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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
AUTOR: SAMANTA MATTEI DE MELLO
Clonagem e expressão da proteína EGFP na região intergênica E/NS1 da cepa vacinal
17D do vírus da Febre Amarela
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz
como parte dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Ciências na área de Biologia Celular e
Molecular.
Orientadores: Dr
a
. Myrna Cristina Bonaldo
Dr. Ricardo Galler
RIO DE JANEIRO
2007
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ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
AUTOR: SAMANTA MATTEI DE MELLO
Clonagem e expressão da proteína EGFP na região intergênica E/NS1 da cepa vacinal
17D do vírus da Febre Amarela
ORIENTADORES: Dr
a
Myrna Cristina Bonaldo
Dr. Ricardo Galler
Aprovada em: 30/07/2007
EXAMINADORES:
Dr
a
Leila de Mendonça Lima (Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular/IOC/FIOCRUZ) - Presidente
Dr
a
Ada Maria de Barcelos Alves (Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular/IOC/FIOCRUZ).
Dr
a
Andrea Cheble de Oliveira (Instituto de Bioquimica Medica
UFRJ/CCS/ICB).
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iii
Rio de Janeiro, 17 de setembro de 2007.
iv
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
CLONAGEM E EXPRESSÃO DA PROTEÍNA EGFP NA REGIÃO INTERGÊNICA
E/NS1 DA CEPA VACINAL 17D DO VÍRUS DA FEBRE AMARELA
RESUMO/ABSTRACT
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Samanta Mattei de Mello
Resumo
O vírus da Febre Amarela (FA) é o membro protótipo do gênero Flavivírus. Para estes,
a única vacina de vírus atenuado, disponível e licenciada até o momento é a da Febre
Amarela, que é composta pelo vírus vacinal da cepa 17D. Este projeto tem como objetivo
geral o estabelecimento de uma nova estratégia de expressão de proteínas heterólogas na
região intergênica E/NS1 e, como objetivos específicos, a construção de dois diferentes vírus
FA recombinantes expressando EGFP e a caracterização dos vírus recombinantes quanto às
suas propriedades biológicas e de estabilidade genética. Esta abordagem baseou-se nos
motivos funcionais e na seqüência de aminoácidos conservados flanqueadores da região
intergênica E e NS1 , os quais foram duplicados e fusionados ao gene heterólogo permitindo,
desta forma, o correto processamento da poliproteína precursora viral.
A região intergênica E/NS1 foi testada quanto à tolerância da inserção e expressão da
proteína no vírus recombinante, por meio de duas construções utilizando o gene repórter
EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) de Aequoria victoria, o qual tem como produto
uma proteína de 238 aminoácidos. Nos dois diferentes vírus FA recombinantes expressando
EGFP, o gene heterólogo foi fusionado a uma seqüência correspondente aos 27 nucleotídeos
5’- terminais do gene da proteína NS1 e, no seu C-terminal, aos domínios haste e âncora,
completos ou parciais. Desse modo, a presente dissertação descreve a construção dos vírus
expressando EGFP de Aequoria victoria na região intergênica E/NS1 do genoma viral FA, a
determinação das suas propriedades de crescimento em monocamadas celulares (cinética de
crescimento viral e fenótipo de placa de lise) e a estabilidade genética das amostras virais
v
após passagens seriadas em monocamadas celulares através da análise das placas de lise, RT-
PCR e Citometria de Fluxo.
A regeneração dos vírus recombinantes foi bem sucedida e a expressão e estabilidade da
proteína confirmada através da detecção de fluorescência e análise do fenótipo de placa,
indicando que a inserção do gene não influencia consideravelmente a viabilidade viral. A
caracterização biológica de cinética de crescimento viral dos vírus recombinantes apontou no
sentido de que as modificações genéticas introduzidas no genoma FA não acarretaram em um
grande comprometimento da estrutura e função viral. Estes resultados são importantes pois,
até o momento, não se conseguiu expressar estavelmente no genoma de flavivírus proteínas
exógenas, devido à instabilidade genética destas inserções, que são deletadas do genoma viral.
vi
Abstract
The Yellow Fever virus (YF) is a prototype member of the genus Flavivirus. The only
available and licensed vaccine to this group of virus is the one against Yellow Fever. This
vaccine is constituted by the vaccinal 17D strain virus. The general aim of this project was the
establishment of a new strategy for expression of heterologous proteins in the intergenic
region E/NS1. The specific aims were the construction of two different recombinant Yellow
Fever virus expressing EGFP and the characterization of their biological and genetic stability
proprieties. This approach is based on functional motifs and amino acid sequence
conservation flanking the E and NS1 intergenic region which were duplicated and fused to the
heterologous gene, allowing the correct processing of the viral polyprotein precursor.
The intergenic region E/NS1 was tested for tolerance of the insertion and heterologous
protein expression in the recombinant virus, through two constructions using the reporter gene
encoding EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), from Aequoria victoria. This gene has
a protein product composed by 238 amino acids. In the two different recombinant FA vírus
expressing EGFP, the heterolog gene was fused to a sequence corresponding to the 27 5’-
terminal nucleotides from the NS1 protein gene and, at the C-terminal, to the complete or
partial stem-anchor domains. Based on that, the present dissertation describes the
constructions of viruses expressing EGFP from Aequoria victoria in the E/NS1 intergenic
region of the YF viral genome; the determination of their growth properties in cell
monolayers (viral growth kinetics and plaque phenotype), and the genetic stability of the viral
samples after serial passages in cell monolayers through plaque phenotype analysis, RT-PCR
and Flow Cytometry.
The regeneration of the recombinant virus was successful and the expression and
stability of the recombinant protein was confirmed through fluorescence detection and plaque
phenotype analysis, suggesting that the cloned gene does not considerably influence the virus
viability. The biological characterization of the growth kinetics of the recombinant virus
shows that the genetic modifications introduced into the YF genome do not compromise viral
structure and function. These results are important since, till this moment, it has not been
possible to stably express foreign proteins within the flavivirus genome due to insert deletions
from the Flavivirus genome.
vii
Trabalho realizado no Laboratório de Biologia
Molecular de Flavivírus do Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular, e no Laboratório de
Tecnologia Virológica (LATEV) do Departamento de
Desenvolvimento Tecnológico/ Bio-
Manguinhos/FIOCRUZ , sob a orientação da Dr
a
Myrna Cristina Bonaldo e Dr. Ricardo Galler.
viii
“Todos querem viver no topo da montanha, mas
toda felicidade e crescimento ocorrem enquanto a
estamos escalando.”
William Shakespeare
ix
Dedico esta dissertação aos meus pais Yara e Ronaldo, à
minha irmã Sabrina e a todos que me apoiaram nesta
jornada.
x
Agradecimentos
Esta seção é dedicada a todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para
a realização desta dissertação.
Em primeiro lugar gostaria de agradecer à Dr
a
Myrna Cristina Bonaldo pela orientação
da presente dissertação de mestrado. Agradeço a ela pela dedicação e a excelente orientação
de cada etapa, experimental e intelectual, pelas valiosas discussões científicas e pela paciência
durante os esclarecimentos das minhas dúvidas e inseguranças ao longo do desenvolvimento
da dissertação. Agradeço, sobretudo, o aprendizado que ela me proporcionou, o crescimento
profissional e pessoal, e a oportunidade de fazer parte de sua equipe.
Agradeço ao Dr. Ricardo Galler, co-orientador desta dissertação, pela orientação de
muitas etapas experimentais, pelas valiosas dicas que me foram dadas durante etapas
experimentais problemáticas, pelas sábias opiniões sobre o andamento da dissertação e,
principalmente, pela oportunidade de fazer parte da sua equipe.
Agradeço ao Dr. Marcos da Silva Freire pelo uso da estrutura do Laboratório de
Tecnologia Virológica (LATEV) do Departamento de Desenvolvimento Tecnológico/ Bio-
Manguinhos/FIOCRUZ, onde foram realizados experimentos utilizando cultura de células e
vírus. Agradeço também, pela simpatia com que sempre fui recebida, ao Dr. Marcos da Silva
Freire e a toda a equipe do seu laboratório: Dr
a
Elena Cristina Caride Siqueira Campos, Dr
a
Anna Maya Yoshida Yamamura, Dr
a
Marcia Archer, Maria Beatriz Junqueira Borges, Alfredo
Verlangieri Jabor, Adriana Oliveira Honorato, Edney do Monte, Gerson de Oliveira da Silva e
Idevaldo Fernando Carvalho.
Gostaria de agradecer também à Dr
a
Claire Fernandes Kubelka e à Dr
a
Andrea
Henriques Pons pela pronta atenção, orientação e pelas valiosas discussões científicas durante
a etapa experimental de Citometria de Fluxo.
Agradeço também a Dr
a
Claire Fernandes Kubelka e sua aluna de mestrado Mariana
Gandini, por gentilmente me ceder os anticorpos para a etapa experimental de Citometria de
Fluxo.
xi
Deixo também meus agradecimentos ao Dr. Marcelo Pelajo Machado pela colaboração
com a etapa experimental de Microscopia Confocal de Fluorescência e a Pedro Paulo de
Abreu Manso pela assistência técnica durante esta etapa experimental.
Agradeço a Dr
a
Leila de Mendonça Lima e ao Dr. Milton Ozório Moraes pela
participação no meu exame de qualificação (Seminário Discente), e por oferecerem sugestões,
exemplos e críticas fundamentais à finalização desta dissertação.
Gostaria de agradecer à Dr
a
Adriana Lima Vallochi e às alunas de mestrado Michelli
Faria de Oliveira e Ana Luiza Chaves Valadão pela minuciosa correção desta dissertação, e
pelas suas valiosas opiniões e sugestões.
Agradeço a revisora Leila de Mendonça Lima pelas opiniões, críticas e sugestões,
essenciais para a finalização desta dissertação
Agradeço muito ao técnico Armindo Caldeira da Rocha pela sua constante preocupação
com o bom andamento do funcionamento do laboratório e por ter sempre procurado atender
prontamente às minhas solicitações. Obrigada também pelas divertidas conversas nos
intervalos e pela sua amizade.
Gostaria de agradecer à Dr
a
Aymara Alves Corrêa Rangel, à aluna de mestrado Ingrid
Siciliano Horbach e à Adriana dos Santos Duarte pela preciosa colaboração em diversas
etapas experimentais e, sobretudo, pelo carinho, companheirismo e amizade.
Agradeço aos meus companheiros e amigos que fazem parte da equipe do Laboratório
de Biologia Molecular de Flavivírus, Ingrid Siciliano Horbach, Adriana dos Santos Duarte,
Danielle Cristina de Paula Souza, Michelli Faria de Oliveira, Ana Luiza Chaves Valadão,
Gisela Freitas Trindade, Raquel Tayar Nogueira, Marlon Gilseppe Veloso de Santana, Ana
Paula Montenegro Generino, Adriana Lima Vallochi e Paula Borba Cruz, o companheirismo e
a amizade. Obrigada por compartilharem comigo de maneira tão agradável o tempo que
passamos juntos.
xii
Meus mais profundos agradecimentos aos meus pais, Yara e Ronaldo, sem os quais esta
dissertação e nenhuma das minhas conquistas seriam possíveis. Muito obrigada por confiarem
em mim, por me darem a oportunidade de estudar e por me apoiarem sempre, de todas as
formas possíveis, durante o mestrado e em todos os momentos da minha vida, sejam eles bons
ou difíceis. Muito obrigada por estarem sempre ao meu lado.
Agradeço à minha irmã e melhor amiga, Sabrina Mattei de Mello que, mesmo distante
fisicamente, esteve ao meu lado, me apoiando, durante esta dissertação e sempre.
Agradeço muito ao meu companheiro Vidal de Freitas Mansano, que sempre procurou
me apoiar, em todos os momentos. Obrigada pelos seus valiosos e sábios conselhos, pessoais
e profissionais, durante esta dissertação; obrigada pela paciência e compreensão durante os
meus momentos difíceis e pela alegria com que você recebeu cada conquista minha.
Agradeço à minha melhor amiga e irmã, Patrícia Rocha Maia que esteve ao meu lado
me apoiando sempre e em todos os sentidos.
Agradeço à coordenação de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular pela pronta
atenção às minhas solicitações e dúvidas e pelo incentivo ao meu desenvolvimento
profissional e científico.
Agradeço aos membros da Banca Examinadora, titulares e suplentes:
Dr
a
Leila de Mendonça Lima (Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular/IOC/FIOCRUZ).
Dr
a
Ada Maria de Barcelos Alves (Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular/IOC/FIOCRUZ).
Dr
a
Andrea Cheble de Oliveira (Instituto de Bioquimica Medica.
UFRJ/CCS/ICB).
Dr Carlos Roberto Alves (Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular/IOC/FIOCRUZ).
Dr
a
Andrea Henriques Pons (Departamento de Ultra-estrutura e Biologia
Celular/IOC/FIOCRUZ).
Agradeço à FIOCRUZ, ao IOC e à FAPERJ pelo suporte financeiro a este trabalho.
xiii
Abreviaturas e Siglas
α-FA Anticorpo anti-Febre Amarela
17D Cepa 17D da vacina contra Febre Amarela
17DD Cepa 17DD da vacina contra Febre Amarela
Asibi Linhagem Asibi do vírus selvagem da Febre Amarela
Bio-Manguinhos Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos
BSA Albumina de Soro Bovino (para o inglês “bovine
serum albumin”)
C 1. Proteína estrutural de nucleocapsídeo; 2. carbóxi
CAP Estrutura em cap da estremidade 5’ do RNAm
cDNA Ácido desoxirribonucleico complementar
CEF Fibroblasto de embrião de galinha (para o inglês
“chicken embryo fibroblast”)
CMC Carboximetilcelulose
CPE Efeito citopático (para o inglês “cytopathic effect”)
CQB Certificado de Qualidade em Biossegurança
CTNBio Comissão Técnica Nacional de Biossegurança
dATP Desoxiadenosina trifosfato
DBBM Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
DEN Dengue
DEN1 Vírus da Dengue sorotipo 1
DEN2 Vírus da Dengue sorotipo 2
DEN3 Vírus da Dengue sorotipo 3
DEN4 Vírus da Dengue sorotipo 4
DEPC Dietilpirocarbonato
DNA Ácido desoxirribonucleico
dNTPs Desoxinucleotídeos Trifosfato
E Envelope ou proteína de envelope
EGFP Para o ingles “Enhanced Green Fluorescent Protein”
ELISA Ensaio imuno enzimático (para o inglês “Enzime
Linked immunosorbent assay”)
EUA Estados Unidos da América
et al e colaboradores
FA Febre Amarela
xiv
FACS Para o inglês “Fluorescence-activated cell sorting”
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
FNV Vírus da cepa neurotrópica francesa (para o inglês
“french neurotropic vírus”)
FUNASA Fundação Nacional de Saúde
HIV-1 Vírus da Imunodeficiência Humana I (para o
inglês “human immunodeficience virus”)
IgG Imunoglobulina G
IOC Instituto Oswaldo Cruz
IRES Sítios internos de entrada de Ribissomo (para o inglês
“Internal Ribossome Entry Sites”
JE Vírus da Encefalite Japonesa
Kb Kilobases (1.000 pares de bases)
LATEV Laboratório de Tecnologia Virológica
LASV Lassa vírus
LS Lote semente
M 1. Concentração molar ou molaridade; 2. Proteína de
Membrana
Meio LB Meio Luria-Bertani
MHC Complexo principal de histocompatibilidade (para o
inglês “Major histocompatibility complex”)
m.o.i. Multiplicidade de infecção (para o inglês “multiplicity
of infection”)
N 1. Concentração normal ou normalidade; 2. Amino
NK Para o inglês “Natural Killer”
UTR Região não-traduzida (para o inglês “untranslated
region)
nt Nucleotídeos
OGM Organismos Geneticamente Modificados
OMS Organização Mundial da Saúde
p.i. Pós-infecção
pb par(es) de base(s)
PBS Solução salina fosfato tamponada (para o inglês
“phosphate buffered saline solution”)
xv
PCR Reação em cadeia de polimerase (para o inglês
“polymerase chain reaction”)
PE Ficoeritrina (para o inglês “Phycoerythrin”)
PFU Unidade formadora de placa (para o inglês
“plaque forming unit”)
PM Peso molecular
poli(A) Estrutura poliadenilada da extremidade 3’ do RNAm
preM Precursor da proteína de membrana
q.s.p. Quantidade suficiente para preencher
RNA Ácido ribonucléico
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
RT 1. RNA polimerase dependente de DNA ou transcriptase
reversa (para o inglês”reverse transcriptase”) 2. Reação
de transcrição reversa (para o inglês “reverse
transcription)
RT-PCR Sistema de transcrição reversa seguida da reação em
cadeia da polimerase
SFB Soro fetal bovino
TA Temperatura ambiente
TBE Vírus da encefalite transmitida por carrapato (para o inglês
“tick-borne encephalitis vírus)
U Unidade
WNV Vírus do Nilo Ocidental (para o inglês “west Nile vírus”)
x
vi
Lista de Figuras
Figura 1.1: Ciclos de Transmissão da Febre Amarela......................................................3
Figura 1.2: Epidemiologia da Febre Amarela .................................................................4
Figura 1.3: Partícula viral do vírus da Febre Amarela ....................................................8
Figura 1.4: Organização do genoma do vírus da Febre amarela ...................................11
Figura 3.1: Mapa circular do vetor pGEM-T Easy .......................................................24
Figura 4.1: Representação esquemática da proteína E do vírus da Febre amarela e das
Construções I e II, e a organização das mesmas no retículo endoplasmático
......................................................................................................................33
Figura 4.2: Esquema da PCR de Fusão para aquisição das Construções I (Cassete de
expressão com a região Haste-âncora da Proteína E Completa) e II (Cassete
de expressão com a região Haste-Âncora da Proteína E Truncada) ...........35
Figura 4.3: Mapa ilustrativo da inserção dos cassetes de expressão nos plasmídeos
pGEM-T Easy das inserções da PCR de fusão das Construções I e II .......36
Figura 4.4: Obtenção dos cassetes de expressão (Construções I e II) ..........................37
Figura 4.5: Subclonagem dos cassetes de expressão no plasmídeo pT3 ......................39
Figura 4.6: Subclonagem dos cassetes de expressão (Construções I e II) no vetor pT3 e
transformação em diferentes cepas de Escherichia coli (E.coli) .................40
Figura 4.7: Esquema ilustrativo da obtenção do molde de cDNA viral ........................42
Figura 4.8: Obtenção do molde de cDNA viral .............................................................43
Figura 4.9: RT-PCR dos sobrenadantes de transfecção dos vírus recombinantes
FA17D/Esa/5.1 glic e FA17D/Esa trun/4 glic .............................................46
Figura 4.10: Curva de Crescimento dos Vírus Recombinantes FA17D/Esa/5.1 glic e
FA17D/Esa trun/4 glic , e dos vírus controle 17DD e 17D/E200T3 ..........47
Figura 4.11: Cinética de expressão de EGFP em células Vero infectadas com os vírus
recombinantes FA17D/Esa/5.1 glic e FA17D/Esa trun/4 glic ....................50
Figura 4.12: Análise cinética da expressão de EGFP em células Vero infectadas pelo
vírus recombinante 17D/Esa/5.1 por FACS ................................................52
Figura 4.13: Análise da expressão de EGFP em células Vero infectadas pelo vírus
recombinante FA17D/Esa trun/4 glic .........................................................60
Figura 4.14: Estabilidade genética do vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic ..........65
Figura 4.15: Estabilidade genética do vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic-2 ......67
Figura 4.16: Estabilidade genética do vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic-4 ......68
Figura 4.17: Estabilidade genética do vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic-5 ......70
xvii
Figura 4.18: Estabilidade genética do vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic-6 .......71
Figura 4.19: Estabilidade genética do vírus recombinante FA17D/Esa trun/4 glic ......74
Figura 5.1: Esquema explicativo do artefato observado durante a análise dos resultados
obtidos pela utilização da técnica de RT-PCR na caracterização dos vírus
recombinantes expressando EGFP ..............................................................83
xviii
Lista de Tabelas
Tabela 3.1: Vetores utilizados para a obtenção do cassete de expressão para EGFP por
PCR .............................................................................................................21
Tabela 3.2: Oligonucleotídeos utilizados nas duas etapas de PCR para a aquisição das
Construções I e II ........................................................................................22
Tabela 3.3: Linhagens de E. coli utilizadas para a subclonagem dos cassetes de
expressão nos vetores pGEM-T Easy e pT3 ...............................................25
Tabela 3.4: Plasmídeos utilizados para a regeneração dos vírus FA recombinantes
expressando EGFP.......................................................................................26
Tabela 4.1: Plasmídeos obtidos após a subclonagem dos cassetes de expressão para
EGFP em pGEM-T Easy e seqüenciamento nucleotídico de amostras
plasmidiais....................................................................................................38
Tabela 4.2: Plasmídeos obtidos após a subclonagem dos cassetes de expressão em pT3
e seqüenciamento nucleotídico de amostras plasmidiais.............................40
Tabela 4.3: Vírus obtidos após a regeneração dos vírus FA recombinantes expressando
EGFP............................................................................................................45
Tabela 4.4: Determinação dos Valores Cinéticos de Crescimento Viral em Cultura de
Células Vero (log10 PFU/ml) .....................................................................47
Tabela 4.5: Determinação do tamanho de placas de lise do vírus FA 17D/Esa/5.1 glic -
passagens virais 2P, 5P1. 10P1, 5P2 e 10P2 – em monocamada de células
Vero .............................................................................................................48
Tabela 4.6: Valores, em porcentagem, de células não infectadas, de células infectadas
com o vírus controle FA 17D/E200T3 e com o vírus recombinante FA
17D/Esa/5.1 glic (marcadas com anticorpos αFA 1:100 anti-IgG de
camundongo-PE 1:50) .................................................................................54
Tabela 4.7: Valores, em porcentagem, de células não infectadas, de células infectadas
com o vírus controle FA 17D/E200T3 e com o vírus recombinante FA
17D/Esa/5.1 glic (marcadas com anticorpos αFA 1:80 anti-IgG de
camundongo-PE 1:40) .................................................................................58
Tabela 4.8: Valores, em porcentagem, de células não infectadas, de células infectadas
com o vírus controle FA 17D/E200T3 e com o vírus recombinante FA
17D/Esa trun/4 glic (marcadas com anticorpos αFA 1:60 anti-IgG de
camundongo-PE 1:30) .................................................................................62
Tabela 4.9: Estabilidade Genética do vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic ...........64
xix
Tabela 4.10: Estabilidade Genética dos vírus recombinantes FA17D/Esa/5.1 glic
clonados .......................................................................................................69
Tabela 4.1: Estabilidade Genética do vírus recombinante FA17D/Esa trun/4 glic .......73
xx
Índice
Resumo ............................................................................................................................iv
Abstract ............................................................................................................................vi
Abreviaturas e Siglas .....................................................................................................xiii
Lista de Figuras .............................................................................................................xvi
Lista de Tabelas ...........................................................................................................xviii
1. Introdução .....................................................................................................................1
1.1. Histórico da Febre Amarela .........................................................................1
1.2. Incidência, Epidemiologia e Ciclo de Transmissão ....................................2
1.3. A Doença ....................................................................................................5
1.3.1. Patologia e Patogênese ........................................................................5
1.3.2. Diagnóstico .........................................................................................5
1.4. Vacinação .....................................................................................................6
1.4.1. A Vacina ..............................................................................................6
1.4.2. A Cepa Vacinal 17D ...........................................................................6
1.4.3. Reações adversas após a vacinação com o vírus 17D .........................7
1.5. O Vírus da Febre Amarela ............................................................................8
1.5.1. Classificação e Estrutura .....................................................................8
1.5.2. Estrutura Genômica e Expressão de Proteínas ....................................9
1.5.3. Ciclo de Replicação ...........................................................................11
1.5.4. Desenvolvimento do vírus vacinal FA 17D como vetor de
expressão...........................................................................................................12
1.5.5. Estratégia de construção dos vírus FA 17D recombinantes ..............12
1.5.6. Estratégia de construção dos vírus FA 17D recombinantes
expressando EGFP ................................................................................................16
2. Objetivos e Metas .......................................................................................................18
3. Material e Métodos .....................................................................................................19
3.1. Construção dos vírus recombinantes ..........................................................19
3.1.1. Obtenção do cassete de expressão para EGFP por PCR ...................19
3.1.2. Clonagem dos cassetes de expressão para EGFP em pGEM-T
Easy..................................................................................................................22
3.1.3. Seqüenciamento nucleotídico de amostras plasmidiais ....................23
3.1.4. Subclonagem do cassete de expressão em pT3 ................................24
3.2. Regeneração dos vírus FA recombinantes expressando EGFP ..................26
xxi
3.3. Produção dos estoques virais de segunda passagem celular ......................27
3.4. Cinética de crescimento viral em monocamadas de células Vero ..............27
3.5. Estudo da morfologia de placas de lise ......................................................27
3.6. Microscopia de fluorescência .....................................................................28
3.7. Citometria de fluxo – FACS .......................................................................28
3.8. Estabilidade Genética dos vírus recombinantes expressando EGFP ..........29
3.8.1 Obtenção dos vírus de passagens seriadas .........................................29
3.8.1.1. Amostras virais não clonadas ...............................................29
3.8.1.2. Amostras virais clonadas ......................................................29
3.8.2. Extração de RNA viral ......................................................................29
3.8.3. RT-PCR .............................................................................................31
3.8.4. Citometria de Fluxo ...........................................................................31
4. Resultados ...................................................................................................................32
4.1. Construção dos vírus FA recombinantes expressando EGFP ....................32
4.2. Recuperação dos Vírus FA Recombinantes expressando EGFP ................44
4.3. Produção de Estoques Virais ......................................................................46
4.4. Curva de Crescimento Viral .......................................................................47
4.5. Estudo da morfologia de placas de lise ......................................................48
4.6. Caracterização da cinética de expressão de EGFP em células Vero
infectadas com os vírus recombinantes 17D/5.1 e FA17D/Esa trun/4 glic através de
microscopia de fluorescência ......................................................................................48
4.7. Caracterização da cinética de expressão de EGFP por células Vero
infectadas com os vírus recombinantes FA17D/Esa/5.1 glic e FA17D/Esa trun/4 glic
através de citometria de fluxo .....................................................................................51
4.7.1. Vírus FA17D/Esa/5.1 glic .................................................................51
4.7.2. FA17D/Esa trun/4 glic ......................................................................63
4.8. Estudo da Estabilidade Genética ................................................................63
4.8.1.Vírus FA17D/Esa/5.1glic ...................................................................63
4.8.1.1. Análise por RT-PCR .............................................................63
4.8.1.2. Análise por citometria de fluxo ............................................64
4.8.2. Clones Virais FA 17D/Esa/5.1 glic ...................................................65
4.8.2.1. Análise por RT-PCR .............................................................66
4.8.2.2. Análise por FACS .................................................................66
4.8.3. Vírus FA 17D/Esa trun/4 glic ...........................................................72
4.8.3.1. Análise por RT-PCR .............................................................72
xxii
4.8.3.2. Análise por citometria de fluxo ............................................72
5. Discussão ....................................................................................................................75
6. Conclusões ..................................................................................................................84
7. Referências Bibliográficas ..........................................................................................85
8. Anexos ......................................................................................................................100
8.1. Meios, reagentes e soluções .....................................................................100
8.2. Artigo ........................................................................................................104
1
1. Introdução
1.1. Histórico da Febre Amarela
A Febre Amarela (FA) é uma doença infecciosa causada pelo vírus da Febre Amarela,
um arbovírus, membro protótipo do gênero Flavivirus. É conhecida como a febre hemorrágica
viral original, e já foi considerada uma das doenças mais temidas e letais até o
desenvolvimento de uma vacina efetiva, cuja utilização teve início em 1930. Hoje a Febre
Amarela afeta mais de 200.000 indivíduos anualmente nas regiões tropicais da África e
América do Sul (Monath, 2001).
A origem da Febre Amarela permanece desconhecida, porém a análise genômica sugere
que o vírus originou-se de outros vírus transmitidos por mosquitos há cerca de 3.000 anos
atrás, provavelmente na África, de onde foi importado para o Novo Mundo durante o tráfico
de escravos (Zanotto et al., 1996). O primeiro registro formal da Febre Amarela, descrita em
um manuscrito, ocorreu em 1648 na Península de Yucatan, México (Fields et al.,1995). A
Febre Amarela chegou ao Brasil no final do século XVII, provavelmente trazida das Antilhas.
Até meados do século XIX, várias teorias eram utilizadas para explicar o surgimento da
doença e embasar as formas de combatê-la. Na primeira metade da década de 1870, ainda
havia fortes divergências sobre os meios de propagação da enfermidade. No final do século
XIX o desenvolvimento dos conhecimentos sobre os microorganismos alteraria
profundamente este quadro. Em 1880, o professor da Faculdade de Medicina do Rio de
Janeiro, Domingos Freire, propôs que a doença era causada por microorganismos. O
conhecimento sobre a forma de transmissão da Febre Amarela deve-se ao médico cubano
Carlos Finlay, que propôs, em 1881, que o mosquito era o transmissor da doença (Teixeira,
2001). Esta hipótese foi confirmada em 1900, quando Walter Reed demonstrou um agente
filtrável no sangue das vítimas da Febre Amarela, mostrando que a transmissão ocorria
através do mosquito Aedes aegypti (Soper et al., 1933), o que permitiu a colocação em prática
de medidas de profilaxia específicas. Maiores progressos foram alcançados em 1927, quando
os médicos da Fundação Rockefeller H. Bauer e A. F. Mahaffy isolaram o vírus da Febre
Amarela por inoculação de macacos Rhesus com o sangue de um paciente no Ghana. No ano
seguinte, o problema do desenvolvimento de uma vacina humana foi solucionado, quando
Max Theiler e Hugh H. Smith, da Fundação Rockefeller, reportaram a atenuação da linhagem
Asibi através de passagens em tecido embrionário de galinha. Este trabalho demonstrou a
segurança do uso deste vírus modificado (17D), com neurotropismo e vicerotropismo
reduzidos, para a imunização humana (Theiler e Smith, 1937a). Este processo originou as
2
vacinas utilizadas nos dias de hoje, as quais foram originadas da cepa 17D do vírus da Febre
Amarela (Theiler e Smith, 1937b; Pugachev et al., 2005).
1.2. Incidência, Epidemiologia e Ciclo de Transmissão
A Febre Amarela pode ocorrer através de dois ciclos de transmissão distintos: o urbano
e o selvagem. Tanto na África quanto nas Américas, a Febre Amarela é mantida na natureza
através do “ciclo selvagem”, por primatas não-humanos e por mosquitos hematófagos
selvagens, de hábitos diurnos, que habitam regiões de florestas tropicais. Na África, os
hospedeiros vertebrados são os primatas não-humanos dos gêneros Cercopitecus e Colubus, e
os mosquitos pertencem ao gênero Aedes. Nas Américas, os primatas não-humanos pertencem
aos gêneros Alouata, Ateles e Cerbus e os mosquitos pertencem ao gênero Haemagogus
(Monath, 2001). Seres humanos são esporadicamente expostos a mosquitos infectados durante
suas atividades ocupacionais, adquirindo a “Febre Amarela Selvagem”. O mosquito
doméstico Aedes aegypti, que co-habita com os seres humanos, pode transmitir o vírus da
Febre Amarela entre seres humanos, dando origem à “Febre Amarela Urbana” (Monath,
2001) (Figura 1.1).
O vírus pode ser mantido durante as estações secas através de transmissão vertical
(transovariana) entre mosquitos. Ovos de mosquitos, contendo vírus, sobrevivem dentro de
cascas de árvores secas e podem dar origem a progênies de mosquitos infectados quando se
inicia a estação de chuvas.
3
Figura 1.1: Ciclos de Transmissão da Febre Amarela: O vírus é mantido através da transmissão entre
primatas não-humanos e mosquitos selvagens. Os humanos adquirem “Febre Amarela Selvagem” quando
expostos a picadas de mosquitos que previamente se alimentaram de macacos infectados. Os vetores e a ecologia
diferem na África e América do Sul. Em ambos continentes, mosquitos Aedes aegypti , que co-habitam com
seres humanos, são responsáveis pela transmissão inter-humana do vírus da “Febre Amarela Urbana” (Adaptada
de Monath, 2001).
A Febre Amarela ocorre nas regiões tropicais da África e da América do Sul (Figura
1.2-A). Anualmente, cerca de 200.000 casos da doença são registrados no mundo, provocando
cerca de 30.000 óbitos. Mais de 5.000 casos na África e 300 na América do Sul são
reportados anualmente, porém acredita-se que a incidência seja de 10 a 50 vezes mais alta que
o constante nos relatórios oficiais, devido ao isolamento das áreas de maior incidência, o que
dificulta a notificação (Monath, 2001). Entre os anos de 1950 e 2004, cerca de 38.000 casos
foram reportados na África e América do Sul (Figura 1.2-B). Na América do Sul, a Febre
Amarela ocorre principalmente na região Amazônica e regiões adjacentes e, entre os anos de
2000 e 2004, 629 casos foram reportados. Peru e Colômbia possuem a maior incidência,
refletindo a baixa cobertura vacinal (WHO, 2005).
4
Figura 1.2: Regiões Endêmicas para Febre Amarela: Em A: Regiões da África e América do Sul
endêmicas para a Febre Amarela. A cor branca indica 0 (zero) casos reportados (Fonte: Centers for Disease
Control and Prevention – CDC, 2007). Em B: Número de casos de Febre Amarela reportados na África e
América entre os anos de 1950 e 2004, baseados na sorologia, estudos de campo e reportagens prévias da doença
(Adaptado de World Health Organization – WHO, 2005).
Regiões do mundo fora da zona endêmica para Febre Amarela infestadas por mosquitos
Aedes aegypti e, portanto, receptivas à introdução e espalhamento da doença incluem as zonas
costeiras da América do Sul, América Central, Caribe, Sul dos EUA, Sul da África, Índia,
Sudeste da Ásia, Austrália, Sul da China, Taiwan e Ilhas do Pacífico (Monath, 2001).
5
1.3. A Doença
1.3.1. Patologia e Patogênese
As manifestações clínicas da Febre Amarela podem variar de uma pequena infecção
abortiva até febre hemorrágica fatal (Kerr, 1951). O período de incubação após a picada pelo
mosquito vetor infectado é de 3 a 6 dias e a manifestação da doença é, geralmente, abrupta e
inclui febre, calafrios, mal-estar, dores de cabeça, mialgia generalizada, náusea e tontura.
Neste estágio, o vírus está presente no sangue com títulos de 10
5
-10
6
partículas
infecciosas/mL, e o paciente pode ser considerado fonte de infecção para os mosquitos
vetores. O “período de infecção” dura alguns dias e pode ser seguido de um “período de
remissão”, com desaparecimento da febre e dos sintomas, devido à retirada dos vírus por
anticorpos ou por resposta imune celular (Monath, 2001).
Pacientes com infecção abortiva podem se recuperar neste estágio, porém em 15-25%
dos casos, a doença reaparece em uma forma mais severa grave, no chamado “período de
intoxicação”, com sintomas que incluem febre alta, vômitos, dor epigástrica, icterícia, falência
renal, hemorragia, hipotensão e coma (Monath, 2001). Nas infecções severas graves letais, as
respostas inflamatórias podem aumentar as lesões e acelerar a morte. As células “Natural
Killers” (NKs) são responsáveis pela lise de neurônios infectados e os Linfócitos T,
responsáveis pela lise de astrócitos infectados. A presença de anticorpos específicos está
relacionada com a morte prematura de camundongos infectados com o vírus FA através da
citólise mediada pelo complemento. Os óbitos ocorrem, geralmente, entre o sétimo e o
décimo dia após o início dos sintomas clínicos e representam 20% a 50% dos casos severos
graves (Burke & Monath, 2001).
1.3.2. Diagnóstico
Os diagnósticos laboratoriais específicos consistem da detecção do vírus ou do antígeno
viral na corrente sanguínea durante a fase pré-ictérica, por sorologia. Não há testes comerciais
disponíveis e o diagnóstico é realizado somente por laboratórios especializados (Monath,
2001).
As células da linhagem AP-61 (Aedes pseudoscutellaris) são as mais sensíveis à
infecção, porém células de mamíferos (Vero, SW13, BHK-21) podem ser utilizadas,
particularmente combinadas com a detecção por PCR ou de antígeno viral por
imunoprecipitação (Monath, 2001). O PCR tem sido utilizado para a detecção do genoma
6
viral em amostras negativas para o isolamento viral (Deubel et al., 1997). Um diagnóstico
rápido e precoce pode ser possível pela detecção de antígenos do vírus da Febre Amarela por
ELISA através de anticorpo monoclonal. Outros testes sorológicos podem ser utilizados,
incluindo “inibição de hematoaglutinação” e neutralização. Reações cruzadas entre o vírus da
Febre Amarela e outros Flavivirus podem complicar os diagnósticos sorológicos,
particularmente em indivíduos que habitam regiões onde existem diversos tipos de Flavivírus
(Monath, 2001).
1.4. Vacinação
1.4.1. A Vacina
Duas vacinas vivas atenuadas foram desenvolvidas na década de 1930: a “Vacina
Neurotrópica Francesa” (FNV), proveniente do vírus selvagem humano submetido a
passagens em cérebro de camundongo, e a vacina 17D, proveniente do vírus selvagem
humano submetido a passagens em ovos embrionados de galinha. A FNV foi uma vacina bem
sucedida, sendo administradas mais de 38 milhões de doses entre 1939 e 1952. Entretanto, a
FNV foi associada a uma alta incidência de reações encefálicas em crianças, sendo, por este
motivo, não mais recomendada a crianças com menos de 10 anos de idade. A FNV parou de
ser produzida em 1980, sendo a 17D o único tipo de vacina contra a Febre Amarela produzida
atualmente (Freestone, 1994).
1.4.2. A Cepa Vacinal 17D
O vírus vivo atenuado vacinal da Febre Amarela (FA) cepa 17D constitui-se numa das
melhores e mais seguras vacinas disponíveis nos nossos dias e tem sido utilizada há mais de
60 anos. Seu uso foi estimado em 400 milhões de doses com baixo custo e alta eficácia.
A cepa vacinal 17D começou a ser desenvolvida em 1928, a partir do vírus selvagem
isolado de um paciente africano cujo nome era Asibi, dando origem ao nome da linhagem. Em
1935, a linhagem FA Asibi foi submetida a 18 passagens em macacos Rhesus e propagada em
tecido embrionário de camundongo, sendo posteriormente cultivada até a passagem de
número 58 em tecido embrionário de galinha (Stokes et al., 1928). Posteriormente, a
linhagem Asibi foi submetida a mais 114 passagens em tecido embrionário de galinha
desnervado (Lloyd et al., 1936). Neste estágio, Theiler e Smith (Theiler & Smith, 1937a)
demonstraram uma acentuada redução do viscero e neurotropismo virais quando inoculado
7
via intracerebral em macacos. Este vírus foi subseqüentemente subcultivado até as passagens
227 e 229 na ausência de soro humano e foi, então, utilizado para imunizar 8 voluntários
humanos (Theiler & Smith, 1937b). Os resultados satisfatórios, soroconversão para FA em
duas semanas e ausência de reações adversas, resultaram na imunização em larga escala
realizada no Brasil, em 1937 (Soper 1937, Smith et al. 1938).
Em janeiro de 1937, Hugh Smith trouxe a cepa 17D para o Brasil, e as primeiras vacinas
foram testadas em 7 indivíduos que trabalhavam em laboratórios. No mesmo ano, os
primeiros lotes contendo soro humano normal foram produzidos (Smith et al., 1938). Uma
importante inovação no processo de produção da vacina foi o desenvolvimento do conceito de
“lote-semente”, o qual visa à manutenção do vírus na mesma passagem evitando, assim,
alterações indesejadas quanto às propriedades biológicas do vírus vacinal. A partir do lote-
semente realizam-se todos os controles de qualidade, como título viral, esterilidade,
imunogenicidade e atenuação (viremia em macacos Rhesus inoculados por via intracerebral
com o vírus 17D para teste de neurotropismo e vicerotropismo) (Post et al., 2001).
Atualmente, Bio-Manguinhos-FIOCRUZ é o responsável pela produção da vacina de
Febre Amarela no Brasil, e é também seu maior produtor mundial, além de possuir uma vasta
experiência no manuseio e produção do vírus 17D em escala industrial (Post et al., 1991).
Além disto, o referido instituto é o único produtor da subcepa 17DD, utilizada no Brasil para
vacinação (Post et al., 2001).
1.4.3. Reações adversas após a vacinação com o vírus 17D
Apesar de o vírus 17D ser considerado uma das melhores e mais seguras vacinas
disponíveis nos nossos dias, possuindo uma metodologia de produção bem estabelecida e um
controle de qualidade rigoroso, alguns casos de reações adversas foram relatados desde o
início de sua utilização, há mais de 60 anos. Apesar da baixa incidência destas reações, elas
são importantes para novas investigações sobre as conseqüências da vacinação (Monath,
2004).
Após a vacinação com o vírus da FA 17D, uma média de 2% a 5% apresenta dores de
cabeça, mialgia e outros sintomas de intensidade moderada. Reações alérgicas incluindo
dermatites, urticária e asma, ocorrem a taxas muito baixas (menos de um em um milhão),
predominantemente em indivíduos com histórico de alergia a ovo (Freestone et al., 1977).
Reações neurológicas são extremamente raras e apenas um caso fatal de encefalite foi
relatado em uma criança de 3 anos de idade (Anon, 1966). Apenas 17 outros casos de
encefalite associada à vacina 17D (8 a 19 dias após a imunização) foram reportados em
8
crianças desde 1945, após a administração de mais de 200 milhões de doses. Quatro destes
casos ocorreram em crianças de 4 meses de idade ou mais jovens, sendo a vacina não
recomendada para crianças de menos de 6 meses de idade (Meegan, 1991).
Apesar destes eventos de reações adversas relatados, o vírus vacinal 17D está entre as
mais seguras e efetivas vacinas virais existentes (Monath, 1999). Desde 1965, cerca de 300
milhões de doses foram administradas em indivíduos residentes em áreas endêmicas para FA.
1.5. O Vírus da Febre Amarela
1.5.1. Classificação e Estrutura
O Vírus da Febre Amarela (FA) é o membro protótipo do gênero Flavivírus, o qual
inclui atualmente cerca de 70 vírus, capazes de causar doenças severas graves como a dengue,
febre hemorrágica e encefalite japonesa (Lindenbach et al., 2006)
O Vírus FA é esférico, com 40-60 nm de diâmetro e possui capsídeo icosaédrico. Seu
genoma é composto de uma única molécula de RNA simples-fita positiva de 10.862
nucleotídeos, com uma estrutura CAP 5' e regiões 5' e 3' não traduzidas (Rice et al., 1985). O
vírus é formado pelo envelope, o qual consiste de uma bicamada lipídica derivada da
membrana celular das células infectadas (Monath, 2001), associado às proteínas estruturais de
nucleocapsídeo (C), pré-membrana/membrana (prM/M) e de envelope (E) (Figura 1.3).
Figura 1.3 – Esquema do vírus da Febre Amarela: prM: proteína precursora de membrana; M: proteína
de membrana; E: proteína de envelope; C: proteína de capsídeo (Adaptado de Heinz & Allison, 2001, Fonte:
Laboratório de Flavivírus, IOC).
9
1.5.2. Estrutura Genômica e Expressão de Proteínas
A primeira seqüência genômica de Flavivírus foi determinada por Rice e colaboradores
(Rice et al., 1985) e sua análise revelou a presença no genoma de RNA de uma fase aberta de
leitura (ORF) de 10.233 bases, a qual codifica uma poliproteína de 3.411 resíduos de
aminoácidos. A poliproteína codifica 10 polipeptídios específicos do vírus e as proteínas
maduras são geradas pela clivagem da poliproteína precursora por proteases virais e celulares
(Rice et al., 1985). A partir da extremidade 5' do genoma viral, as três primeiras proteínas
codificadas são C, prM/M e E, que são as proteínas estruturais virais, ou seja, formam a
partícula viral juntamente com o RNA encapsidado. O restante do genoma codifica para as 7
proteínas não-estruturais, denominadas NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 (Rice
et al., 1985) (Figura 1.4).
Figura 1.4 - Organização do genoma do vírus da Febre Amarela: Em (A): Genes estruturais (em
vermelho), os quais codificam as proteínas C (Capsídeo), E (Envelope) e prM (pré-Membrana), seguidos dos
Genes não-estruturais (em azul) , os quais codificam as proteínas NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5.
Em (B): Organização das proteínas virais estruturais e não-estruturais na membrana do RE, após a tradução e o
processamento da poliproteína viral pelas enzimas signalase e protease viral NS2B/NS3 (Fonte: Lab. Biologia
Molecular de Flavivírus, IOC).
A proteína C de capsídeo interage com o RNA viral, formando o nucleocapsídeo
(Chambers et al., 1990). A proteína prM é o precursor glicosilado da proteína M (proteína de
membrana), a qual está presente nas partículas virais maduras e tem um importante papel na
10
geração de anticorpos e na resposta imune protetora. A prM está presente nas partículas virais
imaturas que, pouco antes de serem liberadas pela célula hospedeira, são convertidas para sua
forma madura pela clivagem da proteína prM por uma furina-protease celular (Stadler et al.,
1997). Sua função é estabilizar a proteína E, de envelope, evitando a prematura exposição de
seu peptídeo de fusão devido ao reduzido pH encontrado na via secretora (Heinz et al., 2003).
Além disto, a prM é também responsável pelo correto dobramento da proteína E tendo,
portanto, função de chaperona (Konishi & Manson, 1993; Allison et al., 1995; Lorenz et al.,
2002).
A proteína E é o principal componente protéico da superfície viral, sendo também o
principal alvo da resposta imune produzida pelo sistema imunológico do hospedeiro (Monath,
2004; Lindenbach et al., 2006). O estudo da estrutura tridimensional da proteína E de
partículas virais maduras do vírus da encefalite transmitida por carrapato (TBE) revelou que
esta proteína é expressa na forma de dímeros, com três domínios definidos, ancorada pelo seu
carboxi-terminal, paralelamente ao envelope viral (Rey et al., 1995; Allison et al., 1999). A
proteína E é mediadora da entrada do vírus na célula hospedeira através da ligação do vírus a
receptores celulares e pela fusão com endossomas, através de um processo dependente de pH,
após a endocitose da partícula viral (Lorenz et al., 2002). O pH acídico do endossoma induz
uma mudança conformacional nos dímeros da proteína E, levando à formação de trímeros e à
exposição de seu peptídeo de fusão, resultando na liberação do nucleocapsídeo viral no
citoplasma da célula hospedeira (Allison et al., 1995; Schalich et al., 1996).
As proteínas não-estruturais estão envolvidas com a replicação viral. Entre os diferentes
Flavivírus, três das proteínas não-estruturais possuem seqüências muito conservadas: NS1,
NS3 e NS5. A proteína NS1 é expressa na superfície de células infectadas na forma de
homodímeros, os quais se associam a membranas de organelas celulares que os transportam
para a superfície celular (Winkler et al., 1988; Winkler et al., 1989). Esta glicoproteína é
essencial para a replicação do RNA viral (Mackenzie et al., 1996; Muylaert et al., 1997). A
proteína NS1 é também secretada sendo, nesta forma, um antígeno solúvel fixador de
complemento, resultando na lise da célula infectada (Brandt et al., 1970).
As proteínas NS2A e NS2B foram relacionadas com processos de propagação viral. A
proteína NS2A está envolvida na montagem da partícula viral, além de ser necessária ao
correto processamento da proteína NS1 (Falgout et al., 1989; Lindenbach et al., 2006). A
proteína NS2B forma um complexo estável com a proteína NS3, atuando como um co-fator
para o complexo serino-protease viral (Falgout et al., 1991). A proteína NS3 possui três
diferentes funções enzimáticas: 1. Protease, participando do processamento da poliproteína
viral. 2. Helicase, através da participação no processo de replicação do RNA viral. 3.
11
Nucleotídeo-trifosfatase e RTPase. Além disto, sua porção N-terminal é o domínio catalítico
do complexo serino-protease NS2B-NS3 (Bazan et al., 1989; Gorbalenya et al., 1989;
Chambers et al., 1990c; Wengler & Wengler, 1993).
As proteínas NS4A e NS4B estão também relacionadas com processos de propagação
viral, através de uma importante interação que ocorre entre as proteínas não-estruturais NS1 e
NS4A (Lindenbach et al., 1999). Esta função da NS4A é corroborada pela co-localização
desta proteína com complexos de replicação (Mackenzie et al., 1998). Além disto, as
proteínas NS4A e NS4B podem bloquear a sinalização pelo interferon, durante a resposta
imune montada pelo hospedeiro (Munoz-Jordan et al., 2003).
A proteína não estrutural NS5 é a polimerase viral (Tan et al., 1996. Ackermann et al.,
2001; Guyatt et al., 2001). Esta proteína forma um complexo com a proteína NS3 e pode
estimular suas atividades de nucleotídeo-trifosfatase, helicase e RTPase (Cui et al., 1998; Yon
et al., 2005).
A seqüência 5’ não-traduzida do RNA codificante da poliproteína precursora não é bem
conservada entre os Flavivírus, apesar de estruturas secundárias comuns terem sido
observadas dentro desta região (Thurner et al., 2004). A organização da região 3’ não
traduzida varia muito entre os vírus oriundos de carrapato e de mosquitos. Neste caso, padrões
estruturais similares e seqüências conservadas foram encontrados entre os Flavivírus
(Markoff, 2003).
1.5.3. Ciclo de Replicação
A entrada do vírus na célula hospedeira é mediada por moléculas receptoras chamadas
clatrinas, encontradas na superfície da membrana celular. Após a ligação, os vírus são
internalizados por endocitose e transportados para um compartimento pré-lisossomal
endocítico, o endossomo, onde um processo de fusão de membranas, mediada por redução do
pH dentro desta organela, libera o nucleocapsídeo dentro do citoplasma. Esta fusão de
membranas é resultante de mudanças conformacionais na proteína E devido à acidificação no
interior da vesícula, o que resulta na trimerização e fusão desta proteína com a membrana do
endossoma (Allison et al., 1995a; Stiasny et al., 1996; Stiasny et al., 2001). No citoplasma da
célula hospedeira, o RNA genômico positivo do vírus se associa à maquinaria celular para
formar novas partículas virais, as quais são montadas no retículo endoplasmático. A progênie
viral deixa a célula hospedeira ligando-se a membranas intracelulares dentro de vesículas
citoplasmáticas, seguem a via secretora e se fundem à membrana plasmática, saindo da célula
hospedeira como vírus maduros (Mackenzie & Westaway, 2001; Lindenbach et al., 2006).
12
1.5.4. Desenvolvimento do vírus vacinal FA 17D como vetor de expressão
O vírus vivo atenuado vacinal da Febre Amarela (FA) cepa 17D constitui-se numa das
melhores e mais seguras vacinas disponíveis nos nossos dias, além de ser de dose única e
possuir baixo custo de produção. Seu uso foi estimado em 400 milhões de doses. Estas
características fazem do vírus vacinal da Febre Amarela 17D um promissor vetor de
expressão de proteínas heterólogas.
Nosso laboratório participou do desenvolvimento da tecnologia de manipulação
genética do vírus 17D (Rice et al., 1989) e descreveu, pela primeira vez, em um Flavivírus,
que é possível a obtenção de lotes sementes vacinais, em condições de boas práticas de
produção, a partir de cDNA (Marchevsky et al., 1995; Galler & Freire, 2001).
O desenvolvimento da técnica dos clones infecciosos (Rice et al., 1989) facilitou a
análise genética molecular da replicação e atenuação dos Flavivírus e permitiu que o vírus
17D da FA pudesse ser utilizado como carreador de epítopos imunologicamente importantes,
de outros agentes infecciosos. Isto se baseia na construção de clones do cDNA do vírus 17D
da FA contendo cópias funcionais dos produtos dos genes virais, à partir dos quais os
transcritos podem ser gerados por transcrição in vitro. Estes transcritos são infecciosos
quando utilizados na transfecção de células hospedeiras apropriadas, e o vírus produzido é
idêntico ao da linhagem parental usada para a clonagem do cDNA. Neste cDNA,
correspondente ao genoma viral completo, podem-se introduzir modificações genéticas em
qualquer região do genoma viral. Nosso grupo forneceu a primeira demonstração, em
Flavivírus, de que é possível a obtenção de um lote-semente vacinal inteiro a partir de alguns
microgramas do cDNA viral molde pelo uso da metodologia corrente de produção da vacina
de FA (Galler et al., 1995) ou pela transfecção de células certificadas de fibroblasto de
embrião de galinha (CEF) para a produção vacinal (Freire et al., 2005).
1.5.5. Estratégia de construção dos vírus FA 17D recombinantes
Diferentes estratégias para a construção de vírus recombinantes são possíveis, e variam
de acordo com a região genômica selecionada para a inserção e com o antígeno a ser
expresso. A alternativa escolhida para a expressão de antígenos heterólogos não deve
comprometer a estrutura e função do vírus; o vírus gerado não pode ser patogênico ou reverter
para uma forma patogênica; a seqüência codante para o antígeno heterólogo deve ser
geneticamente estável uma vez integrada no genoma viral; o vírus FA recombinante, além de
13
ser atenuado deve reter suas propriedades imunogênicas e apresentar o antígeno heterólogo de
modo a induzir uma resposta imunológica apropriada.
A introdução da tecnologia do cDNA infeccioso (Rice et al., 1989) permitiu a
manipulação genética dos genomas de RNA, como o do vírus FA, por meio de várias
abordagens novas. A primeira abordagem para a construção de vírus recombinantes é a
criação de vírus quiméricos, pela troca dos genes prM/E da Febre Amarela pelos genes
homólogos de outro Flavivírus . Esta abordagem gera vírus quiméricos que contêm em seu
envelope viral as proteínas do envelope prM/M/E de outro Flavivírus e tem a vantagem de
que a imunidade prévia contra o vetor não seria limitante, uma vez que a proteína de envelope
E contém todos os epítopos de neutralização viral. Esta abordagem foi descrita pela primeira
vez por Bray e Lai (1991, US Patents 6.184.024 e 6.676.936), os quais descreveram novos
vírus contendo os genes prM/E de dengue 1 ou 2 e o restante do genoma de vírus DEN4.
Vírus quiméricos do genoma 17D foram criados pela troca dos genes prM/E do vírus da
encefalite japonesa (JE) (Chambers et al., 1999), dos quatro sorotipos do vírus dengue
(Guirakhoo et al., 2001; Caufour et al., 2001; Guirakhoo et a.l, 2002; Guirakhoo et al., 2004;
US Patent 6.696.281). Estes vírus candidatos a novas vacinas encontram-se em fase de testes
clínicos, nos quais se apresentam altamente imunogênicas e bem toleradas (Pugachev et al.,
2005).
Nosso grupo de pesquisa construiu quatro vírus quiméricos contendo os genes prM-E de
duas diferentes linhagens de DEN2, e uma destas construções mostrou-se imunogênica em
camundongos e em macacos Rhesus (Caufour et al., 2001).
A segunda abordagem diz respeito à inserção de genes na região 3’ não-traduzida
(UTR) do vírus 17D. Esta abordagem foi desenvolvida com base na variabilidade e
comprimento desta região nos Flavivírus (Filippis et al., 2002; Mutebi et al., 2004). Esta
metodologia foi primeiramente descrita por Andino e colaboradores (Andino et al., 2002), e
envolve a criação de sítios de restrição para a inserção de cassetes de expressão. Estes são
constituídos de seqüências derivadas de enterovírus (Mengo ou Poliovírus) ou de Pestivírus, e
permitem à subunidade ribossomal se ligar de maneira que a tradução do gene heterólogo
ocorra na extremidade 3’ não-traduzida. Desta forma, o RNA viral atua como um mensageiro
bi-cistrônico, permitindo o início da tradução em dois locais distintos do RNA viral. Estas
seqüências são conhecidas como Internal Ribossome Entry Sites (IRES). As inserções de
IRES de Mengo e Enterovírus (569 nucleotídeos) e Poliovírus (663 nucleotídeos) foram feitas
adjacentes à seqüência codante do gene p24 do vírus da imunodeficiência humana tipo 1
(HIV-1). A transfecção de células Vero com o RNA viral transcrito in vitro permitiu a
regeneração viral, porém a análise do genoma destes vírus por meio de seqüenciamento
14
genômico nucleotídico mostrou a deleção de nucleotídeos. A instabilidade genética das
inserções na região 3’não-traduzida do genoma de Flavivírus foi também demonstrada por
Pierson e colaboradores (Pierson et al., 2005).
A terceira abordagem explorada no uso do vírus FA 17D para expressão de antígenos
heterólogos refere-se ao desenvolvimento de replicons. Estas moléculas correspondem a
partes do genoma viral do qual foram removidos os genes estruturais necessários para a
produção de partículas virais, embora mantenham todos os elementos necessários para a
replicação do RNA em si. A amplificação do RNA no citoplasma de células transfectadas
permite a expressão transitória de genes heterólogos, expressão esta que sugere a
possibilidade de uso para vacinação (Khromykh, 2000; Westaway et al., 2003; Harvey et al.,
2004; Tannis et al., 2005). Jones e colaboradores (2005) descreveram recentemente uma série
de replicons baseados no genoma do vírus 17D. Estes replicons consistem do genoma do
vírus 17D desprovido da região estrutural, a qual codifica os genes das proteínas C-prM-E
(nucleotídeos 179 a 2.382). Somente os primeiros 21 aminoácidos de C e os últimos 24
resíduos de E foram mantidos. Três genes heterólogos foram inseridos e expressos nestes
replicons de maneira dependente de replicação do RNA, substituindo as seqüências dos genes
estruturais. No entanto, nenhuma evidência da estabilidade genética dos genes heterólogos,
assim como estudos sobre a imunogenicidade dos produtos dos mesmos, foram observados.
Os níveis de expressão das proteínas heterólogas também não foram especificados, de modo
que a utilização deste sistema para o desenvolvimento de novas vacinas não foi estabelecida.
As aplicações principais deste sistema de expressão, baseado no genoma do vírus 17D, se
limitam a estudos sobre mecanismos de replicação do RNA viral, empacotamento do RNA e
formação de partículas virais.
A quarta abordagem possível é a inserção direta de epítopos celulares ou humorais,
previamente caracterizados, diretamente na poliproteína viral. Foram construídos clones
infecciosos do vírus FA, contendo sítios de restrição no gene E, que codifica a proteína viral
de envelope, os quais permitiram a inserção de epítopos heterólogos em fase. Isto foi possível
graças ao estudo da estrutura tridimensional da proteína E do vírus FA, o qual permitiu a
análise das áreas susceptíveis a inserções (Zhang et al., 2003). Um destes sítios identificados
foi a alça fg, no qual já foram inseridos com sucesso diversos epítopos, incluindo epítopos de
Plasmodium sp, DEN vírus e Arena vírus (Bonaldo et al., 2002; Bonaldo et al., 2005).
O procedimento que foi utilizado na presente dissertação refere-se à quinta abordagem
utilizada na construção de vírus 17D recombinantes. Esta abordagem consiste da duplicação
dos sítios de reconhecimento da protease viral, levando à criação de cassetes de expressão
(McAllister et al., 2000). Dois grupos de pesquisa aplicaram esta estratégia na expressão de
15
antígenos heterólogos: um epítopo de ovalbumina foi expresso entre as proteínas virais não-
estruturais. Este epítopo foi corretamente apresentado no contexto das moléculas de MHC
classe I. Camundongos imunizados com o vírus recombinante produziram uma resposta
CD8+ mensurável ao epítopo heterólogo e foram protegidos contra o desafio de doses letais
de células provenientes de um melanoma maligno expressando ovoalbumina (McAllister et
al., 2000). Outro grupo aplicou esta mesma estratégia na clonagem e expressão de um epítopo
malárico indutor de células T entre NS2B e NS3 (McAllister et al., 2000; Barba-Spaeth et al.,
2005; Tao et al., 2005). Assim sendo, pode-se conceber que epítopos múltiplos podem ser
inseridos em diferentes regiões do genoma de FA.
Utilizando esta mesma abordagem, tornou-se interessante testar este sistema para a
expressão de fragmentos maiores e, até mesmo, de proteínas heterólogas completas.
Tentativas no sentido de se expressar estavelmente proteínas exógenas no genoma de
Flavivírus foram realizadas por alguns grupos. Apesar da obtenção do vírus recombinante ter
sido bem sucedida em alguns casos, os genes que codificam estas proteínas foram deletados
do genoma viral durante as primeiras horas de infecção ou durante as primeiras passagens em
sistema celular. Um vírus do Oeste do Nilo infeccioso, contendo o gene da GFP em seu
genoma, foi obtido (Pierson et al., 2005), porém o gene heterólogo foi deletado do genoma
viral após 96 h de infecção. Outro grupo (Julander et al., 2006) realizou uma nova construção
do vírus West Nile infeccioso contendo o gene da GFP em seu genoma, o qual teve a inserção
heteróloga deletada de seu genoma durante a terceira passagem em sistema celular. Um
estudo recente demonstrou a expressão de um precursor de uma glicoproteína de Lassa vírus
(LASV-GPC), na região intergênica E/NS1 do vírus vacinal FA 17D (YFV17D), resultando
na construção do vírus recombinante YFV17D/LASV-GPC (Bredenbeek et al., 2006). O vírus
recombinante foi capaz de se replicar em cultura celular e processou corretamente a LASV-
GPC, o que foi demonstrado por meio de ensaios de imunofluorescência e Western-blot.
Embora O vírus recombinante tenha apresentado replicação em baixas taxas em cobaias,
houve produção de anticorpos específicos contra LASV e contra o vírus FA 17D. Além disto,
uma única dose subcutânea do vírus recombinante, em cobaias, promoveu 80% de proteção
contra uma dose letal de Lassa vírus. O estudo menciona que o vírus recombinante
YFV17D/LASV-GPC se mantém estável até a quinta passagem em sistema celular, porém
estes resultados não são apresentados formalmente no artigo, bem como estudos mais
aprofundados sobre a caracterização do vírus.
16
1.5.6. Estratégia de construção dos vírus FA 17D recombinantes expressando
EGFP
O procedimento utilizado nesta dissertação também utiliza a região intergênica E/NS1,
que codifica proteínas clivadas pela protease viral, como sítio de inserção para o cassete de
expressão heterólogo. Entretanto, a estratégia utilizada para a construção dos vírus
apresentados nesta dissertação difere da utilizada para a construção do vírus YFV17D/LASV-
GPC pois, neste caso, somente a região codificante para os 23 aminoácidos hidrofóbicos C-
terminais do gene E foram duplicados a 3’ do gene da LASV-GPC para servir de seqüência
sinal e garantir a inserção da proteína NS1 do vírus FA no retículo endoplasmático
(Bredenbeek et al., 2006).
Nesta dissertação, o cassete de expressão foi construído utilizando-se como base a
região haste-âncora (HA) da proteína E do vírus FA, respeitando sua estrutura e a função de
cada elemento nela contido. A região HA se localiza no terminal carbóxi da proteína E de
Flavivírus e é composta por duas regiões alfa-hélices que formam a haste (H1 e H2),
separadas por uma seqüência de conexão (CS), extremamente conservada entre os Flavivírus
(Figura 4.1) e por dois elementos transmembrana (TM1 e TM2) que formam a âncora (Allison
et al., 1999; Zhang et al., 2003).
O elemento mais próximo ao ectodomínio da proteína E , o elemento H1 (aminoácidos
401 a 413 em TBE), da haste, parece estar envolvido com a formação de homotrímeros de
proteína E quando submetida a tratamento de baixo pH. Proteínas que possuem esta região e o
restante da região da haste-âncora deletados são secretadas na forma de homodímeros, porém
são incapazes de formar trímeros. Proteínas E truncadas imediatamente após o elemento H1
são capazes de formar trímeros (Allison et al., 1999). A função do elemento CS (aminoácidos
414 a 430 em TBE) permanece desconhecida, apesar de este ser o elemento da haste mais
conservada entre os Flavivírus (Allison et al., 1999). Os elementos H2 (aminoácidos 431 a
449 em TBE) e TM1 (aminoácidos 450 a 472 em TBE) demonstraram ser importantes para a
estabilidade do dímero prM-E e, portanto, especula-se que podem interagir diretamente com a
proteína prM (Allison et al., 1999).
A região da âncora possui os elementos TM1 e TM2, separados por dois resíduos de
aminoácidos carregados. O elemento TM1 age como um sinal de parada de transferência da
proteína prM no retículo endoplasmático (Allison et al., 1999). O elemento TM2
(aminoácidos 473 a 496 em TBE) age como seqüência sinal de translocação da proteína E
para o lúmen do retículo endoplasmático (Markoff, 1989, Op De Beeck et al., 2004), e
também atua como seqüência sinal para a proteína NS1 durante a síntese protéica (Rice, 1996)
17
contribuindo, assim, para a manutenção da estrutura geral do vírus (Op De Beeck et al., 2003;
Lobigs and Lee, 2004). Cocquerel e colaboradores (Cocquerel et al., 2000) observaram que as
seqüências de aminoácidos que conectam os dois elementos da âncora variam muito entre os
Flavivírus, porém pelo menos um resíduo de aminoácido carregado positivamente (R ou K)
nesta região era conservado, indicando uma importante função. Recentemente, foi
estabelecido que proteínas quiméricas contendo o elemento TM das proteínas prM e E de
Flavivírus, foram localizadas principalmente no retículo endoplasmático, indicando que estes
elementos possuem sinais para a retenção nesta organela (Op de Beeck et al., 2004). Pelo fato
de a montagem das partículas virais ocorrer no retículo endoplasmático, os componentes
virais acumulam-se neste compartimento (Mackenzie & Westaway, 2001).
A região C-terminal da proteína E contém o motivo de aminoácidos VXA, presente
em outros sítios de processamento eucarióticos (Nielsen et al., 1997) e pode representar o
sítio de clivagem da signalase. Clivagens da poliproteína viral pela signalase do hospedeiro
nos sítios intergênicos C-prM, prM-E e E-NS1 originam as proteínas estruturais prM e E, as
quais se mantêm ancoradas na face do lúmen da membrana do retículo endoplasmático, e
formam o envelope viral dos Flavivírus (Higy et al., 2004). Além disto, foi adicionada à
construção a região 3’-terminal do gene NS1. Esta região codifica a seqüência de aminoácidos
DXGC, muito conservada entre os Flavivírus, correspondente ao sítio de clivagem da proteína
E, e responsável por sua importação/entrada no retículo endoplasmático.
Com base nestes estudos, foram construídos dois cassetes de expressão, os quais foram
inseridos na região intergênica E-NS1. Estes cassetes de expressão possuem a cópia do sítio
de clivagem da junção E-NS1 duplicado nas suas extremidades, visando à expressão do
cassete contendo a EGFP como uma proteína independente. Em ambos os cassetes de
expressão, o gene heterólogo codificante para EGFP foram fusionados a uma seqüência
correspondente aos 27 nucleotídeos codificantes para o N-terminal da proteína NS1 e, no seu
C-terminal, aos domínios haste e âncora idênticos aos da proteína E, completos ou parciais.
Esperamos, com esta construção, que a proteína heteróloga seja clivada e separada da
poliproteína viral durante seu processamento pela enzima signalase da célula hospedeira.
O gene repórter EGFP de Aequoria victoria foi selecionado por podermos monitorar a
viabilidade viral por fluorescência celular nos dias posteriores à transfecção do RNA viral.
18
Figura 1. Regiões da proteína E e NS1 usadas na montagem do cassete de expressão da proteína EGFP no
clone infeccioso FA 17D. A região correspondente aos domínios haste (H1e H2) e ancora (TM1 e TM2) da
proteína E esta duplicada e encontra-se fusionada ao carboxiterminal da proteína EGFP. O nove primeiro
resíduos de aminoácidos da proteína não estrutural NS1 foram incorporados também ao amino-terminal da
proteína EGFP. A intenção da fusão destas seqüências virais ao gene da EGFP é tentar minimizar os efeitos
deletereos da inserção nesta região de modo a permitir o correto processamento desta região da poliproteina viral
na membrana do reticulo endopasmatico rugoso celular.
2. Objetivos e Metas
Objetivo geral:
1. Estabelecimento de uma nova estratégia de expressão de proteínas heterólogas na
região intergênica E/NS1.
Objetivos específicos:
1. Construção de dois diferentes vírus FA recombinantes expressando EGFP.
2. Caracterizar os vírus recombinantes quanto às suas propriedades biológicas.
3. Caracterizar os vírus recombinantes quanto às suas propriedades de estabilidade
genética.
19
3. Material e Métodos
As composições dos meios e soluções utilizados na realização desta dissertação
encontram-se descritos na seção de “Anexos”.
Os experimentos de clonagem do genoma viral completo ou parcial em Escherichia coli
e obtenção dos moldes de cDNA dos vírus recombinantes foram realizados no Laboratório de
Biologia Molecular de Flavivírus do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular na
unidade IOC da FIOCRUZ. De acordo com a licença emitida pela Comissão Técnica
Nacional de Biossegurança (CTNBio - CQB 105/99), este laboratório é considerado nível 1
para Organismos Geneticamente Modificados (OGM).
Esta dissertação foi elaborada em colaboração com o Laboratório de Tecnologia
Virológica (LATEV) do Departamento de Desenvolvimento Tecnológico/Bio-
Manguinhos/FIOCRUZ, onde foram realizados experimentos utilizando cultura de células e
vírus. Este laboratório enquadra-se no nível 2 de Biossegurança com instalações em
concordância com o CQB 110/99 da CTNBio.
3.1. Construção dos vírus recombinantes
3.1.1. Obtenção do cassete de expressão para EGFP por PCR
Os dois cassetes de expressão do gene da EGFP foram obtidos por diferentes reações de
PCR (Ver Resultados: Figura 4.2) utilizando-se os oligonucleotídeos descritos na Tabela 3.1.
Para a primeira etapa de PCR foram usados dois conjuntos de oligonucleotídeos para cada
construção.
No caso da Construção I, o gene da EGFP foi ampliado pelo uso de um primeiro par de
oligonucleotídeos, RG 328 (+) e RG 329 (-), que possuem seqüências nucleotídicas
homólogas aos extremos 5’ e 3’ deste gene, respectivamente. Além disto, o oligonucleotídeo
RG 328 (+) possui, na sua porção 5’, uma seqüência nucleotídica, a qual não se pareia durante
a reação, que corresponde à parte da região codante para os 15 nucleotídeos 3´ terminais do
gene E, seguida dos 27 primeiros nucleotídeos do gene da proteína NS1 do vírus FA. O
oligonucleotídeo RG 329 (-) possui uma seqüência nucleotídica, a qual também não se pareia
durante a reação, que corresponde à parte da região codante para os 27 primeiros nucleotídeos
da região HA do gene E, na sua porção 3’ (Resultados: Figura 4.2). A reação de amplificação
do gene da EGFP utiliza como molde o vetor pEGFP-N1 (Clontech) (Ver Resultados: Figura
4.2) e produto esperado desta reação é de 768 pb.
20
O segundo fragmento de PCR, de 339 pb, obtido para a realização da Construção I,
contém a região gênica correspondente à haste e âncora completa da proteína E do vírus FA.
Este fragmento foi obtido utilizando-se o segundo par de oligonucleotídeos RG 330 (+) e RG
331 (-), que possuem seqüências nucleotídicas homólogas aos extremos 5’ e 3’ da região HA
do gene E, respectivamente. Além disto, o oligonucleotídeo RG 330 (+) possui, na sua porção
5’, uma seqüência nucleotídica, a qual não se pareia durante a reação, que corresponde à parte
da região codante para os 24 nucleotídeos 3´ terminais do gene EGFP. O oligonucleotídeo RG
331 (-) possui uma seqüência nucleotídica adicional, 3’ terminal, a qual não se pareia durante
a reação, que corresponde à parte da região codante para os 27 primeiros nucleotídeos do gene
da proteína NS1. A reação de amplificação da região HA completa do gene da proteína E do
vírus de Febre Amarela utiliza como molde o vetor pT3 (Resultados: Figura 4.2).
A Construção II, contendo cassete de expressão heteróloga do gene EGFP fusionado à
região gênica truncada da HA da Proteína E, foi feita da mesma forma, porém por meio do
uso de um primeiro par de oligonucleotídeos, RG 328(+)/RG 332 (-), que possuem seqüências
nucleotídicas homólogas aos extremos 5’ e 3’ do gene da EGFP, respectivamente. O
oligonucleotídeo RG 332 (-) possui, em seu 3’ terminal, um seqüência nucleotídica que
corresponde à parte da região codante para os 28 primeiros nucleotídeos da região H2 do gene
da proteína E, sendo que estes não se pareiam durante a reação. A reação de amplificação do
gene da EGFP também utiliza como molde o vetor pEGFP-N1 (Clontech) (Resultados: Figura
4.2) e produto esperado desta reação é de 768 pb.
A segunda reação utiliza o par de oligonucleotídeos RG 333 (+)/RG 331 (-), em parte
homólogos aos extremos 5’ e 3’, da região HA da proteína E truncada (sem os elementos H1 e
CS, de 92 pb), respectivamente, para a obtenção do fragmento de 247 pb. O oligonucleotídeo
RG 333 (+) possui, também, uma seqüência nucleotídica que corresponde à parte da região
codante para os 22 nucleotídeos 3´ terminais do gene da EGFP, a qual não se pareia durante a
reação. A reação de amplificação da região HA truncada do gene da proteína E do vírus da
Febre Amarela também utiliza como molde o vetor pT3 (Resultados: Figura 4.2).
Para a primeira etapa do PCR, cada amplificação foi feita utilizando-se 10 ng de cada
vetor molde (pEGFP-N1 ou pT3), dNTPs (1 mM), MgSO
4
(1 mM), 1 pmol de cada
oligonucleotídeo, 1 U de Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen), tampão Pfx
Amplification Buffer (1x) (Invitrogen), e água destilada estéril para 25 µl de volume final. As
reações sofreram 30 ciclos de incubação nas seguintes temperaturas: 94ºC por 15 segundos,
55ºC por 30 segundos, 72ºC por 2 minutos. Adicionalmente foi feita uma incubação final de
72ºC por 5 minutos. Os fragmentos foram analisados em gel de agarose 1% em tampão TAE,
purificados através do QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
21
Para a segunda etapa do PCR de fusão dos dois fragmentos de DNA foi utilizado o par
de oligonucleotídeos RG 328 (+) e RG 331 (-), os quais se pareiam nas extremidades dos dois
produtos de PCR obtidos na primeira etapa, unindo-os em um único produto de PCR. A
Construção I deve conter, no sentido 5’ → 3’, a região 3’ do gene da proteína E, os 27
primeiros nucleotídeos do gene da proteína NS1, o gene da EGFP, a região HA completa do
gene da proteína E e os 27 primeiros nucleotídeos do gene da proteína NS1, resultando em um
produto final de PCR de 1.071 pares de bases (pb). A Construção II deve conter os mesmos
elementos da Construção I, com a diferença de que a região HA do gene da proteína E não
possuirá os domínios H1 e CS, resultando em um produto final de PCR de 981 pares de bases
(pb) (Resultados: Figura 4.2).
Para o PCR de fusão, cada amplificação foi feita utilizando-se 25 ng do produto de PCR
contendo o gene da EGFP (768 pb), 10 ng do produto de PCR contendo o gene da região HA
(completa ou truncada), dNTPs (1 mM), MgSO
4
(1 mM), 1 pmol de cada oligonucleotídeo, 1
U de Platinum® Pfx DNA Polymerase, tampão Pfx Amplification Buffer (1x), e água destilada
estéril para 25 µl de volume final. As reações sofreram 30 ciclos de incubação nas seguintes
temperaturas: 94ºC por 15 segundos, 55ºC por 30 segundos, 72ºC por 2 minutos.
Adicionalmente foi feita uma incubação final de 72ºC por 5 minutos. Os fragmentos foram
analisados em gel de agarose 1% em tampão TAE, purificados através do QIAquick Gel
Extraction Kit (Qiagen).
Todos os produtos de reação de PCR foram purificados em sistema de purificação de
produtos de PCR (Qiagen) e analisados por eletroforese em gel de agarose 1% em tampão
TAE.
Tabela 3.1: Vetores utilizados para a obtenção do cassete de expressão para EGFP por PCR
Vetor Resistência a antibióticos Características
pEGFP-N1
Ampicilina
Possui o gene da EGFP
completo.
pT3
Ampicilina
Possui o genoma central do
vírus da Febre Amarela
22
Tabela 3.2: Oligonucleotídeos utilizados nas duas etapas de PCR para a aquisição das Construções
I e II
Primer
Sentido
Seqüência 5´→ 3´
Tm
Plasmídeo
Posição
RG328
+
CTAGGAGTTGGCGCCGATCAAGGATGC
GCCATCAACTTTGGCGTGAGCAAGGGC
GAGGAGCT
55
o
C
pEGFP-N1
679
RG329
-
GCCTTTCATGGTCTGAGTGAACAACTT
CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG
55
o
C
pEGFP-N1
1.398
RG 330
+
CTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAAG
TTGTTCACTCAGACCATGAAAGGC
55
o
C
pT3
1.684
RG331
-
GCCAAAGTTGATGGCGCATCCTTGATC
GGCGCCAACTCCTAGAGAC
55
o
C
pT3
1.971
RG332
-
CCGTATGAATTCCTTTCCCAACCGAAG
TCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG
55
o
C
PEGFP-N1
1.398
RG333
+
CGGCATGGACGAGCTGTACAAGACTTC
GGTTGGGAAAGGAATTCATACGG
55
o
C
pT3
1.773
3.1.2. Clonagem dos cassetes de expressão para EGFP em pGEM-T Easy
Os produtos de PCR foram adenilados para a realização da subclonagem em pGEM-T
Easy (Figura 3.1), utilizando-se 100 ng do produto de PCR, MgCl
2
(2,5 mM), dATP (0,2
mM), 5 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen), tampão PCR Buffer (Invitrogen) e água
destilada e estéril para 10 µl de volume final. As amostras foram incubadas a 70ºC por 15
minutos. Os produtos de PCR adenilados foram, então, subclonados no vetor de expressão
pGEM-T easy (Promega) (Resultados: Figuras 4.1 e 4.2), utilizando-se quantidades
equimolares do vetor (50 ng) e dos insertos para uma proporção 1 vetor: 3 inserto (50 ng),
através da reação de ligação utilizando-se a 1 U da enzima T4 DNA ligase (Invitrogen),
tampão Ligase Reaction Buffer (1x) (Promega), e água destilada estéril para 10 µl de volume
final. As amostras foram incubadas a 16ºC por 12 horas. Esta subclonagem teve como
objetivo obter grande quantidade de DNA correspondente aos cassetes de expressão, e a
certificação da obtenção de extremidades coesivas criadas pela digestão dos plasmídeos com a
enzima de restrição Nar I (Promega).
A etapa seguinte foi a transformação de bactérias E. coli MC1061 (Invitrogen) com os
23
produtos de ligação; as colônias obtidas foram utilizadas em preparação plasmidial em
pequena escala pelo uso do QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) e analisadas em gel de
agarose 0,8% em tampão TAE. A positividade das construções foi confirmada pela alteração
do comprimento do plasmídeo e digestão com a enzima de restrição Nar I (Promega) para a
liberação do cassete de expressão, o qual foi visualisado em gel de agarose 1% em tampão
TAE e purificado conforme descrito acima.
Figura 3.1 - Mapa circular do vetor PGEMT-easy.
3.1.3. Seqüenciamento nucleotídico de amostras plasmidiais
As preparações plasmidiais foram submetidas ao seqüenciamento nucleotídico para a
confirmação da integridade do cassete de expressão utilizando-se os oligonucleotideos RG
328 (+) e RG 331 (-) (Tabela 3.1) o Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems). Para a realização das reações de seqüenciamento, 50 ng de DNA das amostras
foram misturados a 2 µl do reagente Big Dye Terminator (Applied Biosystems), tampão
Sequencing Buffer (1x) (Applied Biosystems), e água para um volume final de 12 µl. As
reações sofreram 30 ciclos de incubação nas seguintes temperaturas: 94ºC por 10 segundos,
45ºC por 5 segundos, 60ºC por 4 minutos. As amostras foram seqüenciadas em seqüenciador
automático (ABI Prism 3100). As construções contendo os cassetes de expressão íntegros e o
do plasmídeo pT3 foram utilizados em preparações plasmidiais em grande escala através do
HiSpeed Plasmid Midi Kit (Qiagen).
24
3.1.4. Subclonagem dos cassetes de expressão em pT3
Foi realizada a digestão do plasmídeo pT3, o qual contém a região central do genoma do
vírus FA 17D vacinal, com a enzima de restrição Nar I (Promega), a qual também foi
utilizada para a criação de extremidades coesivas no cassete de expressão. Após as etapas de
ligação dos cassetes de expressão ao plasmídeo pT3, utilizando-se quantidades equimolares
do vetor (50 ng) e dos insertos para uma proporção 1 vetor: 100 inserto (50 ng) através da
reação de ligação utilizando-se a enzima T4 DNA ligase (Invitrogen), nas condições descritas
acima, preparações de E. coli competentes foram transformadas com os produtos de ligação.
Foram testadas bactérias E. coli DH5α (Invitrogen), XL1-Blue (Stratagene), MC1061
(Invitrogen) e SURE (Stratagene) (Tabela 3.2), para verificar-se qual destas suportaria com
maior sucesso a inserção dos plasmídeos pT3/Esa/5.1, de 10.968 pb, e pT3/Esa trun/4, de
10.878 pb. As colônias de bactérias E. coli DH5α, XL1-Blue, MC1061 e SURE, obtidas após
a transformação com o produto de ligação pT3/Construção I, foram utilizadas em preparação
plasmidial e analisadas em gel de agarose 0,8% em tampão TAE. A positividade das
construções foi confirmada pela alteração do comprimento do plasmídeo e digestão com a
enzima de restrição Nar I (Promega) para a liberação do cassete de expressão, o qual foi
visualisado em gel de agarose 0,8% em tampão TAE.
Devido ao fato desta tratar-se de uma clonagem bidirecional, as preparações plasmidiais
foram submetidas ao seqüenciamento genômico nucleotídico, conforme descrito acima, para a
confirmação da correta orientação do cassete de expressão, utilizando-se oligonucleotídeos
que flanqueiam a região do genoma da FA onde o cassete foi inserido (RG174 (+):
CGGGGTGTGGAGAGAGATGCA e RG19(-): GGGAGTCAACTGAATTTAGGC). Os
oligonucleotídeos RG 174 (+) e RG 19(-) ocupam as posições 1.640 e 2.638 no genoma do
vírus FA 17D, 1.640 e 3.666 no genoma de FA 17D/Esa/5.1 glic, e 1.640 e 3.576 no genoma
de FA 17D/Esa trun/4 glic, respectivamente. As construções contendo os cassetes de
expressão íntegros e com orientação correta foram utilizadas em preparações plasmidiais em
grande escala conforme descrito acima.
25
Tabela 3.3: Linhagens de E. coli utilizadas para a subclonagem dos cassetes de expressão nos
vetores pGEM-T Easy e pT3: Características genotípicas e resistência a antibióticos. endA: Deficiência de
endonucleases (aumenta a qualidade das preparações plasmidiais). recA, recB, recJ: deficiente para
recombinações (aumenta a estabilidade do inserto). hsdR: previne a clivagem do DNA clonado pelo sistema de
endonuclease EcoK. McrA-, McrCB-, McrF-, Mrr-, HsdR-: Restrição-negativas. Gene lacIqZ∆M15: seleção por
cor branco/azul da colônia.
Linhagem de E. coli Genotipo Resistência a
antibióticos
Vantagens
DH5α
φ80dlacZ∆M15: α-
complementação do
gene da β-
galactosidase.
Não possui
Capaz de ser
transformada com
plasmídeos grandes.
MC1061
F
-
araD139
(araABC-leu), 7679
galU galK lacX74,
hsdR (r
k
-
,m
k
+
),
rpsL(Str
R
) thi-1
mcrB (P3: Kan
R
,
Amp
R
(amber), Tet
R
(amber)
Kanamicina
Tetraciclina
Não especificadas pelo
fabricante
XL1-Blue
recA1 endA1 gyrA96
thi-1 hsdR17 supE44
relA1 lac [F´ proAB
lacIqZ∆M15 Tn10
(Tetr)].
Tetraciclina
Excelente para clonagens
de rotina e para vetores
plasmidiais ou lambda.
SURE
(Stop Unwanted
Rearrangement
Events)
e14-(McrA-)
∆(mcrCB-hsdSMR-
mrr)171 endA1
gyrA96 thi-1 supE44
relA1 lac recB recJ
sbcC umuC::Tn5
(Kanr) uvrC
[F´ proAB
lacIqZ∆M15 Tn10
(Tetr)].
Kanamicina
Tetraciclina
Permite a clonagem de
segmentos de DNA não-
clonáveis em outras
linhagens de E. coli.
Não possui os
componentes da via que
cataliza rearranjos e
deleções de estruturas
secundárias e terciárias
não convencionais.
26
3.2. Regeneração dos vírus FA recombinantes expressando EGFP
Foram montados moldes de cDNA, através da digestão dos plasmídeos obtidos após a
clonagem dos cassetes de expressão no plasmídeo pT3 com as enzimas de restrição Nsi I e Sal
I (Promega), posterior ligação de 350 ng de pT3/Esa ou pT3/Esa trun com 200 ng de pE200
ou pE200 glicosilado (contendo sítio de glicosilação no gene da proteína E), utilizando-se a
enzima T4 DNA ligase (Invitrogen), nas condições descritas na seção 3.1, e linearização dos
moldes utilizando-se 20 U da enzima de restrição XhoI (Promega). Para a montagem dos
moldes de cDNA foram selecionados dois clones contendo o cassete de expressão com
orientação correta, para garantir que a viabilidade ou não destes novos vírus não seria devido
a problemas com a qualidade do material. Os moldes de cDNA referidos acima foram
utilizados em reação de transcrição in vitro utilizando-se AmpliScribe™ SP6 Transcription
Kit (Epicentre) conforme as especificações do fabricante.
O RNA obtido foi utilizado na transfecção de monocamada de células Vero na
densidade de 30.000 células/cm
2
em garrafas de 25 cm
2
, através do emprego do lipídeo
catiônico LipofectAmine
®
(GIBCO-BRL), e utilizando-se meio de cultura 199 Earle’s, 5%
NaHCO
3
e 5% de SFB
durante a incubação a 37
o
C e 5% de CO
2
. Após o estabelecimento de
efeito citopático (CPE), os sobrenadantes destas culturas foram coletados e devidamente
identificados.
Tabela 3.4: Plasmídeos utilizados para a regeneração dos vírus FA recombinantes expressando
EGFP
Plasmídeo Característica
pT3/Esa/5.1
Possui a Construção I clonada (proveniente do clone de
bactérias E.coli SURE n
o
5 )
pT3/Esa/8.1
Possui a Construção I clonada (proveniente do clone de
bactérias E.coli SURE n
o
8)
pT3/Esa trun/2
Possui a Construção II clonada (proveniente do clone de
bactérias E.coli SURE n
o
2)
pT3/Esa trun/4
Possui a Construção II clonada (proveniente do clone de
bactérias E.coli SURE n
o
4)
pE200
Possui as extremidades 5’ e 3’ terminais do genoma do
vírus da Febre Amarela
pE200 glic
Possui as extremidades 5’ e 3’ terminais do genoma do
vírus da Febre Amarela. Possui sítio de glicosilação no
gene codificante para a proteína E.
27
3.3. Produção dos estoques virais de segunda passagem celular
Os estoques virais foram preparados por infecção de monocamadas de células Vero na
densidade de 62.500 células/cm
2
a 37
o
C e 5% de CO
2
, utilizando-se os vírus coletados após a
transfecção (sobrenadantes de transfecção), em meio de cultura 199 Earle’s, 5% NaHCO
3
e
5% de SFB. Estes estoques virais de segunda passagem celular foram titulados em placas de
24 poços (Nunc, Naperville, EUA) e parcialmente seqüenciados, conforme descrito no item
3.1, para a confirmação da integridade da inserção heteróloga e usados em todas as etapas de
caracterização viral.
3.4. Cinética de crescimento viral em monocamadas de células Vero
Os vírus recombinantes foram caracterizados por cinética de crescimento viral em
células Vero na densidade de 62.500 células/cm
2
e m.o.i. de 0,02, em garrafas de 25 cm
2
por
144 h a 37°C e 5% de CO
2
, utilizando-se meio de cultura 199 Earle’s, 5% NaHCO
3
e 5% de
SFB. Alíquotas foram coletadas a cada 24 horas e tituladas em placas de 24 poços, em
monocamada de células Vero na densidade de 50.000 células/cm
2
, m.o.i. de 0,02 e tempo de
incubação de 7 dias a 37
o
C e 5% de CO
2
, utilizando-se como cobertura carboximetilcelulose
(CMC) em meio de cultura 199 Earle’s, 5% NaHCO
3
e 5% de SFB.
Foram usados dois vírus controles: (1) o vírus vacinal da Febre Amarela, sub-cepa
17DD e (2) o vírus parental FA 17D/E200T3. Assim, pode-se analisar a capacidade
proliferativa destes diferentes vírus em comparação aos vírus FA 17DD controle.
3.5. Estudo da morfologia de placas de lise
O estudo da morfologia de placas de lise foi realizado em placas de 6 poços (Nunc,
Naperville, EUA), em monocamada de células Vero na densidade de 62.500 células/ cm
2
,
m.o.i. de 0,02 e tempo de incubação de 7 dias a 37
o
C e 5% de CO
2
, utilizando-se como
cobertura carboximetilcelulose (CMC) em meio de cultura 199 Earle’s, 5% NaHCO
3
e 5% de
SFB.
O tamanho de placa foi aferido através da média de 30 medições efetuadas em três
experimentos independentes e usando como controle o vírus vacinal FA 17DD.
28
3.6. Microscopia de fluorescência
A cinética de expressão de EGFP foi realizada em placas de 6 poços (Nunc, Naperville,
EUA), em cada qual foi colocada uma lamínula de vidro. Nos poços contendo as lamínulas,
foram semeadas células Vero na densidade de 62.500 células/ cm
2
, e as mesmas foram
infectadas, por incubação a 37
o
C e 5% de CO
2
, com os vírus recombinantes expressando
EGFP na m.o.i. de 0,02, em meio de cultura 199 Earle’s, 5% NaHCO
3
e 5% de SFB.
Nos intervalos de tempo de 24, 48, 72, 96 e 120 horas, as células foram lavadas duas
vezes com PBS, fixadas com paraformaldeído 4% diluído em tampão fosfato dibásico 0,2 M
por 10 minutos e lavadas uma vez com tampão fosfato dibásico 0,2 M. No caso das células
infectadas com o vírus recombinante carregando a Construção I, as células foram coradas com
Azul de Evans na concentração 1% em tampão TAE, lavadas duas vezes com PBS 1x e, em
seguida, coradas com DAPI (Invitrogen). Cada lamínula contendo as amostras a serem
analisadas foi fixada sobre uma lâmina de vidro própria para a observação no microscópio
confocal de fluorescência.
As amostras foram observadas em microscópio confocal de fluorescência (LSM 510
META, Zeiss), pela “Plataforma multi-usuário de microscopia confocal – PDTIS-FIOCRUZ”.
3.7. Citometria de fluxo - FACS
Para os estudos de cinética de infecção e expressão da EGFP ao longo do tempo, células
Vero foram infectadas com o vírus controle FA 17D/E200T3 e os vírus recombinantes FA
17D/Esa/5.1 glic e FA 17D/Esa trun/4 glic, nas mesmas condições acima descritas. As
suspensões celulares foram obtidas por tripsinização das monocamadas celulares infectadas
nos intervalos de tempo de 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h pós-infecção, centrifugadas a
1.000xg por 7 min a TA e lavadas com PBS 1x gelado. As células foram fixadas com
paraformaldeído 2% em PBS 1x (20 minutos a 4ºC, lavadas e permeabilizadas com PBS com
BSA 1% e 0,15% saponina (10 minutos a 4ºC). Com a finalidade de se determinar o melhor
título para os anticorpos utilizados no experimento, as células infectadas com os vírus FA
17D recombinantes expressando EGFP foram marcadas com anticorpo específico anti-Febre
Amarela (α-FA) (soro hiper-imune de camundongo,ATCC, Bethesda, MA, EUA) nas
diluições 1:60, 1:80 ou 1:100, por 60 minutos a 4ºC. Após a incubação, as células foram
lavadas com PBS-BSA com 0,15% saponina, centrifugadas e incubadas com o anticorpo anti-
IgG de camundongo conjugado a ficoeritrina (PE) (Dako, Glostrup, Dinamarca) diluído 1:30,
29
1:50 ou 1:40, por 30 minutos a 4
0
C. Após uma lavagem adicional com PBS-BSA com 0,15%
saponina, as células foram ressuspensas em paraformaldeído 2%. Esta marcação emite
fluorescência no comprimento de onda 630-780 nm (vermelho) e a EGFP emite fluorescência
no comprimento de onda 490-565 nm (verde). Foram adquiridos 10.000 eventos por amostra
no citômetro de fluxo FacScalibur (BenctonDickinson, Califórnia, EUA) e os dados foram
analisados utilizando-se o software WinMDI (The Scripps Research Institute, Califórnia,
EUA). A porcentagem de células infectadas (FA
+
) e infectadas expressando EGFP
(FA
+
EGFP
+
) foram calculadas subtraindo-se os valores obtidos com células não infectadas
marcadas com os anticorpos.
A estabilidade genética foi avaliada através da proporção entre a porcentagem de células
apresentando dupla-marcação e o total de células infectadas (sometória da porcentagem de
células FA
+
EGFP
+
e FA
+
), representando a manutenção ou perda da inserção heteróloga.
% Expressão Estável = % Células FA
+
EGFP
+
x 100
% Células (FA
+
EGFP
+
) + FA
+
3.8. Estabilidade Genética dos vírus 17D recombinantes expressando EGFP
3.8.1 Obtenção dos vírus de passagens seriadas
3.8.1.1. Amostras virais não clonadas
Os vírus recombinantes foram cultivados por 15 passagens seriadas em células Vero, na
densidade de 62.500 células/cm
2
, m.o.i. de 0,02, em meio de cultura 199 Earle´s, 5% NaHCO
3
e 5% de SFB por 96 horas em estufa com 5% de CO
2
a 37
o
C. Foram feitas duas passagens
seriadas distintas e analisadas as passagens virais 1P, 2P, 5P, 10P e 15P.
3.8.1.2. Amostras virais clonadas
Com o objetivo de selecionarmos um clone do vírus recombinante que expressa a região
HA completa, que mantenha estável a inserção heteróloga dentro de seu genoma por um
número maior de passagens em sistema, clones virais foram inicialmente obtidos por infecção
de uma monocamada de células Vero com o estoque viral (2P), com aplicação de uma
30
cobertura de agarose 1% contendo meio 199 Earle´s, 5% NaHCO
3
e 5% de SFB na
monocamada após infecção. Após incubação em estufa de CO
2
a 37
o
C por 7 dias, aplicou-se
solução “Vermelho Neutro” para a visualização dasplacas de lise. Dez placas de lise foram
selecionadas e isoladas por meio de perfuração da camada de agar com auxílio de uma pipeta
pasteur. O pedaço de agar foi incubado em PBS e submetido a agitação por vortex. A
suspensão viral foi, então, empregada para infecção de monocamadas celulares, na densidade
de 62.500 células/ cm
2
, em placas de 24 poços (Nunc, Naperville, EUA), cada um deles
contendo um clone viral. Após o aparecimento de CPE, as suspensões virais, as quais
correspondem à terceira passagem viral (3P), foram coletadas, originando clones individuais.
Os dez clones virais foram levados até a décima-quinta passagem viral (15P) em monocamada
de células Vero, nas mesmas condições descritas na seção 3.8.1.1. As passagens virais 3P, 5P,
10P e 15P foram utilizadas para posterior análise através de RT-PCR e citometria de fluxo
(FACS).
3.8.2. Extração de RNA viral
O RNA viral das diferentes amostras virais foi extraído do sobrenadante de cultura pelo
método do Trizo-LS (GIBCO-BRL). Neste método, 0,75 mL do Trizol-LS foram adicionados
a 0,25 mL de suspensão viral em microtubo de 1,5 mL e, após a homogeinização, a reação foi
incubada a TA por 5 minutos. Em seguida, foram adicionados 0,2 mL de clorofórmio, a
reação foi homogeneizada vigorosamente por 15 segundos e incubada a TA por 5 minutos.
Após esta incubação, as amostras foram centrifugadas a 12.000xg a 4ºC por 15 minutos.
Neste momento, as amostras encontram-se separadas em 3 fases: uma fase inorgânica, onde se
encontra o RNA viral, na superfície; uma fase protéica, intermediária; e uma fase orgânica,
onde se encontram o Trizo-LS e o clorofórmio, na parte inferior. A fase inorgânica foi
cuidadosamente retirada e transferida para outro microtubo de 1,5 mL. Foi, então, adicionado
às amostras 1 µl de glicogênio 20 µg/µl (Invitrogen), para se obter uma concentração final de
0,2 mg/mL, e 0,5 mL de isopropanol 100%. As amostras foram incubadas por 15 minutos,
centrifugadas a 12.000xg a 4ºC por 15 minutos e o sobrenadante foi descartado. Em seguida,
foi adicionado 1 mL de etanol 70% às amostras e estas foram novamente centrifugadas a
12.000xg a 4ºC, por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o RNA viral obtido foi
ressuspenso em água livre de RNAse e armazenado a - 80ºC.
31
3.8.3. RT-PCR
As amostras de RNA viral foram submetidas ao procedimento de RT-PCR, utilizando-
se oligonucleotídeos que flanqueiam a região onde foi introduzida a inserção heteróloga (RG
174 (+): CGGGGTGTGGAGAGAGATGCA e RG 19 (-):
GGAGTCAACTGAATTTAGGC). Os oligonucleotídeos RG 174 (+) e RG 19(-) ocupam as
posições 1.640 e 2.638 no genoma do vírus FA 17D, 1.640 e 3.666 no genoma de FA
17D/Esa/5.1 glic, e 1.640 e 3.576 no genoma de FA 17D/Esa trun/4 glic respectivamente.
Nesta reação, para a etapa de síntese da primeira fita de cDNA, 2 µl de RNA viral foram
misturados ao oligonucleotídeo negativo RG 19, dNTPs (1 mM), 20 U de rRNasin
®
Ribonuclease Inhibitor (Promega), MgCl
2
(6 mM), a 200 U da enzima M-MLV transcriptase
reversa (Promega), tampão M-MLV Buffer (1x) (Promega), e água destilada estéril para 20 µl
de volume final, e incubados por 60 minutos a 42ºC. Em seguida, foi adicionado a estas
reações o oligonucleotídeo positivo RG 174 (+), MgCl
2
(6 mM), Taq DNA polimerase
(Promega), tampão PCR Buffer (1x) e água destilada estéril para 100 µl de volume final. As
reações sofreram 30 ciclos de incubação nas seguintes temperaturas: 94ºC por 15 segundos,
55ºC por 30 segundos, 72ºC por 2 minutos. Adicionalmente foi feita uma incubação final de
72ºC por 5 minutos. Estes fragmentos foram analisados em gel de agarose 1% em tampão
TAE, purificados através do QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), e seqüenciados conforme
descrito no item 3.1, para averiguação da integridade das inserções heterólogas nos vírus
recombinantes e da ocorrência de alguma modificação não desejada após as passagens
seriadas.
3.8.4. Citometria de Fluxo
Células Vero na densidade de 62.500 células/ cm
2
em meio de cultura 199 Earle´s, 5%
NaHCO
3
e 5% de SFB foram infectadas com os vírus recombinantes das diferentes passagens
seriadas (ver seção 3.8.1.1). No caso dos vírus não clonados (ver seção 3.8.1.1), foram feitas
duas passagens seriadas distintas, e utilizadas as passagens virais 1P (sobrenadante de
transfecção), 2P (estoque viral), 5P, 10P e 15P na m.o.i. de 0,02. No caso dos vírus clonados
(ver seção 3.8.1.1), foram utilizadas as passagens virais 2P, 5P, 10P e 15P na m.o.i. de 0,02.
As células foram analisadas utilizando-se a mesma metodologia descrita na seção 3.7.
32
4. Resultados
4.1. Construção dos vírus FA recombinantes expressando EGFP
A região escolhida para a inserção no genoma FA foi a região intergênica E/NS1. Após
sua tradução, a poliproteína precursora viral sofre clivagem proteolítica promovida pela
peptidase-sinal celular associada à membrana do retículo endoplasmático (RE). Assim, com o
intuito de preservar os motivos conservados desta região, que poderiam ser importantes para o
correto processamento proteolítico da poliproteína viral e da EGFP, realizou-se, inicialmente,
um alinhamento entre as seqüências que flanqueiam o ponto de processamento proteolítico da
peptidase sinal, que envolveriam as diferentes seqüências da região haste-âncora (HA) da
proteína E e do N-terminal da proteína NS1 de Flavivírus com a do vírus TBE, no qual a HA
foi caracterizada, para o estabelecimento deste na proteína E do vírus FA (Stiasny et al., 1996;
Allison et al., 1999)
A região HA é constituída pela região da haste, que por sua vez é constituída pelos
elementos H1, CS e H2 (o elemento CS conecta H1 a H2) e pela âncora, a qual se insere na
membrana do RE da célula hospedeira durante a replicação viral, e no envelope viral,
mantendo a proteína E ancorada. A região da âncora é formada pelos elementos TM1 e TM2,
que são alfa-hélices transmembranares, sendo que TM2 serve como peptídeo sinal para
translocação para o RE e processamento da proteína NS1 viral pela peptidase-sinal (Figura
4.1-A). Neste alinhamento, observou-se que estas seqüências são extremamente conservadas
entre os Flavivirus (Figura 4.1-D), assim como suas seqüências-sinal e as seqüências de seus
sítios de clivagem, isto é, tanto da região HA quanto do N-terminal da proteína NS1, com o
motivo DXGC (não mostrado no alinhamento). Optou-se, portanto, por utilizar o N-terminal
da proteína NS1 e os domínios haste-âncora (HA) da proteína E do vírus FA fusionados no
amino- e caboxi-terminal, respectivamente, da proteína EGFP. A intenção, com esta
estratégia, foi minimizar os efeitos deletérios da inserção nesta região, de modo a permitir o
correto processamento e orientação desta região da poliproteína viral na membrana do retículo
endoplasmático rugoso celular.
Foram construídos dois diferentes cassetes de expressão, os quais foram inseridos na
região intergênica E/NS1 do vírus vacinal da Febre Amarela. O cassete de expressão contendo
a região HA completa (288 pb) possui todos os elementos da região HA do vírus FA (Figura
4.1-B), e a segunda construção consistiu do cassete de expressão com a região HA truncada
(198 pb), isto é, ausência dos elementos H1 e CS da haste (Figura 4.1-C).
33
D)
Figura 4.1: Representação esquemática da proteína E do vírus da Febre Amarela e das Construções
I e II, e a organização das mesmas no retículo endoplasmático. A) Proteína E do vírus da Febre Amarela. B)
e C) Construções I e II, respectivamente: A região correspondente aos domínios haste (H1e H2) e âncora (TM1 e
TM2) da proteína E completa (Contrução I) ou parcial (Construção II) está duplicada e encontra-se fusionada ao
carboxi-terminal da proteína EGFP. Os nove primeiros resíduos de aminoácidos da proteína NS1 foram
incorporados ao amino-terminal da proteína EGFP. D) Alinhamento dos nucleotídeos da região haste-âncora da
proteína E de diferentes Flavivírus. Na figura estão indicadas as regiões utilizadas na construção do cassete de
expressão contendo a seqüência completa (Construção I), e parcial (Construção II) desta região do gene da
proteína E de Febre Amarela. (*) indica posições que contêm um único resíduo completamente conservado. (:)
indica substituições conservadas de aminoácidos. (.) Indica mutações semiconservadas de aminoácidos.
34
Em ambos os cassetes de expressão, o gene heterólogo da EGFP foi fusionado, no
extremo 5´, a uma seqüência correspondente aos 27 nucleotídeos no N-terminal da proteína
NS1 e no seu C-terminal às seqüências HA completa ou parcial (Figuras 4.2).
Os genes recombinantes foram montados por diferentes etapas de PCR. Após a primeira
etapa de PCR para a realização da Construção I foram obtidos dois produtos, um de 768 pb e
outro de 339 pb. O produto de 768 pb contém o gene da EGFP fusionado aos 15 últimos
nucleotídeos do gene E seguido dos 27 primeiros nucleotídeos do gene NS1 na sua
extremidade 5’ terminal e, na sua extremidade 3’ terminal, os 27 primeiros nucleotídeos que
codificam a região HA. O segundo produto de 339 pb, contém a região haste-âncora da
proteína E do vírus FA completa, fusionada aos 24 últimos nucleotídeos do gene EGFP na sua
extremidade 5’ terminal, e os 27 primeiros nucleotídeos do gene NS1 na sua extremidade 3’
terminal (Figura 4.2 e Figura 4.4-A). Após a segunda etapa de PCR, denominada PCR de
fusão, foi obtido um produto de 1.071 pb, que contém os seguintes elementos no sentido
codante 5’→ 3’: os 15 últimos nucleotídeos do gene E, os 27 primeiros nucleotídeos do gene
NS1, o gene EGFP, a região que codifica para a HA completa, e os 27 primeiros nucleotídeos
do gene NS1 (Figura 4.2 e Figura 4.4-A).
No caso da Construção II, após a primeira etapa de PCR, foram obtidos dois produtos,
um de 768 pb e outro de 981 pb. O produto de 768 pb contém o gene da EGFP fusionado aos
15 últimos nucleotídeos do gene E, seguido dos 27 primeiros nucleotídeos do gene NS1 na
sua extremidade 5’ terminal e, na sua extremidade 3’ terminal, os 27 primeiros nucleotídeos
que codificam o elemento H2 da região HA. O segundo produto de 249 pb contém a região
haste-âncora truncada da proteína E, fusionada aos 22 últimos nucleotídeos do gene EGFP na
sua extremidade 5’ terminal e, na sua extremidade 3’ terminal, aos 27 primeiros nucleotídeos
do gene NS1 (Figura 4.2 e Figura 4.4-A). Após a segunda etapa de PCR, foi obtido um
produto de 981 pb, que contém os seguintes elementos, no sentido 5’→ 3’: os 15 últimos
nucleotídeos do gene E, os 27 primeiros nucleotídeos do gene NS1, o gene EGFP, a região
que codifica para a HA truncada, e os 27 primeiros nucleotídeos do gene NS1 (Figuras 4.2 e
Figura 4.4-A).
Estes produtos de PCR foram clonados no vetor de expressão pGEM-T Easy (Figuras
4.3 e 4.4-B) . Após a clonagem dos produtos de PCR no vetor de expressão pGEM-T Easy e
da transformação dos produtos de ligação na cepa MC 1061 de E. coli, foram obtidas e
analisadas diversas colônias bacterianas recombinantes. No caso da Construção I, o tamanho
esperado para o plasmídeo pGEM-T Easy/Esa era de 4.086 pb.
35
Figuras 4.2 - Esquema do PCR de Fusão para aquisição das Construções I (Cassete de expressão com a região haste-âncora da Proteína E Completa) e II (Cassete
de expressão com a região Haste-Âncora da Proteína E Truncada).
36
Figuras 4.3. Mapa ilustrativo da inserção dos cassetes de expressão nos plasmídeos pGEM-T Easy das inserções do PCR de fusão das Construções I e II.
37
Foram analisadas 5 colônias e 2 construções foram positivas para o cassete de expressão
íntegro, o que foi confirmado através de seqüenciamento nucleotídico e por detecção em
eletroforese em gel de agarose do fragmento de cerca de 1.000 pb liberado após a digestão
com a enzima de restrição Nar I (Promega) (Figuras 4.4-B e 4.4-C). Apenas a construção de
número 1 (Figura 4.4-C - Canal 2) - pGEM-T Easy/Esa/1 - foi utilizada nas etapas seguintes
(Tabela 4.1) . No caso da Construção II, o tamanho esperado para o plasmídeo pGEM-T
Easy/Esa trun era de 3.996 pb. Foram analisadas 9 colônias e 2 construções positivas foram
obtidas (Figura 4.4-C).
Figura 4.4 - Obtenção dos cassetes de expressão (Construções I e II): Em (A): No canal 1, o produto
de PCR (Construção I) resultante da fusão entre o produto de PCR correspondente ao gene da EGFP (Canal 2) e
o produto de PCR correspondente à região codante da Haste-âncora completa (Canal 3). No canal 4, o produto
de PCR (Construção II) resultante da fusão entre o produto de PCR correspondente ao gene da EGFP (Canal 5) e
o produto de PCR correspondente à região codante da haste-âncora parcial (Canal 6). Em (B): No canal 1, o
vetor pGEM-T Easy vazio. Nos canais 2 e 3, os vetores pGEM-T Easy/Esa. Nos canais 4 e 5, os vetores pGEM-
T Easy/Esa trun. Em (C): No canal 1, o vetor pGEM-T Easy/Esa usado como controle na verificação da
liberação da Contrução I durante a digestão com a Enzima de restrição Nar I. Nos canais 2 e 3, os vetores
pGEM-T Easy/Esa digeridos com a enzima de restrição Nar I. No canal 4, um dos vetores pGEM-T Easy/Esa
trun obtidos durante a etapa de clonagem, usado como controle na verificação da liberação da Contrução II
durante a digestão com a Enzima de restrição Nar I. Nos canais 5 e 6, os vetores pGEM-T Easy/Esa trun
digeridos com a Enzima de restrição Nar I.
Como a construção de número 1 (Figura 4.4-C- Canal 5) apresentou a deleção de um
nucleotídeo no início da região haste-âncora truncada, mostrado pelo seqüenciamento
nucleotídico do plasmídeo, apenas a construção de número 2 (Figura 4.4-C- Canal 5) -
38
pGEM-T Easy/Esa trun/2 - foi utilizada nas etapas seguintes (Tabela 4.1). A construção de
número 2 se mostrou positiva para o cassete de expressão íntegro, o que foi confirmado
através de seqüenciamento nucleotídico e pela liberação de um produto de cerca de 900 pb
após a digestão com a enzima de restrição Nar I (Promega) (Figuras 4.4-B e 4.4-C).
Para a obtenção dos vírus FA recombinantes, empregou-se o sistema de clone infeccioso
viral, que tem como base os dois plasmídeos bacterianos pT3 e pE200 (Bonaldo et al., 2002).
O primeiro plasmídeo, pT3, derivado do plasmídeo pYFM 5.2 (Rice et al., 1989), contém a
região central do genoma do vírus FA 17D: do nucleotídeo 1.372 ao 8.704. O segundo,
derivado do plasmídeo pYF5’3’IV (Rice et al., 1989), contém as porções inicial (5’) e final
(3’) do genoma viral: nucleotídeos de 1 a 2.271 e de 8.274 a 1.0862, respectivamente. Como
a estratégia de construção dos vírus FA 17D recombinantes para a expressão da proteína
autofluorescente EGFP implica na introdução do cassete de expressão contendo o gene da
proteína EGFP entre os genes das proteínas virais E e NS1, somente o plasmídeo pT3 foi
envolvido na etapa de clonagem do gene de EGFP.
Tabela 4.1: Plasmídeos obtidos após a subclonagem dos cassetes de expressão para EGFP em
pGEM-T Easy e seqüenciamento nucleotídico de amostras plasmidiais.
Plasmídeo Característica
pGEM-T Easy/Esa/1
Possui a Construção I clonada em seu sítio múltiplo de clonagem.
pGEM-T Easy Esa trun/2
Possui a Construção II clonada em seu sítio múltiplo de clonagem
Para a subclonagem dos cassetes de expressão no cDNA genômico FA (Figura 4.5), o
plasmídeo pT3, de tamanho molecular de 9.938 pb, foi digerido com a enzima de restrição
Nar I (Promega) com o objetivo de gerar as mesmas extremidades coesivas presentes nos
cassetes de expressão e purificado conforme o descrito no item 3.1 (Figuras 4.6-A-I e 4.6-B-
I). Após as etapas de clonagem dos cassetes de expressão no plasmídeo pT3 e transformação
em E. coli com os produtos de ligação pT3/Construção I, diversas colônias de bactérias E. coli
DH5α, XL1-Blue, MC1061 e SURE foram obtidas e testadas. A análise das preparações
plasmidiais das colônias bacterianas de E. coli DH5α, XL1-Blue e MC1061 recombinantes
em eletroforese em gel de agarose mostra que o peso molecular dos plasmídeos foi ainda
menor que o peso molecular do plasmídeo pT3, utilizado como controle experimental
negativo durante a eletroforese (Figura 4.6-A-II). Este resultado sugere que o plasmídeo
pT3/Esa sofreu extensas deleções nucleotídicas quando propagado nestas três diferentes
linhagens de E. coli. Portanto o plasmídeo pT3/Esa é instável nestas linhagens de E. coli.
39
Figura 4.5 - Subclonagem dos cassetes de expressão no plasmídeo pT3: As setas vermelhas representam as digestões com a enzima de restrição Nar I (Promega).
As setas azuis representam a ligação dos cassetes de expressão ao plasmídeo pT3 com a enzima T4 DNA ligase (Invitrogen). As setas amarelas representam a transformação
de E. coli SURE com os plasmídeos pT3/Esa e pT3/Esa trun e posterior preparação plasmidial.
40
Figura 4.6: Sublonagem dos cassetes de expressão (Construções I e II) no vetor pT3 e
transformação em diferentes cepas de E.coli: Em (A): (I) No canal 1, o vetor pT3 digerido com a enzima de
restrição Nar I. No canal 2, a Construção I , proveniente do plasmídeo pGEM-T Easy/Esa digerido com a enzima
de restrição Nar I, e purificada a partir de gel de agarose após eletroforese. (II) No canal 1, preparação plasmidial
do vetor pT3. Nos canais 2-12, preparações plasmidiais em pequena escala de bactérias E. coli MC1061
transformadas com a reação de ligação entre a Construção I e o vetor pT3. Os asteriscos indicam plasmídeos
com extensas deleções, indicando que estas bactérias não suportam com sucesso a inserção da Construção I. (III)
No canal 1, preparação plasmidial do vetor pT3. Nos canais 2--9, preparações plasmidiais em pequena escala de
bactérias E. coli SURE transformadas com a reação de ligação entre a Construção I e o vetor pT3. Estas bactérias
suportam com sucesso a inserção do plasmídeo pGEM-T Easy/Esa. Em (B): (I) No canal 1, o vetor pT3 digerido
com a enzima de restrição Nar I. No canal 2, a Construção II , proveniente do plasmídeo pGEM-T Easy/Esa trun
digerido com a enzima de restrição Nar I, e purificada a partir de gel de agarose após eletroforese. (II) No canal
1, preparação plasmidial do vetor pT3. Nos canais 2--5, preparações plasmidiais em pequena escala de bactérias
E. coli SURE transformadas com a reação de ligação entre a Construção II e o vetor pT3. Estas bactérias
suportam com sucesso também a inserção da Construção II.
Tabela 4.2: Plasmídeos obtidos após a subclonagem dos cassetes de expressão em pT3 e
seqüenciamento nucleotídico de amostras plasmidiais.
Plasmídeo Característica
pT3/Esa/5.1
Possui a Construção I clonada (proveniente do clone de bactérias E.coli SURE n
o
5 )
pT3/Esa/8.1
Possui a Construção I clonada (proveniente do clone de bactérias E.coli SURE n
o
8)
pT3/Esa trun/2
Possui a Construção II clonada (proveniente do clone de bactérias E.coli SURE n
o
2)
pT3/Esa trun/4
Possui a Construção II clonada (proveniente do clone de bactérias E.coli SURE n
o
4)
41
Bactérias E. coli da linhagem SURE foram também transformadas com o produto de
ligação pT3/Construção I e a análise das preparações plasmidiais das colônias bacterianas,
através de eletroforese em gel de agarose, mostra que o peso molecular das mesmas é igual
(plasmídeo não-recombinante) ou maior (plasmídeo recombinante) que o peso molecular do
plasmídeo pT3 (Figura 4.6-A-III). Este resultado evidencia a estabilidade do plasmídeo
pT3/Esa após a transformação na linhagem SURE de E.coli, sendo a mesma, portanto,
utilizada nas próximas etapas de construção dos plasmídeos pT3/Esa e pT3/Esa trun.
Os plasmídeos pT3 recombinantes foram inicialmente detectados por eletroforese gel de
agarose e selecionados por uma menor migração eletroforética, quando comparados ao
plasmídeo pT3, utilizado como controle negativo (Figura 4.6-A e 4.6-B) e, posteriormente,
pela análise dos plasmídeos digeridos com Nar I (Promega) para liberação do cassete de
expressão e visualização em gel de agarose. O tamanho esperado para o plasmídeo pT3/ Esa
era de 10.968 pb e para o plasmídeo pT3/Esa trun era de 10.878 pb. Devido ao fato desta
tratar-se de uma clonagem bidirecional, as preparações plasmidiais foram submetidas ao
seqüenciamento nucleotídico para a confirmação da correta orientação do cassete de
expressão.
No caso da Construção I, foram analisadas 40 colônias e obtidas 8 construções positivas
quanto à orientação do cassete de expressão. Apenas as construções de número 5 e 8,
contendo o cassete de expressão íntegro e com correta orientação, foram utilizadas nas etapas
seguintes (Figura 4.6-A III e Tabela 4.2). No caso da Construção II, foram analisadas 6
colônias e foram obtidas 5 construções positivas. Apenas as construções de número 2 e 4,
contendo o cassete de expressão íntegro e com correta orientação, foram utilizadas nas etapas
seguintes (Figura 4.6-B-II e Tabela 4.2). Foram selecionados dois clones contendo o cassete
de expressão com orientação correta, para cada construção (pT3/Esa/5.1 e pT3/Esa/8.1;
pT3/Esa trun/2 e pT3/Esa trun/4), para garantir que a viabilidade ou não destes novos vírus
não seria devido a problemas com a qualidade do material.
Para obtenção dos moldes de cDNA viral (Figuras 4.7 e 4.8), os plasmídeos
pT3/Esa/5.1, pT3/Esa/8.1, pT3/Esa trun/2, pT3/Esa trun/4, pE200 e pE200 glic (contendo
motivo de N- glicosilação na posição E154 no gene da proteína E) foram digeridos com as
enzimas de restrição Nsi I (Promega) e Sal I (Promega) (Figura 4.8-A e 4.8-D). Os produtos
de digestão dos plasmídeos pT3/Esa/5.1, pT3/Esa/8.1, pT3/Esa trun/2, pT3/Esa trun/4 foram
ligados aos produtos de digestão do plasmídeo pE200 ou pE200 glic, utilizando-se a enzima
T4 DNA ligase (Invitrogen) conforme descrito anteriormente, e posteriormente linearizados
com a enzima de restrição Xho I (Figura 4.8-B-II e 4.8-E-II). Assim, o molde de cDNA viral
de cerca de 11 kb foi montado.
42
Figura 4.7 – Esquema ilustrativo da obtenção do molde de cDNA viral.
43
Figura 4.8: Obtenção do molde de cDNA viral
(D)
(E)
(I)
(II)
(F)
44
Figura 4.8: Obtenção do molde de cDNA viral: Em (A): No canal 1, o plasmídeo pT3/Esa/5.1 digerido
com as enzimas de restrição Nsi I e Sal I. No canal 2, o plasmídeo pT3/Esa 8.1 digerido com Nsi I e Sal I. No
canal 3, o plasmídeo pT3 digerido com Nsi I e Sal I. Nos canais 4 e 5, os plasmídeos pE200 e pE200 glicosilado,
respectivamente, digeridos com Nsi I e As lI. Em (B): I: Reação de ligação utilizando a enzima T4 DNA ligase.
No canal 1, molde de cDNA do vírus FA 17D/Esa/5.1 (não glicosilado). No canal 2, molde de cDNA do vírus
FA 17D/Esa/8.1 (não glicosilado). No canal 3, molde de cDNA do vírus FA 17D/Esa/5.1 glic (glicosilado). No
canal 4, molde de cDNA do vírus FA 17D/ Esa/8.1glic (glicosilado). II: Moldes de cDNA digeridos com a
enzima de restrição Xho I. No canal 1, molde de cDNA do vírus FA 17D/Esa/5.1 (não glicosilado). No canal 2,
molde de cDNA do vírus FA 17D/Esa/8.1 (não glicosilado). No canal 3, molde de cDNA do vírus FA
17D/Esa/5.1 glic (glicosilado). No canal 4, molde de cDNA do vírus FA 17D/Esa/8.1glic (glicosilado). Em (C):
RNA viral obtido através de transcrição in vitro. No canal 1, RNA do vírus FA 17DD não glicosilado. No canal
2, RNA do vírus FA 17DD glicosilado. No canal 3, RNA do vírus FA 17D/Esa/5.1 (não glicosilado). No canal 4,
molde de cDNA do vírus FA 17D/Esa/8.1 (não glicosilado). No canal 5, molde de cDNA do vírus FA
17D/Esa/5.1 glic (glicosilado). No canal 6, molde de cDNA do vírus FA 17D/Esa/8.1glic (glicosilado). Em (D)
No canal 1, o plasmídeo pT3/Esa trun/2 glic digerido com as enzimas de restrição Nsi I e Sal I. No canal 2, o
plasmídeo pT3/Esa trun/4 glic digerido com Nsi I e Sal I. No canal 3, o plasmídeo pT3 digerido com com Nsi I e
Sal I. No canal 4 , os plasmídeo pE200 glicosilado digerido com NsiI e SalI. Em (E): I: Reação de ligação
utilizando a enzima T4 DNA ligase. No canal 1, molde de cDNA do vírus FA 17D/Esa trun/2 glic. No canal 2,
molde de cDNA do vírus FA 17D/Esa trun/4 glic . No canal 3, molde de cDNA do vírus FA 17D/E200T3
glicosilado. II: Moldes de cDNA digeridos com a enzima de restrição XhoI. No canal 1, molde de cDNA do
vírus FA 17D/Esa trun/2 glic. No canal 2, molde de cDNA do vírus FA 17D/Esa trun/4 glic . No canal 3, molde
de cDNA do vírus FA 17D/E200T3 glicosilado. Em (F) preparação de RNA viral obtida através de transcrição in
vitro dos seguintes moldes de cDNA: (1) do vírus FA 17D/E200T3 glicosilado; (2) do vírus FA 17D/Esa
trun/2 glic e (3) RNA do vírus FA 17D/Esa trun/4 glic .
As amostras de RNA viral foram obtidas através da reação de transcrição in vitro e uma
parte desta foi analisada em eletroforese de gel de agarose (Figura 4.8-C e 4.8-F). Devido à
presença de estruturas secundárias e terciárias e ao fato do gel não ser desnaturante (com
glioxal/DMSO ou formaldeído), a migração do RNA não foi utilizada para aferirmos o peso
molecular exato do mesmo. Podemos observar nas figuras 4.8-C e 4.8-F que as bandas do
RNA infectivo migram entre as bandas 6,5 e 2,0 kb do marcador de peso molecular. As
bandas de tamanho inferior e em menor quantidade correspondem à transcrição de moldes de
cDNA viral incompletos que são formados juntamente com o completo.
4.2. Recuperação dos Vírus FA Recombinantes expressando EGFP
Entre 72 h e 96 h pós-transfecção dos RNAs dos vírus FA 17D recombinantes para
EGFP, as monocamadas de células Vero apresentaram efeito citopático (CPE). Os
sobrenadantes destas culturas foram, então, coletados e devidamente identificados (Tabela
45
4.3). Devido à melhor replicação dos vírus FA 17D/Esa/5.1 glic e FA 17D/Esa trun/4
glic (aparecimento de CPE em menor tempo que os vírus sem glicosilação na proteína E),
ambos contendo a proteína E glicosilada, estes foram selecionados para serem utilizados nos
experimentos posteriores.
Amostras destas preparações foram submetidas ao seqüenciamento genômico
nucleotídico na região correspondente à região de inserção dos cassetes, com o objetivo de
confirmar a integridade das inserções heterólogas nos vírus recombinantes e de verificar a
ocorrência de alguma modificação não desejada. Para este fim, o RNA dos sobrenadantes de
transfecção (1P) dos vírus recombinantes foi extraído e foi realizado RT-PCR, o qual gerou
um produto de 2.057 pb e outro de 1.940 pb para os sobrenadantes de transfecção dos vírus
FA17D/Esa/5.1 glic e FA17D/Esa trun/4 glic , respectivamente (Figura 4.9), correspondente à
região do genoma viral contendo a inserção heteróloga. Porém, além deste, a reação gerou um
produto de cerca de 1.000 pb (Figura 4.9), o qual poderia ser proveniente de uma população
viral com deleção da inserção heteróloga de seu genoma, ou então corresponder a um artefato
da reação, conforme apresentado posteriormente. A reação de seqüenciamento genômico
nucleotídico não foi bem sucedida devido ao fato da mesma conter dois produtos de PCR e,
desse modo, não permitir a leitura correta da região. Foram realizadas várias tentativas de
seqüenciamento de fragmentos purificados a partir de gel preparativo de agarose. Novamente,
a reação de seqüenciamento genômico nucleotídico não foi bem sucedida, pois não foi
possível a leitura dos nucleotídeos a serem seqüenciados, provavelmente devido à inibição
dos reagentes utilizados na reação de seqüenciamento provocada pelo processo de purificação
a partir de gel de agarose. Assim sendo, a integridade das inserções heterólogas nos vírus
recombinantes foi analisada somente através da técnica de citometria de fluxo e de
microscopia de fluorescência (itens 4.6 e 4.7).
Tabela 4.3: Vírus obtidos após a regeneração dos vírus FA recombinantes expressando EGFP.
Vírus Característica
FA 17D/Esa/5.1
Regenerado a partir do molde de cDNA obtido após ligação de pT3/Esa/5.1 e pE200.
FA 17D/Esa/5.1 glic
Regenerado a partir do molde de cDNA obtido após ligação de pT3/Esa/5.1 e pE200 glic.
FA 17D/Esa/8.1
Regenerado a partir do molde de cDNA obtido após ligação de pT3/Esa/8.1 e pE200.
FA 17D/Esa/8.1 glic
Regenerado a partir do molde de cDNA obtido após ligação de pT3/Esa/8.1 e pE200 glic.
pT3/Esa trun/2 glic
Regenerado a partir do molde de cDNA obtido após ligação de pT3/Esa trun/2 e pE200
glic.
pT3/Esa trun/4 glic
Regenerado a partir do molde de cDNA obtido após ligação de pT3/Esa trun/4 e pE200
glic.
46
Figura 4.9 - RT-PCR dos sobrenadantes de transfecção dos vírus recombinantes FA 17D/Esa/5.1
glic e FA 17D/Esa trun/4 glic: Em A) Vírus FA 17D/Esa/5.1 glic. No canal 1, FA 17D/E200T3, utilizado como
controle experimental negativo. No canal 2, os produtos de RT-PCR do vírus FA 17D/Esa/5.1 glic/1P. Em B)
Vírus FA 17D/Esa trun/4 glic. No canal 1, o vírus não-recombinante FA 17D/E200T3, utilizado como controle
experimental. No canal 2, FA 17D/Esa trun/4 glic /1P.
4.3. Produção de Estoques Virais
A partir dos sobrenadantes de transfecção, denominados primeira passagem (1P), já que
esta foi a primeira vez que o RNA sintetizado in vitro propagou-se e gerou progênie viral em
um sistema celular, foram produzidos estoques virais de modo a se obter um grande número
de amostras homogêneas para a execução dos experimentos posteriores. Estes estoques virais
foram caracterizados em relação ao título viral. O seqüenciamento genômico nucleotídico não
foi realizado devido aos mesmos fatos relatados na seção 4.2. Assim sendo, a integridade das
inserções heterólogas foi analisada somente através das técnicas de citometria de fluxo e de
microscopia de fluorescência (itens 4.6 e 4.7).
Um dos vírus recombinantes contendo o primeiro cassete de expressão (Construção I)
foi selecionado para a realização dos experimentos posteriores, pelo fato de o estoque viral
apresentar melhor título. Este vírus recombinante foi denominado FA17D/Esa/5.1 glic. O
mesmo foi feito para o vírus recombinante contendo o segundo cassete de expressão
(Construção II), e o vírus selecionado foi denominado FA17D/Esa trun/4 glic .
O título obtido para o estoque do vírus FA17D/Esa/5.1 glic foi de 1,52 x 10
6
PFU/ml e
para o estoque do vírus FA17D/Esa trun/4 glic foi de 1,03 x 10
6
PFU/ml, compatíveis com os
controles experimentais e suficientemente elevados para a execução das etapas posteriores do
trabalho.
47
4.4. Curva de Crescimento Viral
Após a infecção de monocamadas de células Vero, o crescimento viral foi acompanhado
até 144 h, com o recolhimento de alíquotas em intervalos de 24 h. Os resultados apresentados
na Figura 4.10 e na Tabela 4.4 são provenientes de três curvas de crescimento independentes.
Pode-se observar que os vírus recombinantes FA 17D/Esa/5.1 glic e FA 17D/Esa trun/4
glic, que apresentam a proteína E glicosilada, e o vírus controle experimental FA
17D/E200T3, sem glicosilação da proteína E, tiveram o pico de crescimento viral 96 horas
pós-infecção, com valores de 6,36 ± 0,54, 6,41 ± 0,05 e 6,40 ± 0,27 log10 PFU/ml,
respectivamente. Porém, o crescimento dos vírus FA17D/Esa/5.1 glic FA17D/Esa trun/4 glic
é menos pronunciado que o crescimento do vírus vacinal FA 17DD (Figura 4.10 e Tabela
4.4), que apresentou um pico de crescimento viral 72 horas pós-infecção, com o título de 7,00
± 0,50 log10 PFU/ml.
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h
horas p.i.
Título (log 10 PFU/ml)
17DD 17D/E200T3
17D/Esa/5.1glic 17D/Esa/4 glic
Figura 4.10 - Curva de Crescimento do Vírus Recombinante FA17D/Esa/5.1 glic e FA17D/Esa
trun/4 glic, e dos vírus controle 17DD e FA 17D/E200T3 em células Vero.
Tabela 4.4: Determinação dos Valores Cinéticos de Crescimento Viral em Cultura de Células Vero
(log10 PFU/mL): Valores da média e de desvio padrão. Em negrito estão destacados os valores correspondentes
ao pico de crescimento viral.
Amostras FA 17DD
FA
17D/E200T3
FA17D/Esa/5.1
glic
FA17D/Esa trun/4
glic
24 h
4,39 ± 0,73 4,25 ± 0,47 3,07 ± 0,39 3,83 ± 0,81
48 h
6,58 ± 0,60 5,96 ± 0,44 4,96 ± 0,74 5,60 ± 0,86
72 h 7,00 ± 0,50
6,21 ± 0,32 5,94 ± 0,56 6,25 ± 0,35
96 h
6,97 ± 0,43
6,40 ± 0,27 6,36 ± 0,54 6,41 ± 0,05
120 h
6,54 ± 0,30 6,30 ± 0,28 6,52 ± 0,25 6,36 ± 0,18
144 h
6,79 ± 0,35 6,61 ± 0,37 6,48 ± 0,24 6,24 ± 0,29
Horas p.i.
48
4.5. Estudo da morfologia de placas de lise
Somente o vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic foi analisado quanto à morfologia
de suas placas de lise. O estoque (2P) do vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic foi
submetido a duas passagens independentes (P1 e P2) em monocamadas de células Vero. O
vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic/2P apresentou tamanho médio de placas de lise
superior ao do vírus controle com fenótipo de placa pequena, FA 17D/E200T3 (Tabela 4.5).
Os vírus recombinantes FA 17D/Esa/5.1 glic/5P1 e FA 17D/Esa/5.1 glic/5P2 apresentaram
tamanho médio de placas de lise semelhante ao vírus FA 17D/E200T3, porém menor ao do
vírus vacinal controle FA 17DD, que apresenta fenótipo de placa grande (Tabela 4.5). Os
vírus recombinantes FA 17D/Esa/5.1 glic/10P1 e FA 17D/Esa/5.1 glic/10P2 apresentaram
tamanho médio de placas de lise superior ao do vírus controle FA 17D/E200T3 (Tabela 4.5).
Tabela 4.5: Determinação do tamanho de placas de lise dos vírus FA 17D/Esa/5.1 glic - passagens
virais 2P, 5P e 10P em monocamada de células Vero. Tamanho das placas em centímetros (média ± desvio
padrão).
Amostra Viral Passagem em
monocamada
celular
Média do tamanho da placa de lise
± Desvio Padrão (cm)
FA 17D/E200T3
3P
1,30 ± 0,39
FA 17DD
2,38 ± 0,92
2P
2,38 ± 1,62
5P1
1,05 ± 0,34
5P2
1,38 ± 0,47
10P1
3,82 ± 1,51
FA17D/Esa/5.1 glic
10P2
3,40 ± 1,28
4.6. Caracterização da cinética de expressão de EGFP por células Vero infectadas
com os vírus recombinantes FA 17D/Esa/5.1 glic e FA 17D/Esa trun/4 glic através de
microscopia de fluorescência
Para o vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic, observou-se uma expressão muito
reduzida de EGFP pelas células 24 h após a infecção. Após 48 h de infecção, a expressão de
EGFP tornou-se significativa, e entre os pontos de 72 e 96 h após a infecção detectou-se um
pico de expressão de EGFP pelas células. Após 120 h de infecção as células já se
encontravam muito comprometidas pela infecção viral, tornando-se escassas. Neste ponto
notou-se uma redução na expressão de EGFP, a qual permanece, todavia, significativa. Além
disto, pode-se observar uma concentração de EGFP em estruturas perinucleares que
49
provavelmente correspondem ao retículo endoplasmático (Figura 4.11-A). As células
infectadas com o vírus FA 17D/E200T3, utilizadas como controle negativo, não apresentaram
emissão de fluorescência verde.
Para o vírus recombinante FA 17D/Esa trun/4 glic, as mesmas características de
expressão de EGFP foram observadas, tendo atingido o pico de expressão entre 72 e 96 h após
a infecção. Podem-se observar as mesmas características descritas para as células infectadas
com o vírus FA 17D/Esa/5.1 glic, ou seja, uma concentração de EGFP nestas mesmas
estruturas perinucleares que provavelmente correspondem ao retículo endoplasmático (Figura
4.11-B).
50
(A) (B)
Figura 4.11: Cinética de expressão de EGFP em células Vero infectadas com o vírus recombinantes FA 17D/Esa/5.1 glic e FA 17D/Esa trun/4 glic: Em (A): Células
Vero infectadas com o vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic por 24, 48, 72, 96 e 120h, fixadas e coradas com Azul de Evans (emissão de fluorescência vermelha) a fim de se
delimitar cada célula, e com DAPI (emissão de fluorescência azul). Como controle, as células foram infectadas com o vírus da Febre Amarela não-recombinante FA 17D/E200T3, no
qual não é detectada emissão de fluorescência em verde. Em (B): Células Vero infectadas com os estoques virais de FA 17D/Esa/5.1 glic e FA 17D/Esa trun/4 glic e fixadas nos
intervalos de tempo de 72 h e 96 h.
51
4.7. Caracterização da cinética de expressão de EGFP por células Vero infectadas
com os vírus recombinantes FA17D/Esa/5.1 glic e FA17D/Esa trun/4 glic através de
citometria de fluxo
A expressão da proteína EGFP expressa pelos vírus FA17D/Esa/5.1 glic e FA17D/Esa
trun/4 glic também foi analisada por citometria de fluxo, empregada devido à observação de
um possível artefato quando a técnica de RT-PCR foi utilizada (Ver seção 4.2). A técnica de
FACS se mostrou mais precisa, além de tornar possível a detecção de antígenos virais e EGFP
ao mesmo tempo.
4.7.1. Vírus FA17D/Esa/5.1 glic
Células Vero não infectadas ou infectadas com os vírus controle FA 17D/E200T3 ou o
recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic foram marcadas com anticorpo a-FA a 1:80 ou 1:100 e
com anticorpo anti-IgG de camundongo conjugado a PE 1:40 ou 1:50 (Figuras 4.12-A e B).
Amostras de células não infectadas foram utilizadas como controle experimental. Entre
0,02 e 2,06% das células não infectadas apresentaram-se positivas para FA, e entre 0,58 e
1,58% para EGFP, configurando baixa interferência dos anticorpos utilizados a 1:100 e 1:50
nos detectores para marcação de FA e EGFP (Figura 4.12-A).
Nas células marcadas com o anticorpo anti-FA a 1:100 e o anti-IgG de camundongo
conjugado a PE a 1:50 (Figura 4.12-A), infectadas com o vírus controle FA 17D/E200T3, o
antígeno viral (FA
+
) pôde ser detectado 24 h após a infecção em 0,77% das células:
(FA
+
+FA
+
EGFP
+
FA
17D/E200T3
) - (FA
+
+FA
+
EGFP
+
Mock
). Porém, não houve marcação para
EGFP: (FA
+
EGFP
+
FA
17D/E200T3
) - (FA
+
EGFP
+
Mock
). A porcentagem de células positivas para
Febre Amarela aumentou para 9,29%, 55,55%, 32,62% e 34,67% após 48, 72, 96 e 120 horas
após a infecção, respectivamente (Tabela 4.6). Entretanto, não houve marcação para EGFP
durante todo o período analisado. Já a infecção pelo vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic
demonstrou a presença do antígeno viral e de EGFP (FA
+
EGFP
+
) em 3,67% das células 24 h
após a infecção. A porcentagem de células duplo-positivas aumentou para 41,58% em 48 h e
40,33% em 72 h, atingindo o platô de 56,36% células duplo positivas em 96 h e mantendo
esta porcentagem em 120 h após a infecção (55,94%) (Tabela 4.6).
52
(A)
53
20
30
40
50
60
70
80
90
100
24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
horas pós-infecção
% células duplo-marcadas/ % células infectadas
Anti-FA 1:100 Anti-IgG de camundongo-PE 1:50)
Figura 4.12-A: Análise cinética da expressão de EGFP por células Vero infectadas pelo vírus
recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic: Análise da expressão de EGFP utilizando o anticorpo α-FA na
concentração 1:100 e anti-IgG de camundongo-PE na concentração 1:50. Porcentagem de células infectadas pelo
vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic que expressam EGFP (% células duplo-marcadas/ % total de células
infectadas x 100) ao longo de 120 horas.
Utilizando-se a equação apresentada na seção de Materiais e Métodos (item 3.7) para a
estimativa do percentual de células infectadas pelo vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic
que expressam tanto a inserção quanto antígenos virais em relação ao total de células que
expressam antígenos virais, conclui-se que este valor é de 32,16% após 24 h de
infecção,aumenta para 83,3% após 48 h de infecção, atinge o pico de expressão em 92,2% das
células após 72 h de infecção e mantém em 84,6% e 87,9% das células após 96 h e 120h de
infecção, respectivamente (Figura 4.12-B).
54
Tabela 4.6: Valores, em porcentagem, de células não infectadas, de células infectadas com o vírus
controle FA 17D/E200T3 e com o vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic (marcadas com anticorpos αFA
1:100 anti-IgG de camundongo-PE 1:50): Expressão de antígenos de FA (FA
+
), EGFP (EGFP
+
), e dupla-
marcação (FA
+
+ EGFP
+
). Os valores para os vírus FA 17D/E200T3 e FA 17D/Esa/5.1 glic são resultantes dos
valores obtidos durante o experimento, subtraídos dos valores obtidos para as células não infectadas (Mock). Os
valores negativos foram considerados 0 (zero).
Tempo (h) 24 48 72 96 120
FA
+
(%)
0,04 0,02 1,32 0,84 2,06
EGFP
+
(%)
0,58 0,64 1,16 1,06 1,58
Mock
(αFA 1:100
anti-IgG de
camundongo-
PE 1:50)
FA
+
+
EGFP
+
(%)
0,03 0,02 0,89 0,73 1,52
FA
+
%
(%)
6,77 61,64 56,7 63,72 68,37
EGFP
+
(%)
0,25 0,04 0,94 0,73 1,30
FA
17D/E200T3
(αFA 1:100
anti-IgG de
camundongo-
PE 1:50)
FA
+
+
EGFP
+
(%)
0,31 0,64 0,02 0 0
FA
+
(%)
7,94 54,65 41,26 64,49 60,76
EGFP
+
(%)
3,84 44,83 74,74 73,37 73,10
FA
17D/Esa/5.1
glic
(αFA 1:100
anti- anti-
IgG de
camundongo-
PE 1:50)
FA
+
+
EGFP
+
(%)
3,67 41,58 40,33 56,36 55,94
55
Os melhores resultados foram obtidos utilizando-se o anticorpo anti-FA a 1:80 e o anti-
IgG de camundongo conjugado a PE a 1:40 (Figura 4.12-B). Amostras de células não
infectadas foram utilizadas como controle experimental. Entre 0,07 e 2,98% das células não
infectadas apresentaram-se positivas para FA, e entre 0,69 e 5,03% para EGFP, configurando
baixa interferência dos anticorpos utilizados a 1:80 e 1:40 nos detectores para marcação de
FA e EGFP (Figura 4.12-B).
Nas células infectadas com o vírus controle FA 17D/E200T3, o antígeno viral (FA+) já
pôde ser detectado 24 h após a infecção em 6,43% das células (Tabela 4.7). A porcentagem de
células positivas para Febre Amarela rapidamente aumentou para 72,43% após 48h de
infecção, atingindo a porcentagem máxima de 85,56% em 72h e diminuindo para 80,98% e
72,98% após 96 e 120h após a infecção (Tabela 4.7). Entretanto, a porcentagem de células
positivas para EGFP se manteve baixa durante todo o período analisado (Tabela 4.7). Já a
infecção pelo vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic demonstrou a presença do antígeno
viral e de EGFP (FA
+
EGFP
+
) em 2,11% das células 24 h após a infecção. A porcentagem de
células duplo-positivas aumentou para 40,77% em 48 h e 58,11% em 72 h, atingindo o platô
de 62,47% células duplo positivas em 96 h e mantendo esta porcentagem em 120 h após a
infecção (62,61%) (Tabela 4.7).
Utilizando-se a equação apresentada na seção de Materiais e Métodos (item 3.7),
conclui-se que a porcentagem de células infectadas que expressam tanto a inserção heteróloga
quanto antígenos virais é de 46,22% após 24 h de infecção, aumenta para 76,08% após 48 h
de infecção, atinge o pico de expressão em 97,74% das células após 72 h de infecção e
mantém em 87,39% e 92,06% das células após 96 h e 120h de infecção, respectivamente
(Figura 4.12-B).
As células infectadas com o vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic apresentaram uma
melhor expressão de antígenos virais e de EGFP nas células infectadas 72 h após a infecção
(Figura 4.12-B). Portanto, estas condições foram utilizadas para todos os estudos do vírus
FA17D/Esa/5.1 glic que utilizaram a técnica de citometria de fluxo.
56
(B)
57
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
horas pós-infecção
% células duplo-marcadas/ % células infectadas
Anti-FA 1:80 Anti-IgG de camundongo-PE 1:40
Figura 4.12-B: Análise cinética da expressão de EGFP por células Vero infectadas pelo vírus
recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic: Análise da expressão de EGFP utilizando o anticorpo α-FA na
concentração 1:80 e anti-IgG de camundongo-PE na concentração 1:40. Porcentagem de células infectadas pelo
vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic que expressam EGFP (% células duplo-marcadas/ % total de células
infectadas x 100) ao longo de 120 horas.
58
Tabela 4.7: Valores, em porcentagem, de células não infectadas, de células infectadas com o vírus
controle FA 17D/E200T3 e com o vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic (marcadas com anticorpos αFA
1:80 anti-IgG de camundongo-PE 1:40): Expressão de antígenos de FA (FA
+
), EGFP (EGFP
+
), e dupla-
marcação (FA
+
+ EGFP
+
). Os valores para os vírus FA 17D/E200T3 e FA 17D/Esa/5.1 glic são resultantes dos
valores obtidos durante o experimento, subtraídos dos valores obtidos para as células não infectadas (Mock). Os
valores negativos foram considerados 0 (zero).
Tempo (h) 24 48 72 96 120
FA
+
(%)
0,4 0,07 1,7 0,89 2,98
EGFP
+
(%)
1,06 0,72 5,03 0,69 1,04
Mock
(aFA 1:80
anti-IgG de
camundongo-
PE 1:40)
FA
+
+
EGFP
+
(%)
0,37 0,07 1,0 0,55 1,02
FA
+
%
(%)
6,43 72,43 86,56 80,98 71,98
EGFP
+
(%)
0 0 0 0,06 0
FA
17D/E200T3
(αFA 1:80
anti- anti-
IgG de
camundongo-
PE 1:40)
FA
+
+
EGFP
+
(%)
0 0,4 0,61 0,09 0
FA
+
(%)
6,56 48,93 62,4 73,56 69,35
EGFP
+
(%)
1,74 46,81 72,69 73,12 74,65
FA
17D/Esa/5.1
glic
(αFA 1:80
anti- anti-
IgG de
camundongo-
PE 1:40)
FA
+
+
EGFP
+
(%)
2,11 40,77 58,11 62,47 62,61
59
4.7.2. FA 17D/Esa trun/4 glic
Quando o anticorpo α-FA foi utilizado na concentração 1:80 e o anticorpo anti-IgG de
camundongo-PE foi utilizado na concentração 1:40, as células infectadas com o vírus controle
FA 17D/E200T3 e com o vírus recombinante FA17D/Esa trun/4 glic não apresentaram uma
marcação satisfatória para o antígeno viral (FA
+
) (Dado não mostrado).
Amostras de células não infectadas foram utilizadas como controle experimental. Entre
0,86% e 4,42% e 0,67% e 4,65% das células não infectadas apresentaram-se positivas para
FA e EGFP, respectivamente, configurando baixa interferência dos anticorpos utilizados a
1:60 e 1:30 nos detectores para marcação de FA e EGFP (Figura 4.13-A e Tabela 4.8).
Após 24 h de infecção com o vírus controle FA 17D/E200T3, o antígeno viral (FA
+
) foi
detectado em 0,77% das células. Ao longo do tempo, a porcentagem de células FA+
aumentou, sendo 9,49% após 48 h, 25,55% após 72 h, 32,62% em 96 h e atingindo 34,66%
após 120 h de infecção. Enquanto que a expressão de EGFP não foi observada no período
analisado (Tabela 4.8).
Nas células infectadas com o vírus recombinante FA 17D/Esa trun/4 glic, o antígeno
viral (FA
+
) foi detectado em 0,28% das células, enquanto a expressão de EGFP e de antígenos
virais pelas células infectadas (EGFP
+
+FA
+
) foi observada em 0,54% das células. Após 48 h
de infecção, o antígeno viral (FA
+
) foi detectado em 12,43% das células, e a expressão de
antígenos virais e EGFP (EGFP
+
FA
+
) foi observada em 12,68% das células. Após 72 h de
infecção, o antígeno viral (FA
+
) foi detectado em 31,26% das células, enquanto a expressão
de antígenos virais e EGFP (EGFP
+
FA
+
) foi observada em 31,29% das células. Após 96 h de
infecção, o antígeno viral (FA
+
) foi detectado em 25,16% das células, e a expressão de
antígenos virais e EGFP (EGFP
+
FA
+
) foi observada em 25,10% das células. Após 120 h de
infecção, o antígeno viral (FA
+
) foi detectado em 46,02% das células, enquanto a expressão
de EGFP (EGFP
+
FA
+
) foi observada em 45,48% das células (Figura 4.13-A).
Utilizando-se a equação apresentada na seção de Materiais e Métodos (item 3.7) para a
estimativa do percentual de células infectadas pelo vírus recombinante FA 17D/Esa trun/4
glic que expressam tanto a inserção quanto antígenos virais em relação ao total de células que
expressam antígenos virais, conclui-se que este valor é de 92,9% após 24 h de infecção,
97,4% após 48 h de infecção, 99,6% após 72 h de infecção, 99,3% após 96 h de infecção e de
98,5% após 120 h de infecção (Figura 4.13-B).
60
(A)
61
(B)
20
30
40
50
60
70
80
90
100
24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
horas pós-infecção
% células duplo-marcadas/ % células infectadas
Anti-FA 1:60 Anti-IgG de camundongo-PE 1:30
Figura 4.13 - Análise cinética da expressão de EGFP por células Vero infectadas pelo vírus
recombinante FA17D/Esa trun/4 glic : Em (A): Análise da expressão de EGFP utilizando anticorpo αFA na
concentração 1:60 e anti- IgG de camundongo-PE na concentração 1:30. Em (B): Porcentagem de células
infectadas pelo vírus recombinante FA17D/Esa trun/4 glic que expressam EGFP (FL1/FL1+FL2 x 100) ao longo
de 120 horas.
As células infectadas com o vírus controle FA 17D/E200T3 e com o vírus recombinante
FA 17D/Esa trun/4 glic apresentaram uma melhor detecção, tanto do antígeno viral (FA
+
)
quanto da expressão da proteína EGFP (EGFP
+
FA
+
), quando se utilizou o anticorpo α-FA na
concentração de 1:60 e o anticorpo anti-IgG de camundongo-PE na concentração de 1:30
(Figura 4.13-A). As células infectadas com o vírus recombinante FA 17D/Esa trun/4 glic
apresentaram uma melhor expressão de antígenos virais e de EGFP nas células infectadas 72
h após a infecção (Figura 4.13-B). Portanto, estas condições foram utilizadas para todos os
estudos do vírus FA17D/Esa trun/4 glic que utilizaram a técnica de citometria de fluxo.
62
Tabela 4.8: Valores, em porcentagem, de células não infectadas, de células infectadas com o vírus
controle FA 17D/E200T3 e com o vírus recombinante FA 17D/Esa trun/4 glic (marcadas com anticorpos
αFA 1:60 anti-IgG de camundongo-PE 1:30): Expressão de antígenos de FA (FA
+
), EGFP (EGFP
+
), e dupla-
marcação (FA
+
+ EGFP
+
). Os valores para os vírus FA 17D/E200T3 e FA 17D/Esa trun/4 glic são resultantes dos
valores obtidos durante o experimento, subtraídos dos valores obtidos para as células não infectadas (Mock). Os
valores negativos foram considerados 0 (zero).
Tempo (h) 24 48 72 96 120
FA
+
(%)
0,86 1,53 1,07 1,74 4,42
EGFP
+
(%)
0,67 0,91 1,04 1,82 4,65
Mock
(aFA 1:60
anti-IgG de
camundongo-
PE 1:30)
FA
+
+
EGFP
+
(%)
0,52 0,88 0,93 1,63 4,22
FA
+
%
(%)
0,77 9,29 25,55 32,62 34,67
EGFP
+
(%)
0 0 0 0 0
FA
17D/E200T3
(αFA 1:60
anti- anti-
IgG de
camundongo-
PE 1:30)
FA
+
+
EGFP
+
(%)
0 0 0 0 0
FA
+
(%)
0,28 12,43 31,26 25,16 46,02
EGFP
+
(%)
2,55 42,49 90,01 88,57 88,17
FA 17D/Esa
trun/4 glic
(αFA 1:60
anti- anti-
IgG de
camundongo-
PE 1:30)
FA
+
+
EGFP
+
(%)
0,54 12,68 31,29 25,10 45,48
63
4.8. Estudo da Estabilidade Genética
Para elucidar se os vírus FA recombinantes expressando EGFP eram geneticamente
estáveis, foram feitas duas séries independentes de passagens consecutivas dos vírus em
monocamadas celulares a partir dos estoques virais de segunda passagem. Todas as passagens
virais foram tituladas para garantir que a m.o.i. se mantivesse em torno de 0,02 (Tabelas 4.9,
4.10 e 4.11).
Devido ao fato de a técnica de RT-PCR ter se mostrado inconclusiva, no que diz
respeito à estabilidade genética dos vírus recombinantes analisados, a estabilidade genética
viral foi também analisada através da técnica de citometria de fluxo.
4.8.1.Vírus FA17D/Esa/5.1glic
Para elucidar se o vírus FA 17D/Esa/5.1 glic recombinante é geneticamente estável,
foram feitas duas séries independentes de passagens consecutivas em monocamadas celulares
dos vírus recombinantes a partir dos estoques virais de segunda passagem. Os vírus foram
levados até a décima-quinta passagem celular e as passagens 5, 10 e 15 (5P, 10P e 15P) foram
utilizadas nos experimentos de RT-PCR de citometria de fluxo (Figura 4.14-A). As m.o.i.
empregadas variaram de 0,015 a 0,06 PFU/mL (Tabela 4.9).
4.8.1.1. Análise por RT-PCR
As preparações de RNA viral foram submetidas a RT-PCR e os produtos analisados por
eletroforese em gel de agarose (Figura 4.14-C). A presença de um fragmento de 2.057pb
indica a presença da inserção heteróloga, enquanto um fragmento de 1.001pb indica a perda
desta.
Pode-se observar que, para as passagens virais 5P e 10P das duas séries independentes
do vírus FA 17D/Esa/5.1glic, houve a detecção de um produto de cerca de 2.000 pb, o qual
corresponde à região do genoma viral contendo a inserção heteróloga (Figura 4.14-C).
Adicionalmente, detectou-se um produto de cerca de 1.000 pb (Figura 4.14-C), conforme
citado no item 4.2 (Figura 4.6). No entanto, a passagem viral 15P gerou apenas um produto de
cerca de 1.000 pb, indicando a perda da inserção heteróloga de seu genoma (Figura 4.14).
64
4.8.1.2. Análise por citometria de fluxo
Células Vero não infectadas ou infectadas com os vírus FA 17D/E200T3 ou FA
17D/Esa/5.1 glic nas várias passagens celulares foram marcadas com anticorpo anti-FA a 1:80
e com anticorpo anti-IgG de camundongo conjugado a PE 1:40, respectivamente. A
estabilidade genética dos vírus foi determinada pela porcentagem de células duplo marcadas
(FA
+
EGFP
+
) e as células infectadas (FA
+
) nas passagens celulares 1P, 2P, 5P, 10P e 15P.
A análise dos resultados mostra que a maior parte das células infectadas com as
passagens virais 5P1 e 5P2 (86,95% e 91,28%, respectivamente) expressa altos níveis de
(Figura 4.14-B). As células infectadas com as passagens virais 10P1 e 10P2 mantêm a
expressão da proteína EGFP (83,5% e 82,53%, respectivamente), porém já se pode notar uma
pequena população de células infectadas com vírus que não mais carregam a inserção
heteróloga, isto é, houve diminuição da porcentagem de células infectadas duplamente
marcadas em relação ao total de células positivas para antígenos virais (Figura 4.14-B). As
células infectadas com a passagem 15P1 mostraram a perda total da inserção heteróloga
(1,20%), e as células infectadas com a passagem 15P2 mostraram uma grande perda da
inserção heteróloga (20,13%) (Figura 4.14-B). Juntos, estes resultados mostram que o vírus
recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic manteve a inserção heteróloga até, pelo menos, a
passagem viral 10P, porém na passagem seriada de número 15P a inserção heteróloga já havia
sido deletada do genoma viral (Figura 4.14-B e C).
Tabela 4.9. Estabilidade Genética do vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic: Número da passagem
viral em monocamada celular, título e m.o.i. expresso em PFU/mL.
Estabilidade Genética do vírus recombinante FA
17D/Esa/5.1 glic
Passagem Título (PFU/mL)
m.o.i.
(PFU/mL)
2P 1,52E+06 0,02
3P1 4,45E+06 0,06
3P2 4,92E+06 0,06
4P1 2,92E+06 0,02
4P2 1,75E+06 0,02
5P1 4,27E+06 0,02
5P2 4,87E+06 0,02
6P1 3,50E+06 0,015
6P2 2,25E+06 0,015
7P1 1,50E+06 0,007
7P2 1,72E+06 0,007
8P1 3,68E+06 0,017
8P2 4,18E+06 0,02
9P1 2,75E+06 0,012
9P2 3,23E+06 0,015
10P1 3,27E+06 0,015
10P2 4,50E+06 0,02
65
Figura 4.14. Estabilidade genética do vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic. Em A) Esquema do
estudo da estabilidade genética do vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic. Em B) Manutenção da inserção
heteróloga pelo vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic avaliada por citometria de fluxo (FACS). Em C)
Produtos de RT-PCR do RNA viral extraído de diferentes passagens seriadas do vírus FA 17D/Esa/5.1 glic: no
canal 1, o vírus não-recombinante FA 17D/E200T3, utilizado como controle experimental. Na canal 2, FA
17D/Esa/5.1/2P. No canal 3, FA 17D/Esa/5.1 glic/5P1. No canal 4, FA 17D/Esa/5.1 glic/5P2. No canal 5, FA
17D/Esa/5.1 glic/10P1. No canal 6, FA 17D/Esa/5.1 glic/10P2 e no canal 7, FA 17D/Esa/5.1 glic/15P1. No canal
8, FA17D/Esa/5.1 glic/15P2.
4.8.2. Clones Virais FA17D/Esa/5.1 glic
Com o objetivo de selecionarmos um clone do vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic,
que expressa a região HA completa, que mantenha estável a inserção heteróloga dentro de seu
genoma por um número maior de passagens em sistema celular, foi realizado o experimento
de “Plaque Pick”, conforme descrito na seção 3.8.1.2. Foram selecionados dez clones virais e
quatro deles foram analisados: FA 17D/Esa/5.1 glic-2, FA 17D/Esa/5.1 glic-4, FA
17D/Esa/5.1 glic-5, FA 17D/Esa/5.1 glic-6.
Para elucidar se os clones virais recombinantes são geneticamente estáveis, foram feitas
passagens consecutivas em monocamadas celulares a partir da passagem viral 3 (3P). Os vírus
foram cultivados até a décima-quinta passagem celular e as passagens 5, 10 e 15 (5P, 10P e
15P) foram analisadas por RT-PCR e citometria de fluxo (Figuras 4.15-A, 4.16-A e 4.17-A).
As m.o.i. empregadas variaram de 0,005 a 0,04 PFU/ml (Tabela 4.10).
66
4.8.2.1. Análise por RT-PCR
As preparações de RNA viral foram submetidas a RT-PCR e os produtos analisados por
eletroforese em gel de agarose (Figuras 4.15-A a E, 4.16-A a E, 4.17-A a E).
O RT-PCR da passagem viral 5 (5P) dos clones denominados FA 17D/Esa/5.1 glic-2
(Figura 4.15-A a E), FA 17D/Esa/5.1 glic-4 (Figura 4.16-A a E) e FA 17D/Esa/5.1 glic-5
(Figura 4.17-A a E) gerou os produtos de cerca de 2.000 pb e de 1.000 pb. O RT-PCR da
passagem viral 10 (10P) do clone FA 17D/Esa/5.1 glic-2 gerou apenas o produto de cerca de
1.000 pb, indicando a perda da inserção heteróloga entre a quinta e a décima passagens virais.
O RT-PCR da passagem viral 10 (10P) dos clones FA 17D/Esa/5.1 glic-4 (Figura 4.16-A a E)
e FA 17D/Esa/5.1 glic-5 (Figura 4.17-A a E) gerou os produtos de cerca de 2.000 pb e de
1.000 pb. Porém o RT-PCR da passagem viral 15 (15P) destes dois clones virais gerou apenas
o produto de cerca de 1.000 pb, indicando a perda da inserção heteróloga entre a décima e a
décima-quinta passagens (Figuras Figura 4.16-A a E e Figura 4.17-A a E)
Para todas as passagens virais analisadas, o RT-PCR do clone denominado FA
17D/Esa/5.1 glic-6 (Figura 4.18-A a E), gerou os mesmos produtos de cerca de 2.000 pb e de
1.000 pb (Figura 4.18-A a E), indicando a manutenção da inserção heteróloga até, pelo
menos, a décima-quinta passagem.
Portanto, de 4 clones do vírus FA 17D/Esa/5.1 glic analisados, 2 mantiveram a inserção
heteróloga até a décima passagem e 1 manteve a inserção heteróloga até, pelo menos, a
décima-quinta passagem.
4.8.2.2. Análise por citometria de fluxo
A análise dos resultados para o clone viral FA 17D/Esa/5.1 glic-2 (Figura 4.15-A a F)
mostrou que 94,5% das células infectadas com a passagem viral 5 expressam EGFP. Porém,
apenas 6,5% das células infectadas com a passagem viral 10 expressam a proteína EGFP,
indicando que a maior parte da população de células infectadas com vírus não mais carrega a
inserção heteróloga em seu genoma (diminuição da porcentagem de células duplamente
marcadas). Para o clone viral FA 17D/Esa/5.1 glic-4 (Figura 4.16-A a F), a análise dos
resultados mostra que 98,6% das células infectadas com a passagem viral 5 expressam EGFP.
67
Figura 4.15: Estabilidade genética do vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic-2 por RT-PCR e
citometria de fluxo. O clone viral FA17D/Esa/5.1 glic-2 foi cultivado em células Vero por até 10 passagens
virais. O sobrenadante das passagens virais 1P (A), 2P (B), 3P (C), 5P (D) e 10P (E) foi recolhido. O RNA das
amostras foi extraído e o RT-PCR realizado (A a E). Após 96h de infecção, as células foram tripsinizadas,
marcadas com anti-FA e anti-IgG-PE e analisadas por citometria de fluxo (A, B, D, E e F).
68
Figura 4.16: Estabilidade genética do vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic-4 por RT-PCR e
citometria de fluxo. O clone viral FA17D/Esa/5.1 glic-4 foi cultivado em células Vero por até 10 passagens
virais. O sobrenadante das passagens virais 1P (A), 2P (B), 3P (C), 5P (D) e 10P (E) foi recolhido. O RNA das
amostras foi extraído e o RT-PCR realizado (A a E). Após 96h de infecção, as células foram tripsinizadas,
marcadas com anti-FA e anti-IgG-PE e analisadas por citometria de fluxo (A, B, D, E e F).
69
Na passagem viral 10, 32,6% das células infectadas expressam a proteína EGFP,
indicando que uma parte da população de células infectadas com vírus que não mais carregam
a inserção heteróloga em seu genoma (diminuição da porcentagem de células duplamente
marcadas). As células infectadas com a passagem viral 15 não mais expressava a proteína
EGFP, indicando a perda da inserção heteróloga entre a décima e a décima-quinta passagens.
A análise dos resultados para o clone viral FA 17D/Esa/5.1 glic-5 (Figura 4.17-A a F)
mostrou que 95,92% das células infectadas com a passagem viral 5 e 76,71% das células
infectadas com a passagem viral 10 expressavam EGFP. As células infectadas com a
passagem viral 15 não mais expressavam EGFP, indicando a perda da inserção heteróloga
entre a décima e a décima-quinta passagens.
No caso do clone viral FA 17D/Esa/5.1 glic-6 (Figura 4.18-A a F), a análise dos
resultados mostrou que 95,78% das células infectadas com a passagem viral 5 e 93,10% das
células infectadas com a passagem viral 10 expressavam EGFP. Cerca de 68% das células
infectadas com a passagem viral 15 expressavam EGFP, porém já se pode notar uma pequena
população de células infectadas com vírus que não mais carregam a inserção heteróloga em
seu genoma (diminuição da porcentagem de células infectadas duplamente marcadas).
Tabela 4.10: Estabilidade Genética dos vírus recombinantes FA17D/Esa/5.1 glic clonados: Número
da passagem viral em monocamada celular e m.o.i, expressa em PFU/mL. NR: não realizado.
Estabilidade Genética dos vírus recombinantes FA17D/Esa/5.1 glic clonados –
m.o.i. (PFU/mL)
Passagem
FA17D/Esa/5.1
glic-2
FA17D/Esa/5.1
glic 4
FA17D/Esa/5.1
glic 5
FA17D/Esa/5.1
glic 6
2P
(estoque viral)
0,02 0,02 0,02 0,02
3P NR NR NR NR
4P 0,02 0,02 0,02 0,036
5P 0,01 0,01 0,01 0,02
6P 0,013 0,013 0,03 0,033
7P 0,04 0,04 0,03 0,04
8P 0,005 0,02 0,013 0,04
9P 0,02 0,02 0,02 0,02
10P 0,02 0,02 0,02 0,017
11P NR NR NR 0,01
12P NR NR NR 0,02
13P NR NR NR 0,02
14P NR NR NR 0,03
15P NR NR NR 0,02
70
Figura 4.17: Estabilidade genética do vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic-5 por RT-PCR e
citometria de fluxo. O clone viral FA17D/Esa/5.1 glic-5 foi cultivado em células Vero por até 10 passagens
virais. O sobrenadante das passagens virais 1P (A), 2P (B), 3P (C), 5P (D) e 10P (E) foi recolhido. O RNA das
amostras foi extraído e o RT-PCR realizado (A a E). Após 96h de infecção, as células foram tripsinizadas,
marcadas com anti-FA e anti-IgG-PE e analisadas por citometria de fluxo (A, B, D, E e F).
71
Figura 4.18.: Estabilidade genética do vírus recombinante FA17D/Esa/5.1 glic-6 por RT-PCR e
citometria de fluxo. O clone viral FA17D/Esa/5.1 glic-6 foi cultivado em células Vero por até 15 passagens
virais. O sobrenadante das passagens virais 1P (A), 2P (B), 3P (C), 5P (D) e 15P (E) foi recolhido. O RNA das
amostras foi extraído e o RT-PCR realizado (A a E). Após 96h de infecção, as células foram tripsinizadas,
marcadas com anti-FA e anti-IgG-PE e analisadas por citometria de fluxo (A, B, D, E e F).
72
4.8.3. Vírus FA17D/Esa trun/4 glic
Para elucidar se o vírus glic recombinante FA17D/Esa trun/4 é geneticamente estável,
foram feitas duas séries independentes de passagens consecutivas em monocamadas celulares
dos vírus recombinantes a partir dos estoques virais de segunda passagem. Os vírus foram
levados até a décima-quinta passagem celular e as passagens 5 e 10 (5P e 10P) foram
utilizadas nos experimentos de RT-PCR e citometria de fluxo (Figura 4.19-A). As m.o.i.
empregadas variaram entre 0,005 e 0,1 PFU/mL (Tabela 4.11).
4.8.3.1. Análise por RT-PCR
As preparações de RNA viral foram submetidas a RT-PCR e os produtos analisados por
eletroforese em gel de agarose (Figura 4.19-C). A presença de um fragmento de 1.940 pb
indica a presença da inserção heteróloga e a de um fragmento de 1.001 pb, a perda da mesma.
O RT-PCR do estoque viral (2P) gerou o produto de cerca de 2.000 pb e também o produto de
cerca de 1.000 pb. Entretanto, na passagem viral 5 foi detectada apenas uma pequena
quantidade do produto de cerca de 2.000 pb, e na passagem viral 10, apenas o produto de
cerda de 1.000 pb, indicando a perda da inserção heteróloga (Figura 4.19-C).
4.8.3.2. Análise por citometria de fluxo
A análise dos resultados mostrou que a maior parte das células infectadas com o estoque
viral (95,78%) expressa altos níveis de EGFP (Figura 4.19-C).
Apenas uma pequena parte das células infectadas com as passagens virais 5P1 e 5P2
(23,22% e 27,91%, respectivamente) (Figura 4.19-B) expressou a proteína EGFP, indicando a
perda da inserção heteróloga por grande parte da população viral. As células infectadas com
as passagens virais 10P1 e 10P2 (1,14% e 1,01%, respectivamente) praticamente não mais
expressavam a proteína EGFP (Figura 4.19-B e C), o que indica que a população viral sofreu
perda quase total da inserção heteróloga. Dessa forma, a inserção e expressão do cassete de
expressão EGFP construção II pelo vírus FA 17D é geneticamente instável.
73
Tabela 4.11: Estabilidade Genética do vírus recombinante FA17D/Esa trun/4 glic: Número da
passagem viral em monocamada celular, título e m.o.i. expressa em PFU/mL.
Estabilidade Genética do vírus
recombinante FA 17D/Esa trun/4 glic
Passagem
Título (PFU/ml)
m.o.i. (PFU/ml)
2P (estoque viral) 1,02E+06 0,02
3P1 1,45E+06 0,03
3P2 1,35E+06 0,026
4P1 4,10E+05 0,008
4P2 2,87E+05 0,005
5P1 1,27E+06 0,025
5P2 1,35E+06 0,026
6P1 2,12E+06 0,04
6P2 1,55E+06 0,03
7P1 3,22E+06 0,06
7P2 2,90E+06 0,06
8P1 5,76E+06 0,1
8P2 5,66E+06 0,1
9P1 2,71E+06 0,05
9P2 3,30E+06 0,06
10P1 1,40E+06 0,03
10P2 2,10E+06 0,04
74
Figura 4.19 - Estabilidade genética do vírus recombinante FA17D/Esa trun/4 glic: Em A) Esquema
do estudo da estabilidade genética do vírus recombinante FA17D/Esa trun/4 glic. Em B) Manutenção da inserção
heteróloga pelo vírus recombinante FA/17D/Esa/5.1 glic-6, através de citometria de fluxo (FACS). Em C)
Produtos de RT-PCR do RNA viral extraído de diferentes passagens seriadas do vírus FA 17D/Esa trun/4 glic:
no canal 1, o vírus não-recombinante FA 17D/E200T3, utilizado como controle experimental. No canal 2, FA
17D/Esa trun/4 glic /S.N. de transfecção. No canal 3, FA 17D/Esa trun/4 glic /2P. No canal 4, FA 17D/Esa trun/4
glic /5P1. No canal 5, FA17D/Esa trun/4 glic /5P2. No canal 6, FA 17D/Esa trun/4 glic /10P1 e no canal 7, FA
17D/Esa trun/4 glic /10P2.
75
5. Discussão:
O sucesso do uso do vírus vivo atenuado da febre amarela (FA) cepa 17D como vacina
humana tornou propício o desenvolvimento do mesmo como um vetor vacinal de expressão
de antígenos heterólogos.
Sem dúvida, o enfoque de maior sucesso até o momento diz respeito à construção de
vírus quiméricos, através da troca dos genes prM/E pelos mesmos genes de outros Flavivírus.
(Lai & Monath, 2003). Recentemente, tornou-se muito promissor o desenvolvimento de
estratégias que envolvessem a inserção de antígenos heterólogos dentro do genoma dos
Flavivírus, visando o desenvolvimento de vacinas polivalentes contra estes vírus e outros
agentes infecciosos. Neste sentido, seqüências curtas de epítopos celulares e humorais foram
inseridas na região intergênica NS2B-NS3 (McAllister et al, 2000; Barba-Spaeth et al., 2005;
Tao et al., 2005) e também de forma direta dentro de um sítio previamente caracterizado
dentro da proteína E (Bonaldo et al., 2002; Bonaldo et al., 2005). Tornou-se interessante
testar este sistema para a expressão de fragmentos maiores e, até mesmo, de proteínas
heterólogas completas. Porém, apesar do sucesso desta abordagem, inserções com mais de 40
códons se mostraram geneticamente instáveis. O genoma dos Flavivírus é pequeno e
compacto, assim, qualquer modificação poderia ter um efeito deletério na replicação do RNA,
no processamento da poliproteína precursora ou na função das proteínas virais.
Como a região E/NS1 representa uma mudança funcional no genoma dos Flavivírus
entre as proteínas estruturais e não-estruturais (Lindenbach et al., 2006), inserções de
fragmentos mais longos de genes neste sítio intergênico poderiam produzir uma menor
perturbação no ciclo viral, em comparação a outros sítios. Apesar de Bredenbeek e seus
colaboradores (Bredenbeek et al., 2006) terem testado a região intergênica E/NS1 do vírus
vacinal 17D para a construção do vírus recombinante YFV17D/LASV-GPC, os dados sobre
atenuação viral, estabilidade genética do vírus recombinante e localização da proteína
heteróloga expressa pelas células infectadas com o mesmo não foram formalmente
reportados. Além disto, a estratégia utilizada para a construção do vírus recombinante
YFV17D/LASV-GPC difere da construção dos vírus apresentados nesta dissertação, pois,
neste caso, somente os 23 aminoácidos hidrofóbicos C-terminais do gene E foram duplicados
a 3’ do gene da LASV-GPC para servir de seqüência sinal e garantir a inserção da proteína
NS1 do vírus FA no retículo endoplasmático.
No caso desta dissertação, o cassete de expressão contendo a proteína EGFP de
Aequoria victoria foi construído utilizando-se como base a região haste-âncora (HA) da
proteína E do vírus da Febre Amarela, respeitando sua estrutura e a função de cada elemento
76
nela contido. A região HA se localiza no terminal carboxi da proteína E dos Flavivírus e é
composta por duas regiões alfa-hélices que formam a haste (H1 e H2), separadas por uma
seqüência de conexão (CS), extremamente conservada entre os Flavivírus, e por dois
elementos transmembrana (TM1 e TM2) que formam a âncora (Allison et al., 1999, Zhang et
al., 2003). O objetivo de se utilizar a região HA de Flavivírus como base na construção dos
cassetes de expressão, respeitando os elementos nela contidos, foi o de se manter a estrutura
tridimensional da mesma, além de conservar a região que sofre a clivagem pela signalase do
hospedeiro durante o processamento da poliproteína viral, localizada dentro na junção do
domínio TM2 com o N-terminal da proteína não estrutural NS1 (Rice, 1996). O desenho dos
cassetes de expressão, onde a seqüência codificante da região HA da proteína E e 27
nucleotídeos localizados no N-terminal do gene da proteína NS1 foram fusionados ao gene da
EGFP, contempla os elementos necessários ao processamento da poliproteína viral e à sua
secreção para dentro de retículo endoplasmático. Dessa forma, se mantém todos os sinais
funcionais, a estrutura molecular e o posicionamento espacial da região que sofre
processamento proteolítico pela peptidase sinal celular (Op de Beeck et al., 2003; Lobigs and
Lee, 2004).
Na construção que utilizou o domínio HA truncado (Construção II) foram excluídos o
elemento H1, envolvido com a formação de homotrímeros de proteína E quando submetida a
tratamento de baixo pH, e o elemento CS, de função desconhecida apesar de ser o elemento
da haste com seqüência mais conservada entre os Flavivírus (Allison et al., 1999). O elemento
H2 foi mantido devido ao fato de formar uma α-hélice contínua com o elemento
transmembranar TM1 (Allison et al., 1999, Zhang et al., 2003). Assim sendo, sua supressão
poderia resultar na desestabilização da estrutura terciária da proteína heteróloga e,
conseqüentemente, afetar a viabilidade do vírus recombinante. Esta construção foi realizada
como uma alternativa, na qual o cassete de expressão de menor extensão poderia
comportar-se de maneira diferente no vírus recombinante resultante, quando comparado ao
cassete de expressão contendo a região HA completa.
Os cassetes de expressão contendo a região HA do gene da proteína E, completa ou
parcial, foram inseridos na região intergênica E/NS1 do genoma viral. As duas construções
realizadas produziram vírus viáveis, que apresentaram características de proliferação, tanto do
vírus FA17D/Esa/5.1 glic quanto do vírus FA17D/Esa trun/4 glic, semelhantes ao vírus
controle FA 17D/E200T3, porém com taxas de crescimento menores que as obtidas para o
vírus vacinal controle 17D. Isto indica que as modificações genéticas introduzidas no genoma
FA não acarretaram em um grande comprometimento da estrutura e função viral, o que se
reflete na capacidade proliferativa dos vírus recombinantes. Porém, as diferenças observadas
77
em relação ao vírus 17D, usado na vacina humana feita no Brasil, não são impeditivas em
relação a todos os procedimentos experimentais deste trabalho, e também não o são em
relação ao seu potencial de produção em larga escala em condições de boas práticas de
produção, que é uma das características determinantes na seleção de vírus recombinantes para
testes de vacinação.
A proteína EGFP pôde ser detectada no estoque dos vírus recombinantes
FA17D/Esa/5.1 glic e FA17D/Esa trun/4 glic até, pelo menos, 120 horas após a infecção de
monocamadas de células Vero. Seu pico máximo de expressão ocorreu 72 horas pós-infecção,
o que coincide com o pico de crescimento viral observado. No entanto, a proteína heteróloga
EGFP, expressa pelos vírus recombinantes FA 17D, permaneceu associada às células, em
estruturas perinucleares que provavelmente correspondem ao retículo endoplasmático. A
região HA da proteína E do vírus FA fusionada ao carboxi-terminal da proteína heteróloga
EGFP provavelmente permitiu que esta permanecesse ancorada no lúmen da membrana do
retículo endoplasmático. Foi demonstrado que as proteínas prM e E de Flavivírus são
translocadas para o retículo endoplasmático, ocorrendo a formação de heterodímeros estáveis
destas proteínas e a montagem da partícula viral (Mackenzie et al., 2001; Lorenz et al., 2003),
estas duas últimas etapas provavelmente dependem do acúmulo de prM e E no retículo
endoplasmático. Foi sugerido que sinais específicos de retenção no retículo endoplasmático
existem no elemento TM1 da HA (Op de Beeck et al., 2004). Recentemente, foi realizado
pelo nosso grupo de pesquisa um estudo de localização celular através da marcação de células
Vero infectadas com o vírus 17D recombinante expressando EGFP associada a HA completa
do vírus FA (FA17D/Esa/5.1 glic) com um marcador específico para retículo endoplasmático.
A observação, através de microscópio confocal de fluorescência, mostrou a co-localização da
EGFP com o retículo endoplasmático (Bonaldo et al., 2007, submetido; seção Anexos). Além
disto, o estudo de marcação metabólica, com metionina- [S
35
], de células Vero infectadas pelo
vírus FA recombinante FA17D/Esa/5.1 glic mostrou que não foi possível detectar a EGFP
heteróloga no sobrenadante de cultura celular infectada, mas somente em extratos celulares,
sugerindo mais uma vez a associação intracelular da proteína heteróloga (Bonaldo et al.,
2007, submetido; seção Anexos). Juntos, estes resultados indicam que a proteína EGFP
heteróloga se mantém associada à célula através, principalmente, da sua retenção no retículo
endoplasmático. A associação da região HA com o gene repórter EGFP pode ser utilizado
como um excelente sistema experimental para se estudar o tráfico de proteínas de Flavivírus
dentro da célula infectada.
Uma característica importante estudada na presente dissertação diz respeito à
estabilidade genética dos vírus FA 17D recombinantes expressando EGFP. Para serem
78
utilizados no desenvolvimento de novas vacinas virais atenuadas expressando antígenos de
outros patógenos, os vírus FA 17D recombinantes contendo os cassetes de expressão
inseridos entre os genes E e NS1 necessitam ser estáveis, ou seja, manter a inserção
heteróloga dentro de seu genoma ao longo das passagens virais. A estabilidade da expressão
da proteína heteróloga pelo vírus recombinante é indispensável no contexto do
desenvolvimento de vacinas virais atenuadas expressando antígenos de outros patógenos, uma
vez que a perda da inserção heteróloga por parte da população viral poderia acarretar na
diminuição da imunogenicidade dirigida ao antígeno exógeno induzida pela vacinação com o
vírus recombinante.
Os vírus 17D recombinantes expressando EGFP foram submetidos a duas passagens
seriais independentes em monocamadas de células Vero para o estudo de sua estabilidade
genética. Foram empregadas algumas metodologias para a avaliação da estabilidade genética
destes vírus. As amostras dos vírus FA17D/Esa/5.1 glic de segunda e quinta (5P1 e 5P2)
passagens seriadas apresentaram fenótipo de placa menor que o vírus vacinal controle 17 DD.
Desta forma, pode-se inferir que o fenótipo de placa reflete a manutenção ou perda da
inserção, ou seja, placas pequenas em relação ao controle representam a população viral que
mantém o inserto dentro do genoma viral, e o aumento do tamanho da placa representa a
população viral que teve o inserto deletado do seu genoma. Isto explicaria o grande desvio
padrão encontrado nas amostras destes vírus FA17D obtidos da décima passagem seriada
(10P1 e 10P2), onde as placas menores representam a parte da população que mantém o
inserto dentro de seu genoma e as placas maiores representam uma pequena parte da
população que teve o inserto deletado, apesar destas serem minoritárias nestas amostras.
A segunda metodologia empregada para a avaliação da estabilidade genética dos vírus
17D recombinantes expressando EGFP foi a análise das passagens seriadas virais por
RT-PCR, utilizando-se oligonucleotídeos que se pareiam em regiões do genoma do vírus FA
que flanqueiam o sítio de inserção. A presença da inserção heteróloga no genoma viral seria
indicada pela formação de um fragmento de DNA de cerca de 2.000 pares de bases (cerca de
1.000 pb do genoma viral mais cerca de 1.000 pb correspondentes à inserção heteróloga).
Dessa forma, a presença da inserção heteróloga na totalidade dos vírus de uma dada amostra
viral seria refletida na detecção de apenas este produto de reação. Alternativamente, a perda
do cassete de expressão pela população de uma dada amostra viral implicaria no aparecimento
de um produto de cerca de 1.000 pares de bases. Entretanto, o que se observou durante a
análise dos resultados foi o aparecimento de produtos de cerca de 2.000 pb, de 1.000 pb, além
de outros produtos de amplificação menos expressiva (especialmente um produto de cerca de
3.000 pb). Em princípio, especulou-se a possibilidade de que parte da população viral estaria
79
tendo a inserção heteróloga deletada de seu genoma, e outra parte da população estaria
mantendo a inserção heteróloga dentro do genoma viral. Este perfil foi mantido nas análises
realizadas com o vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic até a décima passagem e com o
clone viral FA 17D/Esa/5.1 glic-6 até a décima-quinta passagem. Este resultado não era
esperado, pois a experiência acumulada pelo nosso grupo de pesquisa no estudo da
estabilidade genética com diferentes vírus FA recombinantes indica que deleções de
seqüências exógenas inseridas no genoma viral são rapidamente fixadas após uma ou duas
passagens contínuas em monocamadas de células Vero. Isto ocorre devido à pressão seletiva
exercida sobre as populações virais contidas nas amostras (com e sem a inserção heteróloga)
e, uma vez que o crescimento dos vírus que têm seu fenótipo revertido para o tipo vacinal
(não carreadores da inserção heteróloga), por possuírem taxas de crescimento mais altas,
terminam por sobrepujar a população viral recombinante (Bonaldo et al., 2007, submetido;
seção Anexos). Desta forma, foi difícil aceitar a possibilidade de que parte da população viral
tivesse a inserção heteróloga deletada de seu genoma, e outra parte da população mantivesse a
inserção heteróloga dentro do genoma viral e que esta mistura de populações se mantivesse
até a décima passagem sem a fixação do genótipo vacinal.
Uma maneira de se explicar este perfil complexo detectado nas passagens seriadas em
células Vero do vírus recombinante FA 17D/Esa/5.1 glic seria a duplicação, dentro do cassete
de expressão, dos 315 nucleotídeos correspondentes à região gênica da HA do vírus FA (288
nucleotídeos) e ao 5’ terminal do gene da proteína NS1 (27 nucleotídeos), os quais estão
também presentes também dentro da seqüência nucleotídica do gene da proteína E de FA.
Portanto, é concebível que o pareamento entre a sequência de 315 nucleotídeos da região HA
localizada dentro do genoma do vírus FA com a seqüência HA complementar não-alélica
localizada dentro do cassete de expressão, possa levar a formação de moléculas de DNA
“defeituosas” que, durante a amplificação, estariam gerando produtos de PCR de 1.000 pb
(Figura 5.1-C) e de 3.000 pb (Figura 5.1-D).
Para comprovar o perfil artefactual do RT-PCR obtido na análise do vírus
FA17D/Esa/5.1 glic até a décima passagem seriada em células Vero, foi realizado um teste
que consistia da amplificação, por PCR, do plasmídeo pT3/Esa/5.1 glic (com inserção)
utilizando-se os mesmos oligonucleotídeos dos experimentos de RT-PCR (Figura 5.1-A). Por
ser a população de moléculas plasmidiais homogênea (todas possuem a inserção heteróloga),
seria esperado apenas um produto de cerca de 2.000 pb. Entretanto, a reação produziu os
mesmos produtos múltiplos de PCR descritos acima (Figura 5.1-A). O plasmídeo pT3 (sem
inserção) e o vírus FA 17D/E200, utilizados como controles da reação, produziram produtos
80
de 1.000 pb, conforme o esperado (Figura 5.1-A). Portanto, pode-se concluir que os produtos
de PCR adicionais aos esperados tratavam-se de um artefato da reação.
Devido ao fato de a técnica de RT-PCR ter se mostrado inconclusiva no que diz respeito
à estabilidade genética dos vírus recombinantes analisados, a estabilidade genética viral foi
também analisada através de uma terceira metodologia. Pode-se estabelecer uma metodologia
adequada ao estudo de estabilidade genética do genoma viral pelo emprego da técnica de
Citometria de Fluxo (FACS). Esta é baseada na detecção simultânea de antígenos virais de FA
e da autofluorescência da EGFP. A indicação da perda de EGFP seria dada pela diminuição
da relação entre a porcentagem das células apresentando dupla marcação (células que
apresentam antígeno viral e EGFP) e a porcentagem do total de células infectadas (células que
apresentam somente antígeno viral mais as células que apresentam dupla marcação). A
técnica de FACS não deixaria dúvidas quanto à manutenção/perda da inserção heteróloga,
além de reforçar os resultados obtidos através da utilização da técnica de RT-PCR.
Analisados conjuntamente, os resultados obtidos através das três metodologias
empregadas para o estudo da estabilidade genética dos vírus FA recombinantes expressando
EGFP mostram que a região intergênica E/NS1 do vírus FA é suscetível à inserção de genes
heterólogos, e que o cassete de expressão não compromete consideravelmente a estrutura e
função do vírus. Assim, os estudos de estabilidade genética produziram resultados que
demonstram que o vírus FA17D/Esa/5.1 glic é estável, se considerarmos que a produção de
lotes-semente vacinais envolvem em torno de cinco passagens seriadas em cultivo celular,
momento este que os diferentes experimentos independentes não apresentaram população
viral sem inserção. No caso do vírus FA17D/Esa trun/4 glic, os estudos de estabilidade
genética produziram resultados que demonstram que o mesmo é instável.
Estudos demonstraram que sítios localizados na região de α-hélice da haste
(aminoácidos 401 a 413 de TBE), a mesma região que foi deletada do cassete de inserção
durante a construção do vírus FA17D/Esa trun/4 glic, é essencial para a conversão dos
dímeros de proteína E para a forma homotrimérica durante o processo de fusão da membrana
viral à da vesícula endossomal devido à acidificação desta vesícula (Allison et al.,1999;
Zhang et al., 2003). Este processo é essencial para a transição para o estado fusogênico dos
vírus pertencentes ao gênero Flavivírus. De alguma maneira, a deleção desta região do cassete
de expressão, durante a construção do vírus FA17D/Esa trun/4 glic, afetou negativamente a
estabilidade do vírus recombinante, favorecendo a seleção de vírus sem a inserção e fazendo
com que esta deleção fosse fixada na maior parte das populações virais ainda nas primeiras
passagens seriadas em monocamada de células Vero. O elemento H1 é composto de uma
α-hélice conectada ao elemento H2 através da seqüência de conexão CS. Estes dois elementos
81
(H1 e CS), não inclusos no cassete de expressão contendo a região HA truncada,
provavelmente possuem um importante efeito na estabilização da proteína recombinante
EGFP e/ou no processamento da poliproteina viral. A não inclusão dos elementos H1 e CS no
cassete de expressão contendo a região HA truncada resultou, portanto, no comprometimento
da viabilidade do vírus recombinante FA17D/Esa trun/4 glic. Provavelmente, se
considerarmos que a produção de lotes-semente vacinais envolve em torno de cinco passagens
seriadas em cultivo celular, o vírus FA17D/Esa trun/4 glic não é ideal para a utilização como
vetor vacinal, porém poderá ser extremamente útil como vetor de expressão de antígenos
heterólogos em estudos in vivo acerca do tropismo dos Flavivírus por células e tecidos, assim
como dos processos celulares relacionados à infecção por Flavivírus.
Sabe-se que o RNA de Flavivírus é sintetizado de forma semi-conservativa e utiliza o
RNA dupla-fita durante a replicação (Chu & Westaway, 1985; Westaway et al., 1999).
Portanto, é concebível que o pareamento entre a seqüência de nucleotídeos que codifica a
região HA complementar não-alélica poderia levar a formação de cópias do RNA viral com
deleções na inserção heteróloga. Assim, a estabilidade genética dos vírus FA recombinantes
expressando EGFP poderia ser melhorada através da reposição da região repetitiva de 315
nucleotídeos (presente tanto no cassete de expressão quanto no genoma viral) por uma
seqüência de menor homologia. Neste sentido, nosso grupo de pesquisa utilizou o mesmo
cassete de expressão empregado na construção do vírus FA 17D/Esa/5.1 glic inserido, porém,
no cDNA do vírus FA 17D/DEN4, o qual teve a seqüência gênica das proteínas prM e E de
FA substituída pelos genes homólogos do vírus DEN4. Esta construção originou o vírus FA
17D/DEN4/Esa/6, o qual se mostrou geneticamente mais estável que o vírus FA 17D/Esa/5.1
glic, uma vez que a EGFP pode ser detectada no vírus quimérico até, pelo menos, a vigésima
passagem seriada em monocamada de células Vero (Bonaldo et al, submetido; seção Anexos).
O fato de o genoma destes dois vírus possuírem regiões HA divergentes, uma proveniente do
vírus DEN4 e outra proveniente do vírus FA, e que partilham apenas 58% de homologia entre
suas seqüências nucleotídicas, poderia sugerir que quanto mais baixa a homologia entre as
regiões HA, maior a estabilidade genética do vírus recombinante (Bonaldo et al, submetido;
seção Anexos).
Uma outra forma possível de se melhorar a estabilidade genética dos vírus FA
recombinantes expressando EGFP seria a utilização de códons alternativos para a construção
do cassete de expressão, diferentes dos contidos na região HA do vírus FA, mas que
codificam para os mesmos aminoácidos. Esta estratégia poderá reduzir o pareamento entre a
seqüência de nucleotídeos que codifica a região HA presente no genoma do vírus FA e a
seqüência de nucleotídeos que codifica a região HA presente no cassete de expressão.
82
Por último, a comparação de nossos resultados com o material disponível na literatura
científica até o momento indica que a estratégia utilizada neste trabalho é promissora e
inovadora. No presente trabalho, foram apresentadas duas diferentes construções de vírus 17D
que expressam a proteína EGFP, e de forma estável no vírus FA17D/Esa/5.1 glic. Este vírus
atende a alguns dos principais pré-requisitos para sua utilização como vetor vacinal:
integridade estrutural e funcional e estabilidade da seqüência codante para o antígeno
heterólogo uma vez integrada no genoma viral. Estes resultados são importantes no sentido de
que, formalmente, é a primeira vez que se conseguiu expressar estavelmente proteínas
exógenas no genoma de Flavivírus. Este sistema será útil para o desenvolvimento de diversas
vacinas baseadas no vírus FA 17D recombinante atenuado contra outras doenças como a
malária. Ademais, a inserção de genes repórteres dentro do genoma de Flavivírus poderá
permitir estudos de diferentes processos e etapas durante o ciclo viral assim como da
determinação de sinais de endereçamento celular na região HA.
83
Figura 5.1: Esquema explicativo do artefato observado durante a análise dos resultados obtidos pela utilização da técnica de RT-PCR na caracterização dos vírus
17D recombinantes expressando EGFP: Em (A): Gel de agarose 1%. No canal 1, o plasmídeo pT3. No canal 2, o plasmídeo pT3/Esa/5.1 glic. No canal 3, o produto de PCR
gerado pela amplificação do plasmídeo pT3 com os oligonucleotídeos RG174 e RG19. No canal 4, o produto de PCR gerado pela amplificação do plasmídeo pT3/Esa/5.1 glic com
os oligonucleotídeos RG174 e RG19. No canal 5, o produto de RT-PCR gerado pela amplificação do RNA do estoque do vírus 17D/E200T3, com os oligonucleotídeos RG174 e
RG19. No canal 6, o produto de RT-PCR gerado pela amplificação do RNA do estoque do vírus 17D/ Esa/5.1 glic, com os oligonucleotídeos RG174 e RG19. Em (B): re-pareamento
correto das moléculas de DNA, após cada desnaturação e amplificação, durante o RT-PCR. Em (C) e (D): re-anelamento errôneo das moléculas de DNA, após cada desnaturação e
amplificação, durante o RT-PCR. A região repetitiva contida dentro da inserção heteróloga (correspondente à região Haste-âncora da proteína E), estaria se pareando erroneamente
com a região Haste-âncora da proteína E, a qual está presente no genoma do vírus FA. Ao invés de moléculas normais, este pareamento errôneo estaria originando moléculas de
DNA “defeituosas” que, durante a amplificação, estariam gerando produtos de PCR de 1.000 pb (C) e de 3.000 (D).
84
6. Conclusões
- As estratégias de inserção de genes heterólogos entre o gene da proteína estrutural E e
o gene codante da proteína não estrutural NS1 mostrou-se viável e promissora na obtenção de
vírus FA 17D recombinantes, não comprometendo consideravelmente a estrutura e função
viral;
- As características de proliferação dos vírus FA 17D recombinantes foram compatíveis
com procedimentos experimentais deste trabalho e com o potencial para produção em larga
escala em condições de Boas Práticas de Produção;
- A EGFP heteróloga, expressa pelos vírus FA 17D recombinantes, permaneceu
associada às células, em estruturas que provavelmente correspondem ao retículo
endoplasmático, não sendo secretada para o exterior celular;
- Os vírus FA 17D/Esa/5.1 glic FA 17D/Esa trun/4 glic poderão ser extremamente úteis
como vetores de expressão de antígenos heterólogos em estudos in vivo acerca do tropismo
dos Flavivírus por células e tecidos, assim como dos processos celulares relacionados à
infecção por Flavivírus;
- O vírus FA17D/Esa/5.1 glic atende a alguns dos principais pré-requisitos para sua
utilização como vetor vacinal: integridade estrutural e funcional, bem como a estabilidade da
seqüência codificante para o antígeno heterólogo, uma vez integrada no genoma viral;
- O sistema de inserção de genes repórteres dentro do genoma de Flavivírus,
apresentado nesta dissertação, será útil para o desenvolvimento de diversas abordagens
vacinais baseadas na expressão de antígenos de diferentes patógenos humanos na plataforma
genômica do vírus FA 17D atenuado.
85
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100
8. Anexos
8.1. Meios, reagentes e soluções
1. Meio 199 com sais de Earle’s (Meio 199 Earle’s 10x)
Meio 199 com sais de Earle (Sigma) 94,75 g
Água bidestilada q.s.p. 1.000 mL
Instruções: Acertar o pH para 7,2 – 7,6 utilizando HCl 1N; esterilização por filtração em
membrana de 0,22 µm; alíquotas de 50 mL; armazenagem a 4ºC.
2. Meio 199 com sais de Earle’s (Meio 199 Earle ‘s completo)
Meio 199 com sais de Earle 10x 10 mL
NaHCO
3
40 mg/mL (pH 7,0) 2,5 mL (para sistema fechado*
1
)
NaHCO
3
40 mg/mL (pH 7,0) 5 mL (para sistema aberto*
2
)
SFB inativado (Gibco) 5 mL
Sulfato de gentamicina (Schering-Plough) (40 mg/mL) 1 mL
Fungizona (Gibco) (1 mg/ml) 0,1 mL
Água bidestilada q.s.p. 100 mL
Instruções: preparo no momento do uso.
*1: Garrafa.
*2: Placa multi-well.
3. Bicarbonato de sódio 4,4% gaseificado
NaHCO
3
44 g
Vermelho de fenol 1% (m/v) 1 mL
Água destilada q.s.p. 1.000 mL
101
4. Tripsina 5% p/v
Tripsina 5g
Diluente de tripsina 100 mL
Instruções: armazenagem a -20ºC em alíquotas de 1 mL.
5. Verseno
EDTA 1 g
Vermelho de fenol 1% (p/v) 1 mL
PBS q.s.p . 1.000 mL
Instruções: esterilização por autoclavação a 121ºC por 15 minutos; armazenagem a
temperatura ambiente.
6. Tripsina/Verseno
Tripsina (5% p/v) 1 mL
Verseno 100 mL
Instruções: preparo no momento do uso.
7. Carboximetilcelulose (CMC) 1,75 e 3,5%
Água bidestilada q.s.p. 1.000 mL
CMC (Sigma) 17,5 ou 35,0 g
Instruções: homogeneização por agitação vigorosa; esterilização por autoclavação a 121ºC
por 15 minutos; armazenagem a temperatura ambiente.
102
8. Meio LB (Luria-Bertani)
Bacto-triptona (Difco) 10 g
Extrato de levedura (Difco) 5 g
NaCl 10 g
Instruções: esterilização por autoclavação a 121ºC por 15 minutos; armazenagem a
temperatura ambiente. (Sambrook et al., 1989)
9. Solução de vermelho neutro
Meio 199 Earle’s (10x) 1 mL
NaHCO
3
gaseificado 4,4% 0,15 mL
Sulfato de gentamicina (4 mg/mL) 0,2 mL
Vermelho neutro concentrado (1% p/v) 0,3 mL
Água bidestilada q.s.p. 10 mL
Instruções: o ensaio requer 0,5 mL por poço de uma placa de 6 poços; receita para 10 mL;
preparado imediatamente antes do uso, com água bidestilada ou equivalente.
10. Tampão PBS 10x
NaCl 80 g
KCl 20 g
Na
2
HPO
4
.H
2
O 14,4 g
Água Milli-Q q.s.p. 1.000 mL
Instruções: Ajustar pH 7,4 com HCl 1N; esterilização por autoclavação a 121ºC por 15
minutos; armazenagem a temperatura ambiente. (Sambrook et al., 1989)
103
11. Tampão TAE 10x
Tris-Base (Sigma) 48,46 g
EDTA pH 8,0 3,72 g
Ácido acético glacial 11,42 mL
Água milli-Q q.s.p. 1.000 mL
Instruções: esterilização por autoclavação a 121ºC por 15 minutos; armazenagem a
temperatura ambiente. (Sambrook et al., 1989)
12. PBS-BSA (Solução de lavagem):
BSA (Sigma) 5 g
Azida sódica (Sigma) 0,5 g
PBS 1x q.s.p. 500 mL
13. PBS-BSA + Saponina (Solução de permeabilização):
BSA 0,5 g
Azida sódica (Sigma) 0,05 g
Saponina (Sigma) 0,075 g
PBS 1x q.s.p. 50 mL
14. Paraformaldeído 4%
Paraformaldeído (Sigma) 4,0 g
Água milli-Q 50 mL
Tampão fosfato de sódio dibásico 2mM 50 mL
Instruções: Aquecer a água milli-Q até 70ºC. Adicionar, aos poucos, em capela química e
utilizando máscara de proteção, o Paraformaldeído. Clarificar a solução com 1 ou 2 gotas de
NaOH 1N. Deixar esfriar e, em seguida, adicionar o tampão fosfato dibásico (sempre na
proporção 1:1).
104
8.2. Artigo submetido em 22 de maio de 2007
Bonaldo MC, Mello SM, Trindade GF, Rangel A, Duarte AS, Oliveira PJ, Freire MS,
Galler R., 2007. Construction and characterization of recombinant flaviviruses bearing insertions
between E and NS1 genes. Submetido.
Construction and characterization of recombinant
flaviviruses bearing insertions between E and NS1 genes.
Myrna C. Bonaldo
1*
, Samanta M. Mello
1
, Gisela F. Trindade
1
, Aymara A. Rangel
2
,
Adriana S. Duarte
1
, Prisciliana J. Oliveira
1
, Marcos S. Freire
2
, Claire F. Kubelka
3
and
Ricardo Galler
2
1
Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de Biologia Molecular,
de Flavivírus,Rio de Janeiro, Fundação Oswaldo Cruz. Avenida Brasil 4365,
Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ, Brazil, 21045-900;
2
Fundação Oswaldo Cruz,
Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Rio de Janeiro, Brazil;
3
Fundação
Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de Imunologia Viral, Rio de
Janeiro, Brazil.
*Corresponding author
Email:
MCB: mbonaldo@ioc.fiocruz.br
SMM: samello@ioc.fiocruz.br
GFT: gfreitas@ioc.fiocruz.br
AAR: aymara@bio.fiocruz.br
ASD: adriduar@ioc.fiocruz.br
PJO: priscilian@ig.com.br
MSF: freire@bio.fiocruz.br
CFK: claire@ioc.fiocruz.br
RG: [email protected]iocruz.br
2
Abstract
Background. The yellow fever virus, a member of the genus Flavivirus, is an
arthropod-borne pathogen causing severe disease in humans. The attenuated yellow
fever 17D virus strain has been used for human vaccination for 70 years and has several
characteristics that are desirable for the development of new, live attenuated vaccines.
We described here a methodology to construct a viable, and immunogenic recombinant
yellow fever 17D virus expressing a green fluorescent protein variant (EGFP). This
approach took into account the presence of functional motifs and amino acid sequence
conservation flanking the E and NS1 intergenic region to duplicate and fuse them to the
exogenous gene and thereby allow the correct processing of the viral polyprotein
precursor. Results. YF 17D EGFP recombinant virus was grew in Vero cells and
reached a peak titer of approximately 6.45 ± 0.4 log10 PFU/mL at 96 hours post-
infection . Immunoprecipitation and confocal laser scanning microscopy demonstrated
the expression of the EGFP, which was retained in the endoplasmic reticulum and not
secreted from infected cells. The association with the ER compartment did not interfere
with YF assembly, since the recombinant virus was fully competent to replicate and
exit the cell. This virus was genetically stable up to the tenth serial passage in Vero
cells. The recombinant virus was capable to elicit a neutralizing antibody response to
YF and antibodies to EGFP as evidenced by an ELISA test. The applicability of this
cloning strategy to clone gene foreign sequences in other flavivirus genomes was
demonstrated by the construction of a chimeric recombinant YF 17D/DEN4 virus.
Conclusions. This system is likely to be useful for a broader live attenuated YF 17D
virus-based vaccine development for human diseases. Moreover, insertion of foreign
genes into the flavivirus genome may also allow in vivo studies on flavivirus cell and
tissue tropism as well as cellular processes related to flavivirus infection.
3
Background
The yellow fever 17D virus is attenuated and used for human vaccination for 70
years. Some of the outstanding properties of this vaccine include limited viral replication
in the host but with significant expansion and dissemination of the viral mass yielding a
robust and long-lived immune response [1]. It also induces a significant T cell response
[2-5].The vaccine is cheap, applied in a single dose and involves well-established
production methodology and quality control procedures, which include monkey
neurovirulence assay. Altogether, the YF 17D virus has become very attractive as an
expression vector for the development of new live attenuated vaccines [6, 7].
The development of infectious clone technology has allowed the genetic
manipulation of the YF 17D genome, towards the expression of foreign genes. Different
technical approaches to constructing recombinant viruses based on the YF 17D virus are
[6, 8] possible and will vary according to the antigen to be expressed. One major
approach has been the creation of chimeric viruses through the exchange of structural
prM/M/E genes [9]. Another advance has been the expression of particular foreign
epitopes in the fg loop of the E protein [6, 8]. Heterologous epitopes have also been
inserted between the nonstructural proteins by flanking them with proteolytic cleavage
sites specific for the viral NS2B-NS3 protease [10]. Such a strategy was tested for all
sites cleaved by the viral protease, but only three of these positions, the amino-terminus,
and the C-prM and NS2B-NS3 intergenic regions yielded viable viruses. Recombinant
YF 17D viruses with insertions between NS2B-3 replicated best [10] and this
methodology has been further exploited [4, 11].
Based on the natural length variation, the 3’ untranslated region of flaviviruses
[12] has been subjected to the insertion of genetic cassetes containing internal ribosomal
4
entry sites (IRES) from picornaviruses and reporter genes [13]. However, genetic
instability in this region resulted in partial elimination of the cassete [1, 14].
The development of flavivirus replicon technology allowed for the transient
expression of heterologous genes, and its application for vaccination purposes has been
suggested [15-17] Such an approach has also been developed for the YF 17D virus [18,
19].
With regard to vaccine development, the insertion of larger gene fragments is
indeed of interest, as it would allow the simultaneous expression of a number of
epitopes. Given the difficulties in regenerating the YF 17D virus with longer genome
insertions (more than 36 amino acids; prM-E replacements are not considered here as
insertions), be it in between viral protease cleavage sites or in the 3´ NTR, we have
established a new method for the generation of live flaviviruses bearing whole gene
insertions between the E and NS1 protein genes. Although conceptually similar to the
methodology first proposed for insertions at viral protease cleavage sites [10], the
cleavage between E and NS1 is carried out by the cellular signal peptidase present in the
lumen of endoplasmic reticulum where virus maturation takes place. Therefore, a series
of different structural elements are required to allow the recovery of infectious viruses
with whole-gene insertions at this site.
The last 100 amino acids of the flavivirus E protein have been designated as the
stem-anchor region [20] and are not part of the ectodomain for which the dimer
structure has been established [21]. The stem region would electrostatically
accommodate the inferior surface of the E ectodomain and the phospholipids of the
external membrane layer [22]. It is made up of two helices and a connecting segment.
The first helix (H1) forms an angle with the external membrane lipid layer whereas H2
5
rests on the outside with its hydrophobic side directed towards the hydrophobic
membrane core [22, 23].
The anchor region remains associated to the ER membrane through two
antiparallel alpha helical transmembrane hydrophobic domains [TM1 and 2; [22]].
TM1 would serve as an anchor to E whereas TM2 would act as a signal sequence for
NS1, and interactions between the two have a role in viral envelope formation [24].
The segment connecting TM1 and 2 has been shown to vary in amino acid sequence
and length among the Flaviviridae, suggesting specific interactions [25]. Length and
hydrophobicity of transmembrane domains as well as the charges of flanking amino
acids and their structural arrangement may affect the topology of the secreted protein in
the membrane [26]. Therefore, gene insertions between E and NS1 are likely to disrupt
this functional arrangement if the design of such insertions does not contemplate the
complex interactions among the different domains.
Herein we describe the design, construction and regeneration of live YF 17D and
17D-Dengue 4 (YF17D/DEN4) viruses bearing the green fluorescent protein gene
between E and NS1. We have characterized foreign gene expression and genetic
stability as well as recombinant virus immunogenicity.
6
Results
Design of the strategy for the recovery of infectious YF 17D virus bearing
genetic insertions between E and NS1. For the flaviviruses, the polyprotein precursor
transverses the ER membrane at various points being proteolytically processed in the
ER lumen by cellular signal peptidases and in the cytoplasmic side by viral NS2B/NS3
protease. Protein secretion and processing require the presence of functional motifs.
The design of a foreign sequence insertion in the YF 17D virus E and NS1 intergenic
region considered the presence of such motifs as well as amino acid sequence
conservation flanking this location. Figure 1A depicts the topology of the structural
envelope protein E and the non-structural protein NS1. The E protein remains
associated to the ER membrane through two anti-parallel alpha helical transmembrane
hydrophobic domains (TM1 and 2; Fig. 1A).
Figure 1B displays a comparison of the amino acid sequences of the flavivirus E
protein stem-anchor region and the amino-terminus of NS1 protein. This alignment was
the basis for the identification at the amino acid level of the regions corresponding to
each of the different segments in the stem (H1, CS e H2) and anchor (TM1 e TM2).
Furthermore, the amino-terminus of NS1 also exhibited a strong conservation of 3
amino acids (Fig. 1B), which are likely to play a role in recognition, active site binding
and proteolytic cleavage by the signal peptidase.
Our approach towards the regeneration of viable virus with a gene insertion
between E and NS1 was to duplicate the first 9 amino acids of NS1 at the amino-
terminus of the EGFP gene and the whole E protein stem-anchor domain at its carboxi-
terminus (Fig. 1A). This structural arrangement of the EGFP expression cassette should
allow the correct orientation for protein secretion towards the ER lumen, formation and
folding in the ER of the E protein stem-anchor region as well as the appropriate
7
orientation and cleavage at the amino-terminus of NS1. The insertion of EGFP gene in
the chimeric YF17D/DEN4 genome followed the same strategy with the DEN4 E
protein keeping its original stem-anchor region and the EGFP gene with the stem-
anchor region of YF 17D virus.
Recovery of YF17D/Esa/5.1glic recombinant virus and foreign gene
expression. In vitro transcribed RNA was used to transfect cultured Vero cells. When
the cytophatic effect (CPE) was widespread, the viability of the constructs could be
visualized by fluorescence microscopy of the Vero cell monolayers. In the case of the
YF17D/Esa/5.1glic virus it was performed at 72 h post-infection. This viral stock,
called P1, was used for a second passage in Vero cells, or P2, which resulted in a viral
stock with the titer of 6.18 log
10
PFU/mL
Growth and plaque morphology of YF 17D viruses. The growth capacity of
the recombinant YF17D/Esa/5.1glic virus was assessed comparatively to two other
viruses, YF 17DD vaccine and YF17D/E200T3 [6]. Three independent experiments of
virus growth in Vero cell monolayers were carried out and the results are shown in
Figure 2. All experiments were carried out at low MOI according to requirements for
viral vaccine production from certified seed lots.
At 24 h, 120 h and 144h time points there were no significant difference
between the viral titers of YF 17DD vaccine virus and YF17D/Esa/5.1glic (t-test;
P=0.095; P=0.576 and P=0.3890, respectively). But at 48h, 72h and 96 h the
differences in virus yields were statistically significantly (P=0.001; P=0.004 and
P=0.043, respectively). The recombinant YF17D/Esa/5.1glic virus displayed a small
plaque phenotype (0.99 ± 0.2 mm) when compared to the intermediate size of
YF17D/E200T3 (1.65 ± 0.3 mm) and the large plaques of the YF 17DD virus (2.80 ±
0.7 mm).
8
Expression of EGFP by recombinant YF 17D virus. We have approached
EGFP expression in infected Vero cell monolayers by flow cytometry analysis (Fig.
3A). The EGFP expression together with viral antigens was highest between 72 and 96
hours post-infection. Figure 3A shows that EGFP expression was specific to Vero cells
infected with the YF17D/Esa/5.1glic virus. At 96 h post-infection, 61 % of cells were
expressing EGFP as well as viral antigens. These results indicated that the recombinant
YF17D/Esa/5.1glic virus was capable of directing the expression of significant amounts
of the heterologous protein even in cell cultures infected at low multiplicity (MOI of
0.02), pointing out the ability of the virus to disseminate to adjacent cells.
The expression of all viral proteins was monitored by immunoprecipitation (Fig.
3B). Radiolabelled lysates of virus-infected Vero cells were immunoprecipitated under
non-denaturing conditions with EGFP or YF-specific sera and analyzed by SDS-PAGE.
The immunoprecipitation patterns revealed that prM, E, NS1, NS3 and NS5 proteins of
both recombinant YF17D/Esa/5.1glic and YF 17DD viruses co-migrated. An
additional band corresponding to an apparent molecular weight (MW) of 35 kDa was
observed in protein extracts from Vero cells infected solely with YF17D/Esa/5.1glic
(Fig. 3B). This band corresponds to EGFP containing the stem-anchor region and was
specifically recognized by an anti-GFP serum (Fig. 3B). This protein was also
immunoprecipitated by the YF antiserum from YF17D/Esa/5.1glic-infected Vero cells
(Fig.3B). Since cell lysis and immunoprecipitation were carried out under non-
denaturing conditions, membrane-bound viral proteins present in membrane- detergent
micelles due to their amphyphatic character were recognized by YF polyclonal
antiserum and immunoprecipitated. The EGFP, which is likely to be membrane-bound
due to the stem-anchor region, could have been non-specifically carried along with
other viral antigens during immunoprecipitation. Additionally, it was not possible to
9
detect in both YF polyclonal antiserum and EGFP monoclonal antibody
immunoprecipitation profiles higher molecular weight bands corresponding to non-
proteolytic processed products, such as E-EGFP-NS1, E-EGFP and EGFP-NS1. It
suggested the complete processing of the polyprotein precursor in this region.
Moreover, pulse-chase experiments did not reveal the presence of such kind of non-
processed proteins (data not shown). The analysis of the infected cell culture
supernatant revealed only E protein and traces of NS1, suggesting that EGFP was
retained inside the cell.
To determine the intracellular location of the EGFP protein expressed by the
YF17D/Esa/5.1glic virus we initially performed an indirect fluorescence assay in
infected Vero cell monolayers, which were fixed, permeabilized and stained with a
polyclonal antiserum against YF viral antigens (Fig. 4A). The staining of YF antigens
spread from the perinuclear region to a reticular network through the cytoplasm
whereas EGFP was located in the perinuclear area (Fig. 4A). The intracellular location
of EGFP could be better observed by co-localization with an ER marker, ER-Tracker
Red, in infected Vero cells (Fig. 4B). It was possible to confirm that the EGFP
subcellular location overlapped with the ER labeled area and that this protein
accumulated in the perinuclear region of the ER (Fig. 4B). This set of results strongly
indicate that the heterologous protein (EGFP) expressed by the recombinant YF virus is
not secreted from the infected cells and is mainly associated with the ER compartment.
Immunogenicity for mice of YF 17D viruses. We have next asked the question
whether the recombinant virus was able to elicit an immunological response against the
YF virus and the foreign protein. For this purpose groups of 4-week old BALB/c mice
were immunized subcutaneously with two doses of approximately 5.0 log
10
PFU of
10
each virus. Fifteen days after the last dose mice were bled and neutralizing antibodies
to YF measured by PRNT.
Table 1 shows that both the YF 17D vaccine virus and the YF17D/Esa/5.1glic
recombinant virus were capable of eliciting significant titers of neutralizing antibodies
to YF. All animals seroconverted to YF virus after subcutaneous inoculation with
either virus. For YF17D/Esa/5.1glic virus the antibody titers ranged from 1:37 to 1:211
(GMT of 1:80) whereas those elicited by the YF 17DD vaccine virus varied from 1:45
to 1: 308 (GMT of 1:140). The titers of neutralizing antibodies to the YF 17DD virus in
immunized animals were significantly higher than those found for the group of animals
inoculated with YF17D/Esa/5.1glic virus (t test; P < 0.02). It is noteworthy that the
immunization with YF 17D/Esa/5.1glic virus elicited antibodies against EGFP in 80 %
of the animals with titers varying from 26 to 3,535 ng/mL (GMT of 158 ng/mL; Table
1).
Genetic stability of the YF 17D/Esa/5.1glic virus. Genetic insertions between
the E and NS1 genes of recombinant YF 17D viruses must be stable if this strategy is to
be useful for the construction of new live attenuated vaccine viruses expressing
antigens of other pathogens. We have initially evaluated the genetic stability of the
YF17D/Esa/5.1glic virus insertion by RT-PCR amplification of the E-NS1 region of 2P
virus (Fig. 5A). A DNA amplicon of 2,030 bp in length indicated that the cassete region
was complete whereas smaller amplicons would be suggestive of genetic instability.
Passage 2 (2P) displayed a diverse electrophoretic profile of amplicons, varying from
3.0 kb to 1.0 kb (Fig. 5A). This complex profile was also observed after amplification
of a homogenous plasmid DNA preparation (based on its uniform migration in agarose
gel and nucleotide sequence analysis), suggesting the complexity was not necessarily
due to genomic rearrangements upon virus regeneration and an additional passage in
11
Vero cells (Fig.5A, lanes 1-4). The presence of the 1.0 kb amplicon, which is
suggestive of EGFP gene deletion, and other amplicons longer than 2.0 kb were noted
in all RT-PCR reactions using RNA from YF17D/Esa/5.1glic 2P virus or T3 Esa EGFP
plasmid DNA (Fig. 5A).. These are a consequence of spurious amplification during the
bidirectional synthesis of the PCR reaction due to the presence of a direct repeat region
of 315 nucleotides flanking the EGFP gene, which corresponds to the YF 17D virus E
protein stem-anchor and NS1 N-terminal region duplication. So, the band
corresponding to the correct recombinant genomic structure contains 2,030 bp and its
amplification is explained by the pairing represented in Figure 5B. Alternatively,
during the PCR reaction, the stem and anchor gene region of the heterologous EGFP
cassete might hybridize with the homologous and non-allelic region, located at the
complementary negative strand, corresponding to the E protein stem-anchor region
(Fig. 5C). The resulting product would be shorter, with 1,001 bp in length, as it would
not include the insertion cassete, and therefore, be equivalent to the vector virus E-NS1
gene region. On the other hand, the opposite situation could also occur, in which a 288-
nucleotide alignment may occur in the region encoding the stem and anchor domain of
the virus E protein with the negative strand complementary to the heterologous
expression cassete. Accordingly, a longer PCR fragment (3,059 bp) would be produced
including a duplicated EGFP gene (Fig. 5D), which in its turn, is also detected (Fig.
5A) after amplification of plasmid DNA and viral RNA, although with a lower intensity
due to its less efficient synthesis. These interpretations are supported by the single
1,001 bp amplicon profile observed for plasmid and virus that do not contain the
expression cassete, i.e., that have a single stem-anchor sequence. Therefore, the use of
RT-PCR for genetic stability studies constituted only an initial evaluation to determine
the maintenance of the heterologous EGFP cassette in the virus population.
12
We have studied the genetic stability of YF17D/Esa 5.1glic virus by two
independent serial passages of this virus in Vero cells up to the tenth passage (Fig. 6A).
We used infection low MOI. as to maximize the number of viral RNA replication
cycles and thereby increase the chances for mutational events to take place. The cassete
integrity in the viral genome was checked by RT-PCR analysis on RNA extracted from
viral samples at different passage levels. Although the 2.0 kb amplicon, which
corresponds to the complete heterologous expression cassete, was detected as far as the
tenth consecutive passage (Fig. 6B) a smaller amplicon of 1.0 kb was also evident. In
order to clarify whether distinct passage populations were composed of a mixture of
viruses either carrying the entire heterologous cassete or deletions thereof, Vero cells
infected with these viruses at different passage levels were submitted to flow cytometry
analysis. Only 0.8% of the cells infected with the control virus YF17D/E200T3
showed double fluorescence (Fig. 6C), whereas 78 % to 86 % of cells after
YF17D/Esa/5.1glic virus infection was positive for YF viral antigens and EGFP. This
variation in the percentage of positive cells along the passages was not statistically
significant (One-way ANOVA; P = 0.74). These results suggest the continuous
presence of the EGFP gene in the recombinant virus genome and its expression
throughout the passages. However, as we continued with these two independent serial
passage lines in Vero cells up to the fifteenth one, it was possible to demonstrate a
change in the total EGFP+ YF+ labeled cells, which varied from 83 % to 84 % at the
tenth passage to 1 % and 20 %, at the fifteenth, respectively (data not shown).
To better characterize the genetic stability of the YF17D/Esa/5.1glic virus, we
set up a serial passage experiment in Vero cells with 5 plaque purified viral clones. All
Vero cell cultures infected with each of the 5 cloned viruses exhibited double EGFP
and viral antigen fluorescence. The double fluorescence ratio varied from 95 to 99% in
13
cells infected with cloned viruses at their fifth passage. But, at the tenth passage, two
cloned viruses have exhibited a double labeling percentage of 7 % and 33 %,
suggesting the continuous loss of the foreign sequence in this interval (data not shown).
However, the other three cloned virus samples displayed 77 %, 93 % and 80 % of
double gated cells at the tenth passage (data not shown), indicating again genetic
stability of the EGFP-bearing recombinant virus population.
Expression of EGFP by a chimeric flavivirus. To verify whether this strategy
might be applicable to clone foreign sequences in other flavivirus genomes, we have
constructed a recombinant YF17D/DEN4/Esa/EGFP virus, in which the YF prM/E
genes were replaced by the homologous genes of the DEN type 4 virus with the EGFP
cassete being inserted in the same E/NS1 intergenic region (Fig.7A). It is noteworthy
that there were two stem-anchor regions: the first one located just upstream of the
EGFP gene, corresponding to the stem anchor of the dengue 4 E protein gene, and the
second one located just downstream of the EGFP gene, corresponding to the stem-
anchor of the YF 17D virus E protein, as part of the heterologous expression cassete
(Fig.7A). Viable YF 17D/DEN4/Esa/EGFP virus, designated YF17D/DEN4/Esa/6, was
recovered after in vitro transcription and transfection of Vero cells with RNA. The
chimeric YF17D/DEN 4/Esa/6 construct could only be recovered after trypsinization of
the RNA-transfected cell monolayer with an additional incubation of 96 h when CPE
became evident. This viral stock, called P1, was used for a second passage in Vero
cells, or P2, with a titer of 6.48 log10 PFU/mL. Passage 2 virus was used for further
analysis.
Aiming at the characterization of the growth capability of the YF/DEN4/Esa/6
virus in comparison to the YF 17DD vaccine virus and parental chimeric YF17D/DEN4
virus Vero cell monolayers were infected with these viruses at MOI of 0.02. The YF
14
17DD and 17D/DEN4 viruses peaked at 72 hours after infection, with titers of 7.2 ± 0.3
and 6.7 ± 0.4 log
10
PFU/mL, respectively, while the recombinant YF17D/DEN4/Esa/6
virus, at 96 hours after infection displayed a viral titer of 6.3 ± 0.1 log
10
PFU/mL
(Figure 7B). At all the time points of the growth kinetic the titers of the recombinant
EGFP YF/DEN4 virus were significantly different from the corresponding titers of the
YF 17D vaccine virus (t test; P<0.05).
The genetic stability of the chimeric YF17D/DEN4/Esa/6 virus was assessed by
two series of independent passages in Vero cells up to the twentieth passage. The
expected length of DNA amplicon containing the EGFP expression cassete is 2,046 bp,
while the same region in the parental YF17D/DEN4 virus is 1,017 bp long. As can be
observed in Figure 7C, the band that contains the heterologous insertion is maintained
as far as the twentieth passage in both series, indicating viral genetic stability.
15
Discussion
The yellow fever virus has been considered as an appealing viral vector for the
development of new human vaccines [27]. The most successful approach so far has
been the exchange of the YF viral envelope genes with those from other flaviviruses
[9]. These chimeric viruses have been shown to be safe, and immunogenic and are
undergoing clinical trials [28]. It would be desirable, however, the design of strategies
for the insertion of foreign sequences and not only the replacement. In this regard short
sequences encoding known B and T cell epitopes, have been inserted in the intergenic
region between NS2B-NS3 and at a selected site of the E gene [6, 8, 10, 11]. Although
these YF recombinant viruses were immunogenic, attenuated and grew to high titers,
foreign insertions longer than 40 codons were not genetically stable. As the E-NS1
region represents a functional shift in flavivirus genome from the structural to non-
structural genes, insertions of larger gene fragments at this intergenic site might induce
fewer disturbances in the virus cycle as compared to other sites.
During viral RNA translation, the flavivirus polyprotein precursor transverses
the ER membrane at various points being proteolytically processed in the ER lumen by
cellular signalases and at the cytoplasmic side by the viral NS2B/NS3 protease [29].
The E protein remains associated to the ER membrane through two transmembrane
domains (TM1 and TM2). TM2 would also act as a signal sequence for NS1 secretion.
The stem region that connects the E protein ectodomain to the transmembrane domains
consists of the two helices accommodating the inferior surface of the E ectodomain and
the external membrane layer [22]. With regard to the signalase cleavage sites, the
carboxi-terminus of flavivirus E protein is composed of the VXA motif frequently
present in other eukaryotic processing sites [30]. The DXGC amino acid sequence
present at the amino-terminal of NS1 is much conserved among flavivirus. The
16
temporal and spatial coordination of the viral precursor protein processing is critical for
virus morphogenesis [31], and probably also to the assembly of the viral replication
complex. Thus, our design of the expression cassette in which the E protein stem-
anchor and a short segment of NS1 were added to the heterologous sequence
contemplates polyprotein processing and secretion into the ER, processes that are
fundamental to viral viability. Notwithstanding a reduced growth rate as compared to
the original YF 17D vaccine virus, the recombinant YF 17D/Esa/5.1glic and
YF17D/DEN4/Esa/6 virus yields are still suitable for industrial vaccine production.
Recombinant YF 17D viruses bearing genetic insertions between the E and NS1
genes must be stable to be useful for the development of new live attenuated vaccine
viruses expressing antigens of other pathogens. The genetic stability of the EGFP
expression cassette was studied in YF17D/Esa/5.1glic and YF17D/DEN4/Esa/6 viral
samples submitted to serial cell passages. Cells were infected at low MOI (0.02) as this
would force high replication rates for the viral genome thereby allowing recombination
events to take place possibly leading to cassette removal. Nevertheless, these viruses
were genetically stable as far as maintenance of the heterologous cassette is concerned
up to the tenth continuous cultivation (YF17D/Esa/5.1glic) and the 20
th
passage
(YF17D/DEN4/Esa/6). The flow cytometry data for cells infected with
YF17D/Esa/5.1glic supports the genetic stability of the insert up to the tenth passage. It
is possible to produce seed lots intended for industrial production starting from cDNA
with 4 passages [32].
The apparent instability revealed by PCR analyses of the viral E-NS1 genomic
region might be related to the presence of a 288 nt direct repeat flanking the foreign
gene, which corresponds to the duplicated E protein stem-anchor region. It is known
that the flavivirus RNA is synthesized semi conservatively and uses double-stranded
17
RNA as replicative form [33]. Thus, it is conceivable that pairing between the stem-
anchor complementary non-allelic 288-nucleotide sequences might lead to viral RNA
copies with EGFP gene deletions, with these mutants prevailing in viral populations
after some rounds of cell passaging. Consistent with this hypothesis is the observation
that the YF17D/DEN4/Esa/6 is genetically more stable. This is probably due to the
presence of two divergent stem-anchor domains with reduced nucleotide pairing during
RNA replication.
Recombinant YF 17D viruses bearing prM-E from other flaviviruses have been
suggested as new vaccines [9]. In areas with extensive vaccination to YF these
chimeric viruses expressing foreign antigens from the E-NS1 site would be useful to
overcome immunity to YF. We have shown here the viability of one such chimera
bearing the EGFP gene. Interestingly the YF17D/DEN4/Esa/6 virus was more stable
than the YF17D/Esa 5.1glic virus, as the EGFP insertion in this chimeric virus could be
detected up to the twentieth serial passage on Vero cell monolayers. The fact that the
genome of this virus contains two divergent stem-anchor regions, one from DEN 4
virus E gene and the other from YF 17D virus E gene, which share only 58 % of
nucleotide sequence homology suggests that the lower the homology of the stem-
anchor regions, the higher the stability of the recombinant viral genome. A complete
assessment of the genetic stability of a new YF 17D recombinant virus bearing the
EGFP gene fused to the DEN4 stem-anchor sequence is underway using serial
passaging followed by antigen expression monitoring and viral RNA amplification.
This analysis should highlight the true stability of insertions between E and NS1 to
confirm that for this strategy to render genetically stable viruses it is important to use
the stem anchor domains of different flaviviruses.
18
The foreign EGFP expressed by the recombinant YF 17D virus remained cell
associated, since it was not possible to detect it in infected cell culture supernatant, but
only in cell extracts. The same methodology allowed the successful detection of YF
NS1 secretion in different cell types [34]. Moreover, EGFP was located within ER
compartment as shown by confocal microscopy. The presence of the YF 17D E protein
stem-anchor region at its carboxi-terminus is likely to have allowed its anchoring in the
luminal side of the ER membrane. It has been shown that intracellular prM and E are
mostly localized to the ER as stable heterodimers [35] and heterodimer formation is
likely to depend on the accumulation of these proteins in the ER. Interestingly specific
ER retention signals have been suggested to exist in the TM1 domain [36]. The
association of stem-anchor region with the reporter gene EGFP provides an
experimental system to study flavivirus protein trafficking within the infected cell. The
insertion of marker genes into the flavivirus genome may also allow in vivo studies on
viral cell and tissue tropism as well as cellular processes related to infection.
Flaviviruses are assembled in the ER membranes and virions released by exiting
through the Golgi compartment. This process involves hypertrophy of the ER
membranes, due to virus particle accumulation [37] and contributes to ER stress [38]
and apoptosis induction. YF 17D and wild type viruses can induce apoptosis in
immature dendritic cells and hepatocytes [11, 39]. The phagocytosis of apoptotic cells
infected with YF recombinant virus by macrophages might have allowed EGFP peptide
presentation through HLA class II molecules eliciting T cell CD4+ responses. This
type of response would favor an IgG antibody response to the foreign protein, and this
is exactly the type of molecules detected in the ELISA test. On the other hand, infected
cell necrosis might result in local inflammation, leading to the B-cell activation. Both
alternatives would explain why mouse immunization with the recombinant
19
YF17D/Esa/EGFP 5.1 glic virus elicited antibodies to EGFP even with the foreign
protein retained in the cell ER. Studies on the duration of the antibody response and
immunoglobulin isotyping may highlight the predominant mechanism.
One of the hallmarks of YF 17D vaccine is its extremely low incidence of
adverse events. All YF 17D viruses retain a certain degree of neurovirulence for mice
and monkeys. We have shown that the neurovirulence of the YF17D/Esa/EGFP and YF
17D/DEN4/Esa/6 recombinant viruses was not exacerbated for mice further warranting
the potential of this approach to new live virus vaccine development (data not shown).
Final proof for the attenuation of YF 17D recombinant viruses bearing insertions at the
E-NS1 region will have to come from the monkey neurovirulence test , which
constitutes the ultimate standard established to ensure the attenuation of any YF 17D
virus intended for human use [40].
It is noteworthy that a recombinant YF 17D virus expressing a precursor of the
Lassa virus glycoprotein between YF 17D E and NS1 genes has been recently
described [41]. This construct differs from our design since only the 23 carboxi-
terminal hydrophobic amino acids corresponding to the TM2 domain of the YFV 17D
E gene were duplicated downstream of the LASV GPC gene to serve as a signal
sequence to ensure insertion of the YFV 17D NS1 protein into the ER. However, the
proteolytic processing of the Lassa virus protein precursor was not appropriate due to
the lack of an amino terminal hydrophobic domain. Moreover, no evidence for YF and
foreign antigen trafficking in the infected cell was presented. This recombinant
replicated poorly in guinea pigs but still elicited antibodies against both viruses as
measured by Elisa tests.. Deficient immune responses, as a consequence of non optimal
genome structure and polyprotein processing and trafficking ending with low levels of
antigen may explain the partial protection observed in the challenge experiments [41].
20
It was claimed that YF 17D-Lassa recombinant virus growth was comparable to that of
the parental 17D vaccine virus but no data was shown and there was no experimental
evidence for its genetic stability.
The flavivirus genome is small and compact. Any modification may have a
deleterious effect in RNA replication, polyprotein precursor processing or viral protein
function, with unpredictable burden on viral capability to replicate in the vertebrate
animal host and therefore to elicit the robust immune response characteristic of YF 17D
virus [1]. In this regard the work described by Bredenbeek et al and herein is rather
complementary towards the definition of the best strategy to engineering the 17D virus
to express larger foreign protein domains. However, our strategy is likely to be useful
for a broader live attenuated YF 17D virus-based vaccine development for other
diseases since recombinant viruses expressing protozoan and other viral antigens of
interest have been developed.
Conclusions
We were able to express a reporter autofluorescent protein in the intergenic
E/NS1 region of YF 17D virus. The methodology is based on the duplication and
fusion of the functional motifs flanking the E and NS1 intergenic region to the
exogenous gene. It allowed the correct processing of the viral polyprotein precursor
and did not compromise substantially the viral viability. The heterologous cassette was
genetically stable up to the tenth continuous cultivation in the case of YF 17D virus and
to the 20th passage the twentieth passage for the YF17D/DEN4 virus, suggesting that
the lower homology of the stem anchor region the higher the genetic stability of the
recombinant virus.
21
The foreign EGFP expressed by the recombinant YF 17D virus remained cell
associated and could be localized to the RE compartment. The YF recombinant virus
was capable of eliciting significant titers of neutralizing antibodies to YF and also
antibodies against EGFP.
This system is likely to be useful for a broader live attenuated YF 17D virus-
based vaccine development for human diseases. Moreover, insertion of foreign genes
into the flavivirus genome may also allow in vivo studies on flavivirus cell and tissue
tropism as well as cellular processes related to flavivirus infection
Materials and Methods
Cell cultures. Vero cells, originally obtained from ATCC, were grown in
Earle´s199 medium supplemented with 5% fetal calf serum (FCS).
Construction of infectious cDNA clones. The generation of chimeric E/NS1
regions with the EGFP gene was done by PCR-PCR amplification. The first fragment
(783 base pairs; bp) was amplified with positive primer RG328
(5´CTAGGAGTTGGCGCCGATCAAGGATGCGCCATCAACTTTGGCGTGAGCA
AGGGCGAGGAGCT 3’) that contained the last 15 nucleotides of E plus the initial 27
of the NS1 gene (positions 2,453 to 2,479; based on Gene Bank accession number
X03700) and 20 nucleotides from EGFP. The negative stranded oligonucleotide
RG329 (5´GCCTTTCATGGTCT
GAGTGAACAACTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG 3´) contained the last 24
nucleotides of the EGFP gene plus the initial 15 nucleotides corresponding to the
amino-terminal domain of the E protein stem-anchor region. This amplification was
carried out on plasmid pEGFP-C2 (Clontech) with Pfx DNA Polymerase according to
the manufacturer (Invitrogen).
22
The second fragment (339 bp) was based on the amplification of the YF T3
plasmid [6] with oligonucleotides RG330 (5´CTCGGCATGG
ACGAGCTGTACAAGAAGTTGTTCACTCAGACCATGAAAGGC 3´) and RG331
(5´GCCAAAGTTGATGGCGCATCCTTGATCGGCGCCAACTCCTAGAGAC 3´).
This fragment included 24 nucleotides from the carboxi-terminal of the EGFP gene
followed by the YF or DEN4 stem-anchor region (288 bp; YF nucleotides 2,165 to
2,452; Gene Bank accession number U17066) and 27 nucleotides from the amino-
terminus of the NS1 gene (as above).
Both fragments were mixed in equimolar amounts and reamplified with 20 µM
of RG328 and RG331 oligonucleotides. All amplifications were obtained with
Platinum Pfx DNA Polymerase (Invitrogen) according to manufacturer specifications.
The resulting fragment of 1,071 bp was purified with silica-based kit (Qiagen) and
cloned in the pGEM-T plasmid (Promega) using chemically competent E. coli
MC1061. The insert was removed by digestion with Nar I, purified from agarose gel as
above and ligated into YF T3 plasmid using T4 DNA ligase (Invitrogen). This ligation
was used to transform chemically competent E. coli Sure cells (Stratagene).
Recombinant plasmids were screened by digestion with NarI to confirm the insertion
and its orientation was verified by nucleotide sequencing. This led to the identification
of pT3 Esa EGFP. This plasmid contains the middle part of the YF genome and served
later to reconstitute the full genome by ligation with the extreme 5’ and 3’ ends derived
from plasmid E200 [6]. Both plasmids, pE200 and pT3, corresponded to the parental
genetic background of the recombinant YF virus construct and were employed to
generate a parental control virus called YF17D/E200T3. This virus differs from YF
17D at nucleotides 1568, 1570, 8526 and 8808 [6]. The chimeric virus YF17D/DEN4
has the prM/E genes of dengue 4 virus, and its construction will be described
23
elsewhere. The full-length chimeric genome was cloned in pACNR1180 plasmid
bearing or not the EGFP gene between E and NS1 genes [6].
Recovery of virus from cloned cDNA: transcription and transfection. We
have prepared two templates by in vitro ligation [42] of DNA fragments from pE200,
pT3 and pT3Esa EGFP plasmids [6]. For the template with the pT3Esa EGFP plasmid
we utilized a version of pE200 bearing a N-linked glycosylation motif at position E154
of the envelope protein. These templates (E200T3 and E200glic T3 Esa EGFP together
with a full-length YF17D/DEN4-EGFP plasmid) were digested with XhoI, transcribed
by SP6 RNA polymerase (AmpliScribe SP6, Epicentre Technologies) and RNA
preparations transfected into Vero cells with LipofectAmine (Invitrogen) as previously
described [43]. The recovered viruses were designated YF17D/E200T3,
YF17D/Esa/5.1glic and YF/DEN4/Esa/6, respectively. Viral stocks (P2) were prepared
by infecting Vero cell monolayers with the virus present in the supernatant resulting
from transfection (P1) with a multiplicity of infection (MOI) of 0.1. The P2 viruses
were used for all characterizations.
Viral growth and plaque size characterization. Viral growth curves were
determined by infecting monolayers of Vero cells at MOI of 0.02. Cells were seeded at
a density of 62,500 cell/cm2 and infected 24 h later. Samples of cell culture supernatant
were collected at 24-hour intervals post-infection. Viral yields were estimated by
plaque titration on Vero cells. Plaque size was determined by growing viruses in Vero
cells seeded at 62,500 cells/cm2 in six-well plates with an overlay of 3 mL 0.5% low
melting point agarose (Promega) in 199 medium supplemented with 5% fetal bovine
serum. Following 4 days of incubation at 37°C, 2 ml of medium supplemented with
0.1% neutral red was added and the plates were incubated for one more day prior to
fixation. Two YF 17D viruses with different plaquing properties were used as controls:
24
YF17D/E200 T3 with an intermediate plaque and the YF17D/14 virus with a large
plaque phenotype [6]. Two experiments were carried out and the values were derived
from counting 20 plaques for each virus in each assay. The different time points of the
growth curves were compared using t test (GraphPad Prism 3.02 Program). The
differences were considered significant when P < 0.05.
Flow cytometry. Cell samples were obtained from infected monolayers (at
MOI. of 0.02) by trypsin treatment, centrifugation (350 g, 5 min) and washing with
PBS pH 7.4 supplemented with 1 % BSA and 0.01% sodium azide (PBS-BSA-NaN
3
).
Afterwards, Vero cells were adjusted to 10
6
cells/ tube. Cells were fixed in PBS-BSA-
NaN
3
with 1% paraformaldehyde for 20 min at 4
o
C and further washed twice in PBS,
before permeabilization for 20 min at 4
o
C with PBS-BSA- NaN
3
containing 0.15 %
saponin (Sigma Chemical Co). Cells were washed once with PBS-BSA- NaN
3
and
incubated with yellow fever (17D) polyclonal hyperimmune mouse ascetic fluid
(NIAID) diluted to 1:100 in PBS-BSA- NaN
3
-saponin for 60 min at 4
o
C. Cells were
washed again and treated with polyclonal goat anti-mouse immunoglobulins labeled
with R-phycoerytrin (PE; DakoCytomation) for 30 min at 4
o
C. Stained cells, were
washed in PBS-BSA- NaN
3
-saponin, resuspended in PBS-BSA- NaN
3
with 1%
paraformaldehyde and kept at 4
o
C up to three days until acquisition (10,000 events) in
a FACScalibur flow cytometer (BD Biosciences). Data was analyzed using FlowJo 7.2
Software (TreeStar Inc.). Genetic stability analysis was derived from FACS data as the
percentage of double positive (EGFP+ or α-YF +) gated cells over the total α-YF +
antigen cells (EGFP+ and α-YF + gated cells plus α-YF + gated cells). Data was
collected from three independent experiments. One-way ANOVA was performed to
compare the experimental groups using GraphPad Prism (version 3.00 for Windows,
25
GraphPad Software, San Diego California USA). The differences were considered
significant when P < 0.05.
RT/PCR and sequencing. Cell culture supernatants were utilized for viral
RNA extraction with Trizol LS (Invitrogen) and RNA precipitated with isopropanol in
the presence of glycogen (Invitrogen). Amplification of the viral genomic E-NS1 region
encompassing the heterologous insert was performed essentially as described
previously [44]. The RNA was used as template for cDNA synthesis with a negative
strand YF-specific synthetic oligonucleotide (genome position 2619 - 2639), followed
by PCR amplification with the GeneAmp 9600 instrument (Applied Biosystems) and
the GeneAmp RNA PCR Core Kit (Applied Biosystems) with the addition of a positive
YF-specific primer (genome position 1639 - 1659). Amplification products were further
purified from excess primers with silica-based kits (QIAGEN). These products were
sequenced directly without molecular cloning. Nucleotide sequencing reactions were
performed with the BigDye terminator mix version 3.1 (Applied Biosystems) according
to manufacturer’s recommendations. Electrophoresis of fluorescent products was
performed in an ABI PRISM 3730 instrument (Applied Biosystems). Nucleotide
sequences were analyzed using Chromas software version 2.3 (Technelysium Pty Ltd)
and a consensus sequence for each viral genome was derived from contiguous
sequences with SeqMan II software from Lasergene package version 5.07 (DNAStar
Inc.).
Genetic stability assay. Recombinant viruses were submitted to two
independent series of ten passages each in Vero cells at MOI of 0.02. In the fifth and
tenth passages, the Vero cell monolayers at 72 h post-infection were recovered for flow
cytometry analysis to determine EGFP and YF antigen expression. Viral RNA was
26
extracted from the culture supernatants with Trizol LS, cDNA synthesized and
sequenced as described above.
Confocal immunofluorescence microscopy. Vero cells grown on 8-well Lab-
Tek Chamber Slides (Nunc) at a density of 20,000 cells/cm
2
were infected at a MOI of
0.1 with Earle´s199 medium alone (mock infected), or with control virus
YF17D/E200T3 and the recombinant virus YF17D/Esa/5.1glic. Seventy-two hours
post-infection, the cell monolayers were fixed with 4% paraformaldehyde- phosphate
buffer 0.1 M pH 7.8 for 10 min at room temperature. The cells were permeabilized with
PBS containing 0.5% Triton X-100 for 10 min and further incubated in blocking buffer
(PBS containing 3% BSA) for 30 min at room temperature. Both primary- (YF 17D
polyclonal hyperimmune mouse ascitic fluid–NIAID; diluted 1:80 and secondary
antibody (Alexia Fluor 546 goat anti-mouse IgG –Invitrogen; diluted 1:400)
incubations were carried out for 30 min at room temperature. Alternatively, cells were
in vivo labeled in Hank´s Balanced Salt Solution with calcium and magnesium
(HBSS/Ca/Mg, GIBCO) containing 800 nM ER-Tracker Red (Molecular Probes) for 30
min at 37° C. The cells were fixed as described above and washed three times with
HBSS buffer. Both preparations were treated with SlowFadeGold antifade reagent with
DAPI (Invitrogen). Confocal microscopy was performed with a Carl Zeiss confocal
laser-scanning microscope, model LSM 510 META and the image capture was
achieved with the help of the LSM Image Browser 3.5 Software.
Metabolic labelling and immunoprecipitation. Vero cells were infected at a
multiplicity of 0.5 PFU/cell in 60 mm dishes (cell density of 62,500 cells/cm
2
). After a
72 hour incubation, the cells were starved in methionine-free Dulbecco's Modified
Eagle Medium (DMEM) for 20 min and labeled with 30 µCi Redivue [
35
S]methionine
(GE Healthcare Life Sciences) for one hour. The cells were washed once and incubated
27
with 10 mL Earle´s 199 medium with 5% FCS for 3 h at 37°C in a CO
2
incubator. The
supernatants were removed, centrifuged 5 min at 300g at 4°C and protease inhibitors
were added (PMSF 0.1 mM; leupeptin 10 µM; aprotinin 25 µg/ml). The adherent cells
were scraped off and lysed under nondenaturing conditions in the presence of the same
protease inhibitors.
The volume of 250 µL of cell extracts and 1 mL of the cell culture supernatant
of each sample were immunoprecipitated with mouse polyclonal hyperimmune ascitic
fluid to YF 17D (NIAID) and a rabbit polyclonal antiserum directed against GFP
(Clontech). Immunoprecipitates were fractionated with protein A-agarose (Invitrogen)
and analyzed by 10% SDS-PAGE. Gels were treated with sodium salicylate for
fluorographic detection.
Immunogenicity of YF 17D viruses in mice. Groups of ten four-week old
BALB/c mice (CEMIB, UNICAMP) were subcutaneously injected with two doses of
100,000 PFU in 100 µL of YF17D/Esa/5.1glic or YF 17DD viruses with an interval of
15 days. Two weeks after the last immunization, mice were bled from the retrorbital
vein, serum samples were treated for 30 minutes at 56 º C and stored at – 20 º C. YF
neutralizing antibody titer was determined by plaque reduction neutralization test
(PRNT
50
) [45]. The values of neutralizing antibody titers of each experimental group
were compared using t test (GraphPad Prism 3.02 Program). The differences were
considered significant when P < 0.05.
Antibodies to the EGFP heterologous protein were detected by ELISA using
microtiter plates (Costar) coated with 10 ng/well of the recombinant GFP of Aequoria
victoria (Clontech) diluted in 100µL carbonate buffer 0.05 M pH 9.6. After overnight
incubation at room temperature, the plates were washed three times with phosphate-
buffered saline containing 0.05% (v/v) of Tween-20 (PBS-Tween), and blocked at 37°C
28
for two hours with PBS containing 5% (w/v) non-fat milk with 1% (w/v) of bovine
serum albumin (BSA, Sigma Co.). The assays were performed in duplicate and every
plate was composed of the respective pooled sera of each experimental group. The
positive and negative controls consisted respectively of the mouse monoclonal IgG2a
antibody (JL-8) specific for GFP and pooled sera from animals immunized with culture
medium (Clontech). Pooled sera were analyzed in serial dilutions from 1:20 to 1:2,560,
and the JL-8 monoclonal antibody was employed in the range from 10 to 0.78 ng. After
a two-hour incubation at room temperature, unbound antibodies were washed away
with PBS-Tween, and diluted 1:500 peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG heavy
and light chain (Kirkegaard and Perry), was added to each well. After one-hour
incubation at room temperature, the excess labeled antibody was removed by washing,
and the reaction was developed with o-phenylenediamine (Sigma Co.) and 1 µL/ml
H
2
O
2
(Merck). After 15 min, 2M H
2
SO
4
solution was added to stop the reaction and the
plates were read at 492 nm on VERSAmax ELISA reader (Molecular Devices). Every
ELISA plate contained a positive column of serially diluted JL-8 monoclonal antibody,
which provided the standard curve. The different standard curves were analyzed by
linear regression to check the linearity of the data and then used to determine the titers
in the experimental groups. Therefore, the EGFP antibody titers were expressed in
ng/mL based upon the curve established for the JL-8 monoclonal antibody specific to
EGFP.
All animal studies were carried out according to a protocol reviewed and
approved by the Institutional Committee for Experimentation and Care of Research
Animals (CEUA-FIOCRUZ: P0112/02).
Authors' contributions
29
MCB designed the viral constructions and the study, coordinated the study and drafted
the manuscript; SMM carried out the YF virus genome cloning work and the flow
cytometry analysis; GFT performed the confocal microscopy analysis and the EGFP-
ELISA studies; AAR was engaged in the YF/DEN4 virus construction and related
studies; ASD was responsible for nucleotide sequencing, assisted in animal studies and
helped with the ELISA analysis; PJO performed neutralization plaque assays and data
analysis; MSF discussed and assisted in animal studies; CFK designed flow cytometry
analysis and led data interpretation; RG designed the viral constructions and helped to
coordinate the study and manuscript draft. All authors read and approved the final
manuscript.
Competing interests
The authors have declared that the present methodology is the subject of a patent
application having as authors MCB and RG and the Oswaldo Cruz Foundation as the
sponsoring institution.
Acknowledgements
The authors are grateful to the Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos
(Bio-Manguinhos) at Fundação Oswaldo Cruz, for providing the YF 17DD virus and all
the laboratory support and to the Dr. Joel Majerowicz and his team for providing
technical assistance and adequate safety laboratory.
The authors are in debt also to PDTIS-FIOCRUZ for supporting the sequencing and
confocal microscopy studies through the Genomics and Confocal Microscopy
Facilities. This work was supported by grants from FAPERJ, ICGEB, CNPq,
PDTIS/FIOCRUZ (RVR03), the Millennium Institute for Vaccine Technology and
30
Development and the Millennium Institute for Structural Biology and Biotechnology.
MCB and RG were recipients of fellowships from CNPq.
31
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35
Figure 1. Topological arrangement of the flavivirus E stem-anchor region and
its elements. The top panel (A) depicts the topology of part the polyprotein precursor
(E-NS1) of YF virus, its insertion at the endoplasmic reticulum (ER) membrane, the
expected proteolytic cleavage by the ER signal peptidase (blue arrow) and the flavivirus
stem-anchor region with its different elements (H1 and H2; TM1 and TM2). The lower
part of panel (A) illustrates the same region bearing the Enhanced Green Fluorescent
Protein gene (EGFP). The EGFP protein is fused at its amino-terminus with nine
amino acids of YF 17D NS1 protein and with the YF 17D E stem-anchor region at its
carboxi-terminus. Blue arrows indicated ER signal peptidase cleavage sites Panel (B)
presents the sequence alignment (Clustal W method) of the stem-anchor regions of
flavivirus E proteins and the first nine amino acids of the NS1 protein amino-terminus
(TBE; GenBank U27495; YF; GenBank U17066; JE; GenBank M18370; Den 2;
GenBank M19197). Under the alignment, the following symbols denote the degree of
conservation observed at each amino acid position: ( * ) identical in all sequences; ( : )
conserved substitutions and ( . ) semi-conserved substitutions.
Figure 2. Viral growth curves in Vero cells. Cells were infected with either the
control YF 17DD (gray lozenges) and YF17D/E200T3 (black triangles) viruses or the
recombinant YF17D/Esa/5.1glic virus (open circles) at MOI of 0.02 . Each time-point
represents the average titer obtained from three separate experiments with the
respective standard deviations.
Figure 3. Analysis of the EGFP expression in YF 17D virus-infected Vero
cells. (A) Flow citometry analysis at 72 h – post infection. Dot plots show the
expression of YF antigens detected by intracellular staining with murine hyperimmune
serum against YF virus (α-YF; y-axis) and of EGFP by direct detection of its
fluorescence (EGFP; x-axis). The controls consisted of cells infected with no virus
36
(control) and the parental virus ( YF17D/E200T3). Cells infected by the recombinant
virus were labeled (EGFP- α-YF) or (EGFP) only. The percentages of gated cell
populations are indicated in each plot. (B) Immunoprecipitation profiles of protein
extracts from supernatant and infected Vero cells with either YF 17DD or YF
17D/Esa/5.1glic viruses. These samples were immunoprecipitated with murine
hyperimmune serum against yellow fever virus (α-YF) or rabbit polyclonal antiserum
directed to EGFP (α-EGFP). Molecular weight markers are indicated on the left side of
the figure whereas viral and recombinant proteins are identified on the right side.
Figure 4. Intracellular localization of the recombinant EGFP protein. (A) Co-
localization of viral antigens and EGFP. Infected cells were fixed with 4%
paraformaldehyde, permeabilized with 0.5% Triton X-100, and processed for
immunolabeling. The designation on the upper right corner indicates the localization of
the heterologous protein (EGFP); (α-YF) corresponds to the same cells stained with a
hyperimmune antiserum to YF virus proteins; (DAPI) represents DAPI-stained cell
nuclei; (merge) co-localization assessed by spectral overlap (yellow in right down
panel) of the images of this preparation. (B) Co-localization of EGFP and the ER
compartment. Live infected cells were labeled with ER-Tracker Red (Molecular
Probes) and fixed in 4% paraformaldehyde. (EGFP) localization of heterologous
protein; (ER) cells labeled with ER marker; (DAPI) nuclei counterstained with DAPI;
(merge) co-localization assessed by spectral overlap (yellow in right down panels) of
the images of this preparation.
Figure 5. Viral genetic stability and artifactual DNA amplification of the EGFP
gene. (A) Agarose gel electrophoresis of plasmid T3 DNA without and with the EGFP
cassete (lanes 1 and 2, respectively); DNA amplification of plasmid T3 and the
recombinant one (lanes 3 and 4, respectively); RT-PCR on RNA of YF17D/E200T3
37
and YF17D/Esa/5.1glic 2P viruses without and with the EGFP cassete (lanes 5 and 6,
respectively). (B) Schematic representation of the amplification based on the correct
annealing of the E protein gene (black bars) and the EGFP stem-anchor (white bars)
domains from two different DNA strands yielding an amplicon of 2,030 bp. (C) and (D)
schematic representation of the amplification based on the spurious alternative
annealing possibilities of the E protein gene (black bars) and the EGFP stem-anchor
(white bars) regions from two different DNA strands yielding amplicons of 1,001 bp
(without the EGFP cassete and with a single stem-anchor domain, gray bars) or 3,059
bp (with the duplicated EGFP gene and an extra copy of stem-anchor region),
respectively.
Figure 6. Analysis of recombinant virus genetic stability after serial passaging.
(A) Schematics of viral regeneration and subsequent passages (10) of the YF
17D/Esa/5.1 glic virus obtained after RNA transfection. Two independent series of
serial passages (at MOI of 0.02); P1 and P2 were analyzed by RT-PCR and flow
citometry at passages 5 and 10 and are represented in all panels as 5P1, 10P1, 5P2 and
10P2. In these experiments the YF17D/E200-T3 virus was used as negative control for
EGFP expression. (B) Electrophoretic analysis of RT-PCR amplicons from viral RNA
extracted of samples from the supernatant of cultures used to derive the citometry data
(C) according the passage history (A). The length of the main RT-PCR bands are
shown on the left side. (C) The rate of double gated cells (YF+, EGFP+) over the total
YF+ gated cells (YF+, EGFP+ plus YF+, EGFP- gated cells) corresponds to the
percentage of cells infected by YF 17D/Esa/5.1 glic virus stably expressing the EGFP
protein. The respective columns indicate the values for each of the viral passages.
Figure 7. Molecular cloning of EGFP protein expression cassete in the
chimeric YF17D/DEN4 virus genome. (A) Schematic representation of YF
38
17D/DEN4/Esa/EGFP/6 recombinant virus genome and the genetic elements fused to
EGFP gene. (B) Growth of recombinant YF17D/DEN4 viruses in Vero cells. Three
independent experiments were performed to measure viral spread in Vero cells after
infection with an multiplicity of infection (MOI) of 0.02. Cell culture supernatant
aliquots were taken at 24, 48, 72, 96, 120 and 140 hour post-infection (p.i.) and titrated
by plaque formation on Vero cell monolayers. (C) Analysis of recombinant YF
17D/DEN4/Esa/6 virus genetic stability after serial passaging on Vero cell monolayers.
Electrophoretic analysis of RT-PCR amplicons from viral RNA extracted from samples
of the supernatant of cultures according to the passage numbering indicated on top of
each lane. The first lane corresponds to cDNA-derived YF17D/DEN4 virus RNA; the
remaining lanes are RT-PCR profiles from YF17D/DEN4/Esa /6 virus RNA at different
passage levels with lanes 2 and 3 corresponding to amplicons from RNAs of viral
stocks (1P, transfection supernatant) or passage two (2P, first passage of transfection
supernatant), respectively. Lanes 4 to 11 represent RT-PCR products, which were
obtained from viral RNA in the fifth, tenth, 15
th
and 20
th
passages of the two
independent passage lineages (5P1 and 5P2; 10P1 and 10P2, 15P1 and 15P2, 20P1 and
20P2, respectively).
39
Table 1 Immunogenicity of YF17D/Esa/5.1glic for BALB/c mice.
PRNT
50
* ELISA-EGFP***
Immunogen
Animals
(n)
%
seroconversion
GMT ± SD Titer Range**
%
seroconversion
GMT ± SD Titer Range
YF 17DD 15 100 140 ±80 45 -308 0 < 16 < 16
YF17D/Esa/5.1glic
20 100 80 ± 47 37 -211 80 158 ± 1,144
26 – 3,535
199 Earle´s Medium 15 0 < 10 < 10 0 < 16 < 16
* Reciprocal of the dilution yielding 50% plaque reduction.
** Differences in the titers of neutralizing antibodies virus in animals immunized with YF 17DD and YF17D/Esa/5.1glic were statistically
significant (t test; P < 0.02).
***The titer of antibodies directed against EGFP was calculated based on standard curves of a monoclonal antibody specific to GFP and is
expressed in ng/mL.
40
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