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CLÁUDIA PARAGUAÇU PUPO SAMPAIO
EFEITOS DO USO TÓPICO DO METRONIDAZOL EM
FERIDAS COM CICATRIZAÇÃO POR SEGUNDA
INTENÇÃO EM RATOS
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Cirurgia da Pontifícia Universidade
Católica do Paraná - PUCPR, como
pré-requisito para a obtenção do título
de Mestre em Cirurgia.
CURITIBA
2009
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CLÁUDIA PARAGUAÇU PUPO SAMPAIO
EFEITOS DO USO TÓPICO DO METRONIDAZOL EM
FERIDAS COM CICATRIZAÇÃO POR SEGUNDA
INTENÇÃO EM RATOS
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Cirurgia da Pontifícia Universidade
Católica do Paraná - PUCPR, como
pré-requisito para a obtenção do título
de Mestre em Cirurgia.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria de Lourdes Pessole Biondo-Simões
Coordenador: Prof. Dr. Luiz Carlos Von Bahten
CURITIBA
2009
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Dados da Catalogação na Publicação
Pontifícia Universidade Católica do Paraná
Sistema Integrado de Bibliotecas- SIBI/PUCPR
Biblioteca Central
Sampaio. Cláudia Paraguaçu Pupo
S192e Efeitos do uso tópico do metronidazol em feridas com cicatrização
2009 por segunda intenção em ratos/ Cláudia Paraguaçu Pupo Sampaio;
orientadora, Maria de Lourdes Pessole Biondo-Simões.-2009.
60f. : Il.; 30cm
Dissertação (mestrado)- Pontifícia Universidade Católica do
Paraná, Curitiba, 2009.
Bibliografia: f. 48-62
1. Metronidazol. 2. Cicatrização de feridas. 3. Colágeno. 4. Rato.
I. Biondo-Simões, Maria de Lourdes Pessole. II. Pontifícia
Universidade Católica do Paraná. Programa de Pós-Graduação em
Cirurgia. III. Título.
CDD 20.ed.-617
ii
FOLHA DE APROVAÇÃO
Cláudia Paraguaçu Pupo Sampaio
Efeitos do uso tópico do metronidazol em feridas com cicatrização por segunda
intenção em ratos.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Cirurgia da Pontifícia Universidade Católica do Paraná,
como pré-requisito para a obtenção do título de mestre em
cirurgia.
Aprovado em de de 2009
Banca examinadora
Prof. Dr. _________________________ Instituição: ___________________
Julgamento: ______________________ Assinatura: ___________________
Prof. Dr. _________________________ Instituição: ___________________
Julgamento: ______________________ Assinatura: ___________________
Prof. Dr. _________________________ Instituição: ___________________
Julgamento: ______________________ Assinatura: ___________________
iii
AGRADECIMENTOS
À Pontifícia Universidade Católica do Paraná.
Ao Departamento de Medicina da Pontifícia Universidade Católica do
Paraná.
À Prof.ª Dr.ª Maria de Lourdes Pessole Biondo-Simões, pela orientação.
João Antonio Sampaio e Maria Cecília Pupo Sampaio, meus pais, pelo
exemplo.
Catharine Paraguaçu Sampaio Palma, minha filha, pela inspiração.
João A. Palma, meu marido, e seus pais, Irene Edite Eland Palma e
Dirceu Siqueira Palma, pelo apoio.
Carlos Roberto Ballin, Professor da Pontifícia Universidade Católica do
Paraná, pelo apoio.
Luiz Carlos Sava, Professor da Pontifícia Universidade Católica do
Paraná, pelo apoio.
Maristela Palma de Oliveira, minha prima, pelo apoio.
Emir Toktar, amigo da família, pelo apoio técnico.
iv
RESUMO
INTRODUÇÃO: os prejuízos decorrentes da presença de úlceras crônicas, na
população, indicam a necessidade de um recurso que promova a cicatrização
precoce das feridas, evitando sua cronificação. O metronidazol, segundo a
literatura, promove a precocidade do processo de cicatrização de feridas.
OBJETIVO: avaliar os efeitos do metronidazol na cicatrização de feridas por
segunda intenção. MÉTODOS: utilizou-se 80 ratos machos, nos quais se produziu
uma ferida no dorso, distribuídos em dois grupos de 40 animais. Os que
pertenceram ao grupo controle tiveram suas feridas tratadas com soro fisiológico
0,9% e os que pertenceram ao grupo experimento com metronidazol 4%. No 3.º,
7.º, 14.º e 21.º dias avaliou-se o processo cicatricial por parâmetros
macroscópicos e microscópicos (histologia geral e imunoistoquímica).
RESULTADOS: a macroscopia demonstrou que a epitelização e a granulação
ocorreram em menor tempo, no grupo experimento. Houve predomínio do estado
inflamatório agudo, no grupo experimento, apenas no terceiro dia (p=0,023). O
colágeno I apresentou maior concentração, no grupo experimento, no sétimo dia
(p=0,020) e no vigésimo primeiro dia (p=0,016). O colágeno III apresentou maior
concentração no vigésimo primeiro dia (p=0,005). A angiogênese foi avaliada pelo
anti-CD34, o qual demonstrou maior número de vasos, no grupo experimento, no
terceiro dia (p<0,001); e no décimo quarto dia (p=0,003). CONCLUSÃO: o
metronidazol contribui para a cicatrização de feridas por segunda intenção
acelerando a epitelização e a granulação; uma maior concentração de colágeno e
maior angiogênese.
DESCRITORES: Cicatrização de feridas. Metronidazol. Neovascularização
fisiológica. Colágeno. Ratos.
v
ABSTRACT
Introduction: the decurrent damages of the presence of chronic ulcers, in the
population, indicate a need of a resource that promoves the earliness cicatrization,
prevening that chronicles become. The metronidazole, according to literature,
promotes a precocious of the wound healing process. Objective: to evaluate the
effects of metronidazol on ulcers cicatrization by second intention. Methods:
eighty male rats were worked with, on whose dorsum a wound was made, being
all of them distributed in two groups of 40 animals. Those belonging to the control
group had their wounds treated 0,9% NaCl and those that belonged to the
experience group received 4% metronidazol. Evaluations of the cicatrization
process were made on the days 3, 7, 14 and 21 of the beginning of the
experience, through macroscopical e microscopical (histological generality and
imunohistochemical) criterions. Results: macroscopic has shown that the
epithelization and granulation occurred in less time, in the group experiment. It
was predominance of acute inflammatory state only on the third day (p=0,023).
The type I collagen showed larger concentration in the group experiment, on the 7
th
(p=0,020) and 21
sh
(p=0,016) days. The type III collagen showed a larger
concentration on the 21
sh
day (p=0,005). The angiogenesis, as evaluated by the
anti-CD34, demonstrated a larger concentration of vessels, in the experimental
group, with a significant difference on the third (p<0,001) and fourteenth (p=0,003)
days. Conclusion: metronidazol contributes for the cicatrization of wounds at
second intention, promotes earliness epithelization and granulation; a larger
production of collagen and a larger angiogenesis.
Key words: Wounds cicatrization. Metronidazol. Physiological neovascularization.
Collagen. Rats.
vi
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS............................................................................................ III
RESUMO...............................................................................................................IV
ABSTRACT............................................................................................................V
SUMÁRIO .............................................................................................................VI
LISTA DE TABELAS..........................................................................................VIII
LISTA DE QUADROS...........................................................................................IX
LISTA DE FIGURAS..............................................................................................X
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 1
1.1 OBJETIVO................................................................................................... 3
2 LITERATURA................................................................................................... 4
2.1 CICATRIZAÇÃO.......................................................................................... 4
2.1.1 Coagulação............................................................................................ 5
2.1.2 Inflamação.............................................................................................. 5
2.1.3 Proliferação............................................................................................ 6
2.1.4 Contração............................................................................................... 9
2.1.5 Remodelação....................................................................................... 10
2.2 TIPOS DE FERIDAS ................................................................................. 11
2.3 PRODUTOS UTILIZADOS PARA A CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS........ 11
2.4 METRONIDAZOL...................................................................................... 12
2.4.1 Uso terapêutico.................................................................................... 12
2.4.2 Mecanismo de ação............................................................................. 13
2.4.3 Absorção.............................................................................................. 14
2.4.4 Metronidazol oral e metronidazol gel.................................................... 15
2.4.5 Metronidazol e cicatrização.................................................................. 16
3 MÉTODOS...................................................................................................... 21
3.1 AMOSTRA................................................................................................. 21
vii
3.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO................................................................ 21
3.3 GRUPOS EXPERIMENTAIS..................................................................... 23
3.4 APLICAÇÃO DO METRONIDAZOL .......................................................... 23
3.5 ANÁLISE MACROSCÓPICA..................................................................... 24
3.6 ANÁLISE MICROSCÓPICA MICROBIOLÓGICA...................................... 24
3.7 ANÁLISE MICROSCÓPICA HISTOLÓGICA GERAL E
IMUNOISTOQUÍMICA...................................................................................... 24
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................... 27
4 RESULTADOS............................................................................................... 28
4.1 AVALIAÇÃO HOMOGENEIDADE DA AMOSTRA .................................... 28
4.2 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA................................................................ 28
4.2.1 Grupos Controle................................................................................... 28
4.2.2 Grupos Experimento ............................................................................ 29
4.3 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA ................................................................. 29
4.3.1 Avaliação microbiológica...................................................................... 29
4.3.2 Reação Inflamatória Aguda.................................................................. 31
4.3.3 Colágeno.............................................................................................. 35
4.3.4 Angiogênese ........................................................................................ 39
4.4 AVALIAÇÃO COMPARATIVA DOS RESULTADOS ................................. 42
5 DISCUSSÃO................................................................................................... 43
6 CONCLUSÕES............................................................................................... 47
REFERÊNCIAS.................................................................................................... 48
NORMAS ADOTADAS........................................................................................ 53
APÊNDICE I......................................................................................................... 54
ANEXO I............................................................................................................... 56
ANEXO II.............................................................................................................. 58
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Avaliação percentual das células polimorfonucleares................. 31
Tabela 2 - Avaliação percentual das células monomorfonucleares ............. 32
Tabela 3 - Avaliação do estado inflamatório nos grupos controle e
experimento ................................................................................ 32
ix
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Divisão dos grupos ..................................................................... 23
Quadro 2 - Contagem celular do processo inflamatório................................ 26
Quadro 3 - Caracterização da fase do processo inflamatório de acordo com o
escore final de cada grupo.......................................................... 26
Quadro 4 - Comparação da média da variável peso entre grupos controle e
experimento ................................................................................ 28
Quadro 5 - Resultado das culturas dos grupos controle e experimento em d0
.................................................................................................... 30
Quadro 6 - Resultado das culturas dos grupos controle e experimento em d14
.................................................................................................... 30
Quadro 7 - Comparação dos grupos em relação à presença de bactérias em
d0................................................................................................ 30
Quadro 8 - Comparação dos grupos em relação à presença de bactérias em
d14.............................................................................................. 31
Quadro 9 - Comparação dos grupos em relação à presença de bactérias em
d14.............................................................................................. 42
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Localização da lesão................................................................... 22
Figura 2 - Áreas de leitura histológica......................................................... 25
Figura 3 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão do animal do
grupo controle (C) e do grupo experimento (E), com três dias (d3)
de evolução. Hematoxilina-eosina 400X..................................... 33
Figura 4 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do
grupo controle (C) e do grupo experimento (E), com sete dias (d7)
de evolução. Hematoxilina-eosina 400X..................................... 33
Figura 5 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do
grupo controle (C) e do grupo experimento (E), com quatorze dias
(d14) de evolução. Hematoxilina-eosina 400X............................ 34
Figura 6 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do
grupo controle (C) e do grupo experimento (E), com vinte e um
dias (d21) de evolução. Hematoxilina-eosina 400X.................... 34
Figura 7 - Percentual de colágeno total nos grupos controle e experimento35
Figura 8 - Média dos percentuais de colágeno I nos cortes histológicos dos
grupos controle e experimento.................................................... 36
Figura 9 - Média dos percentuais das áreas ocupadas por colágeno III nos
cortes histológicos dos grupos controle e experimento .............. 37
Figura 10 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do
grupo controle (C) e do grupo experimento (E), com três dias (d3)
de evolução. Sirius Red 200X. O colágeno tipo I apresenta-se nas
cores laranja e vermelho; o colágeno tipo III, na cor verde......... 37
Figura 11 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do
grupo controle (C) e do grupo experimento (E), com sete dias (d7)
xi
de evolução. Sirius Red 200X. O colágeno tipo I apresenta-se nas
cores laranja e vermelho; o colágeno tipo III, na cor verde......... 38
Figura 12 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do
grupo controle (C) e do grupo experimento (E), com quatorze dias
(d14) de evolução. Sirius Red 200X. O colágeno tipo I apresenta-
se nas cores laranja e vermelho; o colágeno tipo III, na cor verde.
.................................................................................................... 38
Figura 13 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do
grupo controle (C) e do grupo experimento (E), com vinte e um
dias (d21) de evolução. Sirius Red 200X. O colágeno tipo I
apresenta-se nas cores laranja e vermelho; o colágeno tipo III, na
cor verde..................................................................................... 39
Figura 14 - Média do número de vasos nos cortes histológicos dos grupos
controle e experimento................................................................ 40
Figura 15 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do
grupo controle (C) e do grupo experimento (E), com três dias (d3)
de evolução. Anti-CD34 400X..................................................... 40
Figura 16 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do
grupo controle (C) e do grupo experimento (E), com sete dias (d7)
de evolução. Anti-CD34 400X..................................................... 41
Figura 17 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do
grupo controle (C) e do grupo experimento (E), com quatorze dias
(d14) de evolução. Anti-CD34 400X............................................ 41
Figura 18 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do
grupo controle (C) e do grupo experimento (E), com vinte e um
dias (d21) de evolução. Anti-CD34 400X.................................... 42
1 INTRODUÇÃO
Até o final da Segunda Guerra, a teoria vigente era a de que as lesões
deveriam permanecer secas para propiciar melhor cicatrização. Em 1945, Bloom
utilizou um filme transparente, permeável ao vapor. Em 1950, Schiling utilizou o
mesmo tipo de filme envolto em moldura adesiva de polivinil. Em 1962, Winter e
Roove referiram o benefício do ambiente úmido para a cicatrização e em 1982,
surgiram as coberturas à base de hidrocolóides, para feridas de espessura
parcial, nos Estados Unidos e Europa, disponibilizadas no mercado brasileiro a
partir de 1990¹.
No início dos anos 90 foram lançados os hidropolímeros, que mantém o
meio úmido, além de promover a evaporação do exsudato, favorecendo a
granulação e diminuindo a maceração de tecidos neoformados¹.
Atualmente, os novos recursos visam acelerar o processo de cicatrização
e reduzir as complicações. Entre estes recursos encontram-se: ácidos graxos
essenciais, colágenos biológicos, hidropolímeros, hidrogéis, hidrocolóides e
enzimas proteolíticas. Porém, o custo, de muitos destes, impede sua maior
utilização
2
.
As estatísticas da América do Norte e da Europa, com relação às úlceras
de pressão, indicam, em pacientes de unidade de terapia intensiva (UTI), uma
prevalência superior a 14,8% e incidência de 0,4 a 38%. Em hospitais para
idosos, com problemas crônicos de saúde, a taxa de prevalência se localiza entre
2,3 a 28% e a incidência entre 2,2 a 23,9%. Para pacientes sob cuidados
domiciliares a prevalência é registrada até 29%, sendo a incidência de 6,3%.
Pessoas com lesão medular apresentam uma taxa de prevalência entre 20 e
60%
3
.
Estudo realizado no Hospital Universitário da Universidade de São Paulo,
com pacientes internados em unidades cirúrgicas, cuidados semi-intensivos e
unidades de terapia intensiva, indicou a incidência de úlceras de pressão entre
29,63 e 42,64%. Outro estudo, na mesma cidade, em uma unidade de terapia
intensiva de um hospital privado, revelou a incidência de 10,62%
4
.
2
A equipe da Divisão de Cirurgia Plástica e Instituto de Ortopedia e
Traumatologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo avaliou 45
pacientes com 77 úlceras. Na maioria, pacientes jovens (média de 34,78 anos),
sendo que 100% dos pacientes com lesão medular, 60% das vítimas de lesões
por arma de fogo e 93,3% dos pacientes com enfermidades crônicas
desenvolveram úlceras. A taxa de recorrência foi de 25%
5
.
Isik et al.
6
referem que nos Estados Unidos da América, o tempo médio de
internação de um serviço de referência é de 20 dias e o gasto é de 21.675
dólares/ úlcera.
Cerca de 2,7% da população tem úlceras crônicas nos pés e pernas,
porcentagem que chega a 10% nos diabéticos e que representa a segunda causa
de afastamento do trabalho no Brasil
7
.
Ereno
7
refere a importância do desenvolvimento de curativos, com preços
razoáveis, para atender 4,5 milhões de pessoas, no Brasil, que, provavelmente,
não possam pagar os altos valores dos medicamentos importados.
Apesar dos resultados de pesquisas isoladas, é provável que os dados
estatísticos não retratem de forma fidedigna o sério problema de saúde pública
que as feridas representam, em função dos escassos registros
8
.
É considerada aguda a ferida que completa o ciclo de cicatrização em
período inferior a oito semanas e crônica a ferida cujo tempo de cicatrização
excede a oito semanas
9
, refletindo no enfoque temporal qualquer alteração nas
fases da cicatrização, é importante que todos os recursos que viabilizam um
menor tempo de cicatrização sejam aplicados às feridas agudas com o intuito de
evitar que as mesmas tornem-se crônicas, culminando com os prejuízos que
estas acarretam.
Há pesquisas que indicam que o metronidazol possui propriedades
relacionadas com a cicatrização, promovendo aceleração da contração e da
epitelização, culminando com a precocidade do processo de reparação
10-12
. Rao
11
após realização de experimento, sugeriu uma relação entre o fim dos produtos
oxidativos e a epitelização. Girish e Patil
13
conferiram ao metronidazol a
propriedade pró-cicatricional em função da promoção da epitelização e da
queratinização.
3
Poletti et al.
14
indicaram a aplicação de metronidazol, gel ou solução, para
o controle do odor. Kalinski et al.
15
referiram que o efeito da desodorização do
metronidazol poderia estar relacionado com a erradicação da infecção anaeróbia.
Considerando que o metronidazol encontra-se disponível na rede pública
e apresenta um baixo custo, sua utilização, em feridas crônicas, poderá
representar o acesso de milhões de pessoas a um tratamento de melhor
qualidade, visando não apenas o benefício particular, do paciente que irá utilizá-
lo, mas a redução dos gastos públicos. Há que se considerar que o gasto público
não se limita ao valor do tratamento da úlcera, apenas, mas inclui o tempo de
afastamento do trabalho e o custo diário de um leito, quando o paciente requer
internamento.
O metronidazol pode significar um passo importante no controle de
feridas, por meio da precocidade do reparo tecidual evitando o alto número de
complicações que oneram os gastos públicos e alteram a qualidade de vida de
uma população sofrida física e psicologicamente.
1.1 OBJETIVO
Avaliar os efeitos provocados pelo antibiótico metronidazol a 4%,
comparados aos efeitos com solução fisiológica, de forma tópica, em feridas com
cicatrização por segunda intenção, em ratos.
2 LITERATURA
2.1 CICATRIZAÇÃO
A cicatrização da pele se faz por uma seqüência de eventos, que ocorrem
após uma lesão que pode acometer a epiderme, parte da derme, toda a derme e
a tela subcutânea, ocasionando lesões superficiais, de espessura parcial ou
espessura total, respectivamente. Esta seqüência de eventos depende, entre
outros fatores, da profundidade da lesão. A cicatrização das feridas superficiais
ocorre por migração das células epidérmicas em direção à superfície e
regeneração das células epiteliais em decorrência da perda da inibição de
contato. As estruturas acessórias encontram-se preservadas. As feridas de
espessura parcial, também, cicatrizam por migração das células epidérmicas e
das células epiteliais. Mesmo ocorrendo dano à derme, as estruturas acessórias
encontram-se preservadas. As feridas de espessura total e as feridas com
comprometimento da tela subcutânea podem ser fechadas de forma primária se
as bordas forem limpas e regulares, do contrário ter-se-á que lançar mão do
fechamento por segunda intenção ou por terceira intenção (também conhecido
como primeira intenção adiada). A segunda intenção é indicada para feridas com
perda de tecido, bordas irregulares, necrose tecidual, contaminação ou presença
de tecidos desvitalizados. O fechamento por terceira intenção, onde as bordas
são aproximadas, é indicado quando existe contaminação, perda de tecido ou
risco de infecção
16
.
As fases da cicatrização não possuem marcos específicos que indiquem,
exatamente, onde começa ou termina uma fase. As fases possuem
acontecimentos que as caracterizam, ocorrendo várias divisões do processo de
cicatrização de acordo com o entendimento do autor, procurando todos,
invariavelmente, a apresentação mais didática. A cicatrização de uma ferida
passa por vários processos como: coagulação, inflamação, síntese e deposição
de matriz, angiogênese, fibroplasia, epitelização, contração e remodelação
17
. De
acordo com Mandelbaum et al.
1
pode-se dividir o processo em cinco fases
5
principais: coagulação, inflamação, proliferação, contração e remodelação. Sendo
que a proliferação é dividida em três subfases: reepitelização, fibroplasia e
angiogênese.
2.1.1 Coagulação
Inicia-se, imediatamente, após o surgimento da ferida. No momento da
lesão a formação do coágulo protege a ferida e forma uma matriz, por meio da
qual migram as células durante o processo de reparo. O coágulo consiste de
plaquetas embebidas em uma rede de fibras de fibrina, derivadas da trombina,
associadas à fibronectina plasmática, vitronectina e trombospondina. O coágulo
serve como reserva de citocinas e fatores de crescimento. Os fatores de
crescimento providenciam sinais quimiotáticos que recrutam células inflamatórias
para o local das feridas, iniciam os movimentos celulares de reepitelização e a
contração do tecido conjuntivo
18
.
2.1.2 Inflamação
O processo inflamatório caracteriza-se por apresentar as fases de
hemostasia, deposição de matriz provisória e migração celular
19
. A inflamação é
manifestada por eritema, calor, edema e dor, sendo estes causados pela
vasodilatação capilar e aumento da permeabilidade. Estas alterações vasculares
permitem o extravasamento de proteínas plasmáticas no local da ferida. O
sistema nervoso promove a vasodilatação e o aumento da permeabilidade. As
plaquetas secretam o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), que
ativa os macrófagos e os fibroblastos. Os polimorfonucleares são as primeiras
células inflamatórias a chegarem ao local, em conjunto com fatores de
crescimento e citocinas, com PDGF e interleucinas 1, 6, 8 (IL-1, IL-6, IL-8). Os
polimorfonucleares servem para realizar a limpeza da ferida, removendo os restos
celulares, sendo, também, uma fonte importante de pró-citocinas e de TNF
17
. A
infiltração dos monócitos se dá pela influência do fator de crescimento
transformador (TGF). O PDGF e o fator de crescimento endotelial vascular
6
(VEGF) induzem à formação do tecido de granulação. Aderidos à matriz
extracelular os monócitos transformam-se em macrófagos, os quais secretam as
citocinas pró-inflamatórias, entre elas: fator de necrose tumoral ácido (TNF-a),
fator de crescimento insulina similar 1 (IGF-1) e as interleucinas
19
.
2.1.3 Proliferação
A fase de proliferação é dividida em: reepitelização, fibroplasia e
angiogênese
1
.
2.1.3.1 Reepitelização
Um ou dois dias após a lesão, as células epidermais começam a proliferar
e migrar
20
. Os macrófagos produzem fator de crescimento transformador básico
(TGF-b), fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF-2) e IGF-1, os quais
influenciam o processo de reepitelização
18
. A reepitelização é máxima entre 48 e
72h após a lesão
16
. A mesma cobre, protegendo, a área de falha tecidual que é
preenchida pela granulação e sofre processo de contração
1
. A alteração do
fenótipo promove: retração dos tonofilamentos, dissolução dos desmossomos e
formação dos filamentos de actina e miosina que são responsáveis pela
mobilização. O estímulo para a proliferação e a migração ocorre em função da
ausência de células vizinhas, da ação dos fatores de crescimento e do aumento
de seus receptores. As células epidermais readquirem seu fenótipo, quando
cessa a migração
20
.
2.1.3.2 Fibroplasia
Refere-se ao processo de produção de colágeno e aumento da força
tensil da cicatriz. A síntese de colágeno aumenta durante os primeiros dias e
continua durante duas a quatro semanas, começando a declinar depois de um
mês
12
.
A formação do tecido de granulação (a granulação e a contração
promovem o preenchimento da falta de tecido) começa próximo ao terceiro dia
16
.
7
As moléculas estruturais que formam a nova matriz extracelular
contribuem para a formação do tecido de granulação, o qual vai servir de base
para a migração celular. As moléculas incluem: fibrina, fibronectina ácido
hialurônico. Os fibroblastos são os responsáveis pela síntese, remodelação e
deposição da matriz e interagem com a mesma
20,21
.
O tecido de granulação é um tecido brilhante, vermelho vivo, com
ondulações, composto por uma mescla de elementos celulares, incluindo
fibroblastos, células inflamatórias, componentes neovasculares e da matriz, como
fibronectina, glicosaminoglicanas e o colágeno
1
.
Entre dois e quatro dias depois do trauma, tem-se a migração e a
multiplicação de células mesenquimatosas. A migração dos fibroblastos é dirigida
pela fibronectina, depositada durante as fases iniciais, sendo que o movimento é
facilitado pela presença de grandes quantidades de ácido hialurônico, na matriz
extracelular. Os fibroblastos liberam citocinas que atraem outros fibroblastos. Para
que ocorra a migração é necessária a presença de algumas enzimas proteolíticas
que ajudam a abrir o caminho através da rede de fibrina: a metaloproteinase
matricial 1 (MMP-1), a gelatinase (MMP-2) e a estromelisina (MMP-3). A
concentração de células mesenquimatosas na ferida aumenta graças à
multiplicação dos fibroblastos locais. As mitoses são estimuladas por TGF-b, TNF,
IL-1, fator de crescimento epidérmico (EGF), PDGF, linfocinas e insulina
12
.
O fibroblasto excreta um monômero denominado pró-colágeno. A enzima
pró-colágeno peptidase cliva os pró-peptídeos, originando o tropocolágeno. As
moléculas de tropocolágeno se reúnem formando as fibrilas com as
características bandas de 67 nanômetros. As fibras reticulares do colágeno do
tipo III, são mais delgadas que o colágeno tipo I; possuem maior quantidade de
carboidratos. A cicatrização das feridas cirúrgicas é realizada, de início, com o
colágeno tipo III, que mais tarde será substituído pelo colágeno tipo I, que é mais
resistente. Simões e Cabral
21
registraram a presença de colágeno do tipo I e do
tipo III ao mesmo tempo, sintetizados por fibroblastos. A deposição dos mesmos
apresentava-se sem orientação. Verificaram que a maioria das fibrilas colágenas
tipo III era substituída por fibrilas colágenas tipo I.
A síntese de colágeno soma-se a outros componentes da matriz
extracelular, entre eles fibronectina, elastina e mucopolissacarídeos ou
proteoglicanos. Os fibroblastos produzem condroitina sulfato, dermatano sulfato,
8
heparina, queratano sulfato e ácido hialurônico, substâncias que potencializam a
ação das citocinas
22
. Os componentes da matriz extracelular e os fatores de
crescimento interagem de forma complexa atuando na regulação da formação dos
vasos sangüíneos. Algumas proteínas da matriz podem inibir a angiogênese,
como exemplo a fibronectina
23-5
.
A fibronectina é parte da fibrina e está associada à deposição de fibras
colágenas, fibrilas que são compostas por colágeno tipo III. A produção de
fibronectina aumenta o crescimento do tecido de granulação o que permite a
mobilização dos fibroblastos. A fibronectina servirá como a matriz que unirá os
fibroblastos, formando uma rede
26
. Assim como a fibronectina pode inibir a
angiogênese, outras, como exemplo o colágeno tipo I, podem estimular a
formação de vasos durante o reparo da ferida
27
.
2.1.3.3 Angiogênese
Thakral et al.
26
propõem a hipótese da existência de uma célula que
traduz os múltiplos estímulos da lesão para sinais químicos os quais promovem
regeneração celular, formação de colágeno e fibrose. Todos os sinais que levam
à cicatrização, envolvem o crescimento vascular. O perfil da função desta célula
tradutora é do macrófago, sendo ele indicado como importante célula envolvida
na angiogênese. Stashak et al. citados por Souza et al.
28
referem que a
angiogênese favorece o tempo de cicatrização por aumentar o aporte de
nutrientes e o ingresso celular na região afetada, diminuindo, desta forma, o
tempo de retração da ferida.
A angiogênese é estimulada por macrófagos por meio da liberação de
FGF-2 e VEGF-a. É a responsável pela produção do tecido de granulação, tendo
como precedente a ação dos macrófagos que depositam a matriz do tecido
conjuntivo promovendo a presença do substrato da ferida para onde vão migrar
macrófagos, angioblastos e fibroblastos. As células endoteliais, por ação química
e dos fatores de crescimento, liberam enzimas que destroem a membrana basal
dos vasos sanguíneos existentes. Rudolph e Ballantyne citados por Balbino et
al
29
.
referem que ocorre a migração das células endoteliais, que atravessam a
parede do vaso e através da matriz extracelular seguem em direção ao sítio da
lesão. Uma vez na região externa do vaso, passam por um processo de
9
diferenciação e adquirem a capacidade de formar novos tubos capilares. As
células endoteliais migratórias formam, na parte externa do vaso, um broto capilar
que se une ao capilar de origem restabelecendo o fluxo sangüíneo.
A formação do neovaso começa com a agressão tecidual, com a ativação
dos macrófagos e as substâncias que estes produzem. As proteases (plasmina e
colagenases) digerem a membrana basal e permitem que as células endoteliais
estimuladas pelas citocinas angiogênicas formem o novo novelo vascular que
invade a ferida. A angiogênese cessa por apoptose
19,20
.
O movimento dos pseudópodos é favorecido pela fibronectina, pelas
colagenases e pela integrina. Os altos níveis de lactato, o ph ácido e a diminuição
da tensão de oxigênio na área lesionada estimulam a recanalização dos plexos
capilares. Os macrófagos estimulados por altas concentrações de ácido lático,
diminuição da pressão parcial de oxigênio e algumas aminas biogênicas liberam
citocinas que facilitam a migração e a proliferação endotelial. As citocinas
encontradas são: TGF-a e TGF-b, EGF, TNF-a, PDGF, angiogenina, IL-8 e FGF-
b; podendo, ainda, apresentar algum grau de atuação as prostaglandinas e os
lipídios provenientes dos adipócitos
22
.
2.1.4 Contração
Denomina-se contração ao deslocamento tecidual centrípto, das margens
ao centro da ferida, que ocorre entre 3 e 5 dias após a lesão
22
.
Para Mandelbaum et al.
1
a contração da ferida, em processos de
cicatrização por segunda intenção, poderá ser responsável por uma taxa de
redução de até 62% da superfície de lesão cutânea. O fenômeno se observa
quando os tecidos próximos são móveis. A pele avança com uma velocidade
entre 0,6 e 0,75 mm diários e cessa por inibição de contato, quando a ferida está
fechada, ou quando a tensão excede a força centrípta.
Uma semana após o aparecimento da ferida, o coágulo será preenchido e
invadido por fibroblastos que são estimulados pelo TGF-b e outros fatores de
crescimento que sintetizam e remodelam uma nova matriz rica em colágeno.
Nesta fase, tem-se a transformação de fibroblastos em miofibroblastos, os quais
assemelham-se à células musculares lisas, em sua capacidade contrátil
29,30
.
10
A diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos pode ser induzida por
uma baixa densidade de fibras. Dois fatores interagem para a transformação de
fibroblastos em miofibroblastos: a perda de contato celular e a ação do TGF-b
31
.
O mecanismo responsável pela contração, especificamente, pode se
dever ao movimento dos miofibroblastos através da matriz extracelular. Estes
possuem em seu citoplasma fibras contráteis de actina e miosina, que se originam
de células mesenquimatosas, de mononucleares circulantes ou de fibrócitos
situados ao redor da adventícia de vasos sanguíneos locais, processo facilitado
pelo TGF-b. Os fibroblastos das margens da ferida apresentam mudança de
fenótipo para miofibroblastos, com características funcionais similares ao músculo
liso. Estes miofibroblastos encontram-se alinhados ao redor de depósitos da nova
matriz extracelular, fazendo uniões célula à célula e gerando a força de tensão
29
.
2.1.5 Remodelação
A modelagem do colágeno ocorre pelo equilíbrio entre a síntese e a
degradação deste. Este processo é mediado pelas enzimas proteolíticas
(metaloproteinases), células epidérmicas, células endoteliais e fibroblastos
19
. No
remodelamento ocorrem etapas sucessivas de produção, digestão e orientação
das fibras de colágeno. As fibras são digeridas pela colagenase, ressintetizadas,
rearranjadas de acordo com a organização das fibras do tecido conjuntivo
adjacente e ligadas, lateralmente, por ligações covalentes. A quantidade de
colágeno aumenta durante as primeiras semanas e por volta de 21 dias ocorre um
equilíbrio entre a produção e a degradação. A resistência da cicatriz é dada pela
quantidade de colágeno depositada e pela forma com que as fibras estão
organizadas, sendo o aumento da resistência maior do que poder-se-ia esperar
apenas pela deposição do colágeno. Este processo tem início por volta da terceira
semana após o trauma e persiste por meses ou anos
18,29
.
11
2.2 TIPOS DE FERIDAS
Para o manejo adequado das feridas é importante sua classificação.
As feridas, freqüentemente, são classificadas em agudas e crônicas.
Feridas agudas completam o ciclo de cicatrização em tempo inferior a oito
semanas. Feridas crônicas apresentam falhas na seqüência ou no tempo das
fases da cicatrização
9
.
Segundo a Agency for Healthcare Research Quality (AHRQ)
32
as feridas
de pele são classificadas em feridas de pressão, feridas inflamatórias, feridas por
insuficiência vascular, feridas malignas e miscelânea, que envolve outros tipos de
feridas que não se enquadram nas anteriores. As feridas de pressão dividem-se
em úlceras de decúbito e úlceras neuropáticas; as inflamatórias em desordens
auto-imunes e desordens cutâneas primárias; as feridas por insuficiência vascular
dividem-se em feridas por insuficiência arterial e insuficiência venosa; as malignas
em feridas cutâneas malignas primárias e cutâneas malignas secundárias e a
divisão miscelânea inclui queimaduras, lesões por radiação, lesões por frio,
úlceras por vasculites e picadas de aranha.
As úlceras de decúbito são classificadas de acordo com as definições da
National Pressure Ulcer Advisory Panel (NPUAP)
3
, que avalia a profundidade,
sendo úlcera do estágio I, a alteração relacionada à área de eritema; úlcera do
estágio II, as com perda cutânea de espessura parcial, sem estender-se por toda
a espessura da derme; úlcera do estágio III, as com comprometimento da tela
subcutânea, porém sem comprometer a fáscia e úlcera do estágio IV, aquelas que
se estendem além da fáscia.
2.3 PRODUTOS UTILIZADOS PARA A CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS
Os produtos utilizados para a cicatrização de feridas estão, didaticamente,
agrupados, segundo Mandelbaum et al.
2
, em: recursos destinados à proteção da
pele contra agressões mecânicas ou químicas e prevenção de infecções;
produtos para higienização e antissepsia; produtos para desbridamento químico,
enzimático, autolítico e mecânico; coberturas primárias (entram em contato direto
com o leito da ferida) ou secundárias (fixam as coberturas primárias); produtos
para fixação de coberturas e complementos (faixas e ataduras) e agentes tópicos.
12
Os principais recursos disponíveis, no Brasil, são: ácidos graxos
essenciais; produtos à base de alginato de cálcio; antissépticos e degermantes;
bandagens para compressão; carvão ativado e prata; filmes semipermeáveis;
colágenos biológicos; produtos que utilizam fatores de crescimento;
hidropolímeros; hidrogéis; hidrocolóides; enzimas proteolíticas, isoladas e
combinadas; sulfadiazinas de prata; acetatos de celulose permeáveis ao calor;
protetores cutâneos; membranas permeáveis ao vapor; curativos de gaze
simples; curativos de gaze não aderentes; matrizes de regeneração dérmica;
biopolímeros do látex da seringueira
6
e outros recursos auxiliares e tecnologias
em uso ou em fase de pesquisa como cultura de tecidos e transplante de
fibroblastos, modulações e terapias genéticas, ácidos hialurônicos, agentes
fitoterápicos, laser de baixa potência, terapias larvais, terapias alternativas,
oxigenoterapias hiperbáricas, silicones (em gel, placas e tiras), moldes de contato
total, tratamentos fisioterápicos e derivados do intestino de porco
2
.
2.4 METRONIDAZOL
2.4.1 Uso terapêutico
O metronidazol (1-beta-hidroxietil-2-metil-5-nitroimidazol) é um antibiótico
ativo contra anaeróbios obrigatórios, não tendo atividade significativa contra
anaeróbios facultativos ou aeróbios obrigatórios
33-35
.
O uso terapêutico se faz para protozoários, apresentando alta taxa de
resposta no tratamento para Trichomonas vaginalis
36
em homens e mulheres,
tratamento eficaz contra amebíase, Entamoeba histolytica, Giárdia lamblia.
Apresenta eficácia contra bactérias anaeróbias susceptíveis incluindo Bacteróides
fragilis
37
, Clostridium, Fusobacterium, Peptococcus, Peptoestreptococcus,
Eubacterium, Helicobacter, Campilobacter fetus, Espiroquetas e Gardnerella
vaginalis. É indicado para infecções causadas pelo Bacteróide fragilis
38
e pelo
Clostridium perfringens. É, ainda, eficaz no tratamento da colite
pseudomembranosa causada pelo Clostridium difficile
33
. Também indicado para
infecções dentárias agudas e gengivoperiodontais, como a estomatite de Vicent
33
.
Actinomyces possui a maior parte das cepas resistentes
35,39
. Útil ao combate do
crescimento bacteriano associado à doença de Crohn. Devido à penetração
tecidual pode atingir níveis, clinicamente, eficazes em ossos, articulações e
13
cérebro. Infecções intra-abdominais, ginecológicas, dérmicas, abscesso
cerebral
35,37,40,41
, septicemia bacteriana e endocardite por anaeróbios susceptíveis
respondem a esse fármaco. O metronidazol penetra no cérebro e no líquido
cefalorraquidiano
37,38,42,43
.
Segundo Jokipii et al.
38
e O’Grady et al.
43
o metronidazol apresenta nível
no líquido cerebroespinhal, sendo efetivo agente nas infecções anaeróbias do
sistema nervoso central.
2.4.2 Mecanismo de ação
O mecanismo de ação inicia-se com a penetração da droga na célula
bacteriana, na seqüência ocorre uma atividade redutora, gerando um efeito tóxico
do derivado reduzido, finalizando com a ocorrência da liberação de produtos finais
inativos.
A reação redox se faz em proteínas, em Trichomonas e em ferredoxinas,
em Clostridia
44
.
Essas proteínas reduzem o grupo nitro do metronidazol mediante
reação química não enzimática
44-46
.
A transferência única de elétrons forma um
ânion do radical nitro, reativo, que mata os microorganismos susceptíveis por
mecanismos mediados pelos radicais livres ou compostos intermediários de vida
curta que têm como alvo o DNA e outras biomoléculas vitais
47,48
. Os produtos
tóxicos que se ligam ao DNA inibem sua síntese, resultando na morte celular
47-49
.
A ação específica contra anaeróbios estritos ocorre em função destas bactérias
obterem a sua energia pela oxidação de uma enzima complexa (tiamina
pirofosfatase) que utiliza ferredoxinas ou proteínas como seus transferidores
elétricos. Toda a atividade biológica é devida à redução do seu grupo nitro
44,48-51
.
Edwards et al.
44
indicaram que o mecanismo de ação de uma droga
interfere com o mecanismo peculiar dos diferentes grupos taxonômicos. Referiram
que o espectro de atividade de uma droga reflete seu desenvolvimento biológico.
Nos microorganismos, o hidrogênio está ligado ao mecanismo de transferência de
elétrons, o que ocasiona a redução do grupo nitro. A seletiva toxicidade é
explicada pelo fato de que somente anaeróbios possuem o sistema de redução de
elétrons de potencial negativo. Com a redução dos elétrons, ocorre a formação de
substâncias letais dentro da célula.
14
2.4.3 Absorção
Elewski
52
realizou estudo da cinética da absorção percutânea de
formulações tópicas de metronidazol em pele de cadáver humano in vitro. Foi
avaliada a farmacocinética da absorção percutânea do metronidazol em
diferentes veículos e concentrações, com o agente ativo em seis formulações
tópicas. A pele humana foi conectada a um difusor celular denominado Franz cells
que permite que a mesma seja mantida em temperatura e umidade que simulam
as condições in vivo. O estudo revelou que o fator mais importante para a
penetração do metronidazol através da pele é o veículo, sobrepujando a
concentração do mesmo. Neste estudo o ranking das concentrações foi de maior
absorção para o creme, seguido da loção e tendo como padrão de menor
absorção o gel.
Stolze e Stellfeld
53
avaliaram a absorção sistêmica do metronidazol com
sua aplicação tópica em gel a 25%, em bolsas periodontais inflamadas, a uma
profundidade maior ou igual a cinco milímetros, sendo aplicado em, no mínimo,
dez dentes. O sangue foi colhido antes e após a aplicação do gel, para avaliar a
biodisponibilidade da medicação. Após sete dias os mesmos pacientes receberam
metronidazol na dose de 100mg EV; foi colhido sangue após 48h da aplicação
EV. Após 30h da aplicação do gel, o metronidazol foi encontrado em 100% dos
pacientes; após 36h em 93% dos pacientes; após 48h em 33% dos pacientes e
após 72h, foi encontrado em 9% dos pacientes. A média de eliminação da meia
vida foi idêntica, após as duas formas de 410 minutos. O pico sérico do
metronidazol após aplicação EV foi de, aproximadamente, cinco e dez
microgramas/mililitro, após doses de 250 e 500mg, respectivamente. O tempo
para o pico de concentração, sendo utilizado como forma de avaliar a taxa de
absorção do metronidazol, 25 minutos a quatro horas, mas a média foi de,
aproximadamente, uma hora. O pico de concentração plasmática após aplicação
do gel foi de seis décimos de micrômetro/mililitro, após quatro horas; tal fato
demonstrou que a principal concentração do metronidazol no fluido gengival após
quatro horas, foi alto, 461 µg/ml. O estudo demonstrou que se pode obter altas
concentrações de metronidazol, nas bolsas periodontais, com metronidazol a
25%, sem induzir à altas concentrações plasmáticas.
15
2.4.4 Metronidazol oral e metronidazol gel
Rao et al.
54
compararam o metronidazol oral com o metronidazol gel, em
queimados, nas feridas de espessura parcial, apresentando que o uso oral
acelerou o processo de epitelização, enquanto o uso tópico o deprimiu, o
retardou. O texto reportou que ele é citotóxico em células de mamíferos em
crescimento in vitro, dando suporte ao efeito depressivo do metronidazol em
cicatrização de feridas. Apresentaram como resultado sinais avançados de
cicatrização (restauração completa da epiderme, alta quantidade de feixes de
colágeno na derme e ausência de células inflamatórias na mesma) nas feridas
dos animais tratados com metronidazol oral. Seu uso sistêmico elimina radicais
livres e previne a peroxidação lipídica, reduzindo a perda de área tecidual em
queimados, promovendo a cicatrização. As feridas dos animais tratados com
metronidazol local não apresentaram os mesmos resultados do grupo tratado com
via oral. Na opinião dos autores a alta concentração da forma tópica promoveu o
efeito de citotoxicidade o que retardou a cicatrização, mesmo o metronidazol
tendo um efeito antioxidante. Os autores, ainda, registraram que as formulações
da base em que o mesmo foi colocado eram diferentes. A formulação MGEL-1,
com a qual o resultado não apresentou cicatrização significativa era composta por
carbonados, metil parabenzeno, propil parabenzeno, di-sódio, propileno-glicol e
água para injeção. A formulação MGEL-2, a qual demonstrou efeitos pró
cicatrizantes, era composta por carbopol, álcool isopropílico, di-etanolamina e
alantoína. Os autores acreditam que a alantoína contida na formulação do MGEL-
2 poderia ser a responsável pela reversão do efeito adverso do metronidazol.
Noyan et al.
55
realizaram estudo com o produto Elysol® (metronidazol
25% para uso local), fazendo avaliação clínica e microbiológica de seis grupos de
pacientes com periodontite, durante 42 dias. Para avaliação do estado clínico foi
observado estado gengival, profundidade alveolar e nível de fixação. O primeiro
grupo foi tratado apenas com desbridamento subgengival, o segundo grupo
recebeu metronidazol local, o terceiro grupo metronidazol sistêmico, o quarto
grupo metronidazol local associado a desbridamento subgengival, o quinto grupo
metronidazol sistêmico associado a desbridamento subgengival e o sexto grupo
não recebeu tratamento. A cultura inicial colhida da bolsa gengival apresentou
16
crescimento de bactérias anaeróbias obrigatórias gram negativas: Prevotella
intermédia, Porphyromonas gengivalis, Fusobacterium spp e Campylobacter
rectus. Na cultura, verificou-se, ainda, bactérias anaeróbias facultativas gram
negativas: Capnocytophaga spp, Eikenella corrodens e Actinobacillus
actinomycetemcomitans. Concluiram que todos os grupos resultaram em melhora
clínica (estado gengival/ profundidade alveolar/ nível de fixação) e todos os
tratamentos reduziram o número de microorganismos anaeróbios,exceto o grupo
não tratado. As combinações funcionaram melhor que apenas o desbridamento
subgengival ou apenas o metronidazol. Metronidazol local em combinação com o
desbridamento subgengival pareceu ser mais efetivo, produzindo melhora clínica
e microbiológica.
2.4.5 Metronidazol e cicatrização
2.4.5.1 Metronidazol enteral
Borden et al.
57
determinaram, por meio de estudo comparando 25 ratos
Sprague Dawley tratados com injeção intraperitoneal de metronidazol e 25 ratos
Sprague Dawley tratados com injeção de soro fisiológico, após confecção de
defeito circular, com um centímetro de diâmetro, de espessura total na pele e
incisão standard de laparotomia em linha média, concluiram que não houve
diferença significativa na contração da ferida e na força de resistência da pele;
houve diminuição da força de resistência da aponeurose dos animais tratados
com metronidazol, na segunda e na terceira semana de cicatrização,
desaparecendo após este período e vindo a apresentar a mesma força de
resistência tensional máxima na quinta semana. Concluindo, os autores, referiram
atraso na cicatrização da fáscia da parede abdominal, com efeito revertido no
transcorrer da cicatrização.
Para Prasad e Rao
10
o metronidazol acelera a contração e a epitelização.
Em estudo experimental avaliaram o efeito do cetorolaco, do metronidazol e do
tinidazol na cicatrização pós-operatória, utilizando 4mg/kg para o cetorolaco;
160mg/kg para o metronidazol e 180mg/kg para o tinidazol; todos por via oral. Os
animais foram divididos em dois grupos: ferida aberta e espaço morto, sendo este
17
avaliado pela introdução de um tubo de polietileno. Registraram que a quantidade
de hidroxiprolina das feridas dos animais, em uso de cetorolaco, metronidazol e
tinidazol, foi, significativamente, menor que no grupo controle. O metronidazol e o
tinidazol aumentaram a taxa de contração da ferida e aceleraram a epitelização,
principalmente entre o 12.º e 16.º dias; efeito este não percebido no grupo em uso
do cetorolaco.
Rao
et al.
11
realizaram experimento, pretendendo avaliar a propriedade
antioxidante do metronidazol e se o mesmo promovia a cicatrização em ratos
queimados, comparando o mesmo com dois antioxidantes conhecidos, a vitamina
C e a vitamina E. O experimento foi realizado com cinco grupos de animais; o
primeiro grupo foi usado para determinar os níveis séricos de malonaldeído, não
apresentando queimaduras; o malonaldeído é um aldeído de cadeia curta, sendo
sua formação decorrente da decomposição dos hidroperóxidos lipídicos e sua
concentração utilizada para estimar a intensidade da peroxidação lipídica em
sistemas biológicos, em células e em tecidos
56
. O segundo grupo apresentou
queimadura de espessura parcial, sendo usado como controle dos queimados; o
terceiro grupo recebeu metronidazol 180mg/kg V.O; o quarto recebeu vitamina C
180mg/kg V.O. e o quinto grupo recebeu vitamina E 180mg/kg V.O. Referiram que
radicais livres de oxigênio (ânion superóxido e radicais hidroxi) são produzidos
pela peroxidação lipídica pós queimadura e que estes radicais estão implicados
no desenvolvimento do choque. Malonaldeído, pode ser medido no soro; a
peroxidação lipídica próxima ao local da queimadura causa destruição tecidual
excessiva. Referiram, ainda, que qualquer fator que reduzisse a peroxidação
lipídica ajudaria a promover a cicatrização de lesões por queimaduras. Os grupos
metronidazol, vitamina C e vitamina E apresentaram epitelização precoce, em
mais de dois dias de diferença em relação ao grupo controle. O metronidazol
apresentou propriedade antioxidante equivalente à vitamina E. O mesmo reduziu,
significativamente, a quantidade do malonaldeído, no soro, em 48h pós
queimadura; ofereceu proteção contra infecções anaeróbias, também protegendo
contra alguns aspectos do estresse oxidativo induzido por queimaduras. O
resultado do trabalho sugere uma linha entre o fim dos produtos oxidativos e a
epitelização.
Girish e Patil
13
realizaram avaliação do uso oral de metronidazol com
dose de 108mg, tinidazol com dose de 180mg, cetoconazol com dose de 18mg e
18
fluconazol com dose de 18mg, na cicatrização de incisão cirúrgica de abdômen,
excisão de pele e ferida com espaço morto. Referiram que o efeito antioxidante do
metronidazol aumentou o processo de cicatrização em queimados; o aumento
que o mesmo promove da epitelização e da queratinização, conferem a esse a
propriedade pró cicatricial.
Girish e Patil
13
,
em estudo publicado em 2005, referiram aumento na
contração; os mesmos acreditaram que o resultado desfavorável obtido por
Borden et al.
57
foi devido a baixa dose utilizada, pois os mesmos utilizaram a
dosagem de 108mg/kg. emonstraram, também, aumento da força tensional do
tecido, do tecido de granulação e do conteúdo de hidroxiprolina. O estudo referiu,
na análise histológica, aumento do número de fibroblastos e colágeno nas feridas
dos grupos de tratamento em relação ao grupo controle. Os mesmos utilizaram a
dosagem de 108mg/kg durante dez dias. O resultado discordante de Prasad
10
,
para Girish e Patil
13
se deveu ao fato do mesmo utilizar altas doses de
metronidazol (160mg/kg).
2.4.5.2 Metronidazol tópico
Mandelbaum et al.
1
referiram que vários agentes tópicos atrapalham a
migração epidérmica, quando comparados a grupos de não tratamento. Citaram
que o acetato de triancinolona 0,1% diminuiu 34% a taxa relativa de cura;
nitrofurazona diminuiu 39%; ao contrário peróxido de benzoíla e coberturas com
permeabilidade seletiva melhoraram em 14%; a sulfadiazina de prata e pomada
de neosporina melhoraram em 28%.
O que altera o equilíbrio hospedeiro bactéria é a proliferação bacteriana,
com sua produção de endotoxinas e metaloproteinases, que vão interferir no
processo de cicatrização
58
.
Robson et al.
17
referiu que, nas feridas crônicas, já existe uma flora
bacteriana local, sendo a característica destas feridas a presença de tecido de
granulação, que ocorre na presença de bactérias. As feridas crônicas estão,
freqüentemente, em desequilíbrio bacteriano e os antibióticos sistêmicos têm
demonstrado que não alcançam níveis adequados em tecido de granulação
crônico, não tendo efeito adequado no nível bacteriano desta ferida. Ao contrário,
19
os antibióticos tópicos em forma de creme penetram a profundidade destas
feridas e têm efeito direto no crescimento bacteriano.
Segundo Trindade Neto et al.
59
o gel de metronidazol, em tratamento
concomitante à tetraciclina e seus derivados, é usado para o tratamento de
rosácea leve a moderada com bons resultados, mantendo o paciente em
remissão. Descreveram um caso de rosácea granulomatosa tratada com
limeciclina oral 300 mg/dia e metronidazol gel 0,5% tópico, por 15 dias, na
seqüência limeciclina oral 150mg/dia e metronidazol gel 0,5% por 30 dias, sendo
instituída manutenção da medicação tópica com mais 30 dias, com regressão
completa do quadro.
Poi
51
realizou estudo experimental em ratos, induzindo alveolite e
avaliando o uso tópico da pasta de metronidazol a 10%, aromatizada com menta,
carboximetilcelulose ou lanolina como veículo, comparando com limpeza cirúrgica
e irrigação com soro fisiológico. A composição metronidazol 10%, lidocaína 2%,
menta e carboximetilcelulose ou lanolina, apresentou resultados que indicaram
que a sua aplicação em alvéolos acometidos por alveolite, constitui-se numa
segura opção para o controle da alveolite. Não houve diferença significante entre
os veículos lanolina e carboximetilcelulose. O composto com carboximetilcelulose
apresentou ossificação mais intensa nos terços médio e apical. Dados referentes
a estudos com carboximetilcelulose evidenciaram a utilidade deste material como
veículo para medicações tópicas e proteção mecânica da cavidade bucal, por um
maior espaço de tempo. A carboximetilcelulose é obtida pela ação do derivado
sódico do ácido cloroacético sobre a celulose alcalina, polverenta, branca, usada
na indústria de tintas, de adesivos, em análise química, como antiácido e laxativo.
O material apresentou-se efetivo por manter altas concentrações do agente sobre
a lesão; diminuir a quantidade de material a ser aplicado; aumentar a duração dos
efeitos locais; diminuir a quantidade de material disperso na água e promover
proteção mecânica sobre a lesão. A lanolina, que é uma mistura de colesterol e
seus ésteres, obtida da gordura da lã e usada como base de pomadas e
cosméticos, já foi utilizada como veículo em associações medicamentosas
destinadas em aplicações intra-alveolares.
Pedrazzoli et al.
60
compararam o uso tópico do metronidazol a 25% e o
desbridamento mecânico subgengival, em casos de periodontite, em adultos.
Ambos os tratamentos foram efetivos, no tocante à redução da profundidade da
20
bolsa e do sangramento. O metronidazol induziu a uma mudança importante da
flora subgengival. Ambos os tratamentos reduziram as proporções de
espiroquetas e Prevotella intermedia, com aumento de estreptococos. O
desbridamento aumentou a proporção de Actinobacillus actinomycetemcomitans,
o que foi evitado com o uso do metronidazol. Para o autor o uso tópico do
metronidazol pareceu ser mais efetivo que a terapia mecânica convencional no
tratamento da periodontite.
Mitchell
61
referiu que o metronidazol elimina anaeróbios patogênicos e não
causa distúrbio na flora aeróbia colonizadora.
Walwaikar et al.
62
realizaram estudo avaliando a eficácia e a segurança
da combinação, para uso tópico, metronidazol e iodopovidine (grupo I) em pré e
pós- operatórios de pacientes em comparação com iodopovidine usado sozinho
(grupo II). O estudo apontou melhores resultados para a combinação
metronidazol e iodopovidine; sendo que as culturas das feridas cirúrgicas foram
60% negativas no grupo do metronidazol associado ao PVPI; no grupo do PVPI
isolado as culturas foram 28% negativas. Ocorreu infecção cirúrgica em 12,3% do
grupo I e 24% do grupo II. Os pacientes que fizeram uso da associação
metronidazol e PVPI deixaram o hospital, em média dois dias antes que os
pacientes que utilizaram o PVPI isolado. Os resultados deveram-se ao fato do
metronidazol quebrar o sinergismo bacteriano entre anaeróbios e aeróbios,
promovendo a inibição da fagocitose dos aeróbios por parte dos leucócitos, em
função de substâncias produzidas pelos anaeróbios. Somado à quebra do
sinergismo bacteriano pelo metronidazol temos que o mesmo apresenta ação
antiinflamatória, sendo esta propriedade responsável pela redução e
abrandamento dos parâmetros relacionados à dor, em pacientes tratados com
essa combinação.
Nicholson e Armstrong
12
referiram que o metronidazol tópico a 10%
promoveu diminuição da dor pós hemorroidectomia e melhorou a cicatrização. O
veículo do creme utilizado foi petrolato, mesma substância utilizada como
controle. Concluiram que, no grupo do metronidazol, a dor da ferida incisional foi
minimizada em 7 e 14 dias, significativamente, e houve menos edema e melhor
cicatrização total. O uso do metronidazol oral não mostrou diferença entre os
grupos estudados.
3 MÉTODOS
O projeto que deu origem a este estudo foi submetido ao Comitê de Ética no
Uso de Animais da Pontifícia Universidade Católica do Paraná e aprovado sob n.º
231 (anexo I), tendo obedecido as orientações da Lei 6638 e as recomendações
do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
3.1 AMOSTRA
O estudo foi experimental, no qual foram utilizados 80 ratos machos (Rattus
norvegicus albinus, Rodentia mammalia), da linhagem Wistar, adultos jovens com
idade de 90 dias e com peso entre 184,28g e 255,56g. Alocados em grupos
controle e experimento.
Os animais provenientes do Biotério Central da Pontifícia Universidade
Católica do Paraná, foram mantidos em gaiolas apropriadas para a espécie, em
condições ambientais controladas (temperatura e luminosidade: 12h de ciclo
claro/escuro) com livre acesso à água e à ração-padrão para a espécie. Foram
colocados cinco ratos em cada gaiola.
3.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
O procedimento cirúrgico foi realizado no Laboratório de Técnica
Operatória e Cirurgia Experimental da Pontifícia Universidade Católica do Paraná.
Os animais foram anestesiados sendo utilizada a dosagem de 0,1ml, para
100g de peso do animal, de uma mistura de um mililitro de ketamina (50mg) com
um mililitro de xilazina 2% (20 mg), via intramuscular na porção posterior da coxa
direita
63
. Os animais foram marcados e em seguida foram posicionados em
decúbito ventral, num suporte de madeira, tendo sido fixados os membros
anteriores e os posteriores.
Foi realizada tricotomia, na região dorsal, de cada animal, em área de
24cm² (seis centímetros de comprimento X quatro centímetros de largura),
22
localizada a partir de uma linha imaginária traçada entre os membros anteriores,
estendendo-se por seis centímetros, em direção caudal.
Na seqüência foi realizada antissepsia com polivinilpirrolidona-iodo e
delimitação da área operatória com campo esterilizado fenestrado.
No centro da área tricotomizada foi feita uma demarcação na pele de cada
rato por rotação da borda cortante de um punch metálico, com dois centímetros
de diâmetro. Foi ressecado o segmento de pele circular, de acordo com a
demarcação, tendo sido aprofundada a incisão até expor a fáscia muscular dorsal
(figura 1).
Após o término do ato operatório os animais receberam diclofenaco de
potássio na dose de 10mg/Kg, por via intramuscular com finalidade analgésica e
anti-inflamatória
63
.
As feridas cirúrgicas dos animais foram fotografadas por câmera digital
(modelo Cyber-Shot® P71, Sony, resolução de 3.2 Mpixels), mantida em tripé a
uma distância constante de 34 cm.
Houve perda de um animal, pertencente a um grupo controle, tendo como
provável causa a sedação.
Após a recuperação anestésica estes animais foram levados para o Biotério
da Instituição e devidamente marcados, foram mantidos em gaiolas separadas as
quais foram colocadas em prateleiras à igual distância da fonte de luz e
receberam água e ração balanceada ad labitum.
Figura 1 - Localização da lesão
23
3.3 GRUPOS EXPERIMENTAIS
A amostra de 80 animais foi, aleatoriamente, dividida em 8 grupos de 10
animais (quadro 1). Os mesmos foram submetidos a aplicação de soro fisiológico
0,9% para o grupo controle e metronidazol 4% para o grupo experimento, com
freqüência de uma vez ao dia, sendo que cada grupo foi avaliado com 3 dias, 7
dias , 14 dias e 21 dias, após a lesão.
Quadro 1 - Divisão dos grupos
GRUPOS DIAS DE AVALIAÇÃO
GC3 n-10 3 dias
GC7 n-09* 7 dias
GC14 n-10 14 dias
GC21 n-10 21 dias
GE3 n-10 3 dias
GE7 n-10 7 dias
GE14 n-10 14 dias
GE21 n-10 21 dias
*
Óbito de um animal durante sedação
3.4 APLICAÇÃO DO METRONIDAZOL
Os animais dos grupos controle foram tratados com lavagem da ferida
com solução de NaCl 0,9%
64
. As feridas cirúrgicas foram limpas com gaze
umedecida em solução de NaCl 0,9%, para a retirada de crostas e em seguida
aplicado 0,3ml da mesma solução, com frequência de uma vez ao dia.
As feridas cirúrgicas dos animais dos grupos experimento foram limpas
com gaze umedecida em solução de NaCl 0,9%, para a retirada de crostas e em
seguida foi aplicado metronidazol, suspensão oral (benzoilmetronidazol) 40 mg/ml
(4%) em veículo q.s.p., com freqüência de uma vez ao dia. A dose utilizada foi de
0,3 ml de metronidazol, correspondendo a 12,5mg/dia. Dose obtida a partir da
indicação da dose padrão do metronidazol de 50mg/kg/dia
65
.
Foram avaliados 4 grupos experimento em comparação com os 4 grupos
controle, de acordo com os dias de eutanásia.
24
Após o terceiro dia de tratamento os animais do GC3 e do GE3 sofreram
eutanásia por dose letal de tiopental sódico intra-peritonial (120mg/Kg), sendo
este um dos métodos indicados pela literatura. O mesmo processo ocorreu com o
GC7 e GE7 no sétimo dia, com o GC14 e GE14 no décimo quarto dia e com o
GC21 e GE21 no vigésimo primeiro dia.
3.5 ANÁLISE MACROSCÓPICA
Para a avaliação macroscópica das feridas foi verificada a ocorrência de
hemorragia, presença de crostas, de secreção, de reepitelização
66
e de
granulação.
A presença de reepitelização foi avaliada pelo espessamento das
margens da lesão e existência de camada epitelial fina e contínua, abaixo da
crosta
66
.
O tecido de granulação foi identificado pela presença de tecido brilhante,
vermelho vivo e com ondulações
1
.
3.6 ANÁLISE MICROSCÓPICA MICROBIOLÓGICA
Foi realizada coleta de material para cultura das feridas dos animais dos
grupos 14, controle e experimento, por meio de swab. A coleta foi realizada após
limpeza da ferida cirúrgica, com solução de NaCl 0,9% em d0 (momento da
realização da ferida cirúrgica) e em d14 (antes da eutanásia).
3.7 ANÁLISE MICROSCÓPICA HISTOLÓGICA GERAL E
IMUNOISTOQUÍMICA
Imediatamente, após a eutanásia, as feridas cirúrgicas dos animais foram
fotografadas.
Foi realizada a retirada de cada ferida cirúrgica, com margem de um
centímetro de pele íntegra em torno da lesão, com profundidade até a
musculatura dorsal do rato.
Os segmentos destinados à histologia foram estendidos sobre papel
cartão identificado. Na seqüência, mergulhados em recipiente com formol a 10%
25
por 24 horas. Após este período, foram inclusos em blocos de parafina e
submetidos a cortes de cinco micrômetros.
Os cortes histológicos foram corados por Hematoxilina Eosina e Sirius
Red. Para cada corte histológico, foi realizada a leitura de três campos, para
ambas as colorações, com ampliação de 400X, sobre a área da lesão, para a
coloração Hematoxilina Eosina e 200X para a coloração Sirius Red. Os campos
foram marcados nas lâminas com caneta de retroprojeção; foram definidas áreas
superficiais, sendo as áreas de transição entre o processo cicatricial e os tecidos
antigos dos extremos da ferida e área superficial central da mesma (figura 2).
Figura 2 - Áreas de leitura histológica
Na coloração Hematoxilina Eosina avaliou-se o processo inflamatório com
contagem das células monomorfonucleares e polimorfonucleares.
Para os polimorfonucleares foi atribuído o valor “-1” para campos com até
50 células; o valor “-2” para campos contendo entre 51 e 100 células; o valor “-3”
para campos contendo mais de 100 células.
Para os monomorfonucleares foi atribuído o valor “1” para campos com
até 50 células; o valor “2” para campos contendo entre 51 e 100 células; o valor
“3” para campos contendo mais de 100 células (quadro 1).
Foi realizada a média celular entre os três campos avaliados e o estado
inflamatório da ferida do animal classificado em agudo, subagudo e crônico
67
(
quadro 3).
26
Quadro 2 - Contagem celular do processo inflamatório
NÚMERO DE CÉLULAS POLIMORFONUCLEARES MONONUCLEARES
até 50 -1 1
entre 50 e 100 -2 2
maior que 100 -3 3
Quadro 3 - Caracterização da fase do processo inflamatório de acordo com o
escore final de cada grupo
FASE DO PROCESSO INFLAMATÓRIO
ESCORE FINAL DE CLASSIFICAÇÃO
AGUDO
-9 a -3
SUBAGUDO
-2,9 a 3
CRÔNICO
3,1 a 9
A coloração Picrosírius foi usada para avaliar o colágeno por meio da
birrefringência específica do mesmo, identificando o direcionamento das fibras,
com o uso de um microscópio de luz polarizada.
As fibras mais espessas e com maior birrefringência, apresentaram-se
coradas em tons laranja a vermelho identificando o colágeno tipo I e as fibras
mais finas, e com menor birrefringência, apresentaram-se coradas em verde
identificando o colágeno tipo III
68
.
O microscópio utilizado foi da marca Olympus BX50 com câmeras de
captura 3CCD pró-séries, e o programa de captura de imagens foi o Pró-plus
versão 4.5 da Cybermetics. As imagens foram captadas por uma câmera Sony
®
CCD 101, enviadas a um monitor Sony Trinitron
®
colorido, congeladas e
digitalizadas por uma placa Oculus TCX
®
(coreco), que foram analisadas pelo
aplicativo Image Plus 4.5 para Windows em computador Pentium lll. Em cada um
dos campos foi calculado o percentual de área ocupada pelas fibras vermelhas e
amarelas (colágeno I) e verdes (colágeno III)
68
. Considerando que os demais
tipos de colágeno constituem frações muito pequenas, para fins práticos,
considerou-se a somatória dos colágenos I e III como sendo o colágeno total da
cicatriz.
Para a imunoistoquímica foi utilizado o método tissue array ou mycro
array. Foram retiradas amostras do bloco de parafina utilizado para a confecção
do HE e Picrosírius. A área escolhida para a retirada da amostra foi a área
superficial central da ferida, tendo sido a mesma localizada na lâmina corada por
27
Hematoxilina Eosina, já demarcada com caneta para retroprojetor, utilizada como
espelho para a realização do punch. O punch utilizado foi o número 3. As
amostras foram retiradas e depositadas em um cassete, conforme determinação
do mapa previamente elaborado (apêndice I).
O material foi encaminhado, na seqüência, para processamento
imunoistoquímico (anexo II), tendo sido utilizado o anti-CD34
69,70
. A técnica
imunoistoquímica se baseia numa reação antígeno-anticorpo. O anticorpo liga-se
ao antígeno específico, que por sua vez é reconhecido por um anticorpo
secundário ao qual se liga um complexo enzimático streptavidina-biotina-
peroxidase. A peroxidase transforma uma substância cromogênica, em geral a
diaminobenzidina, que confere à reação positiva uma coloração acastanhada.
O anti-CD34 é um marcador de endotélio, porém não apresenta
resultados satisfatórios para vasos maiores, sendo, conforme sua indicação, para
marcação de microvasculatura. Foi realizada a leitura de dez campos, para cada
corte histológico, complementando a avaliação do processo inflamatório, com
enfoque na avaliação quantitativa da neovascularização. Foi utilizado, para leitura,
microscópio Olimpus BX500. A leitura das lâminas (dez campos por lâmina) foi
realizada por patologista que não conhecia a que animal pertencia, isto é leitura
cega.
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a comparação dos grupos controle e estudo avaliados em cada
momento de sacrifício, foi usado o teste t de Student para amostras
independentes e para avaliação da homogeneidade da amostra. Para a
comparação dos momentos de sacrifício restritos a cada um dos grupos controle
e estudo, foi usado a análise de variância com um fator. A condição de
normalidade das variáveis foi avaliada pelo teste Shapiro-Wilks. Variáveis que não
apresentaram essa condição foram submetidas a uma transformação (raiz
quadrada). Para a comparação de dois grupos em relação a variáveis nominais
dicotômicas foi usado o teste exato de Fisher. Valores de p<0,05 indicaram
significância estatística. Os cálculos foram realizados usando-se o programa
computacional Statistica v.7.
4 RESULTADOS
No procedimento cirúrgico ocorreu o óbito de um rato do grupo controle II,
após indução anestésica. Não houve mais complicações, com boa recuperação
dos demais ratos no pós-anestésico. Na avaliação clínica diária constatou-se boa
recuperação, bom estado geral, presença de atividade física e disposição para
alimentação.
4.1 AVALIAÇÃO HOMOGENEIDADE DA AMOSTRA
A avaliação da variável peso dos animais do grupo controle e do grupo
experimento, demonstrou a distribuição homogênea dos animais, com relação ao
peso (quadro 3).
Quadro 4 - Comparação da média da variável peso entre grupos controle e
experimento
Dia da Eutanásia Grupo Media Desvio Padrão Valor de p*
3 GC3 216,98 19,87
GE3 219,37 14,18
0,93
7 GC7 209,4 12,12
GE7 210,57 18,96
0,877
14 GC14 209,87 10,77
GE14 208,44 17,92
0,832
21 GC21 212,83 17,99
GE21 215,15 9,97
0,671
(*) Teste t Student para amostras independentes, p<0,05
4.2 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA
4.2.1 Grupos Controle
Nenhum rato apresentou hemorragia. Com 24h todos as feridas
apresentaram crostas. Não houve presença de secreção em nenhuma ferida. A
identificação da reepitelização foi possível a partir de 72h. O tecido de granulação
começou a aparecer a partir de 72h.
29
4.2.2 Grupos Experimento
Não houve presença de hemorragia em nenhum rato. Com 48h todas as
feridas apresentaram crostas. Não houve presença de secreção em nenhuma
ferida. A identificação da reepitelização foi possível a partir de 24h. O tecido de
granulação começou a aparecer a partir de 24h.
4.3 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA
4.3.1 Avaliação microbiológica
A avaliação microbiológica realizada no momento da realização da ferida
cirúrgica (d0) e no décimo-quarto dia demonstrou semelhança entre os grupos
controle e experimento (quadros 5, 6, 7 e 8).
30
Quadro 5 - Resultado das culturas dos grupos controle e experimento em d0
Dia 0 CONTROLE EXPERIMENTO
RATO 31 não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
não houve desenvolvimento de
bctérias patogênicas
RATO 32 não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
RATO 33 não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
RATO 34 não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
RATO 35 não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
RATO 36 pseudomonas aeruginosa não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
RATO 37 não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
RATO 38 não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
RATO 39 não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
pseudomonas aeruginosa
RATO 40 não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas
Quadro 6 - Resultado das culturas dos grupos controle e experimento em d14
Dia 14 CONTROLE EXPERIMENTO
RATO 31
enterococcus sp/ estafilococos não
produtor de coagulase
diversas espécies bacterianas
RATO 32
não houve desenvolvimento de
bactérias patogênicas diversas espécies bacterianas
RATO 33 diversas espécies bacterianas serratia marcescens
RATO 34 escherichia coli diversas espécies bacterianas
RATO 35 diversas espécies bacterianas diversas espécies bacterianas
RATO 36
klebsiela ozaenae/ estafilococo não
produtor de coagulase
diversas espécies bacterianas
RATO 37 diversas espécies bacterianas diversas espécies bacterianas
RATO 38 diversas espécies bacterianas diversas espécies bacterianas
RATO 39 diversas espécies bacterianas diversas espécies bacterianas
RATO 40 diversas espécies bacterianas
estafilococos não produtor de
coagulase
Quadro 7 - Comparação dos grupos em relação à presença de bactérias em d0
GRUPO
Bactéria
GC GE
Ausente 9 9
90,00% 90,00%
Presente 1 1
10,00% 10,00%
Total 10 10
Valor de p:1 (Teste exato de Fisher, p<0,05)
31
Quadro 8 - Comparação dos grupos em relação à presença de bactérias em d14
GRUPO
Bactéria
GC GE
Ausente 1 0
10,00% 0%
Presente 9 10
90,00% 100%
Total 10 10
Valor de p:1 (Teste exato de Fisher, p<0,05)
4.3.2 Reação Inflamatória Aguda
No terceiro dia houve maior presença de polimorfonucleares no grupo
experimento. No sétimo dia o maior afluxo foi registrado no grupo controle. No
décimo-quarto dia o afluxo de polimorfonucleares equivaleu-se entre controle e
experimento. No vigésimo-primeiro dia houve maior afluxo de polimorfonucleares
no grupo experimento (tabela 1).
Houve semelhança na distribuição das células monomorfonucleares entre
grupos controle e experimento (tabela 2).
Tabela 1 - Avaliação percentual das células polimorfonucleares
GRUPO CÉLULAS
POLIMORFO-
NUCLEARES
GC3 GE3 GC7 GE7 GC14 GE14 GC21 GE21
n
1
Nenhuma
%
10,00
n 6
2
4
7
9
10
10
7
Até 50
%
60,00
20,00
44,44
70,00
90,00
100,00
100,00
70,00
De 51 a 100 n 2
4
3
2
1
%
20,00
40,00
33,33
20,00
10,00
Acima de 100 n 2
4
2
1
1
1
%
20,00
40,00
22,22
10,00
10,00
10,00
32
Tabela 2 - Avaliação percentual das células monomorfonucleares
GRUPO CÉLULAS
POLIMORFO-
NUCLEARES
GC3 GE3 GC7 GE7 GC14 GE14 GC21 GE21
n
1
Nenhuma
%
10,00
n 10
9
4
4
6
8
6
8
Até 50
%
100,00
90,00
44,44
40,00
60,00
80,00
60,00
80,00
De 51 a 100 n
5
6
4
2
3
2
%
55,56
60,00
40,00
20,00
30,00
20,00
Acima de 100 n
1
%
10,00
Houve predomínio do estado inflamatório agudo apenas no terceiro dia,
no grupo experimento (p=0,023). No sétimo dia, a reação inflamatória foi
semelhante entre os grupos (p=0,458), o mesmo ocorrendo no décimo-quarto dia
(p=1) e no vigésimo-primeiro dia (p=1) (tabela 3).
Tabela 3 - Avaliação do estado inflamatório nos grupos controle e experimento
DIA DA
EUTANÁSIA
GRUPO SUBAGUDO AGUDO TOTAL VALOR DE p*
n
8
2
10
GC3
%
80,00
20,00
n
2
8
10
3
GE3
%
20,00
80,00
0,023
n
7
2
9
GC7
%
77,78
22,22
n
9
1
10
7
GE7
%
90,00
10,00
0,458
n
9
1
10
GC14
%
90,00
10,00
n
10
0
10
14
GE14
%
100,00
0,00
1
n
10
0
10
GC21
%
100,00
0,00
n
9
1
10
21
GE21
%
90,00
10,00
1
33
Cd3
Ed3
Células
inflamatórias
Células
inflamatórias
Figura 3 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão do animal do grupo
controle (C) e do grupo experimento (E), com três dias (d3) de
evolução. Hematoxilina-eosina 400X.
Cd7 Ed7
Células
inflamatórias
Células
inflamatórias
Figura 4 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do grupo
controle (C) e do grupo experimento (E), com sete dias (d7) de
evolução. Hematoxilina-eosina 400X.
34
Cd14
Ed14
Células
inflamatórias
Células
inflamatórias
Figura 5 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do grupo
controle (C) e do grupo experimento (E), com quatorze dias (d14) de
evolução. Hematoxilina-eosina 400X.
Cd21
Ed21
Células
inflamatórias
Células
inflamatórias
Figura 6 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do grupo
controle (C) e do grupo experimento (E), com vinte e um dias (d21)
de evolução. Hematoxilina-eosina 400X.
35
4.3.3 Colágeno
4.3.3.1 Avaliação do colágeno dos grupos controle e experimento
A concentração de colágeno total foi semelhante nos grupos controle e
experimento, em todos os dias avaliados (figura7).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Percentual
Dia da eutanásia
Percentual de Colágeno Total (I e III)
Colágeno III
0,23 0,49 0,19 0,19 0,12 0,06 0,21 0,55
Colágeno I
5,08 6,15 2,99 4,46 3,19 3,92 4,46 6,98
GC3 GE3 GC7 GE7 GC14 GE14 GC21 GE21
p-value=0.847
p-value=0.148
p-value= 0.1
p-value=0.877
Figura 7 - Percentual de colágeno total nos grupos controle e experimento
4.3.3.2 Colágeno tipo I
A concentração de colágeno I, avaliada no terceiro dia, foi semelhante
nos dois grupos (p=0,383). No sétimo dia foi maior no grupo experimento
(p=0,020), no décimo-quarto dia foi semelhante (p=0,354) e voltou a ser maior no
grupo experimento no vigésimo-primeiro dia (p=0,016) (figura 8).
36
-
2,00
4,00
6,00
8,00
Percentual
Dia da eutanásia
Percentual de Colágeno I
GC
5,08 2,99 3,19 4,46
CE
6,15 4,46 3,92 6,98
G3 G7 G14 G21
p-value=0,383
p-value=
0.02
p-value=0.354
p-value=
0.016
Figura 8 - Média dos percentuais de colágeno I nos cortes histológicos dos
grupos controle e experimento
4.3.3.3 Colágeno tipo III
A concentração de colágeno III, avaliada no terceiro dia, foi semelhante
entre os dois grupos (p=0,095). O mesmo ocorreu no sétimo e no décimo-quarto
dia. No vigésimo-primeiro dia foi constatada uma maior concentração do colágeno
III, no grupo experimento (p=0,005) (figura 9).
37
-
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
Percentual
Dia da eutanásia
Percentual de Colágeno III
GC
0,23 0,19 0,12 0,21
GE
0,49 0,19 0,06 0,55
G3 G7 G14 G21
p-value=0.095
p-value=0.918
p-value= 0.160
p-value=
0.005
Figura 9 - Média dos percentuais das áreas ocupadas por colágeno III nos
cortes histológicos dos grupos controle e experimento
’
Cd3 Ed3
Figura 10 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do grupo
controle (C) e do grupo experimento (E), com três dias (d3) de
evolução. Sirius Red 200X. O colágeno tipo I apresenta-se nas
cores laranja e vermelho; o colágeno tipo III, na cor verde.
38
Cd7 Ed7
Figura 11 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do grupo
controle (C) e do grupo experimento (E), com sete dias (d7) de
evolução. Sirius Red 200X. O colágeno tipo I apresenta-se nas
cores laranja e vermelho; o colágeno tipo III, na cor verde.
Cd14
Ed14
Figura 12 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do grupo
controle (C) e do grupo experimento (E), com quatorze dias (d14) de
evolução. Sirius Red 200X. O colágeno tipo I apresenta-se nas
cores laranja e vermelho; o colágeno tipo III, na cor verde.
39
Cd21
Ed21
Figura 13 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do grupo
controle (C) e do grupo experimento (E), com vinte e um dias (d21)
de evolução. Sirius Red 200X. O colágeno tipo I apresenta-se nas
cores laranja e vermelho; o colágeno tipo III, na cor verde.
4.3.4 Angiogênese
O número de vasos, avaliado no terceiro dia, foi maior no grupo
experimento (p<0,001). No sétimo dia, o número de vasos foi semelhante nos dois
grupos (p=0,653), passou a ser maior no grupo experimento no décimo-quarto dia
(p=0,003) e voltou a ser semelhante no vigésimo-primeiro dia (p=0,157) (figura
14).
40
0
5
10
15
Média de contagem
celular
Dia da eutanásia
Média do número de vasos
GC
3,36 7,11 8,5 7,4
GE
7,86 6,7 13,23 8,74
G3 G7 G14 G21
p-value=0.653
p-value
<0.003
p-value
<0.001
p-value=0.157
Figura 14 - Média do número de vasos nos cortes histológicos dos grupos
controle e experimento
Cd3 Ed3
vasos
vasos
Figura 15 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do grupo
controle (C) e do grupo experimento (E), com três dias (d3) de
evolução. Anti-CD34 400X.
41
Cd7
Ed7
vasos
vasos
Ed7
Figura 16 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do grupo
controle (C) e do grupo experimento (E), com sete dias (d7) de
evolução. Anti-CD34 400X.
Cd14 Ed14
vasos
vasos
Figura 17 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do grupo
controle (C) e do grupo experimento (E), com quatorze dias (d14) de
evolução. Anti-CD34 400X.
42
Cd21 Ed21
vasos
vasos
Figura 18 - Fotomicrografias de cortes histológicos da lesão de animal do grupo
controle (C) e do grupo experimento (E), com vinte e um dias (d21)
de evolução. Anti-CD34 400X.
4.4 AVALIAÇÃO COMPARATIVA DOS RESULTADOS
Os resultados que apresentaram diferença significativa entre os grupos
são apresentados no quadro 9.
Quadro 9 - Comparação dos grupos em relação à presença de bactérias em d14
GC GE
crostas 24h 48h
macroscopia reepitelização 72h 24h
granulação 72h 24h
inflamação d3
(agudo) 20% 80%
microscopia colágeno I d7/d21 >
colágeno III d21 >
vasos d3/d14 >
5 DISCUSSÃO
Nicholson e Armstrong
12
referiram além da atividade anti-inflamatória do
metronidazol, a presença de granulação precoce e a diminuição do edema.
Walwaikar et al.
62
, também, referiram atividade anti-inflamatória do metronidazol.
Este estudo, no entanto, discorda de Nicholson e Armstrong
12
e
Walwaikar et al.
62
, pois o grupo experimento demonstrou maior atividade
inflamatória. A ação anti-inflamatória relatada por Nicholson e Armstrong
12
e
Walwaikar et al.
62
, pode ter ocorrido em função da presença de granulação
precoce e pela redução do edema e não por uma ação anti-inflamatória específica
do metronidazol.
Considerando que houve predomínio de polimorfonucleares, no grupo
experimento, é possível correlacionar o metronidazol à indução do maior afluxo de
polimorfonucleares, tornando mais intensa a fase inflamatória.
Nicholson e Armstrong
12
relataram que o metronidazol induz à formação
do tecido de granulação, de forma mais precoce. Na presente dissertação
verificou-se tecido de granulação, precoce, macroscopicamente, com diferença de
dois dias. Este resultado atribuiu-se à maior concentração de colágeno e vasos
encontrada no grupo experimento, provavelmente, propiciada pela intensa fase
inflamatória.
Rao et al.
54
referiram que o metronidazol tópico retarda o processo de
epitelização. Na opinião dos autores a alta dosagem do metronidazol tópico,
10mg/kg, promoveu um efeito de citotoxicidade, retardando a cicatrização,
sobrepujando seu efeito antioxidante.
No entanto, neste estudo utilizou-se uma dosagem maior, de 50mg/kg,
em uso tópico, não registrando nenhum sinal de citotoxicidade. Talvez, o retardo
cicatricial, encontrado por Rao et al.
54
, tenha sido ao contrário da dedução dos
autores, em função de uma baixa dosagem.
Com relação ao estudo de Rao et al.
54
deve-se considerar, ainda, o fato
do gel possuir o menor padrão de absorção, comparado com as outras
formulações
52
.
44
Mandelbaum et al.
1
referiram que a reepitelização é percebida,
macroscopicamente, após três dias, fato confirmado no grupo controle, deste
estudo, porém o tempo de reepitelização do experimento, teve início dois dias
antes do grupo controle. Este fato corrobora com a hipótese da atividade
aceleradora da cicatrização pelo metronidazol. O metronidazol impediu, também,
a formação precoce das crostas.
Para que haja a reepitelização adequada além do estímulo pela falta de
contato celular e fatores de crescimento, que ativam as células epidermais, há
necessidade de um substrato, que somente é fornecido quando o tecido de
granulação alcança a epiderme
29
.
Como os grupos experimentais apresentaram,
nesta pesquisa, precocidade da granulação, maior concentração de colágeno e
maior número de vasos, era esperada a precocidade da reepitelização.
É na fase inflamatória que tem-se a vasodilatação, o aumento da
permeabilidade capilar, a ativação dos fibroblastos e a indução da formação do
tecido de granulação
19
.
A maior atividade inflamatória registrada no grupo experimento foi,
provavelmente, a responsável pela maior concentração de colágeno, que
culminou com a granulação precoce. O metronidazol pode ter ativado os
fibroblastos de forma a produzirem maior quantidade de colágeno.
Nesta presente pesquisa, os grupos experimento apresentaram as
maiores taxas de colágeno. O colágeno I teve suas médias maiores, no sétimo e
no vigésimo-primeiro dia e o colágeno III apresentou maior concentração no
vigésimo-primeiro dia. Não se pode afastar a possibilidade de que se a amostra
fosse maior, os resultados seriam significantes nos demais dias avaliados.
O fibroblasto é uma célula reguladora, devido a sua função de síntese e
reabsorção de colágeno, promovendo o equilíbrio qualitativo e quantitativo desta
proteína. O fibroblasto sintetiza fibrilas colágenas tipo I e III, sendo responsável
pelas substituições das fibrilas de colágeno do tipo III, pelo tipo I
21
.
É provável que, de alguma forma, o metronidazol interfira no padrão
fisiológico do fibroblasto, promovendo maior síntese de fibrila colágena III, ou
menor reabsorção da mesma, conferindo ao colágeno um padrão de imaturidade.
A cicatrização depende da vascularização, além da capacidade de
produzir colágeno. A vascularização promove a chegada das células ao sítio
inflamatório, o aporte de nutrientes e de oxigênio.
45
Para Reed et al.
23
a formação de vasos é modulada pelo TGF-b e pelas
proteínas da matriz. Este fator aumenta a produção de citocinas, as quais
induzem a angiogênese; estimula a produção do colágeno tipo I e inibe a
produção de colagenase intersticial.
Ingberg e Folkman
27
referem que o colágeno tipo I encontra-se entre as
proteínas da matriz que regulam o reparo das feridas, estimulando a formação de
vasos.
O metronidazol poderia, em uma dosagem adequada, propiciar os
fibroblastos a produzirem mais colágeno, promovendo o aumento da
neovascularização.
Os resultados deste estudo demonstraram angiogênese em maiores
proporções na presença do metronidazol.
Pela avaliação dos resultados da histologia, há uma impossibilidade de
reconhecer se o metronidazol tem ação direta ou facilitadora na cicatrização.
Este estudo afasta a possibilidade do melhor resultado encontrado nas
feridas do grupo experimento se dever ao fato do metronidazol ser um antibiótico,
tendo atuação sobre a replicação bacteriana ou mesmo sobre a replicação das
bactérias colonizadoras promovendo um efeito acelerador do processo cicatricial,
uma vez que os resultados das culturas não apresentaram diferenças
significantes.
Pode ocorrer que o metronidazol atue aumentando a atividade
inflamatória, tendo como conseqüência um maior afluxo de fibroblastos, no sítio
da lesão. Na seqüência, faria com que estes fibroblastos produzissem uma maior
quantidade de colágeno. O colágeno tipo I aumentaria o padrão de
neovascularização.
Sendo que a angiogênese aumenta o aporte de nutrientes e o ingresso
celular na região afetada, promovendo menor tempo de cicatrização
29
, pelos
resultados encontrados concluiu-se que o metronidazol propiciou maior
angiogênese, promovendo a precocidade da cicatrização.
A precocidade da granulação e da reepitelização parece não ter relação
com a via utilizada e a dosagem, pois Prasad e Rao
10
, Rao et al.
11
Girish e Patil
13
e utilizaram a via oral; Rao et al.
54
e o presente estudo utilizaram uso tópico.
Todos utilizaram dosagens diferentes: 108mg/kg, 180mg/kg, 160mg/kg, 10mg/kg
46
e 50 mg/kg, respectivamente. No entanto, os resultados alcançados foram
favoráveis à reepitelização precoce.
A dosagem de metronidazol utilizada nesta pesquisa de 50mg/kg pareceu
uma dosagem intermediária efetiva, do ponto de vista pró-cicatricial, capaz de
propiciar maior produção do colágeno; Girish e Patil
13
que utilizaram a dosagem
de 108mg/kg apresentaram maior quantidade de colágeno. A dosagem, utilizada
por Borden et al.
57
, 20mg/kg, provavelmente, não alcançou um valor mínimo
capaz de promover alteração na quantidade de hidroxiprolina e culminou com
atraso na cicatrização e a alta dose, utilizada por Prasad e Rao
10
, 160mg/kg, pode
ter sido responsável, também, pela diminuição na quantidade de hidroxiprolina e
retardo cicatricional por citotoxicidade. Deve-se, ainda, considerar que Girish e
Patil
13
, Borden et al.
57
e Prasad e Rao
10
utilizaram via enteral e neste estudo
utilizou-se uso tópico.
Provavelmente, a dosagem represente o limite qualificador para o efeito
do metronidazol sobre a síntese de colágeno. Assim, dosagens baixas como a
utilizada por Borden et al.
57
(20mg/kg) não propiciariam uma maior síntese de
colágeno; entretanto, dosagens altas, como exemplo, a utilizada por Prasad e
Rao
10
(160mg/kg) apresentariam um efeito citotóxico sobre os fibroblastos,
inibindo a produção do colágeno.
Esta pesquisa utilizou 50mg/kg, em uso tópico, com sucesso na maior
síntese de colágeno, havendo, obviamente, um destaque para o uso tópico, em
função de sua baixa taxa de absorção sistêmica
60
.
Deve-se, ainda, registrar a importância de se obter, com uso tópico,
resultados compatíveis ao uso enteral, lembrando que a taxa de absorção
sistêmica para o uso tópico é baixa, 0,6 µg/ml, após quatro horas da aplicação do
metronidazol gel 25%; sendo de 5 a 10 µg/ml, após 250 e 500 mg,
respectivamente, via endo-venosa
53
.
Como a dosagem parece ser o fator definidor da ação pró-cicatricial, há
que se estabelecer com relação ao metronidazol, tópico, a dosagem mínima que
determine a precocidade da cicatrização.
6 CONCLUSÕES
Analisando os resultados pôde-se concluir que, no rato:
1. o metronidazol propicia a precocidade da epitelização e da
formação do tecido de granulação;
2. o metronidazol propicia maior produção de colágeno I em no
sétimo e no vigésimo-primeiro dia;
3. o metronidazol propicia maior produção de colágeno III no
vigésimo-primeiro dia;
4. o metronidazol propicia maior angiogênese no terceiro e no
décimo-quarto dia.
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J. 1979;11(4):447-55.
69. Hussein MR. Evaluation of angiogenesis in normal and lichen planus skin by
CD34 protein immunohistochemistry: preliminary findings. Cell Biol Int. 2007;
31(10): 1292-295.
70. Pisacane AM, Picciotto F, Risio M. CD31 and CD34 expression as
immunohistochemical markers of endothelial transdifferentiation in human
cutaneous melanoma. Cell Oncol. 2007; 29(1): 59-66.
NORMAS ADOTADAS
Normativa de Vancouver: Uniform Requirements for Manuscripts Submitted
to Biomedical Journals do International Committee of Medical Journal Editors
(
www.icmje.org
).
Normativa da Associação Brasileira de Normas Técnicas- NBR 14.724-
informações e documentos, trabalhos acadêmicos: apresentação. Rio de Janeiro,
2002.
International Committee of Medical Journal Editors. Uniform requirements
for manuscripts submitted to biomedical journals. Ann Int Med 1997; 126(1):36-
47.
International Anatomical Nomenclature Committee. Nomina histologica.
2
nd
ed. New York: Ithaca, 1983.
International Committee on Veterinary Gross Anatomical Nomenclature:
Nomina anatomica veterinária. 3
rd
ed. New York: Ithaca, 1983.
Becker I [editor]. Nomenclatura anatômica da língua portuguesa. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 1977.
APÊNDICE I
55
MAPEAMENTO IMUNOISTOQUÍMICA
Lâmina 01 - Controle D3 - C1D3
Lâmina 05 - Experimento D3 - E1D3
A B C A B C
4 C1 R7 D3 C1 R4 D3 C1 R1 D3 4 E1 R7 D3 E1 R4 D3 E1 R1 D3
3 C1 R8 D3 C1 R5 D3 C1 R2 D3 3 E1 R8 D3 E1 R5 D3 E1 R2 D3
2 C1 R9 D3 C1 R6 D3 C1 R3 D3 2 E1 R9 D3 E1 R6 D3 E1 R3 D3
1 C1 R10 D3 1 E1 R10 D3
Lâmina 02 - Controle D7 - C2D7
Lâmina 06 - Experimento D7 - E2D7
A B C A B C
4 C2 R17 D7 C2 R14 D7 C2 R11 D7 4 E2 R17 D7 E2 R14 D7 E2 R11 D7
3 C2 R18 D7 C2 R15 D7 C2 R12 D7 3 E2 R18 D7 E2 R15 D7 E2 R12 D7
2 C2 R19 D7 C2 R16 D7 C2 R13 D7 2 E2 R19 D7 E2 R16 D7 E2 R13 D7
1 C2 R20 D7 1 E2 R20 D7
Lâmina 03 - Controle D14 - C3D14
Lâmina 07 - Experimento D14 - E3D14
A B C A B C
4 C3 R27 D14 C3 R24 D14 C3 R21 D14 4 E3 R27 D14 E3 R24 D14 E3 R21 D14
3 C3 R28 D14 C3 R25 D14 C3 R22 D14 3 E3 R28 D14 E3 R25 D14 E3 R22 D14
2 C3 R29 D14 C3 R26 D14 C3 R23 D14 2 E3 R29 D14 E3 R26 D14 E3 R23 D14
1 C3 R30 D14 1 E3 R30 D14
Lâmina 04 - Controle D21 - C4D21
Lâmina 08 - Experimento D21 - E4D21
A B C A B C
4 C4 R37 D21 C4 R34 D21 C4 R31 D21 4 E4 R37 D21 E4 R34 D21 E4 R31 D21
3 C4 R38 D21 C4 R35 D21 C4 R32 D21 3 E4 R38 D21 E4 R35 D21 E4 R32 D21
2 C4 R39 D21 C4 R36 D21 C4 R33 D21 2 E4 R39 D21 E4 R36 D21 E4 R33 D21
1 C4 R40 D21 1 E4 R40 D21
ANEXO I
57
ANEXO II
59
IMUNOISTOQUÍMICA CD34- TÉCNICA
As peças retiradas do cassete foram emblocadas em parafina.
Encaminhadas para cortes histológicos em micrótomo de parafina e os cortes
com espessura de cinco micra foram estendidos em lâminas, previamente
lavadas em solução sulfocrômica, emulsionadas com adesivo à base de poli-L-
lisina (Poly-L-Lysine, da marca sigma, USA, código P8920) a 10% e colocadas
em estufa a 60ºC durante 12horas para melhor aderência desses às lâminas .
Depois de identificadas por cada anticorpo as lâminas voltaram à estufa a
60ºC por 20 minutos e, a seguir, foram colocadas em 3 banhos de xilol 5 minutos
cada e em 3 banhos de álcool em concentrações decrescentes de 95%, 70%,
50% e água corrente 5 minutos, conforme procedimento histotécnico usual, em
temperatura ambiente. Em seguida a atividade da peroxidase endógena foi
bloqueada através da imersão em peróxido de hidrogênio a 3% em metanol a
70% durante 20 minutos, então as lâminas foram lavadas em água destilada.
A recuperação antigênica seguiu os procedimentos descritos nos data-
sheet destes. As lâminas do anticorpo ACTINA LISA (dil.:1:250) marca Dako
código M0851 e CD34 ( dil.:1:250) marca Dako código M7165 foram mergulhadas
em tampão citrato de sódio a 0,01M com ph igual a 6.0 em câmara de pressão
PASCAL 2,5 minutos, quando começava a pressão (temperatura chegava a
117ºC). Depois de desligada, quando a temperatura chegava a 90ºC, a câmara de
pressão já estava pronta para abrir.
Após esta etapa, as lâminas foram lavadas em água destilada e
colocadas em tampão PBS ph 7,4 com TWIN 20 marca Sigma código P7949 para
diminuir o background, foram 3 banhos de 5 minutos cada.
Em seguida os cortes foram ciclados por uma caneta hidrofóbica da
marca Dako código S2002, para evitar que a solução com o anticorpo diluído
escorresse, e incubados com os anticorpos, previamente, diluídos em uma
solução de PBS-TWIN20+BSA a 0,1% (solução para bloquear as proteínas
inespecíficas). Após uma hora de reação em temperatura ambiente foi aplicado o
kit da Easy Path ABC Universal, sendo que ao fim de cada etapa as lâminas são
lavadas em tampão PBS-TWIN20.
A seguir foi adicionado o cromógeno DAB marca Dako código K3468 por
30 segundos a 1 minuto em média. Em seguida as lâminas foram lavadas em
60
água destilada e contracoradas em hematoxilina de Harris, azuladas em água
corrente (núcleos em azul para revelar a morfologia do tecido), desidratadas em
álcool com concentrações crescentes 50%, 70%, 90% e P.A. e depois 4 banhos
em xilol e finalmente montadas com goma Damar da marca Proquímios para
fixação das lamínulas e posterior observação ao microscópio óptico. Os cortes
foram pescados para as lâminas.
Foram mantidos em estufa por 24h, para
melhor aderência à lâmina. Sofreram desparafinização e desidratação em álcool
®
.
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