influenciem na resposta aos fármacos, existindo uma

forte evidência de que estas variantes comuns possam desempenhar um papel

importante na variabilidade de resposta aos diferentes fármacos administrados

(GOLDSTEIN, 2003).

Um dos mais conhecidos polimorfismos na resposta terapêutica em pacientes

HIV positivos é o do gene MDR1 (ou ABCB1) que codifica a glicoproteína P (P-gp). A

P-gp é uma proteína de efluxo ATP-dependente. A P-gp foi apenas o primeiro

membro identificado de uma grande e diversificada superfamília que compreende

cerca de cinqüenta cassetes humanos ATP- dependente (ABC), com proteínas que

desempenham funções múltiplas e variadas (CHAN LM, LOWES S, HIRST BH,

2004). De particular interesse nesta análise são os membros da família envolvidos

no transporte das drogas, como as proteínas de efluxo de drogas MDR (resistência a

múltiplas drogas), uma vez que estas proteínas podem ter um grande impacto na

biodisponibilidade da droga e na resistência à quimioterapia, bem como na

homeostase fisiológica (OUDE ELFERINK RP, DE WAART R, 2007).

Os transportadores de drogas tendem a ser super-expressos em tumores,

mas estão em níveis normais em muitos tecidos, sobretudo em locais excretores

como o fígado, rins e intestino, onde eles fornecem uma barreira contra a penetração

da droga, ao propiciar um mecanismo para a sua eliminação. O arsenal de

transportadores ABC envolvidos no efluxo de drogas é apoiado pela metabolização

de drogas por enzimas que modificam a produção dos metabólitos destas drogas,

que são eles próprios substratos para estes transportadores. Assim, um

relacionamento sinérgico existe dentro de tecidos excretores ao proteger o corpo

contra a invasão por compostos estranhos (CHAN LM, LOWES S, HIRST BH, 2004).

Apesar dos transportadores ABC serem diferencialmente expressos em

determinados locais do corpo, sua expressão não acontece de forma estática, os

tecidos têm uma notável capacidade de regular as quantidades de transportadores

da membrana, tanto ao nível de transcrição como na pós-transcrição, a fim de atingir

a homeostase (CHAN LM, LOWES S, HIRST BH, 2004; OUDE ELFERINK RP, DE

WAART R, 2007).

Efavirenz (EFV) é um inibidor da transcritase reversa não-nucleosídeo que

tem demonstrado eficácia e segurança adequadas no tratamento da infecção pelo

vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). Por conseguinte é frequentemente

usado na terapia antiretroviral potente (HAART) implementada para pacientes

virgens e não virgens de tratamento que tipicamente fornece uma redução da carga

viral e benefícios imunológicos (GULICK et al., 2004; GALLANT et al., 2006; .

RIDDLER et al., 2008). O efavirenz é metabolizado principalmente pelo citocromo

P450 (CYP) 2B6 (WARD et al., 2003). Um freqüente polimorfismo não-sinônimo no

exon 4 do CYP2B6 (516G>T, rs3745274) prevê diminuição da depuração plasmática

de efavirenz e aumento no plasma no estado estacionário, como faz um menos

freqüentes não-sinônimo exon 9 CYP2B6 polimorfismo 983T > C (Rs28399499)

(HAAS et al., 2004; HAAS et al., 2005; ROTGER et al., 2005; WANG et al., 2006;

ROTGER et al., 2007).

1.1 Epidemiologia do HIV

A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Acquired Immunodeficiency

Syndrome - AIDS) foi reconhecida oficialmente como doença em 1981, pelo Centro

de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) em função de uma explosão de casos

inexplicados de sarcoma de Kaposi e de pneumonia por Pneumocystis jiroveci em

homossexuais masculinos em diversas cidades dos Estados Unidos (RACHID &

SCHECHTER, 2001). A epidemia de AIDS no Brasil experimentou modificações

profundas desde o seu início na década de 80. De característica regional e restrita a

determinados segmentos populacionais, passou a ser uma epidemia de caráter

nacional nos anos 90.

Dados da UNAIDS (Joint United Nations Programm on HIV/AIDS) divulgados

em julho de 2009 estimam que 33,4 milhões de pessoas vivam com o vírus no

mundo (UNAIDS, 2009). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), o Brasil

se mantém entre os países com epidemia de AIDS, com prevalência da infecção

pelo HIV de 0,61% entre a população de 15 a 49 anos (UNAIDS, 2009).

A América Latina é a região que ocupa a quarta posição em número de

infectados no mundo, sendo o Brasil o país que possui o maior número de casos de

AIDS nesta região, com 506.499 casos de AIDS de janeiro de 1980 até junho de

2008 (Boletim Epidemiológico da AIDS, 2009). No Brasil, a AIDS foi responsável por

205.409 óbitos de 1980 até junho de 2007, sendo as taxas de mortalidade

crescentes até meados da década de 90, estabilizando em cerca de 11 mil óbitos

anuais desde 1998. Após a introdução da política de acesso universal ao tratamento

antiretroviral (ARV), observou-se uma importante queda na mortalidade. A partir do

ano 2000, essa taxa se estabilizou em cerca de 6,0 óbitos por 100 mil habitantes

(Boletim Epidemiológico da AIDS, 2009).

As regiões Sul e Sudeste concentram 80% dos casos. Dados do Boletim

Epidemiológico de AIDS (2009) do Programa Nacional de AIDS do Ministério da

Saúde e da Secretaria Estadual de Saúde do Rio Grande do Sul mostram que o RS

foi o terceiro estado com maior incidência de casos de AIDS de 1983 a 2008, com

46.299. O município de Porto Alegre é o terceiro município brasileiro e o primeiro do

Estado com maior número de casos de AIDS notificados (Boletim Epidemiológico da

AIDS, 2009). Em Santa Cruz do Sul, numa população de 116.000 habitantes, tem

650 infectados com HIV.

A abordagem clínica da infecção pelo HIV e de suas complicações é bastante

complexa (MS/SVS, 2009). Com o advento da terapia antiretroviral potente

(HAART), as manifestações clínicas decorrentes da infecção pelo HIV tornaram-se

menos freqüentes e houve melhora substancial do prognóstico e da qualidade de

vida dos indivíduos infectados. Todavia, a resistência viral, a toxicidade dos

fármacos, os efeitos adversos e a necessidade de alta adesão ao tratamento

permanecem como importantes barreiras ao sucesso prolongado das terapias

(MS/SVS, 2009; MU et al., 2007).

No Brasil, dentre as estratégias para combater a epidemia destaca-se a

política de distribuição dos medicamentos antiretrovirais aos portadores do HIV que

necessitam de tratamento. Vários indicadores evidenciam o efeito positivo dessa

política adotada no país: redução da mortalidade em aproximadamente 50%,

redução do número de internações hospitalares, redução da incidência de infecções

oportunistas, redução da transmissão vertical, dentre outros (GUIMARÃES et al.,

2008; MELCHIOR et al., 2008).

Os atuais esquemas terapêuticos são complexos, de difícil adesão e

associados a reações adversas e interações medicamentosas (KING et al., 2002;

MONTESSORI et al., 2004; KLIMAS et al., 2008; HAMMER et al., 2008).

Atualmente, alguns estudos realizados em diversos países buscam aumentar a

efetividade dos tratamentos disponíveis e incluem tentativas para entender melhor

os efeitos adversos dos agentes antiretrovirais (HAMMER et al., 2008; MOLINA et

al., 2008; MONTESSORI et al., 2004). Efeitos adversos dos antiretrovirais, muitos

dos quais desconhecidos no passado, são cada vez mais freqüentes e, na maioria

das vezes, são os principais responsáveis pela interrupção da terapia (HAMMER et

al., 2008). Em estudo realizado por Borges, foi observado o desenvolvimento de

efeitos adversos (ADR) em 75,4% dos pacientes estudados, sendo os principais

tontura, cefaléia, diarréia, náusea e vômitos (Borges, 2005). O desenvolvimento de

neuropatia, hepatotoxicidade, pancreatite, lipodistrofia, diabetes, dislipidemia,

osteoporose e acidose lática estão entre as complicações que podem piorar

consideravelmente a qualidade de vida do indivíduo infectado pelo HIV recebendo

HAART (MS/SVS, 2009).

O uso de potentes fármacos está geralmente associado com toxicidade e os

fármacos antiretrovirais não são exceção. O aumento das enzimas hepáticas,

descrito em muitos estudos como hepatotoxicidade, vem sendo reportada em muitos

pacientes tratados com antiretrovirais (MENDES-CORREA et al., 2008; NUNES,

2006). No entanto, a prevalência destes casos e as suas causas não são ainda bem

definidas (MENDES-CORREA et al., 2008; NUNES, 2006). Um mecanismo potencial

de associação entre hepatotoxicidade e inibidores da protease (IP) é a alteração no

metabolismo, porque todos os IPs são metabolizados no fígado por várias enzimas

pertencentes ao citocromo P450 (FLEXNER, 1998).

1.2 Tratamento Antiretroviral

Desde o descobrimento do vírus HIV e do conhecimento da patogenia da

AIDS, pesquisadores não mediram esforços relacionados ao desenvolvimento de

novos fármacos e estratégias terapêuticas para o combate da doença (HAMMER,

2008; FLEXNER, 2007).

O principal objetivo da terapia antiretroviral é retardar a progressão da

imunodeficiência e/ou restaurar, tanto quanto possível, a imunidade aumentando o

tempo e a qualidade de vida da pessoa infectada (MS/SVS, 2009). Contudo, a

evolução natural da infecção pelo HIV caracteriza-se por intensa e continua

replicação viral, que resulta, principalmente, na destruição e disfunção de linfócitos T

que expressam o antígeno de membrana CD4 e de outras células do sistema imune.

A depleção progressiva dos linfócitos T CD4, em conjunto com outras alterações

quantitativas e qualitativas do sistema imune, leva à imunodeficiência, que em sua

forma mais grave manifesta-se pelo surgimento de infecções oportunistas e

neoplasias que caracterizam a AIDS. Assim, a supressão máxima e contínua da

replicação viral é desejável para reduzir ou reverter o dano imunológico (ABBAS et

al., 2008).

O início da terapia deve ser recomendado para pacientes assintomáticos com

contagem de linfócitos T CD4 entre 350/mm

e 200/mm

. Nesses indivíduos, a

decisão de iniciar o tratamento dependerá da tendência de queda da contagem de

linfócitos T CD4 e/ou da elevação da carga viral. Para aqueles assintomáticos que

têm contagem de linfócitos T CD4 menor do que 200/mm

e para aqueles que têm

manifestações clínicas associadas ao HIV (independentemente da contagem de

linfócitos T CD4 e da carga viral plasmática) o tratamento deve ser instituído

(MS/SVS, 2009).

Segundo consenso do Ministério da Saúde, referente às recomendações da

terapia antiretroviral em adultos e adolescentes infectados pelo HIV, a terapia inicial

deve sempre incluir três fármacos, sendo dois inibidores da transcriptase reversa

análogos de nucleosídeos (ITRN) associados a um inibidor da transcriptase reversa

não análogo de nucleosídeos (ITRNN) ou a um inibidor da protease (IP), o que

significa que esquemas duplos (apenas com dois ITRN) não devem mais ser

utilizados. A única exceção na qual a terapia dupla pode ser utilizada é o caso de

exposição ocupacional. O uso isolado de AZT ainda é aceitável para a

quimioprofilaxia da transmissão vertical em algumas situações específicas (MS/

SMS, 2008). Na Tabela 2, são apresentados os principais fármacos incluídos em

cada classe de antiretrovirais.

Tabela 2: Principais fármacos licenciados em cada classe de antiretrovirais

ITRN

ITRNN

Outros

Abacavir (ABC)

Didanosina(ddI)

Delavirdina (DLV)

Efavirenz (EFV)

Amprenavir (APV)

Atazanavir (ATV)

Enfuvirtide (Inibidor da

Integrase)

Estavudina (d4T)

Lamivudina (3TC)

Tenofovir (TDF)

Nevirapina (NVP) Indinavir (IDV)

Lopinavir/r (LPV/r)

Nelfinavir (NFV)

Maraviroc (inibidor da

interação com o co-

receptor CCR5)

Zalcitabina (ddC) Ritonavir (RTV)

Zidovudina (AZT) Saquinavir (SQV)

Tipranavir

Darunavir

*modificada a partir de Flexner, 2008. ITRN: inibidor da transcriptase reversa análogo de

nucleosídeos. ITRNN: inibidor da transcriptase reversa não análogo de nucleosídeos. IP: inibidor da

protease.

A preferência é a terapia com 2 ITRN associados a um ITRNN. Os esquemas

que utilizam 2 ITRN + ITRNN são, em geral, de posologia mais simples, o que

provavelmente facilita a adesão ao tratamento. O AIDS Clinical Trials Group

(ACTG) comparou 3 regimes terapêuticos inicias em 757 pacientes: i) efavirenz

com 2 ITRNs; ii) lopinavir potencializado com ritonavir (lopinavir/r) com 2 ITRNs; e

iii) efavirenz com lopinavir/r, sem ITRNs. O esquema que utilizava efavirenz com 2

ITRNs levou à queda da taxa viral e à supressão viral por mais tempo que

lopinavir/r com 2 ITRNs (24% vs 37%, respectivamente) (RIDLLER et al., 2008).

Um ensaio clínico randomizado que comparou diretamente esquemas iniciais de

tratamento de 2 ITRN+efavirenz (ITRNN) com 2 ITRN+lopinavir/r (IP/r) demonstrou

que, na análise de intenção de tratamento, os resultados de supressão viral (carga

viral < 50 cópias/mL) nos pacientes do grupo efavirenz (89% de supressão viral)

foram superiores ao grupo lopinavir/r (77%) em 96 semanas, e a contagem de

linfócitos T CD4 foi maior no grupo lopinavir/r que no grupo efavirenz (287céls./ul e

230/ul, respectivamente) (HAUBRICH et al., 2007).  Não existe dado publicado

sobre tratamento de longo prazo, particularmente em estratégias de terapia

seqüencial, que permitam definir qual seria a abordagem associada com melhores

resultados.

Diante dos resultados de equivalência dos esquemas com 2 ITRN + ITRNN

em relação aos esquemas com 2 ITRN + IP/r, e por vantagens potenciais no manejo

anti-retroviral, o comitê das recomendações para terapia anti-retroviral em adultos e

adolescentes infectados pelo HIV 2007/2008 do Ministério da Saúde/programa

DST/AIDS optou por sugerir esquemas com ITRNN como primeira opção, e

esquemas com IP com o reforço farmacológico do ritonavir (IP/r) como alternativos

para o início de terapia anti-retroviral em pacientes virgens de tratamento (MS/ SMS,

2008).

A associação zidovudina/lamivudina (AZT/3TC) é a mais estudada em

ensaios clínicos randomizados, apresenta resposta virológica equivalente a outras

combinações de 2 ITRN e é habitualmente bem tolerada, tendo sido mantida como a

dupla de ITRN de primeira escolha para compor o esquema antiretroviral inicial. O

AZT e a didanosina entérica (ddI EC) têm um perfil de toxicidade metabólico

considerável. Em ambos são descritos a lipoatrofia em longo prazo, toxicidade

hematológica associada ao AZT, e pancreatite e neuropatia periférica associadas ao

ddI. O abacavir (ABC) pode causar a síndrome de hipersensibilidade e o tenofovir

(TDF) pode causar nefrotoxicidade. Nos casos de intolerância ao AZT, a ddI EC ou o

TDF permaneceram como alternativas, sempre em combinação com a lamivudina

(MS/SVS, 2009).

Em pacientes em uso de AZT, a toxicidade hematológica e a lipoatrofia são

um dos principais efeitos adversos que resultam na modificação do tratamento. O

ABC permanece recomendado na terapia inicial apenas nas situações de

intolerância ao AZT, ao ddI EC e ao TDF, pois seu custo elevado não se traduz em

benefício proporcional quando comparado às outras opções. A estavudina (d4T)

permanece sendo a última opção para substituir o AZT, devido ao acúmulo de dados

científicos e clínicos confirmando a forte associação entre uso do d4T e

desenvolvimento de lipoatrofia e dislipidemia. A dupla ddI/d4T continua excluída da

terapia inicial devido ao maior potencial de toxicidade (MS/SVS, 2009).

Os dois ITRNN disponibilizados no Brasil são o efavirenz (EFZ) e a nevirapina

(NVP). Quanto à escolha dos ITRNN, o efavirenz (EFZ) continua sendo preferencial

à nevirapina (NVP), exceto em gestantes. Essa opção está fundamentada na sua

elevada potência de supressão viral, comprovada eficácia em longo prazo e ao

menor risco de efeitos adversos sérios. Os efeitos adversos mais relacionados ao

EFV, como tonturas, alterações do sono e alucinações, costumam desaparecer após

as primeiras duas a quatro semanas de uso. A NVP é uma opção ao EFZ em

algumas situações, como mulheres que desejam engravidar ou durante a gestação.

Entretanto, a NVP apresenta maior toxicidade hepática, rash cutâneo e risco de

desencadear Síndrome de Stevens-Jonhson (MS/SVS, 2009; HAMMER et al, 2008).

Os inibidores da protease potencializados com ritonavir (IP/r) oferecem menor

probabilidade de desenvolvimento de resistência que os ITRNN. A escolha do IP

para ser a combinação com ritonavir como adjuvante farmacológico tem como

vantagens proporcionar níveis sangüíneos do IP mais elevados, estáveis e por

tempo mais prolongado e menor risco de mutações que confiram resistência viral

(RIDDLER et al, 2006). Esquemas que incluem a associação de IP/r estão

relacionados com uma maior elevação nas contagens de linfócitos T CD4, mas por

outro lado, é mais freqüente a ocorrência de dislipidemias em esquemas com IP/r,

quando comparados a associações que envolvem ITRNN, particularmente o

efavirenz (RIDDLER et al., 2008).

A escolha da terapia inicial envolvendo um esquema composto por um

inibidor da protease deve preferencialmente utilizar o lopinavir (LPV) potencializado

com ritonavir, com base na experiência de uso, no maior número de estudos clínicos

com seguimento de pacientes em longo prazo e na alta potência e durabilidade que

confere aos esquemas antiretrovirais. A associação atazanavir/r (ATV/r), é

considerada a combinação de inibidores da protease alternativa (MOLINA et al,

2008; MS/SVS 2009). De forma geral, o saquinavir/r, indinavir/r e fosamprenavir/r

permanecem como opção de resgate. As principais desvantagens do LPV/r são a

dificuldade de adesão em longo prazo e seus eventos adversos, particularmente

efeitos metabólicos. O ATV/r está mais relacionado à icterícia (MOLINA et al., 2008;

WALMSLEY et al., 2007; CLUMECK et al., 2007).

Raltegravir, um inibidor de integrase, foi aprovado em 2007 para uso em

tratamento experimental de pacientes (STEIGBIGEL et al, 2007; COOPER et al,

2007). Foi comparado com efavirenz num tratamento de pacientes iniciantes, sendo

administradas 4 doses de raltegravir (100, 200, 400, ou 600 mg duas vezes ao dia)

ou efavirenz, cada um combinado com tenofovir e lamivudine. Em 48 semanas, a

proporção dos indivíduos que tinham níveis de RNA de HIV abaixo de 50 copias / mL

foi similar entre os 5 grupos (MARKOWITZ et al, 2007).

Uma nova classe de drogas antiretrovirais foi desenvolvida, são os chamados

inibidores de fusão ou inibidores de entrada. Maraviroc, um antagonista do CCR5, foi

aprovado em 2007 para uso em tratamento experimental de pacientes (SCHLECHT

et al, 2008). Foi utilizado como antiretroviral em pacientes com variantes de HIV-1

que utilizam exclusivamente CCR5 como co-receptor. Maraviroc foi comparado com

efavirenz, cada um combinado com zidovudine/lamivudine. Em 48 semanas, 69,3%

e 65,3% dos pacientes tiveram uma carga viral inferior a 50 copias/mL nos grupos

efavirenz e maraviroc, respectivamente (SAAG et al., 2007).

1.3 Avaliação da resposta terapêutica

A avaliação da resposta terapêutica utiliza como parâmetros a redução da

carga viral e o aumento do número de linfócitos T CD4. Embora um dos principais

objetivos da terapia antiretroviral seja a obtenção de carga viral indetectável (abaixo

de 50 ou 80 cópias/mL) dentro de um período de seis meses, deve-se considerar

como resultado positivo uma grande redução nos seus valores: 90% da carga viral

nas primeiras quatro a seis semanas, ou 99% após 12 a 16 semanas (MS/SVS,

2009).

O impacto inicial da terapia antiretroviral sobre a carga viral tem relação direta

com a carga viral pré-tratamento, o grau de imunodeficiência, a potência do

esquema, o grau de adesão e a tolerância do paciente aos fármacos, assim como

com outros aspectos que possam influenciar a farmacocinética. Sendo assim, a

situação individual do paciente pré-terapia e seu comportamento, uma vez

implementada a terapia, deve ser considerada ao se estabelecer o período de seis

meses como máximo para atingir níveis indetectáveis da carga viral (MS/SVS, 2009).

Alguns pacientes com carga viral indetectável podem apresentar episódios

ocasionais de viremia detectável transitória em baixos valores (geralmente menor

que 1000–2000 cópias/mL) com subseqüente supressão. Essa situação não

caracteriza falha terapêutica, mas sugere-se que seja investigada e que eventuais

problemas com a adesão à terapia sejam corrigidos (HAMMER et al., 2008;

MS/SVS, 2009).

1.4 Efavirenz

Na maioria das orientações, o tratamento com efavirenz (EFV) é o ITRNN

mais recomendado entre os regimes de primeira linha em pacientes que iniciam o

tratamento antiretroviral. Assim, o EFV é uma das drogas antiretrovirais mais

utilizadas (HAMMER et al., 2008).

O EFV é descrito como um derivado do benzoxazinone (2H-3,1-Benzoxazin-

2-one,6-cloro-4(Cyclopropylethynyl) -1,4-dihidro-4-trifluormetil). Sua fórmula empírica

é C14H9CIF3NO2 (RAKHMANINA & VAN DEN ANKER, 2010).

EFV é prontamente absorvido e atinge picos de concentração sérica (Cmax)

de 4,07 ug/ml cerca de 3-5 horas após a administração de 600 mg, a dose oral

padrão do adulto. EFV tem um período de meia-vida no soro de 45 horas e atinge

estado estacionário das concentrações plasmáticas de 6-10 dias. A

biodisponibilidade do EFV é aumentada pela refeição quando comparado ao jejum.

A droga é altamente ligada às proteínas (> 99%), predominantemente à albumina

(RAKHMANINA & VAN DEN ANKER, 2010).

A segurança e a eficácia de EFV em crianças menores de 3 anos de idade

não foram estabelecidas. Os dados sobre a exposição a EFV em mães e seus bebês

em aleitamento materno é limitado. Cerca de 14 a 34% de uma dose de EFV é

recuperada na urina (menos de 1% como droga inalterada) e 16-61% de uma dose é

recuperada nas fezes (principalmente como fármaco inalterado) (RAKHMANINA &

VAN DEN ANKER, 2010). O tratamento pode ter efeitos colaterais, representados

por sonhos anormais, tonturas, sonolência, insônia e diminuição da concentração

(HAAS et al., 2004, MS/SVS, 2009). A freqüência de efeitos colaterais no SNC pode

ser tão elevada, metade dos pacientes apresentando esta queixa, ocorrendo

geralmente durante as primeiras semanas de tratamento. Uma vez que há uma

diferença interindividual considerável nos níveis de meia-vida da droga após a

administração oral de EFV, sugere-se que a ocorrência de efeitos colaterais no SNC

possa refletir o aumento dos níveis plasmáticos EFV.

1.4.1 Monitorização terapêutica de efavirenz

A monitorização terapêutica de fármacos (MTD) é uma abordagem que visa à

otimização e individualização da administração da droga. Essa monitorização é de

grande interesse no tratamento do HIV, pois permite aumentar a eficiência do

tratamento e reduzir os efeitos adversos dos antiretrovirais. EFV se enquadra nos

critérios para a MTD, incluindo uma possível correlação das suas concentrações

plasmáticas com o efeito farmacológico, avaliado pela contagem de células CD4 e

carga viral, bem como com a toxicidade (CSAJKA et al., 2003; MARZOLINI et al.,

2001). Essa correlação é maior com a toxicidade do que com a eficácia do

medicamento (DAHRI & ENSOM. 2007). Além disso, muitos ensaios analíticos

aceitáveis estão atualmente disponíveis para esta droga, exibindo sua variável

disposição cinética interpacientes e intrapaciente (CSAJKA et al., 2003). A MTD

também é considerada uma boa ferramenta para estimar a adesão do paciente ao

tratamento. O abandono é um dos principais problemas associados ao aparecimento

de cepas virais resistentes (FEXNER, 2007). De fato, as mutações do genoma viral

que conferem resistência ao HAART, que levam a mal definidas modificações das

doses terapêuticas, são um dos principais problemas que impedem a MTD destas

drogas. Na verdade, relativamente bem definidas faixas terapêuticas só foram

estabelecidas para pacientes virgem de tratamento. Por conseguinte, o alcance

terapêutico aceito para EFV (1 a 4 mg/litro) deve ser interpretado com cautela

porque pode mudar dependendo de fatores como o estado do paciente, o uso de

regimes de combinação com outros antiretrovirais, a exposição prévia a

antiretrovirais ou não, as mutações que conferem resistência, entre outros (CSAJKA

et al., 2003).

1.5 Efavirenz e farmacogenética

Muitos fatores genéticos humanos influenciam a história natural do HIV pelo

fato de acelerarem ou reduzirem a progressão da infecção ao desenvolvimento da

AIDS (TELENTI, 2002). Fatores relacionados ao hospedeiro também contribuem

para a resposta ao tratamento antiretroviral. A aplicação de um único regime

terapêutico resulta em importantes variações interpessoais relacionadas às

concentrações séricas e às diferenças na susceptibilidade à toxicidade dos fármacos

(TELENTI, 2002; HASS, 2005).

A relação de genes e variantes a serem pesquisados como possíveis

interferentes na resposta individual ao tratamento antiretroviral é frequente. Alguns

genes foram estudados em diversas populações, nas quais mostraram significativas

associações com alterações na resposta terapêutica aos antiretrovirais e com o

desenvolvimento de reações adversas e susceptibilidade à doença (HASS, 2005;

AHUJA et al., 2008; NAKAJIMA & KIMURA, 2008).

Apesar de não existirem muitos dados disponíveis, áreas de investigação

farmacogenética incluem a análise da eficácia da terapia com ITRNs, resposta

neurotóxica e hematotóxica aos ITRNs e ITRNNs, resposta alérgica, e a

probabilidade de resposta aos inibidores de fusão. A partir do momento em que

existirem dados disponíveis, será possível aumentar prospectivamente a chance de

sucesso no tratamento e reduzir a possibilidade de efeitos tóxicos, através da

utilização de uma terapia personalizada (FLEXNER, 2008; HAMMER et al., 2008).

Genes envolvidos na metabolização e transporte de fármacos são importantes alvos

a serem investigados para melhor prever a eficácia e a segurança de diversos

tratamentos (FIEGENBAUM et al, 2005). A farmacogenética é uma área de pesquisa

com grande perspectiva de crescimento que promete auxiliar no uso racional de

diferentes fármacos, bem como no desenvolvimento de novos fármacos

(GOLDSTEIN, 2003).

A resposta à terapia antiretroviral em pacientes HIV-positivo varia

consideravelmente em diferentes aspectos, como na concentração plasmática das

drogas, no desenvolvimento de efeitos adversos e na taxa de recuperação do

sistema imunológico. Esta variação pode ser atribuída a fatores como interações

medicamentosas ou diferenças individuais na capacidade de metabolização dos

fármacos antiretrovirais. A investigação dos fatores que podem interferir na eficiência

da resposta aos antiretrovirais é de grande interesse para o entendimento de como

os pacientes podem responder de forma tão variada à HAART (TELENTI &

ZANGER, 2008).

Importantes variações genéticas do hospedeiro estão associadas a uma

diferente capacidade de metabolização. Várias enzimas desempenham papéis

cruciais no transporte e metabolismo de diferentes fármacos, como a glicoproteína-

P, produto do gene MDR1 (ABCB1), e enzimas do citocromo P450 (CYP450),

diretamente envolvidas na farmacocinética de diversos fármacos (TELENTI &

ZANGER, 2008).

Variantes alélicas de MDR1 e CYP2D6 estão associadas com diferenças nas

concentrações plasmáticas de inibidores da protease (IP) e inibidores não

nucleosídeos da transcritase reversa (ITRNN). Variantes alélicas de MDR1 também

predizem a taxa de imunoreatividade (aumento dos níveis de linfócitos T CD4) após

o início do tratamento com antiretrovirais, o que mostra a relevância de

transportadores para o acesso dos fármacos antiretrovirais a compartimentos

farmacológicos privilegiados (HASS, 2005).

A P-gp é um membro da família dependente de ATP e é codificada pelo gene

humano ABCB1 (ATP-binding cassete, subfamília B), também chamado de

resistência a múltiplas drogas (MDR1), localizado no cromossomo 7p21-21.1 (FOJO

et al., 1986), com cerca de 4,5 kb e 28 exons (CHEN et al., 1990). A P-gp em

humanos é uma proteína transmembrana fosforilada e glicosilada, de 1280

aminoácidos, que contém duas regiões homólogas de seqüências simétricas, cada

qual com 6 domínios transmembrana e um motivo de ligação de ATP (Figura 1). Os

domínios de ligação do ATP agem como ATPases que hidrolisam ATP em ADP+Pi.

Figura 1:

Arranjo de proteínas transmembrana de efluxo ABC, mostrando as 12 regiões de domínio

transmembrana e as duas regiões NBDs (domínios de ligação de nucleotídeos/ATP).

Fonte: adaptada a partir de CHAN LM, LOWES S, HIRST BH, 2004.

A P-gp funciona como uma bomba de efluxo transmembrana, transportando

as drogas do meio intracelular para o extracelular, mas pode também interagir com

as moléculas da droga retidas na bicamada lipídica da membrana celular (Figura 2).

Figura 2: Função da P-glicoproteína (P-gp). Este modelo mostra que o transporte de efluxo mediado

pela P-gp de substratos de drogas pode ocorrer no nível da membrana plasmática ou do

compartimento intracelular. ATP, adenosina trifosfato; ADP, adenosina difosfato; Pi, fosfato

inorgânico.

Fonte: adaptada a partir de MARZOLINI et al., 2004.

A P-gp foi isolada pela primeira vez a partir de células de ovário de hamster

chineses (CHO) resistentes à colchicina (JULIANO RL, LING V, 1976).

Posteriormente, o gene que codifica a P-gp (MDR1) foi identificado devido à sua

superexpressão em células tumorais, associada à aquisição de resistência cruzada a

várias drogas tóxicas anti-câncer (UEDA et al.,1987). Este transportador de drogas

foi também reconhecido como expresso em muitos tecidos normais, sugerindo uma

função fisiológica (CHAN LM, LOWES S, HIRST BH, 2004). A P-gp é encontrada em

locais excretores como a superfície canalicular dos hepatócitos, a superfície apical

de células tubulares proximais nos rins, e na superfície da borda em escova dos

enterócitos. Além disso, a P-gp é também expressa no epitélio do plexo coróide do

cérebro e na superfície luminal dos capilares sanguíneos do encéfalo (barreira

hemato-encefálica). A P-gp também está presente em outros tecidos conhecidos

por ser um obstáculo sangue-tecido, tais como a placenta, os ovários e os testículos,

tendo sido detectada também em células tronco hematopoéticas e células

mononucleares periféricas (PBMC), macrófagos maduros, as células natural killer,

células dendríticas, linfócitos T e B (MARZOLINI et al., 2004). Assim, a função e a

localização anatômica da P-gp sugerem que esse transportador atua como uma

barreira protetora para manter as toxinas fora do corpo, excretando os compostos na

urina, na bile e para o lúmen intestinal, impedindo a acumulação de tais compostos

em órgãos vitais como o cérebro, gônadas e medula óssea, assim como no feto

(MARZOLINI et al., 2004).

A P-gp transporta um amplo espectro de substâncias, incluindo diversos

quimioterápicos e fármacos antiretrovirais da classe dos IP. Estudos de expressão

em diferentes tipos celulares mostraram que a expressão diferencial de P- gp pode

influenciar a atividade e biodisponibilidade de fármacos e que polimorfismos no gene

MDR1 podem ser importantes para a predição da resposta clínica em pacientes sob

terapia HAART (FELLAY et al, 2002; SAITOH et al, 2005).

Estudos bioquímicos sugerem que o transporte de substrato por MDR1 é

acoplado à hidrólise de ATP (SHAROM et al., 1993) e o modelo atualmente aceito é

que a P-gp funciona como uma "bomba de vácuo hidrofóbica", no qual o substrato

interage diretamente com o bolso de ligação da droga na proteína P-gp e é

bombeado do espaço intracelular para o espaço extracelular, assistido pela hidrólise

de ATP em ADP+Pi (revisto em FUNG & GOTTESMAN, 2009). A característica mais

significativa da função da P-gp é a sua ampla especificidade de substrato. Críticas

têm categorizado substratos da P-gp com base no seu uso clínico (MARZOLINI et

al., 2004; PERALTA et al., 2008) e correlacionado níveis de expressão de MDR1

com resistência às drogas. Grande número de substratos, com diferentes estruturas

químicas, são candidatos à metabolização pela P-gp (MARZOLINI et al., 2004).

Esses substratos têm uma ampla gama de funções biológicas, por exemplo, drogas

anti-câncer, inibidores da protease do HIV, anti-histamínicos, bloqueadores dos

canais de cálcio, antibióticos, etc. O mecanismo de ligação do substrato e o

reconhecimento de substratos e inibidores da P-gp são complexos. A P-gp contém

um grande bolso de ligação de drogas, que geralmente é constituído por vários

domínios trans-membrana (TM5, TM6, TM11 e TM12), que determina a

especificidade de substrato. No entanto, são as mutações de aminoácidos na região

transportadora que também alteram a especificidade do substrato, sugerindo que o

reconhecimento de drogas é um processo complexo (FUNG & GOTTESMAN, 2009).

A função da P-gp como transportador é semelhante à de outras drogas

transportadoras. Entre a longa lista de substratos, é evidente que algumas dessas

drogas também são substratos de enzimas metabolizadoras de drogas,

principalmente CYP3A4. Este gene está localizado no cromossomo 7q22.1, muito

próximo da localização cromossômica do MDR1, sugerindo uma inter-dependência

durante a evolução para proteger o organismo das toxinas.

De acordo com o banco de dados de SNPs (HapMap) mantido pelo NCBI

(National Center for Biotechnology Information), existem mais de 50 SNPs na região

de codificação do MDR1 humano. Estudar a localização dos SNPs tem levado a

importantes observações, por exemplo, que os SNPs com mais de 1% de

heterozigosidade foram encontrados em dois terços dos 28 exons do gene. Os SNPs

do MDR1 são mutações sinônimas e não sinônimas e a maioria das mutações são

traduzidas em aminoácidos localizados na região intracelular (Figura 3) (FUNG et al.,

2009)

Figura 3: Esquema da proteína codificada pelo gene MDR1 mostrando a localização dos SNPs. Este

é um modelo hipotético bidimensional da P-gp humana. Cada círculo representa um resíduo de

aminoácido. Círculos vermelhos representam os aminoácidos afetados por SNPs. Resíduos de

aminoácidos afetados por SNPs sinônimo estão marcados com triângulos. Os SNPs do haplótipo

MDR1 (1236C>T: G412, 2677G>T: A893 e 3435C>T: I1145) são circulados. As regiões que codificam

as alças A, D, H, Q, Walker-A e Walker-B estão coloridos em verde, e as posições dos aminoácidos

destes motivos estão resumidos na tabela. Sítios de fosforilação e glicosilação também são

mostrados. (Modificado por Fung et al., 2009).

Polimorfismos genéticos no gene MDR1 foram inicialmente identificados por

Kioka et al, em 1989, em estudos in vitro com células cancerosas (KIOKA et

al.,1989). Em seguida, outros grupos, incluindo Hoffmeyer et al, têm examinado o

conjunto de SNPs da região de codificação de MDR1, em especial a mutação

3435C>T, como um fator preditivo no aparecimento de certas doenças ( câncer,

colite ulcerosa, epilepsia) ou desfecho clínico de tratamentos com fármacos

(imunossupressores, inibidor da protease do HIV, anti-câncer) (HOFFMEISTER,

2000; SCHWAB et al., 2003; MARZOLINI et al., 2004; CHAN LM, LOWES S, HIRST

BH, 2004; OUDE ELFERINK RP, DE WAART R, 2007). A associação entre a

mutação sinônima 3435C>T e a expressão da proteína P-gp em diferentes órgãos

(por exemplo, duodeno, intestino, placenta, fígado, rim) tem sido extensivamente

estudada, porém esses estudos não foram conclusivos, com observações

conflitantes (SIEGSMUND et al., 2002; NAKAMURA et al., 2002; MORIYA et al.,

2002 HITZL et al., 2004; OWEN et al., 2005). Essas observações levaram a uma

mudança de estudo do 3435C>T para o estudo dos efeitos clínicos do haplótipo

MDR1 (BELLUSCI et al., 2009; MARFURT et al., 2010; BALCERCZAK et al., 2010;

GÜMÜ

Ş-AKAY et al., 2009; CHEN et al., 2009; VAHAB et al., 2009). Embora tenham

sido realizados numerosos estudos sobre a mutação 3435C>T, muitos não

pesquisaram os haplótipos do MDR1. Nestes estudos, o tamanho da amostra do

haplótipo é muitas vezes baixo para determinar a significância. Recentes provas, no

entanto, sugerem que o uso do haplótipo mais comum (1236C>T, 2677G>T,

3435C>T) pode ser a melhor forma de detectar a ligação a um fenótipo mais do que

estudar somente o SNP 3435C>T (FUNG et al., 2009).

O efeito do haplótipo na evolução da doença, incluindo câncer, tem sido

relatado (SABAHI Z et al., 2010; TAHARA et al., 2010; CHEN et al., 2010; KHEDRI A

et al., 2010; TAHERI et al, 2010; ANDERSEN et al., 2009; HENRÍQUEZ-

HERNÁNDEZ et al., 2009). Estudos semelhantes aos estudos clínicos do SNP

3435C>T tem mostrado que os haplótipos influenciam na resposta a drogas e nas

doenças. As linhagens celulares expressando MDR1 com a substituição 3435C>T

não alteraram a expressão na superfície celular ou a função de transporte,

comparados com as células com o gene selvagem (KOMAR, 2007; KIMCHI-

SARFATY et al., 2007). É evidente que a substituição 3435C>T não é a única razão

para menor expressão, entretanto, os pacientes portadores do genótipo 3435TT

foram relatados como tendo menor expressão de MDR1 (HOFFMEYER et al., 2000).

Um questionamento importante que tem sido colocado é como um

polimorfismo silencioso no final da região codificante do gene MDR1 pode afetar a

sua expressão. Uma possibilidade é que a substituição 3435C>T pode estar ligada a

um ou mais SNPs ainda não identificados no inicio da região 3 'UTR ou do promotor

que podem afetar a transcrição e os níveis de RNAm. No entanto, a análise de

ligação em pacientes japoneses não revelou uma significativa associação entre o

SNP 3435C>T e outros polimorfismos na região do promotor (SAI et al., 2006). Outra

explicação poderia ser que o RNAm do MDR1 tem a estabilidade alterada pela

substituição 3435C>T. Wang et al. relataram que, no fígado, o alelo 3435C tem

maior expressão do que o alelo 3435T. No mesmo estudo, a expressão in vitro em

células CHO mostrou que o RNAm carregando a mutação T é degradado mais

rápido do que os do tipo selvagem (WANG et al., 2005). No entanto, várias linhas de

evidência sugerem que a substituição 3435C>T não altera a expressão de MDR1

(KIMCHI-SARFATY et al., 2007; HUNG et al., 2008, GOW et al., 2008).

O sitio do SNP 3435C>T está localizado no segundo domínio de ligação de

ATP (Figura 3). A análise da seqüência dos aminoácidos indica que um sinal de

pausa adicional poderia interferir no dobramento de dois motivos. Em primeiro lugar,

poderia afetar a formação da alça Q, um elemento fundamental no mecanismo de

ligação de nucleotídeos, uma vez que forma o domínio de ligação de ATP. Os

aminoácidos que correspondem ao sito de ligação do ATP na P-gp em humanos são

a Gln475 e Gln1118, que estão dispostos na primeira e na segundo porção da alça-

Q e são responsáveis pelo domínio de ligação de ATP e pela comunicação com o

sitio de ligação do substrato (URBATSCH et al., 2000).

O SNP 1236C>T é outro polimorfismo sinônimo no MDR1, que codifica a

glicina no primeiro domínio de ligação do ATP, encontrada entre a alça–A e Walker-

A (Figura 3). Esta substituição parece não afetar a expressão nem a função da

proteína. Os experimentos também mostraram que essa substituição não está

relacionada às alterações na estabilidade do RNAm (WANG et al., 2005).

A interrupção do deslocamento do ribossomo durante a tradução pode ser

causada por um polimorfismo na posição 2677, no exon 21, podendo resultar nas

substituições Ala893Ser (2677G>T) ou Ala893Thr (2677G>A) (Figura 3). Uma

alteração do nucleotídeo 2677 (A893) pode resultar em uma pausa no ribossomo,

que poderá afetar a tradução de aminoácidos. No entanto, estudos têm identificado

substituições de vários aminoácidos (G830V, I849M) que podem mudar a cinética da

atividade de ATPase induzida por drogas (SAKURAI et al., 2007). A análise

bioquímica confirmou que a substituição da alanina 893 (A893) por serina ou

treonina pode alterar o transporte da droga (SAKURAI et al., 2007). Esta evidência

sugere que a mutação A893 provavelmente afeta a atividade de ATPase induzida

por drogas. Esta análise sugere que cada um dos alelos que compõem um completo

haplótipo pode contribuir com mudanças de forma pequena mas significativa,

podendo levar à alteração do dobramento da proteína e da sua função. O

dobramento co-traducional dos dois domínios de ATPase da P-gp é crucial para sua

função. Após traduções sucessivas, os dois domínios de ligação ao ATP são

dobrados juntos para formar um grande domínio que pode hidrolisar dois ATPs para

ADPs de uma forma interdependente. Embora o impacto de cada um dos SNPs no

haplótipo MDR1 pode ser independente, quando presentes juntos podem produzir

fenótipos muito mais salientes (AMBUDKAR et al., 2006).

Estudos demonstraram que existe uma relação de desequilíbrio de ligação

entre os SNPs no exon 26 (3435C>T) e no exon 21 (2677G>T/A), sugerindo que

diferenças funcionais observadas na P-gp, inicialmente atribuídas ao SNP no exon

26 (sinônimo), poderiam ser um resultado de uma associação com o polimorfismo no

exon 21 (não-sinônimo) (KIM et al., 2001; KIM et al., 2009). Três combinações

comuns de haplótipos, encontradas em mais de 70% dos indivíduos, foram relatadas

em vários estudos, e parecem ser observadas em todos os grupos étnicos com um

forte desequilíbrio de ligação entre os exons 26 e 21. Também tem sido

demonstrado que um SNP sinônimo no exon 12 (1236C>T) está ligado ao dos exons

26 (3435C>T) e 21 (2677G>T/A) (KIM et al. 2001, ILLMER et al, 2002; JOHNE et al.,

2002; FELLAY et al, 2002; WINZER et al., 2005). Da mesma forma, quando

possíveis combinações genotípicas dos polimorfismos nos exons 26, 21 e 12 do

MDR1 foram analisados, em mais de 50% dos indivíduos estudados pareceu existir

um forte desequilíbrio de ligação (KIM et al. 2001; ILLMER et al, 2002; JOHNE et al.,

2002; GOTO et al., 2002).

As interações dos inibidores da protease com a P-gp e ABCCs têm sido

extensivamente estudadas, e tem demonstrado que são substratos ou moduladores

dos transportadores de efluxo (LEE et al., 1998; FORD et al., 2003; CHANDLER et

al., 2003). No entanto, os dados relativos à interação dos ITRNN ou ITRN com

transportadores de efluxo são escassos e conflitantes (BERRUET et al., 2005;

DIRSON et al., 2006; WEISS et al., 2007; WEISS et al., 2008). Alguns estudos

relatam que os NNRTIs não são substratos e nem moduladores da P-gp (BERRUET

et al., 2005; DIRSON et al., 2006; WEISS et al., 2007). Outros indicam o potencial do

tratamento em longo prazo com EFV induzir a expressão de P-gp em células

mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou na linhagem celular LS180

(CHANDLER et al., 2003; WEISS et al., 2008).

Os resultados dos estudos que examinam a influência dos polimorfismos do

gene MDR1 na resposta ao tratamento com terapia antiretroviral não são uniformes

(Tabela 3). Estudo realizado por Felley et al. em 123 pacientes com infecção pelo

HIV foi encontrado um aumento significante na contagem de células T CD4 em 3 e 6

meses após o início do tratamento nos pacientes com genótipo 3435TT, e não

houve diferenças na queda da carga viral entre os genótipos TT, CT e CC (FELLEY

et al., 2002). Foi sugerido nesse estudo que o alelo T (variante) poderia resultar em

um aumento na penetração do inibidor de protease nas células T CD4. Além de

alterar a concentração intracelular da droga, a superexpressão da P-gp in vitro

demonstrou reduzir a suscetibilidade de células CD4 à infecção por HIV, afetando a

fusão viral e possivelmente a sua liberação (LEE et al., 2000; SPECK et al., 2002).

Tabela 3. Efeito do polimorfismo do gene MDR-1 sobre a evolução da infecção pelo HIV. Estudos em

pacientes

Pacientes

Polimor

fismos

estudados

Influencia dos diferentes genótipos

Referen

cias

Nº

Característica

Efeitos no CD4

Efeito na carga

viral

123 67 pacientes que

faziam tratamento e

mantinham a

supressão viral com

EFV E NFV, 56

pacientes com

tratamento inicial

3435C>T ↑ CD4 24 semanas

TT=257 cel/mm

CT=165 cel/ mm

CC=121 cel/ mm

Não houve

diferença estatística

Felley et

al., 2002

479 Pacientes sem

tratamento inicial

(virgem)

3435C>T Não houve diferença

estatística

Falha virológica

mais precoce no

genótipo CC

(P=0,07)

Brumme

et al.,

2003

149 Pacientes sem

tratamento inicial

(virgem)

2 ITRN + IP (N=106),

1 ITRN + IP (N= 43)

3435C>T Nenhuma relação

entre o polimorfismo

3435C>T com o

aumento do CD4 em

3 e 6 meses de inicio

do tratamento

antiretroviral

Nenhuma relação

entre o polimorfismo

3435C>T com o

aumento da carga

viral, em 3 e 6

meses de inicio do

tratamento

antiretroviral

Nasi et

al., 2003

71 Pacientes crianças

sem tratamento

inicial (virgem)

tratados com 2 ITRN

+ EFV ou NFV

3435C>T

Não houve diferenças

em 2, 4 e 20

semanas

Cargas virais ↓ de

400 cópias / ml na 8

semana de terapia

antiretroviral nos

genótipos 3435CC

(59%) do que no

genótipo 3435CT

(91%).

Hulgan

et al.,

2003

411 Sem tratamento 3435C>T

2677G>T

Não houve diferença

estatística

in vitro.

Não influencia na

progressão

espontânea do HIV

nas células CD4.

Bleiber

et al.,

2004

129 3TC + d4T + IDV (n =

60)

NVP + d4T + IDV (n

= 69)

3435C>T

2677G>T

Não houve diferenças

em 74 semanas

Não houve

diferenças em 74

semanas

Verstuyf

t et al,.

2005

504 Pacientes sem

tratamento inicial

(virgem) tratados

com EFV (n = 340),

NFV (n = 348). 184

dos 504 participantes

receberam efavirenz

e nelfinavir

3435C>T

2677G>T

Não houve diferenças MDR1 3435

genótipo TT foi

associado com

menor

probabilidade de

falência virológica e

diminuição da

resistência viral ao

efavirenz

Haas et

al., 2005

72 3ITRN (N = 12),

2ITRN + 1 PI (N =

3435C>T

2677G>T/A

Nenhuma relação

entre os

Nenhuma relação

entre os

Winzer

et al.,

40); 2ITRN + 1

ITRNN (N = 20).

Genótipo

composto

2677G>T e

3435C>T

polimorfismos com o

aumento do CD4 em

4, 12, 24 e 48

semanas de inicio do

tratamento

antiretroviral

polimorfismos com

a diminuição da

carga viral em 4, 12,

24 e 48 semanas de

inicio do tratamento

antiretroviral

2005

347 219 Crianças

infectadas e 128

crianças expostas

não infectadas

1236C>T

3435C>T

Genótipos 3435CT,

1236CT e 1236TT e a

análise de pares de

haplótipos

(3435CT/1236CT e

3435CT/1236TT)

mostraram uma

importante proteção

contra a progressão

para AIDS pediátrica.

Bellusci

et al.,

2009

3TC: lamivudina; AZT: zidovudina; d4T: estavudina; EFV: efavirenz; IDV: indinavir; IP: inibidores da

protease; ITRN: inibidores da transcritase reversa análogos de nucleosídeos; ITRNN: inibidores de

transcritase reversa não análogos de nucleosídeos; NFV: nelfinavir; NVP: nevirapina; RTV: ritonavir;

HIV: vírus da imunodeficiência humana.

Brumme et al. (2003) estudaram 479 pacientes recém-diagnosticados com

HIV e os indivíduos com genótipo 3435CC tiveram menor tempo de falha virológica

(definida por uma carga viral > 500 cópias/ml) que os genótipos 3435CT e TT, mas

com diferenças no limite de significância estatística (BRUMME et al., 2003). Este

estudo não encontrou diferenças entre os três genótipos para o desenvolvimento de

resistência às drogas antiretrovirais.

Num estudo realizado em crianças por Hulgan et al., foi encontrada uma

menor proporção de crianças que alcançaram níveis de carga viral abaixo das 400

cópias/ml na oitava semana de terapia antiretroviral com genótipo 3435CC (59%) do

que com o genótipo 3435CT (91%). Um dado deste estudo foi a resposta à terapia

antiretroviral de apenas 57% em crianças com o genótipo 3435TT, que os autores

consideraram não avaliáveis devido ao pequeno número de pacientes neste grupo

(n=7) (HULGAN et al., 2003).

Mais recentemente, foi encontrada uma associação entre o genótipo 3435TT

e uma menor probabilidade de falha virológica e de aparecimento de resistência em

doentes tratados com efavirenz (HAAS et al., 2005). Em outros estudos, não

encontraram diferenças na queda da carga viral entre os genótipos do exon 26

(3435C>T) e exon 21 (2677G>T) em 31 pacientes no estudo ACTG315 (HASS et al.,

2003). Nasi et al. não encontraram relação entre o polimorfismo 3435C>T e o

aumento da carga viral ou o aumento de CD4 em 3 e 6 meses do inicio do

tratamento antiretroviral (NASI et al., 2003). No estudo de Verstuyft et al. não houve

associação entre os genótipos dos polimorfismos do exon 21 e do exon 26 e a

resposta ao tratamento (VERSTUYFT et al., 2005).

Berruet et al realizaram um estudo para pesquisar a relação entre a atividade

funcional da P-gp e a evolução da infecção pelo HIV, com 185 pacientes com

infecção pelo HIV e concluiu que ocorre uma relação inversa entre a atividade da P-

gp e a carga viral (BERRUET et al., 2005). Na análise multivariada deste estudo, a

atividade de P-gp não está associada com outras variáveis demográficas e

terapêuticas, sugerindo que a P-gp apresentou por si só uma atividade inibidora

sobre a replicação viral.

As diferenças entre os dados obtidos in vitro e in vivo têm sido atribuídos à

superexpressão de P-gp. In vitro, a P-gp pode ser expressa mais de mil vezes do

que em células mononucleares do sangue periférico. Bleiber et al. analisaram a

superexpressão dos diferentes genótipos de MDR1 e sua relação com a

permissividade de células T CD4+ de 128 doadores de sangue saudáveis para HIV-

1 e o papel que os alelos de MDR1 nos exons 21 e 26 possuem em modificar a

progressão da doença em 411 indivíduos infectados pelo HIV-1. Diferenças

fisiológicas nos níveis de expressão de MDR1 não modificam a infecção de HIV-1 in

vitro, nem os alelos e haplótipos do MDR1 têm significativa influência na

permissividade de infecção in vitro ou na progressão da doença in vivo antes do

início do tratamento (BLEIBER et al., 2004).

Em um estudo realizado por Zhu et al., foi avaliado o efeito dos SNPs na

recuperação da contagem de células CD4 em resposta ao tratamento antiretroviral

com inibidores da protease e obtiveram dados estatisticamente significativos que

sugerem fortemente uma associação marginal com o SNP 1236MDR1, mas não dos

2677 e 3435 (ZHU et al., 2004).

Bellusci et al., num estudo de progressão da AIDS em crianças na Argentina,

concluíram que não houve associação entre os genótipos de MDR1 e a transmissão

vertical de HIV-1. No entanto, um efeito protetor contra a progressão para a AIDS

estava associado com os genótipos 3435CT, 1236CT e 1236TT (P<0,005, P=0,024

e P=0,026, respectivamente). Além disso, a análise de pares de haplótipos mostrou

que o 3435CT/1236CT e o 3435CT/1236TT exerceram uma importante proteção

contra a progressão para a AIDS pediátrica (P=0,0025 e P=0,006, respectivamente)

(BELLUSCI et al., 2010).

Embora haja controvérsia quanto à importância biológica dos polimorfismos

de MDR1, a maioria dos relatos concorda que há uma associação entre genótipos

específicos ou haplótipos dos polimorfismos dos exons 12, 21 e 26 na

permissividade de infecção pelo HIV-1 sem o seu papel no transporte da droga

(FELLEY et al. 2002; HASS et al., 2003; HASS et al. 2005, BLEIBER et al., 2005;

BELLUSCI et al., 2010).

O presente estudo teve como objetivo realizar um estudo farmacogenético de

associação entre polimorfismos do gene MDR1 de 81 indivíduos HIV-positivo virgem

de tratamento que iniciaram HAART incluindo efavirenz e as respostas virológica e

imunológica observadas.

1.2. OBJETIVOS

1.2.1 Objetivo Geral

Realizar um estudo farmacogenético para investigar o papel dos

polimorfismos 1236C>T, 2677G>T e 3435C>T do gene MDR1 no tratamento inicial

de indivíduos portadores de HIV-1 incluindo o antiretroviral Efavirenz, relacionando

os genótipos identificados com as respostas virológica e imunológica ao tratamento.

1.2.2 Objetivos Específicos

a) Avaliar a carga viral [número de cópias/ml] e níveis de linfócitos T CD4

positivos [células CD4/mm

] no início do tratamento com terapia antiretroviral

incluindo Efavirenz em pacientes HIV positivos e nos três e seis meses após o

início de tratamento

b) Estimar a freqüência genotípica dos SNPs 1236C>T, 2677G>T e 3435C>T do

gene MDR1 dos pacientes HIV positivos.

c) Verificar a associação dos genótipos MDR1 com a carga viral e níveis de

células T CD4+ nos três e seis primeiros meses de tratamento.

1.3 HIPÓTESE

Os polimorfismos 1236C>T, 2677G>T e 3435C>T do gene MDR1 influenciam

na resposta terapêutica de indivíduos HIV-positivos, sendo que indivíduos com os

genótipos 1236 TT, 2677 TT e 3435 TT apresentam um aumento das células T CD4

e uma diminuição da carga viral após 3 e 6 meses de tratamento com HAART

incluindo efavirenz no esquema terapêutico.

CAPÍTULO 2 - ARTIGO

Periodic – Antiviral Therapy

Title – The SNP 3435C>T MDR1 gene is associated with CD4 + cells count in

HIV-positive patients from Brazil.

Jane Dagmar Pollo Renner

, Lia Gonçaves Possuelo

, Andréia Rosane de Moura

Valim

, Raquel Zagonel

, Clarice Sampaio Alho

, Virginia Minghelli Schmitt

Address:

Departmento de Biologia e Farmácia, Universidade de Santa Cruz

(UNISC), Av. Independência 2293, Santa Cruz do Sul, RS, Brazil.

Faculdade de

Farmácia, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS), Av.

Ipiranga, 6681, Pd12, Porto Alegre, RS, Brazil

Email: Jane D. P. Renner* - jane[email protected], Virgínia Minghelli Schmitt –

[email protected]r

* Corresponding author

Running head: MDR1 SNPs and antiretroviral therapy

Abstract

Objective: In a prospective study of HIV-infected patients, we investigated the

influence of MDR1 genotype for three different polymorphisms (1236C>T, 2677G>T,

3435C>T) on the virological and immunological responses to treatment of naïve

patients initiating a highly active antiretroviral therapy (HAART) with one nucleoside

reverse transcriptase inhibitor (NRTI), zidovudine (AZT), and two non nucleoside

reverse transcriptase inhibitor (NNRTI), efavirenz (EFV) and lamivudine (3TC).

Methods: MDR1 genotype was analyzed in 81 patients attending the Municipal

Center for Serology Assistance (CEMAS) in Santa Cruz do Sul, Brazil, who started

HAART between 2008 and 2010. CD4 cell count and viral load were obtained at

baseline, 12 and 24 weeks post therapy initiation. MDR1 genotypes were determined

polymerase chain reaction followed by analysis of restriction fragment length

polymorphism (PCR-RFLP).

Results: Patients with MDR1 3536TT genotype had at 12 and 24 weeks pti a

significantly higher increase in CD4 cell count (343 cells/mm

) compared to baseline

than patients with CT (313 cells/mm

) and CC (231 cells/mm

) genotypes (p<0.001).

No statistically significant difference on CD4 cell count was observed for SNP

1236C>T or 2677G>T. For virological response, based on viral load at 12 and 24

weeks pti compared to baseline, no significant difference was observed for MDR1

tested genotypes.

Conclusion: A significant association was observed between MDR1 3536TT

genotype and increase in CD4+ cell count at 12 and 24 weeks of treatment

compared to baseline. Our data showed that the presence of allele 3435T is

associated with higher CD4+ cell count since baseline. According to our knowledge,

this is the first report in Brazil assessing prospectively CD4 count and viral load in

HIV-1 positive naïve patients. Further studies are needed on MDR1 transporters

polymorphisms, as P-glycoprotein, as well as other enzymes involved in drug

metabolism, to elucidate and improve understanding on the role of pharmacogenetics

on HIV HAART response, targeting optimization of a successful treatment.

Keywords: MDR1 gene, ABCB1 gene, polymorphism, antiretroviral therapy.

BACKGROUND

P-glycoprotein (P-gp), the protein product of Multidrug Resistance (MDR1)

gene, is a 170kD protein first identified in a cancer cell line [1]. P-gp belongs to the

adenosine triphosphate-binding cassette (ABC) super family of membrane

transporters involved in active transport of a wide spectrum of substrates through

lipid bilayers. REF

P-gp is found in the canalicular surface of hepatocytes, on the apical surface

of proximal tubular cells in kidneys, and on the brush border surface of enterocytes

[2].It is also expressed in the epithelium of the brain choroid plexus (which forms the

blood–cerebrospinal fluid barrier), on the luminal surface of blood capillaries of the

brain (blood-brain barrier), besides other tissues known to have blood-tissue barriers,

such as the placenta, the ovaries, and the testes [3]. In addition, P-gp has been

detected in hematopoietic stem cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs),

mature macrophages, natural killer cells, antigen presenting dentritic cells, and T and

B lymphocytes [4,5].

A consequence of its wide distribution and localization, P-gp can influence the

uptake of a drug from gastrointestinal tract, its distribution and elimination by

excretion in urine or bile, as well as its access penetration to the brain or fetus [3].

Some HIV-1 protease inhibitors are P-gp substrates, and therefore P-gp expression

and activity are of high clinical relevance [2- 6].

Oral absorption and tissue penetration of non-nucleoside reverse transcriptase

inhibitor (NNRTI) are affected by the drug transporter P-gp [2]. Polymorphisms in the

MDR1 gene can be associated with differences in P-gp activity and, thus, in drug

disposition. As a consequence, the association between allelic variance of MDR1

gene and NNRTI plasma concentrations was studied with no conclusive results [6-8].

Fellay et al. analyzed the association between Efavirenz (EFV) plasma levels

and allelic variants of MDR1 gene and several other genes. Patients with the MDR1

3435TT genotype 6 months after starting treatment had a greater rise in CD4-cell

count (257 cells/

µL) than patients with the CT (165 cells/µL) and CC (121 cells/µL)

genotype (p=0.0048), and the best recovery of naïve CD4 cells [6]. EFV drug levels

were also signiﬁcantly lower in patients with CYP2D6 extensive-metabolizer TT

alleles. Although in this study patients with the MDR1TT genotype had also a greater

rise in CD4 cell count, this was not conﬁrmed in subsequent studies [7-11].

Is the first study in Brazil in HIV-1 positive that investigated the influence of

MDR1 polymorphisms on the virological and immunological response the progression

of HIV infection it vivo before the initiation of EFV antiretroviral treatment.

METHODS

Patients

This was a prospective cohort study carried out between March 2008 and

March 2010. A total of 81 HIV-1 infected patients started antiretroviral therapy and

clinically followed at the Municipal Center for Serology Assistance (CEMAS) in Santa

Cruz do Sul, Brazil. Inclusion criteria were adult patients (>18 years) naïve of

treatment with antiretroviral drugs, HAART with two NRTIs plus one NNRTI (namely

EFV), HIV load and CD4 cell count determined 12 and 24 weeks after initiation of

therapy performed in the laboratory accredited on the CEMAS. CD4 and CD8 T-

lymphocyte subpopulation counting was performed by flow cytometry using the

FACSCount system (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). HIV-1 viral load was

performed using the NASBA technique (Biomerieux, Marcy l'Etoile, France), no

patient was in use of co-medication characterized as substrate or inhibitor of P-gp.

Treatment was based on current international treatment guidelines [16]. The

study protocol (number 2215/08) was approved by the Ethics Committee of the

University of Santa Cruz do Sul, Rio Grande do Sul, Brazil, and informed written

consent was obtained from all patients.

Exclusion criteria were: presence of clinically

and laboratory confirmed liver chronic disease, results of liver function tests prior to

the beginning of treatment twofold higher than the upper normal limit.

Clinical and epidemiological data, such as age, sex, skin color (selfreported),

alcohol abuse (according to CAGE criteria [17]), and use of another co-medication,

were obtained by application of a standard questionnaire or patient’s medical record

access. Treatment adherence was evaluated by pill counting, frequency of medical

appointment attendance, and information from medical records on regularity of pill

taking.

Genotype analysis

Venous blood (5 mL) was obtained from each participant and DNA extracted

with Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) according to manufacturer’s

instructions. MDR1 genotypes for polymorphisms (SNPs) 1236C>T (rs1128503),

2677G>T (rs2032582) and 3435C>T (rs1045643) were determined by polymerase

chain reaction followed by analysis of restriction fragment length polymorphism

(PCR-RFLP). PCR conditions, primer sequences, restriction enzymes, and fragment

length analysis were carried out according to Cascorbi et al. [12]. A total of 8 random

samples for each investigated polymorphism were PCR amplified, eletrophoresed on

2% agarose gel, bands were cut and purified according to the DNA GFX purified

band kit (GE Health Care) and sequenced according to the MegaBace protocols to

confirm PCR–RFLP results.

Statistical analysis

Statistical analyses were performed using Statistical Package for the Social

Sciences (SPSS) v. 12.0 (SPSS, Chicago, IL) and EPIINFO v. 6.04d (Centers for

Disease Control and Prevention, Atlanta, GA). Results are expressed as mean ±

standard deviation (SD) or as absolute value and percentage. Data were analyzed by

Kruskal-Wallis or Mann-Whitney test. Due to the small sample size a nonparametric

test was used. A P-value of 0.05 was considered to be significant. The observed

genotypic frequencies were tested for Hardy–Weinberg equilibrium (HWE).

RESULTS

Study population

A total of 81 HIV-infected patients attending CEMAS at Santa Cruz do Sul had

DNA specimens available for analysis. Population characteristics are summarized in

Table 1.

MDR1 polymorphisms

Patients’ DNA was analyzed to identify 1236C>T, 2677G>T>A and 3435C>T

MDR1 variants allele and genotype frequencies of the study population are

presented in Table 2.

Genotypic frequencies MDR SNP 1236 in exon 12 were: 0.64 for 1236 CC,

0.34 for 1236 CT and 0.01 for 1236TT. Allelic frequencies were: 0.815 and 0.185 for

C and T, respectively. Genotypic frequencies did not significantly different from the

expected distribution at HWE due to a higher frequency of 1236 CT with respect to

1236 CC and 1236T T with p=0.5.

Analysis of the 2677G>T polymorphism in exon 21 showed 46 (56.8%)

patients with GG genotype, 23 (28.4%) GT and 12 (14.8%) TT. Allelic frequencies

were 0.71 and 0.29 for C and T, respectively. Genotypic frequencies did not

signiﬁcantly differ from the expected distribution at HWE, mainly due to a higher

frequency of 2677GG with respect to 2677GT and 2677TT with p= 0.14.

MDR1 SNP 3435 in exon 26 revealed 47 (58.0%) patients with CC genotype,

21 (25.9%) with CT and 13 (16.0%) with TT and allelic frequencies of 0.55 and 0.45

for C and T, respectively. The distribution data of genotyped samples shown in

Genotypic frequencies did not signiﬁcantly different from the expected distribution at

HWE, mainly due to a higher frequency of 3435CC with respect to 3435CT and

3435TT with p=1.6.

CD4 T cell counts and HIV-1 viral load among patients with MDR1

polymorphisms

Table 3 shows mean values of HIV-1 viral load (VL) count [log copies/ml] at

baseline initiation of therapy and mean values of 12 and 24 weeks after initiation of

antiretroviral therapy. There were no significant differences of viral load decline for

any of the SNP genotypes analysed.

Table 4 shows mean values of CD4 cell count at baseline initiation of therapy

and mean values of CD4 cell determined at 12 and 24 weeks after initiation of

therapy. No significant differences were observed among different genotypes for

SNPs 1236 and 2677. However, patients with the MDR1 3435TT genotype had a

significantly higher mean CD4-cell count at 12 and 24 weeks (343 and 533 cell/mm

respectively) than patients with the CT (313 and 461 cell/mm

, respectively) and CC

(231 and 322 cell/mm

, respectively) genotypes (p<0.001).

DISCUSSION

The ethnic characterization of our study population showed a vast majority of

European descendents, which was expected once the population of Santa Cruz do

Sul is mainly of German origin, which compromised the analysis of antiretroviral

therapy response association between MDR1 polymorphisms and racial differences

in MDR1 allelic frequencies. Winzer et al. found in 72 HIV-1 infected patients from

Germany, genotypic frequencies for MDR1 3435 SNP of 27.7% of CC genotype,

45.8% of CT and 26.4% of TT [7]. This study has not compared of genotypic

frequencies of 3435 C>T variants the Winzer. Analysis of the 2677 SNP

demonstrated 33.3% patients with GG genotype, 31.9% with GT and 25% with TT.

Studies conducted in Brazil by Scheiner et al. in study genetics polymorphisms in Rio

de Janeiro showed different allelic distribution for MDR1 SNPs 1236 and 3435

compared with our study (SNP 1236C: 0.61 and T: 0.39; 3435C: 0.55 and T: 0.45

respectively) [18].

Recent studies have examined the relationship between polymorphic alleles of

the MDR1 gene and the course of HIV infection [6-11]. Such polymorphisms may

alter the metabolism of antiretroviral medications or influence susceptibility to HIV

infectivity [2]. We have investigated the impact of polymorphisms of the MDR1 genes

on the virological and immunological response of treatment with two NRTIs plus one

NNRTI (namely EFV) of naïve patients.

Regarding viral load, no significant association of MDR1 1236, 2677 or 3435

genotypes with viraemia decay was observed during the first six months of therapy.

Winzer et al analyzed data of 20 naïve patients and Nasi et al. of 46 naïve patients

with identical HAART scheme as in our study and also found no association between

the MDR1 genotype at position 3435 and 2677 and plasma viral load decrease

during the first six months of treatment [7,8].

The association of increase in CD4 cells with MDR1 1236 and 2677 genotypes

was not significant, but there was a significant association of CD4 cells increase and

genotype MDR1 3435TT compared with CC and CT at 12 and 24 weeks of

treatment. Our study is consistent with results of Felley et al., which found that

patients with MDR1 3435TT genotype 6 months after starting treatment had a

significant greater rise in CD4 cell count than patients with the CT and CC genotypes

(p>0·0048)[6].

Zhu et al. in a retrospective study found a relationship between the effect of

SNPs on CD4 cell count recovery in response to antiretroviral treatment with PIs, and

obtained a statistically significant evidence that suggested marginal association of

the SNP at MDR1 1236, but not at MDR1 2677 or 3435 [13]. Patient number was 79

(similar to our study), but the class of antiretroviral used for treatment was different,

which possibly explains differences in SNP association.

In a recently published study, Bellusci et al. found a protective effect against

progression to AIDS in children with MDR1 3435CT, 1236CT and 1236TT genotypes

(p<0.005, p=0.024 and p=0.026, respectively)[14]. These results support the notion

that P-gp plays a role in HIV-1 infection independently from its role in drug transport

[14].

The MDR1 3435C>T SNP is a synonymous polymorphism. The TT genotype

may have reduced translation efficiency or may lead to post-translational differences

[16]. It was assumed that the T variant could result in an increase in the penetration

of protease inhibitors on CD4 T cells. Besides changing the intracellular

concentration of drugs, overexpression of P-gp in vitro has been shown to reduce the

susceptibility of CD4 cells to HIV infection affecting viral fusion and possibly its

release [2, 15, 16].

It has been shown that linkage disequilibrium exists between 3435C>T and

2677G>T/A polymorphisms [2]. Therefore, we investigated both SNPs in our study

but analysis of a set of genotypes and haplotypes were not an isolated effect in the

virological or immunological response to treatment of naïve patients (data not

shown).

Our data suggest that the in MDR1 expression appear to have an inﬂuence on

HIV-1 infection in vivo. Inclusion in the genotype/haplotype analysis of the exon 12

(1236C>T) and exon 21 (2677G>T) should not alter our overall results and

conclusion; however, we conclude that in vivo of the estimated time for CD4+ counts

in 12 and 24 weeks increased significantly in the MDR1 3435TT genotype (p<0.001)

compared with MDR1 3435CC.

CONCLUSIONS

No evidence was found for an association between MDR1 1236C>T and

2677G>T and 3435C>T polymorphisms and virological response to therapy in HIV-

positive drug-naïve patients treated with HAART consisting of two NRTIs and one

NNRTI (namely EFV). However, a significant increase in CD4 count was observed in

3435TT individuals after 12 and 24 weeks of treatment compared to baseline. We

conclude that the MDR1 gene SNP 3435C>T, and not the SNPs 1236C>T and

2677G>T, is associated with recovery of CD4+ cells in HIV-positive patients after 12

and 24 weeks of HAART including Efavirenz . Further studies on additional

polymorphisms, whether associated or not with those analysed in this study, are

needed to elucidate the actual role of pharmacogenetics in HIV therapy.

Table 1: Characteristics of studied population

Characteristics

Value

Number of patients, n 81

Sex (female/male), n 48/33

Age (years), [mean (±SD)] 38.49 (± 10.27)

Ethnicity [European descendent / African

descendent]

62/19

IRC, n (%) 1 (1,2)

Liver disease, n (%) 0 (0)

HBV, n (%) 3 (3.7),

HCV, n (%) 5 (6.2)

IDU, n (%) 9 (11.1)

Alcohol, n (%) 8 (9.9)

Body mass index (kg2/cm), [mean (±SD)] 19.46 (± 3.63)

Table 2. Allele and genotype frequencies for the 3 studied SNPs of MDR1 gene

Location

Position

Allele

Effect

Frequency

Genotype

Frequency

HWE

MDR1

1236

Exon 12

rs1128503

C Wobble 81.5 CC 64.2

T 18.5 CT 34.6 YES

TT 1.2

MDR1

2677

Exon 21

rs2032582

G 893Ala 71.0 GG 56.8

T 893Ser 29.0 GT 28.4 YES

TT 14.8

MDR1

3435

Exon 26

rs1045643

C Wobble 71.0 CC 58.0

T 29.0 CT 26.0 YES

TT 16.0

HWE: Hardy–Weinberg equilibrium

Table 3: Viral load [log copies/ml] at baseline, week 12 and 24 after initiation of antiretroviral therapy with

respect to genotypes of MDR1 1236, 2677 and 3435 SNPs

No. (%)

BASELINE

12 WEEK

24 WEEK

MEAN ± SD

MEAN

± SD

MEAN ± SD

MDR1

1236

81 (100)

52 (64.2)

4.45 ± 1.2

2.20 ± 2.0 0.80 ± 1.0

28 (34.6)

3.58 ± 1.6

2.26 ± 1.4 0.59 ± 0.9

1 (1.2)

4.95

0.00 0.00

TT+CT

29 (36.0)

4.15 ± 1.3

2.18 ±1.5 0.57 ± 0.8

MDR1

2677

81 (100)

46 (56.8)

4.15 ±1.4

2.32 ± 1.8

0.83 ± 1.1

23 (28.4)

4.20 ± 1.4

2.29 ± 1.9

0.71 ± 0.8

12 (14.8)

4.07 ± 1.2

1.54 ± 2.0

0.27 ± 0.7

TT+GT

35 (43.0)

4.16 ± 1.3

2.03 ± 1.9

0.56 ± 0.8

MDR1

3435

81 (100)

47 (58.0)

4.20 ± 1.3

2.36 ± 1.8

0.75 ± 0.9

21 (26.0)

3.96 ± 1.5

1.85 ± 1.8

0.63 ± 1.0

13 (16.0)

4.29 ± 1.2

2.14 ± 2.2

0.74 ± 1.0

TT+CT

34 (42.0)

4.08 ± 1.4

1.96 ± 1.9

0.67 ± 1.0

Statistical analysis was performed with Kruskall-Wallis test for the three genotypes (CC vs CT vs TT)

and Mann-Whitney test for the genotypic group (CC vs CT+TT).

Table 4: CD4-cell count [cells/mm

] at baseline, week 12 and 24 after initiation of antiretroviral therapy

with respect to genotypes of MDR1 1236, 2677 and 3435 SNPs.

No. (%)

BASELINE

12 WEEKS

24 WEEKS

MEAN ± SD

MDR1

1236

81 (100)

52 (64.2) 138 ± 43.7 267 ± 106.4 401 ± 136.0

28 (34.6) 143 ± 44.0 273 ± 96.3 370 ± 122.1

1 (1.2) 153.0 381.0 492.0

TT+CT

29 (36.0) 143 ± 43.3 277 ± 96.7 375 ± 122.0

MDR1

2677

81 (100)

46 (56.8) 138 ± 44.2

273 ± 95.7

398 ± 132.4

23 (28.4) 146 ± 43.6

274 ± 126.5

395 ± 144.1

12 (14.8) 138 ± 42.0

253 ± 80.9

363 ± 102.5

TT+GT

35 (43.0) 143 ± 42.6

267 ± 112.2

384 ± 130.7

MDR1

3435

81 (100)

47 (58.0) 134 ± 41.6

231 ± 69.5**

322 ± 86.5**

21 (26.0) 148 ± 42.3

313 ± 140.7**

461 ± 113.4**

13 (16.0) 147 ± 51.1

343 ± 61.0**

533 ± 122.5**

TT+CT

34 (42.0) 148 ± 45.1

325 ± 116.5**

489 ± 120.5**

Statistical analysis was performed with Kruskall-Wallis test for the three genotypes (CC vs CT vs TT)

and Mann-Whitney test for the genotypic group (CC vs CT+TT).

**p<0,001

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8. Epub 2009 May 13.

CAPÍTULO 3

CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO

3.1 Considerações Finais

A terapia antiretroviral para infecção pelo HIV está disponível desde a

introdução e aprovação da zidovudina em 1986. Desde lá, aproximadamente 20

fármacos pertencentes a 4 diferentes classes de fármacos estão disponíveis para o

tratamento da infecção pelo HIV (HAMMER et al., 2008).

O uso de uma combinação de fármacos antiretrovirais para fornecer ao

paciente uma terapia mais potente tem impactado na morbidade e mortalidade

associadas à infecção pelo HIV e à AIDS. Entretanto, estudos clínicos tem

aumentando as possibilidades na seleção e gerenciamento dos regimes

antiretrovirais (ART), incluindo a escolha de terapias mais eficazes para evitar a

toxicidade pelos fármacos e o impacto das interações farmacológicas. Apesar da

introdução da genotipagem viral e da combinação de dados farmacocinéticos da

terapia, a investigação de fatores genéticos do hospedeiro que têm grande impacto,

tanto na eficácia quanto na toxicidade dos ART, pode também auxiliar na seleção de

melhores regimes para cada pacientes (FLEXNER, 2007).

É amplamente reconhecido que todas as classes de ART têm múltiplos

efeitos além da supressão da replicação viral e estão associados com muitos efeitos

adversos, alguns dos quais podem ameaçar a vida do paciente. Até recentemente,

entretanto, não estão claros os motivos pelos quais alguns pacientes desenvolvem

toxicidade, enquanto outros, que utilizando esquemas terapêuticos idênticos, não o

fazem. Múltiplos fatores contribuem para este fenômeno, incluindo a adesão à

terapia, outras doenças concomitantes, e interações medicamentosas; apesar

destes fatores, respostas completas ainda não foram observadas quando estes

fatores são controlados. Embora muitas variáveis influenciem na resposta aos ART,

evidências apontam para variações genéticas do hospedeiro, que podem estar

fortemente associadas com os diferentes perfis de resposta aos ART (KLIMAS et al.,

2008).

Se considerarmos o problema atual da AIDS em nosso meio e as graves

implicações dos efeitos adversos na condução satisfatória dos casos, se evidência a

necessidade de estudos que abordem não só os possíveis fatores extrínsecos

associados, mas também os fatores genéticos potencialmente relevantes

(FLEXNER, 2008; HAMMER et al., 2008).

Nas últimas décadas, vem se consolidando o conceito de que variações no

genoma humano são determinantes importantes que influenciam na susceptibilidade

a doenças infecciosas, sendo responsáveis pela grande variação interindividual na

resposta imune do hospedeiro após infecções, bem como na resposta a diferentes

fármacos (HASS et al., 2005). A existência de grandes diferenças populacionais,

bem como de pequenas variabilidades intrínsecas ao paciente, é consistente com a

possibilidade de a herança genética ser um determinante na resposta aos fármacos.

Estima-se que fatores genéticos sejam responsáveis por 20 a 95% da variabilidade

na biodisponibilidade e efeitos terapêuticos dos fármacos (EVANS et al., 2003).

Em geral, dois tipos de variantes genéticas são descritas: polimorfismos e

mutações. Mutações são geralmente definidas como alterações no DNA (ácido

desoxirribonucléico) que estão associadas à doença, ocorrendo em raros pacientes

(geralmente em menos de 1%). Polimorfismos, por outro lado, são variações comuns

no DNA que geralmente ocorrem em muito mais de 1% da população estudada

(WEINSHILBOUM, 2003). A maioria dos polimorfismos ocorre em nucleotídeos

individuais, sendo chamados de polimorfismos de um único nucleotídeo (do inglês

Single-Nucleotide Polymorphisms - SNPs). Outros polimorfismos ocorrem como

repetições de dinucleotídeos ou como grandes inserções ou deleções. Alguns

destes polimorfismos ocorrem em regiões codificantes dos genes, que podem ou

não mudar o aminoácido codificado, outros ocorrem em regiões não codificantes,

mas podem modular a expressão de genes individuais (WEINSHILBOUM, 2003).

A Glicoproteína P (P-gp) é codificada pelo gene MDR1, que foi

extensivamente estudado em função do fenótipo relacionado a drogas

multirresistentes em certos cânceres. Portanto, uma expressão constitutiva deste

transportador é normal em tecidos como no cérebro, nos túbulos renais, no intestino,

na placenta, nos ovários e nos linfócitos, e tem um importante papel na disposição e

na resposta das drogas (TOZZI, 2010).

A heterogeneidade genética, associada aos SNPs do gene MDR1 tem

recebido significante atenção como um potencial determinante da variabilidade na

disponibilidade e eficácia das drogas (CRESSEY, 2007).

A resposta à terapia antiretroviral tem sido estudada em relação os

polimorfismos do MDR1. A absorção oral e a penetração nos tecidos dos ITRNNs

são afetadas pelo transportador P-gp (CRESSEY, 2007). Fellay et al. encontraram

relação entre a expressão de P-gp em células mononucleares periféricas em

pacientes HIV positivos e a resposta dos linfócitos CD4 ao tratamento. Pacientes

com a variante alélica 3435C>T no exon 26 do gene MDR1 tiveram um significativo

aumento das células CD4 após 6 meses da terapia antiretroviral. Foi levantada a

hipótese de que este benefício associado ao alelo T poderia resultar da aumentada

penetração na célula do antiretroviral e aumentada concentração dentro do linfócito

CD4. Além disso, tem sido demonstrado que o efeito da superexpressão da P-gp in

vitro nas células humanas resulta em redução da suscetibilidade da infecção pelo

HIV por afetar a fusão e possível liberação viral (FELLAY et al., 2002; LEE et al.,

2000; SPECK et al., 2002).

O presente estudo incluiu, de forma prospectiva, 81 indivíduos HIV positivos

que faziam tratamento triplo com 2 ITRN e 1 ITRNN, o Efavirenz, no CEMAS de

Santa Cruz do Sul no período de 2008 a 2010.

A construção metodológica deste estudo levou em consideração limitações

existentes e citadas nos estudos revisados, buscando superar algumas das

relatadas na literatura. Porém, persistiram dificuldades associadas à realidade dos

pacientes e das instituições, como o comparecimento dos pacientes para a

realização dos exames nas 12 ou 24 semanas após início do tratamento,

necessidade de modificação da terapia antiretroviral ou associação de novos

medicamentos, ou mesmo questões associadas às técnicas laboratoriais, como

inviabilidade do material genético para análise.

Não foi encontrada relação significativa dos genótipos dos polimorfismos de

MDR1 1236C>T, 2677G>T e 3435C>T com a queda da carga viral em 12 e 24

semanas de tratemento, mas em contrapartida, a contagem de células T CD4+ teve

um aumento significativo associado ao genótipo 3435TT em comparação com o

genótipo 3435CC nas 12 e 24 semanas do tratamento incluindo Efavirenz. Não foi

realizada a análise conjunta dos genótipos e haplótipos uma vez que a literatura

relata que não apresentam efeito isolado no fenótipo. Isto foi visto por estudos que

relacionaram a carga viral e a contagem de células CD4+ nos polimorfismos

2677G>T e 3435C>T e observaram uma associação mais frequente com o genótipo

3435TT, porém não significativa (WINZER et al. 2005, HASS et al., 2005). Felley et

al., em 80 pacientes com infecção pelo HIV sob tratamento com abacavir e

amprenavir ou abacavir, nelfinavir e saquinavir ou amprenavir encontrou um

aumento significativamente maior na contagem de células T CD4+ nos pacientes

com genótipo 3435TT após 3 e 6 meses do início do tratamento, e não houve

diferenças na queda da carga viral entre os genótipos TT, CT e CC (FELLEY et al.,

2002). Foi sugerido nesse estudo que o alelo T (variante) poderia resultar emum

aumento na penetração do inibidor de protease nas células T CD4. Além de alterar a

concentração intracelular da droga, a superexpressão da P-gp in vitro demonstrou

reduzir a susceptibilidade de células CD4 à infecção por HIV, afetando a fusão viral e

possivelmente a sua liberação (LEE et al., 2000; SPECK et al., 2002).

A importância dos polimorfismos do gene MDR1 na resposta às drogas

antiretrovirais ainda está pouco claro. O aumento do número de publicações sobre

este tema nos últimos anos só confirma o amplo grau de interesse nessa área.

A resposta individual ao tratamento antiretroviral é um fenômeno complexo

que é influenciado por um grande número de variáveis biológicas. Novos estudos

sobre o papel dos polimorfismos do transportador MDR1 e enzimas envolvidas no

metabolismo de drogas são necessários para elucidar o papel dos efeitos

farmacogenéticos na terapêutica para o HIV.

3.2 Conclusão

Os resultados deste estudo permitiram as seguintes conclusões de acordo com seus

objetivos:

• O padrão de diminuição da carga viral foi similar para todos os pacientes após

12 e 24 semanas de HAART incluindo Efavirenz. A redução da carga viral em

12 e 24 semanas não se mostrou associada aos genótipos dos polimorfismos

1236C>T, 2677G>T e 3435C>T do gene MDR1.

• O padrão do aumento das células T CD4+ foi similar para todos os pacientes

após 12 e 24 semanas de HAART incluindo Efavirenz. O aumento no número

de células T CD4+ foi significativamente associado à presença do alelo

3435T, sendo mais elevado nos homozigotos 3435TT, intermediário em

3435CT e menos elevado em 3435CC. O aumento das células T CD4+ após

12 e 24 semanas de HAART incluindo Efavirenz não se mostrou associado

aos genótipos dos polimorfismos 1236C>T e 2677G>T do gene MDR1.

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APÊNDICE 1:

Numero do prontuário: _________________________ Protocolo Nº _________

TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO

Titulo do projeto: Análise de polimorfismos presentes no gene MDR e

correlação com a resposta terapêutica em pacientes HIV positivos: um estudo

farmacogenético.

Objetivos e relevância do estudo:

Nem todos os pacientes quando tomam os remédios para o tratamento do

HIV voltam a sentir-se bem e pouco se conhece sobre o porquê isto acontece.

Pouco se sabe também sobre a epidemiologia do HIV em Santa Cruz do Sul. Por

este motivo, o estudo está sendo realizado para avaliar epidemiologicamente a

população em tratamento para HIV em Santa Cruz do Sul e para tentar descobrir se

existe algum fator genético relacionado com as diferenças na resposta terapêutica.

Procedimentos:

Os voluntários que decidiram participar da pesquisa serão entrevistados para

responderem algumas questões relacionadas a sua saúde, seu perfil

socioeconômico, os fatores de risco que estão associados aos adoecimento por

tuberculose, o consumo de bebidas alcoólicas e sintomas atuais. O voluntário será

submetido a coleta de 10 mL de sangue que será realizada na face anterior do

antebraço com agulha e seringa descartáveis na primeira consulta. Uma amostra de

sangue será encaminhada para a realização dos testes genéticos e outra será

encaminhada para os testes de carga viral e contagem de linfócitos T CD4 e CD8.

Local de estudo:

Os procedimentos de coleta de sangue e entrevista serão realizados no

CEMAS no município de santa Cruz de Sul, as análises genéticas serão realizadas

na UNICS e os testes imunológicos e a carga viral serão encaminhadas para

laboratório conveniado ao SUS.

Riscos e desconfortos:

Os riscos e desconfortos aos participantes deste estudo são aqueles

associados aos procedimentos descritos acima. A coleta de sangue é de uma

pequena quantidade (10 mL) e por dificilmente causará algum mal estar geral, no

entanto poderá haver dor no local da coleta e eventualmente um pequeno

hematoma.

Desistência na participação de estudo:

A participação de cada indivíduo neste estudo é voluntária, ou seja, quem não

quiser participar do estudo esta livre para fazê-lo sem que haja qualquer perda no

atendimento. Se concordar em participar do estudo e mudar de idéia no decorrer do

mesmo, da mesma forma não sofrerá perdas relacionadas ao atendimento a que

tem direito.

Compensação financeira:

Não haverá nenhum pagamento aos pacientes que concordarem em

participar de pesquisa, bem como os participantes da pesquisa não terão nenhum

custo adicional relacionado aos exames realizados.

Confidencialidade das informações:

Toda a informação que será fornecida pelos participantes do estudo eo

resultados dos exames realizados será considerada confidencial e será somente

conhecida pela equipe envolvida no estudo, isto é, não será permitido o acesso a

terceiros. Todos os questionários e matérias coletados serão identificados através de

um código criado na entrada do estudo, este código será a única identificação

utlizada no banco de dados do estudo. Este banco de dados será utilizado para a

análise dos dados e divulgação dos mesmos no meio científico.

Perguntas e dúvidas relacionadas ao estudo:

Este termo de consentimento explica de forma clara o estudo que está sendo

proposto e convida os indivíduos a participar, no entanto se houver alguma dúvida

estas poder ao ser esclarecidas pela equipe do estudo, através da Msc. Jane

Dagmar Pollo Renner em qualquer momento do estudo pelo telefone 3717-7399.

Autorização para estocagem de material biológico:

1. Permito que a minha amostra de sangue seja guardada para ser utilizada em

outra pesquisa, mediante protocolo de pesquisa autorizado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da UNISC, ficando, no entanto livre para solicitar a destruição da mesma, a

qualquer momento, se assim desejar; (sem minha identificação e/ou mantendo

minha privacidade).

( ) Sim, permito.

( ) Não permito que minha amostra seja utilizada em novos estudos.

( ) Desejo que minha amostra seja destruída, após o fim do presente

estudo.

2. Gostaria de ser comunicado de resultados que possam interessar-me

( ) Sim, gostaria.

( ) Não gostaria de ser comunicado de novos resultados.

O significado da assinatura:

A sua assinatura abaixo significa que você entendeu a informação que lê foi

fornecida sobre o estudo e sobre este termo de consentimento. Se você assinar este

documento significa que você concorda em participar do estudo. Você receberá uma

cópia deste termo de consentimento.

Assinatura do voluntário Data:

Assinatura do entrevistador Data:

Assinatura do coordenador do estudo Data:

APÊNDICE 2: Questionário Epidemiológico

Prontuário N°: ______________ Prot ocolo N°_____________

Data da entrevista: __________ Médico:_________________

Nota: Toda a informação será mantida sob estrita confidencialidade. Este

questionário será guardado em arquivos fechados. Seu numero será a única

conexão a informação coletada.

1. Origem (1) hospital (2) ambulatório

Nome:_________________________________________________________

3. Endereço:______________________________________________________

4. Bairro:_________________________________________________________

5. Cidade: (1) Santa Cruz (2)Outra____________Telefone p/ contato

___________

6. Renda familiar (1) Sem renda (2) 1 a 3 salarios mínimos (3) de 3 a 5 (4)

mais de 5

7. Estado civil: (1) acompanhado (2) Não acompanhado (99) IGN

8. Escolaridade: ( )analfabeto ( )_____serie do ____grau (99) IGN

9. Data de nascimento: ___/___/____ Numero de pessoas em

casa____________

10. Gênero: (1) masculino (2) femenino

11. Cor da pele: (1) branca (2) mulata (3) negra (4) amarela (5) parda (6) Outra

(99) IGN

12. Profissão: ___________________________________________ (99) IGN

13. Tabagismo: (1) Sim (2) Não (99) IGN

Cigarros por dia: _____________ (99) IGN

Ex-tabagista: (1) Sim (2) Não (99) IGN

14. Uso de drogas: (1) Sim (2) Não (99) IGN Qual: _____________

15. Hepatopatias:

Hepatite B (1) Sim ( 2 ) Não (99)IGN

Hepatite C (1) Sim ( 2 ) Não (99)IGN

Cirrose (1) Sim ( 2 ) Não (99)IGN

16. Uso de corticóides ou imunodepressores (1) Sim (2)Não (99) IGN

17. Uso de anticoncepcional oral: (1) Sim (2) Não (99) IGN

18. Diabetes Mellitos: (1) Sim (2) Não (99) IGN

- uso de insulina? (1) Sim (2) Não (99) IGN

19. Neoplasia maligna: (1) Sim (2) Não (99) IGN

20. Insuficiência renal: (1) Sim (2) Não (99) IGN

21. Desnutrição (IMC<20): (1) Sim (2) Não (99) IGN

Peso:___________Altura:____________IMC________

22. Gravidez: (1) Sim (2) Não (99) IGN

23. Presidiário: (1) Sim (2) Não (99) IGN

24. Alcoolismo (critérios CAGE): (1) Sim (2) Não (99) IGN

A) Qual o tipo de bebida o Sr(a) prefere?

( )cachaça ( ) cerveja ( ) vinho ( )whisky ( )outro ( ) nenhum

Caso o paciente admita o uso de qualquer bebida citada acima, responda as

perguntas, relacionadas com alcoolismo, abaixo:

B) O Sr(a) tem facilidade de fazer amizades? ( 1)

sim (2) Não

C) Alguma vez sentiu que deveria diminuir a quantidade de bebida? ( 1)

sim (2) Não

D) Alguém critica ou já criticou seu modo de beber? ( 1) sim

(2) Não

E) Costuma beber pela manhã para diminuir o nervosismo ou a ressaca? ( 1)

sim (2) Não

F) Sente-se culpado pela maneira que costuma beber? ( 1)

sim (2) Não

Caso a reposta tenha sido sim para pelo menos 02 questões, assinale

alcoolismo como positivo.

25. Internação hospitalar nos últimos 2 anos: (1) Sim (2) Não (99)IGN

26. Uso de antiretroviral: (1) sim (2) não

27. Antiretroviral em uso:__________________________________________

Se em uso, quais os efeitos colaterias:

Dor de cabeça

Insonia

28.Outros medicamentos:_______________________________________

29. CD4/CD8 antes da terapia______________________________________

CD4/CD8 depois de 3 meses______________________________________

CD4/CD8 depois de 6 meses______________________________________

30. Carga viral antes da terapia_____________________________________

Carga viral depois de 3 meses da

terapia_____________________________________

Carga viral depois de 6 meses da

terapia_____________________________________

ANEXO 1: Aprovação do Comitê de Ética da UNISC

ANEXO 2:

Confirmação da submissão (na pagina seguinte)

ANEXO 3:

Normas da revista Antiviral Therapy (na pagina seguinte)

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