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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO DE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS EM SEQÜÊNCIA
PARA QUANTIFICAÇÃO SIMULTÂNEA DE RETINOL E ÁCIDO
RETINÓICO EM PACIENTES COM DOENÇA HEPÁTICA CRÔNICA
EDLAINE RIJO COSTA
Rio de Janeiro
2010
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i
EDLAINE RIJO COSTA
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS EM SEQÜÊNCIA
PARA QUANTIFICAÇÃO SIMULTÂNEA DE RETINOL E ÁCIDO RETINÓICO EM
PACIENTES COM DOENÇA HEPÁTICA CRÔNICA
ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ CARLOS SARAIVA GONÇALVES
Rio de Janeiro
2010
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas da Faculdade
de Farmácia da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do
título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
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ii
C837d Costa, Edlaine Rijo.
Desenvolvimento e validação de método de cromatografia líquida
de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas em seqüência
para quantificação simultânea de retinol e ácido retinóico em pacientes
com doença hepática crônica/ Edlaine Rijo Costa; orientador José Carlos
Saraiva Gonçalves. – Rio de Janeiro: UFRJ, Faculdade de Farmácia, 2010.
xix, 149f. : il. ; 30cm.
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Farmácia, 2010.
Inclui bibliografia.
1. Quantificação. 2. Retinol. 3. Ácido retinóico. 4. EFS-CLAE-EMS.
5. Doença hepática crônica. I. Gonçalves, José Carlos Saraiva. II. Título.
CDD 615.19
iii
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS EM SEQÜÊNCIA
PARA QUANTIFICAÇÃO SIMULTÂNEA DE RETINOL E ÁCIDO RETINÓICO EM
PACIENTES COM DOENÇA HEPÁTICA CRÔNICA
EDLAINE RIJO COSTA
ORIENTADOR:
_________________________________________________
Prof. Dr. José Carlos Saraiva Gonçalves
Faculdade de Farmácia - UFRJ
BANCA EXAMINADORA:
_________________________________________________
Prof. Dr. Antônio Jorge Ribeiro da Silva
Núcleo de Pesquisa em Produtos Naturais – UFRJ
_________________________________________________
Profa. Dra. Elisabete Pereira dos Santos
Faculdade de Farmácia - UFRJ
_________________________________________________
Profa. Dra. Renata de Mello Perez
Faculdade de Medicina - UFRJ
iv
v
vi
“Se eu pudesse deixar algum
presente a você, deixaria aceso o
sentimento de amor à vida dos seres
humanos. A consciência de aprender
tudo o que nos fora ensinado pelo
tempo afora. Lembraria dos erros
que foram cometidos, como sinais
para que não mais se repetissem. A
capacidade de escolher novos rumos.
Deixaria para você, se pudesse, o
respeito àquilo que é indispensável:
além do pão, o trabalho e a ação. E,
quando tudo mais faltasse, para você
eu deixaria, se pudesse, um segredo:
o de buscar no interior de si mesmo a
resposta para encontrar a saída”.
Mahatma Ghandi
vii
AGRADECIMENTOS
A Deus, luz e caminho durante todo esse trabalho.
Aos meus irmãos, Elaine, Eduardo e Elan, meu cunhado Daniel e minha sobrinha
Maria Eduarda que são a base da minha vida, meus eternos amores, pelo apoio
incondicional e por sempre estarem torcendo e vibrando com minhas conquistas.
Amo vocês.
Ao meu “amore”, Thiago Luiz, por todos esses anos de apoio, carinho, admiração e
compreensão. Com você ao meu lado, essa longa caminhada tornou-se muito mais
suave. Te amo demais.
A minha avó Lucinda e meus tios Léia e Eliezer, presenças constantes em minha
vida, por estarem sempre tão preocupados comigo e contribuindo para meu
crescimento.
À Profa. Dra. Wilza Arantes Ferreira Peres, por compartilhar o projeto dos
retinóides comigo, por todas as dicas e ajuda no desenvolvimento e na estatística
deste trabalho. Muito Obrigada!
À amiga Gabriela Villaça Chaves, doutoranda da Clínica Médica, pela sua busca
incansável por novos pacientes para esse projeto e por toda sua disponibilidade
em me ajudar todas as vezes que precisei. Muito obrigada!
À Profa. Dra. Rita Estrela, por compartilhar conhecimentos, experiências, dicas e
conselhos fundamentais à realização deste trabalho e ao meu crescimento pessoal
e profissional. Obrigada por estar sempre disponível para me ajudar e por estar ao
meu lado nos momentos de desespero.
Às Profas. Dras. Elisabete Pereira dos Santos e Valéria Pereira de Sousa, minha
Comissão de Acompanhamento, por toda ajuda e sugestões para o melhor
desenvolvimento deste trabalho.
Às amigas, Claudia Silvana e Luiza Vargens, minhas fiéis escudeiras, pela
amizade, lealdade, ajuda e carinho tão necessários em minha vida. Obrigada por
todos os dias de papo “Marisa”. Amo vocês!!
À amiga, Maria Angélica, por ter acompanhado meu trabalho desde o início,
estando sempre me incentivando e ajudando em todos os momentos que precisei.
Adoro você!
Aos amigos, Renata e Douglas, por entenderem minhas ausências e mesmo de
longe estarem torcendo pelas minhas vitórias.
À amiga Luciana Figueiredo do Nascimento, por ter sido pessoa tão fundamental
em todos os momentos. Te amo muito, amiga! Você sempre será uma diva!
Saudades!
viii
Ao amigo Adler Paiva, por estar ao meu lado no momento em que mais precisei, me
ensinando que na vida é necessário ter “talento” para vencer.
Ao amigo Gustavo Calil, “Padrão Sinc”, por todos os ensinamentos sobre EFS e por
sempre me ajudar nas horas de desespero com o equipamento. Muito obrigada!
Ao Prof. Dr. François Germain Noël, por entender minhas ausências no laboratório
e por permitir que eu utilizasse as instalações do PBF para realização deste
trabalho.
Aos amigos do PBF, Alessandra, Daylane, Eliana, Joice, Marcelo e Mary Barros,
pelo apoio e amizade sem os quais a realização deste trabalho seria impraticável.
Obrigada por todos os momentos de descontração!
À amiga Deborah Quintanilha, por todos os ensinamentos durante nossos anos de
convivência e pelo estímulo ao ingresso na vida acadêmica.
Aos pesquisadores e alunos do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, por todos os momentos agradáveis que passamos juntos e por todo
apoio durante a realização deste trabalho.
Aos funcionários da Secretaria de Pós-Graduação, Thiago Meyer e Marcelo Araujo,
pela convivência nesse período de aprendizado e por toda ajuda na parte
“burocrática” do mestrado.
A todos os professores participantes da banca examinadora por terem aceitado o
convite para a melhora deste trabalho.
Em especial a todos os pacientes do setor de Hepatologia do Hospital Universitário
Clementino Fraga Filho – HUCFF por permitirem que esse trabalho se tornasse
uma realidade.
ix
RESUMO
COSTA, Edlaine Rijo. Desenvolvimento e Validação de Método de
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada à Espectrometria de
Massas em Seqüência para Quantificação Simultânea de Retinol e Ácido
Retinóico em Pacientes com Doença Hepática Crônica. Rio de Janeiro, 2010.
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
Este trabalho consistiu no desenvolvimento e validação de um método de
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas
em Seqüência (CLAE-EMS) que foi empregado na quantificação simultânea dos
níveis séricos de retinol e ácido retinóico em pacientes com doença hepática
crônica. A razão entre as concentrações séricas destes retinóides foi investigada
como potencial biomarcador de dano hepático.
A extração em fase sólida em linha foi utilizada para isolar os analitos a
partir da matriz biológica, seguida pela injeção direta dos extratos na coluna ACE
AQ® C18 15 cm x 4,6 mm x 5 µm com eluição isocrática, utilizando como fase
móvel 95% de uma mistura de acetonitrila:metanol (55:45 v/v) e 5% de tampão
acetato de amônio 0,01 M pH 6,9, ambas com adição de 0,1% de ácido fórmico.
Foi utilizado, como padrão interno, o acetato de retinila. Os retinóides foram
quantificados em monitoramento das reações múltiplas (MRM), em modo
eletrospray positivo, utilizando as transições m/z 269 93, para o retinol e m/z
301 205, para o ácido retinóico. A validação seguiu os parâmetros
preconizados pela Resolução-RE Nº 899 de 29 de maio de 2003 da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária, tendo o método apresentado precisão, exatidão,
linearidade e limite de quantificação adequados à aplicabilidade do mesmo.
x
As concentrações séricas de retinol, ácido retinóico e a razão entre as
concentrações destes retinóides foram determinadas cinco e sete horas após a
administração de uma dose de 1500 UI ou 2500 UI de palmitato de retinila e
foram correlacionadas com marcadores de lesão hepática, alanina
aminotransferase – ALT e aspartato aminotransferase – AST, e de função
hepática, tempo e atividade de protrombina – TAP, bilirrubina total – BT e
albumina.
Os níveis séricos de retinol se correlacionaram negativa e
significativamente com BT (p=0,038), no tempo de cinco horas após a
administração da dose de 2500 UI de palmitato de retinila. A razão retinol / ácido
retinóico séricos se correlacionou negativa e significativamente com as
concentrações de albumina sérica nos tempos de cinco e sete horas (p=0,047 e
p=0,023, respectivamente), após a dose de 2500 UI de palmitato de retinila e,
também, positivamente com os níveis séricos de ALT e AST (p=0,021 e p=0,041,
respectivamente), no tempo de cinco horas após a dose de 2500 UI,
apresentando-se como um potencial marcador de função e lesão hepatocelular
em pacientes com doença hepática crônica.
xi
ABSTRACT
COSTA, Edlaine Rijo. Development and Validation of method by High
Performance Liquid Chromatography coupled with Tandem Mass
Spectrometry for Simultaneous Quantification of Retinol and Retinoic Acid
in Patients with Chronic Liver Disease. Rio de Janeiro, 2010. Dissertação
(Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
This work consisted in the development and validation of a method by High
Performance Liquid Chromatography coupled with Tandem Mass Spectrometry
(HPLC-MS) that was used in the simultaneous quantification of the serum levels of
retinol and retinoic acid in patients with chronic liver disease. The ratio between
the serum concentrations of these retinoids was investigated as potential
biomarker of hepatic damage.
The on-line solid phase extraction was used to isolate the analytes from the
biological matrix, followed by the direct injection of extracts into an ACE AQ® C18
15 cm x 4.6 mm x 5µm column with isocratic elution, using as mobile phase 95%
of a mixture of acetonitrile: methanol (55:45 v/v) and 5% of 0.01 M ammonium
acetate buffer pH 6.9, both with the addition of 0.1% formic acid. It was used, as
internal standard, the retinyl acetate. Retinoids were quantified in multiple reaction
monitoring (MRM) with positive eletrospray, using m/z 269 93 transition for
retinol and, m/z 301 205 transition for retinoic acid. The validation followed the
parameters established by Resolution number 899 of May 29
th
, 2003 of the
National Agency of Sanitary Surveillance. The method presented precision,
accuracy, linearity and limit of quantification appropriate for its applicability.
xii
The serum concentrations of retinol, retinoic acid and the ratio between
concentrations of these retinoids were determined five and seven hours after
administration of a dose of 1500 IU or 2500 IU of retinyl palmitate and were
correlated with markers of liver injury, alanine aminotransferase – ALT and
aspartate aminotransferase - AST and, markers of liver function, prothrombin time
and activity – PTA, total bilirubin – TB and albumin.
Serum levels of retinol were significantly and negatively correlated with TB
(p=0.038), in the time of five hours after the administration of a dose of 2500 IU of
retinyl palmitate. The ratio retinol / retinoic acid was significantly and negatively
correlated with the concentrations of serum albumin in times of five and seven
hours (p=0.047 and p=0.023, respectively), after the dose of 2500 IU of retinyl
palmitate and, also, positively correlated with serum levels of ALT and AST
(p=0.021 and p=0.041, respectively), in the time of five hours after the dose of
2500 IU, presenting as a potential marker of hepatocellular injury and function in
patients with chronic liver disease.
xiii
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA..................................................................................................................
iv
AGRADECIMENTOS.........................................................................................................
vii
RESUMO...........................................................................................................................
ix
ABSTRACT.......................................................................................................................
xi
SUMÁRIO..........................................................................................................................
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS......................................................................
xvi
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................................
xxi
LISTA DE QUADROS........................................................................................................
xxii
LISTA DE TABELAS.........................................................................................................
xxiii
LISTA DE ANEXOS...........................................................................................................
xxvii
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................
28
1.1. Doença Hepática Crônica – Hepatite, Cirrose Hepática e CHC......................
29
1.2. Fígado e Retinóides........................................................................................
38
1.3. Métodos de Avaliação de Lesão e Função Hepática......................................
44
1.4. Retinóides como Biomarcadores de Patologias..............................................
52
1.5. Métodos Analíticos para Quantificação de Retinóides Séricos.......................
53
2. JUSTIFICATIVA.....................................................................................................
67
3. OBJETIVOS...........................................................................................................
70
3.1. Objetivo Principal.............................................................................................
71
3.2. Objetivos Secundários.....................................................................................
71
4. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................
72
4.1. Desenho do Estudo.........................................................................................
73
4.2. Aspectos Éticos...............................................................................................
75
4.3. Recrutamento de Pacientes............................................................................
75
4.4. Instrumento de Coleta de Dados.....................................................................
76
4.5. Classificação da Gravidade da Cirrose Hepática............................................
76
xiv
4.6. Exames Bioquímicos.......................................................................................
77
4.7. Metodologia da Etapa Analítica.......................................................................
78
4.8. Preparo de Amostras dos Pacientes para Quantificação................................
87
4.9. Análise Estatística...........................................................................................
87
5. RESULTADOS.......................................................................................................
89
5.1. Resultados da Etapa Analítica........................................................................
90
5.2. Resultados da Etapa Clínica...........................................................................
114
6. DISCUSSÃO..........................................................................................................
122
6.1. Discussão da Etapa Analítica..........................................................................
123
6.2. Discussão da Etapa Clínica.............................................................................
126
7. CONCLUSÕES......................................................................................................
131
8. ANEXOS................................................................................................................
133
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................
138
LISTAS
xvi
LISTAS
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AH – ácido hialurônico
ALT – alanina aminotransferase
Anvisa – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
API – do inglês, ―atmospheric pressure ionization‖, ou ionização à pressão
atmosférica
APCI – do inglês ―atmospheric pressure chemical ionization‖, ou ionização
química à pressão atmosférica
APPI – do inglês, ―atmospheric pressure photoionization‖, ou fotoionização à
pressão atmosférica
AST – aspartato aminotransferase
BT – bilirrubina total
CG – cromatografia gasosa
CG-EM – cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
CHC – carcinoma hepatocelular
CLAE – cromatografia líquida de alta eficiência
CLAE-EM – cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de
massas
CLAE-EMS – cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria
de massas em seqüência
CLAE-UV – cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de
ultravioleta
CQ – controle de qualidade
CQ_CA – controle de qualidade de concentração alta
xvii
LISTAS
CQ_CB – controle de qualidade de concentração baixa
CQ_CM – controle de qualidade de concentração média
CRBPII – do inglês ―cellular retinol binding-protein II‖, ou proteína celular ligadora
de retinol
CV – coeficiente de variação
CMD – concentração média determinada
DP – desvio padrão
DPR – desvio padrão relativo
EFS – extração em fase sólida
EFS-CLAE-EMS – extração em fase sólida em linha com cromatografia líquida de
alta eficiência acoplada a espectrometria de massas em seqüência
EH – encefalopatia hepática
EHA – esteato-hepatite alcoólica
EHNA – esteato-hepatite não alcoólica
ELL – extração líquido-líquido
EM – espectrometria de massas
EPP – extração por precipitação de proteínas
EROS – espécies reativas de oxigênio
ESI – do inglês ―eletrospray ionization‖, ou ionização por eletrospray
ET – endotelina
FA – fosfatase alcalina
FM – fase móvel
GGT – gamaglutariltransferase
xviii
LISTAS
HCl – ácido clorídrico
HUCFF – Hospital Universitário Clementino Fraga Filho
IGF – do inglês, ―insulin-like grown factor‖, ou fator de crescimento tipo insulina
IL – interleucina
Inmetro – Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
INR – do inglês, ―international normalized ratio‖, razão normalizada internacional
IUPAC – ―International Union of Pure and Applied Chemistry‖
ITMP – inibidor tecidual de metaloproteinases
ITMP-1 – inibidor tecidual de metaloproteinases tipo 1
KOH – hidróxido de potássio
LD – limite de detecção
LIQ – limite inferior de quantificação
LRAT – do inglês, ―lecithin:retinol acyltransferase‖, ou lecitina:retinol
aciltransferase
LSQ – limite superior de quantificação
MCP-1 – do inglês, ―monocyte chemotactic protein-1‖, ou proteína quimiotática
para monócitos 1
M-CSF – do inglês, ―macrophage colony stimulating factor‖, ou fator estimulador
de colônia para macrófago
ME – matriz extracelular
Medline – ―United States National Library of Medicine‖
MPM – metaloproteinases de matriz
xix
LISTAS
MRM – do inglês, ―multiple reaction monitoring”, ou monitoramento das reações
múltiplas
MTBE – metil-tert-butil-éter
m/z – relação massa/carga
OMS – Organização Mundial de Saúde
PI – padrão interno
PIIINP – do inglês, ―procollagen type III amino-terminal peptide‖, ou peptídeo N-
terminal de pré-colágeno tipo III
PDGF – do inglês, ―platelet derived growth factor”, ou fator de crescimento
derivado de plaqueta
QM – quilomícrons
QMr – quilomícrons remanescentes
RBP – do inglês, ―retinol-binding protein‖, ou proteína carreadora de retinol
RDR – resposta relativa à dose
REH – do inglês, ―retinyl ester hydrolases‖, ou hidrolases de ésteres de retinila
RMN – ressonância magnética nuclear
TAP – tempo e atividade de protrombina
TGF-α – do inglês, ―transforming growth factor-α‖, ou fator de crescimento
transformador alfa
TGF-β – do inglês, ―transforming growth factor-β‖, ou fator de crescimento
transformador beta
TNF-α – do inglês, ―tumor necrosis factor-α‖, ou fator de necrose tumoral alfa
UI – unidade internacional
UV – ultravioleta
xx
LISTAS
VHA – vírus da hepatite A
VHB – vírus da hepatite B
VHC – vírus da hepatite C
VHD – vírus da hepatite D
VHE – vírus da hepatite E
xxi
LISTAS
FIGURAS
Figura 1
Mapa de prevalência mundial de Hepatite C......................................
.
32
Figura 2
Mapa de prevalência mundial de Hepatite B......................................
32
Figura 3
Mapa de prevalência de Hepatite B no Brasil, segundo unidade
federada..............................................................................................
33
Figura 4
Mudanças na arquitetura hepática normal associada com fibrose
hepática avançada..............................................................................
35
Figura 5
Sequência patogênica de ativação fibrogênica das células
estreladas hepáticas a miofibroblastos, levando a fibrose e
cirrose.................................................................................................
37
Figura 6
Estrutura química do retinol – vitamina A, retinaldeído e ácido
retinóico...............................................................................................
39
Fgura 7
Absorção, transporte e metabolismo de retinóides.............................
41
Figura 8
Esquema do espectrômetro de massas triplo quadrupolo..................
55
Figura 9
Esquema do modo de ionização por ESI............................................
56
Figura 10
Etapas da extração em fase sólida.....................................................
59
Figura 11
Organograma do desenho do estudo.................................................
73
Figura 12
Fragmentograma do retinol.................................................................
91
Figura 13
Esquema de fragmentação proposto para molécula de retinol...........
91
Figura 14
Fragmentograma do ácido retinóico...................................................
92
Figura 15
Esquema de fragmentação proposto para a molécula do ácido
retinóico...............................................................................................
92
Figura 16
Cromatograma obtido após injeção direta de solução de palmitato
de retinila 200 ng/mL...........................................................................
95
Figura 17
Cromatograma obtido após EFS de soro enriquecido com palmitato
de retinila 200 ng/mL...........................................................................
95
Figura 18
Cromatograma, em modo MRM, obtido de amostra de soro de
paciente com cirrose Child A, no tempo de colheita de 0h,
submetida à EFS e monitorando as transições m/z 269→93 para
retinol (Tr=5,24 min) e PI (Tr=6,03 min) e m/z 301→205 para ácido
retinóico (Tr=5,08 min)........................................................................
96
xxii
LISTAS
QUADROS
Quadro 1
Mediadores parácrinos envolvidos na ativação da célula estrelada
hepática...........................................................................................
38
Quadro 2
Classificação histológica de fibrose hepática – modelo de
Ishak................................................................................................
45
Quadro 3
Classificação da gravidade da doença hepática de acordo com o
critério de Child & Pugh...................................................................
76
Quadro 4
Estágios de encefalopatia hepática.................................................
77
Quadro 5
Valores de referência dos parâmetros de normalidade dos
exames bioquímicos realizados no HUCFF.....................................
77
Quadro 6
Monitorização em modo MRM do retinol, ácido retinóico e acetato
de retinila.........................................................................................
90
xxiii
LISTAS
TABELAS
Tabela 1
Valores das concentrações dos calibradores empregados na
construção da curva de calibração para calcular precisão e
exatidão do retinol – ROH – Dia 1...................................................
97
Tabela 2
Valores das concentrações dos calibradores empregados na
construção da curva de calibração para calcular precisão e
exatidão do ácido retinóico – RCOOH – Dia 1................................
97
Tabela 3
Precisão e exatidão do retinol – ROH e ácido retinóico – RCOOH
– Dia 1: valores nominais e experimentais das seis réplicas das
amostras controle de qualidade (CQ) nas concentrações baixa
(CB), média (CM) e alta (CA)...........................................................
98
Tabela 4
Valores das concentrações dos calibradores empregados na
construção da curva de calibração para calcular precisão e
exatidão do retinol – ROH – Dia 2...................................................
98
Tabela 5
Valores das concentrações dos calibradores empregados na
construção da curva de calibração para calcular precisão e
exatidão do ácido retinóico – RCOOH – Dia 2................................
99
Tabela 6
Precisão e exatidão do retinol – ROH e ácido retinóico – RCOOH
– Dia 2: valores nominais e experimentais das seis réplicas das
amostras controle de qualidade (CQ) nas concentrações baixa
(CB), média (CM) e alta (CA)...........................................................
99
Tabela 7
Valores das concentrações dos calibradores empregados na
construção da curva de calibração para calcular precisão e
exatidão do retinol – ROH – Dia 3...................................................
100
Tabela 8
Valores das concentrações dos calibradores empregados na
construção da curva de calibração para calcular precisão e
exatidão do ácido retinóico – RCOOH – Dia 3................................
100
Tabela 9
Precisão e exatidão do retinol – ROH e ácido retinóico – RCOOH
– Dia 3: valores nominais e experimentais das seis réplicas das
amostras controle de qualidade (CQ) nas concentrações baixa
(CB), média (CM) e alta (CA)...........................................................
101
Tabela 10
Precisão e exatidão interdias para retinol em matriz biológica........
101
Tabela 11
Precisão e exatidão interdias para ácido retinóico em matriz
biológica...........................................................................................
102
Tabela 12
Precisão e exatidão do retinol – ROH 60 ng/mL e ácido retinóico
– RCOOH 1 ng/mL para determinação de limite de quantificação:
valores nominais e experimentais de cinco réplicas........................
103
xxiv
LISTAS
Tabela 13
Área dos sinais cromatográficos correspondentes às amostras
controle de retinol obtidas por injeção direta de solução e por
extração em fase sólida de soro para cálculo de índice de
recuperação.....................................................................................
104
Tabela 14
Área dos sinais cromatográficos correspondentes às amostras
controle de ácido retinóico obtidas por injeção direta de solução e
por extração em fase sólida de soro para cálculo de índice de
recuperação.....................................................................................
104
Tabela 15
Área dos sinais cromatográficos correspondentes às amostras de
PI obtidas por injeção direta de solução e por extração em fase
sólida de soro para cálculo de índice de
recuperação.....................................................................................
105
Tabela 16
Valores das concentrações dos calibradores empregados na
construção da curva de calibração para calcular estabilidade de
soluções-padrão de retinol...............................................................
106
Tabela 17
Valores das concentrações dos calibradores empregados na
construção da curva de calibração para calcular estabilidade de
soluções-padrão de ácido retinóico.................................................
106
Tabela 18
Estabilidade de soluções de retinol e ácido retinóico: valores
nominais e experimentais das três réplicas das amostras controle
de qualidade (CQ) nas concentrações baixa (CB) e alta (CA)........
107
Tabela 19
Valores de concentrações de retinol e ácido retinóico em
amostras submetidas aos ciclos de congelamento e
descongelamento e recém-preparadas para cálculo de
estabilidade......................................................................................
108
Tabela 20
Valores de concentrações de retinol e ácido retinóico em
amostras deixadas em condições laboratoriais por 8h e recém-
preparadas para cálculo de estabilidade de curta duração.............
108
Tabela 21
Valores de concentrações de retinol e ácido retinóico em
amostras deixadas no injetor por 22h e recém-preparadas para
cálculo de estabilidade pós-processamento....................................
109
Tabela 22
Valores das concentrações dos calibradores empregados na
construção da curva de calibração para calcular precisão e
exatidão do retinol (ROH) em solução – Dia 1................................
110
Tabela 23
Valores das concentrações dos calibradores empregados na
construção da curva de calibração para calcular precisão e
exatidão do ácido retinóico (RCOOH) em solução – Dia 1..............
110
Tabela 24
Precisão e exatidão do retinol – ROH e ácido retinóico – RCOOH
em solução – Dia 1: valores nominais e experimentais das três
réplicas das amostras controle de qualidade (CQ) nas
concentrações baixa (CB), média (CM) e alta (CA).........................
111
xxv
LISTAS
Tabela 25
Valores das concentrações dos calibradores empregados na
construção da curva de calibração para calcular precisão e
exatidão do retinol (ROH) em solução – Dia 2................................
111
Tabela 26
Valores das concentrações dos calibradores empregados na
construção da curva de calibração para calcular precisão e
exatidão do ácido retinóico (RCOOH) em solução – Dia 2..............
112
Tabela 27
Precisão e exatidão do retinol – ROH e ácido retinóico – RCOOH
em solução – Dia 2: valores nominais e experimentais das três
réplicas das amostras controle de qualidade (CQ) nas
concentrações baixa (CB), média (CM) e alta (CA).........................
112
Tabela 28
Precisão e exatidão interdias para solução de retinol.....................
113
Tabela 29
Precisão e exatidão interdias para solução de ácido retinóico........
113
Tabela 30
Estabilidade de soluções de retinol e ácido retinóico nas
condições de análise: valores nominais e experimentais das três
réplicas das amostras controle de qualidade (CQ) nas
concentrações baixa (CB) e alta (CA).............................................
114
Tabela 31
Comparação do retinol sérico basal entre sexo masculino e
feminino...........................................................................................
115
Tabela 32
Comparação do ácido retinóico sérico basal entre sexo masculino
e feminino........................................................................................
115
Tabela 33
Distribuição da amostra segundo etiologia da doença e sexo.........
115
Tabela 34
Comparação da concentração sérica basal (T0) de retinol entre
pacientes que receberam suplementação de 1500 UI e 2500 UI e
das concentrações séricas de retinol obtidas após o recebimento
da dose de palmitato de retinila nos tempos de cinco (T5) e 7
horas (T7)........................................................................................
116
Tabela 35
Comparação da concentração sérica basal (T0) de ácido retinóico
entre pacientes que receberam suplementação de 1500 UI e
2500 UI e das concentrações séricas de ácido retinóico obtidas
após o recebimento da dose de palmitato de retinila nos tempos
de cinco (T5) e 7 horas (T7)............................................................
117
Tabela 36
Comparação da concentração sérica basal (T0) da razão
retinol/ácido retinóico entre pacientes que receberam
suplementação de 1500 UI e 2500 UI e das concentrações
séricas da razão retinol/ácido retinóico obtidas após o
recebimento da dose de palmitato de retinila nos tempos de cinco
(T5) e sete horas (T7)......................................................................
117
Tabela 37
Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações
séricas de retinol, ácido retinóico e razão retinol/ácido retinóico
nos tempos de cinco (T5) e sete (T7) horas após a administração
de 1500 UI de palmitato de retinila..................................................
118
xxvi
LISTAS
Tabela 38
Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações
séricas de retinol no tempo de cinco horas (T5) após a
administração de 2500 UI de palmitato de retinila...........................
119
Tabela 39
Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações
séricas de ácido retinóico no tempo de cinco horas (T5) após a
administração de 2500 UI de palmitato de retinila...........................
119
Tabela 40
Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações
séricas da razão retinol/ácido retinóico no tempo de cinco horas
(T5) após a administração de 2500 UI de palmitato de
retinila..............................................................................................
120
Tabela 41
Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações
séricas de retinol no tempo de sete horas (T7) após a
administração de 2500 UI de palmitato de retinila...........................
121
Tabela 42
Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações
séricas de ácido retinóico no tempo de sete horas (T7) após a
administração de 2500 UI de palmitato de retinila...........................
121
Tabela 43
Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações
séricas da razão retinol/ácido retinóico no tempo de sete horas
(T7) após a administração de 2500 UI de palmitato de retinila.......
121
xxvii
LISTAS
ANEXOS
Anexo 1
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.................................
134
Anexo 2
Instrumento de Coleta de Dados.....................................................
135
Anexo 3
Comprovante de Submissão de Artigo para Revista Científica.......
137
1
INTRODUÇÃO
29
INTRODUÇÃO
1.1 Doença Hepática Crônica – Hepatite, Cirrose Hepática e Carcinoma
Hepatocelular
1.1.1 Definições
Hepatite, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), é uma
inflamação do fígado mais freqüentemente causada por infecção viral.
As hepatites virais são doenças provocadas por diferentes agentes
etiológicos, sendo os mais relevantes, o vírus da hepatite A (VHA), o vírus da
hepatite B (VHB), o vírus da hepatite C (VHC), o vírus da hepatite D (VHD) e o vírus
da hepatite E (VHE). Esses vírus apresentam tropismo primário pelo tecido hepático
e características epidemiológicas, clínicas e laboratoriais distintas (BRASIL, 2005a,
2008a).
Quando a reação inflamatória do fígado, nos casos agudos sintomáticos ou
assintomáticos, persiste por mais de seis meses, considera-se que a infecção está
evoluindo para a forma crônica (BRASIL, 2005a). Os sintomas, quando presentes,
são inespecíficos, predominando fadiga, mal-estar geral e sintomas digestivos.
Somente 20 a 40% dos casos têm história prévia de hepatite aguda sintomática. Em
uma parcela dos casos crônicos, após anos de evolução, pode aparecer cirrose,
com surgimento de icterícia, edema, ascite, varizes de esôfago e alterações
hematológicas (BRASIL, 2005c).
Geralmente, o tratamento das hepatites A e E resulta em recuperação
completa, não existindo casos de hepatite crônica pelo VHA e VHE. Os vírus B, C e
D são aqueles que têm a possibilidade de cronificar.
A freqüência de cronificação é influenciada pela idade em que o paciente se
infecta. Aproximadamente 90% dos neonatos e 50% das crianças se tornarão
cronicamente infectadas pelo VHB, enquanto que em pessoas adultas infectadas
com o mesmo vírus, 5 a 10% evoluem para a forma crônica da doença (BRASIL,
2008a). Já com relação ao VHC, cerca de 80% das pessoas que se infectam,
desenvolvem hepatite crônica (BRASIL, 2008b), sendo que, em média, 20 a 25%
destas podem evoluir para as formas histológicas graves ou cirrose no período de 20
anos, caso não haja intervenção terapêutica. Dentre os cirróticos cerca de 1-5%
desenvolvem câncer primário de fígado (FOCACCIA, 2003).
30
INTRODUÇÃO
O alcoolismo é outro fator etiológico bastante comum de hepatopatias
crônicas (GONÇALVES et al., 2006; MINCIS & MINCIS, 2006). Existem três formas
principais da doença: esteatose hepática, hepatite alcoólica e cirrose, podendo com
freqüência as três lesões coexistirem no mesmo paciente, já que representam
etapas evolutivas de um mesmo processo patológico. Na primeira etapa, o aspecto
histológico característico é a esteatose, depois predominam a necrose e inflamação,
com surgimento de fibrose (hepatite alcoólica), que nas fases mais avançadas leva à
formação de cirrose (GONÇALVES et al., 2006).
A cirrose hepática é uma doença crônico-degenerativa, considerada o estágio
final das diversas hepatopatias crônicas, onde ocorre a conversão da arquitetura
hepática normal em nódulos regenerativos no parênquima hepático que são
encapsulados por septos fibrosos gerando uma cicatriz (PINZANI & ROMBOUTS, 2004;
BRANDÃO et al., 2006; SCHUPPAN & AFDHAL, 2008). Esta cicatriz produz disfunção
hepatocelular e bloqueia o fluxo de sangue através do órgão, diminuindo a
capacidade que o fígado tem de processar nutrientes, hormônios, fármacos e
toxinas, e também reduzindo a capacidade do mesmo em produzir proteínas e
outras substâncias, o que resulta em hipertensão portal e insuficiência hepática
(BATALLER & BRENNER, 2005; GRESSNER et al., 2007).
O álcool e as hepatites virais B e C permanecem como as principais causas
de cirrose em todo o mundo, porém outras etiologias menos freqüentes incluem as
causas metobólicas (hemocromatose, Doença de Wilson, deficiência de α1-
antitripsina, diabete melito, etc.), os distúrbios auto-imunes (hepatite auto-imune tipo
1 e tipo 2), as colestases crônicas (cirrose biliar primária, colangite esclerosante
primária, atresia de vias biliares, etc.), alguns fármacos (amiodarona, metotrexato,
oxifenizatina) e a obstrução ao efluxo venoso hepático (doença veno-oclusiva,
síndrome de Budd-Chiari, etc.) (FOCACCIA, 2003).
O carcinoma hepatocelular (CHC) é um dos tumores malignos mais comuns
no mundo. Várias causas podem contribuir para seu desenvolvimento, porém um
fator comum é sua associação com a doença hepática crônica, mais freqüentemente
cirrose, que é observada em cerca de 70-80% dos CHC, sendo esta considerada
uma condição pré-neoplásica (OKUDA, 2007).
31
INTRODUÇÃO
1.1.2 Aspectos Epidemiológicos
A incidência das hepatites crônicas e cirrose hepática, na população atual,
não podem ser exatamente descrita
porque essas doenças, muitas vezes, apresentam curso clínico silencioso,
podendo permanecer sem apresentar sintomas por um longo período de tempo
(VALKOVA, 2002).
Entre as cinco hepatites virais conhecidas, as mais importantes são as
causadas pelo VHB e VHC e, isso se deve à combinação de dois fatores, um de
natureza epidemiológica e outro de natureza clínica. Epidemiologicamente, a
relevância dessas doenças deve-se à larga distribuição geográfica e ao grande
número de indivíduos infectados, em praticamente todos os países do mundo. Do
ponto de vista clínico, ambas apresentam elevado potencial de cronificação, estando
intimamente associadas ao aparecimento de graves afecções hepáticas,
destacando-se a cirrose e o carcinoma (PASSOS, 2003).
A distribuição das hepatites virais é universal, sendo que a magnitude dos
diferentes tipos varia de região para região, inclusive entre os diferentes estados
brasileiros (BRASIL, 2008a).
A OMS estima uma prevalência de cerca de 3% da população mundial ou,
aproximadamente, a existência de cerca de 170 milhões de portadores crônicos do
VHC (BRASIL, 2005c), fato que tem levado as autoridades de saúde pública a
considerar a hepatite C como a grande pandemia do século XXI (PASSOS, 2003).
No Brasil, não se conhece, ao certo, a prevalência da infecção pelo VHC.
Com base em dados de hemocentros de pré-doadores de sangue, em 2002, a
distribuição variou entre as regiões brasileiras: 0,62% no Norte, 0,55% no Nordeste,
0,28% no Centro-Oeste, 0,43% no Sudeste e 0,46% no Sul. Um dos poucos estudos
de base populacional realizado em nosso meio revelou 1,42% de portadores de anti-
VHC, na Cidade de São Paulo. O Brasil é considerado um país de endemicidade
intermediária para hepatite C (figura 1) (BRASIL, 2008b).
32
INTRODUÇÃO
Figura 1. Mapa de prevalência mundial de Hepatite C (BRASIL, 2008b).
Estima-se que mais de 2 bilhões de pessoas já foram infectadas pelo VHB em
alguma época de suas vidas e que existam cerca de 350 milhões de portadores
crônicos da hepatite pelo vírus B em todo o mundo. A prevalência global da infecção
crônica pelo VHB varia amplamente, desde regiões de alta prevalência (>8%, na
África, Ásia, Pacífico Ocidental e norte do Brasil), média (2-7%, no Leste e Sudeste
da Europa, e nordeste do Brasil) até baixa prevalência (<2%, na Europa Ocidental,
América do Norte e Austrália, sul e sudeste do Brasil) (Figuras 2 e 3). Em regiões de
alta prevalência do VHB, o CHC decorrente desta infecção está entre as três causas
mais freqüente de morte por câncer. (FOCACCIA, 2003).
Figura 2. Mapa de prevalência mundial de Hepatite B, onde HBsAg é a antígeno de superfície do
vírus da Hepatite B (BRASIL, 2008b).
33
INTRODUÇÃO
Figura 3. Mapa de prevalência de Hepatite B no Brasil, segundo unidade federada (BRASIL, 2008b).
Com relação à hepatite alcoólica, a maior parte dos casos é assintomática ou
oligossintomática, assim a real incidência da mesma é desconhecida. Na literatura,
há dados sobre freqüência da doença em grupos heterogêneos submetidos à
biópsia hepática. Os resultados desses estudos indicam que o álcool pode
representar até 50% de todos os casos de cirrose, porém existindo grandes
diferenças geográficas. Em estados onde o consumo de álcool é muito grande, a
cirrose alcoólica pode representar até 90% de todas as cirroses (VALKOVA, 2002).
O CHC é uma das dez neoplasias malignas mais comuns em todo o mundo,
com uma incidência de cerca de quinhentos mil novos casos por ano (CONTE, 2000;
DIAS, 2003). Ele também é considerado pela OMS como um importante problema de
saúde pública, por ser um dos tumores malignos com maior letalidade e com uma
sobrevida extremamente curta.
A incidência do CHC varia muito de acordo com a região do globo terrestre,
podendo os países ser divididos em áreas de alta, intermediária e baixa incidência.
O Brasil é considerado um país de incidência intermediária (FOCACCIA, 2003).
34
INTRODUÇÃO
1.1.3 Fibrogênese e Progressão para Cirrose e Carcinoma Hepatocelular
O fígado é formado pelas células parenquimais (hepatócitos) e quatro tipos de
células não-parenquimais: as células endoteliais que limitam os sinusóides; as
células de Kupffer ou macrófagos hepáticos; células pit ou células natural killer
associadas ao fígado e células estreladas perisinusoidais (BLOMHOFF & WAKE, 1991).
O tecido conectivo do fígado normal consiste de dois componentes básicos:
células especializadas e matriz extracelular (ME). O componente celular são os
fibroblastos, enquanto que a ME pode ser dividida em estruturas fibrosas e massa
interfibrosa amorfa. A ME hepática é formada por três diferentes grupos de
macromoléculas:
- colágenos (tipo I, III, IV e VI);
- glicoproteínas não colagenosas (fibronectina, laminina, entactina/nidogênio,
tenascina, undulina);
- proteoglicanos (perlecano, sindecano).
Glicosaminoglicanos (ácido hialurônico (AH), sulfato de condroitina e sulfato
de dermatano) representam uma parte dos proteoglicanos (VALKOVA, 2002; ROCKEY
& FRIEDMAN, 2006).
No fígado, existe ainda o espaço subendotelial de Disse que, é determinado,
de um lado, pela superfície não-luminal das células endoteliais dos sinusóides e, do
outro lado, sua borda é representada pela membrana dos hepatócitos com
microvilosidades (VALKOVA, 2002).
A fibrose hepática é a deposição excessiva de proteínas de ME, que ocorre
em muitos tipos de doenças hepáticas. O processo fibrogênico é iniciado através da
capilarização dos sinusóides, onde ocorre a redução do número e tamanho dos
poros nas células endoteliais; desenvolvimento de membranas basais e acumulação
de componentes da ME (colágenos tipos I, III, IV e VI; fibronectina; laminina; AH;
tenascina e undulina) no espaço subendotelial de Disse que é conhecida como
fibrose perisinusoidal (figura 4) (REEVES & FRIEDMAN, 2002; VALKOVA, 2002;
BATALLER & BRENNER, 2005; ROCKEY & FRIEDMAN, 2006; GRESSNER et al., 2007).
35
INTRODUÇÃO
Figura 4. Mudanças na arquitetura hepática normal (A) associada com fibrose hepática avançada (B)
(BATALLER & BRENNER, 2005).
A acumulação de tecido fibrótico no espaço subendotelial de Disse causa
deterioração de suplemento de oxigênio e substâncias nutricionais aos hepatócitos,
o que pode levar a necrose dos mesmos com intensificação do processo de
fibrogênese. A capilarização dos sinusóides limita a troca normal de substâncias
entre o plasma e as células hepáticas e, então, representa a principal causa de
deterioração dessas células e desenvolvimento de fibrose hepática ou cirrose.
Simultaneamente, através de receptores específicos de membrana ocorrem
interações entre os componentes da ME e os hepatócitos, o que pode levar a
alterações na expressão genética dos mesmos, levando a perda de suas funções. A
deposição de colágeno no espaço de Disse leva ao estreitamento do lúmen dos
sinusóides e ao aumento da resistência vascular, que contribui para o
desenvolvimento da hipertensão portal (GRESSNER et al., 2007).
A fibrogênese hepática culmina com o desenvolvimento da fibrose
caracterizado por:
- aumento de 3 a 6 vezes da maioria das moléculas de ME, tanto de natureza
colagenosa quanto não-colagenosa;
- elevação desproporcional de alguns componentes da ME, incluindo alguns
tipos de colágeno, proteoglicanos e glicoproteínas estruturais;
36
INTRODUÇÃO
- pequenas mudanças na microcomposição de moléculas específicas da ME,
por exemplo, o grau de hidroxilação das cadeias alfa do colágeno e o grau de
sulfatação dos glicosaminoglicanos e,
- redistribuição de ME no fígado injuriado levando à deposição subendotelial
de tecido conectivo no espaço de Disse (VALKOVA, 2002).
A fibrose hepática é formada não somente como conseqüência das mudanças
de secreção de matriz, mas também por causa das alterações na sua degradação, o
que leva à perda do balanço dinâmico funcional entre fibrogênese e fibrólise. As
metaloproteinases de matriz (MPM) e seus inibidores teciduais específicos (ITMP –
inibidor tecidual de metaloproteinases), bem como as enzimas que ativam algumas
metaloproteinases latentes, participam na degradação da ME hepática (VALKOVA,
2002).
O início da fibrose é usualmente insidioso e a maior parte dos casos de
morbidade e mortalidade ocorre depois do desenvolvimento da cirrose, que na maior
parte dos pacientes, ocorre em um intervalo de 15-20 anos. A fibrose hepática pode
progredir rapidamente para cirrose em várias condições clínicas, incluindo episódios
repetidos de hepatite alcoólica aguda, hepatite subfulminante e colestase em
pacientes com reinfecção de VHC após o transplante de fígado. As principais
complicações clínicas da cirrose incluem ascite, falência renal e encefalopatia
hepática (EH). Pacientes com cirrose podem permanecer livres de suas principais
complicações por vários anos (cirrose compensada). Já a cirrose descompensada é
associada com sobrevivência curta e o transplante de fígado é indicado como única
terapia efetiva (BATALLER & BRENNER, 2005).
A principal causa da fibrogênese é a injúria celular hepática (necrose e
apoptose) com consecutivas reações inflamatórias, que ativam um tipo especial de
célula não-parenquimal localizada no espaço subendotelial na vizinhança dos
hepatócitos. Essas células, conhecidas como células estreladas hepáticas, células
Ito, lipócitos, células perisinusoidais ou células estoque de vitamina A, compreendem
cerca de 1,4% do volume total do fígado e representam uma razão de 4-6
células/100 hepatócitos. Elas estão principalmente relacionadas com o estoque de
aproximadamente 80-90% dos retinóides no fígado normal, mas em condições de
doença, são ativadas a se diferenciarem em células similares aos miofibroblastos,
que são capazes de expressar e secretar quase todos os elementos do tecido
37
INTRODUÇÃO
conectivo (colágeno, elastina, glicoproteínas estruturais, proteoglicanos e AH)
representando a matriz do fígado fibrosado (figura 5) (BATALLER & BRENNER, 2005).
Figura 5. Seqüência patogênica da ativação fibrogênica das células estreladas hepáticas a
miofibroblastos, levando a fibrose e cirrose (GRESSNER et al, 2007).
A ativação das células estreladas, que é o evento central da fibrogênese,
inclui:
(a) estimulação de sua proliferação celular e transformação fenotípica de
célula estrelada para miofibroblastos que produzem componentes de ME;
(b) aumento da expressão de quase todos os genes que codificam proteínas
de ME e,
(c) desenvolvimento da capacidade de contração nas células estreladas, que
contribui para limitar o fluxo sanguíneo e para a hipertensão portal (VALKOVA, 2002).
Além das células estreladas, o influxo de fibrócitos derivados da medula
óssea para o tecido hepático inflamado e a produção de matriz por fibroblastos
portais e células epiteliais biliares também contribuem em menor parte na formação
da cicatriz tecidual. Os miofibroblastos não só produzem um amplo espectro de
componentes da ME, mas também citocinas pró-fibrogênicas e enzimas, que
regulam o catabolismo de colágeno e de outros componentes de matriz como MPM
e seus respectivos inibidores teciduais (ITMP) (GRESSNER et al., 2007).
O processo de ativação das células estreladas e sua diferenciação em
miofibroblastos é realizado através de interações das mesmas com células de
38
INTRODUÇÃO
Kupffer, hepatócitos, células endoteliais sinusoidais, plaquetas e linfócitos, sendo
mediada pela estimulação parácrina com secreção de fatores de crescimento,
citocinas e espécies reativas de oxigênio (EROS) (GRESSNER et al., 2007).
Os principais fatores fibrogênicos liberados pelas células hepáticas são o fator
de crescimento transformador alfa (TGF-α) e beta (TGF-β), o fator de necrose
tumoral alfa (TNF-α) e o fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF). Além
desses, são liberados, ainda, endotelinas (ET), fibronectina celular, interleucinas (IL),
fator de crescimento tipo insulina (IGF), fator estimulador de colônia para macrófago
(M-CSF) e proteína quimiotática para monócito 1 (MCP-1) (Quadro 1) (REEVES &
FRIEDMAN, 2002; VALKOVA, 2002; BATALLER & BRENNER, 2005; GRESSNER et al, 2007).
Quadro 1. Mediadores parácrinos envolvidos na ativação da célula estrelada hepática
Fonte Celular
Mediador Parácrino
Hepatócitos
Peróxidos lipídicos, TGF-β, TGF-α, IL-6, IGF-1, M-CSF, GM-CSF
Células de Kupffer
Peróxidos lipídicos, TGF-β, TGF-α, IL-6, TNF-α, PDGF, gelatinase-B
Células Endoteliais
TGF-β, ET-1, PDGF, fibronectina celular
Plaquetas
PDGF, TGF-β, IGF
Linfócitos
TGF-α, interleucinas
Monócitos
TNF-α, TGF-β, PDGF
Adaptado de REEVES & FRIEDMAN, 2002.
O TGF-β é considerado a principal citocina na fibrogênese do fígado e de
outros órgãos. Ele não só estimula a síntese da ME, como inibe a degradação da
matriz, pela redução da síntese de MPM; aumenta a concentração de inibidores de
proteases; estimula a migração quimiotática e motilidade de fibroblastos e monócitos
e aumenta a expressão de outros fatores de crescimento e receptores para
componentes da ME (VALKOVA, 2002).
1.2 Fígado e Retinóides
1.2.1 Retinóides – Definição e Características
Segundo a Comissão de Nomenclatura Bioquímica da International Union of
Pure and Applied Chemistry (IUPAC), retinóides são substâncias formadas por
quatro unidades isoprenóides unidas de maneira cabeça-cauda. Outras definições
39
INTRODUÇÃO
consideram os retinóides como subsâncias que possuem efeitos biológicos similares
ao retinol, mas não necessariamente relação estrutural com este (WYSS, 1995,
GUNDERSEN & BLOMHOFF, 2001).
Na estrutura molecular de um retinóide natural é possível identificar três
partes fundamentais: um anel de 6 carbonos, uma cadeia poliênica e um grupo
funcional terminal polar com carbonos e oxigênio (figura 6). De acordo com a
estrutura, três gerações de retinóides podem ser estabelecidas (ROOS et al, 1998;
SILVA & BARBOSA, 2008):
- retinóides não aromáticos - 1° geração (β- caroteno – pró-vitamina A,
retinol, ésteres de retinila, retinaldeído, ácido retinóico, ácido 13-cis-retinóico,
entre outros);
- monoaromáticos - 2° geração (etretinato, acitretina, motretinida)
- poliaromáticos - 3° geração (adapaleno, tazarodeno)
Figura 6. Estrutura química do retinol – vitamina A (a), retinaldeído (b) e ácido retinóico (c).
Os retinóides aparecem como cristais amarelos ou, às vezes, na forma de
óleo, como é observado para os ésteres de retinila de cadeia longa. A faixa de
polaridade e solubilidade dos vários retinóides varia de solúvel a insolúvel em
solventes polares como a água e vice-versa em solventes apolares como hexano.
Para os retinóides ionizáveis, como o ácido retinóico, a solubilidade depende do pH
do solvente. O ácido retinóico em seu pKa 6-8 é altamente solúvel em água.
Retinóides apolares como os ésteres de retinila são pouco solúveis em solventes
polares como metanol e acetonitrila
(a)
(b)
(c)
40
INTRODUÇÃO
Os retinóides são termolábeis, fotosensíveis e facilmente atacados por
oxidantes. Estas características estão ligadas principalmente à sua cadeia poliênica,
que contém várias ligações duplas carbono-carbono em conjugação.
Os retinóides naturais e a primeira geração são menos estáveis que os de
segunda geração. A terceira geração possui menos problemas de estabilidade,
porém mesmo assim precauções devem ser tomadas durante a colheita, estoque e
análise das amostras biológicas, para evitar sua oxidação e isomerização (WYSS,
1995).
Os retinóides são reguladores fisiológicos de um grande número de
processos biológicos incluindo desenvolvimento embrionário, visão, reprodução,
formação dos ossos, metabolismo, hematopoiese, diferenciação, proliferação e
apoptose celular (TZIMAS & NAU, 2001; SHIOTA et al., 2006).
Embora, a deficiência de vitamina A esteja associada com a alta incidência e
o aumento da susceptibilidade ao câncer e os retinóides estejam sendo usados
como fármacos para terapia desta doença, a aplicabilidade dessa classe de
substâncias é limitada pela sua atividade teratogênica. Além disso, o uso de doses
excessivas de vitamina A pode produzir uma síndrome de toxicidade característica
chamada de hipervitaminose A que é observada depois da ingestão de mais de 500
mg de retinol para adultos. Seus sinais incluem dores de cabeça severas,
hepatomegalia, vômito e descamação da pele. Toxicidade crônica pode ser
observada após a ingestão diária prolongada de mais de 30 mg de retinol ou durante
o uso clínico de retinóides sintéticos (TZIMAS & NAU, 2001).
1.2.2 Metabolismo dos Retinóides nos Hepatócitos
O fígado é o principal órgão responsável pelo armazenamento, metabolismo e
distribuição da vitamina A para os tecidos periféricos (HENDRIKS et al., 1993; DAWSON
et al., 2000). Dentre os vários tipos de células que compõem este órgão, dois estão
diretamente envolvidos no metabolismo do retinol – hepatócitos e células estreladas
(BLOMHOFF, 1987; BLOMHOFF, 1994).
O início do metabolismo dos retinóides ocorre no lúmen intestinal, onde os
ésteres de retinila provenientes da dieta são emulsificados com sais biliares e
hidrolisados a retinol, por várias enzimas pancreáticas e hidrolases de ésteres de
retinila (REH), antes da sua absorção (BLOMHOFF, 1994).
41
INTRODUÇÃO
No enterócito, o retinol liga-se à proteína celular ligadora de retinol (cellular
retinol binding-protein II – CRPBII) e este complexo é esterificado pela enzima
lecitina:retinol aciltransferase (lecithin: retinol acyltransferase – LRAT). Os ésteres de
retinila formados são, então, incorporados aos quilomícrons (QM), os quais entram
na circulação linfática e migram para circulação sangüínea, onde vários processos
bioquímicos como hidrólise de triacilgliceróis e permuta de apoproteínas ocorrem,
resultando em quilomícrons remanescentes (QMr) (BLOMHOFF, 1994; CHANG, 1994).
Os QMr são captados pelas células parenquimatosas hepáticas, onde os
ésteres de retinila são hidrolisados pelas enzimas REH, localizadas na membrana
plasmática ou nos endossomas, resultando na formação do retinol.
O retinol assim formado pode seguir diferentes caminhos: (1) se ligar à
proteína carreadora de retinol (RBP) e ser liberado para a circulação sangüínea; (2)
ser oxidado até ácido retinóico; (3) ser metabolizado, assim como o ácido retinóico,
em formas mais polares, pelo sistema enzimático citocromo P450; (4) ou então ser
transportado para as células estreladas, onde será armazenado (ROSS &
ZOLFAGHARI, 2004) (figura 7). O estado nutricional de vitamina A do indivíduo
determina a via a ser seguida.
Figura 7. Absorção, transporte e metabolismo de retinóides (SENNO, 2004).
O ácido retinóico é formado através da oxidação do retinol ao retinaldeído
seguido por oxidação do retinaldeído ao ácido retinóico. Controvérsias existem sobre
a identidade das enzimas que catalisam essas reações in vivo. Alguns autores
42
INTRODUÇÃO
sugerem que o retinol é convertido ao retinaldeído por uma álcool desidrogenase
microssomal de cadeia curta e o retinaldeído gerado é, então, oxidado ao ácido
retinóico por uma via citossólica catalisada por uma aldeído desidrogenase
dependente de NAD. Já alguns estudos ligam uma via NADPH-dependente,
catalisada por isoformas do citocromo P450 (CYP) à formação do ácido retinóico
(ROSS, 1993). Dentre os CYPs humanos, os mais eficientes para a oxidação do
retinaldeído ao ácido retinóico são CYP 1A1, 1A2, 1B1, 3A4 e 3A5 (CHEN et al.,
1999; ZHANG et al., 1999; MARRIL et al., 2002).
Muitas vias têm sido propostas para a biossíntese de outros retinóides
derivados do ácido retinóico. O ácido retinóico pode se isomerizar in vitro e in vivo a
seus estereoisômeros 9-cis- e 13-cis-ácido retinóico. Numerosos metabólitos de
ácido retinóico e seus isômeros são formados como resultado de reações de
oxidação ou conjugação. Isoformas específicas do citocromo P450 são capazes de
catalisar a oxidação do ácido retinóico as formas 4-hidroxi, 18-hidroxi e 4-oxo de
metabólitos (TZIMAS & NAU, 2001).
Os CYPs humanos 3A4/5, 2B6, 2C8, 2A6 e 2C9 estão envolvidos no
metabolismo do ácido retinóico aos seus isômeros 9-cis-, 4-hidroxi-9-cis- e 4-oxo-9-
cis-ácido retinóico. Os CYPs 3A4/5, 2B6, e 2C8 cooperam na formação do
metabólito 13-cis-ácido retinóico, enquanto os CYPs 2A6, 2C8 e 2B6 cooperam para
a formação do 4-hidroxi-13-cis e 4-oxo-13-cis-ácido retinóico. (NADIN & MURRAY,
1999; MARRIL et al., 2000; MCSORLEY & DALI, 2000; MARRIL et al., 2002).
2.2.3 Metabolismo dos Retinóides na Fibrose Hepática
Newsome e colaboradores (2000) mostraram que os níveis séricos de retinol
estão baixos em pacientes com doença hepática crônica e este decréscimo está
diretamente relacionado com a progressão da doença hepática, refletindo a perda de
ésteres de retinila das células estreladas. Além disso, para graus similares de Child-
Pugh, os níveis séricos de retinol são significativamente menores em pacientes que
possuem CHC associado à cirrose, quando comparados com aqueles que possuem
apenas cirrose.
Existem várias possíveis explicações para a diminuição dos níveis séricos de
retinol na doença hepática crônica, entre elas estão a síntese defeituosa de proteína
ligadora de retinol (RBP) que evita a mobilização de retinol do fígado para tecidos
43
INTRODUÇÃO
periféricos (MAIO et al., 2000) e a absorção de retinol da dieta que pode estar
prejudicada, explicando porque os níveis estão significativamente mais reduzidos em
pacientes com doença hepática colestática, cujo quadro cursa com má-absorção
crônica de gordura e vitaminas lipossolúveis (NEWSOME et al., 2000).
Tem sido sugerido que os níveis de retinol possam ser usados para monitorar
a progressão da doença hepática crônica e, isto é possível porque as células
hepáticas estreladas que são ricas em retinóides e que produzem albumina são
ativadas a miofibroblastos enquanto o fígado passa pela transformação fibrótica
durante a cirrose. Os miofibroblastos perdem o conteúdo de retinol, bem como a
capacidade de produzir albumina e Newsome e colaboradores (2000) encontraram
correlação (p<0,0188) entre os valores de retinol e albumina que é um marcador de
função hepática.
O principal assunto não resolvido sobre o papel do retinol e seus derivados,
na fibrose hepática, tem sido os mecanismos de perda intracelular e como essa
perda pode facilitar a ativação celular e a fibrose hepática. Os retinóides modulam a
atividade do TGF-β que, no fígado, é a citocina fibrogênica mais potente,
estimulando a produção de colágeno que, por sua vez, suprime o crescimento dos
hepatócitos (OKUNO et al., 1999).
O ácido retinóico exacerba a fibrose hepática, pelo menos em parte, pela
ativação e produção de TGF-β no fígado pelas células estreladas (OKUNO et al.,
1997).
A perda dos ésteres de retinila observados na fibrose pode ser em parte
resultante da rápida conversão a ácido retinóico e aos seus subseqüentes
metabólitos: 9-cis- ácido retinóico, 13-cis-ácido retinóico e 9,13-di-cis-ácido retinóico.
Okuno e colaboradores (1999) observaram um aumento de 58% e 114% na geração
de ácido retinóico e 9,13-di-cis-ácido retinóico, respectivamente, em fígados
fibrosados de ratos.
Como o 9,13-di-cis-ácido retinóico é o principal produto que se forma da
isomerização in vivo do 9-cis-ácido retinóico, a elevação de 9,13-di-cis-ácido
retinóico implica que o metabolismo de retinóides pode estar estimulado e que o
ácido retinóico e subseqüentemente o 9-cis-ácido retinóico podem ser gerados
durante o desenvolvimento da fibrose. Isto sugere que o aumento de ácido retinóico
é mais relevante e que a elevação observada em 9,13-di-cis-ácido retinóico
44
INTRODUÇÃO
meramente reflete o aumento de ácido retinóico e 9-cis-ácido retinóico pré-
existentes.
1.3 Métodos de Avaliação de Lesão e Função Hepática
Testes sorológicos são importantes por serem não invasivos, porém,
freqüentemente, apresentam limitações na avaliação de pacientes com ou sem
sintomas de doenças hepáticas. Comumente é utilizado erroneamente o termo teste
de função hepática, para ensaios que medem lesão hepatocelular. Os verdadeiros
testes de função hepática são aqueles que avaliam a síntese de proteínas, como
albumina e fatores de coagulação ou a capacidade do fígado em metabolizar
substâncias como fármacos (ROCHILING, 2001).
Um marcador de fibrose não invasivo ideal deve:
(a) ser específico para o fígado;
(b) apresentar níveis que não devem ser influenciados pelas alterações
renais ou reticuloendoteliais;
(c) avaliar um ou mais dos seguintes processos: estágio de fibrose, atividade
de deposição ou remoção de matriz;
(d) apresentar metodologia de quantificação simples (AFDHAL & NUNES, 2004).
1.3.1 Biópsia Hepática
A biópsia hepática com consecutiva avaliação histológica é considerada o
método padrão-ouro para a avaliação da fibrose hepática. Exames histológicos são
úteis na identificação das causas das hepatopatias e na determinação do grau
necroinflamatório e do estágio de fibrose através de vários sistemas numéricos
(Knodell, Ishak, METAVIR, Scheuer, Desmet, entre outros) (GRESSNER et al., 2007).
O modelo de Ishak é o mais detalhado, classificando a fibrose em estágios de
zero a seis, significando, o primeiro, ausência de fibrose, e o último, cirrose
estabelecida (Quadro 2).
45
INTRODUÇÃO
Quadro 2. Classificação histológica de fibrose hepática – modelo de Ishak
Estádio
Descrição
F0
Ausência de fibrose
F1
Alargamento de alguns tratos portais por fibrose
F2
Alargamento da maioria dos tratos portais por fibrose
F3
Alargamento da maioria dos tratos portais com pontes freqüentes ligando
tratos
F4
Alargamento da maioria dos tratos portais com pontes freqüentes ligando
tratos portais e veias centro-lobulares
F5
Marcante fibrose em ponte e esboço de nódulos
F6
Cirrose
Embora a biópsia seja o procedimento padrão para avaliar a fibrose hepática,
ela possui alguns problemas:
(a) o método é invasivo podendo causar dor e complicações severas que
podem requerer a hospitalização prolongada. A dor é reportada por cerca de 40%
dos pacientes, enquanto as complicações severas em 0,5% dos mesmos. A biópsia
requer hospitalização de 6-18 h;
(b) pode ocorrer amostragem errada. A média de tamanho de uma biópsia é
de 15 mm, o que representa cerca de 1/50.000 da massa do fígado;
(c) variabilidade intra- e inter-patologista na avaliação histológica da biópsia e
(d) alto custo. O valor de uma biópsia sem complicações é estimado em US$
1032, enquanto a biópsia com complicações custa cerca de US$ 2745 (AFDHAL &
NUNES, 2004; BATALLER & BRENNER, 2005; BLANC et al., 2005; GRESSNER et al., 2007;
MANNING & AFDHAL, 2008).
Além disso, a dinâmica evolutiva da doença hepática faz com que os
pacientes possam necessitar de biópsias repetidas e como este procedimento não é
isento de riscos, torna-se necessário o desenvolvimento de marcadores não-
invasivos que possam detectar formas avançadas e quantificar fibrose (FOCACCIA,
2003).
46
INTRODUÇÃO
1.3.2 Marcadores Séricos de Fibrose Hepática
1.3.2.1 Marcadores de Fibrose de Classe I
Esses marcadores são componentes da matriz que estão com sua expressão
constantemente aumentada pela ativação das células estreladas, ou que tem sua
liberação atrasada devido à disfunção metabólica das células de Kupffer ou
subendoteliais sinusoidais ou são mediadores que também estão constantemente
aumentados durante a fibrogênese. Dentre esses marcadores, podemos citar: AH,
peptídeo amino-terminal de pró-colágeno tipo III (PIIINP), colágenos tipo I e IV,
laminina, MPM, YKL-40, entre outros (GRESSNER et al., 2007).
- Ácido hialurônico
O AH é um glicosaminoglicano sintetizado pelas células estreladas e
degradado pelas células sinusoidais hepáticas, sendo um importante componente da
ME. Altos níveis de AH em pacientes com doenças hepáticas, particularmente
cirrose, tem sido relatado para a disfunção das células endoteliais sinusoidais e
podem refletir aumento da fibrogênese. Em ensaios que avaliam apenas um
marcador que reflete a concentração de ME, o AH aparece como o melhor teste
individual (MANNING & AFDHAL, 2008).
- Peptídeo amino-terminal de pró-colágeno tipo III
O PIIINP é possivelmente o marcador de fibrose mais largamente estudado.
Os níveis de PIIINP estão elevados na hepatite aguda e são correlacionados com os
níveis de aminotransferases. Os níveis desses marcadores refletem o estágio de
fibrose na doença hepática alcoólica, hepatites virais e cirrose (MANNING & AFDHAL,
2008). Embora bastante pesquisado, o PIIINP tem tido sua aplicação clínica limitada
já que ele não é um biomarcador específico do fígado, estando também elevado em
fibrose de pulmão, acromegalia, doenças reumatóides, pancreatites crônicas e
outras enfermidades (GRESSNER et al., 2007).
- Colágenos tipo I e IV
Os níveis de colágeno tipo I estão aumentados em todos os tipos de fibrose
hepática, mas não em estágios necroinflamatórios. O colágeno tipo IV também está
47
INTRODUÇÃO
elevado em pacientes com hemocromatose com fibrose avançada comparada com
controles normais. Em pacientes com doença hepática alcoólica, existe uma
significante correlação entre os níveis de colágeno tipo IV e o estágio fibrótico,
particularmente fibrose periportal (MANNING & AFDHAL, 2008).
- Laminina
A laminina é uma glicoproteína não colagenosa sintetizada pelas células
estreladas e depositada na membrana basal do fígado. Na injúria hepática crônica,
os componentes basais, particularmente laminina, são depositados ao redor dos
vasos, no espaço perisinusoidal e no trato portal e, por isso, os valores séricos de
laminina correlacionam-se com os níveis de pressão portal tanto em cirróticos, como
em hipertensão portal causada por outras etiologias (FOCACCIA, 2003). Os níveis
séricos de laminina e de seu fragmento P1 são elevados em pacientes com doença
hepática crônica devido ao álcool e hepatites virais. A laminina parece ser superior
ao PIIINP, mas inferior ao colágeno tipo IV em predizer a fibrose na hepatite viral
crônica (MANNING & AFDHAL, 2008).
- Metaloproteinases de matriz e Inibidores teciduais de
metaloproteinases
As MPMs e os ITMP são um grupo de proteínas envolvido no controle da
degradação de matriz. As MPMs são produzidas intracelularmente e secretadas na
forma de pró-enzima, que requerem clivagem por mecanismos da superfície celular
para atividade funcional. As ações das MPMs são inibidas pelas ITMPs. A interação
entre MPMs e ITMPs é complexa e como essas moléculas agem localmente e tendo
múltiplas atividades, incluindo ativação de fatores de crescimento, afetando
proliferação celular e inibição da apoptose, a relação permanece não-clara. A MPM-
2 (gelatinase A) é secretada pelas células estreladas ativadas e está aumentada na
presença do colágeno tipo I. Pouco é conhecido sobre o papel da MPM-3
(estromelisina) na injúria hepática. A MPM-9 (gelatinase B) é principalmente
secretada pelas células de Kupffer ativadas. Os níveis plasmáticos dessa proteína
estão aumentados em pacientes com CHC, mas não com hepatite crônica ou cirrose
(MANNING & AFDHAL, 2008).
48
INTRODUÇÃO
- YKL-40
YKL-40 é um novo marcador da fibrose hepática. Ele é uma glicoproteína que
parece funcionar como um fator de crescimento para fibroblastos, condrócitos e
células sinoviais e fator de migração para células endoteliais. As bandas
imunohistoquímicas têm demonstrado positividade para YKL-40 em áreas de fibrose
hepática e fibrogênese (MANNING & AFDHAL, 2008).
1.3.2.2 Marcadores de Fibrose de Classe II
Esses marcadores não estão diretamente relacionados com a patogênese da
fibrose, mas estão alterados no soro ou plasma de pacientes com fibrose e cirrose.
(GRESSNER et al., 2007). Uma grande variedade de marcadores bioquímicos e
combinação de parâmetros podem ser utilizados, porém deve-se fazer a distinção
entre os marcadores de lesão e função hepática. Entre os marcadores de fibrose de
classe II mais utilizados estão os níveis de aminotransferases, fosfatase alcalina
(FA) e gamaglutamiltransferase (GGT), que na verdade, são testes de lesão
hepática e, também, BT, albumina, TAP e imunoglobulinas que são testes de função
hepática.
- Bilirrubina total e frações
A bilirrubina é formada a partir da lise das hemácias, sendo o pigmento
resultante do catabolismo da hemoglobina. A bilirrubina indireta (não-conjugada) é
transportada para o fígado ligada à albumina. Ela é insolúvel em água e, portanto,
não pode ser excretada na urina. A bilirrubina direta (conjugada) é solúvel em água
e aparece na urina.
No fígado, a bilirrubina indireta é conjugada ao ácido glicurônico, formando a
bilirrubina direta e, subseqüentemente, é secretada na bile e intestino. A flora
intestinal quebra a bilirrubina em urobilinogênio, que é, então, reabsorvido e depois
excretado pelo rim na urina ou pelo fígado no trato gastrointestinal.
A bilirrubina no soro, normalmente, é encontrada na forma não-conjugada,
refletindo o balanço entre a produção e a excreção hepatobiliar (ROCHLING, 2001). A
produção de bilirrubina aumenta na hemólise, eritropoiese ineficaz, reabsorção de
hematoma e raramente na injúria muscular. Em todos os casos, a bilirrubina está
principalmente, na forma não-conjugada. A hiperbilirrubinemia conjugada
49
INTRODUÇÃO
caracteristicamente ocorre na doença hepática parenquimal e obstrução biliar (LIMDI
& HYDE, 2003).
A icterícia é devida à impregnação dos tecidos com bilirrubina. A dosagem da
mesma mostrará, nos casos ictéricos, o padrão de icterícia hepatocelular com
aumento das bilirrubinas totais, principalmente, à custa, das frações diretas. A
presença de urobilinogênio na urina é característica das hepatites virais denotando
disfunção celular (FOCACCIA, 2003).
Os níveis de bilirrubinas elevam-se após o aumento das aminotransferases e,
nas formas agudas, podem alcançar valores 20 a 25 vezes acima do normal. Na
urina, pode ser detectada precocemente, antes mesmo do surgimento da icterícia.
Sua normalização costuma ocorrer antes das aminotransferases, exceto nas formas
colestáticas (BRASIL, 2005b, 2008b).
- Aminotransferases
As aminotransferases séricas são enzimas que agem como sensíveis
indicadores de dano hepatocelular, sendo as melhores representantes dos
fenômenos necróticos a que estão submetidos os hepatócitos durante a agressão
por vírus. Dentre as várias transaminases produzidas pelo fígado, duas possuem
maior importância clínica: AST e ALT. Elas participam da gliconeogênese
catalisando a transferência de grupos amino do ácido aspártico ou da alanina para o
ácido cetoglutárico para produzir o ácido oxaloacético e ácido pirúvico,
respectivamente (LIMDI & HYDE, 2003).
A menos específica para o fígado é a AST que está presente no citoplasma e
em isoenzimas mitocondriais, sendo encontrada no coração, músculo esquelético,
rim, cérebro, pâncreas, pulmões, leucócitos e eritrócitos. A ALT é uma enzima
citossólica que é encontrada em maior quantidade nos hepatócitos, por isso sendo
mais específica para o fígado (ROCHLING, 2001; LIMDI & HYDE, 2003).
Injúria hepatocelular, mas não necessariamente a morte celular, é a causa da
liberação dessas enzimas na circulação e, assim os níveis das aminotransferases
ficam elevados na hepatite aguda e crônica, cirrose, congestão hepática e doenças
infiltrativas como infecção ou câncer (ROCHLING, 2001).
Classicamente se considera que quando a dosagem das aminotransferases
ultrapassa 500 UI/L está ocorrendo intensa destruição hepatocítica. Como a ALT é
50
INTRODUÇÃO
uma enzima exclusivamente citoplasmática, seu aumento sérico se correlaciona, na
maioria das vezes, com a presença de lesão hepatocítica aguda. A queda abrupta
dos níveis de AST/ALT no soro pode representar o principal sinal laboratorial de
evolução para hepatites fulminantes, representando a falência progressiva do fígado
devido à destruição extensa do tecido. A persistência dos níveis elevados de
AST/ALT por mais de seis meses, a contar do quadro agudo, é indicativa de
provável cronificação (FOCACCIA, 2003).
Nas formas agudas, as aminotransferases chegam a atingir, habitualmente,
valores até 25 a 100 vezes acima do normal. Em geral, essas enzimas começam a
elevar-se uma semana antes do início da icterícia (sendo que a ALT é a primeira a
aumentar no plasma) e normalizam-se em cerca de três a seis semanas de curso
clínico da doença. Nas formas crônicas, na maioria das vezes não ultrapassam 5
vezes o valor normal e, por vezes, em indivíduos assintomáticos, é o único exame
laboratorial sugestivo de doença hepática (BRASIL, 2005b, 2008b).
O uso dos níveis de ALT ou AST sozinhos para o diagnóstico do estágio de
fibrose não tem mostrado ser clinicamente útil. Pode-se usar a razão AST/ALT,
sendo que se a mesma for maior que 1, sugere-se diagnóstico de cirrose (MANNING
& AFDHAL, 2008).
- Fosfatase alcalina e Gamaglutamiltransferase
As FAs são originadas principalmente de duas fontes, fígado e ossos, mas
podem estar presentes em uma variedade de outros tecidos como intestino e
placenta. A sua elevação pode ser fisiológica ou patológica. O papel fisiológico
dessas enzimas não é claramente entendido, mas sua produção fica aumentada em
tecidos que estejam em estimulação metabólica. Os níveis aumentam, por exemplo,
a partir do terceiro mês de gravidez e também na adolescência, que corresponde ao
período de crescimento (LIMDI & HYDE, 2003).
Várias causas patológicas podem levar à elevação de FA, sendo hepáticas ou
não. Entre elas pode-se citar: doença nos ossos, obstrução do ducto biliar, colestase
induzida por fármacos, entre outras (LIMDI & HYDE, 2003).
A GGT é uma enzima encontrada nos hepatócitos e células epiteliais biliares.
Embora sensível, a sua utilidade é limitada pela falta de especificidade, já que seus
níveis elevados podem ser devido a várias causas, entre elas, doença pancreática,
51
INTRODUÇÃO
infarto do miocárdio, falha renal, doença pulmonar obstrutiva crônica, diabetes e
alcoolismo (LIMDI & HYDE, 2003).
O aumento dos níveis de GGT pode ser utilizado para confirmar uma fonte
hepática de doença para o aumento de FA (ROCHLING, 2001; LIMDI & HYDE, 2003).
- Albumina
A síntese de albumina é uma importante função do fígado. Aproximadamente
10 g é sintetizada e secretada diariamente. Com a doença hepática progressiva, os
níveis sorológicos de albumina caem, refletindo o decréscimo na sua síntese. Os
níveis de albumina são dependentes de um número de outros fatores como estado
nutricional, catabolismo, fatores hormonais e perdas urinária e gastrointestinal.
Mesmo assim, as concentrações de albumina podem ser correlacionadas com o
prognóstico na doença hepática crônica (LIMDI & HYDE, 2003). Esta proteína não é
um bom indicador de função hepática na doença aguda já que sua meia-vida é de
20 dias (ROCHILING, 2001).
- Tempo e atividade de protrombina
A síntese dos fatores de coagulação, exceto fator VIII, também é uma
importante função do fígado. O TAP avalia a taxa de conversão da protrombina em
trombina, o que requer os fatores II, V, VII e X, e assim reflete a função de síntese
do fígado. A vitamina K é requerida para a gama carboxilação de todos esses
fatores (LIMDI & HYDE, 2003).
Nos casos de hepatite crônica, o alargamento do TAP indica a deterioração
da função hepática, porém o TAP também pode estar prolongado na deficiência de
vitamina K e terapia com varfarina. A administração de vitamina K pode ajudar a
distinguir colestase de doença hepatocelular. Se dentro de 24 horas após a
administração, o TAP normalizar, significa que o tempo prolongado é devido a uma
má absorção de vitamina K e a função hepática está inalterada (ROCHLING, 2001;
LIMDI & HYDE, 2003; BRASIL, 2008b).
- Alfafetoproteína
Embora não tenha valor clínico na avaliação de hepatites agudas, seus
valores elevados ou progressivamente crescentes, em pacientes portadores de
52
INTRODUÇÃO
hepatite crônica, em geral, indicam o desenvolvimento de CHC, sendo por isto,
utilizada no screening deste tumor em pacientes cirróticos (BRASIL, 2005b).
1.3.3 Técnicas de Imagem
Finalmente, a fibrose hepática também pode ser diagnosticada por técnicas
de imagem. Ultra-sonografia, tomografia computadorizada e imagem por
ressonância magnética podem detectar mudanças no parênquima hepático devido à
fibrose moderada a grave. Devido ao baixo custo, a ultra-sonografia é a técnica mais
aplicada. Ela á capaz de detectar cirrose hepática baseada nas mudanças
ecogênicas e nodulares do fígado, bem como através de sinais de hipertensão
portal. Todavia, o ultra-som é altamente dependente de um operador treinado e na
presença do aumento da ecogenicidade hepática não há como diferenciar entre
esteatose hepática e fibrose (BATALLER & BRENNER, 2005).
Os métodos de imagem devem fazer parte do acompanhamento de pacientes
portadores de cirrose de etiologia viral, devido à alta freqüência de surgimento de
CHC. A cada três ou quatro meses, os pacientes devem ser examinados,
submetidos ao exame ultra-sonográfico (ou tomográfico) e avaliados
laboratorialmente para determinar se está havendo elevação dos níveis séricos da α-
fetoproteína. Confirmada a presença de nódulos intra-hepáticos, a biópsia
transcutânea guiada por algum método de imagem pode confirmar a presença da
neoplasia (FOCACCIA, 2003).
1.4 Retinóides como Biomarcadores de Patologias
Os biomarcadores podem ser definidos como quaisquer variáveis genéticas,
imunológicas ou bioquímicas que podem ser detectadas e medidas revelando os
processos biológicos normais, patogênicos ou a resposta farmacológica após a
intervenção terapêutica. Nas doenças inflamatórias crônicas, nas neoplasias e nos
processos infecciosos, estes marcadores se relacionam com a atividade ou remissão
do processo patológico, possuindo um importante valor preditivo de evolução clínica
e contribuindo para a escolha do tratamento adequado (SCHRIEFER & CARVALHO,
2008).
53
INTRODUÇÃO
Vários estudos têm demonstrado que os retinóides podem ser usados como
biomarcadores de vários tipos de cânceres, uma vez que as concentrações
plasmáticas ou sorológicas do retinol e seus metabólitos ativos estão inversamente
associadas com a incidência e/ou risco de desenvolvimento de tumores.
Fontham (1990) mostrou que indivíduos com baixa ingestão de retinóides e
carotenóides (pró-vitamina A) possuem alto risco de desenvolver câncer. Hong e
colaboradores (1990) demonstraram que os retinóides decrescem a incidência de
tumores primários e secundários de pescoço e cabeça. Ching e colaboradores
(2002) encontraram que as altas concentrações sorológicas de retinol estavam
significativamente associadas com a redução do risco de câncer de mama.
Peres (2006) também demonstrou que o retinol sérico pode ser um sensível
biomarcador de doenças hepáticas crônicas, uma vez que, as concentrações basais
deste retinóide se correlacionam positivamente com a albumina e negativamente
com as variáveis BT, TAP (segundos acima do controle), razão normalizada
internacional (INR), AST, AST/ALT, FA e α-fetoproteína.
Assim, a utilização de retinóides como biomarcadores, através da sua
quantificação em matrizes biológicas, pode ser muito útil na prática clínica de forma
a avaliar o risco para desenvolvimento de doenças hepáticas crônicas e tumores.
1.5 Métodos Analíticos para Quantificação de Retinóides Séricos
Devido à estrutura poliênica conjugada do retinol, ensaios colorimétricos,
como o método de Carr-Price, podem ser utilizados para a análise de vitamina A.
Neste ensaio, o sistema poliênico dos retinóides é protonado por um ácido forte,
como o ácido trifluoroacético em solvente orgânico levando a formação de uma cor
azul de grande intensidade e, assim, fornecendo um ensaio muito sensível e seletivo
para a análise de vitamina A e estudo de seu metabolismo. Embora, esse método
tenha sido utilizado durante muitos anos, os reagentes requeridos são corrosivos e
nocivos e, por isso, hoje, praticamente caiu em desuso (FURR, 2004).
Outra vantagem da estrutura poliênica é a alta absortividade molar dos
retinóides, que são capazes de absorver luz nas regiões do visível e UV do espectro
eletromagnético (FURR, 2004). Por esta razão, a espectrofotometria no UV tem sido
um método de largo emprego na quantificação de retinóides em matérias-primas
(WYSS, 1990).
54
INTRODUÇÃO
Para a análise de retinóides em fluidos biológicos, a técnica mais utilizada é a
CLAE-UV (WYSS, 1995; GUNDERSEN & BLOMHOFF, 2001), porém outros detectores
como de fluorescência (retinol e ésteres de retinila são fluorescentes em solventes
orgânicos apolares, enquanto os outros retinóides não são), índice de refração,
eletroquímicos e espectrômetro de massas também sejam utilizados (WINGERATH et
al., 1999; FURR, 2004
Embora a CLAE-UV seja a técnica mais utilizada, ela apresenta como
inconveniente o fato da separação e identificação dos retinóides serem complicadas
pela ocorrência de isômeros cis/trans e pela similaridade de espectro de absorção
entre essas substâncias (WINGERATH et al., 1999; GUNDERSEN & BLOMHOFF, 2001).
Uma técnica de identificação complementar como a espectroscopia de
ressonância magnética nuclear (RMN) pode ser utilizada, por ser importante na
determinação estrutural e particularmente útil para distinguir os isômeros cis de trans
(FURR, 2004). O inconveniente desta técnica é que apesar de ser empregada em
alguns laboratórios de pesquisa, ainda não está acessível à rotina clínica (DOOLEY,
2003).
A cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de
massas (CLAE-EM) é uma técnica analítica útil para a análise de retinóides porque
combina o poder de resolução da CLAE com a especificidade e sensibilidade da
espectrometria de massas (EM). Todos os retinóides podem gerar íons sob
condições acidificadas. O retinol e seus ésteres são desidratados sob condições
ácidas gerando o fragmento com m/z 269 [M-17]
+
. Para o ácido retinóico, o
espectrômetro de massas pode ser operado também em modo negativo
(GUNDERSEN & BLOMHOFF, 2001).
A cromatografia gasosa (CG) tem sido pouco utilizada para a análise de
retinóides devido à instabilidade térmica e a volatilidade limitada dessas substâncias
(FURR, 2004). A análise quantitativa de retinóides utilizando a cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) requer hidrólise dos ésteres de
retinila e derivatização do retinol e ácido retinóico. A etapa de hidrólise elimina toda
informação relativa aos ésteres de retinila e a alta temperatura do CG destrói toda
informação a respeito dos isômeros geométricos cis e trans (VAN BREEMEN et al.,
1998, HYÖTYLÄINEN & RIEKKOLA, 2005).
55
INTRODUÇÃO
1.5.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a
Espectrometria de Massas
O acoplamento do detector de EM à técnica de cromatografia líquida permite
que os compostos pré-separados pela cromatografia sejam identificados e
quantificados com alto grau de seletividade, sensibilidade e confiabilidade. Assim,
substâncias presentes em amostras complexas, como os fluidos biológicos, podem
ser analisadas livres de interferentes, evitando resultados falsos positivos ou
negativos, além de diminuir o tempo de análise, tornando o método de CLAE-EM
adequado ao emprego na clínica.
A EM é uma técnica que envolve a ionização e/ou fragmentação de
moléculas, seguida pela separação e quantificação de um fragmento caracterizado
pela relação massa/carga (m/z) (DOOLEY, 2003).
A alta seletividade da técnica de EM está relacionada com sistemas de
triploquadrupolo. Nestes equipamentos, ocorre seleção do íon precursor ou íon ―pai‖
no primeiro quadrupolo (Q1), a fragmentação deste íon selecionado na célula de
colisão (Q2), onde um gás inerte (Hélio ou Argônio) colide em baixa energia,
gerando fragmentos iônicos denominados íons secundários ou íons ―filhos‖, que
serão selecionados no terceiro quadrupolo (Q3) (Figura 8). Quando a técnica ocorre
desta maneira, ou seja, através da seleção de íon precursor e íon secundário, ela é
conhecida como espectrometria de massas em seqüência (EMS).
Figura 8. Esquema do espectrômetro de massas triplo quadrupolo (APPLIED BIOSYSTEMS, 2003).
56
INTRODUÇÃO
A técnica de ionização utilizada nos instrumentos de CLAE-EM e CLAE-EMS
é a Atmospheric Pressure Ionization (API), podendo esta ser dividida em ESI
(Eletrospray Ionization), APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) e APPI
(Atmospheric Pressure PhotoIonization) (APPLIED BIOSYSTEMS, 2003).
Na ionização por ESI, o líquido no qual o analito de interesse encontra-se
dissolvido (fase móvel - FM) passa através de um capilar, à pressão atmosférica,
mantido sob alta voltagem. O alto campo elétrico na ponta do capilar gera um
acúmulo de cargas na superfície do líquido por migração eletroforética e, assim, na
saída do capilar são formadas pequenas gotas altamente carregadas (―spray
eletrostático‖) que são dessolvatadas ao se deslocarem em sentido contrário ao
posicionamento de um eletrodo. A dessolvatação é assistida por um fluxo contínuo
de gás seco (geralmente Nitrogênio) na região do spray. À medida que ocorre a
dessolvatação, o tamanho das gotas é reduzido e há um aumento na densidade de
cargas até o ponto em que a força de repulsão entre as cargas similares fica maior
que as forças de coesão da fase líquida (tensão superficial). Neste momento ocorre
a explosão coulômbica, formando gotas menores. Uma série de explosões passa
ocorrer até que são formados íons do analito a partir dessas gotas, os quais são
transferidos para o interior de espectrômetro de massas (Figura 9) (APPLIED
BIOSYSTEMS, 2003; CHIARADIA et al., 2008).
Figura 9. Esquema do modo de ionização por ESI (CANTÚ et al., 2008).
57
INTRODUÇÃO
Como em ESI, a ionização ocorre diretamente em solução, compostos
sensíveis à temperatura podem ser ionizados sem sofrer degradação. Este modo de
ionização pode ser aplicado aos compostos com massas molares grandes e àqueles
altamente polares que podem ser facilmente ionizados.
Na ionização por APCI, o eluente da coluna cromatográfica passa através de
um nebulizador pneumático, no qual as gotas são geradas e dessolvatadas. O spray
formado passa através de uma região aquecida, na qual o vapor é seco, formando
espécies neutras que passam através de uma corona de descarga que possui um
campo suficiente para gerar ionização. Como o solvente encontra-se em maior
concentração no spray do que o analito, a FM é ionizada preferencialmente e
passam a ocorrer reações entre estes íons em fase gasosa e as moléculas neutras
do analito, o que dá origem aos íons do analito.
Uma vez que a ionização ocorre em fase gasosa, a APCI pode ser
considerada uma fonte complementar a ESI, pois é aplicável a compostos apolares
ou de média polaridade, voláteis e termicamente estáveis (CHIARADIA et al., 2008).
A APPI é semelhante à APCI, porém no lugar da corona de descarga, a APPI
possui uma lâmpada de UV cuja função é ocasionar a ionização das moléculas do
analito presente nas gotículas de spray. A APPI é aplicada a compostos apolares,
como os hidrocarbonetos policíclicos (APPLIED BIOSYSTEMS, 2003).
A importância da técnica de CLAE-EM é evidenciada pelo número de artigos
publicados no United States National Library of Medicine (MEDLINE), onde em 10
anos (1993-2003), ocorreu um aumento no número de publicações envolvendo essa
metodologia de 310% (GELPÍ, 2003).
Particularmente nas análises clínicas, o desenvolvimento desta técnica
promoveu importante avanço nos métodos de diagnóstico e rastreamento de
algumas doenças, como aminoacidopatias, acidemias orgânicas e distúrbios da
beta-oxidação dos ácidos graxos que são detectados no teste do pezinho
expandido. Nos últimos dez anos, a otimização da relação custo-benefício superou a
resistência ao seu emprego, inicialmente demonstrada por autoridades da área de
saúde de alguns países (RASHED, 2001).
58
INTRODUÇÃO
1.5.2 Métodos de Extração de Retinóides a partir da Amostra Biológica
Além da escolha do método de detecção, na quantificação de retinóides
merece especial atenção o método de extração do analito. Este se encontra no soro
ou plasma, normalmente em baixas concentrações e, devido a sua baixa
estabilidade, o processo de extração e a própria análise, deve ter um tempo de
execução breve e brando (HYÖTYLÄINEN & RIEKKOLA, 2005).
Os procedimentos de extração para os retinóides consistem principalmente de
extração por precipitação de proteínas (EPP) e extração líquido-líquido (ELL),
embora a extração em fase sólida (EFS) on-line e off-line também sejam utilizadas
(WYSS, 1995).
A EPP é realizada pela diminuição da solubilidade das proteínas em meio
aquoso, pela adição de um solvente orgânico miscível em água ou pela diminuição
do pH da solução. A adição de solventes imiscíveis em água como hexano,
clorofórmio, acetato de etila e metil-tert-butil-éter (MTBE) pode não levar a
precipitação de proteínas. Dependendo do solvente, dois a quatro volumes deve ser
adicionado para alcançar a remoção quantitativa de proteínas (GUNDERSEN &
BLOMHOFF, 2001).
A ELL clássica para a remoção de retinóides é feita através da adição de um
solvente imiscível em água após a precipitação de proteínas, agitação vigorosa por 5
a 10 minutos, centrifugação e remoção da fase orgânica numa frequência de 1 a 3
vezes. A fase orgânica é enriquecida e o solvente é removido por vácuo ou pela
ação de um gás inerte. O resíduo pode ser dissolvido na fase móvel ou em outro
solvente como metanol. Solventes comuns para a extração são hexano, acetona,
éter de petróleo, clorofórmio, diclorometano, acetato de etila e mistura desses
(GUNDERSEN & BLOMHOFF, 2001).
Após a precipitação de proteínas, o sobrenadante pode também ser
submetido à EFS. A fase sólida é freqüentemente sílica modificada com grupos
alquil. O cartucho extrator contendo a fase sólida pode ser lavado com volumes de
acetonitrila-água ou metanol-água e eluído pela gravidade, vácuo ou pressão
positiva. A eluição das substâncias extraídas pode ser feita pela passagem de um
solvente com força de eluição forte como metanol. O eluído pode ser injetado
diretamente ou evaporado e dissolvido num pequeno volume de fase móvel. A
extração em fase sólida pode ser feita manualmente ou por sistemas automáticos
59
INTRODUÇÃO
que podem ser off-line ou on-line. A vantagem dos equipamentos on-line é dispensar
a manipulação da amostra pelo analista entre a extração e injeção (GUNDERSEN &
BLOMHOFF, 2001).
A EPP e a ELL apresentam as vantagens de serem simples e compatível com
o uso de grande número de solventes puros e disponíveis comercialmente, porém
são trabalhosas, lentas e apresentam o risco de oxidação e isomerização do analito
(QUATTROCCHI et al., 1992).
Na EFS, ocorre diminuição na possibilidade de contaminação da amostra e do
analista; ausência de perda do analito por evaporação e a análise da totalidade do
material da matriz biológica concentrada (HENNION, 1999).
A EFS processa-se em pequenas colunas ou cartuchos de plástico revestidos
por material similar aos empregados nas colunas de CLAE (COLLINS & JARDIM, 2001).
Em geral, os procedimentos de EFS contêm quatro etapas: (1)
condicionamento da fase sólida pelo emprego de solvente/solução adequado para
ajustar as forças do solvente de eluição com o solvente da amostra; (2) carga da
amostra, quando ocorre a retenção do analito e, às vezes, de alguns interferentes;
(3) lavagem da fase sólida para retirar os interferentes menos retidos que o analito;
(4) eluição do analito (figura 10).
Figura 10. Etapas da extração em fase sólida (GILSON GUIDE TO SPE AUTOMATION, 1997).
60
INTRODUÇÃO
1.5.3 Desenvolvimento de Metodologia Analítica
Os métodos analíticos para a quantificação de fármacos e metabólitos em
amostras biológicas desempenham um papel determinante na avaliação e
interpretação dos resultados decorrentes de ensaios pré-clínicos, clínicos e
biofarmacêuticos. Nesse contexto, a validação de um método analítico assume
papel fundamental no reconhecimento e confiabilidade dos dados obtidos a partir do
emprego dessa metodologia.
O desenvolvimento de um novo método analítico é a fase mais crítica de todo
o processo de quantificação de um fármaco, podendo ser mais simples ou complexo
dependendo do analito de interesse, da matriz em que se encontra e da experiência
do investigador. O desenvolvimento da metodologia de quantificação poderá
envolver apenas a adaptação de um método já existente às novas condições
laboratoriais ou implicar em metodologia inovadora, requerendo um trabalho mais
completo. Geralmente, um método analítico bem desenvolvido será fácil de validar,
ou seja, os critérios de aceitação dos parâmetros de validação que asseguram a
aceitabilidade do método serão certamente cumpridos.
1.5.4 Validação de Metodologia Analítica
Antes da implantação de um método analítico é necessário que ele seja
validado. A validação da metodologia analítica é a confirmação por exame e
fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um
determinado uso pretendido são atendidos (BARROS, 2002; BRITTO et al., 2003,
RIBANI et al., 2004). O objetivo da validação é demonstrar que os resultados obtidos
com a metodologia são confiáveis (CAUSON, 1997; HUBERT et al., 1999).
A validação é necessária sempre que se desenvolve um método ou se efetua
adaptações em metodologias já validadas, inclusão de novas técnicas ou uso de
diferentes equipamentos (BRITTO et al., 2003).
No Brasil, a validação da metodologia analítica deve seguir os parâmetros
preconizados por uma das duas agências credenciadoras às quais os laboratórios
que executam as análises devem submeter-se: a Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (Anvisa) ou o Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade
Industrial (Inmetro). Cada um desses órgãos disponibiliza guias para o procedimento
61
INTRODUÇÃO
de validação de métodos analíticos, respectivamente a Resolução-RE N° 899, de 29
maio de 2003 e o documento Inmetro DOQ-CGCRE-008, de março de 2003 (RIBANI
et al., 2004).
Segundo o guia da Anvisa, a validação deve garantir, por meio de estudos
experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas e para
tanto deve apresentar especificidade/seletividade, linearidade, precisão, exatidão,
limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ), estabilidade e recuperação,
adequados à análise. A determinação da maioria desses parâmetros de validação
requer a construção de curvas de calibração.
Curva de calibração e critérios de aceitabilidade
Uma curva de calibração está associada ao modelo matemático que
estabelece uma relação entre a resposta do instrumento (área do sinal
cromatográfico) e a concentração conhecida do analito. Para a construção da curva
de calibração é necessário escolher um método de padronização. Normalmente, o
método escolhido para a análise fármacos em fluidos biológicos é a padronização
interna. Neste método, a curva de calibração inclui uma amostra denominada branco
(matriz biológica sem adição de padrão de fármaco e padrão interno - PI), uma
amostra denominada zero (matriz biológica sem adição de padrão de fármaco,
porém com adição de PI) e seis amostras de concentrações diferentes contendo
tanto o padrão de fármaco quanto o PI.
Para que uma curva de calibração seja aceita, deve-se obter:
- desvio menor ou igual a 20% em relação à concentração nominal para o
limite inferior de quantificação (LIQ);
- desvio menor ou igual a 15% em relação à concentração nominal para as
outras concentrações da curva de calibração;
- no mínimo quatro das seis concentrações da curva de calibração devem
cumprir com os critérios anteriores, incluindo o LIQ e a maior concentração da curva
de calibração;
- o coeficiente de correlação linear deve ser igual ou superior a 0,98 (BRASIL,
2003).
62
INTRODUÇÃO
- Métodos de Padronização
(a) Padronização interna
O método de padronização interna consiste na preparação de padrões de
calibração contendo diferentes concentrações do analito e uma concentração
constante de PI (CASSIANO et al., 2009). O PI é um composto, geralmente com
características estruturais similares ao analito e idealmente deve possuir tempo de
retenção próximo ao mesmo, não deve reagir com o analito ou com qualquer outro
componente da matriz, além de precisar ser bem cromatografado em relação aos
outros componentes da amostra.
Para a quantificação da substância de interesse, inicialmente, analisam-se os
padrões de calibração e se constrói a curva de calibração, relacionando as razões
de áreas (área do analito / área do PI). Posteriormente, analisam-se as amostras de
concentração desconhecida adicionando-se a mesma quantidade de PI que foi
adicionada aos padrões de calibração e através da razão de áreas obtidas no
cromatograma tem-se a concentração do analito na amostra (RIBANI et al., 2004).
(b) Padronização externa
No método de padronização externa compara-se a área da substância a ser
quantificada na amostra com as áreas obtidas a partir de soluções de concentrações
conhecidas preparadas a partir de um padrão. Assim, uma curva é obtida a partir da
preparação de amostras com diversas concentrações, relacionando-se as áreas com
as concentrações. Depois, se utiliza a equação desta curva para calcular a
concentração de uma amostra desconhecida a partir da área obtida na sua injeção.
Este método é mais sensível a erros de preparo de soluções e de amostra (RIBANI et
al., 2004).
(c)Adição de Padrão
Este método consiste na adição de diferentes concentrações do analito à
matriz, que já contém uma quantidade desconhecida do mesmo. A adição deve ser
feita antes do processo de tratamento da amostra. A concentração do analito na
matriz biológica é determinada pela extrapolação da reta definida pelas demais
concentrações analisadas até o ponto onde a mesma corta o eixo das ordenadas.
63
INTRODUÇÃO
O método de adição padrão é trabalhoso, mas é especialmente importante
quando a amostra é muito complexa, quando as interações com a matriz são
significativas e quando houver dificuldade de encontrar um padrão interno adequado
ou uma matriz isenta da substância de interesse (CASSIANO et al., 2009).
Especificidade/Seletividade
A especificidade e/ou seletividade é a capacidade do método analítico em
avaliar o analito na presença de outros componentes que possam estar presentes
na amostra, tais como metabólitos, impurezas, compostos de degradação ou
componentes de matriz (BRASIL, 2003). A seletividade garante que o pico de
resposta seja exclusivamente do composto de interesse (RIBANI et al., 2004). Se a
seletividade não for assegurada, os outros parâmetros da validação estarão
comprometidos.
Existe certa confusão na utilização dos termos seletividade e especificidade,
de forma que a resposta que um método bioanalítico apresenta para as diversas
substâncias presentes em uma amostra é chamada de seletividade, enquanto que a
habilidade que um método possui de responder a uma única substância é chamada
de especificidade (CASSIANO et al., 2009). Como existem poucos métodos
cromatográficos que respondam a apenas uma substância, o termo seletividade é
mais apropriado, sendo sugerida sua utilização pela IUPAC (RIBANI et al., 2004).
Existem vários ensaios para avaliar a seletividade e, segundo a Anvisa,
deve-se realizar a análise de amostras branco (matriz isenta do analito) de seis
indivíduos diferentes e comparar com a matriz enriquecida com o analito, sendo que,
nenhum interferente deve eluir no mesmo tempo de retenção da substância de
interesse.
No caso do retinol e ácido retinóico, não é possível obter a matriz biológica
isenta desses analitos, uma vez que eles são retinóides endógenos, e por isso, o
ensaio de seletividade não foi realizado.
Linearidade
A linearidade corresponde à capacidade do método de fornecer resultados
diretamente proporcionais à concentração do analito (BRASIL, 2003). Ela é
64
INTRODUÇÃO
determinada com auxilio de uma curva de calibração construída para determinar as
concentrações do analito numa faixa de concentração definida entre o LIQ e o limite
superior de quantificação (LSQ).
Precisão
Representa o grau de repetibilidade dos resultados de análises individuais,
quando o procedimento é aplicado diversas vezes numa mesma amostra
homogênea, em idênticas condições de ensaio (BRASIL, 2003).
A precisão é avaliada utilizando-se no mínimo três concentrações (baixa –
CQ_CB, média – CQ_CM e alta – CQ_CA), que são conhecidas como controles de
qualidade (CQ). Deve-se realizar, no mínimo, cinco determinações de cada CQ e a
precisão deve ser determinada intra-corrida (em uma mesma corrida) e inter-corrida
(em corridas diferentes).
A precisão é expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de
variação (CV%), não se admitindo valores superiores a 15%, segundo a fórmula:
DPR = DP x 100
CMD
Onde: DP é o desvio padrão e CMD é a concentração média determinada.
Exatidão
Representa o grau de concordância entre os resultados individuais
encontrados e um valor aceito como referência (BRASIL, 2003).
É determinada da mesma maneira que a precisão, porém a exatidão é
expressa pela fórmula:
Exatidão = Concentração média experimental x 100
Concentração teórica
Limite de Detecção (LD)
É a menor concentração de uma analito em uma amostra que pode ser
detectada, mas não necessariamente quantificada, sob determinadas condições
experimentais (BARROS, 2002; RIBANI et al., 2004).
65
INTRODUÇÃO
O LD é determinado por meio da análise de soluções de concentrações
conhecidas e decrescentes do analito, até que a relação sinal: ruído da linha de
base seja de 3:1 ou 2:1.
Limite Inferior Quantificação (LIQ)
Menor quantidade de um analito numa amostra que pode ser determinada
quantitativamente com precisão e exatidão aceitáveis. É determinado por meio da
análise de matriz biológica contendo concentrações decrescentes do analito até que
se obtenha uma razão sinal:ruído da linha de base de 5:1, ou ainda, através do sinal
de resposta no LIQ que deve ser reprodutível com precisão de 20% e exatidão de
80-120%, através da análise do no mínimo cinco amostras.
Estabilidade
Parâmetro que visa determinar se um analito mantém-se quimicamente
inalterado numa dada matriz sob condições específicas, em determinados intervalos
de tempo.
A estabilidade deve ser estabelecida em soluções-estoque, amostras
biológicas e amostras processadas (CAUSON, 1997), sendo determinada em curta
duração, longa duração, após ciclos de congelamento e descongelamento da
amostra e pós-processamento.
As estabilidades devem ser avaliadas com no mínimo três amostras de
concentrações baixa e alta. Na estabilidade de curta duração, as amostras devem
permanecer em temperatura ambiente de 4 à 24h e analisadas. Os resultados
devem ser comparados com amostras recém-preparadas (BRASIL, 2003).
Na estabilidade após ciclos de congelamento e descongelamento, as
amostras devem ser congeladas à temperatura indicada para armazenamento e
mantidas por 24h, sendo então submetidas ao descongelamento à temperatura
ambiente e quando completamente descongeladas, as amostras devem ser
novamente congeladas por 12 à 24h, repetindo este ciclo pelo número de vezes que
amostras serão descongeladas no estudo (BRASIL, 2003).
Quando são utilizados equipamentos que empregam sistemas automáticos de
injeção, o estudo de estabilidade pós-processamento também deve ser realizado.
Neste caso, três amostras de concentração baixa e alta devem ser preparadas e
66
INTRODUÇÃO
devem aguardar para serem injetadas por um período de tempo maior do que a
duração de uma corrida analítica. Os resultados devem ser comparados com CQ
recém-preparados (BRASIL, 2003).
Recuperação
As amostras biológicas não podem ser analisadas diretamente, devendo ser
previamente submetidas a processos de preparação mais ou menos complexos,
para eliminar possíveis substâncias interferentes.
Todas estas etapas de pré-tratamento das amostras conduzem,
inevitavelmente, a perdas nos analitos, sendo importante estimar a capacidade de
recuperação destes a partir da matriz biológica. Na metodologia bioanalítica,
especialmente em procedimentos cromatográficos, é muito comum a adição de um
PI às amostras antes da respectiva preparação. A adição do PI tem por objetivo
considerar as perdas que ocorrem durante o processo de extração e análise
cromatográfica, ou seja, uma variação na resposta do PI refletirá de forma similar na
resposta do analito porque ambos serão processados em conjunto.
A eficiência de extração de um método analítico, expressa como a
porcentagem da quantidade conhecida de um analito, é obtida através da
comparação dos resultados analíticos de amostras branco acrescidas de padrão, e
submetidas ao processo de extração, com os resultados analíticos de soluções
padrão não extraídas. São desejáveis porcentagens de recuperação próximas de
100%, porém valores menores são admitidos desde que a recuperação seja precisa
e exata (BRASIL, 2003).
A recuperação é analisada comparando-se os resultados de amostras
extraídas a partir de três concentrações (baixa, média e alta) com os resultados
obtidos com soluções padrão não extraídas, que correspondem a 100% de
recuperação.
2
JUSTIFICATIVA
68
JUSTIFICATIVA
A doença hepática crônica é caracterizada por alterações na estrutura e na
capacidade funcional dos hepatócitos, levando à morte celular e formação de
nódulos de regeneração que dificultam a troca de substâncias entre o sangue e as
células hepáticas. Devido ao papel central do fígado nas inúmeras vias bioquímicas
relacionadas com a produção, modificação e utilização de macro- e micronutrientes,
o próprio curso da doença hepática leva a anormalidades metabólicas, propiciando o
desenvolvimento ou agravamento da desnutrição que é relativamente comum em
pacientes acometidos por essa enfermidade.
Este trabalho surgiu a partir da necessidade de continuidade de um estudo de
reserva hepática de vitamina A em pacientes com doença hepática crônica em todos
os graus: hepatite, cirrose Child A, cirrose Child B, cirrose Child C e cirrose
associada ao CHC.
Inicialmente, este estudo foi realizado pela professora Wilza Arantes Ferreira
Peres em sua tese de doutorado “Relação entre o estado nutricional de vitamina
A, estágios da doença e parâmetros bioquímicos de função e lesão hepática
em pacientes com hepatite crônica, cirrose hepática e carcinoma hepatocelular
pelo vírus da hepatite C”. Nessa tese, seu objetivo principal foi avaliar a reserva
hepática de retinol em pacientes com doença hepática crônica causada pelo vírus C
para planejar uma suplementação adequada deste nutriente. O procedimento de
suplementação adequada assume importância na doença hepática grave, pois
enquanto a deficiência de vitamina A pode colaborar com o desenvolvimento de
cirrose e CHC, o excesso desse nutriente pode ser ainda mais prejudicial, pelo fato
do retinol ser hepatotóxico.
A reserva nutricional de vitamina A foi avaliada pelo teste de resposta relativa
à dose (RDR) padrão e como resultados de seu trabalho, Peres descreveu a
necessidade de uma adaptação deste teste, utilizando dose de palmitato de retinila e
tempo de colheita de amostras no protocolo clínico maiores, devido ao fato da
maioria dos pacientes possuírem idade avançada, o que pode acarretar uma
redução na velocidade de absorção da vitamina A.
A partir desta necessidade, desenvolveu-se o projeto de tese intitulado
“Adaptação do teste de avaliação indireta da reserva hepática de retinol para
diagnóstico do estado nutricional de vitamina A em pacientes com cirrose
hepática e carcinoma hepatocelular”. Esta tese foi submetida ao Programa de
69
JUSTIFICATIVA
Pós Graduação em Clínica Médica – Setor de Hepatologia do Hospital Universitário
Clementino Fraga Filho – HUCFF pela doutoranda Gabriela Villaça Chaves, sob
orientação das professoras Dra. Rejane Andréa Ramalho Nunes da Silva e Dra.
Wilza Arantes Ferreira Peres.
O desenvolvimento deste trabalho sob a orientação do Professor Dr. José
Carlos Saraiva Gonçalves, surge da hipótese de que a razão entre as concentrações
séricas de retinol e ácido retinóico seja um biomarcador de dano hepático mais
fidedigno do que os retinóides (retinol e ácido retinóico) empregados isoladamente.
Justifica-se esta hipótese na medida em que a biotransformação do retinol ao ácido
retinóico depende de sistemas enzimáticos hepáticos. Tanto o retinol, como o ácido
retinóico já foram descritos como parâmetros bioquímicos de evolução de
patologias. A razão entre esses produtos, no entanto, ao nosso conhecimento, ainda
não foi descrita como eventual biomarcador de hepatopatias.
3
OBJETIVOS
71
OBJETIVOS
3.1 Objetivo Principal
Desenvolver e validar metodologia analítica por CLAE-EMS para quantificação
simultânea das concentrações séricas de retinol e ácido retinóico aplicável na
rotina hospitalar.
3.2 Objetivos Secundários
1. Determinar as concentrações séricas de retinol e ácido retinóico em
pacientes com cirrose hepática divididos em dois grupos de acordo com a dose
desafio: 1500 UI e 2500 UI de palmitato de retinila.
2. Investigar a influência da dose desafio (1500 UI e 2500 UI) de palmitato de
retinila nas concentrações plasmáticas de retinol, ácido retinóico e na razão entre
essas concentrações, quando relacionadas com os marcadores bioquímicos de
dano hepático.
3. Investigar a influência do tempo de colheita da amostra sangüínea (5 horas
e 7 horas) após a administração da dose de suplementação nas concentrações
plasmáticas de retinol, ácido retinóico e na razão entre essas concentrações,
quando relacionadas com os marcadores bioquímicos de dano hepático.
4. Investigar a relação entre as concentrações séricas de retinol, ácido
retinóico e a razão entre as concentrações destes retinóides, com os marcadores
bioquímicos de função hepática (TAP, BT e albumina) e lesão hepática (ALT e
AST).
4
MATERIAL E
MÉTODOS
73
MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Desenho do Estudo
Trata-se de um estudo de desenvolvimento e validação de metodologia
analítica para quantificação de retinol e ácido retinóico e para a descrição dos
perfis das concentrações destes retinóides em pacientes com cirrose Child A,
incluindo as etiologias viral, alcoólica e criptogênica.
A população estudada foi constituída de pacientes (de ambos os sexos,
independente de etnia e classe social) atendidos no Ambulatório do Serviço de
Hepatologia do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho – HUCFF/UFRJ no
período de outubro de 2007 a março de 2010.
Os pacientes foram divididos em dois grupos: o primeiro seguiu o protocolo
RDR padrão (dose de 1500 UI de palmitato de retinila e colheitas de amostras nos
tempos de 0 e 5 horas), adicionando a este protocolo o tempo de colheita de 7
horas. O outro grupo recebeu uma dose de 2500 UI de palmitato de retinila (dose
desafio) sendo realizadas colheitas nos tempos 0, 5 e 7 horas (figura 11).
Figura 11. Organograma do desenho do estudo
A colheita de sangue no tempo zero (basal) foi realizada após 12 horas de
jejum noturno. Depois da colheita de sangue, foi administrado por via oral, 1500
UI ou 2500 UI de palmitato de retinila (UNICEF, Batch, 948 R.P Schem PTY.Co,
Melbourne, Austrália) diluído em 1 mL de solução oleosa. Em seguida, os
pacientes receberam desjejum padrão (teor total estimado de 9,7g de lipídeos e
378 μg de equivalente de atividade de retinol (RAE) de vitamina A) composto de
200 mL de achocolatado, duas fatias de pão de forma, margarina e queijo tipo
prato, a fim de garantir a absorção do palmitato. Após o intervalo de 5 horas, foi
74
MATERIAL E MÉTODOS
realizada a segunda colheita de sangue e, de 7 horas, a terceira colheita. Durante
este período, os pacientes foram orientados a não consumir nenhum alimento,
sendo permitido somente o consumo de água.
As amostras colhidas foram submetidas à centrifugação a 3000 rpm, por 10
minutos para separação e extração do soro. A seguir, as amostras foram
armazenadas em tubos plásticos (eppendorfs) previamente rotulados, envolvidos
em papel alumínio e novamente etiquetados, para armazenamento imediato em
freezer à temperatura de -80 ºC até o momento das análises.
O protocolo RDR é um método de avaliação indireta da reserva hepática de
retinol. Este protocolo baseia-se no princípio de que, na depleção hepática de
retinol, a apo-RBP (proteína de transporte dos retinóides no sangue), cuja síntese
independe da disponibilidade de retinol, se acumula nos hepatócitos. Diante da
administração de uma pequena dose de retinol (normalmente inferior às
recomendações diárias desta vitamina), este se liga à RBP, formando a holo-
RBP, e é liberado para a corrente sangüínea. Desta forma, o incremento nos
níveis séricos é rápido e sustentado por um período médio de 5 horas, de maneira
que os valores séricos do retinol antes e 5 horas após a administração da dose
devem ser significativamente diferentes (LOERCH et al., 1979).
No teste RDR é administrada uma dose de 1500 UI de palmitato de retinila
utilizada para provocar resposta no tempo de 5 horas. Porém, Mobarhan e
colaboradores (1981), em estudo com pacientes cirróticos, encontraram falta de
RDR positiva em alguns indíviduos e observaram que eles possuíam uma má
absorção ou ainda uma absorção lenta da dose. Além disso, Bulux e
colaboradores (1992) encontraram baixo clearence pós-prandial de lipídeos e
ésteres de retinila na circulação de pacientes idosos e, como a vitamina A
absorvida depende do clerance dos QMs para levá-la do intestino ao fígado, onde
ela será ligada a apo-RBP, os autores sugerem um tempo de 7 horas para RDR
em indivíduos após 60 anos e, por isso, realizamos uma colheita também neste
intervalo após a administração do palmitato de retinila. A utilização da dose de
1500 UI no protocolo RDR é baseada nas respostas características obtidas com
indivíduos saudáveis e, segundo o estudo de Mobarhan e colaboradores (1981), a
dosagem utilizada pode ter sido abaixo da dose necessária para obter resposta
em pacientes que possuem doença hepática associada à absorção limitada de
75
MATERIAL E MÉTODOS
retinóides e, por isso, resolvemos administrar uma dose maior (2500 UI) para
avaliar a resposta desses indivíduos.
4.2 Aspectos Éticos
O presente estudo tem aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de
Janeiro (Protocolo de Pesquisa nº 068/01 – CEP).
4.3 Recrutamento de Pacientes
A inclusão de cada paciente no estudo foi realizada mediante autorização
formal, por meio da assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(Anexo 1), após explicação sobre os objetivos e procedimentos do projeto por
parte de um pesquisador do Núcleo de Pesquisa em Micronutrientes – NPqM do
Instituto de Nutrição Josué de Castro – UFRJ, de acordo com a Resolução Nº 196
de 10/10/1996 do Conselho Nacional de Saúde. Em contrapartida à sua
participação no estudo, os pacientes receberam diagnóstico do estado nutricional
de vitamina A e orientação dietética.
- Critério de Inclusão
Cirrose hepática diagnosticada pela presença de nódulos de regeneração
ao exame histopatológico do fígado ou, na ausência de biópsia, pela presença de
achados clínicos de insuficiência hepática (edema, ascite, icterícia, encefalopatia
hepática – EH) e hipertensão porta (varizes do esôfago, hiperesplenismo ou
achados ultra-sonográficos)
- Critérios de Exclusão
1. Síndromes Disabsortivas;
2. Infecção de moderada a severa gravidade;
3. Diabetes Mellitus insulino-dependente e/ou descompensada;
4. Insuficiência renal, cardíaca ou respiratória;
76
MATERIAL E MÉTODOS
5. Amiloidose;
6. Uso de doses terapêuticas de vitamina A, nos últimos 30 dias;
7. Doenças crônicas não estáveis;
8. Gravidez;
9. Alcoolismo crônico;
10. Neoplasias.
4.4 Instrumento de Coleta de Dados
O instrumento que foi empregado na coleta de dados é constituído de
formulário preenchido pelo pesquisador do Núcleo de Pesquisa em
Micronutrientes – NPqM (Anexo 2), por meio de entrevista e consulta de
prontuários.
4.5 Classificação da Gravidade da Cirrose Hepática
Os pacientes com cirrose hepática foram avaliados em relação à presença
de insuficiência hepática por meio da classificação de Child & Pugh (1973) que os
divide em três grupos (A, B e C) de acordo com a presença e o grau de ascite,
EH, alterações nos níveis de albumina, bilirrubina total (BT) e TAP em segundos.
Essas variáveis são pontuadas de 1 a 3 e é geralmente aceito, embora não
universalmente, que pacientes com somatórios entre 5-6 pontos pertencem ao
grupo A, entre 7-9 pontos ao grupo B e entre 10-15 pontos ao grupo C
(CHRISTENSEN, 1997) (Quadro 3).
Quadro 3. Classificação da gravidade da doença hepática de acordo com o critério de Child &
Pugh (PUGH et al., 1973)
Variáveis
1 ponto
2 pontos
3 pontos
Encefalopatia hepática
Ausente
Grau 1-2
Grau 3-4
Ascite
Ausente
Leve - moderada
Grave – refratária
Albumina (g/dL)
> 3,5
2,8 – 3,5
< 2,8
Bilirrubina total (mg/dL)
< 2,0
2,0 – 3,0
> 3,0
Tempo de protombina
(segundos acima do
controle)
< 4,0
4,0 – 6,0
> 6,0
Child classe A: 5 a 6 pontos; Child classe B: 7 a 9 pontos; Child classe C: 10-15 pontos
77
MATERIAL E MÉTODOS
O grau de EH foi definido pelo julgamento clínico, pela fala e
comportamento do paciente na consulta, pelas alterações relatadas por ele e/ou
familiares e pelos sinais clínicos característicos, categorizados nos estágios
descritos no quadro 4.
Quadro 4. Estágios de encefalopatia hepática
Estágio 1
Alteração no padrão sono-vigília, confusão mental leve, pronúncia alterada das
palavras, tremor (flapping) discreto
Estágio 2
Acentuação do estágio 1, comportamento inapropriado, insônia, flapping presente e
facilmente induzido
Estágio 3
Fala incoerente, confusão mental marcante, sonolência, mas facilmente despertável,
flapping presente
Estágio 4
Coma
O grau de ascite foi classificado em leve, moderado ou grave e
determinado segundo avaliação clínica, resistência à terapêutica diurética e/ou
ultra-sonografia abdominal.
4.6 Exames Bioquímicos
Os pacientes que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido
foram encaminhados para o laboratório de análises clínicas do HUCFF, sendo
coletada amostra de sangue para determinação dos exames bioquímicos
constantes no quadro 5.
Quadro 5: Valores de referência dos parâmetros de normalidade dos exames bioquímicos
realizados no HUCFF
Parâmetros Bioquímicos
Valores de Normalidade adotados no HUCFF
Albumina
3,4 – 5,0 g/dL
Tempo e atividade de protrombina (TAP)
Segundos acima do controle
Bilirrubina Total (BT)
0,0 – 1,0 mg/dL
Aspartato Aminotransferase (AST)
15 – 37 U/L
Alanina Aminotransferase (ALT)
30 – 65 U/L
78
MATERIAL E MÉTODOS
4.7 Metodologia da Etapa Analítica
4.7.1 Equipamentos:
Cromatógrafo Líquido Série 10A – Shimadzu, composto de sistema
controlador SCL-10A VP, bomba de micro-pistão LC-10AD VP,
misturador de fases FCV 10 AL VP e degaseificador DGU-14A
Injetor Triathlon – Spark Holland
Espectrômetro de massas triplo quadrupolo Quattro LC – Micromass
acoplado a gerador de nitrogênio Nitrox UHPLC MS 18 – Domnick
Hunter; a compressor Jun Air e a bomba de vácuo Boc Edwards 28
Extrator em Fase Sólida – Spark Holland, composto de HPD (High
Pressure Dispenser) Mix e ACE (Automated Cartridge Exchange)
Estação de coleta e registro de dados dos cromatogramas com
programas MassLynx 4.0 e SparkLink 1.7
4.7.2 Material:
(a) Solventes
Acetonitrila grau HPLC – Tédia
Água ultrapura obtida através de sistema purificante US Filter
Etanol grau HPLC – Tédia
Metanol grau HPLC – Tédia
Tampão acetato de amônio grau analítico – Tédia
Ácido fórmico 96% – Tédia
(b) Padrões
Acetato de retinila – Sigma
Ácido retinóico - Sigma
Palmitato de retinila – Sigma
Retinol – Sigma
(c) Colunas
Rexchrom® S5-C8 (fase octil) 15 cm X 4,6 mm X 5 µm
79
MATERIAL E MÉTODOS
Restek® Ultra PFP (fase pentafluorofenil) 10 cm X 3,2 mm X 3 µm
ACE AQ® C18 (fase octadecil) 15 cm x 4,6 mm x 5 µm.
(d) Cartuchos para Extração em Fase Sólida
BondElut C8 (fase octil), 40-90 µm, Spark Holland®
BondElut C18 (fase octadecil), 40-90 µm, Spark Holland®
HySphere C18 (EC) (fase octadecil), 8 μm, Spark Holland®
HySphere Resin GP (general phase, fase polidivivil-benzeno), 10-12
µm, Spark Holland®
4.7.3 Preparo de Soluções-padrão
Foram pesadas analiticamente, quantidades equivalentes a 0,1000 g das
substâncias padrões (acetato de retinila, ácido retinóico, palmitato de retinila e
retinol), que foram transferidas quantitativamente para balão volumétrico de 100,0
mL. As soluções foram preparadas em etanol grau HPLC resultando em uma
concentração final de 1 mg/mL (solução estoque). A partir desta solução estoque
foram preparadas diluições, de forma a se obter, as demais soluções necessárias
para a construção de calibradores e controles de qualidade.
4.7.4 Desenvolvimento da Metodologia Analítica:
Parâmetros de Espectrometria de Massas
Nesta etapa, foi investigada a influência de variáveis espectrométricas e
cromatográficas na abundância relativa dos íons monitorados. Os parâmetros
espectrométricos avaliados foram: modo de ionização – APCI e ESI positivo e
negativo; energia do cone de amostra; energia de colisão; temperatura da fonte
de ionização; temperatura de dessolvatação e fluxo do gás de dessolvatação. Os
parâmetros cromatográficos avaliados foram principalmente relacionados a
natureza dos constituintes da fase móvel: misturas de acetonitrila:água e
metanol:água em diversas proporções; acetonitrila:tampão acetato de amônio pHs
6,9 e 4,1 e metanol:tampão acetato de amônio pHs 6,9 e 4,1 em diversas
proporções, com ou sem a adição de 0,1% de ácido fórmico.
80
MATERIAL E MÉTODOS
Para a escolha da energia do cone de amostra, a voltagem foi avaliada
entre 10-50 V. A energia de colisão variou entre 10-30 V. A temperatura da fonte
de ionização foi fixada em 110 ºC e a temperatura de dessolvatação em 330 ºC. O
fluxo de nitrogênio foi avaliado entre 250-700 L/h.
Parâmetros Cromatográficos
Para escolha dos parâmetros cromatográficos foram testadas diversas
proporções das misturas metanol:acetonitrila:água com adição de 0,1% de ácido
fórmico e metanol:acetonitrila:tampão acetato de amônio com adição de 0,1% de
ácido fórmico. As eluições foram investigadas nos modos isocrático e em
gradiente. Além disso, várias colunas com diferentes recheios e tamanhos
também foram testadas, entre elas: Rexchrom® S5-C8 15 cm X 4,6 mm X 5 µm,
Restek® Ultra PFP 10 cm X 3,2 mm X 3 µm e ACE AQ® C18 15 cm x 4,6 mm x 5
µm.
Eliminação dos níveis basais de retinol e ácido retinóico
Soluções etanólicas de retinol na concentração de 100 ng/mL e de ácido
retinóico na concentração de 1 ng/mL foram irradiadas com lâmpada UV 254nm e
alíquotas foram retiradas nos tempos de 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60
min, 90 min, 120 min e 180 min. Estas alíquotas foram analisadas por CLAE-EMS
para observar o decaimento da área dos analitos.
Amostras de soro branco também foram irradiadas por um tempo de 6,5 h
para observar se era possível eliminar o retinol e ácido retinóico basal.
Escolha do Método de Extração dos Analitos a partir da Matriz
Biológica
Para extrairmos os analitos a partir da matriz biológica, foram avaliados
dois métodos de extração: líquido-líquido e em fase sólida. Na escolha do método
a ser empregado foram considerados os parâmetros: índice de recuperação dos
analitos, capacidade de eliminar interferentes, condições de detecção e
quantificação dos dois analitos (retinol e ácido retinóico) e risco operacional,
levando-se em conta as particularidades destas substâncias com relação à
oxidação, isomerização e degradação.
81
MATERIAL E MÉTODOS
Extração líquido-líquido
À 1 mL de soro foram adicionados 3 mL de Hidróxido de potássio (KOH)
0,025 M e esta mistura foi submetida ao vórtex por 20 segundos. Após a
homogeneização, foram adicionados 3 mL de hexano e procedeu-se nova
homogeneização por 20 segundos em vórtex. Esta mistura foi centrifugada por 5
minutos, a 10000 rpm em temperatura ambiente e a fase orgânica contendo os
retinóides apolares (retinol e ésteres de retinila) foi coletada, evaporada,
ressuspensa em fase móvel e injetada em cromatógrafo líquido.
À fração aquosa foi adicionado 250 µL de ácido clorídrico (HCl) 4M e esta
mistura foi submetida ao vórtex por 20 segundos. Após a homogeneização, foram
adicionados 3 mL de hexano e procedeu-se nova homogeneização por 20
segundos em vórtex. Assim como na extração com base, esta mistura foi
centrifugada por 5 minutos, a 10.000 rpm em temperatura ambiente e a fase
orgânica contendo agora os retinóides polares (ácido retinóico e seus metabólitos)
foi coletada, evaporada, ressuspensa em fase móvel e injetada no cromatógrafo
líquido.
Extração em fase sólida
O processo de EFS foi desenvolvido em quatro etapas: condicionamento
do cartucho, carga com a amostra, lavagem (desproteinização) e eluição em linha
(on line). Foram avaliados quatro cartuchos de diâmetro interno de 10 X 2 mm,
porém com fases sólidas e granulometrias diferentes: BondElut C18 40-90 µm;
BondElut C8 40-90 µm; HySphere C18 (EC) 8 μm e HySphere Resin GP 10-12
µm.
Após a escolha do cartucho extrator, foram avaliadas duas extrações:
1ª: Condicionamento com acetato de amônio 2%, carga com 100 µL de
soro, lavagem com metanol, eluição com FM e lavagem do cartucho com acetato
de amônio 0,5%: ACN (85:15).
2ª: Condicionamento com água:acetonitrila (2:1), carga com 100 μL de
soro, lavagem com água, eluição com FM e lavagem do cartucho com ACN.
Entre essas duas extrações, a segunda foi escolhida, por fornecer
melhores perfis dos picos cromatográficos e separação dos interferentes.
82
MATERIAL E MÉTODOS
Após a escolha dos solventes que seriam utilizados em cada etapa da
extração, foram avaliados diferentes volumes e fluxos para cada um deles. A
etapa de carga também foi avaliada de forma que ocorressem uma ou duas
cargas de soro no cartucho. Após, decidir que seriam necessárias duas cargas de
100 µL de soro para obtermos limite de quantificação adequado, foi avaliado a
necessidade de haver lavagem ou não entre essas cargas.
Teste para avaliar a eficiência da EFS em separar os analitos
(retinol e ácido retinóico) dos produtos endógenos interferentes (ésteres de
retinila)
A eficiência do processo EFS em reter os ésteres de retinila presentes
na matriz biológica (soro) e deixar passar à coluna os analitos (retinol e ácido
retinóico) foi avaliada pelo seguinte procedimento:
- Uma solução de palmitato de retinila na concentração de 200 ng/mL foi
injetada de maneira direta (controle positivo) para observar se as
condições experimentais permitem quantificar este éster, monitorado
pela transição m/z 269 → 93 e determinar o seu tempo de retenção;
- Após esta injeção, uma amostra de soro branco foi enriquecida com
200 ng/mL do palmitato de retinila, submetida à EFS e, posteriormente, à
corrida cromatográfica nas mesmas condições que a solução. A
eficiência do processo de EFS foi avaliada através da comparação dos
cromatogramas obtidos a partir da amostra de soro enriquecido com
palmitato de retinila com o controle positivo.
4.7.5 Validação de Metodologia Analítica na Matriz Biológica
Os parâmetros analíticos utilizados para validação do método de
quantificação do retinol e do ácido retinóico por CLAE-EMS foram: linearidade,
precisão e exatidão, limite de detecção, limite de quantificação, índice de
recuperação e estabilidade em solução e na matriz biológica.
83
MATERIAL E MÉTODOS
Linearidade
A linearidade foi avaliada através da construção das curvas de calibração
em soro contendo concentrações adequadas de cada analito:
1º calibrador: 1 ng/mL de ácido retinóico e 60ng/mL de retinol
2º calibrador: 2,8 ng/mL de ácido retinóico e 140 ng/mL de retinol
3º calibrador: 4,6 ng/mL de ácido retinóico e 220 ng/mL de retinol
4º calibrador: 6,4 ng/mL de ácido retinóico e 300 ng/mL de retinol
5º calibrador: 8,2 ng/mL de ácido retinóico e 380 ng/mL de retinol
6º calibrador: 10,0 ng/mL de ácido retinóico e 460 ng/mL de retinol
Para que fossem aceitas, as curvas foram aprovadas em todos os critérios
de aceitação preconizados pela Resolução-RE Nº899 da Anvisa.
Precisão e Exatidão
A precisão e a exatidão foram avaliadas através da quantificação de seis
réplicas de CQ_CB (2,0 ng de ácido retinóico e 120 ng de retinol), CQ_CM (5,5 ng
de ácido retinóico e 190 ng de retinol) e CQ_CA (7,5 ng de ácido retinóico e 345
ng de retinol), em três dias diferentes de forma que fossem determinadas a
precisão e exatidão intra- e inter-corridas.
O valor de CQ_CB foi calculado sendo duas vezes a concentração do LIQ.
O CQ_CA corresponde a 75% do LSQ e o CQ_CM é, aproximadamente, a média
entre CQ_CB e CQ_CA.
Os valores experimentais médios das seis réplicas por concentração foram
utilizados para determinar a precisão e a exatidão em cada uma das
concentrações analisadas, seguindo as fórmulas:
Onde, DP é o desvio padrão e CM é a concentração média determinada.
84
MATERIAL E MÉTODOS
A precisão e exatidão inter-corridas foi calculada através da média dos
valores encontrados para precisão e exatidão intra-corridas em cada um dos três
dias de análise.
Limite de Detecção
O LD foi estabelecido pelo método da relação sinal/ruído da linha de base
determinado a partir de quantidades decrescentes dos analitos em solução até
que fosse obtida a relação sinal/ruído de 2:1.
Limite de Quantificação
O LQ de quantificação foi determinado através da resposta de precisão e
exatidão do LIQ.
Índice de Recuperação
A recuperação foi analisada através da injeção de quatro amostras de soro
branco para cálculo do retinol e ácido retinóico basal e quatro amostras de soro
enriquecidas com os analitos nas concentrações de CQ_CB, CQ_CM e CQ_CA
sem adição PI e extraídas por EFS e soro enriquecido somente com PI e
posteriormente extraído por EFS. O objetivo da injeção do soro branco foi subtrair
dos CQs, a área correspondente aos níveis basais dos analitos, para que a
recuperação pudesse ser comparada com a injeção de soluções-padrão.
O cálculo da recuperação foi feito de acordo com as equações abaixo:
Área amostras extraídas = área CQ – área soro branco
R(%) = Área amostras extraídas x 100
Área de soluções
85
MATERIAL E MÉTODOS
Estabilidade dos analitos em solução
Para avaliar a estabilidade das soluções-padrão, foram preparadas
soluções nas concentrações correspondentes aos CQ_CB e CQ_CA. Estas
soluções foram deixadas nas condições do laboratório (temperatura 20-25 ºC e
umidade relativa 35-55%) durante o período de 8 horas e posteriormente
injetadas. Os resultados foram comparados com injeções de soluções nas
mesmas concentrações, porém recentemente preparadas.
Estabilidade dos analitos após ciclos de congelamento e
descongelamento das amostras sorológicas, curta duração (8 horas) e nas
condições de análise (pós-processamento)
Três réplicas de amostras controle (CQ_CB e CQ_CA) de retinol e ácido
retinóico foram submetidas às seguintes condições experimentais:
(a) Congeladas a -80 ºC por um período de 24 horas, sendo submetidas
ao descongelamento à temperatura ambiente e quando completamente
descongeladas, as amostras foram novamente congeladas por 12 horas,
repetindo este processo de congelamento e descongelamento até serem obtidos
três ciclos. Após os ciclos terem sido completados, as amostras foram extraídas
e, então, analisadas;
(b) Deixadas nas condições laboratoriais durante 8 horas e depois
extraídas e analisadas (estabilidade de curta duração)
(c) Deixadas na bandeja do injetor de amostras, em temperatura ambiente
por 22 horas e depois extraídas e analisadas (estabilidade pós-processamento).
Os valores quantificados para essas amostras foram comparados aos
obtidos com CQs recém-preparados.
A estabilidade pós-processamento, normalmente, é realizada extraindo-se
os analitos a partir da matriz biológica e deixando-se essa amostra já preparada
no injetor por um período de tempo superior a corrida analítica de um lote. No
caso da EFS, as amostras são injetadas e somente depois extraídas e, por isso,
as amostras permaneceram pelo tempo de corrida de um lote no injetor sem
terem passado por qualquer tipo de tratamento.
86
MATERIAL E MÉTODOS
4.7.6 Validação da Metodologia Analítica em Solução
Após ter sido garantido que a metodologia analítica desenvolvida para
quantificação do retinol e ácido retinóico foi aprovada em todos os parâmetros
analíticos de validação em matriz biológica preconizados pela Resolução-RE N°
899 da Anvisa, uma nova validação, porém, agora, em solução foi realizada.
O motivo da realização desta validação em solução está relacionado ao
fato da matriz biológica (soro) conter quantidades endógenas de retinóides que
não puderam ser eliminadas e, portanto, foi necessário quantificar as amostras a
partir de curvas de calibração construídas em solução, conforme Rühl e
Schweigert (2003) e Gundersen e colaboradores (2007). O índice de recuperação
foi utilizado para o cálculo das concentrações dos analitos no soro de pacientes,
de forma que a diferença entre as matrizes pudessem ser compensadas.
Na validação do método de quantificação a partir de curvas de calibração
construídas em solução, foram investigados os parâmetros de linearidade,
precisão, exatidão e estabilidade em solução nas condições de análise do
método. Os critérios utilizados para aprovação também estão descritos na
Resolução-RE N° 899 da Anvisa, porém não são os mesmos utilizados para
matriz biológica. As alterações, nestes critérios, são:
- O coeficiente de correlação (r) mínimo para aceitação das curvas
analíticas é de 0,99;
- Para a precisão e exatidão intra-corrida são utilizadas três réplicas dos
CQs (CQ_CB, CQ_CM e CQ_CA) e a precisão inter-corrida é realizada em dois
dias diferentes. O valor máximo aceito para DPR é de 5%.
Na nova validação foram alteradas as concentrações dos calibradores e
CQs. Os novos valores utilizados foram:
1º calibrador: 0,25 ng/mL de ácido retinóico e 3 ng/mL de retinol
2º calibrador: 0,5 ng/mL de ácido retinóico e 6 ng/mL de retinol
3º calibrador: 1 ng/mL de ácido retinóico e 12 ng/mL de retinol
4º calibrador: 2 ng/mL de ácido retinóico e 24 ng/mL de retinol
5º calibrador: 4 ng/mL de ácido retinóico e 48 ng/mL de retinol
6º calibrador: 8 ng/mL de ácido retinóico e 96 ng/mL de retinol
87
MATERIAL E MÉTODOS
CQ_CB: 0,75 ng/mL de ácido retinóico e 9 ng/mL de retinol
CQ_CM: 3 ng/mL de ácido retinóico e 36 ng/mL de retinol
CQ_CA: 6 ng/mL de ácido retinóico e 72 ng/mL de retinol
4.8 Preparo de Amostras dos Pacientes para Quantificação
Após o descongelamento das amostras de soro dos pacientes, foram
adicionados 10 µL de solução de PI 2 µg/mL a 990 µL deste soro. As amostras
foram vortexadas e depois filtradas através de membranas de acetato de celulose
de 0,45 µm. A amostra filtrada foi, então, submetida à EFS on line. As amostras
foram quantificadas diretamente pelo software MassLynx 4.0.
Cada lote foi composto pelas amostras branco, zero, seis calibradores de
concentrações diferentes em duplicata, amostras de quinze pacientes e CQs para
garantir a precisão e exatidão do método analítico durante o tempo de análise de
uma corrida analítica. No total foram analisados quatro lotes.
Para que o lote fosse aceito, as curvas de calibração precisavam ser
aprovadas seguindo os mesmos critérios de aceitação utilizados na validação da
metodologia analítica e, além disso, pelo menos 67% das amostras controles
(CQ_CB, CQ_CM e CQ_CA) que foram adequadamente distribuídas entre as
amostras dos pacientes, constituindo pelo menos 5% do total das amostras a
serem quantificadas, precisavam ser aprovadas. Para que estas amostras fossem
aceitas foram necessários desvios menores que 15% dos seus respectivos
valores nominais.
4.9 Análise Estatística
Para observar a existência de algum dado aberrante nos resultados dos
ensaios de validação analítica, foi realizado o teste de Grubbs para o nível de
significância de 5%
As análises estatísticas foram realizadas no pacote estatístico SPSS for
windows versão 17.0. Na descrição da amostra, os dados foram expressos em
média ± desvio padrão para variáveis numérica e percentual para as variáveis
qualitativas.
88
MATERIAL E MÉTODOS
As medidas de tendência central e de dispersão das variáveis contínuas
foram calculadas. Aplicou-se o teste de aderência à curva normal Kolmogorov-
Smirnov visando avaliar a simetria da curva de distribuição dos níveis séricos de
retinol e demais parâmetros. Identificou-se a distribuição dos valores referidos
como normal.
A comparação das variáveis numéricas entre dois grupos foi realizada pelo
teste t-Student e a correlação entre as variáveis numéricas foram avaliadas pelo
teste de correlação de Pearson.
O critério de determinação de significância foi o nível de 5%.
5
RESULTADOS
90
RESULTADOS
5.1 Resultados da Etapa Analítica
5.1.1 Definição dos Parâmetros de Espectrometria de Massas
Entre a ionização por ESI ou APCI, foi escolhido a ESI, pois neste modo
obtivemos maior abundância relativa dos dois analitos. Dentre os modos de
ionização testados, foi escolhido o ESI positivo, uma vez que encontramos
dificuldade em ionizar o retinol em modo negativo.
Inicialmente, foram feitos os fragmentogramas do retinol, ácido retinóico e
acetato de retinila (PI), em diversas voltagens de cone e energias de colisão e, a
partir daí, foram escolhidas as transições iônicas a serem monitoradas e as
melhores voltagens para obtenção destas transições (quadro 6).
Quadro 6. Monitorização em modo MRM do retinol, ácido retinóico e acetato de retinila
Analito
Transição iônica
Energia do cone de
ionização (V)
Energia de colisão
(V)
Retinol
m/z 269 → 93
30
30
Ácido retinóico
m/z 301 → 205
22
16
Acetato de retinila
m/z 269 → 93
30
30
A fragmentação do retinol em modo positivo com uma voltagem de 30 V no
cone de ionização e uma energia de colisão de 30 V promove uma abundante
transição m/z 269 → 93, correspondente à perda de uma molécula de água do íon
precursor [M-H]
+
e uma posterior quebra da molécula resultante gerando o
fragmento 93, conforme as figuras 12 e 13 (CAPOTE et al., 2007).
91
RESULTADOS
Figura 12. Fragmentograma do retinol. Fase móvel metanol:água com adição de ácido fórmico
0,1%, eletrospray positivo, cone de ionização 30 V e energia de colisão 30 V
Figura 13. Esquema de fragmentação proposto para a molécula de retinol.
O fragmento monitorado para o acetato de retinila corresponde à perda do
acetato (hidrólise na interface devido a elevada temperatura em meio ácido) e,
posteriormente, de uma molécula de água gerando os mesmos fragmentos que o
retinol.
A fragmentação do ácido retinóico em modo positivo com uma voltagem de
22 V de energia de cone e uma energia de colisão de 16 V, promove a transição
m/z 301 → 205, conforme as figuras 14 e 15.
92
RESULTADOS
Figura 14. Fragmentograma do ácido retinóico. Fase móvel metanol:água com adição de ácido
fórmico 0,1%, eletrospray positivo, cone de ionização 22 V e energia de colisão 16 V
Figura 15. Esquema de fragmentação proposto para a molécula de ácido retinóico.
Os outros parâmetros desenvolvidos para a EM foram:
Energia de ionização no capilar: 2,5 kV
Fluxo do gás de dessolvatação: 650 L/h
93
RESULTADOS
5.1.2 Definição dos Parâmetros Cromatográficos
Durante o desenvolvimento do método analítico foram avaliadas várias
colunas cromatográficas e combinações de fases móveis. Dentre as colunas
testadas, a ACE AQ® foi a que forneceu melhores resultados para a resolução de
picos interferentes, além de apresentar picos de formato simétrico para os
analitos e PI.
Para a escolha da fase móvel, foram testados tampões e solventes que
fossem compatíveis com a EM. Essencialmente, tampões e solventes não-
voláteis foram excluídos para prevenir a precipitação na fonte de ionização. A
escolha da melhor fase móvel entre os diferentes solventes testados foi baseada
na separação cromatográfica, nos tempos de retenção e na intensidade dos
analitos. A melhor fase móvel testada foi composta de 95% da mistura
acetonitrila:metanol (55:45 v/v) com adição de 0,1% de ácido fórmico e 5% de
tampão acetato de amônio 0,01M pH 6,9 com adição de 0,1% de ácido fórmico
em um fluxo de 0,7 mL por minuto. A adição de ácido fórmico na fase móvel
facilita a protonação dos analitos no modo positivo de ionização. Com esta fase
móvel e a coluna ACE AQ®, os tempos de retenção foram de 5,24 minutos para o
retinol; 5,08 minutos para o ácido retinóico e 6,03 minutos para o PI.
Assim, os parâmetros cromatográficos escolhidos para a metodologia
analítica foram:
Coluna: ACE AQ® C18 15 cm x 4,6 mm x 5 μm em temperatura
ambiente
Fase móvel A:B (5:95 v/v), onde fase móvel A é tampão acetato de
amônio 0,01M pH 6,9 com adição de 0,1% de ácido fórmico e fase móvel B
é acetonitrila:metanol (55:45 v/v) com adição de 0,1% de ácido fórmico
Fluxo: 0,7 mL/min
Volume de injeção: 100 μL
5.1.3 Eliminação dos Níveis Basais de Retinol e Ácido Retinóico
Após a solução de retinol ser irradiada com lâmpada UV por um período de
180 minutos, não houve completa degradação do mesmo, tendo a área do analito
94
RESULTADOS
diminuído em cerca de 60%. Já para a solução de ácido retinóico ocorreu
completa degradação em um período de 120 minutos. O soro branco foi irradiado
por um período de 6,5 horas não havendo degradação completa de nenhum dos
dois retinóides. A partir desses resultados, decidiu-se utilizar um poll de soro de
voluntários, sem remover as quantidades basais dos retinóides, na validação da
metodologia analítica.
5.1.4 Definição do Método de Extração
Embora, a ELL tenha sido eficiente, ela não foi utilizada por apresentar
alguns problemas. Primeiramente, ela ocorre em muitas etapas o que é um risco
adicional à oxidação e isomerização dos analitos. Ela também requer grande
contato do analista com a amostra biológica, o que neste caso é um risco para a
segurança do mesmo, uma vez que muitos pacientes possuem cirrose de
etiologia viral. Além disso, nosso objetivo era realizar uma única corrida analítica
para a quantificação dos dois analitos, o que nesse caso não foi alcançado, uma
vez que o retinol é extraído com a base, enquanto o ácido retinóico é extraído
com o ácido, sendo então obtidos em frações diferentes da extração. Outro
problema é que na fração básica são extraídos o retinol e todos os ésteres de
retinila que na espectrometria de massas geram o fragmento de m/z 269. Assim,
seria necessária uma longa corrida cromatográfica para que houvesse uma
separação adequada de todos esses ésteres.
A grande vantagem da EFS está no fato de podermos escolher diferentes
recheios para o cartucho e diversos solventes para realizar a extração, de forma
que os ésteres de retinila fiquem presos ao cartucho e somente o retinol e o ácido
retinóico sejam eluídos, de forma que a corrida cromatográfica possa ser rápida.
Este fato foi demonstrado através do teste de injeção de solução e soro
enriquecido com palmitato de retinila.
Segundo Got e colaboradores (1995), em uma corrida cromatográfica
utilizando uma coluna de fase reversa, o acetato de retinila é o éster com menor
tempo de retenção, sendo seguido pelo palmitato de retinila e posteriormente pelo
oleato de retinila. Assim, quando fizemos a injeção direta da solução de palmitato
de retinila pode-se observar o pico referente a esse éster no tempo de retenção
95
RESULTADOS
de 36,14 minutos (figura 16), porém quando realizamos a EFS do soro
enriquecido com o palmitato de retinila e submetemos as mesmas condições de
análise por 60 minutos, o pico referente ao palmitato não apareceu (figura 17), o
que significa que este éster assim como os outros que são mais lipofílicos
permanecem presos ao cartucho e não são eluídos.
Figura 16. Cromatograma obtido após injeção direta de solução de palmitato de retinila 200
ng/mL. A análise foi realizada em modo MRM, monitorando a transição m/z 269 → 93 para este
analito.
Figura 17. Cromatograma obtido após EFS de soro enriquecido com palmitato de retinila 200
ng/mL. A análise foi realizada em modo MRM, monitorando a transição m/z 269 → 93 para este
analito.
A metodologia final desenvolvida para a EFS foi:
Cartucho extrator fase HySphere C18 (EC), 8 μm
Condicionamento com 1,0 mL de ACN, fluxo de 8000 µL/min
Equilíbrio com 2,0 mL de água, fluxo de 8000 µL/min
Duas cargas com 100 μL de soro
Lavagem com 2,0 mL de água, fluxo de 8000 µL/min
Eluição com fase móvel por 3,5 minutos
96
RESULTADOS
A figura 18 mostra o cromatograma após a injeção de soro de um paciente
com cirrose Child A, utilizando o método de EFS e CLAE-EMS desenvolvido e
descrito anteriormente.
Figura 18. Cromatograma em modo MRM obtido a partir de amostra de soro de paciente com
cirrose Child A, no tempo de colheita de 0h, submetida à EFS e monitorando as transições m/z
269 → 93 para retinol (Tr = 5,24 min) e PI (Tr = 6,03 min) e m/z 301 → 205 para ácido retinóico (Tr
= 5,08 min).
5.1.5 Validação da Metodologia Analítica em Matriz Biológica
Precisão e Exatidão
As concentrações experimentais dos CQs utilizados para o cálculo de
precisão e exatidão foram determinadas em três dias (Dia 1, 2 e 3) com o auxílio
de curvas de calibração construídas especificamente para esse fim (tabelas 1-9).
A precisão e exatidão inter-dias foram calculadas através da média entre os
resultados de cada dia de precisão e exatidão intra-dia (tabelas 10 e 11)
97
RESULTADOS
Precisão e Exatidão Dia 1
Onde ROH é retinol
Tabela 1. Valores das concentrações dos calibradores empregados na construção da curva de
calibração para calcular precisão e exatidão do retinol – ROH – Dia 1
* CC1: Concentração calibrador 1; CC2: Concentração calibrador 2; CC3: Concentração
calibrador 3; CC4: Concentração calibrador 4; CC5: Concentração calibrador 5; CC6:
Concentração calibrador 6; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2:
valor de concentração encontrado para 2ª réplica, %Dev: Desvio padrão percentual; C. N:
concentração nominal conhecida de retinol.
Onde RCOOH é ácido retinóico
Tabela 2. Valores das concentrações dos calibradores empregados na construção da curva de
calibração para calcular precisão e exatidão do ácido retinóico – RCOOH – Dia 1
* CC1: Concentração calibrador 1; CC2: Concentração calibrador 2; CC3: Concentração
calibrador 3; CC4: Concentração calibrador 4; CC5: Concentração calibrador 5; CC6:
Concentração calibrador 6; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2:
valor de concentração encontrado para 2ª réplica, %Dev: Desvio padrão percentual; C. N:
concentração nominal conhecida de ácido retinóico.
98
RESULTADOS
Tabela 3. Precisão e exatidão do retinol – ROH e ácido retinóico – RCOOH – Dia 1: valores
nominais e experimentais das seis réplicas das amostras controle de qualidade (CQ) nas
concentrações baixa (CB), média (CM) e alta (CA)
*Conc. Nominal: concentração nominal conhecida de retinol ou ácido retinóico; DP: desvio
padrão; Prec.: precisão; Exat.: exatidão; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª
réplica; Det. 2: valor de concentração encontrado para 2ª réplica; Det. 3: valor de
concentração encontrado para 3ª réplica; Det. 4: valor de concentração encontrado para 4ª
réplica; Det. 5: valor de concentração encontrado para 5ª réplica; Det. 6: valor de
concentração encontrado para 6ª réplica; --- valor da determinação foi excluído do cálculo
por possuir %Dev maior do que 15 ou por ser aberrante no teste de Grubbs.
Precisão e Exatidão Dia 2
Onde ROH é retinol
Tabela 4. Valores das concentrações dos calibradores empregados na construção da curva de
calibração para calcular precisão e exatidão do retinol – ROH – Dia 2
* CC1: Concentração calibrador 1; CC2: Concentração calibrador 2; CC3: Concentração
calibrador 3; CC4: Concentração calibrador 4; CC5: Concentração calibrador 5; CC6:
Concentração calibrador 6; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2:
valor de concentração encontrado para 2ª réplica, %Dev: Desvio Padrão percentual; C. N:
concentração nominal conhecida de retinol.
99
RESULTADOS
Onde RCOOH é ácido retinóico
Tabela 5. Valores das concentrações dos calibradores empregados na construção da curva de
calibração para calcular precisão e exatidão do ácido retinóico – RCOOH – Dia 2
* CC1: Concentração calibrador 1; CC2: Concentração calibrador 2; CC3: Concentração
calibrador 3; CC4: Concentração calibrador 4; CC5: Concentração calibrador 5; CC6:
Concentração calibrador 6; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2:
valor de concentração encontrado para 2ª réplica, %Dev: Desvio Padrão percentual; C. N:
concentração nominal conhecida de ácido retinóico.
Tabela 6. Precisão e exatidão do retinol – ROH e ácido retinóico – RCOOH – Dia 2: valores
nominais e experimentais das seis réplicas das amostras controle de qualidade (CQ) nas
concentrações baixa (CB), média (CM) e alta (CA)
*Conc. Nominal: concentração nominal conhecida de retinol ou ácido retinóico; DP: desvio
padrão; Prec.: precisão; Exat.: exatidão; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª
réplica; Det. 2: valor de concentração encontrado para 2ª réplica; Det. 3: valor de
concentração encontrado para 3ª réplica; Det. 4: valor de concentração encontrado para 4ª
réplica; Det. 5: valor de concentração encontrado para 5ª réplica; Det. 6: valor de
concentração encontrado para 6ª réplica; --- valor da determinação foi excluído do cálculo
por possuir % Dev maior do que 15 ou por ser aberrante no teste de Grubbs.
100
RESULTADOS
Precisão e Exatidão Dia 3
Onde ROH é retinol
Tabela 7. Valores das concentrações dos calibradores empregados na construção da curva de
calibração para calcular precisão e exatidão do retinol – ROH – Dia 3
* CC1: Concentração calibrador 1; CC2: Concentração calibrador 2; CC3: Concentração
calibrador 3; CC4: Concentração calibrador 4; CC5: Concentração calibrador 5; CC6:
Concentração calibrador 6; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2:
valor de concentração encontrado para 2ª réplica, %Dev: Desvio Padrão percentual; C. N:
concentração nominal conhecida de retinol.
Onde RCOOH é ácido retinóico
Tabela 8. Valores das concentrações dos calibradores empregados na construção da curva de
calibração para calcular precisão e exatidão do ácido retinóico – RCOOH – Dia 3
* CC1: Concentração calibrador 1; CC2: Concentração calibrador 2; CC3: Concentração
calibrador 3; CC4: Concentração calibrador 4; CC5: Concentração calibrador 5; CC6:
Concentração calibrador 6; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2:
valor de concentração encontrado para 2ª réplica, %Dev: Desvio Padrão percentual; C. N:
concentração nominal conhecida de ácido retinóico.
101
RESULTADOS
Tabela 9. Precisão e exatidão do retinol – ROH e ácido retinóico – RCOOH – Dia 3: valores
nominais e experimentais das seis réplicas das amostras controle de qualidade (CQ) nas
concentrações baixa (CB), média (CM) e alta (CA)
*Conc. Nominal: concentração nominal conhecida de retinol ou ácido retinóico; DP: desvio
padrão; Prec.: precisão; Exat.: exatidão; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª
réplica; Det. 2: valor de concentração encontrado para 2ª réplica; Det. 3: valor de
concentração encontrado para 3ª réplica; Det. 4: valor de concentração encontrado para 4ª
réplica; Det. 5: valor de concentração encontrado para 5ª réplica; Det. 6: valor de
concentração encontrado para 6ª réplica; --- valor da determinação foi excluído do cálculo
por possuir % Dev maior do que 15 ou por ser aberrante no teste de Grubbs.
Precisão e Exatidão Inter-dias
Tabela 10. Precisão e exatidão interdias para retinol em matriz biológica
*Prec.: precisão; Exat.: exatidão; CQ_CB: controle de qualidade de concentração baixa;
CQ_CM: controle de qualidade de concentração média; CQ_CA :controle de qualidade de
concentração alta.
102
RESULTADOS
Tabela 11. Precisão e exatidão interdias para ácido retinóico em matriz biológica
*Prec.: precisão; Exat.: exatidão; CQ_CB: controle de qualidade de concentração baixa;
CQ_CM: controle de qualidade de concentração média; CQ_CA :controle de qualidade de
concentração alta.
Limite de Detecção
Através da injeção de soluções contendo concentrações decrescentes dos
analitos até obtenção da relação sinal/ruído de 2:1, ficou estabelecido um limite
de detecção de 0,25ng/mL para o ácido retinóico e 3 ng/mL para o retinol.
Limite de Quantificação
O limite de quantificação foi estabelecido através do cálculo de precisão e
exatidão para as concentrações de 1 ng/mL de ácido retinóico e 60 ng/mL de
retinol (tabela 12). A curva utilizada para este cálculo foi a mesma da precisão e
exatidão – Dia 1.
103
RESULTADOS
Tabela 12. Precisão e exatidão do retinol – ROH 60 ng/mL e ácido retinóico – RCOOH 1 ng/mL
para determinação de limite de quantificação: valores nominais e experimentais de cinco réplicas
* Prec: precisão; Exat: exatidão; DP: desvio padrão; Det.1: valor de concentração encontrado
para 1ª réplica; Det.2: valor de concentração encontrado para 2ª réplica; Det.3: valor de
concentração encontrado para 3ª réplica; Det.4: valor de concentração encontrado para 4ª
réplica; Det.5: valor de concentração encontrado para 5ª réplica; %Dev: Desvio Padrão
percentual.
Índice de Recuperação
A recuperação foi calculada através da injeção direta de soluções de retinol
e ácido retinóico nas concentrações de CQ_CB, CQ_CM e CQ_CA e PI
separadamente. As áreas dos sinais cromatográficos foram comparadas com a
área do soro extraído enriquecido com retinol, ácido retinóico e PI nas mesmas
concentrações das soluções subtraído da área de cada analito no soro branco
que corresponde à quantidade dos retinóides que já estava presente no soro.
O índice de recuperação foi expresso em percentual (R%) para as
diferentes concentrações de retinol (tabela 13), ácido retinóico (tabela 14) e PI
(tabela 15).
104
RESULTADOS
Tabela 13. Áreas dos sinais cromatográficos correspondentes às amostras controle de retinol
obtidas por injeção direta da solução e por extração em fase sólida de soro para cálculo do índice
de recuperação
* R(%): índice de recuperação em porcentagem; DP: desvio padrão; Det.1: área do pico cromatográfico
da 1ª réplica; Det.2: área do pico cromatográfico da 2ª réplica; Det.3: área do pico cromatográfico da 3ª
réplica; Det.4: área do pico cromatográfico da 4ª réplica; SOL: área injeção direta da solução; EFS:
área soro enriquecido com analitos submetido à EFS menos área soro branco submetido à EFS;
CQ_CB: controle de qualidade de concentração baixa; CQ_CM: controle de qualidade de concentração
média; CQ_CA: controle de qualidade de concentração alta.
Tabela 14. Áreas dos sinais cromatográficos correspondentes às amostras controle de ácido
retinóico obtidas por injeção direta da solução e por extração em fase sólida de soro, para cálculo
do índice de recuperação
* R(%): índice de recuperação em porcentagem; DP: desvio padrão; Det.1: área do pico cromatográfico
da 1ª réplica; Det.2: área do pico cromatográfico da 2ª réplica; Det.3: área do pico cromatográfico da 3ª
réplica; Det.4: área do pico cromatográfico da 4ª réplica; SOL: área injeção direta da solução; EFS:
área soro enriquecido com analitos submetido à EFS menos área soro branco submetido à EFS;
CQ_CB: controle de qualidade de concentração baixa; CQ_CM: controle de qualidade de concentração
média; CQ_CA: controle de qualidade de concentração alta.
105
RESULTADOS
Tabela 15. Áreas dos sinais cromatográficos correspondentes às amostras de PI obtidas por
injeção direta da solução e por extração em fase sólida de soro para cálculo de índice de
recuperação
* R(%): índice de recuperação em porcentagem; DP: desvio padrão; Det.1: área do pico
cromatográfico da 1ª réplica; Det.2: área do pico cromatográfico da 2ª réplica; Det.3: área do
pico cromatográfico da 3ª réplica; Det.4: área do pico cromatográfico da 4ª réplica; SOL:
área injeção direta da solução; EFS: área soro enriquecido com analitos submetido à EFS
menos área soro branco submetido à EFS.
Estabilidade dos Analitos em Solução
A estabilidade das soluções foi avaliada através de amostras de CQ
deixadas durante 8 horas nas condições do laboratório. Estes resultados foram
comparados com amostras de soluções de preparação recente. A estabilidade foi
calculada pela fórmula empregada para o calculo de exatidão, utilizando-se o
valor da concentração da amostra recém-preparada como referência (ou
concentração nominal) (tabelas 16-18).
Onde ROH é retinol
106
RESULTADOS
Tabela 16. Valores das concentrações dos calibradores empregados na construção da curva de
calibração para calcular estabilidade de soluções-padrão de retinol
* CC1: Concentração calibrador 1; CC2: Concentração calibrador 2; CC3: Concentração
calibrador 3; CC4: Concentração calibrador 4; CC5: Concentração calibrador 5; CC6:
Concentração calibrador 6; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2:
valor de concentração encontrado para 2ª réplica, %Dev: Desvio padrão percentual; C. N:
concentração nominal conhecida de retinol.
Onde RCOOH é ácido retinóico
Tabela 17. Valores das concentrações dos calibradores empregados na construção da curva de
calibração para calcular estabilidade de soluções-padrão de ácido retinóico
* CC1: Concentração calibrador 1; CC2: Concentração calibrador 2; CC3: Concentração
calibrador 3; CC4: Concentração calibrador 4; CC5: Concentração calibrador 5; CC6:
Concentração calibrador 6; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2:
valor de concentração encontrado para 2ª réplica, %Dev: Desvio padrão percentual; C. N:
concentração nominal conhecida de ácido retinóico.
107
RESULTADOS
Tabela 18. Estabilidade de soluções de retinol e ácido retinóico: valores nominais e experimentais
das três réplicas das amostras controle de qualidade (CQ) nas concentrações baixa (CB) e alta
(CA)
*C. N: concentração nominal conhecida de retinol ou ácido retinóico; DP: desvio padrão;
EST: estabilidade; RP: solução recém-preparada; 8H: solução deixada em condições
laboratoriais por 8h; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2: valor
de concentração encontrado para 2ª réplica; Det. 3: valor de concentração encontrado para
3ª réplica. Valores de concentração em ng/mL.
Estabilidade dos Analitos após Ciclos de Congelamento e
Descongelamento das Amostras Sorológicas, Curta Duração (8 horas) e nas
Condições de Análise (pós-processamento)
A quantificação dos analitos nas amostras submetidas aos ensaios de
estabilidade foi realizada com o auxílio da mesma curva de calibração utilizada
para o cálculo de precisão e exatidão – dia 2.
A estabilidade na matriz biológica foi calculada pela fórmula empregada
para o cálculo de exatidão, utilizando-se o valor da concentração da amostra
recém-preparada como referência (ou concentração nominal) (tabelas 19-21).
108
RESULTADOS
Tabela 19. Valores de concentrações de retinol e ácido retinóico em amostras submetidas aos
ciclos de congelamento e descongelamento e recém-preparadas para cálculo de estabilidade
*C. N: concentração nominal conhecida de retinol ou ácido retinóico; DP: desvio padrão;
EST: estabilidade; CQ_CB: controle de qualidade de concentração baixa; CQ_CA: controle
de qualidade de concentração alta; RP: amostra recém-preparada; CCD: amostra submetida
ao ciclo de congelamento e descongelamento; Det. 1: valor de concentração encontrado
para 1ª réplica; Det. 2: valor de concentração encontrado para 2ª réplica; Det. 3: valor de
concentração encontrado para 3ª réplica. Valores de concentração em ng/mL.
Tabela 20. Valores de concentrações de retinol e ácido retinóico em amostras deixadas em
condições laboratoriais por 8h e recém-preparadas para cálculo de estabilidade de curta duração
*C. N.: concentração nominal conhecida de retinol ou ácido retinóico; DP: desvio padrão;
EST: estabilidade; CQ_CB: controle de qualidade de concentração baixa; CQ_CA: controle
de qualidade de concentração alta; RP: amostra recém-preparada; 8H: amostra submetida
às condições laboratoriais por 8h; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica;
Det. 2: valor de concentração encontrado para 2ª réplica; Det. 3: valor de concentração
encontrado para 3ª réplica. Valores de concentração em ng/mL.
109
RESULTADOS
Tabela 21. Valores de concentrações de retinol e ácido retinóico em amostras deixadas no injetor
por 22 h e recém-preparadas para cálculo de estabilidade pós-processamento
*C. N.: concentração nominal conhecida de retinol ou ácido retinóico; DP: desvio padrão;
EST: estabilidade; CQ_CB: controle de qualidade de concentração baixa; CQ_CA: controle
de qualidade de concentração alta; RP: amostra recém-preparada; 22H: amostras deixadas
no injetor por 22h; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2: valor de
concentração encontrado para 2ª réplica; Det. 3: valor de concentração encontrado para 3ª
réplica. Valores de concentração em ng/mL.
5.1.6 Validação de Metodologia Analítica em Solução
Precisão e Exatidão
As concentrações experimentais dos CQs utilizados para o cálculo de
precisão e exatidão foram determinadas em dois dias (Dia 1 e Dia 2) com o
auxílio de curvas de calibração, construídas especificamente para esse fim
(Tabelas 22-27). A precisão e exatidão inter-dias foram calculadas através da
média entre os resultados de cada dia de precisão e exatidão intra-dia (tabelas 28
e 29)
Precisão e Exatidão Dia 1
Onde ROH é retinol
110
RESULTADOS
Tabela 22. Valores das concentrações dos calibradores empregados na construção da curva de
calibração para calcular precisão e exatidão do retinol (ROH) em solução– Dia 1
* CC1: Concentração calibrador 1; CC2: Concentração calibrador 2; CC3: Concentração
calibrador 3; CC4: Concentração calibrador 4; CC5: Concentração calibrador 5; CC6:
Concentração calibrador 6; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2:
valor de concentração encontrado para 2ª réplica, %Dev: Desvio padrão percentual; C. N:
concentração nominal conhecida de retinol.
Onde RCOOH é ácido retinóico
Tabela 23. Valores das concentrações dos calibradores empregados na construção da curva de
calibração para calcular precisão e exatidão do ácido retinóico (RCOOH) em solução – Dia 1
* CC1: Concentração calibrador 1; CC2: Concentração calibrador 2; CC3: Concentração
calibrador 3; CC4: Concentração calibrador 4; CC5: Concentração calibrador 5; CC6:
Concentração calibrador 6; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2:
valor de concentração encontrado para 2ª réplica, %Dev: Desvio padrão percentual; C. N:
concentração nominal conhecida de ácido retinóico.
111
RESULTADOS
Tabela 24. Precisão e exatidão do retinol – ROH e ácido retinóico – RCOOH em solução – Dia 1:
valores nominais e experimentais das três réplicas das amostras controle de qualidade (CQ) nas
concentrações baixa (CB), média (CM) e alta (CA)
*Conc. Nominal: concentração nominal conhecida de retinol ou ácido retinóico; DP: desvio
padrão; Prec.: precisão; Exat.: exatidão; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª
réplica; Det. 2: valor de concentração encontrado para 2ª réplica; Det. 3: valor de
concentração encontrado para 3ª réplica.
Precisão e Exatidão Dia 2
Onde ROH é retinol
Tabela 25. Valores das concentrações dos calibradores empregados na construção da curva de
calibração para calcular precisão e exatidão do retinol (ROH) em solução– Dia 2
* CC1: Concentração calibrador 1; CC2: Concentração calibrador 2; CC3: Concentração
calibrador 3; CC4: Concentração calibrador 4; CC5: Concentração calibrador 5; CC6:
Concentração calibrador 6; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2:
valor de concentração encontrado para 2ª réplica, %Dev: Desvio padrão percentual; C. N:
concentração nominal conhecida de retinol.
112
RESULTADOS
Onde RCOOH é ácido retinóico
Tabela 26. Valores das concentrações dos calibradores empregados na construção da curva de
calibração para calcular precisão e exatidão do ácido retinóico (RCOOH) em solução – Dia 2
* CC1: Concentração calibrador 1; CC2: Concentração calibrador 2; CC3: Concentração
calibrador 3; CC4: Concentração calibrador 4; CC5: Concentração calibrador 5; CC6:
Concentração calibrador 6; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2:
valor de concentração encontrado para 2ª réplica, %Dev: Desvio padrão percentual; C. N:
concentração nominal conhecida de ácido retinóico.
Tabela 27. Precisão e exatidão do retinol – ROH e ácido retinóico – RCOOH em solução – Dia 2:
valores nominais e experimentais das três réplicas das amostras controle de qualidade (CQ) nas
concentrações baixa (CB), média (CM) e alta (CA)
*Conc. Nominal: concentração nominal conhecida de retinol ou ácido retinóico; DP: Desvio
padrão; Prec.: precisão; Exat.: exatidão; Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª
réplica; Det. 2: valor de concentração encontrado para 2ª réplica; Det. 3: valor de
concentração encontrado para 3ª réplica.
113
RESULTADOS
Precisão e Exatidão Inter-dias
Tabela 28. Precisão e exatidão interdias para solução de retinol
*Prec.: precisão; Exat.: exatidão; CQ_CB: controle de qualidade de concentração baixa;
CQ_CM: controle de qualidade de concentração média; CQ_CA :controle de qualidade de
concentração alta.
Tabela 29. Precisão e exatidão interdias para solução de ácido retinóico
*Prec.: precisão; Exat.: exatidão; CQ_CB: controle de qualidade de concentração baixa;
CQ_CM: controle de qualidade de concentração média; CQ_CA :controle de qualidade de
concentração alta.
Estabilidade nas Condições de Análise
Para avaliar a estabilidade da solução no tempo de corrida de uma curva
analítica, soluções na concentração dos CQs foram deixadas no injetor por 4h e
depois comparadas com soluções recém-preparadas (tabela 30).
114
RESULTADOS
Tabela 30. Estabilidade de soluções de retinol e ácido retinóico nas condições de análise: valores
nominais e experimentais das três réplicas das amostras controle de qualidade (CQ) nas
concentrações baixa (CB), média (CM) e alta (CA)
*C. N.: concentração nominal conhecida de retinol ou ácido retinóico; DP: desvio padrão;
EST: estabilidade; RP: solução recém-preparada; 4H: solução deixadas no injetor por 4h.
Det. 1: valor de concentração encontrado para 1ª réplica; Det. 2: valor de concentração
encontrado para 2ª réplica; Det. 3: valor de concentração encontrado para 3ª réplica. Valores
de concentração em ng/mL.
5.2 Resultados da Etapa Clínica
5.2.1 Descrição da Amostra segundo Sexo e Idade
A amostra foi composta de 63 pacientes, sendo 39 pacientes do sexo
masculino (61,9%) e 24 pacientes (38,1%) do sexo feminino.
A média de idade dos indivíduos foi de 58,94 ± 10,37 anos, variando de 34
a 81 anos, sendo que 20,6% da amostra encontravam-se na faixa de 31 a 50
anos, 66,7% encontravam-se na faixa de 51 a 70 anos, enquanto 12,7% da
amostra possuíam idade superior a 70 anos. A mediana de idade foi de 59,0.
Não houve diferença significativa entre os níveis basais de retinol (p=0,445)
e ácido retinóico (p=0,097) séricos entre os sexos dos indivíduos da amostra
(tabelas 31 e 32)
115
RESULTADOS
Tabela 31. Comparação do retinol sérico basal entre o sexo masculino e feminino
Sexo
n
Média ± DP
(ng/mL)
p-valor
Masculino
39
76,45±26,01
0,445
Feminino
24
67,11±22,77
*n: número de pacientes
Tabela 32. Comparação do ácido retinóico sérico basal entre o sexo masculino e feminino
Sexo
n
Média ± DP
(ng/mL)
p-valor
Masculino
39
2,34±1,10
0,097
Feminino
24
2,22±1,55
*n: número de pacientes
5.2.2 Distribuição dos Indivíduos de acordo com a Etiologia da Cirrose
Do total de pacientes, 1,6% possuem Cirrose Child A de etiologia
criptogênica; 17,7% causada por VHB, 56,5% por VHC; 14,5% de etiologia
alcoólica; 3,2% de etiologia alcoólica com associação de VHB; enquanto a
etiologia de 6,5% dos pacientes é alcoólica associada com VHC (tabela 33).
Tabela 33. Distribuição da amostra segundo etiologia da doença e sexo
Etiologia da
doença
n
%
Sexo masculino
(n)
Sexo feminino
(n)
Criptogênica
1
1,6
1
0
VHB
11
17,7
15
20
VHC
35
56,5
8
3
Alcoólica
9
14,5
8
1
Alcoólica + VHB
2
3,2
2
0
Alcoólica + VHC
4
6,5
4
0
*n: número de pacientes
116
RESULTADOS
5.2.3 Comparação das Concentrações Séricas de Retinol, Ácido
Retinóico e da Razão Retinol / Ácido Retinóico entre os Dois Grupos de
Pacientes Divididos de Acordo com a Dose de Suplemento (1500 UI ou 2500
UI) nos Tempos Zero (T0), Cinco (T5) e Sete (T7) Horas
Dentre a amostra de 63 pacientes, 36 receberam dose de 1500 UI de
palmitato de retinila, enquanto 27 receberam dose de 2500 UI deste suplemento.
Não houve diferença significativa entre as concentrações séricas
basais de retinol, ácido retinóico e da razão retinol / ácido retinóico
(p=0,459; p=0,320 e p=0,332, respectivamente) entre os dois grupos de
pacientes.
Também não houve diferença significativa entre as concentrações
séricas obtidas de retinol, ácido retinóico e da razão retinol / ácido retinóico
quando comparadas as diferentes doses de palmitato de retinila
administradas em um mesmo tempo de colheita de amostra (tabelas 34-
36).
Tabela 34. Comparação da concentração sérica basal (T0) de retinol entre pacientes que
receberam suplementações de 1500 UI e 2500 UI e das concentrações séricas de retinol obtidas
após o recebimento da dose de palmitato de retinila nos tempos de cinco (T5) e sete horas (T7).
Tempo de
Colheita de
Amostras
Pacientes com
Suplementação de 2500 UI
Pacientes com
Suplementação de 1500 UI
p-valor
n
Média ± DP
n
Média ± DP
T0
26
70,08 ± 20,78
34
74,94 ± 28,17
0,459
T5
26
75,33 ± 23,78
34
76,38 ± 28,06
0,583
T7
26
71,12 ± 23,35
34
71,62 ± 23,14
0,961
*n: número de pacientes
117
RESULTADOS
Tabela 35. Comparação da concentração sérica basal (T0) de ácido retinóico entre pacientes que
receberam suplementações de 1500 UI e 2500 UI e das concentrações séricas de ácido retinóico
obtidas após o recebimento da dose de palmitato de retinila nos tempos de cinco (T5) e sete horas
(T7).
Tempo de
Colheita de
Amostras
Pacientes com
Suplementação de 2500 UI
Pacientes com
Suplementação de 1500 UI
p-valor
n
Média ± DP
n
Média ± DP
T0
26
2,50 ± 1,36
34
2,16 ± 1,23
0,320
T5
26
2,75 ± 1,13
34
2,50 ± 1,12
0,913
T7
26
2,58 ± 0,99
34
2,26 ± 1,10
0,610
*n: número de pacientes
Tabela 36. Comparação da concentração sérica basal (T0) da razão retinol / ácido retinóico entre
pacientes que receberam suplementações de 1500 UI e 2500 UI e das concentrações séricas da
razão retinol / ácido retinóico obtidas após o recebimento da dose de palmitato de retinila nos
tempos de cinco (T5) e sete horas (T7).
Tempo de
Colheita de
Amostras
Pacientes com
Suplementação de 2500 UI
Pacientes com
Suplementação de 1500 UI
p-valor
n
Média ± DP
n
Média ± DP
T0
26
34,99 ± 18,04
34
39,40 ± 16,98
0,332
T5
26
30,84 ± 12,82
34
33,41 ± 12,88
0,869
T7
26
31,40 ± 14,50
34
36,48 ± 18,17
0,119
*n: número de pacientes
5.2.4 Correlação entre Marcadores Bioquímicos e Níveis Séricos de
Retinol, Ácido Retinóico e da Razão Retinol/Ácido Retinóico nos Tempos
Cinco (T5) e Sete (T7) Horas, após Administração de 1500 UI de Palmitato de
Retinila
Após a administração de 1500 UI de palmitato de retinila, os níveis séricos
de retinol, ácido retinóico e da razão retinol / ácido retinóico não apresentou
correlação com nenhum dos marcadores de lesão hepática (ALT e AST) e de
função hepática (albumina, TAP e BT) que avaliamos (tabela 37).
118
RESULTADOS
Tabela 37. Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações séricas de retinol, ácido
retinóico e razão retinol / ácido retinóico com nos tempos de cinco (T5) e sete (T7) horas após a
administração de 1500 UI de palmitato de retinila
Marcador
Bioquímico
Retinol Sérico
T5 (ng/mL)
Ácido Retinóico
Sérico T5
(ng/mL)
Razão Retinol /
Ácido Retinóico
Séricos T5
(ng/mL)
Retinol Sérico
T7 (ng/mL)
Ácido Retinóico
Sérico T7
(ng/mL)
Razão Retinol /
Ácido Retinóico
Séricos T7
(ng/mL)
r
s
p-valor
r
s
p-valor
r
s
p-valor
r
s
p-valor
r
s
p-valor
r
s
p-valor
ALT
-0,036
0,833
-0,088
0,611
-0,016
0,927
-0,106
0,538
-0,069
0,697
-0,107
0,547
AST
-0,143
0,407
-0,138
0,424
0,004
0,982
-0,244
0,151
-0,118
0,506
-0,146
0,409
Albumina
-0,021
0,903
0,052
0,763
0,063
0,716
0,123
0,475
0,137
0,440
-0,001
0,995
TAP
-0,118
0,498
-0,105
0,549
0,045
0,799
0,023
0,896
0,077
0,669
0,017
0,926
BT
0,077
0,655
0,032
0,852
-0,033
0,847
0,201
0,239
0,101
0,569
-0,072
0,685
* ALT: alanina aminotransferase; AST: aspartato aminotransferase; TAP: tempo e atividade
de protrombina; BT: bilirrubina total; r
s
:
coeficiente de correlação de Pearson
5.2.5 Correlação entre Marcadores Bioquímicos e Níveis Séricos de
Retinol, Ácido Retinóico e da Razão Retinol/Ácido Retinóico no Tempo
Cinco Horas (T5) após Administração de 2500 UI de Palmitato de Retinila
Após cinco horas da administração de 2500 UI de palmitato de retinila, os
seguintes resultados foram observados:
O marcador BT apresentou correlação negativa e significante com
os níveis séricos de retinol (p=0,038) (tabela 38).
Nenhum dos marcadores bioquímicos apresentou correlação com os
níveis séricos de ácido retinóico (tabela 39).
Os marcadores ALT, AST e albumina apresentaram correlação
significativa com a razão retinol / ácido retinóico. ALT e AST
apresentaram correlação positiva (p=0,021 e p=0,041,
respectivamente) enquanto a albumina apresentou correlação
negativa (p=0,047) (tabela 40).
119
RESULTADOS
Tabela 38. Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações séricas de retinol no tempo
cinco horas (T5) após a administração de 2500 UI de palmitato de retinila
Marcador
Bioquímico
Retinol Sérico (ng/mL)
n
r
s
p-valor
ALT
63
0,088
0,661
AST
63
0,035
0,862
Albumina
63
-0,126
0,531
TAP
62
0,334
0,088
BT
63
-0,402
0,038
* ALT: alanina aminotransferase; AST: aspartato aminotransferase; TAP: tempo e atividade
de protrombina; BT: bilirrubina total; r
s
:
coeficiente de correlação de Pearson; n: número de
pacientes
Tabela 39. Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações séricas de ácido retinóico
no tempo cinco horas (T5) após a administração de 2500 UI de palmitato de retinila
Marcador
Bioquímico
Ácido Retinóico Sérico (ng/mL)
n
r
s
p-valor
ALT
63
-0,338
0,085
AST
63
-0,331
0,091
Albumina
63
0,133
0,509
TAP
62
-0,092
0,649
BT
63
0,020
0,920
* ALT: alanina aminotransferase; AST: aspartato aminotransferase; TAP: tempo e atividade
de protrombina; BT: bilirrubina total; r
s
:
coeficiente de correlação de Pearson; n: número de
pacientes
120
RESULTADOS
Tabela 40. Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações séricas da razão
retinol/ácido retinóico no tempo cinco horas (T5) após a administração de 2500 UI de palmitato de
retinila
Marcador
Bioquímico
Razão Retinol / Ácido Retinóico
Séricos (ng/mL)
n
r
s
p-valor
ALT
63
0,441
0,021
AST
63
0,395
0,041
Albumina
63
-0,386
0,047
TAP
62
0,141
0,483
BT
63
-0,163
0,416
* ALT: alanina aminotransferase; AST: aspartato aminotransferase; TAP: tempo e atividade
de protrombina; BT: bilirrubina total; r
s
:
coeficiente de correlação de Pearson; n: número de
pacientes
5.2.6 Correlação entre Marcadores Bioquímicos e Níveis Séricos de
Retinol, Ácido Retinóico e Razão Retinol/Ácido Retinóico no Tempo Sete
Horas (T7) após Administração de 2500 UI de Palmitato de Retinila
Após sete horas da administração de 2500 UI de palmitato de
retinila, os seguintes resultados foram observados:
Nenhum marcador bioquímico apresentou correlação com as
concentrações séricas de retinol e ácido retinóico (tabelas 41 e 42).
O marcador albumina sérica apresentou correlação significativa e
negativa com a razão retinol/ácido retinóico (p=0,023) (tabela 43).
121
RESULTADOS
Tabela 41. Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações séricas de retinol no
tempo sete horas (T7) após a administração de 2500 UI de palmitato de retinila
Marcador
Bioquímico
Retinol Sérico (ng/mL)
n
r
s
p-valor
ALT
63
0,079
0,693
AST
63
0,006
0,975
Albumina
63
-0,279
0,159
TAP
62
0,238
0,231
BT
63
-0,279
0,158
* ALT: alanina aminotransferase; AST: aspartato aminotransferase; TAP: tempo e atividade de
protrombina; BT: bilirrubina total; r
s
:
coeficiente de correlação de Pearson; n: número de pacientes
Tabela 42. Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações séricas de ácido retinóico
no tempo sete horas (T7) após a administração de 2500 UI de palmitato de retinila
Marcador
Bioquímico
Ácido Retinóico Sérico (ng/mL)
n
r
s
p-valor
ALT
63
-0,261
0,189
AST
63
-0,229
0,251
Albumina
63
0,003
0,987
TAP
62
-0,237
0,233
BT
63
0,200
0,316
* ALT: alanina aminotransferase; AST: aspartato aminotransferase; TAP: tempo e atividade de
protrombina; BT: bilirrubina total; r
s
:
coeficiente de correlação de Pearson; n: número de pacientes
Tabela 43. Correlação entre marcadores bioquímicos e concentrações séricas da razão
retinol/ácido retinóico no tempo sete horas (T7) após a administração de 2500 UI de palmitato de
retinila
Marcador
Bioquímico
Razão Retinol / Ácido Retinóico
Séricos (ng/mL)
n
r
s
p-valor
ALT
63
0,235
0,237
AST
63
0,167
0,404
Albumina
63
-0,435
0,023
TAP
62
0,138
0,491
BT
63
-0,217
0,277
* ALT: alanina aminotransferase; AST: aspartato aminotransferase; TAP: tempo e atividade de
protrombina; BT: bilirrubina total; r
s
:
coeficiente de correlação de Pearson; n: número de pacientes
6
DISCUSSÃO
123
DISCUSSÃO
6.1 Discussão da Etapa Analítica
6.1.1 Desenvolvimento e Validação de Metodologia para Quantificação
de Retinol e Ácido Retinóico
A maioria das metodologias analíticas para quantificação de retinol e ácido
retinóico séricos descritas na literatura apresentam limitações para o uso na rotina
clínica. Dentre as limitações destacamos principalmente o tipo de extração e o
tipo de detecção. A extração dos retinóides, a partir da amostra biológica,
majoritariamente é por ELL (MEYER et al., 1994; MIYAGI et al., 2001; RÜHL, 2006)
e, após separação cromatográfica, a detecção dos analitos é por
espectrofotometria na região do ultravioleta (WYSS, 1995; RÜHL & SCHWEIGERT,
2003). Para os retinóides, esses métodos exigem longos tempos de execução, o
que não é desejável em análises na rotina de laboratórios clínicos.
No presente trabalho, foi desenvolvido e validado um método para a
quantificação simultânea de retinol e ácido retinóico empregando como método de
extração a EFS e após separação cromatográfica a detecção dos analitos é por
espectrometria de massas. Essa metodologia analítica apresenta vantagens
quando comparada aos métodos de ELL e a detecção por UV.
A primeira vantagem está relacionada à maior especificidade do princípio
de detecção. Devido à estrutura poliênica dos retinóides, todos eles absorvem na
mesma faixa do UV, sendo necessário um maior tempo de cromatografia para
evitar a coeluição dos analitos. No espectrômetro de massas, os analitos
(retinóides) são detectados por íons de diferentes razões massa/carga. O retinol
apresenta uma transição m/z 269 → 93, enquanto que o ácido retinóico apresenta
a transição m/z 301 → 205.
Apesar dos ésteres de retinila presentes na matriz sofrerem hidrólise na
fonte de ionização gerando retinol, que posteriormente sofre desidratação
formando o íon de m/z 269, não foi necessário realizar a separação
cromatográfica na coluna, pois o emprego de uma força eluente seletiva na etapa
de EFS evita que os ésteres sejam extraídos e cheguem à mesma. Assim, o uso
combinado da EFS com a CLAE-EM, evitou que fossem necessários longos
124
DISCUSSÃO
tempos de análise, para uma criteriosa separação cromatográfica do retinol e
seus ésteres antes do processo de detecção.
Neste estudo, as condições desenvolvidas para a EFS priorizaram a
retenção dos ésteres na fase estacionária do cartucho extrator. Conforme
demonstramos, o palmitato de retinila não é eluido na etapa de EFS. Nas
condições do método, admite-se que os demais ésteres de cadeia longa (oleato,
estearato, etc) também ficam presos ao cartucho, pois são mais lipofílicos que o
palmitato e, portanto, apresentam maior tempo de retenção, conforme
demonstrada em CLAE-UV operada em fase reversa (GOT et al., 1995).
A automação do método de EFS quando operado em linha com a CLAE-
EMS é outra vantagem da metodologia desenvolvida, uma vez que ela diminui o
contato do analista com a amostra biológica, que no caso de pacientes com
cirrose de etiologia viral está contaminada pelo vírus da hepatite. Outra
característica positiva é diminuir o número de erros experimentais que podem ser
atribuídos ao analista no momento de preparo da amostra, tais como: retiradas de
alíquotas e diluições. Além disso, como os retinóides são sensíveis à luz, calor e
oxigênio, é desejável que a extração ocorra em um menor número de etapas
possíveis, de modo a evitar a degradação ou oxidação da amostra.
Quando comparado aos métodos tradicionais de extração e quantificação
dos retinóides, nossa metodologia apresentou tempo de análise menor do que os
encontrados na literatura. Enquanto analisamos uma amostra em 12 minutos, oito
minutos de corrida cromatográfica e 4 minutos de extração, o método de Meyer e
colaboradores (1994) e Wang e colaboradores (2001) requer 25 minutos para a
corrida cromatográfica (não foi determinado o tempo de extração).
Assim, a metodologia desenvolvida neste trabalho mostrou-se útil para a
aplicação na rotina clínica principalmente por apresentar tempo de análise
reduzido e diminuir riscos de resultados falsos positivo, mais freqüentes na CLAE-
UV.
125
DISCUSSÃO
6.1.2 Eliminação dos Níveis Basais de Retinol e Ácido Retinóico no
Soro Empregado para Construção das Curvas de Calibração
Para a construção das curvas de calibração em métodos analíticos
empregados para a quantificação de produtos endógenos é desejável eliminar os
níveis basais da matriz biológica empregada.
Sabe-se que o retinol é muito sensível à radiação UV e que seus ésteres
são rapidamente inativados em soluções aquosas e alcoólicas expostas à
radiação, porém a extensão e a razão da degradação dependem do grau de
exposição à luz. Este fato tem permitido a eliminação dos níveis basais de retinol
em soro e plasma humano. Entretanto, em vários estudos, os níveis basais de
retinol e retinóico têm sido determinados a partir de curvas de calibração
construídas em salinas ou soluções alcoólicas (GOT et al., 1995; VAN BREMEN et
al., 1998; TALWAR et al., 1998; RÜHL & SCHWEIGERT, 2003; GUNDERSEN et al.,
2007).
Cherng e colaboradores (2005) mostraram que a irradiação de solução de
palmitato de retinila em etanol gera uma série de produtos de fotodecomposição e
EROS através de três diferentes mecanismos que envolvem reações em cadeia
formadas por radicais livres, fotodissociação iônica e fotosensibilização do
palmitato de retinila.
Allwood & Plane (1984 e 1986) mostraram que o retinol é degradado
quando exposto à radiação UV e que essa degradação é não exponencial, sendo
que uma possível explicação para este fato seria de que os produtos de
degradação da vitamina A fornecem uma proteção para o retinol residual.
Neste trabalho não conseguimos realizar a degradação total do retinol e
ácido retinóico de forma a eliminá-los do soro. Isto pode ter ocorrido porque os
processos fotoquímicos envolvem a absorção de energia de ativação suficiente
para que a reação aconteça e a habilidade da luz UV em fornecer energia
radiante apropriada depende do comprimento de onda adequado (LIN &
LANCHMAN, 1969 in ALLWOND & PLANE, 1986).
No trabalho realizado por Allwood & Plane (1986), foi utilizado um
comprimento de onda na faixa de 290-400 nm, sendo necessários períodos de
exposição entre 60 e 240 segundos para a degradação de cerca de 80-90% do
126
DISCUSSÃO
retinol, exceto para altas concentrações. No nosso estudo, nos primeiros minutos
de retirada de alíquotas das soluções de retinol, observou-se uma redução na
área do pico cromatográfico referente a este analito, mostrando que estava
havendo degradação do mesmo. Porém, a partir de um determinado momento, a
área do pico permaneceu constante, mostrando que não estava mais
acontecendo degradação. Acreditamos que o fato de não ter havido degradação
total da amostra esteja ligado ao fato de não estarmos trabalhando no
comprimento de onda ideal da lâmpada UV, de modo que não houve energia
suficiente para a ocorrência do processo fotoquímico e, além disso, por estarmos
quantificando os produtos de decomposição por método analítico diferente (EMS)
dos demais autores.
6.2. Discussão da Etapa Clínica
6.2.1 Comparação das Concentrações Séricas de Retinol, Ácido
Retinóico e da Razão Retinol / Ácido Retinóico entre os Dois Grupos de
Pacientes Divididos de Acordo com a Dose de Suplemento (1500 UI ou 2500
UI) nos Tempos Zero (T0), Cinco (T5) e Sete (T7) Horas
Não houve diferença significativa entre as concentrações séricas basais de
retinol (p=0,459), ácido retinóico (p=0,320) e razão retinol / ácido retinóico
(p=0,332), entre os dois grupos de suplementação. Da mesma maneira, não
houve diferença significativa entre as concentrações dos analitos e sua razão
quando comparado um mesmo tempo de colheita, em dosagens de
suplementação diferentes.
Ao administrarmos a dose de 1500 UI de palmitato de retinila, a
concentração sérica de retinol aumentou 1,92% (de 74,94 ng/mL para 76,38
ng/mL) no tempo de 5 horas. No tempo 7 horas, a concentração diminuiu 6,65%
passando de 76,38 ng/mL para 71,62 ng/mL. O mesmo aconteceu com o ácido
retinóico. Primeiramente, ocorreu um aumento de 15,74% (de 2,16 ng/mL para
2,50 ng/mL) em relação ao ácido retinóico basal, mas 7 horas após a
administração ocorre uma diminuição de 9,6% (de 2,50 ng/mL para 2,26 ng/mL)
em relação ao tempo de 5 horas.
127
DISCUSSÃO
A mesma relação ocorre com a dosagem de 2500 UI, primeiramente, no
tempo de 5 horas, ocorre um aumento de 7,49% (de 70,08 ng/mL para 75,33
ng/mL) nas concentrações de retinol e de 10,0% (de 2,50 ng/mL para 2,75 ng/mL)
para o ácido retinóico em relação aos níveis basais. Porém, 7 horas após a
administração ocorre uma diminuição das concentrações dos retinóides (5,59%
para o retinol, de 75,33 ng/mL para 71,12 ng/mL e 6,18% para o ácido retinóico,
de 2,75 ng/mL para 2,58 ng/mL) quando comparado ao tempo de 5 horas.
Para as duas dosagens, observa-se uma diminuição da razão retinol /
ácido retinóico no tempo de 5 horas (15,20% para 1500 UI e 11,86 % para 2500
UI) em relação ao tempo zero, isto porque o aumento percentual do ácido
retinóico foi maior do que do retinol.
No tempo de 7 horas, a razão retinol / ácido retinóico também diminui em
relação ao tempo zero, porém essa diminuição é menor do que no tempo de 5
horas (7,41% para 1500 UI e 10, 26% para 2500 UI), mostrando que o palmitato
de retinila administrado é inicialmente oxidado a ácido retinóico havendo um
grande incremento na sua concentração no tempo de 5 horas. No tempo de 7
horas, o ácido retinóico continua sendo formado, porém como grande parte do
retinol já foi utilizada, o incremento na concentração é menor.
Ou seja, até 5 horas após administrarmos a dose de palmitato de retinila,
parte do retinol formado através da hidrólise do éster, se liga a apo-RBP e cai na
circulação sanguínea, levando ao aumento dos seus níveis séricos. Porém, parte
do retinol é oxidada a ácido retinóico, que também cai na circulação sanguínea,
havendo assim um aumento nos níveis dos dois retinóides. No tempo de 7 horas,
o retinol que foi formado no fígado já foi utilizado de uma das duas maneiras, ou
se ligou a RBP e caiu na circulação sanguínea, ou foi biotransformado pelas
enzimas hepáticas em outros metabólitos, de forma que as concentrações séricas
de retinol diminuem e de ácido retinóico também. Deve-se observar que as
concentrações de ácido retinóico podem ter diminuído por dois motivos: o primeiro
está relacionado à falta de substrato (retinol) para que as enzimas hepáticas
formem o ácido retinóico. O outro motivo é a utilização do ácido retinóico para a
formação de outros metabólitos como 9-cis-, 4-hidroxi-9-cis-, 4-oxo-9-cis-, 13-cis-,
4-hidroxi-13-cis-, 4-oxo-13-cis-ácido retinóico.
128
DISCUSSÃO
6.2.2 Correlação dos Níveis Séricos de Retinol, Ácido Retinóico e
Razão Retinol / Ácido Retinóico e Marcadores Bioquímicos
Têm sido documentadas mudanças no metabolismo dos retinóides durante
o desenvolvimento da cirrose hepática, porém a dinâmica das alterações dos
níveis dos retinóides entre a circulação e o fígado ainda não é claramente
entendido (NATARAJAN et al., 2005).
Alguns estudos (NEWSOME et al., 2000; ROCCHI et al., 2001; YADAV et al.,
2002; PERES, 2006) quantificam o retinol e o correlacionam com marcadores
bioquímicos de lesão e função hepática. Até o presente momento, nenhum outro
trabalho correlacionou a razão entre retinol e ácido retinóico como possível
biomarcador de doenças hepáticas crônicas. Nesta pesquisa, avaliamos essa
razão por acreditar que através dela podemos ter uma melhor avaliação funcional
do fígado, pois estaríamos estudando a atividade das enzimas relacionadas com
a biotransformação do retinol ao ácido retinóico e, assim, a razão poderia ser um
melhor marcador do que qualquer um desses retinóides isoladamente.
Para avaliar a função enzimática do fígado através da biotransformação do
retinol, administramos duas dosagens diferentes de palmitato de retinila: a dose
de 1500 UI que é a dosagem padrão do protocolo RDR, utilizado para avaliar a
reserva hepática de retinol e uma dose desafio de 2500 UI, adicionando ao
protocolo padrão, o tempo de colheita de 7 horas, uma vez que a maior parte dos
nossos pacientes está numa faixa de 51 a 70 anos, possuindo baixo clearence
pós-prandial de ésteres de retinila.
Para caracterizar uma eventual propriedade biomarcadora atribuída aos
retinóides, correlacionamos as concentrações séricas de retinol, ácido retinóico e
da razão retinol / ácido retinóico com os valores nominais de cinco marcadores
bioquímicos. Dois deles (AST e ALT) são comumente utilizados para avaliar a
lesão hepática, enquanto três deles (albumina, TAP e BT) avaliam a função
hepática em pacientes com doença hepática crônica (GOPAL & ROSEN, 2000).
No presente estudo, o retinol sérico correlacionou-se negativa e
significativamente com a BT (p=0,038), na dosagem de 2500 UI e tempo de
colheita de 5 horas. Rocchi e colaboradores (1991) e Peres (2006) também
encontraram correlação negativa entre retinol e BT (p< 0,001 e p=0,000,
129
DISCUSSÃO
respectivamente), embora Newsome e colaboradores (2000) não tenham
encontrado correlação entre essas variáveis.
Não encontramos correlação significativa das concentrações séricas de
retinol com ALT, corroborando os achados de Peres (2006), Newsome e
colaboradores (2000) e Yadav e colaboradores (2002). Em contraste, Rocchi e
colaboradores (2001) observaram correlação significativa e negativa (p<0,0001)
entre essas variáveis. Deve-se ressaltar que os estudos de Peres (2006) e
Newsome e colaboradores (2000) incluíam indivíduos com doença hepática mais
avançada do que os pacientes de Rocchi e colaboradores (2001).
Também não encontramos correlação entre os níveis séricos de retinol e
AST, assim como Yadav e colaboradores (2002) que não encontraram
significância estatística entre essas duas variáveis. Já Peres (2006) e Rocchi e
colaboradores (2001) encontraram correlação negativa entre retinol e AST
(p=0,001 e p<0,0001, respectivamente), enquanto Newsome e colaboradores
(2000) não analisaram essa variável bioquímica.
Nosso trabalho também não apresentou correlação entre o retinol e TAP,
assim como Newsome e colaboradores (2000), embora Peres (2006) e Rocchi e
colaboradores (1991) tenham encontrado correlação negativa e significante entre
essas variáveis (p=0,000 e p<0,001, respectivamente).
Não encontramos correlação entre retinol e albumina sérica, enquanto
Peres (2006), Rocchi e colaboradores (1991) e Newsome e colaboradores (2000)
encontraram correlação positiva e significativa (p=0,003, p<0,0001 e p=0,018)
entre essas variáveis. Um dos motivos para não termos encontrado correlação
entre retinol e albumina pode ser o fato de nossos pacientes serem todos Child A
enquanto que Peres (2006) e Newsome e colaboradores (2000) possuíam
pacientes com graus de cirrose mais avançados.
Também na dosagem de 2500 UI de palmitato de retinila e tempo de
colheita de 5 horas, as enzimas ALT e AST se correlacionaram positiva e
significativamente com a razão retinol / ácido retinóico (p=0,021 e p=0,041,
respectivamente).
A razão retinol / ácido retinóico também se correlacionou negativa e
significativamente com as concentrações de albumina sérica nos tempos de 5
(p=0,047) e 7 horas (p=0,023), após a dose de 2500 UI de palmitato de retinila.
130
DISCUSSÃO
Com relação à dosagem de 1500 UI, nem o retinol, nem o ácido retinóico e
nem a razão entre eles apresentou correlação com nenhuma variável bioquímica
que demonstra lesão hepática ou comprometimento da função hepática.
Para entendermos as diferenças entre as duas doses e os dois tempos de
colheita, podemos considerar a cinética enzimática relacionada à
biotransformação dos retinóides. A velocidade da reação enzimática, segundo a
equação de Michaelis-Menten depende das concentrações do substrato e da
enzima (NELSON & COX, 2006). A Cirrose Child A é considerada uma patologia
leve quando comparada com os outros graus de cirrose (Child B e C) e até
mesmo com cirrose Child A associada à CHC. Neste caso, acreditamos que o
comprometimento das enzimas hepáticas ligadas à biotransformação do retinol
ainda não seja tão grande e, por isso, ao administrarmos uma dosagem de 1500
UI, os teores enzimáticos conseguem biotransformar o retinol e, por isso, a dose
não apresentou poder discriminatório para identificar correlação entre os
retinóides e os marcadores bioquímicos.
Quando utilizamos a dose de 2500 UI, o teor enzimático requerido para
biotransformar o retinol a ácido retinóico seguramente foi maior e, no tempo de
colheita de 5 horas, foram observadas correlações do retinol à BT e da razão
retinol / ácido retinóico à ALT, AST e albumina. Nessa dose, portanto, o poder
discriminatório foi maior. No tempo de sete horas, a situação se assemelha ao
tempo zero. As concentrações de retinol são tais que as enzimas conseguem
biotransformar o retinol e, por isso, só encontramos correlação com a albumina
sérica.
É provável que em patologias mais graves, como cirrose Child B e C, até
mesmo com uma dosagem de 1500 UI e no tempo de 7 horas já seja possível
detectar essas alterações nas concentrações de retinol e ácido retinóico, uma vez
que as enzimas hepáticas estarão mais comprometidas, havendo maior poder
discriminatório e conseqüentemente correlação com outros marcadores.
7
CONCLUSÕES
132
CONCLUSÕES
A metodologia analítica desenvolvida demonstrou viabilidade de emprego
na rotina clínica: permitiu a quantificação simultânea de retinol e ácido
retinóico com precisão, exatidão, limite de quantificação e tempo de
execução adequados ao fim proposto.
A metodologia permitiu a quantificação dos analitos nas duas condições de
suplementação: doses de 1500 UI e 2500 UI. Não houve diferença
significativa entre as concentrações séricas de retinol, ácido retinóico e da
razão retinol / ácido retinóico nas duas condições de suplementação.
Somente a suplementação na dose de 2500 UI permitiu identificar
correlações dos marcadores bioquímicos investigados com as
concentrações séricas de retinol e com a razão entre as concentrações de
retinol e ácido retinóico.
Na cirrose Child A, o ácido retinóico não se correlacionou com nenhum dos
marcadores bioquímicos investigados; o retinol correlacionou-se
significativamente com a BT sérica enquanto que a razão entre as
concentrações retinol/ácido retinóico correlacionou-se significativamente
com a albumina, AST e ALT séricas.
Face às conclusões expostas, para fins do uso de retinóides como
biomarcadores de dano hepático, recomenda-se o emprego do método de EFS-
CLAE-EMS operado em ESI positivo, para determinar a razão entre as
concentrações séricas de retinol e ácido retinóico 5 horas após a administração
de uma dose de 2500 UI de palmitato de retinila.
8
ANEXOS
134
ANEXOS
ANEXO 1
135
ANEXOS
ANEXO 2
136
ANEXOS
137
ANEXOS
ANEXO 3
COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DE ARTIGO PARA REVISTA CIENTÍFICA
9
REFERÊNCIAS
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