( PDF ) Modulação da glicólise de músculo esquelético e fígado por serotonina

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Bioquímica Médica

Wagner Santos Coelho

MODULAÇÃO DA GLICÓLISE DE MÚSCULO ESQUELÉTICO

E FÍGADO POR SEROTONINA

Rio de Janeiro

2010

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Bioquímica Médica

Wagner Santos Coelho

MODULAÇÃO DA GLICÓLISE DE MÚSCULO ESQUELÉTICO E FÍGADO POR

SEROTONINA

Tese de Doutorado submetida ao programa de

Pós-Graduação em Ciências Biológicas

(Química Biológica), do Instituto de Bioquímica

Médica, da Universidade Federal do Rio de

Janeiro, como parte dos requisitos necessários

para obtenção do grau de Doutor em Ciências.

Orientador: Mauro Sola-Penna

Rio de Janeiro

2010

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iii

COELHO, Wagner Santos

Modulação da glicólise de músculo esquelético e fígado por serotonina.

Rio de Janeiro, UFRJ, Instituto de Bioquímica Médica, CCS, 2010.

XVIII, 145 folhas

Tese – Doutorado em Ciências Biológicas (Química Biológica)

1. Serotonina. 2. Fosfofrutocinase. 3. Sinalização celular

I Universidade Federal do Rio de Janeiro

II. A serotonina controla a glicólise através da regulação da fosfofrutocinase de

músculo e fígado alterando a redistribuição celular da enzima.

FOLHA DE APROVAÇÃO

“Modulação da glicólise de músculo esquelético e fígado por serotonina.”

Wagner Santos Coelho

Membros da Banca Examinadora:

____________________________________________________

Prof. Celso Caruso Neves

Professor Associado do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ

____________________________________________________

Prof

Denise Pires de Carvalho

Professora Associada do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ

____________________________________________________

Prof. José Roberto Meyer Fernandes

Professor Associado do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ

____________________________________________________

Prof. Mario Alberto Cardoso da Silva Neto

Professor Associado do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ

____________________________________________________

Prof. Marcelo Einicker Lamas

Professor Adjunto do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ

____________________________________________________

Prof. Mauro Sola-Penna

Professor Associado do Departamento de Fármacos, FF, UFRJ

Orientador

Rio de Janeiro, RJ, Brasil

Agosto, 2010

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Enzimologia e Controle do Metabolismo –

LabECoM – do Departamento de Fármacos, Faculdade de Farmácia, CCS/UFRJ, sob orientação

do Professor Mauro Sola Penna, na vigência dos auxílios financeiros concedidos pelo Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Programas de Núcleos de

Excelência (PRONEX), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio

de Janeiro (FAPERJ).

“Man's mind,

once stretched by a new idea,

never regains its original dimensions.”

Oliver Wendell Holmes

“The joy of life comes from our encounters with new experiences,

and hence there is no greater joy

than to have an endlessly changing horizon,

for each day to have a new and different sun.”

Chris “Supertramp” McCandless

vii

DEDICATÓRIA

Aos meus pais e meus irmãos,

Exemplos de força e dedicação,

Vencedores em suas essências.

Amor e apoio incondicional.

Sem os quais nada teria sido possível.

viii

DEDICATÓRIA

A Vê,

minha menina,

apoiando-me em tudo,

fonte de amor, luz e inspiração.

Amo-te Zípora!

AGRADECIMENTOS

Aos Amigos Ian, Edil e Cadu, por terem me apresentado ao mundo científico.

Aos amigos do LabECoM (de todas as épocas), por toda convivência e amizade.

o Especialmente a Mônica, Guilherme, Tiago, Raquel, Patrícia, Antônio e Daniel.

Agradeço ao Mario, pelas revisões e sugestões ao longo do desenvolvimento deste

trabalho e pela parceria nas corridas de rua.

Ao Mestre Mauro Sola-Penna pela orientação, incentivo e amizade. Aprendi nessa

caminhada muito mais do que poderia supor, do que esperava. Lições para vida.

Muito obrigado!

RESUMO

_____________________________________________________________________________

A ação hormonal da serotonina (5-HT) tem implicações em muitos processos fisiológicos e

patológicos. Uma das propriedades mais intrigantes é a capacidade de regular processos

mitogênicos. Além disso, a 5-HT aumenta a captação de glicose em músculo e fígado, sugerindo

um efeito sobre o controle do metabolismo de carboidratos em tecidos periféricos. Nesta tese

demonstramos que a 5-HT controla positivamente a atividade da fosfofrutocinase (PFK) de

músculo esquelético e fígado de camundongos, através do receptor 5-HT

, ativando a

fosfolipase C (PLC) e culminando com a redistribuição celular da PFK. Em músculo, esta

ativação leva, por um lado, ao recrutamento da proteína cinase C (PKC) e da calmodulina com

consequente ativação da calmodulina cinase II (CaMKII), que em função do estímulo hormonal

associa-se a PFK. Por outro lado, a esta sinalização aumenta a atividade de enzimas com

atividade tirosina cinases, aumentando a fosforilação da PFK em resíduos de tirosina. Essa

fosforilação pode estar envolvida com alteração dos parâmetros cinéticos da PFK e com sua

redistribuição celular, regulando positivamente esta enzima. Em fígado, os efeitos da 5-HT

através da PLC provavelmente envolvem a ativação da PKC, e a ação da 5-HT resulta em ação

sinérgica a ativação da PFK promovida por insulina e por frutose-2,6-bifosfato (F-2,6-BP).

Adicionalmente, a 5-HT promove redução da glicemia em animais saudáveis e com diabetes

mellitus induzido por streptozotocina. Esses resultados sugerem que a 5-HT é capaz de regular o

fluxo glicolítico em músculo e fígado de camundongos.

______________________________________________________________________________

Palavras chave: fosfofrutocinase, glicólise, serotonina, sinalização celular.

ABSTRACT

_____________________________________________________________________________

Serotonin (5-HT) is a hormone implicated in the regulation of many physiological and

pathological events. One of its most intriguing properties is the ability to up-regulate mitosis.

Moreover, it has been shown that 5-HT stimulate glucose uptake on skeletal muscle, suggesting

that 5-HT may regulate glucose metabolism of peripheral tissues. Our results demonstrate that 5-

HT stimulates skeletal muscle e hepatic PFK, through 5-HT

receptor and phospholipase C

(PLC), resulting in PFK intracellular redistribution. PLC activation in skeletal muscle leads to

protein kinase C (PKC) and calmodulin recruitment, stimulating calmodulin kinase II (CaMK II),

which associates with PFK upon 5-HT action. On the other hand, PLC activation leads to PFK

tyrosine phosphorylation through a signaling hitherto fully understood. 5-HT effects through

hepatic PLC probably involve PKC up-regulation. 5-HT and insulin or fructose-2,6-bisphosphate

(F-2,6-BP) show synergic action upon PFK activation. Furthermore, 5-HT reduces glycemia from

strepzotocin induced diabetic mice or from healthy counterparts. These results taken together

suggest that 5-HT is able to control glycolytic flux in mice skeletal muscle and hepatic tissues.

_____________________________________________________________________________

Keywords: fosfofructokinase, glycolysis, serotonin, cellular signaling.

xii

ABREVIATURAS, FÓRMULAS E SÍMBOLOS

(NH4)2SO4 Sulfato de amônio

[γ-

P]ATP Adenosina 5’-trifosfato marcado radioativamente no fosfato γ

[Pi] Fosfato marcado com isótopo radioativo de fósforo

5-CT 5-carboxamidotriptamina

5-HIAA Ácido 5-hidroxi indolacético

5-HT 5-hidroxitriptamina, serotonina

5-HT

a 5-HT

Classificação das famílias dos receptores de serotonina

5-HTP 5-hidroxitriptofano

5-HTR Receptores de serotonina

5-MeOT 5-metoxitriptamina

8-OH-DPAT 8-hydroxi-2-di-n-ropilamina-tetralina

AAS Ácido acetil salicilico

AC Adenilato ciclase

ADP Adenosina 5’ bifosfato

Akt Proteína cinase B

AMP Adenosina 5’ monofosfato

AMPc Adenosina 3’,5’ monofosfato cíclico

ATP Adenosina 5’ trifosfato

BeWo Linhagem celular de coriocarcinoma de placenta

BIS I Inibidor de PKC

-CaM Cálcio-calmodulina

CaMK Proteína cinase dependente de Ca

-calmodulina

DAG Diacilglicerol

DM Diabetes mellitus

DNA Ácido deoxiribonucleico

DOI ([1-(2,5-Dimetoxi-4-iodofenil)-aminopropano]-hidroclorideo)

EC Células enterocromafins

EDTA Ácido etileno-diamino tetracético

ERK Cinase regulada por sinal extracelular

xiii

F-1,6-BP Frutose-1,6-bifosfato

F-2,6-BP Frutose-2,6-bifosfato

F-6-P Frutose-6-fosfato

F-actina Actina filamentosa

G-3-P Gliceraldeído-3-fosfato

G-6-P Glicose-6-fosfato

GLUT Transportadores de glicose

GK Glicocinase

H-89 Inibidor de PKA

HCl Ácido clorídrico

HK Hexocinase

HT Homogeneizado total

Inositol 1,4,5-trifosfato

IR Receptor de insulina

IRS Substrato do receptor de insulina

JEG-3 Linhagem celular de coriocarcinoma de placenta

1/2

Concentração de substrato na qual é atingida a metade da Vmax da reação

enzimática

KF Fluoreto de potássio

KN-62 (1-[N,O- bis (5-isoquinolinesulfonil)-N-metil-L-tirosil]-4-fenilpiperazina)

LSD Ácido dietilamido lisérgico

MAPK Via das cinases ativadas por sinal mitogênico

MEK Cinases ativadas por sinal mitogênico

MCF-7 Linhagem celular de carcinoma mamário humano

MgCl

Cloreto de magnésio

mTOR Proteína de mamíferos alvo da rapamicina

n Índice de cooperatividade

NaCl Cloreto de sódio

NAD

Nicotinamida adenina dinucleotideo oxidado

NADH

Nicotinamida adenina dinucleotideo reduzido

NIH-3T3 Linhagem celular de fibroblasto

xiv

p70S6K Serina/treonina cinase estimulada por sinal mitogênico

PD98059 Inibidor de MEK

PFK Fosfofrutocinase

PFK-L Isoforma hepática da PFK

PFK-M Isoforma muscular da PFK

PFK-P Isoforma plaquetária da PFK

PFK-2 Enzima bifuncional, fosfofrutocinase-2/frutose-2,6-bifosfatase

PGI Glicose-6-fosfato isomerase

Pi Fosfato inorgânico

PI3K Fosfatidilinositol-3-cinase

PIP

Fosfatidilinositol bifosfato

PIP

Fosfatidilinositol trifosfato

PK Piruvato cinase

PKA Proteína cinase A

PKC Proteína cinase C

PLA Fosfolipase A

PLC Fosfolipase C

PMA Forbol-12-miristate-13-acetato

PMSF Fluoreto de Fenilmetilsulfonil

RNA Ácido ribonucleico

RNA RNA mensageiro

SDS Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS

SNC Sistema nervoso central

STAT Transdutores de sinal e ativadores de transcrição

STZ Streptozotocina

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

U-73122 Inibidor de PLC

ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 – Via glicolítica 10

Figura 2 – Reação da enzima hexocinase 11

Figura 3 – Reação da enzima fosfofrutocinase 14

Figura 4 – β-frutose-2,6-bifosfato 18

Figura 5 – Balanço entre diferentes formas oligoméricas da PFK 25

Figura 6 – Alteração da distribuição celular da PFK 30

Figura 7 – Síntese e metabolismo da serotonina 32

Figura 8 – Receptores de serotonina (5-HTR) e seus efetores intracelulares 35

Figura 9 – Efeitos da 5-HT sobre a atividade da HK 49

Figura 10 – Ativação da enzima PFK por serotonina 50

Figura 11 – Efeitos da 5-HT na redistribuição celular da PFK 52

Figura 12 – Incorporação de fosfato ao conteúdo total de proteína do homogenizado de

Músculo esquelético 54

Figura 13 – Imunoprecipitação e análise do padrão de fosforilação da PFK 56

Figura 14 – Ativação da PFK mediada por serotonina é prevenida por genisteina 57

Figura 15 – Envolvimento do receptor 5-HT

nos efeitos da serotonina sobre a ativação

da PFK 59

Figura 16 – Ativação da PFK é independente do recrutamento da PKA 60

Figura 17 – Ativação da PFK por 5-HT é dependente da fosfolipase C 61

Figura 18 – PMA mimetiza a ativação da PFK induzida por 5-HT 62

Figura 19 – A inibição da PKC previne o efeito da 5-HT no controle da PFK 63

Figura 20 – Efeitos da 5-HT são MAPK independentes 64

Figura 21 – A presença do composto 48/80 previne ativação da PFK por 5-HT 66

Figura 22 – Ativação da PFK é dependente da CaMK II 67

Figura 23 – 5-HT aumenta a coimunoprecipitação entre a PFK e a CaMKII 68

Figura 24 – Atividade da HK de tecido hepático na presença de serotonina 70

Figura 25 – Efeitos da 5-HT na atividade da PFK de fígado de camundongos 71

Figura 26 – Alteração da localização celular da PFK promovida por serotonina 73

xvi

Figura 27 – Efeitos sinérgicos da serotonina e F-2,6-BP no controle da PFK 75

Figura 28 – Regulação da atividade da PFK por serotonina e insulina 76

Figura 29 – Ativação da PFK é dependente do receptor 5-HT

Figura 30 – A inibição de enzimas com atividade tirosina cinase previne os efeitos da 5-HT 79

Figura 31 – Os efeitos da serotonina dependem da ativação de PI3K 80

Figura 32 – Envolvimento da PLC na ação da serotonina 81

Figura 33 – Ação da seotonina provavelmente envolve a ativação da PKC 82

Figura 34 – Glicemia de camundongos controle e diabéticos trados com serotonina 85

Figura 35 – Modelo de controle do fluxo glicolítico por 5-HT em músculo esquelético 96

Figura 36 – Modelo de ativação da PFK mediado por 5-HT em fígado 101

Tabela 1 – Resumo das características dos receptores de serotonina 33

Tabela 2 – Parâmetros cinéticos da enzima fosfofrutocinase modulados por serotonina 51

xvii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

1.1. Metabolismo dos carboidratos 1

1.2. Via glicolítica 6

1.3. Hexocinase (HK) 10

1.4. Fosfofrutocinase (PFK) 14

1.5. Serotonina (5-Hidroxitriptamina – 5-HT) 30

2. OBJETIVOS 40

2.1. Objetivos gerais 40

2.2. Objetivos específicos 40

3. MATERIAL E MÉTODOS 41

3.1. Material 41

3.2. Homogenizado de músculo esquelético e fígado de camundongo 41

3.3. Radioensaio para a atividade da fosfofrutocinase e hexocinase 42

3.4. Atividade da PFK medida através de ensaio espectrofotométrico 43

3.5. Fosforilação de proteína 43

3.6. Fracionamento subcelular 44

3.7. Imunoprecipitação 45

3.8. Western Blotting 45

3.9. Indução do diabetes em camundongos e tratamento 46

3.10. Análise estatística 47

4. RESULTADOS 48

4.1. Efeitos da 5-HT no controle de enzimas glicolíticas de músculo esquelético 48

xviii

4.1.1. Efeitos da 5-HT na atividade da HK e PFK de músculo esquelético de

camundongos 48

4.1.2. Efeitos da 5-HT na sublocalização intracelular da PFK 51

4.1.3. Efeitos da 5-HT na fosforilação da PFK e sua implicação para atividade

enzimática 53

4.1.4. Os efeitos da 5-HT são mediados através da isoforma 5-HT

do receptor 57

4.1.5. Proteínas envolvidas na sinalização da serotonina para ativar a PFK 59

4.2. Efeitos da 5-HT no controle de enzimas glicolíticas de fígado 69

4.2.1. Efeitos da serotonina sobre atividade da HK e PFK de tecido hepático de

camundongos 69

4.2.2. Efeitos da 5-HT sobre a localização celular da PFK de tecido hepático 72

4.2.3. Efeitos sinérgicos da 5-HT e F-2,6-BP no controle da PFK hepática 73

4.2.4. Ativação da PFK de fígado por 5-HT é mediada pelo receptor 5-HT

4.2.5. Ação da serotonina na ativação da PFK depende de uma via que envolve

tirosinas cinases e evolvem a ativação de PI3K 77

4.2.6. A ativação da PFK envolve o recrutamento de PLC e PKC 80

4.3. Efeitos da serotonina no controle da glicemia de animais diabéticos 83

5. DISCUSSÃO 86

6. CONCLUSÕES 104

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 105

8. ANEXOS 130

1. INTRODUÇÃO

1.1 Metabolismo dos Carboidratos

Os carboidratos representam a maior parte de toda matéria orgânica encontrada no

planeta, sendo amplamente distribuídos em animais e plantas, por conta do importante papel

estrutural e metabólico na manutenção da vida dos diversos organismos. A extensa gama de

funções dos carboidratos inclui o seu uso como combustível, intermediários metabólicos e

reserva de energia. Os açucares ribose e deoxiribose formam o arcabouço para as estruturas

dos RNA e DNA respectivamente. Além disso, a celulose é o principal constituinte da

parede celular de plantas; entre muitas outras funções atribuídas aos carboidratos. Embora

animais disponham de mecanismos metabólicos para transformar glicerol e aminoácidos em

carboidratos, a principal fonte de carboidratos provém da dieta, sobretudo da ingestão de

vegetais. As plantas por sua vez, fixam CO

e H

O através de reações fotossintéticas para

constituir os carboidratos que podem ser estocados na forma de amido (Murray et al., 2003).

Carboidratos são compostos aldeídicos ou cetônicos com múltiplas hidroxilas.

Existem três grandes classes de carboidratos: monossacarídeos, oligossacarídeos e

polissacarídeos. O sufixo sacarídeo é derivado do grego sakcharon, e significa açúcar. A

glicose é a forma de carboidrato mais importante, sendo um dos principais combustíveis

metabólicos em mamíferos, e o precursor para a síntese de todos os outros carboidratos no

organismo, incluindo glicogênio (um polissacarídeo usado como forma de estoque de

energia), a galactose (uma das unidades o sacarídica constituinte da lactose, o açúcar do leite

materno), glicolipídeos e carboidratos conjugados a proteínas, como glicoproteínas e

proteoglicanos (Nelson e Cox, 2004).

A maioria dos carboidratos obtidos na dieta é absorvida para a corrente sanguínea na

forma de glicose, e outros açúcares são convertidos a glicose ou outros intermediários

metabólicos no fígado. O processo digestivo de carboidratos complexos provenientes da

alimentação se dá através de hidrólise enzimática dos polissacarídeos sendo então

convertidos a oligossacarídeos e em seguida em mono- e dissacarídeos livres. Os

dissacarídeos são ainda clivados por enzimas específicas como a maltase, lactase, sucarase-

isomaltase, localizadas na parede rugosa das células intestinais, onde então os

monossacarídeos resultantes, bem como os advindos da alimentação são absorvidos. A

absorção de glicose e galactose ocorre através de um mecanismo ativo secundário de co-

transporte do monossacarídeo e sódio; glicose e galactose ainda competem entre si pela

mesma proteína transportadora, a co-transportadora 1 de sódio-glicose (Pfannkuche e Gäbel,

2009). Já a frutose é absorvida por difusão carreada e por não ser ativamente transportada,

sua absorção depende do seu gradiente de concentração, com isto após uma ingestão

moderada à alta de frutose, parte permanece no lumem intestinal servindo como substrato

para fermentação bacteriana (Guyton e Hall, 2006). Células enteroendócrinas apresentam

papel importante como sensores do conteúdo intestinal sinalizando para neurônios entéricos,

através da liberação de vários mediadores, permitindo adequada absorção dos nutrientes

(Blackshaw et al., 2007). Dentre a população de células enteroendócrinas distingue-se dois

principais ramos, incluindo células que expressam o peptídeo YY e/ou o peptídeo

semelhante ao glucagon 1, ou colecistocinina. O outro ramo inclui principalmente células

enterocromafins (EC) que liberam serotonina (Rozengurt e Sternini, 2007). As células EC,

contendo serotonina têm papel crucial como células quimioceptoras (Blackshaw et al.,

2007), percebendo os níveis de glicose e liberando serotonina que age diretamente em

células do enterócito e em neurônios entéricos, favorecendo a captação de glicose e ativando

reflexos de contração peristáltica (Pfannkuche e Gäbel, 2009).

O processo digestivo dos carboidratos culmina com o aumento da glicemia. O índice

glicêmico é o parâmetro obtido a partir do aumento da glicose plasmática em função da

ingestão de um alimento quando comparado a uma quantidade equivalente de glicose pura.

Este parâmetro varia em função da natureza e da quantidade de carboidratos presente na

dieta. Glicose e a galactose têm índice 1, assim como lactose, maltose e trealose que dão

origem a esses monossacarídeos após hidrólise. A frutose por ser absorvida mais lentamente

tem índice glicêmico menor do que 1, assim como a sacarose por conter frutose como um

dos seus monossacarídeos. Entretanto, aproximadamente 80% dos carboidratos absorvidos

após uma refeição encontram-se na forma de glicose, e boa parte da frutose e quase toda

galactose absorvida são rapidamente transformadas em glicose no fígado através de reações

enzimáticas específicas. Então a glicose apresenta-se como o intermediário comum para o

transporte de carboidrato visando a manutenção das necessidades dos diversos tecidos do

organismo (Murray et al., 2003).

Imediatamente após uma refeição rica em carboidratos, a absorção dos carboidratos

através do processo digestivo para a corrente sanguínea leva a rápida secreção de insulina

pelo pâncreas. A insulina é um hormônio protéico sintetizado e liberado pelas células β do

pâncreas em resposta, principalmente, a altos níveis de glicose plasmática. A insulina

modula o metabolismo celular de diferentes maneiras, ativando ou inibindo diversas vias de

sinalização, promovendo a modulação de várias enzimas e vias metabólicas, reprimindo e

ativando vários genes e proteínas do metabolismo intermediário entre outras maneiras

(Ferrannini et al., 1999). Após a ingestão de carboidratos a insulina por sua vez tem o

importante papel de promover a captação e fixação de glicose em quase todos os tipos

celulares do organismo, especialmente direcionando a glicose para os tecidos adiposo,

hepático e muscular (Czech e Corvera, 1999; Pessin et al., 1999).

Ao contrário do co-transporte ativo secundário, dependente de sódio, que ocorre

através da membrana das células gastrointestinais, na maioria dos tecidos a glicose é

transportada através da membrana celular apenas em função do gradiente de concentração,

sendo transportada do meio de maior concentração para o menor concentrado por difusão

facilitada ou por difusão simples (Guyton e Hall, 2006).

O transporte de glicose para o meio intracelular só é possível graças a expressão

tecidual de proteínas transportadoras específicas, denominadas, de forma geral como GLUT

(transportadores de glicose). Existem várias isoformas de GLUT, apresentando diferentes

graus de afinidade e capacidade de transportar glicose (Murray et al., 2003). O padrão de

expressão dos transportadores de glicose varia de acordo com os tecidos. As isoformas

GLUT1 e GLUT4 são as duas principais isoformas expressas no músculo esquelético

(Czech e Corvera, 1999). O GLUT1 que também é encontrado em diversos tecidos do

organismo é responsável pela captação basal de glicose, e está constantemente integrado a

membrana plasmática. Já o GLUT4, encontra-se internalizado na célula, associado a

vesículas, e desloca-se para a membrana plasmática para desempenhar sua função de

captação de glicose apenas após estímulos específicos, como por exemplo durante a

contração muscular e a sinalização desencadeada por insulina. Ao final do estímulo,

gradativamente o pool de GLUT4 sofrerá invaginação, sendo redirecionado para o meio

intracelular (Pessin et al., 1999).

O tecido hepático apresenta papel fundamental na captação de glicose pós prandial e

portanto no controle da glicemia. Cerca de 30 a 40% da glicose que entra através da veia

porta após a ingestão de glicose serão removidas do sangue para repor os estoques hepáticos

de glicogênio (Pagliassotti e Cherrington, 1992, Dardvet et al., 2006), que serão utilizados

posteriormente para manutenção da glicemia em períodos de jejum. Essa captação ocorre

através dos transportadores de glicose GLUT1 e GLUT2, bem como a atividade da enzima

glucocinase, responsável por fosforilar rapidamente a glicose no interior celular e assim

impedir que a mesma seja externalizada, além de favorecer a contínua captação de glicose

por diminuir o gradiente de concentração da forma não fosforilada da glicose no meio

intracelular (Eisenberg et al., 2005, Postic et al., 2001).

Além do estímulo direto na captação de glicose pelo fígado desencadeado pelo

aporte de glicose que chega a veia porta, a insulina apresenta papel fundamental, tendo

efeito adicional sobre essa captação (Cherrington et al, 1998). De fato, o receptor hepático

de insulina (IR) tem papel determinante na captação e metabolismo de glicose, uma vez que

camundongos knockout para IR, específico do fígado, apresentam comprometimento no

teste de tolerância a glicose, hiperinsulinemia e hiperglicemia relacionada a produção

hepática de glicose (Michael et al., 2000). Esses animais apresentam ainda menor expressão

gênica de enzimas glicolíticas como a glicocinase e a piruvato cinase (Michael et al., 2000).

A formação de complexos IR/GLUT1 e IR/GLUT2 em hepatócitos de ratos neonatais e

adultos, respectivamente, sugerem que o IR regula o transporte de glicose no fígado ao

associar-se a transportadores endógenos de glicose, (Nevado et al., 2006, Eisenberg et al.,

2005).

Os mecanismos pelos quais a insulina estimula a captação e utilização de glicose

pelo fígado envolvem ainda outros eventos que incluem, a inativação da enzima hepática

glicogênio fosforilase, impedindo a degradação do glicogênio estocado no fígado; promove

o aumento da captação de glicose ao aumentar a afinidade da enzima glicocinase por

glicose; além de estimular a atividade de enzimas voltadas para a síntese de glicogênio,

especialmente a glicogênio sintase, permitindo a polimerização do monossacarídeo para

formar glicogênio que será estocado (Ferrannini et al., 1999).

A regulação adequada da glicemia é crucial para a manutenção das funções da

maioria dos tecidos corporais. O cérebro por exemplo depende muito da energia derivada da

oxidação de glicose para desempenhar suas funções normais sendo capaz de usar outros

substratos energéticos apenas em situações adversas, com isso as células nervosas são

permeáveis a glicose, e a insulina tem pouco ou nenhum efeito sobre a captação de glicose

por esses tecidos, e o nível glicêmico deve ser mantido sempre acima dos níveis críticos, a

fim de evitar os efeitos nocivos da hipoglicemia (Murray et al., 2003).

Uma vez tendo sido internalizada a glicose tem, de forma geral, três possíveis

destinos; armazenamento na forma de glicogênio nos tecidos hepático e muscular; ser

oxidada em duas moléculas de piruvato através da via glicolíca com consequente geração de

ATP; ou ser oxidada na via das pentose fosfato para gerar ribose-5-fosfato para a síntese de

ácidos nucléicos (Nelson e Cox, 2004).

Muitas doenças estão associadas ao metabolismo de carboidratos, como o diabetes

mellitus, galactosemia, doenças relacionadas ao estoque de glicogênio, e intolerância a

lactose (Murray et al., 2003). Além disso, vários tipos de tumores dependem da energia

derivada da oxidação da glicose para manutenção de suas altas necessidades metabólicas,

dessa forma é fundamental entender os processos envolvidos na regulação do metabolismo

dos carboidratos como uma possível estratégia para prevenção e/ou tratamento dessas

doenças (Gatenby e Gillies, 2004).

Neste trabalho a discussão será encaminhada aos mecanismos metabólicos

envolvidos na oxidação da glicose através da via glicolítica, o papel e a regulação das

enzimas envolvidas nesse processo, e a ação de hormônios que controlam o metabolismo de

carboidratos, especialmente a serotonina.

1.2 Via glicolítica

Durante os estudos sobre os processos envolvidos na fermentação da glicose por

leveduras, Louis Pasteur descobriu que tanto a taxa, quanto a quantidade total de glicose

consumida era maior sob condições anaeróbias, e estudos posteriores demonstraram que o

mesmo fenômeno ocorre em tecido muscular esquelético, denominado “Efeito Pasteur”. As

bases bioquímicas deste processo, hoje, estão esclarecidas. A produção líquida de ATP sob

condições anaeróbias é muito menor do que aquela obtida após a completa oxidação aeróbia

de glicose a CO

, que resulta em produção 15 vezes maior de ATP (Nelson e Cox, 2004). As

tentativas em entender o controle mútuo entre a via glicolítica e a fosforilação oxidativa,

levou muito autores a lançar luz sobre os mecanismos que governam o fluxo glicolítico

(Uyeda, 1979).

Na maioria dos seres vivos conhecidos, a via central do catabolismo da glicose é

conhecida como Via de Embden-Meyerhof ou glicólise. Este processo não é exatamente

igual para todos os organismos, diferindo de um para outro com relação à forma com que

seu fluxo é regulado, e no destino metabólico do piruvato formado, produto final da via. A

glicólise envolve a quebra da glicose em duas moléculas de piruvato através da participação

de 10 enzimas que atuam em sequência.

Os cinco primeiros passos enzimáticos formam a fase conhecida como fase

preparatória. A primeira reação da via é catalisada pela enzima hexocinase (HK), a qual

fosforila a glicose no sexto carbono para formar glicose-6-fosfato (G-6-P) e ADP, tendo o

ATP e glicose como substratos. Essa é uma reação irreversível e regulatória da degradação

da glicose, tendo fundamental importância uma vez que as células não contém

transportadores para a glicose fosforilada, impedindo que esta seja externalizada; sendo

direcionada para algum processo celular. A reação que se segue é uma isomerização

catalisada pela enzima glicose-6-fosfato isomerase (PGI) para formar frutose-6-fosfato (F-6-

P). A próxima reação é catalisada pela enzima fosfofrutocinase (PFK) e representa o

segundo ponto regulatório da via, onde o fosfato da posição γ do ATP, é transferido para a

F-6-P para formar frutose-1,6-bifosfato (F-1,6-BP) e ADP. A F-1,6-BP é substrato da

enzima aldolase, sendo clivada para produzir uma molécula de gliceraldeído-3-fosfato (G-3-

P) e uma de diidroxiacetona fosfato, produtos da primeira fase da glicólise. Essas duas

moléculas são facilmente isomerizadas entre si, através da reação catalisada pela enzima

triosefosfato isomerase. A molécula de G-3-P é o único dos isômeros que serve como

substrato para que a oxidação da glicose possa prosseguir, através da glicólise.

Os cinco passos restantes que constam na segunda fase da glicólise, representam as

etapas aonde ocorre à produção de ATP pela glicólise. Nela a energia liberada pela

transformação de duas moléculas de G-3-P em duas moléculas de piruvato, é conservada

através do acoplamento da fosforilação de quatro moléculas de ADP formando ATP. Para

cada molécula de glicose degradada, a fase de pagamento ocorre em duplicata, uma vez que

a molécula de glicose foi clivada em duas de G-3-P.

As duas moléculas de G-3-P são oxidadas em uma reação catalisada pela enzima

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, uma reação dependente de nicotinamida adenina

dinucleotideo oxidado (NAD

), para formar 1,3-bisfosfoglicerato. A reação a seguir

representa o primeiro ponto do fluxo glicolítico onde há formação de ATP. A molécula de

1,3-bisfosfoglicerato é substrato da enzima fosfoglicerato cinase. Essa enzima catalisa a

transferência de um fosfato do grupo carboxil do 1,3-bisfosfoglicerato para o ADP,

produzindo 3-fosfoglicerato e ATP. O 3-fosfoglicerato é convertido a 2-fosfoglicerato pela

enzima fosfogliceratomutase, agindo no deslocamento de um grupamento fosfato de uma

região para outra da mesma molécula.

Na próxima reação, forma-se um enol pela desidratação do 2-fosfoglicerato. A

enolase catalisa a formação do fosfoenolpiruvato. Essa é uma reação que aumenta o

potencial de transferência do grupamento fosfato. Em seguida, ocorre a transferência

irreversível de um fosfato do fosfoenolpiruvato para o ADP, catalisada pela enzima piruvato

cinase (PK). Nesta última reação da segunda fase da glicólise, forma-se piruvato, gerando

ATP.

Vale lembrar que a fase de pagamento acontece em duplicata para cada molécula de

glicose oxidada na via, logo se formam quatro moléculas de ATP na segunda fase da

glicólise, e o rendimento líquido final é de apenas duas moléculas de ATP por molécula de

glicose degradada, uma vez que duas moléculas de ATP foram gastas na primeira fase da

glicólise. O esquema abaixo resume a relação de substratos e produtos da glicólise:

Glicose + 2NAD

+ 2ADP + 2Pi → 2 piruvato + 2NADH + 2H

+ 2ATP + 2H

O fluxo de glicose através da via glicolítica deve ser regulado para que se mantenha

constante os níveis de ATP, assim como os intermediários necessários para processos

biossintéticos. Em vias metabólicas envolvendo tantas etapas como a glicólise, algumas das

reações enzimáticas estão essencialmente em equilíbrio, e a direção do fluxo da via através

dessas reações dependerão das concentrações de seus substratos, que na verdade irão variar

em função da atividade das enzimas regulatórias da via. As reações regulatórias são

altamente exergônicas e irreversíveis, sendo representadas pelas reações catalisadas pelas

enzimas HK, PFK e PK. As reações da via glicolítica estão apresentadas na figura 1.

O controle do metabolismo glicolítico é possível através da ação coordenada de

vários moduladores alostéricos sobre a atividade dessas enzimas, além de flutuações na

concentração de metabólitos chave, que refletem o balanço celular entre o consumo e a

produção de ATP, e a regeneração de NADH. Deve-se ainda considerar, sob um ponto de

vista mais amplo, que o fluxo metabólico da via é regulado pela ação de vários hormônios

como glucagon, insulina e adrenalina, através da regulação da expressão ou atividade das

enzimas envolvidas na via (Murray et al., 2003, Nelson e Cox, 2004).

Figura 1 – Via glicolítica. Esquema ilustrativo das reações do fluxo glicolítico,

indicando os substratos e produtos das reações. Destaca-se em vermelho a reação da

fosfofrutocinase, enzima chave da via, cuja atividade está correlacionada a velocidade de

todo o fluxo, e que vai ser a principal enzima investigada ao longo deste trabalho.

Os processos envolvidos na regulação da atividade das enzimas que foram alvo de

investigação neste trabalho serão discutidos abaixo.

1.3 Hexocinase (HK)

O primeiro passo do metabolismo de glicose é sua fosforilação para ser convertida em

G-6-P essa reação é catalisada pela enzima HK (ATP: D-glicose 6-fosfo-transferase, EC

2.7.1.2) (Grossbar e Schimke, 1966), como mostrado na reação da figura 2. São descritas

quatro isoenzimas da HK, que diferem quanto as propriedades catalíticas e regulatórias, bem

como a localização subcelular (Wilson, 2003). Estas foram separadas por cromatografia de

troca iônica ou eletroforese a partir de extratos de vários tecidos de mamíferos (González et

al., 1964; Katzen e Schimke, 1965), e são conhecidas como HK tipo I, II, III ou IV, sendo esta

última também conhecida como glicocinase (GK). Em mamíferos, a glicocinase tem 50 kDa

enquanto que as outras isoformas possuem 100 kDa cada uma (Wilson, 1995; Cardenas et al.,

1998).

Figura 2. Reação da enzima hexocinase. Fosforilação da glicose, a partir de ATP, no

sexto carbono para formar glicose-6-fosfato. Reação irreversível e regulatória do fluxo

glicolítico. Adaptado de Nelson e Cox, 2004.

A G-6-P produzida pode ser metabolizada por vias alternativas a glicólise, como ser

destinada a síntese de glicogênio ou a via das pentoses fosfato. A expressão das isoformas de

HK tecido específica é um fator determinante ao padrão do metabolismo de glicose tecidual.

Embora, as isoformas apresentem similaridade estrutural, elas diferem em aspectos

importantes. As hexocinases tipo I, II e III são inibidas pelo produto, G-6-P, entretanto apenas

para a tipo I, o Pi antagoniza essa inibição, enquanto que para as tipo II e tipo III, o Pi na

verdade causa ativação adicional a enzima. Assim, o aumento das concentrações de G-6-P

pode inibir a HK, resultando na diminuição da captação e oxidação de glicose (Wilson, 1995).

Os níveis intracelulares de G-6-P e Pi estão associados ao status energético celular, e propõe-

se que a resposta da HK-I a esses efetores direciona a glicose para a via catabólica da

glicólise, enquanto que o padrão de regulação das isoformas II e III favoreceria o destino

anabólico da glicose, como a síntese de glicogênio ou a síntese de lipídeos através da via das

pentoses fosfato (Wilson, 2003).

A HK-I está expressa de forma ubíqua, consistente com o fato de a glicólise ser uma

via bioenergética importante para a maioria dos tecidos, entretanto essa isoforma é expressa

em grande quantidade em tecidos não sensíveis a insulina, tais como cérebro, rins e

eritrócitos, tecidos que praticamente dependem apenas de glicose para manter suas funções

celulares Tecidos sensíveis a insulina, tais como músculo esquelético, coração e tecido

adiposo, apresentam predominantemente a HK-II (Wilson, 2003).

A HK, assim como outras enzimas glicolíticas, também está localizada em frações

específicas das células. As isoenzimas I e II são capazes de se associarem à mitocôndria,

levando-as a possuir maior atividade quando comparado a sua forma solúvel (Katzen et al.,

1970). Johnson (1960) e Rose e Warms (1967) demonstraram que a HK-I liga-se a membrana

externa da mitocôndria, interagindo com a proteína porina, também conhecida como canais

aniônicos voltagem dependente. Essa localização subcelular torna a HK-I privilegiada para

utilização do ATP produzido na mitocôndria que sai por esses canais (Felgner et al., 1979;

Lindén et al., 1982; Fiek et al., 1982). Embora a HK-II também apresente uma sequência N-

terminal hidrofóbica, responsável pela interação com a mitocôndria, quantidades substanciais

dessa isoforma são encontradas na fração solúvel (Sui e Wilson, 1997). A HK-III por sua vez,

não contém essa mesma sequência hidrofóbica, e estudos indicam que essa enzima encontra-

se preferencialmente solúvel no citosol ou em regiões na periferia nuclear (Preller e Wilson,

1992), contudo, a importância dessa localização ainda não está elucidada.

A GK ou HK-IV é encontrada em hepatócitos e células beta pancreáticas (Weinhouse,

1976; Meglasson e Matschinsky, 1983), apresenta um alto K

para a glicose, tornado-se ativa

apenas na presença de grandes concentrações de glicose, e sua atividade não é afetada por

variações na concentração de G-6-P (Postic et al., 2001). O comportamento cinético é

fisiologicamente determinante para a regulação da captação hepática de glicose em situações

pós absortivas, quando a glicemia encontra-se alta (Sharma et al., 1964).

O interesse em entender a importância do papel da GK, elucidou uma série de

questões. Mutações no gene dessa enzima leva a duas doenças relacionadas ao controle da

glicemia, hiperglicemia familiar em jejum (familial mild fasting hyperglycemia) e a

hipoglicemia hiperinsulinêmica persistente infantil (Froguel et al., 1992; Vionnet et al., 1992;

Velho et al., 1997). Em animais diabéticos a menor captação de glicose observada

correlaciona-se a inibição da síntese de GK, em resposta a queda dos níveis de insulina

circulantes, além da menor atividade da GK e das hexocinases e de vários outros tecidos

(Anderson e Zakim, 1970). Alterações no padrão de expressão gênica da glicocinase

decorrentes a variações de insulina e glicose são reportados em outros trabalhos (Sols et al,

1964, Sharma et al., 1964). Em tecido hepático, a expressão da glicocinase é estritamente

dependente da insulina, com isso os níveis de RNAm e da proteína são dramaticamente

reduzidos em fígado de ratos insulino deficientes, sendo restaurados após o tratamento com

insulina (Iynedjian, et al., 1988). Por outro lado, a super expressão da GK resultou em

estímulo da via glicolítica e da oxidação de glicose (Takeuchi et al., 1996), além de

restabelecer a utilização e estoque de glicose em hepatócitos de ratos diabéticos (Seoane et

al., 1999).

Outras isoformas da HK também apresentam alterações correlacionadas ao diabetes.

Walters e McLean (1968) demonstraram que o diabetes é capaz de reduzir a fração ligada e

aumentar a fração solúvel da atividade da hexocinase em glândula mamária de rato. A

indução do diabetes com aloxano, leva a redução da atividade da HK ligada a frações

específicas das células (Anderson e Zakim, 1970). O aumento fisiológico de cálcio

intracelular parece aumentar a fração ligada da HK em músculo, com concomitante ligação de

outras enzimas glicolíticas ao citoesqueleto muscular (Chen-Zion et al., 1992b, Livnat et al.,

1993a). Esses estudos evidenciam que o diabetes causa redistribuição celular da hexocinase, e

sugerem que esse padrão pode ser um mecanismo importante para o controle do metabolismo

de glicose.

1.4 Fosfofrutocinase (PFK)

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! Figura!3.!Reação!da!enzima!fosfofrutocinase."A enzima fosfofrutocinase catalisa

a reação, irreversível sob condições celulares, de transferência do grupo fosfato da posição γ

do ATP, para o primeiro carbono do substrato frutose-6-fosfato, para formar frutose-1,6-

bifosfato. Essa reação é um dos principais pontos regulatórios da via glicolítica. !H(E.(H*"H#"

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As propriedades da regulação alostérica da F-2,6-BP sobre a atividade da PFK foram

amplamente confirmadas por vários grupos, através de ensaios in vitro. Reinhart e Lardy

(1980) concluíram que a atividade isolada da PFK é insuficiente para atingir as necessidades

metabólicas celulares sob concentrações fisiológicas de F-6-P, em função do Km da PFK para

este substrato (6 mM), mesmo na presença de outros moduladores positivos. Van

Schaffitingen et al. (1981) e Uyeda et al. (1981a) indicaram a F-2,6-BP como o estimulador

que estava faltando para explicar o controle da PFK sob condições fisiológicas, desconhecido

até então, permitindo que a glicólise ocorra no fígado. De fato, hepatócitos de ratos em jejum

incubados com glicose apresentam aumento expressivo no conteúdo de F-2,6-BP, que é

rapidamente degradado após a exposição a glucagon"0Van Schaftingen et al., 1980b).

O ação alostérica promovida pela F-2,6-BP atua de forma sinérgica aos efeitos da

frutose-6-fosfato e do AMP, sugerindo que o substrato e os moduladores positivos cooperam

entre si, para manter a enzima na conformação ativa (Van Schaftingen et al, 1981). Juntos,

esses estudos apresentam importantes conclusões a respeito da ativação da PFK pela F-2,6-

BP; (a) contrapondo-se a inibição do ATP e citrato; (b) diminui o Km da PFK para o substrato

F-6-P, para atingir concentrações fisiológicas; (c) age sinergicamente ao AMP e o Pi,

diminuindo a inibição promovida pelo citrato e ATP; (d) apresenta alta afinidade pela enzima,

e sua concentração altera-se rapidamente em função do estímulo por glucagon ou glicose. Em

vários tecidos de mamíferos a F-2,6-BP encontra-se na faixa de concentração em (µM), além

do fígado, onde foi primeiramente descrita Van Schaftingen et al. (1980a, 1980b), o mesmo é

observado no músculo esquelético e cardíaco (Hue et al., 1982), e pâncreas (Malaisse et al.

1982), onde a F-2,6-BP tem papel crucial na regulação do metabolismo glicolítico.

O tecido muscular cardíaco, por exemplo, requer um suprimento de energia contínuo

para compensar suas necessidades metabólicas, e apresenta grande habilidade em adaptar-se a

disponibilidade de substrato, carga de trabalho e ação hormonal. A maior parte da energia

necessária é proveniente da oxidação de ácidos graxos, entretanto, a utilização de glicose

sobrepõe-se aos outros substratos energéticos no estado pós prandial, quando a glicemia e a

insulinemia estão elevadas (Randle et al., 1963), ou sob estímulo adrenérgico (Challoner et

al., 1966; Depré et al., 1993; Goodwin, 1998). Durante a hipóxia do miocárdio a glicólise

também se encontra estimulada (Williamson, 1966; Rovetto, 1973; Kobayashi, 1979). A

isoforma cardíaca da PFK-2, assim como a hepática, é substrato da PKA. Contudo, a

fosforilação da isoforma cardíaca pela PKA ativa a função bisfosfatásica e inativa a

capacidade cinásica, ao contrário do que acontece no fígado. A PFK-2 cardíaca é mais

sensível a inibição por citrato (Hue e Rider, 1987), e os níveis de citrato e F-2,6-BP

correlacionam-se de forma inversamente proporcional (Depré et al., 1998). O controle

positivo da PFK de músculo esquelético durante exercícios físicos intensos, é dependente do

aumento na concentração da F-2,6-BP, tornando possível a manutenção dos níveis de energia

necessários durante a atividade (Tornheim e Lowenstein, 1976).

Para o controle do metabolismo de carboidratos no fígado, a F-2,6-BP parece ter um

papel ainda mais importante, ao apresentar efeitos na regulação de enzimas glicolíticas e da

gliconeogênese e assim, regular de forma coordenada o fluxo de glicose no fígado (Pilkis et

al., 1988). A atividade da enzima PFK-2 é capaz de integrar sinais provenientes da

disponibilidade nutricional e alterações hormonais para determinar os níveis de F-2,6-BP,

com isso a produção ou degradação de glicose, e em última análise ser um importante

modulador no controle, da ação do fígado na manutenção da homeostase fisiológica de

glicose (Okar et al., 2001 e 2004). Mais recentemente, Smith et al. (2007) evidenciaram a

formação de um complexo entre a PFK-2 e a GK, levando ao aumento da produção de F-2,6-

BP e portanto a ativação da glicólise.

Em estados patológicos como o diabetes mellitus (DM), tem sido postulado que a

reduzida atividade da PFK, observada em alguns tecidos, se dá devido a uma redução no

metabólito F-2,6-BP (Chen-Zion et al., 1994). Wu et al. (2002) promoveram a super

expressão de da PFK-2, mediada por adenovírus, em um modelo de camundongo diabético

tipo II, e reportaram que o aumento na concentração de F-2,6-BP reverteu a resistência a

insulina observada nesses animais.

Em resumo, a frutose-2,6-bifosfato, através da atividade da PFK-2, é capaz de regular

o fluxo metabólico de glicose em vários tecidos, em resposta a variações na captação de

glicose, carga de trabalho, insulina, adrenalina e glucagon; ativando ou inibindo o fluxo

glicolítico. As diferenças na ativação da PFK-2 observada em diferentes tecidos contribui para

que cada órgão desempenhe sua função em resposta a estados metabólicos e fisiológicos

distintos, através do controle da atividade da enzima PFK. Adicionalmente, o padrão de

expressão das isoformas da PFK varia de acordo com o tecido, sendo outro fator importante

para o controle da glicólise tecido específico.

Em mamíferos, são descritas três isoformas de monômeros da PFK, com um peso

molecular variando em torno de 85 kDa, capazes de formar heteroligômeros, representadas

como PFK-M (muscular), PFK-L (hepática) e PFK-P (plaquetária). Essas isoformas são

codificadas pelos cromossomos 1, 21 e 10, respectivamente (Vora et al., 1982; Vora e

Francke, 1981; Vora et al., 1983), apresentam expressão tecidual específica, entretanto

dependendo do tecido pode haver a expressão de um, dois, ou dos três genes; e os produtos

destes genes podem se associar randomicamente formando heteroligômeros (Foe e Kemp,

1985; Sánchez-Martínez et al., 2000; Dunaway et al., (1988).

A primeira indicação da existência de diferentes isoformas da PFK humana veio com a

descoberta de uma doença relacionada a deficiência da isoforma muscular da PFK, a

síndrome de Tarui ou glicogenólise tipo VII, uma doença hereditária autossômica recessiva

(Tarui et al., 1965). A atividade da PFK nestes pacientes representava apenas 2% do valor

normal em músculo e 50% da atividade normal em eritrócitos. Estudos posteriores com estes

pacientes demonstraram que a deficiência é específica da isoforma PFK-M, o que ocasiona

comprometimento na secreção de insulina em resposta a glicose, e resistência periférica a

insulina, levando os autores a sugerirem que essa mutação levaria a predisposição ao DM não

insulino dependente (Ristow et al., 1997).

O músculo esquelético humano adulto expressa exclusivamente a isoforma PFK-M

como um homotetrâmero. O músculo cardíaco contem predominantemente a isoforma

muscular, em relação as outras. O fígado expressa principalmente a isoenzima PFK-L e em

menor escala as PFK-M e PFK-P (Dunaway e Kasten, 1987; Dunaway et al., 1988). A PFK-L

também é a principal isoforma encontrada em placenta, eritrócitos, testículos e rins

(Meierhofer et al., 1979; Kahn et al., 1979). Outros tecidos como o cérebro, pulmão e tireóide

contém as três isoformas em quantidade proporcional (Dunaway e Kasten ,1987; Dunaway, et

al., 1988; Kahn, et al., 1979).

Recentemente, foi demonstrado que camundongos pfk-m knockout apresentam alta

letalidade e expectativa de vida reduzida, ocasionado pelas alterações metabólicas. A redução

na atividade da PFK leva ao bloqueio da glicólise, resultando em aumento do estoque de

glicogênio e redução na disponibilidade de ATP. Finalmente, neste modelo, alterações na

bioenergética muscular e no metabolismo eritrocitário, levam a uma desordem sistêmica

complexa (García et al., 2009).

A PFK pode ainda estar sujeita a outros mecanismos de regulação, que incluem

alterações no padrão de fosforilação, variações no estado oligomérico da enzima, associação a

outras estruturas intracelulares, como interações a proteínas do citoesqueleto, e em última

análise a enzima pode ser submetida a ação de muitos hormônios. A investigação acerca da

ação de diversos hormônios sobre o controle do fluxo glicolítico tem sido foco de trabalho de

muitos grupos de pesquisa. A insulina é um hormônio capaz de exercer múltiplos efeitos em

diferentes órgãos, regulando a homeostase de glicose através do controle da atividade de

vários sistemas enzimáticos, e a expressão gênica e proteica. O músculo esquelético, fígado e

tecido adiposo são classicamente tecidos alvo para ação da insulina sobre o controle do

metabolismo de glicose, e manutenção da glicemia (Peppa. et al., 2010; Bruce e Byrne, 2009).

A ação da insulina altera o padrão de fosforilação de várias proteínas nos seus tecidos alvo,

desencadeando inicialmente a auto fosforilação do IR, capaz de promover fosforilação da

PFK em resíduos de tirosina de músculo esquelético (Sale et al., 1987) e eritrócitos, onde a

elevação no padrão de fosforilação de PFK ocorre em paralelo ao aumento no fluxo glicolítico

e redução da taxa de hemólise, efeitos que são revertidos sob estímulo de altas concentrações

de insulina (Zancan e Sola-Penna, 2005b).

Adicionalmente, outras proteínas cinases como a proteína cinase C (PKC) (Nettelblad

et al., 1986) a proteína cinase dependente de Ca

-calmodulina (CaMK) (Mahrenholz et al.,

1991), além do estímulo adrenérgico ativando a PKA (Alves e Sola-Penna, 2003) também são

capazes de promover modificações covalentes em resíduos de serina e treonina da PFK,

destacando que muitos sítios de fosforilação estão envolvidos na regulação desta enzima. De

fato, a PFK de músculo esquelético (Leite et al., 2007; Kemp et al., 1981), fígado (Furuya e

Uyeda, 1980; Pilkis et al., 1982; Da Silva et al., 2010), cérebro e eritrócitos (Mendicino et al.,

1978; Riquelme et al., 1978; Lagrange et al., 1980) é substrato da proteína cinase dependente

de AMPc.

Recentemente, nosso grupo reportou redução da fosforilação em resíduos de serina da

PFK em músculo esquelético, fígado e tecido adiposo de camundongos diabéticos induzidos

por streptozotocina, e que essa redução pode ser revertida aos níveis do controle, após

tratamento com metformina (Da Silva et al., 2010), o principal derivado de biguanina

(dimetilbiguanida), administrado para o controle glicêmico em indivíduos com DM tipo II

(Hundal e Inzucchi, 2003).

O grau de organização da estrutura quaternária da PFK é determinante para o controle

da sua atividade. Alguns trabalhos sugeriram o modelo de associação entre dímeros e

tetrâmeros da PFK como parte da regulação da enzima (Bock e Frieden, 1976a; Bock e

Frieden, 1976b; Frieden et al., 1976). O balanço entre as diferentes formas oligoméricas é

afetado consideravelmente por variações na concentração da enzima, pH e temperatura. Em

pH baixo (<6.5), a inativação da enzima pode ser correlacionada a diferentes pesos

moleculares das formas ativa e inativa. Essa inativação também é mais evidente em baixas

temperaturas e baixas concentrações da proteína. Esse modelo foi confirmado em outros

trabalhos (Hesterberg e Lee, 1981; Hesterberg e Lee, 1982), demonstrando através de

sedimentação que o peso molecular dos diferentes níveis de organização da PFK variam de 83

kDa a 330 kDa, da forma monomérica a espécies poliméricas, e confirmaram que, realmente,

o tetrâmero é a forma mais simples que apresenta atividade.

! A associação e dissociação da PFK tem sido tema de várias investigações (Aaronson e

Frieden, 1972; Luther et al., 1985; Cai et al., 1990; Drozdov-Tikhomirov et al. 1999; Raïs et

al ., 2000; Berchanski e Eisenstein, 2003; Faber-Barata e Sola-Penna, 2005), e é reportado

que dímeros da PFK apresentam baixa atividade catalítica quando comparados a tetrâmeros

(Davies e Stark, 1970; Colombo et al., 1975; Hesterberg et al., 1981; Reinhart, 1983;

Drozdov-Tikhomirov et al., 1999). Os dímeros da PFK podem dissociar-se em monômeros,

que rapidamente são desnaturados (Uyeda, 1979; Faber-Barata e Sola-Penna, 2005) ou

associam-se a outros dímeros para formar tetrâmeros. Estes podem ainda formar agregados

mais complexos, mantendo-se cataliticamente ativos (Davies e Stark, 1970), como ilustrado

na figura 5.

Figura 5 – Balanço entre diferentes formas oligoméricas da PFK. M1(i) e M2(i),

as formas monoméricas e diméricas, respectivamente, são consideradas inativas (i). M4(a) e

M16(a) são as formas ativas (a) da enzima, tetrâmero e hexadecâmero, respectivamente

(adaptado de Hesterberg e Lee, 1982)

Talvez, um dos mais interessantes mecanismos de regulação da PFK envolvendo a

transição entre dímeros e tetrâmeros seja a inibição da enzima por ATP e a reversão desse

efeito por F-2,6-BP. Foi demonstrado que a inibição da PFK por ATP ligado a seu sítio de

baixa afinidade desencadeia a dissociação dos tetrâmeros da enzima e, assim, inibindo-a. Por

outro lado, a reversão desse efeito pela F-2,6-BP se dá pelo fato desse metabólito estabilizar

os tetrâmeros da enzima, impedindo sua dissociação e, portanto, os efeitos inibitórios do ATP

(Zancan et al., 2007b, 2008).

A capacidade da PFK de associação a proteínas não se restringe a formação de

homoligômeros. A ligação da PFK a outras proteínas tem papel importante na regulação da

atividade catalítica da enzima (Parmeggiani et al., 1966; Cai et al., 1990). Curiosamente, a

forma dimérica da PFK, originalmente inativa, quando ligada a aldolase apresenta atividade

similar a observada para o tetrâmero, é essa associação é capaz de reverter a inibição

promovida pela ligação da proteína a microtúbulos (Orosz et al., 1987; Vértessy et al., 1997).

Da mesma forma, a associação entre dímeros de PFK e Ca

-calmodulina (Ca

-CaM), torna

os dímeros ativos e impede os efeitos inibitórios do ATP e do citrato (Marinho-Carvalho et

al., 2006; 2009).

Em eritrócito humano, a ativação da PFK por insulina envolve a fosforilação da PFK,

além do aumento no influxo de Ca

, com consequente ativação da Ca

-CaM. Ambos efeitos

promovem a dissociação da PFK da proteína banda 3. A redistribuição da localização celular

da PFK em eritrócito é determinante para o controle da atividade da enzima (Zancan e Sola-

Penna, 2005a e 2005b).

Antagonistas de Ca

-CaM, por sua vez, como o composto 48/80 e o clotrimazol, são

capazes de reduzir a glicólise e a produção celular de ATP, e são usados no controle de

doenças que dependem do fluxo glicolítico aumentado, como alguns casos de tumores (Orosz

et al., 1988; Orosz et al., 1997; Penso e Beitner, 2002a; Penso e Beitner, 2002b; Lilling e

Beitner, 1990; Livnat et al., 1993b; Beitner et al., 1991; Glass-Marmor et al., 1997; Beitner,

1998; Meira et al., 2005; Zancan et al., 2007a; Marcondes et al., 2010). A presença de

ativadores de calmodulina, por outro lado, aumentam o consumo de glicose, bem como a

produção celular de ATP (Beitner, 1998).

Esse conjunto de observações sugere que o metabolismo glicolítico é altamente

organizado. Muitas enzimas da via ligam-se reversivelmente a filamentos de células

musculares, com concomitante alterações nos parâmetros cinéticos (Clegg, 1992; Vértessy et

al., 1997; Meira et al., 2005; Beitner, 1993; Chen-Zion et al., 1992a; Pagliaro e Taylor, 1992;

Kuo et al., 1986; Liou e Anderson, 1980; Roberts e Somero, 1987). Liu et al., (2006) através

de um trabalho de revisão, discutiram o papel do citoesqueleto no controle do metabolismo de

glicose, destacando o alto grau de organização do sistema enzimático, ressaltando importantes

aspectos relacionados a dinâmica de organização do metabolismo de glicose, que incluem a

secreção de insulina, a distribuição do substrato do receptor de insulina (IRS), o deslocamento

do GLUT4, e a coordenação e distribuição do metabolismo intracelular de glicose, através do

controle da atividade de enzimas da glicólise e da síntese de glicogênio.

Dentre todas as enzimas glicolíticas que associam-se a proteínas do citoesqueleto, a

PFK é a que a apresenta mecanismos de regulação mais complexos. É a enzima com maior

afinidade a filamentos de actina e essa associação aumenta expressivamente a atividade

catalítica da enzima e com isso a eficiência de todo fluxo glicolítico (Roberts e Somero, 1987;

Clarke e Morton, 1982), provavelmente ao estabilizar a PFK na conformação tetramérica

(Clarke et al., 1984; Alves e Sola-Penna, 2003; Silva et al., 2004; Roberts e Somero, 1987;

Leite et al. 2007), e aumentar a afinidade da enzima ao seu substrato F-6-P, e torná-la menos

sensível a inibição por ATP (Liou e Anderson, 1980; Andrés et al., 1996). Por outro lado, a

associação da PFK a microtúbulos, especialmente a tubulina, leva ao controle negativo da

atividade enzimática (Liou e Anderson, 1980; Andrés et al., 1996; Alves e Sola Penna, 2003;

El-Bacha et al., 2003; Silva et al., 2004; Arnold e Pette, 1968; Walsh et al., 1989), ao deslocar

o equilíbrio entre os oligômeros de PFK para a formação de dímeros e monômeros (Lehotzky

et al., 1993; Vértessy et al., 1997).

Além disso, fatores como variações de pH, contração muscular (Clarke et al., 1980),

fosforilação (Roberts e Somero, 1987; Kuo et al., 1986; Luther e Lee, 1986), a concentração

de cálcio (Andrés et al., 1996; Zancan e Sola-Penna, 2005a), o estado nutricional (Saggerson

e Greenbaum, 1969), algumas infecções virais (El Bacha et al. 2004), o DM (Da Silva et al.,

2010) e o câncer (El-Bacha et al., 2003), modulam a ligação entre a PFK e proteínas do

citoesqueleto, e consequentemente controlam o fluxo glicolítico, em vários tipos celulares.

Em alguns tecidos tumorais esses mecanismos de controle do fluxo encontram-se

alterados, apresentando aumento no consumo de glicose para manter suas necessidades

metabólicas (Baggeto, 1992; Gatenby e Gillies, 2004). O tecido tumoral periférico é rico em

actina, e alguns estudos sugerem que essa característica esteja envolvida na capacidade de

invasão das células cancerígenas (Gabbiani e Kocher, 1983), além disso, células com

capacidade metastática elevada, como a linhagem de melanoma B16, parecem ter mais f-

actina, quando comparadas a linhagens menos invasivas (Holme et al., 1987).

As atividades das enzimas regulatórias da via glicolítica encontram-se elevadas no

câncer. Vários trabalhos relataram aumento nas atividades das enzimas hexocinase

(Bustamante e Pedersen, 1977; Pedersen, 1978; Arora e Pedersen, 1988; Greiner et al., 1994),

fosfofrutocinase (Vora et al., 1985; Van der Heijden et al., 1986; Baggeto, 1992; Sánchez-

Martinez e Aragón, 1997, Zancan et al., 2010) e piruvato cinase (Hammond e Balinsky, 1978;

Beemer et al., 1982; Balinsky et al., 1983; Guminska et al., 1997; Roigas et al., 2000). A

enzima fosfofrutocinase encontra-se preferencialmente associada a filamentos de actina do

citoesqueleto, apresentando maior atividade catalítica, em tecido de carcinoma mamário (El-

Bacha et al., 2003), e na linhagem de células de câncer de mama (MCF-7) (Meira et al.,

2005), quando comparado aos respectivos controles. Essa característica é revertida na

presença de clotrimazol, deslocando a enzima da fração ligada a f-actina para a fração solúvel,

com consequente inibição do fluxo glicolítico, o que leva a menor viabilidade celular (Meira

et al., 2005). Nakamura et al., 1986, sugerem que a atividade da PFK pode ser usada como

marcador bioquímico em alguns tipos de câncer.

Sob uma visão mais ampla, o controle hormonal do metabolismo de glicose envolve

esses mecanismos de controle enzimático. A adrenalina (Alves e Sola-Penna, 2003), e a

insulina (Silva et al., 2004; Zancan e Sola Penna, 2005a e 2005b; Da Silva et al., 2010; Real-

Hohn et al., 2010), controlam a glicólise ao promover a associação da PFK a proteínas do

citoesqueleto. Em tecido muscular esquelético, propõe-se que a insulina promova a

fosforilação da enzima, que por sua vez aumenta a afinidade e associa-se a actina filamentosa,

aumentando sua atividade catalítica (Silva et al., 2004; Da Silva et al., 2010). Os estudos a

respeito da oligomerização e da associação da PFK a elementos celulares ampliaram as

perspectivas relacionadas ao entendimento do controle da glicólise celular em condições

fisiológicas e patológicas. Atualmente, esses mecanismos vêm sendo amplamente

investigados como alvo, para o desenvolvimento de fármacos ou aplicação de agentes

farmacológicos já conhecidos, para o controle do metabolismo de glicose.

A figura 6 apresenta um resumo dos moduladores e mecanismos envolvidos na

distribuição celular da PFK e no controle da atividade enzimática.

Figura 6 – Alteração da distribuição celular da PFK. A enzima fosfofrutocinase

pode ter sua atividade regulada por interação a diversas proteínas do citoesqueleto celular. A

interação a filamentos de actina modula positivamente a atividade catalítica da PFK, e esse é

um importante mecanismo de regulação pela ação da insulina e da epinefrina.

Adicionalmente, em células neoplásicas, o fluxo glicolítico está correlacionado a um maior

grau de interação entre a PFK e a F-actina do citoesqueleto, essa interação quando revertida

pela ação do clotrimazol é capaz de diminuir o fluxo glicolítico e a viabilidade celular em

MCF-7.

1.5 Serotonina (5-Hidroxitriptamina – 5-HT)

A serotonina é sintetizada em diferentes tecidos incuíndo neurônios serotonérgicos no

sistema nervoso central. A glândula pineal produz serotonina como precursor da melatonina.

E células enterocromafins presentes no trato gastrintestinal, as quais sintetizam, estocam e

secretam serotonina biogênica (Barter e Pearse, 1953; Lee et al., 2004). Essa indolamina é

sintetizada a partir da hidroxilação do triptofano em uma reação catalisada pela enzima

triptofano 5-hidroxilase (passo limitante), formando 5-hidroxitriptofano, que é decarboxilado

através da reação catalisada pela enzima 5-hidroxitriptofano decarboxilase, para formar

finalmente serotonina. A serotonina é metabolizada em dois passos enzimáticos para formar o

ácido 5-hidróxi indolacético, o principal produto da degradação de serotonina, como ilustrado

na figura 7 (Lam e Heisler, 2007).

Cerca de 95% de toda serotonina encontrada no sangue está estocada nas plaquetas,

sendo estas os principais transportadores de serotonina no sangue, onde ela apresenta um

papel importante na coagulação sanguínea (Lesurtel et al., 2006).

A ação hormonal da serotonina está relacionada a diversos eventos fisiológicos e

patológicos. Como relatado por Tecott et al. (1995) ela participa em processos de crescimento

e diferenciação celular, podendo promover a regulação da concentração de glicose sanguínea

(Fischer et al., 1995).

A diversidade dos efeitos modulados pela serotonina se dá em função da sua interação

com múltiplos receptores, classificados entre as famílias 5-HT

a 5-HT

, com subsequente

divisão em vários subtipos (Peroutka, 1995). A tabela 1 apresenta um resumo das principais

características das diferentes isoformas dos receptores de serotonina.

Figura 7 – Síntese e metabolismo da serotonina. O aminoácido triptofano é o

precursor na síntese da serotonina, que se dá em dois passos enzimáticos. A enzima

triptofano hidroxilase promove a hidroxilação do triptofano para convertê-lo a 5-

hidroxitriptofano, sendo este o passo limitante da síntese. Em seguida, este sofre

decarboxilação através da ação da enzima 5-HTP decarboxilase, para então formar 5-

hidroxitriptamina ou serotonina. A serotonina pode ser metabolizada, através da deaminação

pela ação da enzima monoamina oxidase, e desidrogenada pela aldeído desidrogenase, para

formar o principal metabólito, o ácido 5-hidroxi indolacético (5-HIAA). Adaptado de Lam e

Heisler, 2007.

Tabela 1 – Resumo das características dos receptores de serotonina.

Receptor!

Agonistas!

Antagonistas!

Proteína !G!

Sinalização!

envolvida!

Funções!gerais!

5=HT

8"OH"DPAT,*buspirona,*

5"CT*

WAY*100635,*

metiotepina,*

spiperona*

i/o

Inibe*AC,*ativa*

canais*de*K

ativa*ERK*

SNC:*hiperpolarização*

neuronal*

5=HT

5"CT,*CP*93129,*

sumatriptano*

SDZ*21009,*

metiotepina,*

yohimbina*

i/o

Inibe*AC,*ativa*

ERK*

SNC:*inibição*da*

liberação*de*

neurotransmissores*

5=HT

Sumatriptano,*L*

694247,*

5"CT*

Metergolina,*

metiotepina,*GR*

127935*

i/o

Inibe*AC*

SNC:*inibição*da*

liberação*de*

neurotransmissores*

5=HT

5"HT*

Metiotepina*

i/o

Inibe*AC*

Não*caracterizado*

5=HT

5"HT*

Metiotepina*

i/o

Inibe*AC*

Não*caracterizado*

5=HT

α"metil"5"HT,*DOI*

Ketanserina,*

ritanserina,*

Spiperona,*

pirinperone*

Ativa*PLC,*PKC,*

ERK,*PLA

SNC:*excitação*

neuronal*

Periferia:*contração*

músculo*liso,*

agregação*plaquetária*

5=HT

α"metil"5"HT,*DOI*

SB*200646,*LY*

53857*

Similar*ao*5"

Motilidade*GI*

5=HT

α"metil"5"HT,*DOI*

Mesulergina,*

ritanserina,*

LY*53857*

Similar*ao*5"

SNC:*secreção*de*fluido*

cerebroespinhal*

5=HT

2"Methyl"5"HT,*

m"clorofenylbiguanida*

Ondansetrona,*

Tropisetrona*

N/A*

Neurônios*centrais*e*

periféricos:*

despolarização*

5=HT

Metoclopramida,*

renzaprida*

GR*113808,*SB*

204070,*

Tropisetrona*

Ativa*AC*e*PKA*

SNC:*excitação*

neuronal*

Periferia:*motilidade*

GI,*taquicardia*

5=HT

5"HT,*5"CT*

Metiotepina*

Desconhecido*

Não*caracterizado*

5=HT

5"HT*

Metiotepina*

Desconhecido*

Não*caracterizado*

5=HT

5"HT,*LSD*

SB*271046*

Ativa*AC*e*PKA*

Não*caracterizado*

5=HT

5"HT,*LSD,*5"CT*

Metiotepina*

Ativa*AC*e*PKA*

Não*caracterizado*

Abreviaturas: 5-CT, 5-carboxamidotriptamina; 5-HT, 5-hidroxitriptamina; 8-OH-DPAT, 8-hydroxi-2-di-n-

ropilamina-tetralina; 5-MeOT, 5-metoxitriptamina; AC, adenilato ciclase; SNC, sistema nervoso central; DOI

(±)-([1-(2,5-Dimetoxi-4-iodofenil)-aminopropano]-hidroclorideo); ERK, cinase regulada por sinal extracelular;

GI, gastrointestinal; LSD, ácido dietilamido lisérgico; PKA, proteína cinase A; PKC, proteina cinase C; PLA,

fosfolipase A; PLC, fosfolipase C. Adaptado de Ruddell et al., 2008.

Com exceção do receptor 5-HT

, que está associado a canais iônicos, todos os outros

receptores pertencem a uma grande família de receptores classicamente descritos como

ligados a proteína-G, podendo regular negativamente ou positivamente a adenilato ciclase

(AC) (Hoyer et al., 1994), além de ser capaz de ativar a fosfolipase C e promover hidrólise do

fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP

) (Conn et al., 1986). A figura 8 apresenta um resumo dos

efetores intracelulares envolvidos na sinalização por serotonina.

Os receptores de serotonina da família 5-HT

são moléculas protéicas monoméricas

com homologia semelhante (458 a 471 aminoácidos), subdividos em 5-HT

, 5-HT

e 5-

, e os dois primeiros são amplamente expressos em tecidos periféricos (Bradley et al.,

1986). Os primeiros efeitos descritos decorrentes da ativação destes receptores referem-se a

respostas contráteis em várias preparações que incluem músculo liso vascular, uterino,

músculo liso urinário, e tecido brônquico. A ativação destes receptores ainda resulta em

agregação plaquetária e aumento da permeabilidade capilar (Hoyer et al,1994). O subtipo 5-

é ainda expresso em eritrócitos (Cook et al., 1994), células de músculo liso da aorta

(Corson et al., 1992), mioblasto fetal (Guillet-Deniau et al., 1997), músculo esquelético de

ratos (Hajduch et al., 1999a), células MCF-7 de carcinoma mamário (Sonier et al., 2006),

células da placenta humana e de coriocarcinoma (Sonier et al., 2005). Muitas áreas do córtex

são ricas nos receptores da família 5-HT

, participando também no controle de ações no

sistema nervoso central. A ativação destes receptores leva a efeitos comportamentais em

roedores e despolarização neuronal em diversos motoneurônios. Em humanos as laminas III e

IV do neocórtex são os principais sítios de expressão dos receptores 5-HT

, que também são

expressos no claustrum, e em algumas regiões do sistema límbico, tendo funções relacionadas

as ações do córtex visual e do núcleo olfatório respectivamente (Pazos et al., 1985 e 1987;

Hoyer et al., 1986). Os receptores 5-HT

apresentam também função neuroendócrina, como

o estímulo a liberação de β-endorfina, corticosterona e hormônio luteinizante em ratos

(Koenig et al, 1987; Lenahan et al, 1987), prolactina em macacos resus (Heninger et al.,

1987).

Figura 8 – Receptores de serotonina (5-HTR) e seus efetores intracelulares. Os 5-

HTRs estão agrupados em 7 famílias, em função dos mecanismos de comunicação celular e

da homologia na sequência proteica. A AC ativada pelos 5-HT

, 5-HT

e 5-HT

sintetiza

AMPc a partir de ATP, levando a ativação da PKA. A PKA é capaz de fosforilar outras

proteínas cinases intermediárias (PK), que regulam canais iônicos, especialmente em

neurônios, resultando em despolarização. O 5HT

, ao contrário inibe a AC, resultando em

hiperpolarização. 5-HT

também inibe a AC, e ativa canais de Ca

dependentes de inositol

1,4,5-trifosfato (IP

). O 5-HT3 está acoplado a canais iônicos não seletivos, e sua ativação

resulta em rápida despolarização. Os 5-HT

são acoplados a proteína G, e ativam a fosfolipase

C (PLC), clivando um fosfolipídeo em diacilglicerol (DAG) e IP

. DAG ativa a PKC, capaz

de ativar outra proteínas cinases. O IP

age liberando Ca

de estoque internos, capazes de

ativar a CaMK, que junto a PKC e PKA podem ativar fatores de transcrição. Adaptado de

Lam e Heisler (2007).

Estes subtipos de receptores de serotonina estão classicamente descritos como

acoplado a proteína G modulando positivamente o metabolismo dos fosfoinositídeos, sendo

ainda capaz de modular a atividade da adenilato ciclase, aumentando a concentração

intracelular de AMPc (Hoyer et al., 1994). Contudo, evidências sugerem o acoplamento a

outros sistemas de sinalização intracelular, como o sistema Janus cinase/STAT, levando ao

aumento do padrão de fosforilação em tirosina de uma série de proteínas (Guillet-Deniau et

al., 1997).

A serotonina é capaz de promover ativação da PKC, dependente de PLC, diacilglicerol

e do aumento no influxo de Ca

(Ase et al., 2005), e de uma cinase regulada por sinal

extracelular (ERK1/2) mediada por PLC-PKC em células de músculo liso uterino (Shum et

al., 2002). Em células NIH-3T3 de fibroblasto, que expressa o subtipo 5-HT

do receptor de

serotonina, foi demonstrado que este receptor interage com calmodulina, e essa interação

promove diminuição da ligação entre o receptor e a proteína G (Turner e Raymond, 2005).

Alguns estudos reportaram aumento na insulinemia, em camundongos, em resposta a

serotonina de forma dependente da dose (Sugimoto et al., 1990; Yamada et al., 1989). A

presença de antagonistas de serotonina ainda leva a hipoglicemia (Wozniak e Linnoila, 1991).

A serotonina ainda leva a redução da liberação de glucagon (Adeghate et al., 1999). O

tratamento de ratos com triptofano, leva a hipoglicemia sem haver concomitante aumento na

liberação de insulina, sugerindo um mecanismo independente a ação da insulina (Smith e

Pogson, 1977). A ligação da serotonina ao seu receptor aumenta a expressão de genes

envolvidos na diferenciação miogênica como o do transportador de glicose GLUT3. A

serotonina causa um aumento rápido na captação de glicose em músculo esquelético,

atribuído principalmente ao aumento no conteúdo de GLUT1, GLUT3 e GLUT4 na

membrana plasmática, efeitos independentes das vias de sinalização insulinêmica, uma vez

que a serotonina não foi capaz de modular o IRS1, fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K), ou

atividade da Akt (Hajduch et al., 1999). A infusão de serotonina ou de um inibidor de

recaptação de serotonina, a fluvoxamina, no sistema porta hepático leva ao aumento na

captação de glicose no fígado de cachorros com hiperinsulinemia (Moore et al., 2004). De

fato, o fígado humano é rico em terminais nervosos responsivos a serotonina, e podem estar

envolvidos com o controle do metabolismo hepático de glicose (El-Salhy et al., 1993).

Em pacientes com DM tipo 2, a concentração plasmática de serotonina encontra-se

aumentada (Pietraszek et al., 1992; Assouline-Cohen et al., 1998), provavelmente pelo fato de

que as plaquetas de pacientes diabéticos apresentaram menor capacidade de ligar-se a

serotonina quando comparado a pacientes sadios, concomitantemente houve um aumento

espontâneo na liberação de serotonina por parte das plaquetas desses indivíduos (Pietraszek et

al., 1992). Além disso, ratos tratados com dexametasona, o qual induz o desenvolvimento de

diabetes similar ao DM tipo 2 humano, demonstraram alterações significativas no número,

bem como conteúdo granular de células produtoras de serotonina do intestino, o que pode

levar a alterações no índice de secreção celular de serotonina (Glisic et al., 2006). Entretanto

resultados opostos foram reportados em camundongos com DM tipo 1, menor índice de

secreção periférica de serotonina (Spangeous e El-Salhy, 1998). Vários estudos reportaram

efeitos de drogas serotonérgicas como fenfluramina, fluoxetina e sertralina, que melhoram a

tolerância a glicose e a sensibilidade a insulina em modelos de ratos obesos e diabéticos e em

humanos diabéticos (Arora et al., 1988; Gomez et al., 2001; Jorgensen, 1977; Picarel-

Blanchot, 1994; Russell et al., 1998; Breum et al., 1995; Maheux et al., 1997; Pestell et al.,

1989; Potter van Loon et al., 1992; Scheen et al., 1991).

A dieta rica em gordura e com baixo teor de carboidratos leva a alterações neuro

endócrinas, supostamente relacionadas ao início do quadro do DM. Essas alterações incluem

menor liberação de serotonina no hipocampo em curto período e supressão total após seis

meses de dieta (Banas et al., 2009), a ingestão de gordura também leva a redução nas

concentrações de serotonina e insulina no hipotálamo (Orosco e Gerozissis, 2001). As fases

inicias de desequilíbrio do balanço homeostático do metabolismo energético e da glicólise

tem papel importante nas alterações permanentes que levam ao quadro do DM (Banas et al.,

2009). Alterações nos níveis séricos de serotonina também foram reportadas em outros

quadros patológicos, podendo estar aumentada na hipertensão e arteriosclerose (Assouline-

Cohen et al., 1998).

Wolf et al. (2005) relataram a associação entre o DM e o desenvolvimento do câncer

de mama, indicando aumento de 10% no risco de desenvolvimento do câncer em indivíduos

diabéticos. Esses efeitos são de forma geral atribuídos a alterações no metabolismo da

insulina, ativação do IGF e aumento na concentração plasmática de hormônios esteróides.

A ação da serotonina apresenta efeitos mitogênicos em diversos tipos tumorais. Sonier

et al. (2004) relataram a presença do receptor 5-HT

em tecido de placenta humana e em

linhagens celulares de coriocarcinoma de placenta, JEG-3 e BeWo, apresentando efeito

mitogênico quando estimulado. A ativação desta mesma isoforma do receptor em linhagem

celular de carcinoma mamário MCF-7, levou ao aumento da taxa proliferativa e viabilidade

celular dessa linhagem (Sonier et al., 2006). Embora ainda não se possa estabelecer uma

correlação entre a ação da serotonina e a ativação de uma via metabólica bioenergética que

possa explicar esses fenômenos, já foi relatada a capacidade da serotonina em aumentar a

captação de glicose em músculo esquelético de ratos, através do aumento na expressão de

transportadores de glicose (Hajduch, 1999b), levantando a hipótese de que o aumento do

fluxo glicolítico pode, em parte, compor as adaptações promovidas pela serotonina,

resultando em aumento da viabilidade celular e taxa proliferativa destas células.

Eritrócitos humanos respondem a ação da serotonina, que é capaz de ativar a enzima

fosfofrutocinase, na fração ligada à membrana destas células. O estímulo serotonérgico ainda

promoveu aumento no conteúdo de lactato, refletindo ativação da via glicolítica (Assouline-

Cohen et al., 1998). Outras evidências sugerem ainda que a serotonina regula a atividade da

PFK de ventrículo de A. cygnea, possivelmente através de fosforilação promovida por

proteína cinase dependente de AMP cíclico intracelular (Michaelidis et al., 1993), sugerindo a

fosforilação da PFK como mecanismo regulatório nesse sistema.

Os mesmos fatores fenotípicos que levam ao desenvolvimento da obesidade, também

apresentam estreita relação com o desenvolvimento do DM tipo 2, que por sua vez pode

alterar a concentração e liberação da serotonina no plasma. Além disso, já foi relatado a

correlação entre o DM tipo 2 e o desenvolvimento do câncer de mama (Wolf et al., 2005), um

tecido altamente dependente do consumo de glicose (Gatenby e Gillies, 2004). O conjunto de

evidências reportado acima sugere que a serotonina seja capaz de ativar vias que promovam o

controle na homeostase de glicose. Entretanto, pouco se sabe sobre a ação da serotonina no

controle das enzimas chave do metabolismo glicolítico e portanto, a investigação das

características e mecanismos envolvidos nessa regulação se torna interessante e necessário

para o entendimento do conjunto de fatores intervenientes nessas condições patológicas.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivos gerais:

Avaliar a regulação do metabolismo glicolítico de tecido hepático e múscular

esquelético de camundongo pela serotonina.

2.2 Objetivos específicos:

Avaliar o efeito da serotonina sobre parâmetros relacionados ao controle da

atividade das enzimas hexocinase e fosfofrutocinase;

Identificar a isoforma do receptor de serotonina ativado;

Identificar componentes metabólicos envolvidos na sinalização da serotonina;

Investigar possíveis mecanismos regulatórios da atividade da enzima

fosfofrutocinase.

Avaliar os efeitos da administração de serotonina in vivo em camundongos

saudáveis e diabéticos.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material

ATP, F-6-P, F-2,6-BP, cloreto de serotonina, ketanserina, 5-metoxitriptamina (5-

MeOT), spiperona, genisteína, wortmanina, composto 48/80, KN-62 (1-[N,O- bis (5-

isoquinolinesulfonil)-N-metil-L-tirosil]-4-fenilpiperazina), proteína agarose A, anti-corpos

anti fosfotirosina (PY), fosfotreonina (PT), fosfoserina (PS), anti-PFK, anti-CaMK,

streptozotocina (STZ) foram obtidos da Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA). H-89, U-

73122, forbol-12-miristate-13-acetato (PMA), BIS I, PD98059 foram adquiridos da

Calbiochem.

Pi foi obtido do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, São Paulo. [γ-

P]ATP é preparado de acordo com Maia et al. (1983).

3.2 Homogeneizado de músculo esquelético e fígado de camundongo

A experimentação com animais foi conduzida de acordo com os procedimentos de

cuidados éticos com os animais. Camundongos Suíço machos (20 – 25g) 10 – 12 semanas,

foram mortos por deslocamento cervical, o fígado ou os músculos da coxa foram rapidamente

removidos. Em seguida foram limpos para remoção dos tecidos conectivo e adiposo. Os

tecidos foram pesados e homogeneizados por 30s com Polytron (Brinkmann Instruments,

Westbury, NY, USA) na presença de 6 volumes de uma solução contendo 50 mM Tris-HCl

(pH 7,5), 30 mM KF, 4 mM EDTA, 15 mM 2-mercaptoetanol, 1 mM de pirofosfato de sódio

e 250 mM Sacarose (Tampão de Homogeneização). Posteriormente o extrato resultante, foi

centrifugado durante 10 minutos a 1000g, para remoção de debris celulares e tecidos não

digeridos, e o sobrenadante (HT) foi usado nos ensaios para medir a atividade das enzimas

estudadas

A concentração de proteína nos extratos celulares foi medida de acordo com Bradford

(1976).

3.3 Radioensaio para a atividade da fosfofrutocinase e hexocinase

A atividade da enzima é avaliada de acordo com Sola-Penna et al. (2002), com

alterações introduzidas por Zancan e Sola-Penna (2005b). Os ensaios foram disparados com

50 µg/ml de proteína, quando a formação de produto é linear em função do tempo, e

realizados a 37°C em 1 ml de meio de reação contendo 50 mM tris-HCl (pH 7.4), 5 mM

MgCl

e 0,1 mM [γ-

P] ATP (4 µci/µmol). Para a atividade da HK, 5 mM de glicose foram

adicionados ao meio de reação, enquanto que 5 mM (NH

)

e 1 mM frutose-6-fosfato

foram adicionados para determinar a atividade da PFK. A reação é interrompida pela adição

de 1 ml de carvão ativo suspendido em uma solução de HCl 0,1 N e manitol 0,5 M (25 g de

carvão por litro de solução). A suspensão é, então, centrifugada a 1000g por 10 min e a

radioatividade presente em 0.4 ml do sobrenadante, contendo [1-

P]Frutose-1,6-bifosfato ou

[6-

P]glicose-6-fosfato formados, é mensurada em um contador de cintilação líquida.

Controles para cada tubo são submetidos às mesmas condições experimentais na ausência de

glicose ou frutose-6-fosfato, para HK e PFK respectivamente, para descontar a hidrólise do

ATP não específica a atividade enzimática.

Os tecidos foram pré-incubados com serotonina por tempos indicados nas figuras ou

ao longo da descrição dos resultados obtidos. A modulação da atividade das enzimas HK e

PFK após o estímulo com serotonina foi medido ao longo de 10 minutos de reação, quando a

formação do produto das reações enzimáticas era linear em função do tempo de reação.

3.4 Atividade da PFK medida através de ensaio espectrofotométrico

A atividade da PFK foi medida em um meio contendo 50 mM Tris–HCl (pH 7.4), 5

mM MgCl

, 5 mM (NH

)

, 1 mM frutose-6-fosfate, 1 mM ATP, 0.5 mM NADH, e o

acoplamento das reações das enzimas 2 mU/ml aldolase, 2 mU/ml triosefosfato isomerase, 2

mU/ml α-glicerofosfato desidrogenase e 50 µg/ml de proteina em um volume final de 200 µl.

A reação foi iniciada com adição da proteína, e a oxidação do NADH foi acompanhada em

espectrofotômetro através da medida na redução da absorbância a 340 nm em um leitor de

microplaca.

3.5 Fosforilação de proteína

Com intuito de investigar a capacidade da serotonina em induzir fosforilação em

extratos de músculo esquelético de camundongos, o homogeneizado foi incubado com 5-HT

25 pM a 37

C por um minuto em um meio de reação contendo 50 mM tris-HCl (pH 7.4), 5

mM MgCl

, 5 mM (NH

)

, e 1 mM [γ-

P] ATP (60 µci/µmol). A reação foi terminada

com 0.1 vol 100 % (p/v) ácido tricloroacético, e as amostras foram centrifugadas (10 min,

3,000g). O precipitado foi coletado, lavado com clorofórmio e novamente centrifugado (10

min, 3,000g). [

P]fosfato incorporado no conteúdo global de proteína foi contado em um

aparelho de cintilação líquida.

3.6 Fracionamento subcelular

O fracionamento subcelular foi realizado após modificações no protocolo proposto por

Alves e Sola-Penna (2003) baseado em protocolos de extração de enzimas ligadas a actina

(Kuo et al., 1986 e Luther e Lee, 1986), como descrito a seguir.

Após submeter o homogeneizado de músculo esquelético às condições testadas

(controle ou tratado com 5-HT), este foi centrifugado durante 10 minutos a 100g, o

sobrenadante foi coletado e novamente centrifugado durante 30 minutos a 100,000g (4

C).

Nos ensaios de atividade enzimática o precipitado foi ressuspendido em 50 µl no tampão de

homogeneização e a atividade enzimática foi medida através de ensaio radiométrico, e ensaios

de western blotting foram conduzidos para avaliar o conteúdo de PFK e actina nas frações

resultantes.

O extrato de tecido hepático foi pré incubado com 5-HT por 30 minutos, e a

preparação do fracionamento foi conduzida de acordo com (Alves e Sola-Penna, 2003; El-

Bacha et al., 2003). Em resumo, o homogeneizado foi centrifugado por 10 minutos a 1000g

C) para separar debris celulares e tecidos não digeridos. O sobrenadante resultante, o HT,

foi centrifugado por 30 minutos a 27,000g (4

C). O precipitado resultante (P1), é uma fração

rica em mitocôndria, lisossomos e componentes nucleares. O sobrenadante obtido (S1),

contendo a maioria das estruturas citoplasmáticas foi novamente centrifugado por 30 minutos

a 120.000 g (4

C). O sobrenadante resultante dessa última centrifugação de alta velocidade

retém a maioria das estruturas solúveis, e o precipitado formado (P2) contém a fração

microssomal e componentes do citoesqueleto. Todas as frações (HT, S1, P1, S2, P2), foram

ensaiadas radiometricamente para avaliar a atividade da PFK e a concentração de proteína.

3.7 Imunoprecipitação

Os extratos de fígado e músculo esquelético foram expostos à serotonina e a diferentes

agonistas e antagonistas de diferentes componentes da sinalização celular nas concentrações e

tempos indicados nas figuras. Os efeitos dos antagonistas e inibidores isoladamente sobre os

parâmetros medidos das enzimas avaliadas, bem como os efeitos dos veículos utilizados,

foram conduzidos adequadamente sempre que necessário (dados não apresentados). A reação

ocorreu em um meio contendo 50 mM tris-HCl (pH 7.4), 5 mM MgCl

, 5 mM (NH

)

e 1

mM ATP e foi iniciada com adição de proteína. A reação foi interrompida com adição de 0,1

ml SDS (10%), para atingir um volume final de 1 ml. As amostras foram centrifugadas por 5

minutos a 1250g (4

C), os sobrenadantes foram coletados e tratados por 4 horas (4

C), com

anticorpo anti-PFK (1:500)/proteína agarose A. Em seguida, as amostras foram centrifugadas

para coletar a proteína A, que foi lavada três vezes com solução salina, seguida da adição de

50 µl de SDS 10%, nova centrifugação e o sobrenadante resultante foi ressuspendido em 50

µl de tampão de amostra (Tris 62,5 mM p.H. 6,8, glicerol 50%, 2 mercaptoetanol 5%, SDS

6%, azul de bromofenol 0,015%). As amostras foram fervidas por 5 minutos, e submetidas a

eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) em 8% de poliacrilamida

de acordo com Laemmli (1970).

3.8 Western Blotting

As amostras obtidas a partir da imunoprecipitação, ou do fracionamento celular, após

serem submetidas a um SDS-PAGE, foram submetidas a western blotting. Em resumo, os géis

obtidos na eletroforese foram transferidos para membrana de nitrocelulose, bloqueados com

TBS-Tween (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 0,15 M NaCl; 0,1% Tween 20) contendo 2% de

albumina sérica bovina e em seguida incubado com anticorpos indicados nas figuras,

subsequentemente a membrana foi lavada cinco vezes com TBS-Tween, seguida de incubação

por 1 hora com anticorpo IgG anti-mouse ou IgG anti-rabbit conjugado a fosfatase alcalina

(1:750). Foram adicionados as membranas 5 ml de substrato para fosfatase alcalina

(Promega). As imagens foram escaneadas e analisadas usando o software ImageQuant

(Molecular Dynamics, USA).

3.9 Indução do diabetes em camundongos e tratamento

Os camundongos foram divididos em dois grupos: Controle e diabéticos (STZ). Os

camundongos foram mantidos em biotério com temperatura controlada, ciclo claro-escuro de

12 h, e livre acesso a comida e água. O diabetes foi induzido de acordo com Da Silva et al,

(2010). Em suma, os animais foram tratados com uma única injeção intraperitoneal (i.p.) de

streptozotocina (200 mg/kg) dissolvida em tampão 100 mM citrato (pH 4,5). Em até cinco

dias após o tratamento com STZ, os animais que apresentaram glicemia acima de 300 mg/dl

foram utilizados como modelos diabéticos nos experimentos. Outras alterações que

caracterizam o diabetes nestes animais incluindo poliúria, polidipsia e perda de peso também

foram observadas.

Serotonina, diluída em salina (5 mg/kg ou 50 mg/kg), ou somente salina foram

administradas intraperitonealmente (i.p.) nos camundongos. Alíquotas de sangue retiradas da

ponta da cauda dos camundongos foram usadas para medir a glicemia usando um glucometro

(Accu-Check

Active-Roche). A glicemia foi acompanhada a partir do tempo zero

periodicamente até o final de 3 horas.

3.10 Análise Estatística

Os dados foram analisados com o Sigma Plot/SigmaStat (Systat, CA, USA). Os

resultados são apresentados como médias (± media e desvio padrão). Os resultados foram

tratados com a análise paramétrica através do teste t-Student’s, para comparações entre as

frações controle e tratado. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas

com intervalo de confiança de 95% (p < 0,05).

Os parâmetros cinéticos enzimáticos foram calculados de acordo com Silva et al.,

2003, através de regressão não linear usando Sigma Plot/SigmaStat integrated software

packages (Systat, CA, USA). Parâmetros cinéticos para ativação da atividade da PFK por 5-

HT foi determinada com a equação:

(1)

onde V é a atividade calculada da PFK a uma dada concentração de 5-HT ([5-HT]), V

é a

atividade da PFK na ausência de 5-HT, Va é a máxima ativação observada, K

1/2

é a constante

de ativação para 5-HT e n é o índice de cooperatividade para ativação.

Parâmetros cinéticos para a ativação do substrato (frutose-6-fosfato) foram calculados

usando a seguinte equação:

(2)

Onde V é a atividade calculada para a PFK a uma dada concentração de frutose-6-fosfato

([F6P]) V

max

é a velocidade máxima obtida a concentração saturante de frutose-6-fosfato, Km

é a constante de afinidade para o substrato e n o índice de cooperatividade.

4. RESULTADOS

Os resultados serão apresentados em duas seções gerais, inicialmente serão descritos

os resultados obtidos nos ensaios com tecido muscular esquelético, em seguida os resultados

observados em extrato de tecido hepático.

4.1 Efeitos da 5-HT no controle de enzimas glicolíticas de músculo esquelético

4.1.1 Efeitos da 5-HT na atividade da HK e PFK de músculo esquelético de

camundongos

A atividade da HK de músculo esquelético de camundongos foi ensaiada na ausência e

na presença de concentrações crescentes de serotonina. O estímulo hormonal foi capaz de

aumentar a atividade da enzima de forma dependente da dose, com incremento significativo a

atividade enzimática (p<0,05, Student’s t-test) a partir da exposição dos extratos musculares a

5-HT 5 pM, e esta ativação manteve-se significativa até a concentração de 50 pM de 5-HT,

quando comparado ao controle, na ausência de estímulo hormonal, chegando a aumentar entre

4 e 5 vezes a atividade da HK, dependendo da dose de 5-HT (figura 9).

Em seguida voltamos nosso interesse em investigar os efeitos da serotonina no

controle da atividade da PFK, bem como possíveis mecanismos envolvidos no controle da

atividade desta enzima.

Figura 9 – Efeitos da 5-HT sobre a atividade da HK. A atividade da HK foi medida

como descrito em Material e Métodos. O ensaio foi iniciado com adição do homogeneizado

de músculo esquelético de camundongo para atingir a concentração final de proteína de 50

µg/ml. A formação do produto [6-

P]glicose-6-fosfato foi medida em um contador de

cintilação líquida. Dados representam valores médios ± erro padrão de, de seis experimentos

independentes (n=6), e estão apresentados em valores relativos ao controle. * Indica diferença

estatística quando comparado ao controle (p<0,05 – Student’s t-test).

Inicialmente, testamos a ação da serotonina na atividade fosfofrutocinásica de músculo

esquelético de camundongos, ao expormos extratos celulares a diferentes concentrações de

serotonina e observamos aumento significativo na atividade desta enzima de maneira

dependente da dose, até 5-HT 25 pM (figura 10). A atividade da PFK aumenta de 31,2 ± 8,7

mU/mg de proteína na ausência de serotonina para 79,4 ± 4,9 mU/µg de proteína

na presença

de 5-HT 25 pM (p<0,05, Student’s t-test). Essa ativação é mantida com altas concentrações de

serotonina, até 5-HT 1 µM (dado não apresentado), e apresenta um K

0,5

de ativação para a

atividade da PFK de 10,8 ± 1,7 pM com índice de cooperatividade de 2,0 ± 0,2, medido

através de regressão não linear como descrito em material e métodos. A concentração de 5-

HT 25 pM foi utilizada nos demais experimentos, uma vez que essa concentração já foi capaz

de apresentar o máximo efeito observado.

Figura 10 – Ativação da enzima PFK por serotonina. A atividade da PFK foi

medida como descrito em Material e Métodos. O ensaio foi iniciado com adição do

homogeneizado de músculo esquelético de camundongo para atingir a concentração final de

proteína de 50 µg/ml. A reação foi interrompida após 1 min (37

C), quando a formação do

produto era linear (cinética de primeira ordem). O produto da reação enzimática, frutose-1,6-

bifosfato, está apresentado na abscissa. Dados representam valores médios de quatro

experimentos independentes (n=4). A linha sólida foi obtida ao fitar uma regressão não linear

expressa na Eq.(1) aos valores plotados. A formação do produto quando estimulada com 5-HT

25 pM foi estatisticamente significativa quando comparado ao controle, apresentado aumento

da atividade da enzima (p<0,05 – Student’s t-test). Adaptado de Coelho et al. 2007.

Com o objetivo de entender os mecanismos envolvidos na ativação da PFK, nós

inicialmente avaliamos propriedades cinéticas da enzima decorrentes ao estímulo hormonal.

Essas análises mostram que a serotonina aumenta a velocidade máxima (V

max

) da enzima, de

161,7 ± 7,6 mU/µg no controle para 232,7 ± 38,0 mU/µg no tratado com 25 pM (Tabela 2,

p<0,05 Student’s t-test), além de aumentar a afinidade da PFK por F-6-P. Como podemos

observar na Tabela 2, o K

0,5

da PFK para esse substrato passou de 0,24 ± 0,07 mM nos

experimentos controle para 0,09 ± 0,02 mM após o estímulo com 5-HT 25 pM, diferença

estatisticamente significativa (p<0,05 Student’s t-test). Contudo, o índice de cooperatividade

(n) não foi alterado em presença de 5-HT 25 pM.

Esses efeitos, de alteração dos parâmetros cinéticos, são similares a alterações

anteriormente reportadas de ativação da PFK quando fosforilada e associada a proteínas do

citoesqueleto (Alves e Sola-Penna, 2003; Silva et al., 2003), direcionando nossa abordagem

experimental ao intuito de esclarecer se esses mesmos mecanismos estão envolvidos na ação

da serotonina sobre o controle da atividade da PFK de músculo esquelético.

Tabela 2 – Parâmetros cinéticos da enzima fosfofrutocinase modulados por serotonina.

Nota: Os parâmetros foram calculados ao fitar a equação (2) descrita em material e métodos aos dados

experimentais obtidos ao medir a atividade da PFK variando as concentrações de F-6-P (0 – 3 mM). Os valores

acima são média ± erro padrão dos parâmetros calculados para quatro experimentos independentes. * Indica que

o valor é estatisticamente diferente daquele obtido para o controle na ausência do hormônio (p<0,05, Student’s t-

test).

4.1.2 Efeitos da 5-HT na sublocalização intracelular da PFK

Para avaliar se a presença de 5-HT 25 pM altera a distribuição celular da PFK em

extrato de músculo esquelético de camundongos, os tecidos foram fracionados após o

estímulo por 1 minuto (37

C) com serotonina. A atividade e o conteúdo da PFK na fração rica

em actina foi medido como descrito em material em métodos.

Um Western Blotting representativo está apresentado na figura 11a, onde pode ser

observado aumento no conteúdo de PFK na fração enriquecida com actina após incubação

Condição

máx

(mU/µg)

0,5

(mM)

Controle

161,7 ± 7,6

0,24 ± 0,07

2,6 ± 0,8

25pM 5-HT

232,7 ± 38,0

0,09 ± 0,02

2,9 ± 0,6

com 5-HT 25 pM. A quantificação de três experimentos independentes demonstraram

aumento de 115 ± 18 % na intensidade da banda da PFK quando comparado ao controle, na

ausência de serotonina (figura 11b, barras cinza,

p<0,05 Student’s t-test), nessas frações ricas

em actina. Nas barras pretas da figura 11b, observa-se que o estímulo com 5-HT aumentou em

116 ± 14% a atividade enzimática da PFK na fração enriquecida com actina, quando

comparada ao controle (

p<0,01 Student’s t-test), indicando uma possível associação entre a

PFK e a actina de músculo esquelético, quando estimulada com serotonina.

Figura 11 – Efeitos da 5-HT na redistribuição celular da PFK. Homogeneizados

de músculo esquelético de camundongo foram incubados na ausência ou presença de 5-HT 25

pM, por 1 minuto (37

C), submetidos a ultracentrifugação (30 min, 100,000 g), os

precipitados resultantes foram analisados para atividade e o conteúdo de PFK, como descrito

em material e métodos. (a) Western Blotting representativo de amostras do precipitado

submetidas a SDS-PAGE e marcados com anticorpos contra PFK (anti-PFK – 1:500) ou

actina (anti-actina – 1:500). (b) Barras pretas: atividade da PFK medida por ensaio

radiométrico como descrito em material e métodos. Barras cinza: quantidade relativa da PFK

(comparada ao controle), medida através de Western Blotting, analisado e quantificado como

descrito em material e métodos. * Indica diferença estatística comparado ao controle (p<0,05,

Student’s t-test). Adaptado de Coelho et al. 2007.

4.1.3 Efeitos da 5-HT na fosforilação da PFK e sua implicação para atividade

enzimática

Na tentativa de entender os possíveis mecanismos de ação da serotonina no controle da

atividade da PFK, medimos inicialmente a capacidade do hormônio em alterar o padrão de

fosforilação de proteínas nos homogeneizados de músculo esquelético de camundongos. A

Figura 12b (barras pretas) apresenta a incorporação de fosfato radioativo a partir de [γ-

]ATP

no conteúdo global de proteínas nos extratos musculares, e observa-se que o estímulo das

preparações com 25 pM de serotonina, promoveu um aumento de 72,9 ± 20,3 % na

quantidade de fosfato incorporada em proteínas. Entretanto esse resultado não permite

estabelecer uma relação direta entre a incorporação de fosfato e a possibilidade de

fosforilação da enzima PFK. Dessa forma, investigamos a capacidade da serotonina em

promover a fosforilação em resíduos de tirosina da PFK, uma vez que a serotonina é capaz de

modular a contração de músculo liso através da ação de proteínas com atividade tirosina

cinásica (McKune e Watts, 2001). Extratos de músculo foram novamente incubados por 1 min

a 37

C na presença ou na ausência de 5-HT 25 pM. Após a incubação, amostras forma

coletadas e conduziu-se um Western Blotting com anticorpo monoclonal de camundongo anti-

fosfotirosina (anti-PY), como descrito em material e métodos.

No painel 12a está apresentado um Western Blotting representativo obtido a partir do

extrato total de músculo esquelético de camundongo estimulado ou não com serotonina.

Comparando quantitativamente as bandas observadas na figura 12a, observa-se que 5-HT 25

pM promoveu um aumento significativo na incorporação de fosfato em resíduos de tirosina

quando comparado ao controle, figura 12b (barras cinza) (∗ p<0,05 Student’s t-test), sem

alterar o conteúdo total de PFK nas amostras. A quantificações de três experimentos

independentes mostraram que a fosforilação em tirosina da PFK aumentou cerca de 108 ±

24%. O aumento da incorporação de fosfato em resíduos de tirosina foi proporcional àquele

observado para a incorporação de [

P]fosfato no conteúdo total de proteínas do

homogeneizado, figura 12b (barras pretas).

Figura 12 – Incorporação de fosfato ao conteúdo total de proteína do

homogeneizado de músculo esquelético. Frações do homogeneizado de músculo esquelético

de camundongos foram incubadas com serotonina por 1 min a 37

C, em seguida as amostras

foram centrifugadas, e o precipitado foi ensaiado para medir a fosforilação de proteínas totais

ou a fosforilação em tirosina. (a) Western Blotting representativo: controle (banda 1) e 5-HT

25 pM (banda 2) submetidos a SDS-PAGE e marcados com anticorpos monoclonais contra

fosfotirosina (anti-PY – 1:1000) ou contra PFK (anti-PFK – 1:500). (b) Quantidade relativa

(comparado ao controle) da incorporação de

P no conteúdo total de proteínas (barras pretas),

e fosforilação em tirosina da PFK (barras cinzas) na ausência e presença de 5-HT 25 pM.

Dados representam média ± erro padrão de três experimentos diferentes (n = 3). * Indica

diferença estatística comparado aos respectivos controles (p<0,05 Student’s t-test). Adaptado

de Coelho et al. 2007.

Essas evidências sugerem fortemente que a serotonina promove a fosforilação da PFK

em resíduos de tirosina. Contudo, os ensaios foram conduzidos com o extrato total de

proteína, e não se pode descartar que as bandas observadas no Western Blotting sejam

provenientes da marcação de outra proteína com peso molecular semelhante ao da PFK,

como algumas isoformas da PKC (Keranen et al., 1995; Ron e Kazanietz, 1999).

Para confirmar se a 5-HT aumenta o padrão de fosforilação da PFK, foram

conduzidos ensaios de imunoprecipitação da PFK na presença de inibidores de proteínas

cinases pelas quais a serotonina poderiam estar mediando esses efeitos. Extratos de músculo

esquelético foram estimulados com serotonina, e os efeitos da serotonina foram desafiados

com a adição de genisteína 26 µM, inibidor de tirosina cinases, e wortmanina 0,1 µM,

inibidor da PI3K, uma lipídeo cinase capaz de ativar a Akt, uma serina/treonina cinase, em

uma via de sinalização mobilizada por insulina (Pandey et al., 2002). Após incubação, as

amostras foram imunoprecipitadas com anti-PFK, e submetidas a um gel SDS-PAGE,

transferida e marcada nas membranas com anticorpos anti-PY e anti-PS. A figura 13

apresenta esses dados. No painel (a) observa-se resultados de Western Blotting

representativos, e o painel (b) representa a quantificação de três experimentos independentes.

Esses resultados revelam que a fosforilação da PFK em resíduos de tirosina induzida por

serotonina é prevenida pela presença da genisteína, mas não pela presença da wortmanina,

sugerindo que o efeito da serotonina envolve atividade tirosina cinásica e ocorre através de

uma via que não envolve ativação de PI3K (figura 13b, barras pretas). Em contrapartida, a

serotonina não foi capaz de induzir a fosforilação em serina da PFK, e esse efeito não foi

alterado pela presença de genisteína, mas foi reduzido quando as amostras foram incubadas

com wortmanina (figura 13b, barras cinzas). Esses dados evidenciam que a serotonina leva a

fosforilação da PFK e tirosina, mas não em serina.

Figura 13 – Imunoprecipitação e análise do padrão de fosforilação da PFK. (a)

Western Blotting representativo, controle (banda 1), 5-HT 25 pM (banda 2), 5-HT 25 pM +

genisteína 26 µM (banda 3) e 5-HT 25 pM + wortmanina 0,1 µM (banda 4). Bandas

correspondentes a 85 kDa (b) Quantificação de três experimentos independentes (n=3), barras

pretas (anti-PY – 1:1000) e barras cinzas (anti-PS – 1:1000), corrigido pelo total de proteína.

PY – Fosfotirosina e PS - fosfoserina Adaptado de Coelho et al. 2007.

Em seguida, fomos investigar a implicação da fosforilação da PFK para a atividade

catalítica da proteína. A atividade da PFK foi medida em espectofotômetro, acompanhada

através da oxidação do NADH como descrito em material e métodos, quando estimuladas

com serotonina, na ausência e na presença de genisteína e wortmanina (figura 14).

Figura 14 – Ativação da PFK mediada por serotonina é prevenida por genisteína.

As mesmas condição testadas para avaliar o padrão de fosforilação foram conduzidas e a

atividade da PFK foi medida através do ensaio acoplado como descrito em material e

métodos. A atividade da PFK está expressa em relação a atividade do controle, na presença ou

na ausência dos aditivos. * Caracteriza diferença significativa quando comparado ao controle

na ausência de estímulos (p<0,05 Student’s t-test). Adaptado de Coelho et al. 2007.

A genisteína reverte a ativação da enzima, e a wortmanina por sua vez, é incapaz de

alterar a ativação promovida pela serotonina, correlacionando-se diretamente aos dados

anteriores, sugerindo que a fosforilação é necessária para a regulação da atividade da enzima

promovida por serotonina.

4.1.4 Os efeitos da 5-HT são mediados através da isoforma 5-HT

do receptor.

Tem sido demonstrado que o tecido muscular esquelético expressa a isoforma 5-HT

do receptor de serotonina, que quando estimulado promove o aumento na captação de glicose

(Guillet-Deniau et al., 1997; Hajduch et al., 1999a; 1999b). Para avaliarmos qual isoforma do

receptor de serotonina estaria envolvida nos fenômenos descritos, os extratos musculares

foram tratados com serotonina na presença de antagonistas e agonistas da isoforma 5-HT

receptor de serotonina. A incorporação de fosfato em tirosina da PFK mediada por 5-HT é

abolida por 1 µM de ketanserina, um inibidor específico do receptor 5HT

(figura 15a, inset).

Da mesma forma, a modulação positiva da atividade da PFK induzida por serotonina é

contraposta com a adição de ketanserina, de forma dependente da dose. A figura 15a mostra

que 0,01 µM do inibidor reverte parcialmente o efeito, e 0,1 µM é capaz de reverter

totalmente o efeito estimulatório da 5-HT, já a concentração de 1 µM reduz a atividade da

PFK abaixo dos níveis do controle. A dependência da receptor 5-HT

é confirmada no

resultado visto na figura 15b, uma vez que os efeitos da serotonina sobre o controle da PFK

são mimetizados pela presença de 5-metoxitriptamina (5-MeOT), um agonista do receptor 5-

, (figura 15b, barras pretas). Além disso, a estimulação promovida por 5-HT ou 5-MeOT

é bloqueada com adição spiperona 1 µM, outro antagonista de 5-HT

. O efeito antagônico do

spiperona é atenuado com o aumento da concentração de 5-MeOT. A presença de spiperona 1

µM previne parcialmente a ativação da PFK promovida por 5-MeOT 1 µM, e é incapaz de

reverter os efeitos positivos sobre a atividade da enzima observados para a ação de 5-MeOT

10 µM (figura 15b, barras cinza).

Esses ensaios indicam que os efeitos da serotonina no controle da PFK em tecido

muscular esquelético são mediados através da isoforma do 5-HT

do receptor de serotonina.

Figura 15 – Envolvimento do receptor 5-HT

nos efeitos da serotonina sobre a

ativação da PFK. Painel (a, inset) Western Blotting representativo da PFK imunoprecipitada

e marcada com anticorpo (anti-PY – 1:1000), controle (banda 1), 5-HT 25 pM (banda 2) e 5-

HT 25 pM + ketanserina 1 µM, bandas correspondentes a 85 kDa. (a) A atividade da PFK foi

medida através do método acoplado acompanhada em espectrofotômetro, na presença de 5-

HT 25 pM e de concentrações indicadas de ketanserina. (b) Atividade da PFK foi ensaiada na

presença ou ausência de 5-HT 25 pM e nas concentrações indicadas de 5-MeOT (barras

pretas). Nas barras cinza os efeitos dos agonistas de 5-HT foram desafiados com adição de 1

µM spiperona (barras cinza). * Indica significância estatística (p<0,05 Student’s t-test) quando

comparado aos respectivos controles. Os dados dos painéis (a) e (b) estão expressos como

média ± erro padrão percentual aos controles. Adaptado de Coelho et al. 2007.

4.1.5 Proteínas envolvidas na sinalização da serotonina para ativar a PFK

O receptor 5-HT

está acoplado a proteína G e pode ativar mais de uma via de

sinalização intracelular, incluindo ativação da AC, aumentando os níveis de AMPc,

resultando na ativação da PKA, capaz de mediar muitos processos intracelulares (Hoyer et al.,

1994). Para testarmos o possível envolvimento da PKA na sinalização induzida pela

serotonina, no controle da atividade da PFK, extratos de músculo esquelético de

camundongos foram pré incubados por 30 minutos na presença ou ausência de concentrações

crescentes de H-89, inibidor de PKA e estimulados com serotonina. Após a incubação as

amostras foram ensaiadas para imunoprecipitar a PFK e avaliar o padrão de fosforilação da

enzima. Através do ensaio radiométrico a atividade da PFK foi mensurada. Os resultados

sugerem que a PKA não é recrutada para a ativação da PFK induzida por serotonina, uma vez

que o H-89 não impediu o aumento na incorporação de fosfato em resíduos de tirosina da

PFK (figura 16a), da mesma forma que não foi capaz de abolir o aumento da atividade da

enzima quando submetida ao estímulo hormonal (figura 16b).

Figura 16 – Ativação da PFK é independente do recrutamento da PKA. Painel (a),

Western Blotting representativo de homogeneizados de músculo esquelético de camundongo

estimulados com 5-HT na presença ou ausência de H-89, a PFK foi imunoprecipitada,

submetida a um gel SDS-PAGE e marcada com anticorpo (anti-PY – 1:1000), nas bandas

correspondentes a 85 kDa, nas seguintes condições: controle (banda 1), 5-HT 25 pM (banda

2), H-89 100 nM (banda 3), 5-HT 25 pM + H-89 100 nM (banda 4). Painel (b), atividade da

PFK foi medida radiometricamente como descrito em material e métodos, após estímulo com

serotonina na ausência ou presença de concentrações crescentes de H-89, como indicado na

figura. Os dados do painel estão expressos como média ± erro padrão em relação ao

controle.* Indica diferença estatística (p<0,05 Student’s t-test) comparado a ausência de

estímulo.

O receptor 5-HT

quanto ativado pode levar também a ativação da PLC, que

promove a hidrólise do PIP

para desencadear seus sinais (Conn et al., 1986; Lam e Heisler,

2007). A participação desta proteína na sinalização mediada por serotonina foi investigada

através de pré-incubação (30 min) dos extratos musculares com U-73122, inibidor da PLC. A

mesma abordagem experimental descrita anteriormente foi conduzida para avaliar o padrão de

fosforilação e de controle da atividade da PFK. Nestes ensaios observamos que a inibição da

PLC é capaz de impedir tanto a ativação da PFK promovida pela serotonina, quanto a

fosforilação em resíduos de tirosina da PFK, figura 17.

Figura 17 – Ativação da PFK por 5-HT é dependente da fosfolipase C. (a) Western

Blottings representativos da PFK imunoprecipitada após pré-incubação com as seguintes

condições: sem estímulo (banda 1), 5-HT 25 pM (banda 2), U-73122 10 µM (banda 3) e 5-HT

25 pM + U-73122 10 µM (banda 4). O primeiro Western Blotting foi marcado para anti-PY

(1:1000) e o segundo contra anti-PFK (1:1000), bandas correspondentes a 85 kDa. (b)

Quantificação de três imunoprecipitações independentes, expressos como a razão entre a

incorporação de fosfato em tirosina e o total de PFK. (c) Atividade da PFK medida pelo

método radiométrico, resultados apresentados como percentual do controle, média ± erro

padrão (n=6). * (p<0,05 Student’s t-test) contra as outras condições.

Esses experimentos sugerem que o controle da atividade da PFK desencadeado pelo

estímulo serotonérgico envolve o recrutamento de uma via dependente de PLC. A ativação

desta proteína resulta em hidrólise de PIP

, para formar DAG e IP

, capazes de ativar outros

mecanismos de comunicação celular. Como a produção de DAG pode ativar a PKC, nós

investigamos se os efeitos da serotonina sobre o controle da atividade da PFK eram mediados

por essa proteína. Inicialmente, os extratos musculares foram pré incubados por 30 minutos

com concentrações crescentes de PMA, um éster de forbol capaz de mimetizar a ativação da

PKC por DAG. A figura 18 ilustra os resultados dos experimentos onde a atividade da PFK,

de homogeneizado de músculo esquelético de camundongo, foi medida através do método

radiométrico após o tratamento com as condições descritas na figura.

Figura 18 – PMA mimetiza a ativação da PFK induzida por 5-HT. Extratos de

músculo foram pré incubados com 5-HT 25 pM ou concentrações crescentes de PMA, como

indicado na figura, e atividade enzimática foi medida radiometricamente. Os dados

representam média ± erro padrão, apresentados como valores relativos ao controle (n=8). *

(p<0,01 Student’s t-test) contra o controle.

A adição de PMA ao meio de pré-incubação promove controle positivo dependente da

dose sob a atividade da enzima PFK, semelhante àquela observado pelo estímulo hormonal.

Em condições biológicas, o aumento nos níveis de DAG é capaz de ativar a PKC, dessa forma

extratos de músculo foram tratados por 30 minutos com BIS I, inibidor da PKC, e após o

estímulo com serotonina a atividade da PFK foi ensaiada pelo método radiométrico. A adição

de BIS I, variando as concentrações de 0,01 µM a 0,05 µM, foi capaz de impedir

completamente a ativação da PFK induzida por 5-HT em todas as concentrações testadas,

onde a atividade enzimática observada foi semelhante aos níveis medidos nos controles na

ausência de estímulo (figura 19).

Figura 19 – A inibição da PKC previne o efeito da 5-HT no controle da PFK. Os

dados estão apresentados em relação ao controle, obtidos através de ensaios radiométricos

(n=6) e apresentados relativos ao controle. As concentrações de BIS I indicadas na figura,

bloquearam o estímulo a atividade da PFK promovida por 5-HT 25 pM. * Indica diferença

significativa, (p<0,05 Student’s t-test), contra as demais condições.

O conjunto de dados apresentados até aqui nos permite sugerir que a serotonina

controla o fluxo glicolítico, regulando a enzima PFK, em uma via metabólica que envolve a

ativação de PLC, resultando em aumento de DAG e consequente ativação das isoformas

clássicas da PKC. As perguntas que surgem referem-se aos elementos metabólicos recrutados

pela ativação da PKC. A 5-HT é capaz de ativar ERK1/2, de células de músculo liso, através

da ativação de PLC e PKC (Shum et al., 2002), direcionando nosso interesse em investigar se

em nosso sistema experimental a 5-HT exerce seus efeitos através da via das cinases ativadas

por fator mitogênico (MAPK) que levaria eventualmente a fosforilação de ERK1/2.

Primeiramente os extratos musculares foram tratados com PD98059, um inibidor da proteína

cinase ativada pelo sinal mitogênico (MEK), cuja ativação precede a ativação de ERK1/2. A

atividade da PFK foi acessada pelo experimento radiométrico, revelando que em condições

onde a proteína MEK e consequentemente a ERK1/2 encontram-se inibidas, a serotonina

mantém a capacidade de gerar estímulo a atividade da PFK. Em seguida, amostras de tecido

homogeneizado foram expostas a 5-HT 25 pM por até 1 hora. Alíquotas das amostras foram

ressuspendidas em tampão de amostra, fervidas e submetidas a um gel SDS-PAGE 12%,

transferidas para membranas de nitrocelulose e marcadas contra anticorpos (anti-P ERK1/2 ou

anti-ERK2). Concomitante a essas condições, frações de tecido também foram expostas a 100

nM de insulina, por 30 e 60 minutos, como controle positivo da fosforilação de ERK1/2

(Dupont et al., 2009). Esses resultados estão expostos na figura 20 (a) e (b), e evidenciam que

o estímulo positivo sobre a PFK, decorrente a ação da 5-HT, ocorre de forma independente a

mobilização da via das MAPK.

Figura 20 – Efeitos da 5-HT são MAPK independentes. Painel (a), o tratamento

com concentrações de 2 µM, 4 µM ou 10 µM, por 30 minutos prévio ao estímulo com

serotonina não preveniu a ativação da PFK. Dados contém valores de média ± erro padrão,

relativos ao controle de 6 experimentos radiométricos. * Significa diferença estatística contra

as outras condições (p<0,05 Student’s t-test). No painel (b), observa-se um Western Blotting

(WB) representativo, de amostras marcadas com anticorpos anti-fosfo ERK1/2 (1:1000) ou

anti-ERK 2 (1:1000), após estímulo de serotonina ou insulina, nas concentrações e tempos

indicados na figura.

Os resultados até aqui apresentados sugerem que a ação da serotonina envolve a

ativação da PKC através da geração de DAG e IP

a partir da ativação da PLC, contudo o IP

formado após a clivagem do PIP

, pode ainda ter participação no sinal desencadeado pelo

estímulo com serotonina. O IP

é um fragmento de fosfolipídeo com capacidade de difundir-

se através da célula e se ligar a receptores na membrana do retículo endoplasmático e

sarcoplasmático, promovendo abertura de canais de Ca

, e liberação Ca

para o citoplasma e

sarcoplasma, respectivamente (Ferris e Snyder, 1992). Em células de músculo liso o aumento

nos níveis citoplasmáticos de cálcio, resulta em contração das células musculares (Somlyo e

Somlyo, 1994). Uma série de outros eventos intracelulares podem ser regulados pela variação

nos níveis de cálcio, incluindo a regulação da proteína ligadora de cálcio, a calmodulina que é

capaz de ativar a PFK (Marinho-Carvalho et al., 2006; Zancan e Sola-Penna, 2005a e 2005b).

Essas observações nos levaram a investigar o envolvimento dos mecanismos ativados

por Ca

na regulação da PFK mediada por serotonina em músculo esquelético de

camundongos. Dessa forma, extratos musculares foram pré-tratados com o composto 48/80,

antagonista de calmodulina, por 30 minutos, nas concentrações indicadas na figura e a

atividade da PFK foi mensurada após o estímulo com 25 pM 5 HT (figura 21). Esse resultado

indica que a regulação positiva de PFK mediada por 5-HT, envolve mecanismos dependentes

da liberação de cálcio, uma vez que o composto 48/80 que é um antagonista de calmodulina e

portanto pode impedir a sinalização que se segue a ativação desta proteína.

Figura 21 – A presença do composto 48/80 previne ativação da PFK por 5-HT.

Extratos de músculo esquelético de camundongos foram expostos a 5-HT 25 pM na ausência

ou presença de concentrações crescentes do composto 48/80, como indicado na figura, em

seguida a atividade da PFK foi mensurada por meio de ensaios radiométricos. Resultados

expressos na forma de média ± erro padrão (n=6) relativos ao controle, sem estímulo. *

Significa diferença estatística (p<0,01 Student’s t-test), quando comparado ao controle.

Para obtermos uma ideia mais clara da participação desses mecanismos, os efeitos

positivos no controle do fluxo glicolítico modulados por 5-HT foram desafiados com a

incubação (30 min) com KN-62, um inibidor da proteína CaMKII, nos homogeneizados de

tecido muscular. Após o estímulo serotonérgico, a atividade da PFK foi medida

radiometricamente (figura 22).

Figura 22 – Ativação da PFK é dependente da CaMKII. Homogeneizado de

músculo esquelético de camundongos foram tratados por 30 minutos com KN-62 (0,01 nM,

0,1 nM, 1 nM e 10 nM). As concentrações de 1 nM e 10 nM preveniram a ativação da PFK

desencadeada por 5-HT 25 pM. Os dados estão apresentados com média ± erro padrão

relativo ao controle (n=6). * Indica significância estatística (p<0,05 Student’s t-test) quando

comparado ao estímulo de 5-HT 25 pM (2ª barra).

Esses ensaios reforçam a ideia de que os efeitos promovidos pela serotonina no

controle da atividade da PFK dependem do controle nos níveis de cálcio, que em última

instância pode levar a ativação da proteína cinase dependente de Ca

/calmodulina, CaMKII.

Outros autores já reportaram a ativação da PFK mediada diretamente por CaMKII

(Mahrenholz et al., 1991). A partir dessa informação, voltamos nosso interesse para

investigação da possível interação entre a CaMKII e a PFK, modulada por 5-HT, através de

ensaios de coimunoprecipitação. A figura 23 apresenta os resultados onde os extratos

musculares foram estimulados com 5-HT 25 pM, e a PFK foi imunoprecipitada com anticorpo

anti-PFK e em seguida as amostras foram ressuspendidas em tampão de amostra, fervidas e

submetidas a SDS-PAGE 10%, transferidas e marcadas em membranas de nitrocelulose, com

anticorpos anti-PFK ou anti-CaMKII. Esses ensaios revelaram que a serotonina é capaz de

promover aumento na quantidade de CaMKII coimunoprecipitada junto a PFK, quando

comparado a ausência do estímulo hormonal.

Figura 23 – 5-HT aumenta a coimunoprecipitação entre a PFK e a CaMKII.

Extratos musculares na ausência ou presença de 5-HT 25 pM, tiveram a PFK

imunoprecipitada como descrito em material e métodos. Em seguida as amostras foram

submetidas a um Western Blotting, usando anticorpos anti-PFK (1:1000) ou anti- CaMKII

(1:1000), como ilustrado na figura. Inset apresenta Western Blotting representativo (n=3),

controle (banda 1), 5-HT 25 pM (banda 2), com peso moleculares indicados na figura. A

quantificação destes ensaios, calculadas como descrito em material e métodos, está expressa

no gráfico de barras, através da relação entre a intensidade da marcação da CaMKII e o total

de PFK. * Indica diferença significativa comparado ao controle (p<0,01, Student’s t-test).

Esse conjunto de dados nos permite postular que a serotonina é capaz de controlar o

fluxo glicolítico, através do controle da atividade das enzimas HK e PFK. O controle da

atividade fosfofrutocinásica ocorre em uma via de sinalização dependente da ativação de PLC

com posterior ativação da PKC e CaMKII, provavelmente regulando os níveis intracelulares

de cálcio.

4.2 Efeitos da 5-HT no controle de enzimas glicolíticas de fígado

4.2.1 Efeitos da serotonina sobre atividade da HK e PFK de tecido hepático de

camundongos

A importância do fígado no controle da homeostase de glicose é amplamente

reconhecida pela comunidade científica (Randle et al., 1963; Cherrington et al., 1998).

Entretanto, existem poucos estudos acerca da ação da serotonina sobre o controle do

metabolismo de carboidratos em tecido hepático, especialmente sobre a ação do hormônio

sobre o controle de enzimas chave da glicólise, direcionando nosso interesse em testar os

efeitos da serotonina sobre o controle da atividade da HK e PFK de tecido hepático.

Os extratos de tecido hepático preparados como descrito em material e métodos foram

pré incubados por 30 minutos na ausência de estímulo hormonal ou na presença de

concentrações crescentes de serotonina (0,1 µM, 1 µM, 10 µM e 100 µM) como indicado na

figura 24 e a atividade da hexocinase foi mensurada através de ensaio radiométrico, avaliando

a formação de [

P]glicose-6-fosfato, ao longo do período onde a geração do produto

encontrava-se linear em função do tempo.

Nestes ensaios observamos que a serotonina não foi capaz de promover alterações na

atividade da enzima, independente da concentração hormonal utilizada, quando comparado ao

controle sem estímulo hormonal.

Figura 24 – Atividade da HK de tecido hepático na presença de serotonina.

Extratos de fígado de camundongos foram tratados com diferentes concentrações de

serotonina, como indicado na figura, por 30 minutos. Em seguida os ensaios de atividade da

HK foram disparados com adição do homogeneizado, chegando a concentração final de 50

µg/ml de proteína. A atividade foi medida pelo método radiométrico como descrito em

material e métodos. Os dados estão expressos como média ± erro padrão de quatro

experimentos independentes (n=4).

Em seguida, nós investigamos se a serotonina era capaz de modular a atividade da

PFK de fígado. Inicialmente, ensaiamos a atividade da PFK de extratos hepáticos, tratados

com 10 µM 5-HT, ao longo de 1 hora. Foram retiradas alíquotas dos homogeneizados

expostos ao hormônio nos tempos indicados na figura 25a, e a atividade da PFK foi medida

acessando a formação de [1-

P]Frutose-1,6-bifosfato formada após 6 minutos de reação,

através do método radiométrico. A concentração de 10 µM 5-HT foi utilizada, por

observarmos que essa concentração promovia o aumento mais expressivo na atividade da

enzima, quando comparado a outras concentração de serotonina, nestes experimentos

realizados pelo método radiométrico, evidenciamos um efeito dependente da dose para a ação

da serotonina no controle da atividade da PFK de fígado. Foram testadas concentrações

variadas de serotonina (0,1 µM, 1 µM, 10 µM, 50 µM e 100 µM), e o hormônio promoveu

aumento significativo na atividade da enzima com 10 µM e 50 µM (p<0,05 Student’s t-test)

(figura 25b).

Figura 25 – Efeitos da 5-HT na atividade da PFK de fígado de camundongos. A

atividade da PFK foi medida pelo método radiométrico. Extratos de tecido hepático foram

incubados na ausência ou presença de serotonina e a atividade da enzima foi medida nos

tempos 0, 15, 30 e 60 minutos (a). No painel (b), os extratos de fígado foram tratados, por 30

minutos, variando-se as concentrações de 5-HT como indicado na figura. Em ambos os

paineis os dados estão apresentados como média ± erro padrão, expressos como percentual

relativo ao controle de seis experimentos independentes (n=6). * Indica diferença estatística

comparado aos respectivos controles (p<0,05, Student’s t-test).

Esses resultados demostram que embora a serotonina não promova alterações na

atividade da enzima HK, ela é capaz de aumentar a atividade da PFK de tecido hepático de

camundongos de forma dependente da dose, apresentando efeito máximo após exposição a 10

µM 5-HT, aumentando em cerca de 50% em relação a atividade observada nos controles. A

ativação da PFK promovida por serotonina também varia em função do tempo de exposição

ao hormônio, aumentando ao longo do período de incubação. O tratamento com serotonina

requer pelo menos 30 minutos de incubação para elevar a atividade da PFK significativamente

quando comparada ao controle, essa ativação ainda é mantida estatisticamente maior por até 1

hora, em relação ao controle sem estímulo serotonérgico (p<0,05 Student’s t-test).

4.2.2 Efeitos da 5-HT sobre a localização celular da PFK de tecido hepático

Para investigarmos se a ativação da PFK mediada por serotonina envolve a alteração

da localização celular da enzima, os homogeneizados de fígado foram tratado por 30 minutos

com 10µM 5-HT, e foram submetidos ao fracionamento celular como descrito em material e

métodos. O homogeneizado total (HT), obtido a partir da primeira centrifugação de baixa

velocidade, foi utilizado para medir a atividade da PFK, e a presença de serotonina modulou

positivamente a atividade da PFK, confirmando os resultados da figura 25. Nestes ensaios os

extratos celulares também foram incubados com F-2,6-BP 100 nM, um potente ativador da

PFK hepática, e observamos que a ação da serotonina apresentou efeito semelhante na

ativação da enzima, àquele observado para ativação promovida por F-2,6-BP. Curiosamente,

o tratamento simultâneo de serotonina e F-2,6-BP, resultou em efeito sinérgico sobre a

ativação da PFK (figura 26a). Frações do HT, submetidas as mesmas condições descritas

acima, passaram posteriormente por processos de ultracentrifugação diferencial, até obtermos

as frações S2, ricas em estruturas solúveis, e as frações P2 contendo proteínas do

citoesqueleto. A atividade da PFK dessas frações foi medida pelo método radiométrico, e os

resultados estão expostos na figura 26b. A presença de F-2,6-BP 100 nM não alterou o padrão

de atividade da PFK nas duas frações quando comparado ao controle. Por outro lado, o

estímulo com 5-HT 10 µM promoveu um aumento da atividade da PFK da fração P2,

sugerindo um deslocamento da enzima para a fração rica em estruturas do citoesqueleto.

Adicionalmente, o estímulo concomitante entre a serotonina e a F-2,6-BP, acarretou em

aumento adicional na atividade da PFK nas frações P2, quando comparado ao efeito positivo

promovido por 5-HT isoladamente (p<0,05 Student’s t-test), reforçando a ideia de que a

serotonina e a F-2,6-BP apresentam ação sinérgica na modulação positiva da atividade da

enzima PFK.

Figura 26 – Alteração da localização celular da PFK promovida por serotonina.

Extratos de fígado de camundongos foram tratados na ausência ou presença de serotonina, F-

2,6-BP ou ambos, por 30 minutos. Posteriormente, os tecidos foram submetidos a diferentes

centrifugações como descrito em material e métodos, e a atividade da PFK das diferentes

frações foi medida radiometricamente. (a) A atividade da PFK do HT. (b) Atividade da PFK

das frações S2 (barras pretas) e P2 (barras cinza). Nos dois painéis a atividade da PFK está

apresentada como média ± erro padrão do percentual relativo ao controle (n=6). * Indica

diferente estatística comparado ao controle (p<0,05 Sutdent’s t-test), # indica diferença

significativa quando comparado as demais condições (p<0,05 Sutdent’s t-test).

4.2.3 Efeitos sinérgicos da 5-HT e F-2,6-BP no controle da PFK hepática

Os resultados anteriores evidenciam uma ação sinérgica entre a serotonina e a F-2,6-

BP tanto no controle da atividade da PFK quanto na alteração da localização celular da

enzima.

Quando extratos de fígado são incubados por 30 minutos com concentrações

crescentes de serotonina, na ausência ou na presença de F-2,6-BP 100 nM, nós observamos

que a serotonina potencializa os efeitos positivos na atividade da PFK promovidos por F-2,6-

BP 100 nM a partir de estímulos com 5-HT 0,1 µM, aumentando progressivamente com o

incremento na concentração hormonal. Essa ativação se torna significativa com 5-HT 10 µM

quando comparado ao efeito da ativação da PFK desencadeada por F-2,6-BP 100 nM sozinha

(figura 27a).

Na figura 27b, testamos a atividade da PFK de tecido hepático exposta a 5-HT 10 µM,

variando as concentrações de F-2,6-BP (barras pretas), e podemos ver que a partir da ação

conjunta de F-2,6-BP 30 nM e serotonina, a ativação da PFK é significativamente maior do

que aquela observada para o estímulo com apenas 5-HT 10 µM. Esse efeito aditivo

permanece até a concentração de F-2,6-BP 100 nM, e se perde com concentrações maiores do

modulador. Através destes experimentos, observamos ainda que a ativação da PFK promovida

por F-2,6-BP sozinha se torna significativa, quando comparado ao controle sem estímulo,

apenas com concentrações acima de 30 nM do modulador (figura 27b, barras cinza). Neste

painel foram utilizadas duas situações como controle, a primeira barra preta representa o

controle positivo, após estímulo com 5-HT 10 µM (30 min), e o controle negativo, na

ausência de qualquer estímulo, representado pela primeira barra cinza.

A F-2,6-BP é reconhecida como o mais potente modulador positivo da PFK (Hers e

Van Schaftingen, 1982; Uyeda et al., 1981a). Contudo, seus efeitos não se restringem ao

controle da PFK, mas também a regulação da atividade de enzimas da gliconeogênese (Pilkis

et al., 1981b; Van Schaftingen e Hers, 1981a), e por isso apresenta um papel fundamental na

regulação do metabolismo glicolítico no fígado. Os níveis hepáticos de F-2,6-BP variam em

função do estado metabólico do organismo, como o estado alimentado ou o jejum que

refletem as concentrações plasmáticas de insulina e glucagon. A insulina é capaz de regular o

fluxo glicolítico em tecido hepático através do controle da enzima bifuncional PFK-2, levando

a produção de F-2,6-BP, com consequente ativação da PFK em fígado (Okar et al., 2001 e

2004).

Figura 27 – Efeitos sinérgicos da serotonina e F-2,6-BP no controle da PFK.

Extratos de tecido hepático foram incubados por 30 minutos com os aditivos nas

concentrações indicadas nas figuras. Em seguida, a atividade da PFK foi medida pelo ensaio

radiométrico com descrito em material e métodos. (a) Atividade da PFK exposta a

concentrações crescentes de 5-HT, na presença de 100 nM F-2,6-BP (n=6). * Indica diferença

estatística quando comparado ao controle, # indica diferença estatística quando comparado ao

estímulo por 100 nM F-2,6-BP (p<0,05 Sudent’s t-test). (b) Curva de F-2,6-BP na presença

(barras pretas), ou ausência (barras cinza) de 10 µM 5-HT (n=8). Dados representam média ±

erro padrão, e estão apresentados em valores percentuais comparado ao controle. * Indica

diferença estatística quando comparado ao controle na ausência de 5-HT (barra cinza), #

indica diferença contra o controle na presença de 5-HT (barra preta), e comparada a respectiva

barra com estímulo apenas da F-2,6-BP (p<0,05 Sudent’s t-test).

A partir destas observações, investigamos os efeitos da exposição de homogeneizados

de fígado ao estímulo mútuo de 5-HT e insulina. Para tanto, os extratos foram estimulados

com concentrações crescentes de 5-HT na ausência e na presença de insulina 100 nM por 30

min, e a atividade da PFK foi mensurada através do método radiométrico. Os resultados

obtidos foram comparados aos efeitos dependente da dose descritos para a ação da serotonina,

ou a ação de insulina 100 nM, sobre a ativação da PFK (figura 28).

Nestes ensaios foram conduzidas duas situações controle, o controle negativo (1ª barra

preta) sem nenhum estímulo, e uma condição estimulada apenas com insulina (1ª barra cinza).

Esses resultados revelam que o estímulo concomitante dos dois hormônios potencializam a

ativação da PFK promovida por ambos isoladamente, demonstrando ação sinérgica entre a

serotonina e a insulina no controle da PFK, e assim no controle do metabolismo de

carboidratos de tecido hepático.

Figura 28 – Regulação da atividade da PFK por serotonina e insulina. Após o

tratamento por 30 minutos com concentrações variadas de 5-HT (0,1 µM, 1 µM, 10 µM, 100

µM) ou com 100 nM insulina na ausência ou presença dessas concentrações de serotonina, a

atividade da PFK foi medida pelo método radiométrico como descrito em material e métodos.

Os resultados obtidos estão ilustrados como média ± erro padrão, relativo ao controle na

ausência de estímulo, 1ª barra preta (n=5). * Indica diferença estatística quando comparado a

ausência de estímulo hormonal (p<0,05 Student’s t-test). # Indica diferença estatística quando

comparado ao estímulo com 100 nM insulina (p<0,05 Student’s t-test).

4.2.4 Ativação da PFK em fígado por 5-HT é mediada pelo receptor 5-HT

Já foi identificada, até o momento, a expressão de membros de cinco famílias de

receptores de serotonina em células estrelares de fígado (5-HT

, 5-HT

5-HT

) (Ruddell et al. 2008). Ao testarmos os efeitos estimulatórios de 10 µM de serotonina

sobre a atividade da PFK na presença de ketanserina, um antagonista específico desta

isoforma do receptor, observamos que a presença de 1 µM do antagonista é capaz de impedir

a ativação promovida por serotonina a níveis abaixo do controle (figura 29). Neste conjunto

de resultados, observamos também que a ketanserina não reverte a ativação da PFK

promovida por F-2,6-BP, entretanto a adição de ketanserina é capaz de prevenir o efeito

aditivo decorrente a presença de 5-HT e F-2,6-BP, reduzindo ao nível da ativação observada

apenas na presença do modulador alostérico da PFK.

Figura 29 – Ativação da PFK é dependente do receptor 5-HT

. Extratos de tecido

hepático foram incubados em diferentes condições, na presença ou ausência dos aditivos

indicados na figura. A atividade da PFK foi medida pelo método radiométrico, e as barras

representam média ± erro padrão de 5 experimentos independentes, apresentados como

percentual do controle. * Indica diferença significativa quando comparado as demais

condições (p<0,05 Student’s t-test).

4.2.5 Ação da serotonina na ativação da PFK depende de uma via que envolve tirosinas

cinases e evolvem a ativação de PI3K.

Assim como observado em músculo esquelético, a ativação da PFK depende da

mesma isoforma do receptor de serotonina a qual em músculo leva a ativação de uma via

dependente de PLC e PKC, para o controle do fluxo glicolítico. Além disso, os diversos

efeitos da serotonina nos vários tecidos alvo podem ainda ser mediados através de outros

mecanismos de comunicação celular como descrito anteriormente.

A insulina, hormônio com importante papel no controle do metabolismo hepático de

carboidratos, é capaz de controlar a PFK hepática através de uma via que envolve ativação de

PI3K e depende da ativação de enzimas com atividade tirosina cinásica (Pandey et al., 2002),

culminando com o aumento da produção de F-2,6-BP, modulando alostéricamente a PFK.

Dessa forma conduzimos ensaios onde, antagonistas ou agonistas específicos de

proteínas com possível papel nos eventos sinalizados pela serotonina, foram adicionados ao

meio de pré-incubação dos extratos de fígado de camundongos, para testarmos a participação

dessas vias de comunicação na ativação da PFK de tecido hepático.

A adição de genisteína ao homogeneizado durante o período de trinta minutos de

exposição a serotonina 10 µM foi capaz de reverter a ativação da PFK de forma dependente

da dose (figura 30). A atividade da PFK retornou aos níveis do controle a partir de genisteína

10 µM, tendo efeito máximo com 50 µM da droga. A adição de genisteína também reverteu a

ativação promovida por F-2,6-BP na atividade da PFK (dados não apresentados), de maneira

semelhante àquela observada para a reversão dos efeitos da serotonina.

Figura 30 – A inibição de enzimas com atividade tirosina cinase previne os efeitos

da 5-HT. Extratos de tecido hepático foram tratados durante 30 minutos com 10 µ M 5-HT na

presença ou ausência de genisteína (1 µM, 10 µM e 50 µM), além de controle na ausência de

aditivos. Após a incubação, a atividade da PFK foi ensaiada pelo método radiométrico. Os

resultados expostos como valores percentuais ao controle, são média ± erro padrão de 4

experimentos (n=4). * (p<0,05 Student’s t-test) quando as barras são comparadas ao estímulo

com 10 µM 5-HT.

Em seguida testamos a participação da PI3K nos efeitos relatados, utilizando a

wortmanina como inibidor deste componente metabólico. A presença da droga no meio de

reação bloqueou os efeitos estimulatórios da serotonina na atividade da PFK, de forma

dependente da dose. A concentração de 10 nM reverteu parcialmente a ativação da PFK e a

wortmanina 100 nM levou a atividade da enzima aos níveis do controle (figura 31).

Figura 31 – Os efeitos da serotonina dependem da ativação de PI3K.

Homogeneizados de fígado foram incubados com 10 µM 5-HT na ausência ou presença de

wortmanina nas concentrações de 1 nM, 10 nM e 100 nM. A atividade da PFK medida pelo

método radiométrico está quantificada em valores médios ± erro padrão (n=4), relativos ao

controle, onde não há presença de aditivos. * Diferença estatística quando comparada a

presença de 10 µM 5-HT (p<0,05 Student’s t-test).

Esse dados sugerem que o controle positivo do fluxo glicolítico em fígado,

desencadeado por serotonina envolve uma via comum a via recrutada pela insulina, contudo a

ação sinérgica entre os dois hormônios no controle positivo da PFK sugere o envolvimento de

mais de uma via de sinalização nos efeitos observados, ou mecanismos distintos de regulação

da atividade da enzima, para cada um dos hormônios, mesmo que haja um componente

comum na comunicação celular.

4.2.6 A ativação da PFK envolve o recrutamento de PLC e PKC

Com o intuito de testar se a ativação do receptor 5-HT

leva a ativação de PLC, como

descrito em músculo esquelético, nós testamos se a ativação da PFK de fígado por serotonina

era mantida mesmo quando desafiada com a presença de um inibidor de PLC (U-73122). Para

estes experimentos, foi utilizado uma concentração única de 10 µM do inibidor (figura 32).

Figura 32 – Envolvimento da PLC na ação da serotonina. Os extratos de fígado

foram pré tratados com 10 µM 5-HT, na ausência ou presença de 10 µM U-73122. Nestes

ensaios foram utilizados dois controles, o controle negativo, representado pela 1ª barra, na

ausência de qualquer aditivo, ou o controle positivo, com adição apenas de 10 µM U-73122.

Após o período de incubação, a atividade da PFK foi mensurada através da formação

radioativa do produto da reação da PFK, [1-

P]Frutose-1,6-bifosfato, como descrito em

material em métodos. Os dados estão quantificados com média ± erro padrão de 4

experimentos independentes. * (p<0,05 Student’s t-test) contra o controle ou 10 µM 5-HT +

10 µM U-73122.

Como ilustrado na figura 32, a inibição de PLC com U-73122 10 µM foi capaz de

prevenir os efeitos positivos da serotonina no controle da PFK, reduzindo a ativação da

enzima aos níveis observados no controle. A presença apenas do inibidor de PLC, foi capaz

de inibir a atividade da PFK até aproximadamente 70% do basal. Esse inibição pode ser

atribuída a uma atividade intrínseca de ativação da PFK por PLC.

A partir destes resultados, os extratos de fígado foram pré tratados com um éster de

forbol (PMA), capaz de mimetizar a ação do DAG na ativação da PKC. O PMA foi

adicionado ao meio de reação por 30 minutos, nas concentrações indicadas na figura 33, na

ausência ou presença de F-2,6-BP 100 nM, e os efeitos observados foram comparados a

ativação da PFK promovida por 5-HT 10 µM sozinha, e pelo efeito aditivo descrito para a

presença de 5-HT 10 µM e F-2,6-BP 100 nM juntas. Esses ensaios demonstraram que o PMA

sozinho foi capaz de ativar a PFK de forma dose dependente (barras brancas achuradas),

elevando a atividade da PFK ao nível da ativação observada para a presença de 5-HT 10 µM

(barra branca).

Figura 33 – Ação da serotonina provavelmente envolve a ativação da PKC.

Homogeneizados de fígado de camundongos foram tratados por 30 minutos com

concentrações crescentes de PMA, sozinho (barras brancas achuradas) ou associado a 100 nM

F-2,6-BP (barras cinzas achuradas), nas concentrações indicadas na legenda da figura. Os

efeitos destas condições sob a atividade da PFK foram acessados pelo método radiométrico, e

foram comparados as condições de ativação promovidas por 10 µM 5-HT (barra branca), e 10

µM 5-HT + 100 nM F-2,6-BP (barra cinza). As barras significam média ± erro padrão,

apresentados como valores relativos ao controle, na ausência de qualquer aditivo (barra preta).

* (p<0,05 Student’s t-test) contra o controle (barra preta). # (p<0,05 Student’s t-test)

comparado a 10 µM 5-HT (barra branca).

A adição tanto de PMA e F-2,6-BP 100 nM juntas ao homogeneizado, resultou em

efeito sinérgico na ativação da PFK (barras cinzas achuradas), semelhante àquele observado

para a presença de serotonina e F-2,6-BP (barra cinza), esses efeitos ainda foram dependentes

de concentrações menores de PMA para atingirem níveis de ativação da enzima superiores

aos observados para ação do PMA isoladamente.

Esse conjunto de resultados sugerem que a serotonina é capaz de ativar a PFK de

tecido hepático através de dois mecanismos independentes de comunicação celular. O

receptor 5-HT

estaria acoplado a PI3K e a PLC, levando a ativação da PKC. Até o presente

momento não temos esclarecido as possíveis proteínas envolvidas no controle da PFK

mediado por serotonina em fígado, e novas abordagens são de grande importância para o

entendimento dos mecanismos envolvidos nesses efeitos.

4.3 Efeitos da serotonina no controle da glicemia de animais diabéticos

A serotonina é capaz de promover aumento na captação de glicose em diferentes

modelos experimentais, incluindo diversos tipos celulares (Assouline-Cohen et al., 1998;

Hajduch, 1999b; Guillet-Deniau et al, 1997). Além disso, drogas que levam ao controle

serotonérgico revertem quadros de hiperinsulinemia e melhoram a tolerância a glicose (Moore

et al., 2004; Arora et al., 1988; Gomez et al., 2001; Jorgensen, 1977).

Com intuito de avaliar a ação da serotonina no controle in vivo da glicemia, evento

importante para o controle do metabolismo celular de carboidratos e determinante para

sustentar um aumento no fluxo glicolítico, uma vez que a 5-HT é capaz de modular a

atividade da PFK em tecidos importantes para o controle glicêmica, induziu-se o diabetes em

camundongos suíços como descrito em material e métodos, e após a caracterização do quadro

diabético estes animais (STZ), e animais controles foram tratados i.p. com doses de 5 mg/kg

ou 50 mg/kg de serotonina ou salina e os níveis glicêmicos foram acompanhados

periodicamente durante 3 horas (figura 34). Nos animais controle (●) ou STZ (○) tratados

com salina, a glicemia manteve-se constante ao longo de todo o período do experimento. A

administração de 5 mg/kg aos animais controle (▼), tampouco foi capaz de exercer efeitos

sobre o controle da glicose plasmática. Em contrapartida, a dose de 50 mg/kg de 5-HT nos

animais controle ( ), promoveu redução a glicemia a cerca de 60% dos níveis mensurados nos

animais tratados com salina (●), após uma hora da administração do hormônio. Em animais

diabéticos, ambas as doses de serotonina reduziram a glicemia. Os efeitos de 5 mg/kg de

serotonina nos animais STZ (■) iniciaram após 1 hora de tratamento e ao final de três horas

reduziram a glicemia aos níveis dos animais controle salina (●). O animais STZ tratados com

50 mg/kg 5-HT (□) apresentaram efeitos ainda mais dramáticos na redução da glicemia, os

níveis glicêmicos observados já eram cerca de 20% menores após 30 minutos da injeção de

serotonina, ao final de 1 hora era de aproximadamente 43% do nível glicêmico medido no

tempo zero. A diminuição da glicemia persistiu e atingiu os níveis dos animais controle após

2 horas da administração de 50 mg/kg 5-HT nos animais diabéticos. Curiosamente, ao final de

3 horas a glicemia destes animais voltava a apresentar-se aumentada em relação aos controles.

Estes resultados evidenciam que a serotonina está envolvida na homeostase de glicose

possivelmente controlando a glicemia através da captação de glicose e da ativação da PFK,

tanto em animais controle quanto em animais diabéticos.

Figura 34 – Glicemia de camundongos controle e diabéticos tratados com

serotonina. Camundongos controle ou com diabetes induzido como descrito em material e

métodos, foram tratados com salina ou serotonina nas doses indicadas na figura e no texto.

Após o tratamento a glicemia foi mensurada utilizando um glicometro nos tempos (0, 30, 60,

120 e 180 min). Os dados representam média ± erro padrão das concentrações de glicose nos

tempos e modelos animais indicados na figura (n = 3), com exceção do animal STZ (□) (n =

1).

5. DISCUSSÃO

Alguns estudos descreveram a capacidade da serotonina em promover aumento na

captação de glicose através de uma via de sinalização distinta daquela descrita para a ação da

insulina sobre o influxo de glicose (Guillet-Deniau et al., 1997; Hajduch et al., 1999a; 1999b).

Contudo esses trabalhos não investigaram se esses efeitos ocorrem concomitantemente ao

aumento do metabolismo de glicose através da via glicolítica. Nossos resultados demonstram

que a serotonina é capaz de aumentar ao fluxo glicolítico em músculo esquelético e fígado de

camundongos, através do controle da atividade de duas das principais enzimas desta via

bioenergética, a HK e a PFK.

A serotonina é capaz de promover ativação tanto da HK quanto da PFK de músculo

esquelético de forma dependente da dose, com efeitos máximos em uma faixa de

concentração entre 20 pM e 30 pM do hormônio (figuras 9 e 10). A ativação da PFK

comparada a ausência do estímulo hormonal permanece significativa mesmo em

concentrações maiores de 5-HT, na faixa de µM (dados não apresentados). O estímulo

serotonérgico altera parâmetros cinéticos importantes da atividade da PFK tornando-a mais

ativa, incluindo o aumento na V

máx

da enzima e a redução do K

0,5

para o substrato F-6-P

(tabela 1). O índice de cooperatividade da enzima por outro lado não é alterado pelo ação da

serotonina, indicando que a ativação da PFK desencadeada por 5-HT não influencia o

aumento da afinidade da enzima pelo substrato F-6-P promovida pela ligação anterior a outra

molécula deste substrato em um diferente sítio de interação da mesma proteína. Contudo,

nossos resultados demonstraram que a enzima apresenta cooperação positiva, representado

pelo valor de n > 1 (tabela 1), como descrito para o comportamento cinético da PFK

(Schirmer e Evans, 1990).

A adição de serotonina a extratos de músculo esquelético de camundongos resulta em

aumento no padrão de fosforilação da PFK em resíduos de tirosina, em contrapartida o

hormônio não é capaz de promover aumento semelhante na fosforilação de resíduos de serina.

A fosforilação correlaciona-se diretamente a ativação da enzima, uma vez que a inibição de

proteínas tirosina cinases, com adição de genisteína, reverte tanto a fosforilação quanto a

ativação da PFK mediados por 5-HT em tecido muscular esquelético (figuras 12, 13 e 14).

Adicionalmente, a serotonina leva ao aumento da associação da PFK a f-actina do

citoesqueleto evidenciada através da observação de aumento do conteúdo e da atividade da

PFK em frações ricas em f-actina após processos de centrifugação (figura 11). A associação

da PFK a essas estruturas celulares é amplamente descrita na literatura como um importante

mecanismo de controle da atividade da enzima (Liou e Anderson, 1980; Kemp e Foe, 1983;

Kuo et al., 1986; Roberts e Somero, 1987; Clegg, 1992; Chen-Zion et al., 1992a; Beitner,

1993; Vértessy et al., 1997). Outros estudos do nosso grupo haviam ainda reportado que a

fosforilação mediada por adrenalina (Alves e Sola-Penna, 2003) e insulina (Silva et al., 2004;

Zancan e Sola Penna, 2005a e 2005b; Da Silva et al., 2010; Real-Hohn et al., 2010) da PFK,

resulta em ativação da enzima. A ação desses hormônios no controle positivo da enzima

envolve alterações de propriedades cinéticas da PFK, e a redistribuição da localização

intracelular da enzima, após a fosforilação da enzima em resíduos de serina ou tirosina,

semelhantes as reportadas no presente estudo. Assouline-Cohen et al. (1997) evidenciaram

um aumento significativo na atividade da PFK em frações ligadas a membrana celular de

eritrócitos decorrentes a ação da serotonina. Neste contexto, nossos resultados sugerem que

esses mecanismos estão envolvidos nos efeitos da 5-HT sobre o controle da atividade da PFK,

e dessa forma a serotonina é capaz de regular a glicólise de músculo esquelético.

O receptor 5-HT

é a principal isoforma expressa em tecidos periféricos, como tecido

muscular esquelético humano, fígado, tecido adiposo (Hoyer et al., 1994; Corson et al., 1992;

Hajduch et al., 1999b), além de células neoplásicas (Sonier et al., 2005; Sonier et al., 2006).

A ativação da PFK induzida por 5-HT é contraposta pela presença de ketanserina, antagonista

de 5-HT

, de forma dependente da dose, onde ketanserina 0,05 µM reverte parcialmente a

ativação da PFK, ketanserina 0,1 µM reverte totalmente e ketanserina 1 µM reduz a atividade

e a fosforilação em resíduo de tirosina da PFK abaixo dos níveis do controle (figura 15a). O

último efeito pode ser atribuído a reversão da atividade intrínseca do receptor que é

antagonizado por altas concentrações da droga ou em função da inibição de outras isoformas

do receptor de serotonina, como os receptores 5-HT

, 5-HT

, uma vez que este

composto, em altas concentrações pode se ligar a esses receptores, antagonizando suas

atividades (Hoyer et al., 1994). Os efeitos da serotonina na ativação da PFK são mimetizados

por 5-MeOT, agonista do receptor 5-HT

. Adicionalmente, a ativação da PFK desencadeada

por 5-HT ou 5-MeOT é antagonizada por spiperona, outro inibidor de 5-HT

, e seus efeitos

inibitórios são atenuados com o aumento da concentração de 5-MeOT (figura 15b),

corroborando que os efeitos positivos no controle da atividade da PFK são mediados pelo

receptor 5-HT

Este é um receptor com sete alças transmembrana acoplado a proteína G que pode

desencadear eventos celulares através de várias cascatas de sinalização (Hoyer et al., 1994).

Nossos experimentos indicam que a PI3K não está envolvida nos efeitos descritos para a ação

da serotonina no controle do fluxo glicolítico, uma vez que a wortmanina não foi capaz de

prevenir a ativação da enzima PFK, assim como não impediu o aumento na incorporação de

fosfato em resíduos de tirosina (figuras 13 e 14). Esses resultados estão de acordo com

trabalhos prévios que demonstraram que o aumento na captação de glicose mediado pelo

receptor 5-HT

ocorre independente da ativação de IRS1, PI3K e Akt (Hajduch et al.,

1999b), todos conhecidos componentes da sinalização por insulina, sugerindo que os eventos

mediados por serotonina ocorrem através de uma cascata de sinalização diferente daquela

recrutada por insulina.

Já foi reportando que a PFK de músculo de um crustáceo (balanus balanus) é ativada

in vitro após a exposição a AMPc exógeno (Simpfendörfer et al., 2006). Em outro estudo os

autores evidenciaram que a serotonina regula a atividade da PFK de ventrículo de um

molusco (anodonta cygnea) através de fosforilação promovida por PKA (Michaelidis et al.,

1993). A PFK de músculo esquelético de coelho também é estimulada após incubação com

PKA e AMPc (Alves e Sola-Penna, 2003; Leite et al., 2007; Spitz et al., 2009). Esses dados

nos levaram a levantar a hipótese de participação da PKA na ativação da PFK de músculo

esquelético de camundongos, quando estimulada com serotonina. No entanto, a serotonina

manteve seus efeitos de ativação e fosforilação em resíduos de tirosina da PFK mesmo na

presença de H-89, inibidor de PKA (figura 16), indicando que a hipótese de envolvimento da

PKA no controle da PFK mediado por serotonina no nosso modelo experimental não se

provou verdadeira, ao contrário dos resultados publicados por Michaelidis et al. (1993).

Em contrapartida a presença do inibidor de PLC (U-73122), e do inibidor de PKC

(BIS I), que inibe a isoformas clássicas da PKC, impedem a ativação e a fosforilação em

tirosina da PFK promovidos por serotonina (figura 17 e 19). Além disso, a ativação da PFK

desencadeada pelo estímulo serotonérgico é mimetizada pela adição de PMA aos extratos de

músculo esquelético de camundongos (figura 18), reforçando as evidências de envolvimento

da PKC na ativação da PFK mediada por serotonina. Esses resultados alinham-se aos muitos

trabalhos da literatura que apontam a sinalização dependente do metabolismo dos

fosfoinositídeos, como a principal via ativada pelos receptores de serotonina da família 5-HT

(Hoyer et al, 1994), através da hidrólise do PIP

, após ativação da PLC-β (Conn et al., 1986).

Simpfendörfer et al. (2006) demonstraram que a adição de fosfatidilserina é capaz de ativar a

PFK in vitro, e apontaram a PKC como possível candidata para ativação da enzima. Ito et al.

(2000) ao investigarem os efeitos da serotonina sobre a síntese de interleucina-6 em células de

músculo liso vascular, correlacionando com o desenvolvimento de aterosclerose, concluíram

que a 5-HT promove a síntese desta molécula chave no processo inflamatório, através do

receptor 5-HT

com consequente ativação da PKC. Neste trabalho os autores ainda

descartaram a participação da PKA nos efeitos atribuídos a ação hormonal.

A endotelina-1, uma outra molécula com propriedades vasoativas, tem a capacidade de

promover vasoconstricção e proliferação em células de músculo liso vascular, exercendo seus

efeitos através da ativação de uma via dependente de PKC e PKA culminando com a ativação

de MEK-1 e ERK1/2 (Chen et al., 2009). Shum et al. (2002) descreveram a participação da

serotonina no estímulo a síntese de uma enzima crítica na manutenção da integridade uterina

(metaloproteinase-13 de matriz). Os efeitos da serotonina descrito por esses autores são

mediados a partir da interação com o receptor de serotonina 5-HT

, induzindo a ativação da

PLC-PKC e posteriormente o recrutamento de proteínas da via das MAPK, com ativação de

MEK e ERK1/2. Essas evidências nos levaram a testar a possível participação destas

proteínas nos eventos relatados nesta tese, contudo a exposição dos extratos de músculo

esquelético a PD98059, inibidor de MEK, foi incapaz de reverter a ativação da PFK induzida

por serotonina (figura 20a). De forma correlata, a serotonina não promoveu fosforilação de

ERK1/2 nos tecidos de músculo esquelético de camundongos, independente do tempo de

exposição à serotonina. Por outro lado, o tratamento dos mesmos tecidos com insulina

resultou em ativação de ERK1/2, ao aumentar a fosforilação destas proteínas (figura 20b).

Dessa forma, a ativação da PFK induzida por serotonina aqui reportada ocorre através de uma

via de sinalização independente de MAPK.

Os resultados até aqui discutidos sugerem a participação de uma via dependente de

PLC e PKC na ativação da PFK induzida por serotonina. A ativação da PLC resulta ainda em

produção de IP

, capaz de ativar vias metabólicas dependentes de Ca

, as quais podem

também ser potencializadas pela própria ação da PKC. Muitas ações atribuídas a serotonina

envolvem vias de sinalização dependentes de Ca

, como a abertura de canais pós sinápticos

dependentes de ATP em células de músculo liso através do receptor 5-HT

(Ase et al.,

2005), a contração da artéria mesentérica de coelhos (Seager et al., 1994), além de a

serotonina ser capaz de promover a produção de IP

e a liberação de Ca

em várias células de

músculo liso de grandes artérias, incluindo aorta de ratos (Nakaki et al., 1985; Roth et al.,

1986; Cohen e Wittenauer, 1987), artéria caudal de ratos (Berta et al., 1986) e aorta de

coelhos (Murphy e Garland, 1993). O Ca

tem importante participação no controle da

glicólise, sendo capaz de regular enzimas glicolíticas através de associação ou dissociação

destas enzimas a proteínas do citoesqueleto celular, levando a ativação ou inibição destas

proteínas. Propõe-se um efeito duplo do Ca

no controle do fluxo glicolítico, onde a

exposição durante curtos períodos leva a ativação da PFK e aldolase, enquanto que a

exposição por longos períodos, caracterizando aumento patológico do Ca

livre, acarreta

diminuição da glicólise em músculo de diafragma de ratos (Chen-Zion et al., 1993), células de

fibroblasto NIH-3T3 (Ashkenazy-Shahar e Beitner, 1999) e eritrócitos (Assouline-Cohen e

Beitner, 1999). O acúmulo anormal de Ca

livre intracelular acarreta severos danos a

miofibrilas de músculo de diafragma de ratos, este efeito correlaciona-se a redução na

produção de ATP através da inibição de enzimas chave da glicólise, ao direcioná-las a frações

solúveis do citosol. Esta ação é contraposta com adição de antagonistas de calmodulina, que

ao inibirem a ação da calmodulina revertem os efeitos inibitórios de altos níveis de Ca

sobre

atividade de enzimas glicolíticas (Beitner e Lilling, 1993).

A incubação do composto 48/80, antagonista de calmodulina, nos extratos de músculo

esquelético de camundongos foi capaz de impedir a ativação da PFK promovida por

serotonina de forma dependente da dose revertendo a atividade da PFK, aos níveis do

controle, com 10 µM e 30 µM do inibidor (figura 21), sugerindo o envolvimento da

calmodulina na sinalização da serotonina. Apesar do composto 48/80 também ter ação

inibitória sobre a PLC, agindo concomitantemente sobre a atividade da calmodulina e da PLC

na inibição da agregação plaquetária (Bronner et al., 1987), a participação de uma via

dependente de calmodulina é reforçada pelos resultados que apresentam os efeitos inibitórios

do KN-62, inibidor de CaMKII, sobre a ativação da PFK induzida por serotonina em músculo

esquelético de camundongos. O KN-62 reverte a ação da serotonina de forma dependente da

dose. Este composto em concentrações abaixo de 0,1 nM não impedem os efeitos do

hormônio, enquanto que 1 nM e 10 nM de KN-62 retornam o padrão da atividade da PFK aos

níveis observados nos controles (figura 22). Adicionalmente o estímulo com serotonina

promove aumento de cerca de 50% na associação entre a CaMKII e a PFK (figura 23),

sugerindo que a CaMKII promova aumento da atividade da PFK após a interação entre as

duas proteínas, contudo os mecanismos de ativação em função desta associação não estão

completamente elucidados.

Em músculo cardíaco o estímulo β-adrenérgico leva a ativação da PLC, capaz de

regular a liberação de Ca

através da ativação da PKC, com consequente ativação da CaMKII

(Oestreich et al., 2009), na qual sua atividade serina/treonina cinásica tem participação

importante no controle das propriedades eletrofisiológicas e contráteis do músculo cardíaco,

através da fosforilação de diferentes proteínas (Hook e Means, 2001; Maier e Bers, 2007),

A PFK cardíaca é uma das proteínas alvo da ação da CaMKII, contudo a fosforilação

da PFK cardíaca pela ação da CaMKII resultou em um aumento da sensibilidade da enzima

pela inibição mediada por ATP e em discreto aumento do K

0,5

para o substrato F-6-P

(Mahrenholz et al., 1991), diferente dos resultados observados para ativação da PFK de

músculo esquelético desencadeada por serotonina no nosso modelo experimental, que são

dependentes da ativação da CaMKII e promovem alterações opostas nos parâmetros cinéticos

da enzima, apesar de ainda não estar clara a importância da interação entre a CaMKII e a

PFK, uma vez que a serotonina não promove aumento na fosforilação de serina da PFK

(figura 13) e não foi possível medir os efeitos da serotonina no padrão de fosforilação em

resíduos de treonina da PFK, que pode ser alvo de fosforilação pela CaMKII para promover

seus efeitos estimulatórios sobre a atividade fosfofrutocinásica.

Adicionalmente a CaM interage diretamente com o receptor 5-HT

de células de

fibroblasto NIH-3T3 (Turner e Raymond, 2005), e com a isoforma 5-HT

em culturas

primárias de neurônios corticais e de células epiteliais do plexo coróide (Labasque et al.,

2008). Essa interação é capaz de regular a ativação da proteína G mediada pelas diferentes

isoformas dos receptores de serotonina.

Esse conjunto de resultados estão de acordo com outros trabalhos do nosso grupo que

reportaram a participação de mecanismos dependentes de Ca

-CaM no controle de enzimas

glicolíticas. A associação entre dímeros inativos de PFK e Ca

-CaM resulta em aumento da

atividade destes dímeros em nível comparável aos tetrâmeros da enzima. Essa associação

impediu a inibição mediada por ATP (> 1 mM), citrato ou lactato e resultou em aumento da

afinidade pelos substratos F-6-P e ATP, além de potencializar a ação estimulatória do ADP e

da F-2,6-BP (Marinho-Carvalho et al., 2006 e 2009). Em eritrócito humano a insulina ativa a

PFK agindo a partir da ativação da Ca

-CaM e da fosforilação da PFK, levando a

redistribuição da enzima que se dissocia da banda 3 inibitória (Zancan e Sola-Penna, 2005a e

2005b), deslocando a PFK que se liga a f-actina aumentando sua atividade catalítica (Real-

Hohn et al., 2010). Além disso, drogas que agem como antagonistas de CaM, como o

composto 48/80 e o clotrimazol são capazes de reduzir a viabilidade de inúmeras células com

fenótipo tumoral (Orosz et al., 1988; Orosz et al., 1997; Penso e Beitner, 2002a; Penso e

Beitner, 2002b; Lilling e Beitner, 1990; Livnat et al., 1993b; Beitner et al., 1991; Glass-

Marmor et al., 1997; Beitner, 1998; Meira et al., 2005), através da inibição de enzimas chave

da glicólise, especialmente em função do deslocamento da PFK de sítios estimulatórios no

citoesqueleto, resultando na redução do fluxo glicolítico representada pela menor produção de

lactato, culminando com a morte celular (Meira et al., 2005). Contudo, tem sido demonstrado

que os efeitos inibitórios do clotrimazol, pelo menos parcialmente, podem ocorrer regulando

diretamente a atividade catalítica da PFK (Zancan et al., 2007; Marcondes et al., 2010).

Por outro lado, a serotonina tem a habilidade de promover a fosforilação da PFK em

resíduos de tirosina, em uma via de sinalização downstream a ativação da PLC. De acordo

com nossos experimentos, a fosforilação em tirosina da PFK, é necessária para ativação da

enzima, uma vez que a inibição da atividade de tirosinas cinases previne os efeitos da

serotonina. Da mesma forma, antagonistas do receptor 5-HT

e da PLC, previnem a ativação

e a fosforilação da enzima. Até o momento não estão totalmente elucidados os mecanismos

envolvidos na fosforilação em resíduos de tirosina da PFK.

A contração da aorta torácica de ratos mediada por serotonina ocorre através do

receptor 5-HT

, acoplado a canais de cálcio do tipo L, envolvendo a atividade da PLC e de

tirosina cinases (McKune e Watts, 2001). Ogden et al., 2006 evidenciaram a participação do

substrato associado a Crk (CAS), uma proteína adaptadora que é substrato para a atividade

tirosina cinásica da Src, na contração arterial de aorta torácica de ratos mediada pelo receptor

5-HT

. CAS é uma proteína essencial para a reorganização da f-actina (Honda et al. 2003;

Tang e Tan, 2003b) regulando a polimerização da actina em células de músculo liso (Tang e

Tan, 2003a). Lu et al., 2008 identificaram a atividade tirosina cinásica da c-Src, uma isoforma

da família das Src abundantemente expressa em músculo liso, como crítica para a contração

da aorta de ratos mediado pelo receptor 5-HT

. A ativação de ERK pelo receptor 5-HT

células PC12, uma linhagem neuronal, ocorre em uma via dependente de PKC/CaM sendo

inibida por genisteína e pela proteína fosfatase 1, inibidores de tirosina cinases e Src,

respectivamente. Além disso, a ativação do 5-HT

resultou em fosforilação de uma série de

proteínas em resíduos de tirosina (Quinn et al., 2002). A administração de ketanserina,

inibidor de 5-HT

em animais com DM induzido por STZ reverte a ativação da Jak2

promovida pelo estímulo com serotonina, em células de músculo liso de ratos (Banes et al.,

2004). A ativação de receptores 5-HT

em células de músculo esquelético desencadeia uma

fosforilação rápida e transiente em resíduos de tirosina da proteína Jak2 (Guillet-Deniau et al.,

1997), na qual a serotonina é capaz de promover aumento da captação de glicose através de

uma via que não depende de elementos da sinalização insulinêmica (Hajduch et al., 1999b). A

participação da via de sinalização que envolve essas proteínas requer investigação e é uma

pergunta norteadora para nossas futuras investigações.

Nossos resultados e outros descritos na literatura nos permitem sugerir um modelo de

ação da serotonina sobre o controle da via glicolítica de músculo esquelético de

camundongos, ilustrado na figura 35. A serotonina desencadeia seus efeitos estimulatórios

sobre a atividade da PFK através da ativação do receptor 5-HT

, acoplado a proteína G,

resultando em ativação de uma via dependente de PLC. Por um lado essa ativação recruta a

PKC, e provavelmente regula flutuações nos níveis de Ca

intracelulares levando a ativação

da Ca

-CaM, com consequente ativação da CaMKII, que associa-se a PFK induzindo

ativação da enzima e aumento no fluxo glicolítico de músculo esquelético de camundongos.

Essa ativação envolve o deslocamento da PFK para frações ricas em f-actina, sugerindo a

associação a essa proteína do citoesqueleto celular, sendo capaz ainda de alterar parâmetros

cinéticos da PFK. Por outro lado, a ativação da PLC resulta em ativação de uma via

dependente de proteínas com atividade tirosina cinásicas, ainda não identificadas, que resulta

em fosforialação e ativação da PFK. Essa fosforilação é um fator importante para favorecer a

associação da PFK a f-actina e para alterar os parâmetros cinéticos da enzima.

A sinalização mediada por serotonina é independente de PKA, MEK e ERK1/2, e não

envolve a PI3K, sugerindo uma via independente do envolvimento de componentes da

sinalização mediada por insulina.

Figura 35 – Modelo de controle do fluxo glicolítico por serotonina em músculo

esquelético. A ativação de receptores 5-HT

de músculo esquelético é capaz de aumentar a

atividade da HK através de uma via ainda não elucidada. Este receptor que está acoplado a

Ptn G e PLC, leva a clivagem do PIP

, produzindo DAG e IP

, que controlam os níveis de

intracelulares e a atividade da PKC, que pode estar diretamente envolvida no controle da

PFK, ou promover junto a ativação da Ca

-CaM o controle sobre a atividade da CaMKII, que

interage com a PFK aumentando a catálise enzimática. A ativação da PLC leva ainda a

ativação de tirosina cinases capazes de fosforilar a PFK. Esse conjunto de alterações promove

o deslocamento da enzima para frações ligadas a f-actina do citoesqueleto celular.

Muitas funções do metabolismo hepático humano são controladas através de fibras

nervosas serotonérgicas, que apresentam relevante papel em resposta a lesão do tecido

hepático através de seus efeitos mitogênicos (Hsu, 1995; Lesurtel et al., 2006), e se estendem

por ramos da artéria hepática, veia porta hepática, ductos biliares e tecido conectivo do septo

interlobular (El-Salhy et al., 1993). A serotonina age como neurotransmissor e

neurohormônio endócrino no controle de suas funções hepáticas (Ruddell et al., 2008). Até o

momento, poucos trabalhos investigaram as ações da serotonina sobre o controle do

metabolismo de carboidratos no fígado.

Estudos fisiológicos conduzidos por Moore et al., 2004a; 2004b; 2005a; 2005b

demonstraram aumento da captação hepática de glicose após infusão de 5-HT ou inibidores

seletivos de 5-HT na veia porta. A 5-HT age diretamente no fígado, inibindo a síntese de

glicogênio em concentrações na faixa de micromolar, e estimulando na faixa de nanomolar

(Hampson et al., 2007). Neste trabalho nós apresentamos evidências da capacidade da

serotonina em controlar o fluxo glicolítico em extratos de fígado de camundongos. Embora a

5-HT não tenha alterado a atividade catalítica da enzima HK, o tratamento do tecido hepático

com o hormônio resultou em ativação da enzima PFK de forma dependente do tempo e da

dose, levando ao aumento da atividade quando comparado aos controles a partir de 30

minutos de pré-incubação e mantendo esse efeito até 1 hora, com diferenças significativas

após a exposição a 10 µM e 50 µM (figura 25).

A associação da PFK a proteínas do citoesqueleto de tecido hepático é um mecanismo

sinalizado pela ação da serotonina no controle da atividade da PFK, de forma semelhante

àquela observada nos extratos de músculo esquelético. Os efeitos da serotonina são aditivos

ao controle positivo da PFK mediados por F-2,6-BP e por insulina (figuras 26, 27 e 28). De

forma semelhante, o estímulo a síntese de glicogênio promovida por α-metil-5-HT, um

agonista dos receptores das famílias 5-HT

/5-HT

, foi aditivo a ação da concentração mais

efetiva de insulina (Hampson et al., 2007). A F-2,6-BP é o mais potente modulador alostérico

da PFK, e tem fundamental importância no controle do metabolismo de carboidratos no

fígado (Wu et al., 2006; Okar et al., 2004; Choi et al., 2002). A insulina é um dos principais

hormônios com habilidade de regular positivamente a atividade da enzima bifuncional PFK-2,

elevando os níveis de F-2,6-BP (Hamer e Dickson, 1990). De fato, o aumento da glicólise

plasmática através da super expressão da PFK-2 ou GK é capaz de reduzir a obesidade (Wu et

al., 2005), a glicemia no DM (Choi et al., 2002), e a produção hepática de glicose, suprimindo

a resistência hepática a insulina no DM tipo 2 (Wu et al., 2002). De forma semelhante o

tratamento com inibidores seletivos da recaptação de serotonina melhoram a tolerância a

glicose em quadros de DM (Pestell et al., 1989). Esses dados sugerem que a serotonina é

capaz de aumentar o metabolismo glicolítico hepático.

Células estrelares de fígado, encontradas no espaço perisinusoidal, com participação

importante nos processos de fibrose (Krizhanovsky et al., 2008) expressam várias isoformas

de receptores de serotonina incluindo os receptores 5-HT

, 5-HT

e 5-HT

(Ruddell et al. 2008). A ativação da PFK mediada por serotonina em tecido hepático é

dependente da isoforma 5-HT

, como observado em músculo esquelético, uma vez que a

presença de 1 µM ketanserina, antagonista específico de 5-HT

, reverteu os efeitos da

serotonina (figura 29). A participação dos receptores 5-HT

e 5-HT

é chave na mediação

dos efeitos da serotonina sobre a proliferação do hepatócito e da recuperação tecidual após

injúria (Ruddell et al., 2008), e de fato a ketanserina é um potente inibidor destes processos

(Papadimas et al., 2006). Adicionalmente a habilidade da serotonina em controlar o fluxo

sanguíneo e o tônus vascular hepático é reduzida com o tratamento de diferentes antagonistas

do receptor 5-HT

(Ruddell et al., 2008).

A inibição de tirosina cinases com o tratamento dos tecidos hepáticos com genisteína

preveniu a ativação da PFK mediada por serotonina de modo dependente da dose. A

concentração de 1 µM não exerceu efeitos significativos, enquanto que 10 µM reverteu a

ativação da PFK parcialmente e 50 µM reduziu a atividade enzimática aos níveis do controle

(figura 30), sugerindo o envolvimento de uma via dependente da atividade de tirosina cinases.

Da mesma forma a incubação com o inibidor de PLC, U-73122, impediu os efeitos positivos

da serotonina sobre o controle da atividade da enzima (figura 32), e ao testarmos a atividade

da PFK na presença de concentrações crescentes de PMA, o qual mimetiza a ação do DAG,

observamos que o PMA é capaz de ativar a PFK de fígado de forma dependente da dose,

atingindo níveis de ativação da enzima semelhantes àqueles observados para ação da 5-HT.

Adicionalmente, o tratamento dos extratos de tecido hepático com PMA e F-2,6-BP

simultaneamente promove efeito sinérgico no aumento da atividade da PFK, resultando em

ativação da enzima semelhante a observada para a ação conjunta da 5-HT e F-2,6-BP (figura

33). Esse conjunto de resultados sugere que a ativação da PFK de tecido hepático

desencadeada por 5-HT envolve a participação de uma via dependente de PLC-PKC e de

tirosinas cinases. Essas observações assemelham-se aos dados descritos para a ação da

serotonina no controle da PFK de músculo esquelético, e trabalhos de outros grupos que

evidenciaram a capacidade da serotonina em controlar ações metabólicas através de vias

dependentes destes componentes da sinalização celular, correlacionando ainda a participação

do receptor 5-HT

e a reorganização de proteínas estruturais do citoesqueleto celular

(McKune e Watts, 2001; Ogden et al., 2006; Honda et al. 2003; Tang e Tan, 2003b; Lu et al.,

2008; Quinn et al., 2002; Banes et al., 2004; Guillet-Deniau et al., 1997).

A adição de wortmanina, inibidor de PI3K, aos extratos de tecido hepático de

camundongos mostrou a habilidade de prevenir a ação estimulatória da serotonina sobre a

atividade da PFK de modo dependente da dose. Com concentrações de 10 nM do composto a

atividade da PFK é parcialmente inibida, enquanto que 100 nM wortmanina reduz a atividade

catalítica da enzima a níveis comparáveis aos dos controles (figura 31), evidenciando a

participação da PI3K nos resultados observados. Esses dados sugerem o envolvimento de uma

via de sinalização comum a utilizada por insulina no controle do metabolismo de carboidratos

no fígado. Adicionalmente, já foi descrita a capacidade da serotonina em exercer efeitos

proliferativos em células de músculo liso de artérias pulmonares, em uma via dependente da

ativação de PI3K-Akt, recrutada a partir da ativação do receptor 5-HT

(Liu e Fanburg,

2006).

100

Em resumo, a serotonina tem a habilidade de regular o fluxo glicolítico de fígado

agindo através do receptor 5-HT

, e recrutando duas alças de regulação para promover

ativação da enzima PFK. Por um lado a serotonina utiliza uma via dependente de PI3K, por

outro ativa a PLC que provavelmente regula positivamente a atividade da PKC levando a

ativação da PFK. A participação da CaMK nestes efeitos, como visto em músculo esquelético,

requer mais experimentos, contudo já está relatado o controle de enzimas chave do fluxo

glicolítico pela ação da CaMK em fígado (Mieskes et al., 1987). Os efeitos da serotonina

sobre o controle da PFK ocorrem de forma sinérgica a ação da insulina, provavelmente em

função da capacidade da insulina em ativar a função cinásica da enzima bifuncional PFK-2,

elevando os níveis de F-2,6-BP que controlam a PFK por meio de mecanismos alostéricos

(Choi et al., 2002; Wu et al., 2006). A alteração da localização celular da PFK de tecido

hepático é um mecanismo importante envolvido na sinalização mediada por serotonina, que

estimula a associação entre a PFK e a f-actina, regulando positivamente a atividade da PFK.

Esses resultados estão ilustrados na figura 36.

Os mecanismos envolvidos no controle do fluxo glicolítico do fígado por serotonina

não estão completamente elucidados e futuras investigações são necessárias para ampliar o

entendimento dos processos celulares que participam destes eventos. O fígado tem a

extraordinária habilidade de promover regeneração tecidual (Mabuchi et al., 2004), e muitas

questões acerca dos processos envolvidos nesse fenômeno encontram-se sem resposta. No

entanto, parece consenso na literatura que a serotonina apresenta importante papel no reparo

tecidual, com envolvimento em processos de proliferação celular, controle da expressão de

fatores de crescimento e regulação do fluxo sanguíneo (Ruddell et al., 2008).

101

Figura 36 – Modelo de ativação da PFK mediado por serotonina. A ativação de

receptores 5-HT

de músculo esquelético é capaz de aumentar a atividade da PFK através de

duas vias de sinalização, uma via dependente de PLC/PKC e outra envolvendo a PI3K. Os

mecanismos que se seguem a ativação destas vias, provavelmente envolve tirosina cinases,

contudo não estão completamente esclarecidos. Os efeitos da insulina sobre o controle da

PFK se dão a partir da ativação do receptor de insulina (IR) com recrutamento do substrato do

receptor de insulina (IRS), culminando com a ativação da PFK-2, elevando os níveis de F-2,6-

BP, que ativam a PFK. A serotonina e a F-2,6-BP apresentam efeitos positivos sinérgicos

sobre a atividade catalítica da PFK. Esse conjunto de alterações promove o deslocamento da

enzima para frações ligadas a f-actina do citoesqueleto celular.

Lesurtel et al., 2006 identificaram as plaquetas como a principal fonte da serotonina

envolvida na regeneração hepática, e esses efeitos foram mimetizados pelo agonista dos

receptores da família 5-HT

, 2,5-dimetoxi-4-iodoamfetamina (DOI) e foram antagonizados

por ketanserina. Pacientes com doença hepática avançada apresentam tendência a desenvolver

quadros hemorrágicos, esses sintomas associados a cirrose hepática são atribuídos em parte a

incapacidade de agregação plaquetária, em função da deficiência de vários fatores que

promovem agregação, incluindo a serotonina (Laffi et al., 1992). Pacientes com cirrose

102

apresentam redução significativa da concentração plasmática periférica de serotonina, bem

como menor concentração de serotonina intraplaquetária (Beaudry et al., 1994; Ćulafić et al.,

2007). Essas observações sugerem que a redução nos níveis de serotonina compromete o

reparo do tecido hepático e desencadeia a maior propensão a sangramentos (Ruddell et al.,

2008). A importância da habilidade da serotonina em controlar a glicólise hepática para

desencadear suas ações de proliferação celular e reparo tecidual requer investigações.

Por outro lado, as ações da serotonina sobre o metabolismo hepático podem ser

deletérias, contribuindo para a fibrose hepática (Ruddell et al., 2006), mediando estresse

oxidativo na esteatose hepática (Nocito et al., 2007) e agravando a hepatite viral (Lang et al.,

2010). Todas essas condições estão envolvidas na tumorigênese do carcinoma hepatocelular

(Schuppan et al., 2008). Nesse contexto a serotonina participa como um fator facilitador da

sobrevivência celular em uma via que envolve a proteína de mamíferos alvo da rapamicina

(mTOR) e a p70 S6K, uma serina/treonina cinase estimulada por sinal mitogênico (Soll et al.,

2010), através principalmente do receptor 5-HT

. (Lesurtel et al., 2006). A possível

implicação dos efeitos da serotonina descritos neste trabalho com a tumorigênese é intrigante.

O controle positivo do fluxo glicolítico é um fenômeno determinante para a viabilidade

celular e contribuí nas adaptações fenotípicas de vários tipos de câncer, correlacionando-se

diretamente ao grau de agressividade do tumor (Gatenby e Gillies, 2004; Gillies e Gatenby,

2007; Gatenby e Gillies, 2007).

Alterações nos mecanismos periféricos e centrais mediados por serotonina ainda têm

implicações no DM tipo 2 através do controle da ingestão alimentar, gasto calórico e

homeostase de glicose (Lam e Heisler, 2007), no qual observa-se aumento da concentração

plasmática livre de serotonina, em função de uma menor capacidade de captação deste

hormônio pelas plaquetas (Pietraszek et al., 1992). Além disso, a indução do DM tipo 2 em

ratos tratados com dexametasona demonstraram alterações significativas no número e no

103

conteúdo granular de células produtoras de serotonina do intestino, alterando a secreção

hormonal (Glisic et al., 2006). A associação entre o DM e vários tipos de câncer vem sendo

estudada há pelo menos 100 anos (Wolf et al., 2005), em que o diabetes é um fator de risco no

desenvolvimento de alguns tumores, incluindo câncer endometrial, carcinoma pancreático

(Czyzyk e Szczepanik, 2000) e câncer de mama (Wolf et al., 2005).

As alterações serotonérgicas relatadas em quadros de DM e sua eventual participação

no desenvolvimento de fenótipos tumorais em diversos tecidos através do controle do fluxo

glicolítico é uma questão interessante a ser investigada. Essa hipótese é sustentada pelo relato

de estudos que sugerem que alguns fármacos com ação antidepressiva, por meio da inibição

da recaptação de serotonina, promovem o desenvolvimento de tumores mamários em animais

(Sharpe et al., 2002, Cotterchio et al., 2000, Kelly et al., 1999, Wang et al., 2001, Brandes et

al., 1992, Hilakivi-Clark et al., 1993), e pelos efeitos reportados para drogas serotonérgicas

como fenfluramina, fluoxetina e sertralina, que melhoram a tolerância a glicose e a

sensibilidade a insulina em modelos de ratos obesos e diabéticos e em humanos diabéticos

(Arora et al., 1988; Gomez et al., 2001; Jorgensen, 1977; Picarel-Blanchot, 1994; Russell et

al., 1998; Breum et al., 1995; Maheux et al., 1997; Pestell et al., 1989; Potter van Loon et al.,

1992; Scheen et al., 1991).

Esses dados sustentam nossas observações in vivo, na qual a serotonina foi capaz de

promover redução da glicemia em camundongos saudáveis e com diabetes induzido por STZ

(figura 34), corroborando com os resultados descritos para o controle da PFK em fígado,

quando a serotonina é capaz de agir na ausência de insulina ou sinergicamente a ação da

insulina ou de F-2,6-BP. Essas observações nos permitem propor que as vias metabólicas

controladas por serotonina para a regulação do fluxo glicolítico são importantes candidatas a

alvo terapêutico para o controle de vários quadros patológicos.

104

6. CONCLUSÕES

A serotonina é capaz de regular a atividade da PFK de músculo esquelético e tecido

hepático de camundongos.

Os efeitos da serotonina envolvem a ativação do receptor 5-HT

Em músculo a ativação da PFK depende, por um lado, de uma via de sinalização com

a participação da PLC-PKC-Ca

-CaM e CaMKII. Por outro lado, envolve a ação de

tirosina cinases.

A ativação da PFK de músculo não envolve PI3K, PKA, MEK e ERK1/2.

Em músculo e fígado a serotonina promove a associação da PFK a proteínas do

citoesqueleto celular, aumentando a atividade enzimática.

Em tecido hepático a ativação da PFK por serotonina ocorre através da PLC e

provavelmente da PKC.

A serotonina e a insulina apresentam efeitos sinérgicos sobre a atividade da PFK

hepática.

A serotonina é capaz de reduzir a glicemia em animais saudáveis ou diabéticos tipo 1.

105

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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