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Christina Monerat Toledo Machado
Desenvolvimento de uma vacina sintética
contra a Leishmaniose Visceral Canina
utilizando tecnologia peptídica (Phage
Display e Spot Síntese)
Universidade Federal de Minas Gerais
Agosto de 2010
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Christina Monerat Toledo Machado
Desenvolvimento de uma vacina sintética
contra a Leishmaniose Visceral Canina
utilizando tecnologia peptídica (Phage Display
e Spot Síntese)
Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Minas Gerais
Belo Horizonte
2010
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Farmacologia Bioquímica e
Molecular do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia do Instituto de Ciências
Biológicas como requisito parcial para a
obtenção do titulo de Doutor em Farmacologia
Bioquímica e Molecular
Orientador: Prof. Carlos Delfin Chávez
Olortegui
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AGRADECIMENTOS
Ao Professor Dr. Carlos Delfin Chávez Olortegui pelos 10 anos de ótima convivência,
orientação e por todo o apoio ao longo desses anos.
Ao Professor Tomaz, pelos conselhos e ensinamentos.
Ao Curso de Pós-Graduação em Farmacologia Bioquímica e Molecular pela possibilidade
de aperfeiçoamento profissional e amadurecimento científico.
Ao Dr. Marco Túlio Ribeiro Gomes. Você foi fundamental para a realização deste trabalho.
Ao Professor Dr. Ricardo Toshio Fujiwara por ter me recebido tão bem em seu laboratório
e por toda a orientação fundamental para o desenvolvimento deste projeto.
A todos os amigos (do passado e presente) do Laboratório de Imunoquímica de Proteínas,
principalmente Ricardo, Liza, Clara, Larissa e Ju, que sempre estiveram disponíveis quando
precisei.
Aos novos amigos do Laboratório de Imunologia e Genômica de Parasitos, especialmente
Pedro Gazzinelli, Jacqueline e Michelle. Muito obrigada pelo aprendizado e ajuda com os
experimentos.
À Marina de Morais Mourão, do Centro de Pesquisas Renê Rachou, por ter sido sempre tão
acessível e gentil.
A toda minha família que sempre me apoiou e incentivou.
Ao Lu, por sempre acreditar em mim e ser meu maior incentivador.
À Lara, meu maior orgulho e principal motivo pelo qual estou aqui hoje.
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS .................................... I
LISTA DE FIGURAS ......................................... V
RESUMO .................................................. VI
ABSTRACT ............................................... VII
1- INTRODUÇÃO ........................................... 1
2- REVISÃO DA LITERATURA ................................. 5
2.1- Agente etiológico e transmissão ..................... 5
2.2- Vetor ............................................... 5
2.3. Ciclo biológico e morfologia ........................ 5
2.4- Epidemiologia ....................................... 6
2.5- Patogenia da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) ..... 7
2.6- Diagnóstico e controle da LVC ....................... 9
2.7- Resposta imune na leishmaniose murina .............. 11
2.8- Vacinas e Leishmaniose Visceral Canina ............. 13
2.9- A técnica de Phage Display: Expressão de peptídeos na
superfície de fagos ..................................... 14
2.10- Síntese de peptídeos em membrana de celulose. Método
de Spot- Síntese ........................................ 15
3- OBJETIVOS ............................................ 17
3.1- Objetivo geral ..................................... 17
3.2- Objetivos específicos .............................. 17
4- MATERIAL E MÉTODOS ................................... 18
4.1- Amostras de soros .................................. 18
4.2- Parasitas e extrato solúvel de Leishmania chagasi .. 18
4.3- ELISA dos soros de cães positivos e negativos ...... 19
4.4- Extração e purificação de imunoglobulinas anti-
L.chagasi e normais para seleção de fagos específicos no
biopanning ...............................................19
4.5- Teste de ELISA para verificação da reatividade das IgGs
purificadas ............................................. 20
4.6- Técnica de Phage Display ........................... 21
4.6.1- Seleção de peptídeos expressos na superfície dos
fagos (Biopanning) ...................................... 22
4.6.2- ELISA para testar a reatividade dos fagos nos três
ciclos de seleção ....................................... 23
4.6.3- Screening de antígenos selecionados .............. 23
4.6.4- Teste de reação cruzada dos clones positivos ..... 24
4.6.5- Subclonagem dos clones positivos ................. 24
4.7- Seqüenciamento de DNA viral ........................ 25
4.7.1- Extração do DNA .................................. 25
4.7.2- Dosagem do DNA ................................... 25
4.7.3- Sequenciamento automático capilar ................ 25
4.8- Identificação e análise de homologia dos peptídeos
selecionados ............................................ 25
4.9- Síntese química manual do peptídeo em fase sólida –
Método F-moc ............................................ 25
4.10- Purificação do peptídeo sintético ................. 27
4.11- Imunoensaios com peptídeos ligados à membrana .... 27
4.12- Ensaio de infectividade in vitro .................. 28
4.13- Preparação de lipossomos para imunização de
camundongos ............................................. 29
4.14- Imunizações de camundongos com lipossomos ......... 30
4.15- Elisa para verificação de anticorpos após ciclo de
imunização .............................................. 31
4.16- Infecção desafio .................................. 31
4.17- Análise da carga parasitária após infecção desafio 31
4.17.1- Extração de DNA do baço ......................... 31
4.17.2- Real time PCR ................................... 32
4.18- Análises pós vacinais ............................. 32
4.18.1- Isolamento e cultura dos esplenócitos ........... 32
4.18.2- Dosagem de citocinas ............................ 33
5- RESULTADOS ........................................... 34
5.1- Teste de ELISA do tipo Indireto para Leishmaniose
Canina .................................................. 34
5.2- Reatividade das imunoglobulinas purificadas frente ao
antígeno de L.chagasi ................................... 35
5.3- Reatividade dos fagos após três ciclos de seleção .. 36
5.4- Seleção dos fagos de interesse (Screening).......... 37
5.5- Especificidade dos clones positivos frente a IgGs
normais ................................................. 38
5.6- Especificidade dos clones positivos frente a IgGs de
cão anti-Trypanosoma cruzi .............................. 39
5.7- Purificação do peptídeo ............................ 41
5.8- Espectrometria de massa ............................ 42
5.9- Imunoensaios com peptídeos ligados à membrana ...... 42
5.10- Análise de infectividade in vitro ................. 43
5.11- ELISA para verificar a reatividade de anticorpos após
imunização .............................................. 44
5.12- Análise da carga parasitária ...................... 45
5.13- Avaliação da produção de citocinas por ELISA ...... 46
6- DISCUSSÃO ............................................ 48
7- CONCLUSÕES ........................................... 53
8- PERSPECTIVAS ......................................... 54
9- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................... 55
LISTA DE ABREVIATURAS
BCIP- 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate
BSA- Bovine Serum Albumine
CBS- Citrate Buffer Sodium
CO
2
-
Dióxido de Carbono
Con A- Concavalina A
DIPC- Diisopropilcabodiimida
DMF- Dimetilformamida
DNA- Ácido Desoxiribonucleico
ELISA- Reação de Imunoadsorção por Ligação Enzimática
Fmoc- Fluorenil Metil Oxicarbonila
g- Grama
HOBt- Hidroxibenzotriazol
HPLC- High Performance Liquid Chromatography
H
2
O
2
-
Peróxido de hidrogênio
ICB- Instituto de Ciências Biológicas
IFN-γ- Interferon gama
IgA- Imunoglobulina A
IgG- Imunoglobulina G
IgG1- Imunoglobulina G1
IgM- Imunoglobulina M
IL-2- Interleucina 2
IL-12- Interleucina 12
IL-4- Interleucina 4
IL-5- Interleucina 5
IL-6-Interleucina 6
IL-10- Interleucina 10
IL-12R- Receptor de Interleucina 12
iNOS- óxido nítrico sintase induzível
KH
2
PO
4-
Fosfato de Potássio Monobásico
KCl- Cloreto de potássio
KDa- Kilodaltons
L- Litro
LPG- Lipofosfoglicano
LT- Linfócito T
LV- Leishmaniose Visceral
LVC- Leishmaniose Visceral Canina
M- Molar
Meio LB- Meio Luria Bertani
Meio RPMI-
mg- Miligrama
mg/mL- Miligrama por mililitro
MTT- 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
mL- Mililitro
mM- Milimolar
N- Normal
NO- Óxido Nítrico
nm- Nanômetro
ng- Nanograma
NaCl- Cloreto de sódio
Na
2
HPO
4-
Difosfato de sódio
NaHCO
3-
Carbonato de sódio
OPD- o-fenilendiamina
PBS- Salina tamponada com fosfato
PCR- Reação em Cadeia da Polimerase
PEG- Polietilenoglicol
pH- Potencial hidrogênionico
RIFI- Reação de Imunofluorescência Indireta
RPM- Rotações por minuto
TBS- Salina Tamponada com Tris
TFA- Ácido trifluoracético
TGF-β - Fator de transformação do crescimento beta
Th0- T auxiliar 0
Th1- T auxiliar 1
Th2- T auxiliar 2
TNF-α- Fator de necrose tumoral alfa
SFB- Soro Fetal Bovino
SDS- Sodium Dodecyl Sulfate
UFMG- Universidade Federal de Minas Gerais
v/v - volume por volume
g- Micrograma
g/mL- Micrograma por Mililitro
L- Microlitro
M- Micromolar
WHO- Organização Mundial de Saúde
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema da lâmina no ensaio de proteção in vitro............................................... 29
Figura 2. Esquema de imunização com peptídeos e lipossomos ou extrato solúvel de L.
chagasi ......................................................................................................................................... 30
Figura 3. Reatividade dos soros de cães frente ao antígeno de Leishmania chagasi ................. 34
Figura 4. Reatividade das imunoglobulinas purificadas ............................................................. 35
Figura 5. Reatividade dos fagos após Pannings 1, 2 e 3 .............................................................. 36
Figura 6. Reatividade dos fagos após o terceiro ciclo de seleção frente a Igs purificadas .......... 37
Figura 7. Reatividade dos clones positivos frente a IgG normal de cão ...................................... 39
Figura 8. Reatividade dos clones selecionados frente a IgG de cão anti T. cruzi ...................... 40
Figura 9. Perfil de eluição do peptídeo sintético em coluna de fase reversa C18 em sistema de
HPLC .................................................................................................................................... 41
Figura 10. Análise por espectrometria de massa do pico purificado com massa estimada de 1886
Da (Dalton) .................................................................................................................................... 42
Figura 11. Análise da reatividade dos peptídeos sobre a membrana com pool de soros positivo e
negativo ......................................................................................................................................... 43
Figura 12. Ensaio de infectividade in vitro.............................................................................. 44
Figura 13. Reatividade dos soros de camundongos imunizados com peptídeos 12A, 11H, não
relacionado (NC) e antígeno frente a eles próprios ....................................................................... 44
Figura 14. Carga parasitária por mg de baço de animais infectados com L. chagasi................... 45
Figura 15. Produção de IFN-γ e IL-10 por cultura de esplenócitos de camundongos BALB/c
imunizados ........................................................................................................................... 46
RESUMO
Leishmania chagasi é um dos principais agentes etiológicos causadores de
Leishmaniose Visceral e apresenta ampla distribuição geográfica no Brasil. A leishmaniose
visceral é um problema de saúde pública e se não tratada pode levar à morte. Neste trabalho
foi avaliada a eficácia protetora contra a infecção por L. chagasi, induzida pela imunização de
camundongos BALB/c com peptídeos sintéticos selecionados pela técnica de Phage Display.
Os níveis de proteção também foram avaliados através da quantificação da carga parasitária,
bem como da resposta celular gerada pela imunização. Peptídeos foram selecionados com
anticorpos IgG anti extrato solúvel antigênico de L. chagasi de cães com leishmaniose
visceral. Foram achados três clones para interagir com IgG anti L. chagasi e os peptídeos
sintéticos correspondentes foram sintetizados pelo método de Spot em membrana de celulose.
Os epitopos 11H (KCPSIPGAVLCV) e 12A (ICARQDPAGNCS) que foram reconhecidos em
Spot pelas IgGs anti L. chagasi, o extrato solúvel de L. chagasi e um peptídeo não relacionado
(NC) foram encapsulados em lipossomos e usados como imunógenos. Apenas nos grupos de
camundongos imunizados com o peptídeo 12A e antígeno solúvel foi possível verificar a
indução de anticorpos. Nosso resultado referente a resposta celular não se mostraram
conclusivos, visto que não houve diferença significativa entre os diferentes grupos de
camundongos estudados. A proteção induzida contra L. chagasi pela imunização com
peptídeos sintéticos foi observada após 30 dias de infecção. Os resultados sugerem que o
grupo imunizado com o peptídeo 11H e 12A apresenta um número menor de parasitas por mg
de tecido, quando comparado aos grupos controles. Os resultados iniciais sugerem que estes
peptídeos podem se tornar candidatos a uma vacina contra a leishmaniose visceral canina
ABSTRACT
Leishmania chagasi is one of the most important etiological agents which can cause
visceral leishmaniasis and gives wide geographical distribution in Brazil. Visceral
leishmaniasis is a public health problem and is untreated can lead to death. In this work, the
protective efficacy against L. chagasi infection has been evaluated in BALB/c mice by
immunization with synthetic peptides selected by Phage Display technique. The protective
levels through parasitary charge and cellular immune response were also evaluated. Peptides
were screened with specific to soluble L. chagasi antigenic extract IgGs antibodies from dogs
suffering visceral leishmaniasis. Three clones were found to interact with anti- L. chagasi IgG
and the corresponding synthetic peptides were synthesized by the Spot method on cellulose
membrane. The 11H (KCPSIPGAVLCV) and 12A (ICARQDPAGNCS) epitopes recognized
in Spot-ELISA by anti-L. chagasi IgG, the soluble extract of L. chagasi and a non related
peptide, were encapsulated by lipossomes and used as immunogens. The humoral response
were observed only in groups immunized with 12A peptide and L. chagasi soluble extract.
Our results about cellular immune response were not concluded. The protection against L.
chagasi by immunization with synthetic peptides were found thirty days after infection. The
results detected that the groups immunized with 12A and 11H peptides showed lower levels
of parasites than control groups. The initial results showed that those peptides can be
considered to compose a vaccine against canine visceral leishmaniasis.
1
1- INTRODUÇÃO
As Leishmanioses são um complexo grupo de doenças causadas por protozoários
intracelulares do gênero Leishmania que infectam macrófagos de uma grande variedade de
mamíferos, incluindo o homem e o cão (De Luca et al., 1999; Nieto et al., 1999). Nas
Américas, pelos menos oito espécies diferentes de Leishmania são os maiores agentes
etiológicos da leishmaniose, incluindo L. chagasi e L. amazonensis, que se encontram em
largas áreas de transmissão e estão associadas com a Leishmaniose Visceral (LV) e
Tegumentar (LT), respectivamente (Grimaldi et al., 1989; Grimald & Tesh, 1993).
A gravidade da doença alcança desde lesões cutâneas simples, de cura espontânea,
até a forma visceral da doença, fatal, se não tratada. Cerca de 500 000 novos casos de
leishmaniose visceral são registrados anualmente (Nunes et al, 2008). Os cães domésticos e
selvagens são os principais reservatórios da doença (Madeira, et al, 2006).
Em meados dos anos 1980, constatou-se uma transformação nos padrões
epidemiológicos da LVA, cuja doença, antes restrita às áreas rurais do nordeste brasileiro,
avançou para outras regiões indenes alcançando a periferia de grandes centros urbanos. A
partir dos anos 1990, os Estados do Pará e Tocantins (região norte), Mato Grosso do Sul
(região centro-oeste), Minas Gerais e São Paulo (região sudeste) passaram a figurar de
maneira significativa nas estatísticas da LVA no Brasil (Ministério da Saúde, 2006).
Devido a este fato, a LV passou a ser foco de preocupação para os órgãos de Saúde Pública
(Silva et al, 2001).
Nos humanos, as manifestações clínicas decorrentes das infecções por Leishmania
são variadas e inespecíficas e incluem febre irregular de longa duração, perda de peso,
hepatoesplenomegalia, linfoadenopatia, anemia, leucopenia, epistaxe, debilidade
progressiva, dentre outros. Quando não tratada a tempo, geralmente evolui para a morte em
conseqüência do estado clínico do paciente (Alencar & Neves, 1982).
Nas Américas, pelos menos oito espécies diferentes de Leishmania são os maiores
agentes etiológicos da leishmaniose, incluindo Leishmania chagasi e L. amazonensis, que
se encontram em largas áreas de transmissão e estão associadas com a leishmaniose
visceral e tegumentar, respectivamente (Grimaldi et al., 1989; Grimald & Tesh, 1993).
2
O cão é o mais importante reservatório quando se considera a forma zoonótica da
doença (Moreno & Alvar, 2002). A importância deste hospedeiro se deve ao contato
freqüente com outros cães e humanos e também ao fato de, na maioria das vezes, não
apresentar sintomas quando infectado, apesar do alto grau de parasitismo na pele e vísceras
(Madeira, et al., 2004; Marzochi et al., 1985). Por esse motivo, o cão é responsável pela
manutenção do parasita nos focos endêmicos e, conseqüentemente, considerado um alvo
estratégico no controle da enfermidade.
A apresentação clínica da leishmaniose visceral canina é conseqüência de interações
complexas entre o parasita e a resposta imune do hospedeiro (Santos-Gomes et al, 2002).
Sendo assim, os cães apresentam sintomatologia clínica variada, que vai desde aparente
estado sadio, até grave estado terminal (Ciaramella et al, 1997). Entretanto, apesar do alto
grau de parasitismo nas vísceras, a maioria deles não apresenta sintomas (Alencar, 1959;
Marty et al, 1992; Madeira et al, 2004).
Devido ao tratamento oneroso e pouco eficaz dos cães infectados e à inexistência de
uma vacina totalmente eficaz, a eliminação de animais soropositivos tem sido utilizada
como forma de controle da doença em vários países (Madeira et al., 2006). As vacinas
caninas já registradas no Brasil apresentam algum efeito protetor contra a leishmaniose
visceral canina, mas nenhuma delas foi propriamente avaliada como medida de controle da
leishmaniose humana (Parra et al., 2007, Fernandes et al., 2008).
Em modelos murinos, após a cura da leishmaniose cutânea os animais adquirem
imunidade. Tal fato tem estimulado experimentos visando o desenvolvimento de vacinas
que possam atuar no controle da infecção (Scott et al., 1987; Guimarães et al., 1996; Reed
& Campos-Neto, 2003).
Antígenos vacinais devem, preferencialmente, ser compartilhados por diferentes
espécies do parasita e imunogênico na maior parte delas. Além disso, não devem interferir
na proteção induzida por outros antígenos, quando presentes na mesma formulação
(Beyrodt, et al, 1997).
A proteção à re-infecção alcançada, em modelos murinos e humanos, após a cura da
leishmaniose cutânea causada por L. major, tem sido a alavanca preconizada pela
Organização Mundial de Saúde para estimular o desenvolvimento de vacinas que possam
ser empregadas como uma das medidas alternativas no controle da doença (WHO, 1993).
3
Na década de 50, formas vivas do parasita L. major, introduzidas em pequeno
número e em regiões não-expostas do corpo, eram administradas a fim de que o homem
desenvolvesse a lesão cutânea e, posteriormente, apresentasse cura espontânea e proteção
contra a re-infecção. Tal técnica, denominada de Leishmanização, deixou de ser
recomendada, uma vez que um número significativo de pacientes não apresentava cura
espontânea, necessitando de tratamento médico. Com a evolução da tecnologia biomédica,
formas vivas atenuadas, extratos brutos, semipurificados ou purificados e, mais atualmente,
proteínas recombinantes e plasmídeos de DNA contendo genes de expressão de proteínas
do parasita passaram a serem utilizados na tentativa de se desenvolverem novos candidatos
à vacina contra as leishmanioses.
Vacinas de peptídeos sintéticos, que induzem imunidade por células-T, são a grande
promessa na prevenção e terapia de doenças infecciosas (Van der Burg et al., 2006) e vêm
sendo usados em protocolos de vacinação contra patógenos extracelulares e intracelulares
(Lindeberg, 1999; Harlow, et al., 1988; Thompson, et al., 1994). Peptídeos sintéticos são
fáceis de produzir em escala industrial, não possuem potencial de integração ou
recombinação genética, omitem seqüências deletérias da proteína de origem, são
quimicamente estáveis, não precisando de condições especiais de armazenamento e são
livres de contaminantes virais ou bacterianos (Jackson, et al., 2006).
Atualmente, técnicas inovadoras como Phage Display e Spot Synthesis, vêm sendo
empregadas na identificação, caracterização e produção de substâncias sintéticas, utilizadas
em estudos de proteção contra várias doenças em todo o mundo (Portefaix et al., 2002;
Hunt et al., 2006; Padoa & Crowther, 2006; Sergeeva et al., 2006; Tan et al., 2007).
A expressão de peptídeos na superfície de fagos, Phage Display, apresenta uma
nova alternativa na busca de antígenos candidatos a vacinas em diferentes doenças. Esta
técnica que consiste na expressão de inúmeros peptídeos, oriundos de bibliotecas
combinatórias de peptídeos expressos na superfície de bacteriófagos da classe M13, que
permite a seleção de alguns destes que apresentem elevada especificidade a uma molécula
alvo e, conseqüentemente, uma ligação com grande afinidade (Yu & Smith, 1996). A
utilização de imunoglobulinas (classe IgG) purificadas a partir de amostras de soros
específicas na seleção dos peptídeos é uma estratégia atrativa que pode ser aplicada em
4
diversas doenças, a fim de se identificar seqüências de aminoácidos específicas aos
anticorpos presentes em tais amostras.
A principal vantagem desta técnica é a ligação direta que existe entre o fenótipo e o
genótipo do fago e a possibilidade de crescimento da avidez entre a molécula alvo e o
ligante. Assim, e possível selecionar epitopos e mimotopos com potencial para serem
usados como antígenos vacinais, utilizando-se, neste caso, soros de cães comprovadamente
infectados com L. chagasi como fonte de seleção para os fagos de interesse.
A técnica de Spot Synthesis, por sua vez, baseia-se na síntese química de peptídeos,
por meio de suas seqüências de aminoácidos identificadas pela técnica de Phage Display
(Molina et al., 1996). A síntese em grande escala dos peptídeos, por meio de spots é
realizada em um curto período de tempo, utilizando-se apenas pequena quantidade de
materiais de consumo e com um rendimento e pureza de produto extremamente elevado,
principalmente quando comparado aos sistemas convencionais de purificação utilizados na
obtenção de proteínas recombinantes.
As técnicas de Phage Display e Spot Synthesis utilizadas neste trabalho são menos
onerosas em relação às empregadas para a produção de proteínas recombinantes,
apresentam maiores rendimentos finais, são mais simples e úteis para exames em grande
escala, adequando-se perfeitamente à condição atual dos países em desenvolvimento que
são acometidos por inúmeras enfermidades e não apresentam uma infra-estrutura eficiente
para o combate de tais doenças (Noya et al., 2003).
5
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- O agente etiológico e morfologia do parasita:
No Brasil, o agente causador da Leishmaniose Visceral é um protozoário da ordem
Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, gênero Leishmania e da espécie Leishmania
(Leishmania) chagasi. As espécies do gênero Leishmania apresentam-se, basicamente, sob
três tipos morfológicos: amastigota, promastigota e paramastigota. As formas amastigotas
são parasitas de células do sistema fagocitário mononuclear (SMF) de vertebrados; as
demais formas são encontradas no trato digestivo do hospedeiro invertebrado.
2.2- Vetor:
São insetos denominados flebotomíneos, pertencentes à Ordem Diptera, Família
Psychodidae, Subfamília Phlebotominae, Gênero Lutzomyia, conhecidos popularmente
como mosquito-palha, tatuquira, birigui, entre outros. Apenas as fêmeas possuem hábitos
hematófagos e são capazes de transmitir o parasita ao hospedeiro vertebrado. (Grimaldi &
Tesh, 1993).
2.3- Ciclo Biológico e transmissão:
Ao picar um animal infectado pra exercer o repasto sanguíneo, o inseto ingere,
juntamente com o sangue, células do SMF, leucócitos e macrófagos parasitados com as
formas amastigotas. No tubo digestivo dos insetos, para se adequar às condições
fisiológicas existentes, estas se multiplicam e transformam-se em formas alongadas,
flageladas e móveis denominadas de promastigotas procíclicas. No esôfago e faringe, estas
sofrem uma nova transformação para a forma paramastigota. Posteriormente, ocorre um
processo denominado metaciclogênese, no qual estas formas diferenciam-se em
promastigotas extremamente ágeis, as promastigotas metacíclicas, que são as formas
infectantes.
Desta forma, o ciclo se completa quando, o inseto, ao exercer novamente o repasto
sanguíneo sobre um hospedeiro não infectado - homem ou cão - inocula as formas
promastigotas metacíclicas, que são fagocitadas por células do SMF, como macrófagos,
células dendríticas e células de Langerhans, onde são formados os fagolisossomos, que se
6
fundem a lisossomos, formando os fagolisossomos. Para adaptação às novas condições
fisiológicas intracelulares existentes, há a diferenciação das formas promastigotas em
amastigotas. Essas formas aflageladas, parasitas intracelulares obrigatórios, são
responsáveis pelo desenvolvimento da doença no hospedeiro. Um novo vetor, não
infectado, poderá ingerir células fagocíticas parasitadas após picar o hospedeiro vertebrado,
completando-se, assim, o ciclo biológico do parasita.
2.4- Epidemiologia:
A Leishmaniose Visceral apresenta amplo espectro epidemiológico no mundo,
ocorrendo em vastas áreas tropicais e subtropicais do globo. Está amplamente distribuída
nas Américas, desde a Argentina até aos Estados Unidos (Grimaldi, et al., 1989). É
considerada endêmica em 87 países (21 no Novo Mundo e 66 no Velho Mundo), com cerca
de 90% de casos notificados em países subdesenvolvidos como Brasil, Bangladesh, Índia e
Sudão (Monteiro et al., 1994).
Acredita-se que 12 milhões de pessoas sejam clinicamente afetadas pela doença.
Segundo levantamentos da Organização Mundial de Saúde, cerca de 1,5 a 2 milhões de
novos casos surgem a cada ano, dos quais 1 a 1,5 milhão correspondem a casos de
leishmaniose tegumentar e cerca de 500.000 a casos de leishmaniose visceral. Por esses
motivos, a OMS classificou as leishmanioses como uma das seis principais doenças
tropicais que afetam países em desenvolvimento (WHO, 1993; Desjeux, 1996).
No Brasil, a leishmaniose visceral é considerada uma zoonose e há uma ocorrência
anual de dois a três mil casos (WHO, 1990). A doença apresenta aspectos geográficos,
climáticos e sociais diferenciados em função da sua ampla distribuição geográfica,
envolvendo as regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste (WHO, 2003).
O Brasil registra 90% de todos os casos de LV que ocorrem no continente
Americano. A região Nordeste do Brasil é a que possui o maior número de casos (70%-
90%), seguido da região Sudeste (6%), região Norte (4%) e finalmente região Centro-Oeste
(1%) (Monteiro et al., 1994).
A migração indiscriminada da população rural para o meio urbano, acompanhada de
animais domésticos como cães e gatos que podem se portar como reservatórios do parasita,
tem contribuído para o aumento do número de casos em áreas urbanizadas e em grandes
7
cidades brasileiras como Campo Grande, Natal e Belo Horizonte, entre outras (Cunha et al.,
1995; Jeronimo et al., 2004; Laison & Rangel, 2005; Oliveira et al., 2006).
Belo Horizonte é considerada, atualmente, zona endêmica de LV (Alves &
Bevilacqua, 2004) e convive, desde 1993, com uma epidemia desta doença. Nos últimos
anos, o número casos humanos e caninos tem crescido, indicando um aumento na
transmissão e também, a relevância do cão na prevalência desta doença (Silva, et al., 2001).
Devido a este fato, a LV assumiu importante papel na saúde pública (Marzochi et al.,
1994).
2.5- Patogenia da Leishmaniose Visceral Canina (LVC)
Na LVC, assim como em todas as doenças parasitárias, fatores específicos
dependentes do hospedeiro e do parasita determinam o desenvolvimento dos mecanismos
patogênicos da doença e das lesões. A apresentação clínica da doença, ou seja, a capacidade
do animal desenvolver ou não a doença, é conseqüência de interações complexas entre o
parasita e a resposta imune do hospedeiro (Santos-Gomes et al., 2002), o que faz com que
os cães apresentem sintomatologia clínica variada, que vai desde aparente estado sadio, até
grave estado terminal (Ciaramella et al, 1997). Entretanto, a maioria deles é assintomática
(Marty et al, 1992)
Diante da grande variação de sintomas clínicos, Mancianti et al. (1998) propuseram
que os cães portadores da infecção fossem classificados em:
• Assintomáticos: cães aparentemente saudáveis, sem sintomas ou sinais clínicos;
• Oligossintomáticos: cães que apresentam perda de peso moderada, lesões de pele discretas
e linfoadenomegalia;
• Sintomáticos: cães que apresentam vários sintomas graves da doença, como dermatopatias
(perda de pêlos, dermatite furfurácea e úlceras), onicogrifose, ceratoconjuntivite e rigidez
dos membros posteriores.
Ainda segundo os autores, cerca de 60% da população canina infectada não
apresenta sintomas evidentes, sendo o restante, em sua maioria, casos pré-patentes, cuja
infecção pode ou não evoluir para a fase patente.
Após a inoculação dos parasitas pelos flebotomíneos na pele de cães susceptíveis, a
maioria é eliminada por fatores do complemento, enquanto outros sobrevivem usando
8
diferentes estratégias (Mosser & Rosenthal, 1993; Peters et al., 1995; Dominguez &
Toraño, 1999). No segundo caso, em alguns animais há o desenvolvimento de resposta
imune adequada específica e controle da infecção, enquanto que em outros há disseminação
dos parasitas da pele para os linfonodos, o baço e medula óssea e destes órgãos, para todo o
organismo (Ferrer, 2002). O período de incubação da doença é extremamente variável,
podendo ser de alguns meses até anos (Marzochi et al., 1985; Ferrer et al., 1995; Nelson et
al., 2001).
Dentre os sintomas da LV canina, as alterações dermatológicas são as mais comuns
(Ciaramella et al., 1997; Ayali & Baneth, 2001; Reis, 2001; Ferrer, 2002; Lima et al., 2003;
Amusategui et al., 2003; Solano-Galego et al., 2004). O pêlo torna-se opaco e surge
alopecia, que em conjunto com a onicogrifose e edema das patas, são os sinais clínicos
mais evidentes. Alguns animais doentes também podem apresentar outros sintomas como
febre, coriza, apatia, diarréia, hemorragia intestinal, perda de peso, hiperceratose,
despigmentação, ulcerações cutâneas particularmente no focinho, nas orelhas e na ponta da
cauda, ceratoconjuntivite e uveíte. (Cunha, 1938; Deane & Deane, 1955
b
; Alencar, 1959;
Genaro et al., 1988). Alguns ainda podem desenvolver uma lesão específica no local da
inoculação das formas promastigotas, o chamado cancro de inoculação.
Após as alterações cutâneas, o sintoma clínico mais comumente descrito na LVC é a
linfoadenomegalia, seja local ou generalizada (Ayali & Baneth, 2001; Reis, 2001; Ferrer,
2002; Lima et al., 2003; Amusategui et al., 2003; Solano-Galego et al., 2004). A
onicogrifose é um sinal marcante da doença canina, sendo observada em cerca de 25% dos
cães com LV (Ciaramella et al., 1997). Alguns autores atribuem a onicogrifose à ação do
parasita na matriz ungueal (Lestoquard & Donatien, 1938, citado por Genaro, 1993) e
outros à ausência do desgaste natural das unhas devido à apatia do cão nos estágios mais
avançados da doença (Marzochi et al., 1985).
Em casos mais graves de envolvimento visceral generalizado, geralmente observa-
se atrofia muscular com paresia das patas posteriores e/ou perda de peso que geralmente
estão associadas à anorexia e outros sinais clínicos como depressão e poliúria (Ferrer,
1989). Nestes estágios mais avançados da doença, é possível observar, ainda, um quadro de
disfunção renal relacionado às elevadas concentrações de imunocomplexos circulantes de
IgM e IgA e à deposição destes nos glomérulos (Margarito et al., 1998; Mancianti et al.,
9
1989). A resistência do hospedeiro está associada com a ativação seletiva e diferenciação
da células efetoras T helper (TH) CD4+ do tipo TH1, que secretam um padrão de citocinas
específicas, entre elas, IL-2 e IFN-γ (Grimaldi & Tesh, 1993). Os animais infectados
apresentam uma diminuição no nível de células TCD4+ em comparação a cães normais
(Moreno & Alvar, 2002).
A presença das formas amastigotas nos órgãos provoca resposta inflamatória,
inicialmente com predominância de neutrófilos e eosinófilos, que são seguidos por um
grande número de macrófagos. Os linfócitos são observados posteriormente, com a
progressão da doença, a inflamação se torna tipicamente granulomatosa (Ferrer, 2002).
Ocasionalmente, a amiloidose grave pode ser encontrada no baço, fígado e rins de cães
acometidos.
Diversas são as alterações bioquímicas e hematológicas já relatadas em cães
naturalmente ou experimentalmente infectados, dentre elas, podemos citar: anemia
normocítica normocrômica, elevação das proteínas totais do soro, diminuição de ferro,
aumento de fibrinogênio plasmático e ceruloplasmina. As alterações bioquímicas estão
relacionadas ao aumento da resposta humoral policlonal, que origina disproteinemia,
traduzida por um aumento das proteínas séricas totais com hiperglobulinemia e
hipoalbuminemia (Genaro, 1993; Cardoso & Cabral, 1998).
2.6- Diagnóstico e controle da LVC
O diagnóstico inicial da leishmaniose é realizado pela avaliação de parâmetros
clínicos e epidemiológicos, porém, para um diagnóstico definitivo, há a necessidade de
exames que comprovem a presença do parasita. A especificidade e sensibilidade dos
métodos dependem do tipo de antígeno utilizado, do tempo de infecção, da carga
parasitária, e da resposta imune do hospedeiro. Há um grande número de testes com
resultados falso-positivos e falso-negativos. Por esse motivo, os exames complementares
são de fundamental importância no diagnóstico definitivo da doença (Ciaramella et al.,
1997; Ferrer et al., 1997 ; Koutinas et al., 1999 e Blavier et al., 2001).
O aspirado de medula óssea e linfonodos é o método diagnóstico mais empregado,
pois o encontro de uma só amastigota em esfregaços já é suficiente para determinar a
positividade do exame (Tavares, Fernandes & Melo, 2003). A principal desvantagem deste
10
método, além do desconforto causado ao animal, é a sensibilidade de apenas 50% nos
aspirados de medula óssea e menos de 30% naqueles de linfonodos (Ferrer, 1997). O nível
de infecção no tecido recolhido também é importante, sendo que um diagnóstico mais difícil
ocorre em casos onde a carga parasitária é menor (Ashford et al., 1995).
O exame parasitológico é o método confirmativo para o diagnóstico da leishmaniose
visceral. Por meio dele, faz-se a detecção do parasita Leishmania a partir de biópsias de
tecidos com lesão ou aspirados de líquidos corporais.
O teste de cultura in vitro, com a posterior identificação microscópica das formas
amastigotas do parasita a partir da confecção de esfregaços de aspirados da medula óssea ou
de linfonodos, é bem utilizado pelos veterinários no diagnóstico da doença (Ferreira et al.,
2003). O teste é rápido e apresenta elevada especificidade, entretanto, possui baixa
sensibilidade, alcançando cerca de 60% em aspirados de medula óssea e 30% nos
linfonodos (Ferrer et al., 1997; Tavares et al., 2003). Em muitos casos faz-se uso de
anestésicos acarretando maior trabalho e maiores custos financeiros. Além disso, a
identificação dos parasitas em esfregaços depende de treino, experiência e habilidade do
examinador (Ayali & Baneth, 2001).
Historicamente, testes sorológicos utilizados no diagnóstico laboratorial da
leishmaniose visceral (ELISA e RIFI) baseiam-se na detecção de anticorpos específicos ao
parasita nas amostras de soro de cães suspeitos de portarem a doença. Tais exames são
baseados na utilização de extratos de proteínas dos parasitas, antígenos semipurificados ou
purificados, apresentados sob a forma de proteínas recombinantes (Grimaldi & Tesh, 1993;
Carvalho et al., 2002; Alvar et al., 2004).
Como os testes sorológicos atualmente empregados apresentam baixa
especificidade, animais vacinados e que desenvolvem sorologia positiva frente aos
antígenos do parasita, por meio da influência da vacina em seu sistema imunológico, são
sacrificados pelos Órgãos de Saúde competentes. Somam-se a este grupo, muitos cães que
apresentam resultados falso-positivos nas triagens sorológicas, que acabam sendo
sacrificados sem a necessidade, apenas como uma medida de controle da infecção. Além
disso, uma porcentagem elevada de cães saudáveis, porém, residentes em áreas endêmicas
de leishmanioses, podem apresentar sorologia positiva em testes sorológicos comumente
empregados.
11
Recentemente, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem se apresentado como
um método rápido e altamente sensível para o diagnóstico de LVC e tem se mostrado útil
também no acompanhamento de cães doentes (Ferrer, 1997), pois é um método com alta
sensibilidade e especificidade (Fisa, et al., 2001). Essa técnica também parece capaz de
distinguir infecção passada de recente (Blackwell, 1992).
Segundo estudos realizados por Quinnell et al. (2001), comparando o desempenho
do ELISA, exame microscópico, cultura e PCR em biópsias de medula óssea, foi
demonstrado que, nas amostras positivas para demonstração do parasita, o PCR apresentou
sensibilidade de 98%, sendo mais alta (78-88%) no início da infecção. O ELISA também
apresentou resultados que variaram de acordo com o tempo de infecção: 41% no início e
93-100% mais tarde. Com base nestes resultados, foi concluído que o PCR teve mais
utilidade na detecção da doença ativa e que o ELISA é mais sensível para detecção da
infecção em todos os cães.
O controle da leishmaniose visceral canina baseia-se na detecção dos animais
infectados, seguido do seu sacrifício e no combate ao vetor transmissor. Tal controle,
entretanto, é uma tarefa difícil devido à grande variedade de espécies do parasita, além
disso, a leishmaniose apresenta-se como uma doença zoonótica que é mantida, em sua
grande maioria, em ciclos naturais envolvendo vetores e reservatórios silvestres. Há
também, a capacidade de adaptação do parasita que, mesmo na ausência de seu reservatório
natural, pode sobreviver em outros hospedeiros presentes em seu habitat (Desjeux, 1992;
Kamhawi, 2000).
Um outro fator que contribui para difícil o controle da doença é a ausência de uma
vacina confiável e efetiva para preveni-la (Fujiwara et al., 2005). A proteção à re-infecção
alcançada, em modelos murinos e humanos, após a cura da leishmaniose cutânea causada
por L. major, tem sido a alavanca preconizada pela Organização Mundial de Saúde para
estimular o desenvolvimento de vacinas que possam ser empregadas como uma das
medidas alternativas no controle da doença (WHO, 1993).
2.7- Resposta imune na leishmaniose murina
Camundongos vêm sendo utilizados na tentativa de se identificar os fatores
responsáveis pelos fenótipos de resistência e susceptibilidade à infecção pelo parasita
12
Leishmania (Launois et al., 1996). Na modulação da resposta imune murina, o macrófago
apresenta antígenos aos linfócitos T, que produzem e secretam citocinas que, por sua vez,
induzem diferentes funções efetoras.
A resposta imune na LV é complexa e se difere significativamente dependendo do
antígeno e local de infecção (Kaye et al., 2004; Stanley & Engwerda, 2007).
A utilização do modelo murino permitiu a identificação de subtipos de LT que
produzem e secretam citocinas que induzem diferentes funções efetoras. Os macrófagos são
as principais células parasitadas por Leishmania. A capacidade destas células de destruir
parasitas intracelulares é o principal mecanismo envolvido no controle da infecção.
Espécies reativas de oxigênio, nitrogênio e óxido nítrico (NO), são os principais
responsáveis pela atividade microbicida dos macrófagos. O NO é produzido nos
macrófagos a partir da L-arginina, em uma reação catalisada pela enzima iNOS. Citocinas
como IFN-ɣ e TNF-α estimulam a expressão da iNOS; a IL-4, IL-10 e TGF-β, por sua vez,
inibem a sua expressão, tornando a célula refratária à atividade parasiticida (Van der Veen,
2000; Brunet, 2001).
Estudos em modelos murinos demonstraram que a imunidade protetora na LV é
mediada por células T e citocinas (Sheppard et al., 1983; Scott et al., 1989; Liew et al.,
1990).
A resistência do hospedeiro está associada à ativação seletiva e diferenciação de
células efetoras T helper CD4+ (Th1) que secretam um padrão de citocinas especificas,
como IL-2, INF-γ, IL-12 e o TNF-α, dentre outras. Por outro lado, a susceptibilidade à
infecção está relacionada à resposta de células CD4+ (Th2) que secretam citocinas
especificas como IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, dentre outras (Sher & Coffman, 1992; Launois et
al., 2002; Peters & Sacks, 2006).
O perfil de citocinas encontrado após a infecção por Leishmania é fundamental para
o desenvolvimento de uma resposta imune benéfica ou prejudicial ao hospedeiro. O
tratamento de camundongos BALB/c susceptíveis à L. (L). major, por exemplo, com a IL-
12 ou com anticorpo monoclonal anti IL-4, logo após a infecção desafio, induz a uma
resposta imune protetora, associada com a produção de citocinas do tipo Th1. A utilização
de anticorpo monoclonal anti IL-12 após o desafio, por sua vez, induz a doença em
13
linhagens de camundongos geneticamente resistentes a este parasita, como C57BL/6
(Launois et al., 2002).
2.8- Vacinas e Leishmaniose Visceral Canina
Devido ao difícil controle da LV, vários trabalhos têm sido conduzidos visando o
desenvolvimento de agentes profiláticos capazes de induzir imunidade protetora contra a
doença (Kaur et al., 2008). Segundo Ravindran et al. (2010), o desenvolvimento de uma
vacina eficaz contra LV é medida essencial para seu controle.
As estratégias empregadas pelas formas amastigotas de Leishmania para evasão dos
mecanismos de defesa do hospedeiro mamífero são pouco conhecidas (Hall & Joiner,
1991). Alguns trabalhos sugerem uma interiorização dos antígenos de membrana para o
citoplasma após as promastigotas metacíclicas serem inoculadas pelo vetor no hospedeiro
(Alexander et al., 1999). Outros sugerem que antígenos de virulência do parasita seriam os
responsáveis pela evasão das defesas do hospedeiro, permitindo, desta forma, sua
sobrevivência e possibilitando a ocorrência da doença (Shapira & Pinelli, 1989; Chang et
al., 2003).
O desenvolvimento de vacinas contra leishmaniose é uma das metas da Organização
Mundial de Saúde (WHO, 2000); dessa forma, pesquisas vêm sendo conduzidas no intuito
de se identificar, isolar, caracterizar e purificar antígenos importantes do parasita para
posterior utilização em protocolos de vacinação contra Leishmania (Button & McMaster,
1988; Fernandes et al., 1997; Sjolander et al., 1998; Stager et al., 2000; Rafati et al., 2001;
Fragaki et al., 2001; Oliveira da Silva et al., 2001).
Vários laboratórios tem se dedicado ao desenvolvimento de uma vacina constituída
de parasitas mortos. Apesar de alguns resultados promissores alcançados contra a
leishmaniose cutânea em humanos, esses não são facilmente reproduzíveis (Mayrink, et al.,
1996; Armijos et al., 1998; Marzochi et al., 1998).
Uma das principais razões pelas quais ainda não se tenha desenvolvido uma vacina
mais eficiente, é o fato de que, principalmente nas regiões tropicais, a doença é causada por
várias espécies do parasita, cada qual com sua própria história natural, seus determinantes
de virulência e patogenicidade (Grimaldi & Tesh, 1993). Neste contexto, um antígeno
vacinal deve, preferencialmente, ser compartilhado por diferentes espécies do parasita e ser
14
imunogênico na maior parte delas, além de não interferir na imunogenicidade induzida por
outros antígenos (Beyrodt et al., 1997).
Segundo Kaur et al. (2008), um candidato em potencial para uma vacina contra
leishmaniose visceral, deverá favorecer o desenvolvimento de uma resposta imune do tipo
Th1 CD4+, mas esta resposta também é dependente da dose do antígeno e da via de
inoculação. A carga parasitária se mostrou menor em camundongos inoculados com
promastigotas por via subcutânea, seguido da via intradérmica, intraperitoneal e
intracardíaca.
De acordo com Ravindran et al. (2010), a imunidade protetora na LV está ligada à
estimulação de uma resposta celular relacionada aos linfócitos Th1 e Th2. Além disso, o
autor destaca a importância do adjuvante na eficácia e duração da resposta e afirma que
vacinas lipossomais são muito eficazes na proteção contra LV em camundongos BALB/c.
Estudos anteriores já demonstraram que adjuvantes como Corynebacterium parvum e
lipossomos são utilizados com eficácia para um aumento da resposta imune à antígenos
leishmaniais e indução de proteção contra LV (Afrin & Ali, 1997).
É necessário conduzir mais estudos na LVC no intuito de identificar os mecanismos
de resistência ou susceptibilidade à infecção por Leishmania nesta espécie (Pinelli et al.,
1994).
2.9- A técnica de Phage Display: Expressão de peptídeos na superfície de fagos
Phage Display (Smith, 1985) é uma técnica de seleção in vitro na qual uma proteína
ou peptídeo é geneticamente fundido a proteínas de superfície de um bacteriófago
filamentoso da classe M13, resultando na expressão de uma proteína heteróloga na
superfície do capsídeo viral. A inserção de seqüências de nucleotídeos nos fagos é feita em
uma região pré-determinada do genoma viral e permite a construção de uma biblioteca
conformacional. Esta biblioteca possui uma população de ligantes em potencial. Cada
membro da biblioteca apresenta uma forma distinta de peptídeo e, portanto, diferentes
capacidades de interação deste com a molécula alvo. Fagos que apresentam em sua
superfície peptídeos com especificidade de ligação desejada, podem ser selecionados da
biblioteca através da ligação com uma molécula imobilizada e a seqüência do peptídeo
selecionado pode ser deduzida da seqüência do DNA encapsulado (Scott & Smith, 1990).
15
Esta técnica possibilita a expressão de um grande número (maior que 10
11
) de
peptídeos ou proteínas na superfície de fagos (Sidhu et al., 2000). Quanto maior for o
número de formas representadas na biblioteca, mais facilmente será encontrado um ligante
afim (Posner et al., 1994).
A partícula viral do bacteriófago M13 é composta por cinco proteínas estruturais
denominadas P3, P6, P7, P8, P9. No fago selvagem encontram-se cerca de 2800 cópias da
proteína oito. Nas extremidades do capsídeo encontram-se de 3 a 5 cópias das demais
proteínas estruturais. A P7 E P9 encontram-se na extremidade distal enquanto que a P3 e P6
estão na proximal. A incorporação de proteínas exógenas na superfície dos fagos é feita
pela fusão destas às proteínas estruturais. As duas principais proteínas utilizadas para este
fim são a P8 e P3. A P3 é necessária para o reconhecimento e infecção da célula e é a
principal proteína estrutural para a apresentação de proteínas exógenas. A P8 é responsável
por 99% da massa de proteína do fago.
Quando comparadas a outras bibliotecas de expressão, os sistemas utilizando fagos
filamentosos apresentam vantagens. Uma delas é que fagos filamentosos não lisam as
células infectadas, o que possibilita a separação de partículas virais do conteúdo
intracelular, eliminando-se muito da reatividade cruzada com proteínas celulares.
Uma outra vantagem desta estratégia é a seleção de epitopos descontínuos,
significando ser possível selecionar um mimotopo (Geysen et al., 1986). A utilização de
amostras de soros na seleção de peptídeos é uma estratégia atrativa que pode ser aplicada
para várias doenças na tentativa de se identificar seqüências específicas que se liguem a
anticorpos presentes nestas amostras (Manoutcharian, et al., 1999).
2.10- Síntese de peptídeos em membrana de celulose. Método de Spot- Síntese
A síntese de peptídeos sobre membrana de celulose permite a síntese rápida e
eficiente de um grande número de peptídeos em delimitações pontuais por volume de
deposição de cada resíduo de aminoácido.
Os aminoácidos são depositados em volume mínimo (0,6 uL) com auxílio de um
micropipetador automático, permitindo obter aproximadamente 50 nanomols de peptídeo
por ponto. A síntese múltipla foi realizada em sintetizador Abimed Spot Synthesis–
ASP222, (Langenfeld, Alemanha) e o plano de distribuição dos aminoácidos, bem como a
16
determinação dos protocolos dos diversos peptídeos, foram definidos em programa de
computação Multipeps (Molina et al., 1996).
Os grupamentos hidroxilas livres sobre as membranas de celulose são utilizados
como pontos de ancoragem para a síntese do peptídeo. Esses grupamentos são conjugados
através de ligação estável com 8 a 10 unidades de polietileno-glicol (PEG), com o objetivo
de afastar o peptídeo do suporte e conferir maior estabilidade na ligação do peptídeo à
membrana.
A síntese do peptídeo inicia-se sempre pelo resíduo C-terminal da seqüência
determinada. Com a desproteção do grupo ligado ao Fmoc pela adição de piperidina (20%
em DMF), as funções aminas são recuperadas e podem ser visualizadas pela coloração azul
com bromofenol. Os aminoácidos são em seguida ativados por DIPC/HOBT (150 l cada
aminoácido) e depositados para reinicio de outro ciclo. As reações de ligação são seguidas
por mudança de coloração dos Spots, passando da cor azul ao verde-amarelado.
As funções NH
2
livres ou que não reagiram, são acetiladas (anidrido acético 10% em
DMF) para evitar a formação de peptídeos errados ou outras ligações indesejáveis. O grupo
protetor Fmoc do próximo aminoácido é novamente eliminado em meio básico pela
piperidina e verificado a ligação pela coloração com bromofenol. Efetuam-se lavagens da
membrana com metanol, e após secagem ao ar fresco, esta membrana é posicionada no
sintetizador para outro ciclo.
Pelo método de Spot, o tamanho do peptídeo sintetizado é limitado a 15-20
aminoácido (Laune et al., 2002), pois há duvidas quanto a qualidade de ligação de peptídeos
muito alongados ou grandes. Ao final da síntese, os grupos laterais dos aminoácidos são
desprotegidos pela adição de ácido trifluoracético-TFA associado a diclorometano e
trietilsilano e assim os peptídeos restam fixados de maneira covalente sobre a membrana.
17
3- OBJETIVOS
3.1- OBJETIVO GERAL
Utilizar tecnologia peptídica (Phage Display e Spot Synthesis) para selecionar peptídeos
capazes de induzir imunoproteção contra infecção experimental em camundongos BALB/c
por L. chagasi.
3.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Selecionar epitopos/mimotopos utilizando anticorpos (da classe IgG) purificados a partir
de amostras de soro de cães com leishmaniose visceral ativa (LVC) e de cães saudáveis, por
meio da técnica de Phage Display.
Extrair e seqüenciar o DNA dos bacteriófagos que expressem os peptídeos que
demonstraram reatividade frente aos anticorpos anti- LVC .
Sintetizar quimicamente, em membranas de celulose e na sua forma solúvel, os peptídeos
identificados.
Avaliar o perfil da resposta celular em camundongos BALB/c gerada pela imunização
com peptídeos selecionados por Phage Display.
Avaliar a influência do peptídeo 12A na proteção contra L. chagasi através de ensaio in
vitro utilizando macrófagos de camundongos imunizados com peptídeos e antígeno solúvel
do parasita.
Avaliar, através da quantificação da carga parasitária, o grau de proteção nos animais
imunizados com os peptídeos sintéticos.
18
4- MATERIAIS E MÉTODOS
4.1- Amostras de soros
Trinta e oito (38) soros de cães de várias raças, naturalmente infectados por L.
chagasi, com resultados positivos por ELISA, RIFI e punção medular para leishmaniose
foram utilizados neste trabalho. Amostras de soros de dezesseis (16) cães saudáveis,
comprovadamente negativos (ELISA, RIFI), foram usadas como controles. Os soros foram
obtidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Minas Gerais e o uso destes
aprovado pelo comitê de ética para pesquisa clínica desta universidade. Quatro soros (4) de
cães infectados com Trypanossoma cruzi (doença de Chagas) também foram utilizados
como controles. Todos os soros foram armazenados a -80
o
C até posterior uso.
4.2- Parasitas e extrato solúvel de Leishmania chagasi
As cepas MHOM/BR/1972/BH46 de L. chagasi e o extrato solúvel protéico
(antígeno) utilizados neste trabalho foram gentilmente cedidos pelo Prof. Ricardo Toshio
Fujiwara, do Departamento de Parasitologia (ICB/UFMG).
Os parasitas foram cultivados em meio LIT suplementado com 10% de soro fetal
bovino inativado (Sigma, EUA), em estufa de oxigênio à temperatura de 23
o
C ± 1
o
C.
Repiques foram efetuados até que os parasitas se encontrassem em fase logarítmica de
crescimento.
Os antígenos solúveis de L. chagasi foram obtidos a partir do cultivo de massa de
promastigotas em meio LIT. A massa final de parasitos foi inicialmente submetida a três
ciclos de congelamento e descongelamento e posteriormente sonicada por ultrassom
(Sonifier Cell Disruptor
®
- Brason Sonic Power Co. – EUA) durante 1 minuto a 40 Watts,
em banho de gelo. A sonicação foi repetida por sete vezes, com intervalo de 1 minuto entre
as sonicações. Em seguida, o material sonicado foi centrifugado a 3000 g por 1 hora e 30
minutos a 4°C, o sobrenadante coletado e transferido para tubos cônicos de diálise
(Centricon 5 kDa, Millipore, EUA) e então submetido à centrifugação a 3000 g por 30
minutos. Por fim, o material remanescente foi filtrado em filtros estéreis descartáveis, de
0,22 m, em condições de fluxo laminar. A concentração de proteínas foi determinada pelo
método de Bradford. As amostras foram armazenadas em alíquotas a -20
0
C até o momento
do uso.
19
4.3- ELISA dos soros de cães positivos e negativos
Para confirmar a presença ou ausência de anticorpos antiantígeno de Leishmania
chagasi nos 38 soros positivos e nos 19 soros negativos de cães, foi realizado um ensaio de
ELISA como descrito abaixo:
• Os poços de uma microplaca de polietileno (FALCON) foram sensibilizados
durante um período que variou entre 12 e 16 horas, a 4
o
C, com 100L/poço (volume padrão)
de solução de tampão carbonato 0,02 M, pH 9,6, contendo o antígeno de L. chagasi (5
g/ml)
• A placa foi lavada com solução de lavagem (PBS com Tween a 0.05%) cinco
vezes para a retirada do antígeno que não aderiu à fase sólida.
• O bloqueio dos sítios livres foi feito com 100L de solução de bloqueio (caseína
2% em PBS 0,05M, pH 7.4) a 37
o
C durante 1 h.
• A placa foi lavada cinco vezes com solução de lavagem e em seguida realizada a
reação com soros de cães positivos (38) e negativos (16) diluídos 1:500 em tampão de
incubação (caseína 0.25% em PBS 0.05M, pH 7.4 e 0.05% Tween 20), a 37
o
C durante 1h.
• Por inversão, retirou-se todo o soro dos poços que foram lavados seis vezes com
solução de lavagem. Foram adicionados 100L de tampão de incubação com anticorpo anti-
Ig normal de cão conjugado a peroxidase diluído (1:1000), a 37
o
C durante 1h.
• As cavidades foram lavadas seis vezes com solução de lavagem. A atividade
enzimática foi revelada através da adição de 100L de solução reveladora (2mg de OPD e
2L de peróxido de hidrogênio para 10 mL de tampão citrato (0,05 M pH 5,0).
• A placa foi incubada por 15 minutos a temperatura ambiente ao abrigo da luz. A
interrupção da reação foi feita com 20L de solução de ácido sulfúrico (1:20) e a leitura
espectrofotométrica feita a 492 nm (SpectraMax 340)
4.4- Extração e purificação de imunoglobulinas anti-L.chagasi e normais para seleção
de fagos específicos no biopanning
A extração das imunoglobulinas, do isotipo IgG para a seleção de fagos específicos
presentes nos soros dos cães com LV e dos animais normais (grupo controle), foi realizada
de acordo com o protocolo da AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH (1998) . Os pools
de soros (positivos e normais) foram precipitados através da adição de sulfato de amônio e
20
posterior filtração em coluna de Proteína A-Sepharose 4B. Após eluição e neutralização, as
IgGs foram dialisadas contra PBS e a concentração destas determinada por
espectrofotômetro (260:280 nm) Gene Quant II apparatus (Pharmacia Biotech).
Após a extração, foi realizado um ensaio de ELISA para verificação da reatividade
das imunoglobulinas de cão anti-L.chagasi e normais frente ao antígeno.
As IgGs anti-L.chagasi e normais purificadas foram testadas por ELISA e utilizadas
como moléculas na bio-seleção dos peptídeos expressos nas superfície de fagos (PHAGE
DISPLAY).
4.5- Teste de ELISA para verificação da reatividade das IgGs purificadas
Foi realizado um ensaio de ELISA para verificação da reatividade das
imunoglobulinas de cão anti-L.chagasi e normais frente ao antígeno. A metodologia
utilizada está descrita abaixo:
• Os poços de uma microplaca de polietileno (Falcon) foram sensibilizados durante
um período que variou entre 12 e 16 horas, a 4
o
C, com 100L/poço (volume padrão) de
solução de tampão carbonato 0,02 M, pH 9,6 contendo o antígeno de L. chagasi dissolvido
em tampão carbonato pH 9.6.
• A placa foi lavada com solução de lavagem (PBS com Tween a 0.05%) três vezes
para a retirada do antígeno que não aderiu à fase sólida.
• O bloqueio dos sítios livres foi feito com 150L de solução de bloqueio (caseína
2% em PBS 0.05M, pH 7.4) a 37
o
C durante 1h.
• A placa foi lavada cinco vezes com solução de lavagem e em seguida realizada a
reação com as IgGs de cães anti-L.chagasi e normais diluídas em tampão de incubação
(caseína 0.25% em PBS 0.05M, pH 7.4 e 0.05% Tween 20), a 37
o
C durante 1h.
• As placas foram lavadas seis vezes com solução de lavagem. Foram adicionados
100L de tampão de incubação com anticorpo anti-Ig total de cão conjugado a peroxidase
diluído 1:1000, a 37
o
C durante 1h.
• As cavidades foram lavadas seis vezes com solução de lavagem. A atividade
enzimática foi revelada através da adição de 100L de solução reveladora (2mg de OPD e
2L de peróxido de hidrogênio para 10mL de tampão citrato 0,05M pH 5,0).
21
• A placa foi incubada por 15 minutos a temperatura ambiente ao abrigo da luz. A
interrupção da reação foi feita com 20L de solução de ácido sulfúrico (1:20) e a leitura
espectrofotométrica feita a 492 nm (SpectraMax340).
4.6- Técnica de Phage Display
4.6.1-Seleção de peptídeos expressos na superfície dos fagos (Biopanning)
Para a seleção de moléculas capazes de se ligar especificamente à imunoglobulinas
do soro de cães com leishmaniose visceral, foram utilizadas quatro bibliotecas que
apresentam peptídeos de 12, 15, 17 e 30 aminoácidos. As bibliotecas foram obtidas por J.
Scott (Simon Fraser University, Burnaby BC, Canadá). Os fagos foram selecionados após
três ciclos consecutivos de seleção e amplificação, a fim de se aumentar a especificidade
das ligações. A bio-seleção foi feita de acordo com protocolo descrito por SMITH em 1985,
com algumas modificações:
• Uma placa de Petri de polietileno (10 x 1.5 cm, Falcon 1029) foi sensibilizada com
as imunoglobulinas purificadas do soro de cães com LV, numa concentração de 100g/mL
em coating buffer (NaHCO
3
100mM pH 8,6), overnight a 4
o
C, sob leve agitação.
• Os anticorpos não ligados foram removidos por cinco lavagens de dois minutos
com solução de lavagem (TBS 50mM, NaCl 150mM, Tween 0.05%, pH 7.5). A placa foi
bloqueada com a adição de 100L/well de solução de bloqueio (TBS 50mM, NaCl 150mM,
Tween 0.05%, pH 7.5, BSA 3%) overnight a 4
o
C.
• Após cinco lavagens de dois minutos com solução de lavagem, 5x10
12
fagos de
cada biblioteca foram adicionados a placa, em 10 mL de TBS 50mM, NaCl 150mM, Tween
0.05%, pH 7.5, para incubação com anticorpos, overnight a 4
o
C.
• Os fagos que não se ligaram foram removidos por dez lavagens de dois minutos
com NaCl/Tris (50mM Tris, 150mM NaCl, 0.5% Tween 20, pH 7.5) e cinco lavagens de
dois minutos com solução de lavagem.
• Os fagos ligados foram eluídos através da incubação com o respectivo competidor
(no caso, o antígeno de L.chagasi), 10µg/mL de TBS (Tris 50mM, NaCl 150mM, Tween
0.05%, PH=7.5), overnight a 4
o
C, sob agitação.
22
• A amplificação dos fagos eluídos foi iniciada com a adição destes em cinco ml de
uma cultura de células de Escherichia coli K-91 (Densidade ótica a 550nm = 1.8,) em meio
LB, que se encontrava em fase exponencial de multiplicação. Depois de uma incubação de
dez minutos a 37
o
C, as bactérias infectadas foram selecionadas com adição de tetraciclina
ao meio (0.2g/mL de meio) por trinta minutos a 37
o
C, com agitação a 225 rpm. Em
seguida, foi adicionada tetraciclina em maior quantidade, 20g/mL de meio, para a seleção
final das bactérias infectadas e conseqüentemente, resistentes. As bactérias infectadas
foram colocadas a 37
o
C overnight com agitação de 225 rpm para propagação.
• A suspensão da cultura de células foi lavada com duas centrifugações (4000 em
seguida 8000 rpm). Os fagos resultantes foram separados do sobrenadante por precipitação
em 20% de polietilenoglicol 8000 (PEG 8000 20% 2.5M NaCl), overnight no gelo.
• O precipitado foi coletado após duas centrifugações a 8000 rpm, a 4
o
C (40 e 10
minutos). O pellet foi dissolvido em 3 mL de Tris/NaCl, e incubado a 37
o
C por trinta
minutos com agitação de 150 rpm e essa solução foi transferida para tubos de
microcentrífuga e centrifugados para retirar qualquer vestígio de bactéria (10 minutos
15000 rpm).
• O sobrenadante foi armazenado a –20
o
C. Após a obtenção dos fagos, estes eram
titulados para se iniciar um novo ciclo de bio-seleção, com o objetivo de aumentar a
especificidade de ligação dos peptídeos selecionados em relação às moléculas alvo
empregadas.
• A titulação foi feita a partir de diluições seriadas (10
-1
a 10
-12
) dos fagos em meio
LB líquido. Dez microlitros das diluições 10
-6
, 10
-8
, 10
-10
e 10
-12
foram utilizadas para
infectar, separadamente, 200L de uma cultura de E. coli em crescimento exponencial
(Densidade ótica a 550nm = 1.8). Para otimizar a infecção, as células eram mantidas a 37
o
C
por quinze minutos e a 37
o
C por mais quinze minutos com agitação de 225 rpm. O volume
total de células (200L) das diluições escolhidas foram plaqueados em meio LB ágar com
Tetraciclina 20g/mL. O título foi estabelecido a partir da maior diluição onde houve
crescimento.
23
4.6.2-ELISA para testar a reatividade dos fagos nos três ciclos de seleção
A fim de comprovar o aumento da afinidade dos fagos pela imunoglobulina anti-
Leishmania chagasi em cada ciclo de seleção (Pannings), após o terceiro panning foi
realizado um ensaio de ELISA, conforme o protocolo descrito abaixo.
• Uma placa para ELISA (Nunc/Polysorp) foi sensibilizada com imunoglobulinas do
pool de soros de cães com leishmaniose visceral em uma concentração de 10g/mL em
coating buffer para Phage Display (NaHCO
3
100mM pH 8,6), 3 horas a 37
o
C.
• O bloqueio dos sítios livres foi feito utilizando-se uma solução PBS-Tween 0.1%
Leite Molico 2% durante uma hora a 37
o
C.
• A cada poço foram adicionados 10
10
fagos que foram eluídos de cada ciclo de
seleção. Como controle negativo, foi utilizada a mesma concentração de fagos silvestres. A
placa foi incubada por 2 horas a 37
o
C.
• Após esta incubação, as cavidades foram lavadas seis vezes com PBS-Tween 0,1%
e incubadas a 37
o
C durante uma hora com anticorpo anti-fago M13 conjugado à peroxidase
(Sigma) diluído 1:5000. As cavidades foram lavadas novamente seis vezes com PBS-
Tween 0,1% e reveladas com 100L de solução reveladora - 2mg de OPD para 10ml de
tampão substrato (40mM citrato trissódico, ácido cítrico e 3.33ml de água oxigenada 30
volumes).
• A interrupção da reação foi feita com 20L de solução de ácido sulfúrico (2N) e a
leitura espectrofotométrica feita a 492nm.
4.6.3- Screening de antígenos selecionados
Ao fim terceiro ciclo de seleção (Panning 3), foi feita uma titulação e colônias bem
isoladas foram amplificadas para serem analisadas individualmente. As colônias foram
transferidas, uma a uma, para uma placa de cultivo celular de 96 poços contendo 200L de
meio LB mais 20g/mL de Tetraciclina que cresceu a 37
o
C overnight com agitação de
225rpm. Essa placa foi centrifugada a 1500rpm por 30 minutos e o sobrenadante da cultura,
onde estão os fagos isolados, foi testado através da técnica de ELISA descrita abaixo:
• Uma placa para ELISA (Nunc/Polysorp) foi sensibilizada com imunoglobulinas do
pool de soros de cães com leishmaniose visceral em uma concentração de 10g/mL de
coating buffer para Phage Display (NaHCO
3
100mM pH 8,6) overnight a 4
o
C.
24
• O bloqueio dos sítios livres foi feito utilizando-se uma solução PBS-Tween 0.1%/
Leite Molico 2% durante uma hora a 37
o
C. A cada poço foram adicionados 50 L do
sobrenadante de cultura de E.coli, infectadas por clones individuais de fagos selecionados
no terceiro ciclo de seleção previamente cultivados como descrito anteriormente, mais 50
L da solução de bloqueio. A placa foi incubada por 1 hora a 37
o
C.
• Após esta incubação, as cavidades foram lavadas 6 vezes com PBS-Tween 0,1% e
incubadas a 37
o
C durante uma hora com anticorpo anti-fago M13 conjugado à peroxidase
(Sigma) diluído 1:5000. As cavidades foram lavadas 6 vezes com PBS-Tween 0,1% e
reveladas com 100L de solução reveladora - 2mg de OPD para 10ml de tampão substrato
(40mM citrato trissódico, mM de ácido cítrico e 3.33mL de água oxigenada 30 volumes).
• A interrupção da reação foi feita com 20L de solução de ácido sulfúrico (2N) e a
leitura espectrofotométrica feita a 492nm.
• Os clones que apresentaram densidade ótica a 492nm superior a 0.8 foram
considerados positivos.
A mesma ELISA foi repetida utilizando-se IgG de cão normal como antígeno.
4.6.4- Teste de reação cruzada dos clones positivos
Com o objetivo de se selecionar apenas clones com alta especificidade contra
anticorpos anti L. chagasi, foi feita uma ELISA como descrito no item 3.4.3, utilizando-se
anticorpos de cão anti- antígeno de Trypanosoma cruzi.
4.6.5- Subclonagem dos clones positivos
Após os clones positivos serem identificados como descrito na etapa anterior; as
bactérias aderidas na placa de cultura foram ressuspendidas em meio LB e novamente
plaqueadas em meio LB ágar contendo tetraciclina 20g/ml, durante a noite a 37
o
C. Uma
colônia correspondente a cada clone positivo foi transferida para cinco ml de meio LB
líquido com tetraciclina e submetido à agitação de 225rpm, durante a noite a 37
o
C. Após
essa etapa, foi acrescentado a cada meio 1mL de glicerol e estes foram aliquotados e
estocados a -80
o
C.
25
4.7- Seqüenciamento de DNA viral
4.7.1- Extração do DNA
Para extrair o DNA dos fagos selecionados no screening, foi usado o protocolo de
extração QIAprep Spin M13 purification procedure protocolo, da QIAGEN. Este kit é
designado exclusivamente para preparação da fita única de DNA do fago M13, utilizando
colunas em microcentrífuga.
4.7.2- Dosagem do DNA
Após a extração, foi feito um gel de agarose 1% e a ele adicionado 1ul do DNA
viral. A título de comparação, foi utilizado um padrão de 250 ng de DNA.
4.7.3- Sequenciamento automático capilar
Após a dosagem, 250 ng de cada DNA foram submetidos ao sequenciamento no
aparelho ABI Prism- 310 Genetic Analyser (Perkim Elmer) localizado no NAGE (Núcleo
de Análise e Expressão Genômica) do Departamento de Bioquímica e Imunologia da
UFMG.
4.8- Identificação e análise de homologia dos peptídeos selecionados
Para identificação dos peptídeos selecionados, primeiramente foi obtida a seqüência
de nucleotídeos que codifica esses peptídeos através da análise das seqüências de DNA.
Após a identificação dos nucleotídeos, foi usada a opção DNA
protein select translate
3’5’ frame 1, do programa proteomics tools disponível em http://www.expasy.ch para
identificar os peptídeos.
As seqüências dos nucleotídeos referentes aos clones seqüenciados, foram
analisadas quanto a similaridade com outras seqüências já registradas em bancos de dados
através do programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST- Altschul et al., 1990)
disponível em http:// www.ncbi.nlm.nih.gov
4.9- Síntese química manual do peptídeo em fase sólida – Método F-moc
Após a obtenção das seqüências peptídicas, procedeu-se à síntese química para a
produção dos epitopos.
26
O peptídeo selecionado foi sintetizado utilizando-se um protocolo de síntese de
peptídeos em fase sólida (gel), que usa aminoácidos especiais para síntese in vitro. Esses
aminoácidos possuem o grupamento amina protegido pelo grupamento Fmoc (fluorenil
metil oxicarbonila) e são acoplados à fase sólida que também se encontra protegida
(resina). O protocolo foi executado conforme Merryfield (1965), introduzindo-se nele
algumas modificações: 54mg da resina (Rink Amide-40M) foram colocados em um tubo
de síntese e o seu grupamento Fmoc foi liberado, cobrindo a resina com 3ml de piperidina
20% em DMF (Dimetilformamida). A resina foi lavada três vezes por 10 minutos com a
solução mencionada, em agitação contínua à temperatura de 37ºC. Todas as lavagens foram
feitas com auxílio de uma bomba a vácuo.
O tubo de síntese foi lavado 3 vezes com 5ml de DMF por lavagem. Iniciou-se,
então, o acoplamento dos aminoácidos Fmoc. A quantidade despendida para cada
aminoácido foi equivalente a 160M. O primeiro aminoácido a ser acoplado é ligado pelo
seu grupamento carboxila ao grupamento amina da resina, formando uma ligação peptídica.
O primeiro aminoácido foi posto no tubo de síntese e para 160M de aminoácido
foram colocados 21.6mg de HOBt (hidroxibenzotriazol) e 25L de DIPC
(diisopropilcabodiimida). O DIPC e HOBt são reagentes que permitem a ativação da
função COOH dos aminoácidos Fmoc.
Com DMF suficiente para cobrir toda a resina, o tubo ficou agitando por 180
minutos a 37
o
C. Após esse tempo, todo o líquido do tubo de síntese foi retirado com auxílio
de uma bomba a vácuo, e a resina lavada com DMF por 3 vezes.
O grupamento amina desse primeiro aminoácido acoplado foi desprotegido lavando
a resina com 3 ml de uma solução de piperidina 20% em DMF três vezes de 10 minutos
cada com agitação contínua à 37
o
C.
O segundo aminoácido, com seu grupamento amina protegido, foi colocado no tubo
de síntese juntamente com o HOBt e DIPC e este foi processado exatamente como o
anterior. Este ciclo foi repetido até que todos os aminoácidos do peptídeo estivessem
acoplados.
Após o término do derradeiro ciclo, o último aminoácido foi desprotegido como os
anteriores e a resina lavada 4vezes, durante 5 minutos cada, com diclorometano. O peptídeo
foi desligado da resina pelo uso de uma solução de clivagem contendo 2.5% de -
27
mercaptoetanol, 2.5% de água, num volume final de 5mL de TFA (ácido trifluoracético). O
tubo de reação ficou agitando com esta solução por 4 horas.
A solução com os peptídeos foi colhida com auxílio de uma bomba a vácuo e os
produtos da síntese foram precipitados com éter gelado overnight a 4
o
C. O tubo foi lavado e
centrifugado três vezes a 3000 rpm por 30 minutos, enquanto o sobrenadante foi
desprezado e o peptídeo ressuspendido em de água.
Após a obtenção do peptídeo, este foi liofilizado, purificado em HPLC e analisado
em espectrômetro de massa para confirmar a exatidão da seqüência.
4.10- Purificação do peptídeo sintético
Os peptídeos foram purificados por cromatografia em fase reversa utilizando a
coluna Sephasil Peptide C18 – Shimadzu (volume 4.24 mL, diâmetro 0.46 cm e altura 15
cm) acoplada a sistema de HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
Primeiramente, a coluna foi lavada com solução A (TFA 1.1% em água) por 10 minutos.
Os componentes presentes foram eluídos, utilizando-se um gradiente que variou entre 0 e
25% de acetonitrila em 75 minutos (0 –10 minutos até 10% de acetonitrila e de 10-75
minutos até 25% de acetonitrila). Os 20 minutos seguintes foram utilizados para lavagem
da coluna com acetonitrila 100%. Após a purificação, o peptídeo foi submetido à
espectrometria de massa (Micromass Q-Tof- micro
TM
), e sua massa molecular foi
confirmada.
4.11- Imunoensaios com peptídeos ligados à membrana
Como outra forma de se verificar a reatividade dos clones positivos selecionados
por Phage Display com soros de cães anti- L.chagasi e normais, estes foram sintetizados em
membrana de celulose (método de Spot Síntese) e o ensaio realizado como descrito abaixo:
As membranas contendo os peptídeos sintéticos foram lavadas três vezes com TBS
(Salina, KCl 0.002M, Tris 0,05M) pH 7.4 e incubadas por 24 horas com solução de
bloqueio (GENOSIS, SU-07-250A) em TBS, contendo Tween-20 a 0,05% (T-TBS) e
sacarose a 0.5%, à temperatura ambiente. Após bloqueio, as membranas foram lavadas e
incubadas com os pools de soros de cães negativo e positivo para leishmaniose visceral por
90 min à 37
o
C. Após novas lavagens, o conjugado (anticorpo anti-cão conjugado com
28
fosfatase alcalina) foi adicionado e mantido sob agitação por 90 minutos. Após duas
lavagens com T-TBS e outras duas subseqüentes com CBS pH 7 por 10 minutos sob
agitação à temperatura ambiente, adicionou-se o substrato para fosfatase (MTT-BCIP,
Sigma) por 30 minutos.
A reação, interrompida após duas lavagens da membrana com tampão CBS pH pode
ser visualizada pela presença de um precipitado azul sobre os peptídeos (spots) mais
reativos.
Ao final dos ensaios imunológicos as membranas foram documentadas e em seguida
submetidas a um tratamento de regeneração, para sua posterior reutilização. As membranas
foram tratadas com dimetilformamida (DMF), reagente A (uréia 8M, 1% de SDS, 0.1% de
2-mercaptoetanol), reagente B (etanol/água/ácido acético na proporção 50:40:10
vol/vol/vol), e metanol para remover os complexos moleculares precipitadas sobre os
peptídeos (três lavagens de 10 min cada). Este procedimento de regeneração permite o uso
das membranas 30-40 vezes utilizando-se a mesma membrana para anticorpos policlonais e
até 70 vezes para anticorpos monoclonais.
4.12- Análise de infectividade in vitro
O peptídeo 12A foi utilizado como antígeno vacinal na infecção por L. chagasi em
um ensaio como descrito a seguir;
Camundongos BALB/c (n=4) de 6 a 8 semanas receberam, por via intraperitoneal, 2
mL de tioglicolato 3%. Após 72 horas, os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical, procedeu-se a assepsia da região abdominal com álcool 70% e, através de um
pequeno corte, a pele foi rompida sem danificar o peritônio.
Para a retirada de macrófagos, foram inoculados 5 mL de PBS 1x estéril no
peritônio dos animais. O líquido contendo as células foi aspirado novamente e colocado em
tubos Falcon de 50mL para centrifugação (1400 rpm, 10 minutos, 4
o
C). O sobrenadante foi
descartado e as células ressuspendidas em 2 mL de meio RPMI suplementado com 10% de
soro fetal bovino e 2% de antibiótico (sulfato de gentamicina). Estas foram então diluídas
20 vezes em solução de Azul de Tripan 0,4% e quantificadas em câmara de Newbauer.
Os macrófagos foram transferidos para placas de cutura de 2 wells (Tissue culture
chamber/slides, Labtek) na concentração de 4×10
5
céls/mL. Ao primeiro well foram
29
adicionados 22μM do peptídeo 12A e o outro recebeu apenas PBS. A placa foi armazenada
em estufada de CO
2
por 24 horas.
No dia seguinte, foram adicionadas à cultura 8×10
5
promastigotas metacíclicas de L.
chagasi e a placa foi novamente armazenada por 48 horas, sob as mesmas condições
descritas anteriormente (fig.1).
Após 48 horas, o sobrenadante foi coletado, a placa de cultura teve o fundo
removido e colocado para secar à temperatura ambiente. Depois de secas, essas lâminas
fora coradas com o kit Panótico Rápido (Laborclin) e o resultado foi analisado em
microscópio.
Fig.1- Esquema da lâmina no ensaio de proteção in vitro
4.13- Preparação de lipossomos para imunização de camundongos
Os peptídeos 12A, 11H, o extrato solúvel de L. chagasi (antígeno) e um peptídeo
não relacionado (controle) foram sintetizados em sua forma solúvel e encapsulados em
lipossomos para posterior imunização, de acordo com o protocolo descrito abaixo:
Para cada mL de lipossomo, foram solubilizados em clorofórmio 96,27 mg de
fosfatidil colina de soja e 38,6 mg de colesterol. Para completa evaporação do clorofórmio,
a solução foi submetida à agitação no rotavapor, a vácuo, em banho maria 20
o
C, até a
formação do filme. Então, foi adicionada água deionizada ao balão volumétrico e este foi
colocado novamente no rotavapor, com o vácuo desligado, por 45 minutos. A solução foi
30
transferida para um tubo falcon, sonicada por 10 minutos e centrifugada a 4ºC, 3000G, 10
minutos. O precipitado foi descartado e para cada mL de sobrenadante, foram adicionados
2,1 mg de cada imunógeno (no caso, peptídeos). Após esse processo, os lipossomos foram
congelados e liofilizados para posterior reidratação.
Na etapa de reidratação, cada mL de lipossomo foi suspendido em 67,14 μl de água
deionizada, agitado no vórtex por 1 minuto e incubado por 10 minutos à temperatura
ambiente. A etapa de agitação e incubação foi repetida por mais 3 vezes e então foram
adicionados mais 67,14 μl de PBS e 9,4 μl de Hidróxido de Alumínio (AlOH
3
).
4.14- Imunizações de camundongos com lipossomos
Antes de cada imunização, os lipossomos foram reidratados e a eles acrescentado
AlOH
3
, como citado no item anterior.
Dois grupos de 20 camundongos BALB/c fêmeas, de 6 a 8 semanas, foram
utilizados neste trabalho para os ensaios de imunização (GRUPOS 1 e 2). O esquema de
imunização está representado pela Fig.2. O primeiro foi utilizado para a infecção desafio e
o segundo para dosagem de citocinas pós-vacina. Ambos foram separados em 4 subgrupos
(A, B, C e D) de 5 animais e receberam seis doses das seguintes vacinas, de acordo com o
esquema abaixo:
GRUPOS 1 e 2
• SUBGRUPO A: lipossomos contendo 50 μg peptídeo 12A
• SUBGRUPO B: lipossomos contendo 50 μg peptídeo 11A
• SUBGRUPO C: 50 μg antígeno solúvel de L. chagasi
• SUBGRUPO D: lipossomos contendo 50 μg peptídeo não relacionado
Fig.2- Esquema de imunização com peptídeos e lipossomos ou extrato solúvel de L.
chagasi
31
4.15- Elisa para verificação do título de anticorpos após ciclo de imunização
Após o término da imunizações, para verificar a reatividade dos animais
imunizados, uma placa de Elisa da marca Falcon foi sensibilizada com 0,5 ug/well de cada
imunógeno e a ela foi adicionado o pool de soros dos animais na diluição de 1:100. Foi
utilizado conjugado anti- mouse peroxidase (SIGMA), na concentração de 1:1000.
4.16- Infecção desafio:
A infecção desafio foi realizada nos camundongos do Grupo 1, uma semana após o
término das imunizações com os lipossomos. Para tal, foram utilizadas 1×10
6
promastigotas
de L. chagasi em fase estacionária de crescimento. Os parasitas foram quantificados em
câmara de Newbauer, sendo ajustados para uma concentração final de 1×10
6
promastigotas
por animal e administradas por via intraperitoneal, em um volume final de 500μL em PBS.
Como controle do experimento, outros 5 camundongos não imunes receberam também o
inóculo de promastigotas.
4.17- Análise da carga parasitária após infecção desafio
Após a infecção desafio (4 a 5 semanas), foi realizado um PCR em tempo real, com
o objetivo de se quantificar a carga parasitária nos animais do grupo 1, que foi determinada
através do baço dos animais.
4.17.1- Extração de DNA do baço
A extração do DNA foi feita através do Kit Wizard® Genomic DNA Purification
Kit (Promega, Madison, WI, USA), de acordo com o protocolo abaixo: • 10 mg do baço
foram retiraradas, colocadas em um tubo contendo 600μl de Nucleo Lysis solution e
homogeneizadas por 10 segundos.
• O lisado foi incubado por 30 minutos em banho a 65
o
C.
• Em temperatura ambiente, adicionou-se 200μl de Protein Precipitation solution.
• Os tubos foram colocados no gelo 5 minutos e centrifugados a 14000g por 4
minutos.
• O sobrenadante foi transferido para um tubo contendo 600μl de isopropanol.
• O tubo foi invertido até a formação de uma massa branca.
32
• Foi feita uma centrifugação por 3 minutos a 14000g e o sobrenadante foi
descartado.
• Foi adicionado ao tubo 600μl de etanol 70% e para lavar o DNA.
• O sobrenadante foi retirado e o tubo foi invertido para a secagem completa.
• 100 μl de DNA Rehydation solution foi adicionada ao tubo e este foi colocado em
banho a 65
o
C por 1 hora.
• O DNA foi dosado no aparelho NanoDrop 2000c (Thermo Scientific).
4.17.2- Real time PCR
A PCR foi realizada utilizando-se 30 ng de DNA extraído do baço, 2,5 pM de
primer F Linf.1-23F: 5’-TCCCAAACTTTTCTGGTCCT-3’, 2,5 pM Primer R Linf.1-
154R:5’-TTACACCAACCCCCAGTTTC-3’.
e 10μl de SYBR® Green PCR Master Mix (Warrington, UK). A reação foi desenvolvida no
aparelho 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems).
A quantificação da carga parasitárias nas amostras foi feita através da comparação
com uma curva padrão determinada pela reação de diferentes diluições (10 a 10
8
) de
leishmanias em baços de animais não infectados.
4.18- Análises pós vacinais:
Uma semana após a ultima imunização, os camundongos do Grupo 2 tiveram o
perfil da resposta imune celular avaliado através da produção de citocinas IFN-γ, IL-4 e IL-
10 nos sobrenadantes das culturas de células.
4.18.1- Isolamento e cultura dos esplenócitos
Uma semana após a última imunização, procedeu-se a coleta do baço e cultura de
esplenócitos. Para tal, os animais foram sacrificados e os baços coletados.
Os órgãos foram macerados em meio de cultura RPMI suplementado com 10% de
soro fetal bovino e 2% de sulfato de gentamicina em tubos Falcon de 50 mL. Após a
maceração, procedeu-se a lavagem das células e, em seguida, a lise de hemácias com
tampão de lise (NH
4
Cl 0,15M, KHCO
3
10mM, EDTA 0,1mM ), por 30 mim. As células
foram então recuperadas por centrifugação (1500 G por 10 mim a 4
o
C) e ressuspendidas em
33
3 mL de RPMI. A seguir, as células foram quantificadas em câmara de Newbauer e
ajustadas para uma concentração final de 1x10
6
células por mL, sendo então diluídas em
meio RPMI completo e plaqueadas em placas de 24 poços.
Cada subgrupo foi submetido ao estímulo de 4 antígenos diferentes. As células
extraídas dos animais do subgrupo A, C e D foram estimuladas com peptídeo 12A,
antígeno solúvel, peptídeo não relacionado e PBS (controle negativo). As do subgrupo B
foram estimuladas com peptídeo 11H, antígeno solúvel, peptídeo não relacionado e PBS.
As concentrações dos peptídeos sintéticos e do extrato protéico solúveis de L.(L.)
chagasi como antígenos estimuladores, foram as menores possíveis capazes de induzir a
máxima produção das citosinas, definidas através de uma curva padrão dose-resposta.
Assim, as concentrações de antígenos utilizadas foram de 10 ug/mL dos peptídeos e de 50
ug/mL de antígeno.
Após o acréscimo dos antígenos, as placas foram incubadas em estufa a 5% de CO
2
por 72 h a 37 °C. Após, os sobrenadantes foram coletados, armazenados a -80° C e
utilizados nos experimentos de ELISA.
4.18.2- Dosagem de citocinas
O perfil da resposta imune celular foi avaliado através da produção das citocinas
IFN- γ e IL-10, nos sobrenadantes das culturas das células após os estímulos. As dosagens
foram realizadas por ELISA de captura, utilizando-se os kits Interest Mouse IFN-γ ELISA
kit, Interest Mouse IL-4 ELISA kit e Interest Mouse IL-10 ELISA kit (Pharmingen), de
acordo com as instruções do fabricante.
34
5- RESULTADOS
5.1- Teste de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) do tipo Indireto para
Leishmaniose Canina
Para confirmar a presença ou ausência de imunoglobulinas anti-antígeno solúvel de
Leishmania chagasi nos soros dos cães positivos e negativos, foi feito um ensaio de
ELISA. O resultado do teste está representado na figura 3.
Fig.3 - Reatividade dos soros de cães frente ao antígeno de Leishmania chagasi. A
placa de ELISA foi sensibilizada com 0,5 µg/well de antígeno. Os soros foram usados na
diluição inicial de 1:500. Foi utilizado anticorpo anti-cão conjugado à peroxidase diluído
1:1000.
Verificamos que todos os 38 soros previamente diagnosticados positivos (RIFI,
ELISA e punção medular) mostraram também reatividade com o antígeno solúvel
desenvolvido nesta tese enquanto que os 16 soros negativos não apresentaram reatividade
frente ao mesmo. Devido a estes resultados, foram feitos dois pools de soros, tanto de soros
Soros positivos Soros negativos
35
positivos como de soros negativos para a extração de imunoglobulinas anti-L.chagasi e de
imunoglobulinas normais para o próprio parasita.
5.2- Reatividade das imunoglobulinas purificadas frente ao antígeno de L.chagasi
A purificação das imunoglobulinas IgGs anti-L.chagasi foi feita por
cromatografia de afinidade em coluna de proteína A-Sepharose segundo o protocolo
descrito em material e métodos. Após purificação, um ensaio de ELISA indireto foi
realizado com o objetivo de se verificar a reatividade destas imunoglobulinas frente ao
antígeno.
O resultado está representado na Figura 4. Verificamos em Fig. 4A que as IgGs
anti- L.chagasi purificadas mantiveram sua a reatividade numa forma diretamente
proporcional à concentração de imunoglobulina utilizada. Na Figura 4B observamos
também que as IgGs provenientes de cães normais não apresentaram reatividade frente ao
antígeno.
IgGs anti-L.chagasi foram utilizados em seguida como ligantes na seleção de fagos
específicos (Biopanning).
A) B)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
10
concentração em ug/well
Abs 492nm
Fig.4-A) Reatividade das imunoglobulinas purificadas. A placa de ELISA foi
sensibilizada com 0,5µg/well de antígeno de L.chagasi. A concentração das
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
10 5 2,5 1,25 0,625 0,3125 0,156
concentração em ug/well
Abs 492nm
36
imunoglobulinas variou de 10µg por well a 0,16µr por well. B) Controle negativo. Foi
usada 10 µg de imunoglobulina do pool de soros negativos.
5.3- Reatividade dos fagos após três ciclos de seleção
Após três ciclos de seleção (Pannings 1, 2 e 3), foi feita uma ELISA tipo sanduíche
para se verificar o aumento da afinidade entre os peptídeos expressos na superfície dos
fagos e as imunoglobulinas anti- L.chagasi (figura 5). As imunoglobulinas usadas nessa
ELISA foram as mesmas utilizadas na seleção incial dos fagos (P1, P2 e P3). A
metodologia de ELISA tipo sanduíche usada esta descrita em materiais e métodos.
Fig.5 - Reatividade dos fagos após Pannings 1, 2 e 3. A placa foi sensibilizada com
10µg/mL do pool de Ig purificada anti L. chagasi e incubada com 10
10
dos fagos eluídos
dos três ciclos de seleção (P1, P2 e P3) e fagos silvestres como controle negativo. Foi
empregado anticorpo anti-M13 conjugado a peroxidase diluído 1:3000 (sigma).
Podemos observar na figura 5 que a reatividade dos fagos é maior no Panning 3,
sugerindo que em cada ciclo a especificidade e a reatividade dos fagos amplificados são
aumentadas.
37
5.4- Seleção dos fagos de interesse (Screening)
A análise da reatividade individual dos clones selecionados no Panning 3 foi
realizada através de uma ELISA sanduíche conforme descrita em material e métodos no
item 4.6.3. Foram sensibilizadas duas placas de ELISA com pool de imunoglobulinas anti-
L.chagasi purificadas do soros de cães (10ug/mL). Como controle negativo foi usado
sobrenadante de cultura de fagos silvestres. O objetivo desta etapa é a individualizar e
selecionar apenas os clones com as maiores reatividades.
Fig 4 – Reatividade dos fagos do Panning 3 frente às imunoglobulinas purificadas. A
placa foi sensibilizada com 10 ug/well do pool de imunoglobulina anti- L. chagasi e
incubada com 50µL do sobrenadante de bactérias K91 com os fagos de interesse.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
A1
A4
A7
A10
B1
B4
B7
B10
C1
C4
C7
C10
D1
D4
D7
D10
E1
E4
E7
E10
F1
F4
F7
F10
G1
G4
G7
G10
H1
H4
H7
H10
Clones
Abs 492 nm
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
A1
A4
A7
A10
B1
B4
B7
B10
C1
C4
C7
C10
D1
D4
D7
D10
E1
E4
E7
E10
F1
F4
F7
F10
G1
G4
G7
G10
H1
H4
H7
H10
Clones
Abs 492nm
F Fagos P3 Abs > 0.8 Fagos P3 Abs < 0.8 Fagos Silvestres
38
Fig.6 – Reatividade dos fagos após o terceiro ciclo de seleção (P3) frente a Igs
purificadas. A placa foi sensibilizada com 0,5µg/well de IgG de cão anti- L.chagasi e
incubada com 50µL do sobrenadante de cultura de de K91 contendo os fagos de interesse.
Como controle negativo foi utilizado 50µL do sobrenadante de cultura de K91 infectada
por fagos silvestres. Foi empregado anticorpo anti-M13 conjugado à peroxidase (sigma)
A figura 6 mostra uma grande variabilidade dos clones frente às IgGs anti
L.chagasi. Aqueles com leituras maiores ou iguais a 0.8 (Abs 492nm) foram considerados
positivos. De 192 clones dispostos inicialmente na placa, apenas 25 mostraram-se
positivos. Estes clones foram selecionados para serem testados frente à imunoglobulina de
cão anti- T. cruzi.
5.5- Especificidade dos clones positivos frente a IgGs normais
Os 25 clones positivos tiveram sua reatividade analisada frente a imunoglobulinas
de cães sadios. O resultado está representado na figura 7.
Controle
positivo
39
Fig.7 – Reatividade dos clones positivos frente a IgG normal de cão. A placa foi
sensibilizada com 10 ug/well do pool de imunoglobulinas de cães do grupo controle e
incubada com 50µL do sobrenadante de bactérias K91 com os fagos de interesse. Como
controle positivo, a placa foi sensibilizada com o pool de IgG anti-Leishmania chagasi e
incubada com 50 uL do sobrenadante de um dos fagos selecionados.
A figura 7 mostra que nenhum dos 25 clones positivos apresentou reatividade frente
a IgG de cães do grupo controle. Os valores observados foram inferiores a 0.2 na
absorbância de 492nm.
5.6- Especificidade dos clones positivos frente a IgGs de cão anti-Trypanosoma cruzi
A especificidade dos clones positivos foi verificada novamente através do ensaio de
ELISA, onde as microplacas de foram sensibilizadas com anticorpos anti T.cruzi.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
A2 B3 B4 B5 D1 D3 E5 F2 H9 CP
clones
Abs 492nm
40
Fig.8 – Reatividade dos clones selecionados frente a imunoglobulina de cão anti T.
cruzi. A placa de ELISA foi sensibilizada com 10µg/mL de Ig de cão chagásico e incubada
com 50 µL de sobrenadante de cultura de K91 contendo os fagos selecionados (Abs > 0.8).
Foi empregado anticorpo anti- M13 conjugado à peroxidase diluído 1:3000.
A figura 8 mostra a reatividade dos clones frente aos antígenos de L.chagasi (azul) e
antígeno de T.cruzi (vermelho). Verificamos que a reatividade frente aos antígenos é muito
variada; os valores de absorbância para anticorpo anti- L.chagasi variam de 0,9 (clones 9B,
1D2) a 1,8 (clones 6G e 11E), enquanto que para o anticorpo anti T.cruzi, esses valores
variam de 0,1 (maioria dos clones) a 0,5 (clones 6G e 11E).
Os clones que apresentaram, respectivamente, alta reatividade (>1,4) contra
anticorpos anti-L.chagasi e baixa reatividade (<0,2) contra anticorpos anti-T.cruzi, foram
selecionados. Por estas características, apenas três clones (3B, 11H e 12A) foram
selecionados e sintetizados para posteriores experimentos.
41
5.7- Purificação do peptídeo 3B
O peptídeo foi purificado por cromatografia em fase reversa utilizando a coluna
Sephasil Peptide C18 – Shimadzu (volume 4.24 mL, diâmetro 0.46 cm e altura 15 cm)
acoplada a sistema de HPLC (High Performance Liquid Chromatography). O perfil do
fracionamento apresentou um pico principal quando foi utilizado um gradiente de
acetronitrila que variou de 0 a 25% de acetronitila em 75 minutos. O perfil cromatográfico
está representado na figura 9. O pico principal foi liofilizado e sua análise foi realizada por
espectrometria de massa, que confirmou a massa molecular do peptídeo.
Fig.9- Perfil de eluição do peptídeo sintético 3B em coluna de fase reversa C18 em
sistema de HPLC.
CHRISTINA CORRIDA 3
27040502:1_UV1_280nm
CHRISTINA CORRIDA 3
27040502:1_Conc
20.0
40.0
60.0
80.0
%B
0.0
5.0
10.0
mAU
30.0
40.0
50.0
60.0
ml
32.43
33.50
35.68
36.92
39.14
40.46
41.27
42.19
43.01
43.80
45.57
48.12
49.08
51.06
52.61
58.73
61.97
12-25% de sol. B em 68min
0,2%/min
42
5.8- Espectrometria de massa
Fig.10- Análise por espectrometria de massa do pico purificado com massa estimada
de 1886 Daltons (Da).
5.9- Imunoensaios com peptídeos ligados à membrana
Após síntese dos peptídeos 11H e 12A em membranas (7 repetições de cada
peptídeos) como descritos em material e métodos, estas membranas foram analisadas com
soros negativo e positivo de cães para leishmaniose.
Os ensaios de imunoanálise das membranas foram realizados como descritos em
materiais e métodos no item 4.11. O resultado está representado na figura 11.
43
Fig.11- Análise da reatividade dos peptídeos sobre a membrana com pool de soros
positivo e negativo. Os soros fora usados na diluição 1:250. Foi empregado anticorpo anti-
IgG de cão conjugada à peroxidase diluído 1:500.
De acordo com a figura 11, podemos perceber que os clones 11H e 12
A mostraram
reatividade apenas frente aos soros positivos.
O clone 3B não reagiu também com o soro positivo ou negativo nestas condições.
5.10- Análise da infectividade in vitro
Para se verificar o comportamento do peptídeo 12A como indutor de proteção foi
realizado um ensaio de infectividade in vitro como descrito no item 4.12. Macrófagos de
camundongos BALB/c foram incubados com peptídeo 12A e PBS (controle negativo) e
promastigotas de L. chagasi.
O ensaio de proteção não apresentou resultados possíveis de serem contabilizados
ao microscópio óptico, devido à alta concentração de macrófagos utilizada nas placas.
Houve uma sobreposição celular (grumos), o que não permitiu a diferenciar a quantidade de
amastigotas presentes nos grupos de imunização.
A figura 12 ilustra o experimento de infectividade in vitro.
12A
3B
11H
Soro positivo
Soro negativo
44
Fig.12- Ensaio de infectividade in vitro. Lâminas evidenciando sobreposição celular dos
macrófagos e promastigotas livres de L. chagasi (aumento 400x).
5.11- Elisa para verificar a reatividade de anticorpos após imunização
Depois de completado o esquema de imunização, camundongos foram sangrados
pelo plexo retro orbital e os soros obtidos foram avaliados por ELISA em um pool
representativo de cada grupo de imunização.
Os resultados estão representados pelo gráfico da figura 13.
Fig.13- Reatividade dos soros de camundongos imunizados com peptídeos 12A, 11H,
não relacionado (NC) e antígeno frente a eles próprios.
45
De acordo com o gráfico acima, podemos observar que os grupos imunizados com
peptídeo 12A(verde) e antígeno solúvel de L. chagasi (azul) foram capazes de induzir
anticorpos reativos contra o próprio imunógeno utilizado, enquanto que os soros dos
animais imunizados com os peptídeos 11H (amarelo) e NC (vermelho) não apresentaram
resposta frente a seus respectivos antígenos.
5.12- Análise da carga parasitária
Após realizada a infecção experimental dos camundongos BALB/c imunes e
controles, foi avaliado o número de parasitas por mg de baço (carga parasitária) mensurado
através A avaliação da carga parasitária foi mensurada através da técnica de PCR em tempo
real (Real Time PCR). O resultado está representado pelo gráfico da figura 14.
Fig.14 – Carga parasitária por mg de baço de animais infectados com L. chagasi. Os
grupos representam os animais imunizados (n=5). Grupo 1- peptídeo 12A, Grupo 2-
peptídeo 11H, Grupo 3- antígeno solúvel de L.chagasi, Grupo 4- Peptídeo não-
relacionado, Grupo 5- Animais não imunes (controle)
Grupos
1 2 3 4 5
Leishmania/mg Baço
0
10
20
30
40
50
46
De acordo com a figura 14, podemos observar que a média de parasitas do grupo 4 e
5 (controles negativos) foi evidentemente maior que a dos outros grupos. Entretanto, não
existe diferença estatística significativa entre eles. Estes resultados podem ser explicados
pelo fato de existir um grande desvio padrão entre os grupos estudados.
5.13- Avaliações da produção de citocinas por ELISA
Com o intuito de avaliar o tipo de resposta imune induzida pela imunização de
animais com os peptídeos sintéticos, foi avaliada a produção de citocinas (IFN-gama e IL-
10) em cultura de esplenócitos de camundongos após o desafio experimental por L.
chagasi.
Os gráficos das figuras 15 A e 15 B a seguir apresentam os dados obtidos referentes
às citocinas anteriormente referidas.
B)
A)
47
Fig.15- A) Produção de IFN-γ por cultura de esplenócitos de camundongos BALB/c
imunizados com peptídeos 12A (Grupo 1), 11H (Grupo 2), não-relacionado NC
(Grupo 4) e antígeno de L. chagasi (Grupo 3). Os grupos 1, 3 e 4 foram estimulados com,
respectivamente, peptídeo 12A, Ag, NC e PBS (controle). O grupo 2 foi estimulado com
peptídeo 11 H, Ag, NC e PBS, respectivamente. B) Produção de IL-10 por cultura de
esplenócitos de camundongos BALB/c imunizados com peptídeos 12A (Grupo 1), 11H
(Grupo 2), não-relacionado NC (Grupo 4) e antígeno de L. chagasi (Grupo 3). Todos
os grupos foram submetidos aos mesmos estímulos utilizados no primeiro experimento
(gráfico IFN-γ).
B)
48
6- DISCUSSÃO
As doenças não atendidas ou negligenciadas — infecciosas ou parasitárias — que
afetam milhões de pessoas pobres na América Latina são uma manifestação evidente das
desigualdades prevalecentes em saúde. Neste grupo podem ser incluídas as helmintíases
intestinais, as esquistossomoses, a filariose linfática, a leptospirose, a leishmaniose, a
cisticercose, a doença de Chagas e a malaria. Todas afetam de maneira considerável as
populações indígenas, os grupos étnicos minoritários, os residentes em zonas marginalizadas e
rurais, e os trabalhadores migrantes. Em conjunto, o custo destas doenças em relação à
produtividade dos trabalhadores e, portanto, ao desenvolvimento econômico dos países, é
enorme. O aperfeiçoamento de métodos preventivos e diagnósticos constitui uma prioridade
das políticas de saúde publica do Brasil.
A linha central de pesquisa desta tese visou a predição, seleção, síntese e utilização
peptídeos, epitopos e/ou mimotopos, identificados pela técnica de Phage Display para
desenvolver peptídeos ou imunógenos sintéticos a serem utilizados na produção de anticorpos
vacinais na leishmaniose visceral murina.
As leishmanioses são doenças endêmicas em diversos países no mundo. Em sua grande
maioria, são compostos por países apresentando as menores taxas de desenvolvimento
mundial (Desjeux, 2004). Estima-se que cerca de 370 milhões de pessoas estejam expostas aos
riscos de infecção e que 12 milhões sejam clinicamente afetadas pela doença.
Segundo levantamentos da Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 1,5 a 2
milhões de novos casos de leishmanioses ocorrem a cada ano, dos quais cerca de 1 a 1,5
milhão correspondem a casos de Leishmaniose tegumentar, que corresponde à forma cutânea,
mucocutânea e cutânea difusa da doença e cerca de 500.000 casos de Leishmaniose visceral
(LV). Dessa forma, a Organização Mundial de Saúde classificou as leishmanioses como uma
das principais doenças endêmicas que afetam especialmente os países em desenvolvimento
(WHO, 2003).
A ocorrência da doença em uma dada área depende da presença do vetor e de
reservatório/hospedeiro susceptível. A transmissão se dá a partir da picada de fêmeas
infectadas de dípteros da espécie Lutzomya Longipalpis. Os cães domésticos constituem um
49
importante reservatório e são responsáveis pela natureza endêmica/epidêmica da doença (Silva
et al., 2001).
Neste trabalho, com o objetivo de se identificar novos antígenos, mais sensíveis e
específicos, escolhemos uma nova estratégia de seleção, a técnica de Phage Display.
Phage Display consiste na expressão de milhares de peptídeos na superfície de
bacteriófagos e que permite a seleção daqueles que apresentam maior especificidade
individual a uma molécula alvo e, conseqüentemente, uma ligação de elevada afinidade
(Smith, 1985).
Anticorpos IgG anti-Leishamania chagasi foram previamente purificados do soro de
cães cuja infecção foi confirmada pelas técnicas de ELISA, RIFI e aspirado de medula e
linfonodos. Após a obtenção, quantificação e caracterização, as imunoglobulinas anti-L.
chagasi foram usadas para sensibilizar as placas para a bio-seleção (biopanning). Foram feitos
três ciclos para que a afinidade de ligação dos fagos às imunoglobulinas aumentasse (Smith,
1985), uma vez os fagos selecionados no primeiro ciclo, são amplificados e utilizados no ciclo
seguinte. No terceiro ciclo, a placa foi sensibilizada com uma quantidade cinco vezes menor
de imunoglobulinas e conseqüentemente apenas os fagos que possuíssem uma maior afinidade
pelas moléculas alvo seriam selecionados e amplificados novamente.
Os clones considerados os mais reativos frente ao anticorpo específico foram testados
frente a IgGs de soros de cães comprovadamente negativos, mas nenhum deles apresentou
reatividade. Então, os mesmos foram avaliados frente a IgGs de cães portadores de Doença de
Chagas, experimentalmente infectados com Trypanosoma cruzi, para verificação da
reatividades cruzada. Destes clones, apenas três apresentaram, simultaneamente, alta
reatividade com anticorpo anti L. chagasi e baixa reatividade com anticorpo anti-T. cruzi.
Os três clones positivos (3B, 11H e 12A) reativos, apenas com anticorpos anti-
Leishmania chagasi tiveram seus DNAs obtidos, analisados e seqüenciados. Com a sequência
de nucleotídeos foi determinada a estrutura primária de estes três peptídeos. Para verificar a
existência de seqüências homólogas em proteínas de L. chagasi ou de outros organismos, foi
realizada a análise em banco de dados (BLAST - Altschul et al., 1990) que não encontrou
homologia com nenhuma proteína descrita, sugerindo que estes peptídeos podem ser parte da
estrutura de proteínas até o momento não descritas, ou tratar-se de epitopos conformacionais,
50
ou ainda serem mimotopos (peptídeos que mimetizam um epitopo sem ter a mesma estrutura
primária).
De posse das seqüências de aminoácidos dos três peptídeos, previamente definidos,
estes foram então sintetizados. O método da síntese química manual de peptídeo em fase
sólida (método F-moc) foi utilizada e capaz de produzir peptídeos com alta pureza,
determinada por HPLC (coluna de fase reversa, vydac-C4) e confirmada por espectrometria de
massa, mostrando que o método utilizado para síntese foi eficiente. Outros peptídeos foram
anteriormente sintetizados, seguindo esta mesma metodologia e utilizados para testes de
imunodiagnóstico (Tsang et al.,1989).
Como outra forma de se confirmar a reatividade dos peptídeos selecionados, com
anticorpos anti-L. chagasi, foi empregada a técnica de Spot-Synthesis (Choulier et al., 2001;
Alvarenga et al., 2002; Machado de Ávila et al, 2004), uma das metodologias mais
amplamente utilizadas para a identificação de epitopos. Esta etapa iniciou-se com a síntese
paralela, sobre uma membrana de celulose, dos três peptídeos. Os anticorpos provenientes de
cães portadores da leishmaniose reconheceram os peptídeos 11H e 12A e também
confirmaram os resultados negativos do peptídeo 3B. Além disso, as IgGs de cães normais não
reconheceram nenhum dos peptídeos sintéticos sobre a membrana.
Confirmada a reatividade de alguns peptídeos por Spot-ELISA com anticorpos de cães
portadores de leishmaniose, estes foram individualmente utilizados em programas de
imunização de camundongos pra se verificar o potencial imunoprotetor destes peptídeos.
Como estratégia para aumentar a resposta imune de camundongos BALB/c contra peptídeos,
estes foram individualmente interiorizados em lipossomos e veiculados com hidróxido de
alumínio. Investigações anteriores demonstraram que vários fatores tais como a dose dos
antígenos, rota de imunização e o uso de adjuvantes contribuem para uma indução preferencial
de células para resposta celular do tipo Th1 ou resposta humoral do tipo Th2 (Abbas et al.,
1996).
Pelo fato da vacinação através do uso de imunógenos como proteínas purificadas ou
peptídeos induzirem uma fraca resposta imunológica ou até mesmo tolerância, o uso de
adjuvantes, são usualmente necessários para aumentar a eficácia da vacinação (Freund, 1956,
Warren et al., 1986). Ravindran et al. (2010) demonstraram que grupos de camundongos
imunizados com antígeno de L. donovani e diferentes adjuvantes apresentaram resposta
51
significativa, entretanto, as maiores respostas foram observadas no grupo imunizado com
vacina lipossomal.
Uma vez completado o programa de imunização, o nível de anticorpos anti- peptídeo
nos diferentes grupos de imunização foi verificado através do método ELISA. Apenas no
grupo de camundongos imunizados com o peptídeo 12A foi possível verificar anticorpos anti-
peptideo. Por outro lado, foi confirmada a existência de anticorpos anti- L. chagasi no grupo
imunizado com antígeno bruto e não houve formação de anticorpos anti-peptídeo 11H e não
relacionado, usado como controle negativo. Pode-se dizer que tais peptídeos não são
imunogênicos, ou seja, não induzem uma resposta humoral.
Estudos em modelos murinos têm marcado diferenças biológicas entre as infecções por
L. major, causadora da leishmaniose cutânea, e espécies causadoras da leishmaniose visceral.
Mosmann & Coffman (1989) documentaram subtipos distintos de células T CD4+ incluindo
as células Th1, que induziam ativação de macrófagos e células B produtoras de anticorpos
IgG2a, e células Th2 indutoras da ativação de células B produtoras de anticorpos IgG1, IgA e
IgE e a secreção de citocinas por essas células impedia o desenvolvimento de células Th1.
Recentemente células T CD4+ secretoras de TGF-β e IL-10 foram descritas e classificadas
como subtipo Th3 (Wilson et al., 2005).
Camundongos resistentes (C57BL/6 e C3H) desenvolvem o subtipo Th1 de resposta
com células produtoras de IFN-γ, IL-12, TNF-α e IL-2 durante a infecção por espécies
causadoras de leishmaniose visceral. Assim como camundongos susceptíveis à infecção por L.
major, há baixa produção de IFN-γ por camundongos BALB/c infectados por Leishmania sp
causadora de doença visceral (Melby et al., 2001b, Wilson et al., 1996). Apesar de
semelhanças na indução de uma resposta imune protetora, mecanismos imunopatogênicos da
leishmaniose visceral ainda não foram elucidados (Lehmann et al., 2000).
Nosso resultado referente às dosagens de citocinas não se mostraram conclusivos, visto
que não houve diferença significativa entre os diferentes grupos de camundongos estudados.
É possível que a proteção induzida pela imunização com os peptídeos sintéticos seja associada
aos níveis não observados de anticorpos, uma vez que camundongos que responderam com
títulos altos e baixos de anticorpos foram suscetíveis e resistentes, respectivamente, a infecção
por L. amazonensis (Lima et al., 1998).
52
A proteção induzida contra L. chagasi pela imunização com peptídeos sintéticos foi
observada após 30 dias de infecção. Os resultados sugerem que o grupo imunizado com o
peptídeo 11H apresenta um número menor de parasitas por mg de tecido. Embora os
resultados não apresentem diferenças estatísticas significativas, acreditamos que o curto tempo
de infecção e as variações no desvio padrão de cada grupo tenham sido determinantes nos
resultados observados. Pensamos que um maior tempo de infecção será necessário para obter
resultados estatisticamente significativos.
53
7- CONCLUSÕES
A técnica de Phage Display permitiu selecionar fagos expressando peptídeos com
afinidade para anticorpos purificados de cães portadores de leishmanisose visceral.
A técnica de Spot Síntese permitiu confirmar a reatividade de duas sequências
peptídicas KCPSIPGAVLCV e ICARQDPAGNCS contra anticorpos anti-
L.chagasi.
As sequências peptídicas obtidas não apresentaram homologia estrutural com
outras sequências presentes em Banco de dados da Leishmania ou de outros
parasitas, sugerindo que estes peptídeos podem ser epitopos comformacionais ou
mimotopos.
A imunização com o peptídeo 12A incorporado em lipossomos foi capaz de
induzir uma resposta de anticorpos.
Não foi possível avaliar a resposta celular nos animais imunizados com
peptídeos sintéticos.
A imunização de camundongos com peptídeos sintéticos induziu uma resposta
protetora contra a infecção experimental pelo L. chagasi, avaliada através da
carga parasitária no baço dos animais.
54
8- PERSPECTIVAS
Repetir os ensaios de imunização com peptídeos sintéticos usando diferentes
esquemas de imunização.
Repetir os ensaios de imunopproteção com maiores tempos de infecção pelo L.
chagas.
Fazer ensaios de infecção in vitro de macrófagos utilizando diferentes quantidades
de células.
Imunolocalização no parasita de antígenos mimetizados pelos peptídeos sintéticos.
Desenvolvimento e padronização de um teste de ELISA para LVC utilizando
como antígenos os peptídeos sintéticos.
55
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