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ELISA MITSUKO AOYAMA
Propagação in vitro e em estufa de
Alcantarea imperialis (Carrière) Harms
(Bromeliaceae) a partir de sementes
Tese apresentada ao Instituto de
Botânica da Secretaria do Meio
Ambiente, como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de
DOUTOR em BIODIVERSIDADE
VEGETAL E MEIO AMBIENTE,
na Área de Concentração de Plantas
Vasculares em Análises Ambientais.
SÃO PAULO
2010
ELISA MITSUKO AOYAMA
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Propagação in vitro e em estufa de
Alcantarea imperialis (Carrière) Harms
(Bromeliaceae) a partir de sementes
Tese apresentada ao Instituto de
Botânica da Secretaria do Meio
Ambiente, como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de
DOUTOR em BIODIVERSIDADE
VEGETAL E MEIO AMBIENTE,
na Área de Concentração de Plantas
Vasculares em Análises Ambientais.
ORIENTADORA: DRA. SOLANGE CRISTINA MAZZONI-VIVEIROS
CO-ORIENTADORA: DRA. CATARINA CARVALHO NIEVOLA
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Ficha Catalográfica elaborada pela Seção de Biblioteca do Instituto de Botânica
Aoyama, Elisa Mitsuko
A638p Propagação in vitro e em estufa de Alcantarea imperialis (Carrière) Harms
(Bromeliaceae) a partir de sementes / Elisa Mitsuko Aoyama -- São Paulo, 2010.
144 p. il.
Tese (Doutorado) -- Instituto de Botânica da Secretaria de Estado do Meio
Ambiente, 2010
Bibliografia.
1. Bromeliaceae. 2. Anatomia. 3. Micropropagação. I. Título
CDU: 582.564
“Quando a gente pensa que sabe
todas as respostas,
vem a vida e muda as perguntas...”
Sócrates
“Três regras básicas:
1 – No caos está a simplicidade
2 – No conflito está a harmonia
3 – No meio da dificuldade
está a oportunidade”
Albert Einstein
“There needs to be
passion behind what you´re
doing or it´s not worth it!”
Lisa Edelstein
Dedico
DedicoDedico
Dedico,
Aos meus pais Cleuza e Takao,
e aos meus irmãos Takao e Eloisa.
Agradecimentos
AgradecimentosAgradecimentos
Agradecimentos
Ao Conselho de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior
(CAPES), pelo auxílio financeiro sob a forma de concessão de bolsa de
Doutorado.
Ao Instituto de Botânica por disponibilizar as dependências para o
desenvolvimento do projeto.
Ao Programa de Pós-Graduação do Instituto de Botânica pela
oportunidade de participar do curso e desenvolver este projeto, principalmente às
coordenadoras Dra. Sonia M. C. Dietrich e Dra. Solange Cristina Mazzoni-
Viveiros, sempre dispostas a me auxiliar em todos os momentos.
Agradeço à Dra. Solange Cristina Mazzoni-Viveiros, pela orientação, pelo
bom convívio e paciência durante a execução do projeto e por acreditar em meu
trabalho.
À Dra. Catarina Carvalho Nievola, pela co-orientação, pelo apoio e
amizade, pelos conhecimentos transmitidos e valiosas sugestões indispensáveis à
elaboração e desenvolvimento do projeto.
Ao Dr. Eduardo Pereira Cabral Gomes, pelas valiosas sugestões na
estatística dos dados do presente trabalho.
Ao Luciano Coelho Rodrigues, pelo auxílio na estatística dos dados do
presente trabalho, pelo apoio e amizade.
À Dra. Jane Elizabeth Kraus pelo empréstimo de bibliografias, pelas
sugestões dadas durante o desenvolvimento do projeto, pelo apoio e amizade.
À Dra. Adriana Mascarette Labinas pelas valiosas sugestões, revisão do
abstract, amizade, apoio, companheirismo, incentivo e preocupação durante todas
as etapas do doutorado.
À Dra. Maria Angela M. Carvalho e M.Sc. Vanessa Fátima de Oliveira,
pelas informações sobre os cálculos de taxa de crescimento.
Ao Dr. Marcos Pereira M. Aidar e M.Sc. Sabrina Costa Ribeiro Latansio-
Aidar, pelas sugestões e pelo empréstimo do radiômetro.
À colega Fernanda Karstedt, pela amizade, apoio, dicas de informática e
auxílio na confecção das pranchas.
Ao colegas Leonardo M. Versieux e Luciana Fiorato, pelo empréstimo de
bibliografias e valiosas sugestões.
Aos membros da banca de qualificação, Dra. Jane Elizabeth Kraus, Dra.
Vivian Tamaki e Dr. Marco Aurélio Tiné, pelas valiosas contribuições.
À Dra. Regina Maria Monteiro de Castilho pela amizade e pelas primeiras
lições de anatomia vegetal.
Aos pesquisadores do Núcleo de Pesquisa em Plantas Ornamentais - Dra.
Vivian Tamaki, Dr. Shoey Kanashiro, Dra. Vanessa Rebouças dos Santos e Dr.
Clóvis José F. de Oliveira Jr. - e às pesquisadoras do Núcleo de Pesquisa em
Anatomia do Instituto de Botânica - Dra. Agnes Elisete Luchi, Dra. Adriana
Hissae Hayashi, Dra. Edenise Segala Alves, pelo empréstimo dos equipamentos,
pelos conhecimentos transmitidos e pela excelente convivência.
A Maria Manoel - funcionária do Núcleo de Pesquisa em Anatomia do IBt,
pela amizade, atenção, preocupação, carinho e apoio dispensados em todas as
etapas do doutorado.
Aos funcionários do Núcleo de Pesquisa em Plantas Ornamentais - Ivomar
Aparecido Medina, Cleonice Righetti de Campos, Dona Luzia Rodrigues
Scarpeta, pela boa convivência.
Aos funcionários da Biblioteca do Instituto de Botânica, em especial à
Bibliotecária Maria Helena Simões Costa Fernandes Gallo, pela atenção e bom
atendimento.
Aos funcionários da Secretaria da Pós-graduação, em especial Márcia
Regina Ângelo e Antonio Aparecido Carlos Borges, pela atenção e bom
atendimento prestado.
Ao alojamento do Instituto de Botânica, em nome da funcionária
responsável Dinorah Evangelista, pela boa condição de moradia e aos colegas do
alojamento, em especial a Katya da Silva Patekoski, Luana Patricia Delegá,
Fernanda Karstedt, Janaina Maria Gonçalves dos Santos, Camila Malone, Simone
Wengrat, Luciana Giacomini, Simone Silva, Cristiane Nascimento pela amizade,
bons momentos e experiências compartilhados.
Aos colegas do Laboratório de Anatomia - Andrea Nunes Vaz Pedroso,
Fernanda Tresmondi, Marcos J. Kitaura, Aline Delgado Pinheiro, Renata
D´Agostino, Diana R. Yamaguti, Cynthia Hering Rinnert, Marcos Pedroso e
Barbara B. Moura - e do Núcleo de Pesquisa em Plantas Ornamentais - Daniela
Soares dos Santos, Flavia Maria Kazue Kurita, Luciana Mollo, Luciana Cabral,
Rosmari Lazarini, Camila Pereira de Carvalho e Sabrina Vanessa de Andrade,
pelo bom convívio, pela troca de informações e amizade.
Ao amigo Alexandre Indriunas, pelas sugestões, no auxílio pela busca por
bibliografias, atenção, paciência e pelo companheirismo, principalmente nos
momentos finais do trabalho.
À amiga Katya da Silva Patekoski pela amizade, pela companhia, por me
ouvir nos momentos difíceis de muito estresse, pela preocupação constante, pelos
momentos de muitas risadas e muita música.
À amiga Luana Patricia Delegá, pela amizade, pelas conversas, pelos
passeios por São Paulo e momentos de descontração.
Às amigas Luciana Costa Santos, Bárbara Helena Ramos e Gabriela Dávila
Ribeiro, pela amizade e companheirismo.
Às colegas Carolina Tiharu Kuriyama, Kesia Tiaki Kimoto e Diana
Rasquinha Yamaguti, por compartilhar o apartamento no período de adaptação
em São Paulo, pela companhia e momentos de diversão.
Ao colega Jorge Luiz Marx Young, pelo apoio, companheirismo e
momentos de descontração.
Aos colegas Gabriel de Castro Vasconcellos Saenz, Renata Maria Pires
Burin, Fernanda Cristiane Simões Neri, pela amizade e apoio durante o primeiro
ano de Doutorado.
A todos, que de alguma forma contribuíram para a realização desse
trabalho.
Muito Obrigada!!!!
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 1
I.1. BROMELIACEAE .......................................................................................................... 1
I.2. A ESPÉCIE A
lcantarea imperialis
(CARRIÈRE) HARMS .......................................... 12
I.3. PROPAGAÇÃO DE BROMELIACEAE .................................................................... 20
I.3.1. Propagação por semente ................................................................................................ 20
I.3.2. Micropropagação ........................................................................................................... 22
I.4. CRESCIMENTO ........................................................................................................... 25
I.5. ACLIMATAÇÃO .......................................................................................................... 27
I.6. ANATOMIA DE PLANTAS MICROPROPAGADAS .............................................. 29
II. OBJETIVO ...................................................................................................................... 32
III. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 32
III.1. COLETA E PREPARAÇÃO DAS SEMENTES ..................................................... 31
III.2. EFEITO DA LUZ NA GERMINAÇÃO DE SEMENTES ..................................... 35
III.3. ACOMPANHAMENTO DO DESENVOLVIMENTO PÓS-SEMINAL .............. 36
III.4. COMPARAÇÃO DO CRESCIMENTO E ANATOMIA DAS PLANTAS
CULTIVADAS IN VITRO, EM ESTUFA E ACLIMATADAS .............................. 36
III.4.1. Estabelecimento do cultivo in vitro a partir de semente ............................................. 36
III.4.2. Estabelecimento do cultivo em estufa a partir de semente ........................................ 37
III.4.3. Aclimatação: estabelecimento do período “in vitro” adequado ................................. 39
III.5. COLETA ...................................................................................................................... 39
III.6. PARÂMETROS AVALIADOS ................................................................................ 40
III.6.1. Análise biométrica ...................................................................................................... 40
III.6.2. Determinação de massa .............................................................................................. 39
III.6.3. Determinação do teor de clorofila e de carotenóides ................................................. 40
III.6.4. Índice de Suculência da parte aérea ............................................................................ 41
III.6.5. Análise de Desenvolvimento ...................................................................................... 41
III.6.6. Análise estrutural ........................................................................................................ 42
III.6.6.1. Anatomia foliar de plantas adultas .......................................................................... 42
III.6.6.2. Anatomia foliar de plantas cultivadas in vitro e em condições de estufa ................ 43
III.7. ANÁLISE DE DADOS ............................................................................................... 44
IV. RESULTADOS .............................................................................................................. 45
IV.1. EFEITO DA LUZ NA GERMINAÇÃO ................................................................... 45
IV.2. DESENVOLVIMENTO PÓS-SEMINAL ................................................................ 46
IV.3. COMPARAÇÃO DO CRESCIMENTO E ANATOMIA DAS PLANTAS
CULTIVADAS IN VITRO E EM CONDIÇÕES DE ESTUFA .............................. 48
IV.4. COMPARAÇÃO DO CRESCIMENTO DAS PLANTAS CULTIVADAS IN
VITRO E APÓS O PERÍODO DE ACLIMATAÇÃO ............................................. 74
V. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 88
VI. CONSIDERAÇÕES FINAIS......................................................................................108
VII. RESUMO ..................................................................................................................... 109
VIII. ABSTRACT ............................................................................................................... 113
IX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 113
X. ANEXOS ......................................................................................................................... 144
1
I. INTRODUÇÃO
I.1. BROMELIACEAE
A família Bromeliaceae compreende, aproximadamente, 60 gêneros e 3170
espécies (Luther 2008), que ocorrem preferencialmente nas zonas tropicais (Leme
1997a, Paula & Silva 2001, Souza & Lorenzi 2005), estendendo-se desde o sul da
América do Norte, passando pela América Central até chegar à região da Patagônia na
América do Sul. Apenas uma espécie é referida para o continente africano na região da
Guiné, Pitcairnia feliciana (A. Chev.) Harms & Mildbraed (Reitz 1983, Jacques-Félix
2000).
Os dois maiores centros de diversidade da família são o leste do Brasil e a região
dos Tepuis, na Venezuela. O Brasil detém um elevado número de representantes de
Bromeliaceae, estimando-se a ocorrência de cerca de 70% dos gêneros e 40% das
espécies, distribuídos especialmente na região Sudeste (Wanderley & Martins 2007).
Entre as características que definem a família, torna-se importante ressaltar
algumas peculiaridades existentes em cerca de 50% das espécies de bromélias, como a
disposição das folhas no eixo caulinar, apresentando uma sobreposição parcial entre elas
e formando os denominados “tanques” ou “cisternas” revestidos por tricomas peltados
na forma de escamas absorventes, que variam em forma e proporção, onde se acumula a
água da chuva ou de irrigação (fitotelma) e detritos, indispensável aos processos de
nutrição da maioria das bromélias (Benzing & Burt 1970). Devido à capacidade de reter
água e nutrientes, o tanque foi considerado como um substituto do solo, pois a água
acumulada, além da matéria orgânica em decomposição, pode ser absorvida pelas folhas
através das escamas (Tomlinson 1969, Benzing 1976, Benzing et al. 1978).
As bromélias habitam, assim, desde áreas litorâneas até altitudes acima de 3.000
metros; de regiões de alta umidade relativa do ar a extremamente secas. Crescem em
2
locais sombrios, como o interior de matas, ou muito ensolarados, como rochas à beira
mar (Reitz 1983, Paula & Silva 2001). As adaptações morfofisiológicas, permitem que
as bromélias vivam em ambientes, frequentemente, oligotróficos e sujeitos ao
ressecamento (Leme & Siqueira Filho 2006), como o tanque, as escamas, que além da
capacidade de absorção de água e nutrientes refletem a luz (Benzing 1980, 2000), o
metabolismo CAM (Crayn et al. 2004, Schulte et al. 2005), a suculência (Kluge & Ting
1978), a resistência ao fogo, entre outras.
A família reúne plantas na sua maioria herbáceas, perenes, terrestres, epífitas ou
rupícolas, com caule reduzido, portadoras de folhas longas dispostas em rosetas e
densamente imbricadas na base (Schultz 1990, Judd et al. 1999, Souza & Lorenzi 2005,
Wanderley & Martins 2007). As folhas podem apresentar bainha aberta, pouco ou muito
distinta da lâmina e, geralmente, de consistência mais delicada, com margem em geral
inteira ou serrilhada a espinescente; lâmina coriácea, carnosa até membranácea, verde,
acinzentada, avermelhada a vinácea, algumas vezes alva, com ou sem ornamentações de
diferentes cores em forma de estrias, faixas ou máculas, desde filiforme a muito
alargada, com ápice muito variável, margem inteira ou serrilhada a fortemente
espinescente (Wanderley & Martins 2007).
A família se encontra incluída na Ordem Poales (APG III 2009) e
tradicionalmente é dividida em três subfamílias, distinguíveis pelo tipo de hábito e pelas
características morfológicas, como posição do ovário e tipo de fruto e semente (Smith &
Downs 1974, 1977, 1979). Pitcairnioideae reúne plantas terrestres, com muitas das
espécies sobre rochas e poucas epífitas, geralmente portadoras de folhas com espinhos
nas margens, ovário súpero, fruto cápsula e semente com apêndices não plumosos
(Smith & Downs 1974). Em Tillandsioideae, as plantas são essencialmente epífitas e
apresentam folhas de margens inteiras, ovário súpero, fruto cápsula e sementes
plumosas (Smith & Downs 1977). Em Bromelioideae, as plantas são, na sua maioria,
3
epífitas e apresentam folhas com margens serrilhadas ou espinescentes e dispostas em
rosetas formando os tanques, enquanto o ovário é ínfero, o fruto baga e as sementes
lisas, sem apêndices (Smith & Downs 1979).
Análises filogenéticas recentes confirmam que Bromelioideae e Tillandsioideae
são monofiléticas (Crayn et al. 2000, Horres et al. 2000, Barfuss et al. 2005, Schulte et
al. 2009, Sass & Specht 2010) e que Pitcairnioideae é polifilética (Crayn et al. 2000,
Horres et al. 2000), tanto que foi proposto por Givnish et al. (2004) e Givnish et al.
(2007) a divisão de Pitcairnioideae em seis subfamílias.
Para as espécies de bromélias formadoras de tanque, a importância das raízes
tem sido atribuída à função de fixar a bromélia à planta hospedeira, tendo pouca ou
nenhuma contribuição na aquisição de nutrientes. Portanto, as bromélias formadoras de
tanque seriam capazes de adquirir os elementos minerais, preferencialmente, por
absorção foliar (Benzing 1976, Benzing et al. 1978).
Além disso, a água acumulada no tanque é um reservatório para diversos
animais, desde larvas de insetos até aves e mamíferos, que podem utilizá-la como fonte
de água, alimento, abrigo ou sítio de acasalamento (Oliveira et al. 1994, Oliveira &
Rocha 1997, Rocha et al. 1997, Teixeira et al. 2006, Chan et al. 2007, Frank &
Lounibos 2009). Alguns animais desenvolvem seu ciclo de vida exclusivamente nesta
água, como o crustáceo Elpidium bromeliarum Müller, 1880 (Reitz 1983). Já outros
utilizam esta água eventualmente, como sapos, pererecas, gambás, etc. Segundo Rocha
et al. (2004), por causa do acúmulo de água dentro dos tanques, organismos vivem a seu
redor, dessa forma as bromélias funcionam como um amplificador da biodiversidade e
ao serem destruídas afetam outros organismos. Manter espécies de bromélias nos seus
ambientes significa, não apenas conservar as espécies de bromélias per se, mas sim,
conservar uma ampla gama da diversidade local.
4
Em conseqüência, a riqueza e a abundância de espécies de bromélias em um
determinado bioma podem ser utilizadas para estimar o status de conservação do
ambiente e a capacidade de suporte da biodiversidade (Leme & Marigo 1983). O fato de
mais da metade das espécies da família ser epífita obrigatória ou facultativa ressalta a
relevância de seu papel biológico, à medida que essas plantas criam no interior das
florestas nichos ecológicos em diversos patamares, bem acima do solo. Soma-se a isso o
grande contingente de espécies rupícolas, que tornam “habitáveis” as superfícies
rochosas totalmente expostas e desprovidas de solo, inclusive as verticais (Leme &
Siqueira Filho 2006).
A anatomia e a fisiologia das espécies de Bromeliaceae são bastantes
particulares devido à presença de adaptações ecológicas, que consistem,
fundamentalmente, na progressiva redução estrutural e funcional das raízes e no
desenvolvimento concomitante de estruturas foliares características, tais como
parênquima armazenador de água, tecidos de sustentação e principalmente as escamas,
caráter de maior relevância (Tomlinson 1969, Braga 1977, Benzing 1980, 2000).
Dentre os estudos anatômicos realizados com Bromeliaceae merecem destaque
alguns trabalhos de cunho descritivo, como o de Billings (1904) com órgãos vegetativos
e reprodutivos de Tillandsia usneoides L., os de Krauss (1948, 1949a, 1949b) e o de
Okimoto (1948) que relatam as características morfoanatômicas dos órgãos vegetativos
e reprodutivos de Ananas comosus (L.) Merril, respectivamente, e ainda o de Robinson
(1969) que descreve a anatomia foliar de representantes dos gêneros Connelia,
Cottendorfia e Navia (Pitcairnioideae). Tomlinson (1969), numa revisão anatômica
abrangente, descreve de forma detalhada a estrutura dos órgãos vegetativos,
principalmente da folha, como a estrutura dos tricomas foliares, dos estômatos e do
mesofilo.
5
Estudos sobre a anatomia foliar de bromélias, presentes em diferentes ambientes,
têm sido realizados com o propósito de melhor compreender a variabilidade adaptativa
observada na família. Entre eles destacam-se: o trabalho de Flores (1975), com espécies
de região árida e de floresta tropical úmida; o de Braga (1977), com espécies da
campina amazônica; o de Brighigna et al. (1984), que investiga a função de certas
características estruturais presentes em espécies de Tillandsia, procedentes de ambientes
áridos e bastante úmidos; o de Gómez & Winkler (1991), sobre bromélias que ocorrem
em áreas de mangue e fora dele; o de Souza & Neves (1996), que separa espécies de
Tillandsia, morfologicamente semelhantes entre si, que ocupam ambientes extremos; o
de Arruda & Costa (2003), com espécies de Vriesea de ambientes xéricos, que possuem
hábito epifítico e saxícola; o de Segecin & Scatena (2005), sobre espécies de Tillandsia
que ocorrem em matas ciliares ou crescem em afloramentos rochosos; os de Proença &
Sajo (2007, 2008), sobre anatomia dos órgãos vegetativos de espécies ocorrentes em
áreas de cerrado do Estado de São Paulo; o de Lobo (2007) e Voltolini et al. (2009),
sobre morfoanatomia de espécies de bromélias denominadas reófita, como Dyckia
brevifolia Baker e Dyckia distachya Hassler.
Outros estudos analisaram a estrutura foliar com ênfase nas modificações que
ocorrem na transição entre as fases juvenil e adulta, principalmente com espécies de
Tillandsioideae que apresentam tanque (Benzing & Renfrow 1971, Adams III & Martin
1986a, 1986b, Reinert & Meirelles 1993, Schmidt & Zotz, 2001). Para Vriesea
geniculata (Wawra) Wawra as principais características observadas nos indivíduos
juvenis foi a maior densidade de escamas e a menor densidade de estômatos (Reinert &
Meirelles 1993).
As escamas, também denominadas de tricomas peltados, têm sido investigadas
há muito tempo com objetivos diversos, entre eles podemos citar os trabalhos sobre a
estrutura, função e importância ecológica dessas estruturas, tanto no papel de absorção
6
(Benzing & Burt 1970, Benzing 1976, Benzing et al. 1976, Benzing et al. 1978, Sakai
& Sandford 1980, Pierce et al. 2001, Ohrui et al. 2007) como na proteção dos raios
solares (Pierce 2007). Alguns trabalhos analisam a estrutura das escamas com fins
taxonômicos, como o de Strehl (1983), que comparou a forma e distribuição das
escamas de 100 espécies de bromélias, o de Varadarajan & Gilmartin (1987) com
espécies de Pitcairnioideae, o de Mosti et al.(2005) com espécies de Tillandsia, o de
Fiorato (2009) com espécies de Tillandsia do Estado da Bahia.
As escamas são constituídas de um pé e um escudo, desempenham importante
papel na economia hídrica das bromélias, auxiliando na sobrevivência do espécime sob
substratos secos e/ou oligotróficos, epifíticos, epilíticos ou terrestres (Benzing 1980,
2000). Elas podem variar quanto à forma, tamanho e disposição na folha. De modo
geral, são mais simples nas espécies terrestres, especialmente da subfamília
Pitcairnioideae, um pouco mais elaborados em Bromelioideae e, finalmente, mais
especializados nas Tillandsioideae (Tomlinson 1969, Benzing 1980, 2000).
Nas plantas terrestres sem tanque há maior concentração de escamas na face
inferior das folhas, a absorção é feita pelas raízes e as escamas servem,
fundamentalmente, para proteger contra a transpiração excessiva, já que cobrem os
estômatos e aumentam a refletância dos raios solares (Benzing 1980). Nas espécies cuja
roseta forma tanque e possuem raízes ainda funcionais, as escamas estão em geral mais
concentradas na bainha foliar, como nas epífitas de Bromelioideae. As raízes atuam
mais na fixação e as escamas já são mais especializadas, com alguma distinção entre as
células do disco e as da ala, sendo as últimas concentricamente dispostas. A maior
especialização ocorre nas Tillandsioideae, onde as raízes são quase inexistentes ou
totalmente ausentes, como no caso de muitas espécies de Tillandsia (figura 1) (Benzing
1980, 2000).
7
Segundo Mantovani & Iglesias (2005), em estudo sobre a germinação e
desenvolvimento inicial de plântula de três espécies de bromélias terrestres, o
aparecimento de escamas ocorre ainda na primeira folha, o que poderia favorecer seu
estabelecimento em substratos mais secos e iluminados.
Outros trabalhos foram realizados com plântulas de bromélias tendo como
enfoque fornecer informações para a taxonomia, dentre eles, destacam-se: o de Pereira
(1988), sobre a morfologia do desenvolvimento pós-seminal de 56 espécies da
subfamília Bromelioideae, fornecendo informações sobre a germinação e as principais
fases do desenvolvimento pós-seminal, além de apresentar um glossário relativo à
terminologia empregada; o de Scatena et al. (2006), que observaram o desenvolvimento
pós-seminal e a morfologia da semente de três espécies de Tillandsia; o de Pereira et al.
(2008), cujo estudo demonstrou que a morfologia de sementes e o desenvolvimento pós-
seminal constituem ferramentas úteis para estudos taxonômicos, ecológicos e de
tecnologia de sementes.
A família Bromeliaceae apresenta uma longa história de uso etnobotânico,
associada aos povos americanos nativos, como fonte de fibras, alimentos, forragens e
medicamentos, além de uso ornamental e místico (Bennett 2000).
Trata-se de uma família que agrupa gêneros de importância econômica para uso
alimentício, como o fruto de Ananas comosus (L.) Merril (abacaxi) e de Ananas
bracteatus (Lindley) Schultes f., usado como sobremesa e no preparo de diversos
produtos (Camargo 1943, Reitz 1983, Rohrbach et al. 2003).
Figura 1.
Esquema da classificação ecológica das espécies de
ocupação no ambiente, modificado de Benzing & Burt (1970) e Benzing (1980).
Esquema da classificação ecológica das espécies de
Bromeliaceae segundo a
ocupação no ambiente, modificado de Benzing & Burt (1970) e Benzing (1980).
8
ocupação no ambiente, modificado de Benzing & Burt (1970) e Benzing (1980).
9
Além de ser empregado como alimento, o abacaxi também é bastante utilizado
na medicina popular. Ele apresenta reconhecidas propriedades medicinais, agindo
principalmente como estomáquico, carminativo, diurético e antiinflamatório, sendo
também indicado para problemas das vias respiratórias e para neurastenia (Albuquerque
1989 apud Lorenzi & Matos 2008).
Os frutos de Bromelia antiacantha Bertol. (caraguatá) são aplicados como
antihelmíntico, purgativos, diuréticos, contra a tosse, asma, bronquite, enquanto o chá
das folhas pode ser utilizado no tratamento de afecções da mucosa bucal (Reitz 1950,
Fenner et al. 2006, Lorenzi & Matos 2008). Análises fitoquímicas da planta indicaram a
presença de saponinas, taninos, mucilagens e possivelmente da enzima ativa bromelina
(Lorenzi & Matos 2008).
A espécie Tillandsia usneoides L. (barba de velho) possui uma resina,
denominada cumarina ou ácido resinoso aromático, sendo utilizada no tratamento de
reumatismo, hemorróidas, hérnia, males do estômago, casos de flatulência, inflamação
do fígado, doenças pulmonares e cardíacas (Reitz 1950). Espécies de Ananas, Bromelia
e Pseudoananas são consideradas antihelmínticas, além de serem usadas contra a
ancilostomíase duodenal, tosses em geral, contra aftas e afecções da mucosa (Hoehne
1939).
Algumas espécies de Bromeliaceae foram e estão sendo estudadas química e
farmacologicamente e, com isto, muitos compostos foram isolados e identificados.
Diferentes classes de compostos orgânicos existentes nessas espécies foram relatadas,
incluindo triterpenos, esteróides, flavonóides, derivados de ácidos cinâmicos, gliceróis,
entre outros, com interessante potencial químico e farmacológico a serem descobertos
(Manetti et al. 2009).
10
Na indústria utilizam-se, como fonte de fibras para cordoaria e tecidos grossos,
folhas de Neoglaziovia variegata (Arr. Cam.) Mez. (caroá) e Ananas lucidus Mill
(curaguá) (Medina 1959) e de curauá (Ananas erectifolius L.B.Smith), da região
amazônica, em substituição à fibra de vidro (Mothé & Araújo 2004).
Além disso, várias bromélias, especialmente dos gêneros Aechmea, Ananas,
Neoregelia, Nidularium, Quesnelia, Guzmania, Alcantarea, Vriesea e Bilbergia,
destacam-se pela sua importância no aspecto ornamental, apresentando inflorescências,
brácteas e folhagens extremamente vistosas e coloridas (Reitz 1983, Rousse 1992, Leme
& Marigo 1983, Melo 1996, Souza & Lorenzi 2005).
Embora a ocorrência original das bromélias seja atribuída às Américas,
notadamente à costa brasileira, os países que mais as comercializam como plantas
ornamentais são Bélgica, Alemanha, Holanda, Japão e Austrália (Paula & Silva 2001,
Kiyna et al. 2004). No Brasil, a utilização das espécies formadoras de tanque, em
projetos paisagísticos de decoração de interiores vem sendo difundida com grande
sucesso. No entanto, muitas dessas plantas são oriundas do extrativismo ilegal (Nahoum
1994, Andrade & Demattê 1999, Rocha et al. 2004).
A produção de bromélias em escala comercial é atividade viável e tem sido
bastante explorada no Brasil, seguindo os passos de outros países, como os Estados
Unidos, a Holanda e a Bélgica. A qualidade das plantas obtidas de produção é superior
àquela de extrações criminosas em florestas (Melo 1996), fato esse que, unido ao preço
acessível, coloca as plantas cultivadas em grande vantagem no mercado. Com as atuais
técnicas disponíveis, os períodos de crescimento e de floração têm sido reduzidos,
aumentando ainda mais as possíveis vantagens econômicas dessa atividade (Andrade &
Demattê 1999).
11
Segundo Andrade & Demattê (1999), em trabalho sobre a produção comercial
de bromélias no Brasil, observou que a produção comercial se intensificou a partir da
década de 90, e que foram localizados 27 produtores, dos quais 18 se encontram na
região Sudeste e nove na região Sul. No Rio de Janeiro há um direcionamento para o
cultivo de plantas de sol, usadas no paisagismo, como as plantas dos gêneros
Alcantarea, Neoregelia e Aechmea. Essa ação é muito importante, pois suprirá o
crescente mercado para paisagismo, hoje abastecido por plantas retiradas ilegalmente.
Das espécies cultivadas, encontramos algumas em perigo de extinção, especialmente
devido ao extrativismo, como Aechmea blanchetiana (Baker) L.B. Smith e Alcantarea
imperialis (Carrière) Harms, cultivada em 13 produtores e considerada planta de ciclo
longo, levando, no mínimo, seis anos para chegar a ponto de comercialização.
Santos et al. (2005) analisaram os aspectos econômicos da cadeia produtiva das
bromélias na cidade de Curitiba (PR), região metropolitana e litoral paranaense,
estimando que somente no Município de Guaratuba sejam coletadas, anualmente, mais
de 30 mil bromélias. A quantidade de bromélias produzidas e extraídas não atende
completamente a demanda do estado, sendo necessária a compra de bromélias
provenientes de outros estados, principalmente de São Paulo e Santa Catarina.
Com isso, o preço de Alcantarea imperialis comercializada varia muito, em
Blumenau (SC) chegando ao valor de oitenta a noventa reais por unidade (Andrade &
Demattê 1999), já em Curitiba e região metropolitana os valores da planta adulta vão de
trinta e cinco reais para o produtor, oitenta e sete reais e cinquenta centavos no atacado
e cento e vinte cinco reais no varejo (Santos et al. 2005).
A cadeia produtiva das bromélias ainda demanda organização dos produtores,
tanto econômica quanto produtiva. A formação de cooperativas ou associações de
produtores proporcionaria escala e uniformidade à produção paranaense, além de,
concomitantemente, tornar-se uma ferramenta para a diminuição da extração ilegal.
12
Tendo em vista esses aspectos, o cultivo, além de ser economicamente mais
interessante, contribui com a preservação dessas espécies.
I.2. A ESPÉCIE Alcantarea imperialis (CARRIÈRE) HARMS
O gênero Alcantarea (E. Morren ex Mez) Harms é endêmico do Brasil e
compreende cerca de 22 espécies que, freqüentemente, formam grandes rosetas capazes
de acumular elevado volume de água. Seus espécimes ocorrem nos afloramentos
rochosos (inselbergs de gneiss graníticos), nos domínios da Mata Atlântica dos Estados
da Bahia, Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo, desde o nível do
mar até 1.900 metros de altitude, e em áreas de campo rupestre da Cadeia do Espinhaço,
na Bahia e Minas Gerais (Versieux & Wanderley 2007a, 2007b, 2007c). O nome do
gênero é uma homenagem ao segundo imperador do Brasil, Dom Pedro de Alcântara
(Grant 1995b, Versieux & Wanderley 2007a). A história taxonômica de Alcantarea tem
sido difícil e seu status no nível de gênero foi reconhecido por Grant (1995a, 1995b).
Versieux (2009) realizou extenso trabalho sobre a sistemática, filogenia e morfologia do
gênero Alcantarea, estabelecendo uma circunscrição mais precisa para as espécies,
elucidando problemas taxonômicos do gênero, a partir de caracteres morfológicos,
anatômicos e moleculares.
Segundo Bárbara et al. (2007), estudos recentes sobre a estrutura genética de
espécies de Alcantarea têm revelado que a população apresenta um alto grau de
isolamento, principalmente as espécies que ocorrem em inselbergs, o que pode ser a
favor da especiação.
Apresentam plantas herbáceas rupícolas, vistosas, perenes, de menos de meio
metro a 5 metros de altura com a inflorescência; caule curto, inconspícuo, ou robusto e
coberto por restos de bainhas foliares. A roseta, em geral, infundibuliforme, forma
13
tanque. As folhas, em geral, são liguladas, distintamente divididas entre lâmina e
bainha, com margem inteira. Com inflorescência simples ou composta; pedúnculos
laterais com brácteas estéreis. Flores vistosas, dísticas ou secundas; pétalas
frequentemente amarelas, raro alvacentas, efêmeras, longas, liguladas, fortemente
recurvas, reflexas e espiraladas, flácidas; estames e estilete em geral exsertos; ovário
semi-ínfero. Fruto cápsula septicida, ovóide, acuminada; sementes comosas no ápice e
na base, os apicais desenvolvidos (Versieux & Wanderley 2007a).
Dentre as espécies de Alcantarea, destaca-se A. imperialis (Carrière) Harms
(sinonímia Vriesea imperialis Carrière) – subfamília Tillandsioideae, conhecida
popularmente como “bromélia imperial”, por ser amplamente empregada no paisagismo
(Martinelli & Vaz 1988, Lorenzi & Souza 1999, Bert 2007, Versieux & Wanderley
2007b, Bobrowski et al. 2009).
A espécie é endêmica da Serra dos Órgãos, no Estado do Rio de Janeiro, com
disjunções em locais relativamente próximos, como o Parque Estadual do Ibitipoca, em
Lima Duarte, Minas Gerais (Leme 1994, Bert 2007, Versieux 2009).
O Parque Nacional da Serra dos Órgãos está localizado nas encostas atlânticas
da Serra do Mar, nos Municípios de Magé, Guapimirim, Teresópolis e Petrópolis
(Drummond 1997). O Parque concentra as partes mais altas da Serra do Mar,
apresentando uma topografia acidentada e grandes desníveis, com altitudes que variam
de 300 até 2.263 metros (Radambrasil 1983). Decorrente de sua localização na região
mais alta do estado, a temperatura mínima no inverno pode atingir valores iguais ou
inferiores a 0°C, no verão a temperatura média é de 24°C, resultando em uma
temperatura média local de 11°C (Ibama 1989).
Planta de grande porte, heliófila, rupícola ou saxícola, geralmente formando
grandes aglomerados populacionais (figura 2); caulescente, com folhas de até 150 cm de
comprimento, numerosas e muito largas (20 cm), cuja textura é moderadamente rígida e
14
com vincos longitudinais, terminando em ápice curtamente acuminado que se torna
abruptamente recurvado (figuras 3 e 4). Forma roseta funelforme, de cor verde até
vermelho-escura (vinoso), obscuramente maculada próximo da base; inflorescência com
dois a três metros de altura, composta, piramidal, com escapo ereto, excedendo as folhas
e com brácteas escapais densamente imbricadas e recurvadas próximo do ápice (figura
4). Essa espécie floresce a partir de outubro, apresenta as maiores flores do gênero, com
sépalas avermelhadas e pétalas brancas, cujo número médio de flores por inflorescência
é de 505 (figuras 4 a 6) (Smith & Downs 1977, Martinelli & Vaz 1988, Leme 1994,
Brown & Gilmartin 1989, Martinelli 1997, Bert 2007, Versieux 2009). A espécie
apresenta antese noturna, com flores iniciando a abertura de maneira rápida, por volta
de 18 horas, sendo os principais visitantes os morcegos (Anoura caudifer E. Geoffroy,
1818 e Artibeus lituratus Olfers, 1818) (Martinelli 1997).
A bromélia imperial pode reter, entre suas bainhas, vários litros de água (figura
7), chegando até 30 litros, e sua inflorescência pode atingir mais de três metros de altura
(figura 4). Para atingir seu porte majestoso, entretanto, necessita de algumas décadas, às
vezes até 40 anos para se tornar adulta (Carvalho 1997). A lentidão de seu
desenvolvimento decorre da pequena quantidade de nutrientes disponíveis nesse
ecossistema, em que a planta não pode contar, num curto espaço de tempo, com a
apreensão pela roseta de boa quantidade de acúmulos orgânicos, como acontece em
ambientes florestais (Naves 2001, Bert 2007). Tal limitação de desenvolvimento pode
interferir já no estabelecimento da plântula (Maun 1994).
Figuras 2-7.
Alcantarea imperialis
Órgãos, Teresópolis, RJ. 3
. Vista geral da planta adulta em fase vegetativa.
em floração. 5
. Detalhe da flor, indivíduo de coloração vinácea.
coloração verde. 7
. Detalhe do centro da roseta onde as folhas formam o tanque.
(3-7).
Alcantarea imperialis
(Carrière) Harms. 2.
Indivíduos em encosta na Serra dos
. Vista geral da planta adulta em fase vegetativa.
4
. Aspecto da planta
. Detalhe da flor, indivíduo de coloração vinácea.
6
. Detalhe da flor, indivíduo de
. Detalhe do centro da roseta onde as folhas formam o tanque.
15
. Detalhe do centro da roseta onde as folhas formam o tanque.
Barra = 10 cm
16
Pode ser cultivada isoladamente ou em grupos, em jardins (figura 8), de permeio
ou não, entre pedras ou ainda em vasos individuais, sempre com terra rica em matéria
orgânica. Multiplica-se por sementes e, eventualmente, pelas mudas que se formam por
brotações de estolões (Lorenzi & Souza, 1999). Porém, segundo Naves (2001), apesar
de produzir sementes em abundância e com alta viabilidade, não é capaz de emitir
brotações laterais como a maioria das plantas dessa família.
Esta informação foi confirmada por Bárbara et al. (2009), em estudos sobre as
relações genéticas e variações nas estratégias reprodutivas de quatro espécies de
Alcantarea, entre elas a A. imperialis, que concluiram que a propagação clonal é
freqüente em populações costeiras de A. glaziouna (Leme) J. R. Grant e A. regina
(Vell.) Harms, mas ausente em espécies de altas altitudes, como A. geniculata (Wawra)
J. R. Grant e A. imperialis. A forte estrutura genética, observada nessas espécies,
constitui uma excelente base para a aplicação de marcadores genéticos para a
conservação dessas bromélias importantes tanto economica como ecologicamente.
São muitas as áreas da Mata Atlântica em que várias espécies de bromélias se
encontram ameaçadas merecendo, portanto, maior atenção. Com a exploração e a
destruição constante de seu maior ecossistema, a Mata Atlântica, aliada ao crescente
interesse de comerciantes atraídos pelas inúmeras espécies ornamentais, as bromélias
correm sério risco de desaparecimento, sendo necessário o desenvolvimento de medidas
de conservação (Tardivo & Cervi 1997, Nunes 2002, Mercier & Nievola 2003). As
queimadas periódicas provocadas por pessoas que consideram as bromélias
responsáveis pela proliferação de mosquitos na cidade, além do fogo acidental
provocado por balões ou outros objetos inflamáveis como cigarros e a eliminação da
vegetação do entorno pela ocupação humana desordenada, têm contribuído, também,
para a ameaça de suas espécies (Nahoum 1994, Leme 1997b).
17
Entre essas áreas, está a região da Serra dos Órgãos (RJ), habitat natural da
bromélia imperial e cujo extrativismo local corresponde à área total de distribuição
(figuras 9-10), já que seus espécimes ocorrem em grandes grupamentos populacionais
(Leme 1994, Carvalho 1997, Nunes 2002). Além do extrativismo, as comunidades de
bromélia imperial vêm sofrendo com os frequentes incêndios na região (figuras 11-12),
principalmente devido à associação da mesma ao capim gordura (Mellinis minutiflora
P.Beauv.), o que poderá levar as bromélias ao limiar da extinção na região de Petrópolis
nos próximos 40 anos, tempo suficiente para a grande parte dos exemplares adultos
existentes completarem seu ciclo de vida e morrerem, sem deixar descendentes (Graeff
& Pagani 1996).
Espécies consideradas com problemas críticos de conservação são aquelas
restritas a uma extensão geográfica com limitada amplitude ecológica e, portanto,
vulneráveis a eventos estocásticos (Mace & Hudson 1999). Essas espécies representam
prioridades na conservação da biodiversidade, sendo necessário melhorar o
conhecimento sobre a biologia das mesmas, especialmente nas áreas da biologia de
populações, genética, ecologia e estratégias de reprodução (Falk 1990, Mace & Hudson
1999, Rodríguez-Estrella & Moreno 2006).
Conforme a lista da flora brasileira ameaçada, Alcantarea imperialis se enquadra
na categoria “em perigo de extinção” (Biodiversitas 2007). Sendo assim, a melhor
estratégia para proteção da diversidade biológica, em longo prazo, é a preservação de
comunidades naturais e populações no ambiente, conhecida como preservação in situ ou
preservação local. Porém, isso nem sempre é possível, sendo necessárias estratégias de
conservação ex situ, onde a espécie é mantida sob supervisão e muitas vezes em
condições artificiais.
Figuras 8-12.
Alcantarea imperialis
o uso ornamental da espécie.
entorno do Parque Nacional
Teresópolis em 02 de agosto de 2007.
dos Órgãos (Carvalho 1997).
Órgãos. 12. Indiv
íduos queimados na Serra de Petrópolis (Graeff & Pagani 1996).
cm (8).
Alcantarea imperialis
(Carrière) Harms. 8.
Vista geral de um jardim, destacando
o uso ornamental da espécie.
9
. Exemplares coletados clandestinamente e apreendidos no
entorno do Parque Nacional
da Serra dos Órgãos, foto publicada no jornal O Diário de
Teresópolis em 02 de agosto de 2007.
10
. Indivíduos retirados ilegalmente da região da Serra
dos Órgãos (Carvalho 1997).
11
. População afetada por incêndio, na região da Serra dos
íduos queimados na Serra de Petrópolis (Graeff & Pagani 1996).
18
íduos queimados na Serra de Petrópolis (Graeff & Pagani 1996).
Barra = 30
19
Os esforços de conservação ex situ são parte importante de uma estratégia de
conservação integrada para proteger as espécies ameaçadas. Indivíduos de populações
ex situ podem ser periodicamente introduzidos ao ambiente selvagem para aumentar os
esforços de conservação in situ; além disso, as populações ex situ, que são sustentáveis,
podem também reduzir a necessidade de se retirar indivíduos do ambiente selvagem
(Primack & Rodrigues 2001).
A conservação ex situ deve ser encorajada, significando uma forma de seguro
contra a extinção da espécie provocada por catástrofes, tanto de origens naturais como
provocadas pelo homem. Além disso, a propagação maciça e uma ampla distribuição de
plantas podem desencorajar a exploração de espécies através do comércio clandestino e
ilegal (Luther 1994).
Considerando-se as bromélias, que são utilizadas por diversas espécies animais
como fonte de água, alimento, abrigo ou sítio de acasalamento, fica claro seu importante
papel na manutenção da biodiversidade (Oliveira et al. 1994, Rocha et al. 1997). As
medidas devem abranger o estudo da biologia dessas plantas, suas populações e
comunidades vegetais, de modo a possibilitar a conservação do patrimônio natural ainda
existente.
Trabalhos visando a micropropagação e a conservação ex situ devem também ser
considerados, diante de sua relevância estratégica no manejo dessas espécies e na
recuperação dos diversos ecossistemas em que vivem (Carneiro & Mansur 2004,
Sarasan et al. 2006). O desenvolvimento de técnicas de produção é indispensável para
minimizar o perigo de extinção da espécie, além de atender à demanda do mercado por
ornamentais e reduzir, indiretamente, a procura por exemplares provenientes do
ambiente natural.
20
I.3. PROPAGAÇÃO DE BROMELIACEAE
I.3.1. Propagação por semente
A produção de bromélias pode ser iniciada a partir de sementes, que para
germinarem podem levar de alguns dias a semanas, dependendo da espécie semeada,
como Acanthostachys pitcairnoides (Mez) Rauh & Barthlott que leva cerca de quatro
dias e Bromelia plumieri (E.Morren) L.B. Sm. que pode levar até 40 dias (Pereira 1988,
Rousse 1992, Menescal 1994).
A forma de propagação mais utilizada por produtores de bromélias da região
metropolitana de Curitiba é a partir de sementes (Santos et al. 2005). O sucesso da
semeadura está intimamente ligado à umidade do substrato, que pode ser matéria
vegetal decomposta (folhas, restos de grama, casca de árvores etc.) ou uma mistura
desses materiais com areia lavada, buscando-se manter as plântulas em locais abrigados
da chuva e do sol para que não sejam danificadas (Menescal 1994, Paula & Silva 2001).
Muitas espécies de bromélias requerem a presença de luz para que as sementes
germinem (Downs 1964), esse controle do processo germinativo pela luz está
relacionado com a adaptação das espécies a seus habitats (Mayer & Poljakoff-Mayber
1982). Mercier & Guerreiro Filho (1990), em trabalho sobre o efeito da luz e da
temperatura na germinação de algumas espécies de bromélias, verificaram que as
sementes são fotoblásticas positivas, não encontrando diferenças entre os regimes
fotoperiódicos de 08 e 16 horas. Com relação à temperatura, os mesmos autores
afirmam que a maior parte das espécies germina entre 20 e 30°C.
Conforme Mollo (2009) observou, em estudo sobre a germinação de sementes
de Alcantarea imperialis em temperaturas de 15ºC, 15/30ºC (termoperíodo
escuro/claro) e 30ºC, o tempo de emergência das plântulas varia em função da
temperatura, sendo que em 30ºC ocorreu 80% da emergência em 14 dias.
21
Segundo Paula & Silva (2001), a falta d’água pode implicar na redução da
porcentagem de germinação ou morte das plântulas recém germinadas. Por outro lado, o
excesso de umidade pode provocar o aparecimento de fungos na semente, causando o
mesmo efeito. Em regiões com baixa umidade relativa do ar é aconselhável cobrir a
sementeira com plástico transparente, formando uma estufa. As plântulas, quando
atingem cerca de 1 a 2 cm, podem ser pulverizadas com adubos foliares, utilizando-se
sempre a metade da dose recomendada pelo fabricante do produto.
Os produtores menos especializados e que usam menos tecnologia optam pelo
cultivo por meio de sementes colhidas de matrizes próprias, enquanto os que buscam
especialização e melhores recursos tecnológicos estão procurando material de
propagação mais tecnicamente elaborado, como aquele proveniente de cultivo de
meristemas ou de sementes selecionadas (Andrade & Demattê 1999).
A propagação de bromélias a partir de sementes, dependendo da espécie
cultivada, pode não ser capaz de fornecer um grande número de plantas em um curto
espaço de tempo, sendo a uniformidade e o vigor das plantas uma característica
interessante ao produtor comercial. Nesse sentido, a multiplicação in vitro oferece
algumas vantagens, como taxas mais elevadas de obtenção de mudas com qualidade
fitossanitária (Mercier & Nievola 2003). Mas, se o principal objetivo é a preservação do
patrimônio genético de uma dada espécie, a micropropagação deve ser iniciada por
meio da cultura in vitro de sementes, as quais devem ser coletadas de diferentes
populações na natureza, compondo uma amostragem ampla de genótipos (Engelmann
1991, Menescal 1996, Mercier & Nievola 2003).
22
I.3.2. Micropropagação
A biotecnologia é uma das ferramentas na conservação das espécies ameaçadas
de extinção. Dentre as técnicas utilizadas para propagação dessas espécies destaca-se o
cultivo in vitro, tanto na germinação de sementes como na propagação clonal por
explantes (Engelmann 1991, Fay 1992, 1994, Sarasan et al. 2006).
O cultivo in vitro tem muitas vantagens sobre as técnicas de propagação
convencionais, como a rápida multiplicação em ambiente controlado, condições livres
de patógenos, redução de espaço físico utilizado para o cultivo, entre outros (Fay 1994,
Engelmann 1997, Thorpe & Harry 1997, Kozai et al. 1997). Também, por meio dessa
técnica é possível intensificar a produção de várias espécies ornamentais (Debergh &
Maene 1981, Debergh 1994, Mercier & Kerbauy 1997) em atendimento à demanda do
mercado de flores e, assim, contribuir indiretamente para a redução do extrativismo
como, por exemplo, das bromélias (Zornig 1996, Mercier & Nievola 2003).
Na tentativa de maximizar a diversidade genética das plantas produzidas por
meio de técnicas in vitro, o material preferido para a iniciação de culturas é,
normalmente, a semente. Dessa forma, espera-se que a integridade genética das plantas
seja mantida, sem correr o risco de induzir à variação somaclonal, relacionada com a
utilização de sistemas de cultura de calos e suspensão, dentre outras (Dodds 1991 apud
Fay 1994, Mercier & Nievola 2003).
Na cultura in vitro, fatores como temperatura, luminosidade, água, substratos e
nutrientes podem ser controlados (Debergh 1991, Kozai et al. 1997, Pospíšilová et al.
1999, Simões et al. 2001, Hazarika 2003, Rodrigues et al. 2005). Além disso, o
ambiente do cultivo in vitro pode ser caracterizado por apresentar espaço limitado,
baixa irradiação, alta umidade relativa do ar no interior dos frascos, o que pode levar a
23
trocas gasosas ineficientes e a um estado de saturação de CO
2
(Kozai et al. 1997,
Pospíšilová et al. 1999).
Para se iniciar o cultivo in vitro de bromélias pode-se utilizar como explante
desde sementes, ápices caulinares, gemas axiliares, fragmentos de folhas, eixos caule-
raiz e plântulas produzidas in vitro (Carneiro & Mansur 2004).
Os primeiros trabalhos com o cultivo in vitro de bromélias iniciaram-se na
década de 70 com Mapes (1973), que utilizou ápices caulinares de Ananas erectifolius
L.B. Sm., Portea petropolitana (Wawra) Mez, Guzmania sp. inoculadas em meio de
cultura K (Knudson 1946) e fitorreguladores. Em seguida, Jones & Murashige (1974)
utilizaram ápices caulinares e gemas axilares de Aechmea fasciata (Lindl.) Baker
inoculadas em meio de cultura MS (Murashige & Skoog 1962), suplementado com
fitorreguladores, logo após testaram essas condições para outros 19 gêneros de
Bromeliaceae.
Devido à sua importância econômica, a espécie de bromélia mais produzida por
técnicas de cultivo in vitro é o abacaxi (Ananas comosus (L.) Merril). O primeiro
trabalho foi de Mathews & Rangan (1979), sobre os fatores hormonais na formação do
calo e subsequente regeneração das plantas. Outros trabalhos foram realizados testando
protocolos, principalmente a concentração de fitorreguladores e o tipo de meio de
cultura, a fim de obter um grande número de plantas de alta qualidade (Mathews &
Rangan 1981, Zepeda & Sagawa 1981, Pescador & Koller 1992, Kiss et al. 1995, Devi
et al. 1997, Teng 1997, Guerra et al. 1999, Vesco et al. 2000, González-Olmedo et al.
2005, Tamaki et al. 2007).
Também foram descritos diversos outros sistemas de cultura in vitro para
bromélias, tanto de espécie de interesse ornamental (Ziv et al. 1986, Mercier & Kerbauy
1992, Naves 2001, Santos 2009), como para endêmicas e ameaçadas (Mercier &
24
Kerbauy 1994, 1995, Arrabal et al. 2002, Pickens et al. 2003, Droste et al. 2005, Rech
Filho et al. 2005, Garcia-Suarez et al. 2006, Alves et al. 2006, Silva et al. 2007, Silveira
et al. 2009), bem como para estudos fisiológicos, principalmente sobre a assimilação de
nitrogênio (Endres & Mercier 2001, Nievola et al. 2001, Endres et al. 2002, Kurita
2008) e estudos sobre o efeito da temperatura no metabolismo (Nievola et al. 2005,
Mollo 2009).
Tais sistemas incluem a obtenção de plantas in vitro a partir de: sementes
(Mercier & Kerbauy 1994, Mercier & Kerbauy 1995, Nievola et al. 2005, Pickens et al.
2003, Droste et al. 2005, Garcia-Suarez et al. 2006, Alves et al. 2006, Pickens et al.
2006, Silva et al. 2007, Mollo 2009, Silva et al. 2009, Silveira et al. 2009, Chu et al.
2010); ápices caulinares (Davidson & Donnan 1977, Prado et al. 2008); gemas axilares
(Mathews & Rangan 1981, Ziv et al. 1986, Pescador & Koller 1992, Kiss et al. 1995,
Rech Filho et al. 2005) ; segmentos nodais (Nievola et al. 2005, Tamaki et al. 2007,
Santos 2009); meristemas (Tombolato et al. 1991); folhas (Hosoki & Asahira 1980,
Mercier & Kerbauy 1992, Vinterhalter & Vinterhalter 1994).
Porém, a maioria dos estudos utiliza reguladores de crescimento, em diferentes
concentrações e combinações, a fim de garantir a produção das plantas. As combinações
entre o uso de reguladores e os tipos de explantes são definidas de acordo com a
resposta morfogênica desejada e a disponibilidade de plantas matrizes. Portanto, o
desenvolvimento de protocolos eficientes de micropropagação exige adequações para
cada espécie, relativas ao tipo de explante, às combinações de reguladores de
crescimento e às condições de cultura (Carneiro & Mansur 2004).
Embora tenha muitas vantagens, as técnicas de micropropagação apresentam
custos elevados, se levar em conta todo o processo da multiplicação, crescimento e
aclimatação (Kozai 1991). Alguns fatores que aumentam o custo da produção são: o
longo período requerido em cada estádio da cultura; a baixa taxa de multiplicação; a
25
contaminação biológica; a porcentagem de plantas mortas devido ao estresse ambiental
durante a fase da aclimatação; as desordens fisiológicas e morfológicas durante a fase
de multiplicação ou do crescimento; os significativos custos com a iluminação, ar
condicionado e esterilização; os significativos custos com os frascos, nutrientes,
reguladores de crescimento, agentes gelificantes e carboidratos; o espaço requerido para
a preparação e manutenção das culturas (Kozai 1990, Zornig 1996).
I.4. CRESCIMENTO
Segundo Larcher (2006), o crescimento é o aumento permanente da quantidade
de substâncias e de volume das partes vivas. As plantas crescem pela adição de módulos
repetidos, como folhas, flores e ramos. Esse modo de crescimento leva à plasticidade,
permitindo às plantas variarem seu padrão de crescimento em resposta à disponibilidade
de luz ou outros fatores ambientais (Gurevitch et al. 2009).
Para que haja atividade de crescimento, é necessário que a planta tenha suas
necessidades biológicas supridas. Essas necessidades se caracterizam como sendo
constituídas pela interação de fatores inerentes ao sistema e de fatores externos, numa
interação genótipo-ambiente (Termignoni 2005).
Porém, para se quantificar o processo de crescimento vegetal, torna-se
necessária a escolha de parâmetros mensuráveis de medidas de crescimento. Esses
parâmetros podem ser altura da planta, massa fresca ou massa seca, número de nós
caulinares, comprimento dos internos caulinares, área foliar, diâmetro do caule, entre
outros. Esses, se medidos em intervalos de tempo constante, vão apresentar a variação
das medidas, dando acréscimo da matéria orgânica acumulada pela planta ao longo do
tempo em que ocorre seu desenvolvimento (Hoffmann & Poorter 2002, Hunt et al.
2002, Benincasa, 2003, Termignoni 2005).
26
Sendo assim, a análise do crescimento é um método que descreve as condições
morfofisiológicas da planta, em diferentes intervalos de tempo, e se propõe a
acompanhar a dinâmica da produção fotossintética, avaliada através da acumulação de
matéria seca. O método pode também ser usado para a investigação do efeito de
fenômenos ecológicos, sobre o crescimento, como a adaptabilidade de espécies em
ecossistemas diversos, efeitos de competição, diferenças genotípicas da capacidade
produtiva, influência de práticas agronômicas sobre o crescimento, etc. Além desses,
existem os fatores intrínsecos que afetam o crescimento e que estão associados com
fenômenos fisiológicos básicos, como fotossíntese, respiração, transporte de
metabólitos, metabolismo do nitrogênio, processos morfogenéticos, entre outros
(Magalhães 1979).
O uso da técnica de cultivo in vitro possibilita o controle dos fatores ambientais,
podendo alterar uma ou mais condições e dessa forma promover uma alteração no
padrão de crescimento (Kozai et al. 1997).
Dentre os fatores que podem influenciar o crescimento das plantas podemos citar
a temperatura. Nievola et al. (2005) verificaram uma redução do crescimento de plantas
de Ananas comosus (L.) Merr. quando cultivadas in vitro em termoperíodo (28ºC claro/
15ºC escuro), em comparação com plantas mantidas a 28ºC constante, sendo o
parâmetro mais afetado o comprimento da planta, pois as plantas que se desenvolveram
em temperatura constante apresentavam o dobro do comprimento se comparadas com as
plantas que permaneceram em alternância de temperatura. Além disso, a mudança no
regime de temperatura afetou o metabolismo fotossintético de CAM para C
3
. A redução
no crescimento também foi demonstrando em trabalho de Mollo (2009), sobre o efeito
da temperatura no crescimento in vitro de plantas de Alcantarea imperialis (Carrière)
Harms, sugerindo que a temperatura baixa teve maior influência em inibir o crescimento
27
das plantas do que a temperatura alta em estimular o processo, no entanto não foram
observadas alterações na morfologia da espécie estudada.
Outro fator importante para o desenvolvimento das plantas é a eficiência
fotossintética e, segundo Engel & Poggiani (1991), está ligada ao teor de clorofila das
plantas, que pode afetar o crescimento e influenciar a adaptabilidade das mesmas aos
diversos ambientes. Plantas da mesma espécie cultivadas in vitro apresentam,
normalmente, redução nos teores de clorofila, quando comparadas àquelas plantas
aclimatadas (Pospíšilová et al. 1999, Borghezan et al. 2003).
Além do crescimento, que usa dados biométricos ou de massa, a quantificação
do conteúdo de clorofila e a de outros compostos nitrogenados têm sido parâmetros
importantes na avaliação da nutrição nitrogenada (Argenta et al. 2004). No crescimento
de plantas clonadas de Ananas comosus cultivar Smooth Cayenne, cultivadas in vitro
em diferentes diluições dos macronutrientes do meio MS (Murashige & Skoog 1962),
foi possível observar que a quantidade de clorofilas a+b não apresentou diferenças
significativas entre os tratamentos MS, MS/2 e MS/5, concluindo que a quantidade
absorvida e assimilada de nitrogênio, a partir do meio MS/5, foi suficiente para o
desenvolvimento normal dessas plantas (Tamaki et al. 2007).
I.5. ACLIMATAÇÃO
Outro momento crucial para o sucesso do cultivo in vitro é a fase da
aclimatação, ou seja, quando as plantas saem das condições in vitro e são transferidas
para as estufas (condição ex vitro). O índice de sobrevivência para algumas espécies,
nessa fase de aclimatação, é muito baixo, tornando-se um grave problema na produção
de plantas (Donnelly & Tisdall 1993, Kadleček et al. 2001).
28
Parâmetros morfofisiológicos do crescimento, como a utilização do CO
2
e
produção de biomassa (Fila et al. 1998, Maciel et al. 2000, Radmann et al. 2001, Shim
et al. 2003), teor de clorofila (Borghezan et al. 2003, Shim et al. 2003), características
estomáticas (Barry-Etienne et al. 2002, Louro et al. 2003, Shim et al. 2003, Barboza et
al. 2006), transpiração e potencial hídrico das folhas (Fila et al. 1998, Barry-Etienne et
al. 2002), têm sido avaliados e relacionados à aclimatação de plantas provenientes de
cultura in vitro.
Vários parâmetros têm sido utilizados para estabelecer qual o melhor momento
para a transferência das plantas cultivadas in vitro para a casa de vegetação. Dentre eles
pode-se citar o tempo de cultivo (Skrebsky et al. 2004) e a massa das plantas (Barboza
et al. 2006). Contudo, o parâmetro mais relatado é o tamanho das plantas
micropropagadas, como foi observado para Syringa vulgaris L. (Hildebrand & Harney
1983), para Euphorbia fulgens Karw. (Zhang & Stoltz 1989), Daphne odora Thunb.
(Christie & Brascamp 1989), Saintpaulia ionantha Wendl (Terceiro Neto et al. 2004).
Segundo Pierik (1987), a diminuição dos subcultivos e, consequentemente, no
tempo de cultivo in vitro aumenta a economia de materiais e substâncias, sendo
importante na relação custo - benefício para a produção comercial. Rodrigues et al.
(2004), em trabalho com o desenvolvimento de mudas de Alcantarea imperialis em
diferentes substratos, relataram que as plantas foram transferidas do cultivo in vitro com
7 meses de idade e 7,5 cm de altura, não fazendo menção se plantas mantidas em outros
períodos no cultivo in vitro apresentaram sucesso na aclimatação.
Adicionalmente, o desenvolvimento de raízes também foi considerado como
fator importante para a aclimatação de plantas de morangueiro (Fragaria x ananassa
Duch.) (Corsato & Crocomo 2002). Esses autores concluíram que as plantas mais
indicadas para a aclimatação apresentavam cinco centímetros de altura, pelo menos dois
pares de folhas e raízes já desenvolvidas, porém não mencionaram qual o tempo de
29
cultivo in vitro necessário para produzir plantas desse tamanho. Por outro lado,
Sobrinho et al. (2007), em trabalho sobre a permanência no cultivo in vitro de plantas
de capim-elefante (Pennisetum purpureum Schum.), verificaram que quanto maior o
tempo in vitro menor era a porcentagem de sobrevivência das plantas na aclimatação.
Porém, ainda não se sabe se o tempo de permanência das plantas no cultivo in vitro
interfere no sucesso da aclimatação.
I.6. ANATOMIA DE PLANTAS MICROPROPAGADAS
Em vários estudos tem-se observado que as condições de cultivo in vitro podem
levar a alterações morfológicas e interferir no processo de aclimatação (Dhawan &
Bhojwani 1987, Donnelly & Tisdall 1993, Majada et al. 2000).
Assim, a técnica de micropropagação propicia alta taxa de multiplicação, mas as
plantas produzidas podem diferir em estrutura, sendo distintas fisiologicamente
daquelas plantas desenvolvidas em casa de vegetação e em campo (Pospíšilová et al.
1999, Calvete et al. 2002, Hazarika 2003).
Dentre as possíveis diferenças anatômicas, entre plantas cultivadas in vitro e em
casa de vegetação, destaca-se a alteração no desenvolvimento das células estomáticas
causando má formação (Noé & Bonini 1996, Blanke & Belcher 1989, Tichá et al. 1999,
Pospíšilová et al. 1999, Brutti et al. 2002). Outras alterações estruturais foram também
encontradas nas escamas (Bandyopadhyay et al. 2004), cutícula (Calvete et al. 2002),
mesofilo (Pospíšilová et al. 1999, Calvete et al. 2002). É provável que essas alterações
ocorridas in vitro possam estar relacionadas à dificuldade de aclimatação de algumas
espécies. Considera-se que o funcionamento do estômato seja fator determinante para a
sobrevivência das plantas no processo de aclimatação, por ser a estrutura responsável
30
pelo controle das trocas gasosas e do suprimento hídrico dos tecidos (Pospíšilová et al.
1999, Hazarika 2003).
Comparações entre as folhas de mudas de Ananas comosus, cultivadas in vitro e
em casa de vegetação, apresentaram variações na freqüência estomática, no
espessamento da cutícula e parede das células epidérmicas, no formato e na sinuosidade
das paredes das células do parênquima aquífero e na presença de células papilosas,
demonstrando sua plasticidade fenotípica. A baixa irradiância e a alta umidade relativa
do ambiente in vitro são fatores que, possivelmente, podem estar relacionados com a
presença de células papilosas (Barboza et al. 2006).
Alguns estudos têm sugerido que o sucesso da aclimatação das plantas oriundas
de cultura in vitro seria dependente da quantidade de substâncias armazenadas nos
tecidos da raiz e da parte aérea, o qual serviria como fonte de carbono a ser consumido
no início do processo, até a emergência de novas folhas (Grout & Millan 1985,
Desjardins et al. 1987).
Assim, informações sobre a morfologia, crescimento e fisiologia das plantas
cultivadas in vitro, em comparação àquelas mantidas em estufa, podem contribuir no
sentido de elucidar o processo de aclimatação.
31
II. OBJETIVO
O objetivo do presente trabalho foi contribuir para conhecimento
anatomofisiológico de Alcantarea imperialis (Carrière) Harms, visando o
estabelecimento de um protocolo para a propagação de mudas a partir de sementes, que
permita obter o maior índice de sobrevivência e produção de plantas dessa espécie com
o menor custo e, consequentemente, estimular os produtores a cultivá-la para a redução
de seu extrativismo e seus reflexos ambientais, principalmente os relativos à
conservação da espécie e à sobrevivência de outros organismos que dela dependem.
Para tanto, diferentes protocolos foram avaliados para mudas cultivadas in vitro
e, posteriormente, submetidas à aclimatação, comparando parâmetros morfológicos e
fisiológicos destas com aqueles de mudas obtidas por meio de cultivo em estufa.
32
III. MATERIAL E MÉTODOS
Para melhor compreensão da metodologia utilizada, todos os itens da mesma se
encontram resumidos no fluxograma da figura 13.
As etapas de cultivo in vitro, em condições de estufa e aclimatação foram
desenvolvidas no Núcleo de Pesquisas em Plantas Ornamentais, e a análise estrutural foi
realizada no Núcleo de Pesquisas em Anatomia, ambos do Instituto de Botânica da
Secretaria do Meio Ambiente do Estado de São Paulo. O experimento foi instalado em
maio de 2007 e encerrado em julho de 2008.
III.1. COLETA E PREPARAÇÃO DAS SEMENTES
As sementes de Alcantarea imperialis foram coletadas de exemplares cultivados
no Núcleo de Pesquisas em Plantas Ornamentais, incluídos na Coleção Viva de
Bromélias do Instituto de Botânica de São Paulo.
O material testemunho se encontra depositado no Herbário do Estado “Maria
Eneyda P.K. Fidalgo” (sigla SP), coleta de L.M. Versieux n
o
. 450.
Após a coleta, as sementes foram separadas manualmente dos frutos (figura 14)
e ficaram acondicionadas em envelopes de papel pardo, mantidas a 10
o
C até a
realização dos experimentos (cerca de 6 meses) na sala de cultura do
Núcleo de
Pesquisas em Plantas Ornamentais.
Para utilização nos experimentos, os apêndices plumosos foram retirados
manualmente das sementes (figuras 15-16), que foram, então, submetidas à
desinfestação superficial segundo Kurita (2008), com etanol 70% por 5 minutos,
seguida por uma imersão em solução de benomil 1% (Benlat) por 5 minutos,
transferidas para solução de hipoclorito de sódio comercial 4% (v/v) adicionada de
algumas gotas de Tween 20, onde foram mantidas durante 60 minutos.
33
Figura 13. Fluxograma das etapas de estabelecimento das plantas in vitro, estufa e aclimatadas.
Figuras 14-19.
Montagem do experimento
(Carrière) Harms. 14
. Fruto seco aberto com sementes expostas.
plumosos. 16
. Semente sem apêndices plumosos.
18. Frasco de cultivo
in vitro
crescimento
. Barra = 1 cm (14
Montagem do experimento
in vitro com sementes de
Alcantarea imperialis
. Fruto seco aberto com sementes expostas.
15
. Semente com apêndices
. Semente sem apêndices plumosos.
17. Frasco de cultivo
in vitro
in vitro
com plantas jovens. 19
. Estante com o experimento na sala de
. Barra = 1 cm (14
-18); 10 cm (19).
34
in vitro
com sementes.
35
Todo o procedimento de desinfestação foi realizado sob agitação manual. Após
essa etapa, o procedimento ocorreu dentro da câmara de fluxo laminar, sendo as
sementes enxaguadas três vezes com água destilada esterilizada e, em seguida,
depositadas em meio de cultura ou em gerbox sob papel de filtro umedecido com água
destilada.
III.2. EFEITO DA LUZ NA GERMINAÇÃO DE SEMENTES
O experimento foi conduzido com delineamento experimental inteiramente
casualizado, envolvendo três tratamentos: fotoperíodos de 12 e 16 horas, com
irradiância de 30 µmol m
-1
s
-1
obtida pelo radiômetro LI-COR model LI-189, e escuro
contínuo, tanto nas condições de cultivo in vitro como em gerbox com papel de filtro.
Cada tratamento teve quatro repetições com 50 sementes cada.
Após desinfestação superficial, as sementes foram colocadas em gerbox sobre
papel de filtro umedecido com água destilada. Para o tratamento no escuro as sementes
foram depositadas em gerbox preto. Todas as sementes dos diferentes tratamentos
receberam água periodicamente.
O lote cultivado in vitro utilizou o meio de cultura básico de Murashige &
Skoog (1962), contendo metade da concentração original dos macronutrientes e a
concentração original dos micronutrientes, representado por MS/2 (Tamaki et al. 2006).
Ao meio foram adicionados 100 mg L
-1
de mio-inositol, 0,1 mL L
-1
de tiamina, 5 g L
-1
de ágar e 30 g L
-1
de sacarose. Em placas de Petri com 10 cm de diâmetro foram
adicionados 10 mL de meio de cultura. Em capela de fluxo laminar de ar estéril foram
depositadas 50 sementes por placa de Petri. Para o tratamento no escuro as placas foram
acondicionadas no interior de gerbox preto. Tanto as placas de Petri como os gerbox
foram mantidos em temperatura de 26 ± 2 ºC. Após 15 dias, foram avaliados a
germinabilidade (porcentagem de germinação) e tempo médio de germinação.
36
III.3. ACOMPANHAMENTO DO DESENVOLVIMENTO PÓS-SEMINAL
Para o acompanhamento do desenvolvimento pós-seminal foram montados lotes
de sementes em cultivo in vitro e em condições de estufa, utilizando-se sementes que,
após a desinfestação superficial, foram colocadas em caixa gerbox sobre papel de filtro
umedecido com água destilada, sendo mantidas nas mesmas condições de luminosidade
e temperatura.
O lote cultivado in vitro utilizou o meio de cultura básico de Murashige &
Skoog (1962), contendo metade da concentração original dos macronutrientes e a
concentração original dos micronutrientes, representado por MS/2 (Tamaki et al. 2006).
Ao meio foram adicionados 100 mg L
-1
de mio-inositol, 0,1 mL L
-1
de tiamina, 5 g L
-1
de ágar e 30 g L
-1
de sacarose. Em placas de Petri com 10 cm de diâmetro foram
adicionados 10 mL de meio de cultura. Em capela de fluxo laminar de ar estéril foram
depositadas 50 sementes por placa de Petri. As placas de Petri foram mantidas em sala
de crescimento, com fotoperíodo de 12 horas, irradiância de 30 µmol m
-1
s
-1
e
temperatura de 26 ± 2ºC.
As coletas foram diárias até 30 dias nas duas condições de cultivo. A descrição
morfológica do desenvolvimento pós-seminal até a formação de uma planta seguiu a
metodologia proposta por Pereira (1988) para espécies de Bromelioideae e de Tillich
(2007) para Poales, as etapas do desenvolvimento foram apresentadas segundo tabela
adaptada de Stewart et al. (2003).
III.4. COMPARAÇÃO DO CRESCIMENTO E ANATOMIA DAS PLANTAS
CULTIVADAS IN VITRO, EM ESTUFA E ACLIMATADAS
III.4.1. Estabelecimento do cultivo in vitro a partir de semente
O meio de cultura básico foi o de Murashige & Skoog (1962), contendo metade
da concentração original dos macronutrientes e a concentração original dos
37
micronutrientes, representado por MS/2 (Tamaki et al. 2006). Ao meio foram
adicionados 100 mg L
-1
de mio-inositol, 0,1 mL L
-1
de tiamina, 5 g L
-1
de ágar e 30 g
L
-1
de sacarose.
Em frascos com 250 mL de capacidade foram adicionados 40 mL do meio. Em
capela de fluxo laminar de ar estéril foram depositadas 15 sementes por frasco de
cultura (figura 16). Os frascos de cultura foram mantidos em sala de crescimento, com
fotoperíodo de 12 horas, irradiância de 30 µmol m
-1
s
-1
e temperatura de 26 ± 2ºC
(figura 13,18-19). As plantas do cultivo in vitro foram transferidas a cada 4 meses para
meio de cultura novo, a fim de que não ocorresse deficiência nutricional.
III.4.2. Estabelecimento do cultivo em estufa a partir de semente
Utilizaram-se 20 caixas gerbox revestidas por papel de filtro umedecido com água
destilada, nas quais foram depositadas 100 sementes por caixa, totalizando 2000
sementes (figuras 13, 20 e 21). Após um mês, as plantas obtidas foram transferidas para
bandejas de isopor de 21,5 x 14,5 x 4 cm preenchidas com substrato de casca de Pinus
moída previamente embebida em água, o espaçamento entre as plantas foi de 3 cm
(figuras 22-23). Após 4 meses de cultivo, as plantas foram transferidas para bandejas de
isopor com 200 células, colocando-se uma planta por célula (De Paula et al. 2006). As
caixas gerbox e as bandejas de isopor foram mantidas na sala de crescimento,
juntamente com as culturas in vitro. As bandejas foram adubadas mensalmente com
solução contendo as mesmas quantidades de macronutrientes, micronutrientes, mio-
inositol e tiamina do meio de cultura MS/2, não foi acrescentada a solução o ágar e a
sacarose. Para evitar a perda excessiva de umidade, as bandejas foram envolvidas por
saco plástico transparente, a irradiância apresentou valores similares com ou sem a
barreira plástica, ou seja cerca de 30 µmol m
-1
s
-1
(figuras 22-23).
Figuras 20-25.
Montagem do experimento em condições de estufa com sementes d
imperialis. 20
. Gerbox com sementes.
plântulas em substrato de casca de
plantas do lote cultivado em estufa envolvida por saco plástic
plantas do lote de aclimatação envolvida por saco plástico (8 meses).
após o período de aclimatação (10 meses). Barra = 2 cm (20
Montagem do experimento em condições de estufa com sementes d
. Gerbox com sementes.
21
. Gerbox com plântulas (1 mês).
plântulas em substrato de casca de
Pinus
envolvida por saco plástico (1 mês).
plantas do lote cultivado em estufa envolvida por saco plástic
o (2 meses).
plantas do lote de aclimatação envolvida por saco plástico (8 meses).
25
. Bandeja com plantas
após o período de aclimatação (10 meses). Barra = 2 cm (20
-23); 10 cm (24-
25).
38
Montagem do experimento em condições de estufa com sementes d
e Alcantarea
. Gerbox com plântulas (1 mês).
22. Bandeja com
envolvida por saco plástico (1 mês).
23. Bandeja com
o (2 meses).
24. Bandeja com
25).
39
III.4.3. Aclimatação: estabelecimento do período “in vitro” adequado
No estudo de aclimatação, 100 plantas cultivadas in vitro foram transferidas para
condições ex vitro após 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses. Para tanto, foram colocadas em
bandejas de isopor com 200 células com substrato de casca de Pinus moída previamente
embebida em água, onde permaneceram por 2 meses (figuras 13, 24-25). As bandejas
foram adubadas mensalmente com solução nutritiva (MS/2), igual àquela utilizada para
as plantas cultivadas em estufa. Para evitar a perda excessiva de umidade, as bandejas
foram envolvidas por saco plástico transparente e permaneceram em sala de
crescimento nas mesmas condições de temperatura e luminosidade das plantas
cultivadas in vitro e em estufa.
Dessa forma, foram estabelecidos os tratamentos, segundo a tabela 1.
Tabela 1. Tratamentos de aclimatação de plantas de Alcantarea imperialis.
Tratamento
Período de cultivo
In vitro Estufa (aclimatação)
I
1 mês
2 meses
II
2 meses 2 meses
III
4 meses 2 meses
IV
6 meses 2 meses
V
8 meses 2 meses
VI
10 meses 2 meses
VII
12 meses 2 meses
III.5. COLETA
As plantas cultivadas in vitro e cultivadas em estufa por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12
meses foram submetidas às análises de acúmulo de massa fresca e seca, análises
biométricas de número e comprimento das raízes e folhas, teor de clorofila e de
carotenóides. As plantas aclimatadas foram coletadas 2 meses após a transferência
(tratamentos I a VII) e analisadas quanto aos mesmos parâmetros (figura 13).
40
III.6. PARÂMETROS AVALIADOS
III.6.1. Análise biométrica
Nas análises biométricas foram avaliadas 50 plantas, coletadas ao acaso de cada
tratamento (dentre as cultivadas in vitro, em estufa e aclimatadas), quanto ao número de
raízes e folhas e, também, quanto ao comprimento da raiz mais longa e da folha mais
longa com o auxílio de régua milimétrica.
III.6.2. Determinação de massa
Retiraram-se, ao acaso, de 3 a 150 plantas provenientes de cultivo in vitro,
cultivo em estufa e plantas aclimatadas. O número de plantas variou de acordo com a
dimensão das mesmas, uma vez que utilizou-se o mínimo 0,1g de massa fresca para
cada amostra. As plantas foram separadas em duas partes, a aérea e a das raízes,
utilizando-se três amostras compostas para cada coleta. As medidas de massa seca
foram realizadas após secagem em estufa a 60ºC, até massa constante (cerca de 72
horas) em balança analítica de precisão.
III.6.3. Determinação do teor de clorofila e de carotenóides
Amostras compostas de cada coleta com no mínimo 0,3 g de folhas frescas
foram congeladas para a determinação de clorofilas e de carotenóides, segundo técnica
descrita por Lichtenthaler (1987), utilizando-se três amostras para cada coleta. A
extração dos pigmentos foi realizada sob baixa luminosidade para impedir sua
degradação pela luz. O material congelado a temperatura de -20°C foi macerado com
acetona P.A. e em seguida filtrado papel de filtro. A solução resultante foi transferida
para cubetas e as leituras foram realizadas, sob penumbra, em espectrofotômetro nos
comprimentos de onda de 710 nm (resíduos), 661,6 nm (clorofila a), 644,8 nm (clorofila
41
b) e 470 nm (carotenóides). O conteúdo de cada pigmento foi calculado pelas equações
apresentadas por Lichtenthaler (1987):
Cl a = [(11,24 A
661,6
)
- (2,04 A
644,8
)]
(V M
-1
)
Cl b = [(20,13 A
644,8
)
- (4,19 A
661,6
)] (V M
-1
)
Cl a + b = (7,05 A
661,6
) + (18,09 A
644,8
)
Cl a b
-1
= C
a
C
b
-1
Carotenóides = [(1000 A
470
) – (1,90 C
a
) – (63,14 C
b
)] 214
-1
Onde:
A é a absorbância, V é o volume da amostra (mL), M é a massa fresca da amostra (mg),
Cl
a
é o valor de clorofila a e Cl
b
é o valor de clorofila b.
Os conteúdos de clorofilas e carotenóides dos tecidos foram expressos em µg do
pigmento por grama de massa fresca.
III.6.4. Índice de Suculência da parte aérea
Segundo Kluge & Ting (1978) o índice de suculência pode ser calculado com
base na equação:
Índice de Suculência (mg µg
-1
) = (massa fresca – massa seca) (teor de clorofila a
+ b)
-1
III.6.5. Análise de Desenvolvimento
A partir dos dados primários (massa fresca e massa seca), parâmetros
subseqüentes foram determinados, tais como:
Razão raiz : parte aérea = (massa seca da raiz) (massa seca da parte aérea)
-1
Razão número de folhas mortas : número total de folhas =
(número de folhas mortas) (número total de folhas)
-1
Razão de peso de folha = (massa seca da parte aérea) (massa seca total da planta)
-1
Distribuição de biomassa (raízes e parte aérea) =
(massa seca do órgão) (massa seca total da planta)
-1
100
42
- Taxa de Crescimento
A taxa de crescimento relativo (TCR) é a variação ou incremento em massa,
altura, número de folhas, área foliar ou qualquer outro parâmetro de avaliação de
crescimento, ao longo de um determinado período, estando diretamente relacionado ao
valor alcançado no período anterior (Benincasa, 2003). Dessa forma, foram utilizados
para cálculos de taxa de crescimento relativo das plantas cultivadas in vitro, em
condições de estufa e aclimatadas os dados de média de massa fresca e seca, tanto das
raízes como da parte aérea.
As taxas de crescimento relativo (TCR) foram calculadas segundo a equação:
TCR = [(LnP
2
- LnP
1
)] (t
2
-t
1
)
-1
Onde:
Ln é o logaritmo natural, P
2
é o valor atual do parâmetro, P
1
é o valor anterior do
parâmetro e t é o tempo (índice
1
= valor inicial e índice
2
= valor final).
III.6.6. Análise estrutural
III.6.6.1. Anatomia foliar de plantas adultas
Buscando um maior entendimento sobre a anatomia da espécie estudada,
realizou-se um estudo sobre a anatomia foliar da espécie adulta, ainda não descrita na
literatura.
Foram utilizadas folhas adultas, expandidas, retiradas da periferia da roseta
foliar de indivíduos provenientes do Núcleo de Pesquisa em Plantas Ornamentais do
Instituto de Botânica de São Paulo, cujo material testemunho da planta mãe se encontra
depositado no Herbário do Estado “Maria Eneyda P.K. Fidalgo” (sigla SP), coleta de
L.M. Versieux n
o
. 450.
43
Amostras da porção mediana da folha foram fixadas em FAA
(formaldeído:ácido acético:álcool etílico 50%, 2:1:18, v/v), de acordo com Johansen
(1940), mantidas por 48 horas e posteriormente transferidas para etanol 70%.
As folhas foram seccionadas transversalmente, à mão livre, com auxílio de
lâmina de barbear e isopor.
As secções foram clarificadas com solução de hipoclorito de sódio a 10%,
coradas com azul de astra 1% e safranina 1% (Bukatsch 1972), desidratadas pela série
etílica e montadas entre lâmina e lamínula com resina Permount®.
As lâminas foram analisadas ao microscópio fotônico e as ilustrações obtidas em
fotomicroscópio, com projeção de escalas micrométricas.
Para análise da micromorfologia das superfícies foliares, as amostras retiradas da
região da bainha foram coletas e imediatamente distentidas entre lâminas de vidro para
a secagem em estufa à temperatura de 40
o
C. Porções foliares, secas, foram fixadas em
suportes de alumínio e metalizadas com ouro para análise ao microscópio eletrônico de
varredura. As características estruturais foram mostradas por meio de elétron-
micrografias.
III.6.6.2. Anatomia foliar de plantas cultivadas in vitro e em condições de
estufa
A estrutura foliar de plantas cultivadas in vitro e em condições de estufa foi
comparada utilizando-se plantas com 4, 6 e 12 meses de idade em cada uma das
condições de cultivo. As plantas cultivadas in vitro e em condições de estufa foram
lavadas em água corrente, as provenientes do cultivo in vitro para retirada do meio de
cultura e as do cultivo em estufa tiveram suas raízes lavadas para a remoção do
substrato. Os estudos foram realizados em cinco plantas de cada condição de cultivo,
utilizando-se a terceira ou quarta folha a partir do ápice.
44
As amostras para os estudos anatômicos foram, inicialmente, fixadas em solução
aquosa 50% de FAA (formaldeído:ácido acético:álcool etílico 50%, 2:1:18, v/v), de
acordo com Johansen (1940), permanecendo 24 horas nessa solução e, posteriormente,
mais 24 horas em solução concentrada do mesmo FAA, sendo em seguida transferidas
para etanol 70%.
Pequenas amostras da porção mediana do limbo foram submetidas à
desidratação em série etílica até etanol 95%, posteriormente pré-infiltradas com solução
de etanol 95% e incluídas em metacrilatoglicol (historresina Leica), seguindo as
instruções do fabricante e a técnica de Feder & O’Brien (1968). O material incluído foi
seccionado em micrótomo rotativo. As secções transversais obtidas (7µm de espessura)
foram coradas com azul de toluidina 0,05% em tampão acetato 0,1M pH 4,7 (O’Brien et
al. 1965, modificado).
As características estruturais foram documentadas por meio de ilustrações,
obtidas com o auxílio de estereomicroscópio equipado com câmara clara, ou por meio
de fotomicrografias.
III.7. ANÁLISE DE DADOS
Para a análise dos dados foi utilizada a estatística descritiva, calculando-se o
desvio padrão entre as médias obtidas. Os dados de biometria (número e comprimento
das raízes, número de folhas sadias e mortas e comprimento das folhas) e de massa,
tanto fresca como seca, foram submetidos ao teste de normalidade, à análise de
variância (ANOVA) e ao teste Tukey, utilizando-se o pacote estatístico BioEstat 5.0.
Com exceção dos dados biométricos e de massa, os demais são índices fisiológicos, que
por serem dados calculados, não obedecem às pressuposições básicas para a análise de
variância.
45
IV. RESULTADOS
IV.1. EFEITO DA LUZ NA GERMINAÇÃO (tabela 2)
Com relação ao fotoperiódico, não foram observadas diferenças significativas
entre os tratamentos com 12 horas e 16 horas (tabela 2), e entre as duas condições de
cultivo (papel de filtro e meio de cultura).
Tabela 2. Porcentagem de germinação de sementes de Alcantarea imperialis cultivadas
in vitro e em papel de filtro submetidas a diferentes fotoperíodos e a escuro contínuo.
PORCENTAGEM DE GERMINAÇÃO(%)
(X ± S)
Tipo de cultivo
Fotoperíodo
Escuro
12 horas 16 horas
In vitro
100 ± 0 aA 100 ± 0 aA 0 ± 0 bB
Papel de filtro
92,5 ± 2,52 aA 93,5 ± 3,42 aA 0 ± 0 bB
*Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical
Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Todavia, foi possível verificar que as sementes dessa espécie são fotoblásticas
positivas, pois não germinaram na condição de ausência de luz, independente do tipo de
cultivo utilizado, apresentando o tempo médio de germinação de quatro dias.
46
IV.2. DESENVOLVIMENTO PÓS-SEMINAL (figuras 26 a 29; tabela 3)
Em Alcantarea imperialis o tipo de germinação é epígea, com a plântula do tipo
criptocotiledonar com cotilédone de reserva.
As plântulas normais observadas se caracterizavam por possuírem raiz principal
curta e cônica (figuras 26 e 27), raízes adventícias surgindo a partir do colo (figura 28),
bainha cotiledonar verde e carnosa (figura 28). A primeira folha é plana, lanceolada, de
bordos inteiros e superpostos na base, formando a roseta (figuras 27 e 28).
Não foram observadas diferenças morfológicas entre as plântulas desenvolvidas
no cultivo in vitro quando comparadas com as plântulas provenientes do cultivo em
estufa.
O que se pode observar é um desenvolvimento mais rápido nas plântulas das
condições in vitro de aproximadamente 2 dias, notadamente a partir do aparecimento da
primeira folha, por volta dos 10 dias; fato semelhante ocorre quando do aparecimento da
segunda folha (tabela 3).
Nas plântulas desenvolvidas no cultivo in vitro, as raízes adventícias também
tiveram predominância de aparecimento em relação às plântulas com mesma idade
cultivadas em gerbox (tabela 3).
Figuras 26-29.
Etapas do desenvolvimento pós
Harms. 26
. Plântulas com 10 a 15 dias.
dias. 27C. 20 dias. 27D
. 25 dias.
cotiledonar;
pf : primeira folha; r: raiz principal; rad: raiz adventícia; s: semente; sf: segunda
folha). Barra = 0,5 cm (26-
29).
Etapas do desenvolvimento pós
-seminal de
Alcantarea imperialis
. Plântulas com 10 a 15 dias.
27. Plântulas com 15 a 25 dias. 27A
. 25 dias.
28. Plântula com 20 dias. 29
. Planta com 40 dias. (bc: bainha
pf : primeira folha; r: raiz principal; rad: raiz adventícia; s: semente; sf: segunda
29).
47
Alcantarea imperialis
(Carrière)
. 15 dias. 27B. 18
48
Tabela 3. Etapas do desenvolvimento pós-seminal de Alcantarea imperialis cultivadas
in vitro e em gerbox por 20 dias.
Etapa
Descrição do desenvolvimento pós-seminal
Tempo
(dias)
In vitro Gerbox
1
Semente embebida e dilatada 1 100% 100%
2
Semente inchada com o tegumento partido 2 100% 100%
3
Início da protusão da raiz (= 1mm) 3 95% 94%
4
Aparecimento da bainha cotiledonar 8 78% 62%
5
Início da primeira folha 10 32% 0
6
Primeira folha expandida 13 56% 4%
7
Aparecimento da segunda folha 15 15% 0
8
Aparecimento das raízes adventícias 20 30% 1%
IV.3. COMPARAÇÃO DO CRESCIMENTO E ANATOMIA DAS PLANTAS
CULTIVADAS IN VITRO E EM CONDIÇÕES DE ESTUFA (figuras 30 a 88;
tabelas 4 a 8)
A análise dos dados biométricos das raízes (figuras 30A,B) mostrou que as
plantas cultivadas in vitro apresentaram maiores valores tanto para o número de raízes
como para o comprimento, sendo as plantas do cultivo in vitro com 12 meses de idade
as que apresentaram as maiores diferenças significativas quando comparadas com as
plantas de mesma idade cultivadas em condições de estufa. O número de raízes (figura
30A) nas plantas cultivadas in vitro sofreu um aumento mais expressivo a partir do 6º
mês de cultivo, sendo que as plantas do cultivo in vitro apresentaram o dobro do
49
número de raízes das plantas com a mesma idade e cultivadas em condições de estufa.
Nas plantas com 12 meses in vitro o número foi 3 vezes o das plantas com a mesma
idade cultivada em condições de estufa.
Com relação ao comprimento das raízes (figura 30B), os valores também
mostraram um aumento relevante nas plantas cultivadas in vitro quando comparadas
com aquelas em condições de estufa, sendo mais evidente a partir do 6º mês. Nas
plantas com 12 meses de cultivo in vitro o aumento no comprimento das raízes foi
quatro vezes maior quando comparadas com as plantas de mesma idade mantidas em
condições de estufa.
Os dados de massa para as raízes, tanto fresca como seca (figuras 30C,D),
apresentaram aumento em todos os períodos analisados. As plantas do cultivo em estufa
apresentaram valores menores de massa fresca das raízes (figura 30C) quando
comparadas com as plantas do cultivo in vitro, sendo essa diferença mais evidente a
partir do 6º mês. Os dados de massa seca das raízes das plantas do cultivo em estufa
(figura 30D) só foram maiores nas plantas com 1 mês de idade, nos demais períodos as
plantas do cultivo in vitro apresentaram valores maiores de massa seca das raízes.
Figura 30.
Crescimento de raízes de plantas de
cultivadas in vitro (○
) e em condições de estufa (
B. Comprimento (cm). C.
Massa fresca (mg).
média de 50 plantas e as barras indicam o desvio padrão.
Crescimento de raízes de plantas de
Alcantarea imperialis
) e em condições de estufa (
□
) por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
Massa fresca (mg).
D.
Massa seca (mg). Os valores representam a
média de 50 plantas e as barras indicam o desvio padrão.
A
D
50
Alcantarea imperialis
(Carrière) Harms
) por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
A. Número.
B
C
51
Em relação à parte aérea, os valores de número de folhas sadias (figura 31A)
foram próximos em todos os períodos analisados, com exceção dos 6 meses de cultivo
in vitro, que apresentou mais folhas sadias quando comparado com as plantas de mesma
idade cultivadas em condições de estufa. Porém, após esse período, os valores ficam
semelhantes e as plantas cultivadas por 12 meses em estufa apresentam cerca de 12
folhas sadias. Para o número de folhas mortas (figura 31B), nas plantas do cultivo in
vitro só começam a ocorrer a partir do 6º mês, e para as plantas cultivadas em condições
de estufa no 2º mês. Embora na condição de cultivo em estufa as folhas morram mais
cedo, no cultivo in vitro a quantidade foi maior, chegando ao dobro dos valores aos 10
meses de cultivo e o triplo com 12 meses.
Quanto ao comprimento das folhas (figura 31C), as plantas apresentaram
aumento nos valores em todos os períodos estudados, porém nas plantas com 6 meses
de cultivo in vitro o comprimento das folhas foi o dobro, quando comparada com as de
mesma idade cultivadas em condições de estufa.
Os dados de massa da parte aérea, tanto fresca como seca, apresentaram
aumento em todos os períodos analisados. Os dados de massas fresca e seca (figura
32A,B) apresentaram as maiores diferenças entre os valores nos períodos de cultivo in
vitro a partir de 6 meses, quando comparados com as plantas de mesma idade cultivadas
em condições de estufa.
Figura 31.
Crescimento da parte aérea de plantas de
cultivadas in vitro (
○) e em condiç
de folhas sadias. B.
Números de folhas mortas.
representam a média de 50 plantas e as barras indicam o desvio padrão.
Crescimento da parte aérea de plantas de
Alcantarea imperialis
○) e em condiç
ões de estufa (□
) por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
Números de folhas mortas.
C.
Comprimento das folhas (cm). Os valores
representam a média de 50 plantas e as barras indicam o desvio padrão.
A
B
C
52
Alcantarea imperialis
(Carrière) Harms
) por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
A. Números
Figura 32.
Crescimento da parte aérea de plantas de
cultivadas in vitro (
○) e em condiç
fresca (mg). B.
Massa seca (mg). Os valores representam a média composta
as barras indicam o desvio padrão.
Crescimento da parte aérea de plantas de
Alcantarea imperialis
○) e em condiç
ões de estufa (□
) por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
Massa seca (mg). Os valores representam a média composta
de plantas (
as barras indicam o desvio padrão.
53
Alcantarea imperialis
(Carrière) Harms
) por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
A. Massa
de plantas (
n = 3) e
A
B
54
A taxa de crescimento relativo, calculado a partir das massas fresca e seca da
parte aérea (MFpa e MSpa - tabela 4), mostrou maiores valores para as plantas
cultivadas in vitro, sendo que o maior valor encontrado foi para as plantas com 2 meses
de idade cultivadas in vitro, nos demais períodos foram similares.
Para os valores de taxa de crescimento relativo, com base na massa fresca e seca
das raízes (MFr e MSr - tabela 4), foi possível observar que as plantas do cultivo in
vitro apresentaram os maiores valores, sendo o período de 2 meses de idade o que
apresentou os maiores dados. Nas plantas cultivadas em condições de estufa o maior
valor de TCR de massa fresca das raízes foi para o 4º mês de cultivo; os maiores valores
de massa seca foram encontrados para o 2º mês de cultivo. Porém, quando se compara a
TCR de massas fresca e seca das raízes entre as plantas cultivadas in vitro e em
condições de estufa, pode-se notar que no 4º mês os valores são similares, independente
do tipo de cultivo. Plantas com 12 meses cultivadas in vitro têm uma TCR de massa
seca de raízes 15 vezes maior que as plantas de mesma idade cultivadas em condições
de estufa, mostrando um investimento acentuado no crescimento nesses orgãos.
Comparando os valores da taxa de crescimento relativo, baseado na massa total
das plantas, tanto fresca (MFt) como seca (MSt), mostram resultados similares aos
dados para a massa da parte aérea (tabela 4).
55
Tabela 4. Taxa de crescimento relativo (TCR) em massa fresca da raiz: MFr = (mg
2
mg
1
-1
) mês
-1
, massa fresca da parte aérea: MFpa = (mg
2
mg
1
-1
)
mês
-1
, massa fresca total: MFt = (mg
2
mg
1
-1
) mês
-1
, massa seca da raiz: MSr = (mg
2
mg
1
-1
) mês
-1
, massa seca da parte aérea: MSpa = (mg
2
mg
1
-1
) mês
-1
,
massa seca total: MSt = (mg
2
mg
1
-1
) mês
-1
, das plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa por 2, 4, 6, 8, 10 e 12
meses. Esses índices fisiológicos por serem dados calculados, não obedecem às pressuposições básicas para a análise de variância.
TAXA DE CRESCIMENTO RELATIVO (TCR)
Período em
meses
In vitro
Estufa
MFr MFpa
MFt MSr MSpa MSt MFr MFpa MFt MSr MSpa MSt
1-2
1,69 1,09 1,15 1,47 1,03 1,1 0,03 0,16 0,15 0,58 0,30 0,34
2-4
0,62 0,67 0,66 0,44 0,74 0,69 0,68 0,57 0,58 0,45 0,63 0,61
4-6
0,76 0,46 0,47 0,95 0,40 0,51 0,15 0,48 0,46 0,36 0,43 0,42
6-8
0,29 0,42 0,43 0,42 0,45 0,44 0,35 0,42 0,42 0,25 0,34 0,34
8-10
0,18 0,30 0,29 (*) 0,12 0,08 0,05 0,01 0,01 0,10 0,11 0,11
10-12
0,50 0,26 0,30 0,65 0,59 0,61 0,11 0,23 0,23 0,04 0,20 0,19
(*) tende a zero
56
Na razão da massa foliar (RMF - tabela 5), as plantas cultivadas em estufa
apresentaram valores maiores quando comparadas com as cultivadas in vitro para todos
os tempos analisados. Entre as plantas cultivadas em condições de estufa o maior valor
de RPF ocorreu naquelas cultivadas por 12 meses.
A razão entre o número de folhas mortas por número de folhas totais (RNF -
tabela 5) foi crescente, tanto para as cultivadas in vitro como as em condições de estufa,
porém analisando os dados das plantas cultivadas in vitro foi possível observar que
esses valores são maiores. Nas plantas com 12 meses de idade cultivadas in vitro a taxa
foi o dobro das plantas de mesma idade cultivadas em condições de estufa.
Na razão raiz:parte aérea calculada com base na massa seca ( RMS - tabela 5),
as plantas cultivadas em condições de estufa apresentaram valores menores quando
comparadas com as plantas cultivadas in vitro para todos os tempos analisados. As
plantas do cultivo in vitro com 6 meses de idade apresentaram 4 vezes a razão raiz:parte
aérea, quando comparadas com aquelas de mesma idade cultivadas em estufa.
57
Tabela 5. Razão da massa foliar (RMF), razão do número de folhas mortas por número total de folhas (RNF) e razão da massa seca da
raiz por massa seca da parte aérea (RMS) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa por 1, 2, 4,
6, 8, 10 e 12 meses. Esses índices fisiológicos por serem dados calculados, não obedecem às pressuposições básicas para a análise de
variância.
Meses
In vitro
Estufa
RMF
RNF
RMS
RMF
RNF
RMS
1
0,87
-
0,15
0,89
-
0,12
2
0,81
-
0,23
0,86
(*)
0,16
4
0,90
-
0,13
0,90
0,09
0,11
6
0,72
0,11
0,39
0,91
0,09
0,10
8
0,73
0,25
0,37
0,92
0,19
0,08
10
0,79
0,39
0,26
0,92
0,14
0,08
12
0,77
0,43
0,30
0,94
0,20
0,06
(*) tende a zero
58
Os dados de teor de pigmentos (tabela 6) mostram uma quantidade maior de
clorofila a nas plantas cultivadas in vitro, quando comparadas com aquelas cultivadas
em estufa nos períodos analisados, com exceção do 6º e 8º mês. O mesmo não ocorre
para os dados de teor de clorofila b, onde a ocorrência foi maior nas plantas cultivadas
em estufa, com exceção das plantas com 1, 2 e 12 meses de idade. Os dados de teor de
carotenóides também foram maiores nas plantas cultivadas in vitro.
Tabela 6. Valores médios de pigmentos (ìg) por massa fresca (g) das plantas de
Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa por 1, 2, 4, 6, 8,
10 e 12 meses.
Os valores representam a média composta (n = 3) e indicam o desvio
padrão.
Já os valores da razão clorofila a : clorofila b (tabela 7) foram maiores nas
plantas cultivadas nas condições in vitro, com exceção das plantas com 10 meses
cultivadas em condições de estufa. Os valores de clorofila a + clorofila b (tabela 7)
apresentaram valores maiores nas plantas cultivadas em condições de estufa nos
períodos de 6, 8 e 10 meses quando comparadas com plantas da mesma idade cultivadas
in vitro.
PIGMENTOS POR MASSA FRESCA
(µg g
-
1
)
(X ± S)
Mese
s
In vitro
Estufa
Clorofila a
Clorofila b
Carotenóides
Clorofila a
Clorofila b
Carotenóides
1
641,47 ± 24,50 229,67 ± 44,14 158,18 ± 15,21 414,09 ± 8,46 193,81 ± 0,91 97,87 ± 0,88
2
616,83 ± 50,73 231,04 ± 48,59 141,98 ± 17,05 435,69 ± 46,58 184,20 ± 18,18 101,10 ± 11,10
4
600,77 ± 32,98 211,57 ± 49,47 144,29 ± 5,17 564,70 ± 12,72 239,32 ± 7,68 127,02 ± 4,75
6
484,56 ± 36,35 183,07 ± 43,26 123,25 ± 6,82 566,26 ± 28,38 239,52 ± 12,77 117,45 ± 5,06
8
531,27 ± 50,11 199,70 ± 32,78 137,84 ± 24,48 499,52 ± 43,88 256,23 ± 42,90 104,70 ± 9,15
10
443,31 ± 46,34 232,74 ± 53,49 103,77 ± 14,05 576,29 ± 19,61 243,50 ± 23,91 128,89 ± 6,21
12
638,94 ± 38,07 242,24 ± 45,26 171,35 ± 27,36 534,82 ± 30,54 232,91 ± 14,20 120,11 ± 7,57
59
Tabela 7. Valores de razão clorofila a : clorofila b e clorofila a + clorofila b de plantas
de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa por 1, 2, 4, 6, 8,
10 e 12 meses. Esses índices fisiológicos por serem dados calculados, não obedecem às
pressuposições básicas para a análise de variância.
Os valores representam a média
composta (n = 3) e indicam o desvio padrão.
PIGMENTOS
(X ± S)
Meses
In vitro Estufa
Clorofila a :
Clorofila b
Clorofila a +
Clorofila b
Clorofila a :
Clorofila b
Clorofila a +
Clorofila b
1
2,86 ± 0,53 871,14 ± 44,90 2,14 ± 0,03 607,90 ± 9,30
2
2,73 ± 0,49 847,87 ± 80,66 2,36 ± 0,03 619,90 ± 64,68
4
2,91 ± 0,46 812,34 ± 82,39 2,36 ± 0,03 804,02 ± 20,11
6
2,80 ± 0,49 667,63 ± 84,27 2,36 ± 0,01 805,78 ± 41,12
8
2,71 ± 0,46 730,97 ± 62,02 1,99 ± 0,42 755,75 ± 37,68
10
1,83 ± 0,54 676,05 ± 68,52 2,39 ± 0,31 819,79 ± 14,57
12
2,71 ± 0,60 881,18 ± 10,14 2,30 ± 0,01 767,73 ± 44,73
O índice de suculência da parte aéreadas plantas cultivadas in vitro apresentou
valores crescentes com o tempo de cultivo in vitro, o mesmo ocorreu com as plantas do
cultivo em condições de estufa (tabela 8). Porém, as plantas cultivadas in vitro
apresentaram valores maiores que as plantas em condições de estufa, principalmente a
partir do 2º. mês de cultivo, sendo que plantas com 12 meses de idade em cultivo in
vitro apresentaram o índice de suculência 4,5 vezes maior que as plantas de mesma
idade do cultivo em estufa.
60
Tabela 8. Índice de suculência da parte aérea (mg µg
-1
) de plantas de Alcantarea
imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
Esses índices fisiológicos por serem dados calculados, não obedecem às pressuposições
básicas para a análise de variância.
Os valores representam a média composta (n = 3).
ÍNDICE DE SUCULÊNCIA (mg µg
-1
)
Meses
In vitro Estufa
1
0,01
0,01
2
0,03 0,01
4
0,11 0,04
6
0,33 0,10
8
0,70 0,24
10
1,42 0,23
12
1,74 0,39
Observando a distribuição de biomassa das plantas cultivadas in vitro e em
condições de estufa (figuras 33 a 39), pode-se notar que os valores relativos a parte
aérea diminuem nas plantas cultivadas in vitro e aumentam nas plantas cultivadas em
estufa. Nas plantas com 12 meses de idade de cultivo in vitro esse valor chega a 77%,
enquanto que plantas de mesma idade de cultivo em estufa apresentaram valor de 94%,
demonstrando um investimento em biomassa na parte aérea e consequentemente
diminuição nas raízes.
Figura 33.
Distribuição de biomassa (calculada com base na massa seca) de raízes e de parte
aérea, em porcentagem, de plantas de
(○) e em condiç
ões de estufa (
serem dados calculados, não obedecem às pressuposições básicas para a análise de variância. Os
valores representam a média composta de plantas (
Distribuição de biomassa (calculada com base na massa seca) de raízes e de parte
aérea, em porcentagem, de plantas de
Alcantarea imperialis (Carrière) Harms
ões de estufa (
□) por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses. Esses índices fisiológicos por
serem dados calculados, não obedecem às pressuposições básicas para a análise de variância. Os
valores representam a média composta de plantas (
n = 3).
61
cultivadas in vitro
A
B
Figuras 34-37. Plantas de
Alcantarea imperialis
cultivo in vitro. 34
. Planta cultivada por 1 mês em condições de estufa.
1 mês em cultivo in vitro.
36
cultivada por 6 meses em cultivo
Alcantarea imperialis
(Carrière) Harms cultivadas em estufa e em
. Planta cultivada por 1 mês em condições de estufa.
35
. Planta cultivada por
36
. Planta cultivada por 6 meses em con
dições de estufa.
cultivada por 6 meses em cultivo
in vitro. Barra = 1 cm.
62
(Carrière) Harms cultivadas em estufa e em
dições de estufa.
37. Planta
Figuras 38-39. Plantas de
Alcantarea imperialis
cultivo in vitro. 38
. Planta cultivada por 12 meses em condições de estufa
por 12 meses em cultivo
in vitro
Alcantarea imperialis
(Carrière) Harms cultivadas em estufa e em
. Planta cultivada por 12 meses em condições de estufa
.
39
in vitro
. Barra = 1 cm.
63
(Carrière) Harms cultivadas em estufa e em
39
. Planta cultivada
64
A estrutura foliar da planta adulta de A. imperialis, em secção transversal na
região mediana do limbo, mostra que a folha é hipoestomática (figura 40) e possui
epiderme uniestratificada e lignificada, dotada de escamas em ambas as faces. Células
subepidérmicas esclerificadas delimitam externamente o mesofilo, enquanto a região
interna é preenchida por parênquima aquífero e clorênquima (figuras 41, 42, 43, 45).
Adjacentes às camadas subepidérmicas da face adaxial ocorrem grupos de fibras (figura
43).
Em vista frontal, exibem escamas dispostas ao acaso revestindo as duas
superfícies, observa-se apenas o escudo, que é constituído pelo disco central e pela ala
(figura 44). Nesta espécie a distinção entre as células do disco central e da ala. O disco é
formado por 4 células centrais, circundadas por dois anéis celulares, sendo o interno
constituído por 8 células e denominado pericentral, e o externo formado por dezesseis
células e chamado subperiférico. A ala é composta por numerosas células periféricas,
alongadas e dispostas radialmente.
No mesofilo observam-se canais de aeração, interrompidos por diafragmas de
células braciformes, que estão ligados à câmara subestomática (figuras 45, 46, 48 e 49).
Idioblastos com ráfides ocorrem na periferia desses canais (figura 47).
Os feixes vasculares são do tipo colateral e se distribuem de forma intercalada
com os canais de aeração (figura 45). Os feixes de maior calibre apresentam calotas de
fibras nos pólos, enquanto que nos de menor calibre ocorrem somente poucas células
esclerificadas (figuras 48 e 49).
Figuras 40-44.
Aantomia foliar de planta adulta de
43. Secções transversais 40
. Superfície foliar fa
mesofilo e da epiderme da face adaxial mostrando o parênquima aquífero (pa) e o clorênquima
(cl). 42
. Detalhe do mesofilo.
mecânica (estrela). 44.
Em vista frontal, escamas simétricas e células epidérmicas com corpo
silicoso (seta). Barra = 50µm (40, 42
ce:
camadas de células sub
aquífero).
Aantomia foliar de planta adulta de
Alcantarea imperialis
(Carrière) Harms
. Superfície foliar fa
ce abaxial (seta: estômato).
mesofilo e da epiderme da face adaxial mostrando o parênquima aquífero (pa) e o clorênquima
. Detalhe do mesofilo.
43
. Superfície foliar face adaxial com grupo de fibras de função
Em vista frontal, escamas simétricas e células epidérmicas com corpo
silicoso (seta). Barra = 50µm (40, 42
-
44); 100 µm (41). (c: cutícula; ca: câmara subestomática;
camadas de células sub
-
epidérmicas esclerificadas; cl: clorênquima; pa: parênquima
65
(Carrière) Harms
. 40-
ce abaxial (seta: estômato).
41. Aspecto do
mesofilo e da epiderme da face adaxial mostrando o parênquima aquífero (pa) e o clorênquima
epidérmicas esclerificadas; cl: clorênquima; pa: parênquima
Figuras 45-49.
Secções transversais de folha de planta adulta de
(Carrière) Harms. 45
. Aspecto geral da lâmina foliar com canais de aeração interrompido por
diafragmas de células braciformes (cn).
(seta). 47
. Detalhe do idioblasto com ráfides (seta).
calibre com calotas de fibras (setas).
de fibras (seta). Barra = 150µm (45); 50 µ
Secções transversais de folha de planta adulta de
Alcantarea imperialis
. Aspecto geral da lâmina foliar com canais de aeração interrompido por
diafragmas de células braciformes (cn).
46. Detalhe do canal de a
eração célula braciforme
. Detalhe do idioblasto com ráfides (seta).
48
. Detalhe do feixe vascular de maior
calibre com calotas de fibras (setas).
49
. Detalhe do feixe vascular de menor calibre com grupo
de fibras (seta). Barra = 150µm (45); 50 µ
m (46); 25µm (47); 100 µm (48-
49).
66
eração célula braciforme
. Detalhe do feixe vascular de menor calibre com grupo
49).
67
Secções transversais da porção mediana da lâmina foliar de plantas de 4, 6 e 12
meses de idade, cultivadas in vitro e em estufa, mostraram que a folha é hipoestomática
e apresenta várias camadas de parênquima aquífero próximas à epiderme (figuras 50-
89).
A epiderme é uniestratificada, as células não apresentam o espessamento da
parede periclinal, dotada de escamas em ambas as faces (figuras 52, 56-58, 63-68, 71-
77, 80-85). Os estômatos se localizam no mesmo nível das demais células epidérmicas
(figuras 54, 56, 68, 75-76, 82-84). As células-guardas apresentam cutícula
periestomática que se projetam formando cristas (figuras 52, 68, 75, 83-84).
No mesofilo ocorre um parênquima aquífero com número de camadas variando
de 3 a 4 tanto na face adaxial quanto abaxial (figuras 50-53, 59-64, 69-74, 78-81, 86).
Entre eles segue o parênquima clorofiliano (clorênquima), formado por células
isodiamétricas (figuras 56, 65-67, 73, 75, 76, 82, 85, 87-88).
Todos os feixes vasculares são do tipo colateral (figuras 53, 55, 56, 64-67, 72-
74, 81-82). Os feixes de maior calibre apresentam calotas de fibras nos dois pólos,
enquanto que nos de menor calibre ocorrem somente poucas células esclerificadas em
ambos os pólos (figuras 53, 55-56, 61, 64-67, 72-73, 81-82, 85, 87, 88). As plantas
jovens não apresentaram células subepidérmicas esclerificadas formando grupos de
fibras e canais de aeração.
As células do clorênquima, presente nas folhas das plantas adultas, apresentam
formato em paliçada ao redor dos canais de aeração e em contato com as células
braciformes, enquanto que nas plantas jovens essas células do clorênquima apresentam
forma isodiamétrica.
Quando se comparam as secções transversais das folhas entre as plantas
cultivadas in vitro com as cultivadas em condições de estufa, é possível observar que as
68
folhas das plantas cultivadas in vitro apresentam mesofilo mais estreito, porém a folha é
morfologicamente mais larga (figuras 50-51, 59-60, 69-70, 78, 86).
Figuras 50-58. Secções tran
sversais de folha de
meses de cultivo em estufa.
50
da epiderme adaxial e parênquima aquífero.
E
stômato com cutícula peristomática.
clorênquima (asterisco), epiderme abaxial e estômato (seta).
(seta) e escama (cabeça de seta)
100 µm (51, 57-
58); 50 µm (52
sversais de folha de
Alcantarea imperialis
(Carrière) Harms
50
-51
. Aspecto geral da secção do terço mediano foliar.
da epiderme adaxial e parênquima aquífero.
53
. Detalhe da borda com idioblastos (seta).
stômato com cutícula peristomática.
55. Feixe vascular. 56
. Aspecto do mesofilo destacando
clorênquima (asterisco), epiderme abaxial e estômato (seta).
57
. Aspecto da borda com estômato
(seta) e escama (cabeça de seta)
58. Detalhe da escama (cabeça de seta
). Barra = 200 µm (50);
58); 50 µm (52
-56).
69
(Carrière) Harms
com 4
. Aspecto geral da secção do terço mediano foliar.
52. Detalhe
. Detalhe da borda com idioblastos (seta).
54.
. Aspecto da borda com estômato
Figuras 59-68.
Secções transversais de folha de
meses de cultivo in vitro. 59
-
do
mesofilo central com parênquima aquífero (asterisco) e idioblato (cabeça de seta).
Detalhe do mesofilo com parênquima aquífero (asterisco) e idioblato (cabeça de seta) e borda
com estômato (seta). 63
. Detalhe da epiderme adaxial e parênquima aquífero.
mesofilo com parênquima aquífero (asterisco), idioblato (cabeça de seta) e estômato (seta).
Detalhe da escama (seta). 67
. Aspecto do clorênquima (cl).
peristomática. (fv: feixe vascular). Barra = 200
Secções transversais de folha de
Alcantarea imperialis
(Carrière) Harms com 4
-
60
. Aspecto geral da secção do terço mediano foliar.
mesofilo central com parênquima aquífero (asterisco) e idioblato (cabeça de seta).
Detalhe do mesofilo com parênquima aquífero (asterisco) e idioblato (cabeça de seta) e borda
. Detalhe da epiderme adaxial e parênquima aquífero.
64
mesofilo com parênquima aquífero (asterisco), idioblato (cabeça de seta) e estômato (seta).
. Aspecto do clorênquima (cl).
68
. Estômatos (setas) com cutícula
peristomática. (fv: feixe vascular). Barra = 200
µm (59-60); 100 µm (61-
62); 50 µm (63
70
(Carrière) Harms com 4
. Aspecto geral da secção do terço mediano foliar.
61. Detalhe
mesofilo central com parênquima aquífero (asterisco) e idioblato (cabeça de seta).
62.
64
-65. Aspecto do
mesofilo com parênquima aquífero (asterisco), idioblato (cabeça de seta) e estômato (seta).
66.
62); 50 µm (63
-68).
Figuras 69-77.
Secções transversais de folha de
meses de cultivo em estufa.
Detalhe da epiderme adaxia
parênquima aquífero (asterico), escamas (cabeça de seta) e estômato (seta).
borda com parênquima aquífero (asterico), escamas (cabeça de seta) e estômato (seta).
Estômatos c
om cutícula peristomática (seta).
(asterisco) e estômato (seta).
77.
vascular). Barra = 200 µm (69
Secções transversais de folha de
Alcantarea imperialis
(Carrière) Harms
meses de cultivo em estufa.
69-70
. Aspecto geral da secção do terço mediano foliar.
Detalhe da epiderme adaxia
l e parênquima aquífero. 72
parênquima aquífero (asterico), escamas (cabeça de seta) e estômato (seta).
73
borda com parênquima aquífero (asterico), escamas (cabeça de seta) e estômato (seta).
om cutícula peristomática (seta).
76
. Aspecto do mesofilo, destacando clorênquima
77.
Aspecto do mesofilo com idioblasto (cabeça de seta). (fv: feixe
vascular). Barra = 200 µm (69
-70); 50 µm (71, 73, 75-76); 100 µm (72, 74, 7
7).
71
(Carrière) Harms
com 6
. Aspecto geral da secção do terço mediano foliar.
71.
. Detalhe do mesofilo central com
73
-74. Detalhe da
borda com parênquima aquífero (asterico), escamas (cabeça de seta) e estômato (seta).
75.
. Aspecto do mesofilo, destacando clorênquima
7).
Figuras 78-85.
Secções transversais de folha de
meses de cultivo in vitro.
78
mesofilo central com parênquima aquífero (asterisco) e est
epiderme adaxial e parênquima aquífero.
(asterisco) e estômato (seta).
(seta). 83-84
. Estômatos com cutícula peristomá
destacando feixe vascular (fv), clorênquima (cl) e escama (seta). (fv: feixe vascular). Barra =
500 µm (78); 100 µm (79 e 81); 50 µm (80, 82
Secções transversais de folha de
Alcantarea imperialis
(Carrière) Harms com 6
78
. Aspecto geral da secção do terço mediano foliar.
mesofilo central com parênquima aquífero (asterisco) e est
ômato (seta).
epiderme adaxial e parênquima aquífero.
81
. Detalhe da borda com parênquima aquífero
(asterisco) e estômato (seta).
82
. Aspecto do mesofilo, destacando clorênquima (cl) e estômato
. Estômatos com cutícula peristomá
tica (setas). 85
. Aspecto do mesofilo,
destacando feixe vascular (fv), clorênquima (cl) e escama (seta). (fv: feixe vascular). Barra =
500 µm (78); 100 µm (79 e 81); 50 µm (80, 82
-85).
72
(Carrière) Harms com 6
. Aspecto geral da secção do terço mediano foliar.
79. Detalhe do
ômato (seta).
80. Detalhe da
destacando feixe vascular (fv), clorênquima (cl) e escama (seta). (fv: feixe vascular). Barra =
Figuras 86-88.
Secções transversais de folha de
meses de cultivo in vitro
e em estufa.
planta cultivada in vitro. 87
. Detalhe do mesofilo com feixe vascular (fv) e clorênquima (cl) em
folha de planta cultivada
in vitro
(cl) em folha de planta cultivada em estufa.
Secções transversais de folha de
Alcantarea imperialis
(Carrière) Harms com 12
e em estufa.
86
. Aspecto geral da secção do terço mediano foliar de
. Detalhe do mesofilo com feixe vascular (fv) e clorênquima (cl) em
in vitro
. 88
. Detalhe do mesofilo com feixe vascular (fv) e clorênquima
(cl) em folha de planta cultivada em estufa.
Barra = 500 µm (86); 50 µm (87-
88).
73
(Carrière) Harms com 12
. Detalhe do mesofilo com feixe vascular (fv) e clorênquima (cl) em
. Detalhe do mesofilo com feixe vascular (fv) e clorênquima
88).
74
IV.4. COMPARAÇÃO DO CRESCIMENTO DAS PLANTAS CULTIVADAS IN
VITRO E APÓS O PERÍODO DE ACLIMATAÇÃO (figuras 89 a 92; tabelas 9 a
14)
O valor de sobrevivência das plantas transferidas das condições in vitro foi de
100%, exceto para o período de 4 meses de permanência in vitro que apresentou 96% de
sobrevivência. Em todos os tratamentos (tempo de permanência no cultivo in vitro)
utilizados não foram observadas variações morfológicas e alterações na pigmentação
das folhas.
A análise comparativa dos dados das plantas provenientes do cultivo in vitro e
após 2 meses de aclimatação em condições de estufa mostrou um aumento dos valores
dos dados biométricos ao longo do tempo.
Com relação aos parâmetros biométricos das raízes, pode-se observar que em
todos os períodos analisados ocorreu um aumento no número das raízes (figura 89A)
das plantas após o período de aclimatação, sendo os períodos de cultivo in vitro de 6 e 8
meses que apresentaram um aumento no número de raízes após a aclimatação
(tratamentos IV e V), com adição de mais de 4 raízes. Os dados de comprimento de
raízes (figura 89B) também apresentaram aumento em todos os períodos analisados,
porém o tratamento III (4 meses em condições in vitro + 2 meses em estufa) foi o que
apresentou o maior aumento no comprimento das raízes de cerca de 1,5 cm.
Os dados de massa das raízes, tanto fresca como seca, apresentaram aumento em
todos os períodos analisados. Os dados de massa fresca das raízes (figura 90A)
apresentaram as maiores diferenças entre os valores nos períodos de cultivo in vitro de 6
e 12 meses, quando comparados com os dados após o período de aclimatação
(tratamentos IV e VII). O mesmo não ocorreu com os valores de massa seca das raízes
Figura 89.
Crescimento de raízes de plantas de
2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses (
□) e submetidas em seguida
Número. B.
Comprimento (cm). Os valores representam a média de 50 plantas e as barras
indicam o desvio padrão.
Crescimento de raízes de plantas de
Alcantarea imperialis
cultivadas
□) e submetidas em seguida
à aclimatação
por 2 meses (
Comprimento (cm). Os valores representam a média de 50 plantas e as barras
75
cultivadas
in vitro por 1,
por 2 meses (
■). A.
A
B
Figura 90.
Crescimento de raízes de plantas de
2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses (
□) e submetidas em seguida
fresca (mg). B.
Massa seca (mg). Os valores representam a média composta (
as barras indicam
o desvio padrão.
Crescimento de raízes de plantas de
Alcantarea imperialis
cultivadas
□) e submetidas em seguida
à aclimatação por 2 meses (
Massa seca (mg). Os valores representam a média composta (
n
o desvio padrão.
76
cultivadas
in vitro por 1,
à aclimatação por 2 meses (
■). A. Massa
n
= 3) de plantas e
A
B
77
(figura 90B), que apresentaram maior diferença no período de 6 meses de cultivo in
vitro, enquanto nos demais períodos os valores são similares.
Os dados biométricos referentes à parte área, como o número de folhas sadias
(figura 91A), apresentaram diferenças nos primeiros meses, sendo que o tratamento II (2
meses in vitro e 2 meses de aclimatação) apresentou o dobro de folhas sadias quando
comparado com os valores antes da aclimatação; a partir dos 4 meses de cultivo in vitro
os valores são similares, com aproximadamente 11 folhas sadias por planta. Porém, a
partir do tratamento IV (4 meses in vitro e 2 meses em estufa) ocorreu uma diminuição
no número de folhas sadias quando comparado com o das plantas cultivadas in vitro. O
número de folhas mortas (figura 91B), no cultivo in vitro, só começou a ocorrer a partir
do 6º mês, enquanto para as plantas aclimatadas já ocorreu a partir do tratamento II (2
meses in vitro + 2 meses em estufa). O tratamento que apresentou o maior número de
folhas mortas foi o tratamento IV (6 meses de cultivo in vitro e após a aclimatação).
Quanto ao comprimento das folhas (figura 92C), as plantas apresentaram
aumento em todos os períodos estudados, porém o tratamento IV (6 meses in vitro + 2
meses em estufa) foi o que apresentou maior diferença entre os valores com cerca de 9
cm.
Para a parte aérea, a diferença entre os valores das plantas do cultivo in vitro
após o período de aclimatação, foi maior no tratamento VII (12 meses de cultivo in vitro
e após a aclimatação), ocorrendo um aumento de massa fresca da parte aérea (figura
92A) de mais de 1000 mg. Os valores de massa seca da parte aérea (figura 92B)
apresentaram um aumento após a aclimatação, independente do tempo de cultivo nas
condições in vitro, sendo o período de 8 meses in vitro o que apresentou a maior
diferença quando comparado com os dados obtidos após os 2 meses de aclimatação.
Figura 91.
Crescimento da parte aérea de plantas de
por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses (
Número de folhas sadias. B.
barras indicam o desvio padrão.
Crescimento da parte aérea de plantas de
Alcantarea imperialis
cultivadas
por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses (
□) e submetidas em seguida
à aclimatação por 2 meses (
Número de folhas mortas. Os valores representam a média e as
barras indicam o desvio padrão.
78
cultivadas
in vitro
à aclimatação por 2 meses (
■). A.
A
B
Figura 92. Crescimento
da parte aérea de plantas de
por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses (
Massa fresca (mg). B.
Massa seca (mg).
e as barras indicam o desvio padrão.
da parte aérea de plantas de
Alcantarea imperialis
cultivadas
por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses (
□) e submetidas em seguida
à aclimatação por 2 meses (
Massa seca (mg).
C.
Comprimento (cm). Os valores representam a médi
e as barras indicam o desvio padrão.
79
cultivadas
in vitro
à aclimatação por 2 meses (
■). A.
Comprimento (cm). Os valores representam a médi
a
A
B
C
80
Para os valores de taxa de crescimento relativo, com base na massa fresca e seca
da parte aérea (MFpa e MSpa – tabela 9), os maiores dados foram relativos ao
tratamento II (2 meses de cultivo in vitro + 2 meses em estufa).
Para os valores de taxa de crescimento relativo, com base na massa fresca e seca
das raízes (MFr e MSr - tabela 9), foi possível observar que as plantas do tratamento II
(2 meses de cultivo in vitro + 2 meses em estufa) apresentaram os maiores dados tanto
para massa fresca como seca, quando comparadas com os demais tratamentos,
demonstrando que nesse período de aclimatação, a partir de plantas cultivadas in vitro
por 2 meses, ocorreu o maior acúmulo de biomassa. Já as plantas do tratamento VII (12
meses de cultivo in vitro + 2 meses em estufa) foram as que apresentaram os menores
valores de TCR. Para a massa fresca das raízes, as plantas do tratamento VII
apresentaram cerca de 10% do crescimento da TCR das plantas do tratamento II e para a
massa seca as plantas do tratamento VII apresentaram 5% de TCR quando comparadas
com as plantas do tratamento II.
Comparando os valores da taxa de crescimento relativo, baseado na massa total
das plantas, tanto fresca (MFt) como seca (MSt), mostram resultados similares aos
dados para a massa da parte aérea (tabela 9), com exceção das plantas do tratamento I
que apresentaram o dobro de TCR da massa fresca total quando comparado com o valor
da TCR para a massa fresca da parte aérea.
Na razão da massa foliar (RPF - tabela 10), as plantas aclimatadas apresentaram
valores maiores quando comparadas com as cultivadas in vitro para todos os tempos
analisados. Entre as plantas aclimatadas o maior valor de RPF ocorreu nas plantas
cultivadas por 4 meses em condições in vitro (tratamento III).
A razão entre o número de folhas mortas por número de folhas totais (RNF-
tabela 10), ou a porcentagem de folhas mortas por planta, foi crescente entre as plantas
cultivadas in vitro, porém analisando os dados das plantas aclimatadas é possível
81
observar que esses valores variam, plantas do tratamento III (4 meses cultivadas in vitro
+ 2 meses em estufa) apresentaram 14% de folhas mortas, já plantas do tratamento IV
(6 meses cultivadas in vitro + 2 meses em estufa) apresentaram o dobro de folhas
mortas. Nas plantas com 12 meses cultivadas nas condições in vitro a porcentagem de
folhas mortas chega a mais de 40%, permanecendo esse valor mesmo depois do período
de aclimatação.
Na razão raiz : parte aérea (RMS - tabela 10), as plantas aclimatadas em todos os
tratamentos apresentaram valores menores quando comparadas com as plantas
cultivadas in vitro para todos os tempos analisados. As plantas do tratamento IV (6
meses de cultivo in vitro + 2 meses em estufa) apresentaram o dobro da RMS quando
comparadas com os valores daquelas antes do período de aclimatação. Os maiores
valores de razão R:PA foram encontrados nas plantas cultivadas in vitro com 6 e 8
meses.
82
Tabela 9. Taxa de crescimento relativo (TCR) em massa fresca da raiz: MFr = (mg
2
mg
1
-1
) mês
-1
, massa fresca da parte aérea: MFpa = (mg
2
mg
1
-1
)
mês
-1
, massa seca da raiz: MSr = (mg
2
mg
1
-1
) mês
-1
, massa seca da parte aérea: MSpa = (mg
2
mg
1
-1
) mês
-1
das plantas de Alcantarea imperialis
cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses e submetidas à aclimatação por 2 meses. Esses índices fisiológicos por serem dados calculados,
não obedecem às pressuposições básicas para a análise de variância.
TAXA DE CRESCIMENTO RELATIVO (TCR)
Meses
In vitro
MFr
MFpa
MFt
MSr
MSpa
MSt
1
0,43 0,77 1,51 0,57 0,64 0,63
2
0,59 0,95 0,92 0,69 0,90 0,87
4
(*) 0,30 0,27 0,17 0,22 0,22
6
0,09 0,73 0,68 0,23 0,65 0,56
8
0,01 0,51 0,46 0,01 0,47 0,39
10
(*) 0,21 0,18 0,02 0,33 0,28
12
0,04 0,25 0,22 0,03 0,04 0,04
(*) tende a zero
83
Tabela 10. Razão da massa foliar (RMF), razão do número de folhas mortas por número total de folhas (RNF) e razão da massa seca da raiz por
massa seca da parte aérea (RMS) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses e submetidas à aclimatação
por 2 meses. Esses índices fisiológicos por serem dados calculados, não obedecem às pressuposições básicas para a análise de variância.
Meses
In vitro
Aclimatadas
RMF
RNF
RMS
RMF
RNF
RMS
1
0,87 - 0,15
0,88 - 0,13
2
0,81 - 0,23
0,87 (*) 0,15
4
0,90 - 0,13
0,89 0,15 0,12
6
0,72 0,11 0,39
0,85 0,28 0,17
8
0,73 0,24 0,37
0,87 0,17 0,14
10
0,79 0,39 0,26
0,87 0,34 0,14
12
0,77 0,43 0,30
0,77 0,47 0,29
(*) tende a zero
84
Os dados de teor de pigmentos (tabela 11) mostram uma quantidade maior de
clorofila a nas plantas cultivadas in vitro quando comparada com das plantas depois do
período de aclimatação, em todos os períodos analisados. O mesmo ocorre para os dados
de teor de clorofila b e carotenóides, com exceção das plantas do tratamento VII (12 meses
de cultivo in vitro + 2 meses em estufa) que apresentou um aumento no teor de clorofila b.
Tabela 11. Valores médios de pigmentos (µg) por massa fresca (g) das plantas de
Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses e submetidas à
aclimatação por 2 meses.
Os valores representam a média composta (n = 3) e indicam o desvio
padrão.
Já os valores da razão clorofila a : clorofila b e clorofila a + clorofila b (tabela 12)
foram maiores nas plantas cultivadas nas condições in vitro, independente do período
analisado, quando comparados com as plantas aclimatadas.
PIGMENTOS POR MASSA FRESCA (µg g
-
1
)
(X ± S)
Meses
In vitro
Aclimatadas
Clorofila a Clorofila b Carotenóides Clorofila a Clorofila b Carotenóides
1
641,47 ± 24,50
229,67 ± 44,14
158,18 ± 15,21
438,54 ± 17,72
158,02 ± 37,10
110,67 ± 8,68
2
616,83 ± 50,73
231,04 ± 48,59
141,98 ± 17,05
492,04 ± 46,23
217,68 ± 21,07
104,65 ± 8,29
4
600,77 ± 32,98
211,57 ± 49,47
144,29 ± 5,17
502,45 ± 24,48
184,80 ± 66,28
117,31 ± 10,28
6
484,56 ± 38,36
183,07 ± 47,79
123,25 ± 6,96
344,36 ± 26,28
145,61 ± 41,12
88,39 ± 17,38
8
531,27 ± 50,11
199,70 ± 32,78
137,84 ± 24,48
314,77 ± 27,57
199,37 ± 24,50
65,32 ± 12,98
10
443,31 ± 62,85
232,74 ± 45,21
103,77 ± 30,45
305,44 ± 29,44
177,47 ± 32,56
71,14 ± 5,01
12
638,94 ± 38,07
242,24 ± 45,26
171,35 ± 27,36
596,57 ± 22,15
270,59 ± 76,38
159,72 ± 17,81
85
Tabela 12. Valores de razão clorofila a : clorofila b e clorofila a + clorofila b de plantas de
Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses e submetidas à
aclimatação por 2 meses. Esses índices fisiológicos por serem dados calculados, não
obedecem às pressuposições básicas para a análise de variância.
Os valores representam a
média composta (n = 3) e indicam o desvio padrão.
PIGMENTOS
(X ± S)
Meses
In vitro
Aclimatadas
Clorofila a :
Clorofila b
Clorofila a +
Clorofila b
Clorofila a :
Clorofila b
Clorofila a +
Clorofila b
1
2,86 ± 0,53
871,14 ± 44,90
2,86 ± 0,53
596,57 ±51,14
2
2,73 ± 0,49 847,87 ± 80,66 2,26 ± 0,01 709,71 ± 67,28
4
2,91 ± 0,46 812,34 ± 82,39 2,94 ± 0,93 687,25 ± 88,47
6
2,80 ± 0,49 667,63 ± 84,27 2,51 ± 0,79 489,97 ± 15,13
8
2,71 ± 0,46 730,97 ± 62,02 1,60 ± 0,31 514,14 ± 3,27
10
1,83 ± 0,54 676,05 ± 68,52 1,96 ± 0,33 482,91 ± 57,67
12
2,71 ± 0,60 881,18 ± 10,14 2,30 ± 0,53 867,16 ± 93,13
O índice de suculência da parte aérea das plantas cultivadas in vitro apresentou
valores crescentes com o tempo de cultivo, o mesmo ocorreu com as plantas de todos os
tratamentos (tabela 13). Porém, as plantas do tratamento V (8 meses in vitro + 2 meses em
estufa) foram as que apresentaram maior diferença entre o índice de suculência após a
aclimatação.
86
Tabela 13. Índice de suculência da parte aérea de plantas de Alcantarea imperialis
cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses e submetidas à aclimatação por 2 meses.
Esses índices fisiológicos por serem dados calculados, não obedecem às pressuposições
básicas para a análise de variância.
Os valores representam a média composta (n = 3).
ÍNDICE DE SUCULÊNCIA (mg µg
-
1
)
Meses
In vitro Aclimatadas
1 0,01 0,06
2 0,03 0,22
4 0,11 0,23
6 0,33 1,94
8 0,70 2,76
10 1,42 2,96
12 1,74 3,01
Observando a distribuição de biomassa das plantas (tabela 14) cultivadas in vitro e
após o período de aclimatação, pode-se notar que cerca de 80% da biomassa foi alocada
para a parte aérea. As plantas após o período de aclimatação apresentaram um aumento nos
valores da distribuição de biomassa da parte aérea e uma diminuição nos valores para as
raízes.
87
Tabela 14. Distribuição de biomassa (calculada com base na massa seca) de plantas de
Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses e submetidas à
aclimatação por 2 meses. Esses índices fisiológicos por serem dados calculados, não
obedecem às pressuposições básicas para a análise de variância.
Os valores representam a
média composta (n = 3).
DISTRIBUIÇÃO DE BIOMASSA (%)
Meses
In vitro
Aclimatadas
Raiz Parte aérea Raiz Parte aérea
1
13,22
86,78
11,73
88,27
2
19,08 80,62 13,38 86,62
4
11,04 88,96 10,04 89,56
6
28,00 72,00 14,40 85,60
8
26,89 73,11 12,74 87,26
10
20,96 79,14 12,51 87,49
12
22,89 77,11 22,64 77,36
88
V. DISCUSSÃO
A propagação de plantas através de técnicas de cultivo in vitro apresenta, segundo
vários autores, inúmeras vantagens se comparadas com a produção em sistemas
convencionais em estufa (Debergh & Maene 1981, Pierik 1987, Ahuja 1993, Debergh
1994, Fay 1994, Zornig 1996, AboEl-Nil 1997, Engelmann 1997, Thorpe & Harry 1997,
Hartmann et al. 2002, Carneiro & Mansur 2004).
Este trabalho se propôs a comparar o desenvolvimento de plantas de Alcantarea
imperialis, conhecida como bromélia imperial, cultivadas in vitro e em condições de
estufa, a partir de sementes e sem o uso de reguladores, de modo a relatar as diferenças no
crescimento das plantas nesses dois tipos de cultivo no decorrer do tempo.
O uso da semente como explante para o início do cultivo in vitro se justifica pela
grande quantidade produzida por esta espécie, além do fato de garantir, assim, diversidade
genética das plantas obitdas, fator de extrema importância pelo fato de se tratar de uma
espécie ameaçada de extinção (Dodds 1991 apud Fay 1994, Mercier & Nievola 2003,
Carneiro & Mansur 2004). Embora seja frequente o uso de reguladores de crescimento no
cultivo in vitro, essas substâncias têm sido consideradas como indutoras de variações
somaclonais (Ziv et al. 1986, Karp 1995, Zornig 1996, Kuksova et al. 1997, Thorpe &
Harry 1997, Gaspar et al. 2002, Joyce et al. 2003, van Staden et al. 2006), o que os tornam
indesejáveis quando se objetiva uma produção homogênea.
Na natureza não há a ocorrência de indivíduos clonais de A. imperialis (Bárbara et
al. 2009) e, dessa forma, a propagação da espécie tem sido realizada exclusivamente por
sementes. Não foram encontrados trabalhos que comparem a germinação das sementes
dessa bromélia in vitro e em gerbox, utilizando papel de filtro para reter a água.
89
Os fatores que influenciam a germinação das sementes são a água, o oxigênio, a
luz, a temperatura, entre outros (Mayer & Poljakoff-Mayber 1982, Labouriau 1983,
Bewley & Black 1994, Castro et al. 2004). Para a bromélia imperial, a influência da
temperatura na germinação destas sementes já foi analisada por Mollo (2009), porém não
foram encontrados na literatura informações sobre o efeito da luz na germinação dessa
espécie.
Segundo Borges & Rena (1993) e Takaki (2001), a sensibilidade das sementes à luz
é bastante variável, de acordo com a espécie, havendo sementes cuja germinação é
influenciada positivamente ou negativamente e, ainda, sementes indiferentes a ela. A
ativação do processo germinativo das sementes pela luz está ligada a um sistema de
pigmento denominado fitocromo, uma cromoproteína solúvel em água de coloração
azulada com máximos de absorção no azul e no vermelho.
As sementes de várias espécies de Bromeliaceae são citadas como sendo
fotoblásticas positivas como nos trabalhos de Downs (1964), Mercier & Guerreiro Filho
(1990), Pinheiro & Borghetti (2003), Pompelli (2006), Wiesbauer et al. (2007).
Neste trabalho, foi possível verificar que as sementes da bromélia imperial são
fotoblásticas positivas, pois não germinaram na ausência de luz, independente do tipo de
cultivo utilizado (papel de filtro e meio de cultura). Há, no entanto, outra espécie de
Bromeliaceae, Dyckia tuberosa (Vell.) Beer, cujas sementes germinam tanto na presença
como na ausência de luz e em uma larga amplitude térmica de 10 a 45ºC, demonstrando
que a germinação não é um fator limitante nesse caso (Vieira et al. 2007).
Segundo Pinheiro & Borghetti (2003), em trabalho sobre a germinação das
sementes das bromélias Aechmea nudicaulis (L.) Griesebach e Streptocalyx floribundus
(Martius ex Schultes F.) Mez em que utilizaram diferentes condições de temperatura e
luminosidade a fim de examinar a capacidade das sementes em germinar em distintas
90
situações microclimáticas, as sementes se mostraram fotoblásticas positivas, porém vale
ressaltar que essa necessidade pode ser limitada em microsítios específicos onde a luz e a
temperatura podem variar, desde a presença de cobertura vegetal no solo como em
condições de soterramento.
Como os espécimes de A. imperialis ocorrem em áreas íngremes com intensa
luminosidade pela ausência de cobertura vegetal alta, há grande probabilidade de
ocorrência de deslizamentos que, consequentemente, podem levar ao soterramento de suas
sementes e prejudicar o processo germinativo.
A germinação de sementes in vitro, pode ser indicada em casos em que as sementes
não germinem em condições ex vitro, como estudo realizado por Pompelli (2006), em que
o autor concluiu que tais sementes não possuem barreira germinativa quando colocadas in
vitro, ao contrário do que acontece na natureza, onde encontram outras barreiras,
provavelmente de natureza física, que as impossibilite de germinar.
Para a A. imperialis não foram observadas diferenças significativas entre a
porcentagem de germinação in vitro e na gerbox em papel de filtro, embora no ambiente in
vitro o teor de umidade seja maior e constante.
Dentre os trabalhos sobre germinação de sementes de A. imperialis, pode-se
destacar o de Naves (2001), que testou o meio de cultura MS (Murashige & Skoog 1962)
com diferentes concentrações de macronutrientes e fotoperíodo de 16 horas, bem como
comparou a germinação in vitro com a obtida em casa de vegetação. As melhores taxas de
germinação ocorreram na concentração de 50 a 75% dos macronutrientes do meio de
cultura e, ainda, os dados foram superiores na germinação in vitro quando comparados
com aqueles obtidos na casa de vegetação.
Outro estudo com sementes de A. imperialis foi o de Mollo (2009), que testou a
germinação das sementes in vitro, em diferentes temperaturas, não encontrando diferenças
91
na porcentagem de emergência das plântulas entre as temperaturas de 26 e 30ºC. Nesse
trabalho, porém, avaliou-se a porcentagem de emergência das plântulas, enquanto no atual
estudo foi avaliada a porcentagem de germinação, sendo considerada como germinada, do
ponto de vista morfológico, a semente que apresentou rompimento do tegumento e a
emergência da base do cotilédone, mesmo parâmetro utilizado por Pereira et al.(2008) para
a germinação da mesma espécie.
Pereira et al. (2008) observaram a germinação das sementes da bromélia imperial,
do ponto de vista morfológico, a partir do sétimo dia da embebição das sementes, enquanto
no presente trabalho verificou-se que isso ocorre em média aos quatros dias após o plantio.
Com relação à porcentagem de germinação, os mesmos autores, utilizaram como substrato
o papel de filtro e observaram 88% de germinação e índice de velocidade de germinação
(IVG) entre 7 e 14 dias. Comparando com os dados do presente estudo essa diferença pode
ter sido ocasionada pelo fato das sementes passarem pela desinfestação superficial durante
mais de 1 hora, este processo envolve o contato das mesmas com substâncias abrasivas
como o hipoclorito de sódio, além disso, foram mantidas sob agitação constante e, com
isso, podem ter o processo de embebição facilitado.
Portanto, em condições in vitro utilizadas neste trabalho, às elevadas porcentagens
de germinação na presença de luz e o curto período para a germinação, associados à baixa
ocorrência de plantas anômalas, são características importantes para a produção de plantas
desta espécie, visando à sua preservação e comercialização.
Após o estudo sobre a germinação de A. imperialis, foi possível acompanhar o
desenvolvimento pós-seminal no cultivo in vitro e em condições de papel de filtro,
observando-se que nesse tipo de plântula o cotilédone não se desprende do tegumento da
semente, mantendo o haustório no interior dos restos seminais, como o observado em
outros trabalhos com plântulas de bromélias (Pereira 1988, Scatena et al 2006, Pereira et
92
al. 2008). O padrão de desenvolvimento observado é o usualmente descrito para
Bromeliaceae, como observado nos trabalhos de Pereira (1988), Scatena et al. (2006),
Tillich (2007) e Pereira et al. (2008).
Em relação à descrição do desenvolvimento pós-seminal, as subfamílias
Pitcairnioideae, Bromelioideae e Tillandsioideae apresentam diferenças morfológicas
marcantes entre si e peculiares aos gêneros. Para Tillandsioideae, a qual pertence A.
imperialis, as principais características distintivas são a presença de bainha cotiledonar
com tamanho mediano, o hipocótilo pouco desenvolvido e forte tendência da raiz primária
ser reduzida ou ausente (Tillich 2007). Porém, no caso de A. imperialis uma espécie
rupícola ou saxícola, a raiz primária já está presente aos 10 dias de idade, e em média a 20
dias já ocorre o aparecimento das raízes adventícias. Esse desenvolvimento das raízes
ocorreu primeiro nas plântulas cultivadas in vitro, diferente do observado por Scatena et al.
(2006) com espécies epífitas de Tillandsia, em que a estrutura que primeiro emergiu foi o
cotilédone haustorial, sem haver o crescimento da raiz primária e as raízes adventícias
tardiamente.
Uma vez estabelecidas às condições ótimas para a propagação da espécie, a partir
de sementes, a técnica de produção de mudas por meio da micropropagação inclui as
etapas de avaliação do crescimento in vitro e em condições de estufa, bem como da
aclimatação. Embora seja considerado que o cultivo in vitro induza um crescimento maior
em comparação ao cultivo em condições de estufa (Fay 1994, Engelmann 1997, Kozai et
al. 1997, Thorpe & Harry 1997), não foram encontrados trabalhos que comparem esse
aspecto ao longo do período de cultivo.
No presente estudo foi possível demonstrar que, a partir de 4 meses de cultivo as
plantas mantidas in vitro diferenciavam-se muito daquelas mantidas em condições de
estufa, principalmente no comprimento das raízes e das folhas.
93
A análise comparativa dos dados das plantas provenientes do cultivo in vitro e em
condições de estufa mostrou um aumento dos valores dos dados biométricos e das massas
das raízes ao longo do tempo. Embora os dois tipos de cultivos tenham sido mantidos nas
mesmas condições de luminosidade e temperatura, no meio de cultura adicionou-se
sacarose, já na solução de MS/2, utilizada para a adubação das plantas cultivadas em
estufa, isso não ocorreu para evitar a proliferação de microorganismos, principalmente de
fungos.
É reconhecido o importante papel da sacarose como componente do meio de
cultura, servindo como fonte de carbono e energia para as plântulas, necessária para
compensar a taxa fotossintética que, nessas condições, é prejudicada em função da
restrição das trocas gasosas (Torres et al. 1998). Contudo, alguns autores atribuem função
aos carboidratos diretamente relacionada ao desenvolvimento de órgãos (Calvete et al.
2002), como das raízes adventícias (Veierskov 1988, McCown 1988, Assis & Teixeira
1998, Grattapaglia & Machado 1998, Pasqual 2001, Aloufa 2003, Souza & Pereira 2007).
Segundo Kozai (1991), a presença de carboidratos no meio de cultura é importante para o
desenvolvimento das raízes, para a multiplicação dos brotos e, bem como, para o aumento
da altura da planta, além disso, segundo Buchanan et al. (2002) e Taiz & Zeiger (2009) a
presença de sacarose propicia o fornecimento de esqueletos carbônicos necessários à
incorporação dos nutrientes.
A presença de raízes nas plantas cultivadas in vitro pode influenciar no sucesso de
aclimatação. A intensificação da produção de raízes in vitro é freqüentemente relacionada
ao emprego de reguladores de crescimento como a auxina sintética, o AIB (ácido-
indolilbutírico). Porém o uso de reguladores de crescimento no meio de cultivo tem sido
associado ao aparecimento de variações somaclonais (Joyce et al. 2003), indesejáveis
quando se pretende uma uniformização da produção ou mesmo a manutenção do genótipo
94
original, isento de mutações, visando programas de conservação (Carneiro & Mansur 2004).
Alternativamente ao uso dessas substâncias, tem sido demonstrado que o aumento da
concentração de carboidratos, mais freqüentemente a sacarose, adicionada ao meio de
cultura, pode ser um fator determinante no sucesso da aclimatação, por induzir o
desenvolvimento do sistema radicular (Sorace et al. 2008). Plantas da orquídea Oncidium
baueri, cultivadas in vitro, na presença de uma concentração maior de sacarose (40 g L
-1
)
que a de costume (30 g L
-1
), apresentou melhor crescimento quando transferida para cultivo
em casa de vegetação. Sorace et al. (2008), que trabalharam com essa espécie, associaram o
maior desenvolvimento do sistema radicular ao sucesso na aclimatação dessa orquídea.
Calvete et al. (2002) observaram que plantas de morangueiro cultivadas in vitro, na
ausência de sacarose, não apresentavam enraizamento e que a concentração de 45 g L
-1
foi a
mais favorável ao aparecimento de raízes.
Dentre os carboidratos utilizados no preparo de meios de cultura, destaca-se a
sacarose, pela praticidade e baixo custo (Grattapaglia & Machado 1998). Além disso, é o
carboidrato mais comum da seiva do floema de muitas plantas (Murashige & Skoog 1962,
Thorpe 1982, Lemos & Baker 1998, Fuentes et al. 2000).
Segundo Jang & Sheen (1994), o aumento do suprimento de sacarose para a planta
favorece o aumento da capacidade de iniciação, crescimento e respiração de órgãos drenos,
através do aumento da expressão de genes relacionados a esses processos.
De acordo com George e Sherrington (1984), concentrações elevadas de açúcar
podem inibir a formação de raízes in vitro. Entretanto, efeitos satisfatórios ocorreram em
experimento com porta-enxerto de pereira realizado por Leite et al. (2000), quando a
sacarose foi utilizada no meio de cultura.
Segundo Faria et al. (2004), a concentração da sacarose influencia o crescimento e
o acúmulo de biomassa (massa fresca) de plantas de Dendrobium nobile Lindl. propagadas
95
in vitro. Resultados semelhantes foram observados por Sorace et al. (2008), em que o uso
de meio Murashige e Skoog (1962) com ½ macronutrientes e com adição de 40 g L
-1
de
sacarose promoveu o desenvolvimento vegetativo mais eficiente da orquídea Oncidium
baueri Lindl., obtendo-se valores maiores tanto para o número como para o comprimento
das raízes.
Outro aspecto que pode favorecer o crescimento das raízes nas condições in vitro é
o estado físico do substrato. No cultivo in vitro o meio utilizado é semi-sólido, com o uso
de ágar para dar consistência, interferindo positivamente na disponibilidade de água,
nutrientes e outras substâncias para as plantas (Grattapaglia & Machado 1998).
Diferentemente, o uso da casca de Pinus como substrato para as plantas cultivadas em
condições de estufa, que além de apresentar outro estado físico, possui capacidade de
retenção de água menor e maior porosidade, quando tal substrato é comparado com o meio
de cultura gelificado, interferindo na disponibilidade de água, nutrientes e nos níveis de
oxigênio para as plantas. Além disso, por não estar em condições assépticas, há competição
pelos nutrientes com os microorganismos que podem estar no substrato.
Conforme Kämpf (1992), para o cultivo de bromélias epífitas o substrato deve ter
baixa densidade, alta permeabilidade e aeração, além de presença de elevada fração de
matéria orgânica para melhoria de suas propriedades. Dimmitt (1992), por sua vez,
ressaltou que os substratos para as bromélias deveriam ser ácidos, com alta capacidade de
campo, boa drenagem e aeração. Kanashiro et al. (2008) observaram que o uso da casca de
Pinus pode ser utilizada como substrato para bromélia Aechmea fasciata (Lindley) Baker,
em substituição ao xaxim, por ser o substrato que apresenta os melhores resultados para o
crescimento da planta. Resultados semelhantes foram obtidos por Barbosa et al. (2008)
para o crescimento de Vriesea ‘Charlotte’.
96
No entanto, a bromélia imperial é considerada como de hábito rupícola ou saxícola,
crescendo em afloramentos rochosos ou solos rasos e pedregosos (Paul 2006), cujas
características físicas de permeabilidade e aeração são semelhantes à casca de Pinus e,
dessa forma, a partir dos resultados obtidos no presente trabalho, o uso de tal substrato para
o cultivo dessa espécie se mostra viável.
Com relação à parte aérea, observou-se um aumento nos valores dos dados
biométricos e das massas, tanto fresca como seca, ao longo do tempo, sendo maiores nas
plantas in vitro. Como mencionado anteriormente, as plantas do cultivo in vitro foram
mantidas em meio de cultura com adição de sacarose, importante fonte de energia, além de
contribuir na estrutura de todos os compostos orgânicos (Murashige 1974, Pierik 1987,
Caldas et al. 1990, Kozai 1990, Kozai 1991, Kozai et al. 1992, Zimmerman 1995, Kozai et
al. 1997, Hartmann et al. 2002).
Outro aspecto que deve ser ressaltado, entre as diferenças do ambiente in vitro e nas
condições de estufa, é o relacionado com as condições atmosféricas.
A propagação de plantas in vitro é um sistema asséptico de modo a evitar que
fungos e outros organismos se desenvolvam no meio nutritivo. Com o intuito de proteger a
cultura de contaminações e para prevenir a dessecação, tanto da planta quanto do meio de
cultivo, as plantas são mantidas em frascos vedados, com restrição não intencional de
trocas gasosas entre a atmosfera interna do frasco e o meio externo (Kozai et al. 1992,
Mensuali-Sodi et al. 1992, Buddendorf-Joosten & Woltering 1994, Zimmerman 1995,
Kozai et al. 1997, Pospíšilová et al. 1999).
É relatado que no interior dos frascos ocorrem altas concentrações especialmente de
CO
2
e de outros gases (Kozai 1991, Buddendorf-Joosten & Woltering 1994, Kozai et al.
1997).
97
Nas condições de altas concentrações de CO
2
se observa
,
normalmente, um
aumento da taxa fotossintética e, consequentemente, um aumento na porcentagem de
clorofila, resultando em uma máxima eficiência fotoquímica do fotossistema 2 (Héloir &
Fournioux, 2001; Luchesini et al., 2001). Além disso, segundo Kozai (1991), a presença de
carboidratos no meio de cultura promove a multiplicação dos brotos e o aumento da altura
da planta.
Alguns trabalhos, inclusive, têm utilizado a aplicação de CO
2
no interior do frasco
como forma de aumentar o crescimento das plantas (Kirdmanee et al. 1995, Fila et al.
2006).
Embora o crescimento das plantas cultivadas in vitro fosse significativamente
maior, a análise anatômica mostrou que não houve diferenças em relação a morfologia dos
estômatos e a distribuição dos tecidos que compõem o mesofilo. Quanto à estrutura a
diferença observada foi na largura da lâmina foliar, sendo maior nas plantas cultivadas in
vitro.
Vale salientar que nas condições in vitro é frequente a ocorrência de vitrificação ou
hiperhidricidade (Pâques & Boxus 1987, Pâques 1991, Cuzzuol et al. 1995, Kevers et al.
2004, Saher et al. 2004, Chakrabarty et al. 2005), modificações nas células estomáticas
(Marín et al. 1988, Blanke & Belcher 1989, Capellades et al. 1990, Sallanon et al. 1991,
Sallanon et al.1993, Tichá et al. 1999, Brutti et al. 2002, Apóstolo et al. 2005, Joshi et al.
2006), espessamento da cutícula e alterações nos tecidos que compõem o mesofilo
(Apóstolo et al. 2005), pouco desenvolvimento do parênquima paliçádico (Noé & Bonini,
1996), diminuição da espessura do mesofilo (Calvete et al. 2002), progressiva
diferenciação entre parênquima paliçádico e lacunoso (Pospíšilová et al. 1999). Tais
aspectos, entretanto, não foram observados nas plantas micropropagadas de A. imperialis
98
estudadas, ou seja, a técnica de cultivo in vitro, sem o uso de reguladores, propiciou maior
crescimento, sem alterar o padrão morfológico das plantas.
Segundo Vesco et al. (2000), em trabalho com 17 diferentes acessos de cultivares
de Ananas comosus (L.) Merr. (abacaxizeiro) cultivados in vitro, a baixa taxa de variantes
somaclonais observada demonstra uma estabilidade genotípica dessa espécie. Para a
bromélia imperial propagada pelo cultivo in vitro sem o uso de reguladores, mesmo sendo
a partir de sementes, não foram observadas variações morfológicas, demonstrando que esta
espécie pode apresentar estabilidade genotípica, como os cultivares de abacaxizeiro.
Segundo Héloir & Fournioux (2001) e Luchesini et al. (2001), nas condições de
altas concentrações de CO
2,
normalmente presentes no cultivo in vitro, se observa um
aumento da taxa fotossintética e, consequentemente, um aumento na porcentagem de
clorofila, que leva a uma máxima eficiência fotoquímica do fotossistema 2.
A quantificação da clorofila é um método indireto de estimar a produtividade de
uma planta. Bojović & Stojanović (2005) observaram que o conteúdo de clorofilas e
carotenóides pode variar de acordo com a adubação. Portanto, o teor de clorofila pode ser
usado para indicar condições de estresse ou de déficit nutricional (Argenta et al. 2001,
Gáborčík 2003, Argenta et al. 2004).
Nas plantas cultivadas in vitro, os teores de clorofila podem variar dependendo da
qualidade e quantidade da luz (Victório et al. 2007) e das formulações do meio de cultura
(Tamaki et al. 2007, Santos 2009), já que as variações no conteúdo total de clorofila e
carotenóides são bons indicadores do estresse em plantas.
A partir dos dados de teor de clorofila total (clorofila a + clorofila b) e da
quantidade de água por planta, é possível calcular o índice de suculência (Kluge & Ting
1978). Quando se comparam os dados ao longo do período do trabalho, nota-se que os
valores aumentam e que são maiores nas plantas cultivadas in vitro. Provavelmente, a
99
suculência esteja relacionada com a adaptação ao ambiente, já que essa característica é
encontrada em plantas de ambiente xéricos ou sujeita a grandes variações de umidade.
Embora não seja uma característica obrigatória, a suculência das folhas
normalmente está relacionada com o metabolismo fotossintético do ácido das crassuláceas
(CAM) (Kluge & Ting 1978, Larcher 2006, Lambers et al. 2008).
As espécies consideradas CAM são comumente caracterizadas por possuírem
folhas espessas, suculentas e que, em secção transversal, pode-se notar a presença de
parênquima aqüífero com várias camadas de células volumosas, com grande vacúolo e
paredes finas (Kluge & Ting 1978, Nelson et al. 2005, Larcher 2006, Lambers et al. 2008).
Em Bromeliaceae, segundo Kluge & Ting (1978), cerca de 14 gêneros e mais de 50
espécies são reportadas como sendo CAM, enquanto Martin (1994) considera que 69% das
bromélias epífitas são CAM.
Segundo Pierce et al. (2002), no caso da bromélia Aechmea dactylina, o
metabolismo CAM é um modo relativamente eficiente de crescimento, dando vantagens
ecofisiológicas se comparadas com plantas de metabolismo fotossintético C
3
O tecido de reserva de água pode funcionar como filtro de luz (Krulik 1980, Sipes
& Ting 1985), transmitindo para o mesofilo apenas 70% da luz que incide na folha (Nishio
& Ting 1993). A alta capacidade de armazenar água compensa os períodos de seca, que
são muito comuns para espécies de hábito rupícola (Larcher 2006, Lambers et al. 2008,
Helbsing et al. 2000).
Para a bromélia imperial, abordada no presente trabalho, que apresentam
crescimento lento e suculência foliar, acredita-se que a espécie pode apresentar o
metabolismo do ácido das crassuláceas (CAM), porém estudos específicos precisam ser
realizados para tal confirmação.
100
Outro aspecto importante, na comparação do crescimento entre as plantas
cultivadas in vitro e em condições de estufa ao longo do tempo, é conhecer em qual
período ocorreu o maior incremento de biomassa nas plantas, contribuindo para determinar
o intervalo de tempo em que ocorreu o maior crescimento. Para isso o cálculo da taxa de
crescimento relativo (TCR) pode ser utilizado, já que o parâmetro de avaliação é
considerado ao longo de um determinado período, estando diretamente relacionado ao
valor no período anterior (Benincasa 2003).
Para o presente trabalho, foram calculadas taxas de crescimento relativo, tanto para
as raízes como para a parte aérea, sendo que em geral, os maiores valores foram
encontrados nas plantas cultivadas in vitro quando comparadas com aquelas, de mesma
idade, em condição de estufa.
Nas taxas calculadas para os dados da parte aérea, os maiores valores obtidos foram
para as plantas cultivadas in vitro com 2 meses de idade, com exceção para a taxa referente
ao número de folhas mortas. Já para as plantas em condições de estufa, as maiores taxas de
crescimento relativo foram observadas para plantas com 4 meses, indicando um atraso no
crescimento quando comparadas com as plantas de cultivo in vitro.
A razão da massa foliar expressa a fração de matéria seca não exportada das folhas
para o resto da planta (Benincasa 2003) e, sendo assim, os dados observados mostram um
aumento na biomassa das folhas nas plantas cultivadas em estufa e um maior incremento
em biomassa da parte aérea.
Nas plantas cultivadas in vitro a razão do número de folhas mortas foi superior,
porém, nas plantas em condições de estufa o início do aparecimento de folhas mortas se
deu em período anterior.
Os valores de taxa de crescimento relativo foram mais altos nas plantas cultivadas
in vitro do que nas plantas em condições de estufa com a mesma idade. Para as taxas
101
calculadas para os dados das raízes, os maiores valores foram para as plantas com 2 meses
de idade, tanto das cultivadas in vitro como as em condições de estufa, demonstrando que
esse período é o que apresenta o maior incremento de biomassa das raízes.
Comparando-se os valores de TCR dos dados das raízes com os da parte aérea,
pode-se dizer que as raízes se desenvolvem mais rápido que a parte aérea. Isso posto, fica
claro que nas condições in vitro o crescimento além de ser maior é mais rápido.
A razão raiz:parte aérea foi maior nas plantas in vitro, acarretando um maior
número de raízes e maior absorção de água e nutrientes, com consequente maior
crescimento da planta.
A distribuição da biomassa calculada com base na massa seca das raízes e da parte
aérea mostrou que para as raízes ocorre, ao longo do tempo, um aumento nos valores para
as plantas cultivadas in vitro e uma diminuição para as plantas em condições de estufa. Já
para os valores da parte aérea ocorreu uma inversão, sendo que para as plantas cultivadas
in vitro houve uma diminuição e nas em condições de estufa um aumento nos valores.
Isso demonstra que as plantas mantidas em condições de estufa, talvez pelas
limitações do substrato, investiram mais na biomassa da parte aérea. Ressalta-se, inclusive,
que a espécie na natureza tem hábito rupícola ou saxícola, não apresentando sistema
radicular profundo. As plantas mantidas in vitro, pela disponibilidade dos nutrientes e
água, investiram tanto na parte aérea como nas raízes. Segundo Hartmann et al. (2002),
plantas com raízes bem desenvolvidas são ideais para a aclimatação, sem a qual as plantas
não resistem à transferência para condições ex vitro, condição em que dependem da taxa
fotossintética e da capacidade de absorção de nutrientes do substrato para sua
sobrevivência. Porém, plantas com muitas raízes dificultam a transferência em casos de
subcultivos, aumentando o trabalho manual de realocação das plantas para novos meios de
cultura, além de aumentar as possibilidades de contaminações.
102
Segundo Larcher (2006), plantas jovens em estádio de desenvolvimento crescem
rapidamente tanto em extensão como em diâmetro. Conforme aumentam de tamanho,
gradualmente assumem sua forma típica e alcançam o equilíbrio na razão parte aérea/parte
subterrânea. Durante a fase principal de crescimento, as plantas estão no pico de suas
atividades metabólicas (fotossíntese, respiração, absorção de substâncias minerais). Do
ponto de vista da competição por espaço nas comunidades vegetais, o rápido crescimento
nos primeiros estágios do desenvolvimento será decisivo para o futuro do indivíduo. É
durante a fase vegetativa de crescimento que se manifestam as características da
plasticidade fenotípica e, sobretudo, as adaptações modificativas em relação às condições
do habitat.
Os resultados descritos anteriormente demonstram que a propagação de plantas de
A. imperialis, a partir de sementes, através do cultivo in vitro é viável, e que não é
necessário manter as plantas por mais de 6 meses, visto que a partir desse período já ocorre
a morte das folhas, possivelmente indicando uma situação de estresse.
As etapas da micropropagação envolvem desde a escolha do explante, o
estabelecimento da cultura, o acompanhamento do crescimento in vitro e a transferência
das plantas das condições assépticas, com alta umidade e disponibilidade de nutrientes,
para condições ex vitro, denominada de aclimatação (Gratapaglia & Machado 1998). Nas
condições de aclimatação as plantas passam a depender da taxa fotossintética e da absorção
de água e nutrientes do substrato (Gratapaglia & Machado 1998).
Segundo Hartmann et al. (2002), o período que as plantas permanecem em
aclimatação varia conforme a espécie, tipo de explante utilizado para iniciar o cultivo,
condições da cultura, composição do meio de cultivo, uso de reguladores e outras
substâncias, entre outros. Porém, a presença e o grau de desenvolvimento das raízes são
fatores limitantes para o processo de aclimatação, já que as plantas irão depender da
103
capacidade de absorção para sobreviver a essa nova condição. Por isso, torna-se importante
realizar as avaliações biométricas antes e após o período de aclimatação para garantir o
crescimento das raízes.
O parâmetro utilizado para a escolha do momento da retirada das plantas dos
frascos varia conforme a espécie estudada, a maioria dos autores citados anteriormente
utilizada o comprimento da planta para selecionar os indivíduos para a aclimatação, como
Rech Filho et al. (2005), com Vriesea reitzii, que transferram plantas com 2 cm para as
condições ex vitro. Outros autores utilizam o tempo de cultivo in vitro como parâmetro
para a retirada das plantas, no entanto, não mencionam suas dimensões (Mercier &
Kerbauy 1992, Arrabal et al. 2002, Pickens et al. 2003, Silva et al. 2007). Diferentemente,
no presente estudo, foram testados os efeitos de diferentes tempos de permanência das
plantas no cultivo in vitro e na aclimatação, a fim de determinar o tempo mínimo de
cultivo in vitro que tenha sucesso na aclimatação.
É importante salientar, que o índice de sobrevivência após 2 meses de aclimatação
observado no presente estudo foi superior a 96% para todos os períodos. Além disso, em
todos os tratamentos (tempo de permanência no cultivo in vitro) utilizados não foram
observadas variações morfológicas e alterações na pigmentação das folhas.
Muitos estudos têm sido realizados sobre a aclimatação de bromélias produzidas a
partir do cultivo in vitro (Mercier & Kerbauy 1992, Arrabal et al. 2002, Pickens et al.
2003, Rech Filho et al. 2005, Alves et al. 2006, Pickens et al. 2006, Silva et al. 2007). Em
todos eles foram observadas altas taxas de sobrevivência ao período de aclimatação,
variando de 89% para espécie Cryptanthus sinuosus L.B. Sm. (Arrabal et al. 2002) a até
100% como em Vriesea reitzii Leme & Costa, Andrea (Rech Filho et al. 2005) e Dyckia
agudensis Irgang & Sobral
(Silva et al. 2007).
104
No caso de bromélias, não foram encontrados na literatura artigos que levem em
consideração o tempo ideal para as plantas permanecerem em aclimatação. Alguns
trabalhos citam períodos muito diferentes, que vão de 15 dias (Silva et al. 2007), 9
semanas (Rech Filho et al. 2005), 60 dias (Pickens et al. 2006) até 32 semanas (Pickens et
al. 2003). Além disso, todos esses trabalhos usaram reguladores do crescimento, que
afetam o desenvolvimento das plantas.
Além de estabelecer o período da aclimatação, alguns trabalhos avaliaram a
influência de diferentes substratos, como o de Pickens et al. (2003) que utilizaram quatro
substratos, encontrando os melhores resultados para a aclimatação de Tillandsia eizii L.B.
Sm. utilizando casca de Pinus. A utilização desse substrato, para a referida espécie, não só
obteve a melhor taxa de sobrevivência mas, também, o maior incremento em biomassa e
altura das plantas.
Para a bromélia imperial foram testados diferentes substratos para a aclimatação
(Rodrigues et al. 2004), os melhores resultados foram observados para a combinação de
50% de terra e 50% de casca de arroz carbonizada, porém, é difícil uma padronização com
uso de terra, já que podem possuir diferentes composições químicas. Para o presente
estudo foi utilizada a casca de Pinus, por ser um substrato facilmente encontrado no
comércio e já ter sido utilizado com sucesso para outras espécies de bromélias (Pickens et
al. 2003, Kanashiro et al. 2008).
A análise comparativa dos dados das plantas da bromélia imperial, provenientes de
diferentes tempos de permanência no cultivo in vitro e após 2 meses de aclimatação em
condições de estufa, mostrou um aumento dos valores dos dados biométricos ao longo do
tempo.
105
Os dados das raízes apresentaram maiores valores nas plantas após a aclimatação,
mostrando que independente do tempo de cultivo in vitro ocorreu o crescimento das raízes
durante a aclimatação.
Já para os dados biométricos da parte aérea, o número de folhas sadias aumenta
após a aclimatação, nas plantas mais jovens cultivadas in vitro, porém após o período de 6
meses de cultivo in vitro, as plantas diminuem a quantidade de folhas sadias. O número de
folhas mortas, após a aclimatação, já ocorre em plantas com 2 meses de cultivo in vitro,
provavelmente, a morte das folhas em plantas tão jovens foi causada pelo estresse da
transferência de substrato.
Com relação aos dados de massa, tanto fresca como seca, das raízes e da parte
aérea, aumentaram em todos os períodos após a aclimatação, indicando que mesmo com a
morte de algumas folhas, ocorreu o incremento da biomassa.
Os teores de pigmentos, clorofila a, clorofila b e carotenóides, diminuíram após a
aclimatação, provavelmente em virtude de alterações na absorção dos nutrientes do
substrato. Dados semelhantes foram citados por Pospíšilová et al. (1999) e Borghezan et
al. (2003). Porém, Osório et al. (2005), depois da aclimatação de plantas de Ceratonia
siliqua L. (Fabaceae), observaram um aumento no conteúdo de clorofila total.
Para os valores de índice de suculência ocorre um aumento nas plantas aclimatadas
se comparadas com os dados antes do período de aclimatação. Esse fator pode indicar que
as plantas aclimatadas armazenaram mais água durante e esse período, provavelmente esse
acúmulo se deva a nova condição de umidade tanto do substrato quanto da atmosfera.
As taxas de crescimento relativo, tanto para os parâmetros calculados para as raízes
como para a parte aérea, foram maiores nas plantas de 2 meses de cultivo in vitro após os 2
meses de aclimatação. Plantas que permaneceram por mais tempo in vitro apresentam
menores valores de taxa de crescimento relativo. Isso demonstra que as plantas mantidas
106
por um tempo prolongado nas condições de cultivo in vitro após o período de aclimatação
crescem, porém numa taxa muito baixa quando comparadas com as plantas que
permaneceram um curto período nas condições in vitro. Tanto que a razão do número de
folhas mortas foi maior nas plantas de 12 meses de cultivo in vitro após a aclimatação.
As plantas cultivadas in vitro por 1 e 2 meses apresentaram os menores valores de
biometria, porém em relação à taxa de crescimento relativo são as que mais apresentaram
incremento após a aclimatação. Segundo Skrebsky et al. (2004) e Sobrinho et al. (2007),
quanto maior o tempo no cultivo in vitro menor a taxa de sobrevivência na aclimatação.
A razão da massa foliar expressa a fração de matéria seca não exportada das folhas
para o resto da planta, os dados observados mostraram um aumento na biomassa das folhas
após o período de aclimatação.
Já a razão raiz:parte aérea diminui nas plantas após a aclimatação, demonstrando
que após esse período o investimento em biomassa passou a ser para a parte aérea. Os
dados da distribuição da biomassa mostram essa mudança no padrão de incremento, pois
em todos os períodos estudados ocorreu a alteração da biomassa da raiz para a parte aérea.
O cultivo in vitro se mostrou, assim, eficiente e pode otimizar a produção da
bromélia imperial, constatando-se que plantas com apenas 2 meses de cultivo in vitro já
podem ser aclimatadas, contribuindo para uma diminuição no tempo de cultivo e na
importante relação custo-benefício para sua produção comercial.
Sugere-se, pois, para conservação da espécie e de sua variabilidade genética, bem
como para a produção de mudas para fins comerciais, que o protocolo adotado leve em
consideração a utilização de sementes, a não aplicação de reguladores de crescimento nos
diferentes tipos de cultivo, o tempo do cultivo in vitro - que deve ser de no mínimo 2
meses e não deve ultrapassar 6 meses, bem como a utilização de casca de Pinus como
substrato e alta umidade relativa do ar na fase de aclimatação, temperatura ambiente
107
próxima a 26°C e fotoperíodo de 12 horas nas três condições de cultivo, garantindo, assim,
um alto índice de sobrevivência de plantas sem alterações morfológicas e um custo
reduzido.
108
VI. CONSIDERAÇÕES FINAIS
• É possível cultivar Alcantarea imperialis a partir de sementes por técnicas de
cultivo in vitro.
• As plantas cultivadas in vitro são maiores e crescem mais rápido em relação as
plantas de mesma idade cultivadas em condições de estufa.
• As plantas obtidas do cultivo in vitro não apresentam alterações morfológicas
quando comparadas com plantas de mesma idade cultivadas em condições de
estufa.
• O tempo de cultivo in vitro não deve ultrapassar 6 meses.
• As plantas com 2 meses de cultivo in vitro são as que apresentaram as maiores
taxas de crescimento relativo após a fase de aclimatação.
• Sendo assim, para a produção da bromélia imperial, plantas com 2 meses de cultivo
in vitro já podem ser aclimatadas, diminuindo a permanência no cultivo in vitro e
consequentemente o custo da produção.
109
VII. RESUMO
O cultivo in vitro de bromélias tem sido considerado uma técnica eficiente para
aperfeiçoar a propagação dessas plantas, que pelos métodos naturais não é capaz de
fornecer em curto espaço de tempo, um grande número de espécimes, o que mais interessa
ao produtor comercial. Para Alcantarea imperialis (Carrière) Harms, utilizada no
paisagismo e considerada ameaçada de extinção devido ao extrativismo ilegal, não existem
relatos que comparem o crescimento in vitro com a produção em estufa. No cultivo in vitro
as plantas são obtidas em condições controladas de assepsia, alta umidade e
disponibilidade de nutrientes, enquanto que aos serem transferidas para crescimento ex
vitro em estufa, a aclimatação, dependem da taxa fotossintética e da absorção de nutrientes
do substrato. A redução do tempo de permanência in vitro, pode diminuir os custos de
manutenção para os produtores. O objetivo do presente trabalho foi estabelecer um
protocolo para a propagação de mudas da espécie Alcantarea imperialis (Carrière) Harms a
partir de sementes, que permita obter o maior índice de produção e sobrevivência de
plantas dessa espécie com o menor custo. Para o lote cultivado in vitro, as sementes após a
retirada dos apêndices plumosos e desinfestação superficial foram depositadas em meio de
cultura Murashige & Skoog (MS), com concentração original dos micronutrientes e metade
da concentração dos macronutrientes (MS/2). Para o lote cultivado em estufa, sementes
foram colocadas em gerbox com papel de filtro para a germinação. Após 30 dias da
germinação, as plantas foram colocadas em bandejas de isopor contendo substrato de casca
de Pinus moída, envoltas com plástico transparente para evitar a perda excessiva de
umidade e adubadas semanalmente com solução de MS/2. Ambos os lotes foram mantidos
em fotoperíodo de 12 h e temperatura de 26 ± 2ºC. Após 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses de
cultivo in vitro, 100 plantas correspondentes a cada período foram transferidas para
condições ex vitro e mantidas por 2 meses em estufa nas mesmas condições de
temperatura, luz e adubação utilizadas no cultivo in vitro. Os parâmetros avaliados, nos
cultivos in vitro e em gerbox, foram taxa de germinação em diferentes fotoperíodos e
desenvolvimento pós-seminal. As sementes são fotoblásticas positivas com porcentagem
de germinação de 93% e o tempo médio de 4 dias. Não foram observadas diferenças
morfológicas no desenvolvimento entre as plântulas cultivadas in vitro e em estufa. As
plantas provenientes do cultivo in vitro, em estufa e as submetidas à aclimatação foram
avaliadas quanto à porcentagem de sobrevivência, número e comprimento de folhas e
raízes, teor de pigmentos, além do ganho de massas fresca e seca, índice de suculência,
razão raiz:parte aérea, razão de peso de folha, distribuição de biomassa e taxa de
crescimento relativo. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e teste
Tukey. Para a análise estrutural, amostras das folhas de plantas adultas incluídas em
metacrilatoglicol foram seccionadas em micrótomo rotativo e as secções obtidas coradas
com azul de toluidina 0,05% em tampão acetato 0,1M pH 4,7. Os resultados demonstraram
que as plantas provenientes do cultivo in vitro apresentaram maiores valores para número e
comprimento de raízes e folhas, principalmente a partir do 4º mês de cultivo, e ganho nas
massas fresca e seca a partir do 6º mês de cultivo. As taxas de crescimento, tanto das raízes
como da parte aérea, foram maiores nas plantas cultivadas in vitro com 2 meses.O teor de
pigmentos, o índice de suculência e a razão raiz : parte aérea foram maiores nas plantas
cultivadas in vitro, demonstrando que nessas plantas ocorre um aumento no investimento
das raízes, enquanto que nas plantas cultivadas em estufa ele é maior para a parte aérea. O
valor mínimo de sobrevivência das plantas cultivadas in vitro e transferidas para a
aclimatação foi de 96% naquelas que permaneceram in vitro durante 4 meses. Os dados
obtidos demonstram ser possível aclimatar plantas da espécie cultivadas in vitro, a partir de
2 meses, pois foi neste período que ocorreram as maiores taxas de crescimento e a
110
distribuição da biomassa apresentou dados similares entre as plantas cultivadas in vitro e as
aclimatadas. Quanto à estrutura a diferença observada entre as plantas cultivadas in vitro e
em estufa foi na largura da lâmina foliar, sendo maior nas primeiras, não foram observadas
alterações nos diferentes tecidos foliares, inclusive nos estômatos. O cultivo in vitro se
mostrou, assim, eficiente e pode otimizar a produção da bromélia imperial, constatando-se
que plantas com apenas 2 meses de cultivo in vitro já podem ser aclimatadas, contribuindo
para uma diminuição no tempo de cultivo e na importante relação custo-benefício para sua
produção comercial.
Palavras chave: Bromeliaceae, anatomia, micropropagação
111
VIII. ABSTRACT
The culture in vitro of bromeliads has been considered an efficient technique to
improve the production of such plants. The natural methods for dissemination of
bromeliads are unable to produce a great number of plants in a short period of time which
is an interesting characteristic for commercial producers. The imperial bromeliad,
Alcantarea imperialis (Carrière) Harms, is used in landscaping and is considered under
risk of extinction due to illegal exploitation. Information concerning the in vitro growth of
this species compared to plants cultivated in greenhouse it is not available to date. The in
vitro culture was obtained under aseptic and high humidity conditions and availability of
nutrients, being transferred for ex vitro condition in greenhouse (acclimatization stage).
During this phase the survival of plants depends on the photosynthetic rate and the
absorption of nutrients from the substrate. The reduction of the in vitro culture period may
contribute for the reduction of the production costs. The aim of this work was to establish a
protocol to propagate Alcantarea imperialis (Carrière) Harms, starting from the seeds, that
allows to obtain the best rate of production with the lowest cost. For in vitro culture lot,
after the removal of the plumous appendices, the seeds were superficially disinfested, and
placed in Murashige & Skoog (MS) culture medium with original micronutrients
concentrations and half concentration of the macronutrients (MS/2). For the greenhouse
culture lot, seeds were germinated in Gerbox with two layers of filter paper. After 30 days
of germination, the plantlets were transferred to polystyrene trays containing Pinus bark as
substrate, covered with transparent plastic to avoid the excessive water loss and weekly
fertilized with MS/2 solution. Both lots of plants were maintained at 12h-photoperiod and
26 ± 2ºC. After 1, 2, 4, 6, 8, 10 and 12 months of in vitro culture, 100 plants from each
period were transferred for ex vitro conditions and maintained for 2 months in a
greenhouse under the same conditions of temperature, light and fertilization. The
germination percentage in different photoperiods and the post seminal development were
analyzed in plants cultured in vitro, greenhouse and acclimatization conditions. The seeds
are photoblastic positive, with 93% of germination index in an average period of 4 days.
There was not any morphological difference between plantlets originated from in vitro and
greenhouse conditions. The plantlets from the different treatments were evaluated
concerning the survival percentage, number and length of leaves and the roots,
concentration of pigments, fresh and dry masses, succulence index, roots : aerial portion
rate, leaf weight, biomass distribution and relative growth index. The data were submitted
to Tukey test. For the structural analysis samples of adult leaves were embedded in glycol
metacrylate medium, sectioned in rotative microtome and the sections stainned with 0.05%
tolluidine blue in 0.1M pH 4.7 acetate buffer. The results demonstrate that plants from in
vitro culture present the greatest number and length of roots and leaves, especially from the
4
th
month and the greatest fresh and dried masses from the 6
th
month. The growing index
for root and leaves were greater in vitro in plants with two-months old. The concentration
of pigments, succulence index, roots reason: aerial portion were greater in plants cultivated
in vitro, indicating an increased root investment, while in plants from the greenhouse the
investment was higher in the aerial portion. The minimum survival value (96%) was
obtained for plants cultivated for 4 months in vitro before transferring to acclimatization
chambers. The obtained data show that it is possible to obtain healthy plants from two-
month old in vitro culture, because during this period there was observed the highest
biomass rate and the biomass distribution of in vitro grown plants was similar to that of
acclimatized plants. Concerning the structural aspects analyzed the only difference
observed was that plants from in vitro culture presented more width leaves than those from
112
acclimatized plants. The in vitro culture was more efficient and could optimize the imperial
bromeliad production, with a special recommendation for the use of two-month old
cultured plants in vitro before acclimatization. This procedure could contribute to the
decrease of the culture period and the reduction of the costs for the commercial production
of the imperial bromeliad.
Key words: Bromeliaceae, anatomy, micropropagation
113
IX.
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X. ANEXOS
Anexo 1 – Dados biométricos de número de raízes de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa por 1, 2, 4, 6,
8, 10 e 12 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 1,98 ± 0,25 fA 2,92 ± 0,80 fA 4,46 ± 1,30 eA 7,64 ± 1,92 dA 8,94 ± 1,83 cA 10,54 ± 1,80 bA
15,86 ± 2,44 aA
Estufa 1,86 ± 0,35 eA 2,36 ± 0,53 deB 2,8 ± 0,81 cdB 3,14 ± 0,99 cB 4,14 ± 1,11 bB 4,84 ± 0,96 aB 4,88 ± 1,42 aB
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 2 – Dados biométricos de comprimento de raízes (cm) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa
por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 0,41 ± 0,13 eA 1,04 ± 0,17 dA 1,33 ± 0,32 dA 3,79 ± 0,97 cA 3,70 ± 0,80 cA 4,79 ± 1,29 bA 6,77 ± 1,60 aA
Estufa 0,28 ± 0,14 cB 0,38 ± 0,16 cB 0,55 ± 0,30 cB 0,78 ± 0,29 cB 1,36 ± 0,47 bB 1,76 ± 0,57 aB 1,48 ± 0,49abB
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 3 – Dados de massa fresca das raízes (mg) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa por 1, 2, 4, 6,
8, 10 e 12 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro
0,66 ± 0,07 cA 3,61 ± 0,60 cA 12,51 ± 1,38 cA 57,15 ± 6,87 bcA 101,88 ± 13,59 bcA 146,84 ± 6,66 bA 398,21 ± 90,50 aA
Estufa
0,63 ± 0,19 cA 0,64 ± 0,03 cB 2,54 ± 0,44 cB 3,46 ± 0,42 bcB 7,04 ± 0,82 abB 7,84 ± 2,57 aB 9,86 ± 0,83 aB
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 4 – Dados de massa seca das raízes (mg) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa por 1, 2, 4, 6, 8,
10 e 12 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 0,1
± 0,009 cA
0,44
± 0,07 cA
1,05
± 0,04
cA 7,08
± 0,50 bcA
16,44
± 1,98 bA
14,95
± 1,17 bA
55,05
± 10,19 aA
Estufa 0,07
± 0,002 cB
0,12
± 0,02 cB
0,31
± 0,09 cB
0,64
± 0,12 bcB
1,06
± 0,05 abB
1,31
± 0,43 aB
1,42
± 0,11 aB
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 5 – Dados biométricos de número de folhas sadias de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa por 1,
2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 3,56
± 0,50 eA
5,84
± 0,51 dA
9,5
± 0,97
cA 12,34
±1,53 abA
11,84
± 1,22 bA
11,88
± 1,87 bB
12,82
± 1,66
aA
Estufa 3,58
± 0,50 fA
4,54
± 0,61 eB
7,56
± 1,09
dB 9,3
± 1,23 cB
11,08
± 1,52 bB
13,2
± 1,77 aA
12,46
± 2,11 aA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 6 – Dados biométricos de número de folhas mortas de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa por 1,
2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 0
± 0
eA 0
± 0
eA 0
± 0
eB 1,58
± 1,54 dA
3,86
± 1,31 cA
7,62
± 1,68 bA
9,56
± 1,95 aA
Estufa 0
± 0
dA 0,02
± 0,14 dA
0,78
± 0,72 cA
0,9
± 0,74 dB
2,64
± 1,22 aB
2,08
± 1,10 bB
3,08
± 1,41 aB
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 7 – Dados biométricos de comprimento da parte aérea (cm) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de
estufa por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 1,37
± 0,20 gA
2,27
± 0,22 fA
5,55
± 0,82 eA
8,29
± 1,10 dA
12,73
± 2,06 cA
16,01
± 1,47 bA
20,77
± 2,31 aA
Estufa 1,28
± 0,13 fA
1,59
± 0,23 fB
2,41
± 0,28 eB
4,19
± 0,49 dB
5,65
± 0,69 cB
6,81
± 0,72 bB
8,67
± 1,06 aB
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 8 – Dados de massa fresca da parte aérea (mg) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa por 1, 2, 4,
6, 8, 10 e 12 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro
8,34 ± 0,70 eA 24,94 ± 0,28 eA 100,35 ± 6,53 deA 237,96 ± 6,32 dA 554,72 ± 5,22 cA 1017,60 ± 37,35 bA 1713,85 ± 111,75 aA
Estufa
8,72 ± 0,72 eA 10,3 ± 0,47 eB 32,46 ± 0,16 dB 78,93 ± 1,04 cB 199,13 ± 5,48 bB 207,34 ± 10,69 bB 319,70 ± 8,80 aB
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 9 – Dados de massa seca da parte aérea (mg) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa por 1, 2, 4,
6, 8, 10 e 12 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 0,66
± 0,08 cA
1,86
± 0,06 cA
8,14
± 0,53 cA
18,20
± 0,33 bcA
44,69
± 0,84 bcA
56,72
± 1,14 bA
185,43
± 33,77 aA
Estufa 0,57
± 0,03 fA
0,77
± 0,008 efB
2,74
± 0,10 eB
6,47
± 0,23 dB
12,91
± 0,56 cB
16,24
± 0,39 bB
23,94
± 1,46 aB
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 10 – Valores médios de clorofila a (µg) por massa fresca (g) das plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de
estufa por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro
641,47 ± 24,50 aA 616,83 ± 50,73 abA 600,77 ± 32,98 abA 484,56 ± 36,35 bcA 531,27 ± 50,11 abA 443,31 ± 46,34 cB 638,94 ± 38,07 aA
Estufa
414,09 ± 8,46 cB 435,69 ± 46,58 bcA 564,70 ± 12,72 aA 566,26 ± 28,38 aA 499,52 ± 43,88 abcA 576,29 ± 19,61 aA 534,82 ± 30,54 abA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 11 – Valores médios de clorofila b (µg) por massa fresca (g) das plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de
estufa por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro
229,67 ± 44,14aA 231,04 ± 48,59 aA 211,57 ± 49,47 aA 183,07 ± 43,26 aA 199,70 ± 32,78 aA 232,74 ± 53,49 aA 242,24 ± 45,26 aA
Estufa
193,81 ± 0,91 aA 184,20 ± 18,18 aA 239,32 ± 7,68 aA 239,52 ± 12,77 aA 256,23 ± 42,90 aA 243,50 ± 23,91 aA 232,91 ± 14,20 aA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 12 – Valores médios de carotenóides (µg) por massa fresca (g) das plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de
estufa por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro
158,18 ± 15,21 aA 141,98 ± 17,05 abA 144,29 ± 5,17 abA 123,25 ± 6,82 abA 137,84 ± 24,48 abA 103,77 ± 14,05 bA 171,35 ± 27,36 aA
Estufa
97,87 ± 0,88 bB 101,10 ± 11,10 bA 127,02 ± 4,75 aA 117,45 ± 5,06 abA 104,70 ± 9,15 abA 128,89 ± 6,21 aA 120,11 ± 7,57 abA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 13 - Delta dos valores de número de raízes: NR = (n
2
n
1
-1
) mês
-1
, comprimento de raízes: CR = (cm
2
cm
1
-1
) mês
-1
, número de folhas
sadias: NFs = (n
2
n
1
-1
) mês
-1
, número de folhas mortas: NFm = (n
2
n
1
-1
) mês
-1
, comprimento de folha: CF = (cm
2
cm
1
-1
) mês
-1
das plantas de
Alcantarea imperialis cultivadas in vitro e em condições de estufa por 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses. Esses índices fisiológicos por serem dados
calculados, não obedecem às pressuposições básicas para a análise de variância.
DELTA
Períodos
In vitro Estufa
NR CR NFs NFm CF NR CR NFs NFm CF
1-2
0,39 0,92 0,49 - 0,50 0,24 0,33 0,24 (*) 0,21
2-4
0,21 0,12 0,24 - 0,45 0,08 0,18 0,25 1,82 0,21
4-6
0,27 0,52 0,13 0,23 0,20 0,06 0,17 0,10 0,08 0,28
6-8
0,08 (*) (*) 0,45 0,21 0,14 0,28 0,9 0,54 0,15
8-10
0,08 0,13 (*) 0,34 0,11 0,08 0,13 0,9 (*) 0,09
10-12
0,20 0,17 0,04 0,11 0,13 (*) (*) (*) 0,20 0,12
(*) tende a zero
Anexo 14 – Dados biométricos de número de raízes de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses e
submetidas à aclimatação por 2 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 1,98 ± 0,25 fB 2,92 ± 0,80 fB 4,46 ± 1,30 eB 7,64 ± 1,92 dB 8,94 ± 1,83 cB 10,54 ± 1,80 bB 15,86 ± 2,44 aB
Aclimatada 2,90 ± 0,68 dA 5,98 ± 1,15 cA 6,32 ± 1,17 cA 12,38 ± 2,91 bA 13,60 ± 2,86 bA 13,30 ± 2,70 bA
19,60 ± 3,39 aA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 15 – Dados biométricos de comprimento de raízes (cm) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12
meses e submetidas à aclimatação por 2 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 0,41 ± 0,13 eB 1,04 ± 0,17 dB 1,33 ± 0,32 dB 3,79 ± 0,97 cB 3,70 ± 0,80 cB 4,79 ± 1,29 bA 6,77 ± 1,60 aA
Aclimatada 0,67 ± 0,30 eA 1,52 ± 0,59 dA 2,83 ± 0,84 cA 4,83 ± 1,00 bA 5,04 ± 1,04 bA 5,01 ± 1,33 bA 7,06 ± 1,35 aA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 16 – Dados de massa fresca das raízes (mg) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses e
submetidas à aclimatação por 2 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro
0,66 ± 0,07 cB 3,61 ± 0,60 cB 12,51 ± 1,38 cA 57,15 ± 6,87 bcA 101,88 ± 13,59 bcA 146,84 ± 6,66 bA 398,21 ± 90,50 aA
Aclimatada
1,59
± 0,16 dA
11,78
± 2,03 dA
10,42
± 2,24 dA
68,32
± 18,66 cA
104,24
± 15,78 bcA
120,33
± 18,38 bA
435,17
± 8,77 aA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 17 – Dados de massa seca das raízes (mg) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses e
submetidas à aclimatação por 2 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 0,1
± 0,009 cB
0,44
± 0,07 cB
1,05
± 0,04
cA 7,08
± 0,50 bcA
16,44
± 1,98 bA
14,95
± 1,17 bA
55,05
± 10,19 aA
Aclimatada 0,32 ± 0,04 dA 1,74 ± 0,28 dA 1,47 ± 0,34 dA 11,23 ± 1,98 cA 16,86 ± 1,39 bA 15,71 ± 2,95 bcA 59,00 ± 1,65 aA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 18 – Dados biométricos de número de folhas sadias de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses
e submetidas à aclimatação por 2 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 3,56
± 0,50 eB
5,84
± 0,51 dB
9,5
± 0,97
cB 12,34
±1,53 abA
11,84
± 1,22 bA
11,88
± 1,87 bA
12,82
± 1,66
aA
Aclimatada 5,98
± 0,62 cA
10,80
± 0,95 abA
10,76
± 1,10 abA
10,12
± 1,96 bB
10,58
± 1,53 bB
11,58
± 1,58 aA
10,86
± 1,71 abB
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 19 – Dados biométricos de número de folhas mortas de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses
e submetidas à aclimatação por 2 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 0
± 0
eA 0
± 0
eB 0
± 0
eB 1,58
± 1,54 dB
3,86
± 1,31 cA
7,62
± 1,68 bA
9,56
± 1,95 aA
Aclimatada 0
± 0 eA
0,32
± 0,55 eA
1,86
± 1,01 dA
4,04
± 1,09 cA
2,14
± 0,73 dB
6,06
± 1,54 bB
9,76
± 2,21 aA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 20 – Dados biométricos de comprimento da parte aérea (cm) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e
12 meses e submetidas à aclimatação por 2 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 1,37
± 0,20 gB
2,27
± 0,22 fB
5,55
± 0,82 eB
8,29
± 1,10 dB
12,73
± 2,06 cB
16,01
± 1,47 bB
20,77
± 2,31 aB
Aclimatada 3,19
± 0,34 fA
5,58
± 0,68 eA
7,50
± 0,83 dA
17,47
± 2,40 cA
21,91
± 3,08 bA
18,04
± 1,81 cA
24,08
± 2,92 aA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 21 – Dados de massa fresca da parte aérea (mg) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses e
submetidas à aclimatação por 2 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro
8,34 ± 0,70 eB 24,94 ± 0,28 eB 100,35 ± 6,53 deB 237,96 ± 6,32 dB 554,72 ± 5,22 cB 1017,60 ± 37,35 bB 1713,85 ± 111,75 aB
Aclimatada
38,97 ± 1,78 dA 163,87 ± 11,54 dA 172,40 ± 28,08 dA 1016,01 ± 55,55 cA 1533,60 ± 91,16 bA
1504,93 ± 38,20 bA 2812,30 ± 29,41 aA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 22 – Dados de massa seca da parte aérea (mg) de plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses e
submetidas à aclimatação por 2 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro 0,66
± 0,08 cB
1,86
± 0,06 cB
8,14
± 0,53 cA
18,20
± 0,33 bcB
44,69
± 0,84 bcB
56,72
± 1,14 bB
185,43
± 33,77 aA
Aclimatada 2,37
± 0,04 dA
11,29
± 0,38 dA
12,61
± 1,90 dA
66,86
± 2,34 cA
115,55
± 13,60 bA
109,87
± 4,56 bA
201,60
± 15,48 aA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 23 – Valores médios de clorofila a (µg) por massa fresca (g) das plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e
12 meses e submetidas à aclimatação por 2 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro
641,47 ± 24,50 aA 616,83 ± 50,73 abA
600,77 ± 32,98 abA
484,56 ± 36,35 bcA
531,27 ± 50,11 abA
443,31 ± 46,34 cA 638,94 ± 38,07 aA
Aclimatada
438,54 ± 17,72 bcB 492,04 ± 46,23 bA 502,45 ± 24,48 abA 344,36 ± 26,28 cdB 314,77 ± 27,57 dB 305,44 ± 29,44 dA 596,57 ± 22,15 aA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 24 – Valores médios de clorofila b (µg) por massa fresca (g) das plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e
12 meses e submetidas à aclimatação por 2 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro
229,67 ± 44,14 aA 231,04 ± 48,59 aA 211,57 ± 49,47 aA 183,07 ± 43,26 aA 199,70 ± 32,78 aA 232,74 ± 53,49 aA 242,24 ± 45,26 aA
Aclimatada
158,02 ± 37,10 aA 217,68 ± 21,07 aA 184,80 ± 66,28 aA 145,61 ± 41,12 aA 199,37 ± 24,50 aA 177,47 ± 32,56 aA 270,59 ± 76,38 aA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 25 – Valores médios de carotenóides (µg) por massa fresca (g) das plantas de Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10
e 12 meses e submetidas à aclimatação por 2 meses.
Tipo de
cultivo
Períodos de cultivo
1 mês 2 meses 4 meses 6 meses 8 meses 10 meses 12 meses
In vitro
158,18 ± 15,21 aA 141,98 ± 17,05 abA 144,29 ± 5,17 abA 123,25 ± 6,82 abA 137,84 ± 24,48 abA
103,77 ± 14,05 bA 171,35 ± 27,36 aA
Aclimatada
110,67 ± 8,68 bB 104,65 ± 8,29 bcA 117,31 ± 10,282 abA 88,39 ± 17,38 bcA 65,32 ± 12,98 cA 71,14 ± 5,01 bcA 159,72 ± 17,81 aA
Letra minúscula compara na horizontal e maiúscula compara na vertical. Médias com a mesma letra não diferem entre si em nível de 1% pelo teste de Tukey.
Anexo 26 - Delta dos valores de número de raízes: NR = (n
2
n
1
-1
) mês
-1
, comprimento de raízes: CR = (cm
2
cm
1
-1
) mês
-1
, número de folhas
sadias: NFs = (n
2
n
1
-1
) mês
-1
, número de folhas mortas: NFm = (n
2
n
1
-1
) mês
-1
, comprimento de folha: CF = (cm
2
cm
1
-1
) mês
-1
das plantas de
Alcantarea imperialis cultivadas in vitro por 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 meses e submetidas à aclimatação por 2 meses. Esses índices fisiológicos
por serem dados calculados, não obedecem às pressuposições básicas para a análise de variância.
DELTA
Meses
In vitro
NR
CR
NFs
NFm
CF
1
0,19 0,24 0,26 0,42
2
0,36 0,19 0,31 (*) 0,45
4
0,17 0,38 0,06 0,31 0,15
6
0,24 0,12 (*) 0,47 0,37
8
0,21 0,15 (*) (*) 0,27
10
0,12 0,02 (*) (*) 0,06
12
0,11 0,02 (*) 0,01 0,07
(*) tende a zero
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