Download PDF
ads:
Londrina - PR
2010
Centro de Ciências Agrárias
Depto. de Ciência e Tecnologia de Alimentos
Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos
Desenvolvimento de ingrediente
simbiótico por fermentação de soro de
leite e do subproduto da agroindústria de
suco de laranja por grãos de Kefir e
cultura probiótica
Eduardo Vinicius Baptista
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Londrina - PR
2010
Centro de Ciências Agrárias
Depto. de Ciência e Tecnologia de Alimentos
Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos
Desenvolvimento de ingrediente simbiótico
por fermentação de soro de leite e do
subproduto da agroindústria de suco de
laranja por grãos de Kefir e cultura probiótica
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciência de Alimentos,
nível Mestrado, da Universidade Estadual
de Londrina, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Ciência
de Alimentos.
Aluno: Eduardo Vinicius Baptista
Orientadora: Profa. Dra. Sandra Garcia
ads:
EDUARDO VINICIUS BAPTISTA
DESENVOLVIMENTO DE INGREDIENTE SIMBIÓTICO POR
FERMENTAÇÃO DE SORO DE LEITE E DO SUBPRODUTO
DA AGROINDÚSTRIA DE SUCO DE LARANJA POR
GRÃOS DE KEFIR E CULTURA PROBIÓTICA
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Profa. Dra. Sandra Garcia (orientadora)
Universidade Estadual de Londrina
________________________________________
Prof.Dr. Raúl Jorge Hernan Castro-Gómez
DCTA/CCA/UEL
________________________________________
Prof.Dr. Cláudio Takeo Ueno
UTFPR/Londrina
Londrina, 27 de agosto de 2010.
À minha mãe, Maria Aparecida, e minha
irmã, Rachel Rossine, pela ajuda em
todos os momentos difíceis e amor que
têm por mim.
A minha noiva Isabella, por todo o amor,
carinho, dedicação, estímulo, paciência e
compreensão pelo meu ser.
“Seja humilde, pois, até o sol com toda sua
grandeza se põe e deixa a lua brilhar.”
“Não cruze os braços diante de uma
dificuldade, pois o maior homem do mundo
morreu de braços abertos!”
“Preocupe-se mais com a sua consciência do
que com sua reputação. Porque sua
consciência é o que você é, e a sua reputação
é o que os outros pensam de você. E o que os
outros pensam, é problema deles.”
“As vezes construímos sonhos em cima de
grandes pessoas... O tempo passa... e
descobrimos que grandes mesmo eram os
sonhos e as pessoas pequenas demais para
torná-los reais!”
(Robert Nesta Marley)
“Se A é o sucesso, então A é igual a X mais Y
mais Z; Onde X = trabalho; Y = lazer; e Z =
manter a boca fechada.”
(Albert Einstein)
AGRADECIMENTOS
À minha mãe por sempre me ajudar, em todos os momentos, me
amparando e permitindo que eu finalizasse este projeto.
À minha irmã, pela sua ajuda e dedicação.
A minha noiva maravilhosa que por todas as vezes esteve ao meu
lado, me ajudando e me aturando com minhas manias.
À minha orientadora, Prof. Dra. Sandra Garcia.
À SACCO, pela cultura Lyofast MT 036 LV, e Dominic Anfiteatro,
pelos grãos de Kefir, que foram fundamentais para a realização da pesquisa.
A CAPES, pela concessão da bolsa de estudos.
BAPTISTA, EDUARDO VINICIUS. Desenvolvimento de ingrediente simbiótico
por fermentação de soro de leite e do subproduto da agroindústria de suco de
laranja por grãos de Kefir e cultura probiótica. 2010. 69f. Dissertação de
Mestrado em Ciência de Alimentos – Universidade Estadual de Londrina, Londrina,
2010.
RESUMO
O mercado para produtos com diferenciado conteúdo de nutrientes continua a
crescer. Neste contexto, este trabalho objetivou desenvolver um ingrediente
simbiótico a base de subprodutos de agroindústrias. Para isto, foi utilizado soro de
leite reconstituído em 7% (p/v), o qual foi fermentado com 10 e 1% (p/v) das culturas
de grãos de Kefir e cultura Lyofast MT 036 LV, respectivamente, sob temperatura de
25°C por 24 horas. Após o processo fermentativo, o bagaço de laranja, previamente
esterilizado por 15 minutos a 121°C, foi adicionado ao soro fermentado na proporção
1:1 (p/v) com a finalidade de fornecer fibras e auxiliar o processo de secagem, que
foi realizada à temperatura de 40°C. Análises de viabilidade celular, pH, umidade,
Aw, exopolissacarídeos e pectina foram realizadas antes e após a secagem. As
contagens de bactérias lácticas, de Lactococcus spp. e de leveduras foram
determinadas utilizando os Agar MRS, M17 e BDA, respectivamente; as análises de
pH, umidade e Aw foram realizadas segundo métodos oficiais; os percentuais de
pectina foram determinados através do KIT Pectin Identification – Megazyme; e a
quantificação de exopolissacarídeos como EPS-equivalente. A estabilidade dos
microorganismos foi avaliada durante 3 meses de armazenamento. As amostras
foram mantidas em saches BOPP metalizado e estocadas sob temperatura de 25°C.
Durante o armazenamento, análises microbiológicas e físico-químicas foram
realizadas a cada 30 dias. Tanto no ingrediente simbiótico fermentado pelos grãos
de Kefir quanto no fermentado pela cultura Lyofast, a contagem de bactérias lácticas
e de Lactococcus spp. foi mantida em 10
7
UFC/g. A contagem de leveduras no
ingrediente simbiótico fermentado pela cultura Lyofast foi de 10
5
UFC/g e no
ingrediente simbiótico fermentado com o Kefir foi de 10
7
UFC/g. Foi realizado o teste
sensorial de aceitação, no qual 10% (p/p) dos ingredientes simbióticos foram
adicionados em uma barra de cereais com formulação caseira. Para as bactérias
lácticas, a viabilidade celular encontrada em ambos os ingredientes simbióticos foi
similar, atingindo ao final do período 7,07 e 7,22 ciclos log/g para Lyofast e Kefir,
respectivamente. Para os Lactococcus spp. foram encontrados os valores de 7,8
ciclos log/g para a Lyofast e 7,62 ciclos log/g para o Kefir. No ingrediente simbiótico
fermentado por grãos de kefir as leveduras estavam presentes em números de 7,53
ciclos log/g e no ingrediente simbiótico fermentado com a cultura Lyofast 5,53 ciclos
log/g. No teste de aceitação foi verificado que as 3 amostras analisadas
apresentaram notas semelhantes, sem diferença estatística a um nível de 95% de
confiança (p=0,05). As barras de cereais adicionadas dos ingredientes simbióticos
desenvolvidos foram bem aceitas pelos consumidores com índices de aceitação de
93% para Lyofast e 91% para Kefir. Os ingredientes simbióticos desenvolvidos no
presente trabalho podem ser uma alternativa para a reutilização dos subprodutos
testados e para a diversificação de produtos com propriedades funcionais.
Palavras-chave: Probiótico. Prebiótico. Bagaço de laranja. Soro em pó. Kefir.
BAPTISTA, EDUARDO VINICIUS. DEVELOPMENT OF SYMBIOTIC INGREDIENT
BY FERMENTATION OF WHEY AND BY-PRODUCT OF ORANGE JUICE
INDUSTRY BY KEFIR GRAINS AND FREEZE-DRIED PROBIOTIC CULTURE.
2010. 69P. DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS –
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA, LONDRINA, 2010.
ABSTRACT
The market for healthy products or with a diversity of nutrients continues to grow. In
this context, this study aimed to develop a ingredient symbiotic based on byproducts
of agro-industry with a functional potential. For this, milk whey reconstituted at 7 %
(w/v) was fermented with 10 and 1 % (w/v) by Kefir grains and Lyofast MT 036 LV,
respectively, at a temperature of 25°C for 24 hours. After the fermentative process,
the Orange peel, sterilized for 15 minutes at 121 °C, was added to fermented whey in
the ratio 1:1 (w/v) in order to provide fiber and help the drying process, which was
performed at a temperature of 40°C for 2-3 days. Samples for determination of cell
viability, pH, moisture, Aw, exopolysaccharides and pectin were taken before and
after drying process. Lactic acid bacteria (LAB), Lactococcus spp. and yeasts counts
were determined using MRS Agar, M17 and BDA, respectively; the pH, moisture and
Aw were performed according to official methods, the percentage of pectin were
determined by Kit Pectin Identification – Megazyme, and quantification of
exopolysaccharides as EPS-equivalent. The stability of microorganisms presents in
the symbiotic ingredients was evaluated during three months of storage. Samples
were kept in BOPP metalized sachets and stored at 25°C. During storage,
microbiological and physical-chemical testes were performed every 30 days. In both
symbiotic ingredients fermented by kefir grains as the fermented ingredient by culture
Lyofast, LAB counts and Lactococcus spp. were maintained at 10
7
CFU/g. The yeast
count in the symbiotic ingredient fermented by Lyofast culture was 10
5
CFU/g and
for the ingredient fermented with Kefir was 10
7
CFU/g. Sensory testing was
performed for acceptance, in which 10% (w/w) of the ingredient was added to a
homemade cereal bar formulation. For LAB, cell viability in both symbiotic
ingredients was similar, reaching at the end of the storage period 7,07 and 7,22 log
cycles/g for Lyofast and Kefir, respectively. For Lactococcus spp. were found values
of 7.8 log cycles/g for Lyofast and 7,62 log cycles/g for Kefir. Yeasts, had a greater
survival in the ingredient symbiotic fermented with Kefir grains (7,53 log cycles/g) and
lowest for the fermented ingredient increased with the Lyofast culture (5,53 log
cycles/g). In acceptance testing, it was found that the three samples analyzed had
similar notes, but with a statistical difference at the 95% confidence (p=0,05). Both
ingredients symbiotic developed were well accepted by consumers with acceptance
rate of 93% and 91% for Lyofast and Kefir respectively. The symbiotic ingredients
developed in this study could be an alternative for the reuse of products tested and to
the diversification of products with functional properties.
Key-words: Probiotics. Prebiotics. Orange peel. Whey. Kefir
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Lista das espécies (por ordem alfabética) que integram os gêneros
Bifidobacterium e Lactobacillus. .............................................................................. 9
Figura 2 - reações dos ingredientes alimentares probióticos e prebióticos com a
microbiota intestinal, relativo aos seus efeitos sobre a saúde. .............................. 16
Figura 3 - Volume anual de soro de leite produzido no mundo (1995-2005). ........... 20
Figura 4 - Processo de preparo do soro fermentado com a cultura Lyofast MT 036
LV. ......................................................................................................................... 25
Figura 5 - Processo de preparo do soro fermentado com a cultura de grãos de Kefir.
............................................................................................................................... 26
Figura 6 - Processo de secagem após adição do soro fermentado ao bagaço de
laranja esterilizado. ................................................................................................ 27
Figura 7 - Médias em log de determinações realizadas em duplicatas para células
viáveis de bactérias lácticas após a fermentação do soro de leite (7% p/v) com a
cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os grãos de Kefir. .............................. 36
Figura 8 - Médias em log de determinações realizadas em duplicatas para as células
viáveis de Lactococcus spp. após a fermentação do soro de leite (7% p/v) com a
cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os grãos de Kefir. .............................. 37
Figura 9 - Médias em log de determinações realizadas em duplicatas para as células
viáveis de leveduras após a fermentação do soro de leite (7% p/v) com a cultura
liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os grãos de Kefir. ......................................... 38
Figura 10 - Soro de leite fermentado com as culturas de grãos de Kefir (A) e Lyofast
MT 036 LV (B) ) a 25°C por 24 horas. ................................................................... 39
Figura 11 - Bagaço de laranja esterilizado a 121°C por 15 minutos. ........................ 40
Figura 12 - Médias em log de determinações realizadas em duplicatas para células
viáveis de bactérias lácticas pós fermentação do soro de leite e pós adição do
bagaço de laranja e secagem. ............................................................................... 41
Figura 13 - Médias em log de determinações realizadas em duplicatas para células
viáveis de Lactococcus spp. pós fermentação do soro de leite e pós adição do
bagaço de laranja e secagem. ............................................................................... 42
Figura 14 - Médias em log de determinações realizadas em duplicatas de Leveduras
pós fermentação do soro de leite e pós adição do bagaço de laranja e secagem. 43
Figura 15 - Ingrediente simbiótico desidratado fermentado com grãos de Kefir (A) e
com a cultura Lyofast MT 036 LV (B)..................................................................... 45
Figura 16 - Média de duas determinações em log para a viabilidade de bactérias
lácticas durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbiótico fermentado
com Kefir e cultura Lyofast MT 036 LV. ................................................................. 46
Figura 17 - Média de duas determinações em log para a viabilidade de Lactococcus
spp. durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbiótico fermentado
com Kefir e cultura Lyofast MT 036 LV. ................................................................. 47
Figura 18 - Média de duas determinações em log para a viabilidade de leveduras
durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbiótico fermentado com
Kefir e cultura Lyofast MT 036 LV. ......................................................................... 48
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição centesimal do soro de leite integral. .................................... 24
Tabela 2 - Média de determinações realizadas em duplicatas para análise de pH do
soro de leite fermentado com a cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os
grãos de Kefir. ....................................................................................................... 39
Tabela 3 - Médias de determinações realizadas em duplicatas da concentração de
exopolissacarídeos pós fermentação e pós adição do bagaço de laranja e
secagem. ............................................................................................................... 41
Tabela 4 - Médias de determinações realizadas em duplicata para o pH das culturas
fermentadas antes e após a adição do bagaço de laranja no processo de
secagem. ............................................................................................................... 43
Tabela 5 - Percentual de pectina do bagaço de laranja in natura e após sua adição
ao soro fermentado com os grãos de Kefir e com a cultura Lyofast MT 036 LV para
o processo de secagem. ........................................................................................ 44
Tabela 6 - Médias de determinações realizadas em duplicatas para o percentual de
umidade do bagaço in natura, do soro fermentado acrescido de bagaço de laranja
e do produto final para as diferentes culturas. ....................................................... 44
Tabela 7 - Médias de determinações realizadas em duplicatas da concentração de
exopolissacarídeos pós fermentação, pós adição do bagaço de laranja e secagem
e durante 3 meses de armazenamento. ................................................................ 48
Tabela 8 - Análise de bactérias lácticas, Lactococcus spp. e leveduras presente na
porção (10g) fornecida aos consumidores. ............................................................ 49
Tabela 9 - Análise de microorganismos patogênicos e indicadores e respectivos
padrões microbiológicos exigidos pela legislação vigente para “Leite de bovinos e
de outros mamíferos e derivados em pó” .............................................................. 50
Tabela 10 - Médias de aceitação do teste de escala hedônica para as amostras 1, 2
e 3. ......................................................................................................................... 51
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 5
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................ 7
2.1 Probióticos ........................................................................................................ 7
2.1.1 Kefir ............................................................................................................. 11
2.1.2 Bactérias Lácticas (BAL) ............................................................................. 12
2.1.2.1 Lactococcus lactis spp. ............................................................................... 13
2.1.3 Leveduras ................................................................................................... 14
2.2 Prebióticos ...................................................................................................... 15
2.2.1 Fibras .......................................................................................................... 17
2.2.1.1 Pectina ........................................................................................................ 18
2.3 Soro de leite ................................................................................................... 19
2.4 Bagaço de laranja ........................................................................................... 20
3 OBJETIVOS ....................................................................................................... 22
3.1 Objetivo Geral ................................................................................................. 22
3.2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 22
4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 23
4.1 Materiais ......................................................................................................... 23
4.1.1 Kefir ............................................................................................................. 23
4.1.2 Bagaço de laranja ....................................................................................... 24
4.1.3 Soro de Leite em pó .................................................................................... 24
4.2 Métodos .......................................................................................................... 25
4.2.1 Preparo e fermentação das culturas ........................................................... 25
4.2.2 Secagem dos substratos ............................................................................. 26
4.2.3 Viabilidade celular ....................................................................................... 27
4.2.3.1 Contagem de bactérias lácticas .................................................................. 28
4.2.3.2 Contagem de Lactococcus spp. .................................................................. 28
4.2.4 Contagem de Leveduras ............................................................................. 29
4.2.5 Armazenamento .......................................................................................... 29
4.2.6 Determinação de pectina total no bagaço de laranja .................................. 30
4.2.7 Quantificação de Exopolissacarídeos (EPS) ............................................... 30
4.2.8 Análises físico-químicas .............................................................................. 31
4.2.9 Análise microbiológica ................................................................................ 32
4.2.10 Análise sensorial ......................................................................................... 32
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 36
5.1 Fermentação do soro de leite ......................................................................... 36
5.2 Adição do bagaço de laranja e sobrevivência à secagem .............................. 39
5.3 Armazenamento ............................................................................................. 46
5.4 Análises Microbiológicas ................................................................................ 50
5.5 Análise sensorial ............................................................................................ 51
6 CONCLUSÕES .................................................................................................. 54
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 55
5
1 INTRODUÇÃO
Atualmente, com a crescente procura dos consumidores por
melhores condições de vida e saúde, a indústria de alimentos tem focado na
produção de novos produtos com características funcionais. Devido às propriedades
que estes produtos apresentam, como redução do colesterol, diminuição da
absorção de gorduras, melhora do funcionamento do trato intestinal (OLIVEIRA et
al., 2002), entre outras, os consumidores estão cada vez mais preocupados em
obter informações sobre os alimentos funcionais, assim como mudar seus hábitos
alimentares. Com isso, o mercado para produtos com apelo saudável ou com
diferenciado conteúdo de nutrientes (baixa caloria, enriquecidos com fibras, etc.)
continua a crescer. No contexto de busca de novos produtos funcionais, os
probióticos e prebióticos têm sido estudados como ingredientes em vários alimentos.
Os probióticos são microorganismos vivos que ao serem
administrados em quantidades adequadas conferem benefícios a saúde do
hospedeiro (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2001; SANDERS, 2003), sendo as
bactérias pertencentes aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium as mais
utilizadas como probióticos. Neste aspecto, destaca-se a utilização dos grãos de
Kefir que são constituídos de uma microbiota variada, tendo como principais
constituintes bactérias do gênero lactobacilos e leveduras (Saccharomyces,
Kluyveromyces, Candida e Picchia). Estes grânulos são tradicionalmente utilizados
para produção de leites fermentados de baixo teor alcoólico (ANFITEATRO, 2000) e
apresentam algumas culturas com propriedades probióticas.
Já os prebióticos são componentes alimentares não digeríveis que
afetam beneficamente o hospedeiro, por estimularem seletivamente a proliferação
ou atividade de populações de bactérias desejáveis no cólon. Adicionalmente, o
prebiótico pode inibir a multiplicação de patógenos, garantindo benefícios adicionais
à saúde do hospedeiro (SAAD, 2006). Esses componentes atuam mais
freqüentemente no intestino grosso, embora também possam ter algum impacto
sobre os microrganismos do intestino delgado (GIBSON, ROBERFROID, 1995;
ROBERFROID, 2001; GILLILAND, 2001; MATTILA-SANDHOLM et al., 2002). Dentre
os prebióticos, destacam-se diversos tipos de fibras que podem ser classificadas
como solúveis, insolúveis ou mistas, podendo ser fermentáveis ou não-fermentáveis.
6
A nova definição de fibra da dieta sugere a inclusão de oligossacarídeos e de outros
carboidratos não-digeríveis (GIBSON e ROBERFROID, 1995). Dentro do grupo de
fibras solúveis e fermentáveis encontra-se a pectina, a qual não é digerida pela α-
amilase e por enzimas hidrolíticas, como a sacarase, a maltase e a isomaltase, na
parte superior do trato gastrointestinal (CARABIN, FLAMM, 1999), e pode ser obtida
de diversos extratos vegetais.
O Brasil é o maior produtor mundial e maior exportador de suco de
laranja (LOPES et al., 2006). O bagaço da laranja é um dos resíduos que em sua
maioria é destinado à alimentação animal; porém, grande parte é destinada a aterros
e usinas de compostagem, sendo considerado um problema ambiental. Sendo o
bagaço da laranja um resíduo obtido da extração industrial de suco e rico em pectina
(BELITZ e GROSCH, 1997; EL NAWAWI e SHEHATA, 1987), uma possível forma
de reaproveitamento economicamente interessante deste resíduo é a utilização da
pectina, um polissacarídeo estrutural que é utilizado como ingrediente espessante e
estabilizante (BOBBIO e BOBBIO, 1995), além de apresentar propriedades
prebióticas (FOOKS, FULLER, GIBSON, 1999).
A indústria de queijo tem como subproduto o soro de leite, o qual
corresponde a cerca de 80 % do volume total do leite utilizado na cadeia de
produção do queijo. O soro é reutilizado por algumas indústrias para a recuperação
de nutrientes, síntese de enzimas, formulação de alguns produtos lácteos, etc.
(SOORO, 2009). Sendo um subproduto altamente poluente, com uma BOD –
demanda bioquímica de oxigênio cerca de 175 vezes maior do que a BOD de
efluentes de esgoto (SMITHERS, 2008), sendo assim um subproduto que requer
muita atenção.
Diante de todas as informações relatadas acima, este trabalho teve
como objetivo a fermentação do soro de leite com grãos de Kefir e com uma cultura
liofilizada de microorganismos probióticos e utilização do bagaço de laranja, resíduo
da indústria de suco, como aditivo de sabor, aroma e fibras, para a produção de um
novo produto com características funcionais.
7
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 PROBIÓTICOS
Determinados grupos de bactérias, principalmente as láticas, além
de atuarem favoravelmente no produto alimentício ao qual foram adicionados, fazem
parte dos microrganismos capazes de exercer efeitos benéficos no hospedeiro,
sendo denominados de microrganismos probióticos. Um microrganismo probiótico
deve necessariamente sobreviver às condições adversas do estômago e colonizar o
intestino, mesmo que temporariamente, por meio da adesão ao epitélio intestinal
(ZIEMER, GIBSON, 1998) e desta forma realizar diversas funções que proporcionam
benefícios ao hospedeiro.
Em condições normais, inúmeras espécies de bactérias estão
presentes no intestino, a maioria delas anaeróbias estritas. A microbiota intestinal
exerce influência considerável sobre uma série de reações bioquímicas do
hospedeiro. Paralelamente, quando em equilíbrio, a microbiota impede que
microrganismos potencialmente patogênicos nela presentes exerçam seus efeitos
prejudiciais. Por outro lado, o desequilíbrio dessa microbiota pode resultar na
proliferação dos microrganismos patógenos, com conseqüente infecção bacteriana
(ZIEMER, GIBSON, 1998).
Segundo Goldin (1998), a palavra probiótico foi introduzida por Lilly e
Stillwell, em 1965, para descrever microorganismos que desempenham atividades
benéficas. Hoje em dia, podem ser encontradas varias outras definições para estes
microrganismos, sendo a mais aceita atualmente a de que probióticos são
microorganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas
conferem benefícios a saúde do hospedeiro (WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2001; SANDERS, 2003).
Dentre as diversas espécies pertencentes aos gêneros Lactobacillus
e Bifidobacterium (Figura 1), somente algumas são consideradas probióticas, sendo
utilizadas em uma ampla quantidade de produtos com características funcionais.
Porém no Brasil somente os L. acidophilus, L. casei shirota, L. casei variedade
8
rhamnosus, L. casei variedade defensis, L. paracasei, Lactococcus lactis,
Bifidobacterium bifidum, B. animalis (incluindo a subespécie B. lactis), B. longum, e
Enterococcus faecium são considerados probióticos (ANVISA, 2007).
9
Figura 1 - Lista das espécies (por ordem alfabética) que integram os gêneros
Bifidobacterium e Lactobacillus.
Fonte: GOMES e MALCATA, 1999.
As espécies probióticas apresentam diversos efeitos biológicos.
Segundo Fuller (1989), há três possíveis mecanismos de atuação dos probióticos. O
10
primeiro deles refere-se à supressão do número de células viáveis de
microorganismos patogênicos mediante produção de compostos com atividade
antimicrobiana, a competição por nutrientes e a competição por sítios de adesão. O
segundo desses mecanismos seria a alteração do metabolismo microbiano, pelo
aumento ou diminuição da atividade enzimática. O terceiro seria o estímulo da
imunidade do hospedeiro, por meio do aumento dos níveis de anticorpos e o
aumento da atividade dos macrófagos. De acordo com Naidu e Clemens (2000), o
espectro de atividade dos probióticos pode ser dividido em efeitos nutricionais,
fisiológicos e antimicrobianos.
Diversos autores vêm sugerindo possíveis efeitos benéficos de
culturas probióticas sobre a saúde do hospedeiro. Entre esses efeitos benéficos,
merecem destaque o controle das infecções intestinais, o estímulo da motilidade
intestinal, com conseqüente alívio da constipação intestinal, a melhor absorção de
determinados nutrientes, a melhor utilização de lactose e o alívio dos sintomas de
intolerância a esse açúcar, a diminuição dos níveis de colesterol, o efeito
anticarcinogênico e o estímulo do sistema imunológico, pelo aumento da produção
de anticorpos e da atividade fagocítica contra patógenos no intestino e em outros
tecidos do hospedeiro, além da exclusão competitiva e da produção de compostos
antimicrobianos (SANDINE et al., 1972; GILLILAND, SPECK, 1977; KIM,
GILLILAND, 1983; FULLER, 1989; GILLILAND, 1989; TEJADA-SIMON et al., 1999;
GOMES, MALCATA, 1999; SHORTT, 1999; SREEKUMAR, HOSONO, 2000;
NAIDU, CLEMENS, 2000).
É interessante citar também que as bactérias probióticas só
apresentam efeitos benéficos no ambiente intestinal quando presentes em um
número mínimo. Por exemplo, o número de L. rhamnosus para reduzir
significativamente a ocorrência da chamada diarréia dos viajantes é de 10
9
UFC/g
(OKSANEN et al., 1990). Assim, considerando um consumo de produtos probióticos
de 100 g, estes devem conter pelo menos 10
7
UFC de bactérias probióticas viáveis
por grama no momento da compra do produto. Este é o número recomendável por
diversos autores (RYBKA, FLEET, 1997; VINDEROLA, RENHEIMER, 2000). Porém,
na legislação brasileira o número estaria entre 10
6
-10
7
células viáveis por mL ou g
do produto na porção diária (ANVISA, 2007).
11
2.1.1 Kefir
O Kefir é derivado da palavra Keif oriunda da Turkia e significa “bem-
estar”, devido à sensação e aos benefícios que ele promove à saúde humana. Pode
ser produzido com leite fresco e é considerado uma cultura starter, sendo utilizado
em diversos processos, como por exemplo, a fabricação de pães. O Kefir apresenta
cerca de 40 componentes aromáticos e podem conter até 2% de álcool; entretanto,
apenas 0,05% a 0,1% de álcool é produzido realmente em 1 dia de fermentação
com os grãos de Kefir. Ele é considerado um alimento funcional, devido à
capacidade de promover benefícios à saúde e resistência a doenças, e também por
apresentar componentes nutricionais (ANFITEATRO, 2000),
A origem do Kefir vem das montanhas Caucasianas, possivelmente
no nordeste de Ossetia, onde tribos locais têm preparado esta “bebida” por cerca de
1000 anos. Estas pessoas são conhecidas pela sua longevidade e boa saúde e o
Kefir é apontado como um dos maiores contribuintes para isto. O Kefir é conhecido
como bebida dos profetas pelas tribos locais e também como os grãos do profeta
Mohamed (TRUM, 1973).
O Kefir é uma suspensão de microrganismos simbiontes formada
por um grande número de cepas de bactérias (predominantemente ácido lácticas -
BAL) e de leveduras, ambas encapsulados em uma matriz de polissacarídeos
secretados pelas BAL (DINIZ et al., 2003).
Os grãos de Kefir produzem uma bebida fermentada utilizada no
ocidente por suas propriedades sensoriais, uso tradicional na medicina popular e
também devido ao fato de alguns microorganismos presentes no Kefir apresentarem
propriedades probióticas. O produto fermentado resulta em uma solução ácida
contendo compostos aromáticos, gás carbônico e etanol. Macroscopicamente, o
Kefir apresenta-se como grãos gelatinosos, medindo de 3 a 20 mm de tamanho e
com propriedades sensoriais definidas para cada combinação microbiológica
(ANFITEATRO, 2000).
12
2.1.2 Bactérias Lácticas (BAL)
As bactérias lácticas (BAL) foram descritas por Orla-Jensen (1919)
para designar um grupo fisiológico de Gram-positivos que fermentam carboidratos a
ácido láctico e também a outros compostos como ácido acético, álcool e dióxido de
carbono. Tem preferência por condições anaeróbias porém são aerotolerantes, não
esporuladas e catalase negativas (VASILJEVIC; SHAH, 2008). Dentre os principais
gêneros, destacam-se Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus e
Pediococcus. Alguns autores sugerem que o gênero Bifidobacterium pertença ao
grupo das bactérias lácticas, entretanto apresentam em seu DNA maiores
quantidades de pares de G+C (guanina-citosina) e assim diferenças filogenéticas em
relação aos outros gêneros (VASILJEVIC; SHAH, 2008).
Revisões taxonômicas destes gêneros sugerem que BAL
compreendem: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,
Vagococcus, Weissella, Lactosphaera e Paralactobacillus (LEISNER et al., 2000).
Amplamente distribuídas, BAL tem sido utilizadas em todo o mundo
para melhorar a preservação, características sensoriais e valor nutricional de uma
ampla variedade de produtos. Isso porque algumas linhagens são capazes de
converter açucares, ácidos orgânicos, proteínas ou gorduras em componentes de
aroma e sabor e também podem contribuir para melhorar a textura e a viscosidade
de produtos fermentados por meio da síntese de exopolissacarídeos (RUAS-
MADIEDO; HUGENHOLTZ; ZOON, 2002).
Algumas espécies de bactérias lácticas produzem substâncias
antimicrobianas como ácido láctico, peróxido de hidrogênio, dióxido de carbono,
diacetil, acetaldeído e bacteriocinas (NAIDU et al., 1999). A ação antagonista de
espécies de BAL contra microorganismos indesejáveis em alimentos tem sido
descrita em vários trabalhos. Muitas BAL isoladas de leite e queijos apresentaram
poder de inibição frente a patógenos e deteriorantes, como Staphylococcus spp.,
Listeria spp., Salmonella spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp. e coliformes
(VAUGHAN et al., 1994; BRASHEARS e DURRE, 1999; URAZ et al., 2001;
ALEXANDRE, 2002; CARIDI, 2003).
13
2.1.2.1 Lactococcus lactis
Lactococcus lactis são bactérias gram-positivas, anaeróbias
facultativas pertencentes ao grupo das bactérias ácido lácticas (BAL), devido a sua
capacidade de converter a lactose presente no substrato em ácido láctico via
fermentação. Por isto, estas bactérias são utilizadas em diversos processos
envolvendo alimentos fermentados (vegetais, leite e carne), onde são responsáveis
pela preservação e características sensoriais, assim como pela cor, textura e sabor
(MIYOSHI et al., 2003).
Os Lactococcus lactis são mesófilos, com crescimento ótimo em
temperatura de 30°C , sendo fermentadores microaerófilos (DUWAT et al., 2000).
Estas bactérias são comumente encontradas na natureza, sob a superfície de
plantas e animais, sendo muito utilizadas na Indústria de Laticínios para a produção
de fermentados, como queijo e manteiga.
Alguns autores consideram determinadas espécies de Lactococcus
spp. probióticas (SANDERS AND HUIS IN’T VELD, 1999; BLANDINO et al., 2003;
VINDEROLA e REINHEIMER, 2003, citados por ESPINOZA e GALLARDO-
NAVARRO, 2010) . Em um estudo que visava verificar as características probióticas
dos microorganismos encontrados nos grãos de Kefir oriundos da Turkia, através da
produção de ácido lático, peróxido de hidrogênio, atividade antimicrobiana e
produção de diacetil e acetaldeído, Yüksekdag, Beytali e Aslim (2004), verificaram
que as linhagens de Lactococcus cremoris e Lactococcus lactis apresentaram
propriedades que podem caracterizá-las como probióticas e de possível uso na
produção de produtos com alto potencial funcional.
Considerando que os grãos de Kefir utilizados no trabalho contém 2
linhagens de Lactococcus lactis, é interessante ressaltar a sua importância na
contribuição das propriedades sensoriais e probióticas do ingrediente simbiótico
obtido que poderá ser utilizado em diversos tipos de alimentos.
14
2.1.3 Leveduras
Leveduras são fungos unicelulares, que se reproduzem
assexuadamente por brotamento ou gemulação, tem crescimento ótimo entre 25°C e
0°C e se desenvolvem bem em pH ácido. Elas apresentam alta diversidade
fisiológica e por isso podem crescer em vários tipos de habitat (JACQUES e
CASAREGOLA, 2008). Esta diversidade tem sido estudada para o desenvolvimento
de um grande número de produtos, para produção de metabólitos industriais, e em
vários processos biotecnológicos, como a produção de proteínas e enzimas.
Algumas espécies de leveduras também são usadas como probióticos, como é o
caso da Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces boulardii (POSTERATO et al.,
2005).
As leveduras são heterotróficas e para seu crescimento requerem
nutrientes minerais e quantidade significante de carbono. A maioria das leveduras
cresce em uma ampla variação de valores de pH, o que permite a elas, em
particular, colonizarem materiais que já apresentam processo fermentativo por
bactérias (LACHANCE e STARMER, 1998). Leveduras são freqüentemente
encontradas em alimentos manufaturados que contém gordura ou grande
quantidade de açúcar. Em animais elas são encontradas na pele e também no trato
gastrointestinal.
Alguns trabalhos citam propriedades probióticas da levedura
Saccharomyces boulardii, onde em infecções experimentais, foram extensivamente
estudadas. Ensaios em humanos, assim como estudos in vitro, mostraram que a S.
boulardii apresenta papel protetor contra alguns patógenos entéricos que provocam
diarréias (CZERUCKA e RAMPAL, 2002; MANSOUR-GHANAEI et al., 2003).
Além da S. boulardii, a S.cerevisiae também é relatada em alguns
trabalhos como probiótica. Em um estudo feito com S.cerevisiae foi relatada a
eficácia da mesma no combate a diarréias em humanos (KOVACS e BERK, 2000).
Na dieta de ruminantes a S. cerevisiae é muito utilizada, pois ela estimula a atividade
dos microorganismos benéficos do trato gastrointestinal, aumentando desta forma a
digestibilidade de nutrientes e o potencial de produção dos animais (NEWBOLD et
al., 1995; WOHLT et al., 1998).
15
2.2 PREBIÓTICOS
Os prebióticos são “ingredientes alimentares não digeríveis por
humanos que exercem um efeito benéfico no indivíduo, estimulando seletivamente o
crescimento e/ou atividade de espécies bacterianas benéficas existentes no cólon
(Figura 2), melhorando a saúde do hospedeiro”. Estes ingredientes, normalmente de
natureza glicídica (geralmente oligossacarídeos), devem ser indigeríveis pelas
enzimas digestivas, alçando o intestino grosso intactos, onde serão especificamente
utilizados por grupos de microrganismos com propriedades benéficas claramente
identificadas (MACFARLANE E CUMMINGS, 1999; ROBERFROID, 2002). Além
disso devem induzir efeitos benéficos sistêmicos ou na luz intestinal do hospedeiro
(MENTEN, 2001).
16
Figura 2 - reações dos ingredientes alimentares probióticos e prebióticos com a
microbiota intestinal, relativo aos seus efeitos sobre a saúde.
Fonte: SAAD, 2006.
No intestino, as diferentes substâncias prebióticas devem ser
preferencialmente fermentadas e promoverem o crescimento de uma ou outra
espécie bacteriana. Sendo assim, a seletividade destes prebióticos poderá ser
verificada, não só quanto ao gênero, mas também quanto à espécie bacteriana. Esta
relação estrutura-função é, no entanto, pouco estudada relativamente aos
prebióticos em geral (RASTALL E MAITIN,2002; RABIU et al., 2001).
Neste contexto, as substâncias prebióticas agem de forma a suprir
os nutrientes necessários para estimular o crescimento de específicas ou diversas
bactérias intestinais benéficas, cujos metabólitos atuam também reduzindo o pH
através do aumento da quantidade de ácidos orgânicos presentes no ceco. Por outro
lado, atuam bloqueando os sítios de aderência (principalmente a D-manose),
imobilizando e reduzindo a capacidade de fixação de algumas bactérias patogênicas
17
na mucosa intestinal. Especula-se também, que as substâncias prebióticas atuam
estimulando o sistema imune, através da redução indireta da translocação intestinal
por patógenos, que determinariam infecções após atingirem a corrente sanguínea
(SAVAGE et al., 1996).
Dentro do grupo de prebióticos, podem-se destacar a inulina, os
frutooligossacarídeos e também diversos tipos de fibras que podem ser classificadas
como solúveis, insolúveis ou mistas, podendo ser fermentáveis ou não-fermentáveis.
2.2.1 Fibras
Considera-se fibra alimentar o conjunto dos componentes dos
alimentos vegetais que resistem à hidrólise pelas enzimas endógenas do tubo
digestivo. Tais resíduos alimentares, como não são digeridos, não possuem valor
calórico, passam para as fezes, e são degradados no intestino grosso (POURCHET-
CAMPOS, 1990).
A fibra alimentar poderá influenciar vários aspectos da digestão,
absorção e metabolismo, entre eles:
A diminuição do tempo de trânsito intestinal dos alimentos;
Aumento da velocidade de absorção intestinal da glicose;
Diminuição dos níveis de colesterol sangüíneo;
Diminuição do conteúdo de calorias ingeridas.
Essas propriedades, segundo Calixto (1993), fazem das fibras um
adequado regulador intestinal. As fibras são ainda fatores de importância em
regimes dietéticos para a prevenção ou tratamento de diabetes e de pessoas com
problemas de hipercolesterolemia ou obesidade. O desenvolvimento de câncer de
cólon e outros distúrbios gastrointestinais pode estar relacionado com a falta de
fibras na dieta.
18
2.2.1.1 Pectina
A pectina é considerada uma fibra solúvel e fermentável, a qual
não é digerida pela α-amilase e por enzimas hidrolíticas, como a sacarase, a
maltase e a isomaltase, na parte superior do trato gastrointestinal (CARABIN,
FLAMM, 1999). Ela está presente na parede celular dos vegetais, em diferentes
formas, conforme o avanço da maturação.
As substâncias pécticas são encontradas nos frutos em formas
diversas, com uma solubilidade diferente dependendo do estado de maturação, cada
uma delas com funções na determinação da textura (SGARBIERI, 1966; CHITARRA,
1973). As pectinas encontram-se principalmente depositadas na parede celular,
atuando como material de ligação entre as células, sendo consideradas fibras com
características espessante, estabilizante (BOBBIO E BOBBIO, 1995) e
apresentando, em alguns casos, propriedades prebióticas (FOOKS, FULLER,
GIBSON, 1999).
Segundo Whistler e Daniel (1985), as substâncias pécticas podem
se apresentar como:
Protopectina: altamente esterificada com metanol; insolúvel em água. Durante
o amadurecimento da fruta, a enzima protopectinase converte a protopectina
em pectina coloidal, ou ácidos pectínicos, que são solúveis em água.
Pectina: polissacarídeo estrutural encontrado na parede celular de vegetais
com a função de conferir rigidez. Também chamada de ácido pectínico, a
pectina é menos metilada que a protopectina. Os ácidos pectínicos são os
ácidos poligalacturônicos coloidais que formam gel em condições específicas.
A ação contínua da pectina-metilesterase sobre o ácido pectínico leva a
remoção completa dos grupos metil-éster e à formação de ácidos pécticos.
Ácidos pécticos: são ácidos poligalacturônicos isentos de grupos metílicos.
São degradados a ácido galacturônico pela enzima poligalacturonase.
Segundo Bobbio e Bobbio (1995), a pectina é formada por 150 a
1.500 unidades de ácido galacturônico unidas por ligações glicosídicas α (1-4) e
apresenta peso molecular entre 100.000 a 200.000 Daltons. A composição e as
19
propriedades da pectina variam de acordo com a fonte, o processo de extração
empregado e tratamentos posteriores à extração (FENNEMA, 2007).
As cadeias lineares de ácido galacturônico possuem grupos
carboxílicos esterificados por radicais metoxil (CH
3
) em maior ou menor grau. O grau
de metoxilação (DM – degree of metoxilation) é uma medida da proporção de grupos
carboxílicos que estão presentes na forma esterificada. Por exemplo, uma pectina de
DM igual a 0,7 indica 70% de esterificação (BOBBIO e BOBBIO, 1995).
A proporção de grupos metil-éster decresce conforme o vegetal
amadurece. O grau de esterificação é calculado pela razão entre o número de
resíduos de ácido D-galacturônico esterificados e o número total de resíduos de
ácido D-galacturônico multiplicado por 100 (WHISTLER e DANIEL, 1985).
2.3 SORO DE LEITE
O soro do leite é um subproduto resultante da fabricação de
queijos, por coagulação da caseína, obtido por adição de ácido ou de enzima (soro
doce). Possui alto valor nutricional, conferido pela presença de proteínas com
elevado teor de aminoácidos essenciais, destacando-se os sulfurados (CAPITANI et
al., 2005).
Além das propriedades nutricionais, as proteínas do soro do leite
são muito conhecidas pela versatilidade de suas propriedades funcionais
tecnológicas como ingredientes em produtos alimentícios, principalmente por sua
elevada solubilidade e capacidade de geleificação. Recentemente, têm sido
atribuídas às proteínas do soro propriedades funcionais fisiológicas, capazes de
produzir um importante controle na modulação do metabolismo e nos mecanismos
de defesa dos organismos animal e humano (SGARBIERI & PACHECO, 1999;
MICKE et al., 2002; ROSANELI et al., 2002).
No Brasil, a produção de bebidas lácteas é uma das principais
opções de aproveitamento do soro do leite, e as mais comercializadas são as
bebidas fermentadas, com características sensoriais semelhantes ao iogurte, e
bebidas lácteas não-fermentadas. Contudo, o aproveitamento desse subproduto
ainda é baixo variando em torno de 15-20% apenas (SMITHERS, 2008), sendo que
20
a produção anual de soro de leite no mundo aumenta em torno de 1-2% segundo a
figura 3. (FAO, 2006).
Figura 3 - Volume anual de soro de leite produzido no mundo (1995-2005).
FONTE: FAO, 2006
2.4 BAGAÇO DE LARANJA
O bagaço da laranja, resíduo da produção industrial do suco, é
composto por flavedo, albedo, membranas, resíduos de polpa e sementes (FOX,
1991; KALE e ADSULE, 1995). O flavedo é a casca propriamente dita, que contém
óleos essenciais e pigmentos. O albedo é a porção branca, fibrosa, de alta
porosidade, aderida internamente ao flavedo, sendo esta camada que contém a
maior concentração de pectina do total contido no bagaço. Membranas presentes no
bagaço contêm celulose, hemicelulose, lignina, pectina, compostos fenólicos,
flavonóides, vitaminas e minerais (FOX, 1991).
Quanto à proporção entre a quantidade de laranjas que entram na
planta para extração de suco e a quantidade de bagaço restante dessa extração, há
variações de acordo com a variedade e o grau de maturação da fruta, o tipo de
processamento e processos subseqüentes à extração de suco.
Até 60% em peso da fruta são resíduos sólidos (casca, partes da
21
polpa e sementes). Proporcionalmente, a laranja contém de 21,5 a 38,1% de casca;
61,9 a 78,6% de polpa e 23,8 a 51,0% de suco. Segundo a Abecitrus (2008), o
bagaço corresponde a cerca de 50%, em peso, das laranjas processadas.
Um destino para o bagaço de laranja é a sua utilização como
matéria prima na produção de óleos Essenciais (D’limoneno) e também como Farelo
de casca de laranja para alimentação animal (ABECITRUS, 2008). De acordo com El
Nawawi e Shehata (1987), para destinar os resíduos da indústria de suco e obter
maior retorno financeiro na indústria de citrus, os resíduos da extração podem ser
utilizados para a produção de pectina.
A quantidade de pectina em bagaço de laranja é variável em
função da variedade e do grau de maturação da fruta, do tempo decorrente entre a
colheita e a extração da pectina e do processamento ao qual a fruta é submetida. O
teor de pectina decresce em frutos conforme avança o amadurecimento (FONSECA,
2001) e conforme aumenta o tempo entre a colheita da laranja e o processamento
de extração de pectina.
Em base seca, aproximadamente 30% do bagaço de laranja é
pectina (EL NAWAWI e SHEHATA, 1987), sendo a extração da pectina do bagaço
de laranja uma outra via de reaproveitamento.
Desta forma, além de ser uma alternativa de aproveitamento para o
resíduo da indústria de suco de laranja, a utilização da pectina, e desse material
como um todo, é uma forma de agregar valor a este subproduto, resultando em
benefícios econômicos e minimizando danos ao meio ambiente.
22
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver um ingrediente simbiótico desidratado, fermentado por
grãos de Kefir e cultura probiótica, utilizando bagaço de laranja e soro de leite.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar se o soro de leite é viável para a fermentação com grãos de
Kefir e com uma cultura comercial liofilizada de microorganismos probióticos
(LYOFAST MT 036 LV).
Determinar a viabilidade das bactérias lácticas, Lactococcus spp. e
leveduras presentes nos grãos de Kefir e cultura LYOFAST MT 036 LV, após os
processos de fermentação do soro e após adição do bagaço de laranja no processo
de secagem.
Determinar o percentual de pectina presente no bagaço da laranja
antes e após a secagem.
Quantificar o teor de exopolissacarídeos produzidos pelas bactérias
durante os processos de fermentação e secagem, e durante o armazenamento.
Verificar a viabilidade dos microorganismos presentes em ambas
culturas por 3 meses na temperatura de 25°C.
Verificar as diferenças sensoriais na barra de cereais adicionada do
ingrediente simbiótico.
23
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 MATERIAIS
4.1.1 Kefir
Os grãos de Kefir foram obtidos de Dominic Anfiteatro e a cultura
liofilizada LYOFAST MT 036 LV foi fornecida pela empresa SACCO localizada em
Campinas, São Paulo, Brasil. Ambos armazenados em freezer (-10°C a -15°C).
Microorganismos encontrados na cultura Lyofast MT 036 LV:
Lactococcus lactis ssp. lactis
Lactococcus lactis spp. lactis biovar diacetylactis
Lactobacillus brevis
Leuconostoc
Saccharomyces cerevisiae
Microorganismos encontrados nos grãos de Kefir:
Lactobacillus spp; Lactococcus spp ; Leuconostoc spp ; Acetobacter spp ;
Streptococcus spp ;Kluyveromyces spp ; Candida spp ; Sacharomyces spp ;
Torula spp ( ANFITEATRO, 2000).
24
4.1.2 Bagaço de laranja
O bagaço de laranja utilizado foi fornecido pela COROL Cooperativa
Agroindustrial, localizada em Rolândia, Paraná, Brasil e utilizado no mesmo dia em
que foi transportado da Corol ao laboratório de desenvolvimento do projeto de
pesquisa.
4.1.3 Soro de Leite em pó
O Soro de leite em pó utilizado no presente trabalho foi cedido pela
empresa Alibra ingredientes Ltda., localizada em Marechal Cândido Rondon,
Paraná, Brasil. Armazenado em câmara fria (4°C).
A composição nutricional do soro de leite esta expressa na tabela 1.
Tabela 1. Composição centesimal do soro de leite integral.
Componente
Soro de Leite integral
Energia, kcal/kg
23 kcal/100g
Matéria seca, %
6,40 %
Proteína bruta, %
0,73 %
Gordura, %
0,03 %
Lactose, %
5,00 %
Cinzas, %
0,64 %
pH
5,80 %
Fonte: Hauptli et al. 2005.
25
4.2 MÉTODOS
4.2.1 Preparo e fermentação das culturas
Para ativação da cultura liofilizada LYOFAST MT 036 LV, uma
alçada da cultura foi inoculada em 100 ml de soro de leite reconstituído a 7% (p/v),
previamente pasteurizado sob temperatura de 85°C por 15 minutos, e incubado a
25°C por 24 horas. Após este período, Erlemeyers contendo 100 ml de soro de leite
reconstituído a 7% (p/v) também pasteurizado foram inoculados com 1% (v/v) da
cultura previamente crescida, e incubados nas mesmas condições que o primeiro
ensaio. Foram realizadas três repicagens sucessivas da cultura sob as mesmas
condições. De acordo com a figura 4.
Figura 4 - Processo de preparo do soro fermentado com a cultura Lyofast MT 036
LV.
Para ativação dos grãos de Kefir, 10% (p/v) dos grãos foram
inoculados em 100 ml de soro de leite reconstituído a 7% (p/v), previamente
26
pasteurizado sob temperatura de 85°C por 15 minutos, e incubados a 25°C por 24
horas. Após este período, Erlemeyers contendo 100 ml de soro de leite reconstituído
a 7% (p/v) também pasteurizado foram inoculados com 10% (p/v) dos grãos
previamente crescidos, e incubados nas mesmas condições que o primeiro ensaio.
Foram realizadas três repicagens sucessivas dos grãos sob as mesmas condições.
De acordo com a figura 5.
Figura 5 - Processo de preparo do soro fermentado com a cultura de grãos de Kefir.
Após a incubação, os grãos de Kefir foram separados do soro
fermentado por filtração em peneira de plástico (sanitizada por imersão em etanol
70%) e posteriormente lavados com água estéril (PIERMARIA et al., 2008), sendo
armazenados a 4°C em soro de leite pasteurizado para posterior análises.
4.2.2 Secagem do bagaço de laranja adicionado de soro de leite fermentado
Após as fermentações do soro de leite com os grãos de Kefir e com
a cultura liofilizada LYOFAST MT 036 LV à 25°C por 24 horas, o bagaço de laranja,
27
esterilizado a 121°C por 15 minutos, foi adicionado na proporção de 1:1 ao soro
fermentado, com o intuito de auxiliar o processo de secagem (estufa - SOC.FABBE
LTDA) e agir como aditivo de sabor, aroma e fonte de fibras.
A secagem foi conduzida sob temperatura de 40° C até peso
constante, aproximadamente 2 a 3 dias.
Após a secagem, o material foi moído (Moinho IKA WORKS, Modelo
A11 Basic). De acordo com a figura 6.
Figura 6 - Processo de secagem após adição do soro fermentado ao bagaço de
laranja esterilizado.
4.2.3 Viabilidade celular
28
4.2.3.1 Contagem de bactérias lácticas
As contagens de bactérias lácticas para ambos ingredientes
simbióticos produzidos com a fermentação pelos grãos de Kefir e também pela
cultura liofilizada foram realizadas após os processos de fermentação do soro,
secagem e em intervalos de 30 dias durante o período de armazenamento. Também
foram realizadas determinações de viabilidade celular na barra de cereais produzida
e adicionada do ingrediente simbiótico para a análise sensorial, com o intuito de
verificar a quantidade de bactérias lácticas na porção fornecida aos consumidores.
A semeadura em placas para contagem das unidades formadoras de
colônia por mL ou g (UFC.mL
-1
ou g
-1
) foi realizada pela técnica de plaqueamento em
profundidade (“Pour Plate”), utilizando o meio de cultivo MRS-agar (“Man, Rogosa,
Sharpe”) para os Lactobacillus. As placas foram incubadas em estufa de cultura
(FANEM LTDA – Modelo 002CB) a 37 °C por 48 horas (SILVA et al., 2001).
Os experimentos foram conduzidos com duas repetições, sendo
submetidos à análise de variância a ANOVA e processados no Programa Statistica
6.0. Os gráficos foram plotados pelo Programa Microsoft Excel 2007.
4.2.3.2 Contagem de Lactococcus spp.
As contagens de Lactococcus spp. para ambos ingredientes
simbióticos produzidos com a fermentação pelos grãos de Kefir e também pela
cultura liofilizada foram realizadas após os processos de fermentação do soro,
secagem e em intervalos de 30 dias durante o período de armazenamento. Também
foram realizadas determinações de viabilidade celular na barra de cereais produzida
e adicionada do ingrediente simbiótico para a análise sensorial, com o intuito de
verificar a quantidade de Lactococcus spp. na porção fornecida aos consumidores.
A semeadura em placas para contagem das unidades formadoras
de colônia por mL ou g (UFC.mL
-1
ou g
-1
) foi realizada pela técnica de plaqueamento
em profundidade (“Pour Plate”), utilizando o meio de cultivo Agar M17 para o
29
crescimento dos Lactococcus spp. As placas foram incubadas em estufa de cultura
(BOD, Modelo TE 391) a 25° C por 72 horas (SOUZA et al., 2003).
Os experimentos foram conduzidos com duas repetições genuínas,
sendo submetidos à análise de variância a ANOVA e processados no Programa
Statistica 6.0. Os gráficos foram plotados pelo Programa Microsoft Excel 2007.
4.2.4 Contagem de Leveduras
As contagens de leveduras para ambos ingredientes simbióticos
produzidos com a fermentação pelos grãos de Kefir e também pela cultura liofilizada
foram realizadas após os processos de fermentação do soro, secagem e em
intervalos de 30 dias durante o período de armazenamento. Também foram
realizadas determinações de viabilidade celular na barra de cereais produzida e
adicionada do ingrediente simbiótico para a análise sensorial, com o intuito de
verificar a quantidade de leveduras na porção fornecida aos consumidores.
A semeadura em placas para contagem das unidades formadoras de
colônia por mL ou g (UFC.mL
-1
ou g
-1
) foi realizada pela técnica de plaqueamento em
profundidade (“Pour Plate”), utilizando o meio de cultivo Agar PDA (Ágar batata
dextrose Acidificado) e adição de ácido tartárico 10% até atingir pH 3,7 - 3,8, para o
crescimento de leveduras. As placas foram incubadas estufa de cultura (BOD,
Modelo TE 391) a 25° C por 72 horas (SILVA et al., 2001).
Os experimentos foram conduzidos com duas repetições genuínas,
sendo submetidos à análise de variância a ANOVA e processados no Programa
Statistica 6.0. Os gráficos foram plotados pelo Programa Microsoft Excel 2007.
4.2.5 Armazenamento
A viabilidade das bactérias lácticas totais dos Lactococcus spp. e
das leveduras foi acompanhada durante 3 meses de armazenamento sob
30
temperatura de 25°C, nas amostras dos ingredientes simbióticos fermentados com
os grãos de Kefir e com a cultura LYOFAST MT 036 LV.
Porções de 20g dos ingredientes simbióticos desidratados foram
embaladas em saches de BOPP (polipropileno bio-orientado) metalizado
hermeticamente selados. Análises de viabilidade celular foram realizadas a cada 30
dias em duplicata para cálculo da média de duas repetições dos tratamentos.
Os experimentos foram submetidos à análise de variância a ANOVA
e processados no Programa Statistic 6.0. Os gráficos foram plotados pelo Programa
Microsoft Excel 2007.
4.2.6 Determinação de pectina total no bagaço de laranja
A determinação de pectina total no bagaço de laranja foi feita com a
utilização do KIT Pectin Identification (Megazyme), antes e depois dos processos de
fermentação e secagem.
O principio deste kit baseia-se no fato da pectina ser dissolvida em
água deionizada e ajustada ao pH 12, para a produção de regiões poli-
galacturonicas e conversão da pectina a pectato. O pectato é incubado com a
enzima pectato liase, a qual hidrolisa os ácidos poligalacturonicos produzindo
oligossacarídeos insaturados que são lidos a 235 nm de absorbância em
espectrofotômetro UV-vísivel (Cintra 20, Modelo GBC).
4.2.7 Quantificação de Exopolissacarídeos (EPS)
A quantificação de EPS foi realizada de acordo com Souza (2004).
Exatamente 10 g do soro não inoculado (padrão – sem ação de microorganismos) e
também do soro fermentado com ambas culturas, foram cuidadosamente pesados
em tubos de centrífuga de 50 ml. Em seguida, foi adicionado 250 ųL de ácido
31
tricloroacético 80 %, as amostras foram agitadas e armazenadas a 4°C por 30
minutos para serem posteriormente centrifugadas (Centrífuga – Ependorf, modelo -
5804 R) a 4°C, 3000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante de cada cultura foi
cuidadosamente transferido para outros tubos de centrífuga e os EPS precipitados
pela adição de etanol frio absoluto. Após nova centrifugação a 13975xg a 4°C por 20
minutos, os EPS separados foram dissolvidos em água destilada.
A concentração do carboidrato total foi determinada usando-se 1 ml dos
precipitados diluídos em água destilada, seguida da adição de fenol 5% (1 ml) e 5 ml
de ácido sulfúrico concentrado (10-20 segundos) em tubos de ensaio. Os tubos
foram mantidos em descanso por 10 minutos, posteriormente agitados e colocados
em banho Maria a 25 ou 30°C, por 10 a 20 minutos. A leitura foi feita em
espectrofotômetro a 490 nm. As concentrações de carboidratos totais foram
determinadas a partir de uma curva de calibração da glicose, em concentrações de
10 a 100 µg/ml. Os resultados foram expressos como EPS-equivalente (mg/100 g
das amostras) para o soro fermentado com cada cultura. Os valores de EPS foram
calculados pela subtração da quantidade de EPS do soro fermentado e dos EPS
presentes no soro não inoculado.
4.2.8 Análises físico-químicas
Análises de pH, atividade de água (Aw) e umidade foram realizadas
em duplicata em cada amostra (soro fermentado com grãos de Kefir e cultura
liofilizada) antes e depois dos processos de fermentação do soro e secagem soro
adicionado do bagaço de laranja. O pH e a umidade foram determinados de acordo
com as normas oficiais do Instituto Adolfo Lutz (2005) e a atividade de água (Aw)
mensurada em aparelho AQUALAB (modelo CX-2), previamente calibrado com água
destilada.
Os experimentos foram conduzidos com duas repetições, sendo
submetidos à análise de variância a ANOVA e processados no Programa Statistica
6.0.
32
4.2.9 Análise microbiológica – ingrediente simbiótico e barra de cereais
Para garantir as condições microbiológicas e a segurança da barra
de cereais a ser oferecida aos provadores, análises de Coliformes a 45°C,
Staphylococcus aureus coagulase positiva e Salmonella spp. foram realizadas
segundo Silva et al. (2001), seguindo as determinações da resolução – RDC n°12,
de 2 de janeiro de 2001 (ANVISA).
4.2.10 Análise sensorial
Anteriormente à realização dos testes sensoriais, o projeto foi submetido ao
“Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos da Universidade
Estadual de Londrina/Hospital Regional Norte do Paraná”, obtendo como parecer
“aprovado” com protocolo n° 0179.0.268.000-08 e Anexo 175/08.
O ingrediente simbiótico obtido no estudo foi adicionado a uma formulação de
barra de cereais devido ao fato de ser um ingrediente em pó e por não ter sido feita
análise de solubilidade do mesmo. Sendo um ingrediente com um sabor amargo e
que não seria muito bem aceito se servido diretamente, este foi adicionado a barra
de cereais com o intuito do sabor amargo ser mascarado pelo doce do açúcar e do
mel presente na mesma.
O produto formulado para a análise sensorial foi uma barra de cereais, com
formulação caseira, onde se utilizou 4 colheres de sopa de açúcar, ½ xícara de mel,
1 xícara de flocos de arroz crocantes, ½ xícara de aveia em flocos; ½ xícara de uva
passa e 1 colher de sopa de margarina, segundo o site “Tudo Gostoso” (2010). Após
a formulação das barras de cereais, foram adicionados 10% (p/p) do ingrediente
simbiótico desenvolvido com a cultura LYOFAST MT 036 LV para confecção da
primeira amostra a ser oferecida aos consumidores e 10% (p/p) do ingrediente
simbiótico desenvolvido com a cultura de grãos de Kefir para confecção da segunda
amostra. A porcentagem de pó utilizado foi calculada em função do número de
microorganismos viáveis na barra de cereais (entre 10
6
e 10
8
UFC/g).
Paralelamente, foi preparada a terceira amostra, constituída pela formulação original
33
- padrão (sem adição do ingrediente simbiótico).
A aceitabilidade das amostras formuladas com os ingredientes
simbióticos foi determinada realizando-se o teste de aceitação com 89 provadores
potenciais, não treinados, utilizando escala hedônica estruturada de nove pontos e
apresentação seqüencial das amostras. A partir dos resultados, foi aplicada análise
variância (ANOVA), utilizando-se um intervalo de confiança de 95% e p<0,05. Os
índices de aceitação foram calculados pelo programa computacional Statistic 6.0.
Segue abaixo o modelo de questionário para recrutamento de
provadores e a ficha de avaliação para o teste de aceitação global do consumidor.
QUESTIONÁRIO PARA RECRUTAMENTO DE PROVADORES (TESTE DE
ACEITAÇÃO)
Desejamos formar uma equipe de provadores para avaliar a
qualidade de uma barra de cereais adicionada de um ingrediente com propriedades
funcionais (pó obtido depois do processo de fermentação). Ser um provador não
exigirá de você nenhuma habilidade excepcional, não tomará muito seu tempo e não
envolverá nenhuma tarefa difícil. A prova será realizada no Laboratório de Análise
Sensorial do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos, leva em torno de
10 minutos e você poderá fazê-la no horário que tiver maior disponibilidade. Se tiver
qualquer dúvida, ou necessitar de informações adicionais, entre em contato
(Eduardo, 3338-3247; 99188124 e Profa Dra. Sandra Garcia, ramal 4984,
[email protected]).
Dados Pessoais
Nome_________________________________________________
Telefone para contato / e-mail_______________________________
1-Faixa etária 2- Sexo
( ) 15-25 ( ) masculino
( ) 25-35 ( ) feminino
( ) 35-50
( ) acima de 50 anos
34
3- Ocupação 4- Escolaridade
( ) aluno _______________________ ( ) 1ºgrau
( ) funcionário ( ) 2ºgrau
( ) professor ( ) 3º grau
( ) outro _______________________ ( ) outro
5. Gosta de barrinha de cereais: ( ) Sim ( ) Não
6- Freqüência de Consumo de:
Barrinha de cereais:
( ) Nunca
( ) Ocasionalmente - _____ vezes por ano
( ) Moderadamente - _____ vezes por mês
( ) Freqüentemente - _____ vezes por semana
Alimentos com alegações funcionais:
( ) Nunca
( ) Ocasionalmente - ___ vezes por ano
( ) Moderadamente - ___vezes por mês
( ) Freqüentemente - ___vezes por semana
Produtos probióticos:
( ) Nunca
( ) Ocasionalmente - ___vezes por ano
( ) Moderadamente - ___vezes por mês
( ) Freqüentemente - ___vezes por semana
Produtos que costuma consumir :
Ficha de avaliação para o teste de aceitação global do consumidor.
35
Produto testado: Barrinha de cereais adicionada ou não, dos ingredientes
simbióticos formulado pelo pesquisador.
Nome: __________________________ _ Data: ____________
Por favor, avalie a amostra de barrinha de cereais utilizando a escala abaixo, para
dizer o quanto gostou ou desgostou do produto e, se desejado, faça comentários
sobre ele.
1- Desgostei muitíssimo
2- Desgostei muito
3- Desgostei
4- Desgostei ligeiramente
5- Não gostei nem desgostei
6- Gostei ligeiramente
7- Gostei
8- Gostei muito
9- Gostei muitíssimo
Código da amostra _________ Nota _________
Código da amostra _________ Nota _________
Código da amostra _________ Nota _________
Você consumiria este produto? _________________________________
36
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 FERMENTAÇÃO DO SORO DE LEITE
A Figura 7 mostra as médias em log de determinações realizadas em duplicatas
para bactérias lácticas após a fermentação do soro de leite com a cultura liofilizada
Lyofast MT 036 LV e com os grãos de Kefir.
Figura 7 - Médias em log de determinações realizadas em duplicatas para células
viáveis de bactérias lácticas após a fermentação do soro de leite (7% p/v) com a
cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os grãos de Kefir.
De acordo com a Figura 7, é possível verificar que as bactérias lácticas da
cultura liofilizada tiveram um crescimento melhor no soro de leite do que as bactérias
lácticas presentes nos grãos de Kefir, apresentando diferença significativa a nível de
95% de confiança (p=0,05).
A Figura 8 mostra as médias em log de determinações realizadas em
duplicatas para os Lactococcus spp. após a fermentação do soro de leite com a
cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os grãos de Kefir.
8,86
7,27
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Lyofast
Kefir
log UFC/ml
37
Figura 8 - Médias em log de determinações realizadas em duplicatas para as células
viáveis de Lactococcus spp. após a fermentação do soro de leite (7% p/v) com a
cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os grãos de Kefir.
De acordo com a Figura 8, é possível verificar que para Lactococcus spp.
houve diferença significativa a nível de 95% de confiança (p=0,05) entre as culturas
utilizadas, sendo a Lyofast a que apresentou um maior crescimento do Lactococcus
spp.
A Figura 9 mostra as médias em log de determinações realizadas em
duplicatas para as leveduras após a fermentação do soro de leite com a cultura
liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os grãos de Kefir.
8,92
8,41
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Lyofast
Kefir
log UFC/ml
38
Figura 9 - Médias em log de determinações realizadas em duplicatas para as células
viáveis de leveduras após a fermentação do soro de leite (7% p/v) com a cultura
liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os grãos de Kefir.
De acordo com a Figura 9, é possível verificar que na fermentação do soro de
leite, houve diferença significativa a nível de 95% de confiança (p=0,05) entre as
culturas utilizadas, sendo possível verificar uma maior quantidade de leveduras nos
grãos de Kefir do que na cultura liofilizada.
Estes resultados estão de acordo com Bissoli (2005), onde é citado que o
Kefir apresenta uma contagem total variando em torno de 10
7
– 10
9
UFC/ml quando
fermentado em leite e de 10
6
-10
8
UFC/ml quando fermentado em soro de leite,
devido a presença de mais nutrientes no leite integral, necessários ao crescimento
das bactérias e leveduras do Kefir. A fermentação ocorre por ação de bactérias
láticas, leveduras e bactérias produtoras de ácido acético e isto provoca uma
diminuição do pH do meio. Os microrganismos utilizados na elaboração dos
ingredientes simbióticos ficam contidos nos grãos de Kefir, uma massa de diferentes
bactérias e leveduras embebida em uma matriz complexa de proteínas e
carboidratos, a qual é recuperada ao final do processo fermentativo (FARNWORTH,
MAINVILLE, 2003). A composição microbiológica e química do Kefir indica que ele é
um produto probiótico complexo (FARNWORTH, 2005).
A Tabela 2 apresenta os valores de pH para o soro de leite fermentado com
ambas culturas. Nela, é possível observar que houve pouca variação de pH entre as
duas fermentações, não sendo encontrada diferença significativa a nível de 95% de
confiança (p=0,05).
5,88
8,6
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Lyofast
Kefir
log UFC/ml
39
Tabela 2 - Média de determinações realizadas em duplicatas para análise de pH do
soro de leite fermentado com a cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os grãos
de Kefir.
Cultura
Soro fermentado
Lyofast
4,17 ± 0,01
Kefir
4,23 ± 0,03
Por mais que não tenha sido constatada diferença estatística, notou-se um pH
menor na fermentação com a cultura Lyofast, possivelmente devido ao fato do maior
crescimento de bactérias lácticas presentes na cultura liofilizada.
A figura 10 mostra os aspectos do soro fermentado com as culturas de grãos
de Kefir (A) e Lyofast MT 036 LV (B) a 25°C por 24 horas.
Figura 10 - Soro de leite fermentado com as culturas de grãos de Kefir (A) e Lyofast
MT 036 LV (B) ) a 25°C por 24 horas.
5.2 ADIÇÃO DO BAGAÇO DE LARANJA E SOBREVIVÊNCIA À SECAGEM
Após o processo de fermentação, foi adicionado o bagaço de laranja ao soro
fermentado, na proporção de 1:1, funcionando como fonte de fibras, aroma e sabor,
e auxiliando no processo de secagem.
A figura 11 apresenta o aspecto do bagaço de laranja (subproduto), após a
A
B
40
esterilização a 121°C por 15 minutos em autoclave, pronto para ser misturado ao
soro de leite fermentado com as culturas de grãos de Kefir e Lyofast MT 036 LV.
Figura 11 - Bagaço de laranja esterilizado a 121°C por 15 minutos.
O bagaço de laranja proporciona alto valor de pectina, principal fibra
encontrada no mesmo. Esta, quando ingerida, encontra-se principalmente
depositada na parede celular das células intestinais, atuando como material de
ligação entre as células e as bactérias presentes no cólon (MANDERSON et al.
2005). A pectina é considerada uma fibra com características espessante,
estabilizante (BOBBIO E BOBBIO, 1995) e também prebiótica (FOOKS, FULLER,
GIBSON, 1999).
A figura 12 relaciona o número total de células viáveis de bactérias lácticas
em log recuperadas após a secagem nos ingredientes simbióticos fermentados com
Kefir e cultura liofilizada.
41
Figura 12 - Médias em log de determinações realizadas em duplicatas para células
viáveis de bactérias lácticas pós fermentação do soro de leite e pós adição do
bagaço de laranja e secagem.
De acordo com a figura 12, pode-se notar que houve uma diminuição de 0,79
ciclos log com a cultura Lyofast e um aumento de 1,56 ciclos log de bactérias
lácticas no soro fermentado com Kefir. Foi observada diferença estatística a nível de
95 % de confiança (p=0,05) entre as culturas. Sendo a cultura de Kefir a que
apresentou maior resistência ao processo de secagem.
A tabela 3 apresenta as concentrações de exopolissacarídeos encontradas
depois dos processos de fermentação do soro de leite e adição do bagaço de laranja
secagem.
Tabela 3 - Médias de determinações realizadas em duplicatas da concentração de
exopolissacarídeos pós fermentação do soro de leite e pós adição do bagaço de
laranja e secagem.
Cultura
Soro fermentado
Pós Secagem
Lyofast
19,3 ± 0,1 mg/100g
20,2 ± 0,1 mg/100g
Kefir
24,8 ± 0,2 mg/100g
26,2 ± 0,2 mg/100g
Nota-se pela tabela 3, que houve um aumento na produção de
exopolissacarídeos durante o processo de secagem. Estes atuam como protetores
das células bacterianas, como pode-se notar nas contagens de células viáveis de
bactérias acido lácticas e de Lactococcus spp depois do processo de secagem.
8,86
8,07
7,27
8,83
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pós fermentação
pós secagem
log UFC/ml ou g
Lyofast
Kefir
42
Alguns autores chegam a caracterizar os exopolissacarídeos secretados pelo
Kefir, como substrato para microorganismos no intestino de hospedeiros, o que
condiciona a caracterização dos exopolissacarídeos funcionarem como prebióticos
(ASHWELL, 2001). Os exopolissacarídeos também têm alto valor para a tecnologia
dos alimentos por aumentarem a textura e viscosidade de produtos (BROADBENT et
al., 2003). A produção de exopolissacarídeos é aumentada conforme a temperatura
de fermentação se altera (ABRAHAM, 1999). Frengova et al. (2002) identificaram
que a presença de leveduras aumenta em quase duas vezes a produção do
quefirano, exopolissacarídeo produzido pelas bactérias dos grãos Kefir. De acordo
com os autores citados explicam-se os resultados encontrados neste estudo, onde
pode-se verificar que houve um aumento na produção de exopolissacarídeos após o
processo de secagem, sendo a maior quantidade encontrada na fermentação pela
cultura dos grãos de Kefir, que apresenta uma maior quantidade de leveduras.
A figura 13 apresenta a viabilidade em log de células de Lactococcus spp.
recuperadas após a secagem.
Figura 13 - Médias em log de determinações realizadas em duplicatas para células
viáveis de Lactococcus spp. pós fermentação do soro de leite e pós adição do
bagaço de laranja e secagem.
De acordo com a figura 13, é possível notar diferença significativa a nível de
95 % (p=0,05) na recuperação de ambas culturas. A cultura Lyofast apresentou uma
queda de 0,8 ciclos log quando comparada a cultura de Kefir (queda de 0,15 ciclos
log).
8,92
8,12
8,41
8,26
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pós fermentação
pós secagem
log UFC/ml ou g
Lyofast
Kefir
43
A figura 14 demonstra a viabilidade em log de células de leveduras
recuperadas após a secagem.
Figura 14 - Médias em log de determinações realizadas em duplicatas de Leveduras
pós fermentação do soro de leite e pós adição do bagaço de laranja e secagem.
De acordo com a figura 14, verifica-se diferença significativa a nível de 95 %
de confiança (p=0,05) entre as duas culturas após a secagem, sendo verificado um
aumento de 0,79 ciclos log de células viáveis de leveduras na cultura Lyofast e uma
queda de 1,38 ciclos log de células viáveis nos grãos de Kefir.
A tabela 4 mostra os valores de pH do bagaço in natura, do soro de leite
fermentado e dos ingredientes simbióticos.
Tabela 4 - Médias de determinações realizadas em duplicata para o pH das culturas
fermentadas no soro de leite antes e após a adição do bagaço de laranja no
processo de secagem.
Cultura
Bagaço
de Laranja
Soro
fermentado
Soro + Bagaço
pós secagem
Lyofast
8,0 ± 0,00
4,17 ± 0,01
4,99 ± 0,01
Kefir
8,0 ± 0,00
4,23 ± 0,03
5,07 ± 0,01
Segundo a tabela 4, constata-se um aumento no valor do pH após a secagem
em ambas culturas. Este aumento é devido à adição do bagaço de laranja que
apresenta um pH de 8,0, relativamente alto em relação ao soro fermentado.
5,88
6,67
8,6
7,22
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pós fermentação
pós secagem
log UFC/ml ou g
Lyofast
Kefir
44
A tabela 5 mostra o percentual de pectina do bagaço in natura e após sua
adição ao soro fermentado para o processo de secagem.
Tabela 5 - Percentual de pectina do bagaço de laranja in natura e após sua adição
ao soro fermentado com os grãos de Kefir e com a cultura Lyofast MT 036 LV para o
processo de secagem.
Cultura
Bagaço in natura
Bagaço + soro
pós secagem
Kefir
19,391 %
15,304 %
Lyofast
19,391 %
16,621 %
Observando a tabela 5, é possível notar que houve um consumo da pectina
nas duas culturas, possivelmente devido a sua utilização pelas bactérias presentes,
que a aproveitaram como substrato.
A utilização da pectina por microorganismos, foi observado por Sunvold et al.
(1995), que observaram variações significativas na produção de ácidos graxos
voláteis, quando a pectina foi utilizada como substrato de fermentação por diferentes
inóculos fecais (gato, cão, cavalo, humano e suíno), sugerindo que as populações
microbianas das diversas espécies animais diferem não só em composição, como
também, apresentam peculiaridades quanto às rotas metabólicas para a
fermentação de um mesmo substrato. Neste estudo, eles constataram que, quando
utilizada a pectina, os microorganismos fermentadores produziram quantidades
significativamente variáveis de acetato, propionato, butirato e lactato em comparação
com a fermentação realizada sem o uso da pectina.
A tabela 6 apresenta os valores de umidade do bagaço in natura, do soro
fermentado acrescido de bagaço de laranja e após o processo de secagem
(ingredientes simbióticos).
45
Tabela 6 - Médias de determinações realizadas em duplicatas para o percentual de
umidade do bagaço in natura, do soro de leite fermentado acrescido de bagaço de
laranja e do ingrediente simbiótico para as diferentes culturas.
Cultura
Bagaço in natura
Soro fermentado
+ bagaço
Pós Secagem
Lyofast
69,74 ± 0,05 %
91,53 ± 0,04 %
4,67 ± 0,01 %
Kefir
69,73 ± 0,05 %
92,24 ± 0,03 %
4,79 ± 0,00 %
È possível notar que o valor da umidade e da Aw dos ingredientes simbióticos
é baixo (aw = 0,411) que favorece a vida de prateleira dos ingredientes simbióticos,
pois a atividade de água baixa funciona como uma barreira para o
aparecimento/contaminação de bactérias patogênicas e deteriorantes.
A atividade de água (aw) baseia-se na quantidade de água livre, que não se
encontra comprometida com as moléculas constituintes do produto e que está
disponível para as reações físicas, químicas e biológicas (WELTI e VERGARA,
1997). No caso de um substrato que apresente baixa atividade de água, há
interrupção do metabolismo dos microorganismos presentes, inibindo o seu
desenvolvimento e/ou reprodução.
Segundo Bell e Labuza (1992), para muitos alimentos o crescimento
microbiano é prevenido com aw entre 0,6-0,7. Portanto para o caso dos ingredientes
simbióticos desenvolvidos neste estudo, que apresentaram um valor de aw = 0,411,
o crescimento microbiano é praticamente nulo, evitando desta forma o processo de
contaminação e/ou crescimento de patógenos.
A figura 15 mostra os aspectos do ingrediente simbiótico desidratado depois
dos processos de fermentação do soro de leite e secagem.
46
Figura 15 - Ingrediente simbiótico desidratado fermentado com grãos de Kefir (A) e
com a cultura Lyofast MT 036 LV (B).
De acordo com a figura 15, é possível observar que os ingredientes simbióticos
apresentaram aparência similar. Após a moagem, os ingredientes simbióticos ainda
apresentaram algum aspecto granular, principalmente devido ao fato da pectina ser
muito higroscópica, o que favorece a aglomeração dos grãos (EASTWOOD, 1992).
5.3 ARMAZENAMENTO
A viabilidade de células de bactérias lácticas, Lactococcus spp. e leveduras
do ingrediente simbiótico foi verificada durante 3 meses de armazenamento e os
resultados expressados abaixo.
A figura 16 demonstra a sobrevivência de bactérias lácticas durante 3 meses
de armazenamento do ingrediente simbiótico.
A
B
47
Figura 16 - Média de duas determinações em log para a viabilidade de bactérias
lácticas durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbiótico fermentado
com Kefir e cultura Lyofast MT 036 LV.
De acordo com a figura 16, verifica-se que desde o início do processo
fermentativo, as bactérias lácticas da cultura Lyofast tiveram uma diminuição de 1,79
ciclos log, alcançando ao final do período de armazenamento 7,07 ciclos log. Já as
bactérias lácticas da cultura de Kefir apresentaram uma sobrevivência maior, porém
sem diferença estatística a nível de 95 % de confiança (p=0,05), tendo uma
diminuição de apenas 0,05 ciclos log, atingindo no final do armazenamento 7,22
ciclos log.
A figura 17 mostra a sobrevivência de Lactococcus spp. durante 3 meses de
armazenamento do ingrediente simbiótico.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
log UFC/ml ou g
Lyofast
Kefir
48
Figura 17 - Média de duas determinações em log para a viabilidade de Lactococcus
spp. durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbiótico fermentado com
Kefir e cultura Lyofast MT 036 LV.
Na figura 17, observa-se que desde o início do processo fermentativo, os
Lactococcus spp. da cultura Lyofast tiveram uma diminuição de 1,12 ciclos log,
alcançando ao final do período de armazenamento 7,8 ciclos log. Já os Lactococcus
spp. da cultura de Kefir apresentaram uma sobrevivência menor, porém sem
diferença estatística a nível de 95 % de confiança (p=0,05), tendo uma diminuição de
0,79 ciclos log, atingindo no final do armazenamento 7,62 ciclos log.
A figura 18 representa a viabilidade das leveduras durante 3 meses de
armazenamento dos ingredientes simbióticos.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
log UFC/ml ou g
Lyofast
Kefir
49
Figura 18 - Média de duas determinações em log para a viabilidade de leveduras
durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbiótico fermentado com Kefir
e cultura Lyofast MT 036 LV.
Segundo a figura 18, as leveduras da cultura Lyofast tiveram uma diminuição
de 0,35 ciclos log, alcançando ao final do período de armazenamento 5,53 ciclos log.
Já as leveduras da cultura de Kefir apresentaram uma sobrevivência menor, com
diferença estatística a nível de 95 % de confiança (p=0,05), tendo uma diminuição de
1,07 ciclos log, atingindo no final do armazenamento 7,53 ciclos log.
A tabela 7 mostra os valores de exopolissacarídeos encontrados nos
ingredientes simbióticos fermentado com Kefir e Lyofast MT 036 LV ao longo do
tempo de armazenamento.
Tabela 7 - Médias de determinações realizadas em duplicatas da concentração de
exopolissacarídeos pós fermentação do soro de leite, pós adição do bagaço de
laranja e secagem e durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbiótico.
Cultura
Soro
fermentado
Pós
Secagem
1 mês
2 meses
3 meses
Lyofast
21,3 mg/100g
22,7 mg/100g
22,5 mg/100g
22,6 mg/100g
20,9 mg/100g
Kefir
24,8 mg/ 100g
26,2 mg/100g
25,9 mg/100g
25,7 mg/100g
23,4mg/100g
Na tabela 7, pode-se notar que houve um consumo do exopolissacarídeo
produzido pós fermentação e secagem durante o processo de armazenamento.
Conforme citado anteriormente, os exopolissacarídeos secretados pelos mesmos
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
log UFC/ml ou g
Lyofast
Kefir
50
presentes no Kefir podem agir como substrato para os microorganismos, atuando
neste caso como prebióticos (ASHWELL, 2001).
5.4 CONTAGEM DE BACTÉRIAS LÁCTICAS, Lactococcus spp., LEVEDURAS E ANÁLISES
MICROBIOLÓGICAS
5.4.1 Contagem de bactérias lácticas, Lactococcus spp. e leveduras na barra
de cereais
Segundo a legislação vigente Anvisa (ANVISA, 2007), para que um produto
contendo microorganismos probióticos possa utilizar a alegação de que “contribui
para o equilíbrio da flora intestinal”, este deve conter de 10
8
-10
9
UFC na porção
diária do produto.
Após a adição dos ingredientes simbióticos desidratados obtidos no trabalho
às barras de cereais correspondente as amostras (Lyofast – amostra 1 e Kefir –
amostra 2), foram realizadas as contagens de células viáveis de bactérias lácticas,
Lactococcus spp. e leveduras de modo a garantir que a barra de cereais
apresentasse a quantidade necessária de probióticos na porção fornecida aos
consumidores (10g).
A tabela 8 representa os resultados obtidos para as análises em questão.
Tabela 8 - Análise de bactérias lácticas, Lactococcus spp. e leveduras presente na
porção de barra de cereais (10g) fornecida aos consumidores.
Microorganismos
Lyofast (amostra 1)
Kefir (amostra 2)
Bactérias Lácticas
3,6 x 10
7
UFC/g
7,2 x 10
7
UFC/g
Lactococcus spp.
5,4 x 10
7
UFC/g
6,42 x 10
7
UFC/g
Leveduras
1,7x 10
7
UFC/g
2,3 x 10
6
UFC/g
Segundo a tabela 8 pode-se comprovar que o consumo de 10 g da barra de
cereais seria o ideal para corresponder à necessidade diária de microorganismos
probióticos segundo a legislação vigente.
51
5.4.2 Análise microbiológica para microorganismos indicadores e patogênicos
na barra de cereais
Para garantir a qualidade e segurança da barra de cereais utilizada na análise
sensorial (amostras 1, 2 e 3), foi realizada a análise microbiológica de
microorganismos patogênicos e indicadores de condições higiênico-sanitárias,
segundo a resolução – RDC n°12, de 2 de janeiro de 2001 (ANVISA).
A tabela 9 representa os resultados obtidos para as análises em questão.
Tabela 9 - Análise de microorganismos patogênicos e indicadores e respectivos
padrões microbiológicos na barra de cereais exigidos pela legislação vigente para
“Leite de bovinos e de outros mamíferos e derivados em pó”
Microorganismos
Lyofast
Amostra 1
Kefir
Amostra 2
Padrão
Amostra 3
Limites
segundo RDC
n°12
Coliformes a 45ºC
-
-
-
4 NMP
Staphylococcus
aureus
< 1,0 x 10
1
UFC/g
< 1,0 x 10
1
UFC/g
< 1,0 x 10
1
UFC/g
1,0 x 10
2
UFC/g
Salmonella spp.
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
De acordo com a tabela 9, verifica-se que os ingredientes simbióticos
fermentados com ambas culturas apresentaram conformidade segundo a legislação
vigente para o consumo humano, não havendo nenhum tipo de contaminação pelos
manipuladores ou oriundo da matéria prima.
5.5 ANÁLISE SENSORIAL
As amostras foram analisadas por 89 consumidores não treinados, utilizando-
se o questionário de escala hedônica de nove pontos.
O resultado de aceitação, conforme mostra a Tabela 10, mostrou que as
médias de aceitação das 3 amostras situaram-se próximas à categoria “gostei
ligeiramente/gostei” da escala hedônica
52
Tabela 10 - Médias de aceitação do teste de escala hedônica para as amostras 1, 2
e 3.
Amostra
Médias de aceitação*
Lyofast (Amostra 1)
6,9
a
Kefir (Amostra 2)
6,73
a
Padrão (Amostra 3)
6,97
a
* Médias acompanhadas de letras iguais não diferem entre si p = 0,05.
A tabela 10 mostra que os ingredientes simbióticos obtiveram uma nota muito
parecida com a amostra feita com a formulação padrão sem a adição dos
ingredientes simbióticos, sem diferença estatística a nível de 95 % de confiança
(p=0,05). Todas as amostras testadas apresentaram nota de aceitação acima da
média.
As respostas individuais do homem, no gostar ou não de um alimento, e os
fatores que influenciam essa preferência são extremamente variados. Os hábitos
alimentares são também vistos como respostas do comportamento cultural existente,
porém esses aos poucos podem ser mudados (RORATO et al., 2006).
O sabor, um fator importante na escolha e aceitação de alimentos, é uma
resposta integrada principalmente à sensação do gosto e do aroma. O gosto é
atribuído aos compostos não voláteis nos alimentos, tais como, açúcares, sais,
cafeína e ácidos. O aroma é bem mais complexo e é devido a dezenas e centenas
de substâncias voláteis, representantes de várias classes químicas. Para cada
pessoa tem-se uma avaliação diferente, é desta forma que se analisa a média das
notas (AMERINE et al., 1965).
Segundo a Cocamar (2008), além do suco, a laranja oferece o óleo essencial
d-limoneno, rico composto aromático que carrega consigo o aroma e o sabor da
fruta. Encontrado na casca da fruta, ele preserva a cor alaranjada da mesma e o
aroma da fruta. Este composto confere sabor e aroma aos produtos da indústria
alimentícia, cosmética, farmacêutica, servindo também como base para a
elaboração de outros aromas.
Segundo os provadores das amostras 1 e 2, ambas apresentavam aroma e
sabor acentuado de laranja, agradável de acordo com a maioria. Entretanto, alguns
consumidores notaram um forte sabor residual amargo. Estes resultados são
53
semelhantes aos encontrados no trabalho de Della Torre et al. (2003), onde foi
analisada a aparência, aroma e sabor de amostras de suco de laranja natural
processado em nove diferentes condições de temperatura de pasteurização. Neste
estudo, verificou-se a presença do sabor amargo por alguns provadores.
54
6 CONCLUSÕES
O soro de leite foi favorável como meio de cultivo para as bactérias
lácticas e Lactococcus spp. de ambas culturas. No entanto, para as leveduras da
cultura Lyofast MT 036 LV o soro de leite não permitiu igual desenvolvimento para as
leveduras presentes nos grãos de Kefir.
Após a adição do bagaço de laranja ao soro fermentado e posterior
secagem, não foi observada alteração na viabilidade celular de nenhum dos
microorganismos presentes nas culturas, sendo verificado um aumento das
bactérias lácticas do Kefir e também das leveduras da cultura Lyofast MT 036 LV.
Durante o armazenamento, ambas culturas mostraram-se
promissoras para o desenvolvimento dos ingredientes simbióticos, mantendo viáveis
as bactérias lácticas e Lactococcus spp. das culturas segundo os parâmetros
exigidos pela legislação brasileira por 3 meses em temperatura ambiente.
Foi verificado que após o processo de secagem houve um aumento
na concentração de exopolissacarídeos, os quais tiveram uma queda durante o
armazenamento de 3 meses, provavelmente pelo próprio consumo dos
microorganismos, que os utilizaram como substrato.
De acordo com os resultados pode-se notar, que o bagaço de
laranja, por apresentar grande quantidade de fibras sendo a pectina a mais
abundante, apresentou um papel importante na manutenção das células viáveis
após o processo de secagem e posterior armazenamento.
Os simbióticos desenvolvidos aderidos a barra de cereais e a
formulação padrão apresentaram diferenças sensoriais significativas, porém médias
de aceitação muito semelhantes, todas com elevado índice de aceitação.
Conclui-se que os ingredientes simbióticos desenvolvidos no
presente trabalho podem ser uma alternativa economicamente viável para a
utilização dos subprodutos testados e para a diversificação de produtos com
propriedades funcionais.
55
REFERÊNCIAS
ABECITRUS. Informativo da Associação Brasileira dos Exportadores de
Cítricos. 21 de Agosto de 2008. Disponível em
<http://www.abecitrus.com.br/subprodutos_br.html>. Acesso em 21 de Agosto 2008.
ABRAHAM, A. G.; ANTONI, G. L. de; Characterization of Kefir grains grown in cow’s
Milk and in soya Milk. Journal of Dairy Research, v. 66, n. 2, p. 327-333, 1999.
ALEXANDRE, D. P.; SILVA, M. R.; SOUZA, M. R. Atividade antimicrobiana de
bactérias lácticas isoladas de queijo de minas artesanal do Serro (MG) frente a
microorganismos indicadores. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e
Zootecnia. v. 54, p. 424-428, 2002.
ANFITEATRO, D.N. Kefir, a probiotic gem cultured with probiotic jewels. 1
a
Edição, South Australia, Tranmere North Post Office, 37 p, 2000.
ASHWELL, M. Functional Foods: A simple scheme for establishing the scientific
validity for all claims. Public Health Nutrition, v. 4, p. 859-862, 2001.
BELL, L. N.; LABUZA, T. P. Composition influence on the pH of reduced-moisture
solutions. Journal Food Science. 57: 732-734, 1992.
BISSOLI, M. C. Respostas lipidêmicas de coelhos à ingestão de ração suplementada
com quefir, 2005, 48 p, Dissertação (Mestrado – Ciência Animal), Universidade José
do Rosário Vellano, Alfenas – MG.
BOBBIO, F.O.; BOBBIO, P.A. Introdução à Química de Alimentos. 2
a
Edição, São
Paulo, Editora Varela, 223 p, 1995.
BRASHEARS, M. M.; DURRE, W. A. Antagonistic action of Lactobacillus lactis
toward Salmonella spp. and Escherichia coli O157:H7 during growth and refrigerated
storage. Journal of Food Protection. v. 62, p. 1336-1340, 1999.
56
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA.
Resolução - RDC n.° 12, de 02 de janeiro de 2001. Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/12_78_polpa.htm>. Acesso em 03/09/2008.
BROADBENT, J. R. et al. Biochemistry, genetics, and applications of
exopolysaccharides production in Streptococcus thermophilus: a review. Journal of
Dairy Science, v. 86, p. 407-423, 2003.
CALIXTO, F.S. Fibra dietética de manzana: hacia nuevos tipos de fibras de alta
calidad. Alimentaria, v.4, n.1, p.57-61, 1993.
CAPITANI, C. D.; PACHECO, M. T. B.; GUMERATO, H. F.; VITALI, A.; SCHIMIDT,
F. L. Recuperação de proteínas do soro de leite por meio de coacervação com
polissacarídeo. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.40, n.11, p.1123-1128, 2005.
CARABIN, I.G.; FLAMM, W.G. Evaluation of safety of inulin and oligofructose as
dietary fiber. Regulatory Toxicology and Pharmacology, New York, v.30, p.268-
282, 1999.
CARIDI, A. Ripening and seasonal changes in microbial groups and in
physicochemical properties of the ewes cheese Pecorino del Poro. International
Dairy Journal. v. 13, p. 191-200, 2003.
CHITARRA, A.B. O marmelo (Cydonia vulgaris, L) e sua polpa no decorrer do
processo de maturação: características bromatológicas. 1973. 64 f. Dissertação
(Mestrado em Ciência dos Alimentos) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas,
Universidade de São Paulo, São Paulo.
COCAMAR. Informativo da Cooperativa agroindustrial COCAMAR. 2008. Disponível
em <http://cocamar.com.br/Portal/industria/produtos_laranja.html>. Acesso em 19 de
junho de 2010.
CZERUCKA, D.; RAMPAL, P. Experimental effects of Saccharomyces boulardii on
diarrheal pathogens. Microbes and Infection, v.4, p. 733-739, 2002.
57
DELLA TORRE, J. C. M.; RODAS, M. A. B.; BADOLATO, G. G.; TADINI, C. C. Perfil
sensorial e aceitação de suco de laranja pasteurizado minimamente processado.
Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 23, p. 105-111, 2003.
DINIZ, R.O.; PERAZZO F.F.; CARVALHO, J.C.T.*; SCHNEENEDORF, J.M.
Atividade antiinflamatória de Kefir, um probiótico da medicina popular. Revista
Brasileira de Farmacognosia., v. 13, p. 19-21, 2003.
DUWAT, P.; CESSELIN, B.; SOURICE, S.; GRUSS, A. Lactococcus lactis, a
bacterial model for stress responses and survival. International Journal of Food
Microbiology, vol. 55, p. 83-86, 2000.
EASTWOOD, M. A. The physiological effect of dietary fiber: an update. Annual
Review of Nutrition, v. 12, p. 19-35, 1992.
EL NAWAWI, S. A.; SHEHATA. F. R. Extracion of pectin of Egyptian Orange peel:
factors affecting the extration. Biological Wastes, v. 20, p. 281-290, 1987.
ESPINOZA, Y. R.; NAVARRO, Y. G. Non-dairy probiotic products. Food
Microbiology, v. 27, p. 1-11, 2010.
FARNWORTH, E.R. Kefir - a complex probiotic. Food Science and Technology
Bulletin, v.2, n.1, p.1-17, 2005.
FARNWORTH, E.R.; MAINVILLE, Handbook of fermented functional foods. 2ª
Edição, Estados Unidos, Editora CRC PRESS, 390 p, 2003.
FENNEMA, Food chemistry. 4
a
Edição, New York, Editora CRC PRESS, 1160p,
2007.
FRENGOVA, G. I.; SIMOVA, E. D.; BESHKOVA, D. M.; SIMOV, Z. I.
Exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria of kefir grains. Verlag der
Zeitschrift für Natuforschung, v. 57, p. 805-810, 2002.
58
FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION. Food outlook n. 2, 2006. Disponível
em: <http://www.fao.org/docrep/009/j8126e/j8126e11.htm>. Acesso em: 28 de
outrubro de 2009.
FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS, WORLD
HEALTH ORGANIZATION. Evaluation of health and nutritional properties of
probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria, 2001.
Disponível em: <ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/probioreport_en.pdf>. Acesso em: 19
ago. 2008.
FOOKS, L.J.; FULLER, R.; GIBSON, G.R. Prebiotics, probiotics and human gut
microbiology. Internationl Dairy Journal, v.9, p.53-61, 1999.
FOX, P. Food Enzymology. v. 1, New York, Editora Elsevier Science Publishers Ltd,
1.108 p, 1991.
FULLER, R. Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology, v.66,
p.365-78, 1989.
GIBSON, G.R.; ROBERFROID, M.B. Dietary modulation of the human colonic
microbiota: introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition, v.125,
p.1401-1412, 1995.
GILLILAND, S.E. Acidophilus milk products. A review of potential benefits to
consumers. Journal of Dairy Science, v.72, p.2483-2494, 1989.
GILLILAND, S.E. Probiotics and prebiotics. In: MARTH, E.H., STEELE, Applied
Dairy Microbiology, v. 2, p. 327-343, 2001.
GILLILAND, S.E., SPECK, M.L. Instability of Lactobacilus acidophilus in yogurt.
Journal of Dairy Science, v.60, p.1395-1398, 1977.
GOLDIN, B.R. Health benefits of probiotics. British Journal of Nutrition, v.80,
p.203-207, 1998.
59
GOMES, A.M.P., MALCATA, F.X. Bifidobacterium spp. and Lactobacillus
acidophillus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties
relevant for use as probiotics. Trends Food Science and Technology, v.10, p.139-
157, 1999.
HAUPTLI, L.; LOVATOO, P. A.; SILVA, J. H . S.; GARCIA, G. G.; JÚNIOR, B. S. B.;
OLIVEIRA, J. L. S. Níveis de soro de leite integral na dieta de leitões na creche.
Ciencia rural, vol. 35, p. 1161-1165, 2005.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. Métodos
físico-químicos para a análise de alimentos. 4ª Edição, Brasília, Ministério da
saúde, 2005.
JACQUES, N.; CASAREGOLA, S. Safety assessment of dairy microorganismos: The
hemiascomycetous yeasts. International Journal of Food Microbiology. v. 126, p.
321-326, 2008.
KALE, P.N.; ADSULE, P.G. Citrus. In: SALUNKHE, D. K.; KADAM, S. S. Handbook
of fruit Science and technology. New York, p. 39-65, 1995.
KIM, H.S., GILLILAND, S.E. Lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct for milk to
aid lactose digestion in humans. Journal of Dairy Science, v.66, p.959-966, 1983.
KOVACS, D. J.; BERK, T. Recurrent Clostridium difficile associated diarrhea and
colitis treated with Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) in combination with
antibiotic therapy: a case report. Journal of the American Board of Family
Practice. v. 13, p. 138-140, 2000.
LACHANCE, M. A.; STARMER, W. T.; Ecology and yeasts. In: Kurtzman, C.P. Fell,
The Yeasts, A Taxonomic Study. 4a Edição, Elsevier Science, Amsterdam, p. 21-
30, 1998.
LEISNER, M. K.; VANCANNEYT, M.; GORIS, J.; CHRISTENSEN, H.; RUSUL, G.
Description of Paralactobacillus selangorensis gen. nov., sp. Nov., a new lactic acid
60
bacterium isolated from chili bo, a Malaysian food ingredient. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology, V. 50, P. 19-24, 2000.
LOPES, F.F., TROMBIN, V.G., FAVA, B.B. e BRUGNARO, R. Perspectivas da
Cadeia Produtiva da Laranja no Brasil. 89 p. 2006. Disponível em: <
http://www.fundace.org.br/arquivos_diversos/agenda_estrategica/Desafios_Citrus_Ja
nk_23_Nov.pdf>. Acesso em: 16 de setembro de 2009.
MACFARLANE GT, CUMMINGS JH. Probiotics and prebiotics: Can regulating the
activities of intestinal bacteria benefit health? British Medical Journal, v. 171, p.
999-1003, 1999.
MANDERSON, K., PINART, M., TUOHY, K. M., GRACE, W. E., HOTCHKISS, A. T.,
WIDMER, W., YADHAV, M. P., GIBSON, G. R., RASTALL, R. A. In Vitro
Determination of Prebiotic Properties of Oligosaccharides Derived from an Orange
Juice Manufacturing By-Product Stream. Environmental Microbiology, v. 71, p.
8383-8389, 2005.
MANSOUR-GHANAEI, F.; DEHBASHI, N.; YAZDANPARAST, K.; SHAFAGHI, A.
Efficacy of Saccharomyces boulardii with antibiotics in acute amoebiasis. World
Journal of Gastroenterology. v. 9, p. 1832-1833, 2003.
MATTILA-SANDHOLM, T.; MYLLÄRINEN, P.; CRITTENDEN, R.; MOGENSEN, G.,
FONDÉN, R.; SAARELA, M. Technological challenges for future probiotic foods.
International Dairy Journal, v.12, p.173-182, 2002.
MICKE, P.; BEEH, K.M.; BUHL, R. Effects of long-term supplementation with whey
proteins on plasma glutathione levels of HIV-infected patients. European Journal of
Nutrition, v.41, p.12-18, 2002.
MIYOSHI, A.; ROCHAT, T.; GRATADOUX, J. J.; LOIR, Y. L.; OLIVEIRA, S. C.;
LANGELLA, P. Oxidative stress in Lactococcus lactis. Genetics and Molecular
Research, v. 2, p. 348-359, 2003.
NAIDU, A. S.; BIDLACK, W. R.; CLEMENS, R. A. Probiotic spectra of lactic acid
61
bacteria. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. v. 38, p. 13-126, 1999.
NAIDU, A.S., CLEMENS, R.A. Probiotics spectra of lactic acid bacteria (LAB) In:
NAIDU, A.S. Natural food Antimicrobial Systems. p.431-462, 2000.
NEWBOLD, C. J.; WALLACE, R. J.; CHEN, X. B.; MCINTOSH, F. M. Different strains
of Saccharomyces cerevisiae differ in theier effects on ruminal bacterial numbers in
vitro and in sheep. Journal of Animal Science. v. 73, p. 1811-1818, 1995.
OKSANEN, P., SALMINEN, S., SAXELIN, M., HÄMÄLÄINEN P., IHANTOLA-
VORMISTO, A., MUURASNIEMI-ISOVIITA, L., NIKKARA, S., OKSANEN, T.,
PÖRSTI, T., SALMINEN, E., SIITONEN, S., STUCKEY, H., TOPPILA, A.,
VAPAATALO, H. Prevention of traveler’s diarrhea by Lactobacillus GG. Annals of
Medicine, v.22, p.53-56. 1990.
OLIVEIRA, M. N.; SIVIERI, K.; ALEGRO, J. H. A.; SAAD, S. M. I. Aspectos
tecnológicos de alimentos funcionais contendo probióticos. Revista Brasileira de
Ciências Farmacêuticas; v. 38, p.1-21, 2002.
PIERMARIA, J. A.; PINOTTI A.; GARCIA, M. A.; ABRAHAM, A. G. Films based on
kefiran, na exopolysaccharide obtained from kefir grain: Development and
characterization. Food hydrocolloids, v. 23, p. 684-690, 2008.
POSTERATO, B.; SANQUINETTI, M.; ROMANO, L.; TORELLI, R.; NOVARESE, L.;
FADDA, G. Molecular tools for differentiating probiotic and clinical strains of
Saccharomyces cerevisae. International Journal of Food Microbiology, v. 193, p.
2950394.
POURCHET-CAMPOS, M.A. Fibra: a fração alimentar que desafia os estudiosos.
Alimentos e Nutrição, v.2, p.53-63, 1990.
RABIU B.A., JAY A.J., GIBSON G.R., RASTALL R.A. Synthesis and Fermentation
Properties of Novel Galacto-Oligosaccharides by β-Galactosidases from
Bifidobacterium Species. Applied and Environmental Microbiology. , v. 67, p.
62
2526-2539, 2001.
RASTALL R.A.; MAITIN V. Prebiotics and synbiotics: Towards the next generation.
Current Opinion in Biotechnology. v. 13, p. 490-496, 2002.
ROBERFROID M. Functional food concept and its application to prebiotics.
Digestive and Liver Disease, v. 34, p. 105-110, 2002.
ROBERFROID, M.B. Prebiotics: preferential substrates for specific germs?
American Journal of Clinical Nutrition, v.73, p.406-409, 2001.
RORATO, F.; DEGÁSPARI, C. H.; MOTTIN, F. Avaliação do nível de conhecimento
de consumidores de produtos diet e light que frequentam um supermercado de
Curitiba. 2006. Disponível em:
<http://ojs.c3sl.ufpr.br/ojs2/index.php/academica/article/view/9011/6312>. Acesso
em: 19 de junho de 2010.
ROSANELI, C.F.; BIGHETTI, A.E.; ANTÔNIO, M.A.; CARVALHO, J.E.; SGARBIERI,
V.C. Efficacy of a whey protein concentrate on the inhibition of stomach ulcerative
lesions caused by ethanol ingestion. Journal of Medicinal Food, v.5, p.221-228,
2002.
RUAS-MADIEDO, P.; HUGENHOLTZ, J.; ZOON, P. An overview of the functionality
of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. International Dairy Journal,
v. 12, p. 163-171, 2002.
RYBKA, S., FLEET, G.H. Populations of Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus,
Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium species in
Australian yoghurts. Food Australia, v.49, p.471-475, 1997.
SAAD, S. M. I. Probióticos e prebióticos: o estado da arte. Brazilian Journal of
Pharmaceutical Sciences, v. 42, p. 53-69, 2006.
SANDERS, M.E. Probiotics: considerations for human health. Nutrition Reviews,
63
v.61, p.91-99, 2003.
SANDINE, W.E., MURALIDHARA, K.S., ELLIKER, P.R., ENGLAND, D.C. Lactic acid
bacteria in food and health: a review with special reference to enteropathogenic
Escherichia coli as well as certain enteric diseases and their treatment with
antibiotics and lactobacilli. Journal of Milk and Food Technology, v. 35, p. 691-
702, 1972.
SANTOS, L. C; CANÇADO, I. C. Probióticos e Prebióticos: vale a pena incluí-los em
nossa alimentação. SynThesis Revista Digital FAPAM, n.1, 2009.
SAVAGE, T.F.; COTTER, P.F.; ZAKRZEWSKA, E.I. The effects of feeding mannan
oligosaccharide on Immunoglobulins, plasma IgG and bile IgA, of wrolstad MW male
turkeys. Poultry Science, v.75, p.143, 1996.
SGARBIERI, V.C. Estudo da composição química do abacaxi. Boletim do Centro
Tropical de Pesquisa e Tecnologia de Alimentos, v.7, p.37-50, 1966.
SHORTT, C. The probiotic century: historical and current perspectives. Trends in
Food Science and Technology, v.10, p.411-417, 1999.
SILVA, N. DA; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N. F. A. Manual de métodos de
análise microbiológica de alimentos. São Paulo: Livraria Varela, 317p, 2001.
SMITHERS, G. W. Whey and whey proteins – From “gutter-togold”. Food Science
Australia, International Dairy Journal, v. 18, p. 695-704, 2008.
SOORO – CONCENTRADO INDUSTRIAL DE PRODUTOS LÁCTEOS LTDA. A
Indústria – mercado. Disponível em: <http://sooro.com.br/meioAmbiente.php>.
Acessado em: 21 de setembro 2009.
SOUZA, C. F. V. DE; ROSA, T. D.; AYUB, M. A. Z. Evolução das características
microbiológicas e físico-químicas durante a elaboração e maturação do queijo
Serrano. Brazilian Journal of Microbiology, v.34, p. 260-266, 2003.
64
SOUZA, D. M. DE; GARCIA-CRUZ, C. H. Produção fermentativa de polissacarídeos
extracelulares por bactérias. Semina: Ciências Agrárias, v.25, p. 331-340, 2004.
SREEKUMAR, O., HOSONO, A. Immediate effect of Lactobacillus acidophilus on the
intestinal flora and fecal enzymes of rats and the in vitro inhibition of Escherichia coli
in coculture. Journal of Dairy Science, v.83, p. 931-939, 2000.
SUNVOLD, G. D. et al., In vitro fermentation, beet pulp, citrus pulp, and citrus pectin
using fecal inoculums from cats, dogs, horses, humans, and pigs and ruminal fluid
from cattle. Journal of Animal Science, v. 73, p. 3639-3648, 1995.
TEJADA-SIMON, M.V., LEE, J.H., USTUNOL, Z., PESTKA, J.J. Ingestion of yogurt
containing L. acidophilus and Bifidobacterium to potentiate immunoglobulin A
responses to cholera toxin in mice. Journal of Dairy Science, v.82, p.649-680,
1999.
TRUM, B. Yogurt, Kefir & Other Milk Cultures. 1
a
Edição, Connecticut, Editora
Keats Pub, 117 p, 1973.
TUDO GOSTOSO. Informativo do site tudo gostoso. 2010. Disponível em:
<http://tudogostoso.uol.com.br/receita/11167-barrinha-de-cereal-light.html>. Acesso
em 20 de Janeiro de 2010.
URAZ, G.; SIMSEK, H.; MARAS, Y. The inhibitory effects of Lactobacillus casei and
Lactobacillus helveticus on Bacillus species isolated from raw Milk in various salt
concentrations. International Journal of Dairy Technology. v. 54, p. 146-150,
2001.
VASILJEVIC, T.; SHAH, N. P. Probiotics – From Metchnikoff of bioactives.
International Dairy Journal, v. 18, p. 714-728, 2008.
VAUGHAN, E. E.; CAPLICE, E.; LOONEY, R. Isolation from food sources, of lactic
acid bacteriathat produced antimicrobials. Journal of Applied Bacteriology. v. 76,
65
p. 118-123, 1994.
VINDEROLA, C.G., REINHEIMER, J.A. Enumeration of L. casei in the presence of L.
acidophilus, bifidobacteria and lactic starter bacteria in fermented dairy products.
International Dairy Journal, v.10, p.271-275, 2000.
WELTI, J.; VERGARA, F. Atividade de água / Conceito y aplicación em alimentos
com alto contenido de humedad. In: AGUILERA, J. M. Temas en Tecnologia de
Alimentos. Santiago – Chile, v.1, p. 11-26, 1997.
WHISTLER, R.L.; DANIEL, J.R. Carbohydrates. In: Fennema, O.R. Food
Chemistry. 2
a
Edição, New York, p. 69-137, 1985.
WOHLT, J. E.; CORCIONE, T. J.; ZAJAC, P. K. Effect of yeast on feed intake and
performance of cows fed diets based on corn silage during early lactation. Journal of
Dairy Science. v. 87, p. 1345-1352, 1998.
YÜKSEKDAG, Z. N.; BEYATLI, Y.; ASLIM, B. Determination of some characteristics
coccoid forms of lactic acid bacteria isolated from Turkish Kefirs with natural
probiotic. Lebensmittel Wissenschaft und Technoligie, v. 37, p. 663-667, 2004.
ZIEMER, C.J., GIBSON, G.R. An overview of probiotics, prebiotics and synbiotics in
the functional food concept: perspectives and future strategies. International Dairy
Journal, v.8, p.473-479, 1998.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo