( PDF ) Estudo do mecanismo de ação tóxica da saxitoxina e avaliação de sua adsorção em materiais alternativos para aplicação em sistemas de tratamento de água

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA

AMBIENTAL

SÍLVIA PEDROSO MELEGARI

ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO TÓXICA DA

SAXITOXINA E AVALIAÇÃO DE SUA ADSORÇÃO EM

MATERIAIS ALTERNATIVOS PARA APLICAÇÃO EM

SISTEMAS DE TRATAMENTO DE ÁGUA

FLORIANÓPOLIS

2010

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SÍLVIA PEDROSO MELEGARI

ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO TÓXICA DA

SAXITOXINA E AVALIAÇÃO DE SUA ADSORÇÃO EM

MATERIAIS ALTERNATIVOS PARA APLICAÇÃO EM

SISTEMAS DE TRATAMENTO DE ÁGUA

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Engenharia

Ambiental da Universidade

Federal de Santa Catarina, como

requisito para a obtenção do

título de Doutor em Engenharia

Ambiental, área de concentração

Toxicologia Ambiental.

Orientador: Prof. William Gerson Matias, Dr.

Co-orientadora: Profª. Cátia Regina Silva de Carvalho Pinto, Drª.

FLORIANÓPOLIS

2010

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RESUMO

Entre os diversos problemas de saúde pública ligados ao

abastecimento de água, a contaminação de mananciais de água

doce por cianotoxinas tem sido muito enfatizado devido ao risco

toxicológico. Assim, esse assunto tornou-se preocupante e é cada

vez mais estudado pela comunidade científica, pois compromete

a qualidade das águas destinada ao consumo humano, atingindo

conjuntos de organismos muito além da comunidade aquática. A

saxitoxina (STX) é uma neurotoxina produzida pela cianobactéria

Cylindrospermopsis raciborskii, que compõe a biota da Lagoa do

Peri, que se apresenta como um dos principais mananciais de

abastecimento de água para o Municipio de Florianópolis-SC.

Este estudo investigou o mecanismo de ação da STX através de

métodos toxicológicos in vitro, além de verificar a capacidade de

adsorção de conchas de ostra e quitina à STX. Os testes

citotóxicos e genotóxicos in vitro realizados para avaliar a ação

da STX sobre células Neuro 2A (N2A) e Vero, foram os testes do

MTT, a fragmentação e a metilação do DNA, a lipoperoxidação e

a freqüência de células micronucleadas. Para os ensaios de

adsorção foi empregando conchas de ostras trituradas e quitina

como matriz adsorvente, e verificado a capacidade de adsorção da

STX de soluções aquosas à estes adsorventes. Para aquantificação

da STX foi empregada a cromatografia líquida de alta eficiência

(HPLC). Os resultados obtidos nas avaliações toxicológicas

demonstraram que a STX possui um potencial efeito citotóxico e

genotóxico, pois induziu às células N2A à apoptose e à

fragmentação e hipermetilação do DNA, além de causar a

oxidação lípidica da membrana celular. Nestas avaliações

toxicológicas ainda foi possível verificar o potencial da STX à

indução de formação de micronúcleos em células N2A e Vero,

com evidências dos efeitos de origem aneugênica. Nos ensaios de

adsorção, foi possível verificar que a concha de ostra e a quitina

foram eficientes para remoção da STX (>60% em 48h) em

amostras da água, na escala de concentrações empregadas neste

estudo.

Palavras-Chave: saxitoxina, células Neuro-2A, células Vero,

efeito citotóxico e genotóxico, adsorção, concha de ostra, quitina.!

ABSTRACT!

Amongst the diverse problems of public health on the water

supply, the contamination of fresh water sources from

cyanotoxins had been emphatized due toxicological risk. Thus,

this subject that concern more and more studied by the scientific

community, therefore compromises the waters quality destined to

the human consumption, reaching organisms beyond the aquatic

community. The saxitoxin (STX) is a neurotoxin produced in

blooms of Cylindrospermopsis raciborski, cyanobacteria that

composes the biota of Peri Lagoon - Florianópolis/SC. This study

evaluated the mechanism of action of STX through toxicology

methods in vitro, besides verifying the absorption capacity of

oyster shell and chitin to STX. To evaluate the action of STX in

Neuro 2A (N2A) and Vero cells, the cytotoxic and genotoxic in

vitro essays employed were: MTT assay, DNA methylation and

fragmentation, lipid peroxidation and frequency of

micronucleated cells. From the adsorption essays were employed

oyster shells powdered and chitin as adsorbents! matrices and

verifying the capacity of absorption of STX soluble to these

adsorbents. The quantification of STX was for high performance

liquid chromatography (HPLC). The results of toxicological

evaluation showed that STX had a potential cytotoxic and

genotoxic effects. The STX’ exposure induced to N2A cells to

cellular apoptosis, DNA fragmentation and methylation and lipid

oxidation of cellular membrane. The toxicological evaluation

demonstrated that STX induced to the N2A and Vero cells

exposedto micronuclei formation, with evidenced to aneugenic

effects. The adsorption assays verified that oyster shell and chitin

were efficient to remove the STX (>60% in 48h) from water

samples, in the concentrations scale employed in this study.

Keywords: Saxitoxin (STX), Neuro 2A cells, Vero cells,

cytotoxic and genotoxic effects, adsorption, oyster shell, chitin.

LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1: Vista panorâmica do Parque da Lagoa do Peri (Fonte:

Oliveira, 2002). ................................................................................ 30

Figura 3.2: Estruturas químicas das toxinas paralisantes de molusco

(PSP). ............................................................................................... 33

Figura 3.3: Estrutura da saxitoxina (STX). ..................................... 33

Figura 3.4: Peroxidação da saxitoxina. ........................................... 37

Figura 3.5: Mecanismo de metilação do DNA. A 5–metilcitosina é

produzida pela ação das DNA-metiltransferases (DNMT 1, 3a ou 3b)

que catalizam a transferência de um grupo meti da S-

adenosilmetionina (SAM) para o carbono na posição 5 da citosina.40

Figura 3.6: Fragmentação do DNA após tratamento de células

Caco2 ao ácido domóico. 1: marcador DNA (“Ladder”); 2: controle;

3:15ng/mL; 4: 30ng/mL; 5:60ng/mL; 6:100ng/mL (Carvalho Pinto-

Silva, 2005). .....................................................................................42

Figura 3.7: Esquema simplificado da lipoperoxidação, com a

formação do malondialdeído e o aduto com a guanina, M1G. ........ 43

Figura 3.8: Fotomicrografia da concha de ostra calcinada (Fonte:

Silva, 2007). .....................................................................................47

Figura 3.9: Fotomicrografia de amostras de quitina proveniente da

carapaça do camarão (1300X) (Fonte: Antonino, 2007).................. 48

Figura 5.1: Perfil dose-resposta da STX em células N2A na

presença e ausência de O/V. Viabilidade celular (%)±DP v.

Concentração de STX em nM. Condição “Sem O/V”: R

=0,997;

condição “Com O/V”:: R

= 0,9904..................................................60

Figure 5.2: Fragmentação do DNA de células N2A extraído após

exposição à STX. O DNA foi isolado de células N2A expostas e a

eletroforese foi realizada em gel de agarose 1,5% nas seguintes

concentrações: 1: Ladder 1000 kpb, 2: OTA (ocratoxina)10µM, 3:

3,0nM, 4: 1,5nM; 5: 0,8nM 6: Controle negativo com antibiótico e 7:

Controle negativo sem antibiótico.................................................... 62

Figura 5.3: % de DNA fragmentado para células expostas à STX,

obtido pela análise da imagem do gel. .............................................63

Figura 5.4: % m5dC com relação a quantidade total de citosina

(dC+m5dC) das amostras do DNA extraídas de células N2A

expostas por 24 horas, para os controles negativo e positivo e as

diferentes concentrações de STX empregadas. ................................ 64

Figura 5.5: Lipoperoxidação induzida pelo aumento da concentração

de STX em células N2A avaliando o efeito da ausência e presença de

diferentes antioxidantes, com dosagem da quantidade de MDA

produzido, após 24 horas de incubação (*diferença significativa com

relação à células não tratadas com STX para p<0.05, e ** com

relação ao controle positivo para p<0.05). ....................................... 70

Figura 5.6: Perfil dose-resposta da STX em células N2A e Vero,

pela viabilidade celular v. concentração STX (R2=0,997 para células

N2A e R2=0,964 para células Vero). ............................................... 76

Figura 5.7: Número de células BNMN induzidas pela STX (0,38;

0,75; 1,50; 3,00 nM) sobre 1000 células binucleadas (BN) N2A e

Vero após 24 horas de exposição. A colchicina foi empregada como

controle positivo. Os resultados estão expressos como média de três

experimentos±DP (n = 3). ................................................................ 77

Figura 5.8: Células N2A coradas com “acridine orange” e brometo

de etídio (Aumento: 1000x) A: controle célula BN; B: célula

BNMN.............................................................................................. 78

Figura 5.9: Processo cinético de adsorção da STX em quitina e pó

de concha. Condições: 10µM STX, 200mg de adsorvente, pH 5,0 e

25ºC.................................................................................................. 82

Figura 5.10: Processo cinético de adsorção da STX em quitina e pó

de concha. Condições: 10µM STX, 200mg de adsorvente, pH 7,0 e

25ºC.................................................................................................. 82

Figura 5.11: Isotermas de adsorção Lin e N-Lin (respect.) de STX

em quitina e pó de concha de ostra à 25ºC e pH 5,0. ....................... 84

Figura 5.12: Isotermas de adsorção Lin e N-Lin (respect.) de STX

em quitina e pó de concha de ostra à 25ºC e pH 7,0. ....................... 85

Figura A1: Curva de calibração do método empregado para

quantificação da STX nos testes de adsorção................................. 116

Figura A2: Cromatograma do padrão da STX 50 µg/L. ............... 117

Figura A3: Curva de calibração do método empregado para

quantificação da citosina e 5-metilcitosina no ensaio de metilação do

DNA. .............................................................................................. 119

Figura A4: Cromatograma da mistura dos padrões empregados para

a quantificação da citosina e 5-metilcitosina (12,5µ g/mL)............ 120

Figura A5: Curva de calibração do método empregado para

quantificação do MDA no ensaio de lipoperoxidação. .................. 122

Figura A6: Cromatograma do padrão do MDA(60nM - t

: 4,58

min). ............................................................................................... 122

Figura A7: Curva de calibração do método empregado para

quantificação da proteína BSA no ensaio de lipoperoxidação....... 124

Figura A8: Esquema de diluição em cascata da STX na microplaca

de 96 poços para os ensaios citotóxicos do MTT........................... 125

Figura A9: Esquema de diluição em cascata da STX na microplaca

de 24 poços para os ensaios de lipoperoxidação e micronúcleo. ... 126

Figura A10: Esquema de diluição em cascata da STX na microplaca

de 6 poços para os ensaios de fragmentação e metilação do DNA.127

LISTA DE TABELAS

Tabela 4.1: Condições para determinação de STX em HPLC com

detector de Fluorescência. (AOAC, 2005). ...................................... 57

Tabela 5.1: Lipoperoxidação medida pela % do aumento na

produção do MDA com relação ao controle. ................................... 71

Tabela 5.2: Parâmetros obtidos pelas isotermas de adsorção da STX

nas diferentes condições analisadas. ................................................ 86

Tabela 5.3: Valores de ∆G

ads

para a STX para os adsorventes

testados nos pH 5,0 e 7,0.................................................................. 87

Tabela A1: Dados para a construção da curva de calibração da STX.

........................................................................................................ 115

Tabela A2: Dados para a construção da curva de calibração da

citosina e 5-metilcitosina................................................................118

Tabela A3: Dados para a construção da curva de calibração MDA.

........................................................................................................ 121

Tabela A4: Dados para a construção da curva de calibração BSA.

........................................................................................................ 123

LISTA DE ABREVIATURAS

AOAC: Association of Official Analytical Chemists

ASP: Aminesic Shellfish Poisiong

BNMN:binucleated micronucleated cells

CASAN: Companhia Catarinense de Águas e Saneamento

CAT: catalase

CBMN: Cytokinesis-block micronucleus assay

COL: Colchicina

CytB: Citocalasina B

DMSO: Dimetil-sulfóxido

DNA: Ácido desoxirribonucléico

DSP: Diarrheic Shellfish Poisiong

EC50: Concentração efetiva 50%

ELISA: Enzime Linked Immunosorbent Assay

FISH: Hibridização in situ por Fluorescência

FD: Fluorescence detector

GPx: glutationa peroxidase

GSH: glutationa reduzida

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

IBAMA: Instituto Brasileiro do Meio Ambiente

ISOC-HAB: International Symposium on Cyanobacterial

Harmful Algal Blooms

LABTOX: Laboratório de Toxicologia Ambiental

LIMA:Laboratório Integrado do Meio Ambiente

Lin: Linear

LMP: Low Melting Point

LPO: Lipoperoxidação

MBA: Mouse Bioassay

MDA: Malondialdeído

MEV: Microscopia Eletronica de Varredura

MN: micronucleus/ micronuclei

MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol il-2,5-difeniltetrazólio)

N-Lin: Não-Linear

NMP: Normal Melting Point

NRC: National Research Council Canada

NSP: Neurotoxic Shellfish Poisoning

O/V: ouabaína/veratridina

OMS: Organização Mundial de Saúde

PBS: Phosphate Buffered Saline – Tampão salino de fosfato

pH: Potencial hidrogeniônico

PSP: Paralitic Shellfish Poisiong

RNA: Ácido ribonucléico

RNase A: Ribonuclease A

RNase T1: Ribonuclease T1

RPMI: Roswell Park Memorial Institute

SDS: Dodecilsulfato de sódio

SOD: Superóxido dismutase

STX: Saxitoxina

TBA: Ácido 2-tiobarbitúrico

USEPA: United State Environmental Protection Agency

UV: ultravioleta

VitE: Vitamina E

VitC: Vitamina C

VMP: Valor máximo permitido

v.: versus

WHO: World Health Organization

SUMÁRIO

CAPÍTULO I ...............................................................................15

1. INTRODUÇÃO.......................................................................15

1.1. Hipóteses da Pesquisa......................................................21

1.1.1. Primeira Hipótese.....................................................21

1.1.2. Segunda Hipótese.....................................................21

1.1.3. Terceira Hipótese .....................................................22

1.2. Justificativa da Pesquisa ..................................................22

CAPÍTULO II..............................................................................25

2. OBJETIVOS............................................................................25

2.1. Objetivo Geral..................................................................25

2.2. Objetivos Específicos.......................................................25

CAPÍTULO III ............................................................................27

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................27

3.1. Eutrofização Natural e Artificial......................................27

3.2. Florações de Algas...........................................................28

3.3. Cianotoxinas ....................................................................31

3.3.1. Toxinas “Paralytic Shellfish Poisons” (PSP) ...........32

3.3.2. Legislação Brasileira v. Cianotoxinas ......................34

3.3.3. Quantificação da STX ..............................................35

3.4. Bioensaios para Monitoramento da Citotoxicidade e

Genotoxicidade Celular ..........................................................37

3.4.1. Teste de citotoxicidade: Teste do MTT....................38

3.4.2. Teste de Micronúcleo ...............................................38

3.4.3. Metilação Biológica .................................................39

3.4.4. Fragmentação do DNA e Apoptose..........................40

3.4.5. Lipoperoxidação Biológica ......................................42

3.5. Propriedades Químicas dos Adsorventes Empregados na

Adsorção da Saxitoxina ..........................................................45

CAPÍTULO IV ............................................................................49

4. METODOLOGIA....................................................................49

4.1. Instalações........................................................................49

4.2. Ensaios de Citotoxicidade e Genotoxicidade...................49

4.2.1. Cultura Celular .........................................................49

4.2.2. Ensaio do MTT: Determinação da EC50 .................50

4.2.3. Fragmentação e Metilação do DNA.........................51

4.2.4. Lipoperoxidação: Extração e Quantificação do MDA

............................................................................................53

4.2.5. Teste do Micronúcleo: Bloqueio Citocinético

(CBMN)..............................................................................55

4.3. Ensaios de Adsorção ........................................................56

4.3.1. Materiais Adsorventes..............................................56

4.3.2. Cinéticas e Isotermas de Adsorção...........................56

4.3.3. Dosagem da Saxitoxina ............................................57

CAPÍTULO V .............................................................................59

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................59

5.1. Resultados do Artigo 1: Ensaio do MTT, Fragmentação e

Metilação do DNA..................................................................59

5.1.1 Influência de STX na Viabilidade Celular: Ensaio de

MTT e Determinação de EC50 ..........................................59

5.1.2. Efeitos de STX na fragmentação do DNA em células

N2A ....................................................................................61

5.1.3. Efeitos de STX na metilação do DNA em células

N2A ....................................................................................63

5.2. Discussão do Artigo 1......................................................65

5.3. Resultados do artigo 2: Lipoperoxidação e Efeito Protetor

de Vitaminas e Enzimas..........................................................69

5.3.1. Lipoperoxidação: efeito do estresse oxidativo .........69

5.4. Discussão do Artigo 2:.....................................................71

5.5. Resultados do Artigo 3: Teste do Micronúcleo ...............75

5.5.1. Influencia da STX na viabilidade celular em Células

N2A e Vero: teste do MTT e Determinação da EC50 .......75

5.5.2. Teste do Micronúcleo...............................................77

5.6. Discussão do Artigo 3:.....................................................78

5.7. Resultados do Artigo 4: Ensaios de Adsorção.................81

5.8. Discussão artigo 4 ............................................................88

5.9. Considerações Finais para Complementação do Estudo de

Caso: Lagoa do Peri................................................................89

CAPÍTULO VI ............................................................................93

6. CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES...............................93

CAPÍTULO VII...........................................................................97

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................97

CAPÍTULO VIII .......................................................................115

8. APÊNDICES .........................................................................115

A1. Curva de calibração da STX ..........................................115

A2. Curva de calibração para quantificação da citosina e 5-

metilcitosina..........................................................................118

A3. Curva de calibração do malondialdeído.........................121

A4. Curva de calibração para a quantificação de proteínas ..123

A5. Esquema de diluição em cascata da STX nas placas de 96

poços para os ensaios citotóxicos do MTT...........................125

A6. Esquema de diluição em cascata da STX nas placas de 24

poços para os ensaios do micronúcleo e lipoperoxidação ....126

A7. Esquema de diluição em cascata da STX nas placas de 6

poços para os ensaios de fragmentação e metilação do DNA

...............................................................................................127

A8. Artigo 1 ..........................................................................128

A9. Artigo 2 ..........................................................................149

A10. Artigo 3 ........................................................................167

A11. Artigo 4 ........................................................................180

CAPÍTULO I

1. INTRODUÇÃO

A água é o principal constituinte de todos os organismos

vivos. O homem, além de usar a água para suas funções vitais

como todas as outras espécies de organismos vivos, utiliza os

recursos hídricos para um grande conjunto de atividades, tais

como, produção de energia, navegação, produção de alimentos,

desenvolvimento industrial, agrícola e econômico. De toda a água

disponível no planeta, apenas 2,5% é água doce; e deste, apenas

0,3% pode ser tratada para a utilização como água potável. Este

precioso recurso, cada vez mais escasso, vem sendo muito

ameaçado por ações antropogênicas (Barata e Crispino, 2006).

A água de má qualidade empobrece as populações locais e

de determinadas regiões, interfere na economia regional e destrói

alternativas saudáveis de desenvolvimento sustentável. (Tundisi,

2003). O acelerado desenvolvimento urbano e industrial está

submetendo a graves pressões os recursos hídricos. A crescente

urbanização no entorno de rios, lagoas e represas vem causando

muitos problemas para os ecossistemas aquáticos. É cada vez

mais evidente a desestabilização das condições de equilíbrio

desses ecossistemas, causada pelo aumento da densidade

populacional nestas localidades além da tolerância do ambiente

aquático (Carvalho, 2004).

Certas características dos ambientes aquáticos lhe conferem

peculiaridades como a alta solubilização de compostos orgânicos

e inorgânicos, possibilitando que os organismos, especialmente

os autótrofos, possam absorver nutrientes por toda a superfície do

corpo e o baixo teor de sais dissolvidos típicos de água doce faz

com que a maioria dos organismos que habitam estes ambientes

seja hipertônica com relação ao meio, sendo, portanto necessárias

adaptações no sentido de manter o equilíbrio osmótico entre os

líquidos internos e o meio (Esteves, 1998).

A diversidade da fauna e flora das águas continentais é

dependente dos mecanismos de funcionamento de rios, lagos,

áreas alagadas, represas, como o ciclo hidrológico e a variedade

de habitat e nichos. O ambiente em que vivemos se caracteriza

por uma vida vegetal muito diversificada da qual depende nossa

existência. As plantas verdes, aquáticas e terrestres, são à base da

cadeia de alimentos para o reino animal. Cerca de 90% da

fotossíntese na Terra é realizada por plantas aquáticas,

principalmente algas planctônicas. Certas algas azuis e algumas

bactérias podem empregar o nitrogênio gasoso da atmosfera na

construção do seu protoplasma e contribuir significativamente

para a síntese de compostos nitrogenados na água e no solo onde

vivem (fixação de nitrogênio) (Barata e Crispino, 2006).

Os seres humanos não estão isolados de seu ambiente

natural; eles estão no topo de muitas cadeias alimentares e há

poucos ecossistemas nos quais a espécie humana não está

envolvida (Azevedo e Chasin, 2003). Impactos ao meio ambiente

e a saúde humana estão cada vez mais presentes no cotidiano de

populações do mundo todo. Dentre as ações antropogênicas que

contribuem para estes impactos, a mais preocupante é a descarga

de fontes difusas e pontuais de nitrogênio e fósforo nos rios, lagos

e represas, a partir de esgotos não tratados e do emprego de

fertilizantes que produzem o fenômeno de eutrofização artificial,

cujos efeitos ecológicos, na saúde humana e nos custos do

tratamento de água são relevantes (Tundisi, 2003).

A eutrofização artificial se manifesta com a quebra do

equilíbrio ecológico. Este processo, causado pelo lançamento de

efluentes domésticos e industriais nos corpos d'água,

disponibiliza uma quantidade maior de matéria orgânica que o

sistema é capaz de decompor. Estes agentes eutrofizantes

(constituído principalmente de nitrogênio, na forma de nitrato e

amônia, e fósforo, na forma de fosfato) estão diretamente

relacionadas com o processo fotossintético das algas, uma vez

que pertencem à estrutura de muitos compostos importantes para

o metabolismo da célula vegetal.

O aumento da concentração de nutrientes implica não só

aumento da densidade de algas, mas também em alterações

qualitativas, como o surgimento de novas espécies e o

desaparecimento de outras. A poluição de um ambiente aquático

envolve, portanto, processos de ordem física, química e biológica.

As florações algais são resultado da interação destes fatores

físicos, químicos e bióticos, caracterizadas por um crescimento

explosivo, autolimitante e de curta duração dos microorganismos

de uma ou poucas espécies, freqüentemente produzindo

colorações visíveis nos corpos de águas naturais (Torgan, 1989

apud Matthiensen et al, 1999).

A floração de algas tóxicas causa gosto e odor

desagradáveis na água e altera o equilíbrio ecológico do

ecossistema aquático. Entre as algas que podem causar floração

em corpos de águas continentais, destacam-se as cianobactérias

que produzem as cianotoxinas. As florações de algas tóxicas em

mananciais utilizados para abastecimento público representaram

um risco potencial aos seus consumidores. As toxinas são

altamente solúveis em águas e não podem ser removidas da água

por sistema de tratamento convencional (Bartran et al 1999).

A contaminação direta e indireta por algas tóxicas e/ou

toxinas liberadas pelas florações, tem sido muito relatada em todo

mundo. Estas florações tóxicas se apresentaram prejudiciais não

somente para os ecossistemas aquáticos, como também para a

saúde humana. Muitos casos que vão desde intoxicações até a

morte, vêm sendo muito citados na literatura, tanto que se pode

observar um aumento significativo na freqüência, intensidade e

distribuição geográfica destas florações nas últimas décadas

(Ressom et al, 1994; Hallegraeff et al, 1995; Chorus e Bartram,

1999).

Esta problemática relatada em todo o mundo foi registrada

no Brasil em relatos de Faria & Cunha (1917) no que se acredita

ser um primeiro episódio de floração de algas no Brasil em 1913,

na baía de Guanabara, no estado do Rio de Janeiro, onde foi

observada a mortandade de peixes. Entretanto, somente em

meados dos anos 80 o fenômeno da floração de algas recebeu

estudos mais aprofundados no Brasil. Estudos pioneiros no país

têm sido realizados nos estados do Rio de Janeiro e do Rio

Grande do Sul, como monitoramento do fitoplâncton tóxico, e

estudos com cianobactérias de água doce, que afetam aos

ecossistemas costeiros, aplicando metodologias de bioensaios e

cromatografia líquida de alta eficiência.

O estudo do fitoplâncton tóxico no estado do Rio de Janeiro

tem sido realizado desde a década de 70 na região de Cabo Frio

(a partir de 1973), e a partir da década de 80 na baía de

Guanabara (desde 1985, com monitoramento semanal) e na baía

da Ribeira (desde 1987, com monitoramento mensal) (Sar et al,

2002). No Rio Grande do Sul, desde 1987, florações da

cianobactéria Microcystis aeruginosa têm sido registradas e

estudadas na Lagoa dos Patos que esta considerada o segundo

maior manancial natural do Brasil (Yunes et al, 2002; Yunes,

2003; Matthiensen et al, 1999).

No estado de Santa Catarina, desde 1994 são realizadas

amostragens de fitoplâncton na costa, sendo que já foram

encontradas algumas florações de algas potencialmente tóxicas. A

partir de 1997 foi estabelecido pelo governo do estado um

programa de monitoramento de fitoplâncton tóxico para o

desenvolvimento sustentável do cultivo de moluscos numa

extensão de 400 km do litoral no estado (Sar et al, 2002). Um

estudo recente realizado em parceria da Universidade Federal de

Santa Catarina com o IBAMA onde foi monitorada a incidência

de fitoplâncton tóxico na Costa Catarinense e seu impacto na

saúde pública e no meio ambiente, apresentou dados

preocupantes e confirmam a necessidade de um monitoramento

constante. O estudo abrangeu mais de 500km do litoral

catarinense e dos 21 pontos amostrados, 17 apresentaram várias

espécies de microalgas tóxicas (Carvalho Pinto-Silva, 2005).

O que é mais preocupante da presença destas algas

potencialmente tóxicas, é as toxinas produzidas, além de serem

hepatotóxicas ou neurotóxicas, podem apresentar genotoxidade,

ou seja, podem causar dano celular em nível de DNA, acelerando

ou aumentando o aparecimento de mutações que estão associadas

ao desenvolvimento de neoplasias. Ainda no estudo de Carvalho

Pinto - Silva (2005) foi comprovado, em ensaios in vitro, que a

exposição de células de adenocarcinoma de intestino grosso

humano (Caco-2) à toxinas marinhas, apresentou elevada

citotoxicidade e genotoxicidade. Isto indica que essas toxinas

diminuem a viabilidade celular, causam danos nas membranas,

alterações nos lisossomos, diminuição da atividade metabólica

das mitocôndrias e induzem apoptose (morte celular

programada). A monitoração destes efeitos genotóxicos das

toxinas é de interesse fundamental na Toxicologia Ambiental

para determinar quais os danos que esta contaminação pode

causar em organismos vivos (Kima e Hyun, 2006; Carvalho Pinto

- Silva, 2005).

Para o caso de florações de cianobactérias tóxicas em

corpos da água utilizados ou para consumo humano ou para

finalidades recreacionais, abordamos um ponto mais crítico, pois

neste evento podem apresentar sérios riscos de saúde para a

população humana. A água segura destinada ao consumo humano

é um dos fatores os mais críticos para garantir a saúde em longo

prazo da população. Dependendo das condições climáticas em

muitas regiões e da carga de nutriente da agricultura, a

comunidade fitoplânctônica presente em reservatórios, lagos e

rios é dominada freqüentemente por cianobactérias. Os sistemas

de tratamento da água não somente têm que reduzir o odor e a cor

durante o processo do tratamento de água, como também têm que

eliminar estas células de cianobactérias, e as toxinas produzidas

por elas (Hoeger et al, 2004).

Um acontecimento que alertou a comunidade científica

brasileira e a população em geral, foi o incidente de grandes

proporções com a intoxicação humana causada por cianotoxinas,

fato ocorrido em 1996, em uma clínica de hemodiálise de

Caruaru - Pernambuco, onde ocorreu a morte de 76 pacientes

intoxicados com hepatotoxinas presentes na água utilizada na

hemodiálise. As mortes ocorreram até cinco meses após o início

dos sintomas. De acordo com informações fornecidas pela

Secretaria de Saúde de Estado de Pernambuco, a referida clínica

recebia água sem um tratamento completo e usualmente era feita

uma cloração no próprio caminhão tanque utilizado para

transportar a água, em períodos de falha no abastecimento pela

rede pública (Jochimsen et al, 1998; Carmichael et al, 2001).

Em ambientes aquáticos, as cianotoxinas normalmente

permanecem contidas nas células das cianobactérias e são

liberadas em quantidade considerável após a lise celular, que

ocorre durante a morte natural, estresse celular, uso de algicidas,

como sulfato de cobre ou cloração. Contudo, a ocorrência de

espécies potencialmente produtoras dessas substâncias em nossos

ambientes aquáticos precisa ser muito bem investigada e

monitorada, a fim de evitar danos à saúde animal, humana e do

próprio ecossistema. Nesse cenário de risco potencial à saúde, as

variáveis cianobactérias e cianotoxinas vêm ganhando espaço em

normas relacionadas à saúde e qualidade ambiental no mundo

todo (Debert et al, 2006).

Com o intuito de minimizar o risco da contaminação de

águas destinadas ao consumo humano, diversos países

estabeleceram procedimentos para monitorar a presença de

cianotoxinas em águas tratadas, porém poucas referências

propõem valores limites para cianobactérias e cianotoxinas. A

Organização Mundial da Saúde, por meio do adendo da segunda

edição do “Guidelines for drinking-water quality” (WHO, 1998),

concluiu que não havia dados suficientes que possibilitassem a

definição de valores de referência para qualquer outra

cianotoxina, além da microcistina-LR. WHO (1998) recomendou

o valor limite máximo para microcistina-LR total (livre mais

intracelular) de 1µg/L, considerando a exposição através da água

de consumo humano. A terceira e mais recente edição do

“Guidelines for drinking-water quality” (WHO, 2003) manteve o

mesmo valor para microcistina-LR e não apresentou valores para

as demais cianotoxinas.

Atualmente, o Brasil é o único país que estabelece limites

para densidade de cianobactérias e concentração de cianotoxinas

em norma nacional, com força de lei (Deberdt et al, 2006). O

Ministério da Saúde estabeleceu a Portaria nº 518 de 2004 como

um dos padrões de potabilidade, para substâncias que apresentam

riscos à saúde, a microcistina, sendo que o valor máximo

permitido (VMP) é de 1 µg/L, e recomenda valores limites para

cilindrospermopsina e saxitoxinas (15,0 µg/L e 3,0 µg/L de

equivalentes STX/L, respectivamente) em água para consumo

humano. Sempre que o número de cianobactérias na água do

manancial, no ponto de captação, exceder 20.000 células/mL (2

/L de biovolume), será exigido a análise de cianotoxinas ou

comprovação de toxicidade na água bruta por meio da realização

de bioensaios em camundongos. Assim, o desenvolvimento dos

métodos para reduzir eficazmente concentrações destas toxinas

abaixo dos níveis aceitáveis transformou-se assim um foco

importante de esforços atuais da pesquisa.

Entretanto, ao estabelecer valores limites da presença de

cianotoxinas em água potável, nos questionamos: até que ponto

estes valores podem ser confiáveis? O quê esses valores podem

causar a saúde humana? A partir dos fatos relatados, e

considerando a problemática da floração de algas tóxicas tão

evidenciada nos últimos tempos, cabe a este estudo responder a

três hipóteses que são as orientadoras desta investigação

científica, que serão apresentadas a seguir.

1.1. HIPÓTESES DA PESQUISA

1.1.1. Primeira Hipótese

Baseando-se nas proposições teóricas de que a saxitoxina é

potencialmente tóxica pertencendo a um grupo de toxinas

neurotóxicas paralisantes, de sua alta solubilidade em água e de

que há evidências significativas da presença de cianobactérias

produtoras desta toxina em um manancial de abastecimento

público, afirma-se que a saxitoxina pode causar efeitos

citotóxicos e genotóxicos aos indivíduos expostos à esta toxina.

1.1.2. Segunda Hipótese

Baseando-se no fato de a genotoxicidade ser um processo

que identifica efeitos precoces de alteração do genoma, nos

indícios de cianotoxinas em concentrações muito baixas induzem

a processos genotóxicos, e nos valores recomendados para

concentrações de saxitoxinas pela Legislação vigente da portaria

nº 518 do Ministério da Saúde, que esta determinação considera a

presença de cianotoxinas em águas potáveis destinadas a

consumo humano, afirma-se que o valor recomendado na portaria

n° 518 do Ministério da Saúde não é seguro, pois valores abaixo

do VMP causam efeitos tóxicos em nível celular.

1.1.3. Terceira Hipótese

Baseando-se no fato de a STX ser uma toxina altamente

solúvel em água, que sistemas convencionais de tratamento de

água não são capazes de removê-la e da possibilidade de

utilização de materiais naturais que tem demonstrado a eficiência

de adsorção de diversos materiais de origem natural, afirma-se

que a concha de ostra e a quitina podem ser empregadas como

adsorvente para a remoção de STX de soluções aquosas.

Âmbito social

1.2. JUSTIFICATIVA DA PESQUISA

A atividade antrópica tem levado a uma crescente

contaminação das lagoas costeiras brasileiras. Essa contaminação

causa mudanças na qualidade das águas, incluindo redução do

oxigênio dissolvido, morte extensiva de peixes e aumento das

incidências de florações de algas tóxicas. A Lagoa do Peri,

situada na área do Parque da Lagoa do Peri é o manancial

utilizado para abastecer o sul e a costa leste da Ilha de

Florianópolis - Santa Catarina. A grande problemática da Lagoa

do Peri é a quantidade de algas que dificulta o tratamento da

água, que causa desde obstrução de filtros até a liberação de

toxina presentes em algumas espécies. De acordo com estudos

locais, a espécie Cylindrospermopsis raciborskii é a dominante

absoluta da Lagoa, e vem preocupando a comunidade científica

por estar entre as espécies de cianobactérias potencialmente

tóxicas. São capazes de produzir cianotoxinas que podem ser

acumuladas na rede trófica atingindo conjuntos de organismos

muito além da comunidade aquática, atingindo a população local

que consome esta água. Até o momento, poucos estudos têm

investigado a contaminação desta lagoa com toxinas e nenhum

estudo ainda foi realizado investigando a genotoxicidade das

toxinas presentes na Lagoa do Peri. Diante do exposto, e

consciente da gravidade do problema apresentado, este estudo

pretende contribuir para a comunidade científica e local,

realizando uma avaliação dos efeitos tóxicos da STX, uma

neurotoxina presente na Lagoa do Peri – Florianópolis/SC,

através de testes de citotoxicidade e genotoxidade desta toxina.

Pretende-se ainda verificar qual a conformidade de valores de

concentração de STX com a legislação vigente do Ministério da

Saúde.

A crescente preocupação com a disponibilidade de água

potável destinada para o abastecimento público vem despertando

um interesse geral para este assunto. A Declaração de Direitos

Humanos de 1948 prevê no artigo 25 que: “toda a pessoa tem

direito a um nível de vida suficiente para lhe assegurar e à sua

família a saúde e o bem-estar”. Para assegurar este direito, é

imprescindível que a água destinada ao consumo humano atenda

a condições mínimas para que possa ser ingerida ou utilizada para

fins higiênicos. Para que a água do manancial não ofereça risco à

saúde pública, deve-se impedir sua contaminação evitando o

despejo de efluentes domésticos e rejeitos industriais nos

mesmos.

O Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental

começou a desenvolver a área de toxicologia ambiental, através

da criação da Disciplina de Toxicologia Ambiental (Portaria n °

168/PREG/96), a partir de setembro de 1996, juntamente com a

montagem e desenvolvimento do Laboratório de Toxicologia

Ambiental - LABTOX. As atividades do LABTOX tiveram início

em fevereiro de 1997, com o objetivo de dar suporte ao ensino,

pesquisa e extensão. Esta estrutura vem sendo utilizada em

estudos científicos no âmbito das florações de algas tóxicas e

controle de poluição ambiental. As técnicas desenvolvidas

possibilitam introduzir nos diagnósticos de qualidade ambiental,

variáveis sobre os efeitos tóxicos e genotóxicos de elementos

químicos dispostos no meio ambiente.

CAPÍTULO II

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

• Estudar o mecanismo de ação tóxica da STX e avaliar sua

remoção da água por adsorção em diferentes materiais de

origem natural.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Implementar uma metodologia analítica utilizando um sistema

HPLC e detector de fluorescência para quantificação de STX

e outros compostos de interesse;

• Avaliar a citotoxidade (viabilidade celular) da STX utilizando

o ensaio do MTT;

• Avaliar os efeitos tóxicos da STX em sistemas genéticos,

utilizando os métodos da fragmentação do DNA e o ensaio da

freqüência de micronúcleo;

• Avaliar os efeitos tóxicos da STX em sistemas epigenéticos,

utilizando os métodos da metilacão do DNA (dosagem da

m5dC) e da lipoperoxidacão (dosagem do malondialdeído);

• Comparar os resultados obtidos com as medidas estabelecidas

à proteção da saúde humana pela Portaria nº. 518 de 2004 -

Ministério da Saúde;

• Verificar a capacidade de adsorção da saxitoxina à conchas de

ostras trituradas e a quitina.

CAPÍTULO III

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Neste capítulo serão feitas breves revisões sobre

eutrofização natural e artificial, floração de algas e a sua

problemática no local de estudo, a Lagoa do Peri, que é um

manancial destinado ao abastecimento público. A seguir, serão

abordadas nesta revisão as cianotoxinas, em especial da

saxitoxina por ser o alvo deste estudo, destacando uma breve

revisão sobre a legislação brasileira que regulamenta estas toxinas

em águas destinadas a consumo humano e metodologias para

qualificar e quantificar estas toxinas em água. Será apresentada

ao final uma revisão sobre alguns bioensaios para monitoramento

dos efeitos genotóxicos que estas toxinas causam.

3.1. EUTROFIZAÇÃO NATURAL E ARTIFICIAL

Os ecossistemas lacustres são paisagens temporárias que

surgem a partir de depressões do terreno, preenchidas de água ao

longo do tempo geológico. Podem decorrer milhares de anos até

que um lago apresente as condições ideais para a proliferação de

peixes e ostente plantas aquáticas superiores, como as que

flutuam na superfície d'água. O processo que resulta num

aumento de nutrientes essenciais para o fitoplâncton e promove o

aumento da produtividade deste ambiente, é chamado de

eutrofização natural. Essa ação acontece de forma natural, e suas

condições passam de oligotróficas a eutróficas, num processo de

envelhecimento natural. Arbitrariamente, o homem aprendeu a

reproduzir o processo natural e assim surgiu a eutrofização

artificial, também chamada de eutrofização acelerada ou

antrópica, que resultam em impactos ao meio ambiente e a saúde

humana, cada vez mais presentes no cotidiano de populações do

mundo todo.

Dentre as ações antropogênicas que contribuem para estes

impactos, a mais preocupante é a descarga de fontes difusas e

pontuais de nitrogênio e fósforo nos rios, lagos e represas, a partir

de esgotos não tratados e do emprego de fertilizantes que

produzem o fenômeno de eutrofização artificial, cujos efeitos

ecológicos, na saúde humana e nos custos do tratamento de água

são relevantes.

A eutrofização artificial se manifesta com a quebra do

equilíbrio ecológico. Este processo, num breve relato de Carvalho

(2004), é causado pelo lançamento de efluentes domésticos e

industriais nos corpos d'água, e disponibiliza uma quantidade

maior de matéria orgânica que o sistema é capaz de decompor.

Estes agentes eutrofizantes (constituídos principalmente de

nitrogênio, na forma de nitrato e amônia, e fósforo, na forma de

fosfato) estão diretamente relacionados com o processo

fotossintético das algas, uma vez que pertencem à estrutura de

muitos compostos importantes para o metabolismo da célula

vegetal.

3.2. FLORAÇÕES DE ALGAS

A floração de algas consiste num crescimento algal

excessivo, o qual pode ser fenômenos naturais regionais de

ocorrência sazonal, mas que na maioria das vezes estão

relacionados a processos de eutrofização artificial causado por

excesso de nutrientes vindos de efluentes domésticos, rejeitos

industriais e fertilizantes da agricultura. A floração de algas pode

causar gosto e odor desagradável na água, modificação da cor das

águas, além de alterar o equilíbrio ecológico do ecossistema

aquático. Matias (2002) afirma que esta indução ao “stress” de

sistemas ecológicos por meio de importantes poluentes modifica

o habitat, introduzindo espécies exóticas e removendo as espécies

nativas. No entanto o mais grave é que certas espécies são

capazes de produzir cianotoxinas que podem ser acumuladas na

rede trófica atingindo conjuntos de organismos muito além da

comunidade aquática.

A intoxicação humana por cianotoxinas ocorre pelo

contato direto com a pele e mucosas, pela ingestão e pela inalação

de água contendo cianobactérias. As cianotoxinas são liberadas

para o ambiente quando as células destas cianobactérias se

rompem. Essas toxinas não podem ser removidas da água pelos

tratamentos convencionais das redes públicas de abastecimento e

são resistentes à fervura. Estas toxinas são compostas por

diversas classes de biomoléculas com função e mecanismos de

síntese ainda não totalmente conhecidos. Algumas delas têm

efeitos antibióticos contra bactérias ou outras algas.

Considerando-se as mais de 5000 espécies conhecidas, apenas um

pequeno número de algas do plâncton produz toxinas (Hallegraeff

et al, 1995).

A presença de florações de cianobactérias em corpos de

águas artificiais ou naturais tem sido relatada em todo o mundo

(Band-Schmidt et al, 2005; Robertson et al, 2004). No Brasil,

muitos dados atualizados têm sido documentados, relatando casos

de floração de algas. Como exemplos têm-se corpos de água

como a Lagoa de Jacarepaguá, no Rio de Janeiro e a Lagoa dos

Patos, no Rio Grande do Sul, onde pesquisadores têm confirmado

a presença de toxinas em valores consideráveis (Tucci e

Sant’anna, 2003, Ferrão-Filho et al, 2002; Magalhães et al, 2001;

Rosa et al, 2005; Matthiensen et al, 1999).

Estudo de Caso: A Lagoa do Peri

Em Santa Catarina, a Lagoa do Peri, situada na área do

Parque da Lagoa do Peri (regulamentado pela Lei Municipal

1828, decretada pela Lei nº 091/82) é o manancial utilizado pela

CASAN (Companhia Catarinense de Águas e Saneamento) para

abastecer o sul e a costa leste da Ilha de Florianópolis, no estado

de Santa Catarina - Brasil. A Figura 3.1 traz uma vista geral do

Parque da Lagoa do Peri, onde pode ser observados a Lagoa e os

seus arredores. A forma de agrupamento humano se diferencia no

interior do Parque, com comunidades voltadas para atividades

agrícolas, associadas à fabricação da farinha de mandioca e da

cachaça de cana, para a população da restinga com uma

diversificada atividade ocupacional (Garcia, 2002). Alem da

população local, todas estas atividades em torno da lagoa,

contribuem para um aumento na quantidade de resíduos gerados.

Acredita-se que uma parte considerável deste resíduo é lançada

de forma clandestina diretamente na lagoa, contribuindo para

alterações nas suas características tróficas.

Figura 3.1: Vista panorâmica do Parque da Lagoa do Peri (Fonte:

Oliveira, 2002).

A grande problemática da Lagoa do Peri é a grande

quantidade de algas que dificulta o tratamento da água, que causa

desde obstrução de filtros até a liberação de toxina presentes em

algumas espécies. Para Silveira (2003), os ambientes de água

doce são os mais importantes para o crescimento de

cianobactérias, visto que a maioria das espécies apresenta um

melhor crescimento em águas neutro-alcalinas (pH 6-9),

temperatura entre 15 a 30°C e alta concentração de nutrientes,

principalmente nitrogênio e fósforo.

Em estudos apresentados por Garcia apud NEMAR

(2002), as espécies algais mais presente em amostras de rede na

Lagoa do Peri, foram:

• Cyanophyceae: Aphanothece comasii, Cylindrospermopsis

raciborskii, Mycrocystis wesenbergii, Planktolyngbya

limnetica, Pseudanabaena galeata.

• Bacillariophyceae: Aulacoseira ambigua.

• Dinophyceae: Peridinium volzii, Peridiniales sp.

• Chlorophyceae: Coelastrum polychordum, Dictyosphaerium

ehrenbergianum, Monoraphidium irregulare.

• Zygnemaphyceae: Cosmarium bioculatum var. depressum,

Staurastrum muticum, Staurastrum sp, Staurastrum

tetracerum, Staurodesmus cuspidatus.

Neste estudo taxonômico, destacou-se a espécie

Cylindrospermopsis raciborskii como a dominante absoluta,

atingindo densidades médias que corresponderam média de 82%

da densidade total. Devido à sua capacidade altamente invasora, a

Cylindrospermopsis raciborskii, dentre as espécies de

cianobactérias potencialmente tóxicas, tem sido objeto de estudo

de diversos pesquisadores e autoridades sanitárias.

Cepas de cianobactérias da espécie Cylindrospermopsis

raciborski já foram isoladas, que foram primeiramente isoladas

de dinoflagelados marinhos. Sua alta competitividade em

ambientes eutrofizados, aliada à sua capacidade de formar

florações e produzir toxinas, fazem desta espécie uma das

cianobactérias mais estudadas tanto do ponto de vista ecológico

como de saúde pública. (Tucci e Sant’anna, 2003).

3.3. CIANOTOXINAS

As toxinas produzidas pelas cianobactérias têm como

função aumentar as defesas contra espécies zooplanctônicas, seus

predadores primários. No caso de águas destinadas ao consumo

humano, Amorim (1997) destaca que os tratamentos

convencionais por filtração, apenas evitam que as células

cheguem à rede de abastecimento, mas não evitam a libertação

das toxinas para a água que irá ser consumida.

A estabilidade das cianotoxinas é uma característica muito

importante na tomada de decisões sobre qualidade de água

quando ocorrem as florações de cianobactérias. Ressom et al.

(1994) descrevem que algumas neurotoxinas apresentam

moléculas relativamente lábeis que tendem a se decompor

rapidamente sob condições naturais em subprodutos não-tóxicos,

enquanto que as hepatotoxinas cíclicopeptidicas são

extremamente estáveis devido à estrutura química que elas

possuem.

De acordo com Matias (1999), o consumo desta água

contaminada e seus derivados podem acarretar em muitos tipos

de patologias: a síndrome da paralisia ou PSP (“Paralytic

Shellfish Poisoning”), a síndrome neurotóxica ou NSP

(“Neurotoxic Shellfish Poisoning”), a síndrome ciguatérica, a

síndrome da amnésia ou ASP (“Amnesic Shellfish Poisoning”) e

a síndrome da diarréia ou DSP (“Diarrheic Shellfish Poisoning”).

Contudo, registros de intoxicações por toxinas são muito

limitados, sendo possível que, em muitos casos, problemas

provocados por estes organismos sejam confundidos com outros

tipos de doenças, tais como gastrenterites, hepatites, herpes-

zoster, acidentes vasculares encefálicos, etc.

3.3.1. Toxinas “Paralytic Shellfish Poisons” (PSP)

As toxinas PSP, sigla esta que pode se traduzida como

“envenenamento paralisante de molusco”, é uma síndrome

neurotóxica que é o resultado da ingestão de moluscos

contaminados que agem no sistema neuromuscular e os efeitos

predominantes são neurológicos e consistem de

formigamento/dormência de face, braços e pernas, queimação,

torpor, sonolência, fala incoerente, ausência de coordenação

muscular, sensação de flutuação e paralisia respiratória. A morte

pode ocorrer em 2 a 25 horas após a ingestão. As toxinas

associadas a esta síndrome foram referenciadas como saxitoxinas,

sendo este o único agente responsável para esta contaminação. Os

incidentes com toxinas PSP tiveram aumento significante a partir

da década de 70, e até a atualidade estas contaminações são

registradas em regiões do mundo, onde até então eram

desconhecidas. Estas contaminações são esporádicas e

imprevisíveis. Na atualidade, as toxinas PSP são consideradas um

problema global, e requer uma grande consciência pública e

profissional (D’Melo, 2003).

As toxinas PSP são pertencentes a um grupo de compostos

altamente polares e solúveis em água. Suas estruturas químicas

estão apresentadas na Figura 3.2 a seguir. A Cylindrospermopsis

raciborski, espécie dominante absoluta na área de estudo, quando

predominante em florações produz algumas toxinas

potencialmente venenosas: a cilindrospermopsina, um alcalóide

com ação tóxica no fígado e rins e duas neurotoxinas paralisantes,

a saxitoxina e a neo-saxitoxina, pertencentes à classe PSP

(Sivonen & Jones, 1999).

Figura 3.2: Estruturas químicas das toxinas paralisantes de molusco

(PSP).

A saxitoxina (STX) é pertencente ao grupo dos alcalóides

neurotóxicos carbamatados, não-sulfatados. Apresenta peso

molecular de 299,3 g/mol, e seu pK

em água é de 8,24. É solúvel

em água e metanol e pouco solúvel em etanol, e não solúvel em

acetona, éter ou clorofórmio. É estável em solução ácida quente

a pH 2,4, e se tornam cada vez mais lábeis com o aumento do pH.

É resistente a cristalização, bastante higroscópica e se

decompõem sem fusão (Ressom et al, 1994). A sua estrutura é

apresenta na Figura 3.3 abaixo.

Figura 3.3: Estrutura da saxitoxina (STX).

A saxitoxina foi identificada pela primeira vez em meio de

água doce proveniente da Aphanizomenon flos-aquae.Além da

Cylindrospermopsis, a saxitoxina também é sintetizada por outras

espécies de cianobactérias de tipos de Anabaena e

Aphanizomenons, por exemplo. A sua toxicidade é extremamente

elevada, apresentando DL

de 5 µg/Kg de peso corpóreo (ratos)

(Bouaïcha, 2001).

A saxitoxina tem uma ação rápida que inibe a condução

nervosa, bloqueando canais de sódio sem afetar permeabilidade a

potássio. Das várias toxinas causadoras de paralisia, apenas a

saxitoxina tem sido uma das neurotoxinas mais estudadas em

detalhes quanto aos seus efeitos farmacológicos, pela dificuldade

de se isolar as outras toxinas para maiores estudos (Silveira,

2003). Ainda assim, pouco tem sido investigado sobre a presença

das saxitoxinas nas águas da Lagoa do Peri (Melo Filho, 2006;

Mondardo, 2004).

São também muito escassas as informações sobre os

efeitos genotóxicos (sobre o genoma) in vitro desta toxina. Em

intensas pesquisas sobre o tema, poucas referências foram

encontradas em pesquisas em bases de dados científicos cruzando

as palavras-chaves “genotoxicidade in vitro” e “saxitoxina”.

Dados recentes de Falconer (2008) publicados no “International

Symposium on Cyanobacterial Harmful Algal Blooms” (ISOC-

HAB), simpósio organizado pela Agência de Proteção Ambiental

dos Estados Unidos (USEPA), relatam que ainda não existem

dados disponíveis na literatura referente as saxitoxinas sobre seus

efeitos de exposição subcrônica, efeitos na reprodução, efeitos

teratogênicos ou carcinogênicos.

3.3.2. Legislação Brasileira v. Cianotoxinas

A importância da água para a vida, saúde, bem estar e

desenvolvimento humano são inquestionáveis, e, assim sendo,

toda pessoa deveria contar com o fornecimento suficiente,

fisicamente acessível e a um custo acessível, de uma água salubre

e de qualidade aceitável para as utilizações pessoais e domésticas

de cada um. Nesse sentido, pode-se afirmar que o acesso à água

potável está intimamente relacionado com o direito à vida, direito

este assegurado pela Declaração Universal de Direitos Humanos

de 1948, artigo XXV.

Conscientes das ameaças que pressionam nossos recursos

hídricos, cada vez mais as cianobactérias e cianotoxinas vêm

recebendo uma atenção especial dos órgãos regulamentadores em

todo o mundo. Países como Austrália e Estados Unidos criaram

estratégias de controles para cianobactérias e cianotoxinas, mas,

como citado anteriormente, o Brasil é o único país na atualidade

que estabelece limites para densidade de cianobactérias e

concentração de cianotoxinas em norma nacional, com força de

lei (Deberdt et al, 2006).

A Legislação Brasileira recomenda como padrão de

potabilidade da água para consumo humano, valor máximo

permitido (VMP) para a microcistina de 1µg/L, e recomenda as

análises para cianotoxinas incluam a determinação de

cilindrospermopsina e saxitoxinas (STX), observando,

respectivamente, os valores limites de 15,0 µg/L e 3,0 µg/L de

equivalentes STX/L. Recomenda ainda que sempre que o número

de cianobactérias na água do manancial, no ponto de captação,

exceder 20.000 células/mL (2mm

/L de biovolume), será exigido

a análise de cianotoxinas ou comprovação da toxicidade na água

bruta por meio de realização de bioensaios em camundongos.

Para análise de cianobactérias e cianotoxinas e comprovação de

toxicidade por bioensaios em camundongos, até o

estabelecimento de especificações em normas nacionais ou

internacionais que disciplinem procedimentos, devem ser

adotadas as metodologias propostas pela Organização Mundial da

Saúde (OMS) em sua publicação Toxic cyanobacteria in water: a

guide to their public health consequences, monitoring and

management (Ministério da Saúde, Portaria nº. 518 de 2004).

3.3.3. Quantificação da STX

A detecção e quantificação de toxinas de cianobactérias

podem ser realizadas através de métodos biológicos (em

camundongos - MBA – Mouse Bioassay), químicos

(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - HPLC) e

bioquímicos (ensaios de inibição das fosfatases e imunoensaios -

teste ELISA- Enzime Linked Immunosorbent Assay). Dentre

estes métodos, o MBA é o método de referência e mais antigo,

empregado desde 1937 (Ben-Gigirey et al, 2007). Contudo, por

uma questão ética, muitas entidades estão empenhadas em reduzir

ao máximo possível o recurso a animais, incentivando

pesquisadores a desenvolverem outros métodos alternativos à

experimentação animal.

O HPLC permite detectar e quantificar a presença de

toxinas em amostras pré-purificadas com grande sensibilidade,

com a vantagem de ser um método químico, e muitos estudos tem

feito comparações, demonstrando a grande eficiência do método

químico com relação ao biológico (Lawrence et al, 1995). No

método químico a detecção é feita espectofotometricamente,

utilizando um comprimento de onda que varia conforme a toxina

de interesse presente na amostra. (Lanças, 2004; Amorim, 1997).

As saxitoxinas em especial não são moléculas

naturalmente fluorescentes, mas para que sejam analisadas por

esta técnica, passam por um processo denominado derivatização,

onde é introduzido na STX outra molécula com propriedade

fluorescente, possibilitando assim a detecção da STX. Diversos

estudos têm empregados esta técnica na identificação de

saxitoxinas. (Oshima et al, 2003; Lawrence et al, 1995). Porem as

técnicas de HPLC de subdividem em duas técnicas que diferem

na derivatização da amostra para a detecção no detector de

fluorescência: a derivatização pré e pós-coluna (Lanças, 2004).

Atualmente, a metodologia que é referenciada pela

Association of Official Analytical Chemists (AOAC) para análise

de PSP é a metodologia que emprega a derivatização pré-coluna.

Esta metodologia de análise tem se demonstrado de fácil

reprodução além de ser prática e eficaz por se tratar de

procedimentos de uma reação muito simples, não necessitando de

equipamentos muito sofisticados acoplados ao sistema de

cromatografia líquida. A reação de derivatização com os

prováveis produtos é apresentada na Figura 3.4 a seguir.

Figura 3.4: Peroxidação da saxitoxina.

3.4. BIOENSAIOS PARA MONITORAMENTO DA CITOTOXICIDADE

E GENOTOXICIDADE CELULAR

O termo citotoxicidade abrange processos de morte celular

induzida, e o termo genotoxicidade abrange processos que

alteram a base genética da vida, quer seja na estrutura físico-

química do DNA (ácido desoxirribonucléico), processo este

chamado de mutagênese, quer seja na alteração do determinismo

genético em nível celular ou orgânico, identificado

respectivamente como carcinogênese e teratogênese. A

genotoxicidade estuda, sob o aspecto genético, o que perturba a

vida ou induz a morte tanto ao nível de célula, como ao nível de

organismo (Silva et al, 2003).

A monitoração de efeitos citotóxicos e genotóxicos de

toxinas são de interesse fundamental na Toxicologia Ambiental

para determinar quais os danos que esta contaminação pode

causar em organismos vivos. Os ensaios citotóxicos e

genotóxicos são importantes ferramentas para avaliação dos

diferentes mecanismos de ação tóxica das toxinas, e estes testes

têm sido incorporados entre ensaios de rotina em laboratórios de

experimentação.

Diversos produtos químicos produzem efeitos adversos na

estabilidade do ecossistema, podendo causar lesões do DNA,

incluindo rupturas de hélice, bases modificadas e “DNA

crosslinks”, que é a ligação de um agente exógeno ou endógeno

que reage em duas posições diferentes do DNA, causando um

bloqueio no processo de replicação e conseqüente morte celular;

o “crosslink” não pode ser reparado (Kima e Hyun, 2006).

Agências de controle ambiental de diferentes países vêm

recomendando a utilização de conjunto de testes para a avaliação

de substâncias quanto as suas características genotóxicas com

vistas a sua regulamentação para consumo ou liberação para o

ambiente. A principal preocupação destas entidades tem sido a

detecção de genotoxicidade em testes de curta duração, bem

como o estudo preditivo destes testes. O mais recomendado é a

combinação de testes dependendo das características do agente

tóxico, utilizando o estudo de diferentes tipos de danos. O

surgimento de base de dados mais completas usando técnicas de

cultura de células enriquece tanto a identificação dos agentes

tóxicos como aqueles com potencial carcinogênico (Silva et al,

2003).

Dentre vários ensaios utilizados para a detecção do dano

em nível citotóxico e do DNA, podemos destacar: o teste do

MTT, o teste do micronúcleo, a metilação biológica e a

lipoperoxidação.

3.4.1. Teste de citotoxicidade: Teste do MTT

O princípio deste ensaio consiste na absorção do sal

MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2,5-difeniltetrazólio))

pelas células sendo reduzido no interior da mitocôndria a um

produto chamado Formazan. A succinato desidrogenase, uma

enzima do ciclo de Krebs ativa em mitocôndrias de células

viáveis, é capaz de transformar o MTT que é de cor amarela em

cristais de formazan, que são de cor escura. Esta capacidade

somente as células viáveis possuem indicando atividade

mitocondrial e conseqüente viabilidade celular (Wan et al, 1994).

3.4.2. Teste de Micronúcleo

Micronúcleos são pequenos corpúsculos compostos de

material cromossômico. Após a divisão das cromátides no

processo mitótico dois núcleos são reconstituídos, um em cada

pólo. A membrana nuclear é refletida ao redor destes dois

conjuntos de cromossomos (Silva et al, 2003). Mas se um

cromossomo inteiro ou um fragmento cromossômico acêntrico

não se integra ao novo núcleo (por não estar unido ao fuso) este

constitui um micronúcleo.

Os micronúcleos são estruturalmente pequenos núcleos

representando o material genético que foi perdido pelo núcleo

principal, como conseqüência de um dano genético que pode ser

causado por agentes físicos, químicos ou biológicos, capazes de

interferir no processo de ligação do cromossomo às fibras do

fuso, ou que possam induzir a perda de material genético. O teste

do micronúcleo detecta estes micronúcleos resultantes das

rupturas cromossômicas durante a divisão celular ou eventos de

perda de cromossomos na anáfase. Este teste detecta, portanto a

mutagênese cromossômica em eucariotos dos tipos clastogênese

(induzido a perda do fragmentos cromossômicos), aneugênese

(induzido a perda de um ou mais cromossomos do conjunto) e

danos no fuso mitótico. Para que o micronúcleo seja visualizado,

é necessária uma divisão celular após o evento mutagênico, por

isso ou é necessário utilizar células que estejam se multiplicando

constantemente (in vivo, p.e. a medula óssea), ou precisa-se fazer

o cultivo celular (in vitro). Assim, os micronúcleos podem ser

identificados em qualquer tipo de célula, e nos testes in vitro os

produtos a serem testados devem ser diluídos preferencialmente

em água ou outro solvente não tóxico (Silva et al, 2003; Ribeiro

et al, 2003).

3.4.3. Metilação Biológica

A metilação biológica consiste na transferência de grupos

metil de S-adenosilmetionina (SAM, um cofator enzimático

presente em todas as células eucarióticas) para a posição 5 da

citosina e é catalisada por enzimas conhecidas como DNA-

metilase (Figura 3.5). A metilação da citosina pode influenciar na

expressão gênica, sendo, portanto um fator epigenético (Havlis e

Trbusek, 2002; Gonzalgo e Jones, 1997).

Este fenômeno epigenético pode ser definido como

mudança no material genético (especialmente no DNA e na

cromatina) que altera a regulação da expressão gênica de maneira

que esta é passada para as células filhas dentro das células

somáticas, porém não é caracterizada como mutação, pois não

envolve mudança na seqüência de DNA. Tem como principais

mecanismos de repressão transcricional a metilação do DNA e a

acetilação das histonas. A modificação no padrão de metilação do

DNA é a alteração epigenômica melhor estudada (Havlis e

Trbusek, 2002; Rein et al, 1998; Gonzalgo e Jones, 1997; Ehrlich

et al, 1982).

Figura 3.5: Mecanismo de metilação do DNA. A 5–metilcitosina é

produzida pela ação das DNA-metiltransferases (DNMT 1, 3a ou 3b)

que catalizam a transferência de um grupo meti da S-adenosilmetionina

(SAM) para o carbono na posição 5 da citosina.

Ocorre quase que exclusivamente nas citosinas que são

seguidas imediatamente por uma guanina (dinucleotídeos CpG).

A maior parte do genoma mostra uma clara depleção desses

dinucleotídeos e os que estão presentes estão quase sempre

metilados (Gonzalgo e Jones, 1997).

A metilação de DNA é o mecanismo que permite que

determinados genes (e não outros) se manifestem dentro de

células normais especializadas, visto que todas as células do

corpo trazem a mesma carga genética. O que as diferencia é a

manifestação de um ou de outro gene durante o desenvolvimento

e em toda a sua vida para desativar genes desnecessários(Silva et

al, 2003).

3.4.4. Fragmentação do DNA e Apoptose

Um padrão morfológico de lesão celular muito conhecido

como apoptose, é atualmente aceito como um modo distinto e

importante de morte celular. A apoptose é uma forma de morte

celular destinada a eliminar células do intoxicante ou hospedeiro

através de uma série coordenada e programada internamente de

eventos executados por um conjunto exclusivo de produtos

gênicos (Cotran et al. 2000).

A apoptose é responsável por numerosos eventos

fisiológicos, adaptativos e patológicos, incluindo a morte celular

induzida por estímulos nocivos que são capazes de causar morte

celular quando fornecidos em baixas doses de calor, radiação,

hipóxia e produtos químicos (Cotran et al. 2000).

As células apoptóticas exibem quebras típicas do DNA

em fragmentos grandes de 50 a 300 quilobases (kb).

Subseqüente, há a clivagem internucleossomica do DNA em

oligonucleossomas em múltiplos de 180 a 200 pares de bases (pb)

por endonucleases dependentes de Ca

e Mg

. Estes fragmentos

podem ser visualizados por eletroforese em gel de agarose com

escalas de DNA. A Figura 3.6 a seguir traz um exemplo de

fragmentação do DNA em gel de agarose (Cotran et al. 2000).

Eletroforese em gel de agarose é uma técnica empregada

para a separação e visualização de fragmentos de DNA e RNA,

onde os fragmentos migram em um gel de agarose durante a

aplicação de uma diferença de potencial, e os fragmentos são

separados de acordo com o seu tamanho. Na visualização de

material genético (DNA e RNA), emprega-se o gel de agarose

por apresentar porosidade irregular, funcionando assim como

uma rede que separa o DNA, por diferença de tamanho, dos

fragmentos menores que chegam mais rápido ao final da corrida

eletroforética. O DNA apresenta-se com carga negativa e, devido

a esta característica pode-se conduzi-lo de um pólo com carga

negativa para um pólo com carga positiva. Porém, este material

genético tem de estar em contato com uma solução salina que

permita a condução elétrica através de íons (Martinez e Paiva,

2008). Para se obter as imagens das corridas eletroforéticas

podem ser utilizadas substâncias intercalantes como o brometo de

etídio ou o SYBR Green, que revelam os ácidos nucléicos sob luz

ultravioleta (Ziper et al, 2004), como mostrado na Figura 3.6.

Figura 3.6: Fragmentação do DNA após tratamento de células Caco2 ao

ácido domóico. 1: marcador DNA (“Ladder”); 2: controle; 3:15ng/mL;

4: 30ng/mL; 5:60ng/mL; 6:100ng/mL (Carvalho Pinto-Silva, 2005).

3.4.5. Lipoperoxidação Biológica

A lipoperoxidação (LPO) se caracteriza pelo processo

onde radicais atacam os ácidos graxos poliinsaturados da

membrana celular, provocando uma reação em cadeia com

lipoperóxidos como produtos intermediários e modificações das

propriedades da membrana, como permeabilidade e fluidez, além

de causar dano a enzimas e receptores. Estes radicais podem ser

espécie “oxirreativa” (contendo um ou mais oxigênios reativos na

sua estrutura) ou da espécie “nitroreativa” (contendo um ou mais

nitrogênios reativos na sua estrutura) (Nair, 2007). Este processo

pode resultar em desestabilização e desintegração da membrana

celular levando o ser humano a sérios problemas de saúde desde

envelhecimento até a susceptibilidade ao câncer. As proteínas

podem sofrer alterações na sua conformação e perda na sua

função. O DNA também pode ser alvo de ataque de radicais

livres.

O processo total da LPO consiste em três estágios: a

iniciação, a propagação e a terminação. Uma vez iniciado, a LPO

!!"!!!!!!!#!!!!!!$!!!!!!!%!!!!!!&!!!!!!!'!

1 2 3 4 5 6

forma radicais peroxil (ROO

) que pode ser rearranjado através

de uma reação do ciclização aos endoperóxidos (precursores do

malondialdeído) produzindo como produto final do processo de

peroxidação, o malondialdeído (MDA) (Figura 3.7). O MDA é

um biomarcador natural produzido nesta reação e que pode ser

quantificado e usado para avaliação desse processo. O MDA é

mutagênico em bactérias e células de mamíferos e carcinogênico

em camundongos (Valko et al, 2007; Halliwell eGutteridge,

1999).

Figura 3.7: Esquema simplificado da lipoperoxidação, com a formação

do malondialdeído e o aduto com a guanina, M1G.

Os antioxidantes são substâncias que retardam ou

previnem a oxidação desse substrato em baixas concentrações em

relação ao substrato oxidável. Desse modo, os antioxidantes

atuam como protetores da oxidação de biomoléculas por radicais

livres e impedem a propagação da reação em cadeia provocada

pelos mesmos (Halliwell, 2007; Damiani, 2006). Tais defesas

antioxidantes são extremamente importantes na remoção direta de

radicais livres, fornecendo assim a proteção biológica máxima.

Um bom antioxidante deve: extinguir especificamente radicais

livres, quelar oxireduzindo metais, interagir (regenerar) com

outros antioxidantes dentro da "rede antioxidante", ter um efeito

positivo na expressão do gene, ser absorvido prontamente, ter

uma concentração nos tecidos e nos biofluidos em um nível

Guanina

Intermediário

fisiologicamente relevante e trabalhar nos domínios aquosos e/ou

membranares (Valko et al, 2007;!Halliwell and Gutteridge, 1999).

As principais defesas enzimáticas antioxidantes são a

superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa

peroxidase (GPx), que servem como linha primária de defesa na

destruição dos radicais livres. Além disso, antioxidantes não-

enzimáticos, como a glutationa reduzida (GSH), tocoferol

(vitamina E) e ácido ascórbico (vitamina C), entre outros,

auxiliam no combate as espécies “oxirreativa” e “nitroreativa”.

Os antioxidantes estão amplamente distribuídos nos organismos

vivos e constituem um sistema de defesa muito importante em

condições aeróbicas (Damiani, 2006). Alguns antioxidantes agem

em ambientes hidrofílicos, outros em ambientes hidrofóbicos, e

alguns em ambos os ambientes da célula. Por exemplo, a

vitamina C reage com o radical livre superóxido na fase aquosa,

enquando a vitamina E reage na fase lipofílica (Halliwell, 2007;

Valko et al, 2007).

A SOD constitui a primeira linha de defesa enzimática

contra a produção intracelular de radicais livre, catalisando a

dismutação do ânion superóxido. Está presente na matriz

mitocondrial (Mn-SOD), no citosol (CuZn-SOD) e no meio

extracelular. Embora o ânion superóxido não seja altamente

danoso, pode extrair elétrons de diversos componentes celulares

causando reações em cadeia de radicais livres. O produto

resultante da reação catalisada pela SOD é o peróxido de

hidrogênio que deve se retirado do meio o mais rápido possível

(Valko et al, 2007).

A CAT é uma enzima presente em células de plantas,

mamíferos e bactérias aeróbicas e é um eficiente catalizador do

peróxido de hidrogênio em água e oxigênio molecular. Está

localizada, principalmente, no peroxissoma, entretanto, outras

organelas como as mitocôndrias podem conter alguma atividade

da CAT. A catálise do peróxido de hidrogênio é importante, pois,

na presença de Fe

, leva à formação de radical hidroxil (reação

de Fenton), altamente reativo e danoso às biomoléculas (Valko et

al, 2007).

A vitamina C (ácido ascórbico) é um importante e

poderoso antioxidante que atua em ambientes hidrofílicos do

corpo. Seus parceiros antioxidantes preliminares são a vitamina E

e os carotenóides, que trabalham juntos tão bem quanto as

enzimas antioxidantes. A vitamina C coopera o com a vitamina E

para regenerar o α-tocoferol dos radicais α-tocoferóis nas

membranas e nas lipoproteínas O ácido ascórbico participa ainda

da regeneração da forma reduzida e antioxidante da vitamina E

(Halliwell e Gutteridge, 1985). O ácido ascórbico puro é sólido,

branco, cristalino e muito solúvel em água. O ácido ascórbico é

necessário in vivo como cofator de várias enzimas, sendo as mais

conhecidas a prolina-hidroxilase e a lisina-hidroxilase, envolvidas

na biossíntese do colágeno. A deficiência do ascorbato na dieta

humana causa o escorbuto. A mais impressionante propriedade

química do ascorbato é a sua habilidade para agir como agente

redutor (doador de elétrons) (Valko et al, 2007).

A vitamina E (α-tocoferol) é o maior antioxidante

lipossolúvel presente em todas as membranas celulares e,

portanto, atua na proteção contra a lipoperoxidação. Oito

tocoferóis são conhecidos, porém o α-tocoferol é o mais

importante biologicamente e os termos α-tocoferol e vitamina E

são quase intercambiáveis na literatura. Como mencionado

anteriormente, o ácido ascórbico é conhecido como o maior

antioxidante hidrofílico, e evidências recentes sugerrem que o α-

tocoferol e o ácido ascórbico funcionam juntos em um processo

cíclico (Valko et al, 2007).

3.5. PROPRIEDADES QUÍMICAS DOS ADSORVENTES

EMPREGADOS NA ADSORÇÃO DA SAXITOXINA

O crescimento excessivo de cianobactérias em

reservatórios de água potável é um problema cada vez mais

comum associado com a eutrofização eexistem diferentes

alternativas de tratamento numa estação de tratamento de água

(ETA) no que concerne à remoção destas cianobactérias e

cianotoxinas (Chow et al, 1999). Quando ocorre a lise das células

de cianobactérias, por causas naturais ou por uso de algicidas, são

liberadas as cianotoxinas, passando a haver essencialmente

toxinas solúveis (Jones e Negri, 1997; Chow et al, 1999). Neste

caso, precisam existir processos de tratamento que consigam

assegurar a sua eficiente e consistente remoção. São necessários

processos que removam compostos orgânicos solúveis, tais como

o uso de ozônio, carvão ativado, nanofiltração ou osmose inversa,

biodegradação, entre muitas outras possibilidades de métodos que

vem sendo testados e otimizados (Chow et al, 1999; Sens et al,

2005; Amorim, 2007). São grandes as evidências do bom

desempenho para a utilização de elevadas dosagens de carvão

ativado em pó, mas este processo se torna lento e caro devido às

grandes quantidades de carvão que precisam ser empregadas

(Keijola et al, 1988; Himberg et al, 1989). Diferentes alternativas

de remoção de cianotoxinas já vêm sendo testadas (Miller et al,

2001; Miller et al, 2005; Burns et al, 2009), porém dada escassez

de informação ainda existente, a utilização de filtros com

materiais alternativos para a remoção de saxitoxina (STX) ainda é

um assunto novo e não muito explorado (Silva, 2005).

Conchas de moluscos bilvalves, em especial as ostras,

consiste preferencialmente de aragonita. A aragonita é uma

modificação mineral do carbonato de cálcio (Kitano et al, 1976).

O carbonato de cálcio (CaCO

) apresenta-se em três modificações

minerais, sendo que a calcita é um dos minerais mais comuns,

sendo o constituinte principal de vastas formações de rochas

sedimentares de calcário. A ocorrência de aragonita está

vinculada a determinadas circunstâncias físico-químicas durante

sua formação. O terceiro polimorfo, a vaterita, é um mineral bem

mais escasso (Blesser e Rodrigues, 2008). A aragonita tem um

arranjo atômico mais compacto do que a calcita, sendo o mineral

formador das conchas, pérolas e corais. Estes carbonatos de

cálcio biogênicos são importantes contribuintes na remoção de

fosfatos de águas, sendo que a aragonita oferece maior superfície

ativa, e maiores sítios adsorventes ativos que a calcita. A

capacidade de adsorção da aragonita é em torno de 20 vezes

maior que a da calcita, baseado no nº de moles de fosfato

adsorvido por grama de partícula (Millero et al, 2001). A Figura

3.8 a seguir apresenta uma fotomicrografia por microscopia

eletronica de varredura (MEV) da aragonita proveniente de

concha de ostras.

Figura 3.8: Fotomicrografia da concha de ostra calcinada (Fonte: Silva,

2007).

A quitina é um polissacarídeo de cadeia linear formado por

unidades de N-acetil-2-dioxi-D-glicopiranose, que são

interligadas por ligações glicosídicas β (1→4) (Kumar, 2000;

Azevedo et al, 2007). A quitina é um material de fontes naturais

renováveis, biodegradável, não-tóxico, insolúvel em água e em

muitos solventes orgânicos (Azevedo et al, 2007; Antonino,

2007). As principais fontes para a obtenção de quitina em

laboratório são os exoesqueletos de vários crustáceos, como

caranguejos e camarões (Kumar, 2000; Antonino, 2007). A

quitina está fortemente associada com proteínas, material

inorgânico, pigmentos e lipídios (Kumar, 2000). Várias condições

são usadas para remover essas impurezas e ainda não existe um

processo padrão. Para isolar a quitina pode-se seguir as etapas de

desproteinização, desmineralização e despigmentação (Azevedo

et al, 2007). O maior problema encontrado na extração da quitina

é seu modo de preparação, pois dificilmente se obtém uma

quitina com as mesmas características da sintetizada

anteriormente, como exemplo, a massa molar e o grau de

acetilação. A Figura 3.9 a seguir traz uma fotomicrografia por

MEV de uma amostra de quitina proveniente de carapaça de

camarão.

Figura 3.9: Fotomicrografia de amostras de quitina proveniente da

carapaça do camarão (1300X) (Fonte: Antonino, 2007).

As carapaças de crustáceos e as conchas de moluscos são

resíduos abundantes e rejeitados pela indústria pesqueira, que em

muitos casos as consideram poluentes. Sua reutilização reduz o

impacto ambiental causado pelo acúmulo nos locais onde é

gerado ou estocado (Goosen, 1996; Azevedo et al, 2007). A

reutilização dessas substâncias é muito relevante do ponto de

vista ambiental e econômico, porque além de eliminar os resíduos

da indústria pesqueira, o custo final de produção é reduzido em

cerca de 60% (Mathur & Narang, 1990). Geralmente estes

materiais são empregados em estudos de adsorção dos mais

diversos metais pesados de soluções aquosas: Cu(ІІ), Zn(ІІ),

Cr(VI), Cd(II), Pb(II) (Kitano et al, 1976; Solodovnik, 2006;

Odoemelam et al, 2009).

CAPÍTULO IV

4. METODOLOGIA

A metodologia empregada para o desenvolvimento do

estudo foi baseada na descrição a seguir. Para todos os ensaios foi

empregado um padrão puro da STX, certificado pelo Institute for

Marine Biosciences (Halifax, NS, Canada).

4.1. INSTALAÇÕES

Para iniciar os trabalhos da pesquisa, foi desenvolvido no

Laboratório de Toxicologia Ambiental – LABTOX a

metodologia de extração, purificação e dosagem da SXT através

da cromatografia líquida (HPLC).

Como parte de um acordo de cooperação internacional,

atividades laboratoriais foram desenvolvidas no Laboratoire de

Toxicologie et Hygiène Appliquèe, Faculté de Pharmacie,

Université Bordeaux 2 – França, sob a orientação do Professor

Edmond Creppy. O laboratório possui sala para cultura de células

com fluxo laminar, estufa de CO

, cromatógrafos líquido e

gasoso e aparelho de absorção atômica. As pesquisas

desenvolvidas no laboratório foram na área de genotoxicidade e

citotoxicidade, como o ensaio do micronúcleo, ensaio do MTT,

dosagem da MDA e dosagem de adutos de DNA.

4.2. ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE E GENOTOXICIDADE

Os testes de genotoxidade foram avaliados in vitro,

avaliando o crescimento celular e utilizando o MDA como

biomarcador. Foram também avaliados a metilação biológica e o

ensaio do micronúcleo em células cultivadas em laboratório.

4.2.1. Cultura Celular

Por estar avaliando uma toxina neurotóxica, foram

escolhidas duas linhagens celulares para os ensaios in vitro: o

neuroblastoma de camundongo Neuro-2A (N2A) e as células

renais de macaco Vero. As células N2A foram obtidas da

Coleção de Cultura Celular Européia catalogo no. 89121404

(Porton Down, UK) e foram cultivadas num meio de cultura

denominado “completo” que consiste em: meio RPMI 1640

complementado com 10% de soro de feto bovino, 2% L-

glutamina (200mM), 1% de penicilina (50 U/mL) e

estreptomicina (50µg/mL) e 1% de piruvato de sódio (100µM) a

37°C e atmosfera com 5% CO

(adaptado de Manger et al, 2003).

As Células Vero foram cultivadas forma cultivadas em meio

RPMI 1640 complementado com 10% de soro de feto bovino, 1%

L-glutamina (1mM), 1% penicilina (50 U/mL) e 1%

estreptomicina (50ug/mL).A cultura foi mantida à 37°C e

atmosfera umidificada com 5% de CO

(Matias & Creppy appud

Terasima & Ysukawa, 1998).

4.2.2. Ensaio do MTT: Determinação da EC50

As células cultivadas foram incubadas em microplacas de

96 poços por 24h com o meio de cultura completo à 37 °C e 5 %

de CO

e após esse período elas foram expostas por um período

de 24h à 37 °C e 5 % de CO

às seguintes concentrações de STX:

0,19, 0,38, 0,75, 1,50, 3,00, 6,00, 12,0 e 24,0 µg/L (0,5, 1,0, 2,0,

4,0, 8,0, 16,0, 32,0 e 64,0 nM). Foram realizada diluições em

cascatas (ver Apêndice A5) com soluções estoque preparadas em

água e soluções mães preparadas com o meio de cultura para

posterior diluição nos poços da microplaca para garantir que o

volume de solução de STX utilizado não ultrapassasse 0,5% do

volume do meio de cultura. As concentrações foram avaliadas em

triplicatas. Um grupo de controle negativo empregando apenas o

meio de cultura e um grupo de controle positivo empregando as

toxinas veratridina (0,05 µM) e ouabaina (0,5 µM) ou

metotrexato (200mM). Após o período de exposição, o meio foi

retirado e foi adicionado 200µL de uma solução de MTT

0,5mg/mL solubilizado no meio RPMI. A microplaca foi

incubada por 2h à 37 °C e 5 % de CO

. Apos incubação, o meio

foi removido cuidadosamente por inversão da microplaca e foi

adicionado 200µL de DMSO. A microplaca foi envolvida em

papel alumínio e colocada numa mesa de agitação por 20

minutos. Após agitação, foi feita a leitura da absorbância em uma

leitora automática de microplacas no comprimento de onda de

560nm. Os valores de absorbância das amostras foram

normalizados e os valores foram expressos em porcentagem de

viabilidade celular através da Equação 1 abaixo. Pela curva

“Viabilidade Celular x Log da concentração” foi determinado a

EC50 (concentração efetiva que mata 50% das células). A partir

da EC50, foram definidas as concentrações para os demais testes.

€

%VC = 100

amostra

− DO

min

( )

max

− DO

min

( )

(Equação 1)

Onde: %VC: viabilidade celular

DO max: absorbância do controle negativo

DO min: absorbância do controle positivo

DO amostra: absorbância da amostra

4.2.3. Fragmentação e Metilação do DNA

A metilação da citosina ocorre quando um grupamento

metila é adicionado no sulco da dupla hélice do DNA celular.

Este estudo foi realizado em quatros etapas e foi baseado nas

descrições a seguir (Kouadio et al, 2007).

1) Extração, purificação e quantificação do DNA: O DNA foi

extraído e purificado através do kit Promega ‘‘Wizard® Genomic

DNA Purification Kit’’ código A112. Após a incubação das

células N2A por 24h em microplacas de 6 poços, foi realizada a

exposição na seguintes concentrações de STX: 0,15, 0,30, 0,60 e

1,20 µg/L (0,38, 0,75, 1,50 e 3,00 nM). Foram feitas diluições em

cascatas (ver Apêndice A7) com soluções estoque preparadas em

água e soluções mães preparadas com o meio de cultura para

posterior diluição nos poços da microplaca para garantir que o

volume de solução de STX utilizado não ultrapassasse 0,5% do

volume do meio de cultura. Um grupo de controle negativo foi

empregado utilizando apenas com o meio de cultura, e um grupo

de controle positivo foi empregado utilizando as toxinas

ocratoxina (OTA - 10µM) ou fumonisina B1 (FB1 - 15 µM).

Foram avaliadas sempre triplicatas de cada caso (STX e controles

positivos e negativos). As microplacas foram incubadas por 24h à

37 °C e 5 % de CO

. Após exposição, o meio de cultura contendo

a STX foi retirado cuidadosamente e as células foram colocadas

em suspensão em 1 mL de PSB com auxilio de uma micropipeta.

A suspensão celular foi transferida para microtubos e

centrifugada por 30 segundos à 16000g. O sobrenadante foi

descartado e o DNA do precipitado foi extraído conforme

descrição do protocolo do kit, com uma modificação na etapa de

precipitação da proteína que consistiu em adicionar 800µL de

clorofórmio para facilitar a separação das fases. O DNA foi

diluído em água ultra-pura 1/200, e quantificado por

espectrometria de ultravioleta. As absorções dos ácidos nucléicos

foram medidas nos comprimentos de onde de 260 e 280nm. A

razão A260/A280 precisa estar entre 1,8 e 2,0 para se garantir que

o DNA está com alto grau de pureza. Após a dosagem do DNA

de cada amostra, um volume contendo 10µg de DNA foi

destinado para a quantificação da 5-metilcitosina.

2) Separação dos Fragmentos de DNA por Eletroforese: Para

eletroforese foram utilizados 10µg de DNA extraídos das células

tratadas com as diferentes concentrações de STX, como citado

anteriormente. A avaliação qualitativa da fragmentação do DNA

foi realizada por eletroforese em 1,5% de gel de agarose e

visualizada pela coloração com brometo de etídio. A eletroforese

foi realizada em uma cuba de eletroforese horizontal (H4 - Life

Technologies - Gibco BRL). A placa de acrílico contendo o gel

foi colocada na cuba e coberta com 1L de tampão TBE (1M Tris-

HCL pH 8,0, 0,1mM EDTA e 0,1M ácido bórico). Depois da

aplicação das amostras, a cuba foi conectada a uma fonte (250

EX – Life Technologies - Gibco BRL), e ajustada para 60 volts

por 180 minutos. O material foi revelado em um transiluminador

de luz UV (TFX 35M - Vilber Lourmat) e fotografado com filme

polaroide (Sigma, França).

3) Liofilização e hidrólise enzimática do DNA: Esta fase teve por

objetivo hidrolisar as proteínas e separar o DNA do RNA. 10 µg

do DNA foram liofilizados num microtubo de centrífuga durante

uma noite com o auxílio de um liofilizador-centrifugador RC 10-

10 (Jouan, France) sob temperatura variável adaptado em série a

uma bomba à vácuo (Edwards) e a um evaporador por

resfriamento (RCT 60). O DNA foi reidratado em 10µL de água

Milli-Q degaseificada. As amostras foram colocadas em um

banho-maria de 100ºC por 1 minuto e em seguidas colocadas em

banho de gelo por 15 min para facilitar a etapa de hidrólise. A

seguir foi acrescentado a cada amostra 1µL de tampão acetato de

potássio 250mM (pH 5.4), 1µL de sulfato de zinco 10mM e 10µL

de Nuclease P1 (0,5U/µL). Em seguida as amostras foram

incubadas por uma noite à 37

C. No dia seguinte, uma segunda

hidrólise enzimática foi realizada com a adição de 2µL de tampão

Tris-HCl 0,5M (pH 8,3) e 2 µL de fosfatase alcalina (0,31U/µL).

O tubo foi incubado por duas horas a 37

C. Apos incubação, foi

adicionado 25 µL de clorofórmio para inativar as enzimas

utilizadas na hidrólise. Os tubos foram centrifugados a 13000g

por 10 minutos. A fase aquosa foi analisada por HPLC.

4) Quantificação da m

dC por HPLC: A quantificação da 5-

metilcitosina foi efetuada por HPLC equipado com coluna C18-

fenil-nucleosil. O solvente utilizado foi uma mistura

(NH

6,5 mM à pH 3,95 com metanol 4% em condições

isocráticas. O volume de injeção foi de 20 µL. O detector de

ultravioleta foi utilizado no comprimento de onda de 254nm (ver

Apêndice A2).

4.2.4. Lipoperoxidação: Extração e Quantificação do MDA

As células N2A foram incubadas com meio de cultura

completo em microplacas de 24 poços por 24h à 37ºC e 5% de

. Após esse período o meio de cultura completo foi removido

e foi adicionado o meio de cultura, e em paralelo o meio de

cultura com diferentes substâncias protetoras separadamente:

vitamina C (16µg/mL), vitamina E (6µg/mL) e enzimas SOD e

CAT (25µg/mL cada uma). As células foram incubadas por mais

1he 37ºC e 5% de CO

. A seguir, a exposição à STX foi realizada

na seguintes concentrações: 0,15, 0,30, 0,60 e 1,20 µg/L (0,38,

0,75, 1,50 e 3,00 nM). Foram feitas diluições em cascatas (ver

Apêndice A6) com soluções estoque preparadas em água e

soluções mães preparadas com o meio de cultura para posterior

diluição nos poços da microplaca para garantir que o volume de

solução de STX utilizado não ultrapassasse 0,5% do volume do

meio de cultura. Um grupo de controle negativo foi empregado

utilizando apenas com o meio de cultura, e um grupo de controle

positivo foi empregado utilizando as toxinas ocratoxina (OTA -

10µM) ou fumonisina B1 (FB1 - 15 µM). Foram avaliadas

sempre triplicatas de cada caso (STX e controles positivos e

negativos). Após incubação de 24h, as células foram recuperadas

no meio para a dosagem do MDA. A suspensão celular foi

centrifugada durante 5 minutos a 800g e 4°C. O meio

sobrenadante foi eliminado, e as células foram ressuspensas em

250µl de tampão SET e agitado vigorosamente em um Vortex.

Uma alíquota de 25µL homogeneizado celular foram retiradas e

congeladas de todas as amostras para posterior dosagem de

proteínas pelo método de Bradford (ver Apêndice A4). As

suspensões celulares e as diluições dos padrões foram tratadas

com 25µl de SDS 7%, 300µl de HCl 0,1N, 40µl de ácido

fosfotunguístico 1% e 300µl de ácido 2-tiobarbitúrico (TBA)

0,67%. Após agitação vigorosa no Vortex, os tubos foram

mantidos no escuro, a 90°C, durante 1 hora, depois resfriados

com gelo durante 10 minutos. O complexo TBA-MDA formado

foi extraído por 600µL de n-butanol. Após centrifugação por 10

minutos a 5000g, a fase butanólica que contém o complexo

MDA-TBA foi retirada e a quantificação do MDA foi realizada

por HPLC-fluorescência. Foi empregada uma pré-coluna

Lichosorb 738, C18 de 10µm de porosidade (10 x 4,6mm) e uma

coluna Bischoff Prontosil Eurobond, C18 de 5µm de porosidade

(250 x 4,6mm) com injeção automática de 90µL. A fase móvel

isocrárica utilizada foi uma mistura metanol:água 4:6 (v/v), pH

8,4 ajustado com KOH 0,5M, à um fluxo de 0,5mL/min. O

detector de fluorescência empregado foi o ICS-8450 com

comprimento de onda de excitação de 515nm e com comprimento

de onda de emissão de 553nm (ver Apêndice A3).

4.2.5. Teste do Micronúcleo: Bloqueio Citocinético (CBMN)

Este teste foi baseado em Ouanes et al(2003), com

algumas modificações. As células N2A e Vero foram incubadas

com meio de cultura completo em microplacas de 24 poços por

24h à 37ºC e 5% de CO

. Apos este período, o meio de cultura

completo foi retirado e a exposição à STX foi realizada nas

seguintes concentrações: 0,15, 0,30, 0,60 e 1,20 µg/L (0,38, 0,75,

1,50 e 3,00 nM). Foram feitas diluições em cascatas (ver

Apêndice A6) com soluções estoque preparadas em água e

soluções mães preparadas com o meio de cultura para posterior

diluição nos poços da microplaca para garantir que o volume de

solução de STX utilizado não ultrapassasse 0,5% do volume do

meio de cultura. Após 6h de incubação à 37ºC e 5% de CO

foi

adicionado a Citocalasina B (5µg/L) aos poços com as células

intoxicadas. As células foram incubadas por mais 18h, à 37ºC e

5% de CO

. O meio com a STX foi removido e as células foram

recuperadas com PBS e centrifugadas à 500g por 5 min. O

sobrenadante foi descartado e as células foram tratadas com

250µL de KCl 0,075M, foram recolocadas em suspensão com a

ajuda de uma micropipeta e apos 10 minutos foram centrifugadas

à 500g por 5 min. O sobrenadante foi descartado e as células

foram fixadas com 250µL da solução metanol:ácido acético 3:1

(v:v). Após 20 minutos, as células fixadas foram espalhadas

delicadamente sobre uma lâmina e deixada secar por 30 min. A

coloração foi feita com 50µL de uma solução brometo de

etídio/acridine orange sobre as células e uma lamínula foi

colocada sobre a lâmina. A contagem das 1000 células

binucleadas para cada amostra foi realizada em microscópio

fluorescente com aumento de 400X, onde foram anotados os

números de micronúcleos encontrados.

4.3. ENSAIOS DE ADSORÇÃO

4.3.1. Materiais Adsorventes

A quitina foi produzida a partir de carapaças de camarão

e foi fornecida pelo Grupo de Pesquisa em Quitinas e Aplicações

Tecnológicas (QUITECH) da Universidade Federal de Santa

Catarina - Brasil, sob a coordenação do Prof. Dr. Mauro César

Marghetti Laranjeira. A quitina bruta foi previamente triturada e

passada em peneiras de 18Mesh para apresentar partículas de

tamanho ≤1,0mm. O pó de ostra foi produzido a partir de cascas

de ostras calcinadas e trituradas. O pó de concha de ostra

empregado é comercializado em lojas de produtos naturais, e já

apresentava partículas de tamanho ≤1,0mm, não necessitando de

preparação prévia. Os materiais adsorventes foram previamente

seco em estufa a 105°C por 24 horas, foram colocados em tubos

de centrífuga tipo “Falcon” nas respectivas massas avaliadas, e

foram esterilizados em autoclave por 15 minutos à 121ºC para

eliminar a interferência por degradação microbiológica.

4.3.2. Cinéticas e Isotermas de Adsorção

O método usado para avaliar o processo de adsorção foi

adaptados de Miller et al. (2001) e Ohe (1996). Para avaliar o

processo de adsorção foram realizados ensaios de cinéticas e

isotermas de adsorção para ambos os adsorventes em diferentes

pH.

Para as cinéticas de adsorção, soluções de STX 10µg/L,

em pH 5,0 e 7,0, foram expostas à 200±5mg do adsorvente à

25ºC, em tréplicas, onde foram analisadas a concentração de STX

residual nos tempos de mistura de 0, 12, 18, 24, 36, 48 e 72h. Os

frascos foram colocados em um agitador orbital tipo “Shaker” a

200rpm e foram amostrados de 0,5mL nos respectivos intervalos

de tempo.

Para as isotermas de adsorção, foram adicionados 10 mL

de solução contendo STX 2-16µg/L, nos pH 5,0 e 7,0, aos tubos

contendo 200±5mg de adsorvente. Os frascos foram colocados

em um agitador orbital tipo “Shaker” a 200rpm e foram

amostrados de 0,5mL nos respectivos intervalos de tempo.

As frações amostrais foram filtradas em membrana de

0,2µm e coletadas num tubo de microcentrifuga. Na seqüência, as

frações foram analisadas em HPLC, para a quantificação da STX.

Um grupo controle foi avaliado na mesma temperatura e tempos

de mistura das amostras sem os adsorventes contendo apenas

10mL das soluções de STX nos pH 5,0 e 7,0 em um tubo estéril,

para avaliar a presença do efeito de degradação da toxina por vias

químicas, enzimática ou microbiológicas.

4.3.3. Dosagem da Saxitoxina

O método analítico para a quantificação da saxitoxina foi

adaptado da metodologia recomendada pela AOAC (2005). O

método de quantificação recomenda a utilização de HPLC com

derivatização pré-coluna e detector de fluorescência. Os

equipamentos utilizados para as análises foram o cromatógrafo

líquido HP1050 com bomba quaternária de eluente e o detector

de fluorescência HP1046A, disponíveis no Laboratório Integrado

do Meio Ambiente – LIMA deste departamento. As condições

para a análise estão descritas na Tabela 4.1 a seguir.

Tabela 4.1: Condições para determinação de STX em HPLC com

detector de Fluorescência. (AOAC, 2005).

Separação no HPLC

Coluna

Supelcosil® C18 (Supelco), 250 mm x 4,6 mm d.i.,

5µm

Eluente A

Acetonitrila

Eluente B

Sol. tamponada de formiato de amônio 0,1N (pH 6)

Fluxo

1,0 mL/ min.

Etapa

Tempo (min)

Eluente A

(%)

Eluente B

(%)

0,0

100

5,0

0,5

99,5

8,0

10,0

Gradiente

12,0

100

Detecção

Fluorescência:

λ Exitação: 330nm

λ Emissão: 390nm

O método de derivatização pré-coluna por peroxidação

da amostra foi preparado com o auxílio de micropipetas

automáticas adicionando de 25 mL de solução aquosa de

peróxido de hidrogênio 10%(v:v) a 250mL de NaOH 1M em

tubos plásticos para microcentrífugas (“Eppendorf”). Esta mistura

foi agitada vigorosamente e após foi adicionado 100mL da

amostra ou padrão de STX que foi derivatizado. O tubo foi

agitado vigorosamente por 2 minutos a temperatura ambiente.

Após a reação, um volume de 20mL de ácido acético glacial

concentrado foi adicionado e agitado vigorosamente a solução

reagente. Uma alíquota de 50ml desta reação foi injetada

diretamente ao HPLC (curva de calibração - Apêndice A1).

CAPÍTULO V

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. RESULTADOS DO ARTIGO 1: ENSAIO DO MTT,

FRAGMENTAÇÃO E METILAÇÃO DO DNA

Os resultados apresentados neste subitem fazem parte do

primeiro artigo elaborado neste estudo e apresentou a toxicidade

da STX sobre as células através dos ensaios do MTT e ensaios de

fragmentação e metilação do DNA. O artigo entitulou-se

“SAXITOXIN INDUCES GENOTOXICITY AND APOPTOSIS

IN NEURO-2A CELLS” e foi submetido à revista científica

“Archives of Toxicology”. O artigo original é apresentado no

Apêndice A8.

5.1.1 Influência de STX na Viabilidade Celular: Ensaio de

MTT e Determinação de EC50

Para a determinação da EC50, uma escala de oito

concentrações de STX (na condição “sem O/V” 0,5, 1,0, 2,0, 4,0,

8,0, 16,0, 32,0 e 64,0 nM e na condição “com O/V” 2,53, 5,07,

10,15, 20,3, 40,6, 81,25, 162,25 e 325 nM) foram aplicadas em

cinco diferentes experimentos, na preença e na ausência de O/V.

Apos exposição das células N2A à STX e analise dos dados, a a

curva de viabilidade pela concentração de STx foi plotada para

ambos os casos (com e sem O/V). Os resultados são apresentados

na Figura 5.1.

Figura 5.1: Perfil dose-resposta da STX em células N2A na presença e

ausência de O/V. Viabilidade celular (%)±DP v. Concentração de STX

em nM. Condição “Sem O/V”: R2=0,997; condição “Com O/V”:: R2=

0,9904.

Uma diferença significativa foi obtida entre as curvas da

condição “sem O/V” e condição “com O/V”. Na condição “com

O/V”, uma baixa viabilidade celular foi observada, e um aumento

dose-dependente da viabilidade foi verificado, e estes resultados

foram confirmados pelos controles negativos e positivos. Na

curva normalizada, com o aumento da concentração de STX, a

condição “sem O/V” apresentou uma redução dose-dependente

dos valores de viabilidade celular, com desvios padrões

significativos. Entretanto os valores destes desvios padrões

obtidos eram consistentes com alguns valores previamente

relatados, levando-se em consideração a precisão total do bio-

ensaio in vitro sob células de aproximadamente 20-30%.

(Humepage et al. 2007). Os resultados do teste de MTT

demonstram que exposição de células de N2A às diferentes

concentrações de STX conduz a uma redução dose-dependente da

atividade metabólica da mitocôndria, extrapolado neste ensaio

pela viabilidade celular, e um comportamento oposto é verificado

na presença de compostos antagônicos à STX.

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As EC50 da STX foram calculadas, sendo que na condição

“sem O/V” foi obtido um valor de 1,1nM (R

= 0,997) e na

condição “com O/V” foi obtido um valor de 18,2nM (R

0,9904). Estes valores de EC50 da STX, para ambas as

circunstâncias em células N2A, são particularmente baixos e

pode-se concluir que esta linhagem celular de origem neural é

muito sensível a STX, e pode-se considerar como um bom

bioindicador para estudar os mecanismos da ação em baixas

concentrações de STX. Assim, de acordo com a EC50

encontrada, os demais ensaios foram adaptados com

concentrações apropriadas para 0,8, 1,5 e 3,0 nM de STX.

5.1.2. Efeitos de STX na fragmentação do DNA em células

N2A

A eletroforese em gel do agarose foi executada para

analisar fragmentos do DNA da exposição das células de N2A à

STX (Figura 5.2). Nas condições de fragmentação descritas

anteriormente, uma fragmentação fraca foi observada no controle

negativo. Assim, foi realizado uma amostra do controle negativo

na condição sem o antibiótico (Figura 2/7). Nestas circunstâncias,

o controle negativo não apresentou nenhuma fragmentação

significativa, confirmando que essa fraca fragmentação provem

da presença do antibiótico. Os fragmentos do DNA podem ser

visualizados somente nas células tratadas com o STX e com o

controle positivo OTA.

Figure 5.2: Fragmentação do DNA de células N2A extraído após

exposição à STX. O DNA foi isolado de células N2A expostas e a

eletroforese foi realizada em gel de agarose 1,5% nas seguintes

concentrações: 1: Ladder 1000 kpb, 2: OTA (ocratoxina)10µM, 3:

3,0nM, 4: 1,5nM; 5: 0,8nM 6: Controle negativo com antibiótico e 7:

Controle negativo sem antibiótico.

Foi observado um aumento na fragmentação do DNA nas

amostras tratadas com o STX, como evidenciadas pelo

fragmentos do DNA, quando comparados com o “Ladder”. Estes

resultado é um indicativo a ocorrência do apoptose. Uma

significativa parte dos fragmentos do DNA são de tamanhos entre

500 e 2000bp, evidenciando a possibilidade de morte celular por

apoptose. Há evidências relatadas na literatura que sugerem que

as poliaminas atuam no caminho da morte celular por apoptose

(Packham and Cleveland 1994; Frostesjo et al. 1997). Estes

resultados confirmaram que a STX, considerado um composto

cíclico da guanidina, induz igualmente a morte celular apoptose.

Para avaliar de uma forma mais quantitativa os resultados

observados anteriormente, a imagem do gel foi submetida à uma

análise de imagens pelo programa ImageJ, que possui uma função

específica para análise de géis de eletroforese. Assim, pela

normalização dos densitogramas de luminosidade das linhas de

corrida das amostras, foi possível gerar um histograma com a %

de DNA fragmentado para cada condição avaliada e este

resultado é apresentado na Figura 5.3.

Figura 5.3: % de DNA fragmentado para células expostas à STX,

obtido pela análise da imagem do gel.

Esse resultado evidencia de forma mais visível o efeito

tóxico da STX sobre células N2A. Para as três concentrações de

STX empregadas nos testes, foi possível verificar um aumento

acima de 50% quando comparado ao controle com antibiótico,

resultado que não é possível observar apenas pela análise visual

da imagem do gel.

5.1.3. Efeitos de STX na metilação do DNA em células N2A

A metilação da deoxicitosina foi avaliada pela

quantificação da 5-metilcitosina (m5dC) de DNA purificado das

células N2A expostas à STX. Esse efeito foi avaliado pelo

método de HPLC-UV. Após 24h da incubação, as células N2A na

100

150

OTA 15!M

1,5

0,75

Cntl com Antib.

Cntl sem Antib.

% DNA fragmentado

STX (nM)

cultura produziram espontaneamente 0,59±0,02% de m5dC. Este

valor foi considerado o valor controle sem STX. A OTA (15

µM), empregada como o controle positivo, aumentou o nível de

m5dC para 3,00±0,69%. A concentração a mais elevada de STX

(3,0 nM) aumentou os porcentagem de m5dC para 4,43± 1,41%

(Figura 5.4). Este resultado evidencia que a STX pode induzir

células N2A à hipermetilação, resultado similar ao controle

positivo, sugerindo que o STX seja um indutor potencial neste

efeito específico. As bases modificadas do DNA podem

representar uma fração menor do genoma, mas ainda exibem

fortes efeitos biológicos (Rein et al. 1998). Por exemplo, somente

3-10% das citosinas em genomas mamíferos são modificadas à

m5dC, mas estas geralmente reprimem a transcrição quando

aglomerados no 5' - extremidades dos genes (Frostesjo et al.

1997; Ehrlich et al. 1982).

Figura 5.4: % m5dC com relação a quantidade total de citosina

(dC+m5dC) das amostras do DNA extraídas de células N2A expostas

por 24 horas, para os controles negativo e positivo e as diferentes

concentrações de STX empregadas.!

5.2. DISCUSSÃO DO ARTIGO 1

O presente estudo avaliou a resposta citotóxica da STX

sobre células N2A, na tentativa de identificar etapas alvo da

morte celular. Para isso foram avaliados efeitos sobre a

viabilidade celular, a fragmentação do DNA das células expostas

e ainda efeitos de indução à metilação do DNA. Foi empregada

uma escala de concentrações de STX que foram identificadas

como citotóxicas pelo ensaio do MTT.

No ensaio do MTT obteve-se um valor de EC50 de

1,112nM PA ausência de O/V, e 18,2nM na presença de O/V. A

presença do antagonista em culturas celulares diminui o tempo de

ensaios de citotoxicidade para 4 a 7 horas (Manger et al. 2003).

Jellett et al. (1995) e Manger et al. (1993) obtiveram valores de

EC50 de 100nM na presença de O/V em células N2A. Cañete e

Diogène (2008) relataram uma EC50 de 8,6nM para a STX em

células N2A na presença de O/V e tempo de intoxicação de 24h.

Não foi observada uma resposta para a STX com a mesma célula

na ausência de O/V com tratamento similar num intervalo de

0,91–58,41 nM de STX. O Gulf Coast Seafood Laboratory

(GCSL) – Food and Drug Administration (FDA), Alabama

obteve uma EC50 aproximado de 3nM com células N2A

(Comunicação pessoal reportado por Cañete and Diogène, 2008).

Ren e Frymer (2004) sugerem que todas as fontes de

variação em cada estágio dos ensaios citotóxicos acabam se

acumulando ao final do teste e geram muitas variações no

resultado final, e sugere que essas etapas sejam decompostas para

identificação das variações específicas em cada uma das etapas.

Ledreux (2006) sugere que essas variações nos ensaios

citotóxicos são essencialmente causadas por parâmetros de

natureza biológica (estado fisiológico das células, numero de

células por poços) e natureza química (variação da concentração

dos químicos empregados, instabilidade das toxinas).Ainda pode

assumir que a sensibilidade das células às toxinas aumenta com o

número de repicações da cultura empregada nos testes (Alvito et

al. 2000).

As discrepâncias entre os nossos resultados e os resultados

de Cañete e Diogenè (2008) podem ser explicadas pelas

diferenças na cultura e no tratamento das células N2A, e na

preparação dos ensaios citotóxicos. Cañete and Diogène (2008)

empregaram na cultura de células meio RPMI com 1% de L-

glutamina (200mM) e 0,5% solução de antibióticos (10mg/mL

estreptomicina and 1000U/ mL de penicilina), solução de tripsina

(0.5g/L) para descolar as células dos frascos de cultura e a

densidade de células foi de 35.000cels/poço nos ensaios

citotóxicos com as células N2A (não foi informado o número de

passagem da cultura celular empregada nos testes). No presente

estudo foi empregado meio de cultura celular suplementado com

2% L-glutamina (200mM) e 1% solução de antibióticos

(10mg/mL estreptomicina and 1000U/ mL de penicilina). No

presente estudo empregamos raspadores para recuperação das

células dos frascos de cultura e a densidade de células foi de

aproximadamente 20.000 cels/poço nos nossos ensaios das

células N2A com passagens entre 14-25 vezes.

Nossos resultados dos ensaios citotóxicos sugerem que o

dano mitocondrial pode estar indiretamente envolvido no

mecanismo tóxico da STX. Este caminho intrínseco pode

possivelmente provocar apoptose como um os eventos finais.

Para uma revisão veja Law e Elmore (2008). Curiosamente,

nossos dados mostram, primeiramente, uma redução da atividade

mitocondrial nos ensaios citotóxicos e no segundo ensaio, os

fragmentos do DNA indicam a participação provável do apoptose

como o caminho principal que conduz à morte das células N2A.

Não foram encontrados relatos na literatura de que a STX

induz à fragmentação do DNA. Nossos dados sugerem que a STX

induz as células N2A à efeitos genotóxicos indiretos, porque

fragmentos do DNA de 500 à 2000 bp foram observados em

todas as concentrações de STX incluído valores abaixo da EC50

(0,8nM). Os dados de metilação induzidos pela STX indicam que

baixas concentrações de STX induzem a um aumento dos níveis

de m5dC. Estudos com ácido ocadáico (OA), uma toxina marinha

conhecida como promotor de tumores, mostrou que ela induz à

hipermetilação em diversas linhagens celulares (Matias and

Creppy, 1998). Este estudo, em uma mesma linha de pesquisa,

avaliou a STX como um possível promotor do tumor.

Os canais de sódio voltagem-dependentes (VGSCs)

demonstram serem fortemente associados com potencial

metástase, como evidenciado pelos seus altos níveis de expressão

em diversos carcinomas agressivos e no controle de vários

estágios da cascata metastática (Onkal and Djamgoz 2009;

Catterall et al. 2007; Fiske et al. 2006). Entretanto, os

bloqueadores dos canais de sódio voltagem-dependentes, no caso

das neurotoxinas, quando usados em concentrações apropriadas,

podem ser medicinalmente úteis em uma variedade de desordens,

incluindo o câncer (Prevarskaya et al. 2007; Onkal and Djamgoz

2009). Um exemplo é tetrodotoxina (TTX) que demonstrou

reduzir diretamente as células menos invasivas (Anderson et al.

2003) e sugerem assim os VGSCs como um alvo viável para a

pesquisa anti-câncer. No presente estudo, a STX inibiu o

crescimento de células de neuroblastomas N2A, indicando uma

interação no mesmo caminho da TTX. Entretanto, estudos têm

demonstrado que estas toxinas (ambas são bloqueadoras do

VGSCs) ligam diferentemente de formas específicas no domínio

I, localização Fen/Cis/Tir (Kirsch et al, 1994). Há distinções entre

a resposta destas duas toxinas para a mutação do sitio da tirosina

401, sugerindo que TTX apresenta uma leve interação, que pode

ter uma interação íntima não ligada com membrana de célula,

protegendo este sitio de modificações químicas levando, e a STX

interage fortemente com os resíduos extracelulares (Penzotti et al.

1998).

A metilação da citosina tem conseqüências mutacionais e

epigenéticas em genomas de mamíferos (Szyf et al. 2003; Baylin

et al. 2001; Gonzalgo and Jones 1997) e citosinas metiladas

devem predispor alguns genes à freqüências mais altas de

transições de desaminações induzidas (Gonzalgo and Jones

1997). A desaminação espontânea da m

dC→T é um dos

caminhos mais importantes indicando que a metilação pode

causar mutagênese. Os efeitos epigenéticos da m

dC pode ser

importante na tumorigênese podendo envolver a inativação dos

proto-oncogenes, mas igualmente a inactivação de genes de

supressor do tumor (Gonzalgo and Jones 1997).

Os efeitos epigenéticos da metilação do DNA e o seu

relacionamento com silêncio transcricional dos genes envolvidos

no sistema de regulação do crescimento celular são considerados

muito importantes na definição dos processos-chave envolvidos

da tumorigênese (Gonzalgo and Jones, 1997). Recentemente,

doenças humanas (outras além do câncer) tem sido identificadas e

são associadas com propriedades epigenéticas e perturbações

destes genes reguladores e a metilação de alguns genes-

chave(Newell-Price et al. 2000). Por exemplo, sabe-se que na

maioria dos tumores extraídos em tratamentos cirúrgicos de

câncer, a taxa de metilação do DNA está modificada e diversas

desregulações do gene envolvido na regulação do ciclo celular

são modificadas em paralelo à ativação dos oncogênes e/ou

inativação de genes supressores de câncer (Gonzalgo and Jones

1997; Newell-Price et al. 2000; Bird 2002; Herman and Baylin

2003; Feinberg and Tycko 2004; Selaru et al. 2009).

A partir dos resultados obtidos neste estudo pode-se propor

uma conexão entre três processos avaliados para a genotoxicidade

induzida da STX: as células expostas às baixas concentrações de

STX conduzem aos danos mitocondriais indiretos e do DNA,

como demonstrado pelo ensaio citotóxicos e pela fragmentação

do DNA respectivamente, evidenciando o caminho apoptótico da

morte celular, e nas mesmas concentrações de STX mostrou altos

níveis de m5dC, e o processo de hipermetilação das bases do

DNA conduz possivelmente à um efeito inibidor de genes de

supressor do tumor.

Em conclusão, os presentes dados confirmam que a

linhagem celular do neuroblastoma de N2A é apropriada para a

avaliação da toxicidade de STX e indicam que os mecanismos

principais que causam efeitos tóxicos indiretos da STX envolvem

as lesões mitocôndrial e do DNA, e modificação do DNA por

hipermetilação (considerado como um efeito epigenético) que

conduz possivelmente à morte celular por um processo apoptótico

ou conduzindo à processo de mutagênese e/ou tumorigênese,

sugerindo que os sistemas de indivíduos expostos à STX durante

eventos de floração de algas tóxicas podem estar expostos a estes

efeitos.

5.3. RESULTADOS DO ARTIGO 2: LIPOPEROXIDAÇÃO E EFEITO

PROTETOR DE VITAMINAS E ENZIMAS

Os resultados apresentados neste subitem fazem parte do

segundo artigo elaborado neste estudo e apresentou a toxicidade

da STX sobre as células através do ensaio de lipoperoxidação. O

artigo entitulou-se “LIPID PEROXIDATION INDUCTION BY

SAXITOXIN IN NEURO-2A CELLS: THE PROTECTIVE

EFFECT OF VITAMINS C AND E, SUPEROXIDE

DISMUTASE AND CATALASE” e foi submetido à revista

científica “Archives of Toxicology”. O artigo original é

apresentado no Apêndice A9.

5.3.1. Lipoperoxidação: efeito do estresse oxidativo

Após 24h de incubação, as células N2A produziram

espontaneamente 83,79±5,94 nM de MDA/mg de proteína. Esse

valor foi considerado como valor controle para células N2A não

tratadas com STX. Após 24 h de exposição apenas ao

antioxidante VitE, as células N2A produziram espontaneamente

59,09±1,57 nM de MDA/mg de proteína, apenas ao antioxidante

VitC8 e VitC16, as células N2A produziram espontaneamente

89,80±9,42 e 107,31±17,29 nM de MDA/mg de proteína

respectivamente e apenas ao antioxidante SOD/CAT, as células

N2A produziram espontaneamente 102,47±10,88 nM de

MDA/mg de proteína. Esses valores foram considerados valores

controles para células N2A não tratadas com STX. Após 24h de

exposição, aumentando as concentrações de STX (0,4 à 3,0nM), a

produção de MDA das células N2A foi significativamente

aumentada (Figura 5.5).

Figura 5.5: Lipoperoxidação induzida pelo aumento da concentração de

STX em células N2A avaliando o efeito da ausência e presença de

diferentes antioxidantes, com dosagem da quantidade de MDA

produzido, após 24 horas de incubação (*diferença significativa com

relação à células não tratadas com STX para p<0.05, e ** com relação

ao controle positivo para p<0.05).

A produção de MDA foi aumentada de 15 à 113% para

0,4 à 3,0 nM de STX, respectivamente, quando comparada com

os relativos controles de células não tratadas com STX (Tabela

1). Quando as células N2A foram tratadas com VitC8, essa taxa

foi aumentada de 66 à 209%, e quando tratadas com VitC16 as

taxas foram aumentadas de 36 à 181% para as mesmas

concentrações de STX (Tabela 1).

Tabela 5.1: Lipoperoxidação medida pela % do aumento na produção

do MDA com relação ao controle.

% aumento MDA

Vit. C

STX (nM)

Sem

Antioxidante

Vit. E

6µg/mL

8µg/mL

16µg/mL

SOD+CAT

25µg/mL

cada

0,4

0,8

109

143

1,5

163

154

3,0

113

120

181

209

160

Controle

Positivo

120

358

298

374

129

1. OTA: 15µM; 2. MTX 20µM.

Quando as células foram tratadas com VitE e das

enzimas SOD/CAT, as taxas de produção do MDA foram

significativamente diminuídas para as menores concentrações de

STX, quando comparado com a condição sem antioxidantes. Para

VitE, as taxas de produção do MDA foram de 3 à 120%, e para

SOD/CAT foram de 3 à 160%, ambas correspondendo de 0,4, à

3,0 nM de STX.

5.4. DISCUSSÃO DO ARTIGO 2:

Neste estudo investigamos os efeitos citotóxicos

individuais da STX na linhagem celular de neuroblastoma de

camundongo Neuro-2A, empregando o teste do MTT. Foram

investigados também os efeitos de lipoperoxidação destas células,

expostas à diferentes concentração de STX, na ausência e

presença de antioxidantes enzimáticos e não-enzimaticos, pela

dosagem do MDA.

Em estudo prévio (Melegari, et al., 2010) foram

investigados os efeitos citotóxicos e genotóxicos da STX sobre

células N2A. Nesse estudo foi evidenciado que a STX induz à

efeitos genotóxicos indiretos as células N2A quando expostas nas

mesmas concentrações trabalhadas neste artigo. Os resultados do

teste no MTT demonstram que a exposição das células N2A em

diferentes concentrações de STX acarreta à uma redução dose-

dependente dos valores de viabilidade celular, e conseqüente

redução da atividade metabólica mitocondrial. Estes resultados

apontam claramente a mitocôndria como um alvo de STX. Esta

evidencia é um indicativo de que a STX afeta a integridade da

organela e, portanto, a integridade da respiração celular. As

células do sistema nervoso possuem uma quantidade elevada de

mitocôndrias devido à grande necessidade de energia (Cooper

and Hausman, 2007). Nossos resultados mostram que este

mecanismo é afetado, podendo ser um dos motivos do efeito

neurotóxico da STX. A EC50 da STX determinada para células

N2A foi um valor baixo, podendo concluir que essa linhagem

celular de origem neuronal é sensível para a neurotoxina em

estudo. Esta evidência qualifica esta célula N2A como adequada

e representativa para o estudo dos mecanismos de ação com

baixas concentrações de STX.

Ainda não foi reportado na literatura estudos do efeito da

linhagem celular N2A expostas à STX e correlação com a

indução à lipoperoxidação, na ausência e presença de

antioxidantes, mas é conhecido que o cérebro e o sistema nervoso

são propensos à estresse oxidativo por não possuírem um sistema

de defesa antioxidante adequado (Halliwell, 2006).

Os níveis de MDA, que aumentam em conseqüência do

LPO pelo estresse oxidativo, foram significativamente mais

elevados em células N2A expostas à STX do que nos controles

sem exposição. Todos os resultados expostos evidenciam que

após 24h de incubação, a STX induz à LPO das células N2A. As

espécies OR provenientes da LPO podem ser produzidas por

substâncias endógenas e exógenas (Møller & Wallin, 1997). Para

este caso, a STX funcionou como uma fonte exógena de estresse

oxidativo, e as espécies OR foram as prováveis responsáveis pela

LPO. Quando produzidas dentro das células, as espécias OR são

capazes de reagir com virtualmente todos os tipos de

biomoléculas (Møller & Wallin, 1997), e as fontes endógenas

potenciais incluem a mitocôndria, o metabolismo do citocromo

P450, os peroxissomas, e a ativação celular inflamatória (Inoue et

al, 2003). Neurotoxinas geralmente conduzem à formação de OR

em classes clinicas do sistema nervoso (Halliwell, 1987).

Avaliando a seqüência dos eventos, é possível propor uma

correlação dos dois processos avaliados para a citotoxicidade

induzida pela STX: as células N2A expostas à baixas

concentrações de STX foram induzidas à lesões mitocondriais e à

peroxidação da membrana lipídica. Seguindo o mecanismo de

neurodegeneração proposto por Halliweel (1999), podemos

sugerir dois mecanismos tóxicos causados pela STX às células

N2A: um primeiro mecanismo começa pelo estresse oxidativo da

exposição à uma espécie reativa (STX), induzindo ao processo de

LPO e formação de MDA. As conseqüências do mecanismo

tóxico da LPO são as modificações das bases, a inibição da

síntese protéica, a denaturação do DNA e a formação de adutos

do DNA, a qual pode induzir à processos genotóxicos,

mutagênicos e ainda carcinogênicos (Baudrimont et al. 1997;

Matias et al., 1999; Halliwell, 2007). Assim, a presença do MDA

citotóxico induz à uma sobrecarga de proteínas anormais,

conduzindo à uma disfunção do proteassoma. Elevados níveis de

dano oxidativo podem resultar não apenas no estresse oxidativo,

mas também em uma falha no sistema de reparo celular

(Halliwell, 2007). Essa disfunção causa uma desregulação do

sistema protetor celular conduzindo à morte celular. No segundo

mecanismo, a espécie reativa (STX) ataca diretamente a

mitocôndria, causando danos mitocondriais irreversíveis e

conduzindo a morte celular (Halliwell, 2007).

Dentre os antioxidantes empregados, a SOD cataliza a

dismutação do ânion superóxido; está presente na matriz

mitocondrial (Mn-SOD), no citosol (CuZn-SOD) e no meio

extracelular. O produto resultante da reação catalisada pela SOD

é o peróxido de hidrogênio que é retirado do meio pela CAT, que

transforma o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio

molecular (Fridovich, 1995; Valko et al., 2006) e é uma enzima

de extrema importância para a proteção do sistema nervoso e

remoção do peróxido formado; a SOD está presente em todos as

partes do sistema nervoso animal (Fridovich, 1995). A CAT está

localizada principalmente no peroxissoma, entretanto, outras

organelas como as mitocôndrias podem conter alguma atividade

da CAT. A VitE (α-tocoferol) é o maior e mais importante

antioxidante lipossolúvel presente em todas as membranas

celulares e, portanto, atua na proteção contra a LPO (Roy et al.,

2002; Valko et al., 2006). Nossos resultados sugerem que a

administração da VitE em pessoas que foram contaminadas pela

STX, pode equilibrar os efeitos da LPO. A VitC (ácido ascórbico)

é um importante e poderoso antioxidante que atua em ambientes

hidrofílicos do corpo. Seus parceiros antioxidantes preliminares

são a VitE e os carotenóides, que trabalham juntos tão bem

quanto as enzimas antioxidantes (Valko et al, 2006).

Os pré-tratamentos com VitE e SOD+CAT ao meio de

cultura antes da exposição à STX pareceram serem eficientes na

prevenção à LPO quando comparadas à VitC. O antioxidante

VitC não se demonstrou eficiente para a proteção da células N2A

quando expostas ao estresse oxidativo da STX, possivelmente

devido à uma alta relação de concentração com a espécie reativa.

Em condições específicas (na presença de Cu intracelular na

forma de [CuZnSOD] do espaço intermembranar mitocondrial e

no citosol) o ascorbato pode ser oxidado produzindo espécies

citotóxicas (Halliwell, 2006). Nesse caso o antioxidante VitC

potencializou de forma sinérgica o efeito tóxico da STX. Assim,

uma pessoa que foi contaminada pela STX deve evitar o consumo

de alimentos e medicamentos com altas concentrações desta

vitamina. A VitC é conhecida como o maior antioxidante

hidrofílico, e evidências recentes sugerem que VitE e VitC

funcionam juntos em um processo cíclico (Kojo, 2004). A VitC

coopera o com a VitE para regenerar o α-tocoferol dos radicais α-

tocopheróis nas membranas e nas lipoproteínas. Uma sugestão

para futuros ensaios é a investigação da interação entre VitC e

VitE no efeito protetor do estresse oxidativo provocado pela STX

para diferentes tempos de incubação.

Os presentes resultados confirmam que a linhagem

celular de neuroblastoma N2A é apropriada para a avaliação da

toxicidade de STX e demonstrou que os principais mecanismos

que provocam seus efeitos tóxicos envolvem danos mitocondriais

indiretos e o estresse oxidativo, conduzindo possivelmente à

morte celular com um processo apoptótico ou lipoperoxidação da

membrana celular. Quando as células N2A foram tratadas com o

VitE e o SOD/CAT, as taxas de produção de MDA diminuíram

significativamente nas concentrações mais baixas de STX,

quando comparadas à condição sem antioxidantes. O antioxidante

de VitC mostrou não ser eficiente para proteger a célula N2A do

ataque oxidativo de STX.

5.5. RESULTADOS DO ARTIGO 3: TESTE DO MICRONÚCLEO

Os resultados apresentados neste subitem fazem parte do

terceiro artigo elaborado neste estudo e apresentou a toxicidade

da STX sobre as células através do ensaio de micronúcleo. O

artigo entitulou-se “MICRONUCLEI INDUCTION IN VERO

CELLS AND NEURO 2-A CELLS BY SAXITOXIN” e foi

submetido à revista científica “Journal of Toxicology”. O artigo

original é apresentado no Apêndice A10.

5.5.1. Influencia da STX na viabilidade celular em Células

N2A e Vero: teste do MTT e Determinação da EC50

Para a determinação da EC50, uma escala de oito

concentrações de STX (0,5 à 64,0nM) foram aplicadas em três

diferentes experimentos. Após exposição das células N2A e Vero

à STX e tratamento dos dados, uma curva de viabilidade v.

concentração de STX foi plotada para os dois casos. Este

resultado é apresentado na Figura 5.6.

Uma redução dose-dependente da viabilidade celular é

observado para ambos os casos com o aumento da concentração

de STX de 0,5 à 64nM. É possível observar também uma

significante semelhança entre as curvas de viabilidade obtidas

para as células N2A e Vero. Os resultados destes testes

demonstram que a exposição das células N2A e Vero à diferentes

concentrações de STX conduz à uma redução da dose-dependente

da atividade metabólica da mitocôndria, e conseqüentemente da

viabilidade celular.

Figura 5.6: Perfil dose-resposta da STX em células N2A e Vero, pela

viabilidade celular v. concentração STX (R2=0,997 para células N2A e

R2=0,964 para células Vero).

Para os testes com as células N2A, a redução foi de

96.2% de viabilidade celular para a concentração de 0,5 nM de

STX para 24,1% para 4,0 nM de STX. Na dose mais elevada de

STX avaliada neste estudo, a viabilidade celular foi de 5,6%. Para

os testes com as células Vero, a redução foi de 87,6% de

viabilidade celular para a concentração de 0,5 nM de STX para

40,6% para 4,0 nM de STX. Na dose mais elevada de STX

avaliada neste estudo, a viabilidade celular foi de 18,6%.

Das curvas plotadas na Figura 5.6, foi possível calcular a

EC50 para as células N2A, que foi de 1,1nM, e para as células

Vero que foi de 1,05nM. Esses resultados definiram o intervalo

de concentrações que foram utilizados no teste do micronúcleo.

Como foram encontrados valores muito próximos de EC50,

determinou-se novamente que os valores testados seriam de 0,4,

0,8, 1,5 e 3,0 nM de STX para ambas as células.

5.5.2. Teste do Micronúcleo

Com relação ao teste do micronúcleo em células N2A e

Vero, as freqüências de BNMN são apresentadas na Figura 5.7.

Este ensaio foi empregado para identificar a genotoxicidade da

STX que possa induzir algum dano ao nível genético. Durante a

contagem de BNMN, foram observados um alto número de

células mononucleadas. Devido a elevada quantidade destas

células, estas foram incluídas na contagem total de micronúcleos,

considerando que esta condição seja induzida pela STX. Os

resultados demonstram um significativo aumento dose-

dependente do BNMN para as células N2A de 4,5±1,3 (0,38nM

de STX) para 10,0±2,2 (3,00nM de STX), quando comparados

com o controle (1,0±0,8), e para as células Vero de 17,5±2,1

(0,38nM de STX) para 27,5±2,1 (3,00nM de STX), quando

comparados com o controle (7,0±1,0).

Figura 5.7: Número de células BNMN induzidas pela STX (0,38; 0,75;

1,50; 3,00 nM) sobre 1000 células binucleadas (BN) N2A e Vero após

24 horas de exposição. A colchicina foi empregada como controle

positivo. Os resultados estão expressos como média de três

experimentos±DP (n = 3).

Nas mesmas condições, as culturas celulares tratadas

com colchicina (controle positivo), demonstraram um

significativo aumento quando comparado com o controle do teste,

apresentando valores de 12,8±3,5 para células N2A e 28,3±2,5

para células Vero. A Figura 5.8 traz a imagem de células

binucleadas controle e células BNMN tratadas com STX.

Figura 5.8: Células N2A coradas com “acridine orange” e brometo de

etídio (Aumento: 1000x) A: controle célula BN; B: célula BNMN.

5.6. DISCUSSÃO DO ARTIGO 3:

No presente estudo, células N2A e Vero foram tratadas

num primeiro estagio com oito concentrações de STX, num

intervalo de 0,5 à 64nM, para determinar a EC50 para as células

avaliadas, e em um segundo estágio com concentrações

específicas (0,4-3,0nM) para avaliar a indução à formação de

micronúcleos pelo teste do micronúcleo em 24 horas de

exposição, enfatizando o tratamento com STX para avaliar a sua

genotoxicidade em induzir danos à nível mutagênico.

Os efeitos genotóxicos da STX pela indução à formação de

micronúcleo ainda não foram relatados na literatura científica.

Em um estudo prévio (Melegari et al., 2010a) foi demonstrado o

potencial efeito citotóxico da STX, induzindo à apoptose celular

de células N2A, e seu significante efeito indutor na perturbação

do sistema de regulação celular. Em outro estudo (Melegari et al.,

2010b) foi demonstrado que a STX pode induzir a significativos

níveis de estresse oxidativo em células N2A. Estudos similares

empregando outras neurotoxinas podem ser encontrados na

literatura. Guzmán et al. (2007) avaliaram o potencial genotóxico

da tetrodotoxina em células ósseas de camundongo marrom, e

não foram encontradas evidências que concluam seu potencial

genotóxico. Carvalho Pinto-Silva et al. (2006) avaliaram o

potencial genotóxico do ácido domóico e ácido ocadáico sobre

células Caco-2. Ambos demonstraram-se mutagênicos, induzindo

à formação de micronúcleos, entretanto o ácido domóico

apresentou apenas danos clastogênicos. Estudos avaliando outras

variadades de toxinas podem ser encontrados na literatura.

Humepage et al. (2000) avaliaram em linfoblastos WIL2-NS a

atividade genotóxica da cilindrospermopsina (CYN), uma potente

toxina que inibe a síntese de proteínas e também comumente

produzida pela cianobatéria Cylindrospermopsis raciborskii. Seus

resultados sugeriram que a CYN age induzindo danos

citogenéticos por dois mecanismos: clastogênicos e aneugênicos.

A colchicina, empregada como controle positivo neste

estudo, é característica pela indução à danos aneugênicos

(Kirchner e Zeller, 2010) e foi escolhida para avaliar a propensão

de indução in vitro à formação de micronúcleo especificamente

aneugênicos.

Com relação aos critérios morfológicos das amostras

analisadas, foi verificada uma elevada presença de células

mononucleadas nas amostras intoxicadas por STX, quando

comparadas com o controle. Esta evidência sugere que a STX

pode inibir a divisão celular. Entretanto, a maioria dos

micronúcleos encontrados foram em células binucleadas, sendo

esse resultado um indicativo do potencial mutagênico da STX.

Não foram observados casos de necrose celular por formação de

células multinucleadas (Fenech, 2000). Foram significativos os

MN com o tamanho de 1/3 à 1/6 do núcleo principal encontrados

em células binucleadas com relação aos MNs menores (Fig.

5.8B). Foram ainda identificadas como característica morfológica

destes MNs: tocam o núcleo principal mas não o sobrepõem e

apresentam a mesma intensidade de coloração do núcleo principal

(Fenech, 2000). Hashimoto et al. (2010) realizaram um estudo na

tentativa de desenvolver uma técnica rápida que discrimine danos

aneugênicos de clastogênicos levando em conta o tamanho dos

micronúcleos (grandes e pequenos) em testes in vitro. Para isso,

escolheram 9 aneugênicos e 6 clastogênicos, comparando a

hibridização in situ por fluorescência (FISH) e a proporção da

contagem de micronúcleos grandes com relação ao total de

micronúcleos encontrados. Seus resultados mostraram que todos

os aneugênicos testados aumentaram significativamente a

proporção de centrômeros positivos (FISH) e apresentaram

maiores proporção de MN de tamanhos grandes. Com isso,

concluíram que o método de classificação por tamanho do

micronúcleo é um método rápido, simples e confiável para

discriminar danos in vitro aneugênicos de clastogênicos. Embora

não tenha sido empregado os ensaios FISH para a caracterização

do dano deste estudo como aneugênico ou clastogênico,

baseando-se nos resultados de Hashimoto et al. (2010) e

considerando a freqüências de MN de tamanho grande, foi

possível estabelecer indícios de que os danos causados pela STX

são de origem aneugênica.

Nossos resultados permitem concluir que, nas condições

testadas, a STX causou significante indução do aumento da

frequência BNMN em ambas as células N2A e Vero, pois a

exposição destas células apresentou uma correlação dose-

dependente com o aumento da concentração de STX. O aumento

da freqüência de micronúcleo com a variação da concentração de

STX evidencia que a STX induz um potencial efeito genotóxico

em células N2A e Vero.

Como sugestão de futuros estudos devem-se efetuar

ensaios do micronúcleo na presença de sondas por ensaios FISH

que identifiquem com uma maior segurança a natureza do dano

aneugênico do clastogênico para confirmar os resultados obtidos

neste estudo. Estudos com outras linhagens celulares, diferentes

da empregada neste estudo, tambem seriam relevantes para

identificar o potencial genotóxico da STX sobre diferentes

sistemas celulares.

5.7. RESULTADOS DO ARTIGO 4: ENSAIOS DE ADSORÇÃO

Os resultados apresentados neste subitem fazem parte do

quarto artigo que está sendo elaborado neste estudo e apresentou

os ensaios de adsorsão da STX sobre dois diferentes adsorventes

(quitina e pó de ostra) em meio tamponados em dois pH

diferentes. O título provisório do artigo é “ESTUDO DO USO

DE QUITINA E CONCHA DE OSTRAS COMO

ADSORVENTES PARA REMOÇÃO DE SAXITOXINA DE

SOLUÇÃO AQUOSA” e quando concluído, será submetido à

revista científica “Water Research”. O projeto preliminar do

artigo é apresentado no Apêndice A11.

5.7.1 Efeito da concentração e o tempo de contato

A STX aquosa foi removida da solução quando em contato

com os adsorventes testados (Figuras 5.9 e 5.10) e as cinéticas de

adsorção da STX ao longo do tempo de mistura para os pH

empregados para a quitina e concha de ostra apresentaram uma

visível remoção (>40% remoção) em ambos os casos testados em

36h de tempo de contato. No experimento controle, apenas com a

STX sem adsorvente, não foi observado a degradação da toxina

ao longo dos tempos de contato do teste.

Figura 5.9: Processo cinético de adsorção da STX em quitina e pó de

concha. Condições: 10µM STX, 200mg de adsorvente, pH 5,0 e 25ºC.

Figura 5.10: Processo cinético de adsorção da STX em quitina e pó de

concha. Condições: 10µM STX, 200mg de adsorvente, pH 7,0 e 25ºC.

A taxa de remoção de STX pelos adsorventes diminui com

o tempo de contato, possivelmente pela saturação dos sítios

adsorventes. Essa saturação dos sítios adsorventes pode estar

associada também à presença de fosfato em solução provenientes

do tampão empregado, especialmente para o caso da concha de

ostra. Essa interferência da concentração iônica dos tampões nos

ensaios de adsorção foi relatada por Miller et al. (2001).Após 48h

de tempo de contato, foi observado que a concentração da STX

em solução tendeu a estabilizar, principalmente em pH 7,0,

provavelmente atingindo o equilíbrio de adsorção entre

adsorvente e adsorvato.

5.7.2. Considerações sobre Adsorção

As isotermas de adsorção Lin e N-Lin podem ser

visualizadas nas Figuras 5.11 e 5.12. De acordo com o isoterma

da adsorção de Freundlich, as frações de cobertura de superfície

(X/m) estão relacionadas à concentração do equilíbrio do

adsorbato. A isoterma de Freundlich descreve o equilíbrio em

superfícies heterogêneas e, por esta razão, não assume uma

capacidade de adsorção em monocamada (Fávere et al., 2010).

A partir das isotermas da Fig. 5.11 e 5.12 foram

determinadas as equações das isotermas de adsorção da STX com

bom ajuste ao modelo Lin e N-Lin de Freundlich para o materiais

empregados como adsorventes à 25ºC (Tabela 5.2). Esse bom

ajuste pode ser explicado pelos materiais empregados serem de

origem natural e apresentarem superfícies heterogêneas. Na

Tabela 5.2 é apresentado os valores de R

para ambos os modelos

testados, que se demonstraram favoráveis em pH 5,0 para quitina

e em pH 7,0 para ambos os adsorventes testados. Por meio do

modelo Lin, pode-se obter valores do coeficiente de distribuição

). São apresentados também na Tabela 5.2 os valores de n,

relacionado com a intensidade de adsorção, e K

que indica a

capacidade do sítio de adsorção.

Figura 5.11: Isotermas de adsorção Lin e N-Lin (respect.) de STX em

quitina e pó de concha de ostra à 25ºC e pH 5,0.

Figura 5.12: Isotermas de adsorção Lin e N-Lin (respect.) de STX em

quitina e pó de concha de ostra à 25ºC e pH 7,0.

Os valores de K

para ambos os pH testados foram

elevados, confirmando que a STX foi adsorvida pelos

adsorventes testados. Os valores de K

em pH 5,0 foram de

47,3L/kg para concha de ostra e 50,2L/kg para a quitina. O K

pH 7,0 foram de 50,6L/kg para concha de ostra e 48,1L/kg para a

quitina (Tabela 5.2). Neste tratamento de isotermas Lin, os

valores de K

não apresentaram diferenças significativas entre os

adsorventes testados.

Tabela 5.2: Parâmetros obtidos pelas isotermas de adsorção da STX nas

diferentes condições analisadas.

Ensaio

Adsorv.

Modelo

linear

(X/m=K

.Ce)

(L/kg)

Modelo não

linear

(Log X/m =

nLog Ce +

LogK

)

(L/kg)

Concha

Ostra

X/m =

47,312Ce +

8,2456

47,312

0,76270

Log (X/m) =

0,949Log Ce

+1,7387

0,949

52,91

0,75626

5,0

Quitina

X/m =

50,168Ce +

1,0669

50,168

0,97521

Log (X/m) =

1,11115LogCe +

1,6078

1,1112

40,53

0,91766

Concha

Ostra

X/m =

50,649Ce -

10,874

50,649

0,99085

Log (X/m) =

1,0245LogCe

+1,6687

1,0245

46,63

0,98426

7,0

Quitina

X/m =

48,135Ce +

8,6811

48,135

0,98528

Log (X/m) =

0,8437LogCe

+1,8077

0,8437

64,22

0,96624

Para as isotermas N-Lin de Freundlich, a STX foi

adsorvida por ambos os adsorventes testados mas apresentou

diferenças significativas entre os adsorventes testados (p>0,05).

Os valores de K

em pH 5,0 foi de 52,91L/kg para concha de

ostra e 40,53L/kg para a quitina, indicando que neste pH a STX

teve uma maior afinidade à concha de ostra. O K

em pH 7,0 foi

de 46,63L/kg para concha de ostra e 64,22L/kg para a quitina,

indicando que neste pH a STX teve uma maior afinidade à quitina

(Tabela 5.2). Os valores de K

encontrados indicam que concha

de ostra em pH 5,0 e para a quitina em pH 7,0 tem maior

capacidade de sítios de adsorção à STX, indicando que este

parâmetro foi afetado pelo pH da solução. Os valores de n

variaram de 0,84 – 1,11 para ambos os adsorventes testados,

revelando que a adsorção da STX foi eficiente.

5.7.3. Considerações Termodinâmicas

A energia livre de Gibbs de adsorção (∆G

ads

) é relatada

por Odoemelam et al. (2009) de acordo com a Equação 5.1

descrita a seguir.

∆G

ads

= - 2,303.R.T.logK (5.1)

Onde R é a constante universal dos gases e T é a

temperatura. Usando os valores de K

calculados pela isotermas

de Freundlich, os valores de ∆G

ads

de adsorção para a STX

puderam ser calculados para os adsorventes testados em ambos os

pH, e são apresentados na Tabela 5.3.

Tabela 5.3: Valores de ∆G

ads

para a STX para os adsorventes testados

nos pH 5,0 e 7,0.

Ensaio

Adsorvente

∆G

ads

(kJ/mol)

Concha Ostra

-9,843

5,0

Quitina

-9,182

Concha Ostra

-9,530

7,0

Quitina

-10,324

Os valores dos ∆G

ads

negativos indicam que a adsorção de

STX nos adsorventes foi espontânea nas condições testadas e

indicam também que o mecanismo da adsorção química é

aplicável à adsorção de STX por ambos os adsorventes. Estes

valores podem ainda ser melhorados favorecendo ainda mais a

adsorção, realizando combinações destes adsorventes com carvão

ativado, por exemplo.

5.8. DISCUSSÃO ARTIGO 4

Este artigo avaliou a capacidade de adsorsão dos

materiais de origem natural quitina e concha de ostra na remoção

de saxitoxina (STX) de soluções aquosas. Observou-se que a

concha de ostra e quitina demonstraram boa capacidade de

remoção da STX de soluções aquosa dentro dos limites de

concentração estudados. As características da concha de ostra e

da quitina foram consistentes com o modelo de adsorção clássico

da isoterma Lin e N-Lin de Freundlich e os valores de K

apresentaram diferenças significativas entre os adsorventes

testados, indicando que concha de ostra em pH 5,0 e a quitina em

pH 7,0 apresentaram maior capacidade de adsorção da STX. Esse

parâmetro possivelmente foi afetado pelo pH do meio. Os valores

dos ∆G

ads

negativos permitem concluir que a adsorção da STX

nestes materiais é favorável e espontânea, e estes podem ser

aplicáveis como adsorventes para a remoção de STX de soluções

aquosas.

Os resultados mostram que o emprego destes materiais

para a remoção de STX de solução aquosa é conveniente,

ressaltando assim mais uma aplicação para a ampla gama de

potenciais aplicações destes materiais. A possibilidade de

incorporação destes materiais em sistemas de tratamento de água

é muito animadora pois as carapaças de crustáceos e as conchas

de moluscos são resíduos abundantes e rejeitados pela indústria

pesqueira, que em muitos casos são considerados poluentes. Sua

reutilização reduz impactos ambientais causado pelo acúmulo nos

locais onde é gerado ou estocado.

É necessário a realização de outros estudos que

investiguem formas de incorporar estes materiais em um sistema

de tratamento de água em grande escala. Outras sugestões de

estudo seriam:

- Avaliação do processo de adsorção destes materiais

associados ao carvão ativado. Numa analise rápida e

superficial esta associação pode ser vantajosa, pois irá

aumentar a eficiência do carvão ativado de remoção da

STX em solução e irá diminuir os custos pois a quantidade

de carvão empregado será menor, podendo ainda melhorar

a velocidade do processo;

- Estudo da avaliação da capacidade de adsorção deste

materiais com outras cianotoxinas solúveis em água como

as hepatotoxinas;

- Estudo de tratamento e destinação final destes resíduos

após adsorção da STX, a fim de minimizar os impactos

ambientais associados.

5.9. CONSIDERAÇÕES FINAIS PARA COMPLEMENTAÇÃO DO

ESTUDO DE CASO: LAGOA DO PERI

Previamente, no exame de qualificação desta tese, foi

proposto um monitoramento da Lagoa do Peri, através da coleta

de amostras de água de alguns pontos de anteriormente

estabelecidos, e por um período de 01 (um) ano seriam realizadas

coletas em intervalos sazonais. Entretanto, após uma melhor

reflexão desta proposta, concluiu-se que esta etapa seria

desnecessária, uma vez que produções científicas dentro do

Programa de Pós Graduação em Engenharia Ambiental da UFSC,

descrevendo monitoramentos sazonais da Lagoa do Peri em

diferentes períodos, foram realizadas ao longo dos últimos anos.

Estes dados serão úteis para discutir o objetivo proposto com a

metodologia inicial desta tese. Assim, irei fazer um breve relato

destes trabalhos, que serão úteis para verificar a presença de STX,

quais as concentrações de STX nestes períodos e se estes valores

estão dentro do estabelecido pela Legislação Brasileira.

Melo-Filho (2006) avaliou o método da ozonização como

pré ou pós-tratamento à filtração direta descendente na remoção

de cianobactérias e saxitoxinas. Foi empregado um método de

detecção de STX por HPLC-FD, não mencionando o limite de

detecção do método. A concentração de STX presente na água

bruta da Lagoa do Peri variou no período de 1 (um) mês de

monitoramento (Maio/2005) de 3,28 a 4,09µg/L. Após o

tratamento proposto, foram encontrados valores entre 0,01-

0,04µg/L eq. STX.

Mondardo (2009) avaliou a filtração em margem como

pré-tratamento à filtração direta descendente na remoção de

células de cianobactérias e saxitoxinas. Foi empregado um

método de detecção de STX por HPLC-FD, não mencionando o

limite de detecção do método. Neste estudo, num monitoramento

de junho-setembro de 2005, não foram detectados valores de

concentração de STX presente na água bruta da Lagoa do Peri.

Entretanto, foram detectados valores de equivalentes de STX,

referentes a outras saxitoxinas do grupo (NEO e GTX), em

concentrações intracelular que variaram de 1,70-7,54 µg/L eq.

STX e dissolvido 3,8 µg/L eq. STX. Estas amostras de água bruta

não foram empregadas no seu tratamento por apresentar valores

muito baixo para avaliação da % de remoção.

Coral (2009) avaliou a remoção de cianobactérias e

cianotoxinas em águas da Lagoa do Peri destinadas ao

abastecimento pela associação de flotação por ar dissolvido e

nanofiltração. Foi empregado um método de detecção de STX por

HPLC-FD, com limite de detecção de 0,08 µg.L

-1

.Em suas coletas

que ocorreram no ano de 2008, foram determinados valores de

STX na água bruta que variaram entre 3,35-10,58µg/L. Após o

tratamento proposto, foram registradas de % de remoção que

variaram de 11,03-100% dependendo de vários fatores como tipo

de filtro, valores de pressão exercida e tempo de contato com os

filtros.

Verificam-se nestes estudos que os valores de

concentração de STX encontrados nas amostras de água bruta

extrapolam os limites permitidos pela legislação brasileira, a

portaria n

518 do Ministério da Saúde, que determina valores de

3,0µg/L de equivalentes STX/L. Entretanto os tratamentos

propostos por esses estudos foram capazes de adequarem suas

amostras de acordo com o valor estabelecido pela legislação

vigente.

De acordo com os ensaios citotóxicos in vitro realizados

neste estudo foi possível encontrar um valor de EC50 para STX

de 1,112nM em células N2A e 1,054nM em células Vero. Ainda

foi observado nestas mesmas concentrações efeitos de estresse

oxidativo e genotóxico induzidos pela presença da STX, como

aumento da incidência de micronúcleos e indução a

hipermetilação do DNA. Foram detectados efeitos genotóxicos

significativos em concentrações de 3,0nM de STX, o que

equivale à uma concentração de aproximadamente 1,2µg/L. Esse

valor equivale à menos da metade do valor recomendado como

VMP pela legislação brasileira. Avaliando estas verificações, é

possível constatar que os valores expostos anteriormente de STX

em amostra de água bruta da Lagoa do Peri em diferente estudos

são elevados e potencialmente tóxicos.

No presente estudo foram investigados os efeitos tóxicos

in vitro da STX sob células N2A e Vero, a fim de confirmar as

primeira e segunda hipóteses propostas nesta pesquisa. Todos

estes resultados encontrados nos ensaios citotóxicos e

genotóxicos confirmaram a primeira e segunda hipóteses de

pesquisa propostas nesta tese. A primeira hipótese afirmava que

“a saxitoxina pode causar efeito citotóxico e genotóxico aos

indivíduos que são expostos esta toxina” e a segunda hipótese

afirmava que “o valor recomendado na portaria n° 518 do

Ministério da Saúde não é seguro, pois valores abaixo do VMP

causam efeitos tóxicos em nível celular”.

Contudo, considerando esta problemática da presença de

STX em água destinadas ao abastecimento público e a alta

solubilidade da STX em água, este estudo apresentou uma

alternativa para a remoção de STX de soluções aquosa, avaliando

os materiais naturais quitina e concha de ostra como adsorventes.

Estes materiais apresentaram boa porcentagem de remoção

(>60% em 48h) e o processo de adsorção apresentou ser

favorável e espontâneo. Estes resultados confirmam a terceira

hipótese de pesquisa que afirmou que “a quitina e a concha de

ostra podem ser empregadas como adsorventes para a remoção de

STX de soluções aquosas”, e propõe uma destinação para estes

resíduos da indústria pesqueira, reduzindo impactos ambientais

provocados pelo subutilização destes materiais.

CAPÍTULO VI

6. CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES

Este estudo apresentou como principal objetivo avaliar os

impactos da saxitoxina na qualidade da água destinada ao

consumo humano, estudando seu mecanismo de ação tóxica e

avaliando seu processo de remoção da água por adsorção em

diferentes materiais de origem natural. Diante dos resultados

apresentados foi possível concluir que:

- A STX apresentou considerável citotoxicidade in vitro nas

células testadas N2A e Vero quando avaliadas pelo método

do MTT, pois os valores de EC50 encontrados foram de

1,112nM em células N2A e 1,054nM em células Vero;

- Os ensaios genotóxicos de fragmentação e metilação do

DNA demonstraram que a STX induziu uma fragmentação

e uma hipermetilação do DNA das células expostas,

indicativos estes de que a STX pode estar induzindo a uma

morte celular programada (apoptose) e a conseqüências

mutacionais e epigenéticas nos genomas das células

expostas;

- A STX apresentou potencial de indução in vitro de células

N2A ao estresse oxidativo, elevando os níveis de MDA

produzidos pela célula exposta. Ainda foi possível

verificar neste ensaio que a vitamina E e as enzimas

combinadas SOD+CAT exercem um efeito protetor nas

células da toxicidade da STX, diminuindo

significativamente os níveis de MDA produzido. Neste

mesmo ensaio, verificou-se que a vitamina C potencializa

os efeitos tóxicos da STX, elevando ainda mais os níveis

de MDA produzidos pela célula;

- Nas condições testadas, a STX causou significante indução

do aumento da frequência BNMN em ambas as células

N2A e Vero, pois a exposição destas células apresentaram

um aumento dose-dependente com o aumento da

concentração de STX, causando efeitos genotóxicos nas

células expostas e esses efeitos foram identificados como

aneugênicos;

- A concha de ostra calcinada e a quitina exibiram boa

capacidade de remoção da STX de soluções aquosa dentro

dos limites de concentração estudados e as características

da concha de ostra e da quitina foram consistentes com o

modelo de adsorção clássico da isoterma Lin e N-Lin de

Freundlich, onde valores de K

apresentaram diferenças

significativas (p>0,05) entre os adsorventes testados,

indicando que concha de ostra em pH 5,0 e a quitina em

pH 7,0 apresentaram maior capacidade de adsorção da

STX.

- Os valores dos ∆G

ads

negativos permitem concluir que a

adsorção da STX nestes materiais é favorável e

espontânea, e estes podem ser aplicáveis como adsorventes

para a remoção de STX de soluções aquosas;

- Em um levantamento de estudos de outros autores

realizados neste departamento que avaliaram a

concentração de STX em amostras de água bruta da Lagoa

do Peri, foram relatadas concentrações que extrapolam os

limites permitidos pela legislação brasileira, a portaria n

518 do Ministério da Saúde, que determina valores de

3,0µg/L de equivalentes STX/L.

Algumas recomendações para futuras pesquisas baseadas

nestes estudos são:

- Realizar outros ensaios citotóxicos e genotóxicos que

identifiquem e confirmem os resultados demonstrados pela

STX neste estudo.

- Estudos com outras linhagens celulares, diferentes da

empregada neste estudo, também seriam relevantes para

identificar o potencial genotóxico da STX sobre diferentes

sistemas celulares.

- Investigar da interação entre VitC e VitE no efeito protetor

do estresse oxidativo provocado in vitro pela STX para

diferentes tempos de incubação.

- Efetuar ensaios do micronúcleo na presença de sondas que

identifiquem com uma maior segurança a natureza do dano

como aneugênico ou clastogênico para confirmar os

resultados obtidos neste estudo.

- Avaliação do processo de adsorção da concha de ostra e

quitina associados ao carvão ativado.

- Estudo da avaliação da capacidade de adsorção da concha

de ostra e quitina com outras cianotoxinas solúveis em

água como as hepatotoxinas;

- Estudo de tratamento e destinação final dos resíduos de

concha de ostra e quitina após adsorção da STX, a fim de

minimizar os impactos ambientais associados.

CAPÍTULO VII

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALVITO, P.C., GALLACHER, S., GAGO, A., LAWRENCE,

J.F., MARTINS, C.A., PEREIRA, P., BENTO, F.S., FRANCA,

F.(2001) Application of the mouse neuroblastoma bioassay to the

study of PSP toxins from Dinoflagellates and cyanobacteria; a

comparison of data generated by the MNB assay to pre and post

column HPLC. Harmful Algae Blooms 2000:257-260.

AMORIM, A. M. G.(1997) Acumulação e Depuração de

Microcistinas por Mytilus Galloprovincialis Lamarck.

Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências da Universidade

do Porto – Porto, Portugal. 56p.

AMORIM, F.F. (2007) Remoção dos Contaminates Orgânicos

β-estradiol e Saxitoxinas (STX, Neo-STX e dc-STX) por meio de

Nanofiltração: Avaliação em Escala de Bancada. Dissertação

(Mestrado). ENC/FT/UnB. Brasilia, Brasil. 133p.

ANDERSON, J.D., HANSEN, T.P., LENKOWSKI, P.W.,

WALLS, A.M., CHOUDHURY, I.M., SCHENCK, H.A., HÖLL,

M.G., PATEL, M.K., SIKES, R.A., BROWN, M.L. (2003)

Voltage-gated sodium channel blockers as cytostatic inhibitors of

the androgenindependent prostate cancer cell line PC-3. Mol

Cancer Ther 2, 1149–1154.

ANTONINO, N. A. (2007) Otimização do processo de

obtenção de quitina e quitosana deexoesqueletos de camarões

oriundo da industria pesqueira paraibana. Dissertação (Mestrado).

UFPB/CCEN. João Pessoa, Brasil. 88p.

AOAC – ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL

CHEMISTS - Official Method 2005.06: Paralytic Shellfish

Poisoning Toxins in Shellfish - Prechromatographic Oxidation

and Liquid Chromatography with Fluorescence Detection. First

Action 2005.

AZEVEDO, F.A., CHASIN, A.A.M. (2003) As Bases

Toxicológicas da Ecotoxicologia, 1a. Ed. Rima e InterTox, São

Paulo. 321p.

AZEVEDO, V. V. C., CHAVES S. A. , BEZERRA D. C.,

LIA FOOK M. V., COSTA A. C. F. M. (2007) Quitina e

Quitosana: aplicações como biomateriais REMAP. 2(3), 27-34

BAND-SCHMIDT, C.J., BUSTILLOS-GUZMÁN, J.,

GÁRATE-LIZÁRRAGA, I., LECHUGA-DEVÉZE, C.H.,

REINHARDT, K., LUCKAS, B. (2005) Paralytic shellfish toxin

profile in strains of the dinoflagellate Gymnodinium catenatum

Graham and the scallop Argopecten ventricosus G.B. Sowerby II

from Bahía Concepción, Gulf of California, México, Harmful

Algae, 4, 21–31,

BARATA, D., CRISPINO, L. M. B. (2006) O Ambiente

Aquático e As Algas, Curso de Capacitação de Monitores e

Educadores, São Paulo: Instituto de Botânica – Ibt, 11p.

BARTRAM, J., CARMICHAEL, W.W., CHORUS, I.,

JONES, G., SKULBERG, O.M., (1999) Introdution, in: Chorus,

I., Bartram, J. (Eds.). Toxic cyanobacteria in water. A guide to

their public health consequences, monitoring and management.

E&FN Spon, London, pp. 12-24.

BAUDRIMONT, I., AHOUANDJIVO, R., CREPPY,

E.E.(1997) Prevention of lipid peroxidation induced by

ochratoxin A in Vero cells in culture by several agents. Chem.

Biol. Interact. 104, 29-40.

BAYLIN, S.B., ESTELLER, M., ROUNTREE, M.R.,

BACHMAN, K.E., SCHUEBEL, K., HERMAN, J.G. (2001)

Aberrant patterns of DNA methylation chromatin formation and

gene expression in cancer. Hum Mol Genet 10, 687–692.

BEN-GIGIREY, B., RODRÍGUEZ-VELASCO, M.L.,

VILLAR-GONZÁLEZ, A., BOTANA L.M. (2007) Influence of

the sample toxic profile on the suitability of a high performance

liquid chromatography method for official paralytic shellfish

toxins control, Journal of Chromatography A, 1140, 78–87.

BERGER, C., BA, N., GUGGER, M., BOUVY, M.,

RUSCONI, F., COUTÉ, A., TROUSSELLIER, M., BERNARD,

C. (2006) Seasonal dynamics and toxicity of Cylindrospermopsis

raciborskii in Lake Guiers (Senegal, WestAfrica). FEMS

Microbiol. Ecol. 57, 355–366.

BESSLER, K. E., RODRIGUES, L. C. (2008) Os polimorfos

de carbonato de cálcio – uma síntese fácil de aragonita. Quim.

Nova, 31(1), 178-180.

BIRD A (2002) DNA methylation patterns and epigenetic

memory. Genes Dev 16, 6-21.

BOUAÏCHA, N.(2001) Impact sanitaire des toxines de

cyanobactéries en milieu d’eau douce. Revue Francaise des

Laboratoires. 336, 39-46.

BRADFORD, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for

the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the

principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254.

BRASIL. Declaração de Direitos Humanos de 1948, artigo 25.

BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Portaria n.º 518, de 25

de Março de 2004. Norma de Qualidade da Água para Consumo

Humano.

BRUSICK, D.J., FIELDS, W.R., MYHR, B.C., DOOLITTLE,

D.J.(2007) Genetic Toxicology. In: Hayes AW (Ed) Principles

and methods of toxicology, Taylor & Francis, New York, pp

1179-1181.

BURNS, J. M., HALL, S., FERRY, J. L. (2009). The

adsorption of saxitoxin to clays and sediments in freshand saline

waters. Water Res. 43, 1899-1904

CAÑETE, E., DIOGÈNE, J.(2008) Comparative study of the

use of neuroblastoma cells (Neuro-2a) and neuroblastoma x

glioma hybrid cells (NG108-15) for the toxic effect quantification

of marine toxins. Toxicon 52, 541–550.

CARMICHAEL, W.W., AZEVEDO, S.M.F.O.,AN, J.S.,

MOLICA, R.J.R., JOCHIMSEN, E.M., LAU, S.,RINEHART,

K.L., SHAW, G.R.,EAGLESHAM, G.K. (2001) Human

Fatalities from Cyanobacteria: Chemical and Biological Evidence

for Cyanotoxins, Environmental Health Perspectives, v. 109, n. 7.

CARVALHO PINTO-SILVA, C.R., FERREIRA, J.F.,

COSTA, R.H.R., BELLI FILHO, P., CREPPY, E.E., MATIAS,

W.G. (2003) Micronucleus induction in mussels exposed to

okadaic acid. Toxicon 41, 93-97.

CARVALHO PINTO-SILVA, C. R. (2005) Incidência de

Fitoplâncton Tóxico na Costa Catarinense: Risco para Saúde

Pública e Meio Ambiente. Tese (Doutorado). PPGEA-UFSC.

Florianópolis, Brasil. 166p.

CARVALHO PINTO-SILVA, C. R., MOUKHA, S.,

MATIAS, W. G., CREPPY, E. (2006) Comparative Study of

Domoic Acid and Okadaic Acid Induced - Chromosomal

Abnormalities in the CACO-2 Cell Line. Int. J. Environ. Res.

Public Health, 3(1), 4-10.

CARVALHO, S. L. (2004) Eutrofização Artificial: Um

Problema em Rios, Lagos e Represas, Correio de Três Lagoas,

Três Lagoas-MS.

CATTERALL, W.A., CESTÈLE, S., YAROV-YAROVOY,

V., YU, F.H., KONOKI, K., SCHEUER, T. (2007) Voltage-gated

ion channels and gating modifier toxins. Toxicon 49, 124–141.

CHOW, C.W.K., DRIKAS, M., HOUSE, J., BURCH,M.D.,

VELZEBOER, R.M.A. (1999). The impact of conventional water

treatment processes on cells of the cyanobacterium Microcystis

aeruginosaWater Res., 33(15), 3253-3262.

CHORUS I., BARTRAM J. (Eds) (1999) Toxic

Cyanobacteria in Water: A Guide to their Public Health

Consequences, Monitoring and Management. London: E&FN

Spon, 416p.

COOPER, G. M., HAUSMAN, R. E.(2007) A célula: uma

abordagem molecular, third ed. Artmed, Porto Alegre, 716p.

CORAL, L.A. (2009) Remoção de cianobactérias e

cianotoxinas em águas de abastecimento pela associação

deflotação por ar dissolvido e nanofiltração. Dissertação

(Mestrado). PPGEA-UFSC. Florianópolis, Brasil. 198p.

COSTA, I.A.S., AZEVEDO, S.M.F.O., SENNA, P.A.C.,

BERNARDO, R.R., COSTA, S.M., CHELLAPPA, N.T. (2006)

Occurrence of toxin-producing cyanobacteria blooms in a

Brazilian semiarid reservoir. Braz. J. Biol. 66, 211-219.

COTRAN, R.S., KUMAR, V., COLLINS, T. (2000)

Adaptações, lesão e morte cellular. In: Robbins Patologia

estrutural e funcional. 6th edn Guanabara Koogan, Rio de

Janeiro, pp 10-18.

CREPPY, E.E., CHIARAPPA, P., BAUDRIMONT, I.,

BORRACCI, P., MOUKHA, S., CARRATÙ, M.R. (2004)

Synergistic effects of fumonisin B1 and ochratoxin A: are in vitro

cytotoxicity data predictive of in vivo acute toxicity? Toxicology

201, 115-123.

DAMIANI, C.R. (2006) Estresse oxidativo e metabolismo em

modelo animal de colite induzida por dextran sulfato de sódio.

Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em

Ciências da Saúde-UNESC. Criciúma, Brasil. 73p.

DEBERDT, G. L. B., CANTUSIO NETO, R.& AGUJARO,

L. F. (2008) Florações de Cianobactérias e Sua Inserção na

Legislação Brasileira, SANASA - Campinas / Educação

Ambiental, 25/10/2006. Disponível em:

http://www.sanasa.com.br/noticias/not_con1.asp?flag=PC-3.

Acesso em 22/04/2008.

D’MELO, J.P.F., ed. (2003) Food Safety – Contaminants and

Toxins, Edinburgh, UK: CABI Publishing, 452p.

EHRLICH, M., GAMA-SOSA, M.A., HUANG, L.H.,

MIDGETT, R.M., KUO, K.C., MCCUNE, R.A., GEHRKE,

C.(1982) Amount and distribution of 5-methycytosine in human

DNA from different types of tissues or cells. Nucleic Acids Res.

10, 2709–2721.

ESTEVES, F.A. (1998) Fundamentos de Limnologia, 2a. Ed.,

Interciência, Rio de Janeiro. 602p.

FALCONER, I.R., HUMPAGE, A.R.(2005) Health risk

assessment of cyanobacterial (blue-green algal) toxins in drinking

water. Int. J. Environ. Res. Public Health 2, 43–50.

FALCONER, I.R.(2008) Health effects associated with

controlled exposures to cyanobacterial toxins, in: Hudnell, H.K.

(Ed.) Cyanobacterial harmful algal blooms: state of the science

and research needs. Springer Press, North Carolina, pp. 607-612.

FARIA, J.G., CUNHA, A.M.(1917) Estudos sobre o

microplancton da baía do Rio de Janeiro e suas imediações. Mem.

Inst. Oswaldo Cruz; 9(1), 68-93.

FÁVERE, V.T, RIELLA, H.G., ROSA, S. (2010)Cloreto de

n-(2-hidroxil) propil-3-trimetil amônio quitosana como

adsorvente de corantes reativos em solução aquosa. Quim. Nova.

XY,1-6.

FERRÃO-FILHO, A. S., DOMINGOS, P., AZEVEDO, S. M.

F. O. (2002) Influences of a Microcystis aeruginosa KÜTZING

bloom on zooplankton populations in Jacarepaguli Lagoon (Rio

de Janeiro, Brazil), Limnologica 32, 295-308.

FENECH, M., CROTT, J., TURNER, J., BROWN, S. (1999)

Necrosis, apoptosis, cytostasis and DNA damage in human

lymphocytes measured simultaneously within the cytokinesis-

block micronucleus assay: description of the method and results

for hydrogen peroxide. Mutagenesis 14, 605–612.

FENECH, M. (2000) The in vitro micronucleus technique.

Mut. Res. 455, 81–95.

FEINBERG A.P.,TYCKO B. (2004) The history of cancer

epigenetics. Nat Rev Cancer 4, 143-153.

FISKE, J.L., FOMIN, V.P., BROWN, M.L., DUNCAN, R.L.,

SIKES, R.A. (2006) Voltage-sensitive ion channels and cancer.

Cancer Metastasis Rev 25, 493–500.

FITZGERALD, D.J., CUNLIFFE, D.A., BURCH,

M.D.(1998) Development of health alerts for cyanobacteria and

related toxins in drinking-water in South Australia. Environ.

Toxicol. 14, 203-209.

FRIDOVICH, I.(1995) Superoxide radical and superoxide

dismutases. Annu. Rev. Biochem. 64, 97-112.

FROSTESJO, L., HOLM, I., GRAHN, B., PAGE, A.W.,

BESTOR, T.H., HEBY, O.(1997) Interference with DNA

methyltransferase activity and genome methylation during F9

teratocarcinoma stem cell differentiation induced by polyamine

depletion. J Biol Chem 272, 4359–4366.

GARCIA, T. V. (2002) Remoção de Algas Através da

Eletroflotação - Tratamento Eletrolítico Seguido de Filtração

Direta no Tratamento de Água de Abastecimento. Dissertação

(Mestrado). PPGEA-UFSC. Florianópolis, Brasil. 97p.

GONZALGO ML, JONES PA (1997) Mutagenic and

epigenetic effects of DNA methylation. Mutat Res 386, 107–118.

GOOSEN, M. E. A. (1996) Applications of chitin and

chitosan, Technomic Publishing Company, Lancaster. 336p

GUZMÁN, A., HENESTROSA, F.A.R., MARÍN A. P., HO,

A., BORROTO, J. I. G., CARASA, I., PRITCHARD, L. 2007.

Evaluation of the genotoxic potential of the natural neurotoxin

Tetrodotoxin (TTX) in a battery of in vitro and in vivo

genotoxicity assays. Mut. Res. 634, 14–24.

HALLEGRAEFF, G.M., ANDERSON, D.M. &

CEMBELLA, A.D., eds. Manual on Harmful Marine Microalgae.

Paris, FR: UNESCO Publishing, 1995, 793p.

HALLIWELL, B.(1987) Oxidants and human disease: some

new concepts. FASEB J. 1, 358-364.

HALLIWELL, B., GUTTERIDGE, J.M.C. (1999) Free

radicals in Biology and Medicine, third ed. Clarendon Press,

Oxford. 704p.

HALLIWELL, B. (2006) Oxidative stress and

neurodegeneration: where are we now? J. Neurochem. 97,1634-

1658.

HALLIWELL, B.(2007) Biochemistry of oxidative stress.

Biochem. Soc. Trans. 35, 1147-1150.

HASHIMOTO, K., NAKAJIMA, Y., MATSUMURA, S.,

CHATANI, F.(2010) An in vitro micronucleus assay with size-

classified micronucleus counting to discriminate aneugens from

clastogens. Toxicology in Vitro 24, 208–216.

HAVLIS, J., TRBUSEK,M. (2002) 5-Methylcytosine as a

marker for the monitoring of DNAmethylation J. Chromatogr. B

781, 373–392.

HERMAN, J.G., BAYLIN, S.B. (2003) Gene silencing in

cancer in association with promoter hypermethylation. N Engl J

Med 349, 2042-2054.

HIMBERG, K., KEIJOLA, A.M., HIISVIRTA, L.,

PYYSALO, H., SIVONEN, K.. (1989). The effect of water

treatment processes on the removal of hepatotoxins

fromMicrocystis andOscillatoria cyanobacteria: A laboratory

study. Water Res. 23 (8), 979-984

HOEGER, S.J., SHAWB, G., HITZFELDC, B.C.,

DIETRICH, D.R.(2004) Occurrence and elimination of

cyanobacterial toxins in two Australian drinking water treatment

plants. Toxicon 43, 639–649.

HUMPAGE, A. R., FENECH, M., THOMAS, P.,

FALCONER, I. R.(2000) Micronucleus induction and

chromosome loss in transformed human white cells indicate

clastogenic and aneugenic action of the cyanobacterial toxin,

cylindrospermopsin. Mut. Res. 472, 155–161.

HUMPAGE, A.R., LEDREUX, A., FANOK, S., BERNARD,

C., BRIAND, J.F., EAGLESHAM, G., PAPAGEORGIOU, J.,

NICHOLSON, B., STEFFENSEN, D. (2007) Application of the

neuroblastoma assay for paralytic shellfish poisons to neurotoxic

freshwater cyanobacteria: interlaboratory calibration and

comparison with other methods of analysis. Environ. Toxicol.

Chem. 26, 1512–1519.

ICMS - Institute of Cell and Molecular Science, Queen Mary's

School of Medicine and Dentistry, Queen Mary, University of

London, 4.

http://www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/uses/apoptosis/dnafra

gmentation/. Accessed 6 July 2009.

IKAWA, M., WEGENER, K., FOXALL, T.L., SASNER, J.J.

(1982) Comparaison of the toxins of the blue-green alga

Aphanizomenon flos-aquae with the Gonyaulaxtoxins. Toxicon

20:747-752.

INOUE, M., SATO, E.F., NISHIKAWA, M., PARK, A.M.,

KIRA, Y., IMADA, I., UTSUMI, K., (2003) Mitochondrial

generation of reactive oxygen species and its role in aerobic life.

Curr. Med. Chem. 10, 2495–2505.

JELLETT, J.F., STEWART, J.E., LAYCOCK, M.V. (1995)

Toxicological evaluation of saxitoxin, neosaxitoxin, gonyautoxin

II, gonyautoxin II plus III and decarbamoylsaxitoxin with the

mouse neuroblastoma cell bioassay. Toxicol. In Vitro 9, 57–65.

JOCHIMSEN, E.M. CAMICHAEL,W.W., AN, J.S., CARDO,

D. M., COOKSON, S.T., HOLMES, C.E.M., ANTUNES,

M.B.C., FILHO, D.A.M., LYRA, T.M., BARRETO, V.S.,

AZEVEDO, S.M.F.O., JARVIS, W.R. (1998) Liver failure and

death following exposure to microcystin toxins at a hemodialysis

center in Brazil. (Abstract). The New England Journal of

Medicine, 338(13), 873-878.

JONES,G.J., NEGRI, A.P.(1997). Persistence and

degradation of cyanobacterial paralytic shellfish poisons (PSPs)

in freshwaters, Water Res. 31, 525–533.

JONES, P.A., BRACHER, M., MARENUS, K., KOJIMA H.

(1999) Performance of the Neutral Red Uptake Assay in the

COLIPA International Validation Study on Alternatives to the

Rabbit Eye Irritation Test. Toxicology in Vitro. 13, 325–333.

KEIJOLA, A.-M., HIMBERG, K., ESALA, A.L., SIVONEN

K., HIISVIRTA, L. (1988). Removal of cyanobacterial toxins in

water treatment processes: Laboratory and pilot scale

experiments. Toxicity Assessment: An International Journal, 3,

643-656.

KIMA, I. & HYUN, C. (2006) Comparative evaluation of the

alkaline comet assay with the micronucleus test for genotoxicity

monitoring using aquatic organisms, Ecotoxicology and

Environmental Safety, 64, 288–297.

KIRSCH, G.E., ALAM, M., HARTMANN, H.A.(1994)

Differential effects ofsulfhydryl reagents on saxitoxin and

tetrodotoxin block of voltage-dependent Na channels. Biophys. J.

67, 2305–2315.

KITANO, Y., KANAMORI,N., YOSHIOKA, S. (1976)

Adsorption of zinc and copper ions on calcite and aragoniteand

its influence on the transformationof aragonite to calcite.

Geochemical Journal, 10, 175-179.

KOJO, S.(2004) Vitamin C: basic metabolism and its function

as an index of oxidative stress, Curr. Med. Chem. 11, 1041–1064.

KOUADIO, J.H., DANOB, S.D., MOUKHA, S., MOBIO,

T.A., CREPPY, E.E.(2007) Effects of combinations of Fusarium

mycotoxins on the inhibition of macromolecular synthesis,

malondialdehyde levels, DNA methylation and fragmentation,

and viability in Caco-2 cells. Toxicon 49, 306-317.

KUMAR,M.N.V.R. (2000). A review of chitin and chitosan

applications. Reactive Func. Polymers. 46, 1-27.

LAGOS, N., ONODERA, H., ZAGATTO, P.A.,

ANDRINOLO, D., AZEVEDO, S.M.F.Q., OSHIMA, Y.(1999)

The first evidence of paralytic shellfish toxins in the freshwater

cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii, isolated from

Brazil. Toxicon 37, 1359-1373.

LANÇAS, F. M. (2004) Extração em Fase Sólida (SPE), São

Carlos: Rima. 96p.

LAW, M., ELMORE, S. (2008) Mechanism of Cell Death. In:

SMART RC, HODGSON E (Eds). Molecular and Biochemical

Toxicology, John Wiley, New York, pp 287-318.

LAWRENCE, J. F., MÉNARD, C., CLEROUX, C. (1995)

Evaluation of prechromatographic oxidation for liquid

chromatographic determination of paralytic shellfish poisons in

shellfish. Journal of AOAC International, 78(2), 514-520.

LEDREUX, A. (2006) Optimisation d’un test sur lignee

cellulaire de neuroblastomes pour la detection de neurotoxines de

microalgues apport de techniques de chimie analytique.

Dissertation. Conservatoire National des Arts et Métiers – Paris.

MACHADO, V. G. (2005) Determinação do Potencial Tóxico

e Genotóxico de Líquido Percolado Gerado em Aterramento

Sanitário de Resíduos Sólidos Urbanos. Dissertação (Mestrado).

PPGEA-UFSC. Florianópolis, Brasil. 90p.

MAGALHÃES, V. F., SOARES, R. M., AZEVEDO, S.

M.F.O. (2001) Microcystin contamination in fish from the

Jacarepaguá Lagoon (Rio de Janeiro, Brazil): ecological

implication and human health risk, Toxicon, 39, 1077-1085.

MANGER, R.L., LEJA, L.S., LEE, S.Y., HUNGERFORD,

J.M., WEKELL, M.M. (1993) Tetrazolium-Based Cell Bioassay

for Neurotoxins Active on Voltage-Sensitive Sodium Channels:

Semiautomated Assay for Saxitoxins, Brevetoxins, and

Ciguatoxins. Anal Biochem 214, 190–194.

MANGER, R.L., LEJA, L.S., LEE, S.Y., HUNGERFORD,

J.M., KIRKPATRICK, M.A., YASUMOTO, T., WEKELL,

M.M. (2003) Detection of paralytic shellfish poison by rapid cell

bioassay: antagonism of voltage-gated sodium channel active

toxins in vitro. J AOAC Int 86, 540-543.

MATHUR, N. K.; NARANG, K. (1990) Chitin and Chitosan,

Versatile Polysaccharides fromMarine Animals. J. Chem. Educ.,

67, 11.

MATIAS, W. G. (1996) Etude des mecanismes moleculaire

d´action de l´acide okadaique, une toxine marine diarrheique, in

vivo et in vitro, These pour le Doctorat de l’Université de

Bordeaux II, Boedeaux –França. 178p.

MATIAS, W.G., CREPPY, E.E. (1998) 5-

Methyldeoxycytosine as a biological marker of DNA damage

induced by okadaic acid in vero cells. Environ Toxicol Water

Quality 13, 83-88.

MATIAS, W. G., CREPPY, E. E. (1998) Lipoperoxidação

Induzida pelo Ácido Okadaico: Uma toxina marinha,

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 4, 40 – 44.

MATIAS, W.G., TRAORE, A., BONINI, M, SANNI, A.,

CREPPY,E. E. (1999) Oxygen reactive radicals production in cell

culture by okadaic acid and their implication in protein synthesis

inhibition. Human & Experimental Toxicology 18, 634-639.

MATIAS, W.G. (1999) Algas: A problemática das

eflorescências de algas marinhas nocivas, Biotecnologia Ciência

& Desenvolvimento 8, 16-17.

MATTHIENSEN, A., YUNES, J. S. & CODD, G. A. (1999)

Ocorrência, Distribuição e Toxicidade de Cianobactérias no

Estuário da Lagoa dos Patos, RS, Rev. Brasil. Biol., 59(3), 361-

376.

MAZIN, A.L. (2009) Suicidal function of DNA methylation

in age-related genome disintegration. Ageing Research Reviews

8, 314–327.

MELO FILHO, L. C. (2006) Avaliação da ozonização como

pré ou pós-tratamento à filtração direta descendente na remoção

de cianobactérias e saxitoxinas. Tese (Doutorado). PPGEA-

UFSC. Florianópolis, Brasil. 263p.

MILLER, B., ALBERTINI, S., LOCHER, F., THYBAUD,

V., LORGE, E.(1997) Comparative evaluation of the in vitro

micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test:

industrial experience, Mutat. Res. 392, 45–59.

MILLER, B., POTTER-LOCHER, F. SEELBACH, A.,

STOPPER, H., UTESCH, D., MADLE, S. (1998) Evaluation of

the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro

chromosomal aberration assay: position of the GUM working

group on the in vitro micronucleus test, Mutat. Res. 410, 81–116.

MILLER, M.J., CRITCHLEY, M.M., HUTSON, J.,

FALLOWFIELD, H. J. (2001). The adsorption of cyanobacterial

hepatotoxins from water onto soil during batch experiments.

Water Res. 35, 1461 – 1468.

MILLER, M.J., HUTSON, J., FALLOWFIELD, H. J. (2005)

The adsorption of cyanobacterial hepatotoxins as a function of

soil properties. J. Water Health, 3(4), 339-347.

MILLERO, F., HUANG,F., ZHU, X., LIU, X., ZHANG, J.

(2001) Adsorption and Desorption of Phosphate on Calciteand

Aragonite in Seawater. Aquatic Geochemistry 7, 33–56.

MOLICA, R.J.R., OLIVEIRA, E.J.A., CARVALHO,

P.V.V.C., COSTA, A.P.N.S.F., CUNHA, M.C.C., MELO, G.L.,

AZEVEDO, S.M.F.O. (2005) Occurrence of saxitoxins and an

anatoxin-a(s)-like anticholinesterase in a Brazilian drinking water

supply. Harm. Algae 4, 743–753.

MØLLER, P., WALLIN, H.(1998) Adduct formation,

mutagenesis and nucleotide excision repair of DNA damage

produced by reactive oxygen species and lipid peroxidation

product. Mut. Res. 410, 271–290.

MONDARDO, R. I. (2004) Influência da Pré-Oxidação na

Tratabilidade das Águas Via Filtração Direta Descendente em

Manancial com Elevadas Concentrações de Microalgas e

Cianobactérias. Dissertação (Mestrado). PPGEA-UFSC.

Florianópolis, Brasil. 147p.

MONDARDO, R.I. (2009). Avaliação da filtração em

margem como pré-tratamento à filtração direta descendente na

remoção de células de cianobactérias e saxitoxinas. Tese

(Doutorado). PPGEA-UFSC. Florianópolis, Brasil. 308p.

NAIR, U., BARTSCH, H., NAIR, J. (2007) Lipid

peroxidation-induced DNA damage in cancer-prone

inflammatory diseases: A review of published adduct types and

levels in humans. Free Radical Biology & Medicine 43, 1109–

1120.

NEWELL-PRICE, J., CLARK, A.J.L., KING, P. (2000) DNA

Methylation and silencing of gene expression. Trends Endocrinol

Metab 11, 142-148.

ODOEMELAM, S. A., EDDY, N. O. (2009) Studies on the

se of Oyster, Snail andPeriwinkle Shells as Adsorbents for the

Removalof Pb

from Aqueous Solution. E-J.Chem., 6, 213-222.

OHE,T. (1996) Antigenotoxic activities of chitin and chitosan

as assayed bysister chromatid exchange. The Science of the Total

Environment 181, 1-5.

OLIVEIRA, J. S. (2002) Análise Sedimentar em Zonas

Costeiras: Subsídio ao Diagnóstico Ambiental da Lagoa do Peri –

Ilha de Santa Catarina-SC, Brasil. Dissertação (Mestrado).

Programa de Pós-Graduação em Geografia-UFSC. Florianópolis,

Brasil. 154p.

ONKAL, R., DJAMGOZ, M.B.A. (2009) Molecular

pharmacology of voltage-gated sodium channel expression in

metastatic disease: Clinical potential of neonatal Nav1.5 in breast

cancer. Eur J Pharm 625, 206–219.

ORR P.T., JONES, G.J.,HAMILTON,G.R.(2004). Removal

of saxitoxins from drinking water by granular activated carbon,

ozone and hydrogen peroxide - implications for compliance with

the Australian drinking water guidelines, Water Res. 38, 4455–

4461.

OSHIMA, Y., LUKAS, B. & HUMMERT, C. (2003)

Analytical methods for paralytic shellfish poisons, in:

HALLEGRAEFF, G.M., ANDERSON, D.M., CEMBELLA,

A.D. (Eds.), Manual on Harmful Marine Microalgae,

Intergovernmental Oceanographic Commission Manuals and

Guides, Paris, France – UNESCO, pp.191–209.

PACKHAM, G., CLEVELAND, J.L. (1994) Ornithine

decarboxylase is a mediator of c-Myc-induced apoptosis. Mol

Cell Biol 14, 5741–5747.

PENZOTTI, J.L., FOZZARD, H.A., LIPKIND, G.M.,

DUDLEY JR, S.C. (1998) Differences in Saxitoxin and

Tetrodotoxin Binding Revealed by Mutagenesis of the Na+

Channel Outer Vestibule. Biophysical J. 75, 2647–2657.

PEREIRA, P., ONODERA, H., ANDRINOLO, D., FRANCA,

S., ARAÚJO, F., LAGOS, N., OSHIMA, Y.(2000) Paralytic

shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium

Aphanizomenon flos-aquae, isolated from Montargil reservoir,

Portugal. Toxicon 38, 1689-1702.

PREVARSKAYA, N., SKRYMA, R., BIDAUX, G.,

FLOURAKIS, M., SHUBA, Y. (2007) Ion channels in death and

differentiation of prostate cancer cells. Cell Death Differ 14,

1295–1304.

REN, S., FRYMIER, P.D. (2004) Reducing bioassay

variability by identifying sources of variation and controlling key

paramters in assay protocol. Chemosphere 57, 81-90.

REIN, T., DEPAMPHILIS, M.L., ZORBAS, H. (1998)

Identifying 5-methylcytosine and related modifications in DNA

genomes. Nucleic Acids Res 26, 2255-2264.

RESSOM, R., SOONG F. S., TURCZYNOWICZ, L.,

FITZGERALD J. , SAADI, O. E., RODER, D., MAYNARD,T.,

FALCONER, I.(1994) Health Effects of Toxic Cyanobacteria

(blue-green algae), Canberra, Australia: Australian Government

Publishing Service, 108p.

RIBEIRO, L. R., SALVADORI, D. M. F., MARQUES, E. K.

(2003) Mutagênese Ambiental. Ed. ULBRA,Canoas. 356p.

ROBERTSON, A., STIRLING, D., ROBILLOT, C.,

LLEWELLYN, L., NEGRIA.(2004) First report of saxitoxin in

octopi, Toxicon 44, 765–771.

ROSA, C. E., SOUZA, M.S., YUNES, J.S. , PROENÇA,

L.A.O., NERY, L.E.M., MONSERRAT J.M.(2005)

Cyanobacterial blooms in estuarine ecosystems: Characteristics

and effects on Laeonereis acuta (Polychaeta, Nereididae), Marine

Pollution Bulletin, 50, 956–964.

ROY S., LADO, B. H., KHANNA, S., SEN, C.K. (2002)

Vitamin E sensitive genes in the developing rat fetal brain: a

high-density oligonucleotide microarray analysis. FEBS Letters

530, 17-23.

RYU, M., KIM, H., LIM. M., YOU K., AHN, J. (2010).

Comparison of Dissolution and Surface Reactions Between

Calcite and Aragonite in L-Glutamic and L-Aspartic Acid

Solutions. Molecules, 15, 258-269.

SALOZHIN, S.V., PROKHORCHUK, E.B., GEORGIEV,

G.P. (2005) Methylation of DNA - One of the Major Epigenetic

Markers. Biochemistry (Moscow) 70, 525-532.

SAR, E.A., FERRARIO, M. E. & REGUERA, B. (2002)

Floraciones Algales Nocivas en el Cono Sur Americano, Instituto

Español de Oceanografia, 311p.

SCHWARZENBACH, R. P; GSCHWEND, P.M.;

IMBODEN, D.M. (2003) Environmental Organic Chemistry, 2º

Ed., USA. pp.275 – 330.

SELARU FM, DAVID S, MELTZER SJ, HAMILTON JP

(2009) Epigenetic events in gastrointestinal cancer. Am J

Gastroent 104, 1910-1912.

SENS, M.L., MELO FILHO, L.C., MONDADO, R.I.,

PROENÇA, L.A.O. (2005) Ozonização: uma alternativapara o

tratamento de águacom cianobactérias. Rev. Ciên. Tecnol. 13, 47-

54.

SILVA, C. R., LEMIESZEK, M.B., FERREIRA, J.F,

RIBEIRO, R.H.C., CREPPY, E., MATIAS, W.G.(2001)

Genotoxicidade do ácido ocadáico: indução de micronucleo em

mexilhões Perna perna. Biotecnologia Ciência &

Desenvolvimento 20, 56-59.

SILVA, J., ERDTMANN, B. & HENRIQUES, J. A.(2003)

Genética Toxicológica, Porto Alegre, RS: Alcance, 424p.

SILVA, A.S. (2005) Avaliação da capacidade de remoção de

saxitoxinas por diferentes tipos de carvão ativado em pó (CAP)

produzidos no Brasil. Dissertação (Mestrado). UnB. Brasília,

Brasil. 115p.

SILVA, D. (2007) Residuo sólido da malacocultura:

caracterização e potencialidade de utilização de conchas de ostras

(Crassostrea gigas) e mexilhão (Perna perna). Dissertação

(Mestrado). PPGEA-UFSC. Florianópolis, Brasil. 135p.

SILVEIRA, A. A. (2003) Remoção de Algas da Água da

Lagoa do Peri Através de Filtração Direta Descendente com Pré-

Filtração Mecânica em Micropeneiras. Dissertação (Mestrado).

PPGEA-UFSC. Florianópolis, Brasil. 117p.

SIVONEN, K., JONES, G. (1999) Cyanobacterial toxins, in:

CHORUS, I., BARTMAN, J. (Eds.) Toxic cyanobacteria in

water: A guide to their public health consequences, monitoring

and management. E&FN Spon, London, pp. 55-124.

SMART, R.C., HODGSON, E. (Eds). (2008) Molecular and

Biochemical Toxicology. John Wiley, New York, pp. 287-318.

SNYKERS, S., VINKEN, M., ROGIERS, V., VANHAECKE,

T.(2007) Differential role of epigenetic modulators in malignant

and normal stem cells: a novel tool in preclinical in vitro

toxicology and clinical therapy. Arch Toxicol 81, 533–544.

STACEY, G., VIVIANI, B. (2001) Cell Culture Models for

Neurotoxicology. In: STACEY, G., DOYLE, A., FERRO, M.

(Eds) Cell Culture Methods for in vitro Toxicology, Kluwer

Academic Publishers, Netherland. pp. 115-130.

SOLODOVNIK. T. (2006)Application of chitin containing

sorbents fortreatment of water solutions. In: LOUREIRO, J.M.

AND KARTEL M.T. (eds.), Combined and Hybrid Adsorbents,

Springer-London. pp.275–280.

SZYF, M. (2003) DNA methylation and cancer therapy. Drug

Resistance Updates 6, 341–353.

TUCCI, A., SANT’ANNA, C.L.(2003) Cylindrospermopsis

raciborskii (Woloszynska) Seenayya & Subba Raju

(Cyanobacteria): variação semanal e relações com fatores

ambientais em um reservatório eutrófico, São Paulo, SP, Brasil.

Rev Brasil Bot. 26, 97-112.

TUNDISI, J. G. (2003) Ciclo Hidrológico e Gerenciamento

Integrado, Gestão das Águas, pp.31-33.

VALKO, M., RHODES, C.J., MONCOLA, J., IZAKOVIC,

M., MAZURA, M.(2006) Free radicals, metals and antioxidants

in oxidative stress-induced cancer. Chem. Bio. Interactions 160,

1–40.

WAN, H., WILLIAMS, R. L., DOHERTY, P. J.,

WILLIAMS, D. F.(1994) Cytotoxicity evaluation of Kevlar and

silicon carbide by MTT assay.Journal of Material Science:

Materials in Medicine. v.5, p.411-415.

WORLD HEALTH ORGANIZATION(1998) Guidelines for

drinking-water quality. Health Criteria and other supporting

information. 2º ed. Geneva: World Health Organization, pp. 13-

14. Addendum to v. 2. Disponível em:

http://www.who.int/water_sanitation_health/dwq/gdwq2v1/en/ind

ex4.html. Acesso em 19/04/2008.

YUNES, J. S., SALOMON, P. S., MATTHIENSEN, A.,

BEATTIE, K. A., RAGGETT S. L., CODD G. A. (2002) Toxic

blooms of cyanobacteria in the Patos Lagoon Estuary, southern

Brazil. J. Aquatic Ecosystem Health 5(4), 223-229.

YUNES, J. S. (2003) Programa AGUAAN - Agilização do

gerenciamento e utilização de águas com algas nocivas,

Biológico, São Paulo, 65(1-2),117-119.

ZIPPER, H., BRUNNER, H., BERNHAGEN, J.,

VITZTHUM, F. (2004). Investigations on DNA intercalation and

surface binding by SYBR Green I, its structure determination and

methodological implications. Nucleic Acids Res 32 (12),

e103(10p.).

ZHONG, B., GU, Z., WHONG, W., WALLACE, W.E.,

ONG, T. (1991) Comparative study of micronucleus assay and

chromosomal aberration analysis in V79 cells exposed to

ethylene oxide, Teratogenesis Carcinogenesis Mutagenesis 11,

227–233.

CAPÍTULO VIII

8. APÊNDICES

A1. CURVA DE CALIBRAÇÃO DA STX

Método analítico empregado: AOAC, 2005.

As análises foram realizadas por HPLC-FD e as condições

de análise já foram descritas na Tabela 3.1. Foram definidos 6

pontos para a construção da curva de calibração e cada ponto foi

injetado em triplicata. Os valores das áreas dos picos de injeção

estão apresentados na Tabela A1 a seguir. A partir do cálculo das

médias das áreas e desvios padrões, foi possível construir a curva

de calibração (Figura A1) que foi empregada para a quantificação

da STX nos testes de adsorção.

Tabela A1: Dados para a construção da curva de calibração da STX.

[STX]

(µg/L)

Área

Inj. 1

Área

Inj. 2

Área

Inj. 3

Média

Áreas

Desvio

Padrão

1,25

504

346

426

425

79,0

2,5

801

655

725

727

73,0

5,0

2519

2622

2594

2578

53,3

9727

6246

7474

7816

1765,5

42006

39401

42462

41290

1651,4

100

85048

79568

86437

83684

3631,9

Figura A1: Curva de calibração do método empregado para

quantificação da STX nos testes de adsorção.

O limite de quantificação do método aplicado foi definido

como sendo o primeiro ponto da curva de calibração, ou seja

1,25µg/L. Em uma posição conservadora, o limite de detecção do

método foi definido como sendo o mesmo valor do limite de

quantificação, ou seja 1,25µg/L. A Figura A2 a seguir mostra o

cromatograma de um ponto da curva de calibração da STX.

Figura A2: Cromatograma do padrão da STX 50 µg/L.

A2. CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA QUANTIFICAÇÃO DA

CITOSINA E 5-METILCITOSINA

Método analítico empregado: baseado em Kouadio et al. 2007.

As análises foram realizadas por HPLC-UV e as condições

de análise já foram anteriormente. Foram definidos 07 pontos

para a construção da curva de calibração. Foi empregado uma

mistura das bases do DNA citosina (dC), timina (dT), guanina

(dG) e adenina (dA), e a base metilada de interesse a 5-

metilcitosina (m

dC). Os valores das áreas dos picos de injeção

estão apresentados na Tabela A2 a seguir. A partir do cálculo das

médias das áreas e desvios padrões, foi possível construir a curva

de calibração (Figura A3) que foi empregada para a quantificação

da citosina e 5-metilcitosina nos ensaios de metilação do DNA.

Tabela A2: Dados para a construção da curva de calibração da citosina

e 5-metilcitosina.

Área dos picos

Pontos da curva de calibração (µg/mL)

Base

(mi

1,00

3,125

6,25

12,5

100

3,150

39277

122251

221921

414131

810463

1618943

3306425

4,233

21370

70158

127373

241603

473479

950606

1945405

6,416

38622

130437

237316

448425

879381

1763639

3593933

8,366

37866

136040

252152

465695

921234

1888361

3844825

19,33

36255

101584

204276

395710

781258

1599636

3282842

Figura A3: Curva de calibração do método empregado para

quantificação da citosina e 5-metilcitosina no ensaio de metilação do

DNA.

O limite de quantificação do método aplicado foi

definido como sendo o primeiro ponto da curva de calibração, ou

seja 1,0µg/mL. Em uma posição conservadora, o limite de

detecção do método foi definido como sendo o mesmo valor do

limite de quantificação, ou seja 1,0µ g/mL. A Figura A4 a seguir

mostra o cromatograma de um ponto da curva de calibração com

a mistura dos padrões.

Figura A4: Cromatograma da mistura dos padrões empregados para a

quantificação da citosina e 5-metilcitosina (12,5µg/mL).

A3. CURVA DE CALIBRAÇÃO DO MALONDIALDEÍDO

Método analítico empregado: baseado em Ouanes et al. 2007.

As análises foram realizadas por HPLC-FD e as condições

de análse já foram anteriormente.. Foram definidos 07 pontos

para a construção da curva de calibração no malondialdeído

(MDA). Os valores das áreas dos picos de injeção estão

apresentados na Tabela A3 a seguir. A partir do cálculo das

médias das áreas, foi possível construir a curva de calibração

(Figura A5) que foi empregada para a quantificação da citosina e

5-metilcitosina nos ensaios de metilação do DNA.

Tabela A3: Dados para a construção da curva de calibração MDA.

[MDA] (nM)

Área (µ V.S)

3,8

5749

7,5

15024

26237

44678

119545

120

265894

240

507742

O limite de quantificação do método aplicado foi

definido como sendo o primeiro ponto da curva de calibração, ou

seja 3,8nM. Em uma posição conservadora, o limite de detecção

do método foi definido como sendo o mesmo valor do limite de

quantificação, ou seja 3,8nM. A Figura A6 a seguir mostra o

cromatograma de um ponto da curva de calibração do padrão do

MDA.

Figura A5: Curva de calibração do método empregado para

quantificação do MDA no ensaio de lipoperoxidação.

Figura A6: Cromatograma do padrão do MDA(60nM - tR: 4,58 min).

A4. CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE

PROTEÍNAS

Método analítico empregado: Bradford, 1976.

As análises foram realizadas por espectrometria de

ultravioleta (UV) e as condições de análise foram descritas

anteriormente. Foram definidos 07 pontos para a construção da

curva de calibração de dosagem da proteína nas células. Como

padrão foi empregada a albumina bovina (BSA). Os valores das

absorbância no comprimento de onda de 595nm estão

apresentados na Tabela A4 a seguir. A partir dos valores de

absorbância foi possível construir a curva de calibração (Figura

A7) que foi empregada para a quantificação da proteína das

amostras celulares noensaio de lipoperoxidação.

Tabela A4: Dados para a construção da curva de calibração BSA.

[BSA] µg/mL

DO 595nm

0,31

0,4817

0,63

0,4597

1,25

0,5339

2,50

0,5995

5,00

0,7405

10,00

1,0544

20,00

1,3898

Figura A7: Curva de calibração do método empregado para

quantificação da proteína BSA no ensaio de lipoperoxidação.

A5. ESQUEMA DE DILUIÇÃO EM CASCATA DA STX NAS PLACAS

DE 96 POÇOS PARA OS ENSAIOS CITOTÓXICOS DO MTT

A Figura A8 a seguir apresenta como foi feito o

protocolo de diluição em cascata do ensaio citotóxico. Para os

ensaios com as células Vero, não foram realizadas as diluições

indicadas no poço verde e laranja, conforme legenda na figura.

Figura A8: Esquema de diluição em cascata da STX na microplaca de

96 poços para os ensaios citotóxicos do MTT.

A6. ESQUEMA DE DILUIÇÃO EM CASCATA DA STX NAS PLACAS

DE 24 POÇOS PARA OS ENSAIOS DO MICRONÚCLEO E

LIPOPEROXIDAÇÃO

A Figura A9 a seguir apresenta como foi feito o

protocolo de diluição em cascata do ensaio do micronúcleo e

lipoperoxidação. Para o ensaio do micronúcleo, foi empregada

como controle positivo a colchicina 0,3µM.

Figura A9: Esquema de diluição em cascata da STX na microplaca de

24 poços para os ensaios de lipoperoxidação e micronúcleo.

A7. ESQUEMA DE DILUIÇÃO EM CASCATA DA STX NAS PLACAS

DE 6 POÇOS PARA OS ENSAIOS DE FRAGMENTAÇÃO E

METILAÇÃO DO DNA

A Figura A10 a seguir apresenta como foi feito o

protocolo de diluição em cascata do ensaio de fragmentação e

metilação do DNA.

Figura A10: Esquema de diluição em cascata da STX na microplaca de

6 poços para os ensaios de fragmentação e metilação do DNA.

A8. ARTIGO 1: SUBMETIDO À REVISTA CIENTÍFICA ARCHIVES

OF TOXICOLOGY

SAXITOXIN INDUCES GENOTOXICITY AND

APOPTOSIS IN NEURO-2A CELLS

Silvia Pedroso Melegari

1,2

, Cátia Regina Silva de Carvalho

Pinto

, Elie Gabriel Augier

, Serge Moukha

2,3

, Edmond Ekué

Creppy

and William Gerson Matias

1. Laboratório de Toxicologia Ambiental, LABTOX – Depto. de Engenharia

Sanitária e Ambiental- Campus Universitário- CEP: 88040-970 –

Florianópolis/SC - Brasil.

2. Laboratoire de Toxicologie et d’Hygiène Appliquée, UFR des Sciences

Pharmaceutiques, Université Victor Segalen Bordeaux 2- 146 rue Léo

Saignat, 33076 Bordeaux cedex, France

3. INRA- Centre de Recherche de Bordeaux Aquitaine, MICA, Unité de

Mycologie et de Sécurité des Aliments, Domaine de la grande Ferrade 71

avenue Edouart Bourleaux BP 81, 33883 Villenave d’Ornon Cedex, France

* Corresponding Author. Address: Laboratório de Toxicologia Ambiental,

LABTOX – Depto. de Engenharia Sanitária e Ambiental- Universidade

Federal de Santa Catarina – Campus Universitário- CEP: 88040-970 -

Florianópolis - SC - Brasil - Tel.: +55 48 37217742 - Fax: +55 48 37219823.

E-mail address: will@ens.ufsc.br (W.G. Matias).

Abstract: Saxitoxin (STX) is a potent neurotoxin of the PSP

group. The effects of STX on ion channels are known, however

its interferences with other cellular macromolecules and the

consequences of such interferences are not fully documented. It is

essential the evaluation of effects of STX and the determination

of biological mechanisms of these effects. The present

experiments evaluated the cytotoxic response of STX (0.5 to 325

nM) to discriminate the pathways which lead to cell death of

mouse neuroblastoma Neuro-2A cells, using the cell viability

determined by MTT test, DNA fragmentation assay and DNA

methylation. The EC50 found from N2A cell line were of

1.112nM (R

=0.997) in absence of O/V and 18.22nM

=0.9904) in presence of O/V. The data of DNA fragmentation

showed which the STX induces indirectly to cell apoptosis. The

minor dose of STX (0.75nM) presented DNA fragments in order

of 500-2000pb. From the dosage of methylation of cytosine

residues (m5dC), it found high values of m5dC (4.43±1.41 %) in

highest concentration of STX (3,0nM). The toxic effect of STX

probably induced this significant disturbance of cellularregulation

systems and the results showed which STX affects important

biological mechanisms at both genetic and epigenetic levels, and

suggest that the systems of individuals exposed to STX during

harmful algal bloom (HAB) events may be at risk.

Keywords: saxitoxin, cytotoxicity, genotoxicity, apoptosis,

Neuro-2A cells.

1. INTRODUCTION

The frequency of blooms of toxic cyanobacteria in fresh

water for human consumption is evident in worldwide literature

probably due to increase environmental pollution and global

warming (Costa et al. 2006; Berger et al. 2006; Hoeger et al.

2004; Lagos et al. 1999; Pereira et al. 2000; Tucci and Sant’anna

2003; Molica et al. 2005). Abundant growth of cyanobacteria in

water reservoirs increasingly creates severe practical problems to

those in charge of water supply to populations. Thus

cyanobacterial toxins, or "cyanotoxins", have become a human

health concern. Cyanotoxins consist in diverse groups of

chemical structures, each of which showing specific toxic

mechanisms (Bartram et al. 1999; Carvalho Pinto-Silva et al.

2003) and toxic effects (Sivonen and Jones 1999).

Saxitoxin (STX) is a neurotoxin classified in the Paralytic

Shellfish Poisoning (PSP) toxins group. Is has been identified for

the first time in fresh water processing plant in relation to

Aphanizomenon flos-aquae (Ikawa et al. 1982). Beside this

species, other species of cyanobacteria (Cylindrospermopsis

raciborskii, Lyngbya and Anabaena) can synthesize the STX

(Tucci and Sant’anna 2003; Sivonen and Jones 1999; Bouaïcha

2001). The fast action of STX, blocking sodium channels in nerve

axons and causing loss of sensation and paralysis, renders this

toxin highly neurotoxic and potentially lethal. The LD50 in

mouse is 8-10µg/kg i.p., 3.4µg/kg i.v. and 260µg/kg oral

(Falconer 2008). The data of cytotoxic and genotoxic effects of

STX are very scarce. For example, there is neither evidence of

human health effects caused directly by consumption of water

which contains saxitoxins – producing cyanobacteria (Fitzgerald

et al, 1999), there are no data for the concentrations of saxitoxin-

type neurotoxins in drinking water, and there were no reports of

neurotoxic symptoms in the town population when neurotoxicity

was detected in the drinking water supply (Falconer and

Humpage, 2005). Recent data published in “International

Symposium on Cyanobacterial Harmful Algal Blooms” (ISOC-

HAB), organized by the United States Environmental Protection

Agency (USEPA) reported which there are no data for subchronic

exposure, reproductive, teratogenic or carcinogenic effects of

STX (Falconer, 2008).

The mouse bioassay is an efficient test methods that can

respond to toxins in proportion to total potency, however, ethical

constraints, associated costs, and mandated restrictions have

contributed toward the need for complementary and alternative

bioassays (Manger et al. 2003). The in vitro assays are being

proposed for toxicological evaluation of different toxins as

alternative to the mouse bioassay (Jellett et al. 1995; Manger et

al. 2003). The study of the cellular responses can contribute to

better understanding the action mechanisms of different toxins.

Several cell-based assays are being routinely used to study the

activity of bioactive compounds. These assays can affect cellular

homeostasis leading to several types of observable effects such as

physiological disruptions of neurotransmission, stimulation of

cell growth or cell mortality (Cañete and Diogène 2008; Stacey

and Viviani 2001). The cytotoxicity assay is useful tool for the

determination of EC50 (the concentration of agonist required to

provoke a response halfway between the baseline and maximum

responses) and the evaluation the cellular damage in the

mitochondria and/or other cell compartments (Cotran et al. 2000).

The use of some antagonist substances in these assays may allow

shorter incubation periods as compared to required time of other

in vitro methods (Manger et al. 2003). The DNA fragmentation

permits detection of apoptotic cell death beside possible necrotic

cell death. The main advantages of this method are: applicable to

all cell types, quick setup and the possibility to detect cumulative

apoptosis (ICMS 2009; Cotran et al, 2000). The DNA

methylation rate (i.e., percent of 5-methyl cytosine (m5dC)

versus the total concentrations of cytosine (dC) + m5dC) induced

from several toxicants with alteration of gene expression and

regulation of cellular division (Matias and Creppy 1998), and is

also capable of modulating (silencing) the production of

functional gene products (Brusick et al. 2007) or increasing

expression of several oncogenes. Elucidation of the toxicity

mechanisms, and as such also, the target of toxicity, could

provide a better prognosis of potential toxicity in vivo, and result

in improved in vitro-to-in vivo extrapolations (Snykers et al.

2007).

The present experiments evaluated of cytotoxic effects of

STX in a mouse neuroblastoma cell line, Neuro-2A, to

discriminate the pathway triggering cell death (DNA

fragmentation and apoptosis, DNA methylation and deregulation

of cell division), using a range of concentrations which are

cytotoxic to these cells as determined by MTT test (indicative of

mitochondrial integrity).

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Cell Lines and Culture Medium

All the chemical products used for the cell culture were

provided by Sigma-Aldrich (Saint Quentin Falavier, France). The

neuro-2A cells (N2A - mouse neuroblastoma cells) were obtained

the National Museum of Nature, Paris – France (from the

European Collection of Cell Cultures catalog no. 89121404;

Porton Down, UK). The cells were grown in 75 cm

flasks, with

culture medium in RPMI 1640 medium supplemented with 10%

fetal bovine serum, 2% L-glutamine solution (200 mM), 1%

sodium pyruvate solution (100 mM) and 1% antibiotic solution

(10 mg/mL streptomycin and 1000U/ mL penicillin). The culture

was maintained at 37°C in a humidified air:CO

(95:5)

atmosphere (adapted from Humpage et al. 2007).

2.2. MTT Assay

Cell viability was determined using MTT [3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay.

The STX certified reference materials were obtained from the

Institute for Marine Biosciences (Halifax, NS, Canada). The cells

(105cells/mL) were seeded in 96-wells microplates with 5% of

and 37ºC for 24h. Then, the cell culture mediums were

removed and the cells were exposed to the concentrations of

STX, diluted in RPMI 1640 (ranging from 0.5 to 325 nM - final

concentration in the well). The cells were tested in presence and

absence of antagonist. The antagonists, veratridine 0.05 mM and

ouabain 0.5 mM (O/V), and the STX concentration were added

and re-incubated for 24 h. Each concentration of STX was

evaluated in triplicates. A negative control group (RPMI 1640

without STX and without O/V) and a positive control group

(RPMI 1640 with O/V) were tested in triplicates. After

incubation, the supernatant was discarded and 200 µL of MTT

solution (0.5 mg/mL in RPMI-1640) was added and re-incubated

for an additional 2h. After incubation, the MTT solution was

discarded and 200 µL of DMSO was added to each well to

dissolve the formazan crystals formed. The plates were then

evaluated on a microplate reader (DYNATECH MR 4000,

France) at 560 nm. A positive O/V control was used to determine

the 0% response, since higher viability is expected in the

presence of effective inhibiting toxin concentrations. The 100%

response corresponds to the maximal viability obtained within the

range of concentrations tested or the negative control. Cell

viability is shown graphically as percent of the control value

(adapted from Humpage et al, 2007).

2.3. Exposition of N2A cells to SXT and Extraction of DNA

The N2A cells (2x10

cells/mL) were seeded in 6-wells

microplates of and treated with 0.75, 1.5 and 3.0 nM of STX in

RPMI 1640 medium for 24 h at 370C. A positive control has

been performed using Ochratoxin A (Creppy et al. 2004). After

treatment, the DNA was isolated with Wizard® Genomic DNA

Purification Kit – Promega, France. The culture medium was

removed and the cells were harvested by scraping with 1 mL of

PBS (Sigma). The suspension of cells from each plate was placed

in a microcentrifuge tube and was centrifuged at 16000xg for 10

sec to pellet the cells. The supernatant was discarded and 600 µL

of Nuclei Lysis Solution and 3mL Rnase Solution were added on

each tube followed by incubation at 37°C for 30 min. At the room

temperature, 200 µl of Protein Precipitation Solution was added

and the tubes were inverted 4–5 times to homogenize the mixture.

The samples were placed on ice bach for 5 min. The tubes were

centrifuged at 16000xg for 4 minutes. The supernatant containing

DNA was removed and the DNA was precipitated with 600 µL of

isopropanol and centrifuged for 1 minute at 16000×g at room

temperature. The isopropanol was discarded and 600 µl of

ethanol 70% was added and the tube was gently inverted several

times to wash the DNA and centrifuged for 1 minute at 16000×g

at room temperature. The ethanol 70% was discarded and the

DNA was dried at room temperature. The DNA dried was re-

dissolved in 100µL of DNA Rehydration Solution. Total DNA

was quantified using the ratio of absorbance at 260/280 (adapted

from Kouadio et al. 2007).

2.4. DNA fragmentation assay in agarose gel electrophoresis

Conventional agarose gel electrophoresis evaluated

qualitatively the DNA fragmentation. 10 µg of purified DNA of

N2A cells treated with STX was carried out by electrophoresis in

agarose gel 1.5% prepared in TBE buffer (Tris 44.5 mM, boric

acid 44 mM and EDTA 50 mM) containing ethidium bromide.

The run was carried out in electrophoresis buffer under 70 V

during 2h (Kouadio et al, 2007).

2.5. Evaluation of DNA methylation

For determination of 5-methyldeoxycytosine (m

dC), 10µ g

of purified DNA of N2A cells treated with STX was dissolved in

10µL of water Milli-Q and incubated at 100°C for 2 min. Then,

the samples were treated with 1 µL of 250 mM potassium acetate

buffer (pH 5.4), 1 µL of 10 mM zinc sulphate, and 10µL of

nuclease P1 (0,5 U/mL; Sigma, France) overnight at 37°C. After

incubation, the samples were treated with 2µL 0.5 M Tris–HCl

(pH 8.3), plus 2µL of the buffer containing alkaline phosphatase

(0.31 U/mL; Sigma, France). This mixture was incubated at 37°C

for 2h. Analysis of composition of DNA bases was performed on

an ICS chromatograph system (Instrumentation Consumable

Service, Toulouse, France) equipped with a UV Spectra Focus 3-

D detector at room temperature (HPLC-UV). HPLC-UV is the

most commonly used chromatographicmethod for analysis of the

genome-wide methylation and the advantages of this method is

yourrepeatabilit y and sensitivity (Havlis and Trbusek, 2002). The

column employed was a phenylnucleosyl column (250×3.4 mm).

Elution was carried out with 6.5mM (NH

pH 3.95 and 4%

methanol (v/v) at a flow rate of 1mL/min. Eluates were

monitored at 254nm. The samples were diluted to 1/4 and the

injection volume was 20µL. Standard DNA bases (dC, dT, dG,

dA – Sigma-Aldrich / 100µg/mL each) and m

dC (10µg/mL)

were used for quantification. The results in µg/mL were used to

calculate the % rate of m5dC as compared to [m

dC+dC]×100.

These rates were presented as mean of the two independents

experiments ± S.E.M., prior to statistical analysis (Kouadio et al.

2007).

2.6. Statistical analysis

The results are presented as mean±S.E.M. and the

correlation factor (R

) was calculated by the GraphPad Prism®

Software, through a sigmoid of variable slope. The EC50 was

estimated of this equation by GraphPad Prism® Software.

3. RESULTS

3.1. Influence of STX on cell viability: MTT Assay and

Determination of EC50

For determination of EC50, a scale of eight concentrations

of STX (to “without O/V” condition 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0, 16.0,

32.0 and 64.0 nM and to “with O/V” condition 2.53, 5.07, 10.15,

20.3, 40.6, 81.25, 162.25 and 325 nM) has been applied in five

different experiments, in the presence and absence of O/V. After

exposure of N2A cells to STX and analyze of the data, a curve of

absorbance versus STX concentration was plotted for both cases

(with and without O/V). The results are shown in Figure 1.

A significant difference was obtained on curves in both

conditions “with O/V” and “without O/V” (Fig. 1). In “with O/V”

condition, high cell viability could be observed, and a dose-

dependent increase of viability values is verified, which are

confirmed by negative controls. In the curve normalized with

increasing the STX concentration, the “without O/V” condition, a

dose-dependent reduction of cell viability values is observed with

a large standard deviation. However this standard deviation

values obtained were consistent with some previously reported

values if one takes into account the overall precision of the cell

bioassay of about 20-30% (Humepage et al. 2007). The results of

MTT test demonstrate which exposure of N2A cells to different

concentrations of STX leads to a dose-dependent reduction of the

metabolic activity in mitochondria, which parallels cell viability,

and an opposite behavior in verified in presence of an

antagonistic compounds to the STX.

The EC50’s of STX were calculated as 1.112nM (R

0,997) in “without O/V” condition and as 18,22nM (R

= 0,9904)

in “with O/V” condition. These EC50’s of STX, from both

conditions, are particularly low and it could be concluded which

this cell line of neural source is very sensitive to STX and it could

be considered as a good bioindicator to study the action

mechanisms in low concentrations of STX. We therefore

designed appropriate experiments with adapted concentrations to

be used for the other tests such as 0.75, 1.5 and 3.0 nM.

3.2. Effects of STX on DNA fragmentation in N2A cells

The agarose gel electrophoresis was performed to analyze

DNA fragments of N2A cells exposure to STX (Figure 2). In

fragmentation conditions as previous described, a weak

fragmentation was observed some times in the negative control. It

led us to perform a negative control without antibiotic (Figure

2/7). In these conditions, the negative control presented no

significant fragmentation. DNA fragments could be seen only in

cells treated with STX and with the positive control OTA.

We observed an increase in DNA fragmentation to the

samples treated with STX, as evidenced by the appearance of

DNA ladders. These results suggest the occurrence of apoptosis.

The sizes of DNA fragments appear to be between 500-1,500bp

in majority suggesting effectively the possibility of cell death by

apoptosis. There are evidences that suggest which the polyamines

act in the pathway of apoptotic cell death (Packham and

Cleveland 1994; Frostesjo et al. 1997). These results confirmed

which the STX, considered a cyclic guanidinium compound,

induce also the apoptotic cell death.

3.3. Effects of STX on DNA methylation in N2A cells

The methylation of deoxycytosine (%m

dC) from purified

DNA of N2A cells treated with STX was evaluated by HPLC-UV

method. After 24h of incubation, the N2A cells in culture

spontaneously produced 0.59±0.02% of m

dC. This value was

considered the control value without STX. Ochratoxin A (OTA

15 µM) employed as positive control increased the level of m

to 3.00±0.69%. The highest concentration of STX (3.0 nM)

increased the percent of m

dC to 4.43±1.41 % (Fig.3). It is

apparent which STX induces N2A cells to hypermethylation,

similar to positive control, suggesting that the STX is a potential

inductor in this specific effect. Modified DNA bases can

represent a minor fraction of the genome, but still exhibit strong

biological effects (Rein et al. 1998). For example, only 3–10% of

cytosines in mammalian genomes are modified to m

dC, but they

generally repress transcription when clustered at the 5’-ends of

genes (Frostesjo et al. 1997; Ehrlich et al. 1982).

4. DISCUSSION

The MTT assays led to an EC50 value of 1.112nM in

absence of O/V and 18.2nM in presence of O/V. The antagonist

substances present in the cell culture delay the onset of

cytotoxicity by 4 to 7 hours (Manger et al. 2003). Both Jellett et

al. (1995) and Manger et al. (1993) obtained approximate values

of EC50 of 100nM in the presence of O/V in N2A cells. Cañete

and Diogène (2008) reported the EC50 of 8.6 nM for STX in

N2A cell line, in the presence of O/V following 24h intoxication

time while they reported no response to STX in the same cells

without O/V treatment at similar STX concentrations of 0.91–

58.41 nM. The Gulf Coast Seafood Laboratory (GCSL) – Food

and Drug Administration (FDA), Alabama obtained an EC50 of

about 3nM with N2A cells, (Dickey personal communication, as

quoted by Cañete and Diogène, 2008).

Ren and Frymer (2004) suggest that all sources of

variation to each stage of cytotoxicy assays are adding in the end,

and they propose to decompose the protocol in some phases, each

phase holding its proper sources of variations. Ledreux (2006)

suggest that these variations in cytotoxicy assays are essentially

caused by parameters of biological nature (physiological state of

the cells, number of cells for well) and chemistries (variation of

concentrations, instability of toxins). Still, it was demonstrated

that the sensibility of cells to the toxin increase with the number

of cells replication (Alvito et al. 2000).

The discrepancy of our results and Cañete and Diogène

(2008)’ results can be explained for the difference in some in

treatment of N2A cells, in the culture and in the preparation of

cytotoxity assay. Cañete and Diogène (2008) used in the cell

culture a medium supplemented with 1% L-glutamine (200mM)

and 0,5% antibiotic solution (10 mg/mL streptomycin and

1000U/ mL penicillin), trypsin solution (0.5 g/L) to dislodge cells

from the flask and cell densities of approximately 35,000

cells/well in your assays with N2A cells (no information about

numbers of passage to cell replication). In the present study was

employed cell culture a medium supplemented with 2% L-

glutamine (200mM) and 1% antibiotic solution (10 mg/mL

streptomycin and 1000U/ mL penicillin), we used scrapers to

dislodge cells from the flask and cell densities of approximately

20,000 cells/well in your assays with N2A cells with passage

between 14-25 times.

Our results of MTT tests suggest which mitochondrial

damage may be involvedindirectly in the toxic mechanism of

STX. This intrinsic pathway may well trigger apoptosis as one

the final events. For a review see Law and Elmore (2008).

Interestingly our data show first, a reduction of mitochondrial

activity and second, the DNA fragments indicating likely

involvement of apoptosis as the main pathway leading to the

death of N2A cells.

There is no report in the literature on DNA fragmentation

induced by STX. Our data suggest which STX inducesto

indirectgenotoxic effect, on N2A cells because DNA fragments

laddering from 500 to 2000bp are observed with all

concentrations of STX including those lower than the EC50 value

(i.e., 0.75 nM). The data on DNA methylation induced by STX

indicate which lower concentrations induced elevated levels of

m5dC. Study with okadaic acid (OA), a marine toxin known to be

tumor promoter, showed which it induces hypermethylation in

several cells lines (Matias and Creppy, 1998). This study, in the

same research line, it would to evaluate the STX as a possible

tumor promoter.

The voltage-gated sodium channels (VGSCs) appear to be

strongly associated with metastatic potential, as evinced by their

high levels of expression in several aggressive carcinomas and

role in controlling various steps of the metastatic cascade (Onkal

and Djamgoz 2009; Catterall et al. 2007; Fiske et al. 2006).

However, the voltage-gated sodium channels blockers, as

neurotoxins, when used at appropriate concentrations, they can

also be medically useful in a variety of disorders, including

cancer (Prevarskaya et al. 2007; Onkal and Djamgoz 2009). An

example is TTX that has been shown to directly reduce the

invasiveness of the cells (Anderson et al. 2003) thus suggesting

sodium channels as a viable target for anti-cancer research. In

present study, STX inhibited the growth of Neuro 2A

neuroblastoma cells, indicating to interact in the same way that

TTX. However, studies have suggested that these toxins (both the

toxins are voltage-gated sodium channels blocker) bind

differently to the isoform-specific domainI Phe/Tyr/Cys location

(Kirsch et al. 1994). There are distinctions between the responses

of these toxins to the mutation of site Tyr 401, they suggested

that TTX presented an interaction might have a more intimate

nonbonded interaction with cell membrane that STX, protecting

this site from chemical modification and STX interacts more

strongly with the more extracellular residues (Penzotti et al.

1998).

Methylation of cytosine has both mutational and epigenetic

consequences on mammalian genomes (Szyf et al. 2003; Baylin

et al. 2001; Gonzalgo and Jones 1997) and the presence of

methylated cytosine may predispose some genes to a higher

frequency of deamination-induced transitions (Gonzalgo and

Jones 1997). Spontaneous deamination of m5dC→T is one of

pathways most important to that DNA methylation may trigger

mutagenesis. The epigenetic effects of m5dC may be important in

tumorigenesis, as they may involve not activation of proto-

oncogenes, but also inactivation of tumor suppressor genes

(Gonzalgo and Jones 1997).

The epigenetic effects of DNA methylation and their

relationship to the transcriptional silencing of genes involved in

cell growth regulatory systems are other important considerations

in defining key processes involved in tumorigenesis (Gonzalgo

and Jones 1997). Very recently, human diseases (other than

cancer) have been identified and are associated with epigenetic

properties and perturbations of these genes regulation and

methylation of some key genes (Newell-Price et al. 2000). It is

for instance known that in most of the tumour excised in surgical

treatment of cancers, the rate of DNA methylation is modified

and several deregulation of gene involved in cell cycle regulation

are modified in parallel to oncogenes activation and/or cancer

suppressing gene inactivation (Gonzalgo and Jones 1997;

Newell-Price et al. 2000; Bird 2002; Herman and Baylin 2003;

Feinberg and Tycko 2004; Selaru et al. 2009).

Following sequence of events, we can be proposed a link

between three processes evaluated for STX-induced genotoxicity:

the cells exposed to low concentrations of STX lead to indirect

mitochondrial and DNA injuries, as demonstrated by the

cytotoxic assay and DNA fragmentation respectively, evidencing

the apoptotic cell death pathway, and the same concentrations of

STX showed high levels of m5dC, and the hypermetilation DNA-

bases process lead to a inhibitor effect of tumor suppressor genes.

In conclusion, the present data confirm which N2A

neuroblastoma cell line is suitable for evaluation of toxicity of

STX and demonstrated which the main mechanisms triggering its

toxic effects involve the mitochondria and DNA lesions and

DNA modification including hypermethylation (considered as

epigenetic effect) leading possibly to cell death through an

apoptotic process or leading to mutagenesis and/or tumorigenesis

process and ours results suggests that the systems of individuals

exposed to STX during harmful algal bloom (HAB) events may

be exposed to theses effects.

Acknowledgements: This study was supported and financed in

part to “Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico” (CNPq) - Brazil. Silvia Pedroso Melegari thanks

for her fellowship in the Laboratory of Toxicology, University of

Bordeaux 2 (France).

5. REFERENCES

Alvito PC, Gallacher S, Gago A, Lawrence JF, Martins CA,

Pereira P, Sam Bento F, Franca F (2001) Application of the

mouse neuroblastoma bioassay to the study of PSP toxins from

Dinoflagellates and cyanobacteria; a comparison of data

generated by the MNB assay to pre and post column HPLC.

Harmful Algae Blooms 2000:257-260.

Anderson JD, Hansen, TP, Lenkowski, PW, Walls AM,

Choudhury IM, Schenck HA, Höll MG, Patel MK, Sikes RA,

Brown ML (2003) Voltage-gated sodium channel blockers as

cytostatic inhibitors of the androgenindependent prostate cancer

cell line PC-3. Mol Cancer Ther 2: 1149–1154.

Bartram J, Carmichael WW, Chorus I, Jones G, Skulberg OM

(1999) Introdution. In: Chorus I, Bartram J (Eds) Toxic

cyanobacteria in water. A guide to their public health

consequences, monitoring and management. E & FN Spon,

London, pp 12-24.

Baylin SB, Esteller M, Rountree MR., Bachman KE, Schuebel

K, Herman JG (2001) Aberrant patterns of DNA methylation

chromatin formation and gene expression in cancer. Hum Mol

Genet 10: 687–692.

Berger C, Ba N, Gugger M, Bouvy M, Rusconi F, Couté A,

Troussellier M, Bernard C (2006) Seasonal dynamics and toxicity

of Cylindrospermopsis raciborskii in Lake Guiers (Senegal,

WestAfrica). FEMS Microbiol Ecol 57:355–366.

Bird A (2002) DNA methylation patterns and epigenetic

memory. Genes Dev 16:6-21.

Bouaïcha N (2001) Impact sanitaire des toxines de

cyanobactéries en milieu d’eau douce. Revue Francaise des

Laboratoires 336:39-46.

Brusick DJ, Fields WR, Myhr BC, Doolittle DJ (2007)

Genetic Toxicology. In: Hayes AW (Ed) Principles and methods

of toxicology, Taylor & Francis, New York, pp 1179-1181.

Cañete E, Diogène J (2008) Comparative study of the use of

neuroblastoma cells (Neuro-2a) and neuroblastoma x glioma

hybrid cells (NG108-15) for the toxic effect quantification of

marine toxins. Toxicon 52:541–550.

Carvalho Pinto-Silva CR, Ferreira JF, Costa RHR, Belli Filho

P, Creppy EE, Matias, WG (2003) Micronucleus induction in

mussels exposed to okadaic acid. Toxicon 41:93-97.

Catterall WA, Cestèle S, Yarov-Yarovoy V, Yu FH, Konoki

K, Scheuer T (2007) Voltage-gated ion channels and gating

modifier toxins. Toxicon 49:124–141.

Costa IAS, Azevedo SMFO, Senna PAC, Bernardo RR, Costa

SM, Chellappa NT (2006) Occurrence of toxin-producing

cyanobacteria blooms in a Brazilian semiarid reservoir. Braz J

Biol 66:211-219.

Cotran RS, Kumar V, Collins T (2000) Adaptações, lesão e

morte cellular. In: Robbins Patologia estrutural e funcional. 6th

edn Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, pp 10-18.

Creppy EE, Chiarappa P, Baudrimont I, Borracci P, Moukha

S, Carratù MR (2004) Synergistic effects of fumonisin B1 and

ochratoxin A: are in vitro cytotoxicity data predictive of in vivo

acute toxicity? Toxicology 201:115-123.

Ehrlich M, Gama-Sosa MA, Huang LH, Midgett RM, Kuo

KC, McCune RA, Gehrke C (1982) Amount and distribution of

5-methycytosine in human DNA from different types of tissues or

cells. Nucleic Acids Res. 10:2709–2721.

Falconer IR, Humpage AR (2005) Health risk assessment of

cyanobacterial (blue-green algal) toxins in drinking water. Int. J.

Environ. Res. Public. Health. 2:43–50.

Falconer IR (2008) Health effects associated with controlled

exposures to cyanobacterial toxins. In: Hudnell HK (Ed)

Cyanobacterial Harmful Algal Blooms: State of the Science and

Research Needs, Springer Press, North Carolina, pp 607-612.

Feinberg AP, Tycko B (2004) The history of cancer

epigenetics. Nat Rev Cancer 4:143-153.

Fiske JL, Fomin VP, Brown ML, Duncan RL, Sikes RA

(2006) Voltage-sensitive ion channels and cancer. Cancer

Metastasis Rev 25:493–500.

Fitzgerald DJ, Cunliffe DA, Burch MD (1998) Development

of health alerts for cyanobacteria and related toxins in drinking-

water in South Australia. Environ Toxicol 14:203-209.

Frostesjo L, Holm I, Grahn B, Page AW, Bestor TH, Heby O

(1997) Interference with DNA methyltransferase activity and

genome methylation during F9 teratocarcinoma stem cell

differentiation induced by polyamine depletion. J Biol Chem

272:4359–4366.

Gonzalgo ML, Jones PA (1997) Mutagenic and epigenetic

effects of DNA methylation. Mutat Res 386:107–118.

Havlis J,Trbusek M(2002) 5 -Methylcytosine as a marker for

the monitoring of DNAmethylation J. Chromatogr. B 781, 373–

392.

Herman JG, Baylin SB (2003) Gene silencing in cancer in

association with promoter hypermethylation. N Engl J Med

349:2042-2054.

Hoeger SJ, Shawb G, Hitzfeldc BC, Dietrich DR (2004)

Occurrence and elimination of cyanobacterial toxins in two

Australian drinking water treatment plants. Toxicon 43:639–649.

Humpage AR, Ledreux A, Fanok S, Bernard C, Briand JF,

Eaglesham G, Papageorgiou J, Nicholson B, Steffensen D (2007)

Application of the neuroblastoma assay for paralytic shellfish

poisons to neurotoxic freshwater cyanobacteria: interlaboratory

calibration and comparison with other methods of analysis.

Environ Toxicol Chem 26:1512–1519.

ICMS - Institute of Cell and Molecular Science, Queen Mary's

School of Medicine and Dentistry, Queen Mary, University of

London, 4.

http://www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/uses/apoptosis/dnafra

gmentation/. Accessed 6 July 2009.

Ikawa M, Wegener K, Foxall TL, Sasner JJ (1982)

Comparaison of the toxins of the blue-green alga Aphanizomenon

flos-aquae with the Gonyaulaxtoxins. Toxicon 20:747-752.

Jellett JF, Stewart JE, Laycock MV (1995) Toxicological

evaluation of saxitoxin, neosaxitoxin, gonyautoxin II,

gonyautoxin II plus III and decarbamoylsaxitoxin with the mouse

neuroblastoma cell bioassay. Toxicol In Vitro 9:57–65.

Kirsch GE., AlamM and HartmannHA(1994) Differential

effects ofsulfhydryl reagents on saxitoxin and tetrodotoxin block

of voltage-dependentNa channels. Biophys. J. 67:2305–2315.

Kouadio JH, Danob SD, Moukha S, Mobio TA, Creppy EE

(2007) Effects of combinations of Fusarium mycotoxins on the

inhibition of macromolecular synthesis, malondialdehyde levels,

DNA methylation and fragmentation, and viability in Caco-2

cells. Toxicon 49:306-317.

Lagos N, Onodera H, Zagatto PA, Andrinolo D, Azevedo

SMFO, Oshima Y (1999) The first evidence of paralytic shellfish

toxins in the freshwater cyanobacterium Cylindrospermopsis

raciborskii, isolated from Brazil. Toxicon 37:1359-1373.

Law M, Elmore S (2008) Mechanism of Cell Death. In: Smart

RC, Hodgson E (Eds). Molecular and Biochemical Toxicology,

John Wiley, New York, pp 287-318.

Ledreux A (2006) Optimisation d’un test sur lignee cellulaire

de neuroblastomes pour la detection de neurotoxines de

microalgues apport de techniques de chimie analytique.

Dissertation. Conservatoire National des Arts et Métiers – Paris.

Manger RL, Leja LS, Lee SY, Hungerford JM, Wekell MM

(1993) Tetrazolium-Based Cell Bioassay for Neurotoxins Active

on Voltage-Sensitive Sodium Channels: Semiautomated Assay

for Saxitoxins, Brevetoxins, and Ciguatoxins. Anal Biochem

214:190–194.

Manger RL, Leja LS, Lee SY, Hungerford JM, Kirkpatrick

MA, Yasumoto, T, Wekell MM (2003) Detection of paralytic

shellfish poison by rapid cell bioassay: antagonism of voltage-

gated sodium channel active toxins in vitro. J AOAC Int 86:540-

543.

Matias WG, Creppy EE (1998) 5-Methyldeoxycytosine as a

biological marker of DNA damage induced by okadaic acid in

vero cells. Environ Toxicol Water Quality 13:83-88.

Mazin AL (2009) Suicidal function of DNA methylation in

age-related genome disintegration. Ageing Research Reviews

8:314–327.

Molica RJR, Oliveira EJA, Carvalho PVVC, Costa APNSF,

Cunha MCC, Melo GL, Azevedo SMFO (2005) Occurrence of

saxitoxins and an anatoxin-a(s)-like anticholinesterase in a

Brazilian drinking water supply. Harm Algae 4:743–753.

Newell-Price J, Clark AJL, King P (2000). DNA Methylation

and silencing of gene expression. Trends Endocrinol Metab

11:142-148.

Onkal R, Djamgoz MBA (2009) Molecular pharmacology of

voltage-gated sodium channel expression in metastatic disease:

Clinical potential of neonatal Nav1.5 in breast cancer. Eur J

Pharm 625: 206–219.

Packham G, Cleveland JL (1994) Ornithine decarboxylase is a

mediator of c-Myc-induced apoptosis. Mol Cell Biol 14:5741–

5747.

Pereira P, Onodera H, Andrinolo D, Franca S, Araújo F,

Lagos N, Oshima Y (2000) Paralytic shellfish toxins in the

freshwater cyanobacterium Aphanizomenon flos-aquae, isolated

from Montargil reservoir, Portugal. Toxicon 38:1689-1702.

Penzotti JL, Fozzard HA, Lipkind GM, Dudley Jr SC (1998)

Differences in Saxitoxin and Tetrodotoxin Binding Revealed by

Mutagenesis of the Na+ Channel Outer Vestibule. Biophysical J.

75:2647–2657.

Prevarskaya N, Skryma R, Bidaux G, Flourakis M, Shuba Y

(2007) Ion channels in death and differentiation of prostate

cancer cells. Cell Death Differ 14:1295–1304.

Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H (1998) Identifying 5-

methylcytosine and related modifications in DNA genomes.

Nucleic Acids Res 26:2255-2264.

Ren S, Frymier PD (2004) Reducing bioassay variability by

identifying sources of variation and controlling key paramters in

assay protocol. Chemosphere 57:81-90.

Salozhin SV, Prokhorchuk EB, Georgiev GP (2005)

Methylation of DNA - One of the Major Epigenetic Markers.

Biochemistry (Moscow) 70: 525-532.

Selaru FM, David S, Meltzer SJ, Hamilton JP (2009)

Epigenetic events in gastrointestinal cancer. Am J Gastroent

104:1910-1912.

Sivonen K, Jones G (1999). Cyanobacterial Toxins. In:

Chorus I, Bartman J (Eds). Toxic cyanobacteria in water: A guide

to their public health consequences, monitoring and management.

E&FN Spon, London, pp 55-124.

Stacey G, Viviani B (2001) Cell Culture Models for

Neurotoxicology. In: Stacey G, Doyle A, Ferro M (Eds) Cell

Culture Methods for in vitro Toxicology, Kluwer Academic

Publishers, Netherland, pp 115-130.

Snykers S, Vinken M, Rogiers V, Vanhaecke T (2007)

Differential role of epigenetic modulators in malignant and

normal stem cells: a novel tool in preclinical in vitro toxicology

and clinical therapy. Arch Toxicol 81:533–544.

Szyf M (2003) DNA methylation and cancer therapy. Drug

Resistance Updates 6: 341–353.

Tucci A, Sant’anna CL (2003) Cylindrospermopsis raciborskii

(Woloszynska) Seenayya & Subba Raju (Cyanobacteria):

variação semanal e relações com fatores ambientais em um

reservatório eutrófico, São Paulo, SP, Brasil. Rev Bras Bot 26:97-

112.

Figure 1: Dose-response profiles of STX in N2A cells in the presence

and absence of O/V. Cellular viability (%) ± SD v. STX concentration.

“Without O/V” condition: R

=0.997; “with O/V” condition: R

= 0.9904.

Figure 2: Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from N2A cells

incubated with STX, Lane 1: Ladder, Lane 2: Positive control - OTA

15µM, Lane 3: STX 3.00 nM, Lane 4: STX 1.50nM, Lane 5: STX 0.75

nM, Lane 6: Negative control with antibiotics, Lane 7: Negative control

without antibiotics.

Figure 3: DNA methylation as measured by determination of the ratio

dC as compared to [dC+m

dC]×100 in the DNA of N2A cells after

incubation of 24h with control, positive control (OTA 15µM) and

different STX concentration.

A9. ARTIGO 2: SUBMETIDO À REVISTA CIENTÍFICA

TOXICOLOGY

LIPID PEROXIDATION INDUCTION BY SAXITOXIN IN

NEURO-2A CELLS: THE PROTECTIVE EFFECT OF

VITAMINS C AND E, SUPEROXIDE DISMUTASE AND

CATALASE

Silvia Pedroso Melegari

, Cátia Regina Silva de Carvalho Pinto

Serge Moukha

2, 3

, Edmond Ekué Creppy

e William Gerson

Matias

1. Laboratório de Toxicologia Ambiental, LABTOX – Depto. de

Engenharia Sanitária e Ambiental- Campus Universitário- CEP:

88040-970 – Florianópolis/SC - Brasil.

2. Laboratoire de Toxicologie et d’Hygiène Appliquée, UFR des

Sciences Pharmaceutiques, Université Victor Segalen Bordeaux 2 -

146 rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux cedex, France

3. INRA- Centre de Recherche de Bordeaux Aquitaine, MICA, Unité de

Mycologie et de Sécurité des Aliments, Domaine de la grande Ferrade

71 avenue Edouart Bourleaux BP 81, 33883 Villenave d’Ornon Cedex,

France

*Corresponding author. Postal address: William Gerson Matias. Laboratório

de Toxicologia Ambiental, LABTOX – Depto. de Engenharia Sanitária e

Ambiental- Universidade Federal de Santa Catarina – Campus Universitário-

CEP: 88040-970 - Florianópolis - SC - Brasil - Tel.: +55 48 37217742 - Fax:

+55 48 37219823.

E-mail address: will@ens.ufsc.br.

Abstract: We investigated the cytotoxic effects of saxitoxin

(STX) in Neuro-2A (N2A) cells, using the MTT (3-[4,5-

dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay

and measurements of malondialdehyde (MDA) levels. The cells

were exposed to different concentrations of STX (0.5-64 nM) in

presence of superoxide dismutase (SOD) with catalase (CAT) and

vitamins E and C (VitE and VitC, respectively) for the

quantification of MDA levels. A dose-dependent decrease of

cellular viability was verified with the increase of STX

concentration, going from 96.2% for the concentration of 0.5nM

of STX to 24.1% for the concentration of 4.0nM of STX. For the

most elevated dose of STX evaluated in the study, the cellular

viability went down to 5.6%. The EC50 values of STX for N2A

cells were of 1.112nM (R2=0.997). The MDA levels increased

from 15 to 113% for 0.38-3.0nM of STX, respectively, when

compared to the relative controls of cells that were not treated

with STX. When the cells were treated with VitE and SOD/CAT,

the production rates of MDA decreased significantly for the

lower concentrations of STX, when compared to the condition

without antioxidants. The VitC antioxidant was shown not to be

efficient to protect the N2A cell from the oxidative attack of

STX.

Keywords: saxitoxin, lipid peroxidation, oxidative stress,

Vitamin E and C, superoxide dismutase, catalase.

1. INTRODUCTION

The frequency of blooms of toxic cyanobacteria in fresh

water destined for human consumption is evident in worldwide

literature probably due to the increase in environmental pollution

and global warming (Costa et al., 2006; Berger et al., 2006;

Hoeger et al., 2004, Lagos et al., 1999; Pereira et al., 2000, Tucci

and Sant’anna, 2003; Molica et al., 2005), creating severe

practical problems to those in charge of water supply for

populations. Thus, cyanobacterial toxins, or "cyanotoxins", have

become a human health concern, because they consist of diverse

groups of chemical structures, each of them presenting specific

toxic mechanisms (Bartam et al., 1999, Carvalho-Pinto-Silva et

al., 2003) and specific toxic effects (Sivonen and Jones, 1999).

Saxitoxin (STX) is a neurotoxic toxin classified in the

Paralytic Shellfish Poisoning (PSP) toxins group and it was

identified for the first time in fresh water proceeding from

Aphanizomenon flos-aquae (Ikawa et al., 1982). Apart from this

species, STX can be synthesized by other species of

cyanobacteria such as Cylindrospermopsis raciborskii, Lyngbya

and Anabaena (Sivonen and Jones, 1999, Bouaïcha, 2001). The

fast action of STX, blocking sodium channels in nerve axons and

causing loss of sensation and paralysis, confers this toxin a highly

neurotoxic and potentially lethal effect 2-25 hours after ingestion.

The LD50 in mice is of 8-10µg/kg i.p., 3.4µg/kg i.v. and

260µg/kg oral (Falconer, 2008). Data regarding the cytotoxic and

genotoxic effects of STX are very scarce. For example, there is

neither evidence of human health effects caused directly by the

consumption of water containing saxitoxins – producing

cyanobacteria (Fitzgerald et al., 1999) - nor data related to the

concentrations of saxitoxin-type neurotoxins in drinking water

that has caused neurotoxic symptoms in populations exposed to

public water supply (Falconer and Humpage, 2005). Recent data

published in the “International Symposium on Cyanobacterial

Harmful Algal Blooms” (ISOC-HAB), organized by the

Environmental Protection Agency of the United States of

America (US-EPA), reported that there are no data on sub

chronic exposure, reproductive, teratogenic or carcinogenic

effects of STX (Falconer, 2008).

There are many methods to investigate the cytotoxic

effects of the mechanisms of action of a toxin. The in vitro assay

has demonstrated to be satisfactory as an alternative to the in vivo

assay, and it has the advantages of being fast and sensible,

excluding the ethical questions that emerge from assays involving

animal experimentation (Smart and Hodgson, 2008).

The lipid peroxidation (LPO) assay, for example, is

characterized by the process where free radicals attack

polyunsaturated fatty acids of the cellular membrane, provoking a

chain reaction with lipid hydroperoxides as intermediate products

(Halliwell, 1987). This process causes modifications in

membrane properties such as permeability and fluidity, apart

from causing damage to enzymes and receptors. It can also result

in the destabilization and disintegration of the cellular membrane,

bringing serious health problems to man, from aging to

susceptibility to cancer (Valko et al., 2006). When initiated, the

LPO forms peroxyl free radicals (ROO·) that can be rearranged

through a cyclization reaction of endoperoxides, producing,

among other final products of this process, malondialdehyde

(MDA). The MDA is a natural biomarker produced in this

reaction, which can be quantified and used for the evaluation of

this process. The MDA is mutagenic in bacteria and mammals

cells and carcinogenic in mice; therefore, it modifies the bases of

the DNA, generating bifunctional intermediates that form

exocyclic DNA adducts and contributing for mutagenic and

carcinogenic effects (Nair et al., 2007; Valko et al., 2006).

Antioxidants are substances that delay and/or prevent the

oxidation of this substratum when in low concentrations in

relation to the oxidable substratum. Antioxidants are widely

distributed in living organisms and are extremely important as

representatives in the direct removal of free radicals (Halliwell

and Gutteridge, 1999; Valko et al., 2006). The main enzymatic

antioxidants are superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and

glutathione peroxidase (GPx), which serve as primary defense in

the destruction of free radicals. Non-enzymatic antioxidants,

such as reduced glutathione (GSH), tocopherol (vitamin E) and

ascorbic acid (vitamin C), among others, assist in the combat

against reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen

species (RNS) (Matias et al., 1999; Halliwell and Gutteridge,

1999; Møller and Wallin, 1997; Valko et al., 2006).

In the present study, we investigated the individual

cytotoxic effects of STX in the Neuro-2A cell line, employing the

MTT assay. The effects of LPO on these cells were also

investigated utilizing different concentrations of STX, in the

absence and presence of enzymatic and non-enzymatic

antioxidants, through the quantification of MDA levels.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Cell Lines and Culture Medium

All the chemical products used for the cell culture were

provided by Sigma-Aldrich (Saint Quentin Falavier, France). The

Neuro-2A cells from the mouse neuroblastoma cell line were

obtained from the National Museum of Nature, Paris – France

(from the European Collection of Cell Cultures catalogue no.

89121404; Porton Down, UK). The cells were grown in 75 cm

flasks, with a RPMI 1640 culture medium supplemented with

10% of fetal bovine serum, 2% of L-glutamine solution

(200mM), 1% of sodium pyruvate solution (100mM) and 1% of

antibiotic solution (10mg/mL streptomycin and 10000U/mL

penicillin). The culture was maintained at 37°C in a humidified

(5%) atmosphere (adapted from Humpage et al., 2007).

2.2. MTT Assay

Cell viability was determined using the MTT [3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay.

The STX certified reference materials were obtained from the

Institute for Marine Biosciences (Halifax, NS, Canada). The cells

(10

cells/mL) were seeded in 96-well microplates with 5% of

at 37ºC for 24 h. Then, the cell culture mediums were

removed and the cells were exposed to the concentrations of

STX, which was diluted in RPMI 1640 (ranging from 0.5 to 64

nM - final concentration in the well). In this test each

concentration of STX was evaluated in triplicates. A negative

control group (RPMI 1640 without STX) and a positive control

group with veratridine 0.05mM and ouabain 0.5mM (O/V) were

tested both in triplicates. After the exposure period, the

supernatant was discarded and 200µL of the MTT solution (0.5

mg/mL in RPMI-1640) was added and re-incubated for an

additional period of 2h. After incubation, the MTT solution was

discarded and 200µL of DMSO were added to each well to

dissolve the formazan crystals formed. The plates were then read

on a microplate reader (DYNATECH MR 4000, France) at 560

nm. The absorbance values of the samples were normalized and

the values were expressed in percentage of cellular viability. The

EC50 (effective molar concentration which produces 50% of the

maximum possible response) was derived from the plotted data

by linear extrapolation from the viability values of the dose-

response curve.

2.3. Lipid peroxidation: extraction and determination of the

MDA–thiobarbituric acid (TBA) adduct

Cells (10

cells/ml) were cultured in 24-well microplates

for 24 h at 37ºC as described above, and then cultures were

separately incubated with different protective substances: vitamin

C (8 and 16µg/mL, respectively VitC8 and VitC16), vitamin E

(6µg/mL, VitE) and enzymes SOD/CAT (25µg/mL each). The

cells were incubated for 1 more hour. A control was employed

using culture medium, and a positive control was employed using

ochratoxin A (OTA - 10µM) or methotrexate (MTX - 20µM).

The N2A cells were intoxicated for 24h at 37ºC with STX in the

concentrations of 0.38, 0.75, 1.50 and 3.00nM. After incubation,

the cells were scrapped and centrifuged at 2000xg for 5 min. The

cell pellets were resuspended in 250µL SET buffer (0.1M NaCl,

20mM EDTA, 50mM Tris–HCl, pH 8.0). To each sample were

added: 25µL SDS 7% (w/v), 300µL HCl 0.1 M, 40µL

phosphotungstic acid 1% (w/v) and 300µL thiobarbituric acid

0.67% (w/v). The tubes were shaken and incubated at 90°C for 1

h in the dark. They were further placed for 15 min in an ice bath

(0°C). After this period, a volume of 300 µL of n-butanol was

added and tubes were shaken vigorously. After centrifugation for

10 min at 900×g at 4°C, the n-butanol phase from each sample

containing the MDA–TBA adduct was separated and analysed

through high performance liquid chromatography (HPLC) with

fluorometric detection.

The HPLC system consisted of an ICS (Instrumentation

Consumable Service, France) chromatography pump equipped

with a Shimadzu 8450 Fluorescence HPLC Monitor (Japan

Spectroscopic Co.). The analysis of the MDA–TBA adducts was

performed at room temperature on a Prontosil Eurobond C18

column (Bischoff Chromatography, Germany, 250x4.6 mm, ø

part.:5µm) using methanol–water 40:60 (v/v) as the mobile phase

was adjusted to pH 8.4 by the addition of KOH 0.5M. The flow

rate was maintained at 0.5 mL/min and an automatic injection of

90µL. The excitation and emission wavelengths were of 515 and

553 nm, respectively (Adapted from Matias et al., 1999). The

amount of MDA-TBA measured is related to the protein content

of cellular homogenates, determined using Bradford’s

colorimetric method (1976).

2.4. Statistical analysis

All the results were expressed as the mean±SEM and the

correlation factor (R

) was calculated by the GraphPad Prism®

Software, through a sigmoid of variable slope. The EC50 was

estimated of this equation by GraphPad Prism® Software and

only significant correlation coefficients are reported. Differences

between the results of MDA levels and the control groups were

compared with one-way analysis of variance (ANOVA) followed

by Tukey’s post hoc test, for multiple comparisons. A

significance level of p < 0.05 was accepted.

3. RESULTS

3.1. Influence of STX on cell viability: MTT Assay and

Determination of EC50

For the cell viability of N2A cells and determination of

EC50 values, a scale of eight concentrations (0.5, 1.0, 2.0, 4.0,

8.0, 16, 32 and 64nM) of STX was applied in three different

experiments. The curve of cell viability as a function of the STX

concentration was normalized and plotted in Figure 1. A dose-

dependent decrease of cell viability of N2A cells was verified

with the increase of 0.5-64nM in STX concentrations. This

reduction went from 96.2% of cell viability for 0.5nM of STX to

24,1% for 4.0nM of STX. In the highest dose of STX evaluated

in this study, the cell viability was 5.6%. The results of the MTT

test demonstrate that the exposure of N2A cells to different

concentrations of STX leads to a dose-dependent reduction of the

metabolic activity in mitochondria, which parallels cell viability.

From Figure 1, it was possible to calculate the EC50 of

STX, which was 1,112nM. This result was important for the

second stage of the study, which consisted in the exposure of

N2A cells and quantification of MDA levels to verify if STX

induces cellular LPO. Therefore, appropriate experiments with

approach values of EC50 such as 3.0nM, 1.5nM, 0.75nM and

0.38nM of STX were adapted for further use in the lipid

peroxidation tests.

3.2. LPO and the effect of oxidative stress

After 24h of incubation, the N2A cells in culture

spontaneously produced 83.79±5.94nM MDA/mg protein. This

value was considered the control value for N2A cells without

STX. After 24h of exposure to the VitE antioxidant, the N2A

cells in culture spontaneously produced 59.09±1.57nM MDA/mg

protein. As for the N2A cells in culture with antioxidants VitC8

and VitC16, they spontaneously produced 89.80±9.42 and

107.31±17.29nM MDA/mg protein, respectively, while the N2A

cells in culture with antioxidants SOD/CAT spontaneously

produced 102.47±10.88nM MDA/mg protein. All these values

were considered the control value for N2A cells without STX.

After 24h of incubation, as the STX concentrations increased, the

MDA production in N2A cells also increased significantly (Fig.

2).

The production of MDA increased from 15 to 113% for

0.38-3.0nM of STX, respectively, when compared to controls

(Tab.1). When N2A cells were pretreated with VitC8, this rate

increased to 66-209%, and when N2A cells were pretreated with

VitC16 the rates went from 36 to 181% for the same

concentrations of STX (Tab.1).

When the N2A cells were pretreated with VitE and with

SOD/CAT, the production rates of MDA decreased significantly

for the lowest STX concentrations, when compared to the

condition without antioxidants. For VitE, the production rate of

MDA was of 3%, 31%, 95% and 120%, and for SOD/CAT it was

of 3%, 47%, 75% and 160%, both for 0.38, 0.75, 1.5 and 3.0nM

STX (Tab.1), respectively.

4. DISCUSSION

In a previous study (Melegari et al., 2010), the cytotoxic

and genotoxic effects of STX in N2A cells had already been

investigated. In this study it was evidenced that STX induces

indirect genotoxic effects in N2A cells when they are exposed in

the same concentrations employed in this research. The results of

the MTT assay demonstrate that the exposure of the N2A cells in

different concentrations of STX causes a dose-dependent

decrease on cellular viability, and a consequent reduction of the

mitochondrial metabolic activity. These results clearly point

mitochondria as a indirect target of STX. This evidence is an

indicative that STX affects the integrity of these organelles and,

therefore, the integrity of cellular respiration. The nervous system

cells possess a high amount of mitochondria due to their great

necessity of energy (Cooper and Hausman, 2007). Our results

show that this mechanism is affected, what might be one of the

reasons for the neurotoxic effect of STX. The EC50 of STX

determined for N2A cells was an extremely low value, which led

to the conclusion that this cell line of neuronal origin is

susceptible to the neurotoxin in study. This evidence qualifies the

N2A cell as adequate and representing for the study of

mechanisms of action with low concentrations of STX.

Studies concerning the effects of the N2A cell line exposed

to STX and the correlation to the induction to lipid peroxidation,

in the absence and presence of antirust substances, have not yet

been reported in the literature, but it is known that the brain and

the nervous system are inclined to oxidative stress due to the lack

of an adjusted antioxidant defense system (Halliwell, 2006).

The MDA levels, which increase as a consequence of the

LPO for oxidative stress, were significantly more elevated in

N2A cells exposed to STX than in controls without exposure. All

the results prove that after 24h of incubation, STX induces the

LPO of N2A cells. Endogenous and exogenous substances can

produce ROS proceeding from LPO (Møller and Wallin, 1997).

For this case, that STX acts as an exogenous source of oxidative

stress, and the ROS were probably responsible for the LPO.

When produced inside of the cells, ROS are capable to virtually

react with all types of biomolecules (Møller and Wallin, 1997),

and potential endogenous sources including mitochondria,

cytochrome P450 metabolism, peroxisomes, and inflammatory

cell activation (Inoue et al., 2003). Neurotoxins generally lead to

the formation of ROS in clinical categories of the nervous system

(Halliwell, 1987).

Evaluating the sequence of events, it is possible to

consider a correlation between the two processes evaluated for

induced cytotoxicity by STX: N2A cells exposed to the low

concentrations of STX were induced to mitochondrial injuries

and peroxidation of the lipid membrane. Through the evaluation

of the mechanism of neurodegeneration proposed by Halliweel

(1999), we suggest two toxic mechanisms caused by STX in N2A

cells: a first mechanism starts with the oxidative stress of the

exposure to ROS (STX), inducing the LPO process and the

formation of MDA. The main consequences of this LPO

mechanism are base modifications, inhibition of protein

synthesis, denaturation of DNA and formation of DNA adducts,

which can induce to genotoxic, mutagenic and carcinogenic

processes (Baudrimont et al., 1997; Matias et al., 1999; Halliwell,

2007). Thus, the presence of the cytotoxic MDA induces an

abnormal protein overload, leading to the dysfunction of the

proteasome. High levels of oxidative damage can result not just

from oxidative stress, but also from the limitation of the cellular

repair system (Halliwell, 2007). This dysfunction causes a

deregulation of the cell protection system, leading to cellular

death. In the second mechanism, the reactive species (STX)

directly attacks the mitochondria, causing irreversible

mitochondrial damages and also leading to cellular death

(Halliwell, 2007).

Among the antioxidants tested, SOD catalyzes the

dismutation of the superoxide free radical; it is present in the

mitochondrial matrix (Mn-SOD), in cytosol (CuZn-SOD) and in

the extracellular medium. The product resultant from the reaction

catalyzed by SOD is the hydrogen peroxide that is removed from

the medium by CAT, which transforms hydrogen peroxide in

water and molecular oxygen (Fridovich, 1995; Valko et al.,

2006). These enzymes are extremely important for the protection

of the nervous system and the removal of peroxide; SOD is

present in all parts of the animal nervous system (Fridovich,

1995). CAT is located, mainly, in peroxisome, however, other

organelles such as the mitochondria can contain some activity of

CAT. VitE (α-tocopherol) is the greatest and most important

hydrophobic antioxidant, present in all cellular membranes and,

therefore, acts in the protection against LPO (Roy et al., 2002;

Valko et al., 2006). Our results suggest that the administration of

VitE in humans contaminated by STX can balance the effect of

LPO. VitC (ascorbic acid) is an important and powerful

hydrophilic antioxidant. Its preliminary antioxidants partners are

VitE and carotenoids, which work together well as antioxidant

enzymes (Valko et al., 2006).

The pre-treatment with VitE and SOD+CAT for the

culture medium before the exposure to STX seemed efficient in

the prevention against the LPO when compared to VitC. VitC

was not efficient for the protection of N2A cells when they were

exposed to the oxidative stress of STX, possibly due to the high

relation of concentration with the reactive species. In specific

conditions (in the presence of intracellular Cu, as [CuZnSOD] in

mitochondrial membrane and in cytosol) the ascorbate can be

oxidated, producing cytotoxic species (Halliwell, 2006). In this

case, VitC performs the most potent toxic effects of STX in a

synergic form, which means that a person contaminated by STX

must prevent the consumption of foods and medicines with high

concentrations of this vitamin. VitC is known as the hydrophilic

antioxidant, and recent evidences suggest that VitE and VitC

function together in a cyclical process (Kojo, 2004). VitC

cooperates with VitE to regenerate α-tocopherol of the α-

tocopherols radicals in the membranes and lipoproteins. A

suggestion for future assays is the investigation of the interaction

between VitC and VitE in the protective effect of the oxidative

stress provoked by STX for different times of incubation.

5. CONCLUSION

The present data confirmed which N2A neuroblastoma cell

line is suitable for toxicity evaluation of STX and demonstrated

which main mechanisms triggering its toxic effects involve the

indirect mitochondrial damage and the oxidative stress, leading

possibly to cell death through an apoptotic process or lipid

peroxidation of cell membranes. When the cells were treated with

VitE and SOD/CAT, the production rates of MDA decreased

significantly on the lower concentrations of STX, when compared

to the condition without antioxidants. The VitC antioxidant was

shown not to be efficient to protect the N2A cell from the

oxidative attack of STX.

6. ACKNOWLEDGMENTS

The authors would like to acknowledge the Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq,

Brazil) for its financial support. S.P. Melegari would also like to

thank for her fellowship in the Laboratory of Toxicology,

University of Bordeaux 2 (France).

7. REFERENCES

Bartram, J., Carmichael, W.W., Chorus, I., Jones, G.,

Skulberg, O.M., 1999. Introdution, in: Chorus, I., Bartram, J.

(Eds.). Toxic cyanobacteria in water. A guide to their public

health consequences, monitoring and management. E&FN Spon,

London, pp. 12-24.

Baudrimont, I., Ahouandjivo, R., Creppy, E.E., 1997.

Prevention of lipid peroxidation induced by ochratoxin A in Vero

cells in culture by several agents. Chem. Biol. Interact. 104, 29-

40.

Berger, C., Ba, N., Gugger, M., Bouvy, M., Rusconi, F.,

Couté, A., Troussellier, M., Bernard, C., 2006. Seasonal

dynamics and toxicity of Cylindrospermopsis raciborskii in Lake

Guiers (Senegal, WestAfrica). FEMS Microbiol. Ecol. 57, 355–

366.

Bouaïcha, N., 2001. Impact sanitaire des toxines de

cyanobactéries en milieu d’eau douce. Revue Francaise des

Laboratoires. 336, 39-46.

Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the

quantitation of microgram quantities of protein utilizing the

principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254.

Cañete, E., Diogène, J. 2008. Comparative study of the use of

neuroblastoma cells (Neuro-2a) and neuroblastoma x glioma

hybrid cells (NG108-15) for the toxic effect quantification of

marine toxins. Toxicon 52, 541–550.

Carvalho Pinto-Silva, C.R., Ferreira, J.F., Costa, R.H.R., Belli

Filho, P., Creppy, E.E., Matias, W.G., 2003. Micronucleus

induction in mussels exposed to okadaic acid. Toxicon 41, 93-97.

Cooper, G. M., Hausman, R. E. 2007. A célula: uma

abordagem molecular, third ed. Artmed, Porto Alegre, 716p.

Costa, I.A.S., Azevedo, S.M.F.O., Senna, P.A.C., Bernardo,

R.R., Costa, S.M., Chellappa, N.T., 2006. Occurrence of toxin-

producing cyanobacteria blooms in a Brazilian semiarid reservoir.

Braz. J. Biol. 66, 211-219.

Falconer, I.R., Humpage, A.R., 2005. Health risk assessment

of cyanobacterial (blue-green algal) toxins in drinking water. Int.

J. Environ. Res. Public Health 2, 43–50.

Falconer, I.R., 2008. Health effects associated with controlled

exposures to cyanobacterial toxins, in: Hudnell, H.K. (Ed.)

Cyanobacterial harmful algal blooms: state of the science and

research needs. Springer Press, North Carolina, pp. 607-612.

Fitzgerald, D.J., Cunliffe, D.A., Burch, M.D., 1998.

Development of health alerts for cyanobacteria and related toxins

in drinking water in South Australia. Environ. Toxicol. 14, 203-

209.

Fridovich, I. 1995. Superoxide radical and superoxide

dismutases. Annu. Rev. Biochem. 64, 97-112.

Halliwell, B., 1987. Oxidants and human disease: some new

concepts. FASEB J. 1, 358-364.

Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C., 1999. Free radicals in

Biology and Medicine, third ed. Clarendon Press, Oxford.

Halliwell, B., 2006. Oxidative stress and neurodegeneration:

where are we now? J. Neurochem. 97,1634-1658.

Halliwell, B., 2007. Biochemistry of oxidative stress.

Biochem. Soc. Trans. 35, 1147-1150.

Hoeger, S.J., Shawb, G., Hitzfeldc, B.C., Dietrich, D.R., 2004.

Occurrence and elimination of cyanobacterial toxins in two

Australian drinking water treatment plants. Toxicon 43, 639–649.

Humpage, A.R., Ledreux, A., Fanok, S., Bernard, C., Briand,

J.F., Eaglesham, G., Papageorgiou, J., Nicholson, B., Steffensen,

D., 2007. Application of the neuroblastoma assay for paralytic

shellfish poisons to neurotoxic freshwater cyanobacteria:

interlaboratory calibration and comparison with other methods of

analysis. Environ. Toxicol. Chem. 26, 1512–1519.

Ikawa, M., Wegener, K., Foxall, T.L., Sasner, J.J., 1982.

Comparison of the toxins of the blue-green alga Aphanizomenon

flos-aquae with the Gonyaulaxtoxins. Toxicon 20, 747-752.

Inoue, M., Sato, E.F., Nishikawa, M., Park, A.M., Kira, Y.,

Imada, I., Utsumi, K., 2003. Mitochondrial generation of reactive

oxygen species and its role in aerobic life. Curr. Med. Chem. 10,

2495–2505.

Jellett, J.F., Stewart, J.E., Laycock, M.V., 1995. Toxicological

evaluation of saxitoxin, neosaxitoxin, gonyautoxin II,

gonyautoxin II plus III and decarbamoylsaxitoxin with the mouse

neuroblastoma cell bioassay. Toxicol. In Vitro 9, 57–65.

Kojo, S., 2004. Vitamin C: basic metabolism and its function

as an index of oxidative stress, Curr. Med. Chem. 11, 1041–1064.

Kouadio, J.H., Danob, S.D., Moukha, S., Mobio, T.A.,

Creppy, E.E., 2007. Effects of combinations of Fusarium

mycotoxins on the inhibition of macromolecular synthesis,

malondialdehyde levels, DNA methylation and fragmentation,

and viability in Caco-2 cells. Toxicon 49, 306-317.

Lagos, N., Onodera, H., Zagatto, P.A., Andrinolo, D.,

Azevedo, S.M.F.Q., Oshima, Y., 1999. The first evidence of

paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium

Cylindrospermopsis raciborskii, isolated from Brazil. Toxicon

37, 1359-1373.

Matias W.G., Traore, A., Bonini, M, Sanni, A., Creppy, E. E.,

1999. Oxygen reactive radicals production in cell culture by

okadaic acid and their implication in protein synthesis inhibition.

Human & Experimental Toxicology 18, 634-639.

Melegari, S.P., Carvalho-Pinto Silva, C.R., Moukha, S.,

Creppy, E.E., Matias, W.G., 2010. Saxitoxin induces genotoxicity

and apoptosis in neuro-2a cells. Arch. Tox., (Submitted).

Molica, R.J.R., Oliveira, E.J.A., Carvalho, P.V.V.C., Costa,

A.P.N.S.F., Cunha, M.C.C., Melo, G.L., Azevedo, S.M.F.O.,

2005. Occurrence of saxitoxins and an anatoxin-a(s)-like

anticholinesterase in a Brazilian drinking water supply. Harm.

Algae 4, 743–753.

Møller, P., Wallin, H., 1998. Adduct formation, mutagenesis

and nucleotide excision repair of DNA damage produced by

reactive oxygen species and lipid peroxidation product. Mut. Res.

410, 271–290.

Nair, U., Bartsch, H., Nair, J., 2007. Lipid peroxidation-

induced DNA damage in cancer-prone inflammatory diseases: A

review of published adduct types and levels in humans. Free

Radical Biology & Medicine 43, 1109–1120.

Pereira, P., Onodera, H., Andrinolo, D., Franca, S., Araújo, F.,

Lagos, N., Oshima, Y., 2000. Paralytic shellfish toxins in the

freshwater cyanobacterium Aphanizomenon flos-aquae, isolated

from Montargil reservoir, Portugal. Toxicon 38, 1689-1702.

Roy S., Lado, B. H., Khanna, S., Sen, C.K. 2002. Vitamin E

sensitive genes in the developing rat fetal brain: a high-density

oligonucleotide microarray analysis. FEBS Letters 530, 17-23.

Smart, R.C., Hodgson, E. (Eds). Molecular and Biochemical

Toxicology. John Wiley, New York, pp. 287-318.

Sivonen K, Jones G. 1999. Cyanobacterial toxins, in: Chorus,

I., Bartman, J. (Eds.) Toxic cyanobacteria in water: A guide to

their public health consequences, monitoring and management.

E&FN Spon, London, pp. 55-124.

Tucci, A., Sant’anna, C.L., 2003. Cylindrospermopsis

raciborskii (Woloszynska) Seenayya & Subba Raju

(Cyanobacteria): variação semanal e relações com fatores

ambientais em um reservatório eutrófico, São Paulo, SP, Brasil.

Rev. Brasil. Bot. 26, 97-112.

Valko, M., Rhodes, C.J., Moncola, J., Izakovic, M., Mazura,

M., 2006. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative

stress-induced cancer. Chem. Bio. Interactions 160, 1–40.

Figure 1: Dose-response profiles of STX in N2A cells by % cellular

viability±SD v. STX concentration (R

=0.997).

Figure 2: LPO levels induced by increasing STX concentrations in N2A

cells, and with several antioxidants, as measured by quantification of

MDA levels, after 24 h of incubation (*p>0.05 in relation with the

control and **p>0.05 in relation with the positive control).

Table 1: Lipid peroxidation measured by the increase of MDA

production (%), when compared to controls.

% Increase MDA production

Vit. C

STX

(nM)

Without

antioxidants

Vit. E

6µg/mL

8µg/mL

16µg/mL

SOD+CAT

25µg/mL

(each)

0.38

0.75

109

143

1.50

163

154

3.00

113

120

181

209

160

Positive

control

120

358

298

374

129

1. MTX 20µM, 2. OTA 10µM

A10. ARTIGO 3: SUBMETIDO À REVISTA CIENTÍFICA

TOXICOLOGY

MICRONUCLEI INDUCTION IN VERO CELLS AND

NEURO 2-A CELLS BY SAXITOXIN

Silvia Pedroso Melegari

, Cátia Regina Silva de Carvalho Pinto

Serge Moukha

, Edmond Ekué Creppy

and William Gerson

Matias

1- Laboratório de Toxicologia Ambiental, LABTOX – Depto. de Engenharia

Sanitária e Ambiental- Universidade Federal de Santa Catarina – Campus

Universitário- CEP: 88040-970 - Florianópolis – SC - Brasil.

2- Laboratoire de Toxicologie et d’Hygiène Appliquée, UFR des Sciences

Pharmaceutiques, Université Victor Segalen Bordeaux 2- 146 rue Léo

Saignat, 33076 Bordeaux cedex, France

* Corresponding Author. Address: Laboratório de Toxicologia Ambiental,

LABTOX – Depto. de Engenharia Sanitária e Ambiental- Universidade

Federal de Santa Catarina – Campus Universitário- CEP: 88040-970 -

Florianópolis - SC - Brasil - Tel.: +55 48 37217742 - Fax: +55 48 37219823.

E-mail address: will@ens.ufsc.br (W.G. Matias).

Abstract: In the present study, Neuro-2A (N2A) and Vero cells

were treated in a first stage with 8 concentrations of STX, in an

interval of 0,5 to 64nM, to determine EC50 for the cells

evaluated, and in as a second stage with specific concentrations

(0,38-3,0nM) to evaluate the induction to the micronuclei

formation with the cytokinesis-block micronucleus (CBMN)

assay in 24 hours of exposition, being emphasized the treatment

with STX to evaluate its genotoxicity in inducing damages to the

mutagenic level. The EC50 for cells N2A was of 1,112nM, and

for the Vero cells it was of 1,052nM. The results demonstrated a

significant increase dose-dependent of micronucleated

binucleated cells (BNMN) for cells N2A and Vero cells.

Evidences had suggested despite the STX can inhibit the cellular

division, and some morphologic criteria observed BNMN cells

were that the micronucleus touches the nucleus main but does not

overlap it and presents the same intensity of coloration of the

main nucleus, and had not been observed cases of cellular

necrosis for formation of multinucleated cells. The MN had still

presented so great of 1/3 to the 1/6 of the main nucleus, being

able to be an indicative of aneugenic effect.

Keywords: saxitoxin, micronuclei, Neuro-2A cells, Vero cells.

1. INTRODUCTION

Saxitoxin (STX) is a neurotoxin classified in the Paralytic

Shellfish Poisoning (PSP) toxins group and it was identified for

the first time in fresh water proceeding from Aphanizomenon

flos-aquae (Ikawa, 1982). Apart from this species, STX can be

synthesized by other species of cyanobacteria such as

Cylindrospermopsis raciborskii, Lyngbya and Anabaena

(Sivonen & Jones, 1999, Bouaïcha, 2001, Hoeger et al., 2004).

The fast action of STX, blocking sodium channels in nerve axons

and causing loss of sensation and paralysis, confers this toxin

highly neurotoxic and potentially lethal effect. The LD50 in mice

is 8-10µg/kg i.p., 3.4µg/kg i.v. and 260µg/kg oral (Falconer,

2008).

Data regarding the cytotoxic and genotoxic effects of STX

are very scarce. Fitzgerald et al. (1999) verified that there is no

evidence of human health effects directly caused by the

consumption of water containing saxitoxins and/or producing

cyanobacteria. Falconer and Humepage (2005) confirmed that

there is no data on the secure concentration levels of STX-type

neurotoxins in drinking water supply. Recent data published in

the “International Symposium on Cyanobacterial Harmful Algal

Blooms” (ISOC-HAB), organized by the Environmental

Protection Agency of United States of America (US-EPA),

reported that there are no data on sub chronic exposure,

reproductive, teratogenic or carcinogenic effects of STX

(Falconer, 2008).

The in vitro assay has demonstrated to be satisfactory as an

alternative to in vivo assay and it has the advantages of being a

fast and sensible assay, excluding ethical questions that emerge

from assays involving animal experimentation. The Neuro-2A

bioassay of the neuroblastoma mouse cell line was described by

by Jellet et al. (1992) as a method to detect the STX.

The study of DNA damage at the chromosome level is an

essential part of genetic toxicology because chromosomal

mutation is an important event in carcinogenesis (Fenech, 2000),

and the understanding of the origin of this damage in the DNA

can contribute to evaluated which mechanisms act the genotoxic

agents (clastogenic and aneugenic effects).

The cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay is

widely employed to evaluate the cytotoxicity and genotoxicity of

chemical products and to monitor human exposure to

environmental carcinogens (Fenech, 2000, Lorge et al., 2006).

This technique was found more favorable than the test of

chromosome aberration, being recommended for spread use in

genotoxicity tests (Miller et al., 1998, Zhong et al. 1991, Miller et

al. 1997). The CBMN assay allows a parallel evaluation and can

be complemented through the incorporation of cytotoxicity

measurements (for example, tests of cellular viability and

counting of cells in apoptosis and necrosis) to identify the main

event caused by a particular xenobiotic agent (Fenech et al.

1999). All these morphologic features can be obtained in the

same cells after appropriate treatment for each case. This assay

was employed in this study to identify if the STX can induce

genetic damage to the mutagenic level of the cell lines evaluated

(Fenech et al. 1999).

In the present study, Neuro-2A (N2A) and Vero cells were

treated in two stages. In the first stage, the treatment was done

with a range of STX concentrations, in an interval of 0.5 to 64

nM, to determine the EC50 of the evaluated cells. In the second

stage, the cells were treated with specific concentrations (0.38-

3.0nM) to evaluate the induction to micronuclei (MN) formation

through the CBMN assay after a 24-hour exposure, emphasizing

the STX treatment to evaluate its genotoxicity when inducing

damages in mutagenic levels.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Cell Lines and Culture Medium

All chemicals employed were provided by Sigma (Saint

Quentin Falavier, France). The N2A cells from the mouse

neuroblastoma cell line were obtained from the National Museum

of Nature, Paris – France (European Collection of Cell Cultures

catalog no. 89121404; Porton Down, UK). The cells were grown

in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine

serum, 2mM L-glutamine, 1mM sodium pyruvate, 50µg/mL

streptomycin, and 50U/mL penicillin. The culture was maintained

at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO

(Humpage et

al., 2007). The Vero cells (Adolpho Lutz Institute, Brazil),

epithelial kidney cells extracted from an African green monkey,

were grown in RPMI 1640 medium, supplemented with 10% fetal

bovine serum, 2mM L-glutamine, 50µg/mL streptomycin, and

50U/mL penicillin. The cell cultures were maintained at 37ºC in a

humidified atmosphere with 5% CO

. (Matias & Creppy appud

Terasima & Ysukawa, 1998).

2.2. MTT Assay

Cell viability was determined using the MTT [3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay.

The STX certified reference materials were obtained from the

Institute for Marine Biosciences (Halifax, NS, Canada). The cells

(10

cells/mL) were seeded in 96-wells multitest plates with 5%

at 370C for 24 h. Then, the culture medium was removed

and the cells were exposed to the concentrations of STX, which

were diluted in RPMI 1640 (ranging from 0.5 to 64nM - final

concentration in the well). All concentrations of STX were

diluted in cascate and evaluated in triplicates. In parallel, a

negative control group (RPMI 1640 without STX) was tested

along with a positive control group (RPMI 1640 with 0.05mM

veratridine and 0.5mM ouabain for N2A cells and RPMI 1640

with 20 µM methotrexate for Vero cells – all final concentrations

in the well). After intoxication, the cells were re-incubated for

24h. Then, the supernatant was discarded and 200µL of MTT

solution (0.5 mg/mL in RPMI-1640) were added to each well and

re-incubated for an additional 2h. The MTT solution was

discarded and 200µL of DMSO were added to each well to

dissolve the formazan crystals formed. After mixing, the plates

were then read on a multitest plates reader (DYNATECH MR

4000, France) at 560 nm. The EC50 (half minimal effective

concentration) was derived from the data plotted by linear

extrapolation from the viability values of the dose-response curve

(Humpage et al, 2007).

2.3. CBMN Assay

After 24h of pre-cultivation of Vero and N2A cells on

24-well multitest plates (10

cells/ml), cultures were treated with

STX (0.38, 0.75, 1.50 and 3.00nM), with RPMI 1640 medium as

negative control and Colchicin (COL / 0.3µM) as positive control

for both cells tested for 24h in triplicates. Cytochalasin B (Cyt-B

- 5 µg/mL) was added to the cultures for an 18-hour incubation,

and the cells were harvested. A mild hypotonic treatment with

0.075M KCl was then performed followed by immediate

centrifugation at 5000g for 5min. The supernatant was discarded

and the cells were fixed in 250µL methanol/acetic acid 3:1(v:v)

for 20 minutes. After, they were dropped on glass slides and dried

for 30min (adapted from Ouanes et al., 2003). The slides were

stained with acridine orange/ethidium bromide for 15min. The

slides were analyzed under 400x magnification using a

fluorescent microscope (Nikon, Eclipse E 400). One thousand

binucleated cells were assessed per slide.

2.4. Statistical Analysis

All the results were expressed as mean±SEM, and the

correlation factor (R

) was calculated by the GraphPad Prism®

Software, through a sigmoid of variable slope. The EC50 was

estimated for this equation by the GraphPad Prism® Software.

For the binucleated micronucleated cells (BNMN), the T-

Student statistic test was employed to compare BNMN

frequencies between treated and control groups. The frequencies

were also compared individually in each group tested.

Significance of differences was set at p ≤ 0.05.

3. RESULTS

3.1. Influence of STX on Cell Viability: MTT Assay and

Determination of EC50

For determination of the EC50, a scale of eight

concentrations of STX (0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0, 16.0, 32.0 and

64.0nM for both cells) was applied in three different experiments.

After the exposure of the N2A and Vero cells to STX and

analysis of the data, a curve of cell viability v. STX concentration

was plotted for both cases. The results are shown in Figure 1.

A similar dose-dependent decrease of cell viability values

is observed for both cases, with an increase in the concentration

of STX. The results of the MTT test demonstrate that the

exposure of N2A and Vero cells to different concentrations of

STX leads to a dose-dependent reduction of the metabolic

activity in mitochondria, and consequently, a reduction in cell

viability.

In the N2A cells, the reduction goes from 96.2% of cell

viability for the concentration of 0.5nM STX to 24.1% for 4.0nM

of STX. In the highest dose of STX evaluated, the cell viability

was 5.6%. In the Vero cells, the reduction goes from 87.6% of

cell viability for the concentration of 0.5nM STX to 40.6% for

4.0nM of STX. In the highest dose of STX evaluated, the cell

viability was 18.6%.

The EC50 of STX calculated was 1.112nM for N2A cells

and 1.052nM for Vero cells. This result was essential for the

second stage of the study, which consisted in the exposure of

N2A and Vero cells to STX from the CBMN assay. Therefore,

we adapted appropriate experiments with approaching values of

EC50 to use in the MTT tests, such as 3.0, 1.5, 0.75 and 0.38nM

of STX.

3.2 CBMN Assay

Concerning the CBMN assay in N2A and Vero cells,

frequencies of BNMN, which are the numbers of BNMN per

1000 binucleated (BN) cells counted, are shown in Fig. 2. This

assay was employed to identify the genotoxic effect of STX that

may lead to genetic and mutagenic damages. During the BNMN

counting, a high number of mononucleated cells was observed.

Due to the elevated amount of these cells, these were included in

the total counting of MN, considering that this condition is

induced by STX. This effect was not observed with COL

(positive control). The results demonstrate a significant dose-

dependent increase of BNMN for N2A cells from 4.5±1.3

(0.38nM) to 10.0±2.2 at the highest concentration of STX

(3.00nM), when compared to the negative control (1.0±0.8). As

for the Vero cells, the increase went from 17.5±2.1 (0.38nM) to

27.5±2.1 at the highest concentration of STX (3.00nM), when

compared to the negative control (7.0±0.8). Figure 3 shows the

image of BN cell controls (Fig. 3A) and BNMN cells induced by

the exposure to STX. In the same conditions, cell cultures treated

with COL showed a significant increase of BNMN when

compared to the negative control with medium culture (12.8±3.5

for N2A cells and 28.3±2.5 for Vero cells).

4. DISCUSSION

The genotoxic effects of STX for the induction to

micronucleus formation have not been reported in scientific

literature yet. In a previous study, (Melegari et al., 2010a) the

potential cytotoxic effect of STX, inducing N2A cells to cellular

apoptosis, was demonstrated, along with its significant inductive

effect in the disturbance of the system of cellular regulation. In

another study (Melegari et al., 2010b), it was demonstrated that

STX can induce N2A cells to significant levels of oxidative

stress.

Similar studies employing other neurotoxins can be

found in the literature. The genotoxic potential of tetrodotoxin in

brown mouse bone cells were evaluated by Guzmán et al. (2007)

and evidences were not found to prove its genotoxic potential.

The genotoxic potential of the domoic and ocadaic acids on Caco

cells was evaluated by Carvalho Pinto-Silva et al. (2006). Both

toxins were considered mutagenic, inducing micronuclei

formation; however, the domoic acid only presented clastogenic

effects.

The genotoxic activity of the cylindrospermopsin (CYN)

was evaluated in WIL2-NS lymphoblasts by Humepage et al.

(2000). CYN is a potent inhibitor of protein synthesis produced

by a number of cyanobacterial species, the most common being

Cylindrospermopsis raciborskii. Its results suggest that CYN acts

to induce cytogenetic damage via two mechanisms, one at DNA

level to induce strand breaks (clastogenic), the other at

kinetochore/spindle level to induce loss of whole chromosomes

(aneugenic).

COL, employed as positive control in this study, is

characteristic for the induction to aneugenic damages (Kirchner

and Zeller, 2010) and it was chosen to evaluate the inclination of

in vitro MN induction, specifically aneugenic.

In relation to the morphologic criteria (Fenech, 2000) of

the analysed samples, an increased presence of micronucleus

(MNs) cells was verified in the samples exposed to STX, when

compared to the control. This evidence suggests that STX can

inhibit cellular division. However, the majority of the MN found

was in BN cells, this result being an indicative of the mutagenic

potential of STX. Cases of cellular necrosis through the formation

of multinucleated cells were not observed (Fenech, 2000). A

significant increase was observed in BN cells regarding the

number of MN with 1/3 the size of the main nucleus in relation to

the smaller MNs (Fig. 3B). Other morphologic characteristics of

the MN found were identified: they touch but do not overlap the

main nucleus and present the same staining intensity (Fenech,

2000).

Hashimoto et al. (2010) had accomplished a study as an

attempt to develop a fast technique that discriminates aneugen

from clastogen damages, considering the size (large or small) of

the MN in in vitro MN assays. Nine aneugen substances were

chosen along with six clastogen substances, comparing the in situ

hybridization through fluorescence (FISH) and the ratio of the

size-classified MN counting in relation to the total MN counting.

The size-classified counting revealed that all 9 aneugens

evaluated increased both frequency and proportion of the large-

size MN when compared to the control vehicle, while the

clastogens increased the frequency, but no increase in the

proportion was observed. With the FISH method, all the

aneugens induced centromere-positive micronuclei but the

clastogens did not. Based on these results, it was considered that

the frequency of large-size MN in the in vitro MN assay is an

alerting index for aneugenic effects and that its proportion is a

simple and reliable index, which is as effective as the FISH

analysis for discrimination of aneugens from clastogens.

Although FISH methods were not employed for the

characterization of aneugen and clastogen effects in this study,

based in the results of Hashimoto et al. (2010) and considering

the frequency of larges MN, it was possible to establish an

indicative that the effects induced by STX are aneugenic.

Our results allow the conclusion that, in the conditions

tested, STX induced a significant increase of BNMN frequency in

both N2A and Vero cells; therefore, the exhibition of these cells

presented a dose-dependent correlation with the increase of the

concentration of STX. The increase of micronucleus frequency

with the variation of the concentration of STX evidences that

STX induces a potential genotoxic effect in N2A and Vero cells.

5. ACKNOWLEDGEMENTS

The authors would like to acknowledge the Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq,

Brazil) for its financial support. S.P. Melegari would also like to

thank for her fellowship in the Laboratory of Toxicology,

University of Bordeaux 2 (France).

6. REFERENCES

Bouaïcha, N., 2001. Impact sanitaire des toxines de

cyanobactéries en milieu d’eau douce. Revue Francaise des

Laboratoires. 336, 39-46.

Carvalho Pinto-Silva , C. R., Moukha, S., Matias, W. G.,

Creppy, E. (2006) Comparative Study of Domoic Acid and

Okadaic Acid Induced - Chromosomal Abnormalities in the

CACO-2 Cell Line. Int. J. Environ. Res. Public Health 3, 4-10.

Falconer, I.R., Humpage, A.R., 2005. Health risk assessment

of cyanobacterial (blue-green algal) toxins in drinking water. Int.

J. Environ. Res. Public Health 2, 43–50.

Falconer, I.R., 2008. Health effects associated with controlled

exposures to cyanobacterial toxins, in: Hudnell, H.K. (Ed.)

Cyanobacterial harmful algal blooms: state of the science and

research needs. Springer Press, North Carolina, pp. 607-612.

Fenech, M., Crott, J., Turner, J., Brown, S. 1999. Necrosis,

apoptosis, cytostasis and DNA damage in human lymphocytes

measured simultaneously within the cytokinesis-block

micronucleus assay: description of the method and results for

hydrogen peroxide. Mutagenesis 14, 605–612.

Fenech, M. 2000. The in vitro micronucleus technique. Mut.

Res. 455, 81–95.

Fitzgerald, D.J., Cunliffe, D.A., Burch, M.D., 1998.

Development of health alerts for cyanobacteria and related toxins

in drinking-water in South Australia. Environ. Toxicol. 14, 203-

209.

Guzmán, A., Henestrosa, F.A.R., Marín A. P., Ho, A.,

Borroto, J. I. G., Carasa, I., Pritchard, L. 2007. Evaluation of the

genotoxic potential of the natural neurotoxin Tetrodotoxin (TTX)

in a battery of in vitro and in vivo genotoxicity assays. Mut. Res.

634, 14–24

Hashimoto, K., Nakajima, Y., Matsumura, S., Chatani, F.

2010. An in vitro micronucleus assay with size-classified

micronucleus counting to discriminate aneugens from clastogens.

Toxicology in Vitro 24, 208–216.

Hoeger, S.J., Shawb, G., Hitzfeldc, B.C., Dietrich, D.R. 2004.

Occurrence and elimination of cyanobacterial toxins in two

Australian drinking water treatment plants. Toxicon 43, 639–649.

Humpage, A. R., Fenech, M., Thomas, P., Falconer, I. R.

2000. Micronucleus induction and chromosome loss in

transformed human white cells indicate clastogenic and

aneugenic action of the cyanobacterial toxin, cylindrospermopsin.

Mut. Res. 472, 155–161.

Humpage, A.R., Ledreux, A., Fanok, S., Bernard, C., Briand,

J.F., Eaglesham, G., Papageorgiou, J., Nicholson, B., Steffensen,

D., 2007. Application of the neuroblastoma assay for paralytic

shellfish poisons to neurotoxic freshwater cyanobacteria:

interlaboratory calibration and comparison with other methods of

analysis. Environ. Toxicol. Chem. 26, 1512–1519.

Ikawa, M., Wegener, K., Foxall, T.L., Sasner, J.J., 1982.

Comparison of the toxins of the blue-green alga Aphanizomenon

flos-aquae with the Gonyaulaxtoxins. Toxicon 20, 747-752.

Matias, W.G., Creppy, E.E. 1998. 5-Methyldeoxycytosine as

a biological marker of DNA damage induced by okadaic acid in

vero cells. Environ. Toxicol. Water Quality 13, 83-88.

Melegari, S.P., Augier, E.G., Carvalho-Pinto Silva, C.R.,

Moukha, S., Creppy, E.E., Matias, W.G., 2010a . Saxitoxin

induces genotoxicity and apoptosis in neuro-2a cells. Arch.Tox.,

(submitted).

Melegari, S.P., Carvalho-Pinto Silva, C.R., Moukha, S.,

Creppy, E.E., Matias, W.G., 2010b. Lipid peroxidation induction

by saxitoxin in neuro-2a cells: the protective effect of vitamins c

and e, superoxide dismutase and catalase. Toxicology (submitted)

Miller, B., Potter-Locher, F. Seelbach, A., Stopper, H.,

Utesch, D., Madle, S. 1998. Evaluation of the in vitro

micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal

aberration assay: position of the GUM working group on the in

vitro micronucleus test, Mutat. Res. 410, 81–116.

Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V., Lorge, E.

1997. Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test

and the in vitro chromosome aberration test: industrial

experience, Mutat. Res. 392, 45–59.

Smart, R.C., Hodgson, E. (Eds) (2008) Molecular and

Biochemical Toxicology. John Wiley, New York, pp. 287-318.

Sivonen K, Jones G. 1999. Cyanobacterial toxins, in: Chorus,

I., Bartman, J. (Eds.) Toxic cyanobacteria in water: A guide to

their public health consequences, monitoring and management.

E&FN Spon, London, pp. 55-124.

Tucci, A., Sant’anna, C.L., 2003. Cylindrospermopsis

raciborskii (Woloszynska) Seenayya & Subba Raju

(Cyanobacteria): variação semanal e relações com fatores

ambientais em um reservatório eutrófico, São Paulo, SP, Brasil.

Rev. Brasil. Bot. 26, 97-112.

Zhong, B., Gu, Z., Whong, W., Wallace, W.E., Ong, T. 1991.

Comparative study of micronucleus assay and chromosomal

aberration analysis in V79 cells exposed to ethylene oxide,

Teratogenesis Carcinogenesis Mutagenesis 11, 227–233.

Fig. 1: Dose-response profiles of STX in N2A and Vero cells for

cellular viability (%) ± SD v. STX concentration (R

=0.997 to N2A

cells and R

=0.9635 Vero cells).

Fig. 2. Number of BNMN cells induced by STX (0.38, 0.75, 1.50,

3.00 nM) in N2A and Vero cells in 24h of exposition. Colchicin was

employed as a positive control. Results are expressed as mean of

three experiments values±standard deviation (n = 3).

Fig. 3: Image of N2A cell stained (Magnification: 1000x) A: control

BN cell; B: BNMN cell.

A11. ARTIGO 4: (SERÁ SUBMETIDO À REVISTA CIENTÍFICA

WATER RESEARCH)

ESTUDO DO USO DE QUITINA E CONCHA DE OSTRAS

COMO ADSORVENTES PARA REMOÇÃO DE

SAXITOXINA DE SOLUÇÃO AQUOSA

Silvia Pedroso Melegari, Cátia Regina Silva de Carvalho Pinto e

William Gerson Matias*

Laboratório de Toxicologia Ambiental, LABTOX – Depto. de Engenharia

Sanitária e Ambiental- Universidade Federal de Santa Catarina – Campus

Universitário- CEP: 88040-970 - Florianópolis - SC - Brasil.

* Autor correspondente: Laboratório de Toxicologia Ambiental, LABTOX –

Depto. de Engenharia Sanitária e Ambiental- Universidade Federal de Santa

Catarina – Campus Universitário- CEP: 88040-970 - Florianópolis - SC -

Brasil - Tel.: +55 48 37217742 - Fax: +55 48 37219823.

E-mail address: will@ens.ufsc.br (W.G. Matias).

Resumo: Este estudo avaliou a capacidade de adsorsão dos

materiais de origem natural quitina e concha de ostra na remoção

de saxitoxina (STX) de soluções aquosa. A cinética de adsorção

foi realizada para 200mg do adsorvente com 10mL de uma

solução de STX 10µg/L preparado nos pH 5,0 e 7,0, e foi

coletado num intervalo de tempo de 12-72h. Para avaliar o

processo de adsorção foram adicionados 10mL de solução

contendo STX 2-16µg/L, nos pH 5,0 e 7,0, aos tubos contendo o

adsorvente previamente pesado (200±5mg). Em seguida, os

frascos foram colocados em um agitador orbital (Shaker) à

200rpm por 24h e 25ºC. Ambas as frações amostrais foram

filtradas em membrana de 0,20µm e coletadas num tubo de

microcentrífuga. Na sequência, as frações foram analisadas em

HPLC, para a quantificação da STX. Observou-se que a concha

de ostra e quitina exibiram boa capacidade de remoção da STX

de soluções aquosa dentro dos limites de concentração estudados.

As características da concha de ostra e da quitina foram

consistentes com o modelo de adsorção clássico da isoterma

linear e não-linear de Freundlich e os valores de K

apresentaram

diferenças significativas entre os adsorventes testados, indicam

que a concha de ostra em pH 5,0 e a quitina em pH 7,0 tem maior

capacidade nos sítios de adsorção à STX. Esse parâmetro

possivelmente foi afetado pelo pH do meio. Os valores dos ∆G

ads

calculados foram negativos permitindo concluir que a utilização

destes adsorventes é favorável e pode ser aplicável como

adsorventes para a remoção de STX de soluções aquosas.

Palavras-chave: saxitoxina, quitina, concha de ostra, adsorção.

1. INTRODUÇÃO

O crescimento excessivo de cianobactérias em

reservatórios de água potável é um problema cada vez mais

comum associado com a eutrofização existem diferentes

alternativas de tratamento numa estação de tratamento de água

(ETA) no que concerne à remoção destas cianobactérias e

cianotoxinas (Chow et al., 1999). Quando ocorre a lise das

células de cianobactérias por causas naturais ou por uso de

algicidas, são liberadas as cianotoxinas, passando a haver

essencialmente toxinas solúveis (Jones & Negri, 1997; Chow et

al., 1999). Neste caso, precisam existir processos de tratamento

que consigam assegurar a sua eficiente e consistente remoção.

São necessários processos que removam compostos orgânicos

solúveis, tais como ozônio, carvão ativado, nanofiltração ou

osmose inversa, biodegradação, entre muitas outras

possibilidades de métodos que vem sendo testados e otimizados

(Chow et al., 1999; Sens et al., 2005; Amorim, 2007; Coral,

2009). São grandes a evidências do bom desempenho para a

utilização de elevadas dosagens de carvão ativado em pó, mas

este processo se torna lento e caro devido as grandes quantidades

de carvão que precisam ser empregadas (Keijola et al. 1988;

Himberg et al. 1989). Diferentes alternativas de remoção de

cianotoxinas já vêm sendo testadas por adsorção (Miller et al.,

2001; Miller et al. 2005; Burns et al. 2009), porém dada à

escassez de informação ainda existente, a utilização de filtros

com materiais alternativos para a remoção de saxitoxina (STX)

ainda é um assunto novo e pouco explorado (Silva, 2005).

Este estudo avaliou a capacidade de adsorsão dos materiais

de origem natural concha de ostra e quitina na remoção de

saxitoxina (STX) de soluções aquosas. Para a verificação da

capacidade na adsorção da STX à conchas de ostras e a quitina,

faz-se necessário um pequeno levantamento das suas

propriedades.

Conchas de moluscos bivalves, em especial as de ostras,

consistem preferencialmente de aragonita. A aragonita é uma

modificação mineral do carbonato de cálcio (Kitano et al. 1976).

O carbonato de cálcio (CaCO

) apresenta-se em três modificações

minerais, sendo que a calcita é um dos minerais mais comuns,

sendo o constituinte principal de vastas formações de rochas

sedimentares de calcário (Blesser & Rodrigues, 2008). A

ocorrência de aragonita está vinculada a determinadas

circunstâncias físico-químicas durante sua formação. O terceiro

polimorfo, a vaterita, é um mineral bem mais escasso (Blesser e

Rodrigues, 2008). A aragonita tem um arranjo atômico mais

compacto do que a calcita, sendo o mineral formador das

conchas, pérolas e corais. Estes carbonatos de cálcio biogênicos

são importantes contribuintes na remoção de fosfatos de águas,

sendo que a aragonita oferece maior superfície ativa, e maiores

sítios adsorventes ativos que a calcita. A capacidade de adsorção

da aragonita é em torno de 20 vezes maior que a da calcita,

baseado no nº de moles de fosfato adsorvido por grama de

partícula (Millero et al., 2001).

A quitina é um polissacarídeo de cadeia linear formado por

unidades de N-acetil-2-dioxi-D-glicopiranose, que são

interligadas por ligações glicosídicas β (1→4) (Kumar, 2000;

Azevedo et al. 2007). A quitina é um material de fontes naturais

renováveis, biodegradável, não-tóxico, insolúvel em água e em

muitos solventes orgânicos (Azevedo et al. 2007; Antonino,

2007). As principais fontes para a obtenção de quitina em

laboratório são os exoesqueletos de vários crustáceos, como

caranguejos e camarões (Kumar, 2000; Antonino, 2007). A

quitina está fortemente associada com proteínas, material

inorgânico, pigmentos e lipídios (Kumar, 2000). Várias condições

são usadas para remover essas impurezas e ainda não existe um

processo padrão. Para isolar a quitina pode-se seguir as etapas de

desproteinização, desmineralização e despigmentação (Azevedo

et al. 2007).

As carapaças de crustáceos e as conchas de moluscos são

resíduos abundantes e rejeitados pela indústria pesqueira, que em

muitos casos são considerados poluentes. Sua reutilização reduz o

impacto ambiental causado pelo acúmulo nos locais onde é

gerado ou estocado (Goosen, 1996; Azevedo et al., 2007). A

reutilização dessas substâncias é muito relevante do ponto de

vista ambiental e econômico, porque além de eliminar os resíduos

da indústria pesqueira, o custo final de produção é reduzido em

cerca de 60% (Mathur & Narang, 1990). Geralmente estes

materiais são empregados em estudos de adsorção dos mais

diversos metais pesados de soluções aquosas: Cu(ІІ),Zn(ІІ),

Cr(VI), Cd(II), Pb(II) (Kitano et al. 1976; Solodovnik, 2006;

Odoemelam et al., 2009).

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Materiais Adsorventes

A quitina foi produzida a partir de carapaças de camarão e

foi fornecida pelo Grupo de Pesquisa em Quitinas e Aplicações

Tecnológicas (QUITECH) da Universidade Federal de Santa

Catarina - Brasil, sob a coordenação do Prof. Dr. Mauro César

Marghetti Laranjeira. A quitina bruta foi previamente triturada e

passada em peneiras de 18Mesh para apresentar partículas de

tamanho ≤1,0mm. O pó de ostra foi produzido a partir de cascas

de ostras calcinadas e trituradas. O pó de concha de ostra

empregado foi comercializado em casas de produtos naturais, e já

apresentava partículas de tamanho ≤1,0mm, não necessitando de

preparação prévia. Os materiais adsorventes foram previamente

seco em estufa a 105°C por 24 horas, foram colocados em tubos

de centrífuga tipo “Falcon” nas respectivas massas avaliadas, e

foram esterilizados em autoclave por 15 minutos à 121ºC para

eliminar a interferência por degradação microbiológica.

2.2. Ensaios de Adsorção

A cinética de adsorção foi realizada para 200mg do

adsorvente com 10mL de uma solução de STX 10µg/L preparado

nos pH 5,0 e 7,0. Os tempos de mistura avaliados nos ensaios em

triplicata foram 0, 12, 18, 24, 36, 48 e 72h, com amostragem de

0,5mL nos respectivos intervalos de tempo à 25ºC.

O método usado para avaliar o processo de adsorção foi

baseado em Miller et al. (2001) e Ohe (1996). Foram adicionados

10mL de solução contendo STX 2-16µg/L, nos pH 5,0 e 7,0, aos

tubos contendo o adsorvente previamente pesado (200±5mg). Em

seguida, os frascos foram colocados em um agitador orbital

(Shaker) a 200rpm por 48h à 25ºC. Todas as amostras foram

avaliadas em triplicatas.

Ambas as frações amostrais foram filtradas em membrana

de 0,20µm e coletadas num tubo de microcentrífuga. Na

sequência, as frações foram analisadas em HPLC, para a

quantificação da STX. Um grupo controle foi avaliado nas

mesmas condições das amostras, na ausência dos adsorventes,

contendo apenas 10mL das soluções de STX 10µg/L nos pH 5,0 e

7,0 em um tubo estéril, para avaliar a presença do efeito de

degradação da toxina por vias químicas, enzimática ou

microbiológicas.

2.3. Análise da saxitoxina

A STX certificada foi obtida no Institute for Marine

Biosciences (Halifax, NS, Canada). A derivatização e

quantificação da STX foi adaptada da metodologia recomendada

pela AOAC (2005). A STX foi derivatizada pré-coluna, em

bancada, pelo método de oxidação com peróxido, que consistiu

em adicionar e agitar 25µL de uma solução aquosa de H

10%

(m:v) em 250µL de NaOH 1M em um tubo de microcentrífuga.

Adicionou-se então 100µL da solução contendo a STX, agitou-se

e deixou-se reagir por 2 minutos à temperatura ambiente.

Adicionou-se 20µL de ácido acético concentrado e misturou, e

esta solução está pronta para ser quantificada. A STX

derivatizada foi quantificada por cromatografia liquida de alta

performance (HPLC) usando o método de calibração externa. O

padrão e as amostras derivatizados foram injetadas (50µL) em

uma coluna C18 Supelco Discovery®(250x4,0 mm d.i., ø 5µm).

O HPLC operou em condições de gradiente de eluente,

empregando como eluente A uma solução tamponada de formiato

de amônio 0,1M, pH 6,0 e eluente B acetonitrila grau HPLC. A

corrida cromatográfica foi de 15 minutos, e o gradiente consistiu

de: 0-1% de B nos primeiro 5 minutos, 1-4% de B nos próximos

3 minutos, 4% de B nos próximos 5 minutos, e 4-0% de B nos

últimos 2 minutos, com 3 minutos de estabilização pós-corrida

antes da próxima injeção. O fluxo do eluente foi de 1mL/min. O

detector empregado foi o de fluorescência com excitação em

340nm e emissão em 390nm.

2.4. Análise estatística

Todos os resultados foram expressos em media±desvio

padrão. A análise de regressão(o fator de correlação - R

equação da reta) foi realizada pelo software Microsoft Excel® e

em paralelo no software GraphPad Prism®.

Os dados obtidos no equilíbrio foram plotados de acordo

com os modelos das isotermas que melhor descrevem a adsorção

deste estudo: o modelo linear (Lin) e o não-linear (N-Lin) de

Freundlich (Eq. 1 e 2), sendo que esta isoterma é atualmente a

mais adotada para a determinação da adsorção das cianotoxinas

em sedimentos (Miller et al., 2001). A quantidade de STX

adsorvida (µg) por kg de adsorvente foi quantificada, e o

coeficiente de adsorção foi calculado a partir destas isotermas de

adsorção (Miller et al., 2001; Miller et al., 2005).

Modelo Lin: X/m = K

.Ce (1)

Modelo N-Lin (Freundlich): X/m = K

.Ce

(2)

Onde: X/m = quantidade em µg de STX adsorvida por kg de

adsorvente (µg STX/kg), Ce = concentração da toxina na solução

no tempo de mistura (µg/L), K

= coeficiente de distribuição

linear, K

= coeficiente de adsorção Freundlich, n = medida de

não-linearidade.

As inclinações das isotermas de adsorção foram

comparadas através do teste T-Student. Um valor de p=0,05 foi

aceito como nível de confiança.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Efeito da concentração e o tempo de contato

A STX aquosa foi removida da solução quando em contato

com os adsorventes testados (Fig. 1 e 2) e as cinéticas de

adsorção da STX ao longo do tempo de mistura para os pH

empregados para a quitina e concha de ostra apresentaram uma

visível remoção (>40% remoção) em ambos os casos testados em

36h de tempo de contato. No experimento controle, apenas com a

STX sem adsorvente, não foi observado a degradação da toxina

ao longo dos tempos de contato do teste.

A taxa de remoção de STX pelos adsorventes diminui com

o tempo de contato, possivelmente pela saturação dos sítios

adsorventes. Essa saturação dos sítios adsorventes pode estar

associada também à presença de fosfato em solução provenientes

do tampão empregado, especialmente para o caso da concha de

ostra. Essa interferência da concentração iônica dos tampões nos

ensaios de adsorção foi relatada por Miller et al. (2001).Após 48h

de tempo de contato, foi observado que a concentração da STX

em solução tendeu a estabilizar, principalmente em pH 7,0,

provavelmente atingindo o equilíbrio de adsorção entre

adsorvente e adsorvato.

3.2 Considerações sobre Adsorção

As isotermas de adsorção Lin e N-Lin podem ser

visualizadas nas Fig. 3 e 4.De acordo com o isoterma da adsorção

de Freundlich, as frações de cobertura de superfície (X/m) estão

relacionadas à concentração do equilíbrio do adsorbato. A

isoterma de Freundlich descreve o equilíbrio em superfícies

heterogêneas e, por esta razão, não assume uma capacidade de

adsorção em monocamada (Fávere et al., 2010).

A partir das isotermas da Fig. 3 e 4 foram determinadas as

equações das isotermas de adsorção da STX com bom ajuste ao

modelo Lin e N-Lin de Freundlich para o materiais empregados

como adsorventes à 25ºC (Tab. 1). Esse bom ajuste pode ser

explicado pelos materiais empregados serem de origem natural e

apresentarem superfícies heterogêneas. Na Tab. 1 é apresentado

os valores de R

para ambos os modelos testados, que se

demonstraram favoráveis em pH 5,0 para quitina e em pH 7,0

para ambos os adsorventes testados. Por meio do modelo Lin,

pode-se obter valores do coeficiente de distribuição (K

). São

apresentadas na Tab. 1 ainda os valores de n, relacionado com a

intensidade de adsorção, e K

que indica a capacidade do sítio de

adsorção.

Os valores de K

para ambos os pH testados foi elevado,

confirmando que a STX foi adsorvida pelos adsorventes testados.

Os valores de K

em pH 5,0 foi de 47,3L/kg para concha de ostra

e 50,2L/kg para a quitina. O K

em pH 7,0 foi de 50,6L/kg para

concha de ostra e 48,1L/kg para a quitina (Tab.1).Neste

tratamento de isotermas Lin, os valores de K

não apresentaram

diferenças significativas entre os adsorventes testados.

Para as isotermas N-Lin de Freundlich, a STX foi

adsorvida por ambos os adsorventes testados mas apresentou

diferenças significativas entre os adsorventes testados (p>0,05).

Os valores de K

em pH 5,0 foi de 52,91L/kg para concha de

ostra e 40,53L/kg para a quitina, indicando que neste pH a STX

teve uma maior afinidade à concha de ostra. O K

em pH 7,0 foi

de 46,63L/kg para concha de ostra e 64,22L/kg para a quitina,

indicando que neste pH a STX teve uma maior afinidade à quitina

(Tab.1). Os valores de K

encontrados indicam que concha de

ostra em pH 5,0 e para a quitina em pH 7,0 tem maior capacidade

de sítios de adsorção à STX, indicando que este parâmetro foi

afetado pelo pH da solução. Os valores de n variaram de 0,84 –

1,11 para ambos os adsorventes testados, revelando que a

adsorção da STX foi eficiente.

3.3. Considerações Termodinâmicas

A energia livre de Gibbs de adsorção (∆G

ads

)é relatada por

Odoemelam et al. (2009) de acordo com a Eq. 3.

∆G

ads

= - 2,303.R.T.logK (3)

Onde R é a constante universal dos gases e T é a

temperatura. Usando os valores de K

calculados pela isotermas

de Freundlich, os valores de ∆G

ads

de adsorção para a STX

puderam serem calculados para os adsorventes testados em

ambos os pH, e são apresentados na Tab. 2.

Os valores dos ∆G

ads

negativos indicam que a adsorção de

STX nos adsorventes foi espontânea nas condições testadas e

indicam também que o mecanismo da adsorção química é

aplicável à adsorção de STX por ambos os adsorventes. Estes

valores podem ainda ser melhorados favorecendo ainda mais a

adsorção, realizando combinações destes adsorventes com carvão

ativado, por exemplo.

4. CONCLUSÕES

Neste estudo, observou-se que a concha de ostra e quitina

demonstraram boa capacidade de remoção da STX de soluções

aquosa dentro dos limites de concentração estudados. As

características da concha de ostra e da quitina foram consistentes

com o modelo de adsorção clássico da isoterma Lin e N-Lin de

Freundlich e os valores de K

apresentaram diferenças

significativas entre os adsorventes testados, indicando que concha

de ostra em pH 5,0 e a quitina em pH 7,0 apresentaram maior

capacidade de adsorção da STX. Esse parâmetro possivelmente

foi afetado pelo pH do meio. Os valores dos ∆G

ads

negativos

permitem concluir que a adsorção da STX nestes materiais é

favorável e espontânea, e estes podem ser aplicáveis como

adsorventes para a remoção de STX de soluções aquosas.

Agradecimentos: Agradecimentos ao Prof. Dr. Mauro Cesar

Marghetti Laranjeira (QUIMTECH – UFSC) pelas amostras de

quitina empregadas nos ensaios de adsorção. À Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal em Nível Superior - CAPES e a

Conselho Nacional de Pesquisa - CNPq pelo financiamento desta

pesquisa.

5. REFERÊNCIAS

AMORIM, F.F. (2007). Remoção dos Contaminantes

Orgânicos β-estradiol e Saxitoxinas (STX, Neo-STX e dc-STX)

por meio de Nanofiltração: Avaliação em Escala de Bancada.

Dissertação (Mestrado) - ENC/FT/UnB. Brasilia. 133p

ANTONINO, N. A. (2007). Otimização do processo de

obtenção de quitina e quitosana de exoesqueletos de camarões

oriundo da industria pesqueira paraibana. Dissertação (Mestrado).

UFPB/CCEN. João Pessoa, Brasil. 88p.

AOAC – ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL

CHEMISTS - Official Method 2005.06: Paralytic Shellfish

Poisoning Toxins in Shellfish – Pre-chromatographic Oxidation

and Liquid Chromatography with Fluorescence Detection. First

Action 2005.

AZEVEDO, V. V. C., CHAVES S. A. , BEZERRA D. C.,

LIA FOOK M. V., COSTA A. C. F. M. (2007). Quitina e

Quitosana: aplicações como biomateriais REMAP. 2(3), 27-34

BESSLER, K. E., RODRIGUES, L. C. (2008). Os

polimorfos de carbonato de cálcio – uma síntese fácil de

aragonita. Quim. Nova, 31(1), 178-180.

BURNS, J. M., HALL, S., FERRY, J. L. (2009). The

adsorption of saxitoxin to clays and sediments in fresh and saline

waters. Water Res. 43, 1899-1904.

CHOW, C.W.K., DRIKAS, M., HOUSE, J.,

BURCH,M.D., VELZEBOER, R.M.A. (1999). The impact of

conventional water treatment processes on cells of the

cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Water Res., 33(15),

3253-3262.

CORAL, L. A. (2009). Remoção de cianobactérias e

cianotoxinas em águas de abastecimento pela associação de

flotação por ar dissolvido e nanofiltração. Dissertação

(Mestrado). PPGEA-UFSC. Florianópolis, Brasil. 198p.

FÁVERE, V.T, RIELLA, H. G., ROSA, S. (2010)Cloreto

de n-(2-hidroxil) propil-3-trimetil amônio quitosana como

adsorvente de corantes reativos em solução aquosa. Quim. Nova.

XY, 1-6.

GOOSEN, M. E. A. (1996) Applications of chitin and

chitosan, Technomic Publishing Company, Lancaster. 336p.

HIMBERG, K., KEIJOLA, A.M., HIISVIRTA, L.,

PYYSALO, H., SIVONEN, K.. (1989). The effect of water

treatment processes on the removal of hepatotoxins from

Microcystis and Oscillatoria cyanobacteria: A laboratory study.

Water Res. 23 (8), 979-984

JONES, G.J., NEGRI, A.P.(1997). Persistence and

degradation of cyanobacterial paralytic shellfish poisons (PSPs)

in freshwaters, Water Res. 31, 525–533.

KEIJOLA, A.-M., HIMBERG, K., ESALA, A.L.,

SIVONEN K., HIISVIRTA, L. (1988). Removal of

cyanobacterial toxins in water treatment processes: Laboratory

and pilot scale experiments. Toxicity Assessment: An

International Journal, 3, 643-656.

KITANO, Y., KANAMORI,N., YOSHIOKA, S. (1976).

Adsorption of zinc and copper ions on calcite and aragonite and

its influence on the transformation of aragonite to calcite.

Geochemical Journal, 10, 175-179.

KUMAR,M.N.V.R. (2000). A review of chitin and

chitosan applications. Reactive Func. Polymers. 46, 1-27.

MATHUR, N. K.; NARANG, K. (1990) Chitin and

Chitosan, Versatile Polysaccharides from Marine Animals. J.

Chem. Educ., 67, 11.

MILLER, M.J., CRITCHLEY, M.M., HUTSON, J.,

FALLOWFIELD, H. J. (2001). The adsorption of cyanobacterial

hepatotoxins from water onto soil during batch experiments.

Water Res. 35, 1461 – 1468.

MILLER, M.J., HUTSON, J., FALLOWFIELD, H. J.

(2005). The adsorption of cyanobacterial hepatotoxins as a

function of soil properties. J. Water Health, 3(4), 339-347.

MILLERO, F, HUANG,F., ZHU, X., LIU, X., ZHANG, J.

(2001) Adsorption and Desorption of Phosphate on Calcite and

Aragonite in Seawater. Aquatic Geochemistry 7: 33–56.

ODOEMELAM, S. A., EDDY, N. O. (2009). Studies on

the se of Oyster, Snail and Periwinkle Shells as Adsorbents for

the Removal of Pb

from Aqueous Solution. E-J.Chem., 6, 213-

222.

OHE,T. (1996). Antigenotoxic activities of chitin and

chitosan as assayed bysister chromatid exchange. The Science of

the Total Environment 181, 1-5.

ORR P.T., JONES, G.J.,HAMILTON,G.R.(2004).

Removal of saxitoxins from drinking water by granular activated

carbon, ozone and hydrogen peroxide - implications for

compliance with the Australian drinking water guidelines, Water

Res. 38, 4455–4461.

SCHWARZENBACH, R. P; GSCHWEND, P.M.;

IMBODEN, D.M. (2003). Environmental Organic Chemistry, 2

Edição, USA, 275 – 330 p.

SENS, M.L., MELO FILHO, L.C., MONDARDO, R.I.,

PROENÇA, L.A.O. (2005). Ozonização: uma alternativa para o

tratamento de água com cianobactérias. Rev. Ciên. Tecnol. 13,

47-54.

SILVA, A.S. (2005). Avaliação da capacidade de remoção

de saxitoxinas por diferentes tipos de carvão ativado em pó

(CAP) produzidos no Brasil. Dissertação (Mestrado) – UnB.

Brasília, Brasil. 115p.

SOLODOVNIK. T. (2006)Application of chitin containing

sorbents fortreatment of water solutions. In: LOUREIRO, J.M.

AND KARTEL M.T. (eds.), Combined and Hybrid Adsorbents,

Springer-London, 275–280 pp.

Fig. 1: Processo cinético de adsorção da STX em quitina e pó de

concha. Condições: 10µM STX, 200mg de adsorvente, pH 5,0 e

25ºC.

Fig. 2: Processo cinético de adsorção da STX em quitina e pó de

concha. Condições: 10µM STX, 200mg de adsorvente, pH 7,0 e

25ºC.

Fig. 3: Isotermas de adsorção Lin e N-Lin (respect.) de STX em

quitina e pó de concha de ostra à 25ºC e pH 5,0.

Fig. 4: Isotermas de adsorção Lin e N-Lin (respect.) de STX em

quitina e pó de concha de ostra à 25ºC e pH 7,0.

Tab. 1: Parâmetros obtidos pelas isotermas de adsorção da STX nas

diferentes condições analisadas.

Ensaio

Adsorv.

Modelo

linear

(X/m=K

.Ce)

(L/kg)

Modelo não

linear

(Log X/m =

nLog Ce +

LogK

)

(L/kg)

Concha

Ostra

X/m =

47,312Ce +

8,2456

47,312

0,76270

Log (X/m) =

0,949Log Ce

+1,7387

0,949

52,91

0,75626

5,0

Quitina

X/m =

50,168Ce +

1,0669

50,168

0,97521

Log (X/m) =

1,11115LogCe +

1,6078

1,1112

40,53

0,91766

Concha

Ostra

X/m =

50,649Ce -

10,874

50,649

0,99085

Log (X/m) =

1,0245LogCe

+1,6687

1,0245

46,63

0,98426

7,0

Quitina

X/m =

48,135Ce +

8,6811

48,135

0,98528

Log (X/m) =

0,8437LogCe

+1,8077

0,8437

64,22

0,96624

Tab. 2: Valores de ∆G

ads

para a STX para os adsorventes testados

nos pH 5,0 e 7,0.

Ensaio

Adsorvente

∆G

ads

(kJ/mol)

Concha Ostra

-9,843

5,0

Quitina

-9,182

Concha Ostra

-9,530

7,0

Quitina

-10,324

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