( PDF ) A influência do vírus da hepatite G (GBV-C) na evolução da infecção pelo HIV em mulheres

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ALÉIA FAUSTINA CAMPOS

A influência do vírus da hepatite G (GBV-C) na evolução

da infecção pelo HIV em mulheres

Dissertação apresentada à Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Mestre em Ciências

Programa de Doenças Infecciosas e

Parasitárias

Orientador: Dr. José Eduardo Levi

São Paulo

2010

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Aos meus queridos pais, meus irmãos, meus amigos

e a Deus por tornar tudo isso possível

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AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, José Eduardo Levi, por acreditar e confiar à mim esse

importante estudo.

À Prof. Dra. Fátima Mitiko Tengan, pela contribuição ímpar na elaboração do

banco de dados e sugestões apresentadas durante o exame de qualificação.

À Dra. Maria Cássia Jacintho Mendes Correa e Dr. Celso Granato, pela

importante contribuição durante o exame de qualificação.

Ao Prof. Dr. Ronaldo César Borges Gryschek, pela grande amizade e participação

constante em minha carreira e no processo de aprendizado dessa dissertação.

Aos amigos do Laboratório de Virologia pela ajuda na análise do material e coleta

dos dados.

Aos amigos do serviço de arquivo médico do SEAP – HIV/aids.

Ao serviço de arquivo médico do Hospital Emílio Ribas.

À Luíza, pelo empenho em recuperar artigos científicos utilizados nesta

dissertação.

Ao Rogério, pela ajuda na análise estatística dos dados coletados.

Ao amigo Gaspar, pelo companheirismo e grande colega de trabalho.

Aos amigos do Ambulatório de Moléstias Infecciosas.

Aos meus amigos por entenderem alguns momentos de ausência.

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP, pelos

recursos disponibilizados nessa dissertação.

Às pacientes , principal motivação desta pesquisa.

SUMÁRIO

Lista de tabelas

Lista de gráficos e figuras

Lista de abreviaturas e siglas

Resumo

Summary

INTRODUÇÃO

1- Histórico ......................................................................................................... 1

2- Epidemiologia da infecção pelo GBV-C ......................................................... 8

3- Epidemiologia da infecção pelo HIV-1............................................................10

4- Vias de transmissão do GBV-C .................................................................... 13

5- Virologia do GBV-C ...................................................................................... 14

6- Diagnóstico laboratorial da infecção pelo GBV-C ........................................ 16

7- A interação GBV-C e HIV ............................................................................. 19

JUSTIFICATIVA DO ESTUDO ........................................................................ 27

OBJETIVOS ..................................................................................................... 28

CASUÍSTICA E MÉTODOS

1- Desenho do estudo ...................................................................................... 29

2- Característica da população do estudo e casuística .................................... 29

3- Alocação das pacientes em grupos ............................................................. 32

4- Testes laboratoriais para determinação da infecção pelo GBV-C

4.1- Determinação qualitativa de anticorpos anti-E2 ............................. 33

4.2- Extração de GBV-C RNA da amostra ............................................. 34

4.3- Reação de transcrição reversa ....................................................... 34

4.4- Reação PCR GBV-C convencional................................................. 34

4.5- Reação de Nested PCR GBV-C ..................................................... 35

4.6- Reação PCR GBV-C em tempo real .............................................. 36

4.6- Calibração do ensaio e curva-padrão ............................................. 37

4.7- Determinação da contagem de carga viral do HIV ......................... 38

4.8- Determinação da contagem de linfócitos T CD4 ............................ 41

5- Análise dos dados coletados ........................................................................ 42

6- Aspectos éticos.............................................................................................. 44

7- Revisão bibliográfica...................................................................................... 44

RESULTADOS ................................................................................................. 45

DISCUSSÃO .................................................................................................... 66

CONCLUSÕES ................................................................................................ 80

ANEXOS .......................................................................................................... 81

REFERÊNCIAS ................................................................................................ 85

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1- Reagentes, volumes e concentrações utilizados na reação da PCR

GBV- C convencional ............................................................................... 35

Quadro 2- Reagentes, volumes e concentrações utilizados na reação

NESTED PCR GBV-C ............................................................................. 36

Quadro 3- Reagentes, volumes e concentrações utilizados na reação da

PCR em tempo real ................................................................................. 37

Tabela 1- Características gerais da população no início do estudo estratificada

pelo perfil GBV-C – SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas ......................... 49

Tabela 2- Frequência de doenças oportunísticas na população durante

o acompanhamento estratificada pelo perfil GBV-C – SEAP/USP e

Hospital Emílio Ribas ............................................................................... 50

Tabela 3- Freqüência de co-infecção na população durante

o acompanhamento estratificada pelo perfil GBV-C – SEAP/USP e

Hospital Emílio Ribas ............................................................................... 51

Tabela 4- Média e mediana dos valores de CD4, carga viral do HIV, CD4 nadir e

carga viral Zênite na população durante o acompanhamento

estratificada pelo perfil GBV-C - SEAP/USP e

Hospital Emílio Ribas ............................................................................... 52

Tabela 5- Média e mediana de esquemas antirretrovirais utilizados no

tratamento do HIV na população durante o acompanhamento

estratificada pelo perfil GBV-C - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas ...... 53

Tabela 6- Freqüência de troca de esquemas ARV’s e do motivo da troca

na população durante o acompanhamento estratificada pelo perfil

do GBV-C – SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas .................................... 54

Tabela 7- Risco relativo de óbito estratificado pelo perfil do GBV-C –

SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas ......................................................... 57

Tabela 8- Análise de regressão múltipla de Cox ajustado por variáveis em

248 pacientes. Modelo parcial. SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas ....... 59

Tabela 9- Análise de regressão múltipla de Cox ajustado por variáveis em

248 pacientes. Modelo final. SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas............ 60

Tabela 10- Resultados dos testes laboratoriais para GBV-C RNA em 57

novas amostras colhidas em 2006-2008 – SEAP/USP e

Hospital Emílio Ribas ............................................................................... 60

Tabela 11- Resultado das variáveis CD4 e carga viral do HIV do GBV-C das 57

pacientes - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas....................................... 63

Tabela 12- Comparação entre a variação CD4, carga viral do HIV basal e

final dos grupos PN, PP, C/I/S/II - SEAP/USP e

Hospital Emílio Ribas .............................................................................. 64

Tabela 13- Comparação entre a variação CD4, carga viral do HIV basal e

final dos grupos PN, PP - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas ............... 65

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1- Prevalência do GBV-C em 248 pacientes - SEAP/USP e

Hospital Emílio Ribas ..................................................................... 47

Gráfico 2- Análise de sobrevida entre pacientes expostas e não

expostas ao GBV-C - Curva de Kaplan-Meier - SEAP/USP e

Hospital Emílio Ribas ...................................................................... 56

Gráfico 3 - Análise de sobrevida entre pacientes GBV-C RNA-/anti-E2 - ;

GBV-C RNA+/antiE2- e GBV-C RNA-/antiE2+ -

Curva de Kaplan-Meier - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas....... 56

Gráfico 4 - Análise de sobrevida entre categorias de CD4.

Curva de Kaplan-Meier - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas ......... 58

Gráfico 5 - Análise de sobrevida entre categorias de carga viral do HIV.

Curva de Kaplan-Meier - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas....... 58

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Hepatotropismo do GBV-C................................................................05

Figura 2- Prevalência do GBV-C em doadores de sangue de diversas

regiões do mundo..............................................................................08

Figura 3- Esquema comparativo da organização do genoma do

GBV-C e VHC mostrando as fases de leitura abertas e

as regiões 5’ e 3’UTR ...................................................................... 16

Figura 4- Mecanismos propostos para explicar a ação do GBV-C

nos pacientes co-infectados com HIV ............................................. 26

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

GBV

Vírus da hepatite G

HGV

Vírus da hepatite G

VHC

Vírus da hepatite C

VHB

Vírus da hepatite B

HTLV1/2

Vírus humano linfotrópico ½

HIV

CHC

Virus da imunodeficiência humana adquirida tipo 1

Hepatocarcinoma

FDA

Food and Drugs Administration

HAART

Terapia de Alta Atividade Antirretroviral

CCR5

Receptor 5 de quimiocinas (C-C)

CXCR4

Receptor 4 de quimiocinas (CXC)

MIP

Proteína inflamatória de macrófagos - 1α

RANTES

Regulated on Activation Normal T Cell-Expressed and Secreted

Interleucina

INFγ

Interferon Gama

SDF

Fator derivado de estroma

ELISA

Ensaio imunoenzimático

cDNA

Ácido desoxirribonucléico complementar

RNA

Ácido ribonucléico

PBMC

Células linfomononucleares de sangue periférico

Região não-estrutural

CTL

Linfócito T citotóxico

PCR

Reação em Cadeia de Polimerase

RESUMO

Campos A F. A Influência do vírus da hepatite G (GBV-C) na evolução da

infecção pelo HIV em mulheres [Dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina,

Universidade de São Paulo; 2010, 96p

INTRODUÇÃO: O vírus da hepatite G (GBV-C) foi descoberto simultaneamente

por dois grupos de pesquisa que buscavam identificar um agente causador de

hepatite pós-transfusional não-A, não-B e não-C. Trata-se de um vírus linfotrópico

que replica primariamente em células mononucleares do sangue periférico

(PBMC), baço e medula óssea, sendo a replicação hepática menos importante.

Sabe-se que, após um período de viremia assintomática, a maioria dos

carreadores virais clareia o vírus ao longo do tempo havendo surgimento do

anticorpo contra a glicoproteína do envelope viral, anti-E2. Uma vez que,

provavelmente, não exista nenhuma associação entre o GBV-C e qualquer

doença identificada até o momento, o mesmo tem sido considerado um vírus

humano não patogênico. Entretanto, alguns estudos demonstraram haver uma

interação benéfica entre o GBV-C e HIV a ponto de retardar a progressão da

infecção pelo HIV para aids. OBJETIVOS: Avaliar a prevalência da viremia e de

anticorpos contra a glicoproteína anti-E2 e estudar o efeito da interação GBV-C e

HIV ao longo do acompanhamento de pacientes femininas baseado em valores

da média e mediana de linfócitos T CD4+ , da carga viral do HIV e da carga viral

quantitativa do GBV-C RNA. MÉTODOS: Foram estudas 248 pacientes femininas

portadoras da infecção pelo HIV acompanhadas por um período de cerca de 10

anos, tendo como término de estudo a data limite de 01/01/2008, ou a data da

última consulta no ambulatório ou a data do óbito. RESULTADOS: Das 115

pacientes expostas, 57 eram GBV-C RNA positivas (23%) e 58 eram anti-E2

positivas (23%). Não houve achado da presença concomitante do GBV-C RNA e

do anticorpo anti-E2 nas pacientes estudas. Com relação à contagem de

linfócitos T CD4+ e de carga viral basal do HIV no início do estudo, não

observamos diferença estatística entre os valores em relação aos grupos (GBV-C

RNA-/anti-E2- , GBV-C RNA+/anti-E2 - e GBV-C RNA -/anti-E2+), sendo o p=0,36

e 0,713, respectivamente. O risco relativo de óbito para o grupo GBV-C+/anti-E2-

foi 63% menor do que para o grupo GBV-C-/anti-E2-. CONCLUSÃO: A

prevalência da viremia por GBV-C RNA e a do anticorpo anti-E2 foi de 23%,

perfazendo uma frequência de exposição ao GBV-C de 46%. Em análise multi-

variada, apenas a carga viral do HIV, maior que 100.000 cópias/mL, e

manifestação de doença oportunística ao longo do acompanhamento das

pacientes estiveram associadas à melhora da sobrevida. Provavelmente, o uso

da terapia antirretroviral para o HIV foi fator limitante na análise de efeito protetor

do GBV-C RNA em nossa casuística.

Descritores: 1. Vírus GBV-C 2. Prevalência 3. HIV 4. Co-infecção GBV-C/HIV

5. Terapia antirretroviral

SUMMARY

Campos A F. Hepatitis G (GBV-C) influence in the prognosis of HIV- infected

women [Dissertation]. São Paulo: University of São Paulo Medical School; 2010,

96p

INTRODUCTION: GB virus C (GBV-C) was discovered by two research groups

that aimed to identify a possible agent responsible for a non-A, non-B and non-C

pos-transfusion hepatitis. There is remarkable evidence that GBV-C is a

lymphotropic virus that primarily replicates in PBMCs, spleen and bone marrow.

This virus does not appear to be hepatotropic and does not replicate effectively in

hepatocytes. After an asymptomatic viremia period, most subjetcs clear the virus

over time with the development of antibody against a viral envelope glycoptrotein

(anti-E2). Since there is probably no association between GBV-C and any identify

disease, this virus has been considered not pathogenic. However, according to

some studies, GBV-C co-infection in HIV seropositive patients is associated with a

slower disease progression and longer survival after AIDS development in HIV

infected patients. Objective: To evaluate the prevalence of GBV-C viremia, anti-

E2 antibody and assess the effect of the interaction of GBV-C and HIV in an

exclusive female cohort, in a follow up period of up to 10 years. Methodos: Two

hundred forty-eight HIV infected women were enrolled in the study. Follow-up

sample was obtained from 248 patients. Laboratorial variables as mean and

median of values of CD4, HIV and GBV-C quantitative viral load, and clinical

parameters as HAART use, OIs influence on survival were investigated. Results:

One hundred and fifteen subjects were exposed to GBV-C: 57 were GBV-C RNA

positive (23%) and 58 were anti-E2 antibody positive (23%). Viral RNA with

concomitant anti-E2 antibodies was not found in any patient. There was no

statistical difference among three studied groups (GBV-C RNA-/anti-E2 - , GBV-C

RNA+/anti-E2- and GBV-C RNA -/anti-E2+), regarding CD4+ and viral load

baselines (p=0,360 and 0,713, respectively). Relative risk of death for GBV-C

RNA+/anti-E2- group was 63% lower than the GBV-C-/anti-E2 group.

Conclusion: Forty-six percent of the enrolled individuals were exposed to GBV-C

virus. Multivariate analysis demonstrated that only HIV load higher than 100.000

copies/mL and opportunistic disease during the follow-up period were associated

to longer survival after AIDS development. Probably, antiretroviral therapy for HIV

in our study blurred the observation of a putative protective effect related to GBV-

C RNA.

Descriptors: 1. GB virus C 2. Prevalence 3. HIV 4. Co-infection GB virus C

and HIV 5. Antiretroviral therapy

Introdução

1 – Histórico

As pesquisas científicas que culminaram com a descoberta do vírus GBV-

C ou vírus da hepatite G tiveram início nos anos de 1960. Em 1967, Deinhardt e

colaboradores, durante pesquisa para isolar o vírus da hepatite A, descobriram

um novo vírus a partir do soro de um cirurgião de nome G. Barker (GB) que

apresentava quadro clínico típico de hepatite aguda manifestado por aumento de

enzimas hepáticas e um período de icterícia de três semanas. O sangue desse

paciente foi inoculado em primatas não humanos e a hepatite manifestada em

todos os animais experimentados. Os achados sugeriram que a causa dessa

hepatite era de um agente viral não identificado, assim nomeado GBV

Contudo, somente em meados dos anos 90, dois grupos de pesquisa, nos

Estados Unidos da América

2,3,4,5

- procurando um novo vírus que poderia ser o

agente etiológico para casos considerados de hepatite não A, não B, não C e não

E - isolaram um vírus RNA da família Flaviviridae nomeado GBV-C/HGV (GB

vírus C ou vírus da hepatite G). Com os dados das pesquisas disponíveis entre

estes dois grupos de pesquisadores foi possível averiguar que o GBV-C e o HGV

possuíam 96% de homologia entre seus genomas, indicando que de fato tratava-

se de duas denominações diferentes do mesmo agente viral. Desde então ambas

as nomenclaturas passaram a ser adotadas na literatura (GBV-C/HGV)

3,4,6,7

Assim, devido ao fato do GBV-C ter sido encontrado durante investigações que

procuravam um novo vírus causador de hepatite e porque os clones virais

provinham de pacientes ou animais com sinais e sintomas de hepatite, este vírus

ficou conhecido equivocadamente como um agente causador de hepatite

Logo após sua descoberta, o GBV-C foi intensamente estudado em

diferentes populações, procurando-se determinar sua história natural. Uma vez

adquirida, a infecção pelo GBV-C geralmente tende a persistir por vários anos em

imunocompetentes e imunossuprimidos. Após esse período de viremia

assintomática, a maioria dos carreadores virais clareiam o vírus ao longo do

tempo havendo surgimento do anticorpo contra uma glicoproteína do envelope

viral, o anti-E2

Trata-se de um vírus linfotrópico, que se replica primariamente em células

mononucleares do sangue periférico (PBMC) incluindo linfócitos T CD4 e

linfócitos B, medula óssea e baço, sendo a replicação hepática menos importante

10,11

. De fato, a demonstração de que o GBV-C não sofre replicação

primariamente no fígado foi feita em um estudo realizado em chimpanzés após

inoculação endovenosa do vírus e não se encontrando qualquer manifestação de

doença hepática

. Apesar da presença do GBV-C em hepatócitos a análise

histológica do fígado com o vírus mostrou-se normal na maioria dos indivíduos

estudados

Uma vez que, provavelmente, não exista nenhuma associação entre o

GBV-C e qualquer doença identificada até o momento, o mesmo tem sido

considerado um vírus humano não patogênico. Esse vírus não é identificado mais

frequentemente em hepatites criptogências ou em hepatites pós-transfusionais

não-A, não-E

14,15,16,17,18

. Tampouco os níveis de transaminases se correlacionam

com a viremia pelo GBV-C em doadores e receptores de sangue, pacientes em

diálise, hemofílicos e usuários de drogas

. Não foi encontrada associação entre

o GBV-C e hepatite fulminante

16,17,18

ou entre viremia pelo GBV-C e cirrose com

insuficiência hepática terminal

. Sabe-se ainda que o GBV-C não influencia a

gravidade da hepatite pós-transplante ou a sobrevida do enxerto

14,15,20,21,22

Outros estudos não lograram êxito em demonstrar qualquer associação entre o

GBV-C e carcinoma hepatocelular, linfoma não-Hodgkin

23,24

, porfiria cutânea

tarda

, líquen plano oral, crioglobulinemia, doença de Sjögren

ou carcinoma

oral

A co-infecção do VHC parece ser mais comum que a do VHB

provavelmente por ser a via de transmissão parenteral mais importante na

aquisição da hepatite C. Estudos demonstram que a prevalência da viremia do

GBV-C em indivíduos co-infectados VHC é de aproximadamente 20 a 30%

A presença do GBV-C parece não alterar o curso da evolução de uma

infecção pelo vírus da hepatite C (VHC) e da hepatite B (VHB)

, ou seja,

provavelmente, não existe relação de um pior desfecho ou maior risco de

desenvolvimento de doença crônica na co-infecção do GBV-C/HBV e ou GBV-

C/VHC. Entretanto, no que se refere à co-infecção GBV-C/VHC, o

desenvolvimento de CHC tem sido investigado e os resultados dos estudos

publicados ainda são conflitantes

29,30,31,32,33,34

. Lightfoot e colaboradores

compararam a frequência do GBV-C RNA entre pacientes sabidamente VHC

positivos negros sul-africanos com CHC e grupo sem o câncer e não

demonstraram diferença estatisticamente significante entre os mesmos quanto ao

maior risco desse câncer. Com resultados semelhantes, um estudo brasileiro

realizado por Strauss e colaboradores

e outro por Leão-Filho e colaboradores

concluíram que a co-infecção GBV-C/VHC não induziu o surgimento de lesão

hepática mais grave, favorecendo a hipótese de que o GBV-C não pareça ser um

fator relevante na etiologia do CHC. Em contrapartida, Tagger e colaboradores

estudando 170 pacientes com hepatite C crônica e CHC e 306 pacientes no

grupo controle (hepatite C crônica e sem CHC) observaram um risco relativo 7,3

vezes maior de detecção do GBV-C RNA em pacientes com o diagnóstico de

CHC. Moriyama e colaboradores

concluíram que a co-infecção pelo GBV-C

não altera o perfil sorológico da hepatite C crônica entretanto, os resultados

demonstraram que a presença do GBV-C esteve associada a piora dos

parâmetros histopalógicos nos indivíduos com hepatite C crônica, sugerindo que

o GBV-C possa ser um risco para o desenvolvimento de CHC nessa população.

Resultados semelhantes foram reportados por Yuan e colaboradores

que

estudaram 144 pacientes com hepatite C crônica e CHC e 252 pacientes no

grupo controle (hepatite C crônica e sem CHC), observando uma chance 5,4

vezes maior da presença da infecção pelo GBV-C RNA entre os pacientes com

CHC.

Assim diante de todos os resultados conflitantes a cerca da real

patogenicidade desse vírus, tem sido consenso na literatura que o GBV-C muito

provavelmente não seja um organismo virulento, não causa doença hepática ou

piora uma doença hepática já instalada e que, nem mesmo, tem o fígado o sítio

primário de infecção

. A maioria dos pacientes com a infecção apresenta o

GBV-C RNA detectado por longo período, mas nenhum deles apresentará

marcadores bioquímicos de hepatite crônica

. Em conclusão, nem a replicação

no fígado nem a associação com hepatite (ou outra doença associada) têm sido

convincentemente definidas na infecção pelo vírus GBV-C

. A Figura 1

confronta algumas conclusões de estudos já publicados que demonstram haver

ou não um hepatotropismo do GBV-C

Fig 1: Hepatotropismo do GBV-C

Hepatotropismo

Não hepatotropismo

Detecção do GBV

C RNA no soro de

pacientes com hepatite aguda não- A não-

Igual detecção da taxa de GBV

C RNA

em doadores com enzima alanina

aminotransferase normal ou elevada

(1,7% e 1,5%, respectivamente)

Modelo histológico de hepatite na

infecção pelo GBV-C

Valores normais das aminotransferases

na presença do GBV-C RNA

Detecção do GBV

C RNA e antígeno NS5

no tecido hepático

Nenhuma correlação entre o nível do

GBV-C RNA e da enzima alanina

aminotransferase

Redução significativa do nível sérico do

GBV-C RNA após transplante hepático

Nível do GBV

C RNA no tecido hepático

menor que no sangue

Fonte: Adaptado Reshetnyak e colaboradores

. World J Gastroenterol. 2008; 14(30): 4725-

Em função dessa falta de relação causa-efeito GBV-C e hepatite, há uma

tendência na literatura em abolir a nomenclatura “vírus da hepatite G” (HGV) e

manter apenas “vírus GB-C” (GBV-C)

. Também por isso, a agência americana

FDA (Food and Drugs Administration) nunca estabeleceu triagem para estes

vírus em doadores de sangue dos EUA

sendo que, aproximadamente uma em

70 unidades de hemoderivados nos Estados Unidos, contém o RNA do vírus

GBV-C

Compreensivelmente, o interesse pelo GBV-C diminuiu após os primeiros

anos de sua descoberta, uma vez que ele não parecia ter maior impacto clínico

nos diferentes grupos de pacientes. Um trabalho brasileiro visando o estudo da

prevalência do GBV-C RNA em 200 amostras de doadores sadios de bancos de

sangue em São Paulo ressalta a possibilidade de que a alta prevalência desse

vírus nessa população (18 doadores GBV-C RNA positivos, prevalência de 9%),

possa contribuir para a hipótese de que o GBV-C seja um agente viral benigno

Além disso, as taxas de prevalência do vírus descritas em pacientes sadios

levantavam questões não só quanto à significância clínica do GBV-C, mas

também quanto a outras possíveis rotas de transmissão - tais como a sexual e

vertical – como importantes para a ampla distribuição do vírus

. Ainda no que se

refere à prevalência desse vírus, sabe-se que apesar da viremia poder persistir

positiva por até 16 anos em indivíduos saudáveis, parece que grande parte

dessas infecções agudas são clareadas, com a produção de um anticorpo

neutralizante detectado no plasma. Desta forma, a infecção pelo GBV-C pode ser

mais comum do que sugerem os estudos de prevalência baseados apenas na

detecção do RNA do vírus

35,39

Entretanto, o mundo voltou sua atenção novamente para este vírus a partir

de 1998, quando estudos de Toyoda e Heringlake propuseram que a interação

entre o HIV e o GBV-C seria benéfica a ponto de retardar a progressão da

infecção pelo HIV para aids

40,41

Posteriormente outras publicações

42,43,44,45,46,47,48

, demonstraram que os

indivíduos infectados pelo HIV e co-infectados pelo GBV-C, apresentaram queda

da mortalidade ou melhora nas condições clínicas (como maior nível de linfócitos

T CD4 e menor uso de antirretrovirais, por exemplo).

De fato, alguns estudos epidemiológicos sugerem fortemente uma

associação entre a infecção pelo GBV-C e o prolongamento da sobrevida em

indivíduos com o HIV

10,49

, não estando, contudo, comprovada a existência de

causalidade entre estes dois eventos

50,51

De qualquer forma, pelo fato do GBV-C e o HIV se replicarem em células

linfócitos T CD4+ é razoável especular que uma interferência viral entre esses

dois vírus possa ocorrer

2 - Epidemiologia da infecção pelo GBV-C

Dados epidemiológicos indicam que o GBV-C é altamente prevalente em

populações de todo o mundo. Essa prevalência é estimada em 1 a 4% na Europa

e América do Norte e 8 a 15% na América do Sul, África e Ásia

13,26,52,62

A Figura 2 mostra as taxas de prevalência do GBV-C em doadores de

sangue de diversas regiões do mundo. O mapa representa as taxas de

prevalência do GBV-C em 11.391 doadores de sangue compilados de 50 estudos

publicados. A detecção do GBV-C foi realizada através do método da reação em

cadeia da polimerase (PCR). Nota-se que em países desenvolvidos, a

prevalência do GBV-C entre doadores de sangue variou de 0,5% a 5%, e nos em

desenvolvimento, de 5% a 18,9%

Fig 2: Prevalência do GBV-C em doadores de sangue de diversas regiões do

mundo

Fonte: Stapleton e colaboradores

. Journal of Viral Hepatitis. 2009; 16: 757-768

A análise filogenética de sequências genômicas do GBV-C isoladas de

amostras obtidas em diversas regiões revelaram a existência de seis genótipos

principais com 12% de divergência genômica entre eles e estreitamente

relacionados com a região geográfica, sugerindo que o GBV-C é um vírus antigo,

que acompanhou as migrações populacionais ao longo do tempo

. O genótipo 1,

com os subtipos 1a e 1b, é predominante na África Ocidental; o genótipo 2, com

os subtipos 2a e 2b, na Europa e EUA; o genótipo 3 na Ásia, o genótipo 4 no

Sudeste Asiático, o genótipo 5 na África do Sul e o novo genótipo 6 na Indonésia

A prevalência de viremia pelo GBV-C/HGV no Brasil entre doadores de

sangue e voluntários sadios está situada entre 5% a 10%. O estudo de Levi e

colaboradores, publicado em 2003, revelou prevalência de 9,7% de positividade

para o GBV-C RNA entre 545 doadores de sangue de São Paulo

Uma pesquisa conduzida pelo grupo de Ribeiro-dos-Santos em São Paulo,

publicada em 2002, demonstrou uma prevalência de 5,1% de GVB-C/HGV entre

1.039 amostras de indivíduos sadios maiores de dois anos

. No mesmo ano,

Oliveira e colaboradores

demonstraram uma frequência de viremia pelo GBV-

C/HGV de 7,1% entre 241 indivíduos doadores voluntários da região central do

Brasil, ou seja, uma endemicidade intermediária da infecção, sendo a via de

transmissão parenteral presente em cerca de 1/3 dos casos e com maior

freqüência entre doadores na quarta década de vida. Nesse estudo, os

pesquisadores determinaram, ainda, o genótipo do GBV-C dos 17 pacientes

GBV-C RNA positivos. Foi encontrado três (17,6%) pacientes com genótipo 1 e

14 pacientes (82,4%) com o genótipo 2. Desses, quatro eram pertencentes ao

subtipo 2a e 10 ao subtipo 2b. O trabalho conclui que no Brasil, há circulação

simultânea dos genótipos 1 e 2 com maior prevalência do subtipo 2b do GBV-C

57.

Outro trabalho publicado por Nishiya e colaboradores

estudaram a

distribuição genotípica do GBV-C em 24 pacientes residentes em São Paulo por

meio de uma análise filogenética de sequenciamento do fragmento de 728 pares

de base da região 5” não-codificadora (5’NCR) do genoma viral sendo

identificados os genótipos 1, 2a e 2b nas respectivas freqüências: 8,3% (2/24),

50% (12/24) e 41,7% (10/24).

No que se refere à co-infecção GBV-C e HIV, parece que a aquisição do

GBV-C usualmente precede a infecção pelo o HIV sendo, infrequentemente,

adquirida depois que a infecção pelo HIV já se encontra estabelecida

. De

qualquer forma, a taxa de infecção do GBV-C nesse grupo tem se mostrado

extremamente alta, com taxa de até 39% de viremia positiva e 46% anti-E2

positivo em um grupo americano multicêntrico de coorte masculina

No Brasil a prevalência de co-infecção HIV e GBV-C foi estudada por

Souza e colaboradores sendo encontrada uma positividade de 24% para o RNA

do GBV-C em uma coorte de 175 pacientes portadores de HIV em São Paulo

3 - Epidemiologia da infecção pelo HIV

Embora inicialmente vinculado aos homens que fazem sexo com homens

(HSH), particularmente nos países industrializados e na América Latina, o HIV se

disseminou rapidamente entre diversos segmentos da sociedade, alcançando

paulatinamente mulheres, crianças e homens com prática heterossexual

Assim, já no começo da década de 80, a aids atingia inicialmente, e de

forma bastante intensa, os usuários de drogas ilícitas endovenosas, homens que

fazem sexo com homens e os indivíduos que receberam transfusão de sangue e

hemoderivados. Desde então, a epidemiologia da infecção no Brasil vem

sofrendo significativa transformação, caracterizada por “heterossexualização,

feminilização, pauperização e interiorização”, ou seja, tem havido persistente

tendência de crescimento de casos entre heterossexuais, mulheres, populações

menos favorecidas socioeconomicamente e em cidades do interior do país

De fato, o perfil epidemiológico do HIV vem mudando e o número de casos

de portadores desse vírus está aumentando entre os heterossexuais, entre as

mulheres, entre pessoas de baixa renda e saindo de grandes centros para

pequenas cidades. Dados atuais da organização mundial de saúde (OMS)

estimam que aproximadamente 30 milhões de pessoas vivam com a infecção

pelo HIV no mundo. Segundo o último boletim epidemiológico do Ministério da

Saúde, até Junho 2008 foram identificados 506.499 casos de aids no Brasil, com

um total de óbitos acumulados até 2007 de 205.409. O número de casos vem

aumentando no país, principalmente nas regiões Norte, Nordeste e Centro- Oeste,

em especial entre as mulheres

Foram identificados até junho de 2008 um total de 333.485 casos de aids

no sexo masculino e 172.995 no sexo feminino. Observou-se também que a

razão de sexo (M:F) no Brasil diminuiu bastante ao longo do tempo, passando de

15,1: 1 em 1986 para 1,5:1 em 2006

Não resta dúvida de que a epidemia de aids é hoje um grande problema

de saúde pública no Brasil e, embora até a atualidade haja muito mais casos

notificados em indivíduos do sexo masculino, a velocidade de crescimento da

epidemia é, como em outros países, muito maior entre as mulheres do que entre

os homens

Em 1999 e 2000, a aids foi a segunda causa de morte para as mulheres

entre 15 e 49 anos, no Estado de São Paulo, sendo a primeira causa, as doenças

cérebro-vasculares. De fato, o decréscimo da razão masculino/feminino de casos

e de óbitos e o fato da aids figurar entre as principais causas de mortalidade nas

mulheres em idade fértil demonstram, inequivocamente, a magnitude com que a

aids tem atingido nossa população feminina

Em 1996, o Brasil desenvolveu um projeto que dava a todos os portadores

do HIV, acesso ao tratamento ao adotar uma política de distribuição gratuita de

antirretrovirais aos portadores de HIV/aids. A partir deste ano, houve respeitável

redução das complicações decorrentes da infecção pelo HIV e aumento da

expectativa de vida entre os indivíduos infectados. Dados do Ministério da Saúde

informam que o coeficiente de mortalidade deste ano foi de 6,0 óbitos por 100 mil

habitantes

Assim desde 1996, quando a terapia antirretroviral eficaz tornou-se viável,

o prognóstico da infecção pelo HIV tem melhorado e os benefícios clínicos do seu

uso refletem sobremaneira em menor progressão para morte em pacientes

infectados. Vale ressaltar que o início dessa terapia é considerado uma das

estratégias mais importantes no que se refere à mudança da história natural da

progressão da infecção pelo HIV no mundo. No Brasil, um estudo realizado por

Marins e colaboradores mostrou que os pacientes com diagnóstico em 1995

tiveram sobrevida mediana de 16 meses e os de 1996, 58 meses

4 - Vias de transmissão do GBV-C

A ubiquidade da presença do GBV-C pode ser atribuída aos diferentes

modos de transmissão que lhe tem sido associados. A forma de transmissão

mais bem documentada tem sido a via parenteral, especialmente por transfusões

sangüíneas e ou hemoderivados. Devida a eficiente forma de transmissão

parenteral, o vírus possui alta prevalência entre usuários de droga endovenosa,

em poli-transfundidos, hemofílicos e hemodialisados

49,52

A prevalência do GBV-C varia de acordo com a população estudada, mas

é certo que ela tende a ser maior em grupos de risco de transmissão sexual e

parenteral. Em um estudo de indivíduos sadios sem fatores de risco para o GBV-

C e níveis de transaminases normais, a viremia esteve presente em 1,9% casos,

entretanto, o GBV-C RNA foi reportado em 6,8% de pacientes sob hemodiálise,

em 18,2% de pacientes co-infectados com o vírus HIV, em 24,4% dos pacientes

co-infectados com o VHC, em 21,1% entre pacientes com história de múltiplas

transfusões sanguíneas, em 28,8% dos pacientes usuários de droga endovenosa

e em 35,2% de pacientes hemofílicos

A transmissão intra-familial do GBV-C também tem sido relatada e

análises de sequências gênicas sugerem que a transmissão vertical (mãe-filho)

também possa ocorrer

. Em um estudo realizado em crianças com menos de 10

anos de idade no Oeste da África, demonstrou que quase 10 a 15%

apresentavam o GBV-C RNA positivo no plasma

Existem várias evidências demonstrando que o GBV-C é transmitido por

via sexual e percutânea tão bem quanto na transmissão da infecção por HIV,

sendo que o grupo de risco no qual a transmissão é mais importante são os

homens que fazem sexo com homens

. Assim, devido às formas de

transmissão similar do HIV e do GBV-C (sexual, vertical e parenteral) a

prevalência do último entre os pacientes sabidamente HIV positivos é maior que

nos indivíduos negativos para o retrovírus.

Em 2002, Ribeiro-dos-Santos e colaboradores

, estudando a prevalência

da infecção pelo GBV-C e fatores de risco associados em uma população de

1.039 indivíduos residentes em São Paulo, demonstraram que a transmissão da

infecção por via sexual é importante para disseminação do vírus, haja vista haver

um aumento da viremia do GBV-C com a idade, uma maior prevalência da

infecção em grupos sexualmente ativos e, principalmente, por haver uma

associação direta de viremia do GBV-C com certas práticas sexuais de risco

(maior número de parceiros sexuais e homens que fazem sexo com homens).

A transmissão intra-familiar do GBV-C também tem sido descrita e

análises de sequências gênicas sugerem que ambas as formas de transmissão,

vertical e horizontal, podem ocorrer

26,52

5 – Virologia do GBV-C

O GBV é um vírus RNA da família Flaviviridae, com três subtipos

nomeados GBV-A, GBV-B e GBV-C, sendo os dois primeiros capazes de

infectarem somente símios e o GBV-C o homem

3,8

O genoma do GBV-C é composto por RNA de fita simples de polaridade

positiva e cerca de 9.400 nucleotídeos contendo uma única fase aberta de leitura,

ORF (Open Reading Frame) que codifica uma grande poliproteína precursora

(3.000 aminoácidos) que, clivada por peptidases do hospedeiro, dá origem a

duas proteínas do envelope viral: E1 e E2

65,66

. Essa fase aberta de leitura se

localiza entre regiões não traduzidas (UTR) nas extremidades 5’ e 3’ do genoma

viral. Uma característica marcante do GBV-C é a ausência da poliproteína

codificadora do nucleocapsídeo ou core viral

26,67

. Alguns trabalhos especulam se

a ausência desse nucleocapsídeo possa ser o responsável pela menor

patogenicidade desse agente viral.

Estudos do genoma do GBV-C demonstram que a região do envelope viral

codifica duas proteínas estruturais E1 e E2, sendo esta, uma glicoproteína que se

localiza na superfície do vírus. Há ainda produção de duas proteases codificadas

na regiões NS2 e NS3 e uma helicase codificada na região NS3 do genoma viral

13,67

Baseado em comparações da organização e de sequências homólogas do

genoma viral, o GBV-C é o vírus humano mais relacionado com o VHC, outro

membro da família Flaviviridae, existindo uma homologia de cerca de 30% dos

aminoácidos entre o genoma desses dois vírus

5,26,68

. As similaridades entre os

dois vírus geralmente são limitadas às regiões gênicas específicas NS3 e NS5B,

havendo pouca ou nenhuma semelhança em porções gênicas que codificam

proteínas do envelope viral, E1 e E2

O esquema comparativo da organização do genoma do GBV-C e VHC,

assim como as diferenças potenciais e as várias funções dos genes são

mostradas na Figura 3.

Outra característica interessante do vírus GBV-C é a de apresentar pouca

variabilidade em genes que codificam certas glicoproteínas do envelope,

diferente do que ocorre com outros dois vírus RNA, HIV e VHC, em que tal

variabilidade está relacionada com mecanismos de persistência viral

Fig 3: Esquema comparativo da organização do genoma do GBV-C e VHC

mostrando as fases de leitura abertas e as regiões 5’e 3’UTR

Fonte: Barzsenyi e colaboradores

26.

Journal of Clinical Virology. 2005; 33: 257-266

6 – Diagnóstico laboratorial da infecção pelo GBV-C

Inúmeras pesquisas que visaram o encontro de um marcador sorológico

do GBV-C focaram regiões de homologia com o VHC. Para este, um dos mais

importantes marcadores sorológicos envolve a proteína do core. Entretanto, no

GBV-C essa proteína está ausente ou truncada, o que explica em parte a grande

dificuldade de desenvolver marcadores sorológicos sensíveis e específicos para

o mesmo

. Para detecção molecular do vírus são utilizados rotineiramente

“primers” alvos de uma região muito conservada do genoma do GBV-C, a 5’ não

codificadora.

A detecção do RNA do GBV-C no sangue é indicativa de viremia positiva,

ou seja, de infecção viral ativa. Já a detecção do anticorpo da glicoproteína do

envelope viral, o anti-E2, indica soroconversão, estando, portanto, usualmente

associada à infecção pregressa

. Assim, em estudos que objetivem determinar a

exposição de uma população ao GBV-C, tanto a detecção do RNA do GBV-C

como do anticorpo anti-E2 devem ser realizadas

Apesar de a viremia do GBV-C poder persistir por muitos anos, 60 a 70%

dos indivíduos imunocompetentes evoluem com clareamento espontâneo do

vírus com concomitante desenvolvimento do anticorpo anti-E2

13,35,71

Especificamente, a relação entre a detecção do anticorpo anti-E2 e a viremia do

GBV-C em doadores de sangue imunocompetentes é de 6:1

. Sabe-se que, a

maioria das pessoas depura o vírus e desenvolve anticorpos, sugerindo

fortemente que a resposta imunológica humoral contra a glicoproteína E2 está

associada ao controle da viremia. Esse anticorpo é detectado nos ensaios

imunoenzimáticos (p.ex.: ELISA), utilizados para o diagnóstico sorológico da

infecção pregressa pelo

GBV-C.

Em 1997, um estudo realizado por Thomas e colaboradores

, comprovou

que a detecção do anti-E2 pode ser definidora não só de clareamento do vírus

GBV-C, mas também um marcador de resistência a re-infecções. Ou seja, os

anticorpos anti-E2, uma vez formados, parecem neutralizar a infectividade do

GBV-C sugerindo que, uma nova infecção deva ser um evento muito raro

Portanto, indivíduos virêmicos para o GBV-C usualmente não apresentam

coexistência de anticorpos anti-E2. Em estudos longitudinais envolvendo

indivíduos imunocompetentes, o aparecimento desse anticorpo esteve

temporalmente relacionado com a perda do RNA do GBV-C no soro, e a

concomitância de viremia e de anti-E2 esteve presente em menos de 1% dos

casos estudados. Assim, parece que a presença do anti-E2 pode neutralizar a

infectividade do GBV-C, com consequente clareamento da viremia

Entretanto, a taxa de clareamento espontâneo do GBV-C RNA e

consequente produção do anti-E2 em co-infectados HIV/GBV-C ocorre em menor

proporção do que em indivíduos imunocompetentes

. Entre os indivíduos

infectados pelo HIV, a relação entre a detecção do anticorpo anti-E2 e a viremia

do GBV-C é geralmente menor que 2:1, sugerindo que o clareamento da viremia

do GBV-C é reduzida em indivíduos com déficit da imunidade celular

. Além

disso, é sabido que o anticorpo pode não ser mais detectado no plasma ao longo

do tempo em 5% e 29% dos casos de pacientes HIV negativos e positivos,

respectivamente

. Rey e colaboradores sugeriram que o déficit imune resultante

da infecção por HIV poderia induzir a essa perda específica de anticorpos anti-E2

Em alguns casos, o GBV-C RNA pode desaparecer sem haver

desenvolvimento concomitante do anticorpo anti-E2 por mecanismo ainda não

explicado

60,26

. Stapleton em trabalho publicado em 2003 ressaltou ainda a

possibilidade de a taxa de depuração espontânea do GBV-C RNA e o

aparecimento de anticorpos anti-E2 em pacientes co-infectados GBV-C/HIV

acontecer de forma mais lenta do que em indivíduos não infectados pelo HIV,

bem como a possibilidade de haver depuração da viremia sem o

desenvolvimento de anticorpos anti-E2 nesses pacientes

7 - A interação GBV - C e HIV

Em 1998, Toyoda e colaboradores

, ao estudarem a infecção pelo GBV-

C em pacientes hemofílicos infectados pelo HIV no Japão, notaram que os co-

infectados (27%) apresentavam cargas virais menores de HIV, embora não

houvesse diferença na progressão para aids e mortalidade entre os dois grupos.

No mesmo ano, o grupo de Heringlake

demonstrou que entre 197

alemães portadores de HIV, aqueles com viremia pelo GBV-C, cerca de 17% da

amostra, tinham contagens de linfócitos T CD4 significativamente maiores,

progressão para aids mais lenta e melhora da sobrevida.

No ano seguinte, Sabin e colaboradores

relataram que a mortalidade de

94 ingleses hemofílicos infectados pelo HIV não foi influenciada pelo GBV-C,

sugerindo que não havia efeito da infecção por este vírus na mortalidade

relacionada ao HIV. Porém nesse estudo, os autores não fizeram distinção entre

os pacientes com viremia pelo GBV-C e aqueles com apenas anticorpos anti-E2,

considerando todos como expostos ao vírus GBV-C.

Ainda em 1999, a equipe de Lefrève

publicou trabalho que confirmou os

achados de Toyoda e Heringlake. Amostras de sangue de 97 franceses

portadores de HIV acompanhados por cinco anos foram analisadas para a

presença de GBV-C RNA. Nesse trabalho, o grupo GBV-C RNA positivo

apresentou contagens de linfócitos T CD4 maiores, menor progressão para aids e

melhora da sobrevida. Além disso, um menor número de pacientes do grupo com

viremia positiva necessitou iniciar a terapia anti-retroviral: 39%, comparados a

68% do grupo mono-infectado pelo HIV.

Tillmann e colaboradores

em 2001

demonstraram em uma análise

restrita ao período de pós-tratamento para o HIV, ou seja, após os pacientes já

terem desenvolvido aids e estarem sob terapia antirretroviral, que a viremia pelo

GBV-C permaneceu como fator preditivo de maior sobrevida. Neste estudo 197

pacientes foram acompanhados prospectivamente e os autores se propuseram a

avaliar a hipótese de que se a viremia pelo GBV-C induz a um efeito benéfico na

infecção pelo HIV, então a carga viral do GBV-C deveria associar-se a um

aumento da contagem de linfócitos TCD4 ou a uma redução da carga viral do HIV.

Os autores demonstram que a carga viral do HIV foi menor nos pacientes

virêmicos para o GBV-C e que houve, ainda, uma correlação inversa entre a

carga viral do GBV-C e a do HIV. O estudo, contudo, não demonstrou nenhuma

correlação entre a viremia do GBV-C e a contagem de linfócitos T CD4.

Nunnari e colaboradores

não só conseguiram provar que a viremia do

GBV-C esteve associada à maior sobrevida mesmo após a introdução do HAART,

mas também foram capazes de demonstrar que a co-infecção GBV-C/HIV

melhorou a eficácia e aumentou a taxa de resposta à terapia antirretroviral.

Em 2003, Polgreen e colaboradores

publicaram um estudo que

envolveu 362 indivíduos infectados pelo HIV, em diversas faixas etárias, de

ambos os sexos e sob vários fatores de risco de exposição ao GBV-C e HIV.

Encontraram viremia pelo GBV-C em 39,8%, sendo que não houve diferença

estatisticamente significativa entre a contagem de linfócitos T CD4 basal dos

grupos positivo e negativo para o GBV-C. Porém, após análise pela regressão de

Cox, foi encontrada mortalidade expressivamente maior no grupo negativo para o

vírus GBV-C (Risco Relativo de 3.7 IC95% de 2.5-5.4), mesmo quando a análise

foi corrigida para o uso de terapia antirretroviral.

Em 2004, Williams e colaboradores

demonstraram que a infecção pelo

GBV-C não exerce efeito protetor logo após os primeiros 12 a 18 meses da

soroconversão para o HIV. Entretanto, identificaram uma sobrevida

significativamente maior no grupo co-infectado após cinco a seis anos de história

de infecção por HIV e que o fim da viremia pelo GBV-C afetava adversamente o

curso da infecção pelo HIV. Os autores concluíram que a dependência do tempo

de infecção pelo HIV pode explicar os resultados contraditórios de outros estudos

quanto ao efeito protetor do GBV-C. Vale ressaltar que nessa coorte os autores

tiveram cuidado de excluir o fator de confusão relacionado ao uso de terapia

antirretroviral potente, amplamente disponível para uso a partir de 1996, ao

inserir na análise somente dados laboratoriais de contagem de linfócitos TCD4 e

carga viral do HIV coletados antes desta data. Assim, fica a dúvida se estas

conclusões são válidas para a era pós-HAART.

Nesse mesmo ano, um estudo retrospectivo em uma coorte de pacientes

que respondeu questionários sobre a qualidade de vida, observou-se que

pacientes infectados por HIV e GBV-C apresentaram uma melhor qualidade de

vida quando comparados com os GBV-C negativos, indicando um curso clínico

da infecção por HIV mais favorável nos pacientes co-infectados

Ao mesmo tempo em que vários estudos científicos sugeriram uma relação

benéfica na interação entre este dois vírus, outros não demonstraram nenhum

efeito protetor.

Brumme e colaboradores

em estudo retrospectivo com 441 pacientes

que visava avaliar a influência da viremia do GBV-C na resposta terapêutica

antirretroviral, não encontraram nenhuma associação benéfica entre GBV-C e

HIV no que se refere aos desfechos clínicos analisados: sucesso ou falha

virológica, falha imunológica ou mortalidade. Vale ressaltar que esse estudo foi

feito baseado apenas na detecção do RNA do GBV-C, ou seja, não considerou

os pacientes que eram anti-E2 positivo.

Do mesmo modo, ou seja, baseado apenas na detecção do RNA do GBV-

C, não foi observada nenhuma influência clínica ou imunológica atribuída ao

GBV-C em um estudo prospectivo envolvendo 157 indivíduos co-infectados

seguidos por uma mediana de tempo de sete anos. Nesse estudo foi encontrado

uma prevalência do GBV-C RNA de 23% (36 pacientes) e nenhuma associação

significativa entre os grupos de pacientes GBV-C RNA positivos e negativos no

que se refere ao primeiro CD4 basal menor que 200 células/mm

(p=0,9), tempo

de diagnóstico de aids (p=0,4) e tempo de morte relacionada a aids (p=0,6)

Souza e colaboradores

analisaram a influência do GBV-C após a

introdução da terapia antirretroviral em amostras de sangue colhidas de 175

pacientes brasileiros que participaram de um estudo prospectivo randomizado. A

viremia pelo GBV-C esteve associada a uma redução de 0,48 log

cópias/mL

maior da carga viral do HIV nas semanas 24, 32 e 48 semanas após o início da

terapia quando comparado aos pacientes negativos para o GBV-C (p=0,009).

Com relação à contagem de linfócitos TCD4, os pacientes virêmicos

apresentaram aumento dos valores dos mesmos quando comparados aos

pacientes não virêmicos, porém não houve diferença estatística significativa

desses valores quando ajustados pela carga viral basal do HIV, terapia

antirretroviral e idade (p=0,70).

Os mecanismos que explicariam o efeito protetor do GBV-C ainda não

foram totalmente esclarecidos e há várias controvérsias em relação às interações

entre GBV-C e HIV in vivo.

As hipóteses que tentam explicar os mecanismos pelos quais o GBV-C

interferiria na progressão da infecção pelo HIV especulam sobre um efeito

inibitório direto do GBV-C na replicação do HIV

11,46,74,75

ou um efeito

potencializador do GBV-C na resposta imunológica ao HIV

47,75

ou ainda que o

GBV-C seja simplesmente um marcador de outro fator não identificado

75,76

O impacto favorável da replicação do GBV-C foi demonstrado a partir de

resultados de estudos in vitro indicando um menor nível de replicação do HIV-1

em culturas de células linfócitos T CD4+ co-infectadas com o GBV-C, e pela

evidência de que a replicação do GBV-C induziria a produção de quimiocitocinas

que levariam a redução de receptores para HIV-1 na superfície dessas células

46,77

A teoria do efeito inibitório direto do GBV-C sobre o HIV leva em conta que

ambos os vírus replicam-se nas células mononucleares do sangue periférico,

inclusive em linfócitos T CD4, T CD8 e linfócitos B

11,76

. A co-infecção dessas

células pelo GBV-C poderia afetar vários estágios do ciclo de vida do HIV,

incluindo a ligação e fusão às células-alvo, transcrição reversa, integração ao

genoma da célula hospedeira, produção do pró-vírus, transcrição e morfogênese

viral, diminuindo a replicação do HIV sem aumentar a toxicidade celular

74,46

Outra possibilidade seria considerar uma série de interações que envolvam

o CCR5, fator importante na transmissão do HIV e progressão da infecção.

Certas cepas do HIV (R5) utilizam o receptor CCR5 para entrar na célula,

enquanto outras cepas usam o co-receptor CXCR4 (X4). Em um estudo in vitro

realizado por Xiang e colaboradores

, a infecção de células mononucleares de

sangue periférico com o GBV-C produziu diminuição da replicação de cepas

isoladas de HIV que usaram CCR5 ou CXCR4 como receptores de entrada

celular. Foi demonstrado que o GBV-C induziu a secreção de citocinas que

levaram a uma diminuição da expressão desses co-receptores. Essas citocinas

implicadas e evidenciadas pelos seus altos níveis de mRNA, incluem RANTES,

MIP-1α α, MIP-1β, ligantes naturais do CCR5 e o SDF-1, único ligante do CXCR4

conhecido.

No que se refere à importância da resposta celular na progressão da

infecção pelo HIV, é sabido que a presença de linfócitos T auxiliares capazes de

produzir um padrão de citocinas de resposta Th1 (IL-2, IL-12 e INFγ) em

detrimento ao padrão Th2 (IL-4 e IL-10) é fundamental para melhor evolução da

infecção. Nunnari e colaboradores

demonstraram que na co-infecção GBV-

C/HIV a resposta imune celular de padrão Th1 revelou-se preservada, com níveis

estáveis de citocinas características deste padrão quando comparado aos

pacientes somente infectados pelo HIV. De fato, nesse estudo, os indivíduos

GBV-C RNA positivos apresentaram níveis de interleucinas IL-2, IL-12, IL-4 e IL-

10 mais estáveis ao longo do seguimento, ao passo que, os indivíduos GBV-C

RNA negativos apresentaram diminuição dos níveis de IL-2 e IL-12 e aumento de

IL-4 e IL-10. Assim, o GBV-C pode ajudar a manter o perfil de citocinas

associadas à progressão lenta para aids.

Estudos recentes têm demonstrado que a glicoproteína E2 do envelope do

GBV-C se liga ao receptor CD81 dos linfócitos T, resultando também em

aumento da secreção da citocina RANTES. Esta citocina induz à internalização

do CCR5 e diminui a expressão do mesmo na superfície celular

78,79,80

Nattermann e colaboradores

demonstraram haver um aumento da citoquina

RANTES e subsequente redução da expressão do co-receptor CCR5 em

linfócitos T CD4 e CD8 de pacientes GBV-C RNA positivo independente da co-

infeção pelo HIV. Neste mesmo trabalho, os autores confirmaram, em parte, os

resultados encontrados por Xiang e colaboradores

que demonstraram ser o

GBV-C capaz de mediar supressão do HIV por induzir a redução do co-receptor

CCR5 e por aumentar a expressão das citocinas RANTES, MIP-1α, MIP-1β e

SDF-1

Assim, um potencial mecanismo que explica o efeito protetor do GBV-C

em co-infectados seria o de induzir uma diminuição da expressão do

quimioreceptor 5 (CCR5) em células infectadas por esse vírus. Sendo este um

co-receptor também importante para entrada do HIV na célula, o GBV-C estaria

influenciando na transmissão do HIV-1 e conseqüente progressão da

imunodeficiência

Já o efeito indireto do GBV-C sobre a progressão do HIV através da

melhora da resposta imunológica seria explicado por uma reação cruzada T

citotóxica. A infecção estabelecida pelo GBV-C levaria a uma resposta T

citotóxica mais intensa contra o HIV, com maior controle sobre a replicação da

infecção mais recente. Com efeito, nota-se que os indivíduos com melhor

resposta T citotóxica direta contra o HIV são geralmente progressores mais

lentos

Um recente estudo brasileiro, publicado em 2009 por Giret e colaboradores

, estudou em 48 pacientes recém infectados pelo HIV, o efeito da viremia pelo

GBV-C na ativação das células T na infecção recente pelo HIV. Os autores não

somente confirmaram a correlação positiva entre a carga viral do HIV-1 e a

porcentagem de células T CD8+CD38+, como também observaram que a viremia

pelo GBV-C esteve associada a uma diminuição da expressão de CD38 nas

células T CD4+ e TCD8+ e CCR5 nas células T CD8+, independentemente da

carga viral do HIV-1, contagem de células T CD4+ e células T CD8+. Os autores

concluem que essa associação entre a replicação do GBV-C e a menor ativação

celular poderiam constituir um dos mecanismos chaves envolvidos na proteção

conferida por esse vírus na progressão para imunodeficiência nos pacientes

infectados pelo HIV.

A Figura 4 é um resumo dos mecanismos propostos para explicar a

interação entre os dois vírus

Fig 4: Mecanismos propostos para explicar a ação do GBV-

C nos pacientes

coinfectados com HIV

Fonte: Adaptado Barzsenyi e colaboradores

. Journal of Clinical Virology. 2005; 33: 257-266

Justificativa

Considerando os resultados da interação entre o GBV-C e HIV ainda

conflitantes na literatura, o presente estudo foi proposto para estudar o efeito da

interação desses dois vírus em uma coorte exclusivamente feminina de pacientes

sabidamente HIV positivas, e, através do desenvolvimento de uma técnica de

PCR em tempo real de detecção quantitativa do RNA do GBV-C, fornecer

informações mais completas e especificas quanto ao comportamento da carga

viral de ambos os vírus na co-infecção.

Vários estudos publicados na literatura têm fornecido evidências científicas

da participação do GBV-C como fator independente associado à melhor

progressão para doença pelo HIV. Os mecanismos envolvidos na interação

destes dois vírus ainda não são bem conhecidos, mas o que se tem observado é

uma melhora do nível de linfócitos T CD4, maior redução da carga viral do HIV

com conseqüente melhora na sobrevida para aids na evolução desses doentes.

Em adição, dado o número limitado de estudos epidemiológicos da co-

infecção GBV-C e HIV no Brasil, surgiu nosso interesse em determinar a

prevalência do GBV-C numa coorte de indivíduos sabidamente infectados pelo

HIV.

Objetivos

• Avaliar a prevalência da viremia (qualitativa e quantitativa) e de anticorpos

contra a glicoproteína E2 do envelope do GBV-C em amostras de plasma das

pacientes femininas com infecção pelo HIV, obtidas entre 1997 e 1999.

• Analisar a evolução para óbito relacionado à aids, através de curva de

sobrevida estratificada pelos marcadores GBV-C RNA e anti-E2, em todas as

pacientes acompanhadas.

• Comparar a média e mediana de linfócitos TCD4+ e de carga viral do HIV das

pacientes classificadas de acordo com a presença de GBV-C RNA e anti-E2,

investigando a correlação da viremia do GBV-C com esses marcadores

evolutivos da infecção por HIV.

• Avaliar descritivamente a persistência viral e a re-exposição ao GBV-C em

nova coleta realizada entre 2006 e 2008 em 57 do total de pacientes

participantes do estudo.

Casuística e Métodos

• Desenho do estudo

Foram realizados dois estudos observacionais: um estudo de coorte

retrospectiva e um estudo transversal de soroconversão em 57 pacientes.

O primeiro tratou-se de um estudo descritivo do tipo coorte retrospectivo

de início definido pela data da detecção de marcadores do GBV-C pelos métodos

da PCR e de anti-E2 em amostras de sangue estocadas entre o período de 1997-

1999. O estudo contou com a participação de 248 pacientes femininas

sabidamente portadoras da infecção pelo HIV seguidas por um período de cerca

de 10 anos, tendo como término de acompanhamento a data limite de 01/01/2008,

ou a data da última consulta no ambulatório ou a data do óbito.

O segundo estudo foi do tipo transversal em que as medições foram feitas

em uma única ocasião, entre 2006 a 2008, e sem um período de

acompanhamento. Foi selecionada uma amostra de 57 pacientes da população e

analisado a distribuição de algumas variáveis.

• Característica da população do estudo e casuística

As amostras de plasma foram coletadas de 265 mulheres durante a

execução do projeto de estudo da infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV)

em pacientes HIV positivas, realizado anteriormente no Laboratório de Virologia

do Instituto de Medicina Tropical (LIM 52 – HCFMUSP)

A coleta das amostras das pacientes foi realizada entre Novembro 1997 a

Setembro 1999 no Instituto de Infectologia Emílio Ribas e no Serviço de Extensão

ao Atendimento de pacientes HIV/Aids – SEAP, da Divisão de Moléstias

Infecciosas e Parasitárias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da

USP e armazenadas a -70 ºC desde então.

Dessa soroteca foram utilizadas 248 amostras disponíveis em quantidade

suficiente para realização dos ensaios de determinação do RNA e do anticorpo

contra a glicoproteína E2 do GBV-C.

Entre 1997 a 1999, todas as 265 pacientes do estudo já apresentavam o

diagnóstico definido de infecção pelo HIV pelo exame sorológico de Elisa e

confirmados por Western Blot.

A partir da data da primeira coleta de sangue das 248 pacientes foi

possível a determinação do perfil do GBV-C e conseqüente estratificação das

pacientes em grupos: pacientes com infecção ativa ou sorologia positiva para o

GBV-C e pacientes que não haviam sido expostas ao vírus. Essas pacientes

foram acompanhadas até um de três desfechos pré-determinados: data limite do

seguimento do estudo (01/01/2008) ou data da última consulta no ambulatório de

suas respectivas instituições de acompanhamento ou a data do óbito.

No período de 2006 a 2008, todas as pacientes que mantinham o

acompanhamento ambulatorial foram convocadas por telefone pelo médico

pesquisador a comparecer às suas respectivas instituições com intuito de

informar sobre a pesquisa e aplicar o Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido. Feito isso, eram realizadas novas coletas de sangue e enviado o

material ao Laboratório de Virologia, LIM 52 – HCFMUSP. Apenas cinquenta e

sete das 248 pacientes que iniciaram o estudo estiveram presentes para essa

segunda coleta de sangue com o objetivo de determinar novamente o perfil de

GBV-C.

Foi realizada a coleta de informações da história clínica através de revisão

detalhada do prontuário médico de cada participante em data pré-agendada no

Serviço de Arquivo Médico - SAME das instituições de seguimento por meio de

impresso padronizado (Anexo 1) bem como de exames laboratoriais referentes a

valores de linfócitos TCD4+ e carga viral do HIV-1 usando o programa SISCEL,

Sistema de Informação de Exames Laboratoriais, das respectivas instituições de

acompanhamento.

O diagnóstico das doenças oportunísticas levou em consideração a

presença de exame laboratorial confirmando a presença do agente seja por

sorologia, cultura ou biologia molecular ou por método de imagem sugestivo da

lesão mais associada ao agente infeccioso. Todas estas informações foram

consideradas mediantes o laudo do exame laboratorial no prontuário médico ou

se estavam relatadas na evolução das mesmas pelo médico assistente.

A busca de informações de óbitos das 248 pacientes participantes do

estudo foi feita através de informações extraídas do Programa de Aprimoramento

das Informações de Mortalidade no Município de São Paulo (PRO-AIM) da

Prefeitura do Município de São Paulo. Esse programa consiste em banco de

dados de registro de todos os óbitos no Município de São Paulo. A pesquisa das

pacientes no referido Programa foi realizada introduzindo como comando de

busca o primeiro nome, seguido do último sobrenome e data de nascimento,

delimitando-se o período de 1996 até 2007. Para as pacientes que evoluíram

para óbito, obtiveram-se ainda informações quanto à data e causa do desfecho

(Anexo 2).

• Alocação das pacientes em grupos

A partir das 248 amostras de sangue estocadas da primeira coleta foi

possível dividir as participantes em três grupos assim nomeados, conforme o

resultado laboratorial da pesquisa de anticorpos anti-E2 e GBV-C RNA no plasma.

Em todas as amostras foram pesquisados anticorpos por ELISA e de material

genético do vírus através de PCR, Nested PCR e PCR-RT para o GBV-C.

• Grupo 1: GBV-C RNA+ /anti-E2- → Expostas ou virêmicas

• Grupo 2: GBV-C RNA- /anti-E2+ → Imunes

• Grupo 3: GBV-C RNA- /anti-E2- → Não expostas

Foi realizada novamente a pesquisa de anticorpos contra a glicoproteína

E2 do GBV-C por ELISA, por PCR, por Nested PCR e por PCR- RT em uma

segunda amostra coletada de 57 pacientes participantes da primeira análise que

mantiveram acompanhamento ambulatorial entre o período de 2006 a 2008,

sendo assim agrupadas, levando-se em conta o resultado do perfil do GBV-C já

obtido na primeira coleta:

• Grupo 4: 1ª amostra negativa e 2ª amostra negativa (GBV-C RNA- /anti-

E2 - e GBV-C RNA- /anti-E2 - ): Persistentemente negativas

• Grupo 5: 1ª amostra e 2ª amostra GBV-C RNA positiva (GBV-C RNA+

/anti-E2 - e GBV-C RNA+ /anti-E2 - ): Persistentemente positivas

• Grupo 6: 1ª amostra anti-E2 positiva e 2ª amostra anti-E2 positiva ou

negativa (GBV-C RNA- /anti-E2 + e GBV-C RNA- /anti-E2 + ou - ): Imunes

• Grupo 7: 1ª amostra GBV-C RNA positiva e 2ª amostra GBV-RNA

negativa (GBV-C RNA+ /anti-E2 - e GBV-C RNA- /anti-E2 + ou - ):

Clareadoras

• Grupo 8: 1ª amostra GBV-C RNA negativa e 2ª amostra GBV-C RNA

positiva (GBV-C RNA- /anti-E2 - e GBV-C RNA+ /anti-E2 - ): Infecções

incidentes

• Grupo 9: 1ª amostra GBV-C RNA negativa e 2ª amostra anti-E2 positiva:

(GBV-C RNA- /anti-E2 - e GBV-C RNA- /anti-E2 + ): Soroconversoras

• Testes laboratoriais para determinação da infecção

por GBV-C

1 – Determinação qualitativa de anticorpos anti-E2

Realizamos a importação dos “kits” de detecção de anticorpo específico

anti-E2 por meio de um ensaio imunoenzimático comercial (µPlate antiHGenv

teste, Roche Diagnostics, Penzburg – Alemanha). Estes “kits” foram doados pelo

Dr. Dietmar Zdunek da empresa Roche Diagnostics, Penzburg – Alemanha. A

reação de ELISA foi realizada conforme indicação do fabricante do “kit”.

2– Extração de GBV-C RNA da amostra

Para extração do GBV-C RNA nas amostras de plasma foi realizada

utilizando o “kit” de extração QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen®,Chattlesworth,

EUA). Ao final obteve-se um eluato de GBV-C RNA de 60 µL de cada amostra.

3 – Reação de Transcrição Reversa

Previamente à pesquisa do GBV-C RNA por PCR, realizou-se a etapa de

síntese do cDNA, utilizando o protocolo “in-house” com hexâmeros randômicos

(N6) e a enzima transcriptase reversa de M-MLV (Applied Biosystems®, EUA).

Após sua síntese o cDNA ficou a 4º C no termociclador, sendo removido e

estocado no freezer a -20º C.

4 – Reação da PCR GBV-C convencional

A PCR convencional para detecção de GBV-C RNA nas amostras foi feita

utilizando “primers” previamente publicados, que amplificam uma porção da

região 5 ’NCR por esta ser a parte mais conservada do vírus.

O procedimento partiu de 5 µL de cDNA em uma reação de PCR, usando

o “primer” anti-sense LG1 (5’ CACTGGTCCTTGTCAACTCGC 3’), o “primer”

sense LG2 (5’ CACTGGGTGCAAGCCCCAGAA 3’) e os reagentes como

indicado no Quadro 1.

Quadro 1: Reagentes, volumes e concentrações utilizados na reação da PCR GBV-C

convencional

Reagentes Volume ( µL) [Final]

Tampão de PCR 10X minus Mg 2,5 1x

dNTPs (2,5mM) 2,0 200 µM

MgCl2 (50mM) 1,5 3,0mM

LG 1 (10µM) 0,5 200 ηM

LG 2 (10µM) 0,5 200 ηM

Taq Platinum (5U/ µL) 0,25 1,25U

H2O DEPEC 7,75 -

Glicerol 57% 2,5 5,70%

Cresol Red (1µg/ µL) 2,5 0.1µg/ µL

Volume Final 20,0

cDNA 5,0

Volume de Reação 25 µL

5 – Reação de NESTED PCR GBV-C

A reação de Nested PCR GBV-C foi padronizada utilizando os “primers”

publicados por Andonov

e colaboradores

e realizada em dois tempos.

Para o primeiro tempo utilizamos 5 µL de cDNA que foi submetido a PCR

usando os “primers” G58 sense ( 5’ CAGGGTTGGTAGGTCGTAAATCC 3’ ) e

G75 anti-sense ( 5’ CCTATTGGTCAAGAGAGACAT 3’ ) e para o segundo tempo

utilizamos 2,5 µL do produto da PCR do primeiro tempo que foi amplificado pelos

“primers” G134 sense ( 5’ GGTCAYCYTGGTAGCCACTATAGG 3’ ) e G131 anti-

sense ( 5’ AAGAGAGACATTG WAGGGCGACGT 3’ ) e reagentes nas

concentrações e volumes mostrados no Quadro 2.

Quadro 2: Reagentes, volumes e concentrações utilizados na reação NESTED PCR GBV-C

Reagentes Volume(µL)

[ Final] Reagentes Volume(µL)

[ Final]

1º PCR

2º PCR

Tampão de PCR

10X minus Mg

2,5 1x

Tampão de PCR

10X minus Mg

2,5 1x

dNTPs (2,5mM) 2,0 200µM dNTPs (2,5mM) 2,0 200µ

MgCl2 (50mM) 1,25 2,5mM MgCl2 (50mM) 1,25 2,5m

G58 (10µM) 0,5 200 ηM G134 (10 µM) 0,5 200

ηM

G75 (10µM) 0,5 200 ηM G131 (10 µM) 0,5 200

ηM

Taq Platinum

(5U/µL)

0,25 1,25U Taq Platinum

(5U/µL)

0,25 1,25U

H2O 8,0 H2O 10,5

Glicerol 57% 2,5 Glicerol 57% 2,5

Cresol Red

1µg/µL

2,5 Cresol Red 1µg/µL 2,5

Volume Final 20,0 Volume Final 22,5

cDNA 5,0 1st round 2,5

Volume de

Reação

25,0 Volume de Reação 25,0

6 – Reação da PCR em tempo real para GBV-C

Adicionou-se à mistura o cDNA e a colocou no equipamento de PCR em

tempo real (ABI Prism 7300 – Applied Biosystems). Esse procedimento utilizou o

“primer” sense RTG1 (5’ GTGGTG GATGGGTGATGACA 3’), o “primer” anti-

sense RTG2 ( 5’ GACCCACCTATAGTGGCTACCA 3’ ) e a sonda anti-sense ( 5’

FAM-CCGGGATTTACGACCTACC-NFQ 3’ ), onde FAM é o composto

fluorescente ou “reporter“, e NFQ significa “non-fluorescente quencher”. Quadro 3.

Quadro 3: Reagentes, volumes e concentrações utilizados na PCR em tempo real

Reagente Volume (µl)

TaqMan Universal PCR Master Mix 2X 10,0

20X Assay Mix 1,0

cDNA 9,0

Volume Final 20,0

Conc. Primers 18 µM

Probe Conc. 5µM

7 – Calibração do ensaio e curva – padrão

Para obter dados quantitativos (carga viral) sempre é necessário haver em

cada corrida alguns tubos/poços que contém cDNAs derivados de concentrações

previamente conhecidas de uma amostra-padrão. Estas diluições da amostra-

padrão são colocadas para o “software” de gerenciamento da reação como

controles (Qc) aos quais se atribuí um valor quantitativo em qualquer unidade

estabelecida, cópias/mL, unidades internacionais/mL, genoma-equivalentes/mL

etc. Como não há até este momento, uma padronização quanto ao GBV-C RNA,

optamos por criar um padrão interno do laboratório, para o qual existe material

abundante e que possa ser analisado muitas vezes. Obtivemos uma bolsa de

plasma já previamente determinado por conter GBV-C RNA e estar livre de

outros agentes infecciosos como VHB, VHC e HIV. Esta bolsa de cerca de 350

mL de plasma foi gentilmente doada pelo Banco de Sangue do Hospital Sírio-

Libanês.

Ao chegar ao Laboratório de Virologia do IMT a bolsa foi descongelada e o

plasma imediatamente aliquotado em microtubos contendo 0,5 mL de plasma

cada um. Uma alíquota foi então diluída com plasma normal GBV-C RNA

negativo, de forma a gerar uma curva de titulação, partindo-se do plasma puro

até uma diluição de 1:100.000. Triplicatas de cada ponto (puro-1:5 - 1:10 - 1:100 -

1:1.000 - 1:10.000 - 1:100.000) foram extraídas e processadas conforme descrito

anteriormente. Os cDNAs foram submetidos à reação da PCR em tempo real.

Observamos que até a diluição de 1:10.000 havia uma amplificação consistente e

reprodutível. Determinamos assim a carga viral da bolsa-padrão em unidades-

aleatórias de GBV-C RNA por mililitro de soro. Então, em cada ensaio foram

incluídos como calibradores os cDNAs desta curva, e os valores obtidos das

amostras são expressos em unidades-aleatórias/mL.

8 - Determinação da contagem de carga viral do HIV

A quantificação da carga viral do HIV-1 foi determinada por três testes

diferentes

- bDNA : QUANTIPLEX HIV-1 RNA 3.0 Assay (BAYER DIAGNOSTICS)

- NASBA : NUCLISENS HIV-1 QT (BioMériex)

- RT-PCR : AMPLICOR HIV-1 MONITOR (ROCHE)

Das três metodologias disponíveis, duas fazem a amplificação de forma

direta, amplificando alvo e uma de forma indireta, amplificando sinal.

Comparações estatísticas revelaram estreita correlação (superior a 90%) entre os

três ensaios. A análise da variação intra-teste não revelou diferenças

sistemáticas entre as duplicatas com nenhuma das três metodologias citadas,

sugerindo boa reprodutibilidade das mesmas.

Entretanto, como elas são baseadas em princípios diferentes, sugere-se

que os resultados sejam comparados dentro do mesmo método.

bDNA ( branched DNA)

A tecnologia do branched DNA é um ensaio de hibridação em fase sólida

tipo sanduíche de ácidos nucléicos usando moléculas de DNA ramificadas

(bDNA). A amostra é tratada com reagente de lise e o material nucléico do vírus

liberado é então hibridado em solução usando dois conjuntos de sondas

oligonucleotídeas. Uma das sondas serve como sonda de captura (localizada na

superfície dos poços da placa) que híbrida especificamente com o RNA do HIV e

faz com que o RNA do HIV fique ligado à placa. A segunda sonda serve para

fixar o RNA do HIV à placa e também para hibridar com um outro conjunto de

sondas: pré-amplificadora e amplificadora (bDNA), a essa última se atribui a

função de aumentar o nível de sinal da hibridação. As moléculas de bDNA atuam

como amplificadoras por se ligar a uma sonda marcada com fosfatase alcalina.

Desta maneira, o sinal gerado pelo complexo HIV RNA-sondas é amplificado

para detecção e quantificação do RNA viral. Finalmente, a adição de um

substrato quimioluminescente reage com a última sonda e o sinal é lido em um

luminômetro. A unidade relativa de luz (RLU) gerada é proporcional à quantidade

de RNA do HIV na amostra. As cópias de RNA do HIV são calculadas usando

uma curva padrão gerada por um conjunto de seis calibradores e três controles

HIV externos. A faixa de detecção de 50 a 500.000 cópias/mL apresenta

linearidade em todo o intervalo.

NASBA – Amplificação baseada na sequência de ácidos

nucleotídeos

A técnica NASBA permite a amplificação isotérmica do RNA do HIV-1 de

filamento simples, utilizando três enzimas: a transcriptase reversa do vírus da

mieloblastose aviária, uma RNAse H, e a RNA polimerase do fago T7. A técnica

permite a obtenção de 10

a 10

cópias em menos de uma hora. Seu limite de

detecção é de 80 cópias do RNA viral por mL de plasma.

RT-PCR – Amplicor

O teste baseia-se em cinco processos principais: preparação da amostra

para extração do material genético do HIV-1; transcrição reversa do RNA – alvo

para produzir DNA complementar (cDNA); amplificação por PCR do cDNA-alvo,

usando iniciadores específicos complementares para o HIV-1; hibridização dos

produtos amplificados com sondas oligonucleotídicas específicas e detecção dos

produtos amplificados e ligados à sonda, por determinação colorimétrica e com

auxílio de um sistema analisador automatizado. Trata-se de metodologia RT-

PCR, que utiliza a região genômica GAG do HIV-1, com faixa de detecção de 400

a 750.000 cópias/mL.

9 - Determinação da contagem de linfócitos T CD4+

A fenotipagem da população linfocitária foi realizada pela técnica de

citometria de fluxo, através do citômetro de fluxo

. Inicialmente, o sangue total

foi incubado com anticorpo monoclonal marcado contra o antígeno CD45 com

intuito de separar a população linfocitária do restante dos leucócitos do sangue

circulante. Em seguida o sangue foi analisado pelo citômetro, que agrupou os

variados tipos de leucócitos em um histograma (“gating” eletrônico). Os linfócitos

assim agrupados (“gated”) foram separados em sub-populações, após incubação

com painel adequado de anticorpos monoclonais marcados.

• Análise dos dados coletados

Os dados coletados foram codificados e digitados em banco de dados

onde tiveram sua consistência averiguada. Os dados nominais e ordinais foram

descritos através de suas freqüências absolutas e relativas. Os dados contínuos

tiveram suas médias e medianas calculadas como medidas de tendência central,

juntamente com os respectivos intervalos interquartis como medidas de dispersão.

Assim, o primeiro quartil (P

) representa o valor abaixo do qual estão os 25%

valores menores, e o terceiro (P

) o valor abaixo do qual estão 75% dos

resultados. Quando se descreve um conjunto de dados de distribuição

assimétrica, a distância entre quartis representa melhor a variação do que a

amplitude ou o desvio padrão, porque não é afetada pelos valores extremos

Como provas de significância estatística para comparação de proporções

foram utilizados os testes qui-quadrado de Pearson ou razão de verossimilhança

para as seguintes variáveis categóricas: modo de transmissão do HIV,

estratificação da contagem de linfócitos T CD4 e da carga viral do HIV, doenças

oportunísticas, co-infecção (VHB, VHC e HTLV), número e motivo de troca dos

antirretrovirais.

A comparação da média da idade entre os grupos foi feita pelo teste

estatístico ANOVA

por se tratar de uma variável com distribuição normal com

mais de dois grupos.

Utilizou-se o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis para comparação das

seguintes variáveis contínuas entre os grupos: tempo de acompanhamento,

tempo entre o diagnóstico do HIV e determinação do perfil do GBV-C, contagem

de linfócitos TCD4 e carga viral do HIV basais e durante o seguimento, nadir de

CD4 e zênite de carga viral do HIV e número de esquemas antirretrovirais. O

teste de Wilcoxon

foi utilizado para comparar as variáveis pareadas distribuídas

em dois momentos: linfócito T CD4 Basal/ linfócito T CD4 Final, carga viral HIV

Basal/ carga viral HIV Final e carga viral GBV-C Basal/ carga viral GBV-C Final.

Para verificar o grau de relação entre variáveis contínuas foi utilizada a

correlação de Spearman quando pelo menos uma das variáveis apresentou

distribuição não normal

Para a análise da sobrevida foi utilizado o método de estimativa de Kaplan-

Meier. A variável tempo de sobrevida foi criada a partir da data da determinação

do perfil do GBV-C RNA e da data do óbito para as pacientes que faleceram e, da

data da determinação do perfil do GBV-C RNA e da última consulta no serviço ou

da data final de seguimento, 01 de janeiro de 2008, para as pacientes que

sobreviveram. Para comparação da diferença de sobrevida entre as categorias foi

utilizado o teste log-rank, dada a proporcionalidade dos riscos

Para a determinação de possibilidade de óbito quanto à infecção pelo

GBV-C na coorte estudada, foi realizado o cálculo do risco relativo como medida

de associação e seus respectivos intervalos de confiança a 95%. O tempo de

sobrevida juntamente com as variáveis CD4 e carga viral do HIV basais, número

de esquemas antirretrovirais, doença oportunística e perfil do GBV-C foi

modelado usando a regressão múltipla de Cox e estimado os riscos relativos de

óbito com os respectivos intervalos de confiança a 95%.

Os testes foram calculados com “p” bicaudal, sendo considerado o valor

menor que 0,05 estatisticamente significativo.

Para construção do banco de dados foi utilizado o programa Microsoft

Excel. A análise dos dados foi realizada com o software SPSS versão 15.0

(SPSS Inc, 2006).

• Aspectos éticos do estudo

O estudo contou com a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do

Instituto de Infectologia Emílio Ribas, do SEAP e da Comissão de Ética para

Análise de Projetos de Pesquisa – CAPPesq – da Diretoria Clínica do Hospital

das Clínicas e da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

(protocolo nº 029/06).

As pacientes que participaram da segunda coleta de sangue para

determinação do GBV-C entre 2006 a 2008, foram convocadas por telefone pelo

pesquisador executante, agendando local para visita em suas respectivas

instituições de acompanhamento para aplicação do Termo de Consentimento

Livre e Esclarecido (Anexo 3) e, se autorizado, coleta de amostra de sangue

para envio ao Laboratório.

• Revisão bibliográfica

Para pesquisa bibliográfica de periódicos foram utilizados os principais

bancos e bases de dados disponíveis eletronicamente, além de literatura corrente

disponibilizada em livros texto. Visando uma maior eficiência na obtenção dos

resultados, além do uso de palavras-chave relevantes ao assunto abordado,

foram utilizados descritores MESH e DeCS indexados respectivamente pelas

bases MEDLINE e LILACS. Também foram revistas algumas publicações citadas

por autores em suas referências. A estrutura dos elementos textuais contidos

nessa dissertação respeitou os preceitos contidos no Guia Oficial do Serviço de

Biblioteca e Documentação da Faculdade de Medicina da Universidade de São

Paulo

Resultados

Os resultados deste estudo serão demonstrados em três momentos.

Primeiramente, foram analisadas as características das pacientes na primeira

coleta, entre 1996 e1998, considerada a basal, em que se determinou o perfil do

GBV-C com estratificação das pacientes em três grupos (GBV-C RNA+ /anti-E2 - ,

GBV-C RNA - /anti-E2 + e GBV-C RNA - /anti-E2 - ). Neste momento analisamos

também outras variáveis tais como: a idade, o tempo de acompanhamento no

estudo, o modo de transmissão do HIV e a contagem de linfócitos T CD4 e carga

viral do HIV basais.

As pacientes foram acompanhadas e os resultados das seguintes variáveis

clínicas e laboratoriais, estratificadas pelo perfil do GBV-C, estudadas: co-

infecção VHB, VHC e HTLV1/2, presença de doença oportunísticas, número de

esquemas antirretrovirais usados e trocas dos mesmos, motivo da troca e

mediana do nadir e zênite da contagem de linfócitos CD4 e carga viral do HIV,

respectivamente.

Por fim, demonstraremos ainda os resultados descritivos obtidos de

variáveis estratificadas pelo perfil do GBV-C na segunda coleta de um grupo de

57 pacientes participantes da primeira análise.

Foram incluídas 248 amostras de pacientes femininas no estudo, com

média de idade no momento da determinação do GBV-C RNA de 32,41anos (DP

7,1 anos) e mediana de 31,6 anos (P

25-75

27 – 38,1 anos). Não houve diferença

estatística na mediana de idade entre os três grupos: pacientes GBV-C RNA+

/anti-E2 - 31,8 anos, pacientes GBV-C RNA- /anti-E2 + 33,23 anos e pacientes

GBV-C RNA- /anti-E2 - 30,64 ; sendo p=0,331. Tabela 1.

Considerando a data da detecção do perfil do GBV-C a de início do

estudo, as 248 pacientes foram acompanhadas em média 7,49 anos (DP 2,89

anos) ou 89,94 meses (DP 34,67 meses) com mediana de 9 anos (P

25-75

6,25 - 9

anos) ou 108 meses (P

25-75

75 -108 meses). Não houve diferença estatística no

tempo de acompanhamento entre os grupos como mostra a Tabela 1.

Das 248 pacientes, 198 tinham informação quanto à data do diagnóstico

sorológico da infecção pelo HIV (Elisa e Western Blot positivos) em prontuário. A

média de tempo em meses entre o diagnóstico do HIV e da determinação do

perfil do GBV-C foi de 29,37 meses (DP 34,02 meses) e a mediana de 21 meses

25-75

8 - 41,25) para as pacientes analisadas, sendo 17,5 meses (P

25-75

3 -

31,25) para o grupo GBV-C RNA+ /anti-E2 - , 23 meses (P

25-75

4 - 43,25) para o

grupo GBV-C- /anti-E2 + e de 23,5 meses (P

25-75

11,75 - 45,25) para o grupo

GBV-C- /anti-E2 - . Não houve diferença estatística entre os grupos (p= 0,079).

Não pudemos determinar, contudo, se a exposição ao vírus do HIV antecedeu à

do GBV-C, uma vez que não é rotina a detecção do GBV-C na avaliação e

acompanhamento dos pacientes HIV positivos recém diagnosticados em nossos

serviços.

Em relação à exposição ao GBV-C obtivemos uma prevalência de 46%.

Das 115 pacientes expostas, 57 eram GBV-C RNA positivas (23%) e 58 eram

anti-E2 positivas (23%). As pacientes consideradas expostas ao vírus GBV-C

tinham como marcador o PCR RNA positivo para o vírus ou apresentavam o

anticorpo anti-E2. Não houve achado da presença concomitante do GBV-C RNA

e do anticorpo anti-E2 nas 248 pacientes estudadas. Gráfico 1.

Gráfico 1- Prevalência do GBV-C em 248 pacientes - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

54%

23%

GBV-C RNA-/antiE2-

GBV-C RNA+/antiE2-

GBV-C RNA-/antiE2+

Foi realizada a contagem da carga viral do GBV-C RNA pelo método

quantitativo da PCR em tempo real. Encontrou-se uma média de 1.396,30 UA/mL

e mediana de 458,9 UA/mL (P

25-75

42,1- 1.614,3 UA/mL).

Com relação à contagem de linfócitos T CD4 e de carga viral basal do HIV

no momento da determinação do perfil do GBV-C, observamos que não houve

diferença estatística entre os valores em relação aos grupos (p=0,36 e p=0,713,

respectivamente), como mostra a Tabela 1. Utilizando o coeficiente de correlação

não-paramétrico de Spearman para determinar a associação entre as variáveis

contagem de linfócitos TCD4, carga viral do HIV e carga viral do GBV-C,

observou-se que não houve correlação entre a contagem basal de linfócitos T

CD4 e da carga viral do GBV-C, sendo r

=0,097 e p=0,129. No que se refere à

carga viral basal do HIV e à carga viral do GBV-C também não houve correlação,

sendo r

= -0,058 e p=0,366.

Em relação à forma de transmissão do HIV, a maior parte das pacientes

(67,2%) relatou possuir parceiros sexuais fixos (maridos), sabidamente

portadores da doença aids. Não houve associação estatisticamente significativa

entre o modo de transmissão do HIV estratificado pelo perfil do GBV-C, sendo p >

0,05, como mostra a Tabela 1.

Baseado em apenas informações de prontuários médicos no momento em

que foi iniciado este estudo observamos que nenhuma paciente apresentava

sorologia positiva para os vírus da hepatite B, C ou HTLV1/2. Não podemos,

entretanto, afirmar categoricamente que as pacientes eram negativas para estes

vírus uma vez que o presente estudo não realizou sorologia das mesmas no

momento da determinação do perfil do GBV-C.

As características gerais das pacientes são demonstradas na Tabela 1.

Tabela 1 - Características gerais da população no início do estudo estratificada pelo perfil GBV-C – SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

Características Gerais N Total GBV-C RNA + /

Anti-E2 – (n=57)

GBV-C RNA - /

Anti-E2 + (n=58)

GBV-C RNA - /

Anti-E2 – (n=133)

Idade em anos (mediana)

248 31,6

(27-38,1)

31,8

(27,93-38,41)

33,23

(28,30-39,30)

30,64

(26,42-36,44)

0,331

Tempo

de a

companhamento

em meses (mediana)

248 108

(75-108)

108

(90-108)

108

(84-120)

108

(72-108)

0,371

Modo Tra

nsmissão HIV

Sexual

186 125(67,2%) 28(63,6%) 29(63%) 68(70,8%) 0,552

Uso de droga EV

186 7(3,8%) 2(4,5%) 2(4,3%) 3(3,1%) 0,893

Tx sanguína

186 6(3,2%) 3(6,8%) 1(2,2%) 2(2,1%) 0,362

CD4 Basal (cels/mm

)

(mediana)

247 286

(163 - 391)

305

(223,5-394,5)

287

(168,75-418,75)

277

(148,5-390)

0,36

CD4 Basal categorizado

<200 cels/mm

77 12(21,1%) 20(34,5%) 45(34,1%) 0,411

200

350 cels/mm

84 24(42,1%) 18(31,0%0 42(31,8%)

>350 cels/mm

86 21(36,8%) 20(34,5%) 45(34,1%)

Carga Viral HIV Basal

cópias/mm

(mediana)

246 3.497,50

(100-38.180,25)

4.153

(288,50-25.562)

2.996,50

(100-66.241,50)

3.492

(405-44.920)

0,713

Carga Viral HIV Basal

categorizada

100

999 cópias/mm

90 21(36,8%) 24(41,4%) 45(34,4%) 0,36

1.0

9.999 cópias/mm

60 15(26,3%) 13(22,4%) 32(24,4%)

10.000

99.999 cópias/mm

58 17(29,8%) 11(19%) 30(22,9%)

>100.000 cópias/mm

38 4(7%) 10(17,2%) 24(18,3%)

*Mediana (P

25%-75%

)

Teste de Kruskal Wallis

Razão de verossimilhança

Teste Qui-quadrado de Pearson

Por meio de revisão do prontuário das pacientes obtivemos informações

de variáveis clínicas e laboratoriais desde o início da primeira consulta. As

pacientes foram acompanhadas até o desfecho final, que foi definido como: data

da última consulta ambulatorial, ou a data limite do estudo considerado

01/01/2008, ou a data do óbito.

Em relação às doenças oportunísticas referidas por essas pacientes em

prontuário médico desde o diagnóstico da infecção pelo HIV, observamos uma

maior prevalência de casos de tuberculose (22,2%), seguida de monilíase oro-

esofágica (19%) e toxoplasmose cerebral (17,3%). Apenas a monilíase oro-

esofágica e a pneumocistose foram mais frequentes no grupo não exposto ao

GBV-C, sendo p= 0,016 e 0,048, respectivamente. Para as demais doenças

oportunísticas avaliadas neste estudo não houve diferença estatística entre os

grupos estratificados pelo perfil do GBV-C, como mostra a Tabela 2.

Tabela 2 – Frequência de doenças oportunísticas na população durante o acompanhamento

estratificada pelo perfil do GBV-C perfil do GBV-C - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

Teste Qui-Quadrado

Razão de Verossimilhança

Características n

GBV

RNA+/anti-E2-

GBV

RNA-/anti-E2+

GBV

RNA-/anti-E2- p

Doença Oportunísticas

Tuberculose

(pulm,gangl,dissem)

35/185 9 (20%) 7 (15,2%) 19(20,2%) 0,760

Monilíase oro

esofágica

26/185 2 (4,4%) 7 (15,2%) 17(18,1%) 0,093

CMV ocular/esofágica

17/185 2 (4,4%) 4 (8,7%) 11(11,7%) 0,342

Herpes Zoster

18/185 2 (4,4%) 5 (10,9%) 11(11,6%) 0,337

PCP

14/185 0 (0%) 3 (6,5%) 11(11,7%) 0,010

Criptococose SNC

4/185 2 (4,4%) 1 (2,2%) 1(1,1%) 0,470

Toxoplasmose SNC

32/185 4 (8,9%) 7 (15,2%) 21(22,3%) 0,133

Micro/Isosporid

iose

8/185 3 (6,7%) 2 (4,3%) 3(3,2%) 0,659

Na pesquisa sorológica de vírus causadores de hepatite crônica (B, e C) e

do HTLV 1/2 ao longo do acompanhamento das pacientes, encontramos a

presença do vírus da hepatite C em 19 (11,7%) pacientes, sendo a viremia

nesses casos confirmada pela presença do RNA do VHC detectado pelo método

da RT-PCR. Em menor proporção, três (1,8%) pacientes apresentaram hepatite B

e cinco (3,8%) HTLV1/2. Não houve diferença estatítistica destas infecções de

acordo com a estratificação pelo perfil do GBV-C (VHB p=0,864, VHC p=0,987 e

HTLV p=0,39), como mostrado na Tabela 3.

Tabela 3 – Frequência de co-infecção na população durante o acompanhamento estratificada pelo

perfil do GBV-C - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

Teste de Kruskal Wallis

Durante o período de acompanhamento foi avaliada a mediana da

contagem de linfócitos T CD4 e carga viral do HIV das pacientes que tinham

informação dessas variáveis no sistema SISCEL. Não houve diferença estatística

entre os grupos. Foi feita também a comparação dos menores valores medianos

de contagem de linfócitos TCD4 (nadir) e os maiores valores medianos de carga

viral do HIV (zênite) entre os grupos, não havendo diferença estatística entre os

mesmos. Estas análises encontram-se descritas na Tabela 4.

Características

n GBV-C

RNA+/anti-E2-

GBV-C

RNA-/anti-E2+

GBV-C

RNA-/anti-E2- p*

infecção

Presença do HbsAg

3/164 1 (2,4%) 1 (2,4%) 1 (1,3%) 0,864

Pres

ença do anti

VHC

19/163 5 (11,9%) 5 (12,2%) 9 (11,3%) 0,987

Presença de anti

HTLV1/2

5/133 0 (0%) 2(5,9%) 3 (4,6%) 0,39

Tabela 4 – Média e mediana dos valores medianos de CD4, carga viral do HIV, CD4 nadir e da

carga viral zênite do HIV na população durante o acompanhamento estratificada pelo

perfil do GBV-C- SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

Teste de Kruskal-Wallis

n Total

GBV-C

RNA+/anti-E2-

GBV-C

RNA-/anti-

E2+

GBV-C

RNA-/anti-

E2-

CD4

mediano

83/248 0,241

Média

444,3 392,1 450,1 487,5

(DP)

232,4 225,5 243,6 263,4

Mediana

425 303,5 407 435,0

25-75

)

283,4 - 612,1 244 - 483,5 272 - 620,5

300 -

632,5

mediano

83/248 0,17

Média

11.196,20 25.697,10 19.750,60 28.617,60

(DP)

24.172,90 91.026,20 74.058,10

107.303,1

Mediana

676 517 399 399

25-75

)

399 - 4.604,3 399 - 11.491,5 399 - 4.137

399 -

1.080

CD4 Nadir

mediano

115/248 0,324

Média

386,2 357,5 399,2 434,5

(DP)

211,9 224,1 225,7 240,6

Mediana

395 280,5 361,5 395

25-75

)

255,9 - 523,4 226,9 - 445,4 252 - 488

266,5 -

607,5

HIV Zênite

mediano

115/248 0,181

Média

25.798,20 30.276,30 29.356,20 34.811,80

(DP)

54.345,50 92.740,60 83.067,20

112.797,5

Mediana

2.950 2.350 1.188 399

25-75

)

399 - 20.535,5 399 - 16.350 399 - 15.600

399 -

6.025

Em relação ao uso de esquemas terapêuticos para o tratamento da

infecção pelo HIV, a mediana de troca de antirretrovirais durante o período de

seguimento foi de quatro trocas, ou seja, semelhante para todas as pacientes

estratificadas pelo perfil do GBV-C. Os intervalos P

25-75

, foram de 2 - 5 trocas

para as pacientes com GBV-C RNA+/anti-E2 - , de 3 - 6 trocas para as pacientes

GBV-C RNA- /anti-E2+, e de 2,8 - 6 trocas para as pacientes GBV-C RNA- /anti-

E2 -, e sendo o p=0,583 pelo teste não paramétrico de Kruskal Wallis. (Tabela 5)

Tabela 5 – Média e mediana de esquema antirretrovirais utilizados no tratamento do HIV na

população durante o acompanhamento estratificada pelo perfil do GBV-C - SEAP/USP

e Hospital Emílio Ribas

n Total

GBV

RNA+/anti-E2-

GBV

RNA-/anti-E2+

GBV

RNA-/anti-E2- p*

esquemas

antirretrovirais

203 0,583

Média(DP)

4,5(2,8) 4,2(2,8) 4,4 (2,5) 4,7 (3)

Mediana(P

)

4 (2 - 6) 4 (2 - 5) 4 (3 - 6) 4 (2,8 - 6)

Teste de Kruskal Wallis

Na Tabela 6 apresentamos o número de trocas de esquemas

antirretrovirais categorizados pela freqüência das mesmas. As informações

quanto à frequência do número de trocas e quais esquemas antirretroviral

utilizados durante todo tempo de acompanhamento das pacientes foram obtidas

de 203 pacientes. Apenas as pacientes que iniciaram e mantiveram terapia

antirretroviral até o fim do acompanhamento do estudo foram consideradas

elegíveis para esta análise.

Não observamos diferença entre os grupos com relação ao número de

trocas estratificada pelo perfil de exposição ao vírus GBV-C, sendo p=0,209.

Ainda, no que se refere às trocas de antirretrovirais ao longo do

acompanhamento das pacientes, foram coletadas informações quanto ao motivo

de troca dos mesmos em prontuário médico. Apenas 129 pacientes tiveram esta

informação documentada no prontuário. Consideraram-se motivos pelo qual o

médico assistente optou-se por troca da terapia a falência imunológica ou

virológica aos antirretrovirais e a manifestação de qualquer evento adverso

atribuível ao uso dessas medicações. Não houve diferença estatística entre

motivo da troca estratificada pelo perfil do GBV-C, sendo p=0,104.

Tabela 6 – Frequência de troca e motivo de troca de esquemas antirretrovirais na população

durante o acompanhamento estratificada pelo perfil do GBV-C - SEAP/USP e Hospital Emílio

Ribas

Razão de Verossimilhança

Teste de Kruskal Wallis

Característica n

GBV-C

RNA+/anti-E2-

GBV-C

RNA-/anti-E2+

GBV-C

RNA-/anti-E2-

Troca de esquema

antirretrovirais

203

0,209

0-3

87 23 (47,9%) 22 (44,9%) 42 (39,6%)

4-7

84 19 (39,6%) 21 (42,9%) 44 (41,5%)

8-11

28 5 (10,4%) 6 (12,2%) 17 (16%)

12-15

4 1 (2,1%) 0 (0%) 3 (2,8%)

Motivo da troca

129/203

0,104

Falência

Virológica/Imunológica

78 19 (70,4%) 15 (45,5%) 44 (63,8%)

Evento Adverso 51 8 (29,6%) 18 (54,5%) 25 (36,2%)

Foi verificado um total de 43 óbitos ao longo de 10 anos de observação.

Houve cinco óbitos no grupo de pacientes com GBV-C RNA positivo, sete óbitos

no grupo de pacientes anti-E2 positivas e 31 óbitos no grupo de pacientes GBV-C

RNA e anti-E2 negativas. Todos os óbitos foram causados pela aids e/ou

relacionados à aids. (Anexo 3)

O tempo médio de sobrevida realizado pelo método de Kaplan-Meier das

248 pacientes do estudo estratificada pelo perfil sorológico do vírus GBV-C, tendo

como desfecho final o óbito relacionado à aids, foi de 9,45 anos IC95% 8,95 -

9,95 para o grupo GBV-C RNA+ /anti-E2 - ; de 9,32 anos IC95% 8,78 - 9,85 para

GBV-C RNA- /anti-E2 + ; e de 8,65 anos IC95% 8,19 - 9,10 para o grupo GBV-C

RNA- /anti-E2 - .

Quando se analisa o grupo não exposto ao vírus, GBV-C RNA- /anti-E2 - ,

e o grupo exposto, GBV-C RNA + e/ou anti-E2 +, encontramos um log-rank com

p=0,010 demonstrando haver uma diferença estatística significativa nas taxas de

sobrevida nos 10 anos de acompanhamento entre esses dois grupos (Gráfico 2).

Essa diferença estatística na análise de sobrevida também foi demonstrada,

ainda que com menor significância, sendo p=0,034, quando se analisa

separadamente as pacientes GBV-C RNA+ /anti-E2 - , GBV-C RNA- /anti-E2 + e

GBV-C RNA- /anti-E2 - . (Gráfico 3).

Gráfico 2 - Análise de sobrevida entre pacientes expostas e não expostas ao GBV-C Curva

de Kaplan-Meier - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

Gráfico 3 - Análise de sobrevida entre pacientes GBV-C RNA-/anti-E2 - ;

GBV-C RNA+/antiE2- e GBV-C RNA-/antiE2+ - Curva de Kaplan-Meier –

SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

Log

rank

0,034

Log-rank p = 0,010

Foram calculados os riscos relativos de óbito utilizando o modelo de Cox

tendo como variável de estratificação o perfil do GBV-C. Houve diferença

estatística na comparação entre as categorias GBV-C RNA- /anti-E2 - e GBV-C

RNA+ /anti-E2 - , p=0,038, sendo o risco relativo de morte para o grupo GBV-C

RNA positivo 63% menor do que nos não expostos. Para o grupo GBV-C RNA-

/anti-E2 - e GBV-C RNA- /anti-E2 + , não houve diferença estatística, porém o

risco de morte foi de 51% menor para o grupo GBV-C RNA- /anti-E2+ em

comparação aos não expostos, sendo p= 0,089, como mostra a Tabela 7.

Tabela 7 – Risco relativo de óbito estratificado pelo perfil do GBV-C - SEAP/USP e

Hospital Emílio Ribas

A contagem de linfócitos T CD4 basais e carga viral do HIV foram

categorizadas e criadas funções Kaplan-Meier para o tempo de sobrevida

segundo essas categorias. Foram testados os tempos de sobrevida com o uso do

teste log-rank. Houve diferença estatística nesta análise para o valor de linfócitos

T CD4 e carga viral do HIV independente do perfil do GBV-C, sendo o p=0,001 e

p<0,001, respectivamente.

Estratificação GBV-C RR

IC (95%)

Inferior Superior

GBV-C RNA-/anti-E2- 1,00

GBV-C RNA+/anti-E2-

0,37

0,14 0,95

0,038

GBV-C RNA-/anti-E2+ 0,49 0,22 1,11 0,089

Gráfico 4 - Análise de sobrevida das pacientes classificadas segundo a contagem de

linfócitos T CD4. Curva de Kaplan-Meier - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

Gráfico 5 - Análise de sobrevida das pacientes classificadas segundo a carga viral do

HIV.Curva de Kaplan-Meier - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

Log

rank

0,00

Log

rank

0,00

Foi realizada a análise de regressão múltipla de Cox com as variáveis

contagem de linfócitos TCD4 e carga viral do HIV basais, número de esquemas

antirretrovirais, doença definidora de aids e o perfil do GBV-C, como mostra a

Tabela 8. O resultado da análise de regressão de Cox demonstrou que somente

as variáveis carga viral do HIV maior ou igual a 100.000 cópias/mL e presença de

doença definidora ao longo do seguimento dessas pacientes demonstraram

associação estatística significativa com a sobrevida. Curiosamente, o mesmo não

ocorreu com a variável perfil do GBV-C. Ou seja, ter carga viral do HIV maior ou

igual a 100.000 cópias/mL em relação aos pacientes com baixa carga viral basal

(<400 cópias/mL), e/ou ter apresentado alguma doença definidora de aids ao

longo do seguimento, esteve relacionado a um risco relativo de 7,63 e 2,87 vezes

de óbito, respectivamente, independente do perfil do GBV-C (p> 0,05).

Tabela 8 - Análise de regressão múltipla de Cox ajustado por variáveis em 248 pacientes.

Modelo parcial. SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

* Teste Qui-Quadrado

Variável RR

IC (95%)

Inferior Superior

CD4 basal

< 200 1,00

200 – 350 0,60 0,24 1,51 0,280

> 350 0,57 0,22 1,50 0,253

CV basal

< 400 1,00

400 - 9.999 2,21 0,59 8,28 0,239

10.000 - 99.999 1,92 0,47 7,80 0,364

>= 100.000

7,63

2,01 28,93

0,003

Número de esquemas ARV

1,02 0,91 1,14 0,743

Doença definidora

Não 1,00

Sim

2,87

1,15 7,16

0,024

Perfil GBV-C

GBV-C RNA-/antiE2- 1,00

GBV-C RNA+/antiE2- 0,75 0,24 2,32 0,613

GBV-C RNA-/antiE2+ 0,66 0,26 1,65 0,370

A Tabela 9 reafirma os resultados obtidos na análise de regressão múltipla

de Cox ajustado apenas pelas variáveis que demonstraram significância

estatística, denominado modelo final.

Tabela 9 - Análise de regressão múltipla de Cox ajustado por variáveis em 248 pacientes.

Modelo final. SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

Variável RR

IC (95%)

Inferior Superior

CV basal

< 400 1,00

400 - 9.999 2,31 0,63 8,54 0,209

10.000 - 99.999 2,10 0,52 8,47 0,296

>= 100.000

9,34

2,60 33,53

0,001

Doença definidora

Não 1,00

Sim

3,76

1,65 8,56

0,002

Teste Qui-Quadrado

Das 248 pacientes cuja primeira amostra foi incluída na análise acima,

conseguimos obter uma 2ª amostra, coletada entre 2006 e 2008, de 57 pacientes.

Nestas 57 pacientes verificamos os seguintes resultados quanto ao perfil

do GBV-C.

Tabela 10 - Resultados dos testes laboratoriais para GBV-C RNA nas 57 novas amostras

colhidas em 2006-2008 - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

Perfil do GBV-C 2ª amostra n %

GBV-C RNA +/anti-E2 +

GBV-C RNA - /anti-E2 +

26%

GBV-C RNA +/anti-E2 -

12 21%

GBV-C RNA -/anti-E2 -

30 53%

Total

57 100%

O resultado da análise do perfil do GBV-C da segunda coleta realizada

entre 2006 e 2007 em amostras de 57 pacientes demonstrou presença do GBV-C

RNA em 12 pacientes (21%).

Foi realizada a contagem da carga viral do GBV-C RNA pelo método

quantitativo da PCR em tempo real nas pacientes virêmicas nesta segunda coleta.

Encontrou-se uma média de 3.609,70 UA/mL e mediana de 428,6 UA/mL(P

25-75

219 - 3.259,4 UA/mL).

Comparando as 12 pacientes virêmicas na primeira e segunda amostra,

observamos que nove pacientes persistiam com o vírus GBV-C positivo

(persistentemente positivas), e apenas três pacientes tiveram contato com o

vírus entre o período da primeira e segunda coleta mantendo-se virêmicas,

conforme demonstrado pela presença do GBV-C RNA apenas na segunda coleta

(infecção incidente).

Ainda com relação à exposição ao vírus durante o intervalo entre as

determinações do perfil do GBV-C, encontramos uma paciente que apresentou

contato com o vírus seguida de soroconversão demonstrada pela produção do

anti-E2 na segunda amostra (soroconversão).

Houve clareamento do GBV-C RNA em quatro amostras (9%). Ou seja,

essas pacientes apresentavam na primeira coleta GBV-C RNA+ /anti-E2 - e na

segunda, GBV-C RNA - /anti-E2 + ou anti-E2 - (clareadoras virais).

As pacientes que na análise da segunda coleta apresentaram um perfil

compatível com clareamento viral, determinado pela detecção do anti-E2 e que

também o foram na primeira coleta, foram consideradas imunes. Das 19 (33%)

pacientes imunes, 13 apresentaram GBV-C RNA- /anti-E2 + nas análises da

primeira e segunda amostras. Seis pacientes apresentaram GBV-C RNA- /anti-

E2+ na primeira mas GBV-C RNA- /anti-E2 - na segunda análise demonstrando

que houve perda do anti-E2, mas persistência de viremia negativa ao longo do

seguimento.

Por fim, 21 pacientes (35%) continuaram não sendo expostas ao vírus

durante todo o seguimento apresentando como perfil GBV-C RNA- /anti-E2 - em

ambas as coletas (persistentemente negativas).

A incidência foi calculada com a população de 57 pacientes das quais

foram excluídas para este estudo as pacientes que não estavam sob risco, sendo

estas as persistentemente positivas (9), as imunes (19) e as clareadoras (4).

Dessa forma, as 25 pacientes restantes que estavam sob risco de adquirir a

infecção pelo GBV-C - grupos das persistentemente negativas (21), infecção

incidente (3) e soroconversão (1) - foram observadas por 226 anos. Neste

universo observamos quatro novas infecções. Portanto a incidência nesse grupo

de mulheres HIV positivas é de 17,7 pessoas por 1.000 anos.

A Tabela 11 mostra os resultados das variáveis contagem de linfócitos

TCD4 e carga viral do HIV e do GBV-C da primeira coleta (basal) e segunda

coleta (final).

Tabela 11 - Resultado das variáveis CD4 e carga viral do HIV do GBV-C das 57 pacientes - SEAP/

Hospital Emílio Ribas

Pacientes

CD4

Basal

CV HIV

Basal

CV GBV

Basal

CD4

Final

HIV

Final

CV GBV

Final

Perfil

GBV-C

Basal

Perfil

GBV-C

Final

Classificação

437 2.115 0 495 51.705 0 0 0 PN

306 100 0 707 399 0 0 0 PN

132 31.655 0 340 399 0 0 0 PN

439 306.885 0 440 399 0 0 0 PN

130 5.975 0 14 183.000 0 0 0 PN

379 100 0 593 399 0 0 0 PN

708 35.505 0 172 399 0 0 0 PN

150 100 0 426 399 0 0 0 PN

220 53.835 0 328 130.000 0 0 0 PN

417 100 0 815 399 0 0 0 PN

277 1.903 0 210 7.645 0 0 0 PN

329 100 0 351 211.000 0 0 0 PN

278 100 0 325 323 0 0 0 PN

474 7.234 0 374 399 0 0 0 PN

277 291.982 0 245 51.600 0 0 0 PN

237 100 0 782 399 0 0 0 PN

544 100 0 737 399 0 0 0 PN

392 2.305 0 757 399 0 0 0 PN

307 4.667 0 373 9.986 0 0 0 PN

409 11.203 0 1.213 51.105 0 0 0 PN

198 1.691 0 167 1.975 0 0 0 PN

228 33.951 820,29 298 49 0 1 0 C

89 100 619,80 508 399 0 1 0 C

74 942 23,43 70 399 0 1 0 C

245 9.936 0 399 399 0 2 0 I

67 3.503 0 238 1.259 0 2 0 I

312 182.274 0 701 77 0 2 0 I

89 677 0 362 3.493 0 2 0 I

359 7.163 0 295 5.075 0 2 0 I

123 414 0 177 145.000 0 2 0 I

155 195.500 0 548 399 3.900,62 0 1 II

253 100 0 629 399 1.335,81 0 1 II

534 118.421 0 307 9.700 28.235,4 0 1 II

135 100 285,92 618 399 211,79 1 1 PP

355 1.411 3.974,57 571 49 495,01 1 1 PP

365 13.042 812,89 463 1.580 269,96 1 1 PP

146 29.006 4,63 209 94.100 109,73 1 1 PP

676 2.404 438,7 1.334 399 488,34 1 1 PP

108 100 1.895,83 568 399 368,84 1 1 PP

655 1.165 4.511,69 724 399 151,91 1 1 PP

108 47.420 9,32 240,69 1 1 PP

317 16.878 637,06 370 79 7.508,10 1 1 PP

375 191.362 0 878 49 0 0 2 S

235 100 4.318,85 393 399 0 1 2 C

143 100 0 418 399 0 2 2 I

241 766 0 757 399 0 2 2 I

308 100 0 447 399 0 2 2 I

253 5.327 0 309 522 0 2 2 I

232 100 0 1.219 399 0 2 2 I

181 100 0 162 1.810 0 2 2 I

424 100 0 776 399 0 2 2 I

543 469 0 542 49 0 2 2 I

297 10.169 0 0 2 2 I

170 76.792 0 199 55.500 0 2 2 I

169 93.743 0 348 49 0 2 2 I

219 100 0 425 731 0 2 2 I

521 14.117 0 295 33.400 0 2 2 I

PP= Persistentemente positivas PN= Persistentemente negativas II= Infecção Incidente

C= Clareadoras S=Soroconversão I= Imunes

Avaliando a variação do valor de contagem de linfócitos TCD4 e da

carga viral do HIV obtida ao final menos a basal dos grupos de pacientes

persistentemente negativas, persistentemente positivas e grupo de pacientes

clareadoras, imunes, soroconversoras e infecção incidente não se observou

diferença estatística entre os valores da média e mediana dos grupos, sendo

p=0,372 e p=0,338, respectivamente. Não se pode concluir, portanto, que as

pacientes persistentemente virêmicas para o GBV-C apresentaram uma variação

de contagem de CD4 e ou uma variação de carga viral do HIV superior aquelas

persistentemente não virêmicas para esse vírus, como mostra a Tabela 12.

Tabela 12 – Comparação entre a variação CD4, carga viral do HIV basal e final dos grupos PN,

PP, C/I/S/II - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

Variável Classificação

Média DP Mediana

n p*

Variação

CD4

(final - basal)

PN 134 279 66 -31,5 320,5 21 0,372

PP 263 237 157 64,5 477,3 8

C/I/S/II 198 257 164,5 21,5 379,3 26

Total 183 262 154 22,0 376,0 55

Variação

CV HIV

(final - basal)

PN -2.620 109.445

299 -4.370,5 22.822,0 21 0,338

PP 4.162 25.408 -1.064 -9.097,8 299,0 8

C/I/S/II -25.966 73.197 -393,5 -24.444,5

299,0 26

Total -12.670 84.657 299 -9.537,0 299,0 55

PP= Persistentemente positivas PN= Persistentemente negativas II = Infecção

Incidente C= Clareadoras S=Soroconversão I= Imunes

* Teste de Wilcoxon

Foi realizada também a comparação do valor de contagem de linfócitos

TCD4 final menos o basal somente entre os grupos de pacientes

persistentemente negativas e as persistentemente positivas, como mostra a

Tabela 13. Da mesma forma, não houve diferença estatística na comparação dos

valores de contagem de linfócitos T CD4 e carga viral do HIV entre os dois

grupos, sendo p=0,153 e p=0,374, respectivamente.

Tabela 13 – Comparação entre a variação CD4, carga viral do HIV basal e final dos grupos PN,

PP - SEAP/USP e Hospital Emílio Ribas

Variável Classificação

Média DP Mediana

n p*

Variação CD4

(final - basal)

PN 134 279 66 -31,5 320,5 21 0,153

PP 263 237 157 64,5 477,3 8

Total 179 266 139 22,0 352,0 29

Variação

CV HIV

(final - basal)

PN -2620 109445 299 -4370,5 22822,0 21 0,374

PP 4162 25408 -1064 -9097,8 299,0 8

Total -3578 81774 299 -4805,0 1710,0 29

PP= Persistentemente positivas PN= Persistentemente negativas

* Teste de Wilcoxon

Discussão

O presente estudo teve como interesse principal a determinação da

prevalência de GBV-C em uma população de mulheres sabidamente HIV

positivas. Consideramos ser esse um trabalho relevante uma vez que dados de

estudos de prevalência realizados em coortes de população exclusivamente

femininas e HIV positivas ainda são escassos na literatura nacional e

internacional. No Brasil existem ainda poucos inquéritos em população de

pacientes infectados por HIV para presença da infecção por GBV-C. Portanto, o

primeiro objetivo desse estudo foi determinar a prevalência do RNA do vírus

GBV-C e do anticorpo anti-E2 em uma coorte de 248 pacientes femininas

sabidamente portadoras de HIV-1.

O estudo também propôs demonstrar e discutir, nessa população brasileira,

o curioso impacto de GBV-C sobre a evolução da infecção pelo HIV quanto ao

efeito protetor da interação entre esses dois vírus, tendo como base a análise de

algumas variáveis clínicas e laboratoriais importantes na evolução da doença por

HIV.

Nosso estudo se distinguiu da maioria dos publicados na literatura por

duas pecularidades: ter casuística exclusivamente composta de mulheres, e

determinar a carga viral de GBV-C por um teste quantitativo, não apenas

qualitativo, permitindo comparar variáveis quantitativas como a contagem de

linfócitos T CD4 e da carga viral de HIV com uma variável também quantitativa, e

não apenas categórica, à carga viral de GBV-C.

O desenvolvimento do método da PCR em tempo real para a

determinação da viremia de GBV-C no estudo e consequentes resultados foram

apresentados e discutidos em dissertação de mestrado de outro pesquisador.

Dessa forma, não foi discutida em detalhes a metodologia para quantificação do

vírus neste trabalho.

A prevalência da viremia de GBV-C encontrada em nossa população, foi

similar a descrita em norte americanos e europeus. Um estudo brasileiro

realizado por Souza e colaboradores

também demonstrou resultados

semelhantes, com uma prevalência de GBV-C RNA de 24% em 175 pacientes

co-infectados por HIV. No que se refere prevalência de GBV-C RNA em doadores

saudáveis de bancos de sangue, dois estudos brasileiros realizados por Ribeiro-

dos-Santos e colaboradores

e Levi e colaboradores

demonstraram uma

prevalência próxima de 10%. O curioso é que os estudos de prevalência de GBV-

C demonstram ser esse um vírus mais presente em indivíduos co-infectados por

HIV que nos doadores de sangue saudáveis. Esse fato pode ser explicado pela

coexistência de mesma via de transmissão entre esses dois vírus, sendo a via

parenteral e sexual as principais relacionadas à aquisição dos mesmos.

Nossa casuística foi composta exclusivamente de mulheres com idade

média de 32 anos, cuja exposição ao HIV foi principalmente sexual (67,2%). Os

trabalhos publicados na literatura confirmam o predomínio da via parenteral e

sexual como principais meios de transmissão de HIV. De fato, no Estado de São

Paulo, desde 1983, tem-se observado que a maioria das mulheres contaminam-

se pelas relações heterossexuais, sendo o uso de drogas injetáveis a segunda

categoria de transmissão mais prevalente entre os casos femininos notificados

Em nossa casuística encontramos uma predominância da transmissão de HIV

por via sexual, provavelmente por se tratar de uma coorte de pacientes femininas,

em que o uso de droga endovenosa ocorre com menor frequência. Vale ressaltar,

que a maioria das pacientes relataram ter parceiros sexuais fixos, maridos,

sabidamente soropositivos para HIV.

Nossa casuística foi composta de pacientes com tempo de diagnóstico por

HIV bastante longo, em média de 7,49 anos. O longo tempo de acompanhamento

dessas pacientes certamente reflete o impacto da melhora da sobrevida após a

era HAART, com a introdução de medicamentos altamente potentes.

Consideramos que o nosso estudo apresentou um tempo de seguimento razoável,

10 anos, já que as pacientes sob terapia tendem a viver por mais tempo com

infecção por HIV.

Estudamos algumas variáveis clínicas e laboratoriais referentes à evolução

da doença por HIV em nossa população. A contagem de linfócitos T CD4 colhida

na inclusão do estudo de 247 pacientes estudadas, resultou em mediana de 286

células/mm

. Em relação à contagem da carga viral de HIV na inclusão de 246

pacientes a mediana foi 3.497,50 cópias/mL.

As variáveis quantitativas, contagem de linfócitos T CD4 basal e carga viral

basal de HIV, bem como a variável quantitativa de carga viral de GBV-C basal,

foram também estudadas quanto à determinação da presença de algum grau de

correlação entre as mesmas. Nosso trabalho não encontrou associação

significativa entre a contagem de linfócitos T CD4 e carga viral de GBV-C basais

nem tão pouco entre a contagem da carga viral de HIV e carga viral de GBV-C

basais, uma vez que o p revelou-se ≥ 0,05 , indicando uma probabilidade do

resultado do nosso estudo ter sido ao acaso, isto é, ser devido a variabilidade da

amostra.

Do mesmo modo, Giret e colaboradores

estudaram esse tipo correlação

entre essas variáveis em uma coorte brasileira de 175 pacientes e também não

encontraram correlação linear positiva significativa entre a carga viral de GBV-C e

a contagem de linfócitos T CD4. No que diz respeito a correlação da carga viral

de GBV-C e carga viral de HIV, apesar do nosso estudo ter demonstrado um

valor inverso esperado, ou seja, valores maiores de carga viral de GBV-C

associaram-se com valores menores de carga viral de HIV, essa diferença não foi

significativa (r

= -0,058 e p=0,366).

Entretanto, nossos resultados não se assemelharam aos encontrados em

um estudo realizado por Toyoda e colaboradores

, especialmente no que se

refere à correlação entre a carga viral quantitativa de HIV e de GBV-C. Nesse

estudo, os autores encontraram valores menores da carga viral de HIV nos 11

pacientes GBV-C RNA positivos (média de carga viral do HIV de 3,53 x 10

cópias/mL)

quando comparado aos 30 pacientes GBV-C RNA negativos (média

da carga viral do HIV de 5,76 x 10

cópias/mL). Entretanto, é interessante

ressaltar que nesse estudo os autores não conseguiram demonstrar uma

associação estatisticamente significativa entre carga viral de HIV e carga viral de

GBV-C com desfecho clínico de diagnóstico mais tardio de aids ou óbito entre os

pacientes. Ou seja, ter tido GBV-C RNA positivo e menor média de carga viral de

HIV não esteve associado a maior sobrevida nos pacientes infectados por HIV

nesse estudo.

Já Lefréve e colaboradores

também estudando a correlação da carga

viral desses dois vírus após cinco anos de acompanhamento de 95 pacientes

infectados por HIV, encontraram um média de carga viral de HIV de 3,4 log

grupo GBV-C RNA positivo comparado com a média de 4,0 log

no grupo GBV-

C RNA negativo, sendo p=0,009.

Da mesma forma que HIV, por compartilharem da mesma via de

transmissão, é comum a concomitância de hepatite B e C com GBV-C. Em nossa

amostra não tivemos informação sobre presença dos vírus das hepatites B e C

no momento do diagnóstico da infecção por HIV ou da determinação de GBV-C.

Dessa forma, não podemos afirmar quantas pacientes eram portadoras de tais

vírus no momento em que iniciamos o acompanhamento das mesmas.

Sabe-se que a via parenteral, principalmente para a hepatite C, e a sexual,

mais importante na hepatite B, são altamente efetivas para a transmissão das

mesmas, embora 30 a 35% dos casos de hepatite B e até 40% dos casos de

hepatite C, não possuam uma via de transmissão bem determinada

84,85,86

Pudemos, no entanto, observar a aquisição dessas hepatites virais ao

longo do acompanhamento das pacientes. Houve maior predominância de VHC

(11,7%) sobre VHB (1,8%) durante o acompanhamento das pacientes.

Encontramos três casos de hepatite B distribuídos igualmente entre os perfis de

GBV-C. Em relação à hepatite C, encontramos nove casos para o grupo de

pacientes expostas e 10 casos para as não expostas. Não houve predomínio de

casos de hepatite B e C entre os indivíduos expostos e não expostos a GBV-C

em nossa casuística. Portanto, apesar de esses vírus terem a mesma via de

aquisição parece não haver relação da presença da viremia de um sobre o outro.

Como observado na co-infecção VHC e HIV, a interação entre diferentes

vírus, com modificação na virulência de um ou de ambos, tem sido descrita na

literatura

84,87

. Entretanto, ainda que por estudos com resultados conflitantes, o

que se tem sido observado no caso da co-infecção GBV-C e HIV é de benefício

em relação à progressão da doença por HIV.

Dado o rigor adotado para a determinação da presença das doenças

oportunísticas em prontuário médico um número expressivamente menor de

pacientes foi analisado. Dos 185 prontuários revisados encontramos uma maior

frequência de tuberculose disseminada, monilíase oro-esofágica e toxoplasmose

cerebral. Esperaríamos encontrar menor frequência de doenças associadas à

infecção por HIV uma vez que alguns trabalhos levantam a hipótese de que a

viremia de GBV-C levaria a um aumento do número de células T CD4 e uma

redução da carga viral de HIV. No entanto, não foi possível confirmar tal hipótese,

já que o grupo de pacientes sabidamente GBV-C RNA positivo não diferiu dos

demais grupos no que se refere à frequência de infecções oportunísticas durante

o acompanhamento. Entretanto, esse resultado deve ser analisado

cautelosamente uma vez que comparamos uma variável laboratorial (perfil de

GBV-C), cuja determinação foi pontual em amostras colhidas entre 1996 a 1997,

com a variável manifestação de doenças oportunísticas, ou seja um desfecho

clínico, ocorridas ao longo do acompanhamento dessas pacientes. Além disso,

há que se considerar que a maioria das pacientes estudadas encontrava-se em

uso de TARV o que por si só, pode ter influência benéfica no controle das

infecções oportunísticas. Devemos levar em consideração também que não

sabemos quantas pacientes permaneceram com a viremia persistente e

consequente proteção quanto ao risco de desenvolvimento de infecções

relacionadas a HIV, uma vez que não é rotina a determinação da PCR para GBV-

C no momento da primeira sorologia Elisa positiva para HIV e ou no

acompanhamento dessas pacientes. Nossa análise foi baseada em apenas duas

medidas pontuais da carga viral de GBV-C, não sendo possível, dessa forma,

determinar o momento mais exato do clareamento desse vírus.

Relativamente pouco é sabido sobre o efeito da co-infecção GBV-C e HIV

na resposta ao tratamento antirretroviral. O estudo brasileiro publicado em 2006

por Souza e colaboradores

, avaliou o efeito de GBV-C RNA na resposta a

terapia antirretroviral em indivíduos HIV positivos virgens de tratamento

antirretroviral que tiveram suas amostras de plasma colhidas e estocadas -70

antes do início da terapia. Foi encontrado uma maior redução da carga viral de

HIV para o grupo com GBV-C RNA positivo medido na semana 24, 32 e 48 após

o início do tratamento antirretroviral em comparação ao grupo GBV-C RNA

negativo, sendo p=0,009. Porém, no que se refere à avaliação da resposta

imunológica, não houve diferença entre os grupos nas respectivas semanas após

o tratamento. Os autores concluíram que provavelmente esse resultado decorreu

de um efeito direto da viremia de GBV-C sobre a replicação de HIV, sendo esse

um mecanismo provável de interação benéfica entre esses dois vírus.

Dos 203 pacientes dos quais obtivemos informações quanto ao tratamento,

apenas três pacientes não tinham usado nenhum esquema terapêutico desde o

diagnóstico de HIV. A grande maioria das pacientes foi amplamente

experimentada no que se refere ao uso de antirretrovirais, com uma mediana de

troca de quatro esquemas durante o tempo de acompanhamento deste estudo.

Na análise por categoria de trocas de antirretrovirais, observamos que a maior

parte das pacientes apresentava de 0-3 e 4-7 trocas, ou seja, uma população de

pacientes bastante experimentada ao longo do acompanhamento da infecção por

HIV.

As trocas de esquemas terapêuticas têm como objetivo o alcance de um

controle virológico e imunológico ótimo das pacientes ou amenização da

toxicidade relacionada ao uso dos mesmos. Para a análise do motivo de troca da

terapia, obtivemos informações em prontuários médicos de apenas 129 pacientes

uma vez que foi bastante frequente a anotação da troca do esquema sem,

contudo, o registro do motivo da mesma. Não foi encontrada associação

estatisticamente significativa entre o motivo da troca e o perfil do GBV-C. Ou seja,

não podemos a partir desses resultados, atribuir uma maior frequência da

variável clínica-laboratorial falência aos antirretrovirais, a um determinado perfil

de GBV-C. O que se pretendia com o estudo da variável tratamento antirretroviral

estratificada pelo perfil de GBV-C era demonstrar a possibilidade de evitar

alterações na terapêutica antirretroviral no grupo exposto a GBV-C, uma vez que

partimos do pressuposto de que nesse grupo haveria pacientes com menor

necessidade de troca dos esquemas antirretrovirais, baseado na hipótese de que

a exposição a GBV-C conduz a um aumento da contagem de linfócitos T CD4 e

redução de carga viral de HIV, e consequente maior chance de sucesso

terapêutico.

De fato, alguns poucos estudos conseguiram comprovar tal associação.

Os resultados de dois estudos de coorte observacional publicados em 2003 por

Nunnari e colaboradores

e Rodriguez e colaboradores

concluíram que os

indivíduos infectados com GBV-C em uso de HAART apresentaram maior chance

de uma resposta virológica completa e um aumento sustentado da contagem de

linfócitos T CD4. Contudo, a metodologia de ambos os estudos é sujeita a críticas.

Por exemplo, no estudo de Rodriguez e colaboradores

, a determinação do

perfil de GBV-C de algumas amostras foi feita após a introdução do HAART e, à

semelhança do que pode ter ocorrido em nosso estudo, os autores ressaltam a

possibilidade de alguns pacientes terem sido expostos ao GBV-C durante o

seguimento do estudo. Ou seja, a comparação entre os grupos GBV-C RNA

positivo e negativo no que se refere à resposta da terapia antirretroviral medida

por aumento dos valores da contagem de linfócitos T CD4 e redução de carga

viral ao longo do seguimento ficou prejudicada, uma vez que indivíduos negativos

poderiam ter se tornado GBV-C RNA positivos ou vice versa. Já no estudo de

Nunnari e colaboradores

, a principal crítica é que a grande maioria dos

pacientes já havia sido exposta à terapia antirretroviral previamente a

determinação do perfil de GBV-C.

Brumme e colaboradores

, em um estudo de coorte retrospectiva para

avaliar a influência do GBV-C RNA na resposta à terapia antirretroviral, não

demonstraram efeito benéfico na viremia de HIV em 40 meses, cerca de três

anos de acompanhamento dos pacientes. Houve apenas uma menor mediana

de carga viral de HIV no grupo GBV-C RNA positivo e uma tendência, ou seja,

uma diferença não estatística de maior mediana na contagem de linfócitos T CD4

nesse mesmo grupo. Porém, vale ressaltar ainda que o trabalho não fez

diferença entre o grupo que apresentava anti-E2 positivo, o que indicaria uma

exposição prévia ao RNA desse vírus. Sabemos que, uma eventual vantagem na

sobrevida nos pacientes anti-E2 positivos quando comparados com os indivíduos

não expostos a GBV-C pode ser explicada pela exposição prévia a GBV-C em

algum momento na evolução da doença por HIV.

O que tem sido demonstrado na literatura, é que a infecção persistente por

GBV-C parece ser necessária para os efeitos benéficos e o clareamento da

infecção por esse vírus precocemente no curso da infecção por HIV não promove

manutenção desses efeitos. Corroborando tal achado, Williams e colaboradores

demonstraram em estudo que os pacientes HIV positivos cujo RNA de GBV-C

é clareado durante o seguimento, apresentaram uma maior taxa de mortalidade

do que aqueles com infecção ativa persistente por GBV-C, ou seja, GBV-C RNA

persistentemente positivo. Em conclusão, os trabalhos ressaltam que talvez a

persistência da infecção por GBV-C seja a chave para associação entre GBV-C e

a melhora da sobrevida em pacientes co-infectados.

Quanto à determinação do número de óbitos na nossa população ao longo

do acompanhamento das mesmas, utilizamos informações provenientes do

banco de dados sobre mortalidade por aids do Programa de Aprimoramento das

Informações de Mortalidade no Município de São Paulo (PRO-AIM). Bronhara e

colaboradores

, avaliando o desempenho da vinculação determinística no

banco de óbito por aids desse programa, concluíram que o mesmo proporcionou

a maior cobertura dos casos estimados de óbitos por aids ocorridos no período

estudado, com maior quantidade de informações completas e melhor localização

geográfica dos casos. Os autores atribuíram a melhor eficácia desse banco ao

fato de utilizar um procedimento de busca ativa realizada a partir das declarações

de óbito a qual resulta em melhor informação. Consideramos, portanto, que as

informações obtidas por esse banco de dados em nosso estudo foram

consideravelmente confiáveis.

Analisando o risco relativo de óbito entre os grupos, encontramos

diferença estatística apenas entre o grupo GBV-C RNA-/anti-E2- e GBV-C

RNA+/anti-E2-, sendo o risco relativo de morte 63% menor nesse último. Na

análise uni-variada de sobrevida média utilizando o método de Kaplan-Meier

conseguimos demonstrar que o grupo GBV-C RNA positivo apresentou uma

maior sobrevida ao longo de 10 anos de acompanhamento do nosso estudo. Do

mesmo modo, a análise de sobrevida tendo como variáveis a contagem de

linfócitos T CD4 e carga viral de HIV, separadas por categorias, também

demonstrou diferença estatística.

Utilizando-se de uma análise regressão múltipla de Cox, na qual

associamos variáveis clínicas e laboratoriais, fomos capazes de definir que

apenas as variáveis carga viral maior ou igual a 100.00 cópias/mL e/ou ter tido

doença definidora de aids no acompanhamento do estudo tiveram risco relativo

maior de óbito, independente da viremia de GBV-C. Em outras palavras, a partir

desse resultado, podemos concluir que o efeito protetor de GBV-C na sobrevida

das pacientes demonstrado na análise de Kaplain-Meier, não foi um fator

independente de alteração dos valores da contagem de linfócitos T CD4 e da

carga viral de HIV, sugerindo que a viremia de GBV-C não esteve associada à

mudanças nessas duas variáveis laboratorias, amplamente utilizadas no manejo

clínicos de doentes com a infecção por HIV como indicadores e preditores

confiáveis de progressão da doença.

Em conclusão, alguns estudos publicados conseguiram demonstrar que

poderia existir uma associação entre a infecção por GBV-C e a maior sobrevida

em pacientes HIV positivos, porém não demonstraram uma relação de

causalidade entre estes eventos. Os mecanismos de tal efeito protetor

permanecem por ser investigados. O fato é que ambos os vírus infectam e se

replicam em células mononucleares do sangue periférico (PBMC’s) sugerindo

que possam interagir direta ou indiretamente no ciclo celular

Entre o período de 2006 a 2008, realizamos novamente a determinação do

perfil de GBV-C. Porém, a coleta foi realizada em apenas 57 pacientes das 248

incluídas no início do estudo. Considerando-se que houve 43 óbitos durante o

acompanhamento das pacientes, obtém-se uma taxa de retorno de 57/205= 28%,

muito abaixo do esperado. As razões para essa baixa anuência foram: um

número significativo de pacientes desligou-se do atendimento de suas instituições,

algumas pacientes recusaram em participar da segunda análise do estudo ou não

compareceram à entrevista agendada pelo médico infectologista após contato via

telefone para processar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e então

coleta da amostra de sangue.

Encontramos apenas quatro novos casos de infecção por GBV-C ao longo

de 10 anos de acompanhamento (três pacientes GBV-C RNA - / anti-E2 - na

primeira coleta e GBV-C RNA +/ anti-E2 – na segunda coleta e um paciente GBV-

C RNA -/anti-E2- na primeira coleta e GBV-C RNA -/anti-E2+ na segunda coleta).

Entretanto, parece que a incidência de GBV-C RNA seja mesmo pequena.

No estudo de Nunnari e colaboradores

, no que se refere a determinação do

perfil de GBV-C, os autores realizaram nesse estudo duas medidas de GBV-C,

uma no início e outra no final de oito anos de seguimento e não encontraram

nenhuma exposição a GBV-C durante esse período. Segundo Stapleton e

colaboradores

, a aquisição de GBV-C usualmente precede a aquisição de HIV,

sendo infrequente a aquisição de GBV-C após uma infecção por HIV já bem

estabelecida.

O resultado da comparação dos valores médios e medianos entre a

variação (final menos basal) da contagem de linfócitos TCD4 e da carga viral do

HIV de pacientes persistentemente positivas e negativas (em relação a presença

de GBV-C RNA), não demonstrou um maior aumento na contagem de linfócitos T

CD4 e ou uma maior redução de carga viral do HIV no grupo GBV-C RNA

persistentemente positivo, o que representaria um efeito protetor de progressão

da doença por HIV, comparado ao grupo GBV-C RNA persistentemente negativo.

Nosso estudo apresentou algumas limitações. Foi conduzido em pacientes

com diagnóstico de infecção por HIV já definido, sendo a grande maioria já sob

uso de terapia antirretroviral. Dessa forma, não conseguimos determinar o

momento da soroconversão para HIV, nem tão pouco de GBV-C e,

principalmente, excluir o uso da terapia antirretroviral como importante fator

contribuidor de melhora de sobrevida entre os grupos.

Uma crítica ao nosso estudo é que a análise de sobrevida das 248

pacientes iniciou-se em 1996, período marcado pela introdução do HAART em

diversos centros de referência e tratamento em DST/aids no Brasil. Nosso

trabalho de coorte retrospectiva iniciou-se no momento da determinação do perfil

de GBV-C em amostras de pacientes coletadas entre 1996 a 1998. Desde essa

data, a maioria das pacientes já havia sido exposta à terapia antirretroviral seja a

monoterapia, terapia dupla e ou ao esquema HAART, caracterizado por compor

um esquema antirretroviral de alta potência com no mínimo três drogas, sendo

dois inibidores da transcriptase reversa análogos de núcleos(t)ídeo (ITRN),

associados a um inibidor da transcriptase reversa não-análogo de núcleosídeos

(ITRNN) ou a um inibidor de protease (IP) no esquema terapêutico. Assim, nosso

estudo tem como viés o uso de terapia antirretroviral como um importante fator

determinante de melhor sobrevida como já foi discutido, e, não necessariamente,

devido à presença de RNA GBV-C como fator protetor como visto em alguns

trabalhos. É possível que GBV-C seja um marcador da presença de outros

fatores que resultam em retardo na progressão da infecção por HIV ou que GBV-

C atue diretamente como causador da redução da replicação de HIV.

Além disso, temos que admitir que estudamos uma população feminina

selecionada, por se tratar de pacientes seguidas em dois grandes centros

acadêmicos de referência em tratamento de DST/aids no Estado de São Paulo.

Ora, não resta dúvida que estes centros dispõem de acompanhamento

laboratorial e manejo clínico cuidadoso e adequado dos pacientes HIV positivos

por médicos especialistas bem treinados e eficientes, além de grande

possibilidade de investigação e detecção de doenças oportunísticas, e de

acompanhamento psicológico dos pacientes por pessoal treinado presente

amiúde nesses centros. Certamente essa disponibilidade de serviços oferecidos

aos pacientes nesses centros de atendimento, altera de forma considerável a

sobrevida dos mesmos. Reconhecemos, portanto, que todos os recursos

humanos e laboratoriais para o atendimento destas pacientes nesses centros são

fundamentais, sem os quais, a administração pura e simples da terapêutica

antirretroviral e ou até mesmo a viremia persistente de GBV-C, não seriam

suficientes para mudar o prognóstico da infecção por HIV.

Uma outra importante limitação do nosso estudo é o seu caráter

retrospectivo e a possibilidade de vieses. Os dados registrados foram obtidos da

transcrição de prontuários médicos proporcionando perda da qualidade de

aferição das informações. De fato, houve uma grande variação na qualidade das

informações colhidas, pois muitos prontuários avaliados estavam incompletos,

sendo alguns excluídos por completo durante o processo de amostragem. Ainda,

não foi possível descartar possíveis vieses do observador, decorrentes da

interpretação subjetiva desses registros, principalmente em relação aos dados

epidemiológicos.

Conclusões

• A prevalência da viremia por GBV-C é de 23% e a do anticorpo anti-E2 é

23%, perfazendo uma freqüência de exposição ao GBV-C de 46%.

• A melhora da sobrevida entre as mulheres expostas ao GBV-C em relação

as não expostas na análise uni-variada demonstrou provável associação

com a presença do RNA do GBV-C, contudo, a análise multi-variada

demonstrou que apenas a carga viral maior de 100.000 cópias/mL e ou

manifestações de doenças oportunísticas ao longo do seguimento

estiveram associadas à melhora da sobrevida.

• O risco relativo de óbito para o grupo GBV-C RNA +/ anti-E2 - é 63%

menor do que para o grupo GBV-C RNA- / anti-E2 - .

• Não houve correlação entre a carga viral do GBV-C e as contagens de

linfócitos T CD4 e carga viral do HIV.

• A população estudada foi bastante experimentada no que se refere ao uso

de antirretrovirais para o tratamento da infecção do HIV.

• Provavelmente a terapia antirretroviral foi fator limitante na análise de

efeito protetor do GBV-C RNA em pacientes infectadas pelo HIV.

• A análise de associação do GBV-C com o VHB e VHC durante o

acompanhamento do estudo ficou prejudicada pois não dispusemos de

dados quanto a presença desses vírus no início do estudo.

• Os mecanismos do efeito protetor da co-infecção GBV-C e HIV

permanecem por ser investigados.

Anexo 1: Impresso de Pesquisa

PROJETO DE PESQUISA

“A INFLUÊNCIA DO VÍRUS DA HEPATITE G (GBV-C) NA EVOLUÇÃO DA

INFECÇÃO PELO HIV EM MULHERES”

1. IDNUM:_____________Iniciais:____________

2. Status GBV-C: Coleta 1:_______ Coleta 2:________

3. Data da 1ª sorologia positiva para HIV: _________________

4. Exposição so HIV: Parenteral: - Uso de drogas injetáveis: 1

- Transfusão sanguínea : 2

Sexual: 3

Ignorado: 4

5. Doença definidora de aids: Sim: 1 Não: 2

____________________________________________________________

6. Uso de terapia antirretroviral:

7. Data início da TARV:________________________________

8. Número de trocas de ARV’s: _________________________

9. Motivo de trocas de ARV’s: - Falência 1

- Efeito adverso 2

- Ignorado 3

10. ARV’s usados:

____________________________________________________________

11. Sorologias:

-Hepatite B: AgHbs + : 1 AgHbs - : 2

-Hepatite C: antiVHC + : 1 antiVHC - : 2

-HTLV1/2: + : 1 - : 2

Anexo 2: Classificação internacional de doenças (CID) das

causas de óbitos

E-872: Acidose

B-202: Doença pelo HIV resultando em doença citomegálica

B-238: Doença pelo HIV resultando em outra afecção não especificada

B-207: Doença pelo HIV resultando em infecções múltiplas

B-208: Doença pelo HIV resultando em outras doenças infecciosas e

parasitárias

B-203: Doença pelo HIV resultando em outras infecções virais

A-169: Tuberculose respiratória, não especificada, sem menção de

confirmação bacteriológica ou histológica

B-201: Doença pelo HIV resultando em outras infecções bacterianas

B-227: Doença pelo HIV resultando em doenças múltiplas classificadas em

outra parte

B-206: Doença pelo HIV resultando em pneumonia por pneumocistis carinni

E-149: Diabetes melito não especificado, sem complicações

B-200: Doença pelo HIV resultando em infecções micobacterianas

C-211: Neoplasia de canal anal

Anexo 3: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

HOSPITAL DAS CLÍNICAS

FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

(Instruções para preenchimento no verso)

__________________________________________________________________

I - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU

RESPONSÁVEL LEGAL

NOME DO PACIENTE

.:............................................................................

DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ........................................ SEXO : .M



DATA NASCIMENTO: ......../......../......

ENDEREÇO ................................................................................ Nº ........APTO:........

BAIRRO:..................................................................... CIDADE .................................

CEP:.........................................TELEFONE: DDD (.......) ...........................................

2.RESPONSÁVEL

LEGAL ...........................................................................................................................

NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.) .................................................

DOCUMENTO DE IDENTIDADE :....................................SEXO: M



DATA NASCIMENTO.: ....../......./......

ENDEREÇO:............................................................................................. Nº............... APTO: .............................

BAIRRO:........................................................................... CIDADE: ......................................................................

CEP:............................................. TELEFONE:DDD (..........)...............................................................................

_________________________________________________________________________________________

II - DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA

1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA.- “

A influência da infecção pelo vírus da hepatite G

(HGV) na evolução da doença pelo HIV em mulheres

”

PESQUISADOR: .José Eduardo Levi

CARGO/FUNÇÃO: Biolgista Molecular INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº 23.407/01-D

UNIDADE DO HCFMUSP: Laboratório de Investigação Médica em Virologia (LIM-52)

3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA:

SEM RISCO



RISCO MÍNIMO

RISCO MÉDIO



RISCO BAIXO



RISCO MAIOR



(probabilidade de que o indivíduo sofra algum dano como consequência imediata ou tardia do estudo)

4.DURAÇÃO DA PESQUISA : 18 meses

_________________________________________________________________________________________

A Sra. está sendo convidada a participar de um estudo sobre a infecção pelo HGV (Vírus da

Hepatite G Humano). Embora este vírus tenha este nome, ele não causa hepatite, e até o

momento não se conhece nenhuma outra doença causada por ele. O que se descobriu é que o

HGV parece ter uma influência benéfica nas pessoas infectadas pelo HIV, aumentando a

sobrevida e retardando a evolução da AIDS. Essa informação ainda é debatida entre os

pesquisadores e nós queremos verificar se isso, a “proteção” pelo HGV, acontece também em

uma população de mulheres infectadas pelo HIV.

Para poder efetuar este estudo precisamos investigar mulheres com HIV que venham

sendo acompanhadas há um longo tempo, > 5 anos, com informações precisas de sua

evolução clínica, e exames laboratoriais documentados (Carga Viral HIV e CD4), além da

existência de amostras coletadas há mais de 5 anos e estocadas corretamente.

Como a Sra. participou em 1997-1999 de um estudo sobre o Papilomavírus Humano

(HPV, vírus de infecção genital) existem amostras de seu sangue que foram estocadas e

servem para verificar se na época o vírus da hepatite G estava presente. Pretendemos também

fazer um teste de seu sangue atualmente, para assim compararmos sua evolução clínica e

laboratorial em relação à Aids e se houve alguma influência do HGV nesta evolução.

Sua participação ou recusa em participar deste estudo, ou sua decisão de abandonar o

estudo em qualquer momento, não implicará em qualquer alteração na qualidade de seu

atendimento médico. Nenhum exame a mais será solicitado ou colhido sem que seja

solicitado pelo médico lhe atendendo. Você terá livre acesso a todas informações relativas a

esta pesquisa e à sua participação nela, em qualquer momento que desejar. Os dados desta

pesquisa serão mantidos em sigilo, sendo disponíveis apenas para o prórpio paciente, o

médico lhe assistindo e os pesquisadores envolvidos.

Consinto que seja utilizado material de meu sangue colhido no passado e na data atual no

estudo científico acima descrito. Entendo que não será realizada nenhuma coleta de exame

adicional ao necessário para meu acompanhamento normal. Declaro que, após

convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o que me foi explicado, consinto

em participar do presente Protocolo de Pesquisa.

São Paulo, de de 200 .

Nome

Assinatura

Data __/__/__

(carimbo ou nome Legível) Médico responsável:

Coordenador do Estudo: Dr. José Eduardo Levi – Instituto de Medicina Tropical da

Universidade de São Paulo, fone 11 3062 2645, e-mail : [email protected]

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