( PDF ) Resposta inflamatória aguda, lesão axonal e desmielinização após isquemia focal experimental no estriado de ratos adultos

Download PDF

ads:

RENATA DUARTE DE SOUZA

RESPOSTA INFLAMATÓRIA AGUDA, LESÃO AXONAL E

DESMIELINIZAÇÃO APÓS ISQUEMIA FOCAL EXPERIMENTAL NO

ESTRIADO DE RATOS ADULTOS

Belém-Pa

2006

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

RENATA DUARTE DE SOUZA

RESPOSTA INFLAMATÓRIA AGUDA, LESÃO AXONAL E

DESMIELINIZAÇÃO APÓS ISQUEMIA FOCAL EXPERIMENTAL NO

ESTRIADO DE RATOS ADULTOS

Dissertação apresentada ao colegiado do

Curso de Pós-graduação em Neurociências

e Biologia Celular da Universidade Federal

do Pará, para obtenção do título de Mestre

em Ciências Biológicas.

Área de concentração: Neurociências

Orientador: Prof. Dr. Walace Gomes Leal

Belém-Pa

2006

ads:

Aprovada em: _____/_____/_____

Banca Examinadora:

_____________________________________________

Prof. Dr. Walace Gomes Leal

UFPA -Orientador

_______________________________________________

Prof. Antonio Pereira Jr.

UFPA

_______________________________________________

Prof. Dr. .

UFPA

________________________________________________

Prof. Dr.

UFPA

A parte experimental deste trabalho foi realizada

no Laboratório de Neuroanatomia Funcional,

Departamento de Morfologia, Centro de Ciências

Biológicas da Universidade Federal do Pará, sob

a orientação do Professor Dr. Walace Gomes

Leal, entre Maio de 2005 a Julho de 2006. No

período de Fevereiro a Agosto de 2006, a autora

recebeu bolsa da CAPES.

Aos meus pais, Maria Tereza e Josemar,

com muito amor e eterna gratidão.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por tudo de bom que acontece em minha vida.

Ao meu esposo Fábio Rodrigues, pelo amor, carinho, cumplicidade, dedicação e

compreensão, especialmente na fase final deste trabalho.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Walace Gomes Leal, pela orientação, incentivo e

conhecimentos transmitidos nesta área tão complexa, a Neurociência.

Ao Prof. Dr. Cristovam Wanderley Picanço Diniz, chefe do Laboratório de

Neuroanatomia Funcional da Universidade Federal do Pará, que permitiu a realização

dos experimentos desta dissertação em seu laboratório.

Aos meus amigos de Laboratório, Rafael Lima e Ana Maria Rabelo, pela ajuda

constante na realização da fase experimental deste trabalho e pela companhia divertida

durante todo o período do mestrado. Os bons momentos que passamos juntos ficarão

sempre na lembrança, com certeza.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Neurociências e Biologia

Celular, pelos ricos conhecimentos transmitidos.

Aos colegas do Laboratório de Neuroanatomia Funcional da Universidade

Federal do Pará, pela ajuda com as tarefas laboratoriais e empréstimo de materiais para

a realização desta dissertação.

Ao Departamento de Pós-Graduação da PROPESP/UFPA, pelo auxílio com a

bolsa da CAPES

RESUMO

Durante doenças neurodegenerativas agudas e crônicas, uma cascata de eventos

patológicos que inclui resposta inflamatória, excitotoxicidade e, estresse oxidativo

induz perda tecidual secundária, tanto na substância cinzenta quanto na branca.

Lesão axonal e desmielinização são alterações histopatológicas importantes da

fisiopatologia destas doenças. Apesar deste fato, poucos estudos têm investigado os

padrões temporais da resposta inflamatória, lesão axonal e desmielinização, que

ocorrem após lesão isquêmica do sistema nervoso central (SNC). Nesta dissertação,

descrevemos os padrões de resposta inflamatória aguda, de lesão axonal e da

bainha de mielina, após lesão isquêmica focal induzida por microinjeções de 10

pmoles de endotelina-1, no estriado de ratos adultos. Os animais foram

perfundidos nos tempos de sobrevida 1, 3 e 7 dias após as referidas injeções.

Secções de 20 µm foram coradas pela hematoxilina e marcadas por

imunohistoquímica para neutrófilos (anti-MBS-1), macrófagos/microglia ativados

(anti-ED1), lesão axonal (anti-APP) e mielina (anti-MBP). Foram realizadas

contagens dos números de neutrófilos e macrófagos nos tempos de sobrevida

especificados e as comparações entre os grupos foram feitas por análise de

variância com correção de Tukey, considerando-se como nível de variância P<

0.05. Houve recrutamento de neutrófilos e macrófagos para o parênquima estriatal

tanto para o sítio de injeção de endotelina-1 como para regiões circundjacentes. O

pico máximo de recrutamento de neutrófilos ocorreu no primeiro dia pós-lesão,

diminuindo nos tempos de sobrevida subseqüentes (P<0.05). Macrófagos ativados

foram evidenciados no estriado isquêmico a partir do primeiro dia pós-lesão, mas o

recrutamento máximo destas células inflamatórias ocorreu entre 3 e 7 dias

(P<0.05). Danos progressivos à bainha de mielina nos tratos de substância branca

foram observados principalmente nos tempos de sobrevida mais tardios. Não foi

encontrada lesão axonal em nenhum dos tempos de sobrevida avaliados. Os

padrões de resposta inflamatória aguda aqui descritos não estão de acordo com

estudos prévios, os quais relataram ausência de recrutamento de neutrófilos após a

injeção de ET-1 no estriado de ratos. Os resultados da presente dissertação

sugerem que a inflamação aguda e a desmielinização progressiva, mas não a lesão

ao cilindro axonal, são importantes componentes da lesão isquêmica estriatal

aguda.

Palavras-Chave: Isquemia focal, Neutrófilos, Macrófagos, Mielina, Lesão axonal,

Neurodegeneração.

ABSTRACT

Following acute and chronic neurodegenerative disorders, a cascade of pathological

events including inflammatory response, excitotoxicity, oxidative stress induces

secondary tissue loss in both gray and white matter. Axonal damage and demyelination

are important components of the white matter demise during these diseases. In spite of

this, few studies have addressed the patterns of inflammatory response, axonal damage

and demyelination following focal ischemic damage to the central nervous system

(CNS). In the present study, we describe the patterns of inflammatory response, axonal

damage and myelin impairment following microinjections of 10 pmoles of ET-1 into

the rat striatum. Animals were perfused at 1 day, 3 days and 7 days after injection. 20

µm sections were stained by hematoxylin and immunolabed for neutrophils (anti-MBS-

1), activated macrophages/microglia (anti-ED1), damaged axons (anti-APP) and

myelin (anti-MBP). There were recruitment of both neutrophils and macrophages to the

damaged striatal parenchyma with maximum recruitment at 1 day and 7 days,

respectively. Progressive myelin impairment in the white matter tracts has been

observed mainly at late survival times. Damaged axons were not present in all evaluated

survival times. The patterns of acute inflammatory response described are not in

agreement with a previous study, which reported absence of neutrophil recruitment

following endothelin-1 injection into the rat striatum. These results suggest that acute

inflammation and demyelination, but not damage to axonal cylinder are important

components of acute striatal ischemic damage.

Key words: Focal ischemia, Neutrophils, Macrophages, Myelin, Axonal damage

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1- Secção parassagital correspondente ao local de injeção

Figura 2- Prancha com fotomicrografias pela técnica de Hematoxilina

Figura 3 - Prancha com fotomicrografias pela imunohistoquímica MBS1

Figura 4- Médias das contagens do número de neutrófilos e macrófagos: 1, 3

e 7 dias após a injeção

Figura 5-Prancha com fotomicrografias pela imunohistoquímica ED1

Figura 6- Prancha com fotomicrografias pela imunohistoquímica -APP

Figura 7- Prancha com fotomicrografias pela imunohistoquímica MBP

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO

......................................................................................................

1.1 ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO

............................................................

1.1.1 Epidemiologia

.....................................................................................................

1.1.2 Centro Isquêmico e Penumbra Isquêmica

.......................................................

1.1.3 Degeneração Secundária

...................................................................................

1.1.4 Fatores Etiológicos e Fisiopatologia

.................................................................

1.1.4.1 Excitotoxicidade

...............................................................................................

1.1.4.2 Despolarização Periinfarto

................................................................................

1.1.4.3 Inflamação

........................................................................................................

1.1.4.4 Acidose tecidual

................................................................................................

1.1.4.5 Estresse Oxidativo

............................................................................................

1.1.4.6 Apoptose

...........................................................................................................

1.2 ISQUEMIA NA SUBSTÂNCIA BRANCA

..........................................................

1.3 ISQUEMIA FOCAL EXPERIMENTAL POR INJEÇÃO DE ENDOTELINA-

1.4 O PARADIGMA EXPERIMENTAL

.....................................................................

1.5 OBJETIVOS ..........................................................................................................

1.5.1 Objetivo Geral

....................................................................................................

1.4.2 Objetivos Específicos

.........................................................................................

2. MÉTODOS EXPERIMENTAIS

...........................................................................

2.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O MÉTODO EXPERIMENTAL

UTILIZADO

.................................................................................................................

2.2. PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS E INJEÇÃO DE ENDOTELINA-1

...........

2.3 PERFUSÃO E ANÁLISE HISTOLÓGICA

..........................................................

2.4 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E IMUHISTOQUÍMICA 29

2.4.1 Visualização dá Área da Lesão

........................................................................

2.4.2 Estudos Imunohistoquímicos

............................................................................

2.4.2.1 Marcadores Inflamatórios

.................................................................................

2.4.2.2 Mielina

..............................................................................................................

2.4.2.3 Lesão Axonal

....................................................................................................

2.4.3 Análise Qualitativa

............................................................................................

2.4.4 Análise Quantitativa

..........................................................................................

2.4.5 Análise Estatística

..............................................................................................

3. RESULTADOS

.......................................................................................................

3.1 PADRÕES HISTOPATOLÓGICOS GERAIS

......................................................

3.2. RESPOSTA INFLAMATÓRIA APÓS LESÃO ESTRIATAL ISQUÊMICA

.....

3. 3. LESÃO AXONAL

................................................................................................

3. 4. LESÃO AXONAL

................................................................................................

4. DISCUSSÃO

............................................................................................................

4.1 CONSIDERAÇÕES TÉCNICAS

...........................................................................

4.2 RESPOSTA INFLAMATÓRIA NO ESTRIADO APÓS INJEÇÃO FOCAL

DE ET- 1

.............................................................................................................................

4.3 DANOS PROGRESSIVOS À BAINHA DE MIELINA NOS TRATOS DE

SUBSTÂNCIA BRANCA DO ESTRIADO APÓS LESÃO ISQUÊMICA

...............

5. CONCLUSÃO

.........................................................................................................

6. REFERÊNCIAS

......................................................................................................

1. INTRODUÇÃO

1.1 ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO

1.1.1 Epidemiologia

O Acidente Vascular Encefálico (AVE) integra um grupo de doenças

heterogêneas, no qual dois fatores principais são responsáveis pela patogênese: a

oclusão dos vasos sangüíneos e a hemorragia cerebral (DIRNAGL et al., 1999;

MERGENTHALER et al., 2004; CARMICHAEL, 2006; RIJNTJES, 2006). Isto

permite a classificação dos AVEs em isquêmicos e hemorrágicos (DIRNAGL et al.,

1999; LO, 2003; MERGENTHALER et al., 2004). No AVE isquêmico, a obstrução

dos vasos ocasiona uma redução permanente ou transitória do fluxo sangüíneo em

uma determinada região cerebral, provocando lesão tecidual (DIRNAGL et al., 1999;

LO, 2003; MERGENTHALER et al., 2004). Em aproximadamente 75% dos casos, a

artéria é ocluída por um êmbolo ou por uma trombose local (DIRNAGL et al., 1999;

MERGENTHALER et al., 2004).

Epidemiologicamente, o AVE constitui-se em uma das principais causas de

morte na população (TAYLOR et al., 1996; LO, 2003). No ano de 1999, cerca de 5.5

milhões de pessoas morreram em conseqüência desta alteração patológica, o que

corresponde a aproximadamente 10% de todos os óbitos provocados pelos mais

diversos fatores (TAYLOR et al., 1996; DIRNAGL et al., 1999; LO, 2003;

MERGENTHALER et al., 2004).

No Brasil, os dados epidemiológicos sobre AVE são bastante limitados.

Porém, alguns estudos relatam que a distribuição dos óbitos por doenças do aparelho

circulatório, entre as quais o AVE - vem aumentando entre adultos jovens, já a partir

dos 20 anos, assumindo o patamar de primeira causa de falecimentos na faixa dos 40

anos e predominando nas faixas etárias subseqüentes (FALCAO, 2004). Estes autores

descrevem ainda que de acordo com dados do Sistema de Informação Hospitalar do

Sistema Único de Saúde (SIH/SUS), no período de um ano, do total de internações de

moradores do Recife em hospitais próprios ou conveniados ao SUS no Estado de

Pernambuco, que as doenças do aparelho circulatório ocupam o segundo lugar nas

internações hospitalares, excluídas as complicações da gravidez, parto, puerpério e os

transtornos mentais. No total das internações por DAC, 37% destas estão situadas

entre 20 a 59 anos.

Além da alta incidência, o AVE é uma das alterações patológicas que provoca

em seus sobreviventes grandes limitações funcionais e déficits neurológicos. Somente

nos Estados Unidos da América (EUA), aproximadamente quatro milhões de pessoas

convivem com suas seqüelas debilitantes (TAYLOR et al., 1996).

1.1.2 Centro Isquêmico e Penumbra Isquêmica

O acidente vascular isquêmico neural caracteriza-se por complexos eventos

espaciais e temporais que duram algumas horas ou muitos dias (LO, 2003;

MERGENTHALER et al., 2004; CARMICHAEL, 2006; FREGNI & PASCUAL-

LEONE, 2006; HLUSTIK & MAYER, 2006; RIJNTJES, 2006) e resulta de uma

redução permanente ou transitória do fluxo sanguíneo do encéfalo. A redução do fluxo

sanguíneo é, em muitos casos, causada pela oclusão de uma artéria cerebral, seja

através de um êmbolo ou de uma trombose local, gerando isquemia e conseqüente

lesão tecidual (DIRNAGL et al., 1999; MERGENTHALER et al., 2004). Na

isquemia cerebral, são comumente distinguidas duas regiões: o centro do infarto e

uma zona periférica, chamada de penumbra isquêmica. Associadas a estas duas

regiões, há diferentes tipos de morte celular, incluindo necrose e apoptose (DIRNAGL

et al., 1999; LO, 2003; MERGENTHALER et al., 2004). Uma redução significativa

do fluxo sanguíneo na área isquêmica central causa alterações nos processos

metabólicos, no suprimento energético celular e na homeostase iônica, o que gera

perda da integridade celular por necrose ou apoptose em poucos minutos (DIRNAGL

et al., 1999; MERGENTHALER et al., 2004).

O centro isquêmico sofre despolarização anóxica (pouco suprimento de

oxigênio) dentro de 1-3 minutos, com concomitante aumento na concentração

extracelular de K

que chega, aproximadamente, a 70 mM. Ocorre influxo excessivo

de cálcio nas células e conseqüente diminuição desse íon no meio extracelular dentro

de 1-2 minutos. Durante o período de reperfusão (quando o fluxo sanguíneo é

restabelecido), por exemplo, duas horas após isquemia focal temporária, a

concentração de extracelular de K

pode retornar aos níveis fisiológicos. Apesar deste

fato, o fenômeno patológico descrito possui manifestações morfológicas que

consistem de infarto (necrose) tecidual em todo o centro (LIPTON, 1999). A rapidez

da morte neuronal e glial no centro isquêmico faz com estas células não possam ser

salvas por meio de intervenções terapêuticas. A perda tecidual no centro isquêmico,

portanto, é permanente.

Os eventos na penumbra isquêmica são menos drásticos, mas podem levar ao

infarto caso um procedimento terapêutico não seja implementado. A penumbra

isquêmica, que é uma zona periférica dentro do território de fluxo comprometido,

sofre danos médios devido à perfusão residual de vasos sanguíneos colaterais

(DIRNAGL et al., 1999; LO, 2003; MERGENTHALER et al., 2004). O rompimento

da homeostase celular na região da penumbra leva a um processo mais lento de morte

neuronal e glial e, conseqüentemente, a um aumento progressivo da área de lesão.

Nesta região, a cascata de sinalização inflamatória e apoptótica, bem como outros

eventos patológicos, exercem um papel importante na gênese dos danos teciduais

(STOLL et al., 1998; DIRNAGL et al., 1999; DEL ZOPPO et al., 2000; MATTSON

et al., 2000; IADECOLA & ALEXANDER, 2001; ALLAN & ROTHWELL, 2003;

LO, 2003; MERGENTHALER et al., 2004; SUGAWARA et al., 2004;

JEMMERSON et al., 2005). A região de penumbra, que logo após o AVC é de

aproximadamente 50%, reduz-se com o tempo, aumentando o centro da lesão

isquêmica (MERGENTHALER et al., 2004).

Células cerebrais que estão comprometidas pela ativação excessiva de

receptores glutamatérgicos, influxo excessivo de Ca

, radicais livres, lesão

mitocondrial e de DNA podem morrer por necrose ou apoptose. O tipo de morte

celular depende, em parte, da natureza e intensidade do estímulo, do tipo celular e do

estágio do seu ciclo de vida ou desenvolvimento (MARTIN et al., 1998). Necrose é o

mecanismo de morte celular predominante que ocorre após oclusão vascular aguda

permanente, enquanto que um dano mais leve provoca morte celular por apoptose, um

tipo de morte celular programada (MARTIN et al., 1998; DIRNAGL et al., 1999;

MERGENTHALER et al., 2004). Evidências experimentais sugerem que a morte

celular programada é mais freqüente na região de penumbra isquêmica (DIRNAGL et

al., 1999; GINSBERG, 1999; MERGENTHALER et al., 2004).

No centro isquêmico, os níveis de ATP caem para aproximadamente a 25%

dos valores basais e permanecem assim entre 5 minutos e 4 horas da isquemia. Na

isquemia temporária, estes níveis de ATP retornam à aproximadamente dois terços do

normal em até 4 horas. Os níveis de oxigênio retornam ao normal, mostrando que o

fluxo sanguíneo comprometido não é a base para o dano tecidual que ocorre durante a

reoxigenação (DIRNAGL et al., 1999; LOVE, 1999; CHOI, 2000; LO, 2003;

ALEXANDROVA & BOCHEV, 2005).

Na região de penumbra isquêmica, a utilização de glicose é elevada nos

estágios iniciais após o AVE, mas cai para aproximadamente a 50% do normal (igual

ao do centro isquêmico) em 3 horas e meia, o que sugere comprometimento

significativo da função celular neste período. Em algumas regiões da penumbra, a taxa

de utilização da glicose está bem reduzida durante os estágios iniciais de reperfusão, o

que é considerado uma valiosa evidência que o tecido sofrerá infarto (ZHAO et al.,

1994; LIPTON, 1999). O fluxo sanguíneo na penumbra isquêmica diminui durante o

acidente vascular, mas permanece bem mais elevado do que no centro isquêmico.

Apesar desta diferença de fluxo sanguíneo, pode ocorrer infarto da região de

penumbra isquêmica através de mecanismos secundários, que serão discutidos

posteriormente (LIPTON, 1999; ALEXANDROVA & BOCHEV, 2005;

HELDMANN et al., 2005; MARQUARDT et al., 2005; CARMICHAEL, 2006;

HILLIS, 2006; RIJNTJES, 2006).

Há ainda outro ponto importante a ser destacado que é a integridade da barreira

hematoencefálica (BHE), a qual depende da interação da matriz celular e é composta

de células endoteliais e astrócitos. Após insultos isquêmicos, a matriz extracelular e os

mecanismos de sinais intracelulares são danificados. Proteases, especialmente as

metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs), possuem um papel importante

nestas alterações patológicas. MMP2 e MMP9 são induzidas 1-3 horas após isquemia

cerebral (LO, 2003). A expressão de MMPs correlaciona-se com o dano à BHE, o

risco de transformação hemorrágica e a extensão do dano neuronal (LO, 2003). A

destruição da lâmina basal por MMPs permite a migração de leucócitos e pode levar a

um edema vasogênico (LO, 2003). A inibição genética, bem como a inibição

farmacológica de MMPs, não apenas reduze o dano à BHE, mas também o volume do

infarto (LO, 2003; MERGENTHALER et al., 2004).

1.1.3 Degeneração Secundária

Sob a denominação degeneração neuronal secundária reúne-se um grupo de

eventos destrutivos que podem afetar células, as quais não foram ou foram apenas

marginalmente afetadas pela lesão inicial (TATOR & FEHLINGS, 1991; LYNCH &

DAWSON, 1994; YAMAURA et al., 2002). No SNC, os neurônios e seus axônios

que não foram ou que foram apenas parcialmente afetados pela lesão primária podem

degenerar tardiamente se não forem salvos através de intervenção terapêutica. Em

doenças neurodegenerativas agudas do SNC, uma lesão primária na substância

cinzenta pode alastrar-se e comprometer a substância branca, ou vice-versa, induzindo

lesão axonal e, deste modo, aumentando de forma significativa o déficit funcional

(DE_KEYSER et al., 1999; DEWAR et al., 1999; COLEMAN & PERRY, 2002;

STYS, 2005).

Os mecanismos de degeneração neuronal secundária não estão totalmente

estabelecidos, mas acredita-se que inúmeros fatores podem estar envolvidos. Destes

fatores, inflamação, neurotoxicidade mediada por glutamato, apoptose e formação de

radicais livres parecem possuir importância crucial (TATOR & FEHLINGS, 1991;

TATOR & KOYANAGI, 1997; GOMES-LEAL, 2002a; FREIRE, 2004; GOMES-

LEAL, 2005). Além desses, existem evidências na literatura que destacam também a

isquemia pós-traumática, desequilíbrios iônicos, formação de metabólitos e outros

neurotransmissores (ácido gama amino butírico – GABA, opióides, serotonina), os

quais parecem, em determinadas situações experimentais, contribuir para a morte

neuronal (TATOR & FEHLINGS, 1991; LYNCH & DAWSON, 1994; TATOR &

KOYANAGI, 1997).

Diminuição do fluxo sanguíneo com perfusão insuficiente de oxigênio

(hipóxia) para o tecido e subseqüente comprometimento metabólico são achados

comuns em casos de trauma cerebral e medular, além de AVE (LYNCH &

DAWSON, 1994; SCHWAB & BARTHOLDI, 1996; DIRNAGL et al., 1999;

MERGENTHALER et al., 2004). Estes eventos patológicos podem levar à

degeneração neuronal, estresse oxidativo, excitotoxicidade e desequilíbrio iônico

(HALL & BRAUGHLER, 1993; LOVE, 1999; PETTY & WETTSTEIN, 1999).

Tratamentos que são eficazes para diminuir a área de lesão isquêmica em animais de

experimentação também reduzem a área de lesão induzida por trauma (HIROSE &

CHAN, 1993; WEAVER et al., 1997; BORDI & UGOLINI, 1999; DEWAR et al.,

1999; PIN et al., 1999; SCHULZ et al., 1999).

1.1.4 Fatores Etiológicos e Fisiopatologia

Com relação aos eventos fisiopatológicos do AVE e de outras doenças

neurodegenerativas agudas, estes são extremamente complexos e envolvem diversos

mecanismos, os quais resultam em prejuízos ao metabolismo do tecido cerebral,

ocasionados pela oclusão vascular que interrompe o fluxo sangüíneo local (LO, 2003;

MERGENTHALER et al., 2004). Entre os principais mecanismos relacionados à

fisiopatologia do AVE podem ser citados a excitotoxicidade, a produção de radicais

livres, acidose tecidual, as despolarizações periinfarto, inflamação e apoptose

(DIRNAGL et al., 1999; LO, 2003; MERGENTHALER et al., 2004).

1.1.4.1 Excitotoxicidade

O tecido neural possui um consumo relativamente alto de oxigênio e glicose e

depende quase que exclusivamente da fosforilação oxidativa para a produção de

energia. Desta forma, a diminuição do fluxo sangüíneo restringe a chegada de

substratos, em especial de oxigênio e glicose ao cérebro (DIRNAGL et al., 1999).

Com esta redução, as reservas energéticas são perdidas e conseqüentemente ocorre

desequilíbrio iônico, liberação de neurotransmissores e inibição da recaptação destes,

especialmente do glutamato, que é o principal aminoácido excitatório do sistema

nervoso central de vertebrados (MELDRUM, 2000a; LO, 2003; MERGENTHALER

et al., 2004).

O Glutamato exerce sua ação através de três tipos principais de receptores ionótropicos pós-sinápticos nas membranas

das células: N-Metil-D-Aspartato (NMDA), Kainato e -amino-3-hidroxil-5-metil-4- ácido isoxazolpropiônico (AMPA). Além

disso, o referido aminoácido excitatório também se liga a receptores metabotrópicos, um tipo de receptor acoplado a um sistema

envolvendo a participação de proteínas G, o qual funciona através da liberação de segundos mensageiros, que por sua vez ativam

canais iônicos presentes na membrana (CONN & PIN, 1997).

Para ratificar a importância do glutamato na fisiologia do SNC, destaca-se que 80% da população total de neurônios

do córtex cerebral são glutamatérgicos (MELDRUM, 2000a). A liberação e a inibição da recaptação dos neurotransmissores

possui um papel primordial na excitotoxicidade, visto que acarreta o acúmulo excessivo de glutamato no meio extracelular

induzindo a ativação dos receptores glutamatérgicos citados a pouco– AMPA e Kainato- nas membranas celulares de neurônios e

glia (MELDRUM, 1994; MELDRUM, 2000b). Com a ativação dos receptores, o potencial de membrana é perdido, ocorre a

despolarização e, conseqüentemente, o influxo de Cloreto (Cl

), Sódio (Na

) e Cálcio (Ca

) para o meio intracelular.

Especificamente, a ativação dos canais de cálcio dependente de voltagem permite a entrada abrupta deste cátion, iniciando uma

série de eventos citoplasmáticos e nucleares fundamentais para o dano tecidual, tais como, a ativação de diversas proteases -

calpaínas, fosfolipases e endonucleases, que degradam os componentes estruturais do citoesqueleto e da matriz extracelular, tão

essenciais para a integridade celular (MELDRUM, 1994; MELDRUM, 2000b).

Apesar de seus efeitos deletérios diretos, estas enzimas quando ativadas,

podem ainda gerar espécies reativas de radicais livres, resultando em peroxidação

lipídica e danos à membrana celular. Como exemplo das referidas enzimas, podem ser

citadas a fosfolipase A

e a cicloxigenase (CHEN & STRICKLAND, 1997).

Além disso, o cálcio também é fundamental para a produção da enzima sintase

do óxido nítrico (NOS), responsável pela síntese de óxido nítrico, o qual reage com o

ânion superóxido para formar substâncias extremamente lesivas, tais como o

peroxinitrito e as hidroxilas, que promovem danos teciduais (DIRNAGL et al., 1999) .

1.1.4.2 Despolarização Periinfarto

O centro da região isquêmica cerebral é caracterizado pelo déficit no fluxo

sangüíneo, baixos níveis de ATP, depleção das reservas energéticas, desequilíbrio

iônico e falência do metabolismo local, os quais resultam em aumento da

concentração extracelular de glutamato e potássio para a região. Estes fatores

associados fazem com que a morte tecidual ocorra em poucos minutos, visto que, as

células neuronais são submetidas a despolarização anóxica e não são mais capazes de

se repolarizar (DIRNAGL et al., 1999; MERGENTHALER et al., 2004).

Entretanto, nos estágios iniciais da oclusão vascular na periferia dessa região

central, ou seja, na área denominada penumbra isquêmica, a perfusão sangüínea é

ainda mantida por meio da circulação dos vasos colaterais. Assim, a repolarização das

células neuronais pode ocorrer, porém com grande consumo energético (DIRNAGL et

al, 1999; MERGENTHALER et al, 2004) .

Durante os estágios iniciais da oclusão vascular, a região da penumbra

corresponde à cerca da metade ou um terço do volume da lesão e ainda é capaz de

metabolizar glicose. Porém com o decorrer do tempo, e por todos os fatores descritos

acima, as células neuronais desta região também morrem (principalmente por

apoptose), expandindo o processo lesivo (DIRNAGL et al, 1999; MERGENTHALER

et al, 2004; MARQUARDT et al, 2005). Este evento patológico exemplifica o

fenômeno de degeneração secundária, discutido previamente.

Nos modelos experimentais de AVE em ratos, camundongos e gatos foi

constatado que na penumbra ocorrem repetidas despolarizações, também chamadas de

despolarizações periinfarto, as quais podem ser bloqueadas através do uso de

antagonistas de receptores glutamatérgicos, tanto do tipo NMDA quanto do tipo

AMPA (ROTHMAN & OLNEY, 1986; CHOI, 2000; SCHABITZ et al., 2000;

MERGENTHALER et al., 2004). Isso demonstra que, pelo menos em animais, a

preservação do tecido neuronal da penumbra isquêmica torna-se uma necessidade,

quando o objetivo é a neuroproteção. Contudo, em humanos, não foi possível detectar

esse tipo de despolarização, nem por meio eletrofisiológico nem funcional, o que não

deixa claro o seu papel da fisiopatologia do AVE (DIRNAGL et al., 1999;

MERGENTHALER et al., 2004).

1.1.4.3 Inflamação

A inflamação é um componente essencial do mecanismo de defesa contra

infecções, tanto no SNP quanto no SNC. O encéfalo possui várias características que

fazem com que a resposta inflamatória que nele ocorre, seja diferente da que acontece

nos demais órgãos (MATYSZAK, 1998; WYSS-CORAY, 2002; ALLAN &

ROTHWELL, 2003). Existe uma barreira natural que regula o fluxo de substâncias

que entram e saem do SNC, a barreira hematoencefálica (BHE), a qual protege o

encéfalo de substâncias lesivas, limitando a entrada de moléculas grandes e células

circulantes (KABANOV & BATRAKOVA, 2004).

Esta BHE fornece ao SNC uma restrição às células do sistema imune, o que

torna a resposta inflamatória no tecido nervoso menos intensa que nos outros tecidos

(KABANOV & BATRAKOVA, 2004). Este fato levou o sistema nervoso a ser

considerado como um órgão de “privilégio imunológico” (MATYSZAK, 1998;

WYSS-CORAY, 2002; ALLAN & ROTHWELL, 2003).

Desse modo, no SNC, o estágio inicial da inflamação, que começa poucas

horas após a isquemia, é caracterizado pela expressão de moléculas de adesão celular

no endotélio vascular, assim como pela circulação de leucócitos – linfócitos,

granulócitos, monócitos/macrófagos - no sangue (VILLARREAL et al., 2001;

WAKEFIELD & KUMAR, 2001; GOMES-LEAL, 2002b). Estas moléculas de

adesão interagem com receptores de superfície nos neutrófilos, os quais, por sua vez,

aderem ao endotélio, atravessam o leito vascular e entram no parênquima cerebral. No

caso de um processo isquêmico, esses neutrófilos acumulam-se nos microvasos

sangüíneos da região da penumbra, interrompendo a circulação para a referida região,

o que agrava o processo isquêmico.

Após lesão aguda do sistema SNC, o pico de recrutamento de neutrófilos é de

24 horas, um tempo mais tardio, quando comparado a tecidos não neurais, onde o

maior recrutamento dessas células ocorre em cerca de 8-12 horas após uma lesão

primária (SCHNELL et al., 1999; GOMES-LEAL, 2005). Em seguida a onda de

recrutamento de neutrófilos que, como mencionado, cessa após 24 horas da lesão

primária, ocorre o recrutamento de monócitos sanguíneos para o sítio da lesão

isquêmica (SCHNELL et al., 1999; GOMES-LEAL, 2005). Estes monócitos

transformar-se-ão em macrófagos ativados no parênquima neural e tornam-se o tipo

celular predominante no período entre cinco e sete dias depois da isquemia (STOLL et

al., 1998; DIRNAGL et al., 1999; ALLAN & ROTHWELL, 2003;

MERGENTHALER et al., 2004). Dessa forma, observa-se que as interações celulares

citadas possuem papel valioso na inflamação do tecido cerebral induzida pelo AVE

(STOLL et al., 1998; DIRNAGL et al., 1999; ALLAN & ROTHWELL, 2003;

MERGENTHALER et al., 2004).

Existem também moléculas que são expressas pelas células endoteliais, poucas

horas após a isquemia, sendo as principais ICAM-1 ou VCAM-1, as quais medeiam a

interação com os leucócitos. O bloqueio desta interação com anticorpos contra ICAM-

1, CD18 e CD11b não somente reduz o acúmulo dos leucócitos, mas a área de infarto

tecidual (PELLEGATTA et al., 1996; MATUTE et al., 1997).

Os leucócitos, juntamente com os neurônios e as células da glia- astrócitos e

microglia- produzem citocinas, em particular citocinas proinflamatórias, tais como, o

fator de necrose tumoral (TNF), as interleucinas-1 e 6 (IL-1 e IL-6), as quais

exacerbam os danos provocados pela lesão isquêmica (DIRNAGL et al., 1999;

BECKER et al., 2001). Além das citocinas inflamatórias, algumas citocinas anti-

inflamatórias também são sintetizadas, entre as quais a TGF-1 e a IL-10. Estas

citocinas regulam a inflamação, diminuindo-a e, por conseguinte, exercem efeito

protetor no contexto da isquemia cerebral (MERGENTHALER et al., 2004).

Além da produção de citocinas, há também duas enzimas essenciais no estágio

da inflamação que são a sintase do óxido nítrico imunológica (iNOS) e a

ciclooxigenase tipo II (COX2). Em modelos experimentais de isquemia cerebral,

existem estudos que demonstram que a inibição da iNOS reduz o tamanho do infarto

em aproximadamente 30%, até mesmo se o tratamento começar apenas 24h após a

indução da isquemia (IADECOLA & ROSS, 1997; CHANG et al., 2004; PEREZ-

ASENSIO et al., 2005). É importante destacar ainda o fato desta enzima produzir uma

grande quantidade de NO, o qual é altamente tóxico, devido a sua participação na

formação do peroxinitrito. A COX2 é mais facilmente detectada na região da

penumbra isquêmica. Participa ativamente na produção de radicais livres, o que a

torna potencialmente lesiva para o local citado (NOGAWA et al., 1997; HARA et al.,

1998). Dessa forma, tanto a iNOS quanto a COX2 apresentam-se como alvos de

grande interesse terapêutico, visto que em modelos experimentais de roedores, ambas

apresentaram efeito protetor por 6-24 h após a isquemia (CHOPP & ZHANG, 1996) .

É importante destacar a participação da microglia durante a lesão isquêmica.

Estas células gliais possuem um papel fundamental na inflamação do SNC, uma vez

estas representam as células imunes primárias desta região (KREUTZBERG, 1996;

MINGHETTI & LEVI, 1998; STOLL et al., 1998; STREIT et al., 2004). A sua

principal atuação neste processo envolve a região da penumbra, onde são capazes de

produzir várias citocinas proinflamatórias, bem como, metabólitos tóxicos incluindo

ânion superoxido e peroxinitrito (STOLL et al., 1998; STREIT et al., 2004). Além

disso, a microglia ainda apresenta grande poder de fagocitose nos acidentes

isquêmicos (STOLL et al., 1998; STREIT et al., 2004). Além das células microgliais,

é válido destacar o papel exercido pelos astrócitos no processo inflamatório que ocorre

após AVE (ASCHNER, 1998; STOLL et al., 1998; MERGENTHALER et al.,

2004). Estas células sintetizam inúmeras citocinas pro-inflamatórias, além de fatores

neuroprotetores (ASCHNER, 1998).

Entretanto, é válido mencionar que existem evidências experimentais de o

processo inflamatório pode possuir efeito benéfico após lesão do SNC (LAZAROV-

SPIEGLER et al., 1998; RAPALINO et al., 1998; KNOLLER N, 2005;

SCHWARTZ & YOLES, 2005). Recentemente, relatou-se um ensaio clínico de fase I,

no qual o transplante autólogo de macrófagos foi bem tolerado por alguns pacientes

humanos com lesão aguda medula espinhal (KNOLLER N, 2005). Estas pessoas

apresentaram melhor prognóstico clínico que o grupo não submetido ao tratamento.

1.1.4.4 Acidose tecidual

Na fisiopatologia do AVC, a redução do suprimento de oxigênio ocasiona um

acúmulo de lactato via glicólise anaeróbica e, por conseguinte, acidose tecidual.

Assim, de acordo com a hipótese lactato-acidose, a acidose induzida pela isquemia

produz consideráveis danos aos tecidos após um evento isquêmico focal cerebral, ou

seja, ainda que as taxas de glicose estejam elevadas não há redução do dano no tecido

cerebral (MERGENTHALER et al., 2004). Entretanto, permanecem obscuros os

mecanismos de como isso acontece, mas sabe-se que a acidose tecidual interfere

inclusive com a síntese intracelular de proteínas e bloqueia os receptores NMDA

(MERGENTHALER et al., 2004).

1.1.4.5 Estresse Oxidativo

Diversos estudos experimentais têm destacado o papel do estresse oxidativo na

fisiopatologia das doenças neurológicas, em especial os que utilizam modelos de

isquemia e reperfusão, como os de isquemia focal/global transitória em roedores

(LOVE, 1999; LEWEN et al., 2000; ALEXANDROVA & BOCHEV, 2005;

CHONG et al., 2005). Nesses trabalhos, o fluxo sangüíneo cerebral é reduzido pela

oclusão dos vasos, diminuindo por conseguinte, os níveis de oxigênio àquelas regiões.

Em seguida, é realizada a reperfusão, que proporciona reoxigenação aos tecidos e

fornece substratos para numerosas reações enzimáticas. Durante a reperfusão, ocorre a

formação de radicais livres, ânion superóxido, peroxinitrito, ânion hidroxila que

podem induzir lesão do tecido neural (LOVE, 1999; LEWEN et al., 2000;

NOSHITA et al., 2002; SUGAWARA et al., 2004). A utilização experimental de

enzimas anti-oxidantes, que tamponam radicais livres, possui efeito neuroprotetor

após isquemia (NOSHITA et al., 2002).

1.1.4.6 Apoptose

Também denominada morte celular programada, a apoptose tem início

algumas horas após a isquemia ou, ocasionalmente, passados alguns dias desta. Em

geral, a apoptose acontece tardiamente em relação ao evento isquêmico, na região da

penumbra, diferindo-se temporal e espacialmente das mortes neuronal e glial

instantâneas, que caracterizam o centro da lesão (DIRNAGL et al., 1999; SCHULZ et

al., 1999; SNIDER et al., 1999; ELDADAH & FADEN, 2000; ZIPFEL et al., 2000;

MERGENTHALER et al., 2004).

O tipo de morte celular predominante durante a isquemia depende do grau de

intensidade da lesão ou da natureza da via sinalizadora (DIRNAGL et al., 1999; LO,

2003; MERGENTHALER et al., 2004). A cascata bioquímica que leva à morte por

apoptose envolve uma complexa interação molecular, que culmina na ativação de um

grupo de proteases conhecidas como caspases, uma família de aspartases de cisteína

(MERGENTHALER et al., 2004), catalisadoras de destruição celular (ELDADAH &

FADEN, 2000; HENGARTNER, 2000; LO, 2003; LOSSI et al., 2005). Estas

proteases são expressas em células cerebrais adultas e jovens, particularmente nos

neurônios. São clivadas e ativadas de maneira seqüencial, através de vias intrínsecas e

extrínsecas, sendo a primeira basicamente mitocondrial e a segunda, induzida pela

ligação dos receptores FAZ e TNF (ELDADAH & FADEN, 2000;

HENGARTNER, 2000; LO, 2003; LOSSI et al., 2005).

Na via intrínseca, são característicos os níveis elevados de cálcio intracelular,

espécies reativas de oxigênio, glutamato e lesão no DNA (ELDADAH & FADEN,

2000; HENGARTNER, 2000; LO, 2003; LOSSI et al., 2005). Além disso, é

fundamental citar o papel desempenhado pelas mitocôndrias no processo,

principalmente durante a liberação da enzima citocromo c, uma proteína solúvel em

água localizada na periferia da membrana desta organela e constituinte essencial da

cadeia respiratória mitocondrial (HENGARTNER, 2000). Estudos in vitro mostram

que ocorre a liberação da referida proteína da mitocôndria para o citoplasma em

condições patológicas. Por exemplo, em ratos,a citocromo c é translocada para o

compartimento citosólico após isquemia focal transitória (WATANABE et al., 1998).

Contudo, para que ocorra a liberação de citocromo c, é necessária a presença

das proteínas Bcl-2, as quais são subdivididas em funções pró-apoptóticas – Bid, Bax,

Bad, Bag- e anti-apoptótica – Bcl-2, Bcl-x

. Na via intrínseca, Bad e Bax translocam-

se à membrana interna mitocondrial com a finalidade de formar poros de

permeabilidade transitória (PTP), os quais desencadeiam a liberação da proteína citada

(HENGARTNER, 2000). Adicionalmente, a citocromo c pode ainda ser liberada para

o citoplasma, caso a membrana mitocondrial seja diretamente danificada por radicais

livres (HENGARTNER, 2000).

A citocromo c interage com o homólogo CED-4, Apaf-1, trifosfato

deoxiadenosina e ATP, para formar apoptosomas (HENGARTNER, 2000). Estes

ativam a caspase –9, a qual é provavelmente o iniciador da cascata dependente de

citocromo c. Além desta, ainda estão envolvidas, respectivamente, as seguintes

caspases 2, 6, 8 e 10 (HENGARTNER, 2000). A caspase 3 ativa a DNAse,

provocando danos ao DNA, enquanto a caspase 11 é uma pró-caspase crítica para a

ativação das caspases 1 e 3 (HENGARTNER, 2000; LO, 2003).

Enfim, as caspases são responsáveis pela clivagem de mais de 30 proteínas, o

que pode provocar danos ao DNA e conseqüentemente, levar a célula à morte por

apoptose. Entre as proteínas clivadas estão a polimerase poli(ADP-ribose) – PARP,

capaz de mediar reparos no DNA por meio da geração de polímeros de ADP-ribose, e

algumas proteínas do citoesqueleto (HENGARTNER, 2000; LO, 2003). A ativação

excessiva de PARP causa depleção de ATP, o que é considerado, por alguns

pesquisadores, um fator citotóxico (HENGARTNER, 2000; LO, 2003). Além disso, a

PARP também é capaz de induzir suicídio celular através de uma via independente de

caspases, através do fator indutor de apoptose (AIF). Confirmando essa idéia,

pesquisas experimentais em camundongos demonstraram que o bloqueio de PARP

diminui consideravelmente o infarto após oclusão transitória da artéria cerebral média

(ELIASSON et al., 1997; ELIASSON et al., 1999).

Em uma outra via molecular de apoptose, o ativador de caspases derivado das

mitocôndrias (Smac) é liberado por estímulos apoptóticos, liga-se à proteína inibidora

de apoptose (IAP), inativando-a e promovendo a ativação da caspase-3

(HENGARTNER, 2000; LO, 2003; SUGAWARA et al., 2004). A IAP possui efeitos

anti-apoptóticos, inibindo apoptosomas e a caspase-3 (MERGENTHALER et al.,

2004; SUGAWARA et al., 2004).

A via extrínseca de apoptose é iniciada por componentes da família de

receptores de morte celular, como por exemplo, o Fas e o TNF-α. Estes ligantes agem

em seus respectivos receptores o que leva o acoplamento à molécula adaptadora

FADD. Este evento molecular ativa a procaspase 8 (LO, 2003; MERGENTHALER et

al., 2004). Por sua vez, a caspase 8 ativa a caspase 3, a qual cliva PARP e ativa CAD,

promovendo danos ao DNA e morte celular (LO, 2003).

Por fim, é válido ressaltar que existe interação entre essas vias intrínseca e

extrínseca. Por exemplo, a caspase-8 pode estimular uma das proteínas da família Bcl-

2, a Bid e iniciar a via mitocondrial de apoptose (SUGAWARA et al., 2004).

1.2 ISQUEMIA NA SUBSTÂNCIA BRANCA

Nos estudos clássico em Neuropatologia, tem-se privilegiado os padrões de

degeneração na substância cinzenta e negligenciado-se os eventos degenerativos na

substância branca (DE_KEYSER et al., 1999; DEWAR et al., 1999; COLEMAN &

PERRY, 2002). No entanto, recentemente percebeu-se que a lesão axonal induz mais

déficits neurológicos do que a lesão do corpo celular, principalmente em doenças

neurodegenerativas agudas (AGRAWAL & FEHLINGS, 1997b; STYS, 1998;

KANELLOPOULOS et al., 2000; LI et al., 2000; IRVING et al., 2001; LI & STYS,

2001; STYS, 2004; STYS, 2005). A ineficácia dos estudos clínicos em descobrir

agentes terapêuticos para as doenças do SNC, pode ser em grande parte devida ao fato

destes agentes não serem capazes de proteger a substância branca (DE_KEYSER et

al., 1999; DEWAR et al., 1999).

Recentemente, as realizações de outros estudos estão contribuindo para o

estabelecimento dos mecanismos responsáveis pela lesão axonal, principalmente

durante trauma e isquemia (STYS, 2005). Em processos isquêmicos, o

comprometimento da mielina, dos corpos de oligodendrócitos e de axônios

correspondem a um evento histopatológico de grande importância, que deve contribuir

enormemente para os déficits funcionais (IRVING et al., 1997; YAM et al., 1997;

STYS, 1998; YAM et al., 1998; PETTY & WETTSTEIN, 1999).

Uma parcela dos acidentes isquêmicos acontece diretamente na substância

branca, ou ainda, esta região pode ser afetada tardiamente após uma lesão primária na

substância cinzenta (PANTONI et al., 1996; PETTY & WETTSTEIN, 1999;

KANELLOPOULOS et al., 2000). Os mecanismos moleculares que levam à lesão da

substância branca parecem envolver excitotoxicidade mediada por receptores do tipo

AMPA/KAINATO, reversão da atividade de ATPases transportadoras de glutamato

presentes na mielina, concomitante ao influxo de Na

e Ca

(AGRAWAL &

FEHLINGS, 1997b; AGRAWAL et al., 1998; MCDONALD et al., 1998; STYS,

1998; AGRAWAL et al., 2000; LI et al., 2000; LI & STYS, 2001; PARK et al.,

2003).

Contudo, existem poucos estudos que tenham investigado o comprometimento

da substância branca através de modelos de isquemia focal (HUGHES et al., 2003).

Um dos poucos modelos disponíveis, onde a substância branca pode ser

primariamente lesada, sem afetar a substância cinzenta é o proposto por Hughes et al.,

(2003), onde pequenas quantidades do peptídeo vasoconstritor endotelina-1 (ET-1)

são injetadas em no parênquima neural. Abaixo discutiremos este modelo.

1.3 ISQUEMIA FOCAL EXPERIMENTAL POR INJEÇÃO DE ENDOTELINA-1

A família dos peptídeos conhecidos como endotelinas (ETs) é constituída por

três componentes: ET–1, ET–2; ET-3, os quais foram isolados originalmente do

sobrenadante de cultura de células endoteliais (YANAGISAWA et al., 1988a;

YANAGISAWA et al., 1988b; YANAGISAWA & MASAKI, 1989). São

reconhecidos como potentes agentes vasoconstritores e podem ser encontrados em

diversas espécies animais, inclusive nos humanos (YANAGISAWA et al., 1988b;

MASAKI & YANAGISAWA, 1992; MOTTE et al., 2005).

Os variados tipos de endotelina têm suas atividades mediadas por dois subtipos

de receptores acoplados à cascata de proteína G, que são denominados ET

e ET

(PARK & THORNHILL, 2000). O primeiro subtipo citado, ou seja, o ET

apresenta

maior afinidade pelas ET-1 e ET-2 do que pela ET3, estando localizado

predominantemente nas células musculares lisas das artérias piais do córtex cerebral

(MASAKI & YANAGISAWA, 1992). A finalidade deste receptor é mediar a

vasoconstrição no leito vascular. Já o subtipo ET

possui igual afinidade pelos três

tipos de ETs, sendo encontrado nas células endoteliais. Seu efeito é produzir

vasodilatação por meio da produção de substâncias vasodilatadoras (RUBANYI &

POLOKOFF, 1994; MOTTE et al., 2005).

Os receptores de endotelina podem ser expressos em células neurais, tais como

neurônios, microglia, células gliais, células epiteliais do plexo corióide e células

ependimais dos ventrículos cerebrais (MASAKI & YANAGISAWA, 1992;

RUBANYI & POLOKOFF, 1994).

A ET-1 é um potente vasoconstrictor de artérias cerebrais de médio e grande

calibre (YANAGISAWA et al., 1988b). Esta propriedade fez com que pesquisadores

utilizassem a injeção intracerebral de ET-1 como um modelo de isquemia focal do

SNC (FUXE et al., 1989; AGNATI et al., 1991; FUXE et al., 1992; HOM et al.,

1992; HUGHES et al., 2003). Em um experimento, Fuxe et al., (1992) realizaram

injeções estereotáxicas de 430 pMoles de ET-1 no estriado, o que causou uma redução

no fluxo sanguíneo nesta região de até 60% em uma hora e de 40% após três horas da

injeção do referido neurotóxico (Fuxe et al, 1992).

Em 2003, Hughes e colaboradores propuseram um modelo de isquemia focal

da substância branca, onde injeções estereotáxicas de quantidades bem menores de

ET-1 (10 pmoles/l) foram suficientes para induzir uma redução de até 60% (por mais

de 3h) do fluxo sanguíneo local no estriado e córtex cerebral, com concomitante dano

neural, incluindo lesão axonal, resposta inflamatória, lesão de oligodendrócitos e

desmielinização (HUGHES et al., 2003). Este modelo foi inovador, considerando-se

que é possível com o mesmo restringir a lesão isquêmica a uma pequena área, como a

substância branca cortical.

Estes achados são de suma importância, uma vez que, a extensão e a duração

da redução no fluxo sangüíneo cerebral definem o prognóstico patológico.Em

modelos experimentais de AVE, constatou-se que uma redução de 80% a 90% na

perfusão sangüínea cerebral em um espaço curto de tempo – aproximadamente 30

minutos ou menos, invariavelmente resulta em falência energética e morte neuronal

(BOLANDER et al., 1989). Outras investigações mostram que reduções menos

severas na perfusão cerebral, porém por um período mais longo de tempo, como por

exemplo, acima de três horas, podem levar à morte neuronal. Ou seja, mesmo

pequenas e breves reduções no fluxo sangüíneo podem levar a morte de neurônios

(HUGHES et al., 2003).

Além dos experimentos em animais, estudos clínicos demonstraram o aumento

nos níveis sangüíneos e no fluído cerebroespinhal de ET-1 em pacientes, nas primeiras

18 horas após o AVE (LAMPL et al., 1997). Estes estudos demonstraram certa

correlação entre os níveis deste peptídeo com os déficits neurológicos ocasionados

pela lesão cerebral. Dessa forma, quanto mais elevados forem os níveis de ET-1, mais

severas são as limitações e incapacidades apresentadas pelos pacientes (ZIV et al.,

1992).

1.4 O PARADIGMA EXPERIMENTAL

Como relatado anteriormente, a substância branca é altamente vulnerável à

isquemia (PANTONI et al., 1996) e demonstrou-se que a lesão de axônios,

oligodendrócitos e bainha de mielina são importantes alterações patológicas que

contribuem para os déficits funcionais decorrentes de trauma, AVE e outras doenças

neurodegenerativas agudas (YAM et al., 1997; LI et al., 1999; LI et al., 2000;

IRVING et al., 2001; STYS, 2005). Apesar disso, poucos estudos (HUGHES et al.,

2003) investigaram, em diferentes tempos de sobrevida, a evolução temporal da

resposta inflamatória, lesão axonal e desmielinização após isquemia focal no CNS.

Na presente dissertação, descrevemos os padrões de resposta inflamatória,

lesão axonal e da bainha de mielina em diferentes tempos de sobrevida após injeções

focais de ET-1 no estriado de ratos adultos. Dessa forma, estendemos os

conhecimentos relatados por investigações prévias (HUGHES et al., 2003), através de

uma análise sistemática do comprometimento destes parâmetros histopatológicos.

1.5 OBJETIVOS

1.5.1 Objetivo Geral

Descrever os padrões inflamatórios, de degeneração da bainha de mielina e

lesão axonal em diferentes tempos de sobrevida, após isquemia focal induzida por

microinjeções de ET-1 no estriado de ratos adultos.

1.4.2 Objetivos Específicos

1.4.2.1 Implementar o modelo de isquemia focal através de microinjeções de ET-1 no

estriado de ratos adultos.

1.4.2.2 Descrever a evolução da área de lesão isquêmica no modelo experimental

proposto.

1.4.2.3 Descrever qualitativa e quantitativamente os padrões de recrutamento de

neutrófilos e macrófagos, em diferentes tempos de sobrevida, após lesão isquêmica

experimental.

1.4.2.4 Descrever os padrões neurodegenerativos na substância branca, com ênfase no

comprometimento da bainha de mielina e de axônios.

1.4.2.5 Estabelecer parâmetros de comprometimento histopatológico no modelo de

isquemia focal em questão, para estudos futuros que utilizem abordagens

neuroregenerativas e neuroprotetoras

2. MÉTODOS EXPERIMENTAIS

2.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O MÉTODO EXPERIMENTAL

UTILIZADO

Estudos prévios determinaram o modelo experimental de isquemia focal que

foi utilizado na presente dissertação (HUGHES et al., 2003). Desse modo, usou-se o

efeito vasoconstritor da ET-1 para indução de isquemia focal no estriado de ratos

adultos, através de microinjeções intracerebrais desta substância.

Este método lesivo é um modelo experimental de AVE, no qual injeções de

pequenas quantidades do vasoconstritor citado induzem isquemia focal, porém sem o

comprometimento da barreira hematoencefálica (FUXE et al., 1989; AGNATI et al.,

1991; HUGHES et al., 2003). Este modelo experimental é considerado inovador,

comparado aos métodos mais tradicionais, os quais preconizam a obstrução

experimental de artérias cerebrais, tais como a artéria cerebral média (LIPTON, 1999).

Além disso, é bem menos trabalhoso, pois não necessita para sua implementação, da

complicada cirurgia para a obstrução das artérias cerebrais.

2.2. PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS E INJEÇÃO DE ENDOTELINA-1

No presente estudo, foram utilizados ratos machos adultos da linhagem Wistar

(N=8 por tempo de sobrevida, incluindo 3 animais controle), os quais pesavam em

média 290 g e que foram cedidos pelo biotério da Universidade Federal do Pará

(UFPA). Estes animais foram profundamente anestesiados com injeção intraperitoneal

(i.p) de uma mistura de Vetanarcol® (cloridrato de cetamina, 72 mg/ Kg – Laboratório

Koning S.A) e Kenzol® (cloridrato de xilazina, 9 mg/ Kg – Laboratório Koning S.A).

Antes dos animais serem posicionados no aparelho estereotáxico (Insight, Brasil), os

reflexos corneanos e de retirada das patas foram testados. A estereotaxia foi realizada

somente quando estes reflexos foram completamente abolidos pela anestesia.

Com o animal devidamente posicionado no aparelho estereotáxico, foi

realizada a tricotomia e a assepsia do campo cirúrgico com solução de iodo a 2%. Em

seguida, uma incisão na linha mediana foi realizada, no sentido antero-posterior, para

a exposição da calota craniana.

Para as injeções de ET-1 (Sigma, EUA) no estriado dos ratos adultos, foram

utilizadas as seguintes coordenadas esterotáxicas, tomando-se como referência o ponto

Brégma (PAXINOS, 1982): antero-posterior = 0.5, médio-lateral = 4.0, dorso-ventral

= 5.5. Após o estabelecimento da área de injeção por meio da estereotaxia, uma

pequena abertura foi feita no crânio dos animais com auxílio de uma broca

odontológica (carbide PM nº6, Meisinger) até a exposição da dura-máter, a qual foi

removida do campo cirúrgico. Em seguida, uma micropipeta de vidro com ponta de

10-20 µm e graduações de 1l (Sigma, Brasil), foi posicionada no estereotáxico de

acordo com coordenadas anteriormente descritas, para a injeção intraestriatal por

pressão (Figura 1) de 10 pmoles de ET-1 diluídos em 1 l de solução salina estéril

(N= 5 animais/tempo de sobrevida). Após esta injeção, a micropipeta foi mantida

estacionária por mais 5 minutos, antes de ser retirada lentamente do parênquima

neural, a fim de evitar refluxo da substância neurotóxica. Nos animais controle,

apenas injetou-se o mesmo volume de solução salina estéril (N= 3 animais/tempo de

sobrevida). Para a identificação da área de lesão, uma pequena quantidade do corante

azul de colanil foi adicionada, tanto à solução contendo o neurotóxico como à solução

controle. Por fim, as camadas musculares foram repostas e suturadas.

Durante todo o procedimento, os animais foram aquecidos por uma manta

térmica e a temperatura deles controlada através de termômetro retal.

Após a cirurgia, os animais foram mantidos com água e comida à vontade,

durante os tempos de sobrevida de 24 horas, 72 horas (3 dias) e 168 horas (7 dias).

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas sugeridas pela

Society for Neuroscience, pelo National Institutes of Health (NIH, USA) e com

anuência do Comitê de Ética em Pesquisa com Animais de Experimentação da UFPA

(CEPAE/UFPA).

Figura 1. Esquema ilustrativo mostrando o sítio de injeção de endotelina-1 no estriado

de ratos adultos (pipeta). e= estriado; c = cápsula interna; g= globo pálido.

2.3 PERFUSÃO E ANÁLISE HISTOLÓGICA

Após os tempos de sobrevida especificados, os animais foram profundamente

anestesiados com injeção intraperitoneal (i.p) de uma mistura de Vetanarcol®

(cloridrato de cetamina,72 mg/ Kg, Laboratório Koning S.A) e Kenzol® (cloridrato de

xilazina, 9 mg/ Kg, Laboratório Koning S.A) e perfundidos através do ventrículo

esquerdo do coração com solução salina a 0,9% heparinizada, seguida por

Paraformaldeído a 4% (Sigma, EUA) diluído em tampão fosfato 0,2M (pH 7.4).

Depois deste procedimento, os encéfalos foram removidos das caixas cranianas e, pós-

fixados no mesmo fixador utilizado para a perfusão, por um período de 24 horas.

Em seguida a pós-fixação, o tecido encefálico foi mantido em gradientes de

solução crioprotetora, segundo o seguinte protocolo: crioprotetora a 25% (30

minutos), a 50% (4-6 h), a 100% (24-48 h). Os cérebros crioprotegidos foram

congelados em gel de imersão para criostato (Tissue Tek) a uma temperatura de -55°C,

em criostato provido de efeito Peltier (Carl Zeiss, Microm, Alemanha). Os blocos

foram posicionados no criostato para obtenção de secções coronais e parasagitais do

encéfalo com espessura de 20 µm. Também foram coletadas algumas secções de 50

µm, para coloração de rotina e visualização da área de lesão. Todas estas secções

foram montadas diretamente em lâminas gelatinizadas e mantidas em um freezer a -

20°C, aguardando imunohistoquímica ou outra técnica de coloração.

2.4 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E IMUHISTOQUÍMICA

2.4.1 Visualização dá Área da Lesão

Para visualização da área de lesão, secções de 20 µm foram coradas pela

hematoxilina. A zona da injeção de ET-1 foi reconhecida pela presença do corante

azul de colanil, co-injetado com o referido neurotóxico; pelo palor tecidual (perda de

coloração na neurópila) e ainda, por perda e/ou necrose de corpos neuronais e gliais

induzidos pelo processo isquêmico.

2.4.2 Estudos Imunohistoquímicos

Com a finalidade de avaliar os padrões de resposta inflamatória, alterações na

bainha de mielina e lesão axonal no modelo experimental proposto, realizou-se uma

série de estudos imunohistoquímicos. Os anticorpos utilizados são apresentados na

tabela 1.

Tabela 1. Anticorpos, fabricantes e diluição utilizados na presente dissertação.

Anticorpo

Fabricante

Diluição

ED-1 Serotec 1:500

MBS

CNS Inflammation Group

1:2000

APP

Zymed

1:50

MBP Chemicon international 1:500

2.4.2.1 Marcadores Inflamatórios

Para identificar a presença de macrófagos/microglia ativados, na área de lesão

e em regiões circundjacentes, foi utilizado o anticorpo ED1 (1:500, Serotec), que

reconhece um epítopo na membrana de lisossomas localizados no citoplasma de

macrófagos ativados (ROBINSON et al., 1986).

Os neutrófilos foram marcados com o anticorpo policlonal MBS-1 (1:2000,

CNS Inflammation Group, Southampton University, UK), o qual reconhece epítopos

presentes na maioria da população de neutrófilos.

2.4.2.2 Mielina

Para a avaliação das alterações na bainha de mielina, utilizou-se o anticorpo monoclonal anti-

proteína básica de mielina (do inglês, MBP myelin

2001).

2.4.2.3 Lesão Axonal

Com o intuito de investigar a ocorrência de lesão axonal durante o processo de degeneração secun

que a imunocitoquímica para o -APP é um marcador sensível de lesão axonal

(GENTLEMAN et al., 1993; MCKENZIE et al., 1996), tanto experimentalmente,

como em estudos de distúrbios patológicos em seres humanos (LI et al., 1995).

2.4.3 Análise Qualitativa

Todas as secções coradas pelos diferentes métodos histológicos e imunohistoquímicos

foram inspecionadas em microscópio óptico (Nikon, Optiphot-2, Japão). Imagens com

os campos mais ilustrativos foram obtidas de secções estriatais dos cérebros dos

animais injetados com ET-1, bem como dos controles, em todos os tempos de

sobrevida avaliados. Para tanto, foi utilizada uma câmara digital acoplada a um

microscópio óptico (Stereoinvestigator, MicroBrightField, EUA). Brilho, resolução e

contraste das imagens digitalizadas foram ajustados com auxílio do programa de

computador Adobe Photoshop CS2 (versão 9.0).

2.4.4 Análise Quantitativa

Os números de neutrófilos e macrófagos/microglia ativados (3 campos/secção;

3 secções/animal) foram contados com o auxílio de uma gradícula de 1 mm

de área

acoplada à ocular de microscópio óptico (Nikon, Optiphot-2, Japão), utilizando-se a

objetiva de 40X. As contagens foram realizadas nas regiões estriatais com maior

densidade de células, considerando-se um campo central e 2 campos laterais separados

por 1 mm.

2.4.5 Análise Estatística

As médias e os desvios padrão das contagens foram obtidos para todos os

grupos de dados. As comparações entre os grupos foram realizadas pela análise de

variância (ANOVA) para um critério com correção a posteriore de Tukey. O nível de

significância foi de P<0.05. As médias foram plotadas em coordenadas cartesianas,

em função do tempo de sobrevida. A análise estatística descrita foi realizada

utilizando-se o software Bioestat 4.0 (AYRES, 2005). Os gráficos foram feitos

utilizando-se o Microsoft Excel (Microsoft Office 2003).

3. RESULTADOS

3.1 PADRÕES HISTOPATOLÓGICOS GERAIS

Neste estudo, a lesão do tecido neural foi induzida por meio da injeção de 10

pmoles de ET-1 no estriado de ratos adultos e, visualizada em secções coronais e

parassagitais coradas pela hematoxilina (Figura 1) Nestas secções, o sítio de injeção

da ET-1 foi evidenciado pela presença do corante azul de colanil, injetado juntamente

com o referido neurotóxico ou com a solução salina estéril, bem como pelos padrões

neurodegenerativos incluindo palor tecidual e perda de corpos celulares.

A injeção de ET-1 induziu edema, perda tecidual progressiva e resposta

inflamatória intensa (Figura 2C-H). Os animais controle, os quais foram injetados

apenas com solução salina estéril, não apresentaram o mesmo padrão lesivo (Figura

2A-B). A perda tecidual progressiva com características necróticas foi maior nos

tempos de sobrevida de 3-7 dias (Figura 2G). Estes resultados confirmam relatos

anteriores que sugeriram que microinjeções de ET-1 são um excelente método de

isquemia focal experimental (HUGHES et al., 2003).

Houve evidente recrutamento de células inflamatórias desde o primeiro dia

após a injeção (Figura 2C-H). Como confirmado pelos estudos imunohistoquímicos

descritos a seguir, tanto neurotrófilos como macrófagos ativados foram encontrados

na área da lesão e em regiões adjacentes (Figura 2C-H). Células da linhagem

polimorfonuclear (neutrófilos) foram encontradas em grande quantidade no

parênquima estriatal lesado no tempo de sobrevida de 1 dia (Figura 2C-D). Estas

células foram raramente encontradas no tempo de sobrevida de 3 dias (Figura 2E-F) e

desapareceram do parênquima estriatal lesado 7 dias após a injeção (Figura 2G-H).

Figura 2. Análise histopatológica em secções coronais coradas pela hematoxilina.

Animais controle injetados com solução salina estéril (A-B) ou isquêmicos injetados

com endotelina-1, 1 (C-D), 3 (E-F) e 7 dias (G-H) após a injeção. Células

inflamatórias (setas) podem ser observadas no ou próximas ao sítio de injeção. As

células inflamatórias são preferencialmente da linhagem polimorfonuclear no tempo

de sobrevida de 1 dia (C-D) e da linhagem mononuclear nos tempos de sobrevida 3-7

dias (E-H). A perda tecidual aumenta com os tempos de sobrevida mais tardios (G).

Notar o azul de colanil no sítio de injeção (A-C). Escalas: 50 µm (A,C,E,G); 20 µm

(B,D,F,H).A partir de 3 dias, células da linhagem mononuclear (macrófagos)

tornaram-se predominante no tecido lesado (Figura 2E-F). Estas células foram

raramente encontradas no tempo de sobrevida de 1 dia (Figura 2C-D) e foram

abundantes no parênquima estriatal dos animais injetados com ET-1, 7 dias após a

injeção (Figura 2G-H).

Estes padrões de recrutamento foram confirmados pelos estudos

imunocitoquímicos descritos a seguir e diferem de estudos prévios (HUGHES et al.,

2003), que relataram a ausência de recrutamento de neutrófilos após injeção de ET-1.

3.2. RESPOSTA INFLAMATÓRIA APÓS LESÃO ESTRIATAL ISQUÊMICA

Como já mencionado na descrição da histopatologia básica, no presente estudo

houve um evidente recrutamento de células inflamatórias para a área da lesão. Estes

resultados foram confirmados através da utilização de anticorpos específicos para

neutrófilos (anti-MBS-1) e macrófagos (anti-ED1). Estes anticorpos foram utilizados

com sucesso em estudos anteriores para a imunomarcação de células inflamatórias

após lesão experimental aguda no SNC de ratos (GOMES-LEAL, 2005).

Neutrófilos foram encontrados no estriado lesado, no sítio de injeção de ET-1 e

em regiões adjacentes, principalmente no tempo de sobrevida de 1 dia (Figura 3C-D).

Estas células não foram encontradas, ou o foram em pequenas quantidades no mesmo

tempo de sobrevida dos animais injetados com solução salina estéril (Figura 3A-B). A

análise quantitativa revelou que a média do número de neutrófilos foi de cerca de 11 

4 células/campo neste tempo de sobrevida (Figura 4). No tempo de sobrevida de 3

dias, houve uma diminuição significativa no número de neutrófilos no parênquima

estriatal (Figura 3E-F). O número médio de neutrófilos por campo de contagem caiu

para aproximadamente 2  1 neste tempo de sobrevida (Figura 4).

Figura 3. Recrutamento de neutrófilos no estriado de ratos adultos injetados com

endotelina-1. Animais controle injetados com solução salina estéril (A-B) ou

isquêmicos injetados com endotelina-1, 1 (C-D), 3 (E-F) e 7 dias (G-H) após a injeção.

As setas apontam para neutrófilos marcados pelo anticorpo MBS-1. A quantidade de

neutrófilos é maior no tempo de sobrevida de 1 dia (C-D). Notar o azul de colanil no

sítio de injeção (C-H). As secções foram contracoradas com hematoxilina Escalas: 50

µm (A,C,E,G); 20 µm (B,D,F,H).

Figura 4. Contagem do número de macrófagos e neutrófilos recrutados para o

parênquima estriatal de ratos adultos após lesão isquêmica. Médias das contagens do

número de neutrófilos (barras claras) e macrófagos (barras escuras) realizadas em 1, 3 e

7 dias após a injeção. O pico máximo de recrutamento de neutrófilos ocorreu no tempo

de sobrevida de 1 dia (*P<0.05), diminuindo após 3 dias (*P<0.05) e desaparecendo 7

dias após a injeção (*P<0.05). O número de macrófagos no estriado aumentou

significativamente entre 3 e 7 dias, com pico máximo no tempo de sobrevida de 7 dias

(*P<0.05). As comparações foram feitas por ANOVA, com correção a posteriore de

Tukey. Barras de erro são desvios padrão.

Neutrófilos não foram encontrados, mesmo no sítio de injeção de ET-1, no tempo de

sobrevida de 7 dias (Figuras 3G-H e 4). Este decréscimo do número de neutrófilos em

função do tempo de sobrevida foi estatisticamente significativo (P<0.05, ANOVA-

Tukey). Estes dados diferem dos relatados anteriormente por Hughes et al (2003).

Neste estudo, os autores não encontraram marcação para neutrófilos, utilizando o

anticorpo MBS-1, após injeção de ET-1 no estriado de ratos adultos, em nenhum dos

tempos de sobrevida analisados (6h, 1, 3 e 7dias).

A quantidade de células ED1+ (macrófagos/microglia ativados) aumentou

progressivamente no parênquima estriatal entre 1 e 7 dias pós-injeção (Figuras 5C-H e

4). No estriado de animais controle injetados com solução salina estéril, houve

recrutamento de poucos macrófagos para o parênquima estriatal (Figura 5 A-B).

Poucas células ED1+ (8  2 células/campo) foram encontradas no tecido estriatal no

tempo de sobrevida de 1 dia (Figuras 4 e 5C-D). O número de células ED1+ aumentou

para 21  1 células/campo no tempo de sobrevida de 3 dias e para 35  7

células/campo 7 dias após a injeção (Figuras 4 e 5E-H). Estas diferenças foram

estatisticamente significativas (P<0.05, ANOVA-Tukey).

3. 3. LESÃO AXONAL

Para a marcação de axônios lesados, foi utilizada a imunohistoquímica para a

proteína precursora β-amilóide (β-APP, do inglês β-amyloid precursor protein), que é

uma técnica já estabelecida como um excelente marcador de lesão axonal

{GENTLEMAN, 1993). Nos tempos de sobrevida investigados, não se encontrou

marcação pela imunohistoquímica

Figura 5. Recrutamento de macrófagos revelados pela imunohistoquímica para ED1 no

estriado de ratos adultos injetados com endotelina-1. Animais controle injetados com

solução salina estéril (A-B) ou isquêmicos injetados com endotelina-1, 1 (C-D), 3 (E-F)

e 7 dias (G-H) após a injeção. As setas apontam para células ED1+. A quantidade de

células ED1+ no parênquima estriatal é maior entre 3 e 7 dias pós-lesão. Notar o azul de

colanil no sítio de injeção. As secções foram contracoradas com hematoxilina. Escalas:

50 µm (A,C,E,G); 20 µm (B,D,F,H). As secções foram contracoradas com

hematoxilina. Escalas: 50 µm (A,C,E,G); 20 µm (B,D,F,H).

do precursor β-amilóide (Figura 6). Estes resultados sugerem que não houve

comprometimento do cilindro axonal no presente modelo de isquemia focal. Resultado

similar foi relatado anteriormente por Hughes et al., (2003) após injeção de ET-1 no

estriado de ratos.

3.3. ALTERAÇÕES NA BAINHA DE MIELINA

Com a finalidade de averiguar alterações na bainha de mielina, foi utilizada a

imunohistoquímica para a proteína básica de mielina (MBP, do inglês myelin basic

protein). Esta imunohistoquímica foi usada com sucesso em trabalhos prévios, os

quais utilizavam modelos experimentais de doenças neurodegenerativas agudas

(IRVING, 2001; DOS SANTOS ET AL., 2006). Houve perda progressiva da

reatividade para MBP em função do tempo de sobrevida (Figura 7B,D,F), ou seja, a

perda de reatividade para MBP pôde ser observada a partir de 1 dia após a injeção de

ET-1 (Figura 7B) e acentuou-se nos tempos de sobrevida de 3 e 7 dias (Figura 7D,F).

Os animais controle não apresentaram tal alteração (Figura 7A,C,E)

Figura 6. Imunohistoquímica para o precursor beta amilóide – um marcador de lesão

axonal no estriado de ratos adultos submetidos à isquemia focal. Animais controle

injetados com solução salina estéril (A-B) ou isquêmicos injetados com endotelina-1, 1

(C-D), 3 (E-F) e 7 dias (G-H) após a injeção. Não houve imunoreatividade em axônios

tanto em animais controle (A-B), como em animais isquêmicos (C-H) para todos os

tempos de sobrevida observados. As setas apontam para a substância branca sem lesão

axonal em B, F e H e para uma célula inflamatória em D. Notar o azul de colanil no

sítio de injeção. As secções foram contracoradas com hematoxilina . Escalas: 50 µm

(A,C,E,G); 20 µm (B,D,F,H).

Figura 7. Desmielinização progressiva no estriado de ratos adultos injetados com

endotelina-1. Tratos de substância branca estriatais no lado contralateral (A,C,E) e no

lado ipsilateral do estriado injetado com 10 pMoles de endotelina-1, 1 (B), 3 (D) e 7

dias (F) após a injeção. Notar a perda mais intensa da reatividade para proteína básica

de mielina nos tempos de sobrevida mais tardios (D e F). Escala = 50 µm.

4. DISCUSSÃO

4.1 CONSIDERAÇÕES TÉCNICAS

Na presente dissertação, realizamos microinjeções de ET-1 no estriado de ratos

adultos com a finalidade de induzir isquemia focal, para avaliarmos os padrões

temporais de resposta inflamatória, lesão axonal e desmielinização. Também

estendemos os resultados descritos previamente em outras investigações, utilizando o

mesmo modelo experimental {Hughes, 2003 #914}, através da análise sistemática dos

referidos parâmetros histopatológicos em três tempos de sobrevida: 1, 3 e 7 dias.

A maior vantagem deste modelo de isquemia é a natureza focal da lesão

produzida. A injeção de 10 pmoles de ET-1 no estriado de ratos induz uma lesão

restrita a esta região do SNC, com eventos patológicos secundários que incluem

inflamação aguda e desmielinização. A presente investigação confirmou estudos

anteriores, os quais sugeriram que microinjeções de ET-1 constituem um excelente

método de isquemia focal transitória (CLARKE et al., 1989; FUXE et al., 1989;

AGNATI et al., 1991; HUGHES et al., 2003). Injeções de pequenas quantidades

deste neurotóxico reduzem mais de 60% do fluxo sangüíneo cerebral local (HUGHES

et al., 2003).

Outra vantagem é que esta técnica necessita de menos tempo para ser

executada que os modelos clássicos, os quais utilizam a oclusão experimental de

artérias, como, por exemplo, a artéria cerebral média. Além disso, a injeção de ET-1,

através de micropipetas de vidro com diâmetro interno variando entre 10-20 µm,

permite diferenciar claramente os eventos patológicos primários e secundários, tanto

na substância cinzenta quanto na substância branca (GOMES-LEAL, 2004; GOMES-

LEAL, 2005). Além disso, fica claro a partir dos resultados apresentados, que injeções

focais de ET-1 em áreas específicas do SNC de ratos representam um modelo para

investigação de procedimentos terapêuticos, incluindo estudos de isquemia na

substância branca (HUGHES et al., 2003).

4.2 RESPOSTA INFLAMATÓRIA NO ESTRIADO APÓS INJEÇÃO FOCAL DE

ET-1

Os resultados mostraram resposta inflamatória intensa após microinjeções de

ET-1 no estriado de ratos, com recrutamento tanto de leucócitos mononucleares, como

de leucócitos polimorfonucleares. Estes achados foram observados em secções

coradas pela hematoxilina, assim como, em secções imunomarcadas por anticorpos

específicos contra células da resposta inflamatórias aguda. Estes dados claramente

diferem dos previamente relatados por Hughes et al., (2003). Estes autores não

encontraram recrutamento de neutrófilos após microinjeções de ET-1 no estriado de

ratos, em nenhum dos tempos de sobrevida avaliados. Também, no referido estudo, a

ativação de macrófagos/microglia não ocorreu até 72 horas após a injeção de ET-1,

enquanto que a ativação destas células inflamatórias, na presente dissertação, foi

observada a partir do tempo de sobrevida de 24 horas.

As razões para estes resultados discrepantes não são bem claras. Nesta

dissertação, foi utilizada a mesma concentração de ET-1 (10 pmoles/µl), bem como a

mesma linhagem de ratos Wistar, usada por Hughes e colaboradores (2003).

Entretanto, utilizamos coordenadas estereotáxicas ligeiramente diferentes. As injeções

realizadas no presente estudo são mais posteriores ao Brégma que as usadas pelos

referidos autores. Ainda assim, esta é uma explicação improvável para os resultados

discrepantes, uma vez que não há evidências científicas para esta variação regional da

resposta inflamatória no estriado de ratos submetidos a alguma condição patológica.

Existe a possibilidade de que a explicação para estes resultados discrepantes

esteja nas diferenças entre os procedimentos imunohistoquímicos utilizados e não em

mecanismos patológicos intrínsecos. Em nosso estudo, foi realizado o pré - tratamento

das secções com ácido bórico 0.2M, pH 9.0, previamente aquecido a 65

C por 25

minutos. Este procedimento aumenta a intensidade da marcação imunohistoquímica,

induz recuperação antigênica e foi usado com sucesso em investigações anteriores

(PICANCO-DINIZ, 2004; GOMES-LEAL, 2005).

O recrutamento de leucócitos mononucleares e polimorfonucleares têm sido

relatado por diversos estudos utilizando modelos experimentais de doenças do SNC

(BOLTON & PERRY, 1998; CARLSON et al., 1998; SCHNELL et al., 1999;

GOMES-LEAL, 2004; 2005) e após doenças neurodegenerativas agudas em seres

humanos (AKOPOV et al., 1996; HOLMIN et al., 1998). Demonstrou-se que o pico

máximo de recrutamento de neutrófilos ocorre cerca de 1 dia após lesão aguda do

cérebro (BOLTON & PERRY, 1998) e da medula espinhal (CARLSON et al., 1998;

SCHNELL et al., 1999; GOMES-LEAL, 2005). Nestes mesmos estudos, o

recrutamento máximo de macrófagos ocorre em cerca de 7 dias após a lesão primária

(BOLTON & PERRY, 1998; CARLSON et al., 1998; SCHNELL et al., 1999;

GOMES-LEAL, 2004; 2005).

Akopov et al., (1996) investigaram a dinâmica do acúmulo de leucócitos

polimorfonucleares em infartos cerebrais humanos, bem como a associação deste

evento patológico com a lesão cerebral e os subseqüentes déficits neurológicos. A

dinâmica do acúmulo das citadas células inflamatórias foi estudada de 3 a 6, 6 a 12, 12

a 24 horas e 6 a 9, 28 a 30, e 90 dias após o AVE. Paralelamente, foi realizada a

avaliação das respostas neurológicas e de volume do infarto no momento da admissão

dos pacientes, de 6 a 9 dias e de 28 a 30 dias após o AVE. O referido estudo

demonstrou acúmulo intenso de leucócitos polimorfonucleares nas regiões do infarto

cerebral. Além disso, demonstrou, através de técnicas estatísticas, uma correlação

direta do acúmulo patológico dos leucócitos polimorfonucleares com os danos

cerebrais observados e com prognóstico neurológico desfavorável.

A resposta inflamatória foi investigada após contusões cerebrais humanas

(HOLMIN et al., 1998). Logo após o trauma, a inflamação é principalmente

intravascular e dominada pelas células polimorfonucleares, mas as células

inflamatórias infiltram o parênquima cerebral em pacientes submetidos à cirurgia,

cerca de 3 a 5 dias pós-lesão (HOLMIN et al., 1998). Estes mesmos autores

mostraram que as células inflamatórias podem produzir efeitos potencialmente

deletérios, tais como degeneração celular aguda e efeitos degenerativos de longa

duração em humanos (HOLMIN et al., 1998).

Numerosos estudos experimentais confirmaram e aumentaram os

conhecimentos iniciais existentes sobre o papel patológico das células inflamatórias

em doenças neurodegenerativas agudas (BLIGHT, 1994; TAOKA et al., 1997;

TAOKA et al., 1998; POPOVICH et al., 1999). Inibidores da elastase de neutrófilos

atenuam acentuadamente os distúrbios motores nas patas traseiras de ratos submetidos

à compressão da medula espinhal (TAOKA et al., 1998). Resultados similares foram

obtidos através da depleção de leucócitos e administração do anticorpo monoclonal

anti-selectina-P (TAOKA et al., 1997). Além disso, a depleção do recrutamento de

macrófagos hematogênicos com pó de sílica (BLIGHT, 1994) ou lipossomas

encapsulados de clodronato (POPOVICH et al., 1999) induz melhor recuperação

motora em ratos submetidos à lesão aguda da medula espinhal.

Os resultados descritos acima fornecem suporte aos achados da presente

dissertação, os quais referem que os tipos citados de leucócitos são recrutados para o

estriado isquêmico e que estas células inflamatórias podem exercer um papel

determinante na etiologia da perda tecidual progressiva encontrada após microinjeções

de ET-1. Esta hipótese pode ser testada em estudos futuros, que utilizem

procedimentos para inibir o recrutamento e a ativação de células inflamatórias. Nessas

investigações futuras, os resultados devem ser interpretados com precaução,

considerando-se os efeitos benéficos da resposta inflamatória, o que tem sido

reportado por inúmeras investigações (LAZAROV-SPIEGLER et al., 1996;

RAPALINO et al., 1998). Recentemente, relatou-se em um estudo de fase I que o

transplante autólogo de macrófagos foi bem tolerado em pacientes com lesão aguda da

medula espinhal (KNOLLER, 2005). Entre os oito pacientes estudados, três obtiveram

significante recuperação de suas funções motoras e sensoriais após o tratamento

(KNOLLER, 2005).

4.3 DANOS PROGRESSIVOS À BAINHA DE MIELINA NOS TRATOS DE

SUBSTÂNCIA BRANCA DO ESTRIADO APÓS LESÃO ISQUÊMICA

Houve uma perda contínua de reatividade para MBP nos tratos de substância

branca, após injeção focal de ET-1 no estriado de ratos adultos. Estudos anteriores já

haviam descrito danos à bainha de mielina, 1 dia após microinjeções de ET-1 na

referida região cerebral (HUGHES et al., 2003). Neste mesmo estudo citado, não

foram descritos danos à mielina nos tempos de sobrevida mais tardios. Apesar disso,

em outro estudo foi detectada uma evidente redução dos níveis de MBP no estriado

isquêmico, mesmo duas semanas após oclusão da artéria cerebral média (IRVING et

al., 2001). Estes resultados apóiam os achados da presente dissertação de que ocorre

comprometimento da bainha de mielina em tempos de sobrevida tardios.

Embora na presente dissertação não se tenha investigado os padrões de

degeneração de oligodendrócitos, há diversas evidências na literatura de que estas

células gliais são lesadas após isquemia, tanto no estriado como no córtex cerebral de

ratos (IRVING et al., 1997; IRVING et al., 2001; HUGHES et al., 2003). Resultados

similares foram descritos após injeções de agonistas glutamatérgicos nestas regiões do

SNC (IRVING et al., 1996a; FOWLER et al., 2003). Estes achados histopatológicos

também foram relatados após AVE e traumatismo craniano em humanos (IRVING et

al., 1996b).

Desta forma, os resultados da presente dissertação, bem como os relatados por

outros autores, sugerem que lesão à bainha de mielina e aos oligodendrócitos é um

componente importante da fisiopatologia do AVE e de outras desordens neurais

agudas. Os mecanismos responsáveis pelas alterações patológicas na substância

branca ainda estão sendo investigados, mas parecem envolver excitotoxicidade

glutamatérgica através da ativação excessiva de receptores do tipo não-NMDA,

localizados principalmente em astrócitos, nos corpos de oligodendrócitos e na bainha

de mielina (LI et al., 1999; LI et al., 2000; LI & STYS, 2001; STYS, 2004). A

reversão patológica de bombas metabólicas transportadoras de glutamato,

ocasionando liberação excessiva deste aminoácido excitatório a partir do axônio para

o meio extracelular, com subseqüente excitotoxicidade através de influxo excessivo de

e Ca

parece ser um evento crucial durante degeneração da substância branca (LI

et al., 1999; LI & STYS, 2001; STYS, 2005).

Futuramente, outros estudos poderão investigar possíveis abordagens

terapêuticas para a proteção de oligodendrócitos e bainha de mielina durante lesões

isquêmicas. Os parâmetros histopatológicos estabelecidos neste e em estudos

anteriores (IRVING et al., 2001; FOWLER et al., 2003; HUGHES et al., 2003)

podem ser usados como base para comparações com os mesmos parâmetros em

animais submetidos a procedimentos neuroprotetores ou neuroregenerativos.

Evidências experimentais sugerem que antagonistas de canais de sódio (AGRAWAL

& FEHLINGS, 1997b) e de AMPA/Kainato (AGRAWAL & FEHLINGS, 1997a; LI

et al., 1999; LI & STYS, 2000; MCCRACKEN et al., 2002) protegem a substância

branca, após lesão traumática e isquêmica em modelos in vitro e in vivo.

Novos procedimentos terapêuticos experimentais, como por exemplo, terapia

com células-tronco (MAHMOOD et al., 2006; SHEN et al., 2006a; SHEN et al.,

2006b) e amplificação da neurogênese endógena (ARVIDSSON et al., 2002;

KOKAIA et al., 2006; THORED et al., 2006) poderão ser testados, utilizando o

modelo de isquemia focal por injeção de ET-1.

4.4 AUSÊNCIA DE LESÃO AXONAL APÓS MICROINJEÇÕES DE ET-1 NO

ESTRIADO DE RATOS ADULTOS

Na presente dissertação, não foi verificada lesão axonal após microinjeções de

ET-1 no estriado de ratos. Este achado experimental é similar ao previamente relatado

Hughes et al., (2003), utilizando um paradigma experimental semelhante. Isto é

surpreendente, visto que microinjeções da mesma quantidade de ET-1 são capazes de

induzir lesão axonal na substância branca do córtex cerebral de ratos (HUGHES et al.,

2003). Além disso, a oclusão transitória da artéria cerebral média de ratos induz lesão

axonal no córtex e no estriado desses animais, a partir de 1 dia pós-lesão (IRVING et

al., 2001). Esses resultados sugerem que diferentes tratos de substância branca podem

ser mais ou menos vulneráveis ao dano isquêmico, dependendo do modelo

experimental empregado.

Por outro lado, lesões da bainha de mielina e alterações patológicas em

oligodendrócitos na ausência de danos ao cilindro axonal, são achados que estão de

acordo com numerosos estudos prévios, os quais sugerem que astrócitos,

oligodendrócitos e a bainha de mielina são bastante vulneráveis a excitotoxicidade

após trauma e isquemia, devido apresentarem um grande número de receptores

AMPA/Kainato (AGRAWAL & FEHLINGS, 1997b; YAM et al., 1998;

ROSENBERG et al., 1999; LI & STYS, 2000). Estes receptores não estão presentes

no cilindro axonal ou o estão em pequenas quantidades, o que explicaria sua menor

vulnerabilidade (STYS, 2005).

5. CONCLUSÃO

Na presente dissertação, verificamos os padrões de resposta inflamatória, lesão

axonal e desmielinização após lesão focal isquêmica induzida por microinjeções de

endotelina-1 no estriado de ratos. Os resultados mostraram recrutamento de células

inflamatórias, tanto de leucócitos mononucleares quanto polimorfonucleares, bem

como danos à bainha de mielina mesmo na ausência de lesão axonal, principalmente

nos tempos de sobrevida mais tardios. Estes resultados aumentam os conhecimentos

previamente relatados em outros estudos, que utilizaram o modelo experimental de

isquemia focal por injeção de ET-1 e sugerem que a bainha de mielina é mais

vulnerável à isquemia que o cilindro axonal. Estudos futuros devem investigar, com

base nos parâmetros histopatológicos descritos nesta e em outras investigações, os

efeitos de novos métodos terapêuticos experimentais, incluindo amplificação da

neurogênese endógena e a terapia com células tronco.

6. REFERÊNCIAS

AGNATI, L.F., ZOLI, M., KUROSAWA, M., BENFENATI, F., BIAGINI, G., ZINI, I.,

HALLSTROM, A., UNGERSTEDT, U., TOFFANO, G., FUXE, K.: A New Model of

Focal Brain Ischemia Based on the Intracerebral Injection of Endothelin-1. Italian

Journal of Neurological Sciences, v. 12, p. 49-53, 1991.

AGRAWAL, S.K., FEHLINGS, M.G.: The Effect of the Sodium Channel Blocker Qx-314

on Recovery after Acute Spinal Cord Injury. Journal of Neurotrauma, v. 14, p. 81-

88, 1997a.

AGRAWAL, S.K., FEHLINGS, M.G.: Role of Nmda and Non-Nmda Ionotropic Glutamate

Receptors in Traumatic Spinal Cord Axonal Injury. Journal of Neuroscience, v. 17,

p. 1055-1063, 1997b.

AGRAWAL, S.K., NASHMI, R., FEHLINGS, M.G.: Role of L- and N-Type Calcium

Channels in the Pathophysiology of Traumatic Spinal Cord White Matter Injury.

Neuroscience, v. 99, p. 179-188, 2000.

AGRAWAL, S.K., THERIAULT, E., FEHLINGS, M.G.: Role of Group I Metabotropic

Glutamate Receptors in Traumatic Spinal Cord White Matter Injury. Journal of

Neurotrauma, v. 15, p. 929-941, 1998.

AKOPOV, S.E., SIMONIAN, N.A., GRIGORIAN, G.S.: Dynamics of Polymorphonuclear

Leukocyte Accumulation in Acute Cerebral Infarction and Their Correlation with

Brain Tissue Damage. Stroke, v. 27, p. 1739-1743., 1996.

ALEXANDROVA, M.L., BOCHEV, P.G.: Oxidative Stress During the Chronic Phase after

Stroke. Free Radical Biology and Medicine, v. 39, p. 297-316, 2005.

ALLAN, S.M., ROTHWELL, N.J.: Inflammation in Central Nervous System Injury.

Philosophical Transactions of the Royal Society Lond B Biological Sciences, v.

358, p. 1669-1677, 2003.

ARVIDSSON, A., COLLIN, T., KIRIK, D., KOKAIA, Z., LINDVALL, O.: Neuronal

Replacement from Endogenous Precursors in the Adult Brain after Stroke. Nature

Medicine, v. 8, p. 963-970, 2002.

ASCHNER, M.: Astrocytes as Mediators of Immune and Inflammatory Responses in the

Cns. Neurotoxicology, v. 19, p. 269-281., 1998.

AYRES, M.: Biostat 4.0. ed 4th, Belém, Sociedade Civil Mamirauá/MCT/CNPQ. Imprensa

Oficial do Estado do Pará, 2005.

BECKER, K., KINDRICK, D., RELTON, J., HARLAN, J., WINN, R.: Antibody to the

Alpha4 Integrin Decreases Infarct Size in Transient Focal Cerebral Ischemia in Rats.

Stroke, v. 32, p. 206-211., 2001.

BLIGHT, A.R.: Effects of Silica on the Outcome from Experimental Spinal Cord Injury:

Implication of Macrophages in Secondary Tissue Damage. Neuroscience, v. 60, p.

263-273., 1994.

BOLANDER, H.G., PERSSON, L., HILLERED, L., D'ARGY, R., PONTEN, U.,

OLSSON, Y.: Regional Cerebral Blood Flow and Histopathologic Changes after

Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats. Stroke, v. 20, p. 930-937, 1989.

BOLTON, S.J., PERRY, V.H.: Differential Blood-Brain Barrier Breakdown and Leucocyte

Recruitment Following Excitotoxic Lesions in Juvenile and Adult Rats. Experimental

Neurology, v. 154, p. 231-240, 1998.

BORDI, F., UGOLINI, A.: Group I Metabotropic Glutamate Receptors: Implications for

Brain Diseases. Progress in Neurobiology, v. 59, p. 55-79, 1999.

CARLSON, S.L., PARRISH, M.E., SPRINGER, J.E., DOTY, K., DOSSETT, L.: Acute

Inflammatory Response in Spinal Cord Following Impact Injury. Experimental

Neurology, v. 151, p. 77-88, 1998.

CARMICHAEL, S.T.: Cellular and Molecular Mechanisms of Neural Repair after Stroke:

Making Waves. Annals of Neurology, v. 59, p. 735-742, 2006.

CHANG, C.P., LEE, C.C., CHEN, S.H., LIN, M.T.: Aminoguanidine Protects against

Intracranial Hypertension and Cerebral Ischemic Injury in Experimental Heatstroke.

Journal of Pharmacological Sciences, v. 95, p. 56-64, 2004.

CHEN, Z.L., STRICKLAND, S.: Neuronal Death in the Hippocampus Is Promoted by

Plasmin-Catalyzed Degradation of Laminin. Cell, v. 91, p. 917-925, 1997.

CHOI, D.: Stroke. Neurobiological Disease, v. 7, p. 552-558., 2000.

CHONG, Z.Z., LI, F., MAIESE, K.: Oxidative Stress in the Brain: Novel Cellular Targets

That Govern Survival During Neurodegenerative Disease. Progress in Neurobiology,

v. 75, p. 207-246, 2005.

CHOPP, M., ZHANG, Z.G.: Anti-Adhesion Molecule and Nitric Oxide Protection

Strategies in Ischemic Stroke. Current Opinion in Neurology, v. 9, p. 68-72, 1996.

CLARKE, J.G., LARKIN, S.W., BENJAMIN, N., KEOGH, B.E., CHESTER, A.,

DAVIES, G.J., TAYLOR, K.M., MASERI, A.: Endothelin-1 Is a Potent Long-Lasting

Vasoconstrictor in Dog Peripheral Vasculature in Vivo. Journal of Cardiovascular

Pharmacology, v. 13 Suppl 5, p. S211-212, 1989.

COLEMAN, M., PERRY, V.: Axon Pathology in Neurological Disease: A Neglected

Therapeutic Target. Trends in Neurosciences, v. 25, p. 532, 2002.

CONN, P.J., PIN, J.P.: Pharmacology and Functions of Metabotropic Glutamate Receptors.

Annual Review of Pharmacology and Toxicology, v. 37, p. 205-237, 1997.

DE_KEYSER, J., SULTER, G., LUITEN, P.G.: Clinical Trials with Neuroprotective Drugs

in Acute Ischaemic Stroke: Are We Doing the Right Thing? Trends in

Neurosciences, v. 22, p. 535-540, 1999.

DEL ZOPPO, G., GINIS, I., HALLENBECK, J.M., IADECOLA, C., WANG, X.,

FEUERSTEIN, G.Z.: Inflammation and Stroke: Putative Role for Cytokines,

Adhesion Molecules and Inos in Brain Response to Ischemia. Brain Pathology, v. 10,

p. 95-112, 2000.

DEWAR, D., YAM, P., MCCULLOCH, J.: Drug Development for Stroke: Importance of

Protecting Cerebral White Matter. European Journal of Pharmacology, v. 375, p.

41-50, 1999.

DIRNAGL, U., IADECOLA, C., MOSKOWITZ, M.A.: Pathobiology of Ischaemic Stroke:

An Integrated View. Trends of Neuroscience, v. 22, p. 391-397, 1999.

ELDADAH, B.A., FADEN, A.I.: Caspase Pathways, Neuronal Apoptosis, and Cns Injury.

Journal of Neurotrauma, v. 17, p. 811-829., 2000.

ELIASSON, M.J., HUANG, Z., FERRANTE, R.J., SASAMATA, M., MOLLIVER, M.E.,

SNYDER, S.H., MOSKOWITZ, M.A.: Neuronal Nitric Oxide Synthase Activation

and Peroxynitrite Formation in Ischemic Stroke Linked to Neural Damage. Journal of

Neuroscience, v. 19, p. 5910-5918, 1999.

ELIASSON, M.J., SAMPEI, K., MANDIR, A.S., HURN, P.D., TRAYSTMAN, R.J., BAO,

J., PIEPER, A., WANG, Z.Q., DAWSON, T.M., SNYDER, S.H., DAWSON, V.L.:

Poly(Adp-Ribose) Polymerase Gene Disruption Renders Mice Resistant to Cerebral

Ischemia. Nature Medicine, v. 3, p. 1089-1095, 1997.

FALCAO, A.L., VERAS, I., CARVALHO, E.M.F., BARRETO, K.M.L: Early

Cerebrovascular Accident: Implications in Working-Age Adults Assisted by the

Brazilian Public Health System. Revista Brasileira de Saúde Materno Infantil, v. 4,

p. 95-101, 2004.

FOWLER, J.H., MCCRACKEN, E., DEWAR, D., MCCULLOCH, J.: Intracerebral

Injection of Ampa Causes Axonal Damage in Vivo. Brain Research, v. 991, p. 104-

112, 2003.

FREGNI, F., PASCUAL-LEONE, A.: Hand Motor Recovery after Stroke: Tuning the

Orchestra to Improve Hand Motor Function. Cognitive and Behavioral Neurology,

v. 19, p. 21-33, 2006.

FREIRE, M.A., GOMES-LEAL, W., PEREIRA JR, FRANCA, JG, GUIMARÃES JS,

PICANÇO-DINIZ, C.W.: Morphometric Study of the Progressive Changes on Nadph

Diaphorase Activity in the Developing Rat’s Barrel Field. Neuroscience Research, v.

p. 2004.

FUXE, K., CINTRA, A., ANDBJER, B., ANGGARD, E., GOLDSTEIN, M., AGNATI,

L.F.: Centrally Administered Endothelin-1 Produces Lesions in the Brain of the Male

Rat. Acta Physiologica Scandinavica, v. 137, p. 155-156, 1989.

FUXE, K., KUROSAWA, N., CINTRA, A., HALLSTROM, A., GOINY, M., ROSEN, L.,

AGNATI, L.F., UNGERSTEDT, U.: Involvement of Local Ischemia in Endothelin-1

Induced Lesions of the Neostriatum of the Anaesthetized Rat. Experimental Brain

Research, v. 88, p. 131-139, 1992.

GENTLEMAN, S.M., NASH, M.J., SWEETING, C.J., GRAHAM, D.I., ROBERTS, G.W.:

Beta-Amyloid Precursor Protein (Beta App) as a Marker for Axonal Injury after Head

Injury. Neuroscience Letters, v. 160, p. 139-144, 1993.

GINSBERG, M.D., BELAYEV, L., ZHAO, W., HUH, P.W.,BUSTO, R.: The Acute

Ischemic Penumbra: Topography, Life Span and Therapeutic Response. Acta

Neuchir.Suppl., v. 72, p. 45-50, 1999.

GOMES-LEAL, W.: Inflamação Aguda, Resposta Glial E Degeneração Axonal Em Um

Modelo De Excitotoxicidade Na Medula Espinhal. In Departamento de Morfologia,

CCB. Belém, Universidade Federal do Pará, 2002a:197.

GOMES-LEAL, W., CORKILL, D.J., FREIRE, M.A.M, PICANÇO-DINIZ, C.W.P.,

PERRY, V.H.: Astrocytosis, Microglia Activation, Oligodendrocyte Degeneration and

Pyknosis Following Acute Spinal Cord Injury. Experimental Neurology, v. 190, p.

456-467, 2004.

GOMES-LEAL, W., CORKILL, D.J., PICANÇO-DINIZ, C.W., PERRY, V.H.: Systematic

Analysis of Axonal Damage and Its Possible Correlation with Inflammatory Response

in Different White Matter Tracts of Acutely Injured Rat Spinal Cord. Brain

Research, v. 1066, p. 57-70, 2005.

GOMES-LEAL, W., CORKILL, D.J., PICANÇO-DINIZ, C.W.P., PERRY, V.H.: Acute

Inflammation, Glial Activation and Axonal Damage in an Excitotoxic Model of Acute

Spinal Cord Injury. International Spinal Cord Annual Meeting abstracts., v. p.

2002b.

HALL, E.D., BRAUGHLER, J.M.: Free Radicals in Cns Injury. Reseach Publications

Association for Research in Nervous and Mental Disease, v. 71, p. 81-105, 1993.

HARA, K., KONG, D.L., SHARP, F.R., WEINSTEIN, P.R.: Effect of Selective Inhibition

of Cyclooxygenase 2 on Temporary Focal Cerebral Ischemia in Rats. Neuroscience

Letters, v. 256, p. 53-56, 1998.

HELDMANN, U., THORED, P., CLAASEN, J.H., ARVIDSSON, A., KOKAIA, Z.,

LINDVALL, O.: Tnf-Alpha Antibody Infusion Impairs Survival of Stroke-Generated

Neuroblasts in Adult Rat Brain. Experimental Neurology, v. 196, p. 204-208, 2005.

HENGARTNER, M.: The Biochemistry of Apoptosis. Nature, v. 407, p. 770-776, 2000.

HILLIS, A.E.: Neurobiology of Unilateral Spatial Neglect. Neuroscientist, v. 12, p. 153-

163, 2006.

HIROSE, K., CHAN, P.H.: Blockade of Glutamate Excitotoxicity and Its Clinical

Applications. Neurochemical Research, v. 18, p. 479-483, 1993.

HLUSTIK, P., MAYER, M.: Paretic Hand in Stroke: From Motor Cortical Plasticity

Research to Rehabilitation. Cognitive and Behavioral Neurology, v. 19, p. 34-40,

2006.

HOLMIN, S., SODERLUND, J., BIBERFELD, P., MATHIESEN, T.: Intracerebral

Inflammation after Human Brain Contusion. Neurosurgery, v. 42, p. 291-298;

discussion 298-299., 1998.

HOM, G.J., TOUHEY, B., RUBANYI, G.M.: Effects of Intracoronary Administration of

Endothelin in Anesthetized Dogs: Comparison with Bay K 8644 and U 46619.

Journal of Cardiovascular Pharmacology, v. 19, p. 194-200, 1992.

HUGHES, P.M., ANTHONY, D.C., RUDDIN, M., BOTHAM, M.S., RANKINE, E.L.,

SABLONE, M., BAUMANN, D., MIR, A.K., PERRY, V.H.: Focal Lesions in the Rat

Central Nervous System Induced by Endothelin-1. Journal of Neuropathology and

Experimental Neurology, v. 62, p. 1276-1286, 2003.

IADECOLA, C., ALEXANDER, M.: Cerebral Ischemia and Inflammation. Current

Opinion in Neurology, v. 14, p. 89-94, 2001.

IADECOLA, C., ROSS, M.E.: Molecular Pathology of Cerebral Ischemia: Delayed Gene

Expression and Strategies for Neuroprotection. Annals of the New York Academy of

Sciences Ann N Y Acad Sci, v. 835, p. 203-217, 1997.

IRVING, E.A., BENTLEY, D.L., PARSONS, A.A.: Assessment of White Matter Injury

Following Prolonged Focal Cerebral Ischaemia in the Rat. Acta Neuropathologica

(Berl), v. 102, p. 627-635, 2001.

IRVING, E.A., MCCULLOCH, J., DEWAR, D.: Intracortical Perfusion of Glutamate in

Vivo Induces Alterations of Tau and Microtubule-Associated Protein 2

Immunoreactivity in the Rat. Acta Neuropathologica, v. 92, p. 186-196, 1996a.

IRVING, E.A., NICOLL, J., GRAHAM, D.I., DEWAR, D.: Increased Tau

Immunoreactivity in Oligodendrocytes Following Human Stroke and Head Injury.

Neuroscience Letters, v. 213, p. 189-192, 1996b.

IRVING, E.A., YATSUSHIRO, K., MCCULLOCH, J., DEWAR, D.: Rapid Alteration of

Tau in Oligodendrocytes after Focal Ischemic Injury in the Rat: Involvement of Free

Radicals. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, v. 17, p. 612-622,

1997.

JEMMERSON, R., DUBINSKY, J.M., BRUSTOVETSKY, N.: Cytochrome C Release

from Cns Mitochondria and Potential for Clinical Intervention in Apoptosis-Mediated

Cns Diseases. Antioxid Redox Signal, v. 7, p. 1158-1172, 2005.

KABANOV, A.V., BATRAKOVA, E.V.: New Technologies for Drug Delivery across the

Blood Brain Barrier. Current Pharmaceutical Design, v. 10, p. 1355-1363, 2004.

KANELLOPOULOS, G.K., XU, X.M., HSU, C.Y., LU, X., SUNDT, T.M.,

KOUCHOUKOS, N.T.: White Matter Injury in Spinal Cord Ischemia: Protection by

Ampa/Kainate Glutamate Receptor Antagonism. Stroke, v. 31, p. 1945-1952, 2000.

KNOLLER N, A.G., FULGA V, ZELIG G, ATTIAS J, BAKIMER R, MARDER JB,

YOLES E, BELKIN M, SCHWARTZ M, HADANI M.: Clinical Experience Using

Incubated Autologous Macrophages as a Treatment for Complete Spinal Cord Injury:

Phase I Study Results. Journal of Neurosurgery Spine, v. 3, p. 173-181, 2005.

KOKAIA, Z., THORED, P., ARVIDSSON, A., LINDVALL, O.: Regulation of Stroke-

Induced Neurogenesis in Adult Brain--Recent Scientific Progress. Cerebral Cortex,

v. 16 Suppl 1, p. i162-167, 2006.

KREUTZBERG, G.W.: Microglia: A Sensor for Pathological Events in the Cns. Trends of

Neuroscience, v. 19, p. 312-318., 1996.

LAMPL, Y., FLEMINGER, G., GILAD, R., GALRON, R., SAROVA-PINHAS, I.,

SOKOLOVSKY, M.: Endothelin in Cerebrospinal Fluid and Plasma of Patients in the

Early Stage of Ischemic Stroke. Stroke, v. 28, p. 1951-1955, 1997.

LAZAROV-SPIEGLER, O., RAPALINO, O., AGRANOV, G., SCHWARTZ, M.:

Restricted Inflammatory Reaction in the Cns: A Key Impediment to Axonal

Regeneration? Molecular Medicine Today, v. 4, p. 337-342., 1998.

LAZAROV-SPIEGLER, O., SOLOMON, A.S., ZEEV-BRANN, A.B., HIRSCHBERG,

D.L., LAVIE, V., SCHWARTZ, M.: Transplantation of Activated Macrophages

Overcomes Central Nervous System Regrowth Failure. The Faseb Journal, v. 10, p.

1296-1302., 1996.

LEWEN, A., MATZ, P., CHAN, P.H.: Free Radical Pathways in Cns Injury. Journal of

Neurotrauma, v. 17, p. 871-890., 2000.

LI, G.L., FAROOQUE, M., HOLTZ, A., OLSSON, Y.: Changes of Beta-Amyloid

Precursor Protein after Compression Trauma to the Spinal Cord: An Experimental

Study in the Rat Using Immunohistochemistry. Journal of Neurotrauma, v. 12, p.

269-277, 1995.

LI, S., JIANG, Q., STYS, P.K.: Important Role of Reverse Na(+)-Ca(2+) Exchange in

Spinal Cord White Matter Injury at Physiological Temperature. Journal of

Neurophysiology, v. 84, p. 1116-1119, 2000.

LI, S., MEALING, G.A., MORLEY, P., STYS, P.K.: Novel Injury Mechanism in Anoxia

and Trauma of Spinal Cord White Matter: Glutamate Release Via Reverse Na+-

Dependent Glutamate Transport. Journal of Neuroscience, v. 19, p. RC16, 1999.

LI, S., STYS, P.K.: Mechanisms of Ionotropic Glutamate Receptor-Mediated Excitotoxicity

in Isolated Spinal Cord White Matter. Journal of Neuroscience, v. 20, p. 1190-1198,

2000.

LI, S., STYS, P.K.: Na(+)-K(+)-Atpase Inhibition and Depolarization Induce Glutamate

Release Via Reverse Na(+)-Dependent Transport in Spinal Cord White Matter.

Neuroscience, v. 107, p. 675-683, 2001.

LIPTON, P.: Ischemic Cell Death in Brain Neurons. Physiological Reviews, v. 79, p. 1432-

1568, 1999.

LO, E.H., DALKARA, T., MOSKOWITZ, M.A.: Mechanisms, Challenges and

Opportunities in Stroke. Nature reviews neuroscience, v. 4, p. 399-415, 2003.

LOSSI, L., CANTILE, C., TAMAGNO, I., MERIGHI, A.: Apoptosis in the Mammalian

Cns: Lessons from Animal Models. Vet Journal, v. 170, p. 52-66, 2005.

LOVE, S.: Oxidative Stress in Brain Ischemia. Brain Pathology, v. 9, p. 119-131., 1999.

LYNCH, D.R., DAWSON, T.M.: Secondary Mechanisms in Neuronal Trauma. Current

Opinion in Neurology, v. 7, p. 510-516, 1994.

MAHMOOD, A., LU, D., QU, C., GOUSSEV, A., CHOPP, M.: Long-Term Recovery after

Bone Marrow Stromal Cell Treatment of Traumatic Brain Injury in Rats. Journal of

Neurosurgery, v. 104, p. 272-277, 2006.

MARQUARDT, L., RUF, A., MANSMANN, U., WINTER, R., BUGGLE, F.,

KALLENBERG, K., GRAU, A.J.: Inflammatory Response after Acute Ischemic

Stroke. Journal of the Neurological Sciences, v. 236, p. 65-71, 2005.

MARTIN, L.J., AL_ABDULLA, N.A., BRAMBRINK, A.M., KIRSCH, J.R., SIEBER,

F.E., PORTERA_CAILLIAU, C.: Neurodegeneration in Excitotoxicity, Global

Cerebral Ischemia, and Target Deprivation: A Perspective on the Contributions of

Apoptosis and Necrosis. Brain Research Bulletin, v. 46, p. 281-309, 1998.

MASAKI, T., YANAGISAWA, M.: Endothelins. Essays in Biochemistry, v. 27, p. 79-89,

1992.

MATTSON, M.P., CULMSEE, C., YU, Z.F.: Apoptotic and Antiapoptotic Mechanisms in

Stroke. Cell and Tissue Research, v. 301, p. 173-187, 2000.

MATUTE, C., SANCHEZ_GOMEZ, M.V., MARTINEZ_MILLAN, L., MILEDI, R.:

Glutamate Receptor-Mediated Toxicity in Optic Nerve Oligodendrocytes.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America, v. 94, p. 8830-8835, 1997.

MATYSZAK, M.K.: Inflammation in the Cns: Balance between Immunological Privilege

and Immune Responses. Progress in Neurobiology, v. 56, p. 19-35., 1998.

MCCRACKEN, E., FOWLER, J.H., DEWAR, D., MORRISON, S., MCCULLOCH, J.:

Grey Matter and White Matter Ischemic Damage Is Reduced by the Competitive

Ampa Receptor Antagonist, Spd 502. Journal of Cerebral Blood Flow and

Metabolism, v. 22, p. 1090-1097, 2002.

MCDONALD, J.W., ALTHOMSONS, S.P., HYRC, K.L., CHOI, D.W., GOLDBERG,

M.P.: Oligodendrocytes from Forebrain Are Highly Vulnerable to Ampa/Kainate

Receptor-Mediated Excitotoxicity. Nature Medicine, v. 4, p. 291-297., 1998.

MCKENZIE, K.J., MCLELLAN, D.R., GENTLEMAN, S.M., MAXWELL, W.L.,

GENNARELLI, T.A., GRAHAM, D.I.: Is Beta-App a Marker of Axonal Damage in

Short-Surviving Head Injury? Acta Neuropathologica, v. 92, p. 608-613., 1996.

MELDRUM, B.: Amino Acids as Dietary Excitotoxins: A Contribution to Understanding

Neurodegenerative Disorders. Brain Research. Brain Research Reviews, v. 18, p.

293-314, 2000a.

MELDRUM, B.S.: Glutamate as a Neurotransmitter in the Brain: Review of Physiology and

Pathology. Journal of Nutrition, v. 130, p. 1007S-1015S, 2000b.

MELDRUM, B.S.: The Role of Glutamate in Epilepsy and Other Cns Disorders.

Neurology, v. 44, p. S14-23, 1994.

MERGENTHALER, P., DIRNAGL, U., MEISEL, A.: Pathophysiology of Stroke: Lessons

from Animal Models. Metabolic Brain Disease, v. 19, p. 151-167, 2004.

MINGHETTI, L., LEVI, G.: Microglia as Effector Cells in Brain Damage and Repair:

Focus on Prostanoids and Nitric Oxide. Progress in Neurobiology, v. 54, p. 99-125.,

1998.

MOTTE, S., MCENTEE, K., NAEIJE, R.: Endothelin Receptor Antagonists.

Pharmacology & Therapeutics, v. p. 2005.

NOGAWA, S., ZHANG, F., ROSS, M.E., IADECOLA, C.: Cyclo-Oxygenase-2 Gene

Expression in Neurons Contributes to Ischemic Brain Damage. Journal of

Neuroscience, v. 17, p. 2746-2755, 1997.

NOSHITA, N., SUGAWARA, T., HAYASHI, T., LEWEN, A., OMAR, G., CHAN, P.H.:

Copper/Zinc Superoxide Dismutase Attenuates Neuronal Cell Death by Preventing

Extracellular Signal-Regulated Kinase Activation after Transient Focal Cerebral

Ischemia in Mice. Journal of Neuroscience, v. 22, p. 7923-7930, 2002.

PANTONI, L., GARCIA, J.H., GUTIERREZ, J.A.: Cerebral White Matter Is Highly

Vulnerable to Ischemia. Stroke, v. 27, p. 1641-1646; discussion 1647, 1996.

PARK, E., LIU, Y., FEHLINGS, M.G.: Changes in Glial Cell White Matter Ampa Receptor

Expression after Spinal Cord Injury and Relationship to Apoptotic Cell Death.

Experimental Neurology, v. 182, p. 35-48, 2003.

PARK, L., THORNHILL, J.: Hypoxic Modulation of Striatal Lesions Induced by

Administration of Endothelin-1. Brain Research, v. 883, p. 51-59, 2000.

PAXINOS, G.: The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates San Diego, Elsevier, 1982.

PELLEGATTA, F., LU, Y., RADAELLI, A., ZOCCHI, M.R., FERRERO, E.,

CHIERCHIA, S., GAJA, G., FERRERO, M.E.: Drug-Induced in Vitro Inhibition of

Neutrophil-Endothelial Cell Adhesion. Brain Journal of Pharmacology, v. 118, p.

471-476, 1996.

PEREZ-ASENSIO, F.J., HURTADO, O., BURGUETE, M.C., MORO, M.A., SALOM,

J.B., LIZASOAIN, I., TORREGROSA, G., LEZA, J.C., ALBORCH, E., CASTILLO,

J., KNOWLES, R.G., LORENZO, P.: Inhibition of Inos Activity by 1400w Decreases

Glutamate Release and Ameliorates Stroke Outcome after Experimental Ischemia.

Neurobiology Disease, v. 18, p. 375-384, 2005.

PETTY, M.A., WETTSTEIN, J.G.: White Matter Ischaemia. Brain Research. Brain

Research Reviews, v. 31, p. 58-64, 1999.

PICANCO-DINIZ, C.W., BOCHE, D., GOMES-LEAL, W., CUNNINGHAN, C, PERRY,

VH: Neuropil and Neuronal Changes in Hippocampal Nadph-Diaphorase

Histochemistry in the Me7 Model of Murine Prion Disese. Neuropathology and

Applied Neurobiology, v. p. 2004.

PIN, J.P., DE_COLLE, C., BESSIS, A.S., ACHER, F.: New Perspectives for the

Development of Selective Metabotropic Glutamate Receptor Ligands. European

Journal of Pharmacology, v. 375, p. 277-294, 1999.

POPOVICH, P.G., GUAN, Z., WEI, P., HUITINGA, I., VAN ROOIJEN, N., STOKES,

B.T.: Depletion of Hematogenous Macrophages Promotes Partial Hindlimb Recovery

and Neuroanatomical Repair after Experimental Spinal Cord Injury. Experimental

Neurology, v. 158, p. 351-365., 1999.

RAPALINO, O., LAZAROV-SPIEGLER, O., AGRANOV, E., VELAN, G.J., YOLES, E.,

FRAIDAKIS, M., SOLOMON, A., GEPSTEIN, R., KATZ, A., BELKIN, M.,

HADANI, M., SCHWARTZ, M.: Implantation of Stimulated Homologous

Macrophages Results in Partial Recovery of Paraplegic Rats. Nature Medicine, v. 4,

p. 814-821., 1998.

RIJNTJES, M.: Mechanisms of Recovery in Stroke Patients with Hemiparesis or Aphasia:

New Insights, Old Questions and the Meaning of Therapies. Current Opinion in

Neurology, v. 19, p. 76-83, 2006.

ROBINSON, A.P., WHITE, T.M., MASON, D.W.: Macrophage Heterogeneity in the Rat

as Delineated by Two Monoclonal Antibodies Mrc Ox-41 and Mrc Ox-42, the Latter

Recognizing Complement Receptor Type 3. Immunology, v. 57, p. 239-247., 1986.

ROSENBERG, L.J., TENG, Y.D., WRATHALL, J.R.: 2,3-Dihydroxy-6-Nitro-7-

Sulfamoyl-Benzo(F)Quinoxaline Reduces Glial Loss and Acute White Matter

Pathology after Experimental Spinal Cord Contusion. Journal of Neuroscience, v.

19, p. 464-475, 1999.

ROTHMAN, S.M., OLNEY, J.W.: Glutamate and the Pathophysiology of Hypoxic--

Ischemic Brain Damage. Annals of Neurology, v. 19, p. 105-111, 1986.

RUBANYI, G.M., POLOKOFF, M.A.: Endothelins: Molecular Biology, Biochemistry,

Pharmacology, Physiology, and Pathophysiology. Pharmacological Reviews, v. 46,

p. 325-415, 1994.

SCHABITZ, W.R., LI, F., FISHER, M.: The N-Methyl-D-Aspartate Antagonist Cns 1102

Protects Cerebral Gray and White Matter from Ischemic Injury Following Temporary

Focal Ischemia in Rats. Stroke, v. 31, p. 1709-1714, 2000.

SCHNELL, L., FEARN, S., KLASSEN, H., SCHWAB, M.E., PERRY, V.H.: Acute

Inflammatory Responses to Mechanical Lesions in the Cns: Differences between

Brain and Spinal Cord. European Journal of Neuroscience, v. 11, p. 3648-3658,

1999.

SCHULZ, J.B., WELLER, M., MOSKOWITZ, M.A.: Caspases as Treatment Targets in

Stroke and Neurodegenerative Diseases. Annals of Neurology, v. 45, p. 421-429,

1999.

SCHWAB, M.E., BARTHOLDI, D.: Degeneration and Regeneration of Axons in the

Lesioned Spinal Cord. Physiological Reviews, v. 76, p. 319-370., 1996.

SCHWARTZ, M., YOLES, E.: Macrophages and Dendritic Cells Treatment of Spinal Cord

Injury: From the Bench to the Clinic. Acta Neurochirurgica Supplements, v. 93, p.

147-150, 2005.

SHEN, L.H., LI, Y., CHEN, J., ZACHAREK, A., GAO, Q., KAPKE, A., LU, M.,

RAGINSKI, K., VANGURI, P., SMITH, A., CHOPP, M.: Therapeutic Benefit of

Bone Marrow Stromal Cells Administered 1 Month after Stroke. Journal of Cerebral

Blood Flow and Metabolism, v. p. 2006a.

SHEN, L.H., LI, Y., CHEN, J., ZHANG, J., VANGURI, P., BORNEMAN, J., CHOPP, M.:

Intracarotid Transplantation of Bone Marrow Stromal Cells Increases Axon-Myelin

Remodeling after Stroke. Neuroscience, v. 137, p. 393-399, 2006b.

SNIDER, B.J., GOTTRON, F.J., CHOI, D.W.: Apoptosis and Necrosis in Cerebrovascular

Disease. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 893, p. 243-253, 1999.

STOLL, G., JANDER, S., SCHROETER, M.: Inflammation and Glial Responses in

Ischemic Brain Lesions. Progress in Neurobiology, v. 56, p. 149-171., 1998.

STREIT, W.J., MRAK, R.E., GRIFFIN, W.S.T.: Microglia and Neuroinflammation: A

Pathological Perspective. Journal of Neuroinflammation, v. 1, p. 14, 2004.

STYS, P.K.: Anoxic and Ischemic Injury of Myelinated Axons in Cns White Matter: From

Mechanistic Concepts to Therapeutics. Journal of Cerebral Blood Flow and

Metabolism, v. 18, p. 2-25, 1998.

STYS, P.K.: General Mechanisms of Axonal Damage and Its Prevention. Journal of

Neurological Sciences, v. 233, p. 3-13, 2005.

STYS, P.K.: White Matter Injury Mechanisms. Current molecular medicine, v. 4, p. 113-

130, 2004.

SUGAWARA, T., FUJIMURA, M., NOSHITA, N., KIM, G.W., SAITO, A., HAYASHI,

T., NARASIMHAN, P., MAIER, C.M., CHAN, P.H.: Neuronal Death/Survival

Signaling Pathways in Cerebral Ischemia. NeuroRx, v. 1, p. 17-25, 2004.

TAOKA, Y., OKAJIMA, K., MURAKAMI, K., JOHNO, M., NARUO, M.: Role of

Neutrophil Elastase in Compression-Induced Spinal Cord Injury in Rats. Brain

Research, v. 799, p. 264-269., 1998.

TAOKA, Y., OKAJIMA, K., UCHIBA, M., MURAKAMI, K., KUSHIMOTO, S., JOHNO,

M., NARUO, M., OKABE, H., TAKATSUKI, K.: Role of Neutrophils in Spinal Cord

Injury in the Rat. Neuroscience, v. 79, p. 1177-1182., 1997.

TATOR, C.H., FEHLINGS, M.G.: Review of the Secondary Injury Theory of Acute Spinal

Cord Trauma with Emphasis on Vascular Mechanisms. Journal of Neurosurgery, v.

75, p. 15-26., 1991.

TATOR, C.H., KOYANAGI, I.: Vascular Mechanisms in the Pathophysiology of Human

Spinal Cord Injury. Journal of Neurosurgery, v. 86, p. 483-492., 1997.

TAYLOR, T.N., DAVIS, P.H., TORNER, J.C., HOLMES, J., MEYER, J.W., JACOBSON,

M.F.: Lifetime Cost of Stroke in the United States. Stroke, v. 27, p. 1459-1466, 1996.

THORED, P., ARVIDSSON, A., CACCI, E., AHLENIUS, H., KALLUR, T., DARSALIA,

V., EKDAHL, C.T., KOKAIA, Z., LINDVALL, O.: Persistent Production of Neurons

from Adult Brain Stem Cells During Recovery after Stroke. Stem Cells, v. 24, p. 739-

747, 2006.

VILLARREAL, G., ZAGORSKI, J., WAHL, S.M.T., F.: Inflammation:Acute.

Encyclopedia of Life Sciences, v. p. 1-8, 2001.

WAKEFIELD, D., KUMAR, R.K.: Inflammation:Chronic. Encyclopedia of Life Sciences,

v. p. 2001.

WATANABE, M., FUJIMURA, Y., NAKAMURA, M., YATO, Y., OHTA, K., OKAI, H.,

OGAWA, Y.: Changes of Amino Acid Levels and Aspartate Distribution in the

Cervical Spinal Cord after Traumatic Spinal Cord Injury. Journal of Neurotrauma,

v. 15, p. 285-293, 1998.

WEAVER, C.E., MAREK, P., PARK_CHUNG, M., TAM, S.W., FARB, D.H.:

Neuroprotective Activity of a New Class of Steroidal Inhibitors of the N-Methyl-D-

Aspartate Receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, v. 94, p. 10450-10454, 1997.

WYSS-CORAY, T., MUCKE, L.: Inflammation in Neurodegenerative Disese - a Double

Edged Sword. Neuron, v. 35, p. 419-432, 2002.

YAM, P.S., PATTERSON, J., GRAHAM, D.I., TAKASAGO, T., DEWAR, D.,

MCCULLOCH, J.: Topographical and Quantitative Assessment of White Matter

Injury Following a Focal Ischaemic Lesion in the Rat Brain. Brain Research, v. 2, p.

315-322, 1998.

YAM, P.S., TAKASAGO, T., DEWAR, D., GRAHAM, D.I., MCCULLOCH, J.: Amyloid

Precursor Protein Accumulates in White Matter at the Margin of a Focal Ischaemic

Lesion. Brain Research, v. 760, p. 150-157, 1997.

YAMAURA, I., YONE, K., NAKAHARA, S., NAGAMINE, T., BABA, H., UCHIDA, K.,

KOMIYA, S.: Mechanism of Destructive Pathologic Changes in the Spinal Cord

under Chronic Mechanical Compression. Spine, v. 27, p. 21-26., 2002.

YANAGISAWA, M., KURIHARA, H., KIMURA, S., GOTO, K., MASAKI, T.: A Novel

Peptide Vasoconstrictor, Endothelin, Is Produced by Vascular Endothelium and

Modulates Smooth Muscle Ca2+ Channels. Journal of Hypertension Supplement,

v. 6, p. S188-191, 1988a.

YANAGISAWA, M., KURIHARA, H., KIMURA, S., TOMOBE, Y., KOBAYASHI, M.,

MITSUI, Y., YAZAKI, Y., GOTO, K., MASAKI, T.: A Novel Potent Vasoconstrictor

Peptide Produced by Vascular Endothelial Cells. Nature, v. 332, p. 411-415, 1988b.

YANAGISAWA, M., MASAKI, T.: Endothelin, a Novel Endothelium-Derived Peptide.

Pharmacological Activities, Regulation and Possible Roles in Cardiovascular Control.

Biochemical Pharmacology, v. 38, p. 1877-1883, 1989.

ZHAO, Q., PAHLMARK, K., SMITH, M.L., SIESJO, B.K.: Delayed Treatment with the

Spin Trap Alpha-Phenyl-N-Tert-Butyl Nitrone (Pbn) Reduces Infarct Size Following

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats. Acta Physiological

Scandinavica, v. 152, p. 349-350, 1994.

ZIPFEL, G.J., BABCOCK, D.J., LEE, J.M., CHOI, D.W.: Neuronal Apoptosis after Cns

Injury: The Roles of Glutamate and Calcium. Journal of Neurotrauma, v. 17, p. 857-

869, 2000.

ZIV, I., FLEMINGER, G., DJALDETTI, R., ACHIRON, A., MELAMED, E.,

SOKOLOVSKY, M.: Increased Plasma Endothelin-1 in Acute Ischemic Stroke.

Stroke, v. 23, p. 1014-1016, 1992.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 