( PDF ) Leucoplasia oral:tratamento cirúrgico com laser de CO2 e de diodoe análise por imuno-histoquímica da expressão de proteínasrelacionadas à carcinogênese (p53, COX-2 e EGFR)

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VIVIAN CUNHA GALLETTA KERN

Leucoplasia oral:

tratamento cirúrgico com laser de CO

2

e de diodo

e análise por imuno-histoquímica da expressão de proteínas

relacionadas à carcinogênese (p53, COX-2 e EGFR)

São Paulo

2010

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VIVIAN CUNHA GALLETTA KERN

Leucoplasia oral:

tratamento cirúrgico com laser de CO

2

e de diodo

e análise por imuno-histoquímica da expressão de proteínas

relacionadas à carcinogênese (p53, COX-2 e EGFR)

Tese apresentada à Faculdade de

Odontologia da Universidade de São

Paulo para obtenção do título de Doutor

em Odontologia

Área de Concentração: Diagnóstico Bucal

Orientador: Prof. Dr. Dante Antonio

Migliari

São Paulo

2010

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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou

eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Catalogação da Publicação

Serviço de Documentação Odontológica

Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo

Kern, Vivian Cunha Galletta

Leucoplasia oral: tratamento cirúrgico com laser de CO

2

e de diodo

e análise por imuno-histoquímica da expressão de proteínas

relacionadas à carcinogênese (p53, COX-2 e EGFR) / Vivian Cunha

Galletta Kern; orientador Dante Antonio Migliari. -- São Paulo, 2010.

89p. : fig., tab.; 30 cm.

Tese (Doutorado) -- Programa de Pós-Graduação em Odontologia.

Área de Concentração: Diagnóstico Bucal -- Faculdade de

Odontologia da Universidade de São Paulo.

1. Leucoplasia bucal – Tratamento cirúrgico – Lasers. 2.

Carcinogênese bucal. 3. Marcadores biológicos de tumor. I. Migliari,

Dante Antonio. II. Título.

CDD 617.63

BLACK D65

FOLHA DE APROVAÇÃO

Kern VCG. Leucoplasia oral: tratamento cirúrgico com laser de CO

2

e de diodo e

análise por imuno-histoquímica da expressão de proteínas relacionadas à

carcinogênese (p53, COX-2 e EGFR). Tese apresentada à Faculdade de

Odontologia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em

Odontologia.

Aprovado em: / /

Banca Examinadora

Prof(a). Dr(a)._____________________Instituição: __________________________

Julgamento: ______________________Assinatura:__________________________

Prof(a). Dr(a)._____________________Instituição: __________________________

Julgamento: ______________________Assinatura:__________________________

Prof(a). Dr(a)._____________________Instituição: __________________________

Julgamento: ______________________Assinatura:__________________________

Prof(a). Dr(a)._____________________Instituição: __________________________

Julgamento: ______________________Assinatura:__________________________

Prof(a). Dr(a)._____________________Instituição: __________________________

Julgamento: ______________________Assinatura:__________________________

Aos meus pais, Silvia e Paulo Galletta, pelo exemplo de dedicação ao

estudo e ao trabalho, e pelo permantente estímulo e apoio às minhas atividades

acadêmicas.

Aos meus avôs Liete e José Meinberg, Leonor e Domingos Galletta, por

terem sido ao longo de suas vidas pessoas verdadeiramente altruístas, modelos que

tento seguir.

A meu marido, Jorge Kern, pelo amor, compreensão, paciência e o apoio

durante este período em que muitas vezes preteri nossa vida particular para poder

concluir este trabalho.

Ao meu irmão Gilberto Galletta e à Inês Dias, por compartilharem este e

outros momentos importantes de minha formação pessoal e profissional.

Aos meus pacientes, pelo carinho e por permitirem o meu aprendizado,

científico e humano.

AGRADECIMENTOS

Aos colegas da disciplina de Estomatologia Clínica, em especial, Alessandra

Rodrigues de Camargo, Ana Cláudia Luiz, Ana Paula Candido dos Santos, Ângela

Miura, Anna Torrezani, Bianca Freo, Camila de Barros Gallo, Carina Domaneschi,

Erica Fernanda Patrício da Silva, Gabriela Artico, Ingrid Schneider, Silvio Hirota,

Vivian Pellegrini, pela amizade e pelo companheirismo durante os anos que

trabalhamos juntos.

Aos professores da disciplina de Estomatologia Clínica, Andréa Lusvarghi

Witzel, Celso Augusto Lemos Jr., Fábio Abreu Alves, Fernando Xavier Silveira, Ester

Goldenberg Birman e Norberto Nobuo Sugaya, por compartilhar conhecimento, e

contribuir para meu desenvolvimento como clínica e aspirante a pesquisadora.

Às funcionárias do departamento de Estomatologia, em especial, à Cecília

Muniz, Cida Andrade, Iracema Mascarenhas, Néia dos Santos e Zilda, pela

convivência e pelo trabalho dedicado à pós-graduação.

Aos colegas da disciplina de Patologia Bucal, em especial a Alexandra Fontes

da Costa, Brunno Santos de Freitas Silva e Renata Acay, pela orientação e apoio

durante as atividades laboratoriais e à Flávia Caló pela contribuição expressiva na

análise das reações deste trabalho.

Às técnicas do laboratório de Patologia Bucal, Elisa Santos e Beatriz (Bia)

Costa, por me acompanharem pacientemente durante a realização dos

procedimentos laboratoriais necessários para o desenvolvimento deste estudo,

desde a silanização das lâminas, inclusão dos blocos, corte dos espécimes até as

reações de imuno-histoquímica.

Aos professores da disciplina de Patologia Oral, em especial, a Prof.ª Suzana

Castanhede Orsini Machado de Sousa por permitir a realização da investigação

laboratorial deste trabalho.

Às colegas de pós-graduação, Tatiana Toporcov e Kazue Kanegani, pela

realização dos testes estatísticos e pela contribuição na interpretação dos resultados

do trabalho.

Às funcionárias do Laboratório Especial de Lasers em Odontologia (LELO),

Liliane Souza e Eugênia (Gê) Pereira Brandão, pela dedicação com a qual

contribuíram para o desenvolvimento de nosso trabalho no LELO.

Às professoras da disciplina de Dentística, Ana Cecília Aranha e Patrícia

Freitas, por me receberem no LELO há 6 anos, e pela colaboração com o

desenvolvimento do protocolo de lasers em Estomatologia.

Ao professor Carlos de Paula Eduardo por ter me concedido a oportunidade

de fazer parte da equipe do LELO, uma experiência essencial em minha formação

profissional, e por estar disponível a investir em novas idéias e conceitos,

contribuindo para a renovação da prática na clínica odontológica.

À professora da disciplina de Cirurgia Maria Cristina Zindel Delboni, por abrir

as portas da clínica de pós-graduação, possibilitando a coleta de material dos

pacientes atendidos naquele ambulatório, e pela conduta ética com a qual me

recebeu.

À professora da disciplina de Patologia Geral, Luciana Corrêa, pela

cooperação neste e em outros trabalhos, por meio de um diálogo aberto, elucidativo,

contribuindo com meu crescimento acadêmico.

À professora do Mestrado Profissionalizante de Lasers em Odontologia e

amiga Luciane Hiramatsu Azevedo, minha eterna gratidão pela convivência clínica e

científica, pelo incentivo permanente com o qual me estimulou a buscar

aperfeiçoamento profissional e pessoal.

Ao professor Fábio Daumas Nunes, por concordar com a realização deste

trabalho em cooperação com a disciplina de Patologia Bucal e por ter

acompanhando de perto minhas atividades clínicas, participando ativamente do

trabalho.

Ao meu orientador, Prof. Dante Antonio Migliari, pela dedicação à minha

orientação na prática clínica e na redação de artigos científicos, desde meu ingresso

como estagiária na disciplina de Estomatologia Clínica até a conclusão deste

trabalho e por haver transmitido os valores éticos de conduta clínica e acadêmica

que tento seguir em minha vida profissional.

“Any intelligent fool can make things bigger, more complex, and more violent.

It takes a touch of genius -- and a lot of courage -- to move in the opposite direction”

Albert Einstein

Kern VCG. Leucoplasia oral: tratamento cirúrgico com laser de CO

2

e de diodo e

análise por imuno-histoquímica da expressão de proteínas relacionadas à

carcinogênese (p53, COX-2 e EGFR). [tese]. São Paulo: Universidade de São Paulo,

Faculdade de Odontologia; 2010.

RESUMO

Leucoplasia oral (LO) é uma lesão potencialmente maligna, definida como uma placa

branca que não pode ser caracterizada como outra doença da mucosa oral. Dentro

de certo consenso, as LOs devem ser tratadas, mas nenhum tratamento disponível

tem a capacidade de prevenir a transformação maligna. Este trabalho teve como

objetivo avaliar a eficácia do tratamento cirúrgico das LOs por lasers de CO

2

e diodo

e verificar a ocorrência de desfechos clínicos de recidivas, desenvolvimento de

novas lesões ou transformação maligna após o tratamento. Adicionalmente foi

realizado estudo imunohistoquímico em material biopsiado das lesões e em tecido

normal gengival (grupo controle). Fatores reconhecidamente de risco como hábitos

nocivos (álcool e tabagismo), características clínicas das lesões, grau de displasia,

bem como a expressão dos anticorpos investigados, foram analisados e

relacionados com a ocorrência de desfechos clínicos em 40 pacientes atendidos no

ambulatório de Estomatologia Clínica. Os cortes histológicos das lesões foram

classificados de acordo com o grau de displasia e com um sistema binário, e

subsequentemente foram testados para os anticorpos anti-p53, anti-COX-2 e anti-

EGFR através de reação imuno-histoquímica. Análise de Kaplan-Meier, seguida do

teste de log-rank e análise de regressão de Cox avaliaram a ocorrência de

recorrência, desenvolvimento de novas lesões e transformação maligna e possíveis

fatores relacionados com esses desfechos clínicos. Teste de odds ratio e de x

2

avaliaram a expressão dos anticorpos investigados em LOs e grupo controle.

Pacientes com LO apresentaram idade média de 60,5 anos e a relação

homem/mulher foi de 1,35:1. Hábitos de tabagismo e etilismo foram prevalentes em

homens. A maior parte das lesões era < 2 cm (57,1%), tinha aspecto homogêneo

(67,3%) e displasia epitelial (61,2%); apenas 7 lesões eram de “alto risco” (sistema

binário). Desfechos clínicos de recorrência, desenvolvimento de novas lesões ou

transformação maligna foram observados em 37,5% dos pacientes; 2 pacientes

desenvolveram malignidade em sítios distintos da LO inicial. Análise estatística

mostrou associação entre desfecho de recorrência e lesões de alto risco, e entre

desfecho de desenvolvimento de novas lesões e mulheres acima de 60 anos. Os

anticorpos p53 e COX-2 foram mais expressos em LOs que no grupo controle, mas

a expressão de nenhum anticorpo foi relacionada com os desfechos clínicos

avaliados. O tratamento por lasers de alta potência (CO

2

e diodo) mostrou-se

eficiente na remoção das lesões, embora não tenha evitado desfechos clínicos de

recorrência, desenvolvimento de novas lesões e transformação maligna. Lesões de

alto risco e mulheres acima de 60 anos constituíram fatores de risco aos desfechos

clínicos, enquanto os anticorpos analisados não foram eficientes para prognosticar a

evolução das LOs.

Palavras-Chave: Leucoplasia bucal. Marcadores biológicos. Ciclooxigenase 2.

Receptor do fator de crescimento epidérmico. Proteína supressora de tumor p53.

Análise de sobrevida.

Kern VCG. Oral leukoplakia: surgical treatment with CO

2

and diode lasers and

analysis of the expression of proteins related to carcinogenesis (p53, COX-2 e

EGFR) by immunohistochemistry [tese]. São Paulo: Universidade de São Paulo,

Faculdade de Odontologia; 2010.

ABSTRACT

Oral leukoplakia (OL) is a potentially malignant lesion, defined as a white patch that

cannot be characterized as any other disease of the oral mucosa. In general, OL

should be treated; however no treatment available has been able to prevent

malignant transformation. The aim of this study was to evaluate the efficacy of

surgical treatment with CO

2

and diode lasers in 40 patients with OL and the

occurrence of clinical outcomes of recurrence, development of new lesions or

malignant transformation, after treatment. Additionally, an immunohistochemistry

study was performed in OL biopsy-specimen and in gingival normal tissue (control

group). Recognized risk factors such as habits (alcohol and tobacco), clinical

characteristics of lesions, grade of dysplasia, as well as the expression of

immunohistochemistry reaction were analyzed. Histological slides of lesions were

classified according to the grade of dysplasia and a binary system, and subsequently

tested for the anti-p53, anti-COX-2 and anti-EGFR antibodies by

immunohistochemistry assay. Kaplan-Meier analysis along with log-rank test and Cox

regression analysis were used to assess the occurrence of clinical outcomes and the

association with risk factors. Odds ratio and x

2

tests evaluated the expression of the

investigated antibodies in OLs and in the control group. Patients with OL had a mean

age of 60.5 years and the men/women ratio was of 1.35:1. Smoking and alcohol

habits were more prevalent among men than in women. Lesions were clinically

characterized as measuring less than 2 cm (57.1%), with a homogenous aspect

(67.3%) and histologically with epithelial dysplasia (61.2%); only 7 lesions were

classified as of high-risk (binary system). Clinical outcomes (recurrence, development

of new lesions and malignant transformation) were observed in 37.5% patients; 2

patients developed malignancy in areas distant from the initial OL site. Statistical

analysis showed association between recurrence and high-risk lesions, and between

development of new lesions and women over 60 years old. Anti-P53 and anti-COX-2

antibodies were more expressed among OL than in the control group, but no

antibody expression was related to the clinical outcomes analyzed. Surgical

treatment with high-power lasers (CO

2

and diode) showed to be efficient in the

removal of OL lesions, but it did not avoid clinical outcomes of recurrence,

development of new lesions and malignant transformation. High-risk lesions and

women over 60 years old constituted risk factors for the clinical outcomes, while the

analized antibodies were not usefull markers to characterize OL lesions with higher

risk of malignancy.

Keywords: Oral leukoplakia. Biological markers. Ciclooxygenase 2. Epidermal growth

factor receptor. Tumor suppressor protein p53. Survival analysis.

LISTA DE FIGURAS

Figura 5.1 - Curva de Kaplan-Meier para os desfechos em conjunto (recorrência,

nova lesão ou transformação maligna) .................................................50

Figura 5.2 - Curva de Kaplan-Meier para o desfecho de recorrência........................50

Figura 5.3 - Curva de Kaplan-Meier para o desfecho de novas lesões.....................51

Figura 5.4 - Curva de Kaplan-Meier dos grupos de pacientes apresentando lesões

iniciais de alto ou baixo risco, para os desfechos em conjunto

(recorrência, desenvolvimento de novas lesões ou transformação

maligna) (A) e para o desfecho de recorrência isoladamente (B) .........52

Figura 5.5 - Curva de Kaplan-Meier dos grupos de pacientes para o desfecho de

desenvolvimento de novas lesões de acordo com o gênero (A) e a idade

(B) .........................................................................................................53

Figura 5.6 - Padrão de marcação do anticorpo anti-p53 nas LOs (A) e no grupo

controle (B) (aumento de 100 x) ...........................................................57

Figura 5.7 - Padrão de marcação do anticorpo anti-COX-2 nas LOs (A) e no grupo

controle (B) (aumento de 100 x); em detalhe pode-se observar

marcação citoplasmática de células epiteliais na camada basal,

parabasal e espinhosa (aumento de 400 x) ..........................................57

Figura 5.8 - Padrão de marcação do anticorpo anti-EGFR S (A) e anti-EGFR SM (B)

no grupo controle (aumento de 100 x); nota-se a expressão dos dois

clones nos mesmos estratos do epitélio (camada basal) ......................58

Figura 5.9 - Padrão de marcação do anticorpo anti-EGFR S e anti-EGFR SM no

grupo de LOs (aumento de 100 x); nota-se a expressão do anti-EGFR S

restrito à camada basal (A), enquanto a expressão do anti-EGFR SM se

estende até camada espinhosa (B) ......................................................58

LISTA DE TABELAS

Tabela 4.1 - Critérios citológicos e arquiteturais utilizados para a classificação

binária ..................................................................................................39

Tabela 4.2 - Fatores considerados para análise estatística .....................................43

Tabela 5.1 - Idade e hábitos de risco (fumo e álcool) de acordo com o gênero de

pacientes com LO, atendidos na Clínica de Estomatologia de 2003 a

2009.....................................................................................................45

Tabela 5.2 - Características clínicas (tipo e tamanho) de acordo com a localização

das LO (n=49)......................................................................................46

Tabela 5.3 - Detalhamento de características clínicas e histológicas de pacientes

com LO que tiveram desfechos de recorrência, desenvolvimento de

novas lesões ou transformação maligna..............................................49

Tabela 5.4 - Análise de regressão univariada de Cox para desfechos clínicos em

conjunto (recorrência, desenvolvimento de novas lesões e

transformação maligna)........................................................................54

Tabela 5.5 - Análise de regressão multivariada de Cox para desfechos clínicos em

conjunto (recorrência, desenvolvimento de novas lesões e

transformação maligna)........................................................................54

Tabela 5.6 - Análise de regressão univariada de Cox para o desfecho clínico de

recorrência ...........................................................................................55

Tabela 5.7 - Análise de regressão univariada de Cox para o desfecho clínico de

desenvolvimento de novas lesões .......................................................56

Tabela 5.8 - Análise de regressão multivariada de Cox para o desfecho clínico de

desenvolvimento de novas lesões .......................................................56

Tabela 5.9 - Distribuição da marcação dos anticorpos nos grupos de pacientes com

LO e grupo controle..............................................................................60

Tabela 5.10 - Distribuição da marcação dos anticorpos nos grupos de pacientes de

LO com desfecho clínico e sem desfecho clínico.................................60

Tabela 5.11 - Distribuição da marcação dos anticorpos de acordo com a classificação

binária ..................................................................................................61

Tabela 5.12 - Distribuição da marcação dos anticorpos de acordo com a classificação

da displasia (OMS, 2005).....................................................................61

Tabela 5.13 - Distribuição da marcação das proteínas EGRF S e EGFR SM entre as

lesões leucoplásicas ............................................................................62

Tabela 5.14 - Distribuição da marcação das proteínas EGRF S e EGFR SM entre

espécimes do grupo controle ...............................................................62

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS

AgNOR silver-stainable nucleolar organizer region (região organizadora

nucleolar corada por prata)

COX-2 ciclo-oxigenase 2

EGFR epidermal growth factor receptor (receptor do fator de crescimento

epidérmico)

HPV human papilloma virus (papiloma vírus humano)

IC intervalo de confiança

LO leucoplasia oral

Mm milímetro

Ml mililitro

nm nanômetro

OMS Organização Mundial da Saúde

PAS periodic acid shiff

PG prostraglandina

p53 proteína supressora de tumor p53

S tipo selvagem

SIL squamous intraepithelial lesions (lesões escamosas intra-epiteliais)

SIN squamous intraepithelial neoplasia (neoplasia escamosa intra-epitelial)

SM tipo selvagem e mutante

SUMÁRIO

p.

1 INTRODUÇÃO ...........................................................................................17

2 REVISÃO DA LITERATURA......................................................................21

2.1 LEUCOPLASIA ORAL: PREVALÊNCIA E FATORES ASSOCIADOS A SUA

ETIOLOGIA ................................................................................................21

2.2 FATORES ASSOCIADOS À TRANSFORMAÇÃO MALIGNA DAS

LEUCOPLASIAS ORAIS ............................................................................24

2.3 PROCEDIMENTO DE BIÓPSIA E AZUL DE TOLUIDINA..........................27

2.4 TRATAMENTO DA LEUCOPLASIA ORAL.................................................27

2.4.1 Modalidades terapêuticas........................................................................27

2.4.2 Tratamento cirúrgico com lasers de CO

2

e de diodo.............................28

2.5 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DA LEUCOPLASIA ORAL E USO DE

MARCADORES MOLECULARES..............................................................30

2.5.1 Grau de displasia e classificação binária...............................................30

2.5.2 Marcadores moleculares p53, COX-2 e EGFR........................................31

2.5.3 Justificativa deste estudo........................................................................34

3 PROPOSIÇÃO ...........................................................................................36

4 CASUÍSTICA - MATERIAL E MÉTODOS..................................................37

4.1 CASUÍSTICA..............................................................................................37

4.2 MÉTODO....................................................................................................37

4.2.1 Critérios de diagnóstico da LO................................................................37

4.2.2 Anamnese, exame clínico e procedimento de biópsia..........................38

4.2.3 Análise histopatológica, grau de displasia e classificação binária .....38

4.2.4 Expressão de marcadores imuno-histoquímicos..................................39

4.2.4.1 Reações de imuno-histoquímica.................................................................39

4.2.4.2 Análise da expressão dos anticorpos.........................................................41

4.2.5 Tratamento cirúrgico com laser de alta potência..................................42

4.2.6 Desfechos clínicos pós-tratamento cirúrgico dos pacientes...............42

4.2.7 Análise estatística ....................................................................................43

4.2.7.1 Curva de Kaplan-Meier, log-rank e análise de regressão de Cox para

análise de desfechos clínicos .....................................................................43

4.2.7.2 Odds ratio e x

2

para análise da expressão dos marcadores imuno-

histoquímicos..............................................................................................44

5 RESULTADOS...........................................................................................45

5.1 CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS E HÁBITOS................................45

5.2 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DAS LOS................................................46

5.3 TRATAMENTO CIRÚRGICO COM LASER DE ALTA POTÊNCIA ............46

5.4 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA .................................................................47

5.5 DESFECHOS CLÍNICOS OBSERVADOS (RECORRÊNCIAS,

DESENVOLVIMENTO DE NOVAS LESÕES E TRANSFORMAÇÃO

MALIGNA)... ...............................................................................................48

5.5.1 Curva de Kaplan-Meier (análise de sobrevida), log-rank e análise de

regressão de Cox......................................................................................48

5.6 EXPRESSÃO DOS ANTICORPOS ANTI-P53, ANTI-COX-2, ANTI-EGFR S

E ANTI-EGFR SM.......................................................................................56

5.6.1 Análise da expressão dos anticorpos ....................................................59

6 DISCUSSÃO ..............................................................................................63

7 CONCLUSÕES ..........................................................................................70

REFERÊNCIAS.........................................................................................................71

ANEXOS...................................................................................................................81

17

1 INTRODUÇÃO

Leucoplasia é uma lesão com potencial de malignização, caracterizada por

placas ou manchas brancas, que pode ocorrer na mucosa oral, faringe e laringe

(Slaughter et al., 1953; Axéll et al., 1996). Em reunião coordenada pela Organização

Mundial da Saúde (OMS) em Londres, Reino Unido, em Maio de 2005, atualizou-se

o conceito de leucoplasia oral (LO), segundo o qual o “termo leucoplasia deve ser

usado para identificar placas brancas de risco incerto, tendo excluído (outras)

doenças ou condições conhecidas que não possuem potencial aumentado de

transformação maligna” (Warnakulasuriya et al., 2007).

O diagnóstico da LO é feito por exclusão de fatores etiológicos, com exceção

do consumo de tabaco, e pelo exame histopatológico para exclusão de outras

doenças específicas. A LO de etiologia desconhecida é denominada idiopática, e a

associada ao tabagismo de LO tabaco-associada (Axéll et al., 1996; Reibel, 2003).

Outros fatores que podem estar associados à LO, e que também não excluem seu

diagnóstico, são o consumo habitual de álcool, a presença de Candida sobreposta à

LO e a presença do papilomavírus humano (HPV). Esses fatores também têm sido

relacionados ao risco de transformação maligna (Napier; Speight, 2008; van der

Waal, 2009).

O consumo crônico de álcool permanece controverso na etiologia das LOs e é

descrito na literatura mais frequentemente como um fator sinérgico ao tabaco do que

como um fator de risco independente para o surgimento das leucoplasias (Dietrich et

al., 2004; Napier; Speight, 2008).

Outro fator controverso é a associação de Candida ssp à LO. Ainda não se

sabe se a Candida ssp causa lesões brancas não removíveis à raspagem, ou se é

uma infecção superposta às leucoplasias pré-existentes, já que esse microrganismo

está presente particularmente em LO localizadas em dorso de língua ou em mucosa

jugal (van der Waal, 2009).

A presença do HPV em algumas lesões de LO e em espécimes de carcinoma

epidermoide oral indica que esse vírus pode desempenhar algum papel na evolução

da carcinogênese oral. Entretanto, ainda não há evidências consistentes entre a

relação do HPV e o prognóstico das LO (Napier; Speight 2008).

18

De acordo com a literatura, a taxa de transformação maligna das LOs varia de

4% a 6%, porém pode chegar a 18%, dependendo da população e dos hábitos

prevalentes em determinadas áreas geográficas (Reibel, 2003).

Características clínicas, localização das lesões e presença de displasias

epiteliais constituem fatores importantes para a análise do potencial de

transformação maligna. Aspecto clínico não homogêneo (vegetações e áreas

eritematosas coexistentes) associado à localização anatômica (assoalho bucal e

ventre de língua) e tipo de mucosa (não queratinizada) são características que

implicam maior grau de suscetibilidade de transformação maligna (van der Waal;

Axéll, 2002; Bánóczy et al., 2003; Jaber et al., 2003; Reibel, 2003). Alterações

displásicas do epitélio estão associadas à atipia celular, perda da maturação normal

e da sua estratificação (Pindborg et al., 1997). Quanto mais proeminentes e

numerosas elas são, mais severa é a displasia, que pode ser classificada em leve,

moderada ou intensa (Pindborg et al., 1997).

De forma geral, por apresentarem risco de malignização, as LOs devem ser

tratadas. No entanto, o tratamento não assegura a eliminação de risco do

desenvolvimento do carcinoma epidermoide e tampouco elimina a ocorrência de

recidivas da lesão (van der Wall; Axéll, 2002; Reibel, 2003; Lodi et al., 2007). Dois

aspectos se mostram relevantes para as leucoplasias: o tratamento e uso de

marcadores para associar o potencial de malignização.

O tratamento das LOs é cirúrgico, embora medicamentos tópicos, como o

ácido retinoico, também sejam utilizados, com indicação restrita a alguns casos (Lodi

et al., 2002). A remoção das lesões pode ser realizada por cirurgia convencional,

cirurgia por laser de alta potência, crioterapia, eletrobisturi e terapia fotodinâmica

(Laskaris, 2000).

A crioterapia apresenta eficácia limitada devido à falta de precisão da

profundidade de tecido congelado, enquanto a eletrocauterização promove um pós-

operatório desfavorável devido ao dano térmico nos tecidos manipulados, em geral

maior que o dano térmico causado pelo laser (Laskaris, 2000; Yeh, 2000).

Terapia fotodinâmica pode ser uma terapia de eficiência semelhante ao

tratamento cirúrgico, mas certamente possui o custo mais alto entre os métodos,

pois além do laser (não cirúrgico ou de baixa potência), requer substância

fotossensível, que encarece o procedimento (Sieron et al., 2003).

19

O tratamento cirúrgico com laser de alta potência mostra-se vantajoso em

relação à técnica cirúrgica convencional, permitindo controle de sangramento

transoperatório, melhor visibilidade da área cirúrgica e intervenção em lesões

extensas. Os comprimentos de onda de 10.600 nm do laser de CO

2

,

e de 808 nm do

laser de diodo são frequentemente utilizados em tecidos moles, sendo o primeiro

absorvido intensamente pela água e o segundo pela hemoglobina (Ishii et al., 2003;

D’Arcangelo et al., 2007). A alta absorção de energia do laser pelos tecidos

caracteriza o corte preciso e superficial do feixe, minimizando o dano térmico aos

tecidos adjacentes, além da diminuição de bacteremia. O reparo tecidual é

caracterizado pela redução da contração da ferida cirúrgica, uma vez que a

quantidade de miofibroblastos observada em incisões por laser é menor do que a

observada em incisões por bisturi (Luomanen et al., 1988; Zeinoun et al., 2001). No

entanto, o tempo de reparação nas cirurgias a laser é prolongado em relação à

cirurgia convencional (Fisher; Frame, 1984; Luomanen et al., 1988; Luomanen,

1992).

Sendo a LO uma doença potencialmente maligna, o exame histopatológico

convencional é útil para identificar alterações displásicas, porém nem sempre

suficiente para determinar o potencial de malignidade (van der Waal et al., 1997).

Características clínicas também podem não ser suficientes para caracterizar o

potencial das lesões (van der Waal; Axéll, 2002; Jaber et al., 2003; Reibel, 2003). A

introdução de marcadores biológicos pode ampliar a identificação de lesões de maior

risco, auxiliar no planejamento do tratamento e reduzir taxas de transformação

maligna das lesões (Scully; Sudbø; Speight, 2003; Tsantoulis et al., 2006; Mithani et

al., 2007).

O objetivo do uso de marcadores moleculares é possibilitar a identificação de

alterações na expressão de proteínas codificadas por oncogenes ou por genes

supressores de tumores e relacioná-los ao potencial de malignização das LOs

(Warnakulasuriya, 2000).

O evento genético mais comum na carcinogênese oral é a mutação do gene

supressor de tumor p53. O p53 protege a integridade do genoma através da

apoptose ou da cessação do ciclo celular quando ocorre dano ao DNA celular

(Giaccia; Kastan, 1998; Smith et al., 2001). Outros genes estudados, mais

recentemente, o EGFR e o COX-2 foram relacionados com a promoção da

proliferação celular, entre outros processos da carcinogênese oral (Smith et al.,

20

2001; Atula et al., 2006; Tsantoulis et al., 2006; Harari et al., 2007). Estudos mostram

o aumento da expressão de proteínas codificadas pelos genes p53, EGFR e COX-2

em displasia oral (Shin et al., 1994; Cruz et al., 2002; Renkonen et al., 2002). De

acordo com um modelo elaborado por Lippman et al. (2005), esses três genes estão

relacionados com a progressão da carcinogênese oral, a partir da ativação do

EGFR, e subsequentemente, com eventos moleculares envolvendo o COX-2,

aumentando a frequência de mutações (possivelmente do p53), levando então à

proliferação desregulada do epitélio (Lippman et al., 2005).

O ambulatório de Estomatologia atende pacientes procedentes da

comunidade local e referenciados à FO-USP para o tratamento de diversas doenças,

incluindo as lesões brancas, principalmente a LO. Embora não temos uma

prevalência exata da LO em nosso ambulatório, o número de atendimento

registrados varia entre 5 e 6 casos anuais.

O propósito deste presente estudo foi inicialmente estabelecer um protocolo

de tratamento das LOs. Adicionalmente, investigar os benefícios clínicos do uso de

marcadores imuno-histoquímicos nessas lesões para melhor monitoramento dos

pacientes.

21

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 LEUCOPLASIA ORAL: PREVALÊNCIA E FATORES ASSOCIADOS A SUA

ETIOLOGIA

Desde 1994, a partir do Simpósio de Uppsala, a definição das LOs tem sido

modificada com o objetivo de uniformizar critérios de diagnóstico, com base no

conceito atual sobre a biologia de doenças orais potencialmente malignas. O novo

consenso estabeleceu que a leucoplasia é uma “lesão predominantemente branca

que não pode ser caracterizada como outra lesão definível: algumas leucoplasias se

transformarão em câncer”, considerando ainda a associação da LO com o tabaco

(Axéll et al., 1996; Warnakulasuriya et al., 2007).

Estima-se que a prevalência mundial da LO varia entre 1% e 5%; os

resultados dos estudos epidemiológicos diferem de acordo com a etnia e hábitos da

população avaliada, além dos critérios clínicos utilizados no diagnóstico das lesões

(Roosaar et al., 2007; Napier; Speight, 2008). A maior parte dos estudos é realizada

em países onde a população avaliada é de “alto risco” em virtude de seus hábitos

intensos de alcoolismo ou tabagismo, como a Índia, ou em países desenvolvidos

onde comumente populações procedentes de hospitais são avaliadas, o que poderia

superestimar os valores reais (Lim et al., 2003; Fisher et al., 2005; Napier; Speight,

2008). Uma revisão sistemática de trabalhos publicados desde 1986, que utilizou

critérios de diagnóstico definidos pelo Simpósio de Uppsala, estimou a prevalência

global da leucoplasia entre 1,7% e 2,7%. No entanto, ressaltaram a limitação dessa

revisão, pois os estudos utilizados para a avaliação nem sempre consideraram

populações representativas da população adulta (Petti, 2003).

Consumo crônico do tabaco e do álcool, infecção por Candida sp,

características clínicas e grau de displasia, são alguns fatores associados à

incidência da LO e a sua taxa de transformação maligna. O uso do tabaco é

fortemente associado à incidência da leucoplasia em países em que o hábito é

prevalente na população em diversas formas de consumo (nuts, quids, areca), assim

como nos países desenvolvidos, em que o cigarro é a forma mais frequente. O

hábito de fumar mais de 20 cigarros por dia foi associado à ocorrência da LO,

22

aumentando o risco de aparecimento dessa lesão em 2,4 a 15 vezes (Dietrich et al.,

2004). Paradoxalmente, LOs em indivíduos não tabagistas parecem ter maior risco

para o desenvolvimento de malignização das lesões (Napier; Speight, 2008).

Hamadah e Thomson (2009), observou que pacientes não fumantes e que não

consumiam álcool regularmente tiveram piores taxas de sobrevivência após 5 anos

do tratamento cirúrgico (Hamadah; Thomson, 2009). Outros estudos apontam maior

risco de transformação maligna das LOs entre as mulheres que não possuem o

hábito de tabagismo, sugerindo que LOs idiopáticas teriam maior risco de

cancerização entre este gênero (Silverman et al., 1984; Schepman et al., 1998).

O papel do álcool na etiologia da LO ainda é controverso, mas o consumo

regular de bebidas alcóolicas em quantidade além do recomendado é comum entre

pacientes com lesões potencialmente malignas e malignas (Napier; Speight, 2008).

O consumo excessivo do álcool pode ter efeito sinérgico ao cigarro, pois fumantes

que também são etilistas possuem maior risco a neoplasias malignas orais que

somente fumantes. Esse efeito ocorre possivelmente porque a ingestão crônica de

álcool causa o aumento da penetração de carcinógenos na mucosa oral, seja

através do aumento da solubilidade dos carcinógenos ou através do aumento da

permeabilidade da mucosa oral a estas substâncias nocivas presentes no tabaco

(Wight; Ogden, 1998; Reichart, 2001).

Lim et al. (2003) detectou o aumento do risco de lesões malignas ou

potencialmente malignas em 350% para fumantes de mais de 20 cigarros por dia,

tanto em homens quanto em mulheres. Homens que relatavam beber mais de 20

unidades de álcool por semana tinham risco 3 vezes maior de desenvolver neoplasia

maligna ou LO (Lim et al., 2003). Um estudo epidemiológico na Suécia acompanhou

a evolução de LO e constatou que após 10 anos todos os indivíduos que

desenvolveram neoplasia maligna eram fumantes e alcoólicos moderados (Roosar et

al., 2007). Em outro estudo, realizado na Itália, a LO foi encontrada em 13,8% dos

casos de um grupo de homens adultos (> 40 anos) considerado de alto risco por

causa da prevalência dos hábitos de tabagismo e etilismo, ainda que a associação

estatística para os hábitos e a LO tenha sido negativa (Campisi; Margiotta, 2000).

Jaber et al. (1999) observou em seu estudo que o desenvolvimento de displasia

epitelial oral foi influenciado sinergicamente pelo tabaco e pelo álcool (Jaber et al.,

1999).

23

A maior parte dos estudos confirma a prevalência da LO em homens

(Lumerman et al., 1995; Saito et al., 2001; Jaber et al., 2003; Lim et al., 2003; Petti,

2003; Lee et al., 2006), possivelmente por serem mais frequentes hábitos de

tabagismo e consumo de álcool entre este gênero (Napier; Speight, 2008). No

entanto, como mencionado anteriormente, mulheres portadoras de LO sem hábitos

podem ter maior taxa de malignização das lesões (Schepman et al., 1998; Saito et

al., 2001; Napier; Speight, 2008).

Associação entre o fungo Candida ssp e carcinogênese oral é questionável.

Não se sabe se a Candida ssp está relacionada à etiologia da LO, ou se é uma

infecção superposta às lesões leucoplásicas. Na literatura há relatos do aumento da

transformação maligna em LOs infectadas por Candida ssp, e estudos em animais

revelam que o fungo tem alto potencial de produção endógena de nitrosaminas,

substâncias carcinogênicas na mucosa oral (Reibel, 2003). Porém clinicamente,

essa associação nem sempre é verificada. Silverman et al. (1984) indentificou LOs

superpostas à Candida ssp, porém não enontraram relação com casos de

transformação maligna (Silverman et al., 1984). Ainda assim, lesões com

identificação do fungo Candida ssp por citologia esfoliativa ou por PAS de biópsia

incisional devem ser tratadas com antifúngico, e o exame citológico deve ser

repetido para verificação da efetividade da terapia, a fim de eliminar possível

superposição das lesões por Candida ssp (van der Wall et al., 1997; Holmstrup et al.,

2006).

A citologia esfoliativa é um método de diagnóstico de rotina para lesões

potencialmente malignas em colo de útero, que também pode ser utilizado em

mucosa oral. Trata-se de um teste minimamente invasivo, sem a necessidade de

anestesia local, para a coleta de amostra do epitélio estratificado de mucosa. Células

provenientes de raspagem da mucosa, e visualizadas em microscópio óptico

representariam a presença ou não de displasia, identificada inicialmente em células

provenientes da camada basal. Embora falso negativos ou falso positivos possam

ocorrer, a técnica tem sido aprimorada, como na citologia esfoliativa de base líquida,

para permitir resultados mais fidedignos (Epstein et al., 2002).

Outro fator relacionado à etiologia das LOs, a presença do papilomavírus

humano (HPV), especialmente dos subtipos 16 e 18, foi observada em LOs e em

neoplasias malignas orais, mas seu papel na carcinogênese oral permanece

contraditório (Napier; Speight, 2008). Um trabalho recente realizou teste para

24

identificação do HPV em 167 pacientes com LO que foram acompanhados

clinicamente para verificação de transformação maligna. Os autores não

encontraram associação entre a presença do HPV e a transformação maligna,

sugerindo que a identificação do HPV em LOs não é indicador do prognóstico das

lesões (Yang et al., 2009).

2.2 FATORES ASSOCIADOS À TRANSFORMAÇÃO MALIGNA DAS

LEUCOPLASIAS ORAIS

Na mucosa oral, a LO pode ocorrer antes do surgimento do carcinoma de

células escamosas, com taxas variáveis descritas na literatura, dependendo da

população estudada e o tempo de estudo (Schepman et al., 1998). De fato, quanto

maior o período de acompanhamento das leucoplasias, maior é a taxa de

malignização das lesões (Silverman et al., 1984; Schepman et al., 1998; Napier;

Speight, 2008). Em seu estudo, Schepman et al. avaliou 166 pacientes por 29

meses em média, e detectou 2,9% de transformação maligna ao ano. Esta taxa

aumentou em 50% quando o tempo de acompanhamento foi prolongado para 200,8

meses (Schepman et al., 1998). Lee et al. (2000) reportou 31,4% de transformação

maligna das leucoplasias no período de 10 anos (Lee et al., 2000), Lumerman et al.

obteve taxa de 16% durante uma média de 18.4 meses (Lumerman et al., 1995), e

Holmstrup relatou 12% em 7,5 anos (Holmstrup et al., 2006). No entanto, um cálculo

da taxa global de transformação maligna mostrou que apenas 1,36% das LO

desenvolvem malignidade por ano (Petti, 2003). Scheifele e Reichart (2003) sugerem

a padronização de uma taxa de transformação anual para comparar resultados, já

que as taxas descritas nos diversos trabalhos da literatura variam com o período de

acompanhamento (Scheifele; Reichart, 2003).

Em nações desenvolvidas, a maior parte dos indivíduos é acometida pela LO

entre a 6ª e 7ª década de vida, já nos países em desenvolvimento ocorrem, em

média, de 5 a 10 anos antes (Silverman et al., 1984; Lumerman et al., 1995; Jaber et

al., 2003; Napier et al., 2003; Dietrich et al., 2004; Nagao et al., 2005; Napier;

Speight, 2008). A taxa de transformação maligna parece não variar com a idade

(Petti, 2003). Em estudo retrospectivo de 630 pacientes, divididos em grupos com

25

idade acima e abaixo de 35 anos, não foi identificada diferença significativa entre os

grupos a taxa de transformação maligna, que foi de 5,0% para o grupo jovem, e de

5,6% para o grupo mais velho (Jaber et al., 2003).

Na tentativa de relacionar um “perfil clínico” da LO com seu potencial de

cancerização, as lesões são classificadas por sua superfície em homogêneas

(superfície plana branca) e não homogêneas (superfície eritroleucoplásica, nodular e

exofítica), pelo tamanho (<2 cm, >2 cm a 4 cm, >4 cm) e localização (áreas com

maior ou menor risco) (Axéll et al., 1996; van der Wall; Axéll, 2002). Alguns trabalhos

reportam a mucosa jugal como o sítio de maior incidência da leucoplasia (Reichart,

2000; Napier; Speight, 2008), enquanto outros reportam assoalho e língua (Frame et

al., 1984; Chu et al., 1988; Flynn et al., 1988; Roodenburg et al., 1991; Lumerman et

al., 1995; Shepman et al., 1998; Thomson; Wylie, 2002; Napier et al., 2003; van der

Hem et al., 2005; Hamadah; Thomson, 2009) ou gengiva/rebordo alveolar (Nagao et

al., 2005).

O risco de transformação maligna e de displasia epitelial intensa tem sido

relacionado com a localização em borda lateral de língua e assoalho bucal, e com

característica de superfície não homogênea (Silverman et al., 1984; Holmstrup et al.,

2006), mas essa associação nem sempre é verificada. Em amostra de LO

predominante em língua e assoalho, Schepman et al. (1998) não encontrou maior

taxa de malignização relacionada com a localização das lesões, mas sim com o

aspecto clínico não homogêneo (Schepman et al., 1998). Outro trabalho extenso

relatou não haver associação estatística entre as características clínicas de

superfície ou localização da lesão e o grau de displasia epitelial em população do

Oeste europeu (Jaber et al., 2003). Saito et al. (2001) descreveu maior taxa de

transformação maligna em leucoplasia de língua, nenhum caso foi reportado em

assoalho. O autor destacou a possibilidade da falha do tratamento utilizado ser

responsável pela prevalência de casos de malignização em língua, já que a

criocirurgia teve alta taxa de insucesso e foi utilizada na maior parte dos casos

naquela localização (Saito et al., 2001).

O tamanho da LO e o aspecto da superfície também parecem estar

relacionados com o risco aumentado à transformação maligna. Napier et al.

concluíram que lesões de grande extensão (que envolvem mais de um sítio

anatômico) tinham aproximadamente 6 vezes mais risco de progressão para

carcinoma epidermoide, enquanto outros fatores analisados (gênero, idade,

26

tabagismo, aspecto da superfície, localização e tamanho das lesões) não

influenciaram a ocorrência de transformação maligna (Napier et al., 2003). Holmstrup

et al. também observaram risco 5 vezes maior de lesões maiores que 200 mm

2

para

a transformação maligna, e 7 vezes maior em lessões com aspecto não homogêneo

(Holmstrup et al., 2006). Porém, nem sempre as características clínicas das LOs

(tamanho, localização e a superfície da lesão) são relacionadas com maior riscos de

cancerização (Saito et al., 2001; Thomson; Wylie, 2002; van der Hem et al., 2005).

Outra característica das LOs que pode indicar risco diferenciado a

malignização é o número de lesões presentes na mucosa. LOs múltiplas devem ser

analisadas de maneira distinta das LOs únicas, por possuírem outra suscetibilidade

genética, ainda pouco estudada. Nesses casos, deve ser enfatizada a possibilidade

do aumento do risco de cancerização das lesões orais e da mucosa do trato

gastrointestinal como um todo (Lee et al., 2000). O acometimento da LO em

múltiplos sítios sugere que o campo de cancerização abrange uma extensão maior

da mucosa oral que em LOs únicas (Hamadah et al., 2009). Em estudo sobre

leucoplasias de acometimento múltiplo, foram realizadas múltiplas biópsias

incisionais a fim de determinar um “mapa” clínico-histológico das lesões espalhadas

pela mucosa, com o objetivo de determinar um protocolo de tratamento cirúrgico por

laser restrito às lesões em sítios de maior displasia. Todos os pacientes adultos

avaliados eram fumantes e consumiam álcool. A maior parte das lesões (cerca de

70%) apresentava hiperplasia (sem displasia) ou displasia leve. Leucoplasias

homogêneas ocorreram mais frequentemente em mucosa jugal, mucosa alveolar e

borda lateral de língua. De maneira similar às LOs únicas/localizadas, as

leucoplasias múltiplas apresentaram displasia moderada ou carcinoma in situ em

regiões concideradas de alto risco (palato mole, região de fauces, ventre de língua e

assoalho de boca), independente do aspecto clínico da lesão. Portanto, sugeriu-se a

remoção cirúrgica de lesões localizadas nessas áreas de displasia intensa, ainda

que os autores afirmem não ser possível prever o comportamento de LOs múltiplas,

baseado apenas em aspectos clínicos e histopatológicos (Thomson; Hamadah,

2007). Outro estudo, de Saito et al., verificou maior taxa de transformação maligna

em pacientes com múltiplas lesões do que em pacientes com lesões localizadas

(Saito et al., 1999)

27

2.3 PROCEDIMENTO DE BIÓPSIA E AZUL DE TOLUIDINA

O diagnóstico da leucoplasia depende não somente da exclusão de fatores

etiológicos conhecidos, mas também de um procedimento de biópsia incisional bem

realizado. Espécime da biópsia deve ser representativo da lesão para definir a

graduação da displasia epitelial presente no tecido (Lumerman et al., 1995). O azul

de toluidina é um corante metacromático que pigmenta DNA mitocondrial em células

que contêm volume aumentado de ácido nucleico, o qual sugere proliferação local

anormal. Aplicação tópica do azul de toluidina tem sido utilizada como um

procedimento clínico adjunto de baixo custo e fácil manipulação para o

reconhecimento de lesões malignas e displasia epitelial de alto grau. A sensibilidade

e a especificidade do corante para identificar lesões malignas são altas, em

contraste com a dificuldade de interpretação do resultado em leucoplasias, onde o

corante apresenta variações da intensidade do azul. Apesar da variação da

sensibilidade do teste para lesões displásicas descrita na literatura, este corante

pode auxiliar na seleção do sítio da biópsia incisional (Allen, 1998; Epstein et al.,

2002; Meltzer, 2007).

2.4 TRATAMENTO DA LEUCOPLASIA ORAL

2.4.1 Modalidades terapêuticas

Poucos estudos compararam os índices de transformação maligna de LOs

tratadas cirurgicamente com os de LOs sem tratamento (Saito et al., 2001; Homstrup

et al., 2006; Arduino et al., 2009), porém nota-se nesses estudos uma tendência de

indicação do tratamento para lesões com características clínicas e histológicas de

maior risco. Além disso, não existe nenhum estudo randomizado controlado

publicado na literatura (Lodi et al., 2002).

Tradicionalmente, o tratamento indicado para a LO é a excisão cirúrgica,

independente da severidade de displasia epitelial ou das características clínicas das

28

lesões (Kademani; Dierks, 2007; van der Wall, 2009). Outros tipos de tratamento,

como o ácido retinoico tópico, a crioterapia ou a terapia fotodinâmica, foram

investigados, mas nenhum apresentou resultados que comprovadamente

indicassem eficácia na prevenção da transformação maligna das LOs (Lodi et al.,

2002).

Em revisão sistemática, Lodi et al. (2002) avaliou trabalhos que utilizaram

bleomicina tópica, ácido retinoico tópico, vitamina A sistêmico e beta caroteno

sistêmico como tratamento para a leucoplasia. Apesar da melhora clínica das lesões,

nenhuma dessas terapias foi considerada eficiente para a prevenção da

transformação maligna, e eventualmente houve efeitos adversos de várias

severidades, não justificando o benefício dessas modalidades terapêuticas (Lodi et

al., 2002).

O tratamento com crioterapia possui altos índices de recidiva, provavelmente

pela falta de precisão do volume final de tecido congelado, além da desvantagem de

apresentar longos períodos para reparação (Yeh, 2000; Saito et al., 2001).

A cirurgia convencional tem como vantagem a conservação das margens da

lesão removida para exame histopatológico, mas requer procedimento adicional de

enxerto para lesões extensas e pode causar cicatriz limitante de função para casos

persistentes de recidiva (Kademani; Dierks, 2007).

2.4.2 Tratamento cirúrgico com lasers de CO

2

e de diodo

Atualmente, a remoção de LOs com laser de CO

2

(α = 10.600 nm) é a

modalidade de tratamento mais comum (Lodi; Porter, 2008). Além do CO

2

, outro

laser amplamente utilizado para cirurgia em tecidos moles é o de diodo (α = 808

nm); o primeiro laser é intensamente absorvido pela água e o segundo pela

hemoglobina (Ishii et al., 2003; D’arcangelo et al., 2007).

Entre as vantagens da cirugia com lasers de alta potência, estão o controle de

sangramento, diminuição da bacteremia e melhor visualização do campo cirúrgico, a

redução da formação de cicatriz favorecendo o manejo das LOs e preservando a

mobilidade dos tecidos moles irradiados (Luomanen et al., 1988; Luomanen, 1992).

Particularmente, a cirurgia com laser para LOs extensas é vantajosa, pois permite a

29

remoção de grandes áreas sem a necessidade de incisões auxiliares ou enxertos

para fechamento da ferida cirúrgica (Meltzer, 2007). Como a reparação se dá pela

migração do epitélio novo formado na periferia para o centro da lesão, alguns

autores sugerem a vaporização das bordas da lesão, com a intenção de diminuir a

possibilidade de recidiva (Ishii et al., 2003; van der Hem et al., 2005; Hamadah;

Thomson, 2009).

A principal desvantagem da técnica com laser em relação a cirurgia com

lâmina de bisturi é a cicatrização prolongada, de 4 semanas em média (Kademani;

Dierks, 2007; Meltzer, 2007). As complicações após tratamento cirúrgico com lasers

de alta potência compreendem o desenvolvimento de granulomas (Chu et al., 1988;

Vivek et al., 2008), a sialodenite causada pela obstrução do ducto da glândula

submandibular e parestesia de língua (Thomson; Wylie, 2002).

Apesar das vantagens do uso dos lasers de alta potência para a remoção das

LOs, o tratamento não assegura a eliminação do risco de desenvolvimento do

carcinoma de células escamosas e tampouco elimina recidivas da lesão (van der

Wall; Axéll, 2002; Reibel, 2003; Lodi; Porter 2008).

Após a remoção cirúrgica das LOs por laser de alta potência, recorrências são

frequentes nos locais adjacentes às lesões primárias, assim como o surgimento de

novas lesões em sítios diferentes do sítio inicial, independentemente do tempo entre

a excisão e a reaparição da lesão (Schepman et al., 1998; Laskaris, 2000; van der

Waal; Axéll, 2002; Lodi; Porter, 2008). Na literatura, as taxas de recorrência

compreendem entre 10% e 57% (Chu et al., 1988; Chiesa et al, 1990; Roodenburg

et al., 1991; Schepman et al., 1998; Schoelch et al, 1999; Saito et al., 2001;

Thomson; Wylie, 2002; Ishii et al., 2003; Chandu; Smith, 2005; van der Hem et al.,

2005; Vivek et al., 2008; Hamadah; Thomson, 2009). Essa variação pode ser

atribuída aos tipos de lasers utilizados, parâmetros de irradiação, critérios de

inclusão, período de acompanhamento e etnia da população estudada (Lodi; Porter,

2008).

Autores que utilizaram microscópio associado ao laser de alta potência para

melhor visualização das margens das lesões reportaram as menores taxas de

recorrências, entre 10–38% (Frame et al., 1984; Chiesa et al. 1990; Roodenburg et

al., 1991; Chu et al., 1988; van der Hem et al., 2005), enquanto trabalhos que não

dispunham de tal equipamento relataram taxas entre 22–57% (Flynn et al., 1988;

Schoelch et al., 1999; Thomson; Wylie, 2002; Chandu; Smith, 2005; Hamadah;

30

Thomson, 2009). Em relação aos critérios de inclusão e exclusão, é importante

observar que estudos que incluíram pacientes com lesões em lábio apresentaram

taxas menores de desfechos clínicos (Chiesa et al., 1990; Roodenburg et al., 1991;

van der Hem et al., 2005).

Outro critério relativo à metodologia dos estudos é o grau de displasia das

LOs tratadas. No trabalho de Vivek et al. (2008) pacientes com lesões que

apresentaram displasia intensa foram excluídos e apenas 3 casos de transformação

maligna e 3 casos de recorrência foram registrados após 3 anos de seguimento dos

pacientes (Vivek et al., 2008). Holmstrup et al. avaliou retrospectivamente pacientes

tratados e não tratados por cirurgia convencional para o desfecho de transformação

maligna e constatou que a taxa de transformação maligna foi de 12% para o primeiro

grupo e de 4% para o segundo, concluindo que o tratamento cirúrgico não foi

eficiente na prevenção da transformação maligna. No entanto, o critério para seleção

dos pacientes no grupo a ser tratado era presença de displasia epitelial ou

localização da LO em borda ou ventre de língua e assoalho bucal. Dessa forma,

71% das lesões tratadas cirurgicamente apresentaram displasia epitelial, enquanto

apenas 12% das lesões não tratadas apresentaram displasia na biópsia incisional

(Holmstrup et al., 2006). Os critérios escolhidos pelo autor para determinar o

tratamento das LOs correspondem a fatores de maior risco à transformação maligna

e provavelmente influenciaram nos resultados do trabalho.

2.5 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DA LEUCOPLASIA ORAL E USO DE

MARCADORES MOLECULARES

2.5.1 Grau de displasia e classificação binária

O grau de displasia epitelial presente em leucoplasia ainda permanece o

melhor método para avaliar lesões de maior risco de desenvolver carcinoma (Lee et

al., 2000; Cowan et al., 2001; Reibel, 2003; van der Wall, 2009). Entretanto, a

análise histopatológica é subjetiva, podendo ocorrer diferenças de atribuição da

severidade de displasia entre examinadores (Abbey et al., 1995; Fisher et al., 2004).

31

Para um diagnóstico mais acurado, é sugerida a revisão da lâmina por outro

avaliador que não seja o primeiro patologista, e entre duas regiões distintas do corte.

A de maior severidade deve prevalecer como resultado com o objetivo de não

subdiagnosticar uma lesão, pois espécimes de biópsia excisional mostram graus

variáveis de displasia ao longo do epitélio (Pentenero et al., 2003).

O sistema de classificação mais utilizado para determinar o grau de displasia

é o da OMS, que reconhece cinco estágios histopatológicos em lesões epiteliais

precursoras (LOs) de acordo com atipias citológicas e mudanças arquiteturais

observadas no epitélio: hiperplasia escamosa, displasia leve, displasia moderada,

displasia intensa e carcinoma in situ (World Health Organization Classification of

Tumours, 2005). Outros sistemas de classificação histológica das LOs foram

sugeridos na literatura, como o ponto de corte AgNOR (Silver-stainable Nucleolar

Organizer Region), que pode ser útil para distinguir entre displasia leve ou

moderada, o SIN (Squamous Intra-epithelial Neoplasia), utilizado para a

classificação de lesões cervicais pré-malignas e o SIL (Squamous Intraepithelial

Lesions), utilizado entre patologistas laringologistas (Chattopadhyay; Ray, 2008; van

der Waal, 2009). Em relação a esses sistemas, a OMS não indica o uso do SIN, pois

esta nomenclatura considera a presença de neoplasia inserida no epitélio, e não há

evidências de que todas as LOs evoluirão em neoplasias (Warnakulasuriya et al.,

2008). Recentemente o grupo de especialistas da OMS do Centro de Câncer e Pré-

câncer Oral sugere o uso de um sistema binário para classificar as lesões em “baixo

risco” e “alto risco” com o objetivo de prognosticar o risco de transformação maligna

das LOs com mais eficiência (Warnakulasuriya et al., 2008; van der Waal, 2009).

Esse sistema foi desenvolvido e testado por Kujan et al., com resultados satisfatórios

em relação à concordância entre os escores dos patologistas (Kujan et al., 2006).

2.5.2 Marcadores moleculares p53, COX-2 e EGFR

Ainda que características clínicas ou histológicas indiquem o risco de

cancerização das LOs, o carcinoma epidermoide oral pode surgir de lesões

“inócuas”, sem displasia ou com aspectos clínicos considerados de baixo risco (Cruz

et al., 1998; Cowan et al., 2001; Holmstrup et al., 2006).

O uso de marcadores

32

moleculares pode representar um avanço na intervenção de lesões orais com risco

de malignização. Técnicas mais sensíveis para a identificação de marcadores

moleculares permitem o reconhecimento de modificações precoces do epitélio, antes

mesmo que a alteração da morfologia do tecido seja clinicamente perceptível

(Regezi et al., 1995; Srinivasan; Jewell, 2001; Warnakulasuriya et al., 2008).

A mutação do gene p53 é um dos eventos genéticos mais comuns da

carcinogênese oral, e é encontrada em até 80% dos carcinomas de células

escamosas orais (Cruz et al., 1998). Os genes supressores de tumor, como o p53,

têm a função de evitar que as células adquiriram características malignas, por meio

da regulação de “check-points” durante o ciclo celular, monitorando a replicação do

DNA e da mitose. Acredita-se que a supressão do crescimento celular induzida pelo

p53 promove um mecanismo pelo qual células geneticamente danificadas têm tempo

para a reparação de seu DNA, razão pela qual o p53 é chamado de “guardião do

genoma” (Cruz et al., 1998). O p53 quando mutado é inativado, ocorrendo perda da

regulação da proliferação, diferenciação e morte celular (Mithani et al., 2007). A

detecção da proteína p53 através da imuno-histoquímica geralmente indica

presença da sua forma ineficaz, pois sua forma nativa e funcional possui meia-vida

curta (Giaccia; Kastan, 1998). A expressão do p53 tem sido detectada por

imunohistoquímica em 10–50% das LOs, sendo mais intensa conforme o aumento

do grau de displasia, e está relacionada com lesões de maior risco de transformação

maligna, indicando a possibilidade desse marcador molecular em identificar lesões

de alto risco de malignização (Regezi et al., 1995; Cruz et al., 1998; Lee et al., 2000;

Tanda et al., 2000; Piatelli et al., 2002; Kurokawa et al., 2003; Fan et al., 2006). No

entanto, alguns trabalhos não encontraram associação entre o aumento da proteína

p53 e a mutação do seu gene precursor em leucoplasias e enfatizam a necessidade

de outros marcadores para uso em lesões iniciais da carcinogênese (Shanavaz et

al., 2000; Warnakulasuriya, 2000). Resultados conflitantes são atribuídos a

diferenças de metodologia, como a técnica laboratorial para detecção da proteína ou

da mutação do gene, o acompanhamento ou não dos pacientes para verificar o

comportamento clínico da lesão, além do uso de diferentes métodos de

quantificação da expressão do anticorpo no tecido epitelial (Warnakulasuriya, 2000).

Estudos de imuno-histoquímica mostram marcação positiva do p53 no núcleo de

células epiteliais, sendo que em tecidos normais ela é restrita à camada basal,

33

enquanto em LOs ela pode ocorrer em camadas mais superiores do epitélio (Cruz et

al., 2002; Fan et al., 2006).

As COX são enzimas responsáveis pela catalisação da reação de síntese de

prostaglandinas (PGs). A COX-1 está presente na maioria dos tecidos em sua forma

constitutiva e media a síntese de PGs que desempenham funções fisiológicas

normais, como a proteção da mucosa gastrointestinal. No entanto, a COX-2 não é

detectada na maioria dos tecidos normais e sua produção pode ser induzida em

resposta a estímulos de citocinas pró-inflamatórias, fatores de crescimento e

promotores de tumores. Cada produto derivado das PGs desempenha uma série de

atividades biológicas, e diversas malignidades aparentam produzir maior quantidade

de certas PGs (por exemplo, PGE

2

) possivelmente alterando a proliferação celular, a

angiogênese, e a apoptose (Banerjee et al., 2002; Lin et al., 2002). A COX-2 pode

ser identificada em vários tipos de neoplasias malignas, principalmente as do trato

gastrointestinal, e em LOs (Chan et al., 1999; Banerjee et al., 2002; Renkonen et al.,

2002; Shibata et al., 2005; Sawhney et al., 2007). Estudos verificaram através de

reações de imuno-histoquímica a marcação positiva do COX-2 no citoplasma celular

do epitélio de LOs, enquanto a expressão da COX-2 em tecidos normais é

praticamente inexistente (Renkonen et al., 2002; Shibata et al., 2005; Atula et al.,

2006).

Receptores de fatores de crescimento (epidermal growth factor receptor) são

moléculas pertencentes à “família” denominada erbB ou HER, reguladoras do

crescimento celular (proliferação, migração e diferenciação celular) pois transmitem

sinais extracelulares de proliferação, provenientes de seus ligantes, para o

citoplasma, através da membrana plasmática. Hiperatividade ou aumento da

expressão do EGFR induz a ativação de diversos substratos intracelulares,

desencadeando sinais de mitose e outros eventos ligados à progressão de tumores

(Harari et al., 2007; Specenier; Vermorken, 2007). Quando há inibição do EGFR, o

ciclo celular é bloqueado na fase G1 e outros mecanismos de controle da

proliferação são desencadeados, entre eles a hipofosforilação do retinoblastoma

(Rb). Há 4 subtipos de receptores da erbB (EGFR/erbB1, erbB2/neu, erbB3 e

erbB4), mas o EGFR/erbB1 é o subtipo superexpresso em grande parte dos

carcinomas de células escamosas orais, e está relacionado a um pior prognóstico

dessa malignidade (Hiraishi et al., 2006). A imuno-histoquímica tem sido uma técnica

amplamente utilizada para detectar a expressão do EGFR em carcinomas orais

34

(Grandis et al., 1996; Hiraishi et al., 2006), mas pouco se sabe sobre esse receptor

em LOs (Srinivasan; Jewell, 2001). Assim como o p53, o EGFR foi encontrado super

expresso em tecido adjacente a carcinomas de cabeça e pescoço, e sua expressão

é expandida às camadas superiores do epitélio à medida que se observa o aumento

de displasia epitelial (Shin et al., 1994; van Oijen et al., 1998).

Há evidências da relação entre a expressão do p53 e da COX-2. A expressão

da COX-2 foi verificada em neoplasias malignas de cabeça e pescoço que

continham a variante mutante do p53, enquanto foi verificada supressão da

transcrição da COX-2 pela atividade do gene supressor de tumor p53 em seu estado

normal (Subbaramaiah et al., 1999; Gallo et al., 2003). Essa associação parece

ocorrer especialmente em neoplasias malignas de estadiamento inicial, não

ocorrendo a mesma relação em neoplasias em estágio avançado (Atula et al., 2006).

A ativação da sinalização do EGFR pode levar ao aumento da transcrição da

COX-2, e consequentemente ao aumento da produção de PGE

2

. Essa PG pode

induzir a sinalização do EGFR estimulando a proliferação celular por um mecanismo

complexo de feedback (Dannenberg et al., 2005). Há evidências da eficácia do

bloqueio simultâneo das vias da carcinogênese mediadas pela COX-2 e pelo EGFR

para a inibição do crescimento do carcinoma epidermoide, sendo, portanto possíveis

agentes de quimioprevenção (Chen et al., 2004; Choe et al., 2005).

Segundo um modelo de progressão da carcinogênese oral, o EGFR, COX-2 e

p53 estão envolvidos em diferentes estágios da progressão do epitélio displásico à

neoplasia maligna (Lippman et al., 2005). No entanto, não há estudos que avaliem a

expressão desses 3 marcadores moleculares em LOs. A expressão do p53, COX-2 e

EGFR em LOs através de reações imuno-histoquímicas poderia ser útil na

investigação de LOs de maior risco à transformação maligna.

2.5.3 Justificativa deste estudo

Aspectos clínicos e histopatológicos das LOs não são suficientes para

identificar lesões que poderão desenvolver malignidade. O uso de marcadores

moleculares pode ser útil para identificar LOs com maior potencial de malignização e

auxiliar no monitoramento dos pacientes de risco. O tratamento adequado das LOs

35

também é relevante, e o laser de alta potência pode constituir um recurso

terapêutico para essa finalidade.

36

3 PROPOSIÇÃO

Os objetivos deste estudo foram:

1. Determinar características clínicas e demográficas dos pacientes com LO;

2. Avaliar o efeito do tratamento de LOs por excisão com laser de CO

2

e de diodo;

3. Avaliar a expressão das proteínas p53, COX-2 e EGFR em cortes histológicos

de biópsia incisional das lesões tratadas;

4. Identificar fatores que podem afetar a recorrência, desenvolvimento de novas

lesões ou transformação maligna da LO.

37

4 CASUÍSTICA-MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CASUÍSTICA

Este estudo foi composto por 40 pacientes com leucoplasia oral (LO),

atendidos consecutivamente no ambulatório da Disciplina de Estomatologia Clínica

da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo (FO-USP) no período

de 2003 a 2009. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

FO-USP (protocolo 160/2007; Anexo A). Os pacientes foram informados sobre os

objetivos do estudo e o termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido de cada

participante, conforme as diretrizes e normas regulamentadoras de pesquisas

envolvendo seres humanos (Anexo B).

4.2 MÉTODO

4.2.1 Critérios de diagnóstico da LO

O diagnóstico da LO foi baseado nos critérios estabelecidos no Simpósio

Internacional sobre Lesões Brancas da Mucosa Oral, realizado em Uppsala, Suécia,

em 1994, segundo os quais, as LOs devem ter um diagnóstico provisório inicial

baseado em dados do exame clínico (ou seja, a identificação de uma lesão

predominante branca em forma de placa ou mancha que não pode ser caracterizada

como nenhuma outra doença da mucosa oral), e outro definitivo auxiliado pela

exclusão de fatores etiológicos, quer sejam mecânico (trauma por fricção ou

mordiscatum), físico ou químico (à exceção do tabagismo) e pelo exame

histopatológico. O exame histopatológico é indicado tanto para excluir lesões que

podem ter aparência clínica semelhante às das LOs (especificamente o líquen plano

oral em placa, o nevo branco esponjoso e a candidose hiperplásica) como para

identificar a presença ou não de displasia epitelial. Pacientes em cujas lesões

38

brancas foram identificados possíveis fatores etiológicos, e nas quais não houve

sinais de regressão em um período de 8 semanas após a eliminação dos fatores,

foram incluídos no estudo como portadores de LO. Lesões localizadas em lábio não

foram consideradas para a análise, já que podem coexistir com a queilite actínica.

4.2.2 Anamnese, exame clínico e procedimento de biópsia

Informações sobre uso contínuo de medicação sistêmica e/ou tópica,

antecedentes médicos recentes e pregressos, história familiar de neoplasias, hábitos

nocivos (tabagismo e etilismo), idade, gênero, e etnia foram registradas em

prontuário específico (Anexo C). Exame físico intraoral incluiu localização, tamanho

e caracterização morfológica das LO (homogênea e não homogênea).

Previamente a biópsia, material obtido das superfícies das lesões por

raspagem foram corados com PAS para pesquisa de Candida spp. Pacientes PAS-

positivos foram tratados com antifúngico por duas semanas e retestados.

Posteriormente, as lesões foram coradas com azul de toluidina para selecionar áreas

mais representativas de biópsia. Áreas de aspecto não homogêneo da superfície da

lesão (regiões exofíticas, eritematosas, erosivas ou ulceradas) foram

preferencialmente biopsiadas independente de positividade para o azul de toluidina.

Em pacientes com múltiplas lesões foram realizadas múltiplas biópsias. Lesões

menores do que aproximadamente 1 cm foram removidas por biópsia excisional.

Espécimes foram fixados em formol a 10% e enviados para análise histopatológica

no Laboratório de Patologia Bucal da FO-USP.

4.2.3 Análise histopatológica, grau de displasia e classificação binária

Os critérios de análise histopatológica das LOs seguiram a classificação da

OMS (2005) que subdivide as lesões em hiperplasia, displasia discreta, moderada

ou intensa e carcinoma in situ, de acordo com a severidade e extensão de

alterações citológicas e arquiteturais presentes no epitélio (World Health

39

Organization Classification of Tumours, 2005). Adicionalmente, foi utilizado um

sistema binário que classifica as lesões de acordo com o número de alterações

observadas na arquitetura do epitélio e na morfologia celular (descritas na Tabela

4.1), caracterizando lesão de “alto risco” (com no mínimo 4 alterações arquiteturais e

5 citológicas) e de “baixo risco (menos que 4 alterações arquiteturais ou menos de 5

alterações citológicas) (Kujan et al., 2006; Warnakulasuriya et al., 2008). Tanto a

análise histológica, quanto o grau de displasia, foram realizadas pelo serviço de

rotina da disciplina de Patologia Bucal da FO-USP. A análise do sistema binário foi

realizada por um patologista “cego” em relação aos dados clínicos.

Tabela 4.1 - Critérios citológicos e arquiteturais utilizados para a classificação binária

Alterações arquiteturais Alterações citológicas

1. Estratificação irregular do epitélio 1. Variação do tamanho do núcleo

2. Perda da polaridade da camada basal 2. Variação da forma do núcleo

3. Projeções em gota 3. Variação do tamanho celular

4. Aumento do número de figuras mitóticas 4. Variação da forma celular

5. Mitoses anormais superficiais

5. Aumento da proporção

núcleo/citoplasma

6. Queratinização precoce 6. Aumento do tamanho do núcleo

7. Pérolas de queratina 7. Figuras mitóticas atípicas

8. Aumento do tamanho e da forma do

nucléolo

9. Hipercromatismo

Baseado em Kujan et al. (2006)

4.2.4 Expressão de marcadores imuno-histoquímicos

4.2.4.1 Reações de imuno-histoquímica

O teste de imuno-histoquímica foi realizado em todos os espécimes viáveis de

biópsia incisional das LOs e em 20 amostras de tecido de gengiva clinicamente

40

saudável obtidas de procedimentos cirúrgicos de exodontia realizados na Clínica

Odontológica da FO-USP. Previamente à coleta de tecido de gengiva saudável, os

pacientes foram informados sobre os objetivos do estudo e o termo de

consentimento livre e esclarecido foi obtido de cada participante (Anexo D).

Para a realização das reações imuno-histoquímicas, os cortes foram

submetidos aos seguintes anticorpos separadamente: anticorpo monoclonal de

camundongo anti-p53 humano (clone DO-7, DAKO, Carpinteria, Califórnia, USA),

anticorpo monoclonal de camundongo anti-COX-2 humano (clone CX-294, DAKO),

anticorpo monoclonal de camundongo anti-EGFR humano tipo selvagem (S) (clone

DAK-H1-WT, DAKO), e anticorpo monoclonal de camundongo anti-EGFR tipo

selvagem e mutante (SM) (kit Pharm Dx for manual use, clone 2-18C9, DAKO).

Para controle positivo e negativo das reações foram utilizados espécimes de

carcinoma epidermoide oral para os anti-p53 e anti-COX-2, e de condiloma

acuminado oral para o anti-EGFR S. Como controle do anti-EGFR SM foi utilizada

lâmina fornecida pelo fabricante. O controle negativo foi realizado omitindo o

anticorpo primário.

A partir dos espécimes fixados em formol e emblocados em parafina, foram

preparados cortes com espessura de 3 µm, estendidos em lâminas de vidro

silanizadas, e deixados em estufa a 60°C por 24 hor as antes de iniciar as reações

imuno-histoquímicas. Primeiramente, os cortes foram desparafinados em dois

banhos de xilol e, em seguida, reidratados em cadeia descendente de etanóis. Após

a reidratação, foi feita a remoção do pigmento formólico através de incubação em

hidróxido de amônia a 10% em solução alcoólica (etanol 95%), por 10 minutos, e

lavagem em água subsequentemente.

Os cortes receberam tratamento de recuperação antigênica, com EDTA pH

9,0 para o anti-p53 e TRIS-EDTA pH 9,0 para o anti-COX-2 e o anti-EGFR S, em

banho maria, durante 30 minutos. Ao final do tratamento de recuperação antigênica,

os cortes foram imediatamente lavados em água corrente, durante 10 minutos, e

imersos em água destilada. Em seguida, seguiram para a etapa de bloqueio da

peroxidase endógena tecidual, realizada pela incubação em dois banhos, de 15

minutos cada, em solução 1:1 de peróxido de hidrogênio a 10% e metanol. Repetida

a lavagem em água, foram imersos em solução de TRIS pH 7,4, com dois banhos de

5 minutos cada.

41

Os anticorpos foram diluídos em solução tampão de TRIS, pH 7,6, acrescidos

de albumina bovina a 1%, em uma diluição de 1:75 para o p-53 e de 1:100 para o

anti-COX-2 e o anti-EGFR S e foram incubados sobre os cortes durante 30 minutos

para o anti-p53, e 120 minutos para o anti-COX-2 e o anti-EGFR S. Para a

incubação do anticorpo de ligação e do complexo terceário, foi usado o sistema o kit

LSAB+ (DAKO) para o anti-p53 e o sistema Advance HRP (DAKO) para os anti-

COX-2 e anti-EGFR S. Todas as condições experimentais precedentes, e as

descritas a seguir, foram otimizadas previamente em laboratório.

As reações foram reveladas pela diaminobenzidina (DAKO Liquid DAB+,

K3468) através de incubação por 10 minutos e, após lavagem em TRIS e água

deionizada, para remoção de excessos, os cortes foram contracorados com

hematoxilina de Mayer. Desde a utilização do anticorpo secundário até a

contracoloração todos as etapas foram realizadas automaticamente com o auxílio do

Autostainer DAKO e entre cada etapa realizada na máquina, os cortes passaram por

lavagens em solução tampão de TRIS pH 7,6.

Para o anti-EGFR SM, o tratamento de recuperação antigênica, bloqueio da

peroxidase endógena, incubação do anticorpo e do complexo terceário, revelação e

contracoloração, foram utilizados reagentes contidos no kit e as reações foram

realizadas manualmente de acordo com as instruções do fabricante.

Desidratação em série crescente de etanóis seguida de diafanização em xilol

e montagem das lamínulas com resina Permount, concluíram as reações realizadas

e as lâminas seguiram para análise em microscopia de luz (microscópio modelo

CHS, Olympus Optical Co., Ltd, Japão).

4.2.4.2 Análise da expressão dos anticorpos

A expressão dos anticorpos anti-p53, anti-EGFR (S e SM) e anti-COX-2 foi

avaliada por dois indivíduos calibrados previamente, os quais realizaram análise

qualitativa, verificando se houve marcação positiva e em que estrato do epitélio

(camada basal, parabasal ou espinhosa) ocorreu (Cruz et al, 1998; Shin et al., 1994).

Células foram consideradas positivas para os anticorpos quando houve marcação do

42

núcleo celular para o anti-p53, do citoplasma para o anti-COX-2, e da membrana

celular para os anti-EGFR.

4.2.5 Tratamento cirúrgico com laser de alta potência

O tratamento cirúrgico consistiu da excisão das LOs com laser de CO

2

(UM–

L30, Union Medical Engeneering Co, EUA; 10.600 nm, 5–10 W, modo contínuo) ou

laser de diodo (GaAlAs, ZAP softlase, ZAP Lasers Inc., EUA; 808 nm, 2–4 W, modo

contínuo). O laser de CO

2

foi preferencialmente utilizado devido às propriedades de

seu comprimento de onda, que promove corte rápido e dano térmico superficial. O

laser de diodo foi utilizado para lesões de difícil acesso cirúrgico (por exemplo,

palato mole) devido ao seu sistema de entrega que permite o contato da fibra óptica

com o tecido, reduzindo riscos de acidentes por irradiação em tecidos normais

adjacentes.

A técnica de excisão inclui em geral a demarcação das lesões por

vaporização com 1 mm de profundidade a 5 mm de sua margem. Em seguida, com o

auxílio de uma pinça clínica posicionada no sulco demarcado, as lesões foram

tracionadas verticalmente e ressecadas em sua base utilizando o laser como um

instrumento de corte. O tecido conjuntivo subjacente à área removida foi deixado

exposto à cavidade bucal, com reparação da área cirúrgica ocorrendo por segunda

intenção. Complicações ocorridas após o tratamento cirúrgico foram tratadas e

registradas. Os pacientes foram monitorados a cada 3 meses, sendo o período

mínimo de acompanhamento de 6 meses. Pacientes que não retornaram às

consultas de seguimento não foram excluídos e seus dados foram registrados até a

data da última consulta.

4.2.6 Desfechos clínicos pós-tratamento cirúrgico dos pacientes

Os desfechos clínicos considerados foram: recorrências, aparecimento de

novas lesões, ocorrência de transformação maligna.

43

4.2.7 Análise estatística

4.2.7.1 Curva de Kaplan-Meier, log-rank e análise de regressão de Cox para

análise de desfechos clínicos

Os desfechos clínicos (recorrência, novas lesões e transformação maligna)

foram analisados pela curva de Kaplan-Meier (análise de sobrevida).

A curva de Kaplan-Meier, complementada pelo teste de log-rank, foi utilizada

para analisar fatores que podem afetar a ocorrência dos desfechos clínicos,

especificamente gênero, idade, localização da lesão, tamanho da lesão, superfície

da lesão, grau de displasia, classificação binária, consumo de álcool, tabagismo e

história familiar de neoplasia maligna. Os fatores foram dicotomizados para facilitar a

análise estatística, conforme detalhado na tabela 4.2.

Tabela 4.2 - Fatores considerados para análise estatística

Fatores Dicotomização

Gênero Feminino Masculino

Idade ≥ 60 anos < 60 anos

Localização da

lesão

Borda língua, ventre língua,

fauce, assoalho bucal

Demais localizações

Tamanho da lesão ≥ 2 cm < 2 cm

Superfície da lesão Não homogênea Homogênea

Grau de displasia Intensa

Ausente, discreta ou

moderada

Classificação

binária

Alto risco Baixo risco

Álcool Consumo habitual (>200g/semana) Consumo esporádico

Tabagismo Sim Não

História familiar de

neoplasia maligna

Sim Não

44

O risco (hazard ratio) da ocorrência dos desfechos para cada fator estudado

foi avaliado pela análise univariada de regressão de Cox. Análise multivariada de

regressão de Cox foi realizada para verificar se há associação entre os fatores ou se

são independentes para os desfechos clínicos analisados. Para a análise

multivariada de Cox somente os fatores com P < 0,1 obtidos na análise univariada

foram considerados. Significância estatística foi estabelecida para P < 0,05.

4.2.7.2 Odds ratio e x

2

para análise da expressão dos marcadores imuno-

histoquímicos

Teste de odds ratio (razão de chance) foi utilizado para avaliar a frequência

da expressão dos anticorpos anti-p53, anti-EGFR e anti-COX-2 entre os grupos de

lesões LO e grupo controle (tecido de gengiva normal), entre lesões com e sem

desfechos clínicos, entre lesões de alto e baixo risco e entre lesões que

apresentaram e que não apresentaram displasia epitelial intensa.

Teste de x

2

avaliou possíveis diferenças de expressão entre os anticorpos

EGFR S e EGFR SM nos grupos de lesões LO e no grupo controle (tecido de

gengiva normal).

45

5 RESULTADOS

5.1 CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS E HÁBITOS

A amostra deste estudo consisitiu de 40 pacientes, 23 homens– idade média

de 56,56 anos (variação, 28–84 anos)– e 17 mulheres, idade média de 64,53 anos

(variação, 33–88 anos).

Dezesseis pacientes relataram história familiar de neoplasia maligna,

envolvendo o trato gastrointestinal (6 casos), a mucosa oral (4 casos), a mama ( 2

casos), o útero, pele e pulmão (1 caso em cada órgão), e 1 caso de localização não

especificada. Dois pacientes relataram história pregressa de neoplasia maligna (1

caso mama, e outro com 2 neoplasias distintas, em cordas vocais e próstata).

Consumo habitual de tabaco e/ou álcool foi constatado em 19 homens

(82,6%), dos quais 7 (30,4%) relataram consumo regular de tabaco e álcool, 11

(47,8%) somente de tabaco e 1 (4,3%) somente de álcool, enquanto 5 (21,7%) não

relataram hábitos de risco. Entre as mulheres, foi constatado hábito de tabagismo

em 6 pacientes (35.3%) e nenhum envolvendo consumo de álcool (Tabela 5.1).

Apenas 2 pacientes (homens) cessaram o hábito de fumar após serem orientados a

respeito da relação da LO com o tabaco.

Tabela 5.1 - Idade e hábitos de risco (fumo e álcool) de acordo com o gênero de pacientes com

LO atendidos na Clínica de Estomatologia, de 2003 a 2009

Gênero

Homens Mulheres

Idade

< 60 anos 15 6

≥ 60 anos 8 11

Tabagismo

≤ 20 cig/dia 11 6

> 20 cig/dia 7 0

não 5 11

Álcool*

< 200 g/semana 3 0

≥ 200 g/semana 5 0

não 15 17

*De acordo com o consumo seguro de álcool estabelecido pelo Centers for Disease Control and

Prevention, 2005

46

5.2 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DAS LOS

Características clínicas e localização das lesões estão detalhadas na tabela

5.2. O aspecto homogêneo foi a característica clínica predominante nas LOs (33/49;

67,3%), a maioria das lesões media menos que 2 cm de diâmetro (28/49; 57,1%), e

os sítios mais afetados foram: borda de língua (13/49; 26,5%), mucosa jugal (10/49;

20,4%) e assoalho bucal (7/49; 14,3%).

Tabela 5.2 - Características clínicas (tipo e tamanho) de acordo com a localização das LOs (n = 49)

Características de superfície Tamanho

Localização Homog Não homog

Total <2 cm 2 a 4 cm >4 cm Total

Borda de língua 6 7 13 2 8 3 13

Mucosa jugal 9 1 10 8 2 0 10

Assoalho bucal 5 2 7 4 3 0 7

Palato duro 3 1 4 4 0 0 4

Gengiva 1 1 2 1 0 1 2

Rebordo alveolar 3 1 4 4 0 0 4

Palato mole 3 0 3 3 0 0 3

Fauces 0 2 2 1 1 0 2

Dorso de língua 1 1 2 1 1 0 2

Ventre de língua 0 1 1 0 1 0 1

Trígono

retromolar

1 0 1 1 0 0 1

Subtotal 32 17 49 29 16 4 49

Homog = homogênea

Não homog = não homogênea

5.3 TRATAMENTO CIRÚRGICO COM LASER DE ALTA POTÊNCIA

Um total de 49 lesões foi observado nos 40 pacientes; 9 pacientes

apresentavam mais de uma lesão. O tempo médio de acompanhamento dos

pacientes foi de 22 meses (variação, 6–71 meses).

47

Remoção cirúrgica por laser de alta potência foi o tratamento preferencial

para a maioria das lesões. Tratamento por vaporização foi indicado em 8 lesões

devido à proximidade delas à superfície dental (3 casos), a ductos salivares (2

casos) e a vasos sanguíneos superficiais (3 casos). Biópsia excisional com laser de

alta potência foi realizada em 12 lesões menores que 1 cm.

Durante o pós-operatório o sintoma mais frequentemente relatado foi de

“queimação”, controlado pelo uso de bochechos com cloridrato de benzidamina

0,15%. O uso de análgesicos foi prescrito quando necessário. A ocorrência de dor

esteve associada à localização da LO, principalmente em borda de língua e mucosa

jugal. Medicação antiinflamatória não esteroidal foi utilizada para 7 pacientes, 5

tinham LOs em borda de língua, 1 em mucosa jugal e 1 em assoalho. Os sintomas

ocorreram predominantemente do 3º ao 10º dia após a intervenção cirúrgica.

Reparo com re-epitelização completa da mucosa tratada por cirurgia a laser

foi observado em 4 a 5 semanas após o tratamento. Durante a reparação 2

pacientes apresentaram tecido hiperplásico de aspecto granulomatoso, removidos

por vaporização com laser de CO

2

em um caso, e por cirurgia convencional em

outro, com subsequente reparação completa.

5.4 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA

Análise histopatológica das biópsias das LO revelou que 61,2% dos

espécimes apresentaram displasia epitelial (30/49), 9 (18,3%) com displasia intensa,

14 (28,6%) com displasia moderada e 7 (14,3%) com displasia leve. Análise pela

classificação do sistema binário (Kujan et al., 2006) identificou apenas 7 lesões de

alto risco e 42 lesões de baixo risco.

48

5.5 DESFECHOS CLÍNICOS OBSERVADOS (RECORRÊNCIAS,

DESENVOLVIMENTO DE NOVAS LESÕES E TRANSFORMAÇÃO MALIGNA)

Recorrência (reaparecimento da lesão no mesmo sítio inicial) foi observada

em 7 pacientes (17,5%); desenvolvimento de novas lesões (surgimento de lesão de

LO em sítio distinto do inicial) em 4 pacientes (10%); desfechos de recorrência

seguidos de desenvolvimento de nova lesão em 4 pacientes (10%). Desfechos

clínicos (recorrência ou desenvolvimento de novas lesões) foram mais frequentes

em língua (6 casos) e assoalho bucal (3 casos). Dois pacientes (5%) desenvolveram

lesão maligna (carcinoma epidermoide) em sítios diferentes da lesão inicial.

Malignização ocorreu em média 11,3 meses após o tratamento da lesão inicial.

Detalhamento dos casos com desfechos clínicos são mostrados na tabela 5.3.

5.5.1 Curva de Kaplan-Meier (análise de sobrevida), log-rank e análise de

regressão de Cox

Curva de Kaplan-Meier mostrou que a probabilidade de os pacientes estarem

livres de qualquer desfecho clínico após 20 meses foi de aproximadamente 50%

(Figura 5.1). Para o desfecho de recorrência isoladamente, foi de aproximadamente

70% (Figura 5.2), e para o desfecho de novas lesões, de 50% (Figura 5.3). Após 20

meses de acompanhamento, a curva manteve-se no mesmo nível para o desfecho

de recorrência, porém decresceu para o desfecho de novas lesões.

Tabela 5.3 - Detalhamento de características clínicas e histológicas de pacientes com LOs que tiveram desfechos de recorrência, desenvolvimento de novas

lesões ou transformação maligna

Nº Idade Gênero

Localização

da lesão

Grau de displasia

(OMS, 2005)

Classificação

do risco

(Kujan, 2006)

Desfecho

Tempo para o

desfecho

Tempo de

acompanhamento

1 28 M Borda língua Intensa Alto risco Recorrência 3 meses 30 meses

2 62 F Assoalho bucal Intensa Baixo risco

Recorrência

Nova lesão

6 meses

7meses

27 meses

3 78 F Mucosa jugal Moderada Baixo risco Recorrência 8 meses 13 meses

4 66 F Gengiva vestibular Sem displasia Baixo risco Nova lesão 17 meses 29 meses

5 78 F Mucosa jugal Sem displasia Baixo risco

Recorrência

Nova lesão

6 meses

20 meses

24 meses

6 70 M Borda língua Moderada Alto risco Recorrência 9 meses 56 meses

7 73 F Mucosa jugal Moderada Baixo risco

Recorrência

Nova lesão

2 meses

24 meses

43 meses

8 55 M Ventre língua Sem displasia Baixo risco Recorrência 1 mês 6 meses

9 64 F Borda língua Moderada Baixo risco Nova lesão 7 meses 20 meses

10 83 M Fauce Intensa Alto risco

Transformação

maligna

6 meses 12 meses

11 58 F Dorso língua Sem displasia Baixo risco Recorrência 6 meses 27 meses

12 55 F Assoalho bucal Discreta Baixo risco Nova lesão 4 meses 6 meses

13 38 M Dorso língua Moderada Baixo risco

Recorrência

Nova lesão

24 meses

24 meses

49 meses

14 79 F Borda língua Moderada Baixo risco Nova lesão 41 meses 67 meses

15 38 M Rebordo alveolar Sem displasia Baixo risco Recorrência 12 meses 27 meses

16 45 M Borda língua Intensa Baixo risco Recorrência 9 meses 71 meses

17 57 F Mucosa jugal Sem displasia Baixo risco

Transformação

maligna

19 meses 20 meses

18 58 M Assoalho bucal Intensa Alto risco Recorrência 1 mês 18 meses

49

50

Figura 5.1 - Curva de Kaplan-Meier para os desfechos clínicos em conjunto (recorrência,

desenvolvimento de novas lesões ou transformação maligna)

Figura 5.2 - Curva de Kaplan-Meier para o desfecho de recorrência

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

0

20

40

60

80

Tempo após a cirurgia (meses)

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

0

20

40

60

80

Tempo após a cirurgia (meses)

Pro

babilidade livre de recorrência

Probabilidade livre de qualquer desfecho

51

Figura 5.3 -Curva de Kaplan-Meier para o desfecho de desenvolvimento de novas lesões

Teste de log-rank mostrou associação estatisticamente significante para o

grupo de pacientes com lesões de alto risco em comparação com os de lesões de

baixo risco, para os desfechos clínicos analisados conjuntamente (P = 0,009) e para

o desfecho de recorrência isoladamente (P = 0,037) (Figuras 5.4A e 5.4B). Para o

desfecho de novas lesões isoladamente, verificou-se associação estatisticamente

significante para o grupo de pacientes > 60 anos (P = 0,024) e para as mulheres (P

= 0,059) (Figuras 5.5A e 5.5B).

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

0

20

40

60

80

Tempo após a cirurgia (meses)

Probabilidade livre de novas lesões

52

Figura 5.4 - Curva de Kaplan-Meier dos grupos de pacientes apresentando lesões iniciais

de alto ou baixo risco, para os desfechos clínicos em conjunto (recorrência,

desenvolvimento de novas lesões ou transformação maligna); log-rank P =

0,009 (A) e para o desfecho de recorrência isoladamente; log-rank P = 0,037

(B)

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

0

20

40

60

80

Tempo após a cirurgia (meses)

Baixo risco

Alto risco

Probabilidade livre de recorrência

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

0

20

40

60

80

Tempo após a cirurgia (meses)

Baixo risco

Alto risco

Probabilidade livre de recorrência

53

Figura 5.5 - Curva de Kaplan-Meier dos grupos de pacientes para o desfecho de

desenvolvimento de novas lesões de acordo com o gênero; log-rank P =

0,059 (A) e a idade; log-rank P = 0,024 (B)

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

0

20

40

60

80

Tempo após a cirurgia (meses)

< 60 anos

≥ 60 anos

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

0

20

40

60

80

Tempo após a cirurgia (meses)

Homens

Mulheres

Probabilidade livre de novas lesões

Probabilidade livre de novas lesões

54

O resultado da análise de regressão univariada de Cox (Tabela 5.4) para os

fatores associados aos desfechos clínicos analisados em conjunto mostrou que

pacientes classificados como portadores de lesões de alto risco apresentam um

risco maior para o desenvolvimento de desfechos clínicos do que pacientes com

lesões de baixo risco (hazard ratio = 4,09; IC = 1,65–10,14). Outros fatores

analisados (gênero, idade, localização da lesão, superfície da lesão, grau de

displasia, álcool, tabagismo, história familiar de neoplasia maligna) não tiveram

influência estatisticamente significante como fatores de risco para a ocorrência de

desfechos clínicos (P > 0,05). Com relação ao tamanho das lesões, observou-se

maior risco para o desenvolvimento dos desfechos clínicos em lesões maiores que 2

cm do que lesões menores que 2 cm, porém a diferença não foi estatisticamente

significante (P = 0,094). Utilizando a análise de regressão multivariada de Cox para

avaliar se existe associação entre lesões de alto risco e lesões > 2 cm para a

ocorrência dos desfechos clínicos verificou-se que lesões de alto risco constituem

por si só fator de risco independentemente do tamanho da lesão (hazard ratio = 4,8;

IC = 1,72–13,49; Tabela 5.5).

Tabela 5.4 - Análise de regressão univariada de Cox para desfechos clínicos em conjunto

(recorrência, desenvolvimento de novas lesões e transformação maligna)

Variável

Hazard ratio P

IC (95%)

Gênero 1,06 0,895 0,41–2,70

Idade 1,51 0,370 0,61–3,75

Localização da lesão 0,94 0,894 0,38–2,32

Tamanho da lesão**

2,19

0,094

0,87–5,53

Superfície da lesão 1,37 0,486 0,55–3,41

Grau de displasia 2,24 0,124 0,80–6,26

Classificação binária

4,09

0,002*

1,65–10,14

Álcool 0,68 0,651 0,13–3,50

Tabagismo 0,88 0,781 0,36–2,11

História familiar de neoplasia maligna 0,64 0,382 0,24–1,72

* estatisticamente significante (P < 0,05)

** variável considerada para análise de regressão multivariada (P < 0,01)

Tabela 5.5 - Análise de regressão multivariada de Cox para desfechos clínicos em conjunto

(recorrência, desenvolvimento de novas lesões e transformação maligna)

Variável

Hazard ratio P

IC (95%)

Tamanho da lesão 2,4 0,069 0,93–6,26

Classificação binária 4,8 0,003 1,72–13,49

55

Análise de regressão univariada de Cox foi usada para testar isoladamente os

desfechos de recorrência e novas lesões, mas não para transformação maligna, pois

houve apenas 2 casos com este desfecho.

Análise de regressão univariada de Cox usada para testar os desfechos

clínicos isoladamente mostrou que o risco para o desfecho de recorrência (Tabela

5.6) foi maior para pacientes com lesões de alto risco comparado com o de

pacientes com lesões de baixo risco (hazard ratio = 3,69; IC = 1,03–13,11). Como

nenhuma outra variável testada apresentou valor de P estatisticamente significante e

valores de P < 0,1, para o desfecho de recorrência não foi realizada análise de

regressão multivariada de Cox. O risco do desfecho de novas lesões (Tabela 5.7) foi

maior para pacientes do gênero feminino (hazard ratio = 4,22; IC = 0,94–18,85) e

para pacientes com idade ≥ 60 anos (hazard ratio = 5,32; IC = 1,10–25,54), mas

somente o último apresentou diferença estatisticamente significante. Análise de

regressão multivariada de Cox para pacientes do gênero feminino e pacientes com

idade ≥ 60 anos mostrou que os dois fatores (idade e gênero) são interdependentes

para a ocorrência de novas lesões. Os dois fatores isoladamente não têm influência

estatisticamente significante no desenvolvimento de novas lesões (P > 0,05; Tabela

5.8).

Tabela 5.6 - Análise de regressão univariada de Cox para o desfecho clínico de recorrência

Variável

Hazard ratio P

IC (95%)

Gênero 0,58 0,393 0,17–1,99

Idade 0,96 0,950 0,31–2,98

Localização da lesão 0,76 0,637 0,25–2,28

Tamanho da lesão 1,93 0,240 0,64–5,85

Superfície da lesão 1,52 0,443 0,51–4,50

Grau de displasia 2,55 0,122 0,77–8,39

Classificação binária 3,69 0,044* 1,03–13,11

Álcool 1,01 0,990 0,19–5,17

Tabagismo 1,34 0,617 0,42–4,24

História familiar de neoplasia maligna 0,57 0,367 0,16–1,92

*estatisticamente significante (P < 0,05)

56

Tabela 5.7 - Análise de regressão univariada de Cox para o desfecho clínico de desenvolvimento de

novas lesões

Variável

Hazard ratio P

IC (95%)

Gênero**

4,22

0,059

0,94–18,85

Idade

5,32

0,037*

1,10–25,54

Localização da lesão 0,64 0,459 0,20–2,04

Tamanho da lesão 2,62 0,168 0,66–10,36

Superfície da lesão 0,40 0,244 0,09–1,83

Grau de displasia 0,52 0,577 0,05–4,95

Classificação bináriaº – – –

Álcool 1,16 0,874 0,17–7,74

Tabagismo 0,38 0,167 0,09–1,49

História familiar de neoplasia maligna 1,70 0,447 0,42–6,81

* estatisticamente significante (P < 0,05)

** variável considerada para análisede regressão multivariada (P < 0,01)

º não foi possível realizar o teste

Tabela 5.8 - Análise de regressão multivariada de Cox para o desfecho clínico de

desenvolvimento de novas lesões

Variável

Hazard ratio P

IC (95%)

Gênero 3,10 0,138 0,69–13,90

Idade 4,14 0,101 0,75–22,64

5.6 EXPRESSÃO DOS ANTICORPOS ANTI-P53, ANTI-COX-2, ANTI-EGFR S E

ANTI-EGFR SM

As reações imunohistoquímicas foram realizadas em 39 das 49 lesões de LO;

10 blocos parafinados de biópsia de LO não apresentavam material suficiente para

processar as reações.

O anticorpo anti-p53 foi positivo em 26 lesões de LO (26/39; 66,6%) e em 4

espécimes do grupo controle (4/20; 20%). No entanto, a expressão no grupo

controle foi restrita à camada basal, enquanto no grupo LO não houve predomínio de

expressão em uma camada específica (Figuras 5.6A e 5.6B).

57

Figura 5.6 - Padrão de marcação do anticorpo anti-p53 nas LOs (A) e no grupo controle (B) (aumento

de 100 x)

O anticorpo anti-COX2 foi positivo em 21 lesões de LO (21/39; 53,8%),

apresentando padrão de expressão focal e mais frequente na camada basal,

especialmente em lesões com displasia epitelial intensa ou de alto risco. Em

espécimes do grupo controle o anti-COX2 marcou a camada basal em apenas 2

casos (2/20; 10%; Figuras 5.7A e 5.7B).

Figura 5.7 - Padrão de marcação do anticorpo anti-COX-2 nas LOs (A) e no grupo controle (B)

(aumento de 100 x); em detalhe pode-se observar marcação citoplasmática de células

epiteliais na camada basal, parabasal e espinhosa (aumento de 400 x)

58

Os anticorpos anti-EGFR apresentaram padrão de expressão uniforme em

lesões de LO e no grupo controle. O anticorpo anti-EGFR S foi positivo desde a

camada basal até a camada espinhosa em 11 lesões do grupo de LO (11/39; 28%) e

em 11 espécimes do grupo controle (11/20; 55%). O anticorpo anti-EGFR SM foi

positivo desde a camada basal até a espinhosa em 20 lesões de LO (21/39; 53,8%)

e em 10 espécimes do grupo controle (10/20; 50%; Figuras 5.8A, 5.8B e 5.9A, 5.9B).

Figura 5.8 - Padrão de marcação do anticorpo anti-EGFR S (A) e anti-EGFR SM (B) no grupo

controle (aumento de 100 x); nota-se a expressão dos dois clones nos mesmos

estratos do epitélio (camada basal)

Figura 5.9 - Padrão de marcação do anticorpo anti-EGFR S e anti-EGFR SM no grupo de LOs

(aumento de 100 x); nota-se a expressão do anti-EGFR S restrito à camada basal (A),

enquanto a expressão do anti-EGFR SM se estende até camada espinhosa (B)

59

5.6.1 Análise da expressão dos anticorpos

De acordo com os resultados observados na análise microscópica, a variável

expressão dos anticorpos foi dicotomizada para permitir a análise estatística.

• Anticorpos anti-p53 e anti-COX-2 dicotomizados em: ausência de marcação e

marcação em qualquer estrato do epitélio (camada basal, parabasal ou

espinhosa).

• Anticorpos anti-EGFR S e anti-EGFR SM dicotomizados em: ausência de

marcação na camada espinhosa (sem marcação, marcação nas camadas basal

ou parabasal) e marcação na camada espinhosa.

A análise pelo teste de odds ratio mostrou associação estatisticamente

significante da expressão do p53 (OR = 4,66; IC = 1,45–14,96) e do COX-2 (OR =

10,50; IC = 2,13–51,52) no grupo de pacientes com LO comparados com a do grupo

controle (Tabela 5.9). Não houve diferença estatisticamente significante quando a

expressão dos anticorpos (p53, COX-2, EGFR S e EGFR SM) no grupo de pacientes

com desfechos clínicos foi comparada com a dos pacientes sem desfechos clínicos

(P > 0,05; Tabela 5.10). Não houve diferença estatisticamente significante da

expressão dos anticorpos (p53, COX-2, EGFR S e EGFR SM) entre o grupo de

lesões de baixo risco comparado com a do grupo de lesões de alto risco (P > 0,05;

Tabela 5.11). Não houve associação estatisticamente significante da expressão dos

anticorpos p53, EGFR S e EGFR SM entre as lesões com displasias intensas

comparadas com as lesões de menor grau de displasia e sem displasia (P > 0,05;

Tabela 5.12). Dada a amplitude de expressão do anticorpo anti-COX-2 não foi

possível executar o teste estatístico.

A análise do teste de x

2

mostrou que a diferença de expressão entre os

anticorpos anti-EGFR S e anti-EGFR SM nos cortes histológicos das LOs não foi

estatisticamente significante (P = 0,064; Tabela 5.13). Também não houve diferença

estatisticamente significante de expressão entre os anticorpos anti-EGFR S e anti-

EGFR SM nos cortes histológicos de mucosa gengival normal do grupo controle (P =

1; Tabela 5.14).

60

Tabela 5.9 - Distribuição da marcação dos anticorpos nos grupos de pacientes com LO e grupo

controle

Marcação do

anticorpo

Grupo LO

(n = 39)

Grupo controle

(n = 20)

Odds ratio P

IC (95%)

p53

positiva

negativa

26

13

6

14

4,66

0,016*

1,45–14,96

COX2

positiva

negativa

21

18

2

18

10,50

0,002*

2,13–51,52

EGFR S

esp positiva

esp negativa

11

28

11

9

0,32

0,08

0,10–0,08

EGFR SM

esp positiva

esp negativa

20

19

10

10

1,05

0,8

0,35–3,09

* estatisticamente significante (P < 0,05)

esp positiva: marcação positiva na camada espinhosa

esp negativa: ausência de marcação na camada espinhosa

Tabela 5.10 - Distribuição da marcação dos anticorpos nos grupos de pacientes de LO com desfecho

clínico e sem desfecho clínico

Marcação do

anticorpo

Grupo com

desfecho

(n = 18)

Grupo sem

desfecho

(n = 21)

Odds ratio P

IC (95%)

p53

positiva

negativa

12

6

14

7

1

0,733

0,16–2,39

COX2

positiva

negativa

11

7

10

11

1,72

0,602

0,48–6,20

EGFR S

esp positiva

esp negativa

5

13

6

15

0,96

0,762

0,23–3,89

EGFR SM

esp positiva

esp negativa

11

7

9

12

2,09

0,414

0,58–7,55

esp positiva: marcação positiva na camada espinhosa

esp negativa: ausência de marcação na camada espinhosa

61

Tabela 5.11 - Distribuição da marcação dos anticorpos de acordo com a classificação binária

Marcação do

anticorpo

Alto risco

(n = 7)

Baixo risco

(n = 32)

Odds ratio P

IC (95%)

p53

positiva

negativa

3

4

23

9

0,29

0,302

0,05–1,58

COX2

positiva

negativa

6

1

15

17

6,80

0,147

0,73–36,11

EGFR S

esp positiva

esp negativa

1

6

10

22

0,36

0,660

0,03–3,46

EGFR SM

esp positiva

esp negativa

3

4

17

15

0,66

0,940

0,12–3,44

esp positiva: marcação positiva na camada espinhosa

esp negativa: ausência de marcação na camada espinhosa

Tabela 5.12 - Distribuição da marcação dos anticorpos de acordo com a classificação da displasia

(OMS,2005)

Marcação do

anticorpo

Intensa

(n = 9)

Não intensa

(n = 30)

Odds ratio P

IC (95%)

p53

positiva

negativa

5

4

21

9

0,53

0,686

0,11–2,42

COX2º

positiva

negativa

9

0

12

18

–

–

–

EGFR S

esp positva

esp negativa

1

8

10

20

0,25

0,380

0,02–2,28

EGFR SM

esp positiva

esp negativa

5

4

15

15

1,25

0,930

0,27–5,58

º não foi possível realizar o teste

esp positiva: marcação positiva na camada espinhosa

esp negativa: ausência de marcação na camada espinhosa

62

Tabela 5.13 - Distribuição da marcação das proteínas EGRF S e EGFR SM entre as lesões

leucoplásicas

Marcação do

anticorpo

EGFR S

(n = 39)

EGFR SM

(n = 39)

X

2

P

X

2

Correção

de Yates

P

esp positiva

esp negativa

11

28

20

19

4,33 0,037 3,42 0,064

* estatisticamente significante (P < 0,05)

esp positiva: marcação positiva na camada espinhosa

esp negativa: ausência de marcação na camada espinhosa

Tabela 5.14 - Distribuição da marcação das proteínas EGRF S e EGFR SM entre espécimes do grupo

controle

Marcação do

anticorpo

EGFR S

(n = 20)

EGFR SM

(n = 20)

X

2

P

X

2

Correção

de Yates

P

esp positiva

esp negativa

11

9

10

10

0,10 0,751 0,00 1,000

esp positiva: marcação positiva na camada espinhosa

esp negativa: ausência de marcação na camada espinhosa

63

6 DISCUSSÃO

Durante o período de 2003 a 2009, 40 pacientes com LO foram examinados e

diagnosticados em nossa clínica, correspondendo à média de 5,7 pacientes ao ano.

Comparativamente, a frequência de atendimento de pacientes com LO em nossa

clínica aproxima-se à da média de atendimento relatada em outros estudos, de 8,6

pacientes por ano (Schepman et al. 1998; Saito et al., 2001; Thomson; Wylie, 2002;

Chandu; Smith, 2005; van der Hem et al., 2005; Holmstrup et al., 2006). Alguns

desses estudos são realizados em centros de referências, onde a média de

atendimento ultrapassa 11 pacientes por ano.

Embora não haja dados exatos da prevalência da LO em nossa população, o

número de atendimentos anuais registrados neste estudo indica que é uma doença

de relativa frequência, o que demanda investigações constantes, sobretudo por ser

uma lesão cancerizável. O fato de a LO ser uma doença geralmente assintomática,

sendo por isso diagnosticada, na maioria dos casos, em exame clínico de rotina,

representa um dado que pode caracterizar uma sub-representação da doença em

ambulatórios.

Estudos populacionais em geral mostram que a LO afeta predominantemente

indivíduos na faixa etária entre 50 e 70 anos, e com maior incidência em homens,

com a relação homens/mulheres de 2,5 a 3:1 (Petti, 2003). A média de idade

observada nos pacientes deste estudo foi de 60,5 anos, com maior prevalência em

homens, porém a relação homem/mulher foi de 1,3:1, semelhante à de resultados de

outros estudos similares, mostrando que a LO tende a ocorrer com igual frequência

em homens e mulheres em atendimento ambulatorial (Napier; Speight, 2008). A

maior prevalência da doença em homens, verificada em estudos populacionais,

pode ser explicada pela maior exposição dos homens aos hábitos de tabagismo. A

tendência do número de casos de LO ocorrer de forma similar em homens e

mulheres nos ambulatórios deve-se provavelmente a maior procura pela mulher a

cuidados preventivos de saúde, permitindo a identificação da LO com mais

frequência, enquanto nos homens a identificação ocorreria em menor proporção e

de forma mais casual.

Em relação à localização das lesões, este estudo mostrou que borda lateral

da língua, mucosa jugal e assoalho bucal foram os sítios mais afetados, em ordem

64

decrescente. Estudos epidemiológicos indicam resultados um pouco diferentes,

sendo a mucosa bucal a área mais afetada (Napier; Speight, 2008). Características

clínicas predominantemente observadas neste estudo foram o aspecto homogêneo

(67,3%) e tamanho de até 4 cm (89,9%). Segundo a literatura, LOs em áreas como

borda lateral da língua e assoalho bucal, aspecto não homogêneo e lesões maiores

que 4 cm apresentam maior risco de malignização (van der Waal, 2009). Todavia, há

registros de malignização de LOs também em lesões de aspecto homogêneo e

menores que 4 cm. Clinicamente não há dados que possam prognosticar com

confiabilidade lesões que irão ou não ter transformação maligna. Baseado nisto, não

houve diferença de conduta clínica entre pacientes que apresentaram lesões

homogêneas e não homogêneas e também lesões menores ou maiores que 4 cm.

Essa conduta incluiu lesões que não apresentaram displasia epitelial. Quanto à

localização, lesões localizadas em borda e assoalho de língua tiveram uma

avaliação mais rigorosa, pois como já mencionado, o índice de malignização nessas

áreas é acentuadamente mais elevado.

Um dos objetivos deste estudo foi avaliar a eficácia do laser de alta potência

no tratamento das LOs. Dados do aspecto terapêutico mostraram que os lasers de

alta potência utilizados (de CO

2

e de diodo) foram eficientes para a remoção

cirúrgica das LOs, e o pós-operatório foi bem tolerado pela maioria dos pacientes,

independentemente do tipo de laser. A sintomatologia dolorosa esteve mais

associada a áreas de atrito constante, como borda lateral da língua e mucosa jugal,

do que em áreas menos sujeitas a traumas, como o assoalho bucal.

Complicações pós-operatórias foram observadas somente em dois casos,

caracterizadas pela reparação tardia associada ao aparecimento de granulomas nas

áreas irradiadas. Em um dos casos esta complicação pôde ser atribuída à menor

vascularização do local da cirurgia (palato duro) associada ao intenso hábito de

tabagismo, e, no outro caso, à condição sistêmica do paciente (diabetes mellitus) e

possível trauma da região. Complicações após a remoção das LOs por laser de alta

potência provavelmente não são comuns (há poucos casos relatados na literatura),

porém esses tipos lasers devem ser manipulados somente por profissionais

habilitados.

Embora o tratamento preferencial para as LOs seja o cirúrgico, principalmente

pelo uso dos lasers, devido à rapidez e ao melhor controle do sangramento que

esses instrumentos cirúrgicos oferecem, os pacientes não permanecem livres de

65

recorrência ou do aparecimento de novas lesões (Lodi; Porter, 2008). Durante

avaliações periódicas após excisão cirúrgica das LOs, recorrências ou

desenvolvimento de novas lesões foram observados em 37,5% dos pacientes;

recorrências isoladamente corresponderam a 27,5% dos casos. Esses resultados

não diferem dos dados relatados na literatura científica, que registram uma variação

de 10% a 57% (Lodi; Porter, 2008).

Variações do percentual de recorrências e desenvolvimento de novas lesões

têm sido atribuídas a critérios de inclusão e exclusão dos pacientes e aos

equipamentos cirúrgicos utilizados. Especificamente, alguns estudos excluíram

pacientes com alto grau de displasia, favorecendo a diminuição das taxas de

recorrência; outros utilizaram microscópio associado ao laser, o que permite uma

melhor execução da técnica, reduzindo também o grau de recorrência (Frame et al.,

1984; Chu et al., 1988; Chiesa et al., 1990; Roodenburg et al., 1991; van der Hem et

al., 2005; Holmstrup et al., 2006; Lodi; Porter, 2008; Vivek et al., 2008).

Apenas 2 casos com transformação maligna foram observados neste estudo,

correspondendo a 5% da casuística, compatível com os percentuais de

transformação maligna das LOs registrados na literatura (4%–12%). Deve ser

ressaltado que os 2 casos observados ocorreram em localizações distintas do sítio

inicial da LO. O desenvolvimento de lesões malignas em sítios distintos da lesão

inicial também foi notado em outros estudos (Schepman et al., 1998; Chandu; Smith,

2005; Hamadah; Thomson, 2009), sugerindo a presença de alterações distribuídas

em toda a mucosa oral, corroborando com a ideia da existência de um campo de

cancerização que acomete o epitélio oral como um todo. Essas malignizações em

sítios distintos da lesão inicial reforçam a necessidade do acompanhamento dos

pacientes com LO por período indefinido, tão longo quanto possível.

Outro dado importante em relação a esses 2 casos de transformação maligna

foi a detecção do carcinoma epidermoide somente na biópsia excisional. A análise

histopatológica das biópsias incisionais dessas lesões mostraram hiperqueratose

com displasia epitelial intensa. Esse evento foi observado também em outros

trabalhos, pois biópsias incisionais são pouco representativas em lesões

potencialmente malignas (Thomson; Wylie, 2002; van der Hem et al., 2005).

Para evitar a falha na identificação de áreas de malignidade em LOs sugere-

se a realização de biópsias mais extensas (punch com mínimo de 6 mm),

preferencialmente em áreas de aspecto erosivo ou verrucoso (van der Hem et al.,

66

2005). A remoção completa das lesões e sua subsequente análise histopatológica

são importantes para determinar o grau de displasia e detectar eventual presença de

carcinoma epidermoide (Chiesa et al., 1990; Lumerman et al., 1995). Desse modo,

embora o tratamento cirúrgico das LOs não seja eficaz como uma intervenção de

prevenção de transformação maligna, ela pode desempenhar o papel de detectar o

câncer em um estágio inicial quando este não é identificado na biópsia incisional

(Lodi; Porter, 2008).

Após 20 meses de seguimento clínico, a probabilidade dos pacientes estarem

livres de qualquer desfecho clínico (recorrência, desenvolvimento de novas lesões e

transformação maligna) foi de aproximadamente 50%. Após esse período, a curva

para o desfecho de recorrência manteve-se sem variações, enquanto a curva para o

desfecho de novas lesões decresceu. No que se refere às recorrências, ainda que o

controle local das lesões tenha sido aparentemente estabelecido durante o período

analisado, o seguimento dos pacientes deve ser mantido, pois a porcentagem de

pacientes livres de LO tende a diminuir com o tempo de acompanhamento (Chiesa

et al., 1990; Chandu; Smith, 2005; Hamadah; Thomson, 2009).

Dos fatores analisados que podem contribuir com os desfechos clínicos, os

mais significativos foram as alterações morfológicas epiteliais severas,

caracterizadas como lesões de alto risco. Os fatores gênero feminino e idade

superior a 60 anos também estiveram associados ao desenvolvimento de novas

lesões. Portanto, os resultados deste estudo mostraram que lesões de alto risco,

gênero feminino e idade superior a 60 anos devem ser considerados fatores de

maior relevância para o risco de malignização das LOs. Na literatura consultada não

há consenso entre os fatores de risco para os desfechos clínicos, inclusive alguns

autores não observaram nenhuma associação entre os fatores e desfechos (Saito et

al., 2001; Thomson; Wylie, 2002; van der Hem et al., 2005). Porém, alguns fatores

como paciente do gênero feminino sem hábitos de tabagismo, tamanho da lesão, e

displasia epitelial intensa, são referenciados como os mais frequentemente

associados aos desfechos clínicos (Schepman et al., 1998; Napier et al., 2003;

Chandu; Smith, 2005; Holmstrup et al., 2006).

Poucos estudos analisaram conjuntamente a classificação binária (lesões de

alto e baixo risco) e o grau de displasia para a ocorrência de desfechos clínicos pós

tratamento cirúrgico de LOs. Como analisado neste estudo, a classificação binária

pode ser mais eficiente do que a classificação da displasia ao prognosticar lesões

67

com maior risco a recorrências, devendo ser incluído na avaliação histopatológicas

das LOs, como também sugerido em recente artigo de Warnakulasuryia et al. (2008).

Considerando apenas fatores intrísecos às lesões (tamanho, aspecto de

superfície e alterações morfológicas do epitélio), algumas condutas como o aumento

da área de excisão, complementada pela vaporização das margens cirúrgicas,

auxiliam na redução de recorrências e asseguram a remoção de lesões com

malignização incipiente, conforme mostram os resultados dos estudos de Chiesa et

al. (1990) e Hamadah e Thomson (2009).

Estudos realizados nas últimas décadas não evidenciaram nenhum tipo de

marcador específico que possa servir como indicador confiável no prognóstico das

LOs (Warnakulasuriya, 2000; Warnakulasuriya et al., 2008). Diversos marcadores

moleculares associados à transformação maligna têm sido investigados para

diferentes tipos de neoplasias malignas. No presente estudo os marcadores EGFR,

COX-2 e p53 foram selecionados para investigação, pois há evidências da

participação deles no processo inicial da carcinogênese (Lippman et al., 2005).

Os padrões de expressão do p53, COX-2 e do EGFR SM observados em

nosso estudo estão de acordo com os relatados na literatura (Cruz et al., 2002;

Renkonen et al., 2002; Shibata et al., 2005; Fan et al., 2006). A frequência e o

padrão de expressão dos marcadores p53 e COX-2 observada nas LOs, em

comparação ao observado no grupo controle, sugerem que as LOs têm alterações

moleculares epiteliais semelhantes às observadas em neoplasias malignas orais.

Embora as LOs expressem os marcadores p53 e COX-2 de maneira significativa,

estes marcadores não foram associados a lesões que tiveram desfechos clínicos

desfavoráveis (recorrência, desenvolvimento de novas lesões ou transformação

maligna). A ausência de correlação entre os marcadores e os desfechos clínicos

deve-se provavelmente ao processo biológico de indução epitelial envolvido nos

desfechos de recorrências e no desenvolvimento de novas lesões, não associado

aos marcadores moleculares investigados. Quanto ao desfecho de transformação

maligna, os dados apresentados neste estudo são limitados na avaliação deste

aspecto, uma vez que apenas 2 casos de malignização foram observados. Em

caráter especulativo, pode-se dizer que os marcadores p53 e COX-2 podem ser

úteis como indicadores da existência de potencial de malignização de lesões, mas

não necessariamente como indicadores precisos de transformação maligna.

68

Associação significante entre expressão do p53 e o grau de displasia foi

verificada em 2 estudos (Kurokawa et al., 2003; Cruz et al., 2002), enquanto em

outros essa associação não foi evidenciada (Kannan et al., 1996; Piatelli et al., 2002;

Fan et al., 2006). Os achados do estudo de Kannan et al. (1996) mostraram ainda

que a expressão do p53 foi mais frequente nas lesões não displásicas que nas

displásicas. No presente estudo, também não foi observada uma associação

estatisticamente significante entre a expressão do p53 e o grau de displasia ou em

LOs de baixo risco. Os diferentes resultados apresentados em relação à expressão

do p53 em LOs podem ser explicados pelas diferenças de metodologias no

processamento das reações de imuno-histoquímica e na quantificação da expressão

do anticorpo.

Considerando o grau de displasia observado nas LOs, apenas o COX-2 foi

expresso em todas as lesões apresentando displasia intensa e em 6 das 7 lesões

classificadas como de alto risco. Os dados em relação à severidade da displasia

estão de acordo com os resultados de outro estudo semelhante (Shibata et al.,

2005). Seria importante investigar se LOs com transformação maligna apresentam

marcação positiva para a COX-2, o que não foi possível realizar neste presente

estudo. Esse tipo de investigação apresenta conflito ético, pois a análise da

expressão da COX-2 em LOs como indicador de transformação maligna só poderia

ser feita se as lesões permanecessem sem tratamento cirúrgico e fossem

acompanhadas por tempo necessário até a ocorrência da malignização.

A expressão dos dois clones do anti-EGFR (S e SM) observada em tecidos

normais mostra que esses receptores estão presentes normalmente no epitélio da

mucosa oral, enquanto que em LOs há uma tendência da perda da expressão do

anti-EGFR S na camada espinhosa do epitélio. A ausência de associação

estatisticamente significante entre a marcação do EGFR SM na camada espinhosa e

as LOs possivelmente ocorreu pelo tamanho insuficiente da amostra. A possibilidade

de que houvesse diferença na expressão entre os clones do anti-EGFR poderia

indicar que não há diferença relevante entre o número de receptores presentes em

tecido normal e o leucoplásico, mas que os receptores mutados observados no

epitélio de LOs possivelmente desempenham um papel distinto dos receptores

normais. Para confirmar esta hipótese, seria necessário investigar a expressão em

LOs e tecido epitelial normal de um anticorpo anti-EGFR que marcasse somente os

receptores mutados.

69

Os resultados deste e de outros estudos imuno-histoquímicos mostraram-se

limitados no que diz respeito a ampliar a capacidade de prognosticar LOs com maior

risco de malignização. Fatores como idade, gênero e classificação binária, além de

outros de importância já estabelecida, como a extensão da lesão, localização e grau

de displasia, são os indicadores com os quais devemos nos basear para avaliar

lesões com maior potencial de malignização. O tratamento proposto constitui um

recurso importante de remoção de lesões com malignização precoce clinicamente

não detectáveis, embora não tenha ação de alterar os eventos de recorrência,

desenvolvimento de novas lesões ou transformação maligna.

70

7 CONCLUSÕES

1. LOs são lesões de relativa frequência em nosso ambulatório; mulheres estiveram

menos expostas ao hábito de tabagismo.

2. Tratamento por lasers de alta potência (CO

2

e diodo) mostrou-se eficiente na

remoção das lesões, mas não evitou desfechos clínicos de recorrência,

desenvolvimento de novas lesões e transformação maligna.

3. Idade acima de 60 anos no gênero feminino constituiu fator de risco ao

desenvolvimento de novas lesões após o tratamento.

4. Lesões de alto risco foram associadas à ocorrência de recorrências após o

tratamento.

5. Os marcadores p53, COX-2 e EGFR (clone S e clone SM) não constituíram

indicadores associados ao risco aumentado de desfechos clínicos.

71

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81

ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa

82

83

ANEXO B – Termo de consentimento para pacientes com LO

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PARTICIPACÃO EM

PESQUISA

OBJETIVOS

As informações abaixo são para esclarecer e pedir a sua participação voluntária neste

estudo, que tem o objetivo de acompanhar placas brancas na boca (também chamadas de

leucoplasias orais) tratadas com laser cirúrgico, e realizar estudo laboratorial (também

chamado de reação imunohistoquímica) do material colhido na biópsia incisional de rotina na

Clínica de Estomatologia, Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo (FOUSP).

O título da pesquisa é “Estudo do potencial de malignização da leucoplasia oral marcadores

imunohistoquímicos e da utilização de laser de CO

2

e de diodo como tratamento”. Este

trabalho está sendo conduzido pela cirurgiã-dentista Vivian Cunha Galletta Kern, aluna

regular do curso de pós-graduação de Diagnóstico Bucal da FOUSP em nível de doutorado.

BENEFÍCIOS

O tratamento convencional das placas brancas em boca (leucoplasias orais) consiste na

remoção cirúrgica, seja por lâmina de bisturi ou laser de alta potência. A utilização do laser

cirúrgico para o tratamento desta condição tem vantagens como: controle de sangramento,

maior visibilidade para o cirurgião, redução do tempo de cirurgia, menor cicatriz, menor

bacteremia, e dispensa a necessidade de sutura (ponto). No entanto, apresenta a desvantagem

de ter uma cicatrização relativamente mais longa que a técnica tradicional. Caso você prefira a

cirurgia por lâmina de bisturi à cirurgia por laser, ou ainda declinar da condição de

participante desta pesquisa, não haverá prejuízo do atendimento e do tratamento na Clínica de

Estomatologia da FOUSP. A duração do tratamento é independente deste estudo, sendo

garantido mesmo após a conclusão da pesquisa.

DESCRIÇÃO DO ESTUDO E RISCO POTENCIAL

Caso você tenha concordado em participar da pesquisa, será realizado o protocolo de

tratamento de rotina da disciplina de Estomatologia Clínica, que consiste em:

- exame de citologia esfoliativa: coleta de células descamativas da mucosa da boca por

meio de raspagem de uma escova estéril na área da lesão branca. Este procedimento não dói,

nem provoca ferida.

- coloração com azul de toluidina: aplicação de ácido acético 1% embebido em

algodão para limpeza da área da lesão branca, em seguida, aplicação do corante azul de

toluidina 10% por 1 minuto, e novamente aplicação de ácido acético 1% para remoção do

excesso de corante. Este procedimento não dói, nem provoca ferida e é realizado para

verificar se há alguma área favorável para a realização da biópsia incisional.

- biópsia incional: coleta de parte da lesão branca através da remoção com lâmina de

bisturi, sob anestesia local. Este procedimento é necessário para confirmação da hipótese

diagnóstica clínica. Eventualmente, durante o pós-operatório, será necessário o uso de

medicamento analgésico, de custo do próprio paciente.

84

Confirmado o diagnóstico de leucoplasia oral, o paciente receberá o tratamento, que

consistirá na remoção cirúrgica da lesão branca com laser cirúrgico. Este procedimento é de

risco mínimo, considerando a possibilidade de acidente pela irradiação de outras áreas que

não sejam a lesão. Eventualmente, durante o pós-operatório, será necessário o uso de

medicamento analgésico, de custo do próprio paciente. Retornos periódicos serão marcados

para controle da doença, durante 1 ano.

Parte da lesão branca removida será enviada ao Serviço de Patologia Bucal da FOUSP,

para a conclusão do diagnóstico e estudo laboratorial denominado de reação de

imunohistoquímica.

GARANTIA DE SIGILO/ DÚVIDAS E ESCLARECIMENTOS

Os registros de sua participação neste estudo são confidenciais, e permanecerão sob a

guarda do pesquisador responsável e à disposição do Comitê de Ética em Pesquisa

Envolvendo Seres Humanos da FOUSP. Não se fará, no curso do estudo ou depois deste e em

qualquer tipo de apresentação ou publicação científica, uso de informação que possa

identificá-lo ou comprometê-lo. Você poderá, entretanto, vir a ser solicitado a confirmar por

escrito que participou desse estudo. Caso tenha alguma dúvida, você poderá perguntar direta e

pessoalmente ao pesquisador, ou ainda através do telefone (11) 3091-7883.

CONSENTIMENTO PÓS-INFORMAÇÃO

Após ler estas informações e de ter minhas dúvidas suficientemente esclarecidas pelo

pesquisador, eu _____________________________________________________, RG

_______________________, concordo em participar de forma voluntária neste estudo.

São Paulo, ____ de _________________ de _______

__________________________________________________

(Assinatura do participante da pesquisa ou do seu representante legal)

Endereço do participante: ___________________________________________

Bairro:_________________________________CEP:_____________________

Telefone:__________________ Cidade:________________________________

85

ANEXO C – Formulário utilizado para o protocolo de tratamento das leucoplasias orais

PROTOCOLO DE LASERS DE ALTA POTÊNCIA EM LEUCOPLASIAS

Nº USP: Nº Semiologia: ___________

Nome: Idade: _____

Endereço: CEP: _____________

Cidade: Estado: Natural de: _____________

Telefones: res: cel: com:

________________

RG: _____________________ Profissão: ___________________ Gênero: ( )M ( )F

Data de nascimento: ___ /__ / ___ Estado Civil: _________________

leucoderma ( ) feoderma ( ) melanoderma ( ) xantoderma ( )

Características da lesão:

Tamanho: <2cm ( ) >2cm a 4cm ( ) >4cm ( )

Quantidade: Tipo: ( ) homogênea ( ) não-homogênea

Duração: ______dias______meses______anos

Cor: ( ) branca ( ) predominantemente branca ( ) branca com áreas de eritema

Superfície: ( ) lisa ( ) corrugada ( ) estriada ( ) verrucosa ( ) papular

Removível por raspagem: ( ) não ( ) sim Presença de ulcerações: ( ) sim ( ) não

Localização da lesão:

Língua ( ) D ( ) E ( ) dorso ( ) ventre Mucosa jugal ( ) D ( ) E

Rebordo Alveolar Superior ( ) D ( ) E ( ) V ( ) P ( ) anterior

Rebordo Alveolar Inferior ( ) D ( ) E ( ) V ( ) P ( ) anterior

Palato duro ( ) D ( ) E ( ) linha média Palato mole ( ) D ( ) E ( ) linha média

Assoalho de boca ( ) D ( ) E ( ) linha média

Sintomatologia:

Ausente ( ) ardência ( ) dor ( )

Exame histopatológico da(s) lesão(ões):

Data Número do AP Grau de Displasia

86

Exames complementares:

Data

Cit. Esfoliativa

(positivo/negativo para

candidose)

Azul de Toluidina

(positivo/negativo)

HISTÓRIA MÉDICA

Hipertensão ( ) Há quanto tempo: ________________

Medicamento(s): Tempo de uso: ________________

Diabetes ( ) tipo 1 ( ) tipo 2 Há quanto tempo: ________________

Medicamento(s): Tempo de uso: ________________

Cardiopatia ( ) Há quanto tempo: ________________

Medicamento(s): Tempo de uso: ________________

Outras enfermidades ( ) (rim, fígado, pulmão, tireóide)

Há quanto tempo: ________________

Medicamento(s): Tempo de uso: ________________

Outros medicamentos

Medicamento: Tempo de uso: ________________

Medicamento: Tempo de uso: ________________

HISTÓRIA FAMILIAR DE MALIGNIDADE ( ) sim/local:______________ ( ) não

HÁBITOS

Fumo ( ) sim ( ) não Há quanto tempo: Quantidade: ________________

Tipo: Parou há quanto tempo: _________________

Álcool ( ) sim ( ) não Há quanto tempo: Quantidade: ________________

Tipo: Parou há quanto tempo: _________________

Drogas ( ) sim ( ) não Há quanto tempo: Quantidade: ________________

Tipo: Parou há quanto tempo: ________________

87

LASER UTILIZADO: CO2 ( ) DIODO ( ) POTÊNCIA_____W

CONDUTA CLÍNICA E PROCEDIMENTOS REALIZADOS

88

ANEXO D – Termo de consentimento para pacientes do grupo controle

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PARTICIPACÃO EM

PESQUISA

OBJETIVOS

As informações abaixo são para esclarecer e pedir a sua participação voluntária neste

estudo, que tem o objetivo de acompanhar pacientes com placas brancas na boca,

denominadas de leucoplasia oral (este não e o seu caso), tratadas com laser cirúrgico, e

realizar estudo laboratorial (também chamado de reação imunohistoquímica) do material

colhido na biópsia incisional de rotina na Clínica de Estomatologia, Faculdade de

Odontologia da Universidade de São Paulo (FOUSP). O título da pesquisa é “Estudo do

potencial de malignização da leucoplasia oral marcadores imunohistoquímicos e da utilização

de laser de CO

2

e de diodo como tratamento”. Este trabalho está sendo conduzido pela

cirurgiã-dentista Vivian Cunha Galletta Kern, aluna regular do curso de pós-graduação de

Diagnóstico Bucal da FOUSP em nível de doutorado.

BENEFÍCIOS

A sua participação nesta pesquisa não trará benefícios diretos a você, porém poderá

beneficiar pacientes portadores da leucoplasia oral, uma lesão que pode se transformar em

câncer de boca com o passar do tempo, sem tratamento eficiente até o presente momento.

Caso você prefira não participar ou declinar da condição de participante desta pesquisa, não

haverá prejuízo do atendimento e do tratamento na Clínica Odontológica da FOUSP. A

duração do tratamento é independente deste estudo, sendo garantido mesmo após a conclusão

da pesquisa.

DESCRIÇÃO DO ESTUDO E RISCO POTENCIAL

Caso você tenha concordado em participar da pesquisa, será realizada a coleta de um

pequeno fragmento de tecido gengival normal que foi removido durante o procedimento

cirúrgico, sem prejuízo para o fechamento da ferida ou sua cicatrização. Este fragmento será

utilizado para um estudo laboratorial denominado reação imunohistoquímica. O objetivo deste

estudo é comparar a reação deste fragmento com a reação de fragmentos da lesão de

leucoplasia oral de outros pacientes, para possivelmente estabelecer quais lesões de

leucoplasia possuem risco de transformação maligna, ou seja, de se transformarem em câncer

de boca.

O procedimento para a coleta do fragmento de tecido gengival removido durante o

procedimento cirúrgico não tem nenhum risco para você, nem prejudicará seu tratamento.

GARANTIA DE SIGILO/ DÚVIDAS E ESCLARECIMENTOS

Os registros de sua participação neste estudo são confidenciais, e permanecerão sob a

guarda do pesquisador responsável e à disposição do Comitê de Ética em Pesquisa

Envolvendo Seres Humanos da FOUSP. Não se fará, no curso do estudo ou depois deste e em

qualquer tipo de apresentação ou publicação científica, uso de informação que possa

identificá-lo ou comprometê-lo. Você poderá, entretanto, vir a ser solicitado a confirmar por

89

escrito que participou desse estudo. Caso tenha alguma dúvida, você poderá perguntar direta e

pessoalmente ao pesquisador, ou ainda através do telefone (11) 3091-7883.

CONSENTIMENTO PÓS-INFORMAÇÃO

Após ler estas informações e de ter minhas dúvidas suficientemente esclarecidas pelo

pesquisador, eu _____________________________________________________, RG

_______________________, concordo em participar de forma voluntária neste estudo.

São Paulo, ____ de _________________ de _______

__________________________________________________

(Assinatura do participante da pesquisa ou do seu representante legal)

Endereço do participante: ___________________________________________

Bairro:_________________________________CEP:_____________________

Telefone:__________________ Cidade:________________________________

HÁBITOS

Fumo ( ) sim ( ) não Há quanto tempo: Quantidade: ________________

Tipo: _______________ Parou há quanto tempo: _________________

Álcool ( ) sim ( ) não Há quanto tempo: Quantidade: ________________

Tipo: _______________ Parou há quanto tempo: _________________

Drogas ( ) sim ( ) não Há quanto tempo: Quantidade: ________________

Tipo: _______________ Parou há quanto tempo: ________________

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