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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos
Área de Bromatologia
Análise diferencial do proteoma da polpa do mamão
durante o amadurecimento utilizando eletroforese
bidimensional
Silvia Beserra Nogueira
Tese para obtenção do título de
DOUTOR
Orientador:
Prof. Dr. João Roberto Oliveira do Nascimento
São Paulo
2010
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos
Área de Bromatologia
Análise diferencial do proteoma da polpa do mamão
durante o amadurecimento utilizando eletroforese
bidimensional
Silvia Beserra Nogueira
Tese para obtenção do título de
DOUTOR
Orientador:
Prof. Dr. João Roberto Oliveira do Nascimento
São Paulo
2010
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100p.
Silvia Beserra Nogueira
Análise diferencial do proteoma da polpa do mamão durante
o amadurecimento utilizando eletroforese bidimensional
Comissão Julgadora
da
Tese para obtenção do grau de Doutor
Prof. Dr. João Roberto Oliveira do Nascimento
Presidente/Orientador
1º Examinador
2º Examinador
3º Examinador
4º Examinador
São Paulo, de de 2010.
AGRADECIMENTOS
À Deus por guiar meus passos em todos os momentos.
Ao meu marido, Thiago Kanyo Dutra, por acreditar em mim, me apoiar sempre
e fazer minha vida mais feliz.
Aos meus queridos pais Ademiro da Silva Nogueira e Maria das Graças
Beserra Nogueira pelo amor e por toda uma vida de luta para que eu che
.
Ao meu irmão Leandro Beserra Nogueira pelo amor e amizade.
À minha família e parentes que torcem por mim mesmo a distância.
da
abalho.
Ao Prof. Dr. João Roberto Oliveira do Nascimento
.
à FAPESP pelos auxílios financeiros
(02/12452-9 e 2008/52447-0).
Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Labate
.
Ao Prof. Dr. Fábio Cesar Gozzo por possibilitar a realização de algumas
análises.
- em Ciência dos
Alimentos, em especial a Prof. Dra. Beatriz Rosana Cordenunsi e ao Prof. Dr.
Eduardo Purgatto pelo carinho e colaboração.
de química e bioquímica de alimentos por facilitarem
nosso trabalho, em especial a Tânia Misuzu Shiga pelo carinho e amizade.
, Renato Astorino Filho,
Tatiana Torres Toledo, Roberta Ghedine der Agopian, Claudineia Aparecida
Soares, Cíntia e tantos outros que passaram e de
.
,
Muito Obrigada!
NOGUEIRA, S.B. Análise diferencial do proteoma da polpa do mamão
durante o amadurecimento utilizando eletroforese bidimensional. Tese de
Doutorado, 2010, 100p. [Faculdade de Ciências Farmacêuticas da
Universidade de São Paulo].
RESUMO
O mamão papaia (Carica papaya L.) é uma fruta tropical de grande relevância
comercial uma vez que o Brasil é o maior produtor mundial e terceiro maior
exportador da fruta. Contudo, por ser uma fruta climatérica, tem uma vida pós-
colheita limitada, devido ao rápido amaciamento da polpa. Neste trabalho foi
realizada uma investigação proteômica comparativa de polpa do mamão verde
e maduro. Várias centenas de componentes protéicos (spots) foram resolvidos
em géis 2-DE (faixa de pH 4-7) utilizando a eletroforese diferencial em gel
(DIGE) e posteriormente as imagens geradas foram analisadas pelo programa
PDQuest. Os spots diferencialmente expressos foram retirados do gel, digeridos e
sequenciados (ESI-Q-TOF-MS/MS). Em geral, as proteínas diferencialmente
expressas foram associadas ao metabolismo do etileno, resposta ao estresse,
metabolismo de carbono e outros importantes processos fisiológicos. Os papéis
de algumas das proteínas identificadas foram discutidos em relação à
qualidade dos frutos do mamão. Este estudo fornece a primeira caracterização
das mudanças no proteoma da polpa do mamão durante o amadurecimento.
Deste modo a identificação de proteínas envolvidas na instalação ou
desenvolvimento do amadurecimento pode contribuir para o entendimento
deste processo e, também, gerar subsídios para avanços tecnológicos visando
à qualidade e diminuição das perdas pós-colheita.
Palavras-chave: Amadurecimento dos frutos, Proteoma diferencial, DIGE,
Carica papaya L.
NOGUEIRA, S.B. Differential analysis of papaya fruit proteome during
ripening using two-dimensional electrophoresis. Tese de Doutorado, 2010,
100p. [Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo].
ABSTRACT
Papaya (Carica papaya L.) fruit is a relevant tropical crop since Brazil is the
world's largest producer and third largest exporter of fruit. However being a
climacteric fruit, has a limited green life due to the rapid pulp softening. We
report here a comparative proteomic investigation of fruit pulp from unripe and
ripe papayas. Several hundreds of protein components were resolved on 2-DE
gels (pH range 47) using the differential gel electrophoresis (DIGE) approach,
and images were analyzed by PDQuest. The variable components were
excised, in-gel digested and were analyzed by ESI-Q-TOF-MS/MS. In general,
the differentially expressed proteins were associated to ethylene metabolism,
stress response, carbon metabolism and other important physiological
processes. The roles of some of the identified proteins were discussed in
relation to papaya fruit quality. To the best of our knowledge, this investigation
provides the first characterization of the changes in papaya fruit pulp proteome
during ripening. Thus the identification of proteins involved in the installation or
development of the ripening may contribute to the understanding of this process
and also provide subsidies for technological advances aimed at quality and
reduction of post harvest losses.
Keywords: Fruit ripening, Differential proteome, DIGE, Carica papaya L.
ABREVIATURAS
1-MCP
1-Metilciclopropeno
2DE
eletroforese bidimensional
CCD
dispositivo de carga acoplada (charge-coupled device)
CBB
coomassie brilliant blue
DIGE
eletroforese diferencial em gel
(difference gel electrophoresis)
DPC
dias pós-colheita
DTT
ditiotreitol (tio-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol)
EDTA
ácido etilenodiamino tetra-acético
(ethylenediaminetetraacetic acid)
ESI
ionização por electrospray (electrospray ionization)
EST
expressed sequence tags
FID
detector de ionização de chama (fire ionization detector)
FT-MS
ressonância de íon ciclotron de transformada
(fourier transform íon cyclotron)
IEF
focalização isoelétrica (isoeletric focusing)
IPG
gradiente imobilizado de pH (immobilized pH gradient)
IPP
isopentenil-difosfato
kDa
quilodalton
LC-MS
cromatografia líquida acoplada a espectrometria de
massa
LED
diodo emissor de luz
MALDI
espectrometria de massa por desorção e ionização a
laser assistida
(matrix-assisted laser desorption/ionization)
MSDB
mass spectrometry protein sequence data base
MS
espectrometria de massas
m/z
razão massa carga
PAGE
eletroforese em gel de poliacrilamida
(polyacrylamide gel electrophoresis)
pI
ponto isoelétrico
PG
poligalacturonase
PL
pectate liase
PME
pectiname7tilesterase
ppm
Partes por milhão
SDS
dodecil sulfato de sódio (sodium dodecyl sulfate)
TCA
ácido tricloroacético
TCD
detector de condutividade térmica
(thermal conductivity detector)
TOF
Tempo de vôo (time-of-flight)
TRIS
(hidroximetil) aminometano
(hydroxymethylaminomethane)
V
Voltagem
Vh
volts-hora
SUMÁRIO
Pág.
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................
01
1.1 Expressão gênica e amadurecimento...............................................
03
1.2 Proteômica.........................................................................................
05
2. OBJETIVO...........................................................................................
13
3. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................
14
3.1 Amostras...........................................................................................
14
3.2 Caracterização das amostras............................................................
14
3.3 Extração de proteínas........................................................................
16
3.4 Eletroforese SDS-PAGE....................................................................
17
3.5 Eletroforese bidimensional-2DE........................................................
17
3.6 Análise das imagens dos géis corados com coomassie brilliant blue...
22
3.7 Análise das imagens dos géis de proteínas marcadas por
fluorescência-DIGE..................................................................................
23
3.8 Digestão de proteínas........................................................................
25
3.9 LC-MS/MS.........................................................................................
26
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................
27
4.1 Amostragem.......................................................................................
27
4.2 Extração de proteínas .......................................................................
30
4.3 Eletroforese bidimensional: géis corados com coomassie brilliant blue
33
4.4 Análise DIGE............................................................................................
42
4.5 Seleção dos spots para digestão.............................................................
51
4.6 Espectrometria de massas .....................................................................
52
4.6.1 Taxa de identificação de proteínas em Carica papaya L.....................
52
4.7 Classificação funcional das proteínas.....................................................
58
4.7.1 Síntese e regulação de etileno.............................................................
58
4.7.2 Hidrolases.......................................................................................
65
4.7.3 Metabolismo secundário.................................................................
68
4.7.4 Metabolismo energético........................................................................
70
4.7.4.1 Metabolismo de carbono....................................................................
71
4.7.5 Síntese e armazenamento de proteínas..............................................
73
4.7.6 Proteínas de resposta ao estresse.......................................................
74
4.7.7 Proteínas de estresse oxidativo............................................................
78
4.7.8 Múltiplos spots de uma mesma proteína..............................................
80
5. CONCLUSÃO............................................................................................
82
6. REFERÊNCIAS.........................................................................................
84
7. ANEXOS ...................................................................................................
98
LISTA DE TABELAS
Pág.
Tabela 1.
Esquema de marcação com as cianidinas (Cy2, Cy3 e
Cy5) dos dois pontos de maturação para cada
amostragem........................................................................
20
Tabela 2.
Análise qualitativa da presença de spots de proteínas
nos extratos dos grupos de amostras representativas do
mamão papaia nos estádios de maturação verde e
maduro. Os valores correspondem às médias das
densidades óticas encontradas para a triplicata de géis e
a razão entre esses valores...............................................
39
Tabela 3.
Análise quantitativa da presença de spots de proteínas
nos extratos dos grupos de amostras representativas do
mamão papaia nos estádios de maturação verde e
maduro. Os valores correspondem às médias das
densidades óticas encontradas para a triplicata de géis e
a razão entre esses valores...............................................
41
Tabela 4.
Análise qualitativa da presença de spots de proteínas
nos extratos dos grupos de amostras representativas do
mamão papaia nos estádios de maturação verde e
maduro. Os valores correspondem às médias das
densidades óticas encontradas para a triplicata de géis e
a razão entre esses valores...............................................
46
Tabela 5.
Análise qualitativa da presença de spots de proteínas
nos extratos dos grupos de amostras representativas do
mamão papaia nos estádios de maturação verde e
maduro. Os valores correspondem às médias das
densidades óticas encontradas para a triplicata de géis e
a razão entre esses valores...............................................
47
Tabela 6.
Proteínas de Carica papaya L. identificadas através da
análise DIGE durante o amadurecimento do fruto...................
54
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1.
Caracterização fisiológica de três distintas amostragens
do mamão papaia. As amostragens I (linhas pretas) e II
(linhas vermelhas) e III (linhas azuis) tiveram o
amadurecimento acompanhado pelos seguintes
parâmetros: A) quantidade de CO
2
produzido pela
respiração dos frutos, B) etileno produzido pelos frutos,
C) firmeza da polpa. As barras verticais representam o
erro padrão das médias n=6 amostragens I e II, n= 9
amostragem III)..................................................................
21
Figura 2.
Caracterização fisiológica de três amostragens distintas
do mamão papaia. Imagens dos frutos mostrando as
mudanças típicas na cor da casca e da polpa para as
amostragem I (a), II (b) e III (c) (DPC dias pós-colheita)...
22
Figura 3.
Eletroforese sob condições desnaturantes (SDS-PAGE)
de proteínas extraídas da polpa do mamão papaia. As
letras A, B e C indicam os extratos de amostras pré-
climatéricas obtidas das amostragens I, II e III,
respectivamente, enquanto as letras D, E, e F indicam os
extratos de amostras climatéricas das amostragens I, II
e III, respectivamente, separadas em gel de
poliacrilamida 12% (SDS-PAGE). As proteínas foram
coradas utilizando-se coomassie brilliant blue. Os
números à esquerda indicam o tamanho das bandas do
padrão de peso molecular, em KDa...................................
25
Figura 4.
Eletroforese bidimensional de proteínas da polpa do
mamão papaia verde (a) e maduro (b). As proteínas
foram separadas em um gradiente de pH 3-10 na
primeira dimensão e em SDS-PAGE 12% na segunda
dimensão. As proteínas foram coradas utilizando a
coloração com coomassie brilliant blue. Os números a
esquerda indicam o tamanho da banda do padrão de
peso molecular em KDa.....................................................
27
Figura 5.
Imagens dos géis resultantes das análises DIGE do
mamão papaia verde e maduro. A coluna verde 1,2,3
representa as imagens do mamão verde foram marcados
com Cy3 e 4,5,6 as que foram marcados com Cy5. A
coluna pool todas as imagens foram marcadas com Cy2.
A coluna maduro 1,2,3 representa as imagens de mamão
maduro que foram marcadas com Cy5 e 4,5,6 as que
foram marcadas com Cy3. As linhas representam as três
imagens pertencentes ao mesmo gel................................
36
Figura 6.
Imagem multicanal da análise DIGE obtida através da
sobreposição de canais de fluorescência da Cy2 (pool),
Cy3 (pré-climatérico), e Cy5 (climatério). As setas
indicam spots de proteínas diferencialmente expressos
selecionados após análise de teste T de Student
de identificação. A escala de pH de separação da IEF
(pH 4-7) está localizada na parte superior, e da posição
do peso molecular está à esquerda da imagem...............
50
Figura 7.
Classificação funcional das 37 proteínas da polpa do
mamão papaia identificadas como diferencialmente
expressas durante o amadurecimento...............................
60
1. Introdução _________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
1
1. INTRODUÇÃO
O mamão papaia (Carica papaya L.) é um fruto de grande importância
comercial para o Brasil, uma vez que o país é o maior produtor mundial da
fruta, com 24% da produção total mundial e o terceiro maior exportador, sendo
que a produção em 2006 representou um recorde nacional, com 1.897.639
toneladas (IBGE, 2006). Além disso, está entre as frutas mais apreciadas e
consumidas no Brasil (EMBRAPA, 2009), sendo uma excelente fonte de
nutrientes, vitaminas (vitamina C e pró-vitamina A) e minerais (magnésio)
(WALL, 2006).
O mamão papaia é uma fruta climatérica, que apresenta comportamento
típico durante o amadurecimento, com aumento da respiração e da produção
de etileno (SEYMOUR, TAYLOR e TUCKER, 1993). As principais alterações
físico-químicas como a mudança na coloração, na textura, acúmulo de
açúcares e de compostos voláteis, ocorrem durante o amadurecimento e são
finalizadas na senescência (GIOVANNONI, 2001). Estas transformações
resultam em um fruto final com características atrativas para os consumidores,
além de determinar características nutricionais importantes, como quantidade e
composição de fibras, lipídeos, vitaminas e composição de antioxidantes
(BRAMLEY, 2002).
Nos frutos climatéricos as transformações físico-químicas ocorrem
rapidamente após a colheita, tornando-os muito perecíveis, o que exige
medidas de controle apropriadas do amadurecimento, de forma a aumentar a
vida útil do produto. No caso do mamão, as alterações que ocorrem na
1. Introdução _________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
2
coloração da casca, passando da cor verde para amarela, são resultantes,
principalmente, da degradação da clorofila e do aumento da síntese de
pigmentos, como os carotenóides (CHITARRA e CHITARRA, 1990). De acordo
com Fabi (2007) a concentração de alguns carotenóides como: all-trans-
licopeno, all-trans--criptoxantina e all--caroteno, aumentaram durante o
amadurecimento da polpa de frutos de mamoeiro.
A diminuição da firmeza da polpa é um indicativo importante do
amadurecimento do mamão e um dos principais fatores que contribuem para
torná-lo extremamente perecível. Em frutos a degradação de polissacarídeos
da parede celular, como celulose, hemicelulose e pectina levam as alterações
na parede celular e, consequentemente, ao amaciamento da polpa
(SEYMOUR, TAYLOR e TUCKER, 1993). As altera
:
poligalacturonase (PG), pectinametilesterase (PME) e pectate liase (PL), entre
outras. A atividade de PME aumenta gradualmente ao longo do
amadurecimento permitindo a atividade da PG através da demetilação das
pectinas. No caso da PG o aumento é bem significativo, concomitante com o
aumento da produção de etileno no mamão papaia (PAULL e CHEN, 1983).
Genes que codificam para PG já foram caracterizados em muitas outras frutas,
e alguns estudos têm revelado a expressão deste gene induzido pelo etileno.
De acordo com Fabi e colaboradores (2009) em mamões o gene da PG
é induzido pelo etileno. Porém, a inibição do mesmo por 1-MCP não impediu o
amadurecimento total do fruto. Estes resultados podem ser um indicativo de
1. Introdução _________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
3
que outras enzimas etileno independentes participam do processo do
amadurecimento.
A rápida diminuição da firmeza da polpa do mamão predispõe o fruto a
injúrias mecânicas e a presença de microorganismos. Foi estimada uma perda
pós-colheita mundial de 40 a 100% do mamão (PAULL et al., 1997). Apesar
disso, as técnicas de manejo pós-colheita como o uso de embalagens
especiais, o tratamento térmico e a aplicação de inseticidas ainda não
provaram ser completamente eficazes para minimizar e prevenir as perdas
(SAUCEDO-VELOZ, 1997). Portanto, é importante conhecer os mecanismos
moleculares de controle do processo de maturação da fruta e o amaciamento
da polpa e identificar eventuais pontos em seu metabolismo que possam ser
trabalhados com o intuito de reduzir as perdas econômicas e nutricionais.
1.1 Expressão gênica e amadurecimento
A expressão gênica desempenha papel importante no amadurecimento
de frutos uma vez que, genes específicos parecem ser necessários durante
esse processo (GIOVANNONI, 2004). Porém, estes estudos estão limitados a
poucos frutos como no estudo de genes envolvidos no processo de
amadurecimento de tomate (GIOVANNONI, 2001; MATAS et al., 2009) no
estudo de genes envolvidos na sinalização de etileno durante o
amadurecimento em banana (MBÉGUIÉ et al., 2008) e nos estudos
relacionando o ácido ascórbico com o inicio do amadurecimento de uvas
(LUND et al., 2008).
1. Introdução _________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
4
A obtenção da sequência de nucleotídeos do genoma de plantas
constitui o início da realização de muitos outros estudos. Embora os dados
obtidos pela genômica sejam relevantes, eles são limitados, uma vez que, o
conhecimento de todo o código genético pode ter pouco valor caso não haja
informações sobre a regulação espaço-tempo dos genes. Estas limitações
estão associadas à dificuldade de obtenção de informações sobre o nível de
expressão dos genes, ou sobre as características das proteínas expressas, tais
como a sua localização subcelular, eventuais modificações pós-tradução como
glicosilações e fosforilações, interações proteína-proteína e proteína-DNA, bem
como a estrutura e a função biológica das proteínas (TYERS e MANN, 2003).
Uma maneira de complementar a pesquisa genômica é o estudo do seu
produto final (as proteínas). Assim, grande ênfase tem sido dada à genômica
funcional, que visa identificar a função dos genes e das proteínas através de
estudos do transcriptoma, da proteoma e da metaboloma dos organismos.
Embora a expressão do gene a nível transcripcional forneça informações
importantes sobre a transcrição da fase inicial do genoma para a maquinaria
celular, os níveis de mRNA não são sempre compatíveis com a abundância de
proteínas. Além disso, devido ao splicing alternativo, processamento de mRNA,
proteólise de proteínas e modificações pós-traducionais, um gene pode
produzir muitas proteínas diferentes. Não sendo isso bastante, as funções da
proteína são definidas pela classificação subcelular, a interação com outras
moléculas e a regulação via sinalização celular e ambientais (CHEN e
HARMON, 2006). A proteômica complementa outras abordagens da genômica
funcional, incluindo perfis de expressão baseados em microarray, sistemática
de perfis fenotípicos na célula e no nível de organismo. A integração desses
1. Introdução _________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
5
conjuntos de dados através da bioinformática pode criar um banco de dados
global da função do gene, que servirá como referência poderosa das
propriedades e das funções da proteína.
Deste modo, estudos sobre os produtos finais dos genes, as proteínas,
podem complementar aqueles sobre as sequências de genes, além de fornecer
informações importantes acerca da expressão gênica.
1.2 Proteômica
O termo proteoma é definido como conjunto de todas as proteínas
codificadas pelo genoma em um determinado momento metabólico (WILKINS
et al., 1996). O proteoma é altamente dinâmico e dependente do estado atual
da célula, mudando com o desenvolvimento do organismo e em resposta a
qualquer alteração no seu ambiente (TYERS e MANN, 2003). Devido ao
dinamismo da expressão gênica das células, a proteômica consiste numa
ferramenta importante para descrever as proteínas totais de organelas, órgãos
ou tecidos em diferentes condições biológicas e contribui para entender o
funcionamento dos genes (CHEN e HARMON, 2006). As informações obtidas
como nível de expressão e ponto isoelétrico são informações complementares
ao mecanismo de regulação, quantidade, atividade, isoformas de proteínas,
modificações pós-tr
para os estudos da genômica funcional (TYERS e MANN, 2003).
1. Introdução _________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
6
A obtenção do extrato protéico é a primeira fase antes da separação das
proteínas, sendo uma etapa crítica na produção dos resultados finais da
análise. A qualidade do extrato depende da quantidade de proteínas obtidas,
ausência de contaminantes como pigmentos, carboidratos e compostos
fenólicos e variedade de proteínas extraídas para uma resolução de qualidade
e boa separação das mesmas no gel (NEBRICH et al., 2009).
O tecido vegetal de frutos é considerado de difícil extração de proteínas
devido à sua baixa concentração (SONG et al., 2006) e à presença de grande
quantidade de substâncias interferentes como sais, carboidratos e polifenóis
(WANG et al., 2006). Recentemente muitos trabalhos foram realizados com o
intuito de estabelecer o melhor protocolo para extração de proteínas de tecido
vegetal como nos trabalhos com morango (ZHENG et al., 2007), meristema de
banana (CARPENTIER et al., 2005) e uva (VINCENT, WHEATLEY e CRAMER,
2006). Os protocolos para extração utilizando TCA/acetona e extração fenólica
com precipitação em acetato de amônia e metanol (ISAACSON et al., 2006)
têm sido testados com maior frequência, sendo que, a extração fenólica parece
ser o que obtêm melhor qualidade de extrato.
Após a extração de proteínas, a separação da mistura protéica é
realizada tanto por 2-DE (GORG et al., 1999), ou diferentes tipos de LC
(DAHER et al., 2010). A eletroforese bidimensional tem sido a estratégia mais
utilizada para análise do proteoma em plantas (CARRETTE et al., 2006).
A eletroforese bidimensional (2-DE) pode resolver em um único gel mais
de 5.000 proteínas simultaneamente, e detectar 1 ng de proteína por spot.
1. Introdução _________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
7
Além disso, ela estabelece um mapa das proteínas intactas, o que reflete as
mudanças no nível de expressão, isoformas ou modificações pós-traducionais.
Outro ponto da proteômica, baseada na eletroforese bidimensional, é que esta
permite o acesso a dados qualitativos que mostram apenas se uma proteína
está presente ou não na amostra estudada e, dados quantitativos, que revelam
as concentrações de determinada proteína nas diferentes condições analisadas
(GORG, WEISS e DUNN, 2004).
A eletroforese bidimensional (2-DE) é dividida em duas etapas principais
onde, na primeira dimensão,
(pI , o valor do pH no qual a proteína tem carga
residual nula. No pI
, que possuem boa capacidade tamponante em seus
valores individuais de pI
. Isto faz com que ocorra a migração da amostra, de acordo
com o seu valor de pH. Desta forma, em valores de pH mais baixos que o pI
.
Já na segunda dimensão, a separação se dá de acordo com suas
massas moleculares a sua mobilidade electroforética, na qual as proteínas
menores irão migrar mais rápido que as proteínas maiores. Após a obtenção
dos géis as proteínas podem ser visualizadas através da utilização de corantes
como coomassie brilliant blue (CBB), prata ou fluorescência que permitem
visualizar as proteínas no gel (CANDIANO et al., 2004).
1. Introdução _________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
8
DIGE é um sistema de marcação de proteínas que permite a separação
quantitativa proteômica de duas ou mais amostras por detecção de
fluorescência óptica de proteínas diferencialmente marcadas que são
separadas eletroforeticamente no mesmo gel. DIGE é uma alternativa para a
quantificação de metodologias baseadas em MS e pode contornar suas
limitações analíticas. Por exemplo, consegue analisar as proteínas, mantendo-
as intactas, além de detectar uma gama ampla de proteínas sendo interessante
em aplicações onde a sensibilidade extrema é necessária (UNLU, MORGAN e
MINDEN, 1997). Na eletroforese bidimensional diferencial em gel é possível
analisar em um mesmo gel duas condições experimentais diferentes,
eliminando as variações resultantes de diferenças de corrida dos géis
independentes. As amostras de proteínas são marcadas antes da eletroforese
com corantes fluorescentes, as cianidinas Cy2, Cy3, Cy5. As cianidinas têm um
grupo NHS-éster -amino
de resíduos de lisina das proteínas (ALBAN et al., 2003). Essa técnica
apresenta uma sensibilidade maior quando comparada com a coloração com
prata ou com coomassie brilliant blue, uma vez que é capaz de detectar uma
quantidade muito pequena de proteínas. Além disso, diminui a variação de gel
para gel (ALBAN et al., 2003).
Para a análise DIGE o extrato de proteínas de cada grupo é marcado
com corante fluorescente que exibe comprimento de onda específico para
excitação e emissão. Assim, três amostras diferentes (amostra controle
marcada com Cy3, amostra experimental marcada com Cy5 e, uma mistura de
todas as amostras utilizadas na análise marcadas com Cy2) são misturadas
após a marcação para a focalização isoelétrica e resolvidas no mesmo gel
1. Introdução _________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
9
bidimensional. O padrão interno é constituído a partir do pool (mistura) de
alíquotas de quantidades iguais de todas as amostras que serão analisadas e é
aplicado junto com as outras duas amostras marcadas com os outros dois
fluoróforos em cada gel. Isso permite o calculo das razões para a mesma
proteína entre as amostras no mesmo gel bem como entre géis, de forma a
diminuir a variação experimental e propiciar o aumento da confiança da
quantificação das proteínas entre as amostras dos diferentes géis. Além disso,
reduz o número de repetições de géis por experimento, uma vez que, no
mesmo gel estão duas amostras mais o pool (UNLU, MORGAN e MINDEN, 1997).
A digitalização e a análise das imagens são as etapas seguintes, após a
separação das proteínas nos géis. Primeiramente, a imagem é digitalizada e,
para isso, estão disponíveis vários equipamentos para a aquisição da imagem
do gel 2-DE, incluindo scanners, densitômetros a laser e câmeras charge-
coupled device (CCD). Em seguida, as imagens são analisadas utilizando-se
programas de análise de imagem (Delta2D, DECODON, BioRad, GE
Helthcare) para obter informações sobre a variação das proteínas, de
modo a poder selecionar os spots (proteínas) diferencialmente expressos
quantitativamente e qualitativamente (NEBRICH et al., 2009). A identificação
dos spots selecionados é feita através de sua remoção do gel, seguida por
digestão enzimática (como a tripsina, por exemplo) e posterior identificação dos
peptídeos por espectrometria de massas.
A espectrometria de massas (MS) mede a razão massa/carga (m/z) da
amostra ionizada a ser analisada e consistem em uma fonte de íons, um
analisador de massas e um detector que registra o número de íons de cada
1. Introdução _________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
10
valor m/z. A ionização por electrospray (ESI) e a ionização/dessorção por
matriz assistida a laser (MALDI) estão entre as técnicas mais utilizadas para
volatilizar e ionizar as proteínas ou peptídeos. Na ionização por electrospray o
analisador de massas gera a informação do espectro da massa do íon do
fragmento do peptídeo. Os principais analisadores utilizados em proteômica
são time-of-flight (TOF), íon trap, quadrupolo e fourier transform íon cyclotron -
FT-MS (AEBERSOLD e MANN, 2003) Cada um desses analisadores possui
um desempenho diferente e podem ser utilizados separadamente ou em
conjunto. Com os dados obtidos pela espectrometria de massas existe a
possibilidade de identificação das proteínas através da comparação com os
bancos de dados de sequências de genes e proteínas já disponíveis, como
Genebank e SwissProt (NEBRICH et al., 2009).
Em plantas, as análises proteômicas foram iniciadas com milho
(TOUZET et al., 1996) e Arabidopsis thaliana (SAHNOUN et al., 2000). De
acordo com os trabalhos iniciais, existem algumas dificuldades quanto à
análise proteômica vegetal como a obtenção de um extrato protéico adequado
para a análise. Isto é, sem a presença de compostos interferentes como
pigmentos e carboidratos que afetam a eletroforese bidimensional produzindo
estrias verticais e/ou horizontais (WANG et al., 2006). Além disso, a
identificação de proteínas de espécies cujos genomas ainda não foram
sequenciados também dificulta a análise uma vez que, a identificação e a
caracterização das proteínas; é possível pela disponibilidade de sequências
genômicas e de sequências expressas (Expressed Sequence Tags - EST)
(CANOVAS et al., 2004).
1. Introdução _________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
11
A compreensão de alguns processos como o amadurecimento tem sido
possível devido à união de técnicas complementares a genômica, como a
proteômica. O conhecimento a respeito do amadurecimento pode levar a
descoberta de pontos de controle desse processo, possibilitando, assim, o
aprimoramento do manejo pós-colheita através da tecnologia ou do uso do
melhoramento genético, propiciando aumento da qualidade final e aumento da
vida de prateleira dos frutos. Existem estudos sobre o amadurecimento de
frutos utilizando a proteômica como ferramenta, como no caso de: tomate
(ROCCO et al., 2006), uva (DEYTIEUX et al., 2007) e morango (BIANCO et al.,
2009). Porém, para o mamão papaia ainda não existe nenhum trabalho que
aborde o amadurecimento utilizando a análise proteômica.
Apesar de ainda não existir acervo completo com sequências de genes
ou proteínas do mamoeiro, é possível prosseguir a análise a partir de buscas
baseadas na homologia entre proteínas de outras espécies vegetais já
seqüenciadas, como Arabidopsis thaliana. Isso é possível, pois, as proteínas
são mais conservadas nas plantas, o que facilita sua identificação em um
organismo que não teve o seu genoma completamente sequenciado (como no
caso da Carica papaya L.) pela sua comparação com proteínas bem conhecidas,
como as de Arabidopsis thaliana (LISKA e SHEVCHENKO, 2003). As identificações
e caracterizações de proteínas também são possíveis através de sequências
expressas já disponíveis para o mamão papaia (DEVITT et al., 2006).
1. Introdução _________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
12
A rápida mudança do estádio de maturação verde para o estádio
maduro demonstra uma situação em que o estabelecimento e a comparação
de mapas protéicos dos perfis de proteínas entre ambos estádios de maturação
poderia resultar na identificação de proteínas associadas com essa transição.
2. Objetivo ___________________________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
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2. OBJETIVO
Estabelecer mapas protéicos da polpa do mamão papaia (Carica papaya
L.) nos estádios de maturação verde e maduro e, a partir das comparações
entre esses mapas, identificar spots de proteínas diferentemente expressas.
3. Material e Métodos ___________________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
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3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amostras
Foram utilizadas três amostragens biológicas diferentes nos
experimentos. Deste modo foram utilizados frutos de mamoeiro (Carica papaya
L. cv. Golden) para duas amostragens caracterizadas neste trabalho
(amostragens I e II) e frutos previamente caracterizados por Fabi (2007)
denominada amostragem III. Os frutos das três amostragens foram cedidos
pela empresa Agra Pex Comércio Exterior LTDA (www.agrapapaya.com) cuja
fazenda está localizada no estado do Espírito Santo, Brasil.
3.2 Caracterização das amostras
A caracterização das amostragens I e II foi iniciada com um dia após a
colheita, com frutos em boas condições fito-sanitárias, pesando entre 200 e
300 g. Essas frutas foram mantidas em incubadora com temperatura e umidade
controladas e tiveram o amadurecimento monitorado através de medidas
diárias de CO
2
, etileno, textura e mudança na cor da casca e da polpa.
Do total de 200 frutos obtidos, 6 frutos foram diariamente selecionados
ao acaso para compor as amostragens I e outros 6 frutos para compor a
amostragem II. Para as medidas de CO
2
e etileno, os frutos foram
acondicionados durante 1 hora em frascos individuais (1,4 L e 1,1 L,
respectivamente) hermeticamente fechados. Ao término desse período
3. Material e Métodos ___________________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
15
amostras de ar para medida de etileno (10 mL) e CO
2
(1 mL) foram coletadas
do ambiente interno dos frascos para a análise. A composição de gases foi
determinada por cromatografia gasosa (HP-6890) utilizando uma coluna HP-
Plot Q (30 m, I.D. 0,53 mm), com injetor e detector a 250 ºC e corrida
isotérmica a 30 ºC. Para a análise de etileno foi utilizado o detector de
ionização de chama (FID), enquanto que para a análise do CO
2
foi utilizado o
detector de condutividade térmica (TCD). As medidas foram feitas 1 hora após
a chegada dos frutos ao laboratório e diariamente a intervalos de 24 horas.
Para o cálculo da medida dos gases, foram levados em consideração o
volume do frasco de armazenamento, a massa dos frutos e o tempo de
acúmulo dos gases (FABI, 2007).
Após as medidas de CO
2
e etileno, os frutos foram submetidos à análise
da firmeza das polpas, de acordo com o método descrito por Fabi (2007). As
polpas foram perfuradas com uma sonda de penetração (3 mm de diâmetro) de
um texturômetro, sendo a medida expressa em N.cm
2
. Para isso, foram retiradas
da polpa de cada fruto três seções cilíndricas de 1 cm de altura e 3 cm de
diâmetro distando 0,5 cm da casca. Após essa análise, as frações remanescentes
dos frutos foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas
a -80 C. Os frutos pré-climatéricos foram denominados de frutos verdes e os
frutos climatéricos de frutos maduros.
3. Material e Métodos ___________________________________________________________________
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3.3 Extração de proteínas
A extração de proteínas foi feita de acordo com o procedimento
descrito por Carpentier e colaboradores (2005) com algumas modificações.
Aproximadamente 1 g da polpa armazenada à -80 C foi macerada e ressuspendida
com 5 mL de tampão de extração (50 mM de Tris HCl pH 8,5; 5 mM de
EDTA, 100 mM de KCL, 1% de DTT, 30% de sacarose e 0,01 µL coquetel inibidor
de protease para tecidos vegetais (Sigma-P9599) e 0,01 µL de coquetel inibidor
fosfatase I e II Sigma-P2850 e P5726, respectivamente) e homogeneizados
com agitação por 30 segundos. Igual volume de fenol com pH ajustado para
8,5 foi adicionado aos tubos contendo as amostras. Estas foram então
deixadas sob agitação por 15 minutos a 4 C.
Após centrifugação (6.000 g) a 4 C por 10 minutos, os sobrenadantes
foram transferidos para novos tubos. A fase orgânica coletada foi re-extraída
com tampão de extração e mantida sob agitação novamente por 15 minutos
a 4 C. Após nova centrifugação (6.000 g) a 4 C por 10 minutos, a fase orgânica
foi coletada e adicionada de 5 volumes de acetato de amônio 100 mM. Após 12
horas a -20 C, procedeu-se à centrifugação (16.000 g) por 30 minutos a 4 C.
O precipitado foi submetido a uma lavagem com acetona adicionada de
DTT (0,2%) durante 15 minutos a -20 C. Após a secagem a temperatura
ambiente por 30 minutos o precipitado de proteínas resultante da extração foi
solubilizado em 1 mL de tampão de extração (7 M de uréia, 2 M de tiouréia, 4%
de CHAPS, 1% de DTT) por agitação constante a temperatura ambiente por
3. Material e Métodos ___________________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
17
1 hora. A concentração de proteínas totais foi determinada utilizando o 2-D
Quant Kit (GE Healthcare), de acordo com as instruções do fabricante.
3.4 Eletroforese SDS-PAGE
Amostras contendo 15 µg do extrato de proteínas de cada ponto de cada
amostragem foram desnaturadas separadamente em solução desnaturante de
amostra -mercaptoetanol, 10% glicerol, 0,5 M Tris pH 6,8 e
0,05% azul de bromofenol) e fervidas por 5 minutos (LAEMMLI, 1970).
Posteriormente foi feito um gel desnaturante com 12% de acrilamida e a
solução contendo as proteínas foi aplicada neste gel. E para a corrida foi
utilizada uma voltagem de 200 V. As bandas separadas foram visualizadas por
coloração com coomassie brilliant blue (CBB) G-250 (NEUHOFF et al., 1990).
3.5 Eletroforese bidimensional-2DE
Alíquotas de solução contendo 1 mg de proteína, extraídas dos
diferentes estádios de maturação da amostragem I foram solubilizadas em
DeStreak Rehydration Solution (GE Healthcare) e 0,5% de IPG buffer. Para a
eletroforese bidimensional das amostras coradas foram feitas triplicas de géis
das amostras verde e madura da amostragem I.
3. Material e Métodos ___________________________________________________________________
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Para a focalização isoelétrica tiras de géis com gradiente de pH
imobilizado (Immobiline DryStrip gels - GE Healthcare) de 24 cm e pH 3-10
foram reidratadas nessa solução por 20 horas a temperatura ambiente. A
focalização foi realizada no sistema Ettan IPGphor System (GE Healthcare)
com a seguinte programação: 1 hora a 500 V, 8 horas a 1.000 V, 3 horas a
8.000 V (gradiente), 4 horas e 45 minutos a 8.000 V.
Para a separação na segunda dimensão, as tiras de géis foram
incubadas por 15 minutos em solução de equilíbrio (6 M de uréia, 50 mM de
Tris-HCL pH 8,8, 30% de glicerol, 2% de SDS e 0,002% de azul de bromofenol)
contendo 1% de DTT e posteriormente incubadas em solução de equilíbrio
contendo 2,5% de iodoacetamida por mais 15 minutos. A separação das
proteínas na segunda dimensão foi realizada em gel de poliacrilamida a 12,5%
com 1,5 mm de espessura utilizando-se o sistema Ettan DALT Six (GE Healthcare).
As proteínas foram visualizadas por coloração com coomassie brilliant
blue (CBB) G-250 (NEUHOFF et al., 1990). Os géis foram enxaguados com
água destilada e corados por 12 horas com a solução de coloração (10% de
sulfato de amônio, 25 de ácido fosfórico e 5% de CBB). Posteriormente os géis
foram transferidos para uma solução neutralizadora (0,1 M de Tris-HCL pH 6,5
ajustado com ácido fosfórico) por 3 minutos e em seguida lavados com 50% de
etanol por 1 minuto. Os géis foram transferidos para a solução fixadora (20%
de sulfato de amônio) e posteriormente foram corados novamente com a solução
de coloração por mais 12 horas e descorados como descrito anteriormente para
uma melhor visualização dos spots. Após a descoloração, os géis foram
mantidos em solução de fixação a 4 C até a aquisição da imagem.
3. Material e Métodos ___________________________________________________________________
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Para a eletroforese diferencial em gel (DIGE) foram utilizadas alíquotas
das soluções de proteínas obtidas na extração dos dois pontos de maturação,
verde e maduro, das três amostragens (Tabela 1) e foram feitas duplicatas de
cada gel. Antes da marcação as amostras foram purificadas usando 2-D Clean-
Up Kit, como descrito pelo fabricante para a remoção de contaminantes que
pudessem comprometer a marcação. Após a purificação as amostras foram
solubilizadas em tampão de reidratação para DIGE (7 M de uréia, 2 M de
tiouréia, 4% de CHAPS, 10 mM de Tris pH 8,0).
3. Material e Métodos ___________________________________________________________________
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Tabela 1. Esquema de marcação com as cianidinas (Cy2, Cy3 e Cy5) dos dois
pontos de maturação para cada amostragem.
Gel 1
Gel 2
Gel 3
Gel 4
Gel 5
Gel 6
Padrão interno (pool)
Cy2
Cy2
Cy2
Cy2
Cy2
Cy2
Verde (V)
Cy3 V1
Cy3 V2
Cy3 V3
Cy3 V1
Cy3 V2
Cy3 V3
Maduro (M)
Cy5 M1
Cy5 M2
Cy5 M3
Cy5 M1
Cy5 M2
Cy5 M3
V1,M1: amostragem I
V2,M2: amostragem II
V3,M3: amostragem III
pool: V1+M1+V2+M2+V3+M3
Géis 4, 5 e 6 são duplicatas dos géis
1. 2 e 3
3. Material e Métodos ___________________________________________________________________
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21
Os extratos de proteínas foram marcados com o sistema de marcação
fluorescente mínima (Amersham CyDye DIGE Fluors minimal dyes for Ettan
DIGE, da GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante. Os géis
que continham as amostras de frutos verdes das três amostragens que foram
marcadas com o corante Cy3, as maduras que foram marcadas com o corante
Cy5 e o pool marcado com o corante Cy2. Assim, 50 µg de extrato de proteína
de cada amostra foram marcadas com 400 pmol de corante fluorescente e
incubadas no escuro e no gelo por 30 minutos. A reação foi interrompida pela
adição de 1µL de lisina 10 mM e incubada por 10 minutos no escuro e em gelo.
As amostras de proteínas marcadas com as cianidinas foram diluídas em
DeStreak Rehydration Solution (GE Healthcare) e 0,5% de IPG buffer.
Tiras de géis com gradiente de pH imobilizado (Immobiline DryStrip gels -
GE Healthcare) de 24 cm e pH 4-7 foram reidratadas nessa solução por 20
horas a temperatura ambiente. A focalização foi realizada com o sistema Ettan
IPGphor System (GE Healthcare) com programação de: 1 hora a 500 V, 7
horas a 1.000 V, 3 horas a 8.000 V (gradiente), 5 horas e 36 minutos a 8.000 V.
Para a separação na segunda dimensão, as tiras de géis foram
incubadas por 15 minutos em solução de equilíbrio (6 M de uréia, 50 mM de
Tris-HCl pH 8,8, 30% de glicerol, 2% de SDS e 0,002% de azul de bromofenol)
adicionada de 1% de DTT e posteriormente incubadas em solução de equilíbrio
adicionada de 2,5% de iodoacetamida por mais 15 minutos. A separação das
proteínas na segunda dimensão foi realizada em gel de poliacrilamida a 12,5%
com 1,5 mm de espessura utilizando-se o sistema Ettan DALT Six (GE
Healthcare) em placas de vidro de baixa fluorescência.
3. Material e Métodos ___________________________________________________________________
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22
3.6 Análise das imagens dos géis corados com coomassie
brilliant blue
As imagens das triplicatas de géis corados com coomassie brilliant blue
foram digitalizadas no scanner LabScan III, versão 6.0 (GE Healthcare)
utilizando a resolução de 200 dpi e filtro transparente e arquivadas em formato
tagged image file format (TIFF) para posterior análise com o programa
PDQuest 8.0.1 (Bio-Rad). A triplicata de géis das amostras de frutos, verde e
maduro, foi então analisada usando o programa PDQuest (Bio-Rad).
Primeiramente as imagens foram ajustadas para estarem do mesmo
tamanho e formato e assim poderem ser comparadas e em seguida foram
filtradas para remover qualquer tipo de ruído (sinal de fundo), porém sem afetar
os spots. Em seguida os spots de proteínas de cada imagem foram detectados
automaticamente usando o Spot Detection Parameter Wizard após os
parâmetros anteriores de formatação ter sido ajustados. Os spots foram
editados manualmente adicionando ou excluindo aqueles spots que repetiam
ou eram ausentes em mais de um gel. Os géis com separação de amostras
obtidas de frutas de um mesmo estádio de maturação foram comparados entre
si e agrupados a fim de atribuir uma identidade comum para os mesmos spots
derivados de imagens diferentes. A normalização foi feita com o método de
densidade total na imagem do gel, em que a intensidade em pixels de cada
spot de um gel é dividida pelo valor de intensidade total de todos os pixels da
imagem, e os resultados foram expressos em ppm (partes por milhão).
3. Material e Métodos ___________________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
23
Os volumes dos spots normalizados das triplicatas de géis dos dois
estágios de maturação foram comparados, e analisados de acordo com o teste-
T de Student para verificar se eles foram significativamente diferentes (p < 0,05). Os
spots foram analisados qualitativamente e quantitativamente. A análise qualitativa
correspondeu à detecção de spots presentes em apenas um grupo, mas não
no outro, empregando como critério definidor da presença de um spot no gel o
valor de intensidade acima de 1,5 vezes o valor de fundo observado no gel. A
análise quantitativa correspondeu aos spots que apresentaram aumento, ou
redução, de 50% da intensidade tendo com referência o valor dado pela
amostra verde.
3.7 Análise das imagens dos géis de proteínas marcadas por
fluorescência-DIGE
As imagens dos seis géis DIGE foram digitalizadas utilizando-se o
equipamento VersaDoc MP 4000 (Bio-Rad) que emprega uma câmera charge
coupled device (CCD) para a captação da imagem dos géis. Primeiramente
padronizou-se o ajuste do zoom, do diafragma e do foco para o tamanho e
distância do gel para melhor captura da imagem e visualização dos spots.
Posteriormente o método de captura de imagem apropriado para cada
cianidina foi selecionado, de modo que para a cianidina Cy2 foi utilizado como
fonte de excitação: diodo emissor de luz (LED) azul e filtro de emissão 530BP,
para a cianidina Cy3 LED verde e filtro de emissão 605BP e para a cianidina
Cy5 LED vermelho com filtro de emissão 695BP. Cada gel foi colocado dentro
3. Material e Métodos ___________________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
24
do compartimento da câmera e exposto à luz específica por 30 segundos para
a captura de cada uma das três imagens geradas a partir da florescência das
três cianidinas.
As imagens foram ajustadas para estarem com o mesmo tamanho e
formato e assim poderem ser comparadas utilizando-se o programa PDQuest.
versão 8.0. Posteriormente foram filtradas para remover qualquer tipo de ruído
(sinal de fundo), porém sem afetar a qualidade dos spots. Os spots foram
detectados, editados manualmente, o volume do spot quantificado e a
normalização dos volumes dos spots foram baseadas no padrão interno
marcado com Cy2.
As proteínas diferencialmente expressas foram selecionadas pela
análise com teste-T de Student (p < 0,05). O programa permitiu identificar
proteínas que tiveram variação quantitativa, ou seja, aquelas correspondentes
a spots que aumentaram ou diminuíram de intensidade entre os grupos
(triplicatas de géis de amostras de frutos verde e maduro) baseados em limites
préselecionados, ou seja, spots que apresentaram aumento, ou redução, de
50% da intensidade do valor de referência dado pela amostra verde. Também
foi realizada a análise qualitativa que faz à detecção de spots presentes em
apenas um grupo, mas não no outro, empregando como critério definidor da
presença de um spot no gel, o valor de intensidade acima de 1,5 vezes o valor
de fundo observado no gel.
3. Material e Métodos ___________________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
25
3.8 Digestão de proteínas
Para a retirada desses spots do gel, foi feito um gel bidimensional
preparativo contendo 750 mg de proteínas e a metodologia utilizada para o seu
preparo foi de acordo com a eletroforese bidimensional descrita em métodos,
conforme item 3.5.
Os spots foram isolados de cada uma das repetições do gel e após
serem fragmentados com o auxílio do bisturi, foram imersos em solução de
descoloração (50% de acetonitrila e 25 mM de bicarbonato de amônio) até total
remoção do corante. Após desidratação com acetonitrila 100%, os fragmentos
de gel foram reidratados e as proteínas foram reduzidas em 50 mM de
bicarbonato de amônio e 20 mM de DTT a 56 ºC por 40 minutos.
Posteriormente, as proteínas foram alquiladas com 55 mM de
iodoacetamida em 50 mM de bicarbonato de amônio por 30 minutos ao abrigo
da luz. Os fragmentos dos géis foram desidratados com acetonitrila 100%
seguida de reidratação com 25 mM de bicarbonato de amônio contendo 10 µL
de tripsina (Promega) por 14 horas a 37 ºC. A ação da tripsina foi interrompida
pela adição de solução bloqueadora (50% acetonitrila e 5% de ácido fórmico) e
os peptídeos obtidos foram eluídos por duas extrações com mistura de 50% de
acetonitrila, 1% de ácido fórmico, seguida de extração com mistura de 60% de
metanol, 1% de ácido fórmico e finalmente acetonitrila pura.
3. Material e Métodos ___________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
26
Em todas as etapas de eluição os fragmentos de gel foram mantidos em
banho de ultra-som por 20 minutos a 40 ºC. Todas as frações de eluição resultantes
de cada spot foram combinadas no mesmo tubo e submetidas à secagem em
concentrador a vácuo sob temperatura ambiente (CELEDON et al., 2007).
3.9 LC-MS/MS
espectrometria de massas. O sequ
em plataforma cromatografia líquida associada a espectrometria de massa
(LC-MS/MS) -TOF
Ultima API (Waters, Micromass), acoplado a um sistema online de HPLC
capilar CaplC XE Pump (Waters).
Os espectros MS/MS gerados pelo sequenciamento dos
pelo programa ProteinLynx v2.1 (Waters) de cada amostra foram
processados posteriormente pelo programa MASCOT MS/MS Ion Search
(www.matrixscience.com) que comparou as seqüências obtidas com os dados
depositados nos bancos de dados do SwissProt e NCBI. As modificações fixam
das e depositadas em bancos de
dados foi feita automaticamente.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
27
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Amostragem
As medidas de etileno, CO
2
e textura para as amostragens I e II
iniciaram-se com um dia após a colheita (DPC) e encerram-se no sexto dia
pós-colheita enquanto que a análise da amostragem III iniciou-se no segundo
dia após a colheita e terminou no décimo dia. Os frutos das três amostragens
(I, II e III) apresentaram mudanças semelhantes, na síntese de etileno, no
aumento da taxa respiratória e na diminuição da firmeza da polpa (Figura 1 a,
b, c, respectivamente). Essas modificações correspondem à mudança
característica e esperada de frutos climatéricos.
Os frutos apresentaram mudanças nas cores da casca e da polpa, como
pode ser observado na Figura 2 a, b, c, sendo que do quarto dia em diante a
casca já estava totalmente amarela para as amostragens I e II. Para as
amostragens I e II as análises foram encerradas no sexto dia pós-colheita, pois
após esse período os frutos apresentaram sinais evidentes de senescência ou
podridão. As mudanças observadas na amostragem III (FABI, 2007) foram
similares às observadas nas amostragens I e II, sendo que o aumento da taxa
respiratória, o pico de etileno e a diminuição da firmeza da polpa ocorreram no
quarto dia após a colheita.
As três amostragens apresentam as transformações características do
amadurecimento, com pico de etileno, CO
2
e diminuição da textura semelhantes,
assim como as mudanças de cor da casca do fruto.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
28
A
B
C
Figura 1. Caracterização fisiológica de três distintas amostragens do mamão
papaia. As amostragens I (linhas pretas) e II (linhas vermelhas) e III (linhas
azuis) tiveram o amadurecimento acompanhado pelos seguintes parâmetros:
A) quantidade de CO
2
produzido pela respiração dos frutos, B) etileno
produzido pelos frutos, C) firmeza da polpa. As barras verticais representam o
erro padrão das médias n=6 amostragens I e II, n= 9 amostragem III).
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
29
c
1 2 3 4 5 6
D.P.C.
a
1 2 3 4 5 6
D.P.C.
2
D.P.C.
3 4 5 6 7 8 9 10
c
b
Figura 2. Caracterização fisiológica de três amostragens distintas do mamão
papaia. Imagens dos frutos mostrando as mudanças típicas na cor da casca e
da polpa para as amostragens I (a), II (b) e III (c) (DPC dias pós-colheita).
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
30
Uma das poucas diferenças notadas foi que nas amostragens I e II o
período de amadurecimento foi mais breve do que na amostragem III. Esses
resultados mostram que apesar de serem amostragens de colheitas diferentes
as três amostragens apresentam as mesmas características durante o
amadurecimento, seja pelo aumento da taxa respiratória seja pela diminuição
da textura, demonstrando assim que estão adequadas para o trabalho uma vez
que o objetivo de obter replicatas biológicas de frutas representativas dos
estádios pré-climatéricos e climatérico para as análises posteriores foi
alcançado.
Com base nas mudanças fisiológicas observadas, os frutos das
amostragens I e II escolhidos para as análises dos perfis de proteínas foram
aqueles com 1 dia após a colheita (DPC) e com 3 DPC, representativos de
frutas pré-
amostragem III foram selecionados os frutos amostrados no 2 DPC (verdes) e
4 DPC (maduras), correspondentes aos mesmos estádios de maturação das
frutas verdes e maduras das amostragens I e II.
4.2 Extração de proteínas
Embora muitos protocolos tenham sido descritos para extração de
proteínas em tecidos vegetais, não existe na literatura um método de extração
de proteínas específico para a polpa do mamão. De acordo com Wang et al.
(2006) a extração fenólica produz uma amostra de alta qualidade para tecidos
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
31
recalcitrantes, como o mamão papaia, uma vez que os compostos
interferentes, que comumente provocam manchas e estrias na eletroforese
bidimensional são removidos ao ficarem retidos na fase aquosa.
As proteínas foram extraídas das frutas das três amostragens e dos dois
estádios de maturação utilizando-se a extração fenólica e a precipitação das
proteínas com acetato de amônio (CARPENTIER et al., 2005). Os extratos
protéicos obtidos foram quantificados e apresentaram um rendimento total de
proteínas de 1 mg de proteína por grama de polpa, que é semelhante aos valores
encontrados no experimento utilizando meristema de banana (CARPENTIER et al.,
2005). Após a quantificação das proteínas, procedeu-se a SDS-PAGE dos dois
pontos de maturação da amostragem I e II para verificar a qualidade do extrato.
Foram aplicados no gel 15 µg de proteínas de cada extrato com o intuito
de verificar a qualidade dos mesmos (Figura 3). A extração mostrou-se
eficiente, pois as amostras não apresentaram sinais de contaminação de
impurezas como carboidratos, pigmentos, compostos fenólicos, ou degradação,
pois as bandas estavam bem definidas e sem arraste. O fato de aplicar
quantidades iguais e os extratos apresentarem aspecto semelhante tem
importância, pois quanto mais semelhante a amostras do mesmo estádio mais
fácil de encontrar diferenças entre os estádios diferentes. A análise SDS-PAGE
sugere que as amostras dos diferentes estádios são semelhantes, porém, já é
perceptível a diferença de expressão de algumas bandas.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
32
Figura 3. Eletroforese sob condições desnaturantes (SDS-PAGE) de proteínas
extraídas da polpa do mamão papaia. As letras A, B e C indicam os extratos de
amostras pré-climatéricas obtidas das amostragens I, II e III, respectivamente,
enquanto as letras D, E, e F indicam os extratos de amostras climatéricas das
amostragens I, II e III, respectivamente, separadas em gel de poliacrilamida
12% (SDS-PAGE). As proteínas foram coradas utilizando-se coomassie brilliant
blue. Os números à esquerda indicam o tamanho das bandas do padrão de
peso molecular, em KDa.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
33
4.3 Eletroforese bidimensional (géis corados com coomassie
brilliant blue)
Após a obtenção de um extrato protéico que se mostrou adequado para a
SDS-PAGE, o mesmo extrato foi utilizado para separação por eletroforese
bidimensional com o objetivo de visualizar a distribuição das proteínas ao longo
do gel quanto ao ponto isoelétrico e massa molecular, bem como se a
resolução dos spots estaria adequada, isto é, sem a presença de estrias
resultantes de baixa solubilidade das proteínas durante a focalização
isoelétrica, o que prejudicaria a detecção e quantificação de spots.
Inicialmente, as proteínas dos dois estádios de maturação da amostragem
I foram primeiramente separadas em tiras de géis de gradiente de pH
imobilizado (tiras de géis de 7 cm de comprimento) com intervalo de pH 3-10, a
fim de se testar a eletroforese bidimensional para os extratos de proteínas dos
dois estádios de maturação. Na Figura 4 as amostras dos dois estádios de
maturação apresentaram-se distribuídas predominantemente na faixa de pH 4-7
com a presença de poucos spots nos extremos da faixa de pH utilizada.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
34
Figura 4. Eletroforese bidimensional de proteínas da polpa do mamão papaia
verde (a) e maduro (b). As proteínas foram separadas em um gradiente de pH
3-10 na primeira dimensão e em SDS-PAGE 12% na segunda dimensão. As
proteínas foram coradas utilizando a coloração com coomassie brilliant blue.
Os números a esquerda indicam o tamanho da banda do padrão de peso
molecular em KDa.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
35
Os géis não apresentaram estrias verticais mostrando que o extrato estava
livre de sal e outros agregados protéicos (GORG et al., 1999) apresentando
algumas estrias horizontais, possivelmente devido à insuficiente solubilização de
algumas proteínas mais abundantes ou com maior massa molecular, mas que
não comprometeriam a qualidade geral da análise.
O método de coloração utilizando coomassie brilliant blue foi
padronizado, uma vez que os géis apresentavam muitas diferenças de
intensidade da coloração, bem como manchas e spots mais corados que outros
na mesma triplicata de corrida o que interfere na análise das imagens. Foi
observada uma certa inconsistência na coloração, o que, de fato, é uma das
desvantagens da coloração como CBB. Devido a isso, foi feita uma otimização
da coloração, para aumentar a sensibilidade e não ter diferenças de intensidade
dos mesmos spots por causa da variação da coloração de um gel para o outro.
Ficou estabelecida a coloração com coomassie brilliant blue
(WESTERMEIER, 2006) na qual os géis foram corados por 12 horas e
descorados como descrito no item 3.5, sob agitação constante. Após a
descoloração os géis foram submetidos a um novo ciclo de coloração por 12
horas, o qual teve por objetivo aumentar a instensidade dos spots visíveis em
comparação com a primeira coloração, além de possibilitar a visualização de
spots que não apareciam com apenas um ciclo de coloração. A adição desse
novo ciclo aumentou a sensibilidade uma vez que há a maior deposição de
coomassie brillant blue e maior fixação. A agitação constante fez com que os
géis não ficassem manchados devido a precipitação do CBB. Somente após o
segundo ciclo de coloração os géis foram então digitalizados. Com essa
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
36
padronização os spots apresentaram intensidades similares entre as triplicatas,
houve aumento no número de spots visíveis e apresentou uma melhor
reprodutibilidade, pelo fato da coloração ter sido aplicada por tempo suficiente,
ou repetidamente e sob agitação, especialmente para géis com tamanho maior
(24 cm, por exemplo).
Após terem sido encontradas as condições que propiciavam a obtenção
de géis de boa qualidade em escala de separação reduzida (tiras de separação
isoelétrica com 7 cm de comprimento), foram realizadas triplicatas de eletroforese
bidimensional a partir da separação em tiras de 24 cm de comprimento com
pH 3-10 para cada estádio de maturação. Essa faixa de pH mais ampla foi
escolhida como avaliação preliminar para poder visualizar a distribuição dos
spots no gel. A escolha da faixa de pH é um dos fatores que afetam a
visualização das mudanças de expressão de proteínas (GORG et al., 1999), e
apesar de uma faixa muito ampla poder dificultar uma maior resolução de spots
muito próximos, resultando em sobreposição de proteínas (overlapping) o uso
de um gradiente de pH mais abrangente oferece uma visão geral do estado do
mapa protéico.
A triplicata de géis dos dois grupos de amostras, verde e maduro, foi
então analisada usando o programa PDQuest. Primeiramente as imagens
foram ajustadas para estarem do mesmo tamanho e formato e assim poderem
ser comparadas e filtradas para remover qualquer tipo de ruído (sinal de
fundo), porém sem afetar os spots. Em seguida os spots de proteínas de cada
imagem foram detectados usando o Spot Detection Parameter Wizard, sendo
necessário ajustar os seguintes parâmetros: tamanho do menor spot,
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
37
intensidade do spot mais fracamente corado e do maior local de maior
agrupamento de proteínas com nítido overlapping.
Após a detecção dos spots a sensibilidade também foi ajustada, pois
muitos spots menos intensos não foram detectados automaticamente, porém,
isso também levou ao aumento de falsos positivos, uma vez que o parâmetro
ficou mais sensível aos ruídos da imagem. Deste modo foi feita a opção de
diminuir a sensibilidade e adicionar manualmente os spots visíveis, porém que
não foram detectados automaticamente pelo programa. O critério utilizado para
a edição manual foi que, caso houvesse repetição de spot em pelo menos dois
géis da triplicata, este seria adicionado no terceiro gel caso não estivesse
presente. De maneira inversa, se um spot estivesse presente em apenas um
gel ele não seria considerado como presente na amostra.
A etapa seguinte foi a de estabelecer correspondência entre os mesmos
spots identificados nos diferentes géis (matching) e para isso foi utilizada
primeiramente a ferramenta automática do programa e, posteriormente, foi feita
a edição manual utilizando os mesmo critérios citados acima. Todas essas
edições foram feitas utilizando como referência o gel master, que consiste
numa imagem virtual que compreende todos os spots presentes em todos os
géis da análise. Todas as comparações entre spots e entre os géis, assim como a
edição e o agrupamento de spots, foram coordenadas através do gel master.
De modo a eliminar as interferências das variações não-relacionadas
com a expressão diferencial das proteínas as quantidades de spots de todos os
densidade
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
38
pixels de cada spot de um
gel é dividida pelo valor de intensidade total de todos os pixels da imagem, e os
resultados foram expressos em partes por milhão (ppm). O programa gera uma
tabela final com densidade ótica média para dados quantitativos ou qualitativos
de cada spot de cada grupo de amostras. A partir disso, foi possível identificar
as proteínas que tiveram variação na análise qualitativa que corresponde à
detecção de spots presentes (Tabela 2) em apenas um grupo, mas não no
outro. Na Tabela 2 a coluna spot corresponde ao número de identificação do
spot, e as colunas denominadas verde e maduro indicam a intensidade ótica
média de cada spot
quantas vezes a intensidade do spot aumentou ou diminuiu com o
amadurecimento em relação ao valor observado no grupo de amostras verde.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
39
Tabela 2. Análise qualitativa da presença de spots de proteínas nos extratos
dos grupos de amostras representativas do mamão papaia nos estádios de
maturação verde e maduro. Os valores correspondem às médias das densidades
óticas encontradas para a triplicata de géis e a razão entre esses valores.
Spot
Verde
Maduro
Razão
Spot
Verde
Maduro
Razão
13
2,5
403,7
158,7
6803
2,5
109,7
43,13
110
2,5
366,1
143,92
6808
2,5
48,5
19,08
208
2,5
1039,3
408,63
6906
2,5
229,5
90,22
2305
2,5
325,8
128,08
6907
2,5
112,2
44,12
2504
2,5
401,8
157,98
7003
2,5
470,9
185,14
2608
2,5
552,7
217,32
7402
2,5
1205,4
473,92
3206
2,5
1876,2
737,66
7405
2,5
324,9
127,73
3303
2,5
702,2
276,08
7407
2,5
3322,7
1306,37
3503
2,5
824,0
323,97
7602
2,5
527,6
207,42
3505
2,5
738,6
290,39
7612
1246,1
3,1
0,00
3511
1308,3
3,1
0,00
7709
287,0
3,1
0,01
3704
2,5
236,0
92,77
7714
2,5
45,9
18,03
3705
2,5
282,8
111,17
7903
2,5
196,2
77,15
3709
2,5
587,8
231,12
7904
2,5
116,3
45,71
4306
328,5
3,1
0,01
8206
1904,7
3,1
0,00
4502
2,5
477,9
187,88
8803
2,5
365,3
143,61
4511
155,9
3,1
0,02
4606
1011,0
3,1
0,00
4607
977,6
3,1
0,00
4709
2,5
230,0
90,44
4804
2,5
351,0
138,01
4805
2,5
198,3
77,96
4806
212,6
3,1
0,01
4807
2,5
606,7
238,54
5301
2,5
562,8
221,27
5303
2,5
155,5
61,12
5404
317,8
639,7
2,01
5702
2,5
249,0
97,91
5706
2,5
85,9
33,79
5801
2,5
177,5
69,79
5804
2,5
96,7
38,02
5807
2,5
137,8
54,17
5809
2,5
126,4
49,71
6403
2,5
689,0
270,88
6601
2,5
338,7
133,16
6708
2,5
79,2
31,15
6801
2,5
170,2
66,91
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
40
Para as análises qualitativas o programa atribuiu um valor mínimo de
intensidade para os spots ausentes a fim de efetuar os cálculos posteriores da
análise estatística (atribuiu 2,5 para ausência de spots nas amostras verdes e
3,1 para ausência em amostras maduras). A análise quantitativa revelou os
spots de proteínas presentes em ambos os estádios, mas que apresentaram
aumento ou diminuição corresponde aos spots que aumentaram ou diminuíram
de intensidade, e os resultados podem ser vistos na Tabela 3. Na coluna
spot aumentou ou
diminuiu em relação ao valor observado no grupo verde, tomado como
referência na análise quantitativa. Estas variações foram validadas através do
teste T de Student, com nível de significância de 95% e somente os spots que
passaram nesse teste foram considerados na composição da lista final de
spots de proteínas diferencialmente expressas.
Dos 378 spots detectados com aparente diferença de expressão entre
os estádios de amadurecimento, apenas 74 spots foram considerados
estatisticamente significativos. Dentre esses, nove spots foram considerados
presentes apenas nas frutas verdes e 43 spots foram considerados presentes
apenas nas frutas maduras, mostrando que, aparentemente, existem mais
proteínas associadas exclusivamente com o estádio de maturação maduro, o
que reflete o aumento de síntese protéica que acompanha o amadurecimento.
Para a análise quantitativa, o teste T de Student confirmou variação significativa
para 22 proteínas, sendo que a maior parte das alterações correspondeu ao
aumento da intensidade dos spots em frutas maduras em relação às verdes.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
41
Tabela 3. Análise quantitativa da presença de spots de proteínas nos extratos
dos grupos de amostras representativas do mamão papaia nos estádios de
maturação verde e maduro. Os valores correspondem às médias das
densidades óticas encontradas para a triplicata de géis e a razão entre esses
valores.
Spot
Verde
Maduro
Razão
9
187,9
1294,2
6,89
1003
150,0
619,4
4,13
2303
1271,8
3652,0
2,87
2601
5306,7
2478,0
0,47
2602
1752,5
689,6
0,39
3501
2918,4
1219,7
0,42
3604
257,5
111,5
0,43
4504
955,8
255,1
0,27
4508
985,6
2787,1
2,83
4509
461,7
973,9
2,11
4604
2514,5
656,1
0,26
4710
583,1
233,4
0,40
5502
1042,0
2441,2
2,34
5808
329,8
161,5
0,49
5901
479,8
238,4
0,50
6406
534,3
1259,4
2,36
7408
663,6
2744,9
4,14
7609
475,5
332,2
0,38
7610
598,9
76,5
0,13
7804
6366,2
2488,3
0,39
7906
74,4
282,3
3,79
8310
200,1
614,0
3,07
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
42
Os resultados obtidos com os géis corados com coomassie brilliant blue
foram preliminares, pois foi utilizada apenas uma amostragem biológica, a
amostragem III. Isso resultou em um baixo poder de análise, uma vez que é
mais fácil perceber mudanças quando existem mais modelos de comparação
do que quando há apenas um (HUNT et al., 2005). Por isso existe uma grande
importância de usar maior número de replicatas biológicas. Por exemplo, se a
análise fosse feita para as três replicatas teria de ser feito um número muito
grande de géis, além disso, a coloração com coomassie brilliant blue e a
separação são etapas que introduzem grande variabilidade na análise. Apesar
disso, essa caracterização das proteínas na faixa de pH 3-10 confirma a
observação inicial de que a maior parte das proteínas extraídas parecem estar
concentradas na faixa de pH 4-7, para os dois estádios de maturação. Assim,
para as análises seguintes decidiu-se pelo uso da faixa de pH 4-7 na
separação dos extratos das três amostragens.
4.4 Análise DIGE
O sistema de análise DIGE, eletroforese diferencial em gel, foi utilizado a
por possibilitar maior sensibilidade de detecção de proteínas e menor variação
técnica ou experimental devido às diferenças nas condições da corrida da
eletroforese. Além disso, por permitir a incorporação de um padrão interno
permite a normalização individualizada de cada spot, diminuindo assim o
número de corridas necessárias e aumentando a qualidade dos dados para a
análise estatística. Valcu e Valcu (2007) descreveram que as fontes de
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
43
variabilidade que influenciam os resultados 2-DE são principalmente:
variabilidade biológica (como variedade genética e fatores ambientais) e
variabilidade técnicas (pode resultar de qualquer fase do experimento desde a
coleta e o armazenamento da amostra, até a análise das imagens e a variação
do manipulador a qualidade dos reagentes). A fim de detectar apenas as
proteínas com variação de expressão durante o amadurecimento do mamão
papaia e não variações técnicas e biológicas, o sistema DIGE foi utilizado para
a comparação dos extratos protéicos dos dois estádios de maturação das três
amostragens. As três amostragens foram utilizadas para que o experimento
tivesse maior confiabilidade a fim de diminuir a variação biológica nos
experimentos posteriores e aumentar a confiabilidade da análise. Também
foram feitas duplicatas de géis para cada experimento, a fim de diminuir a
variabilidade técnica.
Inicialmente as proteínas de todas as amostras foram marcadas com o
fluoróforo Cy5 e procedeu-se a eletroforese unidimensional para verificar a
qualidade da marcação que mostrou que o extrato estava adequado para a
marcação DIGE. A etapa seguinte foi a preparação dos seis strips de 24 cm de
comprimento e pH 4-7, sendo que em cada gel foram aplicadas três amostras:
os géis com as amostras verdes das três amostragens que foram marcadas
com o corante Cy3, as maduras que foram marcadas com o corante Cy5 e o
pool marcado com o corante Cy2. Neste experimento três amostras biológicas
diferentes (amostragem I, II e III) para os dois pontos de maturação (verde e
maduro) foram comparadas e analisadas (Figura 5).
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
44
a
Figura 5. Imagens dos géis resultantes das análises DIGE d
o mamão papaia verde e maduro. A coluna
verde 1,2,3 representa as imagens do mamão verde foram marcados com Cy3 e 4,5,6 as que foram
marcados com Cy5. A coluna pool todas as imagens foram marcadas com Cy2. A coluna maduro 1,2,3
representa as imagens do mamão maduro que foram marcadas com Cy5 e 4,5,6 as que foram marcadas
com Cy3. As linhas representam as três imagens pertencentes ao mesmo gel.
.
Poll
Pré-climatérico
Climatérico
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
45
Após obter a média da intensidade dos spots foi necessária a
normalização a fim de compensar as variações técnicas como quantidades
diferentes de proteínas aplicadas nos géis e as possíveis diferenças entre a
marcação das amostras. Dessa maneira, os volumes dos spots de todos os
géis foram normalizados para remover as variações não-relacionadas com a
expressão diferencial das proteínas. A normalização com base no padrão
interno (imagem com spots marcados com Cy2) foi feita para cada valor de
intensidade de cada spot marcado com as cianidinas Cy3 e Cy5 e os
resultados foram expressos em ppm. As variações entre os spots obtidas pelas
análises quantitativas e qualitativas, assim com descrito para as análises dos
géis corados com coomassie brillant blue, foram validadas através do teste T
de Student, com nível de significância de 95% e somente os spots que
passaram nesse teste foram considerados na composição da lista final de
spots de proteínas diferencialmente expressas.
Dos 426 spots validados, apenas 37 spots foram considerados
diferencialmente expressos com p < 0,05. Desses 37 spots, 10 foram
identificados como spots de proteínas presentes apenas na amostra do mamão
maduro (Tabela 4), mostrando que existem mais proteínas presentes apenas
no estádio de maturação maduro que no verde, o que reflete o aumento de
síntese protéica que acompanha o amadurecimento.
Os outros vinte e sete spots foram indicados pela análise quantitativa
(Tabela 5) compreendendo as proteínas com aumento de expressão de pelo
menos 1,5 vezes, no estádio maduro.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
46
Tabela 4. Análise qualitativa da presença de spots de proteínas nos extratos
dos grupos de amostras representativas do mamão papaia nos estádios de
maturação verde e maduro. Os valores correspondem às médias das
densidades óticas encontradas para a triplicata de géis e a razão entre esses
valores.
Spot
Verde
Maduro
Razão
3105
2,06
696,7
337,83
3203
2,06
458
222,09
3204
2,06
1152,2
558,66
3804
2,06
409,3
198,47
3902
2,06
159,6
77,4
5803
2,06
123,1
59,7
5804
2,06
183,8
89,1
6801
2,06
216,5
104,98
6802
2,06
54,1
26,25
7408
2,06
1281,4
621,33
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
47
Tabela 5. Análise qualitativa da presença de spots de proteínas nos extratos
dos grupos de amostras representativas do mamão papaia nos estádios de
maturação verde e maduro. Os valores correspondem às médias das
densidades óticas encontradas para a triplicata de géis e a razão entre esses
valores.
Spot
Verde
Maduro
Razão
1602
1238,3
2806,4
2,77
1603
1243,9
2655,9
2,14
1605
36,5
187,4
5,13
1801
1021,6
4841,5
4,74
1805
2198,8
8996,3
4,09
2705
1981,2
3405,8
1,72
2801
2302,8
8648,4
3,76
2802
975,8
4608
4,72
2805
209,1
1531,6
7,32
3202
8233
35539,1
4,32
3506
135,4
708,9
5,77
3702
1999,2
3670,4
1,84
3803
1264,8
6916,2
5,47
4502
86,1
3209,4
37,28
4801
56,1
184,3
3,29
5202
754,1
5553
7,36
6101
9167,1
14171,8
1,55
6308
191,3
420,8
2,2
7104
2514,6
7111,7
2,83
7810
171,3
721,9
4,21
8104
224,1
2642,4
11,79
8203
3228,2
6011,5
1,86
8204
456
2424,4
5,32
8702
178,6
686,2
3,84
8704
1193,1
2384,2
2
9301
582,9
2474,1
4,24
9302
110,4
607,9
5,51
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
48
Essas observações mostram que parece ocorrer maior variação
qualitativa do que variação quantitativa durante o amadurecimento, o que foi
sugerido pela avaliação preliminar dos géis, pois visualmente não se notam
diferenças muito evidentes, como pode ser observado na Figura 5. Todas as 9
imagens dos diferentes géis apresentaram um perfil de spots muito similar,
porém as imagens do mesmo gel possuem ruídos de coloração ou sinal de
fundos muito diferentes, mais escuros ou claros que outros.
Conforme os resultados obtidos nas Tabelas 4 e 5, a maior parte das
alterações corresponde ao aumento de spots nos géis dos estádios de
maturação maduro em relação às verdes. De qualquer modo, foi identificado
um número razoável de spots que parecem corresponder a proteínas variações
de expressão mais pronunciadas, conforme apresentado na Figura 6.
A Figura 6 é uma imagem multicanal que permite a visualização
combinada dos spots das três imagens do mesmo gel ao mesmo tempo
sendo que os géis da amostragem I foram os escolhidos como
representativos das demais amostragens. Na imagem multicanal as
proteínas do padrão interno marcadas com Cy2 são apresentadas em cor
azul, os spots da amostra verde, marcados com Cy3, são apresentados em
cor verde e os spots da amostra madura, marcados com Cy5, são
apresentados em cor vermelha. Deste modo, a cor mais destacada da
sobreposição das cores/imagens permite visualizar as proteínas mais
abundantemente expressas no determinado estádio de maturação da cor
escolhida para aquela imagem. Assim, o spot que foi identificado no pool, no
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
49
verde e no maduro simultaneamente sem diferença de expressão estará na
cor branco. Os spots que aparecem em rosa são devido à sobreposição das
cores azul (pool) e vermelho (maduro).
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
50
Figura 6. Imagem multicanal da análise DIGE obtida através da sobreposição de canais de fluorescência
da Cy2 (pool), Cy3
(pré-climatérico), e Cy5 (climatério). As setas indicam
spots de proteínas diferencialmente expressos selecionados após
análise de teste T de Student
separação da IEF (pH 4-7) está localizada na parte superior, e da posição do peso molecular está à esquerda da imagem.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
51
A cor azul claro que seria resultado da sobreposição da imagem do pool
(azul) e amostras verdes não aparece confirmando os resultados vistos nas
Tabelas 3 e 4 que mostram que não há aumento significativo da expressão de
proteínas no estádio verde. As proteínas selecionadas após a análise do teste
de Student
setas, juntamente com seus respectivos números de identificação. A faixa de
pH de separação da IEF foi de 4-7.
4.5 Seleção dos spots para digestão
Os 37 spots considerados diferencialmente expressos foram
selecionados para a digestão, sendo isolados de gel preparativo, para cada
amostragem e cada estádio de maturação, empregando uma quantidade total
de 750 µg de proteínas adicionadas de 50 µg de cianidina (Cy5). Os géis foram
corados com coomassie brilliant blue e as proteínas marcadas com
fluorescência permitiram confirmar a correspondência entre os spots
identificados na análise DIGE e aqueles no gel preparativo, pois as imagens
geradas utilizando coloração com coomassie brilliant blue pod
spot retiradas das triplicatas de
géis fora-
de cada amostra.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
52
4.6 Espectrometria de massas
Os espectros resultantes do seqüenciamento dos 15 spots por ESI-
Q-TOF MS/MS foram analisados utilizando o programa MASCOT
(www.matrixscience.com
. Utilizou-se banco de dados Mass
Spectrometry Protein Sequence Data Base (MSDB) que possui alta qualidade
de sequu
grupamento alquil pela iodoacetamida, selecionou-se a carbamidometil (C)
como modificação fixa.
4.6.1 Taxa de identificação de proteínas em Carica papaya L.
Os espectros resultantes do sequenciamento por LC-MS/MS de 37 spots
foram analisados contra as bases de dados de proteínas Swiss-Prot e NCBi.
Deste total, 30 spots (81%) puderam ser identificados resultando em 20
proteínas diferentes. A Tabela 6
identificadas a partir da análise da eletroforese bidimensional e a classificação
atribuída a elas. Nela estão relacionados o número de identificação do spot, a
espécie a qual tiveram maior similaridade e o valor desta (score), ponto
isoelétrico e massa molecular teórico e valor de intensidade para cada spot no
estádio verde e no maduro.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
53
Não foi possível a identificação de 7 spots (19%), provavelmente pela
baixa concentração de peptídeos e nem a classificação de 2 spots,
possivelmente por falta de identidade com as seqüências depositadas nos
bancos de dados utilizados, como ocorreu com dois spots (3202 e 8203). Uma
boa parte das proteínas identificadas apresentaram similaridade com proteínas
já caracterizadas para mamão (33,3%) e depositadas em bancos de dados.
As demais proteínas apresentaram similaridade com proteínas bem
caracterizadas em outras espécies como Arabidopsis thaliana, o que pode ser
explicado pelo fato de haver um grande acervo de seqüências disponíveis, em
razão do genoma completamente sequenciado e, também por pertencerem à
mesma ordem (Brassicales).
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
54
Tabela 6. Proteínas de Carica paya L. identificadas através da análise DIGE durante o amad
urecimento do fruto.
continua
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
55
Continuação da Tabela 6. Proteínas de Carica paya L. identificadas através da análise DIGE durante o amadurecimento do fruto.
continua
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
56
Continuação da Tabela 6. Proteínas de Carica paya L. identificadas através da análise DIGE durante o amadurecimento do fruto.
continua
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
57
Continuação da Tabela 6. Proteínas de Carica paya L. identificadas através da análise DIGE durante o amadurecimento do fruto.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
58
4.7 Classificação funcional das proteínas
As proteínas identificadas foram classificadas de acordo com sua função
biológica em categorias funcionais (RISON, HODGMAN e THORNTON, 2000).
Como pode ser observado na Figura 7, grande parte das proteínas
seqüenciadas da polpa de Carica papaia L. participam de processos celulares
como resposta ao estresse, metabolismo de energia (como metabolismo de
glicose) e proteínas relacionadas à síntese de DNA, RNA, proteínas e
aminoácidos, carboidratos, nucleotídeos e lipídeos.
(19%) estando presentes proteínas que participam da
perda da textura do fruto.
4.7.1 Síntese e regulação de etileno
O etileno é um hormônio que está envolvido na aceleração do
amadurecimento e senescência de frutos climatéricos. Durante a maturação, o
etileno se liga ao seu receptor na célula e desencadeia uma série de eventos
que levam ao amadurecimento e senescência do fruto. Já foi visto que a
inibição da ligação do etileno ao seu receptor pode reduzir a produção e a ação
do mesmo e, com isso, retardar o amadurecimento e a senescência de frutos
climatéricos. Devitt e colaboradores (2006) relataram várias sequências de
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
59
ESTs do mamão com similaridade significativa com proteínas associadas a
síntese e regulação de etileno e hidrolases de membrana e parede celular que
consequentemente leva ao amaciamento da polpa do fruto.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
60
Figura 7. Classificação funcional das 37 proteínas da polpa do mamão papaia
identificadas como diferencialmente expressas durante o amadurecimento.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
61
A metionina é um aminoácido essencial sintetizado apenas por plantas e
microorganismos. As proteínas metionina sintase (MetE, EC 2.1.1.14), spots
1801, 1805 e 6802, participam da síntese de metionina (Met). Em plantas, a
metionina serve como precursor de diversos processos metabólicos, incluindo
a síntese de proteínas e etileno (ZEH et al., 2002).
Os três spots identificados como MetE apresentaram aumento
acentuado da expressão dessa enzima em frutos climatéricos sugerindo um
aumento na demanda de precursores de etileno a partir da metionina. O gene
que codifica essa enzima já foi relatado em batata (ZEH et al., 2002) e os
transcritos desse gene foram encontrados mais abundantemente nas flores do
que em folhas e raízes e, em quantidades menores ainda, no caule e nos
tubérculos. Concluiu-se que, embora em níveis diferentes, a biossíntese de
metionina ocorre em todos os tecidos da planta, não só nos órgãos de origem,
embora a taxa possa variar em diferentes órgãos. Dados um pouco mais
antigos indicam que a cistationina--sintase (enzima que catalisa a primeira
etapa da via de síntese de metionina) em morango (NAM et al., 1999) e MetE
em frutos de tomate (ZEGZOUTI et al., 1999) são altamente expressas durante
a formação dos frutos. Isso pode indicar que há uma maior demanda por
metionina durante a floração e formação dos frutos o que pode explicar o
aumento da expressão de metionina sintase.
Por conseguinte, é razoável especular que a biossíntese de
aminoácidos, especialmente a biossíntese de metionina, ocorre em tecidos
como frutas e flores, a fim de alcançar as concentrações intracelulares
necessárias de aminoácidos. Sarry e colaboradores (2004) estudaram os
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
62
proteomas dos mesocarpos de seis variedades de uva e identificaram níveis de
metionina sintase similares entre elas. Os spots 1801 e 1805 apresentaram
massas moleculares similares às encontradas no trabalho com uvas, porém
com pI diferente. Três proteínas foram identificadas como metionina sintase e
as variações de intensidade dos spots 1801 e 1805 foram semelhantes com
aumento de aproximadamente 4,7 vezes e mesma massa molecular com
variação pequena de pI. Já o spot 6802 não teve expressão em frutos pré-
climatéricos e sua intensidade foi elevada em 27 vezes em amostras de frutos
climatéricos com pI e massa molecular diferentes dos outros dois spots.
As proteínas S-adenosilmetionina sintase (SAM, EC 2.5.1.6), spot 4502,
catalizam a formação da S-adenosilmetionina a partir da metionina, que é o
precursor da síntese de etileno. Foram caracterizados os níveis de expressão
de genes de SAM durante o desenvolvimento ou senescência dos ovários da
ervilha. Durante a senescência desses órgãos, os níveis de mRNA de SAM
aumentaram, provavelmente associados com a biossíntese de etileno, uma vez
que o tratamento dos ovários com aminoetoxivin
), resultou em um atraso na
senescência e na prevenção do acúmulo mRNA de SAM (GOMEZ-GOMEZ e
CARRASCO, 1996). Lindermayr e colaboradores (2006) relataram também o
mecanismo molecular da S-nitrosilação em SAM de Arabidopsis thaliana e
observaram a diminuição da concentração de etileno, sugerindo que este
aminoácido atua regulação da síntese do etileno. Deste modo, a expressão
dessa enzima parece estar diretamente relacionada com o controle e regulação
do etileno. Esses dados sustentam os resultados obtidos nesse trabalho na
qual a expressão dessa enzima (spot 4502) mostrou aumento de intensidade
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
63
no estádio climatérico. Para o mamão ainda não havia relatos da expressão
diferencial dessa enzima em diferentes estádios de maturação, tendo sido
descrito, apenas, que uma enzima putativa já foi clonada de uma biblioteca de
cDNA do mamão.
A enzima 1-aminociclopropano-1-carboxílico oxidase (ACC oxidase EC
1.14.17.4) também é uma enzima chave na via do etileno, uma vez que catalisa
a etapa final da biossíntese; seu papel durante o amadurecimento de frutos
como tomate (ANJANASREE, VERMA e BANSAL, 2005), banana (LOPEZ-
GOMEZ et al., 1997) e mamão (LIN, LIN e SHAW, 1997) tem sido o foco de
pesquisas de diversos grupos por muitos anos. No trabalho realizado por
Roeder e colaboradores (2009) foi observado que os níveis de mRNAs da ACC
oxidase aumentaram durante o desenvolvimento e a senescência das flores de
Nicotiana suaveolens, que se correlaciona com a produção de etileno.
O nível da oxidase do ácido 1-aminociclocarboxílico (ACC), substrato
para a ACC oxidase, foi relatado como inicialmente baixo no mesocarpo, sendo
ampliado em até três vezes quando o pico da síntese de etileno ocorre. Isto
sugere que, no auge da síntese de etileno, a atividade da ACC oxidase pode
ser limitante (PAULL e CHEN, 1990).
Em outro trabalho os níveis de mRNA da ACC oxidase em mamão
(encontrados em frutos pré-climatérios) foram muito baixos na casca e muito
altos na polpa. Por outro lado, os níveis em frutos climatéricos se tornaram
bastante perceptíveis na casca e abundantes na polpa (LOPEZ-GOMEZ et al.,
2004). Diferentemente do que foi descrito no trabalho desses autores, foi
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
64
verificado que a expressão dessa proteína (spot 7408) foi pouco detectável em
frutos pré-climatéricos, tendo aumentado expressivamente em frutos
climatéricos. Este comportamento diferente no estádio pré-climatérico pode ser
explicado pelo fato de existirem dois genes que codificam para essa proteína
(CHEN et al., 2003). Chen e colaboradores (2003) isolaram um novo gene
(CP-ACO2) que codifica para ACC oxidase e que tem 77% de identidade com o
gene (CP-ACO1) reportado previamente. Ele também foi identificado como
induzido pelo etileno, porém, análises de Northern blot revelaram que os genes
CP-ACO2 são induzidos durante amadurecimento dos frutos e senescência
foliar, enquanto que os genes CP-ACO1 foram induzidos antes do estádio da
mudança de cor do fruto. Esses dados sugerem que o spot 7408 tenha sido
codificado pelo gene (CP-ACO2) relacionado com o estádio posterior a
mudança de cor.
Como essa enzima é bastante estudada, já foi descrita a tentativa de
supressão dessa proteína em frutos transgênicos de mamoeiro (LOPEZ-
GOMEZ et al., 2009). Os frutos transgênicos demonstraram redução marcante
nos níveis de mRNA para ACC oxidase, seguido de um atraso no
amadurecimento, porém, ocorreram alterações não desejáveis na textura e cor
da casca, mostrando, assim, que a pesquisa precisa de maior aprofundamento.
Os diferentes estudos de pós-colheita para frutos climatéricos, como o
mamão papaia, apontam o amaciamento da polpa como um fator fundamental
para ser controlado (PAULL et al., 1997). Deste modo, as enzimas envolvidas
na síntese de etileno representam pontos fundamentais para a investigação,
uma vez que o etileno participa do processo de amadurecimento dos frutos. O
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
65
mamão é muito suscetível ao rápido amadurecimento causado pelo etileno e
muitas das estratégias usadas atualmente para prolongar a vida de prateleira
do mamão são baseadas no controle da ação e produção do etileno.
Fabi (2007) estudou a resposta ao etileno e ao 1-MCP durante o
amadurecimento do mamão. Os resultados obtidos mostraram que o 1-MCP
pode diminuir a qualidade das frutas tratadas. Mas, mesmo com o uso de
etileno para provocar ou induzir a maturação homogênea, a qualidade dos
frutos resultantes é menor quando comparada à dos frutos que foram deixados
para amadurecer naturalmente. Talvez a disponibilidade de frutos com baixa
produção de etileno endógeno possa reduzir substancialmente as perdas
causadas por este hormônio. Os genes responsáveis pela síntese, ACC sintase
e ACC oxidase, tem sido alvos de estudo e de estratégias de manipulação e
repressão desses genes no amadurecimento do tomate ou em outras espécies
(MATAS et al., 2009).
4.7.2 Hidrolases
As invertases de parede celular ou - fructofuranosidases (spots 2801,
2802, 2805, 3803, 3804 e 4801) estão ionicamente ligadas a parede celular
devido a sua neutralidade (pI básico e baixo pH). Essas enzimas promovem a
clivagem hidrolítica da sacarose em monômeros de hexose, além de regular
muitos aspectos do crescimento e do desenvolvimento das plantas, quando
sozinhas, ou em combinação com hormônios de plantas (ROITSCH e
GONZALEZ, 2004).
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
66
As invertases ácidas de parede celular são consideradas enzimas-chave
na mobilização da sacarose e no equilíbrio entre a produção e o escoamento
da mesma pela planta. Estas enzimas fornecem carboidratos que serão
levados para os tecidos através da via apoplástica (FOTOPOULOS, 2005).
Estas proteínas tiveram aumento de expressão significativo nas frutas
climatéricas (Figura 7). Os seis spots referentes às invertases apresentaram
padrões de variação de Mr e pI similares (spots 2801, 2802, 2805, 3803 e
4801) com exceção do spot 3804 cuja a razão da intensidade foi bem maior
que a dos demais. Essas isoformas podem ocorrer devido a modificações pós-
traducionais, proteólise ou diferença de subunidades terminais. Em mamão
essas enzimas provavelmente atuam disponibilizando frutose e glicose para
outros processos como a respiração e a biossíntese de compostos primários e
secundários que requerem maior demanda desses açúcares durante o
amadurecimento.
As alfa-galactosidases (EC 3.2.1.22), similar ao spot 3506, são enzimas
amplamente distribuídas em plantas e já foram relatadas durante o
desenvolvimento de folhas e frutos, bem como sementes e tubérculos
(MARRACCINI et al., 2005). Dependendo do tipo da isoforma, a enzima pode
ser distribuída no citosol, bem como no vacúolo e, em alguns casos, na parede
celular (SOH, ALI e LAZAN, 2006). Fernandez e colaboradores (1995)
correlacionaram o aumento dessa enzima com a mudança na composição de
açúcares da parede celular durante o amadurecimento de azeitonas. Soh e
colaboradores (2006) observaram que, durante o amadurecimento do mamão,
a atividade da alfa-galactosidase aumentou concomitantemente com a perda
de firmeza da polpa. Este aumento foi em grande parte atribuído a uma das
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
67
três isoformas de alfa-galactosidase estudadas (-gal 2). Essa isoforma
também teve uma marcante capacidade de catalisar o aumento da solubilidade
e despolimerização de pectina, enquanto os polímeros ainda se mantinham
estruturalmente ligado à estrutura da parede celular, de forma similar ao que
ocorre durante a maturação.
Shiga e colaboradores (2009) observaram que o amaciamento da polpa
do mamão durante o amadurecimento é uma consequência da solubilização de
grande parte da massa molecular de galacturonanos de frações de pectina da
parede celular. Este processo parece ser dependente dos níveis de etileno e é
provável que a liberação dos galacturonanos seja resultado da ação de uma
endo-poligalacturonase. Esses resultados, as modificações na parede celular
observadas pela análise química de Shiga e colaboradores (2009) são
compatíveis com o aumento da alfa-galactosidase (spot 3506). Dessa maneira,
esse resultado pode dar uma nova pista de mais uma enzima envolvida no
processo de amaciamento da polpa.
A estreita correlação entre as alterações da textura, atividade e níveis de
proteína, bem como a capacidade para modificar a parede celular, sugerem
que a enzima alfa-galactosidase contribui para o amaciamento do fruto do
mamão durante o amadurecimento. O spot 3506 também teve aumento de
intensidade da fase pré-climátérica para a climatérica e apresentou massa
molecular de 45 KDa, próxima àquela descrita no trabalho de Soh e
colaboradores (2006). Essas proteínas merecem maior atenção, pois podem
ser de importância para o melhoramento do mamão papaia por participar da
alteração na textura da polpa do fruto.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
68
4.7.3 Metabolismo secundário
Os precursores para a produção de carotenóides são sintetizados
através da via do metilerititol fosfato (MEP). As enzimas GcpE (hidroxi-metil-
butenil-4-difosfato-sintase) participam dessa via catalisando a conversão de
metileritritol 2,4-ciclo difosfato para hidroxi-metil-butenil 4-difosfato, que é o
precursor direto para a síntese de isopentenil-difosfato (IPP) e isômero-
dimetilalil-difosfato (DMAPP) que por sua vez são precursores para a síntese
de carotenóides (QUEROL et al., 2002). Em trabalho com tomate foi
identificada uma seqüência de cDNA que codifica uma proteína bastante
similar à GcpE (RODRIGUEZ-CONCEPCION et al., 2003). Através de análise
molecular da variação de transcritos em diferentes estádios de
amadurecimento dos frutos de tomate, não foram observadas alterações
significativas na expressão gênica de GcpE.
Porém, no caso do mamão, o spot 5803, similar a que? teve um
marcante aumento na intensidade (61 vezes) durante a maturação, com
expressão não-detectável no estádio pré-climatérico. Este é um resultado
esperado, uma vez que, a biossíntese de carotenóides e sua regulação durante
o desenvolvimento e maturação dos frutos é um processo complexo, que
ocorre juntamente com a diferenciação dos cloroplastos em cromoplastos e
alterações nas propriedades organolépticas do fruto. Portanto, pode ser
esperada uma maior atividade da via MEP para suprir um intenso acúmulo de
carotenóides durante o amadurecimento. Essas enzimas são importantes uma
vez que os carotenóides afetam o valor nutricional do fruto e sensorial do fruto.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
69
Desse modo, o conhecimento a respeito dessa enzima pode trazer melhorias
para a qualidade do fruto, relativas à cor.
relacionada diretamente com o processo de amadurecimento e com os fatores
que o influencia, presença de
etileno, entre outros fatores.
A enzima aldeido desidrogenase, (EC 1.2.1.3), spots 1605 e 1602, teve
aumento da intensidade em frutos maduros em mamão e pode estar associada
com a formação de compostos voláteis (FUGGATE et al., 2010). Giribaldi e
colaboradores (2007) relataram que essa enzima também está envolvida na
destoxificação de aldeídos e na resistência a patógenos em pimentão, além do
papel no metabolismo energético, como na entrada do acetato no ciclo de
Krebs. Es
-colheita. Os dois spots tiveram aumento
na intensidade, porém, com padrão de variação diferente, o spot 1602
aumentou 2,2 vezes enquanto que o spot 1605 aumentou 5,1 vezes. Isso
sugere que essas proteínas podem ser reguladas de maneira diferente, uma
vez que houve diferença nos valores de intensidade. Elas possuem a mesma
massa molecular e pI diferentes, porém, os valores de pI estão próximos,
sugerindo possíveis isoformas.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
70
4.7.4 Metabolismo energético
Quando um tecido se encontra em alta atividade metabólica é também
alta a necessidade de energia. As ATP sintases (ATPase) são enzimas
multiméricas que contribuem para a geração do gradiente de prótons através
do tonoplasto. A ATP sintase
partir de ADP na presença do gradiente de prótons, através da membrana. Foi
observado que a supressão antisense dessa enzima reduz o crescimento do
fruto, mas não afeta a concentração de açúcar, como visto em frutos de tomate
(FAUROBERT et al., 2007). Em membrana plasmática de uva, em diferentes
estádios de maturação, não foram verificadas grandes diferenças na expressão
dessa enzima (ZHANG et al., 2008). Diferentemente, em mamão, o spot 3105
teve intensidade detectada apenas em frutos maduros, indicando uma forte
indução da expressão durante o amadurecimento. Isso ocorre, provavelmente,
por ser necessário nesta fase maior transporte de prótons para fornecer
energia durante a maturação, devido ao aumento da respiração.
As oxidureductases málicas (EC 1.1.1.38), spots 2705, 3702, são
enzimas que catalisam a descarboxilação oxidativa do malato para piruvato,
com a liberação simultânea de dióxido de carbono e conversão de NADP
+
para
NADPH. Um aumento acentuado na atividade da enzima málica foi observado
durante o amadurecimento da maçã, frutos de cereja e pera (HIRAI, 1978).
Isso também foi observado em mamão, como pode ser notado pelo
aumento nos spots 2705 e 3702. Ambas as enzimas (spots 2705 e 3702)
apresentaram sequências com elevada similaridade com as da enzima já
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
71
identificada em tomate. Além disso, apresentaram um padrão de variação da
intensidade com maior expressão do spot 3702 que foi 59 vezes mais intenso
nas amostras climatéricas que nas pré-climatéricas. Por outro lado, o spot 2705
apresentou um aumento regular de 18 vezes no estádio climatérico
O aumento da expressão dessa enzima pode ter relação com a maior
demanda de energia e piruvato, o qual participa de vários outros processos
metabólicos como o ciclo de Krebs, podendo ser convertido a carboidrato via
gliconeogênese ou convertido a energia através da Acetil-CoA. Outra
justificativa para o aumento de expressão dessa enzima durante o
amadurecimento do mamão seria a maior necessidade de NADPH. O NADPH
está relacionado com as vias de defesa, como a via da glutationa, que também
teve uma enzima aumentada (a glutationa transferase, spot 6101) e também
participa da síntese de ácidos graxos.
4.7.4.1 Metabolismo de carbono
A glicólise é uma via do metabolismo primário da célula e o principal
processo de uso energético da glicose. Nessa via, a glicose, um açúcar de 6
carbonos, é dividido em dois açúcares de 3 carbonos, que são oxidados e
rearranjados para produzir duas moléculas de piruvato. Além de preparar um
substrato para oxidação do ciclo do ácido tricarboxílico, a glicólise produz uma
pequena quantidade de energia química na forma de ATP e NADH.
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
72
As triose-fosfato-isomerases (EC 5.3.1.1), que no mamão tem um
provável correspondente no spot 3203, são enzimas da via glicolítica que estão
associadas com a obtenção de energia e o metabolismo de carbono. Como
visto no trabalho durante a maturação de tomate, ocorre um aumento do
catabolismo, ocorrendo indução de enzimas da glicólise, como a triose fosfato
isomerase, que produz substratos para a respiração e síntese de malato, a
partir de açúcares liberados durante a maturação. Foi observado no trabalho de
Rocco e colaboradores (2006) um aumento dos níveis dessa enzima de 0,6
vezes para o tomate no estádio breaker e 0,4 vezes no tomate vermelho em
relação ao tomate verde. O spot 3203 teve um aumento de intensidade de 222
vezes sugerindo que grande quantidade de energia é necessária durante o
amadurecimento do mamão papaia.
Além de moléculas de ATP a glicólise produz duas moléculas de
piruvato, o qual é oxidado nas mitocôndrias pela piruvato desidrogenase
(EC 1.2.4.1), uma enzima que também foi encontrada neste trabalho, como
indicado pelo spot 6308 O piruvato pode ser canalizado para o ciclo de Krebs e
é convertido em Acetil-CoA pela piruvato desidrogenase. Através do aumento
no fluxo do ciclo de Krebs, observou-se que a subunidade E1 da enzima
piruvato desidrogenase é mais abundantemente expressa no estádio maduro
em uvas (NEGRI et al., 2008), indicando uma maior produção de energia
durante este estádio. Perez e colaboradores (2002) observaram que os níveis
de atividade da piruvato descarboxilase e da piruvato desidrogenase poderiam
estar envolvidos, também, nas diferentes distribuições de compostos voláteis
entre cultivares de morango. Além disso, alterações da atividade da enzima
piruvato desidrogenase, a qual converte piruvato em Acetil-CoA,
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produzido durante o amadurecimento, pode provocar alterações nas
concentrações de compostos voláteis produzidos.
O spot 6308 teve aumentado de intensidade de 2,19 vezes em relação à
intensidade do spot das amostras de frutos pré-climatérico. Este aumento pode
ser justificado tanto pela necessidade de maior quantidade de energia como
também pelo acúmulo de compostos que compõem o aroma durante esta fase.
Essa enzima teve alta identidade com aquela identificada em brotos de milho,
com pI e Mr similares aos encontrados no trabalho de Thelen, Miernyk e
Randall (1998). Esse resultado tem muita importância para o amadurecimento
do mamão e para a qualidade do fruto, uma vez que o aroma e as outras
características organolépticas são muito importantes na sua qualidade final.
4.7.5 Síntese e armazenamento de proteínas
Antes do início da perda da firmeza da polpa, o fruto aumenta quase que
exclusivamente pela expansão de células, o que exige alongamento da parede
celular e acúmulo de solutos dentro do vacúolo. O fator de elongação 2 (spot
3902) é um polipeptideo que catalisa o último passo do ciclo de elongação (a
translocação) durante a síntese de proteínas (IGLEWSKI, 1994).
Os resultados obtidos para o spot 3902, com aumento da expressão da
proteína durante o amadurecimento, estão de acordo com os dados
apresentados por Zegzouti e colaboradores (1999) que demonstrou que frutos
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de tomate verdes tratados com etileno apresentaram acúmulo de um transcrito
(ER49) que codifica para um gene denominado LeEF-Ts
mt
e que corresponde a
um fator de elongação mitocondrial envolvido na síntese de proteínas. Deste
modo, o etileno parece estimular a síntese e/ou armazenamento de proteínas
durante o amadurecimento. No mamão, provavelmente este aumento na
expressão dessa proteína se deve ao aumento da produção de etileno, pois
essa enzima teve maior expressão em frutos climatéricos do que em frutos pré-
climatéricos. Isto sugere que, durante essa etapa do amadurecimento, existe
uma maior demanda de síntese protéica, provavelmente para suprir e executar
os processos metabólicos que ocorrem na maturação.
4.7.6 Proteínas de resposta ao estresse
As proteínas de resposta ao estresse estão envolvidas na respostas ao
estresse biótico e abiótico. Proteínas de resposta ao estresse são
principalmente heat shock proteins (HSP) e chaperoninas, que são uma classe
de proteínas responsáveis pelo dobramento, translocação e degradação de
proteínas, mantendo a conformação funcional (WANG et al., 2004).
Diferentes proteínas de choque térmico (HSP), pertencente às famílias
chaperonina e HSP pequenas (sHSP), ocorrem em plantas. A família HSP,
como a HSP 70 (EC 3.6.4.10), similar ao spot 7810, também participa da
proteção da estrutura de proteínas sendo induzidas ou mais intensamente
expressas em resposta a altas e baixas temperaturas. O estresse celular pode
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ser causado por fatores bióticos e abióticos e normalmente danificam
macromoléculas como DNA, proteínas ou lipídios de membranas. Quando o
sinal de estresse é iniciado o nível de proteínas envolvidas na defesa do
organismo eleva-se ou elas tornam-se ativas (KULTZ, 2005). Em tomate, HSP
pequenas estão envolvidas nos processos de desenvolvimento dos frutos
(FAUROBERT et al., 2007). Recentemente, Rocco e colaboradores (2006)
demonstraram em trabalho com tomate que a isoforma citosólica da HSP 70
aumenta 2,6 vezes quando estádio maduro é comparado ao verde. No caso do
spot 7810, este teve a intensidade aumentada em 4,2 entre os estádios verde e
maduro. Além disso, a enzima apresentou Mr (71 KDa) e pI (5,1) próximo ao
encontrado no trabalho Rocco e colaboradores (2006). Assim, é possível que
no mamão essa proteína desempenhe um papel protetor equivalente aos
encontrados por Kultz (2005), Faurobert e colaboradores (2007) e Rocco e
colaboradores (2006).
As chaperonas (spot 8702) compõem uma família de proteínas que
estão envolvidas no dobramento e auxilio ao redobramento de proteínas
sintetizadas em procariotos, mitocôndrias e plastídios. Porém, a caracterização
funcional das chaperonas em plantas é limitada. Já foi reportado que essas
enzimas são importantes na assistência de proteínas plastidiais como a
rubisco. As chaperonas desempenham papel importante na aclimatação
fotossintética ao estresse térmico, possivelmente, protegendo a rubisco ativase
de desnaturação térmica (WANG et al., 2004). A expressão elevada dessa
enzima (spot 8702) no estádio climatérico sugere que, durante este período,
seja necessária uma maior estabilização de proteínas, uma vez que durante o
amadurecimento ocorrem vários processos oxidativos. Esse aumento pode ser
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importante para o processo de amadurecimento normal do mamão papaia, uma
vez que durante o amadurecimento ocorrem alterações bioquímicas que podem
desencadear um processo de estresse, induzindo essas enzimas a atuarem em
resposta ao estresse elevando assim o nível de proteínas de defesa.
As fibrilinas de plantas, também denominadas proteínas de plastídeo
associadas a lipídios (PAP), similares aos spots 5804 e 8204, são proteínas
plastídicas reguladas durante a diferenciação do cromoplasto em certas frutas.
Os cromoplastos são responsáveis pelas cores laranja, amarelo, vermelho das
flores, frutos, folhas e algumas raízes. As proteínas de plastídeo associadas a
lipídios são proteínas envolvidas na conversão de cromoplastos em
cloroplastos, a qual é caracterizada pelo acúmulo de carotenóides e pela
degradação de clorofila durante a maturação de frutos de pimenta (ROMERO
et al., 1997). Como no trabalho com frutos de pimenta, o spot 8204 também
apresentou aumento durante a maturação (91 vezes), porém, o spot 5804 não
apresentou intensidade na fase pré-climatérica, aumentando sua intensidade
em 5,3 vezes em amostras de frutos climatéricos.
Esse aumento é condizente com a mudança na cor da polpa, pois, é
uma das alterações que ocorrem durante o amadurecimento. Além disso, o pI e
a massa molecular também variaram muito. É importante conhecer os padrões
das diferentes isoformas pois, elas podem estar sendo ativadas e reguladas de
maneira diferente podendo assim exercer funções diferentes uma das outras.
Desse modo, conhecer essa proteína e cada isoforma pode ser importante uma
vez que, pode ser um ponto de intervenção ou manipulação no processo de
desenvolvimento da cor do mamão.
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Recentemente, essa proteína também foi relacionada ao estresse
hídrico em folhas de pimentas (LANGENKAMPER et al., 2001). Isso foi
comprovado após a clonagem do cDNA que codifica para uma proteína de
cloroplasto de batata, altamente homologa à fibrilina em pimenta, previamente
caracterizada como uma proteína relacionada ao estresse hídrico, CDSP-34
(GILLET et al., 1998). A proteína presente no spot 9302 foi similar à proteína
homóloga à fribrilina, CDSP-34, que apresenta alta similaridade com uma
proteína cromoplástica de pimenta envolvida no seqüestro de carotenóides e
está relacionada ao estresse hídrico. A intensidade do spot aumentou
significativamente do fruto verde para o fruto maduro em 5,5 vezes. Além disso,
essa informação pode ser também de interesse para o entendimento do
processo de desenvolvimento da cor, cromoplasto e etc.
Foi observado que a atividade de enzimas quitinases aumentou
significativamente no início do amadurecimento de uva (ROBINSON, JACOBS
e DRY, 1997). Essas proteínas estão envolvidas na resposta a estresses
bióticos (GUARINO et al., 2007). As endoquitinases (spot 5202) em mamão
também tiveram aumento durante a maturação e apresentaram Mr e pI
diferente do teórico descrito na Tabela 6. A presença de todas essas enzimas
que participam da resposta ao estresse, dentre as quais as quitinases, podem
ser também parte de mecanismo protetor. Esse mecanismo pode ser induzido
durante a maturação, para que os frutos tenham um conjunto de enzimas de
defesa presentes para responder rapidamente em caso de ataque de patógeno.
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O melhor entendimento sobre as proteínas de defesa em mamão
durante o amadurecimento, bem como os níveis de expressão dessas
proteínas, pode facilitar a pesquisa no controle de perdas pós-colheita, tanto
em relação ao estresse biótico como abiótico. Isso, por exemplo, poderia levar ao
entendimento de qual a melhor temperatura para acondicionar os frutos e que
menos os afetem.
4.7.7 Proteínas de estresse oxidativo
Os organismos aeróbicos estão continuamente expostos ao oxigênio,
que os tornam propensos a danos gerados por radicais livres. O estresse
oxidativo é largamente mediado pelas espécies ativas de oxigênio, por
exemplo, o ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila. Em
plantas, espécies reativas de oxigênio são produzidas por foto-redução de O
2
durante a fotossíntese. Algumas proteínas como as peroxidases, catalases e
glutationa transferase são encarregadas da remoção de radicais livres em
decorrência do estresse oxidativo (REICHHELD et al., 1999).
A glutationa transferase (EC 2.5.1.18) é uma enzima que participa da
destoxificação de uma variedade de compostos xenobióticos da célula e por
isso tem sido estudada para possibilitar a desntoxificação de herbicidas em
plantas (MARRS, 1996). Além disso, o sítio de domínio da glutationa
transferase (spot 6101) também é encontrado em fatores de elongação 1-gama
e de proteínas da família HSP 26 que estão relacionadas ao estresse (LEVI et
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al., 2006). Já foi relatado que em várias espécies de plantas há uma expressão
gene-específica e variável dessa enzima durante o desenvolvimento, em
resposta a fatores ambientais, químicos ou a patógenos. Também foi visto que
essas enzimas podem executar uma variedade de funções relacionadas aos
flavonóides e à deposição desses compostos no vacúolo (LEVI et al., 2006).
Essa enzima já foi isolada de sementes do mamão e foi verificado o
possível papel da glutationa no acúmulo de isotiocianatos (moléculas que
conferem resistência a ataques de fungos) (NAKAMURA et al., 2000). Além
disso, o isotiocianato também tem sido relatado pelo seu pote
(BRADLOW et al., 1991). Rossetto e
colaboradores (2008) detectaram níveis significativos de isotiocianato também
na polpa do mamão. Foi verificada que a quantidade obtida consumindo 200 g
de polpa do fruto é comparável aos níveis presentes em 100 g de outros
vegetais (brócolis, couve-flor, repolho branco). Do mesmo modo, o consumo do
fruto é mais vantajoso considerando que os vegetais necessitam de
processamento antes do consumo, e as condições de processamento
usualmente empregadas afetam negativamente os valores de isotiocianatos.
Frutos de Amelanchier alnifolia responderam ao progressivo aumento do
estresse oxidativo nas fases anteriores da maturação com um aumento da
regulação de glutationa transferase durante a fase final de maturação
(ROGIERS, KUMAR e KNOWLES, 1998). Em mamão, o spot 6101 também
apresentou alguma intensidade em frutos verdes e aumentou durante a
maturação, comprovando que há um aumento da expressão dessa proteína.
Esse aumento é esperado, uma vez que, durante o processo do
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amadurecimento, compostos xenobióticos podem ser gerados em maior
quantidade devido às várias reações bioquímicas que ocorrem durante o
processo. Essa enzima apresentou alta similaridade com a proteína já descrita
para mamão com o score de 622, com pI e Mr similares aos pI e Mr téoricos.
.
Além disso, o isotiocianato desempenha papel importante de proteção do
próprio fruto.
4.7.8 Múltiplos spots de uma mesma proteína
Quinze proteínas foram representadas por spots múltiplos com pI
diferentes e/ou Mr. Assim, dos 37 spots 20 corresponderam a proteínas
distintas, correspondendo a 40% dos spots identificados.
Isoformas de proteínas são geralmente separadas durante a eletroforese
bidimensional e ocorrem por vários mecanismos: variação alélica, interações
de subunidades diferentes, degradação de proteínas, ou modificações pós-
tradução. Algumas linhas horizontais de spots podem ser observadas no gel
como múltiplos spots. Dentro dessas linhas, a análise identificou múltiplos spots
da mesma proteína. Esses mesmos spots de proteínas, que normalmente tem
tamanhos moleculares semelhantes, mas pontos isoelétricos ligeiramente
4. Resultados e Discussão_______________________________________________________________
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diferentes podem ser decorrentes de modificações pós-tradução que provocam
alterações na carga de proteína ou diferença nas sequências de aminoácidos.
Os mecanismos de modificações pós-traducionais c
(MANN e JENSEN, 2003).
A presença de múltiplos spots de uma mesma prote
muitos trabalhos que utilizam a
spots (MECHIN et al., 2004) e muitas delas haviam sido
glicosiladas. Na análise proteômica de meristema de banana, também foi
observada a presença de várias isoformas e, utilizando o sequenciamento de
novo, conseguiram identificar as diferentes isoformas resultantes de variações
alélicas, ou de locos gênicos diferentes (SAMYN et al., 2006).
Mesmo sem poder ainda definir os motivos que explicam alguns dos
múltiplos spots de uma mesma proteína em mamão, é primordial ressaltar a
importância de obter informações sobre o padrão bioquímico e de expressão
das isoformas, pois, isso pode ter reflexos também no papel funcional desta
proteína e na sua contribuição para processos implicados na qualidade da
fruta.
5. Conclusão ________________________________________________________________________
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5. CONCLUSÃO
Essa é a primeira abordagem proteômica para polpa do mamão e oferece
uma grande quantidade de novas informações que podem contribuir para
melhorar a compreensão dos elementos envolvidos no processo de
amadurecimento do tecido em questão. A análise comparativa dos mapas de
proteínas em dois diferentes estádios de maturação apresentou informações
sobre o padrão de expressão de algumas proteínas associadas com o
processo de maturação da polpa do mamão papaia (Carica papaya L.).
,
estando presentes nessa categoria algumas proteínas que participam da perda
da firmeza do fruto. No estádio climatérico foi maior a expressão das enzimas
envolvidas na biossíntese de etileno e seu precursor em comparação ao
estádio pré-climatérico. Tanto as hidrolases e as enzimas envolvidas na
biossíntese de etileno e seu precursor são importantes para a compreensão de
como é regulada a perda da firmeza na conversão de frutos verdes a maduros,
uma vez que a textura é uma das principais características de qualidade do
fruto. Da mesma forma, desde o início da maturação até o fim da mudança de
cor há um acréscimo nas proteínas envolvidas na defesa do fruto, indicando
que os mecanismos de defesa são fortalecidos durante o amadurecimento,
provavelmente para prevenir o ataque de patógenos. Essas informações
podem ser importantes para embasar estratégias visando maior resistência ao
estresse biótico e abiótico na fase pós-colheita. As proteínas envolvidas no
metabolismo energético também tiveram aumento na expressão, o que é
5. Conclusão ________________________________________________________________________
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esperado, uma vez que, maior quantidade de energia é necessária para suprir
o aumento do metabolismo das proteínas das demais categorias.
A técnica 2D-DIGE-LC-MS-MS foi adequada para a identificação de um
grupo de proteínas, tendo sido possível identificar proteínas diferencialmente
expressas potencialmente envolvidas em processos bioquímicos que controlam
importantes características da qualidade dos frutos, tais como carotenóides,
biossíntese de aroma e textura.
A investigação proteômica iniciada aqui, contribui para ampliar a
compreensão do metabolismo do mamão e sua regulação durante o
amadurecimento, permitindo o desenvolvimento de novas práticas para a
manutenção da qualidade dos frutos.
6. Referências ________________________________________________________________________
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NOGUEIRA, S.B.
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7. ANEXOS
Anexo 01.
Ficha do Aluno ...............................................................
98
Anexo 02.
Informações para os Membros de Bancas Julgadoras
de Mestrado/Doutorado...................................................
100
Anexo 01. Ficha do Aluno_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
98
Anexo 01. Ficha do Aluno_______________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
99
Anexo 02. Informações para os Membros de Bancas Julgadoras de Mestrado/Doutorado _____________
____________________________________________________________________________________
NOGUEIRA, S.B.
100
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