( PDF ) Detecção mediante técnica de PCR e caracterização molecular de Xanthomonas albilineans, agente causal da escaldadura das folhas em cana-de-açúcar

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Kirley Michelly Marques da Silva

DETECÇÃO MEDIANTE TÉCNICA DE PCR E CARACTERIZAÇÃO

MOLECULAR DE Xanthomonas albilineans, AGENTE CAUSAL DA

ESCALDADURA DAS FOLHAS EM CANA-DE-AÇÚCAR

Universidade Federal de Alagoas

Centro de Ciências Agrárias

Curso de Pós-Graduação em Agronomia

RIO LARGO, ESTADO DE ALAGOAS

FEVEREIRO DE 2006

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Kirley Michelly Marques da Silva

DETECÇÃO MEDIANTE TÉCNICA DE PCR E CARACTERIZAÇÃO

MOLECULAR DE Xanthomonas albilineans, AGENTE CAUSAL DA

ESCALDADURA DAS FOLHAS EM CANA-DE-AÇÚCAR

RIO LARGO – ESTADO DE ALAGOAS – BRASIL

FEVEREIRO DE 2006

Dissertação apresentada à Coordenação do Curso de

Mestrado em Agronomia, Área de Concentração em Produção

Vegetal, como requisito parcial para a obtenção do grau de

Mestre em Ciências.

Departamento de Fitotecnia e Fitossanidade

Centro de Ciências Agrárias

Universidade Federal de Alagoas

Orientação: Profº Dr. Gaus Silvestre de Andrade Lima

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III

TERMO DE APROVAÇÃO

DETECÇÃO MEDIANTE TÉCNICA DE PCR E CARACTERIZAÇÃO

MOLECULAR DE Xanthomonas albilineans, AGENTE CAUSAL DA

ESCALDADURA DAS FOLHAS EM CANA-DE-AÇÚCAR

Kirley Michelly Marques da Silva

(Matrícula 2004M21D09S-9)

BANCA EXAMINADORA:

______________________________________

Profº. Dr. Gaus Silvestre de Andrade Lima

Centro de Ciências Biológicas

Departamento de Botânica

______________________________________

Dra. Arlinda Pereira Eloy

Centro de Ciências Agrárias

Departamento de Fitotecnia e Fitossanidade

______________________________________

Profª. Dra. Edna Peixoto da Rocha Amorim

Centro de Ciências Agrárias

Departamento de Fitotecnia e Fitossanidade

______________________________________

Dra. Iraíldes Pereira Assunção

Centro de Ciências Agrárias

Departamento de Fitotecnia e Fitossanidade

Rio Largo, Estado de Alagoas, Brasil, em 23 de Fevereiro 2006.

OFEREÇO

Aos meus familiares que, mesmo distantes, sempre me apoiaram, em especial

os tios PAULO, PAULA e MARGARETH. A minha amiga THALITA REGINA

pelos ensinamentos da vida e alegria,

minha HOMENAGEM

Primeiramente ao Deus Todo Poderoso que me

deu Forças, Saúde e Paz para conduzir esse

trabalho.

Aos meus irmãos LINDEMBERG e JÚNIOR, pela

amizade.

A minha sobrinha amada LARISSA JULIE, pela

alegria.

A minha amiga ALANA pelo apoio.

Ao meu amado MANOEL MESSIAS pela ajuda,

amor e companheirismo.

Aos meus amados pais GILBERTO

MARQUES (in memoriam) e

FRANCISCA PEREIRA, pelo amor e

exemplo de dedicação, empenho,

paciência, honestidade e perseverança

que sempre tiveram,

DEDICO

“É melhor tentar e falhar, que se preocupar e ver a vida

passar. É melhor tentar, ainda que em vão, que se sentar

fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar, que

em dias tristes em casa me esconder. Prefiro ser feliz, embora

louco, que em conformidade viver"

Martin Luthen King Jr.

AGRADECIMENTOS

A Universidade Federal de Alagoas (UFAL), pela oportunidade de aprimoramento

profissional.

Em especial ao Professor Drº Gaus Silvestre de Andrade Lima, pelas orientações,

amizade e paciência constante.

A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas (FAPEAL), pela concessão

da bolsa de estudos.

Aos docentes do Departamento de Fitopatologia, Profª Drª Iraíldes Assunção e Profº

MsC. Marcelo Cruz, pelo apoio, amizade e ensinamentos.

A Coordenadora do Curso de Pós-Graduação, Profª Drª. Edna Peixoto da Rocha

Amorim, pela amizade, ensinamentos, paciência e acima de tudo apoio que sempre

tivera.

A todos os funcionários do Laboratório de Fitopatologia, pela amizade.

Ao Programa de Melhoramento Genético da Cana-de-Açúcar, na pessoa do Profº

MsC. Geraldo Veríssimo Barbosa, pelo apoio durante a realização deste trabalho.

Aos amigos que me incentivaram e me apoiaram nos momentos difíceis que passei:

Izael Oliveira, Paulo Pedro, Juliana Paiva, Júlio César, Sarah Jacqueline, Muciana Cunha,

Márcio Félix e Kátia Cilene.

Ao secretário e amigo Geraldo Lima, pela amizade e disponibilidade que sempre

mostrou.

Ao Profº Drº. Júlio Cezar Franco de Oliveira, UNESP-Jaboticabal, pelas amostras da

bactéria que me concedera.

A todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste

trabalho.

VII

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS

VIII

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE ABREVIAÇÕES

RESUMO

XII

ABSTRACT

XIII

Introdução

Revisão da literatura

2.1.

Histórico, Etiologia e Importância Econômica da Escaldadura das

folhas

2.2.

Sintomatologia da Escaldadura das folhas

2.3.

Epidemiologia da Escaldadura das folhas

2.4.

Variabilidade genética de X. albilineans

2.5.

Diagnose da Escaldadura das folhas

Metodologia

3.1.

Local de execução dos trabalhos

3.2.

Detecção de X. albilineans por meio da técnica de PCR

3.2.1.

Obtenção de células de X. albilineans a partir das folhas

3.2.2.

Obtenção de células de X. albilineans a partir dos colmos

3.3.

Composição e ciclagem das PCR’s

3.4.

Incidência de X. albilineans em variedades comerciais de cana-de-

açúcar do Estado de Alagoas

3.5.

Seqüênciamento da região ITS (16S – 23S) do rDNA do isolado de

X. albilineans do Estado de Alagoas

3.6.

Comparação da seqüência obtida com outras seqüências

depositadas no GenBank

3.7.

Análise filogenética

Resultados e Discussão

4.1.

Detecção de X. albilineans mediante a técnica de PCR

4.2.

Incidência de X. albilineans no Estado de Alagoas

4.3.

Determinação da seqüência da região ITS (16S – 23S) do isolado de

X. albilineans do Estado de Alagoas

Conclusões

Referências Bibliográficas

VIII

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.

Composição das PCR’s utilizadas na detecção de X. albilineans

Tabela 2.

Similaridade (%) da região ITS (16S – 23S) entre isolados de

Xanthomonas albilineans e de Xanthomonas sacchari

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.

Folhas de cana-de-açúcar com clorose e estria clorótica,

sintomas típico da escaldadura das folhas causada por

Xanthomonas albilineans

Figura 2.

Esquema de uma planta de cana-de-açúcar mostrando os

diferentes órgãos submetidos à extração de células de

Xanthomonas albilineans

Figura 3.

Esquema da região ITS (Intergenic Transcribed Spacer) do DNA

ribossomal de Xanthomonas albilineans

Figura 4.

Reações de amplificação a partir de plantas sabidamente

infectadas (RB 9564). As linhas de 1 a 3 e 17 a 19 correspondem

às amostras do último entrenó (UE). As linhas 4 a 6 e 20 a 22

correspondem às amostras do primeiro entrenó (E1). As linha 7

a 9 e 23 a 25 correspondem às amostras do segundo entrenó

(E2). As linhas 10 a 12 e 26 a 28 correspondem às amostras da

folha +1 e as linhas 13 a 15 e 29 a 31 correspondem às amostras

da folha +3. A linha 32 corresponde ao cont. positivo. A –

amostras de seiva concentradas; B - amostras de seiva diluídas

Figura 5.

Produtos de amplificação obtidos com os primers

PGBL1/PGBL2 para amostras de cana-de-açúcar. A linha 1

corresponde à amostra da variedade VAT 90-212 proveniente da

Usina Caeté; as linhas 2 a 4 correspondem às amostras da

Usina Sinimbú; as linhas 5 a 7 correspondem às amostras do

clone RB 9564 da Serra do Ouro, as linhas 8 a 10 às amostras de

VAT 90-212 da Usina Santo Antônio e a linha 11 representa o

controle negativo

Figura 6.

Seqüência de nucleotídeos correspondente à região ITS (16S-

23S) do DNA ribossomal de Xanthomonas albilineans

amplificada com a utilização dos primers PGBL1/PGBL2

Figura 7.

Seqüências depositadas no GenBank que apresentaram

maiores Score e menores e-value com o isolado de

Xanthomonas albilineans proveniente do Estado de Alagoas

Figura 8.

Alinhamento das seqüências da região ITS 16S-23S do isolado

de Xanthomonas albilineans de Alagoas e de outros isolados

relacionados. xal2005- X. albilineans/AL; Xa-LA- X.

albilineans/LA; ICMP196- X.albilineans/SP; LMG471- X. sacchari

Figura 9.

Árvore filogenética ilustrando o relacionamento do isolado de

Xanthomonas albilineans do Estado de Alagoas com outros

isolados

LISTA DE ABREVIAÇÕES

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

ITS

Espaço Transcrito Intergênico (Intergenic Transcribed Spacer)

Miligrama

Mililitro

Milimolar

µL

Microlitro

µM

Micromolar

Nanograma

PCR

Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain

Reaction)

Picograma

Unidade

XII

RESUMO

A escaldadura das folhas causada pela bactéria Xanthomonas albilineans é

uma das principais doenças da cana-de-açúcar. O diagnóstico desta bacteriose é

muito difícil em conseqüência das dificuldades de isolamento da bactéria e pelo

fato dos sintomas serem confundidos com os sintomas decorrentes de outros

fatores bióticos e abióticos. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver

uma metodologia rápida e precisa, para a diagnose da escaldadura das folhas da

cana-de-açúcar, usando a técnica de PCR, verificar a incidência de X. albilineans

e caracterizar molecularmente um isolado de X. albilineans proveniente do estado

de Alagoas mediante seqüênciamento da região ITS (16S-23S) do rDNA.

Diferentes procedimentos de obtenção de células bacterianas a partir do colmo e

folhas para serem usadas diretamente nas PCR’s foram avaliados. Posteriormente

foi realizado o seqüênciamento da região amplificada. Constatou-se a ocorrência

de X. albilineans em vários canaviais do Estado de Alagoas. A obtenção de

células bacterianas a partir de fragmentos de colmos imersos em água destilada

demonstrou ser a melhor alternativa para a diagnose da escaldadura das folhas

por PCR. O seqüênciamento do produto de PCR revelou uma seqüência de 271

nucleotídeos que quando submetidas no GenBank gerou mais de 60 seqüências

correspondentes a Xanthomonas spp com elevado score e e-value próximo à

zero. A maior identidade (98,2%) foi observada para um isolado de X. albilineans

proveniente dos Estados Unidos.

Termo para indexação: Diagnose molecular, detecção, filogenia molecular

XIII

ABSTRACT

Sugarcane leaf scald disease by Xanthomonas albilineans is one of the

mainly diseases found at sugarcane. This bacteriose has a very difficult diagnose,

considering the difficulties of isolating the bacterium and the common confusions

between the symptoms decurrently of other biotic and abiotic factors. The aim of

this study is to develop a fast and accurate methodology to diagnose sugarcane

leaf scald disease, using a technique of PCR’s, to determine the incidence of

sugarcane leaf scald, and to molecularly characterize, trough sequencing the rDNA

ITS region (16S – 23S), an isolated of X. albilineans. Different procedures for

obtain bacterial cells from stem and leaves for directly used in the PCR’s.

Subsequently, a sequencing of the amplified region by PCR was accomplished.

Xanthomonas albilineans was detected in various regions in the Alagoas state. The

bacterial cells from stem fragments in distilled water, was the best alternative for

diagnosis of sugarcane leaf scald disease. Sequencing of PCR products revealed

a fraction of 271 nucleotides which, when submitted to GenBank had generated

more than sixty representatives series of Xanthomonas spp with high scores end

e-value close to zero. The highest homologies (98,2%) was observed for one

isolated from X. albilineans from United States.

Index terms: Molecular diagnoses, detection, molecular filogeny.

1. INTRODUÇÃO

Até a década de 1970 a cultura da cana-de-açúcar desenvolveu-se em

diferentes regiões do Brasil, constituindo verdadeiros pólos açucareiros (MASUDA,

1980). Hoje o cultivo desta cultura constitui-se numa das principais atividades

econômicas do Brasil devido à produção de açúcar e do álcool, sendo o país

responsável por 25% da produção mundial (ALMEIDA et al., 2003). Em 2005, a

produção do País foi de 440 milhões de toneladas de cana-de-açúcar, 5,7%

superior à safra 2004, calculada pelo IBGE. Estima-se que mais de 5.9 milhões de

hectares sejam plantados em todo o Brasil, sendo 430 mil hectares só no estado

de Alagoas. O cultivo da cana-de-açúcar é a principal atividade agrícola do Estado

e maior empregadora de mão-de-obra, sendo estimado em torno de 18 postos de

trabalho/ha o que significa aproximadamente 700 mil empregos diretos (CONAB,

2006).

Apesar de rústica, a cana-de-açúcar sofre a incidência de uma vasta gama

de patógenos que isoladamente ou em conjunto podem reduzir consideravelmente

sua produção. Dentre os agentes fitopatogênicos, as bactérias podem causar

sérias perdas devido à falta de métodos de identificação e controle eficientes. As

bactérias patogênicas da cana-de-açúcar incluem: Acidovorax avenae subsp.

avenae, Herbaspirillum rubrisubalbicans, Pantoea ananas, Pseudomonas syringae

pv. syringae, Xanthomonas axonopodis pv. vasculorum (syn X. campestris pv.

vasculorum tipo A), X. vasicola pv. vasculorum (syn. X. campestris pv. vasculorum

Tipo B), Xanthomonas albilineans e Leifsonia xyli subsp. xyli (BRADBURY, 1986;

RAHIMIAN, 1995; BALDANI et al., 1996; YOUNG et al., 1996; EVTUSHENKO et

al., 2000).

No Nordeste brasileiro, a escaldadura das folhas é uma das principais

doenças da cana-de-açúcar. O diagnóstico dessa doença é muito difícil em

conseqüência das dificuldades de isolamento da bactéria e pelo fato dos sintomas

serem confundidos com os sintomas decorrentes de outros fatores bióticos e

abióticos, como a incidência de fitoplasmas, estresse hídrico, fitotoxidez por

herbicidas, etc.

Métodos sorológicos e microscópicos foram desenvolvidos para

diagnosticar a escaldadura das folhas, mas apresentam várias desvantagens, pois

só são eficientes quando a bactéria atinge altas concentrações, momento em que

a produção já está comprometida e o patógeno disseminado para outras plantas

(HONEYCUTT et al., 1995). Esses métodos vêm sendo substituídos pelas

técnicas moleculares, principalmente pela PCR (reação da polimerase em cadeia),

que apresenta muitas vantagens em relação às técnicas convencionais. Sua

sensibilidade é muito alta, podendo detectar o patógeno em concentrações até

cem vezes menores que a concentração necessária para detecção por métodos

sorológicos. A velocidade do processamento das amostras também é outra

característica favorável da técnica de PCR. Adicionalmente, a diagnose mediante

PCR independe da fase de desenvolvimento da planta e de infecções por outros

patógenos ou de fatores ambientais.

Apesar dos avanços as metodologias de diagnósticos da escaldadura das

folhas por PCR, ainda depende do isolamento da bactéria e da extração de seu

DNA, assim o desenvolvimento de estratégias para o diagnóstico da escaldadura

das folhas da cana de maneira mais rápida e segura poderá prestar um grande

auxílio para o melhoramento visando resistência genética à doença, desenvolvido

tanto pela RIDESA como para outros programas de melhoramento da cana-de-

açúcar.

Esse trabalho teve como objetivos desenvolver uma metodologia rápida e

precisa para a diagnose da escaldadura das folhas da cana-de-açúcar e

caracterizar molecularmente um isolado de X. albilineans proveniente do estado

de Alagoas, mediante o seqüênciamento da região intergênica (ITS 16S-23S) do

rDNA.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Histórico, Etiologia e Importância Econômica da Escaldadura das folhas

A escaldadura das folhas em cana-de-açúcar foi, primeiramente registrada

na Austrália em 1911 por North, mas fortes evidências indicam sua ocorrência nas

Ilhas Fiji em 1908 (DAVIS et al., 1997). A causa da doença foi descoberta,

independentemente, e descrita em 1920 por Wilbrink em Java e por North na

Austrália. Logo depois, a doença foi encontrada nas Filipinas, Mauricius e Hawaii.

Por volta de 1961, à escaldadura das folhas fôra relatada em 22 países produtores

de cana-de-açúcar e atualmente a sua ocorrência já foi constatada em

praticamente todas as áreas produtoras. Em alguns países, a doença é um fator

limitante na produção de cana-de-açúcar e um dos principais focos do

melhoramento genético da cultura (DAVIS et al., 1997). A escaldadura das folhas

trata-se de uma bacteriose vascular, cujo agente causal, Xanthomonas albilineans,

é restrita ao xilema.

Segundo ARRUDA (1944) X. albilineans foi introduzida no Brasil em 1929,

com a importação do cultivar Badila, da Austrália. A primeira ocorrência dessa

doença no país foi feita em Piracicaba-SP e municípios vizinhos além de Campos,

no Rio de Janeiro.

Xanthomonas albilineans foi primeiramente nomeada como Bacterium

albilineans por ASHBY 1929

(apud MARTIN et al., 1961), posteriormente foi

proposto o gênero Phytomonas em lugar de Bacterium por ser, seguramente, uma

bactéria que causava doenças em plantas, e em decorrência da sintomatologia

ficou conhecida como Phytomonas albilineans (ASHBY) MANGROU.

Em uma nova reclassificação proposta por DOWSON (1943), o gênero

Xanthomonas foi criado e passou a incluir “...bactérias com pigmentação amarela,

apresentando único flagelo polar...”. Por possuir essas características, P.

albilineans foi reclassificada como Xanthomonas albilineans (ASHBY) DOWSON

(1943). Sua taxonomia atual é: filo Proteobacteria, ordem Xanthomodales, família

Xanthomonadaceae (BIRCH, 2001).

Xanthomonas albilineans é uma bactéria gram-negativa, não fastidiosa,

aeróbica, medindo 0,25-0,3 x 0,6-1,0 μm, possui um único flagelo polar, não é

redutora de nitrato, apresenta atividade da enzima catalase e não usa asparagina

como única fonte de carbono e nitrogênio (KIMATI et al., 2005; SCHAAD, 1988).

Segundo TOKESHI (1980), quando recentemente isolada, a bactéria é de

crescimento lento em meio de cultura, produzindo pequenas colônias amareladas,

brilhantes, convexas e de bordos lisos.

O meio de cultura mais recomendado para o crescimento de X. albilineans

é o de Wilbrink (WILBRINK, 1920

apud AKIBA, 1978), porém os resultados de

AKIBA (1978) com meio Wilbrink modificado (W-2) proporcionou melhores

resultados de crescimento com menor tempo de incubação do que os obtidos com

o meio original. NORTH, segundo KOIKE (1972), cita que há perda de

patogenicidade quando a bactéria é cultivada “in vitro” por tempo prolongado. Em

meio Wilbrink líquido a 28ºC, a suspensão de X. albilineans com 60% de

transmitância no espectrofotômetro a 625 nm de comprimento de onda, equivale a

aproximadamente 8x10

células/mL (AKIBA, 1978). Outros meios também foram

ASHBY, S. F. The bacterium which causes gumming disease of sugarcanes with notes

on two other bacterial diseases of the same host. Trop. Agric. 6, 135-138. 1929.

utilizados para cultivo de X. albilineans obtendo resultados satisfatórios como, por

exemplo, o meio em caldo de cana (MONACO et al., 2004).

A temperatura ótima de crescimento desta bactéria é de 25 a 28ºC (KIMATI

et al, 2005). No entanto, o crescimento pode ocorrer até 37ºC (BREED et al.,

1957).

Durante o crescimento da bactéria, há produção de um polissacarídeo

chamado xantana. A xantana é obtida a partir de bactérias do gênero

Xanthomonas, que vivem em alimentos como o milho e a cana-de-açúcar e que,

durante sua nutrição, produzem essa goma. Esse polissacarídeo trata-se de uma

grande molécula que dá consistência e homogeneidade a produtos variados. Essa

molécula, atualmente, é utilizada nas indústrias de alimento e farmacêutica

(UNESP, 2005).

Além da cana-de-açúcar, outras espécies de gramíneas (Família Poaceae)

podem ser hospedeiros alternativos de X. albilineans. A infecção natural ocorre em

Zea mays, quando cresce perto de cana-de-açúcar infectada, como também

Brachiaria piligera, Imperata cylindrica, Panicum maximum, Paspalum spp.,

Pennisetum purpureum e Rottboellia cochinchinensis em regiões com cana-de-

açúcar (SORDI, 1986). As espécies do gênero Bambusa vulgaris, Coix lacryma-

Jobi, Cymbopogon citratus, Sorghum verticilliflorum e Thysanolaena máxima

também são susceptíveis quando inoculados artificialmente (ORIAN, 1942).

2.2 Sintomatologia da escaldadura das folhas

Os sintomas da escaldadura das folhas podem manifestar-se em três fases

distintas: a fase latente que é a que prevalece na maioria das variedades

comerciais, que apresentam tolerância convivendo com o patógeno sem

manifestar sintomas externos, a fase crônica caracteriza-se pelo aparecimento de

estrias finas, esbranquiçadas, nas folhas e bainhas; folhas eretas e enroladas com

seca das pontas e um abundante desenvolvimento de brotos laterais,

normalmente no sentido de baixo para cima. Apesar da bactéria ser restrita ao

xilema, os sintomas de clorose na fase crônica resultam em alterações nas células

do clorênquima (Figura 1). A fase aguda caracteriza-se pela repentina murcha e

morte das plantas afetadas, como se a planta tivesse sido escaldada com água

quente (daí o nome escaldadura). Internamente, quando se corta os colmos no

sentido longitudinal, pode-se observar descoloração vascular, de cor avermelhada,

principalmente na região dos nós. Os sintomas internos são mais visíveis em

colmos com sintomas da fase crônica, aparecendo nos colmos com sintomas da

fase aguda, somente nos casos em que há formação de brotos laterais (KIMATI et

al., 2005).

Figura 1 - Folhas de cana-de-açúcar com clorose e estria clorótica, sintomas típico da

escaldadura das folhas causada por Xanthomonas albilineans.

Estudos relatam que a clorose causada em plantas doentes tem origem no

bloqueio da diferenciação dos cloroplastos causado por uma fitotoxina. Este

composto é da família da albicidina, produzido no xilema por X. albilineans. A

fitotoxina inibe a replicação do DNA nos plastídeos, resultando no bloqueio da

diferenciação dos cloroplastos (BIRCH & PATIL, 1987).

A biossíntese de albicidina é altamente regulada em X. albilineans. Como

nos demais organismos produtores de antibióticos, a albicidina é acumulada

quando a cultura de X. albilineans se aproxima da fase estacionária, e não durante

a fase logarítmica. Esta é também muito sensível às condições de cultivo,

incluindo a composição do meio. A produção de albicidina é estimulada na

ausência de fosfato ou é fortemente inibida por vários aminoácidos que,

substancialmente, estimulam o crescimento do patógeno (ZHANG et al., 1998)

apud BIRCH (2001).

Clorose

Estria clorótica

FONTE: www.plantpathology.famu.edu

Segundo BIRCH & PATIL (1987), os mutantes de X. albilineans que não

produzem albicidinas também não são capazes de produzir sintomas cloróticos ou

de algum outro sintoma sistêmico em cana-de-açúcar inoculada. Isto indica que as

albicidinas são responsáveis pelos sintomas cloróticos em cana-de-açúcar e que

desempenham um papel importante na enfermidade (OCPI, 1998). Trabalhos

recentes vêm sendo feitos visando à obtenção de uma enzima de desintoxicação

de albicidina para seu emprego no tratamento de plantas infectadas com

escaldadura das folhas, como também obter a seqüência do DNA responsável

pela codificação dessa enzima para a produção de plantas transgênicas (OCPI,

1998).

2.3 Epidemiologia da escaldadura das folhas

A doença pode ser transmitida de várias formas, preferencialmente pelo

plantio de mudas e rebolos infectados e pelo instrumento de corte (MARTIN &

ROBINSON, 1961). AKIBA (1978) constatou que a bactéria pode ficar viável

nesses instrumentos por até 6 dias, podendo assim ocorrer à transmissão a longa

distância.

A latência desta bactéria na planta infectada é um fenômeno bastante

comum, isto é, apesar de infectada a planta não manifesta sintomas visíveis

(MASUDA, 1980). Segundo DESTÉFANO et al., (2002) isto dificulta o serviço de

quarentena, pois a planta apesar de estar infectada com a bactéria, não mostra

sintomas por longos períodos, podendo passar despercebida e ser liberada pelo

sistema de quarentenário. Este fenômeno explica o fato freqüentemente

observado em canaviais onde a doença causa prejuízos consideráveis em alguns

anos e outros não (MASUDA, 1980).

Estudos demonstram evidências que existem outros agentes envolvidos na

disseminação da bactéria. HUTCHINSON & ROBERTSON (1953) constataram a

ZHANG, L.;XU, L.& BIRCH, R. G. Factor affecting biosynthesis by Xanthomonas albilineans of

albicidin antibiotics and phytotoxins. J. Appl. Microb.. 85, 31023-1028. 1998.

__________________________

transmissão da bactéria no campo por intermédio de ratos, funcionando estes

como eficientes vetores. HUGHES (1969) admitiu que a água de lixiviação pode

carregar e transmitir a bactéria, mas falhou na comprovação. Na Austrália,

PERSLEY (1971, 1973) admite a sobrevivência da bactéria no solo por poucos

dias, relatando a ocorrência natural em outras gramíneas como parte do ciclo vital

do patógeno, naquelas condições, a disseminação em vários casos se deu por

algum agente desconhecido associado à alta pluviosidade e ventos fortes. DAVIS

et al., (1997), verificaram a disseminação da bactéria na forma de aerosóis na

Flórida.

Estudando a epidemiologia da doença em Queensland, PERSLEY (1973)

concluiu que o aparecimento de sintomas externos está condicionado ao “stress”

provocado pela temperatura e regime de água, e que o outono seco e o frio

antecipado do inverno favorecem tal manifestação durante o inverno rigoroso.

Segundo DANTAS (1958) e MARTIN & ROBINSON (1961), os sintomas podem

estar ligados também à própria resistência da planta, ou seja, cultivares

resistentes ou tolerantes podem conter células bacterianas em seus tecidos,

porém não evidenciam os sintomas da doença (portadores assintomáticos) sendo

por isso perigosas fontes de inóculo para cultivares suscetíveis.

2.4 Variabilidade genética de X. albilineans

DAVIS et al., (1997) conduziram um extensivo trabalho sobre a

variabilidade genética de 218 isolados de X. albilineans de 31 regiões geográficas

da Ásia e Américas do Norte e do Sul, utilizado digestão enzimática do DNA e

eletroforese em campo pulsado. Os autores demonstraram a existência de 54

haplótipos que formaram oito grupos, mas não houve correlação com a origem

geográfica dos isolados ou com as variedades em que as bactérias foram

isoladas. Além disso, evidências de reações diferenciais de variedades de cana-

de-açúcar foram observadas nas Ilhas Mauricius, sugerindo a existência de raças

do patógeno.

Baseando-se na utilização de anticorpos policlonais ROTT et al., (1994)

identificaram três sorotipos de X. albilineans. Posteriormente, com o uso de

anticorpos monoclonais, ALVAREZ et al., (1996) agruparam 38 isolados da

bactéria em três grupos, os quais por sua vez, puderam ser agrupados em oito

subgrupos. Essa divisão foi confirmada por estudos de RFLP conduzidos no

mesmo trabalho.

Essa grande variabilidade tem sido apontada como uma das principais

causas para o surgimento de epidemias da escaldadura das folhas em várias

áreas produtoras (AUTREY et al., 1989). Tem sido sugerido que as principais

causas para o aumento da variabilidade de X. albilineans são mutações,

recombinação genética e a entrada de cepas exóticas (DAVIS et al., 1997).

2.5 Diagnose da Escaldadura das folhas

A diagnose da escaldadura das folhas tem sido há muito tempo estudada,

uma vez que o diagnóstico visual dos sintomas não é confiável devido à latência

que é relativamente comum quando a população de X. albilineans ainda é

pequena na planta (SORDI, 1986; BIRCH, 2001) e a inespecificidade dos

sintomas.

Nos primeiros trabalhos realizados com X. albilineans as dificuldades

começavam com as metodologias inadequadas de isolamento. DEAN (1974)

avançou muito nos estudos quando propôs o isolamento direto a partir das folhas

com sintomas. Este método foi melhorado por AKIBA (1978) e modificado por

MASUDA & TOKESHI (1978), que denominaram de “isolamento por corrida de

bactéria”, que consiste em observar no microscópio estereoscópico, a exudação

da bactéria para gotas de água estéril, a partir de pequenas secções de folhas

com sintomas, transferindo-se o exudado para o meio de cultura adequado.

Meios de culturas seletivos também consistiam em um método de diagnose,

porém é um método lento, requerendo, no mínimo, oito dias para a formação de

colônias características do patógeno (PERSLEY, 1972).

O uso de plantas-testes também é um método de diagnose muito utilizado.

PERSLEY (1972) preconiza o milho doce como planta-teste a se detectar X.

albilineans e demonstrar sua patogenicidade, já que neste caso não haveria o

risco da planta estar previamente infectada, pois não ocorre a transmissão por

semente.

Métodos sorológicos, como imunofluorescência, ELISA, “dot blot” e “tissue

blot” utilizando-se anticorpos policlonais têm se mostrado eficientes ferramentas

na detecção da bactéria, constatando inclusive infecções latentes (LÉOVILLE &

CÓLENO, 1976; AUTREY et al., 1989; COMSTOCK & IREY, 1992). Porém

RICAUD et al., (1977) demonstraram que a reação sorológica não conseguiu

detectar uma infecção latente, perdendo em precisão para inoculação do caldo em

plantas-testes. Mediante ELISA e dot-blot WANG et al., (1999) detectaram X.

albilineans em concentrações até um limite de 10

cel/mL no extrato vascular,

sendo um método insuficiente para infecções latentes.

Por sua vez, a tecnologia da reação de polimerase em cadeia (PCR)

causou uma verdadeira revolução na biologia tanto na pesquisa quanto nas áreas

envolvendo diagnósticos e melhoramento genético de plantas. Esta técnica é uma

das ferramentas mais úteis em biologia molecular, pois permite amplificar, “in

vitro”, milhões de vezes um fragmento específico de DNA. Este método de

diagnose tem se mostrado muito útil uma vez que tem sido utilizado na detecção

não só de bactérias, mas de outros fitopatógenos (NAZAR et al., 1991

;

ROBERTSON et al., 1991

; HARRIS et al., 1990

apud BATISTA, 1993).

No caso da escaldadura das folhas, PAN et al., (1997; 1999) avaliaram

“primers” para a detecção da bactéria a partir de suspensões celulares obtidas de

culturas puras.

Uma das combinações de primers utilizadas mostrou-se altamente

específica, não produzindo produtos de amplificação quando outras Xanthomonas

spp, e outras bactérias patogênicas ou saprófitas da cana-de-açúcar foram

utilizadas nas PCR’s.

NAZAR, R. N.; HU, X.; SCHIMIDT, J.; CULHAM, D. & ROBB, J. Potencial use of PCR-amplified

ribossomal intergenic sequences in the detection and diferentiation of Verticillium wilt pathogens.

Physiol. Mol. Plant. Pathol. 39:1-11. 1991.

ROBERTSON, N. L.; FRENCH, R. & GRAY, S. M. Use of group-specific primers and the

polymerase chain reaction for the detection and identification of luteoviruses. J. Gen. Virol. 72:

1473-7. 1991.

HARRIS, T. S.; SANDALL, L. J. & POWERS, T. O. Identification of single Meloidogyne juveniles

by polymerase chain reaction amplification of mitochondrial DNA. J. Nematol. 22:518-24.1990.

Segundo COOTE (1990), a técnica de PCR apresenta muitas vantagens

nos casos de diagnose porque além de permitir uma rápida e fácil avaliação das

amostras ainda permite uma inspeção visual direta dos produtos amplificados não

havendo a necessidade de “Southern blotting”.

DESTÉFANO et al., (2002) desenvolveram uma metodologia baseada em

PCR-RFLP para diferenciação de espécies de Xanthomonas que infectam cana-

de-açúcar. A metodologia consiste na amplificação da região espaçadora entre as

subunidades 16S e 23S do DNA ribossomal, seguida da clivagem do produto de

PCR com as endonucleases Alu I, Hae III, Hpa II e Mbo I. Com esse procedimento

foi possível distinguir X. albilineans, X. campestris pv. vasculorum e X. sacchari.

JAFEERALLY-FAKIM et al., (2000) empregaram sondas específicas para

detecção de X. albilineans. Essas sondas foram identificadas após hibridização

subtrativa com o DNA de X. campestris pv. vasculorum.

3. METODOLOGIA

3.1 Local de execução dos trabalhos

Os trabalhos foram desenvolvidos no Laboratório de Fitopatologia do

Centro de Ciências Agrárias (CECA), da Universidade Federal de Alagoas (UFAL),

no período de janeiro de 2004 a novembro de 2005.

3.2 Detecção de X. albilineans mediante técnica de PCR

Foram avaliados diferentes procedimentos visando à detecção de X.

albilineans em folhas e colmos de plantas de cana-de-açúcar sabidamente

infectadas (RB 9564). Inicialmente, a presença da bactéria foi avaliada nas folhas

+1 e +3 e no primeiro, segundo e último entrenó da variedade RB 9564

sabidamente infectados (Figura 2). O último entrenó foi definido como aquele onde

a folha +1 estava inserida e o primeiro entrenó aquele imediatamente acima do

solo.

Figura 2 - Esquema de uma planta de cana-de-açúcar mostrando os diferentes órgãos

submetidos à extração de células de Xanthomonas albilineans.

3.2.1 Obtenção de células de X. albilineans a partir de folhas

3.2.1.1 Procedimento 1

Folhas de cana-de-açúcar foram cortadas em pedaços pequenos, com o

auxílio de uma tesoura. Cerca de 100 mg de fragmentos foliares foram colocados

2º entrenó

1º entrenó

Último entrenó

Folha +3

Folha +1

em tubos de microcentrífuga de capacidade de 1,5 mL, ao quais foram

adicionados 500 μL de água destilada. Os tubos foram centrifugados durante 10

min a 10.000 rpm e o sobrenadante descartado. O pellet foi ressuspendido em 500

μL tampão fosfato de potássio a 0,1 M, pH 7,0. Posteriormente, as amostras foram

utilizadas (ou armazenadas a 40 ºC) nas PCR’s.

3.2.1.2 Procedimento 2

Num outro procedimento as folhas foram cortadas em pedaços pequenos

os quais foram colocados em béqueres contendo 15 mL de água destilada. O

beckers foram mantidos durante duas horas a 4 ºC a fim de que as bactérias

migrassem do tecido da planta para a água. Após esse período alíquotas de 1,5

mL das suspensões foram colocadas em tubos de microcentrífuga e centrifugadas

a 10.000 rpm durante 10 min. Decorrido esse tempo, o sobrenadante foi

descartado e o pellet ressuspendido conforme procedimento 1.

3.2.2 Obtenção de células de X. albilineans a partir de colmos

3.2.2.1 Procedimento 3

Colmos foram cortados em pedaços de aproximadamente 1,2 cm de

comprimento por 0,5 cm de largura e colocados em tubos de microcentrífuga de

500 μL dos quais o fundo foi devidamente removido com auxílio de uma tesoura.

Os tubos de 500 μL foram encaixados dentro de tubos de microcentrífuga de 1500

μL e centrifugados a 13000 rpm durante 10 min para que a seiva dos colmos fosse

coletada no tubo maior. Posteriormente, foi adicionado a essa suspensão tampão

fosfato de potássio a 0,1 M, pH 7,0 (500 μL) com o intuito de reduzir a

fermentação. As amostras foram imediatamente utilizadas nas reações de PCR’s.

3.2.2.2 Procedimento 4

No último procedimento testado, os colmos foram cortados em pequenos

pedaços e aproximadamente 4,7 g foram transferidos para béqueres de 50 mL

contendo 10 mL de água destilada. Os beckers foram mantidos a 4 ºC durante

duas horas. Após esse período foram retiradas alíquotas de 1,5 mL das

suspensões e colocadas em tubos de microcentrífuga de 1500 μL. As amostras

foram centrifugadas a 10000 rpm durante 10 minutos, o sobrenadante descartado

e o pellet ressuspendido em 500 L de tampão fosfato de potássio a 0,1 M, pH

7,0. As amostras foram utilizadas diretamente nas PCR’s ou armazenadas em

freezer (-20 ºC) até sua utilização.

3.3 Composição e ciclagem das PCR’s

Alíquotas de 1,0 μL das suspensões obtidas utilizando-se os procedimentos

1 a 4 (itens 3.2.1 e 3.2.2) foram diretamente empregadas nas reações de

amplificações. As reações foram preparadas para um volume final de 15 μL e suas

composições podem ser encontradas na Tabela 1.

Para avaliar a sensibilidade da metodologia de extração, todas as amostras

foram diluídas na proporção de 1:10 (v/v), as quais também foram utilizadas nas

PCR’s.

Foram utilizados os “primers” PGBL1 (5’-CTTTGGGTCTGTAGCTCAGG-3’)

e PGBL2 (5’-GCCTCAAGGTCATATTCAGC-3’) que direcionam, especificamente,

a amplificação de uma seqüência de 288 pb da região ITS (16S-23S) do DNA

ribossômico de X. albilineans (Figura 3) (PAN et al., 1999). Como controle positivo

das reações foram utilizadas suspensões preparadas a partir de colônias puras de

X. albilineans.

Figura 3 - Esquema da região ITS (Intergenic Transcribed Spacer) do DNA ribossomal de

Xanthomonas albilineans.

As amplificações foram efetuadas em termociclador Eppendorf modelo

Mastercycler Personal, programado para 94 ºC por 2 min para a lise das células

bacterianas seguido de 40 ciclos cada um constituído pela seguinte seqüência: 94

ºC por um min, 45 ºC por um min e 72 ºC por 30 s. Após os 40 ciclos, foi feita uma

etapa de extensão final de 2 min a 72 ºC e finalmente a temperatura foi reduzida a

4 ºC.

Após as amplificações, foram adicionados, em cada amostra, 1 μL de

uma mistura de azul de bromofenol (0,25%) e sacarose (40%) em água. Essas

amostras foram aplicados em gel de agarose (1,5%) e submersos em tampão TAE

(TRIS-Acetato-EDTA). Posteriormente essas amostras foram submetidas à

eletroforese (3V/cm) durante 2 horas. Ao término da corrida, os géis foram

corados com brometo de etídeo (5 ng/ml) por 45 min, em seguida visualizado sob

luz ultravioleta. O tamanho dos fragmentos amplificados foram estimados

mediante comparação com fragmentos de tamanhos conhecidos (1 kb Plus DNA

Ladder – Invitrogen).

Tabela 1 - Composição das PCR’s utilizadas na detecção de Xanthomonas albilineans.

Componente

Volume ( L)

Concentração

Extrato

1,0

1-3 pg de DNA

dNTP’S

2,0

0,2 mM

MgCl

0,4

75 mM

10x

1,5

16S

23S

288 pb

PGBL1

PGBL2

PGBL1

2,5

0,2 μM

PGBL2

2,5

0,2 μM

Taq DNA polimerase

0,3

1 U

4,8

TOTAL

15,0

3.4 Incidência de X. albilineans em variedades comerciais de cana-de-açúcar

no Estado de Alagoas

Visando avaliar a incidência de X. albilineans em Alagoas, plantas

apresentando sintomas sugestivos da doença e plantas aparentemente sadias

foram coletadas em diferentes localidades do estado: Usina Caeté (São Miguel

dos Campos), Usina Santa Clotilde (Rio Largo), Usina Santo Antônio (São Luiz do

Quitunde), Usina Sinimbú (Jequiá da Praia), Destilaria Paisa (Penedo) e Estação

de Floração e Cruzamento de Cana-de-Açúcar da Serra do Ouro (Murici).

Foram coletadas plantas de clones e variedades: RB 931011, RB 931530,

RB 931003, RB 94503, RB 961, RB 98701, RB 99701, RB 99702, RB 99710, RB

863129, RB 928064, RB 931611, RB 72454, RB 92579, RB 93509, RB 867515,

RB 855113, RB 813004, RB 9564, SP 79-1011, SP 83-2847, SP 81-3250, SP 71-

1406, SP 71-6949, VAT 90-212 e VAT 90-186.

Empregando-se o procedimento 4 (item 3.2.2.2) foram obtidas alíquotas de

seiva das plantas coletadas, as quais foram empregadas em PCR’s. As condições

e a ciclagem das PCR’s utilizadas nessa etapa foram às mesmas descritas no

item 3.2.2.

3.5 Seqüênciamento da região ITS (16S-23S) do rDNA do isolado de X.

albilineans

Com o objetivo de caracterizar molecularmente o isolado de X. albilineans.

realizou-se o seqüênciamento da região amplificada por PCR. Inicialmente

procedeu-se a purificação do produto da amplificação, utilizando-se o Kit GFX

PCR DNA e Gel Band Purification Kit. O produto de PCR foi quantificado em gel

de agarose 2% empregando-se o Low DNA Mass Ladder (Invitrogen) como

referência.

A reação para seqüênciamento foi efetuada num termociclador MJ

Research, modelo PTC 200, no Centro de Estudos do Genoma Humano, da

Universidade de São Paulo (USP). A composição da reação foi a seguinte:

produto de PCR 2 µL (25-30 ng), premix de seqüênciamento 4 µL, “primer” 5 µM

0,6 µL, água milliQ 3,4 µL, totalizando 10 µL. O fragmento foi seqüenciado de

ambas as extremidades, utilizando-se os “primers” PGBL1 e PGBL2,

separadamente, em um aparelho MegaBace 1000 (GE Healthcare).

3.6 Comparação da seqüência obtida com outras seqüências depositadas no

GenBank

A seqüência da região ITS (16S-23S) do rDNA de X. albilineans foi editada

e comparada com outras seqüências depositadas no GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), utilizando-se o programa Blastn.

3.7 Análise Filogenética

As seqüências depositadas no GenBank que apresentaram maiores

identidades com o isolado estudado foram salvas, no formato Fasta,

posteriormente comparadas utilizando-se o programa DNAMAN 4.0. Esse mesmo

programa foi utilizado na construção de uma árvore filogenética, com um

Bootstrap de 1000.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Detecção de X. albilineans mediante técnica de PCR

No presente trabalho foi possível detectar a bactéria X. albilineans a partir

da seiva obtida tanto de folhas quanto de colmo de cana-de-açúcar. A detecção foi

demonstrada por meio da amplificação de uma banda única e específica, com

cerca de 300 pb (Figura 4). Os “primers” utilizados na amplificação anelam na

região compreendida entre os genes que codificam para as subunidades 16S e

23S do RNA ribossomal (PAN et al., 1999). Tem sido demonstrado que tal região

é muito conservada para indivíduos da mesma espécie ou até de mesmos

patovares ou variedades e por isso tem sido preferencialmente utilizada nos

procedimentos de detecção de várias bactérias fitopatogênicas, como por

exemplo, X. axonopodis pv. phaseoli, X. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans

(HALFELD -VIEIRA et al., 2001), Xylella fastidiosa (POLTRONIERI et al., 2005), X.

axonopodis pv. passiflorae (GONÇALVES & ROSATO 2002a), Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis (DREIER et al., 1995), entre outras.

Poucos estudos foram efetuados para a diagnose molecular da escaldadura

das folhas. PAN et al., (1997; 1999) avaliaram vários “primers”, concluindo que a

melhor combinação era proporcionada por PGBL1 e PGBL2 – os “primers”

utilizados no presente estudo. No entanto, os autores realizaram a amplificação a

partir de células obtidas de culturas puras. Portanto, o presente trabalho é pioneiro

em realizar a detecção de X. albilineans a partir de seiva de plantas de cana-de-

açúcar.

O uso da seiva diretamente nas PCR, dispensando as etapas de isolamento

da bactéria e extração de DNA, torna o procedimento de diagnose mais rápido e

econômico permitindo inclusive a exploração comercial por parte de laboratórios

qualificados. Segundo HALFELD-VIEIRA et al., (2001) teste preliminares

mostraram que a supressão destas etapas não afetam a eficiência da reação. A

possibilidade de dispensar a etapa de extração de DNA foi possível em

decorrência do fato que o DNA de organismos procariotos não se encontram

compartimentalizado no núcleo nem complexado com proteínas formando

cromatina.

Figura 4 - Reações de amplificação a partir de plantas sabidamente infectadas (RB 9564). As

linhas de 1 a 3 e 17 a 19 correspondem às amostras do último entrenó (UE). As linhas 4 a 6 e 20 a

22 correspondem às amostras do primeiro entrenó (E1). As linha 7 a 9 e 23 a 25 correspondem às

amostras do segundo entrenó (E2). As linhas 10 a 12 e 26 a 28 correspondem às amostras da

folha +1 e as linhas 13 a 15 e 29 a 31 correspondem às amostras da folha +3. A linha 32

corresponde ao cont. positivo. A - amostras de seiva concentradas; B - amostras de seiva diluídas.

M 33 3435 36 37 38 39 40 41 4243 44 45 46

M 49 50 51 52 5354 55 56 57 58 59 6061 62

6364

EECE2

F+

300

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

M 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

F+3

F+1

F+3

F+ 1

300

Uma outra vantagem desse procedimento experimental é sua alta

sensibilidade, tornando possível a detecção da bactéria mesmo em suspensões

muito diluídas. Segundo PAN et al., (1999), a sensibilidade dos “primers” PGBL1 e

PGBL2 é estimada em torno de 1 pg de DNA genômico de X. albilineans, o que

equivale a quatro células da bactéria por reação.

Melhores resultados nas PCR’s foram alcançados quando a seiva foi obtida

de colmos. Para amostras de folhas as amplificações foram observadas apenas

esporadicamente. A ausência de amplificação constatada na maioria das amostras

provenientes de folhas pode ser conseqüência da presença de substâncias que

inibem a ação da Taq DNA polimerase. Outra possibilidade seria uma menor

concentração de bactérias nesse órgão. Contudo, essa hipótese estaria em

desacordo com as observações de MARTIN & WISMER (1961) onde os autores

afirmaram que X. albilineans é encontrada mais comumente nas folhas e na

porção apical da planta. A possibilidade de detecção da bactéria a partir de

amostras de folhas seria extremamente vantajosa, pois são coletadas e

processadas mais facilmente que as amostras de colmos.

Adicionalmente foi verificado que o uso da força centrífuga para coletar a

seiva a partir de colmo ou de folhas é um procedimento que não proporciona bons

resultados, quando comparado à infusão de fragmentos desses órgãos em água.

Para explicar esses resultados sugere-se que possivelmente a força centrífuga

esteja promovendo não só a saída da bactéria dos tecidos infectados, mas

também de várias substâncias indesejadas, principalmente polissacarídeos

(provenientes da planta ou da própria bactéria). Essas substâncias atuariam

inibindo a amplificação da seqüência alvo. De fato, vários autores têm

demonstrado a ação inibitória de carboidratos em PCR’s, podendo ser citados

FERREIRA & GRATTAPAGLIA (1995) e JAUFEERALLY-FAKIM & DOOKUN

(2000).

A imersão de fragmentos de colmos em água destilada por 2 horas mostrou

ser o método mais eficiente para a detecção de X. albilineans por PCR. Segundo

BIRCH (2001) e KIMATI et al (2005), essa bactéria apresenta flagelo polar

permitindo , assim, sua motilidade dentro do xilema possibilitando sua migração do

tecido da planta para a água sem que para isso haja solubilização de uma grande

quantidade de polissacarídeos provenientes da cana-de-açúcar e/ou da bactéria.

A diluição das amostras de seiva na proporção de 1:10, de um modo

geral, não influenciou os resultados das PCR’s, ressaltando a alta sensibilidade da

técnica. Dessa forma produtos de amplificação foram observados tanto nas

reações contendo alíquotas de seiva concentradas como nas respectivas

amostras de seiva diluída. As únicas exceções foram duas amostras do primeiro

entrenó. Para a amostra 1 do primeiro entrenó a amplificação só foi verificada na

reação contendo seiva diluída, enquanto que para a amostra 3 do primeiro entrenó

a situação inversa foi verificada.

4.2 Incidência de X. albilineans no Estado de Alagoas

A bactéria X. albilineans foi constatada em amostras provenientes das usinas

Santo Antônio, Sinimbú e Caeté, bem como da Estação Experimental de

Florescimento e Cruzamentos da Serra do Ouro (Figura 5). Sua presença também

foi constatada em plantas assintomáticas, fato bastante preocupante, pois

favorece sua disseminação por meio da utilização de instrumentos de corte

(BIRCH, 2001).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M

Figura 5 - Produtos de amplificação obtidos com os primers PGBL1/PGBL2 para amostras de

cana-de-açúcar. A linha 1 corresponde à amostra da variedade VAT 90-212 proveniente da Usina

Caeté; as linhas 2 a 4 correspondem às amostras da Usina Sinimbú; as linhas 5 a 7 correspondem

às amostras do clone RB9564 da Serra do Ouro, as linhas 8 a 10 às amostras de VAT 90-212 da

Usina Santo Antônio e a linha 11 representa o controle negativo.

Foi verificado que a grande maioria das amostras da variedade VAT 90-212

encontravam-se infectadas com X. albilineans. A alta suscetibilidade dessa

variedade tem sido constatada nos canaviais alagoanos.

Os resultados obtidos no presente trabalho demonstram a viabilidade do

uso da técnica da PCR para diagnose da escaldadura das folhas a partir de seiva

obtida de colmos de plantas sintomáticas ou assintomáticas.

4.3 Determinação da seqüência da região ITS (16S-23S) do isolado de X.

albilineans do Estado de Alagoas

O seqüênciamento do produto de PCR gerado com a amplificação

direcionada pelos “primers” PGBL1/PGBL2 revelou um fragmento de 271

nucleotídeos (Figura 6). Essa é a única seqüência de X. albilineans proveniente da

região nordeste do Brasil a ser depositada no GenBank.

TGTAGAGCGCACCTGATAGGGCTGAGGTCGGTGGTTCGAGTCCTCCCAGACCCACCACTCT

GAATGTATCGCACACGAAGAATTTGAATGATTCGGCGCTGAGGCCGGGTCGTGTTCTTTAAT

AATTAGTGATGTAGCGAACGTTTGAGAACAATACTCTCGACGTGTCGTTGTGGCTAAGGCGG

GGACTTCGAGTCCCTAAAATTGAGTCGTTATAGTTCGCGTCCGGGCTTTGTACCCCTGGGCT

GAATATGACCTTGAGGCACGAATT

Figura 6 - Seqüência de nucleotídeos correspondente à região ITS (16S-23S) do DNA

ribossomal de Xanthomonas albilineans amplificada com a utilização dos primers

PGBL1/PGBL2.

A comparação dessa seqüência com outras seqüências depositadas no

GenBank revelou mais de 60 seqüências provenientes de Xanthomonas spp com

elevado score e e-value próximo à zero (Figuras 7).

Figura 7 - Seqüências depositadas no GenBank que apresentaram maiores Score e

menores e-value com o isolado de Xanthomonas albilineans proveniente do Estado de

Alagoas.

As maiores identidades foram observadas com outros dois isolados de X.

albilineans, um proveniente dos Estados Unidos (AF251154) e o outro do Brasil

(AF209751.1). Verificou-se também alta identidade do isolado LMG471 de X.

sacchari (90%) (Figura 8).

38xal2005

40Xa-LA

40ICMP196

40LMG471

Consensus

TGTAGAGCGCA..CCTGATAGGGCTGAGGTCGGTGGTTCG

GTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCGGTGGTTCG

78xal2005

80Xa-LA

80ICMP196

80LMG471

Consensus

AGTCCTCCCAGACCCACCACTCTGAATGTATCGCACACGA

GGTCCTCCCAGACCCACCACTCTGAATGTATCGCACACGA

AGTCCTCCCAGACCCACCACTCTGAATGTATCGCACACTA

118xal2005

120Xa-LA

120ICMP196

119LMG471

Consensus

AGAATTTGAATGATTCGGCGCTGAGGCCGGGTCGTGTTCT

AGAATTTATATGC.TCGGCATTGAGGCCGTAGCGTGTTCT

158xal2005

160Xa-LA

160ICMP196

159LMG471

Consensus

TTAATAATTAGTGATGTAGCGAACGTTTGAGAACAATACT

TTAATAATTTGTGATGTAGCGAGCGTTTGAGAACAAACTT

198xal2005

200Xa-LA

200ICMP196

198LMG471

Consensus

CTCGACGTGTCGTTGTGGCTAAGGCGGGGACTTCGAGTCC

CTC.ACGTGTCGTTGTGGCTAAGGCGGGGACCTCGAGTCC

235xal2005

237Xa-LA

239ICMP196

235LMG471

Consensus

CTA.AAA.TTGAGTCGTTAT.AGTTCGCGTCCGGGCTTTG

CTA.AAATTTGAGTCGTTATAAGTTCGCGTCCGGGCTTTG

CTAGAAA.TTGAGTCGTTAT.AGTTCGCGTCCA.GCTTTG

271xal2005

273Xa-LA

275ICMP196

270LMG471

Consensus

TACCCCTGGGCTGAATATGACCTTGAGGCACGAATT

TACCCCTGGGCTGAATATGACCTTGAGGCAACTTGA

TACCCCTGGACTGGATATGACCTTGAGGCAACTTGA

TACCCCTGA.CTGAATATGACCTTGAGGCAACTTGA

Figura 8 - Alinhamento das seqüências da região ITS 16S-23S do isolado de

Xanthomonas albilineans de Alagoas e de outros isolados relacionados. xal2005- X.

albilineans/AL; Xa-LA- X. albilineans/LA; ICMP196- X.albilineans/SP; LMG471- X.

sacchari.

A alta identidade entre o isolado de X. albilineans com um isolado de X.

sacchari observada nesse trabalho está em acordo com os dados de

DESTÉFANO et al., (2002), os quais durante uma análise de agrupamento

envolvendo vários de isolados de Xanthomonas spp constataram um estreito

relacionamento filogenético entre isolados de ambas as espécies.

A alta identidade da região seqüenciada do isolado de X. albilineans de

Alagoas com um isolado de X. sacchari seria um fato preocupante, pois isolados

dessa segunda espécie poderiam ser detectados por PCR através da utilização

dos primers PGBL1/PGBL2, contudo PAN et al., (1999) demonstraram que esses

“primers” são específicos para X. albilineans, não amplificando para as oito

linhagens de X. oryzae subsp. oryzae, duas linhagens de X. campestris, quatro

linhagens de X. campestris pv. translucens, três linhagens de X. fragariae, sete

bactérias saprófitas de cana-de-açúcar não identificadas e uma linhagem de

Leifsonia xyli subsp. xyli trabalhadas.

O alinhamento das seqüências correspondentes à região ITS (16S-23S) do

rDNA do isolado de Alagoas com os isolados mais relacionados encontra-se

representado na Figura 9. Corroborando as observações de vários pesquisadores,

constatou-se uma grande conservação da região considerada. As diferenças

podem ser atribuídas a substituições e/ou deleções/inserções de 1 ou 2

nucleotídeos (Figura 9), observações que estão de acordo com a pesquisa

desenvolvida por GONÇALVES & ROSATO (2002b).

X. albilineans/AL

X. albilineans/LA

X. albilineans/SP

X. sacchari

0.05

X. albilineans/AL

X. albilineans/LA

X. albilineans/SP

X. sacchari

0.05

Figura 9 - Árvore filogenética ilustrando o relacionamento do isolado de Xanthomonas

albilineans do Estado de Alagoas com outros isolados.

Comparações dois a dois realizadas entre o isolado caracterizado no

presente estudo e os isolados mais relacionados revelou identidades variando de

87,6 a 98,2% para a região estudada, conforme verificado na Tabela 2. Esses

valores são compatíveis com dados divulgados por outros autores.

Tabela 2 - Similaridades (%) da região ITS 16S-23S entre isolados de Xanthomonas

albilineans e de Xanthomonas sacchari.

Isolado

X. albilineans/LA*

X. albilineans/AL

X.albilineans/SP

X. sacchari

X.albilineans/LA

100

95,6

98,2

92,0

X.albilineans/AL

100

93,8

87,6

X. albilineans/SP

100

90,9

X. sacchari

100

* LA: Los Angeles (EUA)

Por exemplo, GONÇALVES & ROSATO (2002b) determinaram a seqüência

da região ITS de 17 espécies de Xanthomonas, constatando variações de 63 a

99%. Como esperado, por se tratar de uma espécie distinta, valores mais baixos

foram obtidos nas comparações envolvendo o isolado de X. sacchari.

Considerando o isolado de Alagoas verificou-se maior identidade (98,2%) com o

isolado ICMP de X. albilineans proveniente dos Estados Unidos (Tabela 2).

O relacionamento filogenético do isolado caracterizado com outros isolados

foi estimado utilizando-se o programa DNAMAN 4.0. Como observado na Figura

10 o isolado de Alagoas relaciona-se mais proximamente ao isolado de X.

albilineans proveniente de Los Angeles (EUA). Esse fato é de certa forma

surpreendente, pois seria esperado que esse isolado agrupasse com o isolado

brasileiro (São Paulo). Esse resultado sugere que o isolado de Alagoas pode ter

sido introduzido diretamente dos EUA, juntamente com material de plantio. A

situação inversa também não pode ser descartada. Essa prática apesar de

indesejável, é relativamente comum entre os agricultores brasileiros. No entanto,

faz-se necessário o seqüênciamento de isolados de outras regiões produtoras

para que essa hipótese possa ser comprovada. Conforme esperado, verificou-se

também que os isolados de X. albilineans formaram um ramo a parte na árvore,

sendo o outro ramo formado pelo isolado de X. sacchari. Baseando-se nessa

mesma região genômica GONÇALVES & ROSATO (2002b) elaboraram uma

árvore filogenética de 17 espécies de Xanthomonas, verificando o agrupamento de

X. albilineans num ramo próximo ao ramo ocupado por X. sacchari, uma vez mais

ilustrando o estreito relacionamento entre essas espécies.

5. CONCLUSÕES

A bactéria Xanthomonas albilineans encontra-se amplamente disseminada

no Estado de Alagoas;

A supressão da etapa de extração de DNA da bactéria não interfere na

PCR para detecção de X. albilineans.

O emprego da técnica de PCR, utilizando-se a seiva obtida por infusão de

fragmentos do colmo em água destilada demonstrou-se eficiente na detecção de

X. albilineans, mesmo em plantas assintomáticas;

A diluição da seiva utilizada nas PCR’s não interfere na qualidade das

amplificações;

O isolado de X. albilineans caracterizado no presente estudo foi mais

relacionado a um isolado proveniente de Los Angeles (EUA).

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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