( PDF ) Análise de metodologias empregadas na detecção do ácido okadaico em moluscos bivalves sob enfoque da NBR ISO/IEC 17025.

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UFRRJ

INSTITUTO DE TECNOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA

DE ALIMENTOS

TESE

Análise de metodologias empregadas na detecção do ácido okadaico em

moluscos bivalves sob enfoque da NBR ISO/IEC 17025.

Ana Lúcia Medeiros dos Santos Ribeiro

2010

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE TECNOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA

DE ALIMENTOS

ANÁLISE DE METODOLOGIAS EMPREGADAS NA DETECÇÃO DO

ÁCIDO OKADAICO EM MOLUSCOS BIVALVES SOB ENFOQUE DA

NBR ISO/IEC 17025.

Ana Lúcia Medeiros dos Santos Ribeiro

Sob a Orientação da Professora:

Stella Regina Reis da Costa

Co-orientação do Professor:

Marcelo Azevedo Neves

Tese submetida como requisito parcial

para a obtenção do grau de Doutor em

Ciência, no Programa de Pós-

Graduação em Ciência e Tecnologia de

Alimentos. Área de concentração em

Ciência de Alimentos.

Seropédica, 19 de Julho de 2010

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UFRRJ / Biblioteca Central / Divisão de Processamentos Técnicos

594

R484a

Ribeiro,

Ana Lúcia Medeiros dos

Santos, 1967-.

Análise de metodologias

empregadas na detecção do Ácido

Okadaico em moluscos Bivalves sob

enfoque da NBR ISO/IEC 17025 /

Ana

Lúcia Medeiros dos Santos Ribeiro –

2010.

87 f.: il.

Orientador: Stella Regina R

eis da

Costa.

Tese (doutorado) –

Universidade

Federal Rural do Rio de Janeiro,

Programa de Pós-Graduação em

Ciência

e Tecnologia de Alimentos.

Bibliografia: f. 77-87.

1. Bivalve (Molusco) -

Teses. 2.

Alimentos – Análise -

Teses. 3.

Intoxicação alimentar –

Teses. I.

Costa, Stella Regina Reis da, 1957-

II. Universidade Federal Rural do

Rio de Janeiro. Programa de Pós-

Graduação em

Ciência e Tecnologia de

Alimentos. III. Título.

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE TECNOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

ANA LÚCIA MEDEIROS DOS SANTOS RIBEIRO

Tese submetida como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciências, no

Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Área de concentração

em Ciência de Alimentos.

TESE APROVADA EM: 19 de Julho de 2010

________________________________________________________________

Stella Regina Reis da Costa (Dra) - UFRRJ

(orientadora)

________________________________________________________________

Eliane Teixeira Mársico (Dra) - UFF

________________________________________________________________

Walnei Smarçaro (Dr.) - INMETRO

________________________________________________________________

Sérgio Carmona de São Clemente (Dr.) - UFF

________________________________________________________________

Pedro Paulo de Oliveira Silva (Dr.) - UFRRJ

DEDICATÓRIA

Aos meus queridos filhos Hugo e Yuri......

AGRADECIMENTOS

A Deus, que me acompanha em tudo o que faço;

Aos meus pais, João e Luizete, pelo incentivo e apoio constante, além do exemplo de

vida e dedicação;

Ao meu querido marido José Tadeu e aos nossos filhos Hugo e Yuri, pelo apoio,

incentivo e compreensão nos momentos em que o tempo dedicado a eles foi subtraído pelo

estudo;

Aos meus irmãos Grácia, Antônio, João e Eremita que sempre estiveram presentes,

mesmo quando distantes;

A minha querida orientadora Stella Regina Reis da Costa, pela orientação e confiaça

no desenvolvimento do trabalho;

Ao professor Marcelo Azevedo Neves, pela co-orientação e pelo importantíssimo

auxílio na determinação da estimativa da incerteza e pela presença sempre constante;

As amigas Vanessa e Gesilene, pela presença constante, incentivo e apoio

incondicional, principalmente naquelas horas em que dá vontade de jogar tudo para o alto;

Ao professor e amigo Pedro Paulo de Oliveira Silva, pelo apoio, incentivo e amizade e

principalmente pela confiança depositada;

A equipe ToxMar, pelo apoio e amizade;

A todos que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho;

RESUMO

RIBEIRO, Ana Lúcia Medeiros dos Santos. Análise de metodologias empregadas na

detecção do ácido okadaico em moluscos bivalves sob enfoque da NBR ISO/IEC 17025.

2010. 87f. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos). Instituto de Tecnologia,

Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro,

Seropédica, RJ, 2010.

Como alimento utilizado pelo homem, os moluscos bivalves são considerados de excelente

valor nutricional, pois contém proteínas de excelente valor biológico, baixo teor de gorduras,

vitaminas, minerais e carboidratos. Estes moluscos são filtradores e se alimentam

principalmente de organismos fitoplanctônicos (microalgas), que podem produzir a ficotoxina

ácido okadaico (AO) e seus congêneres que são os principais responsáveis pelo

desencadeamento do Envenenamento Diarréico por Moluscos que acomete humanos.

Portanto, o controle da qualidade da água de cultivo e da carne dos moluscos é fundamental

para garantir que ele não ofereça riscos à saúde do consumidor. O presente estudo em como

objetivo geral analisar sob o enfoque da NBR ISO/IEC 17025 três metodologias analíticas

empregadas na detecção da ficotoxina diarreica ácido okadaico que empregam a

cromatografia líquida de alta eficiência como método de identificação e quantificação. A

operacionalidade e a acessibilidade de cada metodologia foi analisada através da elaboração

de fluxogramas detalhando etapas, solventes, reagentes e equipamentos utilizados. A partir da

comparação pode-se concluir que a metodologia Silva (2001) apresentou vantagens quanto a

redução do tempo de realização e do custo por análise. Foram identificados os requisitos

técnicos da norma NBR ISO/IEC 17025 que serão considerados para que sejam

implementados, foram identificadas as fontes de incerteza que influem no resultado das

análises e foi estimada incerteza da metodologia Silva (2001).

Palavras-chave: Envenenamento Diarreico por Moluscos, Pescado, Estimativa da Incerteza,

Segurança do Alimento, Metodologia Analítica.

ABSTRACT

RIBEIRO, Ana Lúcia Medeiros dos Santos. Methodologies Analysis used in okadaic acid

detection from shellfish under approach of ISO / IEC 17025. 2010. 87f.. Thesis (Ph.D. in

Science and Technology of Food). Instituto de Tecnologia, Universidade Federal Rural do

Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2010.

Used as food by man, bivalve molluscs are considered of great nutritional value because it

contains protein of high biological value, low-fat, vitamins, minerals and carbohydrates.

These shellfish are filter feeders and feed mainly on phytoplankton (microalgae), which can

produce Phycotoxins okadaico acid (OA) and their counterparts who are primarily responsible

for triggering the Shellfish Poisoning by diarrhea that affects humans. Therefore, control of

water quality and cultivation of shellfish meat is crucial to ensuring that it does not pose a risk

to consumer health. In this study we analyzed the methodologies used in the detection of AO

by high performance liquid chromatography under focus of ISO / IEC 17025. The operability

and accessibility of each method was analyzed by drawing flowcharts detailing steps,

solvents, reagents and equipment used. From the comparison we can conclude that the Silva

(2001) methodology presented the advantages regarding the reduction of time of performance

and cost analysis. It identified the technical requirements of standard ISO / IEC 17025 which

will be considered to be implemented and We identified the sources of uncertainty that

influence the outcome of the analysis and was estimated the uncertainty of the Silva (2001)

methodology.

Key words: Diarrhoetic Shellfish Poisoning, Fish, Estimation of Uncertainty, Food Security,

Analytical Methodology.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Dados de produção aquícola mundial. A) Valores percentuais por grupos

referentes ao volume de produção total de 51,7 milhões de toneladas; B) Valores

percentuais por grupos referentes ao montante total gerado de U$$ 78,8 bilhões.

Modificada de FAO (2009).

Figura 2. Ficotoxina diarreica Ácido Okadaico e seus congêneres

Dinophysistoxina-1,2,3. Onde R1, R2 e R3 são os radicais onde se encaixam o

hidrogênio (H), metil (CH

) e acil na molécula possibilitando a diferenciação

entre os congêneres. Modificado de FAO (2004).

Figura 3.

Fatores quem ocasionam variações nos resultados devido à medida

(LINHARES et al 2002).

Figura 4. Fatores que ocasionam variações nos resultados devido ao método de

ensaio. (LINHARES et al 2002).

Figura 5. Fatores que ocasionam variações nos resultados devido aos

equipamento (Adaptado de LINHARES et al, 2002)

Figura 6. Fatores que ocasionam variações nos resultados devido ao material.

(LINHARES et al 2002).

Figura 7. Etapas do processo da estimativa da incerteza (ELLISON et al., 2003

)

Figura 8. Representação da distribuição normal (ELLISON et al., 2003)

Figura 9. Representação da distribuição retangular (ELLISON et al., 20003).

Figura 10. Representação da distribuição triangular (ELLISON et al., 20003).

Figura 11. Fluxograma das etapas, reagentes e procedimentos da metodologia

Lee et al (1987).

Figura 12. Fluxograma das etapas, reagentes e procedimentos da metodologia

SIGMA (1993)

Figura 13. Fluxograma das etapas, reagentes e procedimentos da metodologia

Silva (2001).

Figura 14. Etapas do procedimento de quantificação da toxina AO que

contribuem com a incerteza da metodologia Silva (2001).

Figura 15. Diagrama de Ishigawa das fontes de incerteza na determinação da

concentração de BAP em ACN.

Figura 16. Diagrama de Causa e efeito das fontes de incerteza no preparo da

solução padrão de AO.

Figura 17. Cromatograma do padrão ácido ocadaico com tempo de retenção

16,150 e área de 148434. Fonte: Lourenço et al.,(2007a).

Figura 18. Diagrama de Causa e efeito das fontes de incerteza do procedimento

caracterização do padrão.

Figura 19. Cromatograma da amostra 01 da primeira coleta realizada na enseada

de Maciéis. A) cromatograma da amostra com a presença da toxina com tempo de

retenção de 16,675 e área de 43711 e B) da coinjeção com tempo de retenção de

16,728 e área de 65698. (Fonte: Lourenço et al., (2007a)

Figura 20. Diagrama de causa e efeito das fontes de incerteza na etapa de

quantificação da massa de toxina AO em uma amostra.

LISTA DE QUADROS

Quadro 1.

Dados utilizados no Cálculo da Dose Aguda de Referência para a

ficotoxina diarreica ácido okadaico (e equivalentes) por pesquisadores Ad hoc da

FAO/IOC/WHO para Biotoxinas Marinhas (UNESCO, 2005) comparado ao

recomendado pela European Food Safety Authority (ALEXANDER et al., 2008).

Quadro 2. Métodos de ensaio e métodos analíticos utilizados para detecção de

toxinas diarreicas em moluscos bivalves; adaptado de Fernandéz et al., (2002).

Quadro 3. Principais Caracte

rísticas dos métodos de detecção para toxinas

diarreicas do grupo dos okadaiatos (ALEXANDER et al., 2008).

Quadro 4 Condições cromatográficas para detecção da ficotoxina ácido

okadaico propostas por LEE et al., 1987.

Quadro 5. Condições cromatográficas para detecção de AO propostas por

SIGMA (1993).

Quadro 6. Condições cromatográficas para detecção de AO em sistema de

CLAE-DF propostas por Silva (2001).

Quadro 7. Estrutura de organização da NBR ISO/IEC 17025, apresentando

os requisitos da direção e os requisitos técnicos que devem ser contemplados

pelo laboratório ao implantar a norma.

Quadro 8. Divisor utilizado em cada distribuição

Quadro 9. Relação entre nível de confiança e fator de abrangência.

Quadro 10. Checklist elaborado baseado nas análises realizadas sob o

enfoque da NBR ISO/IEC 17025, permite a organização dos itens necessários

para a realização das análises a partir da seleção e verificação da vidraria, dos

reagentes, dos equipamentos e do analista. Indicndo as ações que devem ser

tomadas.

Quadro 11. Resumo das grandezas medidas diretamente para cálculo da

massa do padrão injetado no cromatógrafo

Quadro 12. Resumo dos valores usados na metodologia Silva (2001) para

cálculo da incerteza-padrão da massa de padrão usada na análise

cromatográfica.

Quadro 13. Tempo de retenção (em minutos) e área do padrão do AO em

sistema CLAE-DF, utilizando coluna C18 e fase móvel acetonitrila: água ultra

pura, na proporção 85:15 (v/v)

(

LOURENÇO et al., 2007a).

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Solventes utilizados na etapa de extração das metodologias

analisadas. A - Lee et al., (1987); B - SIGMA (1993); C – Silva (2001).

Tabela 2. Reagentes cromóforos, bases catalisadoras, tempos e temperaturas

utilizados na etapa de derivação das metodologias analisadas. A - Lee et al.,

(1987); B - SIGMA (1993); C – Silva (2001).

Tabela 3. Variáveis passíveis de aumentar a incerteza na detecção do AO

identificadas nas metodologias analisadas.

Tabela 4. Componentes da incerteza da etapa do preparo da solução de

1-bromoacetil(pireno) (BAP) em acetonitrila (ACN)

Tabela 5. Componentes da incerteza da etapa do preparo do padrão AO

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas

ACN - acetonitrila

ADAM - 9-antrildiazometano

ANVISA – Agência Nacional de Vigilânica Sanitária

AO – Ácido okadaico

CGCre – Coordenação Geral de Credenciamento

CLAE-DF – Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por flourescência

CNCMB - Comitê Nacional de Controle Higiênico-Sanitário de Moluscos Bivalves

BAP - 1-(bromoacetil)pireno

BPL – Boas Práticas de Laboratório

DICLA - Divisão de Credenciamento de Laboratórios de Calibração e de Ensaio.

DIISO - N,N-diisopropiletilamina

DTX1 – Dinofisistoxina 1

DTX2 – Dinofisistoxina 2

DTX-3 - Dinofisistoxina 3

FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations – Organização de

Alimentos e Agricultura das Nações Unidas

FDA – Food and Drug Administration – Administração de Drogas e Alimentos nos Estados

Unidos.

INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial

MAPA – Minitério de Agricultura Pecuária e Abastecimento

NATA - National Association of Testing Authorities

POP – Procedimento Operacional Padrão

SEAP – Secretaria Especial de Aquicultura e Pesca

SGQ – Sistema de Gestão da Qualidade

SI – Sistema Internacional de Unidades

SQ – Sistema de Qualidade

TEA - trietilamina

URL - Uniform Resource Locator - Localizador Uniforme de Recursos

VIM - Vocabulário Internacional de Termos Fundamentais e Gerais de Metrologia

Símbolos utilizados no cálculo da incerteza

- área do pico de retenção da toxina no cromatógrafo

- Concentração inicial de BAP em ACN

- concentração de AO dissolvido em ACN

K – fator de abrangência

- massa inicial de BAP

- massa de BAP em V

- massa de AO inicialmente dissolvida em ACN

- massa de AO coletada, presente em V

mp - massa do padrão

- massa da toxina na amostra

– resolução da pipeta usada para medir V

- resolução da pipeta usada para medir V

u(m3) - incerteza-padrão de m

u(V3) - incerteza-padrão de V

u(V4) - incerteza-padrão de V

u(m4) - incerteza-padrão de m

(massa de AO coletada)

u(V

) - incerteza-padrão de V

u(m

) = incerteza-padrão da massa da toxina

u(mp) = incerteza-padrão da massa do padrão

u(Ap) = incerteza-padrão da área do pico de retenção do padrão

u(A

)

= incerteza-padrão da área do pico de retenção da toxina.

- volume inicial de ACN

- volume coletado da solução de BAP em ACN

- volume de ACN inicialmente usado para dissolver o AO

- volume coletado da solução de AO em ACN

- soma de volumes coletados: V

= V

+ V

Va - volume da amostra injetada

Vp - volume do padrão

U – Incerteza expandida;

uc – Incerteza combinada;

u – Incerteza padrão;

u(y) – Incerteza padrão associada aos dados de entrada;

u(x) – Incerteza padrão associada aos dados de saída;

uA – Incerteza padrão do tipo A;

uB – Incerteza padrão do tipo B;

ua – Incerteza padrão relativa a amostra;

up – Incerteza padrão relativa ao padrão;

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO

1.1 Apresentação do Problema 01

1.2 Justificativa

1.3 Hipótese

1.4 Objetivos

1.4.1 Objetivo geral 04

1.4.2 Objetivos específicos 04

1.5 Relevância 04

1.6 Delimitação da Pesquisa

1.7 Estrutura do Trabalho

REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Moluscos Bivalves 06

2.1.1 Taxonomia e aspectos gerais 06

2.2 Moluscos Bivalves na Alimentação Humana 06

2.2.1 Valor nutricional dos moluscos bivalve

2.3

Alimento Seguro Aplicado ao Pescado

2.4 Toxinas Diarréicas

2.4.1 Estrutura química 10

2.4.2 Envenenamento diarréico por molusco 12

2,4.3 Níveis máximos permitidos: panorama nacional e internacional 13

2.5

Metodologia de Detecção de To

xinas

Diarreica

2.5

.1 Método normativo: bioensaio com camundongos

2.5.2

Cromatografia

líquida de alta e

ficiência

2.5.3 A metodologia oficial (LEE et al, 1987) 18

2.5.4 A metodologia descrita por SIGMA (1993) 19

2.5.5 A metodologia SILVA (2001) 20

2.5.6 Análise critica das diferenças entre as metodologias analisadas

2.6 Ferramentas da

Qualidade

2.7

Norma

ABNT NBR ISO/IEC 17025

2.7.1 Métodos de ensaio e calibração e validação de métodos 24

2.7.2 Equipamentos 24

2.7.3 Rastreabilidade da medição 25

2.7.3.1 Materiais de referência 25

2.7.4

Manuseio de itens de ensaio e calibração

2.7.5

Garantia da qualidade dos resultados de ensaio e calibraçã

2.7.6 Principais causas de erro em alguns requisitos técnicos e suas ações preventivas 27

2.8 Incerteza 29

2.8.1 Processso de estimativa da incerteza de medição 30

2.8.2 Formas de avaliação da incerteza 32

2.8.3 Tipos de incerteza

2.8.3.1 Incerteza padrão (

)

2.8.3.2 Incerteza padrão combinada (

)

2.8.3.3 Incerteza expandida (U) 36

3 METODOLOGIA DA PESQUISA

.1 Classificação da

esquisa

.2 Etapas da

esquisa

.2.1 Metodologia

3.2.2 Coleta de dados 38

3.2.3 Seleção das metodologias empregadas na detecção de toxina diarreicas a serem analisadas 39

3.2.4 Estudo e avaliação dos itens na norma NBR ISO/IEC 17025 junto ao INMETRO 39

3.2.5 Avaliação das metodologias identificando as principais variáveis que podem interferir no

reaultado

3.2.6 Identificação dos requisitos da norma NBR ISO/IEC 17025 a serem implementados

3.2.7 Elaboração do procedimento para o cálculo da incerteza

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Comparação entre as Metodologias Analisadas

4.1.2 Etapas

4.1.3 Solventes e reagentes utilizados em cada metod

ologia

4.2 Operacionalidade e Acessibilidade

4.3 Possíveis Variáveis Interferentes Identificadas nas Metodologias Analisadas

4.4 Requesitos Técnicos da NBR ISO/IEC 17025 a Serem Implementados

4.5 Elaboração do Procedimento Para o Cálculo da Incerteza de Medição da Metodologia

de Detecção de AO Proposta por SILVA (2001)

4.5.1 Estimativa da incerteza da metodologia Silva (2001) pela ABORDAGEM

RESUMIDA

4.5.2 Estimativa da incerteza da metodologia Silva (2001) pela ABORDAGEM

DETALHADA

4.5.2.1 Incerteza da etapa de preparo da solução de 1-

bromoacetil(pireno) (BAP)

4.5.2.2 Preparo da solução padrão de ácido okadaico (AO)

4.5.3 Caracterização do padrão no cromatógrafo Waters 740

4.5.4 Quantificação da toxina em uma amostra usando um cromatógrafo Waters 740

4.5.4.1 Cálculo da incerteza padrão da área do padrão u(

AT-I

) e da área da toxina u(

AP-I

)

4.5.4.2 Cálculo da incerteza padrão da massa de toxina (u(m

))

5 CONCLUSÕES

6 RECOMENDAÇÕES

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 INTRODUÇÃO

1.1 Apresentação do Problema

A qualidade do pescado está diretamente relacionada à qualidade do ambiente em que

ele está ou vive. O consumo do mesmo pode acarretar doenças em humanos, através da

transmissão via cadeia alimentar de microrganismos patogênicos, parasitoses e biotoxinas

produzidas pelo fitoplâncton, as ficotoxinas.

Em zonas costeiras, locais de grande produtividade, a população local é fortemente

dependente da atividade pesqueira (pesca e aquicultura) para a obtenção de proteína animal.

Ao longo das últimas quatro décadas, as estatísticas mostram uma acentuada redução da

atividade pesqueira proveniente da pesca extrativista e a ascenção da aquicultura (cultivo de

organismos aquáticos). Demostra assim seu potencial para atender aos desafios da segurança

alimentar que poderá dispor da metade do pescado consumido pela população humana

mundial, da geração de empregos e renda, principalmente em países em desenvolvimento. No

ano de 2006, este segmento do setor pesqueiro foi responsável por 47% do pescado

consumido no mundo gerando um consumo per capita de 7,8 kg (FAO, 2007).

No cenário brasileiro a aqüicultura também encontra-se em plena ascenção,

apresentando um crescimento médio anual de 21,1%, sendo o segmento da malacocultura

(cultivo de moluscos) a segunda atividade mais expressiva da maricultura (cultivo de

organismos marinhos) brasileira destacando-se na economia do país. A produção nacional é

liderada por Santa Catarina (em fase de industrialização da cadeia produtiva), seguida de São

Paulo, Espírito Santo e Rio de Janeiro (BRASIL, 2008). No ano de 2000, 75% dos bivalves

disponíveis para o consumo foram fornecidos por cultivos.

No estado do Rio de Janeiro, esta atividade vem se destacando através do cultivo de

moluscos bivalves, principalmente em função da potencialidade do litoral fluminense para o

seu desenvolvimento (áreas abrigadas, temperaturas amenas), baixo custo de produção inicial,

da padronização e fornecimento constante do produto e rentabilidade. A produção de bivalves

(ostras, mexilhões e vieiras) no ano de 2006 atingiu um volume de 25,9 toneladas (receita de

R$ 183.000,00). Na Baía de Sepetiba, a produção de bivalves compreende o cultivo de

mexilhões da espécie Perna perna (LINNAEUS, 1758) e de vieiras Nodipecten nodosus

(LINNAEUS, 1758). A produção média anual ainda é modesta, mas a atividade é de

importante cunho social e econômico para a região porque é geradora de alimento e

empregos, atuando na complementação da renda de pescadores artesanais contribuindo para a

fixação das populações tradicionais em seus locais de origem. No contexto brasileiro, o baixo

custo para iniciar a produção levou a um grande crescimento da atividade, antes mesmo que

houvesse tempo para regulamentação da maricultura no país.

Moluscos bivalves (mexilhões, ostra e vieiras) são animais filtradores que se

alimentam exclusivamente de partículas como matéria orgânica e principalmente as

microalgas marinhas que se encontram em suspensão na água. Dentre as microalgas existem

algumas que são produtoras de ficotoxinas que apresentam efeitos nocivos ao homem.

Os moluscos não possuem capacidade seletiva na filtração dos alimentos e são capazes

de bioacumular uma série de substâncias e agentes potencialmente nocivos, entre eles as

ficotoxinas (toxinas produzidas por microalgas). Desse modo, o consumo de certos frutos do

mar pode ser nocivo à saúde humana e se faz necessário o controle de sua produção e

comercialização tanto ao nível de mercado externo quanto de mercado interno para garantir a

saúde do consumidor.

Na última década tem-se observado um aumento nos casos envolvendo intoxicações

por ficotoxinas marinhas associadas ao consumo de mexilhões. No Brasil foram identificadas

as microalgas produtoras e a ficotoxina ácido okadaico no litoral sul, sudeste e nordeste, fato

que aumenta a necessidade de investimento no controle da qualidade da produção.

Segundo recomendação da Comissão Oceanográfica Intergovernamental da UNESCO,

regiões onde haja consumo de moluscos e que não sejam submetidas a nenhum tipo de

monitoramento (da qualidade dos organismos e/ou do ambiente) devem ser consideradas de

alto risco para a Saúde Pública.

Na Europa, Japão, Estados Unidos da América e na América do Sul (Chile, Argentina

e Uruguai) o controle das ficotoxinas em frutos do mar é realizado através de monitoramento

constante da qualidade da água e do pescado, principalmente moluscos filtradores e peixes,

antes que estes cheguem ao mercado. No Brasil ainda não existe uma regulamentação sobre o

assunto. Existe apenas a Portaria do Ministério da Saúde (MS) Nº. 518 de 25 de março de

2004 (BRASIL, 2004) que aprova normas, procedimentos e responsabilidades relativos ao

controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano. Nesta portaria no Capítulo

II Art. 4º parágrafo X e XI as ficotoxinas produzidas por cianobactérias (microcistinas,

cilindrospermopsina e saxitoxinas) são incluídas, assegurando desta forma o consumo de água

por humanos (BRASIL, 2004).

Em outubro de 2005, através do Decreto nº 5.564, foi instituído o Comitê Nacional de

Controle Higiênico-Sanitário de Moluscos Bivalves (CNCMB) com o objetivo de

“estabelecer e avaliar os requisitos necessários para a garantia da qualidade higiênico-sanitária

dos moluscos bivalves, visando à proteção da saúde da população e a criação de mecanismos

seguros para o comércio nacional e internacional” (BRASIL, 2005).

1.2 Justificativa

A questão das algas nocivas é um pouco mais complexa. É muito difícil prever com

precisão onde e quando ocorrerão eventos de florações de algas tóxicas, mesmo em situações

nas quais existe um longo histórico de análises. Por este motivo, a classificação de áreas em

mais ou menos afetadas por esse tipo de evento, não resolve o problema. Para determinar

com segurança se os moluscos produzidos oferecem risco de intoxicação por ficotoxinas

(toxinas produzidas por algas) é necessário o monitoramento constante dos níveis de toxina

nos mexilhões e da concentração de algas tóxicas na água onde eles são cultivados.

Nos países onde existe o monitoramento da qualidade da água de cultivo e da carne do

molusco, são utilizados métodos biológicos para a detecção da ficotoxina, no entanto, estes

métodos apresentam baixa especificidade e seletividade além de enfrentarem problemas éticos

com relação a utilização de camundongos. Os métodos analíticos são constantemente

utilizados para detectar e quantificar amostras positivas para o bioensaio. A União Européia

tem recomendado que sejam empenhados esforços a fim de desenvolver metodologias mais

acessíveis e que tenham seus resultados garantidos quanto a qualidade (ALEXANDER et al.,

2008). Métodos como a cromatografia líquida de alta eficiência são capazes de detectar e

quantificar a toxina ácido okadaico (AO) e seus congêneres dinofisistoxina-1 (DTX-1),

dinofisistoxina-2 (DTX-2) e dinofisistoxina-3 (DTX-3) em baixas concentrações, prevenindo

assim, além do efeito agudo, o efeito crônico da ação desta ficotoxina que é a carcinogênese.

Pesquisas desenvolvidas no litoral sul do Rio de Janeiro registraram a presença de

espécies de dinoflagelados potencialmente tóxicos e detecção da toxina ácido okadaico em

mexilhões explotados de bancos naturais e cultivados em fazendas de maricultura no litoral

sul do Rio de Janeiro, nas baías de Sepetiba e Ilha Grande (FERREIRA, 2004; OLIVEIRA,

2005; LOURENÇO et al., 2007a; MARINÉ et al., 2010).

Na baía de Sepetiba a maricultura tem um importante cunho social e econômico

(SCOTT, 1998). A ilha Guaíba e a ponta da Marambaia são ambientes costeiros empregados

para o cultivo de moluscos bivalvos com fins comerciais. Na Ilha Guaíba funcionam duas

fazendas marinhas: a da VALE (antiga MBR) que iniciou um trabalho de repovoamento da

baía em 1996 cultivando pós-larvas de camarão-rosa (Farfantepeneaus paulensis, PÉREZ-

FARFANTE, 1967) e, posteriormente, iniciaram os cultivos com mexilhões (P. perna), ostras

(C. gigas) e vieiras (N. nodosus); e a AMAR que está em funcionamento desde 2005

cultivando principalmente mexilhões (P. perna) e vieiras (N. nodosus), com perspectivas para

o cultivo de ostras (C. gigas). A fazenda encontra-se a 6,2 km de distância de Mangaratiba e

atualmente cerca de 30 maricultores (na sua maioria mulheres) associados a AMAR. O

volume produzido ainda é modesto, mas muito significativo (principal fonte de renda) para as

famílias envolvidas na atividade. No ano de 2007 a produção foi de 6.630 kg de mexilhões

(informação verbal)

. No costão rochoso da ilha da Marambaia, em Pescaria Velha, existe um

importante banco natural de mexilhões (P. perna) que é explotado por catadores e

marisqueiros da região. O molusco é comercializado no mercado local e/ou usado para o

sustento de suas famílias. Deste banco natural também são retiradas pelos maricultores da

AMAR as sementes de mexilhões que são usadas para a confecção das cordas mexilhoneiras,

havendo também a possibilidade de abastecimento de outras fazendas da região segundo

preconizado pela Instrução Normativa 105 do IBAMA (2006) (BRASIL, 2006).

Desde 2006 o Laboratório de Toxinas Marinhas (ToxMar – DTA/IT/UFRRJ) atua em

parceria com a Associação de Maricultores de Mangaratiba e com a Secretaria de Agricultura,

Meio Ambiente e Pesca (Prefeitura de Mangaratiba) através da realização de um

monitoramento piloto do fitoplâncton potencialmente tóxico, da qualidade bacteriológica dos

moluscos produzidos e da água do cultivo, além de orientar e conscientizar quanto a

necessidade de implantação de boas práticas na aquicultura.

A fim de ampliar sua atuação em relação ao monitoramento da qualidade da carne dos

moluscos comercializados e consumidos pela população, o laboratório ToxMar busca o

desenvolvimento de seus processos com base em ferramentas que garantam a qualidade de

seus resultados, possibilitando que estes possam ser comparáveis a padrões oficiais de órgãos

regulamentares estabelecidos pelos órgãos governamentais. A norma NBR ISO/IEC 17025, é

uma ferramenta que descreve o mecanismo para evidenciar a competência técnica dos

laboratórios na realização de calibrações e ensaios. Esta norma determina habilidades, atitudes

e conhecimentos que, quando integrados e utilizados, permitem atingir com sucesso os

resultados esperados nos ensaios analíticos, envolvendo todos os processos de um Sistema de

Gestão da qualidade, garantindo a qualidade dos mesmos.

A aplicação do conceito de incerteza de medição é fundamental para os laboratórios

brasileiros que almejam obtenção de reconhecimento pelo INMETRO da capacidade de

realização de ensaios em conformidade com a NBR ISO/IEC 17025.

A utilização da palavra incerteza transmite certo desconforto imediato, uma sensação

de insegurança. Do ponto de vista técnico-científico, esta palavra expressa dúvida em relação

a um resultado analítico. Independentemente da área de atuação, é de extrema importância o

estudo e o conhecimento da incerteza de medição associada a um resultado de análise, em

particular quando aplicado à indústria de alimentos. O conhecimento da incerteza possibilita a

tomada de decisões quanto às conformidades econômicas, legais e de saúde em produtos

passíveis de fiscalização.

A determinação da incerteza da medição permite ampliar a confiabilidade da análise,

visto que, o resultado de uma medição é meramente uma estimativa do valor do mensurado,

ao relatar seu resultado torna-se necessária a indicação quantitativa e qualitativa desta

estimativa, de forma tal que aqueles que a utilizam possam avaliar sua confiabilidade e

Notícia fornecida por Silvia Melo no XXI Encontro Brasileiro de Malocologia (EBRAM), no Rio de Janeiro,

em julho de 2009.

permite que estes resultados possam ser comparados com padrões oficiais de órgãos

regulamentares. O conhecimento da incerteza da metodologia utilizada permite avaliar sua

eficiência bem como identificar as fontes de incerteza e, a partir destas, avaliar aquela que

exerce maior efeito sobre o resultado, podendo assim minimizar sua interferência.

1.3 Hipótese

Os ensaios que não seguem os procedimentos propostos na norma NBR ISO/IEC

17025 podem conter erros experimentais levando a falsos resultados.

1.4 Objetivos

1.4.1 Objetivo Geral

Comparar qualitativamente sob o enfoque da NBR ISO/IEC 17025 três metodologias

analíticas empregadas na detecção da ficotoxina diarreica ácido okadaico que empregam

a cromatografia líquida de alta eficiência como método de identificação e quantificação

desta ficotoxina.

1.4.2 Objetivos Específicos

- Elaborar fluxograma de procedimentos para cada metodologia analisada, identificando

etapas, solventes e reagentes utilizados;

- Comparar aspectos de operacionalidade e acessibilidade das metodologias avaliadas;

- Identificação dos requesitos técnicos da NBR ISO/IEC 17025 passíveis de serem

emplementados nas metodologias analisadas;

- Identificar quais as variáveis que contribuíram para a incerteza nas etapas analisadas

da metodologia detecção do AO em mexilhões proposta por Silva (2001);

- Desenvolver o procedimento para realizar a estimativa da incerteza da metodologia de

detecção do AO em mexilhões proposta por Silva (2001);

- Estimar a incerteza da metodologia de detecção do AO em mexilhões proposta por

Silva (2001);

- Identificar as etapas que contribuem significativamente para a incerteza final do

resultado;

1.5 Relevância

A ausência de monitoramento representa um risco constante à saúde do consumidor

que pode estar consumindo produtos contaminados por ficotoxinas. Além disso, os ensaios de

detecção realizados sem o controle da garantia da qualidade podem gerar resultados com erros

e não corresponderem à realidade. Estes resultados poderiam expressar valores acima dos

reais, implicando na proibição do consumo de produtos que apresentarem níveis de

contaminação toleráveis. Essas ações poderiam gerar impactos sociais, uma vez que

acarretaria a proibição do consumo com reflexos na comercialização, fato que resultaria em

prejuízos na arrecadação de renda pelos maricultores. Por outro lado, os resultados das

análises poderiam ainda expressar valores abaixo dos reais, o que resultaria na liberação para

o consumo de produtos com níveis acima do permitido pela legislação, pondo em risco a

saúde dos consumidores. Desta maneira, as informações geradas poderão contribuir para o

desenvolvimento de análises cromatográficas para detecção do ácido okadaico,

fundamentadas no modelo de gestão proposto pela NBR ISO/IEC 17025, garantindo desta

forma a qualidade dos resultados gerados.

O desenvolvimento dos estudos comparativos das metodologias de detecção do AO,

objetivam identificar as possíveis vantagens operacionais e de acessibilidade, inerentes a

utilização da metodologia proposta por SILVA (2001) desenvolvida e utilizada no

Laboratório ToxMar para a detecção e quantificação da toxina AO em moluscos bivalves; e

identificar itens da norma NBR ISO/IEC 17025 passíveis de serem implantados no laboratório

a fim de garantir a qualidade dos seus ensaios de detecção, favorecendo a ampliação do

projeto piloto de monitoramento através da realização de pesquisas de detecção de AO.

Este trabalho concentra esforços no sentido de contribuir para o aumento de

informações relativas a incertezas de medições aplicadas a laboratórios de detecção de toxinas

marinhas. O conhecimento gerado por esta pesquisa constituirá insumo para a implantação de

um sistema de gestão da qualidade no Laboratório ToxMar/UFRRJ favorecendo o

desenvolvimento de suas atividades junto ao desenvolvimento da maricultura responsável e

para a manutenção da saúde dos consumidores no litoral sul do Rio de Janeiro sob a

perspectiva do alimento seguro.

1.6 Delimitação da Pesquisa

A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Toxinas Marinhas (ToxMar –

DTA/IT/UFRRJ), portanto, os itens da norma NBR ISO/IEC 17025 selecionados atendem a

realidade deste laboratório.

Foram analisadas três metodologias de detecção da ficotoxina ácido okadaico por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE-DF): metodologia Lee et al (1987),

metodologia SIGMA (1993) e a metodologia Silva (2001). A realização da análise foi baseada

em informações obtidas em publicações científicas e entrevistas com pesquisadores.

A análise teve como foco principal a operacionalidade (número de etapas, tempo de

realização e condições exigidas) e acessibilidade (custo e condições de armazenamento dos

reagentes e solvente) de cada metodologia, além de identificar os requisitos da norma NBR

ISO/IEC 17025 passíveis de serem implementados no laboratório ToxMar.

Foi desenvolvido o procedimento para determinação da incerteza de medição da

metodologia proposta por Silva (2001), visto que, esta é a metodologia utilizada nas análises

de detecção realizadas no laboratório ToxMar,

1.7 Estrutura do Trabalho

Esta pesquisa se organiza da seguinte forma: revisão de literatura que consiste na

fundamentação teórica na qual se baseia o presente estudo; metodologia que evidencia os

procedimentos adotados para a realização da pesquisa, resultados e discussão, onde são

apresentados os resultados e é realizada uma discussão baseada em autores e estudos

anteriores, as conclusões obtidas, as recomendações futuras e a bibliografia utilizada.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Moluscos Bivalves

2.1.1 Taxonomia e aspectos gerais

Os bivalves são animais invertebrados, exclusivamente aquáticos, pertencentes ao filo

Mollusca, classe Bivalvia (também chamada Pelecypoda ou Lamellibranchia). Caracterizam-

se por apresentarem massa corporal mole e não segmentada, protegida por duas estruturas de

carbonato de cálcio denominadas valvas (conchas) (LEAL e FRANCO, 2008).

Domínio Eukaria

Filo Mollusca

Classe Bivalvia

Ordem Mytiloida

Família Mytilidae

Gêneros Mytilus, Mytella e Perna

Ordem Ostreoida

Família Ostreidae

Gêneros Crassostrea, Ostrea

Ordem Pteroida

Família Pectinidae

Gêneros Pecten, Nodipecten, Argopecten

2.2 Moluscos Bivalves na Alimentação Humana

Moluscos bivalves são utilizados na alimentação humana desde a pré-história.

Segundo Ranabal (1988) evidências como depósitos de conchas próximos à cavernas

empregadas como habitação por hominídeos e uso de conchas na manufatura de adornos

indicam o consumo deste tipo de alimentos.

No Brasil, os moluscos, especialmente os mexilhões, apresentam uma ampla

distribuição geográfica ocorrendo em toda a costa Atlântica da América do Sul sendo

explotado, cultivado e consumido, principalmente em regiões costeiras (AVELAR, 1998;

FERREIRA; MAGALHÃES, 2003).

As populações litorâneas apreciam esse tipo de alimento sendo comum encontrar em

bares, restaurantes, hotéis e pousadas pratos preparados com moluscos. No entanto, é

necessário destacar que, em nível nacional, o consumo de mexilhões é baixo e parece estar

associado à falta de hábito dos brasileiros em comer frutos do mar e a forma simples de

apresentação do produto, in natura, o que não estimula o consumo. Em nosso país a

comercialização de moluscos cultivados é feita basicamente na forma in natura (fresco na

concha) ou pré-cozida e congelada (sem a concha) atendendo um mercado muito regional ou

local e de forma sazonal. Apenas uma pequena parcela dos moluscos cultivados em Santa

Catarina é comercializada em nível nacional (BEIRÃO et al., 2000).

Atualmente bivalves continuam sendo extraídos de bancos naturais, mas sobretudo

tornaram-se amplamente consumidos devido ao seu cultivo (malacocultura). Constituem o

segundo grupo em volume de produção (27%) e o terceiro (15%) em valores gerados para os

dados aquícolas mundiais conforme visto na Figura 1 (FAO, 2009).

Os principais moluscos bivalves produzidos pertencem às famílias Mytilidae

(mexilhões), Ostreidae (ostras) e Pectinidae (vieiras ou coquiles), todas inseridas no filo

Mollusca. No Brasil as principais espécies cultivadas são os nativos mexilhão Perna perna

(LINNEAUS, 1758), a vieira Nodipecten nodosus (LINNAEUS, 1758), a ostra de mangue

Crassotrea rhizophorae (GUILDING, 1828) e a exótica ostra do Pacífico Crassostrea gigas

(THUMBERG, 1793) (BRASIL, 2008).

2.2.1 Valor nutricional dos moluscos bivalves

A composição nutricional dos moluscos é influenciada por fatores como espécie, sexo,

grau de maturação sexual, temperatura, salinidade da água, local de cultivo e tipo de

alimentação (CONTRERAS-GUZMAN, 1994). Zlatanos (2008) verificaram que a época do

ano também é um fator que afeta a composição nutricional de mexilhões cultivados no golfo

de Keramaicos na Grécia, concluindo que as maiores concentrações são encontradas no final

da primavera e início do verão. Os moluscos são organismos filtradores, portanto se

alimentam retendo substâncias presentes na água que passa através deles, por isso a

composição nutricional é alterada de acordo com o ambiente em que eles são cultivados

(TRAMONTE, 2003).

Peixes de água doce

Moluscos

Crustáceos

Peixes diádromos

Peixes marinhos

Outros

Figura 1. Dados de produção aquícola mundial. A) Valores percentuais por

grupos referentes ao volume de produção total de 51,7 milhões de toneladas; B)

Valores percentuais por grupos referentes ao montante total gerado de U$$ 78,8

bilhões. Modificada de FAO (2009).

O valor nutritivo da carne de bivalves se reflete nos teores de proteína e gordura. O

teor de proteína bruta fica em torno de 10% apresentando em sua composição um teor de

aminoácidos essenciais completo e balanceado contribuindo para o alto valor biológico da

dieta. A carne apresenta um baixo teor de gordura (cerca de 1,5%) e colesterol, e apenas cerca

de 20 a 28 % de calorias, em que os ácidos graxos mais frequentes são os polinsaturados (40 –

45 g.100 g

-1

de porção comestível) e menos de 80 mg de colesterol.100 g

-1

de carne. Essa

composição apresenta grandes vantagens nutricionais porque essa gordura polinsaturada é

fonte de ácidos graxos benéficos ao organismo humano, da serie ômega-3 (eicosapentaenoico-

EPA e -linolênico) e ômega-6 (docosahexaenoico-DHA), além de assegurar uma melhor

digestão e assimilação pelo organismo humano (DONG, 2001).

O mexilhão apresenta baixos níveis de ômega-3, que ainda assim são maiores do que

os encontrados na carne vermelha. De acordo com Rapper et al., (1992) a concentração é de

0,84. 100

-1

g de porção comestível.

Estudos realizados em Florianópolis, comprovaram que ostras C. gigas, C.

rhizophorae (nativa da região), os mexilhões da espécie P. perna e mariscos são importantes

fontes de zinco, que se encontra bastante biodisponível e desempenha um papel importante no

crescimento, na cicatrização de feridas e na maturação sexual (TRAMONTE, 2003). O zinco

também atua como constituinte de diversas enzimas e proteínas, e ainda está envolvido na

estabilização de membranas estruturais e na proteção celular, além de interferir na

concentração do hormônio do crescimento (MACDONALD, 2000).

Dong (2001) concluiu que o ferro também é um mineral encontrado em quantidades

significativas nos mexilhões (4,0 miligramas/100 gramas). Este mineral participa da formação

da hemoglobina que atua no transporte de oxigênio.

Pesquisas têm evidenciado constantemente os vários benefícios de uma dieta rica em

pescado (TRAMONTE, 2003; FERREIRA; MAGALHÃES, 2003), tanto no que se refere à

proteína de alto valor biológico como aos ácidos graxos poliinsaturados presentes. Todavia, é

necessário garantir que o consumo de moluscos, como ostras e mexilhões, não represente

risco à saúde do consumidor, uma vez que estes animais filtram a água retendo e

concentrando agentes patogênicos e são muitas vezes comidos crus (RIEDEL, 2005). Outro

fator de risco é a presença da ficotoxina AO em baixas concentrações, que apesar de não

desencadear os sintomas gastrointestinais, apresenta uma potente capacidade de promover

tumores no sistema digestivo (SUGANUMA et al., 1988; ITO e TERAO, 1994;

FIORENTINI et al., 1996; MATIAS e CREPPY, 1996; TRIPURANENI et al., 1997; OTERI

et al., 1998; DARANAS et al., 2001).

2.3 Alimento Seguro Aplicado ao Pescado

A qualidade higiênico-sanitária como fator de segurança do alimento tem sido

amplamente estudada e discutida, uma vez que as doenças veiculadas por alimentos (DTA)

são um dos principais fatores que contribui para os índices de morbidade nos países da

América Latina e do Caribe. O Comitê World Health Organization – Organização Mundial de

Saúde (WHO), Food and Agriculture Organization of the United Nation - Organização de

Alimentos e Agricultura das Nações Unidas (FAO) admitem que doenças oriundas de

alimentos contaminados são, provavelmente, o maior problema de saúde no mundo

contemporâneo (FAO, 1995).

É importante destacar que não se deve confundir segurança do alimento ou alimento seguro, com

segurança alimentar, que é de cunho profundamente social. Segurança do alimento, para ZUIN et al

(2004) significa que o alimento não representa nenhum tipo de risco à saúde de quem o

consome, isto é, livre de contaminações químicas, físicas ou microbiológicas.

Segurança do alimento é, sem dúvida, um tema estratégico não apenas no aspecto da

saúde pública, mas também da competitividade entre os mercados.

“Existe segurança alimentar quando todas as pessoas, em todos os momentos, têm acesso

físico e econômico à alimentação suficiente, sadia e nutritiva afim de atender suas

necessidades dietárias e preferências alimentares para uma vida ativa e saudável” (World

Food Summit, 1996).

Portanto:

• O alimento deve estar disponível a TODAS as pessoas;

• Durante TODOS os momentos;

• As pessoas devem ter ACESSO FÍSICO ao alimento;

• As pessoas devem ter POSSIBILIDADE ECONÔMICA para adquirir o alimento.

O requisito de segurança dos alimentos, na maioria das vezes, é de difícil percepção e,

por isso, tem chamado à atenção das autoridades de saúde, sejam nacionais ou internacionais.

Entre os principais órgãos internacionais, destacam-se: FAO; WHO; Organização das Nações

Unidas (ONU); National Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods -

Consultoria do Comitê Nacional sobre Critérios Microbiológicos para Alimentos

(NACMCF); Food and Drug Administration - Administração de Drogas e Alimentação nos

Estados Unidos da América (FDA); United States Department of Agriculture - Departamento

da Agricultura dos Estados Unidos (USDA); Occupational Safety and Health Administration

- Administração da segurança ocupacional e da saúde (OSHA); National Institute for

occupational Safety and Health - Instituto Nacional de Perigos Ocupacionais e da Saúde

(NIOSH). Entre as principais atividades executadas por estas entidades, destacam-se (WHO,

1999):

• desenvolvimento de políticas nacionais de segurança dos alimentos;

• desenvolvimento e/ou aprimoramento de legislações de alimentos;

• desenvolvimento de tecnologias de alimentos para garantir a saúde pública.

Cardoso (2005) relata algumas razões para a necessidade de garantir a segurança do

alimento. Entre elas:

• o fato das doenças de origem alimentar terem se tornado uma parte significativa dos

problemas de saúde do mundo contemporâneo, sendo uma importante causa da diminuição da

produtividade;

• o aumento do conhecimento sobre os efeitos perigosos e crônicos das doenças transmitidas

pelos alimentos, na saúde humana;

• o surgimento de patógenos mais resistentes;

•o aumento no número de pessoas vulneráveis, como idosos, imunodeprimidos, subnutridos;

• a crescente industrialização e aumento da produção, provocando a elevação na taxa de

riscos, e conseqüentemente, a contaminação de maior número de indivíduos;

• as mudanças no estilo de vida, como o hábito de comer fora de casa, em restaurantes, fast-

food, lanchonetes;

•o aumento do turismo e do comércio internacional de produtos alimentícios, disseminando os

perigos para os outros países;

•o aumento da consciência do consumidor sobre a segurança do alimento.

A conscientização dos consumidores sobre a necessidade de consumir alimentos mais

saudáveis e que não tragam riscos à saúde, tem obrigado organizações governamentais,

indústrias e meios acadêmicos e científicos a reverem completamente o quadro conceitual e os

instrumentos de que dispõem, para alcançar essa necessidade.

A inocuidade do pescado está relacionada à qualidade do ambiente em que ele vive

podendo ser afetado por todas as alterações que nele ocorrem, principalmente devido à

contaminação ambiental, já que a causa poluidora mais comum registrada no mundo inteiro é

o lançamento de efluentes domésticos e industriais nos ecossistemas aquáticos (SOUSA,

2003). Embora moluscos bivalves sejam alimentos nutritivos, também podem ser vetores de

doenças em humanos por serem transmissores de patógenos (vírus, bactérias e protozoários),

resíduos químicos e ficotoxinas, nocivos à saúde do homem (LENOCH, 2003; LOURENÇO

et al., 2007a; LEAL e FRANCO 2008).

Os mexilhões, ostras e vieiras alimentam-se exclusivamente por filtração das

partículas que encontram-se em suspensão na água acumulando nos seus tecidos as

ficotoxinas. O acúmulo desses toxicantes no animal não afeta a sua saúde e muito menos

altera as suas características sensoriais (odor, cor, sabor e textura), um agravante para os

consumidores regulares de moluscos, constituindo um problema de saúde pública (FAO,

2004).

O aumento da produção de moluscos bivalves cultivados ou extraídos de bancos

naturais tem levado a um aumento dos relatos envolvendo a toxicidade de moluscos e a

intoxicação de humanos por venenos de moluscos em todas as partes do mundo, inclusive no

Brasil (PROENÇA et al., 1998; PROENÇA et al., 1999; FAO, 2004; OLIVEIRA et al., 2005;

TOYOFUKU, 2006; PROENÇA et al., 2007; SOUZA et al., 2007; ANDERSON et al., 2008).

Para assegurar a qualidade do alimento, programas de monitoramento da toxicidade

dos moluscos e da ocorrência de espécies de fitoplâncton potencialmente tóxicas são

desenvolvidos em diversas localidades (ANDERSEN, 1996). Da mesma forma, estudos são

realizados para se conhecer a biologia das espécies e os fatores que controlam a produção das

toxinas.

Em nível nacional, uma das medidas implementadas pelo Governo Federal através da

Secretaria Especial de Aqüicultura e Pesca da Presidência da República (SEAP/PR),

atualmente Ministério da Pesca e Aqüicultura - MPA (lei 11958 de 26 de junho de 2009), foi

à criação do Programa Nacional de Controle Higiênico e Sanitário de Moluscos Bivalves

(PNCMB) que prevê a criação de um programa de monitoramento da qualidade da água nas

áreas de cultivo e a qualidade dos organismos cultivados para a presença de microrganismos,

metais pesados e ficotoxinas proveniente de FAN’s visando proteção à saúde do consumidor e

à criação de mecanismos seguros para o comércio nacional e internacional (BRASIL, 2005).

O governo brasileiro junto ao MPA e outras instâncias governamentais vêm estimulando a

expansão e a consolidação da atividade de forma racional. As políticas praticadas até o

momento buscam fortalecimento do setor como cadeia produtiva. E o estabelecimento de

normas sanitárias aplicáveis à produção e venda do produto in natura ou beneficiado ajudará

o setor a se fortalecer como cadeia produtiva (SEAP, 2005).

2.4 Toxinas Diarreicas

2.4.1 Estrutura química

O ácido okadaico foi inicialmente isolado de esponjas negras Halichondria okadai e

do dinoflagelado Prorocentrum lima (TACHIBANA et al., 1981). Posteriormente foi

identificado como um ácido graxo poliéter lipofílico de cadeia linear (Figura 2), com peso

molecular de 804,4661 e fórmula C

(QUILLIAM; WRIGHT, 1995). Essa toxina é

definida como metabólito secundário produzido por dinoflagelados (SHIMIZU, 1993 apud

CEMBELLA e WRIGHT, 1996).

Segundo Cembella e Wright (1996) metabólicos secundários são compostos naturais,

biologicamente ativos, produzidos por vias metabólicas secundárias não usuais ou por desvio

do metabolismo primário. Mesmo não desempenhando, aparentemente para os organismos

produtores, função vital, para muitos pesquisadores a síntese de compostos tão complexos

poderia funcionar como alelopáticos (defesa química), reserva intracelular de nutrientes,

ativador de reprodução sexuada e proteção como herbivoria (GEOHAB, 1998).

O ácido okadaico é a principal toxina da síndrome DSP produzida por algumas

espécies de dinoflagelados pertencentes aos gêneros Dinophysis e Prorocentrum, que

acumulada na glândula digestiva de moluscos bivalves causa a síndrome da diarreia ou DSP

em consumidores de moluscos (YASUMOTO et al., 1980; YASUMOTO et al., 1989; MARR

et al., 1992).

Segundo Matias e Creppy (1996) as propriedades tóxicas do AO foram atribuídas à

sua capacidade de inibir a atividade das enzimas fosfatases 1 e 2A, que causam efeitos em

processos intracelulares e em diversos metabolismos contráteis, genes de transcrição,

estrutura de manutenção do citoesqueleto, receptor intermediário de tradução do sinal e

divisão celular.

Além de causar DSP o AO é promotor de alterações na sequência de DNA em células

(genotóxico) (SILVA et al., 2001), promotor de tumores (carcinogênico) (SUEOKA; FUJIKI,

1997), neurotóxico (FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ et al., 1997) e interfere em várias funções

celulares e inibe a produção de proteínas nos hemócitos (citotóxico) (HUYNH et al., 1998).

O principal sintoma de DSP causado pelo AO, a diarreia, pode ser explicado pela

hiperfosforilação das proteínas que controlam a secreção de íons de sódio pelas células

intestinais ou pelo aumento da fosforilação do citoesqueleto das células do epitélio intestinal

resultando, ambas, em alterações na permeabilidade intestinal, que por sua vez leva à perda

passiva de fluidos (QUILLIAM; WRIGHT op cit.).

Também tem sido sugerido que o AO possua um mecanismo similar ao da bactéria

Vibrio cholerae, onde a ativação da enzima adenil ciclase gera um efeito em cascata

aumentando a adenosina monofosfato cíclico (cAMP). Este fosforila certas proteínas que

regulam a secreção dos íons de sódio nos intestinos. Por esse motivo os sintomas de DSP são,

às vezes, referidos como falso cólera (BURGESS; SHAW, 2001).

Figura 2. Ficotoxina diarreica Ácido Okadaico e seus congêneres

Dinophysistoxina-1,2,3. Onde R1, R2 e R3 são os radicais onde se encaixam o

hidrogênio (H), metil (CH

) e acil na molécula possibilitando a diferenciação

entre os congêneres. Modificado de FAO (2004).

A inibição das proteínas fosfatase 1 e 2A, também tem sido relacionada com a

inflamação do intestino e a produção de diarreia (HAMANO et al., 1986; COHEN et al.,

1990). Existem evidências de que o AO pode ser responsável pelo aumento da permeabilidade

intracelular em células epiteliais humanas, em cultivo (TRIPURANENI et al., 1997). Sugere-

se que os sintomas primários, observados no DSP, sejam causados pela hiperfosforilação das

proteínas que controlam a secreção do sódio (Na

) pelas células do epitélio intestinal,

resultando no desequilíbrio hidroeletrolítico celular, com perda de fluídos pelas células

(COHEN et al., 1990).

2.4.2 Envenenamento diarreico por molusco

Em 1976 o Envenenamento Diarreico por Moluscos foi definido como uma doença,

sendo identificados seus sintomas, Dinophysistoxina-1 como toxina envolvida, Dinophysis

fortii como organismo causador e a vieira Patinopecten yessoensis como vetor para humanos

(YASUMOTO et al., 1980).

Os sintomas clínicos de DSP podem ser confundidos com os de uma gastroenterite de

origem bacteriana. Não causam óbitos. Em eventos agudos, com ingestão de doses acima de

1g AO.kg

-1

de peso corpóreo (TOYOFUKU et al., 2006) os sintomas são náuseas, dores

abdominais, vômitos e diarréia. Surgem no intervalo entre 30 minutos até poucas horas após o

consumo de moluscos contaminados. Raramente o quadro clínico manifesta-se passadas mais

de 12 horas. Os sintomas cessam após três dias, com ou sem tratamento médico. Recomenda-

se apenas aumento na ingestão de líquidos e reposição de eletrólitos (FAO, 2004).

Consumidores regulares de moluscos contaminados com toxinas diarreicas abaixo do

limite necessário ao desencadeamento dos sintomas agudos encontram-se expostos ao efeito

crônico destas toxinas. Estudos têm demonstrado que o AO ingerido nestas baixas

concentrações não provoca distúrbios gastrintestinais, mas apresenta uma potente capacidade

de promover tumores no sistema digestório (CORDIER et al., 2000).

Devido ao fato de não ocorrerem casos de óbitos e os sintomas do envenenamento

diarreico serem facilmente confundidos com uma gastroenterite se torna difícil o diagnóstico

da DSP (HALLEGRAEFF, 1993). Porém o que agrava este quadro no cenário brasileiro é o

fato de que os agentes de saúde não possuem informações suficientes sobre as síndromes de

envenenamento por moluscos. Apenas em Santa Catarina os casos de diarréia associada ao

consumo de moluscos constituem notificação obrigatória (PROENÇA; VILLAC, 2003). O

conjunto destes fatores torna o registro epidemiológico desta doença difícil de ser realizado.

Talvez isto justifique o fato de haverem escassos dados epidemiológicos, apesar das espécies

de microalgas potencialmente tóxicas estarem presentes em amostras de plâncton marinho e

de apresentarem uma distribuição ampla, em todo o Cone Sul Americano (PROENÇA et al.,

1998; FERREIRA, 2009).

Incidentes de DSP foram confirmados na Europa, na Oceania, na América do Norte e

América do Sul (AVARIA, 1992; MÉNDEZ et al., 1993; HALLEGRAEFF, 1998). Ramirez

(2003), detectou o AO em mexilhões de Pontevedra, em Vigo – Espanha. Todas as amostras

de mexilhões foram positivas nas três profundidades avaliadas (2, 7 e 15m) em concentrações

variadas. Estas variações possivelmente ocorreram devido ao aumento e redução das

populações das espécies de Dinophysis dominantes: D. acuminata e D. acuta. Na Grécia, o

primeiro episódio de DSP ocorreu em 2000, quando várias pessoas apresentaram sintomas

gastrintestinais após o consumo de mexilhões originários do golfo Termaikos (Mar Egeu). Em

2002 foi relatado um surto de DSP durante 4 meses na mesma região (MOURATIDOU et al.,

2006). Os perfis das toxinas, detectados na Nova Zelândia em 2002, produzidos por espécies

de Dinophysis, mostraram que a concentração nas células pode variar substancialmente de

acordo com as condições do meio aquático (como teor de nutrientes) e alterações climáticas

(como temperatura). Pode haver ainda variações no conteúdo de toxinas por célula dentro de

uma mesma população. Nesta pesquisa observou-se a predominância das PTXs isoladas de D.

acuta em relação ao AO, na proporção de 5:1. Em D. acuminata estavam os mais baixos

níveis de PTX e os mais altos de AO (MACKENZIE, 2005).

No Brasil, em janeiro de 2007 no município de Bombinhas, foi registrada a

intoxicação de 130 consumidores de mexilhões que apresentaram os sintomas clássicos dessa

síndrome como vômito, náusea, diarreia e dores abdominais. Esta intoxicação foi confirmada

através de bioensaios com camundongos, mostrando o alto grau de risco epidemiológico que

estas toxinas apresentam no litoral de Santa Catarina (PROENÇA et al., 2007).

No litoral sul do Rio de Janeiro as pesquisas desenvolvidas registraram a ocorrência de

espécies planctônicas de dinoflagelados potencialmente tóxicos e a toxicidade de moluscos

cultivados e em bancos naturais (OLIVEIRA, 2001; FERREIRA, 2004; LOURENÇO, 2004;

MARINÉ, 2007; FERREIRA, 2009).

O AO foi pioneiramente detectado em mexilhões capturados na baía de Sepetiba por

Oliveira et al., (2005) que encontraram AO em amostras de mariscos coletadas em Sepetiba e

Mangaratiba. As concentrações médias de 19,61ng de AO.g

-1

de hepatopâncreas e 9,88ng de

AO/g de hepatopâncreas detectadas em Sepetiba e Mangaratiba, respectivamente ficaram

abaixo dos níveis preconizados pela União Européia (2002), Dec./225/EC, o nível máximo

permitido de AO em moluscos (em todo o corpo ou alguma parte específica) foi estipulado

em 160 µg.kg

-1

ou 0,16 µg.g

-1

Ferreira (2004) detectou o ácido okadaico em dois pontos estudados, na baía de

Sepetiba, em situação de primavera e de verão. As concentrações encontradas foram muito

pequenas, incapazes de deflagrar os sintomas clássicos de DSP. Em situação de primavera,

foi encontrada em mexilhões da ilha da Madeira com concentração média de 14,83 ng AO.g

-1

hepatopâncreas de molusco, e na Guaíba com 6,37 ng AO.g

-1

hepatopâncreas de molusco.

Para moluscos coletados em situação de verão, foram encontradas quantidades ligeiramente

maiores: 23,07 ng AO.g

-1

hepatopâncreas de molusco para Madeira e 24 ng AO.g

-1

hepatopâncreas de molusco para Guaíba.

Lourenço et al., (2007) encontrou a toxina AO em mexilhões Perna-perna, em

Maciéis, na baía de Ilha Grande, uma amostra das três coletadas, apresentou a ficotoxina AO

na concentração de 2,65 ng.g

-1

de hepatopâncreas.

Mariné et al., (2010) observaram na baía de Ilha Grande, praia de Maciéis, amostras de

mexilhões durante os meses de maio a outubro de 2006. Todas as amostras analisadas

apresentaram contaminação pela toxina AO em concentrações que variaram entre 0,20µg.g

-1

8,54µg.g

-1

de glândula digestiva. Apesar de estarem abaixo do necessário para o

desenvolvimento do envenenamento diarreico por moluscos, cerca de 48µg.g

-1

de glândula

digestiva. Esses valores situam-se acima do limite permitido para comercialização e consumo,

segundo a União Europeia, que estipulou o nível máximo em 0,16µg.g

-1

(do corpo todo ou

alguma parte específica do molusco separadamente) (Decisão 2002/225/EC).

Os estudos realizados até o momento nas baías de ilha Grande e Sepetiba,

evidenciaram que a contaminação de todas as amostras, em baixas concentrações, demonstra

o alto risco da ação carcinogênica nos consumidores regulares, principalmente nos próprios

maricultores que consomem o excedente da produção.

2.4.3 Níveis máximos permitidos: panorama nacional e internacional

Na União Européia as Diretivas de 1991, 1997 e 2002 estabeleceram normas sanitárias

detalhadas para a produção e comercialização dos bivalves quanto à presença de ficotoxinas.

Tal procedimento determinou limites para a presença de ficotoxinas (níveis regulatórios

provisórios) nos moluscos com vistas à proteção da saúde pública. Estes limites foram

estabelecidos com base em dados epidemiológicos onde se empregou como nível de

referência toxicológica o cálculo do LOAEL

conforme visto no Quadro 1. A partir do

LOAEL, utilizando um fator 3 de incerteza, foi estabelecida a Dose de Referência Aguda

provisória = 0,3µgAO equivalente por peso corpóreo

-1

. Porém, devido não haver uma base de

dados epidemiológicos consistentes e, principalmente, não haver estudos toxicológicos

crônicos não foi possível determinar com segurança uma taxa diária de ingestão

(TOYOFUKU, 2006; ALEXANDER et al., 2008).

Quadro 1. Dados utilizados no Cálculo da Dose Aguda de Referência para a ficotoxina

diarreica ácido okadaico (e equivalentes) por pesquisadores Ad hoc da FAO/IOC/WHO para

Biotoxinas Marinhas (UNESCO, 2005) comparado ao recomendado pela European Food

Safety Authority e aos dados epidemiológicos utilizados no Codex Alimentarius

(ALEXANDER et al., op cit.). Adaptado de Ferreira (2009).

Dados LOAEL

(µgAOeq)

Dose Aguda de Referência

(Provisória)

Nível

Máximo

(Consumo)

Japão

1,2-1,6 -

0,16 mg. kg

-1

Noruega

1-1,5 -

Codex 1 0,33 µg.kg de peso corpóreo

EFSA 0,8 0,3 µg.kg de peso corpóreo

Por quilograma de peso corpóreo.

Surtos de DSP utilizados em estudos epidemiológicos em que se basearam

os cálculos de LOAEL.

No Brasil a política sanitária adotada para a produção e venda dos bivalves abordam as

questões relacionadas à qualidade bacteriológica da água de cultivo e do produto final exposto

a venda no mercado (BRASIL, 2001; BRASIL, 2005). Quanto à presença de ficotoxinas na

carne de moluscos no Brasil, as áreas de produção (cultivo e extração) não são monitoradas

para a ocorrência de espécies tóxicas de dinoflagelados e nem para a detecção de ficotoxinas.

Exceto o estado de Santa Catarina, maior produtor nacional de bivalves, que tem 80% de sua

produção certificada com Selo de Inspeção Federal e monitorada desde março de 2009 quanto

à ficotoxinas diarreicas, paralisantes e amnésicas (SOUZA et al., 2009).

Em Santa Catarina o controle da sanidade aquícola é regulamentado através da

portaria 021 da Secretaria de Desenvolvimento da Agricultura de 1º de outubro de 2002, onde

foi estabelecido que a presença de toxinas paralíticas (envolvidas no Envenenamento

Paralisante por Moluscos - EPM) e diarreicas (envolvidas no Envenenamento Diarreico por

Moluscos - EDM) nos bivalves seriam de notificação obrigatória ao órgão executor do

Ministério da Pesca e Aquicultura (SEADR, 2002). Porém os limites toxicológicos permitidos

para a comercialização do produto e as metodologias para análise (fitoplâncton e toxina) não

foram abordados nessa Portaria e para o monitoramento são empregados os limites

preconizados internacionalmente. Quem executa o monitoramento de ficotoxinas é o Projeto

de Controle Higiênico-Sanitário de Moluscos Bivalves através do Laboratório de Estudos

sobre Algas Nocivas da Universidade do Vale do Itajaí (SOUZA et al., 2009). O andamento

atualizado, tanto da suspensão da comercialização devido à presença das ficoxinas, quanto sua

liberação, pode ser acompanhada online na URL http://www.pecmb.wordpress.br.

2.5 Metodologia de Detecção de Toxinas Diarreicas

As toxinas diarreicas podem ser detectadas, identificadas e quantificadas baseando-se

em seu modo de ação tóxica sobre um sistema biológico (in vivo, quando emprega o uso de

Lowest Observed Adverse Effect Level. Nível inferior de efeito adverso observado.

mamíferos ou in vitro, quando emprega o uso de culturas de células) ou em sua composição e

estrutura química. Na primeira situação são empregados os métodos de ensaio e na segunda as

metodologias analíticas. O bioensaio com camundongos foi o primeiro método de detecção

empregado na pesquisa de toxinas diarreicas (YASUMOTO et al., 1987) tais ensaios

apresentam grande sensibilidade, mas baixa especificidade e alto limite de detecção.

Posteriormente desenvolveram-se ensaios analíticos que apresentam alta sensibilidade e

especificidade e menor limite de detecção. O Quadro 2 apresenta as principais metodologias

dos métodos de ensaio e métodos analíticos (FAO, 2004).

Quadro 2. Métodos de ensaio e métodos analíticos utilizados para detecção de toxinas

diarreicas em moluscos bivalves.

Método de ensaio

Métodos analíticos

Ensaios in vivo Ensaios in vitro Cromatografia líquida de alta eficiência

Bioensaio Imunoensaio (RIA e ELISA) Detecção UV

Ensaios de inibição enzimática

(PP2A)

Detecção fluorimétrica

Ensaios celulares

Detecção por espectrometria de massa

Ensaios de receptores Eletroforese capilar

Fonte: Fernandez et al., (2002).

Uma amostra (matriz biológica) pode ser contaminada com mais de um tipo de toxina

e conter mais de um tipo de congênere das toxinas presentes, por exemplo, moluscos

contaminados simultaneamente com ocadaiatos (AO, DTX´s) e yessotoxinas. Os ensaios

quantificam um valor do conteúdo total da(s) toxina(s) e seus congêneres baseando-se na

medição de uma única resposta: a biológica ou a bioquímica, que engloba a atividade de todos

os congêneres presentes na amostra, onde a toxicidade é determinada em função de uma curva

dose-resposta e a concentração da toxina é expressa em equivalente-grama (eqg).

(FERNÁNDEZ et al., 2002).

No método analítico é realizada a separação, identificação e quantificação individual

de cada congênere das toxinas em função de uma resposta instrumental que é proporcional à

concentração de cada uma das toxinas presentes na amostra. Porém, a utilização de métodos

analíticos requer a calibração do equipamento com padrões certificados de concentração

conhecida de cada uma das toxinas envolvidas no estudo (FERNÁNDEZ et al., op cit.).

Em experimento com escalopes, alimentados com cepas toxígenas de Prorocentrum

lima, o AO foi a principal toxina produzida e 76% do total de toxinas diarréicas presentes

foram encontradas nas glândulas digestivas do molusco (BAUDER et al., 1996), certificando

assim o uso da glândula digestiva para o processo de extração da toxina.

2.5.1 Método normativo: bioensaio com camundongos

As autoridades Européias utilizam bioensaios com camundongos para a rotina de

monitoramento de ficotoxinas, este ensaio foi inicialmente desenvolvido por Yasumoto et al

(1987) e atualmente as autoridades europeias recomendam que o preparo da amostra e a

extração da toxina da glândula digestiva do molusco seja realizada de acordo com o

Procedimento Operacional Padrão proposto pelo Community Reference Laboratory for

Marine Botoxin (CRL-MB, 2007). A toxicidade da amostra é determinada pela menor dose

capaz de matar dois camundongos em um grupo de três, no período de 24 h (ALEXANDER

et al., 2008). As principais características deste método estão apresentadas no Quadro 3.

Quadro 3. Principais características dos métodos de bionsaio e cromatografia líquída de alta

eficiência por detecção fluorimétrica utilizados para detecção de toxinas diarreicas do grupo

dos okadaiatos.

Bioensaio Cromatografia Líquida

Sensibilidade Baixa Alta

Especificidade

Alta

Limite de detecção

±160 µg AO eq. Kg

15 µg AO. Kg

Limite de quantificação

40 µg AO. Kg

Duração

(horas po

r amostra)

48h

24h

Fonte: Alexander et al., (2008)

A utilização deste método apresenta as vantagens de fornecer resultados com relação

a toxicidade total baseada na resposta de um ser vivo, além de não necessitar equipamentos

analíticos complexos. Porém, requer a utilização de grande quantidade de camundongos, o

que acarreta problemas éticos, além de apresentar baixa sensibilidade e especificidade, baixa

reprodutibilidade interlaboratorial e sofrer interferência de compostos endógenos tais como

ácidos graxos livres levando a resultados falsos positivos (QUILLIAM, 1995; FERNÁNDEZ

et al., 2002; FAO, 2004).

Atualmente estudos confirmaram que o bioensaio com camundongos apresenta

apenas 40 a 50% de posssibilidade de considerar como positiva uma amostra contaminada

com AO em quantidades correspondentes ao atual limite regulatório de 160 µg. Kg

-1

molusco; aumentando-se o nível de contaminação para 200 µg toxina. Kg

-1

de molusco passa-

se a considerar 90% das amostras contaminadas como positivas. Dessa forma o nível de

contaminação determina a ocorrência do percentual de falsos negativos: 60-50% no limite de

contaminação mais baixo (limite regulatório) e apenas 10% de falsos negativos com o limite

de contaminação de 200 µg toxina. Kg

-1

de molusco (AUNTE et al., 2007; ALEXANDER et

al., op cit.). Este tipo de ensaio apresenta limite de detecção alto, ou seja, amostras

contaminadas com baixas concentrações do AO seriam consideradas falsamente como

negativas. Dessa forma, os consumidores não estariam protegidos do efeito crônico do AO

que é a carcinogênese. Outro problema diz respeito ao fato de que o bioensaio não detecta a

dinophysistoxina-3 (DTX-3), uma ficotoxina produto da biotransformação do AO, DTX-1,2

pelas enzimas digestivas dos moluscos. Em função destes problemas, existe uma tendência

internacional em se substituir o bioensaio por metodologias analíticas, mais precisas, sensíveis

e seletivas, como a CLAE (FAO, op cit.).

2.5.2 Cromatografia líquida de alta eficiência por detecção fluorimétrica (CLAE-DF)

A CLAE utiliza instrumentos muito sofisticados que podem ser totalmente

automatizados. É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas e uma fase

móvel que é eluida sob altas pressões. Ela tem a capacidade de realizar separações e análises

quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras,

em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade. É uma

técnica analítica de alta tecnologia, precisão e reprodutibilidade, usada como modelo

alternativo, aos bioensaios, na identificação e quantificação das ficotoxinas (COLLINS et al.,

2006).

Este tipo de cromatografia é usado para separação de espécies iônicas ou

macromoléculas e compostos termolábeis. A cromatografia é um processo físico de

separação, no qual os componentes a serem separados distribuem-se em duas fases: fase

estacionária (coluna cromatográfica) e fase móvel. A fase móvel é um solvente que deve

dissolver a amostra sem qualquer interação química entre ambas, além de ter alto grau de

pureza ou ser de fácil purificação, para que possibilite a realização de análises de alta

sensibilidade. A fase estacionária é sólida ou semirígida, constituída ou preenchida por

partículas porosas de sílica (esféricas ou irregulares, com diferentes diâmetros e polaridades) e

suportam pressão de até 350 bar (PERES, 2002; COLLINS et al., 2006). A diferença de

polaridade entre as fases estacionária e móvel é que determinará a separação das diferentes

substâncias presentes na amostra e seu tempo de retenção.

O equipamento utilizado na CLAE é caro e sofisticado, pois é o resultado da

aplicação de alta pressão, necessária para operar colunas altamente eficientes, recheadas com

partículas de diâmetro muito pequeno, a uma velocidade de fluxo de poucos mL.min

-1

. O

equipamento é composto pelo reservatório da fase móvel, pela bomba de alta pressão, pelos

medidores de pressão, pelo injetor da amostra, pela coluna, pelo detector e pelo registrador

(COLLINS et al., 2006).

O reservatório da fase móvel deve ser resistente aos ataques dos líquidos utilizados

como fase móvel e pode ser de aço inoxidável (inerte e inquebrável), vidro ou plástico

(inerte). Geralmente, utiliza-se um erlenmeyer que seja resistente ao ataque químico do

solvente. A bomba de alta pressão é responsável pelo funcionamento do fluxo da fase móvel a

uma pressão alta e constante, a fim de garantir a reprodutibilidade, sensibilidade e resolução

da análise. Os medidores de pressão otimizam a separação dos componentes da amostra, para

determinar a eficiência de separação, além de indicar problemas no sistema, como

entupimento (aumento de pressão) ou vazamento (diminuição da pressão) (PERES, 2002;

COLLINS et al., 2006).

O sistema de injeção da amostra é responsável pelo sucesso de uma eficiente

representatividade da amostra analisada, deve ser reprodutível e ter grande variedade de

volumes de injeção (de 10 a 100 µL de volume). Em qualquer tipo de cromatografia, a coluna

é o coração do cromatógrafo, pois é a parte principal do equipamento, na CLAE emprega-se

uma coluna fechada reaproveitável, portanto, até centenas de separações individuais podem

ser realizadas com a mesma coluna, se bem que, em alguns casos, é necessário regenerá-la

após algumas separações (COLLINS et al., 2006).

Acoplado à coluna cromatográfica encontra-se o detector que mede de forma

contínua alguma propriedade física dos componentes da amostra separados na coluna

analítica, enviando como resposta um sinal elétrico que será registrado no processador como

um pico; é responsável pela identificação das substâncias que foram separadas durante sua

passagem pela fase estacionária. Existem vários tipos de detectores que podem ser utilizados,

dependendo do tipo de composto que será analisado. Porém todos devem atender aos

seguintes requisitos: alta sensibilidade, eficiente detecção mínima, baixo nível de ruído, largo

intervalo de linearidade, alta estabilidade e boa repetitividade (PERES, 2002).

Para as toxinas diarreicas geralmente emprega-se o detector de fluorescência, visto

que tais toxinas apresentam a capacidade de fluorescer após terem sido derivadas com

reagentes cromóforos. Este tipo de detector consegue captar substâncias presentes na ordem

de picogramas (PERES, 2002).

A capacidade de resposta de um detector de fluorescência é vital tanto para a

identificação quanto para a quantificação das ficotoxinas. O registrador utilizado pode ser um

integrador ou um microcomputador cuja sua leitura gera um pico, de área conhecida, que elui

em um tempo também conhecido (tempo de retenção). Dessa forma o tempo de retenção

identifica a substância e sua área possibilita o cálculo da concentração desta substância.

Manter a linearidade de resposta do detector é a forma de mantê-lo calibrado e garantir que

sua leitura seja acurada e precisa (COLLINS et al., 2006).

As vantagens deste método consistem na alta especificidade e sensibilidade, no

poder de identificar e quantificar as toxinas do grupo AO individualmente na amostra, ser

capaz se detectar a toxina em quantidades inferiores aos limites estabelecidos pela União

Europeia, bem como poder identificar a presença de DTX3 além de poder ser automatizado.

Porém, este método requer a utilização de equipamentos de alto custo, necessita de pessoal

altamente treinado, reagentes e padrões de referência certificada para identificação e

quantificação das toxinas (ALEXANDER et al., 2008). As características gerais deste método

encontram-se no Quadro 3.

Os processos de detecção da toxina AO e seus congêneres utilizando a cromatografia

líquida de alta eficiência, divide-se basicamente em 4 etapas: extração da toxina, derivação,

limpeza em fase sólida (SPE) e análise cromatográfica (FAO, 2004).

Na etapa de extração promove-se a limpeza do extrato e o isolamento da toxina na

amostra, através da utilização de diferentes solventes. A toxina AO e seus congêneres não

absorvem as longitudes de onda do espectro visível em UV, todos os métodos de

quantificação destas toxinas utilizam a etapa de derivação pré-coluna, que consiste na

conversão da toxina a éster fluorescente, através da esterificação com um reagente cromóforo

que se liga a função carboxila destes compostos, após a etapa de derivação, na maioria das

metodologias, é realizada a etapa de limpeza em fase sólida que consiste na retirada de

interferentes resultantes das reações do reagente cromóforo com a toxina, bem como do

excesso de reagente cromóforo que pode reagir com ácidos graxos livres e interferir na leitura

dos resultados durante a análise cromatográfica. Para a realização desta etapa utiliza-se um

cartucho Sep-pak de sílica ao qual é aplicado o extrato derivado, em seguida a coluna é lavada

com solventes que retiram os interferentes e ao final o extrato derivado é eluído (VALE,

2006).

Neste estudo foram analisadas a metodologia oficial recomendada pela união

europeia para detecção do AO por CLAE-DF, metodologia proposta por Lee et al., (1987). A

metodologia apresentada no manual SIGMA (1993) e a proposta por Silva (2001),.

A metodologia Silva (2001) foi desenvolvida no Laboratório ToxMar/UFRRJ e tem

sido utilizada em estudos de detecção de AO em mexilhões oriundos das baías de Sepetiba e

Ilha Grande.

A seguir, foram detalhadas cada uma das metodologias que serão analisadas nesta

pesquisa.

2.5.3 Metodologia Lee (1987)

 Extração

Homogenizar por 2 min a temperatura ambiente, amostras de 1 grama de glândula

digestiva com 4 mL de metanol aquoso (80%), em seguida centrifugar (3000 rpm/10 min). O

extrato metanólico (camada superior) é submetido a duas etapas de limpeza: a primeira duas

vezes com 2,5 mL de éter de petróleo (descartando-se a camada superior) em seguida

adicionar 1 mL de água e 4 mL de clorofórmio, agitando em um mixer por 20 segundos e

centrifugar. Transferir a camada inferior para tubo teste graduado (10 mL). A camada superior

re-extrair com 4 mL de clorofórmio. Retirar a camada inferior. O extrato em clorofórmio é

mantido no tubo graduado.

 Derivação com ADAM

Secar com nitrogênio uma alíquota de 0,5 mL do extrato em clorofórmio, adicionar

200 µL de solução ADAM a 0,1% e deixar reagir por 1 hora a 25ºC em local escuro. Após o

período de reação, evaporar o solvente. O produto é dissolvido em 1,0 mL de

hexano:clorofórmio (1:1) e tranferido para uma seringa de 10 mL.

 Limpeza em fase sólida

Ativar a coluna de extração em fase sólida (SPE) com 5 mL de hexano:clorofórmio,

adicionar o conteúdo da seringa e em seguida adicionar 5 mL de clorofórmio. Eluir os ésteres

com 5 mL de clorofórmio aquoso (95:5), o eluído (ésteres de AO e DTX-1) será tranferido

para outro tubo teste e secado sob ação do nitrogênio. O resíduo será dissolvido em 0,1 mL de

metanol aquoso. Injetar 10 µL no cromatógrafo.

 Condições cromatográficas

As condições cromatográficas utilizadas nesta metodologia encontram-se descritas no

Quadro 4.

Quadro 4 Condições cromatográficas para detecção da ficotoxina ácido okadaico

propostas por LEE et al., 1987.

Fase móvel

Acetonitrila/metanol/água (8:1:1)

Fluxo

1 mL/min

Injeção 10 µL

Emissão

Excitação

365 nm

2.5.4 Metodologia descrita por Sigma (1993)

 Extração

Para cada 1g de amostra misturar 39 mL de metanol aquoso 80%, agitar e em seguida

submeter a amostra a um banho ultrasônico por 10 min, seguido de centrifugação (por 15

minutos a 2000 rpm).

Transferir o sobrenadante para tubos com tampa de rosca e misturar 2,5 mL de éter de

petróleo agitando-se com inversão por 1 minuto, abrir cuidadosamente o tubo para liberar os

gases e fechar em seguida. Aguardar a separação das fases e descartar a fase do éter de

petróleo (superior), repetir uma vez este processo.

Adicionar 1 mL de água e 4 mL de clorofórmio (ou diclorometano) na fase

metanólica (inferior), para promover o isolamento da toxina. Agitar com inversão, abrir o

tubo para liberar gases e aguardar a separação em fases. Após a separação das fases transferir

a fase inferior para um tubo de rosca de 13 X 100 mm e adicionar 4 mL de clorofórmio,

realizar a secagem com nitrogênio. Repetir este procedimento com a fase superior.

Redissolver o extrato seco de clorofórmio em 0,5 mL de acetonitrila.

 Derivação com 1-bromoacetilpireno (BAP) e N,N-diisopropiletilamina (DIPA)

Adicionar a uma alíquota de 0,5 mL do extrato em acetonitrila (ACN), 0.5 mL da

solução de BAP em ACN e 0,015 mL da solução de DIPA 5% em ACN, submeter a mistura

a um banho ultrasônico por 10 minutos, em seguida ao banho-maria (75ºC por 15 minutos).

Realizar a secagem com nitrogênio e em seguida a redissolução do extrato em 1 mL

hexano/clorofórmio (1:1).

 Limpeza em fase sólida (SPE)

Ativar a coluna de sílica para extração em fase sólida com 5 mL de

hexano/clorofórmio (1:1). Transferir o extrato derivado e dissolvido em hexano/clorofórmio

para a coluna. Lavar o tubo que continha o extrato com 1 mL de hexano/clorofórmio (1:1) e

acrescentar a coluna. Adicionar a coluna 5 mL de hexano/clorofórmio (1:1), seguido de 5

mL de clorofórmio, carreando resíduos da etapa de derivatização.

Secar a coluna com ar e descartar o hexano/clorofórmio e o clorofórmio. Eluir o

extrato da amostra que ficou aderido a coluna com 5 mL de clorofórmio/metanol (95:5).

Evaporar o solvente com nitrogênio, rediluir com 0,5 mL de acetonitrila e transferir para um

frasco com tampa de rosca.

 Condições cromatográficas

As condições cromatográficas utilizadas nesta metodologia encontram-se descritas no

Quadro 5.

Quadro 5. Condições cromatográficas para detecção de AO propostas por SIGMA (1993).

2.5.5 Metodologia Silva (2001)

 Extração

Homogeneizar 20g de glândula digestiva e retirar uma alíquota de 1grama a qual é

adicionada 4 mL de metanol aquoso (MeOH-H2O, na proporção de 80:20 (v/v)), submeter os

tubos ao banho de ultra-som (por 10 minutos) e em seguida centrifugar (2000 rpm por 15

minutos). Transferir o sobrenadante para um tubo com tampa de rosca.

O extrato metanólico é submetido a duas etapas de limpeza: a primeira duas vezes com

2,5 mL de éter de petróleo (o tubo é agitado por inversão durante 1 minuto, esperar a

separação de fase e descartar a camada superior) e em seguida duas vezes com 4 mL de

clorofórmio e 1 mL de água (agitar o tubo por inversão durante 1 minuto, esperar a separação

de fase, transferir a fase inferior para um balão volumétrico). Secar os extratos em evaporador

rotatório a 60C. A fração restante é transferida para tubo de hemólise e termina-se a secagem

com nitrogênio. Adicionar ao extrato seco 0,5 mL de acetonitrila.

 Derivação com 1-Bromoacetilpireno (BAP) e Trietilamina (TEA)

Ao extrato da toxina acrescenta-se 0,5 mL da solução de 1-bromoacetil(pireno) em

acetonitrila e 0,015 mL (15 µL) da solução de trietilamina 30% em acetonitrila. Os tubos são

submetidos ao banho ultra-sônico por 10 minutos e, em seguida, aquecidos em banho-maria a

75ºC por 20 minutos. Posteriormente, promove-se a secagem com nitrogênio e redissolve-se

em 0,25 mL de acetonitrila o extrato derivado de ácido okadaico com 1-bromoacetil(pireno),

para injetar posteriormente no cromatógrafo.

Fase móvel

Acetonitrila/água (75:25)

Fluxo

0,4 mL/min para coluna de 2 mm e 1,0 mL/min para coluna de 4,6 mm

Injeção

20 µL

Emissão

418 nm

Excitação

365 nm

 Condições cromatográficas

As condições cromatográficas utilizadas nesta metodologia encontram-se descritas no

Quadro 6.

Quadro 6. Condições cromatográficas para detecção do ácido okadaico em sistema de

CLAE-DF propostas por Silva (2001).

Fase móvel acetonitrila:água ultra-pura (85:15)

Fluxo

1 mL.min

Injeção

20 l

Atenuação

Emissão

440 nm

2.5.6 Análise crítica da diferença entre as três metodologias analisadas

A metodologia proposta por Lee et al., (1987) utiliza como reagente cromóforo a 9-

antrildiazometano (ADAM), reagente que, apesar da alta seletividade, apresenta baixa

estabilidade e alto custo, fato que levou ao desenvolvimento de pesquisas em busca de

reagentes mais estáveis e mais acessíveis a fim de viabilizar a realização das análises (FAO,

2004). Dentre as metodologias desenvolvidas foram analisadas neste estudo a metodologia

proposta no manual SIGMA (1993) e a proposta por Silva (2001), ambas utilizam como

reagente cromóforo 1-bromoacetilpireno (BAP) que foi considerado por Dickey e seus

colaboradores (1993) como um reagente cromóforo alternativo e eficiente para a detecção do

AO, apresentando maior estabilidade e menor custo quando comparado com o ADAM.

A análise destas metodologias permitirá identificar possíveis vantagens

operacionais, visto que podem ser observados diferentes tempos de reação, utlização de

reagentes e solventes distintos, em quantidades variáveis.

2.6 Ferramentas da Qualidade

Os conceitos relacionados com o termo qualidade tiveram suas origens associadas às

atividades de controle da qualidade, que é representado por um conjunto de ações ou medidas

desenvolvidas com o objetivo de assegurar que os serviços ou produtos gerados atendam aos

requisitos segundo os quais foram especificados. A Norma NBR ISO 8402/94 define Controle

da Qualidade como sendo um conjunto de técnicas e atividades operacionais usadas para

atender aos requisitos para a qualidade. (CARDOSO, 2005)

A implantação de um Sistema de Qualidade (SQ) promove maior organização e

introduz métodos mais eficientes, com sistematização das atividades (MALMFORS et al.,

2004). Esta implantação ocorre através da utilização de conjuntos de técnicas inter-

relacionadas , que procuram orientar uma organização, no sentido de satisfazer e superar as

expectativas de seus clientes, aumentando sua competitividade. Com a evolução do sistema de

gestão, a necessidade de padronizar a atuação dos laboratórios aumentou a procura por

requisitos técnicos que assegurassem a implementação e demonstração da competência dos

laboratórios em fornecer resultados válidos e confiáveis. Em um mercado competitivo, as

instituições devem apresentar diferenciais para sobreviverem ou alcançar crescimento e

conquistar um número maior de clientes. Atender determinadas especificações constatadas em

normas ou publicações referentes à qualidade pode ser um destes diferenciais (CARDOSO,

2005).

Todos os laboratórios que realizam ensaios devem implantar algum tipo de Sistema de

Gestão da Qualidade (SGQ), seja a NBR ISO/IEC 17025 ou as Boas Práticas de Laboratório

(BPL). Ao implantar o SGQ, o laboratório reduz erros e oscilações em resultados, padroniza

os procedimentos, a equipe adquire mais segurança e oferece maior confiabilidade nas

análises, o que aumenta a satisfação do cliente.

A implementação de um SQ tem como objetivo geral facilitar intercâmbios

internacionais de bens ou serviços, através da adoção de normas comuns em organizações de

diferentes países. Como objetivo específico, busca o controle e a melhoria contínua dos

processos de trabalho para uma crescente satisfação de seus clientes (CARDOSO, 2005).

A NBR ISO/IEC 17025 tem caráter voluntário e é a norma de escolha para o

desenvolvimento de métodos, verificação do cumprimento de especificações, pesquisa básica

e qualquer outro tipo de ensaio, e as BPL se aplicam aos ensaios não-clínicos regulamentados,

para fins de registro de drogas, agrotóxicos, aditivos, estudos de impacto, entre outros.

2.7 Norma ABNT NBR ISO/IEC 17025

A Norma NBR ISO/IEC 17025 publicada em 1999 sucedeu o ISO/IEC Guide 25 de

1990. A forma da ISO/IEC Guide 25 permitia que as organizações desenvolvessem

interpretações, aplicações e documentos orientativos de forma desestruturada. Por sua vez, a

Norma de 1999 já estava alinhada com a ISO 9001/2:1994, e por isso, apresentava duas

seções principais, uma com requisitos da direção e outra com os requisitos técnicos, notas

esclarecedoras sobre o texto com exemplos, mas que não eram parte integrante da Norma, e

orientações para o estabelecimento de aplicações para áreas específicas. Além da mudança

estrutural, para a Europa era vantajoso que a Organização Internacional de Normalização

(ISO) publicasse a Norma Internacional, ao invés do Guia. Desta forma, evitaria que os

laboratórios utilizassem dois documentos, um para o mercado europeu e outro para o não

europeu, pois o acordo existente entre a ISO e o Comitê Europeu de Normalização (CEN) não

permite que este desenvolva normas conflitantes com as da ISO (VAN DE LEEMPUT, 1999).

Com a nova edição da ISO 9001 em 2000, foi necessário rever a NBR ISO/IEC

17025:1999. Assim, em maio de 2005 foi aprovada a segunda edição da NBR ISO/IEC

17025.

No Brasil, a NBR ISO/IEC 17025:2005, válida a partir de 31 de outubro de 2005,

descreve o mecanismo para evidenciar a competência técnica dos laboratórios na realização

de calibrações e de ensaios. A norma é estruturada em duas partes: os requisitos da direção e

os requisitos técnicos, que encontram-se expostos no Quadro 7. A norma independe do

número de pessoas ou do tipo de ensaios ou serviço prestado, engloba os requisitos gerenciais

da série ISO 9000: “assim, o laboratório que implanta a NBR ISO/IEC 17025 contempla a

NBR ISO/IEC 9000, mas o inverso não é verdadeiro, pois esta última não possui os requisitos

técnicos de aplicação específica para laboratórios” (MAGALHÃES, 2006).

Quadro 7. Estrutura de organização da NBR ISO/IEC 17025, apresentando os

requisitos da direção e os requisitos técnicos que devem ser contemplados pelo

laboratório ao implantar a norma. No grifo os itens considerados na presente pesquisa.

A competência dos laboratórios de ensaio e calibração deve ser reconhecida por

organismos de acreditação com base na NBR ISO/IEC 17025, pois esta demonstra a solidez

do gerenciamento e a competência técnica do laboratório. “A NBR ISO/IEC 9001 por si só

não demonstra a competência do laboratório para produzir dados e resultados tecnicamente

válidos”. A NBR ISO/IEC 17025 é uma norma que estabelece diretrizes para competência de

laboratórios analíticos, ou seja, determina habilidades, atitudes e conhecimento que, quando

integrados e utilizados, permitem atingir com sucesso os resultados esperados nos ensaios

analíticos e/ou calibração, envolvendo todos os processos de um Sistema de Gestão da

qualidade (MAGALHÃES, op cit.).

Os princípios de um SGQ implantado através da NBR ISO/IEC 17025 são aplicáveis a

quaisquer laboratórios públicos, privados de economia mista que atuem na área de ensaios

analíticos ou de calibração, desde que as mudanças necessárias não consistam em adequação

de equipamentos ou aquisição de novos bens, pois é importante a mudança de comportamento

de todo o quadro de colaboradores. “Estes devem ter a consciência de que a competência final

do processo de medição será alcançada se em todas as etapas possuírem responsabilidades e

objetivos bem definidos que, consequentemente, levarão à qualidade” (CARDOSO, 2004).

Organização

Sistema de gestão

Controle de documentos

Análise crítica de pedidos, propostas e contratos

Subcontratação de ensaios e calibração

Aquisição de serviços e suprimentos

Atendimento ao cliente

REQUISITOS DA Reclamações

DIREÇÃO Controle de serviços de ensaios e/ou calibração não conforme

Melhoria

Ação corretiva

Ação preventiva

Controle de registros

Auditorias internas

Análise crítica pela direção

Generalidades

Pessoal

Acomodações e condições ambientais

Métodos de ensaio e calibração e validação de métodos

REQUISITOS Equipamentos

TÉCNICOS Rastreabilidade da medição

Amostragem

Manuseio de itens de ensaio e calibração

Garantia da qualidade de resultados de ensaio e calibração

Apresentação de resultados

2.7.1 Métodos de ensaio e calibração e validação de métodos

A NBR ISO/IEC 17025 trata deste requisito no item 5.4 (5.4.1 a 5.4.7), abordando

aspectos gerais, seleção de métodos, métodos desenvolvidos pelo laboratório, métodos não

normalizados, validação de métodos, estimativa da incerteza de medição e controle de dados.

No aspecto geral, a Norma estabelece que o laboratório deve utilizar métodos e

procedimentos apropriados para todos os ensaios dentro do seu escopo de trabalho. Deve ter

todas as instruções necessárias, atualizadas e disponíveis ao seu pessoal, e garantir que

desvios aos métodos sejam documentados, tecnicamente justificados, autorizados e aceitos

pelo cliente. Utilizar “métodos e procedimentos apropriados” significa que estes devem ser

adequados para um determinado propósito ou fim (ABNT, 2005).

Quando o laboratório propõe ao cliente a realização do serviço segundo um

determinado método e procedimento, este deve de preferência ter sido publicado em normas

internacionais, regionais ou nacionais ou por organizações técnicas relevantes. No entanto, o

laboratório pode utilizar métodos desenvolvidos internamente ou métodos não normalizados

(ABNT, op cit.). São considerados métodos não normalizados aqueles desenvolvidos pelo

próprio laboratório ou outras partes, ou adaptado a partir de métodos normalizados e

validados. Por exemplo, métodos publicados em revistas técnicas, métodos de fabricantes de

equipamentos, métodos utilizando conjuntos (kits) de ensaio e instrumentos portáteis

(INMETRO, 2007). Os métodos não normalizados devem ser validados, e nesse processo a

necessidade de utilização de materiais de referência deve ser considerada. A validação

consiste na comprovação, através do fornecimento de evidência objetiva, de que os requisitos

para uma aplicação ou uso específicos pretendidos foram atendidos. (ABNT NBR ISO/IEC

9000).

Para se ter confiabilidade em medições, um dos mais importantes pré-requisitos é o

conhecimento da incerteza de medição, a qual é baseada na rastreabilidade a referências

reconhecidas, como materiais de referência certificados, métodos de alto valor metrológico ou

outras, idealmente ao Sistema Internacional de Unidades (SI) (RICHTER; GUTTLER, 2003).

Para estimar a incerteza de medição dos ensaios e calibrações realizados segundo

métodos e procedimentos, o laboratório deve considerar todos os componentes de incerteza

importantes para uma determinada situação (ELLISON et al., 2003).

2.7.2 Equipamentos

Este requisito é tratado no item 5.5 (5.5.1 a 5.5.3) da norma em pauta. Antes de dar

início ao ensaio deve ser verificada a presença de todos os equipamentos necessários para

amostragem, medição e ensaio, bem como a verificação das especificações dos equipamentos

envolvidos antes de sua utilização. O laboratório deve estar aparelhado com todos os

equipamentos requeridos para o desempenho correto dos ensaios, os equipamentos e seus

softwares devem ser capazes de alcançar a exatidão requerida e devem atender as

especificações pertinentes aos ensaios em questão. Nos casos em que o laboratório precisar

usar equipamentos que estejam fora de seu controle permanente, ele deve assegurar que os

requisitos da norma sejam atendidos (ABNT, 2005).

Devem ser estabelecidos programas de calibração para as grandezas ou valores-chave

dos instrumentos, quando estas propriedades tiverem um efeito significativo sobre os

resultados. Antes de serem utilizados, os equipamentos devem ser calibrados e/ou verificados.

As instruções atualizadas sobre o uso e manutenção do equipamento (incluindo quaisquer

manuais pertinentes fornecidos pelo fabricante do equipamento) devem estar disponíveis para

uso pelo pessoal apropriado do laboratório. A operação dos equipamentos deve ser realizada

por pessoal autorizado e capacitado (ABNT, op cit.).

O equipamento que tenha sido submetido a sobrecarga, que tenha sido manuseado

incorretamente, que produza resultados suspeitos, que mostre ter defeitos ou estar fora dos

limites especificados, deve ser retirado de serviço (ABNT, op cit.).

2.7.3 Ratreabilidade das medições

O Vocabulário Internacional de Termos Fundamentais e Gerais de Metrologia (VIM,

2007) define rastreabilidade como: propriedade do resultado de uma medição ou do valor de

um padrão estar relacionado a referências estabelecidas, geralmente a padrões nacionais ou

internacionais, através de uma cadeia contínua de comparações, todas tendo incertezas

estabelecidas.

A definição determina que a rastreabilidade é uma propriedade do resultado de medição

e, portanto a frase “rastreável à instituição X” é uma simplificação de “rastreável a um valor

de referência mantido pela instituição X”. Da mesma forma, “rastreável ao SI” é uma

simplificação de “rastreável ao valor de referência obtido pelas realizações das unidades do SI

acordadas”. A definição implica em necessidade de um esforço, a nível nacional e

internacional, para prover padrões de referências amplamente aceitos, e em nível individual

do laboratório, demonstrar a necessidade de relacionar-se a esses padrões nacionais e

internacionais (ELLISON et al., 2003).

A rastreabilidade das medições é abordada no item 5.6 e, nos aspectos gerais,

prescreve que todo equipamento utilizado em ensaios que tenha efeito significativo sobre a

exatidão ou a validade do resultado do ensaio, calibração ou amostragem deve ser calibrado

antes de entrar em serviço. O laboratório também deve estabelecer um programa e

procedimento para a calibração dos equipamentos, e é recomendável que sejam incluídos os

padrões e materiais de referência. Para laboratório de ensaios, deve haver um programa de

calibração para os equipamentos de medição e ensaio utilizados com funções de medição, a

não ser que tenha sido estabelecido que a contribuição associada a calibração pouco contribui

para a incerteza total do resultado do ensaio (ABNT, 2005).

Quando a rastreabilidade ao SI não for possível, as referências devem ser buscadas por

meio de recursos como materiais de referência certificados, métodos e padrões consensados,

além de participar de comparações interlaboratoriais. O uso de materiais de referência

propicia informação sobre o efeito combinado de todas as fontes de incerteza do resultado de

uma análise, desde que, o material de referência adequado esteja disponível (MOURA, 2006).

Em medições químicas existem normalmente vários procedimentos analíticos desde a

amostragem até o resultado. Mudanças podem ocorrer durante o processo analítico tais como

perda ou mudança do analito (RONG, 1997). Já que nem sempre os resultados de medições

químicas podem ser rastreáveis ao mol, é necessário buscar outras formas para a

rastreabilidade, através de padrões internacionais, nacionais e outros tipos de padrões que

sejam reconhecidos e os resultados serão rastreados às essas referências que encontram-se

dentro de uma hierarquia metrológica que deve ser seguida, para que a rastreabilidade do

resultado de um procedimento analítico seja estabelecida e aceita (ELLISON et al., 2003).

O laboratório deve ter procedimentos para efetuar em segurança, o manuseio,

transporte, armazenamento e uso dos padrões de referência e dos materiais de referência de

forma a prevenir contaminação ou deterioração e proteger sua integridade (ABNT, 2005).

2.7.3.1 Materiais de referência

De acordo com o VIM (INMETRO, 2007), material de referência é o material ou

substância que tem um ou mais valores de propriedades que são suficientemente homogêneos

e bem estabelecidos para ser usado na calibração de um aparelho, na avaliação de um método

de medição ou atribuição de valores e materiais.

Aqueles que não são acompanhados de um certificado são, em geral, denominados

materiais de referência não certificados. Mas também são utilizados muitos outros termos

como materiais produzidos internamente, materiais de controle do laboratório, materiais de

referência do laboratório. Emmons (2005) afirma que o termo “material de controle da

qualidade” (MCQ) é preferível para este subgrupo de materiais que somente atende às

características de estabilidade e homogeneidade adequadas ao uso pretendido.

De acordo com Moura (2006) os materiais de referência são importantes ferramentas

na determinação de muitos aspectos da qualidade de medição e são usados para fins de

validação de métodos, calibração, estimativa da incerteza de medição, treinamento e para fins

de CQ - Controle de Qualidade interno e GQ - Garantia da Qualidade externa (ensaios de

proficiência).

Em um sentido mais amplo, a validade de medições pode ser assegurada quando:

• são usados métodos validados e equipamentos validados.

• pessoal qualificado e competente é encarregado do trabalho.

• a comparabilidade com medições realizadas em outros laboratórios é assegurada

(rastreabilidade e incerteza de medição).

• há evidência independente do desempenho (ensaios de proficiência).

• são empregados procedimentos de CQ e GQ bem definidos, preferivelmente envolvendo

acreditação de terceira parte (INMETRO, 2003)

Uma operação de medição freqüentemente serve a mais de um propósito, e pode haver

sobreposição de funções. Diferentes tipos de materiais de referência são requeridos para

diferentes funções. Por exemplo, conforme o Guia para a expressão da incerteza de medição

(INMETRO, 2003), um material de referência certificado seria desejável para validação de

um método, mas um material de referência de trabalho seria adequado para CQ.

2.7.4 Manuseio de itens de ensaio e calibração

O laboratório deve ter um sistema para identificação dos itens de ensaio, que deve ser

mantida durante a permanência do item no laboratório. O sistema deve ser projetado e

operado de forma a assegurar que os itens não sejam confundidos fisicamente nem quando

citados em registros ou outros documentos. Além do sistema de identificação, deve haver no

laboratório, procedimentos e instalações adequadas para evitar deterioração, perda ou dano no

item de ensaio durante o armazenamento, manuseio e preparação. Quando houver necessidade

de armazenamento dos itens sob condições ambientais especificadas, estas devem ser

mantidas, monitoradas e registradas (ABNT, 2005).

O laboratório deve ter procedimentos para o transporte, recebimento, manuseio,

proteção, armazenamento, retenção e remoção dos itens de ensaio incluindo todas as

providências necessárias para a proteção da integridade do item de ensaio e para a proteção

dos interesses do laboratório e do cliente (ABNT, 2005).

2.7.5 Garantia da qualidade de resultados de ensaio e calibração

A NBR ISO/IEC 17025 trata da garantia da qualidade dos resultados de ensaio e

calibração no requisito 5.9 (5.9.1 e 5.9.2), abordando o controle da qualidade (CQ) e a ação

resultante da análise dos dados de CQ.

O requisito estabelece que sejam implementadas medidas de CQ para o

monitoramento da validade dos ensaios e calibrações. São sugeridas algumas técnicas,

incluindo o uso regular de materiais de referência certificados e/ou controle interno da

qualidade com materiais de referência secundários. Convém que as técnicas utilizadas sejam

apropriadas para o tipo e volume do trabalho realizado (ABNT, op cit.).

2.7.6 Principais causas de erro de alguns requisitos técnicos e suas ações preventivas

As possíveis causas de erros gerados pela medida, pelo método utilizado, pelos

equipamentos e pelos materiais (regentes, padrões, solventes) foram esquematizas por

Linhares et al., (2002), que apresentaram alguns requisitos técnicos exigidos pela NBR NBR

ISO/IEC 17025, como uma relação de causa e efeito (Diagrama de Ishikawa) enfatizando nos

ramos secundários todas as ações preventivas (item 4.11) exigidas na referida norma.

A observação destas causas e efeitos permite identificar e comparar as causas que

podem ser consideradas nas metodologia que serão analisadas neste estudo, visto que também

se tratam de análises cromatográficas, portanto, muitos fatores serão comuns.

As possíveis causas de erros de medidas (Figura 03) estão relacionadas com os

equipamentos de medida (item 5.5), com as medidas volumétricas que são realizadas durante

o processo do ensaio, com as condições ambientais locais onde as medições estão sendo

realizadas (item 5.3) e com a rastreabilidade de todas estas medidas (item 5.6).

Figura 3. Fatores quem ocasionam variações nos resultados devido à medida

(LINHARES et al., 2002).

O método de ensaio (Item 5.4) utilizado pode ser considerado o coração de todo o

sistema de qualidade de um laboratório de ensaio. Portanto, Fatores ligados ao processo de

validação (Item 5.4.5), seleção do método mais adequado (Item 5.4.2), tipo de metodologia a

ser usada (Itens 5.4.3 e 5.4.4), troca de informações com os clientes quanto ao objetivo da

análise, matriz do analito, limite de detecção e prazo desejado são fundamentais para a

obtenção da qualidade desejada. No que concerne ao procedimento em si, é necessário

estabelecer como deverá ser estimada a incerteza global do resultado produzido (Item 5.4.6),

o controle dos dados essencialmente relacionados com os cálculos e transferência dos dados

(Item 5.4.7) e a necessidade de instruções operacionais claras e objetivas sobre como executar

o método em questão (Item 5.4.1).

Com relação à garantia da qualidade (Item 5.9) é necessário que o Laboratório

disponha de um sistema de controle adequado para a monitoramento da validade dos ensaios

realizados. O uso regular de materiais de referência certificados e/ou o controle interno

utilizando materiais de referência secundários, como também a participação do Laboratório

em programas interlaboratoriais e ensaios de proficiência, quando possível, são recomendados

pela Norma.

Figura 4. Fatores que ocasionam variações nos resultados devido ao método

de ensaio (LINHARES et al 2002).

Com relação aos equipamentos (Item 5.5) (Figura 05) podemos verificar que fatores

ligados à manutenção, desempenho, contaminações, deterioração e regulagem (Item 5.5.6),

aliado a uma necessidade de instruções claras de operação, são fatores que poderão afetar a

qualidade dos resultados.

Figura 5. Fatores que ocasionam variações nos resultados devido aos

equipamentos (Adaptado de LINHARES et al., 2002).

Quanto ao material (Figura 06) é comum dizer-se que não se pode fornecer qualidade

se não se recebe qualidade. O Laboratório deve garantir que os suprimentos, reagentes e

demais materiais de consumo tenham a qualidade exigida para os ensaios a serem realizados

(Item 4.6.2). Os reagentes utilizados e as soluções resultantes devem ser controlados sob

vários aspectos. A rastreabilidade do certificado dos reagentes é um dos itens que devem ser

verificados.

Figura 6. Fatores que ocasionam variações nos resultados

devido ao material. (fonte: LINHARES et al 2002)

As amostras envolvendo também a amostragem (Itens 5.7 e 5.8) devem apresentar

certas características que garantam a sua representatividade, homogeneidade e integridade,

não somente quando da sua entrada, mas durante a sua permanência no Laboratório.

2.8 Incerteza

Atualmente, diferentes setores da indústria, da saúde, da área de meio ambiente, entre

outros, utilizam os resultados de análises gerados em laboratórios químicos para a tomada de

decisões. Com base nestes resultados, aceitam-se ou rejeitam-se matérias primas, diferenciam-

se desempenho de fornecedores, processos produtivos são modificados, atua-se sobre a saúde

das pessoas e dos animais (PALMIGIANI, 2005).

Através de estimativas de incerteza é possível obter resultados com maior aceitação

estatística e menor erro, sendo que fazer uma medida consiste em "cercar" um valor

verdadeiro. Assim se pode entender porque um valor medido só tem sentido quando

acompanhado de sua incerteza, que representa o intervalo de confiança atribuído ao resultado.

A comparação direta não é sempre possível; em conseqüência deve-se considerar uma relação

(lei física) entre a grandeza a ser medida e outras grandezas conhecidas ou mensuráveis

diretamente (BURIN, 2006).

Por definição, a incerteza de medição é o parâmetro associado ao resultado de uma

medição, que caracteriza a dispersão dos valores que podem ser fundamentadamente

atribuídos a um mensurando (INMETRO, 2007).

O resultado de uma medição é meramente uma estimativa do valor do mensurado, ao

relatar seu resultado torna-se necessária a indicação quantitativa e qualitativa desta estimativa,

de forma tal que aqueles que a utilizam possam avaliar sua confiabilidade. A incerteza do

resultado de medição reflete a falta do conhecimento exato – ou dúvida – quanto ao valor

verdadeiro do mensurado. Ela compreende, em geral, muitos componentes. Alguns desses

componentes podem ser estimados com base na distribuição estatística dos resultados das

séries de medições e podem ser caracterizados por desvios padrão experimentais. Outros

componentes, que também podem ser caracterizados por desvios padrão, são avaliados por

meio de distribuições de probabilidade assumidas, baseadas nas experiências ou em outras

informações, conforme expresso no Guia para a expressão da incerteza de medição –

(INMETRO, 2003).

O Guia para expressão da incerteza de medição da ISO (ISO GUM), edição 2003, foi

elaborado no sentido de harmonizar as metodologias utilizadas pelos laboratórios de

metrologia para a estimativa da incerteza nas medições, bem como servir como um guia de

fácil entendimento e implementação nas diferentes áreas da metrologia. Seu princípio consiste

em demonstrar que a incerteza global do ensaio ou calibração incorpora diversas fontes de

incerteza, que surgem de efeitos sistemáticos e aleatórios, propiciando, assim a

comparabilidade dos resultados das medições executadas por laboratórios distintos

(INMETRO, 2003).

A incerteza da medição está diretamente ligada com o controle de qualidade e a

garantia da qualidade, aspectos envolvidos na validação de métodos (BURNS, 2004).

2.8.1 Processo de estimativa da incerteza de medição

A estimativa da incerteza é simples em seu princípio. Na prática, a incerteza de um

resultado pode provir de muitas fontes possíveis, incluindo exemplos tais como definição

incompleta, amostragem, efeitos da matriz e interferências, condições ambientais, incertezas

das massas e instrumentos de medição volumétrica, valores de referência, aproximações e

suposições incorporadas ao método e ao procedimento de medição, e a variação aleatória

(CAMÕES, 2001).

A descrição do Guia para a expressão da incerteza de medição – GUM (INMETRO,

2003), envolve a identificação de todas as possíveis fontes de incerteza para o método; a

estimação de sua magnitude para os dados experimentais e a combinação destas incertezas

individuais para apresentar uma incerteza expandida (BARWICK et al., 1999).

A avaliação da incerteza é baseada na identificação e quantificação dos efeitos dos

parâmetros de influência sobre a incerteza global. Além disso, requer a compreensão do

procedimento de medição e das incertezas associadas a cada um dos fatores que influenciam o

resultado. A medição de uma grandeza é sempre iniciada através da identificação do

mensurando, associado aos respectivos métodos de medição e procedimento de medição

(BUCHMANN e SARKIS, 2002).

As tarefas que precisam ser executadas para se obter uma estimativa da incerteza

associada ao resultado de uma medição serão resumidas a seguir em quatro etapas segundo o

Guia EURACHEM/CITAC determinando a incerteza na medição analítica, 1º edição

brasileira, 2002 (ELLISON et al., 2002).

Etapa 1. Especificação do mensurando

O objetivo desta etapa é descrever o procedimento de medição. Consiste em enumerar

as etapas de medição e uma expressão matemática do mensurando e os parâmetros dos quais

ele depende (ELLISON et al., 2002).

Etapa 2. Identificação das fontes de incerteza

Esta etapa é uma das mais difíceis na avaliação da incerteza de medições analíticas,

porque há um risco de negligenciar as fontes de incerteza, por um lado, e contá-las duas

vezes, por outro. A utilização de um diagrama de causa e efeito, é um modo possível de

ajudar a evitar que isso ocorra (ELLISON et al., 2002).

Etapa 3. Quantificação dos componentes de incerteza

Medir ou estimar a dimensão do componente de incerteza associado a cada fonte

potencial de incerteza identificada. Geralmente é possível estimar ou determinar uma única

contribuição à incerteza associada a diversas fontes distinta. É também importante considerar

se os dados disponíveis abrangem suficientemente as fontes de incerteza, e programar

cuidadosamente experimentos e estudos adicionais para assegurar que todas as fontes sejam

adequadamente consideradas (ELLISON et al., 2003).

Etapa 4. Calcular a incerteza combinada

As informações obtidas na etapa 3 consistirão de diferentes contribuições

quantificadas para a incerteza total, sejam associadas a fontes individuais ou aos efeitos

combinados de diversas fontes. As contribuições devem ser expressas como desvios padrão, e

combinadas conforme as regras apropriadas para se ter uma incerteza combinada. O fator de

abrangência apropriado deve ser aplicado para se chegar a uma incerteza expandida

(ELLISON et al., 2003).

As etapas descritas acima se encontram sumarizadas na Figura 7.

Figura 7. Etapas do processo da estimativa da incerteza (ELLISON et al., 2003).

Para o resultado de uma medição, a incerteza total, denominada incerteza padronizada

combinada (uc), é um desvio padrão estimado igual à raiz quadrada positiva da variância

total, obtida pela combinação de todos os componentes da incerteza, independentemente de

como foram avaliados (ELLISON et al., 2003; Guia para a expressão da incerteza de medição

– INMETRO, 2003).

Em química analítica, para a maioria das aplicações, deve ser utilizada uma incerteza

expandida (U). A incerteza expandida fornece um intervalo dentro do qual se acredita, com

um alto nível de confiança, que esteja o valor do mensurando. É obtida pela multiplicação da

incerteza combinada, por um fator de abrangência (k). A escolha do fator k é baseada no nível

de confiança desejado (CAMÕES, 2001).

2.8.2 Formas de avaliação da incerteza

a) Avaliação do tipo A

Método de avaliação da incerteza pela análise estatística de uma série de observações.

Quando um conjunto de muitas medições repetidas é realizado, a média e o desvio padrão

estimado (s) podem ser calculados do conjunto (BUCHMANN, 2002).

O desvio padrão experimental da media é obtido de um procedimento de análise, do

cálculo da média aritmética ou de uma análise de regressão adequada (INMETRO, 2003).

Metrologicamente afirma-se que a melhor estimativa de uma grandeza, que varia

aleatoriamente é a média aritmética x, das diversas (n) medidas efetuadas. A variância

estimada (s

) ou desvio padrão estimado (s) caracteriza a variabilidade dos valores medidos,

Xi, ou seja, a dispersão em torno do valor médio (INMETRO, 2003).

De acordo com Mendes e Rosário (2005) a melhor estimativa da variância da média é

a variância experimental da média s

( ), que origina o desvio padrão experimental da média

(1) cuja expressão é:

(1)

Logo, o desvio padrão experimental da média é dado por:

s (2)

O desvio padrão experimental da média, dado em (2), qualifica quanto o valor médio

representa a grandeza a ser medida Xi. Quanto maior for o número de repetições, tanto melhor

será esta estimativa (MENDES; ROSÁRIO, 2005).

Por diversas razões (principalmente de caráter econômico) o número de repetições (n)

de uma medição é reduzido, variando tipicamente entre três e dez. Quando isso acontece, é

necessário utilizar um coeficiente, conhecido como “fator de abrangência”, ou “coeficiente t-

Student”, que considera o fato da amostragem ser pequena. Essa distribuição t-Student

permite estimar a incerteza tipo A, obtida estatisticamente, mesmo com baixo número de

repetições (INMETRO,2003).

Deste modo, a incerteza padrão tipo A (u(A)) para um certo nível de significância, ou

de confiança (usualmente se usará 95,45% de probabilidade), que definirá o valor de t, é

obtida através da equação (3) abaixo, conforme INMETRO (2003):

(3)

Sendo:

n = número de medições realizadas;

s = desvio padrão.

b) Avaliação do tipo B

As avaliações do Tipo B da incerteza padrão “é o método de avaliação da incerteza por

outros meios que não a análise estatística de uma série de observações”. São incertezas

estimadas usando qualquer outra informação. Pode ser informação de medições em

experiências passadas, de certificados de calibração, especificações do fabricante, de

informações publicadas, e do bom senso (ELLISON et al., 2003; INMETRO, 2003b).

Uma avaliação do tipo B da incerteza padrão exige discernimento baseado na

experiência e conhecimento geral, sendo essa uma habilidade que pode ser desenvolvida com

a prática pelo analista. Quando bem fundamentada, utilizando adequadamente a informação

disponível, essa pode ser tão confiável quanto uma avaliação do tipo A, especialmente em

uma situação em que a avaliação do tipo A é baseada somente em um número pequeno de

medições estatisticamente independentes (INMETRO, 2003).

Algumas observações são importantes para avaliação da incerteza. Sempre que

possível os erros sistemáticos devem ser corrigidos, ao adicionar as incertezas do tipo B deve

ser feita uma análise criteriosa para que não haja repetição, isto é, que não se considere mais

de uma vez a mesma fonte de incerteza (MENDES; ROSÁRIO, 2005).

Buchmann e Sarkis (2002), avaliaram a incerteza da concentração da solução estoque

como do tipo B, pois não existiam informações específicas sobre a distribuição dos valores de

concentração medidos dentro do intervalo específico, considerou-se uma distribuição

retangular.

2.8.3 Tipos de incerteza

2.8.3.1 Incerteza padrão (u)

É a incerteza associada aos dados de entrada u(y) relativos ao resultado de medição e é

expressa como um desvio padrão do mensurando u(x). Em alguns casos utiliza-se a incerteza

padrão relativa de medição, que é a incerteza padrão de medição associada a uma estimativa

dividida pelo módulo desta estimativa, portanto adimensional. Quando a estimativa for igual a

zero este conceito não se aplica (INMETRO, 2003).

Incerteza do resultado de uma medição expressa como equivalente a um desvio

padrão. Sempre estará em um nível de confiança de 68%. Todas as incertezas contribuintes

devem ser expressas no mesmo nível de confiança, convertendo-se então em incerteza padrão.

A incerteza padrão é a margem cujo tamanho pode ser pensada como “mais ou menos um

desvio padrão” (ELLISON et al., 2000).

É a incerteza do resultado de uma medição expressa com um desvio padrão. Esta

incerteza deve expressar todas as componentes, tipos A e B, correspondentes a um desvio

padrão. Para obtê-la divide-se o valor de cada contribuição de incerteza pelo seu respectivo

divisor correspondente à distribuição de probabilidade assumida ou atribuída, de acordo com

o Quadro 8 abaixo, que mostra o divisor atribuído a cada distribuição (MENDES; ROSÁRIO,

2005).

Quadro 8. Divisor utilizado em cada distribuição de probabilidade.

Fonte: MENDES; ROSÁRIO, 2005.

Distribuição

Divisor

Normal (certificado de calibração)

k (Fator de abrangência)

Retangular

Triangular

a) Distribuição normal (Gaussiana)

É sem dúvida a distribuição de probabilidade mais importante dentre as utilizadas em

metrologia. Sua função densidade de probabilidade tem forma de um sino (Figura 8) sendo

media (X) e desvio padrão (σ) representados abaixo (MENDES; ROSÁRIO, 2005).

Figura 8. Representação da distribuição normal (forma de um sino).

(ELLISON et al., 20003).

Segundo Mendes e Rosário (2005) quanto maior o número de medições feitas de um

mesmo mensurando, mais próximos da “normalidade”, ou seja, mais próximo da distribuição

normal será seu comportamento (na forma de sino). À medida que aumenta o número de

medições (n>200) a distribuição tende à normal.

Para obter-se uma distribuição próxima a normal faz-se necessário um número grande

de medições (n>200), como não é viável realizar em um laboratório 200 medições de um

mesmo mensurando, devemos aplicar um fator de correção com o objetivo de aproximar, ou

estimar, a distribuição de pequenos valores a uma distribuição normal. Esse fator é conhecido

como t-Student, é calculado em função do tamanho da amostra, n, ou do grau de liberdade, υ,

e do nível de confiança (probabilidade) desejado. Metrologicamente utiliza-se o nível de

confiança de 95,45% de probabilidade (MENDES; ROSÁRIO, 2005).

b) distribução retangular (uniforme)

É uma distribuição que descreve razoavelmente, em termos de probabilidade, o

conhecimento inadequado sobre a grandeza de entrada, quando na ausência de qualquer outra

informação que não os limites de variabilidade (INMETRO, 2003). É feita uma estimativa sob

a forma de uma faixa máxima (± a) sem se ter conhecimento do formato da distribuição, a

distribuição tem o formato apresentado na figura 9 (ELLISON et al., 2003).

A distribuição retangular é bem aplicada quando há uma distribuição com densidade

de probabilidade constante entre os limites superior e inferior, devendo assim ser suposta para

a possível variabilidade da grandeza de entrada. Desta maneira quando a distribuição de

probabilidade for a mesma num determinado intervalo, ou seja, quando a probabilidade de

ocorrer de maneira igual a todo o intervalo, tem-se uma distribuição retangular, cujo divisor é

(INMETRO, 2003).

Este tipo de distribução é metrologicamente adotada, na maioria dos casos, para a

resolução de instrumentos de medição, por ser considerada uma distribuição mais

conservadora, pois aumenta um pouco a incerteza final. Sendo assim quando na dúvida de

qual distribuição adotar, recomenda-se a retangular por fornecer uma incerteza maior e não

privilegiar nenhum intervalo (MENDES; ROSÁRIO, 2005).

Quando não houver base para se crer que é mais provável um erro maior ou um erro

menor, a estimativa de incerteza deve ser tratada como caracterizando uma distribuição

retangular (INMETRO, 2002).

Figura 9. Representação da distribuição retangular

(ELLISON et al., 20003).

c) Distribuição triangular

É a distribuição utilizada quando a probabilidade de ocorrência do resultado de uma

medição for maior na parte central, e que apresente a tendência de decair linearmente nas

extremidades de um determinado intervalo (MENDES; ROSÁRIO, 2005).

Se os limites de um intervalo de dados forem dados sem um nível de confiança, mas

com razões para supor que valores extremos sejam improváveis, assume-se geralmente uma

distribuição triangular, utilizando-se o divisor da distribuição como (s = a/ ). Quando

houver uma tendência, ou seja, quando um erro menor ou então um erro maior for

considerado substancialmente mais provável a estimativa da incerteza deve ser tratada como

uma distribuição triangular, (INMETRO, 2002). Sua função densidade de probabilidade tem

a forma de um triângulo (figura 10).

Figura 10. Representação da distribuição retangular

(ELLISON et al., 20003).

Alguns profissionais de metrologia adotam a distribuição triangular para estimar a

incerteza de indicadores analógicos (tipo ponteiro). Sua incerteza final é menor quando

comparada à utilização da distribuição retangular para este mesmo caso (MENDES;

ROSÁRIO, 2005).

2.8.3.2 Incerteza padrão combinada (uc)

Incerteza padronizada de um resultado de medição quando este resultado é obtido por

meio dos valores de várias outras grandezas, sendo igual à raiz quadrada positiva de uma

soma de termos, sendo estes as variâncias ou covariâncias destas outras grandezas,

ponderadas de acordo com quanto o resultado das medições variam com mudanças nestas

grandezas (ELLISON et al., 2003).

A determinação da incerteza padrão combinada, é obtida com a combinação das

diferentes incertezas padrão u(x

), não correlacionadas, envolvidas no processo de medição.

Sempre terá um nível de confiança de 68 % (SOUZA et al., 2006; FIDÉLIS, 2004).

Calcula-se a incerteza combinada (u

) conforme as expressões matemáticas (4), (5) e

(6) abaixo (INMETRO, 2003):

(4)

(5)

(6)

A incerteza combinada (u

) pode ser obtida derivando os fatores de influência,

considerando quando necessário o grau de liberdade efetivo (υeff) através da equação de

Welch-Satterthwaite, conforme relações (7) e (8) (INMETRO, 2003) a seguir:

(7)

(8)

O número de graus de liberdade efetivo (υeff) é o número de termos de uma soma

menos o número de restrições aos termos da soma. Quando fazemos um número reduzido de

medições, aproxima-se de uma distribuição normal, aplicando-se o fator de correção da

distribuição de t-Student (MENDES; ROSÁRIO, 2005).

Estima-se o grau de liberdade efetivo resultante da incerteza combinada quando as

incertezas padrão de várias fontes de incerteza são consideradas para estimar a incerteza

padrão combinada (MENDES; ROSÁRIO, 2005).

2.8.3.3 Incerteza expandida (U)

Grandeza que define um intervalo em torno do resultado de uma medição que pode ser

esperado em englobar uma grande fração da distribuição de valores que podem ser

razoavelmente atribuídos ao mensurando. A incerteza expandida é expressa com um nível de

confiança de aproximadamente 95 % ou 99 % (ELLISON et al., 2003).

A incerteza expandida é obtida pela multiplicação do fator de abrangência (k) pela

incerteza padrão combinada (u

). O valor k (advindo do coeficiente t-Student) atribui a

expansão requerida para a incerteza combinada calculada. A multiplicação por uma constante

(k) não fornece nenhuma informação adicional, é apenas uma maneira de representar a

incerteza final a um nível de confiança estabelecido. O valor obtido atribui o intervalo de

dados com a probabilidade de ocorrência associado ao resultado de medição. A incerteza

expandida (U) pode ser calculada como mostra a equação (9) (INMETRO, 2003; SOUZA et

al., 2006)

(9)

Sendo:

U = incerteza expandida;

k = fator de abrangência;

uc = incerteza padrão combinada.

Assumindo-se uma distribuição normal, o quadro 9, a seguir relaciona o fator de

abrangência (k) a um dado nível de confiança (p). Quando temos um número elevado de

medições (n>30), utiliza-se como regra k = 2 para expressar a incerteza expandida

(MENDES; ROSÁRIO, 2005):

Quadro 9. Relação entre nível de confiança e fator de abrangência.

Nível de confiança

p(%)

Fator de abrangência

68,27 1,000

90,00

1,645

95,00

1,960

95,45 2,000

99,00 2,576

99,73

3,000

68,27 1,000

Fonte: MENDES; ROSÁRIO (2005)

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Classificação da pesquisa

Para a classificação da pesquisa tomou-se como base o critério proposto por Vergara

(2005), que a qualifica em relação a dois aspectos: quanto aos fins e quanto aos meios de

investigação.

Quanto aos fins, a pesquisa é classificada em EXPLORATÓRIA, EXPLICATIVA e

APLICADA. Exploratória, pois é realizada em área na qual há pouco conhecimento

acumulado e sistematizado. Explicativa, pois visa esclarecer quais fatores contribuem, de

alguma forma, a ocorrência de determinado fenômeno. Aplicada porque é motivada pela

necessidade de resolver problemas concretos. A presente pesquisa enquadra-se nesta

classificação visto que de acordo com a pesquisa bibliográfica realizada foi possível verificar

que são poucas as informações sobre estudos que vizam a realização de ensaios de detecção

do AO por CLAE-DF de acordo com as orientações da NBR ISO/IEC 17025. A comparação

entre as metologias permitirá indicar aquela que melhor se adequa aos procedimentos

determinados pela NBR ISO/IEC 17025 visando aumentar a garantia da qualidade dos

resultados gerados, bem como, a elaboração do procedimento para o cálculo e a determinação

da incerteza da metodologia Silva (2001).

Quanto aos meios, a presente pesquisa foi realizada a partir do estudo de uma

coletânea de métodos de ensaio, publicada em livros e artigos científicos, acessível ao público

em geral, caracterizando-se como uma pesquisa bibliográfica e, supõe intervenção

participativa na realidade a partir dos resultados estabelecidos com base nas análises e

cálculos realizados caracterizando-se também como um tipo particular de pesquisa

participante e aplicada que de acordo com Vergara (2005) é classificada como pesquisa-ação.

3.2 Etapas da Pesquisa

3.2.1 Metodologia

Para esta pesquisa foi levada em consideração a importância da detecção das toxinas

AO por CLAE-DF, como uma das ferramentas capazes de contribuir com a qualidade e a

segurança dos mexilhões comercializados e consumidos por humanos, além da necessidade

de investir na implementação de um sistema de gestão da qualidade que aumente a garantia da

qualidade dos resultados gerados nas análises desenvolvidas no laboratório ToxMar tornando-

os passíveis de serem comparados a padrões oficiais de órgãos regulamentares estabelecidos

pelos órgãos governamentais, o que requer o conhecimento da incerteza para aumentar a

confiabilidade do resultado.

A presença da toxina em determinados níveis resulta na proibição do consumo,

refletindo na produção e venda deste produto que gera problemas de cunho social e

financeiro, visto que para alguns maricultores a comercialização deste produto é a sua única

fonte de renda.

Diferentes metodologias de detecção são utilizadas porém apenas a metologia proposta

por Lee et al., (1987) passou por um processo de validação para a detecção de AO e DTX-1.

A necessidade de fornecer resultados com garantias de qualidade e métodos alternativos que

viabilizem a realização das análises para o desenvolvimento de um programa de

monitoramento impulsionou e estimulou o desenvolvimento desta pesquisa.

3.2.2Coleta de dados

A coleta de dados é parte integrante do processo da pesquisa bibliográfica.

Os seguintes meios para a coleta de dados foram utilizados:

 Bibliográfico: para a fundamentação teórica do trabalho foi realizada uma investigação

sobre legislações; norma NBR ISO/IEC 17025 e, um panorama geral do

monitoramento de ficotoxinas em pescado em diferentes países, as técnicas de

detecção e quantificação da toxina AO, a implementação de sistemas de qualidade nos

laboratórios, entre outros, com o uso de material acessível ao público em geral, tais

como livros, teses, dissertações e artigos de onde foram pesquisadas as metodologias

analisadas.

 Documental: baseado em documentos internos publicados pelo INMETRO, como

algumas normas técnicas e as metodologias dos ensaios de detecção utilizados nesta

pesquisa.

 Entrevistas com pesquisadores a fim de obter maiores informações sobre o

desenvolvimento das metodologias e sobre a norma NBR ISO/IEC 17025.

 URL: através de consultas via internet para buscar mais dados secundários referentes

ao setor de análise; tais como normas vigentes, publicações online, entre outras.

3.2.3 Seleção das metodologias a serem avaliadas

Atualmente, a metodologia mais utilizada nos monitoramentos é o bioensaio com

camundongos, porém sabe-se que esta técnica enfrenta problemas com relação a ética quanto

ao uso de animais em seus ensaios além de apresentar baixa especificidade e sensibilidade

(FREMY et al 1999), portanto a implementação de técnicas capazes de apresentar mais

especificidade e sensibilidade, como a CLAE-DF se faz necessária.

Através da revisão da literatura foi possível identificar diferentes metodologias de

detecção por CLAE-DF e escolher dentre as existentes as três metodologias que foram

analisadas no presente estudo. Esta escolha foi realizada em função da utilização em

diferentes países e da importância que cada uma apresenta, conforme descrito a seguir.

A metodologia proposta por LEE et al., (1987) é a metodologia oficial utilizada em

vários países que realizam o monitoramento da toxina AO, nesta metodologia o reagente

cromóforo utilizado é o ADAM, que apresenta baixa estabilidade e alto custo, fato este que

levou ao desenvolvimento de pesquisas a fim de buscar reagentes cromóforos mais estáveis e

de menor custo, que apresentem resultados similares aos obtidos com o reagente em questão.

A metodologia proposta por SIGMA (1993) é a que acompanha o kit obtido quando da

compra do padrão para a toxina AO, sendo proposta para a identificação e quantificação da

toxina. Esta metodologia utiliza o BAP como cromóforo e o DIPA como base catalizadora.

Metodologia Silva (2001) foi desenvolvida e é utilizada pelo laboratório ToxMar da

UFRRJ – realiza detecção e quantificação de ficotoxinas, bem como a identificação e

quantificação de microalgas potencialmente produtoras das toxinas - esta metodologia

também utiliza o BAP como reagente cromóforo porém a base catalisadora é o TEA (30% em

acetonitrila).

3.2.4 Estudo e avaliação dos ítens na norma NBR ISO/IEC 17025 junto ao Inmetro

Foram realizadas pela autora, visitas ao INMETRO, nas quais foi desenvolvido um

estudo sobre os itens da norma NBR ISO/IEC 17025, bem como o aporte de bibliografia que

possibilitou o melhor entendimento da norma e a determinação dos itens pertinentes ao

presente estudo, visto que o estudo se limitou a análise da metodologia de detecção do AO

sem a sua realização.

3.2.5 Avaliação das metodologias identificando as principais variáveis que podem

interferir no resultado.

Durante a análise das metodologias foi elaborado um fluxograma no qual foram

esquematizadas as etapas, os reagentes, os solventes e os tempos de reação para cada

metodologia (Figuras 9, 10 e 11). A partir deste detalhamento foi possível identificar as

variações em cada etapa das diferentes metodologias, além de possibilitar a identificação das

variáveis de acordo com o nível de interferência que cada uma é capaz de exercer sobre o

resultado.

1g amostra

Adicionar 4 mL MeOH 80% / homogeneizar por 2 min

temperatura ambiente / centrifugar (3000 rpm/10 min)

Adicionar 1 mL de água e 4 mL de clorofórmio

agitar com mixer/20s/ centrifugar

Transferir fase inferior para tubo graduado

Reextrair sobrenadante com 4 mL de clorofórmio

Adicionar o precipitado ao tubo

Transferir o eluído para tubo teste / secar sob N

Dissolver em 0,1 mL de metanol aquoso

EXTRAÇÃO

Adicionar ao sobrenadante 2,5 mL éter

de petróleo / descartar sobrenadante

Manter o extrato em clorofórmio

DERIVAÇÃO

SPE

Secar 0,5 mL do extrato / adicionar 100 µL de ADAM 0,1%

Reagir por 1 h / 25°C / escuro

Evaporar o solvente / diluir o produto em 1 mL de

hexano:clorofórmio/ transferir para seringa 10 mL

Ativar coluna com 5mL de hexano:clorofórmio

Transferir o conteúdo da seringa

lavar a coluna com 5mL de clorofórmio /

Eluir os ésteres como 5 mL de clorofórmio:metanol aquoso

Figura 11. Fluxograma das etapas, reagentes e procedimentos da metodologia Lee et al

(1987)

Injetar 10µL no cromatógrafo

1g amostra

Adicionar 4 mL MeOH 80% / homogeneizar 2 min

temp ambiente /BUS 10min/ centrifugar (2000 rpm/15 min)

Adicionar 1 mL de água e 4 mL de clorofórmio

agitar com inversão 1 min

Transferir fase inferior para tubo graduado /

Reextrair sobrenadante com 1 mL de água e 4 mL

de clorofórmio /Adicionar o precipitado ao tubo

Transferir o eluído para tubo teste / secar sob N

redissolver em 0,5 mL de acetonitrila

EXTRAÇÃO

Adicionar ao sobrenadante 2,5 mL éter de petróleo

/agitar com inversão 1min/ descartar sobrenadante

Secar o extrato com N

e adicionar

0,5 mL de acetonitrila

0,5 mL de extrato/ Adicionar 0,5 mL BAP em ACN + 15 µL

DIPA 5% em ACN / BUS por 10 min / Reagir por 15

min a 75°C

Evaporar em N

/ diluir em 1 mL de

hexano:clorofórmio/ transferir para seringa 10 mL

Ativar coluna com 5mL de hexano:clorofórmio

Transferir o

extrato derivado para a coluna

Adicionar a coluna 5 mL de hexano:clorofórmio/ 5 mL de

clorofórmio / descartar o eluído / secar a coluna / eluir o

extrato com 5 mL de clorofórmio:metanol

DERIVAÇÃO

SPE

Figura 12. Fluxograma das etapas, reagentes e procedimentos da metodologia SIGMA(1993)

Figura 13. Fluxograma das etapas, reagentes e procedimentos da metodologia Silva (2001).

Injetar 10µL no cromatógrafo

1g amostra

Adicionar 4 mL MeOH 80% / homogeneizar 2 min

temp ambiente /BUS 10min/ centrifugar (2000 rpm/15 min)

Adicionar 1 mL de água e 4 mL de clorofórmio

agitar com inversão 1 min

Transferir fase inferior para tubo graduado /

Reextrair sobrenadante com 1 mL de água e 4 mL

de clorofórmio /Adicionar o precipitado ao tubo

secar sob N

redissolver em 0,5 mL de acetonitrila

EXTRAÇÃO

Injetar 20µL no cromatógrafo

Adicionar ao sobrenadante 2,5 mL éter de petróleo

/agitar com inversão 1min/ descartar sobrenadante

Secar o extrato com N

e adicionar

0,5 mL de acetonitrila

DERIVAÇÃO

0,5 mL de extrato/ Adicionar 0,5 mL BAP em ACN +

15 µL TEA 30% em ACN / BUS por 10 min /

Reagir por 20 min a 75°C

3.2.6 Identificação dos requisitos da Norma NBR ISO/IEC 17025 a serem

implementados

A identificação dos principais gargalos e fontes de não conformidades na realização

dos ensaios de detecção tem como base os seguintes requisitos técnicos da Norma NBR

ISO/IEC 17025: métodos de ensaio (item 5.4), equipamentos (item 5.5), rastreabilidade da

medição (item 5.6), e a garantia da qualidade de resultados de ensaio e calibração (item 5.9)

bem como o uso de materiais de referência.

3.2.7 Elaboração do procedimento para o cálculo da incerteza

A elaboração do procedimento para a estimativa da incerteza da metodologia

Silva(2001) utilizada para a detecção da ficotoxina AO, no laboratório ToxMar, foi realizada

de acordo com Guia de expressão de incerteza, INMETRO (2003).

Inicialmente foram identificadas quatro etapas na metodologia que contribuem com a

incerteza do resultado. Para cada etapa foi especificado o mensurado, foram identificadas as

fontes de incerteza, elaborado o diagrama de Ishikawa (causa e efeito), elaborado o

procedimento para estimar a incerteza padrão, combinada e expandida desta metodologia.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Comparação entre as Metodologias Analisadas

A análise comparativa realizada para o desenvolvimento dos fluxogramas (figuras 9,

10 e 11) para as três metodologias em questão, permitiu identificar algumas diferenças quanto

ao número de etapas empregadas na obtenção do extrato e em relação aos cromóforos e

catalisadores empregados na etapa de derivação.

4.1.2 Etapas

Apenas a etapa de extração da toxina à partir da matriz biológica foi consenso para as

três metodologias relativa aos reagentes empregados.

A metodologia oficial proposta por Lee et al., (1987) foi o primeiro método analítico

por cromatografia líquida de alta eficiência desenvolvido para detecção de toxinas AO e

DTX-1. A metodologia consiste em etapas de extração da toxina a partir de uma matriz

biológica, derivação do extrato seguida de uma etapa de limpeza pós-derivação (SPE) para

então o material derivado ser submetido à análise cromatográfica. A metodologia SIGMA

(1993) emprega as três etapas, sendo diferente apenas quanto aos reagentes usados na

derivação. Silva (2001) modificou o procedimento da etapa de derivação descrito por SIGMA

op. cit.. A modificação consiste na substituição da base catalisadora da reação entre o

cromóforo e a toxina AO.

Nas metodologias avaliadas foi utilizada como matriz biológica a glândula digestiva

de moluscos bivalves (LEE et al., op cit. usaram mexilhões – Mytilus edulis - e vieiras –

Patinopecten yessoensis -) para a extração da toxina, excetuando a metodologia SIGMA que

não descreve a origem da matriz e nem o tecido para análise. Yasumoto et al., (1978)

afirmaram que a glândula digestiva (o que corresponde a 20-25% do peso corporal desse

animal) é o órgão no qual as toxinas estão mais concentradas, pois este tecido apresenta maior

percentual de lipídeos e as toxinas são lipossolúveis.

A etapa de extração foi comum nas metodologias em questão, ou seja, apenas uma

única extração foi realizada com metanol aquoso a 80%, diferindo apenas com relação a

centrifugação. Lee et al., empregaram 3000 rpm/ 10 min, enquanto SIGMA e Silva

empregaram 2000 rpm/15 min. Na limpeza do extrato durante a etapa de extração, Lee et al.,

utilizaram clorofórmio além do éter de petróleo e da solução de clorofórmio:água, conforme

pode ser verificado na Tabela 1. De acordo com Lee et al., (1987) o conteúdo de toxina

extraída não aumenta significativamente com a repetição do passo de extração em metanol.

Após a extração Lee et al., mantiveram o extrato em clorofórmio, enquanto SIGMA e

Silva mantiveram em acetonitrila.

Tabela 1 Solventes utilizados na etapa de extração das metodologias analisadas. A - Lee et

al., (1987); B - SIGMA (1993); C – Silva (2001).

Na etapa de derivação Lee e seus colaboradores utilizaram apenas uma alíquota de 0,5

mL do extrato em clorofórmio, enquanto SIGMA e Silva secaram todo o volume obtido após

a extração e depois redissolveram em 0,5 mL de acetonitrila.

Lee e seus colaboradores propuseram um tempo de reação mais longo para a reação de

derivação da toxina (AO e DTX-1) com o reagente cromóforo 9-antrildiazometano (ADAM).

Esta reação consiste na conversão da toxina em um éster fluorescente pela associação com o

reagente cromóforo, desta forma a molécula pode ser identificada pelo detector de

fluorescência do cromatógrafo.

A esterificação da toxina usando ADAM foi completada em 1 hora a 25°C no escuro.

Não foi empregada nenhuma base para acelerar a reação de derivação. Nas outras duas

metodologias o reagente cromóforo utilizado para a esterificação do AO foi similar, o 1-

bromoacetilpireno (BAP), no entanto, empregou-se para a catálise da reação diferentes bases.

Em SIGMA a reação de derivação foi catalisada pela base N,N-Diisopropiletilamina (DIPA) a

5% em acetonitrila e concluída em 15 minutos; e em Silva (2001) a reação de esterifição foi

catalisada pela trietilamina (TEA) a 30% em acetronitrila por 20 minutos, conforme pode ser

verificado na tabela 2.

Lee et al., (1987) verificaram que períodos de reação mais longos que 1 hora não

resultaram em aumento dos ésteres da toxina. Silva (2001) observou que tempos de reação

inferiores a 20 minutos, catalisados por TEA a 30%, mostraram uma baixa linearidade da

intensidade de fluorescência (altura do pico), ou seja, uma menor unidade de área. Concluindo

que para a base empregada, o tempo de 20 minutos foi o ideal para a reação de derivação.

Tabela 2. Reagentes cromóforos, bases catalisadoras, tempos e temperaturas utilizados na

etapa de derivação das metodologias analisadas. A - Lee et al., (1987); B - SIGMA (1993); C

– Silva (2001).

Metodologia A

Metodologia B

Metodologia C

Extração

Metanol:água (1x)

(3000 rpm/10 min)

Metanol:água (1x)

(2000 rpm/15 min)

Metanol:água (1x)

(2000 rpm/15 min)

Limpeza do

extrato

Éter de petróleo (2x)

Clorofórmio:água (2x)

Clorofórmio (1x)

éter de petróleo (2x)

Clorofórmio:água (2x)

éter de petróleo (2x)

clorofórmio:água (2x)

Metodologia A Metodologia B Metodologia C

Reagente

cromóforo

ADAM

0,1% em metanol

BAP

Base

catalisadora

DIPA 5% em acetonitrila

TEA 30%

em acetonitrila

Tempo e

tempetatura

25°C/1 hora

(no escuro)

75°C/15 min

(banho maria)

75°C/20 min

(banho maria)

Na etapa de separação dos ésteres das toxinas AO e DTX-1 por extração em fase

sólida (SPE), tanto Lee et al.,(1987) quanto SIGMA (1993) executaram procedimentos de

obtenção similares, excetuando Silva (2001) que não realizou esta etapa. A não realização

desta etapa de SPE foi possível pois o autor verificou em seus experimentos que nenhuma

substância eluía no mesmo tempo ou próximo ao tempo de retenção do AO, não havendo

risco de picos interferentes que pudessem ser confundidos ou ampliar o pico do AO gerado

pelo cromatograma. A observação de Silva (2001) vem ao encontro da conclusão de González

et al., (1998) que afirmaram que esta etapa de limpeza ou pós derivação em sílica (SPE) é

fundamental pois reduz os picos interferentes e o ruído químico presentes na maioria dos

cromatogramas gerados.

A utilização de solventes de diferentes solubilidades e polaridades para a lavagem do

cartucho SPE resulta na remoção dos interferentes, principalmente ácidos graxos livres (AGL)

presentes em altas concentrações nos moluscos, e que também podem reagir com o

cromóforo, o que pode levar a obtenção de resultados falsos positivo (LEE et al., 1987;

LAWRENCE et al., 1996; VALE, 2006).

Na literatura outros autores propuseram modificações na etapa de pós derivação

desenvolvida por Lee et al., (1987). Os solventes utilizados podem influenciar na

reprodutibilidade do método, na maior ou menor ação dos agentes interferentes, na própria

decomposição do reagente de derivação (ADAM e BAP) ou na reação destes com AGL e ou a

reação dos ésteres da toxina com os AGL (QUILLIAN, 1995; AASE; ROGSTAD, 1997;

GONZÁLEZ et al., 1998). De acordo com Rodrigues e Vale (2009) tanto o BAP quanto a

base catalisadora, quando em excesso, podem reagir com os ácidos graxos livres presentes na

amostra.

4.1.3 Solventes e reagentes utilizados em cada metodologia

Para confecção do extrato bruto a partir da matriz biológica todas as metodologias

analisadas empregaram uma solução de metanol:água na proporção de 80:20 (v/v).

Prosseguindo-se a extração foi empregado éter de petróleo e uma solução de clorofórmio e

água. Não foi encontrada diferença no emprego de solventes na etapa de extração para

nenhuma das três metodologias analisadas no presente trabalho.

Em relação à etapa de derivação houve divergência tanto em relação ao cromóforo empregado

quanto da base catalisadora. A metodologia oficial (LEE et al., 1987) utilizou 9-

antrildiazometano como reagente cromóforo e não fez uso de base catalisadora. As outras

duas metodologias, SIGMA (1993) e Silva (2001), utilizaram 1-bromoacetil(pireno) como

reagente cromóforo e cada uma empregou uma diferente base catalisadora. São escassas as

informações na literatura referindo-se a base catalisadora. Porém, esta é uma substância

importante na reação de derivação com o reagente BAP, pois é ela que acelera a reação que

resulta na conversão do AO a um éster fluorescente.

A metodologia SIGMA (1993) preconizou como base catalisadora o DIPA. Esta base

foi utilizada por Dickey et al., (1993) que verificaram sua ampla utilização para a derivação

de ácidos graxos livres, ácidos biliares e ácidos carboxílicos, sendo uma das mais eficientes

para catalisar este tipo de reação. Além de concluir que o excesso molar de 50 vezes foi

suficiente para promover a derivação de todo o AO presente na amostra. No mesmo estudo

estes autores concluíram que uma temperatura de 75ºC por 15 minutos foi suficiente para a

reação completa de derivação do ácido okadaico presente na amostra com o 1-

bromoacetil(pireno) catalisado pela base DIPA.

Silva (2001) também usou o 1-bromoacetil(pireno) para esterificação do AO. Porém,

propôs uma modificação na etapa de derivação descrita por SIGMA (1993). O autor

empregou uma base alternativa, a trietilamina, para catalisar a reação de derivação. A

trietilamina foi testada em diferentes concentrações (20%, 30%, 40% e 50%), sempre diluída

em acetonitrila. A temperatura de reação foi mantida a 75ºC e o tempo de derivação foi

testado (15 min e 20 min). O autor concluiu com base no tempo de retenção e na área média

do volume injetado, que a temperatura de 75ºC/ 20 min foi suficiente para a reação ser

completada. A base TEA mostrou-se tão eficiente quanto o DIPA com relação a sua ação

catalisadora, porém com custo muito inferior. Quando é realizado um grande número de

análises (como nos monitoramentos), este fato contribui com a redução dos custos tornando

mais viáveis a realização das análises.

Apesar de sua excelente capacidade de detecção, a instabilidade do 9-

antrildiazometano levou os pesquisadores a buscarem reagentes de derivação alternativos. Em

FAO (2004) encontram-se compilados vários relatos de reagentes que foram testados, Shen et

al., (1991) utilizaram 4-bromometil-7-methoxicoumarin, Dickey et al., (1993) introduziram 1-

bromoacetilpireno, enquanto Akasaka et al., (1996) utilizaram 2,3-(antracenedicarboximido)

ethiltrifluoro-methanosulphonato e Lawrence et al., (1996) testaram o 9-

chloromethylanthraceno. Tendo se destacado o 1-bromoacetil(pireno) (BAP). Segundo

González (1998) apesar destes reagentes serem mais estáveis, apresentarem menor custo e

menor limite de detecção, apenas o BAP superou a eficiência do ADAM, pois todos os

demais requeriam uma etapa de SPE mais complexa, que consiste em um sistema de dupla

coluna de HPLC com válvula, ou um tempo maior do que o ADAM para que a molécula de

AO fosse convertida a um éster fluorescente, atingindo uma derivação quantitativa estável.

Este fato onera a análise e demanda um tempo maior para a sua realização. A metodologia

proposta por Dickey (1993), que empregava o BAP utilizou uma etapa de SPE igual à

utilizada para derivação com ADAM.

Prassoupoulou et al., (2009) realizaram experimentos de detecção do AO em

mexilhões (Mytillus galoprovincialis), utilizando o BAP como reagente cromóforo e

obtiveram resultados que apresentaram menores interferências cromatográficas além de

concluirem que o reagente foi estável e necessitou de menor tempo de reação. Estes resultados

confirmam o que foi observado anteriormente por Dickey et al., (1993), Kelly et al., (1996) e

González et al., (2000) que realizaram experimentos utilizando o 1-bromoacetil(pireno) como

reagente cromóforo em amostras de moluscos bivalves e necessitaram de um tempo de reação

inferior ao utilizado na derivação com ADAM e obtiveram cromatogramas com menos

interferência cromatográfica na detecção do AO.

Estudos posteriores utilizando a metodologia Silva (2001) foram realizados por

Ferreira (2004) que analisou amostras de mexilhões coletadas na baía de Sepetiba e

quantificou a toxina AO em concentrações que variaram de 2 a 20 ng.g

-1

de glândula digestiva

de mexilhão, a autora verificou também que as maiores concentrações de AO foram

detectadas no verão quando comparados com as detecções realizadas na primavera. Oliveira

(2005) também utilizando mexilhões coletados na baia de Sepetiba e Mangaratiba obteve

concentrações médias de 19,61ng de AO.g

-1

de glândula digestiva em Sepetiba e 9,88ng de

AO.g

-1

de glândula digestiva. Lourenço et al., (2007a) analisando mexilhões Perna perna,

detectaram a ficotoxina ácido okadaico, com concentração de 2,65 ngAO.g

-1

de glândula

digestiva de molusco, em apenas uma amostra das três coletadas no mês de março de 2004 na

enseada de Maciéis localizada na baía de Ilha Grande; e Mariné (2010) analisou amostras de

mexilhões Perna perna também na enseada de Maciéis localizada na baía de Ilha Grande, nos

meses de maio a outubro de 2006, e verificou que todas as amostras analisadas apresentaram

contaminação pela toxina AO em concentrações que variaram entre 0,20µg.g

-1

e 8,54µg.g

-1

glândula digestiva. Esses valores situam-se acima do limite permitido para comercialização e

consumo, segundo a União Europeia, que estipulou o nível máximo em 0,16µg.g-1 (do corpo

todo ou alguma parte específica do molusco separadamente) (Decisão 2002/225/EC). Estes

autores também verificaram que nenhuma substância eluia no mesmo tempo ou muito

próximo ao tempo de retenção do AO, confirmando o que foi anteriormente observado por

Silva (2001), que a partir desta constatação alterou o procedimento proposto por SIGMA

(1993) excluindo a etapa de SPE. Os resultados confirmaram que a derivação do ácido

okadaico pelo reagente cromóforo 1-bromoacetil(pireno) e a base catalisadora trietilamina

30% em acetonitrila promoveu a derivação do AO permitindo sua detecção e quantificação,

baseando-se nas concentrações de AO observadas pelos autores.

4.2 Operacionalidade e Acessibilidade

Com relação ao número de etapas realizadas em cada metodologia, observou-se que

apesar de apresentarem o mesmo número de etapas – extração, derivação e SPE – as

metodologias propostas por Lee e SIGMA apresentaram tempos de realização bem diferentes.

Na etapa de derivação tanto em Lee e colaboradores quanto em SIGMA o tempo de reação

difere. Em Lee a esterificação do AO só foi completada após uma hora e sob a temperatura de

25ºC, e enquanto para SIGMA o produto da reação, o éster do AO, foi produzido após a

permanância em banho maria a 75ºC por 15 minutos, conforme exposto nas figuras 9 e 10.

A metodologia Silva (2001) demanda um tempo ainda menor do que o preconizado

por SIGMA. Esta redução do tempo de realização é conseqüência da realização de apenas

duas etapas (extração e derivação). Tornando esta metodologia mais acessível para a

realização de um grande número de análises e gerando também redução no custo das análises.

De acordo com Lee et al., (1987) o reagente cromóforo ADAM apresenta baixa

estabilidade, fato que implica em ações que objetivem garantir a manutenção de sua

estabilidade. Lee et al disseram que o ADAM foi estável por vários meses quando estocado a

– 25ºC, ao abrigo da luz. No entanto, a solução preparada, ADAM 0,1% em metanol, apenas

por uma semana. Quanto aos ésteres de AO em metanol também foram estáveis por vários

meses. Aumentando o tempo de armazenamento.

O BAP também necessita ser armazenado a -20ºC, ao abrigo da luz, porém este

reagente apresenta maior estabilidade, possibilitando um maior período de armazenamento

(DICKEY et al., 1993; GONZÁLEZ et al., 2000).

As modificações propostas por Silva (2001) permitiram a determinação do AO. E

quando comparada as demais metodologias investigadas mostrou vantagens operacionais e de

acessibilidade, ou seja, a redução de uma etapa durante o procedimento (SPE) tornou o

método mais rápido, além da redução dos custos para cada análise.

4.3 Possíveis Variáveis Interferentes Identificadas nas Metodologias Analisadas

A análise das metodologias permitiu identificar nas diferentes etapas de cada uma, as

variáveis que podem interferir nos resultados.

Para cada variável foi identificada a medida preventiva que permitirá minimizar e

controlar sua interferência no resultado conforme mostra a Tabela 3.

Foi realizada uma análise mais detalhada da metodologia Silva (2001), pois esta é a

metodologia utilizada no laboratório ToxMar, fato que tornou possível o acesso a informações

sobre os reagentes, o padrão, os equipamentos e os materiais de medição volumétrica

utilizados na realização das análises, bem como a detalhes da realização da análise,

informações que são fundamentais para determinar a incerteza.

A etapa de preparo da solução padrão do ácido okadaico, do reagente cromóforo 1-

bromoacetilpireno e da base catalisadora trietilamina (que antecedem a realização da análise),

e a incerteza da injeção do material, bem como a determinação da área no cromatograma,

foram identificadas como as principais fontes de incerteza na metodologia analisada.

O processo de quantificação da toxina na amostra resulta da relação de

proporcionalidade estabelecida entre a massa de ácido okadaico presente na área do pico do

cromatograma do padrão com a área do pico da amostra correspondente ao tempo de retenção

do AO.

As áreas são fornecidas pelos cromatogramas e a massa do padrão é conhecida, pois

sabe-se quanto foi utilizado no preparo da solução padrão. Modela-se que a área da amostra é

proporcional a área do padrão, calculando-se desta forma a massa de ácido okadaico na

amostra.

Tabela 3 Variáveis passíveis de aumentar a incerteza na detecção do AO identificadas nas

metodologias analisadas.

O conhecimento da incerteza da balança usada para medir as massas usadas no preparo

da solução de 1-bromoacetil(pireno), o conhecimento da incerteza da massa de ácido okadaico

contida no frasco fornecido pelo fabricante, além do conhecimento da incerteza da pipeta

utilizada para medir os volumes de solvente utilizados são variáveis que contribuem de forma

significativa para a incerteza do resultado da análise e precisam ser conhecidas para que esta

possa ser calculada e associada ao resultado final da análise.

4.4 Requisitos Técnicos da NBR NBR ISO/IEC 17025 a Serem Implementados

A análise das metodologias de detecção do ácido okadaico, tendo como base a NBR

NBR ISO/IEC 17025, permitiu a identificação de alguns requisitos técnicos que podem afetar

a garantia da qualidade dos resultados gerados, se estes não forem considerados.

Tendo como base a realidade do laboratório ToxMar/UFRRJ foram identificados

alguns itens da norma NBR NBR ISO/IEC 17025 passíveis de serem implementados para

aumentar a garantia da qualidade das análises realizadas.

É importante garantir que todos os materiais, equipamentos, reagentes e solventes que

serão utilizados na análise estejam em condições de uso e em quantidades adequadas para a

realização das análises. Para avaliar estas condições, foi elaborado um checklist (Quadro 10)

que apresenta um roteiro que facilita a verificação e a realização de um levantamento prévio

das condições necessárias para a realização do trabalho.

Item do ensaio Variável Medida preventiva

Pesagem de reagentes

Massa dos reagentes

calibração da balança

conhecimento da incerteza.

Medida dos volumes

utilizados

Volume da pipeta e da

microsseringa

Calibração da pipeta e

microseringa

conhecimento da incerteza

Reação de derivação

Tempo / temperatura

Controle do tempo

Calibração do banho maria

Injeção do material no

cromatógrafo

Volume do material

Calibração do dispositivo de

injeção

Determinação da área do

cromatograma

Área do pico

Calibração do integrador

Inicialmente, no item “a” do checklist (Quadro 10) será identificada e selecionada a

vidraria, verificando a quantidade necessária, as condições de limpeza e as condições de

armazenamento, além da calibração dos materiais de medida volumétrica (pipetas) que serão

utilizadas para medir os volumes que contribuem com a incerteza do resultado.

O item “b” do checklist (Quadro 10) permite um levantamento dos equipamentos

necessários, a relização do registro dos procedimentos de calibração, mantendo sempre

atualizado e verificando a realização destas atividades. Quando forem usados equipamentos

que não estejam sobre o controle do laboratório é importante assegurar que os requisitos de

calibração e manutenção sejam atendidos.

Através da item “c” do checklist (Quadro 10) é possível fazer um levantamento dos

reagentes, solventes e padrões; verificando a acessibilidade (através da realização de cotações

junto aos fornecedores), a validade e as condições de armazenamento daqueles que já

existirem no laboratório e o preparo das soluções e padrões envolvidos nas análises.

O item “d” do checklist (Quadro 10) trata da verificação do responsável pela

realização da análise, destacando a importância da identificação de um responsável e do

preparo deste profissional, que deve ser treinado e avaliado comprovando sua capacidade em

realizar a análise.

É importante que todas as avaliações realizadas sejam registradas, e estes registros

sejam arquivados em local acessível por todos os envolvidos no desenvolvimento das

análises.

Quadro 10. Checklist elaborado baseado nas análises realizadas sob o enfoque da NBR

NBR ISO/IEC 17025, permite a organização dos itens necessários para a realização das

análises a partir da seleção e verificação da vidraria, dos reagentes, dos equipamentos e

do analista. Indicando as ações que devem ser tomadas.

Checklist

1. Etapa de preparo dos reagentes e solventes

a. Vidraria

1. Separação da vidraria (adequação ao volume da amostra)

2. Quantidade

3. Calibração

4. Limpeza

5. Armazenamento

b. Equipamentos

1. Tipos de equipamentos

2. Calibração

i. Quem faz

ii. Como fazer

iii. Com que frequência fazer

c. Reagentes

1. Preparo

i. Padrões

ii. soluções

2. Condições de armazenamento

i. Temperatura de armazenamento

ii. Estabilidade

iii. Fotossensibilidade

3. Acessibilidade

i. Obtenção

ii. Custo

d. Analista

1. Treinamento

Avaliação

Após a verificação preliminar das condições necessárias para o desenvolvimento das

análises, algumas medidas devem ser verificadas e garantidas durante a realização de cada

etapa da metodologia.

Na etapa de extração da toxina, a utilização de equipamentos como a balança de

precisão, o banho ultrasônico (BUS) e a centrífuga requerem cuidados referentes à

necessidade de calibração e manutenção.

De acordo com o item 5.5.2 da norma que trata dos equipamentos.

Por tratar-se de um ensaio de detecção de ficotoxinas presentes no alimento que

podem vir a afetar a saúde do homem, erros em nível de ppm podem ao final do ensaio levar a

produção de resultados que não expressam a real situação, expondo o consumidor a uma

situação de risco, principalmente levando em consideração o efeito crônico do AO que é

carcinogênico. Estes resultados poderiam expressar valores acima ou abaixo dos reais,

implicando na proibição do consumo de produtos que apresentarem níveis de contaminação

toleráveis. Essas ações poderiam gerar impactos sociais, uma vez que acarretaria a proibição

do consumo e conseqüente redução nas vendas pelos maricultores, que na maioria das vezes

tem esta atividade como sua principal fonte de renda, além de gerar desemprego quando há

proibição da comercialização.

A utilização dos equipamentos por pessoal capacitado também é tratado nesta norma,

no item 5.5.3. Os analistas ou técnicos responsáveis pelas atividades devem ser treinados e

posteriormente avaliados, comparando seus resultados com os de um analista mais experiente,

antes que este realize as análises.

“5.5.3 Os equipamentos devem ser operados por

pessoal autorizado. Instruções atualizadas sobre o uso e

manutenção do equipamento (incluindo quaisquer

manuais pertinentes fornecidos pelo fabricante do

equipamento) devem estar prontamente disponíveis

para uso do pessoal apropriado do laboratório.”

“5.5.2 os equipamentos e seus softwares usados para

ensaio, calibração e amostragem, devem ser capazes de

alcançar a exatidão requerida e devem atender as

especificações pertinentes aos ensaios e/ou calibrações

em questão. Devem ser estabecidos programas de

calibração para as grandezas ou valores-chave dos

instrumentos quando estas propriedades tiverem um

efeito significativo sobre os resultados. Antes de ser

colocado em serviço, o equipamento (incluindo aquele

usado para amostragem) deve ser calibrado ou verificado

para verificar se ele atende aos requisitos especificados

pelo laboratório e às especificações da norma pertinente.

Ele deve ser verificado e/ou calibrado antes de ser

utilizado.”

Outro fator importante é a calibração dos equipamentos de medição volumétrica. De

acordo com Danilo et al., (2007) a existência de erros instrumentais que podem ser

consequência de pipetas, buretas e frascos volumétricos que podem liberar ou conter

quantidades diferentes das indicadas em suas graduações; pode ocasionar o fornecimento de

resultados inválidos. Portanto, se faz necessário garantir que estes equipamentos estejam

calibrados e que suas incertezas sejam conhecidas.

Ribani et al., (2004) verificaram que para gerar resultados confiáveis e reprodutíveis,

as amostras, os padrões e reagentes usados devem ser estáveis por um período razoável (um

dia, uma semana, um mês, dependendo da necessidade). Portanto é necessário testar a

estabilidade das amostras e padrões em termos de temperatura e tempo, bem como em relação

a fotossensibilidade em relação ao reagente de derivação, ao padrão e a amostra derivada. O

controle da temperatura de armazenamento foi um fator importante. De acordo com Ribani et

al., (2004) se uma solução não for estável em temperaturas ambientes, a diminuição da

temperatura pode aumentar a estabilidade das amostras e padrões. Com relação ao tempo,

estabilidade de dias ou meses é mais desejável, entretanto em alguns casos, as soluções

precisam ser preparadas cada vez que forem realizadas as análises.

4.5 Elaboração do procedimento para a realização do cálculo da Incerteza da

Metodologia de Detecção do AO proposta por Silva (2001).

Neste trabalho, foi estimada a incerteza da metodologia Silva (2001), utilizada no

laboratório ToxMar que busca aprimorar a qualidade de suas análises e a garantia de seus

resultados. A incerteza foi estimada de acordo com o Guia para a Expressão da Incerteza de

Medição (INMETRO, 2003).

A sequência de procedimentos, avaliados na presente pesquisa, que contribuem com a

incerteza no processo de quantificação da massa de toxina AO, em uma amostra de

mexilhões, esta representada na Figura 14.

Figura 14. Etapas do procedimento de quantificação da toxina AO

que contribuem com a incerteza da metodologia Silva (2001).

Inicialmente foi realizada uma análise que forneceu de forma mais imediata o

resultado da medida (melhor estimativa e incerteza) da toxina AO.

Posteriormente, foram identificadas as fontes de incerteza e consideradas as suas

contribuições, estimou-se a incerteza padrão combinada pela raiz quadrada da soma

quadrática das incertezas padrão.

Preparo do BAP

Preparo da

solução padrão de AO

Caracterização do padrão

Determinação da quantidade

de toxina em uma amostra

As fontes de incerteza contempladas neste trabalho foram: incerteza do preparo do 1-

Bromoacetilpireno (BAP), preparo da solução padrão de ácido okadaico (AO), Caracterização

do padrão no cromatógrafo Waters 740, determinação da quantidade de toxina em uma

amostra por CLAE, usando o cromatógrafo Waters 740.

A partir da análise dos procedimentos de preparo dos reagentes, identificação da

incerteza dos equipamentos e dos materiais de medição volumétrica, bem como a realização

dos cálculos pertinentes, foi possível desenvolver o procedimento para realização da

estmativa da incerteza de medição para a metodologia Silva (2001).

Para cada etapa do procedimento foi especificado o mensurado, foram identificadas as

fontes de incerteza e calculadas as incertezas padrão, incerteza padrão combinada. De acordo

com o guia de expressão da incerteza (INMETRO, 2003)

Todas as medidas serão apresentadas em unidades práticas (mg, mL, mg.mL

-1

), isto é,

aquelas já consagradas para esta metodologia.

Foram adotadas duas abordagens para avaliação da incerteza da massa do padrão a ser

injetado na análise cromatográfica, descritas a seguir.

(i) ABORDAGEM DETALHADA: Rastreou-se passo a passo os valores das incertezas

das grandezas envolvidas a cada etapa da Metodologia Sila (2001);

(ii) ABORDAGEM RESUMIDA: Se expressou a medida indireta da massa de toxina

AO (“m

”) explicitamente como função apenas das grandezas controladas e/ou medidas,

rastreadas na etapa (i), e a sua incerteza foi obtida a partir de tal expressão.

Avaliou-se as incertezas em um estudo de caso, a saber, conforme a pesquisa de

Lourenço et al., (2007).

4.5.1 Estimativa da incerteza da metodologia Silva (2001) pela ABORDAGEM

RESUMIDA.

Verificamos que uma maneira de realizar a medida indireta da massa de toxina AO

(“m

”) detectada na análise cromatográfica, conforme a metodologia Silva (2001), consiste

em primeiro expressar m

(massa usada como padrão para a análise cromatográfica, que é fixa

para esta metodologia) como função apenas das grandezas controladas e/ou medidas

diretamente, conforme o Quadro 11.

Quadro 11 – Resumo das Grandezas Medidas Diretamente para cálculo da massa do padrão

injetado no Cromatógrafo

Parâmetro / Grandeza

Símbolo

(unidade)

Instrumento de

Medida

Melhor

estimativa

Incerteza-

padrão

Massa de ácido okadaico

inicialmente dissolvida em

acetronitrila

(mg)

[Dado fornecido

pelo fabricante]

0,025

0,001 mg

Volume coletado da solução de

1-Bromoacetilpireno em

acetronitrila

(mL) Pipeta

0,50 mL

0,03 mL

Volume de acetronitrila

inicialmente usado para

dissolver o ácido okadaico

(mL) Pipeta

25,00 mL

0,03 mL

Volume coletado da solução de V

(mL) Pipeta 0,50 mL 0,03 mL

ácido okadaico em acetronitrila

Volume coletado da solução de

trietilamina 30% em

acetonitrila

cat

(mL): Microseringa

0,01500

0,00003

Volume do padrão injetado no

cromatógrafo

(mL)

Injetora

automática

0,020 mL

0,006 mL

Agrupando as relações (24), (28) e (31), apresentadas adiante, temos uma expressão

para cálculo de m

que envolve apenas as grandezas controladas ou medidas diretamente:

 

cat423

VVV V

V V





(em mg) (10)

Sabemos que o método empregado no cálculo de uma grandeza (medida indireta) pode

mudar o valor da incerteza associada (INMETRO, 2003) (MENDES; ROSÁRIO, 2005), e

esta seria assim específica ao método de cálculo. A Incerteza-padrão para esta expressão (10)

é dada na relação (11):

cat

)u(V

)u(m

)u(V

)u(m

































































































(11)

As expressões dos fatores de sensibilidade são dadas a seguir:



cat423

cat2p3

)VV(VV

)V(VVm











)VV(VV

cat423









)VV(VV

cat423









)VV(VV

VVm

cat42

p43









 

cat423

334p

cat

)VV(V V

V m V V

)u(V











Para os parâmetros da metodologia Silva (2001), valores numéricos dos fatores de

sensibilidade e das parcelas para cálculo da incerteza na massa de padrão injetada são dados

na Quadro 12.

Note-se que as grandezas cujos valores são controlados por medidas diretas nas pipetas

têm contribuição significativa para o valor da incerteza.

Utilizando os resultados do Quadro 12 na expressão (11), temos (com um algarismo

significativo) que a incerteza-padrão da massa do padrão vale:

u(m

)= 3 x 10

-6

mg logo,

U(m

) = 6 x 10

-6

Utilizando os resultados do Quadro 12 na expressão (10), temos (considerando a

incerteza calculada) que a massa do padrão vale:

= 10  6 g

Vale informar que mesmo empregando a Abordagem Detalhada – ver relação (32)

adiante – a massa do padrão na metodologia Silva (2001) é determinada em 10  6 g.

Quadro 12 – Resumo dos valores usados na metodologia Silva (2001) para cálculo da

incerteza-padrão da massa de padrão usada na análise cromatográfica.

Fator de

Sensibilidade

Valor do Fator de

sensibilidade usado

no cálculo

Incerteza-

padrão da

grandeza de

entrada

Parcela

Valor da

parcela usada

no cálculo



9,997816 x10

-6

mg/mL

0,03 mL

)u(V















8,996069 x10

-14



4,926108 x10

-4

mg/mL

0,006 mL

)u(V















8,735956 x10

-12



3,940887 x10

-4

0,001 mg

)u(m















1,553059 x10

-13



3,940887 x10

-7

mg/mL

0,03 mL

)u(V















1,397753 x10

-16



9,706617 x10

-6

mg/mL

0,03 mL

)u(V















8,479658 x10

-14

cat



9,706617 x10

-6

mg/mL

0,00003 mL

cat

)u(V















8,479658 x10

-18

Por fim, quanto à determinação da massa de toxina AO em uma amostra sob análise,

podemos empregar os seguintes resultados analíticos

, empregando os parâmetros específicos

da metodologia Silva (2001), com a observação de que a unidade de massa é mg:

1. Massa de Toxina:



















(41)

2. Incerteza na Massa de toxina:









)(A

0,0910

)u(m





















(42)

Detalhes adiante, a partir das relações (33), (38) e pela aplicação da Equação de Welch-Satterthwaite (7)

3. Graus de Liberdade efetivos:









   

0,09

)(A

















































(43)

Nas expressões acima, A

é a área obtida em uma medida cromatográfica, sendo X = P,

para amostras que servem como padrão cromatográfico e X = T para amostras sob análise

para determinação da toxina AO. Desta forma, temos que:

 n

é o número de medidas cromatográficas de “X”;



A é a média das medidas de áreas obtida na medida do padrão (deve-se a massa m

);



A é a média das medidas de áreas obtida na medida do amostra sobre análise (deve-

se a massa de toxina m

presente na amostra);



 





















1n se

1nn

1n se0

X X

)(A

;

 O número de graus de liberdade, na metodologia Silva (2001) para determinação de

é: 

  .

Com esta abordagem (mais prática) não é possível determinar os valores intermediários

das grandezas envolvidas na metodologia Silva (2001), porém permite realizar uma análise

que forneça de forma mais imediata o resultado da medida.

A seguir será aplicada a metodologia para cálculo de incertezas, que permite rastrear a

cada etapa da metodologia Silva (2001) o valor das grandezas envolvidas e suas incertezas.

4.5.2 Estimativa da incerteza da metodologia Silva (2001) pela ABORDAGEM

DETALHADA.

4.5.2.1. Incerteza da etapa de preparo da solução de 1-Bromoacetilpireno (BAP)

O reagente cromóforo 1 bromoacetil(pireno) é utilizado para a conversão da ficotoxina

ácido okadaico em um éster fluorescente, capaz de ser detectado por cromatografia líquida de

alta eficiência por detecção fluorimétrica (CLAE-DF). Este reagente é obtido no estado sólido

e necessita ser dissolvido em acetonitrila para então ser adicionado ao ácido okadaico. O

preparo da solução de BAP é uma das etapas que contribui com a incerteza da metodologia.

 Especificação do mensurado: Para preparar a solução de BAP, são dissolvidos em balão

volumétrico estéril m

= 20 mg de 1-bromoacetil(pireno) (BAP) em V

= 20 mL de

acetonitrila (ACN). A solução é transferida para tubo com tampa estéril, protegido da luz por

papel alumínio, mantido sob refrigeração. Desta solução são coletados V

= 0,5 mL para

serem misturados ao ácido okadaico (AO). A balança usada registra até 4 dígitos e possui

incerteza nominal de 0,1 mg. Os volumes foram medidos com pipeta cuja resolução é de 0,1

mL. Não se sabe o fator de abrangência da mesma.

Para determinar a concentração (C

) da solução do reagente cromóforo BAP / ACN foi

adotada a equação (12), e para calcular a massa de BAP (m

) no volume da solução de BAP

/ACN (V

) coletado, foi adotada a equação (13), dadas a seguir:

(12)

(13)

Neste estudo:

(13a)

A melhor estimativa dos valores de concentração e de massa de BAP são:

Relembrando:

: Concentração inicial de BAP em ACN

: massa inicial de BAP

: volume inicial de ACN

: volume coletado da solução de BAP em ACN

: massa de BAP em V

 Identificação das fontes de incerteza

A partir da equação (15) foram identificadas as fontes (variáveis) que contribuem com

a incerteza desta etapa do ensaio que se encontram representadas na figura 13 através de um

Diagrama de Ishikawa. As fontes de incerteza foram as medidas de massa obtidas com a

balança e medidas de volume obtidas com a pipeta.

Figura 15. Diagrama de Ishikawa apresentando as fontes de incerteza na determinação

= 1 mg.mL

= 0,5 mg

da concentração de 1-bromoacetil(pireno) (BAP) em acetonitrila (ACN).

 Determinação da expressão para o cálculo das incertezas padrão (u) de m

, v

e a

incerteza padrão combinada (u

) e expandida (U) de m

Para o cálculo da incerteza padrão (u) de cada etapa, utilizaram-

se os dados fornecidos

pelos fabricantes da balança e pipetas empregados na análise, dividindo-os pelos seus

respectivos fatores de abrangência (k) declarados.

Para a obtenção de m

, V

e V

, uma única medida foi realizada, portanto, os graus de

liberdade de todas estas medidas é infinito: , e , (INMETRO,

2003).

A incerteza combinada (uc) foi obtida derivando os fatores de influência, considerando

quando necessário o grau de liberdade efetivo (υeff) através da equação de Welch-

Satterthwaite.

Obteve-se a incerteza expandida (U) multiplicando-se por 2 (dois) o valor encontrado

na incerteza combinada para uma probabilidade de 95,45% (MENDES; ROSÁRIO, 2005).

Para uma grandeza “x”:

 Cálculo da incerteza padrão u(m

) (de m

)

De acordo com INMETRO (2003) o erro de arredondamento advindo da limitação do

dispositivo indicador (balança) permite assumir “distribuição retangular”, pois se trata da

leitura de equipamento digital cuja incerteza foi declarada pelo fabricante. Nesta situação é

feita uma estimativa sob a forma de uma faixa máxima. Sendo a incerteza dada pelo

fabricante para a leitura, sem especificação do nível de confiança, a expressão (14) a seguir

permite determinar a incerteza padrão de

(14)

com .

No presente estudo a incerteza da balança foi de 0,1 mg. Portanto, , e assim:

(14a)

As incertas envolvidas foram determiunadas como:

Logo:

 Cálculo da incerteza padrão de V

(u(V

))

= 0,06 mg

= 0,1 mg

= 20,0



0,1 mg

O volume de ACN adicionado ao BAP foi medido com uma pipeta cuja resolução de

leitura (R

) é dada pelo fabricante. Portanto a incerteza da resolução é ,

Novamente pode der empregada a “distribuição retangular”. A incerteza padrão é calculada

pela expressão (15), a seguir:

(15)

com

Neste estudo, a resolução da pipeta utilizada (Rv

) é igual a 0,1 mL, portanto:

(15a)

As incertas envolvidas foram determiunadas como:

Logo:

 Cálculo da incerteza padrão de V

(u(V

))

O volume da solução de BAP em ACN coletado para ser adicionado ao AO também

foi medido com uma pipeta cuja resolução da leitura (R

) também foi fornecida pelo

fabricante. Por analogia com u(V

), para o cálculo de u(V

) foi adotada a expressão (16).

(16)

com .

Neste estudo, R

= 0,1 mL. Portanto, as incertas envolvidas foram determiunadas como:

Logo:

 Cálculo da Incerteza combinada (u

) de m

(u(m

))

A massa de 1-bromoacetil(pireno) coletada na alíquota da solução de BAP em ACN

) foi determinada pela expressão (17) e depende de outras grandezas

. Para estimar a incerteza da grandeza “m

” foi aplicada a derivada em

= 0,03 mL

= 0,06 mL

(V2)

= 0,03 mL

= 0,06 mL

= 0,50 ± 0,06 mL

= 20,00 ± 0,06 mL

suas variáveis de influência direta no cálculo para obter a incerteza combinada (22) conforme

as expressões abaixo:

(17)

Derivando-se as variáveis de entrada (y), na primeira variável da expressão (18), faz-se

a derivada em relação ao volume inicial de acetonitrila (V

(18)

Em seguida a derivada da variável em relação ao volume coletado da solução de BAP

e ACN (V

), expressão (19):

(19)

E por último a derivada da variável em relação a massa inicial de BAP (m

), expressão

(20) a seguir,

(20)

Logo, combinam-se estas variáveis oriundas de fontes não correlacionadas, já

derivadas de uma única expressão (21), substituindo os componentes para equação (22) a

seguir;

(21)

(22)

Logo, a expressão para cálculo da incertza da masa de BAP coltada é:

(22a)

Neste estudo, considerando os valores de m

, V

e suas incertezas anteriormente

determinadas, temos que as icertezas envolvidas tiveram os seguintes valores:

Consultando a relação (7), como ν

, ν

e ν

são iguais a ∞, então ν

também é ∞.

Portanto, a medida de massa de BAP coletado é:

u(m

)

= 0,03 mg

U(m

) = 0,06 mg

Na etapa de preparo do BAP as medidas de volume realizadas com a pipeta foram as

fontes que apresentaram maior contribuição para a determinação da incerteza da massa de

BAP no volume da solução de BAP/ACN coletado para ser utilizada na etapa seguinte,

conforme apresentado na tabela 4.

Tabela 4. Componentes da incerteza da etapa do preparo da solução de

1-bromoacetil(pireno) (BAP) em acetonitrila (ACN)

Estimativa

da grandeza

Fonte de

incerteza

Valor da

incerteza

u(i)

Massa inicial de BAP (m

)

20 mg

U balança

0,1

0,06 mg

Volume inicial de ACN (V

)

20 mL

pipeta

0,1

0,03 mL

Volume coletado de BAP

em ACN (V

)

0,5 mL

pipeta

0,1

0,03 mL

Massa de BAP na solução

BAP/ACN (m

)

0,5 mg

pipeta

0,1

0,03 mg

4.5.2.2. Preparo da solução padrão de ácido okadaico (AO)

O sal de potássio do ácido okadaico (C

) - Prorocentrum concavum, é usado

como material de referência, fornecido pela Sigma Aldrish Co. O frasco fornecido pelo

fabricante contém m

= 25 µg (0,025 mg), com incerteza relativa percentual nominal de 5 %.

Para medir os volumes são utilizadas sempre as mesmas pipetas cuja incerteza já foi

declarada.

 Especificação do mensurado

Para o preparo da solução, o conteúdo total do frasco de AO (m

) é dissolvido em 25

mL de acetonitrila (V

). Coleta-se desta solução 0,5 mL (V

), adiciona-se a 0,5 mL

previamente coletados da solução de 1-bromoacetil(pireno) em acetonitrila (V

) e acrescenta-

se 0,015mL de trietilamina (TEA) 30% em acetonitrila (V

cat

O volume de TEA é medido em uma microsseringa de 0,050 mL cuja resolução de

leitura fornecida pelo fabricante (R

Vcat

) é de 0,001 mL e não se sabe o fator de abrangência da

mesma. O volume final (V

) é a soma destes três volumes.

Para determinar a concentração (C

) da solução de ácido okadaico em acetonitrila

utiliza-se a expressão (23), e a determinação da massa de AO na solução obtida pela

expressão (24).

(23)

(24)

Relembrando:

= 0,050 ± 0,06 mg

: massa de ácido okadaico inicialmente dissolvida em acetonitrila

: volume de acetonitrila inicialmente usado para dissolver o ácido okadaico

: volume coletado da solução de ácido okadaico em acetonitrila

: massa de ácido okadaico coletada, presente em V

cat

: volume coletado da solução de trietilamina 30% em acetonitrila

: concentração de ácido okadaico dissolvido em acetonitrila

: soma de volumes coletados: V

= V

+ V

cat

: concentração de AO em V

Nesta pesquisa, os valores emprgados foram:

(23a)

(24a)

As melhores estimativas dos valoresforam então:

 Identificação das fontes de incerteza

A partir da especificação do mensurado foram identificadas as fontes (variáveis) de

incerteza desta etapa: medidas voluméricas realizadas com a pipeta e com a microsseringa a

massa de ácido okadaico contida no frasco fornecido pelo fabricante. Estas fontes estão

representadas no diagrama de Ishikawa (causa e efeito) apresentado na figura (16).

Figura 16. Diagrama de Ishikawa apresentando as fontes de incerteza no preparo da solução

padrão de AO, .

 Determinação da expressão para o cálculo das incertezas padrão (u) de m

, V

cat

e a incerteza padrão combinada (u

) e expandida (U) de m

Usou-se a seguinte simbologia:

(2)

= 0,001 mg.mL

= 0,0005 mg

u(m

): incerteza padrão de m

u(V

): incerteza padrão de V

u(V

): incerteza padrão de V

u(Vcat): incerteza padrão de Vcat

): incerteza padrão de m

(massa de AO coletada)

): incerteza padrão de V

Pelos mesmos argumentos usados no estudo de m

, V

e V

, os graus de liberdade são

infinitosm(ver relação 7), portanto, ν

∞ ,

∞

, ν

∞

, ν

cat

∞

e ν

∞

 Cálculo da incerteza padrão de m

(u(m

))

A incerteza u(m

) é a incerteza da massa de ácido okadaico fornecida pelo fabricante.

Pelas informações obtidas, neste estudo esta incerteza foi obtida através da expressão (25) a

seguir,

u(m

) = 0,05 . m

(25)

u(m

) = 0,05 . 0,025

Os vaores das incertzas envolvidas foram:

A medida indireta da massa de ácido okadaico fornecida pelo fabricante foi:

 Cálculo da incerteza padrão de V

(u(V

)) e V

(u(V

))

Os volumes V

e V

foram medidos utilizando as mesmas pipetas usadas para medir V

e V

. Portanto, a resolução da pipeta dada pelo fabricante: Rv

= Rv

0,1mL. Logo, as incertezas destes volumes são iguais aquelas determinadas para V

e V

pelas

equações (15) e (16). Temos assim:

u(V

) = 0,03 mL

U(V

) = 0,06 mL

u(V

) = 0,03 mL

U(V

) = 0,06 mL

Logo, o volume de acetonitrila foi medido indiretamente como:

Da mesma forma, o volume coletado da solução de AO (m

) dissolvido em 25 mL de

acetonitrila foi medido indiretamente como:

u(m

)

= 0,001 mg

U(m

) = 0,002 mg

= 0,025 ± 0,002 mg

= 25,00 ± 0,06 mL

 Cálculo da incerteza padrão de V

cat

(u(V

cat

))

Sendo dada pelo fabricante a resolução (RV

cat

) da microsseringa usada para medir o

volume da base catalisadora trietilemina (V

cat

) adicionada a solução de AO, a incerteza da

resolução é:

Novamente pode ser empregada a “distribuição retangular” (ver Quadro 8). Desta

forma, a incerteza padrão é calculada pela expressão a seguir

(26)

Neste estudo, R

Vcat

= 0,001 mL, Logo:

(26a)

As incertezas envolvidas foram determinadas como:

u(V

cat

) = 0,0003 mL

U(V

cat

) = 0,0006 mL

Logo, o volume de trietilamina (TEA) 30% em acetonitrila foi medido indiretamente como

 Cálculo da incerteza combinada de m

))

A massa de ácido okadaico coletada da solução de AO em ACN (m

) foi determinada

pela expressão (24) e também depende de outras grandezas Para

estimar a incerteza da grandeza “m

” foi empragdo o método de propagação de incertezas ,

mediante determinação das derivadas em relação a suas variáveis de influência direta. Se

obteve a relação (27) a seguir,

(27)

Neste estudo, considerando os valores de m

, V

e suas incertezas anteriormente

determinadas, temos

u(m

) = 0,00004 mg

U(m

) = 0,00008 mg

= 0,50 ± 0,06 mL

cat

= 0,0150 ± 0,0006 mL

Logo, a massa de ácido okadaico coletada da solução de AO em ACN foi medida como:

 Cálculo da incerteza combinada de V

))

Adicionando as três soluções coletadas: 1-bromoacetil(pireno) em acetonitrila (V

ácido okadaico em acetonitrila (V

) e trietilamina 30% em acetonitrila (V

cat

) obtem-se o

volume (V

), apresentado na expressão (28) a seguir:

+ V

cat

= V

(28)

= 0,5 + 0,5 + 0,015

Nesta pesquisa, a melhor estimativa de V

foi:

(28a)

Em conformidade com o Guia de expressão da incerteza de medição (INMETRO,

2003) a incerteza deste volume é obtida pela expressão (29), a seguir

(29)

Nesta pesquisa, a partir dos valores anteriormente calculados de u(V

), u(V

) e u(Vcat),

respectivamente pelas expressões (16a), (16b) e (26a) conclui-se que

A concentração de ácido okadaico (C

) no volume V

é obtido pela expressão (30), a seguir.

(30)

Nesta pesquisa, consiederando os valores da massa de AO coletada (m

) presente na solução

AO/ACN (com volume V

) e o volume otal V5 dados anteriormente, temos que a melhor

estimantiva para esta concentração é:

Vale resslatar que os volumes medidos com a pipeta foram os que tiveram maior

contribuição com a incerteza na determinação da massa de AO presente no volume da solução

de AO / ACN coletado, conforme pode ser verificado na tabela 5.

Tabela 5. Componentes da incerteza da etapa do preparo do padrão AO

Estimativa

da grandeza

Fonte de

incerteza

Valor da

incerteza

u(i)

=0,04 mL

U(V

) = 0,08 mL

= 5.10

mg . mL

= 1,02 mL

= 0,00050 ± 0,00008 mg

Massa de AO utilizada (m

) 0,025 mg U conteúdo do

frasco

0,05 0,01 mg

Volume inicial de ACN (V

)

25 mL

pipeta

0,1

0,03 mL

Volume coletado solução

AO/ACN(V

)

0,5 mL

pipeta

0,1

0,03 mL

Massa de AO coletada na

solução AO/ACN (m

)

0,0005 mg

pipeta

0,1

0,00004 mg

Volume de TEA (Vcat)

0,015 mL

Microsseringa

0,0001

0,0003 mL

Adição das soluções (V

)

1,015 mL

pipeta

0,1

0,04 mL

Para determinar a massa do padrão no volume injetado V

no cromatógrafo foi adotada a

expressão (31), dada a seguir,

(31)

No presente estudo, a melhor estimativa de m

é:

A dterminação da incerteza de m

depende da dterminação da incerteza de V

 Cálculo da incerteza padrão de Vp (u(Vp))

Note-se que u(m

) e u(V

) já estão conhecidas. A incerteza padrão de Vp, a saber,

u(Vp), de acordo com o manual do operador do cromatógrafo Waters 70, é dada pelo

dispositivo usado para injetar o padrão, pois o volume não é fixo. Porém no laboratório

ToxMar é utilizado um injetor automático de injeta um volume fixo de V

= 20µL (valor

nominal). A incerteza padrão máxima será obtida pela expressão (32), a seguir;

u(V

) =

(32)

Neste estudo, se calculou u(V

) e se obteve valores a seguir (em mL):

As incertezas envolvidas foram determinadas como:

= 0,00001 mg

Logo, a medida indireta do volume de padrão injetado foi:

 Cálculo da incerteza padrão de mp (u(mp))

Para estimar a incerteza da massa do padrão u(mp), foram obtidos os graus de liberdade

pela equação de Welch-Satterthwaite, porém usando incertezas relativas. Visto que os graus

de liberdade das grandezas de entrada m

, V

, Vp e V

valem infinito, o valor dos graus de

liberdade foram zero.

A incerteza da grandeza “mp” depende de outras grandezas a saber:

. Note-se que as grandezas m

e V

são correlacionadas. De acordo

com o Guia para expressão da incerteza de medição (INMETRO, 2003) nesta relação: temos

qu considrar o termo de covariancia u(a, b) estimada entre as grandezas “a” e “b” , No caso

em estudo, “a” e “b” são selecionados entre m

, V

, Vp. Obtem-se, considerando a

covariância:

(33)

Verificou-se que a covariância estimada entre m

e V

pode ser expressa em termos de

variável da qual ambos dependem: “V

”. Como pode ser verificado nas expressões (34) e a já

descrita (28), dadas a seguir

(34)

(28)

A estimativa da incerteza da massa do padrão u(m

) foi obtida pela expressão (35) a

seguir,

(35)

Substituindo-se as variáveis por seus respectivos valores, foi calculada a incerteza de mp

neste estudo, obtendo as seguintes incertezas:

= 0,006 mL

U(V

) = 0,01 mL

= 0,02 ± 0,01 mL

Como ν

∞. O fator de abrangência é k =

2,0 e a incerteza expandida é U(mp) =

2,0 x u

, desta forma, a medida de mp é dada por :

Ou ainda:

4.5.3 Caracterização do padrão no cromatógrafo Waters 740

A caraterização (identificação do tempo de retenção e área) do padrão de ácido okadaico

foi realizada com base nos cromatogramas obtidos por Lourenço e colaboradores (2007) que

detectaram e quantificaram a toxina AO em mexilhões na baía de Ilha Grande, utilizando a

metodologia Silva (2001) no laboratório ToxMar/UFRRJ.

 Especificação do mensurado: Para caracterização do padrão AO no sistema CLAE, foram

realizadas sucessivas injeções do 1-(bromoacetil)pireno (BAP) puro, da acetonitrila (ACN)

pura, do BAP derivatizado com trietilamina 30 %, e por fim, do padrão aqui discutido. Foram

gerados perfis cromatográficos que possibilitaram a confirmação da identidade do pico da

substância AO. Estas injeções permitiram determinar um indicativo do intervalo de tempo de

retenção esperado, não participando de forma quantitativa nesta análise.

Após identificado o perfil da toxina, cinco injeções do padrão foram feitas (ver Quadro

13 a seguir) e obteve-se:

Tempo de retenção médio: 16,524 min

Área média: 88263,80 µVs

Desvio padrão do tempo de retenção: 0,21 minutos

Estes resultados indicam uma boa reprodutibilidade dos resultados, mostrando que o

sistema de cromatografia empregado apresentou um bom desempenho da coluna.

A partir de cinco sucessivas injeções da substância padrão no cromatógrafo o perfil, o

tempo de retenção e a área média da substância padrão passaram a ser conhecidos. Esses

conhecimentos possibilitaram a identificação da ficotoxina AO no perfil gerado por

cromatografia líquida de alta eficiência.

Quadro 13 – Tempo de retenção (em minutos) e área do padrão do AO em sistema CLAE-

DF, utilizando coluna C18 e fase móvel acetonitrila: água ultra pura, na proporção 85:15

(v/v). Fonte: Lourenço et al., (2007).

u(mp)

= 0,000003 mg

U(m

) = 0,000006 mg

= 0,000010 ± 0,0000006 mg

= 10 ± 6 µg

A figura 17 apresenta o resultado do cromatograma do padrão com tempo de retenção de

aproximadamente 16,150 min.

O equipamento em pauta controla o volume de material injetado, com valor nominal

20 µl (0,02 mL) e incerteza desconhecida. A massa de AO nestes 20 µl é detectada pelo

cromatógrafo e expressa em uma medida que consiste em apresentar um gráfico, em que são

traçados picos. Cada pico tem por base o tempo de retenção da substância. A área do pico

(“Ap”) é proporcional à massa da substância, pois o volume injetado é controlado e fixo (os

supracitados 20µl).

Se empregou seguinte simbologia :

Vp = volume de padrão injetado

= massa de AO no volume do padrão injetado

Ap = área do pico que caracteriza a presença de mp em Vp.

Figura 17 - Cromatograma do padrão ácido okadaico com tempo de retenção 16,150 e

área de 148434. Fonte: Lourenço et al.,(2007a).

Data Tempo de retenção (min)

Área (µVs)

26/jun

16,150

148434

16,571 80890

16,665

76240

16,601 42996

16,631

92759

Média

16,52

88263,80

Desvio Padrão 0,21 38369,19

 Identificação das fontes de incerteza: Baseado na especificação do mensurado e na

expressão (31), foi possível identificar as fontes (variáveis) que contribuem com a incerteza

da etapa de caracterização do padrão do ácido okadaico no cromatógrafo Waters 740.

Foi realizada a propagação do erro no valor da massa de AO injetada no cromatógrafo, a

incerteza do injetor e a área do pico medida pelo sistema de medição. Estas fontes estão

representadas no diagrama de Ishikawa (causa e efeito) apresentado na figura (18).

Figura 18. Diagrama de Ishikawa das fontes de incerteza do procedimento

de caracterização do padrão.

4.5.4 Quantificação da toxina em uma amostra usando um cromatógrafo Waters 740

A quantificação da toxina ácido okadaico em uma amostra de mexilhões, foi realizada

com base nos resultados obtidos por Lourenço e colaboradores (2007a) que detectaram e

quantificaram a toxina AO em mexilhões na baía de Ilha Grande, utilizando a metodologia

Silva (2001) no laboratório ToxMar/UFRRJ.

A amostra positiva (Figura 19 - cromatograma A) apresentou tempo de retenção de

16,675 min e área de 43711 µVs, com concentração de 2,65 ng de AO.g

-1

de hepatopâncreas

de molusco. Para a confirmação da identidade dos picos gerados na amostra foi realizada a

coinjeção do padrão na amostra suspeita. No cromatograma B da figura 19 verificou-se o

aumento da área dessa substância de 43711 µVs para 65698 µVs. O aumento das áreas

indicou a soma das massas da toxina presentes naturalmente na amostra adicionada à massa

presente no padrão .

 Especificação do mensurado: É injetado um volume de 20 µL da amostra derivada que

gera a área do pico de retenção. Modela-se que a massa de toxina é proporcional à área

deste pico. O cálculo da masa de toxina presente na amostra é realizado pela expressão

(36) a seguir,

(36)

Logo,

Usou-se a seguinte simbologia:

Va = volume da amostra injetada

= massa da toxina

= área do pico de retenção da toxina no cromatógrafo

mp = massa do padrão

Vp = volume do padrão

Nesta pesquisa, a partir do cromatograma de injeção da amostra analisado temos que a

área da toxina (A

) é igual a 43711 µVs. A área média do padrão (Ap) apresentada

anteriormente é 88263,80 µVs e a massa do padrão obtida em (31) foi igual a 0,00001 mg.

Portanto a massa da toxina presente nesta amostra foi obtida em (36a). No estudo realizado

por Lourenço et al., (2007) as concentrações de AO foram expressas em nanogramas (ng), por

este motivo neste estudo também será utilizada esta unidade para referenciar a massa de AO.

(36a)

Figura 19 - Cromatograma da amostra 01 da primeira coleta

realizada na enseada de Maciéis. A) cromatograma da amostra

com a presença da toxina com tempo de retenção de 16,675 e área

de 43711 e B) da coinjeção com tempo de retenção de 16,728 e

área de 65698. (Fonte: Lourenço et al., (2007)

A B

A melhor estimativa é, assim:

● Identificação das fontes de incerteza: A partir da especificação do mensurado foram

identificadas as principais variáveis que contribuem com a incerteza desta etapa que

consiste na determinação da massa de AO presente na amostra: volume do material

injetado (controlado pelo dispositivo de injeção), área do pico medida pelo software do

sistema de medição. Conforme descrito anteriormente, a quantificação da massa de AO na

amostra é determinada através da relação da área do cromatograma da amostra com a área do

padrão, portanto os fatores que infuenciam na determinação da área do padrão se refletirão na

determinação da massa da amostra (figura 20).

Figura 20. Diagrama Ishikawa representando as fontes de incerteza na etapa de quantificação

da massa de toxina AO em uma amostra.

Usou-se a seguite simbologia:

u(m

) = incerteza padrão da massa da toxina

u(mp) = incerteza padrão da massa do padrão

u(Ap) = incerteza padrão da área do pico de retenção do padrão

u(A

)

= incerteza padrão da área do pico de retenção da toxina.

Note-se que a incerteza da massa do padrão (u(mp)) já é conhecida, pois foi determinada

na expressão (35a).

4.5.4.1. Cálculo da incerteza padrão da área do padrão u(

AT-I

) e da área da toxina u(

AP-I

)

As áreas do padrão e da toxina são registras pelo equipamento em função da quantidade

do AO presente e da sensibilidade do dispositivo que registra o cromatograma. Neste estudo a

sensibilidade do registro determinada pelo operador é de 5 µVs Portanto, a incerteza oriunda

do equipamento de registro da área do padrão (u

(Ap-I)

) e da toxina (u

(AT-I)

) é estimada a partir

das expressões 36 e 37, dadas a seguir;

= 5.10

(36)

(37)

As incertezas envolvidas foram determinadas como:

Neste estudo, a área da toxina é determinada a partir de uma injeção, portanto,

(37a)

Logo, a medida da área da toxina é:

Se uma dada área Ax também é obtida por média de “N

” medidas, sua incerteza é

estimada através da expressão (38), a seguir

(38)

A incerteza padrão de uma dada área Ax, quando esta corresponde a média de deiversas

áreas, é obtida a partir da expressão (39) a seguir:

(39)

U (A

) (39B)

Neste estudo, a área do padrão corresponde a média de cinco áreas, portanto sua

incerteza é estimada a partir da expressão (39B) com N = 5. Desta forma, as incertezas

envolvidas foram determnadas como:

Logo, a medida da área do padrão é:

u(A

T-I

) = 1,4

µVs

U(A

T-I

) = 0,0003.10

µVs

(Ap)

= 17732,43 µVs

(Ap)

= 3.10

µVs

= (9 ± 3). 10

µVs

= (4,3711 ± 0,0003). 10

µVs

4.5.4.2. Cálculo da incerteza padrão da massa de toxina (u(m

))

A estimativa da incerteza da massa de toxina presente na amostra foi obtida através da

expressão (40), a seguir:

(40)

Obteve-se assim as incertezas:

A medida da massa de AO presente na amostra pode ser então expressa como:

ou seja, de 1 a 9 ng de ácido okadaico por molusco nas condições realizadas por Lourenço et

al., (2007).

(mt)

= 2.10

(mt)

= 4.10

-6

= 5 ± 4 ng.g de molusco

5 CONCLUSÕES

Com o desenvolvimento deste trabalho, a partir da elaboração e análise dos

fluxogramas foi possível:

(1) Verificar as diferenças operacionais e de acessibilidade entre as metodologias analisadas.

Pode-se concluir que a metodologia Silva (2001) quando comparada as demais se revelou

mais rápida e com um custo mais reduzido para a sua realização. Estas vantagens foram

atribuídas ao uso conjugado do 1-bromoacetil(pireno) com a base trietilamina (30%) em

acetonirila associado a exclusão da etapa extração em fase sólida (SPE) na referida

metodologia.

(2) Identificar alguns itens da NBR ISO/IEC 17025 que necessitam ser considerados a fim de

aumentar a garantia da qualidade das análises realizadas no laboratório ToxMar, são eles:

calibração dos materiais de medição e equipamentos que tem influência sobre a incerteza, uso

de padrão de referência a fim de garantir a rastreabilidade da medida, o conhecimento da

incerteza das análises realizadas, analista treinado e avaliado, registro de informações

pertinentes a estabilidade e condições de armazenamento dos reagentes e solventes, calibração

dos equipamentos e materiais de medidas, bem como o conhecimento da incerteza destes.

(3) Identificar as seguintes etapas da metodologia como principais contribuentes da incerteza

de medição: o preparo do BAP, preparo da solução de AO, caracterização do padrão no

cromatógrafo Waters 70 e a determinação da quantidade de toxina em uma amostra por

CLAE, usando o cromatógrafo Waters 70. Além de distinguir os diferentes tipos de

incerteza, identificar suas fontes e tratá-las corretamente. A obtenção das equações permitiu

avaliar a influência e contribuição das variáveis, atribuir as expansões adequadas e interpretar

os resultados obtidos.

(4) A variável volume, medida com a pipeta, foi a principal contribuinte com a incerteza desta

metodologia nas diferentes etapas analisadas, requerendo uma atenção especial, no que diz

respeito a utilização de pipetas calibradas e com alta sensibilidade, a fim de minimizar a sua

influência na incerteza do resultado.

(5) Contribuir de modo significativo para o aumento de informações relacionadas à

acessibilidade da metodologia de detecção do ácido okadaico em moluscos bivalves proposta

por Silva (2001), em relação as metodologias propostas por Lee (1987) e SIGMA (1993).

(6) Contribuir com informações relacionadas à implementação de itens da NBR ISO/IEC

17025, caracterizando a importância de sua aplicação.

(7) Contribuir com o aumento de informações relacionadas à incerteza de ensaios de

cromatografia líquida de alta eficiência, em especial para a metodologia Silva (2001).

(8) Identificar que os resultados obtidos ao término desta tese têm grande potencial para

contribuir para o aumento da garantia da qualidade dos resultados das análises de detecção da

toxina ácido okadaico em mexilhões, realizadas no laboratório ToxMar.

6 RECOMENDAÇÕES

- Implementar no laboratório ToxMar os itens da NBR ISO/IEC 17025 identificadas

neste estudo como passíveis de serem aplicadas.

- Estender o mesmo cálculo de estimativa das incertezas propostas para a massa da

amostra, para as outras substâncias que acompanham a massa.

- Apresentação das expressões para estimativa da incerteza em forma analítica para

que possam ser utilizadas quando variações de equipamentos e reagentes forem

aplicadas.

- Desenvolvimento de um software que automatize todo o procedimento de estimativa

da incerteza, preferencialmente em ambiente Windows.

- Utilizando uma amostra para realizar as três metodologias.

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