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INSTITUTO DE MEDICINA INTEGRAL PROF. FERNANDO FIGUEIRA
Programa de Pós-graduação em Saúde Materno Infantil
Curso de Doutorado em Saúde Materno Infantil
RESPOSTA INFLAMATÓRIA EM ASPIRADO NASOFARÍNGEO DE
CRIANÇAS MENORES DE CINCO ANOS COM INFECÇÃO RESPIRATÓRIA
AGUDA NO RECIFE, BRASIL
DOUTORANDA:
MARIA DO CARMO MENEZES BEZERRA DUARTE
Recife, 2010
ORIENTADOR:
PROF.
O
DR.
JAILSON DE BARROS CORREIA
CO-ORIENTADOR: PROF.
O
DR. MURILO BRITTO
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
MARIA DO CARMO MENEZES BEZERRA DUARTE
RESPOSTA INFLAMATÓRIA EM ASPIRADO NASOFARÍNGEO DE
CRIANÇAS MENORES DE CINCO ANOS COM INFECÇÃO RESPIRATÓRIA
AGUDA NO RECIFE, BRASIL
Recife, 2010
Tese
apresentad
a
à
P
ós
-
graduação em
S
aúde
Materno Infantil do Instituto de Medicina Integral
Prof. Fernando Figueira (IMIP) como parte dos
requisitos para obtenção do título de Doutora em
Saúde Materno Infantil.
Área de Concentração: Epidemiologia dos
principais problemas de Saúde Materno Infantil.
Linha de pesquisa: Estudos clínicos e
epidemiológicos de doenças infecciosas na infância
e adolescência.
ORIENTADOR:
PROF.
O
DR.
JAILSON DE BARROS CORREIA
CO-ORIENTADOR: PROF.
O
DR. MURILO BRITTO
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Ficha catalográfica
Preparada pela Biblioteca Ana Bove
Instituto de Medicina Integral Professor Fernando Figueira - IMIP
D812r
Duarte
, Maria do Carmo Menezes Bezerra
Resposta inflamatória em aspirado nasofaríngeo de crianças menores de cinco anos com
infecção respiratória aguda no Recife / Maria do Carmo Menezes Bezerra Duarte. -- Recife: M.
C. B. M. Duarte, 2010.
129 f. : il.
Tese (doutorado) – Programa de Pós - Graduação Stricto Sensu em Saúde Materno
Infantil – Instituto de Medicina Integral Professor Fernando Figueira, IMIP.
Área de Concentração: Epidemiologia dos principais problemas de saúde materno
infantil.
Linha de pesquisa: Estudos clínicos e epidemiológicos de doenças infecciosas na
infância e adolescência.
Orientador: Dr. Profº. Jailson de Barros Correia
Co-orientador: Profº. Dr. Murilo Britto
1. Adenovirus Humanos. 2. Bocavírus Humano. 3. Bronquiolite. 4. Citocinas. 5. Infecções
Respiratórias. 6. Metapneumovirus. 7. Pneumonia. 8. Rhinovirus. 9. Vírus Sincicial
Respiratório Humano. 10. Mycoplasma Pneumoniae. I. Correia, Jailson de Barros, orientador.
II. Britto, Murilo, co-orientador. III. Título.
NLM W4
BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO
RESPOSTA INFLAMATÓRIA EM ASPIRADO NASOFARÍNGEO DE
CRIANÇAS MENORES DE CINCO ANOS COM INFECÇÃO RESPIRATÓRIA
AGUDA NO RECIFE, BRASIL
Membros:
Prof.
a
Dra. Sílvia Maria Lucena Montenegro – CPqAM/FIOCRUZ
Prof.
O
Dr. Emanuel Sávio Cavalcanti Sarinho - UFPE
Prof.
a
Dra. Mª Júlia Gonçalves de Mello - IMIP
Prof.
O
Dr. José Eulálio Cabral Filho – IMIP
Prof.
O
Dr. Jailson de Barros Correia (IMIP) (orientador)
Prof.
O
Dr. Edvaldo da Silva Souza – IMIP (Suplente)
Curso de Doutorado em Saúde Materno Infantil do Programa de Pós-graduação em
Saúde Materno Infantil do Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira.
Data: 28.07.2010
Orientador:
Prof.
O
Dr.
Jailson de Barros Correia
Co-orientador: Prof.
O
Dr. Murilo Britto
PRÉ-BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO
RESPOSTA INFLAMATÓRIA EM ASPIRADO NASOFARÍNGEO DE
CRIANÇAS MENORES DE CINCO ANOS COM INFECÇÃO RESPIRATÓRIA
AGUDA NO RECIFE, BRASIL
Membros:
Prof.
a
Dra. Sílvia Maria Lucena Montenegro – CPqAM/FIOCRUZ
Prof.
O
Dr. Demócrito de Barros Miranda Filho - UPE
Prof.
a
Dra. Mª Júlia Gonçalves de Mello - IMIP
Prof.
O
Dr. Edvaldo da Silva Souza - IMIP
Curso de Doutorado em Saúde Materno Infantil do Programa de Pós-graduação em
Saúde Materno Infantil do Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira.
Data: 05.07.2010
Orientador:
Prof.
O
Dr.
Jailson de Barros Correia
Co-orientadores: Prof.
O
Dr. Murilo Britto
“Quando houver contraste
entre a tua alegria
e um céu cinzento,
ou entre a tua tristeza
e um céu em festa
bendiz o desencontro
que é aviso divino
de que o mundo
não começa nem acaba em ti”.
Aviso de Deus, Dom Helder Camara
DEDICATÓRIA
Ao meu companheiro, Fernando,
que com sua sensibilidade,
me ensina a ver a vida com outros olhos,
a respeitar o direito do próximo,
e a lutar pela equidade entre
homens, mulheres e crianças.
Aos meus pais, Alba e José Duarte (in memmoriam)
e a Dinha Zete (in memmoriam),
que com seus
exemplos ensinaram-me a fazer frente às adversidades
da vida.
Aos meus filhos, Bruno, Luiza e Carol,
bálsamo e estímulo maiores de minha vida.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador e amigo professor Jailson Corria, por sua mente brilhante e capacidade
de articulação em momentos críticos, pela sua dedicação, estímulo, companheirismo e apoio
irrestrito no desenvolvimento desta tese.
Ao meu co-orientador professor Murilo Britto, pelo apoio oferecido no desenvolvimento
desta tese, em especial na fase de planejamento e qualificação do projeto.
Ao presidente do IMIP Antônio Carlos Figueira, pela sua capacidade e determinação de
gestão, fazendo com que o sonho de alguns pediatras iluminados liderados pelo professor Fernando
Figueira há 50 anos floresça como um “gigante”, mantendo a qualidade da assistência oferecida à
população pobre de Pernambuco.
Ao Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Saúde Materno Infantil, professor João
Guilherme, ao vice-coordenador, professor José Eulálio e ao Superintendente de Pesquisa, Ensino e
Extensão Comunitária, professor Fernando Menezes pelos ensinamentos, apoio e confiança na
conclusão desta tese.
Aos professores da Pós-graduação stricto sensu do IMIP pela convivência prazerosa e pelos
conhecimentos adquiridos. Em especial, ao professor Eulálio que me faz refletir, por exemplo,
sobre Sócrates “Só sei que nada sei”, ao professor Natal que com paciência e persistência nos
ensina análise estatística e a professora Melania Amorim, minha orientadora no Mestrado, uma das
responsáveis por minha formação acadêmica.
Aos professores da Universidade de Liverpool, professores Tony Hart (in memoriam), Paul
McNamara, Luis Cuevas, Angela Fonceca, Mark Hopkins e à mestranda Katie Rose onde realizei o
estágio doutoral, pela oportunidade de intercâmbio com a excelência acadêmica na área de estudo e
pela enorme paciência de ensinar pediatras a trabalhar numa bancada de laboratório.
Aos meus colegas do doutorado: Edvaldo, Suely, Ana Porto, Raquel, Jucille, Marília pelo
convívio harmonioso do grupo e à Patrícia, parceira e amiga desde a fase de elaboração deste
projeto, até as “andanças” por Liverpool, por ter me ajudado no trabalho exaustivo das análises no
laboratório, no inglês e fazendo relevantes observações a esta tese. A Alex Souza por ter me
substituído por três meses na PG-SMI meu muito obrigado.
Aos meus amigos de trabalho do IMIP e do Hospital Esperança, meu muito obrigado, em
especial a Mônica Lins, Thaysa Menezes, Renata Beringuer, Sheyla Levy, Anuska Lins, Eliane
Germano Alex Caminha e a Júlia Mello, pelo companheirismo e compreensão pelas minhas
ausências.
A Socorro Cavalcanti e aos profissionais da Emergência Pediátrica do IMIP, pelo apoio na
realização da coleta de dados desta pesquisa. Esperamos que os resultados contribuam para
melhoria da assistência prestada a nossas crianças.
Aos membros da pré-banca, professores Demócrito Miranda Filho, Sílvia Montenegro, Julia
Mello e Edvaldo Souza pelas importantes contribuições na tese.
As minhas tias Albene e Anadélia, pelo estímulo e apoio incessante ao longo da minha
caminhada.
A Ana, segunda mãe de meus filhos, por ajudar a educá-los e assumir muitos dos meus
afazeres domésticos.
A mestranda Nancy Correia e as auxiliares de pesquisa Shirley, Neide e Luciana, que nos
ajudaram de forma exemplar na coleta dos dados e na logística desta pesquisa.
A Patrícia Moura, do Laboratório de Virologia da Universidade de Pernambuco, pela
gentileza de armazenar nossas amostras no freezer a -70
o
C durante alguns meses.
Ao CNPq, ao Fundo de Amparo a Pesquisa e Ensino do IMIP (FAPE) e ao Department of
Child Health, University of Liverpool, Institute of Child Health, Alder Hey Children's Hospital,
Liverpool, Reino Unido pelo suporte financeiro a esta pesquisa.
A todas as crianças e aos seus responsáveis que participaram desta pesquisa, pela confiança
na equipe de pesquisa.
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1
I. APRESENTAÇÃO..........................................................................................................19
1.1. Justificativa..................................................................................................................20
1.2. Contextualização da origem do estudo, execução e produção dos artigos
científicos ....................................................................................................................21
CAPÍTULO 2
II. INTRODUÇÃO..............................................................................................................26
2. Patogênese e imunidade .................................................................................................26
2.1 Citocinas .......................................................................................................................27
2.2 O HVSR como protótipo da IRA viral na criança .......................................................29
2.2.1 Resposta imune inata do hospedeiro na IRA por HVSR ..........................................30
2.3 Comportamento de citocinas em crianças com IRA por HVSR de acordo com
gravidade de doença ......................................................................................................34
2.4 Resposta imune na IRA de acordo com o tipo de vírus e por Mycoplasma
Pneumoniae ..................................................................................................................39
CAPÍTULO 3
III. OBJETIVOS.................................................................................................................45
CAPÍTULO 4
MÉTODOS..........................................................................................................................48
4.1. Local do estudo............................................................................................................48
4.2. Desenho do estudo.......................................................................................................48
4.3. Período de coleta de dados...........................................................................................48
4.4. Critérios de elegibilidade.............................................................................................48
4.5. População e amostra ...................................................................................................49
4.6 Fluxograma da capitação de pacientes e de procedimentos ........................................50
4.7. Definição de termos e operacionalização das variáveis...............................................51
4.8. Técnica de coleta, processamento e anális e dos exames de detecção viral e da
resposta imune ......................................................................................................................59
4.9. Coleta de dados e controle de qualidade das informações...........................................61
4.10. Análise estatística......................................................................................................63
4.11. Aspectos éticos..........................................................................................................63
CAPÍTULO 5
V RESULTADOS/ARTIGOS............................................................................................64
5.1. Artigo 1....................................................................................................................65
5.2. Artigo 2....................................................................................................................80
CAPÍTULO 6
VI. CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................................94
CAPÍTULO 7
VII. REFERÊNCIAS .........................................................................................................97
APÊNDICES......................................................................................................................102
ANEXOS............................................................................................................................127
LISTA DE ABREVIATURAS, ACRÔNIMOS
1
E SÍMBOLOS
ANF – Aspirado nasofaríngeo
BV – Bocavírus
CAA – Células apresentadoras de antígeno
Chlamydophila pneumoniae – C. pneumoniae
CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
ELISA - do inglês “Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay”
EUA – Estados Unidos da América
Flu – Influenza humano
FNT – Fator de necrose tumoral
GM-CSF – Fator estimulante de colônias de macrófagos e granulócitos
HadV - Adenovírus humano
HCoV – Coronavírus humano
HMPV – Metapneumovírus humano
HPIV – Parainfluenza humano
HRV – Rinovírus humano
HVSR - Vírus sincicial respiratório humano
IFN - Interferon
IMIP – Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira
IL – Interleucina
IRA – Infecção respiratória aguda
LBA – Lavado broncoalveolar
1
Nomenclatura dos vírus segundo as recomendações do Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus, 2009.
LTC CD8+ - linfócito T citotóxico CD8+
L Th1 – Linfócito T helper 1
L Th2 – Linfócito T helper 2
L Th17 – Linfócito T helper 17
LTH CD4+ - Linfócito T helper CD4+
Mpp - Mycoplasma pneumoniae
OMS – Organização Mundial de Saúde
PCR – Reação em cadeia da polimerase
RANTES - do inglês “regulated on activation normal T-cell expressed e secreted”
RT-PCR - Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa
SISNEP – Sistema Nacional de Ética em Pesquisa
SNP – Polimorfismo nucleotídico simples
SUS – Sistema Único de Saúde
TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TLR 4 – Receptor Toll-like 4
14
LISTA DE QUADROS, TABELAS E FIGURAS
Figura 1. Receptores e mediadores envolvidos na resposta inflamatória contra vírus do
epitélio das vias aéreas.
9
Figura 2. Diagrama esquemático da resposta imune Th1, Th2 e Th17. 11
Figura 3. Resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro frente a infecção viral. 15
Quadro 1. Estudos clínicos sobre produção de citocinas em crianças com IRA por
VSR de acordo com gravidade de doença.
18
Quadro 2. Estudos clínicos e produção de citocinas em crianças com IRA por vírus e
Mycoplasma pneumoniae.
22
Article 1.
Table 1 Characteristics of 71 children aged < 5 years with acute respiratory infection
from Recife, Brazil, June 2008-October 2009.
Figure 1. Cytokines concentrations of all group and between each two groups
62
60
Article 2.
Table 1. Characteristics of 44 infants from Recife, Brazil, with respiratory syncytial
vírus infection, according hospitalization, June 2008-October 2009.
Table 2. Cytokine concentrations in nasopharyngeal aspirates of HRSV-infected
children by hospital or ambulatory management, June 2008-October 2009.
74
75
15
RESUMO
Duarte, MCMB. Resposta inflamatória em aspirado nasofaríngeo de crianças menores de cinco anos com
infecção respiratória aguda no Recife, Brasil. [Tese] Recife: Pós-graduação em Saúde Materno Infantil,
Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira (IMIP); 2010. 136 p.
Estima-se que quatro milhões de crianças morram a cada ano devido às infecções respiratórias agudas e que
metade dessas mortes ocorra em menores de seis meses de idade. Os vírus são responsáveis por grande parte
do impacto destas infecções. Estima-se que o vírus sincicial respiratório humano sozinho acarrete no mínimo 3,4
milhões de admissões hospitalares e entre 66.000 a 199.000 mortes em crianças menores de cinco anos
anualmente em todo o mundo, sendo 99% destes óbitos em países em desenvolvimento. Vários estudos têm
demonstrado que o tipo, carga e virulência do vírus por um lado e fatores relacionados ao hospedeiro por outro,
como idade, suscetibilidade genética e estado imune são implicados na patogênese e gravidade da infecção
respiratória aguda viral. Dentre esses fatores, a resposta imunológica do hospedeiro é considerada o principal
fator determinante da gravidade da doença e suas conseqüências em longo prazo. Poucos estudos têm avaliado
as respostas imunes do hospedeiro frente à infecção viral de acordo com a gravidade de doença, ou entre
diferentes vírus e bactérias atípicas que podem apresentar síndromes clínicas similares. Além disso, a maioria
dos estudos avaliaram as respostas imunes T helper 1 e T helper 2, enquanto que as respostas imunes T helper
17 tem sido raramente descritas. Os objetivos da tese foram investigar se concentrações de citocinas, em
aspirado nasofaríngeo, diferem de acordo com diversos patógenos respiratórios em crianças com infecção
respiratória aguda no Brasil e se as concentrações de citocinas diferem de acordo com a gravidade da doença
em crianças de baixo nível sócioeconômico no Brasil, infectadas pelo vírus sincicial respiratório humano. Foi
realizado um estudo prospectivo, exploratório, do tipo descritivo, no período de junho de 2008 a outubro de 2009.
Foram incluídas no primeiro estudo crianças menores de cinco anos, com diagnóstico clínico de infecção
respiratória aguda com até sete dias de doença, com Reação em Cadeia da Polimerase Multiplex positiva para
um único dos seguintes patógenos: adenovírus humano, bocavírus humano, metapneumovírus humano, rinovírus
humano, vírus sincicial respiratório humano e Mycoplasma pneumoniae na ausência de co-detecção para
influenza humano A e B, parainfluenza humano 1, 2, 3 e 4, coronavírus NL63, 229E, HKUI e OC43 e
Chlamydophila pneumoniae. No segundo estudo foram incluídas crianças menores de dois anos, com diagnóstico
clínico de infecção respiratória aguda com até sete dias de doença, com Reação em Cadeia da Polimerase
Multiplex positiva para vírus sincicial respiratório humano na ausência de co-detecção para os outros patógenos
respiratórios citados acima. Foram excluídas nos dois estudos as crianças com história de cardiopatia congênita
complexas, doenças pulmonares graves crônicas e imunodeficiências. As citocinas interferon-γ, fator de necrose
tumoral-α, interleucina-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17 e fator estimulador de colônias de macrófagos e
granulócitos foram mensuradas no aspirado nasofaríngeo através do ELISA. No primeiro estudo, 71 crianças
menores de cinco anos com infecção respiratória aguda por um único patógeno respiratório: vírus sincicial
respiratório humano (23), metapneumovírus humano (11), adenovírus humano, rinovírus humano, bocavírus
humano (10 cada) ou infecção por Mycoplasma pneumoniae (7) foram avaliadas. Nenhuma das crianças
necessitou de ventilação mecânica e todas sobreviveram. Em geral, as concentrações de citocinas não
evidenciaram diferenças entre os patógenos. Entre as exceções, a IL-17 foi maior em crianças com Mycoplasma
16
pneumoniae quando comparadas com as crianças com infecção viral (p = 0,036). Estudos futuros são
necessários para elucidar o papel da resposta Th17 na infecção respiratória aguda. O segundo estudo descreve
as concentrações de citocinas em aspirado nasofaríngeo de 44 crianças infectadas apenas pelo vírus respiratório
sincicial humano de acordo com a gravidade da doença [necessidade de admissão hospitalar e gravidade clínica:
leve (não internada), moderada (internada, sem oxigenioterapia) e grave (internada, oxigenioterapia ou
saturometria de oxigênio < 93%)]. Nenhuma das respostas das citocinas mostrou diferença estatisticamente
significativa entre os grupos. Os dados do presente estudo sugerem que mediadores inflamatórios parecem não
predizer admissão hospitalar ou necessidade de uso de oxigênio em crianças com infecção apenas pelo vírus
sincicial respiratório humano em crianças de baixo nível sócioeconômico no Brasil.
Palavras-chave: adenovírus humanos, bocavírus humano, Brasil, bronquiolite, citocinas, infecção respiratória
aguda, metapneumovírus, pneumonia, rhinovírus, vírus sincicial respiratório humano, Mycoplasma pneumoniae.
17
ABSTRACT
Duarte, MCMB. Cytokine inflammatory responses in nasopharyngeal aspirates of children under five years
with acute respiratory infections in Recife, Brazil. [Thesis] Recife: “Pós-graduação em Saúde Materno Infantil,
Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira (IMIP)”; 2010. 136 p.
It is estimated that four million children die each year due to acute respiratory infections and half of these deaths
occur in infants under six months old. Viruses are responsible for much of the impact of these infections. It is
estimated that the human respiratory syncytial virus alone will result in at least 3.4 million hospital admissions and
between 66,000 to 199,000 deaths in children under five each year worldwide, with 99% of these deaths in
emerging countries. Several studies have shown that the type, load and virulence of the virus on the one hand,
and host factors on the other, such as age, genetic susceptibility and immune status are implicated in the
pathogenesis and severity of acute viral respiratory infection. Among these factors, the host immune response is
considered the main factor determining the disease severity and its consequences in the long term. Few studies
have evaluated the host immune responses against viral infection according to disease severity, or between
different viruses and atypical bacteria that can produce similar clinical syndromes. Furthermore, most studies have
evaluated the T helper 1 and T helper 2 immune responses cells, whereas T helper 17 immune responses have
rarely been described. The objectives of the thesis were to investigate whether cytokines concentrations in
nasopharyngeal aspirate differ according to several respiratory pathogens in children with acute respiratory
infection in Brazil and if the cytokines concentrations differ according to disease severity in children of low
socioeconomical status in Brazil, infected by human espiratory syncytial virus. A prospective, exploratory,
descriptive study was conducted from June 2008 to October 2009. In the first, study children under five years were
included with a clinical diagnosis of acute respiratory infection with up to seven days of illness, with Polymerase
Chain Reaction Multiplex positive for one of the following pathogens: human adenovirus, human bocavirus, human
metapneumovirus, human rhinovirus, human respiratory syncytial virus and Mycoplasma pneumoniae, and with no
co-detection for influenza A and human B, human parainfluenza 1, 2, 3 and 4, coronavirus NL63, 229E, HKUI and
OC43 and Chlamydophila pneumoniae. In the second study, children younger than two years were included with a
clinical diagnosis of acute respiratory infection with up to seven days of illness, with Polymerase Chain Reaction
Multiplex positive for human respiratory syncytial virus and with no co-detection for other respiratory pathogens
cited above. In both studies, children with a history of complex congenital heart disease, severe chronic lung
disease and immunodeficiencies were excluded. The cytokines interferon-γ, tumor necrosis factor-α, interleukin-4,
IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17 and colony-stimulating factor macrophages and granulocytes were
measured in nasopharyngeal aspirate using ELISA. In the first study, 71 children under five with acute respiratory
infection by a single respiratory pathogen - human respiratory syncytial virus (23), human metapneumovirus (11),
human adenovirus, human rhinovirus, human bocavirus (10 each) or Mycoplasma pneumoniae (7) were
evaluated. None of the children required mechanical ventilation and all survived. In general, the cytokines
concentrations showed no differences between the pathogens. Among the exceptions, IL-17 was higher in
children with Mycoplasma pneumoniae when compared to children with viral infection (p = 0.036). Further studies
are needed to elucidate the role of the Th17 response in acute respiratory infection. The second study describes
the cytokines concentrations in nasopharyngeal aspirates of 44 children infected only by human respiratory
18
syncytial virus according to disease severity [need for hospital admission and clinical severity: mild (not
hospitalized), moderate (admission, without oxygen) and severe (hospitalized, use of oxygen or oxygen
saturometry <93%)]. None of the cytokines showed a statistically significant difference between groups. The data
from this study suggest that inflammatory mediators seem to not predict hospitalization or need for oxygen use in
infants infected only by respiratory syncytial virus in children of low socioeconomic status in Brazil.
Key-words: human adenoviruses, human bocavirus, Brazil, bronchiolitis, cytokines, acute respiratory infection,
metapneumovirus, pneumonia, rhinovirus, human respiratory syncytial virus, Mycoplasma pneumoniae.
1
19
CAPITULO 1 - APRESENTAÇÃO
20
I. Apresentação
Esta tese é composta por sete capítulos: I. Apresentação (constituída pela justificativa
do estudo, contextualização, execução e produção dos artigos científicos), II. Introdução, III.
Objetivos, IV. Métodos, V. Resultados, composto de dois artigos originais, VI. Considerações
finais (onde destacamos a importância e aplicabilidade desta pesquisa), VII. Referências, além
dos Apêndices e Anexos.
1.1. Justificativa do estudo
As infecções respiratórias agudas representam um dos principais problemas de saúde
pública em todo o mundo devido à alta morbidade e letalidade, particularmente em menores
de cinco anos. Estima-se que quatro milhões de crianças morram a cada ano devido a infecção
respiratória aguda e que metade dessas mortes ocorra em menores de seis meses de idade. Os
vírus são responsáveis por grande parte do impacto da infecção respiratória aguda. Estima-se
que o vírus sincicial respiratório humano sozinho acarrete no mínimo 3,4 milhões de
admissões hospitalares e entre 66.000 a 199.000 mortes em crianças menores de cinco anos
anualmente em todo o mundo, sendo 99% destes óbitos em países em desenvolvimento.
Vários estudos têm demonstrado que o tipo, carga e virulência do vírus por um lado e
fatores relacionados ao hospedeiro por outro como idade, suscetibilidade genética e estado
imune, são implicados na patogênese e gravidade da infecção respiratória aguda viral.
Avanços no entendimento da patogênese da infecção respiratória aguda apontam para causa
multifatorial, embora a resposta imunológica do hospedeiro seja considerada o principal fator
determinante da gravidade da doença e suas conseqüências a longo prazo.
21
Na literatura mundial, são poucos os estudos em crianças com infecção respiratória
aguda que identifiquem múltiplos patógenos respiratórios (vírus e bactérias atípicas)
simultaneamente e que correlacionem o padrão da resposta inflamatória do hospedeiro de
acordo com gravidade de doença pelo vírus sincicial respiratório humano ou entre os diversos
patógenos respiratórios. Além disso, a grande maioria dos estudos publicados sobre
patogênese da doença respiratória viral foi realizada em países desenvolvidos, com poucos
estudos em regiões de clima tropical e em países em desenvolvimento com recursos limitados,
onde a apresentação clínica poderia ser influenciada por fatores ambientais, nutricionais e
sócioeconômicos.
Portanto, um melhor entendimento dos mecanismos de resposta imune do hospedeiro
em crianças com infecção respiratória aguda atendidas no Instituto de Medicina Integral Prof.
Fernando Figueira - IMIP contribui para preencher uma lacuna do conhecimento e pode
subsidiar a detecção precoce de casos graves, fornecendo observações preliminares para o
desenvolvimento de estratégias terapêuticas relacionadas à imunomodulação da doença
respiratória viral, assim como identificar possíveis marcadores inflamatórios preditores de
gravidade da doença.
1.2. Contextualização da origem do estudo, execução e produção dos artigos
científicos
A idéia do estudo colaborativo com a Escola de Medicina Tropical de Liverpool, a
Universidade de Liverpool e o Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira - IMIP
sobre infecção respiratória aguda viral em crianças menores de cinco anos surgiu em uma
reunião de pesquisa realizada após o Simpósio Internacional de Doença Meningocócica da
22
qual participamos da coordenação em fevereiro de 2005 em Recife. Nesta reunião ocorreu
uma “tempestade de idéias” sobre potenciais projetos de pesquisa colaborativos. Entre os
convidados presentes estiveram os Prof.
o
Dr. Charles Antony Hart (Universidade de Liverpool
- Inglaterra), Prof.
o
Luis Cuevas (Escola de Medicina Tropical de Liverpool - Inglaterra),
Prof.
a
Dra. Madeleine Thomson (Instituto Internacional de Pesquisas em Previsão Climática de
Nova Iorque – EUA) e Prof.
o
Dr. Paul Baines (Alder Hey Children’s Hospital de Liverpool -
Inglaterra) e pesquisadores pernambucanos, entre eles Prof.
o
Dr. Jailson Correia, Prof.
o
Dr.
Murilo Britto, Prof.
a
Dra. Júlia Mello e a doutoranda.
Em reuniões subsequentes delineamos o objeto de estudo e desenvolvemos o projeto de
pesquisa translacional original intitulado “Prevalência, patogênese e fatores de risco para
gravidade das infecções agudas virais do trato respiratório em crianças menores de cinco anos
em Recife, Brasil” sob a coordenação, no Brasil, do Prof. Dr. Jailson de Barros Correia e na
Inglaterra, do Prof. Dr. Charles Antony Hart. Este projeto envolveu a princípio duas
doutorandas, Prof.
a
Mª do Carmo Menezes Bezerra Duarte e Prof.
a
Patrícia Gomes de Matos
Bezerra, e dois mestrandos Natacha Calheiros de Lima Petribú e Joakim Cunha Rego. O
projeto teve custo total calculado, em 2006, em R$ 72.000,00 (conforme projeto originalmente
apresentado ao CNPq), dos quais R$ 39.560,00 foram obtidos junto ao CNPq e o restante
como contrapartida do Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira - IMIP e da
Universidade de Liverpool. Com o súbito falecimento, em setembro de 2007, do nosso
principal colaborador externo (Prof. Charles Anthony Hart), que era o garantidor de
contrapartidas, tanto técnicas quanto financeiras, foi iniciado um longo processo de
renegociação e identificação de novos parceiros para o projeto. Foi então incorporado à
pesquisa o Prof. Dr. Paul McNamara, (Institute of Child Health, Alder Hey Children's
23
Hospital, Liverpool – Inglaterra) que esteve em Recife em maio de 2007 para discussão in
loco das etapas de desenvolvimento da pesquisa.
A coleta de dados do projeto âncora teve início em março de 2008 e a do estudo de
inflamação a partir de maio do mesmo ano. Após processamento inicial das amostras de
aspirado nasofaríngeo no Laboratório de análises do IMIP os espécimes foram armazenados
em freezer de congelamento a -70°C. Inicialmente, o armazenamento foi feito no Laboratório
de Virologia da Universidade de Pernambuco e posteriormente, no Laboratório de Pesquisa
Translacional Prof. C. Anthony Hart no Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira
- IMIP até transporte para análise de identificação de patógenos e de citocinas na Universidade
de Liverpool. A fim de otimizar a etapa de transporte das amostras para o exterior a
doutoranda realizou e obteve certificação no XXIII Curso Especial de Regulamentação do
Transporte De Material Biológico por via aérea – Categoria 1, regulamentado pela Agência
Nacional de Aviação Civil (ANAC) e expedido pela Sociedade Brasileira de Profissionais em
Pesquisa Clínica (SBPPC) em novembro de 2008 [Anexo I].
Em junho e julho de 2009 cumprimos estágio doutoral na Universidade de Liverpool
sob a supervisão dos Prof.
os
Dr. Paul McNamara, Angela Fonceca e Mark Hopkins.
Recebemos treinamento e fizemos extração do RNA/DNA em equipamento robotizado, PCR
Multiplex para diferentes patógenos respiratórios e análise de citocinas de aspirado
nasofaríngeo. Nos meses seguintes, a mestranda Katie Rose da Universidade de Liverpool se
inseriu na pesquisa e efetuou alguns exames de PCR Multiplex e análise de citocinas.
Por se tratar de um estudo exploratório, os resultados da pesquisa foram debatidos
sistematicamente através de teleconferências com nossos colaboradores estrangeiros, a fim de
discutirmos a inserção dos resultados no conhecimento científico atual sobre a resposta imune
24
do hospedeiro com infecção respiratória aguda. Diante da surpreendente taxa de co-detecção
de patógenos respiratórios na análise interina dos dados, enviamos nova remessa de amostras
para a Universidade de Liverpool no final de abril de 2010 cujo resultado já se encontra
incorporado à presente tese.
Diante das características dos achados e após avaliação da melhor estratégia para
publicação dos resultados, optamos por elaborar artigos de forma sintética. Após reuniões do
grupo, baseados na avaliação dos escopos, fatores de impactos e potencial publicação dos
artigos em jornais científicos de interesse, resolvemos encaminhá-los para o The Journal of
Infectious Disease, em formato de brief report (artigo intitulado “Local cytokine inflammatory
responses in children with acute respiratory infections by viral and atypical bacteria”, com
2000 palavras e duas tabelas/figuras) e para o European Respiratory Journal, em formato de
research letter (artigo intitulado “Cytokines do not seem to predict admission or need for
oxygen in infants from low income families with single respiratory syncytial virus infection”,
com 1500 palavras e 1 tabela).
1
25
CAPITULO 2 - INTRODUÇÃO
26
II. Introdução
2. Patogênese e imunidade
Estudos têm demonstrado que o tipo, carga e virulência do agente infeccioso, de um
lado, e fatores relacionados ao hospedeiro como idade, suscetibilidade genética e estado
imune, do outro, são implicados na patogênese e gravidade da doença, embora a resposta
imune pareça exercer papel fundamental [1,2].
O impacto da infecção respiratória aguda (IRA) viral no hospedeiro depende de sua
capacidade em desenvolver uma resposta apropriada frente ao vírus, mantendo a estrutura das
vias aéreas normais. Esta proteção é realizada inicialmente através da resposta imune inata
inespecífica e completada pelas respostas imunes adaptativas humorais e celulares, que
estabelecem uma memória específica para prevenção de reinfecção (Figura 1) [2,3,4].
Idealmente, o vírus deve ser erradicado antes de causar dano celular substancial,
minimizando as lesões provocadas pela resposta inflamatória do hospedeiro. Além do efeito
citopático direto, alguns pacientes podem apresentar inflamação imunomediada, caracterizada
por uma elevada resposta imunoproliferativa aos antígenos virais [2-6]. No caso do vírus
sincicial respiratório humano (HVSR), possíveis razões para essa resposta são que as células T
são necessárias para erradicação deste agente no tecido pulmonar infectado e em algumas
circunstâncias a resposta das células T pode causar significante sequela [3].
27
Figura 1. Receptores e mediadores envolvidos na resposta inflamatória contra vírus do epitélio das vias aéreas. Modificado
de Dakhama et al. [2] 2005. CHP: complexo de histocompatibilidade principal; MAIC: molécula de adesão intercelular;
MACV: moléculas de adesão das células vasculares; MAC-Ep: molécula de adesão de células epiteliais; CGRP: peptídeo
relacionado ao gene de calcitonina; EGF: Fator de crescimento epitelial; PDGF: Fator de crescimento derivado das
plaquetas; TGF: Fator transformante do crescimento; G-CSF: Fator estimulador de colônias de granulócitos; GM-CSF: Fator
estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos; bFGF: Fator de crescimento básico do fibroblasto; IGF: Fator de
crescimento tipo insulina; IFN: interferon; IL: interleucina; FNT: fator de necrose tumoral; ENA-78: do inglês, epithelial
neutrophil-activating peptide 78; GRO: crescimento relacionado a oncogênese; MCP: proteína quimiotáxica dos monócitos;
MIP: proteína inibidora do macrófago; RANTES: do inglês “regulated on activation normal t-cell expressed e secreted”;
quimiocina reguladora da ativação normal da expressão e secreção de células T; PG: prostaglandina; TXB2: tromboxane B2;
LT: leucotrieno; CFTR: Regulador de condutância transmembrana da fibrose cística. *Mediadores inflamatórios estudados.
2.1 Citocinas
As citocinas podem ser definidas como proteínas reguladoras secretadas pelos
macrófagos, células dendríticas, neutrófilos e eosinófilos, cujas ações incluem numerosos
efeitos nas células do sistema imune e modulação da resposta inflamatória [4,5].
Fatores de crescimento
*
EGF
PDGF, TGF-αβ
G-CSF, GM-CSF
bFGF
IGF
Neuropeptídeos
CGRP
Substância P
Integrinas
α1-6,8,9
β1,4-6,8
Moléculas CHP
Classe I e II
Citocinas
*
IFN- α
αα
α/β/γ
γγ
γ
IL-1β, FNT-α
αα
α
IL-2, IL-4
IL-5, IL-6
IL
-
10
Quimiocinas
*
IL-8, ENA-78, GRO-α
MCP-1,4
MIP-1α, MIP-3α
RANTES
,
Eotaxina
Peptídeos
antimicrobianos
Defensinas (α, β)
Catelicidinas (LL-37)
Lisozima
Lactoferrina
Colectinas:
Proteínas surfactantes A, D
Padrões de reconhecimento
Receptores Toll-like 1-10
CD14
CFTR
Mucinas
Radicais de oxigênio
Gases:
Óxido nítrico
Mediadores lipídicos
Prostaglandinas:
PGE
2
, PGF
2X
, TXB
2
Leucotrienos
LT B
4
,C
4
,D
4
,E
4
Moléculas de adesão
MAIC-1, MACV-1, MAC-Ep
28
As suas ações biológicas incluem características como pleiotropismo (propriedade de
atuar sobre diferentes células e múltiplos alvos), redundância (diferentes citocinas podem ter
ações similares), sinergismo (ou antagonismo) e o efeito cascata (a citocina pode aumentar ou
diminuir a produção de outra citocina). Esta multiplicidade de ações e sua meia vida curta
dificultam o entendimento da função das citocinas na resposta imune e na patogênese das
doenças infecciosas, embora muitos estudos forneçam evidências do papel fundamental destas
na regulação da resposta do hospedeiro, como na proliferação e diferenciação das células T e
B. Existem mais de 100 citocinas descritas na literatura [5,6].
Estudos avaliando resposta inflamatória local em aspirado nasfaríngeo (ANF) e lavado
broncoalveolar (LBA) em crianças com IRA têm demonstrado que respostas inflamatórias
locais do tipo Th1, Th2 e Th17 são induzidas por vírus respiratórios e bactérias atípicas [4,9-
11].
De acordo com a função, as citocinas podem ser agrupadas conforme os distintos tipos
de células T helper (Th), que são baseadas nos tipos de citocinas produzidas pelas células T
quando estimuladas para diferenciação [7]. As células T são classificadas em três tipos de
células T helper efetoras: Th1, Th2 e Th17 (Figura 2). As células Th1 produzem largas
quantidades de interferon-γ (IFN-γ), induzem a reação de hipersensibilidade retardada, atuam
na ativação de macrófagos e são essenciais para a defesa contra patógenos intracelulares.
Células Th2 produzem principalmente interleucina-4 (IL-4) e são importantes na indução da
produção de IgE, recrutamento de eosinófilos para sítios de inflamação e ajudam na eliminação
das infecções por parasitas [7].
As células Th17 produzem a citocina regulatória IL-17 que age
na interface entre a imunidade inata e a adaptativa [8]. Especificamente, induzem a produção
de quimiocina (por exemplo, IL-8), fatores de crescimento [por exemplo, fator estimulante de
29
colônias de macrófagos e granulócitos (GM-CSF)], citocinas pró-inflamatórias (por exemplo,
IL-6) e moléculas co-estimulantes [por exemplo, molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1)],
através das células do estroma mesenquimal determinando o recrutamento e ativação dos
neutrófilos no sítio da inflamação [8].
Grupo Células de produção Células alvo Agentes infecciosos
Th1
Bactérias intracelulares
Fungos
Vírus
Th17
Bactérias extracelulares
Fungos
Th2
Parasitas
Figura. 2 Diagrama esquemático da resposta imune Th1, Th2 e Th17. Modificado de Miossec P et al., [7] 2009.
Th: Linfócitos T helper, IFN: interferon; IL: interleucina.
2.2 O HVSR como protótipo da IRA viral na criança
O HVSR é o mais importante dos patógenos respiratórios virais em crianças em
especial de baixa idade e é o mais extensamente estudado e, por isso, pode ser utilizado como
protótipo de IRA viral, com o qual os demais agentes virais são comparados. Ademais, é
menos conhecida a resposta imune à infecção pelos outros vírus respiratórios [1-7].
Macrófagos
Células dentríticas
IL
-
4
IL-13
IL
-
5
IL
-
4R
Eosinófilos
Basófilos
Neutrófilos
IL
-
17A
IL-17F
IL-21
IL-22
IL
-
23R
IFN-γ
γγ
γ
IL-2
IL-12R
30
2.2.1 Resposta imune inata do hospedeiro na IRA por HVSR
A resposta precoce do hospedeiro frente à IRA viral se desenvolve na mucosa
respiratória com a interação do vírus com as células endoteliais. O HVSR ao penetrar por via
intranasal infecta as células epiteliais da mucosa respiratória que recobre as vias aéreas
estendendo-se aos macrófagos alveolares. Desta forma, o HVSR se espalha no trato respiratório
através da transferência do vírus célula a célula [2,4,6].
O hospedeiro, então, por meio da imunidade inata recruta efetores moleculares e células
fagocíticas para o sítio de infecção através da liberação de citocinas. Estudos sobre a
quimiotaxia dos neutrófilos, adesão e citotoxicidade sugerem que os neutrófilos têm papel
importante nas alterações patológicas que ocorrem na bronquiolite. Na infecção pelo HVSR, a
quimiotaxia dos neutrófilos depende da produção de potente quimiocina, IL-8, pelas células
epiteliais respiratórias e pelos macrófagos [2-4,6].
Por sua vez, os macrófagos têm importante papel no controle da resposta imune na
infecção viral, não apenas por interação direta através dos linfócitos helper e citotóxicos, mas
também devido à produção de citocinas. Os macrófagos podem destruir os patógenos, porém
mais comumente agem como células apresentadoras de antígeno (CAA). In vitro, as células
epiteliais respiratórias infectadas pelo HVSR secretam RANTES (do inglês “regulated on
activation normal T-cell expressed e secreted”), MIP-1α, IL-6, IL-8 e IL-1β, enquanto que os
macrófagos secretam IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL12 e FNT-α. Estas citocinas regulam a
resposta imune aumentando a permeabilidade vascular e determinando a ativação e
31
recrutamento dos linfócitos, neutrófilos, células NK e possivelmente de eosinófilos para o sítio
da infecção [12-14].
O reconhecimento de produtos microbianos pelas células do hospedeiro é mediado por
receptores padrões. Os dois receptores mais importantes, o CD14 e o receptor Toll-like 4 (TLR
4), são essenciais para a resposta imune inata tanto contra vírus, quanto contra bactérias Gram
negativas, Gram positivas e micobactérias [15].
Esta interação que envolve receptores vírus-específicos e receptores Toll-like, segue-se
de eventos sinalizadores intracelulares, determinando a secreção de interferon tipo 1 (IFN-
alfa/beta). IFN tipo 1, por sua vez, atua inibindo a replicação viral dentro da célula infectada e
evita que os vírus se difundam para células adjacentes [2,6]
Outrossim, o FNT-α pode mediar a lise das células infectadas, promovendo exposição
do vírus ao sistema imune. Pode também mediar o processo de apoptose [2]. Muitos vírus
escapam a esta resposta antiviral inicial. No entanto, as células epiteliais infectadas secretam
citocinas pró-inflamatórias, FNT-α e IL-1β, em quantidades suficientes para induzir a
expressão de moléculas de adesão na superfície das células endoteliais dos vasos sanguíneos
adjacentes, seguindo-se de adesão e transmigração de células inflamatórias circulantes [2-4].
Todavia, muitos vírus podem escapar a esta resposta imune inata inespecífica e
transitória, necessitando o hospedeiro de mecanismo de defesa antígeno específico para
erradicar o patógeno e prevenir reinfecção [2-4,6]. Desta forma, a resposta imune inata é
rápida, mas, não determina expansão clonal, nem memória imunológica [4].
32
2.2.2 Resposta imune adaptativa do hospedeiro na IRA viral
A imunidade adaptativa é compreendida pela resposta mediada por células e a resposta
imune humoral. A resposta mediada por células promove a eliminação viral, enquanto que a
humoral está primariamente envolvida na imunidade protetora [2-4,6].
A resposta imune adaptativa se inicia com as células apresentadoras de antígeno, que
são ativadas pelo IFN-γ e IL-12 produzidas pelos macrófagos, linfócitos T-gama e delta e as
células NK durante a resposta imune inata [2,6]. Estas citocinas (IFN-γ e IL-12) têm papel
central na diferenciação das células precursoras Th1 e Th2 promovendo a diferenciação das
células Th1 e inibição das células Th2 [5]. As células apresentadoras de antígeno capturam e
selecionam antígenos virais imunologicamente relevantes, através da apresentação dos
linfócitos T CD4 e CD8 a molécula de complexo de histocompatibilidade principal (Figura 3)
[2]. Os linfócitos T são então ativados, através de complexa seqüência de eventos que
envolvem as citocinas e interações cognatas, determinando o desenvolvimento de respostas dos
linfócitos T antígeno-específico [2,3,6].
Evidências mostram que padrões de células Th1 e Th2 determinam o tipo de resposta
imune na infecção pelo HVSR e o espectro de expressão das citocinas afeta o mecanismo de
controle envolvido na regulação da patogênese da doença e na cronicidade [4,6,16].
Respostas Th1 são caracterizadas pela secreção de IFN-γ, IL-2 e FNT e promovem a
produção de opsonização e de anticorpos fixadores de complemento. Estas células também
estimulam a ativação dos macrófagos, a citotoxicidade anticorpo dependente e a
hipersensibilidade retardada. Enquanto que, respostas Th2 são caracterizadas pela secreção de
33
IL-4, IL-5, e IL-13 e promovem a resposta imune humoral, incluindo do tipo IgE e IgG1 (ou
IgG4 em humanos) [2,3,5,6].
Figura 3. Resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro frente à infecção viral. Modificado de Dakhama et al., [2] 2005.
FNT: fator de necrose tumoral; M: macrófago; IL: interleucina; IFN: interferon; NK: células natural killer; γδT: células T-γδ; APC: células
apresentadoras de antígeno; MHC: complexo de histocompatibilidade principal; Tho: células T helper imaturas CD4; Tcp: precursor de
células T citotóxicas CD8; Th1: células T CD4 antígeno-específico produtoras de citocinas tipo 1; Tc1: células T CD8 antígeno-específico
produtoras de citocinas tipo 1; CTL: linfócitos T citotóxicos; Th2: células T CD4 antígeno-específico produtoras de citocinas tipo 2; Tc2:
células T CD8 antígeno-específico produtoras de citocinas tipo 2; Ig: imunoglobulina.
Em paralelo, os linfócitos B capturam os antígenos virais solúveis e os apresentam aos
linfócitos T CD4 antígeno-específicos, que produzem o sinal necessário para a proliferação e
diferenciação dos linfócitos B imaturos antígeno-específicos em linfócito B de memória e
plasmócitos produtores de anticorpos [2]. Dependendo da natureza do antígeno viral e da
atuação das células T helper cognatas, vários anticorpos serão produzidos determinando a
neutralização dos vírus [2,3].
Perforina
Granzima
Resposta inata Resposta adaptativa
Vírus
FNT-
α
αα
α
IFN
-
γ
γγ
γ
Imunopatologia
Imunoproteção
34
Após erradicação dos vírus respiratórios a inflamação geralmente se resolve. O número
de células T citotóxicas virais específicas declina dramaticamente, deixando uma pequena
população de células de memória. Essas células de memória são responsáveis por uma resposta
acelerada durante o próximo contato com o vírus [2,3]. Também nos tecidos periféricos, como
os pulmões, um conjunto de células T de memória fica presente por um período de tempo após
a resolução da infecção viral. Essas células contribuem para uma resposta durante reinfecções
apesar de não poderem se dividir localmente e, portanto, não garantirem uma resposta
sustentada [2,3]. Entretanto, podem contribuir reduzindo a carga viral até que as células
efetoras que são ativadas nos linfonodos alcancem os pulmões infectados. Ademais, as células
T são capazes de produzir quimiocinas que podem contribuir para resposta secundária
acelerando o recrutamento de efetores derivados de linfonodos [2-4].
Desta forma, durante a reinfecção tanto a resposta imune inata quanto a adaptativa são
ativadas objetivando erradicar os vírus sem causar imunopatologia significativa [2].
2.3 Comportamento de citocinas em crianças com IRA por HVSR de acordo com
gravidade de doença
Vários estudos têm investigado o comportamento das citocinas em crianças com IRA
por HVSR de acordo com gravidade de doença [18-32]. No entanto, vários desses estudos
baseiam-se em pesquisas experimentais em animais, e em estudos observacionais em humanos
com grupos relativamente pequenos de participantes [3].
Desregulação das respostas das citocinas locais avaliadas em ANF e LBA têm sido
associado com gravidade da doença pelo HVSR, mas os resultados dos diversos estudos não
35
são completamente consistentes e por vezes são conflitantes [18-32]. Redução das
concentrações de IFN-γ, representante da resposta Th1, têm sido associado a maior duração de
ventilação mecânica e oxigenoterapia [18,21]. Outrossim, redução dos níveis de IL-8, potente
quimiocina, têm sido associados com maior tempo de oxigenoterapia e tempo de permanência
hospitalar [21,22]. Por sua vez, redução dos níveis de substância P, um marcador da
inflamação neurogênica, têm sido associado a maior de oxigênio e de ventilação mecânica [18].
Por outro lado, estudos sobre a associação entre a gravidade HVSR e IL10, citocina reguladora,
produziram resultados conflitantes, como níveis mais elevados têm sido negativamente [21], de
forma positiva [19], ou mesmo não correlacionados [22] com a infecção HRSV grave. Em
relação a IL-4, representante da resposta Th2, estudos não encontraram diferença significativa
entre IL-4 e gravidade de doença [21,22].
No Quadro 1, estão sumarizados estudos clínicos com as respostas das citocinas
avaliadas no presente estudo [19-32].
36
Resposta imune*
Autor (ano
e país de
realização
do estudo
)
Pacientes/
Classificação de gravidade de
doença
Espécime
Quando
Identificação
Citocinas/
quimiocinas
mensuradas
IFN-γ
FNT-α
αα
α
IL-4 IL-5 IL-6 IL-8 IL-10 IL-12 IL-13 IL-17 GM-CSF
Vieira [19],
2010
(Brasil)
30 crianças, < 3 meses, IRA
baixa por HVSR em UTI
neonatal.
Gravidade de doença: sistema
de escore clínico, tempo de O
2
,
de ventilação mecânica e
duração da internação.
ANF
Sangue
Admissão
IMF indireta,
Cultura viral,
PCR: HMPV,
HRV, HVSR
(confirmação)
FNT-α, IL-6,
IL-10, CCL5,
sICAM-1.
Correlação
positiva:
IL-6 (soro)
e tempo
de O
2
e de
internação
Correlação
positiva
IL-10
(ANF) e
escore
clínico
Larrañaga
[20], 2009
(Chile)
75
crianças,
< 6 meses e 24
controles. 2 grupos: 75
lactentes,
IRA baixa por HVSR e
24 controles saudáveis.
Gravidade de doença: sistema
de escore clínico.
Plasma
Admissão e
24-48 após.
IMF/Cultura
viral/PCR
INF-γ, FNT- α,
IL-6, IL-8, IL-10,
IL-13, IL-17.
Sem
diferença
em relação
a gravidade
de doença
Sem diferença
entre casos
moderados e
graves.
Sem
diferença
em relação
a gravidade
de doença
↑ casos
moderados
X casos
graves.
Detecção:
15% .
Bennett
[21], 2007
(Estados
Unidos)
96 crianças, < 2 anos com BQL.
2 grupos: BQL: HVSR (+) 62 /
HVSR (-) 34 [13 outros vírus; 22
vírus (-)].
Gravidade de doença:
necessidade de hospitalização,
duração de O
2
e tempo de
fluidos intravenoso.
ANF
Admissão
Cultura viral,
PCR:
HMPV,
Flu A, Flu B e
HVSR.
IL–1β, 2, 4, 5, 6,
7, 8, 10, 12, 13,
17, GMCSF,
GCSF, IFN-γ,
MCP-1, MIP-1β,
e FNT-α.
Correlação
inversa apenas
entre BQL
HVSR com
duração de
O2.
Sem
correlação
com
duração de
O2, fluidos
IV e
admissão
hospitalar.
Sem
correlação
com
duração de
O2, fluidos
IV e
admissão
hospitalar.
A maioria das
crianças com
níveis
indetectáveis.
Correlação
inversa
entre BQL
HVSR com
duração de
O2.
Correlação
inversa entre
BQL HVSR
com duração
de O2.
Correlação
inversa
entre BQL
HVSR com
duração de
O2.
A maioria das crianças com níveis
indetectáveis.
Sem
correlação
com
duração de
O2, fluidos
IV e
admissão
hospitalar.
Semple
[18], 2007
(Inglaterra)
197 crianças, < 2 anos, BQL por
HVSR.
3 grupos: leve: sem O2 (27),
moderado: O2 (114) e grave:
VM (56).
ANF e se
VM LBA.
Admissão
ELISA:
HVSR
IFN-γ, IL-9,
substância P.
↓IFN-γ
O
2
ou
VM X casos
leves.
Bermejo-
Martin [22],
2007
(Espanha)
44 crianças, < 2 anos IRA baixa
2 grupos: 22 IRA baixa HVSR e
22 controles.
Gravidade de doença:
Escore de gravidade clínica
ANF e
sangue.
Admissão
Teste imuno-
cromatográfi
co rápido,
Cultura, IMF.
IL-1b, IL-2, IL-
12p70, IFNc,
FNT-α, IL-13,
IL-4, IL-6, IL-10,
IP-10, IL-8,
MIP1a, MIP-1b,
FGFb, GCSF,
PDGFbb, IL-
1RA, IL-17.
Associação
significativa
IL-8 e dias de
hospitalizaçã
o (ANF).
IL-8 e O
2
Saturação
(sangue).
Pinto [23],
2006
(Chile)
42 crianças IRA HVSR, <12
meses, 3 grupos: 21 grave, 21
leve e 21 controles.
Gravidade de doença: grave
aqueles hospitalizados com
escore de Tal de 2 or 3 (FR,
intensidade da sibilância, cianose,
uso de musculature acessória)/
Sat. O
2
< 93%.
PBMC
(Sangue)
IMF indireta
IL-12, IFN-γ,
IL-4, IL-5 e
IL-10.
IFN-γ
↓ nos
graves X
leves or
controles na
fase aguda.
Sem
diferença
nos 3
grupos na
fase
aguda.
Sem
diferença
nos 3 grupos
na fase
aguda.
Sem
diferença
nos 3
grupos na
fase
aguda.
IL-12 ↓
nos
graves X
leves or
controles
fase
aguda.
Quadro
1
.
Estudos clínicos sobre produção de citocinas em crianças com infecção respiratória aguda por vírus sincicial respiratório humano de acordo com
gravidade de doença,
1995-2010.
37
Resposta imune*
Autor (ano
e país de
realização
do estudo
)
Pacientes/
Classificação de gravidade de
doença
Espécime
Quando
Identificação
Citocinas
mensuradas
IFN-γ
FNT-α
αα
α
IL-4 IL-5 IL-6 IL-8 IL-10 IL-12 IL-13 IL-17 GM-CSF
Pitrez [24],
2005
(Brasil)
62 crianças < 2 anos, BQL,
sibilância recorrente, IRA alta. 3
grupos: 29 BQL, 18 sibilância e
15 IVAS. Gravidade de doença:
BQL X IRA alta.
ANF
1ª 48 horas
de admissão
IMF
IFN-γ, IL-4
Sem
diferença
entre os
grupos.
Sem
diferença
entre os
grupos.
Pitrez [25],
2005
(Austrália)
71 crianças <18 meses, IRA,
sibilância recorrente.3 grupos:
36 BQL, 17 sibilância recorrente
and 18 IRA alta. Gravidade de
doença: BQL X IRA alta.
ANF
1ª 48 horas
de admissão
IMF
IL-8, IL-10,
IFN-γ, IL-11
Sem
diferença
entre os
grupos.
Sem
diferença
entre os
grupos.
↑ IL-10
BQL X
IRA alta
ou
sibilância
recorrente
Giugno [26],
2004
(Brasil)
62 crianças < 2 anos, BQL
HVSR. Gravidade de doença:
Sat.O
2,
escore clínico, tempo de
O
2
e hospitalização e uso de VM.
ANF
Admissão
IMF indireta
ou ELISA.
IL-2
(Sem diferença
IL-2 X gravidade
de doença)
Garofalo
[27], 2004
(Estados
Unidos)
41, < 14 meses, IRA
3 grupos: 10 IRA alta e 31 BQL
hipoxica e não hipóxica.
Gravidade de doença: IRA alta,
BCL não hipóxica e BQL
hipóxica (Sat. O
2
≤ 95%).
ANF.
Admissão
IMF direta
IL-12, IL-18,
IFN-γ
Sem
diferença
entre os 3
grupos.
Sem
diferença
entre os 3
grupos.
Legg [28],
2003
(Inglaterra)
88 recrutados antenatal (pais
atópicos ou asmáticoa). 28 IRA
HVSR +.
2 grupos: 19 IRA alta e 9 BQL.
Gravidade de doença:
IRA alta X BQL
ANF e
sangue.
PCR
ANF: INF- , IL-
4, IL-10, IL-12 e
carga viral
HVSR.
Sangue; mRNA
IFN- , IL-4, IL-
12, IL-18 mRNA.
↓ IFN-γ BQL
no D1–2 X
IRA alta.
↑ IL-4 no
D5–D7
BQL:IRA
alta,
tendência
↑níveis no
D1-D2.
Sem diferença entre os
grupos.
.
van Benten
[29], 2003
(Holanda)
22, 14 BQL HVSR e 8 IRA alta
HVSR
2 grupos: 14 BQL e 8 IRA alta
Gravidade de doença:
IRA alta X BQL
ANF
Admissão e
2-4 semanas
IMF direta
ICAM-1, IFN-γ,
IL-4, IL-6, IL-8,
IL-10, IL-12, IL-
18.
Sem
diferença
BQL X IRA
alta (fase
aguda).
Sem diferença BQL X IRA alta (fase aguda)
de Waal
[30], 2003
(Holanda)
33, < 2anos IRA
3 grupos: 13 IRA baixa HVSR, 9
IRA alta HVSR negativo e 11
BQL HVSR
Gravidade de doença:
IRA alta X BQL
PBMC
(sangue) e
brush nasal
(células-T)
Admissão, 6,
12, 18 e 24 m,
e ≈14 dias
após IRA alta.
FN-γ, IL-4,
IL-13.
38
IRA: infecção respiratória aguda; BQL: bronquiolite; HVSR: virus sincicial respiratório humano; HadV: Adenovirus humano; BV: bocavírus; HMPV: metapneumovirus humano; Flu: influenza humano; HPIV: parainfluenza humano; ANF: aspirado
nasofaríngeo; LBA: lavado broncoalveolar não broncoscópico; ELISA - do inglês “Enzyme Linked Immunono Sorbent Assay”; PCR: reação em cadeia da polimerase; IL – interleucina; IFN: interferon; FNT: fator de necrose tumoral; GM-CSF: fator
estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos; SP: substância P; RANTES ou CCL5: do inglês “regulated on activation normal T-cell expressed e secreted”; MIP-1: do inglês “ macrophage inflammatory protein”; O2: oxigenioterapia, VM:
ventilação mecânica; IMF: imunofluorescência, IV: intravenoso; sICAM-1: sICAM-1: do inglês “soluble intercellular adhesion molecule 1”; GCSF: fator estimulante de colônias de granulócitos;ICAM-1: do inglês “Inter-Cellular Adhesion Molecule 1”;
FGFb: do inglês “Fibroblast Growth Factor, Basic”; MCP-1: do inglês “Monocyte chemotactic protein-1”; PDGFbb: do inglês “Platelet-derived growth factor subunit B”. *As citocinas relacionadas foram avaliadas na tese.
.
Resposta imune*
Autor (ano
e país de
realização
do estudo
)
Pacientes/
Classificação de gravidade de
doença
Espécime
Quando
Identificação
Citocinas
mensuradas
IFN-γ
FNT-α
αα
α
IL-4 IL-5 IL-6 IL-8 IL-10 IL-12 IL-13 IL-17 GM-CSF
ANF: sem correlação com gravidade de
doença.
Sheeran
[31], 1999
(Estados
Unidos)
35, 28 IRA HVSR e 7 crianças
controles.
2 grupos hospitalizados: 14
intubados e 14 não intubados.
Gravidade de doença: (1) n° de
dias de hospitalização; (2) dias
de MV; (3) dias de uso de O2;
and (4) Escore de injúria
pulmonar de Murray et al.
ANF e
aspirado
traqueal D1,
D3, D5 e
Sangue
RANTES,
MIP-1-α, IL-6,
IL-8, IL-10 ANF
e aspirado
traqueal.
Aspirado
traqueal:
sem
correlação
com
gravidade
de
doença.
Aspirado traqueal:
correlação inversa com
dias de intubação e dias de
suplementação de O2.
Smyth [32],
1997
(Inglaterra)
94 < 1 ano Infecção HVSR
Gravidade de doença: muito
leve: apenas coriza (6); leve
simtomas de IRA baixa (33);
moderado: requerendo sonda
gátrica ou fliudos IV(24); grave:
requerendo O2 ou ventilação
mecânica (26).
Sangue
IL-4, soluble IL-2
receptor
(sCD25),
sICAM-1,
myeloperoxidase.
Nenhuma
correlação
com
gravidade
de
doença.
39
2.4 Resposta imune na IRA de acordo com o tipo de vírus e por Mycoplasma pneumoniae
Poucos estudos têm investigado a resposta imune Th1, Th2 e Th17 em crianças
com IRA de acordo com diferentes tipos de vírus ou bactérias atípicas [7,9,11,33,34]. Esses
estudos em sua maioria baseiam-se em pesquisas experimentais em animais, e em estudos em
humanos observacionais exploratórios com grupos relativamente pequenos de participantes [3].
No entanto, alguns estudos demonstram que infecção por vírus respiratórios pode induzir
diferentes respostas inflamatórias locais [9,33-38]. Crianças infectadas por HVSR apresentam
respostas imunes Th1, INF-γ, mais baixas e respostas Th2, IL-4, mais altas quando comparadas
a crianças infectadas por outros tipos de vírus [9,33,35]. Por outro lado, resposta imune Th17
tem sido bem estudada no contexto das doenças inflamatórias crônicas e auto-imunes, embora
pareça também estar envolvida na patogênese das doenças infecciosas [7,8,11]. Resposta Th17
em doenças infecciosas pulmonares tem sido relatada em humanos e/ou modelos animais para
algumas bactérias como Klebsiella pneumoniae, Bordetella pertussis, Mycobacterium
tuberculosis e fungos, mas o papel nas doenças respiratórias virais e a causada pelo
Mycoplasma pneumoniae permanece indefinida [7,8,11]. Estudo comparando níveis séricos de
IL-17 e de GM-CSF entre crianças com Mpp/ Clamydophila pneumoniae e infecções virais não
encontraram diferenças significativas [39].
Os estudos clínicos descritos na literatura pesquisada comparando o comportamento das
respostas imunes Th1, Th2 e Th17 em crianças com IRA de acordo com o tipo de vírus e por
Mycoplasma pneumoniaesão sumarizados no Quadro 2 [9,10,34-47].
40
Resposta imune* Autor
(ano
e país de
realização
do estudo)
Pacientes
Patógeno: HVSR/
HadV/ HRV/BV/
HMPV/Mpp/Flu/HPIV/
controles
Idade Espécime
Quando
Identificação
Citocinas
IFN-γ
FNT-α
αα
α
IL-2 IL-4 IL-6 IL-8 IL-10 IL-17 GM-CSF
Byeon [9],
2009
(Coréia)
277 com IRA baixa,
4 grupos: 119 HVSR /
31 HadV/71 Flu/ 56
HPIV.
Crianças ANF
Admissão
Cultura
IL-4, IL-5, IFN-γ. HVSR < Flu ou
HadV
ou HPIV
Flu < HVSR ou
HadV
ou HPIV
Jartti [35],
2009
(Finlândia)
61 pacientes, 2 grupos
50, 1° ou 2°episódio
de sibilância, HRV ou
HVSR e 11 controles
assintomáticos.
3-35
meses
Sangue
Admissão, 2-3
semanas e após
a alta. Cultura/
PCR Antígeno
viral/ Anticorpos
IgG
IFN -γ, IL -2, IL-4, IL-5,
IL-10, IL-12, IL-13.
HRV > HVSR
HRV > controles
(fase aguda).
HRV >
controles
(fase aguda)
Nenhuma
diferença entre
os grupos.
HRV >
controles
(fase aguda)
Choi [36],
2009
(Coréia)
94 pacientes, 3 grupos
58 com Mpp pneumonia
(G1: 12 com sibilância,
G2: 46 sem sibilância)
and G3: 36 sem Mpp
pneumonia.
3-15 anos Sangue
Admissão
Titulação de
anticorpos
IL-4, IL-5, IFN-γ, VEGF. Nenhuma
diferença entre os
grupos.
Nenhuma
diferença entre
os grupos.
Moro [37],
2009
(Estados
Unidos)
134 pacientes, 2
grupos 78
HadV
/
56 controles
assintomáticos.
< 4 anos ANF
Admissão
PCR para 15
tipos de virus
respiratórios.
IL-1α, β, IL-2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 10, 12, 13, 15, 17, IFN
α e γ, GM-CSF,FNT-α,
MCP-1, MIP-1α e β, IP-10,
eotaxina, RANTES, MIG.
Nenhuma
diferença
HadV
x
controles
HadV
>controles
.
Nenhuma diferença
HadV
x
controles
HadV
>controles.
Nenhuma diferença entre HADV X controles
Chung [10],
2008
(Coréia)
59 com BCL + 18
controles, 3 grupos
30 HVSR/
29 BV/
18 controles .
< 2 anos ANF
Admissão
PCR para 10
tipos de virus
respiratório.
IL-2, IL-4, IL-5, IL-10,
IFN-γ, FNT-α.
BV ou HVSR >
controles.
IFN-γ /IL-10: BV <
HVSR
HVSR >
BV.
HVSR >
controles.
BV >
controles
BV ou HVSR >
controles.
HVSR > BV
HVSR >
controles.
Oda [38],
2008
(Japão)
86 pacientes, 3 grupos
3 gr: 40 HVSR
/
23 HadV./
23 controles .
< 2 anos Sangue
Dia 1 e 4.
Teste de
detecção de
antígenos.
IL-4, IL-6, IFN-γ.
Fase aguda (D1):
nenhuma
diferença HVSR
X HadV.
Fase aguda (D1): nenhuma
diferença HVSR X HadV.
Melendi
[33], 2007
(Argentina)
87 com IRA, 3 grupos
46 HVSR/
22 HMPV/
19 Flu.
< 1 ano ANF
Admissão
PCR: HMPV
Hexaplex
assay: HVSR,
Flu
IL-2, IL-4, IL-13, IFN-γ.
Flu > HVSR.
Nenhuma
diferença HVSR
and HMPV.
IFN- γ/IL-4: HMPV <
HVSR ou Flu.
Apenas Flu
apresentou
níveis
detectáveis.
Flu > HVSR ou
HMPV.
Nenhuma
diferença HVSR
and HMPV.
Michelow
[39], 2007
(Estados
Unidos)
55 com pneumonia;
5 grupos 12 Mpp (10)
ou Chlamydophila (2)/
12 pneumococo/
8 vírus/11 infecções
mistas/12 patógenos
não identificados.
6 semanas
a 18 anos
Sangue
Não relatado.
ELISA: Mpp,
Chlamydophila
Vírus/Cultura
viral
FNT-α, IFN-α, IFN-γ,
GM-CSF, IL-1b, IL-2, IL-
4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10,
IL-12, IL-13, IL-15 e
IL-17.
Nenhuma
diferença entre os
grupos.
Nenhuma
diferença
entre
Mpp/CP e
vírus
Nenhuma diferença entre os
grupos..
Nenhuma
diferença
entre
Mpp/CP e
virus.
Nenhuma diferença entre
Mpp/CP e virus.
Nenhuma
diferença
netre
Mpp/CP e
vírus. MPP/C
> pneumo
Nenhuma
diferença
entre
Mpp/CP e
virus.
Quadro 2
.
Estudos clínicos de produção
de citocinas em crianças com infecção respiratória aguda por virus e
Mycoplasma pneumoniae,
1995
-
2010.
41
Resposta imune*
Autor (ano e
país de
realização
do estudo
)
Pacientes
Patógeno: HVSR/
HadV/ HRV/BV/
HMPV/Mpp/Flu/HPIV/
controles
Idade Espécime
Quando
Identificação
Citocinas
IFN-γ
FNT-α
αα
α
IL-2 IL-4 IL-6 IL-8 IL-10 IL-17 GM-CSF
McNamara
[40], 2007
(Inglaterra)
45 HVSR BCL,
2 grupos
31 HVSR+/ HMPV+ e
14 HVSR+/HMPV-.
< 18
meses
BAL
1
as
48 h de VM.
PCR: HMPV.
FNT-α, IFN-γ, IL-4, IL-
10, IL-8, IL-9, IL-13, IP-
10, MCP-1, MIP-1a,
RANTES, eotaxina.
Nenhuma diferença entre os
grupos.
Nenhuma
diferença entre
os grupos.
Nenhuma diferença entre
os grupos.
Yoon [41],
2007
(Coréia)
Resumo no J
Allergy Clin
Immunol
60 pacientes, 2 grupos
35 Mpp + sibilância 25
controles saudáveis.
3 a 14
anos
Sangue
Não relatado.
IL-4, IL-5, ECP. Nenhuma
diferença entre
os grupos..
Fernandez
[42], 2005
(Chile)
133 IRA crianças,
3 grupos:68 HVSR,
21 HadV, 44 controles
não infectados.
< 2 anos
Sangue
Não relatado
IMF/Cultura
IFN-γ, IL-10.
HadV >
HRSV e
controles.
Nenhuma
diferença
entre os 3
grupos.
Kristjansson
[43], 2005
(Suécia)
98IRA crianças,
3 grupos:
39 HVSR,
9 Flu ou HPIV,
50 controles .
≤ 7 meses ANF
Admissão
IMF direta
IL-4, IL-5, IFN-
γ,
MIP-
1β e eotaxina.
HVSR >
controles.
HVSR >
controles.
Laham [34],
2004
(Argentina)
87 IRA, 3 grupos
46 HVSR/
22 HMPV/
19 Flu.
< 1ano ANF
Admissão
PCR
FNT-α, IL-6, IL-8, IL-10,
IL-12, IL-1β.
HMPV <
HVSR mas,
similar Flu.
HMPV < HVSR ou Flu. Nenhuma
diferença
entre os 3
grupos.
Aberle
[44], 2004
(Áustria)
60 IRA baixa,
5 grupos:
32 HVSR/
7 HadV/
16 HRV/
5 HPIV/
13 controles.
< 32
semanas
Sangue
(PBMC)
Admissão
ELISA/ Cultura/
PCR
IFN-γ
HadV > controles
HRV > controles
HPIV > controles.
HVSR nenhuma
diferença X
controles.
Leve: HRV >
HVSR. HVSR >
leve X grave.
HRV > leve X
grave.
Joshi [45],
2003
(Austrália)
60 crianças, 101 IRA,
2 grupos:
16 HVSR/85 HVSR
neg
35 HRV/66 HRV neg
< 200 dias ANF
PCR, Cultura e
IMF.
IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-10 IFN-γ/ IL-10:
HVSR < HRV
Não detectado.
Jartti [46],
2002
(Finlândia)
IRA e sibilância
2 grupos:
10 HMPV
? HVSR ( controles
históricos)
3 meses a
< 16 anos
ANF
Admissão
PCR/Cultura
viral.
IL-8, RANTES HMPV >
HVSR.
42
IRA: Infecção respiratória aguda; HVSR: humano vírus sincicial respiratório; HadV: adenovirus humano; BV: bocavirus; HMPV: metapneumovirus humano; Mpp: Mycoplasma pneumoniae; Clamydophila pneumoniae: CP; Flu: influenza humano; HPIV:
parainfluenza; ANF: aspirado nasofaríngeo; LBA: lavado broncoalveolar não broncoscópico; ELISA: do inglês “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”; PCR: reação em cadeia da polimerase; IMF: imunofluorescência; IL: interleucina;IFN: interferon; FNT:
fator de necrose tumoral; GM-CSF: fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos; RANTES: do inglês “regulated on activation normal T-cell expressed e secreted”; VEGF: do inglês “vascular endothelial growth factor”; MIP-1 macrophage
inflammatory protein; MCP-1: do inglês “Monocyte chemotactic protein-1”; IP-10: do inglês “Interferon-gamma-inducible protein 10”; sICAM-1: do inglês “soluble intercellular adhesion molecule 1”; sVCAM-1: do inglês “soluble vascular adhesion molecule 1’.
*As citocinas relacionadas foram avaliadas na tese.
Resposta imune*
Autor (ano e
país de
realização
do estudo
)
Pacientes
Patógeno: HVSR/
HadV/ HRV/BV/
HMPV/Mpp/Flu/HPIV/
controles
Idade Espécime
Quando
Identificação
Citocinas
IFN-γ
FNT-α
αα
α
IL-2 IL-4 IL-6 IL-8 IL-10 IL-17 GM-CSF
Sung [47],
2001
(China)
21 IRA, 2 grupos
11 HVSR/
10 Flu.
< 18m ANF e sangue
Admissão
IMF direta/
Cultura.
IL-2, 4, 5, RANTES,
sICAM-1, sVCAM-1 e
FNT-α.
HVSR < Flu
(ANF).
Nenhuma
diferença
HVSR X
Flu.
HVSR > Flu
(soro).
43
Diante do exposto, evidencia-se a necessidade de novas investigações sobre o tema.
Ressalta-se que os estudos que investigam a relação entre o padrão da resposta imune Th1,
Th2 e Th17 do hospedeiro e gravidade da doença respiratória viral, e entre respostas imunes
de acordo com diferentes patógenos respiratórios têm sido realizados em países desenvolvidos,
havendo escassez destes em regiões de clima tropical e em países em desenvolvimento, onde a
apresentação clínica da doença poderia ser agravada por fatores ambientais, nutricionais e
sócio-econômicos.
Dentre os poucos estudos realizados no Brasil e encontrados na literatura (busca nas
bases de dados PubMed, Scielo e LILACS) destacam-se três estudos. Primeiro, realizado por
Pitrez
et al.,
24
(2005) no Rio Grande do Sul, envolvendo 29 crianças com bronquiolite aguda,
18 com sibilância recorrente e 15 com IRA alta, no qual os autores não encontraram um
padrão predominante de produção de citocinas Th1 (IFN-
γ
) e Th2 (IL-4), sugerindo que
fatores múltiplos, como padrão genético da resposta imune do hospedeiro e fatores ambientais,
poderiam estar envolvidos na patogênese da doença. Segundo, realizado por Giugno
et al
.,
26
(2004) também no Rio Grande do Sul, no qual avaliou-se a resposta imune Th1 em 62
crianças hospitalizadas com bronquiolite aguda através da medição da IL-2 no ANF não
observando diferença significativa entre os níveis de IL-2 e gravidade de doença. Terceiro,
realizado em São Paulo por Vieira
et al
.,
19
(2010), no qual avaliaram a resposta das citocinas
FNT-
α
, IL-6, IL-10, CCL5 e sICAM-1 de acordo com a gravidade clínica em 30 crianças
menores de três meses com IRA baixa por HVSR internadas em unidade de terapia intensiva
neonatal. Os autores encontraram uma correlação positiva significante entre a gravidade da
doença na admissão hospitalar e as concentrações de sICAM-1 e de IL-10 na secreção
nasofaríngea.
1
44
Neste sentido, o presente estudo que faz parte de um maior intitulado “Prevalência,
patogênese e fatores de risco para gravidade das infecções agudas virais do trato respiratório
em crianças menores de cinco anos em Recife, Brasil” tem como finalidade avaliar o
comportamento das respostas imunes inatas e adaptativas Th1, Th2 e Th17 em aspirado
nasofaríngeo de crianças com infecção respiratória aguda de acordo com diversos patógenos
respiratórios e investigar se as concentrações de citocinas diferem de acordo com a gravidade
da doença em crianças de baixo nível sócioeconômico no Brasil infectadas pelo HVSR.
45
CAPITULO 3 - OBJETIVOS
46
III. Objetivos
Estudo 1.
Verificar se concentrações de citocinas em aspirado nasofaríngeo diferem de acordo com
diversos patógenos respiratórios em crianças, menores de cinco anos, com infecção
respiratória aguda no Brasil.
Estudo 2.
Investigar se as concentrações de citocinas em aspirado nasofaríngeo diferem de acordo com a
gravidade da doença em crianças, menores de dois anos de baixo nível sócio-econômico no
Brasil, infectadas pelo vírus sincicial respiratório.
1
47
CAPITULO 4 - MÉTODOS
48
IV. Métodos
4. 1 Local do estudo
Esta tese foi desenvolvida no Programa de Pós-graduação em Saúde Materno Infantil
e a coleta de dados realizada na Emergência Pediátrica e no setor de internamento do Instituto
de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira (IMIP), em Recife, Pernambuco. O IMIP assiste
a população pediátrica da região metropolitana do Recife e de outras cidades do Estado,
usuária do Sistema Único de Saúde.
4. 2 Desenho de estudo
Estudo prospectivo, exploratório, do tipo descritivo.
4. 3 Período de coleta de dados
Os dados foram coletados no período de 17 de junho de 2008 a 1 de outubro de 2009.
4. 4 Critérios de elegibilidade
Estudo 1:
Critérios de inclusão:
Crianças menores de cinco anos, de ambos os sexos, com diagnóstico clínico de IRA com até
sete dias de doença.
Reação em cadeia da polimerase (PCR) positiva para um único dos seguintes patógenos
HVSR, adenovírus humano (HadV), rinovírus humano (HRV), bocavírus (BV),
49
metapneumovirus humano (HMPV),
Mycoplasma pneumoniae
(Mpp) na ausência de co-
detecção para influenza humano (Flu) A e B, parainfluenza humano (HPIV) 1, 2, 3 e 4,
coronavírus humano (HCoV) NL63, 229E, HKUI e OC43 e
Chlamydophila pneumoniae
(CP).
Critérios de exclusão
Crianças com história de cardiopatia congênita complexa, doenças pulmonares graves crônicas
e imunodeficiências.
Estudo 2:
Critérios de inclusão:
Crianças menores de 2 anos, de ambos os sexos, com diagnóstico clínico de IRA com até sete
dias de doença.
PCR positivo para HVSR na ausência de co-detecção de patógenos respiratórios para HMPV,
Flu A e B, HPIV 1, 2, 3 e 4, HCoV NL63, 229E, HKUI e OC43, HadV, HRV, BV,
Mycoplasma pneumoniae
e
Chlamydophila pneumoniae
.
Critérios de exclusão
Crianças com história de cardiopatia congênita complexa, doenças pulmonares graves crônicas
e imunodeficiências.
4. 5 População e amostra
A população do estudo foi constituída de crianças menores de cinco anos com IRA,
incluindo quadros de bronquiolite, pneumonia, sibilância episódica viral e IRA alta, usuárias
do Sistema Único de Saúde, do Nordeste do Brasil.
50
Foram avaliadas todas as crianças que preencheram os critérios de elegibilidade dos
estudos.
4. 6 Fluxograma da captação de pacientes e de procedimentos
Os participantes foram selecionados pelos médicos plantonistas da Emergência
Pediátrica do IMIP, segundo os critérios elegíveis de casos. A partir da identificação dos
casos, os responsáveis pelas crianças foram contatados, solicitando-se a assinatura do Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido (APÊNDICE 1).
Foi realizado o registro dos participantes diariamente de acordo com a data de entrada,
em um livro de registro criado para o estudo, no qual foram coletados dados referentes às
crianças pela auxiliar de pesquisa e pelos pesquisadores envolvidos no estudo.
A aplicação do formulário (APÊNDICE 2) e a coleta de exames seguiram o
fluxograma proposto para a pesquisa.
51
FLUXOGRAMA DE PESQUISA: VÍRUS RESPIRATÓRIOS
Pesquisadores responsáveis: Dra. Mª do Carmo Duarte e Dr. Jailson Correia
Critérios de inclusão: crianças menores de 5 anos, incluindo recém-nascidos, de ambos os sexos, com infecção respiratória aguda (IRA). O diagnóstico clínico
de IRA baseia-se na presença de coriza, tosse, taquipnéia, tiragens ou sibilância por até 7 dias do atendimento hospitalar, incluindo quadros de bronquiolite,
pneumonia, sibilância episódica viral e IRA alta.
* A coleta dos espéci
mes
em
até
a 24ª hora de
admissão. Exames: ANF
-
detecção viral
(
RT
-
PCR
)
e dosagens de
citocinas; s
angue
-
hemocultura para bactérias nas
crianças que iniciarem antibioticoterapia. Procedimento no laboratório do IMIP dos espécimes coletadas em até 2 horas.
Identificação dos casos de infecção respiratória aguda
em menores de 5 anos
(por busca ativa dos pesquisadores ou quando identificados pelos médicos e enfermeiras)
Rejeitam participar
da pesquisa
= 0
PCR Multiplex = 383
Checagem dos critérios de elegibilidade projeto âncora (equipe de pesquisa) =
383
SIM
= 383
Aplicação do formulári
o = 383
Aceitam participar
da pesquisa
(TCLE)
=
383
EM TOD
AS AS CRIANÇAS
*
- Coleta de aspirado nasofaríngeo = 383
na admissão
(us
ar
1
ml de solução salina livre de RNAses para diluir o ANF.
Estudo 1
Checagem dos critérios de elegibilidade =
71 crianças
Estudo 2
Checagem dos critérios de elegibilidade
=
44 crianças
51
4. 7 Definição de termos e operacionalização das variáveis do projeto âncora
2
Os diagnósticos de pneumonia, bronquiolite, sibilância episódica viral e infecção
respiratória aguda alta foram classificados pela pesquisadora de forma consensual com outra
pesquisadora após revisão dos registros das crianças de acordo com definições “a priori”. As
variáveis foram categorizadas em sim ou não.
• Bronquiolite:
doença aguda em lactentes menores de 18 meses de vida, caracterizada por
sinais e sintomas prévios de infecção respiratória das vias aéreas superiores, seguida por
dificuldade respiratória, na qual sibilância pode estar presente.
•
••
• Pneumonia:
uma doença respiratória aguda associada à taquipnéia e tiragem intercostal ou
em um paciente com estertores difusos ou focais, diminuição do murmúrio vesicular, na
presença ou não de confirmação radiológica.
•
Sibilância episódica viral:
sibilância durante períodos de tempo distintos, muitas vezes em
associação com evidência clínica de uma rinofaringite viral, com ausência de sibilância entre
os episódios [48].
• Infecção respiratória aguda alta:
doença aguda, caracterizada pela presença de sinais e
sintomas gerais e do aparelho respiratório, como febre, coriza, tosse seca ou produtiva, e na
qual taquipnéia, tiragem intercostal e estridor podem estar presentes.
•
••
• Classificação de gravidade de doença:
variável categórica nominal, policotômica obtida
pela pesquisadora, classificada em leve: infecção respiratória aguda sem internamento
hospitalar; moderada: infecção respiratória aguda com internação hospitalar sem necessidade
2
As variáveis do estudo sobre resposta inflamatória estão sublinhadas.
52
de oxigenioterapia; grave: infecção respiratória aguda com internação hospitalar com
necessidade de oxigenioterapia ou saturometria de oxigênio monor que 93%.
•
••
• Hipoxemia:
variável categórica (sim/não), definida como saturometria d
e oxigênio
menor que 93%, aferida pela auxiliar de pesquisa através da oximetria de pulso antes da coleta
do aspirado nasofaríngeo.
Variáveis demográficas
•
••
• Idade:
variável numérica contínua expressa em meses, determinada a partir da data de
nascimento do registro de nascimento ou cartão da criança ou por informação do
acompanhante na admissão pela auxiliar de pesquisa.
•
••
• Sexo:
variável categórica nominal dicotômica (masculino/feminino).
•
••
• Estado nutricional:
variável numérica contínua obtida através dos indicadores peso/idade,
altura/idade e peso/altura segundo o padrão de crescimento infantil da Organização Mundial
de Saúde (OMS), (2006), assinalado em escores-z coletadas. As medidas antropométricas de
peso e altura (comprimento) foram realizadas pela auxiliar de pesquisa com o emprego de
balanças eletrônicas e antropômetros, de acordo com recomendações da OMS.
•
••
• Procedência:
variável categórica nominal policotômica obtida pela auxiliar de pesquisa,
expressa pelo município de residência da criança, categorizada em mesorregiões:
Metropolitana do Recife, Mata, Agreste, Sertão e do São Francisco.
•
••
• Tipo de casa:
variável categórica nominal policotômica (tijolo /taipa/ outro) referente ao
tipo de construção do domicílio obtida pela auxiliar de pesquisa referido pelo responsável pela
criança.
53
•
••
• Suprimento de água:
variável categórica nominal policotômica (encanada, de poço,
nascente ou cacimba) obtida pela auxiliar de pesquisa referido pelo responsável pela criança.
•
••
• Número de pessoas que residem no domicílio:
variável numérica contínua obtida pela
auxiliar de pesquisa por questionamento ao responsável pela criança.
•
••
• Número de pessoas que dormem com a criança no mesmo dormitório (incluindo o
paciente):
variável numérica contínua obtida pela auxiliar de pesquisa por questionamento ao
responsável.
•
••
• Renda familiar mensal per capita:
variável numérica contínua policotômica, expressa em
reais, obtida através da renda do chefe da família mais a renda dos outros moradores incluindo
o bolsa família, dividida pelo número de moradores do domicílio, referida pelo responsável
pela criança no último mês.
•
Número de irmãos:
variável numérica contínua obtida pela auxiliar de pesquisa por
questionamento ao responsável.
•
••
• Idade materna:
variável numérica contínua expressa em anos da genitora obtida pela
auxiliar de pesquisa por questionamento ao responsável.
•
••
• Escolaridade materna:
variável numérica expressa em anos completos e aprovados de
estudo da genitora, obtida pela auxiliar de pesquisa por questionamento ao responsável.
•
••
• Ocupação materna:
variável categórica definida pela profissão materna obtida pela auxiliar
de pesquisa por questionamento ao responsável.
•
••
• Escolaridade paterna:
variável numérica expressa em anos completos e aprovados de
estudo do genitor, obtida pela auxiliar de pesquisa através do responsável pela criança.
54
•
••
• Tabagismo na residência:
variável categórica, definida pela presença (sim/não) de
tabagismo em moradores do domicílio da criança, obtida pela auxiliar de pesquisa junto ao
responsável pela criança.
•
••
• Tipo de combustível usado para cozinhar:
variável categórica nominal policotômica
referente ao tipo de combustível usado para cozinhar no domicílio: madeira/carvão/gás/
parafina/outros, obtida pela auxiliar de pesquisa por questionamento ao responsável pela
criança.
Variáveis clínicas
•
••
• Peso ao nascimento
: variável numérica contínua expressa em gramas, obtida do cartão de
vacina ou da declaração do nascido vivo ou ainda do prontuário do paciente dos hospitais
envolvidos no estudo ou ainda referida pela genitora.
•
Prematuridade:
variável categórica nominal dicotômica (sim/não), definida pela idade
gestacional ao nascimento menor que 37 semanas obtida do cartão de vacina ou da declaração
do nascido vivo da criança ou ainda referida pela genitora.
•
••
• Doença de base coexistente:
variável categórica nominal obtida pela auxiliar de pesquisa
definida pela presença de cardiopatia congênita, doença pulmonar crônica e imunodeficiência,
doença neurológica referida pelo responsável pela criança.
•
••
• História de doença respiratória e de alergia:
variável categórica nominal obtida pela
auxiliar de pesquisa, definida pela presença de pneumonia, asma/sibilância, tosse há mais de
um mês, tuberculose, eczema, rinite e outras, referida pelo responsável pela criança.
•
••
• Internamento anterior:
variável categórica nominal dicotômica (sim/não) obtida pela
auxiliar de pesquisa, referida pelo responsável pela criança.
55
•
••
• Motivo de internamento anterior:
variável categórica nominal definida pelo motivo do
internamento anterior ao atual, obtido pela auxiliar de pesquisa referido pelo responsável pela
criança.
•
••
• Antecedentes mórbidos familiares:
variável categórica nominal dicotômica definida pela
história de
asma, tuberculose e de outras doenças respiratórias nos familiares da criança obtido
pela auxiliar de pesquisa referido pelo responsável pela criança.
•
••
• Estado vacinal:
variável composta por variáveis dicotômicas, aferidas por inquérito ao
responsável, ou verificação do cartão de saúde da criança, categorizadas em atualizado
(Sim/Não), em função das seguintes vacinas: BCG, Pólio, DPT, sarampo, caxumba, hepatite
B, rotavírus, influenza e HIB.
•
••
• Aleitamento materno:
variável categórica nominal dicotômica (sim/não), definida pela
presença de aleitamento materno obtida pela auxiliar de pesquisa por questionamento ao
responsável.
•
••
• Tempo de aleitamento materno exclusivo
: variável numérica contínua (em meses),
definida pelo tempo de uso de leite materno exclusivo, obtida pela auxiliar de pesquisa por
questionamento ao responsável.
•
••
• Alimentação mista:
variável categórica nominal dicotômica (sim/não), definida pela
presença de água ou alimento diferente do leite materno, obtida pela auxiliar de pesquisa
por questionamento ao responsável.
Variáveis relacionadas à história médica atual
•
••
•
Sintomas e sinais gerais e do aparelho respiratório na admissão
: variável composta
por variáveis dicotômicas (sim/não), obtidas pela auxiliar de pesquisa por questionamento
56
ao responsável ou do prontuário ou durante o exame de admissão. Foram investigadas as
presenças de coriza, tosse, dificuldade para respirar, dispnéia, chiado/sibilância, apnéia,
cianose e febre e tiragem intercostal.
•
••
• Tempo de duração da doença -
variável numérica contínua expressa em dias na admissão,
obtido pela auxiliar de pesquisa referido pelos responsáveis. O tempo de duração da doença
foi considerado desde o primeiro sintoma de IRA até o primeiro atendimento no IMIP.
• Cianose:
variável categórica nominal definida pela presença (sim/não) de cianose (coloração
azulada da pele e/ou mucosa) em leito ungueal ou região perioral na criança que esteja
respirando em ar ambiente, aferida pelo médico plantonista durante a admissão da criança.
•
••
•
Freqüência cardíaca:
variável numérica contínua expressa em batimentos por minuto,
aferida durante o atendimento da criança. A freqüência cardíaca foi aferida durante um minuto
contando-se os batimentos do pulso radial, obtida do prontuário do paciente.
•
••
•
Oximetria de pulso:
variável numérica contínua expressa em percentual, aferida antes da
coleta do aspirado nasofaríngeo da criança.
•
••
•
Freqüência respiratória:
variável numérica contínua expressa em incursões por minuto,
aferida durante o atendimento da criança. A freqüência respiratória foi aferida durante um
minuto através da inspeção dos movimentos da caixa torácica da criança, sem camisa ou blusa
obtida do prontuário do paciente.
• Temperatura:
variável numérica contínua expressa em graus Celsius, aferida em região
axilar durante o atendimento da criança, com termômetro de mercúrio durante três minutos,
obtida do prontuário do paciente.
• Tiragem intercostal:
variável categórica, definida pela presença (sim/não) de retração da
porção inferior do tórax, durante a inspiração no exame de admissão. A presença ou não de
57
tiragem foi realizada durante a inspeção da caixa torácica da criança, sem camisa ou blusa,
pelo médico plantonista.
•
Uso de oxigênio:
variável categórica nominal dicotômica (sim/ não) obtida do prontuário do
paciente.
•
••
• Tempo de uso de oxigenioterapia:
variável numérica contínua expressa em horas, obtida
do prontuário do paciente.
•
••
• Uso de ventilação mecânica:
variável nominal dicotômica (sim/não) obtida do prontuário
do paciente.
•
••
• Presença de
i
nfecção relacionada à assistência à saúd
e
(infecção hospitalar):
variável
nominal dicotômica (sim/não) obtida do prontuário do paciente. Considera-se infecção
relacionada à assistência à saúde qualquer infecção adquirida após a internação do paciente,
que se manifeste durante a internação ou até 48 horas após a alta, quando se relaciona com a
hospitalização ou com procedimentos hospitalares. O diagnóstico de infecção hospitalar é
dado pelo conjunto de dados clínicos e laboratoriais estabelecidos pelo Sistema de Vigilância
de Infecção Nosocomial (NISS) do
Centers for Disease Control
(CDC) de Atlanta (EUA) e o
Ministério da Saúde do Brasil. Acompanhou-se o paciente para definição de infecção (durante
a permanência hospitalar) [49].
•
••
• Tempo de duração dos sintomas e sinais:
variável numérica contínua expressa em dias,
obtidas pela auxiliar de pesquisa por questionamento ao responsável ou do prontuário durante
o exame de admissão. Foram investigadas o tempo de duração dos seguintes sinais e sintomas:
coriza, tosse, dificuldade para respirar, dispnéia, chiado/sibilância, apnéia, cianose e febre e
tiragem intercostal.
58
•
••
• Tempo de permanência no hospital:
variável numérica contínua expressa em dias, obtida
do prontuário do paciente.
•
••
• Condição de saída:
variável nominal policotômica (alta/óbito/transferência), obtida do
prontuário do paciente.
Variáveis laboratoriais e radiológicas
•
••
• Gasometria:
variável composta das variáveis pH, pO
2
, pCO
2
e
base excess
, apresentadas de
forma numérica contínua, obtida do prontuário da criança por coleta de gasometria do sangue
arterial periférico ou central processado no gasômetro ROCHE OMNIC.
•
••
• Hemograma com plaquetas:
variável numérica contínua expressa pelo número de
leucócitos em gramas por decilitros, plaquetas em mm
3
e hemoglobina em gramas por
decilitros, obtida através de coleta de sangue referido no prontuário da criança.
•
••
• Achado radiológico
– Laudo radiológico da primeira radiografia de tórax realizada após
atendimento da criança. Os laudos foram realizados pelos radiologistas do IMIP seguindo a
rotina do hospital.
Variáveis relacionadas aos agentes virais
•
••
• Patógenos respiratórios
: variável composta caracterizada pela presença de HVSR, HMPV,
influenza A e B, parainfluenza 1, 2, 3 e 4, coronavírus NL63, 229E, HKUI e OC43,
Adenovirus humano, rinovírus humano, bocavírus,
Mycoplasma pneumoniae
,
Chlamydophila
pneumoniae
em secreção de nasofaringe pela técnica de reação em cadeia da polimerase com
transcrição reversa (RT-PCR) Multiplex.
59
Variáveis relacionadas à resposta imune
•
••
• Nível de citocina:
variável composta. As citocinas IFN-
γ
, FNT-
α
, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-
10, IL-12, IL-13, IL-17 e GM-CSF foram mensuradas e apresentadas de forma numérica,
contínua, expressa pela dosagem de citocinas de espécimes da nasofaringe em pg/ml. A
dosagem de citocinas e de quimiocinas foi feita através de técnicas de imunoensaio enzimático
(ELISA).
4.8 Técnica de coleta, processamento e análise dos exames de detecção de patógenos
respiratórios e da resposta imune
Coleta de aspirado nasofaríngeo: a coleta da secreção nasofaríngea foi realizada pela auxiliar
de pesquisa devidamente treinada após a instilação de um ml de solução salina na narina.
Usou-se sonda de aspiração traqueal estéril, número 6, acoplada a uma bomba de aspiração
manual que provoca leve pressão negativa para coleta de secreção respiratória. A secreção
aspirada foi depositada em três tubos estéreis e misturada com um ml de solução salina
tamponada cada, sendo estocadas em caixa de gelo a 4°C para processamento laboratorial do
IMIP das espécimes em até duas horas.
Processamento dos espécimes de nasofaringe no IMIP: inicialmente, o processamento
laboratorial foi realizado no IMIP nas primeiras duas horas da coleta por técnica de laboratório
devidamente treinada (APÊNDICE 3). O ANF misturado à solução salina tamponada foi
filtrado por meio de tubo cônico graduado através de tecido de 60 microns (Sefar Tenyl,
Brasil) com pipeta de um ml e o volume pós-filtrado foi anotado. Dez
µ
l da amostra foram
60
pipetados e misturados em tubo (Eppendorf, Brasil) de um ml com 10
µ
l de “tripan blue”
(Vertec, Brasil). Primeiramente, foram determinadas as concentrações das células e suas
contagens diferenciais, através de técnicas já padronizadas. A qualidade das amostras foi
determinada contando-se as células viáveis que não coravam pelo azul de tripano em um
hemocitômetro. O percentual de células viáveis é o número de células viáveis dividido pelo
número total de células (não viáveis mais viáveis), multiplicado por 100. Usando o volume
pós-filtração, o número de células totais na amostra foi calculado. A amostra foi centrifugada a
500 g (3800 rpm) por cinco minutos a 4°C. O sobrenadante foi então dividido em alíquotas de
500
µ
l e estocado em criotubo na geladeira a 2 a 8°C e posteriormente a -70
o
C. Em seguida,
10
µ
l de 2-mercaptoetanol (Sigma – Aldrich, Brasil) foi adicionado a um ml de RLT lysis
buffer (QIAGEN group, Inglaterra). Um volume de 350
µ
l dessa solução, suficiente para lisar
500 células, foi adicionado ao agrupamento de células (cell pellet). Para um número maior de
células, o volume proporcional dessa solução foi calculado. A solução foi estocada em
criotubos no freezer a -70°C, em alíquotas de 500
µ
l. O filtro de tecido com secreção retida
também foi congelado em criotubo a -70°C.
Processamento dos espécimes de nasofaringe em Liverpool
Extração de RNA/DNA e Multiplex RT-PCR:
as amostras congeladas foram transportadas
para a Universidade de Liverpool, para a extração de RNA/DNA e realização de Multiplex
RT-PCR. As extrações de RNA e DNA totais foram realizadas usando-se o QIA symphony
Mini Kit (Pathogen Complex 200 protocol), de acordo com as instruções do fabricante e
imediatamente congeladas a -70°C, até a realização do PCR (APÊNDICE 4). Dezessete
patógenos virais e bacterianos respiratórios (HVSR, HMPV, HPIV 1, 2, 3, 4, FLU A e B, BV,
61
HadV, coronavírus 229E, NL63, OC43 e KHU1, HRV, Mpp,
Clamydia pneumo-
niae)
foram pesquisados usando-se protocolos diagnósticos de Multiplex RT-PCR
(APÊNDICE 5), previamente descritos [50]. Os PCR com alvos de DNA utilizaram 10 ul de
ácido nucléico purificado com o Roche LC480 Probes Master kit (Roche Diagnostics, Burgess
Hill, UK) ou Qiagen Quantitect Probe PCR kit (Qiagen, Crawley, UK) para o Multiplex PCR
do HadV, Mpp,
Clamydia pneumoniae
e PCR para BV, respectivamente, de acordo com as
instruções dos fabricantes. As condições térmicas de ciclagem foram realizadas conforme
descritas anteriormente, exceto pela remoção do “hold” de 50
o
C para a transcrição reversa, e a
extensão do “hold” de ativação da enzima a 95
o
C para cinco minutos para o Roche LC 480
Probe Master kit ou 15 minutos para o Qiagen Quantitect Probe PCR kit. Todos os ensaios
foram realizados no Lightcycler 480 real-time PCR machine (Roche).
Dosagem de citocinas no ANF:
a dosagem das citocinas foi realizada através de técnicas de
imunoensaio enzimático (ELISA) no sobrenadante do ANF. As citocinas inflamatórias IFN-
γ
,
FNT-
α
, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17 e GM-CSF foram mensuradas pela
técnica de análise em fluxo tipo Luminex. Foram utilizados para este fim kits comerciais
validados (Bioplex ELISA, BioRad, San Diego, CA, USA) de acordo com procedimentos
operacionais do Laboratório de Microbiologia Médica da Universidade de Liverpool. As
amostras de ANF foram testadas para avaliação do teor de proteína total a fim de selecionar
amostras viáveis para a medição das citocinas e correção de diferenças na técnica de coleta.
4.9 Coleta de dados e controle de qualidade das informações
Antes do início do estudo, foi realizadaa apresentação do projeto a todos os membros
envolvidos na pesquisa a fim de se detectar e resolver potenciais dificuldades práticas. Um
62
treinamento envolvendo as auxiliares de pesquisa sobre entrevista, consentimento informado,
acesso ao prontuário e exame físico da criança incluindo oximetria de pulso foi realizado pela
doutoranda. O questionário foi testado na Emergência Pediátrica sob supervisão da doutoranda
e a qualidade das entrevistas foi periodicamente avaliada. Um sistema de checagem foi
preparado para ser utilizado pelos pesquisadores para detecção de inconsistências nos
formulários.
Os pacientes foram identificados pelos médicos plantonistas da emergência pediátrica
do IMIP, previamente cientes do estudo e convidados pela auxiliar de pesquisa, uma técnica
de enfermagem especialmente treinada para esse estudo. Uma busca ativa na unidade de
observação da emergência também foi realizada para identificar crianças admitidas durante o
período noturno. A auxiliar de pesquisa permaneceu no setor de emergência de segunda a
sexta feira durante 8 horas diurnas. Os pais/responsáveis que aceitaram participar do estudo
assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (APÊNDICE 1) e responderam a
um instrumento padronizado de coleta de dados (APÊNDICE 2), contendo todas as
informações sobre história pessoal pregressa, informações socioeconômicas, ambientais e
demográficas, história médica atual, achados clínicos, diagnósticos e condição de alta. Após o
preenchimento dos formulários, estes foram revisados, um a um, pelas doutorandas visando
detectar eventuais falhas ou omissões a fim de que pudessem ser corrigidas.
Os questionários foram numerados e correlacionados com a numeração das amostras,
visando-se a acurácia dos dados. Desta forma, todas as amostras de aspirado nasofaríngeo
foram rotuladas e receberam um número seqüenciado. Estas foram estocadas com códigos
numéricos e mantidas congeladas a -70
o
C até serem transportadas para a Universidade de
Liverpool conforme normas internacionais. As técnicas laboratoriais foram padronizadas e
63
validadas em Liverpool para a identificação de patógenos respiratórios [51]. As boas práticas
de segurança clínicas, laboratoriais e radiológicas foram seguidas.
4.10 Análise estatística
Os dados foram coletados em um formulário pré-estabelecido, pré-codificado e
posteriormente digitados em dupla entrada no Excel (APÊNDICE 2).
Inicialmente, realizou-se a análise descritiva dos dados, construindo-se tabelas de
distribuição de frequência, calculando-se medidas de tendência central (mediana) e de
dispersão (intervalo interquartil).
Para testar a associação entre concentrações de citocinas e gravidade de doença pelo
HVSR e entre concentrações de citocinas de acordo com diferentes patógenos respiratórios
utilizou-se testes não paramétricos (Teste de Mann-Whitney
U
para dois grupos e Teste de
Kruskall-Wallis para comparação de mais de dois grupos) através do programa SPSS versão
17. Valor de
p
< 0,05 foi considerado significante.
4.11 Aspectos Éticos
Esta pesquisa teve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa em seres humanos do
IMIP, n° 896/06 (ANEXO 2), com registro no SISNEP através do CAEE 0150.0.099.000-06.
Os pesquisadores comprometeram-se a seguir rigorosamente os postulados e normas das
resoluções 196/96 e 292/99 do Conselho Nacional de Saúde. A coleta de dados foi iniciada
após a aprovação e obtenção por escrito do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido junto
aos responsáveis das crianças (APÊNDICE 1).
64
CAPITULO 5 – RESULTADOS / ARTIGOS
1
65
V. Artigos
5.1 Artigo 1
Cytokine inflammatory responses in children with acute respiratory infections by
different viruses and atypical bacteria
Authors
Maria do Carmo M B Duarte
1
,
Paul S McNamara
2
,
Patrícia G M Bezerra
1,3
, Murilo C A de
Britto
1,3
, Katie Rose
2
,
Luis E. Cuevas
4
, Angela Fonceca
2
, Mark Hopkins
5
, Nara Cavalcanti
1
,
Jailson B Correia
1,6*
.
Affiliations:
1
Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira (IMIP), Recife, Brazil.
2
Department of Child Health, University of Liverpool, Institute of Child Health, Alder Hey
Children's Hospital, Liverpool, UK.
3
Faculdade Pernambucana de Saúde, Recife, Brazil.
4
Liverpool School of Tropical Medicine, UK.
5
Liverpool Specialist Virology Centre, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, UK.
6
Faculdade de Ciências Médicas, Universidade de Pernambuco, Recife, Brazil.
*Corresponding author
Aim: The Journal of Infectious Diseases / brief report: 2000 words and 2 figures/ tables
66
ABSTRACT
This study describes cytokine immune responses in 71 children <5 years with acute respiratory
infections associated with single human respiratory syncytial virus (23), human
metapneumovirus (11), human adenovirus, human rhinovirus, human bocavirus (10 each) or
Mycoplasma pneumoniae
infection (7). Nasopharyngeal aspirates were assayed for interferon-
γ
, tumor necrosis factor-
α
, interleukin (IL) -2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17 and granulocyte
macrophage colony stimulating factor by ELISA. Overall, cytokine concentrations showed no
difference by pathogen. Among the few exceptions, IL-17 was increased in children with
Mycoplasma pneumoniae
compared with children with viral infections (
p
=0.036). Further
studies to elucidate the role of Th17 response in ARI are warranted.
Keywords
: cytokines; human respiratory syncytial viruses; human metapneumovirus; human
adenovirus; human rhinovirus; human bocavirus;
Mycoplasma pneumoniae;
respiratory tract
infections; Brazil.
67
INTRODUCTION
Acute respiratory infections (ARI) are estimated to cause 4 million deaths annually and half of
these occur in infants less than six months old [1,2]. Viruses cause a high disease burden and
human respiratory syncytial virus (HRSV) alone is estimated to cause 3.4 million hospital
admissions and up to 200,000 yearly deaths worldwide [2]. The virus type, viral load,
virulence and host-related factors such as age, genetic susceptibility and immune status have
been implied in disease pathogenesis and severity [3-7]. Studies assessing nasopharyngeal
aspirates (NPA) and bronchoalveolar lavage (BAL) in children with ARI have highlighted the
role of host immunity and the cytokine-mediated inflammatory responses elicited by HRSV
and other viruses [5-7]. Differences in the local inflammatory response have been associated
with co-detection of two or more viruses, but few studies have compared responses between
different viruses and other pathogens such as atypical bacteria that may present similar clinical
features [5-9]. Most reports also describe cytokines representing T helper-1 (Th1) and (Th2)
and T helper-17 (Th17) immune response has rarely been described in the context of ARI
[8,9].
This study describes cytokine concentrations in nasopharyngeal aspirates of children with ARI
associated with single viral and atypical respiratory pathogens.
68
METHODS
This was a prospective observational study of 383 consecutive children aged < 5 years with
respiratory symptoms attending the hospital emergency department of the Instituto de
Medicina Integral Prof. Fernando Figueira (IMIP) between June 2008 and October 2009.
Children were enrolled weekdays, from 7 am to 5 pm, independently of the severity of the
episode.
A subset of 71 children who tested positive for a single polymerase chain reaction (PCR) for a
selection of 17 pathogens were included to measure their inflammatory responses. The
pathogens tested included: HRSV, human metapneumovirus (HMPV), human adenovirus
(HadV), human bocavirus (BV), human rhinovirus (HRV) and
Mycoplasma pneumoniae
(Mpp). Children positive for more than one of the pathogens tested, those with complex
congenital heart abnormalities, immunodeficiency or chronic severe pulmonary diseases were
excluded.
IMIP is a general hospital that provides free medical care within the public health system and
is located in Recife (population 1.5 million inhabitants), northeast of Brazil. Admitted patients
were followed up daily until discharge and their medical records were reviewed for
complementary information. Clinical phenotypes of pneumonia, bronchiolitis, episodic viral
wheeze and upper respiratory infection were categorised by investigators after consensually
reviewing records according to a priori definitions. Disease severity was defined as mild
(acute respiratory symptoms, treated as outpatients), moderate (admitted to hospital due to
acute respiratory symptoms, but no use of oxygen supplementation) and severe (admitted to
69
hospital, with evidence of hypoxemia or use of oxygen supplementation). Hypoxemia was
defined as arterial oxygen saturation < 93%.
NPA samples were obtained soon after initial medical assessment or within the first 24 hours
of admission, according to a standardised protocol [7]. The aspirate was immediately flushed
with 1 ml of sterile saline solution into Eppendorf tubes, and placed in a cold box. The same
trained research assistant collected aspirates and applied a standardised questionnaire to
parents or guardians. Laboratory processing took place in the hospital laboratory within two
hours of collection. Sample quality was monitored by counting viable cells in a
haemocytometer chamber (trypan blue staining). Samples were centrifuged supernatants kept
frozen at -70ºC. RNA/DNA extraction and simultaneous detection of respiratory pathogens by
Multiplex-PCR (LightCycler 480 Real-Time PCR System, Roche) were performed in the
Department of Medical Microbiology, University of Liverpool, United Kingdom. Samples
were tested for HRSV, HMPV, human influenza (FLU) A and B, human parainfluenza (HPIV)
1, 2, 3 and 4, human coronavirus (HCoV) NL63, 229E, HKUI and OC43, HadV, HRV, human
bocavirus, Mpp and
Chlamydophila pneumoniae
using previously described oligonucleotide
primers [M. Hopkins, J. Correia and I. Hart, submitted].
70
NPA samples were tested for total protein content to select viable samples for cytokine
measurement and to correct for differences in collecting techniques. A commercially available
ELISA kit (Bioplex ELISA, BioRad, San Diego, CA, USA) was used to measure interferon
(IFN) -
γ
, tumor necrosis factor (TNF) -
α
, interleukin (IL) IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17
and granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) concentrations.
Cytokine concentrations were expressed in median pg/mL (interquartile range). For analysis,
children were categorized by pathogen in 6 groups. With non-parametric statistical tests, each
cytokine had concentrations compared for differences between groups (Kruskal-Wallis),
between each pair of groups and by the subset of Mpp versus all other (viral) infections
(Mann-Whitney) in SPSS version 17. A
p
-value of <0.05 was considered statistically
significant. The hospital Research Ethics Committee approved the protocol (number 896/06).
Parents and guardians gave written consent.
71
RESULTS
Patient characteristics
The characteristics of 71 children aged < 5 years with ARI due to single infections (23 HRSV,
10 human adenovirus, 10 human rhinovirus , 10 human bocavirus, 11 HMPV and 7 Mpp) are
shown in table 1. Children’s ages varied from 13 days to 43 months. Two children had
significant co-morbidities (epilepsy and hydrocephaly). None of the children needed
mechanical ventilation and all survived.
Cytokine responses
IL-6, IL-8, IL-10, IL-17 and GM-CSF had detectable concentrations in >75% samples, while
TNF-
α
and IL-4 were detectable in > 65% of cases. IFN-
γ
and IL-2 were detectable in 56.3%
and 42.3% cases, respectively.
Figure 1 shows inflammatory mediators in NPA of patients with ARI, grouped by pathogen.
IL-17 was the only mediator to show significant differences among all groups (Kruskall-
Wallis,
p
= 0.025) and between the group of 7 children with Mpp when compared to 64
children with any viral agent (Mann Whitney U test,
p
= 0.036). IL-17 concentrations were
higher in children infected with Mpp compared with those with rhinovirus (p =0.006) and with
bocavirus (p = 0.003) and marginally significant when compared with adenovirus (p = 0.051).
IL-17 was also increased in children with HMPV when compared to rhinovirus (p = 0.039).
72
Levels of GM-CSF were significantly higher in children infected with Mpp compared with
adenovirus (p = 0.040), bocavirus (p = 0.032) and marginally significant when compared with
HRV (p = 0.051). IL-2 concentrations were higher in children infected with Mpp when
compared to those with HRV (p = 0.049). IL-8 production was lower in children infected with
HRSV than in those infected with HRV (p = 0.031). There were no differences between each
of the groups in the case of IL-4, IL-6, IL-10, TNF-
α
and IFN-
γ
.
73
DISCUSSION
This is among the first reports to simultaneously assess local inflammatory responses by
respiratory pathogen in children with ARI where multiplex PCR was used to identify several
viruses and atypical bacteria and rule out co-detections. Overall, similar inflammatory
responses were found when cytokine concentrations were compared in children with one of
six pathogens (HRSV, HMPV, HadV, BV, HRV and Mpp). A noticeable exception was the
increased production of IL-17 (and perhaps GM-CSF) by Mpp infected children compared
with children with viral infections.
IL-17 is a regulatory cytokine operating at the interface of innate and acquired immunity and
is mainly produced by Th-17 cells [10,11]. IL-17 stimulates the recruitment and local
activation of neutrophils by inducing the production of chemokines (e. g. IL-8), growth factors
(e.g. GM-CSF), proinflammatory cytokines (e.g. IL-6) and co-stimulatory molecules (e.g.
intercellular adehesion molecule-1) [10]. These mechanisms have been implied in the
pathogenesis of autoimmune, chronic inflammatory and, more recently, also infectious
diseases [10,11]. While a protective effect of Th17 immune responses has been described in
BAL murine models for Mpp
infection [12], we found no previous studies assessing IL-17 and
GM-CSF responses in NPA of humans with ARI by Mpp [8,11,12]. The comparisons of
serum IL-17 and GM-CSF concentrations among children with Mpp/
Clamydophila
pneumoniae
and viral infections did not show significant differences between the two groups
[9]. Our findings suggest that the role of Th17 immune response in ARI in children warrants
further research.
74
Studies investigating the role of Th1 and Th2 inflammatory responses in NPA in children with
ARI have mostly compared HRSV responses (as a prototype of viral infection) with other
viruses [5-7]. Some studies have proposed that HRSV elicits a distinct response, which could
be partially responsible for its severity. For instance, HRSV infected children have been
shown to have significantly lower levels of IFN-
γ
when compared with HadV, human
influenza or human parainfluenza [5,6]. Other studies describe higher levels of TNF-
α
and IL-
10 in HRSV-infected children when compared with other viruses such as human bocavirus
and HMPV [7,13]. HRSV-induced levels of IL-4 have also been described, resulting in
conflicting evidence when compared with human influenza, HMPV, HadV or human
parainfluenza [5,6,9,13]. None of these cytokines showed differences in the present study. The
only difference observed was a lower concetration of IL-8, a potent chemo-attractant and
activator of neutrophils, monocytes, and T lymphocytes in HRSV infected children when
compared with children infected by HRV. While this is in agreement with some studies [14],
other reports show no differences or even opposite results [7,9].
Interpreting negative findings is somewhat more difficult in exploratory studies where the
relatively small number of cases in each group may imply insufficient power to detect minor
differences. Other limitations regard the fact we did not include healthy controls nor
distinguish primary from re-infections, where immune responses might have been different.
The use of NPA for cytokines analysis can be debatable, but levels of inflammatory cytokines
in the upper respiratory tract have been shown to correlate with those in the lower respiratory
75
tract in children [15]. The strengths of our study were the use of standardized procedures,
careful sample processing (within two hours of collection) and quality control monitoring, the
correction for dilution factors and the fact that the simultaneous pathogen detection allowed us
to select groups of children with single infections.
The overall lack of difference between local immune responses here reported suggests further
research is needed to elucidate immune response mechanisms in ARI in children. Whether the
genetic background or environmental exposures down or up-regulate local inflammation and
minimize any differences remains unclear. The role of viral load, host genetic polymorphisms
(such as of toll-like receptor 4) and epigenetic influences on inflammatory response should be
investigated. Further longitudinal studies (powered to control for disease presentation, severity
and time of symptoms) should be designed to assess clinical and immunological response to
respiratory pathogens in different settings and including infants from different social and
economic strata.
ACKNOWLEDGMENTS
We would like to acknowledge Prof. Tony Hart who is greatly missed and who was very much
involved in setting up this study. Brazil’s CNPq - National Council for Technological and
Scientific Development (grant number 479381/06-2) and IMIP’s Fund for Teaching and
Research supported this study. We would also like to thank the Wellcome Trust for funding
PSM.
76
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78
Table 1. Characteristics of the 71 children aged < 5 years with acute respiratory infection from Recife, Brazil,
June 2008-October 2009.
Respiratory pathogens*
Variables
HRSV
(n=23)
HadV
(n=10)
HRV
(n=10)
BV
(n=
10)
HMPV
(n=11)
Mpp
(n=7)
Male, n (%)
10 (43,5) 9 (90) 4 (40) 7 (70) 6 (55) 4 (57)
Age at admission (months), median (IQR)
4 (6) 15 (21) 4 (13) 11 (6.3) 10 (12.8) 9 (23)
Weight on admission (Kg), median (IQR)
†
6.3 (2.8) 8.9 (4.7) 7.2 (5.7) 9.5 (15.5) 8.5 (2.4) 7.5 (7.1)
Gestation at birth < 37 weeks, n (%)
†
2 (8.7) 0 (0) 2 (20) 4 (40) 0 (0) 0 (0)
Weight at birth < 2.5 kg, n (%)
5 (22) 0 (0) 1 (10) 2 (20) 0 (0) 0 (0)
Breastfed > 2 months or breastfeeding, n (%)
21 (91.3) 8 (80) 9 (90) 10 (100) 9 (81.8) 6 (85.7)
History of allergy, n (%)
4 (17.4) 4 (40) 1 (10) 1 (10) 2 (18.2) 2 (28.6)
Maternal education (years), median (IQR)
7 (8) 7.5 (7.5) 6.5 (4.5) 8 (3.5) 8 (5.5) 5 (4)
URI:BCL:PN:EVW
††
2:13:8:0 0:3:5:2 0:6:2:2 1:6:2:1 1:3:6:1 1:3:3:0
Mild: Moderate: Severe cases
2:16:5 1:9:0 1:5:4 6:3:1 1:7:3 1:5:1
Length of stay (days) median (IQR)
3 (4) 4 (12.5) 2.5 (3.7) 0 (4.5) 4 (7) 2 (7)
*HRSV: respiratory syncytial virus, HadV: human adenovirus, HRV: human rhinovirus, BV: human bocavirus, HMPV:
human metapneumovirus, Mpp: Mycoplasma pneumoniae. Data are medians, IQR: inter-quartile range.
†
Kruskal-Wallis tests
were performed to check for differences between groups for each variable, but gestation at birth < 37 weeks and Weight at
admission p < 0.05 (others were non-significant).
††
BCL: bronchiolitis, PN: pneumonia, EVW: Episodic viral wheeze, URI:
upper respiratory infection.
79
80
5.2 Artigo 2
Cytokines do not predict admission patterns or need for oxygen in infants with respiratory syncytial
virus
Authors
Maria do Carmo M B Duarte
1
,
Paul S McNamara
2
,
Patrícia G M Bezerra
1,3
, Murilo C A de Britto
1,3
, Luis E.
Cuevas
4
, Katie Rose
2
,
Angela Fonceca
2
, Mark Hopkins
5
, Nara V. Cavalcanti
1
, Jailson B Correia
1,6*
.
Affiliations:
1
Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira (IMIP), Recife, Brazil.
2
Department of Child Health, University of Liverpool, Institute of Child Health, Alder Hey Children's
Hospital, Liverpool, UK.
3
Faculdade Pernambucana de Saúde, Recife, Brazil.
4
Liverpool School of Tropical Medicine, UK.
5
Liverpool Specialist Virology Centre, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, UK.
6
Faculdade de Ciências Médicas, Universidade de Pernambuco, Recife, Brazil.
*Corresponding author
Aim: European Respiratory Journal / research letter 1200 words and 2 tables.
ABSTRACT
81
This study describes cytokine concentrations in nasopharyngeal aspirates of 44 human respiratory syncytial
virus (HRSV) infected children according to disease severity. Multiplex PCR for 16 other respiratory
pathogens ruled out co-detections. Interferon-
γ
, tumor necrosis factor-
α
, interleukin (IL) -4, IL-5 IL-6, IL-8,
IL-10, IL-12, IL-13, IL-17 and granulocyte macrophage colony stimulating factor were measured by ELISA.
Children were grouped by severity into ambulatory and hospitalized and these were sub grouped regarding
oxygen requirement. None of the cytokine responses showed statistically significant differences between
groups. Inflammatory mediators do not seem to predict admission or need to use oxygen in children with
confirmed single RSV infection from low socioeconomic background in Brazil.
Keywords
: Brazil; bronchiolitis; cytokines; pneumonia; respiratory syncytial virus, human; respiratory tract
infections.
82
INTRODUCTION
Human respiratory syncytial virus (HRSV) is estimated to cause 3.4 million annual hospital admissions and
up to 200,000 deaths in children with less than 5 years worldwide, with most deaths occurring in developing
countries [1]. The clinical severity of HRSV infection ranges from asymptomatic infection to severe disease
as a result of complex viral and host immunity interactions [2]. Viral loads and virulence factors and the
host's inflammatory responses may play a role in the pathogenesis of the disease [3-7]. An imbalanced
cytokine inflammatory response has been associated with disease severity, although these findings have not
always been replicated and the pathogenesis and role of specific inflammatory markers and cell types in
disease severity remains debatable [4-7]. There is a paucity of information regarding the inflammatory
responses of children with HRSV infections in tropical regions, where HRSV poses a high burden of disease
and environmental and nutritional conditions are different [1,5] This study describes the patterns of cytokine
concentrations of children with HRSV infections according to disease severity in children attending a
reference hospital in northeast Brazil.
83
METHODS
This was a prospective observational study of children < 2 years old with acute respiratory infections (ARI)
in Recife, Northeast Brazil. The study was conducted at the Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando
Figueira (IMIP) between June 2008 and October 2009, a publically funded teaching hospital that provides
services to self-referred and referred patients. Children presenting with respiratory symptoms such as cough,
coryza, fast breathing, chest indrawing or wheezing for up to seven days were consecutively enrolled
(weekdays, from 7 am to 5 pm) at the time they attended the emergency department. ARI diagnosis was
based on clinical signs and included upper respiratory infection, bronchiolitis and pneumonia. HRSV
infection was detected by polymerase chain reaction (PCR). Children were excluded if they had
immunodeficiency, complex congenital heart abnormalities, chronic severe pulmonary diseases or co-
detection of another respiratory pathogen.
Children were assessed by the emergency service and treated ambulatory or admitted according to the
hospital guidelines. Arterial oxygen saturation was obtained on enrollment from all children and hypoxemia
was defined as a saturation < 93%. Severity was categorised into mild (the clinician decided ambulatory
care), moderate (admitted to hospital, but no oxygen required) and severe (admitted to hospital, with
hypoxemia or oxygen supplementation).
Nasopharyngeal aspirates (NPA) were obtained on enrolment (up to 24 hours of admission), and processed
within two hours of collection, following a standardised protocol [7]. Sample quality was monitored by
counting viable cells in a haemocytometer chamber. Samples were centrifuged and the supernatant kept
frozen at -70ºC until analysis at the Departments of Medical Microbiology and Child Health, University of
Liverpool, United Kingdom. Following RNA and DNA extraction, Multiplex PCR (LightCycler 480 Real-
84
Time PCR System, Roche) were used to detect HRSV, human metapneumovirus, human influenza A and B,
human parainfluenza 1, 2, 3 and 4, human coronaviruses NL63, 229E, HKUI and OC43, human adenovirus,
human rinovirus, human bocavirus,
Mycoplasma pneumoniae
and
Chlamydophila pneumoniae
using
previously described oligonucleotide primers [8].
Nasopharyngeal aspirates were tested for total protein content to select viable samples for cytokine
measurement and to correct for differences in collecting techniques. Specimens were assayed for interferon-
gamma (INF-
γ
), tumor necrosis factor-
α
(TNF-
α
), interleukin (IL) -4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13,
IL-17 and granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) by ELISA (Bioplex, BioRad, San
Diego, CA, USA). Non-parametric statistics were used (SPSS version 17) and
p
-values <0.05 were
considered statistically significant. Ethical approval was obtained from IMIP's Research Ethics Committee
(number 896/06) and parents and guardians of the children gave written informed consent.
85
RESULTS
Forty four of 298 children < 2 years screened for 17 pathogens had single HRSV infections. Of these, 24
were treated as outpatients and 20 were admitted to hospital (11 with moderate and 9 with severe disease).
Their age ranged from 13 days to 20 months and none of them had used palivizumab or antivirals, nor had
important co-morbidities, needed mechanical ventilation or died (Table 1). None of the children were
enrolled more than once, even if they had presented to hospital with subsequent episodes of ARI during the
study period.
There were detectable amounts of IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13 and GM-CSF in more than 90%, of
TNF-
α
, IL-4 and IL-17 in 75% and of IFN-
γ
in 55% of the samples. There were no concentration differences
in any of the markers tested between ambulatory and hospitalized children, nor between mild, moderate and
severe groups, as seen in Table 2.
86
DISCUSSION
This is among the first reports to simultaneously assess local inflammatory responses in HRSV infected
children by severity where multiplex PCR was used to rule out co-detections of several viruses and atypical
bacteria. There were no differences in the NPA cytokine concentrations of outpatient and hospitalized
children with HRSV or between children with mild, moderate and severe HRSV ARI.
The need for hospitalization is often used as a clinically relevant marker of severity, but it has rarely been
assessed in studies on inflammation in HRSV disease. In agreement with the present report, a study enrolling
< 2 year-old children from Houston (USA) also found cytokine levels no to be significantly different
between hospitalized and ambulatory patients [5]. Most studies assessing NPA inflammatory markers in
HRSV infections have evaluated an array of other severity criteria and imbalances in NPA cytokine
concentrations have been proposed to explain disease severity. Reduced IFN-
γ
concentrations (leading to
reduced antiviral activity) have been associated with longer mechanical ventilation and oxygen therapy
duration [5,7]. Likewise, reduced levels of IL-8, a potent chemoattractant and activator of neutrophils,
monocytes, and T lymphocytes, have been associated with longer duration of oxygen therapy and length of
stay in hospital [3,5,10]. Reduced levels of Substance P, a marker of neurogenic inflammation, have been
associated with higher oxygen and mechanical ventilation requirements [7]. Conversely, studies on the
association between HRSV severity and IL10, a regulatory cytokine, have yielded conflicting results, as
higher levels have been negatively [5,10], positively [4] or even not correlated [3] with severe HRSV
infection. Differences amongst studies highlight that the role of cytokines as markers of disease severity in
infants with HRSV remains subject to debate.
87
Limitations of the present study include the fact that only symptomatic patients were enrolled, so cytokine
levels in children without respiratory symptoms were not available for comparison. The number of children
was relatively small, particularly in the two subgroups of hospitalized patients and this may have reduced the
power to detect smaller differences regarding oxygen requirement. Also, cytokines were measured only once
during the time of illness and it was not possible to verify the rises and falls of cytokine levels during the
course of disease. However, the present study is amongst the first reports to simultaneously assess local
inflammatory responses in HRSV infected children in low and middle income countries. The strengths of the
study include the use of multiplex PCR to enable ruling out co-detections of other common pathogens, the
standardized sample processing, quality monitoring and protein assays to correct for variations in NPA
collecting techniques.
The present study suggests no predictive role of NPA cytokine measurements regarding need of hospital
admission. Whether differences in genetic background or higher exposure to frequent and multiple viral
infections, nasal carriage of bacterial pathogens and to an array of environmental antigens and
lipopolysaccharides down or up-regulate local inflammation and minimize any effect remains unclear [10].
The role of viral load, host genetic polymorphisms (such as of toll-like receptor 4) and epigenetic influences
on inflammatory response should be addressed in further longitudinal studies conducted in different settings
and including infants from different social and economic strata.
ACKNOWLEDGMENTS
We would like to acknowledge Prof. Tony Hart who is greatly missed and who was very much involved in
setting up this study. Brazil’s CNPq - National Council for Technological and Scientific Development (grant
88
number 479381/06-2) and IMIP’s Fund for Teaching and Research supported this study. We would also like
to thank the Wellcome Trust for funding PSM.
89
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91
Table 1. Characteristics of 44 infants from Recife, Brazil, with respiratory syncytial virus infection, according to hospitalization,
June, 2008-October, 2009.
Disease severity
Variables
No admission
(n=24)
Hospital admission
(n=20)
p
Male, n (%)
12 (50) 11 (55) 0.74
Age (months), median (IQR)
6.0 (6.5) 3.5 (6.5) 0.08
Weight on admission (Kg), median (IQR)
3.9 (4.0) 3.3 (1.6) 0.23
Gestational age at birth < 37 weeks, n (%)
4 (16.7) 2 (10) 0.33
Weight at birth < 2.5 kg, n (%)
4 (16.7) 5 (25) 0.45
Breastfeeding (of any duration), n (%)
20 (83.3) 19 (95) 0.23
History of allergy, n (%)
8 (33.3) 3 (15) 0.17
Smoker in the household, n (%)
11 (45.8) 8 (40) 0.70
Maternal education (years), median (IQR)
8.0 (5.0) 7.0 (6.5) 0.76
URI:BCL:PN
†
6:18:0 0:10:10 0.00
Length of hospitalization (days), median (IQR)
- 4 (3.8) -
†
URI: upper respiratory infection, BCL: bronchiolitis, PN: pneumonia. Data are medians,
IQR: inter-quartile range
. Mann-Whitney U
test for differences between groups.
92
Table 2. Cytokine concentrations in nasopharyngeal aspirates of HRSV-infected children by hospital or ambulatory
management, June 2008-October 2009.
Clinical management
Ambulatory
(n=24 )
Hospitalised
(n=20)
p
IFN-γ
γγ
γ
9.3 (0-45) 0.0 (0-50) 0.84
TNF-α
αα
α
83 (0-175) 136 (68-280) 0.21
IL-4
1.5 (0-2.2) 1.7 (0.9-2.6) 0.41
IL-5*
4.7 (3.1-6.1) 5.2 (3.5-6.9) 0.45
IL-6
88 (49-321) 87.8 (59-150) 0.94
IL-8
1530 (833-3122) 1619 (801-2330) 0.87
IL-10
20.2 (11.6-28) 26.5 (14.6-37) 0.19
IL-12*
5.7 (4.4-7.6) 4.5 (0.3-6.1) 0.29
IL-13*
6.7 (5.2-9.3) 10.5 (6.2-12.7) 0.10
IL-17
14.5 (5.9-22.7) 1.7 (0-25.8) 0.11
GM-CSF
27.9 (21-38) 26.3 (14-36) 0.49
IFN- interferon; TNF – tumor necrosis factor; IL – interleukin; GM-CSF – granulocyte-macrophage
colony stimulating factor. Data are medians, (p25-75). Mann-Whitney U test used for differences
between groups.
*
IL-5, IL-12 and IL-13 were measured in 31 infants.
93
CAPITULO VI – CONSIDERAÇÕES FINAIS
94
VI. Considerações finais
Importância do estudo e aplicabilidade
1.
Estudos sobre infecções respiratórias agudas são de grande relevância devido à alta morbidade e
mortalidade da doença em menores de cinco anos principalmente, nos países pobres e em desenvolvimento.
2.
O estudo sobre o comportamento da resposta imune de crianças com IRA que vivem em condições
sócioeconômicas desfavorecidas contribui com informações para preencher uma lacuna do conhecimento
científico, até então, pouco investigada. Avaliamos o comportamento de várias citocinas no ANF em
crianças menores de cinco anos com IRA após identificação de 17 patógenos respiratórios através de PCR
Multiplex, excluindo-se as co-detecções.
3.
No primeiro estudo, nossos resultados indicam pela primeira vez na literatura que as respostas
inflamatórias no aspirado nasofaríngeo da IL-17 e GM-CSF são diferentes na infecção por
Mycoplasma
pneumoniae
quando comparadas a determinados tipos de vírus. Por outro lado, não encontramos diferenças
importantes na resposta inflamatória aos diversos tipos de vírus nos grupos estudados.
4.
No segundo estudo, a falta de diferença na resposta inflamatória local questiona o papel das citocinas
como marcadores de gravidade de doença em crianças com infecção por HVSR vivendo, em más condições
sócioeconômicas.
5.
O papel da carga viral, polimorfismos genéticos do hospedeiro e influências epigenéticas na resposta
inflamatória devem ser avaliados em estudos longitudinais futuros conduzidos em diferentes contextos,
incluindo crianças de diferentes condições sócioeconômicas.
Impacto institucional
1
95
O presente estudo teve uma abordagem de pesquisa translacional, colocando a bancada do laboratório a
serviço das perguntas clínico-epidemiológicas. Também envolveu parcerias científicas com centros de
excelência no exterior. Estas características foram importantes para a formação da doutoranda, além de
contribuírem para a institucionalização da linha de pesquisa “Estudos clínicos, epidemiológicos e
translacionais das doenças infecciosas na infância e adolescência” e da Pós-graduação em Saúde Materno
Infantil.
96
CAPITULO VII – REFERENCIAS
97
VII. Referências
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102
Apêndices
1
103
APÊNDICE I – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
(2 vias)
Instituto Medicina Integral Prof. Fernando Figueira (IMIP)
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Pesquisa: Prevalência, patogênese e fatores de risco para gravidade das infecções agudas
virais do trato respiratório em crianças menores de cinco anos em Recife, Brasil.
Caro Sr (a) ________________________________ (nome do pai, mãe ou responsável).
Meu nome é ______________________________________e sou pesquisador (a) do IMIP. Em
conjunto com a Universidade de Liverpool (Inglaterra), estamos fazendo uma pesquisa sobre
problemas respiratórios nas crianças menores de cinco anos. Esta pesquisa pretende estudar vírus e
algumas bactérias que causam problemas respiratórios, como resfriado, pneumonia e bronquiolite
(inflamação dos brônquios), além de conhecer melhor os fatores que levam estas infecções a serem
mais graves em algumas crianças. Esses fatores incluem a produção de algumas substâncias de
defesa, assim como de características herdadas (ou genéticas) das crianças.
Sua participação e de sua criança forneceriam informações importantes aos médicos sobre os vírus
mais comuns e os mecanismos com que estes causam infecções respiratórias em crianças.
Por isso, peço sua autorização para que sua criança participe da pesquisa. Solicitamos que
respondam um questionário, com perguntas sobre sua família e a sua criança.
Após o questionário, nós gostaríamos de retirar uma amostra do catarro do nariz da sua criança,
utilizando um tubinho plástico estéril (limpo). Isto não será perigoso nem doloroso, mas sua criança
pode não gostar. Gostaríamos também de retirar uma amostra de sangue (3 ml) de sua criança para
testes de laboratório. Isto também não será perigoso, e evitaremos que seja doloroso utilizando uma
pomada anestésica. Caso sua criança piore pedimos sua autorização para repetir o exame do catarro
do nariz e de sangue de sua criança. Se sua criança necessitar realizar outros exames durante o
atendimento/ internamento, aproveitaremos a mesma coleta de sangue.
O tratamento de sua criança seguirá a rotina do Hospital. Embora não possamos oferecer os
resultados do estudo imediatamente, podemos enviá-lo, para sua casa assim que tivermos o
104
resultado, se você desejar. Você deve se sentir completamente livre para participar do estudo. Se
você participar ou não deste estudo não fará nenhuma diferença no tratamento de sua criança, e
você tem todo o direito de pedir para ser excluída do estudo a qualquer momento em que você
julgar necessário. Isso não causará nenhuma restrição no tratamento de sua criança.
Nem os testes
nem qualquer outro exame ou procedimento lhe custarão dinheiro.
Solicitamos a autorização para consulta a informações complementares nos prontuários e
garantimos que nenhuma informação que possa identificar sua criança ou sua família será revelada.
Se o (a) Sr. (a) tiver qualquer dúvida com respeito à pesquisa, poderá entrar em contato comigo pelo
telefone ________________ ou com Drs. Jailson Correia e Murilo Britto, pesquisadores
responsáveis, pelo telefone (81) 21224702.
Recife, ____ de _____________ de 200___.
___________________________________ _________________________________
Pai, mãe ou responsável pelo menor. Pesquisador (a) responsável pelo estudo
105
APÊNDICE II – INSTRUMENTO DE COLETA DE DADOS
FORMULÁRIO DE PESQUISA DE INFECÇÕES RESPIRATÓRIAS
AGUDAS – IMIP
Registro: Data da entrevista: / / Hora: :
Data do atendimento na emergência: / / Hora: :
Entrevistador: ____________________________________________
DADOS GERAIS:
Participante: _____________________________________________________________
Endereço: _______________________________________________________________
Ponto de referência: _______________________________________________________
Responsável: ____________________________________________________________
Telefones: - -
Data de nascimento / / Sexo (Masculino=1, Feminino=2)
HISTÓRIA MÉDICA PREGRESSA
1 - Peso ao nascimento 9999 Não sabe PNAS
2 – A criança foi prematura (nasceu antes dos 9 meses)? [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, idade gestacional semanas semanas 99 Não sabe
PREMAT
IGSEM
3 - A criança já teve alguma vez na vida?
Pneumonia [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, primeiro episódio: anos meses
Quantas vezes:
Tosse durante mais de 1 mês [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, quantas vezes:
Tuberculose [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, quando ocorreu: anos meses
Cansaço/chiado/sibilância [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, primeiro episódio: anos meses
Quantas vezes:
Asma referida por médico [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, primeiro episódio: anos meses
Rinite alérgica referida por médico [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, primeiro episódio: anos meses
PNEUMONIA
1VEZPNEUMO
VEZESPNEUMO
TOSSE1MES
VEZESTOSSE
TB
1VEZTB
SIBILO
1VEZSIBILO
VEZESSIBILO
ASMA
1VEZASMA
RINITE
1VEZRINITE
106
Urticária [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Conjuntivite alérgica [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Alergia a picada de inseto [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Alergia alimentar [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Alergia a medicamento [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
URTIC
CONJUNT
INSETO
ALIM
MEDIC
4 - A criança já foi internada alguma vez por:
Asma [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, quantas vezes
Diarréia [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, quantas vezes
Desnutrição [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, quantas vezes
Pneumonia [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, quantas vezes
A criança ficou internada nos últimos 30 dias? [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, qual a causa? ____________________________________________
INTASMA
NINTASMA
INTDIARR
NINTDIARR
INTDESNU
NINTDESNU
INTPNEUMO
NINTPNEUMO
INTOUTRAS
OUTINT ___________
5 - A criança tem ou já teve:
Doença do coração? [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, qual ______________________________
Doença do pulmão? [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, qual ______________________________
Deficiência de imunidade? [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, qual ______________________________
A criança tem ou já teve alguma outra doença? [1] Sim [2] Não [9] Não
sabe
Se sim, qual ______________________________
DCORA
TIPOCOR ___________
DPULM
TIPODP _____________
DIMUNO
TIPODI _____________
DOUTRA
TIPODO ____________
6 – Imunizações:
107
BCG Doses [0] Nenhuma [9] Desconhecido/ sem cartão/ ilegível
Hepatite B (HB) Doses [0] Nenhuma [9] Desconhecido/ sem cartão/ ilegível
Sabin (Pólio) Doses [0] Nenhuma [99] Desconhecido/ sem cartão/ ilegível
Tetra (DPT+HIB) Doses [0] Nenhuma [9] Desconhecido/ sem cartão/ ilegível
DPT (Tríplice) Doses [0] Nenhuma [9] Desconhecido/ sem cartão/ ilegível
HIB Doses [0] Nenhuma [9] Desconhecido/ sem cartão/ ilegível
Tríplice viral (MMR) Doses [0] Nenhuma [9] Desconhecido/ sem cartão/ ilegível
Rotavírus Doses [0] Nenhuma [9] Desconhecido/ sem cartão/ ilegível
Pneumo 7 valente Doses [0] Nenhuma [9] Desconhecido/ sem cartão/ ilegível
Pneumo 23 Doses [0] Nenhuma [9] Desconhecido/ sem cartão/ ilegível
Gripe (Influenza) Doses [0] Nenhuma [9] Desconhecido/ sem cartão/ ilegível
Há quanto tempo fez a dose mais recente meses
BCG
HB
SABIN
TETRA
DPT
HIB
MMR
ROTA
PNEUMO7
PNEUMO23
GRIPE
TEMPOGRIPE
7 – A criança mama? [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, pule as próximas duas questões
8 – A criança mamou? [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
9 – Se sim, até que idade mamou? [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
meses
10 - Enquanto mama(va), recebe(u) outro alimento (incluindo água)? [1] Sim [2] Não [9]
Não sabe
Caso afirmativo, com que idade começou a receber outro alimento? meses
dias
MAMA
MAMOU
MAMOUMESES
OUTRALIM
OUTRALIMDIA
11 –
Tipo de moradia: [1] Casa [2] Apartamento [3] Quarto/cômodo [4] Outro [9]
Não sabe
12 – Quantos cômodos ao todo?
13 – Servindo de dormitório
TIPOCASA
CMDTOTAL
COMODORME
PAREDE
108
14 - De que são feitas as paredes da moradia? [1] Alvenaria ou tijolo [2] Taipa [3]
Madeira [4] outro [9] Não sabe
15 – O abastecimento de água chega até dentro de casa?
[1] Sim [2] Não [9] Não sabe
16 – Tratamento da água de beber: [1] Fervida [2] Filtrada [3] Mineral [4] Outro [5] Sem
tratamento [9] Não sabe
17 – Tipo de luz utilizada: [1] Elétrica [2] Gás [3] Querosene [4] Outros [9] Não sabe
18 – Número de pessoas que dormem na casa: [99] Não sabe
19 – Número de pessoas que dormem no mesmo quarto com a criança (incluindo a
criança): [99] Não sabe
20 – A mãe da criança mora em casa? [1] Mãe biológica [2] Madrasta [3] Não mora em
casa [4] Falecida [9] Outra condição
21 – Qual a idade materna? [99] Não sabe/ não é pertinente
22 – Ocupação materna: ___________________
23 – Quantos anos completos a mãe estudou? [99] Não sabe
24 – O pai da criança mora em casa? [1] Pai biológico [2] Padrasto [3] Não mora em casa
[4] Falecido [9] Outra condição
25 – Qual a idade paterna? [99] Não sabe/ não é pertinente
26 – Ocupação paterna: __________________ [9] Não sabe
27 – Quantos anos completos o pai estudou? [99] Não sabe
28 – Número de irmãos mais novos: [99] Não sabe
29 – Número de irmãos mais velhos: [99] Não sabe
30 - Número de crianças menores de 18 anos (incluindo a criança): [99]
Não sabe
31 - Quanto o chefe da família ganhou com o seu trabalho no mês passado? (a pessoa que
possuir a maior renda em casa): Salário: R$
,
00 [9999] Não sabe
32 - O chefe da família teve outro trabalho ou rendimento no mês passado?
AGUA
TRATAGUA
LUZ
DORMEM
DORMCRIAN
PRESMAE
IDADEMAE
OCUPMAE __________
ESCOLMAE
PRESPAI
IDADEPAI
OCUPAI
ESCOLPAI
IRMAOSN
IRMAOSV
MENORES
RENDCHEF
TRABOUTRO
109
[1] Sim [2] Não [9] Não sabe
33 – Quanto ganhou? R$
,
00 [9999] Não sabe
34 – No mês passado, quanto ganharam as outras pessoas que moram na casa?
R$
,
00 [9999] Não sabe
35 – A família está inscrita no PROGRAMA BOLSA FAMÍLIA (PBF)?
[1] Sim [2] Não [9] Não sabe
36 - Quanto ganhou do PBF no mês passado? R$
,
00 [9999] Não sabe
37 – Há pessoas que fumam na casa? [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
38 - O que é usado para cozinhar na casa? [1] Gás [2] Madeira ou carvão [3] Eletricidade
[4] Outros [5] Gás e madeira ou carvão [6] Gás e eletricidade [7] Madeira ou carvão e
eletricidade [8] Outras combinações [9] Não sabe
OUTCHEF
OUTPESSO
PBF
GANHOPBF
FUMAM
COZINHA
HISTÓRIA DA DOENÇA ATUAL – DURAÇÃO DA DOENÇA
39 – Coriza [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, início dias
horas
Duração dias
horas
40 – Tosse [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, início dias
horas
Duração dias
horas
41 – Dificuldade para respirar ou cansaço [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, início dias
horas
Duração dias
horas
42 – Chiado no peito/sibilância [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, início dias
horas
Duração dias
horas
43 – Apnéia [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, início dias
horas
Há quanto tempo? dias
horas
44 – Cianose [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, início dias
horas
Duração dias
horas
CORIZA
INICIOCORIZ
DURACORIZ
TOSSE
INICIOTOSSE
DURATOSSE
DIFICRESP
INICIODRESP
DURADRESP
CHIADO
INICIOCHIA
DURACHIADO
APNEIA
INICIOAPN
TAPNEIA
CIANOSE
INICIOCIAN
DURACIAN
110
45 – Gemido [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, início dias
horas
Duração dias
horas
46 – Febre [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, início dias
horas
Duração dias
horas
47 – Otalgia [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, início dias
horas
Duração dias
horas
48 – Outros _____________________________
Início dias
horas
Duração dias
horas
49- Outros ______________________________
Início dias
horas
Duração dias
horas
GEMIDO
INICIOGEM
DURAGEM
FEBRE
INICIOFEBR
DURAFEBRE
OTALGIA
INICIOOT
DURAOT
OUTR1 _____________
INICIOOUTR1
DURAOUTR1
OUTR2 _____________
INICIOOUTR2
DURAOUTR2
Diagnósticos clínicos na emergência:
59 – Rinofaringite [1] Sim [2] Não
60 – IVA com Sibilância/ asma: [1] Sim [2] Não
61 – Amigdalite/Faringite: [1] Sim [2] Não
62 – Laringotraqueobronquite/laringite/Laringotraqueíte: [1] Sim [2] Não
63 – Bronquiolite: [1] Sim [2] Não
DIVAS
DASMA
DAMIGD
DLARING
DBRONQUIOL
Exame Físico na Emergência:
50 – Peso gramas
51 – Altura cm
52 - Temperatura axilar ,
o
C
53 – Freqüência cardíaca bpm
54 – Freqüência respiratória /min
55 – Tiragem [1] Sim [2] Não
56 – Cianose [1] Sim [2] Não
57 – Saturometria de O2 %
Se em uso de O2, qual a concentração de O2 %
58 – Sinais de OMA na otoscopia [1] Sim [2] Não [3] Não realizada
PESO
ALTURA
TAXILAR
FC
FR
TIRAGEM
CIANOSE
SATO2
FiO2ADM
OTOSC
111
64 – Pneumonia ou BCP: [1] Sim [2] Não
65 – Pneumonia ou BCP com derrame: [1] Sim [2] Não
66 – Otite média aguda: [1] Sim [2] Não
67 – Outros (especificar): ______________________
DBCP
DBCPDERR
DOMA
DOUTR3
68 – Fez Rx de tórax na emergência? [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Laudo do Rx de tórax emergência: ________________________________________
____________________________________________________________________
RX EMERG
Laudo RXEMERG
_______________
69 – No momento da admissão, a criança está aceitando bem a alimentação? [1] Sim [2]
Não [9] Não sabe
70 – No momento da admissão, a criança tem dificuldade para mamar? [1] Sim [2] Não
[9] Não sabe/não mama
Se sim, início dias
horas
Duração dias
horas
71 – No momento da admissão, a criança está tomando líquidos bem? [1] Sim [2] Não [9]
Não sabe
Se não, início dias
horas
Duração dias
horas
72 – No momento da admissão, a criança está hipoativa? [1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, início dias
horas
Duração dias
horas
73 – No momento da admissão, a criança está largada/letárgica? [1] Sim [2] Não [9]
Não sabe
Se sim, início dias
horas
Duração dias
horas
74 – A criança necessitou mais de um atendimento na emergência na doença atual?
[1] Sim [2] Não [9] Não sabe
Se sim, quantas vezes
75 - A criança freqüenta creche?
[1] Sim [2] Não [9] Não sabe
ALIMENTAÇÃO
INICIOBXALIM
DURABXALIM
DIFICMAMAR
INICDIFMAMAR
DURDIFMAMAR
BXLIQUIDOS
INICIOBXLIQ
DURABXLIQ
HIPOATIV
INICIOHIPOATIV
DURAHIPOATIV
LETARGIA
INICIOLETARG
DURALETARG
MAISUMEMERG
QTEMERG
CRECHE
BAN
112
No Exame Físico na emergência
76 - Batimento de asa do nariz [1] Sim [2] Não
77 - Ausculta cardíaca _________________________________________________
78 - Ausculta respiratória ______________________________________________
79 – Escore de sintomas respiratórios na criança
_________________
_________________
RSS
Coleta de amostras laboratoriais:
80 – Aspirado nasofaríngeo: [1] Sim [2] Não
Coleta: / / ; / ; / ; /
81 – Sangue: [1] Sim [2] Não
82 – Lavado broncoalveolar 1: [1] Sim [2] Não
ANF
QTANF
SG
LBA
83 - Nível de hemoglobina (1ª dosagem após admissão) g%
84 - Número de leucócitos (1ª dosagem após admissão)
85 - Número de plaquetas (1ª dosagem após admissão)
86 – Na 1ª gasimetria após a admissão no IMIP
FiO2 %
PaO2 %
PaCO2 mmHg
pH
87 - Antibioticoterapia nos primeiros 3 dias de admissão [1] Sim [2] Não
Qual antibiótico? [1] Ampi [2]Ampi + genta [3] Oxacilina +
cloranfenicol [4] Outros. Especificar ______________________
88 - Presença de infecção hospitalar [1] Sim [2] Não
89 – Duração da resolução dos sintomas e sinais? dias
90 - Tempo de permanência hospitalar em dias
91 - Data da alta: / /
Hora da alta: :
92 - Estado da saída [1] Alta [2] Óbito [3] Transferência
93 – Hemocultura: [1] Sim [2] Não
94 - Diagnóstico(s) na alta _____________________
Hb
LC
PLQ
FIO
2
PaO
2
PaCO
2
pH
ATBPADM
QUALATB
IH
DURSINT
TPPERMHOSP
Dalta / /
Halta :
Estado da saída
SGCULT
113
SEGUIMENTO DO PACIENTE HOSPITALIZADO
Sintomas/Data __/__ __/__ __/__ __/__ __/__ __/__ __/__ _/__ __/__
95 – Uso de O
2
[1] P [2] A
96- Modalidade de O
2
:
[1]Cateter/halo
[2]CPAP [3]VNI [4]VM [5] NBZ [9] Não
97 – Concentração de O
2
98 – Venóclise [1] P [2] A
99 – SNG [1] P [2] A
Sintomas/Data __/__ __/__ __/__ __/__ __/__ __/__ __/__ _/__ __/__
95 – Uso de O
2
[1] P [2] A
96- Modalidade de O
2
:
[1]Cateter/halo
[2]CPAP [3]VNI [4]VM [5] NBZ [9] Não
97 – Concentração de O
2
98 – Venóclise [1] P [2] A
99 – SNG [1] P [2] A
Sintomas/Data __/__ __/__ __/__ __/__ __/__ __/__ __/__ _/__ __/__
95 – Uso de O
2
[1] P [2] A
96- Modalidade de O
2
:
[1]Cateter/halo
[2]CPAP [3]VNI [4]VM [5] NBZ [9] Não
97 – Concentração de O
2
98 – Venóclise [1] P [2] A
99 – SNG [1] P [2] A
114
NAS CRIANÇAS MENORES DE 18 MESES ADMITIDAS NA UTIP
Data de admissão na UTIP: / /
Data da alta na UTIP: / /
100 - PRISM
101 - PIM
102 - Escore de gravidade clínica respiratória
103 - Ventilação mecânica invasiva [1] Sim [2] Não
Se sim, duração dias horas
104 - Ventilação mecânica não invasiva [1] Sim [2] Não
Se sim, duração dias horas
Modalidade: [1] CPAP [2]VNI
105 - 1ª gasimetria na UTI
PaO2 mmHg
PaCo2 mmHg
pH
BE
106- Uso de drogas vasoativas [1] Sim [2] Não
specificar [1]Dopa [2Dobuta [3]Adrenalina/Nora
[6]Outras________
Dose _________________________________
Se sim, duração dias horas
107 - Uso de cateter venoso/arterial central [1] Sim [2] Não
Se sim, duração dias horas
PRISM
PIM
ESCGRAVR
VMA
DURVMA
VNI
DURVNI
MODALIDVNI
PaO2ENT
PaCO2ENT
pHENT
BE
DGVASOAT
TPDGVASOAT
DOSEVASOAT
DURDRVASOAT
CVC
DURCVC
115
APÊNDICE III – PROCEDIMENTO LABORATORIAL NO IMIP
Procedimentos para coleta e processamento laboratorial do aspirado nasofaríngeo
1- Coletar a secreção nasofaríngea usando sonda de aspiração traqueal estéril número 6
acoplada à bomba de aspiração manual. Ainda na emergência, diluir o aspirado em 3 tubos
com 1ml de solução salina tamponada cada e refrigerá-los até o processamento laboratorial em
duas horas.
2- Filtrar o ANF com SF para o tubo cônico graduado através do tecido de 60 microns com
pipeta de 1ml. Anotar o volume pós filtrado.
3- Pipetar 10 microlitros da amostra e misturar em tubo de Eppendorf de 1ml com 10
microlitros de (azul de tripano) – 1:1.
4- Calcular o percentual de viabilidade e concentração de células /ml (hemacitômetro). As
células viáveis são as que não ficam coradas pelo azul de tripano.
5- Usando o volume pós-filtração, calcular e anotar o número de células totais na amostra.
- Processamento com Trizol (seguir passos de 6 a l1):
6- Dividir o número de células totais por 2.000.000 para fornecer o volume de Trizol
necessário para solubilizar as células após a centrifugação.
7- Centrifugar a amostra a 500g (3800rpm) por 5 minutos a 4
o
C.
8- Aliquotar o sobrenadante (de 500mcl – 0,5ml) e estocar em criotubo em freezer a -70
o
C.
9- Adicionar Trizol ao concentrado de células para dar uma concentração de 2.000.000 de
células por ml, como foi calculado pela contagem de células.
10- Homogeneizar o concentrado de células.
116
11- Aliquotar a mistura da amostra com o Trizol (de 500 em 500mcl – 0,5ml) e estocar em
freezer a -70oC.
-Processamento com RLT lysis buffer (passos de 12 a 16):
12- Centrifugar a amostra a 500g (3800rpm) por 5 minutos a 4
o
C.
13- Aliquotar o sobrenadante (500ul) e estocar em criotubos a -70
o
C.
14- Adicionar 10uL de 2-mercaptoetanol a 1mL de RLT lysis buffer. Preparar a solução no
mesmo dia (válido por 1 semana em temperatura ambiente).
15- Um volume de 350uL dessa solução é necessária para lisar 5x106 células. Esse volume é
adicionado ao agrupamento de células (cell pellet). Um volume de 350uL é usado para lisar
500 células. Acima desse número, um volume proporcional é calculado.
16- Pipetar algumas vezes para assegurar a completa lise. A solução deve estar clara antes de
ser colocada no freezer a -70°C, em alíquotas de 500ul.
117
APÊNDICE IV – PROCEDIMENTO LABORATORIAL EM LIVERPOOL
EXTRAÇÃO DO RNA/DNA
Preparação das amostras para a extração do RNA/DNA no QIAsymphony
1- Descongelar amostras do freezer a – 70
o
C.
2- Colar etiquetas com códigos de barra (luvas calçadas):
- 1 para o livro de registro laboratorial.
- 1 para o tubo de amostra + buffer.
- 1 para o tubo do eluato.
3- Estação de trabalho – capela de fluxo laminar (luvas calçadas):
- Limpar superfície com álcool isopropílico.
- Colocar dentro da capela: o Vortex, duas caixas de ponteiras livres de DNA/RNA de
100 e 300 µL, lixo para ponteiras, frasco de ATL buffer, racks com as amostras (etiquetas
vermelhas) e tubos vazios para as amostras + buffer, e frasco com água destilada.
- Tubos para colocar o ATL buffer e amostras para a extração:
- Pipetar 100 µL do buffer nos frascos vazios e no frasco do controle negativo.
- Colocar um tubo de amostra por vez no Vortex durante 5 a 10 segundos.
- Pipetar 300 µL da amostra para a extração. Não permitir a formação de
bolhas.
- Volume total por tubo = 400 µL (300 µL da amostra + 100 µL do buffer).
Obs.: caso a amostra contenha menos de 300 µL, completar para 300 µL com buffer ATL.
Calibrar a pipeta com volume definido (ex. 200 ou 250 µL).
118
- Adicionar 300 µL de água destilada no frasco de controle negativo.
- Ao final, limpar a superfície da capela com álcool isopropílico.
Estação de trabalho - QIAsymphony (luvas calçadas):
1- Ligar o QIAsymphony.
- Obs.: existem quatro gavetas: AMOSTRAS, REAGENTES E CONSUMÍVEIS,
RESÍDUOS E ELUATO. A preparação da máquina inicia-se com a gaveta do eluato, seguida
dos resíduos e finaliza com a gaveta das amostras.
2- Abrir a gaveta do eluato:
- Escanear o código de barra que se deseja usar (ex. n.1).
- Pressionar “yes” e selecionar o adaptador de eluição que se deseja utilizar –
“Coolable Sarsted 24 tube rack”.
- Colocar o adaptador da abertura:
- Colocar os tubos etiquetados para o eluato no adaptador de eluição.
- Locais do rack para eluição:
- Cada rack possui 24 locais:
- A1:1 a 24;
- A2: 1 a 24, sendo o controle negativo colocado na posição 12 e
o controle positivo na posição 13 (FLU AB).
- Pressionar “add”.
- Repetir etapas para o local 2 – “Adapter 24 tube screw cap”.
- Fechar a gaveta.
- Pressionar “close”.
119
- Aguardar pelo escaneamento do inventário para a gaveta da eluição.
3 – Abrir a gaveta dos resíduos:
- Reabastecer os cartuchos vazios e colocar um novo saco de lixo.
- Assegurar-se que existam quatro caixas vazias.
- Assegurar-se que o frasco para resíduos líquidos está vazio.
- Fechar a gaveta de resíduos e iniciar e aguardar o término do escaneamento do
inventário.
4- Abrir a gaveta dos reagentes e consumíveis:
- Assegurar que existam:
- 3 caixas cheias de “Sample Prep Cartridges”.
- 1 caixa cheia de “Rod Covers”.
- 4 racks cheios de ponteiras azuis de 200 µL.
- 14 racks cheios de ponteiras pretas de 1500 µL.
- Preencher os cartuchos de reagentes necessários para a extração.
- Colocar as esferas magnéticas no Vortex por três minutos antes de carregá-las
no cartucho de reagentes. Certificar-se que o papel de alumínio foi removido.
- Limpar os códigos de barra com lenço de papel antes de carregá-las no
cartucho.
- Certificar-se que o rack de enzimas foi adicionado.
- Certificar-se que todas as tampas dos tubos de reagentes foram removidas.
- Pressionar “scan bottle” na tela do “reagents and consumables” e escanear o código
de barras do Buffer ATL. Colocar o ATL buffer no deck.
120
- Certificar-se que nenhum material precipitado esteja visível no ATL buffer. Se
for o caso, aquecer a 37
o
C até a sua dissolução (forno de microondas por 5 segundos).
- Fechar lentamente a gaveta dos reagentes e consumíveis e iniciar o escaneamento do
inventário.
5 – Abrir a gaveta das amostras:
- Colocar o suporte de tubos na linha de parada da abertura escolhida (ex. 1) e aguardar
até a luz verde piscar.
- Deslizar o suporte de tubos lenta e suavemente.
- Aguardar pela luz laranja.
- Pressionar o botão lote que agora sinaliza “carregado” e tornou-se azul.
- Atribuir o protocolo “Labware”: “pathogen – RNA”.
- Editar as identificações dos tubos, se necessário.
- Atribuir um ensaio de controle.
- Pressionar “next”.
- Atribuir um slot para o eluato
- Definir o volume do eluato (ex. 60).
- Pressionar “queue”.
- Repetir se lotes maiores forem ser processados.
- Carregar os controles internos de RNA transportador:
- Colocar o tubo na linha de parada da abertura escolhida (ex. A) e aguardar até
a luz verde piscar.
- Deslizar o suporte de tubos lenta e suavemente.
- Aguardar pela luz laranja.
121
- Pressionar o botão “IC” que agora sinaliza “carregado” e tornou-se azul.
- Atribuir o “Labware”.
- Atribuir o controle interno necessário.
- Pressionar “OK”.
- Pressionar “RUN”.
6- Amostras, controle interno, controles positivos e controles negativos:
- 1 X controle interno (Carrier RNA – 480 µL + MS2 – 166 µL + AVE – 20 ml) para
cada 8 amostras. Colocar o controle interno no rack A.
- Incluir em cada rodada:
- 1 X controle positivo (FLU AB - 300 µL + Buffer ATL - 100 µL).
- 1 X controle negativo (distilled water - 300 µL + Buffer ATL - 100 µL).
- Colocar as amostras nos racks.
- Na tela “touch screen”:
- Digitar o tipo de tubo da amostra (2ml).
- Digitar as identificações das amostras.
- Uma vez finalizado, pressionar “escaneamento total”.
- Ordenar 3 X o mesmo código de barra: 1. Tubo da amostra; 2. Tubo do eluato; 3.
Arquivo.
7- Remover um lote processado:
- Abrir a gaveta do eluato.
- Retirar o rack da abertura.
122
- Trocar as tampas dos tubos com o RNA/DNA extraído por novas tampas numeradas
com adesivos verdes e estocar os tubos em freezer a - 70
o
C.
8- Realizar a manutenção:
- No menu principal, pressionar “maintenance”.
- Pressionar luz “UV light” por 15 minutos.
9- Desligar o QIAsymphony.
123
PCR MULTIPLEX
- Laboratório de “specially difficult organisms”:
- Levar amostras de RNA extraído em ordem no rack.
- Encher bandeja com gelo.
- Programar 2 minutos no timer.
- Colocar criotubos no suporte aquecido para desnaturar o RNA.
- Ao final de 2 minutos, retirar criotubos do suporte e colocá-los na bandeja com gelo.
- Transferir criotubos em ordem para rack.
- Preparar o protocolo FLU 4 plex MM.
- Deixar os reagentes no freezer a - 20
o
C.
- Invit 1-step qRTPCR – vortex por 5 segundos – centrifugar por 5 segundos – 650 µL.
- Clear primer – agitar suavemente – centrifugar por 5 segundos – 52 µL.
- Flu pdC Probe mix – agitar suavemente – centrifugar por 5 segundos – 13 µL.
- Superscript Enz – agitar suavemente – centrifugar por 5 segundos) – 26 µL.
- H2O – 299 µL.
- Misturar reagentes na cabine de segurança, usando luvas e criotubos e ponteiras DNA e RNA
free.
- Ao final, ligar luz ultravioleta e guardar reagentes na geladeira.
- Laboratório de trabalho:
- Manipular placa de PCR pelas bordas com luvas, marcá-la com letras A, B, C e D e n. 3, 6 e
9 para facilitar pipetagem e mantê-la sobre o gelo (para evitar início das reações).
- Pipetar 20 µL do FLU 4 plex MM.
124
- Pipetar 5 µL do RNA extraído, indo com a pipeta até o fundo do orifício e subindo com a
ponteira pelas laterais do orifício.
- Ao término, aplicar papel adesivo com cuidado para não encostar os dedos.
- Manter a placa sobre o gelo.
- Laboratório de PCR:
- Centrifugar a placa por tempo pré-determinado: 150g/1min.
- Abrir máquina de PCR LightCycler 480 Real-Time PCR System and Software (Roche) e
colocar a placa.
- Aguardar por 2 luzes verdes.
- Clicar no monitor: <novo exame>, protocolo <upper resp 6 phx runprotocol>.
- Salvar em novo arquivo: <Recife FLU dia-mês-ano>
- Editar quantidade de orifícios.
Protocolo – Flu A + Flu B + RSV + HMPV
Flu 4plex MM
95
o
C 2 min** 1x 26 52
Invit 1-step qRTPCR 12.5 326 650
50
o
C 20 min HMPV/RSV/Flu F+R 1 26 52
95 2 min Flu pdC Probe mix 0.25 6.5 13
95
10
sec Superscript Enz 0.5 13 26
58
45
sec x 50 H2O 5.75 149.5 299
72
1
sec ** RNA 5
20 µL + 5 µL of extracted RNA
125
Protocolo - hCoV OC43 + NL63 + 229E + HKU1
IH hCoV Multiplex MM
95
o
C 2 min** 1x 100
Invit 1-step qRTPCR 12.5 1250
50
o
C 20 min hCoV primer mix 1 100
95 2 min hCoV probe mix 0.4 40
95
10
sec Superscript Enz 0.5 50
58
45
sec x 50 H2O 5.6 560
72
1
sec ** RNA 5
20 µL + 5 µL of extracted RNA
Protocolo - PIV1 + PIV 2 + PIV 3 + PIV 4 + CONTROLE INTERNO
IH PIV Multiplex MM
95
o
C 2 min** 1x 100
Invit 1-step qRTPCR 12.5 1250
50
o
C 20 min PIV, MS2 primer mix 1 100
95 2 min Guns Rhino F+R (10uM) 1 100
95
10
sec PIV, MS2 probe mix 0.4 40
58
45
sec x 50 Guns Rhino Hex (10 uM) 0.4 40
72
1
sec Superscript Enz 0.5 50
H2O 4.2 420
** RNA 5
20 µL + 5 µL of extracted RNA
126
APÊNDICE V – DIVULGAÇÃO DA PESQUISA
5.1. Resumo publicado no American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine
127
Anexos
1
1
1
1
128
ANEXO I – Certificação: Regulamentação de transporte de material biológico por via
aérea pela Sociedade Brasileira de Profissionais em Pesquisa Clínica.
1
129
ANEXO II – Comprovante de aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa em seres
humanos
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
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Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
