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TATIANA LANÇAS
Responsividade do tecido pulmonar
periférico de pacientes com Doença Pulmonar
Obstrutiva Crônica
SÃO PAULO
2009
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Doutor em Ciências
Área de concentração: Patologia
Orientadora: Profa. Dra. Marisa Dolhnikoff
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Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta
publicação:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver)
Universidade de São Paulo. Faculdade de medicina. Serviço de Biblioteca e
Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.
Elaborado por Annelise Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria
Fazanelli Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria
Vilhena. 2ª ed. São Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação; 2005.
Abreviatura dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in
Index Medicus.
SUMÁRIO
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Lista de abreviaturas, símbolos e siglas
Lista de figuras
Lista de tabelas
Lista de anexos
Resumo
Summary
1. INTRODUÇÃO...............................................................................................01
1. 1 DPOC..................................................................................................02
1.1.1 DEFINIÇÃO, PREVALÊNCIA E MORTALIDADE............................................02
1.1.2 ETIOLOGIA, QUADRO CLÍNICO E CLASSIFICAÇÃO......................................04
1.1.3 FISIOPATOLOGIA..................................................................................08
1.2 HIPER-RESPONSIVIDADE........................................................................15
1.3 TECIDO PULMONAR PERIFÉRICO..............................................................17
2. OBJETIVOS.................................................................................................20
3. MÉTODOS...................................................................................................22
3. 1 CASUÍSTICA...........................................................................................23
3. 2 OBTENÇÃO DO TECIDO............................................................................24
3. 3 AVALIAÇÃO DA MECÂNICA DO TECIDO PULMONAR PERIFÉRICO........................24
3.4 ANÁLISE MORFOLÓGICA............................................................................28
3.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA.............................................................................31
4. RESULTADOS..............................................................................................33
4. 1 DADOS DEMOGRÁFICOS E DE FUNÇÃO PULMONAR........................................34
4.2 MECÂNICA DO TECIDO PULMONAR PERIFÉRICO.............................................35
4.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA............................................................................38
4.4 CORRELAÇÕES.......................................................................................39
5. DISCUSSÃO.................................................................................................43
6. CONCLUSÕES.............................................................................................51
7. ANEXOS.....................................................................................................53
8. REFERÊNCIAS.............................................................................................65
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS
Δ delta
%R porcentagem de aumento de resistência
%E porcentagem de aumento de elastância
ACh acetilcolina
AML actina de músculo liso
CaCl
2
cloreto de cálcio
CAPPesq Comissão de ética para análise de projetos de pesquisa
C0
2
gás
carbônico
CVF capacidade vital forçada
DPOC doença pulmonar obstrutiva crônica
E elastância
Ebasal elastância basal
EACh elastância pós-acetilcolina
HCFMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo
HR hiper-responsividade
Hz hertz
KCl cloreto de potássio
KH
2
PO
4
dihidrogenofosfato de potássio
MEC matriz extracelular
MgSO
4
sulfato de magnésio
NaCl cloreto de sódio
NaHCO
3
bicarbonato de sódio
O
2
oxigênio
R resistência
Rbasal resistência basal
RACh resistência pós-acetilcolina
T tensão
VEF
1
volume expiratório forçado no primeiro segundo
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema da mecânica do tecido pulmonar periférico..................27
Figura 2. Fotografia do equipamento de análise da mecânica do tecido
pulmonar periférico.......................................................................................27
Figura 3. Demonstração do método de morfometria convencional..............30
Figura 4. Demonstração do método de análise de imagem........................31
Figura 5. Gráficos dos valores de resistência basais e pós-ACh.................36
Figura 6. Gráfico dos valores de elastância basais e pós-ACh....................36
Figura 7. Gráfico das porcentagens de aumento de resistência..................37
Figura 8. Gráfico das porcentagens de aumento de elastância...................37
Figura 9. Gráfico das correlações entre a proporção de volume de fibras
elásticas e a densidade alveolar de neutrófilos, macrófagos e linfócitos
CD8+.............................................................................................................41
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Classificação espirométrica de gravidade da DPOC...........08
TABELA 2. Anticorpos e métodos utilizados nas colorações de imuno-
histoquímica.........................................................................................30
TABELA 3. Dados demográficos e de prova de função pulmonar.........35
TABELA 4. Densidade alveolar de células inflamatórias........................38
TABELA 5. Proporção de volume de células positivas para α-actina de
músculo liso e de fibras colágenas e elásticas.....................................39
TABELA 6. Correlações entre os valores de mecânica e os parâmetros
morfológicos.........................................................................................40
LISTA DE ANEXOS
Anexo A. Aprovação da Comissão de Ética para Análise de Projetos de
Pesquisa (CAPPesq)....................................................................................54
Anexo B. Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital A.C.
Camargo.......................................................................................................55
Anexo C. Tabela de dados dos pacientes do estudo...................................56
Anexo D. Tabelas de dados utilizados na análise estatística do
estudo...........................................................................................................57
RESUMO
Lanças T. Responsividade do tecido pulmonar periférico de pacientes com
Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica [tese]. São Paulo: Faculdade de
Medicina, Universidade de São Paulo; 2009.
Mais de 60% dos pacientes com Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica
(DPOC) podem apresentar hiper-responsividade brônquica. Entretanto, não
se sabe se, além das vias aéreas, o tecido pulmonar periférico também
apresenta uma resposta exagerada a um agonista na DPOC. No presente
estudo foi investigado o comportamento mecânico in vitro e as alterações
estruturais e inflamatórias do tecido pulmonar periférico de 10 pacientes com
DPOC comparados com 10 controles não fumantes. Foram realizadas
medidas de resistência (R) e elastância (E) de fatias pulmonares em
situação basal e após desafio com Acetilcolina. Também foram analisados
no tecido alveolar as densidades de neutrófilos, eosinófilos, macrófagos,
mastócitos e linfócitos CD8+ e CD4+, além do conteúdo de células positivas
para α-actina de músculo liso, fibras elásticas e colágenas. Os valores de R
após o tratamento com Acetilcolina (RACh) e a porcentagem de aumento de
resistência (%R) foram significativamente maiores no grupo DPOC
comparado ao grupo controle (p≤0,03). O grupo DPOC também apresentou
densidade de macrófagos (p=0,04) e linfócitos CD8+ (p=0,017)
significativamente maior e conteúdo de fibras elásticas significativamente
menor (p=0,003) comparado ao grupo controle. Foi observada uma
correlação positiva significativa entre a %R e a densidade de eosinófilos e
linfócitos CD8+ (r=0,608, p=0,002; e r=0,581, p=0,001, respectivamente), e
também uma correlação negativa significativa entre a %R e a relação VEF
1
/
CVF (r=-0,451, p<0,05). Concluímos que a resposta colinérgica de fatias de
parênquima pulmonar está aumentada em pacientes com doença pulmonar
obstrutiva crônica e parece estar relacionada tanto à densidade de
eosinófilos e de linfócitos CD8+ no tecido alveolar quanto ao grau de
obstrução determinado pela prova de função pulmonar.
Descritores: doença pulmonar obstrutiva crônica, bronquite crônica,
enfisema pulmonar, pulmão/fisiopatologia, hiper-reatividade brônquica,
mecânica, alvéolos pulmonares.
SUMMARY
Lanças T. Hyperresponsiveness of peripheral lung parenchyma in Chronic
Obstructive Pulmonary Disease [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina,
Universidade de São Paulo”; 2009.
Up to 60% of COPD patients can present airway hyperresponsiveness.
However, it is not known whether the peripheral lung tissue also presents an
exaggerated response to agonists in COPD. In this study we investigated the
in vitro mechanical behavior and structural and inflammatory changes of
peripheral lung tissue of 10 COPD patients and compared to 10 non-smoking
controls. We measured resistance (R) and elastance (E) of lung strips at
baseline and after acetylcholine (ACh) challenge. We further assessed the
alveolar tissue density of neutrophils, eosinophils, macrophages, mast cells
and CD8+ and CD4+ cells, and the content of α-smooth muscle actin+ cells,
elastic fibers and collagen fibers. Values of R after ACh treatment (RACh)
and percent increase of tissue resistance (%R) were significantly higher in
COPD group compared to controls (p≤0.03). There was a significantly higher
density of macrophages (p=0.04) and CD8+ cells (p=0.017) and a lower
elastic fiber content (p=0.003) in COPD group compared to controls. We
observed a significant positive correlation between %R and eosinophil and
CD8+ cells density (r=0.608, p=0.002; and r=0.581, p=0.001, respectively),
and also a negative correlation between %R and FEV1/FVC (r=-0.451,
p<0.05). We conclude that the cholinergic responsiveness of parenchymal
lung strips is increased in COPD patients and seems to be related to alveolar
tissue eosinophilic and CD8 lymphocytic inflammation and also to the degree
of airway obstruction at pulmonary function test.
Key Words: chronic obstructive pulmonary disease, chronic bronchitis,
pulmonary emphysema, lung/physiopathology, bronchial hyperreactivity,
mechanics, pulmonary alveoli.
Introdução
1. INTRODUÇÃO
1.1 DPOC
1.1.1 DEFINIÇÃO, PREVALÊNCIA E MORTALIDADE
A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) é definida como “uma
doença evitável e tratável com alguns efeitos extrapulmonares significativos
que podem contribuir para a gravidade em alguns pacientes. O componente
pulmonar é caracterizado por limitação ao fluxo aéreo que não é totalmente
reversível. A limitação ao fluxo aéreo é geralmente progressiva e associada
a uma resposta inflamatória anormal do pulmão a partículas ou gases
nocivos” (Rabe et al., 2007).
A DPOC é uma das principais causas mundiais de morbidade e
mortalidade e resulta em um impacto social e econômico substancial e
crescente. A prevalência, a morbidade e a mortalidade da doença variam
entre os países e entre grupos diferentes de um mesmo país, mas, em geral,
estão relacionadas diretamente à prevalência do tabagismo. Em muitos
países, a poluição do ar resultante da queima de biomassa (lenha, carvão e
outros combustíveis) tem também sido identificada como importante fator de
risco (Rabe et al., 2007).
A prevalência da DPOC pode variar muito em razão de diferenças nos
métodos de levantamento, nos critérios de diagnóstico e nas abordagens
analíticas (Halbert et al., 2006). As menores estimativas de prevalência são
geralmente as baseadas em relatos pessoais de um diagnóstico médico de
DPOC ou condição equivalente. A maioria dos dados mundiais mostra que
menos de 6% da população afirma ter a doença, o que reflete o sub-
reconhecimento e subdiagnóstico da DPOC (van den Boom et al., 1998). Por
outro lado, estudos realizados em diversos países com métodos
padronizados e incluindo parâmetros espirométricos fornecem evidências de
que, em indivíduos com mais de 40 anos, a prevalência de DPOC pode
chegar a cerca de 25% (Rabe et al., 2007). Os dados de prevalência no
Brasil, obtidos de questionários de sintomas, permitem estimar a DPOC em
adultos maiores de 40 anos em 12% da população, ou seja, 5.500.000
indivíduos (II Consenso Brasileiro sobre DPOC, 2004). Na cidade de São
Paulo a prevalência da DPOC varia de 6 a 15,8% em indivíduos maiores de
40 anos (Menezes et al., 2005).
O fato da DPOC não ser devidamente reconhecida e tratada e de
muitas vezes ser considerada uma causa de morte contribuinte ou omitida
do atestado de óbito, influencia na precisão dos dados de mortalidade. Mas,
apesar desse fato, a DPOC é uma das causas mais importantes de morte na
maioria dos países. Em 1990, a doença ocupava o sexto lugar como causa
de morte no mundo e deverá ficar em terceiro lugar em 2020 (Lopez et al.,
2006). Essa mortalidade elevada é devido à “epidemia” do tabagismo e às
mudanças demográficas na maioria dos países, com a maioria da população
vivendo mais. Em 2000, o número de mortes por DPOC nos Estados Unidos
foi maior entre as mulheres do que entre os homens (59.936 contra 59.118),
no entanto o índice de mortalidade entre as mulheres permanece
ligeiramente abaixo do observado em homens (Rabe et al., 2007). No Brasil,
vem ocorrendo um aumento do número de óbitos por DPOC nos últimos 20
anos, em ambos os sexos, tendo a taxa de mortalidade passado de 7,88
para 19,04 em cada 100.000 habitantes nas décadas de 1980 e 1990,
respectivamente e ocupando da 4ª à 7ª posição entre as principais causas
de morte (II Consenso Brasileiro sobre DPOC, 2004).
1.1. 2 ETIOLOGIA, QUADRO CLÍNICO E CLASSIFICAÇÃO
A principal causa da doença pulmonar obstrutiva crônica é o
tabagismo. Entretanto, evidências consistentes de estudos epidemiológicos
mostram que não fumantes também podem desenvolver obstrução crônica
ao fluxo aéreo (Behrendt et al., 2005).
A DPOC é uma doença poligênica e um exemplo clássico de
interação entre genética e meio ambiente. O fator de risco genético mais
evidente é a deficiência hereditária grave de alfa-1 antitripsina que provoca
um desenvolvimento prematuro e acelerado de enfisema panlobular
associado à diminuição da função pulmonar e que ocorre tanto em fumantes
quanto em não fumantes com deficiência grave. O caráter familiar de
obstrução ao fluxo aéreo tem sido observado em irmãos de pacientes com
DPOC grave, sugerindo a influência de fatores genéticos nesta
suscetibilidade. Os resultados de estudos genéticos, entretanto, têm sido
bastante inconsistentes e as variantes genéticas que influenciam o
desenvolvimento da DPOC (além da deficiência de alfa-1 antitripsina) não
têm sido definitivamente identificadas (Rabe et al., 2007).
Dentre os tipos de exposições inalatórias que predispõem ao
desenvolvimento da DPOC estão a fumaça de tabaco, a poeira e os agentes
químicos ocupacionais, e a poluição do ar.
Os indivíduos que fumam cigarro têm maior prevalência de sintomas
respiratórios e anormalidades na função pulmonar, maior taxa de declínio
anual no VEF
1
e maior taxa de mortalidade quando comparados a não
fumantes. Outros tipos de tabagismo, populares em vários países, também
representam fatores de risco para DPOC. Além disso, a exposição passiva à
fumaça de cigarro, que aumenta o impacto total sobre os pulmões de
partículas e gases inalados, pode contribuir para a ocorrência de sintomas
respiratórios e DPOC. A observação de que apenas parte dos fumantes
[estimada em 15 a 20% na maioria dos estudos, ou até 41% em tabagistas
acompanhados por mais de 20 anos (Lokke et al., 2006)] desenvolve DPOC
clinicamente significativa contribui para a hipótese de interferência de fatores
genéticos (Rabe et al., 2007).
As exposições ocupacionais incluem poeiras orgânicas e inorgânicas
e agentes químicos. Estas exposições contribuem para 10-20% tanto dos
sintomas quanto do comprometimento funcional da DPOC (Balmes et al.,
2003).
A poluição doméstica do ar resultante da queima de biomassa em
habitações pouco ventiladas também representa um fator de risco
importante para a DPOC, principalmente entre mulheres em países em
desenvolvimento (Salvi e Barnes, 2009). Os altos níveis de poluição do ar
nos grandes centros urbanos também são prejudiciais para os indivíduos
com doenças pulmonares e/ou cardíacas pré-existentes, mas a real
importância da poluição atmosférica no desenvolvimento da DPOC não está
totalmente estabelecida. Outros fatores relevantes para a predisposição à
doença são o sexo, as infecções respiratórias, o crescimento e o
desenvolvimento pulmonares, o nível socioeconômico, o estado nutricional e
as comorbidades (Rabe et al., 2007).
Pelo fato da DPOC frequentemente se desenvolver em tabagistas de
longa data, os pacientes muitas vezes têm uma variedade de doenças
relacionadas ao tabagismo e ao envelhecimento (Soriano et al., 2005).
Porém, a própria DPOC também tem efeitos extrapulmonares significativos
(como perda de massa muscular, anemia, osteoporose, depressão), que
levam à presença de comorbidades (Agusti, 2005).
O componente pulmonar manifesta-se inicialmente nos pacientes
fumantes com tosse produtiva que ocorre em aproximadamente 50% dos
fumantes, pode ser diária ou intermitente e pode preceder a dispnéia ou
aparecer simultaneamente a ela. A dispnéia é o principal sintoma associado
à incapacidade, redução da qualidade de vida e pior prognóstico. É
geralmente progressiva com a evolução da doença e muitos pacientes só a
referem numa fase mais avançada da doença (II Consenso Brasileiro sobre
DPOC, 2004).
O diagnóstico de DPOC é realizado com base na apresentação clínica
dos sintomas e nos exames de espirometria, radiológicos e de gasometria e
pH. A espirometria é obrigatória na suspeita clínica da DPOC e deve ser
realizada antes e após a administração de broncodilatador e de preferência
em uma fase estável da doença. Os parâmetros mais importantes a serem
avaliados neste exame são a capacidade vital forçada (CVF), o volume
expiratório no primeiro segundo (VEF
1
) e a relação VEF
1
/CVF. A existência
de limitação ao fluxo aéreo é definida pela presença da relação VEF
1
/CVF
abaixo de 0,70 pós-broncodilatador (II Consenso Brasileiro sobre DPOC,
2004).
Uma classificação espirométrica simples de gravidade da doença em
quatro estágios é proposta por razões educacionais (Tabela 1). As medidas
da relação VEF
1
/CVF e VEF
1
pós-broncodilatador são recomendadas para o
diagnóstico e avaliação da gravidade da DPOC, mas, o grau de
reversibilidade da obstrução pulmonar não é mais recomendado para
diagnóstico, diagnóstico diferencial com asma, ou prognóstico da resposta
ao tratamento de longo prazo com broncodilatadores ou corticóides (Rabe et
al., 2007).
Tabela 1. Classificação espirométrica de gravidade da DPOC*
Estágio I: Leve
VEF
1
/CVF < 0,70
VEF
1
≥ 80% do previsto
Estágio II: Moderado
VEF
1
/CVF < 0,70
50 ≤ VEF
1
< 80% do previsto
Estágio III: Grave
VEF
1
/CVF < 0,70
30 ≤ VEF
1
< 50% do previsto
Estágio IV: Muito grave VEF
1
/CVF < 0,70
VEF
1
< 30% do previsto
VEF
1
< 50% do previsto mais
insuficiência respiratória
* baseada no VEF
1
pós-broncodilatador.
VEF
1
: volume expiratório forçado no primeiro segundo; CVF: capacidade vital
forçada; Insuficiência respiratória: pressão parcial arterial de oxigênio (PaO
2
) menor
que 8,0 kPa (60mmHg) com ou sem pressão parcial arterial de gás carbônico
(PaCO
2
) maior que 6,7 kPa (50mmHg) respirando ar ao nível do mar.
1.1. 3 FISIOPATOLOGIA
As alterações características da DPOC são encontradas nas vias
aéreas proximais, nas vias aéreas periféricas, no parênquima pulmonar e na
vasculatura pulmonar (Hogg, 2004). O processo inflamatório crônico causa
alterações dos brônquios (bronquite crônica), alteração dos bronquíolos
(bronqueolite obstrutiva) e destruição do parênquima pulmonar (enfisema
pulmonar) (II Consenso Brasileiro sobre DPOC, 2004).
A inflamação crônica cursa com aumento da densidade de células
inflamatórias específicas em diferentes regiões do pulmão e alterações
estruturais resultantes do processo repetido de lesão e reparo. Em geral,
estas alterações inflamatórias e estruturais das vias aéreas aumentam com
a gravidade da doença e persistem mesmo após o abandono do hábito de
fumar (Rabe et al., 2007).
A inflamação nos pacientes com DPOC parece ser uma amplificação
da resposta inflamatória normal do sistema respiratório a irritantes crônicos
como a fumaça de cigarro. Os mecanismos responsáveis por esta
amplificação não são totalmente conhecidos, mas podem ser geneticamente
determinados. O estresse oxidativo e o excesso de proteinases no pulmão
também estão envolvidos no mecanismo de lesão inflamatória (Rabe et al.,
2007). A inflamação na DPOC envolve diferentes tipos celulares, mas,
principalmente neutrófilos, macrófagos e linfócitos (Barnes et al., 2003).
Os neutrófilos são as células efetoras primárias na DPOC e as
proteinases liberadas por estas células, principalmente a elastase, são
responsáveis pelas principais alterações estruturais. Alguns estudos têm
demonstrado que fumantes apresentam um aumento do número de
neutrófilos no tecido pulmonar (Saetta et al., 1997), no escarro (Rutgers et
al., 2000) e no lavado broncoalveolar (Martin et al., 1985). Um aumento
ainda maior na densidade destas células ocorre com o desenvolvimento da
DPOC e está associado à gravidade da doença (Stockley, 2002). O índice
de troca gasosa (medida fisiológica mais direta do enfisema) é inversamente
proporcional aos níveis de marcadores associados aos neutrófilos em
pacientes com DPOC (Ekberg-Jansson et al., 2001). Os neutrófilos destes
pacientes também têm resposta quimiotática e atividade proteolítica
aumentadas (Burnett et al., 1987) e expressam mais moléculas de adesão
(Noguera et al., 2001) em comparação com as células de indivíduos não-
fumantes sem DPOC. Além disso, as enzimas neutrofílicas são capazes de
causar todas as alterações patológicas características da DPOC incluindo o
enfisema, a hipersecreção de muco e a diminuição do batimento ciliar
(Sapey e Stockley, 2005).
Um grande aumento na densidade de macrófagos é encontrado nas
vias aéreas, no parênquima pulmonar, no lavado broncoalveolar e no
escarro de pacientes com DPOC (Barnes, 2005). Estas células estão
localizadas nas regiões de destruição das paredes alveolares nos pacientes
com enfisema. Além disso, existe uma correlação entre o número de
macrófagos nas vias aéreas e a gravidade da DPOC (Di Stefano et al.,
1998). Os macrófagos alveolares possuem a capacidade de secretar um
grande número de mediadores inflamatórios incluindo mediadores lipídicos,
quimiocinas, citocinas, fatores de crescimento e espécies reativas de
oxigênio e nitrogênio. Estas células podem ser ativadas por diversos
estímulos, incluindo fumaça de cigarro, citocinas pró-inflamatórias,
endotoxinas e estímulos imunes. Os macrófagos de pacientes com DPOC
apresentam liberação aumentada de mediadores inflamatórios quando
comparados a células de fumantes normais, que, por sua vez, secretam
mais mediadores do que macrófagos de indivíduos não fumantes (Barnes,
2005).
Diversos estudos têm identificado as células T CD8+ como o linfócito
predominante nas vias aéreas e no parênquima pulmonar de fumantes com
DPOC, embora as células T CD4+ também estejam aumentadas nestes
pacientes (Cosio, 2005). O’Shaughnessy e colaboradores (1997) e Saetta e
colaboradores (1998) estudando as grandes e as pequenas vias aéreas,
respectivamente, mostraram que a única diferença significativa no infiltrado
celular inflamatório de fumantes assintomáticos e fumantes com DPOC é
que estes últimos apresentavam um aumento de linfócitos CD8+. Além
disso, nestes dois estudos houve uma correlação negativa entre a
densidade destas células e o grau de obstrução ao fluxo aéreo medido pelo
VEF
1
. Majo e colaboradores (2001) demonstraram que, em fumantes com
DPOC, ambos os linfócitos CD8+ e CD4+ aumentavam de acordo com o
aumento da carga tabágica dos mesmos, o que não acontecia com fumantes
normais sugerindo, desta forma, que as células T CD4+ também estão
envolvidas no processo inflamatório da DPOC. Estes autores também
encontraram um aumento do número de células apoptóticas nos pulmões de
fumantes com DPOC e este aumento apresentou uma correlação positiva
com o número de linfócitos CD8+ citolíticos nas paredes alveolares. Este e
outros estudos que demonstram apoptose aumentada de células
pulmonares estruturais em pulmões enfisematosos sugerem que as células
T CD8+ induzem apoptose de células epiteliais e endoteliais no enfisema
(Cosio, 2005).
Os linfócitos B estão aumentados nas vias aéreas periféricas e no
interior de folículos linfóides possivelmente como uma resposta à
colonização crônica e infecção das vias aéreas (Hogg et al., 2004).
Na doença estável, os eosinófilos são ocasionalmente descritos, mas
não são as células geralmente encontradas na mucosa brônquica de
pacientes com DPOC como ocorre na asma leve/moderada. Porém, os
eosinófilos podem ser encontrados em maior número na mucosa brônquica
de pacientes com DPOC leve ou moderada durante as exacerbações da
doença quando comparados com pacientes com DPOC estáveis (Saetta et
al., 1994; Zhu et al., 2001). Entretanto, esse aumento de eosinófilos é
diferente do aumento descrito na asma. A presença de eosinófilos nas
exacerbações da DPOC é transitória e geralmente restrita aos capilares
sanguíneos (Di Stefano et al., 2004).
Alguns estudos também demonstraram um aumento de mastócitos
em pacientes com DPOC quando comparados com controles sem limitação
ao fluxo aéreo (Grashoff et al., 1997; Pesci et al., 1994). Os mastócitos
podem desempenhar um papel na patogênese da DPOC por meio da
indução da produção de colágeno, da proliferação de fibroblastos e da
liberação de vários mediadores incluindo proteases potentes com a triptase
e a quimase (Gosman et al., 2008).
A bronquite crônica está associada à hiperplasia de ambas as células
caliciformes epiteliais e as glândulas submucosas das vias aéreas. As
mucinas, glicoproteínas complexas que fornecem as propriedades
viscoelásticas do muco, são um mecanismo de defesa essencial nas vias
aéreas superiores. A regulação destas mucinas está alterada nos pulmões
de pacientes com DPOC. As vias aéreas de fumantes contêm mais células
caliciformes do que as de não fumantes e a ativação destas células resulta
em hipersecreção de muco levando à obstrução das vias aéreas (Rahman,
2005).
Um aumento da geração de espécies reativas de oxigênio também é
encontrado em pacientes com DPOC. Essas espécies reativas podem ser
cruciais na amplificação da resposta inflamatória normal dos pulmões à
fumaça de cigarro e oxidantes do meio ambiente (agentes nocivos), mas
também estão envolvidas no mecanismo protetor contra os efeitos do cigarro
por meio da indução de genes antioxidantes. A presença do estresse
oxidativo tem consequências importantes em diversos eventos da
patogênese da DPOC, como a lesão do epitélio dos espaços alveolares, o
sequestro e a migração de neutrófilos para o pulmão, o desequilíbrio entre
proteinases e antiproteinases, a hipersecreção de muco, a apoptose e o
remodelamento da matriz extracelular (MEC) (Rahman, 2005).
Outro aspecto importante da patogênese da DPOC é o processo de
remodelamento pulmonar, que afeta principalmente as pequenas vias
aéreas (espessamento, fibrose, perda dos acoplamentos bronquíolo-
alveolares) e o parênquima pulmonar (enfisema) (Jeffery, 2004). O enfisema
contribui para a limitação ao fluxo aéreo por meio da redução do
recolhimento elástico, enquanto as alterações das pequenas vias aéreas
aumentam a resistência ao fluxo. Estes dois componentes geralmente
coexistem em proporções variadas e interagem para contribuir para a
limitação total ao fluxo aéreo (Sturton et al., 2008).
Todos os componentes da MEC (colágeno, fibras elásticas e
proteoglicanos) parecem estar envolvidos no processo de remodelamento
pulmonar na DPOC. A parede das pequenas vias aéreas apresenta
espessamento causado principalmente por fibrose (Jeffery, 2001). Este
espessamento envolve a lâmina própria, o músculo liso e a adventícia (Hogg
et al., 2007). Os mecanismos de sinalização para o processo fibrótico
começaram a ser elucidados nas vias aéreas grandes e pequenas de
animais expostos à fumaça de cigarro (Wang et al., 2003; Wang et al., 2005;
Kenyon et al., 2003). Estudos em humanos também demonstraram que a
sinalização para o processo fibrótico está aumentada nas células epiteliais
das pequenas vias aéreas de fumantes (De Boer et al., 1998; Takizawa et
al., 2001). Tanto em animais quanto em humanos, o início desta resposta
parece ocorrer via ativação direta do TGF-β1 pelos constituintes do cigarro,
mesmo na ausência de infiltração de células inflamatórias (Churg et al.,
2006). Entretanto, oxidantes derivados destas células provavelmente
amplificam esta resposta (Wang et al., 2003). Não se sabe, porém, se a
inibição desta sinalização pró-fibrótica resultaria na resolução do
espessamento da via aérea e na restauração da função pulmonar.
O processo de remodelamento no enfisema pulmonar é causado
principalmente pelo desequilíbrio entre as proteinases e antiproteinases. O
enfisema associado à fumaça de cigarro pode ser descrito pelos seguintes
eventos: 1) recrutamento de células inflamatórias para o interior dos espaços
aéreos terminais do pulmão; 2) liberação, por estas células inflamatórias, de
proteinases elastolíticas em maior quantidade do que os inibidores em locais
específicos causando lesão da MEC; 3) células estruturais do pulmão são
destruídas tanto em resposta à perda da MEC quanto por um evento
primário e 4) reparo ineficaz de alvéolos e de fibras elásticas e,
provavelmente, de outros componentes da MEC resultando em alargamento
dos espaços alveolares (Shapiro, 2005).
Os estudos que avaliaram o conteúdo de colágeno no tecido
pulmonar de indivíduos com DPOC mostraram um aumento bioquímico e
histológico de colágeno no parênquima alveolar de indivíduos com enfisema
centrilobular (Cardoso et al., 1993; Vlahovic et al., 1999). As fibras elásticas
do septo alveolar também estão alteradas nos indivíduos com enfisema,
apresentando fragmentação (Finlay et al., 1996). Os estudos, porém, que
quantificaram essas fibras mostraram resultados conflitantes. Vlahovic e
colaboradores (1999) demonstraram um aumento no volume de septos
alveolares com um aumento paralelo de fibras elásticas no tecido pulmonar
de pacientes enfisematosos. Outro estudo, porém, mostrou preservação da
espessura do septo alveolar e diminuição no conteúdo de fibras elásticas no
tecido pulmonar de pacientes com DPOC quando comparados com
indivíduos fumantes sem obstrução (Black et al., 2008).
1. 2 HIPER-RESPONSIVIDADE
A hiper-responsividade das vias aéreas (HRVA), definida como uma
resposta constritora exagerada das vias aéreas a diferentes estímulos, é um
fenômeno característico da asma (Grootendorst e Rabe, 2004). Entretanto, a
prevalência de HR também é alta em pacientes com DPOC, variando de
25% a 87%, dependendo da população estudada (Yan et al., 1985; Kanner
et al., 1994; Tashkin et al., 1992).
Enquanto na asma a HRVA é considerada um marcador da
inflamação e está relacionada à gravidade da doença, sabe-se muito menos
sobre os mecanismos envolvidos na HRVA em pacientes com DPOC
(Grootendorst e Rabe, 2004). A HR das vias aéreas na DPOC está
associada a uma redução da função pulmonar (Sparrow et al., 1987), a um
pior prognóstico (Postma et al., 1991; Tashkin, 1996) e a maior mortalidade
(Hospers et al., 2000). Os mecanismos propostos para a HRVA na DPOC
incluem inflamação e hipertrofia de músculo liso das vias aéreas, aumento
da espessura da parede da via aérea por remodelamento e alterações
estruturais no parênquima alveolar (enfisema) (Postma e Kerstjens, 1998). A
presença de HRVA em indivíduos com DPOC está associada, portanto, à
limitação basal ao fluxo aéreo. Entretanto, estudos que mostram que a
HRVA na DPOC está associada ao perfil inflamatório das vias aéreas
(Rutgers et al., 2000, Finkelstein et al., 1995), que indivíduos com HRVA têm
um risco aumentado de desenvolver DPOC (Brutsche et al., 2006), e que
pacientes com DPOC leve ou precoce apresentam HRVA (Tashkin et al.,
1996), sugerem que a HR pode ser uma característica fisiopatológica da
DPOC e não um marcador indireto da obstrução das vias aéreas (Postma e
Kerstjens, 1998, Grootendorst e Rabe, 2004).
Estudos in vitro têm sido conduzidos com o objetivo de avaliar o papel
do músculo liso da via aérea na HR em pacientes com DPOC. De Jongste e
colaboradores demonstraram que a resposta de bronquíolos à histamina é
significativamente maior em pacientes com DPOC comparada a indivíduos
sem a doença (De Jongste et al., 1987). Outros autores também mostraram
que bronquíolos isolados de pacientes obstruídos geram uma força
isométrica máxima maior em resposta à acetilcolina (ACh) do que
bronquíolos de pacientes não obstruídos, sugerindo que uma função
alterada do músculo liso periférico pode ser um importante determinante na
função anormal das vias aéreas em pacientes com doenças pulmonares
obstrutivas (Opazo Saez et al., 2000).
1. 3 TECIDO PULMONAR PERIFÉRICO
Estudos experimentais têm demonstrado que, não só as vias aéreas,
mas também o parênquima alveolar pode responder a agonistas constritores
(Fredberg et al.,1993).
A obstrução ao fluxo de ar, característica na DPOC, provoca um
aumento da resistência pulmonar que é um fator determinante para o gasto
de energia que ocorre durante a respiração. Grande parte dessa resistência
é determinada pelas vias aéreas; porém, tem sido proposto que o pulmão
distal pode ter um papel fundamental na resistência pulmonar total.
Considera-se pulmão distal as vias aéreas com calibre ≤ 2 mm de diâmetro e
o parênquima pulmonar adjacente (Tulic e Hamid, 2002). Tem sido
observado que o parênquima pulmonar pode também apresentar aumento
de resistência durante uma constrição induzida por agonistas em diferentes
modelos animais de asma (Homma et al, 2005; Nagase et al, 1995; Tomioka
et al, 2002; Xisto et al, 2005).
Embora a heterogeneidade de constrição da via aérea possa ser
responsável pelas alterações observadas na resistência do tecido em
resposta a agonistas (Lutchen et al, 1996), um aumento nessa resistência
tecidual pode também refletir um papel direto do parênquima na resposta
pulmonar total. O local da resposta contrátil do parênquima alveolado ainda
não está totalmente estabelecido. Os mecanismos que podem estar
potencialmente envolvidos nesta resposta são: a contração de
miofibroblastos ou células intersticiais contráteis (Kapanci et al, 1974, Fukui
et al, 1996), alterações mecânicas da matriz extracelular, contração de
células musculares lisas ao nível de ductos alveolares, de pequenas vias
aéreas ou de vasos presentes no tecido pulmonar periférico (Lai et al, 1994;
Ludwig, 1997).
Fatias de parênquima pulmonar submetidas a oscilações sinusoidais
in vitro podem ser usadas com o objetivo de determinar o comportamento
mecânico do tecido, uma vez que representam exclusivamente as unidades
distais do tecido pulmonar e permitem uma melhor avaliação das
propriedades puras do tecido (Fust et al, 2004; Leite-Junior et al, 2003).
Foi demonstrado anteriormente que o tecido pulmonar periférico
humano á capaz de apresentar uma resposta contrátil à ACh in vitro com
aumento de resistência e elastância. Nesse estudo, não houve diferença na
resposta contrátil entre as fatias de tecido pulmonar com ou sem vias
aéreas. Esses resultados sugerem que a resposta à acetilcolina ocorre em
nível de parênquima pulmonar e independe da presença de vias aéreas no
tecido analisado (Dolhnikoff et al, 1998). Entretanto, não se sabe se esta
contratilidade do parênquima está alterada na DPOC. Embora seja bem
conhecido que o grau de limitação ao fluxo aéreo em pacientes com DPOC
é amplamente determinado por alterações inflamatórias e estruturais das
pequenas vias aéreas e do parênquima pulmonar, não se sabe se uma
contratilidade alterada em um nível distal pode ser parte do mecanismo de
HR e obstrução na DPOC.
Com o objetivo de investigar se a resposta contrátil do pulmão distal
poderia contribuir para a patogênese da HR na DPOC, foi analisado o
comportamento mecânico dinâmico de fatias de parênquima pulmonar
periférico de pacientes com DPOC antes e durante uma constrição induzida
por ACh, e este comportamento foi comparado ao de controles não
fumantes. Também foi investigado se essas alterações mecânicas do
parênquima in vitro se correlacionam com parâmetros estruturais e
inflamatórios do tecido pulmonar e com a função pulmonar in vivo.
Objetivos
2. OBJETIVOS
Os objetivos deste estudo foram:
• Avaliar a mecânica do tecido pulmonar periférico de pacientes com
Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica e compará-la à de indivíduos
controles em situação basal e em resposta a um agonista constritor.
• Analisar as possíveis correlações entre a mecânica do tecido
pulmonar e os parâmetros morfológicos (inflamatórios e estruturais)
das fatias de tecido pulmonar.
• Analisar as possíveis correlações entre a mecânica do tecido
pulmonar e parâmetros clínicos (idade e tempo de fumo) e dados da
prova de função pulmonar.
Métodos
3. MÉTODOS
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética para Análise de
Projetos de Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo (CAPPesq – HCFMUSP), sob o protocolo
número 086/03 (Anexo A) e pelo Comitê de Ética do Hospital A.C. Camargo
(Anexo B).
Todos os pacientes incluídos no estudo assinaram um termo de
consentimento livre e esclarecido.
3.1 CASUÍSTICA
Os indivíduos incluídos neste estudo foram separados em dois
grupos, de acordo com os seguintes critérios:
Grupo DPOC: pacientes tabagistas ou ex-tabagistas com diagnóstico
clínico de doença pulmonar obstrutiva crônica e obstrução na prova de
função pulmonar (Rabe et al., 2007).
Grupo controle: indivíduos não-tabagistas sem doença pulmonar
prévia e sem obstrução à prova de função pulmonar (VEF
1
/CVF > 0,70).
No período entre 2003 e 2006, foi coletado tecido pulmonar periférico
de 63 pacientes submetidos à cirurgia de ressecção pulmonar para retirada
de tumor primário ou metastático. Destes pacientes, 17 foram excluídos por
não apresentarem dados de prova de função pulmonar.
Dos 46 pacientes restantes, 26 indivíduos tabagistas ou ex-tabagistas
foram excluídos por não preencherem os critérios clínico-funcionais de
DPOC. O grupo DPOC foi então constituído por 10 pacientes fumantes ou
ex-fumantes com diagnóstico de DPOC, submetidos à ressecção pulmonar
para retirada de neoplasia. O grupo controle foi constituído por 10 indivíduos
não-fumantes, sem doença pulmonar prévia, submetidos à ressecção
pulmonar para retirada de nódulos metastáticos ou para retirada de lesões
pulmonares isoladas, benignas, diagnosticadas aos exames de imagem.
Os dados demográficos e de função pulmonar foram obtidos por meio
de revisão dos prontuários.
3.2 OBTENÇÃO DO TECIDO
Fragmentos de tecido pulmonar foram obtidos no centro cirúrgico
imediatamente após a ressecção pulmonar. O tecido foi coletado nas áreas
livres de tumor, correspondendo às regiões mais periféricas do segmento
pulmonar retirado na cirurgia. O tecido foi transportado do centro cirúrgico
em solução de Krebs (mM: NaCl, 118; KCl, 4,5; NaHCO
3
, 25,5; CaCl
2
, 2,5;
MgSO
4
, 1,2; KH
2
PO
4
, 1,2; glicose 10; Sigma Chemical, St. Louis, MO).
3.2 AVALIAÇÃO DA MECÂNICA DO TECIDO PULMONAR PERIFÉRICO
Dos fragmentos coletados de tecido pulmonar foram então obtidas
uma ou duas fatias subpleurais (10 x 2 x 2 mm), dependendo da quantidade
de material disponível. O comprimento de repouso (L
r
) e o peso úmido (W
0
)
de cada fatia foram medidos. Clipes de metal foram colados com cianocrilato
em cada extremidade da fatia e, por meio de hastes de aço (0,5 mm de
diâmetro) acopladas aos clipes de metal, uma extremidade da fatia pulmonar
foi conectada a um transdutor de força (modelo 404A; Aurora Scientific Inc.,
Ontário, Canadá) e a outra extremidade foi conectada a um braço oscilatório
servo-controlado (modelo 300B; Aurora Scientific Inc., Ontário, Canadá). O
braço oscilatório é capaz de realizar excursões de 8 mm e resoluções de
comprimento de 1 µm e foi, por sua vez, conectado a um gerador (modelo
3030; BK Precision, Califórnia, USA) que controla a frequência, a amplitude
e a forma de onda das oscilações. A tensão de repouso (T) foi obtida pela
movimentação de um parafuso de microscópio adaptado ao equipamento
que realizava lentos deslocamentos verticais do transdutor de força. Os
sinais de força e comprimento foram convertidos de analógico para digital
com auxílio de um conversor e gravados em um computador compatível. As
fatias foram pré-condicionadas por ciclos lentos de tensão de 1 a 2 g por três
vezes e, após o terceiro ciclo, foram fixadas em 1g e mantidas no banho
orgânico contendo solução de Krebs aerada com 95% de O
2
e 5% de CO
2
por 50 minutos para permitir um stress relaxation. Durante este tempo, a
solução de Krebs foi trocada a cada 15 minutos. A frequência de oscilação
foi 0,25 Hz e a amplitude foi de 2,5% de L
r
. Após estes 50 minutos, a tensão
final de repouso era aproximadamente 0,8g (Figuras 1 e 2).
Após o período de stress relaxation, medidas basais de resistência
(R) e elastância (E) foram obtidas por 5 minutos e após a adição de
acetilcolina (ACh) 10
-3
M (Sigma Chemical, St. Louis, MO) por mais 15
minutos. A concentração final de ACh no banho orgânico foi de 0,17mg/ml.
A resistência e a elastância foram estimadas pela equação (Lauzon,
1991):
(1) T = EΔl + R (Δl/Δt) + K
Onde T = tensão, l = comprimento, Δl/Δt = é a alteração de
comprimento por unidade de tempo, e K é uma constante que reflete a
tensão de repouso. Os resultados foram padronizados para o tamanho de
cada fatia. A área de secção transversal (A
0
) da fatia de tecido pulmonar foi
obtida pela fórmula:
(2) A
0
(cm
2
) = W
0
/ (ρ x L
r
)
Onde ρ é a densidade de massa do tecido adotada como 1,06g cm
-3
,
W
0
é o peso úmido em gramas e L
r
é a tensão em repouso em cm. Os
valores de R e E foram multiplicados por L
r
/A
0
. Após a oscilação mecânica,
as fatias foram fixadas em formalina 10% por 48 horas e emblocadas em
parafina para análise histológica.
FIGURA 1. Esquema da mecânica do tecido pulmonar periférico. As
fatias de tecido pulmonar periférico foram conectadas a um transdutor de
força e a um braço oscilatório e foram suspensas em um banho orgânico
(solução de Krebs).
FIGURA 2. Fotografia do equipamento de análise da mecânica do tecido
pulmonar periférico.
3.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA
Cortes de 5 µm de espessura das fatias de parênquima pulmonar
foram coradas pelo método de histoquímica com hematoxilina e eosina para
análise histológica de rotina, com coloração de Luna para identificação de
eosinófilos (Luna, 1986; Watanabe, 2004) e com Picro-Sirius e Resorcina-
Fucsina para avaliação do conteúdo de fibras colágenas e de fibras
elásticas, respectivamente (Dolhnikoff et al., 1999; Lanças et al., 2006). As
fatias pulmonares foram também submetidas à reação imuno-histoquímica
para quantificação de células positivas para α-actina de músculo liso (AML),
neutrófilos, macrófagos, mastócitos e linfócitos CD8+ e CD4+. A Tabela 1
apresenta os respectivos anticorpos utilizados em cada coloração.
Para a análise imuno-histoquímica, os blocos foram desparafinizados
e uma solução de peróxido de hidrogênio foi aplicada por 35 minutos para
inibir a atividade de peroxidase endógena. A recuperação do antígeno foi
realizada com solução citrato por 45 minutos, exceto no caso da coloração
para neutrófilos. Os cortes foram incubados com o anticorpo primário
overnight a 4
o
C. O kit LSAB® Plus-HRP (K-0690 DAKO Corporation,
Carpinteria, USA) foi usado como anticorpo secundário e, como cromógeno,
foi usado o 3,3 Diaminobenzidina (DAB) (Sigma Chemical Co, St Louis, MO,
USA). Os cortes foram contracorados com hematoxilina de Harris.
Com o método de morfometria convencional (Weibel e Cruz-Orive,
1997) foi avaliada a densidade de células inflamatórias no parênquima e
proporção de volume de células positivas para α-AML das fatias pulmonares.
Utilizando-se um retículo de 100 pontos (com área de 43,312 µm
2
no
aumento de 400x) acoplado à ocular do microscópio foi quantificado o
número de pontos que incidiam no tecido alveolar e o número de células
inflamatórias em cada campo (Figura 3). A densidade de células
inflamatórias foi determinada pelo número de células positivas dividido pela
área de tecido. A contagem foi realizada em 15 campos em um aumento de
400x e os resultados foram expressos por células/mm
2
. A proporção de
volume de células α-AML+ foi determinada pela divisão entre o número de
pontos que incidiam nas células α-AML+ e o número total de pontos que
incidiam no tecido das fatias pulmonares. As medidas foram realizadas em
10 campos em um aumento de 400x.
A proporção de vias aéreas, vasos sanguíneos e parênquima nas
fatias pulmonares também foi avaliada por morfometria e determinada pelo
número de pontos que incidiam respectivamente nas paredes das vias
aéreas, nas paredes dos vasos sanguíneos e nos septos alveolares
divididos pelo número total de pontos incidiam no tecido das fatias
pulmonares. As medidas foram realizadas em um aumento de 200x em todo
o comprimento da fatia.
O conteúdo de fibras colágenas e de fibras elásticas das fatias de
tecido pulmonar periférico foi obtido por análise de imagem utilizando-se o
software Image-Pro® Plus 4.1 for Windows® (Media Cybernetics–Silver
Spring, MD, USA) em um computador compatível conectado a uma câmera
digital acoplada a um microscópio ótico (Leica DMR, Leica Microsystems
Wetzlar GmbH, Germany). A área de fibras colágenas e elásticas do tecido
alveolar foi medida em toda extensão de cada fatia. A proporção de volume
de fibras colágenas e elásticas no tecido alveolar foi obtida pela divisão
entre a área positiva e a área total de parênquima (Figura 4).
TABELA 2. Anticorpos e métodos utilizados nas colorações de imuno-
histoquímica.
Anticorpos Pré-tratamento Espécie Clone Diluição Origem
α-smooth muscle actin Citrato Mouse 1A4 1:500 Dako, DNK
Neutrophil elastase
-
Mouse NP57 1:300 Dako, DNK
Mast Cell Citrato Mouse AA1 1:1200 Dako, DNK
Macrophage Citrato Mouse KP1 1:3200 Dako, DNK
CD4 Citrato Mouse OPD4 1:400 Dako, DNK
CD8 Citrato Mouse C8/144B 1:50 Dako, DNK
FIGURA 3. Demonstração do método de morfometria convencional. A:
fotomicrografia de uma fatia de tecido pulmonar periférico com coloração
imuno-histoquímica para linfócitos CD8+ (aumento de 400x) e B: retículo
utilizado sobre o mesmo campo da figura A. A densidade celular foi
determinada pelo número de células dividido pela área de tecido.
A BA B
FIGURA 4. Demonstração do método de análise de imagem. A:
fotomicrografia (aumento de 200x) de uma fatia de tecido pulmonar periférico
corado com Picro-Sirius (análise de fibras colágenas); B: marcação da luz
alveolar (azul) que subtraída da área total da figura resulta na área total de
tecido e C: marcação da área de fibras colágenas (azul). Determina-se a
densidade de fibras colágenas neste campo de análise dividindo-se a área
corada da figura 4C pela área total de tecido.
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa SPSS
15.0® (SPSS, Chicago, Illinois, USA). Após aplicação do teste de
Kolmogorov-Smirnov, as variáveis foram submetidas ao teste T de Student
ou ao teste de Mann-Whitney para comparação dos diferentes parâmetros
entre os dois grupos. As correlações entre os parâmetros mecânicos,
morfológicos e funcionais foram realizadas pelos testes de Pearson ou
Spearman. Os resultados foram expressos por média±DP. O nível de
significância foi estabelecido como p<0.05 para todas as análises (Zar,
1984).
Resultados
4. RESULTADOS
4.1 DADOS DEMOGRÁFICOS E DE FUNÇÃO PULMONAR
A tabela 3 mostra os dados demográficos e de prova de função
pulmonar dos pacientes dos dois grupos. A média de idade foi
significativamente maior no grupo DPOC quando comparado ao grupo
controle (p=0,039). Houve uma diferença de gênero entre os grupos com
uma predominância de pacientes do sexo masculino no grupo DPOC e de
pacientes do sexo feminino no grupo controle. Todos os pacientes do grupo
controle eram não fumantes e no grupo DPOC 5 pacientes eram tabagistas
e 5 ex-tabagistas com uma média de consumo de cigarro de 70,8±10,3
anos/maço.
As médias dos valores de VEF
1
, %VEF
1
e VEF
1
/CVF foram,
respectivamente, 34,3% (p=0,024), 43,4% (p=0,001) e 35,6% (p<0.001)
menores no grupo DPOC quando comparados ao grupo controle. Dentre os
pacientes do grupo DPOC, 2 foram classificados como DPOC leve e 5 como
DPOC moderado de acordo com a classificação proposta pela Global
Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) (Rabe et al., 2007).
TABELA 3. Dados demográficos e de prova de função pulmonar dos grupos
controle e DPOC.
Controle DPOC
Idade (anos)
54±6
67±4*
Gênero 2M:8F 8M:2F
Tabagismo (anos/maço) -- 70,8±10,3
Fumantes/Ex-fumantes -- 5/5
VEF
1
(L)
2,33±0,59
1,75±0,44*
VEF
1
, (%pred.)
100,11±16,08
69,82±15,43*
VEF
1
/CVF
0,80±0,05
0,59±0,07*
Valores expressos em média±DP.
M: masculino; F: feminino;*p≤0,04 comparado ao grupo controle.
VEF
1
: volume expiratório forçado no primeiro segundo;
%pred: porcentagem do VEF
1
predito; CVF: capacidade vital forçada.
4.2 MECÂNICA DO TECIDO PULMONAR PERIFÉRICO
As figuras 5 e 6 mostram, respectivamente, os valores de resistência
e elastância (basais e após adição de acetilcolina) nos dois grupos
estudados. Foi observado um aumento significativo nos valores de R e E
(p≤0,003 e p≤0,023, respectivamente) após adição de ACh quando
comparados aos respectivos valores basais em ambos os grupos. Além
disso, os valores de R pós-ACh foram significativamente maiores no grupo
DPOC quando comparado ao grupo controle (p=0,032). A intensidade de
resposta foi calculada como a porcentagem de aumento de R e E após
desafio com acetilcolina em relação aos valores basais (Figuras 7 e 8). A
porcentagem de aumento de R foi significativamente maior no grupo DPOC
quando comparado ao grupo controle (p=0,024). Porém, nenhuma diferença
significativa foi observada na porcentagem de aumento de E entre os dois
grupos.
FIGURA 5. Gráfico dos valores de resistência basais e pós-ACh nos
grupos controle e DPOC (* p≤0,003 comparado aos valores basais; #
p=0,032 comparado ao grupo controle).
FIGURA 6. Gráfico dos valores de elastância basais e pós-ACh nos
grupos controle e DPOC (* p≤0,023 comparado aos valores basais).
FIGURA 7. Gráfico das porcentagens de aumento de resistência
(%Resistência) dos grupos controle e DPOC (*p=0,024 quando comparado
ao grupo controle).
FIGURA 8. Gráfico das porcentagens de aumento de elastância
(%Elastância) dos grupos controle e DPOC.
4.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA
As densidades de células inflamatórias no tecido alveolar dos
pacientes dos dois grupos são apresentadas na Tabela 4. Foi observado um
aumento significativo na densidade macrófagos e linfócitos CD8+ no grupo
DPOC quando comparado ao grupo controle (p=0,04 e p=0,017,
respectivamente). Não houve diferença significativa nas densidades de
neutrófilos, eosinófilos, mastócitos e linfócitos CD4+.
TABELA 4. Densidade alveolar de células inflamatórias das fatias de tecido
pulmonar.
Controle DPOC
Macrófagos
278,79±151,29
528,65±322,91*
Neutrófilos 124,74±127,51 303,47±262,42
Eosinófilos 25,44±19,36 62,26±69,03
Mastócitos 277,46±131,06 302,96±92,16
Linfócitos CD4+ 68,15±68,59 65,84±37,32
Linfócitos CD8+
87,20±48,83
157,95±60,35*
Valores expressos em média±DP.
*p≤0,04 comparado ao grupo controle.
A análise dos componentes estruturais na totalidade das fatias de
parênquima pulmonar mostrou uma média de 3,6±5,5% de vias aéreas,
16,7±8,3% de vasos sanguíneos e 79,6±9,7% de tecido alveolar. Em seis
fatias do grupo DPOC e nove fatias do grupo controle, nenhuma via aérea foi
identificada.
A tabela 5 mostra os valores de proporção de volume de células
positivas para α-actina de músculo liso e de fibras colágenas e elásticas das
fatias de tecido pulmonar. O grupo DPOC apresentou uma diminuição
significativa no conteúdo de fibras elásticas quando comparado ao grupo
controle (p=0,004). Não houve diferença no conteúdo de células α-actina+ e
de fibras colágenas entre os dois grupos estudados.
TABELA 5. Proporção de volume de células positivas para α-actina de
músculo liso e de fibras colágenas e elásticas das fatias de tecido pulmonar.
Controle DPOC
Células α-actina+ 0,15±0.04 0,16±0,04
Fibras colágenas 0,23±0,10 0,18±0,12
Fibras elásticas 0,18±0,04
0,12±0,04*
Valores expressos em média±DP.
*p=0,004 em relação ao grupo controle.
4.4 CORRELAÇÕES
A tabela 6 mostra as correlações entre os valores de mecânica do
tecido pulmonar periférico e os parâmetros morfológicos de densidade
alveolar de células inflamatórias e de proporção de volume de células
positivas para α-actina de músculo liso, fibras colágenas e fibras elásticas
das fatias pulmonares dos grupos controle e DPOC. Foram observadas
correlações significativas positivas entre a densidade alveolar de eosinófilos
e os valores de RACh, EACh, %R e %E; entre a densidade alveolar de
macrófagos e os valores de RACh e entre a densidade alveolar de linfócitos
CD8+ e %R. Foram observadas também correlações significativas negativas
entre a proporção de volume de fibras elásticas e os valores de Rbasal,
Ebasal, RACh e EACh.
TABELA 6. Correlações entre os valores de mecânica e os parâmetros
morfológicos dos grupos controle e DPOC (valores de r)*.
Rbasal RACh %R Ebasal EACh %E
Neutrófilos NS NS NS NS NS NS
Eosinófilos NS
0,39
(0,043)
0,58
(0,001)
NS
0,39
(0,039)
0,42
(0,026)
Macrófagos NS
0,58
(0,001)
NS NS NS NS
Mastócitos NS NS NS NS NS NS
Linfócitos CD4+ NS NS NS NS NS NS
Linfócitos CD8+ NS NS
0,44
(0,031)
NS NS NS
Células α-actina+ NS NS NS NS NS NS
Fibras colágenas NS NS NS NS NS NS
Fibras elásticas
-0,49
(0,004)
-0,41
(0,017)
NS
-0,39
(0,025)
-0,42
(0,015)
NS
Rbasal=resistência basal; RACh=resistência pós-ACh; %R=porcentagem de aumento de resistência pós-ACh;
Ebasal=elastância basal; EACh=elastância pós-ACh; %E= porcentagem de aumento de elastância pós-ACh
Os dados são apresentados como: valores de r (p).
NS=não significantes.
Em relação às correlações entre os parâmetros morfológicos entre si,
houve uma correlação negativa significativa entre o conteúdo de fibras
elásticas das fatias pulmonares e a densidade alveolar de neutrófilos,
macrófagos e linfócitos CD8+ (Figura 9).
FIGURA 9. Gráficos das correlações entre a proporção de volume de
fibras elásticas e a densidade alveolar de neutrófilos, macrófagos e linfócitos
CD8+ dos grupos controle e DPOC.
As correlações entre os dados da prova de função pulmonar e os
parâmetros: idade, valores de mecânica do tecido pulmonar periférico e
parâmetros morfológicos dos grupos controle e DPOC mostraram uma
correlação positiva significativa entre a idade e os valores de VEF
1
e da
relação VEF
1
/CVF (r= -0,620; p=0,003 e r= -0,450; p=0,045,
respectivamente). Foi observada, também, uma correlação negativa
significativa entre a %R e os valores da relação VEF
1
/CVF (r= -0,450;
p=0,046).
Discussão
5. DISCUSSÃO
O presente estudo demonstrou que a resposta contrátil do tecido
pulmonar periférico está aumentada em pacientes com doença pulmonar
obstrutiva crônica e que esta resposta está associada tanto à densidade de
eosinófilos e de linfócitos CD8+ no tecido alveolar quanto ao grau de
obstrução determinado pela prova de função pulmonar.
Tem sido proposto que a hiper-responsividade de vias aéreas em
pacientes com DPOC é amplamente dependente da limitação basal ao fluxo
aéreo e pode representar um epifenômeno da redução do calibre das vias
aéreas (Grootendorst e Rabe, 2004). Entretanto, o fato de pacientes com
DPOC leve ou precoce (que possuem, portanto, uma obstrução leve ao fluxo
aéreo) apresentarem hiper-responsividade brônquica sugere que esta
resposta exagerada pode ser uma característica fisiopatológica da DPOC e
não uma conseqüência da obstrução das vias aéreas (Tashkin, 1996;
Postma e Kerstjens, 1998; Grootendorst e Rabe, 2004). Poucos estudos em
humanos têm investigado esta questão com uma análise de pequenas vias
aéreas isoladas in vitro. De Jongste e colaboradores (1987) demonstraram
que pacientes com DPOC apresentam uma resposta bronquiolar aumentada
em resposta à histamina quando comparados a pacientes sem a doença.
Opazo Saez e colaboradores (2000) também demonstraram que as
pequenas vias aéreas de pacientes asmáticos ou com DPOC apresentam
uma resposta à acetilcolina aumentada quando comparados a pacientes
controles não obstruídos. No presente estudo, a oscilação mecânica de
fatias de tecido pulmonar humano permitiu que o comportamento do
parênquima pulmonar periférico de pacientes com DPOC fosse avaliado pela
primeira vez, observando-se uma maior responsividade do tecido desses
indivíduos quando comparado a controles. Os estudos experimentais citados
acima, analisados em conjunto, reforçam a hipótese de que a hiper-
responsividade seja uma característica fisiopatológica da DPOC.
Uma vez que as alterações do parênquima pulmonar são importantes
determinantes da obstrução de vias aéreas na DPOC, torna-se relevante
avaliar se uma resposta contrátil aumentada também ocorre neste nível.
Além disso, o estudo funcional do pulmão distal nas doenças obstrutivas
pode contribuir para uma melhor abordagem terapêutica dos pacientes. Um
dos obstáculos para uma possível resolução da lesão nas pequenas vias
aéreas está no acesso de novas drogas a este compartimento relativamente
inacessível. As terapias atuais são administradas por via inalatória e estudos
anteriores têm demonstrado que as partículas normalmente utilizadas, em
torno de 3 a 5 µM, são excelentes para alcançar as vias aéreas de
condução, mas que para atingir as pequenas vias aéreas é necessário a
utilização de partículas menores, em torno de 1 µM (Tashkin, 1999; Dolovich
et al., 2005).
A fatia de tecido pulmonar periférico é composta principalmente por
parênquima pulmonar com uma pequena porção de pequenas vias aéreas e
vasos e tem sido usada como um modelo para avaliação do comportamento
mecânico do parênquima pulmonar (Ludwig et al., 1994). Foi demonstrado
anteriormente que fatias de tecido pulmonar humano podem responder a um
desafio com ACh mesmo na ausência de pequenas vias aéreas (Dolhnikoff
et al., 1998). No presente estudo observamos que 6 de 16 fatias pulmonares
do grupo DPOC não apresentavam vias aéreas na análise morfológica. De
maneira interessante, as fatias sem vias aéreas mostraram uma resposta
semelhante àquelas que continham pequenas vias aéreas sugerindo, desta
forma, que, tanto as pequenas vias aéreas quanto o tecido alveolar
contribuíram para a resposta contrátil aumentada nos pacientes com DPOC.
Em pulmões normais, o efeito de ancoramento do parênquima
pulmonar é crucial para a manutenção da patência das vias aéreas e tem
sido sugerido que a contratilidade do parênquima poderia representar um
fator protetor ao estreitamento das vias aéreas (Hoppin, 1995). Entretanto,
se os acoplamentos alveolares estão rompidos, como no enfisema
centrilobular, por exemplo, a ligação entre a via aérea e o parênquima
adjacente se altera favorecendo o estreitamento da luz bronquiolar. Nesta
situação, a contratilidade alveolar poderia aumentar o efeito de ruptura dos
septos e a perda da interdependência via aérea-parênquima.
Uma limitação deste estudo foi a ausência de testes de
broncoprovocação in vivo e, portanto, a impossibilidade de analisar uma
relação entre as respostas a agonistas in vivo e in vitro. Entretanto,
observou-se uma correlação fraca, mas significativa, entre a intensidade de
resposta tecidual à ACh (%R) e o grau de obstrução determinado pela prova
de função pulmonar (VEF
1
/CVF), o que reforça a idéia de que a hiper-
responsividade na DPOC está associada à perda de função pulmonar e à
gravidade da doença (Postma e Kerstjens,1998; Tashkin et al.,1992).
Embora neste estudo os pacientes do grupo controle sejam
significativamente mais jovem que os do grupo DPOC, é improvável que a
idade tenha influenciado os resultados, pois, estudos anteriores
demonstraram que uma idade maior não representa um risco aumentado
para hiper-responsividade e que, em qualquer idade, a atopia e o calibre das
vias aéreas são considerados os maiores determinantes da hiper-reatividade
na população geral (Britton et al., 1994).
Houve uma diferença na proporção de gênero entre os dois grupos
com predominância de pacientes do sexo masculino no grupo DPOC e de
pacientes do sexo feminino no grupo controle. Está bem estabelecido na
literatura o fato de que mulheres apresentam uma maior prevalência de HR
de vias aéreas quando comparadas aos homens (Kanner et al., 1994;
Manfreda et al., 2004; Langdeau et al., 2009). Portanto, é possível que os
resultados deste estudo estejam subestimados.
Os mecanismos envolvidos na resposta alveolar a um agonista não
são totalmente compreendidos e podem envolver a contração de células
musculares lisas dos ductos alveolares ou miofibroblastos alveolares. Esta
resposta contrátil também pode ser dependente do grau e do tipo de
inflamação alveolar e da composição da matriz extracelular (Lanças et al.,
2006). Não foram observadas diferenças no conteúdo de actina entre o
grupo DPOC e o grupo controle e não houve correlação entre o conteúdo de
actina e a resposta tecidual. Estes resultados sugerem que a responsividade
aumentada no grupo DPOC pode estar associada a uma alteração na
função contrátil do tecido e não a uma alteração na massa muscular.
Assim como em outros estudos anteriores (Jeffery, 2004; Di Stefano
et al., 2004; Saetta et al., 1999), observamos um aumento na densidade
alveolar de linfócitos CD8+ e macrófagos nos pacientes com DPOC. Poucos
estudos investigaram a relação entre a inflamação e a hiper-responsividade
na DPOC. Rutgers e colaboradores (2000) demonstraram que a hiper-
responsividade à AMP na DPOC está associada a um aumento na
densidade de células CD8+ nas paredes das vias aéreas e a um número
maior de eosinófilos no escarro. No presente estudo também foi observada
uma associação entre a magnitude da resposta tecidual e a densidade
alveolar de células CD8+ e, embora a densidade de eosinófilos no
parênquima não tenha sido significativamente diferente entre os dois grupos,
foi observada uma correlação positiva significativa entre a quantidade de
eosinófilos e a %R. Um possível mecanismo envolvido na resposta tecidual
contrátil poderia ser a liberação de mediadores broncoconstritores pelos
eosinófilos como os leucotrienos e o PAF (platelet activating factor).
Acredita-se que esse mesmo mecanismo ocorra in vivo e poderia explicar a
associação entre a inflamação eosinofílica de vias aéreas e a hiper-
responsividade nas exacerbações da DPOC (White et al., 2003). Outro
mecanismo possível poderia ser a liberação de ACh por via extra-neuronal
mediada pela inflamação e a ativação de receptores muscarínicos nos
linfócitos T e/ou no músculo liso das vias aéreas periféricas (Barnes, 2004).
A análise dos receptores muscarínicos no tecido pulmonar periférico de
pacientes com DPOC certamente contribuiria para a compreensão dos
mecanismos envolvidos na resposta contrátil aumentada do pulmão distal
destes pacientes.
Ao contrário de alguns estudos anteriores que mostraram um aumento
bioquímico e histológico de colágeno alveolar no enfisema centrilobular, este
estudo não apontou diferenças significativas no conteúdo de colágeno entre
os dois grupos (Cardoso et al., 1993; Vlahovic et al., 1999). O contraste
entre estes resultados pode estar relacionado a diferenças na caracterização
dos pacientes e nas amostras de tecido, uma vez que não foram
selecionados pulmões enfisematosos pela análise morfométrica. Embora
todos os pacientes do grupo DPOC sejam obstruídos, não se sabe quantos
apresentavam enfisema. Os estudos que investigaram o conteúdo elástico
do tecido alveolar na DPOC mostraram tanto redução (Black et al., 2008)
quanto aumento (Vlahovic et al., 1999) de fibras elásticas. Embora não
tenham sido observadas diferenças significativas nos valores de elastância
entre os dois grupos, houve uma diminuição significativa no conteúdo de
fibras elásticas nas fatias de tecido pulmonar do grupo DPOC quando
comparadas às do grupo controle. Além disso, houve uma correlação
negativa significativa entre o conteúdo de fibras elásticas e a densidade de
neutrófilos no parênquima pulmonar, indicando o papel destas células na
lesão tecidual neste grupo de pacientes.
Portanto, os resultados deste estudo mostram que a resposta
colinérgica de fatias de parênquima pulmonar periférico está aumentada em
pacientes com DPOC e está associada à infiltração de eosinófilos e linfócitos
CD8+ no tecido alveolar, reforçando a idéia de que a hiper-responsividade é
uma característica fisiopatológica da DPOC e que não está restrita às vias
aéreas, coexistindo em um nível pulmonar mais distal. O significado
fisiopatológico deste comportamento do tecido pulmonar no mecanismo de
hiper-responsividade in vivo deve ser ainda investigado.
Conclusões
6. CONCLUSÕES
• Pacientes com Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica apresentam
maior resposta contrátil do tecido pulmonar periférico em relação a
indivíduos controles.
• A responsividade do tecido pulmonar periférico de pacientes com
DPOC está associada tanto à inflamação tecidual eosinofílica e de
linfócitos CD8+, quanto ao grau de obstrução ao fluxo aéreo
determinado pela prova de função pulmonar.
Anexos
7. ANEXOS
ANEXO A. Aprovação da Comissão de Ética para Análise de Projetos de
Pesquisa (CAPPesq – HCFMUSP).
ANEXO B. Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital A.C.
Camargo.
ANEXO C. Tabela de dados dos pacientes do estudo.
Casos Classificação Iniciais Sexo Idade Hospital Tabagismo
SH - 26 Controle MSE F 65
A.C.
Camargo
Não tabagista
SH - 30 Controle JJ F 61
A.C.
Camargo
Não tabagista
SH - 31 Controle AMBV F 73
A.C.
Camargo
Não tabagista
SH - 40 Controle FTK F 53
A.C.
Camargo
Não tabagista
SH - 49 Controle TMR F 62 HC Não tabagista
SH - 57 Controle BSR F 52
A.C.
Camargo
Não tabagista
SH - 59 Controle JCS F 58
A.C.
Camargo
Não tabagista
SH - 63 Controle FADP M 19
A.C.
Camargo
Não tabagista
SH - 71 Controle JLO M 33
A.C.
Camargo
Não tabagista
SH - 74 Controle MFB F 60
A.C.
Camargo
Não tabagista
SH - 46 DPOC CROS M 58 HC
Ex-tabagista (67 a/m).
Parou há 1 mês.*
SH - 47 DPOC HT M 71 HC
Ex-tabagista (36 a/m).
Parou há 7 meses.*
SH - 48 DPOC EG F 41
A.C.
Camargo
Tabagista (40 a/m)
SH - 51 DPOC HF F 64 HC Tabagista (50 a/m)
SH - 61 DPOC RCL M 79
A.C.
Camargo
Tabagista (60 a/m)
SH - 77 DPOC PSV M 72 HC Tabagista (90 a/m)
SH - 88 DPOC GAS M 65 HC Tabagista (75 a/m)
SH - 50 DPOC ATS M 75 HC
Ex-tabagista (60 a/m).
Parou há 6 meses.*
SH - 73 DPOC NBV M 75
A.C.
Camargo
Ex-tabagista (150
a/m).
Parou há 5 anos.*
SH - 50 DPOC JAF M 74 HC
Ex-tabagista (80 a/m).
Parou há 10 anos.*
* Cessação do tabagismo referente à data em que o tecido pulmonar foi coletado.
ANEXO D. Tabelas de dados utilizados na análise estatística do estudo.
Caso Classificação
Resistência
basal (N.s/m²)
Resistência
Pós-Acetilcolina
(N.s/m²)
Aumento
resistência (%)
Elastância
Basal (N/m²)
Elastância
Pós-Acetilcolina
(N/m²)
Aumento
elastância (%)
SH - 26 Controle 1348,63 1360,28 0,86 23320,75 23324,91 0,02
SH – 30 Controle 4081,11 4615,33 13,09 83321,73 86559,87 3,89
SH - 31 Controle 2760,63 3006,68 8,91 54144,51 55716,10 2,90
SH - 40 Controle 2975,14 3434,58 15,44 63793,79 82105,91 28,71
SH 57- A Controle 3742,49 4404,19 17,68 58483,49 64972,22 11,09
SH 57 - B Controle 3718,98 4657,41 25,23 63450,60 73990,94 16,61
SH 59 - A Controle 1336,78 1385,68 3,66 27286,43 28027,16 2,71
SH 59 - B Controle 3022,75 3062,98 1,33 59750,45 59889,79 0,23
SH 63 - A Controle 3684,52 3760,97 2,07 67386,74 69124,31 2,58
SH 63 - B Controle 2661,07 2767,46 4,00 52453,25 54333,03 3,58
SH 71 - A Controle 5734,21 5894,35 2,79 98769,60 103803,70 5,10
SH 71 - B Controle 1915,90 2229,25 16,36 39226,77 43243,00 10,24
SH 74 - A Controle 5977,45 6207,21 3,84 103859,10 104597,20 0,71
SH 74 - B Controle 4042,51 4479,73 10,82 59878,15 64476,62 7,68
SH 49 - A Controle 2864,96 3323,90 16,02 43466,17 49701,47 14,35
SH 49 - B Controle 3753,12 4506,70 20,08 74418,90 79892,34 7,35
Caso Classificação
Resistência
basal (N.s/m²)
Resistência
Pós-Acetilcolina
(N.s/m²)
Aumento
resistência (%)
Elastância
Basal (N/m²)
Elastância
Pós-Acetilcolina
(N/m²)
Aumento
elastância (%)
SH - 46 DPOC 10808,49 13688,22 26,64 149575,60 152898,10 2,22
SH - 47 DPOC 3010,08 3300,53 9,65 58267,38 61519,75 5,58
SH - 48 DPOC 2416,20 3790,91 56,90 47359,00 66267,90 39,93
SH 61 - A DPOC 7704,15 8256,23 7,17 92710,70 97004,02 4,63
SH 61 - B DPOC 4711,95 5231,62 11,03 55017,97 63432,14 15,29
SH 77 - A DPOC 5275,84 5656,91 7,22 76570,98 78502,41 2,52
SH 77 - B DPOC 8474,67 10553,09 24,53 114154,60 133082,70 16,58
SH 88 - A DPOC 4419,68 4731,78 7,06 81403,48 85454,86 4,98
SH 88 - B DPOC 5230,13 5569,00 6,48 90797,99 95591,41 5,28
SH 53 - B DPOC 3109,60 3665,30 17,87 64683,42 65931,16 1,93
SH 50 - A DPOC 7358,96 9846,96 33,81 105068,90 112513,90 7,09
SH 50 - B DPOC 5861,11 7720,79 31,73 71097,53 84535,20 18,90
SH 73 - A DPOC 2620,78 2989,50 14,07 46874,32 48937,28 4,40
SH 73 - B DPOC 2500,96 3443,95 37,70 39134,90 44007,81 12,45
SH 51 - A DPOC 4480,65 7058,05 57,52 74373,03 118705,20 59,61
SH 51 - B DPOC 4590,80 5466,42 19,07 74961,99 81666,44 8,94
Caso Classificação
Neutrófilos
(células/mm²)
Eosinófilos
(células/mm²)
Macrófagos
(células/mm²)
Mastócitos
(células/mm²)
Linfócitos CD4+
(células/mm²)
Linfócitos CD8+
(células/mm²)
SH - 26 Controle 188,48 10,13 224,47 452,24 195,51 74,14
SH – 30 Controle 86,75 14,94 98,25 468,58 61,24 108,36
SH - 31 Controle 8,91 12,48 86,58 208,84 26,14 55,50
SH - 40 Controle 16,91 49,55 118,40 234,11 16,98 49,92
SH 57- A Controle 101,75 10,17 597,11 285,71 199,45 279,86
SH 57 - B Controle 159,65 17,62 372,59 264,42 90,66 111,58
SH 59 - A Controle 40,65 16,20 327,08 - 6,03 60,08
SH 59 - B Controle 21,65 9,16 342,05 401,88 4,46 90,54
SH 63 - A Controle 187,47 37,44 245,88 93,37 - 80,01
SH 63 - B Controle 236,19 46,07 213,27 139,15 - 39,13
SH 71 - A Controle 426,16 16,37 399,34 184,08 25,10 59,20
SH 71 - B Controle 405,06 - 561,88 128,78 29,10 189,03
SH 74 - A Controle 5,98 12,25 710,89 238,37 21,94 30,99
SH 74 - B Controle - 22,78 110,29 129,11 9,93 53,52
SH 49 - A Controle 171,02 44,40 320,04 - 190,86 -
SH 49 - B Controle 131,18 85,87 - - 49,52 -
Caso Classificação
Neutrófilos
(células/mm²)
Eosinófilos
(células/mm²)
Macrófagos
(células/mm²)
Mastócitos
(células/mm²)
Linfócitos CD4+
(células/mm²)
Linfócitos CD8+
(células/mm²)
SH - 46 DPOC 475,64 86,80 274,86 281,28 55,92 162,80
SH - 47 DPOC 324,68 9,82 320,67 406,79 115,89 83,74
SH - 48 DPOC 59,78 29,60 439,37 238,02 50,51 -
SH 61 - A DPOC - - 598,85 - - -
SH 61 - B DPOC - - 559,95 402,18 31,63 83,79
SH 77 - A DPOC 749,73 0 952,39 323,00 46,49 212,31
SH 77 - B DPOC 454,32 - 506,04 280,42 14,85 153,92
SH 88 - A DPOC 112,79 15,44 558,45 259,04 - -
SH 88 - B DPOC 95,59 18,40 435,63 262,79 - -
SH 53 - B DPOC 784,13 61,45 168,53 140,21 64,53 261,99
SH 50 - A DPOC 189,37 258,93 811,21 423,42 - 206,58
SH 50 - B DPOC 211,50 149,49 769,61 398,87 22,64 -
SH 73 - A DPOC 85,51 - 238,84 294,18 74,48 145,26
SH 73 - B DPOC 95,46 15,55 259,74 441,62 156,71 147,37
SH 51 - A DPOC 125,06 68,66 1003,02 258,39 143,41 135,28
SH 51 - B DPOC 54,79 203,37 1472,42 180,62 67,12 -
Caso Classificação
Actina
(proporção)
Colágeno
(proporção)
Elástica
(proporção)
Vias aéreas
(%)
Vasos
(%)
Septos
alveolares (%)
SH - 26 Controle 0,13 0,37 0,20 0 14 86
SH – 30 Controle 0,21 0,45 0,20 0 4 96
SH - 31 Controle 0,13 0,19 0,19 0 4 96
SH - 40 Controle 0,16 0,12 0,22 0 13 87
SH 57- A Controle 0,16 0,27 0,16 0 11,56 88,44
SH 57 - B Controle 0,14 0,24 0,20 0,15 24,85 75
SH 59 - A Controle 0,15 0,12 0,13 11,11 6,55 82,34
SH 59 - B Controle 0,11 0,11 0,19 0 15,63 84,38
SH 63 - A Controle - 0,19 0,15 2,06 13,84 84,10
SH 63 - B Controle 0,09 0,14 0,18 0 12,62 87,38
SH 71 - A Controle 0,08 0,23 0,13 0 4,97 95,03
SH 71 - B Controle 0,21 0,11 0,09 17,04 17,04 65,92
SH 74 - A Controle 0,15 0,19 0,24 0,24 22,27 77,49
SH 74 - B Controle 0,15 0,21 0,22 0 38,15 61,85
SH 49 - A Controle 0,21 0,26 0,14 7,26 6,44 86,30
SH 49 - B Controle - 0,29 0,11 10,37 3,06 86,57
Caso Classificação
Actina
(proporção)
Colágeno
(proporção)
Elástica
(proporção)
Vias aéreas
(%)
Vasos
(%)
Septos
alveolares (%)
SH - 46 DPOC - 0,04 0,05 0 16,26 83,74
SH - 47 DPOC 0,18 0,11 0,10 0 15,40 84,60
SH - 48 DPOC 0,13 0,10 0,15 0 26,51 73,49
SH 61 - A DPOC - 0,45 0,09 0 10,39 89,61
SH 61 - B DPOC 0,18 0,42 0,12 1,25 19,95 78,80
SH 77 - A DPOC 0,11 0,11 0,03 6,33 16,20 77,47
SH 77 - B DPOC 0,19 0,13 0,04 0 19,14 80,86
SH 88 - A DPOC 0,20 0,36 0,14 0 15,27 84,73
SH 88 - B DPOC 0,27 0,20 0,11 3,40 31,53 65,07
SH 53 - B DPOC 0,11 0,12 0,13 1,24 18,82 79,95
SH 50 - A DPOC 0,21 0,33 0,14 3,29 23,47 73,24
SH 50 - B DPOC 0,12 0,30 0,13 11,09 17,31 71,60
SH 73 - A DPOC 0,11 0,18 0,18 5,38 24,53 70,09
SH 73 - B DPOC 0,24 0,23 0,19 3,53 29,11 67,36
SH 51 - A DPOC 0,13 0,15 0,09 16,60 19,57 63,83
SH 51 - B DPOC 0,18 0,11 0,13 16,63 19,60 63,76
Caso Classificação
Valores pré-broncodilatador
CVF (L)
CVF
(% do previsto)
VEF
1
(L)
VEF
1
(% do previsto)
VEF
1
/CVF
SH - 26 Controle 2,14 89 1,78 91 0,83
SH - 30 Controle 2,44 97 1,87 90 0,77
SH - 31 Controle 3,28 136 2,34 121 0,71
SH - 40 Controle 2,72 - 2,19 - 0,81
SH - 49 Controle 1,77 81 1,56 100 0,88
SH - 57 Controle 3,38 131 2,82 130 0,83
SH - 59 Controle 3,26 100 2,70 102 0,83
SH - 63 Controle 3,38 82 2,78 79 0,82
SH - 71 Controle 4,10 89 3,45 90 0,84
SH - 74 Controle 2,59 110 1,88 98 0,73
CVF: capacidade vital forçada; VEF
1
: volume expiratório forçado no primeiro segundo.
Caso Classificação
Valores pré-broncodilatador
Valores pós-broncodilatador
CVF (L) CVF (%)* VEF
1
(L) VEF
1
(%)* VEF
1
/CVF CVF (L) CVF (%)* VEF
1
(L) VEF
1
(%)* VEF
1
/CVF
SH - 46 DPOC 2,14 89 1,78 91 0,83 3,96 107 2,57 86 0,65
SH - 47 DPOC 2,44 97 1,87 90 0,77 3,11 100 1,82 74 0,59
SH - 48 DPOC 3,28 136 2,34 121 0,71 3,62 104 2,30 79 0,64
SH - 51 DPOC 2,72 - 2,19 - 0,81 3,04 87 1,74 64 0,57
SH - 61 DPOC 1,77 81 1,56 100 0,88 - - - - -
SH - 77 DPOC 3,38 131 2,82 130 0,83 3,92 94 2,28 69 0,58
SH - 88 DPOC 3,26 100 2,70 102 0,83 2,51 76 1,39 55 0,55
SH - 50 DPOC 3,38 82 2,78 79 0,82 2,47 99 1,56 81 0,63
SH - 73 DPOC 4,10 89 3,45 90 0,84 - - - - -
SH - 50 DPOC 2,59 110 1,88 98 0,73 2,77 - 1,73 - 0,62
CVF: capacidade vital forçada; VEF
1
: volume expiratório forçado no primeiro segundo.
* porcentagem do previsto.
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116.
Apêndice
Hyperresponsiveness of Peripheral Lung Parenchyma in Chronic
Obstructive Pulmonary Disease
Tatiana Lanças
1
, David Itiro Kasahara
1
, Jefferson Luiz Gross
2
, Ruy Camargo
Pires-Neto
1
, Daniel Deheinzelin
2
Thais Mauad
1
, Elnara Márcia Negri
1,2
, Marisa
Dolhnikoff
1
.
Experimental Air Pollution Laboratory (LIM05), Department of Pathology,
São Paulo University Medical School
1
and Department of Thoracic Surgery,
A.C. Camargo Hospital
2
, São Paulo, Brazil.
Address for correspondence and requests for reprints to:
Tatiana Lanças, R.T. Ph.D., Department of Pathology, São Paulo University Medical School, Av. Dr.
Arnaldo, 455 – Room 1155, 01246-903, São Paulo, SP, Brazil. Phone/Fax: 55 11 3061-8521/e-mail:
tatilancas@usp.br
Funded by: FAPESP, CNPq, LIMHC-FMUSP.
Running head: lung strips responsiveness in COPD
Subject code for classification of the article: 9.13 COPD: Pathogenesis
Word count: 2559
At a glance commentary
Scientific Knowledge on the Subject
Airway hyperresponsiveness (AHR) is present in a high proportion of COPD
patients and is associated with a worse prognosis. It is not clear yet if AHR is a
pathophysiological feature of COPD or an epiphenomenon of airway obstruction.
Whether or not the peripheral lung tissue is involved in the mechanism of AHR in
COPD also remains to be established.
What This Study Adds to the Field
The contractile responsiveness of lung parenchyma is increased in COPD patients
and is associated with tissue eosinophilic and CD8-lymphocytic inflammation. This
exacerbated response supports the hypothesis that hyperresponsiveness is a
pathophysiological characteristic of COPD and that it is not restricted to the
airways, but coexists at the distal lung level.
This article has an online data supplement, which is accessible from this issue’s
table of content online at: www.atsjournals.org.
ABSTRACT
Rationale: Up to 60% of COPD patients can present airway hyperresponsiveness.
However, it is not known whether the peripheral lung tissue also presents an
exaggerated response to agonists in COPD. Methods: In this study we
investigated the in vitro mechanical behavior as well as the structural and
inflammatory changes of peripheral lung tissue in 10 COPD patients and
compared them to 10 non-smoking controls. We measured the resistance (R) and
elastance (E) of the lung strips at baseline and after acetylcholine (ACh) challenge.
We further assessed the alveolar tissue density of neutrophils, eosinophils,
macrophages, mast cells and CD8+ and CD4+ cells, and the content of α-smooth
muscle actin-positive cells, elastic fibers and collagen fibers. Measurements and
main results: Values of R after ACh treatment (R
ACh
) and percent increase in tissue
resistance (%R) were significantly higher in the COPD group than in the controls
(p≤0.03). There was a significantly higher density of macrophages (p=0.04) and
CD8+ cells (p=0.017) and a lower elastic fiber content (p=0.003) in the COPD
group as compared to controls. We observed a significant positive correlation
between %R and both eosinophil density and CD8+ cell density (r=0.608, p=0.002;
and r=0.581, p=0.001, respectively), and also a significant negative correlation
between %R and FEV
1
/FVC (r=-0.451, p<0.05). Conclusions: The cholinergic
responsiveness of parenchymal lung strips is increased in COPD patients and
seems to be related both to alveolar tissue eosinophilic and CD8-lymphocytic
inflammation and also to the degree of airway obstruction at the pulmonary
function test.
Keywords: distal lung, lung strips, oscillatory mechanics, COPD.
INTRODUCTION
Airway hyperresponsiveness (AHR), defined as an exaggerated response
of the airway to nonspecific stimuli, is considered to be a characteristic feature of
asthma
1
. However, the prevalence of AHR is also high in patients with chronic
obstructive pulmonary disease (COPD), varying from 25% to 87%
2,3,4
.
In asthma, AHR is considered a hallmark of inflammation and is related to
the severity of the disease, but much less is known about its mechanisms in
patients with COPD
1
. AHR in COPD is associated with reduced lung function
5
,
worse prognosis
6,7
, and increased mortality
8
. Mechanisms proposed for AHR in
COPD include airway inflammation, airway remodeling, and structural changes in
alveolar parenchyma (emphysema)
9
. The presence of AHR in subjects with COPD
seems to greatly depend, therefore, on baseline airflow limitation. However,
studies that show that AHR in COPD is associated with the airway inflammatory
cell profile
10,11
, that individuals with AHR at baseline have an increased risk for
COPD
12
, and that patients with mild or early COPD present AHR
7
all suggest that
AHR may be a pathophysiological feature of COPD, rather than a surrogate
marker of airway obstruction
9,1
.
In order to address the potential role of airway smooth muscle (ASM) in
ARH in patients with COPD, in vitro studies have been conducted. De Jongste et
al.
13
reported that the response of bronchioles to histamine was significantly greater
in COPD patients than in subjects without COPD. It was also reported that isolated
bronchioles of obstructed patients generate a higher maximal isometric force in
response to acetylcholine (ACh) than do bronchioles from non-obstructed
patients
14
. This suggests that altered peripheral ASM function may be an important
determinant of abnormal airway function in patients with obstructive airway
diseases.
Experimental studies have shown that not only the airways but also the
alveolar parenchyma can respond to constrictor agonists
15
. We previously
demonstrated that human peripheral lung tissue is also able to present a
contractile response to ACh in vitro
16
. Whether this parenchymal contractility is
altered in COPD is not known. Although the degree of airflow limitation in COPD
patients is largely determined by the inflammatory and structural changes of small
airways and lung parenchyma, it is not known whether an increased contractility at
the distal level could be part of the mechanism of AHR and obstruction in these
patients.
In order to investigate the contribution of the contractile response of the
distal lung to the pathogenesis of AHR in COPD, we analyzed the dynamic
mechanical behavior of parenchymal strips of COPD patients before and during
ACh-induced constriction and compared the response with that of non-smoking
controls. We further investigated whether changes in in vitro parenchymal
mechanics correlated to structural and inflammatory parameters and to in vivo
pulmonary function.
METHODS
This study was approved by the review boards for human studies of São
Paulo University Medical School and A.C. Camargo Hospital. Written consent was
obtained from all the subjects involved in the study.
Subjects: We collected peripheral lung tissue from 20 patients undergoing
therapeutic lung resection for primary or metastatic lung tumors from 2003 to 2006.
Patients were divided into two groups: a control group (non-smokers without any
previous lung disease) and a COPD group (current or ex-smokers with a clinical
diagnosis of COPD and an FEV1/FVC<70% at the pulmonary function test). No
patient had a clinical history of asthma.
Tissue Mechanics: The oscillatory mechanics of the subpleural parenchymal
strips was evaluated as previously described
17
(additional detail is provided in an
online data supplement). One or two strips were obtained from each patient,
depending on tissue availability. Measurements of tissue resistance (R) and
elastance (E) were obtained at baseline (R
BAS
and E
BAS
, respectively) and after
adding ACh (10
-3
M, Sigma Chemical, St. Louis, MO) to the bath (R
ACh
and E
ACh
,
respectively). The oscillatory frequency was 0.25 Hz. After the mechanical
oscillation, the strips were processed for histological analysis. Sections of lung
strips were stained with H&E, Luna (eosinophils), Resorcin-Fuchsin (elastic fibers)
and Sirius Red (collagen fibers). Alpha-smooth muscle actin (α-SMA)-positive
cells, neutrophils, macrophages, mast cells and CD4+ and CD8+ lymphocytes
were identified by immunohistochemistry as previously described
18
(Table1).
Morphological Study: By conventional morphometry, we assessed the
tissue strip density of inflammatory cells and α-SMA+ cells and the volume
proportion of tissue constituents
18,17
. Using a 100-point grid with a known area, we
counted the number of points hitting the tissue strip and the number of
inflammatory cells in each field. Inflammatory cell density was determined as the
number of cells divided by the alveolar tissue area (cells/mm
2
). The volume
proportion of α-SMA+ cells was determined by the points hitting positive cells
divided by the total points hitting the tissue strip. All measurements were
performed in 10 to 15 fields per strip at a 400x magnification by an investigator
blinded to the study group. The volume proportions of the airways, blood vessels
and parenchyma in the lung strips were determined as the points hitting the airway
walls, blood vessel walls or alveolar septa, respectively, divided by the total
number of points. Measurements were performed at 200x magnification in the
entire strip length. The volume proportion of collagen and elastic fibers in the
tissue strip was obtained by image analysis using the software Image-Pro® Plus
4.1 for Windows® (Media Cybernetics–Silver Spring, MD, USA) on a compatible
microcomputer connected to a digital camera and coupled to a microscope (Leica
DMR, Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Germany). Volume proportion is
expressed as the area of collagen or elastic fibers within the tissue strip divided by
the total strip area.
Statistical analysis was performed using the SPSS 15.0® computer
package (SPSS, Chicago, Illinois, USA). After testing the distribution of data,
either a Student’s t-test or a Mann-Whitney U test was used to compare the
different parameters between the two groups. Correlations between morphological,
mechanical and functional parameters were performed using the Pearson or
Spearman rank test. Results are expressed as mean±SD. The level of significance
was set at p<0.05.
RESULTS
The demographic and functional data of the COPD patients and controls are
shown in Table 2. The mean age was higher in the COPD group (p=0.039). Mean
values of FEV
1,
% predicted FEV
1
and FEV
1
/FVC were, respectively, 34.3%
(p=0.024), 43.4% (p=0.001) and 35.6% (p<0.001) lower in the COPD group
compared to the controls. Among patients with COPD, two were classified as
having mild COPD and five as having moderate COPD according to the Global
Initiative for Chronic Obstructive Pulmonary Disease (GOLD)
19
. Three patients did
not have post-bronchodilator data and could not be classified.
Oscillatory Mechanics: Sixteen strips (mean length = 12.2 mm) were
analyzed in each group. Figure 1 shows values of R and E (basal and post-agonist
challenge) in the two groups. Both groups showed a significant increase in R and
E after the agonist challenge (p<0.02). Values of R
ACh
were significantly higher in
the COPD group compared to the controls (p=0.032). We also observed a higher
percent increase in tissue resistance (%R) in the COPD group than in the controls
(p=0.024) (Figure 2).
Morphological Analysis: Table 3 shows the inflammatory cell density of the
parenchymal strips in the two groups. We observed a significantly higher density of
macrophages and CD8+ cells in the COPD group compared to controls (p=0.04
and p=0.017, respectively). The volume proportion of α-SMA+ cells and
extracellular matrix fibers in lung strips is presented in Table 4. The COPD group
showed a significantly lower volume proportion of elastic fibers compared to
controls (p=0.004). The mean volume proportion of airways, blood vessels and
lung parenchyma in the lung strips was 3.6 ± 5.5%, 16.7 ± 8.3% and 79.6 ± 9.7%,
respectively. In six strips in the COPD group and in nine strips in the control group,
the small airways were not present at the histological analysis.
We observed significant positive correlations between the %R and the
strips’ eosinophil density and CD8+ cell density (r=0.58, p=0.001 for eosinophills;
r=0.61, p=0.002 for CD8+ cells) and a significant negative correlation between %R
and FEV
1
/FVC (r=-0.45, p<0.05). There was also a significant negative correlation
between the strips’ content of elastic fibers and the neutrophil density (r=-0.62,
p<0.001).
DISCUSSION
In the present study, we showed that the contractile response of peripheral
lung tissue is increased in COPD patients and is likely to be associated to the
tissue eosinophilic and CD8-lymphocytic inflammation and to the degree of
obstruction at the pulmonary function test.
It has been proposed that AHR in COPD patients is largely dependent on
the baseline airflow limitation and may represent an epiphenomenon of reduced
airway caliber
1
. However, studies that show that patients with mild or early COPD,
and therefore with only mild obstruction, still present AHR suggest that it may be a
pathophysiological feature of COPD rather than a surrogate marker of airway
obstruction
7,9,1
. Few in vitro human studies have investigated this issue with an
analysis of isolated small airways. De Jongste et al.
13
showed a greater
bronchiolar response to histamine in patients with COPD compared to subjects
without COPD. Opazo Saez et al.
14
showed a higher response to ACh of
peripheral airways from obstructed subjects, including asthmatics and COPD
patients, compared to non-obstructed controls. In the present study, the oscillatory
mechanics of human lung strips allowed us to address, for the first time, the
behavior of peripheral lung parenchyma in COPD. Taken together, these previous
experimental studies and our present results support the hypothesis that
hyperresponsiveness is a pathophysiological characteristic of the disease.
Since parenchymal changes are major determinants of airway obstruction in
COPD, it is reasonable to question whether a higher contractile response can also
occur at this level. The lung strip is mainly comprised of lung parenchyma with a
small proportion of small airways and vessels and has been used as a model of
parenchymal lung behavior
20
. We have previously shown that normal human lung
strips can respond to an ACh challenge even in the absence of small airways
16
. In
the present study, we observed that in 6 out of 16 strips of the COPD group, no
airways could be identified in the morphological analysis. Interestingly, the strips
devoid of airways showed a response of the same magnitude as those strips
containing small airways, suggesting that both small airways and alveolar tissue
contributed to the increased contractile response of the peripheral lung tissue in
COPD patients.
In normal lungs, the tethering effect of the lung parenchyma is crucial for the
maintenance of airway patency, and it has been suggested that parenchymal
contractility could represent a protective factor for airway narrowing
21
. However, if
alveolar attachments are ruptured, such as in centrilobular emphysema, this would
alter the airway–parenchyma tethering to favor airway narrowing. In this situation,
alveolar contractility would increase the effect of an alveolar rupture on the loss of
airway–parenchyma interdependence.
One limitation of our study was the lack of bronchoprovocation tests in vivo,
so it was not possible to investigate a relationship between in vivo and in vitro
responses. However, we observed a weak but significant relationship between the
degree of tissue response to ACh (%R) and the degree of obstruction determined
by the pulmonary function test (FEV
1
/FVC). This reinforces the idea that
hyperresponsiveness in COPD is associated with the loss of lung function and
disease severity
9,4
.
Although our control group was younger than the COPD group, it is not
likely that age could have influenced our results. Previous studies have shown that
older age does not represent a higher risk for AHR and that at any given age,
atopy and airway caliber are considered to be the major determinants of
hyperreactivity in the general population
22
.
There was a different gender proportion between the two groups, with a
predominance of male patients in the COPD group and of female subjects in the
control group. It is well known that women present a higher prevalence of AHR
compared to men
3,23,24
, so therefore it is possible that our results are
underestimated.
The mechanism involved in the alveolar response to an agonist is not fully
understood, and can involve the contraction of alveolar ducts’ smooth muscle cells
or of alveolar myofibroblasts. This contractile response can also be dependent on
the degree and type of alveolar inflammation and on the extracellular matrix
composition17. We did not observe any difference in the content of α-smooth
muscle actin+ cells between the COPD strips and the control strips, and there was
no correlation between actin content and tissue response. These findings suggest
that the increased responsiveness of lung strips in the COPD group may be
associated with a change in tissue contractile function rather than a change in
muscle mass.
In accordance with previous studies25,26,27, we observed a higher density
of alveolar CD8+ cells and macrophages in COPD patients. Few studies have
investigated the relationship between inflammation and AHR in COPD. Rutgers et
al.
10
demonstrated that hyperresponsiveness to AMP in COPD is associated with
an increased density of CD8+ cells in airway walls and with higher numbers of
sputum eosinophils. In the present study, we also found an association between
the magnitude of the strip response and the tissue density of CD8+ cells and,
although the strip eosinophil density was not significantly different between the two
groups, we observed a significant correlation between eosinophil counts and %R.
One possible mechanism involved in the strip contractile response could be the
release of eosihophilic bronchoconstrictor mediators such as leukotrienes and
platelet activating factor. The same mechanism is likely to occur in vivo and could
explain the association between an eosinophilic infiltration and AHR in COPD
exacerbations
28
. Another possible mechanism could be an inflammation-mediated
extraneuronal release of ACh and the activation of muscarinic receptors on T-
lymphocytes and/or peripheral ASM
29
. An analysis of muscarinic receptors in the
peripheral tissue of COPD patients would certainly improve our understanding of
the mechanisms involved in the increased contractile response of the distal lung in
these patients.
In contrast to previous studies that showed a biochemical and histological
increase in alveolar collagen in centrilobular emphysema, we did not observe any
difference in collagen content between the two groups
30,31
. These contrasting
results may be due to differences in the patients’ characterization and in the tissue
sampling, as we did not sample emphysematous lung tissue for the morphometric
analysis. Although all patients in our COPD group were obstructed, we do not
know how many of them presented with emphysema. Studies that have
investigated the elastic content of alveolar tissue in COPD have shown either a
reduction
32
or an increase
31
in elastic fibers. Although there was no significant
difference in elastance values between the two groups, we observed a significant
decrease in elastic content in strips from COPD patients compared to controls.
Furthermore, there was a significant negative correlation between the content of
elastic fibers and the neutrophil density in the lung strips, indicating the role of
neutrophils in tissue injury.
In conclusion, our findings show that the cholinergic responsiveness of
parenchymal lung strips is increased in COPD patients and is associated with
alveolar tissue eosinophilic and CD8-lymphocytic inflammation. Our results support
the idea that hyperresponsiveness is a pathophysiological characteristic of COPD
and that it is not restricted to the airways, but rather coexists at the distal lung
level. The pathophysiological significance of this pulmonary tissue behavior in the
mechanism of AHR in vivo needs to be further investigated.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors thank the members of the Departments of Thoracic Surgery of São
Paulo University Medical School and A.C. Camargo Hospital, São Paulo, Brazil for
permission to collect the lung tissue.
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LEGENDS FOR FIGURES
Figure 1: The graphs show baseline (bas) and post-acetylcholine (ACh) values of
resistance (R) and elastance (E) in the Control and COPD groups. *, p≤0.023
compared to baseline; #, p=0.032 compared to control.
Figure 2: The graph shows the percent increase in tissue resistance and elastance
in Control and COPD groups. *, p=0.024 compared to control.
TABLES
Table 1: Antibody types and processing used in immunohistochemical analyses
Table 2: Characteristics of the subjects
Controls COPD
Gender 2M:8F 8M:2F
Age, yr
54 ± 16 67 ± 11*
Smoking,
pack-years
---
70.8 ± 32.6
FEV
1
, L
2.33 ± 0.59 1.75 ± 0.44*
FEV
1
, % pred
100.11 ± 16.08 69.82 ± 15.43*
FEV
1
/FVC
0.80 ± 0.05 0.59 ± 0.07*
Values expressed as mean ± SD.
* Significantly different from controls (p<0.04).
M: male; F: female, FEV
1
: forced expiratory volume in one second;
%pred: percentage of predicted; FVC: forced vital capacity, L: liters.
Antibody Pre-treatment Species Clone Dilution Origin
α-smooth muscle actin Citrate Mouse 1A4 1:500 Dako, Denmark
Neutrophil elastase - Mouse NP57 1:300 Dako, Denmark
Mast Cell Citrate Mouse AA1 1:1200 Dako, Denmark
Macrophage Citrate Mouse KP1 1:3200 Dako, Denmark
CD4 Citrate Mouse OPD4 1:400 Dako, Denmark
CD8 Citrate Mouse C8/144B 1:50 Dako, Denmark
Table 3: Lung strip inflammatory cell density (cells/mm²)
Controls
COPD
Macrophages
278.79 ± 151.29 528.65 ± 322.91 *
Neutrophils
124.74 ± 127.51 303.47 ± 262.42
Eosinophils
25.44 ± 19.36 62.26 ± 69.03
Mast cells
277.46 ± 131.60 302.96 ± 92.16
TCD4
+
cells
68.15 ± 68.59 65.84 ± 37.32
TCD8
+
cells
87.20 ± 48.83 157.95 ± 60.35 *
Values expressed as mean ± SD.
*Significantly different from controls (p<0.02).
Table 4: Volume proportion of α-SMA-positive cells and ECM fibers in lung strips
Controls COPD
α-SMA+ cells 0.15 ± 0.04 0.16 ± 0.04
Elastic fibers
0.18 ± 0.04 0.12 ± 0.04 *
Collagen fibers
0.23 ± 0.10 0.18 ± 0.12
Values expressed as mean ± SD.
*
Significantly different from controls (p=0.004).
ECM=extracellular matrix, α-SMA=alpha smooth muscle actin
FIGURES
Figure 1
Figure 2
Hyperresponsiveness of Peripheral Lung Parenchyma in Chronic
Obstructive Pulmonary Disease
Tatiana Lanças, David Itiro Kasahara, Jefferson Luiz Gross, Ruy Camargo Pires-
Neto, Daniel Deheinzelin, Thais Mauad, Elnara Márcia Negri, Marisa Dolhnikoff.
ONLINE DATA SUPPLEMENT
METHODS
Oscillatory mechanics evaluation: The resting length (Lr) and wet weight (W
0
) of
each strip were measured. Metal clips were glued to either end of the tissue strip
with cyanoacrylate. Steel wires (0.5 mm diameter) were attached to the clips; one
end was connected to a force transducer (Model 404A; Aurora Scientific Inc.,
Ontario, Canada) and the other end was connected to a servo-controlled lever arm
(Model 300B; Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada). The lever arm was capable
of peak-to-peak length excursions of 8mm and length resolutions of 1 µm, and was
in turn connected to a function generator (Model 3030; B&K Precision Corp.,
California, USA), which controlled the frequency, amplitude and waveform of the
oscillation. The resting tension (T) was set by movement of a screw thumb wheel
system, which effected slow vertical displacements of the force transducer. Length
and force signals were converted from analog to digital with an analog-to-digital
converter and recorded in a compatible computer. The strips were preconditioned
by slowly cycling tension from 0 to 2g three times and, after the third cycle, they
were fixed at 1g and maintained in the organ bath containing Krebs solution
aerated with 95% of O
2
and 5% of CO
2
for 50 minutes to allow stress relaxation,
during which Krebs solution was changed every 15 minutes. The frequency of
oscillation was 0.25 Hz and the amplitude was 2.5% Lr. After stress relaxation the
final resting tension was approximately 0.8g.
Measurements of resistance (R) and elastance (E) were obtained at
baseline (R
BAS
and E
BAS
, respectively) for 5 minutes and after adding ACh 10
-3
M
(Sigma Chemical, St. Louis, MO) to the bath (R
ACh
and E
ACh
, respectively) for 10
minutes. Resistance and elastance were estimated by the recursive least-
squares algorithm to the equation of motion:
(1) T = EΔl + R (Δl/Δt) + K
where T = tension, l= length, Δl/Δt = is the length change per unit time, and K is a
constant reflecting resting tension. Results were standardized for strip size. The
unstressed cross-sectional area (A
0
) of the strip was obtained from the formula:
(2) A
0
(cm
2
) = W
0
/ (ρ x L
r
)
where ρ is the mass density of the tissue taken as 1.06g cm
-3
, W
0
is the wet
weight in grams, and Lr is the resting length in cm. Values of R and E were
multiplied by Lr/A0.
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