( PDF ) Caracterização da bacteriocina produzida por lactococcus lactis subsp. lactis MK02R isolado de rúcula (Euruca Sativa Mill) e avaliação do seu potencial probiótico utilizando o modelo dinâmico TIM-1

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos

Área de Bromatologia

Caracterização da bacteriocina produzida por Lactococcus lactis subsp.

lactis MK02R isolado de rúcula (Euruca sativa Mill.) e avaliação do seu

potencial probiótico utilizando o modelo dinâmico TIM-1

Monika Francisca Kruger

Tese para obtenção do grau de

DOUTOR

Orientadora:

Profa. Dra. Bernadette D. G. M. Franco

São Paulo

2010

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Monika Francisca Kruger

Caracterização da bacteriocina produzida por Lactococcus lactis subsp. lactis

MK02R isolado de rúcula (Euruca sativa Mill.) e avaliação do seu potencial

probiótico utilizando o modelo dinâmico TIM-1

Comissão Julgadora

Tese para obtenção do grau de Doutor

Profa. Dra. Bernadette Dora Gombossy de Melo Franco

orientador/presidente

____________________________

. examinador

____________________________

. examinador

____________________________

. examinador

____________________________

. examinador

São Paulo, ___________________ de _______ .

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“Viva como se você fosse morrer amanhã,

mas aprenda como se você fosse viver para sempre”

Mahatma Ghandi

AGRADECIMENTOS

À Prof

. Dr

Bernadette D. G. M. Franco, pela orientação segura, oportunidade de

aprendizado e confiança depositada em mim durante todo o curso de doutorado.

Ao Matheus de Souza Barbosa, Dr. Svetoslav D. Todorov e Daniella N. Furtado pela

amizade verdadeira e pelo apoio durante a realização dos experimentos.

Ao prof

. Dr. Antônio de Miranda do Departamento de Biofísica da Universidade Federal

de São Paulo pelo apoio nas realizações dos testes cromatográficos.

Ao prof

. Dr. João Moreira do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de

Minas Gerais pelo auxílio na identificação do isolado MK02R.

Às professoras Dr

Maria Teresa Destro e Dr

Mariza Landgraf pela atenção e o pronto

auxílio nos momentos de dúvidas.

À prof

. Dr

Susana Saad pela oportunidade de participação no projeto CAPES-

WAGENINGEN (n°. 3916-06-5), o qual me proporcionou a realização do estágio na

Holanda.

Aos professores Dr. Hauke Smidt e Dr. Erwin Zoetendal da Universidade de Wageningen

pelo auxilio constante na execução e análise dos experimentos realizados.

Ao Dr. Koen Venema e Sanne Van Rijn pelo apoio na execução e análise dos experimentos

realizados no TNO (Zeist, Holanda) e pelo convívio agradável.

Aos colegas do Laboratório de Microbiologia da Universidade de Wageningen pelo auxílio

e pelos momentos agradáveis de descontração.

Às funcionárias Kátia e Lúcia do Laboratório de Microbiologia de Alimentos da FCF-USP

pelo incentivo, apoio e amizade.

Aos colegas do Laboratório de Microbiologia de Alimentos da FCF-USP pelo convívio

agradável no ambiente de trabalho e também pelos bons momentos de descontração que

compartilhamos.

Aos funcionários Jorge e Elaine da secretaria de Pós-graduação da FCF-USP pela paciência

e disposição.

Aos secretários Mônica, Edilson e Cleonice da FCF-USP, pela colaboração e auxílio nos

momentos necessários.

À minha mãe Elza, ao meu pai Armin (in memorium), e aos meus irmãos Rainer, Karin,

Francine e Roberto, pelo amor, respeito, reconhecimento, compreensão e apoio em todos

os momentos da minha vida.

À minha tia Brunilde e ao tio André pela inspiração, amor, reconhecimento e apoio.

Aos meus sobrinhos Anna Luiza e Erich por trazerem sempre aquele sorriso ingênuo e

alegre de criança, tornando minha vida muito feliz.

À toda minha família, meus tios e primos, e meus amigos que na convivência do dia-a-dia

me apóiam e me respeitam e, sem perceberem, tornam mágicos muitos momentos de

minha vida.

Ao Krisztián Kovacs pelas flores, amor e amizade e à família Kovacs pelo carinho e apoio.

À CAPES pela concessão das bolsas de estudo do programa de doutorado, do programa

PAE e do programa de estágio no exterior.

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS ........................................................................................................................... X

LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................................... XI

LISTA DE ANEXOS ......................................................................................................................... XIV

RESUMO ........................................................................................................................................ XV

ABSTRACT .................................................................................................................................... XVII

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 01

1.1. Bactérias láticas e suas aplicações em alimentos ........................................................................ 02

1.2. BAL e segurança dos alimentos .......................................................................................................... 05

1.2.1. Nisina e suas aplicações em alimentos ..................................................................................... 11

1.3. BAL como cultura probiótica em alimentos funcionais .................................................................... 16

2. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 21

2.1. Objetivo global .................................................................................................................................. 21

2.2. Objetivos específicos ........................................................................................................................ 21

3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................................... 23

3.1. Isolamento e identificação de bactérias láticas ........................................................................... 23

3.1.1. Isolamento de bactérias láticas ........................................................................................ 23

3.1.2. Caracterização morfológica e bioquímica dos isolados ................................................... 23

3.1.3. Avaliação inicial da atividade antimicrobiana das BAL isoladas ....................................... 24

3.1.4. Identificação do isolado MK02R ....................................................................................... 25

3.2. Identificação e caracterização das bacteriocinas ......................................................................... 26

3.2.1. Avaliação da natureza protéica ........................................................................................ 27

3.2.2. Caracterização da bacteriocina produzida pelo isolado MK02R ...................................... 27

3.2.2.1. Avaliação da estabilidade térmica ........................................................................................ 28

3.2.2.2. Avaliação da influência do pH ............................................................................................... 28

3.2.2.3. Avaliação da sensibilidade à compostos tensoativos, detergentes e NaCl .......................... 29

3.2.2.4. Avaliação do espectro de ação ............................................................................................. 29

3.2.3. Avaliação da ação da bacteriocina MK02R ............................................................................. 31

3.2.3.1. Avaliação da inibição da multiplicação microbiana .............................................................. 31

3.2.3.2. Avaliação da capacidade de causar lise celular .................................................................... 31

3.2.4. Avaliação da influência da temperatura e da presença de cisteína na produção da

bacteriocina MK02R ................................................................................................................................. 32

3.2.5. Determinação da presença do gene nisina no isolado MK02R ........................................... 33

3.2.6. Adsorção da bacteriocina MK02R às células produtoras ..................................................... 34

3.2.7. Purificação da bacteriocina MK02R ........................................................................................ 34

3.2.8. Análise por cromatografia de fase líquida (HPLC) e espectrometria de massas .............. 35

3.3. Avaliação da sobrevivência das BAL no ambiente simulado do trato gastrointestinal

humano, utilizando o modelo dinâmico TIM-1 .................................................................................... 36

3.3.1. Preparo do modelo dinâmico do trato gastrointestinal TIM-1 para a realização dos

experimentos ................................................................................................................................ 39

3.3.2. Preparo do material para os testes no modelo dinâmico do trato gastrointestinal

TIM-1 ............................................................................................................................................. 41

3.3.3. Avaliação da sobrevivência das BAL no modelo dinâmico do trato gastrointestinal

TIM-1 ............................................................................................................................................. 43

3.3.4. Avaliação da atividade de bacteriocinas após o trânsito no modelo dinâmico do

trato gastrointestinal TIM-1 .......................................................................................................... 44

3.3.5. Análise estatística ............................................................................................................ 45

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................................... 46

4.1. Isolamento e identificação das cepas de BAL isoladas de rúcula .............................................. 46

4.2. Caracterização da bacteriocina produzida por L. lactis MK02R ................................................. 48

4.2.1. Avaliação do espectro de atividade da bacteriocina produzida por L. lactis MK02R ...... 50

4.2.2. Avaliação da inibição da multiplicação microbiana .............................................................. 52

4.2.3. Avaliação da capacidade de causar lise celular ..................................................................... 53

4.2.4. Avaliação da influência da temperatura e da presença de cisteína na produção da

bacteriocina MK02R ................................................................................................................................. 54

4.2.5. Adsorção de bacteriocina MK02R às células produtoras .................................................... 57

4.2.6. Determinação da presença do gene de nisina em L. lactis MK02R. ................................... 58

4.2.7. Determinação dos aminoácidos da bacteriocina MK02R por espectrometria de

massas após purificação por cromatografia de fase-líquida (HPLC) ................................................. 61

4.3. Avaliação da sobrevivência de L. lactis MK02R, L. sakei 2a e do efeito do co-cultivo

com E. faecium LMA1 no modelo dinâmico do trato gastrointestinal TIM-1 ................................. 64

4.3.1. Avaliação da produção de bacteriocinas por L. lactis MK02R e L. sakei 2a no

modelo dinâmico do trato gastrointestinal TIM-1 .............................................................................. 70

5. CONCLUSÕES ............................................................................................................................ 73

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................ 75

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Características bioquímicas de bactérias láticas (adaptado de Salminen et

al., 2004)

Tabela 2: Classificação das bacteriocinas produzidas por bactérias Gram positivas

segundo Klaenhammer (1993)

Tabela 3: Classificação das bacteriocinas produzidas por bactérias Gram positivas

proposta por Cotter, Hill e Ross (2005)

Tabela 4: Classificação das bacteriocinas produzidas por bactérias Gram positivas

proposta por Heng et al. (2007)

Tabela 5: Cepas bacterianas e condições de cultivo empregadas na determinação

do espectro da bacteriocina produzida pelo isolado MK02R

Tabela 6: Microrganismos utilizados nos testes no modelo dinâmico TIM-1

Tabela 7: Composição da amostra inicial injetada no modelo dinâmico TIM-1

Tabela 8: Caracterização inicial da substância antimicrobiana produzida por L. lactis

MK02R avaliada pelo método spot-on-lawn

Tabela 9: Espectro de atividade do sobrenadante da cultura de L. lactis MK02R

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura primária das variantes naturais de nisina: A, Z, Q e U. Dha,

dehidroalanina; Dhb, dehidrobutirina; Ala-S-Ala, lantionina; Abu-S-Ala, metil-

lantionina. Os aminoácidos marcados em cinza diferem dos aminoácidos da nisina A.

Figura 2: Mecanismos de ação da nisina. A dupla ação está representada por sua

ligação à membrana, causando a formação de poros e também o bloqueio da síntese

de peptideoglicanos da parede celular.

Figura 3: Esquema simplificado do modelo dinâmico TIM-1 (TNO). A) compartimento

do estômago; B) esfíncter pilórico; C) compartimento do duodeno; D) válvula

peristáltica; E) compartimento do jejuno; F) válvula peristáltica; G) compartimento

do íleo; H) válvula íleo-cecal; I) eletrodos de pH; J) frasco de secreção gástrica com

ácidos e enzimas; K) frascos de secreções duodenais com e bicarbonato; L) soluções

com eletrólitos para controle do pH intestinal; M) pré-filtro N) filtro com membranas

de exclusão de 5 kDa; O) sistema de absorção de líquidos; P) fechamento do sistema

de diálise.

Figura 4: Média dos valores de pH nos compartimentos do estômago, duodeno,

jejuno e íleo no modelo TIM-1, durante os experimentos.

Figura 5: Proporção dos volumes médios do efluxo final e de líquidos retidos durante

os experimentos no modelo TIM-1.

Figura 6: Produto de 800 pb gerado por amplificação do 16S-23S DNAr de L. lactis

MK02R. Marcador de peso molecular (M) de 1 Kb.

Figura 7: Restrição enzimática do amplicom do produto de PCR do 16S-23S DNAr de

L. lactis MK02R. Os sinais positivos e negativos na parte inferior da figura significam

clivagem positiva ou negativa, respectivamente. Marcador de peso molecular (M) de

1 Kb.

Figura 8: Multiplicação de Listeria innocua a 37°C em caldo BHI com ou sem a adição

de 20% do sobrenadante da cultura de L. lactis MK02R.

XII

Figura 9: Multiplicação de Listeria monocytogenes Scott A a 37°C em caldo BHI com

ou sem a adição de 20% do sobrenadante da cultura de L. lactis MK02R.

Figura 10: Multiplicação de Lactobacillus sakei ATCC 15521 a 30°C em caldo MRS

com ou sem a adição de 20% do sobrenadante da cultura de L. lactis MK02R.

Figura 11: Multiplicação de L. lactis MK02R (linhas) e produção da bacteriocina

MK02R (barras) a 37°C em caldo MRS acrescido de 0,0%, 0,5% ou 1,0% de cisteína.

Figura 12: Multiplicação de L. lactis MK02R (linhas) e produção da bacteriocina

MK02R (barras) a 30°C em caldo MRS acrescido de 0,0%, 0,5% ou 1,0% de cisteína.

Figura 13: Multiplicação de L. lactis MK02R (linhas) e produção da bacteriocina

MK02R (barras) a 25°C em caldo MRS acrescido de 0,0%, 0,5% ou 1,0% de cisteína.

Figura 14: Produto de amplificação do DNA obtido através da PCR com os primers de

expressão de nisina (Nisf e Nisr). Marcador de peso molecular (M) de 100 pb.

Figura 15: Sequência de aminoácidos da bacteriocina produzida por L. lactis MK02R

deduzida por análise do DNA, comparada com as sequências das nisinas A, Z, F e Q.

O peptídeo líder das variantes de nisina consiste de 13 aminoácidos (da posição -13

até a posição 1), seguida pelos aminoácidos que codificam o peptídeo maduro (da

posição 1 até a posição 34). A diferença entre os aminoácidos da nisina produzida

por L. lactis MK02R em relação às outras variantes de nisina estão sinalizadas com a

cor vermelha.

Figura 16: Perfil cromatográfico (HPLC) da amostra purificada da bacteriocina MK02R

utilizando a coluna preparativa C

(2,2  150 mm, 3,5 m, 60 poros, Nova-Pak,

Waters C18).

Figura 17: Perfil da espectrometria de massas da bacteriocina MK02R (A) e da nisina

Z (B). (A) Obtido utilizando Micromass (ZMD- Waters Corporation, Milford, MA,),

com eluição em 30 minutos com gradiente linear de acetonitrila (CH

CN) acidificado

de 5% a 95% a uma vazão de 0,4 ml/min. (B) Obtido de Sun et al. (2009).

XIII

Figura 18: Viabilidade de Lactococcus lactis MK02R utilizando os Protocolos 1 e 2 (P1

e P2) durante o trânsito no modelo dinâmico TIM-1

Figura 19: Viabilidade de Lactobacillus sakei 2a utilizando os Protocolos 1 e 2 (P1 e

P2) durante o trânsito no modelo dinâmico TIM-1

Figura 20: Viabilidade de Enterococcus faecium LMA1 utilizando os Protocolos 1 e 2

(P1 e P2) durante o trânsito no modelo dinâmico TIM-1

Figura 21: Flutuação das contagens da população de L. lactis MK02R em comparação

com as amostras iniciais durante a passagem no modelo TIM-1

Figura 22: Flutuação das contagens da população de L. sakei 2a em comparação com

as amostras iniciais durante a passagem no modelo TIM-1

Figura 23: Flutuação das contagens da população de E. Faecium LMA1 em

comparação com as amostras iniciais durante a passagem no modelo TIM-1

XIV

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1: Anotação do sequenciamento genético do 16-23S DNAr de Lactococcus

lactis subsp. lactis MK02R

Anexo 2: Representação dos aminoácidos em código, abreviação, bem como seu

códon genético

RESUMO

Após a constatação da escassez de estudos realizados com vegetais crus

na busca por novas estirpes de bactérias láticas (BAL) produtoras de bacteriocinas

e diante do potencial tecnológico da aplicação destas cepas tanto como agentes

de conservação em alimento, bem como cultura probiótica em alimentos

funcionais, este estudo objetivou isolar e identificar cepas de bactérias láticas

potencialmente bacteriocinogênicas de amostras de rúcula obtidas no comércio

local de São Paulo, SP – Brasil, identificar e caracterizar as bacteriocinas

produzidas pelos isolados e avaliar o potencial probiótico dos isolados testando

sua sobrevivência no modelo dinâmico do trato gastrointestinal TNO gastro-

Intestinal Model - TIM-1 disponível no TNO (The Netherlands Organization for

Applied Scientific Research) divisão Quality of Life (Zeist, Holanda). A produção de

bacteriocinas neste modelo também foi avaliada, comparando-se com L. sakei 2a,

também produtora de bacteriocinas e ainda avaliou-se a interferência na

viabilidade de E. faecium LMA1. A cepa Lactococcus lactis subsp. lactis MK02R de

rúcula produziu uma bacteriocina sensível à enzimas proteolíticas, termoestável e

não influenciada pelo pH, sendo capaz de inibir Enterococcus faecium,

Lactobacillus sakei, Listeria innocua, Lactobacillus delbrueckii e Listeria

monocytogenes de diferentes grupos sorológicos. Os ensaios genéticos utilizando

primers Nisf e Nisr confirmaram que a bacteriocina MK02R é uma nisina,

apresentando uma alteração dos aminoácidos no peptídeo líder em relação às

nisinas A, Z, Q, F e U, porém com a estrutura do peptídeo maduro idêntica ao da

nisina F. Estes resultados foram confirmados por espectrometria de massas de

amostras purificadas por HPLC. L. lactis MK02R resistiu à passagem no modelo

XVI

dinâmico TIM-1, apresentando uma alta capacidade de sobreviver nas condições

simuladas do trato gastrointestinal humano. Entretanto, não foi capaz de causar a

redução no número de E. faecium LMA1. Em contrapartida, L. sakei 2a, mesmo

apresentando uma sobrevivência menor, foi capaz de causar uma redução de 70%

na população de E. faecium LMA1 no ambiente simulado do TGI. Não foi

detectada atividade residual da ação antimicrobiana das bacteriocinas produzidas

por L. lactis MK02R ou L. sakei 2a após a passagem pelo modelo dinâmico TIM-1.

Estes resultados evidenciam a possível aplicação de L. lactis MK02R como um

agente de controle biológico na conservação de alimentos e também como uma

cultura potencialmente probiótica.

Palavras-chave: Bactérias ácido láticas (BAL), Lactococcus lactis subsp. lactis,

Nisina, Trato gastrointestinal, Probióticos, Vegetais.

XVII

ABSTRACT

Given the scarcity of studies performed with raw vegetables addressing the

search for new bacteriocinogenic strains of lactic acid bacteria (LAB) and

considering the technological application of these strains as food preservatives and

probiotic cultures in functional foods, this study was aimed at isolation and

identification of bacteriocinogenic LAB strains from samples of rocket salad

obtained in the local market of São Paulo, SP - Brazil, subsequent characterization

of the bacteriocins produced by these LABs and evaluation of their probiotic

potential by testing their survival in the dynamic gastrointestinal model TNO gastro-

Intestinal-Model - TIM-1, available at the TNO (Netherlands Organization for

Applied Scientific Research) Quality of Life division (Zeist, Netherlands). The

studies in the TIM-1 model were also done with another bacteriocinogenic strain L.

sakei 2a for comparison, evaluating their interference on the viability of E. faecium

LMA1. The bacteriocin produced by strain Lactococcus lactis subsp. lactis MK02R

isolated from rocket salad was sensitive to proteolytic enzymes, heat-stable and not

influenced by the pH. The bacteriocin inhibited the growth of Enterococcus faecium,

Lactobacillus sakei, Listeria innocua, Lactobacillus delbrueckii and Listeria

monocytogenes from different serological groups. The amplification with specifc

primers Nisf and Nisr indicated that the bacteriocin produced by the strain MK02R

is a nisin, with a change in the amino acid sequence of the leader peptide when

compared to nisin A, Z, Q, U and F, but with the structure of the mature peptide

homologous to that of nisin F. These results were confirmed by mass spectrometry

of purified samples obtained by HPLC. L. lactis MK02R withstood the test in the

dynamic model TIM-1, presenting capability to survive in the simulated conditions

XVIII

of the human gastrointestinal tract. However, the strain was not able to cause a

reduction in the number of E. faecium LMA1. On the other hand, L. sakei 2a, even

presenting lower survival, was able to cause 70% reduction in the population of E.

faecium LMA1 in the gut simulated environment. No residual antimicrobial activity

of bacteriocin produced by L. lactis MK02R or L. sakei 2a was detected after the

transit through the dynamic model TIM-1. These results demonstrate the possible

application of L. lactis MK02R both as a biocontrol agent in food preservation and

as a potentially probiotic culture.

Keywords: Lactic acid bacteria (LAB), Lactococcus lactis subsp. lactis MK02R,

Nisin, Probiotic, Vegetables.

1. INTRODUÇÃO

Bactérias láticas ou bactérias ácido láticas (BAL) constituem um grupo de

microrganismos amplamente distribuídos na natureza. As BAL são

tradicionalmente usadas na fermentação de alimentos e bebidas, contribuindo para

o desenvolvimento do sabor e do aroma através da produção de compostos

aromáticos (Ponce et al., 2008; Saguir et al., 2009). Entretanto, sua utilização em

alimentos se torna a cada dia mais interessante por vários motivos além da

fermentação.

Muitas BAL são capazes de produzir de uma grande variedade de

compostos antimicrobianos, tais como ácidos orgânicos, diacetil, peróxido de

hidrogênio, dióxido de carbono, álcool, aldeídos e bacteriocinas, que podem

interferir na multiplicação de bactérias deteriorantes e patogênicas presentes nos

alimentos. As bacteriocinas produzidas pelas BAL se apresentam como uma

alternativa tecnológica bastante promissora na solução do aumento da resistência

microbiana decorrente do uso de conservantes convencionais (Gálvez et al., 2010;

Mitra, Chakrabartty e Biswas, 2010; Ponce et al., 2008; Rodríguez et al., 2010;

Soliman e Donkor, 2010).

Outro motivo do interesse da indústria pelas BAL é que algumas espécies,

como Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus rhamnosus, são reconhecidamente

probióticas, agregando o status de alimento funcional ao produto onde são

adicionados (Justé, Thomma e Lievens, 2008). Além disso, a utilização de culturas

de BAL e/ou seus produtos metabólicos em alimentos é reconhecida pelos

consumidores como uma forma natural de conservação, o que demonstra seu

aspecto positivo considerando a demanda crescente por produtos livres de

conservantes artificiais (Carr, Chill e Maida, 2002; Gálvez et al., 2010; Rodríguez et

al., 2003).

1.1. Bactérias láticas e suas aplicações em alimentos

A designação bactérias láticas (BAL) se aplica a um grupo de bactérias que

têm o ácido lático como principal produto metabólico da fermentação de açúcares,

gerados através de duas vias metabólicas distintas: a via glicolítica e a via da

pentose-fosfato (Axelsson, 1998; Klaenhammer et al., 2005). Desde o primeiro

isolamento de uma cultura pura de uma bactéria produtora de ácido lático de

amostras de leite por J. Lister em 1873, classificada como "Bacterium lactis"

(Axelsson, 1998), houve uma expansão na classificação destas bactérias, que

passaram a ser isoladas de vários outros alimentos e também do trato

gastrointestinal (TGI) de humanos e de animais.

As BAL são microrganismos Gram positivos, não patogênicos, não

esporulados, anaeróbios/aerotolerantes, desprovidos de citocromos, apresentam

reação de catalase negativa, são ácido tolerantes e possuem o metabolismo

estritamente fermentativo (Górska et al., 2007). Os gêneros Lactobacillus,

Streptococcus, Leuconostoc e Pediococcus formam a base do grupo das bactérias

láticas. Além destes, os gêneros Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus,

Lactococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, e Weissella possuem

importância do ponto de vista da tecnologia dos alimentos (Górska et al., 2007),

enquanto que os gêneros Lactobacillus, Streptococcus e Enterococcus são

microrganismos comensais do TGI humano (Ranadheera, Baines e Adams, 2010).

A diferenciação dos gêneros dentro do grupo das bactérias láticas está

baseada no modo de fermentação da glicose em condições específicas de

multiplicação, podendo ser caracterizadas como homofermentativas, quando o

produto metabólico é principalmente ácido lático, ou heterofermentativas, quando

além do ácido lático, são produzidos também o etanol, ácido acético e CO

(Kučerová et al., 2007).

Os gêneros de BAL diferem entre si em relação à temperatura de

multiplicação, tolerância ao NaCl e sais biliares e resistência ao pH. A Tabela 1

apresenta resumidamente as características bioquímicas dos diferentes gêneros

de BAL (Kučerová et al., 2007; Salminen, Von Wright e Ouwehand, 2004). No

entanto, para a identificação das espécies das BAL são necessários testes de

fermentação de carboidratos, formação de acetoína, análise da hidrólise da

arginina, testes de hemólise, bem como a utilização de métodos moleculares

complementares para a detecção da presença de nucleotídeos altamente

específicos situados na seção intergênica do 16S-23S DNA ribossomal (Amor,

Vaughan e De Vos, 2007; Kučerová et al., 2007).

As BAL utilizadas como culturas “starters” e seus produtos metabólicos, tal

como as bacteriocinas, são considerados Generally Regarded as Safe (GRAS)

pela Food and Drug Administration (FDA), dos Estados Unidos, ou seja, podem ser

utilizados em alimentos sem nenhuma restrição (Deegan et al., 2006;

Maragkoudakis et al., 2009).

Tabela 1: Características bioquímicas de bactérias láticas (adaptado de Salminen et al., 2004)

Bacilos

Cocos

Características

Carnobacterium

Lactobacillus

Aerococcus

Enterococcus

Lactococcus

Vagococcus

Leuconostoc

Pediococcus

Streptococcus

Tetragenococcus

Produção de CO

Multiplicação a

10°C

Multiplicação a

45°C

Multiplicação em

NaCl 6.5%

Multiplicação em

NaCl 18%

Multiplicação em

pH 4.4

Multiplicação em

pH 9.6

Produção de ácido

lático

D,L,DL

L, DL

homofermentativo (-) e heterofermentativo (+)

produção de D, L ou DL ácido lático a partir de glicose

NI: não informado

1.2. BAL e a segurança dos alimentos

Um dos aspectos importantes da aplicação das BAL em alimentos se refere

ao seu uso como bioconservante, visando a segurança dos alimentos (Gálvez et

al., 2010; Savadogo et al., 2006). O efeito de conservação não se dá apenas pelas

condições ácidas que estes microrganismos criam nos alimentos, mas também

pode resultar da produção de diversas substâncias antimicrobianas, como o

peróxido de hidrogênio, etanol, diacetil, dióxido de carbono (CO

), e ainda,

bacteriocinas ou substâncias semelhantes às bacteriocinas (Dalié, Deschamps e

Richard-Forget, 2010; Gálvez et al., 2010; Maragkoudakis et al., 2009; Ponce et

al., 2008).

As bacteriocinas são peptídeos biologicamente ativos produzidos por uma

grande variedade de microrganismos Gram positivos e Gram negativos, porém, as

produzidas por bactérias láticas são as mais estudadas por apresentarem um

grande potencial de aplicação nos alimentos (Deegan et al., 2006; Gálvez et al.,

2010; Gutiérrez et al., 2005; Rodgers, 2008).

Estas substâncias antimicrobianas diferem dos antibióticos clássicos quanto

aos mecanismos de síntese, modo de ação, espectro antimicrobiano, toxicidade e

mecanismos de resistência (Montville e Chen, 1998; Sang e Blecha, 2008; Settanni

e Corsetti, 2008). As bacteriocinas são sintetizadas nos ribossomos das bactérias

e atuam na membrana citoplasmática de células sensíveis dissipando a força

próton motriz, através da formação de poros na bicamada lipídica ou causando a

inibição da síntese de compostos essenciais à sobrevivência da célula (Dalié,

Deschamps e Richard-Forget, 2010; Devlighere et al., 2004). De maneira geral, as

bacteriocinas apresentam efeito bactericida decorrente da lise celular, podendo

também apresentar um efeito bacteriostático, impedindo a multiplicação celular

(Dalié, Deschamps e Richard-Forget, 2010; Oscáriz et al., 2008).

As bacteriocinas são moléculas catiônicas, anfifílicas, contendo entre 30 e

60 aminoácidos, e são agrupadas em classes distintas de acordo com suas

características bioquímicas e genéticas, porém esta classificação passa por

constantes atualizações (Cotter, Hill e Ross, 2005; Dalié, Deschamps e Richard-

Forget, 2010; Drider et al., 2006; Heng e Tagg, 2006; Heng et al., 2007). A primeira

classificação feita por Klaenhammer em 1993, já dividia as bacteriocinas em quatro

classes (Tabela 2).

Tabela 2: Classificação das bacteriocinas produzidas por bactérias Gram positivas segundo

Klaenhammer (1993)

Classe

Características

Exemplos

Lantibióticos, peptídeos pequenos (<5kDa), contendo

aminoácidos lantionina e β-metil-lantionina, catiônicos e

hidrofílicos com estrutura flexível

Nisina, Lactacina 481

Lantibióticos, peptídeos pequenos (<5kDa), contendo

aminoácidos lantionina e β-metil-lantionina, globulares, com

estrutura rígida e rede de anéis não carregados ou

carregados com carga negativa

Mersacidina

IIa

Peptídeos pequenos (<5kDa), termoestáveis, sintetizados a

partir de resíduos de glicina, ativos contra Listeria, contendo

uma sequência YGNGV-C no N-terminal

Pediocina PA-1, Sakacinas A

e P, Leucocina A,

Carnobacteriocinas, etc.

IIb

Peptídeos formados por dois componentes agindo

simultaneamente na formação de poros

Lactococina G e F, Lactacina

F, Plantaricina EF e JK

III

Proteínas grandes (>30kDa) termolábeis

Helveticinas J e V-1829,

Acidofilucina A, Lactacinas

A e B

Proteínas complexas, com atividade dependente da

associação de um ou mais grupos funcionais (carboidratos

ou fosfolipídios)

Plantaricina S, Leucocina S,

Lactacina 27 e Pediocina J1

Porém, com o isolamento e caracterização de novas bacteriocinas

produzidas por bactérias Gram positivas, novas classificações foram propostas

(Cotter, Hill e Ross, 2005; De Jong et al., 2006; Eijsink et al., 2002; Heng e Tagg,

2006; Heng et al., 2007), conforme indicado nas Tabelas 3 (Cotter, Hill e Ross,

2005) e 4 (Heng et al., 2007).

Tabela 3: Classificação das bacteriocinas produzidas por bactérias Gram positivas proposta

por Cotter, Hill e Ross (2005)

Classe

Características

Exemplos

Lantibióticos, peptídeos ou proteínas catiônicas e

hidrofílicas contendo aminoácidos lantionina e β-

metil-lantionina. Inclui os peptídeos lineares ou

globulares, e ainda os lantibióticos contendo dois

componentes

Nisina, Lactacina 481,

Mersacidina, Salvaricina A,

Sublancina 168,

Cinamicina

IIa

Peptídeos pequenos (<5kDa), termoestáveis,

sintetizados através de resíduos de glicina, ativos

contra Listeria, contendo uma sequência YGNGV-C

no N-terminal

Pediocina PA-1, Sakacinas

A e P, Leucocina A

IIb

Peptídeos formados por dois componentes agindo

simultaneamente na formação de poros

Lactococina G e F,

Lactacina F, Plantaricina,

Lacticinina 3147

IIc

Peptídeos com estrutura cíclica, envolvendo a

ligação das terminações N e C-terminal

(IIc i) Enterocina AS48;

(IIc ii) Gassericina A,

Reuterina 6

IId

Peptídeos lineares, tipo não-pediocina, podendo ser

subdivididos de acordo com a sequência do

peptídeo líder, não classificadas nos outros grupos

Lactococina A, Divergicina

A, Carnobacteriocinas,

Turicina S

Bacteriolisinas

Proteínas complexas, grandes (>30kDa) termolábeis,

com atividade dependente da associação de um ou

mais grupos funcionais (carboidratos ou

fosfolipídios)

Lisostafina, Enterocina A

Tabela 4: Classificação das bacteriocinas produzidas por bactérias Gram positivas proposta

por Heng et al. (2007)

Classe

Características

Exemplos

Ia1

Lantibióticos pequenos (<5kDa) contendo aminoácidos

lantionina e β-metil-lantionina, catiônicos e hidrofílicos com

estrutura alongada e flexível do tipo nisina

Nisina A, Z, Q, U e F

Ia2

Lantibióticos pequenos (<5kDa) contendo aminoácidos

lantionina e β-metil-lantionina, catiônicos e hidrofílicos com

estrutura alongada e flexível do tipo SA-FF22

Lacticina 481,

Salvaricina A,

Sublancina 168.

Lantibióticos, peptídeos pequenos (<5kDa) contendo

aminoácidos lantionina e β-metil-lantionina, globulares,

com estrutura rígida e rede de anéis não carregados ou

carregados com carga negativa

Mersacidina,

Cinamicina

Lantibióticos formados por dois peptídeos contendo

lantionina agindo simultaneamente

Lactacina 3147,

Citolisina

IIa

Peptídeos pequenos (<5kDa), estáveis ao calor, sintetizados

através de resíduos de glicina, ativos contra Listeria,

contendo uma sequência YGNGV-C no N-terminal

Pediocinas,

Sakacinas, Leucocina

A, Bavaricina A

IIb

Peptídeos formados por dois componentes agindo

simultaneamente na formação de poros

Lactococina G,

Lactacina F

Plantaricinas,

Lactococina G,

Acidocina JI 132

IIc

Peptídeos sec-dependentes, com os terminais C e N ligados

por ligação covalente

Divergicina A,

Lactococina A e 972

III

IIIa

Proteínas grandes (>30kDa) termolábeis capazes de causar

lise, ou bacteriolisinas

Helveticina V-1829,

Acidofilucina A,

Lacticinas A

IIIb

Proteínas grandes (>30kDa) termolábeis não líticas

Helveticina J,

Colicinas E2-E9

Proteínas complexas, geralmente globulares com atividade

dependente da associação de um ou mais grupos funcionais

como carboidratos ou fosfolipídios

Leucocina S,

Lacticina 27 e

Enterocina AS-48

A maioria das BAL produtoras de bacteriocinas conhecidas atualmente

foram isoladas de alimentos (Adnan e Tan, 2007; Deegan et al., 2006; Gálvez et

al., 2010), sendo considerados os microorganismos mais indicados para melhorar

a segurança microbiológica destes produtos, uma vez que se apresentam

adaptadas a estes ambientes (Gálvez et al., 2010).

Embora comuns em outros alimentos, poucos estudos relatam a ocorrência

de cepas de BAL produtoras de substâncias antimicrobianas em vegetais crus.

Trias et al. (2008) isolaram 496 cepas de BAL de frutas frescas, sementes,

vegetais orgânicos não processados e saladas prontas para o consumo, vendidas

em embalagens plásticas na Espanha, verificando que apenas 18 foram capazes

de inibir Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, Penicillium expansum,

Monilinia laxa ou Botrytis cinerea, que são importantes microrganismos

deteriorantes em vegetais. Pela caracterização do gene 16S DNAr, os isolados

com atividade antimicrobiana foram identificados como Leuconostoc

mesenteroides, Leuconostoc citreum, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis,

Weissella cibaria e Enterococcus mundtii. O sobrenadante das culturas destes

isolados foi ativo contra pelo menos um dos microrganismos alvo testados, porém,

a atividade antimicrobiana decorreu da ação de ácidos ou peróxido de hidrogênio,

não tendo sido detectada nenhuma substância antimicrobiana de natureza

protéica, como bacteriocinas.

Ponce et al. (2008) isolaram quatro cepas de BAL potencialmente

bacteriocinogênicas a partir de amostras de vegetais orgânicos na Argentina,

observando que Lactococcus lactis e Enterococcus canis isolados de espinafre, e

Enterococcus hirae e Enterococcus faecium isolados de acelga apresentaram

atividade inibitória contra diversos patógenos de origem alimentar. Apesar de a

atividade antimicrobiana ter ocorrido pela ação de compostos protéicos presentes

no sobrenadante das culturas, os autores não identificaram ou caracterizaram

estas substâncias.

Sathe et al. (2007) avaliaram a atividade antifúngica de uma cepa de

Lactobacillus plantarum isolada de espinafre comercializada na Índia, e

observaram a inibição de Aspergillus flavus, Fusarium graminearum, Rhizopus

stolonifer e Botrytis cinerea, tanto pela inoculação direta da bactéria lática neste

vegetal, como pelo uso do sobrenadante da cultura. As amostras inoculadas

apresentaram um aumento da vida-de-prateleira e a atividade antimicrobiana foi

atribuída à ação de bacteriocinas, embora nenhum estudo tenha sido feito para a

caracterização destes peptídeos.

Uhlman et al. (1992) isolaram a cepa L. lactis D53 a partir de uma amostra

de salada fresca contendo endívia, alface e rabanete e de cenouras fermentadas

comercializadas na Alemanha. O sobrenadante da cultura foi submetido a vários

testes de resistência a enzimas proteolíticas, atividade em diferentes valores de pH

e de tolerância térmica, confirmando-se que a atividade inibitória contra as

diversas cepas de Listeria monocytogenes testadas decorreu da ação de

bacteriocinas. O estudo apresentou evidências da produção de um peptídeo do

tipo nisina, porém não foram feitos testes adicionais para uma melhor

caracterização do composto antimicrobiano.

As bacteriocinas da Classe I são as mais estudadas e melhor

caracterizadas. São também denominadas lantibióticos (“lanthionine containing

antibiotic”) devido à presença de aminoácidos tioeter lantionina (Lan) e/ou β-metil-

lantionina (MeLan) no anel intramolecular, ou ainda à presença de outros resíduos

modificados, como a 2,3- didehidroalanina (Dha) ou a 2,3-didehidrobutirina (Dhb),

em sua estrutura química (Cotter, Hill e Ross, 2005; Ghalfi et al., 2010; McAuliffe,

Ross e Hill, 2001; Miller, Chumchalova e McMullen, 2010). As bacteriocinas da

classe I mais conhecidas são a nisina A e suas variantes naturais Z, Q, U e F.

1.2.1. Nisina e suas aplicações em alimentos

A nisina foi descoberta na Inglaterra em 1928, durante observação do

metabolismo de uma linhagem especial de Streptococcus lactis (reclassificado

posteriormente como Lactococcus lactis), capaz de inibir cepas de bactérias láticas

pela liberação de uma substância protéica. Esta proteína foi isolada e denominada

nisina. O nome deriva de “Group N Inhibitory Substance” acrescido do sufixo “-ina”,

comumente utilizado para antibióticos (Settanni e Corsetti, 2008).

Em 1947, a nisina foi purificada a partir de culturas de Lactococcus lactis

subsp. lactis e utilizada inicialmente como agente terapêutico no controle da

mastite em animais. Posteriormente, em 1951, foi proposto seu uso como

antimicrobiano alimentar devido à sua degradação pelas enzimas digestivas do

trato gastrointestinal (Thomas, Clarkson e Delves-Broughton, 2000).

A primeira preparação comercial de nisina (Nisaplin®) foi feita em 1953 pela

empresa Aplin and Barrett, Ltd., Inglaterra, comercializada atualmente pela

empresa Danisco A/S, Dinamarca. Porém, a aprovação da Food and Drug

Administration (FDA – Estados Unidos) para utilização em alimentos ocorreu

apenas em 1988. Após o seu reconhecimento como GRAS, houve um

considerável aumento no interesse pela nisina e outras bacteriocinas como

agentes de conservação de alimentos (Bastos, Coutinho e Coelho, 2010;

Maragkoudakis et al., 2009; McAuliffe, Ross e Hill, 2001; Tafreshi et al., 2010).

A nisina é produzida durante a fase exponencial da multiplicação de L. lactis

subsp. lactis, geralmente cessando sua produção quando o microrganismo entra

na fase estacionária (Gillor, Etzion e Riley, 2008; Nes, Yoon e Diep, 2007; Tafreshi

et al., 2010). A nisina é sintetizada nos ribossomos como um pré-peptídeo

biologicamente inativo, que é posteriormente modificado enzimaticamente e

transportado para o ambiente extracelular, onde se torna uma molécula ativa. O

processo envolve genes de transcrição organizados em quatro operons:

nisABTCIPRK, nisI, nisRK e nisFEG (Lubelski et al., 2008).

Até o momento, cinco variantes naturais de nisina são conhecidas: nisina A,

nisina Z, nisina Q, nisina U e nisina F (Kwaadsteniet, Ten Doeschate e Dicks,

2008). A nisina A, a primeira a ser descoberta, difere da nisina Z apenas no

aminoácido da posição 27, possuindo uma histidina no lugar da asparagina. A

nisina Q difere da nisina A por apresentar modificações nos aminoácidos das

posições 15, 21, 27 e 30. A nisina U apresenta alterações nos aminoácidos das

posições 4, 15,18, 20, 21, 27, 29, 30 e 31, quando comparada à nisina A. Já a

nisina F, recentemente caracterizada por Kwaadsteniet, Ten Doeschate e Dicks

(2008), possui uma isoleucina no lugar da valina na posição 30, quando

comparada à nisina Q. Apesar das diferenças nas posições dos aminoácidos, a

atividade antimicrobiana das nisinas é bastante similar (Lubelski et al., 2008). A

Figura 1 apresenta a estrutura química das nisinas A, Z, Q e U.

Com exceção da nisina U produzida por Streptococcus uberis isolado de

secreções mamárias de bovinos (Jayarao et al., 1991; Wirawan et al., 2006), todas

as outras variantes naturais de nisina conhecidas até o momento são produzidas

por cepas de Lactococcus lactis.

Figura 1: Estrutura primária das variantes naturais de nisina: A, Z, Q e U. Dha,

dehidroalanina; Dhb, dehidrobutirina; Ala-S-Ala, lantionina; Abu-S-Ala, metil-lantionina. Os

aminoácidos marcados em cinza diferem dos aminoácidos da nisina A.

Fonte: https://oa.doria.fi/bitstream/handle/10024/29669/lantibio.pdf?sequence=1

A cepa produtora da nisina A foi isolada a partir de uma cultura “starter”

utilizada para a fabricação de queijos (Gross e Morell, 1971), enquanto que cepas

produtoras de nisina Z foram isoladas de queijos (Mulders et al., 1991; Olasupo et

al., 1999), Kimchi (Park, Itoh e Fujisawa, 2003), Dahi (Mitra, Chakrabartty e

Biswas, 2007) e leite cru (Bravo, Rodríguez e Medina, 2009). L. lactis produtor da

nisina Q foi isolado de água do rio Hikosan, no Japão (Zendo et al., 2003), e a

cepa produtora de nisina F foi isolada do intestino de peixes (Clarias gariepinus) de

água doce na África do Sul (Kwaadsteniet, Ten Doeschate e Dicks, 2008). Até o

momento não há informação sobre BAL isolada de vegetais crus capazes de

produzir nisina.

A nisina tem um espectro de ação limitado, sendo ativa contra alguns

microrganismos Gram positivos, como Lactococcus spp, Streptococcus spp,

Staphylococcus spp, Listeria spp, Mycobacterium spp, e células vegetativas ou

esporos de Bacillus e Clostridium. Normalmente a nisina não tem ação inibitória

contra microrganismos Gram negativos. No entanto, há relatos sobre a atividade

quando a nisina é utilizada em combinação compostos que causam lesões na

membrana celular de bactérias Gram negativas, como agentes quelantes (EDTA,

por exemplo) e tensoativos (SDS, por exemplo) (Hammou et al., 2010; Pranoto,

Rakshit e Salokhe, 2005; Samelis et al., 2005).

O mecanismo de ação dos lantibióticos ainda não está totalmente

esclarecido. Estudos indicam que a porção N-terminal da molécula de nisina é

capaz de interagir com grupos fosfolipídicos na membrana citoplasmática das

células alvo, interferindo na síntese de peptideoglicanos, enquanto que a porção

C-terminal é a responsável pela formação de poros (Cotter, Hill e Ross, 2005).

Desta maneira, a nisina pode apresentar um modo de ação duplo: ela pode se ligar

ao lipídeo II, que é o principal transportador de subunidades de peptideoglicanos

do citoplasma para a parede celular, impedindo a síntese da parede celular e

levando a célula à morte; ou ainda pode utilizar o lipídeo II como uma molécula de

acoplamento para sua inserção na membrana, levando à formação de poros e

consequente dissipação da força próton-motriz, inibição do transporte de

aminoácidos e o efluxo de substâncias com baixo peso molecular, como íons e

ATP (Cotter, Hill e Ross, 2005; Richard et al., 2006; Wilson-Stanford et al., 2009).

Na Figura 2 é possível visualizar o duplo modo de ação da nisina.

Figura 2: Mecanismos de ação da nisina. A dupla ação está representada por sua ligação à

membrana, causando a formação de poros e também o bloqueio da síntese de

peptideoglicanos da parede celular.

Fonte: http://www.nature.com/nrmicro/journal/v3/n10/images/nrmicro1273-f2.gif

1.3. BAL como cultura probiótica em alimentos funcionais

Outra aplicação bastante importante das BAL em alimentos está

relacionada aos produtos probióticos com atribuição do status de alimento

funcional. Estes alimentos têm um grande apelo comercial, diretamente

relacionado com seu potencial terapêutico e/ou benefícios conferidos ao

organismo (Kimoto-Nira et al., 2009; O`Flaherty e Klaenhammer, 2010).

O termo probiótico deriva da expressão grega “pro bios”, que significa “a

favor da vida” (Hörmannsperger e Haller, 2010). Segundo a ANVISA (Brasil, 2008),

as bactérias probióticas são “microrganismos vivos capazes de melhorar o

equilíbrio microbiano intestinal produzindo efeitos benéficos à saúde do indivíduo”.

De acordo com a Food and Agriculture Organization/World Health Organization

(FAO/WHO, 2001), probióticos são definidos como “microrganismos vivos que

oferecem benefícios ao organismo quando ingeridos em quantidades adequadas”.

Alguns dos efeitos benéficos à saúde atribuídos ao consumo de produtos

probióticos descritos na literatura incluem: o aumento da resistência contra invasão

de agentes patogênicos na mucosa do TGI, a prevenção da diarréia do viajante, da

diarréia infantil e da síndrome do intestino irritável, o fortalecimento do sistema

imunológico, a redução da intolerância à lactose, a redução dos níveis séricos de

colesterol, a prevenção da osteoporose e o melhor aproveitamento dos nutrientes

dos alimentos (Culligan, Hill e Ross, 2009; Oelschlaeger, 2010; O`Flaherty e

Klaenhammer, 2010; Ranadheera, Baines e Adams, 2010; Sanders, 2008). Outros

benefícios estão relacionados à prevenção e tratamento de doenças crônicas dos

tratos gastrointestinal, respiratório e urogenital (Culligan, Hill e Ross, 2009;

O`Flaherty e Klaenhammer, 2010; Ranadheera, Baines e Adams, 2010).

Recentemente, Oelschlaeger (2010) propôs uma classificação para o efeito

terapêutico dos probióticos, baseada em três mecanismos distintos de ação no

TGI: (1) efeito imunomodulador, ou seja, capacidade de modular as defesas do

hospedeiro, incluindo a imunidade inata e o sistema imune adquirido; (2) efeito

antimicrobiano, ou seja, ação direta sobre outros microrganismos comensais e/ou

agentes patogênicos, competindo por nutrientes ou indisponibilizando sítios de

adesão; e (3) efeito modulador, ou seja, inativação de toxinas e desintoxicação do

hospedeiro, atuando no metabolismo e digestão de componentes dos alimentos no

ambiente do TGI. Os três modos de ação estão envolvidos de alguma forma na

defesa contra infecções, na prevenção de câncer e na manutenção ou

reconstituição do equilíbrio fisiológico da microbiota intestinal (Oelschlaeger, 2010).

Para proporcionar algum benefício ao organismo, as BAL probióticas devem

atingir 10

-10

UFC/g do conteúdo intestinal (Kimoto-Nira et al., 2009). No Brasil, a

ANVISA (Brasil, 2002) estipula que a quantidade mínima viável do probiótico no

produto pronto para o consumo deva estar entre 10

e 10

UFC.

Os principais representantes das bactérias probióticas pertencem aos

gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium, pois não apresentam fatores de virulência

para o organismo humano (Moussavi e Adams, 2010; Sakar, 2010; Sanders,

2008). É importante ressaltar que o gênero Bifidobacterium, apesar de ser

tradicionalmente designado como BAL, utiliza a enzima frutose-6-fosfoquinase

(bifid shunt) para a degradação das hexoses, estando portanto filogeneticamente

separado do grupo das BAL (Felis e Dellaglio, 2007).

Na lista de alegações da ANVISA (Brasil, 2008), são consideradas bactérias

probióticas com uso permitido no Brasil as seguintes espécies: Lactobacillus

acidophilus, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus casei rhamnosus,

Lactobacillus casei variedade defensis, Lactobacillus paracasei, Lactococcus lactis,

Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animallis (incluindo a subespécie B.

lactis), Bifidobacterium longum e Enterococcus faecium. Porém, estudos recentes

citam ainda Lactobacillus crispatus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,

Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii,

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus helveticus,

Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis,

Bifidobacterium essensis, Bifidobacterium laterosporus, Saccharomyces boulardii,

Streptococcus thermophilus, e algumas espécies dos gêneros Propionibacterium,

Pediococcus e Leuconostoc como as principais espécies microbianas utilizadas

como probióticos (Ranadheera, Baines e Adams, 2010).

Segundo Sakar (2010), a seleção de uma cepa probiótica de uso em

alimentos funcionais depende não apenas de sua capacidade de causar um

benefício de saúde definido, mas também de algumas características fisiológicas

do microrganismo, tais como tolerância à bile e ao pH ácido. A atividade

antimicrobiana é também um fator importante, mas sabe-se que cepas probióticas

semelhantes podem ter diferentes mecanismos de ação contra patógenos

(Culligan, Hill e Ross, 2009; Hörmannsperger e Haller, 2010; Sakar et al., 2010;

Wohlgemuth, Loh e Blaut, 2010).

Uma das características mais importantes das cepas probióticas está

relacionada com sua sobrevivência durante a passagem pelo trato gastrointestinal

(Frizzo et al., 2010; Fujiwara et al., 2001; Maragkoudakis et al., 2006). Para esta

avaliação, frequentemente são utilizados testes simulados in vitro, que são

limitados uma vez que não reproduzem com fidelidade as condições encontradas

no trato gastrointestinal. O comportamento dos microrganismos nos testes in vitro

pode ser muito diverso do observado in vivo (Bonomo et al., 2010; Dunne et al.,

2001; Golod et al., 2009; Morelli, 2007; Sakar et al., 2010). No entanto, os testes in

vivo também são limitados por não reproduzem adequadamente o TGI humano, já

que modelos animais como ratos, porcos e cachorros são utilizados. Desta forma,

em função da diversidade de fatores, incluindo a variabilidade dos modelos e as

qualidades específicas das cepas empregadas, os resultados das culturas

avaliadas são em sua maioria reportados como espécie-dependentes (Bernbom et

al., 2006; Gronbach et al., 2010; Park et al., 2008). Uma alternativa para avaliar de

forma mais adequada a viabilidade de culturas probióticas durante a passagem no

trato gastrointestinal é a utilização de modelos dinâmicos capazes de mimetizar as

condições do trato gastrointestinal e a cinética do processo de digestão, tal como o

modelo TIM-1, desenvolvido pelo TNO (The Netherlands Organization for Applied

Scientific Research), Zeist, Holanda (Kheard et al., 2010; Marteau et al., 1997;

Minekus et al., 1995). O modelo dinâmico TIM-1 oferece precisão,

reprodutibilidade, fácil manipulação e possibilidade de coleta de amostras em

qualquer ponto do trato digestivo e em qualquer momento durante a digestão

simulada, sem restrições éticas como as necessárias quando se utiliza modelos

animais (Blanquet et al., 2004). Além disso, resultados obtidos utilizando-se o

modelo TIM-1 foram validados quando comparados à estudos com voluntários

humanos ou com animais monogástricos em relação à cinética de trânsito

intestinal e concentrações de ácido e bile durante a digestão (Minekus et al.,

1995), à sobrevivência microbiana no estômago e no intestino delgado (Marteau et

al., 1997), à biodisponibilidade de minerais em cereais (Larsson, Minekus e

Havenaar, 1997) e à biodisponibilidade de vitaminas em leite (Verwei et al., 2006).

Apesar de inúmeros estudos terem avaliado a sobrevivência de bactérias

láticas probióticas no TGI, a capacidade de produção de bacteriocinas por estas

culturas no ambiente do trato gastrointestinal humano raramente é estudada, de

forma que os possíveis efeitos benéficos do estabelecimento destas culturas no

ambiente competitivo do intestino são ainda pouco conhecidos (Ross et al., 2010;

Sleator, 2010).

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo global

Isolar bactérias láticas (BAL) produtoras de bacteriocinas a partir de

alimentos de origem vegetal, identificar e caracterizar as bacteriocinas produzidas

e ainda avaliar o potencial probiótico destas culturas, mensurando-se sua

capacidade de sobreviver e de produzir bacteriocinas durante a passagem pelo

modelo simulado do trato gastrointestinal humano, TIM-1.

2.2. Objetivos específicos

 Isolar e identificar novas cepas de BAL produtoras de bacteriocinas a partir de

amostras de rúcula comercializada na cidade de São Paulo – SP, utilizando

métodos fenotípicos e genotípicos;

 Caracterizar as bacteriocinas produzidas pelas BAL isoladas quanto à sua

natureza protéica, estabilidade, espectro de ação e dinâmica de produção;

 Identificar as bacteriocinas produzidas através da determinação dos genes

envolvidos em sua produção e do sequenciamento dos peptídeos por

espectrometria de massas após purificação por cromatografia de fase líquida

(HPLC);

 Avaliar a sobrevivência das BAL e sua capacidade de produção de

bacteriocinas no trato gastrointestinal humano, utilizando o modelo dinâmico

TIM-1 (TNO gastro-Intestinal Model), disponível no TNO (The Netherlands

Organization for Applied Scientific Research), Zeist, Holanda;

 Avaliar a influência das BAL bacteriocinogênicas na sobrevivência do

microrganismo entérico E. faecium LMA1 no trato gastrointestinal humano,

utilizando o modelo dinâmico TIM-1.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Isolamento e identificação de bactérias lácticas

3.1.1. Isolamentos de bactérias láticas

Porções de 10g de rúcula crua obtidas no mercado local de São Paulo, SP

(Brasil) foram homogeneizadas com 90 ml de água peptonada (AP - 0,1% peptona

bacteriológica) esterilizada, empregando-se um homogeneizador de pistões

(Stomacher - Seward Medical, Inglaterra). A partir deste homogeneizado foram

preparadas diluições decimais seriadas em AP e alíquotas de um mililitro destas

diluições foram inoculadas em placas adicionando-se porteriormente 20 ml do

meio seletivo para bactérias láticas MRS ágar (Difco). As placas foram incubadas

em aerobiose por até 96 horas a 30°C. Dez a doze colônias foram selecionadas

aleatoriamente e purificadas em ágar MRS (Difco) pelo método de esgotamento.

As culturas puras foram armazenadas a -70°C em caldo MRS (Difco)

suplementado com glicerol (20%, v/v).

3.1.2. Caracterização morfológica e bioquímica dos isolados

As colônias isoladas foram primeiramente submetidas a testes morfológicos,

fisiológicos e bioquímicos que incluíram coloração de Gram, produção de catalase

e oxidase e tolerância a 15% de cloreto de sódio ou a 20% de sais biliares

(Kučerová et al., 2007). A coloração de Gram foi feita através do tratamento de

células devidamente fixadas em lâminas de vidro pelo calor e coradas com cristal

violeta, lugol, álcool e fucsina. O teste de catalase foi feito adicionando-se uma

gota de peróxido de hidrogênio à superfície das culturas cultivadas em ágar MRS

(Difco), observando-se o borbulhamento imediato da culturapara resultado positivo.

A produção de oxidase foi testada com o auxílio de tiras de Oxidase (Laborclin

Ltda.).

Para o teste de tolerância ao sal e sais biliares, frascos contendo caldo MRS

(Difco) foram acrescentados de NaCl (Sigma) para a concentração final de 15%

(p/v) ou de sais biliares (Oxoid) para a concentração final 20% (p/v), inoculados

com os isolados e incubados em aerobiose a 30°C por 48 horas. Após este

período, uma alíquota de cada caldo foi transferida para placas contendo ágar

MRS (Difco) e incubadas novamente em aerobiose a 30°C por 24 horas. A

presença de colônias nas placas foi interpretada como resistência a 15% de NaCl

ou 20% de sais biliares.

Colônias com características de cocos ou bacilos Gram positivos, catalase e

oxidase negativas, capazes ou não de se multiplicarem em MRS acrescido de 15%

de NaCl ou 20% de sais biliares foram consideradas bactérias láticas.

3.1.3. Avaliação inicial da atividade antimicrobiana das BAL

isoladas

Dos isolados iniciais, apenas sete foram identificados como bactérias láticas

e submetidos ao teste spot-on-lawn para detecção da capacidade de inibir Listeria

monocytogenes Scott A e Lactobacillus sakei ATCC 15521 (Lewus e Montville,

1991). Para isso, os sete isolados foram cultivados em caldo MRS (Difco) a 30ºC

por 24 horas e as culturas foram submetidas à centrifugação 12.000 x g por 10

minutos. O pH dos sobrenadantes foi ajustado para 6,0, utilizando-se solução de

NaOH 10 N (Sigma), para evitar uma possível atividade inibitória decorrente da

produção de ácidos orgânicos. Em seguida os sobrenadantes foram esterilizados

por filtração em membrana (0,22 µm – Millipore, Estados Unidos) e transferiu-se

10µL para a superfície de placas previamente inoculadas com 10

UFC/ml de

Listeria monocytogenes Scott A em ágar BHI (Difco) ou 10

UFC/ml de

Lactobacillus sakei ATCC 15521 em ágar MRS (Difco). A formação de um halo de

inibição de multiplicação bacteriana no local onde o sobrenadante foi colocado

indicou a atividade antimicrobiana. Dos isolados testados, apenas um, denominado

MK02R, apresentou atividade antimicrobiana, assim que somente este isolado foi

utilizado no desenvolvimento do restante do trabalho.

3.1.4. Identificação do isolado MK02R

Para a identificação, o isolado MK02R foi submetido a testes moleculares de

sequenciamento da seção intergênica 16-23S DNAr por PCR-ARDRA (Amplified

Ribosomal DNA Restriction Analysis) de acordo com Moreira et al., (2005).

O DNA total do isolado MK02R foi extraído utilizando-se o kit Qiagen ®

"Blood DNeasy & Tissue Kit" (Qiagen, Valencia, Estados Unidos) seguindo as

recomendações do fabricante. O DNA ribossomal da seção intergênica 16S-23S

foi amplificado por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando-se

oligonucleotídeos ou primers universais 16-1A, 5'-GAATCGCTAGTAATCG- 3’ e

23-1B, 5'-GGGTTCCCCCATTCGGA-3' (Moreira et al., 2005). O programa de

amplificação utilizado foi: 94°C por 2 min, 35 ciclos de 94°C por 30 s, 55°C por 1

min 72°C por 1 min e 72°C por 10 min. Os produtos da PCR foram submetidos à

eletroforese em gel de agarose 1,4% em tampão TBE (0,5% Tris-Borato-EDTA) e

visualizados por transiluminador UV, após coloração com brometo de etídio.

Supercoiled DNA Ladder (1 Kb) (GE Healthcare Bio-Sciences – Inglaterra) foi

utilizado como o marcador de peso molecular. O gene de interesse foi selecionado

pelo número e tamanho das bandas dos fragmentos de DNA gerados pelo isolado.

O peso molecular esperado da amplificação do16-23S DNAr pode variar entre 500

a 900 pb, dependendo da espécie de BAL detectada. Os fragmentos que

apresentaram peso molecular compatível com os genes de interesse foram

purificados utilizando-se o kit GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification (GE

Healthcare Bio-Sciences - Inglaterra), submetidos à análise de restrição enzimática

(PCR-ARDRA), e então sequenciados.

Os experimentos de amplificação do DNA, os ensaios com enzimas de

restrição e o sequenciamento dos fragmentos de DNA amplificados obtidos na

PCR foram realizados no Núcleo de Análise de Genoma e Expressão Gênica

(NAGE), no Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas

Gerais.

3.2. Identificação e caracterização das bacteriocinas

As bacteriocinas produzidas pelo isolado MK02R foram caracterizadas

através de uma série de ensaios bioquímicos e térmicos. Em todos estes ensaios,

a atividade antimicrobiana foi monitorada empregando-se o método spot-on-lawn

utilizando as culturas de Listeria monocytogenes e Lactobacillus sakei ATCC

15521 como microrganismos indicadores, conforme descrito no item 3.1.3..

3.2.1. Avaliação da natureza protéica

A natureza protéica das substâncias antimicrobianas produzidas pelo

isolado MK02R foi verificada através do tratamento com protease tipo XIV (5,8

U/mg - Sigma), proteinase K (45,2 U/mg - Sigma), α-quimiotripsina (55 U/mg -

Sigma), pepsina (Merk, INGLATERRA) e papaína (Wallerstein Ltda) na

concentração final de 1 mg/ml em 0,2 M tampão fosfato pH 7,0. Alíquotas do

sobrenadante da cultura de MK02R obtidas conforme descrito no item 3.1.3. foram

incubadas na presença das enzimas por 2 horas a 37°C. Em seguida essas

amostras foram aquecidas a 100°C por 2 minutos, para inativar as enzimas

adicionadas, e garantir que a inibição dos microrganismos indicadores se desse

efetivamente pela ação da bacteriocina. Alíquotas de caldo MRS (Difco)

esterilizado adicionado das enzimas em tampão fosfato pH 7,0 serviram como

controles negativos do experimento. A atividade antimicrobiana foi avaliada

utilizando-se o método spot-on-lawn, conforme descrito no item 3.1.3..

3.2.2. Caracterização da bacteriocina produzida pelo isolado

MK02R

A bacteriocina produzida pelo isolado MK02R foi caracterizada através de

uma série de ensaios bioquímicos e térmicos. Em todos os ensaios, a atividade

antimicrobiana da bacteriocina foi monitorada empregando-se o método spot-on-

lawn, conforme descrito no item 3.1.3.

3.3.2.1 Avaliação da estabilidade térmica

A estabilidade térmica das bacteriocinas produzidas pelo isolado MK02R foi

determinada incubando-se o sobrenadante da cultura, obtido conforme descrito no

item 3.1.3., a 60°C e 100°C por 10, 30 e 60 minutos. Também foi avaliada a

resistência da bacteriocina à temperatura de esterilização por autoclavagem, ou

seja, a 121°C por 15 min. Como controle positivo, empregou-se o sobrenadante

não submetido aos testes de calor.

3.3.2.2. Avaliação da influência do pH

A influência do pH sobre a estabilidade das bacteriocinas produzidas pelo

isolado MK02 foi avaliada ajustando o pH do sobrenadante da cultura para 2,0; 6,0

e 9,0 utilizando HCl 1M (Sigma) ou NaOH 1M (Sigma) e incubando a 37°C por 2

horas. A atividade residual da bacteriocina foi testada após o ajuste do pH para

6,0, a fim de evitar a interferência do pH na avaliação da atividade do peptídeo. A

atividade antimicrobiana foi determinada pela presença de uma zona clara de

inibição nas placas contendo a cultura dos microrganismos indicadores.

3.3.2.3. Avaliação da sensibilidade à compostos

tensoativos, detergentes e NaCl

Para esta avaliação, amostras separadas do sobrenadante da cultura do

isolado MK02R foram acrescentadas de SDS (Dodecil sulfato de sódio) 1%

(Sigma), uréia 1% (Sigma), EDTA (Ácido etilonodiamino tetra-acético) 1% (Sigma)

ou NaCl 6,5% (Sigma) e incubadas por 5 horas a 37°C. Alíquotas do sobrenadante

sem a adição destes compostos e alíquotas destes compostos dissolvidos em

água destilada estéril foram utilizadas como controle positivo e negativo,

respectivamente.

3.3.2.4. Avaliação do espectro de ação

O espectro de ação foi avaliado utilizando-se os microrganismos listados na

Tabela 5, que apresenta também os meios de cultivo e temperatura utilizados,

assim como a origem destes microrganismos. Para este teste, o sobrenadante da

cultura MK02R foi diluído sucessivamente na razão de 1:2 (v/v) em placas de

microtitulação estéreis (Microwel Plates 96F), utilizando-se o diluente MES (2 - [N-

morfolina] etanosulfônico). As diluições foram submetidas ao teste spot-on-lawn

conforme descrito no item 3.1.3. em placas contendo os diferentes microrganismos

em teste, quantificando-se a atividade antimicrobiana de acordo com Rosa et al.

(2002). A atividade foi calculada em unidades arbitrárias (UA) por ml, sendo uma

UA definida como a recíproca da maior diluição que apresentou inibição. A

sensibilidade à bacteriocina foi determinada pela presença de uma zona clara de

inibição na cultura dos microrganismos indicadores.

Uma solução contendo 25 mg/ml de Nisaplin® (Danisco A/S, Dinamarca)

diluída em HCl 0,1 N (Sigma), esterilizada por filtração em membrana (0,22 µm –

Millipore, Estados Unidos) foi utilizada em paralelo neste teste para comparação

dos resultados obtidos.

Tabela 5: Cepas bacterianas e condições de cultivo empregadas na determinação do

espectro da bacteriocina produzida pelo isolado MK02R

Culturas

Temperatura de incubação

Meio de cultura

Gram-positivas

Bacillus cereus ATCC 11778

30°C

TSBye

Enterococcus faecium LMA1 (a)

37°C

TSBye

Lactobacillus delbrueckii (b)

30°C

MRS

Lactobacillus sakei ATCC 15521

30°C

MRS

Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a (c)

30°C

MRS

Listeria innocua (d)

37°C

TSBye

L. monocytogenes Scott A

37°C

TSBye

L. monocytogenes ATCC 7644

37°C

TSBye

Staphylococcus aureus ATCC 29213

37°C

TSBye

Gram-negativas

Escherichia coli ATCC 8739

37°C

TSBye

Escherichia coli ATCC 35150

37°C

TSBye

Escherichia coli O157:H7

37°C

TSBye

Enterobacter aerogenes ATCC 13048

37°C

TSBye

Enterobacter aerogenes ATCC 7644

37°C

TSBye

Salmonella Enteritidis ATCC 13076

37°C

TSBye

S. Thyphimurium ATCC 14028

37°C

TSBye

(a) Isolada de alimentos (b) Isolada de leite; (c) Isolada de linguiça frescal; (d) Isolada de carne de frango;

TSBye: Caldo Tripticase de Soja (Difco) acrescido de 0,5% de extrato de levedura (Sigma); MRS: caldo MRS (Difco)

3.2.3. Avaliação da ação da bacteriocina MK02R

3.2.3.1. Avaliação da inibição da multiplicação microbiana

O potencial de inibir a multiplicação celular foi avaliado através da adição de

20 ml do sobrenadante do isolado MK02R, obtido conforme descrito no item 3.1.3.,

a 100 ml da cultura de Listeria monocytogenes Scott A e de Listeria innocua em

meio BHI e de Lactobacillus sakei ATCC 15521 em MRS, na fase exponencial de

crescimento (DO

600nm

~ 0,02) (Todorov et al., 2008). Os frascos foram incubados a

37°C e a multiplicação dos microrganismos foi monitorada através de leituras da

densidade ótica (DO

600nm

) a cada hora até o tempo máximo de 14 horas. As

leituras foram feitas em espectrofotômetro (Ultraspec® 2000, Amershan Pharmacia

Biotech, Estados Unidos). Como controle positivo utilizou-se a cultura dos

microrganismos indicadores sem a adição do sobrenadante da cultura do isolado

MK02R.

3.2.3.2. Avaliação da capacidade de causar lise celular

O potencial de causar lise nas células viáveis dos microrganismos

indicadores pela bacteriocina MK02R foi avaliado através da adição do

sobrenadante da cultura a um volume igual de cultura de Listeria monocytogenes

Scott A e de Listeria innocua em meio BHI e Lactobacillus sakei ATCC 15521 em

MRS no início da fase estacionária de multiplicação (DO

600nm

~ 0,8-1,5). Para isso,

os microrganismos indicadores foram cultivados a 37°C por até 18 horas para que

atingissem o início da fase estacionária de multiplicação, e então foram

centrifugados a 5000 x g por 5 min (4°C), lavados com solução salina esterilizada

(SS) por duas vezes e ressuspensos em 10 ml de SS. Volumes iguais do

sobrenadante da cultura de MK02R, obtidos conforme descrito no item 3.1.3.,

foram adicionados às culturas indicadoras e incubados por 1 hora a 37°C. A

determinação do número de células viáveis dos microrganismos indicadores foi

feita através da semeadura em ágar antes e após a incubação e seu resultado foi

expresso em UFC/ml. Suspensões dos três microrganismos indicadores sem a

adição do sobrenadante da cultura MK02R foram utilizadas como controles

positivos de multiplicação.

3.2.4. Avaliação da influência da temperatura e da presença de

cisteína na produção da bacteriocina MK02R

Nesta avaliação, o isolado MK02R foi cultivado em 250 ml de caldo MRS a

25°, 30° ou 37°C, na presença de L-mono-cisteína (Sigma) 0,0%, 0,5% e 1,0%, a

fim de avaliar a melhor combinação de temperatura e concentração de cisteína

para a produção da bacteriocina. A cisteína é um agente redutor que promove a

formação de um ambiente anaeróbio no meio de cultura, estimulando a

multiplicação das BAL (Ravula e Shah, 1998). A multiplicação bacteriana foi

monitorada através de leituras de absorbância a 600 nm, usando um

espectrofotômetro (Ultraspec® 2000, Amersham Pharmacia Biotech, Estados

Unidos), a cada hora durante 17 horas. A produção de bacteriocina nas diferentes

condições de cultivo foi determinada pelo método spot-on-lawn, conforme descrito

no item 3.1.3., utilizando-se L. sakei ATCC 15521 como cultura indicadora.

3.2.5. Determinação da presença do gene de nisina no isolado

MK02R

O DNA total do isolado MK02R foi extraído pelo kit Qiagen ® "DNeasy Blood

& Tissue Kit" (Qiagen, Valencia, Estados Unidos) seguindo a recomendação do

fabricante. O DNA isolado foi amplificado com os primers Nisf, 5’- ATG AGT AAA

ACA GAT TTC AAC TT - 3’ e Nisr, 5’- TTA TTT GCT GTG TAC AAC CG - 3’,

construídos com base no gene estrutural da nisina Q (GenBank AB100029)

descrito por Kwaadsteneit et al. (2008). As condições de amplificação foram: 1

ciclo de 94°C por 4 min, 35 ciclos de 94°C por 45 s, 48°C por 30 s, e 72°C por 45

s; e 1 ciclo de 72°C durante 7 min. Os produtos da PCR foram purificados com o

kit de purificação QiaQuick PCR (Qiagen) e sequenciados por empresa

terceirizada. A sequência de aminoácidos da bacteriocina MK02R foi deduzida

pelos códons (Anexo 2) do DNA amplificado utilizando o programa BLAST

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e sua homologia foi comparada com as

sequências das variantes naturais de nisina listadas no GenBank.

3.2.6. Adsorção da bacteriocina MK02R às células produtoras

Este teste foi feito com o objetivo de avaliar a adsorção da bacteriocina à

membrana citoplasmática da própria cepa produtora. Foi utilizado o método

descrito por Yang, Johnson e Ray (1992), que consiste na obtenção da maior

quantidade possível de bacteriocinas livres em solução através do abaixamento do

pH, que provoca uma alteração na tensão da membrana celular, liberando para a

solução os peptídeos naturalmente aderidos às membranas das células

produtoras. Para isto, uma cultura do isolado MK02R com 18 horas de incubação

em aerobiose a 30°C teve seu pH ajustado para 6,0 com uma solução de NaOH

1M (Oxoid) esterilizada. A cultura foi centrifugada (20.000 x g, 15 min, 4°C), as

células foram lavadas com tampão fosfato 0,1M (pH 6,5) esterilizado e

ressuspensas em 10 ml de NaCl 0,1M (Sigma), pH 1,5, sendo então mantidas sob

agitação constante a 4°C por 1 hora. Em seguida, a cultura foi novamente

centrifugada (20000 x g, 15 min, 4°C), selecionando-se o sobrenadante, que teve o

pH neutralizado a 7,0 com NaOH 1M (Sigma). A atividade antimicrobiana da

solução foi avaliada pelo método spot-on-lawn de acordo com Rosa et al., (2002),

com modificações (Todorov et al., 2008), conforme descrito no item 3.1.3..

3.2.7. Purificação da bacteriocina MK02R

Uma cultura de 24 horas do isolado MK02R (2%, v/v) foi adicionada a 8L de

caldo MRS (Difco) acrescido de 0,5 mg/ml de cisteína (Sigma). Após incubação a

30C, sem agitação, por 18 horas a cultura foi submetida à centrifugação (3.000 x

g, 10 min, 4°C). Após a remoção do sobrenadante, as células foram submetidas a

uma extração ácida, conforme descrito por Yang, Johnson e Ray (1992) e Rosa et

al. (2002). Para isto o sedimento foi submetido à duas lavagens com tampão 2 -

[N-morfolina] etanosulfônico (MES, Sigma) a 0,5 M, pH 6,5, e ressuspenso em 400

mL de solução de NaCl 0,1 M (Sigma) com pH ajustado para 1,5 com ácido

fosfórico (Sigma) concentrado. Após 2 horas de agitação a 4°C, a suspensão foi

novamente centrifugada a 3000 x g por 15 min a 4°C. Em seguida, o pH do

sobrenadante foi neutralizado a 7,0 com NaOH 20N (Sigma) e submetido à diálise

e concentração através do sistema Amicon (Millipore, Bedford, Estados Unidos),

utilizando-se membranas com limite de exclusão de 1.000 Da. Este extrato foi

esterilizado por filtração em membrana (0,22 µm – Millipore, Estados Unidos) e

posteriormente submetido aos testes de atividade antimicrobiana conforme

descrito no item 3.1.3..

3.2.8. Análise por cromatografia de fase líquida (HPLC) e

espectrometria de massas

O extrato obtido no item 3.2.7. foi purificado por HPLC (Waters Delta 600,

Milford, Estados Unidos), utilizando-se uma coluna preparativa de fase reversa. As

amostras foram carregadas na coluna C18 Júpiter (21,2 x 250 mm, 15 mm, 300

poros, Phenomenex, Torrance, Estados Unidos) com gradientes lineares (declive B

0,33%/min) e eluídas utilizando-se os solventes A (TFA/H2O 0,1%) e B (0,1%

TFA/H2O: CH3CN - 40:60) com uma vazão de 10,0 ml/min. As frações contendo a

bacteriocina purificada foram injetadas em HPLC contendo uma coluna C18 Nova-

Pak (2,2  150 mm, 3,5 m, 60 poros, Waters C18) acoplado a um

espectrofotômetro de massas Micromass (ZMD- Waters Corporation, Milford, MA,).

A eluição foi realizada em 30 minutos utilizando gradiente linear de acetonitrila

(CH

CN) acidificado de 5% a 95% a uma vazão de 0,4 ml/min. A absorbância foi

medida entre 191 e 400 nm, utilizando um modelo de arranjo de diodos Waters

996. As medições das massas foram realizadas com escala de massa entre 500 e

3.930 m/z (relação massa/carga) (fluxo de gás nitrogênio: 2,6 L/h; agulha: 2,5 kV;

cone de tensão: 47 V; aquecedor da fonte: 105ºC; aquecedor do solvente: 400ºC,

energia íon 1,0 V e multiplicador: 996 V) (Fukao et al., 2008). Os experimentos de

HPLC e espectrometria de massas foram realizados no Departamento de Biofísica

da Universidade Federal de São Paulo.

3.3. Avaliação da sobrevivência das BAL no ambiente simulado do

trato gastrointestinal humano, utilizando o modelo dinâmico

TIM-1

Para a avaliação da sobrevivência das BAL no ambiente do TGI humano

utilizou-se o modelo dinâmico TNO gastro-Intestinal Model (TIM-1), descrito por

Minekus et al. (1995), disponível no TNO (The Netherlands Organization for

Applied Scientific Research) divisão Quality of Life (Zeist, Holanda) (Figura 3).

O modelo TIM-1 é composto por quatro compartimentos conectados que

simulam o estômago, o duodeno, o jejuno e o íleo. Cada compartimento é

constituído de dois tubos de vidro com tubos plásticos flexíveis em seu interior. O

espaço entre os tubos plásticos flexíveis e os tubos de vidro é preenchido com

água aquecida a 37ºC com o objetivo de simular a temperatura do corpo humano.

Além disso, esta água é submetida à pressão pulsante controlada por sensores e

monitorada por computador, de forma a simular os movimentos peristálticos do

estômago e do intestino delgado. As frequências de contrações são de cinco e seis

vezes por minuto para os compartimentos gástrico e duodenal, respectivamente, e

de sete vezes por minuto para os compartimentos do jejuno e do íleo.

Figura 3: Esquema simplificado do modelo dinâmico TIM-1 (TNO). A) compartimento do estômago;

B) esfíncter pilórico; C) compartimento do duodeno; D) válvula peristáltica; E) compartimento do

jejuno; F) válvula peristáltica; G) compartimento do íleo; H) válvula íleo-cecal; I) eletrodos de pH; J)

frasco de secreção gástrica com ácidos e enzimas; K) frascos de secreções duodenais com e

bicarbonato; L) soluções com eletrólitos para controle do pH intestinal; M) pré-filtro N) filtro com

membranas de exclusão de 5 kDa; O) sistema de absorção de líquidos; P) fechamento do sistema

de diálise.

Fonte: http://www.whole-isticsolutions.com/hr_pdf/research.pdf

O pH em cada compartimento e o trânsito do conteúdo luminal de um

compartimento para outro são controlados por computador, simulando os índices

esperados para o TGI de humanos, podendo ainda ser ajustado para simular o

TGI de crianças ou animais. O pH é constantemente monitorado por eletrodos

acoplados à todos os compartimentos e, quando necessário, uma solução de HCl

1M (Sigma) ou NaHCO

1M (Sigma) é injetada para restabelecer o pH ideal de

cada um dos compartimentos. O trânsito do conteúdo luminal é controlado por

bombas e válvulas que são abertas automaticamente quando o volume excede a

capacidade máxima de um determinado compartimento. As bombas injetam

constantemente o suco gástrico dentro do compartimento do estômago, enquanto

bile e suco pancreático são injetados no compartimento do duodeno. O suco

gástrico contém pepsina (0,28 ml/mg) da mucosa gástrica de suínos (CE 3.4.23.1,

Sigma-Aldrich, Brasil) e lipase (0,25 mg/ml) de Rhizopus oryzae (CE 3.1.1.3,

Amano Pharmaceuticals, Japão) dissolvidos em uma solução de eletrólitos (NaCl,

3 g/l; KCl, 1,1 g/l; CaCl

, 0,15 g/l; NaHCO

0,60 g/l; pH 2,0). A secreção duodenal

contém 7% de pancreatina em pó (Pancrex V, Paines & Byrne, Greenford, Reino

Unido) e 4% de extrato de bile de suínos (Sigma-Aldrich Canadá, Ltd.), também

dissolvidos numa solução de eletrólitos (NaCl, 5 g/l; KCl, 0,6 g/l; CaCl

, 0,30 g/l; pH

7,0).

Nos compartimentos do jejuno e do íleo está acoplado um dispositivo

tubular de fibras, contendo membranas semipermeáveis em seu interior, que

dializam o fluído do quimo, simulando a absorção de nutrientes durante o processo

de digestão. Compostos com até 5 kDa são filtrados pelas membranas e

transferidos para o fluído de diálise. Esse sistema de absorção é ativado quando

há mais fluído entrando pelo duodeno (via conteúdo luminal) que saindo pelo íleo

(via válvula íleo-cecal). Após a passagem por todos os compartimentos, as frações

do fluído luminal são eliminadas do modelo e recolhidas em tubos acondicionados

em gelo.

3.3.1. Preparo do modelo dinâmico do trato gastrointestinal TIM-1

para a realização dos experimentos

Antes de iniciar e após o término de cada experimento, o modelo foi

desinfetado por 60 minutos com uma solução (10% v/v) de um detergente

comercial contendo cloro em sua composição (Lavo Inc., Montreal, PQ, Canadá),

seguido por lavagens sucessivas com água desmineralizada estéril. A completa

eliminação de cloro foi monitorada mensurando-se o pH da água de lavagem em

todos os compartimentos desinfetados, sendo considerados satisfatórios aqueles

que apresentaram pH 6,0.

Os experimentos com o modelo TIM-1 foram realizados nas mesmas

condições fisiológicas encontradas para o TGI humano. Assim, o pH do estômago

foi ajustado para 2,0 ±0,5, do duodeno para 6,5±0,5, do jejuno para 6,5±0,5, e do

íleo para 7,0 ±0,5, conforme indicado na Figura 4. As secreções digestivas foram

injetadas à velocidade 0,5 mL/min de suco gástrico e 1,0 mL/min de bile e suco

pancreático durante as seis horas de análise.

Figura 4: Média dos valores de pH nos compartimentos do estômago, duodeno, jejuno e

íleo no modelo TIM-1, durante os experimentos.

O esvaziamento gástrico iniciou-se 20 minutos após a injeção da amostra

em teste, seguido por um escape gradual e contínuo até o tempo máximo de 3,5

horas, momento em que houve a completa eliminação do volume contido no

estômago. As frações liberadas do estômago circularam continuamente pelos

compartimentos do duodeno, jejuno e íleo, seguindo a cinética das condições

fisiológicas do TGI humano. Os volumes eliminados pelo compartimento íleo-

cecal, ou seja, após a passagem completa pelo modelo TIM-1, foram denominados

efluxo final. A Figura 5 apresenta os volumes médios de efluxo final obtidos desde

a primeira até a sexta hora de análise.

Tempo (horas)

Estômago

Tempo (horas)

Duodeno

Tempo (horas)

Jejuno

Tempo (horas)

Íleo

Figura 5: Proporção dos volumes médios do efluxo final e de líquidos retidos durante os

experimentos no modelo TIM-1.

3.3.2. Preparo do material para os testes no modelo dinâmico do

trato gastrointestinal TIM-1

Além do isolado MK02R, as cepas L. sakei 2a e E. faecium LMA1 também

foram submetidas aos testes de sobrevivência no modelo dinâmico do trato

gastrointestinal TIM-1. A cepa L. sakei 2a, também isolada no laboratório de

Microbiologia de Alimentos da FCF/USP por De Martinis e Franco (1998), foi

selecionada por ser outra cepa de BAL produtora de bacteriocinas para fins de

comparação de resultados. A cepa de E. faecium LMA1 foi selecionada por ser

uma BAL presente na microbiota intestinal, empregada como um indicador da

atividade das BAL produtoras de bacteriocinas na redução de um patógeno

entérico no ambiente intestinal simulado.

20%

40%

60%

80%

100%

120%

Volume medido / volume inicial (%)

Tempo

Efluxo final

Líquido retido

O comportamento das cepas no modelo TIM-1 foi avaliado empregando-se

as culturas isoladamente ou em combinação, conforme descrito na Tabela 6.

Tabela 6: Microrganismos utilizados nos testes no modelo dinâmico TIM-1

Microrganismos

Isolado MK02R

Isolado MK02R + E. faecium LMA1

L. sakei 2a

L. sakei 2a + E. faecium LMA1

E. faecium LMA1

O isolado MK02R e L. sakei 2a foram cultivados por 18 horas em caldo

MRS (Difco) a 30°C e E. faecium LMA1 foi cultivado em BHI (Difco) a 37°C. As

culturas foram centrifugadas (3.000 x g, 10 min, 10°C) e ressuspendidas em 10 ml

de SS de forma a obter uma suspensão com 10

-10

UFC/mL.

As soluções iniciais contendo enzimas (2.100 U/mg de pepsina, Sigma;

12.700 U/mg de tripsina Tipo III, Sigma e 15.000 U/mg de lípase, Amano

Pharmaceuticals, Japão), suco gástrico (conforme descrito no item 3.4.), 250 g de

água (Protocolo 1) ou 250 g de leite de vaca comercial esterilizado (Protocolo 2)

(Tabela 7), foram adicionadas das suspensões bacterianas em teste. A utilização

de dois protocolos diferentes objetivou avaliar a interferência de uma matriz

alimentar (leite) na sobrevivência das BAL no TIM-1.

Tabela 7: Composição da amostra inicial injetada no modelo dinâmico TIM-1

Componentes

Protocolo

Água esterilizada

250 g

Leite de vaca esterilizado

250 g

Suco gástrico

50 g

Enzimas

5 g

Suspensão bacteriana

10 g

Total

315 g

pH final

5,5

3.3.3. Avaliação da sobrevivência das BAL no modelo dinâmico do

trato gastrointestinal TIM-1

A viabilidade dos microrganismos durante a passagem pelo modelo TIM-1

foi monitorada nas amostras da solução inicial antes de serem injetadas no

equipamento (Tempo 0) e nas amostras do efluxo final, a cada hora, até o tempo

máximo de 6 horas, através de semeadura pour plate conforme Hoben e

Somasegaran (1982). Todas as amostras foram submetidas à diluição decimal

seriada em SS e alíquotas de um mililitro destas diluições foram transferidas para

placas de petri vazias, às quais se adicionou ágar MRS para quantificação do

isolado MK02R e L. sakei 2a ou ágar BHI para contagem de E. faecium LMA1,

com incubação a 30ºC e 37ºC, respectivamente, por 24 horas. Nos ensaios

realizados com culturas em combinação, adicionou-se neomicina (5mg/ml) para a

contagem seletiva de L. sakei 2a, nisina (2mg/ml) para a contagem seletiva do

isolado MK02R ou vancomicina (5mg/ml) para a contagem seletiva de E. faecium

LMA1. Considerando a hipótese de aquisição intrínseca de resistência aos

antibióticos, os microrganismos presentes nas placas foram confirmados através

da adição de uma sobrecamada de ágar BHI contendo E. faecium LMA1 (10

UFC/ml), incubando-se a 30ºC por mais 24 h. As colônias que apresentaram um

halo de inibição sobre o microrganismo indicador da sobrecamada foram

quantificadas como as BAL do objeto de estudo.

As contagens obtidas nas placas foram ajustadas de acordo com o fator de

diluição dos líquidos ao longo de sua passagem no modelo TIM-1, com auxílio do

software TIMALL 041201 disponível no TNO (Quality of Life, Zeist, Holanda). Os

resultados foram expressos em log UFC/g.

3.3.4. Avaliação da atividade de bacteriocinas após o trânsito no

modelo dinâmico do trato gastrointestinal TIM-1

Para a avaliação da atividade das bacteriocinas nas amostras coletadas

após a passagem pelo TIM-1 as enzimas digestivas presentes nessas amostras

foram inativadas através de imersão imediata em água aquecida a 100°C por 10

min, seguida de centrifugação a 12.000 x g por 10 minutos. Em seguida, os

sobrenadantes foram neutralizados a pH 6,0 pela adição de NaOH 1M (Sigma),

esterilizados por filtração em membrana (0,22 µm – Millipore, Estados Unidos) e

submetidos ao teste de antagonismo spot-on-lawn, conforme descrito no item

3.1.3., utilizando-se L. sakei ATCC 15521 como cultura indicadora.

3.3.5. Análise estatística

Os resultados obtidos nos testes de sobrevivência no ambiente do TGI

utilizando o modelo dinâmico TIM-1 foram submetidos à análise de variância

(ANOVA) e, quando detectadas diferenças significativas (p<0,05) entre as médias

dos resultados, aplicou-se o teste de comparação T de Student. O programa

utilizado foi o STATISTICA (StatSoft

, versão 7.0 - Oklahoma, Estados Unidos).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Isolamento e identificação das cepas de BAL isoladas de rúcula

Das colônias inicialmente isoladas das amostras de rúcula em ágar MRS,

sete foram caracterizadas como bactérias láticas. Entretanto, apenas um destes

isolados, denominado MK02R foi capaz de inibir Listeria monocytogenes Scott A e

Lactobacillus sakei ATCC 15521 nos testes iniciais de antagonismo, sendo o único

isolado selecionado para a continuidade do trabalho.

As figuras 6 e 7 apresentam os resultados da amplificação do DNA total de

L. lactis MK02R e dos testes de restrição enzimática, respectivamente. Na Figura 6

é possível visualizar o fragmento amplificado com os primers utilizados, de peso

molecular de aproximadamente 800 pb.

Figura 6: Produto de 800 pb gerado por amplificação do 16S-23S DNAr de L. lactis MK02R.

Marcador de peso molecular (M) de 1 Kb.

O fragmento do 16S-23S DNAr do isolado MK02R extraído do gel de

agarose (Figura 7) apresentou o perfil de Lactococcus nos testes de PCR-ARDRA

visto que não foi restringido com as enzimas Sph, NcoI, Nhe, Ssp, Sfu, EcoRV,

Vsp, Hinc, EcoRI, HindI e AvrII, mas apresentou clivagem positiva com a enzima

Dra.

Figura 7: Restrição enzimática do amplicom do produto de PCR do 16S-23S DNAr de L.

lactis MK02R. Os sinais positivos e negativos na parte inferior da figura significam clivagem

positiva ou negativa, respectivamente. Marcador de peso molecular (M) de 1 Kb.

Através dos testes morfológicos, fisiológicos, bioquímicos e do

sequenciamento do fragmento 16S-23S DNAr, o isolado MK02R foi identificado

como Lactococcus lactis subsp. lactis (doravante denominado L. lactis MK02R). O

sequenciamento do DNA do isolado apresentou 99% de homologia esta espécie,

conforme anotação genética disponível no GenBank (Anexo 1).

Cepas de L. lactis subsp. lactis, como a isolada neste estudo, são comuns

em alimentos (Campos et al., 2006; Gálvez et al., 2010; Goméz et al., 2002; Mitra,

Chakrabartty e Biswas, 2007; Park, Itoh e Fujisawa, 2003; Ponce et al., 2008),

porém poucas são provenientes de vegetais crus (Ponce et al., 2008). A maioria

das cepas de L. lactis conhecidas atualmente são provenientes de produtos

lácteos e seus derivados, vegetais fermentados ou produtos cárneos. Ponce et al.

(2008) identificaram apenas uma cepa de L. lactis subsp. lactis dentre 45 isolados

obtidos de amostras de espinafre. Trias et al. (2008) identificaram apenas uma

cepa de L. lactis dentre 496 isolados de BAL provenientes de amostras de frutas

frescas, sementes, vegetais orgânicos não processados e saladas prontas para o

consumo.

4.2. Caracterização da bacteriocina produzida por L. lactis MK02R

A atividade antimicrobiana do sobrenadante da cultura de L. lactis MK02R

em caldo MRS (Difco) foi destruída após o tratamento com protease do tipo XIV

(5,8 U/ml - Sigma), proteinase K (45,2 U/mg - Sigma), α-quimiotripsina (55 U/mg -

Sigma) e papaína, mas não foi afetada pelo tratamento com pepsina (Tabela 8).

Estes resultados confirmam a natureza protéica do inibidor produzido por L. lactis

MK02R. Sua atividade manteve-se inalterada após o tratamento térmico de 60

minutos a 60°C ou 100°C, mas foi perdida após 15 minutos a 121°C

(autoclavagem). A bacteriocina MK02R permaneceu ativa após a incubação em pH

2,0, 6,0 e 9,0 por duas horas e após o tratamento com agentes químicos SDS

(1%), uréia (1%), EDTA e NaCl (6,5%).

Tabela 8: Caracterização inicial da substância antimicrobiana produzida por L. lactis MK02R

avaliada pelo método spot-on-lawn

Atividade da bacteriocina MK02R

Tratamento

L. monocytogenes Scott A

Scott A

L. sakei ATCC 15521

Enzimas

α-quimiotripsina

Protease

Proteinase K

Papaína

Pepsina

2,0

6,0

9,0

Temperatura

60°C por 10 min

por 30 min

por 60 min

100°C por 10 min

por 30 min

por 60 min

121°C por 15 min

Compostos

SDS 1%

Uréia 1%

EDTA 1%

NaCl 6,5 %

Kelly, Davey e Ward (1998), Ponce et al. (2008), e Uhlman et al. (1992)

obtiveram resultados bastante semelhantes aos aqui relatados em relação à

atividade residual dos compostos antimicrobianos produzidos por cepas de L. lactis

isoladas de vegetais após o tratamento térmico e exposição à diversos valores de

pH. Mitra, Chakrabartty e Biswas (2007), observaram que a bacteriocina

produzida por L. lactis W8 permaneceu estável ao tratamento com agentes

químicos (surfactantes ou detergentes), tais como uréia, EDTA, SDS, entre outros,

também em conformidade com os resultados apresentados neste trabalho.

A estabilidade das bacteriocinas é um importante fator para seu uso como

conservante em alimentos (Mitra, Chakrabartty e Biswas, 2007; Simsek et al.,

2009). Considerando que o sobrenadante da cultura de L. lactis MK02R

apresentou-se estável em diferentes valores de pH, após o tratamento térmico e

após à exposição à agentes detergentes e surfactantes, a bacteriocina produzida

pelo isolado MK02R tem grande potencial de utilização como conservante natural.

4.2.1. Avaliação do espectro de atividade da bacteriocina

produzida por L. lactis MK02R

A bacteriocina MK02R inibiu Enterococcus faecium LMA1, Listeria innocua e

Listeria monocytogenes ATCC 7644 com uma concentração final de 1600 UA/ml,

mas foi mais eficaz contra Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a, Lactobacillus

delbrueckii e L. monocytogenes Scott A com atividade de 200 UA/ml (Tabela 9). A

concentração de apenas 100 UA/ml foi suficiente para inibir Lactobacillus sakei

ATCC 15521. O sobrenadante não foi eficaz contra Staphylococcus aureus ATCC

29213, ou contra as cepas Gram negativas como Escherichia coli ATCC 8739,

Escherichia coli ATCC 35150, Escherichia coli O157:H7, Enterobacter aerogenes

ATCC 13048, Enterobacter aerogenes ATCC 7644, Salmonella Enteritidis ATCC

13076, S.Thyphimurium ATCC 14028. Os controles paralelos com nisina comercial

Nisaplin® (25 mg/ml, Danisco A/S, Dinamarca) mostraram que a substância

antimicrobiana produzida por L. lactis MK02R possui um espectro de ação

bastante semelhante à nisina.

Tabela 9: Espectro de atividade do sobrenadante da cultura de L. lactis MK02R

Atividade antimicrobiana (UA/ml)

Culturas

Bacteriocina MK02R

Nisaplin ®

Gram-positivas

Bacillus cereus ATCC 11778

Enterococcus faecium LMA1 (a)

1600

Lactobacillus delbrueckii (a)

200

Lactobacillus sakei ATCC 15521

100

Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a (c)

200

Listeria innocua (d)

1600

L. monocytogenes Scott A

200

L. monocytogenes ATCC 7644

1600

Staphylococcus aureus ATCC 29213

Gram-negativas

Escherichia coli ATCC 8739

Escherichia coli ATCC 35150

Escherichia coli O157:H7

Enterobacter aerogenes ATCC 13048

Enterobacter aerogenes ATCC 7644

Salmonella Enteritidis ATCC 13076

S. Thyphimurium ATCC 14028

(a) Isolada de alimentos (b) Isolada de leite; (c) Isolada de linguiça frescal; (d) Isolada de carne de frango;

TSBye: Caldo Tripticase de Soja (Difco) acrescido de 0,5% de extrato de levedura (Sigma); MRS: caldo MRS (Difco)

A atividade de bacteriocinas contra cepas relacionadas às cepas produtoras

é uma das características principais destes antimicrobianos (Bastos, Coutinho e

Coelho, 2010; Heng et al., 2007), assim, não é surpresa que o antimicrobiano

produzido por L. lactis MK02R tenha sido ativo contra as cepas de Lactobacillus

testadas. A inibição de diferentes cepas de L. monocytogenes ressalta o potencial

do uso desta bacteriocina em alimentos, considerando que este patógeno possui

grande importância em se tratando de doenças transmitidas por alimentos.

4.2.2. Avaliação da inibição da multiplicação microbiana

Os resultados da multiplicação celular após a adição de 20% do

sobrenadante da cultura de L. lactis MK02R às culturas frescas de L. innocua, L.

monocytogenes e L. sakei ATCC 15521 estão apresentados nas Figuras 8, 9 e 10,

observando-se que o antimicrobiano foi capaz de inibir a multiplicação de todos os

microrganismos testados por até 14 horas.

Figura 8: Multiplicação de Listeria innocua a 37°C em caldo BHI com ou sem a adição de 20% do

sobrenadante da cultura de L. lactis MK02R.

Figura 9: Multiplicação de Listeria monocytogenes Scott A a 37°C em caldo BHI com ou sem a

adição de 20% do sobrenadante da cultura de L. lactis MK02R.

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

1,8

600nm

Tempo (horas)

L. innocua

L. innocua + bacteriocina MK02R

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

1,8

600nm

Tempo (horas)

L. monocytogenes

L. monocytogenes + bacteriocina MK02R

Figura 10: Multiplicação de Lactobacillus sakei ATCC 15521 a 30°C em caldo MRS com ou sem a

adição de 20% do sobrenadante da cultura de L. lactis MK02R.

4.2.3. Avaliação da capacidade de causar lise celular

A adição do sobrenadante da cultura de L. lactis MK02R à cultura de L.

monocytogenes Scott A contendo 10

- 10

UFC/ml resultou numa acentuada

redução no número de células viáveis, que não foram mais detectadas após uma

hora de contato, ou mesmo após mais 48 horas de incubação. No entanto, não

houve alteração na quantidade de células das amostras controles (10

e 10

UFC/ml), sugerindo uma ação bactericida do antimicrobiano produzido por L. lactis

MK02R. Resultados semelhantes foram obtidos com as bacteriocinas HA-6111-2

produzidas P. acidilactici e bacteriocina HA-5692-3, produzida por E. faecium

(Albano et al., 2007).

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

600nm

Tempo (horas)

Lactobacillus sakei

Lactobacillus sakei + bacteriocina MK02R

4.2.4. Avaliação da influência da temperatura e da presença de

cisteína na produção da bacteriocina MK02R

As figuras 11, 12 e 13 apresentam a multiplicação de L. lactis MK02R e a

produção da bacteriocina MK02R em caldo MRS contendo diferentes

concentrações de cisteína por até 17 horas a 37°C, 30°C e 25°C, respectivamente.

Figura 11: Multiplicação de L. lactis MK02R (linhas) e produção da bacteriocina MK02R

(barras) a 37°C em caldo MRS acrescido de 0,0%, 0,5% ou 1,0% de cisteína.

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

Atividade (UA/ml)

600nm

Tempo (horas)

0% cis

0.5% cis

1.0% cis

0% cis

0.5% cis

1.0% cis

Figura 12: Multiplicação de L. lactis MK02R (linhas) e produção da bacteriocina MK02R

(barras) a 30°C em caldo MRS acrescido de 0,0%, 0,5% ou 1,0% de cisteína.

Figura 13: Multiplicação de L. lactis MK02R (linhas) e produção da bacteriocina MK02R

(barras) a 25°C em caldo MRS acrescido de 0,0%, 0,5% ou 1,0% de cisteína.

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

Atividade (UA/ml)

600nm

Tempo (horas)

0% cis

0.5% cis

1.0% cis

0% cis

0.5% cis

1.0% cis

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

Atividaade (UA/ml)

600nm

Tempo (horas)

0% cis

0.5% cis

1.0% cis

0% cis

0.5% cis

1.0% cis

Verificou-se que, independente da concentração de cisteína no caldo MRS

(Difco), a fase exponencial foi mais rapidamente atingida quando a cultura de L.

lactis MK02R foi realizada a 37ºC. Nesta temperatura, a fase exponencial foi

atingida duas horas após o início do cultivo, enquanto que a 30ºC foram

necessárias três horas, e a 25ºC, seis horas.

Quanto à produção de bacteriocina, verificou-se que a máxima

concentração atingida foi de 600 UA/ml, obtida após 8h a 37ºC e 30ºC, e após 14

horas a 25ºC. As curvas apresentadas nas Figuras 11, 12 e 13 indicam que a

produção da bacteriocina inicia-se aproximadamente na metade da fase

exponencial de multiplicação de L. lactis MK02R, atingindo o máximo de produção

no início da fase estacionária, independente da temperatura de incubação.

Campos et al. (2006) relataram resultados semelhantes trabalhando com L. lactis

subsp. lactis isolado do intestino de peixes, verificando ainda que a atividade

antimicrobiana estava presente mesmo após 72 horas. Outros autores também

relatam que a produção da bacteriocina está diretamente relacionada com a fase

de multiplicação do microrganismo (Franz et al., 1997; Ponce et al., 2008; Tafreshi

et al., 2010). Geralmente a produção inicia-se na metade ou no final da fase

exponencial de crescimento, podendo se estender durante a fase estacionária de

multiplicação (Ponce et al., 2008; Tafreshi et al., 2010).

Conforme pode ser observado nas Figuras 11, 12 e 13, a presença de

cisteína no caldo MRS nas concentrações de 0,5% ou 1,0% aumentou a produção

da bacteriocina pela cepa L. lactis MK02R, de forma mais evidente quando a

temperatura utilizada foi 37ºC. Quando a incubação foi feita a 30ºC ou a 25ºC,

esse efeito foi menor. No entanto, a presença de cisteína teve pouca influência na

multiplicação de L. lactis MK02R. A 25ºC observou-se certo efeito negativo no

período de 8 a 13 horas, que desapareceu em seguida. Apesar de interferir pouco

na multiplicação da cepa, a cisteína influenciou a produção de bacteriocina,

principalmente quando a incubação foi feita a 37ºC. Sabe-se que fatores que

alteram a taxa de multiplicação do microrganismo produtor da bacteriocina estarão

diretamente relacionados com a produção do peptídeo (Gillor, Etzion e Riley, 2008;

Liu et al., 2010; Penna et al., 2005).

Penna e Moraes (2002) testaram o efeito da adição de sacarose,

asparagina, fosfato de potássio ou Tween ao meio MRS na produção de nisina e

observaram que 5,0 g/l de sacarose com 29 g/l de asparagina resultaram em

máxima produção de nisina na fase exponencial da multiplicação de L. lactis. A

cisteína, utilizada nos experimentos como coadjuvante para potencializar a

produção da nisina (Stoyanova et al., 2006), apresentou um efeito positivo sobre a

produção da bacteriocina MK02R quando concentrações de 0,5% ou 1,0% foram

adicionadas ao MRS com incubação a 37°C. No entanto, quando a incubação foi

feita a 25°C ou 30°C, este efeito potencializador não foi tão proeminente.

4.2.5. Adsorção da bacteriocina MK02R às células produtoras

Os resultados indicam que após o tratamento das células em pH 1,5 houve

uma liberação de grande quantidade de bacteriocina adsorvida à membrana de L.

lactis MK02R para o meio. Após a neutralização do pH da solução observou-se

uma atividade antagônica de 200 UA/ml sobre L. monocytogenes Scott A. Estes

resultados estão de acordo com outros estudos que também relataram pouca ou

nenhuma adsorção de bacteriocinas às células produtoras em pH 1,5, como a

plantaricina ST31 (Todorov et al., 1999), a pediocina ST18 (Todorov e Dicks,

2004), as bacteriocinas HA-6111-2 e HA-5692-3 (Albano et al., 2007) e a bozacina

B14 (Ivanova et al., 2000).

Cerca de 93 a 100% da bacteriocina sintetizada ficam aderidas à parede

das células produtoras quando cultivadas em pH 6,0, porém essa adsorção cai

para menos de 5% quando em pH 1,5 - 2,0 (Pongtharangku e Demirci, 2007;

Yang, Johnson e Ray, 1992). O estudo da adsorção/dessorção de bacteriocinas à

membrana celular das células produtoras é imprescindível no desenvolvimento de

protocolos eficientes visando a máxima recuperação do peptídeo antimicrobiano

para a purificação de grandes quantidades destes compostos (Pongtharangku e

Demirci, 2007).

4.2.6. Determinação da presença do gene de nisina em L. lactis

MK02R

Visto que o isolado MK02R foi identificado como L. lactis subsp. lactis, uma

espécie freqüentemente produtora de nisina, e que o espectro de ação da

bacteriocina MK02R apresentou-se similar ao da nisina comercial Nisaplin®

(Danisco A/S, Dinamarca), testou-se a presença do gene responsável pela

produção de nisina no DNA do isolado. O resultado da amplificação do DNA de L.

lactis MK02R com os primers Nisf e Nisr está apresentado na Figura 14.

Figura 14: Produto de amplificação do DNA obtido através da PCR com os primers de

expressão de nisina (Nisf e Nisr). Marcador de peso molecular (M) de 100 pb.

Quando o DNA de L. lactis MK02R foi amplificado com os primers Nisf e

Nisr foi gerado um fragmento com peso molecular de 300 pb, indicando que L.

lactis subsp. lactis MK02R possui determinantes genéticos associados à produção

de uma variante da nisina (Kwaadsteneit et al., 2008). Os primers Nisf e Nisr

amplificam o gene de codificação da nisina Q, e diferem apenas por uma ou duas

bases dos genes estruturais da nisina A, Z, U e F, o que permite a amplificação

dos genes destas nisinas. Para a confirmação da nisina produzida por L. lactis

MK02R a sequência dos aminoácidos da bacteriocina MK02R foi deduzida com

base neste fragmento de 300 pb gerado após a amplificação do DNA utilizando os

primers Nisf e Nisr. A sequência obtida foi comparada com as sequências das

nisinas A, Z, Q e F, disponíveis no GenBank, conforme apresentado na Figura 15.

Figura 15: Sequência de aminoácidos da bacteriocina produzida por L. lactis MK02R

deduzida por análise do DNA, comparada com as sequências das nisinas A, Z, F e Q. O

peptídeo líder das variantes de nisina consiste de 13 aminoácidos (da posição -13 até a

posição 1), seguida pelos aminoácidos que codificam o peptídeo maduro (da posição 1 até

a posição 34). A diferença entre os aminoácidos da nisina produzida por L. lactis MK02R

em relação às outras variantes de nisina estão sinalizadas com a cor vermelha.

A sequência de aminoácidos deduzida da nisina MK02R difere das demais

nisinas nos aminoácidos das posições -12, -11, -8, -7, -6 e -5, correspondentes à

sequência do peptídeo líder da nisina.

A sequência da nisina produzida por L. lactis MK02R apresentou

semelhança à sequência gravada para o gene estrutural de codificação da nisina Z

(número de acesso GenBank X61144), exceto pela presença de valina em vez de

isoleucina na posição 30. Esta comparação também foi feita com a nisina Q

(número de acesso GenBank AB100029), que também apresenta valina na

posição 30. A cepa L. lactis MK02R difere da nisina Q pois possui alanina e não

valina na posição 15, e metionina no lugar da leucina na posição 21 do peptídeo

líder. No entanto, apresenta homologia à sequência da nisina F nas posições

correspondentes à sequência do peptídeo maduro (posições 1 até 34).

-20 -10 1 10 20 30

Nisina MK02R MSTKDFNLDL VMV SVSRRRS GASPRITSIS LCTPGCKTGA LMGCNMKTAT CNCSVHVSK

Nisina F MSTKDFNLDL V SVSKKDS GASPRITSIS LCTPGCKTGA LMGCNMKTAT CNCSVHVSK

Nisina Z MSTKDFNLDL V SVSKKDS GASPRITSIS LCTPGCKTGA LMGCNMKTAT CNCSIHVSK

Nisina A MSTKDFNLDL V SVSKKDS GASPRITSIS LCTPGCKTCA LMGCNMKTAT CNCSIHVSK

Nisina Q MSTKDFNLDL V SVSKTDS GASTRITSIS LCTPGCKTGV LMGCN LKTAT CNCSVHVSK

É importante ressaltar que a aplicação de diferentes abordagens para a

caracterização de uma bacteriocina é crítica. Muito frequentemente, os autores

relatam a identificação de uma nova bacteriocina apenas com base na presença

de genes de produção de bacteriocinas, sem avaliar se tais genes são expressos

(Kwaadsteniet et al., 2006; Kwaadsteniet, Ten Doeschate e Dicks, 2008). Albano et

al. (2007) assinalaram a presença dos genes da pediocina PA-1 em duas cepas

diferentes de P. acidilactici, porém, não apresentaram evidências efetivas da

expressão destas bacteriocinas, assim que a expressão e produção destes

antimicrobianos são apenas presumidas. A purificação da bacteriocina seguida

pela espectrometria de massas e o sequenciamento de aminoácidos, mesmo que

apenas parcial, são necessários para verificar se os genes das bacteriocinas estão

sendo expressos (Zendo et al., 2008).

4.2.7. Determinação dos aminoácidos da bacteriocina MK02R por

espectrometria de massas após purificação por

cromatografia de fase líquida (HPLC)

A Figura 16 apresenta os resultados da separação primária da bacteriocina

por cromatografia de fase líquida (HPLC) e a Figura 17 a varredura por

espectrometria de massas.

Figura 16: Perfil cromatográfico (HPLC) da amostra purificada da bacteriocina MK02R

utilizando a coluna preparativa C

(2,2  150 mm, 3,5 m, 60 poros, Nova-Pak, Waters

C18).

Figura 17: Perfil da espectrometria de massas da bacteriocina MK02R (A) e da nisina Z (B).

(A) Obtido utilizando Micromass (ZMD- Waters Corporation, Milford, MA,), com eluição

em 30 minutos com gradiente linear de acetonitrila (CH

CN) acidificado de 5% a 95% a

uma vazão de 0,4 ml/min. (B) Obtido de Sun et al. (2009).

O sequenciamento parcial dos aminoácidos das amostras purificadas do

antimicrobiano por espectrometria de massas demonstrou certa homologia com o

sequenciamento deduzido do DNA amplificado com os primers Nisf e Nisr,

reforçando principalmente a presença de uma valina na posição 30 e de alanina na

posição 15. Os outros aminoácidos modificados deduzidos pelo sequenciamento

do DNA, como a metionina na posição 21, não puderam ser confirmados pelo

cromatograma.

Apesar da eficácia na caracterização parcial de nisina, o método de

cromatografia líquida (HPLC) apresenta certa dificuldade na identificação exata do

peptídeo, visto que as moléculas das nisinas A, Z, Q, U e F são bastante parecidas

(Zendo et al., 2008). No entanto, os resultados apresentados indicam que a cepa

L. lactis subsp. lactis MK02R não só possui um determinante genético para a

produção de nisina, como também é capaz de produzir e exportar a nisina para o

meio extracelular.

A presença de aminoácidos modificados no peptídeo líder da nisina F

produzida por L. lactis MK02R pode auxiliar em estudos futuros relacionados à

regulação da expressão e na caracterização dos processos moleculares

envolvidos na biosíntese desta bacteriocina. A função do peptídeo líder das

bacteriocinas está relacionada com sua atividade biológica, já que é o peptídeo

responsável por fornecer o sinal de reconhecimento para o gene ABC

transportador. Se houver uma alteração na estrutura do peptídeo líder, o processo

de reconhecimento fica comprometido e a bacteriocina não é exportada para o

meio extracelular (Todorov, 2009).

Entretanto, os testes cromatográficos confirmaram a produção e os testes

de antagonismo confirmaram a ação da nisina produzida por L. lactis MK02R. A

alteração dos genes da nisina produzida por L. lactis MK02R é única, e pode servir

para elucidar a influência da organização dos operons envolvidos na biosíntese da

nisina.

4.3. Avaliação da sobrevivência de L. lactis MK02R, L. sakei 2a e do

efeito do co-cultivo com E. faecium LMA1 no modelo dinâmico do

trato gastrointestinal TIM-1

As figuras 18, 19 e 20 apresentam os resultados da sobrevivência de L.

lactis MK02R, L. sakei 2a e E. faecium LMA1, respectivamente, no modelo

dinâmico TIM-1.

Figura 18: Viabilidade de Lactococcus lactis MK02R utilizando os Protocolos 1 e 2 (P1 e P2)

durante o trânsito no modelo dinâmico TIM-1.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

Log (UFC/g)

Tempo (horas)

L. lactis MK02R P1

L. lactis MK02R + E. faecium P1

L. lactis MK02R P2

L. lactis MK02R + E. faecium P2

Figura 19: Viabilidade de Lactobacillus sakei 2a utilizando os Protocolos 1 e 2 (P1 e P2)

durante o trânsito no modelo dinâmico TIM-1.

Figura 20: Viabilidade de Enterococcus faecium LMA1 utilizando os Protocolos 1 e 2 (P1 e

P2) durante o trânsito no modelo dinâmico TIM-1.

Conforme apresentado na Figura 18, L. lactis MK02R resistiu bem à

passagem pelo TIM-1, apresentando contagens de 7 log UFC/g nas amostras

obtidas no Tempo 0, mantendo uma população de 6 log UFC/g desde a primeira

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

Log (UFC/g)

Tempo (horas)

L. sakei 2a P1

L. sakei 2a + E. faecium P1

L. sakei 2a P2

L. sakei 2a + E. faecium P2

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

Log (UFC/g)

Tempo (horas)

E. faecium P1

E. facecium + L. lactis MK02R P1

E. faecium + L. sakei 2a P1

E. faecium P2

E. faecium + L. lactis MK02R P2

E. faecium + L. sakei 2a P2

até a sexta hora de análise, sem diferenças significativas (p>0,05) nestas

contagens. Da mesma maneira não foram detectadas diferenças significativas nas

contagens obtidas nos experimentos em co-cultura com E. faecium LMA1 ou nas

contagens obtidas utilizando os protocolos P1 e P2 (p>0,05).

Durante a passagem pelo modelo dinâmico TIM-1, houve uma redução

significativa (p<0,05) na viabilidade de L. sakei 2a (Figura 19). No Tempo 0 as

contagens de L. sakei 2a eram de 6 log UFC/g, porém na primeira hora estas

contagens foram significativamente reduzidas para 2 log UFC/g (p<0,05). Em

seguida a cepa apresentou uma recuperação gradual, atingindo contagens de 4

log UFC/g na sexta hora de análise.

Em contrapartida, E. faecium LMA1 (Figura 20), quando cultivado

isoladamente, apresentou uma alta capacidade de persistir nas condições

simuladas do trato gastrointestinal, atingindo populações de aproximadamente 8

log UFC/g desde o Tempo 0 até a sexta hora de análise, independente do

protocolo utilizado (p>0,05).

L. lactis MK02R resistiu às condições de estresse a qual foi submetida

durante a passagem no modelo TIM-1, estando em acordo com estudos que

demonstraram um alto índice de sobrevivência de L. lactis no ambiente do TGI

(Kang et al., 2010; Roy et al., 2008; Kimoto et al., 2003; Bernbom et al., 2006;

Drouault et al., 1999; Klijn, Weerkamp e De Vos, 1995). Kimoto et al. (2003)

observaram que Lactococcus lactis N7 apresentou resistência a diferentes valores

de pH e aos sais biliares em testes in vitro, e ainda demonstraram a capacidade de

sobrevivência de L. lactis N7 no ambiente do trato gastrointestinal ao recuperar a

cultura nas fezes de ratos após 12 (10

-10

UFC/g), 24 (10

UFC/g) e 48 (10

UFC/g) horas após a administração do microrganismo via oral. Em outro estudo,

Bernbom et al. (2006) observaram o efeito da administração de Lactococcus lactis

CHCC5826, produtora de nisina A em comparação com Lactococcus lactis

CHCH2862, não produtora de bacteriocinas, na composição da microbiota

intestinal de ratos. Os autores concluíram que a administração de ambas as

linhagens de L. lactis causaram um aumento no número de células de

Bifidobacterium e uma redução no número de espécies de Enterococcus/

Streptococcus no duodeno, íleo, ceco e cólon quando comparados com ratos

controles, sem diferença significativa entre os resultados das cepas produtora ou

não produtora de nisina. Drouault et al. (1999) também avaliaram a viabilidade de

L. lactis no TGI de ratos e observaram um índice de 90-98% de sobrevivência no

estômago, demonstrando a alta capacidade de adaptação do microrganismo ao

estresse ácido. Entretanto, observaram que apenas 10-30% da população foi

recuperada no duodeno e jejuno, indicando que a cepa apresenta uma baixa

resistência à secreção biliar e ao suco pancreático.

Em contrapartida, L. sakei 2a apresentou uma baixa resistência à passagem

pelo modelo dinâmico TIM-1 quando comparada com L. lactis MK02R. Park et al.

(2008) descreveram índices de 50% de sobrevivência de L. sakei probio 65 ao

suco gástrico e de 79% de sobrevivência do microrganismo na presença de sais

biliares desconjugados em testes in vitro. Bonomo et al., (2010) observaram uma

redução de 80% na sobrevivência de L. sakei subsp. sakei submetida ao

tratamento em condições de estresse ácido, observando que o menor valor de pH

suportado pelo microrganismo é de 2,5.

E. faecium caracteriza-se como um microrganismo altamente adaptado ao

ambiente do TGI (Weiss et al., 2010). Além disso, a cepa de E. faecium LMA1

selecionada para este estudo é resistente ao antibiótico vancomicina, o que pode

aumentar sua virulência e patogenicidade, considerando que cepas de E. faecium

resistentes à vancomicina estão associadas a um alto índice de mortalidade (53%)

decorrente de infecções em hospitais no Brasil (Pereira et al., 2010). Nos Estados

Unidos, o grupo Enterococci resistentes à vancomicina é o terceiro maior grupo de

patógenos relacionado aos casos de bacteremia e infecção neonatal (Piper et al.,

2009).

O efeito protetor do leite sobre as células de BAL é bastante conhecido e já

foi demonstrado também nas condições adversas do intestino (Kheadr et al., 2010;

Kimoto et al., 2003). Este efeito protetor foi mais evidente nos experimentos feitos

com L. sakei 2a, causando um aumento significativo (p<0,05) da sobrevivência e

permanência do microrganismo no ambiente simulado do TGI humano, que

apresentou contagens entre 5 e 6 log UFC/g durante as seis horas de análise. No

entanto, a sobrevivência de L. lactis MK02R e E. faecium LMA1 não foi

significativamente (p>0,05) afetada pela adição da matriz alimentar, visto que estes

microrganismos apresentaram boa sobrevivência, mesmo sem a presença do leite.

Apesar da alta capacidade de sobrevivência demonstrada por L. lactis

MK02R ao ambiente simulado do TGI, o microrganismo não foi capaz de causar a

redução de E. faecium LMA1. Em contrapartida, L. sakei 2a, mesmo apresentando

uma viabilidade reduzida, foi capaz de reduzir em 70% o número de células viáveis

de E. faecium LMA1 quando estas culturas foram co-inoculadas. Recentemente,

Carvalho et al. (2010) demonstraram que L. sakei 2a produz, além da sakacina,

outros dois peptídeos com atividade antimicrobiana contra E. faecium, enquanto

que, como foi apresentado neste estudo, L. lactis MK02R produz apenas um

antimicrobiano ativo contra esta cepa. Por outro lado, Bambirra et al. (2007)

comprovaram que a atividade in vivo de L. sakei 2a contra a colonização intestinal

por L. monocytogenes Scott A em ratos gnobióticos foi decorrente da competição

por sítios de adesão, e não pela produção de bacteriocinas in situ.

As Figuras 21, 22 e 23 apresentam os valores das diferenças na população

de L. lactis MK02R, L. sakei 2a e E. faecium LMA1, respectivamente, em relação

ao inóculo inicial, durante a passagem no modelo TIM-1.

Figura 21: Flutuação das contagens da população de L. lactis MK02R em comparação com as

amostras iniciais durante a passagem no modelo TIM-1.

Figura 22: Flutuação das contagens da população de L. sakei 2a em comparação com as amostras

iniciais durante a passagem no modelo TIM-1.

-6,00

-5,00

-4,00

-3,00

-2,00

-1,00

0,00

0 1 2 3 4 5 6 7

Δ Log (UFC/g)

Tempo (horas)

L. lactis MK02R P1

L. lactis MK02R + E. faecium P1

L. lactis MK02R P2

L. lactis MK02R + E. faecium P2

-5,00

-4,00

-3,00

-2,00

-1,00

0,00

0 1 2 3 4 5 6 7

Δ Log (UFC/g)

Tempo (horas)

L. sakei 2a P1

L. sakei 2a + E. faecium P1

L. sakei 2a P2

L. sakei 2a + E. faecium P2

Figura 23: Flutuação das contagens da população de E. Faecium LMA1 em comparação com as

amostras iniciais durante a passagem no modelo TIM-1.

Apesar do considerável potencial da aplicação dos probióticos na terapia ou

na prevenção de doenças do TGI, é importante ressaltar que muitas cepas

probióticas com alegação de benefícios à saúde não tiveram sua ação confirmada

por evidências experimentais, sugerindo que a eficácia demonstrada por uma

cultura específica não deve ser transferida à espécie (Wohlgemuth, Loh e Blaut,

2010).

4.3.1. Avaliação da produção de bacteriocinas por L. lactis MK02R

e L. sakei 2a no modelo dinâmico do trato gastrointestinal

TIM-1

Neste estudo, não foi observada a atividade residual de bacteriocinas

produzidas por L. lactis MK02R ou L. sakei 2a após a passagem dos

microrganismos pelo modelo dinâmico TIM-1. Poucas pesquisas descrevem o

comportamento das bacteriocinas em ambientes do trato gastrointestinal. Bernbom

-8,00

-6,00

-4,00

-2,00

0,00

2,00

0 1 2 3 4 5 6 7

Δ Log (UFC/g)

Tempo (horas)

E. faecium P1

E. facecium + L. lactis MK02R P1

E. faecium + L. sakei 2a P1

E. faecium P2

E. faecium + L. lactis MK02R P2

E. faecium + L. sakei 2a P2

et al. (2006) observaram que a administração de nisina A não causou qualquer

alteração na composição da microbiota de ratos após a ingestão oral do peptídeo

antimicrobiano purificado. Entretanto, Kheadr et al. (2010) relataram atividade

antimicrobiana de pediocina produzida por Pediococcus acidilactici UL5

recuperada do compartimento do estômago, do duodeno, do jejuno e do íleo em

ensaios realizados no TIM-1. Reunanen e Saris (2009) avaliaram a degradação da

nisina (6,75 μg/g) no TGI de cachorros, observando que no jejuno houve uma

recuperação de 66% de nisina 30 minutos após a ingestão do antimicrobiano. No

entanto, após uma hora de exposição neste ambiente, apenas 17,5% da

concentração inicial da nisina foi recuperada. A nisina, assim como outras

bacteriocinas produzidas por BAL, são degradadas pela enzima pancreática α-

quimiotripsina presente no ambiente do TGI. Segundo Gálvez et al. (2010), além

do impacto sobre a atividade das bacteriocinas, as enzimas digestivas podem

interferir na produção destes antimicrobianos, de uma maneira cepa-dependente.

Se por um lado as bacteriocinas não agem de maneira efetiva no ambiente

intestinal, por outro, não possuem efeito adverso ao organismo quando

administrados em soluções puras, ou quando produzidos in situ, a partir de

culturas instaladas na microbiota intestinal (Bernbom et al., 2006; Reunanen e

Saris, 2009; Ross et al., 2010).

A compreensão de como as células produtoras de bacteriocinas

sobrevivem no ambiente do TGI pode auxiliar no desenvolvimento de estratégias

para uma melhor aplicação destas culturas tanto em nível industrial, como em nível

terapêutico (Ross et al., 2010; Simsek et al., 2009). A produção desses metabólitos

antimicrobianos é geralmente demonstrada em estudos in vitro, porém ainda não

está claro se estes peptídeos antimicrobianos são produzidos ou se possuem

alguma atividade in vivo. Os resultados obtidos neste estudo concordam com

outros apresentados na literatura, demonstrando que o antagonismo de

bacteriocinas contra células sensíveis nos testes in vitro não são geralmente os

mesmos aos apresentados no ambiente do trato gastrointestinal (Bambirra et al.,

2007; Simsek et al., 2009).

No que diz respeito a aplicações terapêuticas, os agentes antimicrobianos

produzidos por BAL utilizadas como culturas probióticas podem desempenhar um

papel importante nas interações in vivo durante sua passagem pelo trato

gastrointestinal humano, contribuindo assim para a saúde do intestino. No entanto,

mais estudos são necessários para desvendar o papel preciso das bacteriocinas

produzidas por BAL neste processo (De Vuyst e Leroy 2007; Ross et al., 2010).

5. CONCLUSÕES

Com base nos resultados obtidos, é possível concluir que:

(A) Lactococcus lactis subsp. lactis MK02R isolado de rúcula produz a nisina F,

com atividade inibitória contra E. faecium LMA1, L. sakei ATCC 15521, L.

sakei 2a, e microrganismos de importância alimentar, tal como L. innocua e

L. monocytogenes, apresentando um alto potencial de aplicação para a

conservação de alimentos;

(B) A nisina F produzida por L. lactis MK02R apresentou alta estabilidade

térmica, resistência ao pH ácido ou básico e à compostos surfactantes e

detergentes, aumentando sua potencialidade de aplicação em alimentos;

condições de estresse do ambiente simulado do trato gastrointestinal

humano, apresentando um grande potencial de utilização como cultura

probiótica;

(D) L. sakei 2a apresentou baixa resistência às condições simuladas do TGI,

no entanto, inibiu E. faecium LMA1, apresentando potencial para estudos

futuros como uma cultura potencialmente probiótica.

(E) Não foi detectada atividade residual de bacteriocinas após os ensaios no

modelo dinâmico TIM-1, assim que não se pode inferir se houve a produção

destes compostos no ambiente do TGI, ou ainda se estariam relacionados

com a ação das BAL na redução E. faecium LMA1, de forma que testes

mais sensíveis são necessários para validar esta hipótese.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Applied Microbiology, v. 104 (2), p. 499-507, 2008.

ANEXO 1

Anotação do sequenciamento genético do 16-23s DNAr de Lactococcus lactis subsp.

lactis MK02R

H05 well H05 Placa22_281107 Run01 Cimarron 3.12 579

GACACTGNTGCTAATACTGCACGTTGAGCGCTGAAGGTTGGTACTTGTACCGACTGGATGAGCAGCGAACG

GGTGAGTAACGCGTGGGGAATCTGCCTTTGAGCGGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCGCATA

AAAACTTTAAACACAAGTTTTAAGTTTGAAAGATGCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGTATTAG

CTAGTTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATT

GGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCT

GACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGGTAGAGAAGAACGTTG

GTGAGAGTGGAAAGCTCATCAAGTGACGGTAACTACCCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC

GCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGTGGTTTATTAAC

GTCTGGTGTAAAAGGCAGTGGGCTACAACCATTGTATGCATTGGAAACTGGGTTACAGACTTGGACGTGCC

ACGGGAAGCAGAGNAGAAAGTGGGGAAAAATTTTTCCCCACTGGGTTGGTTAGCCGGGGGTGCACATTGG

CCGTTTAGCATTCATCACTNNAGCACGAGGAAACCAAACCAGGGGTTGGGCGGAAGCGAGGCGTCCTATCC

TTGGGAGGCCCTATGTAAACTTAGACGCCANTGAAGGGCTCNAAAACAGCNGGTTGGGGGGANCGCAAN

AAAGCAGGGAGTTAAGAAATAC

>H06 well H06 Placa22_281107 Run01 Cimarron 3.12 876

GTACTTAGAGCGCCTCCTTNTTTGTTAGGCAACCTACTTCGGGTACTCCCAACTCTCCGGTGGTGTGACGGG

CGGTGTGTACAAGGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTT

CATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTAAGAGATTAGCTAAACATCACTGTCTC

GCGACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCAT

CCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCGTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAACAATAGG

GGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTAT

CCCGTGTCCCGAAGGAACTTCCTATCTCTAGGAATAGCACGAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCG

TTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCG

GTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTATTGCGTTAGCTGCGATACAGAGAACTTATAGCTCCCTACATCTAGC

ACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCCTCAGTGT

CAGTTACAGGCCCAGGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCCAGTATATTCTACGGCAGTTTCACCGG

TACCCATGGAATTCCACTCTCCTCTCCTGGACCTCAAGNCTACCCAGGTTCCATGGCTTACAATGGTTGAGCC

CACTGCCTTTTTTCACCGGATTTATTAACCACCCTGGGGTTCGTTTTAGCCCCAATAAATCCGGGCGAAGGTC

TGGGACTCACGTTTCCGGGTGTGGNACGGTTAATTTTGGCCGGCCCCTTCCTCGGGGGTGGGTAACCCGCC

NTTTGTANAGGTTTCCTCCTCTTCACCAAGGTTTTTCTTTTCCACCAGAGTTTTACTCAGACGCTTTTTTTCTCC

ACGNGGGGNAGCGCGAAATTTATTGNGNAACCATCCTGTGNCCCCNATGGGGGGTGACACAGGGCGCCCC

ACAGGGTGNGCTCGGNTCCCAACATCAAGCGATGNGGTCAG

ANEXO 2

Representação dos aminoácidos em código, abreviação, bem como seu códon genético

Código

Abreviação

Aminoácido

Trios de bases (códons) no DNA

Ala

Alanina

gct, gcc, gca, gcg

Cys

Cisteína

tgt, tgc

Asp

Ácido Aspártico

gat, gac

Glu

Ácido Glutâmico

gaa, gag

Phe

Fenilalanina

ttt, ttc

Gly

Glicina

ggt, ggc, gga, ggg

His

Histidina

cat, cac

Ile

Isoleucina

att, atc, ata

Lys

Lisina

aaa, aag

Leu

Leucina

tta, ttg, ctt, ctc, cta, ctg

Met

Metionina

atg

Asn

Asparagina

aat, aac

Pro

Prolina

cct, ccc, cca, ccg

Gln

Glutamina

caa, cag

Arg

Arginina

cgt, cgc, cga, cgg, aga, agg

Ser

Serina

tct, tcc, tca, tcg, agt, agc

Thr

Treonina

act, acc, aca, acg

Val

Valina

gtt, gtc, gta, gtg

Trp

Triptofano

tgg

Tyr

Tirosina

tat, tac

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