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Moacir Marocolo Júnior
“Remodelamento elétrico em corações de ratos
tratados com esteróide anabólico”
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM CIÊNCIAS
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Rio de Janeiro, 2010
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Moacir Marocolo Júnior
Remodelamento elétrico em corações de ratos tratados
com esteróide anabólico
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas
(Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessários à obtenção
do título de Doutor em Ciências biológicas
(Fisiologia)
Orientador: Jose Hamilton Matheus Nascimento
Emiliano Horacio Medei
Rio de Janeiro
2010
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FICHA CATALOGRÁFICA
Moacir Marocolo Júnior
Remodelamento cardíaco em um modelo de tratamento
crônico com esteróide anabólico/ Moacir Marocolo Júnior. Rio
de Janeiro:UFRJ/IBCCF, 2010.
Tese (Doutorado em Fisiologia) – Universidade Federal
do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
Pós-Graduação em Fisiologia, 2010.
Orientador: José Hamilton Matheus Nascimento
1. Esteróide Anabólico. 2. Eletrofisiologia. 3.
Repolarização ventricular – Teses. I. Nascimento, José
Hamilton Matheus (Orient.). II. Universidade Federal do
Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
IBCCF. III. Remodelamento cardíaco em um modelo de
tratamento crônico com esteróide anabólico.
CDD:
Moacir Marocolo Júnior
REMODELAMENTO ELÉTRICO EM CORAÇÕES DE RATOS
TRATADOS COM ESTERÓIDE ANABÓLICO
Rio de Janeiro, 23 de setembro de 2010.
___________________________________________________________________
(José Hamilton Matheus Nascimento, Doutor, IBCCF/UFRJ (Orientador)
___________________________________________________________________
(Emiliano Horacio Medei, Doutor, IBCCF/UFRJ/XERÉM (Orientador)
___________________________________________________________________
(Gisele Zapata-Sudo, Doutora, ICB/UFRJ)
___________________________________________________________________
(Alysson Roncally Carvalho, Doutor, IBCCF/UFRJ)
___________________________________________________________________
(Valdo José Dias, Doutor, DCB/UFTM)
___________________________________________________________________
(Cristiane del Corsso, Doutora, IBCCF/UFRJ (Revisora)
Toda a nossa ciência, comparada com a realidade, é primitiva e infantil e, no
entanto, é a coisa mais preciosa que temos.
Albert Einstein (1879 – 1955)
O primeiro pecado da humanidade foi a fé.
A primeira virtude foi a duvida.
Carl Sagan (1934 – 1996)
Agradecimentos
Ao professor e amigo José Marques Novo Júnior, pelo incentivo na carreira
acadêmica, pelos ensinamentos sólidos e multidisciplinares durante a iniciação
científica.
Ao professor e amigo Renato Miranda, incentivador incondicional na minha profissão
e pela importância crucial no meu ingresso no mestrado.
Ao professor Jurandir Nadal, pela orientação e contribuição na minha formação e
ampliação dos conhecimentos durante minha estada na Engenharia Biomédica.
Ao Dr. Paulo Roberto Benchimol Barbosa pelos brilhantes ensinamentos científicos
e auxílio na orientação e formação no mestrado.
Ao amigo Guto, pela viabilização da minha carreira no magistério superior.
Ao professor e amigo Maurício Bara, pelo incentivo e apoio em momentos difíceis.
Ao professor e amigo José Hamilton, pela oportunidade de ingresso no programa de
doutorado, pela confiança e paciência e por todo o conhecimento transmitido
durante esta longa convivência.
Ao amigo Emiliano, por importantes ensinamentos, fundamentais na minha formação
e pela importante colaboração no desenvolvimento deste estudo.
Aos amigos de profissão e de coração do Laboratório de Eletrofisiologia Cardíaca,
antigos e recentes, uns mais e outros menos presentes: Ana Carolina Carvalho,
Fredson Serejo, Luiz Fernando, Cássia, Elen, Bruno Esporcate, Fabrício, Pedro
Paulo, Silvio Marques, Edil, Alex, Paulo, Mara, Emanuele, Leonardo, Jamil, Raquel.
A Sandra Brito, por ter colaborado desde sempre nos momentos importantes desde
os primeiros dias no IBCCF.
Ao corpo técnico e administrativo do IBCCF, por nos ajudar nas tarefas que nos
parecem invisíveis.
Aos meus pais, presença incondicional em minha vida em todos os momentos, que
me oportunizaram um bem incalculável: uma ótima educação.
Às amizades conquistadas e consolidadas ao longo da vida Klinger, Andersen,
Anderson Kiffer, Toledão, Schimitz, Kamimura, Leleu, Aline, Marquinho (obrigado
também pelo apoio logístico), Eurico, Alexandre Xaxixa, Baiano, Octavio, Fred
Frazão, muito obrigado.
Ao meu mestre e amigo, Luiz Carlos P. Monteiro, pelos mais de 18 anos de
convivência, por me mostrar que a persistência e dedicação sempre nos levam aos
nossos objetivos.
Aos recentes amigos da UFTM, que compreenderam algumas ausências e
dificuldades nessa etapa final.
Ao Schimitz, companheiro de viagem, amigo de longa data, obrigado pelo incentivo
e admiração, saiba que foi de grande importância nessa etapa.
Ao Toledão, amigo incondicional, obrigado pela ajuda na profissão, pela confiança
sempre explícita e por me oportunizar os grandes incentivos e progressos da minha
carreira, serei eternamente grato.
A todos os carros usados nesses 5 anos de idas e vindas ao Rio de Janeiro,
totalizando mais de 400.000 Km percorridos.
RESUMO
MAROCOLO, Moacir. Remodelamento elétrico em corações de ratos tratados com
esteróide anabólico. Rio de Janeiro, 2010. Tese de doutorado (Doutorado em
Fisiologia)- Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio
de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
O sedentarismo pode ser considerado um dos principais fatores ligado às causas de
morte decorrentes de doenças cardiovasculares. O exercício físico regular reduz o
risco de mortalidade de todas as causas, especialmente as cardiovasculares. O uso
de esteróides anabólicos (EAA) não está mais restrito ao esporte de alto rendimento,
tendo se tornado um problema de saúde pública e associado à ocorrência de
distúrbios cardiovasculares e morte súbita. O presente estudo objetivou investigar se
a administração crônica de esteróide anabólico (decanoato de nandrolona)
influenciaria o mecanismo de repolarização ventricular e a função cardíaca
autonômica em ratos sedentários e treinados, submetidos com tratamento crônico
com esteróide anabólico. Ratos Wistar machos foram treinados e tratados com EAA,
submetidos à avaliações biométricas, eletrocardiográficas e ecocardiográficas
durante 8 semanas. Ao final do protocolo experimental, cortes teciduais cardíacos
foram empregados nos estudos moleculares e morfométricos. Cardiomiócitos
isolados foram utilizados nos registros eletrofisiológicos. Tratamento com EAA
promoveu aumento do peso cardíaco, com aumento do diâmetro e redução do
número de núcleos dos cardiomiócitos. Aumento e redução da FE% no grupo
treinado Controle e Deca sedentário foi observada. Aumento do intervalo QT e
dispersão de QT (QTd) e disfunção autonômica cardíaca foram identificados em
decorrência do tratamento com EAA. O treinamento físico não impediu os efeitos
delétrios do EAA sobre a função autonômica cardíaca, alterada a partir da 4ª
semana de tratamento. A duração do potencial de ação (DPA) sofreu aumento e a
corrente I
to
foi reduzida no grupo DECA, comparado ao Controle, assim como as
subunidades Kv 1.4, Kv 4.3 e KchIP2. Não houve alterações na deposição de
colágeno e expressão de RNAm para colágeno tipo I e III. O tratamento crônico com
EAA provoca aumento do peso do coração, com redução do número e aumento do
diâmetro dos núcleos dos cardiomiócitos, promove disfunção autonômica,
identificada a partir da 4ª semana de tratamento (não impedida pelo treinamento
físico) e aumento do QT e QTd. Mudanças na repolarização ventricular podem ser
explicadas, pela redução na densidade da corrente I
to
em conseqüência da
diminuição da expressão das subunidades Kv1.4, Kv4.3 e KChIP2 nos animais
tratados com esteróide anabólico. O remodelamento elétrico cardíaco induzido pelo
decanoato de nandrolona pode contribuir substancialmente para a gênese de
arritmias e morte súbita cardíaca.
ABSTRACT
MAROCOLO, Moacir. Heart electrical remodeling in rats treated with anabolic
steroids. Rio de Janeiro, 2010. Tese de doutorado (Doutorado em Fisiologia)--
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Rio de Janeiro, 2010.
A sedentary lifestyle can be considered one of the main factors linked to causes of
death due to cardiovascular diseases. Regular exercise reduces the risk of mortality
from all causes, especially cardiovascular. The use of anabolic steroids (AAS) is no
longer restricted to high performance sport, having become a public health problem
and associated with the occurrence of cardiovascular disturbances and sudden
death. This study aimed to investigate whether chronic administration of anabolic
steroid (nandrolone decanoate) would alter the mechanism of ventricular
repolarization and cardiac autonomic function in sedentary and trained rats submitted
to chronic treatment with anabolic steroid. Male Wistar rats were trained and treated
with AAS, undergoing biometric evaluations, ECG and echocardiography during 8
weeks. At the end of the experimental protocol, heart tissue sections were used in
morphometric and molecular studies. Isolated cardiomyocytes were used in
electrophysiological recordings. AAS treatment promoted an increase in heart weight,
with increased diameter and reducing the number of cardiomyocyte nuclei. Increase
or decrease in EF% in the trained group and Deca sedentary control was observed.
Increased QT interval and QT dispersion (QTd) and cardiac autonomic dysfunction
were identified as a result of treatment with EAA. Physical training did not prevent the
negative effects of AAS on cardiac autonomic function, changed from the 4th week of
treatment. The action potential duration (APD) had increased and current Ito was
reduced in DECA group compared to control, as well as the subunits Kv 1.4, Kv 4.3
and KchIP2. No change in collagen deposition and mRNA expression for collagen
type I and III. Chronic treatment with AAS causes an increase in heart weight,
reduced number and increased diameter of cardiomyocyte nuclei, promotes
autonomic dysfunction, identified from the 4th week of treatment (not hindered by
physical training) and increased QT and QTd. Changes in ventricular repolarization
can be explained by the reduction in current density Ito a result of decreased
expression of Kv1.4 subunits, Kv4.3 and KChIP2 in animals treated with anabolic
steroid. The cardiac electrical remodeling induced by nandrolone decanoate can
contribute substantially to the genesis of arrhythmias and sudden cardiac death.
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1. Estrutura molecular do decanoato de nandrolona e da testosterona.
Figura 2. Eletrocardiograma mostrando os picos R e o maior e menor intervalo entre
eles - RR máximo e mínimo, respectivamente.
Figura 3. Tacograma da série de intervalos RR em função do número de ordenação
de batimentos cardíacos, mostrando a variação entre intervalos RR consecutivos,
durante aquisição do eletrocardiograma em condições de repouso supino, em
indivíduo voluntário.
Figura 4. Potencial de ação, corrente transitória de efluxo e canais de K
+
dependentes de voltagem.
Figura 5. Método de registro do ECG.
Figura 6. Efeito do tratamento com decanoato de nandrolona e exercício sobre a
massa corporal ao longo de 8 semanas.
Figura 7. Massa de gordura corporal após 8 semanas de treinamento e/ou
tratamento com decanoato de nandrolona.
Figura 8. Parâmetros ecocardiográficos medidos antes e após o treinamento e/ou
tratamento com decanoato de nandrolona.
Figura 9. Parâmetros ecocardiográficos medidos antes e após o treinamento e/ou
tratamento com decanoato de nandrolona.
Figura 10. Intervalo QT e intervalo QT corrigido pela freqüência cardíaca medidos
antes e durante o treinamento/tratamento com decanoato de nandrolona.
Figura 11. Efeito do exercício e tratamento com decanoato de nandrolona sobre os
parâmetros de variabilidade da freqüência cardíaca analisados no domínio do
tempo.
Figura 12. Efeito do exercício e tratamento com decanoato de nandrolona sobre os
índices espectrais da variabilidade da freqüência.
Figura 13. Evolução do índice espectral em baixa freqüência.
Figura 14. Potencial de repouso do ventrículo esquerdo e direito de ratos
sedentários controle e tratados com AAS e ratos treinados controle e tratados com
AAS.
Figura 15. Efeito do treinamento e/ou tratamento com decanoato de nandrolona
sobre a amplitude do potencial de ação dos ventrículos esquerdo e direito.
Figura 16. Exemplos de potenciais de ação registrados em tecido isolado de
ventrículo esquerdo e direito de ratos sedentários não-tratados e tratados com
decanoato de nandrolona.
Figura 17. Duração do potencial de ação a 30% da repolarização do VE e VD de
ratos sedentários não tratados ou tratados e treinados não tratados e tratados.
Figura 18. Duração do potencial de ação a 90% da repolarização dos ventrículos
esquerdo e direito de ratos sedentários não tratados ou tratados e treinados não
tratados e tratados.
Figura 19. Características eletrofisiológicas da corrente I
to
registrada em
cardiomiócitos do ventrículo esquerdo de ratos controle e tratados com decanoato
de nandrolona.
Figura 20. Características eletrofisiológicas da corrente I
to
registrada em
cardiomiócitos do ventrículo direito de ratos controle e tratados com decanoato de
nandrolona.
Figura 21. Níveis de expressão de RNAm das subunidades Kv1.4, Kv4.2, Kv4.3 e
KChIP2 nos ventrículos direito e esquerdo de ratos controle e tratados com
decanoato de nandrolona.
Figura 22. Fotomicrografias mostrando cortes histológicos de ventrículo direito dos
grupos CS e DS e de ventrículo esquerdo dos grupos CS e DS.
Figura 23. A, número de núcleos por área nos ventrículos direito e esquerdo de
ratos controle e tratados com decanoato de nandrolona. B, diâmetro do núcleo,
normalizado pelo valor do grupo controle. C, deposição de colágeno determinada
como a área corada por pricosirius red expressa como percentagem da área total.
Figura 24. A e B, níveis de expressão gênica de RNAm de colágeno tipo I e tipo III,
respectivamente, nos ventrículos direito e esquerdo de ratos controle e tratados com
decanoato de nandrolona .
Tabela 1. Modalidades e esteróides anabólicos mais citados entre praticantes de
academias no Rio Grande do Sul.
Tabela 2. Protocolo de treinamento dos ratos em esteira rolante.
Tabela 3. Efeitos do tratamento com DECA e treinamento sobre o peso
corporal e cardíaco dos ratos.
Tabela 4. QTd antes e ao final do protocolo experimental.
LISTA DE ABREVIATURAS e SIGLAS
4-AP: 4-aminopiridina
5α-DHT: 5α-dihidro-testosterona
ACSM: Colégio Americano de Medicina Esportiva
AF: alta freqüência
Ag: prata
AgCl: cloreto de prata
BF: baixa freqüência
CdCl
2
: cloreto de cádmio
CS: grupo controle sedentário
CT: grupo controle treinado
Ctrl.: controle
DECA: decanoato de nandrolona
DPA: duração do potencial de ação celular
DPA
30
: duração do potencial de ação medido a 30% da repolarização
DPA
90
: duração do potencial de ação medido a 30% da repolarização
DS: grupo deca sedentário
DT: grupo deca treinado
EAA: esteróide anabólico androgênico
ECG: eletrocardiograma
EGTA: etilenoglicol-bis (β-aminoetileter)-N, N, N, N-ácidotetraacético
FC: freqüência cardíaca
FE%: fração de ejeção no ventrículo esquerdo (expressa em percentual)
FFT: transformada rápida de fourier
GΩ: Giga Ohms
HE: hematoxilina-eosina
I/V: relação corrente voltagem
I
Ca
: corrente de cálcio
I
K,Ach
: corrente de potássio retificadora de influxo ativada por acetilcolina
I
K,ATP
: corrente de potássio retificadora de influxo ativada por ATP
I
K
: corrente de potássio retificadora retardada
I
K1
: corrente de potássio retificadora de influxo
I
Kr
: corrente de potássio retificadora retardada componente rápido
I
Ks
: corrente de potássio retificadora retardada componente lento
I
Na
: corrente de sódio
I
Na-Ca
: corrente através do trocador sódio/cálcio
I
to
: corrente transiente de saída de potássio
Kv: isoforma predominante da subunidade α da corrente I
to,1
Média ± EPM: média ± erro padrão média
ms: milisegundos
mV: milivolt
p: nível de significância (alfa)
pA: picoampère
PA: potencial de ação
PAS: pressão arterial sitêmica
pNN5%: percentual dos intervalos sucessivos com diferença superior a 5 ms
QT: intervalo QT do eletrocardiograma
QTc: intervalo QT corrigido pela freqüência cardíaca
QTd: dispersão do intervalo QT do eletrocardiograma
Qtmax: máximo intervalo QT
RMSSD: raiz média quadrática da diferença entre intervalos RR normais sucessivos
RR: intervalo entre os picos R do eletrocardiograma
RT-PCR:
SDNN: desvio padrão entre intervalos RR normais sucessivos
SNA: sistema nervoso autônomo
S-T: intervalo S-T
T: onda T do eletrocardiograma
TEA-Cl: Cloreto de tetraetilamônio
VE: ventrículo esquerdo
VFC: variabilidade da freqüência cardíaca
Vh: potencial holding, no qual a célula é mantida para estudo eletrofisiológico
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 16
1.1 Remodelagem cardíaca decorrente do exercício físico 17
1.2 Esteróides Androgênicos Anabólicos (EAA) 20
1.2.1 Testosterona 20
1.2.2 Esteróides Anabólicos Androgênicos 22
1.2.3 Decanoato de Nandrolona 22
1.2.4 Mecanismo de ação dos EAAs 24
1.2.5 Uso dos EAAs 25
1.2.6 Esteróides anabólicos na atualidade 27
1.2.7 Efeitos Colaterais dos EAAs 30
1.3 Parâmetros de repolarização ventricular no ECG 34
1.4 Função autonômica cardíaca: Variabilidade da Freqüência Cardíaca
36
1.5 Correntes iônicas envolvidas na repolarização ventricular 39
1.6 Hipótese do Trabalho 42
1.7 OBJETIVOS 43
1.7.1 Objetivo Geral
43
1.7.2 Objetivos Específicos
43
2. MATERIAIS E MÉTODOS 44
2.1 Animais 44
2.2 Protocolo experimental 44
2.3 Protocolo de treinamento 44
2.4 Medidas Biométricas 45
2.5 Avaliação Ecocardiográfica 45
2.6 Avaliação eletrocardiográfica 46
2.6.1 Análise do Eletrocardiograma: Repolarização ventricular 48
2.6.2 Análise do Eletrocardiograma: Variabilidade da freqüência cardíaca 49
2.7 Estudo Eletrofisiológico: Potencial de ação e corrente iônica 50
2.7.1 Registro do Potencial de ação 50
2.7.2 Registro da corrente transiente de efluxo de K (I
to
) 52
2.8 Extração Total de RNA e RT-PCR quantitativo 56
2.9 Análise Morfométrica 57
2.10 Análise estatística 58
3. RESULTADOS 59
3.1 Biometria 59
3.1.1 Peso corporal 59
3.1.2 Peso do coração 59
3.1.3 Peso de gordura retroperitoneal 60
3.2 Avaliação ecocardiográfica 61
3.3 Intervalo QT e dispersão de QT 64
3.4 Variabilidade da Freqüência Cardíaca 65
3.5 Potencial de Ação 68
3.6 Correntes Iônicas 72
3.7 Biologia Molecular 75
3.8 Análise histológica
77
4. DISCUSSÃO 80
5. CONCLUSÕES 88
6. REFERÊNCIAS 89
APÊNDICE A 116
APÊNDICE B 124
1. INTRODUÇÃO
As doenças cardiovasculares são as principais causas de morte no mundo,
sendo consideradas um grave problema de saúde pública. Conforme os dados da
Organização Mundial de Saúde (The World Health Report 1998, 1999, 2000 e 2001),
as enfermidades cardiovasculares atingiram elevados índices de morbilidade e
mortalidade em todo o mundo (30,9% em 1998, e 30% em 2000, com 16.690.000 e
16.701.000 mortes, respectivamente), sendo a doença isquêmica do coração a de
maior incidência, superando enfermidades cerebrovasculares, doenças do trato
respiratório e AIDS/HIV.
No Brasil, dados do Ministério da Saúde (2007), mostram que as causas mais
freqüentes de mortes são as doenças cerebrovasculares, as doenças isquêmicas do
coração e o infarto agudo de miocárdio, dados semelhantes aos que foram
destacados pela Organização Mundial de Saúde para países desenvolvidos.
Nesse contexto, o sedentarismo pode ser considerado um dos principais
fatores ligado às causas de morte decorrentes de doenças cardiovasculares
(McGAVOCK et al., 2006). Em decorrência disso a prática regular de atividade física
vêm, cada vez mais, ganhando importância na sociedade e mais que isso, vem
sendo adotada por profissionais de educação física, médicos, fisioterapeutas e pela
população em geral como parte integrante não só do tratamento de inúmeras
doenças, mas também e principalmente, como agente profilático dos eventos
adversos relacionados ao sedentarismo (WEBER-ZION et al., 2004; MCGAVOCK et
al., 2006; SEALS et al., 2008; WEINSTOCK, 2010). Como resultado, muitas
organizações internacionais de saúde têm lançado recomendações referentes à
intensidade e qualidade do exercício necessário ao indivíduo para melhorar a saúde
humana (SEALS et al., 2008; DONNELLY et al., 2009; MYERS et al., 2009).
O exercício físico regular reduz o risco de mortalidade de todas as causas,
especialmente as cardiovasculares, promove a saúde mental e aumenta a
resistência dos músculos, ossos e articulações (ACSM, 2003), melhora o
condicionamento físico e a qualidade de vida (HECKMAN & McKELVIE, 2008). Uma
única sessão de exercício físico provoca redução na pressão arterial, efeito esse que
pode ser mantido por até 24 h após o exercício (NEGRÃO & RONDON, 2001;
GUIMARÃES et al., 2010). Além disso, o exercício físico regular pode corrigir a
disfunção endotelial e aumentar o condicionamento físico dos indivíduos
(HAMBRECHT et al., 1998).
No entanto, diversas modalidades esportivas exigem dos praticantes uma
rotina de treinamento que, além de promover uma melhoria significativa do
condicionamento físico pode resultar a médio ou longo prazo em adaptações
cardiovasculares expressivas. Entre as mudanças cardíacas observadas mediante o
treinamento regular de alta intensidade destaca-se a remodelagem mecânica,
acompanhada do remodelamento autonômico e elétrico.
1.1 Remodelamento cardíaco decorrente do exercício físico
O treinamento físico regular de alta intensidade produz alterações adaptativas
no tamanho, forma e função do coração, caracterizando o que se denomina
“coração de atleta”. A massa do ventrículo esquerdo pode ser até 45% maior em
corações de atletas competitivos, comparada aos indivíduos sedentários (MARON,
1986; BASILICO, 1999). O padrão e a magnitude das alterações na estrutura
cardíaca podem diferir de acordo com a natureza da atividade física, isto é, dinâmica
ou estática (MARON & PELLICCIA, 2006). Na atividade física dinâmica, a
sobrecarga de volume produz um remodelamento cardíaco caracterizado por manter
inalterada a relação entre a espessura da parede e o raio da câmara ventricular
esquerda (hipertrofia excêntrica) (PLUIM et al., 2000; MARON & PELLICCIA, 2006).
Por outro lado, exercícios estáticos geram uma sobrecarga de pressão que induz um
remodelamento com aumento significativo na relação entre a espessura da parede e
o raio da câmara ventricular (hipertrofia concêntrica) (STOLT et al., 1999; PLUIM et
al., 2000). Essas alterações morfológicas induzidas pelo treinamento físico fazem
parte de um processo fisiológico adaptativo, dinâmico e reversível, associado à
função sistólica e diastólica normais (MARON & PELLICCIA, 2006).
O remodelamento cardíaco e vagotonia decorrentes do treinamento de alto
esforço podem levar a alterações no eletrocardiograma de um atleta, tais como:
aumento da voltagem, presença de onda U, retardo de condução átrio-ventricular,
repolarização precoce e aumento do intervalo QT (HOLLY et al., 1998). Muitas
dessas alterações também estão presentes em determinadas doenças cardíacas,
dificultando a distinção entre o fisiológico e o patológico. O remodelamento
mecânico fisiológico se caracteriza por aumento do débito sistólico, aumento da
fração de sangue ejetada na sístole, redução da pressão arterial (PA) sistêmica e da
freqüência cardíaca (FC) de repouso, aumento da função contrátil do cardiomiócito
individual e aumento incipiente a moderado de toda a massa miocárdica (TAYLOR
et al., 1955; BRUCE et al., 1963; BRUCE, 1971; MITCHELL & BLOMQVIST, 1971;
BRUCE et al., 1973; WEXLER & GREENBERG, 1974; LEVINE et al., 1991;
PELLICCIA et al., 1991; KETELHUT et al., 1994; MOORE & KORZICK, 1995;
WARBURTON et al., 2000; MEIBODI et al., 2002).
Acompanhando o remodelamento mecânico, fazem-se notar: 1) o
remodelamento da função autonômica, caracterizado por aumento da atividade
vagal e redução da atividade simpática, acompanhada de redução da FC basal e; 2)
o remodelamento elétrico, caracterizado entre outros aspectos, pela redistribuição
dos tempos de ativação e repolarização ventriculares, aumento da amplitude
(tensão) máxima de ativação ventricular total, redução da energia dos potenciais
elétricos observados ao final da ativação, aumento do tempo de ativação ventricular
(aumento da duração do complexo QRS), precocidade do início da repolarização
ventricular e inversão da onda T, que se apresentam de forma característica no
eletrocardiograma de superfície (ECG) (SMITH et al., 1989; PELLICCIA et al., 1991;
JORDAENS et al., 1994; MOORE & KORZICK, 1995; WOODIWISS & NORTON,
1995; TURRINI, 2000; WARBURTON et al., 2000; NATALI et al., 2002; BARBOSA et
al., 2004; MEDEI et al., 2010).
Ao contrário da hipertrofia fisiológica resultante de adaptações ao treinamento
físico (SEDEHY & ASHLEY, 2010), a hipertrofia cardíaca de origem patológica é
considerada um fator de risco independente para morbidade e mortalidade
cardiovascular, estando associada à eventos arrítmicos (CHRISTIAANS et al., 2010).
O aumento da duração do potencial de ação e a redução da velocidade de condução
no miocárdio hipertrofiado podem originar vias de reentradas e pós-potenciais
precoces que desencadeariam arritmias, como a taquicardia ventricular e a fibrilação
ventricular, levando à morte súbita (HART, 1994; LIU et al., 2003A).
A morte súbita em atletas jovens, embora rara, pode ocorrer durante ou logo
após esforço físico vigoroso, tendo como causa mais comum a cardiomiopatia
hipertrófica não diagnosticada previamente (MARON & PELLICCIA, 2006).
Entretanto, muitos casos de morte súbita em atletas têm sido associados ao uso
abusivo de esteróides anabólicos. Devido a essa relação com eventos de morte
súbita, a melhor compreensão dos reais efeitos do esteróide anabólico associado ao
exercício físico tem grande importância para a explicação de casos freqüentes de
morte súbita de atletas de alto nível de diferentes modalidades esportivas, cada vez
mais comuns em todo o mundo.
1.2 Esteróides Androgênicos Anabólicos (EAA)
1.2.1 Testosterona
A testosterona é o principal hormônio sexual masculino, anabólico,
androgênico (substâncias que induzem e mantém as características sexuais
secundárias nos homens), produzido pelas células de Leydig nos testículos e sua
secreção é controlada pelo hormônio de liberação das gonadotrofinas no hipotálamo
(LIU et al., 2003A; TAMAKI et al., 2003).
A função endócrina da testosterona foi sugerida na antiguidade, sendo
descrito que o lendário cirurgião indiano Susruta, em torno do ano 140 a.C. propôs a
ingestão de tecido testicular como estratégia na cura da impotência sexual
(KOCHAKIAN, 1993; KOCHAKIAN & YESALIS, 1993). Em 1889, o médico francês
Brow-Séquard realizou experimento nele próprio, injetando extrato aquoso de
testículos de cães e cobaias e descreveu o resultado como aumento em sua saúde
geral e aumento da força muscular (FREEMAN et al., 2001). Nas décadas de 20 e
30 diversos experimentos utilizando injeções de extrato testicular em animais
castrados mostraram que tal metodologia era capaz de reverter os efeitos da
castração, tanto no âmbito das características sexuais secundárias quanto da
promoção do anabolismo (KOCHAKIAN, 1993; KOCHAKIAN & YESALIS, 1993;
SCHÄNZER, 1996).
Em 1935 a testosterona foi isolada, identificada, e sintetizada em laboratório a
partir do colesterol. David e colaboradores deram nome ao hormônio e no final de
1935 a síntese da testosterona foi descrita por dois grupos distintos: primeiro
Butenandt e Hanish e exatamente uma semana depois Ruzicka e Wettstein
publicaram seus artigos. Esses pesquisadores foram indicados ao Prêmio Nobel em
1939, ocasião na qual Butenandt foi forçado pelo governo nazista a desistir do
prêmio (FREEMAN et al., 2001).
O potencial terapêutico da testosterona em diversas situações catabólicas,
como por exemplo AIDS e osteoporose, tem direcionado à síntese de muitos
derivados, mais apropriadamente denominados de esteróides anabólicos
androgênicos (EAA).
Os andrógenos são classificados como hormônios esteróides, cuja molécula
precursora é o colesterol. O composto ativo da testosterona é a 5α-dihidro-
testosterona (5α-DHT), obtida pela sua redução. O processo de transformação da
testosterona em 5α-DHT é catalisado pela enzima 5α-redutase. Sabe-se que este
composto apresenta níveis de biopotência até 5 vezes maiores que a testosterona
(BARDIN & PAULSEN, 1981). A testosterona e derivados, em doses fisiológicas,
proporcionam o aumento da síntese de proteínas, aumento da atividade do
glicogênio muscular e apresenta efeito antagônico à ação proteolítica dos
glicocorticóides (
PÄRSSINEN et al., 2002;
LIU et al., 2003A
)
. A testosterona é utilizada
terapeuticamente em alguns casos patológicos, como no hipogonadismo, nas
anemias aplásicas, no edema angioneurótico hereditário e nas distrofias musculares
(
PÄRSSINEN et al., 2002)
. Contudo, os EAAs, análogos sintéticos da testosterona,
são muitas vezes utilizados ilicitamente por atletas e freqüentadores de academias,
com a finalidade de incrementar o ganho de massa ou para fins puramente
estéticos.
1.2.2 Esteróides Anabólicos Androgênicos
Os EAA são compostos sintéticos desenvolvidos originariamente com
propósitos terapêuticos, obtidos a partir de modificações na estrutura molecular da
testosterona, visando a potencialização de seus efeitos, e que têm como resultados,
dentre outros, aumentos na síntese de proteínas e ganhos em massa muscular
(STRAUSS & YESALIS, 1991; SHAHIDI, 2001). São quimicamente relacionados ao
hormônio sexual masculino, consequentemente, apresentam alta atividade
androgênica (
PÄRSSINEN et al., 2002;
LIU et al., 2003A; TAMAKI et al., 2003). Assim,
apresentam estimulação significativa da miogênese, aumento da densidade do
nitrogênio nos músculos, aumento da massa magra (muscular) e inibição da
atividade catabólica (BRODSKY et al., 1996; SINGH et al., 2003).
1.2.3 Decanoato de Nandrolona
A nandrolona (19-nortestosterona; IUPAC: 17β-Hydroxi-4-estren-3-ona) é um
dos EAA mais consumidos ilicitamente. A sua síntese em laboratório foi descrita
inicialmente em 1950 por Birch e confirmada em 1953 por Wilds e Nelson (apud
BRICOUT & WRIGHT, 2004). A nandrolona é classificada como uma substância
xenobiótica, contudo existem evidências de que níveis muito baixos deste esteróide
possam ser produzidos de forma endógena, como intermediários da síntese de
estrógenos provenientes de precursores androgênicos (BRICOUT &
WRIGHT, 2004).
A nandrolona quando comparada à testosterona, apresenta maior resistência
à metabolização e à aromatização e maior afinidade pelo receptor androgênico
(Kuhn, 2002). Diferentemente da testosterona, a 5α-redução da nandrolona reduz
sua afinidade pelo receptor androgênico, (BERGINK et al., 1985). Assim, em tecidos
desprovidos da atividade 5α-redutase, como o tecido muscular, a nandrolona tem
potente efeito, ao contrário da ação sobre tecidos com alta atividade da 5α-redutase,
como a próstata. Seu metabolismo ocorre no fígado e seus metabólitos principais
são a 19-norandrosterona (19-NA), 19-noretiocolanolona (19-NE) e 19-
norepiandrosterona (19-NEA). Em exame antidoping a detecção de nandrolona é
feita a partir dos metabólitos 19-NA e 19-NE na urina (BRICOUT & WRIGHT, 2004).
A nandrolona é comercializada sob a forma de seu éster decanoato
(decanoato de nandrolona, Deca Durabolin
®
; C
28
H
44
O
3
; peso molecular: 428,65), e
mais raramente sob a forma do éster fenilpropionato (fenilpropionato de nandrolona,
Durabolin
®
; C
27
H
34
O
3
; peso molecular: 406,6). A figura 1 ilustra a estrutura molecular
da testosterona e do decanoato nandrolona.
Testosterona
Decanoato de Nandrolona
Figura 1: Estrutura molecular do decanoato de nandrolona e da testosterona. Modificado de Shahidi,
2001.
O Decanoato de Nandrolona (DECA) é comercializado diluído em veículo
oleoso (90% de óleo de amendoim / 10% de álcool benzílico, v/v). A administração
da nandrolona intramuscular em combinação com as propriedades do veículo da
droga permite a lenta liberação da nandrolona na circulação. Após uma única
injeção intramuscular de decanoato de nandrolona, o pico de concentração sérica é
atingido em 30-72 h, sendo a meia vida de 7-12 dias (BAGCHUS et al., 2005).
1.2.4 Mecanismo de ação dos EAAs
O mecanismo de ação dos esteróides anabólicos é de natureza genômica,
onde há interação entre ligante e receptor intracelular levando à formação de um
complexo capaz de se ligar a elementos responsivos específicos no DNA,
desencadeamento de transcrição gênica e conseqüente síntese de proteínas
(SHAHIDI, 2001). As
moléculas de esteróides entram na célula, ou
passivamente por difusão através da membrana ou assistida por qualquer
transportador e, posteriormente, receptores intracelulares, localizados no
citosol ou no núcleo, ligam o esteróide, assim passando por uma mudança
conformacional. Isso leva à dissociação das proteínas acessórias, que já
mantiveram o receptor em uma forma ativa, e a um aumento da afinidade do
DNA do domínio de ligação ao DNA. O complexo esteróide-receptor migra
para o núcleo, onde influencia a transcrição dos genes em mRNA.
Finalmente, o RNAm é traduzido em moléculas de proteína, que exercem
funções biológicas.
Os efeitos genômicos, sob o ponto de vista clínico surgem
horas ou dias após a interação dos esteróides com o receptor (LÖSEL et al., 2003A
e 2003B).
Outro mecanismo também descrito, de natureza não genômica, chamados de
efeitos não-clássicos dos esteróides, capaz de se manifestar em células desprovidas
de núcleos, como eritrócitos, plaquetas e espermatozóides. Há discordância entre os
tipos de receptores e interações envolvidos nos efeitos não-genômicos de
esteróides, onde haveria também uma ligação dos esteróides a receptores de
membrana, situação na qual receptores associados especificamente aos efeitos
não-genômicos foram descritos (LÖSEL et al., 2003A e 2003B).
1.2.5 Uso dos EAAs
A história de utilização dos EAA tem suas raízes na antiga endocrinologia.
Mais de 6000 anos atrás agricultores notaram que os animais castrados eram mais
facilmente domesticáveis. Os antigos egípcios e romanos acreditavam que os
testículos e pênis de animais tinham especiais poderes de cura. Atletas da Grécia
Antiga usavam uma grande variedade de substâncias que promoviam a melhora do
desempenho, tais como extratos de plantas e extrato testicular (HOBERMAN &
YESALIS, 1995). Há também relatos de que antigos romanos utilizavam substâncias
estimulantes para melhoria de desempenho e que os Incas faziam uso de folhas de
coca para redução da fadiga (VERROKEN, 2000; CARPENTER, 2007; DE ROSE,
2008).
A utilização de esteróides anabólicos na prática clínica foi primeiramente
relatada em torno de 1940, sendo empregados no tratamento de traumas,
queimaduras, procedimentos pós-cirúrgicos, dentre outros (BASARIA et al., 2002).
Atualmente, os EAAs são empregados nos tratamentos de reposição hormonal em
indivíduos do sexo masculino com deficiência na produção de andrógenos,
osteoporose e caquexia secundária à AIDS e à doenças crônicas diversas, como
cirrose hepática, insuficiência renal crônica, câncer e doença pulmonar obstrutiva
crônica (STRAUSS & YESALIS, 1991, BASARIA et al., 2002; BAGCHUS et al.,
2005).
Entretanto, o uso não clínico dos EAAs tem sido empregado por atletas e não
atletas por quase cinco décadas com intuito de aumento de desempenho pelo
crescimento muscular e aumento de força (SULLIVAN et al., 1998; URHAUSEN et
al., 2004). Kuhn (2002) argumentou que o uso de esteróides anabólicos em homens
sadios não acarretaria no aumento de força ou massa muscular, resultados esses
que podem estar ligados às baixas dosagens, suficientes somente para ocasionar
leves aumentos nas concentrações plasmáticas, que não ultrapassam os limites da
normalidade. No entanto, outro estudo relata que em humanos, após 6 semanas de
tratamento com EAA, comparando-se doses terapêuticas com doses mais elevadas
(sendo essa dose elevada ainda inferior ao dobro da dose terapêutica, não
refletindo, portanto, as doses utilizadas em casos de abuso de esteróides), houve
aumentos significativos em variáveis antropométricas e força muscular no grupo
tratado com doses mais elevadas (FRIEDL et al., 1991).
Nesse contexto, a auto-administração dessas substâncias por atletas de nível
competitivo e pessoas que praticam atividade física é cada vez mais comum, seja
para fins de aumento do desempenho esportivo ou simplesmente estéticos
(TERNEY & MCLAIN 1990; YESALIS et al., 1993; HANDELSMAN et al., 1997;
KORKIA & STIMSON 1997; IRIART & ANDRADE, 2002; MOREAU & SILVA, 2003;
SILVA et al., 2007).
Dentre os EAAs, o decanoato de nandrolona é um dos mais consumidos
(FRIZON et al., 2005; NIDA 2006), em virtude de seu menor efeito androgênico e
significante efeito anabólico, proporcionando aumento da massa muscular (EVANS
2004). O índice anabólico da nandrolona, calculado como a razão entre os seus
efeitos anabólicos e androgênicos, é 10 vezes maior que o da testosterona
(WALLACE, 2001; KUHN, 2002).
As dosagens comumente utilizadas ilicitamente pelos indivíduos situam-se em
geral entre 10 e 100 vezes os valores terapêuticos recomendados (NIDA, 2006).
Doses de até 1000 vezes também já foram descritas (CSA, 1988). O período de
utilização está entre 6 e 12 semanas, sendo a forma de administração geralmente a
injetável, combinada ou não com outros tipos de esteróides (NIDA, 2006).
1.2.6 Esteróides anabólicos na atualidade
A utilização de EAA sempre foi um mito, muitas vezes sem comprovações
científicas. Ainda assim alguns dados epidemiológicos analisados no período de
1997-2001 nos EUA mostraram aumentos de 1,8% para 2,8% em relação ao
consumo ilícito de EAA (NIDA, 2006). Contudo, mais recentemente, a prevalência de
uso de EAA aumentou para 6% em atletas americanos, com índices crescentes de
consumo entre os estudantes do curso secundário (NIDA, 2006). Em relação às
análises epidemiológicas no Brasil, Araújo e cols. (2002) verificaram que entre 183
praticantes de exercícios físicos em academias de Goiânia (GO) 21% relataram
terem feito uso de EAA. Com conseqüências mais graves em relação à saúde
pública, o estudo de Iriart e Andrade (2002) relatou que alguns usuários de EAA,
além de conscientes em relação aos fatores de risco associados à utilização de
doses suprafisiológicas destas drogas, comentaram que compartilhavam as seringas
utilizadas na administração da droga.
Todas essas descrições são fortemente ligadas aos resultados vistos nas
competições internacionais, Jogos Olímpicos e campeonatos mundiais, onde os
atletas superam constantemente os níveis fisiológicos de desempenho imagináveis.
Além de estricnina, heroína, cocaína e morfina também são citadas como drogas
presentes nos primeiros Jogos Olímpicos (Verroken, 2000).
Na Segunda Guerra Mundial esteróides foram utilizados para aumentar a
agressividade dos soldados e aumentar o aumento de peso em sobreviventes de
campos de concentração. A primeira administração de esteróides em atletas
amadores ocorreu na União soviética em 1954 e eles vem sendo largamente usados
desde os Jogos Olímpicos de Tóquio em 1964 (BOMZE et al., 1991). Em outros
Jogos Olímpicos como em Munique, 1972, um terço dos atletas assumiram utilizar
esteróides. Em Montreal, 1976, cerca de 68% dos atletas admitiram os uso de EAA
(CARPENTER, 2007). Nas décadas de 1970 e 1980, os países do bloco soviético
faziam uso de EAA em seus programas secretos de treinamento. Além disso,
cientistas desenvolviam métodos de administração das drogas com objetivo não só
de melhoria do desempenho, mas também de burlar os testes de controle antidoping
(FRANKE & BERENDONK, 1997). A nandrolona tem marcante papel na história de
utilização de esteróides. Nos Jogos de 1984 em Los Angeles, 9 casos de uso de
nandrolona foram registrados, a maioria em atletas de levantamento de peso. Nos
Jogos Olímpicos de 1988, o caso em que o velocista Ben Johnson perdeu a
medalha por uso de estanozolol entrou para a história (CROWTHER, 2004).
Atualmente, a real prevalência de uso de EAA é extremamente duvidosa, uma
vez que todas as informações a respeito do assunto são omitidas ou distorcidas.
Calcula-se que cerca de 3 milhões de indivíduos da população americana já tenham
feito uso de esteróides (SJÖQVIST et al., 2008). Yesalis & Bahrke (2000) estimaram
uma prevalência de cerca de 3 a 12% em indivíduos americanos do sexo masculino
em algum período da vida. Estima-se que em atletas de elite, cerca de 67% fazem
uso de esteróides (FORTUNATO et al., 2007). Em fisiculturistas, prevalencia de até
99% já foi mencionada (YESALIS et al., 1993). Em outros países valores entre 2 e
3% de utilização de EAA entre a população de estudantes suecos, britânicos,
canadenses, australianos e sul-africanos (YESALES & BAHRKE, 2000). Um estudo
de mostrou também que mais de 4% de estudantes da Jordânia faziam uso de EAA
(TAHTAMOUNI et al., 2008).
No Brasil alguns estudos mostram a incidência de utilização de esteróides na
população. Frizon e cols. (2005) caracterizaram o perfil típico de usuários de
esteróides como sendo indivíduos do sexo masculino, idade entre 21 e 25 anos, que
objetivam melhora da estética e ganho de fora e massa muscular. No Amazonas
cerca de 2,1% de estudantes já fizeram uso de esteróides (LUCAS et al., 2006). Em
Goiânia Canuto e cols. (2006) mostraram que 2,7% dos calouros de uma
universidade da usaram esteróides. No Rio de Janeiro o número sobe para 19,2%
na utilização de esteróides em estudantes de Educação Física (PALMA et al., 2007).
Tabela 1: Modalidades e esteróides anabólicos mais citados entre praticantes de academias
no Rio Grande do Sul:
0,241Natação e Aeróbica
0,241Musculação, Aeróbica e outra
0,482Musculação e Outra
4,0617Musculação e Natação
11,4848Musculação e Aeróbica
0,482Natação
5,0321Outra
4,0617Aeróbica
73,93309Musculação
%N
o
de ParticipantesModalidade
0,241Natação e Aeróbica
0,241Musculação, Aeróbica e outra
0,482Musculação e Outra
4,0617Musculação e Natação
11,4848Musculação e Aeróbica
0,482Natação
5,0321Outra
4,0617Aeróbica
73,93309Musculação
%N
o
de ParticipantesModalidade
1,961Oxandrin® (oxandrolona)
3,932Depo-testosterone® (ciprionato de testosterona)
5,893Hemogenin® (oximetolona)
5,893Equipoise® (undecilenato de boldenona)
13,727Dianabol® (metandrostenolona)
15,688Winstrol® (estanozolol)
17,649
Durateston® (fenilpropionato, isocaproato,
propionato e decanoato de testoterona)
35,2918Deca-durabolin® (decanoato de nandrolona)
% usoN
o
de vezes que foi citadoEsteróide
1,961Oxandrin® (oxandrolona)
3,932Depo-testosterone® (ciprionato de testosterona)
5,893Hemogenin® (oximetolona)
5,893Equipoise® (undecilenato de boldenona)
13,727Dianabol® (metandrostenolona)
15,688Winstrol® (estanozolol)
17,649
Durateston® (fenilpropionato, isocaproato,
propionato e decanoato de testoterona)
35,2918Deca-durabolin® (decanoato de nandrolona)
% usoN
o
de vezes que foi citadoEsteróide
Adaptado de Frizon et al., (2005).
Em cidades do Rio Grande do Sul, 6.5% dos indivíduos entrevistados faziam
uso de EAA, sendo a musculação a modalidade com maior prevalência e a Deca-
durabolin
®
(decanoato de nandrolona) o esteróide mais utilizado, conforme descrito
na tabela 1 (FRIZON et al., 2005). Outros estudos mostraram que 19% dos
praticantes de academias da cidade de São Paulo Silva e Moreau (2003) e 6,5% em
Goiânia (ARAÚJO et al., 2002). Além disso, o perfil sócio-econômico dos jovens
usuários de esteróides pertence à classe social A e B (CANUTO et al., 2006).
Baseando-se nos dados aqui descritos, podemos concluir que o padrão de utilização
de EAA no Brasil não difere de outros países e pode ser considerado um problema
de saúde pública.
1.2.7 Efeitos Colaterais dos EAAs
A utilização dos EAAs em doses suprafisiológicas está diretamente
relacionada à diversos efeitos colaterais, como, aumento do LDL colesterol,
disfunção tireoidiana, prevalência de calvície precoce, câncer de próstata,
hepatotoxidade, hipertrofia do miocárdio, hipertensão arterial, entre outros (STOLT
et al., 1999; HARTGENS & KUIPERS, 2004; PAYNE et al., 2004; KAFROUNI et al.,
2007). Tanto em homens quanto em mulheres, os EAAs produzem distúrbios
dermatológicos, como a alopecia androgenética (calvície de padrão masculino), o
aumento na oleosidade da pele e cabelos, acne severa, dermatite seborréica e
icterícia (SCOTT 3RD & SCOTT, 1992; NIDA 2006).
O abuso de EAA provoca alterações no eixo hipotálamo-hipófise-gonadal por
meio de feedback negativo, onde o aumento das concentrações circulantes de
andrógenos exógenos acarreta a redução dos níveis de LH e FSH, o que resulta na
diminuição ou supressão da produção endógena de andrógenos pelos testículos
(Evans, 2004). Podemos destacar ainda a atrofia testicular e distúrbios na
espermatogênese (oligospermia/azoospermia), geralmente reversíveis quando há
interrupção do uso dentro de um período de até seis meses (MARAVELIAS et al.,
2005). Pode ocorrer também ginecomastia, redução na libido e impotência sexual
(PAVLATOS et al., 2001), onde a condição de impotência e perda de libido pode
perdurar por até um ano após a interrupção do uso de EAA (BICKELMAN et al.,
1995). Em mulheres, além de efeitos teratogênicos associados, o uso de EAA pode
causar alterações virilizantes, redução do volume dos seios acompanhada por
diminuição nos níveis de gordura corporal, amenorréia, hipertrofia clitoriana, atrofia
uterina, hirsutismo e engrossamento de voz (MARAVELIAS et al., 2005). Além disso,
o sistema músculo-esquelético pode sofrer maiores lesões, e na idade pré-púbere o
fechamento epifisário precoce ligado a uma baixa estatura pode ser notado (CSA,
1988; STRAUSS & YESALIS, 1991). Aumento no peso dos rins decorrente do
tratamento com decanoato de nandrolona (HOSEINI et al., 2009) e mais raramente
efeitos colaterais renais como insuficiência renal aguda e aparecimento de
nefroblastoma também foram descritos na literatura (MODLINSKI & FIELDS, 2006).
A função hepática também é afetada diante do uso de EAA, sendo a hepatite
colestática com icterícia, cistos hepáticos hemorrágicos, heptomas benignos e
tumores malignos relatados (CSA, 1990).
Síndromes e sintomas psiquiátricos, como aumento da agressividade,
comportamento psicóticos, mania e depressão, aumento de hostilidade também são
descritos entre usuários de esteróides (RUBINOW & SCHIMIDT, 1996;
HANNAN et al., 1991). Além destes, a dismorfia muscular, um distúrbio da imagem
corporal onde o usuário busca constantemente aumento da massa muscular,
mesmo em casos de extrema hipertrofia são prevalente em usuários de esteróides.
Nesses indivíduos a sensação de perda de massa muscular pode desencadear o
aparecimento de transtornos de ansiedade e distúrbios relacionados à auto-estima e
está ligada ao abuso de outras substâncias psicoativas (BROWER 2002;
KANAYAMA et al., 2008). Aumento de tendências suicidas em usuários de
esteróides comparados a não-usuários e aumento da incidência de sintomas
psiquiátricos em indivíduos usuários com predisposição também podem ser
identificados (THIBLIN et al., 1999; BOLDING et al., 2002).
Recentemente, vários estudos têm revelado a toxicidade cardiovascular dos
EAAs (WILSON, 1988; MELCHERT et al., 1995; SULLIVAN et al., 1998; KUTSCHER
et al., 2002; HARTGENS & KUIPERS, 2004). Complicações cardíacas severas, tais
como: insuficiência cardíaca, trombose, infarto do miocárdio, fibrilação ventricular e
morte cardíaca súbita, em atletas que faziam uso abusivo de esteróide anabólico,
têm sido relatados (SULLIVAN et al., 1998, TUNSTALL-PEDOE, et al., 1994).
Algumas observações relatam o efeito anti-isquêmico dos EAAs, sendo a
testosterona um vasodilatador coronário (YUE et al., 1995; CHOU et al., 1996,
WEBB et al., 1999).
O uso crônico de doses suprafisiológicas de esteróide anabólico induz
hipertrofia cardíaca que pode evoluir para insuficiência cardíaca (SULLIVAN et al.,
1998; URHAUSEN et al., 2004; NOTTIN et al., 2006; KASIKCIOGLU et al., 2009).
Experimentos com administração crônica de EAA mostram hipertrofia miocárdica,
redução da complacência do ventrículo esquerdo, e redução da capacidade
inotrópica miocárdica (RAMO, 1987; KARHUNEN, 1988). Menores níveis de
distensibilidade aórtica em fisiculturistas usuários de esteróides (KASIKCIOGLU
et al., 2009), aumento das respostas vasoconstritoras à adrenalina, serotonina e
endotelina (AMMAR et al., 2004) corroboram a associação entre abuso de
esteróides e aumento da ocorrência de vasosespasmo coronariano e infarto do
miocárdio (SULLIVAN et al., 1998). Infarto do miocárdio e acidentes vasculares
cerebrais isquêmicos também são descritos (LAROCHE, 1990; LYNGBERG, 1991;
GÜNES et al., 2004). A hipertensão arterial é um efeito colateral secundário ao
abuso de esteróides (SULLIVAN et al., 1998) e, mesmo em indivíduos treinados, a
pressão arterial diastólica e o duplo produto - medição estimativa do esforço
cardíaco e consumo de oxigênio miocárdico, obtido pela multiplicação da frequência
cardíaca (medida em bpm) pela pressão arterial sistólica (medida em mmHg) - são
aumentados quando os indivíduos fazem uso de EAAs (GRACE et al., 2003).
Eventos de morte súbita durante ou logo após exercício vigoroso
(especialmente em atletas em competição) são relatados (MARON & PELLICCIA,
2006). Contudo, poucos estudos relacionados à morte súbita em usuários de EAAs
são encontrados (HAUSMANN et al., 1998; THIBLIN et al., 2000; FINESCHI et al.,
2005). A maioria dos casos relatados de morte súbita em atletas usuários de EAAs
ocorreram em indivíduos sem doenças cardíacas estruturais (JORDAENS, 1994;
MOROE et al., 1995). No entanto, há descrições de morte súbita com alterações
estruturais da parede miocárdica, perda da função diastólica, aumento da massa
miocárdica ventricular, hipertrofia e fibrose anormais (DI BELLO et al., 1999,
URHAUSEN et al., 1999).
Segundo Kennedy & Lawrence (1993), o uso de EAA aumenta claramente o
risco de morte súbita associada à fibrilação atrial e taquicardia ventricular. Esse risco
é potencializado pelo exercício intenso (APPLEBY et al., 1994; NIEMINEN et al.,
1996; SULLIVAN et al., 1999). Alterações na microestrutura do miocárdio,
caracterizadas por desarranjo miofibrilar, necrose tecidual e fibrose, podem
potencializar as alterações elétricas desencadeadoras das arritmias e morte súbita
em indivíduos com histórico de abuso de esteróides (SULLIVAN et al., 1998).
Necropsias em indivíduos jovens e treinados que vieram a óbito durante treinamento
mostraram evidências de cardiomiopatia hipertrófica e miocardite, com focos de
fibrose e necrose miocárdica, porém sem alterações coronarianas (LUKE et al.,
1990; KENNEDY & LAWRENCE, 1993; THIBLIN et al., 2009).
Diversos estudos têm demonstrado que informações prognósticas em relação
a morte súbita cardíaca decorrente de doenças cardiovasculares, como infarto do
miocárdio, neuropatia decorrente de diabetes, cardiomiopatia hipertrófica, arritmias e
fibrilação ventriculares, prolapso idiopático da válvula mitral e mortalidade pós infarto
do miocárdio podem ser identificadas a partir da avaliação de diferentes parâmetros
do ECG, como intervalo QT e QTd (DAVIDOWSKI & WOLF, 1984; YI et al., 1998a;
STOLT et al., 1999) e variabilidade da freqüência cardíaca (KLEIGER et al., 1987),
na qual o prolongamento do intervalo QT e QTd estão diretamente relacionados à
disfunção cardiovascular. Além disso, a variabilidade da freqüência cardíaca é uma
importante ferramenta para avaliar a atividade do sistema autonômico, cuja
disfunção é fortemente associada ao aumento de mortalidade decorrente de
problemas cardiovasculares (SCHWARTZ et al., 1992; TASK FORCE, 1996).
1.3 Parâmetros de repolarização ventricular no ECG
O eletrocardiograma é uma importante ferramenta no diagnóstico das
alterações da atividade elétrica do coração, por ser um método não invasivo, de
baixo custo, fácil reprodutibilidade e análise.
No traçado do ECG encontram-se ondas, segmentos e intervalos que refletem
a atividade elétrica do coração. O intervalo QT é definido como a medida do início do
complexo QRS até o final da onda T ou U, assim, este intervalo representa a
duração total da atividade elétrica ventricular (ANTZELEVITCH, 2004). Os valores
obtidos normalmente são corrigidos pela fórmula de Bazett (QTc = QT/√RR), já que
a freqüência cardíaca pode influenciar, obtendo-se assim o intervalo QT corrigido
(QTc) (ZEHENDER et al., 1990; YI et al., 1998a e 1998b; BROUWER et al., 2003).
Convencionalmente, a duração da repolarização no ECG é quantificada pela medida
do intervalo QT ou QTc, sendo ambos usados clinicamente para estimar o risco de
arritmias ventriculares em certos grupos de pacientes.
Yi et al. (1998b) mostraram que alterações do intervalo QT podem ser
consideradas no estabelecimento prognóstico de pacientes com baixo e alto risco de
morte súbita cardíaca pós-infarto do miocárdio. O aumento do intervalo QT pode
fornecer importantes informações na identificação de indivíduos com alto risco de
desenvolvimento de doenças cardiovasculares como doença arterial coronariana
(MAEBUCHI et al., 2010). Além das doenças cardiovasculares, o prolongamento do
intervalo QT é um preditor independente de morte súbita em pacientes com doença
renal crônica em estágio final (HAGE et al., 2010), preditor do risco de
desenvolvimento de diabetes melitus (CHRISTENSEN et al., 2010; NAGAYA et al.,
2010) e relacionado à hipertensão arterial (MIYAJIMA et al., 2007).
A dispersão do intervalo QT (QTd) é definida como a diferença entre o maior
e o menor valor do intervalo QT nas 12 derivações do ECG de superfície
(STOLT et al., 1999). QTd é um parâmetro que reflete a heterogeneidade da
repolarização ventricular (DAY, 1990; BEAUBIEN, 2002; CARDOSO, 2003). Dado
que o aumento da heterogeneidade da repolarização ventricular cria substrato para
regiões de reentrada e arritmias ventriculares que levam podem levar à morte súbita,
a QTd pode ser utilizada como um preditor de morte súbita (ANASTASIOU-
NANA et al., 2000; SALLES, 2003). A QTd passou a ser aceita com uma ferramenta
não-invasiva para detecção da heterogeneidade da repolarização ventricular, sendo
um marcador de arritmogênese, especialmente diante de um substrato isquêmico
(TOMASSONI et al., 1998). A mensuração da QTd, através de registros do ECG
pode assim, ser muito útil na identificação de condições patológicas em atletas com
hipertrofia ventricular esquerda (ZOGHI et al., 2002).
O risco de morte súbita também pode ser identificado pelo aumento da QTd
(ANASTASIOU-NANA et al., 2000)
.
Alterações da repolarização reconhecidas no ECG são
freqüentemente relacionadas ao desenvolvimento da hipertrofia ventricular. Estudos eletrofisiológicos
têm demonstrado que essas alterações na repolarização são resultado do prolongamento da duração
do potencial de ação (DPA) (ARONSON, 1980). Stolt et al. (1999) observaram
que em atletas de
resistência com hipertrofia fisiológica do ventrículo esquerdo (sem utilização de EAA)
não era detectado aumento da QTd, embora tenha sido verificado o prolongamento
do intervalo QT. Os estudos de Stolt et al. (1999) e Browne et al. (1982)
sugerem
que o aumento do intervalo QT em atletas está associado à hipertrofia ventricular
fisiológica e à uma maior atividade vagal. Esta maior atividade parassimpática
estaria associada a três fatores distintos: redução da sensibilidade dos receptores β-
adrenérgico (SYLVESTRE-GERVAIS et al., 1982); aumento da estimulação aferente
vagal (incremento parassimpático) através dos barorreceptores, incluindo os
receptores do bulbo carotídeo e os pressorreceptores do ventrículo esquerdo
(MARON, 1986; BASILICO, 1999); e, maior liberação de acetilcolina para
antagonizar a ação adrenérgica (HOLLY et al., 1998). Contudo, estas alterações no
ECG tendem a se normalizar quando o indivíduo interrompe o processo de
treinamento (BASILICO, 1999).
1.4 Função autonômica cardíaca: Variabilidade da Freqüência Cardíaca
A frequência cardíaca (FC) instantânea, batimento-a-batimento, reflete o
conjunto dos efeitos da atuação das alças simpática e parassimpática do sistema
nervoso autônomo sobre as células marcapasso do nodo sinusal, as quais
promovem elevação e diminuição do ritmo cardíaco, respectivamente. Tal atuação é
chamada de modulação autonômica da freqüência cardíaca (HAINSWORTH, 1995).
A variabilidade da FC (VFC) é a variação que ocorre entre batimentos
cardíacos sucessivos, em ritmo sinusal. Os sinais de VFC são obtidos a partir dos
intervalos RR registrados no ECG (Figura 2), com os quais são construídos os
tacogramas (Figura 3). Considerando-se que as variações da FC são mediadas pelo
sistema nervoso autônomo, a quantificação destas variações reflete o efeito da
modulação autonômica sobre a atividade cronotrópica do coração (KLEIGER et al.,
1995; MALIK et al., 1996). Estudos prévios mostram que a análise da VFC pode
fornecer informações prognósticas independentes nas arritmias ventriculares
(KLEIGER et al., 1987; BIGGER et al., 1992; LOMBARDI et al., 2000). O
desequilíbrio do sistema nervoso autônomo (SNA), caracterizado pela redução do
tonus vagal e predominante ativação simpática tem sido associado ao aumento da
mortalidade cardiovascular, incluindo morte súbita cardíaca (TASK FORCE, 1996).
A análise da VFC constitui um método não-invasivo de estimativa da
modulação simpática e parassimpática sobre o coração (TASK FORCE, 1996). Com
o treinamento físico aeróbico e o aumento do nível de condicionamento físico do
indivíduo, aumenta a atividade do sistema nervoso parassimpático, com
conseqüente aumento da modulação autonômica e da VFC (JURCA et al., 2004). A
análise temporal da VFC em indivíduos treinados mostrou aumento da diferença
entre os intervalos R-R, representado pelo aumento do desvio padrão entre intervalo
RR normais sucessivos (SDNN), NN50 (número de intervalos NN que apresentam
diferença de duração superior a 50 ms), pNN50 (proporção da diferença entre
intervalos RR normais adjacentes até 50 ms – NN50/n) e RMSNN (raiz média
quadrática da diferença entre intervalos NN normais sucessivos) e aumento na
variância dos valores de RR médio, onde a redução do intervalo RR indica redução
da atividade parassimpática e aumento da simpática, diretamente relacionados à
diminuição do SDNN, pNN50 e RMSNN (JANSSEN et al., 1993; SACKNOFF et al.,
1994; GOLDSMITH et al., 1997; YATACO et al., 1997; BONADUCE et al., 1998;
MELANSON, 2000). Disfunção autonômica cardíaca, com redução da atividade
parassimpática, foi demonstrada em ratos tratados cronicamente com decanoato de
nandrolona (PEREIRA-JUNIOR et al., 2006).
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Número de amostras
mV
RR mínimo
RR máximo
Milisegundos
mV
Figura 2 – Eletrocardiograma mostrando os picos R e o maior e menor intervalo entre eles - RR
máximo e mínimo, respectivamente (MAROCOLO, 2005).
350 400 450 500 550 600 650 700
680
700
720
740
760
780
800
820
840
860
880
900
Batimentos
Intervalo R-R (m s)
Figura 3: Tacograma da série de intervalos RR em função do número de ordenação de batimentos
cardíacos, mostrando a variação entre intervalos RR consecutivos, durante aquisição do
eletrocardiograma em condições de repouso supino, em indivíduo voluntário (MAROCOLO, 2005).
1.5 Correntes iônicas envolvidas na repolarização ventricular
A forma do potencial de ação cardíaco é decorrente da interrelação entre
diferentes correntes iônicas, despolarizantes e repolarizantes, expressas nos
diferentes tipos celulares que compõem o coração.
Dentre as correntes iônicas despolarizantes encontramos a corrente de sódio
(I
Na
), as corrente de cálcio, tipo L (I
Ca,L
) e T (I
Ca,T
) e a corrente do trocador Na-Ca, o
seu modo normal. Dentre as correntes repolarizantes, predominam as correntes de
potássio. Entre elas encontra-se a corrente transiente de saída (I
to,1
), sensível a 4-
aminopiridina (JOSEPHSON, 1984), a corrente de potássio retificadora retardada (I
K
)
com seus dois componentes, rápido (I
Kr
) e lento (I
Ks
), demonstrado por Sanguinetti et
al., (1990) e Li et al., (1996) no miocárdio humano e a corrente de potássio
retificadora de influxo (I
K1
). Também outras correntes repolarizantes de potássio
podem ser citadas, tal como, I
kur
, I
K,ACh
, I
K,ATP
, I
Kss
(TAMARGO, 2004).
A figura 4 mostra exemplos de traçados da corrente I
to
e a estrutura
molecular do canal de K
+
dependente de voltagem (K
v
). A subunidade α é o
principal componente formador do poro do canal iônico. Os canais K
V
são
tetrâmeros formados pela associação de 4 subunidades α (Fig. 4C e 4D),
associadas a diferentes subunidades β regulatórias (Fig 4E). Em ventrículo
humano, Kv4.3 é a isoforma predominante da subunidade α de I
to,1
(DIXON
et al., 1996; KÄÄB et al., 1996) e a diminuição na expressão de Kv4.3 está
diretamente relacionada à diminuição na densidade da corrente (KÄÄB et
al., 1996). Em ventrículo de rato, as isoformas Kv1.4, Kv 4.2 e Kv4.3
constituem os canais iônicos responsáveis pela corrente I
to,1
– Fig 4B
(KOBAYASHI et al., 2003, GALLEGO et al., 2009), sendo Kv 4.2 a isoforma
predominante (
OUDIT et al., 2001
).
A B
C
D
E
Canais K
v
Subunidades α
αα
α do canal de K
+
Subunidades K
v
β
ββ
β, KChIP2 e Mink do canal de K
+
A B
C
D
E
Canais K
v
Subunidades α
αα
α do canal de K
+
Subunidades K
v
β
ββ
β, KChIP2 e Mink do canal de K
+
Figura 4. Potencial de ação, corrente transitória de efluxo e canais de K
+
dependentes de voltagem.
A, diagrama esquemático do potencial de ação cardíaco e as correntes iônicas predominantes em
cada fase. B, corrente transitória de efluxo (I
to
) em miócito atrial humano. C subunidades α
associadas em tetrâmero formando um poro seletivo ao K
+
. D, representação esquemática da
estrutura da subunidade α com 6 domínios que atravessam a membrana (Modificada de Zipes DP,
Jalife J, editors. Cardiac Electrophysiology: From Cell to Bedside, 4th ed. Philadelphia: Saunders,
2004. p.399 e Pourrier et al., 2003).
O prolongamento da duração do potencial de ação (DPA) pode ser devido ao
aumento e/ou persistência das correntes despolarizantes ou diminuição das
correntes repolarizantes. No rato, I
to,1
é a principal corrente responsável pela
repolarização do potencial de ação ventricular, contribuindo também na modulação
do acoplamento excitação-contração (SAH et al., 2003). Aumento da DPA por
diminuição na densidade de I
to,1
tem sido observado em ventrículos de ratos em
diferentes modelos experimentais, tais como insuficiência cardíaca
(DIXON et al., 1996), diabetes (GALLEGO et al., 2009), condições de estresse
térmico (DENG & LIU, 2007), hipertrofia cardíaca induzida por aumento de pressão
(TOMITA et al., 1994) e hipertensão em ratos SHR (LI & JIANG, 2000). Em
ventrículos de cães (KÄÄB et al., 1996) ou coelhos (TSUJI et al., 2000) com
insuficiência cardíaca, a diminuição de I
to,1
também é responsável pelo
prolongamento DPA. Li e cols. (2004) mostraram a mesma ocorrência em células
atriais humanas de indivíduos com insuficiência cardíaca.
1.6 Hipótese do Trabalho
Nossa hipótese de trabalho baseia-se na premissa de que a administração
crônica de esteróide anabólico influenciaria o mecanismo de repolarização
ventricular e a função cardíaca autonômica, o que poderia explicar eventos de morte
súbita cardíaca em praticantes de exercício e usuários de esteróide anabólico.
Além de mudanças na atividade elétrica do coração, refletidas ao
eletrocardiograma de superfície, alterações na densidade de correntes iônicas
cardíacas induzidas pelo treinamento aeróbico têm sido descritas na literatura
(STOLT et al., 1999; WARBURTON et al., 2000). O processo de remodelamento
elétrico cardíaco cria um substrato que é altamente favorável ao desencadeamento
de arritmias ventriculares potencialmente letais, que causam morte súbita
(JORDAENS et al., 1994; MARBAN, 1998; TOMASELLI & MARBÁN, 1999;
BILLMANN, 2009).
Embora o funcionamento do SNA e o perfil de repolarização ventricular
tenham sido descritos na literatura, a sua relação com o uso de EAAs é pouco
conhecida. Assim, o conhecimento do remodelamento eletrofisiológico cardíaco que
pode ocorrer em situações de uso abusivo de esteróides anabólicos, comumente
acompanhados de treinamento físico torna-se importante, uma vez que poderia estar
relacionado a eventos de morte súbita. A melhor compreensão dos reais efeitos do
esteróide anabólico associado ao exercício físico crônico regular e a explicação dos
mecanismos fisiológicos, celulares e moleculares relacionados a estes eventos tem
grande importância para a explicação de casos freqüentes de morte súbita de atletas
de alto nível de diferentes modalidades esportivas, cada vez mais comuns em todo o
mundo.
1.7 OBJETIVOS
1.7.1 Objetivo Geral
Investigar alterações eletrofisiológicas, autonômicas e funcionais, associadas
ao remodelamento cardíaco em ratos sedentários e treinados, submetidos ao
tratamento com esteróide anabólico.
1.7.2 Objetivos Específicos
Avaliar as alterações induzidas pela administração crônica de decanoato de
nandrolona, associada ou não ao exercício físico, sobre:
I. Os parâmetros de repolarização do eletrocardiograma in vivo;
II. A função autonômica cardíaca;
III. Avaliação morfofuncional do coração;
IV. O perfil do potencial de ação ventricular;
V. A corrente iônica repolarizante I
to,1
;
VI. Os níveis de expressão das subunidades K
V
1.4, K
V
4.2, K
V
4.3 e KChIP2.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos com massa corporal inicial entre 340 e
360g. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, forradas com lascas
de madeira esterilizada, com ração e água ad libidum. A investigação seguiu os
preceitos do “Guia para o Uso de Cuidado de Animais de Laboratório” (Publicação
do NIH Nº 85-23, revisada em 1985, USA) e foi aprovada pela Comissão de
Avaliação do Uso de Animais em Pesquisa da Instituição (protocolo IBCCF 006).
Os animais foram alocados em 4 grupos:
1. Sedentário, tratado com veículo da droga (Controle sedentário, CS);
2. Sedentário, tratado com esteróide anabólico (Deca Sedentário, DS);
3. Treinado, tratado com veículo da droga (Controle Treinado, CT);
4. Treinado, tratado com esteróide anabólico (Deca Treinado, DT).
2.2 Protocolo experimental
Durante 8 semanas os animais dos grupos DS e DT receberam 10 mg/Kg de
decanoato de nandrolona (Deca Durabolim©, Organon, Brasil), enquanto os animais
pertencentes aos grupos CS e CT receberam o mesmo volume do veículo da droga
[90% de óleo de amendoin / 10% de álcool benzílico (v/v)], administrados
semanalmente por injeção no músculo glúteo médio (PHILLIS et al., 2000).
2.3 Protocolo de treinamento
Após 5 dias de adaptação ao exercício em esteira rolante (Insight
®
, Brasil),
inclinação de 0% e velocidade de 8 m/min durante 15 min, os animais foram
treinados 5 vezes por semana durante 8 semanas. A intensidade do programa foi de
10 m/min durante 15 min na primeira semana, aumentando progressivamente até
atingir 16 m/min e 60 min de duração na última semana, sendo cada uma das
etapas mostrada na tabela 2.
Tabela 2. Protocolo de treinamento dos ratos em esteira rolante
2
Dias da Semana Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4
2
a
10
1
- 15
2
12 - 15 16 - 20 16 - 30
3
a
10 - 15 14 - 15 16 - 20 16 - 35
4
a
10 - 15 16 - 15 16 - 25 16 - 35
5
a
10 - 15 16 - 15 16 - 25 16 - 40
6
a
10 - 15 16 - 15 16 - 30 16 - 40
Dias da Semana Semana 5 Semana 6 Semana 7 Semana 8
2
a
16 - 45 16 - 55 16 - 60 16 - 60
3
a
16 - 45 16 - 55 16 - 60 16 - 60
4
a
16 - 50 16 - 60 16 - 60 16 - 60
5
a
16 - 50 16 - 60 16 - 60 16 - 60
6
a
16 - 55 16 - 60 16 - 60 16 - 60
1
velocidade (m/min) -
2
tempo (min);
2
Adaptado de WISLØFF & BRUBAKK, 2001; CARVALHO et al., 2005
2.4 Medidas Biométricas
O peso corporal foi medido semanalmente em balança analítica (Marte
®
A-
500, Brasil). Ao final do protocolo experimental e das avaliações in vivo os animais
foram então heparinizados (500UI / 100g de peso corporal), anestesiados e
sacrificados por inalação de CO
2
. Os corações foram pesados e a massa expressa
em termos absolutos (g) e relativos (normalizada pelo peso corporal). A razão peso
do coração/peso corporal (mg/g) foi utilizada como índice de hipertrofia (PHILLIS et
al., 2000; CHAVES et al., 2006).
2.5 Avaliação Ecocardiográfica
A ecocardiografia é um método não-invasivo capaz de fornecer dados a
respeito do volume, massa e função hemodinânica do coração, através da análise da
anatomia e da função sistólica e diastólica das câmaras cardíacas.
Antes do início e ao final do tratamento e treinamento (8 semanas), os animais
foram anestesiados (quetamina/xilazina: 80/20 mg kg
-1
, i.p.), tricotomizados na região
torácica ventral e submetidos à avaliação ecocardiográfica (Caris Plus, Esaote, Itália).
Os exames foram conduzidos e analisados pelo mesmo avaliador, de maneira cega
quanto ao grupo experimental de cada animal. Todas as medidas foram adquiridas em
triplicatas sendo posteriormente calculados os valores médios. Para análise da
anatomia cardíaca foram mensurados: diâmetro de VE (cm), espessura de septo (cm)
e parede posterior (cm). Para análise da função cardíaca foram mensurados: fração
de ejeção (FE%) e débito cardíaco (L/min). Foi empregado um transdutor de 10 MHz
de cristal piezoelétrico.
2.6 Avaliação eletrocardiográfica
Para avaliação dos parâmetros eletrocardiográficos (intervalo QT e dispersão
de QT), o ECG foi registrado in vivo em animais anestesiados (quetamina/xilazina:
80/20 mg kg
-1
, i.p.). Os ratos foram fixados com esparadrapo em uma mesa
cirúrgica, em posição supina, e quatro pequenas agulhas de aço inoxidável,
inseridas subcutaneamente nos membros dos animais, constituindo os eletrodos
para registros do ECG nas derivações frontais DI, DII, DIII, aVR, aVL e aVF.
Adicionalmente, foram inseridos três eletrodos subcutâneos na região torácica dos
animais para registro nas derivações precordiais V
1
, V
2
e V
5
.
Para a análise da variabilidade da freqüência cardíaca, o registro de ECG foi
obtido de animais não anestesiados. Os animais passaram por cuidadosa tricotomia
da região torácica anterior, realizada sem anestesia, 24 horas antes de cada registro
do eletrocardiograma. Um colete de material elástico, confeccionado de modo a se
ajustar à circunferência do tórax dos animais, com 2 eletrodos de platina ligados
cada a um cabo suficientemente longo para ser conectado ao sistema de registro do
ECG. Os eletrodos foram posicionados na parte interna do colete de forma a ter
contato com a pele do animal, dispostos espacialmente numa pseudo-derivação D
2
.
Detalhes do colete podem ser observados na Figura 5B. Um gel condutor próprio
para registro de ECG foi cuidadosamente aplicado sobre cada eletrodo de modo a
evitar uma ponte de contato elétrico entre os mesmos. Os registros de ECG foram
realizados em ambiente silencioso e sempre no mesmo período do dia (07:00 -
09:00 h). Após o colete ser vestido (Figura 5A), o animal era colocado em um
recipiente de acrílico próprio para contenção de rato (Figura 5C) e mantido por 5 min
para adaptação, seguido de registro do ECG durante 10 min. Todos os animais
foram previamente condicionados ao colete e ao recipiente de contenção durante
uma semana, 15 min/dia.
a
b
c
A
C
B
-
PAE
PAD
Cauda
Cabeça
D2
a
c
c
b
a
b
+
-
PAE
PAD
Cauda
Cabeça
D2
a
c
c
b
a
b
+
-
PAE
PAD
Cauda
Cabeça
D2
a
c
c
b
a
b
+
Figura 5. Método de registro do ECG: A, colocação do colete no animal. B, diagrama esquemático da
face interior do colete ilustrando as posições dos eletrodos (+) e (-). PAD: pata anterior direita; PAE:
pata anterior esquerda. C, animal sob contenção durante o registro do ECG.
Os eletrodos foram conectados às entradas de um amplificador AC
diferenciais de 4 canais (Model 1700, AM Systems, USA). Os sinais foram
amplificados e filtrados (freqüência passa-banda: 0,1 Hz - 1 kHz). A conversão
analógica-digital dos sinais foi obtida com o programa Axoscope 9 (Axon
Instruments, USA) e interface analógica-digital Digidata 1322A (Axon Instruments,
USA), com resolução A/D de 16 bits. A frequência de amostragem foi de 2 kHz. Os
registros foram armazenados digitalmente para posterior processamento e análise
off line pelo programa AxoScope 9 (Axon Instruments). Maiores detalhes sobre a
metodologia de aquisição do ECG vide Apêndice A.
2.6.1 Análise do Eletrocardiograma: Repolarização ventricular
Os registros eletrocardiográficos dos animais anestesiados foram analisados
para obtenção dos seguintes parâmetros: freqüência e ritmo cardíaco, duração da
onda P, do intervalo PR, complexo QRS, intervalo QT e dispersão do intervalo QT. O
intervalo QT é definido como o intervalo entre o início do complexo QRS e o final da
onda T, ponto onde esta cruza a linha isoelétrica, determinada visualmente e em
concordância com os métodos descritos na literatura (LEPESCHKIN, 1952). Quando
a onda T não estava bem definida descartou-se o registro. Extra-sístoles e pós-
extrasístoles também foram excluídas. Em muitas espécies a duração do intervalo
QT é inversamente relacionada à média da freqüência cardiaca. Portanto, em nosso
estudo o intervalo QT foi corrigido pela freqüência cardíaca usando-se a equação de
Bazett (QTc = QT/(RR)1/2), onde RR é o intervalo entre duas ondas R consecutivas,
dado em segundos. O índice de dispersão do intervalo QT foi obtido pelo cálculo da
diferença entre os valores máximo e mínimo de intervalo QT obtidos das 9
derivações registradas simultaneamente e não foi corrigida pela freqüência cardíaca
(ZABEL et al., 2000).
2.6.2 Análise do Eletrocardiograma: Variabilidade da freqüência cardíaca
A análise da variabilidade da freqüência cardíaca foi realizada de acordo com
as diretrizes da Força-Tarefa da Sociedade Européia de Cardiologia e Sociedade
Norte-Americana de Marcapasso e Eletrofisiologia (TASK FORCE, 1996). Todos os
algoritmos empregados foram escritos em Matlab 7.0 (Mathworks, USA).
O sinal de ECG bruto foi filtrado por um filtro digital passa-banda (2-300 Hz)
IIR (Infinite Impulse Response), tipo Chebyshev. Extrassístoles ventriculares e
supraventriculares e batimentos ectópicos foram excluídos. Os intervalos R-R entre
os batimentos foram extraídos, empregando-se o algoritmo de Pan-Tompkins
(MEYER et al., 2006). Empregou-se limiar de corte, com pico variável para
identificação das ondas R, filtradas de acordo com os critérios de Berntson et al.
(1990). Após, 180s de sinal estável foram selecionados em cada registro para a
análise da VFC. Após detecção dos picos R (e subseqüente geração dos
tacogramas), nos casos em que foi necessária a realização de edição, a
interpolação de eventos (artefatos de interferência elétrica, batimentos ectópicos e
extrassístoles) foi conduzida e menos de 1% do total de intervalos RR detectados.
No domínio do tempo foram extraídos: RR - média dos intervalos entre os
picos R, SDNN - desvio padrão dos intervalos RR, RMSSD - raiz média quadrática
dos quadrados das diferenças entre intervalos RR sucessivos, e pNN5 - percentual
de intervalos RR sucessivos maiores que 5 ms (AUBERT et al., 1999).
Para a análise espectral (domínio da freqüência), os tacogramas foram
reamostrados em intervalos iguais a 10 Hz (método spline de interpolação cúbica) e
a tendência linear foi removida. A raiz quadrática da magnitude para cálculo do
espectro de potência foi obtida após aplicação da FFT (Transformada Rápida de
Fourier), com promediação para redução da variância da FFT e seguiu o método do
periodograma (Periodograma de Welch: 256 pontos, 50% de sobreposição,
janelamento de Hamming). O espectro de potência de todos os segmentos foram
promediados para redução da variância da FFT como um estimador espectral. Além
disso, o espectro de potência médio foi suavizado usando uma janela retangular de
3 pontos. De acordo com estudos prévios sobre variabilidade da freqüência cardíaca
em ratos (BROWN et al., 1994; KRÜGER et al., 1997; PEREIRA-JUNIOR et al.,
2006), duas regiões de interesse foram definidas: baixa freqüência (BF : 0,2 Hz–0,8
Hz) e alta freqüência (AF: 0,8 Hz até 2,5 Hz), expressa como um percentual da
potência média do espectro. A potência (ms
2
) foi determinada como a área sob o
espectro nas faixas de freqüência acima descritas. A razão entre as potências em
BF e AF (BF/AF) foi utilizada como índice de balanço simpatovagal no coração
(PAGANI et al., 1986; YAMAMOTO et al., 1991).
2.7 Estudo Eletrofisiológico: Potencial de ação e corrente iônica
O estudo eletrofisiológico do remodelamento iônico induzido pelo treinamento
físico e/ou esteróide anabólico foi efetuado em tecido isolado e cardiomiócitos
isolados dos ventrículos direito e esquerdo.
2.7.1 Registro do Potencial de ação
A técnica de empalamento intracelular através de microeletródio de vidro foi
usada para estudar os efeitos do tratamento crônico com EAA sobre a duração do
potencial de ação ventricular. Os animais foram heparinizados (500 UI/100 g de
peso do animal), e sacrificados por inalação de CO
2
. O coração foi retirado, lavado
em solução Tyrode e dissecado para obtenção de fatias das paredes dos ventrículos
esquerdo e direito. Estas foram fixadas com pequenos alfinetes de aço inoxidável à
camada de Sylgard
®
no fundo de uma cuba de acrílico (volume de aproximadamente
6 ml), mantendo a superfície endocárdica para cima. As fatias foram continuamente
perfundidas com solução de Tyrode, contendo (em mM): 129 NaCl, 4 KCl, 0,9
NaH
2
PO
4
, 0,5 MgSO
4
, 5,9 glicose, 1,8 CaCl
2
, 22 NaHCO
3
, saturada com mistura
carbogênica (95%O
2
e 5% CO
2
) para manutenção do pH em 7,4 e oxigenação do
tecido. A entrada de solução na cuba ocorria através de um tubo de vidro envolto por
uma resistência alimentada por uma fonte DC, controlada manualmente, mantendo a
temperatura do banho em 35
0
C. O fluxo foi mantido constante em 3 ml/min, por uma
bomba peristáltica (Gilson MiniPuls 3). Durante os experimentos o tecido foi
estimulado por pulsos retangulares de corrente, com duração de 0,5 a 3 ms,
frequ6encia de 1 Hz e intensidade cerca de duas vezes o valor limiar determinado
para cada músculo, aplicados através de um par de eletrodos de prata cloretados
(Ag/AgCl) e conectados a um estimulador (DS2, Digitimer). A freqüência de
estimulação (1 Hz) foi controlada por um gerador de freqüência (Digitimer D4030,
Digitimer).
Para o registro do potencial transmembrana foi utilizado microeletrodo
convencional de vidro (LING & GERARD, 1949), fabricado a partir do estiramento de
um tubo de vidro de borosilicato de 1,0 mm de diâmetro, em um estirador vertical
(PP-83, Narishige), formando dois microeletródios. Cada microeletródio foi
preenchido com solução de KCl 3M, na qual inseriu-se um fio de Ag/AgCl conectado
ao estágio de entrada de um pré-amplificador de alta impedância (MEZ-7200, Nihon-
Kohde).
Com o auxílio de um micromanipulador (Narishige), o tecido foi impalado pelo
microeletrodo com resistência de ponta entre 10 e 20 MΩ DC. O eletrodo de
referência foi formado por um fio de Ag/AgCl mergulhado diretamente no banho e
conectado à entrada “terra” do pré-amplificador.
O sinal obtido na saída do pré-amplificador foi enviado a um condicionador de
sinal (CyberAmp 320, Axon Instruments) e depois digitalizado por um sistema de
aquisição de dados (interface A/D TL-2 e software Axotape, Axon Instruments),
controlado por um microcomputador onde os sinais foram armazenados para
posterior análise.
Para o estudo do efeito do EAA no potencial de ação, avaliamos o potencial
de repouso (PR), a amplitude do potencial de ação (APA) e a duração, aos níveis de
30% (DPA
30
) e 90% (DPA
90
) da repolarização, dos potenciais de ação registrados
sob ciclos de estimulação de 1000 ms.
2.7.2 Registro da corrente transiente de efluxo de K (I
to
)
Para o estudo da corrente repolarizante I
to
, cardiomiócitos ventriculares foram
dissociados enzimaticamente dos corações dos ratos ao final do período de
treinamento/tratamento. Os animais foram heparinizados (heparina, 500 UI/100 g de
peso do animal) e sacrificados por inalação de CO
2
. Após toracotomia, o coração foi
extraído rapidamente, pesado e então canulado pela artéria aorta a um sistema de
perfusão. As soluções de perfusão foram mantidas a uma temperatura de 36 ± 0,5
ºC e borbulhadas continuamente com oxigênio a 100%. Para obtenção dos
cardiomiócitos, perfundiu-se o coração inicialmente com solução Tyrode
(em mM):
NaCl 132, KCl 4, HEPES 10, MgCl
2
1,2, glicose 5, CaCl
2
1. pH: 7.3,
para realizar a
lavagem do sangue. Após eliminação de resíduos de sangue, foi perfundida a
solução Tyrode sem cálcio nominal, até a assistolia. A partir desse momento
iniciava-se a perfusão da solução de Tyrode sem cálcio contendo colagenase tipo II
(190 UI / ml, Worthington, USA), por um período variável de 5 a 15 min, até que o
coração ficasse com um aspecto amolecido. Procedeu-se então a lavagem com
solução de Tyrode sem cálcio por 10 min, com objetivo de remover toda a
colagenase. Em seguida, o coração foi colocado em uma placa de Petri contendo
solução Tyrode sem cálcio e os ventrículos direito e esquerdo e septo foram
dissecados, picotados e colocados cada um deles em poços de uma placa de
cultura contendo solução KB modificada (em mM): KCl 30, Ácido glutâmico 70,
HEPES 10, MgCl
2
1, glicose
10, Taurina 20, KH
2
PO
4
10, EGTA (etilenoglicol-bis(β-
aminoetileter)-N,N,N´,N´-ácidotetraacético) 0,3, pH 7,3. Em cada poço da placa os
cardiomiócitos foram dispersados mecanicamente usando-se um pipeta Pasteur. As
células foram usadas dentro de 8 h após a dissociação.
Alíquotas das células dissociadas foram transferidas para uma câmara de
acrílico, montada sobre a platina de um microscópio invertido (Nikon Diaphot). A
câmara foi perfundida continuamente com solução Tyrode contendo 1,8 mM de
CaCl
2
a um fluxo constante de aproximadamente 1 ml/min. As correntes iônicas
foram registradas segundo a técnica de patch-clamp na configuração whole-cell
(HAMILL et al., 1981). Micropipetas foram confeccionadas a partir de capilares de
borossilicato (A-M Systems Inc., USA) por tracionamento em um estirador horizontal
de pipetas (Sutter Instruments, Co, Mod. P - 97). As micropipetas foram preenchidas
com solução eletrolítica (em
mM: KCl 50, MgSO
4
1, EGTA - etilenoglicol-bis β-
aminoetileter-N, N, N, Nácidotetraacético 10, Acido L-Aspártico 80, KH
2
PO
4
10, HEPES
5 e ATP
(Na+)
3, titulada com KOH para pH 7,2),
e apresentavam resistências de ponta
entre 3 e 7 MΩ. O eletrodo de referência consistia de um fio de Ag/AgCl imerso no
banho. Um fio de Ag/AgCl no interior da micropipeta constituía o eletrodo de registro
conectado a um pré–amplificador conversor corrente-voltagem (headstage CV 4,
Axon Instruments), que estava ligado a um amplificador Axopatch 200 (Axon
Instruments, USA). O conjunto pipeta e pré-amplificador estava acoplado a um
micromanipulador hidráulico (Narishige, Nikon, Japão), que permitia a aproximação
da pipeta em direção à superfície de uma célula através de movimentos ultrafinos.
Após o contato entre a pipeta e a membrana celular formava-se um selo de elevada
resistência (5-10 GΩ). A aplicação de um breve pulso de pressão negativa rompia o
“patch” de membrana na “boca” da pipeta, estabelecendo a configuração whole-cell
da técnica de patch clamp. Para determinação da capacitância da membrana
celular, analisou-se as correntes em respostas à pulsos de voltagem de baixa
amplitude (-10, -5 e +5 mV), a partir de um potencial imposto de -70 mV. A
capacitância foi calculada como a razão entre a carga total, Q, (estimada através da
integração da área sob o transiente de corrente capacitiva) e a magnitude do pulso
(5 ou 10 mV). Em seguida, procedeu-se a compensação da capacitância membranar
e resistência em série, utilizando-se o circuito de compensação do amplificador.
A aplicação dos protocolos de voltagem e a aquisição dos sinais de corrente
foram efetuadas através de um sistema de aquisição de dados, constituído de uma
placa digitalizadora DIGIDATA 1440 e o software Pclamp 10.1 (Axon Instruments,
USA), instalados em um microcomputador. O sinal de corrente foi filtrado a 1 kHz
(filtro Bessel passa-baixa de 8 pólos, Modelo 902, Frequency Devices) e adquirido à
taxa de 5 kHz.
Para registro de I
to
utilizou-se uma solução intrapipeta (em mM: 50 KCl, 1
MgSO
4
, 10 EGTA, 80 ácido L-aspártico, 10 KH
2
PO
4
, 5 HEPES e 3 Na
2
ATP, titulada
com KOH para pH 7,3). Externamente, as células foram perfundidas com solução
Tyrode contendo 100µM de CdCl
2
, para bloquear a corrente I
Ca,L
e TEA-Cl para
bloquear I
K
. Todos os registros de corrente foram efetuados à temperatura ambiente
(23-25° C). As trocas da solução externa foram obti das em cerca de 50-60
segundos, usando-se uma bomba peristáltica (Gilson, Minipuls 3). Ao início de cada
experimento, antes da formação do selo, o potencial de junção entre a solução de
pipeta e o do banho foi ajustado para zero através do circuito offset do amplificador.
Os registros foram efetuados 2 minutos após o rompimento e as células mantidas a
um potencial constante (potencial holding, Vh) de -60 mV.
Para a caracterização eletrofisiológica de I
to
em cardiomiócitos, dos
ventrículos direito e esquerdo, de animais sedentários não-tratados e tratados com
decanoato de nandrolona foram avaliados os seguintes parâmetros: capacitância da
membrana celular, densidade (amplitude normalizada pela capacitância celular) da
corrente I
to
, curva corrente / voltagem, dependência de voltagem da ativação e
inativação e as cinéticas de ativação e reativação.
Foram aplicados 4 pulsos de voltagem compreendidos entre -85 mV e -75 mV
com incrementos de 5 mV, a partir de um potencial imposto de -60 mV, para
determinar a capacitância da membrana celular e utilizar este valor em cálculos
posteriores envolvendo a densidade de corrente membranar. A capacitância
membranar foi avaliada através da razão entre a carga total, Q, (estimada através da
integração da área sob os transientes capacitivos registrada com um filtro de 10
kHz) e a magnitude do pulso (5 mV).
Para avaliar a dependência de voltagem de I
to
, pulsos teste com duração de
500 ms e potencial variando de -50 a 60 mV foram aplicados a cada 6 s, em
incrementos de 10 mV, partindo do Vh de -60 mV. Cada pulso foi precedido por um
curto pré-pulso (80 ms) de -60 para -40 mV para inativar I
Na
. A inativação steady-
state de I
to
foi determinadada por um protocolo de pulso duplo, consistindo de um
pulso condicionado de 200 ms variando de -50 mV a 60 mV, em incrementos de
10 mV, seguido por um pulso de teste de 500 ms para +60 mV, onde o pico da
corrente foi medido.
Neste protocolo, os resultados foram plotados para uma
função de Boltzmann I/I
max
, onde I/I
max
= 1 / [1 + exp (Vm – V
1/2
) / k], onde V
m
é
o potencial de membrana, V
1/2
potencial de membrana onde ocorre 50% da
inativação (curva de inativação "steady-state") da corrente e k o fator de
inclinação (slope), todos expressos em mV.
2.8 Extração Total de RNA e RT-PCR quantitativo
Os níveis da expressão de RNAm de Kv1.4, Kv4.2 and Kv4.3 nos animais
controle e tratados com esteróide foram mensurados por Real Time RT-PCR (qRT-
PCR). Após o tratamento com DECA ou veículo, os ventrículos direito e esquerdos
foram dissecados e imediatamente congelados em nitrogênio líquido. O RNA total foi
extraído de corte de 30 mg de músculo cardíaco congelado e DNase tratada usando
o RNeasy® Fibrous Tissue Mini Kit (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante.
1µg do RNA total foi reversamente transcrito em DNAc utilizando primers aleatórios
e transcriptase reversa Super-Script III (Invitrogen) seguindo as orientações do
fabricante. Amplificações em tempo real foram realizadas em ABI Prism 7500
(Applied Biosystems). As reações de amplificação foram realizadas em placas de 96
poços com 25 µl de volume final contendo 1 µl de DNAc diluído em 10x, 12,5 µl of 2x
Power SYBR Master Mix (Applied Biosystems) e 150 nM de cada primer, frente e
verso. O programa de amplificação foi a 55ºC durante 2 min, 95ºC durante 10 min,
seguido de 40 ciclos de 95º por 30s e 58ºC por 1 minuto. A eficiência do RT-PCR foi
avaliada usando diluições seriais do modelo do DNAc, e os dados da curva reversa
de meltincriptase foram coletados para verificar a especificidade da RT-PCR. Cada
DNAc foi amplificado em 3 vezes e uma amostra correspondente sem transcriptase
reversa (nenhuma amostra de RT) foi incluída como controle negativo. Além disso, a
expressão dos genes escolhidos foi normalizada com a do GAPDH como controle
interno.
As quantidades relativas da expressão gênica específica do RNAm foram
determinadas pelo método comparativo CT expresso pela fórmula 2
-(Ct)
, onde Ct
refere-se ao ciclo de "limite" e é determinado para cada chapa pelo Real 7500-Time
PCR Sequence Detection System Software (Applied Biosystems). ∆Ct é a diferença
entre o Ct do RNAm alvo menos o Ct do controle endógeno (GAPDH). A dobra de
mudança na expressão dos genes-alvo em resposta aos tratamentos foi calculada
da seguinte forma: média ± dp de 2
-(Ct)
para cada controle e grupo tratados seguida
pela determinação da relação entre o tratamento / controle.
2.9 Análise Morfométrica
A análise histológica foi feita por hematoxilina e eosina para a visualização
das estruturas celulares e Picrosirius vermelho para a análise da fibrose, de acordo
com protocolos padrão.
Os corações foram cortados transversalmente, fixados em paraformaldeído a
4%, embebidos em parafina e seccionados a 5 µm de espessura ao nível dos
músculos papilares. Os cortes foram corados com hematoxilina-eosina (HE) para a
visualização de estruturas celulares e Picrosirius red para a análise de fibrose.
As secções de cada coração foram visualizadas e analisadas sob microscopia
ótica utilizando lente objetiva 40x (Zeiss Axiovert 200). As imagens foram adquiridas
com uma câmera colorida (AxioCam HRC, Zeiss) e analisadas usando o software de
análise de imagens Pro Plus 5.0 (Media Cybernetics, Silver Springs, MD, EUA). A
quantificação do colágeno foi estimada em secções coradas com picrosirius red,
enquanto a determinação do número e diâmetro dos núcleos dos cardiomiócitos foi
realizada em secções coradas com HE. Vinte e cinco campos escolhidos
aleatoriamente foram analisados por animal.
2.10 Análise estatística
Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). Para
identificar a normalidade das variáveis foi aplicado o teste de Shapiro-Wilks. As
comparações transversais entre os grupos foram realizadas utilizando-se o teste t de
Student não-pareado ou Teste de Mann-Whitney. Análise de variância ANOVA two-
way com aplicação do teste post-hoc de Bonferroni foi usada para a comparação
dos resultados envolvendo medidas repetidas. Os softwares Microsoft Excel 2003
(Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) e GraphPad Prism 4 (GraphPad
Software, Inc.) foram utilizados. A significância estatística estabelecida em todas as
análises foi p < 0,05.
3. RESULTADOS
3.1 Biometria
3.1.1 Peso corporal
O efeito do tratamento com EAA sobre o peso corporal dos animais está
ilustrado na Figura 6. O peso médio inicial foi igual para todos os grupos. Os grupos
CS e DS tiveram aumento da massa corporal ao longo das 8 semanas e
apresentaram diferenças de peso apenas nas duas últimas semanas. A massa
corporal do grupo CT manteve-se constante a partir da 2ª semana de treinamento e
foi significativamente menor do que a massa do grupo CS a partir da 3ª semana. A
massa corporal do grupo DT foi maior que a do grupo CT apenas nas 3ª, 4ª e 5ª
semanas; e foi menor do que a do grupo DS nas 3 últimas semanas do tratamento.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
340
350
360
370
380
390
400
410
420
CT
DT
CS
DS
a
a
b
a
a
a
a
b
b
b
a
a
a
Semanas
Peso Corporal (g)
Figura 6. Efeito do tratamento com decanoato de nadrolona e exercício sobre o peso corporal (g) ao
longo de 8 semanas. CS: controle sedentário, DS: deca sedentário, CT: controle treinado, DT: deca
treinado. Valores expressos em média ± erro padrão da média.
a
p < 0,01 vs. CS;
b
p < 0,01 vs. DS.
Para todos os grupos, n=13.
3.1.2 Peso do coração
O peso do coração apresentou diferença entre os grupos quando comparado
em valores absolutos, sendo maior nos grupos DS e DT e menor no grupo CT,
comparados ao grupo CS. O grupo DT apresentou massa cardíaca menor em
relação ao grupo DS. Quando considerado o peso do coração normalizado pelo
peso corporal, não foi encontrada diferença significativa entre os grupos DT e DS
(tabela 3).
Tabela 3. Efeitos do tratamento com DECA e treinamento sobre o peso corporal e
cardíaco dos ratos.
Peso do coração
Grupo
Absoluto (g) Relativo (mg/g)
CS
(n=13)
2,01 ± 0,03 5,05 ± 0,3
DS
(n=13)
2,09 ± 0,01
a
5,44 ± 0,16
a
CT
(n=13)
1,92 ± 0,02
a
5,54 ±0,24
a
DT
(n=13)
2,01 ± 0,01
b, c
5,67 ± 0,20
a
Valores expressos em média ± erro padrão da média. Peso relativo do coração expresso como a
razão do peso absoluto do coração pelo peso corporal final.
a
p < 0,05 vs. CS,
b
p < 0,001 vs. CT,
c
p
< 0,0001 vs. DS.
3.1.3 Peso de gordura retroperitoneal
O peso de gordura retroperitoneal mensurada ao final do protocolo mostrou-
se reduzida nos grupos DS, DT e CT quando comparados ao grupo CS. O
tratamento com EAA não produziu diferença significativa na massa de gordura
quando comparados aos grupos treinados CT e DT (Figura 7).
CS DS CT DT
0
1
2
3
4
5
6
a
a
a
Gordura retroperitoneal (g)
Figura 7. Massa de gordura retroperitoneal (g) após 8 semanas de treinamento e/ou tratamento com
decanoato de nandrolona. Valores expressos em média ± erro padrão da média.
a
p < 0,05 vs. CS.
Para todos os grupos, n=11.
3.2 Avaliação ecocardiográfica
As avaliações ecocardiográficas das estruturas cardíacas são mostradas na
Figura 8. Não houve diferença entre os grupos para espessura de septo (Fig. 8A) e
parede posterior (Fig. 8B), antes e após o tratamento/treinamento. O grupo CT
apresentou diâmetro do ventrículo esquerdo maior comparado aos grupos CS e DT,
enquanto este último apresentou o diâmetro de VE maior que o do grupo DS (Fig.
8C).
CS
0
C
T
0
D
S
0
D
T
0
CS
8
C
T
8
DS 8
D
T
8
0.0
0.1
0.2
Septo
Espessura (cm)
CS 0
CT 0
DS 0
D
T
0
C
S
8
CT
8
DS 8
DT 8
0.0
0.1
0.2
Espessura (cm)
P. Posterior
CS
0
CT
0
DS
0
DT 0
CS 8
CT 8
DS 8
DT
8
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
a
b ,c
Diâmetro de VE (cm)
A
C
B
Figura 8. Parâmetros ecocardiográficos medidos antes (0) e após (8) o treinamento e/ou tratamento
com decanoato de nandrolona. A, espessura de septo. B, espessura de parede posterior. C, diâmetro
de ventrículo esquerdo (VE).
a
p < 0,01 vs. CS8,
b
p < 0,01 vs. DS8,
c
p <0,01 vs. CT8. Para todos os
grupos, n=10.
Na avaliação ecocardiográfica da função cardíaca não foram observadas
diferenças significativas no débito cardíaco na comparação entre os grupos, antes e
após o treinamento/tratamento (Fig. 9A). Todos os grupos apresentaram valores
similares de fração de ejeção na semana 0. Entretanto, na 8ª. semana do
treinamento/tratamento a fração de ejeção mostrou-se aumentada no grupo CT
(comparado aos grupos CS e DT) e diminuída no grupo DS quando comparado aos
grupos CT e DT (figura 9B).
CS 0
C
T 0
DS 0
D
T 0
CS
8
C
T
8
DS
8
D
T
8
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
Débito Cardíaco (L/min)
CS
0
CT
0
DS 0
D
T 0
CS
8
CT 8
DS 8
DT
8
0
25
50
75
100
Fração de Ejeção (%)
a
b
A
B
Figura 9. Parâmetros ecocardiográficos medidos antes (0) e após (8) o treinamento e/ou tratamento
com decanoato de nandrolona. A, débito cardíaco; B, fração de ejeção. Valores expressos em
média ± erro padrão da média.
a
p < 0,001 vs CS8,
b
p < 0,001 vs DS8,
c
p < 0,01 vs CT8. Para todos os
grupos, n=10.
3.3 Intervalo QT e dispersão de QT
O tratamento com decanoato de nandrolona prolongou o intervalo QTc do
grupo DS, com diferença significativa em relação aos grupos CS (a partir da 3ª
semana) e DT (a partir da 4ª semana). O intervalo QTc do grupo CT não mudou
significativamente ao longo das 8 semanas de tratamento, sendo menor que o grupo
CS a partir da 4ª semana (figura 10B).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
50
60
70
80
90
CS
DS
CT
DT
a
a
a
a
a
b
b
b
b
b
c
c
c
c
c
Semanas
QT (ms)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
130
150
170
190
210
230
CS
DS
CT
DT
a
a
a
a
a
a
b
b
b
b
b
c
c
c
c
c
Semanas
QTc (ms)
A
B
Figura 10. Intervalo QT (A) e intervalo QT corrigido pela freqüência cardíaca (B) medidos antes
(Semana 0) e durante (semanas 1 a 8) o treinamento/tratamento com decanoato de nandrolona. QTc
foi determinado pela fórmula de Bazzet. Os valores estão expressos em média ± erro padrão da
média.
a
p < 0,01,
b
p < 0,01 versus CS,
c
p < 0,001 vs. DT. Para todos os grupos, n=13.
A tabela 4 mostra os valores da dispersão de QT entre as semanas 0 e 8. Os
grupos DS e DT apresentaram aumento significativo do QTd na 8ª semana, quando
comparados aos respectivos controles CS e CT.
Tabela 4. QTd antes e ao final do protocolo experimental (valores expressos em ms).
Grupos Semana 0 Semana 8
CS
(n=11)
16,26 ± 1,23 27,17 ± 0,5
DS
(n=11)
14,56 ± 0,9 35,32 ± 1,1
a
CT
(n=11)
15,13 ± 1,08 26,40 ± 0,7
DT
(n=11)
15,67 ± 1,41
29,32 ±1, 12
b, c
Valores expressos em média ± erro padrão da média.
a
p < 0,01 vs. CS,
b
p < 0,01 vs. CT,
c
p < 0,01 vs. CS.
3.4 Variabilidade da Freqüência Cardíaca
Os resultados das análises de VFC no domínio do tempo, registradas ao
longo de 8 semanas estão sumarizadas na figura 11. Pode-se observar que não
houve diferença significativa entre os grupos para RR (intervalo RR médio). Porém,
as outras variáveis mostram diferenças na 4ª e 8ª semanas. O SDNN (desvio padrão
dos intervalos RR) apresentou redução nos grupos DS e DT comparados ao grupo
CS. A RMSSD (raiz média quadrática dos quadrados das diferenças entre intervalos
RR sucessivos), índice de controle parassimpático no domínio do tempo, mostrou-se
significativamente reduzida nos grupos DS e DT comparados aos respectivos
controles.
O percentual de intervalos sucessivos com diferença superior a 5 ms (pNN5)
mostrou-se reduzido na 8ª semana no grupo DS comparado aos grupos CS e DT. O
grupo CT apresentou pNN5 significativamente aumentado comparado aos grupos
CS e DT. Houve uma recuperação parcial do grupo treinado e tratado com esteróide
na oitava semana (Figura 11 D)
C
S 0
CT 0
DS 0
DT 0
C
S 4
CT 4
DS 4
DT 4
C
S 8
CT 8
DS 8
DT 8
0
30
60
90
120
150
180
RR (ms)
C
S
0
CT 0
D
S 0
DT 0
C
S
4
C
T
4
D
S
4
DT 4
CS 8
C
T
8
D
S
8
D
T
8
0
3
6
9
12
b
b
a
SDNN (ms)
C
S 0
CT 0
DS
0
D
T
0
C
S 4
C
T
4
DS 4
DT 4
C
S
8
C
T
8
DS 8
DT 8
0
3
6
9
12
a
b
a
RMSSD (ms)
b
a
C
S 0
CT 0
D
S
0
D
T
0
C
S
4
C
T
4
DS 4
DT 4
C
S 8
CT 8
D
S 8
DT 8
0
10
20
30
40
a
a,b,c
pNN5 (%)
a
A
DC
B
Figura 11. Efeito do exercício e tratamento com decanoato de nandrolona sobre os parâmetros de
variabilidade da freqüência cardíaca analisados no domínio do tempo. RR, intervalo RR médio (A),
SDNN, desvio padrão entre intervalo RR normais sucessivos (B), RMSSD, raiz média quadrática da
diferença entre intervalos RR normais sucessivos (C) e pNN5(%), percentual de intervalos RR
sucessivos maiores que 5 ms (D). Valores expressos em média ± erro padrão da média.
a
p<0,05 vs
CS4 e CS8, respectivamente;
b
p<0,001 vs CT4 e CT8, respectivamente;
c
p<0,001 versus DS8. Para
todos os grupos, n=11.
Conforme pode ser visto na figura 12, a análise estatística dos valores de
potência espectral em alta freqüência (AF, componente espectral relacionado ao
controle parassimpático) demonstra que nas semanas 4 e 8, este índice apresentou-
se significativamente reduzido nos grupos DS e DT comparados aos respectivos
Controles (p < 0,001). Na 8ª semana, o grupo CT apresentou aumento significativo
deste índice em comparação com o grupo CS. A razão entre as potências espectrais
em BF e AF (BF/AF) foi significativamente maior nos grupos DS e DT comparados
aos grupos CS e CT, respectivamente (p < 0,001) tanto na 4ª quanto na 8ª semana
do protocolo. Juntos, tais resultados comprovam que o tratamento com decanoato
de nandrolona foi capaz de reduzir a atividade parassimpática cardíaca, com desvio
do balanço simpato-vagal em direção ao predomínio do primeiro, em detrimento do
segundo. O componente de baixa freqüência (BF) não mostrou diferença
significativa entre os grupos do período de tratamento (figura 13).
CS
0
CT 0
DS
0
D
T 0
C
S 4
CT 4
DS
4
D
T 4
C
S 8
CT 8
DS
8
DT 8
0
3
6
9
12
15
a
a
b
b
AF (ms
2
)
a
CS
0
CT 0
DS
0
DT 0
CS
4
CT 4
DS
4
DT 4
CS 8
CT
8
DS 8
DT
8
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
a
a
b
b
BF/AF
A
B
Figura 12. Efeito do exercício e tratamento com decanoato de nandrolona sobre os índices espectrais
da variabilidade da freqüência. A semana zero representa os valores basais registrados previamente
ao início do protocolo. Potência espectral da alta freqüência diminuída nos grupos tratados com
esteróide a partir da 4ª semana (A). Relação baixa freqüência/alta freqüência aumentada nos grupos
tratados com nandrolona também a partir da 4ª semana (B). Valores expressos em média ± erro
padrão da média.
a
p<0,001 vs CS4 e CS, respectivamente;
b
p<0,001 versus CT4 e CT8,
respectivamente. Para todos os grupos, n=11.
CS 0
C
T
0
DS 0
DT
0
C
S
4
C
T
4
D
S
4
D
T
4
CS 8
CT
8
DS 8
DT
8
0
3
6
9
12
BF (ms
2
)
Figura 13. Evolução do índice espectral em baixa freqüência (BF). A semana zero representa os
valores basais registrados previamente ao início do protocolo. Valores expressos em média ± erro
padrão da média. n =11.
3.5 Potencial de Ação
Dando continuidade ao estudo, avaliamos as alterações induzidas pelo
esteróide anabólico nos potenciais de ação de ambos os ventrículos de ratos
sedentários e treinados. A figura 14 mostra que o tratamento com EAA não alterou
significativamente o potencial de repouso dos ventrículos direito e esquerdo dos
quatro grupos experimentais. A figura 15 mostra que a amplitude do potencial de
ação foi maior nos grupos tratados com EAA, em comparação com seus respectivos
controles, em ambos os ventrículos.
PR (mV)
PR (mV)
Figura 14. Potencial de repouso (PR) do ventrículo esquerdo (VE) e direito (VD) de ratos sedentários
controle (CS) e tratados com EAA (DS) e ratos treinados controle (CT) e treinados tratados com EAA
(DT). CS - 4 animais, registros: 25 VD e 40 VE; DS - 5 animais, registros: 40 VD e 49 VE; CT -
5 animais, registros: 40 VD e 40 VE; DT - 3 animais, registros: 30 VD e 30 VE. Valores expressos em
média ± erro padrão da média.
a
b
b
c
Figura 15. Efeito do treinamento e/ou tratamento com decanoato de nandrolona sobre a amplitude do
potencial de ação (APA) dos ventrículos esquerdo (VE) e direito (VD). CS - 4 animais, registros: 25VD
e 31 VE; DS – 3 animais, registros: 23 VD e 23 VE; CT – 4 animais, registros: 39 VD e 39 VE; DT - 3
animais, registros: 30 VD e 30 VE.
a
p < 0.02 vs. CS,
b
p < 0.0007 vs. CT; VE:
c
p < 0,001 vs. CS.
Valores expressos em média ± erro padrão da média.
50 ms
100 ms
25 mV
25 mV
50 ms
100 ms
25 mV
25 mV
CS
DS
Figura 16. Exemplos de potenciais de ação registrados em tecido isolado de ventrículo esquerdo e
direito de ratos sedentários não-tratados (CS) e tratados com decanoato de nandrolona (DS).
A figura 16 ilustra os potenciais de ação registrados em fatias de miocárdio
isoladas dos ventrículos direito e esquerdo de ratos sedentários controle (CS) e
tratados com decanoato de nandrolona (DS). Note que, em ambos os grupos, a
duração do potencial de ação é maior no ventrículo esquerdo, comparado ao direito.
O tratamento com EAA aumentou a duração do potencial de ação. Para avaliar o
efeito do decanoato de nandrolona sobre o prolongamento do potencial de ação, a
sua duração foi medida ao nível de 30% (DPA
30
) e 90% (DPA
90
) da repolarização.
Como ilustrado na figura 17, a DPA
30
do grupo DS foi significativamente
menor em relação ao grupo CS no ventrículo direito, mas não no ventrículo
esquerdo. Em ambos os ventrículos, não houve diferença significativa entre os CT e
DT, entretanto a DPA
30
de ambos os grupos treinados foi significativamente maior
em relação ao grupo CS.
A figura 18 mostra que a DPA
90
do grupo DS foi menor no ventrículo direito e
maior no ventrículo esquerdo quando comparada com o grupo CS. Em ambos os
ventrículos, a DPA
90
do grupo CT foi maior em relação aos grupos CS e DT.
Em ambos os ventrículos, o exercício induziu aumento de DPA
30
e DPA
90
,
enquanto o tratamento com decanoato de nandrolona diminuiu a DPA
90
dos grupos
treinados. Entretanto, nos ratos sedentários o tratamento com EAA aumentou a
DPA
90
do ventrículo esquerdo e reduziu ambas, DPA
30
e DPA
90
do ventrículo direito.
Ventrículo direito
CS DS CT DT
0
1
2
3
4
5
6
7
a
b
a
DPA
30
(ms)
Ventrículo esquerdo
CS DS CT DT
0
10
20
a a
DPA
30
(ms)
Figura 17. Duração do potencial de ação a 30% da repolarização (DPA30) do VE e VD de ratos
sedentários não tratados (CS, VD 25 registros, e VE 39 registros; 4 animais ) ou tratados (DS, VD: 40
registros e VE: 49 registros; 5 animais); e treinados não tratados (CT, VD: 39 registros e VE: 40
registros; 5 animais) e tratados (DT, VD: 31 registros e VE: 26 registros; 3 animais).
a
p < 0.0001 vs.
CS,
b
p < 0,005 vs. CS.
Ventrículo direito
CS DS CT DT
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
a
a
b,c
DPA
90
(ms)
Ventrículo esquerdo
CS DS CT DT
0
25
50
75
100
a
a
b
DPA
90
(ms)
Figura 18. Duração do potencial de ação a 90% da repolarização (DPA
90
) dos ventrículos esquerdo
(VE) e direito (VD) de ratos sedentários não tratados (CS, VD:14 e VE: 26 registros em 3 animais) ou
tratados (DS, VD: 13 e VE: 20 registros em 3 animais) e treinados não tratados (CT, VD: 39 e VE: 39
registros de 5 animais) e tratados (DT, VD: 31 e VE: 26 registros de 3 animais).
a
p < 0,0001 vs CS;
b
p < 0,05 vs. CT;
c
p < 0,0001 vs. DS.
3.6 Correntes Iônicas
Dado que o tratamento com decanoato de nandrolona induziu aumento
apenas na DPA
90
do ventrículo esquerdo do grupo DS, resolvemos avaliar neste
grupo a densidade da corrente I
to
(principal corrente iônica repolarizante do rato), em
comparação com o grupo controle (CS).
A capacitância celular medida nos cardiomiócitos do ventrículo direito de ratos
sedentários tratados com decanoato de nandrolona foi maior em relação ao grupo
controle (CS: 58,46 ± 2,2 pF, n = 30 versus DS: 82,56 ± 5,0 pF, n = 28; p < 0,01). Os
valores médios de capacitância dos cardiomiócitos do grupo CS foram maiores no
ventrículo esquerdo que no direito. Entretanto, no ventrículo esquerdo, a
capacitância não apresentou diferença significativa (p = 0,8) entre o grupos CS
(92,7 ± 9,7 pF; n = 30) e DS (89,6 ± 7,8 pF; n = 28).
A densidade da corrente I
to
mensurada em cardiomiócitos do ventrículo
esquerdo mostrou-se significativamente reduzida, no intervalo de +30 a +60 mV, no
grupo DS comparado ao CS (Figura 19A-B). Por outro lado, no ventrículo direito, a
densidade de I
to
não apresentou diferença significativa entre os grupos em todos os
potenciais de membrana testados, como podemos observar na figura 20A-B. Além
disso, o tratamento com decanoato de nandrolona não alterou a dependência de
voltagem da inativação “steady-state” de I
to
, tanto em VE (CS: V
1/2
= -10,46 ± 2,5
mV; slope = 5,00 ± 0,3 vs. DS: V
1/2
= -10,68 ± 1,6 mV; slope = -4,7 ± 0,3; p > 0,05 -
figura 19 C) quanto em VD (CS: V
1/2
= -9,19 ± 1,4 mV; slope = 4,59 ± 0,5 vs. DS:
V
1/2
= -7,9 ± 1,1 mV, slope = 4,92 ± 0,1, p > 0,05; Figure 20 C). O tratamento com
decanoato de nandrolona não alterou a cinética da inativação de I
to
no ventrículo
esquerdo, não havendo diferença estatística entre as constantes de tempo (τ) dos
grupos CS e DS em todos os potenciais de membrana avaliados (figura 19D).
Entretanto, no ventrículo
direito houve aumento da constante de tempo (
τ
) do grupo DS
em relação ao grupo CS, em todos os potenciais de membrana avaliados, como
mostrado na figura 20 D.
-75 -50 -25 25 50 75
25
50
CS
DS
a
b
b
b
Voltagem (mV)
Ito (pA/pF)
+60mV
-60mV
-40mV
500 ms
+60mV
-60mV
-40mV
+60mV
-60mV
-40mV
500 ms
B
A
VENTRÍCULO ESQUERDO
-75 -50 -25 0 25 50
0.0
0.5
1.0
CS
DS
Voltagem (mV)
I/Imax
C
-80mV
+30mV
+60mV
-80mV
+30mV
+60mV
10 20 30 40 50 60
0
20
40
60
CS
DS
Voltagem (mV)
τ
τ
τ
τ
(ms)
D
Figura 19. Características eletrofisiológicas da corrente I
to
registrada em cardiomiócitos do ventrículo
esquerdo de ratos controle (CS, n=18) e tratados com decanoato de nandrolona (DS, n=15). A,
traçados representativos da corrente I
to
dos grupos CS (parte superior) e DS (parte inferior). B,
protocolo de voltagem e curvas corrente-voltagem mostrando diferenças significativas entre os grupos
na faixa de +30 a +60 mV (n = 18). C, protocolo de voltagem e curva de dependência de voltagem da
inativação “steady state”, para CS V
1/2
= -10,46 ± 2,5 mV; slope = 5,00 ± 0,3 vs. DS: V
1/2
= -10,68 ±
1,6 mV; slope = -4,7 ± 0,3; p > 0,05. D, dependência de voltagem da constante de inativação de I
to
,
onde. Valores expressos em média ± erro padrão da média.
a
p < 0,05,
b
p < 0,005 vs. CS.
AA
-75 -50 -25 0 25 50
0.0
0.5
1.0
CS
DS
Voltagem (mV)
I/Imax
10 20 30 40 50 60
0
10
20
30
40
DS
CS
a
a
b
b
b
b
Voltage (mV)
τ
τ
τ
τ
(ms)
-75 -50 -25 25 50 75
-5
5
10
15
20
25
CS
DS
Voltagem (mV)
Ito (pA/pF)
+60mV
-60mV
-40mV
500 ms
+60mV
-60mV
-40mV
+60mV
-60mV
-40mV
500 ms
B
A
D
-80mV
+30mV
+60mV
-80mV
+30mV
+60mV
VENTRÍCULO DIREITO
Figura 20. Características eletrofisiológicas da corrente I
to
registrada em cardiomiócitos do ventrículo
direito de ratos controle (CS, n=16) e tratados com decanoato de nandrolona (DS, n=13). A, traçados
representativos da corrente I
to
dos grupos CS (parte superior) e DS (parte inferior). B, protocolo de
voltagem e curvas corrente-voltagem (n = 16). C, protocolo de voltagem e curva de dependência de
voltagem da inativação “steady state”, para CS: V
1/2
= -9,19 ± 1,4 mV; slope = 4,59 ± 0,5 vs. DS: V
1/2
=
-7,9 ± 1,1 mV, slope = 4,92 ± 0,1, p > 0,05. D, dependência de voltagem da constante de inativação
de I
to
. Valores expressos em média ± erro padrão da média.
a
p < 0,05,
b
p < 0,001 vs. CS.
3.7 Biologia Molecular
Para tentar explicar os possíveis mecanismos moleculares subjacentes às
alterações eletrofisiológicas decorrentes do tratamento com decanoato de nandrolona,
foi avaliado, o perfil de expressão de RNAm (Real Time RT-PCR [qRT-PCR]) das
subunidades de I
to
nos ventrículos direito e esquerdo de ambos os grupos. A figura 21
mostra os níveis normalizados de RNAm das subunidades Kv1.4, Kv4.3 e Kv4.2 e da
subunidade regulatória KChIP2. Como observado no lado esquerdo da figura 22, não
houve diferença significativa entre os grupos nos níveis de expressão de RNAm das
subunidades Kv1.4, Kv4.3, Kv4.2 e KChIP2 do ventrículo direito. No lado direito da
figura 22 podemos observar que os níveis de expressão de RNAm para Kv1.4, Kv4.3 e
KChIP2 no ventrículo esquerdo foram significativamente alterados no grupo DS. O
ventrículo esquerdo do grupo DS apresentou redução dos níveis de RNAm de Kv1.4
(23,4%), Kv4.3 (73,2%) e KChIP2 (26,2%), em relação ao grupo CS. O nível de RNAm
de Kv4.2 apresentou grande variação entre os animais tratados com decanoato de
nandrolona (aumento de 250% em 4 animais e decréscimo de 29% em 3 outros animais
do mesmo grupo).
Ventrículo Direito Ventrículo Esquerdo
CS
CS
DS
CS
Modulação (%)
Modulação (%)
Modulação (%)
Fold Change
Modulação (%)
Modulação (%)
Modulação (%)Modulação (%)
a
a
a
Modulação (%)
Figura 21. Níveis de expressão de RNAm das subunidades Kv1.4, Kv4.2, Kv4.3 e KChIP2 nos
ventrículos direito e esquerdo de ratos controle (CS, n = 5) e tratados com decanoato de nandrolona
(DS, n = 7). O nível de RNAm foi determinado por RT-PCR e os dados foram normalizados pelo nível
de expressão do gene GAPDH. Os valores do grupo DS estão expressos como média ± erro padrão
da média relativa ao grupo CS.
a
p < 0,05 vs. CS.
3.8 Análise histológica
Para a análise morfométrica do miocárdio, cortes histológicos dos ventrículos
direito e esquerdo dos grupos CS e DS foram corados por hematoxilina-eosina (HE),
como ilustrado na figura 22. O número de núcleos, normalizado pela área, foi menor no
grupo DS, tanto no VD (CS = 186,0 ± 10,7 núcleos/µm
2
vs. DS =
142,7 ± 4,9 núcleos / µm
2
; n = 4, p < 0,0006) quanto no VE (CS = 248,5 ± 9,6
núcleos/µm
2
vs. DS = 176,6 ± 8,2 núcleos/µm
2
; n = 4, p < 0,0001), representando
respectivamente 23,3% e 28,9% menos núcleos por área, comparado ao grupo CS
(Figura 23A). A hipertrofia dos cardiomiócitos do grupo DS foi indicada pelo aumento do
diâmetro do núcleo em ambos os ventrículos, direito (19,5%, p = 0,004) e esquerdo
(67,7%, p < 0,0001), comparado ao grupo CS (Figura 23B).
A
C
B
D
A
Figura 22. Fotomicrografias mostrando cortes histológicos de ventrículo direito dos grupos CS (A) e
DS (B) e de ventrículo esquerdo dos grupos CS (C) e DS (D). HE, 400x. Barra: 20 µm.
Para verificar se os corações dos animais tratados com decanoato de nandrolona
apresentavam fibrose, cortes histológicos corados por picrosirius red foram analisados
quanto à presença de colágeno. A figura 23 C mostra que não houve diferença
significativa entre os grupos CS e DS quanto à deposição de colágeno, tanto no
ventrículo direito (CS = 0,8 ± 0,1% vs. DS = 0,7 ± 0,3%, p = 0,6) quanto no esquerdo
(CS = 1,24 ± 0,1% vs. DS = 1,3 ± 0,2%, p = 0,8).
Figura 23. A, número de núcleos por área nos ventrículos direito (VD) e esquerdo (VE) de ratos
controle (CS) e tratados com decanoato de nandrolona (DS). B, diâmetro do núcleo, normalizado pelo
valor do grupo controle (CS). C, deposição de colágeno determinada como a área corada por
pricosirius red expressa como percentagem da área total. Valores expressos em média ± erro padrão
da média.
a
p < 0,01;
b
p < 0,001;
c
p < 0,0001 vs. grupo CS, n = 4 em cada grupo.
A figura 24 mostra que não houve diferença nos níveis de expressão gênica
de RNAm para cólágenos I (A) e III (B), nos ventrículos direito e esquerdo dos
grupos CS e DS.
CS DS CS DS
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
VD VE
Modulação (%)
CS DS CS DS
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
VD VE
Modulação (%)
Colágeno I
Colágeno III
A
B
Figura 24. A e B, níveis de expressão RNAm de colágeno tipo I e tipo III, respectivamente, nos
ventrículos direito (VD) e esquerdo (VE) de ratos controle (CS) e tratados com decanoato de
nandrolona (DS). Valores expressos em média ± erro padrão da média, n = 4 em cada grupo.
4. DISCUSSÃO
No presente estudo investigamos as alterações eletrofisiológicas associadas
ao remodelamento cardíaco induzido pelo tratamento crônico com dose
suprafisiológica de esteróide anabólico, associado ou não ao exercício físico.
A dose do esteróide anabólico decanoato de nandrolona utilizada no presente
estudo foi a mesma utilizada em estudos anteriores do nosso grupo (CHAVES et al.,
2006; PEREIRA-JUNIOR et al., 2006) e de outros grupos (TRIFUNOVIC et al., 1995;
NORTON et al., 2000; WOODIWISS et al., 2000). Esta dose tem equivalência com a
dosagem usada em humanos que fazem uso abusivo de esteróides anabólicos
(POPE & DATZ, 1988). No presente estudo, os animais tratados com decanoato de
nandrolona apresentaram menor ganho de peso corporal ao longo das semanas, em
comparação ao grupo controle, além de apresentarem menor massa de gordura
retroperitoneal. Estudos anteriores já relataram baixo ganho de peso corporal em
ratos tratados cronicamente com alta dose de decanoato de
nandrolona(TRIFUNOVIC et al., 1995; LINDBLON et al., 2003; BISSOLI et al., 2009).
Essa diferença de ganho de peso corporal também foi observada por Mirkhani e
cols. (2005) em animais que receberam uma menor dose (3 mg/kg/semana) de
decanoato de nandrolona. Além disso, uma menor massa de gordura corporal em
animais tratados com esteróide anabólico foi descrita por Lindblon e cols. (2003),
postulando, após evidenciarem aumentos nos níveis do hormônio estimulador dos
melanócitos, que essa alteração poderia ser mediada por anormalidades no sistema
de melanocortinas. Pode-se considerar então, um efeito lipolítico do EAA
ocasionando menor ganho de peso corporal no grupo tratado com decanoato de
nandrolona (DE PERGOLA, 2000). Outros estudos também evidenciaram redução
nos níveis de gordura corporal em decorrência do tratamento com decanoato de
nandrolona (CARSON et al., 2002; ROCHA et al., 2007). Além disso, alguns estudos
mostraram redução do peso corporal total em ratos submetidos ao treinamento físico
sem tratamento com esteróides (BALLOR 1991; WISLOFF & BRUBAKK, 2001), o
que pode explicar ainda melhor a redução do peso corporal aliado ao tratamento
com esteróide anabólico. Entretanto, Liang e cols. (1993) não encontraram
diferenças no peso corporal entre ratos sedentários e aqueles submetidos ao
treinamento crônico.
No nosso estudo, os animais tratados com decanoato de nandrolona (grupos
DS e DT) apresentaram maior peso absoluto do coração comparado aos seus
respectivos controles (CS e CT). Entretanto, a razão peso do coração/peso corporal
não mostrou diferença entre os grupos. Este resultado contrasta com estudos
prévios em nosso laboratório (PEREIRA-JUNIOR et al., 2006) e de outro grupo
(BEUTEL et al., 2005), onde o peso absoluto do coração não apresentou diferença
entre grupos, enquanto o peso relativo foi significativamente maior no grupo tratado
com decanoato de nandrolona. Em contraste, Andrade e cols. (2008) mostraram
aumento do peso do coração e razão peso do coração/peso corporal, com hipertrofia
ventricular esquerda confirmada por análise morfométrica e histológica, após 4
semanas de tratamento com decanoato de nandrolona.
Mesmo sem diferenças significativas entre os grupos na relação peso do
coração/peso do corporal, observou-se alterações em outros parâmetros, tais como:
aumento do peso do coração com baixo número e maior diâmetro dos núcleos dos
cardiomiócitos dos animais tratados com EAA, que caracterizam uma hipertrofia
cardíaca (CLUZEAUD et al., 1984). A redução do número total de núcleos nos
animais tratados com EAA pode sugerir um efeito cardiotóxico do decanoato de
nandrolona ligado a um possível mecanismo pró-apoptótico. A indução de apoptose
em decorrência do uso de EAA já foi previamente descrita (FANTON et al., 2009).
No presente trabalho não se observou aumento do conteúdo, nem dos níveis
de RNAm de colágeno I e III. Esse achado contradiz o estudo de Rocha e cols.
(2007) que mostraram aumento no conteúdo de colágeno, mas não na expressão de
RNAm. Esta divergência pode ser justificada pelo emprego de animais de diferentes
idades, já que o estudo de Rocha et al. (2007) utilizou ratos mais jovens do que os
utilizados em nosso estudo.
O exame ecocardiográfico não revelou alterações na espessura do septo e
nem da parede posterior do ventrículo esquerdo dos animais tratados com
decanoato de nandrolona, tanto sedentários (DS) quanto treinados (DT). Entretanto,
a análise ecocardiográfica mostrou aumento do diâmetro do ventrículo esquerdo nos
animais treinados dos grupos CT e DT, mas nenhuma diferença entre os grupos CS
e DS. Estes resultados sugerem que o maior diâmetro do VE nos grupos treinados
seja um indicativo de hipertrofia induzida pelo exercício. Não foi observada diferença
significativa no débito cardíaco dos quatro grupos experimentais. Entretanto, os
animais treinados não-tratados com EAA apresentaram maior fração de ejeção,
enquanto os animais tratados com EAA (DS e DT) mostraram redução da fração de
ejeção, em comparação com seus respectivos controles (CS e CT). Fato este que
pode estar relacionado ao desenvolvimento de hipertrofia cardíaca com perda da
função.
A hipertrofia cardíaca é um fator de risco cardiovascular e tem sido associada
à ocorrência de arritmias cardíacas e morte súbita em atletas de endurance e
usuários de EAA (LUKE et al., 1990; HART, 2003; MARON, 2003). A análise da
variabilidade da freqüência cardíaca (VFC) é um método não-invasivo que permite
identificar a ocorrência de disfunção autonômica cardíaca sendo, portanto, utilizada
como marcador de prognóstico de arritmias cardíacas e morte súbita (KLEIGER et
al., 1987; TASK FORCE, 1996, TSUJI et al., 1996; ROWAN III et al., 2007). Nosso
grupo mostrou, em um estudo transversal em ratos, alterações no controle
autonômico cardíaco parassimpático após oito semanas de tratamento com
decanoato de nandrolona (PEREIRA-JUNIOR et al., 2006). Assim, ao realizarmos
uma avaliação longitudinal da VFC, foi possível evidenciar que a disfunção
autonômica cardíaca pode ocorrer precocemente, sendo identificável a partir da 4ª
semana de tratamento com EAA, onde pode-se observar redução significativa do
componente espectral de alta freqüência (AF) e aumento da razão entre os
componentes de baixa e alta freqüência (BF/AF) nos animais tratados com
decanoato de nandrolona, tanto sedentários (DS) quanto treinados (DT). Estes
resultados foram confirmados após a 8ª semana de tratamento, tal como mostrado
previamente por nosso grupo (PEREIRA-JUNIOR et al., 2006). A análise da VFC no
domínio do tempo também evidenciou disfunção autonômica, pois os parâmetros
SDNN, RMSSD e pNN5 estavam reduzidos nos animais tratados com EAA,
ratificando a disfunção autonômica já evidenciada pela análise espectral nesse
estudo e em estudo prévio de Pereira-Junior e cols. (2006). Um estado de
hiperresponsividade às catecolaminas, associado a um possível mecanismo central
de aumento do tônus simpático têm sido descrito em animais tratados com esteróide
anabólico (MCNUTT et al., 1988; KENNEDY & LAWRENCE, 1993).
Alterações na modulação autonômica do coração podem desenvolver-se em
conseqüência do remodelamento cardíaco (GRASSI et al., 1988). No entanto, em
seu estudo Andrade e cols. (2008) não mostraram alterações de controle
cardiopulmonar (Reflexo de Bezold-Jarisch) após 4 semanas de tratamento com
nandrolona, resultado corroborado pelo mesmo grupo após 8 semanas de
tratamento (BISSOLI et al., 2009). À luz desses resultados, podemos sugerir que a
disfunção autonômica parassimpática mostrada no presente estudo pode ser
resultado de anormalidades centrais no controle autonômico cardiovascular ao invés
de alterações nas atividades de receptores cardíacos. O treinamento físico não
impede os efeitos deletérios sobre o sistema autonômico desencadeados pelo
esteróide anabólico.
O desvio no balanço autonômico, descrito em diferentes condições
patológicas como infarto do miocárdio, hipertensão e estresse (LOMBARDI et al.,
1987; COHEN et al., 2000) e o efeito arritmogênico da atividade simpática no
coração, decorrente da redução no período refratário absoluto (MARTINS & ZIPES,
1980) estão intimamente associados à ocorrência de arritmias ventriculares e morte
súbita cardíaca (ESLER, 1992). Lombardi e cols. (2000) mostraram aumento de
BF/AF previamente à ocorrência de taquicardias ventriculares, com detecção de
aumento de ativação simpática nos pacientes. Neste contexto, a avaliação do curso
temporal da VFC, nos permitiu identificar manifestações precoces dos efeitos
fisiopatológicos do EAA.
A dispersão do intervalo QT (QTd) é um marcador de heterogeneidade
espacial da repolarização ventricular (SYLVEN et al., 1984; MIRVIS 1985;
BEAUBIEN et al., 2002; CARDOSO et al., 2003) e substrato de arritmias
ventriculares (TOMASSONI et al., 1998; JAIN & AVASTHI, 2004). A QTd tem sido
utilizada como preditor de morte súbita em diferentes patologias, tais como doença
coronária e taquicardia ventricular não sustentada (BOGUN et al., 1996;
ANASTASIOU-NANA et al., 2000), em pacientes com intervalo QT longo (DAY et al.,
1990), na cardiomiopatia hipertrófica (BUJA et al., 1993), na insuficiência cardíaca
(BARR et al., 1994; Yi et al., 1998b), e em pacientes sob terapia de ressincronização
ventricular (CHALIL et al., 2006), entre outras. Em nosso estudo, o aumento da QTd
nos animais tratados com decanoato de nandrolona pode ser um indicativo de maior
susceptibilidade arritmogênica, entretanto, não foi possível observar arritmias
cardíacas e morte súbita nesses animais, durante o período estudado. Stolt e cols.
(1999) observaram aumento na QTd em atletas de endurance e halterofilistas
usuários de EAA, o que ratifica nossos resultados em animais. Estes resultados
corroboram a proposta de uso da QTd como ferramenta não-invasiva na
estratificação de condições cardíacas patológicas em atletas (ZOGHI et al., 2002).
Em nosso estudo observamos retardo na repolarização ventricular, refletida
no aumento significativo do intervalo QT e do intervalo QT corrigido (QTc) a partir da
3ª/4ª semana de tratamento dos animais com decanoato de nandrolona. Phillis e
cols. (2000) também observaram aumento do intervalo QT em ratos tratados com
decanoato de nandrolona, entretanto, esse resultado foi obtido na presença de
cocaína. Aumento do intervalo QT, sem aumento da QTd, foi observado em atletas
de resistência com hipertrofia cardíaca fisiológica (STOLT et al., 1999). No entanto,
em contraste com nossos resultados, esses mesmos autores relataram intervalo QT
mais curto associado com o aumento da QTd em um grupo de atletas usuários de
EAA (STOLT et al., 1999). Esta discrepância de resultados poderia ser devida a um
maior nível sérico de testosterona induzindo encurtamento do intervalo QT nos
atletas usuários de EAA, pois já foi mostrada uma associação entre maior nível de
testosterona sérica e menor duração do potencial de ação e menor susceptibilidade
a arritmias induzidas por dofetilide (PHAM et al., 2001). Contudo, nesse contexto, o
treinamento físico impede o retardo na repolarização ventricular desencadeado pela
administração crônica de nandrolona.
Mostramos também que o aumento no tempo de repolarização nos animais
tratados com esteróide anabólico foi evidenciado pelo aumento na duração do
potencial de ação. O prolongamento do potencial de ação e a diminuição da corrente
I
to
, associados à hipertrofia cardíaca têm sido mostrados em diferentes modelos
animais de doenças cardiovasculares, como: hipertensão arterial sistêmica (CERBAI
et al., 1994); diabetes (SHIMONI et al., 1994); infarto (KAPRIELIAN et al., 1999),
entre outros. Neste contexto, um achado importante foi a evidência de menor
densidade da corrente de K
+
transitória de efluxo (I
to
) contribuindo para o
prolongamento do intervalo QT e do potencial de ação do ventrículo esquerdo dos
animais tratados com EAA. A corrente I
to
é uma das principais correntes
repolarizantes em cardiomiócitos ventriculares de ratos (CLARK et al., 1993) e os
genes que codificam os canais de I
to
predominantemente expressos nos ventrículos
de ratos são Kv1.4, Kv4.2 e Kv4.3 (DIXON & MCKINNON, 1994; CASIS et al., 1998;
WICKENDEN et al., 1999, PATEL & CAMPBELL, 2005). Alterações na expressão
gênica dessas isoformas estão associadas a mudanças na densidade, dependência
de voltagem ou cinética da corrente I
to
, afetando significativamente a duração do
potencial de ação e refletindo no prolongamento do intervalo QT (TAKIMOTO et al.,
1997; KAPRIELIAN et al., 1999; NISHIYAMA et al., 2001; QIN et al., 2001; GOLTZ et
al., 2007). Em nosso estudo observamos redução na densidade de I
to
juntamente
com diminuição na expressão gênica das subunidades α Kv1.4 e Kv4.3 e da
subunidade β KChIP2 no ventrículo esquerdo do ratos sedentários tratados com
decanoato de nandrolona (DS). Corroborando com estes achados, as durações do
potencial de ação e do intervalo QTc foram significativamente maiores neste grupo
comparado ao grupo controle (CS). Semelhante aos nossos resultados, outros
estudos usando o rato como modelo de doença encontraram também
prolongamento do potencial de ação, redução de I
to
e “down-regulation” de Kv4.3
nos cardiomiócitos ventriculares de ratos hipertensos (GOLTZ et al., 2007;
TAKIMOTO et al., 1997; CAPUANO et al., 2002), diabéticos (NISHIYAMA et al.,
2001), infartados (KAPRIELIAN et al., 1999), entre outros. Porém, em contraste com
nossos resultados, esses estudos mostraram “down-regulation de Kv4.2 e “up-
regulation” de Kv1.4, ao passo que observamos redução da expressão de RNAm de
Kv1.4 e aumento nessa expressão para Kv4.2 em alguns animais, embora na média
o grupo DS não tenha apresentado diferença significativa no nível de expressão do
Kv4.2, comparado ao grupo CS. A diminuição na expressão de RNAm de Kv4.3 é
consistente com a redução da mesma para KChIP2, dado que esta subunidade β é
importante para o tráfico de Kv4.3 para o sarcolema (KUO et al., 2001).
Por outro lado, não foi observada nenhuma mudança significativa no nível de
expressão de RNAm das subunidades Kv1.4, Kv4.2, Kv4.3 e KChIP2 no ventrículo
direito dos ratos tratados com EAA. Estes dados estão de acordo com os resultados
do estudo eletrofisiológico, no qual não foi observado mudança na densidade e
dependência de voltagem de I
to
. Porém diverge em relação à observação do
aumento da constante temporal de inativação de I
to
nos cardiomiócitos do ventrículo
direito.
Embora não tenhamos observado arritmias e morte súbita em nosso modelo
de abuso de EAA, o remodelamento elétrico e histológico, junto ao desbalanço
autonômico observados neste estudo, sugerem que o tratamento com EAA cria
substrato para a gênese de distúrbios elétricos. A expressão de Kv1.4, Kv4.2, e
Kv4.3 difere entre as diferentes regiões do coração (WICKENDEN et al., 1999). Ao
passo que Kv4.3 tem uma distribuição homogênea, Kv4.2 é mais expressivo no
epicárdio do que no endocárdio da parede ventricular de ratos (CASIS et al., 1998;
WICKENDEN et al., 1999). Assim, a redução da expressão de RNAm de Kv4.3 e a
não alteração ou aumento da expressão de Kv4.2 aumentaria a heterogeneidade
elétrica entre as regiões endo e epicárdica, aumentando a dispersão de
repolarização e criando um substrato de instabilidade elétrica, que favorece a
arritmogênese e morte súbita cardíaca.
5. CONCLUSÕES
1. O aumento do peso do coração, conjuntamente com a redução do número
de núcleos e maior diâmetro dos núcleos dos cardiomiócitos do grupo tratado com
decanoato de nandrolona podem caracterizar hipertrofia cardíaca nesses animais.
2. O tratamento crônico com decanoato de nandrolona resultou em disfunção
cardíaca autonômica, representada pelo desvio do balanço simpato-vagal, com
redução na atividade vagal, identificada na 4ª semana de tratamento. Nesse
contexto o treinamento físico não recupera os efeitos gerados pelo esteróide. Essa
disfunção cardíaca autonômica parece se manifestar de forma precoce e pode estar
relacionada ao aumento da suscetibilidade à ocorrência de arritmias ventriculares e
morte súbita cardíaca.
3. Alterações na repolarização ventricular, evidenciadas pelo aumento do
intervalo QT e da QTd, assim como pelo aumento da duração do potencial de ação,
também são desencadeadas pelo tratamento crônico com esteróide anabólico. O
treinamento físico impede o prolongamento da repolarização ventricular.
4. As mudanças na repolarização ventricular podem ser explicadas, ao menos
em parte, pela redução na densidade da corrente I
to
em conseqüência da diminuição
da expressão das subunidades Kv1.4, Kv4.3 e KChIP2 nos animais tratados com
esteróide anabólico.
5. O remodelamento elétrico cardíaco induzido pelo decanoato de nandrolona
pode contribuir substancialmente para a gênese de arritmias e morte súbita
cardíaca, ao passo que o treinamento físico inibe alterações da repolarização
ventricular, mas não a disfunção autonômica dos animais.
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APÊNDICE A
Artigo publicado nos Anais da Academia Brasileira de Ciências (2010),
validando metodologia não-invasiva para registro do ECG em ratos.
APÊNDICE B
Artigo publicado no Journal of Molecular and Cellular Cardiology (2010).
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