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Élida dos Santos Fernandes
Sensibilidade do vírus Cantagalo ao
ST-246 e Avaliação do seu
Mecanismo de Ação
Dissertação submetida ao Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, visando à
obtenção do grau em Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica)
Rio de Janeiro, 2010
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO
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Élida dos Santos Fernandes
SENSIBILIDADE DO VÍRUS CANTAGALO AO ST-246 E AVALIAÇÃO DO SEU
MECANISMO DE AÇÃO
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em Biológicas (Biofísica)
Orientador: Dra. Clarissa Damaso
Banca examinadora: Dr. Norton Heise
Dr. Edson Elias da Silva
Dr. André Marco de Oliveira Gomes
Revisor e
Suplente externo: Dra. Ana Beatriz Furlanetto Pacheco
Suplente Interno: Dr. Ronaldo da Silva Mohana Borges
Rio de Janeiro
2010
ii
Fernandes, Élida dos Santos
Sensibilidade do vírus Cantagalo ao ST-246 e Avaliação do seu Mecanismo de
Ação. / Élida dos Santos Fernandes / Rio de Janeiro: UFRJ/, IBCCF, 2010.
xii, 112 f.
Orientador: Clarissa Damaso
Dissertação (Mestrado): UFRJ, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Pós-
Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2010.
1. Vírus Cantagalo. 2. ST-246. 3. Poxvírus.
I. Damaso, Clarissa. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho, Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica).
III. Título.
iii
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular de Vírus do Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação da
Prof
a
. Clarissa Rosa de Almeida Damaso, com auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à
Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior (CAPES).
iv
Agradecimentos
Nossa !!!!! Tenho muito a agradecer!!!!! Por onde começar??
Bem, lá vou eu! Primeiramente agradeço à Deus pela benção vida e pelos pais
maravilhosos que me deu. Meus pais foram a base de tudo pra mim, sempre. São verdadeiros
anjos que me ensinaram o caminho da verdade e lutaram pra que este dia e outros dias
maravilhosos de minha vida se concretizassem. Obrigada por tudo! Não poderia deixar de fazer
um agradecimento especial ao meu marido Pedro. Que antes mesmo de ser meu marido, me
apoiou em cada escolha que fiz e esteve comigo durante todos esses anos de UFRJ. Obrigada por
ter me esperardo até tarde no término de experimentos, além das idas ao Fundão nos finais de
semana.
Um agradecimento mais que especial à minha orientadora Clarissa Damaso pela
dedicação que ela teve comigo e tem com cada aluno no laboratório. Adorei ser uma “menina
fofinha da Clarissa”. Obrigada pela confiança depositada em mim durante todos estes anos de
laboratório e pelas ótimas conversas sobre este projeto tão maravilhoso.
Agradeço a todos os amigos queridos que fiz durante esses anos de laboratório: Desyreé,
Laila, Priscila, Raisa, Jociane,André, Daniel, Cristiana, Sheila, Patrícia, Carol e é claro, a
Maluzinha do meu coração. Tenho um carinho especial por cada um e poderia ficar aqui
escrevendo páginas e páginas para demonstrar a enorme saudade que irei sentir de vocês, das
conversas diárias, das ajudas nas horas que tudo dá errado! Obrigado por vocês existirem em
minha vida! Não poderia deixar de agradecer ao Ademilson pela alegria e amizade.
Aos Drs. Dennis Hruby e Robert Jordan da SIGA Tecnologies que forneceram o ST-246
para a realização deste projeto.
Aos laboratórios do Dr. Rafael Linden, Dr. Pedro Lagerblad e Dr. Marcos Farina pelo
uso dos microscópios de fluorescência.
À Dra.
Madalena Barroso do Inmetro (Xerém-RJ) pela ajuda com o uso do microscópio
confocal
À Dra. Marcia Attias do Laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha Meyer pelo uso do
microscópio eletrônico de varredura e ajuda na preparação das amostras.
À Dra. Wanda Von Kruger que autorizou a utilização do biotério de experimentação
para a realização dos ensaios com os camundogos.
v
À Dra. Luciana Arruda, do Instituto de Microbiologia- UFRJ, que me acomponhou nos
experimentos de citometria de fluxo e me ajudou na interpretação dos resultados obtidos.
Ao Dr. Nissin Moussatché pelo carinho, amizade e troca de idéias sobre o projeto.
Ao Eduardo Camacho, da Unidade Genômida-IBCCF-UFRJ, que me ensinou todas as
técnicas de inoculação em animais que utilizei neste trabalho. Obrigada mesmo!
À todos aqueles que torceram por mim ou me ajudaram de alguma forma na realização
deste projeto.
vi
Resumo
O vírus Cantagalo (CTGV) é uma cepa de vírus vaccinia (VACV) isolada a partir de
lesões pustulares de gado leiteiro e ordenhadores do estado do Rio de Janeiro em 1999, com
ocorrência subsequente em vários estados brasileiros. Até o momento não existem drogas anti-
poxvírus licenciadas, ressaltando a importância da disponibilidade de um antiviral eficaz para o
tratamento de infecções causadas pelo CTGV e outros Orthopoxvirus. O ST-246 é um potente
inibidor da replicação de Orthopoxvirus em cultura de células e em modelo animal. Estudos de
mapeamento de resistência indicaram que o alvo da droga é proteína viral F13, requerida para a
produção de vírus extracelulares. Dessa forma, nesse trabalho tivemos por interesse analisar o
efeito do ST-246 sobe a replicação do CTGV.
Inicialmente, avaliamos o efeito do ST-246 em condições de ciclos múltiplos de infecção
e observamos um efeito mais drástico da droga sobre a formação de placas virais e cometas do
CTGV, em relação a outros Orthopoxvirus. O IC
50
para CTGV foi de 0,0086 µM, enquanto que
para VACV-WR foi de 0,055 µM. A dosagem da atividade de β-galactosidase, expressa sob
controle de um promotor viral por CTGV e VACV-WR recombinantes, e a avaliação da
produção de partículas virais associadas à célula e extracelulares, confirmaram a maior
sensibilidade do CTGV ao ST-246, nestas condições de infecção.
A administração oral de ST-246 100 mg/kg em camundongos infectados com CTGV
preveniu a formação de lesão dermal na cauda, enquanto que, para VACV-WR, houve apenas
uma diminuição da severidade da lesão primária, confirmando a maior sensibilididade do CTGV
também in vivo.
A proteína F13 sintetizada por CTGV ou VACV-WR colocaliza com o marcador de
endossoma CI-MPR e tem sua localização subcelular alterada na presença de ST-246. Além
disso, CTGV acumula menos F13 e B5 ao longo da infecção e incorpora cerca de duas vezes
menos F13 nas formas virais extracelulares, em relação a VACV-WR.
vii
Abstract
Cantagalo virus (CTGV) is a vaccinia virus (VACV) strain isolated in 1999 from pustular
lesions on dairy cattle and milkers in Rio de Janeiro state, with subsequent occurrence in several
Brazilian states. So far there is no anti-poxvirus drugs licensed, emphasizing the importance of
the availability of an effective antiviral drug for the treatment of infections caused by CTGV and
other Orthopoxvirus. ST-246 is a potent inhibitor of orthopoxvirus replication in cell culture and
in animal model. Studies aimed on mapping the resistance to the drug indicated that ST-246
targets VACV F13 protein, leading to a block in the production of extracellular virus. In this
work we evaluated the effect of ST-246 on CTGV replication.
Initially, we evaluated the effect of ST-246 on multiple-step growth cycles and observed
that the effect of the drug was more drastic on CTGV plaque and comet formation when
compared with other Orthopoxvirus. The drug showed an IC
50
of 0.0086 µM and 0.055 µM
against CTGV and VACV-WR, respectively. Evaluation of β-galactosidase activity, under
control of a viral promoter in recombinant CTGV and VACV-WR as well as the analysis of
dose-response curves of the production of extracellular and cell-associated viruses confirmed the
higher susceptibility of CTGV to ST-246.
Oral administration of 100 mg/kg ST-246 to mice infected with CTGV prevented the
formation of dermal lesion on the tail, whereas in VACV-WR infected animals, we observed
only a decrease in the severity of the primary lesion, confirming the higher susceptibility of
CTGV in vivo as well.
F13 synthesized by CTGV and VACV-WR colocalized with the endosomal marker CI-
MPR and its subcellular localization was altered in the presence of ST-246. Furthermore, F13
and B5 proteins accumulated less intensely during CTGV infection and F13 was incorporated
approximately twice times less in CTGV extracellular particles.
viii
Abreviações e Símbolos
µg micrograma
µL microlitro
µM micromolar
ARAV vírus Araçatuba
BFA Brefeldina A
BSA Albumina sérica bovina
BPV vírus Buffalopox
CAV vírus associado à célula
CDC Center for Disease Control
CDV Cidofovir
CEV vírus extracelular associado à célula
CD-MPR Receptor de manose-6-fosfato dependente de cálcio
CI-MPR Receptor de manose-6-fosfato independente de cálcio
cm centímetro
CPV virus Cowpox
CTGV vírus Cantagalo
DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DIC Contraste Inteferencial Diferencial
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA ácido desoxirribonucléico
DO densidade ótica
DTT ditiotreitol
EDTA Etileno - diamino tetra acetato de sódio
EEV vírus extracelular envelopado
FDA Food and Drug Adminstration
g gravidade
GPV2 vírus Guarani P2
HIV vírus da imunodeficiência adquirida
HKD histidina, lisina e ácido aspártico
ix
HPMPC (S)-9[3-fluoro-2-(fosfonometoxi)propil]citosina
IEV vírus intracelular envelopado
IgG imunoglobulina G
IMV vírus intracelular maduro
IMBCH N
1
-isonicotinoil-N2-3-clorobenzoilhidrazina
IOC Instituto Oswaldo Cruz
IV vírus imaturo
kDa mil Daltons
kg Quilograma
kpb mil pares de base
LB Luria Bertani
M molar
mg miligrama
mA miliampere
MEV microscopia eletrônica de varredura
mM milimolar
MOI Multiplicidade de infecção
MPXV vírus Monkeypox
MTT Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide
ng nanograma
nm nanômetros
NMRI
Naval Medical Research Institute
NP-40 Nonidet P-40
NYCBH New York City Board of Health
o
C grau Celsius
OMS Organização Mundial da Saúde
ORF quadro aberto de leitura
pmol picomol
PBR Poxvirus Bioinformatics Resource Center
PBS tampão fosfato salino
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
x
PFU Unidade formadora de placa
PSTV vírus Passatempo
RNA Ácido Ribonucléico
RPM rotação por minuto
SCR Repetição curta consenso
SDS dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS
T.A. temperatura ambiente
TEMED N, N, N, N – tetrametilenodiamina
TK timidina quinase
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
VACV Vírus Vaccinia
WR Western Reserve
xi
Sumário
1.Introdução: .........................................................................................................................2
1.1.Família Poxviridae. ................................................................................................................. 2
1.2.O ciclo replicativo dos poxvírus. ............................................................................................ 3
1.3.Formação e liberação de partículas extracelulares de células infectadas. ............................ 8
1.4. O vírus Cantagalo. ............................................................................................................... 13
1.5. Poxvírus e Antivirais. ........................................................................................................... 16
1.6. ST-246. ................................................................................................................................ 17
2. Objetivos ......................................................................................................................... 22
3. Materiais e Métodos ........................................................................................................ 24
3.1. Células ................................................................................................................................. 24
3.2. Vírus .................................................................................................................................... 24
3.3. ST-246 ................................................................................................................................. 25
3.4. Propagação de estoque viral ............................................................................................... 25
3.5. Semi-purificação dos estoques virais .................................................................................. 26
3.6. Purificação de vírus intra- e extracelulares ......................................................................... 26
3.7. Análise da produção de placas virais ................................................................................. 27
3.8. Análise da formação de vírus associados à célula (CAV) e extracelulares (EEVs) ............... 28
3.9. Titulação das amostras virais por ensaio de placas ............................................................ 29
3.10. Ensaio de Citotoxidade ..................................................................................................... 29
3.11. Detecção da atividade de β-galactosidase expressa por vírus recombinante .................. 30
3.12. Ensaio de redução de Cometa .......................................................................................... 30
3.13. Ensaio de infecção de camundongos via lesão dermal..................................................... 31
3.14. Ensaios de Imunofluorescência ........................................................................................ 31
3.15. Sequenciamento da ORF de F13L .................................................................................... 33
3.15.1.Reação em cadeida da plimerase (PCR)................................................................33
3.15.2. Análise e purificação dos produtos de amplificação ................................................. 34
3.15.3. Sequenciamento de DNA e análise de sequências .................................................... 34
3.16. Preparo das amostras para análise por Western Blot ...................................................... 35
3.17. Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) ................................... 36
3.18. Western Blot ..................................................................................................................... 36
xii
3.19. Transformação de bactérias e Preparação de DNA plasmidial ......................................... 38
3.20. Transfecção de células BSC-40 com o plasmídeo pSG5-p37............................................. 39
3.21. Análise densitométrica dos autoradiogramas .................................................................. 40
3.22. Processamento de imagens .............................................................................................. 40
3.23. Análise Estatística ............................................................................................................. 40
4. Resultados ....................................................................................................................... 41
4.1. Análise da citotoxidade do ST-246 ...................................................................................... 42
4.2. Efeito do ST-246 sobre a formação de placas virais de CTGV e de outros Orthopoxvirus . 42
4.3. Efeito do ST-246 sobre a atividade da β-galactosidase expressa por vírus recombinante 47
4.4. Efeito do ST-246 sobre a formação de vírus associados à célula (CAVs) e extracelulares
(EEVs) em condições de ciclos múltiplos de infecção ................................................................ 49
4.5. Efeito do ST-246 in vivo (via lesão dermal) ......................................................................... 53
4.6. Análise da sequência de aminoácidos de ortólogos de F13 em Orthopoxvirus ................. 59
4.7. Localização intracelular da proteína F13 e de outras proteínas de IEV/CEV/EEV .............. 61
4.8. Acúmulo de proteínas de virais durante a infecção por Western Blot ............................... 70
4.9. Incorporação de F13, B5 e A34 nos EEVs produzidos por CTGV e VACV-WR ..................... 73
4.10. Sensibilidade do CTGV ao ST-246 em células BSC-40 superexpressando F13 .................. 75
5. Discussão ......................................................................................................................... 78
6. Conclusões ....................................................................................................................... 89
7. Perspectivas ..................................................................................................................... 91
8. Referências Bibliográficas ................................................................................................. 93
xiii
1
1-INTRODUÇÃO
2
1.Introdução:
1.1.Família Poxviridae.
A Família Poxviridae é constituída por vírus envelopados com genoma DNA
dupla-fita linear, variando de 135 a 360 kpb (PBR, 2010), e que se replicam inteiramente
no citoplasma de células de vertebrados (subfamília Chordopoxvirinae) ou invertebrados
(subfamília Entomopoxvirinae). Os poxvírus codificam a maioria das enzimas e fatores
importantes na transcrição e replicação do seu genoma e seus transcritos não sofrem
splicing (Moss, 2007).
Os poxvírus são vírus grandes (350 x 270 nm), com morfologia oval ou em
forma de tijolo e apresentam uma ou mais membranas lipídicas, dependendo da forma
infecciosa. Apresentam um core bicôncavo no centro, onde se encontra o genoma
associado a proteínas. Em cada concavidade do core, há um corpúsculo lateral de função
desconhecida (Figura 1) (Moss, 2007).
O vírus vaccinia (VACV), pertencente à subfamília Chordopoxvirinae, é o
membro protótipo do gênero Orthopoxvirus e sua origem permanece desconhecida
(Fenner et al., 1988; Moss, 2007). Esse vírus foi utilizado na vacinação contra a varíola,
erradicada em 1977 após uma campanha de vacinação mundial organizada pela OMS
(Fenner et al., 1988; Esposito e Fenner, 2001). Na literatura, é consenso que o VACV
não apresenta hospedeiro animal, não sendo encontrado na natureza (Fenner et al., 1988;
Esposito e Fenner, 2001; Moss, 2007). Entretanto, há algumas exceções relatadas na
literatura: o vírus bufalopox, o vírus Cantagalo (CTGV) e outras cepas de VACV bem
próximas ao CTGV. O vírus bufalopox tem sido isolado na Índia a partir de búfalos e
humanos desde a década de 60 (Dumbell e Richardson, 1993), enquanto o vírus
Cantagalo e outros VACVs similares (CTGV-like) tem sido isolados no Brasil desde
1999, como será descrito em detalhes posteriormente (Damaso et al., 2000; Schatzmayr
et al., 2000; de Souza Trindade et al., 2003; Nagasse-Sugahara et al., 2004; Leite et al.,
2005; Lobato et al., 2005; Trindade et al., 2006; Moussatché et al., 2008; Medaglia et al.,
2009).
3
Figura 1. Micrografia eletrônica do vírus Cantagalo em células Hep-2 (Damaso et al., 2000).
O genoma do VACV varia de 166 a 199 kpb de acordo com a cepa e tem
capacidade de codificar cerca de 200 proteínas (Goebel et al, 1990; PBR, 2010). Genes
envolvidos na replicação do genoma e controle de expressão gênica estão mais no centro
e os genes relacionados ao escape da resposta imune e interação com o hospedeiro estão
nas extremidades. A nomenclatura das ORFs mais utilizada está baseada no genoma do
vírus vaccinia (VACV) cepa Copenhagen. O genes são designados por letras
correspondentes aos fragmentos de DNA gerados através da digestão do genoma pela
enzima de restrição Hind III, seguido pela numeração da ORF dentro do fragmento e da
letra L ou R, que determina o sentido da transcrição da ORF, sendo para a esquerda ou
direita, respectivamente (Goebel et al., 1990). Desta forma, o gene F13L, por exemplo,
corresponde ao 13° gene do fragmento F e que apresenta a transcrição da direita para a
esquerda. Por convenção, a proteína sintetizada a partir desta ORF é designada como F13
(Goebel et a.l., 1990).
1.2.O ciclo replicativo dos poxvírus.
A infecção de cultura de células com o VACV e outros Orthopoxvirus resulta em
um profundo efeito citopático, mudanças na permeabilidade de membrana e uma
inibição da síntese de DNA, RNA e proteínas celulares (Damaso e Moussatché, 1992;
4
Moss, 2007). O ciclo infeccioso tem início quando a partícula viral é adsorvida à
membrana celular, após sua ligação a receptores específicos na membrana plasmática da
célula, liberando o core no citoplasma. Estudos sugerem que a entrada possa ocorrer
através de fusão com a membrana plasmática, via endocitose ou por macropinocitose
(Smith et al., 2002; Jason e Helenius, 2010).
O ciclo replicativo se divide em três etapas distintas de expressão gênica: fase
inicial, fase intermediária e fase tardia, que apresentam promotores e fatores
transcricionais virais específicos para cada etapa (Figura 2). É organizado em forma de
cascata, em que as etapas posteriores não ocorrem se as anteriores não tiverem ocorrido
com sucesso. A fase inicial corresponde à síntese de RNAs mensageiros iniciais, que por
sua vez, são traduzidos uma grande variedade de proteínas iniciais, incluindo moléculas
de escape da resposta do hospedeiro, enzimas e fatores atuantes na replicação do DNA e
na transcrição dos genes da fase intermediária. Toda esta fase ocorre utilizando enzimas
e fatores que se encontram no interior do core das partículas virais que iniciaram a
infecção (Condit & Niles, 2003; Moss, 2007).
Após a fase inicial, segue-se a replicação do DNA viral que ocorre
exclusivamente por intermédio de fatores e enzimas virais, assim como a regulação
negativa da transcrição dos genes iniciais. Esta etapa ocorre em sítios específicos do
citoplasma chamados de fábricas virais ou virossomas. O DNA é replicado em estruturas
concateméricas que são posteriormente resolvidas em unidades monoméricas de genoma
(Garcia e Moss, 2001). Após a replicação do DNA, tem início a fase pós-replicativa da
expressão gênica que é dividida em fases intermediária e tardia. Na fase intermediária, há
a síntese de proteínas que vão atuar como fatores transcricionais para expressão dos
genes tardios (Vos e Stunnenberg, 1988). Na etapa tardia, são sintetizados mRNAs e
proteínas tardias, que irão atuar como componentes majoritáros da membrana e do core
da partícula viral recém-formada, além dos fatores e enzimas necessários para a
transcrição inicial, que serão empacotados nas partículas nascentes para atuar em um
próximo ciclo replicativo (Condit et al., 2006).
5
Figura 2. Desenho esquemático do ciclo replicativo do vírus vaccnia. IV: vírus imaturos;
IVN: vírus imaturos com nucleóide; IMV: vírus intracelular imaturo; IEV: vírus envelopado
intracelular; CEV: vírus extracelular associado à célula; EEV: vírus extracelular envelopado.
(Fonte: Laboratório de Biologia Molecualr de Vírus-IBCCF-UFRJ).
Paralelamente à fase tardia de expressão gênica, inicia-se o processo de
morfogênese ou montagem da partícula viral, onde observamos a formação de crescentes
de membrana, associados às fábricas virais, que empacotam o DNA viral associado à
proteínas, formando a partícula imatura não infecciosa, denominada vírus imaturo (IV)
(Figura 3A). No entanto, a estrutura dos crescentes ainda é controversa, sendo que sua
origem e estrutura vêm sendo debatidas desde a década de 60. Estudos iniciais
mostraram a presença de uma bicamada lipídica única que seria sintetizada de novo,
utilizando-se enzimas virais, dando origem ao envelope do VACV (Dales e Siminovitch,
1961; Dales e Mosbach, 1968). Reforçando esta teoria, estudos recentes envolvendo
microscopia eletrônica da partícula viral e de células infectadas com o VACV revelaram
a presença de uma membrana única sem continuidade com membranas celulares
(Hollinshead et al., 1999; Carter et al., 2005; Heuser, 2005), sendo este o modelo mais
aceito. Em contrapartida, alguns autores defendem a teoria de que o crescente seria
formado por uma bicamada lipídica dupla derivada e contínua com o compartimento
intermediário entre o retículo endoplasmático e o complexo de Golgi (Sodeik et al.,
1993).
6
Após a formação do IV, inicia-se o processo de maturação do vírus. O VACV
produz diferentes tipos de partículas infecciosas. Estas, apresentam abundância,
estruturas e localizações diferentes durante a infecção. Além disso, o percentual de
produção de cada forma infecciosa depende da cepa viral e da linhagem celular (Blasco e
Moss, 1992), assim como cada forma apresenta proteínas de envelope específicas (Smith
et al., 2002).
Inicialmente, o IV dará origem ao vírus maduro intracelular (IMV) através de um
processo de maturação não muito conhecido, mas que envolve a clivagem de algumas
proteínas estruturais, como p4a, p4b e L4 (VanSlyke et al., 1991). Os IMVs são
formados dentro das chamadas fábricas virais ou virossomas e possuem forma de tijolo
(Condit et al., 2006). Parte dos IMVs deixam as fábricas virais e são transportados para
endossomas ou rede trans-Golgi onde receberão mais duas membranas para formar os
IEVs (vírus envelopado intracelular) (Tooze et al., 1995, van Eijl et al., 2002, Schmelz et
al., 1994) (Figura 3A). Alternativamente, a maior parte dos IMVs formados permanecem
no citoplasma até que ocorra a lise celular. O transporte de IMVs para os sítios de
aquisição de membranas é via microtúbulos e requer a proteína A27, que está presente na
superfície dos IMVs (Sanderson et al., 2000).
Os IEVs são transportados para a superfície da célula via microtúbulos, onde
ocorre a fusão das membranas celular e viral (Hollinshead et al., 2001; Ward e Moss,
2001) (Figura 3A). As duas membranas que envolvem os IEVs, apresentam uma
composição proteica única que compreende 7 proteínas virais que não são encontradas
nos IMVs (Figura 3B). Estas proteínas são codificadas pelos genes F12L (Zhang et al,
2000), F13L (Hirt et al., 1986), A33R (Roper et al., 1998), A34R (Ducan e Smith, 1992),
A36R (Parkinson e Smith, 1994), A56R (Payne e Norrby, 1976, Shida, 1986) e B5R
(Engelsan et al., 1992; Isaacs et al., 1992). As partículas retidas na superfície da célula
são denominadas de vírus extracelular associado à célula (CEV), ou se estas forem
liberadas para o meio extracelular, recebem o nome de vírus envelopado extracelular
(EEV) (Figuras 3A e 3B). Os CEVs são importantes no espalhamento da infecção célula-
célula e, por consequência, na formação da placa viral, enquanto os EEVs são
importantes na disseminação do vírus para células mais distantes (Smith et al., 2002;
Condit et al., 2006).
7
Na face citoplasmática da membrana celular, abaixo do CEV, há polimerização
de actina, formando projeções chamadas caudas de actina, que propulsionam o CEV para
infectar as células adjacentes (Hiller et al., 1979; Cudmore et al, 1996; Wolfe et al.,
1998; Smith et al., 2002; Doceul et al., 2010) (Figura 3A). Atualmente é consenso na
literatura que a formação de caudas de actina tem um papel essencial no espalhamento da
infecção e na formação das placas virais (Smith et al., 2002; Doceul et al., 2010). O
processo de polimerização das caudas de actina e as proteínas envolvidas serão
detalhados no item seguinte.
Figura 3. Desenho esquemático do ciclo replicativo do vírus vaccinia (A) e da disposição
das proteínas dos envelopes das formas virais IEV, CEV e EEV (B). IV: vírus imaturos;
IMV: vírus intracelular maduro; MT: microtúbulos; IEV: vírus envelopado intracelular, CEV:
vírus extracelular associado à célula; EEV: vírus extracelular envelopado (fonte: modificado
de Smith et al., 2002).
1.3.Formação e liberação de partículas extracelulares a partir de células
infectadas.
Dentre as proteínas exclusivas das formas extracelulares (F12, F13, B5, A33,
A34, A36 e A56), as proteínas F13 e B5 têm papel crucial na aquisição das duas novas
8
membranas para formar os IEVs (Blasco e Moss, 1991; Engelstad e Smith, 1993; Wolfe
et al., 1993). A proteína B5 é uma glicoproteína de 42 kDa com uma topologia de
membrana tipo-1. O ectodomínio de B5R contém 4 repetições consenso (SRCs) que são
características de membros da superfamímila de proteínas de controle de complemento e
cujo papel na produção de vírus extracelular, placa viral e caudas de actina ainda não é
bem compreendido (Mathew et al., 1998; Herrera et al., 1998). No entanto, vírus
mutantes deletados de B5R tem níveis de produção de EEV de 5 a 10 vezes menores que
o vírus selvagem, além de formar uma placa viral pequena, produzirem poucas caudas de
actina e serem atenuados in vivo (Takahashi-Nishimaki et al., 1991; Engelstad e Smith,
1993; Martinez-Pomares et al., 1993; Wolffe et al., 1993).
O gene F13L codifica um polipeptídeo de 37 kDa que se localiza em membranas
do trans-Golgi (Figura 4). A associação desta proteína com membranas celulares é
mediada via palmitoilação de um ou ambos resíduos adjacentes de cisteína nas posições
185 e 186 (Grosenbach et al., 1997; Schmutz et al., 1995). A alteração destes resíduos de
cisteínas para alanina altera a distribuição intracelular de F13 (Grosenbach, et al., 1998).
A proteína F13 também apresenta 2 motivos HDK de 16 aminoácidos, conservados em
fosfolipases e sintases fosfolipídicas (Koonin, 1996; Cao et al., 1997). Estudos anteriores
demonstraram que a infecção com mutantes no motivo HDK ou tratamento com inibitor
de fosfolipases, butanol-1, resultou numa falha no processo de formação de IEVs (Roper
e Moss, 1999; Husain e Moss, 2002).
Além disso, a proteína F13 apresenta um domínio de montagem viral tardio
(YxxL), que em outros vírus envelopados, como HIV-1 (vírus da imunodeficiência
humana tipo-1), demonstrou estar envolvido no processo de brotamento viral (Gottlinger
et al., 1991; Huang et al., 1995). Em VACV, a deleção ou substituição dos resíduos do
motivo YxxL de F13 resultou em um diminuição da liberação de EEVs, com formação
de placa viral pequena (Honeychurch et al., 2007). Estudos anteriores demonstraram que
o motivo YxxL da proteína p9 do vírus da anemia infecciosa eqüina (EIAV) se liga à
proteína celular AIP1/Alix, e a ausência de expressão desta proteína levou à um
decréscimo na produção de vírions EIAV e HIV-1 (Martin-Serrano et al., 2003; Strack et
al., 2003; Segura-Morales et al., 2005). O silenciamento da expressão de AIP1/Alix por
RNAi em células infectadas com VACV também causou uma queda na produção de
9
vírus extracelulares (Honeychurch et al., 2007). AIP1/Alix é uma proteína citosólica que
foi originalmente identificada como parceira de ALG-2, uma proteína ligadora de Ca
2+
implicada em sinalização apoptótica (Missotten et al., 1999, Vito et al., 1999). Porém,
estudos posteriores relacionaram a proteína AIP1/Alix a outros mecanismos celulares
como a formação de endossomas tardios, tráfego endocítico de membranas e adesão
celular. (Odorizzi, 2006). No entanto, até o momento não se sabe se AIP1/Alix
colocaliza e interage fisicamente com F13.
Figura 4. Análise da sequencia de aminoácidos de ortólogos de F13. (A) Representação
gráfica de F13 ilustrando a localização dos sítios de palmitoilação, resistência aos antivirais
ST-246 (G277C) e IMCBH (D280Y) , o domínio de montagem viral tardio (YxxL) e o
motivo fosfolipase HKD. (B) Comparação da sequencia de aminoácidos dos ortólogos de
F13, a partir do aminoácido 245 ao 302, mostrando que os sítios de resistência ao ST-246
(posição 277) e IMCBH (posição 280) encontram-se conservados, identificados pelos
asteriscos (Modificado de Yang et al., 2005).
Algumas drogas anti-poxvírus tem como alvo a proteína F13, de modo a inibir o
progresso da infecção no estágio de formação das partículas extracelulares (IEVs). A
droga N
1
-isonicotinoyl-N2-3-chlorobenzoylhydrazine (IMBCH) inibe a liberação do
vírus vaccinia em cultura de células, mas não tem efeito na produção de vírus
10
intracelulares, nem apresenta efeito antiviral in vivo (Hiller et al., 1981; Husain e Moss,
2003; Payne e Kristenson, 1979; Schmutz et al., 1991). O fenótipo de vírus resistentes a
IMCBH foi mapeado e mostra uma única alteração de asparagina para tirosina na
posição 280 do gene F13L (Schmutz et al., 1991). Na presença de IMCBH, a proteína
F13 é redistribuída no citoplasma similarmente ao fenótipo observado em células
infectadas com vírus vaccinia variantes contendo a alteração C185A (Hiller et al., 1981).
A proteína F13 também é alvo do antiviral ST-246 (Yang et al., 2005), como será
abordado em detalhes mais adiante.
Estudos anteriores demonstraram que as proteínas B5 e F13 co-localizam em
vesículas pós-Golgi (Husain e Moss, 2001), e mais recentemente, por ensaios de co-
imunopreciptação, foi comprovada a interação física entre estas duas proteínas (Chen et
al., 2008).
Uma vez formados os IEVs, estes são transportados para a periferia da célula via
microtúbulos. Este transporte pode ser inibido reversivelmente pela adição de nocodazol
(Ward e Moss, 2001; Hollinshead et al., 2001). Duas proteínas virais estão implicadas no
transporte dos IEVs, A36 e F12. Estas duas proteínas são encontradas exclusivamente
sobre a membrana mais externa do IEV e não estão associadas com CEVs ou EEVs
(Figura 5A) (van Eijl et al., 2002; Wolffe et al., 2001). Microscopia eletrônica de
transmissão e confocal mostrou que a deleção de F12L causa uma bloqueio da infecção
após a formação dos IEVs e não são observados CEVs na superfície da célula (Zhang et
al., 2000; van Eijl et al., 2002). Contudo, até o momento não foi demonstrada uma
associação direta entre F12 e o sistema de transporte via microtúbulos (Roberts e Smith,
2008).
A proteína A36 parece estar envolvida no transporte de vírions para a superfície
da célula via interação com o motor molecular de cinesina-1 (Ward e Moss, 2004), e os
resíduos 71 –100 da proteína A36 parecem ser cruciais para este movimento (Rietford et
al., 2001) (Figuras 5A e 5B). Recentemente, os papéis de F12 e A36 no transporte de
IEVs foram comparados diretamente, e foi visto que a deleção de F12L tem um efeito
profundo sobre a formação de CEV, entretanto a deleção de A36R não tem (Herrero-
Martinez et al., 2005). Embora a proteína A36 pareça estar diretamente envolvida no
11
recrutamento de cinesina-1 para o IEV, na ausência de A36 ocorre a formação de CEVs
e EEVs (Sanderson et al., 1988; van Eijl et al., 2000; Hollinshead et al., 2001),
sugerindo que outra proteína presente no IEV pode interagir com cinesina-1 ou que outra
forma de transporte pode ser usada (Ward e Moss, 2004). Duas proteínas virais
interagem com A36. Uma é A33 por meio de sua cauda citoplasmática e esta interação é
requerida para sua incorporação nas membranas virais (Ward et al., 2003) (Figura 5B).
Além disso, a interação entre as proteínas A36 e F12 foi recentemente descrita por
Johnston e Ward (2008), mostrando que mutações no sítio de interação de F12 com A36
leva à uma diminuição da produção de CEV e EEV infecciosos.
Figura 5. Motilidade do vírus vaccinia via microtúbulos e formação de caudas de actina.
(A) Uma ilustração de como as quinases celulares da família Src atuam na motilidade do
vírus vaccinia dentro células infectadas. IEV: vírus envelopado intracelular; CEV: vírus
extracelular associado à célula. (B) Esquema da proteína A36 indicando o domínio
transmembrana (TM), os dois resíduos de tirosina que são fosforilados (Tyr 112 e Tyr
132) e a região onde a proteína viral A33 interage com A36 para facilitar o
recrutamento desta para os IEVs. Caixa verde clara: região de ligação a cinesina e A33;
caixas verdes escuras: sítio de ligação das cinases Src; caixas cinzas: sítios de ligação dos
adaptadores Nck e Grb2. (fonte: modificado de Munter et al., 2006).
Tendo o IEV alcançado a membrana plasmática, sua membrana mais externa se
fusiona com a membrana da célula para expor o vírion (CEV) sobre a superfície celular.
Desta forma, o domínio SCR4 da proteína B5 ficará exposto na superfície do CEV,
atuando na formação de uma cascata de sinalização que irá ativar quinases celulares da
12
família Src (Newsome et al., 2004). Uma vez ativadas, as quinases Src permacecem
associadas abaixo do CEV no sítio de montagem dos filamentos de actina (Newsome et
al., 2004) (Figuras 5A e 6). Durante este processo, a proteína A36 está localizada na
membrana plasmática abaixo do CEV, com grande parte da cadeia polipeptídica voltada
para a face citosólica (Figura 6) (van Eijl et al., 2000). Quinases Scr fosforilam os
resíduos de tirosina 112 e 132 da proteína A36, que, em última análise, levam ao
recrutamento de Nck como um complexo de proteínas celulares, contendo WIP (WASP
interacting protein) e N-WASP, sendo este complexo estabilizado via interações com
Grb2 (Frischknecht et al., 1999; Scaplehorn et al., 2002; Zettl e Way, 2002). Por fim, o
recrutamento de N-WASP estimula a atividade de nucleação de actina do complexo
celular Arp 2/3 e formação das caudas de actina abaixo do CEV (Frischknecht et al.,
2001). Estudos posteriores demonstratam que quinases celulares da família Abl também
são capazes de fosforilar a proteína A36, resultando na polimerização de actina abaixo
do CEV (Timothy et al., 2006).
Outras proteínas virais são requeridas, indiretamente, para a formação de caudas
de actina. A proteína A34 regula a incorporação das proteínas B5 e A33 (Earley et al.,
2008; Perdiguero et al., 2008) no EEV, logo, quando A34 ou A33 estão ausentes na
membrana do IEV, a proteína A36 também estará. Outro estudo sugere a participação
direta de A33 e B5 na formação e estabilização das caudas de actina (Katz et al., 2003).
As projeções de actina não atuam na liberação do EEV e o mecanismo de
aderência de um CEV na superfície celular é desconhecido, mas estudos sugerem que as
proteínas A33, A34 e B5 estejam envolvidas (Blasco et al., 1993; Mathew et al., 1996;
Roper et al., 1998; Katz et al., 2002). No entanto, ainda não se sabe se essas proteínas
interagem com proteínas celulares na superfície da célula ou com proteínas virais
derivadas da membrana externa do IEV fusionada com a célula.
13
Figura 6. Polimerização da cauda de actina abaixo do CEV (vírus extracelular associado
à célula). A cascata de sinalização que leva à formação das caudas de actina começa com a
fosforilacação da face citoplasmática da proteína A36 por quinases celulares das famílias Src
ou Abl, com o subseqüente recrutamento de Nck e Grb2, WIP e N-WASP, seguido da
polimerização de actina via complexo Arp 2/3. (Fonte: Modificado de Smith et al., 2003).
1.4. O vírus Cantagalo
O vírus Cantagalo (CTGV) foi isolado a partir de um surto ocorrido em fazendas
no noroeste do estado do Rio de Janeiro em 1999, que acometia o gado leiteiro e os
ordenhadores. O aspecto clínico da infecção era o aparecimento de pápulas que evoluíam
para vesículas e, posteriormente, para pústulas, sugerindo que o agente etiológico poderia
ser um poxvírus (Figura 7 A-D). Ainda eram observados sintomas como febre e, em
humanos, linfadenopatia axilar. A infecção provocava grande prejuízo econômico, já que
as vacas doentes não podiam ser ordenhadas, ocasionando muitas vezes mastite e perda
das tetas. As amostras foram coletadas e, através e técnicas de biologia molecular, o
agente foi descrito como sendo uma cepa do VACV (Damaso et al., 2000). A
identificação do CTGV levantou uma importante questão, visto que a literatura refere-se
14
ao VACV como não tendo hospedeiro natural (Fenner et al., 1988; Moss, 2007), exceto
pela cepa buffalopox que acomete o gado leiteiro e búfalos na Índia (Fenner et al., 1988;
Moss, 2007; Moussatché et al., 2008). Assim, o CTGV foi o segundo caso descrito no
mundo e o primeiro nas Américas de persistência de um VACV na natureza.
Além dos surtos na região de Cantagalo (RJ), outros episódios de CTGV-like
ocorreram na mesma época, e mesmo atualmente, em diversos municípios do RJ
(Schatzmayr et al., 2000), bem como em outros estados como São Paulo, Minas Gerais,
Goiás e Espírito Santo (Nagasse-Sugahara et al., 2004; Lobato et al., 2005; Damaso et
al., 2007, Megid et al., 2008) (Figura 7E). Outros episódios ocorridos em São Paulo e
Minas Gerais tiveram seus agentes etiológicos também caracterizados como cepas de
VACV próximas ao CTGV e denominados vírus Araçatuba (de Souza Trindade et al.,
2003), Passatempo (Leite et al., 2005) e Guarani P2 (Trindade et al., 2006). Em 2009, nosso
grupo descreveu o primeiro caso de CTGV-like na região Norte, no estado do Tocantins
(Medaglia et al, 2009). Assim, é fato que o CTGV conseguiu estabelecer-se na natureza e
continua gerando perdas econômicas consideráveis em diversas propriedades,
principalmente da região sudeste, que comercializam leite utilizando a ordenha manual.
15
Figura 7. Lesões na teta de gado bovino (A e B) e mão de retireiro (C e D) após infecção
com isolados CTGV-like. As setas indicam as áreas contendo as lesões. (E) Regiões
geográficas e estados brasileiros onde foram reportados episódios de CTGV-like, desde 1999,
estão indicados no mapa. ARAV-vírus Araçatuba; PSTV- vírus Passatempo, GPV2 – vírus
Guarani P2 (Fonte: Mousstache et al., 2008 (A,B,C,D) e Medaglia et a.l, 2009 (E), com
modificações).
16
1.5. Poxvírus e Antivirais.
A recente preocupação mundial com o possível uso do vírus da varíola como
arma biológica e a ocorrência de surtos de CTGV-like no Brasil reforçam a importância
da descoberta de compostos com ação anti-poxvírus. No entanto, apesar de um grande
número de compostos recém-descobertos serem capazes de inibir a replicação de vários
Orthopoxvirus in vitro, estes compostos apresentam diversos efeitos associados, devido a
mecanismos não específicos de ação (Baker et al., 2003). Devido ao seu extenso genoma
e por codificar um grande número de proteínas, os poxvírus possuem vários alvos para a
ação de antivirais. Além das proteínas virais, também podem constituir bons alvos
algumas proteínas celulares essenciais para os vários passos de seu ciclo replicativo
(adsorção, expressão gênica, morfogênese e liberação dos vírus recém-formados) (Neyts
& De Clercq, 2003).
Não há drogas antivirais licenciadas para uso contra infecções por poxvírus e
apenas dois compostos têm sido, até o momento, considerados promissores para futuro
uso comercial: cidofovir (HPMPC ou CDV) e ST-246. O CDV é um nucleosídeo
acíclico fosfonado, análogo de citidina, que apresenta atividade antiviral contra diversos
vírus de genoma DNA, inclusive com ação comprovada in vivo e in vitro contra os
poxvírus varíola, monkeypox, vaccinia, cowpox, Orf e Molluscum contagiosum
(Nettleton et al., 2000; De Clercq, 2002; Baker et al., 2003; Bray & Roy, 2004).
Entretanto, o CDV é apenas licenciado para uso clínico no tratamento de retinite causada
por citomegalovírus em pacientes imunodeprimidos (Kern et al., 2002). Em 2009, Jesus
e colaboradores demonstraram que o CDV foi capaz de inibir a replicação do CTGV e do
VACV-IOC (cepa vacinal utilizada pelo Instituto Oswald Cruz, durante a campanha de
erradicação da varíola) com um IC
50
(concentração que inibiu em 50% a replicação viral)
de 7,68 µM e 9,66 µM, respectivamente (Jesus et al., 2009a). Além disso, o CDV
também foi eficaz em inibir a replicação de outros isolados de CTGV-like obtidos entre
2001-2007 nos estados de Minas Gerais, Espírito Santo e Rio de Janeiro (Jesus et al.,
200). E embora os diversos estudos apontem para a replicação do DNA viral como alvo
de ação do CDV, um estudo recente, desenvolvido em nosso laboratório, demonstrou
17
que na presença da droga a morfogênese do VACV foi severamente afetada na transição
de IV para IMV. Observou-se importante inibição do empacotamento do genoma nas
partículas virais possivelmente relacionado a alterações observadas na estrutura do DNA
viral (Jesus et al., 2009b).
Recentemente, o órgão americano Food and Drug Adminstration (FDA)
autorizou, em caráter excepcional, o uso do CDV e ST-246 no tratamento emergencial de
uma criança com quadro grave de eczema vaccinatum (efeito adverso da vacinação com
VACV), levando à cura do paciente (Kaiser, 2007). Os casos de complicação pós-vacinal
são preocupantes, principalmente devido à gravidade (Kaiser, 2007; Jacobson et al.,
2008). Assim, A OMS tem estimulado enfaticamente o estudo desses compostos, como
relatado na recente reunião anual sobre pesquisa com o vírus da varíola (OMS, 2009).
1.6. ST-246.
O ST-246 é um composto recém-descoberto (4-trifluoromethyl-N-
(3,3a,4,4a,5,5a,6,6a-octahydro-1,3-dioxo-4,6-ethenocycloprop[f]isoindol-2(1H)-yl)-
benzamide), de baixo peso molecular (376) e foi identificado durante o rastreamento de
356.240 compostos em testes de atividade anti-Orthopoxvirus (Figura 8) (Yang et al.,
2005). O ST-246 apresentou forte atividade antiviral contra o vírus vaccinia cepas IHD-J
e NYCBH, vírus ectromelia, cowpox, camelpox, monkeypox e duas cepas de varíola
(Yang et al., 2005, Duraffour et al., 2007). Além disso, apresentou alta seletividade para
Orthopoxvirus e é cerca de 8.000 vezes mais potente do que o CDV (Yang et al., 2005).
Estudos de mapeamento de resistência tem apontado o gene F13L como o único
alvo de ação do ST-246 (Yang et al., 2005, Durrafour et al., 2008). O fenótipo de placa
pequena observada na presença da droga e a habilidade do composto em prevenir a
disseminação in vivo estão de acordo com a inibição da formação de vírus extracelulares
observada nos diversos trabalhos (Yang et al., 2005, Quenelle et al., 2007; Nalca et al.,
2008; Jordan et al., 2009). No entanto, sugere-se que seu modo de ação dependa da cepa
viral e tipo celular, de acordo com a taxa de EEV produzido em cada situação (Duraffour
18
et al., 2007). Sendo assim, o ST-246 é uma poderosa ferramenta no estudo do mecanismo
de formação de vírus extracelulares.
Figura 8. Estrutura química do ST-246 (Yang et al., 2005).
Recentemente, foi visto que a proteína F13 interage com proteínas que se
associam com endossomas tardios, como TIP47, Rab9 e CI-MPR, e que esta interação é
rompida na presença de ST-246 (Chen et al., 2008). Proteínas Rab pertencem à
superfamília das proteínas Ras e estão envolvidas na distribuição de compartimentos
celulares por regular o movimento de vesículas e organelas ao longo de filamentos do
citoesqueleto (Zerial e McBride, 2001). A proteína Rab9 tem papel na reciclagem de
receptores de manose-6-fosfato dependente de cácio (CD-MPR) e receptores de manose-
6-fosfato independente de cálcio (CI-MPR) de endossomas tardios para a rede trans-
Golgi (TGN) (Orsel et al., 2000). A reciclagem de CI-MPR dependente de Rab9 é
realizada mediante interações com a proteína TIP47, um efetor específico de Rab9
(Carroll et al., 2001). Chen e colaboradores (2008) sugerem que, ao romper interações
Rab9-F13, o ST-246 estaria bloqueando a formação do complexo de membranas
envolvidas na biogênese do IEV e que este possa ser o mecanismo de ação da droga.
Além disso, na presença de ST-246, a ligação entre as proteínas B5 e F13 também é
desfeita (Chen et al., 2008). Ainda não se sabe se o ST-246 inibe a atividade fosfolipase
19
de F13, já demonstrada como importante para a formação das partículas extracelulares
(Roper e Moss, 1999; Husain e Moss, 2002).
Muitos estudos têm comprovado eficácia do ST-246 em prevenir o aparecimento
de sinais clínicos de doença e morte de animais infectados com diferentes
Orthopoxvirus.. Diversos modelos experimentais utilizando camundongos (incluindo as
cepas BALB/c, NMRI, ANC/R e Nu/nu), coelhos, cães, macacos e esquilos infectados
por diferentes rotas de inoculação (intranasal, intravenosa, intradérmica, subcutânea e
aerossol) com diferentes Orthopoxvirus (vírus vaccinia cepas IHD-J, Lister e WR; vírus
ectromelia; vírus cowpox; vírus rabbitpox e vírus monkeypox) têm possibilitado o
estabelecimento de estratégias de dosagem e estudos farmacocinéticos para se estabelecer
a eficácia do antiviral (Yang et al., 2005; Jahrling et al., 2007; Quenelle et al., 2007a;
Quenelle et al., 2007b; Sbrana et al., 2007; Grosenbach et al., 2008; Nalca et al., 2008;
Huggins et al., 2009; Jordan et al., 2009). Em modelos em que se realiza um desafio letal
com Orthopoxvirus, o tratamento com o ST-246 pode ser iniciado até 72 horas após a
infecção para se obter uma proteção completa (Huggins et al., 2009). Em primatas não
humanos, o ST-246 protegeu macacos cynomolgus de um desafio letal intravenoso com
os vírus monkeypox e varíola, ao reduzir significativamente a carga viral e a formação de
lesão (Huggins et al., 2009; Jordan et al.,2009). O ST-246 já completou a fase I de testes
clínicos em humanos, se mostrando seguro e bem tolerado quando administrado
oralmente como uma dose única diária em voluntários saudáveis (homens e mulheres)
(Jordan et al., 2008; Jordan et al., 2010). A partir destes estudos, foi estabelecido que a
dose única diária de 400 mg/dia de ST-246 em humanos é necessária para se atingir uma
concentração plasmática acima da concentração necessária para se combater uma
infecção causada por Orthopoxvirus, ao compararmos com os dados obtidos em modelos
utilizando primatas não-humanos (Huggins et al., 2009; Jordan et al.,2009; Jordan et al.;
2010).
Assim, o ST-246 tem sido recomendado pela OMS como uma droga promissora
no tratamento de infecções por Orthopoxvirus, sendo considerado a primeira opção de
tratamento caso sua eficácia e segurança em humanos seja confirmada e aprovada pelo
FDA americano (OMS, 2009). Formulações alternativas do ST-246 estão sendo testadas,
20
como cápsulas para adultos, suspensões orais para crianças e pessoas idosas, e formas
intravenosas injetáveis para situações de emergência.
21
2-OBJETIVOS
2. Objetivos:
22
O objetivo geral desta dissertação é caracterizar o efeito antiviral da droga
ST-246 sobre a replicação do vírus Cantagalo (CTGV).
Os objetivos específicos são:
Analisar o efeito antiviral do ST-246 sobre a replicação do CTGV, comparando
com o efeito sobre outros orthopoxvírus, quanto à :
- formação de placas virais;
- produção de partículas infecciosas intra- e extracelulares;
- expressão de β-galactosidase por vírus recombinantes.
Avaliar do efeito antiviral do ST-246 in vivo em modelo de lesão dermal em
camundongos infectados com CTGV;
Comparar a sequência da proteína F13 (alvo de ST-246) de CTGV com a de
outros orthopoxvirus;
Analisar o efeito do ST-246 sobre a localização intracelular de F13 e de outras
proteínas de envelope de CTGV, comprando com VACV-WR
Avaliar o acúmulo de F13 durante a infecção com CTGV em presença de ST-
246;
Avaliar o conteúdo de F13 e de outras proteínas de EEV em partículas virais
purificadas de CTGV e VACV-WR.
Iniciar a avaliação da super-expressão de F13 em células infectadas em presença
de ST-246 e avaliar a formação de placas virais.
23
3-MATERIAIS E MÉTODOS
3. Materiais e Métodos:
24
3.1. Células
Nos ensaios foram utilizadas células BSC-40 (células de rim de macaco verde
africano) e RK13 (células de rim de coelho) crescidas em monocamada a 37
o
C com 5%
de CO
2
, em placas para cultura de tecido de 60 mm ou 100 mm de diâmetro. Foi utilizado
meio de cultura DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Invitrogen) suplementado
com 5% de soro fetal bovino, estreptomicina 0,1 mg/mL, 500 unidades de pencilina/mL,
piruvato de sódio 0,11 µg /mL, fungizona 2,5 µg/ mL e bicarbonato de sódio 0,24 %.
O repique de manutenção das células foi realizado a cada 3 ou 4 dias, descartando-se o
meio antigo, lavando a monocamada duas vezes com solução salina PBS (NaCl 0,8%;
KCl 0,02%; Na
2
PO
4
0,15%; KH
2
PO
4
0,02%; pH 7,2), seguido de tratamento das células
com tripsina 0,25% e EDTA 1 mM em PBS a 37
o
C por 1 minuto. Após o tratamento
com tripsina, as células da placa foram ressuspensas em meio de cultura fresco e passadas
para novas placas de cultura na proporção 1:8 (células:meio). Placas de 60 mm e 100 mm
de diâmetro com monocamada confluente apresentam cerca de 2,6 x 10
6
e 5 x 10
6
células, respectivamente.
3.2. Vírus
Neste trabalho, foram utilizados os vírus Cantagalo (CTGV) isolado CM-01, vírus
vaccinia cepa WR (VACV-WR), vaccinia cepa Wyeth (VACV-Wyeth), vaccinia cepa
IOC (VACV-IOC), e cowpox cepa Brighton Red (CPV). O vírus Cantagalo foi isolado de
lesão pustular em vacas, como descrito na Introdução (Damaso et al., 2000), seguido de
seleção clonal após 3 ciclos de purificação por placa. O VACV-IOC e VACV-Wyeth
foram originalmente cedidos ao laboratório pelo Dr. Hermann Schatzmayr (Instituto
Oswaldo Cruz, RJ) em 1981, como ampolas liofilizadas de vacina antivariólica, e
também submetidos à seleção clonal. O vírus cowpox foi gentilmente cedido pelo Dr
Richard Moyer da University of Florida, EUA.
Além disso, foram utilizados os vírus recombinantes CTGV-EGFP e VACV-WR-
GFP, que expressam o gene da β-galactosidade de Escherichia coli sob controle de um
25
promotor viral inicial/tardio (p7.5). O gene da β-galactosidade foi inserido no locus do
gene da timidina quinase (TK), e gentilmente cedido pelo Dr Peter Turner da University
of Florida, EUA. A construção do CTGV-EGFP foi realizada por Sheila Albert dos Reis
durante seu doutorado (dados não publicados).
3.3. ST-246
O ST-246 foi gentilmente fornecido por pela SIGA Technologies, Inc. A droga foi
solubilizada em DMSO 100% para uma concentração final de 10 mM e posteriormente
diluída em meio de cultura para as concentrações finais utilizadas nos experimentos in
vitro. Para os experimentos in vivo, utilizamos uma suspensão aquosa do ST-246 em
hidroxipropil-metilcelulose 1% contendo Tween 80 0,5%.
3.4. Propagação de estoque viral
Para propagação dos vírus, monocamadas confluentes de BSC-40, em placas de
100 mm de diâmetro (5 x 10
6
células), foram infectadas com CTGV ou com VACV-WR
com uma MOI (multiplicidade de infecção) de 0,1 e 0,01, respectivamente, em 1 mL de
solução salina de Puck (Vermelho de Fenol 0,02%; NaCl 8%; KCl 0,4%; glicose 1%;
NaHCO
3
.6H
2
O 0,35%; MgCl
2
4%). Durante a fase de adsorção, as monocamadas foram
agitadas com intervalos de 15 minutos, durante 2 horas à temperatura ambiente. Após 48
horas de infecção, as monocamadas foram recolhidas e centrifugadas a 1000 x g por 10
minutos a 4
o
C. O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspenso em PBS
(Damaso et al., 2000). O estoque viral foi armazenado a –70° C e utilizado nos ensaios
experimentais, para semi-purificação ou purificação de vírus, como descrito no item 3.5.
O título dos estoques virais foi determinado por ensaio de placa como descrito no item
3.9. Os estoques virais de VACV-IOC foram preparados da mesma forma como descrito
acima para CTGV, enquanto que os estoques dos vírus VACV-Wyeth e Cowpox foram
preparados por colegas do laboratório que gentilmente forneceram uma amostra.
26
3.5. Semi-purificação dos estoques virais
Os estoques de células infectadas com CTGV ou VACV-WR, preparados como
descrito no item acima, foram diluídos em água deionizada estéril e macerados com
homogeneizador tipo Dounce para o completo rompimento das células. Em seguida, as
amostras foram submetidas à centrifugação a 1000 x g por 10 minutos para clarificação
dos debris celulares. O sobrenadante foi transferido para outro tubo e reservado. O
sedimento foi ressuspenso em Tris HCl 10 mM (pH 7,5), macerado novamente e
submetido a um novo ciclo de centrifugação. Os dois sobrenadantes foram aplicados no
topo de um colchão de sacarose 36% e submetidos à centrifugação, utilizando rotor
SW41 (Beckman) a 20000 rpm por 90 minutos a 4
o
C. O sedimento obtido foi
ressuspenso em Tris HCl 10 mM (pH 7,5) e submetido à centrifugação a 13000 g por 40
minutos a 4
o
C, sendo finalmente ressuspenso em Tris HCl 10mM (pH 7,5), aliquotado e
mantido a -80
o
C. O título viral do estoque foi determinado por ensaio de placa, como
descrito no item 3.9.
3.6. Purificação de vírus intra- e extracelulares
Para utilização nos ensaios em camundongos, vírus semi-purificados (item 3.5) e
ressupensos em 1 mL de Tris HCl 10mM (pH 7,5) foram aplicados no topo de um
gradiente de sacarose de 25 a 40% em Tris HCl 10 mM (pH 7,5) e centrifugados em rotor
SW41 (Beckman) a 14000 rpm por 45 minutos a 4
o
C. Bandas visíveis localizadas a
aproximadamente ¼ do fundo do tubo foram recolhidas, submetidas à lavagem em Tris
HCl 10 mM (pH 7,5) e armazenadas como descrito no item 3.5 (Damaso e Moussatché,
1992).
Para ensaios de Western blot, o seguinte procedimento para obtenção de vírus
purificado foi utilizado: monocamadas de células BSC-40 em placas de 100 mm de
diâmetro (5 x 10
6
células) foram infectadas com uma MOI de 10 de CTGV ou VACV-
WR. A fase de adsorção foi realizada em 1 mL de solução salina de Puck à temperatura
ambiente por 30 minutos, com agitação suave a cada 15 minutos. Após este período, o
inóculo foi removido e meio fresco completo contendo DMSO 0,1% ou 10 µM de ST-
27
246 foi adicionado. Para a obtenção dos vírus extracelulares (EEVs), após 16 horas de
infecção, o meio de cultura foi recolhido e submetido à centrifugação a 800 x g por 10
minutos a 4
o
C para remoção de células soltas. O sobrenadante foi recolhido e submetido
à centrifugação em centrífuga Sorval (rotor SS34) a 10000 rpm por 1 hora a 4º C . Em
seguida, o sedimento contendo os EEVs foi ressuspenso em Tris HCl 10 mM (pH 7,5) e
submetido novamente à centrifugação a 13000 x g por 40 minutos a 4
o
C, sendo
finalmente ressuspenso em PBS 1X e armazenado a -80
o
C. Os vírus intracelulares (cell-
associated virus; CAV) foram obtidos das monocamadas de células infectadas por 16
horas, recolhidas em água deionizada estéril e submetidas a ciclos de
congelamento/descongelamento. O material foi submetido à homogeneização com
Dounce e os lisados obtidos foram centrifugados em um colchão de sacarose 36%, como
descrito no item 3.5. O título viral foi determinado por ensaio de placas como descrito no
item 3.9.
3.7. Análise da produção de placas virais
Monocamadas de células BSC-40 ou RK13 cultivadas em placa de 6 poços (1 x
10
6
células por poço) foram infectadas com 350 PFUs/poço (MOI= 0,00035) de CTGV
ou outros Orthopoxvirus, conforme o experimento, em 200 µL de solução salina de Puck.
A etapa de adsorção ocorreu por 2 horas à temperatura ambiente. Após este período, o
inóculo foi removido e adicionou-se meio de cultura fresco completo contendo DMSO
0,05% ou ST-246, nas concentrações indicadas, por 48 horas. Para o ensaio de 96 horas,
após a etapa de adsorção, adicionamos às culturas de células 2-metil-celulose 1%. As
placas foram mantidas a 34,6
o
C (ensaio de 96 horas) ou a 37
o
C (ensaio de 48 horas).
Para a contagem das placas virais no ensaio de 48 horas, retiramos o meio de cultura e
adicionamos solução de cristal violeta 0,1% em formaldeído 10% por 1 hora. Para a
visualização das placas virais no ensaio de 96 horas, adicionamos solução de cristal
violeta 0,2% em formaldeído 20% por 1 hora, sem a retirada prévia do meio de cultura.
As placas virais visualizadas foram contadas manualmente.
Para detectar a expressão de β-galactosidase nas placas virais, as células foram
infectadas com 200 PFUs (MOI=0,0002) dos vírus recombinantes CTGV-EGFP ou
28
VACV-WR-GFP, como acima descrito. Após 48 horas de infecção, na ausência ou
presença de ST-246 a 37
o
C, o meio de cultura foi descartado e as monocamadas foram
lavadas 3 vezes com PBS e fixadas com paraformaldeído 4% por 5 minutos. As
monocamadas foram novamente lavadas 3 vezes com PBS e incubadas por 18 horas à
temperatura ambiente, sob agitação, com solução contendo X-gal (ferrocianeto de
potássio 0,004M; MgCl
2
0,002M; X-gal 0,4 mg/mL). Após este período de incubação, os
focos de atividade enzimática foram detectados através da formação de placas azuis
(Sanes et al., 1986).
3.8. Análise da formação de vírus associados à célula (CAV) e extracelulares
(EEVs)
Monocamadas de células BSC-40 confluentes em placa de 35 mm (10
6
células)
foram infectadas com CTGV ou VACV-WR com uma MOI de 0,001 ou 10, conforme o
ensaio. A adsorção foi realizada à temperatura ambiente em 200 µL de solução salina de
Puck por 30 minutos (MOI=10) ou 2 horas (MOI=0,001), com intervalos de agitação.
Após este período, as monocamadas foram lavadas por duas vezes com PBS e em
seguida, foi adicionado meio de cultura fresco completo contendo DMSO 0,1% ou ST-
246, em diferentes concentrações. As placas foram mantidas a 37
o
C e, após o tempo de
infecção desejado para cada ensaio, o meio de cultura (1,5 mL) foi recolhido para a
obtenção dos vírus extracelulares (EEVs) e as células foram raspadas em 1,5 mL de água
estéril. Para coleta dos EEVs, o meio de cultura foi submetido à centrifugação a 1000 x g
por 10 minutos a 4
o
C para a remoção de células soltas. Em seguida, uma alíquota do
sobrenadante foi incubada com anticorpo neutralizante anti-A28 (6,25 µg/mL) (Foo et
al., 2009) por 1 hora a 37
o
C para neutralização de IMVs contaminantes no meio de
cultura. Imediatamente, as amostras seguiram para determinação do título viral por ensaio
de placas como descrito no item 3.9.
As células lisadas em água foram submetidas a 3 etapas de congelamento e
descongelamento para liberação dos vírus associados à célula (CAV). Amostras foram
armazenadas a -80
o
C e submetidas posteriormente à titulação por ensaio de placas como
descrito no item 3.9.
29
3.9. Titulação das amostras virais por ensaio de placas
Amostras contendo lisados de células infectadas, vírus extracelulares em
suspensão e alíquotas de vírus purificados foram submetidas a diluições seriadas de 10
vezes em solução salina de Puck, a partir do estoque. Em seguida, células BSC-40 em
placas de 6 poços (5 x 10
6
células/poço) foram infectadas com 200 µL de inóculo de três
diluições adequadas. A fase de adsorção ocorreu por 2 horas à temperatura ambiente,
com agitação leve a cada 15 miutos. Após este período, o inóculo foi removido e foi
adicionado meio de cultura fresco completo. Com 48 horas de infecção, o meio de cultura
foi descartado, as células foram coradas e as placas contadas como descrito no item 3.7
(Damaso e Moussatché, 1992). O cálculo do título viral foi feito multipicando-se a média
do número de placas por 5 e pela diluição correspondente O título viral foi expresso
como unidade formadora de placa por mililitro (PFU/mL).
3.10. Ensaio de Citotoxidade
Monocamadas de células BSC-40 ou RK13 em placa de 96 poços foram
incubadas com concentrações crescentes de ST-246 ou DMSO 0,25% (veículo) ou
DMSO 10 % (controle de morte celular), diluídos em meio fresco completo. Após 48 ou
96 horas de adição do ST-246, o meio de cultura foi removido e foram adicionados 50 µL
de MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, SIGMA) (1mg/mL) diluído em meio de
cultura (sem soro). As culturas foram incubadas por 4 horas a 37
o
C. Após este período, o
meio foi descartado e 100 µL de DMSO 100% foram adicionados para a solubilização do
produto formado (formazana). Em seguida, a placa foi mantida sob agitação leve por 20
minutos e a quantificação foi realizada pela medição da absorbância a 540 nm (Takeuchi
et al, 1991).
3.11. Detecção da atividade de β-galactosidase expressa por vírus recombinante
30
Células BSC-40 em placa de 35 mm (10
6
células) foram infectadas com uma MOI
de 0,001 de CTGV-EGFP ou VACV-WR-GFP em 200 µL de solução salina de Puck.
Após 2 horas de adsorção à temperatura ambiente, o inóculo foi removido e meio de
cultura fresco completo contendo DMSO 0,05% (veículo) ou com diferentes
concentrações de ST-246 foi adicionado. Após 48 horas de infecção, o sobrenadante foi
descartado e monocamadas foram recolhidas em 200 µL de água deionizada estéril. As
amostras foram congeladas e descongeladas 3 vezes e 800 µL de PBS foram adicionados.
Como descrito por Damaso e Keller (1994), para um volume total de 1 mL de extratos
celulares, foram adicionados 40 µL (2 gotas) de clorofórmio e 60 µL (3 gotas) de SDS
01%. Imediatamente, após forte agitação, foram removidos 25 e 150 µL do extrato para
WR-GFP e CTGV-EGFP, respectivamente, e adicionado PSB para completar 930 µL de
mistura total, seguido da adição de 75 µL de tampão Z 10X (tampão fosfato de sódio 1M
pH 7,0; KCl 0,1M; MgSO
4
0,01M; β-mercaptoetanol 0,5M) e 150 µL de ONPG (O-
nitrophenyl-B-D-galactopyranoside; Sigma Co.) 4 mg/mL diluído em tampão Z 1X. Após
desenvolvimento de coloração amarela, devido à clivagem do substrato em galactose e
nitrofenol, a reação foi parada por adição de 340 µl Na
2
CO
3
(1M) e a absorbância
determinada por espectrofotometria a 420 nm (Guarente e Ptashne, 1981).
3.12. Ensaio de redução de Cometa
Monocamadas de células BSC-40 em placas de 6 poços (10
6
células por poço)
foram infectadas com 50 PFUs por poço (MOI= 0,00005) de VACV-WR ou CTGV em
200 µL de solução salina de Puck. Após 2 horas de adsorção à temperatura ambiente, o
inóculo foi removido e as células receberam meio de cultura fresco completo contendo
DMSO 0,05% ou ST-246 em diferentes concentrações. As placas foram incubadas em
um ângulo fixo (5 graus) por 3 dias (VACV-WR) ou 4 dias (CTGV) a 34,6
o
C. Após o
tempo de infecção desejado, as monocamadas foram coradas como descrito no item 3.7
para visualização dos cometas.
31
3.13. Ensaio de infecção de camundongos via lesão dermal
O ensaio foi baseado em procedimento descrito por Melamed e colaboradores
(2007) e Grosenbach e colaboradores (2008). Grupos de 3 a 5 camundongos BALB/c
fêmeas de 5 a 7 semanas (pesando em torno de 20 g) foram anestesiados com xilazima (6
mg/kg) e ketamina (100 mg/kg) por via intraperitonial. Em seguida, 10
6
ou 10
8
partículas
purificadas de CTGV ou 10
6
partículas de VACV-WR em 10 µl de PBS foram
depositados na cauda dos camundongos a 1 cm da base, seguido de escarificação com
uma agulha 24G por aproximadamente 30 vezes, cobrindo uma extensão de 1 cm. Os
animais foram mantidos em gaiolas com microisoladores contendo filtro no topo. O
tratamento com a suspensão de ST-246 nas doses indicadas ou veículo (Tween 80 0,5%,
hidroxipropil-metilcelulose 1%) foi realizado por gavagem oral e iniciado 4 horas após a
infecção, sendo mantido por 7 dias consecutivos. Os camundongos foram monitorados
para sinais de doença, peso e tamanho da lesão na cauda por até 22 dias, seguido de
eutanásia através de deslocamento cervical. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de
Ética na Utilização de Animais (CEUA) do CCS-UFRJ.
3.14. Ensaios de Imunofluorescência
Células BSC-40 em lamínulas de 13 mm de diâmetro foram infectadas com uma
MOI de 10 (nesto caso, foram utilizadas 2 x 10
4
células) ou MOI de 0,0005 (50
PFUs/lamínula) (9 x 10
4
células) de CTGV, CTGV-EGFP, VACV-WR ou WR-GFP em
100µl de solução salina de Puck. Após 30 minutos (MOI=10) ou 2 horas (MOI=0,0005)
de adsorção, o inóculo foi removido e meio de cultura fresco contendo ST-246 0,02 ou 10
µM, conforme o experimento, foi adicionado, além do controle contendo DMSO 0,02 ou
0,1 %, respectivamente. Em alguns ensaios, Brefeldina A (Sigma) (10 µg/mL) foi
adicionada no tempo zero. Após o tempo de infecção desejado, o meio foi removido e as
células foram fixadas com paraformaldeído 4% por 10 minutos à temperatura ambiente.
De acordo com o ensaio, as células foram ou não permeabilizadas com Triton X-100
0,5% por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram incubadas com
solução de bloqueio (PBS/BSA 1%) por 1 hora, lavadas 3 vezes com esta solução,
32
seguido de incubação com o(s) anticorpo(s) primário(s), diluído(s) em solução de
bloqueio conforme o ensaio (Tabela 1), por 1 hora à temperatura ambiente. Após este
período, as células foram lavadas novamente 3 vezes com solução de bloqueio e
incubadas com o(s) anticorpo(s) secundário(s) adequado(s) anti-IgG de camundongo,
conjugado a Alexa Fluor 488 ou Alexa Fluor 555 (Invitrogen); anti-IgG de coelho,
conjugado a Alexa Fluor 488 ou Alexa Fluor 555; anti-IgG de cabra conjugado a Alexa
Fluor 555; anti-IgG de rato conjugado a Cy2 ou Dylight 549 (Jackson Immunoresearch),
diluído(s) 1:200 em solução de bloqueio, por 1 hora à temperatura ambiente. Após mais 3
lavagens com PBS 1X, procedemos a marcação com DAPI (1 µg/mL) por 5 minutos que
permite a visualização dos núcleos e virossomas no citoplasma celular (Castro et al.,
2003). Para a montagem das lamínulas nas lâminas, utilizamos 4 µL da solução de
montagem (N-Propil Galato 0,2 M em glicerol). As marcações foram analisadas em
microscópio de fluorescência confocal invertido Leica (TCSSP5) do Inmetro ou
microscópio de fluorescência convencional invertido Zeiss (Axio Observer Z1) do
Instituto de Bioquímica Médica-UFRJ.
Tabela 1. Anticorpos utilizados nos ensaios de imunofluorescência
Anticorpo Animal de
Origem
Diluição Incubação Origem
Anti-CI-MPR
Clone 2G11
Camundongo 1:700 1 hora Novus
Biologicals
Anti-AIP1-Alix
Clone N-20
Cabra
1:300
1 hora
Santa Cruz
biotechnology, inc.
Anti-F13 Rato 1:5 1 hora Dr. Jacomine
Locker, EMBL,
Alemanha
Anti-B5 Rato 1:50 1 hora Dr. Geoffrey
Smith, Imperial
College,
Inglaterra
Anti-A34 Coelho 1:100 1 hora Dr. Rafael
Blasco, INIA,
Espanha
Anti-A33 Coelho 1:100 1 hora Dr.Michael
Way, London
33
Research
Institute,
Inglaterra
Anti-A36 Coelho 1:100 1 hora Dr.Michael
Way, London
Research
Institute,
Inglaterra
Anti-D8 Camundongo 1:50 1 hora Dr. Geoffrey
Smith, Imperial
College,
Inglaterra
3.15. Sequenciamento da ORF de F13L
3.15.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
O sequenciamento foi realizado a partir dos produtos (amplicons) purificados da
reação de PCR. Para isso, realizamos o ensaio de PCR com os iniciadores externos
(F13fwd ext e F13rev ext) ao gene viral F13L, cujas seqüências estão descritas na Tabela
2. Para a reação, alíquotas contendo de 1 a 2 µL de DNA total extraído de células
infectadas com CTGV ou VACV-IOC (estoques já existentes em nosso laboratório)
foram incubadas em tampão de PCR (KCl 50mM; Triton X100 0,1%; Tris-HCl 10mM;
pH 9,0) contendo Taq DNA Polimerase recombinante 1U, MgCl
2
1,5 mM, dATP, dGTP,
dCTP, e dTTP 250µM cada e 0,5 picomoles dos iniciadores, em 50µl de volume final. A
reação de amplificação consistiu em 10 minutos de desnaturação inicial a 94
o
C, seguidos
de 35 ciclos de 94
o
C por 45 segundos, 50
o
C por 45 segundos e 72
o
C por 2 minutos.
Após o término dos ciclos, houve uma etapa de extensão final a 72
o
C por 8 minutos.
34
Tabela 2: Iniciadores utilizados nos ensaios de PCR e nas reações de sequenciamento
Iniciadores
(nomes)
Sequência
F13rev Ext 5’ATT GAC TGA GTT AGG TTG TG ATT CG 3’
F13rev D2 5’CTG GAG GAT CTA TAC ATA CGA TTA A 3’
F13rev D3 5’CTG TGA AGG TTT TCA CTA TTC AGA A 3’
F13fwd Ext 5’TAC GCA ATA TCT CAA TAG TTT CAT AAT TG 3’
F13fwd D2 5’GTC TTA GCC GAC TTG AGT TT 3’
F13fwd D3 5’AAG CGC TCC CCT AGT CGT AC 3’
3.15.2. Análise e purificação dos produtos de amplificação
Para análise do tamanho dos fragmentos obtidos pelo ensaio de PCR, aplicamos
as amostras em gel de agarose 0,8% em tampão TAE (Tris-Acetato 0,04M, EDTA 1 mM;
pH 8,0) contendo brometo de etídio 0,5 µg/mL. A corrida eletroforética foi realizada em
tampão TAE a 60 V. A observação dos fragmentos foi feita com auxílio de um
transluminador com luz ultravioleta e o tamanho dos fragmentos foi comparado ao
marcador 2-log ladder (New England Biolabs). A purificação dos amplicons foi feita
com o Kit Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification, de acordo com as
orientações do fabricante (GE Healthcare). A quantificação foi realizada a partir da
análise densitométrica das imagens digitalizadas, como descrito no item 3.23.
3.15.3. Sequenciamento de DNA e análise de sequências
Para a reação de sequenciamento, 20 ng de amplicons purificados foram utilizados
e 3,2 pmoles de cada iniciador (F13rev Ext e F13fwd Ext) (Tabela 2), inclusive
iniciadores que anelam internamente à ORF (F13rev D2, F13fwd D2, F13rev D3, F13fwd
D3). O volume de reação foi completado para 10 µl com os reagentes do Kit Big Dye
35
Terminator DNA Sequencing (Applied Biosystems). A reação de sequenciamento
consistiu de 25 ciclos de 96
o
C por 10 segundos, 55
o
C por 5 segundos e 60
o
C por 4 min. A
separação dos fragmentos de DNA foi realizada no sequenciador automático ABI-PRISM
3100 (Applied Biosystems), localizado na Unidade Genômica do IBCCF-UFRJ. A
análise das sequências obtidas, a geração dos contigs e produção da sequência consenso
final foram realizadas utilizando o pacote de programas Lasergene (DNAStar Inc.). A
sequência do ortólogo de F13L de VACV-WR foi obtida em bancos públicos (PBR,
2010) (número de acesso VG0001500). Para o alinhamento da sequência final com as
seqüências dos ortólogos de VACV-IOC e VACV-WR, utilizamos os programas BioEdit
(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) e Clustal W
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
3.16. Preparo das amostras para análise por Western Blot
Células BSC-40 em placa de 35 mm (10
6
células) foram infectadas com uma MOI
de 5 ou 10 de CTGV ou VACV-WR em 200 µL de solução salina de Puck. Após 30
minutos de adsorção à temperatura ambiente, o inóculo foi removido e adicionado meio
de cultura fresco completo contendo DMSO 0,1% ou ST-246 10 µM. Após o tempo de
infecção desejado, o sobrenadante foi desprezado e as monocamadas de células foram
recolhidas em 150 µL de tampão de amostra contendo glicerol 10%, DTT 100 M, SDS
1%, azul de bromofenol 0,02%, β-mercaptoetanol 0,1% e Tris-HCl 50 mM (pH 6,8) e
armazenadas a – 20
o
C. Células não infectadas foram processadas de forma similar.
Para a análise por Western blot de partículas virais purificadas, foi realizada a
dosagem de proteína de cada estoque através do método de Bradford (Bradford, 1976).
Desta forma, após a quantificação, 4 µg ou 8 µg de proteína foram solubilizados em no
máximo 20 µl de tampão de amostra.
As amostras foram aquecidas a 100
o
C por 15 minutos e 20 µL/poço foram aplicados em
SDS-PAGE.
36
3.17. Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE)
O gel de poliacrilamida de separação era constituído por Tris-HCl 375 mM (pH
8,8), acrilamida 12,5% ou 14%, bisacrilamida 0,35%, SDS 0,1%, persulfato de amônio
0,25% e TEMED 0,05%. O gel de concentração era composto por Tris-HCl 125 mM (pH
6,8), acrilamida 4,5%, bisacrilamida 0,15%, SDS 0,1%, persulfato de amônio 0,5% e
TEMED 0,025% (Laemmli, 1970; Damaso e Mousstaché, 1992).
Após aplicação de 20 µL de cada amostra por poço do gel, a corrida eletroforética
foi feita sob corrente constante (20 mA) em tampão de corrida (glicina 192 mM; Tris 25
mM; SDS 0,1%). Após esta etapa, os géis obtidos, a membrana de nitrocelulose e os
papéis filtro foram incubados em tampão de transferência (Tris 25 mM; glicina 192 mM;
metanol 20%), sob agitação durante 20 minutos. A transferência das proteínas para a
membrana foi realizada utilizando-se o aparelho Semi-dry (BioRad) a 0,8 mA/cm
2
por
duas horas (Damaso e Moussatché, 1998). Após a transferência, a membrana foi estocada
a –20
o
C até posterior ensaio de imunodetecção de proteínas por Western Blot ou
imediatamente incubada por 1 hora em solução de bloqueio (PBS-Blot [NaCl 1%; KCl
0,025%; NaHPO
4
.7H
2
O 0,0271%; KH
2
PO
4
0,025%] e 5% de leite desnatado). Para
vizualização das bandas de proteínas no gel, este foi corado em uma solução contendo
azul de Coomassie (azul de coomassie R250 0,1%; ácido acético 10%; metanol 45%),
sob agitação constante. Após cerca de 30 minutos, o gel foi transferido para uma solução
descorante (metanol 35%; ácido acético 10%) e mantido sob agitação constante até a
visualização das proteínas. Finalmente, o gel foi incubado em solução de secagem
(glicerol 1%; etanol 40%) por 3 horas, e após este período, foi colocado entre folhas de
papel celofane sobre uma placa de vidro até a secagem completa (Damaso e Moussatché,
1992).
3.18. Western Blot
O ensaio de Western blot foi baseado em procedimento adaptado por Damaso et
al. (2000). Após a etapa de bloqueio descrita acima, a membrana foi lavada 3 vezes por 5
minutos em solução de PBS-Blot com Nonidet P-40 (NP-40) 0,05%. Em seguida, a
membrana foi incubada por diferentes tempos com o anticorpo primário (ver Tabela 3)
37
diluído em solução de bloqueio. Seguiram-se mais 3 lavagens de 5 minutos com PBS-
Blot contendo NP-40 0,05%. Posteriormente, a membrana foi incubada com o anticorpo
secundário apropriado, diluído em solução de bloqueio contendo NP-40 0,05%.
Finalmente, foram realizadas 2 lavagens de 7 minutos com PBS-Blot contendo NP-40
0,05%, seguido de uma lavagem com PBS-Blot por 2 minutos. A detecção das proteínas
foi realizada pela utilização do sistema Western Blotting Luminol Reagent (Pierce Protein
Research Products), seguindo instruções do fabricante, seguido de exposição a filme de
raio X ( Kodak MXG/ Plus).
Tabela 3. Anticorpos utilizados nos ensaios de Western Blot
Anticorpo Origem Diluição Incubação Origem
Anti-F13 Rato 1:600 18 horas Dr. Rafael
Blasco, INIA,
Espanha
Anti-A33 Coelho 1:1000 18 horas Dr.Michael
Way, London
Research
Institute,
Inglaterra
Anti-A36 Coelho 1:3000 18 horas Dr.Michael
Way, London
Research
Institute,
Inglaterra
Anti-D8
Coelho
1:1500
18 horas
Dr. Ed Niles,
SUNY School
of Medicine,
Estados Unidos
Anti-H3 Coelho 1:1500 18 horas Dr.Bernard
Moss, National
Institutes of
Health, Estados
Unidos
Anti-B5 Rato 1:50 18 horas Dr. Geoffrey
38
Smith, Imperial
College,
Inglaterra
Anti-A18 Camundongo 1:6000 18 horas Dr. Richard
Condit,
University of
Florida, Estados
Unidos
Anti-A34 Coelho 1:2500 18 horas Dr. Rafael
Blasco, INIA,
Espanha
Anti-α-tubulina Camundongo 1:3000 1 hora Sigma-Aldrich
3.19. Transformação de bactérias e Preparação de DNA plasmidial
O plasmídeo pSG5-p37 utilizado em nossos ensaios foi gentilmente doado pelo
Dr. Rafael Blasco (INIA) (Borrego et al., 1999). Para a construção do plasmídeo pSG5-
p37, a ORF de F13 foi clonada no sítio BamHI do vetor pSG5 (Stratagene) sob controle
de um promotor de eucarioto. A amplificação da amostra original foi realizada através de
transformação de bactérias e extração de DNA plasmidial em média escala, como
descrito a seguir.
Os estoques de E. coli, cepa DH5α competentes para eletroporação foram
preparados conforme Sambrook e Russell (2004). Para a eletroporação das bactérias,
foram adicionados 10 ng do DNA plasmidial a uma alíquota de 100 µL de bactérias
competentes em cubetas de eletroporação. A amostra foi mantida a 4
o
C por 5 minutos e
submetida a choque elétrico, utilizando o aparelho Gene Pulser-II (BioRad) a 200Ω
resistência, 25 µF de capacitância e 1,8 kV para cubetas com 1mm de espaçamento entre
os eletrodos. Em seguida, foi adicionado 1 mL de meio LB (NaCl 1%; triptona 1%;
extrato de levedura 0,5%) e a amostra permaneceu sob agitação constante por 1 hora a
37
o
C. Em seguida, 10% ou 90% do volume de suspensão das bactérias foram plaqueados
39
em meio LB ágar 1,5 % contendo 100µg/ml de ampicilina, seguido de incubação por 18
horas a 37
o
C.
Uma única colônia isolada foi recolhida e propagada em 70 mL de meio LB,
contendo 100µg/mL de ampicilina, por 18 horas a 37
o
C sob agitação constante de 150
rpm. O DNA plasmidial foi purificado utilizando-se o Plasmid Midi Kit (Qiagen),
seguindo as instruções do fabricante, gerando um rendimento total de 100 µg do
plasmídeo pSG5-p37. A quantificação foi realizada por leitura da absorbância a 260 nm.
3.20. Transfecção de células BSC-40 com o plasmídeo pSG5-p37
Para o ensaio de transfecção, monocamadas de células BSC-40 em placas de 60
mm (10
6
células) foram transfectadas por 18 horas com 4 µg do plasmídeo pSG5-p37
(Borrego et al., 1999). Inicialmente, foi preparada uma mistura contendo o DNA (4 µg do
plasmídeo diluído em água MiliQ em 96 µL de meio de cultura Optmem sem soro nem
antibióticos [Invitrogen]) e outra mistura contendo lipofectamina (14 µL de
lipofectamina [Invitrogen] em 86 µL de meio de cultura Optmem). Em seguida, as duas
misturas foram reunidas e incubadas a 4° C por 30 minutos. Enquanto isso, o meio de
placas de cultura foi descartado, as monocamadas foram lavadas 2 vezes com PBS,
seguido a adição de 3 mL de meio de cultura Opitmem. As placas foram mantidas a 37
o
C
por 30 minutos. Transcorrido este período, o meio de cultura foi descartado e 3 mL de
meio de cultura Optmem fresco foi adicionado. A mistura de transfecção foi lentamente
adicionada com rotação suave sobre o meio da placa de cultura. As células foram
mantidas a 37° C por 18 horas, quando então, foram repicadas na proporção 1: 25 em
placas de 24 poços ou 1:3 em placas de 35 mm em meio DMEM completo. Após assentar
nas placas por um perído de 4 horas, as células foram infectadas com uma MOI de 0,001
de CTGV ou VACV-WR por 40 horas, na ausência ou presença de concentrações
crescentes de ST-246. Em alguns ensaios foram utilizados CTGV e VACV-WR
recombinantes expressando o gene da β-galactosidase sob controle de promotor viral
inicial/tardio, como já descrito.
40
Para a visualização das placas virais, as células foram coradas com solução de
cristal violeta 0,1% em formaldeído 1% por 1 hora ou, quando infectadas com vírus
recombinantes, receberam solução contendo X-Gal, como descrito no item 3.7.
3.21. Análise densitométrica dos autoradiogramas
Os autoradiogramas dos ensaios de Western Blot foram analisados por
densitometria após captura das imagens em formato TIFF (Adobe Photoshop, vs. 7.0) por
escaneamento dos filmes de raio-X. A partir das imagens, os traçados densitométricos
foram obtidos pelo programa de análise e processamento de imagens Scion Image (Beta
Release 4; Scion Corporation). Os valores obtidos foram analisados no programa Excel
(Microsoft) e expressos como unidades arbitrárias.
3.22. Processamento de imagens
As imagens obtidas pelas análises de microscopia de fluorescência foram
processadas para ajustes de brilho e contraste através de utilização do programa Adobe
Photoshop 7.0. As imagens sobrepostas foram geradas a partir das ferramentas “Images
to Stack” e “Z Project” do programa Image J 1.42
(http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html).
3.23. Análise Estatística
Os valores de “p” foram obtidos com a realização do teste-t do programa Excel
(Microsoft), a partir de 3 valores distintos, com distribuição bi-caudal e variação desigual
entre duas amostras consideradas.
41
4-RESULTADOS
42
4. Resultados:
4.1. Análise da citotoxidade do ST-246
Inicialmente, foi avaliado o efeito citotóxico do ST-246 sobre as células BSC-40
e RK13, embora o ST-246 não tenha apresentado, até o momento, nenhum efeito
citotóxico em diversas linhagens celulares testadas (Yang et al. 2005; Durrafour et al.,
2007). Para isso, as células foram incubadas com concentrações de ST-246 que variavam
de 5 até 100 µM durante 48 ou 96 horas, quando então procedemos a análise pelo método
do MTT, como descrito em Material e Métodos.
Os resultados demonstram que a droga não se mostrou citotóxica para as
linhagens BSC-40 e RK13 após 48 horas (Figuras 9A e 9B) ou 96 horas (Figura 9A) de
incubação em nenhuma das concentrações testadas, de forma que o CC
50
(concentração
na qual 50% das células encontram-se viáveis) foi superior a 100 µM. Desta forma,
qualquer efeito causado pelo ST-246 nos experimentos a seguir não estará relacionado
com a perda de viabilidade celular, mas sim com uma ação da droga na replicação viral.
4.2. Efeito do ST-246 sobre a formação de placas virais de CTGV e de outros
Orthopoxvirus
Com o objetivo de verificarmos o efeito do ST-246 sobre a formação de placas de
CTGV, monocamadas de células BSC-40 foram infectadas com 350 PFUs de CTGV na
presença de concentrações crescentes da droga por um período de 48 horas, quando então
as placas virais foram contadas, como descrito em Material e Métodos. De acordo com os
resultados mostrados na Figura 10B, houve uma inibição de 46% na formação de placas
virais de CTGV com 0,01 µM de ST-246, alcançando-se 93% de inibição quando 0,02
µM do ST-246 foi adicionado. Em seguida, realizamos ensaio similar com outras cepas
de VACV e também com o vírus cowpox, outra espécie do gênero Orthopoxvirus, além
de estendermos a faixa de concentrações do ST-246 utilizadas. A Figura 10C mostra que,
quanto à formação de placas virais, o CTGV foi significativamente mais sensível à ação
do ST-246 do que outros Orthopoxvirus. Observamos uma inibição de 100% para a
43
Figura 9. Análise da citotoxidade do ST-246 em células BSC-40 e RK13. Monocamadas de
células BSC-40 (A) e RK13 (B) foram incubadas a 37
o
C por 48 ou 96 horas na presença de
concentrações crescentes de ST-246, indicadas nos gráficos. A citotoxidade foi analisada pelo
método de MTT e a absorbância foi avaliada a 540 nm, como descrito em Material e Métodos. Os
resultados foram expressos como porcentagem do controle de morte celular, que corresponde à
incubação das células com DMSO 10%. Os gráficos foram construídos a partir de 3 experimentos
distintos relizados em replicatas de 8.
44
formação de placas virais do CTGV com concentração igual ou superior a 0,05 µM,
enquanto que para o VACV-IOC, o segundo vírus mais sensível, a inibição total da
formação de placas só foi atingida com 0,1 µM de ST-246. O IC
50
calculado para cada
vírus é mostrado na Figura 10D. O índice de seletividade (SI), calculado como a razão
entre CC
50
e IC
50
, foi >11.111 para o CTGV. Baseando-se na relação dos IC
50
,
verificamos que o CTGV foi cerca de 6,4 vezes mais sensível à ação do ST-246 do que o
VACV-WR, cepa mais estudada mundialmente.
A Figura 10A compara as placas virais formadas pelos vírus CTGV, VACV-WR
e VACV-IOC após 48 horas de infecção em presença de ST-246. Observamos que o
CTGV forma normalmente uma placa viral menor em relação aos demais vírus testados e
que, em presença do ST-246, estas placas virais tornam-se ainda menores. Desta forma, a
maior sensibilidade do CTGV ao ST-246 poderia estar relacionada com o fato de o
CTGV formar uma placa viral muito pequena que, na presença da droga, não pudesse
mais ser observada nas condições deste ensaio. Por isso, estendemos o tempo de infecção
para 96 horas para permitir que a placa viral aumentasse de tamanho (Figura 11A). A
quantificação do resultado está apresentada na Figura 11B, e confirma a maior
sensibilidade do CTGV ao ST-246. Na concentração de 0,05 µM de ST-246 houve 97,2%
de inibição de formação de placas virais, enquanto para os vírus VACV-IOC e VACV-
WR, a inibição da replicação viral na mesma concentração da droga foi de 19% e 17%,
respectivamente.
Experimento semelhante foi realizado em células RK13, pois já foi demonstrado
que a infecção pelo vírus vaccinia nestas células produz alta quantidade de EEVs (Payne,
1979). Sendo assim, poderíamos observar um efeito diferente daquele obtido em células
BSC-40. De acordo com o resultado mostrado na Figura 11C, após 96 horas de infecção,
observamos um perfil de inibição para o CTGV similar ao observado no ensaio com
BSC-40, com 100% de inibição na presença de 0,05 µM, enquanto para os vírus VACV-
IOC e VACV-WR a inibição da replicação viral nessa concentração foi de 29% e 20%,
respectivamente.
45
Figura 10. Efeito do ST-246 sobre a formação de placa de diferentes Orthopoxvirus após 48
horas de infecção. Células BSC-40 foram infectadas com 350 PFU (MOI=0,00035) de CTGV ou
outros Orthopoxvirus e tratadas com as concentrações de ST-246 indicadas. Após 48 horas de
infecção, as células foram coradas com solução de cristal violeta 0,1% e as placas virais foram
contadas, com descrito em Material e Métodos. (A) Placas de culturas de células BSC-40 coradas
após infecção com diferentes Orthopoxvirus. Imagens representavivas são apresentadas. (B e C)
Gráficos expressam os resultados em % do controle, que corresponde ao tratamento com DMSO
0,05%, e foram construídos a partir da média de 3 experimentos independentes realizados em
duplicata. (D) Valores de IC
50
, baseados no ensaio da figura A.*p<0,05.
46
Figura 11. Efeito do ST-246 sobre a formação de placa de diferentes cepas de VACV após
96 horas de infecção. Células BSC-40 (A e B) ou RK13 (C) foram infectadas com 350 PFU
(MOI=0,00035) de CTGV, VACV-WR ou VACV-IOC e tratadas com as concentrações de ST-
246 indicadas. Após 96 horas de infecção, as células foram coradas com solução de cristal violeta
0,1% e as placas virais foram contadas, como descrito em Material e Métodos. (A).Placas de
culturas de células BSC-40 coradas após infecção com diferentes cepas de VACV. Imagens
representavivas são apresentadas (B e C) Gráficos expressam os resultados em % do controle,
que corresponde ao tratamento com DMSO 0,05% (veículo), e foram construídos a partir da
média de 3 (B) ou 2 (C) experimentos independentes realizados em duplicata. *p<0,05.
47
Desta forma, podemos concluir que o CTGV foi o Orthopoxvirus que sofreu a
maior inibição da formação de placa viral na presença da droga nos dois tipos celulares
testados, após 48 horas ou 96 horas de infecção.
4.3. Efeito do ST-246 sobre a atividade da β
ββ
β-galactosidase expressa por vírus
recombinante
Com o objetivo de confirmamos e quantificarmos a produção viral nas condições
do ensaio anterior, realizamos dosagem de atividade enzimática, utilizando os vírus
CTGV-EGFP e VACV-WR-GFP que, além de expressar o gene EGFP/GFP, também
expressam o gene da β−galactosidase de E. coli sob controle de um promotor viral
inicial/tardio (p7.5). Para isso, infectamos monocamadas de BSC-40 com ambos os vírus,
como descrito anteriormente, na presença ou ausência de ST-246. Após 48 horas de
infecção procedemos a incubação com X-Gal (Figura 12A) ou realizamos a dosagem da
atividade de β-galactosidase (Figura 12B), como descrito em Material e Métodos.
Na figura 12A podemos observar que mesmo nas células não tratadas com droga a
placa viral de VACV-WR tem maior diâmetro do que a de CTGV, como já observado
anteriormente (Figuras 10A e 11A). Esta diferença sugere que o CTGV apresente uma
deficiência de espalhamento da infecção célula a célula. Além disso, na presença de ST-
246, para ambos os vírus há uma dimunuição do tamanho da placa viral (figura 12A),
confirmando os resultados anteriores (figuras 10 e 11). Novamente, verificamos uma
maior sensibilidade do CTGV a ST-246, pois na presença de 0,02 µM da droga poucas
placas azuis foram observadas, formando focos de infecção ou placas diminutas. A
quantificação da atividade de β-galactosidase confirmou este resultado, pois observamos
para CTGV uma inibição da atividade enzimática cerca de 4 vezes superior na presença
da droga, quando comparamos com a inibição obtida para VACV-WR (Figura 12B).
48
Figura 12. Efeito do ST-246 sobre a atividade de β-galactosidase em células infectadas com
CTGV-EGFP ou VACV-WR-GFP. Monocamadas de células BSC-40 foram infectadas com
CTGV ou VACV-WR recombinantes contendo o gene da β-galactosidase sob controle de um
promotor viral na presença das concentrações indicadas de ST-246. Após 48 horas de infecção as
monocamadas foram processadas para incubação com X-Gal, como descrito em Material e
Métodos. (A) Visualização detalhada de placa viral azul representativa de CTGV e VACV-WR.
Setas indicam o raio da placa viral, demonstrando o espalhamento da infecção. (B) Quantificação
da atividade de β-galactosidase expressa como porcentagem em relação ao controle, que
correponde a células tratadas com 0,05% de DMSO. O gráfico foi construído a partir da média de
3 experimentos independentes.
49
4.4. Efeito do ST-246 sobre a formação de vírus associados à célula (CAVs) e
extracelulares (EEVs) em condições de ciclos múltiplos de infecção
Tendo sido visto um maior efeito do ST-246 sobre a formação de placas do
CTGV, se comparado a outras cepas de vaccinia, avaliamos a seguir o efeito da droga
sobre a produção de progênie viral intra e extracelular. Os vírus intracelulares são
constituídos, em sua maioria, por IMVs, porém há também recolhimento de IEVs e CEVs
nas condições experimentais utilizadas, sendo assim denominamos estas formas virais em
conjunto como vírus associados à célula (CAVs). Embora o ensaio anterior tenha
sugerido, por via indireta através da atividade de β-galactosidase, que a produção de
CTGV foi mais severamente inibida, em relação ao VACV-WR, a dosagem do título
viral permite a confirmação dos resultados e também nos fornece dados sobre a produção
de virus extracelular.
Para isso, células BSC-40 foram infectadas com 1000 PFUs (MOI=0,001) de
CTGV e VACV-WR na presença de concentrações crescentes do ST-246 por 48 horas,
quando então os CAVs e vírus extracelulares (EEVs) foram recolhidos para titulação por
ensaio de placas, como descrito em Material e Métodos. Estas condições, assim como nos
ensaios anteriores, permitem a análise da infecção após múltiplos ciclos, tendo em vista
que as células foram infectadas com baixa MOI e, à medida que o tempo de infecção
transcorre, novas células, até então não infectadas, passam a ser infectadas pela progênie
viral produzida em uma célula vizinha. Assim, quando reforçamos o termo “múltiplos
ciclos de infecção” estamos, na verdade, enfocando o espalhamento da infecção na
monocamada.
Os títulos de CAVs de CTGV e de VACV-WR na ausência de tratamento com
ST-246 foram 2,1 x 10
7
PFU/mL e 2,2 x 10
8
PFU/mL, respectivamente, demonstrando
que CTGV produz cerca de 1 log a menos de CAVs, nestas condições de infecção, em
relação ao VACV-WR. Na Figura 13A, observamos que, ao realizarmos o tratamento
com concentrações crescentes do ST-246, houve uma maior redução na produção de
CAVs para o CTGV quando comparado a VACV-WR, pois na presença de 0,05 µM da
droga obtivemos uma inibição de 2 logs no título de CTGV, enquanto que, para a mesma
concentração, observamos uma queda de quase 1 log no título de VACV-WR. A Figura
50
13B ressalta melhor as diferenças no perfil de inibição dos dois vírus, como já observado
com 0,001 µM da droga. O IC
50
baseado na inibição da produção de CAVs foi de 0,0108
µM para o VACV-WR e 0,00146 µM para o CTGV. Nestas condições, o CTGV foi 7,4
vezes mais sensível à droga que VACV-WR.
Nós também observamos 1 log de diferença na produção da progênie viral
extracelular entre CTGV (1,5 x 103 PFU/mL) e VACV-WR: e (1,2 x 104 PFU/mL), na
condição controle. Na presença do ST-246 verificamos uma queda de 3 logs na produção
de EEVs para o CTGV com 1 µM da droga (Figura 13C), enquanto que, na mesma
concentração obtivemos redução de 2 logs para VACV-WR (Figura 13C). A Figura 13D
mostra esses resultados como percentagem do controle, que corresponde ao tratamento
com DMSO 0,1%, revelando a queda mais acentuada na produção de EEVs do CTGV em
relação a VACV-WR, quando utilizamos concentrações de ST-246 acima de 0,005 M.
Paralelamente, realizamos um ensaio de redução da formação de cometas na
presença de ST-246, com o objetivo de confirmarmos a maior inibição da produção de
vírus extracelulares do CTGV, em comparação com VACV, observada no ensaio
anterior. Cometas são formados a partir da liberação de partículas virais extracelulares no
meio de cultura, estabelecendo infecções secundárias com a formação de um rastro na
monocamada (Appleyard et al., 1971). Infectamos células BSC-40 com 50 PFUs de
VACV-WR ou CTGV, por 3 ou 4 dias, respectivamente, com uma inclinação de 5 graus.
O tempo de incubação após a infecção foi escolhido com intuito de visualizar placas
virais de tamanho adequado, por isso variou para os dois vírus.
Como mostrado na Figura 14, a formação de cometas de CTGV foi drasticamente
inibida com 0,015 µM de ST-246. Contudo, para VACV-WR, nós ainda observamos
cometas na presença de 0,05 µM de ST-246. No entanto, estes dados devem ser
interpretados com cautela em razão do tempo de infecção utilizado para cada vírus. Com
isso, podemos concluir que, assim como para a formação de placas virais, a produção de
partículas infecciosas associadas à célula e partículas extracelulares do CTGV se mostrou
mais sensíivel à ação antiviral do ST-246 quando comparado à cepa VACV-WR.
51
Figura 13. Efeito do ST-246 sobre a produção de vírus associadas à célula (CAVs) e
extracelulares (EEVs). Células BSC-40 foram infectadas com um MOI=0,001 de CTGV ou
VACV-WR e tratadas com as concentrações de ST-246 indicadas nos gráficos. Após 48 horas de
infecção, as células (A, B) e o meio de cultura (C, D) foram recolhidos separadamente e as
amostras tituladas por ensaio de placa, como descrito em Material e Métodos. B e D mostram os
valores de A e C expressos em % controle, que correnponde ao tratamenro com DMSO 0,1%. Os
resultados representam a média de 4 ensaios independentes titulados em duplicata. *p< 0,05
52
Figura 14. Efeito do ST-246 sobre a formação de cometas de CTGV e VACV-WR.
Monocamadas de células BSC-40 foram infectadas com uma MOI=0,0005 de CTGV ou VACV-
WR e tratadas com as concentrações indicadas de ST-246. As placas de cultura foram incubadas a
uma inclinação de 5 graus. Após 3 (VACV-WR) ou 4 (CTGV) dias, as células foram coradas com
solução de cristal violeta 0,1%, como descrito em Material e Métodos.Para melhor visualização
dos cometas as imagens são apresentadas com as cores invertidas (negativo).
53
4.5. Efeito do ST-246 in vivo (via lesão dermal)
Os resultados obtidos até o momento demonstram que o CTGV foi, dentre os
Orthopoxvírus testados, o mais sensível à ação do ST-246 in vitro. No entanto, não
sabíamos se o ST-246 seria capaz de inibir a replicação do CTGV in vivo e se este
também apresentaria uma alta sensibilidade à droga em modelo animal.
Estudos anteriores mostraram que a melhor estratégia para se analisar o efeito do
ST-246 in vivo em infecção de camundongos, é a inoculação das partículas virais (cerca
de 10
3
PFUs) pela veia caudal (Yang et al., 2005). No entanto, em ensaios iniciais, ao
infectarmos camundongos Balb/C com 5 x 10
3
partículas infecciosas de CTGV pela veia
caudal, não observamos lesão nem sinais clínicos de infecção sistêmica (perda de peso,
falta de socialização e pêlo eriçado) após 8 dias de infecção. Já a infecção por VACV-
WR apresentou diversas pequenas lesões ao longo da cauda e os sinais clínicos de
doença, com morte após 15 dias de infecção (dados não mostrados). Com a elevação da
dose para 10
7
PFUs de CTGV, visualizamos a formação de poucas e diminutas lesões ao
longo da cauda, impossibilitando a quantificação. Estas desapareceram após 10 dias de
infecção, sem aparecimento de sintomatologia (dados não mostrados). Desta forma, o
modelo de infecção pela rota intravenosa não pode ser escolhido para se testar o efeito do
ST-246 sobre a infecção do CTGV in vivo, nem para comparar a diferença de
sensibilidade entre CTGV e VACV-WR.
Assim, o modelo de escolha foi o de lesão dermal por escarificação da cauda, pois
obtivemos lesões aparentes após infecção dos animais com 10
6
partículas infecciosas, de
ambos os vírus (Figura 15). Para o ensaio, camundongos Balb/C fêmeas de 5 a 7 semanas
de idade foram escarificados na base da cauda com 10
6
PFUs de VACV-WR ou CTGV,
como descrito em Material e Métodos. O VACV-WR formou uma lesão mais severa que
CTGV (Figuras 15B-E) e, além disso, formaram-se diversas lesões secundárias ao longo
da cauda (Figura 15E), não observadas após infecção por CTGV (Figura 15D),
demonstrando que VACV-WR espalha melhor a infecção do que CTGV em modelo de
lesão dermal. As crostas das lesões se mantiveram por 25 e 10 dias no caso de VACV-
WR e CTGV, respectivamente.
54
O tratamento com ST-246 foi realizado com doses da droga com base em
parâmetros farmacocinéticos já estabelecidos (Yang et al., 2005). A administração oral
do ST-246 foi iniciada após 4 horas de infecção e mantida por 7 dias. Os animais foram
fotografados 7 a 11 dias pós-infecção, entretanto os mantivemos sob observação por até
22 dias.
Após tratamento com ST-246, notamos que com 10mg/kg não houve a formação
de lesões secundárias após infecção com VACV-WR (Figuras 16A, 16B, 16F e 16G) e,
conforme aumentamos a dose a partir de 50 mg/kg, observamos uma diminuição da
severidade da lesão primária (Figuras 16A-E). Estes resultados estão de acordo com os
dados obtidos por Grosenbach e colaboradores (2008). Por outro lado, em animais
infectados com CTGV, observamos um efeito mais intenso do ST-246 (Figura 17). A
partir de 10 mg/kg já verificamos uma redução na severidade da lesão primária, bem
evidente com 50 mg/kg (Figuras 17A-D). Além disso, com 100 mg/kg de ST-246 houve
uma prevenção total do aparecimento da lesão do CTGV (Figura 17E).
Realizamos também ensaios infectando os animais com uma carga viral 100 vezes
maior de CTGV, ou seja, 10
8
partículas virais. Como podemos observar nas Figuras 16H
e 16I, ainda sim, não observamos formação de lesões secundárias ao longo da cauda dos
animais tratados com o veículo. Em camundongos tratados com 100 mg/kg do ST-246
por 7 dias, também não houve formação de lesão, apenas um inchaço e vermelhidão no
local da escarificação (Figuras 17G e 17I).
Desta forma, podemos concluir que o ST-246 foi capaz de prevenir o
aparecimento da lesão do CTGV neste modelo. Este é, até o momento, o Orthopoxvírus
mais sensível à ação do ST-246 também in vivo.
55
Figura 15. Infecção de camundongos com CTGV e VACV-WR via escarificação na cauda.
Camundongos Balb/C fêmeas (3 a 5 animais por grupo) foram escarificados com 10
6
partículas
infecciosas de CTGV (B e D), VACV-WR (C e E) ou com PBS (A) na base da cauda, como
descrito em Materiais e Métodos. Após 7 dias de infecção, as lesões foram fotografadas e
imagens representativas de 3 experimentos distintos foram escolhidas. A-C: Visão dorsal das
caudas. D e E: Visão lateral das caudas. As setas apontam para as lesões secundárias.
56
Figura 16. Efeito do ST-246 in vivo após infecção de camundongos com VACV-WR via
escarificação da cauda. Camundongos Balb/C fêmeas (3 a 5 animais por grupo) foram
escarificados com 10
6
partículas infecciosas de VACV-WR, seguido de administração oral de
suspensão de ST-246, ou veículo, como descrito em Materiais e Métodos. Após 7 dias de
infecção e tratamento, as lesões foram fotografadas e imagens representativas de 3 experimentos
distintos foram escolhidas. A-E: Visão dorsal das caudas. F e G: Visão ventral das caudas.
57
58
Figura 17. Efeito do ST-246 in vivo após infecção de camundongos com CTGV via
escarificação da cauda. Camundongos Balb/C fêmeas (3 a 5 animais por grupo) foram
escarificados com 10
6
(A-E) ou 10
8
(F-I) partículas infecciosas de CTGV, seguido de
administração oral de suspensão de ST-246 ou veículo, como descrito em Materiais e Métodos.
Após 7 dias de infecção e tratamento, as lesões foram fotografadas e imagens representativas de 3
experimentos distintos foram escolhidas. A-G: Visão dorsal das caudas. H e I: Visão lateral das
caudas mostradas em F e G.
59
4.6. Análise da sequência de aminoácidos de ortólogos de F13 em Orthopoxvirus
O gene F13L é descrito até o momento como o único alvo de ação de ST-246
(Yang et al., 2005 e Durrafour et al., 2008). Tendo visto nos experimentos anteriores que
o CTGV foi o vírus mais sensível ao ST-246 e considerando que não é conhecida a
sequência do ortólogo de F13L em CTGV, determinamos sua sequência de nucleotídeos.
Também determinamos a sequência do ortólogo de F13L na cepa VACV-IOC, que
também era desconhecida. Para tal, procedemos à amplificação por PCR e posterior
sequenciamento dos amplicons, como descrito em Materiais e Métodos. A partir das
sequências de nucleotídeos geradas, foram determinadas as sequências de aminoácidos de
F13. Como podemos observar na Figura 18, todos os sítios descritos até o momento como
importantes para a funcionalidade da proteína F13, como os sítios de palmitoilação,
motivo YxxL, motivo HKD, sítio de resistência a IMCBH e sítio de resistência ao ST-
246 (Figura 5, Introdução) estão conservados nas sequências de CTGV e VACV-IOC. As
caixas amarelas indicam alterações de aminoácidos, mas somente uma é restrita ao
CTGV, resultado na troca de um ácido aspártico por asparagina, na posição 217. Essa
alteração não foi encontrada em nenhum dos 11 outros poxvírus analisados, cujas
sequencias encontram-se disponíveis em bancos de dados (VACV-cepa Copenhagen,
vírus Cowpox- cepa Brighton Red, vírus Ectromelia, VACV-cepa Lister, VACV-cepa
MVA, VACV-cepa LC16m, vírus Monkeypox-cepa LBR, vírus Horsepox, vírus da
varíola-cepa GAR, vírus da varíola-cepa BGD e vírus Camelpox) (dados não
mostrados)
.
No entanto, até o momento não sabemos se esta alteração poderia estar
relacionada à maior sensibilidade do CTGV ao ST-246.
60
Figura 18. Alinhamento múltiplo das sequências preditas de aminoácidos de ortólogos de
F13 em VACV-WR, CTGV e VACV-IOC. Os sítios e motivos importantes de F13 estão
salientados em caixas coloridas mostradas abaixo do alinhamento.
61
4.7. Localização intracelular da proteína F13 e de outras proteínas de
IEV/CEV/EEV
Posteriormente, avaliamos se a proteína F13 expressa por CTGV apresentava
padrão de localização intracelular similar a de VACV-WR, além de avaliar se haveria
colocalização desta com a proteína endossomal CI-MPR durante a infeção por CTGV,
como descrito para VACV-WR (Chen et al., 2008). Para isso, infectamos células BSC-40
com uma MOI de 10 por 16 horas e, após este período, processamos as amostras para
ensaios de imunofluorescência como descrito em Materiais e Métodos.
Primeiramente, observamos uma marcação perinuclear bem restrita da proteína
CI-MPR em células não infectadas, como mostrado na Figura 19A. Este resultado está de
acordo com sua localização em endossomas tardios e rede trans-Golgi, já descrita em
trabalhos anteriores (Willingham et al., 1983; Griffiths et al., 1988). No entanto, nas
células infectadas com CTGV ou VACV-WR, embora a marcação continue
majoritariamente perinuclear, verificamos um espalhamento da marcação de CI-MPR
numa área mais ampla (Figuras 19E e 19N). A marcação para F13 foi similar nas duas
infecções, com uma marcação perinuclear forte, consistente com sua localização em
membranas do trans-Golgi e endossomas tardios (Lorenzo et al, 2000; e Hussain e Moss,
2001), e uma marcação pontilhada pelo citoplasma, que provavelmente corresponde às
formas IEVs (Hiller e Weber, 1985). Além disso, observamos a colocalização das
proteínas F13 e CI-MPR na infecção por CTGV, assim como descrito para VACV-WR e
também observado neste trabalho (Chen et al., 2008) (Figuras 19G-H e 19P-Q). Após o
tratamento com 10 µM de ST-246, observamos perda da localização perinuclear de F13 e
espalhamento da proteína pelo citoplasma, concomitante com a redução na intensidade
geral de marcação (Figuras 19J e 19S). Este efeito da droga sobre a proteína F13 resultou
na perda da colocalização de F13 e CI-MPR na infecção por CTGV, assim como já havia
sido descrito para VACV-WR (Chen et al., 2008) e também observado em neste trabalho
(Figuras 19L-M e 19T-U).
Paralelamente, investigamos uma possível colocalização entre a proteína F13 e a
proteína celular AIP1/Alix, em razão de esta ser uma forte candidata a interagir
fisicamente com F13, como previamente mencionado na Introdução (Item 1.4). Em
62
Figura 19. Localização subcelular da proteína F13 de VACV-WR e CTGV e sua
colocalização com a proteína celular CI-MPR. Células BSC-40 foram infectadas com uma
MOI=10 de VACV-WR (E-M) e CTGV (N-U) ou não infectadas (N.I.) (A-D). Após 16 horas de
infecção, na ausência ou presença de 10 µM de ST-246, as amostras foram processadas para
imunofluorescência e analisadas em microscópio confocal, conforme descrito em Materiais e
Métodos. As marcações foram feitas com anticorpos anti-F13 e anti-CI-MPR. Imagens
representativas são apresentadas. DIC: Contraste de Interferência Diferencial. Barras = 10µm.
63
células não infectadas, observamos uma marcação difusa de Alix pelo citoplasma
(Figuras 20B-D). Durante a infecção por VACV-WR ou CTGV, observamos o mesmo
padrão de marcação de F13 (Figuras 20E e 20N), já descrito no ensaio anterior. Porém,
como mostrado nas Figuras 20F-H e 20O-Q, não observamos alteração na localização da
proteína Alix após infecção, nem colocalização entre Alix e F13. Na presença de ST-246
10µM, novamente observamos a perda da localização de F13 na região perinuclear, como
observado na Figura 19, e ausência de colocalização com Alix (Figuras 20I-M e 20R-U).
Em seguida, analisamos se o efeito do ST-246 sobre a localização de F13 se
estendia a outras proteínas de envelope de IEV/CEV/EEV, como B5, A33, A34 e A36,
utilizando as mesmas condições de infecção do ensaio anterior. Como mostrado nas
figuras 21A-D, visualizamos a marcação perinuclear na proteína CI-MPR, como acima
descrito, em células não infectadas. Após infecção com VACV-WR ou CTGV,
observamos uma marcação pontilhada pelo citoplasma para a proteína B5, porém
majoritariamente perinuclear (Figuras 21F e 21O), o que está de acordo com sua
localização em membranas do trans-Golgi, e colocalização da proteína viral com a
proteína CI-MPR, na infecção por ambos os vírus (Figuras 21G e 21P). Ao contrário do
observado para proteína F13, após tratamento com ST-246 10µM não houve alteração da
localização da proteína B5 de VACV-WR ou CTGV, permanecendo a marcação
perinuclear e colocalização com CI-MPR (Figuras 21J-L e 21S-T). Infelizmente, não
pudemos avaliar a colocalização de F13 e B5, tendo em vista que ambos os anticorpos
foram produzidos em rato. Porém, com base nos resultados obtidos nas Figuras 19 e 21,
podemos sugerir que o tratamento com ST-246 provavelemente leva à perda de
colocalização dessas proteínas.
Para analisarmos a localização das proteínas virais A33, A34 e A36, utilizamos
também DAPI para marcar o núcleo da célula e os virossomas ou fábricas virais (sítios
citoplasmáticos de replicação viral). Durante a infecção por VACV-WR ou CTGV, as
proteínas A33 e A36 apresentaram uma marcação pontilhada pelo citoplasma, além de
uma marcação perinuclear forte, na mesma região das fábricas virais (Figuras 22F-H,
22O-Q, 23F-H e 23O-Q). Já a proteína A34 apresentou uma marcação difusa pelo
citoplasma, além da marcação perinuclear intensa (Figuras 24F-H e 24O-Q), coincidente
64
65
Figura 20. Localização subcelular da proteína F13 de VACV-WR e CTGV e da proteína
celular AIP1/Alix. Células BSC-40 foram infectadas com uma MOI=10 de VACV-WR (E-M)
ou CTGV (N-U), ou não infectadas (N.I.) (A-D). Após 16 horas de infecção, na ausência ou
presença de 10 µM de ST-246, as amostras foram processadas para imunufluorescencia,
utilizando anticorpos anti-F13 e anti-Alix, e analisadas em microscópio confocal, como descrito
em Materiais e Métodos. Imagens representativas são mostradas. DIC: Contraste de Interferência
Diferencial. Barras = 10µm.
66
Figura 21 Localização subcelular da proteína B5 de VACV-WR e CTGV e sua
colocalização com a proteína celular CI-MPR. Células BSC-40 foram infectadas com uma
MOI=10 de VACV-WR (E-M) e CTGV (N-U) ou não infectadas (N.I.) (A-D). Após 16 horas de
infecção, na ausência ou presença de 10 µM de ST-246, as amostras foram processadas para
imunofluorescência e analisadas em microscópio confocal, conforme descrito em Materiais e
Métodos. As marcações foram feitas com anticorpos anti-B5 e anti-CI-MPR. Imagens
representativas são apresentadas. DIC: Contraste de Interferência Diferencial. Barras = 10µm.
67
Figura 22. Localização subcelular da proteína A33 de VACV-WR e CTGV. Células BSC-40
foram infectadas com uma MOI=10 de VACV-WR (E-M) e CTGV (N-U) ou não infectadas
(N.I.) (A-D). Após 16 horas de infecção, na ausência ou presença de 10 µM de ST-246, as
amostras foram processadas para imunofluorescência e analisadas em microscópio de
fluorescência convencional, conforme descrito em Materiais e Métodos. As marcações foram
feitas com anticorpo anti-A33 e DAPI. Imagens representativas são apresentadas. As setas
brancas apontam para virossomas. N= núcleo. DIC: Contraste de Interferência Diferencial. Barras
= 10µm.
68
Figura 23. Localização subcelular da proteína A36 de VACV-WR e CTGV. Células BSC-40
foram infectadas com uma MOI=10 de VACV-WR (E-M) ou CTGV (N-U) ou não infectadas
(N.I.) (A-D). Após 16 horas de infecção, na ausência ou presença de 10 µM de ST-246, as
amostras foram processadas para imunofluorescência e analisadas em microscópio de
fluorescência convencional, conforme descrito em Materiais e Métodos. As marcações foram
feitas com anticorpo anti-A36 e DAPI. Imagens representativas são apresentadas. As setas
brancas apontam para o virossomas. N= núcleo. DIC: Contraste de Interferência Diferencial.
Barras = 10µm.
69
Figura 24. Localização subcelular da proteína A34 de VACV-WR e CTGV. Células BSC-40
foram infectadas com uma MOI=10 de VACV-WR (E-M) e CTGV (N-U) ou não infectadas
(N.I.) (A-D). Após 16 horas de infecção, na ausência ou presença de 10 µM de ST-246, as
amostras foram processadas para imunofluorescência e analisadas em microscópio de
fluorescência convencional, conforme descrito em Materiais e Métodos. As marcações foram
feitas com anticorpo anti-A34 e DAPI. Imagens representativas são apresentadas. As setas
brancas apontam para o virossomas. N= núcleo. DIC: Contraste de Interferência Diferencial.
Barras = 10µm.
70
com a marcação para os virossomas. A localização dessas proteínas durante a infecção
está de acordo com observações anteriores (Lorenzo et al., 2000). O tratamento com ST-
246 não induziu alterações na localização dessas proteínas (Figuras 22J-M, 22S-U, 23J-
M, 23S-U, 24J-M e 24S-U), demonstrando que, dentre as proteínas de envelope das
formas virais extracelulares, somente F13 teve sua distribuição alterada pelo tratamento
com a droga.
4.8. Análise do acúmulo de proteínas de virais durante a infecção por Western
Blot
A fim de compararmos o acúmulo de proteínas virais ao longo da infecção por
VACV-WR e CTGV, infectamos células BSC-40 com uma MOI de 5 e as amostras
foram recolhidas nos tempos indicados para análise por Western Blot, conforme descrito
em Materiais e Métodos.
Como mostrado na Figura 25,
o CTGV acumulou menos proteínas F13 e B5 ao
longo de 24 horas de infecção, em relação a VACV-WR. Fazendo a análise
densitométrica de 3 experimentos independentes, observamos uma redução de 28% e
27% no acúmulo das proteínas F13 e B5 de CTGV, respectivamente, em relação a
VACV-WR. O mesmo não ocorreu para as demais proteínas de envelope de EEV
testadas (A33, A34 e A36).
Como controle, nós também avaliamos o acúmulo de proteínas de envelope de
IMV (H3, D8 e A28) e core (A18) e não observamos diferença no acúmulo destas
proteínas entre CTGV e VACV-WR, com exceção da proteína H3, que apresentou menor
expressão em CTGV (Figura 25).
Tendo visto, através do ensaio de imunofluorescência, uma diminuição da
intensidade de marcação de F13 de VACV-WR e CTGV após tratamento com ST-246
10µM (Figura 19), nosso próximo passo foi avaliar se este fenômeno estaria relacionado
a uma diminuição da expressão de F13 após tratamento com a droga. Para tal, infectamos
células BSC-40 com uma MOI de 10 de VACV-WR ou CTGV, na ausência ou presença
de 10µM de ST-246. Novamente, após os tempos de infecção indicados, amostras foram
recolhidas para análise por Western Blot. Como podemos observar na Figura 26, não
71
Figura 25. Análise comparativa do acúmulo de proteínas virais durante a infecção por
VACV-WR e CTGV. Células BSC-40 foram infectadas com uma MOI=5 de VACV-WR ou
CTGV. Após os tempos indicados, amostras foram recolhidas e analisadas através de SDS-PAGE
12,5%, seguido de Western Blot utilizando anticorpos específicos para a detecção das proteínas
de interesse. N.I: células não infectadas. Os marcadores de peso molecular estão indicados em
kDa à direita das figuras. A marcação para a proteína célular α-tubulina foi utilizada como
controle de carregamento.
72
Figura 26. Efeito do ST-246 sobre o acúmulo da proteína F13 ao longo da infecção por
VACV-WR e CTGV. Células BSC-40 foram infectadas com uma MOI=10 de VACV-WR ou
CTGV e tratadas ou não com 10 µM de ST-246. Após os tempos indicados, amostras foram
recolhidas e analisadas através de SDS-PAGE 12,5%, seguido de Western Blot utilizando o
anticorpo anti-F13, conforme descrito em Materiais e Métodos. N.I: células não infectadas. A
marcação de peso molecular está indicada em kDa à direita das figuras.
73
houve diminuição do acúmulo da proteína F13 após tratamento com ST-246 durante a
infecção por nenhum dos vírus. Dessa forma, a diminuição da intensidade de
fluorescência de F13 observada no ensaio da Figura 19, não está associada a uma
diminuição da expressão de F13 durante o tratamento com ST-246.
4.9. Incorporação de F13, B5 e A34 nos EEVs produzidos por CTGV e VACV-
WR
Vimos no ensaio anterior que F13 e B5 acumulam menos durante a infecção por
CTGV em relação a VACV-WR. Assim, analisamos se a incorporação dessas proteínas
nos EEVs destes vírus também seria diferente. Dessa maneira, também era de nosso
interesse avaliar como seria o padrão de incorporação dessas proteínas nos EEVs
produzidos em presença de ST-246. Para isso, células BSC-40 foram infectadas com uma
MOI de10 de VACV-WR ou CTGV por 16 horas. Após este período, o sobrenadante foi
recolhido e partículas virais extracelulares foram purificadas e processadas para análise
por Western Blot, como descrito em Materiais e Métodos.
Na Figura 27 observamos, em células não tratadas, uma menor incorporação da
proteína F13 nas partículas EEV do CTGV em relação ao VACV-WR. No entanto, para
as demais proteínas de envelope de IEV/CEV/EEV testadas, B5 e A34, não observamos
diferenças entre VACV-WR e CTGV. Cabe lembrar que B5 acumula menos durante a
infecção por CTGV (Figura 25), porém esse menor acúmulo não é refletido em menor
incorporação nos EEVs, como acontece com F13. Realizamos também a marcação para
p4b (proteína majoritária de core viral) e D8 (proteína de envelope de IMV) como
controles. Da mesma forma, não visualizamos diferenças entre CTGV e VACV-WR nos
resultados obtidos. A18 (proteína do core viral) foi tomada como controle de
carregamento. proteína incorporada igualmente em todas amostras. A análise
densitométrica das imagens obtidas de 3 experimentos independentes foi realizada a
partir da normalização com os valores obtidos para A18 (Figuras 27B, 27C e 27D). A
análise revelou cerca de 2 vezes mais F13 na partícula de VACV-WR, em relação ao
CTGV, enquanto que, para as demais proteínas, não observamos uma diferença
significativa. Nas amostras contendo partículas
74
Figura 27. Incorporação de proteínas em partículas virais extracelulares purificadas de
VACV-WR e CTGV. Células BSC-40 foram infectadas com uma MOI=10 de VACV-WR e
CTGV e tratadas ou não com 10 µM de ST-246. Após 16 horas de infecção, os sobrenadantes das
células infectadas foram recolhidos para a purificação dos EEVs, conforme descrito em Materiais
e Métodos. Cerca de 8 µg de proteína de cada amostra foram analisados através de SDS-PAGE
12,5%, seguido de Western Blot utilizando anticorpos para a detecção das proteínas indicadas.
Autorradiogramas de um experimento representativo de CTGV e VACV-WR são apresentados.
Os marcadores de peso molecular estão indicados em kDa à direita das figuras. *p< 0,05.
75
virais extracelulares produzidas na presença do ST-246, não observamos alterações na
incorporação das proteínas testadas, ao compararmos com o controle não tratado.
4.10. Sensibilidade do CTGV ao ST-246 em células BSC-40 superexpressando
F13
Como uma tentativa de abordar se a maior sensibilidade do CTGV ao ST-246
estaria relacionada a uma menor taxa de expressão de F13, avaliamos se a superexpressão
de F13 causaria levaria a um fenótipo similar ao de VACV-WR, ou seja, mais resistente à
droga. Para o ensaio, células BSC-40 foram transfectadas com plasmídeo pSG5-p37
(Borrego et al., 1999), que gera suprexpressão de F13, seguido de infecção com 100
PFUs (MOI=0,001) de VACV-WR ou CTGV na presença de diversas concentrações de
ST-246. Após 40 horas de infecção, as placas virais formadas foram analisadas como
descrito em Materiais e Métodos.
Na Figura 28 A, podemos observar que não houve alteração relevante no perfil de
sensibilidade do CTGV, ao compararmos os resultados obtidos em células não-
transfectadas e transfectadas, confirmado pela contagem do número de placas e cálculo
do percentual de inibição. Observamos, sim, uma diminuição do número de placas virais
de CTGV e VACV-WR formadas após infecção em células transfectadas. Contudo, ao
avaliarmos a eficiência de transfecção através de ensaio de imunofluorescência usando
anticorpo anti-F13, observamos um baixíssimo número de células marcadas para F13
após transfecção e previamente à infecção (Figura 28D). Ensaios similares foram
realizados variando as quantidades utilizadas de plasmídeos, analisando a expressão de
F13 e utilizando células RK-13. Em todas as situações, porém, não conseguimos uma
eficiência de transfecção satisfatória (dados não mostrados). Dessa forma, a partir deste
ensaio não foi possivel avaliar se a sensibilidade do CTGV ao ST-246 estaria relacionada
à disponibilidade de F13 durante a infecção.
76
\
Figura 28. Sensibilidade do CTGV ao ST-246 em células BSC-40 superexrpressando a
proteína F13. (A) Monocamadas confluentes transfectadas ou mock-transfectadas com o
plasmídeo pSG5-p37 foram infectadas com uma MOI= 0,001 de VACV-WR ou CTGV, e
tratadas ou não com as concentrações indicadas de ST-246. Após 40 horas de infecção, as
monocamadas foram coradas com solução de cristal violeta 0,1%. B-E: Monocamadas
transfectadas (D-E) ou não (B-C) por 18 horas com o plasmídeo pSG5-p37, seguido de
imunofluorescência usando anticorpo anti-F13. Barras = 10µm.
77
5-DISCUSSÃO
78
5. Discussão:
No decorrer da última década, surtos de CTGV-like têm sido relatados em
diversas regiões do Brasil, mostrando um espalhamento da infecção pelo território
brasileiro (Damaso et al., 2000; Schatzmayr et al., 2000; de Souza Trindade et al., 2003;
Nagasse-Sugahara et al., 2004; Leite et al., 2005; Lobato et al., 2005; Trindade et al.,
2006; Damaso et al., 2007, Megid et al., 2008; Medaglia et al, 2009). O primeiro caso foi
descrito em 2000, por Damaso e colaboradores, a partir de um surto que ocorreu na
cidade de Cantagalo, no estado do Rio de Janeiro. A doença acometeu o gado leiteiro,
com o aparecimento de lesões nas tetas e úberes, impedindo a ordenha do animal. Em
humanos, a doença se manifestava pelo aparecimento de lesões nas mãos e braços dos
ordenhadores (Damaso et al., 2000). As infecções por vírus CTGV-like geram grandes
perdas econômicas, principalmente para o pequeno produtor, que realiza ordenha manual,
contribuindo rapidamente para o espalhamento da infecção para o homem e,
consequentemente, para outros animais.
O CTGV foi caracterizado como sendo uma cepa do vírus vaccínia,
filogeneticamente próximo à cepa VACV-IOC, utilizada pelo Instituto Oswaldo Cruz
como vacina durante a campanha de erradicação da varíola no Brasil (Fenner et al., 1988;
Damaso et al., 2000). É consenso na literatura que o virus vaccinia não possui
hospedeiro natural e sua origem não é conhecida (Fenner et al., 1988; Moss, 2007). Os
vírus buffalopox (BPV) e CTGV são as únicas cepas de VACV que ocorrem na natureza.
O BPV tem sido isolado na Índia desde a década de 60 até os dias de hoje, onde se tornou
a maior a zoonose ocupacional com importantes consequências econômicas. As infecções
pelo BPV causam lesões características de VACV, acometendo búfalos, gado leiteiro e
humanos que entram em contato com esses animais (Dumbell and Richardson, 1993;
Kolhapure et al., 1997; Sihgh et al., 2006).
Infecções causadas por outros Orthopoxvirus também têm sido relatadas na
literatura. Desde 1970, diversos casos de infecções pelo vírus monkeypox (MPXV) vêm
ocorrendo em países das regiões central e leste do continente africano (Moss, 2007). A
principal rota da transmissão da doença seria o contato com animais silvestres, como
primatas, roedores e esquilos (Jezek e Fenner, 1988). No entanto, a partir da década de
90, uma série de investigações apontou que, na grande maioria dos casos, a principal via
79
de transmissão se deu a partir do contato homem a homem. Esta forma de transmissão
foi, em parte, atribuída ao fato de uma grande parcela da população ser jovem e nunca ter
sido vacinada contra a varíola, já que a campanha de erradicação da doença ocorreu na
década de 70 (Moss, 2007). No ano de 2003, o MPXV foi introduzido nos Estados
Unidos via importação de roedores silvestres do leste da África para o país, que foram
comercilizados por pet shops americanas como animais de estimação (CDC, 2003). Outro
Orthopoxvírus que infecta humanos é o vírus cowpox (CPV). O CPV é encontrado em
regiões da Europa e Ásia, sendo os roedores seus hospedeiros naturais (Baxby e Bennet,
1997). A infecção em humanos é uma zoonose e a transmissão se dá, principalmente,
pelo contato com gatos domésticos (hospedeiro intermediário), animais de zoológico,
como elefantes e, mais recentemente, ratos que são criados como animais de estimação
na Europa. O problema tem se agravado intensamente desde 2008, principalmente na
Alemanha (Campe et al., 2009; Ninove et al., 2009; Kurth et al., 2009).
Como vimos, diversas infecções por Orthopovirus têm sido relatadas ao longo dos
anos, em diversos continentes. No entanto, não existe nenhum antiviral disponível para o
tratamento destas infecções. Desde a erradicação da varíola em 1980, houve um
decréscimo no desenvolvimento de terapias anti-poxvírus. No entanto, devido às recentes
questões políticas mundiais, com o receio de um possível uso da varíola como arma
biológica, a OMS vem estimulando o desenvolvimento de novas drogas antivirais para
serem utilizadas em caso de emergência (OMS, 2009). Além disso, complicações
decorrentes da vacinação, como eczema vaccinatum, vaccinia generalizada, além de
ulcerações no local da vacinação, podem ocorrer com frequência variada (Belongia e
Naleway, 2003; Wollenberg e Engler, 2004; Waibel e Walsh, 2006), podendo evoluir
para casos graves ou mesmo fatais em indivíduos imunocomprometidos, o que aumenta a
demanda por drogas eficazes. Os casos recentes de surtos de CTGV-like no Brasil e de
CPV na Europa também têm sido alvo de preocupação pelas autoridades mundiais de
saúde.
Segundo a OMS, as drogas mais promissoras para o tratamento de infecções por
poxvírus são: o Cidofovir (HPMPC ou CDV) e o ST-246 (OMS, 2009). O CDV é um
análogo de nucleosídeo fosfonado que tem demonstrado atividade contra vírus de
genoma DNA, tais como papilomavírus, poliomavírus, adenovírus, herpesvírus e
80
poxvírus (De Clercq, 2003). No entanto, CDV é apenas licenciado para uso clínico no
tratamento de retinite causada por citomegalovírus em pacientes imunodeprimidos. A
administração do CDV é feita pela via intravenosa, respeitando a dose limite de
nefrotoxicidade do composto (Lalezari et al., 1997). O uso tópico do CDV contra
infecções pelos poxvírus Orf e Molluscum contagioum demonstrou, contudo, bastante
eficácia, e pode ser uma opção no tratamento de lesões cutâneas por poxvírus (Sonvico et
al., 2009, Mathes e Frieden, 2010). O hexadeciloxipropil-cidofovir ou CMX001 é um
composto análogo ao CDV, que pode ser administrado pela via oral e tem demonstrado
grande eficácia em combater infecções por Orthopoxvirus em modelo animal, sem
apresentar efeito nefrotóxico (Kern et al., 2002; Quenelle et al., 2004). Estudos do nosso
laboratório já demonstraram a eficácia do CDV em inibir a replicação do CTGV em
cultura de células, porém de forma não tão potente quanto o ST-246 (Jesus et al., 2009a).
Em 2005, Yang e colaboradores descobriram um novo e potente inibidor da
replicação de Orthopoxvirus, o ST-246. Desde então, diversos trabalhos têm sido
publicados demonstrando a eficácia da droga em conter o espalhamento de infecções por
Orthopoxvírus in vitro e in vivo, como descrito na Introdução. Até o momento, o ST-26 é
o anti-Orthopoxvirus mais potente e com comprovada eficácia em humanos, embora
ainda não tenha sido licenciado pelo FDA americano (Kaiser, 2007). O nome comercial
adotado é Tecovirimat (Bolken e Hruby, 2010).
Através da técnica de resgate de marcador de um vírus Cowpox resistente ao ST-
246, foi possível mapear o locus gênico que confere resistência à droga. A mutação
responsável pela resistência consiste na troca de uma glicina por uma cisteína na posição
277 da proteína codificada pelo gene V061 (Yang et al., 2005). O gene V061 do vírus
cowpox é homólogo ao gene F13L do VACV, que codifica uma proteína majoritária
(F13) requerida para a formação de vírus extracelulares. Todos os trabalhos publicados
até o momento sugerem que a proteína F13 seja o único alvo de ação do ST-246 (Yang et
al., 2005; Duraffour et al., 2008).
Dessa forma, neste trabalho caracterizamos o efeito antiviral do ST-246 sobre a
replicação do CTGV in vitro e in vivo, avaliamos o mecanismo geral de ação do ST-246 e
analisamos a expressão do ortólogo de F13L em CTGV.
81
Para iniciarmos o estudo, avaliamos o efeito de diversas concentrações do ST-246
sobre a formação de placas virais do CTGV, ou seja, em condições de ciclos múltiplos de
infecção. A curva dose-resposta mostrou um efeito drástico da droga sobre a replicação
do CTGV, pois na presença de 0,02 µM de ST-246 a inibição foi de 93%, após 48 horas
de infecção em células BSC-40 (Figura 10B). Ao realizarmos este mesmo ensaio para
outros Orthopoxvirus, vimos que o CTGV foi o vírus mais sensível à ação do ST-246,
enquanto o CPV foi o mais resistente (Figura 10C). Ao compararmos os resultados
obtidos com CTGV aos de VACV-WR, que é a cepa de VACV mais estudada
mundialmente, os valores de IC
50
foram de 0,0086 µM e 0,05 µM, respectivamente
(Figura 10D). Dessa forma, concluímos que o CTGV foi 6,4 vezes mais sensível ao ST-
246 do que VACV-WR.
A placa viral formada por CTGV já é normalmente menor em comparação a
VACV-IOC e VACV-WR (Figura 10A). Desta forma, a maior sensibilidade do CTGV ao
ST-246 poderia estar relacionada ao fato de ele formar uma placa viral pequena que, na
presença da droga, diminuiria de tamanho impedindo sua visualização e contagem. Para
testarmos esta possibilidade, realizamos três ensaios distintos, ainda sob condições de
ciclos múltiplos de infecção: estendemos o tempo de infecção para 96 horas, para que as
placas virais aumentassem de tamanho, facilitando a visualização das mesmas, dosamos a
atividade de β-galactosidase produzida por vírus recombinantes e determinamos a
produção de partículas infecciosas. Com o aumento do tempo de infecção, observamos
uma queda ainda mais drástica da curva dose-resposta do CTGV ao ST-246 em relação
aos demais vírus, tanto em células BSC-40 quanto em RK-13 (Figura 11), evidenciando
um efeito independente da linhagem celular utilizada.
A dosagem da atividade de β-galactosidade expressa sob controle de um promotor
viral inicial/tardio (p7.5) pode ser tomada como indicativo da expressão gênica viral
durante a infecção. CTGV teve a atividade inibida mais drasticamente em presença do
ST-246, em relação ao VACV-WR, demonstrando que a maior sensibilidade do CTGV
ao ST-246 não é apenas uma questão de tamanho de placa viral (Figura 12B).
Estes resultados foram corrroborados pela dosagem do título viral intracelular
(CAVs) que reflete a produção de vírus nos focos de infecção. Novamente, a produção de
CAVs do CTGV foi mais severamente inibida, em relação ao VACV-WR, com valores
82
de IC
50
de 0,00146 µM e 0,0108 µM (Figuras 13A e 13B), respectivamente. A única
diferença observada entre este ensaio e o anterior, foi a porcentagem de inibição obtida
pelo tratamento com ST-246 0,01 µM na infecção com VACV-WR. No ensaio anterior
tivemos 20% de inibição da atividade de β-galactosidase nesta concentração, enquanto
que, a inibição da produção de CAVs de VACV-WR foi de 47%. (Figuras 12B e 13B)
Esta diferença entre os resultados provavelmente está relacionada à sensibilidade das
metodologias utilizadas, já que no primeiro ensaio estamos vendo o efeito da droga sobre
a expressão gênica viral (promotor natural do vírus controla a expressão de β-
galactosidase), enquanto que, no segundo ensaio estamos quantificando diretamente a
produção de partículas virais.
Como já descrito para outros Orthopoxvirus, o ST-246 também inibiu a produção
de EEVs produzidos por CTGV. A análise revelou que em algumas concentrações a
diferença de sensibilidade entre VACV-WR e CTGV foi significativa (Figura 13D).
Além disso, em condições de ciclos de múltiplos de infecção, o CTGV produz 1 log a
menos de CAVs e EEVs, em relação a VACV-WR (Figuras 13A e 13C). Um fato
interessante foi a queda mais acentuada da produção de CAVs em relação à produção de
EEVs, quando analisamos concentrações de ST-246 menores que 0,01 µM, durante a
infecção por ambos os vírus (Figuras 13B e 13D). Como a produção de partículas
extracelulares é descrita como sendo alvo de ação da droga (Yang et al., 2005, Quenelle
et al., 2007a; Nalca et al., 2008; Jordan et al., 2009), esperaríamos ver uma inibição mais
intensa da formação destas partículas, mesmo com baixas concentrações de ST-246. No
entanto, só observamos este padrão de resposta em concentrações mais elevadas. Acima
de 1 µM, a produção de CAVs se manteve estável em 10
5
PFU/mL para CTGV e 5 x 10
5
PFU/mL para VACV-WR, enquanto que a produção de EEV caiu abruptamente,
alcançando inibição completa (Figuras 13A e 13C).
Ainda assim, evidenciamos que, também na formação de EEV, há uma maior
sensibilidade do CTGV ao ST-246 em relação a VACV-WR (Figura 13D), corroborado
pelo ensaio de formação de cometas (Figura 14). Este ensaio foi realizado com tempos de
infecção diferentes para cada vírus (4 dias para CTGV e 3 dias para VACV-WR), pois ao
realizarmos o ensaio com VACV-WR com 4 dias de infecção, as placas formadas foram
83
muito grandes, impedindo a visualização dos cometas, ao passo que com 3 dias, CTGV
formou cometas muito pequenos mesmo no controle (dados não mostrados).
O espalhamento da infecção viral também é fator decisivo para o sucesso da
infecção in vivo. Sabe-se que toda mutação que prejudique o espalhamento da infecção
do VACV em cultura de células, e consequentemente, leve a uma diminuição da placa
viral, causa uma atenuação da virulência in vivo, mostrando a importância de um
espalhamento rápido e eficaz da infecção para a virulência do VACV (Engelstad e Smith,
1993; Parkinson e Smith, 1994; McIntosh e Smith, 1996; Zhang et al., 2000).
Em 2009, Reis analisou a virulência do CTGV em modelo intranasal de infecção
em camundongos Balb/C. O CTGV gerou sinais clínicos de doença apenas na dose de
10
8
PFU/camundongo, porém a infecção não foi letal. Já VACV-WR foi letal em doses
tão baixas quanto 5 x 10
5
PFU/camundongo. Assim, concluiu-se que o CTGV é um vírus
altamente atenuado para este modelo de infecção. Visando testar o efeito do ST-246 na
infecção por CTGV in vivo, testamos inicialmente a rota de infecção intravenosa. Yang e
colaboradores (2005) testaram o efeito do ST-246 (50 mg/kg por 5 dias) em
camundongos NMRI infectados com 4 x 10
3
partículas de VACV-WR pela rota
intravenosa (veia caudal) e observaram que os animais apresentaram apenas 1% do
número de lesões, quando comparados aos animais que receberam placebo. No entanto,
em nossos ensaios, ao infectarmos camundongos Balb/C com 5 x 10
3
partículas
infecciosas de CTGV, não observamos o aparecimento de lesões na cauda, nem sinais
clínicos de infecção sistêmica (dados não mostrados). Mesmo utilizando 10
7
partículas
infecciosas de CTGV, observamos a presença de poucas e diminutas lesões ao longo da
cauda, impossibilitando a contagem das mesmas (dados não mostrados), sem o
aparecimento de sintomas clínicos de doença. Dessa forma, o CTGV se mostrou mais
atenuado que VACV-WR também no modelo intravenoso de infecção, não sendo este
adequado para testarmos a ação do ST-246 sobre a replicação do CTGV in vivo, nem
para compararmos sua sensibilidade com a de VACV-WR.
Utilizando o modelo de lesão dermal por escarificação da cauda de camundogos
Balb/C, observamos lesões aparentes com 7 dias de infecção, após inoculação com 10
6
partículas infecciosas de CTGV ou VACV-WR (Figura 15). Dessa forma, este modelo foi
o escolhido para se testar a ação do ST-246 in vivo. Além disso, esta rota de inoculação é
84
a que melhor mimetiza a rota de transmissão do CTGV na natureza, que se dá pela
presença de abrasões na pele que entram em contato com partículas virais infecciosas
(Damaso et al., 2000).
A presença de uma lesão primária mais severa e de lesões secundárias na cauda
dos camundongos infectados com VACV-WR confirmaram sua maior virulência, em
relação ao CTGV, também no modelo de lesão dermal (Figura 15). Durante a infecção
por CTGV não observamos o surgimento de lesões secundárias, mesmo com doses de 10
8
PFU/camundongo (Figuras 17F e 17H). Após tratamento com ST-246 houve diminuição
da severidade da lesão primária e desaparecimento das lesões secundárias de VACV-WR,
em concordância com resultados obtidos em trabalhos anteriores (Grosenbach et al.,
2008) (Figura 16). Em comparação, camundongos infectados com CTGV precisaram de
doses menores de ST-246 para que houvesse uma diminuição da severidade da lesão
primária e, após a administração de 100 mg/kg da droga, houve prevenção do
aparecimento da lesão de CTGV (Figura 17). Dessa forma, em relação ao VACV-WR, o
CTGV foi mais sensível à ação do ST-246 também in vivo, mesmo quando utilizamos
doses 100 vezes superiores de vírus (Figura 17).
Esta maior susceptibilidade do CTGV ao ST-246 não necessariamente pode ser
correlacionada a sua menor virulência se comprado ao VACV-WR. Trabalhos anteriores
demonstraram que o ST-246 (100 mg/kg) não preveniu o aparecimento, mas sim,
diminuiu a severidade da lesão formada por cepas de VACV, como ACAM2000 e
Dryvax, que são cepas atenuadas e utilizadas como vacinas contra a varíola (Grosenbach
et al., 2008; Berhanu et al., 2009). Assim, por este aspecto, foi surpreendente observar
um efeito tão drástico do ST-246 sobre a formação da lesão do CTGV. Em conjunto,
nossos resultados indicam que a menor virulência do CTGV in vivo, associada a uma
baixa taxa de mortalidade e baixo poder de propagação (formação de lesões secundárias),
pode estar relacionada à formação de caudas de actina menores, prejudicando o
espalhamento célula a célula e disseminação da infecção. Contudo, outros fatores de
interação com o hospedeiro e de elicitação de resposta imunológica devem também estar
envolvidos.
Com o intuito de investigarmos a causa da maior sensibilidade do CTGV ao ST-
246, sequenciamos a ORF do gene F13 deste virus. Ao compararmos a sequência de
85
aminoácidos da proteína F13 com outros Orthopoxvirus, observamos um único
polimorfismo restrito ao CTGV (Figura 18). No entanto, não sabemos se este resíduo é
importante para a funcionalidade da proteína ou se está envolvido na interação entre F13
e B5, ou entre F13 e proteínas celulares. Além disso, este polimorfismo pode estar em um
sítio que confere maior sensibilidade à droga.
O mecanismo pelo qual o ST-246 atua sobre a proteína F13 ainda não foi descrito.
Até o momento sabe-se que as interações entre F13 de VACV-WR e proteínas de
endossoma tardio, como Rab9, TIP47 e CI-MPR, além da interação F13-B5, são
rompidas na presença de ST-246, pois a droga altera a localização da proteína F13 em
células infectadas por VACV-WR. Com isso, a proteína passa a não mais colocalizar com
o marcador de endossoma tardio CI-MPR (Chen et al., 2009). Ao analisarmos a
localização da proteína F13 de CTGV durante a infecção, observamos uma marcação
perinuclear forte e colocalização com CI-MPR, além de uma marcação pontilhada pelo
citoplasma, que provavelmente corresponde às formas IEVs, assim como descrito para
VACV-WR e confirmado por nós (Figura 19). Na presença de ST-246, visualizamos a
dispersão da proteína F13 pelo citoplasma, acompanhada de uma diminuição moderada
da intensidade de fluorescência e perda da colocalização com CI-MPR, da mesma forma
como descrito para VACV-WR (Chen et al., 2009). No entanto, a diminuição da
intensidade de fluorescência de F13 não está associada a um efeito do ST-246 sobre o
acúmulo da proteína durante a infecção (Figura 25), mas talvez ao seu espalhamento no
citoplasma ou relocalização, associada a uma possível ocultação do epítopo reconhecido
pelo anticorpo.
Estudos com o antiviral IMCBH demonstraram que na presença da droga também
ocorre alteração da localização da proteína F13 (Hiller et al., 1981). No entanto, ao
contrário do observado na presença de ST-246, há uma redução drástica da intensidade de
fluorescência, impossibilitando a visualização da marcação. Além disso, também de
forma diferente do ST-246, este efeito do IMCBH é acompanhado de uma queda de 3
logs na produção de partículas virais extracelulares, em condição de ciclo único de
infecção, e ausência de caudas de actina, provavelmente devido à ausência de CEVs na
superfície celular (Payne e Kristenson, 1979; Hiller et al., 1981).
86
Como demonstramos, a proteína B5 de CTGV ou VACV-WR não teve sua
localização alterada após tratamento com ST-246, sugerindo que a ligação B5-F13 foi
rompida nestas condições (Figura 21). Da mesma forma, não foram observadas alterações
de localização para outras proteínas de EEV, sob efeito de ST-246, como A33, A36 e
A34 (Figuras 22, 23 e 24). É interessante notar, entretanto, que mesmo com a
relocalização de F13 em presença de ST-246 e a perda de colocalização entre F13/ B5 e
F13/ CIMPR, verificamos produção equivalente de CEV e EEV nestas condições. Como
F13 é essencial para a formação dos vírus extracelulares, podemos supor que, nas
condições analisadas, ainda há moléculas de F13 suficientes e corretamente localizadas
para a formação de níveis normais dessas formas virais.
Como abordado na Introdução (item 1.3), a proteína celular AIP1/Alix é apontada
como uma forte candidata a interagir fisicamente com F13. No entanto, através de ensaio
de imunofluorescência, vimos que não há colocalização entre as duas proteínas durante a
infecção por CTGV e VACV-WR. Contudo, a presença de um domínio de montagem
viral tardio (YxxL) na sequência de F13 e a queda da produção de vírus extracelulares de
VACV, após silenciamento da expressão de AIP1/Alix (Honeychurch et al., 2007), são
fortes indícios de uma possível interação entre estas proteínas. Futuramente, a realização
de ensaios de co-imunopreciptação irá definitivamente confirmar se há ou não interação
entre F13 e Alix.
A análise da cinética de acúmulo de proteínas virais, por Western Blot, revelou
diferenças no acúmulo de algumas proteínas sintetizadas por CTGV e VACV-WR.
Embora a diferença observada não tenha sido drástica, os resultados revelaram que,
durante a infeccção por CTGV, as proteínas F13 e B5 acumulam 28% e 27% a menos,
respectivamente, em relação ao observado para VACV-WR (Figura 25). Além disso,
também observamos que EEVs de CTGV incorporam cerca de duas vezes menos F13,
em relação a EEVs de VACV-WR (Figura 25). Dessa forma, uma menor expressão de
F13 durante a infecção por CTGV, associada a uma menor taxa de incorporação desta
proteína nos EEVs, poderia estar relacionada à ação antiviral mais eficaz do ST-246
sobre a replicação do CTGV, acarretando numa maior sensibilidade. Contudo, é
importante lembrar que a produção de CEV/EEV entre CTGV e VACV-WR em alta
MOI é similar, o que, por outro lado, sugere que a menor produção de F13 por CTGV
87
não afete a produção e a infecciosidade das partículas virais, como acima discutido. Além
disso, vimos que partículas virais de CTGV e VACV-WR produzidas na presença de ST-
246 não apresentaram alteração na incoporação da proteína F13 e de outras proteínas
virais, como p4b, A18, D8, B5 e A34.
Mesmo assim, testamos se a superexpressão de F13 poderia aumentar a resistência
do CTGV ao antiviral ST-246. Contudo, não obtivemos resultados conclusivos, tendo em
vista que a expressão de F13 foi muito baixa e com pouquíssimas células marcadas após
transfecção (Figura 28). Dessa forma, o menor número de placas virais de VACV-WR e
CTGV formadas em células transfectadas não está relacionado com a superexpressão de
F13 nestas células, nem a incubação com o reagente lipofectamina, já que células mock-
transfectadas não apresentaram o mesmo resultado. Para investigarmos essa questão,
futuramente iremos utilizar células RK13 que expressam a proteína F13
constitutivamente, a fim de evitarmos artefatos decorrentes do processo de transfecção.
Em suma, nossos resultados mostram que o CTGV é o Orthopoxvírus mais
sensível à ação antiviral do ST-246, tanto in vitro, quanto em modelo animal. Com isso, o
ST-246 é a droga mais promissora para se combater as infecções por CTGV que vem
ocorrendo desde 1999 no Brasil. No futuro, nossa intenção é testar a eficácia do ST-246
no tratamento da infecção de bovinos por CTGV, através do uso da formulação tópica da
droga.
88
6-CONCLUSÕES
89
6. Conclusões:
- Em modelo animal de lesão dermal, o CTGV é mais sensível ao ST-246 do que
VACV-WR. Este é o único exemplo até o momento em que o ST-246 foi capaz de
prevenir o aparecimento de lesão dermal por um Orthopoxvirus.
- Em ensaios em cultura de células, o CTGV é o Orthopoxvirus mais sensível ao
ST-246 dentre aqueles testados até o momento, apresentando severa inibição da formação
de placas virais, a produção de partículas infecciosas associadas à célula e partículas
extracelulares, quando analisado mais de um ciclo de infecção.
- A sequência do ortólogo de F13L em CTGV foi determinada e comparada às de
outros poxvírus, revelando que todos os sítios importantes para a funcionalidade da
proteína F13 estão conservados. Encontrou-se uma alteração de aminoácidos restrita ao
CTGV (posição 217), que poderia estar relacionada a sua maior sensibilidade ao ST-246.
- A proteína F13 sintetizada por VACV-WR e CTGV não colocaliza com a
proteína celular AIP1/Alix.
- As proteínas F13 e B5 sintetizadas pelo CTGV, assim como demonstrado para
VACV-WR, colocalizam com CI-MPR nos endossomas tardios. Apenas a colocalização
de F13 é desfeita em presença de ST-246, sugerindo o rompimento da ligaçao entre B5 e
F13 de CTGV, na presença da droga.
- O tratamento com ST-246 não induziu alterações na localização de outras
proteínas de envelope como A33, A34 e A36, presentes nos virossomas durante a
infecção
- F13 e B5 acumulam menos durante a infecção de células por CTGV do que por
VACV-WR. O tratamento com ST-246 não causou diminuição do acúmulo da proteína
F13 durante a infecção por nenhum dos vírus.
- Partículas extracelulares de CTGV incorporam cerca de 2 vezes menos F13 em
relação a VACV-WR. Para outras proteínas de envelope testadas, B5 e A34, não
observamos diferenças entre VACV-WR e CTGV. Partículas virais extracelulares
produzidas na presença do ST-246, não sofrem alterações na incorporação destas
proteínas .
90
7-PERSPECTIVAS
91
7. Perspectivas:
- Realizar ensaios de co-imunoprecitação para analisarmos se outras interações
entre as proteínas de membrana de EEVs, além da interação B5-F13, são rompidas na
presença de ST-246.
- Realizar ensaios de microscopia eletrônica de transmissão, a fim de avaliarmos a
morfologia das partículas virais formadas na presença de ST-246.
- Investigar se a mutação exclusiva do gene F13L de CTGV está relacionada à
maior sensibilidade à droga, através da substituição da ORF de CTGV pela ORF de
VACV-WR.
- Obter uma expressão mais robusta de F13 em células não infectadas através da
utilização de células RK13 que expressam F13 constitutivamente para ensaios de
infecção e tratamento com ST-246.
- Ampliar a eficácia da droga in vivo utilizando formulação tópica do ST-246 em
bovinos.
92
8-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
93
8. Referências Bibliográficas:
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