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FRANCISCO DE ASSIS MENDES GOES JR
RELAXAMENTO DO CORPO CAVERNOSO DE COELHO INDUZIDO PELA
FRAÇÃO ALCALOIDAL F3-5 DE Aspidosperma ulei MARKGR.
Dissertação submetida à Coordenação do Programa
de Pós-Graduação Stricto Senso em Cirurgia da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do
Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau
de Mestre em Cirurgia.
Orientador: Prof. Dr. Lúcio Flávio Gonzaga Silva
FORTALEZA
2007
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FRANCISCO DE ASSIS MENDES GOES JR
RELAXAMENTO DO CORPO CAVERNOSO DE COELHO INDUZIDO PELA
FRAÇÃO ALCALOIDAL F3-5 DE Aspidosperma ulei MARKGR.
Dissertação submetida à Coordenação do Programa
de Pós-Graduação Stricto Senso em Cirurgia da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do
Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau
de Mestre em Cirurgia.
Aprovada em 30 / 05 / 2007
BANCA EXAMINADORA
______________________________________
Prof. Dr. Lúcio Flávio Gonzaga Silva
Universidade Federal do Ceará
______________________________________
Prof. Dr. Paulo Roberto Leitão de Vasconcelos
Universidade Federal do Ceará
______________________________________
Prof. Dr. Nilberto Robson Falcão Nascimento
Universidade Estadual do Ceará
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Para Annya
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Doutor LÚCIO FLÁVIO GONZAGA SILVA, do Departamento de
Cirurgia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, orientador,
pelos ensinamentos e a convivência sempre agradável.
Ao Professor Doutor PAULO ROBERTO LEITÃO DE VASCONCELOS, Coordenador
do Programa de Pós-Graduação Stricto Senso em Cirurgia da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal do Ceará, pelo nobre compromisso com a
formação de mestres e doutores no Ceará.
Ao Professor Doutor NILBERTO ROBSON FALCÃO NASCIMENTO, do Instituto
Superior de Ciências Biomédicas da Universidade Estadual do Ceará, por dividir
generosamente seus conhecimentos, essenciais ao planejamento e execução dos
ensaios experimentais.
Ao Professor JOÃO BATISTA GADELHA DE CERQUEIRA, do Departamento de
Cirurgia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, pelo incentivo
constante ao meu crescimento profissional.
Às Professoras Doutoras CLÁUDIA FERREIRA SANTOS e MARTA REGINA
KERNTOPF MENDONÇA, do Instituto Superior de Ciências Biomédicas da
Universidade Estadual do Ceará, pela imprescindível contribuição durante a
realização dos experimentos.
Aos Professores Doutores ANTÔNIO ALDO MELO FILHO e SÉRGIO BOTELHO
GUIMARÃES, pelas valiosas sugestões para o aprimoramento deste trabalho,
apresentadas durante o exame de qualificação.
Aos colegas de pós-graduação FERNANDO CÉSAR MUNIZ FREITAS e
FRANCISCO JOSÉ ARNAUD BATISTA, pelo espírito de equipe e companheirismo.
Aos Professores do Programa de Pós-Graduação Stricto Senso em Cirurgia da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, pela excelente qualidade
das disciplinas ministradas.
Às Secretárias do Programa de Pós-Graduação Stricto Senso em Cirurgia da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, MARIA LUCIENE VIEIRA
DE OLIVEIRA e MAGDA MARIA GOMES FONTENELE, pelo trabalho competente,
solicitude e gentileza.
À Universidade Federal do Ceará e Universidade Estadual do Ceará, por toda a
infra-estrutura disponibilizada para a realização deste estudo.
“A marcha da ciência é como a planície
do deserto: o horizonte foge sempre”
Graça Aranha
RESUMO
Relaxamento do corpo cavernoso de coelho induzido pela fração alcaloidal F
3-5
de
Aspidosperma ulei Markgr. FRANCISCO DE ASSIS MENDES GOES JR. Pós-
Graduação Stricto Senso em Cirurgia, Faculdade de Medicina, Universidade
Federal do Ceará (Grau de Mestre em Cirurgia). Maio, 2007. Orientador: Prof.
Dr. Lúcio Flávio Gonzaga Silva.
A disfunção erétil é um problema mundial de saúde pública e, apesar dos avanços
trazidos pela utilização dos inibidores da fosfodiesterase tipo-5, ainda há muito
interesse em novas alternativas de tratamento, especialmente quando derivadas de
produtos naturais. Alguns pesquisadores observaram os efeitos pró-eréteis de uma
fração rica em alcalóides de Aspidosperma ulei Markgr., denominada F
3-5.
Neste
estudo, foi avaliado o grau de relaxamento induzido por F
3-5
no corpo cavernoso de
coelho, bem como possíveis mecanismos farmacológicos envolvidos, in vitro. Foram
realizados diversos ensaios experimentais, utilizando-se os métodos de superfusão
de tecido em cascata e de banho isolado de tecido. Com tiras de corpo cavernoso
pré-contraídas com fenilefrina (5 µM), foram produzidas curvas de dose-resposta de
relaxamento para F
3-5
, papaverina e DMSO. Também foram realizados ensaios para
avaliação dos efeitos de L-NAME, 7-NI, ODQ, propranolol, atropina, sildenafil e F
3-5
sobre os relaxamentos mediados por nitroprussiato de sódio, acetilcolina,
isoproterenol, sildenafil e F
3-5
. Com preparações de corpo cavernoso despolarizadas,
em um meio livre de cálcio e rico em potássio (60 mM), os efeitos de F
3-5
e DMSO
sobre as contrações induzidas pelo aumento progressivo na concentração de Ca
2+
(1 – 300 mM) foram observados. F
3-5
foi capaz de induzir o relaxamento completo do
corpo cavernoso de coelho, com magnitude similar à da papaverina para todas as
doses testadas, exceto 3 mg, quando apresentou relaxamento significantemente
maior. As superfusões de L-NAME, 7-NI e ODQ não inibiram significantemente os
relaxamentos provocados por F
3-5
, sugerindo que este age independentemente da
via nitrérgica. Propranolol e atropina também não interferiram significantemente com
os relaxamentos mediados por F
3-5
, indicando que receptores β-adrenérgicos ou
muscarínicos também não devem estar envolvidos. F
3-5
não amplificou
significantemente os relaxamentos promovidos por nitroprussiato de sódio ou
acetilcolina, ao contrário de sildenafil, sugerindo que não age por inibição da
fosfodiesterase tipo-5. Finalmente, em tecido cavernoso pré-incubado com F
3-5
, a
dose mínima de Ca
2+
necessária para contração muscular foi trinta vezes superior
àquela utilizada em tecido sem tratamento prévio ou tratado com DMSO. Esta
inibição das contrações de corpo cavernoso mediadas pelo Ca
2+
sugere, portanto,
que F
3-5
pode atuar através do bloqueio de canais de cálcio voltagem-dependente.
Descritores: Apocynaceae; Fitoterápico; Impotência
ABSTRACT
Relaxation of rabbit corpus cavernosum induced by the alkaloidal fraction F
3-5
from
Aspidosperma ulei Markgr. FRANCISCO DE ASSIS MENDES GOES JR. Stricto
Senso Post-Graduation in Surgery, Faculty of Medicine, Federal University of
Ceará (Master’s Degree in Surgery). May, 2007. Advisor: Prof. Dr. Lúcio Flávio
Gonzaga Silva.
Erectile dysfunction is a worldwide public health issue and, in spite of advances
brought by the utilization of type-5 phosphodiesterase inhibitors, there is still much
interest in new treatment alternatives, especially when derived from natural products.
Some investigators observed the pro-erectile effects of an alkaloidal-rich fraction from
Aspidosperma ulei Markgr., named F
3-5
. In this study, it was evaluated the degree of
relaxation induced by F
3-5
on rabbit corpus cavernosum, as well as possible
pharmacological mechanisms involved, in vitro. Several experimental assays were
performed, utilizing the methods of cascade tissue superfusion and isolated tissue
bath. With strips of corpus cavernosum pre-contracted with phenilephrine (5 µM),
dose-response curves of relaxation for F
3-5
, papaverine and DMSO were produced.
There were also assays for evaluation of the effects of L-NAME, 7-NI, ODQ,
propranolol, atropine, sildenafil and F
3-5
on the relaxations mediated by sodium
nitroprusside, acetylcholine, isoproterenol, sildenafil and F
3-5
. With depolarized
preparations of corpus cavernosum, in a calcium-free, potassium-rich (60 mM)
medium, the effects of F
3-5
and DMSO on the contractions induced by the
progressive increase in Ca
2+
concentration (1 – 300 mM) were observed. F
3-5
was
capable of inducing complete relaxation of rabbit corpus cavernosum with magnitude
similar to that of papaverine for all doses tested, except 3 mg, when it presented a
significantly higher relaxation. Superfusions of L-NAME, 7-NI and ODQ did not
significantly inhibit the relaxations provoked by F
3-5
, suggesting that it acts
independently of the nitrergic pathway. Propranolol and atropine also did not
significantly interfere with relaxations mediated by F
3-5
, indicating that β-adrenergic or
muscarinic receptors also might not be involved. F
3-5
did not significantly amplify the
relaxations promoted by sodium nitroprusside or acetylcholine, as opposed to
sildenafil, suggesting that it does not act through inhibition of type-5
phosphodiesterase. Finally, in cavernous tissue pre-incubated with F
3-5
, the minimum
dose of Ca
2+
necessary for muscular contraction was thirty times superior to that
utilized on the tissue without previous treatment, or treated with DMSO. This
inhibition of the contractions of corpus cavernosum mediated by Ca
2+
suggests,
therefore, that F
3-5
can act through blockade of voltage-dependent calcium channels.
Key-words: Apocynaceae; Phytotherapeutic; Impotence
LISTA DE FIGURAS
Figura
Página
1 Anatomia do pênis e detalhamento da arquitetura dos corpos
cavernosos nos estados de flacidez e tumescência
15
2
Mecanismo molecular do relaxamento do músculo liso peniano
19
3
Aspidosperma ulei Markgr.
24
4
Uleína
27
5
nor-uleína
28
6
Tetrahidro-3,14,4,21-elipticina
28
7 Relaxamentos máximos induzidos por doses crescentes de F
3-5
,
papaverina e DMSO
34
8 Relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh e F
3-5
,
isoladamente, e durante superfusão de L-NAME
36
9 Relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh e F
3-5
,
isoladamente, e durante superfusão de 7-NI
37
10 Relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh, sildenafil e F
3-
5
, isoladamente, e durante superfusão de ODQ
38
11 Relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh, isoproterenol e
F
3-5
, isoladamente, e durante superfusão de propranolol
40
12 Relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh e F
3-5
,
isoladamente, e durante superfusão de atropina
42
13 Relaxamentos máximos induzidos por SNP e ACh, isoladamente,
e durante superfusão de F
3-5
e sildenafil
44
14 Contrações máximas induzidas pelo CaCl
2
, isoladamente, e após
incubação com F
3-5
e DMSO
46
15 Contrações máximas induzidas por doses crescentes de CaCl
2
,
isoladamente, e após incubação com F
3-5
e DMSO
46
LISTA DE TABELAS
Tabela
Página
1 Ensaios com superfusão de tecido em cascata
31
2 Ensaio com banho isolado de tecido
32
3 Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos
induzidos por doses crescentes de F
3-5
, papaverina e DMSO
34
4 Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos
induzidos por SNP, ACh e F
3-5
, isoladamente, e durante
superfusão de L-NAME
36
5 Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos
induzidos por SNP, ACh e F
3-5
, isoladamente, e durante
superfusão de 7-NI
37
6 Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos
induzidos por SNP, ACh e F
3-5
, isoladamente, e durante
superfusão de ODQ
38
7 Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos
induzidos por SNP, ACh, isoproterenol e F
3-5
, isoladamente, e
durante superfusão de propranolol
40
8 Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos
induzidos por SNP, ACh e F
3-5
, isoladamente, e durante
superfusão de atropina
42
9 Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos
induzidos por SNP e ACh, isoladamente, e durante superfusão
de F
3-5
e sildenafil
44
10 Dados numéricos correspondentes às contrações máximas
induzidas pelo CaCl
2
, isoladamente, e após incubação com F
3-5
e
DMSO
46
LISTA DE ABREVIATURAS
7-NI 7-nitroindazol
ACh Acetilcolina
AMP Monofosfato de adenosina
ATP Trifosfato de adenosina
Atrop. Atropina
cAMP Monofosfato de adenosina cíclico
cGMP Monofosfato de guanosina cíclico
DE Disfunção Erétil
DMSO Dimetil sulfóxido
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial
EPM Erro-padrão da média
GC Guanilato ciclase
GMP Monofosfato de guanosina
iNOS Óxido nítrico sintase induzível
Isopr. Isoproterenol
L-NAME L-nitro arginina metil éster
NA Noradrenalina
NANC Não adrenérgico não colinérgico
nNOS Óxido nítrico sintase neuronal
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
ODQ 1H-[1,2,4]oxadiazol [4,3,-a]quinoxalin-1-ona
PDE5 Fosfodiesterase tipo 5
PDEs Fosfodiesterases
pGC Guanilato ciclase particulada
PGE1 Prostaglandina E1
Prop. Propranolol
sGC Guanilato ciclase solúvel
Sild. Sildenafil
SNP Nitroprussiato de sódio
SUMÁRIO
RESUMO ...............................................................................................................
7
ABSTRACT ........................................................................................................... 8
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................. 9
LISTA DE TABELAS ............................................................................................. 10
LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................
11
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................
13
2 OBJETIVO ....................................................................................................... 26
3 MÉTODO ......................................................................................................... 27
4 RESULTADOS .................................................................................................
33
5 DISCUSSÃO ....................................................................................................
47
6 CONCLUSÃO .................................................................................................. 55
7 REFERÊNCIAS ............................................................................................... 56
13
1 INTRODUÇÃO
Bases morfológicas da ereção peniana
De modo geral, a anatomia peniana é similar em todas as espécies de
mamíferos (SACHS; MEISEL, 1988). O pênis é formado por três estruturas
cilíndricas: dois corpos cavernosos dorsais emparelhados e separados por um septo
incompleto, e um corpo esponjoso ventral que envolve a uretra e expande-se
distalmente, formando a glande. Eles são envoltos conjuntamente pela fáscia de
Buck, tecido subcutâneo e pele (ANDERSSON; WAGNER, 1995).
A túnica albugínea contém o tecido erétil peniano e é fundamental para sua
flexibilidade, rigidez e resistência. Ela é composta de uma dupla camada de fibras
elásticas e colágenas, cuja espessura é variável. Nos corpos cavernosos, o
revestimento albugíneo é bastante espesso, porém, no corpo esponjoso é mais
delgado e menos resistente à tensão, sendo inclusive ausente na glande (BITSCH
et al., 1990; HSU et al., 1992).
A arquitetura dos corpos cavernosos é similar à do corpo esponjoso, exceto
pela glande, que apresenta riqueza de anastomoses venosas. Trabéculas de
músculo liso, fibras elásticas e colágenas, fibroblastos, e tecido conjuntivo frouxo
dispõem-se num arranjo aleatório, formando lacunas revestidas por endotélio
vascular, denominadas espaços sinusoidais. Eles são abastecidos por uma densa
rede de arteríolas e nervos terminais e têm papel central nos processos de ereção e
detumescência (LUE, 2002).
A parte proximal do pênis não é móvel e está ligada ao osso pélvico. É
chamada de raiz, composta de dois ramos e um bulbo. Os ramos correspondem às
extremidades proximais dos corpos cavernosos, e conectam-se aos músculos
isquiocavernosos. O bulbo compreende o segmento inicial do corpo esponjoso e
associa-se ao músculo bulbocavernoso (PAGANI; DI DIO, 2002).
O principal suprimento sangüíneo ao pênis advém da artéria pudenda interna,
ramo da artéria ilíaca interna. Em alguns indivíduos, artérias acessórias com outras
origens podem ser responsáveis pela irrigação peniana. Após atravessar o canal de
Alcock, a artéria pudenda interna se torna artéria peniana, a qual divide-se em
artérias dorsal, bulbouretral, e cavernosa. A artéria cavernosa fornece numerosos
14
ramos terminais, denominados artérias helicinais, que penetram os corpos
cavernosos e abastecem os espaços sinusoidais. As artérias helicinais têm formato
espiralado e apresentam-se contraídas quando o pênis está flácido, entretanto,
durante a ereção, elas retificam-se e aumentam de calibre. A artéria dorsal supre a
glande, enquanto a artéria bulbouretral irriga o bulbo e o corpo esponjoso (LUE,
2002).
A drenagem venosa peniana inicia-se com vênulas distribuídas por todo o
órgão, as quais se fundem num plexo imediatamente abaixo da túnica albugínea.
Deste plexo, originam-se as veias emissárias, que perfuram a túnica e organizam-se
em três sistemas: superficial, intermediário e profundo. O sistema superficial traz o
sangue proveniente da pele e tecido subcutâneo através da veia dorsal superficial,
que drena para a veia safena. O sistema intermediário drena a parte distal (pendular)
do pênis através da veia dorsal profunda, que por sua vez termina no plexo venoso
periprostático. O sistema profundo recebe o sangue da parte proximal (infra-púbica)
do pênis e o leva pelas veias cavernosa, crural e peri-uretral para a veia pudenda
interna. Além destes padrões de drenagem, as veias dos três sistemas também se
comunicam entre si, de modo variável (LUE, 2002).
O pênis recebe inervação tanto autonômica quanto somática. Fibras nervosas
simpáticas e parassimpáticas (autonômicas) regulam os eventos neurovasculares
durante a ereção e detumescência. As fibras nervosas sensitivas e motoras
(somáticas) são responsáveis pelas sensações e pelo controle da atividade dos
músculos isquiocavernosos e bulbocavernoso (DE GROAT; BOOTH, 1993).
Os nervos cavernosos conduzem os impulsos autonômicos, com o
componente simpático originando-se dos segmentos medulares T11 a L2, e o
componente parassimpático dos segmentos S2 a S4. A estimulação medular tóraco-
lombar (simpática) induz detumescência, enquanto a estimulação medular sacral
(parassimpática) causa ereção (PAGANI; DI DIO, 2002). Os nervos cavernosos são
facilmente lesados durante cirurgias radicais da bexiga, próstata e reto,
determinando disfunção erétil (WALSH; BRENDLER; CHANG, 1990).
O nervo pudendo é responsável pela inervação somática, concentrada nos
segmentos S2 a S4 da medula espinhal. Inúmeros receptores distribuídos por todo o
pênis, especialmente na glande, conectam-se aos feixes do nervo dorsal do pênis, e
este ao nervo pudendo, o qual adentra a medula, de onde neurônios sensitivos
conduzem o impulso até o cérebro. Os estímulos motores são conduzidos pelo nervo
15
pudendo aos músculos isquiocavernosos e bulbocavernoso, cujas contrações são
responsáveis pela fase rígida da ereção e pela ejaculação, respectivamente (LUE,
2002).
No passado, acreditava-se que o nervo dorsal do pênis fosse, assim como o
nervo pudendo, puramente somático. Foi demonstrado, porém, que o nervo dorsal é
misto, com fibras somáticas e autonômicas, regulando tanto a função erétil quanto a
ejaculação (GIULIANO et al., 1993).
Os centros supra-espinhais relacionados à função sexual e ereção peniana
foram identificados, em estudos com animais, na área pré-óptica medial e no núcleo
paraventricular do hipotálamo e hipocampo (McKENNA, 1998).
FIGURA 1 – Anatomia do pênis e detalhamento da arquitetura dos corpos cavernosos nos estados de
flacidez e tumescência (Extraído de BARROS, 2005).
16
Mecanismo hemodinâmico da ereção peniana
A musculatura lisa presente nos corpos cavernosos e nas paredes arteriais
tem papel central na ereção peniana. No estado de flacidez, a musculatura está
contraída, o que regula o suprimento sanguíneo para o mínimo necessário. Após a
estimulação sexual, segue-se o relaxamento muscular, cuja primeira conseqüência é
o aumento do fluxo sanguíneo para o pênis. Os espaços sinusoidais dos corpos
cavernosos, que no estado flácido são virtuais, começam a ser preenchidos com
sangue, aumentando o volume do órgão. Passa a haver compressão dos plexos
venosos contra a túnica albugínea, reduzindo-se bastante a drenagem. Este
mecanismo veno-oclusivo gera um aumento gradual da pressão intracavernosa, que
leva o pênis da posição de relaxamento para o estado ereto (ereção cheia).
Subseqüentemente, os músculos isquiocavernosos contraem-se, gerando um
aumento adicional de pressão intra-cavernosa (ereção rígida). No corpo esponjoso,
como a túnica albugínea é mais delgada, as pressões são cerca de metade das
observadas nos corpos cavernosos, facilitando a expulsão do sêmen através da
uretra. Na fase de detumescência, ocorre a reversão destes eventos. A seqüência
inicia-se com um breve aumento da pressão intracavernosa, devido ao fato de que o
músculo liso cavernoso começa a contrair-se quando o mecanismo veno-oclusivo
ainda está funcionante. Com a reabertura dos canais venosos, a pressão diminui, a
princípio lentamente e depois de modo rápido, até restabelecerem-se os parâmetros
de flacidez peniana (LUE, 2002).
Modulação farmacológica da ereção peniana
O tecido muscular liso do pênis exibe um padrão de atividade contrátil
espontânea, além de ser sensível às ações de numerosas substâncias endógenas e
exógenas (CHRIST et al., 1990). Atualmente, está bem claro que o estado funcional
do pênis (flacidez, tumescência ou ereção) é conseqüência direta do equilíbrio entre
os estímulos à contração e ao relaxamento do músculo liso peniano. Diversos
neurotransmissores e sistemas de transmissão, centrais e periféricos, estão
envolvidos nestes processos (ANDERSSON, 2001).
17
Neurotransmissores centrais
A regulação da função erétil no sistema nervoso central é compreendida
apenas parcialmente, sendo que as maiores contribuições para isso vêm dos
estudos com animais (SACHS, 2000). Dentre os neurotransmissores centrais com
efeito estimulante sobre a função sexual, destacam-se a dopamina, a ocitocina, os
hormônios adrenocorticotrópico e α-melanócito-estimulante, os aminoácidos L-
glutamato e N-metil-D-aspartato, e o NO (PEHEK et al., 1988; MELIS et al., 1997;
ANDERSSON, 2001). Deprimem o comportamento sexual os opióides, como a
morfina, bem como o ácido γ-aminobutírico (MCINTOSH; VALLANO; BARFIELD,
1980; MELIS et al., 2000). A serotonina tem um efeito geral inibitório sobre a função
sexual masculina, porém dependendo dos subtipos de receptores e dos locais de
ação no sistema nervoso central sua ação pode ser facilitatória (ANDERSSON,
2001). Por fim, a NA e a ACh têm papel questionável no controle central da ereção
peniana, pois ainda há poucas evidências experimentais neste sentido
(ANDERSSON, 2001).
Neurotransmissores periféricos
A modulação periférica da função erétil envolve os nervos, endotélio
sinusoidal e vasos sanguíneos penianos, os quais produzem e liberam substâncias
que regulam o estado de contração do músculo liso cavernoso. Estes agentes se
dividem entre os que promovem contração e os que estimulam o relaxamento do
músculo liso cavernoso (LUE, 2002).
A inervação adrenérgica peniana é abundante, sendo a principal responsável
pelo estado de flacidez do órgão. A liberação de NA, um agonista α e β-adrenérgico
causa contração da musculatura lisa do pênis (ANDERSSON; WAGNER, 1995). Nos
corpos cavernosos, a densidade de receptores α é cerca de dez vezes maior que β,
tendo sido demonstrado experimentalmente que a ação direta da NA ocorre por
intermédio do subtipo α1 (SIRONI et al., 2000). No entanto, os receptores α2
também têm um possível papel na manutenção da flacidez do pênis, através de
bloqueio da liberação de NO e, sendo assim, o bloqueio combinado α1 e α2 poderia
ser uma forma de melhorar a função erétil (TEJADA et al., 2000). É importante
destacar que a estimulação de receptores adrenérgicos do subtipo β3 promove o
18
relaxamento do tecido cavernoso, por estímulo à síntese do cAMP (CIRINO, 2003).
As endotelinas, liberadas pelo endotélio sinusoidal, também estão implicadas no
mecanismo de flacidez peniana. Supõe-se que sua ação possa ser direta, como um
regulador do tônus do músculo liso cavernoso, bem como indireta, através da
modulação dos efeitos contráteis de outros agentes, principalmente a NA (LUE,
2002). Diversas evidências experimentais comprovam a ação contrátil da
angiotensina II sobre o tecido muscular liso cavernoso. Entretanto, ainda não ficou
claro se a angiotensina II é fisiologicamente importante na regulação do tônus deste
músculo (ANDERSSON, 2003).
O pênis também é densamente provido de inervação colinérgica,
encontrando-se receptores muscarínicos de quatro tipos (M1 – M4) nos corpos
cavernosos (HEDLUND; ALM; ANDERSSON, 1999). A ACh é um potente indutor do
relaxamento cavernoso, principalmente por estimular o endotélio cavernoso e as
fibras nervosas NANC a liberarem NO (LUE, 2002). Além disso, ao ligar-se aos
receptores muscarínicos dos nervos adrenérgicos, ela inibe a liberação de NA,
contribuindo ainda mais para o relaxamento (KLINGE; SJOSTRAND, 1977). O
polipeptídio intestinal vasoativo é amplamente encontrado nas fibras nervosas
penianas (DAIL, 1993). Ele estimula a adenilil-ciclase, causando aumento da
concentração de cAMP, que está diretamente envolvido no relaxamento do músculo
liso cavernoso (MILLER et al., 1995). Os prostanóides, notadamente a PGE1,
também estimulam a ereção pelo aumento da síntese de cAMP. O ATP causa
aumento da pressão intracavernosa e ereção em experimentos com animais, porém
seu papel na regulação da função erétil em humanos não é bem conhecido.
Finalmente, a adrenomedulina, o peptídio relacionado ao gene da calcitonina e a
nociceptina são outros agentes relaxantes da musculatura lisa cavernosa cuja
participação no controle da ereção fisiológica é investigada (ANDERSSON, 2001).
Óxido nítrico
A via nitrérgica parece ser a mais importante para a ereção peniana, em seres
humanos (BOOLELL et al., 1996). O endotélio e as fibras nervosas NANC do pênis
sintetizam o NO a partir do aminoácido L-arginina. A enzima NOS é fundamental
para esta síntese, pois catalisa a conversão da L-arginina em NO e L-citrulina. A
NOS é encontrada em três isoformas: nNOS (neuronal), iNOS (induzível) e eNOS
19
(endotelial), sendo nNOS e eNOS as mais importantes para a ereção peniana
(MONCADA; HIGGS; FURCHGOTT, 1997).
A função do NO é ativar a GC, uma enzima de ação crucial no processo de
relaxamento muscular cavernoso (IGNARRO; 1991). Esta enzima ocorre em
diversos tecidos e possui duas isoformas, denominadas sGC (solúvel) e pGC
(particulada). A sGC é o principal receptor peniano do NO, porém a pGC vem sendo
investigada como possível alvo de modulação farmacológica da ereção (KUTHE et
al., 2003). Após ser ativada pelo NO, a sGC catalisa a conversão do GMP em cGMP
(ANDERSSON, 2001).
FIGURA 2 – Mecanismo molecular do relaxamento do músculo liso peniano (Extraído de SILVA,
2003).
20
O cGMP, assim como o cAMP, funciona como segundo mensageiro, ativando
proteína cinases específicas e desencadeando um conjunto de ações que diminuem
a concentração intracelular do cálcio (ANDERSSON, 2001). Estes eventos incluem
abertura dos canais de potássio e hiperpolarização celular; seqüestro do cálcio
intracelular no retículo endoplasmático; e inibição de canais de cálcio voltagem-
dependente, com bloqueio do influxo de cálcio. A diminuição do cálcio intracelular
determina dissociação dos complexos de miosina cinase e calmodulina, o que por
sua vez causa desfosforilação da miosina e relaxamento muscular (LUE, 2002).
As PDEs formam uma superfamília de enzimas que hidrolisam cGMP e
cAMP, convertendo-os em GMP e AMP, respectivamente. Existem numerosas
isoformas de PDEs, com diferentes propriedades e distribuições teciduais (LUE,
2002). No tecido cavernoso humano, a PDE5 é responsável pela metabolização do
cGMP e cAMP. Deste modo, a inibição da PDE5 causa aumento da concentração
intracelular de cGMP, acentuando o relaxamento do músculo liso cavernoso
mediado pelo NO (AYDIN et al., 2001).
Disfunção erétil
Os primeiros relatos de DE remontam ao ano 2000 AC, em papiros egípcios.
Na Grécia, Aristóteles sugeriu que a ereção era conseqüência do preenchimento do
pênis com ar. Posteriormente, Leonardo da Vinci observou que o pênis ereto dos
homens enforcados ficava cheio de sangue, mas foi Ambroise Paré quem
descreveu, em 1585, a anatomia do pênis e o mecanismo da ereção pelo aumento
do fluxo sanguíneo. Apesar de tudo isso, grande parte dos conhecimentos sobre a
fisiologia da ereção peniana foi obtida nos últimos 30 anos (LUE, 2002).
Atualmente, a DE é definida como inabilidade consistente ou recorrente para
obtenção e / ou manutenção de ereção suficiente para atividade sexual (NIH, 1993).
Por consistente, entende-se um período superior a três meses, à exceção dos casos
de etiologia traumática ou iatrogênica, onde a causa da DE é óbvia. Segundo um
grande estudo multicêntrico, o “Men’s Attitudes to Life Events and Sexuality”
(MALES), publicado em 2004, 16% da população masculina com idade entre 20 e 75
anos já apresentou DE (ROSEN et al., 2004). No Brasil, cerca de 18% dos homens
na faixa etária dos 40 – 70 anos apresenta algum grau de DE, sendo que apenas
uma minoria é tratada (MOREIRA et al., 2001).
21
Há diversos sistemas para a classificação da DE. Eles podem ser baseados
na causa ou no mecanismo neurovascular subjacente. A classificação proposta pela
Sociedade Internacional de Pesquisa sobre Impotência divide a DE em orgânica e
psicogênica. O tipo orgânico subdivide-se em etiologias vasculogênica, neurogênica,
anatômica e endocrinológica. Já a DE psicogênica pode ser dos sub-tipos
generalizada ou situacional (LUE, 2002).
Ao longo das últimas décadas, o tratamento da DE vem apresentando notável
evolução. A utilização das próteses penianas foi o primeiro avanço importante, pois
representam uma solução prática e muito eficiente. No entanto, é necessário um
procedimento cirúrgico invasivo, além de haver risco de complicações infecciosas,
comprometendo os resultados (TELÖKEN, 2002). A terapia de injeção
intracavernosa veio posteriormente, com o objetivo de promover resultados tão
efetivos quanto os das próteses, com maior simplicidade. São injetados fármacos
como a papaverina, um inibidor não-seletivo das PDEs, o alprostatil, uma
prostaglandina sintética, e a fentolamina, um α-bloqueador adrenérgico. Entretanto,
apesar dos ótimos resultados, a injeção em si pode causar incômodos ao paciente,
como dor local, constrangimento do casal, e até priapismo (BRAGA; JARDIM, 2002).
Até 1998, ainda não havia um tratamento para a DE que fosse ao mesmo tempo
cômodo e eficaz. Neste ano, iniciou-se a comercialização do citrato de sildenafil, um
inibidor seletivo da PDE5, iniciando-se a era da terapêutica oral para DE. O sildenafil
mostrou excelente resultados, em diversos grupos de pacientes, além se ser bem
tolerado, com efeitos adversos bem menores que os das outras opções existentes.
Mais recentemente, dois outros inibidores da PDE5, tadalafil e vardenafil, juntaram-
se ao sildenafil, constituindo o atual padrão-ouro de tratamento da DE (MORALES;
PAGANI; GLINA, 2002).
Agentes naturais no tratamento da DE
A despeito do enorme sucesso dos inibidores da PDE5, as substâncias de
origem natural com atividade eretogênica ainda despertam a curiosidade e interesse
de pacientes e pesquisadores (DREWES; GEORGE; KHAN, 2003). A utilização em
larga escala dos inibidores da PDE5 mostrou que uma parcela significante dos
usuários não está completamente satisfeita, seja por ineficácia das drogas, pelos
efeitos colaterais, ou pela limitação do uso concomitante com nitratos. Além disso,
22
vários indivíduos admitem preferência por produtos de origem natural no tratamento
da DE, estimulando a busca de novas alternativas terapêuticas (SPERLING et al.,
2002).
O Ginkgo biloba é utilizado há muitos anos pela população geriátrica tendo-se
mostrado eficaz como estimulante da função erétil. As pesquisas sugerem que o
Ginkgo biloba pode ser utilizado para tratar a DE induzida por drogas
antidepressivas (MCKAY, 2004).
Cordyceps sinensis é um fungo, empregado tradicionalmente pela medicina
chinesa. Relata-se que sua utilização promove melhoras nas funções sexuais e
reprodutivas, em ambos os sexos (ZHU; HALPERN; JONES, 1998).
A maca (Lepidium meyenii) é uma planta nativa do Peru. Seu uso nas
comunidades rurais andinas é muito tradicional, atribuindo-se a ela propriedades
afrodisíacas (CICERO; BANDIERI; ARLETTI, 2001).
Uma planta chinesa famosa em todo o mundo, o ginseng (Panax ginseng) é
consumido há séculos como afrodisíaco. Apesar disso, não existem evidências
experimentais suficientes para comprovar este efeito (TODA et al., 2001).
A Eurycoma longifolia, originária da Malásia, é empregada há anos com
diversos propósitos medicinais. Seu uso como estimulante sexual é recente, o que
tem suscitado a realização de pesquisas (DREWES; GEORGE; KHAN, 2003).
Tribulus terrestris é amplamente empregada no sudoeste da África, Índia e
China para estimular a função sexual masculina. O princípio ativo protodioscina pode
aumentar a libido e potenciar a ereção peniana (ADAIKAN et al., 2000).
Extratos de Huperzia saururus, Satureja parvifolia e Senecio eriophyton
também têm atividade in vitro comprovada. Eles relaxaram completamente corpos
cavernosos pré-contraídos com fenilefrina (HNATYSZYN et al., 2003).
No Brasil, uma combinação de ervas conhecida como catuama é utilizada
como afrodisíaco. A catuama inclui quatro plantas: Paullinia cupana (guaraná),
Trichilia catigua (catuaba), Zingiber officinalis (gengibre) e Ptychopetalum olacoides
(marapuama) (DREWES; GEORGE; KHAN, 2003). Estudos in vitro demonstraram
relaxamento pela catuama em tecido cavernoso de coelho, promovido
principalmente pelo guaraná (ANTUNES et al., 2001).
Muirapuama é outro produto empregado como estimulante sexual, no Brasil.
Trata-se de um composto de Ptychopetalum olacoides e Ptychopetalum uncinatum,
e sua eficácia já foi demonstrada em um ensaio clínico (WAYNBERG, 1990).
23
A planta indiana Coleus foskohlii é a fonte do princípio ativo forskolina, cujos
estudos in vitro demonstraram relaxamento do tecido cavernoso, mediado pelo
cAMP (DREWES; GEORGE; KHAN, 2003). Um ensaio clínico comprovou a ação
eretogênica desta substância (MULHALL et al., 1997).
A papaverina, obtida a partir de Papaver somniferum, é um inibidor
inespecífico das PDEs, com potente ação no aumento das concentrações penianas
de cAMP e cGMP (JEREMY et al., 1997). Ela é muito eficaz para terapia de injeção
intracavernosa, porém pode causar priapismo e fibrose dos corpos cavernosos
(ANDERSSON, 2001).
A ioimbina, um alcalóide indólico encontrado em diversas fontes botânicas, é
um potente antagonista seletivo dos receptores adrenérgicos α2, utilizada tanto em
estudos farmacológicos, quanto no tratamento da DE (TAM; WORCEL; WYLLIE,
2001).
Aspidosperma ulei Markgr.
Aspidosperma ulei Markgr., conhecida popularmente como Pitiá, é uma árvore
de grande porte, encontrada nas florestas do tipo estacional subcaducifólia das
regiões Norte e Nordeste do Brasil. Ela pertence ao gênero Aspidosperma, da
família Apocynaceae, que tem cerca de 57 espécies, caracteristicamente ricas em
alcalóides indólicos (BARROS, 2005).
Uma outra espécie deste gênero, Aspidosperma quebracho blanco, é há
muito tempo associada ao tratamento da DE, na América do Sul e na Europa
(BAUMBUSCH; PAPP; KOPA, 1995). Na Alemanha, onde é utilizada como droga de
prescrição, foi recentemente descoberto que sua ação pró-erétil é possivelmente
devida, em parte, ao seu conteúdo de ioimbina (SPERLING et al., 2002).
Especula-se, portanto, que outras representantes do gênero Aspidosperma
também possam ser empregadas na terapêutica da DE. No entanto, apesar do
potencial como possível fonte de substâncias eretogênicas, são poucas as
pesquisas sobre Aspidosperma ulei Markgr.
Banerjee e Lewis (1955) realizaram o primeiro estudo farmacológico
publicado sobre Aspidosperma ulei Markgr. Utilizando uma solução de alcalóides
extraídos do caule da planta, observaram atividade anti-espasmogência sobre
diversos tecidos de roedores.
24
Schmutz, Hunziker e Hirt (1957), e Lehner e Schmutz (1961), utilizando
cascas da raiz de Aspidosperma ulei Markgr., isolaram os alcalóides uleína, 1,2-
dihidro-olivacina e 1,2-dihidro-elipticina.
Abreu e Silva et al. (2002) demonstraram que a uleína tem atividade
tripanomiscida, enquanto Soares et al. (2004) observaram que este alcalóide
interfere com contratilidade induzida pelo cálcio em útero e aorta, aparentemente por
ação direta sobre canais de cálcio.
FIGURA 3 – Aspidosperma ulei Markgr. (Extraído de BARROS, 2005).
25
Campos et al. (2006) isolaram uma fração alcaloidal indólica de
Aspidosperma ulei Markgr., denominada F
3-5
e composta de uleína, nor-uleína e
tetrahidro-3,14,4,21-elipticina. Eles estudaram os efeitos desta fração sobre o
comportamento de camundongos machos Swiss. Foram observados padrões de
atividade associados a ereção peniana nos animais tratados com o extrato,
sugerindo que F
3-5
poderia facilitar as ereções por mecanismos dopaminérgicos,
adrenérgicos e nitrérgicos.
Considerando-se o potencial de Aspidosperma ulei Markgr. como fonte de
substâncias naturais com atividade eretogênica, bem como a escassez de pesquisas
sobre este tema, decidiu-se estudar os efeitos de sua fração alcaloidal F
3-5
sobre o
relaxamento da musculatura lisa cavernosa de coelho.
26
2 OBJETIVO
Avaliar o grau de relaxamento induzido pela fração alcaloidal F
3-5
de
Aspidosperma ulei Markgr sobre o corpo cavernoso de coelho, in vitro, bem como
possíveis mecanismos farmacológicos envolvidos.
27
3 MÉTODO
Animais
Os estudos foram realizados de acordo com as recomendações da Comissão
de Ética em Pesquisa Animal, da Universidade Federal do Ceará. O projeto de
pesquisa recebeu aprovação pelo processo número 44/05.
Foram utilizados 36 coelhos da linhagem Nova Zelândia, machos, adultos,
com peso entre 2,0 – 2,5 kg, obtidos na Universidade Federal do Ceará. Os animais
ficaram acomodados no biotério setorial do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, sob
ciclo de claro – escuro de doze horas, sendo alimentados com dieta padrão de
laboratório (Purina Chow
®
) e água à vontade.
Planta
A planta foi coletada em Garapa, município de Acarape, estado do Ceará. A
espécie foi identificada e catalogada (exsicata n. 30823) no Herbário Prisco Correia
da Universidade Federal do Ceará. O isolamento da fração F
3-5
foi realizado no
Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará,
segundo o método descrito por Campos (2006). A fração contém os seguintes
alcalóides indólicos: uleína, nor-uleína e tetrahidro-3,14,4,21-elipticina.
FIGURA 4 – Uleína.
28
FIGURA 5 – nor-uleína.
FIGURA 6 – Tetrahidro-3,14,4,21-elipticina.
Fármacos
A solução de Krebs-Henseleit – com pH ajustado para 7,4 – foi utilizada na
seguinte composição (em mM): NaCl 118; NaHCO
3
25; KCl 4,7; KH
2
PO
4
1,2;
MgSO
4
.7H
2
O 1,17; CaCl
2
.2H
2
O 2,5; e glicose 5,6. Fenilefrina, SNP, ACh, L-NAME,
7-NI, ODQ, isoproterenol, atropina e DMSO foram adquiridos de Sigma Co. (E.U.A.).
O tiopental sódico foi obtido de Laboratórios Cristália (Brasil) e o citrato de sildenafil
de Laboratórios Pfizer (Brasil). Todos os fármacos foram diluídos em solução salina
fisiológica, exceto F
3-5
, que foi dissolvido em DMSO.
Equipamentos
Utilizaram-se agitador magnético (Fanem, Brasil), agulhas descartáveis (BD,
Brasil), balança analítica (Marte AL-200, Brasil), balança para pesagem de animais
(Filizola, Brasil), bomba para infusão (Imbracrios BI-900, Brasil), bomba para
perfusão (Watson-Marlow Limited MHRE-200, Inglaterra), material cirúrgico (EDLO,
Brasil), pHmêtro (Alalion PM-608, Brasil), pipetas automáticas (Jencons, Inglaterra),
pipetas Pasteur (Unilab, Brasil), ponteiras plásticas para pipetas (Unilab, Brasil),
29
polígrafo (Graphtec Watanabe LR-300, Japão), seringas descartáveis (BD, Brasil) e
vidrarias (Vidrolabor, Brasil).
Preparação do corpo cavernoso de coelho
Procedeu-se à eutanásia por injeção endovenosa de tiopental sódico, em
dose letal (60 mg/kg). O pênis foi removido inteiro, até o ponto de aderência com o
osso pélvico, sendo imediatamente colocado em imersão na solução nutritiva de
Krebs-Henseleit. Em seguida, o tecido cavernoso foi cuidadosamente dissecado,
removendo-se os tecidos conjuntivos e a túnica albugínea. Cada pênis forneceu uma
tira longitudinal (2 cm) de corpo cavernoso dissecado. Os segmentos de tecido
cavernoso foram mantidos em solução de Krebs-Henseleit até o início dos ensaios
experimentais, o que não excedeu uma hora após a remoção dos mesmos.
Superfusão de tecido em cascata
As tiras de corpo cavernoso foram montadas em cascata, com tensão de
repouso ajustada para 2g, sendo superfundidas com solução de Krebs-Henseleit (5
ml/min) aerada com uma mistura de O
2
(95%) e CO
2
(5%), sob temperatura de 37°C.
As respostas teciduais foram captadas através de alavancas auxotônicas ligadas a
transdutores isotônicos para músculo liso, e conectados a um polígrafo de seis
canais, o qual produziu os traçados correspondentes.
Decorrido o período de equilíbrio de 1 hora, foi realizado o ajuste de
sensibilidade dos transdutores para obtenção de respostas de magnitude similar, e
iniciou-se a superfusão de fenilefrina (5 µM), com o intuito de aumentar o tônus
basal dos tecidos. Neste momento, o sistema estava pronto para utilização.
Foram realizados sete ensaios distintos (Tab. 1). Em cada um deles, as
médias dos relaxamentos máximos induzidos por cada substância foram expressas
como valores numéricos percentuais, em relação à média dos relaxamentos
máximos determinados por SNP (1,3 – 13 nM), a qual foi definida como 100%.
No experimento I (n = 6), foram construídas curvas de dose-resposta para F
3-
5
, papaverina e DMSO. As soluções foram infundidas em bolus, com doses
progressivamente elevadas (0,01; 0,1; 1; 3 mg) e administradas a cada dez minutos,
observando-se também um período de repouso de trinta minutos entre os testes com
30
substâncias diferentes.
No experimento II (n = 3), foram registrados os relaxamentos provocados
pelas infusões em bolus, com intervalos de dez minutos, de SNP (1,3 – 13 nM), ACh
(600 pM) e F
3-5
(1 mg), seguidas de um período de repouso de trinta minutos. Iniciou-
se a superfusão de L-NAME (10 µmol/min), e após vinte minutos, infundiu-se
novamente SNP (1,3 – 13 nM), ACh (600 pM) e F
3-5
(1 mg), respeitando-se os
intervalos de dez minutos entre cada administração.
No experimento III (n = 4), foram registrados os relaxamentos provocados
pelas infusões em bolus, com intervalos de dez minutos, de SNP (1,3 – 13 nM), ACh
(600 pM) e F
3-5
(1 mg), seguidas de um período de repouso de trinta minutos. Iniciou-
se a superfusão de 7-NI (10 µmol/min), e após vinte minutos, infundiu-se novamente
SNP (1,3 – 13 nM), ACh (600 pM) e F
3-5
(1 mg), respeitando-se os intervalos de dez
minutos entre cada administração.
No experimento IV (n = 4), foram registrados os relaxamentos provocados
pelas infusões em bolus, com intervalos de dez minutos, de SNP (1,3 – 13 nM), ACh
(600 pM) e F
3-5
(1 mg), seguidas de um período de repouso de trinta minutos. Iniciou-
se a superfusão de ODQ (10 µmol/min), e após vinte minutos, infundiu-se
novamente SNP (1,3 – 13 nM), ACh (600 pM) e F
3-5
(1 mg), respeitando-se os
intervalos de dez minutos entre cada administração.
No experimento V (n = 4), foram registrados os relaxamentos provocados
pelas infusões em bolus, com intervalos de dez minutos, de SNP (1,3 – 13 nM), ACh
(600 pM), isoproterenol (30 nM) e F
3-5
(1 mg), seguidas de um período de repouso de
trinta minutos. Iniciou-se a superfusão de propranolol (10 µmol/min), e após vinte
minutos, infundiu-se novamente SNP (1,3 – 13 nM), ACh (600 pM), isoproterenol (30
nM) e F
3-5
(1 mg), respeitando-se os intervalos de dez minutos entre cada
administração.
No experimento VI (n = 4), foram registrados os relaxamentos provocados
pelas infusões em bolus, com intervalos de dez minutos, de SNP (1,3 – 13 nM), ACh
(600 pM) e F
3-5
(1 mg), seguidas de um período de repouso de trinta minutos. Iniciou-
se a superfusão de atropina (10 µmol/min), e após vinte minutos, infundiu-se
novamente SNP (1,3 – 13 nM), ACh (600 pM) e F
3-5
(1 mg), respeitando-se os
intervalos de dez minutos entre cada administração.
No experimento VII (n = 4), foram registrados os relaxamentos provocados
pelas infusões em bolus, com intervalo de dez minutos, de SNP (1,3 – 13 nM) e ACh
31
(600 pM), seguidas de um período de repouso de trinta minutos. Iniciou-se a
superfusão de sildenafil (10 µmol/min), e após vinte minutos, infundiu-se novamente
SNP (1,3 – 13 nM) e ACh (600 pM), respeitando-se o intervalo de dez minutos entre
cada administração. Neste momento, a superfusão de sildenafil foi suspensa,
observando-se novo repouso de trinta minutos. Iniciou-se a superfusão de F
3-5
(0,1
mg/min), e após vinte minutos, infundiu-se novamente SNP (1,3 – 13 nM) e ACh
(600 pM), respeitando-se o intervalo de dez minutos entre cada administração.
EXPERIMENTO n INFUSÃO SUPERFUSÃO
I
6 SNP
Papaverina
F
3-5
DMSO
II
3 SNP
ACh
F
3
-
5
L-NAME
III
4 SNP
ACh
F
3
-
5
7-NI
IV
4 SNP
ACh
F
3
-
5
ODQ
V
4 SNP
ACh
Isoproterenol
F
3
-
5
Propranolol
VI
4 SNP
ACh
F
3
-
5
Atropina
VII
6 SNP
ACh
Sildenafil
F
3
-
5
TABELA 1 – Ensaios com superfusão de tecido em cascata.
Banho isolado de tecido
Os segmentos de corpo cavernoso foram montados em banhos isolados, com
tensão de repouso de 1g, contendo 5 ml de solução de Krebs-Henseleit aerada com
uma mistura de O
2
(95%) e CO
2
(5%), sob temperatura de 37°C. As respostas
teciduais foram captadas através de alavancas auxotônicas ligadas a transdutores
isotônicos para músculo liso, e conectados a um polígrafo de seis canais, o qual
produziu os traçados correspondentes.
32
Decorrido o período de equilíbrio de 1 hora, foi realizado o ajuste de
sensibilidade dos transdutores para obtenção de respostas de magnitude similar. A
solução de Krebs-Henseleit dos banhos foi drenada e substituída por uma solução
de Krebs-Henseleit modificada, livre de Ca
2+
e rica em K
+
(60 mM). Neste momento,
o sistema estava pronto para utilização.
Neste ensaio (Tab. 2), as médias das contrações máximas provocadas pelo
CaCl
2
(300 mM) nos tecidos pré-incubados com outras substâncias foram expressas
como valores numéricos percentuais, em relação à média das contrações máximas
induzidas pelo CaCl
2
(300 mM) nos tecidos sem incubação prévia, a qual foi definida
como 100%.
No experimento VIII (n = 5), foram construídas curvas de dose-resposta
relativas à adição de CaCl
2
aos banhos. Doses progressivamente elevadas (1; 3; 10;
30; 100; 300 mM) de CaCl
2
foram acrescentadas aos banhos, em bolus, a intervalos
de dez minutos. Em seguida, a solução de Krebs-Henseleit modificada foi substituída
e, após um período de repouso de trinta minutos, os tecidos foram incubados com
F
3-5
(0,5 mg) durante vinte minutos. O CaCl
2
foi adicionado novamente, em doses
progressivamente elevadas (1; 3; 10; 30; 100; 300 mM), em bolus, a intervalos de
dez minutos. A solução de Krebs-Henseleit modificada foi novamente trocada e,
após trinta minutos, os tecidos foram incubados com DMSO por vinte minutos,
seguindo-se a adição de doses progressivamente elevadas (1; 3; 10; 30; 100; 300
mM) de CaCl
2
, em bolus, a intervalos de dez minutos.
EXPERIMENTO n INFUSÃO INCUBAÇÃO
VIII
5 CaCl
2
F
3-5
DMSO
TABELA 2 – Ensaio com banho isolado de tecido.
Análise estatística
Os dados obtidos nos experimentos estão apresentados como Médias e EPM.
As diferenças estatísticas foram determinadas com o uso do teste ANOVA,
considerando-se significante p < 0,05.
33
4 RESULTADOS
Experimento I: relaxamento cavernoso induzido por F
3-5
A Figura 7 mostra curvas de dose-resposta para F
3-5
, papaverina e DMSO,
onde cada ponto equivale à Média ± EPM dos valores de relaxamento observados.
Na Tabela 3, estão listados os valores numéricos correspondentes. Doses
crescentes de F
3-5
e papaverina determinaram relaxamentos progressivamente
maiores. F
3-5
e papaverina, na dose de 0,1 mg, apresentaram a primeira resposta de
relaxamento significante, em relação ao DMSO. Na dose de 3 mg, o relaxamento
promovido por F
3-5
foi significantemente maior que o relaxamento estimulado pela
papaverina.
34
0.01 0.1 1 10
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
*
*
*
*
*
*
*
*
#
(F
3-5
)
(Papaverina)
(DMSO)
3
Dose (mg)
Relaxamento (%)
FIGURA 7 – Relaxamentos máximos induzidos por doses crescentes de F
3-5
, papaverina e DMSO (n
= 6; * p < 0,05, comparado com DMSO; # p < 0,05, comparado com papaverina).
Dose
(mg)
F
3-5
Papaverina DMSO
Média EPM Média EPM Média EPM
0,01 3,90 2,30 2,10 0,36 0,00 0,00
0,03 11,90 4,30 8,20 2,90 0,90 0,10
0,10 29,60 8,60 19,60 3,70 1,60 0,30
0,30 64,00 12,60 45,80 6,30 3,90 1,20
1,00 119,90 8,00 89,70 9,30 4,30 1,30
3,00 192,10 7,60 143,50 6,00 4,60 1,60
TABELA 3 – Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos induzidos por doses
crescentes de F
3-5
, papaverina e DMSO (n = 6).
35
Experimentos II, III e IV: envolvimento da via nitrérgica
Na Figura 8, as barras representam as Médias ± EPM. Na Tabela 4, estão
listados os valores numéricos correspondentes. A superfusão de L-NAME inibiu
significantemente o relaxamento promovido por ACh, porém não afetou as respostas
induzidas por SNP e F
3-5
.
Na Figura 9, as barras representam as Médias ± EPM. Na Tabela 5, estão
listados os valores numéricos correspondentes. A superfusão de 7-NI não afetou as
respostas induzidas por SNP, ACh e F
3-5
.
Na Figura 10, as barras representam as Médias ± EPM. Na Tabela 6, estão
listados os valores numéricos correspondentes. A superfusão de ODQ inibiu
significantemente as respostas evocadas por SNP e ACh, porém não afetou as
respostas induzidas por F
3-5
.
36
SNP
SNP+L-NAME
Ach Ach+L-NAME F
3-5
F
3-5
+L-NAME
0
30
60
90
120
*
Relaxamento (%)
FIGURA 8 – Relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh e F
3-5
, isoladamente, e durante
superfusão de L-NAME (n = 3; * p < 0,05, comparado com o respectivo controle).
SNP
ACh F
3-5
Média EPM Média EPM Média EPM
- 100,00 0,00 61,00 5,70 52,20 5,30
L-NAME
98,60 4,70 1,60 0,03 51,40 7,20
TABELA 4 – Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh
e F
3-5
, isoladamente, e durante superfusão de L-NAME (n = 3).
37
SNP SNP+7-NI Ach Ach+7-NI F
3-5
F
3-5
+7-NI
0
50
100
150
200
250
300
350
Relaxamento (%)
FIGURA 9 – Relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh e F
3-5
, isoladamente, e durante
superfusão de 7-NI (n = 4).
SNP
ACh F
3-5
Média EPM Média EPM Média EPM
- 100,00 0,00 86,60 15,70 285,10 62,10
7-NI 114,40 8,20 81,20 12,50 236,10 46,90
TABELA 5 – Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh
e F
3-5
, isoladamente, e durante superfusão de 7-NI (n = 4).
38
SNP SNP+ODQ Ach Ach+ODQ F
3-5
F
3-5
+ODQ
0
25
50
75
100
*
*
Relaxamento (%)
FIGURA 10 – Relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh e F
3-5
, isoladamente, e durante
superfusão de ODQ (n = 4; * p < 0,05, comparado com o respectivo controle).
SNP ACh F
3-5
Média EPM Média EPM Média EPM
- 100,00 0,00 28,10 1,80 37,00 14,00
ODQ 10,70 2,70 4,50 1,10 28,10 5,20
TABELA 6 – Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh
e F
3-5
, isoladamente, e durante superfusão de ODQ (n = 4).
39
Experimento V: envolvimento de receptores β-adrenérgicos
Na Figura 11, as barras representam as Médias ± EPM. Na Tabela 7, estão
listados os valores numéricos correspondentes. A superfusão de propranolol inibiu
significantemente o relaxamento induzido por isoproterenol, porém não afetou os
relaxamentos promovidos por SNP e F
3-5
.
40
SNP
SNP+Prop.
Ach Ach+Prop. Isopr. Isopr.+Prop. F
3-5
F
3-5
+Prop.
0
30
60
90
120
150
180
*
Relaxamento (%)
FIGURA 11 – Relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh, isoproterenol e F
3-5
, isoladamente, e
durante superfusão de propranolol (n = 4; * p < 0,05, comparado com o respectivo controle).
SNP ACh Isoproterenol F
3-5
Média EPM Média EPM Média EPM Média EPM
- 100,00
0,00 71,90 12,50 47,70 7,80 137,80
23,50
Propranolol
73,70 6,50 82,00 17,70 8,50 2,45 101,90
12,60
TABELA 7 – Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh,
isoproterenol e F
3-5
, isoladamente, e durante superfusão de propranolol (n = 4).
41
Experimento VI: envolvimento de receptores muscarínicos
Na Figura 12, as barras representam as Médias ± EPM. Na Tabela 8, estão
listados os valores numéricos correspondentes. A superfusão de atropina inibiu
significantemente o relaxamento mediado pela ACh, entretanto não afetou os
relaxamentos promovidos por SNP e F
3-5
.
42
SNP SNP+Atrop. Ach Ach+Atrop. F
3-5
F
3-5
+Atrop.
0
30
60
90
120
*
Relaxamento (%)
FIGURA 12 – Relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh e F
3-5
, isoladamente, e durante
superfusão de atropina (n = 4; * p < 0,05, comparado com o respectivo controle).
SNP ACh F
3-5
Média EPM Média EPM Média EPM
- 100,00 0,00 29,70 8,60 49,00 14,30
Atropina 92,80 4,00 1,30 0,30 49,00 14,30
TABELA 8 – Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos induzidos por SNP, ACh
e F
3-5
, isoladamente, e durante superfusão de atropina (n = 4).
43
Experimento VII: envolvimento de inibição da PDE5
Na Figura 13, as barras representam as Médias ± EPM. Na Tabela 9, estão
listados os valores numéricos correspondentes. A superfusão de sildenafil amplificou
significantemente os relaxamentos provocados por SNP e ACh. No entanto, a
superfusão de F
3-5
foi incapaz de amplificar as respostas relaxantes induzidas por
SNP e ACh.
44
SNP SNP+F
3-5
SNP+Sild. Ach Ach+F
3-5
Ach+Sild.
0
50
100
150
200
250
300
*
*
Relaxamento (%)
FIGURA 13 – Relaxamentos máximos induzidos por SNP e ACh, isoladamente, e durante superfusão
de F
3-5
e sildenafil (n = 6; * p < 0,05, comparado com o respectivo controle).
SNP Ach
Média EPM Média EPM
- 100,00 0,00 164,30 34,30
F
3-5
72,20 17,70 131,00 28,40
Sildenafil 156,00 16,30 242,00 25,00
TABELA 9 – Dados numéricos correspondentes aos relaxamentos máximos induzidos por SNP e
ACh, isoladamente, e durante superfusão de F
3-5
e sildenafil (n = 6).
45
Experimento VIII: envolvimento de canais de cálcio voltagem-dependente
Na Figura 14, as barras representam as Médias ± EPM. Na Tabela 10, estão
listados os valores numéricos correspondentes. A figura 15 apresenta curvas de
dose-resposta, onde os números correspondem às concentrações de Ca
2+
, em mM.
As contrações promovidas pelo CaCl
2
foram significantemente inibidas pela
incubação com F
3-5
, o que não foi observado em relação ao DMSO.
46
CaCl
2
CaCl
2
+F
3-5
CaCl
2
+DMSO
0
25
50
75
100
*
Contração (%)
FIGURA 14 – Contrações máximas induzidas pelo CaCl
2
, isoladamente, e após incubação com F
3-5
e
DMSO (n = 5; * p < 0,05, comparado com o respectivo controle).
CaCl
2
CaCl
2
+ F
3-5
CaCl
2
+ DMSO
Média EPM Média EPM Média EPM
100,00 0,00 42,40 5,90 89,36 4,90
TABELA 10 – Dados numéricos correspondentes às contrações máximas induzidas pelo CaCl
2
,
isoladamente, e após incubação com F
3-5
e DMSO (n = 5).
CaCl
2
CaCl
2
+ F
3-5
CaCl
2
+ DMSO
FIGURA 15 – Contrações máximas induzidas por doses crescentes de CaCl
2
, isoladamente, e após
incubação com F
3-5
e DMSO (n = 5).
47
5 DISCUSSÃO
Aspidosperma ulei Markgr. é uma espécie comum no Brasil, e tem
potencial para ser utilizada como fitoterápico de fácil aquisição e baixo custo no
tratamento da DE (CAMPOS et al., 2006). Apesar disso, apenas recentemente
passou-se a estudá-la com este propósito, o que acentua a relevância de pesquisas
sobre suas propriedades farmacológicas. Neste trabalho, foram investigados os
efeitos da fração alcaloidal F
3-5
de Aspidosperma ulei Markgr. sobre o tecido
cavernoso de coelho, in vitro. Diversos ensaios funcionais foram realizados, com o
intuito de determinar o grau de relaxamento cavernoso induzido por F
3-5
, bem como
os possíveis mecanismos farmacológicos implicados.
Os estudos sobre neurotransmissão e fármacos relacionados aos
processos de contração e relaxamento do músculo liso cavernoso e da vasculatura
peniana têm sido bastante freqüentes, porém a disponibilidade de tecido cavernoso
humano é muito restrita (ANDERSSON, 2001). Os pesquisadores geralmente
conseguem obter corpos cavernosos humanos a partir de doadores cadáver de
órgãos para transplante, ou ainda de pacientes que se submetem a cirurgias de
mudança de sexo (SPERLING et al., 2002; SILVA et al., 2005). O mais comum,
portanto, é a utilização de tecidos de outros mamíferos, mesmo considerando-se que
nem todas as informações obtidas a partir dos estudos com animais são diretamente
aplicáveis aos seres humanos (SACHS, 2000; STEERS, 2000). O coelho foi
escolhido como animal de experimentação, por ser habitualmente utilizado nas
pesquisas sobre DE, permitir padronização quanto à raça, sexo e peso, além de
fornecer um fragmento de corpo cavernoso adequado aos modelos experimentais
empregados (KERFOOT et al., 1993; JEREMY et al., 1997; CHOI; CHUNG; CHOI,
1999).
A planta foi obtida e processada para isolamento de F
3-5
segundo os
procedimentos descritos por Campos et al. (2006), que demonstraram pela primeira
vez as propriedade eretogênicas de Aspidosperma ulei Markgr. Estes autores
isolaram distintas frações, a partir de um extrato etanólico das cascas da raiz da
planta. A fração F
3-5
– composta de três alcalóides: uleína, nor-uleína e tetrahidro-
3,14,4,21-elipticina – foi utilizada neste estudo, por ter sido apontada como
responsável pelos efeitos pró-eréteis.
48
Para os ensaios funcionais, optou-se pela superfusão de tecido em
cascata e pelo banho isolado de tecido, dois modelos experimentais bastante
utilizados nas pesquisas sobre a modulação farmacológica dos processos de
contração e relaxamento dos corpos cavernosos.
A superfusão de tecido em cascata foi escolhida para os estudos de
relaxamento dos corpos cavernosos. Este método possibilita a manutenção das
características biológicas dos tecidos por cerca de 24 horas. Além disso, vários
fragmentos de tecido cavernoso podem ser testados simultaneamente, sob as
mesmas condições. Isto permite a realização de ensaios experimentais que
demandem a infusão seqüencial de diversos fármacos, observando-se os efeitos de
cada um deles sobre os tecidos, e alternando-se períodos de repouso para equilíbrio
(VANE, 1964).
O banho isolado de tecido foi utilizado no ensaio de contração dos corpos
cavernosos. Com esta técnica, também se conservam as propriedades biológicas
dos tecidos por cerca de um dia inteiro, podendo ser realizados testes simultâneos
de várias amostras, com múltiplos fármacos. Entretanto, diferentemente da
superfusão de tecido em cascata, neste modelo é possível manter os fragmentos de
corpo cavernoso imersos em um meio líquido, cuja composição é precisamente
ajustada. Esta particularidade justificou seu uso no experimento de contração
muscular, onde a composição iônica do meio era diferente do estado fisiológico
(TEIXEIRA, 2001).
Desde a descoberta de um fator de relaxamento dependente do endotélio
(FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980), posteriormente identificado como óxido nítrico
(PALMER; FERRIGE; MONCADA, 1987), numerosos estudos têm reforçado seu
papel central no relaxamento da musculatura lisa em diversos órgãos (IGNARRO et
al., 1987a; IGNARRO et al., 1987b; EKELUND; MELLANDER, 1990; GAW;
WADSWORTH; HUMPHREY, 1990; KELM; SCHRADER, 1990; MONCADA, 1990;
ANDERSSON; WAGNER, 1995). O SNP é um fármaco que se dissolve
espontaneamente em meio aquoso, fornecendo NO diretamente aos tecidos, sem
depender das fontes endógenas desta substância (MONCADA; HIGGS;
FURCHGOTT, 1997). Ele foi utilizado em todos os ensaios de relaxamento
cavernoso como parâmetro de comparação entre as substâncias testadas, servindo
de controle interno. Foram observadas diferenças nas sensibilidades dos corpos
cavernosos ao relaxamento pelo SNP, entre os experimentos, possivelmente devido
49
às características intrínsecas dos tecidos. Por este motivo, utilizaram-se doses
diferenciadas de SNP (1,30 – 13,00 nM), capazes de provocar um relaxamento
inicial completo dos corpos cavernosos.
A princípio, investigou-se a capacidade de promoção do relaxamento dos
corpos cavernosos por F
3-5
. A infusão de F
3-5
estimulou o relaxamento das
preparações de tecido cavernoso de coelho, de modo consistente e diretamente
relacionado ao aumento progressivo das doses. Isso mostra que F
3-5
tem efeito local
sobre os tecidos, embora obviamente não se possa descartar, in vivo, a presença de
mecanismos centrais de estímulo da função erétil por F
3-5
, bem como interações
com outros sistemas de neurotransmissão.
A papaverina, in vivo, estimula o mecanismo veno-oclusivo peniano,
favorecendo as ereções (JUENEMANN et al., 1986; DELCOUR et al., 1987). Além
disso, in vitro, esta substância é capaz de relaxar os sinusóides e os vasos
sanguíneos cavernosos (KIRKEBY; FORMAN; ANDERSSON, 1990). Seu principal
mecanismo farmacológico de ação é através de inibição não-seletiva de PDEs
(ANDERSSON, 1994). Atualmente, a papaverina é utilizada para o tratamento da
DE, através de injeção intracavernosa, com excelentes resultados (ANDERSSON,
2001). Considerando-se o relaxamento cavernoso completo promovido pela
papaverina, in vivo e in vitro, este fármaco foi utilizado como referência para
comparação com F
3-5
. Foi observado que, em relação à papaverina, F
3-5
apresentou
relaxamentos equivalentes, para doses iguais, exceto na dose máxima de 3 mg,
quando induziu relaxamento significantemente superior. Estes achados denotam
que, in vitro, F
3-5
promove excelente relaxamento dos corpos cavernosos, com
magnitude superior à verificada com papaverina.
O DMSO é uma substância incapaz de promover relaxamento ou
contração do tecido cavernoso (BARROS, 2005). Tanto F
3-5
como papaverina foram
capazes de produzir relaxamentos significantemente superiores às respostas
observadas com a infusão do DMSO, para todas as doses utilizadas, a partir de 0,1
mg. Isso demonstra que as substâncias testadas eram, de fato, responsáveis pelos
relaxamentos observados.
As fontes endógenas de NO são as fibras nervosas NANC e o endotélio
(ANDERSSON; WAGNER, 1995). Atualmente, sabe-se que o NO sintetizado pela
nNOS das fibras NANC é responsável pelo relaxamento imediato do tecido
cavernoso, enquanto o NO produzido pela eNOS, no endotélio, garante a
50
manutenção deste relaxamento, durante a ereção fisiológica (ANDERSSON, 2003).
Experimentalmente, a liberação de NO pelas fibras NANC pode ser obtida através
de estimulação elétrica ou ainda por substâncias com atuação neuronal direta, como
o veneno de Tytus serrulatus; enquanto que a infusão de ACh é capaz de estimular
a produção de NO endotelial (TEIXEIRA, 2001). Desta forma, a ACh foi empregada
nos ensaios de relaxamento dos corpos cavernosos, com o intuito de demonstrar a
integridade endotelial, condição indispensável para a correta interpretação das
respostas provocadas pelas substâncias, em cada experimento.
Inibidores específicos da NOS e da sGC foram utilizados para
investigação de um mecanismo de ação nitrérgico de F
3-5
. O L-NAME é um inibidor
da NOS, com predileção pela eNOS, e por isso age reduzindo a disponibilidade de
NO de origem endotelial (MONCADA; HIGGS; FURCHGOTT, 1997). Como seria
esperado, nos corpos cavernosos superfundidos com L-NAME o relaxamento
provocado pela ACh foi quase abolido, enquanto o relaxamento estimulado por SNP
praticamente não foi afetado. Estes dados indicam que L-NAME efetivamente inibiu
a produção endotelial de NO. Como as respostas relaxantes evocadas por F
3-5
não
foram influenciadas, nesta situação, pode-se supor que o relaxamento cavernoso
por F
3-5
ocorre independentemente do NO endotelial.
O 7-NI é capaz de inibir eNOS e nNOS, porém apresenta seletividade
bem maior para esta última, uma vez que é ativamente captado pelos neurônios
(BABBEDGE et al., 1993; MOORE et al., 1993; WOLFF; LUBESKIE; UMANSKY,
1994; MONCADA; HIGGS; FURCHGOTT, 1997). De acordo com as observações de
Teixeira (2001), 7-NI inibiu o relaxamento promovido através de nNOS, pelo veneno
de Tytus serrulatus. Durante a superfusão de 7-NI, não houve alterações
significantes no efeito de SNP, que não depende do NO endógeno. A ACh também
não sofreu interferência de 7-NI, provavelmente devido à menor afinidade deste
composto pela eNOS, na dose utilizada. F
3-5
não teve seus relaxamentos dos corpos
cavernosos modificados significantemente pela adição de 7-NI, sugerindo que sua
ação prescinde a estimulação das fibras NANC.
O ODQ é empregado para demonstrar o envolvimento da via NO-cGMP
no relaxamento cavernoso de várias espécies de mamíferos, inclusive o homem
(TEIXEIRA et al., 1998; HEDLUND; ALM; ANDERSSON, 1999; MIZUSAWA et al.,
2001; TEIXEIRA et al., 2001). Ele bloqueia seletivamente a sGC, no mesmo sítio
utilizado pelo NO, não apresentando efeito sobre a pGC (GARTHWAITE et al., 1995;
51
BRUNNER et al., 1996; SCHRAMMEL et al., 1996). No tecido cavernoso
superfundido com ODQ, observou-se inibição dos relaxamentos provocados por
SNP e ACh, uma vez que ambos agem através do NO. Entretanto, o ODQ não
afetou as preparações de corpos cavernosos relaxadas com F
3-5
. Os resultados
deste ensaio indicam que, se F
3-5
realmente age por estímulo à síntese do cGMP,
provavelmente a via do NO-cGMP não está envolvida, não sendo possível descartar
o estímulo à produção do cGMP por atuação de F
3-5
em outros sítios da sGC, ou
mesmo em pGC.
Teixeira et al. (2004) demonstraram a presença de receptores β-
adrenérgicos atípicos nos corpos cavernosos de coelho. Estes autores observaram
que o isoproterenol, um agonista β-adrenérgico, estimula a produção do cAMP,
promovendo um relaxamento do tecido cavernoso superior aos de todos os outros
agonistas β testados. Teixeira et al. (2004) também conseguiram bloquear os
relaxamentos induzidos por isoproterenol com a superfusão de um antagonista β-
adrenérgico não seletivo, o propranolol. No presente estudo, observou-se que o
isoproterenol teve seus relaxamentos quase abolidos pela superfusão de
propranolol, demonstrando a integridade do mecanismo de relaxamento cavernoso
mediado por receptores β-adrenérgicos. Entretanto, o propranolol foi incapaz de
alterar significantemente os relaxamentos provocados por SNP e ACh, uma vez que
estes fármacos utilizam a via nitrérgica. No caso de F
3-5,
a superfusão de propranolol
também não afetou os relaxamentos, sugerindo que F
3-5
não age através dos
receptores β-adrenérgicos.
O pênis é rico em receptores muscarínicos, dos tipos M1, M2, M3 e M4
(TRAISH et al., 1995). Além de estimular receptores M3 endoteliais, a ACh age em
receptores M2 e M4 no músculo liso cavernoso, promovendo o aumento do cAMP
(TRAISH et al., 1995). A ACh também atua em receptores muscarínicos presentes
nas fibras adrenérgicas, inibindo a liberação de NA (TEJADA et al., 1988, 1989). A
atropina é um agente anti-colinérgico por excelência, ligando-se aos receptores
muscarínicos e impedindo a ação da ACh, embora, em altas doses, promova o
relaxamento cavernoso, in vitro (CHOI; CHUNG; CHOI, 1999). No estudo da
associação de F
3-5
com os receptores muscarínicos, utilizou-se a atropina em dose
baixa, observando-se o que seria previsível: os relaxamentos mediados por SNP
permaneceram inalterados, enquanto os relaxamentos induzidos pela ACh foram
fortemente inibidos, durante a administração de atropina, indicando sua capacidade
52
de bloqueio dos receptores muscarínicos. Neste ensaio, não foi possível evidenciar
um mecanismo de ação dependente de receptores muscarínicos, uma vez que a
superfusão de atropina não causou nenhuma interferência sobre os relaxamentos
cavernosos estimulados por F
3-5
.
O papel crucial do NO nos relaxamentos do músculo liso e vasos
sanguíneos penianos é devido ao estímulo para conversão do GMP em cGMP
(TRIGO-ROCHA et al., 1993). O cGMP desencadeia os eventos intracelulares
necessários ao relaxamento cavernoso, e tem sua concentração regulada pelo
equilíbrio entre síntese e hidrólise, que é realizada pela PDE5, nos corpos
cavernosos (BEAVO, 1992). Estudos in vivo e in vitro demonstraram que o sildenafil,
um inibidor seletivo da PDE5, amplifica os relaxamentos promovidos pelo NO, ao
contribuir para o incremento na concentração de cGMP (JEREMY et al., 1997;
CHUANG et al., 1998; BALLARD et al., 1998; MORELAND; GOLDSTEIN; TRAISH,
1998; CARTER; BALLARD; NAYLOR, 1998). No experimento para avaliação deste
mecanismo, o sildenafil foi capaz de amplificar os relaxamentos promovidos por SNP
e ACh, comprovando o sinergismo de ação entre estes fármacos, que por vias
distintas elevam a concentração intracelular do cGMP. No entanto, a superfusão de
F
3-5
não amplificou os relaxamentos de SNP e ACh, demonstrando que sua ação
provavelmente não está baseada em inibição da PDE5.
A cascata de eventos iniciada pelo cGMP culmina com a queda na
concentração intracelular de Ca
2+
, determinando o relaxamento muscular (AYDIN et
al., 2001). A membrana da célula muscular lisa é rica em canais iônicos ativos, que
se tornam permeáveis de acordo com as variações de polaridade determinadas pela
composição do meio (ANDERSSON, 2001). Os canais de cálcio voltagem-
dependente contribuem para a manutenção do tônus do músculo liso cavernoso, por
permitirem um fluxo contínuo de Ca
2+
para o interior da célula (FOVAEUS;
ANDERSSON; HEDLUND, 1987; CHRIST et al., 1989, 1992; NOACK; NOACK,
1997). Já se observou que diversos bloqueadores de canais de cálcio podem relaxar
tecido cavernoso de coelho, in vitro (KERFOOT et al., 1993). No presente estudo,
procurou-se demonstrar este mecanismo com a utilização de preparações de corpos
cavernosos incubadas em um meio livre de Ca
2+
e previamente despolarizadas pela
adição de K
+
(60 mM) a este meio. Nesta situação, canais de cálcio voltagem-
dependente são ativados, o que permite o fluxo deste íon entre os meios intra e
extracelular, de acordo com os gradientes de concentração. Ao se acrescentar aos
53
banhos Ca
2+
, sob a forma de CaCl
2
, observou-se contração muscular
progressivamente maior, a partir da dose de 1 mM, atestando a permeabilidade de
canais de cálcio voltagem-dependente. A pré-incubação dos tecidos com DMSO,
como seria esperado, não modificou a curva de dose-resposta para as contrações
dos corpos cavernosos induzidas pelo Ca
2+
. No entanto, a adição prévia de F
3-5
aos
banhos modificou bastante a curva de dose-resposta. Nesta situação, as primeiras
contrações dos fragmentos de corpos cavernosos só apareceram a partir da dose de
30 mM. Além disso, a média das contrações máximas observadas nos tecidos
tratados com F
3-5
foi significantemente inferior às médias das contrações máximas
provocadas nos tecidos sem pré-incubação ou incubados com DMSO. Estes dados
sugerem que F
3-5
inibiu os efeitos do Ca
2+
, provavelmente por bloqueio de canais de
cálcio voltagem-dependente.
Os ensaios funcionais aqui realizados vêm acrescentar novas
informações sobre Aspidosperma ulei Markgr. A fração F
3-5
relaxa completamente
corpos cavernosos de coelho, in vitro, possivelmente através do bloqueio de canais
de cálcio voltagem-dependente, e de modo independente da via nitrérgica, da
estimulação de receptores β-adrenérgicos ou muscarínicos, e de inibição da PDE5.
Estes dados corroboram as observações pioneiras de Campos et al. (2006), que
observaram o efeito pró-erétil de F
3-5
em camundongos, com algumas ressalvas no
que diz respeito aos mecanismos de ação propostos por estes autores
(dopaminérgico, nitrérgico e noradrenérgico). Um mecanismo dopaminérgico, por
sua natureza central, não pode ser testado in vitro. Quanto à via nitrérgica, há que
se considerar as limitações dos estudos in vivo para a determinação exata do
mecanismo de ação de um fármaco, pois diversos fatores relacionados à via de
administração, absorção e interações com outras substâncias no organismo podem
interferir com a interpretação dos resultados. Optou-se por não investigar um
mecanismo noradrenérgico, apesar das evidências indiretas apresentadas por
Sperling et al. (2002) em estudos com Aspidosperma quebracho blanco, que possui
alcalóides similares aos encontrados em Aspidosperma ulei Markgr. Estes autores
observaram dois componentes responsáveis pelos efeitos da planta: um mecanismo
de bloqueio α-adrenérgico, bem como outro mecanismo que não foi caracterizado.
Além disso, como F
3-5
é composta de três alcalóides, é razoável supor que mais do
que um deles possa ter ação eretogênica, com mecanismos farmacológicos
distintos.
54
Portanto, além do bloqueio de canais de cálcio, sugerido pelos resultados
deste trabalho, há que se considerar outras possibilidades para explicação dos
relaxamentos cavernosos provocados por F
3-5
. Primeiramente, é preciso caracterizar
o papel de cada um dos alcalóides componentes da fração, de modo a concentrar os
estudos nas substâncias com atividade eretogênica. Também é importante a
realização de novas pesquisas in vivo, para investigação de possíveis ações centrais
de F
3-5
. Com relação aos mecanismos periféricos de atuação de F
3-5
, é interessante
investigar as hipóteses de bloqueio α-adrenérgico, modulação de canais de potássio,
ou ainda atividade sobre a pGC. Maiores conhecimentos sobre Aspidosperma ulei
Markgr. podem esclarecer melhor a fisiologia e farmacologia da ereção peniana,
além de significar uma nova opção terapêutica, potencialmente beneficiando um
grande número de pacientes.
55
6 CONCLUSÃO
1. A fração alcaloidal F
3-5
de Aspidosperma ulei Markgr. induz o relaxamento
completo do corpo cavernoso de coelho, in vitro.
2. O relaxamento cavernoso induzido por F
3-5
aparentemente não envolve a via
nitrérgica, receptores β-adrenérgicos, receptores muscarínicos ou inibição da
PDE5.
3. O relaxamento cavernoso induzido por F
3-5
provavelmente ocorre através do
bloqueio de canais de cálcio voltagem-dependente.
56
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