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Jamille de Araújo Bitencourt
“Análise Citogenética de espécies do gênero
Hypostomus (Loricariidae; Hypostominae) das bacias
do rio de Contas e Recôncavo Sul/Bahia.”
Londrina
2010
Universidade Estadual de Londrina
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Jamille de Araújo Bitencourt
“Análise Citogenética de espécies do gênero
Hypostomus (Loricariidae; Hypostominae) das bacias
do rio de Contas e Recôncavo Sul/Bahia.”
Londrina
2010
Instituto Agronômico do Paraná
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Universidade Estadual de Londrina
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Jamille de Araújo Bitencourt
“Análise Citogenética de espécies do gênero
Hypostomus (Loricariidae; Hypostominae) das bacias
do rio de Contas e Recôncavo Sul/Bahia.”
Dissertação apresentada ao Programa de Pós–
Graduação em Genética e Biologia Molecular,
da Universidade Estadual de Londrina, como
requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre.
Orientadora: Dr. Ana Lúcia Dias
Co-Orientador: Paulo Roberto Antunes de
Mello Affonso
Londrina
2010
Jamille de Araújo Bitencourt
Análise Citogenética de espécies do gênero Hypostomus (Loricariidae; Hypostominae)
das bacias do rio de Contas e Recôncavo Sul/Bahia.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Genética e Biologia Molecular da
Universidade Estadual de Londrina como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profº Dr. Luiz Antonio Carlos Bertollo
Universidade Federal de São Carlos
Profº Dr ºAndré Laforga Vanzella
Universidade Estadual de Londrina
Profª Drª Ana Lúcia Dias
Universidade Estadual de Londrina
Londrina, 26 de fevereiro de 2010
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pela vida concedida, por estar presente em
cada obstáculo me ajudando a superá-los iluminando meus passos.
À minha querida orientadora Ana Lucia Dias, por ter me aceitado, pela
confiança, paciência, ensinamentos e por estar sempre disposta a me ajudar.
Ao meu amigo, co-orientador Paulo Roberto, por ter dispertado o meu interesse
pelo conhecimento, pelos momentos de aprendizagem e estímulo constantes, e por me
fazer acreditar que sou capaz. Sem ele com certeza a concretização desse sonho não
seria possível.
À professora Lucia Giuliano-Caetano, pela oportunidade e pelas valiosas
contribuições que foram essenciais para o desenvolvimento desse trabalho.
À Renata da Rosa, pelas sugestões e críticas fundamentais oferecidas durante o
exame de qualificação.
Aos membros da banca examinadora, o prof
o
. Dr. André Laforga Vanzella pelas
excelentes sugestões oferecidas e o prof
o
. Dr. Luiz Antonio Carlos Bertollo, pela sua
atenção, generosidade e cuidado, suas sugestões foram fundamentais para a conclusão
deste trabalho. Muito obrigada.
Ao CNPq pelo financiamento do projeto e apoio no andamento das pesquisas.
À Universidade Estadual de Londrina e o Programa de Pós Graduação em
Genética e Biologia Molecular, pela estrutura e apoio necessários.
À Sueli, secretária da pós-graduação, por ser muito prestativa, e esta sempre de
bom humor.
À toda a minha família, em especial Felipe, Cardoso e Dinda, por serem meu
suporte, pela força, carinho e amor. À mainha (Vera), pois tudo que sou devo a ela. Essa
é mais uma vitória nossa.
Ao meu pai, por ser um exemplo a se seguir e que, apesar de não estar mais entre
nós, está presente em meu coração e minhas lembranças.
Ao meu noivo e eterno companheiro Álvaro, por estar sempre ao meu lado e
pela compreensão nos momentos em que estive ausente. Obrigada por existir em minha
vida.
Aos amigos e colegas do laboratório, (Marce, Natalia, Angelica de Paula,
Angélica Rossoti, Larissa pires, Larissa Lacerda, Vanessa, Tatiana, Renata, Ana
Cláudia, Laura, Vivian e Juceli), que são minha familia londrinense e que além do
apoio, tornaram a minha experiência ainda mais valiosa. Obrigada a todos pela
oportunidade de aprender e contribuir, nunca esquecerei vocês.
Em especial a minha amiga Josivanda e a meu irmãozinho relapso Fabio
Takagui, pelas alegrias e tristezas compartilhadas, pelas resenhas, conselhos e
companheirismo. Jamais seremos um ponto em cada parte do Braisl e sim um eterno
triangulo, pois onde eu for levarei vocês comigo no coração.
À amiga Michelli, um amor de pessoa, pela ajuda e incentivo, e por acreditar em
mim.
À todos os meus colegas e amigos de Londrina, especialmente Luana, Maikel,
Priscila e Juliana, que tornaram a presença neste curso ainda mais prazerosa.
À minha amiga Isabel (bolinho), por estar sempre presente nas minhas
conquistas, pela ajuda e apoio tão necessários.
Aos professores e amigos (Dr
a
. Ana Maria, Dr. Paulo Carneiro, Dr. Juvenal
Cordeiro, Sergio Siqueira Júnior, Vitor Hugo, Mavione e Aline) do laboratório de
Genética de Organismos Aquáticos (LAGOA) da Universidade Estadual do Sudoeste da
Bahia UESB, pelas contribuições e apoio tão essenciais para o desenvolvimento dessa
pesquisa.
A todos os meus amigos e pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram
para a execução desse trabalho, me insentivando intelectual e emocionalmente.
RESUMO
A fim de ampliar os dados citogenéticos da ictiofauna das bacias do Atlântico leste,
análises cromossômicas foram realizadas em populações de Hypostomus aff. unae e
Hypostomus cf. wuchereri (Loricariidae, Hypostominae) de bacias costeiras da Bahia,
Nordeste do Brasil. Todos os exemplares compartilharam o número modal de 2n=76 e
uma RON simples localizada no segundo par metacêntrico. Contudo, foram detectadas
fórmulas cariotípicas exclusivas de H. aff. unae para cada localidade amostrada ao
longo da bacia do rio de Contas (rios de Contas, Preto do Costa, Preto do Criciúma e
Oricó). Adicionalmente, as populações de ambas as espécies também foram
diferenciadas pela microestrutura cariotípica após bandamento C, coloração com
fluorocromos e digestão com as enzimas de restrição Alu I, Bam HI, Hae III e Dde I. As
populações de H. aff. unae dos rios de Contas e Preto do Costa apresentaram blocos
heterocromáticos terminais e intersticiais ricos em pares de bases AT na maioria dos
cromossomos acrocêntricos, diferenciando-se quanto a posição e pares envolvidos. Já os
espécimes da população do rio Preto do Criciúma apresentaram marcações DAPI
positivas (mais evidentes), nas regiões intersticiais, enquanto que na população do rio
Oricó, os blocos heterocromáticos intersticiais e terminais foram observados corados
igualmente por CMA
3
e DAPI. Apenas esta última população não apresentou
heterocromatina associada à região organizadora de nucléolo, porém, todas elas
apresentaram as RONs ricas em bases GC. Em relação às duas populações de H. cf.
wuchereri, diferenças na microestrutura também foram igualmente assinaladas. A
população do rio Una (bacia do Recôncavo Sul) apresentou grandes blocos
heterocromáticos terminais, compostos por sítios intercalados ricos em AT e GC,
enquanto que a população do rio Mutum (bacia do rio de Contas) apresentou regiões de
heterocromatina intersticiais e terminais menos evidentes, ricas em AT. Em ambas, as
RONs apresentaram-se CMA
3
positivas, porém, não foi evidenciada heterocromatina
associada à essa região. Os resultados obtidos com a digestão enzimática revelaram
grande heterogeneidade entre as populações das duas espécies analisadas e permitiram a
caracterização de diferentes famílias de DNA repetitivo, além de padrões específicos
gerados nas regiões eucromáticas. Os dados do presente trabalho demonstram que H.
aff. unae e H. cf. wuchereri apresentam uma evolução cariotípica divergente entre as
populações analisadas, caracterizando distintas unidades evolutivas.
Palavras-chave: Bacias do Leste, enzimas de restrição, heterocromatina, Hypostominae.
ABSTRACT
In order to increase the cytogenetic data of the ichthyofauna from Eastern Atlantic
basins, chromosomal analyses were carried out in populations of Hypostomus aff. unae
and Hypostomus cf. wuchereri (Loricariidae, Hypostominae) from costal basins of
Bahia, Northeastern Brazil. All specimens shared a modal number of 2n=76 and single
NORs located on the second metacentric pair. However, exclusive karyotypic formulae
were detected within each sample of H. aff. unae throughout Contas river basin (Contas,
Preto do Costa, Preto do Criciúma and Oricó rivers). Moreover, populations of both
species were differentiated by their karyotype microstructure after C-banding,
fluorochrome staining and digestion with the restriction enzymes Alu I, Bam HI, Hae III
and Dde I. The populations of H. aff. unae from Contas and Preto do Costa rivers
presented AT-rich terminal and interstitial heterochromatic blocks in most of
acrocentric chromosomes, being distinguishable by the block position and pair
involved. On the other hand, the specimens from Preto do Criciúma River presented
more conspicuous DAPI-positive marks at the interstitial region, while the population
from Oricó River presented equally CMA
3
and DAPI stained heterochromatic segments.
Only the latter population lacked heterochromatin associated with the nucleolar
organizer regions, but all of them presented GC-rich NORs. As for both the two
populations of Hypostomus cf wuchereri, microstructure differences were also
observed. The population from Una River (Recôncavo Sul basin) presented large
terminal heterochromatic blocks interspersed with AT- and GC-rich regions, whereas
the samples from Mutum River (Contas river basin) showed paler AT-rich interstitial
and terminal heterochromatic regions. In both populations, the NORs were CMA
3
positive but no heterochromatin was observed. The results obtained by enzymatic
digestion revealed a remarkable heterogeneity among populations of both analyzed
species and allowed the characterization of different families of repetitive DNA, besides
specific patterns in the euchromatin. The present data show that the populations of H.
aff. unae and H. cf. wuchereri present a divergent karyotypic evolution between the
analyzed populations, characterizing distinct evolutionary units.
.
Key-words: Eastern Basins, Restriction Enzymes, Heterochromatin, Hypostominae.
LISTA DE TABELAS
Tabela 01. Dados citogenéticos em espécies de Loricariidae .................................................
20
Artigo I: CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA DE QUATRO POPULAÇÕES DE
Hypostomus aff. unae DA BACIA DO RIO DE CONTAS
Tabela 01. Dados citogenéticos compilados para espécies do gênero Hypostomus...............
49
Tabela 02. Fórmulas cariotípicas das populações de Hypostomus aff. unae agrupadas nas
classes m/sm e st/a.....................................................................................................................
52
Artigo II: ANÁLISE DA HETEROGENEIDADE DA HETEROCROMATINA EM
Hypostomus aff. unae (Siluriformes, Loricariidae)
Tabela 01. Relação das enzimas de restrição (ER) utilizadas nas preparações
cromossômicas de Hypostomus aff. unae, com as respectivos sítios de corte, concentrações
e tempos de incubação em que se obtiveram os melhores resultados.......................................
68
Tabela 02. Dados das populações referentes à digestão da heterocromatina pelas enzimas
AluI, Hae III, Dde I e Bam HI. .................................................................................................
71
Artigo III: CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA DE POPULAÇÕES Hypostomus
cf. wuchereri DE BACIAS HIDROGRÁFICAS COSTEIRAS DA BAHIA
Tabela 01. Dados das população do rio Una e Mutum referentes à digestão da
heterocromatina pelas Alu I, Hae III, Dde I e Bam HI. ............................................................
88
LISTA DE FIGURAS
Figura 01. A) Mapa representando a divisão hidrográfica nacional. B) Mapa da região
hidrográfica do Atlântico Leste e suas principais bacias. Fonte: Conselho Nacional de
Recursos Hídricos- CNRH, Agência Nacional de Águas- ANA, (2003) e Ministério do Meio
Ambiente – MMA, (2006)...........................................................................................................
33
Figura 02. Exemplares das populações de Hypostomus aff. unae: rio de Contas(A), rio Preto
do Costa (B), rio Oricó (C) e rio Preto do Criciúma (D). ...........................................................
34
Figura 03. Exemplar de Hypostomus cf. wuchereri. Fonte: Profº Dr. Claudio Zawadski
(UEM)..........................................................................................................................................
34
Figura 04. Locais de coleta. A) Mapa das bacias do Nordeste: IV- Bacia do rio de Contas; V-
Bacia do Recôncavo Sul. B) a- rio Una. C) a- rio de Contas, b- rio Preto do Costa, c- rio
Oricó, d- rio Preto do Criciúma e e- rio Mutum..........................................................................
34
Artigo I: CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA DE QUATRO POPULAÇÕES DE
Hypostomus aff. unae DA BACIA DO RIO DE CONTAS
Figura 01: Cariótipos das populações de Hypostomus aff. unae. (A) rio de Contas, (B) Preto
do Costa, (C) Oricó e (D) Preto do Criciúma. Em destaque o par portador das RONs após
tratamento com nitrato de Prata, bandamento C, coloração com CMA3 e FISH com sonda de
DNAr 18S. Observar em C a não ocorrência de heterocromatina associada às
RONs............................................................................................................................................
56
Figura 02: Cariótipos de Hypostomus aff. unae após bandamento C. (A) População do rio
das Contas, (B) População do rio Preto do Costa, (C) População do rio Oricó e (D) População
do rio Preto do Criciuma. Em destaque os cromossomos com sítios heteromórficos em A e
B...................................................................................................................................................
Figura 03. Metáfases de Hypostomus aff, unae das populações do rio das Contas (A), Preto
do Costa (B), Oricó (C) e Preto do Criciúma (D) após coloração com CMA 3. Os asteriscos
indicam os pares cromossômicos portadores das RONs e as setas evidenciam os sítios
positivos, ricos em pares de base GC na população do rio Preto do Costa.................................
57
58
Figura 04. Metáfases de Hypostomus aff. unae das populações do rio de Contas (A), Preto
do Costa (B), Oricó (C) e Preto do Criciúma (D) após coloração com DAPI, evidenciando
diversos cromossomos portadores de sítios positivos, ricos em pares de bases AT. Os
asteriscos indicam os pares portadores das RONs.......................................................................
59
Artigo II: ANÁLISE DA HETEROGENEIDADE DA HETEROCROMATINA EM
Hypostomus aff. unae (Siluriformes, Loricariidae)
Figura 01. Pares cromossômicos da população A de Hypostomus aff. unae evidenciando as
bandas heterocromáticas C-positivas e o padrão de bandas gerado com as endonucleases de
restrição: Alu I, Hae III, Dde I e Bam HI. ...................................................................................
75
Figura 02. Pares cromossômicos da população B de Hypostomus aff. unae evidenciando as
bandas heterocromáticas C-positivas e o padrão de bandas gerado com as endonucleases de
restrição: Alu I, Hae III, Dde I e Bam HI.....................................................................................
76
Figura 03. Pares cromossômicos da população C de Hypostomus aff. unae evidenciando as
bandas heterocromáticas C-positivas e o padrão de bandas gerado com as endonucleases de
restrição: Alu I, Hae III, Dde I e Bam HI. ...................................................................................
77
Figura 04. Pares cromossômicos da população D de Hypostomus aff. unae evidenciando as
bandas heterocromáticas C-positivas e o padrão de bandas gerado com as endonucleases de
restrição: Alu I, Hae III, Dde I e Bam HI.....................................................................................
77
Figura 05. Idiograma representativo dos pares cromossômicos das populações A, B, C e D
de Hypostomus aff. unae, evidenciando o padrão geral de bandas após a digestão com as
enzimas Alu I, Bam HI, Hae III e Dde I. ....................................................................................
78
Artigo III: CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA DE POPULAÇÕES Hypostomus
cf. wuchereri DE BACIAS HIDROGRÁFICAS COSTEIRAS DA BAHIA
Figura 01. Cariótipos de Hypostomus cf. wuchereri. (A) População do rio Mutum, (B)
População do rio Una. Em destaque os portadores das regiões organizadoras de nucléolo
(RONs) após a coloração com nitrato de Prata, (Ag RONs), bandamento C (BC) e coloração
com cromomicina A3 (CMA3)...................................................................................................
94
Figura 02. Pares cromossômicos com sítios heterocromáticos em Hypostomus cf. wuchereri.
(A) População do rio Una, (B) População do rio Mutum............................................................
94
Figura 03. Cromossomos de Hypostomus cf. wuchereri submetido a coloração com os
fluorocromos cromomicina A
3
(CMA
3
) e DAPI. População do rio Mutum: A e B. População
do rio Una: C e D. Os asteriscos indicam os cromossomos portadores das RONs. A, e C,=
CMA3 e B e D= DAPI.................................................................................................................
95
Figura 04. Pares cromossômicos de Hypostomus cf. wuchereri da população do rio Una
evidenciando as regiões heterocromáticas C-positivas e o padrão de bandas correspondentes
obtidos com as endonucleases de restrição: Alu I, Hae III, Dde I e Bam HI...............................
96
Figura 05. Pares cromossômicos de Hypostomus cf. wuchereri da população do rio Mutum
evidenciando as regiões heterocromáticas C-positivas e o padrão de bandas correspondentes
obtidos com as endonucleases de restrição: Alu I, Hae III, Dde I e Bam HI...............................
97
Figura 06. Idiograma representativo dos pares cromossômicos das populações de
Hypostomus cf. wuchereri evidenciando o padrão geral de bandas após a digestão com as
enzimas Alu I, Bam HI, Hae III e Dde I. População do rio Una (A), População do rio
Mutum(B).....................................................................................................................................
97
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................................
6
ABSTRACT……………………………………………………………………........………
7
1.0. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA.................................................................................
13
1.1. Caracterização da região hidrográfica do Atlântico Leste.....................................
13
1.1.1. Bacia do rio de Contas .....................................................................................
13
1.1.2. Sub -Bacia do Recôncavo Sul...........................................................................
15
1.2. Considerações gerais sobre a ordem Siluriformes e família Loricariidae.............
17
1.3. Citogenética da família Loricariidae com ênfase na subfamília
Hypostominae.........................................................................................................................
18
2.0. OBJETIVOS..............................................................................................................
31
2.1. OBJETIVO GERAL......................................................................................
31
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................
31
3.0. MATERIAL E LOCAL DE COLETA.....................................................................
32
4.0. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................
35
ARTIGO I...............................................................................................................................
44
CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA DE QUATRO POPULAÇÕES DE
Hypostomus aff. unae DA BACIA DO RIO DE CONTAS.................................................
45
ARTIGO II.............................................................................................................................
65
ANÁLISE DA HETEROGENEIDADE DA HETEROCROMATINA EM Hypostomus
aff. unae (Siluriformes, Loricariidae)...................................................................................
66
ARTIGO III............................................................................................................................
83
CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA DE POPULAÇÕES Hypostomus cf.
wuchereri DE BACIAS HIDROGRÁFICAS COSTEIRAS DA BAHIA...........................
84
CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................................
103
13
1.0. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
1.1. Caracterização da região hidrográfica do Atlântico Leste
A região hidrográfica do Atlântico Leste localiza-se aproximadamente entre as
coordenadas 9º40’ a 19º 00’ de latitude sul e 36º 40’ a 44º 00’ de longitude oeste,
compreendendo os estados da Bahia, Minas Gerais, Espírito Santo e Sergipe. Com uma
área de 386.092 km
2
, equivalente a 4% do território brasileiro. A região pode ser
dividida como 26% de sua área dentro do Estado de Minas Gerais, 1% no estado do
Espírito Santo, 69% no estado da Bahia e 4% no Estado de Sergipe (Figura 01a)
(MMA, 2006).
Essa região encontra-se dividida em cinco principais bacias as quais são
subdivididas em 16 unidades hidrográficas: Bacia do Rio de Contas, Itapicuru-
Paraguaçu (sub-bacias: Itapicuru, Paraguaçu, Recôncavo Sul ou Recôncavo 01 e
Recôncavo Norte ou Recôncavo 02), Jequitinhonha (sub-bacias: Jequitinhonha 01, 02,
03 e Pardo), Itanhém-Mucuri (sub-bacias: Itaúnas, Litoral Sul BA 01, Mucuri e São
Matheus) e Bacia Real – Sergipe (sub-bacias: Litoral SE 01, Litoral SE 02 e Vaza-
Barris) (MMA, 2006) (Figura 01b).
1.1.1. Bacia do rio de Contas
A bacia do rio de Contas localiza-se na região centro-sul do estado da Bahia,
Planalto Sul-baiano e parte meridional da Chapada Diamantina, entre as coordenadas de
12º 55’ e 15º 30’ de latitude sul e 39º 00’ e 42º 35’ de longitude oeste. Faz limites ao
norte com a bacia do rio Paraguaçu e com as bacias do Leste, a oeste com a bacia do rio
São Francisco, a leste com o Oceano Atlântico e ao sul com a bacia do rio Pardo e com
o Estado de Minas Gerais (SRHSH, 1993).
O rio de Contas é o principal rio dessa bacia, com nascente na Chapada
Diamantina e desaguando no Oceano Atlântico no município de Itacaré. Essa bacia
apresenta três regiões com características fisiográficas bem diferenciadas: Alto, Médio e
Baixo Contas. O Alto Contas é a parte da bacia compreendida do divisor de águas do rio
São Francisco até, aproximadamente, as cidades de Itanhacú e Anagé, com extensão de
183 km, e um desnível de 896 km, onde predominam as características climáticas e
fisiográficas do semi-árido baiano. Nesta região localizam-se os principais tributários do
rio de Contas: os rios Brumado, do Antônio e Gavião. O Médio Contas é um trecho da
14
bacia compreendido entre a cidade de Contendas do Sincorá e Jequié, onde ocorre a
transição do clima semi-árido da caatinga para o clima semi-úmido do Baixo Contas.
Nesta região destacam-se os rios Sincorá, Jacaré e Jequiezinho, tributários da margem
esquerda do Contas bem como o grande reservatório da Barragem da Pedra, situado a
18 km a montante da cidade de Jequié (SRHSH, 1993).
A Barragem da Pedra foi construída na década de 60 com a finalidade de
promover o abastecimento de água, a geração de energia elétrica e incremento da pesca.
A barragem compreende também os municípios de Manoel Vitorino e Maracás.
Segundo Paiva (1982), o rio de Contas tem uma área de drenagem de 38.720 km
2
, nas
proximidades do reservatório.
Os diferentes mosaicos formados pelos ecótonos no perímetro do reservatório
estabelecem mudanças nos padrões espaciais e temporais nas comunidades de peixes,
como a composição taxonômica, estrutura trófica, guildas de reprodução e diversidade
que, anteriormente, eram estabelecidos pelos ciclos sazonais (PIANKA, 1974;
WINEMILLER & LESLIE, 1992). Sabe-se, ainda, que a construção de represas pode
promover uma interrupção no fluxo gênico entre populações de organismos aquáticos,
com alterações subseqüentes nas freqüências de genes das espécies, alterando as
proporções relativas dos componentes da diversidade intra e inter-populacional (AVISE
& FELLEY, 1979; VRIJENHOEK, 1998). Os reservatórios podem causar modificações
no padrão de dispersão de várias espécies de peixes migratórios (AGOSTINHO et al.,
1992) e, sob determinadas circunstâncias, podem conduzir à extinção de espécies
incapazes de se adaptar a esse tipo de mudança (GODINHO & GODINHO, 1994).
Além disso, visando aumentar a produção pesqueira, o antigo Departamento
Nacional de Obras Contra as Secas - BA (DNOCS) transferiu para o Reservatório da
Barragem da Pedra, algumas espécies de outras bacias hidrográficas brasileiras, tais
como Plagioscion squamosissimus (pescada), Prochilodus costatus (curimatã) e
Astronotus ocellatus (apaiari). Outras espécies foram acidental ou intencionalmente
introduzidas, como Pygocentrus piraya, Serrasalmus brandtii (piranhas) e Cichla sp.
(tucunaré) e encontram-se dispersas ao longo da bacia (BRITSKI et aI., 1988). A
introdução de espécies tem gerado consequências desastrosas na ictiofauna nativa, pois
introduzem patógenos, promovem redução genética e competem com espécies nativas,
levando à diminuição da abundância e mesmo à extinção (HILSDORF & PETRERE,
2002).
15
Adicionalmente a essa problemática, uma avaliação recente da qualidade das
águas da bacia hidrográfica do rio de Contas detectou o comprometimento de alguns
locais pela ejeção de esgotos domésticos. O principal foco de tal contaminação localiza-
se no município de Jequié, onde foram verificados ainda níveis anormais de cloretos e
sólidos totais. Outros locais também são afetados por esgotos domésticos como os
trechos de mananciais sob a influência dos núcleos urbanos dos municípios de Ipiaú e
Ubatã (CRA, 2001).
1.1.2. Sub -Bacia do Recôncavo Sul
A unidade hidrográfica Recôncavo Sul drena uma área de 17.788 km
2
e situa-se
aproximadamente entre as coordenadas 12º 40' a 14º 20' de latitude Sul e 38 º55' a 40º
20' de longitude Oeste, o que lhe confere características climáticas tropicais,
influenciadas pelas áreas planálticas a oeste e pela proximidade do mar a leste. Limita-
se ao norte e a oeste com a bacia do rio Paraguaçu, a sul e a oeste com a bacia do Rio de
Contas, e a leste com o Oceano Atlântico. Os principais cursos hídricos que cortam as
bacias do Recôncavo Sul são os rios Jaguaripe, Jequiriçá, Ribeira do Cupido, Rio do
Braço, Una, Jequié, Almas, Preto e Cachoeira Grande (MMA, 2006).
Segundo informações do Centro de Recursos Ambientais da Bahia (CRA, 2001),
do Instituto Mineiro de Gestão das Águas (IGAM, 2002) e do Ministério do Meio
Ambiente (MMA, 2006), toda a região hidrográfica do Atlântico Leste encontra-se
bastante alterada por ações antrópicas. Em relação à Bacia do Recôncavo Sul, os
problemas relacionados à estas ações incluem: atividades agropecuárias e extrativismo
vegetal (desmatamento, utilização de agrotóxicos), atividade de mineração (degradação
de áreas), atividade urbana (lançamento de esgotos domésticos, disposição inadequada
de resíduos sólidos) e atividade industrial (lançamento de efluentes líquidos) (CRA,
2001).
Tais atividades têm causado sérios desequilíbrios aos ecossistemas naturais,
especialmente o lançamento de esgotos domésticos, constituindo a principal fonte de
comprometimento dos mananciais nesta bacia (MMA, 2006). Atualmente, os rios que
compõem as bacias do Recôncavo Sul recebem despejo de efluentes domésticos sem
tratamento das cidades localizadas em suas margens, apresentando assim elevados
índices de contaminação por bactérias do grupo coliforme. Cabe mencionar, que os
16
teores mais elevados de coliformes fecais foram registrados no rio Una, localizado à
jusante da Companhia Valença/Industrial e rio Jaguaripe, localizado no centro da cidade
de Nazaré (CRA, 2001).
A atividade turística também merece destaque, cuja expansão nem sempre vem
acompanhada de procedimentos ambientais adequados, representando mais um fator de
degradação importante e que deve ser continuamente monitorado. Em muitos casos, o
turismo apresenta forte potencial poluidor, como ocorre no rio Una, que divide a cidade
de Valença, hoje maior centro de turismo da Costa do Dendê (área do baixo sul,
incluindo Morro de São Paulo e Camamu) (MELO, 2006). Neste sentido, é possível
reconhecer a existência de um cenário representado por grandes pressões antrópicas,
porém, contextualizados pelo seu caráter mais local.
Em relação à atividade pesqueira, a bacia do Recôncavo Sul apresenta uma
produção bem abaixo de seu potencial, mesmo assim a região é a principal responsável
pelo abastecimento de pescado de Salvador, e a carcinicultura vêm ganhando
importância crescente na produção de pescado regional. A ictiofauna encontrada na área
inclui espécies de relevante importância comercial, tais como: robalo, tainha, linguado e
algumas espécies migratórias como o dourado (CRA 2001).
De acordo com algumas previsões, as taxas de extinção em espécies aquáticas
serão cinco vezes superiores às espécies terrestres nas próximas décadas (COATES,
2004). Apesar disso, o planejamento de estratégias para conservação e o manejo
sustentável da biodiversidade aquática são ainda recentes (ABELL et al., 2002). Tendo
em vista que a região hidrográfica do Atlântico Leste tem sofrido grande pressão das
atividades humanas (CRA, 2001; IGAM, 2002 e MMA, 2006), ações prementes na área
de conhecimento e conservação da diversidade de peixes ao longo da bacia do Rio de
Contas são necessárias, uma vez que vários ecossistemas encontram-se impactados por
quase toda a sua extensão (CRA, 2001, RAPINI et al., 2006). Tais impactos resultam
numa elevada taxa de perda de habitats e diversidade, principalmente em lugares de
extrema importância biológica e com carência de informações como é o caso das bacias
da Bahia (MMA, 2006).
De fato, apesar dos principais sistemas hidrográficos do leste do Brasil
(Paraguaçu, Contas, Jequitinhonha, Doce, Paraíba do Sul, Ribeira de Iguape, Itajaí e
Jacuí), bem como várias outras pequenas drenagens adjacentes, apresentarem um alto
17
grau de endemismo (RIBEIRO, 2006), o conhecimento essencial, sobre os padrões de
diversidade genética de várias espécies e populações de peixes em bacias dessa região
permanecem praticamente desconhecidos (MEDRADO et al., 2008).
1.2. Considerações gerais sobre a ordem Siluriformes e família Loricariidae.
Entre os Ostariophysi, os Siluriformes representam um grupo rico e
excepcionalmente diverso de peixes, classificados em terceiro lugar entre as ordens dos
vertebrados (NELSON, 2006), com 36 famílias, 477 gêneros e 3088 espécies e ampla
distribuição geográfica. Os bagres, como são popularmente conhecidos, foram
diagnosticados primariamente como um grupo natural de água doce, porém, a tolerância
à salinidade de várias espécies estende-se, ou é mesmo limitado, em níveis estuarinos ou
oceânicos. Assim, enquanto a maioria deles é registrada em águas interiores, a
distribuição da ordem também inclui as regiões costeiras e ilhas próximas aos
continentes (FERRARIS JR, 2007).
As espécies de peixes da ordem Siluriformes assumem desde pequeno até grande
porte, apresentando hábitos sedentários, o que contribui para a grande dificuldade
apresentada por esses peixes em superar cachoeiras e corredeiras que se interpõem às
suas raras migrações (BRITSKI, 1981). Os Loricariidae, pertencentes a esta ordem, são
comumente conhecidos como cascudos e ocupam o segundo lugar em número de
espécies entre os peixes neotropicais (REIS et al. 2003). Eles possuem uma grande
capacidade adaptativa, pois estão presentes em habitats muito variados e distribuem-se
por todo o neotrópico (REIS, et al., 2003).
De acordo com Ferraris, Jr. (2007), já foram descritos 70 gêneros e 716 espécies
de Loricariidae, sendo que muitas novas espécies são descritas todos os anos (por ex.,
JEREP et al., 2007; ZAWADSKI et al., 2008; SARMENTO-SOARES et al., 2009).
Armbruster (2004) divide a família Loricariidae em seis subfamílias: Lithogeninae,
Neoplecostominae, Hypoptopomatinae, Loricariinae, Delturinae e Hypostominae. A
subfamília Hypostominae encontra-se subdividida em cinco tribos: Corymbophanini,
Rhinelepini, Pterygoplichtini, Ancistrini e Hypostomini (REIS et al., 2006).
O gênero Hypostomus, pertencente a subfamília Hypostominae, é considerado
dominante nos rios brasileiros (BRITSKI, 1972) e um dos mais complexos da ictiofauna
neotropical, possuindo grande número de espécies com sistemática extremamente
18
confusa (REIS et al., 1990). Seus representantes possuem abertura bucal mais ampla e
corpo mais achatado. Assim, devido seu formato corporal, populações expressivas de
Hypostomus sp, estão predominantemente associadas a riachos com boa disponibilidade
de corredeiras e boa qualidade ripária, sugerindo que atributos populacionais dessas
espécies possam ser posteriormente incorporados à avaliação da integridade biótica dos
riachos da região neotropical (CASATTI et al.. 2005).
1.3. Citogenética da família Loricariidae com ênfase na subfamília Hypostominae.
Diante do grande número de espécies, os estudos citogenéticos são ainda
escassos em Loricariidae (ALVES, 2000; ARTONI & BERTOLLO, 2001), ou mesmo
inexistentes (ex: subfamília Lithogeninae). Estima-se que apenas 111 espécies de
Loricariidae já tenham sido estudadas citogeneticamente (Tabela 01). Esses resultados
indicam grande diversidade cariotípica, com ampla variação no número diplóide de
2n=34 em Ancistrus sp. 1 e Ancistrus sp. 2 (OLIVEIRA et al., 2006) a 2n=96 em
Upsilodus sp. (KAVALCO et al., 2005). Esta diversidade sugere a ocorrência de vários
rearranjos Robertsonianos e inversões conduzindo a uma evolução cariotípica
divergente (ARTONI & BERTOLLO, 2001).
Além da diversidade numérica, verifica-se grande variabilidade estrutural em
Loricariidae. Rearranjos estruturais, com fórmulas cariotípicas diferenciadas, podem ser
encontrados mesmo entre membros de uma mesma espécie, como observado em
Rineloricaria latirostris por Giuliano-Caetano (1998).
Em Hypostominae, apenas doze gêneros: Hypostomus, Liposarcus, Rhinelepsis,
Pogonopoma, Ptrygoplichthys, Megalancistrus, Glyptoperichthys, Corymbophanes,
Panaque, Ancistrus, Baryancistrus e Hemiancistrus possuem informações citogenéticas,
sendo Hypostomus o que apresenta o maior número de espécies já cariotipadas
(KAVALCO et al., 2005). Ate o presente momento, o número diplóide nessa subfamília
varia de 2n=34 para Ancistrus sp. (OLIVEIRA et al., 2009) a 2n=84 em Hypostomus sp
2-Rio Perdido NUP 4249 (CEREALI, et. al. 2008). Os dados disponíveis para estes
gêneros indicam que rearranjos Robertsonianos e inversões pericêntricas atuaram no
processo de diversificação cariotípica da subfamília (KALVACO, 2003). Entretanto, é
possível que essa diversidade cromossômica seja também reflexo de uma possível
origem polifilética dos Hypostominae, como indicado em estudos de filogenia
19
morfológica por Schaefer (1987) (KAVALCO et al., 2005).
A presença de 54 cromossomos parece ser uma característica ancestral em
Loricariidae (ARTONI & BERTOLLO, 2001), podendo ser observada em todos os
Neoplecostominae (ALVES, 2000; ALVES et al., 2005; KAVALCO et al., 2005), em
algumas espécies de Loricariinae (FENOCCHIO et al., 1993; SCAVONE & JULIO Jr.,
1994) e Hypostominae (ALVES, et al., 2005; MURAMOTO et al., 1968; ARTONI &
BERTOLLO, 2001) e vários Hypoptomatinae (CAMILO, 2004; FERREIRA et al.,
2005; ANDREATA, 1991; ANDREATA et al., 1992; 1994; 2006), sendo as duas
últimas consideradas basais na família (ARMBRUSTER, 2004).
Os representantes do gênero Hypostomus apresentam uma série de
peculiaridades cromossômicas e são, sem dúvida, de grande interesse para a
citogenética de peixes. Aproximadamente 30 espécies de Hypostomus foram estudadas
até o momento e os números diplóides variam de 2n=52 (ARTONI & BERTOLLO,
2001) a 2n=84 (CEREALI et al., 2008) (Tabela 01), com uma maior freqüência de
2n=76. É possível que a estrutura cromossômica com menor número diplóide seja a
mais ancestral dentro de Hypostomus, enquanto 2n mais elevados sejam tipicamente
derivados. Dessa forma, as fissões cêntricas surgem como um provável processo de
importância evolução cariotípica deste grupo (ARTONI & BERTOLLO, 2001).
O número de espécies cariotipadas é relativamente baixo quando comparado à
diversidade biológica de Loricariidae, representando apenas cerca de 15% das espécies
descritas. Até o momento, há poucos relatos de cromossomos sexuais nestes peixes,
como os cromossomos heteromórficos do tipo XX/XY ou ZZ/ZW ocorrem em espécies
de subfamílias diferentes, como Hypostominae, Hypoptopomatinae e Loricariinae
(ARTONI & BERTOLLO, 2001), além da ocorrência de sistemas de cromossomos
sexuais múltiplos do tipo Z
1
Z
1
Z
2
Z
2
/Z
1
Z
2
W
1
W
2
em Ancistrus sp. 3 e XX/XY
1
Y
2
em
Ancistrus sp. 8, subfamília Hypostominae (OLIVEIRA et al., 2006) e um sistema tipo
XX/XY
1
Y
2
em H. carvalhoi, Loricarinae (CENTOFANTE et al., 2006). No gênero
Hypostomus, dois tipos de sistema de cromossomos sexuais foram observados, ZZ/ZW
para Hypostomus sp G (ARTONI, 1996) e um provável sistema XX/XY para H.
macrops (MICHELE et al., 1977).
20
Tabela 01. Dados citogenéticos em espécies de Loricariidae
Espécie
Localidade
2n
Fórmula
Cromossômica
B
Crom.
sexuais
Referência
HYPOPTOPOMATINAE
Corumbataia
C. cuestae
Ribeirão Lapa (SP)
54
28m+20sm+6st
---
-------
17
C. cuestae
Rio Alambari,
Botucatu (SP)
54
34m+20sm
---
-------
24
C. tocantinensis
Rio Vermelho, Goiás
(GO)
54
28m+26sm
---
------
24
Hisonotus
H. depressicauda citado como
Microlepdogaster
depressicauda
Rio Santo Inácio (SP)
54
14m+28sm+2st+10a
----
--------
8
H. gibbosos
Rio Betari (SP)
58
--------------------
---
-------
9
H. leucofrenatus
Ribeirão do Cavalo,
Jaraguá do Sul (SC)
54
22m+24sm+6st+2a
---
-------
10
H. leucofrenatus, citado como
Microlepdogaster
leucofrenatus
Rio Marumbi (PR)
54-56
22m+26sm+4st+2a (M)
22m+25sm+5st+2a (F)
0-2
ZZ/ZW
7
H. leucofrenatus, citado como
Microlepdogaster
leucofrenatus
Rio Poço Grande
(SP)
54-56
24m+26sm+4st (M)
24m+25sm+5st (F)
0-2
ZZ/ZW
7
H. nigricauda
Rio Guaíba, Eldorado
do Sul (RS)
54
26m+20sm+8st
---
-------
10
Hisonotus sp citado como
Microlepdogaster sp.
Ribeirão Jacutinga
(SP)
54
--------------------
---
-------
8
Hisonotus sp citado como
Microlepdogaster sp.
Ribeirão Quinta (SP)
54
--------------------
---
---------
8
Hisonotus sp. A
Rio Paraitinga,
Salesópolis (SP)
54
26m+26sm+2st
---
-------
10
Hisonotus sp. D
Ribeirão Grande,
Pindamonhangaba
(SP)
54
26m+26sm+2st
---
-------
10
Hypoptopoma
H. guentheri
Rio Piraí, Poconé
(MT)
54
10m+18sm+8st+18a
---
-------
24
Microlepdogaster
Microlepdogaster sp. A
Rio Alambari (SP)
54
30m+20sm+4st
---
-------
8
Microlepdogaster sp. B
Ribeirão Moia (SP)
54
22m+28sm+4st
---
-------
8
21
Espécie
Localidade
2n
Fórmula
Cromossômica
B
Crom.
sexuais
Referência
Otocinclus
O. affinis
Rio Biguá (SP)
54
46m+8sm
---
-------
8
O. affinis
Rio Bonito (RJ)
54
40m+12sm+2st
---
-------
8
O. aff. vestitus
Rio Livramento (PA)
72
22m+12sm+4st+34a
---
-------
8
O. flexilis
Santo Antônio da
Patrulha, (RS)
54
36m+18sm
---
-------
24
O. vittatus
Rio Cuiabá, Santo
Antônio do Leverger
(MT)
54
12m+10sm+14st+18a
---
-------
24
O. vittatus
Rio Taquari, Coxim
(MS)
54
36m+18sm
---
-------
24
Otothyris
O. juquiae
Rio Preto, Itanhaém
(SP)
54
32m+10sm+12st
---
-------
24
O. travassosi
Rio Ribeira da Terra
Firme, Canavieiras
(BA)
54
26m+16sm+12st
---
-------
24
Parotocinclus
P. maculicauda
Rio Poço Grande
(SP)
54
20m+32sm+2st
---
-------
8
Schizolecis
S. guentheri
Ribeirão Parati-
Mirim, Parati (RJ)
54
30m+18sm+6a
---
-------
24
S. guentheri
Ribeirão Sítio do
Meio, Mongaguá
(SP)
54
30m+18sm+6a
---
-------
24
S. guentheri
Ribeirão Descoberto,
Guaratuba (PR)
54
30m+18sm+6a
---
-------
24
S. guentheri
Ribeirão Garuva,
Garuva (SC)
54
30m+18sm+6a
---
-------
24
Pseudotocinclus
Pseudotocinclus n.sp.
Rio Juquiá, Juquitiba
(SP)
54
22m+24sm+8st
---
-------
24
P. maculicauda
Rio Poço Grande
(SP)
54
20m+32sm+2st
---
-------
5
P. tietensis
Piracicaba (SP)
54
28m+20sm+6st. (F)
27m+21sm+6st. (M)
---
XX/XY
6
Pseudotothiris
Pseudotothiris obtusa
Rio Itanhaém (SP)
54
26m+18sm+4st+6a
---
-------
8
HYPOSTOMINAE
22
Espécie
Localidade
2n
Fórmula
Cromossômica
B
Crom.
sexuais
Referência
Tribo ancistrini
Ancistrus
A. cuiabae
Baia do Arrombado,
Mato Grosso (MT)
34
20m+8sm+6st
19m+8sm+6st+1a
18m+8sm+6st+2a
---
-------
42
A. cf. dubius
Bacia do Rio
Paraguai (MT)
44
18m+10sm+16st/a
---
ZZ/ZW
29
A. cf. dubius
Rio Coxipó, Chapada
dos Guimarães (MT)
42
24m+10sm+8st
---
-------
30
A. cf. dubius
Riacho Fundo,
Poconé;
Riacho Pari, Cuiabá;
Riacho Flacha,
Cáceres (MT)
42
24m+10sm+8st
---
XX/XY
30
A. multispinnis
Rio Itapocu (SC)
52
28m/sm+24st/a
---
-------
2
A. ranunculus
Rio Xingu (PA)
48
20m+8sm+6st+14a.(M)
19m+9sm+6st14a. (F)
---
ZZ/ZW
34
Ancistrus sp.
Rio Paraná (PR)
48
18m+14sm+12st+4a
---
-------
11
Ancistrus sp.
Rio Itapocu (SC)
52
28m/sm+ 24st/a
---
-------
1
Ancistrus sp.
Rio Iguaçu (PR)
48
18m+14sm+12st+4a
---
-------
28
Ancistrus n. sp.
Rio Betari (SP)
52
32m/sm+20st/a
---
-------
2
Ancistrus n. sp.
Rio São Francisco
(AC)
38
30m/sm+8st
---
-------
2
Ancistrus n sp. 1,
Rio Vermelho, Goiás
Velho (GO)
39
40
33m+6sm.(M)
34m+6sm.(F)
---
XX/X0
4
Ancistrus n sp. 2
Rio Guaruva (SC)
52
10m+16sm+12st+14a
---
-------
4
Ancistrus sp. 2
Rio Itapocu (SC)
52
28m/SM+24st/a
---
-------
1
Ancistrus sp. 2
Lago Catalão (AM)
34
21m+9sm+4st.(M)
22m+8sm+4st.(F)
---
XX/XY
33
Ancistrus sp. 3
Rio Igarapé, São
Francisco (AC)
38
30m/SM+8st/a
---
---------
1
Ancistrus sp. 3
Rio Demeni (AM)
52
12m+12sm+2st+26a.(M)
11m+11sm+3st+27a(F)
---
Z
1
Z
1
Z
2
Z
2
/
Z
1
Z
2
W
1
W
2
33
Ancistrus sp. 6
Lago Aiapuá (AM)
52
14m+10sm+2st+26a.(M)
14m+11sm+2st+25a.(F)
---
ZZ/ZW
33
Ancistrus sp. 7
Igarapé Dimona
(AM)
52
16m+8sm+2st+26a
---
-------
33
Ancistrus sp. 8
Igarapé Barretinho
(AM)
39
38
27m+10sm+2st.(M)
26m+10sm+2st.(F)
---
XX/XY
1
Y
2
33
23
Espécie
Localidade
2n
Fórmula
Cromossômica
B
Crom.
sexuais
Referência
Ancistrus sp. mocoari
Rio Branco (RR)
46
18m+11sm+6st+11a.(M)
18m+12sm+6st+10a.(F)
---
XX/XY
43
Ancistrus sp. purus
Rio Purus (AM)
34
20m+12sm+2st.(F)
21m+11sm+2st.(M)
---
XX/XY
43
Ancistrus sp. trombetas
Rio Trombetas (PA)
38
22m+8sm+5st+3a
---
-------
43
Ancistrus sp. vermelho
Rio Demeni (AM)
42
26m+6sm+4st+6a
---
-------
43
Baryancistrus
B. aff. niveatus
Rio Xingu (PA)
52
16m+32sm+4st
---
-------
40
Hemiancistrus
Hemiancistrus sp.
Rio Araguaia (MT)
52
20m+20sm+12st/a
---
-------
16
H. spilomma
Rio Araguaia (MT)
52
25m+21sm+6st. (M)
24m+22sm+6st. (F)
---
ZZ/ZW
33
H spinosissimus
Rio Araguaia (MT)
52
26m+22sm+4st
---
-------
33
Megalancistrus
M. aculeatus
Rio Paraná (PR)
52
26m+26sm
---
-------
11
M. aculeatus
Rio Iguaçu (PR)
52
26m+26sm
---
-------
28
Panaque
P. cf. nigrolíneatus
Rio Araguaia (MT)
52
26m+20sm+6st
---
-------
16
Tribo Corymbophanini
Corymbophanes
Corymbophanes n. sp.
Rio Chopotó,
Desterro de Melo
(MG)
54
20m+20sm+14st
---
-------
3
Tribo Hypostomini
Hypostomus
H. affinis
Ribeirão Jacuí (SP)
66
14m+14sm+12st+26a
---
-------
27
H. ancistroides
Afluentes do Rio
Tibagi
68
16m+18sm+34st/a
---
-------
12
H. ancistroides
---------------
68
10m+26sm+32st/a
---
-------
36
H. ancistroides
Rio Mogi-Guaçu
(SP)
68
16m+18sm+34st/a
---
-------
12
H. ancistroides
Rio Araquá,
Botucatu (SP)
68
18m+10sm+12st+28a
---
-------
4
24
Espécie
Localidade
2n
Fórmula
Cromossômica
B
Crom.
sexuais
Referência
H. ancistroides
---------------
68
10m+27sm+31st/a (M)
10m+28sm+30st/a (F)
---
XX/XY
31
H. albopunctatus
Rio Mogi-Guaçu (SP)
74
10m+20sm+44st/ a
---
-------
12
H. albopunctatus
Rio Piracicaba (SP)
74
10m+20sm+44st/ a
---
-------
17
H. aff. auroguttatus
Rio Mogi-Guaçu (SP)
76
8m+30sm+38st/a
---
-------
12
H. emarginatus
Rio Araguaia (MT)
52
16m+30sm+6st/a
---
-------
16
H. goyazensis
Rio Vermelho, Goiás
Velho (GO)
72
10m+16sm+10st+36a
---
-------
4
H. macrops
---------------
68
10m+14sm+44st/a
---
---------
31
H. nigromaculatus
Ribeirão três Bocas e
dos Apertados (PR)
76
6m+20sm+50st/a
---
-------
37
H. nigromaculatus
Rio
Mogi-Guaçu (SP)
76
8m+20sm+48st/a
---
-------
37
H. paulinus
---------------
74
10m+20sm+44st/a
---
-------
31
H. paulinus
Ribeirão Três Bocas
76
6m+16sm+54st/a
---
-------
36
H. plecostomus
---------------
54
24m/sm+12st+18a
---
-------
32
H. regani
Rio Mogi-Guaçu (SP)
72
10m+20sm+42st/a
---
-------
12
H. regani
Rio Araquá,
Botucatu (SP)
72
12m+18sm+26st+16a
---
-------
4
H. regani
Ribeirão do Jacutinga
(PR)
72
10m+18sm+44st/a
---
-------
36
H. regani
Rio Piumhi, São
francisco (MG)
72
8m+16sm+20st+28a
---
-------
41
Hypostomus sp 2-Rio Perdido
NUP 4249
Rio Perdido (MS)
84
6m + 16sm + 62st/a
---
-------
19
Hypostomus sp 3-Ribeirão
Salobrinha NUP 4247
Ribeirão Salobrinha
(MS)
82
83
84
6m+12sm+64st/a
6m + 12sm + 65st/a
6m+12sm+66st/a
1-2
-------
19
Hypostomus sp.1
Rio Paranapanema
(SP)
64
--------------------
---
-------
22
Hypostomus sp.1ª
Ribeirão dos Patos
(MG)
76
6m+8sm+16st+46a
---
-------
41
25
Espécie
Localidade
2n
Fórmula
Cromossômica
B
Crom.
sexuais
Referência
Hypostomus sp.1b
Ribeirão das Araras
(MG)
76
6m+8sm+16st+46a
---
-------
41
Hypostomus sp.2
Ribeirão das Araras
(MG)
74
10m+6sm+16st+42a
---
-------
41
Hypostomus sp.2
Ribeirão Jacutinga
(SP)
68
--------------------
---
-------
22
Hypostomus sp.2
Ribeirão Alambari
(SP)
68
--------------------
---
-------
22
Hypostomus sp. 3
Ribeirão Quinta (SP)
72
--------------------
---
-------
22
Hypostomus sp. 3
Ribeirão Edgardia
(SP)
72
--------------------
---
-------
22
Hypostomus sp. 3
Rio Paranapanema
(SP)
72
--------------------
---
-------
22
Hypostomus sp. 4
Ribeirão Hortelã (SP)
76
--------------------
---
-------
22
Hypostomus sp. 4
Rio Paranapanema
(SP)
76
--------------------
---
-------
22
Hypostomus sp. A
Rio Rincão (SP)
70
18m+14sm+38st/a
---
-------
12
Hypostomus sp. B
Rio Mogi-Guaçu (SP)
72
12m+18sm+42st/a
---
-------
12
Hypostomus sp. B
Rio Mogi-Guaçu (SP)
72
13m+18sm+41st/a
---
-------
14
Hypostomus sp. C
Rio Mogi-Guaçu (SP)
72
10m+18sm+44st/a
---
-------
12
Hypostomus sp. D1
Rio Mogi-Guaçu
(SP)
72
10m+26sm+36st/a
---
-------
12
Hypostomus sp. D2
Rio Mogi-Guaçu (SP)
72
14m+20sm+38st/a
---
-------
12
Hypostomus sp. E
Rio Mogi-Guaçu (SP)
80
8m+16sm+56st/a
---
-------
12
Hypostomus sp. F
Rio São Francisco
(MG)
76
10m+16sm+50st/a
---
-------
11
Hypostomus sp. F
Rio São Francisco
(MG)
75
10m+17sm+48st/a
---
-------
14
Hypostomus sp. G
Rio Araguaia (MT)
64
14m+24sm+26st/a. (M)
15m+24sm+25st/a. (F)
---
ZZ/ZW
13
H. strigaticeps
Ribeirão três Bocas,
Rio Jacutinga e Rio
Taquari (PR)
72
10m+16sm+46st/a
---
-------
36
H. strigaticeps
Rio Mogi-Guaçu (SP)
74
8m+4sm+62st/a
---
-------
31
Liposarcus
L. anisitsi
Rio Preto (SP)
52
16m,+24sm,+8st,+4a
---
-------
15
L. anisitsi
Rio Piracicaba (SP)
52
16m+28sm+6st+2a
---
-------
17
L. anisitsi
Rio Tietê, Botucatu
(SP)
52
28m+12sm+8st+4a
---
-------
4
26
Espécie
Localidade
2n
Fórmula
Cromossômica
B
Crom.
sexuais
Referência
L. anisitsi
Rio Miranda,
Corumbá (MS)
52
8m+14sm+14st+16a
---
-------
4
L. multiradiatus
Rio Orinoco,
Bolivar,Venezuela
52
22m+18sm+12st
---
-------
4
Pogonopoma
P. wertheimeri
Rio Mucuri (BA)
54
20m+30sm+4st
---
-------
16
Tribo Pterygoplichthini
Glyptoperichthys
G. gibbiceps
Rio Orinoco,
Bolivar,Venezuela
52
20m+24sm+8st
---
-------
4
Pterygoplichthys
P. multiradiatus
Rio Solimões (AM)
52
--------------------
---
-------
20
P. joselimaianus
Bacia do ri Araguaia
(MT)
52
28m+16sm+8st/a
---
-------
33
Tribo Rhinelepini
Rhinelepsis
R. áspera
Rio Paraná (PR)
54
20m+26sm+8st
---
-------
16
LORICARIINAE
Harttia
H. carvalhoi
Bacia do rio Paraiba
do Sul (SP)
52
53
18m+18sm+8st+8a
17m+18sm+8st+8a
---
XX/XY
1
Y
2
18
H. kronei
Rio Betari (SP)
58
42m/sm+16st/a
---
-------
1
H. loricariformis
Ribeirão grande (SP)
52
32m/sm+20st/a
---
-------
1
H. loricariformis
Rio Paraitinga (SP)
56
16m+22sm+10st+8a
---
-------
27
Loricaria
Loricaria sp.
Rio Guaíba (RS)
66
2m+2sm+62a
---
-------
1
Loricaria sp.
Rio Solimões (AM)
62
--------------------
---
-------
20
Loricaria sp.
Rio Paraná (PR)
64-69
10m+6sm+4st+44a
1-5
-------
38
L. macrodon
------------
58
18m+2sm+38st/a
---
-------
31
L. parva
------------
48
--------------------
---
-------
35
L. prolixa
Rio Paraná (PR)
62
20m+4sm+38a
---
-------
38
Loricariichthys
L. platymetopon
Rio Paraná (PR)
54
6m+20sm+4st+24a
---
ZZ/ZW
39
27
Espécie
Localidade
2n
Fórmula
Cromossômica
B
Crom.
sexuais
Referência
Loricariichthys sp.
Rio Paraná (ARG)
54
6m+26sm+4st+18a
---
-------
23
Sturisoma
S. cf. nigrirostrum
Rio Araguaia (MT)
74
20m+18sm+36st/a
---
-------
16
Rineloricaria
R. kronei
Ribeirão Cavalo (SP)
64
6m/sm+58st/a
---
-------
1
R. kronei
Rio Itapocu
64
6m/sm+58st/a
---
-------
1
R. cf. latirostris
Rio Piumhi , rio São
Francisco (MG)
62
14m/SM+34st/a
---
-------
41
R. latirostris
Rio Passa Cinco (SP)
44
44
44
44
44
44
44
12m+4sm+28a
10m+4sm+30a
13m+2sm+29a
13m+4sm+27a
13m+1sm+30a
10m+4sm+30a
10m+3sm+31a
---
-------
25
R. latirostris
Rio Passa Cinco (SP)
46
10m+3sm+33a
---
-------
25
R. latirostris
Rio Mogi-Guaçu (SP)
36
37
38
39
40
24m/sm+12st/a
23m/sm+14st/a
22m/sm+16st/a
21m/sm+18st/a
20m/sm+20st/a
---
-------
25
R. latirostris
Ribeirão Três Bocas
(SP)
43
44
46
47
48
17m/sm+26st/a
16m/sm+28st/a
14m/sm+32st/a
13m/sm+34st/a
12m/sm+36st/a
---
-------
25
R. latirostris
Rio Passa Cinco (SP)
44
45
46
47
16m/sm+28st/a
15m/sm+30st/a
14m/sm+32st/a
13m/sm+34st/a
---
-------
25
R. latirostris
Ribeirão do Maringá
(PR)
46
14m/sm+30st/a
---
-------
21
R. pentamaculata
Córrego Tauá e
Córrego Tatupeba
(PR)
56
8m/sm+48st/a
---
--------
21
R. pentamaculata
Córrego Tauá (PR)
56 a
59
------------------
0-3
--------
21
R. pentamaculata
Ribeirão Keller (PR),
córrego
56
8m/sm+48st/a
---
--------
21
R. pentamaculata
Ribeirão Keller (PR)
56
8m/sm+48st/a
---
--------
25,26
Rineloricaria sp.
Rio Betari (SP)
70
2m/sm+68st/a
---
-------
1
NEOPLECOSTOMINAE
Pareiorhaphis
28
Espécie
Localidade
2n
Fórmula
Cromossômica
B
Crom.
sexuais
Referência
Pareiorhaphis splendens
citado como Hemipsilichthys
splendens
Rio Marumbi,
Morretes (PR)
54
20m+30sm+4st
---
-------
3
Pareiorhaphis splendens
citado como Hemipsilichthys
splendens
Rio São João, Garuva
(SC)
54
20m+30sm+4st
---
-------
1,3
Pareiorhaphis sp. citado
como Hemipsilichthys n. sp.
Rio dos Patos, Lapa
(PR)
54
20m+20sm+14st
---
-------
3
Pareiorhaphis steindachneri
citado como H. steindachneri
Ribeirão Cavalo,
Jaraguá do Sul, (SC)
54
20m+20sm+14st
---
-------
3
Pareiorhaphis vestigipinnis
citado como Hemipsilichthys
vestigipinnis
Rio Caveiras, Painel
(SC)
54
20m+20sm+14st
---
-------
3
Isbrueckerichthys
I. alipionis
Rio Betari, Iporanga
(SP)
54
38m/sm+16st/a
---
-------
1
I. duseni
Rio Betari, Iporanga
(SP)
54
20m+20sm+14st
---
-------
3
Kronichthys
K. heylandi
Rio Betari, Iporanga
(SP)
54
50m/sm+4st/a
---
-------
1
K. lacerta
Rio Marumbi,
Morretes (PR)
54
20m+20sm+14st
---
-------
3
K. subteres
Rio Betari, Iporanga
(SP)
54
20m+20sm+14st
---
-------
3
Neoplecostomus
N. microps
Ribeirão Grande,
Pindamonhangaba
(SP)
54
42m/sm+12st/a
---
-------
1
N. microps
Ribeirão Grande,
Cidade Campos do
Jordão (SP)
54
42m/sm+12st/a
---
-------
1
N. microps
Rio Paraitinga (SP)
54
24m+20sm+10st
---
-------
27
N. paranensis
Ribeirão Hortelã,
Botucatu (SP)
54
36m/sm+18st/a
---
-------
1
N. paranensis
Ribeirão Sapateiro,
Barbacena (MG)
54
20m+20sm+14st
---
-------
3
Pareiorhina
P. rudolphi
Ribeirão Grande (SP)
54
48m/sm+6st/a
---
-------
1
29
Espécie
Localidade
2n
Fórmula
Cromossômica
B
Crom.
sexuais
Referência
P. rudolphi
Córrego Convento,
Pindamonhangaba
(SP)
54
26m+16sm+12st
---
-------
3
DELTURINAE
Upsilodus
Upsilodus sp.
Rio Paraitinga (SP)
96
16m+8sm+72a
---
-------
27
1- Alves, 2000; 2- Alves et al., 2003; 3- Alves et al., 2005; 4- Alves et al., 2006; 5- Andreata, 1991; 6- Andreata et
al., 1992; 7- Andreata et al., 1993; 8- Andreata et al., 1994; 9- Andreata et al., 2000; 10- Andreata et al., 2006; 11-
Artoni, 1996; 12- Artoni & Bertollo, 1996; 13- Artoni et al., 1998; 14- Artoni & Bertollo, 1999; 15- Artoni et al.,
1999; 16- Artoni & Bertollo, 2001; 17- Camilo, 2004; 18- Centofante et al, 2006; 19- Cereali et al., 2008; 20- Della-
Rosa et al., 1980; 21- Errero-Porto, 2007; 22- Fenerich & Oliveira, 2004; 23- Fenocchio et al., 1993; 24- Ferreira et
al., 2005; 25- Giuliano-Caetano, 1998; 26- Giuliano-Caetano et al , 1999; 27- Kavalco et al., 2005; 28- Lara, 1998;
29- Mariotto et al., 2004; 30- Mariotto & Miyazawa, 2006; 31- Michelle et al., 1977; 32- Muramoto et al., 1968; 33-
Oliveira et al., 2006; 34- Oliveira et al., 2007; 35- Post, 1965; 36- Rubert, 2007; 37- Rubert et al., 2008; 38-
Scavone & Julio Jr., 1994; 39- Scavone & Julio Jr., 1995; 40- Souza et al., 2004; 41- Mendes-Neto, 2006; 42-
Marioto et al., 2009; 43- Oliveira et al. 2009
A análise da variabilidade cariotípica pode ser complementada pela localização
das regiões organizadoras de nucléolos (RONs). Apesar dos loricarideos mostrarem
fenótipos variados de RONs, uma tendência para a manutenção da condição
plesiomórfica é observada, ou seja, um único par de RONs situado na posição terminal
dos cromossomos (OLIVEIRA & GOSZTONYI, 2000). Esta característica é encontrada
em Hypostominae, Hypoptopomatinae (ARTONI, 1996) e Loricariinae (KAVALCO et
al., 2005). Nos Hypostomus, as regiões organizadoras de nucléolo coradas com nitrato
de Prata também apresentam fenótipos variados. Apesar das espécies desse gênero
apresentarem uma maior freqüência de RONs múltiplas e um freqüente polimorfismo de
tamanho dessas regiões entre cromossomos homólogos, também se verifica a presença
de espécies com um único par de RONs (ARTONI & BERTOLLO, 1999). Contudo, a
localização exata desses cistrons ribossômicos utilizando hibridação fluorescente in situ
(FISH) com sondas de DNAr 18S ou 45S é conhecida para poucas espécies da família,
como H. affinis (KAVALCO et al., 2004) e Corumbataia cuestae (CAMILO, 2004).
As análises de heterocromatina são ainda escassas entre os Siluriformes, apesar
da sua distribuição e composição serem importantes para a compreensão da evolução
cariotípica do grupo. Em Loricariidae, grande quantidade de heterocromatina,
principalmente na região intersticial, é considerada uma condição basal como
constatado em Upsilodus sp. que apresentou blocos heterocromáticos abundantes
30
(KAVALCO et al. 2005). Já para a subfamília Hypostominae, dois padrões gerais de
distribuição da heterocromatina foram propostos. O primeiro grupo apresenta menos
heterocromatina, localizada na região telomérica e/ou centromérica, associada a
espécies com pequeno número diplóide; o segundo grupo apresenta grandes segmentos
intersticiais de heterocromatina em vários cromossomos acrocêntricos, associado às
espécies com elevado número diplóide, revelando uma relação entre o número diplóide
dos cromossomos e a heterocromatina na região terminal e próxima aos centrômeros
(ARTONI & BERTOLLO, 2001).
Em Loricariidae, regiões ricas em GC são descritas em Hypostomus (ARTONI
et al., 1998; ARTONI & BERTOLLO, 1999; KAVALCO et al., 2004) e Rineloricaria
(GIULIANO-CAETANO, 1998), entre outros. No geral, os Hypostomus apresentam as
RONs ricas em GC, coradas positivamente com CMA
3
e negativamente com DAPI
(RUBERT et al., 2008; CEREALI et al., 2008), seguindo o padrão comum aos peixes.
Por outro lado, regiões ricas em AT raramente são descritas em teleósteos, embora
sejam encontradas faixas fluorescentes com coloração DAPI em algumas espécies de
Hypostomus estudadas por Artoni e Bertollo (1999). Sendo assim, as variações
cromossômicas morfológicas e numéricas entre os Hypostomus são muito freqüentes.
Por isso, os estudos citogenéticos mostram-se promissores, não só entre diferentes
espécies, mas também entre populações de uma dada espécie, a fim de elucidar
possíveis mecanismos evolutivos que possam estar ocorrendo nesse grupo (DIAS &
MORELLI, 2005).
31
2.0. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Caracterizar citogeneticamente quatro populações de Hypostomus aff. unae
(Steindachner, 1878) da bacia do rio de Contas/BA e duas populações de Hypostomus
cf. wuchereri (Günther, 1864) das bacias do rio de Contas e Recôncavo Sul/BA.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estabelecer o número diplóide e fórmula cariotípica das espécies coletadas;
Caracterizar as regiões organizadoras de nucléolos.
Determinar o padrão de distribuição e diferenças na composição de bases da
heterocromatina utilizando as enzimas de restrição;
Identificar as regiões cromossômicas ricas em pares de bases GC e AT;
Comparar os dados obtidos com os de outras espécies analisadas da família,
inferindo sobre as tendências evolutivas do gênero Hypostomus.
32
3.0. MATERIAL E LOCAL DE COLETA
Foram analisados 46 exemplares de Hypostomus aff. unae (Siluriformes,
Loricariidae), sendo 10 (3 machos, 2 fêmeas e 5 imaturos) do canal principal da bacia
do rio de Contas (13
o
51’51” S e 40
o
04’54” W), 10 (6 machos, 1 fêmeas e 3 imaturos) do
rio Preto do Costa (13°45’84” S e 39°56’47” W), 15 (9 machos e 6 imaturos) do rio
Oricó (14º08’03” S e 39º21’30” W), e 11 (4 machos, 4 fêmeas e 3 imaturos) do rio preto
do Criciúma (13º 55'45" S e 39º 57'57" W) (Figuras 03a, b, c, d e Figura 05). Da
espécie Hypostomus cf. wuchereri foram analisados 16 espécimes, sendo 11 (7 machos
e 5 imaturos) do rio Mutum na bacia do rio de Contas (13 º 43’ 18’’ S e 39 º 51’ 20’’
W) e 6 exemplares (1 macho e 5 imaturos) do rio Una, bacia do Recôncavo Sul
(13º21'55" S e 39º04'35" W) (Figuras 04 e 05).
13
Figura 01. A) Mapa representando a divisão hidrográfica nacional. B) Mapa da região hidrográfica do Atlântico Leste e suas principais
bacias. Fonte: Conselho Nacional de Recursos Hídricos- CNRH, Agência Nacional de Águas- ANA, (2003) e Ministério do Meio Ambiente –
MMA, (2006).
13
Figura 02. Exemplares das populações de Hypostomus aff. unae: rio de
Contas(A), rio Preto do Costa (B), rio Oricó (C) e rio Preto do Criciúma (D).
Figura 03. Exemplar de Hypostomus cf. wuchereri.
Fonte: Profº Dr. Claudio Zawadski (UEM)
Figura 04. Locais de coleta. A) Mapa das bacias do Nordeste: IV- Bacia do rio de Contas; V-Bacia
do Recôncavo Sul. B) a- rio Una. C) a- rio de Contas, b- rio Preto do Costa, c- rio Oricó, d- rio
Preto do Criciúma e e- rio Mutum.
14
4.0. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABELL, R.; THIEME, M.; DINERSTEIN, E. & OLSON, D. A sourcebook for
conducting bioIogicaI assessments and developing biodiversity visions for
ecoregion conservation. v. 2: Freshwater Ecoregions. Washington, DC, USA:
World Wildlife Fund. 2002. Disponível em:
www.wwfus.org/science/freshwater.cfml.
AGOSTINHO, A. A.; JULIO JR.; H. F. & BORGHETTI, J. R. Considerações sobre os
impactos dos represamentos na ictiofauna e medidas para sua atenuação. Um
estudo de caso: Reservatório de Itaipu. Unimar v. 14, p. 89-107. 1992.
ALVES, A. L. (2000). Análise da evolução dos gêneros da subfamília
Hemipsilichthiinae (Ostariophysi, Siluriformes, Loricariidae) com base em
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Universidade Estadual Paulista. p. 1- 129.
ALVES, A. L.; C. OLIVEIRA & F. FORESTI. Karyotype variability in eight species
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ALVES, A. L.; OLIVEIRA, C. & FORESTI, F. Comparative cytogenetic analysis of
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(Siluriformes: Loricariidae). Genética. v. 124, p. 127–136. 2005.
ALVES, A. L.; OLIVEIRA, C.; NIRCHIO, M.; GRANADO, A. & FORESTI, F.
Karyotypic relationships among the tribes of Hypostominae (Siluriformes:
Loricariidae) with description of XO sex chromosome system in a Neotropical
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(Pisces, Siluriformes, Loricariidae). Dissertação de Mestrado, Universidade de
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Loricariidae): II. XX/XY sex chromosome heteromorphism in Pseudotocinclus
tietensis. Cytologia. v. 57, p. 369-372. 1992.
15
ANDREATA, A. A.; ALMEIDA-TOLEDO, L. F.; OLIVEIRA, C. & TOLEDO-
FILHO, A. S. Chromosome studies in Hypoptopomatinae (Pisces, Siluriformes,
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ANDREATA, A. A.; ALMEIDA-TOLEDO, L. F.; OLIVEIRA, C. & TOLEDO-
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ANDREATA, A. A.; OLIVEIRA, C & FORESTI, F. Karyological characterization of
four Neotropical fish species of the genus Hisonotus (Teleostei, Loricariidae,
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23
ARTIGO I
CARACTERIZAÇÃO DA BIODIVERSIDADE DE Hypostomus aff. unae
(SILURIFORMES, LORICARIIDAE) NA BACIA DO RIO DE CONTAS.
EVIDÊNCIAS CROMOSSÔMICAS POPULACIONAIS.
* Este artigo será submetido à publicação na revista Neotropical Icthiology
24
CARACTERIZAÇÃO DA BIODIVERSIDADE DE Hypostomus aff. unae
(SILURIFORMES, LORICARIIDAE) NA BACIA DO RIO DE CONTAS.
EVIDÊNCIAS CROMOSSÔMICAS POPULACIONAIS.
Jamille de Araújo Bitencourt
1
, Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso
2
, Lucia
Giuliano-Caetano
1
, Paulo Luis Souza Carneiro
2
e Ana Lúcia Dias
1
1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, CCB, CEP
86051-970, Londrina, Paraná, Brasil, fone (43) 3371-4527 (e-mail: anadias@uel.br)
2
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia,
DCB, CEP 45200-000, Jequié, Bahia, Brasil, fone (73) 35289661 (e-mail:
paulomelloaffonso@yahoo.com.br)
RESUMO
Foram analisadas citogeneticamente quatro populações de Hypostomus aff. unae
(Loricariidae, Hypostominae) ao longo da bacia do rio de Contas (Nordeste do Brasil).
Todas as populações compartilharam o mesmo número diplóide e RONs simples
localizadas na região terminal do segundo par metacêntrico. Porém, quatro fórmulas
cariotípicas foram estabelecidos para cada localidade amostrada: 12m+16sm+48st/a,
12m+20sm+44st/a, 10m+14sm+52st/a, 10m+20sm+46st/a. Os sítios de DNAr,
detectados pela FISH confirmaram os resultados obtidos pela impregnação com nitrato
de prata. Os dados de bandamento C e coloração com fluorocromos revelaram
diferenças interpopulacionais acentuadas. As populações dos rios de Contas e Preto do
Costa apresentaram 17 pares com blocos heterocromáticos terminais e intersticiais
conspícuos, ricos em pares de bases AT, além de heterocromatina associada às RONs.
Contudo, essas marcações diferiram quanto à posição e par cromossômico envolvido. Já
a população do rio Preto do Criciúma apresentou 8 pares com heterocromatina apenas
nas regiões intersticiais, ricos em pares de bases AT e também intercalada à região
organizadora de nucléolo. A população do rio Oricó apresentou 6 pares com bandas C
intersticiais e terminais evidentes, coradas igualmente pelo CMA
3
e DAPI, sem
marcações associadas às RONs. Todas as populações apresentaram o par organizador
nucleolar rico em bases GC. Os dados obtidos foram resolutivos para evidenciar a
evolução cariotípica em Hypostomus aff. unae e demonstrar diferenças existentes entre
as quatro populações analisadas, podendo representar importantes marcadores
citotaxonomicos para essa espécie.
INTRODUÇÃO
De acordo com inventário recente, a ictiofauna neotropical de água doce é
extremamente rica, compreendendo cerca de 4475 espécies válidas, mais 1550 espécies
não descritas, devendo abranger mais de 6025 espécies (Reis et al., 2003). Esta imensa
variabilidade tem sido objeto de estudos citogenéticos e evolutivos, os quais têm se
intensificado nos últimos trinta anos com um importante impacto no conhecimento e
25
conservação da biodiversidade de peixes neotropicais (Almeida-Toledo, 2006).
A família Loricariidae está entre os grupos mais especiosos e taxonomicamente
complexos de teleósteos (Nelson, 2006). Ela encontra-se dividida em seis subfamílias:
Lithogeninae, Neoplecostominae, Hypoptopomatinae, Loricariinae, Delturinae e
Hypostominae, sendo a última subdividida em cinco tribos: Corymbophanini,
Rhinelepini, Pterygoplichtini, Ancistrini e Hypostomini (Reis, 2006). De acordo com
Ferraris Jr (2007), esta família compreende cerca de 710 espécies conhecidas,
distribuídas em 96 gêneros, com várias novas espécies descritas todos os anos (Jerep et
al., 2007; Zawadski et al., 2008; Sarmento-Soares et al., 2009). Dentre eles, o gênero
Hypostomus está entre os mais abundantes da ictiofauna neotropical, com estimativas de
aproximadamente 130 espécies (Zawadski et al., 2008) e taxonomia extremamente
confusa (Reis et al., 1990). Contudo, estudos citogenéticos na família são ainda
escassos, visto que apenas cerca de 15% das espécies apresentam alguma informação.
Embora reduzidos, esses dados ja demonstram grande diversidade cariotípica
entre as espécies de Loricariidae, com ampla variação numérica de 2n=34 em Ancistrus
sp. (Oliveira et al., 2009) a 2n=96 cromossomos em Upsilodus sp. (Kavalco et al.,
2005). Esta diversidade sugere a ocorrência de vários rearranjos cromossômicos,
principalmente fissões cêntricas e inversões pericêntricas, conduzindo a uma evolução
cariotípica divergente dentro do grupo (Artoni & Bertollo, 2001). Tais resultados
corroboram também a aplicabilidade da citogenética na análise de populações e espécies
de peixes neotropicais, fornecendo informações valiosas para a compreensão das
relações entre grupos, identificação de espécies crípticas e complexos de espécies,
detecção de polimorfismos populacionais e inferências evolutivas (Oliveira et al.,
2009).
Comparando-se os dados disponiveis entre as regiões do Brasil, os registros
citogenéticos são ainda incipientes em populações naturais de bacias no nordeste
brasileiro, as quais apresentam uma ictiofauna ainda pouco conhecida e alto grau de
endemismo (Ribeiro, 2006), reforçando a necessidade de intencificar os estudos nessa
região. Por essas razões, o presente trabalho visa caracterizar citogeneticamente
populações de Hypostomus aff. unae da bacia costeira do rio de Contas, Bahia,
fornecendo informações inéditas sobre a biodiversidade da ictiofauna regional e
tendências sobre a evolução cromossômica no gênero Hypostomus.
26
MATERIAL E MÉTODOS
Foram coletados e analisados 46 exemplares de Hypostomus aff. unae, sendo 10
(3 machos, 2 fêmeas e 5 imaturos) do canal principal da bacia do rio de Contas (
13
o
51’51” S e 40
o
04’54” W), 10 (6 machos, 1 fêmeas e 3 imaturos) do rio Preto do
Costa (13°45’84” S e 39°56’47” W), 15 (9 machos e 6 imaturos) do rio Oricó
(14º08’03” S e 39º21’30” W), e 11 (4 machos, 4 fêmeas e 3 imaturos) do rio Preto do
Criciúma (13º 55'45" S e 39º 57'57" W). Essas populações serão doravante identificadas
por A (rio de Contas), B (rio Preto do Costa), C (rio Oricó) e D (rio Preto do Criciúma).
Exemplares testemunhos foram identificados pelo Dr. Claudio Zawadski (UEM) e
depositados na coleção ictiológica da Universidade Estadual de Maringá (UEM –
NUPELIA), PR, Brasil.
Os cromossomos mitóticos foram obtidos de acordo com a metodologia descrita
por Bertollo et al. (1978). A estimulação mitótica foi realizada por injeção prévia de
solução de fermento biológico, segundo Lee e Elder (1980) ou solução composta por
Munolan (antígeno bacteriano e fúngico) e água (1 comprimido: 0,5 ml de água), de
acordo com Molina (2001). Os cromossomos foram classificados em: metacêntricos
(m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a), como comumente
utilizado em peixes (Bertollo et al., 1983; Morelli et al., 1983; Portela et al., 1988, entre
outros). As regiões organizadoras de nucléolos foram detectadas pela impregnação por
nitrato de prata - AgRONs (Howell & Black, 1980) e hibridação fluorescente in situ
(FISH), de acordo com Heslop-Harrison et al., (1991), com modificações de Cuadrado
& Jouve (1994), utilizando a sonda de DNAr 18S obtida a partir do DNA genômico de
Prochilodus argenteus (Prochilodontidae) (Hatanaka & Galetti Jr., 2004). O padrão de
distribuição da heterocromatina foi determinado a partir do bandamento C (Sumner,
1972). Os sítios cromossômicos ricos em pares de bases GC e AT foram evidenciados
por fluorocromos cromomicina A
3
e DAPI, respectivamente (Schweizer, 1980) com
modificações.
RESULTADOS
Os exemplares de H. aff. unae apresentaram o número modal 2n=76 em todas as
populações. Porém, diferenças inter-populacionais foram assinaladas, com
estabelecimento de quatro fórmulas cariotípicas: 12m+16sm+48st/a (NF= 104) para os
27
espécimes da população A, 12m+20sm+44st/a (NF=108) para os espécimes da
população B, 10m+14sm+52st/a (NF=100) para os espécimes da população C e
10m+20sm+46st/a (NF= 106) para os espécimes da população D (Figura 1a, b, c e d).
Constrições secundárias localizadas na porção terminal do segundo par de
cromossomos metacêntricos foram freqüentemente visualizadas, apresentando-se
heteromórficas em todos os indivíduos e coincidentes com as regiões organizadoras de
nucléolo, caracterizando assim um sistema de RONs simples (Figura 01a, b, c e d, em
detalhe). Os sítios ativos de DNAr, detectados pela impregnação por nitrato de prata,
foram confirmados pela FISH. Assim como as constrições secundárias e as RONs
ativas, o tamanho dos cístrons ribossomais também mostrou-se usualmente
heteromórfico entre os homólogos por FISH (Figura 01a, b, c e d, em detalhe).
Em relação à heterocromatina, as quatro populações amostradas apresentaram
além de bandas C positivas centroméricas, bandas conspícuas intersticiais e/ou
terminais em diversos pares de cromossomos acrocêntricos (Figura 02). Entretanto
ocorrem algumas especificidades em relação à distribuição das bandas heterocromáticas
entre as quatro populações. Assim, a população A se diferencia por apresentar
marcações bem mais evidentes nos cromossomos, assim como por um numero maior de
cromossomos com blocos heteromórficos (pares 18, 21 e 37), enquanto que a população
B evidenciou apenas um par cromossômico bem evidente com esta característica (par
22) (Figura 02a e b, detalhe).
Por sua vez, as populações C e D não apresentam cromossomos com blocos
heterocromáticos heteromórficos. Contudo, enquanto que a população D mostra
segmentos heterocromáticos associados com as RONs, bem como as populações A e B,
esta característica encontra-se ausente na população C (Figura 02c e d).
A coloração com os fluorocromos
base-específicos demonstrou, em todos as
populações, um único par de cromossomos com marcações CMA
3
positivas e DAPI
negativas coincidentes com as RONs, caracterizando-as como ricas em bases GC
(Figura 01 em detalhe e Figura 03). Entretanto, vários sítios ricos em AT, DAPI
positivos, foram evidenciados entre as populações, ocupando principalmente regiões
intersticiais e terminais de cromossomos acrocêntricos (Figura 04).
A partir dos métodos citogenéticos empregados, nenhuma evidência de
cromossomos sexuais heteromórficos foi observada na espécie H. aff. unae foi indicada.
28
DISCUSSÃO
Vários rearranjos Robertsonianos e inversões pericentricas conduziram a uma
evolução cariotípica divergente na família Loricariidae (Artoni & Bertollo, 2001), o que
pode ser observado pelos distintos números diplóides e formulas cariotípicas descritos
em espécies dessa família. Tal diversidade pode ser particularmente observada em
Hypostominae, cujo gênero Hypostomus apresenta números diplóides variando de
2n=52 em H. emarginatus (Artoni & Bertollo, 2001), a 2n=84, em Hypostomus sp 2-Rio
Perdido NUP 4249 (Cereali et al., 2008).
Até o momento, apenas cerca de 30 espécies das 117 já descritas para o gênero
possuem informações citogenéticas (Tabela 01). Destas, 30% apresentam 2n=76, 26%
com 2n=72, 13% com 2n=74 e 10% com 2n=68, sendo que os demais números
diplóides (52, 54, 64, 70, 80, 82 e 84) estão distribuídos entre os 21% restantes destas
espécies. Dessa forma os números 76 e 72 representam, até agora, as condições mais
frequentes no gênero.
Tabela 01. Dados citogenéticos compilados para espécies do gênero Hypostomus.
Espécie
Localidade
2n
Fórmula
Cromossômica
B
Crom.
Sexuais
Ref.
Hypostomus
H. affinis
Ribeirão Jacuí (SP)
66
14m+14sm+12st+26a
---
-------
10
H. ancistroides
Afluentes do Rio Tibagi
(PR)
68
16m+18sm+34st/a
---
-------
3
H. ancistroides
---------------
68
10m+26sm+32st/a
---
-------
13
H. ancistroides
Rio Mogi-Guaçu (SP)
68
16m+18sm+34st/a
---
-------
3
H. ancistroides
Rio Araquá,
Botucatu (SP)
68
18m+10sm+12st+28a
---
-------
1
H. ancistroides
---------------
68
10m+27sm+31st/a (M)
10m+28sm+30st/a (F)
---
xx/xy
11
H. albopunctatus
Rio Mogi-Guaçu (SP)
74
10m+20sm+44st/ a
---
-------
3
H. albopunctatus
Rio Piracicaba (SP)
74
10m+20sm+44st/ a
---
-------
7
H. aff. auroguttatus
Rio Mogi-Guaçu (SP)
76
8m+30sm+38st/a
---
-------
3
H. emarginatus
Rio Araguaia (MT)
52
16m+30sm+6st/a
---
-------
6
H. goyazensis
Rio Vermelho, Goiás
Velho (GO)
72
10m+16sm+10st+36a
---
-------
1
H. macrops
---------------
68
10m+14sm+44st/a
---
-------
11
29
Espécie
Localidade
2n
Fórmula
Cromossômica
B
Crom.
Sexuais
Ref.
H. paulinus
---------------
74
10m+20sm+44st/a
---
-------
11
H. paulinus
Ribeirão Três Bocas
76
6m+16sm+54st/a
---
-------
13
H. plecostomus
---------------
54
24m/sm+12st+18a
---
-------
12
H. regani
Rio Mogi-Guaçu (SP)
72
10m+20sm+42st/a
---
-------
3
H. regani
Rio Araquá,
Botucatu (SP)
72
12m+18sm+26st+16a
---
-------
1
H. regani
Ribeirão do Jacutinga
(PR)
72
10m+18sm+44st/a
---
-------
13
H. regani
Rio Piumhi, São francisco
(MG)
72
8m+16sm+20st+28a
---
-------
15
H. strigaticeps
Ribeirão três Bocas, Rio
Jacutinga e Rio Taquari
(PR)
72
10m+16sm+46st/a
---
-------
13
H. strigaticeps
Rio Mogi-Guaçu (SP)
74
8m+4sm+62st/a
---
-------
11
Hypostomus sp 3-
Ribeirão Salobrinha
NUP 4247
Ribeirão Salobrinha (MS)
82
83
84
6m+12sm+64st/a
6m + 12sm + 65st/a
6m+12sm+66st/a
1-2
-------
8
Hypostomus sp 2-Rio
Perdido NUP 4249
Rio Perdido (MS)
84
6m + 16sm + 62st/a
---
-------
8
Hypostomus sp.1
Rio Paranapanema (SP)
64
--------------------
---
-------
9
Hypostomus sp.1a
Ribeirão dos Patos (MG)
76
6m+8sm+16st+46a
---
-------
15
Hypostomus sp.1b
Ribeirão das Araras (MG)
76
6m+8sm+16st+46a
---
-------
15
Hypostomus sp.2
Ribeirão das Araras (MG)
74
10m+6sm+16st+42a
---
-------
15
Hypostomus sp.2
Ribeirão Jacutinga (SP)
68
--------------------
---
-------
9
Hypostomus sp.2
Ribeirão Alambari (SP)
68
--------------------
---
-------
9
Hypostomus sp. 3
Ribeirão Quinta (SP)
72
--------------------
---
-------
9
Hypostomus sp. 3
Ribeirão Edgardia (SP)
72
--------------------
---
-------
9
Hypostomus sp. 3
Rio Paranapanema (SP)
72
--------------------
---
-------
9
Hypostomus sp. 4
Ribeirão Hortelã (SP)
76
--------------------
---
-------
9
Hypostomus sp. 4
Rio Paranapanema (SP)
76
--------------------
---
-------
9
Hypostomus sp. A
Rio Rincão (SP)
70
18m+14sm+38st/a
---
-------
3
Hypostomus sp. B
Rio Mogi-Guaçu (SP)
72
12m+18sm+42st/a
---
-------
3
Hypostomus sp. B
Rio Mogi-Guaçu (SP)
72
13m+18sm+41st/a
---
-------
5
Hypostomus sp. C
Rio Mogi-Guaçu (SP)
72
10m+18sm+44st/a
---
-------
3
Hypnstomus sp. D1
Rio Mogi-Guaçu (SP)
72
10m+26sm+36st/a
---
-------
3
30
Espécie
Localidade
2n
Fórmula
Cromossômica
B
Crom.
Sexuais
Ref.
Hypostomus sp. D2
Rio Mogi-Guaçu (SP)
72
14m+20sm+38st/a
---
-------
3
Hypostomus sp. E
Rio Mogi-Guaçu (SP)
80
8m+16sm+56st/a
---
-------
3
Hypostomus sp. F
Rio São Francisco (MG)
76
10m+16sm+50st/a
---
-------
2
Hypostomus sp. F
Rio São Francisco (MG)
75
10m+17sm+48st/a
---
-------
5
Hypostomus sp. G
Rio Araguaia (MT)
64
14m+24sm+26st/a. (M)
15m+24sm+25st/a. (F)
---
ZZ/ZW
4
H. nigromaculatus
Ribeirão três Bocas e
Ribeirão dos apertados
(PR)
76
6m+20sm+50st/a
---
-------
14
H. nigromaculatus
Rio
Mogi-Guaçu (SP)
76
8m+20sm+48st/a
---
-------
14
H. aff. unae
Rio de Contas (BA)
76
12m+16sm+48st/a
---
-------
16
H. aff. unae
Rio Preto do Costa (BA)
76
12m+20sm+44st/a
---
-------
16
H. aff. unae
Rio Oricó (BA)
76
10m+14sm+52st/a
---
-------
16
H. aff. unae
Rio Preto do Criciuma
(BA)
76
10m+20sm+46st/a
---
-------
16
H. cf. wuchereri
Rio Una (BA)
76
10m+18sm+48st/a
---
-------
17
H. cf. wuchereri
Rio Mutum (BA)
76
10m+18sm+48st/a
---
-------
17
1- Alves et al. (2006), 2- Artoni (1996), 3- Artoni & Bertollo (1996), 4- Artoni et al. (1998), 5- Artoni &
Bertollo (1999), 6- Artoni & Bertollo (2001), 7- Camilo (2004), 8- Cereali et al. (2008), 9- Fenerich &
Oliveira (2004), 10- Kavalco et al. (2005), 11- Michelle et al. (1977), 12- Muramoto et al. (1968), 13-
Rubert (2007), 14- Rubert et al. (2008), 15- Mendes-Neto. (2008), 16- Presente estudo, 17- Bitencourt,
2010.
A partir de comparações com grupos basais relacionados, a presença de 2n=54
pode corresponder à uma característica plesiomórfica em Loricariidae (Artoni &
Bertollo, 2001). Embora essa condição seja compartilhada por várias subfamílias de
Loricariidae, ela está presente em apenas em algumas espécies de Hypostominae
(Alves, et al., 2005; Muramoto et al.,1968; Artoni & Bertollo, 2001), e somente em H.
plecostomus (Muramoto et al., 1968) no gênero Hypostomus (Tabela 01).
Adicionalmente, a correlação entre um maior número de cromossomos
metacêntricos e submetacêntricos em algumas espécies com menor número diplóide, e
um maior número de cromossomos subtelo-acrocêntricos em algumas espécies com
elevado número diplóide, evidenciam o provável papel dos rearranjos Robertsonianos,
do tipo fissões centricas, na evolução cariotípica dos Loricariidae (Artoni & Bertollo,
2001). Assim, por exemplo, na tribo Ancistrini, Ancistrus sp. trombetas apresenta
2n=34 e fórmula cariotípica 22m+ 8sm + 3st+3a (Oliveira et al., 2009) enquanto na
31
subfamília Delturinae, Upsilodus sp. apresenta 2n=96 e possui 16m + 8sm + 72a
(Kavalco et al., 2005).
Com base nessas considerações, os dados citogenéticos ora obtidos sugerem que
H. aff. unae apresentam um cariótipo também derivado, reforçando a hipótese do papel
das fissões centricas na historia carioevolutiva do gênero (Artoni & Bertollo, 2001:
Kavalco et al., 2005). Entretanto, é evidente que outros tipode rearranjos
cromossômicos também contribuíram para a evolução cariotípica dos Hypostomus.
Assim, mesmo mantendo um mesmo numero diplode (2n=76), as diferentes formulas
cariotípicas observadas entre as quatro populações amostradas sugerem que inversões
pericentricas provavelmente atuaram na diferenciação cromossômica entre estas
populações.
De fato, variações de fórmulas cariotípicas tem sido também observadas entre
populações de H. ancistroides, H. regani (Artoni & Bertollo, 1996; Alves et al., 2006;
Rubert, 2007), H. nigromaculatus (Rubert et. al., 2008). É evidente que não se pode
decartar um certo grau de influência técnica na determinação das diferentes fórmulas
cariotípicas, decorrentes do tamanho reduzido dos cromossomos, do grau de
condensação da cromatina e, consequentemente, da identificação das diferentes classes
de cromossomos presentes no cariótipos. Entretanto, o agrupamento dos cromossomos
em apenas duas classes, ou seja m/sm e st/a, minimiza em parte essa problemática,
destacando assim as diferenças mais reais entre as populações como pode ser observado
na Tabela 02.
Tabela 02. Fórmulas cariotípicas das populações de Hypostomus aff. unae agrupadas
nas classes m/sm e st/a.
Populações
Fórmulas cariotípicas
A
28m/sm + 48st/a
B
32m/sm + 44st/a
C
24m/sm+52st/a
D
30m/sm +46st/a
32
Além do numero diplóide conservado, as quatro populações se caracterizam por
RONs simples, presentes na região terminal do braço longo do segundo par de
cromossomos metacêntricos (Figura 01a, b, c e d, detalhe). Mantendo assim a possível
condição plesiomórfica proposta para a família Loricariidae (Artoni, 1996).
Contudo, o tamanho das RONs mostrou-se usualmente heteromórfico entre os
homólogos em todas as populações, sendo mais evidente na população D. Situações
polimórficas, envolvendo diferenças no tamanho das RONs entre cromossomos
homólogos são freqüentes entre espécies de peixes que apresentam RONs simples
(Foresti et al., 1981), possivelmente resultantes de duplicações/deleções, decorrentes de
crossing over desigual e trocas entre as cromátides irmãs (Affonso et al., 2002),
podendo ainda apresentar caráter hereditário.
A hibridação in situ fluorescente utilizando sonda de DNAr 18S confirmou não
só a localização dos genes ribossomais como também o heteromorfismo de tamanho
entre as RONs homólogas, demonstrando que tal diferença é de fato estrutural e não
meramente transcricional como poderia supor-se a partir das marcações Ag-RONs
(Figura 01a, b, c e d em detalhe).
A co-localização de sitios de RONs e de heterocromatina é comumente
evidenciada entre os Hypostomus, como verificado nas populações A, B e D, em H.
nigromaculatus (Rubert et al., 2008), H strigaticeps (Rubert, 2007), e bem como em
outros grupos de peixes (Artoni & Bertollo, 2001). Entretanto, é importante salientar
que esse tipo de relação nem sempre se faz presente, a exemplo de Upsilodus sp.,
Neoplecostomus microps (Kavalco et al., 2005) e da população C de H. aff. unae do
presente trabalho. Por outro lado, tais populações apresentaram as RONs ricas em GC,
conforme evidenciado pelos sinais positivos após a coloração com o fluorocromo
Cromomicina A
3
.
A presença de uma grande quantidade de blocos heterocromáticos,
principalmente na região intersticial dos cromossomos, parece ser uma condição
ancestral nos Loricariidae, visto que tal característica é freqüentemente observada nessa
família e em Callichthyidae (Kavalco et al., 2004), ambas filogeneticamente
relacionadas (Reis, 1998). Segundo Artoni & Bertollo (2001), dois padrões gerais de
distribuição da heterocromatina podem ser destacados na subfamília Hypostominae: o
primeiro cracterizado por uma menor heterocromatina, localizada preferencialmente na
33
região terminal e/ou centromérica, associado a espécies com menor número diplóide; o
segundo caracterizado por grandes segmentos intersticiais em vários cromossomos
acrocêntricos, associado a espécies com maior número diplóide. Aparentemente, as
populações de H. aff unae, embora apresentando um número diplóide relativamente alto
(2n=76), não se encaixam estritamente no segundo padrão, conforme teoricamente é
esperado, evidenciando uma maior complexidade no tocante à distribuição da
heterocromatina nos Hypostomus.
Em geral, os exemplares aqui estudados, além de apresentarem blocos
heterocromáticos mais conspícuos situados na região terminal e ocupando boa parte de
cromossomos acrocêntricos, também exibiram um padrão de distribuição equilocal da
heterocromatina intersticial, isto é, segmentos heterocromáticos situados em uma
posição equidistante em vários cromossomos acrocêntricos, parecendo estar em
conformidade com o modelo de ditribuição proposto por Schweizer e Loidl (1987). Essa
parece ser uma característica comum na família Loricariidae (Kavalco et al. 2004).
As diferenças na localização das bandas C entre as populações podem ser
explicadas por inversões paracêntricas ou transposições, visto que a presença de blocos
heterocromáticos terminais é mais comum no gênero Hypostomus. A partir daí é
possível que estes blocos tenham sido amplificados e/ou acumulados por trocas
desiguais evoluindo independentemente, não descartando a possibilidade de que os
citótipos tenham se originados a partir de tais amplificações. Por outro lado, a
ocorrência de blocos heterocromaticos heteromórficos como observado nas populações
A (pares 18, 21 e 37) e B (par 22), pode ser explicada por crossing over desigual, como
proposto para outras espécies de peixes (Mantovani et al., 2000).
A presença de sítios cromossomicos DAPI positivos, ricos em AT, é rara em
peixes, sendo detectadas apenas em algumas espécies de Hypostomus (Artoni &
Bertollo, 1999). Entretanto esses sitios foram frequentemente evidenciados entre as
populações A, C e D (Figura 04a, c e d). Já a população B apresentou vários sitios
corados igualmente por CMA e DAPI indicando que os trechos ricos em GC e AT
estejam intercalados, mas visualizados como um sinal único e sobreposto em função da
resolução da técnica (Figura 03b e 04b). Representando mais uma característica
diferencial entre as populações.
34
Ainda, a localização dos blocos ricos em AT em regiões equivalentes de
distintos pares cromossômicos sugere que eles tenham uma origem comum e foram
distribuídos por modelos de dispersão de heterocromatina para sítios equilocais em um
determinado grupo de cromossomos (Schweizer & Loidl, 1987). Hipóteses similares
têm sido propostas para explicar padrões preferenciais de distribuição de
heterocromatina em algumas espécies de peixes com cariótipos derivados (Affonso &
Galetti, 2005).
As variações macro e microestruturais observadas nas populações de H. aff.
unae estudadas no presente trabalho podem estar correlacionadas aos padrões de
distribuição e comportamento das espécies de Hypostomus. Os hábitos sedentários
apresentados pelos siluriformes contribuem para a grande dificuldade apresentada por
esses peixes em superar cachoeiras e corredeiras que se interpõem às suas raras
migrações (Britski, 1981). Devido a essa capacidade de deslocamento relativamente
baixa, o endemismo é facilitado (Castro, 1999), o que poderia levar à fixação de
rearranjos por deriva genética ou mesmo por seleção natural, caso tenham algum valor
adaptativo, levando à diferenciação interpopulacional.
Os dados ora obtidos mostram a eficácia da análise da localização e da
composição dos blocos heterocromáticos na identificação de polimorfismos
cromossomicos e caracterização de espécies. Todavia, apesar da sua importância para o
entendimento da evolução cariotípica, estudos sobre heterocromatina ainda são escassos
entre Siluriformes, assim como em muitas espécies da ictiofauna neotropical, sobretudo
de bacias isoladas do leste do Brasil. Neste sentido, o presente estudo representa o
primeiro registro entre os loricarridae das bacias exclusivas do Nordeste brasileiro.
Nossos dados evidenciam que Hypostomus aff. unae apresenta uma evolução
cariotípica divergente entre as populações analisadas, caracterizando distintas unidades
evolutivas.
35
Figura 01: Cariótipos das populações de Hypostomus aff. unae. (A) rio de Contas, (B) Preto do
Costa, (C) Oricó e (D) Preto do Criciúma. Em destaque o par portador das RONs após tratamento
com nitrato de Prata, bandamento C, coloração com CMA3 e FISH com sonda de DNAr 18S.
Observar em C a não ocorrência de heterocromatina associada às RONs.
36
Figura 02: Cariótipos de Hypostomus aff. unae após bandamento C.
(A) População do rio das Contas, (B) População do rio Preto do Costa,
(C) População do rio Oricó e (D) População do rio Preto do Criciuma.
Em destaque os cromossomos com sítios heteromórficos em A e B.
37
Figura 03. Metáfases de Hypostomus aff, unae das populações do rio das Contas (A), Preto do
Costa (B), Oricó (C) e Preto do Criciúma (D) após coloração com CMA 3. Os asteriscos indicam
os pares cromossômicos portadores das RONs e as setas evidenciam os sítios positivos, ricos em
pares de base GC na população do rio Preto do Costa.
38
Figura 04. Metáfases de Hypostomus aff. unae das populações do rio de Contas (A), Preto
do Costa (B), Oricó (C) e Preto do Criciúma (D) após coloração com DAPI, evidenciando
diversos cromossomos portadores de sítios positivos, ricos em pares de bases AT. Os
asteriscos indicam os pares portadores das RONs.
39
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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44
ARTIGO II
HETEROGENEIDADE DA HETEROCROMATINA EM Hypostomus aff. unae
(Siluriformes, Loricariidae)
* Este artigo será submetido à publicação na revista Genetica
45
HETEROGENEIDADE DA HETEROCROMATINA EM Hypostomus aff. unae
(Siluriformes, Loricariidae)
Jamille de Araújo Bitencourt
1
, Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso
2
, Lúcia
Giuliano-Caetano
1
e Ana Lucia Dias
1
1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, CCB,CEP
86051-970, Londrina, Paraná, Brasil, fone (43) 3371-4527 (e-mail: anadias@uel.br)
2
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade estadual do Sudoeste da Bahia,
DCB, CEP 45200-000, Jequié, Bahia, Brasil, fone (73) 35289661 (e-mail:
paulomelloaffonso@yahoo.com.br)
RESUMO
Análises citogenéticas usando bandamento C e digestão cromossômica com diversas
endonucleases de restrição foram realizadas em quatro populações (A, B, C e D) de
Hypostomus aff unae (Loricariidae, Hypostominae) da Bacia do rio de Contas (BA),
nordeste do Brasil. Todas as populações apresentam 2n=76, RONs simples no segundo
par de cromossomos metacêntricos, porém, fórmulas cariotípicas exclusivas para cada
uma delas. As populações A e B apresentaram blocos heterocromáticos terminais e
intersticiais conspícuos na maioria dos cromossomos acrocêntricos, e equivalente às
RONs, com diferenças referentes à posição e ao par envolvido. Já a população D
apresentou marcações mais evidentes nas regiões intersticiais e também intercaladas à
região organizadora de nucléolo, enquanto que blocos heterocromáticos intersticiais e
terminais, não coincidentes com as RONs, foram observados na população C. Os dados
obtidos a partir da digestão com as enzimas Alu I, Bam HI, Hae III e Dde I, revelaram
grande heterogeneidade nas frações de heterocromatina, permitindo a identificação de
diferentes famílias de DNA repetitivo nas populações, além de padrões específicos
gerados nas regiões eucromáticas. A análise com enzimas de restrição mostrou ser
altamente informativa, revelando diferenças populacionais e particularidades na
composição do genoma em H. aff. unae.
INTRODUÇÃO
As endonucleases de restrição (ER) são uma ferramenta poderosa no estudo da
organização do DNA (Lima-de-Faria et al., 1980). Essas enzimas bacterianas
reconhecem e clivam seqüências alvo na dupla fita de DNA, gerando um padrão de
bandas cromossômicas altamente específico para cada uma delas (Lloyd & Thorgaard,
1988). A remoção de fragmentos de DNA torna possível o estudo de áreas específicas
dos cromossomos, no que diz respeito a sua estrutura e a composição de bases (Lorite et
al., 1999; Sanchez et al., 1990, 1991; Lozano et al. 1991; Bianchi et al., 1985, entre
outros). Devido a essa característica, o bandamento obtido com as ER representam um
método sensível de análise da heterocromatina (Pieczarka et al. 1996), podendo revelar
46
maior grau de heterogeneidade e melhores análises comparativas do que o tradicional
bandamento C.
Apesar da aplicação de enzimas de restrição ter sido amplamente utilizada na
análise cromossômica de uma variedade de espécies animais (Miller et al., 1976;
Kaelbling et al., 1984; Lima-de-Faria et al., 1980; Bianchi et al., 1985; Marchi &
Mezzanotte, 1988; Marchi & Mezzanotte, 1990; Juan et al. 1990; Pieczarka et al. 1996;
entre outros), poucos estudos de diferenciação da heterocromatina utilizando ER em
cromossomos de peixes estão disponíveis, sendo restritos a certos grupos como
Characidae (Kantek, et al., 2007; Maistro, et al., 1999), Prochilodontidae (Maistro et al.
2000), Pimelodidae (Swarça, et al., 2005; Carvalho & Dias, 2005), Salmonidae (Lloyd
& Thorgaard, 1988; Sanchez et al., 1990, 1991; Lozano et al., 1991; Albuín et al.,
1994), Muraenidae (Cau et al., 1988) e Scophthalmidae (Bouza et al., 1994).
No gênero Hypostomus, a heterocromatina mostra-se associada à cromossomos
heteromórficos (Cereali et al., 2008; Kavalco, et al., 2004; 2005) e sexuais (Artoni et
al., 1998), bem como a casos de polimorfismo (Rubert, et al., 2008). Adicionalmente, as
espécies de Hypostomus ainda apresentam variabilidade na natureza e distribuição de
heterocromatina (Artoni & Bertollo, 1999). Contudo, os dados referentes a tal
heterogeneidade foram obtidos através do emprego de bandamento C e fluorocromos,
sendo a utilização da digestão enzimática, ainda inexistente no gênero e até mesmo na
família Loricariidae.
O presente trabalho teve por objetivo analisar comparativamente cromossomos
metafásicos de Hypostomus aff. unae, pelo bandamento C e enzimas de restrição,
caracterizando a distribuição e natureza da heterocromatina entre distintas populações
desta espécie.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram coletados e analisados 46 exemplares de Hypostomus aff. unae, de quatro
populações distintas, sendo 10 (3 machos, 2 fêmeas e 5 imaturos) do canal principal da
bacia do rio de Contas ( 13
o
51’51” S e 40
o
04’54” W), 10 (6 machos, 1 fêmeas e 3
imaturos) do rio Preto do Costa (13°45’84” S e 39°56’47” W), 15 (9 machos e 6
imaturos) do rio Oricó (14º08’03” S e 39º21’30” W), e 11 (4 machos, 4 fêmeas e 3
imaturos) do rio Preto do Criciúma (13º 55'45" S e 39º 57'57" W). Exemplares
47
testemunhos foram identificados por Dr. Claudio Zawadski (UEM) e depositados na
coleção ictiológica do NUPELIA – UEM, Maringá, PR, Brasil. Essas quatro populações
passaram a ser identificadas respectivamente por A, B, C e D.
A obtenção de cromossomos mitóticos seguiu a metodologia descrita por
Bertollo et al. (1978). A estimulação mitótica foi realizada por injeção prévia de solução
de fermento biológico, segundo Lee e Elder (1980) ou solução composta por Munolan
(antígeno bacteriano e fúngico) e água (1 comprimido: 0,5 ml de água), de acordo com
Molina (2001). Os cromossomos foram classificados em: metacêntricos (m),
submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a), como comumente
utilizado em peixes (Bertollo et al., 1983; Morelli et al., 1983; Portela et al., 1988, entre
outros).
A detecção das regiões de heterocromatina C positivas foi realizada de acordo
com Sumner (1972), com modificações. A digestão in situ por endonucleases de
restrição foi realizada de acordo com Mezzanotte et al. (1983), com modificações.
Foram adicionados 30 µl da solução de cada enzima utilizada (suspensa em tampão
apropriado e H
2
O destilada), nas preparações cromossômicas. Seguindo-se a incubação
das lâminas em câmara úmida à 37 ºC por tempos e concentrações que variavam de
acordo com a atividade de cada enzima (Tabela 01).
Tabela 01. Relação das enzimas de restrição (ER) utilizadas nas preparações
cromossômicas de Hypostomus aff. unae, com as respectivos sítios de corte,
concentrações e tempos de incubação em que se obtiveram os melhores resultados.
Endonucleases de
restrição
Sítio de corte
Concentração
Tempo de
incubação
Alu I
(5’- AG ↓ CT - 3’)
0,4 U/ µl
4h
Bam HI
(5’- G ↓ GATCC - 3’)
0,5 U
15h
Hae III
(5’-GG ↓ CC - 3’)
6 U/ µl
14h
Dde I
(5’- C ↓ TNAG – 3’)
2 U/ µl
4h
Após a incubação, as lâminas foram lavadas com água destilada e coradas com
Giemsa 5% em tampão fosfato (pH 6,8) por 8 minutos.
48
RESULTADOS
Os espécimes das quatro populações apresentam um numero modal de 2n=76
cromossomos. Porém, distintos padrões de distribuição da heterocromatina foram
evidenciados pelo bandamento C. Apesar das populações A e B apresentarem 17 pares
com marcações conspícuas em regiões terminais e intersticiais de cromossomos
acrocêntricos, além de heterocromatina centromérica e associada às RONs, elas
diferiram quanto à posição e ao par envolvido (Figura 01 e 02). Blocos
heterocromáticos heteromórficos foram também evidenciados em ambas as populações.
Além do par portador das RONs, os pares 18, 21 e 37 nos espécimes da população A e o
par 22 nos espécimes da população B apresentaram diferenças de tamanho entre os
homólogos.
A população C apresentou 6 pares com marcações intersticiais e terminais, não
coincidentes com as RONs (Figura 03), enquanto a população D apresentou 8 pares de
cromossomos marcados em sua maioria nas regiões intersticiais de cromossomos
acrocêntricos e também coincidentes com a região organizadora de nucléolo (Figura
04).
Os tratamentos com ER permitiram evidenciar diferenciações interpopulacionais
a partir dos padrões obitidos em diferentes regiões cromossômicas, sobretudo na
heterocromatina (Tabela 02).
Cinco tipos de heterocromatina portadoras de diferentes famílias de DNA foram
identificadas na população A: (a) a heterocromatina dos pares cromossomos 2, 17, 21,
30, da porção centromérica da heterocromatina dos pares 1, 3, e 35, e da região terminal
do par 29 forma digeridas por todas as enzimas; (b) os pares cromossômicos 16, 18 e 25
não apresentam nenhuma das seqüências; (c) os pares 7, 22, 23, 32 e apenas a
heterocromatina terminal dos pares 1, 3 e 35 forma digeridas pela Alu I, Bam HI e Dde
I; (d) o par 28 e a porção superior do bloco heterocromático do par 29 foram digeridas
pela Hae III, Bam HI e Dde I; (e) e o par 37 foi digerida pela Alu I (Figura 01).
As famílias de DNA repetitivo detectadas na população B foram separadas em
seis grupos: (a) a heterocromatina dos pares 2, 5, 10, 11, 16, 17, 28, 29 e 34 foram
digeridas por todas as enzimas; (b) os pares cromossômicos 18, 22 e 30 não
apresentavam nenhuma das seqüências alvo; (c) os pares 25 e 36 foram digeridos Alu I,
Bam HI e Hae III; (d) a heterocromatina do par 8 foi digerida pela Hae III e Dde I; (e) o
49
par 32 foi digerido pela Alu I e Dde I; (f) e o par 21foi digerida Alu I, Hae III e Dde I
(Figura 02).
Os dados referentes à digestão enzimática das regiões heterocromáticas da
população C permitiu a separação desta em quatro grupos diferentes: (a) onde a região
centromérica do par 21 e as extremidades do bloco terminal do par 23 não apresentaram
nenhuma das seqüências; (b) o par 8 foi digerido apenas pela Hae III; (c) o par 15, a
região central do bloco 23 e o par 26 apresentaram foram digeridos pela Bam HI; (d) o
par 19 e a porção telomérica do par 21 foram digeridos Bam HI e Dde I (Figura 03).
A heterocromatina da população D foi dividida em quatro diferentes grupos: (a)
o par 2 foi digerida por todas as enzimas; (b) os pares 4, 18, 22, 24 e 27 não apresentam
nenhumas das seqüências; (c) o par 29 só apresenta sitio alvo para Bam HI; (d) e o par
33 foi digerido pela Hae III e Dde I (Figura 04).
Em todas as populações, a região organizadora de nucléolo (par 2) apresentou-se
digerida por todas as enzimas, mesmo naquelas em que os blocos heterocromáticos não
foram evidenciados pelo bandamento C.
Em relação ao padrão gerado nas regiões eucromáticas, algumas bandas
conspícuas foram observadas, revelando-se específicas para cada enzima e população.
De modo geral, a população A apresentou uma grande quantidade de cromossomos com
marcações produzidas pela Hae III, enquanto que as populações B e C apresentaram
mais marcações produzidas pela Alu I. Já a população do D mostrou um maior numero
de cromossomos com padrão de bandas geradas por todas as enzimas.
50
Tabela 02. Resultados da digestão enzimática da heterocromatina nos cromossomos das populações
de Hypostomus. aff unae pelas enzimas AluI, Hae III, Dde I e Bam HI. ( ) = heterocromatina digerida;
( ) = heterocromatina não digerida, (±) = heterocromatina parcialmente digerida;
População
Banda C
Par.
Enzima de Restrição
Alu I
Hae III
Dde I
Bam HI
A
1
+
±
+
+
2
+
+
+
+
3
+
±
+
+
7
+
–
+
+
16
–
–
–
–
17
+
+
+
+
18
–
–
–
–
21
+
+
+
+
22
+
–
+
+
23
+
–
+
+
25
–
–
–
–
28
–
+
+
+
29
±
+
+
+
30
+
+
+
+
32
+
–
+
+
35
+
±
+
+
37
+
–
–
–
B
2
+
+
+
+
5
+
+
+
+
8
–
+
+
–
10
+
+
+
+
11
+
+
+
+
16
+
+
+
+
17
+
+
+
+
18
–
–
–
–
21
+
+
+
–
22
–
–
–
–
25
+
+
–
+
28
+
+
+
+
29
+
+
+
+
30
–
–
–
–
32
+
–
+
–
34
+
+
+
+
36
+
+
–
+
8
–
+
–
–
15
–
–
–
+
19
–
–
+
+
C
21
–
–
±
±
23
–
–
–
±
26
–
–
–
+
D
2
+
+
+
+
4
–
–
–
–
18
–
–
–
–
22
–
–
–
–
24
–
–
–
–
27
–
–
–
–
29
–
–
–
+
33
–
+
+
–
51
DISCUSSÃO
A digestão dos cromossomos metafásicos por endonucleases de restrição (ER)
produz uma diminuição geral na intensidade da coloração do cromossomo e o
aparecimento de bandas com um padrão característico para cada enzima (Lima-de-Faria
et al., 1980). A diminuição de coloração da cromatina é tida como uma evidência direta
da importância da remoção de fragmentos de DNA pelas enzimas de restrição (Miller et
al., 1983; Bianchi et al., 1985; Kaelbling, et al., 1984), mas outros fatores também
influenciam nesse processo.
O difícil acesso da enzima ao DNA cromossômico também vem sendo apontada
como possível causa dos padrões observados (Gosálvez et al., 1986; Marchi &
Mezzanotte, 1990). Burkholder & Weaver (1977), estudando as interações DNA –
proteína na cromatina condensada e não condensada em ratos e humanos, constataram
uma sensibilidade diferencial à digestão enzimática das frações da cromatina devido a
diferenças na ligação das proteínas ao DNA, visto que estas o protegem contra a
digestão enzimática. Porém, a relação desses fatores na diferenciação dos cromossomos
ainda não é claramente compreendida. Adicionalmente, mudanças conformacionais da
estrutura do cromossomo também têm sido sugeridas para explicar resultados
produzidos por algumas ER nos cromossomos humanos (Mezzanotte et al., 1985).
No presente trabalho, a utilização desses tratamentos, revelou a existência de
uma grande heterogeneidade de frações da heterocromatina de Hypostomus aff. unae,
por vezes localizadas em cromossomos distintos, no mesmo cromossomo ou
pertencentes ao mesmo bloco heterocromático. Baseado nesses resultados foi possível
detectar similaridades e diferenças intra e inter-populacionais, como observado na
Figura 05. As enzimas clivaram e possivelmente retiraram o DNA das regiões
eucromáticas e heterocromáticas, como evidenciado pela diminuição da coloração em
algumas regiões dos cromossomos. Dessa forma, as bandas observadas são
interpretadas em termos de ausência da seqüencia alvo das enzimas e não remoção do
DNA.
Os dados obtidos sugerem que algumas regiões de heterocromatina em
diferentes cromossomos e populações possuem uma composição similar, enquanto
outras teriam uma composição exclusiva. Assim, os padrões de bandamento gerados
52
refletem diretamente a natureza molecular das regiões de heterocromatina (Sanchez et
al., 1991), não sendo descartada também a possibilidade do acesso diferencial das
enzimas às seqüências alvo.
A partir dessa acentuada heterogeneidade da heterocromatina, conclui-se que as
populações de H. aff. unae possuem famílias de heterocromatina constituídas por
diferentes seqüências de DNA altamente repetitivo. Uma situação semelhante pôde ser
observada em Salmo salar (Albuín et al., 1994) e Salmo trutta (Sanchez et al., 1991),
em que a utilização de ER permitiu a detecção de tipos disitintos de heterocromatina em
regiões particulares dos cromossomos.
De acordo com Schweizer &Loidl (1987), o arranjo não aleatório dos
cromossomos durante a interfase pode favorecer a ligação de regiões cromossômicas e a
dispersão da heterocromatina para sítios equilocais de um cromossomo para outro,
como já proposto para a distribuição da heterocromatina intersticial em espécies do
gênero Hypostomus (Artoni & Bertollo, 1999). Assim sendo, é provável que aqueles
blocos heterocromaticos que compartilham a mesma composição tenham uma origem
comum e tenham se dispersado no complemento cromossômico de H. aff. unae,
posteriormente ao longo do processo de evolução cariotípica, eles poderiam ter sido
amplificados ou acumulados por trocas desiguais, transposições e/ou duplicações
regionais, como similarmente proposto para Centropyge. aurantonotus (Affonso &
Galetti Jr., 2005). Sendo assim, é possível que as divergências cromossômicas entre as
populações tenham envolvido rearranjos na organização estrutural da heterocromatina e
se fixaram nas populações por deriva genética ou mesmo por seleção natural, caso
tenham algum papel adaptativo.
Apesar da detecção de diferenças inter-populacionais, tanto por bandamento C
como com as enzimas, algumas regiões de heterocromatina se mantiveram resistentes a
digestão das ERs nas populações, principalmente na população D, evidenciando uma
maior diferença na composição do DNA ou organização da heterocromatina em relação
às demais. Essa população também se apresenta mais divergente das demais pela alta
freqüência de bandas C intersticiais ao invés de terminais (Figura 05).
Vale ressaltar que a região organizadora de nucléolo (par 2) apresentou-se
digerida por todas as enzimas em todas as populações, demonstrando que as seqüências
alvo destas apresentam-se intercaladas a essa região, mesmo na população C onde os
53
blocos heterocromáticos não são evidentes pelo bandamento C. Tal comportamento
difere do observado por Sanches et al. (1990), em que uma digestão diferencial ocorreu
na RON, evidenciando a presença das seqüências alvo das enzimas Dde I e Hae III e
uma quantidade moderada da Alu I, a qual digeriu parcialmente essa região.
Alguns pares de cromossomos com blocos heteromórficos ocorrem nas
populações A (pares 18, 21 e 37) e na população B (par 22). Entretanto, apenas o par 21
da população A apresentou todas as seqüências alvo das enzimas utilizadas, enquanto
que os demais apresentaram blocos heterocromáticos resistentes à digestão das mesmas.
Trabalhos utilizando enzimas de restrição são escassos na citogenética de peixes
neotropicais, o que restringe análises cariotípicas mais pormenorizadas. Contudo, essa
abordagem pode ser altamente informativa para espécies com grande quantidade de
heterocromatina como a estudada no presente trabalho, podendo revelar particularidades
na composição do genoma da espécie.
De fato, além da diferenciação na formula cariotípica, bem como entre os sítios
cromossômicos GC e AT-ricos (Bitencourt et al., em preparação) as quatro populações
de Hypostomus aff unae mostram-se também diferenciadas quanto aos padrões
cromossômicos gerados pelas endonucleases de restrição, reforçando o grau de
divergência evolutiva e a biodiversidade já fixada entre elas.
13
Figura 01. Pares cromossômicos da população A de Hypostomus aff. unae evidenciando as bandas
heterocromáticas C-positivas e o padrão de bandas gerado com as endonucleases de restrição: Alu I,
Hae III, Dde I e Bam HI.
13
Figura 02. Pares cromossômicos da população B de Hypostomus aff. unae evidenciando as bandas
heterocromáticas C-positivas e o padrão de bandas gerado com as endonucleases de restrição: Alu I,
Hae III, Dde I e Bam HI.
13
Figura 03. Pares cromossômicos da população C de Hypostomus aff.
unae evidenciando as bandas heterocromáticas C-positivas e o padrão
de bandas gerado com as endonucleases de restrição: Alu I, Hae III,
Dde I e Bam HI.
Figura 04. Pares cromossômicos da população D de Hypostomus aff. unae evidenciando as
bandas heterocromáticas C-positivas e o padrão de bandas gerado com as endonucleases de
restrição: Alu I, Hae III, Dde I e Bam HI.
13
Figura 05. Idiograma representativo dos pares cromossômicos das populações A, B, C e D de Hypostomus
aff. unae, evidenciando o padrão geral de bandas após a digestão com as enzimas Alu I, Bam HI, Hae III e
Dde I.
13
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17
ARTIGO III
IDENTIFICAÇÃO DE UNIDADES EVOLUTIVAS DISTINTAS ENTRE
POPULAÇÕES ALOPÁTRICAS DE Hypostomus cf. wuchereri
(SILURIFORMES, LORICARIIDAE). EVIDENCIAS CARIOTÍPICAS.
* Este artigo será submetido à publicação na revista Journal of Fish Biology
18
IDENTIFICAÇÃO DE UNIDADES EVOLUTIVAS DISTINTAS ENTRE
POPULAÇÕES ALOPÁTRICAS DE Hypostomus cf. wuchereri
(SILURIFORMES, LORICARIIDAE). EVIDENCIAS CARIOTÍPICAS.
Jamille de Araújo Bitencourt
1
, Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso
2
, Lucia
Giuliano-Caetano
1
e Ana Lucia Dias
1
1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, CCB,CEP
86051-970, Londrina, Paraná, Brasil, fone (43) 3371-4527 (email: anadi[email protected])
2
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade estadual do Sudoeste da Bahia,
DCB, CEP 45200-000, Jequié, Bahia, Brasil, fone (73) 35289661 (email:
paulomelloaffonso@yahoo.com.br)
RESUMO
Duas populações alopátricas de Hypostomus cf wuchereri (Siluriformes, Loricariidae)
de duas bacias costeiras da Bahia (Brasil) foram caracterizadas citogeneticamente no
presente trabalho. Ambas populações compartilham 2n=76, formula cariotípica de
10m+18sm+48st/a (NF=104) e RONS simples terminais no segundo par metacêntrico.
Diferenças microestruturais foram detectadas através do bandamento C, coloração com
fluorocromos CMA
3
e DAPI, e digestão com as enzimas de restrição Alu I, Bam HI,
Hae III e Dde I. A população do rio Una apresentou grandes blocos heterocromáticos
terminais, compostos por sítios intercalares ricos em AT e GC, enquanto que a
população do rio Mutum apresentou regiões de heterocromatina intersticiais e terminais
menos evidentes, ricas em AT. As RONs das duas populações apresentaram-se ricas em
GC. Cada enzima utilizada, gerou um padrão de bandas específico para cada população,
tanto na eucromatina como na heterocromatina. Adicionalmente a digestão enzimática
permitiu a caracterização de diferentes famílias de heterocromatina. Com base nesses
dados pode-se inferir que essas populações estão evoluindo independentemente,
favorecidas pelo isolamento geográfico entre elas.
INTRODUÇÃO
A ictiofauna dos sistemas hidrográficos costeiros do leste do Brasil apresenta
grande significado biogeográfico. As principais bacias da região (Paraguaçu, Contas,
Jequitinhonha, Doce, Paraíba do Sul, Ribeira de Iguape, Itajaí e Jacuí) bem como várias
outras pequenas drenagens adjacentes apresentam um alto grau de endemismo (Ribeiro
et al., 2006). De fato, cada vez mais espécies de peixes nessas bacias são descritas e/ou
reavaliadas sob o ponto de vista taxonômico, confirmando a riqueza de espécies
19
regionais (Oyakawa & Mattox, 2009; Sarmento-Soares et al., 2009; Zanata & Camelier,
2009).
Por sua vez, os estudos da biodiversidade dependem de informações sobre níveis
de variabilidade intra e interpopulacional e caracterização de unidades evolutivas. As
análises genéticas e citogenéticas constituem uma importante ferramenta para tais
estudos, especialmente em grupos taxonomicamente controversos. Elas auxiliam na
identificação de polimorfismos populacionais (Giuliano-Caetano, 1998), complexos de
espécies (Bertollo et al., 2000) e espécies crípticas (Medrado et al., 2008). Contudo,
apesar do grande número de trabalhos citogenéticos em bacias do sudeste brasileiro e,
mais recentemente, na bacia Amazônica, pouco se sabe sobre as espécies do nordeste
brasileiro (Medrado et al., 2008).
Hypostomus é um dos gêneros mais especiosos entre os Siluriformes,
compreendendo 117 a 130 espécies. Essa imprecisão quanto ao numero de espécies
descritas é devido ao reconhecimento de Aphanotorulus, Isorineloricaria e Squaliforma
como gêneros válidos por Ferraris Jr. (2007), enquanto Armbruster (2004; 2007) os
considera sinonímia de Hypostomus. Desde então, novas espécies vem sendo
continuamente descritas, revelando a grande diversidade de formas do gênero (Jerep et
al., 2007; Zawadski et al., 2008) que compõem um grupo dominante nos rios
brasileiros, incluindo as bacias do Leste.
A espécie Hypostoms wuchereri foi descrita por Gunther em 1864 para os “rios
do Brasil”. Apesar da indefinição da localidade-tipo, acredita-se que o autor referia-se à
bacia do rio Paraguaçu, na Bahia (Reis et al.,2003). Contudo, devido à falta de
levantamentos mais amplos, não se sabe a real distribuição dessa espécie, até o
momento, restrita à bacia do Paraguaçu e do São Francisco (citado como Hypostomus
cf. wuchereri por Garavello & Garavello, 2004).
Portanto, o presente trabalho tem por objetivo caracterizar citogeneticamente
duas populações de Hypostomus cf. wuchereri de bacias costeiras da Bahia (Bacia do
rio de Contas e Recôncavo Sul), fornecendo informações inéditas sobre a biodiversidade
da ictiofauna regional e contribuindo para estudos taxonômicos e biogeográficos.
20
MATERIAL E MÉTODOS
Doze exemplares (7 machos e 5 imaturos) de Hypostomus cf. wuchereri foram
coletados no rio Mutum (13º43’18’’ S e 39º51’20’’W), bacia do rio de Contas,
município de Jequié (BA), e seis (1 macho e 5 imaturos) no rio Una (13º21'55" S e
39º04'35" W), bacia do Recôncavo Sul, município de Valença (BA). Exemplares
testemunhos foram identificados pelo Dr. Claudio Zawadski (Universidade Estadual de
Maringá-UEM) e depositados na coleção ictiológica do NUPELIA – UEM, Maringá,
PR, Brasil.
A obtenção de cromossomos mitóticos seguiu a metodologia de Bertollo et al.
(1978). A estimulação mitótica foi realizada através da injeção prévia nos animais de
solução de fermento biológico, descrita por Lee e Elder (1980). Os cromossomos foram
classificados em grupos: metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos
(st) e acrocêntricos (a), como comumente realizado em peixes (Bertollo et al., 1983;
Morelli et al., 1983; Portela et al., 1988, entre outros). As regiões organizadoras de
nucléolos foram detectadas pela impregnação por nitrato de Prata-AgRONs (Howell &
Black, 1980). O padrão de distribuição da heterocromatina foi determinado pelo
bandamento C (Sumner, 1972). Para a determinação dos sítios ricos em pares de bases
GC e AT foram utilizados os fluorocromos Cromomicina A
3
e DAPI, respectivamente
(Schweizer, 1978), com modificações. A digestão in situ por endonucleases de restrição
foi realizada de acordo com Mezzanotte et al. (1983), utilizando as enzimas Alu I (5’-
AG↓CT - 3’) com concentração de 0,4 U/µl por 4h, Bam HI (5’- G↓GATCC - 3’) com
0,5 U/µl por 15h, Hae III (5’-GG↓CC - 3’) com 6 U/µl por 14h e Dde I (5’- C↓TNAG –
3’) com 2U/µl por 4h.
RESULTADOS
Todos os exemplares de H. cf. wuchereri apresentaram numero modal de 2n=76,
com fórmula cariotípica de 10m+18sm+48st/a (NF=104) independentemente da
população analisada (Figura 01).
A impregnação pela prata evidenciou um sistema de RONs simples, com
marcações na região terminal do braço longo no segundo par de cromossomos
metacêntricos em ambas as populações (Figura 01 em detalhe). Tais marcações
21
apresentaram-se usualmente heteromórficas entre os homólogos e coincidentes com
constrições secundárias.
Por outro lado, o padrão de distribuição de heterocromatina diferiu
significativamente entre as populações. A população do rio Una apresentou 6 pares de
cromossomos acrocêntricos com grandes blocos terminais (pares 17, 21, 24, 26 e 31) e
um par acrocêntrico com uma discreta marcação intersticial (par 30) (Figura 02a). Os
espécimes do rio Mutum apresentaram bandas C mais conspícuas na região terminal de
um par de cromossomos submetacêntricos (par 8) e três pares acrocêntricos (21, 26 e
29) e na região intersticial de quatro pares de cromossomos acrocêntricos (16, 18, 28 e
31) (Figura 02b). Não foram visualizados blocos heterocromáticos associados às RONs
ou heterocromatina centromérica nas duas populações.
O tratamento com os fluorocromos base-específicos revelou, em ambas as
populações, um único par de cromossomos com marcações CMA
3
positivas e DAPI
negativas coincidentes com as RONs, caracterizando-as como ricas em bases GC
(Figura 01 em detalhe, e figura 03a e c). Entretanto, a população do rio Mutum
apresentou sítios ricos em AT equivalentes aos blocos heterocromáticos evidentes no
bandamento C (Figura 03b). Por outro lado, a população do rio Una apresentou blocos
com marcações intercalares de CMA
3
e DAPI, revelando uma marcante
heterogeneidade de sítios ricos em GC e AT de cromossomos acrocêntricos (Figura 03c
e d).
Os dados correspondentes à composição da heterocromatina com base nas
seqüências alvo das enzimas selecionadas nas populações do rio Una e Mutum estão
sumarizados na Tabela 01, evidenciando diferentes tipos de heterocromatina de ambas
as populações.
A população do rio Una apresentou três grupos de heterocromatina: as regiões
de banda C dos pares 26, 30 e 31 foram digeridas por todas as enzimas; o par 24 e a
extremidade do bloco heterocromático de um cromossomo do par 17 foram digeridos
apenas pela Dde I; e o par 21 e a região central do bloco heterocromático de um
cromossomo do par 17 foram digeridos pela Dde I e pela Bam HI (Figura 04).
22
Tabela 01. Resultados da digestão enzimática da heterocomatina C-positiva, presente
nos pares cromossômicos de Hypostomus cf. wuchereri, utilizando as endonucleases de
restrição Alu I, Hae III, Dde I e Bam HI. ( ) = heterocromatina digerida; ( ) = heterocromatina
não digerida;(±) = heterocromatina parcialmente digerida.
População
Banda C
Par.
Enzima de Restrição
Alu I
Hae III
Dde I
Bam HI
Rio Una (Bacia do
rio de Contas)
17
–
–
+
±
21
–
–
+
+
24
–
–
+
–
26
+
+
+
+
30
+
+
+
+
31
+
+
+
+
Rio Mutum (Bacia
do Recôncavo
Sul)
8
+
+
+
+
16
–
–
–
+
18
+
–
+
+
21
+
–
+
+
26
+
–
–
+
28
+
–
+
+
29
–
–
–
–
31
–
–
–
+
Já na população do rio Mutum, a heterocromatina foi separada em 5 grupos: a
heterocromatina do par 8 apresentou-se rica nas seqüências alvo de todas as enzimas; os
pares 18, 21 e 28 foram digeridos pela Alu I, Dde I e Bam HI; os pares 16 e 31 foram
digeridos apenas pela Bam HI; o par 26 digerido pela Alu I e Bam HI; e o par 29 não
apresentou nenhuma das seqüências-alvo das enzimas, permanecendo intacto (Figura
05).
Em relação às regiões eucromáticas, a população do rio Una apresentou as
seqüências alvo da Hae III e Dde I distribuídas uniformemente ao longo de toda a
eucromatina e um padrão de bandas gerado pela Alu I. Já na população do rio Mutum,
as enzimas Hae III e Dde I produziram uma grande quantidade de bandas ao longo dos
cromossomos, enquanto que a seqüência alvo da Alu I apresentou-se distribuída
uniformemente. Por sua vez, o tratamento com a Bam HI não mostrou diferenças
evidentes entre as duas populações.
DISCUSSÃO
Numeros diplóides e de cromossomos acrocêntricos relativamente altos, como
observado em H. cf. wuchereri, parece representar um caráter derivado neste gênero,
visto que o numero diplóide de 2n=54 pode ser uma condição plesiomórfica para a
23
família Loricariidae (Artoni & Bertollo, 2001). Desse modo, sugere-se que as fissões
cêntricas tenham desempenhado um importante papel na evolução cariotípica de H. cf.
wuchereri, levando ao aumento do número diplóide e de cromossomos portadores de
apenas um braço nessa espécie. Situação similar é observada também para Hypostomus
aff. unae (2n=76) da bacia do rio de Contas (Bitencourt et al., em preparação). Os dados
até agora disponíveis indicam que os números diplóides de 76 e 72 são os mais
freqüentes no gênero, sendo observados em 30% e 26%, das espécies de Hypostomus,
respectivamente.
As regiões organizadoras de nucléolos (RONs) em Hypostomus são variáveis em
número e posição. Além de um freqüente polimorfismo de tamanho dessas regiões entre
cromossomos homólogos, a presença de espécies com RONs simples (Artoni &
Bertollo, 1999; 2001) ou múltiplas (Kavalco et al., 2005; Rubert et al. 2008) é também
observada, sendo esta última a condição mais frequente no gênero (Artoni & Bertollo,
2001).
A presença de um sistema de RONs simples na espécie estudada parece
caracterizar a manutenção da condição plesiomórfica da família Loricariidae e dos
peixes de modo geral (Artoni, 1996). Assim como a maioria das espécies de
Hypostomus, o tamanho das RONs apresentou-se usualmente heteromórfico entre os
homólogos e coincidentes com as constrições secundárias em H. cf. wuchereri. Tais
polimorfismos de tamanho nas RONs entre cromossomos homólogos são muito
freqüentes em espécies portadoras de um único par organizador nucleolar (Foresti et al.,
1981). Essa diferença é possivelmente resultante de duplicações/deleções ou crossing
over desiguais, conforme também já proposto por vários autores (Galetti, 1998; Affonso
et al, 2002). Deve ser ressaltado, porém, que tais diferenças foram detectadas por
impregnação pelo nitrato de Prata, envolvendo assim a atividade dos sítios de DNAr e
não a sua estrutura propriamente dita. Assim sendo, análises complementares por
hibridação in situ com sondas de 18S ou 45S poderão confirmar se tais polimorfismos
são também estruturais.
Diferentemente da população do rio Una, a qual apresenta blocos terminais
conspícuos, os espécimes de H. cf wuchereri do rio Mutum apresentam alguns dos
cromossomos com heterocromatina intersticial e marcações terminais menos evidentes
(Figura 02a e b). Artoni & Bertollo (2001), evidenciaram que algumas espécies de
Hypostominae com elevado número diplóide apresentam grandes segmentos
24
intersticiais de heterocromatina em vários cromossomos acrocêntricos, enquanto que
outras espécies com menor 2n apresentam menos heterocromatina, localizada na região
terminal e/ou centromérica. Dessa forma, os dados ora obtidos em H. cf. wuchereri,
sugerem que o padrão de distribuição de heterocromatina pode ser mais variável entre
os hypostominae que o previamente proposto.
A localização dos blocos heterocromáticos na espécie estudada pode ser
derivada por inversões ou transposições da heterocromatina originalmente terminal de
alguns cromossomos acrocêntricos para a porção intersticial de outros, devido ao
arranjo não aleatório dos cromossomos durante a intérfase segundo Schweizer & Loidl
(1987). Isto explicaria a distribuição equilocal da heterocromatina observada entre os
cromossomos não homólogos na população do rio Mutum, como já proposto para
Hypostomus sp E e Hypostomus sp F por Artoni & Bertollo (1999).
Essas diferenças inter-populacionais são ainda mais acentuadas com a utilização
de técnicas mais refinadas para análise composicional da heterocromatina, como a
utilização de fluorocromos e enzimas de restrição, revelando peculiaridades sobre a
estrutura cromossômica destas populações.
Os dados disponíveis na literatura mostram que regiões ricas em GC são comuns
em Hypostomus (Artoni et al., 1998; Artoni & Bertollo, 1999; Kavalco et al., 2004) e
que, embora a presença de sinais positivos para DAPI seja uma condição rara em
peixes, algumas espécies do gênero também apresentaram essa característica (Artoni &
Bertollo, 1999). Em geral, as RONs em Hypostomus são ricas em GC, o que pode ser
observado em três populações de H. nigromaculatus (Rubert et al., 2008), em
Hypostomus sp 2- rio Perdido NUP 4249 (Cereali et al., 2008) e nos exemplares aqui
analisados.
A localização dos blocos ricos em AT na população do rio Mutum está em
regiões equivalentes de distintos pares cromossômicos que, provavelmente, foram
distribuídos por modelos de dispersão de heterocromatina para sítios equilocais
(Schweizer & Loidl, 1987), a exemplo do proposto para outras espécies de peixes
(Mantovani et al., 2000; Affonso & Galetti, 2005). No caso da população do rio Una, a
heterocromatina parece ter seguido um caminho evolutivo diferenciado com a presença
de blocos ricos em AT e GC em varios cromossomos do complemento, condição rara
em vertebrados inferiores. A origem desse padrão pode ser explicada pela provável
25
inserção de seqüências ricas em GC na heterocromatina originalmente rica em AT. Uma
vez estabelecida, essa seqüência heterogênea poderia ser também dispersa para regiões
eqüidistantes, em distintos pares cromossômicos conforme descrito anteriormente.
Contudo, a origem dessas seqüências GC intercalares permanece uma questão a ser
elucidada.
A utilização da digestão in situ com quatro endonucleases de restrição, Alu I,
Hae III, Bam HI e Dde I, facilitou o pareamento dos cromossomos homólogos e a
detecção de diferentes famílias de DNA altamente repetitivo. As regiões coradas
fracamente representam a perda de heterocromatina digerida por essas enzimas,
enquanto as bandas geradas indicam regiões resistentes à digestão devido à ausência de
seqüências alvo e/ou conformação da cromatina e associação com proteínas (Gosalvez
et al., 1987; Burkholder & Weaver, 1977).
Em geral, os diferentes tratamentos com endonucleases de restrição produziram
uma marcante heterogeneidade nos cromossomos das populações de Hypostomus cf
wuchereri, concluindo-se que estas possuem famílias de heterocromatina constituídas
por diferentes seqüências de DNA altamente repetitivo. Poucas semelhanças foram
encontradas entre as populações, à exceção da heterocromatina dos pares 26, 30 e 31 da
população do rio Una e o par 8 da população do rio Mutum, os quais foram digeridos
por todas as enzimas, em ambas as populações (Figura 06).
Uma situação contraditória pode ser observada no que se refere à atividade da
enzima Hae III. Como essa enzima corta regiões ricas em GC, seria esperado que os
blocos heterocromáticos presentes nos pares 17, 21, 24 e 25 da população do rio Una
apresentassem uma porção digerida por esta enzima, visto que são evidenciados pela
CMA
3
e, portanto, ricos em GC. De acordo com Gosalvez et al. (1987), os efeitos da
digestão enzimática nos cromossomos podem ser explicados tanto pela presença e
ausência de suas seqüencias alvo, como pela habilidade destas em cortar a seqüência
alvo, a qual pode não estar acessível ou, ainda, pelo tamanho de seus alvos específicos.
Dessa forma, é possível que alguns desses fatores esteja implicado na ausência de
digestão desses sítios heterocromáticos, os quais se mantiveram inalterados após o
tratamento com a Hae III.
Outra peculiaridade na digestão enzimática observada na população de H. cf
wuchereri do rio Una diz respeito às bandas heteromórficas entre os cromossomos
26
homólogos do par 17 após tratamento com Bam HI, a qual digeriu apenas a região
central do bloco heterocromático de um dos homólogos (Figura 04). Este resultado
demonstra a heterogeneidade existente em frações da heterocromatina, reforçando a
diferença entre as populações analisadas.
Diferenças em outras áreas dos cromossomos não referentes aos blocos
heterocromáticos também foram detectadas. Dessa forma, as enzimas produziram um
padrão de bandas divergente em ambas as populações, principalmente no que se refere a
atividade das enzimas Hae III, Dde I e Alu I. As diferenças existentes no padrão de
digestão indicam caminhos evolutivos distintos, frente as duas populações de H. cf.
wuchereri, dando origem as distintas famílias de DNA repetitivo detectadas entre elas.
Assim sendo, apesar de compartilhar o mesmo número diplóide e formula
cariotípica, as populações de H. cf. wuchereri do rio Una e Mutum apresentam
diferenças microestruturais acentuadas. O estabelecimento da diferenciação na
microestrutura cromossômica entre as populações de H. cf. wuchereri aqui estudadas,
possivelmente se deve a histórias evolutivas distintas favorecidas pelo isolamento
geográfico entre as bacias onde essas populações se encontram, sugerindo que possíveis
pressões seletivas ou efeitos de deriva alteraram a organização cromossômica dessas
populações.
Os dados disponíveis na literatura, tais como intervalo de distribuição de alguns
grupos de peixes e a identificação de espécies endêmicas, sugerem a existência de
unidades biogeográficas ou mesmo sub-províncias, ao longo das bacias costeiras do
leste do Brasil, como as amostradas nesse trabalho (Bizerril, 1994; Ribeiro, 2006).
De fato, múltiplos e sucessivos eventos de encurtamento e alargamento das
placas tectônicas afetaram as margens continentais e podem ter favorecido tanto a
divisão quanto a conectividade entre várias bacias adjacentes (Lundberg et al., 1998,
Pamponet et al., 2008). A última transgressão marinha sobre o continente poderia ter
levado à separação entre populações costeiras previamente conectadas, promovendo
assim a sua diversificação alopátrica (Beheregaray et al., 2002).
Um cenário evolutivo similar ao observado em H. cf. wuchereri foi descrito para
Hoplias malabaricus (Characiformes, Erythrinidae), onde diferenças relacionadas ao
conteúdo de heterocromatina indicam certo grau de diferenciação genética entre as
27
populações das bacias do rio Itapicuru e do rio de Contas, sistemas hidrográficos
costeiros da Bahia (Jacobina et al., 2009).
Com base nos dados obtidos, pode-se inferir que as populações de H. cf.
wuchereri, estejam evoluindo independentemente, podendo futuramente constituir
espécies distintas, já que encontram-se em bacias relacionadas, mas independentes,
mantendo algumas similaridades como a macroestrutura cariotípica.
28
Figura 01. Cariótipos de Hypostomus cf. wuchereri. (A) População do rio
Mutum, (B) População do rio Una. Em destaque os portadores das regiões
organizadoras de nucléolo (RONs) após a coloração com nitrato de Prata, (Ag
RONs), bandamento C (BC) e coloração com cromomicina A3 (CMA3).
Figura 02. Pares cromossômicos com sítios heterocromáticos em Hypostomus
cf. wuchereri. (A) População do rio Una, (B) População do rio Mutum.
29
Figura 03. Cromossomos de Hypostomus cf. wuchereri submetido a coloração com os
fluorocromos cromomicina A
3
(CMA
3
) e DAPI. População do rio Mutum: A e B.
População do rio Una: C e D. Os asteriscos indicam os cromossomos portadores das
RONs. A, e C,= CMA3 e B e D= DAPI.
30
Figura 04. Pares cromossômicos de Hypostomus cf. wuchereri da população do rio
Una evidenciando as regiões heterocromáticas C-positivas e o padrão de bandas
correspondentes obtidos com as endonucleases de restrição: Alu I, Hae III, Dde I e
Bam HI.
31
Figura 05. Pares cromossômicos de Hypostomus cf. wuchereri da população do rio Mutum
evidenciando as regiões heterocromáticas C-positivas e o padrão de bandas correspondentes
obtidos com as endonucleases de restrição: Alu I, Hae III, Dde I e Bam HI.
Figura 06. Idiograma representativo dos pares cromossômicos das populações
de Hypostomus cf. wuchereri evidenciando o padrão geral de bandas após a
digestão com as enzimas Alu I, Bam HI, Hae III e Dde I. População do rio Una
(A), População do rio Mutum(B)
32
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37
CONSIDERAÇÕES FINAIS
1- As quatro populações de Hypostomus aff. unae e as duas Hypostomus cf. wuchereri
analisadas apresentaram numero modal de 2n=76 com grande quantidade de
cromossomos acrocêntricos, correspondente à uma provável uma sinapomorfia dentro
de Hypostomus.
2- Formas cariotipicas distintas foram estabelecidas para cada população amostrada de
H. aff. unae, evidenciando que inversões pericêntricas atuaram na diversificação das
populações, enquanto que as populações de H. cf. wuchereri compartilham a mesma
formula cariotípica.
3- Todas as populações das duas espécies, apresentaram um sistema de RONs simples
com heteromorfismos de tamanho entre os homólogos, mantendo uma provável
condição plesiomórfica da família Loricariidae.
4- A técnica de FISH confirmou a presença de sítios de DNAr 18S na região terminal
do segundo par de cromossomos metacêntricos em H. aff. unae, e demonstrou que a
diferença entre os homólogos é de fato estrutural
5- Distintos padrões da distribuição heterocromatina foram observados entre as
populações nas populações referentes à quantidade de pares envolvidos, localização dos
blocos heterocromáticos e composição de pares de bases AT e GC.
6- As populações de H. aff. unae dos rios de Contas e Preto do Costa apresentaram
sítios ricos em AT em regiões terminais e intersticiais em distintos pares
cromossômicos, enquanto que a população do rio Preto do Criciúma apresentou tais
sítios restritos as regiões intersticiais. Já a população do rio Oricó apresentou marcações
intersticiais e terminais evidentes, coradas igualmente pelo CMA
3
e DAPI, referentes
aos blocos de heterocromáticos.
38
7- Todas as populações analisadas apresentaram as RONs ricas em GC porém, apenas
os exemplares de H. aff. unae do rio de Contas, rio Preto do Costa e rio Preto do
Criciúma apresentaram a heterocromatina associada a essas regiões, evidenciada pelo
bandamento C.
8- Em H. cf wuchereri, grandes blocos terminais com marcações intercalares com
CMA
3
e DAPI foram evidenciados, revelando uma marcante heterogeneidade ao longo
da heterocromatina dos seis pares de cromossomos acrocêntricos na população do rio
Una, enquanto que na população do rio Mutum foram detectadas regiões de
heterocromatina intersticiais e terminais menos evidentes, ricas em bases AT.
9- Cromossomos heteromórficos foram detectados apenas nas populações do rio de
Contas e do rio Preto do Costa de H. aff. unae através da técnica de bandamento C,
assim como na população de H. cf. wuchereri do rio Una pela digestão com BamHI.
10- Uma marcante heterogeneidade de frações de heterocromatina foi evidenciada com
a utilização de enzimas de restrição, detectando diferenças microestruturais e
permitindo a detecção de famílias de heterocromatina em todas as populações
analisadas.
11- Os exemplares de H. aff. unae e H. cf. wuchereri apresentam uma evolução
cariotípica divergente entre as populações analisadas, caracterizando distintas unidades
evolutivas.
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