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LONDRINA
2010
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPTO. DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
PROGRAMA DE MESTRADO E DOUTORADO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
AGNES IZUMI NAGASHIMA
“DESENVOLVIMENTO DE PRODUTOS EFERVESCENTES
ADICIONADOS DOS PROBIÓTICOS Lactobacillus acidophilus E
Saccharomyces boulardii”
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AGNES IZUMI NAGASHIMA
“Desenvolvimento de produtos efervescentes adicionados dos probióticos
Lactobacillus acidophilus e Saccharomyces boulardii”
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-graduação em
Ciência de Alimentos da
Universidade Estadual de
Londrina como requisito
necessário à obtenção do título de
Mestre em Ciência de Alimentos
Prof. Dr. Raúl Jorge Hérnan Castro Gómez
ORIENTADOR
LONDRINA
2010
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AGNES IZUMI NAGASHIMA
“Desenvolvimento de produtos efervescentes adicionados dos probióticos
Lactobacillus acidophilus e Saccharomyces boulardii”
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Prof. Dr. Raúl Jorge Hérnan Castro Gómez (orientador)
Universidade Estadual de Londrina (UEL)
____________________________________________
Profa. Dra. Claudia Dorta
Faculdade de Tecnologia (FATEC- Marília-SP)
____________________________________________
Profa. Dra. Marcela Maria Baracat
Universidade Estadual de Londrina (UEL)
Londrina, 03 de setembro de 2010.
A Deus, meu guia e protetor;
Aos meus pais, Getúlio e Michiko, pela vida, amor, dedicação e incentivo;
À minha irmã, Luciene, pelo amor, compreensão e apoio.
DEDICO.
“Assim, depois de muito esperar, um dia como qualquer outro decidi triunfar.
Decidi não ficar à espera das oportunidades e fui procurá-las.
Decidi ver cada problema como a oportunidade de encontrar uma solução.
Decidi ver cada deserto como a oportunidade de encontrar um oásis.
Decidi ver cada noite como um mistério a resolver.
Decidi ver cada dia como a oportunidade de ser Feliz.
Naquele dia descobri que o meu único rival eram apenas as minhas debilidades e
que estas são a única e melhor forma de me superar.
Naquele dia deixei de ter medo de perder e comecei a ter medo de não ganhar.
Descobri que não era o melhor e que talvez nunca o tenha sido.
Deixou de me importar quem ganhara ou quem perdera.
Agora simplesmente me importa ser melhor que ontem.
Aprendi que o difícil não é chegar ao topo, mas sim nunca deixar de subir.
Aprendi que o maior sucesso que posso alcançar é o ter direito de chamar a
alguém de "amigo".
Descobri que o amor é mais do que uma simples paixão.
O amor é uma filosofia de vida.
Naquele dia deixei de ser o reflexo dos meus poucos sucessos alcançados e
comecei a ser a minha própria luz do meu presente.
Aprendi de que nada serve ser luz se não for para iluminar também o caminho da
Humanidade.
Naquele dia decidi mudar tanta coisa.
Aprendi que os sonhos são apenas para transformar em realidade e desde esse
dia que não durmo para descansar.
Agora apenas durmo para sonhar.”
(Walt Disney
)
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela minha vida, por Ele sempre me proteger, me guiar e me iluminar em
todos os passos da minha vida, por Ele ser tão presente;
Ao Prof. Dr. Raúl Jorge Hérnan Castro Gómez pela orientação, ensinamentos,
paciência e incentivos durante todo desenvolvimento do trabalho. Por ele ser esse
orientador que eu tanto admiro – como orientador, professor e pessoa, muito
especial na minha vida;
À Universidade Estadual de Londrina (UEL) pela oportunidade de realizar meu
mestrado e pela infra-estrutura disponibilizada e ao Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro;
À minha família, meu tudo na vida, pelo amor eterno e incondicional. Pelo carinho e
pela preocupação; pelo colo e pelas broncas; pela educação e pela disciplina; pelos
princípios morais, pelas alegrias, pela compreensão; por sempre estar ao meu lado,
por sempre me apoiar, me guardar, me ensinar, não importa o esforço e o sacrifício
pela minha felicidade. Porque sem vocês eu nada seria. Pai, Mãe e minha Irmã: eu
amo vocês para sempre;
A Profa. Dra. Marcela Maria Baracat pelo apoio e ensinamento na área de produção
de comprimidos;
À Profa. Dra. Claudia Dorta pelos ensinamentos e confiança que tanto contribuíram
para minha formação profissional;
Ao Paulo Eduardo Pansiera, pela colaboração no desenvolvimento do trabalho,
convívio e amizade, que foi muito importante e a Giselle Aparecida Nobre Costa pela
cooperação e amizade durante o desenvolvimento deste trabalho;
Aos funcionários Ciro Alves e Irandi Luvizeto, do LPM, pela ajuda na produção e
testes dos comprimidos e ao Nilson de Jesus Carlos e Jurandir Pereira Pinto, pela
ajuda na liofilização dos microrganismos;
À Profa. Dra. Sandra Garcia e à Profa. Dra. Lucia Helena Miglioranza pela
participação na minha banca de qualificação, pelas correções e sugestões que
foram muito úteis;
Aos docentes e funcionários do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos
pelos ensinamentos e auxílio;
Aos meus parentes, em especial minhas avós Mitico e Tomoko, tios e primos, em
especial a tia Lucila, tia Miyuki, tio Hélio e tio Shinji, que me apoiaram desde o
começo e sempre torceram por mim;
Às minhas queridas amigas Fernanda P. B. Darpossolo, Sandra Zago, Alessandra
Pereira e Giselle N. Onuki pela amizade verdadeira e compreensão;
Aos meus colegas do Programa de Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos,
em especial aos amigos Rafael Mizubuti Brito, Alessandra Tsuruda, Luiz Morioka,
Carol Calliari, Rodrigo A. L. Santos, Angélica Ishikawa, Thiago Montagner, Luiz
Gustavo A. Aristides, Henrique Rett, Isabella Lima, Eduardo Baptista, Cássia
Takabayashi, Breno Silveira, Elvis Martins, Flávia Montanuci, pela convivência e
amizade;
Ao Dr. Ademir Assis Henning, Antonio R. Melchiades e Vilma Stroka, pela
compreensão para realização deste trabalho;
Ao meu amado escritor José Roberto Torero, por sempre me dar força e estímulo,
seja direta ou indiretamente, quando preciso;
Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho e
para que essa etapa da minha vida pudesse ser concretizada.
NAGASHIMA, Agnes Izumi. Desenvolvimento de produtos efervescentes
adicionados dos probióticos Lactobacillus acidophilus e Saccharomyces
boulardii. 2010. 79 p. Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos) –
Universidade Estadual de Londrina, Londrina , 2010).
RESUMO
Probióticos são microrganismos vivos, que administrados em quantidades
adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro, sendo sua influência
benéfica sobre a microbiota intestinal humana, incluindo fatores como efeitos
antagônicos, competição e efeitos imunológicos. Assim, este trabalho apresentou
como objetivo desenvolver produtos efervescentes com os microrganismos
probióticos Lactobacillus acidophilus e Saccharomyces boulardii (comprimido, pó e
ingrediente), identificar a melhor formulação em função da viabilidade dos
microrganismos probióticos, além do cultivo e multiplicação dos mesmos e sua
desidratação. Também se analisou as propriedades físicas do comprimido (força de
compressão aplicada, peso médio, dureza e friabilidade) e se avaliou a viabilidade
dos microrganismos no processo de fabricação, no trato gastrointestinal e sua
estabilidade no armazenamento. O pó e o ingrediente probióticos efervescentes
mantiveram estabilidade e viabilidade durante o período de armazenamento. Já o
comprimido, além de exigir maior número de equipamentos e etapas de produção, o
efeito de compressão afetou a viabilidade dos microrganismos.
Palavras-chave: viabilidade, comprimido, desidratação, armazenamento.
NAGASHIMA, Agnes Izumi. Development of effervescent products added of
probiotics Lactobacillus acidophilus and Saccharomyces boulardii. 79 p. 2010.
Dissertation (Master‟s degree in Food Science – Londrina State University, Londrina-
PR, 2010).
ABSTRACT
Probiotics are live microorganisms, which administered in adequate amounts, confer
a health benefit on the host, and its beneficial effect on human intestinal microbiota,
including factors such as antagonism, competition and immunological effects.The
objective of this study was developing of effervescent products with the probiotics
Lactobacillus acidophilus and Saccharomyces boulardii (tablet, powder and an
ingredient), identify the best formulation based on the viability of probiotic
microorganisms, as well as growing and multiplying them and their dehydration. Also
was examined the physical properties of tablet (compressive force applied, average
weight, hardness and friability) and was evaluated the viability of microrganisms in
the manufacturing process, in gastrointestinal tract and its storage stability. The
effervescent, ingredient and powder, with probiotics, both maintained stability and
viability during the storage period. Already the tablet required more equipment and
production stages and the effect of compression affect the viability of
microorganisms.
Keywords: viability, tablet, dehydration, storage.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Mecanismos de ação de Saccharomyces boulardii em Clostridium
difficile, Vibrio cholerae e EPEC Escherichia coli enteropatogênica,
causadores de diarréia ............................................................................25
Figura 2 – Esquema de obtenção de L. acidophilus em pó .................................... 35
Figura 3 – Esquema de obtenção de S. boulardii em pó ........................................ 37
Figura 4 – Pó efervescente probiótico ......................................................................58
Figura 5 – Comprimido efervescente probiótico na compressora ............................59
ANEXO
Figura 6 – Placa com MRS ágar inoculado com Lactobacillus acidophilus incubado
a 37 °C (A) e placas de BDA (batata dextrose Agar) (B), BDA +
cloranfenicol (C), MEA (malt extract Agar) (D), MEA acidificadado (E)
Lactobacillus inoculados com L. acidophilus incubado a 25 °C...............77
Figura 7 – Placas com MRS agar inoculadas com Lactobacillus acidophilus
(A), Saccharomyces boulardii (B), L. acidophilus + S. boulardii (C)
e L. acidophilus + S. boulardii + 666 ppm de cetoconazol (D),
todos incubados a 37 °C..........................................................................78
Figura 8 – Placas com MRS ágar inoculada com Saccharomyces boulardii (A) e
com S. boulardii + cetoconazol 666 ppm (B), incubados a 37 °C...........79
Figura 9 – Placas com MRS agar inoculada com Lactobacillus acidophilus (A) e
com L. acidophilus + cetoconazol 666 ppm (B), incubados a 37 °C.......79
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Características de Lactobacillus acidophilus ………….……..……………22
Tabela 2 – Ingredientes e níveis utilizados no desenho experimental 2
(9-5)
............39
Tabela 3 – Desenho Experimental 2
(9-5)
: Formulações codificadas para avaliação
dos efeitos dos componentes (em g) sobre a viabilidade dos
microrganismos probióticos ................................................................... 40
Tabela 4 – Viabilidade de Lactobacillus acidophilus liofilizado, armazenados aos
zero, 15, 30, 45 e 60 dias, a 5 °C e 60 % de umidade relativa ..............47
Tabela 5 – Perda de viabilidade do Lactobacillus acidophilus durante
armazenamento a 5°C por um período de 60 dias ............................... 47
Tabela 6 – Viabilidade de Saccharomyces boulardii liofilizado, armazenados a 5 °C e
60 % de UR ............................................................................................ 47
Tabela 7 – Perda de viabilidade do Saccharomyces boulardii durante
armazenamento a 5°C durante 60 dias................................................... 48
Tabela 8 – Viabilidade de Lactobacillus acidophilus e Saccharomyces boulardii
desidratados em estufa a 40 °C, armazenados a 5 °C e 60 % de
umidade relativa .................................................................................... 48
Tabela 9 – Perda de viabilidade de Lactobacillus acidophilus e Saccharomyces
boulardii durante armazenamento a 5 °C durante 60 dias .......................49
Tabela 10 – Viabilidade de Lactobacillus acidophilus após 60 dias de
armazenamento a 5°C e 60% UR .........................................................50
Tabela 11 – Viabilidade de Saccharomyces boulardii após 60 dias de
armazenamento a 5 °C e 60 % UR.......................................................51
Tabela 12 – Efeito dos ingredientes(em g) utilizados na formulação do comprimido e
do pó na viabilidade dos microrganismos probióticos (UFC).................54
Tabela 13 – Efeitos dos ingredientes da formulação no crescimento da
Saccharomyces boulardii .....................................................................55
Tabela 14 – Efeitos dos ingredientes da formulação no crescimento do Lactobacillus
acidophilus ..............................................................................................56
Tabela 15 – Formulação do pó efervescente probiótico (produzidos por
liofilização em solução 10 % de leite desnatado ..................................57
Tabela 16 – Formulação laboratorial do comprimido efervescente probiótico
(produzidos por liofilização em solução 10 % leite desnatado) ............58
Tabela 17 – Formulação Industrial do comprimido efervescente probiótico
(produzidos por desidratação em estufa na presença de
amido de milho) ....................................................................................60
Tabela 18 – Viabilidade de L. acidophilus e S. boulardii no pó efervescente
probiótico, produzidos por liofilização com leite desnatado a 10 % em
condições de laboratório e armazenados aos zero, 15, 30, 45 e 60 dias
a 25 °C .................................................................................................61
Tabela 19 – Viabilidade de L. acidophilus e S. boulardii no comprimido
efervescente probiótico (produzidos por liofilização com leite
desnatado 10 % ) e armazenados a 25°C durante 60 dias ................61
Tabela 20 – Viabilidade de L. acidophilus e S. boulardii comerciais do pó
efervescente probiótico, armazenados a 25 °C durante 60
dias .......................................................................................................61
Tabela 21 – Peso médio em gramas e dureza média em Newton (N) de 10
comprimidos efervescente probiótico ...................................................62
Tabela 22 – Caracterização Física para o Comprimido Efervescente Probiótico ....63
Tabela 23 – Efeito da força de compressão na viabilidade dos probióticos.............64
Tabela 24 – Viabilidade de L. acidophilus e S. boulardii, aos zero, 30, 60, 90 e 120
min de contato com suco gástrico artificial............................................66
Tabela 25 – Viabilidade de L. acidophilus e S. boulardii durante 150 min de contato
com suco intestinal artificial ..................................................................66
Tabela 26 – Estabilidade de L. acidophilus e S. boulardii em refresco comercial
durante 48 h .........................................................................................68
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 14
2. JUSTIFICATIVA .......................................................................................................... 16
3. OBJETIVOS ................................................................................................................................ 17
3.1. OBJETIVO GERAL .......................................................................................................... ..17
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. ..17
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................................... 18
4.1. PROBIÓTICOS................................................................................................................................18
4.2. BACTÉRIAS LÁCTICAS ............................................................................................. .........20
4.2.1. Lactobacillus acidophilus ......................................................................................................21
4.3. LEVEDURAS .................................................................................................................. .23
4.3.1. Saccharomyces boulardii...................................................................................................... 24
4.4. VIABILIDADE DE MICRORGANISMOS ............................................................................................26
4.5. DESENVOLVIMENTO DE PRODUTOS PROBIÓTICOS ....................................................................26
4.6. COMPRIMIDOS ..............................................................................................................................27
4.7. EXCIPIENTES ................................................................................................................................29
5. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................... ..32
5.1. INFRA- ESTRUTURA ............................................................................................... .....32
5.2. MICRORGANISMOS .................................................................................................................. 32
5.3. EXCIPIENTES .............................................................................................................. 32
5.4. PRODUÇÃO DE MICRORGANISMOS EM PÓ ..............................................................................33
5.4.1. Ativação, obtenção da biomassa e produção de L.acidophilus em pó...........................33
5.4.2. Ativação, obtenção da biomassa e produção de S. boulardii em pó...............................36
5.5. CONTAGEM DE BACTÉRIA LÁCTICA E LEVEDURA......................................................................38
5.6. DESENVOLVIMENTO DOS PRODUTOS PROBIÓTICOS EFERVESCENTES EM
PÓ..........................................................................................................................................................38
5.6.1. Comprimido e pó efervescentes probióticos.......................................................................39
5.6.1.1. Viabilidade dos microrganismos ...................................................................................... 41
5.6.1.2. Propriedades físicas dos comprimidos.............................................................................41
5.6.1.2.1. Peso médio .......................................................................................................................41
5.6.1.2.2. Dureza............................................................................................................................... 42
5.6.1.2.3. Friabilidade........................................................................................................................42
5.6.1.2.4. Desintegração ..................................................................................................................42
5.6.1.2.5. Estabilidade no armazenamento .................................................................................. 43
5.6.1.3. Efeito da força de compressão na viabilidade dos probióticos.................................... 43
5.6.1.4. Efeito do trato gastrointestinal na viabilidade dos probióticos.......................................43
5.7. DESENVOLVIMENTO DE INGREDIENTE EM PÓ EFERVESCENTE
PROBIÓTICO..........................................................................................................................................44
5.7.1. Estabilidade do ingrediente em pó efervescente probiótico ............................................44
5.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA ..............................................................................................................45
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................... 46
6.1. PRODUÇÃO E ESTABILIDADE DOS MICRORGANISMOS PROBIÓTICOS NO
ARMAZENAMENTO.................................................................................................................................46
6.2. DESENVOLVIMENTO DE PRODUTOS EFERVESCENTES PROBIÓTICOS.........................................53
6.2.1.Formulação do pó e comprimido efervescentes probióticos .............................................57
6.2.2.Viabilidade dos Microrganismos nos Produtos Efervescentes
Probióticos...........................................................................................................................................60
6.2.3.Propriedades Físicas dos Comprimidos ..............................................................................62
6.2.4. Efeito da força de compressão na viabilidade dos probióticos.........................................64
6.2.5. Efeito do trato gastrointestinal na viabilidade dos probióticos..........................................65
6.3. DESENVOLVIMENTO DE INGREDIENTE EFERVESCENTE PROBIÓTICO.........................................67
7. CONCLUSÕES ........................................................................................................................... 69
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 71
14
1. INTRODUÇÃO
Probióticos são produtos ou suplementos contendo microrganismos ou
componentes microbianos viáveis que, quando ingeridos, alteram a microbiota
presente e exercem efeitos benéficos à saúde. Podem influenciar a fisiologia
intestinal, direta ou indiretamente, por meio da modulação da microbiota endógena
ou o sistema imune intestinal. Entre os diversos gêneros que integram este grupo,
destacam-se Bifidobacterium, Saccharomyces e Lactobacillus, em particular, a
espécie Lactobacillus acidophilus.
Lactobacillus acidophilus é uma bactéria láctica amplamente utilizada
por ser reconhecido seu efeito probiótico, sendo seguro, e apresenta efeito
antagônico contra patógenos, tolerância a ácido e sais biliares e aderência ao
epitélio intestinal, prevenção de diarréia associada a antibióticos e produção de
substâncias antimicrobianas.
Saccharomyces boulardii é uma levedura probiótica importante para
prevenção ou tratamento de distúrbios gastrointestinais, com efeitos
farmacodinâmicos semelhantes aos efeitos protetores da microbiota intestinal
normal. Libera substâncias que inibem certas toxinas bacterianas e seus efeitos
patogênicos são imunoestimulantes e antiinflamatórios na mucosa intestinal.
A viabilidade de probióticos na matriz de alimentos depende de muitos
fatores, tais como pH, temperatura da estocagem e presença de microrganismos
competidores e inibidores.
Após a sua ingestão, os microrganismos probióticos devem ser
capazes de sobreviverem às condições de estresse presentes no trato
gastrointestinal, como suco gástrico, presença de sais biliares e enzimas digestivas
e manter sua viabilidade e atividade metabólica no intestino para exercerem os
efeitos benéficos aos hospedeiros.
Em relação aos desafios tecnológicos, quanto à produção industrial e
armazenamento, os microrganismos devem manter-se estáveis e viáveis em níveis
satisfatórios durante todo o prazo de validade do produto. No entanto, durante a
secagem, como no caso da liofilização, ocorre perda em sua viabilidade, sendo
muitas vezes necessária a utilização de protetores nesse processo.
15
A maioria dos produtos probióticos apresenta-se disponível na forma
líquida ou semisólida, e principalmente como produtos lácteos – leites fermentados,
queijos e iogurtes. A aplicação de culturas probióticas em produtos que não são
derivados do leite representa inovação. Outros produtos oferecem potencial para a
administração de culturas probióticas, como produtos a base de soja, sorvete,
produtos nutritivos em pó, cápsulas e comprimidos. Estes têm vantagens por
apresentar dosagens exatas, facilidade de administração, boa aceitação junto ao
consumidor e aptidão para a produção em grande escala.
16
2. JUSTIFICATIVA
A estabilidade das células probióticas quanto a sua viabilidade é um
dos mais importantes fatores para obter melhor eficiência para proteção das células
ao longo do tempo de validade de um produto.
A combinação de probióticos com diferentes mecanismos de ação é
interessante para a ampliar a proteção da preparação bioterapêutica.
A maioria dos produtos probióticos disponíveis no mercado é composto
por produtos lácteos. Mais estudos devem ser realizados a fim de se obter maior
variedade de produtos que apresentem capacidade probiótica, com manutenção de
sua viabilidade após processo de produção e sua ingestão.
Assim, pesquisas relacionadas à inovação tecnológica são válidas, e o
presente trabalho, uma tentativa de colocar à disposição no mercado opções de
produto probiótico efervescente de consumo diário sem restrição que poderá ser
adicionado a qualquer produto líquido, conferindo-lhe sabor agradável, além de
promover a ingestão, com benefícios na saúde do consumidor.
17
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Desenvolver produtos probióticos efervescentes com Lactobacillus acidophilus e
Saccharomyces boulardii.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar a viabilidade de L. acidophilus e S. boulardii após sua
desidratação e produção de um pó utilizando liofilizador ou estufa;
Verificar a viabilidade dos probióticos durante armazenamento de dois
meses a 5 °C;
Testar a influência dos excipientes na viabilidade dos microrganismos em
estudo;
Determinar parâmetros físicos (peso, dureza, tempo de desintegração e
friabilidade) do comprimido probiótico efervescente;
Avaliar a influência da força de compressão na produção dos
comprimidos na viabilidade da bactéria láctica e levedura;
Observar a viabilidade dos microrganismos após armazenamento do pó e
dos comprimidos por dois meses a 25 °C;
Testar sobrevivência dos microrganismos no pó em condições
gastrointestinais simuladas.
18
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1. PROBIÓTICOS
O termo „probiótico‟, de origem grega, significa „para a vida‟, e tem sido
utilizado das maneiras mais diversas ao longo dos últimos anos. Uma definição de
probiótico muito utilizada e completa é a proposta por Havenaar e Huis in‟t Veld
(1992): “os agentes probióticos são definidos como microrganismos viáveis (o que
inclui bactérias lácticas e leveduras na forma de células liofilizadas ou de produto
fermentado) que exibem um efeito benéfico sobre a saúde do hospedeiro após
ingestão, devido à melhoria das propriedades da microbiota endógena”.
Baseada nessa definição, Schrezenmeir e de Vrese (2001)
propuseram a seguinte definição para probiótico: “preparação de ou produto
contendo microrganismos viáveis definidos, em número suficiente, que alteram a
microflora (por implantação ou colonização) em um compartimento do hospedeiro e
exerce efeitos benéficos a sua saúde”. Entretanto, a definição atualmente aceita
internacionalmente é que são microrganismos vivos, administrados em quantidades
adequadas, que conferem benefícios à saúde do hospedeiro (Food and Agriculture
Organization of United Nations; World Health Organization, 2001).
O consumo regular de microrganismos probióticos viáveis pode ser
eficaz na melhoria da tolerância à lactose, redução dos níveis de colesterol, controle
em infecções gastrointestinais causadas por vírus ou bactérias. Além disso, foi
relatado que a colonização de algumas cepas de probióticos pode reduzir a
severidade da diarréia aguda em crianças e diarréia em pacientes com câncer
ginecológico tratados com radioterapia pélvica (GIRALT et al., 2006; KLAYRAUNG
et al., 2009).
Bactérias e leveduras são os microrganismos mais comuns utilizados
como probióticos, mas diferem fundamentalmente nos mecanismos de ação,
metabolismo e resistência a antibióticos. Essencialmente, três gêneros de bactérias
19
e um de levedura são a base para a maioria das preparações: Bifidobacterium,
Escherichia, Lactobacillus e Saccharomyces. Quatro mecanismos são atribuídos aos
probióticos para explicar seu efeito protetor: imunomodulação do hospedeiro
(mecanismo atribuído tanto às bactérias lácticas como às leveduras), antagonismo
através da produção de substâncias inibidoras ou tóxicas aos patógenos e
competição com o patógeno por adesão aos sítios ou fontes nutricionais (atribuídos
às bactérias lácticas) e inibição da produção ou ação da toxina bacteriana (atribuído
à levedura) (FILHO-LIMA et al., 2000).
A grande vantagem da terapia com probióticos é a ausência de efeitos
secundários, como a seleção de bactérias resistentes. Os efeitos benéficos destes
microrganismos são basicamente os mesmos da microbiota normal do corpo
humano, utilização em grande quantidade daqueles que possuem eficácia
comprovada, podendo ser constituintes normais da microbiota, como bifidobactérias
e lactobacilos, ou não, como a levedura S. boulardii. (MARTINS, 2005).
Para que um probiótico possa expressar todas as suas
potencialidades benéficas quando ingerido, é necessário que ele chegue viável,
metabolicamente ativo e em quantidade suficiente no ecossistema em que se espera
que vá atuar. Contudo, para poder sobreviver por longo tempo durante o
armazenamento até sua ingestão, um probiótico deve ser conservado numa forma
onde seu metabolismo seja bastante reduzido ou até suspenso. Esse estado de
dormência deve ser revertido rapidamente quando o probiótico chegar no
ecossistema digestivo. Além de permitir a manutenção da viabilidade por longo
período de tempo, a liofilização tem como outra vantagem a de impedir, pela baixa
atividade de água, toda possibilidade de contaminação posterior do produto.
(MARTINS et al., 2006).
Uma vez ingeridas, uma rápida e eficiente reativação das células
probióticas é necessária para que elas possam demonstrar os seus efeitos benéficos
ao longo da maior porção possível do trato digestivo, já que o local de atuação e/ou
invasão dos agentes patogênicos varia do intestino delgado (Salmonella) até o cólon
(Shigella). Diante dos fluxos que percorrem o trato digestivo, os probióticos se
comportam, portanto, como marcadores de trânsito e tem relativamente pouco
tempo para sua reativação e posterior atuação (MARTINS et al., 2006).
20
4.2. BACTÉRIAS LÁCTICAS
Bactérias lácticas são cocos ou bastonetes Gram-positivos, não
esporogênicos, fermentadores, produtores de ácido láctico como resultado final da
fermentação de carboidratos, catalase negativos e apresentam metabolismo e
características fisiológicas semelhantes. Os gêneros tradicionais são: Streptococcus,
Lactococcus, Enterococcus, Vagococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc
e Carnobacterium (AXELSSON, 1993; SCHLEIFER et al., 1995).
Muitas espécies de bactérias lácticas (Lactobacillus, Lactococcus,
Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc), utilizadas na produção de alimentos
fermentados, têm apresentado antagonismo a outras bactérias, incluindo as do
mesmo gênero e/ou patógenos (McMULLEN e STILES, 1996).
A capacidade de produzir grande quantidade de ácidos orgânicos
(fundamentalmente ácido láctico), por fermentarem os carboidratos presentes nos
alimentos e conseqüentemente reduzirem o pH, é o fator primário em que se baseia
a atividade antimicrobiana das bactérias lácticas (MAGRO et al., 2000). Além disso,
as bactérias lácticas têm capacidade de produzir outras substâncias inibitórias, tais
como: peróxido de hidrogênio, diacetil, metabólitos de oxigênio,entre outras (PIARD
E DESMAZEAUD, 1991).
Além de inibir o crescimento de patógenos nos alimentos fermentados,
acredita-se que as bactérias lácticas proporcionem efeitos benéficos à saúde. As
bactérias do ácido lático são as principais representantes dos probióticos em
alimentos e produtos farmacêuticos. Muitos alimentos, incluindo leite não
fermentado, leite fermentado, iogurte, culturas secas, bebidas e doces contendo
culturas vivas de bactérias lácticas promotoras de benefícios à saúde são
denominados probióticos (RICHARDSON, 1996).
Bactérias lácticas inibem o desenvolvimento de diversos
microrganismos indesejáveis e patogênicos nos alimentos e, assim, além de lhes
conferir características sensoriais desejáveis, estendem a vida útil e podem oferecer
efeito benéfico. Essa ação se atribui aos metabólitos desses microrganismos
21
(ácidos orgânicos, H
2
O
2
etc.) e às substâncias produzidas como antibióticos e
bacteriocinas. Estas são, em geral, pequenas proteínas catiônicas, heterogêneas e
hidrofóbicas, que apresentam de 20 a 60 resíduos de aminoácidos, ponto isoelétrico
elevado, características anfipáticas; variam consideravelmente quanto ao
microrganismo produtor, ao espectro de ação, ao peso molecular e às suas
propriedades bioquímicas. Nesse sentido, vários estudos têm indicado que as
bacteriocinas são uma das principais substâncias responsáveis pela ação
antimicrobiana mediada pelas bactérias lácticas (SANTOS, 1993; VERHEUL et al.,
1997).
As bactérias lácticas têm grande importância econômica, já que de
forma natural ou adicionada intencionalmente, desempenham importante papel na
fermentação de grande variedade de alimentos. Assim, a utilização de bactérias
lácticas na elaboração de alimentos tem crescido nos últimos tempos. Atualmente,
são conhecidos alguns dos efeitos que a fermentação exerce sobre a conservação
de produtos e, por isso, é importante conhecer, dirigir e melhorar esses processos,
visando à obtenção de produtos de melhor qualidade. As bactérias lácticas são
capazes de converter açúcares, ácidos orgânicos, proteínas ou gorduras em
componentes de aroma e sabor e também podem contribuir para melhorar a textura
e a viscosidade de produtos fermentados por meio da síntese de exopolissacarídeos
(RUAS-MADIEDO et al., 2002).
4.2.1. Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus acidophilus é uma bactéria láctica comum, em formato de
bastonete, que se encontra na forma de células livres, aos pares ou em cadeias
curtas, tamanho típico de 0.6-0.9 µm de largura e 1.5-6.0 µm de comprimento,
Gram- positiva, catalase negativa, pouco tolerante à salinidade do meio, anaeróbia a
microaerófila, com o crescimento em meios sólidos favorecido por anaerobiose ou
pressão reduzida de oxigênio e homofermentativa.
É uma das principais bactérias benéficas encontradas no intestino
humano e animal e na vagina, que se adere a parede intestinal, cobrindo o
22
revestimento do intestino, não deixando espaço para organismos prejudiciais,
prevenindo contra microrganismos patogênicos. Na tabela 1, podem-se observar
algumas características de L. acidophilus.
São bactérias fracas formadoras de ácidos e crescem em temperatura
entre 20 a 48 ºC, sendo a temperatura ótima de crescimento a 37 ºC. É um
microrganismo probiótico que apresenta um conjunto significativo de apoio à
pesquisa, como modulação benéfica da atividade metabólica de bactérias intestinais,
prevenção de diarréia associada a antibióticos, preservação da integridade intestinal
durante radioterapia, estimulação da resposta imune sistêmica, aumento da
biodisponibilidade de ferro, redução bacteriana vaginal e produção de substâncias
antimicrobianas que atuam contra outras bactérias, vírus, protozoários e fungos
(CHALLEM, 1995 apud TENNEY, 1996; FRANCO, LANDGRAF e DESTRO, 1996;
GOMES e MALCATA, 2002; MOUNTZOURIS et al., 2009).
Na área farmacêutica, são formulados em comprimidos, sendo capazes
de proteger-se de condições desfavoráveis e fornecer substâncias ativas no trato
intestinal. Com excipientes adequados e boa compressão, pode-se a garantir alta
estabilidade de Lactobacillus acidophilus em suco gástrico artificial (STADLER e
VIERNSTEIN, 2003).
Tabela 1. Características de Lactobacillus acidophilus (adaptado de Gomes e
Malcata, 2002)
Lactobacillus acidophilus
Microaerófilo
Lys-D Asp
Glicerol
34-37
DL
Homofermentativo
23
4.3. LEVEDURAS
As leveduras são empregadas, com grande freqüência, na obtenção
de produtos de consumo diário, entre eles o pão e as bebidas alcoólicas,
destacando-se as fermentadas e aquelas posteriormente destiladas. Caracterizam-
se por apresentarem alta resistência às condições de ambiente, pH, presença de
sais e temperatura de até, aproximadamente 35 ºC, alta taxa de reprodução,
podendo se reproduzir sexuadamente, formando esporos, ou por reprodução
assexual, envolvendo brotamento, gemulação ou fissão binária (BLUMER, 2002).
Esses fungos apresentam diversas propriedades importantes como
não produção de esporos alergênicos ou micotoxinas como os bolores, ou
metabólicos antibióticos como os produzidos por antagonistas bacterianos. As
leveduras têm geralmente maior resistência às bruscas alterações ambientais
(gradientes de pH, alterações osmóticas, etc.) quando comparadas a bactérias
lácticas, assim como menor necessidade de nutrientes que resultem em reduções
de custos nos processos de produção. E podem colonizar superfícies secas por
longos períodos de tempo. Utilizam rapidamente nutrientes disponíveis, sendo
capazes de crescerem em várias fontes de carbono e de fornecer grande quantidade
de biomassa em tempo relativamente pequeno. Além disso, as células das
leveduras contêm quantidades elevadas de vitaminas, minerais e aminoácidos
essenciais e efeito benéfico quando adicionadas ao alimento (BAPTISTA, 2001).
Determinadas leveduras apresentam o fator “killer”, um peptídeo
tóxico liberado no meio de cultivo capaz de inibir o crescimento de outros
microrganismos sendo detectado em diversos gêneros como Saccharomyces spp.,
Candida spp., Cryptococcus spp., Debaryomyces spp., Hansenula spp.,
Kluyveromyces spp., Pichia spp., Torulopsis spp (PHILLISKIRK e YOUNG, 1975).
Todas as toxinas “killer” detectadas consistiram de proteínas
ácidas com ponto isoelétrico aproximado de pH 4,0, sendo a maioria com massa
molecular entre 10-20 kDa. (RADLER et al., 1993). Porém, pouco se conhece ainda
sobre o mecanismo de ação. Evidências indicaram atuação na membrana de células
sensíveis, reduzindo o pH intracelular e causando conseqüente extravasamento de
íons potássio e ATP, entre outros . O transporte de aminoácidos e a bomba de
prótons também foram inibidos sendo que todos os efeitos citados constituíram no
24
indicativo de aumento na permeabilidade do próton em células sensíveis (DE LA
PEÑA et al., 1981; SKIPPER e BUSSEY, 1977). Muitas toxinas de leveduras são
glicoproteínas formadoras de prótons capazes de originar canais iônicos
(MARTINAC et al., 1990), resultando em desestabilização do potencial eletroquímico
da membrana e eventual morte celular.
4.3.1. Saccharomyces boulardii
Saccharomyces boulardii é uma levedura natural e foi isolada da
casca da lichia em meados de 1920, na Indochina, pelo microbiologista francês
Henri Boulardi. A partir de estudos taxonômicos e baseado em diferentes métodos
de tipagem molecular, Saccharomyces boulardii apresentou características
fisiológicas, bioquímicas e macro e micromorfológicas típicas de Saccharomyces
cerevisiae, além de sequências do domínio D1/D2 do 26S rDNA idênticos, podendo
ser considerado como membro de Saccharomyces cerevisiae (VAN DER AA KÜLE
e JESPERSEN, 2003).
Esse microrganismo é utilizado para tratar ou prevenir várias
enfermidades gastrointestinais, existindo evidência sobre sua função na prevenção
da diarréia associada ao uso de antibiótico em pacientes de alto risco e tratamento
de infecções intestinais recorrentes causadas por Clostridium difficile. Produz efeitos
farmacodinâmicos semelhantes aos efeitos protetores da microbiota intestinal
normal(BUTS, 2005).
Seu mecanismo de ação está parcialmente esclarecido: liberação in
vivo de substâncias que inibem certas toxinas bacterianas e seus efeitos
patogênicos, tróficos, antisecretores, imunoestimulantes e antiinflamatórios na
mucosa intestinal. Ao ser administrado regularmente por via oral, não se instala no
trato gastrointestinal, mantendo sua forma viável em um nível estável de
concentração a partir do terceiro dia de administração, desaparecendo das fezes
48 h depois de interromper a terapia (BUTS, 2005).
25
Na figura 1 estão representados alguns dos mecanismos de ação da
levedura Saccharomyces boulardii contra microrganismo patógenos causadores de
diarréia, Clostridium difficile, Vibrio cholerae e EPEC Escherichia coli
enteropatogênica. O S. boulardii produz protease que inibe as toxinas A e B do
Clostridium difficile e auxilia no aumento da imunoglobulia A antitoxina A. Além
disso, a levedura inibe a toxina colérica produzida por Vibrio cholerae inibindo a
adenilato ciclase. Também, a S. boulardii pode inibir a fosforilação protéica ativada
pela EPEC (GOULET, 2009).
Figura 1. Mecanismos de ação de Saccharomyces boulardii em Clostridium difficile,
Vibrio cholerae e EPEC Escherichia coli enteropatogênica, causadores de
diarréia (GOULET, 2009 modificado)
26
4.4. VIABILIDADE DE MICRORGANISMOS
Segundo Kailasapathy e Rybka (1997) e Hamilton-Miller, et al.(1999),
as culturas probióticas podem não sobreviver em número suficientemente alto
quando submetidas a determinadas condições, como por exemplo, o
armazenamento em baixas temperaturas e a passagem pelo trato gastrointestinal
humano. São considerados alimentos probióticos aqueles que contenham pelo
menos 10
6
UFC (unidades formadoras de colônia) de células viáveis/g ou mL de
produto, disponíveis todo o tempo de vida-útil.
Porém, vários fatores como acidificação do produto final, tipos de
ácidos produzidos, o teor de oxigênio presente durante o armazenamento, os
compostos antimicrobianos e a perda de nutrientes do leite podem reduzir sua
viabilidade e, conseqüentemente, prejudicar suas propriedades probióticas. Para se
tentar minimizar este tipo de problema pode-se citar o uso do probiótico liofilizado, a
utilização dos métodos de microencapsulação ou ainda da tecnologia da Engenharia
Genética, através do desenvolvimento de linhagens mais específicas a
determinadas condições (SHAH et al., 1995;SANDHOLM et al., 2002).
Além disso, é desejável quanto ao processamento de alimentos que as
cepas sejam apropriadas para a produção industrial em larga escala,devendo ser
resistentes nas condições de preparo, seja por liofilização, secagem por spray drying
ou estufa. Assim, a sobrevivência das bactérias probióticas no produto alimentício é
fundamental, necessitando alcançar populações suficientemente elevadas
(tipicamente acima de 10
6
UFC/mL ou g) para ser de importância fisiológica ao
consumidor (JELEN e LUTZ, 1998; SAAD, 2006).
4.5. DESENVOLVIMENTO DE PRODUTOS PROBIÓTICOS
O propósito da administração de produtos probióticos é resultar em
microbiota intestinal balanceada, a qual, por sua vez, terá um impacto favorável
sobre a saúde do consumidor. Uma seleção adequada de cepas deve ser conduzida
para o processamento de produtos alimentícios probióticos. Essa seleção visa
27
garantir a sobrevivência desses microrganismos à passagem pelo trato
gastrintestinal, após a manutenção de sua viabilidade no próprio produto-alvo,
durante a sua elaboração e o seu armazenamento, bem como conferir propriedades
tecnológicas adequadas a esse produto.
O veículo alimentício escolhido para a incorporação de cepas
probióticas deve ser cuidadosamente estudado para a seleção conveniente do par
cepa probiótica-veículo, particularmente nos produtos fermentados, para os quais a
multiplicação de probióticos pode resultar em características não peculiares ou
mesmo indesejáveis ao produto. A verificação da compatibilidade e adaptabilidade
entre as cepas selecionadas e os referidos veículos é fundamental. Esses pré-
requisitos representam desafios tecnológicos significativos, uma vez que muitas
bactérias probióticas são sensíveis à exposição a oxigênio, calor e ácidos. Diversos
produtos lácteos probióticos, principalmente fermentados, e alguns não-lácteos, vêm
sendo desenvolvidos (KOMATSU et al., 2008).
4.6. COMPRIMIDOS
Comprimidos são preparações farmacêuticas de consistência sólida,
forma variada, geralmente cilíndrica ou lenticular, obtidas agregando-se, por meio de
pressão, várias substâncias secas e podendo ou não encontrar-se envolvidos por
revestimentos especiais, tomando, nesse caso, a designação, de comprimidos
revestidos.
Possui relevância pelas inúmeras vantagens que apresenta – precisão
na dosagem; conservação geralmente ilimitada ou pelo menos muito melhor do que
a apresentada pelas soluções; rapidez na preparação; economia atendendo à
facilidade de produção e rendimento; boa apresentação e reduzido volume. Além
disso, apresenta múltiplas aplicações como finalidade terapêutica, analítica e
depuradora de águas (PRISTA et al., 2002).
A compressão direta é o processo de escolha da indústria farmacêutica
para produzir comprimidos. Para tal, é preciso submeter o produto,
28
convenientemente preparado, a uma pressão exercida entre dois punções no interior
de uma câmara de compressão ou matriz, cujo fundo é constituído pelo punção
inferior. Simplicidade, redução de custos, rapidez, maior rendimento, não exposição
do fármaco ao calor e aos solventes são vantagens oferecidas na produção de
sólidos orais. Porém, o processo requer a utilização de excipientes com
características específicas de compatibilidade físico-química, compactabilidade,
fluidez, lubricidade e habilidade de proporcionar misturas uniformes (PRISTA et al.,
2002; TOLLER e SCHMIDT, 2005).
Além da compressão direta, existem outras técnicas como granulação
por via úmida e granulação a seco, cada um com suas próprias características,
sendo a compressão direta o processamento mais rápido e prático. Al-Mohizea et al.
(2007) estudaram a produção de um comprimido de leveduras, utilizando a
compressão direta e granulação a seco, em comparação a granulação úmida.
Verificaram que a compressão direta foi a melhor técnica na produção desse
comprimido, quanto as propriedades físicas testadas, principalmente quanto ao
tempo de desintegração.
Embora simples em termos de processos unitários envolvidos, a
compressão direta é altamente influenciada pelas características de escoamento,
fluidez, compressibilidade e potencial de diluição dos adjuvantes farmacotécnicos
utilizados. Comprimidos são constituídos por princípios ativos e excipientes, dos
quais, nenhum possui todas as características físico-químicas apropriadas para o
desenvolvimento de um processo de compressão. Muitas formulações (70-80 %)
contêm excipientes em concentrações superiores as do ativo, consequentemente, os
excipientes devem contribuir, significativamente, para a funcionalidade e
processamento da formulação (NACHAEGARI e BANSAL, 2004).
Apesar dos comprimidos representarem uma forma farmacêutica
bastante estável, alguns comprimidos podem sofrer alterações, por influência de
fatores como: ar, umidade, escolha de excipientes e materiais de acondicionamento.
A oxidação, geralmente, é acompanhada pela alteração da cor dos comprimidos,
devido a reações de excipientes incompatíveis e, a solução deste problema, muitas
vezes se faz por adição de catalisadores negativos (antioxidante). Para evitar a
hidrólise, é comum o revestimento do granulado e quando há perda de constituintes
voláteis, recorre-se a utilização de absorventes e a secagem deve se proceder à
29
baixa temperatura e depois de prontos, acondicionados em lugar fresco e em
embalagens impermeáveis (BRANDÃO, 2001).
Em comprimidos efervescentes, a efervescência é promovida pela
libertação de gás (oxigênio ou anidrido carbônico) a partir de um peróxido ou a partir
da junção de um ácido, como o cítrico, tartárico, ascórbico, algínico, etc, com um
bicarbonato. Este último tipo de efervescência torna os comprimidos mais
agradáveis e melhora a absorção, dado que o gás carbônico estabiliza a mucosa
gástrica (PRISTA et al., 2002).
Klayraung et al. (2009) investigaram o efeito da sobrevivência de
Lactobacillus fermentum em comprimidos com relação a força de compressão,
utilizando excipientes formadores de matriz, como ftalato de hidroxipropil
metilcelulose (HPMCP) ou outros agentes de intumescimento. Observaram que a
proporção de excipientes formadores de matriz e a força de compressão afetam as
propriedades de comprimidos probióticos em termos de resistência à tração e
desintegração assim como a sobrevivência da bactéria. Comprimidos manufaturados
com alta força de compressão mostraram baixo tempo de desintegração e alta
viabilidade celular. A estabilidade ao armazenamento dos comprimidos foi
considerada boa quando estocados a 10 °C por seis meses.
4.7. EXCIPIENTES
Para se realizar a compressão da maioria das substâncias para obter
o comprimido, é necessária a presença de excipientes. Estes são substâncias
diferentes do princípio ativo, que tem por fim diluir o produto, aglutinar as suas
partículas, facilitar a desagregação do comprimido, evitar a aderência do pó às
punções e à matriz, podem auxiliar no processamento do sistema durante a
fabricação, proteger ou melhorar a estabilidade, biodisponibilidade ou aceitação,
ajudar na identificação do produto, melhorar qualquer outro atributo de segurança e
efetividade do princípio ativo durante armazenamento ou uso (MORETON, 1995;
PRISTA et al., 2002).
30
A origem dos excipientes pode ser animal – lactose, gelatina, ácido
esteárico; vegetal – amidos, açúcares, celulose; mineral – fosfato de cálcio e sílica e
sintética – polietilenoglicol, polisorbatos, povidona. Os excipientes existentes em
qualquer fórmula de comprimidos podem ser divididos essencialmente em dois
grandes grupos. Os excipientes tecnológicos compreendem os compostos que são
adicionados à substância ativa porque se pretende veiculá-la na forma de
comprimido e destinam-se a conferir ao produto a comprimir as características
adequadas de compressibilidade ou a facilitar a cedência do fármaco. A sua inclusão
é praticamente obrigatória em quase todas as fórmulas, como é o caso dos diluentes
(inertes, adicionados aos pós a comprimir com a finalidade de originarem
comprimidos de peso convenientes), lubrificantes (asseguram um completo
enchimento da matriz e evitam a aderência dos pós aos cunhos da máquina, durante
compressão), aglutinantes (asseguram compressibilidade) e desagregantes (para
acelerar a dissolução) (PIFFERI e RESTANI, 2002; PRISTA et al., 2002).
Os outros excipientes cuja adição é facultativa e que são adicionados
quer devido à natureza específica do fármaco ou para melhorar suas características
sensoriais, como os absorventes (adicionados com a finalidade de absorver água
dos extratos ou de fixar certos compostos voláteis), os molhantes (diminuem a
tensão interfacial pó e ar, favorecendo a dissolução) ou os tampões (mantém estável
o pH de uma fórmula), os aromatizantes (essências), edulcorantes (corrigir o gosto
de uma dada preparação) e corantes (torna o comprimido mais atrativo) (PRISTA et
al., 2002; AULTON,2005).
As características físico- químicas dos excipientes influenciam no
comportamento de compactação dos sistemas sólidos particulados, uma vez que
estes se apresentam, geralmente, em proporções maiores que o próprio fármaco, na
formulação do comprimido. Cury et al. (2008) avaliaram a influência do tamanho dos
granulados de celulose nas características físicas de comprimidos obtidos em
diferentes diâmetros de punção e observaram que a redução do tamanho dos
granulados levou à obtenção de compactos com resistência mecânica adequada e
rápida desintegração, além de permitir a produção dos comprimidos sem a utilização
de forças que representem o limite máximo do equipamento.
31
Os excipientes farmacêuticos podem ser responsáveis por inúmeras
Reações Adversas a Medicamentos (RAM). Entre as formulações farmacêuticas
mais consumidas no Brasil, principalmente as de uso pediátrico e de venda livre,
foram detectados como possíveis causadores de RAM: metilparabeno,
propilparabeno, corante amarelo tartrazina, bissulfito de sódio, benzoato de sódio,
lactose, cloreto de benzalcônio, sorbitol e álcool benzílico. Assim, além de ter que
garantir a dosagem, estabilidade e biodisponibilidade do princípio ativo, os
componentes utilizados como excipientes, devem apresentar caracteríticas com
função tecnológica, e ser seguro. Há necessidade de maior atenção por parte dos
profissionais de saúde, dos usuários de medicamentos e da avaliação pelos
sistemas de farmacovigilância, da presença de excipientes como possíveis indutores
de RAM (PIFFERI e RESTANI, 2003; SILVA et al., 2008).
32
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. INFRA- ESTRUTURA
O trabalho foi desenvolvido no laboratório de Microbiologia do
Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos (Centro de Ciências Agrárias) e
no Laboratório de Medicamentos da Universidade Estadual de Londrina.
5.2. MICRORGANISMOS
A bactéria láctica utilizada foi Lactobacillus acidophilus La-5 liofilizada,
cedida gentilmente pela Christian Hansen (Dinamarca).
Já a levedura foi Saccharomyces boulardii isolada a partir do produto
comercial Floratil
®
(Merck).
5.3. EXCIPIENTES
Foram utilizados para a formulação do comprimido efervescente
probiótico (excipientes grau farmacêutico):
- Ácido cítrico anidro;
- Ácido tartárico;
- Amarelo crepúsculo;
- Amido de milho;
- Aroma de laranja;
33
- Bicarbonato de sódio;
- Estearato de magnésio [CH
3
(CH
2
)
16
COO]
2
Mg;
- Polivinilpirrolidona (PVP);
- Sacarose;
- Stevia;
- Soro de leite;
- Talco [Mg
6
(Si
2
O
5
)
4
(OH)
4
]USP.
5.4. PRODUÇÃO DE MICRORGANISMOS EM PÓ
Para obtenção dos microrganismos probióticos em pó, utilizou-se a
desidratação por liofilização e por estufa com circulação de ar.
5.4.1. Ativação, obtenção da biomassa e produção de L. acidophilus em pó
A cultura mãe, de L. acidophilus liofilizada, foi reativada em 10 mL de
solução estéril (110 °C/5 min) de leite em pó desnatado (Molico) 10 % adicionado de
1% de sacarose, e incubada a 37 °C por 18-24 h (PEREIRA e GÓMEZ,2007).
Adicionou-se 90 mL de solução estéril de leite em pó desnatado 10 % à cultura
assim produzida. Após ser incubada nas mesmas condições iniciais, adicionou-se
900 mL de solução estéril de leite em pó desnatado 10 % aos 100 mL da cultura
obtida, permanecendo em incubação a 37 °C por 18-24 h. Posteriormente, uma
parte desse cultivo foi centrifugada (Centrifuga Eppendorf) a 12.850 x g/10 min/ 4 °C,
para assim obter biomassa úmida. Esta foi congelada com adição ou não de: leite
desnatado 10 %, glicerol ou tampão fosfato 0,2 M (pH=7,2) para posteriormente ser
liofilizada (liofilizador Perroni LS300). Obteve-se assim: Lactobacillus acidophilus
34
sem protetor (La-1), L. acidophilus com leite em pó desnatado (La-2), L. acidophilus
com glicerol (La-3) e L. acidophilus com glicerol e tampão fosfato 0,2 M ,pH=7,2 (La-
4).
No cultivo obtido após fermentação e sem centrifugação, em uma parte
adicionou-se carbonato de cálcio na relação 1:1 e na outra, amido de milho na
mesma proporção. A secagem destas amostras foi conduzida em estufa com
circulação de ar a 40 °C (Nova Ética) até massa constante (12 a 14 h), obtendo-se
assim: L. acidophilus com carbonato de cálcio (La-5) e L. acidophilus com amido de
milho (La-6).
As amostras obtidas La-1 a La-6 foram armazenadas por dois meses a
5 °C para verificar a estabilidade, conforme item 5.5. Os diferentes tratamentos
podem ser visualizados na figura 2.
35
Figura 2. Esquema de obtenção de L. acidophilus em pó.
36
5.4.2. Ativação, obtenção da biomassa e produção de Saccharomyces
boulardii em pó
A biomassa de S. boulardii foi obtida adicionando assepticamente 100
mg do Floratil
®
em 100 mL de meio YPD (Yeast, Peptone, Dextrose) esterilizado e
incubado a 30 °C, por 12 h, sob agitação de 200 rpm em incubadora shaker
refrigerada (Marconi MA 830/A) (MULLER, 2007). Em seguida a este cultivo
adicionou-se 900 mL de YPD estéril incubado a 30 °C, por 20 h, sob agitação de 150
rpm (Tecnal TE- 421). Posteriormente, uma parte foi centrifugada (3.500 x g/ 10
min./ 10°C), obtendo-se uma biomassa úmida sendo liofilizada(liofilizador Perroni
LS300): sem aditivos (Sb-1), com adição de solução de leite desnatado 10 % (Sb-2),
com adição de glicerol (Sb-3) e com adição de glicerol e tampão fosfato 0,2 M,
pH=7,2 (Sb-4).
A uma parte do caldo de cultivo obtido após fermentação e sem
centrifugação, adicionou-se carbonato de cálcio na relação 1:1 e na outra, amido de
milho na mesma proporção. A secagem destas amostras foi conduzida em estufa
com circulação de ar a 40°C (Nova Ética) até massa constante (12 a 14 h), obtendo-
se assim: Saccharomyces boulardii com carbonato de cálcio (Sb-5) e S. boulardii
com amido de milho (Sb-6). Essa produção pode ser visualizada na figura 3.
As amostras obtidas Sb-1 a Sb-6 foram armazenadas por dois meses
a 5 °C para verificar a estabilidade, conforme item 5.5.
37
Figura 3. Esquema de obtenção de S. boulardii em pó.
38
5.5. CONTAGEM DE BACTÉRIA LÁCTICA E LEVEDURA
Para a contagem de bactéria láctica e levedura, aplicou-se a técnica
de semeadura em profundidade (método de “pour plate”) utilizando-se,
respectivamente, MRS (Man, Rogosa e Sharp) Agar e BDA (Agar Batata Dextrose)
estéreis, inoculando assepticamente as placas, em triplicata, a partir de diluições
seriadas adequadas das amostras em água peptonada 0,1 % estéril. As placas
foram incubadas em estufa a 37 °C para Lactobacillus acidophilus e a 25 °C para
Saccharomyces boulardii, durante 72 h. A obtenção UFC foi dada pela equação
abaixo:
UFC/mL ou UFC/g = N x F, onde N é o número de colônias e F o fator de diluição.
5.6. DESENVOLVIMENTO DOS PRODUTOS PROBIÓTICOS EFERVESCENTES EM PÓ
A fim de disponibilizar mais opções de produtos probióticos no
mercado, propôs-se desenvolver comprimidos, pós e ingredientes, todos
efervescentes com probióticos, para serem adicionados a água (comprimido ou pó)
e a refrescos em pó ou líquidos (ingrediente), facilitando assim a ingestão diária de
microrganismos probióticos.
Os microrganismos probióticos em pó sugeridos, também podem ser
produzidos industrialmente por empresas de biotecnologia existentes e na
eventualidade dos produtos que estão sendo proposto venham a ser implementados
industrialmente, a indústria poderá optar por produzi-los ou adquiri-los de outras
empresas.
39
5.6.1. Comprimido e pó efervescentes probióticos
Para a definição da composição do comprimido e pó efervescentes
probióticos, realizou-se a avaliação dos efeitos dos componentes sobre a viabilidade
dos microrganismos por meio de experimentos baseados no planejamento fatorial
2
n
, onde n corresponde ao número de variáveis. Foi utilizado o planejamento fatorial
fracionado 2
(9-5)
, resolução III, num total de 16 experimentos, tendo a viabilidade dos
probióticos como resposta. Para obtê-la, cada uma dessas 16 formulações foi
adicionada a 9,0 mL de caldo nutriente estéril, inoculada assepticamente com L.
acidophilus e S. boulardii para em seguida ser incubadas durante 24 h a 30 °C
quando foi verificada a concentração (UFC/g) dos microrganismos probióticos
utilizando a metodologia descrita no item 5.6.1.1.
A Tabela 2 indica os níveis de variação dos ingredientes utilizados no
desenho experimental 2
(9-5)
e na Tabela 3 as formulações codificadas para avaliação
dos efeitos dos componentes sobre a viabilidade dos microrganismos probióticos.
A partir dos resultados obtidos nos testes para verificação da
influência dos excipientes, obteve-se a melhor formulação do comprimido, sendo
este preparado pela mistura dos ingredientes e os comprimidos obtidos a partir de
uma compressora rotativa (marca Neuberger 16 punções, modelo MN2).
Tabela 2. Ingredientes e níveis utilizados no desenho experimental 2
(9-5)
Ingredientes
Níveis
-1
+1
Ácido tartárico
5,0 %
20,0 %
Ácido cítrico
5,0 %
20,0 %
Bicarbonato de Na
5,0 %
20,0 %
PVP
5,0 %
15,0 %
Aroma
0,2 %
2,0 %
Stevia
0,2 %
2,0 %
Sacarose
0,2 %
2,0 %
Soro
5,0 %
15,0 %
Manitol corado
4,0 %
40,0 %
40
Tabela 3. Desenho Experimental 2
(9-5)
: Formulações codificadas para avaliação dos efeitos dos componentes (em g) sobre a
viabilidade dos microrganismos probióticos
Ácido
tartárico
Ácido cítrico
Bicarbonato
de sódio
PVP
Aroma
Stevia
Sacarose
Soro
Manitol
corado
1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
1
2
1
-1
-1
-1
1
-1
1
1
-1
3
-1
1
-1
-1
1
1
-1
1
-1
4
1
1
-1
-1
-1
1
1
-1
1
5
-1
-1
1
-1
1
1
1
-1
-1
6
1
-1
1
-1
-1
1
-1
1
1
7
-1
1
1
-1
-1
-1
1
1
1
8
1
1
1
-1
1
-1
-1
-1
-1
9
-1
-1
-1
1
-1
1
1
1
-1
10
1
-1
-1
1
1
1
-1
-1
1
11
-1
1
-1
1
1
-1
1
-1
1
12
1
1
-1
1
-1
-1
-1
1
-1
13
-1
-1
1
1
1
-1
-1
1
1
14
1
-1
1
1
-1
-1
1
-1
-1
15
-1
1
1
1
-1
1
-1
-1
-1
16
1
1
1
1
1
1
1
1
1
41
5.6.1.1. Viabilidade dos microrganismos
Uma quantidade de 700 mg do pó ou comprimido foi adicionado a 6,3
mL de água peptonada e após 2 minutos, recolheu-se uma alíquota de 1 mL para
diluição seriada para plaqueamento em MRS ágar adicionado do antifúngico
Cetoconazol (no Anexo, figuras 7, 8 e 9), a fim de se contar o número de unidades
formadoras de colônia de Lactobacillus acidophilus após crescimento em estufa a
37 °C por 72 h. Também retirou-se uma alíquota para contagem da levedura em
BDA (Agar batata dextrose), em estufa durante 72 h, não sendo necessária a
utilização de um antibiótico, uma vez que L. acidophilus não se desenvolveu nessas
condições (no Anexo, figura 6).
5.6.1.2. Propriedades físicas dos comprimidos
Para determinar as propriedades físicas dos comprimidos obtidos, foram
realizados os seguintes testes:
5.6.1.2.1. Peso médio
Pesaram-se, individual e aleatoriamente, 10 comprimidos, em
balança analítica (Mettler AE-200) e determinou- se a média dos mesmos,
considerando-se um desvio de ± 5% em relação ao peso médio (Farmacopéia
Brasileira, 1988).
42
5.6.1.2.2. Dureza
Determinou-se por meio da resistência ao esmagamento ou à ruptura sob
pressão contínua medida com auxílio de um durômetro (Erweka TBH-30) e o
resultado obtido pela média aritmética da resistência de 10 comprimidos expresso
em Newton (N) (Farmacopéia Brasileira, 1988). Recomenda-se valor de dureza
mínima de 30 N.
5.6.1.2.3. Friabilidade
Determinou-se a resistência dos comprimidos a choque e atrito em
friabilômetro (Erweka TAR). Amostras de 10 comprimidos foram submetidos a 25
rpm por quatro minutos. É aceitável o valor máximo de 1 % de perda de peso dos
comprimidos pesados (Farmacopéia Americana, 32 ed.).
5.6.1.2.4. Desintegração
Determinou-se o tempo de desintegração de seis comprimidos em
aparelho de desintegração (Erweka ZT3) e utilizando-se água destilada a 37 °C ±
2 °C como meio de desintegração (Farmacopéia Americana, 32 ed.). Para
comprimidos efervescentes se aceita como tempo limite de desintegração de cinco
minutos.
43
5.6.1.2.5. Estabilidade no armazenamento
Os comprimidos e o produto em pó foram armazenados por dois meses
a 25 °C, com análises periódicas da viabilidade dos microrganismos de acordo com
o item 5.6.1.1.
5.6.1.3. Efeito da força de compressão na viabilidade dos probióticos
Por meio de forças de compressão distintas, produziram-se
comprimidos com diferentes durezas: 20 N, 40 N e 60 N. Realizou-se a contagem
dos microrganismos, conforme item 5.6.1.1, a fim de verificar a relação entre dureza
e viabilidade.
5.6.1.4. Efeito do trato gastrointestinal na viabilidade dos probióticos
Adicionou-se 1,0 g de produto em 9,0 mL de suco gástrico simulado
esterilizado (0,08 M HCl contendo 0,2 % de NaCl em pH 2,0), permanecendo em
contato por duas horas a 37 °C . Após incubação, 1,0 mL da amostra foi retirado nos
tempos de 30, 60, 90 e 120 minutos para determinação da viabilidade dos
microrganismos e outro 1,0 mL, nesses mesmos tempos, adicionado a 9,0 mL de
suco intestinal simulado estéril (0,05 M K
2
PO
4
em pH 6,8 adicionado de 0,6 % de
sais biliares) incubados a 37 °C por 150 minutos. Passado esse tempo, 1,0 mL foi
utilizado para verificar a viabilidade dos microrganismos probióticos (RAO et
al.,1989; THANTSHA et al., 2008 modificados).
44
5.7. DESENVOLVIMENTO DE INGREDIENTE EM PÓ EFERVESCENTE PROBIÓTICO
Produziu-se uma formulação para desenvolvimento de um ingrediente
efervescente probiótico em pó para ser adicionado a outros produtos, como por
exemplo, refresco em pó ou líquidos. Foi utilizado um ácido orgânico juntamente
com bicarbonato de sódio como componentes para produzir efervescência. A
quantidade de microrganismo probiótico foi determinada considerando a
concentração destes microrganismos obtidos por desidratação para atingir 10
4
UFC/mL de refresco líquido.
Foram preparados dois refrescos em pó comerciais, sendo um normal
(A) e outro dietético (B) aos quais foi adicionado o ingrediente efervescente
probiótico, armazenado durante 48 h a 5 °C para verificar a viabilidade dos
microrganismos nos seguintes tempos: 0 h; 0,75 h; 3 h; 7 h; 12 h; 24 h e 48 h.. Esta
foi determinada conforme descrito no item 5.6.1.1.
5.7.1. Estabilidade do ingrediente em pó efervescente probiótico
Ingredientes do refresco em pó comercial A (normal): açúcar,
edulcorantes artificiais (aspartame, ciclamato de sódio, acesulfame de potássio e
sacarina sódica), polpa de laranja desidratada, acidulante ácido cítrico, citrato de
potássio, antiumectante fosfato tricálcico, corante inorgânico dióxido de titânio,
espessantes carboximetilcelulose e goma xantana e corantes artificiais (amarelo
crepúsculo e tartrazina), aromatizante,ferro, vitamina C, vitamina A.
Ingredientes do refresco em pó comercial B (dietético): edulcorantes
artificiais (ciclamato de sódio, aspartame e sacarina sódica), maltodextrina, polpa de
laranja, acidulante ácido cítrico, citrato de sódio, antiumectante fosfato tricálcico,
corante inorgânico dióxido de titânio, corantes artificiais (amarelo tartrazina e
amarelo crepúsculo), espessantes (carboximetilcelulose e goma xantana), aroma
idêntico ao natural de laranja, antioxidante ácido ascórbico.
45
5.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A viabilidade dos microrganismos foi avaliada pela análise de
variância ANOVA para detectar diferenças significativas e as médias, obtidas a partir
de contagens em triplicata, comparadas pelo teste de Tukey com nível de 5 % de
significância, programa estatística SAS- Agri (CANTERI et al., 2001).
46
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1. PRODUÇÃO E ESTABILIDADE DOS MICRORGANISMOS PROBIÓTICOS NO
ARMAZENAMENTO
O cultivo de L. acidophilus apresentou contagem de 9,0 x10
8
UFC/mL e
sua biomassa (obtida pela centrifugação), de 1,91 x10
10
UFC/g. Para a levedura, a
contagem do cultivo foi de 2,4 x10
8
UFC/mL e da biomassa de 1,4 x10
10
UFC/g.
Nas tabelas 4, 6 e 8, são apresentados os valores de concentração
(log UFC/g) de Lactobacillus acidophilus e Saccharomyces boulardii desidratados
por liofilização e por secagem em estufa, armazenados durante dois meses em
ambiente controlado a 5°C e 60% UR. As tabelas 5 e 7 indicam as perdas de
viabilidade dos probióticos (log UFC/g) durante o armazenamento.
Verifica-se nestas tabelas, que durante o armazenamento de dois
meses, ocorreu a queda da viabilidade para ambos os microrganismos, com média
de 2,19 ciclos logaritmicos para Lactobacillus acidophilus e de 0,50 ciclo logaritmico
para Saccharomyces boulardii, indicando uma maior estabilidade da levedura
quando comparada à bactéria.
Zárate e Nader-Macias (2006) também obtiveram queda na viabilidade
de L. acidophilus CRL 1259, L. paracasei CRL 1289 e L. salivarius CRL 1328
imediatamente após processo de liofilização, com valores de 0,05 a 2 ciclos
logarítmicos.
Como se pode observar a liofilização da biomassa do Lactobacillus
acidophilus adicionada de leite desnatado (La-2) foi a que apresentou maior
estabilidade no armazenamento seguida do tratamento La-3. O mais afetado foi o
tratamento La-4, com glicerol e tampão (Tabelas 4 e 5).
47
Tabela 4. Viabilidade de Lactobacillus acidophilus liofilizado,
armazenados aos zero, 15, 30, 45 e 60 dias, a 5 °C
e 60% de umidade relativa.
Tratamentos
Tempo de Armazenamento (dias)
0
15
30
45
60
La-1
9.14
7.42
6.67
5.83
5.71
La-2
8.09
7.21
8.16
6.81
6.72
La-3
8.11
7.25
7.04
5.63
6.15
La-4
9.56
6.57
6.94
5.63
6.11
La-1: Lactobacillus acidophilus ; La-2: L.acidophilus + leite; La-3: L.acidophilus
+ Glicerol; La-4: L.acidophilus + glicerol + tampão
Tabela 5. Perda de viabilidade do Lactobacillus acidophilus durante armazenamento
a 5°C por um período de 60 dias
log 0 dias –
log 15 dias
log 15 dias –
log 30 dias
log 30dias –
log 45 dias
log 45 dias –
log 60 dias
log 0 dias –
log 60 dias
La-1
1,65
0,75
0,84
0,12
3,43
La-2
0,88
-0,95
1,35
0,09
1,37
La-3
0,83
0,21
1,41
-0,52
1,96
La-4
2,99
-0,37
1,31
-0,48
3,45
La-1: Lactobacillus acidophilus ; La-2: L.acidophilus + leite; La-3: L.acidophilus + Glicerol;
La-4: L.acidophilus + glicerol + tampão
No caso da liofilização da biomassa da Saccharomyces boulardii o
tratamento na presença de glicerol e tampão (Sb-4) foi o tratamento que apresentou
maior estabilidade durante o período de 60 dias de armazenamento, sendo seguida
pelo tratamento Sb-3 que utilizou apenas o glicerol. O tratamento Sb-1 foi o que
apresentou menor estabilidade (Tabelas 6 e 7).
Tabela 6. Viabilidade de Saccharomyces boulardii liofilizado,
armazenados a 5°C e 60% UR
Sb-1: Saccharomyces boulardii ; Sb-2: S.boulardii+ leite; Sb-3: S.boulardii + Glicerol;
Sb-4: S.boulardii + glicerol + tampão
Tratamentos
Tempo de Armazenamento (dias)
0
15
30
45
60
Sb-1
9.21
9.29
8.52
8.78
8.25
Sb-2
9.63
9.37
9.11
9.31
8.71
Sb-3
9.04
9.94
8.87
8.81
8.42
Sb-4
9.28
9.51
8.96
9.16
9.11
48
Tabela 7. Perda de viabilidade do Saccharomyces boulardii durante armazenamento
a 5°C durante 60 dias
Tratamento
log 0 dias –
log 15 dias
log 15 dias –
log 30 dias
log 30 dias –
log 45 dias
log 45 dias –
log 60 dias
log 0 dias -
log 60 dias
Sb-1
-0,08
0,77
-0,26
-0,26
0,96
Sb-2
0,26
0,26
-0,20
0,60
0,92
Sb-3
0,90
1,07
0,06
0,39
0,62
Sb-4
-0,23
0,55
-0,20
0,05
0,17
Sb-1: Saccharomyces boulardii ; Sb-2: S.boulardii+ leite; Sb-3: S.boulardii s + Glicerol; Sb- 4:
S.boulardii + glicerol + tampão
Além do processo de liofilização, utilizou-se desidratação em estufa
por ser um processo viavelmente mais econômico, uma vez que não utiliza
equipamentos como centrífuga e liofilizador, além de ser um procedimento
tecnologicamente mais simples e produtivo. No entanto, o produto obtido apresenta
menor concentração de microrganismo probiótico (Tabela 8) quando comparada às
amostras obtidas por liofilização (Tabelas 4 e 6), uma vez que no preparo desses
produtos não se procedeu a centrifugação do cultivo.
Tabela 8. Viabilidade de Lactobacillus acidophilus e Saccharomyces
boulardii desidratados em estufa a 40°C, armazenados a
5°C e 60% de umidade relativa.
La-5 :Lactobacillus acidophilus + CaCO
3
; La-6: L.acidophilus + amido de
milho; Sb-5: Saccharomyces boulardii + CaCO
3
; Sb-6: S.boulardii+ amido de
milho
Tratamentos
Tempo de Armazenamento (dias)
0
15
30
45
60
La-5
7.61
4.23
4.83
3.99
4.93
La-6
5.45
4.89
6.94
5.31
5.16
Sb-5
7.31
7.28
7.17
7.27
7.41
Sb-6
7.31
7.25
7.15
7.01
6.91
49
Tabela 9. Perda de viabilidade de Lactobacillus acidophilus e Saccharomyces
boulardii durante armazenamento a 5 °C durante 60 dias
Tratamento
log 0 dias –
log 15 dias
log 15 dias –
log 30 dias
log 30 dias –
log 45 dias
log 45 dias –
log 60 dias
log 0 dias -
log 60 dias
La-5
3,38
-0,6
0,84
-0,94
2,68
La-6
0,56
-2,05
1,63
0,15
0,29
Sb-5
0,03
0,11
-0,10
-0,14
-0,10
Sb-6
0,06
0,10
0,13
0,10
0,40
La-5 :Lactobacillus acidophilus + CaCO
3
; La-6: L.acidophilus + amido de milho; Sb-5:
Saccharomyces boulardii + CaCO
3
; Sb-6: S.boulardii + amido de milho
Assim, observa-se na tabela 9 acima, que durante o armazenamento
na presença de amido de milho (La-6), o Lactobacillus acidophilus obteve uma
menor perda em sua concentração, o que pode indicar a importância do amido de
milho na estabilidade da bactéria nesse período. Já para o caso da levedura, o
tratamento com carbonato de cálcio (Sb-5) apresentou estabilidade levemente
superior à do amido de milho (Sb-6).
De acordo com os resultados acima descritos, pode-se verificar que em
ambos os processos ocorrem perdas de viabilidade (sobrevivência) dos probióticos
em função, provavelmente, das tecnologias de secagem às quais foram submetidas,
que segundo alguns pesquisadores podem trazer como consequência danos celular,
seja na parede, membrana (oxidação lipídica) e no próprio DNA, além de
desnaturação protéica. A sobrevivência dos microrganismos submetidos a
processos de secagem e/ou armazenamento depende de vários fatores que
interagem entre si, tais como a espécie, sua concentração inicial, composição do
substrato, condições de cultivo, tecnologias de conservação, reidratação de cepas,
entre outros (TEIXEIRA et al.,1995; CARVALHO et al., 2004).
Pode-se verificar por meio das tabelas 5 e 7, que a queda mais
acentuada de viabilidade, da maioria dos tratamentos, ocorreu durante os 15
primeiros dias de armazenagem, provavelmente porque nesta fase alguns
microrganismos não conseguem se adaptar às novas condições . Observa-se
também que, após os dois meses de armazenamento, a maior queda de
concentração (total de perda de ciclos logaritimicos), tanto para L. acidophilus como
50
para S. boulardii, foi para as amostras liofilizadas e sem um veículo, sendo de 3,36 e
0,96, respectivamente. Isto indica a importância do uso de protetores no processo de
liofilização de microrganismos, uma vez que neste processo, as células passam por
condições extremas, como congelamento e baixa atividade de água, produzindo
injúria estrutural e fisiológica, que trazem como consequência uma queda na
viabilidade.
Pela análise estatística dos resultados na tabela 10, da viabilidade de
L. acidophilus após 60 dias de armazenamento, observa-se que o melhor tratamento
significativo para a bactéria foi o La-2, Lactobacillus acidophilus adicionado de leite
desnatado 10 % obtido por liofilização, seguidos de La-3 e La-4 que não
apresentaram significância entre eles. Já para a perda de viabilidade (log 0 dia – log
60 dias), o La-6 (adicionado de amido de milho) e o La-2, com leite desnatado 10 %
foram os que obtiveram maior estabilidade após os 60 dias de armazenamento.
Tabela 10. Viabilidade e perda de viabilidade de Lactobacillus acidophilus após 60
dias de armazenamento a 5°C e 60% UR
Tratamento
log (UFC/g)
0 dias
log (UFC/g)
60 dias
log 0 dias -
log 60 dias
La-1
9,133 a
5,703 c
3,430 a
La-2
8,090 b
6,717 a
1,373 d
La-3
8,110 b
6,150 b
1,960 c
La-4
9,563 a
6,107 b
3,456 a
La-5
7,607 c
4,933 d
2,673 b
La-6
5,456 d
5,157 d
0,300 d
C.V. (%)
2,12
2,09
11,00
Letras iguais nas colunas não diferem pelo teste de Tukey em nível de 5 % de
probabilidade.
La-1: L.acidophilus ; La-2: L.acidophilus + leite;La-3: L.acidophilus + Glicerol;
La-4: L.acidophilus + glicerol + tampão; La-5 :L. acidophilus + CaCO
3
;
La-6: L.acidophilus + amido de milho
La-1 a La-4: liofilizados; La-5 e La-6: desidratados em estufa
51
No caso da levedura (Tabela 11), foi Saccharomyces boulardii liofilizado
com glicerol e tampão (Sb-4) o que obteve maior contagem no final do período de
armazenamento de 60 dias, sendo seguido pelo Sb-2, em que a levedura foi
liofilizada na presença de leite desnatado 10 %, e de Sb-3, liofilizado com glicerol.
Em relação à perda de viabilidade, Sb-5 (adicionado de carbonato de cálcio) e Sb-4
(adicionado de glicerol e tampão) obtiveram maior estabilidade durante o período de
armazenamento.
Tabela 11. Viabilidade e perda de viabilidade de Saccharomyces boulardii
após 60 dias de armazenamento a 5 °C e 60% UR
Tratamento
log (UFC/g) 0
dias*
log (UFC/g)
60 dias**
log 0 dias -
log 60 dias
Sb-1
9,203 bc
8,253 c
0,960 a
Sb-2
9,627 a
8,700 b
0,926 a
Sb-3
9,043 c
8,417 bc
0,626 ab
Sb-4
9,273 b
9,113 a
0,170 cd
Sb-5
7,303 d
7,397 d
-0,100 d
Sb-6
7,313 d
6,907 e
0,406 bc
C.V. (%)
0,81
1,62
31,11
Sb-1: S. boulardii ; Sb-2: S.boulardii+ leite;
Sb-3: S.boulardii s + Glicerol; Sb-4: S.boulardii + glicerol + tampão ;
Sb-5: S. boulardii + CaCO
3
; Sb-6: S.boulardi i+ amido de milho
Sb-1 a Sb-4: liofilizados; Sb-5 e Sb-6: desidratados em estufa
De acordo com os resultados apresentados, verifica-se que o leite
desnatado mostrou-se um importante veículo protetor para a obtenção de uma boa
viabilidade, tanto para L. acidophilus como para S. boulardii e, também, para a
estabilidade durante armazenamento para L. acidophilus (Tabelas 10 e 11). Isso
porque o leite desnatado contém grande quantidade de nutrientes, como 32 -35,7 %
de proteínas e 48,4 – 54,1 % de lactose que, segundo alguns pesquisadores, podem
evitar injúria celular pela estabilização dos constituintes da membrana celular, que
cria uma estrutura porosa em produtos liofilizados, facilitando a posterior reidratação,
52
além de conter proteínas que fornecem uma estrutura protetora às células
(SELMER-OLSEN et al., 1999; ABADIAS et al., 2001; NANASOMBAT e SRIWONG,
2007).
Por outro lado, o glicerol é bioquimicamente compatível com estruturas
celulares sendo frequentemente usado na conservação de cepas microbianas. É
considerado, assim, como um agente crioprotetor, uma vez que impede a difusão da
água no interior das células, não permitindo formação de cristais de gelo e o
consequente rompimento celular, mantendo desta forma a estabilidade da parede e
vitalidade da mesma durante o processo de congelamento. Assim, as células podem
ser preservadas por um tempo maior e recuperar suas funções normais quando
forem devidamente descongeladas (TSURUTA et al., 1998; CAMPOS et al.,2004;
ARRUDA et al.,2007).
Segundo Barreto et al. (2003), a maioria dos produtos comercializados
no Brasil ainda não contém ou não declara a presença de cepas probióticas de
maior interesse, como Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus e
bifidobactérias, predominando os leites fermentados produzidos com fermentos
láticos e Lactobacillus sp. Os produtos que declaram a presença de culturas puras
de L. casei apresentam excelente condição de viabilidade das cepas, ao contrário
dos que declaram a presença de L. acidophilus e bifidobactérias,encontradas em
contagens abaixo de 10
5
UFC/g. A perda de viabilidade desses microrganismos nos
produtos fermentados parece não depender apenas do tempo de estocagem, mas
também da própria sensibilidade das cepas às condições de processo. Portanto,
para elevar a taxa de sobrevivência desses microrganismos serão necessárias
inovações tecnológicas como seleção de cepas mais resistentes ao processo
utilizado, microencapsulação, pré-adaptação às condições de estresse, adição de
micronutrientes e agentes redutores.
Se o processo de congelamento for lento, haverá tempo para a água se
dirigir às células por osmose. Assim, se estas não perderem água rapidamente para
manter o equilíbrio interno, cristais de gelo eventualmente se formam, o que torna o
uso de protetores importante, uma vez que reduzem a quantidade de ligação com a
água na superfície das proteínas, formando ponte de hidrogênio com a proteína
(BERNY e HENNEBERT, 1991; ABADIAS, 2001).
Dessa forma, no preparo da formulação do comprimido e do pó
efervescente probiótico, a produção dos microrganismos foi por liofilização da
53
biomassa das culturas dissolvidas em solução 10 % de leite desnatado, uma vez
que esse tratamento foi o melhor para a bactéria láctica, tanto na viabilidade quanto
estabilidade e, o segundo melhor para a levedura na obtenção de viabilidade. Uma
vez que o pó obtido do tratamento para a levedura com glicerol e tampão, não foi um
pó muito fino e se procurou utilizar a mesma metodologia de produção para ambos
os microrganismos (Figuras 2 e 3).
6.2. DESENVOLVIMENTO DE PRODUTOS EFERVESCENTES PROBIÓTICOS
A tabela 12 abaixo apresenta os efeitos dos ingredientes da
formulação do comprimido sobre a viabilidade dos microrganismos (Lactobacillus
acidophilus e Saccharomyces boulardii) utilizando o planejamento fatorial 2
(9-5)
.
54
Tabela 12 . Efeito dos ingredientes(em g) utilizados na formulação do comprimido e do pó na viabilidade dos microrganismos
probióticos (UFC).
Ácido
tartárico
Ácido
cítrico
Bicarbonato
de sódio
PVP
Aroma
Stevia
Sacarose
Soro
Manitol
corado
L. acidophilus
S. boulardii
1
0,05
0,05
0,05
0,05
0,002
0,002
0,002
0,05
0,40
9,28
11,07
2
0,20
0,05
0,05
0,05
0,020
0,002
0,020
0,15
0,04
3,92
11,34
3
0,05
0,20
0,05
0,05
0,020
0,020
0,002
0,15
0,04
5,38
7,82
4
0,20
0,20
0,05
0,05
0,002
0,020
0,020
0,05
0,40
3,26
10,35
5
0,05
0,05
0,20
0,05
0,020
0,020
0,020
0,05
0,04
9,75
9,98
6
0,20
0,05
0,20
0,05
0,002
0,020
0,002
0,15
0,40
10,97
11,40
7
0,05
0,20
0,20
0,05
0,002
0,002
0,020
0,15
0,40
10,93
11,35
8
0,20
0,20
0,20
0,05
0,020
0,002
0,002
0,05
0,04
4,28
6,77
9
0,05
0,05
0,05
0,15
0,002
0,020
0,020
0,15
0,04
9,16
10,73
10
0,20
0,05
0,05
0,15
0,020
0,020
0,002
0,05
0,40
6,73
6,44
11
0,05
0,20
0,05
0,15
0,020
0,002
0,020
0,05
0,40
4,26
7,89
12
0,20
0,20
0,05
0,15
0,002
0,002
0,002
0,15
0,04
6,17
10,29
13
0,05
0,05
0,20
0,15
0,020
0,002
0,002
0,15
0,40
10,46
11,03
14
0,20
0,05
0,20
0,15
0,002
0,002
0,020
0,05
0,04
9,65
10,81
15
0,05
0,20
0,20
0,15
0,002
0,020
0,002
0,05
0,04
10,61
10,58
16
0,20
0,20
0,20
0,15
0,020
0,020
0,020
0,15
0,40
10,70
10,68
55
Na tabela 13, apresentam-se os resultados dos efeitos principais e sua
significância.
Tabela 13. Efeitos dos ingredientes da formulação no crescimento
da Saccharomyces boulardii
Efeito
p
Mean/Interc.
9,90812
0,000000
Ácido tartárico (g)
- 0,29625
0,673704
Ácido cítrico (g)
-0,88375
0,235046
Bicarbonato de sódio (g)
0,83375
0,259533
PVP (g)
-0,20375
0,771204
Aroma (g)
-1,82875
0,034145
Stevia (g)
-0,32125
0,648407
Sacarose (g)
0,96625
0,199145
Soro (g)
1,34375
0,091579
Manitol corado (g)
0,23625
0,736304
Como se observa na tabela 13, os ingredientes que apresentaram
efeitos negativos para o crescimento da levedura foram o ácido tartarico, ácido
cítrico, a polivinilpirrolidona (PVP), o aroma natural idêntico ao de laranja e o
adoçante “Stevia”. Destes, o único que foi significativo foi o aroma (p=0,034145).
Estes resultados sugerem que os ingredientes que apresentaram efeitos negativos
na viabilidade da levedura podem provocar uma queda na concentração do
microrganismo após a preparação da bebida, que poderia ser menos prejudicial
quando estes ingredientes estiverem presentes na formulação do pó na menor
concentração possível, tendo especial cuidado com a concentração do aroma. Cabe
salientar, entretanto, que o produto está desenhado para ser consumido
56
imediatamente após sua reidratação e não poderia ser guardado após sua
preparação.
Tabela 14. Efeitos dos ingredientes da formulação no crescimento
do Lactobacillus acidophilus
Efeito
p
Mean/Interc.
7,84437
0,000001
Ácido tartárico (g)
-1,76875
0,052793
Ácido cítrico (g)
-1,79125
0,050639
Bicarbonato Na (g)
3,64875
0,002539
PVP (g)
1,24625
0,140831
Aroma (g)
-1,81875
0,048131
Stevia (g)
0,95125
0,243085
Sacarose (g)
-0,28125
0,715112
Soro (g)
1,23375
0,144176
Manitol corado (g)
0,95875
0,239806
Verifica-se na tabela 14, que a concentração do Lactobacillus
acidophilus foi afetada negativamente pelo ácido tartárico, ácido cítrico, sacarose e
pelo aroma, sendo este último o único no qual o efeito foi significativo (p=0,048). Os
outros ingredientes, como o bicarbonato de sódio, o soro de leite, o adoçante
“Stevia”, PVP e o manitol corado, apresentaram um efeito positivo, sendo que o
único que foi significativo foi o bicarbonato. Um aumento de concentração destes
ingredientes na composição do comprimido ou na formulação de um produto em pó
favoreceria a estabilidade desta bactéria no produto, sendo o teor de bicarbonato o
mais influente neste sentido. Entretanto, como já foi mencionado anteriormente, o
produto está proposto para ser consumido imediatamente após sua preparação.
57
6.2.1. Formulação do pó e comprimido efervescentes probióticos
Considerando os resultados dos efeitos dos ingredientes na viabilidade
dos microrganismos probióticos, foi obtida a formulação do pó efervescente
probiótico (Figura 4) indicada na tabela 15 e do comprimido efervescente probiótico
(Figura 5) nas tabelas 16 e 17.
Tabela 15. Formulação do pó efervescente probiótico (produzidos por
liofilização em solução 10 % de leite desnatado
Composição do pó
Quantidade (%g)
Lactobacillus acidophilus*
10,0
Saccharomyces boulardii*
10,0
Ácido cítrico
15,0
Bicarbonato de sódio
15,0
Aroma de laranja
1,0
Stevia
1,0
Manitol corado**
48,0
*suficiente para atingir uma concentração de 10
6
UFC/g
** 2,4 mL de solução de amarelo crepúsculo a 1% mais 3,6 mL de água em 30 g de manitol.
Secagem em estufa com circulação de ar e triturado em moinho (Coffee grinder Model DCG-20)
58
Figura 4. Pó efervescente probiótico
Tabela 16. Formulação laboratorial do comprimido efervescente probiótico
(produzidos por liofilização em solução 10 % leite desnatado).
Composição comprimido
Quantidade (%g)
Lactobacillus acidophilus*
10,0
Saccharomyces boulardii*
10,0
Ácido cítrico
15,0
Bicarbonato de sódio
15,0
PVP
9,3
Aroma de laranja
1,0
Stevia
1,0
Manitol corado**
38,7
* suficiente para atingir uma concentração de 10
7
UFC/comprimido
** 2,4 mL de solução de amarelo crepúsculo à 1% mais 3,6 mL de água em 30 g de manitol.
Secagem em estufa com circulação de ar e triturado em moinho
59
Figura 5. Comprimido efervescente probiótico na compressora
Na formulação do pó e comprimido efervescente probiótico, conforme
tabelas 5 e 6, respectivamente, utilizou-se os microrganismos produzidos por
liofilização em solução 10 % de leite desnatado, como anteriormente justificado.
Além disso, realizou-se a produção do comprimido efervescente
probiótico em maior escala - industrial, utilizando-se assim na sua formulação
(Tabela 17), talco que é um agente antiagregante, ligante, diluente e lubrificante de
cápsulas e comprimidos, além de estearato de magnésio, excipiente lubrificante e
antiaderente nas formulações. Por ser uma formulação industrial, em que se utilizou
uma grande quantidade de microrganismo em pó, optou-se por produzir os
probióticos utilizando a desidratação em estufa com circulador de ar com amido de
milho, uma vez que é um processo tecnologicamente mais viável na obtenção de
grande quantidade de biomassa em pó, e como já mencionado, não há a
necessidade de centrifugador e liofilizador.
60
Tabela 17. Formulação Industrial do comprimido efervescente
probiótico (produzidos por desidratação em estufa na
presença de amido de milho
Composição do comprimido
Quantidade (%g)
Lactobacillus acidophilus*
10,0
Saccharomyces boulardii*
10,0
Ácido cítrico
15,0
Bicarbonato de sódio
15,0
PVP
9,3
Aroma de laranja
1,0
Stevia
1,0
Talco
2,0
Estearato de magnésio
0,6
Manitol corado**
36,1
*ou suficiente para atingir uma concentração de 10
7
UFC/comprimido)
** 2,4 mL de solução de amarelo crepúsculo à 1% mais 3,6 mL de água em 30 g de manitol.
Secagem em estufa com circulação de ar e triturado em moinho
6.2.2. Viabilidade dos Microrganismos nos Produtos Efervescentes
Probióticos
Nas tabelas 18 e 19, observam-se resultados de viabilidade durante
armazenamento a 25 °C, durante 60 dias, para L. acidophilus e S. boulardii no pó e
comprimido probiótico efervescente, respectivamente. Na Tabela 20, apresentam-se
os resultados da viabilidade dos microrganismos no pó probiótico efervescente
elaborado com cepas liofilizadas comerciais.
61
Tabela 18. Viabilidade de L. acidophilus e S. boulardii no pó efervescente
probiótico, produzidos por liofilização com leite desnatado a 10 %
em condições de laboratório e armazenados aos zero, 15, 30,
45 e 60 dias a 25°C.
Microrganismo Probiótico
Tempo de Armazenamento
0
15
30
45
60
L.acidophilus
5.15
5.08
6.11
5.48
4.92
S. boulardii
6.70
6.43
6.60
6.69
6.62
Tabela 19. Viabilidade de L. acidophilus e S. boulardii no comprimido
efervescente probiótico (produzidos por liofilização com leite
desnatado 10 % ) e armazenados a 25°C durante 60 dias
Microrganismo Probiótico
Tempo de Armazenamento (dias)
0
dias
15 dias
30 dias
45 dias
60 dias
L.acidophilus
5.18
3.79
5.18
3.72
2.91
S. boulardii
5.30
4.18
3.67
3.85
2.99
Tabela 20. Viabilidade de L. acidophilus e S. boulardii comerciais
do pó efervescente probiótico, armazenados a 25°C
durante 60 dias
Microrganismo
Probiótico(comercial)
Tempo de Armazenamento (dias)
0 dias
15 dias
30 dias
45 dias
60 dias
L.acidophilus*
11.08
10.28
8.78
8.08
8.04
S. boulardii*
9.96
9.26
9.40
9.78
9.99
*Cepas comerciais liofilizadas.
Observa-se que para o pó efervescente probiótico (tabela 18), ocorreu
pequena queda da contagem durante o armazenamento (menos de 0,3 ciclos
logarítmicos), para ambas as cepas. Já para o comprimido efervescente probiótico
(tabela 19), houve queda mais expressiva na contagem dos probióticos
(aproximadamente 2,3 ciclos logarítmicos) uma vez que a força de compressão a
que foram submetidos é uma pressão relativamente alta em um período curto de
tempo e pode ter interferido na viabilidade dos microrganismos (item 6.2.4.). Os
62
resultados obtidos no pó efervescente probiótico produzido com cepas comerciais
(tabela 20), mostram um comportamento diferente das cepas produzidas no
laboratório para obter o mesmo produto. Assim, o L. acidophilus teve uma queda de
quase 3 ciclos logarítmicos e a S. boulardii se manteve praticamente estável,
sugerindo que as condições de produção das cepas comerciais é menos eficiente do
que as empregadas no laboratório, especificamente no caso do L. acidophilus.
6.2.3. Propriedades Físicas dos Comprimidos
Para um comprimido estar disponível no mercado, deve passar por
inúmeros estudos e testes, assim a farmacopéia determina os limites aceitáveis para
os vários critérios de qualidade em que a formulação deve apresentar para ser
aprovada. Obedecendo aos critérios, tem-se a máxima garantia possível de que será
produzido um produto que poderá ser utilizado com segurança pela população.
Abaixo, na tabela 21, são apresentados os valores médios para peso e
dureza dos comprimidos obtidos em escala laboratorial:
Tabela 21. Peso médio em gramas e dureza média em Newton (N) de 10
comprimidos efervescente probiótico
Caracterização
Comprimido
Recomendado
Peso médio
0,694 ± 0,495%
Máx.: ± 5,0%
Dureza média
69,9
Min.: 30 N
O valor de peso médio obtido foi de 0,694 g e desvio padrão relativo de
0.495 %, estando de acordo com a Farmacopéia Brasileira que prevê uma variação
de no máximo 5%.
Obteve-se uma dureza média de 69,9 N, sendo que mínima
recomendada é de 30 N.
63
A tabela 22 apresenta os resultados para os valores de peso médio,
dureza média, friabilidade e tempo de desintegração, dos comprimidos obtidos em
escala industrial.
Tabela 22. Caracterização Física para o Comprimido Efervescente Probiótico
(formulação industrial)
Caracterização
Comprimido
Recomendado
Peso médio (g)*
0,948 ± 0,047%
Max. :± 5%
Dureza média (N)*
38,70
Mín.: 30
Friabilidade (% de perda de
massa)*
0,066
Max.: 1,0%
Desintegração (min)**
1,33
Max.: 2,0
*valor médio de 10 comprimidos; **valor médio de 6 comprimidos
O resultado de peso médio encontrado foi de 0,948 g e desvio padrão
relativo de 0,047 %, estando de acordo com a Farmacopéia Brasileira que prevê
uma variação de no máximo 5%.
Obteve-se 38,7 N como valor médio da dureza dos 10 valores obtidos
no durômetro, sendo a dureza mínima recomendada de 30 N. A dureza de um
comprimido é proporcional ao logaritmo da força de compressão e inversamente
proporcional à porosidade. Quanto maior a força de compressão, menor sua
porosidade e maior serão a resistência, dureza e tempo de desagregação.
O valor obtido de friabilidade (grau de resistência que se manifesta em
relação ao choque, atrito, rolamento, agitação e fricção) foi de 0,066, o que
corresponde a uma perda de 0,66 % do peso inicial, sendo um valor dentro dos
padrões recomendados que é de 1,0 % de perda máxima.
Em relação ao tempo de desintegração, que depende do mecanismo
que age o desintegrante utilizado na formulação do comprimido, cinco comprimidos
64
se desintegraram em menos de um minuto e apenas um demorou três minutos para
se desintegrar, sendo concordante com o tempo máximo de dois minutos.
Quanto ao aspecto visual dos comprimidos, observou-se que ocorreu o
problema de “capping” em alguns comprimidos, o que pode ter sido causado por
fatores como pressão em excesso na compressão, presença de muito ar absorvido
durante o processo, elevado número de partículas pequenas, falta de aglutinantes,
granulado muito seco, cristais muito grandes, punções e matrizes rugosos ou com
impurezas e/ou velocidade de compressão elevada (F. BRAS, 1988; BRANDÃO,
2001).
Pelas análises, o comprimido correspondeu aos requisitos
tecnológicos, com fácil adaptação ao processo industrial e parâmetros
farmacopeicos adequados (peso médio, dureza, friabilidade e desintegração).
6.2.4. Efeito da força de compressão na viabilidade dos probióticos
Na tabela 23 abaixo encontra-se o efeito da força de compressão na
viabilidade de S. boulardii e L. acidophilus.
Tabela 23. Efeito da força de compressão na viabilidade dos probióticos.
S. boulardii
L. acidophilus
Pó antes da compressão – 0 N
Comprimido a 20 N
Comprimido a 40 N
Comprimido a 60 N
10,86 a
10,18 b
8,93 c
8,57 d
10,51 b
10,80 a
8,19 d
8,39 c
C.V. (%)
0,41
0,48
Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5%
de probabilidade.
65
Com o aumento da dureza, a contagem dos microrganismos foi
inferior, uma vez que a força de compressão acima de 20 N interferiu na viabilidade
dos probióticos. É provável que exista uma seleção da população mais resistente à
compressão que permanece viável acima de certos valores e neste caso
aparentemente há um valor critico de compressão entre 20 e 40 N que seleciona a
população mais resistente, já que com 40 N e 60 N as contagens dos probióticos
permaneceram praticamente as mesmas.
Dependendo da pressão aplicada, a compressão das células pode
causar dano à parede, a membrana e até perda da viabilidade, uma vez que sob
estresse mecânico, algumas células podem não tolerar a essa compressão. Com o
aumento da força aplicada, o dano ocorre no primeiro momento principalmente na
parede celular e na medida em que esta pressão aumenta, atingirá também a
membrana celular. Assim, tem sido observado que a viabilidade celular diminui
quase linearmente com a força de compressão utilizada (CHAN e ZANG, 2002).
Por outro lado, Bora et al. (2009), observaram que houve queda na
viabilidade dos esporos do probiótico Bacillus coagulans com aumento da força de
compactação indicando que a sobrevivência também depende da espécie do
probiótico e do diluente utilizado na formulação. Uma redução na viabilidade de
diferentes linhagens de lactobacilos durante produção de comprimidos de culturas
liofilizadas foi verificada por Maggi et al(2000).
6.2.5. Efeito do trato gastrointestinal na viabilidade dos probióticos
Nas tabelas 24 e 25 são apresentados os valores de contagem de L.
acidphilus e S. boulardii após contato com suco gástrico artificial e suco intestinal
artificial, respectivamente.
66
Tabela 24. Viabilidade de L. acidophilus e S. boulardii, aos zero, 30, 60, 90 e 120
min de contato com suco gástrico artificial.
Contagem dos probióticos no suco gástrico (log n°UFC/mL)
Tempo de contato (min)
0
30
60
90
120
L. acidophilus
11.46
9.02
8.8
9.55
9.58
S. boulardii
10.22
8.61
8.64
9.54
9.82
Tabela 25. Viabilidade de L. acidophilus e S. boulardii durante 150 min de
contato com suco intestinal artificial
Contagem dos probióticos no suco intestinal (log n°UFC/mL)
Tempo de contato (min)
0
150
L. acidophilus
5,26
4,16
S. boulardii
8,42
8,33
Durante o período de 120 minutos em que o Lactobacillus acidophilus
esteve em contato com o suco gástrico artificial, houve queda no log n°UFC com o
decorrer do tempo, passando de 11,46 inicialmente para 9,58 após 120 minutos de
contato. Na sequência , quando este probiótico foi inoculado do suco gástrico para o
suco intestinal, houve uma queda considerável de log n° UFC 9,58 para 5,26, devido
à diluição ocorrida no teste e provavelmente devido à mudança brusca de pH, de 2,0
no suco gástrico para 6,8 encontrado no suco intestinal, além do efeito que a
presença de sais biliares neste último poderiam causar.
Cabe mencionar, entretanto, que o mecanismo de tolerância aos sais
biliares não é completamente compreendido e é difícil definir uma concentração
máxima a que um microrganismo deva suportar para ser considerado bile-resistente,
uma vez que a concentração desta substância não é estática, variando em função
do tempo e em diferentes partes do intestino. Sabe-se que a fluidez das membranas
é temperatura dependente, permitindo a entrada de maiores concentrações de sais
67
biliares em temperaturas mais elevadas. Assim sendo, o efeito bactericida dos sais
biliares depende da linhagem do microrganismo (MARTEAU et al. 1997;
MADUREIRA et al., 2005; MARTINS et al., 2005).
Entretanto, cabe salientar que, durante os 150 minutos que o probiótico
ficou em contato com o suco intestinal artificial, a contagem permaneceu
praticamente constante, uma vez que permaneceu a população viável com
tolerância maior aos sais biliares.
Madureira et al. (2005) observaram que Lactobacillus acidophilus LAC-
1 quando pré-incubada em suco gástrico artificial por 120 minutos ,ocorreu queda na
contagem do número de células viáveis de aproxidamente 3 ciclos logarítimicos e
nos subsequentes 30 minutos em contato com sais biliares.
Por outro lado, Saccharomyces boulardii apresentou uma pequena
queda em sua contagem após permanecer, durante 120 minutos, em contato com o
suco gástrico artificial. Porém, ao passar para o suco intestinal artificial, sua
contagem diminuiu, principalmente devido à diluição exigida pelo teste, mantendo-se
praticamente constante durante os 150 minutos que esteve em contato com o suco
intestinal artificial. O que indica maior resistência das leveduras quando comparadas
às bactérias.
6.3. DESENVOLVIMENTO DE INGREDIENTE EFERVESCENTE PROBIÓTICO
Em testes prévios, experimentos indicaram que o ácido tartárico
interfere no crescimento dos microrganismos em estudo, assim, optou-se pela
utilização do ácido cítrico, juntamente com bicarbonato de sódio, na proporção 1:1,
para a efervescência.
Para cada quantidade de produto em pó necessário na preparação de
1,0 L. ou no mesmo volume de um refresco líquido, haveria que adicionar 6,0 g de
bicarbonato de sódio; 6,0 g de ácido cítrico; Saccharomyces boulardii e
Lactobacillus acidophilus em pó, suficiente para atingir uma concentração de 10
7
(UFC/L). O ingrediente probiótico efervescente também poderia ser disponibilizado
68
na forma de sache de 2,5 g por copo de 200 mL de refresco (1,2 g de ácido cítrico,
1,2 g de bicarbonato de sódio e 0,1 g de probiótico em pó)
Tabela 26. Estabilidade de L. acidophilus e S. boulardii em refresco comercial
durante 48 h.
0 h
0,75 h
3 h
7 h
12 h
24 h
48 h
Marca A
L.acidophilus
4,45
3,77
4,26
4,11
4,11
3,85
3,78
S. boulardii
6,34
6,48
6,34
6,30
6,43
6,48
7,11
Marca B
L.acidophilus
4,48
4,62
4,56
4,20
4,26
4,45
4,23
S. boulardii
6,20
5,95
5,83
5,83
5,86
5,90
6,30
valores expressos em log UFC/mL
Na tabela 26, observa-se que os microrganismos mantiveram contagem
constante, com pequena queda na contagem da bactéria, sendo ideal o consumo
desse produto até 48 h.
Neves (2005) desenvolveu um fermentado probiótico de suco de maçã
com Lactobacillus casei e Lactobacillus acidophillus em suco clarificado de maçã,
das variedades Gala e Fuji e observou que o produto mantém a viabilidade dos
probióticos durante armazenamento por 28 dias sob refrigeração. Em estudos de
crescimento e viabilidade de duas espécies de Lactobacillus em suco de maçã
clarificado observou-se que o L. casei apresentou maior número de unidades
formadoras de colônia no suco de maçã gala que o L. acidophilus.
69
7. CONCLUSÕES
Independente do processo de desidratação e dos veículos utilizados
na secagem, a viabilidade de Lactobacillus acidophilus foi mais afetada que a da
Saccharomyces boulardii, durante os 2 meses de armazenamento a 5 °C e 60% UR;
Para os tratamentos testados, a maior queda de concentração dos
microrganismos probióticos, ocorreu durante os quinze primeiros dias de
armazenagem sendo mais acentuada para as amostras que foram liofilizadas sem
um veículo;
Leite desnatado mostrou-se um importante veículo na liofilização para
a obtenção de uma boa viabilidade e estabilidade para L. acidophilus;
O desenvolvimento do Lactobacillus acidophilus foi afetado
negativamente, mas não de forma significativa, pelo ácido tartárico, ácido cítrico, e a
sacarose. Entretanto, o aroma de laranja apresentou um efeito negativo significativo
no desenvolvimento desta bactéria;
O soro de leite, o adoçante “Stevia”, a polivinilpirrolidona (PVP) e o
manitol corado, apresentaram um efeito positivo não significativo sobre o
crescimento o Lactobacillus acidophilus, sendo que o bicarbonato de sódio afetou
significativamente seu crescimento;
Os ingredientes que apresentaram efeitos negativos para o
crescimento de S. boulardii foram o ácido tartárico, ácido cítrico, PVP, adoçante
“Stevia” e o aroma de laranja, sendo este o único com efeito significativo. Já os que
apresentaram efeitos positivos, mas não significativos, foram o bicarbonato de sódio,
sacarose, soro e manitol corado;
Os microrganismos probióticos presentes no ingrediente efervescente,
se mantiveram estáveis durante 48 h em refresco líquido;
Durante os dois meses de armazenamento a 25 °C em embalagens de
plástico fechados, ocorreu queda mais expressiva na contagem dos probióticos no
comprimido efervescente probiótico do que no pó efervescente probiótico;
Houve queda na contagem dos microrganismos com o aumento da
força de compressão acima de 20 Newtons;
70
O comprimido apresentou parâmetros farmacopeicos adequados: peso
médio (0,948 ± 0,047% g), dureza(38,70 N), friabilidade (0,066 %) e desintegração
(1,33 min);
A desidratação em estufa com circulação de ar, utilizando amido de
milho ou carbonato de cálcio como veículo, apresenta-se como um método
economica e tecnologicamente viável na produção de microrganismos probióticos
em pó;
O ingrediente efervescente probiótico e o pó efervescente probiótico
mostram-se mais promissores do ponto de vista industrial, com obtenção de uma
melhor viabilidade durante o armazenamento do produto, além de não necessitarem
de ingredientes (talco, estearato de magnésio, PVP) e equipamentos (compressor,
durômetro, desintegrador, friabilômetro) para produção do comprimido, significando
um menor investimento.
71
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABADIAS, M.; BENABARRE, A.; TEIXIDÓ, N.; USALL, J.; VIÑAS, I. Effect of freeze-
drying and protectants on viability of the biocontrol yeast Cândida sake. Internat. J.
Of Food Microbiol., v.65, p.173-182, 2001
AL-MOHIZEA, A.M.; AHMED, M.O.; AL-JENOOBI, F.I.; MAHROUS, G.M./ ABDEL-
RAHMAN, A.A. Formulation and evaluation of dried yeast tablets using different
techniques. Eur. J. of Pharm. and Biopharm., v.67, p.251-259, 2007
ARRUDA, P.V.; RODRIGUES, R.C.L.B.; FELIPE, M.G.A. Glicerol: um subproduto
com grande capacidade industrial e metabolic. Rev. Analytica, n.26, p.56-62, 2007
AULTON, M.E. Pré-formulação farmacêutica: delineamento de formas farmacêuticas. 2 ed.
Porto Alegre: Artmed;.2005
AXELSSON, L.T. Lactic acid bacteria: classification and physiology. In: SALMINEN,
S., VON WRIGHT, A. (eds) Lactic acid bacteria. New York: Marcel Dekker, Inc.,
p.1-64, 1993.
BAPTISTA, A. S. Saccharomyces cerevisiae em milho armazenado e o efeito na
redução de aflatixicoses. Dissertação de Mestrado. Escola Superior de Agricultura
“Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 81p , 2001.
BARRETO, G. P. M.; SILVA, N.; SILVA, E. D.; BOTELHO, L.; YIM, D. K.; ALMEIDA,
C. G.; SABA, G. L. Quantificação de Lactobacillus acidophilus, Bifidobactérias e
Bactérias Totais em Produtos Probióticos Comercializados no Brasil. Braz. J. Food
Tech., v.6, n.1, p.19-126, jan./jun. 2003.
Berny, J.F., Hennebert, G.L. Viability and stability of yeast cells and filamentous
fungus spores during freeze drying:effects of protectants and cooling rates.
Mycologia v.83,p.805–815, 1991.
BLUMER, S. A. G. Enriquecimento com ferro em Saccharomyces cerevisiae.
Dissertação de Mestrado. Escola Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz”,Universidade de São Paulo Piracicaba, 53p., 2002.
BORA, P.S.; PURI, V.; BANSAL, A.K. Physicochemical Properties and Excipient
Compatibility studies of Probiotic Bacillus coagulans Spores. Sci. Pharm.v.77, p.
625-637, 2009.
BRANDÃO, A. C. da C. Ensaios para laboratório de controle da qualidade e controle
da produção de medicamentos, 2001. Disponível em: <
http://www.boaspraticasfarmaceuticas.com.br/includes/ensaios_lab_medicamentos>
Acesso em: 24 abr. 2010.
BUTS, J-P. Ejemplo de un medicamento probiótico: Saccharomyces boulardii
liofilizada. Rev. Gastroenterol. Perú v.25 n.2, Lima abr./jun., 2005.
72
CAMPOS, A. K.; MOTA, M. A .; ARAUJO, J. V.; CECON, P. R. Atividade predatoria,
crescimento radial e esporulacao de fungos predadores de nematóides
Monacrosporium ssp, submetidos a criopresevacao. Ciênc. Rural, Santa Maria,
v.34, n.2, p.465-469, mar-abr, 2004.
CANTERI, M. G., ALTHAUS, R. A., VIRGENS FILHO, J. S., GIGLIOTI, E. A.,
GODOY, C. V. SASM - Agri : Sistema para análise e separação de médias em
experimentos agrícolas pelos métodos Scoft - Knott, Tukey e Duncan. Revista
Brasileira de Agrocomputação, v.1, n.2, p.18-24. 2001.
CARVALHO, A.S.; SILVA, J.; HO, P.; TEIXEIRA, P.; MALCATA, F.X.; GIBBS, P.
Relevant factors for the preparation of freeze-dried lactic acid bactéria. Intern. Dairy
J. v.14, p.835-847, 2004.
CHAN, E.S.; ZHANG, Z. Encapsulation of Probiotic Bacteria Lactobacillus
Acidophilus by Direct Compression Food and Bioproducts Processing, v.80p,p.
78-82, 2002
CURY, B. S. F. ; SILVA JÚNIOR, N.P.; CASTRO, A. D. Influência das propriedades
de granulados de celulose nas características físicas dos comprimidos - Rev. Ciênc.
Farm. Bás. Apl., v.29, n.1, p.37-44, 2008
DE LA PEÑA, P.; BARROS, F.; GASCÓN, S.; LAZO, P.S.; RAMOS, S. Effect of
yeast killer toxin on sensitive cells of Saccharomyces cerevisiae. The J. of Biolog.
Chemistry, Bethesda, v.256, n.20, p.10420-10425, 1981.
FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 4. ed São Paulo: Atheneu, parte I, 1988
FILHO – LIMA, J.V.M.; VIEIRA, E.C.; NICOLI, J.R. Antagonistic effect of
Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces boulardii and Escherichia coli
combinations against experimental infections with Shigella flexneri and Salmonella
enteritidis subsp. Typhimurium in gnotobiotic mice. J. of Applied Microb., v.88,
p.365-370, 2000.
FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION (FAO) OF THE UNITED NATIONS
AND WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Guidelines for the Evaluation of
Probiotics in Food. Report of a Joint FAO/WHO Working Group on Drafting
Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, 2002.
<http://www.who.int/foodsafety/fs_management/en/probiotic_guidelines.pdf> Acesso
em: 28 jun. 2009.
FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF M.; DESTRO, M. T. Microb. dos alimentos.
São Paulo: Atheneu, 1996.
GIRALT, J., PEREZ REGADERA, J., ROMERO, J., VERGES, R., DE LA FUENTE,
I., BIETE, A., ARENAS, M., COBO, J., GUARNER, F. Double-blind, multicenter,
randomized,placebo-controlled nutritional trial of the efficacy of fermented milk with
the probiotic Lactobacillus casei in preventing radiation-induced diarrhea in patients
with gynecologic cancer treated with pelvic radiotherapy. Int. J.Radiat. Oncol. Biol.
Phys. v.66,p.S-129, 2006.
73
GOMES, A. M. P.; MALCATA, F. X. Agentes probióticos em alimentos: aspectos
fisiológicos e terapêuticos, e aplicações tenológicas. Biotec. Alimentar: Boletim de
Tecnologia, v.101, p.12–22. 2002.
GOULET, O. Effets de Saccharomyces boulardii dans le traitement et la prevention
des diarrheas de l´enfant. J. de pédiatrie et de puériculture , v.22, p.337-340,
2009.
HAMILTON-MILLER, J. M. T., SHAH, S., e WINKLER, J. T. Public health issues
arising from microbiological and labelling quality of foods and supplements containing
probiotic microorganisms.Public Health Nutrition,v. 2, p.223–229, 1999.
HAVENAAR, R.; VELD, J.H.J.H.I. Probiotics: a general view. In: WOOD, B.J.B. (ed.)
The lactic acid bactéria in health e disease . Vol 1. Amsterdam: Elsevier Applied
Science Publishers, 1992.
JELEN, P.; LUTZ, S. Functional milk and dairy products. In: MAZZA, G., ed.
Functional foods: biochemical and processing aspects. Lancaster: Technomic
Publishing,. p.357-381,1998.
KAILASAPATHY, K., e RYBKA, S. Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium
spp: Their therapeutic potential and survival in yoghurt. Australian J. of Dairy
Techn., v.52, p.28–35, 1997.
KLAYRAUNG, S.; VIERNSTEIN, H.; OKONOGI, S. Development of tablets
containing probiotics: effects of formulation and processing parameters on bacterial
viability. Intern. J. of Pharm. , v.370, p.54-60, 2009.
KOMATSU, T.R.; BURITI, F.C.A.; SAAD, S.M.I. Inovação, persistência e criatividade
superando barreiras no desenvolvimentos de alimentos probióticos. Rev. Bras. de
Ciênc. Farm. v.44, n.3, jul./set.,p.329-347, 2008.
MAGGI, L.; MASTROMARINO, P.; MACCHIA, S.; BRIGIDI, P.; PIROVANO, F.;
MATTEUZZI, D.; CONTE, U. Technological and biological evaluation of tablets
containing different strains of lactobacilli for vaginal administration. European of
Pharm. and Biopharm., v.50, p.389-395, 2000.
MAGRO, M.L.M.; CORBACHO, J.M. M.; SORRIBES, C.H. et al. Las bacteriocinas de
las bacterias lacticas 1: Definición, clasificación, caracterización y métodos de
detección. Alimentaria, v.37, p.59-66, 2000.
MARTEAU, P.; MINEKUS, M.; HAVENAAR, R.; HUIS IN´T VELD, J.H. Survival of
lactic acid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine: validation
and the effects of bile. J. Dairy Sci., v.80, p.1031-1037, 1997.
MARTINAC, B.; ZHU, H.; KUBALSKI, A.; ZHOU, X.; CULBERTSON, M.; BUSSEY,
H.; KUNG, C. Yeast K1 killer toxin forms ion channels in sensitive yeast spheroplasts
and in artificial liposomes. Cell Biology, Madison, v.87, p.6228-6232, 1990.
74
MARTINS, F. dos S. ; BARBOSA, F. H. F.; PENNA, F.J.; ROSA, C.A.; NARDI,
R.M.D.; NEVES, M.J.; NICOLI, J.R. Estudo do potencial de linhagens de
Saccharomyces cerevisiae através de testes in vitro. Rev, de Bio. E Ciênc. da
Terra, v.5, 2005.
MARTINS, F. dos S.; ROSA, C.A.; NICOLI, J.R.; MACHADO, D.C.C.; PENNA, F.J.;
NEVES, M.J. Efeito do método de conservação na viabilidade, reativação.
Colonização intestinal e efeito imunomodulador de dois produtos probióticos a base
de leveduras. Rev. Bras. Med., v.63, p. 36-41, 2006.
McMULLEN, L.M., STILES, M.E. Potencial for use of bacteriocin producing lactic acid
bacteria in the preservation of meats. J. Food Prot., Ames, suppl., p.64-71, 1996.
MORETON, R.C. Excipients to the year 2000. In: Excipients and delivery systems for
pharmaceutical formulations (KARSA, D.R.; STEPHENSON, R.A. eds.) Royal
Society of Chemistry, p.13-22, 1995.
MOUNTZOURIS, K.C.; KOTZAMPASSI, K.; TSISTSIKOS, P.; KAPOUTZIZ,K.;
FEGEROS, K. Effects of Lactobacillus acidophilus on gut microflora metabolic
biomarkers in fed and fasted rats. Clinical Nutrition, v.28, p.318-324, 2009.
MULLER, J.L.; PROTTI, K.L.; MACHADO, M. da S.; LACERDA, L.L.V.de;
BRESOLIN, T.M.B.; PODLECH, P.S. Comparação do crescimento de
Saccharomyces boulardii em fermentador por batelada tipo air lift e shaker. Ciênc.
Tecnol. Aliment., v.27, p.688-693, 2007.
NACHAEGARI, S. K.; BANSAL, A.K. Coprocessed excipients for solid dosage
forms. Pharm.Techn., v.1, p.52-64, 2004.
NANASOMBAT, S.; SRIWONG, N. Improving viability of freeze-dried lactic acid
bactéria using lyoprotectants in combination with osmotic and cold adaptation.
KMITL Sci. Tech. J. , v.7 n. S1, p. 61-69, nov 2007.
NEVES, L.S. Fermentado probiótico de suco de maçã. Tese de Doutorado. Univ.
Fed. do Paraná, Curitiba, 106 p, 2005.
PEREIRA, V.G.; GÓMEZ, R.J.H.C. Atividade antimicrobiana de Lactobacillus
acidophilus, contra microrganismos patogênicos veiculados por alimentos. Semina:
Ciências Agrárias, Londrina, v. 28, n. 2, p. 229-240, abr./jun, 2007.
PHILLISKIRK, G.; YOUNG, T. W. The occurrence of killer character in yeasts of
various genera. Antonie Van Leeuwenhoek, Dordrecht, v.41, n.2, p.147-151, 1975.
PIARD, J.C.; DESMAZEAUD, M. Inhibiting factors produced by lactic acid bacteria-
1.Oxygen metabolites and products from catabolism. Lait, v.71, p.525-541, 1991.
PIFFERI, G.; RESTANI, P. The safety of pharmaceutical excipients. Il farmaco , v.
58, p. 541-550, 2002.
75
PRISTA, L.N.; ALVES, A.C.; MORGADO, R.; LOBO, J.S. Tecnologia farmacêutica ,
v.1, 6ª. Ed.; Fundação Caloueste Gulbenkian, 2002.
RADLER, F.; HERZBERGER, S.; SCHONIG, I.; SCHWARZ, P. Investigation of a
killer strain of Zygosaccharomyces bailli. J. of General Microb., London, v.139,
n.495-500, 1993.
RAO, A.V.; SHIWNARAIN, N.; MAHARAJ, L. Survival of microencapsulated
Bifidobacterium pseudolongum in simulated gastric and intestinal juices. Can. Inst.
of Food Science and Tech. J. , v.22, p. 345-349, 1989.
RICHARDSON, D. Probiotics and products innovation. Nutrition and Food
Science., London, n.4, p.27- 33, 1996.
RUAS-MADIEDO, P.; HUgENHOLTZ, J.; ZOON, P. An overview of the functionality
of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. Intern. Dairy J., v. 12, p.
163-171, 2002.
SAAD, S. M. I. Probióticos e prebióticos: o estado da arte. Braz. J. of Pharm.
Scienc., v. 42, n. 1, p. 01-16, 2006.
SANDHOLM, M.T.; MYLLÄRINEN, P.; CRITTENDEN, R.; MOGENSEN,G.;FONDÉN,
R.; SAARELA, M. Tecnological challenges for future probiotic foods. Intern. Dairy J.,
n.12, p.173-182., 2002
SANTOS, W.L.M. Aislamiento y caracterización parcial de una bacteriocina
producida por Pediococcus sp. 347, de origem cárnico. Madrid: Universidade
Complutense de Madrid, (Tese, Doutorado), 294p, 1993.
SCHLEIFER, K.-H.; EHRMANN, M.; BEIMFOHR, C., BROCKMANN, E.; LUDWIG,
W. Application of molecular methods for the classification and identification of lactic
acid bacteria. Int. Dairy J., v.5, p.1081-1094, 1995.
SCHREZENMEIR, J.; de VRESE, M. Probiotics, prebiotics, and synbiotics –
approaching a definition. Am. J. Clin. Nutr. v.73, p.361-364, 2001.
SHAH, N. P.; LANKAPUTHRA W. E. V.; BRITZKYLE M. L.; KYLE W.S.A. Survival of
Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum in comercial yoghurt during
storage. Int. Dairy J. v.5, p.515 – 521, 1995
SILVA, A. V. A. da; FONSECA, S. G. da C.; ARRAIS, P. S. D.; FRANCELINO, E. V.
Presença de excipientes com potencial para indução de reações adversas em
medicamentos comercializados no Brasil. Rev. Bras. de Ciênc. Farmac., v.44, n.3,
p.397-405,jul./set, 2008.
SKIPPER, N.; BUSSEY, H. Mode of action of yeast toxins: energy requirement for
Saccharomyces cerevisiae killer toxin. J. of Bacteriology, Washington, v.129, n.2,
p.668-677, 1977.
76
STADLER,M.; VIERNSTEIN, H. Optimization of formulation containing viable lactic
acid bacteria. Int. J. Pharm. v.256, p. 117–122, 2003.
TEIXEIRA, P.C..; CASTRO, H.M.; MALCATA, F.X.; KIRBY, R.M. Survival of
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus following spray-drying. J. of Dairy Science ,
v. 78, p. 1025-1031, 1995.
TENNEY, D. Acidophilus. Woodland Publishing, 26p., 1996
THANTSHA, M.S.; CLOETE, T.E.; MOOLMAN, F.S.; LABUSCHAGNE, P.W.
Supercritical carbon dioxide interpolymer complexes improve survival of B. longum
Bb-46 in simulated gastrointestinal fluids. Int. J. of Food Microb., v.129, p.88-92,
2008
TOLLER, A.B.; SCHMIDT, C.A. Excipientes à base de cellulose e lactose para
compressão direta. Disciplin. Scientia , Santa Maria, v. 6, n.1, p. 61-80, 2005.
TSURUTA, T.; ISHIMOTO, Y.; MASUOKA, T. Effects of glycerol on intracellular ice
formation and dehydration of onion epidermis. Annals of the New York Academy of
Sciences, v. 858, p. 217-226, 1998.
VAN DER AA KÜHLE, A.; JESPERSEN, L. The taxonomic position of
Saccharomyces boulardii as evaluated by sequence análisis of the D1/D2 domain of
26S rDNA, the ITS1-5.8S rDNA-ITS2 region and the mitochondrial cytochrome-c
oxidase II gene. System. Appl. Microbiol. V.26; p. 564-571; 2003.
VERHEUL, A., RUSSELL, N.J., HOF. R.V., ROMBOUTS, F.M., ABEE, T.
Modifications of membrane phospholipid composition in nisinresistant Listeria
monocytogenes Scott A. Appl. Environ. Microbiol., Washington, v.63, n.9, p.3451-
3457, 1997.
ZÁRATE, G.; NADER-MACIAS, M.E. Viability and biological properties of probiotic
vaginal lactobacilli after lyophilization and refrigerated storage into gelatin capsules.
Process Biochemistry, v.41, p. 1779-1785, 2006.
77
ANEXO
Figura 6 – Placa com MRS ágar inoculado com Lactobacillus acidophilus incubado
a 37 °C (A) e placas de BDA (batata dextrose Agar) (B), BDA +
cloranfenicol (C), MEA (malt extract Agar) (D), MEA acidificadado (E)
Lactobacillus inoculados com L. acidophilus incubado a 25 °C.
78
Figura 7 – Placas com MRS agar inoculadas com Lactobacillus acidophilus
(A), Saccharomyces boulardii (B), L. acidophilus + S. boulardii (C)
e L. acidophilus + S. boulardii + 666 ppm de cetoconazol (D),
todos incubados a 37 °C.
79
Figura 8 – Placas com MRS ágar inoculada com Saccharomyces boulardii (A) e
com S. boulardii + cetoconazol 666 ppm (B), incubados a 37 °C.
Figura 9 – Placas com MRS agar inoculada com Lactobacillus acidophilus (A) e
com L. acidophilus + cetoconazol 666 ppm (B), incubados a 37 °C.
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