( PDF ) Novos genes da galactose oxidase de espécies do complexo Gibberella fujikuroi

Download PDF

ads:

Universidade Estadual de Maringá

Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas

– Área de concentração: Biologia Celular e Molecular

FABIO APARECIDO CORDEIRO

NOVOS GENES DA GALACTOSE OXIDASE

DE ESPÉCIES DO COMPLEXO Gibberella

fujikuroi

Maringá

2009

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

FABIO APARECIDO CORDEIRO

NOVOS GENES DA GALACTOSE OXIDASE

DE ESPÉCIES DO COMPLEXO Gibberella

fujikuroi

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-graduação em Ciências

Biológicas (Área de Concentração -

Biologia Celular e Molecular) da

Universidade Estadual de Maringá,

para obtenção do grau de Mestre em

Ciências Biológicas.

Orientadora: Prof

. Dr

. Ione Parra

Barbosa-Tessmann

Maringá

2009

ads:

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)

Cordeiro, Fabio Aparecido

C794n Novos genes da galactose oxidase de espécies do complexo

Gibberella fujikuroi. / Fabio Aparecido Cordeiro. --

Maringá, 2009.

53 f. : il. color., figs., tabs.

Orientador : Prof. Dr. Ione Parra Barbosa- Tessmann.

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de

Maringá, Departamento de Bioquímica, Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas, 2009.

1. Gibberella fujikuroi - Galactose oxidase. 2.

Galactose oxidase. 3. Galactose oxidase - Genes - Clonagem.

4. Fusarium verticillioides - Galactose oxidase. 5.

Fusarium subglutinans - Galactose oxidase. I. Barbosa-

Tessmann, Ione Parra, orient. II. Universidade Estadual de

Maringá. Departamento de Bioquímica. Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas. III. Título.

CDD 21.ed. 572.829

BIOGRAFIA

Fabio Aparecido Cordeiro nasceu em Cruzeiro do Oeste-PR em 12 de novembro de

1982. Possui bacharelado em Ciências Biológicas com ênfase em biotecnologia e licenciatura

em Ciências Biológicas, ambos pela Universidade Paranaense (2006). Após a conclusão do

Mestrado na Universidade Estadual de Maringá, ele ingressará no Programa de Doutorado em

Bioquímica na Universidade Federal do Paraná, no qual já se encontra aceito.

DEDICATÓRIAS

Ao meu pai, que nunca mediu esforços para educar os filhos.

À minha mãe, que nunca esqueceu de mim em suas orações.

À minha avó Luzia, que com sua enorme força de vontade de viver nos contempla

com a alegria de sua companhia.

Às minhas irmãs Ana Paula e Ana Lúcia, pelo carinho recebido.

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradeço a Deus, que tornou possível toda a trajetória até aqui.

Meus sinceros agradecimentos à Drª. Ione Parra Barbosa Tessmann, que transcendeu

seu papel de orientadora, sendo também uma conselheira.

Agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

pela bolsa de estudos concedida, o que tornou possível o meu sonho de seguir a carreira

científica.

Agradeço também à Fundação Internacional para a Ciência (IFS – International

Foundation for Science), da Suécia, e à Fundação Araucária (Secretaria de Estado da Ciência,

Tecnologia e Ensino Superior), do Estado do Paraná, pelo financiamento do projeto de

pesquisa.

APRESENTAÇÃO

Esta dissertação é composta de um artigo científico que descreve a clonagem e a

análise de dois novos genes da enzima galactose oxidase de duas espécies do complexo

Gibberella fujikuroi: Fusarium subglutinans e Fusarium verticillioides. Em consonância com

as regras do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, o trabalho foi redigido

como um artigo científico, que será enviado para a revista Genetics and Molecular Biology.

Cordeiro, FA and Barbosa-Tessmann, IP (2009). New galactose oxidase genes from species

of the Gibberella fujikuroi complex. Genetics and Molecular Biology. A ser submetido.

SUMÁRIO

NOVOS GENES DA GALACTOSE OXIDASE DE ESPÉCIES DO COMPLEXO

Gibberella fujikuroi..................................................................................................12

RESUMO..................................................................................................................12

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................13

2 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................16

2.1 Material....................................................................................................................16

2.2 Programas de bioinformática.................................................................................17

2.3 Microrganismos e manutenção...............................................................................17

2.4 Caracterização morfológica e cultural dos isolados.............................................18

2.5 Cultivo dos microrganismos em meio líquido.......................................................18

2.6 Análise da atividade enzimática.............................................................................19

2.7 Extração do DNA.....................................................................................................19

2.8 Clonagem dos genes da galactose oxidase de F. subglutinans e de F.

verticillioides.............................................................................................................21

2.9 Análises das sequências obtidas .............................................................................25

2.10 Extração de RNA e RT-PCR..................................................................................26

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................27

3.1 Caracterização morfológica e cultural dos isolados .............................................27

3.2 Análise da atividade enzimática .............................................................................28

3.3 Clonagem dos genes da galactose oxidase de F. subglutinans e de F.

verticillioides .............................................................................................................28

3.4 Análises das sequências obtidas..............................................................................29

3.5 Análise de RT-PCR..................................................................................................33

4 CONCLUSÕES........................................................................................................33

5 AGRADECIMENTOS ............................................................................................34

REFERÊNCIAS.......................................................................................................34

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Produção de galactose oxidase...........................................................................42

TABELA 2 - Similaridade entre os genes clonados da galactose oxidase com genes da

galactose oxidase de Fusarium spp. encontrados em bancos de dados .............43

TABELA 3 - Similaridade entre as proteínas galactose oxidase derivadas dos genes

clonados com proteínas da galactose oxidase derivadas de genes

encontrados em bancos de dados .......................................................................44

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Desenho de iniciadores e amplificação de um fragmento do gene da

galactose oxidase de F. subglutinans. ….......................................................... 45

FIGURA 2 - Características culturais e morfológicas dos isolados........................................ 46

FIGURA 3 - Amplificação dos genes da galactose oxidase por PCR..................................... 47

FIGURA 4 - Alinhamento múltiplo da sequência de nucleotídeos dos genes clonados

com a sequência do gene gaoA da galactose oxidase de

F. austroamericanum......................................................................................... 48

FIGURA 5 - Relação entre genes da galactose oxidase de Fusarium spp. ............................ 49

FIGURA 6 - Mapa de restrição dos genes da galactose oxidase de G. moniliformis,

de F. subglutinans e de F. verticillioides........................................................... 50

FIGURA 7 - Alinhamento múltiplo da sequência de aminoácidos das proteínas

derivadas dos genes clonados com a sequência da proteína codificada

pelo gene gaoA de F. austroamericanum .......................................................... 51

FIGURA 8 - Estrutura tridimensional das proteínas ............................................................... 52

FIGURA 9 - Resultado da reação de RT-PCR........................................................................ 53

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AN – Número de acesso no GenBank (“Acession number”).

BDA – Meio ágar batata dextrose.

CML – Coleção micológica de Lavras.

CTAB – Brometo de cetil trimetilamônio.

DNA – Ácido desoxirribonucléico.

EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético.

EST – “Expressed sequences tags” – seqüências expressas.

ITS – Região interna e transcrita do gene do RNA ribossomal.

LB – Meio Luria Bertani.

min – Minuto(s).

ORF – Janela de leitura aberta (“open reading frame”).

pb – Pares de bases

PCR – Reação da polimerase em cadeia.

RNA – Ácido ribonucléico.

RT – Reação da transcriptase reversa.

RT-PCR – Reação da transcriptase reversa e reação da polimerase em cadeia.

seg – Segundo(s).

TAE – Tampão Tris-Acetato-EDTA.

TE – Tampão Tris-EDTA.

U – Unidades internacionais.

UnB – Universidade de Brasília.

UFC – Unidade Formadora de colônia.

RESUMO GERAL

Introdução: A galactose oxidase é uma metaloproteína de cobre que converte galactose para

um aldeído e é utilizada para dosagem de galactose, síntese de carboidratos e diagnóstico de

câncer. Ela é produzida principalmente por Fusarium austroamericanum, sendo seu gene já

clonado deste microrganismo. Também é produzida por Fusarium acuminatum e por isolados

do complexo Gibberella fujikuroi, mas os genes da galactose oxidase destas espécies são

desconhecidos. Objetivos: Clonar, sequenciar e analisar o gene da galactose oxidase de

espécies do complexo G. fujikuroi. Métodos: Um alinhamento da sequência de genes da

galactose oxidase já clonados evidenciou uma região de alta identidade, que foi escolhida para

desenho de iniciadores de amplificação. Os iniciadores desenhados foram utilizados em uma

reação de PCR com o DNA genômico de Fusarium subglutinans para amplificar um

fragmento de DNA de 263 pb, o qual foi clonado e sequenciado. Uma análise de similaridade

usando este fragmento evidenciou uma sequência no genoma de Gibberella moniliformis

(Fusarium verticillioides), a qual corresponde a um gene com uma ORF de 679 resíduos de

aminoácidos. Iniciadores desenhados para amplificar toda a região codificante deste gene

foram utilizados em reações de PCR com o DNA genômico de F. verticillioides e de F.

subglutinans, duas espécies do complexo G. fujikuroi. Os fragmentos de DNA (2040 pb)

amplificados foram clonados e sequenciados e a sua transcrição endógena foi evidenciada por

RT-PCR. As sequências obtidas foram comparadas com sequências de outros genes da

galactose oxidase e uma árvore filogenética foi inferida. Resultados e Discussão: Os genes

clonados correspondem a genes da galactose oxidase de F. verticillioides e de F.

subglutinans. A árvore filogenética evidenciou a presença de três linhagens ortólogas de

genes da galactose oxidase em Fusarium spp. Conclusões: A clonagem desses novos genes

da galactose oxidase permitirá futuros estudos com as proteínas por eles codificadas, por meio

de expressão em sistemas recombinantes.

GENERAL ABSTRACT

Introduction: Galactose oxidase is a copper enzyme that converts galactose to an andehyde

and is used for galactose concentration estimation, carbohydrate synthesis, and cancer

diagnosis. It is produced mainly by Fusarium austroamericanum, being its gene already

cloned for this species. It is also produced by Fusarium acuminatum and by isolates of the

Gibberella fujikuroi complex, but the galactose oxidase genes from these species are

unknown. Objectives: To clone, sequence, and analyze the galactose oxidase gene from

species of the G. fujikuroi complex. Methods: An alignment performed with galactose

oxidase genes found in data banks has evidenced a region of high similarity that was chosen

for primer design. The designed primers were used in a PCR reaction with genomic DNA

from F. subglutinans to amplify a DNA fragment of 263 bp that was cloned and sequenced. A

similarity analysis using this fragment has evidenced a sequence in the Gibberella

moniliformis (Fusarium verticillioides) genome, which corresponds to a gene with an ORF of

679 amino acids residues. Primers were designed to amplify the entire coding region of this

gene and were used in PCR reactions with the genomic DNA of F. verticillioides and of F.

subglutinans, two species of the G. fujikuroi complex. The amplified fragments (2040 bp)

were cloned and sequenced and their endogenous transcription was evidenced by RT-PCR.

The obtained sequences were compared with sequences from other galactose oxidase coding

genes and a phylogenetic tree was inferred. Results and Discussion: The cloned genes

correspond to galactose oxidase genes from F. verticillioides and from F. subglutinans. The

phylogenetic tree evidenced three orthologous lineages of galactose oxidase genes in

Fusarium spp. Conclusions: The cloning of these new galactose oxidase coding genes will

allow future studies of the coded proteins through expression in recombinant systems.

NOVOS GENES DA GALACTOSE OXIDASE DE ESPÉCIES DO

COMPLEXO Gibberella fujikuroi

Cordeiro, F.A.

, Barbosa-Tessmann, I.P.

RESUMO

A galactose oxidase é uma metaloproteína monomérica que contém um átomo de cobre como

cofator e que converte galactose para um aldeído. Ela é utilizada para dosagem de galactose,

síntese de carboidratos e diagnóstico de câncer. Esta enzima é produzida principalmente por

Fusarium austroamericanum, uma espécie do complexo Fusarium graminearum, mas

também por Fusarium acuminatum e por isolados dos complexos F. graminearum e

Gibberella fujikuroi. O gene gaoA que codifica a enzima de F. austroamericanum já foi

clonado, mas os genes desta enzima das outras espécies secretoras ainda não foram clonados.

Alguns problemas associados com a galactose oxidase de F. austroamericanum, tais como

alto ponto isoelétrico, baixa eficiência catalítica e dificuldade de purificação fazem com que

haja a procura de genes homólogos. Neste trabalho, foram clonados e sequenciados os genes

da galactose oxidase de duas espécies do complexo G. fujikuroi: Fusarium verticillioides e

Fusarium subglutinans. A transcrição endógena destes genes foi demonstrada por RT-PCR.

Uma árvore filogenética inferida pelo alinhamento dos genes clonados com outros genes da

galactose oxidase encontrados em bancos de dados revelou a presença de três linhagens

ortólogas de genes da galactose oxidase em Fusarium spp. Com a clonagem destes novos

genes da galactose oxidase, futuros estudos de expressão heteróloga poderão ser realizados.

Aluno de mestrado do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas – Biologia Celular e Molecular.

Professora Associada do Departamento de Bioquímica da Universidade Estadual de Maringá.

1 INTRODUÇÃO

A galactose oxidase (

-galactose: O

oxirredutase, E.C. 1.1.3.9) é uma metaloproteína

monomérica que contém um átomo de cobre como cofator. Esta enzima foi primeiramente

detectada no meio de crescimento de Polyporus circinatus (COOPER et al., 1958), o qual foi

isolado na região sul do Brasil. Nobles e Madhosingh (1963), porém, reidentificaram o fungo

como sendo Dactylium dendroides (depositado em coleções de cultura com os números

NRRL 2903 e ATCC 46032), um micoparasita do P. circinatus. Em seguida, o fungo

produtor de galactose oxidase foi reclassificado como Fusarium graminearum (ÖGEL et al.,

1994; NIESSEN E VOGEL, 1997; O’DONNELL et al., 2000). Com a organização do

complexo de espécies F. graminearum, este isolado foi reconhecido como linhagem 1 deste

complexo ou Fusarium austroamericanum (O’DONNELL et al., 2004). Além do F.

austroamericanum, outras poucas espécies de fungos filamentosos são relatadas como

capazes de produzir a galactose oxidase, entre elas: isolados do complexo Gibberella fujikuroi

(GANCEDO et al., 1967; AISAKA e TERADA, 1982); Fusarium moniliforme f. sp.

subglutinans (BARBOSA-TESSMANN et al., 2001), o qual é atualmente classificado como

Fusarium subglutinans (LESLIE e SUMMERELL, 2006), Fusarium acuminatum

(BARBOSA-TESSMANN et al., 2001) e isolados do complexo F. graminearum

(BARBOSA-TESSMANN et al., 2001). O F. austroamericanum é o microrganismo com

maior potencial produtor comparado aos demais, sendo ele referência em pesquisa,

manipulação e produção industrial da enzima galactose oxidase.

A galactose oxidase de F. austroamericanum catalisa a oxidação de dois elétrons de

muitos álcoois primários, sobretudo o grupo 6-hidroxi da

-galactose, para o aldeído

correspondente, com concomitante redução de oxigênio para peróxido de hidrogênio

(WHITTAKER, 2002; WHITTAKER, 2003; WHITTAKER, 2005). Esta enzima também

possui alta atividade com diidroxiacetona, rafinose, melibiose e metil-galactopiranosídeos,

sendo o melhor substrato a diidroxicetona (WHITTAKER, 2002; GASPAROTTO et al.,

2006). A galactose oxidase de F. acuminatum e de G. fujikuroi possui especificidade de

substratos semelhante a da enzima de F. austroamericanum (AISAKA et al., 1984;

ALBERTON et al., 2007).

A galactose oxidase possui grande importância biotecnológica e é aplicada em: 1)

biosensores para dosagem de

-galactose, lactose e outros substratos da galactose oxidase

(SHLEEV et al., 2005; KONDAKOVA et al., 2007; TKAC et al., 2007); 2) biocatalisador na

síntese enzimática de aldeídos e carboidratos (BASU et al., 2000; ANDREANA et al., 2002;

FRANKE et al., 2003; SIEBUM et al., 2006; SHELDON, 2007); 3) estudos de coloração

histoquímica (SCHULTE e SPICER, 1983; FORTELIUS e MATTJUS, 2006); e 4) detecção

de câncer pelo método de coloração citoquímica usado para identificar o dissacarídeo (Gal-

(β13)-GalNAc) em glicoproteínas de fluidos corporais (SHAMSUDDIN, 1996; VUCENIK

et al., 2001; CHAGPAR et al., 2004).

O gene gaoA, o qual codifica a galactose oxidase de F. austroamericanum, já foi

clonado e sequenciado (MCPHERSON et al., 1992). Este gene não possui íntrons e possui um

sítio predominante de início de transcrição bem estabelecido (MCPHERSON et al., 1992). O

gene codifica um mRNA de aproximadamente 2,5 kpb, com uma parte codificante de 2043

pb, que corresponde a uma proteína com 680 aminoácidos, a qual contém uma sequência

sinal de secreção de 41 resíduos de aminoácidos na extremidade amino terminal. Esta

sequência sinal é parcialmente clivada durante o processo de secreção, resultando em uma

pró-proteína que necessita de posterior processamento para formar a proteína madura

(MCPHERSON et al, 1992; ROGERS et al., 2000; FIRBANK et al., 2001; WHITTAKER,

2002; FIRBANK et al., 2003). Há relatos do uso da tecnologia do DNA recombinante, nos

quais o gene gaoA da galactose oxidase de F. austroamericanum foi expresso em fungos

filamentosos, em leveduras e em bactérias (WHITTAKER e WHITTAKER, 2000; XU et al.,

2000; SUN et al., 2001). A importância desta enzima também levou alguns pesquisadores a

realizarem estudos de mutagênese para tentar melhorar o perfil catalítico desta enzima

(DELAGRAVE et al., 2001; SUN et al., 2001; SUN et al., 2002; DEACON et al., 2004;

WILKINSON et al., 2004; ESCALLETES e TURNER, 2008). Outros genes da galactose

oxidase que já foram clonados incluem o gene da galactose oxidase de Fusarium venenatum

(GOLIGHTLY et al., 2001) e da bactéria Stigmatella aurantiaca (SILAKOWSKI et al.,

1998), embora não haja relatos da produção desta enzima por estes microrganismos. Um

ponto a ressaltar é que os genes da galactose oxidase dos outros microrganismos produtores,

como F. subglutinans e F. acuminatum, ainda não foram clonados e a clonagem destes genes

poderia beneficiar o conhecimento desta família de genes e os estudos de expressão

recombinante desta enzima.

O uso da galactose oxidase em suas diversas aplicações apresenta algumas limitações

como o nível relativamente baixo da expressão secretora pelo F. austroamericanum, o que

torna a sua purificação um processo difícil e a preparação comercial bastante cara (MAZUR,

1991). Outra limitação da enzima inclui sua elevada basicidade com pH

de 12 (ETTINGER e

KOSMAN, 1981), o que não é adequado para estudos de histoquímica, pois uma proteína

altamente básica pode ser inibida e inativada por contaminantes macromoleculares e pode ser

menos reativa com glicoconjugados ligados nas membranas celulares (MAZUR, 1991).

Ainda, a enzima possui reduzida termoestabilidade e perde 50% de sua atividade a 67ºC

(SUN et al., 2001). Em termos cinéticos, a enzima possui um elevado K

para a galactose (68

- 175 mM) e uma baixa eficiência catalítica, com K

cat

na ordem de 4,46 x 10

-1

(BARON et al., 1994).

O complexo G. fujikuroi pertence à seção Liseola dentro do gênero Fusarium. Nesta

seção, estão incluídas espécies que produzem macroconídias e microconídias em cadeias e/ou

em falsas cabeças, mas que não produzem clamidósporos (LESLIE e SUMMRELL, 2006).

Nove espécies morfológicas constituindo nove populações de cruzamento (A a I) formam o

complexo G. fujikuroi (LESLIE e SUMMERELL, 2006). Aisaka e Terada (1982) estudaram

algumas propriedades cinéticas da galactose oxidase de um isolado de G. fujikuroi. Esta

enzima possui um K

menor para a galactose (43 mM) e um menor pH

(3,7), tendo, assim,

uma maior especificidade para a galactose e sendo, assim, menos básica, o que a torna mais

adequada para as aplicações biotecnológicas da galactose oxidase.

Considerando o exposto, este trabalho teve como objetivo a clonagem, o

sequenciamento e a análise dos genes da galactose oxidase de Fusarium verticillioides e de F.

subglutinans, duas espécies pertencentes ao complexo G. fujikuroi. A importância desta

clonagem é para um aumento no conhecimento de sequências gênicas codificadoras da

enzima galactose oxidase e para futuros estudos de expressão recombinante desta proteína.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Material

Iniciadores para a reação de PCR foram sintetizados pela Invitrogen (Brasil).

Polimerases para a reação de PCR (“Platinum Taq DNA polymerase” e “Platinum Pfx DNA

polymerase”), dNTPs, sistema de clonagem (“TA Cloning® kit”), sistema de purificação de

reação de PCR (“PureLink™ PCR Purification Kit”), proteinase K, X-gal, fenol, sistema de

síntese da primeira fita para RT-PCR (“SuperScript™ First Strand Synthesis for RT-PCR

kit”), sistema de purificação de RNA total (“PureLink™ Micro-to-Midi Total RNA

Purification System kit”) e os marcadores moleculares λDNA/HindIII e 1 kpb foram

adquiridos da Invitrogen (E.U.A.). A termocicladora utilizada foi a Techne TC-312

(Inglaterra). Ribonuclease A, CTAB, bissulfito de sódio, Trizma-Base, ampicilina, Taq DNA

polimerase, peroxidase, o-dianisidina, lauroilsarcosina, β-mercaptoetanol e CuSO

•5H

foram adquiridos da Sigma-Aldrich (E.U.A.). EDTA dissódico e SDS foram adquiridos da

Promega (E.U.A.). Para análises sob Luz UV, foram utilizados o transiluminador e a câmera

fotográfica Polaroid da Fisher Scientific (E.U.A.). Para fotografias na luz clara e ao

microscópio, foi utilizada a câmera fotográfica Sony Cybershot (E.U.A.). O microscópio

utilizado foi o modelo MDL-150-BPI binocular Medilux (China). Todos os outros reagentes

tinham grau analítico ou grau superior.

2.2 Programas de bioinformática

ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html ou http://www.align.

genome.jp): utilizado para alinhamento de sequências, análise de similaridade e inferência de

árvore filogenética. BLAST (http://www.pubmed.org): utilizado para pesquisa de

similaridade. Translate (http://au.expasy.org/tools/dna.html): utilizado para conversão de

sequência de nucleotídeos em sequência de aminoácidos. CDD (“Conserved Protein Domain

Database”) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi): utilizado para pesquisa

de domínios estruturais. pI/MW (http://au.expasy.org/tools/pi_tool.html): utilizado para

cálculo do pH

e da massa molecular das proteínas. NEBcutter (http://tools.neb.com/

NEBcutter2/index.php): utilizado para análise de sítios de enzimas de restrição. SWISS

MODEL-Repository (http://swissmodel.expasy.org/workspace/): utilizado para geração dos

modelos estruturais das proteínas.

2.3 Microrganismos e manutenção

F. subglutinans UnB 379 (teleomorfo: Gibberella subglutinans, população de

cruzamento E do complexo G. fujikuroi) identificado como produtor da enzima galactose

oxidase (BARBOSA-TESSMANN et al., 2001), foi obtido da coleção do Dr. J. C. Dianese

(Universidade de Brasília – UnB). F. verticillioides CML 767 (teleomorfo: Gibberella

moniliformis; população de cruzamento A do complexo G. fujikuroi) foi adquirido da coleção

do Dr. L. H. Pfenning (Universidade Federal de Lavras). G. fujikuroi NRRL 2278

(teleomorfo: Fusarium fujikuroi; população de cruzamento C do complexo G. fujikuroi). F.

austroamericanum (teleomorfo: Gibberella zeae), primeiramente identificado como produtor

de galactose oxidase (COOPER et al., 1958), foi doado pelo Dr. C. Kemmelmeier

(Universidade Estadual de Maringá). Estes isolados estão sendo mantidos em tubo inclinado

de meio ágar batata dextrose (BDA) (LESLIE e SUMMERELL, 2006), com repique

trimestral e em tubo inclinado de BDA coberto com óleo mineral. A cepa TOP10 da bactéria

E. coli foi comprada da Invitrogen (E.U.A.). Esta cepa está sendo preservada em meio Luria

Bertani (LB) (triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%, pH 7,0) adicionado de

glicerol para uma concentração final de 50%, a -20

2.4 Caracterização morfológica e cultural dos isolados

Para a diferenciação cultural e morfológica entre os isolados de F. verticillioides

CML 767 e de F. subglutinans UnB 379, foi realizado um cultivo em meio BDA em tubo

inclinado e um microcultivo. Para o microcultivo, os isolados foram inoculados em um bloco

de BDA (um cm

) colocado entre lâmina e lamínula em placa de petri com ambiente úmido

proporcionado por um pedaço de algodão embebido em água estéril. Em ambas as culturas, a

incubação foi feita por sete dias, à temperatura ambiente e no escuro. Os tubos foram

fotografados diretamente e as lâminas foram observadas em microscópio e fotografadas da

ocular.

2.5 Cultivo dos microrganismos em meio líquido

O meio líquido para produção de micélio foi o descrito por Markus et al. (1965). Este

meio é preparado em três soluções A: (NH

)

15 mM, NH

125 mM, extrato de

levedura 0,1%, KH

66 mM, Na

HPO

56 mM; Solução B: MgSO

·7H

O 1,62 mM,

MnSO

·H

O 11,8 µM, CuSO

·5H

O 10 µM; e solução C: glicose 1%. Estas soluções foram

esterilizadas separadamente em autoclave a 121ºC e 1 atm, por 20 min. Antes do inóculo, as

soluções foram combinadas assepticamente em frascos de 125 mL da seguinte forma: 22,5

mL da solução A, 0,5 mL da solução B e 2 mL da solução C somando um volume final de 25

mL. As concentrações indicadas são as finais do meio. O inóculo consistiu de um fragmento

de 1 cm

de cultura recente em BDA inclinado. Após a transferência, o fragmento foi

subdividido em frações menores. Os frascos inoculados foram incubados por três dias a

25ºC, no escuro, em uma incubadora com agitação orbital a 100 rpm.

2.6 Análise da atividade enzimática

Para a análise enzimática, os microrganismos foram crescidos no meio líquido como

descrito acima. As culturas obtidas foram utilizadas como inóculo (2% vol/vol) para novos

frascos de 125 mL contendo 25 mL do mesmo meio líquido. As subculturas foram incubadas

nas mesmas condições por três dias. Após esta incubação, elas foram centrifugadas (5 min,

1500g) e o sobrenadante foi utilizado para o teste enzimático.

A atividade da galactose oxidase foi determinada por espectrofotometria com o

método da peroxidase/o-dianisidina (AMARAL et al., 1966; TRESSEL e KOSMAN, 1982),

como segue. A mistura de reação consistiu de 0,5 mL da amostra (sobrenadante); 1,4 mL de

mistura reativa [tampão fosfato 50 mM, pH 7,0; o-dianisidina (Sigma D-3252) 0,2 mg/mL

previamente diluída em metanol (2,0 mg/mL); peroxidase (Sigma P-8125) 0,04 mg/mL (6

U/mL)]; e 0,1 mL de solução de

-(+)-galactose 0,5 M. A mistura de reação foi mantida a

30ºC por 30 min. Nessa reação, o peróxido de hidrogênio produzido pela ação da galactose

oxidase é reduzido pela peroxidase, com concomitante oxidação da o-dianisidina para um

produto de cor marrom, o qual é lido a 460 nm. A solução utilizada como branco continha

0,1 mL de água destilada no lugar do substrato. Uma unidade enzimática foi definida como o

aumento de uma unidade de absorbância em 30 min de reação a 30

2.7 Extração do DNA

Os microrganismos foram cultivados no meio líquido como descrito acima e as

culturas obtidas foram filtradas em gaze estéril. O micélio retido na gaze foi utilizado para

extração do DNA genômico com uso do protocolo descrito por Koenig et al. (1997), com as

modificações descritas em Biazio et al. (2008), como segue. A massa micelial filtrada foi

macerada em nitrogênio líquido até redução a um pó fino, o qual foi transferido para

microtubos (aproximadamente 300 µL para cada tubo) e foi adicionado de 700 µL do tampão

de extração. Este reagente consiste de uma mistura de: tampão de lise do núcleo (Tris 0,2 M,

pH 7,5; EDTA 50 mM; CTAB 2%), tampão de isolamento de DNA (Tris 0,1 M, pH 7,5;

EDTA 5 mM; sorbitol 0,35 M) e solução de N-lauroilsarcosina 5% na proporção de 1:1:0,4.

Antes do uso, 38 mg de bissulfito de sódio foram adicionados para cada 9,6 mL do tampão de

extração. Os tubos foram incubados por 60 min a 65ºC, com agitação a cada 10 min para

homogeneização. Após esta incubação, a suspensão foi extraída com solvente orgânico pela

adição de 500 µL da mistura clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) em cada tubo e agitação por

inversão por 5 min, até formar uma emulsão. As amostras foram centrifugadas a 12.000g por

10 min, à temperatura ambiente, e o sobrenadante foi transferido para um tubo limpo. Ao

sobrenadante foram adicionados 5 µL de RNAse A (20 mg/mL) e a solução foi incubada a

37ºC por 30 min. Em seguida, foram adicionados 5 µL de Proteinase K (20 mg/mL) e uma

nova incubação foi feita por 30 min a 56ºC. O DNA foi precipitado pela adição de 700 µL de

isopropanol com uma leve agitação e incubação overnight a -20

C. O DNA foi coletado por

centrifugação a 12000g por 5 min. O sobrenadante foi descartado e o DNA foi lavado com

500 µL de etanol 70%. O DNA foi coletado novamente por centrifugação a 12000g por 5 min

e o sobrenadante foi descartado. O DNA foi novamente lavado com etanol 70% e coletado

por centrifugação a 12000g por 5 min. O sobrenadante foi descartado e o DNA e as paredes

internas do tubo foram secos à temperatura ambiente por aproximadamente 10 min. O DNA

foi ressuspenso em 100 µL de tampão TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) e estocado em

refrigerador a -20ºC. A quantidade do DNA das amostras foi determinada por meio de leitura

da absorbância a 260 nm.

2.8 Clonagem dos genes da galactose oxidase de F. subglutinans e de F. verticillioides

Inicialmente, um par de iniciadores degenerados (FW 5´-GCTCGTGGKTA

TCAGTCATC-3´ e RV 5´-CAGTTCATSGCTGTGCTAGG-3´) foi desenhado com base em

regiões conservadas encontradas com o alinhamento de genes (Figura 1A) ou de fragmentos

de genes (“expressed sequence tag”- EST) da galactose oxidase de F. austroamericanum

(MCPHERSON et al., 1992; GenBank AN M86819), de Fusarium venenatum (GOLIGHTLY

et al., 2001; GenBank BD244461) e de Fusarium sporotrichioides (GenBank AN BI191247).

Estes iniciadores foram utilizados em uma reação de PCR com o DNA genômico de F.

subglutinans. A reação de amplificação foi realizada em tubos de PCR contendo 25 µL da

seguinte mistura de reação: tampão da enzima 1X (Tris-HCl 20 mM, pH 8,4; KCl 50 mM),

MgCl

1,5 mM, 1,5 U de Platinum Taq DNA polimerase; 0,2 mM de cada dNTP; 50 pmol de

cada iniciador (FW e RV) e 400 ng do DNA genômico. A reação de PCR consistiu de 25

ciclos de 1 min e 30 seg a 94ºC, 1 min e 30 seg a 57ºC e 2 min a 72ºC. Antes dos ciclos, as

amostras foram aquecidas por 5 min a 94ºC e, após os ciclos, as amostras foram incubadas

por 10 min a 72ºC. Para verificar a amplificação de um fragmento de DNA, dez µL da reação

de PCR acrescidos de 2 µL de tampão de carregamento 6X (azul de bromofenol 0,25%,

xileno de cianol FF 0,25%, sacarose 40%) foram aplicados em um gel de agarose 1,5%

contendo brometo de etídeo (0,25 µg/mL) e tampão TAE 1X (Tris-acetato 40mM; ácido

acético 20mM; EDTA 1mM). A corrida eletroforética foi feita em tampão TAE 1X a 80-100

V. O gel foi analisado sob luz UV.

O fragmento de DNA obtido (Figura 1B) foi clonado com uso do kit TA Cloning®,

como segue. Um microlitro da reação de PCR foi incubado por 16 horas a 16ºC com a

seguinte mistura: 50 ng do vetor pCR2.1, tampão da T4 DNA ligase 1 X e 4 U da T4 DNA

ligase em um volume de 10 µL. Dois microlitros da reação de ligação foram utilizados para

transformar 50

µL da bactéria E. coli cepa TOP10 feita competente com o método descrito

por Chung et al. (1989), como segue. Uma alçada do estoque da bactéria em glicerol foi

espalhada em uma placa de Agar LB, a qual foi incubada a 37

C durante uma noite. Uma

única unidade formadora de colônia (UFC) foi transferida para um tubo contendo 5 mL de

meio LB líquido, o qual foi incubado por uma noite a 37

C, com agitação de 100 rpm em uma

incubadora com rotação orbital. Cinquenta microlitros da cultura obtida foram transferidos

para um novo tubo contendo 5 mL de meio LB e crescidos por aproximadamente 3 horas.

Quinhentos microlitros desta última cultura foram centrifugados à temperatura ambiente (10

min, 9.000g) e o sedimento foi ressuspenso em 50 µL de tampão de transformação gelado

(TSS) (polietilenoglicol 8000 10%; dimetil sulfóxido 5%; triptona 1%; extrato de levedura

0,5%; NaCl 1%). As células foram mantidas no gelo e utilizadas imediatamente para a

transformação pela adição de 2 µL de β-mercaptoetanol 0,5 M e 2 µL da reação de ligação e

incubação por 30 min no gelo. Após esta incubação, as células foram submetidas a um choque

térmico a 42

C por 45 seg. Duzentos e cinquenta microlitros de tampão SOC (triptona 2%;

extrato de levedura 0,5%; NaCl 8,6 mM; KCl 2,5 mM; MgCl

10 mM; glicose 20 mM) foram

adicionados e a mistura foi incubada sob agitação por uma hora a 37

C. Cem microlitros desta

mistura foram plaqueados em agar LB/ampicilina (50 µg/mL). Para seleção azul/branca de

UFCs contendo o plasmídeo, o meio sólido de LB foi previamente coberto com 40 µL de X-

gal (20 mg/mL). As placas foram incubadas a 37ºC por uma noite.

Para o isolamento do DNA plasmidial em pequena escala, o método de lise alcalina

baseado no protocolo descrito em Sambook e Russel (2001) foi utilizado. Uma única UFC da

bactéria contendo o plasmídeo (cor branca) foi inoculada em 5 mL de meio LB/ampicilina

(50 µg/mL) e incubada sob agitação orbital de 100 rpm por uma noite a 37ºC. Após este

período, 1,5 mL da cultura foram transferidos para um tubo e centrifugados (2 min, 9000g).

O sedimento foi ressuspenso em 250 µL do tampão de ressuspensão (Tris 50 mM; EDTA 10

mM; pH 8,0) e 250 µL da solução de lise (NaOH 0,2 N; SDS 1%) foram adicionados. Após

homogeneização, 250 µL da solução de neutralização (acetato de potássio 3 mM; ácido

acético glacial 15,2 mM) foram adicionados. Após homogeneização, a mistura foi

centrifugada (5 min, 12000g) e o sobrenadante foi transferido para outro tubo. O DNA foi

precipitado com adição de dois volumes de isopropanol, homogeneização e incubação por 2

min à temperatura ambiente. O DNA foi coletado por centrifugação (5 min, 12000g). O

sobrenadante foi descartado e o sedimento de DNA foi lavado com etanol 70%. O DNA foi

coletado novamente por centrifugação (5 min, 12000g). O DNA lavado foi seco à

temperatura ambiente por 10 min e ressuspenso em 50 µL de tampão TE contendo RNAse A

(20 mg/mL). Após incubação de 1 h a 37

C, o DNA foi armazenado a -20ºC. A concentração

do DNA foi avaliada em espectrofotômetro por leitura em 260 nm e os plasmídeos obtidos

foram avaliados por análise de restrição.

O plasmídeo obtido foi utilizado como molde (50 ng) em uma nova reação de PCR

realizada como descrito acima, mas em um volume final de 100 µL. O fragmento amplificado

foi purificado com uso do kit Purelink™ PCR Purification e enviado para sequenciamento no

Centro de Estudos do Genoma Humano (CEGH) da Universidade de São Paulo (USP). As

reações de sequenciamento foram realizadas com os iniciadores degenerados desenhados para

amplificar o fragmento interno do gene da galactose oxidase de F. subglutinans e com o kit

DYEnamic ET Dye Terminator com a Thermo Sequenase™ II DNA Polimerase (GE

Healthcare). O sequenciamento foi realizado em um sequenciador MegaBACE 1000 (GE

Healthcare). As sequências foram analisadas pelo software Sequence Analyser utilizando o

Base Caller Cimarron 3.12, conforme informações do CEGH, http://genoma.

ib.usp.br/servicos/sequenciamento.php (15 de janeiro de 2009).

A sequência do fragmento amplificado foi utilizada para uma pesquisa BLAST e

evidenciou um gene no genoma do Gibberella moniliformis 7600 (cromossomo 10,

cont3.113) (anamorfo: F. verticillioides) com uma janela de leitura aberta (ORF – “Open

Reading Frame”) de 679 resíduos de aminoácidos, muito semelhante ao tamanho da enzima

galactose oxidase de F. austroamericanum. F. subglutinans e F. verticillioides pertencem ao

complexo de espécies G. fujikuroi.

Em seguida, novos iniciadores foram desenhados para amplificar todo o gene da

galactose oxidase de G. moniliformis (FW 5´-ATGAAGTCTTTCTACTCCTTGGC

CTTGTGC-3´ e RV 5´-TCAGACAGTGACCTTAATGGTGCTAGCAACG-3´). Estes

iniciadores foram utilizados em reações de PCR com o DNA genômico de F. subglutinans e

de F. verticillioides. As reações de amplificação foram realizadas em tubos de PCR

contendo: tampão da enzima 1X, 400 ng de DNA genômico, MgSO

1,0 mM, 0,3 mM de

cada dNTP, 50 pmol de cada iniciador e 1,25 U de Platinum® Pfx DNA polimerase, em um

volume total de 50 µL. A PCR foi executada com uma incubação inicial de 5 min a 94ºC

para desnaturação do DNA, e com 25 ciclos de 1 min a 94ºC, 1 min a 60ºC e 2 min a 68ºC.

Depois dos ciclos, as amostras foram submetidas a 68ºC por 10 min para completa extensão

dos fragmentos e refrigeradas a 4ºC. Para verificar a amplificação do produto, dez µl da

reação de PCR foram analisados em gel de agarose 1%, como descrito acima.

A enzima Platinum® Pfx DNA polimerase é uma enzima com atividade

exonucleásica 3′5′ e portanto possui alta fidelidade. No entanto, ela não adiciona um

resíduo 3´ terminal de desoxiadenosina necessário para a clonagem do fragmento de DNA

amplificado com o kit de clonagem TA Cloning®. O fragmento de DNA amplificado foi,

então, tratado com a Taq DNA polimerase para inserção de uma desoxiadenosina 3´

terminal, como segue. A reação de PCR realizada com a Platinum® Pfx DNA polimerase foi

adicionada com 1 U da Taq DNA polimerase e incubada por 10 min a 72

C. Em seguida, a

reação foi extraída com uma mistura de fenol (equilibrado com Tris, pH 8,0) e clorofórmio

com agitação em vórtex e centrifugação (5 min a 12000g). Após a centrifugação, a camada

aquosa foi transferida para um microtubo limpo e o DNA foi precipitado com adição de 2,5

volumes de etanol 100% e acetato de sódio (pH 5,2) para uma concentração final de 0,3 M.

O DNA precipitado foi coletado por centrifugação (5 min, 12000 g) e o sedimento obtido foi

lavado com etanol 70% com nova centrifugação (5 min, 12000 g). O sedimento final foi

ressuspenso em um volume correspondente ao volume inicial da reação de PCR com tampão

TE. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados com uso do kit TA Cloning®,

conforme descrito acima, e enviados para o Centro de Estudos do Genoma Humano da USP

para sequenciamento. Os iniciadores universais M13 direto e inverso direcionados para o

plasmídeo de clonagem (pCR®2.1 do kit TA cloning®) foram utilizados para sequenciar as

extremidades 3´ e 5´ do gene. Iniciadores internos ao gene também foram utilizados para

sequenciar completamente ambas as fitas da molécula de DNA. As sequências foram

alinhadas e um consenso foi gerado.

2.9 Análises das sequências obtidas

Os plasmídeos obtidos foram digeridos individualmente com uma ou duas enzimas de

restrição pela incubação individual dos mesmos com a(s) enzima(s) e com o tampão

daquela(s) enzima(s) 1X a 37

C por uma hora. O produto da digestão foi analisado em gel de

agarose. Mapas de restrição também foram gerados no programa NEBcutter.

Para a construção de uma árvore filogenética, as sequências dos genes clonados e do

gene gaoA de F. austroamericanum foram utilizadas para encontrar genes da galactose

oxidase no Fusarium Comparative Database (http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/

fusarium_graminearum/MultiHome.html) e no GenBank (http:// www.pubmed.org) com uso

do programa BLAST nos bancos de nucleotídeos, de patentes, de ESTs e de genomas. Os

genes encontrados foram analisados com o programa CDD para a presença dos três domínios

estruturais presentes na proteína derivada do gene gaoA de F. austroamericanum. Os genes

que não codificavam proteínas com o mesmo padrão estrutural da galactose oxidase de F.

austroamericanum foram descartados. Somente as sequências codificantes dos genes foram

alinhadas. A partir dos alinhamentos foi inferida uma árvore filogenética de agrupamento de

vizinhos (“neighbor joining”).

Os genes clonados foram traduzidos com uso do programa Translate e as sequências

de aminoácidos obtidas foram comparadas com as sequências das proteínas galactose oxidase

derivadas dos genes encontrados nos bancos de dados. A presença e a posição de aminoácidos

importantes para a catálise foram avaliadas. Modelos estruturais tridimensionais das proteínas

foram obtidos por comparação com a estrutura tridimensional da proteína galactose oxidase

de F. austroamericanum com uso do programa SWISS MODEL-Repository.

2.10 Extração de RNA e RT-PCR

Para a extração do RNA, os microrganismos foram cultivados por três dias como

descrito acima. O RNA foi extraído com o kit PureLink™ Micro-to-Midi Total RNA

Purification System, como segue. O micélio e/ou esporos foram coletados por filtração em

gaze ou centrifugação (5 min, 1.000g). As células foram maceradas em nitrogênio líquido e

100 µL do macerado foram transferidos para microtubos estéreis. Um volume de 500 µL da

solução de lise contendo 5 µL de β-mercaptoetanol foi então adicionado. A mistura foi

mantida no gelo e homogeneizada por passagem em agulha estéril (18G). Após centrifugação

(2 min, 12000g), o sobrenadante foi transferido para um outro microtubo e 300 µL de etanol

100% foram adicionados. Após homogeneização, toda a mistura foi passada na coluna que

acompanha o kit com uso de centrifugação (15 seg, 12000g) à temperatura ambiente. A

coluna foi lavada com uso de centrifugação (15 seg, 12000g) à temperatura ambiente, uma

vez com 700 µL do tampão de lavagem I e duas vezes com 500 µL do tampão de lavagem II.

A coluna foi centrifugada (1 min, 12000g) para secar a membrana e o RNA foi eluído com

adição de 30 µL de água destilada livre de RNase e centrifugação (2 min, 12000g) à

temperatura ambiente. A concentração de RNA foi estimada espectrofotometricamente por

leitura de absorbância a 260 nm.

Cinco microgramas de RNA total foram utilizados para a reação da transcriptase

reversa (RT) com uso do kit SuperScritp™ First-Strand Synthesis System for RT-PCR, como

segue. O RNA foi incubado com 1 mM de cada dNTP e 0,5 µg de Oligo (dT)

12-18

a 65

C por 5

min. Após esta incubação, a mistura foi transferida para um banho de gelo e adicionada de 9

µL da seguinte mistura: tampão da RT 2,2 X, MgCl

11,1 mM, DTT 0,022 M e 40 U de

RNaseOUT

. Esta mistura foi incubada a 42ºC por 2 min, adicionada de 50 U da enzima

SuperScript

II RT e incubada novamente a 42

C por 50 min. A reação foi interrompida por

incubação a 70 ºC por 15 min e transferência para o gelo. Em seguida, foram adicionadas 2 U

de RNase H e foi feita uma incubação por 20 min a 37 ºC. A mistura obtida continha o cDNA,

o qual foi utilizado na reação de PCR.

Os iniciadores utilizados na reação de PCR com o cDNA obtido foram os mesmos

utilizados para amplificar o gene inteiro da galactose oxidase de G. moniliformis. A seguinte

mistura foi preparada: tampão da enzima 1X, MgCl

1,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 50

pmol de cada iniciador, 2 U de Platinum® Taq DNA polimerase e 2 µL da reação de RT

contendo o cDNA como molde, em um volume total de 50 µL. A PCR foi executada com uma

incubação inicial de 5 min a 94ºC para desnaturação do DNA, e com 25 ciclos de 1 min e 30

seg a 94ºC, 1 min e 30 seg a 60ºC e 2 min a 72ºC. Depois dos 25 ciclos, as reações foram

submetidas a uma temperatura de 72ºC, por 10 min, para completa extensão dos fragmentos, e

refrigeradas a 4ºC. Para verificar a amplificação do produto, dez µL da reação de PCR foram

analisados em gel de agarose 1%, como descrito acima.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Caracterização morfológica e cultural dos isolados

O isolado de F. verticillioides pigmentou o meio BDA com cor salmão-pêssego e o

isolado de F. subglutinans pigmentou o meio BDA com cor púrpura (Figura 2A). Ambos os

isolados apresentaram micélio de cor branca (Figura 2A). Na análise de microcultivo em

BDA, o isolado de F. verticillioides formou apenas microconídios produzidos em cadeias e

não formou clamidosporos (Figura 2B). Por sua vez, o isolado de F. subglutinans formou

microconídios e macroconídios em falsas cabeças e também não formou clamidosporos

(Figura 2B). Os resultados obtidos mostram que os isolados utilizados realmente pertencem a

espécies diferentes, mas que os dois isolados apresentam características de espécies do

complexo G. fujikuroi.

3.2 Análise da atividade enzimática

Os resultados para a produção da enzima galactose oxidase pelo F. subglutinans e pelo

F. verticillioides são apresentados na Tabela 1. Somente o F. subglutinans foi capaz de

produzir a enzima galactose oxidase, quando crescido nas condições descritas na seção de

Material e Métodos. Esta produção ocorreu em quantidades muito pequenas (0,05 U/mL de

meio) com o teste enzimático realizado com 30 min de incubação (Tabela 1), o que está de

acordo com dados da literatura para este isolado (BARBOSA-TESSMANN et al, 2001). Em

comparação com o F. austroamericanum, que produz em torno de 25 U/mL de meio de

cultivo no teste enzimático realizado com dez min de incubação (GASPAROTTO et al.,

2006), o nível produtor do F. subglutinans é muito baixo.

3.3 Clonagem dos genes da galactose oxidase de F. subglutinans e de F. verticillioides

Os iniciadores desenhados para amplificar toda a parte codificante do gene da

galactose oxidase de G. moniliformis foram capazes de amplificar um fragmento de

aproximadamente 2000 pb do DNA genômico de F. verticillioides, de F. subglutinans, de F.

fujikuroi e de F. austroamericanum, com uso da enzima Platinum Pfx DNA polimerase

(Figura 3). Os fragmentos de DNA amplificados do DNA genômico de F. verticillioides e de

F. subglutinans foram clonados e sequenciados. Estas sequências serão depositadas no

GenBank e terão um número de acesso. Considerando que F. verticillioides é a forma

assexuada da G. moniliformis, o resultado obtido era esperado. Como F. subglutinans e F.

fujikuroi são espécies pertencentes do complexo G. fujikuroi, os iniciadores devem ter

reconhecido algum gene ortólogo destas espécies. De fato, após a clonagem e o

sequenciamento, uma similaridade de 94% foi observada entre os genes da galactose oxidase

de F. subglutinans e de G. moniliformis (Tabela 2). No entanto, a amplificação de um

fragmento de DNA de aproximadamente 2000 pb do DNA genômico de F.

austroamericanum não era esperada. Com a análise de busca de genes similares no GenBank

foi encontrado um gene no genoma de G. zeae (NZ AACM02000140) com 82 e 83% de

similaridade com os genes clonados de F. subglutinans e de F. verticillioides,

respectivamente. É provável que os iniciadores reconheceram este gene nas condições

utilizadas com a enzima Platinum Pfx DNA polimerase. Uma reação de PCR similar realizada

com a Platinum Taq DNA polimerase não foi capaz de amplificar qualquer fragmento de

DNA do DNA genômico de F. austroamericanum (dado não mostrado). Um fato a ser

ressaltado é que como a reação de PCR para amplificação dos genes clonados foi realizada

com uma enzima com leitura de prova e o sequenciamento de ambas as fitas do DNA foi

realizado as sequências gênicas obtidas devem ser altamente confiáveis.

3.4 Análises das sequências obtidas

Os genes clonados possuem 2040 pb com uma janela de leitura aberta (ORF) de 679

resíduos de aminoácidos. Os resultados da análise de similaridade mostram que os genes

clonados possuem uma alta identidade com outros genes da galactose oxidase de outros

isolados de Fusarium spp. (Tabela 2, Figura 4), sendo, portanto, genes da galactose oxidase.

A árvore filogenética inferida é mostrada na Figura 5. Os resultados obtidos

concordam com os dados do alinhamento. Estes resultados mostram que há pelo menos três

linhagens ortólogas de genes da galactose oxidase em Fusarium spp. De acordo com estes

resultados, há relatos na literatura sobre a existência de cinco a seis isoenzimas para a

galactose oxidase em F. austroamericanum (KOSMAN et al., 1974; TRESSEL e KOSMAN,

1980). Estas diferentes linhagens ortólogas de genes poderiam codificar isoenzimas

diferentes. Do melhor de nosso conhecimento, esta é a primeira vez que uma árvore

filogenética para o gene da galactose oxidase é inferida e a existência de mais de uma

linhagem ortóloga para este gene é identificada. Sugerimos a seguinte nomenclatura para as

linhagens dos genes da galactose oxidase de Fusarium spp.: gaoA para a linhagem do gene

gaoA de F. austroamericanum, gaoB para a linhagem dos novos genes clonados de espécies

do complexo G. fujikuroi e gaoC para a terceira linhagem de genes.

Para provar que os genes clonados de F. verticillioides e de F. subglutinans

representam dois genes diferentes e que a diferença encontrada no sequenciamento era real e

não apenas artefato de sequenciamento, uma análise de restrição foi realizada. As análises de

restrição realizadas no laboratório e pelo programa NEBcutter demonstraram uma diferença

no sítio de restrição da enzima KpnI, que está presente no gene de F. subglutinans e ausente

no gene de F. verticillioides (Figura 6). O mapa de restrição do gene da galactose oxidase de

G. moniliformis (AAIM02000113) obtido no programa NEBcutter mostra os mesmos sítios de

restrição do gene de F. verticillioides. Como há diferenças no comprimento dos fragmentos

de restrição com a enzima KpnI, foi concluído que os genes da galactose oxidase de F.

verticillioides e de F. subglutinans são genes diferentes, mesmo sendo de espécies tão

correlatas.

A Tabela 3 mostra os resultados da análise de similaridade entre as sequências de

aminoácidos das proteínas derivadas dos genes clonados e das proteínas derivadas dos genes

encontrados nos bancos de dados. Um alinhamento das proteínas dos genes clonados com a

proteína derivada do gene gaoA de F. austroamericanum é mostrado na Figura 7. Embora

haja também uma alta similaridade entre as proteínas derivadas dos genes clonados e das

proteínas derivadas dos genes pertencentes à linhagem gaoC, estas proteínas possuem maiores

número de resíduos de aminoácidos e massa molecular (Tabela 3). No entanto, a massa

molecular e o número de resíduos indicados podem não ser estes para as proteínas maduras,

visto que os sítios corretos do início de transcrição e de tradução e de remoção da sequência

sinal de secreção são desconhecidos. A principal diferença entre as proteínas derivadas da

linhagem de genes gaoC e as outras proteínas da galactose oxidase é uma longa extremidade

aminoterminal que não alinha com as sequências das outras proteínas (não mostrado).

A galactose oxidase de F. austroamericanum já foi cristalizada e a estrutura obtida por

estudos de cristalografia de Raios X foi relatada quase 20 anos atrás (ITO et al., 1991). O sítio

ativo compreende um átomo de cobre em uma geometria piramidal quadrática distorcida com

a tirosina 495 ocupando a posição axial. A His581, a His496, a Tyr495, a Tyr272 e o ligante

exógeno (água ou acetato, no lugar do substrato) coordenam o cobre em uma posição

equatorial. O traço mais interessante deste complexo é uma ligação tioéter na posição orto do

grupo hidroxílico entre a Tyr272 e a Cys228. Esta ligação presumidamente diminui o

potencial redox do par tirosil/tirosina. Para catalisar a oxidação de dois elétrons do substrato,

a enzima usa o átomo de cobre e a Tyr272 ligada com a Cys228, a qual funciona como um

cofator secundário interno (LEE et al., 2008). O anel indólico do Trp290 está π-empilhado

com a Tyr272 e parece controlar o acesso do sítio ativo e blindar o cofator Cys-Tyr da

exposição ao solvente, controlando assim a estabilidade e o potencial redox do radical tirosil

(ROGERS et al., 2007). Para entender melhor o mecanismo catalítico da galactose oxidase,

estudos de abordagem biomimética têm sido realizados (THOMAS, 2007) e os dados obtidos

com estes estudos corroboram os resultados obtidos anteriormente com a enzima. O

alinhamento das proteínas derivadas dos genes clonados com a proteína derivada do gene

gaoA de F. austroamericanum mostrado na Figura 7 revelou a conservação dos aminoácidos

do sítio ativo nas diferentes proteínas.

A galactose oxidase de F. austroamericanum é uma enzima secretada, cuja maturação

requer vários passos sucessivos: clivagem da sequência sinal de 41 resíduos de aminoácidos

que direciona a translocação para o espaço extracelular, ligação do metal e processamento do

cofator com a formação da ligação tioéter entre a Tyr272 e a Cys228. A conversão da forma

precursora inativa para a forma cataliticamente ativa de 639 resíduos de aminoácidos requer

somente cobre e oxigênio (MCPHERSON et al, 1992; ROGERS et al., 2000; FIRBANK et

al., 2001; WHITTAKER, 2002; FIRBANK et al., 2003). Não é possível afirmar que as

proteínas derivadas dos genes da galactose oxidase de F. verticillioides e de F. subglutinans

sofra o mesmo processamento, no entanto, como observado na Figura 7, há a presença de um

peptídeo de 31 resíduos de aminoácidos na extremidade aminoterminal das proteínas que

parece corresponder ao peptídeo sinal da proteína de F. austroamericanum. Caso este

peptídeo fosse removido das proteínas dos genes clonados, as proteínas maduras teriam 645

resíduos de aminoácidos.

A forma madura da galactose oxidase de F. austroamericanum consiste de três

domínios predominantemente em β-conformação, com apenas um segmento em α-hélice

(resíduos de 327-332). O primeiro domínio (resíduos de 1-155) tem uma estrutura de β-

sanduíche e é ligado ao segundo domínio por uma cadeia polipeptídica bem ordenada. O

segundo e maior domínio (resíduos de 156-532) tem uma pseudo-simetria de sete estruturas

repetidas com uma aparência global de uma flor de sete pétalas, em que cada pétala consiste

de quatro segmentos em β-conformação formando uma folha β-pregueada antiparalela. Este

domínio é chamado de domínio Kelch e o íon cúprico está presente perto do eixo central desta

estrutura. Três dos quatro ligantes do cobre, a Tyr-272, a Tyr-495 e a His-496 estão

localizados no segundo domínio. O terceiro domínio (resíduos 533-639) fica no lado oposto

do local onde está o cobre no segundo domínio. Dois dos sete segmentos em β-conformação

do terceiro domínio entram no meio do segundo domínio, ao longo do eixo do motivo de

pseudo simetria, servindo como um ligante para o cobre (ITO et al., 1991). O quarto ligante

do cobre, a His-581, está localizado na extremidade do segmento em β-conformação do

terceiro domínio que entra na cavidade central do segundo domínio (FIRBANK et al., 2001).

Para evidenciar a presença destes três domínios nas proteínas derivadas dos genes clonados,

uma estrutura virtual foi gerada por comparação com a estrutura da galactose oxidase de F.

austroamericanum. Como pode ser evidenciado na Figura 8, os modelos estruturais obtidos

mostram a presença dos três domínios nas proteínas dos genes clonados.

3.5 Análise de RT-PCR

A transcrição de um gene eucariótico resulta em um mRNA celular. A Figura 9

mostra os resultados da análise de RT-PCR, revelando a transcrição dos genes da galactose

oxidase clonados em F. verticillioides e em F. subglutinans, assim como dos genes ortólogos

em F. fujikuroi e em F. austroamericanum. A transcrição do gene da galactose oxidase em F.

verticillioides não corresponde com os resultados obtidos na análise enzimática, visto que

este microrganismo não produziu a enzima. Este fato deve ser devido a alguma falha em

algum dos vários passos da expressão gênica como a tradução, o endereçamento e o

processamento da proteína produzida. Outra interpretação para o resultado obtido é a

existência de uma possível falha técnica pela contaminação da preparação do RNA com

DNA. O RNA total obtido deveria ter sido tratado com uma DNAse antes da reação de RT-

PCR para descartar esta hipótese.

4 CONCLUSÕES

Por meio deste trabalho, foi possível obter e analisar as sequências gênicas da

galactose oxidase de F. verticillioides e de F. subglutinans. Foi verificado a transcrição destes

genes nos dois microrganismos. Além disso, houve uma contribuição para o aumento do

conhecimento sobre genes da galactose oxidase em Fusarium, uma vez que vários genes

foram encontrados em banco de dados e uma comparação entre eles resultou em uma árvore

filogenética que evidenciou a presença de pelo menos três linhagens ortólogas de genes da

galactose oxidase em Fusarium spp. Em adição, os estudos realizados aqui possibilitarão

futuros estudos de expressão heteróloga dos genes clonados e a caracterização bioquímica das

enzimas recombinantes.

5 AGRADECIMENTOS

Agradecemos à Fundação Internacional para a Ciência (Suécia) e Fundação Araucária,

pela ajuda financeira, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pela bolsa de mestrado de F. A. Cordeiro, e aos Professores Dr. C. Kemmelmeir

(UEM), Dr. J. C. Dianese (UnB) e L. H. Pfenning (UFLA), pela gentil doação dos isolados.

REFERÊNCIAS

AISAKA, K.; TERADA, O. Purification and properties of galactose oxidase from Gibberella

fujikuroi. Agric. Biol. Chem., v. 46, p. 1191-1197, 1982.

AISAKA, K.; UWAJIMA, T.; TERADA, O. Kinetic properties of galactose oxidase from

Gibberella fujikuroi. Agric. Biol. Chem., v. 48, p. 1425-1431, 1984.

ALBERTON, D.; OLIVEIRA, L. S.; PERALTA, R. M.; BARBOSA-TESSMANN, I. P.

Production, purification, and characterization of a novel galactose oxidase from Fusarium

acuminatum. J. Basic Microb., v. 47, p. 203-212, 2007.

AMARAL, D.; KELLY-FALCOZ, F.; HORECKER, B. L. Galactose oxidase of Polyporus

circinatus. Meth. Enzymol., v. 9, p. 87-92, 1966.

ANDREANA, P. R.; XIE, W.; CHENG, H. N.; QIAO, L.; MURPHY, D. J.; GU, Q. M.;

WANG, P. G. In situ preparation of β-D-1-O-hydroxylamino carbohydrate polymers

mediated by galactose oxidase. Org. Lett., v. 4, p. 1863-1866, 2002.

BARBOSA-TESSMANN, I. P.; SILVA, D. A. da; PERALTA, R. M.; KEMMELMEIER, C.

A new species of Fusarium producer of galactose oxidase. J. Basic Microb., v. 41, p. 143-

148, 2001.

BARON, A. J.; STEVENS, C.; WILMOT, C.; SENEVIRATNE, K. D.; BLAKELEY, V.;

DOOLEY, D. M.; PHILLIPS, S. E. V.; KNOWLES, P. F.; MCPHERSON, M. J. Structure

and mechanism of galactose oxidase. The free radical site. J. Biol. Chem., v. 269, p. 25095-

25105, 1994.

BASU, S. S.; DOTSON, G. D.; RAETZ, C. R. H. A facile enzymatic synthesis of uridine

diphospho-(

C)galacturonic acid. Anal. Biochem., v. 280, p. 173-177, 2000.

BIAZIO, G. R. de; LEITE, G. G. S.; TESSMANN, D. J.; BARBOSA-TESSMANN, I. P. A

new PCR approach for the identification of Fusarium graminearum. Braz. J. Microbiol., v.

39, p. 554-560, 2008.

CHAGPAR, A.; EVELEGH, M.; FRITSCHE Jr, H. A.; KRISHNAMURTHY, S.; HUNT, K.

K.; KUERER, H. M. Prospective evaluation of a novel approach for the use of a quantitative

galactose oxidase-Schiff reaction in ductal fluid samples from women with breast carcinoma.

Cancer, v. 100, p. 2549-2554, 2004.

CHUNG, C. T.; NIEMELA, S. L.; MILLER, R. H. One-step Preparation of competent

Escherichia coli: Transformation and Storage of Bacterial Cells in the Same Solution. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, v. 86, p. 2172-2175, 1989.

COOPER, J. A. D.; SMITH, W.; BACILA, M.; MEDINA, H. Galactose oxidase from

Polyporus circinatus, Fr. J. Biol. Chem., v. 234, p. 445-448, 1958.

DEACON, S. E.; NAHMOUD, K.; SPOONER, R. K.; FIRBANK, S. J.; KNOWLES, P. F.;

PHILLIPS, S. E. V.; MCPHERSON, M. J. Enhanced fructose oxidase activity in a galactose

oxidase variant. ChemBioChem, v. 5, p. 972-979, 2004.

DELAGRAVE, S.; MURPHY, D. J.; PRUSS, J. L. R.; MAFFIA III, A. M.; MARRS, B. L.;

BYLINA, E. J.; COLEMAN, W. J.; GREK, C. L.; DILWORTH, M. R.; YANG, M. M.;

YOUVAN, D. C. Application of a very high-throughput digital imaging screen to evolve the

enzyme galactose oxidase. Protein Eng., v. 14, p. 261-267, 2001.

ESCALETTES, F.; TURNER, N. J. Directed evolution of galactose oxidase: generation of

enantioselective secondary alcohol oxidases. ChemBioChem., v. 6, p. 857-860, 2008.

ETTINGER, M. J.; KOSMAN, D. J. Chemical and catalytic properties of galactose oxidase.

In Copper proteins, ed. T.G. Spiro. New York: John Wiley and Sons, 1981. pp. 219-261.

FIRBANK, S. J.; ROGERS, M. S.; WILMOT, C. M.; DOOLEY, D. M.; HALCROW, M. A.;

KNOWLES, P. F.; MCPHERSON, M. J.; PHILLIPS, S. E. V. Crystal structure of galactose

oxidase: an unusual self-processing enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 98, p. 12932-

12937, 2001.

FIRBANK, S. J.; ROGERS, M. S.; HURTADO-GUERRERO, R.; DOOLEY, D. M.;

HALCROW, M. A.; PHILLIPS, S. E. V.; KNOWLES, P. F.; MCPHERSON, M. J. Cofactor

processing in galactose oxidase. Biochem. Soc. Trans., v. 31, p. 506-509, 2003.

FORTELIUS, M.; MATTJUS, P. Galactose oxidase actin on galactose xontaining glycolipids

– a fluorescent method. Chem. Phys. Lipids, v. 142, p. 103-110, 2006.

FRANKE, D.; MACHAJEWSKI, T.; HSU, C. C.; WONG, C. H. One-pot synthesis of

fructose using coupled multienzyme systems based on rhammulose-1-phosphate aldolase. J.

Org. Chem., v. 68, p. 6828-6831, 2003.

GANCEDO, J. M.; GANCEDO, C.; ASENSIO, C. Widespread occurrence of galactose

oxidase and glucose oxidase in fungi. Arch. Biochem. Bioph., v. 119, p. 588-590, 1967.

GASPAROTTO, E. P. L.; ABRÃO, S. C. C.; INAGAKI, S. Y.; TESSMANN. D. J.;

KEMMELMEIER. C.; BARBOSA-TESSMANN, I. P. Production and characterization of

galactose oxidase produced by four isolates of Fusarium graminearum. Braz. Arch. Biol.

Tech., v. 49, p. 557-564, 2006.

GOLIGHTLY, E.; BERKA, R. M.; REY, M. W. Polypeptides having galactose oxidase

activity and nucleic acids encoding same. US Pat 6,277,612, 2001.

ITO, N.; PHILLIPS, S. E. V.; STEVENS, C.; OGEL, Z. B.; MCPHERSON, M. J.; KEEN, J.

N.; YADAV, K. D. S.; KNOWLES, P. F. Novel thioether bond revealed by 1.7 Å crystal

structure of galactose oxidase. Nature, v. 350, p. 87-90, 1991.

KOENIG, R. L.; PLOETZ, R. C.; KISTLER, H. C. Fusarium oxysporum f.sp. cubense

consists of a small number of divergent and globally distributed clonal lineages.

Phytopathology, v. 87, p. 915-923, 1997.

KONDAKOVA, L.; YANISHPOLSKI II, V.; TERTYKH, V.; BUGLOVA, T. Galactose

oxidase immobilize on silica in an analytical determination of galactose oxidase-containing

carbohydrates. Anal. Sci., v. 23, p. 97-101, 2007.

KOSMAN, D. J.; ETTINGER, M. J.; WEINER, R. E.; MASSARO, E. J. The molecular

properties of the copper enzyme galactose oxidase. Arch. Biochem. Biophys., v. 165, p. 456-

467, 1974.

LEE, Y.-K.; WHITTAKER, M. M.; WHITTAKER, J. W. The electronic structure of the Cys-

Tyr• free radical in galactose oxidase determined by EPR spectroscopy. Biochemistry, v. 47,

p. 6637-6649, 2008.

LESLIE, J. F.; SUMMERELL, B. A. The Fusarium Laboratory Manual. Oxford: Blackwell

Publishing, 2006.

MARKUS, Z.; MILLER, G.; AVIGAD, G. Effect of culture conditions on the production of

galactose-oxidase by Dactylium dendroides. Appl. Microbiol., v. 13, p. 686-693, 1965.

MCPHERSON, M. J.; ÖGEL, Z. B.; STEVENS, C.; YADAV, K. D. S.; KEEN, J. N.;

KNOWLES, P. F. Galactose oxidase of Dactylium dendroides. Gene cloning and sequence

analysis. J. Biol. Chem., v. 267, p. 8146-8152, 1992.

MAZUR, A. W. Galactose oxidase. Selected properties and synthetic applications. ACS Sym.

Ser., v. 466, p. 99-110, 1991.

NIESSEN, M. L.; VOGEL, R. F. Specific identification of Fusarium graminearum by PCR

with gaoA targeted iniciadores. System. Appl. Microbiol., v. 20, p. 111-113, 1997.

NOBLES, M. K.; MADHOSINGH, C. Dactylium dendroides (Bull.) Fr. misnamed as

Polyporus circinatus Fr. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 12, p. 146-147, 1963.

O’DONNELL, K.; KISTLER, H. C.; TACKE, B. K.; CASPER, H. H. Gene genealogies

reveal global phylogeographic structure and reproductive isolation among lineages of

Fusarium graminearum, the fungus causing wheat scab. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 97, p.

7905-7910, 2000.

O’DONNELL, K.; WARD, T. J.; GEISER, D. M.; KISTLER, H. C.; AOKI, T. Genealogical

concordance between the mating type locus and seven other nuclear genes supports formal

recognition of nine phylogenetically distinct species within the Fusarium graminearum clade.

Fungal Genet. Biol., v. 41, p. 600-623, 2004.

ÖGEL, Z. B.; BRAYFORD, D.; MCPHERSON, M. J. Cellulose-triggered sporulation in the

galactose oxidase-producing fungus Cladobotryum (Dactylium) dendroides NRRL 2903 and

its re-identification as a species of Fusarium. Mycol. Res., v. 98, p. 474-480, 1994.

ROGERS, M. S.; BARON, A. J.; MCPHERSON, M. J.; KNOWLES, P. F.; DOOLEY, D. M.

Galactose oxidase pro-sequence cleavage and cofactor assembly are self-processing reactions.

J. Am. Chem. Soc., v. 122, p. 990-991, 2000.

ROGERS, M. S.; TYLER, E. M.; AKYUMANI, N.; KURTIS, C. R.; SPOONER, R. K.;

DEACON, S. E.; TAMBER, S.; FIRBANK, S. J.; MAHMOUD, K.; KNOWLES, P. F.;

PHILLIPS, S. E. V.; MCPHERSON M. J.; DOOLEY, D. M. The stacking tryptophan of

galactose oxidase; a second-coordination sphere residue that has profound effects on tyrosyl

radical behavior and enzyme catlysis. Biochemistry, v. 46, p. 4606-4618, 2007.

SAMBROOK, J.; RUSSELL, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third

edition. Plainview: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

SCHULTE, B. A.; SPICER, S. S. Light microscopic histochemical detection of sugar residues

in secretory glycoproteins of rodent and human tracheal glands with lectin-horseradish

peroxidase conjugates and the galactose oxidase-Schif sequence. J. Histochem. Cytochem., v.

31, p. 391-403, 1983.

SHAMSUDDIN A. M. A simple test for cancer screening. Anticancer Res., v. 16, p. 2193-

2200, 1996.

SHELDON, R. A. Cross-linked enzyme aggregates (CLEA®s): stable and recyclable

biocatalysts. Biochem. Soc. Trans., v. 35, p. 1583-1587, 2007.

SHLEEV, S.; TKAC, J.; CHRISTENSON, A.; RUZGAS, T.; YAROPOLOV, A. I.;

WHITTAKER, J. W.; GORTON, L. Direct electron transfer between copper-containing

proteins and electrodes. Biosens. Bioelectron., v. 20, p. 2517-2554, 2005.

SIEBUM, A.; WIJK, A. V.; SCHOEVAART, R.; KIEBOOM, T. Galactose oxidase and

alcohol oxidase: scope and limitations for the enzymatic synthesis of aldehydes. J. Mol.

Catal. B: Enzym.., v. 41, p. 141-145, 2006.

SILAKOWSKI, B.; POSPIECH, A.; NEUMANN, B.; SCHAIRER, H. U. Stigmatella

aurantiaca fruiting body formation is dependent on the fbfA gene encoding a polypeptide

homologous to chitin synthases. J. Bacteriol., v. 178, p. 6706-6713, 1996.

SUN, L.; PETROUNIA, I. P.; YAGASAKI, M.; BANDARA, G.; ARNOLD, F. H.

Expression and stabilization of galactose oxidase in Escherichia coli by directed evolution.

Protein Eng., v. 14, p. 699-704, 2001.

SUN, L.; BULTER, T.; ALCADE, M.; PETROUNIA, I. P.; ARNOLD, F. H. Modification of

galactose oxidase to introduce glucose 6-oxidase activity. ChemBioChem., v. 8, p. 781-783,

2002.

TKAC, J.; WHITTAKER, J. W.; RUZGAS, T. The use of single walled carbon nanotubes

dispersed in a chitosan matrix for preparation of a galactose biosensor. Biosens. Bioelectron.,

v. 22, p. 1820-1824, 2007.

THOMAS, F. Ten years of a biomimetic approach to the copper (II) radical site of galactose

oxidase. Eur. J. Inorg. Chem., v. 17, p. 2379-2404, 2007.

TRESSEL, P. S.; KOSMAN, D. J. Galactose oxidase from Dactylium dendroides. Meth.

Enzymol., v. 89, p. 163-171, 1982.

VUCENIK, I.; GOTOVAC, J.; DRUZIJANIC, N.; SHAMSUDDIN, A. M. Usefullness of

galactose oxidase-Schiff test in rectal mucus for screening of colorectal malignancy.

Anticancer Res., v. 21, p. 1247-1256, 2001.

XU, F.; GOLIGHTLY, E. J.; SCHNEIDER, P.; BERKA, R. M.; BROWN, K. M.;

JOHNSTONE, J. A.; BAKER, D. H.; FUGLSANG, C. C.; BROWN, S. H.; SVENDSEN, A.;

KLOTZ, A. V. Expression and characterization of a recombinant Fusarium spp. galactose

oxidase. Appl. Biochem. Biotechnol., v. 88, p. 23-32, 2000.

WHITTAKER, J. W. Galactose oxidase. Adv. Prot. Chem., v. 60, p. 1-49, 2002.

WHITTAKER, J. W. Free radical catalysis by galactose oxidase. Chem. Rev., v. 103, p. 2347-

2363, 2003.

WHITTAKER, J. W. The radical chemistry of galactose oxidase. Arch. Biochem. Biophys., v.

433, p. 227-239, 2005.

WHITTAKER, M. M.; WHITTAKER, J. W. Expression of recombinant galactose oxidase by

Pichia pastoris. Protein Expr. Purif., v. 20, p. 105-111, 2000.

WILKINSON, D.; AKUMANYI, N.; HURTADO-GUERREIRO, R.; DAWKES, H.;

KNOWLES, P. F.; PHILLIPS, S. E. V.; MCPHERSON, M. J. Structural and kinectic studies

of a series of mutants of galactose oxidase identified by directed evolution. Protein Eng. Des.

Sel., v. 17, p. 141-148, 2004.

Tabela 1.

Produção de galactose oxidase

Isolado Atividade enzimática (U/mL de sobrenadante)

F. subglutinans UnB 379 0,05 ± 0,03

F. verticillioides CML 767 0

Os valores representam a média e o desvio padrão dos resultados obtidos nas análises

realizadas separadamente nos filtrados de quatro frascos de cultura.

Tabela 2.

Similaridade entre os genes clonados da galactose oxidase com genes da

galactose oxidase de Fusarium spp. encontrados em bancos de dados

Gene GenBank AN/

Microrganismo

GenBank AN/Microrganismo

% de

similaridade

AAIM02000113/G. moniliformis 2040 94

AN/F. verticillioides 2040 94

AAXH01000610/F. oxysporum f. sp.

lycopersici

2040 94

AACM02000140/G. zeae 2040 82

BD244461/F. venenatum 2040 82

M86819/F. austroamericanum 2043 59

XM_391208.1/G. zeae 2043 59

AAXH01000616.1/F. oxysporum

f. sp. lycopersici

2046 59

AAIM02000112.1/G. moniliformis 2046 59

AAIM02000007.1/G. moniliformis 3303 56

AAXH01000074.1/F. oxysporum

f. sp. lycopersici

3213

AN/F. subglutinans

2040 pb

AACM02000010.1/G. zeae 3204 56

AAIM02000113/G. moniliformis 2040 99

AAXH01000610/F. oxysporum f. sp.

lycopersici

2040 94

AACM02000140/G. zeae 2040 83

BD244461/F. venenatum 2040 82

M86819/F. austroamericanum 2043 58

XM_391208.1/G. zeae 2043 58

AAXH01000616.1/F. oxysporum

f. sp. lycopersici

2046 59

AAIM02000112.1/G. moniliformis 2046 59

AAIM02000007.1/G. moniliformis 3303 55

AAXH01000074.1/F. oxysporum

f. sp. lycopersici

3213

AN/F. verticillioides

2040 pb

AACM02000010.1/G. zeae 3204 55

Os números de acesso no GenBank destes genes serão atribuídos após depósito no

banco de dados.

Os números correspondem ao número de acesso no GenBank.

Os dados apresentados foram obtidos com o programa ClustalW.

Tabela

Similaridade entre as proteínas galactose oxidase derivadas dos genes clonados com

proteínas da galactose oxidase derivadas de genes encontrados em bancos de dados

Gene Proteína

GenBank AN/

Microrganismo

GenBank AN/Microrganismo

Resíduos

de amino-

ácidos

M.M.

(Da)

% de

similaridade

AAIM02000113/

G. moniliformis

679 9,28 73044 96

AN/F. verticillioides 679 9,28 73044 96

AAXH01000610/F. oxysporum

f. sp. lycopersici

679 9,19 73032 95

AACM02000140/G. zeae 679 9,08 73014 89

BD244461/F. venenatum 679 9,08 73113 88

M86819/F. austroamericanum 680 8,30 72823 60

XM_391208.1/G. zeae 680 8,30 72791 60

AAXH01000616.1/F. oxysporum

f. sp. lycopersici

681 8,63 72777 60

AAIM02000112.1/

G. moniliformis

681 8,63 72777 60

AAIM02000007.1/

G. moniliformis

1100 9,08 117563 52

AAXH01000074.1/F. oxysporum

f. sp. lycopersici

1070 8,98 113619 54

AN/

F. subglutinans

679 resíduos de

aminoácidos

pI=9,21

M.M.=73050 Da

AACM02000010.1/G.zeae 1067 8,09 113719 55

AAIM02000113/G. moniliformis 679 9,28 73044 100

AAXH01000610/F. oxysporum

f. sp. lycopersici

679 9,19 73032 97

AACM02000140/G. zeae 679 9,08 73014 90

BD244461/F. venenatum 679 9,08 73113 89

M86819/F. austroamericanum 680 8,30 72823 60

XM_391208.1/G. zeae 680 8,30 72791 60

AAXH01000616.1/F. oxysporum

f. sp. lycopersici

681 8,63 72777 60

AAIM02000112.1/

G. moniliformis

681 8,63 72777 60

AAIM02000007.1/

G. moniliformis

1100 9,08 117563 52

AAXH01000074.1/F. oxysporum

f. sp. lycopersici

1070 8,98 113619 54

AN/

F. verticillioides

679 resíduos de

aminoácidos

pI=9,28

M.M.=73044 Da

AACM02000010.1/G.zeae 1067 8,09 113719 55

Os números de acesso no GenBank destes genes serão atribuídos após depósito no referido

banco de dados.

Os números correspondem ao número de acesso no GenBank.

Dados obtidos com o programa Translate e Compute pI/MW.

Os dados apresentados foram obtidos com o programa ClustalW.

BD244461/

F.venenatum

CGGCGAGTGGGTTCCTGGCCCCGATATGCAGATTGCTCGTGGTTATCAGTCATCTGCCAC 938

BI191247/

F. sporotrichioides

-------------------------ATGCAGATTGCTCGTGGTTATCAGTCATCAGCTAC 35

M86819/

F. austroamericanum

CGATAGCTGGATCCCGGGACCTGACATGCAAGTGGCTCGTGGGTATCAGTCATCAGCTAC 1791

***** * ******** *********** ** **

BD244461/F. venenatum

CACTTCTGATGGACGTGTGTTCACTATCGGTGGTTCATGGAGTGGTCCTCGTGGCGGCAA 998

BI191247/F. sporotrichioides

CACTTCTGATGGACGTGTCTTCACTATCGGCGGTTCATGGAGTGGTCCCCGTGGTGGCAA 95

M86819/F. austroamericanum

CATGTCAGACGGTCGTGTTTTTACCATTGGAGGCTCCTGGAGCGGTGGCGTATTTGAGAA 1851

** ** ** ** ***** ** ** ** ** ** ** ***** *** * **

BD244461/F. venenatum

GAACGGCGAGATTTACGATCCCAAGGCCAGAACTTGGACTTCCCTTCCCAAGTGTCTTGT 1058

BI191247/F. sporotrichioides

GAACGGCGAGATCTACGACCCCAAGGCCAGAACCTGGACATCCCTTCCCAAGTGTCTTGT 155

M86819/F. austroamericanum

GAATGGCGAAGTCTATAGCCCATCTTCAAAGACATGGACGTCCCTACCCAATGCCAAGGT 1911

*** ***** * ** ** * * ** ***** ***** ***** **

BD244461/F.venenatum

TAGCCCTATGCTTACAAAAGATAAGGAAGGTGTTTACAAGGCCGACAACCACGCTTGGCT 1118

BI191247/F. sporotrichioides

TGGTCCTATGCTCACCAAAGATAAGGAGGGTGTCTACAAGGCTGACAACCACGCTTGGCT 215

M86819/F. austroamericanum

CAACCCAATGTTGACGGCTGACAAGCAAGGATTGTACCGTTCAGACAACCACGCGTGGCT 1971

** *** * ** ** *** * ** * *** * *********** *****

BD244461/F.venenatum

CTTTGGCTGGAAGAAGGGAAGTGTCTTCCAGGCTGGCCCTAGCACAGCCATGAACTGGTA 1178

BI191247/F. sporotrichioides

CTTTGGTTGGAAGAAGGGCAGTGTCTTCCAAGCTGGACCTAGCACAGCGATGAACTGGTA 275

M86819/F. austroamericanum

CTTTGGATGGAAGAAGGGTTCGGTGTTCCAAGCGGGACCTAGCACAGCCATGAACTGGTA 2031

****** *********** ** ***** ** ** *********** ***********

Figura 1. Desenho de iniciadores e amplificação de um fragmento do gene da galactose

oxidase de F. subglutinans. A) Alinhamento ClustalW de um fragmento do gene da galactose

oxidase de F. austroamericanum (MCPHERSON et al., 1992; GenBank M86819), de F.

venetatum (GOLIGHTHY et al., 2001; GenBank BD244461) e de F. sporotrichioides

(GenBank BI191247). A posição dos iniciadores desenhados está evidenciada. B) Gel de

agarose (1,5%) corado com brometo de etídeo mostrando o fragmento de DNA de 263 pb

amplificado em uma reação de PCR, utilizando os iniciadores direcionados para amplificar a

região de alta similaridade mostrada na parte A) desta figura e o DNA genômico de F.

subglutinans. O marcador de tamanho molecular utilizado foi o 1 kpb.

1.018

517

263 pb

298

220

Figura 2. Características culturais e morfológicas dos isolados. A) Culturas de F.

subglutinans UnB 379 e de F. verticillioides CML 767 crescidos em meio BDA em tubo

inclinado, por 7 dias, à temperatura ambiente e no escuro. B) Estruturas reprodutivas dos

isolados de F. subglutinans UnB 379 e de F. verticillioides CML 767 crescidos em meio

BDA em microcultivo, por 7 dias, à temperatura ambiente e no escuro.

400 X 1000 X

F. subglutinans UnB 379

F. verticillioides CML 767

F. subglutinans UnB 379F. verticillioides CML 767

400 X 1000 X

F. subglutinans UnB 379

400 X 1000 X

F. subglutinans UnB 379

F. verticillioides CML 767

F. subglutinans UnB 379F. verticillioides CML 767 F. subglutinans UnB 379F. verticillioides CML 767

Figura 3. Amplificação dos genes da galactose oxidase por PCR. Gel de agarose (1%) corado

com brometo de etídeo mostrando os fragmentos de DNA de aproximadamente 2000 pb

amplificados nas reações de PCR, utilizando os iniciadores direcionados para amplificar toda

a região codificante do gene da galactose oxidase de G. moniliformis. O marcador de tamanho

molecular utilizado foi o λDNA/HindIII.

2027

2322

AN/F. subglutinans ATGAAGTCTTTCTACTCCTTGGCCTTGTGCCTCGGTGCCTTCTTCAATGCAGCCACTGCCATTGATCCTGAGGA-GCAGGGACAACAG--CCTGGAAAG-----TTCGCTGCTGCTCCCC 112

AN/F. verticillioides ATGAAGTCTTTCTACTCCTTGGCCTTGTGCCTTGGTGCCTTCTTCAATGCAGCCACTGCCATTCCACCAGAGGA-GCAGGGACAACAG--CCTGGAAAG-----TTCGCTGCTGCTCCCC 112

M86819/F. austroamericanum ATGAAACACCTTTTAACACTCGCTCTTTGCTTCAGCAGCATCAATGCTGTTGCTGTCACCGTCCCTCACAAGGCCGTAGGAACTGGAATTCCTGAAGGGAGTCTTCAGTTCCTGAGCCTT 120

***** * * * * ** * *** * * * ** ** ** ** * * *** * *** ** * **** * * * * * *** **

AN/F. subglutinans CAG---TCGGTTC-------AAACCCCATTGACCGTAAGGGATGGACTGTCAAGTGTTCCAGCCAGGCTCCAAATTTCCCCTGTGGTAGAGCCATCGATGGTGACAAGAACACCTTCTGG 222

AN/F. verticillioides CCG---TTGGCTC-------AAACCCCATTGACCGCAAGGGATGGACTGTCAAGTGTTCCAGCCAGGCTTCAAACTTCCCCTGTGGTAGAGCCATCGATGGTGACAAGAACACCTTCTGG 222

M86819/F. austroamericanum CGAGCCTCAGCACCTATCGGAAGCGCCATTTCTCGCAACAACTGGGCCGTCACTTGCGACAGTGCACAGTCGGGAAATGAATGCAACAAGGCCATTGATGGCAACAAGGATACCTTTTGG 240

* * * * ** * ***** ** ** *** * **** ** *** * ** * ***** ***** ***** * ***** ***

AN/F. subglutinans CAGACTCCCTATGGCACAACCAACACGCC---GCCTCCTCACACCATCACCATTGACATGAAGCAGACCCAGTATGTCAGTGGTCTCCAGATTACACCTCGCCAAGACGGCAACACCCGT 339

AN/F. verticillioides CAGACTCCCTATGGCACAACCAACACGCC---TCCTCCTCACACCATCACCATTGACATGAAGCAGACTCAGTATGTCAGTGGTCTCCAGATTACACCACGCCAAGACGGCAACACCCGT 339

M86819/F. austroamericanum CACACATTCTATGGCGCCAACGGGGATCCAAAGCCCCCTCACACATACACGATTGACATGAAGACAACTCAGAACGTCAACGGCTTGTCTATGCTGCCTCGACAGGATGGTAACCAAAAC 360

** ** ******* * * * ** ** ******** *** ************ ** *** * **** ** * ** ** ** ** ** ** ***

AN/F. subglutinans AACTGGATTGGTCGACATGAAGTCTACCTCAGCTCTGACGGCACCAACTGGGGAAAGCCCGTTGCCTTTGGAACTTATTGGGGAGACAAGTACCCCTGGAT-CACAAACTTTGAGACTCA 458

AN/F. verticillioides AACTGGATTGGTCGACATGAAGTCTACCTTAGCTCTGACGGCACCAACTGGGGAAAGCCCGTTGCCTTTGGAACATACTGGGGAGACAAGTACCCCTGGAT-CACAAACTTTGAGACTCA 458

M86819/F. austroamericanum GGCTGGATCGGTCGCCATGAGGTTTATCTAAGCTCAGATGGCACAAACTGGGGCAGCCCTGTTGCGTCAGGTAGTTGGTTCGCCGACTC-TACTACAAAATACTCCAACTTTGAAACTCG 479

****** ***** ***** ** ** ** ***** ** ***** ******** * ** ***** * ** * * * * *** *** * ** * * ******** ****

AN/F. subglutinans TCCTGCTCGCTATCTCCGCTTTGTTGCCCTCTCTAACGTGAACTCCGACTATCCTTGGATTGCTATTGCCGACTTTCAAGTCTACAATGCT--CTCAAGTACAACCCGCCTGCTAAGGGT 576

AN/F. verticillioides GCCTGCTCGCTATCTTCGCTTTGTTGCCCTTTCTAACGTGAACTCCGACTATCCCTGGATTGCTATTGCCGACTTTCAAGTCTACAACGCT--CTCAAGTACAATCCCCCTGTTAAGGGT 576

M86819/F. austroamericanum CCCTGCTCGCTATGTTCGTCTTGTCGCTATCACTGAAGCGAAT---GGCCAGCCTTGGACTAGCATTGCAGAGATCAACGTCTTCCAAGCTAGTTCTTACACAGCCCCCCAGCCT--GGT 594

************ * ** **** ** * ** * * *** * * * ** **** * ***** ** * * **** * * *** ** *** ** ** * ***

AN/F. subglutinans CTTGGAAAATGGGGTCCTACTATTGACTTCCCAGTCATCCCCGTCGCTGGTGCCGTTGAGCCTGTCTCCGGAAAGGTCGTCATCTGGTCTGCTTACCGATATGATGCTTTCCAAGGCACC 696

AN/F. verticillioides CTTGGAAAATGGGGTCCTACTCTTGACTTCCCCGTCATTCCCGTCGCTGGTGCCGTTGAGCCTGTCTCAGGAAAGGTCGTCATCTGGTCTGCTTACCGATATGATGCTTTCCAAGGCACC 696

M86819/F. austroamericanum CTTGGACGCTGGGGTCCGACTATTGACTTACCGATTGTTCCTGCGGCTGCAGCAATTGAACCGACATCGGGACGAGTCCTTATGTGGTCTTCATATCGCAATGATGCATTTGGAGGATCC 714

****** ******** *** ******* ** * * ** * **** ** **** ** ** *** *** * ** ****** * ** ** ******* ** *** **

AN/F. subglutinans ACTCCCCGTGGTGGCTTCACTCTCACTTCTATCTGGGACCCCAAGACCAACGTCATCTCCAACCGCAATGTTTCCAACAACCATCACGACATGTTCTGCCCTGGTATTTCCATGGACGGT 816

AN/F. verticillioides ACTCCTCGGGGTGGCTTCACTCTCACTTCTATCTGGGACCCCAAGACCAACGTCATCTCCAACCGCAATGTTTCCAACAACCATCACGACATGTTCTGCCCTGGTATTTCCATGGACGGT 816

M86819/F. austroamericanum CCT------GGTGGTATCACTTTGACGTCTTCCTGGGATCCATCCACTGGTATTGTTTCCGACCGCACTGTGACAGTCACCAAGCATGATATGTTCTGCCCTGGTATCTCCATGGATGGT 828

** ***** ***** * ** *** ****** ** ** * * *** ****** *** * ** * * ** ** ***************** ******** ***

AN/F. subglutinans GAGGGACAGATTGTCGTTACTGGCGGCAACGACGCTAAGAAGACTACCAT-TCTCATGC--CTGATGGTAACTGGGTTCCTGGCCCTGACATGCAGATTGCTCGTGGTTACCAATCATCT 933

AN/F. verticillioides GAGGGACAGATTGTCGTCACTGGTGGTAACGATGCGAAGAAGACTACCAT-TCTCATGC--CTGATGGCAACTGGGTTCCTGGCCCTGACATGCAGATTGCTCGTGGTTACCAATCATCT 933

M86819/F. austroamericanum AACGGTCAGATCGTAGTCACAGGTGGCAACGATGCCAAGAAGACCAGTTTGTATGATTCATCTAGCGATAGCTGGATCCCGGGACCTGACATGCAAGTGGCTCGTGGGTATCAGTCATCA 948

* ** ***** ** ** ** ** ** ***** ** ******** * * * * ** * ** * * **** * ** ** *********** * ******** ** ** *****

AN/F. subglutinans GCTACTTGCTCTGATGGCCGCGTTTTCACCATCGGTGGTTCGTGGAGCGGTGCCCGTGGCGGTAAGAACGGTGAAATCTATGACCCCAGGGCCAAGACCTGGACATCTCTTCCCAAGTGT 1053

AN/F. verticillioides GCTACTTGCTCTGACGGCCGTGTTTTCACCATCGGTGGCTCATGGAGCGGTCCCCGTGGCGGCAAGAACGGTGAAATCTACGACCCCAAGGCCAAGACCTGGACCTCCCTTCCCAAGTGC 1053

M86819/F. austroamericanum GCTACCATGTCAGACGGTCGTGTTTTTACCATTGGAGGCTCCTGGAGCGGTGGCGTATTTGAGAAGAATGGCGAAGTCTATAGCCCATCTTCAAAGACATGGACGTCCCTACCCAATGCC 1068

***** ** ** ** ** ***** ***** ** ** ** ********* * * ***** ** *** **** *** * ***** ***** ** ** *****

AN/F. subglutinans CTCGTCGGCCCTATGCTCACCCACGACAAGGAGGGTGTCTACAAGGCTGACAACCACGCTTGGCTCTTTGGCTGGAAGAAGGGCAGTGTTTTCCAGGCTGGACCCAGCACAGCCATGAAC 1173

AN/F. verticillioides CTCGTCGGCCCTATGCTCACCAAGGACAAGGAGGGTGTCTACAAGTCTGACAACCACGCTTGGCTCTTTGGCTGGAAGAAGAACAGTGTTTTCCAGGCTGGACCCAGCACAGCCATGAAC 1173

M86819/F. austroamericanum AAGGTCAACCCAATGTTGACGGCTGACAAGCAAGGATTGTACCGTTCAGACAACCACGCGTGGCTCTTTGGATGGAAGAAGGGTTCGGTGTTCCAAGCGGGACCTAGCACAGCCATGAAC 1188

*** *** *** * ** ****** * ** * *** * *********** *********** ********* ** ***** ** ***** ***************

AN/F. subglutinans TGGTACTACACCGATAGGGGTACTCAGGGTAACACCAAGGCTGCCGGTACTCGACGAAAGAACGGCAGAGTTGACCCTGACTCTATGAACGGCAACGTTGCCATGTTTGATGCCGTCAAG 1293

AN/F. verticillioides TGGTACTACACCACCAAGGGCACTCAGGGTGACACCAAGGCTGCTGGTACTCGACGAAAGAACGGCAGAATTGATCCTGATTCCATGAACGGCAATGTTGCCATGTTCGATGCCCTTAAG 1293

M86819/F. austroamericanum TGGTACTATACCAGTGGAAGT------GGTGATGTGAAGTCAGCCGGAAAACGCCAGTCTAACCGTGGTGTAGCCCCTGATGCCATGTGCGGAAACGCTGTCATGTACGACGCCGTTAAA 1302

******** *** * *** * *** * ** ** * ** * *** * * * * ***** * *** *** ** * ** ***** ** *** * **

AN/F. subglutinans GGCAAGATCCTCACCTTTGGCGGTGCTACCAGCTACCAGCAGGCTCCTGCCACTGCTAACGCTCACGTCCTCACCATTGACCAGCCTGGTGCCATTGCCCAAACCGCTCTCGTTGGAAAC 1413

AN/F. verticillioides GGCAAGATTCTCACCTTTGGCGGTGCTACCAGCTACCAACAAGCTCCTGCCACTGCTAACGCTCATGTTCTCACAATTGACCAGCCCGGTGCCATCGCCCAGACTGCTCTCGTTGGGAAC 1413

M86819/F. austroamericanum GGAAAGATCCTGACCTTTGGCGGCTCCCCAGATTATCAAGACTCTGACGCCACAACCAACGCCCACATCATCACCCTCGGTGAACCCGGAAC-ATCTCCCAA--CACTGTCTTTGCTAGC 1419

** ***** ** *********** * * ** ** * ** ***** * ***** ** * **** * * * ** ** * ** **** ** ** *** * *

AN/F. subglutinans AACGGTGCTGGTATCCACGCTCGTGTCTTCGCTACCTCTACCATTCTCCCTGACGGAAACGTCTTCATCACTGGCGGTCAATCTTACTCCAACCCTTTCACCGACACCAACGCTCAGCTC 1533

AN/F. verticillioides AACGGTGCTGGTATTCACGCCCGTGTCTTCGCTACCTCTGTCATCCTCCCTGACGGAAACGTCTTCATCACTGGTGGCCAATCTTACTCCAACCCGTTCACCGACACCAACGCTCAGCTC 1533

M86819/F. austroamericanum AATGG--GTTGTACTT-TGCCCGAACGTTTCACACCTCTGTTGTTCTTCCAGACGGAAGCACGTTTATTACAGGAGGCCAACGACGTGGAATTCCGTTCGAGGATTCAACCCCGGTATTT 1536

** ** * *** ** ** ** ****** * ** ** ******* * ** ** ** ** ** *** * ** *** ** * * * * *

AN/F. subglutinans GAGCCTGAGATGTTCATTTCCTCCTCCAACACATTCACTAAGCAACAGCCCAACACTATTCCCCGCACCTATCACAGTATGTCTCTGCTGCTGCCAGATGGTACTGTCTTCAACGGTGGC 1653

AN/F. verticillioides GAGCCCGAGATGTTCATTTCCTCCTCCAACACATTCGCTAAGCAACAATCCAACACCATTCCCCGCACGTATCACAGTATGTCTCTGCTGCTGCCAGATGCTACTGTCTTCAACGGTGGC 1653

M86819/F. austroamericanum ACACCTGAGATCTACGTCCCTGAACAAGACACTTTCTACAAGCAGAACCCCAACTCCATTGTTCGCGTCTACCATAGCATTTCCCTTTTGTTACCTGATGGCAGGGTATTTAACGGTGGT 1656

** ***** * * * * **** *** ***** * ***** * *** *** ** ** ** ** ** ** ** * ** **** * ** ** ********

AN/F. subglutinans GGTGGTCTTTGCGGTAGCTGCAAGAGCAACCACTTTGACGCTCAGATCTTCACCCCTCAGTATCTCCTCGATGGCAACGGTAACCTTGCTACCCGCCCCAAGATCACTGCTGTTTCGGCC 1773

AN/F. verticillioides GGTGGTCTCTGCGGTAGCTGCAAGAGCAACCACTTTGACGCTCAGATCTTCACCCCTCAGTACCTCCTTGATGGCAACGGTAACCTTGCTACCCGCCCCAAGATCACTGCTGTTTCGGCT 1773

M86819/F. austroamericanum GGTGGTCTTTGTGGCGATTGTACCACGAATCATTTCGACGCGCAAATCTTTACGCCAAACTATCTTTACAATAGCAACGGCAATCTCGCGACACGTCCCAAGATTACCAGAACCTCTACA 1776

******** ** ** ** * * ** ** ** ***** ** ***** ** ** * ** ** ** ******* ** ** ** ** ** ******** ** ** *

AN/F. subglutinans ACTACTGCCAAGGTCGGTAGCACCATCACCGTCACTGCCAACAGCGCCATCAAGAGCGCTTCTCTTATGCGATACGGAACTGCGACACATGTTGTCAACACCGATCAGCGCCGCATTCCT 1893

AN/F. verticillioides ACTACTGCCAAAGTCGGTAGCACCATCACTGTCACTGCCAACAGCGCCATCAAGAGCGCTTCTCTTATCCGATACGGAACTGCGACACATGTTGTCAACACTGACCAGCGCCGCATTCCT 1893

M86819/F. austroamericanum CAGAGCGTCAAGGTCGGTGGCAGAATTACAATCTCGACGGATTCTTCGATTAGCAAGGCGTCGTTGATTCGCTATGGTACAGCGACACACACGGTTAATACTGACCAGCGCCGCATTCCC 1896

* * *** ****** *** ** ** ** * * * * ** * * ** ** * ** ** ** ** ** ******** ** ** ** ** **************

AN/F. subglutinans TTGGCCCTGACAGGTGCTGGTACCAACAAGTACTCTTTCAAGATTCCCAATGATTCTGGTATTGCCCTCCCTGGCTACTGGATGCTTTTTGTCATCAACAACGCCGGTGTTCCCAGCGTT 2013

AN/F. verticillioides TTGGCCCTGACTGGTGCTGGTACTAACAAGTACTCTTTCAAGATTCCTAATGACTCTGGTATTGCCCTCCCCGGCTACTGGATGCTCTTCGTCCTCAACAACGCTGGTGTTCCTAGCGTT 2013

M86819/F. austroamericanum CTGACTCTGACAAACAATGGAGGAAATAGCTATTCTTTCCAAGTTCCTAGCGACTCTGGTGTTGCTTTGCCTGGCTACTGGATGTTGTTCGTGATGAACTCGGCCGGTGTTCCTAGTGTG 2016

** * ***** *** ** * ** ****** * **** * ** ****** **** * ** ************ * ** ** * *** ** ******** ** **

AN/F. subglutinans GCTAGCACCATTAAGGTCACTGTCTGA 2040

AN/F. verticillioides GCTAGCACCATTAAGGTCACTGTCTGA 2040

M86819/F. austroamericanum GCTTCGACGATTCGCGTTACTCAGTGA 2043

*** ** *** ** *** ***

Figura 4. Alinhamento múltiplo das sequências de nucleotídeos dos genes clonados e do gene

gaoA da galactose oxidase de F. austroamericanum (Genbank M86819). AN indica o número

de acesso a ser atribuído no GenBank. Os símbolos (*) representam nucleotídeos idênticos.

Figura 5. Relação entre genes da galactose oxidase de Fusarium spp. A árvore filogenética

apresentada foi inferida pelo método de semelhança de vizinhos (“neighbor joining”) com

base na sequência de nucleotídeos dos genes da galactose oxidase clonados de F. subglutinans

e de F. verticillioides e de genes da galactose oxidase encontrados nos bancos de dados. As

sequências em negrito foram obtidas neste trabalho, mas ainda não possuem número de

acesso (AN) no GenBank. Os números de acesso no GenBank das outras sequências estão

indicados.

AN/F. subglutinans

AAXH01000610.1/F. oxysporum f. sp. lycopersici

AN/F. verticillioides

BD244461/F. venenatum

AACM02000140.1/G. zeae

AAIM02000007.1/G. moniliformis

AACM02000010.1/G. zeae

XM_391208.1/G. zeae

M86819/F. austroamericanum

AAXH01000616.1/F. oxysporum f. sp. lycopersici

AAIM02000112.1/G. moniliformis

AAXH01000074.1 /F. oxysporum f. sp. lycopersici

gaoA

gaoB

gaoC

AN/F. subglutinans

AAXH01000610.1/F. oxysporum f. sp. lycopersici

AN/F. verticillioides

BD244461/F. venenatum

AACM02000140.1/G. zeae

AAIM02000007.1/G. moniliformis

AACM02000010.1/G. zeae

XM_391208.1/G. zeae

M86819/F. austroamericanum

AAXH01000616.1/F. oxysporum f. sp. lycopersici

AAIM02000112.1/G. moniliformis

AAXH01000074.1 /F. oxysporum f. sp. lycopersici

AN/F. subglutinans

AAXH01000610.1/F. oxysporum f. sp. lycopersici

AN/F. verticillioides

BD244461/F. venenatum

AACM02000140.1/G. zeae

AAIM02000007.1/G. moniliformis

AACM02000010.1/G. zeae

XM_391208.1/G. zeae

M86819/F. austroamericanum

AAXH01000616.1/F. oxysporum f. sp. lycopersici

AAIM02000112.1/G. moniliformis

AAXH01000074.1 /F. oxysporum f. sp. lycopersici

gaoA

gaoB

gaoC

Figura 6. Mapa de restrição dos genes da galactose oxidase de G. moniliformis, de F.

subglutinans e de F. verticillioides.

AAIM02000113/G. moniliformis

+1 2040 pbXhoI

1531 pb

AN/F. verticillioides

+1 2040 pbXhoI

1531 pb

AN/F. subglutinans

+1 2040 pbXhoI

1531 pb

KpnI

1913 pb

AAIM02000113/G. moniliformis

+1 2040 pbXhoI

1531 pb

AN/F. verticillioides

+1 2040 pbXhoI

1531 pb

AN/F. subglutinans

+1 2040 pbXhoI

1531 pb

KpnI

1913 pb

AN/F. subglutinans

+1 2040 pbXhoI

1531 pb

KpnI

1913 pb

F.verticillioides MKSFYSLALCLGAFFNAATAIPPEEQGQ-------QPGKFAAAPPVGSNPIDRKGWTVKC 53

F.subglutinans MKSFYSLALCLGAFFNAATAIDPEEQGQ-------QPGKFAAAPPVGSNPIDRKGWTVKC 53

F.austroamericanum MKHLLTLALCFSSINAVAVTVPHKAVGTGIPEGSLQFLSLRASAPIGS-AISRNNWAVTC 59

** : :****:.:: .*.:: : * * .: *:.*:** .*.*:.*:*.*

F.verticillioides SSQASNFPCGRAIDGDKNTFWQTPYGTTNTP-PPHTITIDMKQTQYVSGLQITPRQDGNT 112

F.subglutinans SSQAPNFPCGRAIDGDKNTFWQTPYGTTNTP-PPHTITIDMKQTQYVSGLQITPRQDGNT 112

F.austroamericanum DSAQSGNECNKAIDGNKDTFWHTFYGANGDPKPPHTYTIDMKTTQNVNGLSMLPRQDGNQ 119

.* .. *.:****:*:***:* **:.. * **** ***** ** *.**.: ******

F.verticillioides RNWIGRHEVYLSSDGTNWGKPVAFGTYWGDKYPWITNFETQPARYLRFVALSNVNSDYPW 172

F.subglutinans RNWIGRHEVYLSSDGTNWGKPVAFGTYWGDKYPWITNFETHPARYLRFVALSNVNSDYPW 172

F.austroamericanum NGWIGRHEVYLSSDGTNWGSPVASGSWFADSTTKYSNFETRPARYVRLVAITEANGQ-PW 178

..*****************.*** *:::.*. . :****:****:*:**:::.*.: **

F.verticillioides IAIADFQVYNALKYNPPVKGLGKWGPTLDFPVIPVAGAVEPVSGKVVIWSAYRYDAFQGT 232

F.subglutinans IAIADFQVYNALKYNPPAKGLGKWGPTIDFPVIPVAGAVEPVSGKVVIWSAYRYDAFQGT 232

F.austroamericanum TSIAEINVFQASSYTAPQPGLGRWGPTIDLPIVPAAAAIEPTSGRVLMWSSYRNDAFGGS 238

:**:::*::* .*..* ***:****:*:*::*.*.*:**.**:*::**:** *** *:

Cys228

F.verticillioides TPRGGFTLTSIWDPKTNVISNRNVSNNHHDMFCPGISMDGEGQIVVTGGNDAKKTTILMP 292

F.subglutinans TPRGGFTLTSIWDPKTNVISNRNVSNNHHDMFCPGISMDGEGQIVVTGGNDAKKTTILMP 292

F.austroamericanum P--GGITLTSSWDPSTGIVSDRTVTVTKHDMFCPGISMDGNGQIVVTGGNDAKKTSLYDS 296

. **:**** ***.*.::*:*.*: .:************:**************:: .

Tyr272 Trp290

F.verticillioides DGN-WVPGPDMQIARGYQSSATCSDGRVFTIGGSWSGPRGGKNGEIYDPKAKTWTSLPKC 351

F.subglutinans DGN-WVPGPDMQIARGYQSSATCSDGRVFTIGGSWSGARGGKNGEIYDPRAKTWTSLPKC 351

F.austroamericanum SSDSWIPGPDMQVARGYQSSATMSDGRVFTIGGSWSGGVFEKNGEVYSPSSKTWTSLPNA 356

..: *:******:********* ************** ****:*.* :*******:.

F.verticillioides LVGPMLTKDKEGVYKSDNHAWLFGWKKNSVFQAGPSTAMNWYYTTKGTQGDTKAAGTRRK 411

F.subglutinans LVGPMLTHDKEGVYKADNHAWLFGWKKGSVFQAGPSTAMNWYYTDRGTQGNTKAAGTRRK 411

F.austroamericanum KVNPMLTADKQGLYRSDNHAWLFGWKKGSVFQAGPSTAMNWYYTSG--SGDVKSAGKRQS 414

*.**** **:*:*::***********.**************** .*:.*:**.*:.

F.verticillioides NGRIDPDSMNGNVAMFDALKGKILTFGGATSYQQAPATANAHVLTIDQPGAIAQTALVGN 471

F.subglutinans NGRVDPDSMNGNVAMFDAVKGKILTFGGATSYQQAPATANAHVLTIDQPGAIAQTALVGN 471

F.austroamericanum NRGVAPDAMCGNAVMYDAVKGKILTFGGSPDYQDSDATTNAHIITLGEPGTSPNTVFASN 474

* : **:* **..*:**:*********:..**:: **:***::*:.:**: .:*.:..*

F.verticillioides NGAGIHARVFATSVILPDGNVFITGGQSYSNPFTDTNAQLEPEMFISSSNTFAKQQSNTI 531

F.subglutinans NGAGIHARVFATSTILPDGNVFITGGQSYSNPFTDTNAQLEPEMFISSSNTFTKQQPNTI 531

F.austroamericanum --GLYFARTFHTSVVLPDGSTFITGGQRRGIPFEDSTPVFTPEIYVPEQDTFYKQNPNSI 532

. .**.* **.:****..****** . ** *:.. : **:::...:** **:.*:*

Tyr495 His496

F.verticillioides PRTYHSMSLLLPDATVFNGGGGLCGSCKSNHFDAQIFTPQYLLDGNGNLATRPKITAVSA 591

F.subglutinans PRTYHSMSLLLPDGTVFNGGGGLCGSCKSNHFDAQIFTPQYLLDGNGNLATRPKITAVSA 591

F.austroamericanum VRVYHSISLLLPDGRVFNGGGGLCGDCTTNHFDAQIFTPNYLYNSNGNLATRPKITRTST 592

*.***:******. **********.*.:**********:** :.*********** .*:

F.verticillioides TTAKVGSTITVTANSAIKSASLIRYGTATHVVNTDQRRIPLALTGAGTNKYSFKIPNDSG 651

F.subglutinans TTAKVGSTITVTANSAIKSASLMRYGTATHVVNTDQRRIPLALTGAGTNKYSFKIPNDSG 651

F.austroamericanum QSVKVGGRITISTDSSISKASLIRYGTATHTVNTDQRRIPLTLTNNGGNSYSFQVPSDSG 652

:.***. **::::*:*..***:*******.**********:**. * *.***::*.***

F.verticillioides IALPGYWMLFVLNNAGVPSVASTIKVTV 679

F.subglutinans IALPGYWMLFVINNAGVPSVASTIKVTV 679

F.austroamericanum VALPGYWMLFVMNSAGVPSVASTIRVTQ 680

:**********:*.**********:**

Figura 7. Alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos das proteínas derivadas dos

genes clonados e da proteína codificada pelo gene gaoA de F. austroamericanum (Genbank

M86819). Aminoácidos em vermelho: pequeno (+ hidrofóbico, + aromático, - Y);

aminoácidos em azul: acídico; aminoácidos em magenta: básico; aminoácidos em verde:

hidroxílico (+ básico, - Q). Símbolos representam: * resíduos idênticos; : substituições

conservadas; e . substituições semiconservadas. A região sublinhada corresponde à seqüência

sinal da proteína imatura. Os resíduos de aminoácidos importantes do sítio ativo estão

enquadrados em retângulos e indicados.

Figura 8. Estrutura tridimensional das proteínas. A) A estrutura da enzima de F.

austroamericanum é derivada do gene gaoA (MCPHERSON et al., 1992). As estruturas das

enzimas de F. subglutinans e de F. verticillioides foram derivadas das sequências de

aminoácidos obtidas dos genes clonados neste trabalho. São mostrados os três domínios

estruturais da enzima, em vermelho o domínio I, em verde o domínio II e em azul o domínio

III. B) Rotação de 90 graus no sentido horizontal para frente das figuras do painel A. Em

evidência está a estrutura em pseudosimetria de sete pétalas do domínio II (domínio Kelch)

das respectivas enzimas.

F. austroamericanum F. subglutinans F. verticillioides

Figura 9. Resultado da reação de RT-PCR. Gel de agarose (1%) mostrando os produtos

amplificados de uma reação de PCR, utilizando os iniciadores desenhados para amplificar

toda a região codificante do gene da galactose oxidase de G. moniliformis e o cDNA de F.

verticillioides CML 767, de F. subglutinans UnB 379, de G. fujikuroi NRRL 2278 e de F.

austroamericanum. O marcador molecular foi o λDNA/HindIII. Na reação do controle

positivo, foi utilizado como molde o DNA genômico (400 ng) de F. verticillioides e na reação

do controle negativo nenhum DNA ou cDNA foi utilizado

2027

2322

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 