( PDF ) Caracterização de genes hipotéticos e o papel da enolase da superfície de C. albicans na adesão celular

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RICHARD CARDOSO DA SILVA

Caracterização de genes hipotéticos e o papel da

enolase da superfície de C. albicans na adesão

celular

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo – Escola

Paulista de Medicina, para obtenção

do Título de Mestre em Ciências.

SÃO PAULO

2010

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RICHARD CARDOSO DA SILVA

Caracterização de genes hipotéticos e o papel da

enolase da superfície de C. albicans na adesão

celular

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo – Escola

Paulista de Medicina, para obtenção

do Título de Mestre em Ciências.

Orientador: Profº Dr. Marcelo Ribeiro

da Silva Briones

SÃO PAULO

2010

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iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA

E PARASITOLOGIA

Chefe do departamento: Prof. Dra. Clara Lúcia Barbieri Mestriner

Coordenador da Pós-Graduação: Profº. Dr. Renato Arruda Mortara

Silva, Richard Cardoso da.

Caracterização parcial de genes hipotéticos e estudo da função da

enolase da superfície de C.albicans / Richard Cardoso da Silva - São

Paulo, 2010, 141p.

Tese (Mestrado)-Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista

de Medicina. Programa de Pós-graduação em Microbiologia e Imunologia

Hypothetical genes characterization and the role of C. albicans surface

enolase on cell adhesion.

1.Genes hipotéticos 2.Genes CaYlr339c e CaYdr187c 3. Enolase da

parede celular 4. Plasminogênio 5. Adesão ao tecido gastrointestinal

Este trabalho foi financiado pela Capes (bolsa

de mestrado) e pela Fundação de Amparo à

Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP,

Conselho Nacional de Pesquisa e

Desenvolvimento - CNPq, World Health

Organization - WHO e Howard Hughes Medical

Institute - HHMI.

Aos meus queridos pais

Cardoso e Sueli

vii

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer imensamente ao Dr. Marcelo Briones por ter me

aceitado em seu laboratório ainda na graduação, pelos ensinamentos que tanto

contribuíram para a minha formação científica e principalmente por ter acreditado em

meu potencial.

Aos meus queridos pais e irmãos pelo apoio, amizade, carinho, atenção,

incentivo e compreensão em cada etapa da minha vida profissional.

À Dra. Renata Carmona por todas as ajudas em várias etapas deste trabalho,

por ter realizado a inferência filogenética da enolase e pela colaboração em todos os

meus trabalhos.

À Dra. Silvia Kawashita pela amizade, companheirismo, discussões e por

todos os ensinamentos desde a iniciação científica.

À Dra Ana Carolina Padovan por ter me ensinado muitas das técnicas

experimentais aplicadas neste trabalho.

À Paloma Hernandez pelo suporte técnico, ajuda nos experimentos e por

todos os seqüenciamentos de DNA.

Ao Luiz Fernando por ter me auxiliado na realização das inferências

filogenéticas e na utilização do programa MrBayes.

À Vitória Amorim pela indispensável ajuda em todas as etapas deste trabalho.

À Carla Cristi e Claudio Viera pelo auxilio durante as imunizações de coelhos

e camundongos.

viii

Ao técnico Manoel da disciplina de biofísica da Unifesp, pela disponibilização

de instrumentos para a realização dos experimentos com intestinos de

camundongos.

À Paola Rossi pela essencial ajuda em diferentes etapas deste trabalho.

Às amigas do laboratório Carol Vaidotas, Danielle, Melissa, Paloma e Thais

pelo companheirismo, agradável convívio, incentivo e ajudas em diferentes etapas

deste trabalho.

Às alunas Denise e Cristiane e as técnicas Ivanilde e Mônica da disciplina de

microbiologia por todas as ajudas ao longo deste trabalho.

A todas as pessoas do departamento de Microbiologia, Imunologia e

Parasitologia (professores, funcionários e alunos) que de alguma forma colaboraram

para a realização este trabalho.

"Nothing is impossible; there are ways

that lead to everything, and if we had sufficient will we

should always have sufficient means. It is often merely for

an excuse that we say things are impossible."

Francois La Rochefoucauld

SUMÁRIO

Lista de Figuras ........................................................................................................ xiv

Lista de Tabelas ....................................................................................................... xvi

Lista de Abreviaturas ................................................................................................ xvii

Resumo .................................................................................................................... xix

Abstract .................................................................................................................... xx

1. INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................ 01

2. CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE GENES HIPOTÉTICOS DE C. albicans .... 04

2.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 05

2.1.1. O genoma de C. albicans ............................................................................... 06

2.2 OBJETIVO ..................................................................................................... 09

2.3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 10

2.3.1. LINHAGENS DE Escherichia coli ................................................................... 10

2.3.2. LINHAGENS DE C. albicans e S. cerevisiae .................................................. 10

2.3.3. PLASMÍDEOS ................................................................................................ 10

2.3.4. OLIGONUCLEOTÍDEOS ................................................................................ 11

2.3.5. MANIPULAÇÃO DE RNA ............................................................................... 12

2.3.5.1 Indução de hifas em C. albicans .................................................................. 12

2.3.5.2 Extração do RNA total de C. albicans (levedura e hifa) ............................... 12

2.3.5.3. Quantificação do RNA total ......................................................................... 13

2.3.5.4. Verificação da integridade do RNA total em gel de agarose ...................... 13

2.3.5.5 Tratamento do RNA com DNAse I ............................................................... 14

2.3.5.6 Reação de Transcriptase reversa ................................................................ 14

2.3.5.7 PCR com cDNA de levedura e hifa .............................................................. 14

2.3.6. CLONAGEM DAS ORFS CaYlr339c e CaYdr187c ........................................ 15

2.3.6.1 Extração de DNA genômico de C. albicans ................................................. 15

2.3.6.2 Tratamento do DNA com RNase ................................................................. 16

2.3.6.3. Amplificação das ORFs CaYlr339c e CaYdr187c ........................................ 16

2.3.6.4. Eletroforese de fragmentos de DNA ............................................................ 16

2.3.6.5 Tratamento do DNA e ligação...................................................................... 17

2.3.6.6 Preparação de bactérias competentes ........................................................ 17

2.3.6.7 Transformação de bactérias competentes ................................................... 18

2.3.6.8 Minipreparação de DNA plasmidial .............................................................. 18

2.3.7. SEQUENCIAMENTO DE DNA ....................................................................... 19

2.3.7.1 Reação de Sequenciamento........................................................................ 19

2.3.7.2 Precipitação do DNA ................................................................................... 20

2.3.7.3. Montagem das seqüências consenso – contigs .......................................... 20

2.3.8. MUTAGÊNESE SÍTIO DIRIGIDA ................................................................... 21

2.3.8.1 Amplificação por PCR .................................................................................. 21

2.3.8.2 Tratamento com DpnI e Pfx ......................................................................... 21

2.3.8.3. Ligação (Circularização) .............................................................................. 22

2.3.9. EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES ............ 22

2.3.9.1 Construções em pET28a(+) e pGEX6P3 ..................................................... 22

2.3.9.2 Expressão das proteínas recombinantes ..................................................... 23

2.3.9.3. Purificação da proteína recombinante His

-Caylr339cp .............................. 23

2.3.9.4 Purificação da proteína recombinante GST-126aa187cp ............................ 24

2.3.9.5 Quantificação de proteínas .......................................................................... 24

2.3.10. GEL SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis)

PARA SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS ..................................................................... 24

2.3.11. PRODUÇÃO DE SOROS ............................................................................. 25

2.3.11.1. Produção de soro anti His

-Caylr339cp em coelhos .................................. 25

2.3.11.2. Produção de soro anti GST-126aa 187cp de camundongos ..................... 26

2.3.12. WESTERN BLOT ......................................................................................... 26

2.3.13. DETECÇÃO DA PRESENÇA DA PROTEÍNA CaYlr339cp EM EXTRATOS

CELULARES DE C. albicans .................................................................................... 27

2.3.14. REAGENTES UTILIZADOS.......................................................................... 28

2.3.14.1. Meios de cultura ........................................................................................ 28

2.3.14.2. Tampões .................................................................................................... 29

2.3.15. ANÁLISE IN SÍLICO DA SEQUÊNCIA DEDUZIDA DE AMINOÁCIDOS DAS

ORFs CaYlr339c E CaYdr187c. ............................................................................... 29

2.3.16. INFERÊNCIA FILOGENÉTICA ..................................................................... 30

2.3.16.1. Obtenção das sequências e alinhamentos ................................................ 30

2.3.16.2. Inferência filogenética ................................................................................ 30

2.4 RESULTADOS .............................................................................................. 32

2.4.1. SELEÇÃO DOS GENES HIPOTÉTICOS ....................................................... 32

2.4.2. PREDIÇÕES DAS PROTEÍNAS PUTATIVAS EM SERVIDORES DE

PREDIÇÃO ............................................................................................................... 33

2.4.3. AS ORFs CaYdr187c E CaYlr339c SÃO TRANSCRITAS .............................. 37

xii

2.4.4. AMPLIFICAÇÃO DAS ORFs .......................................................................... 38

2.4.5. INFERÊNCIA FILOGENÉTICA ....................................................................... 42

2.4.6. ANÁLISE DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA ................................................... 45

2.4.7. MUTAGÊNESE SÍTIO DIRIGIDA ................................................................... 49

2.4.8. EXPRESSÃO HETERÓLOGA DAS PROTEÍNAS EM E.coli .......................... 51

2.4.8.1. Proteína His

-CaYlr339cp ............................................................................ 51

2.4.8.2. Proteína GST-CaYdr187cp .......................................................................... 53

2.4.9. PRESENÇA DAS PROTEÍNAS EM C. albicans ............................................. 55

2.4.9.1. Proteína putativa CaYlr339cp ...................................................................... 55

2.4.9.2. Proteína putativa CaYdr187cp ..................................................................... 58

2.5 DISCUSSÃO.................................................................................................. 60

2.6 CONCLUSÕES .............................................................................................. 67

2.7 PERSPECTIVAS FUTURAS ......................................................................... 68

3. ESTUDO DA FUNÇÃO DA ENOLASE DA SUPERFÍCIE DE C. albicans ......... 69

3.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 70

3.1.1. C. albicans no intestino ................................................................................... 70

3.1.2. Enzimas da via glicolítica expressas na superfície celular ............................. 74

3.1.3. A enolase ........................................................................................................ 75

3.2 OBJETIVO ..................................................................................................... 80

3.3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 81

3.3.1. PREPARAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE His

-enolase E ANTI-SORO

................................................................................................................................. 81

3.3.1.1 Expressão da proteína recombinante His

-enolase ..................................... 81

3.3.1.2 Purificação da proteína recombinante His

-enolase .................................... 81

3.3.1.3. Purificação do anti-soro anti-His

enolase .................................................... 82

3.3.1.4. Pureza e viabilidade da proteína recombinante ........................................... 82

3.3.2. ENSAIO DE ADESÂO DE C. albicans AO TRATO GASTROINTESTINAL

MURINO ................................................................................................................... 83

3.3.2.1 Microorganismos e condições de crescimento ............................................ 83

3.3.2.2 Preparação de discos de tecido gastrointestinal de camundongos ............. 83

3.3.2.3. Ensaio de adesão de C.abicans ao tecido gastrointestinal murino .............. 84

3.3.2.4. Ensaio de inibição da adesão por competição ............................................ 84

3.3.2.5 Ensaio de inibição da adesão (bloqueio da C. albicans com anticorpos) .... 85

xiii

3.3.2.6 Ensaio de atividade fungicida das proteínas recombinantes e dos soros .... 85

3.3.2.7 Ensaio de inibição da adesão (bloqueio de receptores de C. albicans

ligantes de fibronectina e plasminogênio Humanos) ................................................ 86

3.3.2.8 Análise dos dados ...................................................................................... 86

3.3.3. ENSAIOS DE LIGAÇÃO DE C. albicans A FIBRONECTINA E

PLASMINOGÊNIO HUMANOS ................................................................................ 87

3.3.4. CO-IMUNOPRECIPITAÇÃO........................................................................... 88

3.3.4.1 Preparo do extrato protéico de C. albicans .................................................. 88

3.3.4.2 Pre-Clearing do extrato protéico .................................................................. 88

3.3.4.3. Co-imunoprecipitação .................................................................................. 88

3.3.5. INFERÊNCIA FILOGENÉTICA ....................................................................... 89

3.3.6. ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS ........................................................................ 90

3.4 RESULTADOS .............................................................................................. 91

3.4.1. Expressão heteróloga de enolase em E.coli ................................................... 91

3.4.2. O bloqueio da enolase com anticorpos é capaz de inibir a adesão de C.

albicans ao TGI murino ............................................................................................. 93

3.4.3. Adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal murino ............................... 94

3.4.4. Pré-incubação de discos de TGI com enolase recombinante inibe a adesão de

C. albicans ................................................................................................................ 97

3.4.5. Ligação de C. albicans a fibronectina e plasminogênio humanos .................. 101

3.4.6. Ensaios de Ligação da proteína recombinante His

-enolase a fibronectina e

plasminogênio humano por western blot .................................................................. 104

3.4.7. Co-Imunoprecipitação ..................................................................................... 104

3.4.8. Ensaios de inibição da adesão ao tecido gastrointestinal a partir do bloqueio de

receptores da superfície de C. albicans .................................................................... 107

3.4.9. Inferência filogenética ..................................................................................... 109

3.5 DISCUSSÃO.................................................................................................. 113

3.6 CONCLUSÕES .............................................................................................. 123

3.7 PERSPECTIVAS FUTURAS ......................................................................... 124

4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 125

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Classificação das ORFs do genoma de C. albicans linhagem SC5314 .... 02

Parte 1

Figura 1. Classificação das ORFs do genoma de C. albicans linhagem SC5314 .... 08

Figura 2. Análise in sílico das proteínas putativas CaYlr339cp e CaYdr187cp ........ 34

Figura 3. Predição de Modificações pós traducionais das proteínas putativas ........ 36

Figura 4. Gel de agarose 1% - PCR com cDNAs de levedura e hifa de C. albicans 37

Figura 5. Gel de agarose 1% - PCR das ORFs CaYlr339c e CaYdr187c ................ 38

Figura 6. Alinhamento das sequências de nucleotídeo das ORFs CaYlr339c e

CaYdr187c, linhagem SC5314 e WO-1 de C. albicans ............................................ 41

Figura 7. Árvore filogenética inferida pelo método Bayesiano a partir das sequências

de aminoácidos de proteínas similares a CaYlr339cp .............................................. 44

Figura 8. Alinhamento múltiplo da sequência de aminoácidos e comparação da

estrutura secundária de proteínas similares a CaYlr339cp ...................................... 47

Figura 9. Cromatogramas gerados no seqüenciamento das ORFs para confirmação

das mutações sítio dirigida realizadas por PCR ....................................................... 50

Figura 10. Expressão da proteína His

-CaYlr339cp em E. coli ................................ 52

Figura 11. Expressão da proteína GST-CaYdr187cp em E. coli. ............................. 53

Figura 12. Detecção da proteína CaYlr339cp em extratos celulares de C. albicans por

western blot .............................................................................................................. 56

Figura 13. Detecção da proteína CaYlr339cp em extratos celulares de levedura e hifa

de C. albicans, mas não em meios condicionados por western blot ........................ 57

Figura 14. Reconhecimento de proteína recombinante GST-187cp pelo soro

policlonal ................................................................................................................... 59

Parte 2

Figura 1. Microscopia eletrônica da mucosa do intestino delgado humano (Biópsia)

................................................................................................................................. 72

Figura 2. Esquema da Interação de C. albicans com a superfície da mucosa ........ 74

Figura 3. Pureza da proteína His

-enolase determinada a partir da análise

eletroforética em géis de poliacrilamida corados com azul de Coomassie e Nitrato de

prata ......................................................................................................................... 91

Figura 4. Reconhecimento da proteína enolase recombinante com anti-His

enolase

por western blot ........................................................................................................ 92

Figura 5. Adesão de C. albicans (linhagem SC5314 e L757) a discos de tecido

gastrointestinal murino .............................................................................................. 94

Figura 6. Inibição da adesão a discos de TGI murino a partir do bloqueio de C.

albicans com anti-His

enolase .................................................................................. 95

Figura 7. Atividade fungicida de anti-His

-enolase contra C. albicans ..................... 97

Figura 8. Inibição da adesão de C. albicans a discos de tecido gastrointestinal

murino previamente incubados com His

-enolase .................................................... 98

Figura 9. Avaliação da atividade fungicida da proteína recombinante His

-enolase

contra C. albicans ..................................................................................................... 100

Figura 10. Reconhecimento das proteínas humanas purificadas (fibronectina e

plasminogênio) com anticorpos específicos por western blot ................................... 102

Figura 11. Análise qualitativa da ligação de C. albicans a fibronectina e plasminogênio

humanos blot ............................................................................................................ 103

Figura 12. Co-Imunoprecipitação do plasminogênio e enolase ............................... 106

Figura 13. A proteína fibronectina não é co-imunoprecipitada com a enolase ........ 106

Figura 14. Ensaio de Inibição da adesão ao tecido gastrointestinal a partir do bloqueio

de receptores de fibronectina e plasminogênio ........................................................ 108

Figura 15. Árvore filogenética inferida pelo método Bayesiano a partir das sequências

de aminoácidos das enolases .................................................................................. 112

Figura 16. Alinhamento múltiplo e comparação das estruturas secundárias das

enolases de C. albicans, M. musculus e H. sapiens ................................................. 113

xvi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Linhagens de E.coli ................................................................................. 10

Tabela 2 - Linhagens de C. albicans e S. cerevisiae................................................ 10

Tabela 3 - Plasmídeos ............................................................................................. 10

Tabela 4 - Oligonucleotídeos ................................................................................... 11

xvii

LISTA DE ABREVIATURAS

µg Micrograma

µl Microlitro

°C Graus Celsius

A absorbância

aa aminoácido

ANOVA - Análise de variância

ATP trifosfato de adenosina

BSA Albumina bovina sérica

CAI Índice de Adaptação dos Códons

cDNA Ácido desoxiribonucleico complementar

Contig contiguous

D.O. Densidade óptica

dATP Desoxiadenosina trifosfato

dCTP Desoxicitosina trifosfato

DEPC Dietilpirocarbonato

dGTP Desoxiguanosina trifosfato

DNA Ácido desoxiribonucleico

dNTP Desoxinucleosídeo

DTT ditiotreitol

dTTP Desoxitimidina trifosfato

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

EGTA

Ethylene glycol tetraacetic acid

fM Fentomol

FN Fibronectina

g aceleração da gravidade

GST Glutationa S-transferase

GTR general time reversible (modelo geral de tempo reversível)

h Hora

His Histidina

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

HRP Horseradish peroxidase

HSP Heat Shock Protein

Ig Imunoglobulina

IPTG Isopropil-D-tiogalactopiranosídeo

Kb Quilobase

kDa Quilodaltons

LB Lysogeny Broth

LPS Lipopolissacarídeo

M Molar

mA miliampére

mab Anticorpo monoclonal

mb Megabase

MEC Matriz extracelular

mg Miligrama

min Minuto

mL Mililitro

mm Milímetro

mM Milimolar

xviii

MW peso molecular

N Nitrogênio ou Normal

ng Nanograma

nm Namômetro

ORF fase aberta de leitura

PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida

pb Pares de bases

PBS Tampão fosfato salina

PBS-T Tampão fosfato salina com 0,1% de tween-20

PCR Reação de polimerização em cadeia

pH potencial de hidrogênio

PLG Plasminogênio

pM Picomol

PMSF Fluoreto de fenil-metil-sulfonila

PVDF Poly(vinylidene fluoride)

RGD Arginina - Glicina - Ácido aspártico

RIPA

RNA Ácido ribonucleico

rpm Rotações por minuto

RT-PCR Reação de polimerização em cadeia – transcriptase reversa

SDS dodecil sulfato de sódio

SE Erro padrão

SNP Polimorfismo de base única

SOC Super Optimal Catobolite Repression Broth

Spp. Espécies

TAE Tris – acetato – EDTA

TEMED N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina

TGI Tecido gastrointestinal

Tris Tris-hidroximetil amino metano

U unidade de enzima

U.V. Luz ultravioleta

UFC Unidade formadora de colônia

V Volume

v/v volume por volume

YPD Extrato de levedura, peptona e dextrose

xix

RESUMO

Os agentes antifúngicos de uso corrente na medicina apresentam alta toxicidade e

efeitos colaterais, tem como alvo poucos constituintes celulares, e muitos mecanismos de

resistência já foram descritos. Com o objetivo de identificar potenciais novos alvos para

drogas antifúngicas, duas ORFs hipotéticas de Candida albicans, potencialmente essenciais

e com perfis singulares de expressão foram caracterizados. A ORF CaYlr339c é conservada

em outros fungos do gênero Candida e Saccharomyces, é transcrita nas fases de levedura e

hifa e a presença de seu produto protéico de aproximadamente 18 kDa foi constatada em

extratos celulares de leveduras e hifas de C. albicans a partir de experimentos de western

blot. A ORF CaYdr187c é conservada em poucos representantes do gênero

Saccharomyces, é transcrita apenas na fase de levedura e potencialmente codifica uma

proteína de superfície. Esses dados indicam que as ORFs selecionadas são genes reais e

podem ser bons candidatos para a descoberta de novas funções e para o desenvolvimento

futuro de novos agentes antifúngicos. Numa tentativa de testar o possível papel da proteína

putativa de superfície CaYdr187cp na adesão celular, constatamos que a incubação de

discos de tecido gastrointestinal com a proteína recombinante enolase, utilizada inicialmente

como controle em nossos experimentos, foi capaz de inibir a adesão de C. albicans de

maneira dose dependente em até 70%. O papel da enolase de superfície na adesão celular

foi confirmado a partir da inibição da adesão em até 50% observada com o bloqueio da

superfície de C. albicans com anticorpos anti-enolase. A capacidade de ligação da enolase

de C. albicans ao plasminogênio foi confirmada a partir de experimentos de co-

imunoprecipitação. A pré-incubação de C. albicans com esta proteína foi capaz de inibir

parcialmente sua adesão reforçando a idéia de que a enolase realmente esteja mediando à

adesão deste organismo ao tecido gastrointestinal. Em contrapartida, a enolase não foi co-

imunoprecipitada com a fibronectina e a pré-incubação de C. albicans com esta proteína

falhou em inibir sua adesão indicando que a inibição observada com a enolase

recombinante não é decorrente do bloqueio da fibronectina no tecido gastrointestinal. Este

trabalho é o primeiro a demonstrar que a enolase presente na superfície de C. albicans está

envolvida em mecanismos de adesão, podendo ser um importante fator de virulência neste

organismo. Assim, esta proteína poderia ser utilizada no desenvolvimento de vacinas ou

estratégias de controles a partir da inibição da adesão de C. albicans ao tecido

gastrointestinal com o intuito de prevenir sua proliferação.

ABSTRACT

Current antifungal agents in medicine presents high toxicity and collateral

effects, targets limited cell constituents and different resistance mechanisms have

already been described. In order to identify novel potential antifungal drug targets,

two hypothetical Candida albicans genes potentially essential and with singular

expression profile have been characterized. The ORF CaYlr339c is conserved

among fungal species from Candida and Saccharomyces genus, is transcribed in

yeast and hyphae and an approximately 18-kDa protein was identified in hyphae and

yeasts C. albicans cell extracts by western blotting. The ORF CaYdr187c is

conserved in a few representatives of the Saccharomyces genus, is transcribed only

in yeasts and potentially codifies a surface protein. These findings indicate that the

selected ORFs are real genes and could be good candidates for the discovery of new

functions and the development of new antifungal agents in the future. In an attempt

to test the possible role of the putative surface protein CaYdr187cp on cell adhesion,

we find out that incubation of the gastrointestinal Murine disks with the recombinant

protein enolase, initially employed as a control in our experiments, was able to inhibit

C. albicans adhesion in a dose-dependent manner in 70%. The role of surface

enolase on cell adhesin was confirmed with the 50% of the adhesion inhibition

observed after blocking C. albicans surface with antibodies anti-enolase. The binding

capacity of enolase to plasminogen was confirmed by co-immunoprecipitation.

Preincubation of C. albicans with this protein partially inhibited the adhesion

supporting the idea that enolase is really mediating the adhesion of this organism to

gastrointestinal tissues. On the other hand, enolase was not co-immunoprecipitated

with fibronectin and pretreatment of C. albicans with this protein failed to inhibit the

adhesion, indicating that the observed inhibition with recombinant enolase was not

due to the blocking of fibronectin in the gastrointestinal disks. This was the first work

to demonstrate that surface C. albicans enolase is involved in cell adhesion, being a

potential virulence factor in this organism. Accordingly, this protein could be useful in

vaccine development and is a promising candidate for the prevention of C. albicans

proliferation by the inhibition of its adhesion.

Esta tese é composta de uma Introdução geral e duas partes independentes

compostas de: Introdução, objetivos, materiais e métodos, resultados, discussões e

conclusões específicas. A primeira parte da tese trata da caracterização parcial de

genes hipotéticos de C. albicans e a segunda parte trata do papel da enolase na

adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal.

1 INTRODUÇÃO GERAL

A Candida albicans é um fungo oportunista, do filo Ascomycota, ordem

Saccharomycetales, (Alexopoulos, et al., 1996). Sob circunstâncias normais, a

levedura C. albicans é um membro benigno da microbiota de indivíduos sadios,

vivendo como comensal na superfície das mucosas, incluindo o trato gastrointestinal

e a cavidade oral (Odds, 1988; Ruhnke, 2002). Em seu estado comensal, C. albicans

existe em equilíbrio com outros organismos da microbiota, com o tecido epitelial,

com as defesas do sistema imunológico do hospedeiro e outras condições

ambientais. Entretanto, perturbações deste equilíbrio em um paciente vulnerável

podem resultar em um crescimento desordenado deste organismo, (Pittet, 1994)

podendo causar desde micoses superficiais (candidíase) até infecções

generalizadas (candidemia), se disseminando pelo sangue e invadindo órgãos

internos (Dalle, 2010; Murad, 2001).

A habilidade de sobreviver e infectar vários sítios anatômicos distintos, com

suas pressões ambientais específicas, é importante para que este organismo possa

sobreviver como comensal ou patogênico (Brown, 2002). C. albicans é considerada

um fungo dimórfico, uma vez que apresenta dois modos proeminentes de

proliferação: a forma de levedura (célula oval que se reproduz por brotamento), e a

forma de hifa (filamento linear formado de células separadas por septos, sem

constrições visíveis nestes locais) (Figura 1). A mudança entre essas formas é o

resultado de uma complexa interação de fatores internos e externos e é coordenada

em parte por proteínas reguladoras que são conservadas entre células eucarióticas.

Entretanto, leveduras e hifas não são os únicos estados morfológicos desse

organismo. A pseudo-hifa (cadeia de células alongadas cuja separação da célula

filha e da célula mãe não ocorreu durante o processo de brotamento, com

constrições visíveis na junção célula-célula) (figura 1), o clamidósporo (esporos

assexuais, unicelulares e esféricos, e com uma espessa parede celular)

(Alexopoulos, et al., 1996) e a forma opaca (necessária para a realização do mating),

representam tipos celulares distintos e se formam em resposta a condições

genéticas e ambientais específicas (Mitchell, 1998; Whiteway e Bachewich, 2007). A

mudança de morfologia de levedura para a hifa contribui para a virulência de C.

albicans, sendo a hifa a forma mais invasiva e a mais freqüentemente identificada

em tecidos infectados (Calderone e Fonzi, 2001; Gow e Odds, 2002; Lo, 1997;

Rooney, 2002; Stoldt, et al., 1997). Mutantes defectivos na formação de hifa são

avirulentos. Tal fato denota a relevância da transição levedura-hifa para a

patogenicidade de C. albicans (Leberer, 1996).

Figura 1. Morfologia da C. albicans. Levedura: célula oval que se reproduz por brotamento.

Hifa verdadeira: células separadas por septos. Pseudo-hifa: cadeia de células com

constrições na junção célula-célula. Fonte: Arnaud et al (2009).

Além disso, outros fatores de virulência estão envolvidos na patogênese de C.

albicans dentre ele: a adesão às células e ao tecido do hospedeiro, a secreção de

proteinases e fosfolipases que também contribuem para invasão e disseminação de

tecidos, a variabilidade antigênica e a imunomodulação dos mecanismos de defesa

do hospedeiro (Calderone e Fonzi, 2001; Chaffin, 1998). Estes fatores são

importantes para a alta adaptabilidade e capacidade de colonização de C. albicans

(Hostetter, 1994).

Quatro espécies de Candida, C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis e C.

parapsilosis, juntas são responsáveis por aproximadamente 95% das infecções por

Candida (Butler e Baker, 1988). No entanto C. albicans ainda é o agente mais

comumente isolado, ficando em 4º lugar na lista de infecções adquiridas em

hospitais nos Estados Unidos, atrás apenas de infecções causadas por bactérias

gram negativas (Sanglard e Bille, 2002), com uma taxa de mortalidade variando de

35 a 40% (Chen, 2003). No Brasil, Candida spp. é o quarto patógeno mais

frequentemente isolado de hemoculturas. A cada 1000 admissões de pacientes em

hospitais, 2,49 casos apresentam candidemia, sendo que 40,9% destes casos são

causados por C. albicans (Colombo, 2006).

Características comuns a pacientes que desenvolvem candidemia incluem, e

não se restringem a: doença cardíaca e pulmonar, câncer, insuficiência renal,

cirurgia, presença de cateter intravenoso e especialmente terapia anterior com

antibióticos (94% dos casos) (Cheng, et al., 2006; Colombo, 2006). O crescente

aumento no número de infecções causadas por fungos oportunistas é decorrente do

aumento da freqüência de pacientes transplantados, do emprego de quimioterapia

mais agressiva e do aumento do número de indivíduos contaminados com o vírus

HIV (Marr, et al., 2002).

Já a alta taxa de mortalidade associada à candidíase sistêmica se deve

principalmente a (i) morosidade no diagnóstico por conta da ausência de

manifestações clínicas específicas. (ii) Ausência de testes diagnósticos sensíveis e

específicos que acarretam na administração empírica de altas quantidades de

drogas nefrotóxicas, muitas vezes desnecessárias. (iii) Limitações do tratamento por

conta da baixa eficiência, resistência e efeitos colaterais resultantes do uso das

drogas antifúngicas de uso corrente. Tais fatores contribuem para que a candidemia

represente um grande peso na mortalidade, morbidez e gastos clínicos em todo o

mundo (Pfaller, 1992).

Assim, a elucidação dos mecanismos, fatores e moléculas responsáveis pela

patogenicidade de C. albicans são de extrema importância para o desenvolvimento

de novas e mais eficientes estratégias para o combate de infecções causadas por

este e por outros fungos patogênicos.

2: CARACTERIZAÇÃO DE GENES HIPOTÉTICOS DE C.

albicans.

2.1 INTRODUÇÃO

O recente progresso na pesquisa genômica iniciou-se em 1995 com o

seqüenciamento, pelo método de shotgun, do primeiro genoma completo de um

organismo celular. O genoma de 1.8 Mb da bactéria Haemophilus Influenzae

(Fleischmann, 1995). Desde então, o sequênciamento dos genomas de uma grande

variedade de espécies de eubactérias, arqueobactérias e eucariotos foram

finalizados e muitos outros estão em andamento (ncbi.nlm.nih.gov/genomeprj),

resultando num rápido acúmulo de informações em bancos de dados e na

necessidade de desenvolvimento de algoritmos para a identificação de genes,

baseado nas características de suas sequências (Gerstein, 2007). A identificação da

maioria dos genes nos genomas seqüenciados é baseada tanto na similaridade com

outros genes conhecidos quanto na significância estatística de uma sequência ser

codificadora de proteína (Rogic, 2001). Na maioria dos casos o gene é identificado

como uma fase aberta de leitura (ORF do inglês Open Reading Frame) anotada no

genoma (Doolittle, 1996).

Uma ORF é definida com uma fita de DNA que começa em um códon de

iniciação (ATG), finaliza em um dos códons de terminação e pode potencialmente

ser traduzida em um polipeptídeo. O processo de anotação de um genoma

geralmente envolve a utilização de ferramentas computacionais que realizam a

tradução dos nucleotídeos nas seis fases de leitura possíveis, identificando as ORFs

com tamanhos previamente definidos (Stein, 2001). No projeto de seqüenciamento

do genoma de C. albicans, por exemplo, as ORFs com menos de 100 aminoácidos

foram desconsideradas (Jones, et al., 2004). De acordo com o Candida Genome

Database (CGD), uma ORF não é considerada um gene até que seja evidenciada a

presença de um transcrito e ou de um produto protéico (Arnaud, 2005). Nesta tese,

ORFs que não atendam a estes critérios serão designadas como genes hipotéticos.

Genes hipotéticos são aqueles que ainda não foram caracterizados

experimentalmente e cuja anotação não pode ser inferida a partir da simples

comparação com genes conhecidos. Esses genes podem não possuir nenhum

homólogo conhecido ou podem ser homólogos de genes com função desconhecida,

sendo portanto denominados genes hipotéticos conservados. Esses genes

correspondem a uma fração significativa dos bancos de dados públicos (Kolker,

2004). O genoma de C. albicans linhagem SC5314 foi re-anotado e estima-se que

~32% dos genes codificadores de proteínas sejam hipotéticos (figura 1a) (Braun,

2005).

A re-anotação de ORFs previamente detectadas é uma prática comum na

pesquisa genômica. Motivações para re-anotações incluem a possibilidade de

descoberta de novos genes, proteínas e funções celulares. Geralmente as re-

anotações envolvem a correção das sequências de nucleotídeos que afetam o

códon de iniciação ou de terminação, a fase de leitura ou a sequência codificadora

de uma determinada ORF, ou ainda a anotação de diferentes sítios de iniciação ou a

presença de introns e exons. Embora o processamento automático dos dados seja

um importante elemento no processo de revisão e atualização das sequências do

genoma, somente a verificação experimental dos genes e de seus produtos

funcionais irá avaliar o desempenho de ferramentas computacionais na anotação de

um genoma. Como todas as anotações de genomas representam hipóteses que

precisam ser verificadas (Ouzounis e Karp, 2002), a caracterização de genes

hipotéticos é de extrema importância para testar essas hipóteses.

2.1.1 O genoma de C. albicans

Apesar das dificuldades encontradas na montagem de seu genoma, em

decorrência de sua diploidia e alta heterozigose, C. albicans foi o primeiro fungo

patogênico a ter o seu genoma seqüenciado (Magee e Magee, 2005). O projeto foi

finalizado em 2004, (Jones, et al., 2004) totalizando aproximadamente 16 milhões de

pares de bases, distribuídos em 412 supercontigs (Montagem 19). A linhagem

SC5314 foi escolhida para o seqüenciamento em decorrência de sua virulência em

modelos animais e de seu cariótipo diplóide verificado em experimentos de

eletroforese. O número de ORFs que codificam proteínas acima de 100 aminoácidos

foi estimado em 6197. O genoma diplóide de C. albicans possui 8 pares de

cromossomos homólogos com tamanhos que variam de 1 a 4 Mb. Os cromossomos

são enumerados do cromossomo R ao cromossomo 7 em ordem decrescente de

tamanho (Magee e Magee, 2005). Uma nova montagem do genoma de C. albicans

foi realizada em 2008 (montagem 21), totalizando aproximadamente 14,3 Mb e 6107

ORFS codificadoras de proteínas de 100 ou mais aminoácidos (Butler, 2009). As

ORFs codificadoras de proteínas do genoma de C. albicans são classificadas pelo

Candida Genome Database (CGD) em não caracterizadas, quando são preditas com

base na comparação de suas sequências com genes conhecidos, sendo que a

inexistência de dados experimentais que evidenciem a expressão de um produto

protéico é o que impede sua classificação como uma ORF verificada. A ORF é

classificada como dúbia, quando não é conservada em outras espécies fúngicas e

não parecem indistinguíveis de sequências aleatórias presentes no genoma, sendo

pouco provável que codifiquem um produto protéico (candidagenome.org). A figura

1b demonstra a classificação das ORFs do genoma de C. albicans linhagem SC5314

denotando o elevado número de ORFs classificadas como não caracterizadas no

genoma de C. albicans.

O seqüenciamento da linhagem WO-1 de C. albicans, que pertence a um

diferente subgrupo populacional (Tavanti, 2005), foi publicado em 2009 (Butler,

2009). As montagens das duas linhagens (SC5314 e WO-1) são altamente

colineares, com 12 inversões de 5 a 94 kb, exceto que na linhagem WO-1, alguns

cromossomos não homólogos sofreram recombinações de suas sequências

repetitivas principais (MRS). Foram encontradas taxas similares de polimorfismos de

base única (SNPs, do inglês Single Nucleotide Polymorphism) em cada linhagem

(um SNP para cada 330-390 bases) e duas vezes essa taxa entre as linhagens. A

montagem do genoma da linhagem WO-1 totalizou aproximadamente 14,4 Mb e

6107 ORFs (Butler, 2009).

Figura 1. Classificação das ORFs do genoma de C. albicans linhagem SC5314 A: Genes

hipotéticos no genoma de C. albicans, linhagem SC5314 de acordo com a re-anotação do

genoma realizada por Braun et al (2005). Em vermelho: Genes hipotéticos (13%), em

verde: Genes hipotéticos conservados (19%) e em azul: demais genes (68%). B:

Classificação das ORFs do genoma de C. albicans linhagem SC5314 de acordo com o

CGD. Em verde: Verificadas (20%), em azul: Não caracterizadas (77%) e em vermelho:

Dúbias (3%). Dados obtidos a partir do – CGD Candida Genome Database.

(candidagenome.org/chace/genomesnapshot) acesso em: 17/09/2009.

2.2 OBJETIVO

Os agentes antifúngicos de uso corrente na medicina apresentam alta

toxicidade e efeitos colaterais, tem como alvo poucos constituintes celulares, e

muitos mecanismos de resistência já foram descritos (Ghannoum e Rice, 1999),

indicando a necessidade de desenvolvimento de novos alvos para drogas

antifúngicas que escapem a estes mecanismos. Uma busca manual no genoma

sequenciado de C. albicans foi realizada em nosso laboratório com base em três

critérios. (i) Os genes deveriam ser hipotéticos, aumentando assim a probabilidade

de se identificar novos genes, (ii) potencialmente essenciais, já que se deseja a

morte do organismos causador da infecção, (iii) e com baixo nível de expressão, o

que implica numa menor dosagem da droga e menos efeitos colaterais. Dentre os

genes hipotéticos pré selecionados, as ORFs CaYdr187c e CaYlr339c foram as que

melhor atenderam a esses critérios e portanto foram selecionadas para este estudo.

Assim, o principal objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular

destes potenciais novos alvos para drogas antifúngicas.

2.3 MATERIAIS E MÉTODOS

2.3.1 LINHAGENS DE Escherichia coli

Tabela 1 - Linhagens de E. coli

Linhagem

Genótipo

Referência

DH5α supE, ∆lacU169, (ϕ80lacZ∆M15),

hsdr17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1,

relA1, F´(traD36, proAB+, lacq,

lacz∆M15)

(Woodcock, et al., 1989)

BL21(DE3) F-, ompT, hsdS

), dcm, gal

λ(DE3)

Novagen

Rosetta (DE3)

F-, ompT, hsdS

), gal, dcm

(DE3), pRARE (

argU, argW, ilex, glyT,

leuW, proL)

Novagen

2.3.2 LINHAGENS DE C. albicans e S. cerevisiae

Tabela 2 - Linhagens de C. albicans e S. cerevisiae

Organismo

Linhagem

Origem

C. albicans SC5314 Stanford Genome Technology Center

C. albicans L757 LEMI (Laboratório Especial de Micologia da Unifesp)

S. cerevisiae

S288c (Mortimer e Johnston, 1986)

2.3.3 PLASMÍDEOS

Tabela 3 - Plasmídeos

Plasmídeo

Descrição

Origem

Aplicação

pBluescript II SK

pUC Ori, origem de replicação ColE1, amp

Stratagene

Clonagem

pET 28a (+)

Promotor T7 lac, His-tag N-terminal, sítio

para trombina, Kan

Novagen

Expressão

heteróloga de

proteínas

recombinantes

pGEX 6P3

Glutationa S-transferase N-terminal, lac l

sítio para Prescission, amp

Amersham

Expressão

heteróloga de

proteínas

recombinantes

2.3.4 OLIGONUCLEOTÍDEOS

Tabela 4 - Oligonucleotídeos

Oligonucleotídeo

Sequência

Aplicação

Exylr339c-F

Exylr339c-R

5’-CTCGGATCCATGTTCAACATGTTCAA -3’

5’-CTGCTCGAG

TCAATACTTCTCCAAAT-3’

Amplificação da ORF

Caylr339c

Mtylr339c1-F

Mtylr339c1-R

5’-GTTGGAACACCCAAAGCTTGG-3’

5’-CAAGATTGCAGAAGGTACC-3’

Mutação do 1º códon

CTG para TCT

Mtylr339c2-F

Mtylr339c2-

5’-GCACCAGCT

TCT

GCTGGTGCAGC-3’

5’-CGTTGCTCCAAAAGATGTTTGG-3’

Mutação do 2º códon

CTG para TCT

Mtylr339c3-F

Mtylr339c3-R

5’-CTCTT

TCG

ACCATGGTG-3’

5’-CCATCGAAGGTTTCTTGTC-3’

Mutação do 3º e 4º códon

CTG para TCG

Mtylr339c5-F

Mtylr339c5-R

5’-CATTTGTTGGGAAGAAAC-3’

5’-CACGAAATAGAAAAGGCC-3’

Mutação do 5º códon

CTG para TCT

Exydr187c-F

Exydr187c-R

5’-CTCGGATCCATGGGGTTGGTAAACAC-3’

5’-CTGCTCGAG

TCATTGCCCACCAATGT-3’

Amplificação da ORF

Caydr187c

Exydr187c2-R 5’-CTGGAATTCTGTCCACCCCGTAGTG-3’ Amplificação da ORF

Caydr187c (Região I)

Mtydr187c1-F

Mtydr187c1-R

5’-CCAATGTTAACAATTTTTCAGC-3’

5’-GCTTGAATGTAGATGAAATC-3’

Mutação do 1º códon

CTG para TCT

Mtydr187c2-F

Mtydr187c2-R

5’-TGGCTCCGTCGGCATTGGA-3’

5’-TTATCGAAAATGTTGAAGCA-3’

Mutação do 2º códon

CTG para TCG

M13-F

M13-R

5’-CGTTTTACAACGTCGTGACTGGG-3’

5’-CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT-3’

Sequenciamento

pbluescript II SK

5pGEX

3pGEX

5’- GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3’

5’-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3’

Sequenciamento

pGEX6P 3

T7-F

T7-R

5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’

5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’

Sequenciamento

pET28a (+)

ACT1-F

ACT1-R

5’-GAACGTCCAATGAATCCAAAATC-3’

5’-GTTCGAAATCCAAAGCAACGTAAC-3’

Amplificação do gene da

actina de C. albicans

Sublinhado: Sítios de restrição para BamHI e XhoI nos oligonucleotideos Forward e Reverse

respectivamente.

Negrito: Códons que foram modificados por mutagênese sítio dirigida por PCR.

2.3.5 MANIPULAÇÃO DE RNA

2.3.5.1 Indução de hifa de C. albicans

A linhagem SC5314 de C. albicans foi cultivada em 10 mL de meio YPD

líquido a 37ºC overnight, 200 rpm. Uma alíquota desta cultura foi centrifugada por 5

min a 6.000 rpm e lavada 3 vezes com PBS 1X pH 7.4 e ressuspensa em 1 mL de

PBS. A absorbância foi medida a 660 nm para se obter a concentração das

leveduras. A concentração foi estimada a partir da curva pré-estabelecida de

densidade ótica x concentração de leveduras. As células foram então diluídas para a

concentração 10

células/mL no soro fetal bovino com dextrose 5 mg/mL. As

leveduras foram incubadas por 2 h à 37ºC, 200 rpm. Após esta incubação, as células

foram observadas ao microscópio para estimar a proporção de hifas e leveduras. Foi

encontrada a porcentagem aproximada de 90% de hifas em relação às leveduras.

As hifas assim induzidas foram lavadas com PBS e submetidas à extração e

quantificação do RNA total.

2.3.5.2 Extração do RNA total de C. albicans (levedura e hifa)

Para a extração de RNA total as células foram centrifugadas a 10.000 rpm por

2 min, lavadas com EDTA 10 mM (pH 8,0) e ressuspensas em 200 µL de tampão

protoplasto (sorbitol 1 M, EDTA 100 mM e DTT 50 mM pH 7,5) acrescido de

Zimoliase (Zymo- Research). A amostra foi incubada a 37ºC por 120 min com

agitação ocasional e novamente centrifugada a 10.000 rpm por 5 min. 1 mL de

TRIZOL

(Invitrogen) foi adicionado ao precipitado, seguido de agitação em vortex e

incubação à temperatura ambiente por 5 min. A amostra foi centrifugada a 12.000

rpm por 15 min a 4ºC, a fase aquosa transferida para um novo tubo e precipitada

com 500 µL de isopropanol. Após incubação de 10 min no gelo, a suspensão foi

centrifugada a 12.000 rpm por 10 min a 4ºC. Descartado o sobrenadante, o

precipitado de RNA foi lavado em 500 µL de etanol 70% e novamente centrifugado a

8.500 rpm por 5 min a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado seco por

10 min à temperatura ambiente. O RNA foi ressuspenso em 40 µL de água DEPC e

imediatamente congelado à -80ºC. As hifas induzidas foram processadas da mesma

maneira para extração do RNA total.

2.3.5.3 Quantificação do RNA total

Para quantificação do RNA, Foram diluídos 5 µL de DNA em 1 mL de água

Milli-Q estéril. Em seguida a absorbância foi medida em comprimento de onda de

260 nm e obedecida à proporção de 40 µg/mL de RNA para a absorbância de 1.

Também foi medida a absorbância em 280 nm de comprimento de onda para

verificar a pureza do RNA. A razão entre as leituras DO

260

/DO

280

permite uma

estimativa da pureza do DNA, sendo que valores da razão entre 1,8 e 2,0 indicam

extrações puras. A razão abaixo de 1,6 indica grande quantidade de contaminantes,

e na sua ocorrência procedia-se uma nova extração de RNA.

2.3.5.4 Verificação da integridade do RNA total em gel desnaturante de

agarose

A integridade do RNA total extraído foi verificada a partir da visualização do

mesmo em gel de eletroforese contendo 1,5% de agarose em tampão fosfato de

sódio e formaldeído. Para 50 mL de gel, 0,500 g de agarose foi acrescentado a 41,5

mL de água Milli-Q tratada com DEPC e 0,5 mL de tampão fosfato de sódio 1 M (pH

7,0). A solução foi aquecida até a dissolução completa da agarose. Na capela após

o acréscimo de 8 mL de formaldeído, o gel foi colocado no suporte por 45 min á

temperatura ambiente até sua polimerização. Na preparação das amostras

utilizaram-se aproximadamente 4 µg de RNA, 3 vezes o volume de tampão de

amostra para RNA, EDTA 10 mM e 1 µL de brometo de etídio 1 µg/µL. As amostras

foram desnaturadas a 70ºC por 5 min e esfriadas no gelo por 2 min. O tampão

fosfato de sódio 0,01 M foi utilizado na corrida eletroforética sob as condições de 80

V por 1 h e 30 min. O tampão foi circulado a cada 15 min para reequilibrar o pH na

cuba.

2.3.5.5 Tratamento do RNA com DNAse I

O RNA extraído foi tratado com DNase livre de RNase para eliminação de

eventual contaminação do RNA por DNA. Nessa reação, foram utilizados 5 µg de

RNA, 1 µL de DNase livre de RNAse (Promega), 1X tampão para Dnase (Tris-HCL

40mM pH 8,0, MgSO4 10mM, CaCl

1mM), 2,8 µL de RNAguard

41U/µL

(Amersham Pharmacia), e água Milli-Q DEPC para um volume final de 32 µL. A

mistura foi incubada por 30 min a 37ºC e a reação interrompida com a adição de 1X

RQ DNAse stop solution (EGTA 20 mM pH 8,0), seguida de incubação a 65ºC por 15

min. O RNA tratado com DNAse foi estocado a -80ºC.

2.3.5.6 Reação de Transcriptase reversa

A enzima SuperScript

II (Invitrogen) foi utilizada na RT-PCR, seguindo o

protocolo sugerido pelo fabricante. Utilizou-se nessa reação 12 µg de RNA, 400 ng

de Oligo d(T)

(Promega), 0,5 mM de dNTP mix e água DEPC para um volume final

de 14 µL, incubando a mistura por 15 min a 65ºC e passando-a para o gelo por 2

min. Posteriormente, foram adicionados 4 µL de 5X Tampão First-Strand Buffer

(Invitrogen), 1 µL de DTT 0,1 M e 1 µL da enzima SuperScript

II. A reação foi

incubada a 42ºC por 1 h e inativada a 65ºC por 15 min. Após a RT-PCR, o cDNA foi

tratado com RNAse H para remoção do RNA complementar, adicionando

diretamente à reação, 1 U da enzima e incubando a 37ºC por 20 min.

2.3.5.7 PCR com cDNA de levedura e hifa

Para verificar a ausência de contaminação de DNA nas amostras, assim

como a presença e integridade do cDNA, o produto de RT-PCR de levedura e hifa

foram submetidos a PCR com os oligonucleotídeos que flanqueiam as ORFs

CaYlr339c e CaYdr187c, assim com o gene ACT1-actina de C. albicans. Todas as

reações consistiram de MasterMix 2X (Promega), 15 pMoles de cada

oligonucleotídeo, 2 µL de cDNA de levedura ou hifa e água Milli-Q para um volume

final de 25 µL. As condições de ciclagem foram as seguintes: 94

C por 5 min, 35

ciclos de 94

C por 45 seg, 54

C por 1 min e 72

C por 1 min, seguidos de uma

extensão final de 72

C por 10 min. Como controle as mesmas reações foram

realizadas utilizando 0,5 µL de RNA tratado com DNAse de levedura e hifa para

descartar a possibilidade de amplificação devido à possível contaminação do RNA

com DNA.

2.3.6 CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO DA ORF CaYlr339c e

CaYdr187c.

2.3.6.1 Extração de DNA genômico de C. albicans

A linhagem SC5314 de C. albicans foi crescida overnight em 2 mL de meio

YPD a 37

C em agitação até o começo da fase estacionária (2 x 10

células/mL). 1,3

mL da cultura foi transferido para um tubo eppendorf de 1,5 mL e centrifugado a

6.000 rpm durante 3 min. Em seguida o sobrenadante foi removido, ressupendido em

1 mL de água Milli-Q estéril e centrifugado a 6.000 rpm por 3 min. O sobrenadante foi

descartado, as células foram ressuspendidas em 200 µL de tampão protoplasto (10

µL β-mercaptoetanol (Sigma), 100 µL Tris - HCl 1 M, pH 7,4, 20 µl EDTA 10 mM, 100

µL zimoliase 100 U/80 µL (Zymo Research), 770 µL água Milli-Q estéril) e incubadas

por 2 h a 37

C sob inversão de 20 em 20 min. Posteriormente foi adicionado 200 µL

de solução de lise (20 µL NaOH 10 N, 100 µL SDS 10%, 880 µL água Milli-Q estéril)

e misturada cuidadosamente por inversão. A amostra foi incubada a 65

C por 20 min

e esfriada rapidamente no gelo. Foi adicionado 200 µL de acetato de potássio 5 M,

pH 5,4 e misturado por inversão. A amostra foi incubada no gelo por 15 min e

centrifugada a 13200 rpm por 3 min a 4ºC. O sobrenadante foi tranferido para tubos

novos onde posteriormente foi adicionado 0,6 volumes de isopropanol e misturado

por inversão. A amostra foi incubada á temperatura ambiente por 5 min e

centrifugada por 5 min a 13.200 rpm à temperatura ambiente. Foi adicionado 1 mL de

etanol 70%, misturado por inversão, incubado a temperatura ambiente por 10 min e

centrifugado por 10 min a 13200 rpm. A lavagem e centrifugação com etanol foi

repetida mais uma vez. O pellet foi seco por 20 min á temperatura ambiente e diluído

em 50 µL de água Milli-Q estéril.

2.3.6.2 Tratamento do DNA com RNase

Para a purificação do DNA, foi adicionado 48 µL de água Milli-Q estéril, 1 µL

de Tris-HCl 1 M pH 7,5 e 1 µL de RNAseA (Sigma) ao pellet e incubado à 37ºC por 1

h. O DNA foi precipitado com a adição de 10 µL de acetato de sódio (NaOAc) 3 M e

220 µL de etanol absoluto gelado. A suspensão foi homogeneizada, incubada por 10

min no gelo e centrifugada por 15 min a 13.000 rpm. Após desprezar o

sobrenadante, foram adicionados 500 µL de etanol 80%. A amostra foi novamente

centrifugada por 15 min a 13.000 rpm, o etanol retirado e o pellet seco por 10 min. O

pellet foi eluído em 50 µL de água Milli-Q esterilizada. O DNA foi quantificado

conforme item 2.3.5.3 obedecida a proporção de 50 µg/mL de DNA para a

absorbância 1.

2.3.6.3 Amplificação das ORFs CaYlr339c e CaYdr187c.

Os oligonucleotídeos para a amplificação das ORFS Caylr339c e Caydr187c

foram desenhados com base nas sequências provenientes do seqüenciamento do

genoma de C. albicans linhagem SC5314, montagem 19, disponível em

(candidagenome.org). Para a amplificação destas ORFS, foram utilizados MasterMix

2X (Promega), oligonucleotídeos na concentração final de 500 nM, 40 ng de DNA

genômico e água Milli-Q para um volume final de 20 µl. As condições de ciclagem

foram as seguintes: 94ºC por 5 min; 35 ciclos de 94ºC por 1 min, hibridação por 30

seg nas temperaturas (Exylr339c: 54ºC, Exydr187c: 53ºC, Exydr187c2: 50ºC) e

elongação a 72ºC por (Exylr339c e Exydr187c: 1 min, Exydr187c2: 35 seg),; seguido

de uma extensão final a 72ºC por 10 min. Os amplicons foram purificados utilizando

GFX

PCR DNA and Gel Band Purification kit (GE Healthcare) conforme protocolo

do fabricante. As PCR´s foram posteriormente quantificadas em gel de agarose 1%.

2.3.6.4 Eletroforese de fragmentos de DNA

Alíquotas de DNA genômico total, plasmidial, digestões ou produtos de PCR

foram analisados em gel de agarose em tampão TAE para análise qualitativa e

quantitativa. Os fragmentos foram visualizados em transiluminador de UV e

fotografados utilizando o Gel Logic 100 Imaging System (Kodak).

2.3.6.5 Tratamento do DNA e ligação

A clivagem do vetor foi realizada a partir da seguinte reação: 5 µg de

pBluescript II SK, 10X tampão React 2, 10 U de EcoRV (Amersham) e água MilliQ

para um volume final de 20 µL. A reação foi incubada a 37ºC overnight. A

defosforilação do vetor foi realizada conforme a seguinte reação: 20 µL do vetor

clivado, 10X tampão CIAP, 1 U de CIAP Calf Intestinal Alkaline Phosphatase

(Promega) e água MilliQ para um volume final de 40 µL. A reação foi incubada a

C por 30 min e posteriormente foi adicionado mais 1 U de CIAP com uma nova

incubação de 37

C por 30 min . O vetor tratado foi então purificado com o kit GFX

(GE Healthcare) e quantificado em gel de agarose 1%, utilizando o marcador High

Mass (Invitrogen). A fosforilação e o preenchimento de extremidades protuberantes

dos produtos de PCR foram realizadas a partir da incubação a 37

C por 1 h de 20µL

de PCR, 10X B/K (Blunting/Kinasing buffer), 6 U de PNK (Polinucleotídeo quinase) e

5 U de Klenow (USB) e água MilliQ para um volume final de 40 µL. O inserto foi

purificado com o kit GFX (GE Healthcare) e quantificado em gel de agarose 1%,

utilizando o marcador Low Mass (Invitrogen). A reação de ligação consistiu de 1 U

de T4 DNA Ligase (Invitrogen), 5X buffer, 20 fMoles do vetor, 60 fMoles do inserto e

água MilliQ para um volume final de 40 µL. A reação foi incubada overnight a 14

2.3.6.6 Preparação de bactérias competentes

As linhagens de E. coli DH5α, BL21 (DE3) e Rosetta (DE3) foram preparadas

para a transformação de acordo com metodologia descrita (Sambrook, et al., 1989),

Inoculamos uma pequena quantidade de E. coli em 2 mL de meio LB sem

antibióticos. Após crescimento overnight a 37°C sob agitação (200 rpm), uma

alíquota de 500 µL do meio de cultura foi diluída (1:100) em 50 mL de meio LB em

um erlenmeyer. A cultura foi incubada sob agitação por um período de 2 h à

temperatura de 37ºC, para que as células entrassem em fase logarítmica de

crescimento. A absorbância da solução foi medida em espectrofotômetro em

comprimento de onda de 560 nm. Após leitura entre 0,5 e 0,7, a cultura foi colocada

em gelo e centrifugada a 6.000 rpm por 5 min a 4ºC. O sobrenadante foi removido e

o precipitado ressuspendido em 5 mL de CaCl

100 mM gelado. Completado o

volume para um total de 50 mL, a suspensão foi incubada em gelo por 10 min e

depois centrifugada por 5 min a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e foi adicionado

CaCl

100 mM gelado em volume correspondente a 10 vezes a DO da cultura. A

suspensão foi incubada no gelo por 30 min e depois conservada em geladeira até o

dia seguinte quando glicerol foi adicionado até a concentração de 15% do volume.

Após a adição do glicerol, alíquotas de 200 µL foram preparadas e estocadas em

freezer -80ºC.

2.3.6.7 Transformação de bactérias competentes

Todo o volume da reação de ligação acrescido de água Milli-Q estéril para um

volume de 100 µL foram misturados á alíquotas de células competentes previamente

descongeladas. As células foram incubadas por 30 min no gelo e posteriormente

submetidas a choque térmico a 42ºC por 1,5 min e retornadas ao gelo por 2 min. A

suspensão foi transferida para um tubo estéril, contendo 1 mL de meio SOC e 40 µL

de IPTG (Isopropyl-B-D-Thiogalactopyranoside) e incubadas à 37ºC durante 1 h com

agitação suave (125 rpm), para permitir a expressão do gene de resistência a

ampicilina e do gene LacZ. A suspensão de bactérias foi plaqueada em meio sólido

apropriado, recoberto com 70 µL de Bluo-Gal 20 mg/mL (Life Technologies, Grand

Island, NY, USA). A placa foi incubada a 37ºC overnight.

2.3.6.8 Minipreparação de DNA plasmidial

As colônias isoladas foram crescidas em meio LB com ampicilina (100 µg/mL)

durante 18 h a 37ºC, 200 rpm. 1,5 mL da cultura foi centrifugado por 1 min a 13.200

rpm em temperatura ambiente e o sobrenadante foi descartado. O pellet foi

ressuspenso com 100 µL de Solução I (Glicose 50 mM, Tris-HCL 25 mM, EDTA 10

mM – pH 7,5) contendo 1 µL de RNAse A 100 µg/mL (Sigma) utilizando vortex.

Foram adicionados 200 µL da Solução de lise II (lise) (NaOH 0,2 N, SDS 1%),

homogeneizado suave e brevemente em vortex e acrescentados 200 µL da Solução

III (de neutralização) (Acetato de Potássio 3 M pH 4,5). A suspensão foi

homogeneizada suavemente por inversão, incubada no gelo por 30 min e

centrifugada durante 15 min a 13.200 rpm à temperatura ambiente. O sobrenadante

foi transferido para um tubo novo, adicionado de 300 µL de isopropanol, misturado

suavemente por inversão e centrifugado por 10 min a 13.200 rpm. O pellet de DNA

plasmidial foi lavado com etanol 70% gelado, centrifugado por 5 min a 13.200 rpm,

drenado com papel absorvente, seco a 60ºC até a evaporação completado etanol. O

DNA foi ressuspenso em 30 µL de água Milli-Q estéril e analisado em gel de agarose

temperatura ambiente e ressuspenso em 30 µL de água Milli-Q estéril.

2.3.7 SEQUENCIAMENTO DE DNA

2.3.7.1 Reação de Sequenciamento

Os seqüenciamentos dos fragmentos de DNA clonados foram feitos em

seqüênciador automático de capilar ABI PRISM 3100 (Applied Biosystem, Foster

City, CA, USA). Em cada reação eram utilizados os oligonucleotídeos que hibridam

no plasmídeo externamente ao fragmento clonado (M13-F, M13-R; T7-F, T7-R;

5pGEX, 3pGEX). O seqüenciamento procedeu de acordo com o método de

terminação de cadeia por dideoxinucleotídeo (Sanger, et al., 1977) modificado para

seqüenciamento utilizando terminadores de cadeia dideoxinucleotídeos

fluorescentes BigDye

. Para tanto, 1 µg de plasmídeo foram colocados em uma

reação padrão contendo 2 µl Big Dye

Terminator Ready Reaction Mix – DNA

polimerase AmpliTaq, tampão Tris-HCL pH 9,0, MgCl

, deoxinucleotídeos trifosfato

(dATP, dCTP, dITP, dUTP) e dideoxinucleotídeos marcados com um doador e um

aceptor de fluorescência, 2µl de tampão Save Money, 1 µl de oligonucleotídeo 3,2

pmoles/µL e água Milli-Q para completar 10µL. As condições de ciclagem foram:

96ºC por 5 min, 25 ciclos de 96ºC por 10 seg, 50ºC por 5 seg e 60ºC por 4 min.

2.3.7.2 Precipitação do DNA

Ao final da ciclagem, foram acrescentados à reação de seqüenciamento 40 µL

de etanol 80%, e a reação foi incubada à temperatura ambiente por 15 min. A

reação foi, então, centrifugada durante 45 min a 2.970 x g, à temperatura ambiente,

e o etanol desprezado por inversão. Foram adicionados 150 µL de etanol 70%, e a

reação foi novamente centrifugada por 15 min a 2.970 x g. O álcool foi descartado

por inversão e os tubos foram deixados por 15 min em estufa a 60°C. 10 µL de

formamida HI-DI

foram acrescentados a cada reação. No momento da aplicação

no gel, a solução foi desnaturada por 5 min a 90°C e mantida no gelo por 5 min.

2.3.7.3 Montagem das seqüências consenso – contigs

As seqüências consenso – contigs – foram montadas utilizando os programas

Phred, Phrap e Consed (Ewing e Green, 1998; Ewing, et al., 1998a; Gordon, et al.,

1998). O programa Phred é um programa de identificação de bases que gera dois

tipos de arquivos de saída: um com a seqüência de nucleotídeos propriamente dita,

e outro com um escore de qualidade atribuído para cada nucleotídeo de um

cromatograma, valor que é utilizado pelo programa Phrap para a montagem de

contigs com um escore associado. O programa Phrap foi implementado para a

montagem de seqüências de DNA obtidas por shotgun e permite a utilização de

seqüências inteiras ao invés de apenas as regiões de boa qualidade, pois ao invés

de determinar uma seqüência consenso a partir das parciais, constrói um mosaico

utilizando as regiões de melhor qualidade de cada uma. O programa Consed permite

editar as montagens das seqüências consenso realizadas pelo Phrap.

2.3.8 MUTAGÊNESE SÍTIO DIRIGIDA

2.3.8.1 Amplificação por PCR (Polymerase Chain Reaction)

Os cinco códons CTG da ORF CaYlr339c e os dois códons CTG da ORF

Caydr187c foram modificados para TCT ou TCG (Tabela 3) através da técnica de

mutagênese sítio dirigida por PCR (Weiner, 1995). As reações de amplificação foram

realizadas com o Elongase Amplification System (Invitrogen) e consistiram de 40

pMoles de cada oligonucleotídeo (Tabela 3), 300 µM de dNTP, mistura dos tampões

A e B (60 mM Tris-SO

(pH 9,1), 18 mM (NH

)

), numa proporção em que a

concentração final de MgSO

na reação fosse de 1,4 mM, 100 ng da miniprep (ORF

Caylr339c ou Caydr187c mutada + pbluescript II SK), 2 µl de Elongase Enzyme Mix

e água MilliQ para um volume final de 50 µl. As condições de ciclagem foram as

seguintes: 94

C por 30 seg, 25 ciclos de 94

C por 30 seg, hibridação por 30 seg nas

temperaturas (Mtylr339c1: 47ºC, Mtylr339c2: 54.1ºC, Mtylr339c3: 50ºC, Mtylr339c5:

55.5ºC, Mtydr187c1: 50ºC, Mtydr187c2: 52ºC) e 68

C por 4,3 min, seguidos de uma

extensão final de 68

C por 10 min.

2.3.8.2 Tratamento com DpnI e Pfx

O DNA parental e o novo DNA sintetizado contendo a mutação foram tratados

com a enzima DpnI–5´-Gm6ATC-3´ (QIgene) que cliva apenas o DNA metilado

(template). A enzima PfX (Invitrogen) foi utilizada para remover as bases

indesejadas estendidas pela DNA polimerase, permitindo a posterior ligação do DNA

linear. A reação consistiu de 40 µl da PCR (ORFs mutadas + pbluescript II SK), 0,1

µl de BSA 10 µg/µL e água MilliQ para um volume final de 70 µL. A reação foi

incubada a 37ºC overnight. Foi adicionado 5 U da enzima PfX e incubado por 1 h a

68ºC. A digestão foi purificada com o Kit para purificação de DNA GFX

PCR DNA

and Gel Band Purification kit (GE Healthcare) conforme protocolo do fabricante.

2.3.8.3 Ligação (Circularização)

A ligação do DNA sintetizado contendo a mutação foi realizada a partir da

reação de 20 µL do DNA purificadado, 4 µL de ATP 10 mM, 2 U de T4 DNA Ligase

(Invitrogen), 5X Ligase Buffer e água Milli-Q para um volume final de 40 µL. A reação

foi incubada overnight a 14ºC. Posteriormente o DNA foi transformado em E. coli -

DH5α conforme item 2.3.6.7. A miniprepração e o sequenciamento para confirmação

da presença da mutação foram realizados conforme itens 2.3.6.8 e 2.3.7

respectivamente.

2.3.9 EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

2.3.9.1 Construções em pET28a(+) e pGEX6P3

Os fragmentos foram liberados do vetor de clonagem pBluescript II SK

através da digestão com as enzimas de restrição BamHI e XhoI (Amersham). Os

vetores pET28a(+) e pGEX6P3 foram digeridos com as mesmas enzimas de

restrição conforme especificações do fabricante. Os vetores foram desfosforilados

com a enzima CIAP (Promega). Os fragmentos e os vetores digeridos foram

purificados com o GFX

PCR DNA and Gel Band purification Kit (GE Healthcare) e

quantificados em gel de agarose. A reação de ligação foi realizada com a enzima T4

DNA ligase (Invitrogen) conforme especificações do fabricante. Todo o volume da

ligação foi utilizado na transformação de bactérias DH5

α conforme descrito no item

2.3.6.7. Após a extração dos plasmídeos recombinantes e a confirmação da

clonagem por sequenciamento, 1µg de plasmídeos foram utilizados na

transformação de bactérias competentes da linhagem BL21 (DE3) ou Rosetta (DE3).

Após o insucesso da expressão da proteína integral e de segmentos sem o peptídeo

sinal e sem as regiões transmembranas com cauda de histidina, optou-se por

expressar a proteína integral e alguns segmentos fusionados com GST (Glutationa

S-transferase) no vetor pGEX6P3 (Amersham).

2.3.9.2 Expressão das proteínas recombinantes

Colônias isoladas de bactérias das linhagens BL21 (DE3) ou Rosetta (DE3)

contendo o plasmídeo de expressão foram crescidas em um pré-inóculo a 37°C em

meio LB com o antibiótico apropriado por 18 h. O pré-inóculo foi diluído 1:50 no

mesmo meio. A cultura foi incubada a 37°C, com agitação a 200 rpm, até atingir A

600

= 0,2 - 0,3 (para indução de 18 h) ou A

600

= 0,6 (para indução por até 4 h). Nesse

ponto foi realizada a indução da expressão protéica com IPTG 1 mM, em condição

de alta aeração (250 rpm em frascos de volume superior a pelo menos 5X o volume

de cultura). As proteínas recombinantes His

-Caylr339cp e GST-126aa187cp foram

induzidas a 23ºC overnight (18 h). A cultura pós-indução foi centrifugada a 4.000 rpm

por 10 min a 4°C, e o precipitado foi ressuspenso em PBS 1X gelado, na proporção

1,5 ml tampão: 100 ml cultura. A amostra foi congelada a -80ºC e, após

descongelamento, foi incubada no gelo com lisozima (para uma concentração final

de 1 mg/ml, a partir de solução estoque 50 mg/ml) por 30 min, e em seguida

sonicada (sonicador Branson Sonifier 450) e centrifugada em tubos de 2 ml para

microcentrífuga a 14.000 rpm por 20 min a 4°C. O sobrenadante (fração solúvel) e o

precipitado ressuspenso em solução de uréia 6 M (fração insolúvel) foram

aliquotados e armazenados a -20ºC.

2.3.9.3 Purificação da proteína recombinante His

-Caylr339cp

Verificou-se por SDS-PAGE que His

-Caylr339cp encontrava-se na fração

insolúvel do extrato. A resina quelante de níquel (QIAGEN) foi lavada três vezes em

água Milli-Q em tubo de 15 mL e equilibrada três vezes com 4 volumes de tampão

de ligação (imidazol 5 mM, NaCl 500 mM, Tris-HCl 20 mM pH 8,0, uréia 6 M). O

extrato insolúvel foi adicionado à resina e incubado por 2 h sob agitação a 4ºC. Após

três lavagens com 6 volumes de tampão de ligação, a resina foi lavada três vezes

com 6 volumes de tampão de lavagem (imidazol 20 mM, NaCl 500 mM, Tris-HCl 20

mM pH 8,0, uréia 6 M). Foram feitas, então, três eluições com 2 volumes de tampão

de eluição (imidazol 1 M, NaCl 500 mM, Tris-HCl 20 mM pH 8,0, uréia 6 M). Todas

as eluições foram dialisadas 3 h contra um tampão Tris-HCl 20 mM pH 8,0, uréia 2 M

e depois contra um tampão Tris-HCl 20 mM pH 8,0, uréia 1 M overnight a 4ºC. A

proteína recombinante foi quantificada pelo método de Bradford utilizando diferentes

concentrações de BSA como padrão (Bradford, 1976).

2.3.9.4 Purificação da proteína recombinante GST-126aa187cp

A proteína GST-126aa187cp foi obtida na fração insolúvel do extrato. Com o

objetivo de se obter a fração solúvel da proteína e purifica-la com o GST-Glutathione

Affinity System (Amersham), diferentes linhagens de E. coli, temperaturas e

concentrações de IPTG foram testadas sem sucesso. Assim o extrato contendo a

proteína insolúvel foi aplicado em um gel SDS-PAGE 10%. Um pequeno pedaço do

gel foi corado com azul de Coomassie e descorado (conforme item 2.3.10) de modo

a guiar o corte da banda correspondente. A proteína recombinante foi cortada com

lâminas limpas e eluída overnight a 4ºC em água Milli-Q. A proteína resultante foi

concentrada em tubos centricon (Millipore) e quantificada pelo método de Bradford

(Bradford, 1976).

2.3.9.5 Quantificação de proteínas

Quantidades variáveis da proteína recombinante purificada foram adicionadas

a 1 mL de solução de Coomassie Brilliant Blue e a absorbância a 595 nm foi

determinada em espectrofotômetro. A concentração da proteína foi determinada

utilizando uma curva-padrão de BSA de 2 a 10 µg (Bradford, 1976). A proteína

também foi quantificada por SDS-PAGE (utilizando como padrão quantidades

conhecidas de BSA). Diluiu-se a proteína para uma concentração final de uso de

800 ng/µL.

2.3.10 GEL SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel

electrophoresis) PARA SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS.

Os géis foram preparados conforme abaixo:

Composição

Gel de separação

Gel de

Empacotamento

10% 15% 20%

Acrilamida/bis-acrilamida (30%/ 0,8%)

5 mL 5 mL 5 mL 1,3 mL

Tris-HCl 3M pH 8,8 1,9 mL 1,9 mL 1,9 mL X

Tris-HCL1M pH 6,8 X X X 1,25 mL

O destilada 8,1 mL 5 mL 5 mL 7,2 mL

SDS 10%

150 µL 150 µL 150 µL 100 µL

Persulfato de amônia 10%

150 µL

150 µL 150 µL

100 µL

TEMED (GIBCO BRL)

40 µL 40 µL 40 µL 20 µL

Para análise protéica foi utilizado o método de SDS-PAGE. Extratos celulares

ou proteínas purificadas foram adicionados de tampão Laemmli 4X ,fervidas por 5

min e aplicadas no gel. Para coloração dos geis foram usadas soluções de azul de

Coomassie (0,25% Coomassie Blue R250 em etanol 50% e ácido acético 7,5%). Os

geis foram descorados e fixados em solução ácido acético 10% e etanol absoluto

20%. Após este procedimento os géis foram secos a 37

C em Gel Drying Film

(Promega).

2.3.11 PRODUÇÃO DE SOROS

2.3.11.1 Produção de soro anti His

-Caylr339cp em coelhos

Para a produção de anticorpos policlonais contra a proteína His

-Caylr339cp,

2 coelhos foram imunizados por injeção subcutânea de 150 µg de His

-Caylr339cp

purificada, acompanhada do mesmo volume de adjuvante completo de Freund

(Sigma), seguida de 2 injeções de 100 µg da proteína acompanhada do mesmo

volume de adjuvante incompleto de Freund (Sigma) a cada 22 dias depois da

primeira dose. Uma alíquota de sangue foi coletada no dia da primeira administração

com a finalidade de se obter o soro Pré-Imune. O sangue total foi coletado 50 dias

depois da primeira imunização por punção cardíaca. Para obtenção do soro, o

sangue dos animais foi incubado por 1 h 37°C e depois a 4°C overnight. Após

centrifugação a 1.000 rpm por 15 min, passou-se o sobrenadante (soro) para tubos

novos, armazenando-os a -20°C.

2.3.11.2 Produção de soro anti GST-126aa 187cp de camundongos

Para a produção de anticorpos policlonais contra a proteína GST- Caydr187cp

foram utilizados 8 camundongos Balb/c. Foram realizadas quatro imunizações com

intervalos de 7 dias. Cada dose consistiu de 25 µg da proteína GST-126aa187c

purificada por camundongo, acompanhada do mesmo volume de adjuvante

completo (primeira dose) ou incompleto (demais doses) de Freund (Sigma). Como

controle, 3 camundongos foram imunizados com 10 µg de GST. A coleta do sangue

foi feita por punção cardíaca. O soro foi obtido conforme acima (item 2.3.11.1).

2.3.12 WESTERN BLOT

Após a resolução por SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para

membrana de nitrocelulose - Hybond

ECL ou de PVDF

- Hybond P (GE Healthcare),

em tampão apropriado (Tris-HCl pH 8,3, glicina 192 mM, metanol 20%), em cuba de

transferência (Transphor Power Lid – Hoefer). Para verificar a eficiência da

transferência, a membrana foi corada com Ponceau (Ponceau 0,5% (Sigma), ácido

acético 1%). Em seguida, a membrana foi lavada com água bidestilada para

remoção do corante e bloqueada com solução de leite desnatado 5% (Molico) à

temperatura ambiente por 1 h, sob agitação. A membrana foi então lavada com

água bidestilada e incubada com anticorpo primário (anti-soro, soro pré-imune ou

anticorpo monoclonal) em PBS 1X nas diluições conforme abaixo.

Anticorp

o / Soro

Diluição

Incubação

Anti-His

Tag camundongo

Anti-His

-Caylr339cp - coelho

Soro pré-imume Coelho

Anti-GST - camundongo

Anti-GST-126aa187cp - camundongo

Soro pré-imune camundongo

Anti-His

enolase - coelho

Monoclonal

Policlonal

1:3000

1:500

1:1000

1:400

1:1000

TA – 1 h

4ºC - On

TA – 1 h

A membrana foi incubada sob agitação conforme tabela 5. Em seguida, a

membrana foi lavada três vezes com PBS 1X/Tween



20 0,1% e incubada com

anticorpo secundário anti IgG-HRP (horseradish peroxidase) (GE Healthcare) na

diluição de 1:1.000 ou proteína A-HRP (GE Healthcare) na diluição de 1:3000 em

PBS-T 1X à temperatura ambiente por 1 h, sob agitação. Após essa incubação, a

membrana foi lavada mais quatro vezes com a solução PBS 1X/Tween



20 0,1% e

depois com água bidestilada até a remoção total do detergente. A detecção foi feita

por quimioluminescência, utilizando o ECL ou ECL-Plus Western blotting

analysis

system (GE Healthcare), segundo protocolo do fabricante. Quando necessário

reutilizar a mesma membrana para incubação com outro anticorpo, a membrana

após a primeira revelação foi incubada por 30 min a 55

C com solução de stripping

(Tris-HCl 62,5mM pH6,8; SDS 2%; β-mercaptoetanol 100mM). Depois de repetidas

lavagens com água, a membrana foi bloqueada e o protocolo foi seguido como

descrito acima para o soro ou anticorpo em questão.

2.3.13 DETECÇÃO DA PRESENÇA DA PROTEÍNA CaYlr339cp EM

EXTRATOS CELULARES DE C. albicans

Para a preparação do extrato protéico de leveduras, Células (C. albicans

SC5314 e L757 e S. cerevisiae S288c) foram crescidas em meio YPD a 30ºC

overnight, sob agitação (200 rpm), centrifugadas a 6.000 rpm por 3 min e lavadas 3

vezes com PBS gelado. A ausência de hifas foi avaliada a partir da visualização das

células em microscópio ótico. Posteriormente as células foram ressuspendidas

em PBS, quantificadas em espectrofotômetro (comprimento de onda de 660

nm) e diluídas para concentrações de (6 x 10

, 6 x 10

e 6 x 10

células com

RIPA buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% Deoxycholate – DOC, 0,1% SDS, 50

mM tris pH 8,0,). Posteriormente foram adicionados a suspensão: 1 mM de PMSF,

0,5 µL de antipaína 1 µg/mL e 0,5 µL de coquetel de inibidores de protease (Sigma –

p8215). As suspensões foram adicionadas a tubos contendo o mesmo volume de

Beads geladas (500 µm). As suspensões foram então vortexadas vigorosamente

duas vezes por 3 min, com intervalo de 1 min no gelo e centrifugadas a 10.000 g por

5 min a 4ºC. O sobrenadante foi transferido para tubos novos e congelados a -80ºC

até o momento do uso. A concentração protéica do extrato foi estimada pelo método

de Bradford conforme item 2.3.9.5. Para o preparo de extrato protéico de hifas, C.

albicans SC5314 foi crescida conforme acima e induzidas conforme item 2.3.5.1. Foi

encontrada a porcentagem aproximada de 88% de hifas em relação às leveduras

após observação por microscopia ótica das células induzidas. O extrato protéico de

1 x 10

células (hifas) foi preparado conforme acima. Para o preparo de meio

condicionado, C. albicans SC5314 foram crescidas em meio YPD a 30

C por 72 h

com a finalidade de se obter o extrato protéico do meio condicionado. Para isso,

após a incubação, os meios foram separados das células por centrifugação.

Posteriormente os mesmos foram filtrados em membranas de 0,22 µm,

concentrados em pelo menos 550 X e congelados a –80

C. A presença da proteína

CaYlr339cp nos extratos protéicos de levedura e hifa foi realizada por western blot

utilizando o anti-soro produzido em coelhos contra a proteína CaYlr339cp numa

diluição de 1:500. O anticorpo secundário foi substituído pela proteína A-HRP (GE

Healthcare) e detecção só foi possível a partir da utilização do ECL-Plus Western

blotting

analysis system.

2.3.14 REAGENTES UTILIZADOS

2.3.14.1 Meios de cultura

Para bactérias:

Meio LB:

Triptona (DIFCO) 1%, NaCl (Synth), 0,5% extrato de levedura (DIFCO) 1%, ágar

(DIFCO) 2% (para meio sólido) com antibiótico apropriado (Ampicilina 100 µg/mL ou

Canamicina 15 µg/mL)

Meio YT:

Triptona 0,8%, NaCl 0,25%, extrato de levedura 1%, ágar 2%,

canamicina 15 µg/mL.

Meio SOC:

Triptona (DIFCO) 2%, NaCl (Synth) 0,05%, KCl (Synth) 2,5mM, MgCl

(MERCK)

7mM, glicose (DIFCO) 20mM, pH 7,0.

Para fungos:

Meio YPD:

Extrato de levedura (DIFCO) 1%, dextrose (MERCK) 2%, peptona (DIFCO) 2%, agar

2% (para meio sólido).

YPD com cloranfenicol:

Cloranfenicol: 34 µg/mL.

2.3.14.2 Tampões

Tampão de amostra para DNA (6x):

Orange G 0,25%, ficol (type 400, GE) 15%,diluídos em água.

Tampão de amostra para RNA:

750 µL formamida, 90 µL formaldeído, 15 µL tampão fosfato 1 M, 270 µL água

DEPC, 0,1 mg azul de bromofenol.

Tampão LB 4X:

0,625 M Tris-HCl pH 6,8; 10% glicerol; 3% SDS; 5% β-mercaptoetanol, 0,1% azul de

bromofenol.

Tampão de corrida para SDS-PAGE RB 10X:

Tris-base 3 g/L, Glicina 14,4 g/L, SDS 0,1%.

Tampão TAE:

Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM pH 8,0.

2.3.15 ANÁLISE IN SÍLICO DA SEQUÊNCIA DEDUZIDA DE AMINOÁCIDOS

DAS ORFs CaYlr339c E CaYdr187c.

Análises das características da proteína putativa (peso molecular teórico, e

estrutura secundária) foram realizadas utilizando o programa Protean do pacote

DNAstar (DNAstar Inc., Madison, Wis). O mapeamento das estruturas secundárias

nos alinhamentos foi realizado a partir da exportação dos dados do programa

Protean para planilhas do Excel (pacote Office). Predições de modificações pós-

traducionais (sítios putativos de glicosilação e fosforilação) foram realizadas nos

servidores de predição disponíveis na página (cbs.dtu.dk/services/).

2.3.16 INFERÊNCIA FILOGENÉTICA

2.3.16.1 Obtenção das sequências e alinhamentos

A sequência de nucleotídeos das ORFs CaYlr339c e CaYlr339c (nº de acesso

no Genbank: XM_715215.1 e XM_713964 respectivamente) foi obtida no Candida

Genome Database, (candidagenome.org), montagem 19, e utilizada como query

para a realização de buscas utilizando o serviço BLAST (Basic Local Alignment

Search Tool). Mais especificamente essas buscas foram realizadas utilizando o

BLASTN (busca em banco de dados de nucleotídeos utilizando a sequência de

nucleotídeos como query) e TBLASTX (busca em base de dados de nucleotídeos

traduzidos nas seis fases de leitura utilizando a sequência de nucleotídeos traduzida

como query). As ORF CaYlr339c e CaYdr187c possuem um overlap total com as

ORFs CaYlr340w e CaYdr188w (fita sense). Uma vez que as ferramentas BLASTN

E TBLASTX realizam buscas nas seis fases de leitura das sequências de

nucleotídeos depositadas nos bancos de dados, somente as sequências (+) foram

selecionadas, já que a utilização de sequências (-) eram referentes às ORFs

CaYlr340w e CaYdr188w. As sequências de aminoácidos deduzidas das sequências

de nucleotídeos foram então utilizadas, e quando indisponíveis, as sequências de

nucleotídeos foram traduzidas in sílico a partir do programa Bioedit. As sequências

de aminoácidos deduzidas da ORFs também foram submetidas ao serviço BLASTP

(Busca em banco de dados de proteínas utilizando uma sequência de aminoácidos

como query) Somente sequências com E-value igual ou inferior a e-

foram

consideradas. As sequências selecionadas foram alinhadas pelo programa ClustalW

(Thompson, et al., 1994) e ajustadas manualmente no editor de sequência Seaview

(Galtier, 1996).

2.3.16.2 Inferência filogenética

A árvore filogenética foi inferida pelo programa MrBayes (Huelsenbeck,

2001), utilizando o modelo GTR (General Time Reversible) para substituição de

aminoácidos com distribuição gama. As árvores foram calculadas por 5 x 10

gerações em duas análises independentes, amostrando-se uma árvore a cada 100

gerações, até que os desvios padrão das freqüências de partições – split

frequencies, ficassem abaixo de 0.01 (Distribuição estacionária da probabilidade

posterior). Os parâmetros e as árvores foram sumarizados a partir do descarte de

25% das amostras obtidas (50.001 amostras) totalizando 12.500 árvores. A árvore

foi posteriormente formatada utilizando o programa FigTree v1.3.1.

2.4 RESULTADOS

2.4.1 SELEÇÃO DOS GENES HIPOTÉTICOS

Com o objetivo de se identificar potenciais novos alvos para drogas anti-

Candida albicans, uma busca manual no genoma sequenciado de C. albicans foi

realizada em nosso laboratório como parte da tese de Doutorado da estudante

Renata Carmona e Ferreira (Ferreira, 2007) com base em três critérios.

Os genes deveriam ser:

Hipotéticos, aumentando assim a probabilidade de se identificar novos genes.

Para isso, a montagem 19 do genoma de C. albicans, linhagem SC5314

(candidagenome.org) foi inspecionada manualmente, seguindo os seguintes

critérios: ORFs maiores que 500 pb, com similaridade ≥ 60% com genes de

Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe.

Potencialmente essenciais, uma vez que se deseja a morte do organismo a partir

da inibição de seu produto gênico.

Baseado em dados da deleção sistemática disponíveis no banco de dados do

genoma do S. cerevisiae (yeastgenome.org) (Giaever, et al., 2002).

Com baixo nível de expressão, o que implica numa menor dosagem da droga e

redução de possíveis efeitos colaterais.

O Índice de adaptação dos códons (CAI) (Sharp e Li, 1987) que prediz o nível de

expressão dos genes, foi calculado pelo programa codonW disponível em

(bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/codonw.html).

Dentre os 744 genes hipotéticos, as ORFs CaYdr187c (orf19.6098) e

CaYlr339c (orf19.7014), foram selecionadas para este estudo, pois possuíam os

menores CAIs (0,084 e 0,088 respectivamente numa escala de 0 a 1, indicando

assim uma baixa expressão gênica. Para efeito de comparação, a ORF que codifica

a abundante proteína enolase em C. albicans possui um CAI de 0.679.

2.4.2 PREDIÇÕES DAS PROTEÍNAS PUTATIVAS EM SERVIDORES DE

PREDIÇÃO

As proteína putativas codificadas pelas ORFs CaYlr339c e CaYdr187c foram

previamente caracterizadas em servidores de predição por Ferreira (2007).

As análises indicaram que a proteína putativa codificada pela ORF CaYlr339c

possui peso molecular de aproximadamente 18 kDa é rica em regiões de alfa-hélice

e folhas beta, possui algumas regiões de alta hidrofilicidade e é consideravelmente

antigênica (Figura 2a). As análises indicaram ainda que esta proteína possivelmente

não possua peptídeo sinal canônico e hélices transmembrana.

As análises indicaram que a proteína putativa CaYdr187cp possui peso

molecular aproximado de 26 kDa, peptídeo sinal putativo e 2 hélices

transmembrana. Análises in sílico da sequência de aminoácidos desta proteína

indicaram ainda que a mesma possui poucos aminoácidos envolvidos na formação

de alfa-hélice e muitos aminoácidos envolvidos na formação de folhas beta, além de

regiões de hidrofobicidade que corroboram os dados obtidos a partir da predição de

hélices transmembrana. Embora bastante hidrofóbica esta proteína é

consideravelmente antigênica (Figura 2b).

Com o objetivo de se determinar as possíveis funções e categorias funcionais

dessas proteínas putativas, suas sequências de aminoácidos foram submetidas ao

servidor ProtFun por Ferreira (2007). Este método preditivo parte do princípio de que

proteínas que realizam as mesmas funções compartilham alguns atributos e

características. O Protfun integra (utilizando o método de redes neurais), 14 atributos

individuais, dentre eles: sequências de sinalização e localização intracelular, sítios

de N e O-glicosilação, fosforilação de S (serina) / T (treonina) / Y (tirosina),

propriedades físicas e químicas de aminoácidos, estrutura secundária, dentre outras.

Nem sempre tais atributos estão relacionados com a estrutura primária das

proteínas, sendo que padrões mais complexos de correlações entre aminoácidos

também são considerados (Jensen, 2002). O método classifica a proteína em três

categorias: (1ª) Categoria funcional, descrita inicialmente para a E. coli (Riley, 1993),

(2ª) enzima/não enzima (Jensen, 2002) e (3ª) ontologia (Apenas 14 categorias),

baseado no sistema de classificações de ontologia dos genes (Gene ontology – GO)

(Ashburner, et al., 2000). As predições indicaram que a proteína CaYlr339cp não é

uma enzima, está relacionada ao processo de tradução celular na categoria

funcional, e na categoria ontologia foi relacionada com a resposta imune celular. A

proteína CaYdr187cp também não foi classificada como uma enzima, é

possivelmente uma proteína do envelope celular, e sua ontologia é de resposta

imune (Ferreira, 2007).

Figura 2. Análise in sílico da sequência de aminoácidos das proteínas putativas. A:

CaYlr339cp, B: CaYdr187cp. As letras à esquerda referem-se a regiões de alfa-hélice (A),

folha beta (B), giro - turn –T (T) e espiral -coil – C (C) de acordo com diferentes métodos

listados à direita. Todos os métodos e índices foram implementados utilizando o programa

Protean (DNAstar, Madison, Wisconsin). Fonte: Ferreira (2007)

As sequências de aminoácidos das proteínas putativas foram submetidas aos

servidores NetNGlyc Server para predição de N-glicosilação e NetOGlyc Server para

predição de O-glicosilação. A proteína CaYlr339cp possui 13 possíveis sítios de O-

glicosilação nas posições 20, 21, 23, 24, 26, 38, 60, 61, 65, 74, 75, 79 e 129 e não

possui nenhum sítio possível de N-glicosilação (figura 3a), corroborando as demais

predições que indicam que esta proteína seja intracelular. Já a proteína

CaYdr187cp, possui 2 sítios putativos de N-glicosilação nas posições 85 e 98 (score

de 0,6699 e 0,6738 respectivamente (limiar: 0,5), que como em predições anteriores,

sugerem que está proteína seja de superfície. Também foram preditos 3 sítios

putativos de O-glicosilação nas posições 29, 30 e 211 para esta proteína (figura 3b).

As proteínas também foram submetidas ao servidor NetPhos para predição de sítios

putativos de fosforilação de serinas, treoninas ou tirosinas. A proteína CaYlr339cp

possui 15 sítios possíveis de fosforilação nas posições 10, 28, 38, 60, 69, 74, 75, 81,

110, 115, 131, 137, 152, 157 e 168 (figura 3a). A proteína CaYdr187cp também

possui 15 sítios de fosforilação nas posições 30, 48, 87, 89, 92, 95, 130, 134, 145,

200, 206, 210, 213, 218 e 225 (figura 3b).

A) CaYlr339cp

MFNMFNKVAS EGPTLASCST TLTSETISMV PSAILVGTPK AWKKEVLPGSI

PVLPAGIQTS FGATAPASAG AATTLETTMS LMDFKSPLVK MKPTLPLMNGN

NFSNSGNSDK KPSMALSTMV FLPIKTTASP LKAFSISCIC WEETLSTPTTK

IDL

YSSNNSL NLEKY

B) CaYdr187cp

MGLVNTTTLD LAAFLTVPSG SLGKTIPLTT CDWESDAPMT LTTLMLSTLKD

PFFITRATAS TTSLAMVSST PYCLAAITGF TAFNRSVSND STFSTTNSSNV

FITNLFAKLN PWMISSTFKP NVNNFSA

TLR NSPARMITRL VLSPISNSCCF

DAWIKIFTTG WTISNSLSMV AASLVMNFLP NLLTMILFLP LGPM

EVSKIEA

ISRTASTFSI MAPSALEKEE YPCLNKPEFG ACGNFNDIGGQ

Figura 3. Predição de sítios de N e O-glicosilação. Sequência de aminoácidos das proteínas

putativas A: CaYlr339cp e B: CaYdr187cp e seus possíveis sítios de N e O-glicosilação.

Aminoácidos em verde: sequência sinal putativa predita pelo servidor Signal P 3.0.

Aminoácidos sublinhados: Duas hélices transmembrana preditas pelo servidor TMHMM

v2.0. Em caixas azuis estão destacadas as serinas (S) e treoninas (T) preditas como O-

glicosiladas em proteínas intracelulares (

NetOGlyc); em caixas amarelas estão destacadas

as aspariginas (N) preditas como N-glicosiladas (

NetNGlyc). Aminoácidos em vermelho

indicam as serinas (S), treoninas (T) e tirosinas (Y) preditas como fosforiladas (NetPhos

Server).

2.4.3 AS ORFs CaYdr187c E CaYlr339c SÃO TRANSCRITAS

Para confirmar se as ORFs CaYdr187c e CaYlr339c são transcritas, as

mesmas foram amplificadas por RT-PCR utilizando cDNA obtido de RNA

extraído da linhagem SC5314 de C. albicans. As amplificações foram

realizadas com oligonucleotídeos específicos, desenhados a partir da

seqüência depositada no genoma de C. albicans (montagem 19) conforme a

tabela 4. O gene da actina 1 foi utilizado como controle positivo. Amplificações

sob as mesmas condições foram realizadas utilizando o RNA tratado com

DNase (controle negativo), indicando que o RNA estava livre de DNA e que as

ORFs foram realmente amplificadas a partir do cDNA. Os resultados indicam

que a ORF CaYlr339c é transcrita tanto na fase de levedura como na fase de

hifa, e que a ORF CaYdr187 é transcrita apenas na fase de levedura (figura 4).

Resultados similares foram obtidos a partir da amplificação das ORFs

utilizando cDNAs obtidos de diferentes extrações de RNA, confirmando desta

maneira a transcrição das ORFs e a expressão levedura específica da ORF

CaYdr187c.

Figura 4. Gel de agarose 1% do PCR com cDNAs de levedura e hifa de C. albicans

linhagem SC5314. M: Marcador Ladder 100 1: cDNA de levedura, 2: RNA de levedura

tratado com DNAse, 3: cDNA de hifa, 4: RNA de hifa tratado com DNAse. Os nomes

acima dos números indicam as ORFs que foram amplificadas. A ORF CaYdr187c

(738pb) foi amplificada apenas na fase de levedura. A ORF CaYlr339c (507pb) foi

amplificado tanto na fase de levedura como na fase de hifa. Parte do gene da Actina 1

(300pb) foi utilizado como controle positivo. Não houve amplificação quando da

utilização de RNA tratado com DNAse como template (controle negativo).

2.4.4 AMPLIFICAÇÃO DAS ORFs

As ORFs CaYlr339c e CaYdr187c foram amplificadas com os mesmos

oligonucleotídeos utilizados na RT-PCR (figura 4) desenhados a partir da

montagem 19 do genoma de C. albicans linhagem SC5314. A ORF CaYdr187c

também foi amplificada sem a sequência sinal putativa (figura 5).

Figura 5. Gel de agarose 1% dos produtos de PCR. M: Marcador Ladder 100, 1:

CaYlr339c (507 pb), 2: CaYdr187c (738 pb), 3: CaYdr187c sem peptídeo sinal (648

pb).

As sequências de nucleotídeos das ORFs CaYlr339c e CaYdr187c,

amplificadas a partir da linhagem SC5314, foram clonadas, seqüenciadas e

apresentaram 100% de identidade com as sequências depositadas no genoma

de C. albicans SC5314 (Jones, et al., 2004). Porém, algumas diferenças foram

verificadas entre as sequências de nucleotídeos das ORFs CaYlr339c e

CaYdr187c da linhagem SC5314 em relação a sequência das mesmas ORFs

depositada no genoma de C. albicans, linhagem WO-1 (Butler, 2009).

Ao todo foram verificadas nove substituições de nucleotídeos na ORF

CaYlr339c. As substituições nas posições 213 e 399 foram sinônimas,

mantendo os aminoácidos glicina e leucina respectivamente. As demais

substituições (sete) foram não sinônimas e estão localizadas nas posições 357,

476, 478-480, 481 e 490, originando a troca de cinco aminoácidos para grupos

químicos diferentes: serina (polar) por leucina (hidrofóbico), serina (polar) por

fenilanina (hidrofóbico), asparigina (polar) por leucina (hidrofóbico), asparigina

(polar) por histidina (carregado), asparigina (polar) por ácido aspártico (não

carregado), respectivamente (Figura 6a). A ORF CaYdr187c possui seis

substituições de nucleotídeos sinônimas nas posições 111, 279, 312, 363, 444

e 495 mantendo os aminoácidos alanina, isoleucina, lisina, serina, treonina e

alanina, respectivamente (figura 6b).

A) CaYlr339c

SC5314 ATGTTCAACATGTTCAACAAGGTAGCTTCGGAAGGACCAACTTTAGCATCTTGTTCAACAACCTTAACATCGGAAACAATTTCAATGGTACCTCTGGCA

M F N M F N K V A S E G P T L A S C S T T L T S E T I S M V P L A

WO-1 ------------------------------------------------------------------------------------ATGGTACCTCTGGCA

SC5314 ATCTTGGTTGGAACACCCAAAGCTTGGAAGAAAGAGGTCTTACCTGGTTCCATACCAGTGTTACCGGCTGGAATCCAAACATCTTTTGGAGCAACGGCA

I L V G T P K A W K K E V L P G S I P V L P A G I Q T S F G A T A

WO-1 ATCTTGGTTGGAACACCCAAAGCTTGGAAGAAAGAGGTCTTACCTGGTTCCATACCAGTGTTACCGGCTGGAATCCAAACATCTTTTGGAGCAACGGCA

SC5314 CCAGCTCTGGCTGGTGCAGCAACAACATTAGAAACAACAATGTCTCTAATGGATTTTAAATCACCGTTGGTGAAAATGAAACCAACGTTACCTTTGATG

P A L A

G A A T T L E T T M S L M D F K S P L V K M K P T L P L M

WO-1 CCAGCTCTGGCTGGAGCAGCAACAACATTAGAAACAACAATGTCTCTAATGGATTTTAAATCACCGTTGGTGAAAATGAAACCAACGTTACCTTTGATG

SC5314 AATGGCAACAATTTTTCAAATTCTGGCAATTCAGACAAGAAACCTCTGATGGCTCTTCTGACCATGGTGTTTTTACCCATCAAGACGACGGCATCACCT

N G N N F S N S G N S D K K P L M A L

L T M V F L P I K T T A S P

WO-1 AATGGCAACAATTTTTCAAATTCTGGCAATTCAGACAAGAAACCTCTGATGGCTCTTCTAACCATGGTGTTTTTACCCATCAAGACGACGGCATCACCT

SC5314 CTCAAGGCCTTTCTGATTTCGTGCATTTGTTGGGAAGAAACATTATCGACACCAACGACGAAGATAGATTTGTATTCTTCTAACAATTCTCTTAATTTG

L K A F L I S C I C W E E T L S T P T T K I D L Y S S N N S L N L

WO-1 CTTAAGGCCTTTCTGATTTCGTGCATTTGTTGGGAAGAAACATTATCGACACCAACGACGAAGATAGATTTGTATTCTTTTCTACATTCTCTTGATTTG

F L H D

SC5314 GAGAAGTAT

E K Y

WO-1 GAGAAGTAT

B) CaYdr187c

SC5314 ATGGGGTTGGTAAACACGACAACTTTGGATTTGGCGGCGTTTTTGACGGTACCTTCAGGTTCTCTTGGGAAGACCATACCCTTGACCACTTGCGATTGG

M G L V N T T T L D L A A F L T V P S G S L G K T I P L T T C D W

WO-1 ATGGGGTTGGTAAACACGACAACTTTGGATTTGGCGGCGTTTTTGACGGTACCTTCAGGTTCTCTTGGGAAGACCATACCCTTGACCACTTGCGATTGG

SC5314 GAGAGCGATGCACCCATGACCTTGACCACTCTTATGTTGTCGACATTGAAAGACCCGTTCTTCATAACTAGGGCAACGGCATCAACGACGAGTTTGGCG

E S D

A P M T L T T L M L S T L K D P F F I T R A T A S T T S L A

WO-1 GAGAGCGATGCGCCCATGACCTTGACCACTCTTATGTTGTCGACATTGAAAGACCCGTTCTTCATAACTAGGGCAACGGCATCAACGACGAGTTTGGCG

SC5314 ATGGTATCTTCTACGCCGTACTGTTTAGCGGCGATCACTGGCTTCACTGCTTTTAATAGGTCAGTTTCGAACGACTCGACTTTTTCAACGACCAACTCG

M V S S T P Y C L A A I T G F T A F N R S V S N D S T F S T T N S

WO-1 ATGGTATCTTCTACGCCGTACTGTTTAGCGGCGATCACTGGCTTCACTGCTTTTAATAGGTCAGTTTCGAACGACTCGACCTTTTCAACGACCAACTCG

SC5314 TCCAATGTTTTCATCACAAACTTGTTTGCCAAGTTGAACCCCTGGATGATTTCACTGACATTCAAGCCCAATGTTAACAATTTTTCAGCAACGTTGAGG

S N V F

I T N L F A K L N P W M I S L T F K P N V N N F S A T L R

WO-1 TCCAATGTTTTCATAACAAACTTGTTTGCCAAGTTGAACCCCTGGATGATTTCACTGACATTCAAACCCAATGTTAACAATTTTTCAGCAACGTTGAGG

I K

SC5314 AACTCGCCAGCAAGGATGATTACTAGGTTAGTGTTGTCGCCCATTTCGAATTCCTGCTGCTTTGATGCCTGGATCAAGATTTTCACTACGGGGTGGACA

N S P A R M I T R L V L S P I

S N S C C F D A W I K I F T T G W T

WO-1 AACTCGCCAGCAAGGATGATTACTAGGTTAGTGTTGTCGCCCATTTCAAATTCCTGCTGCTTTGATGCCTGGATCAAGATTTTCACTACGGGGTGGACG

S T

SC5314 ATTTCCAATTCGTTAAGCATGGTGGCGGCATCGTTGGTGATGAATTTTTTGCCCAACTTGTTGACGATGATCTTGTTTCTTCCACTTGGACCCATGGAG

I S N S L S M V A A S L V M N F L P N L L T M I L F L P L G P M E

WO-1 ATTTCCAATTCGTTAAGCATGGTGGCGGCATCGTTGGTGATGAATTTTTTGCCCAACTTGTTGACGATGATCTTGTTTCTTCCACTTGGACCCATGGAG

SC5314 GTGAGTAAGATAGAGGCGATTTCACGAACTGCTTCAACATTTCTGATAATGGCTCCGTCGGCATTGGAGAAGGAGGAGTATCCTTGTTTGAATAAGCCT

V S K I E

A I S R T A S T F L I M A P S A L E K E E Y P C L N K P

WO-1 GTGAGTAAGATAGAGGCAATTTCACGAACTGCTTCAACATTTCTGATAATGGCTCCGTCGGCATTGGAGAAGGAGGAGTATCCTTGTTTGAATAAGCCT

SC5314 GAGTTTGGTGCTTGTGGTAACTTCAACGACATTGGTGGGCAA

E F G A C G N F N D I G G Q

WO-1 GAGTTTGGTGCTTGTGGTAACTTCAACGACATTGGTGGGCAA

Figura 6. Alinhamento das sequências de nucleotídeo das ORFs A: CaYlr339c e B: CaYdr187c provenientes dos projetos genoma de C.

albicans linhagem SC5314, Jones et al,( 2004) e WO-1, Butler et al, (2009). No centro, a sequência de aminoácidos deduzidos das ORFs.

Em vermelho: substituição de nucleotídeos e aminoácidos envolvidos, em azul, sublinhado

: os códons envolvidos nas substituições

sinônimas ou não sinônimas, em verde: códons CTG que foram mutados para leucina.

2.4.5 INFERÊNCIA FILOGENÉTICA

ORF CaYlr339c

As sequências de aminoácidos obtidas a partir de buscas em diferentes

bancos de dados foram alinhadas e continham 224 posições totalizando 11

sequências. A fim de estabelecer as relações filogenéticas entre estas proteínas

putativas, uma árvore filogenética foi inferida utilizando-se o método Bayesiano

(Huelsenbeck, 2001).

A proteína CaYlr339cp de C. albicans forma um grupo monofilético com

outras proteínas do gênero Candida (probabilidade posterior de 98%), estando

mais proximamente relacionada à proteína CtYlr339c (XP_002550587.1) da

também espécie diplóide C. tropicalis e mais distantemente relacionada de

proteínas das espécies haplóides: C. lusitaniae, C. guilliermondii e D. hansenii

(figura 10). A proteína CaYlr339cp possui cerca de 50% de similaridade de

sequência de aminoácidos em relação a proteína Ylr339cp (094085.1) de S.

cerevisiae (essencial para a viabilidade deste organismo). Esta proteína, assim

como as demais sequências do gênero Saccharomyces não formaram um clado

distinto, ficando separadas uma das outras, indicando que as mesmas não são tão

conservadas entre si, como as sequências do gênero Candida (figura 10). Até o

momento das buscas em bancos de dados (maio de 2009), não foram

encontradas sequências de outros gêneros fúngicos similares a estas proteínas,

com exceção da sequência de A. fumigatus. A proteína putativa codificada por

este fungo (EDP55845.1) possui apenas ~29% de similaridade de sequência de

aminoácidos em relação às demais proteínas de fungos e desta maneira formou

outro clado com a proteína putativa humana. A proteína humana

(XP_0023422561_1) possui cerca de 20% de similaridade de sequências de

aminoácidos em relação à proteína CaYlr339cp e em relação as demais proteínas

e fica mais distanciada na árvore filogenética em relação as demais proteínas

(figura 7).

ORF CaYdr187c

As buscas em bancos de dados retornaram apenas duas sequências: A

proteína putativa Ydr187c de S. cerevisiae (XP_98588.4) e uma proteína putativa

de K. lactis (XP_88943.5), o que impossibilitou a realização de uma inferência

filogenética. Buscas em genomas completos utilizando a sequência de

nucleotídeos da ORF mostraram que a sequência é conservada em várias outras

espécies de fungos, porém, a tradução in sílico de todas essas sequências indicou

a presença de códons de terminação em diferentes regiões das proteínas

putativas.

Figura 7. Árvore filogenética inferida pelo método Bayesiano a partir das sequências de aminoácidos. Os números acima dos nós indicam a

probabilidade posterior. Nomes das sequências, em vermelho: fungos do gênero Candida, em azul: Fungos do gênero Saccharomyces em

preto: A. fumigatus e H. sapiens Os números de acesso das sequências no Genbank

estão entre parênteses.

2.4.6 ANÁLISE DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA

ORF CaYlr339c

Como previamente constatado (figura 2a), a proteína putativa codificada pela ORF

CaYlr339c é rica em folhas beta e alfa-hélice, sendo que aproximadamente 50 e 35% de

seus aminoácidos estão envolvidos na formação dessas estruturas. Com o objetivo de se

verificar se a estrutura secundária das proteínas putativas similares a CaYlr339cp são

conservadas entre si, as sequências de aminoácidos dessas proteínas foram analisadas

pelo método de Garnier-Robson (Garnier e Robson, 1989) no programa protean

(DNAstar). Com exceção da proteína putativa humana, que é pobre em segmentos de

folha beta e rica em segmentos de alfa-hélices e espiral (Coil-C), as demais proteínas

putativas de fungos, incluindo a proteína putativa mais distantemente relacionada (figura

7) de A. fumigatus (AF), apresentam cerca de 50 ±4,72 e 33% ±4,73 de seus

aminoácidos envolvidos na formação de folhas beta e alfa-hélice respectivamente. A

estrutura secundária das proteínas putativas do gênero Candida também são mais

conservadas entre si do que as proteínas putativas do gênero Saccharomyces (figura

8a). É possível observar que em algumas regiões a estrutura secundária é mantida

mesmo em regiões cujos aminoácidos não são idênticos ou similares. Por exemplo, a

proteína putativa CaYlr339cp possui 95,83% de identidade e similaridade de

aminoácidos em relação a proteína de C. tropicalis (CT), porém 100% de seus

aminoácidos estão envolvidos na formação das mesmas estruturas secundárias. O

oposto também pode ser observado entre a proteína CaYlr339c e a proteína de C.

lusitaniae (CL), e entre as proteínas de P. guilliermondii (PG) e D. hansenii (DH) (figura

11). A estrutura secundária da proteína putativa de A. fumigatus (AF) e H. sapiens (HS)

são bastante divergentes em relação às demais proteínas fúngicas. (figura 8a).

ORF CaYdr187c

Assim como a proteína codificada pela ORF CaYdr187c de C. albicans (figura 2b),

a proteína putativa Ydr187cp de S. cerevisiae (SC) também possui grande parte de seus

aminoácidos envolvidos na formacão de folhas betas e possuem poucos aminoácidos

envolvidos na formação de alfa-hélices (figura 8b). Grandes disparidades são

observadas entre a estrutura secundária de ambas as proteínas em relação a proteína

de K. lactis (KL), que é rica em alfa-hélices e possui um número menor de aminoácidos

envolvidos na formação de giro (Turn-T) (Figura 8b).

A) 10 20 30 40 50 60 70 80 90

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

SC 1 -----------------------------------MVPLAILVG-------TPKAWKKEVLPGSIPVLTALTQMSSGATAPALAGAATLL

KL2 1 ------------------------------------------------------------------------------------------

KT 1 -------MFNKFNKAASEAPTLVPASTTLTSETISMVPLAILVG-------TPKAWKKEVLPGSIPVLTALTQMSSGAIPPALAGAATTL

CA 1 -------MFNMFNKVASEGPTLASCSTTLTSETISMVPSAILVG-------TPKAWKKEVLPGSIPVLPAGIQTSFGATAPASAGAATTL

CT 1 -------MFNMFNKVASDGPTLASCSTTLTSETISMVPSAILVG-------TPKAWKKEVLPGSIPVLPAGIQTSFGAMAPASAGAATTL

CL 1 -------MFNKFNKEASDGPTLVPASTTLTSETISMVPSAILVG-------TPKAWKKEVLPGSIPVLPAGTQTSFGATAPASAGAATTL

PG 1 -------MFNMFNKVASEGPTLPSFSTTLTSDTISMVPSAILVG-------TPKAWKKEVLPGSIPVLPAGIHTSAGATAPALAGAATTL

DH 1 -------MSNMFNKVASEGPTLLLVSTTLTSETISMVPLAILVG-------TPKAWKKEVLPGSIPVLPAGIQTSFGATAPALAGAATTL

KL1 1 ---VNGEMFNKFNKEASEAPTLLPASTTLTSETISMVPLAILVG-------TPKAWKKEVLPGSIPVLTARTQISSGATAPALAGAATLL

AF 1 -----------------------------------MVPRAILVG-------TPRAWKNEVLPGSIPVLPAGTQTSAGAMAPARAGAATRL

HS 1 MQSFLCFIKHFRVVDAAIVEYLLDDQPKGEGGDVEHVQQRGFAGSHFVSMVIPKAWKKEVFSGPRPVFWAGTVTSHGAMAPARAAAGTLL

100 110 120 130 140 150 160 170 180

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

SC 49 ETITFLISVNGSLVKTKPTLPLTKGNNFSKSGKSDKKPLMALLTMVFLPIKTTALPLNSFLTSCICWEETLSTPTTNKDLYSSKYSLNLA

KL2 1 -----------------------------------MKPLTALLTMVFLPIKTTALPLKFFLTSCICWEDTLSTPTTKTDLYSSKYSLSLA

KT 77 EVMTSLMSFKESLVKTKPTLPLTKGNNFSKSGKSERKPLMARLTMVFLPMRTTPRPLRSFLTSCICCEETLSTPTTNTDLYSSKYSLSLA

CA 77 ETTMSLMDFKSPLVKMKPTLPLMNGNNFSNSGNSDKKPSMALSTMVFLPIKTTASPLKAFSISCICWEETLSTPTTKIDLYSSNNSLNLE

CT 77 ETTVSLIVFKSPLVKMKPTLPLTNGNNFSNSGNSDKKPSMALSTMVFLPIKTTASPLKAFSISCICWEETLSTPTTKIDLYSSNNSLNLV

CL 77 EVTTSSMDFKSLLVKMKPTLPSTKGNNFSYSGNSVKKPSMALSTMVFLPINTVASPLKAFSISCIC------------------------

PG 77 EVMVSLTDFKSSLVKMKPTLPLTKGNNFSKSGKSAKNPLKALLTMVFLPINTTPSPLNARLISCIC------------------------

DH 77 ETMVSLMVFKSLLVKMKPTLPLTKGINFSYSGKSAKNPLKALLTMVFLPIKTVASPRKAFLISCICWDETLSTPTMKIDLYSSNNSLNLL

KL1 81 AMMTSLISCKESLVKMKPTLPLTKGNNFS-------------------------------------------------------------

AF 49 ARILVLTSFRSPLQ----TLVLRVVGDEALDGTANLDFMDDQTYHSVLTHQDDGLATESETDLVHLLRADIVDTDNEDGLVLIEKALELI

HS 91 ASNMSLISVRSSLVNTKPTFPQI-------------------------------------------------------------------

190 200 210 220

....|....|....|....|....|....|....|....|....|

SC 139 KYSAFFSRMPPISNLLYVFIRLFAGCLKVFRLCILWLKLEKRIEN

KL2 56 KYSAFFSRTPPISTFLVI------GCLR-----------------

KT 167 KY-------------------------------------------

CA 167 KY-------------------------------------------

CT 167 KY-------------------------------------------

CL 142 ---------------------------------------------

PG 142 ---------------------------------------------

DH 167 KY-------------------------------------------

KL1 109 ---------------------------------------------

AF 135 EVSGLGS--------------------------------------

HS 113 ---------------------------------------------

10 20 30 40 50 60 70 80 90

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

CA MGLVNTTTLDLAAFLTVPSGSLGKTIPLTTCDWESDAPMTLTTLMLSTLKDPFFITRATASTTSLAMVSSTPYCLAAITGFTAFNRSVSN

SC --------------------------------------------------MKRCACLSNSPTRHTTVVVPSPVISSCAAAALAISTAVGD

KL ----------------------------------------------------MLNTQSTANGAKNEECCDTILELSEVDAARTKASLSSN

100 110 120 130 140 150 160 170 180

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

CA DSTFSTTNSSNVFITNLFAKLNPWMISSTFKPNVNNFSATLRNSPARMITRLVLSPISNSCCFDAWIKIFTTGWTISNSLSMVAASLVMN

SC WICISVSNTLPSLVSLMLPAPSTSIFSVPLGPKLVSRTDCKPSADVTLTFKAASLLNDSAFGFNNCNDMLLLYLYYNLLLLTASTPLTFT

KL EIFVDMFNKISTDLSAALWKDSAIIVG--WIPLFNNFSAAPNSAPVMITTEVVPSPASTSCAPETSTNILATGCKIAICFKMVCPSLEII

200 210 220 230 240 250 260 270 290

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.

CA FLPNLLTMILFLPLGPMEVSKIEAISRTASTFSIMAPSALEKEEYPCLN------------KPEFGACGNFNDIGGQ---------

SC FSTHCTHTLLYIILS----VFRSFLTRITTTNTSPSENFATKAKLP----------------------------------------

KL ISPLDVLIILSIPLGPKEVRIASATARAAIILALRTSCGFSRFLKVALEGCLACETIFSNSLYDWGKIPNDKLIRSSLPKQIRTFR

Azul: Alfa-Hélice

Verde: Folha Beta

Amarelo: Espiral (Coil-C)

Cinza: Giro (Turn-T)

Figura 8. Alinhamento múltiplo da sequência de aminoácidos de proteínas similares a

CaYlr339cp e comparação de suas estruturas secundárias. A: CaYlr339cp B: CaYdr187cp. S.

cerevisiae (SC), K. thermotolerans (KT), C. albicans (CA), C. tropicalis (CT), C. lusitaniae (CL), P.

guilliermondii (PG), D. Hansenii (DH), K. lactis (KL), A. fumigatus (AF) e H. sapiens (HS). Os

aminoácidos foram coloridos de acordo com o seu envolvimento na formação das estruturas

secundárias: alfa-hélice, folha beta, Espiral e giro, (cores conforme legenda acima). Os números

acima do alinhamento indicam a posição dos aminoácidos no alinhamento; O alinhamento

múltiplo foi realizado pelo programa Clustal W e formatado pelo programa Bioedit. A estrutura

secundária foi predita pelo método de Garnier-Robson e implementada pelo programa Protean

(DNAstar).

2.4.7 MUTAGÊNESE SÍTIO DIRIGIDA POR PCR

Em C. albicans e em outras espécies do gênero candida, o códon CUG codifica

para o aminoácido serina ao invés de leucina (Santos MA, 1995). Portanto, para a

realização da expressão heteróloga das ORFs CaYlr339c e CaYdr187c em E. coli, foi

necessário a substituição dos códons CUG para códons que codifiquem para o

aminoácido serina. Assim, os amplicons 1 (CaYlr339c) e 3 (CaYdr187c sem a sequência

sinal putativa) (figura 5) ,clonados em vetor pbluescript foram utilizados em ensaios de

mutagênese sítio dirigida por PCR para a mutação de cinco códons CTG na ORF

CaYlr339c (figura 6a) e dois códons CTG na ORF CaYdr187c (figura 6b) utilizando os

oligonucleotídeos listados na tabela 4.

Figura 9. Cromatogramas gerados no seqüenciamento das ORFs A: CaYlr339c e B:

CaYdr187c para confirmação da mutagênese sítio dirigida. Os códons CTG (codifica para o

aminoácido leucina em E. coli) foram mutados para TCT ou TCG (codificam para o

aminoácido serina em E. coli)

2.4.8 EXPRESSÃO HETERÓLOGA DAS PROTEÍNAS EM E. coli

2.4.8.1 Proteína His

-CaYlr339cp

A ORF CaYlr339c mutada foi subclonada em vetor de expressão pET28a(+)

em fusão com uma cauda de histidina na porção N-terminal. A proteína recombinante

foi expressa na linhagem BL21 (DE3) de E. coli a 23°C por 18 h, e purificada com

resina quelante de níquel a partir da fração insolúvel do lisado de bactérias (Figura

10a). Após a purificação, todo o eluato foi dialisado conforme item 2.3.9.3. Uma banda

de aproximadamente 18 kDa foi verificada a partir da separação eletroforética da

proteína purificada em SDS-PAGE e coloração com azul de Coomassie, coincidindo

com o seu peso molecular teórico (Figura 10c). De modo a confirmar a expressão

desta proteína, um western blot foi realizado com um anticorpo monoclonal contra a

cauda de histidina. A proteína recombinante His

-CaYlr339cp de ~18 kDa foi

reconhecida no extrato insolúvel e também após a sua purificação com resina

quelante de níquel, confirmando assim sua correta purificação. A proteína His

enolase de ~50 kDa foi utilizada como controle positivo (Figura 10b e 10d).

Figura 10. Expressão da proteína His

-CaYlr339cp em E. coli. A e C: Geis de poliacrilamida

15% (SDS-PAGE) corados com azul de Coomassie. B e D: Western blot com anticorpo anti-

His

tag. M: Marcador de peso molecular em kDa (quilodaltons). Em A e B - NI: Extrato de E.

coli pré-indução, I: Extrato de E. coli após indução com IPTG, FS: Fração solúvel do extrato,

FI: Fração Insolúvel do extrato. Em C e D – 1: His

-CaYlr339cp purificada (~18 kDa), 2: His

enolase purificada (~50 kDa).

2.4.8.2 Proteína GST-CaYdr187cp

Inicialmente tentamos sem sucesso expressar a proteína recombinante sem a

sequência sinal, fusionada à cauda de histidina ou GST. Desta maneira, foram

realizadas diferentes construções nos vetores pET28a(+) em fusão com uma cauda

de histidina (N-terminal) e pGEX6P3 em fusão com GST (N-terminal). Obtivemos

sucesso apenas na expressão de uma região localizada na porção N-terminal da

proteína (aa 24-126), com peso molecular teórico aproximado de 10 kDa, em fusão

com GST (~25 kDa) (figura 11a) no vetor pGEX6P3, totalizando um peso molecular

aproximado de 35 kDa. A proteína recombinante foi expressa na linhagem Rosetta

(DE3) de E. coli a 23°C por 18 h e obtida na fração insolúvel do extrato. Como não foi

possível purificar a proteína recombinante com a resina de Glutationa-Sepharose

(Glutathione Sepharose

, GE Healthcare) por problemas de solubilidade, optou-se

por purificá-la diretamente do gel. Também não foi possível digerir a proteína 187

fusionada a proteína GST com a protease Prescission™ (GE Healthcare). A

separação dos lisados de E. coli e da proteína recombinante por SDS-PAGE e a

posterior coloração com azul de Comassie nos permitiu confirmar o peso molecular

teórico da proteína recombinante expressa (Figura 11b) Para confirmar a correta

expressão da proteína recombinante, foi realizado um western blot com um soro

policlonal contra a proteína GST produzido em camundongos. O anticorpo

reconheceu a proteína GST-CaYdr187cp e a proteína GST utilizada como controle

positivo, (Figura 11c) indicando o sucesso da expressão da proteína recombinante

fusionada a GST.

Figura 11. Expressão da proteína GST-CaYdr187cp em E. coli. Seta vermelha indica a

proteína GST-CaYdr187cp expressa. A: Esquema representativo da região da proteína

expressa em E. coli (aa 1 ao 126 sem a sequência sinal). B: Gel de poliacrilamida 10% (SDS-

PAGE) corado com azul de Coomassie. M: Marcador de peso molecular em kDa

(quilodaltons). NI: Extrato de E. coli pré-indução, I: Extrato de E. coli após indução com IPTG

por 18 h a 23°C, FS: Fração solúvel do extrato, FI: Fração Insolúvel do extrato. 1: GST, 2:

GST-CaYdr187cp (~35 kDa). C: Western blot com anticorpo policlonal produzido em

camundongos (anti-GST). As amostras referem-se a 1: GST-CaYdr187cp (~35 KDa) e 2: GST

(~25 kDa).

2.4.9 PRESENÇA DAS PROTEÍNAS EM C. albicans

Com o objetivo de verificar se as proteínas putativas CaYlr339cp e CaYdr187cp

são expressas em C. albicans, a proteína recombinante His

-CaYlr339cp foi injetada

em coelhos e a proteína GST-CaYdr187cp (126 aa) foi injetada em camundongos

para a produção de soros policlonais.

2.4.9.1 Proteína putativa CaYlr339cp

Em experimentos de western blot, o soro anti-His

CaYlr339cp foi capaz de

reconhecer a proteína recombinante e falhou em reconhecer a proteína His

enolase e

proteínas do extrato protéico de E. coli BL21 (DE3). Após exaustivas preparações e

otimizações de extratos protéicos sob diferentes condições, o soro finalmente

reconheceu uma proteína de aproximadamente 18 kDa (um pouco menor que a

proteína recombinante de 18,6 kDa) em extratos protéicos de C. albicans (linhagem

SC5314) preparados com a utilização de 10

e 10

células (figura 12a). Assim como o

soro pré-imune (figura 12c), o soro anti-His

CaYlr339cp também não foi capaz de

reconhecer outras proteínas no extrato celular de C. albicans. A proteína Ylr339cp (N°

de acesso no genbank: XP_724678) de S. cerevisiae, que possui (64%) de identidade

e (55%) de similaridade de sequência de aminoácidos com a proteína CaYlr339cp,

também não foi reconhecida pelo soro. Para descartar a hipótese de que o

reconhecimento obtido com o soro anti-His

CaYlr339cp não era decorrente do

reconhecimento de porções protéicas ricas em histidina no extrato celular, um western

blot foi realizado com o anticorpo monoclonal contra a cauda de histidina. O anticorpo

anti-His

tag reconheceu a proteína His

CaYlr339cp e a proteína His

-enolase de ~50

kDa (controle positivo), mas não foi capaz de reconhecer outras proteínas nos

extratos fúngicos (figura 12b).

Figura 12. Detecção da proteína CaYlr339cp em extratos celulares de C. albicans. A:

Western blot realizado com o soro policlonal produzido em coelhos contra a proteína His

CaYlr339cp. B: Western blot realizado com o anticorpo monoclonal anti-His

tag. C: Western

blot realizado com o soro pré-imune de coelhos. As amostras referem-se à NI: Extrato de E.

coli pré-indução. I: Extrato de E. coli após a indução com IPTG. 1: His

-enolase. 2: Extrato

celular de 10

células de S. cerevisiae S288c. Nas demais canaletas, extratos celulares de C.

albicans realizados com 3: 10

células, 4: 10

células, 5: 10

células e 6: 10

células. As setas

vermelhas indicam a proteína CaYlr339cp detectada nos extratos celulares de C. albicans. A

esquerda, padrão de peso molecular em kDa (quilodaltons).

Com o objetivo de confirmar se a proteína CaYlr339cp também é expressa nas

fases de hifa de C. albicans, extratos protéicos de hifa foram preparados. Por

microscopia ótica, a porcentagem de hifas em relação a leveduras nas células

utilizadas para a preparação do extrato foi estimada em ~85%. Assim como no extrato

de levedura, o soro anti-His

CaYlr339cp também reconheceu uma proteína de

aproximadamente 18 kDa (figura 13a). Uma vez que não é possível detectar esta

proteína a partir de extratos preparados com menos de 10

células (figura 12a), sua

detecção no extrato de hifas não deve ser decorrente da presença de leveduras

(~15%) no extrato de hifa. O soro anti-His

CaYlr339cp não foi capaz de reconhecer a

proteína em meios condicionados (MC) obtidos de sobrenadantes de cultura de

leveduras, indicando que a proteína não é secretada por C. albicans. Como controle,

a mesma membrana foi incubada contra a enolase, que é expressa tanto em

leveduras como em hifas. A figura 13b mostra o reconhecimento da enolase nativa de

~48 kDa nos extratos de leveduras e hifas, sendo que houve o reconhecimento de

outras bandas de menor e maior peso molecular não verificadas em leveduras, no

extrato de hifas. Por conta da indisponibilidade de anticorpos que reconhecessem

proteínas secretadas de C. albicans, o soro contra a enolase também foi utilizado

como controle positivo na detecção de proteínas no meio condicionado, uma vez que

sua presença nestes meios já foi previamente observada (Sundstrom, 1994), porém a

enolase também não foi detectada no meio condicionado (MC) (figura 13b).

Figura 13. A proteína CaYlr339cp pode ser encontrada em extratos celulares de levedura e

hifa de C. albicans, mas não em meios condicionados. A: Western blot realizado com o soro

policlonal produzido em coelhos (anti-His

enolase). B: Western blot realizado com o soro

policlonal produzido em coelhos (anti-His

CaYlr339cp). As amostras referem-se à NI: Extrato

de E. coli pré-indução. I: Extrato de E. coli após a indução com IPTG por 18 h a 23°C. 1: His

enolase. 2: His

-CaYlr339cp. Lev: Extrato celular de 10

células de C. albicans (fase de

levedura) hifa: Extrato celular de 10

células de C. albicans (fase de hifa). MC: Meio

condicionado de leveduras (sobrenadante de culturas). As setas vermelhas indicam a

proteína CaYlr339cp detectada nos extratos celulares de C. albicans. A esquerda, padrão de

peso molecular em kDa (quilodaltons).

Com o propósito de confirmar a presença da proteína CaYlr339cp em C.

albicans, experimentos de citometria de fluxo foram realizados com células

permeabilizas com saponina e células vivas não permeabilizadas. Não foram

observadas diferenças significativas entre o número de células marcadas pelo soro

anti-His

CaYlr339cp em relação ao soro pré-imune. Da mesma forma, não foi possível

confirmar a presença da proteína CaYlr339cp em experimentos de microscopia de

imunofluorescência (Dados não mostrados).

2.4.9.2 Proteína putativa CaYdr187cp

Em experimentos de western blot, o soro anti-GST-CaYdr187cp foi capaz de

reconhecer a proteína GST-CaYdr187cp de ~35 kDa e em menor escala, a proteína

GST de ~25 kDa (figura 14), indicando que o soro possui maior afinidade pela

proteína 187 fusionada a proteína GST do que pela proteína GST não fusionada. O

soro pré-imune de camundongos não foi capaz de reconhecer nenhuma das proteínas

recombinantes. Predições realizadas a partir da sequência de aminoácidos da

proteína CaYdr187cp, indicam que ela possivelmente seja encontrada na superfície

de C. albicans em associação a membrana plasmática a partir de suas hélices

transmembrana (Ferreira 2007). Entretanto, não foi possível detectar sua presença

em C. albicans a partir de experimentos de western blot, realizados com extratos

celulares totais ou extratos protéicos ricos em membranas celulares, preparados por

separação de fase com a utilização do detergente não iônico Triton X-114, conforme

(Bordier, 1981; Qoronfleh, 2003). Também não foi possível detectar a presença desta

proteína em C. albicans a partir de experimentos de citometria de fluxo, uma vez que

não foram observadas diferenças significativas entre o número de células marcadas

pelo soro anti-GST-CaYdr187cp em relação ao soro pré-imune. Assim, novos

experimentos são necessários para confirmar a expressão da proteína CaYdr187cp

por C. albicans.

Figura 14. O soro anti-GST-CaYdr187cp reconhece a proteína recombinante. Membrana

hibridada com soro policlonal anti-GST-CaYdr187cp produzido em camundongos. As

amostras referem-se à GST: ~1 µg de GST (~25 kDa) expressa em E. coli e purificada. GST-

187: ~1 µg GST-CaYdr187cp (~35 kDa) expressa em E. coli e purificada. A esquerda, padrão

de peso molecular em kDa (quilodaltons).

2.5 DISCUSSÃO

A prevalência de infecções fúngicas associadas a altas taxas de morbidade e

mortalidade tem aumentado nas últimas décadas, indicando assim a necessidade de

desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. (Sable, 2008). Os agentes

antifúngicos de uso corrente são limitados, apresentam alta toxicidade e efeitos

colaterais, tem como alvo poucos constituintes celulares e muitos mecanismos de

resistência já foram descritos (Ghannoum e Rice, 1999). A partir deste cenário,

diferentes estratégias vêm sendo utilizadas para a identificação de genes visando

desenvolvimento de novos alvos para drogas antifúngicas, dentre elas: a identificação

de genes essenciais em C. albicans (Cheng, et al., 2006; Roemer, 2003), análises de

perfis de expressão gênica de células tratadas com diferentes drogas (De Backer, et

al., 2002), caracterização de genes diferencialmente expressos nas fases de levedura

e hifa (Melo, 2006) dentre outras. Contudo, estas estratégias dificultam a identificação

de alvos ainda não caracterizados que permitam o desenvolvimento de novas classes

de agentes antifúngicos. Um dos principais argumentos que apóiam os projetos de

sequênciamento de genomas completos de fungos patogênicos é a possibilidade de

se identificar novos alvos terapêuticos (Braun, 2005). Com o sequenciamento do

genoma de C. albicans (Jones, et al., 2004), um grande número de ORFs

potencialmente codificadoras de proteínas cujas funções são desconhecidas foram

identificadas (figura 1), oferecendo uma oportunidade sem precedentes para a

ampliação do repertório de compostos antifúngicos a partir da caracterização de

novos genes (Cheng, et al., 2006). Desta maneira, com o propósito de se identificar

novos genes que pudessem ser potenciais novos alvos para drogas, uma busca

manual no genoma de C. albicans foi realizada por nosso grupo. As ORFs

selecionadas tinham que ser: (1) hipotéticas, com o objetivo de se priorizar a detecção

de alvos que permitam o futuro desenvolvimento de diferentes classes de inibidores,

(2) potencialmente essenciais, uma vez que se deseja a morte do fungo a partir da

inibição de seu produto gênico. A maioria dos genes essenciais de S. cerevisiae

(Giaever, et al., 2002) e S. pombe (Decottignies, 2003) foram determinados através

de métodos de interrupção de genes em larga escala. Porém, a identificação de

genes essenciais em C. albicans é dificultada por conta de sua diploidia (os dois

alelos devem ser deletados) e ausência de um ciclo sexual (Sanglard, 2001). Desta

maneira

, a essencialidade das ORFs selecionadas foi baseada na deleção

sistemática de genes neste organismo, e precisa ser confirmada em C. albicans. (3)

Pouco expressos, o que implica numa menor dosagem da droga e redução de efeitos

colaterais. Para isso as ORFs selecionadas foram caracterizadas através de índices

que medem o padrão do uso dos códons, dentre eles o índice de adaptação dos

códons (CAI), que mede a adaptação do uso dos códons na tendência dos genes

altamente expressos (Sharp e Li, 1987), e foi utilizado para predizer o nível de

expressão das ORFs com base em suas seqüências. Dentre as 744 ORFs obtidas na

triagem manual, as ORFs CaYlr339c e CaYdr187c foram selecionadas pois

possuíam os menores CAIs, indicando uma baixa expressão (Ferreira, 2007).

Comparações entre as sequências de nucleotídeos das ORFs CaYlr339c e

CaYdr187c da linhagem SC5314 com as mesmas ORFs depositadas no genoma da

linhagens WO-1 de C. albicans indicam a presença de algumas mutações sinônimas

nas duas ORFs e mutações não sinônimas na ORF CaYlr339c (figura 6). Butler et al

(2009) já haviam observado a presença de altas taxas de mutações entre essas duas

linhagens diplóides a partir da comparação de seus genomas (Butler, 2009). Uma

dessas mutações não sinônimas constatadas na ORF CaYlr339c, gera a substituição

de um dos cinco códons CTG (que em C. albicans codifica para serina e não para

leucina) (Santos MA, 1995), para o códon CTA, que codifica para o aminoácido

leucina. As substituições dos códons CTG por outros códons que codificam para o

aminoácido leucina podem ser decorrentes de diferenças no conteúdo GC entre

essas duas linhagens que consequentemente influenciam a utilização do códon que

codifica para este aminoácido (Butler, 2009). Porém essas diferenças podem também

ser decorrentes do sequenciamento de outros alelos, uma vez que C. albicans é um

organismo diplóide (Jones, et al., 2004).

Como não sabíamos se as ORFs selecionadas eram realmente genes ou

mesmo se suas presenças seriam decorrentes de eventuais erros na anotação do

genoma, ensaios de RT-PCR a partir de RNA extraído da linhagem SC5314 foram

realizados com oligonucleotídeos específicos. A ORF CaYlr339c é transcrita tanto na

fase de levedura como na fase de hifa de C. albicans, porém a ORF CaYdr187c é

transcrita apenas na fase de levedura (figura 4). Estes resultados indicam que as

ORFs selecionadas são genes reais. Uma nova montagem do genoma de C. albicans,

linhagem SC5314, realizada em 2008 (montagem 21), sugeriu que a ORF CaYlr339c

possui apenas 423pb, iniciando a partir da posição 84 da sequência previamente

anotada (montagem 19). Os dados de RT-PCR aqui apresentados indicam que a ORF

possui de fato 507pb, uma vez que foram utilizados oligonucleotídeos que flanqueiam

as primeiras posições da sequência de nucleotídeos desta ORF. Após a realização da

triagem manual realizada no genoma de C. albicans por nosso grupo, a ORF

CaYdr187 (transcrita) foi desconsiderada e removida da base de dados do genoma de

C. albicans. Os dados de RT-PCR aqui apresentados confirmam o fato de que

sequências e anotações de genomas devem ser tratadas como hipóteses de trabalho

que precisam ser continuamente testadas e afinadas (Fisk, 2006).

A proteína putativa codificada pela ORF CaYlr339c é similar a outras proteínas

putativas de funções desconhecidas presentes em outros fungos e em humanos e

pode ser classificada como uma proteína codificada por um gene hipotético

conservado (figura 1b). A inferência filogenética realizada pelo método Bayesiano

mostrou o agrupamento desta proteína com outras proteínas do gênero Candida. O

alto suporte constatado na formação deste clado sugere que essas proteínas sejam

homólogas (figura 7). Contudo, não foi possível confirmar se a proteína Ylr339cp de

S. cerevisiae, assim como as demais proteínas do gênero Saccharomyces, são

homólogas da proteína CaYlr339cp de C. albicans, uma vez que o número de

sequências utilizadas na inferência filogenética foi limitado. Assim, novos estudos são

necessários para melhor entender as relações filogenéticas entre essas proteínas

putativas. A inferência filogenética mostrou também que a proteína CaYlr339cp, assim

como as demais proteínas do gênero Candida e Saccharomyces são

filogeneticamente distantes da proteína putativa humana. Diferenças entre essas

proteínas putativas fúngicas e a proteína putativa humana também foram observadas

a partir da análise de suas estruturas secundárias (figura 8a). Estes dados indicam

que estas proteínas fúngicas poderiam ser utilizadas como alvos antidrogas, pois

possivelmente minimizariam potenciais efeitos colaterais exercidos por inibidores

contra proteínas do hospedeiro. A partir das sequências depositadas em bancos de

dados foi possível constatar que proteína putativa codificada pela ORF CaYdr187c é

conservada apenas em S. cerevisiae e K. lactis, o que impediu a realização de uma

inferência filogenética. Tal fato pode ser limitante para o desenvolvimento de agentes

antifúngicos de amplo espectro, porém o acúmulo de sequências adicionais nas

bases de dados pode mudar este cenário no futuro. Sua possível presença na

membrana plasmática de C. albicans a torna interessante para o desenvolvimento

futuro de terapias antifúngicas e marcadores moleculares específicos.

Todas essas proteínas putativas similares a CaYlr339cp e CaYdr187cp

codificadas por fungos do gênero Candida e Saccharomyces são codificadas por

ORFs potencialmente pouco expressas, uma vez que possuem baixos CAIs (entre

0.063 e 0.092), calculados a partir da utilização dos valores de fitness relativo de S.

cerevisiae (Sharp e Li, 1987). A partir desses dados é possível especular que esse

grupo de proteínas manteve seus perfis de expressão gênica ao longo da evolução

(utilização de códons raros) e possivelmente desempenham funções onde a

abundância da proteína não é requerida.

À medida que genomas completos foram seqüenciados, foi verificado que

alguns genes possuem overlap com outros genes, compartilhando a mesma

sequência de DNA em uma fase diferente de leitura. (Gerstein, 2007). As ORFs

selecionadas possuem overlaps com outras ORFs caracterizadas presentes na fita

sense. A ORF CaYlr339c possui um overlap total com a ORF CaYlr340w, codificadora

de uma proteína ribossomal – RPP0 (nº de acesso no Genbank: XP_720309.1).

Essas duas ORFs são positivamente reguladas pela proteína Tbf1p que atua na

regulação positiva de outras 45 ORFs, sendo que 16 delas também codificam

proteínas ribossomais (Hogues, 2008). Uma vez que em C. albicans e em outros

organismos, genes com funções similares são co-expressos (Ihmels, 2005), é

possível sugerir que a ORF CaYlr339c, expressa nas fases de levedura e hifa de C.

albicans (figura 4), também codifique uma proteína ribossomal. Esses dados são

concordantes com a predição de função realizada por Ferreira (2007) que indicou que

a proteína codificada por esta ORF está potencialmente envolvida em mecanismos de

tradução celular (Ferreira, 2007). As ORFs de C. tropicalis e S. cerevisiae também

possuem um overlap total e parcial respectivamente com ORFs que codificam a

mesma proteína ribossomal (RPP0), indicando que possivelmente essas ORFs

desempenham os mesmos papeis nestes organismos. Já a ORF CaYdr187c possui

um overlap total com a ORF CaYjl008c que codifica uma proteína chaperonina

citoplasmática – CCT8 (XP_719058.1). Da mesma maneira, a ORF Ydr187c (S69749)

de S. cerevisiae também possui um overlap parcial com uma ORF similar,

codificadora de uma proteína chaperonina citosólica CCT6 (NP_010474.1). Alguns

autores especulam que a presença de ORFs sobrepostas surgiu como resultado de

pressões evolutivas para minimizar o tamanho do genoma e aumentar a densidade da

informação genética, outros sugerem que pode ser um fenômeno que despontou ao

longo da evolução para facilitar a expressão gênica de polipeptídeos funcionalmente

relacionados (Normark, 1983). ORFs menores sobrepostas a ORFs maiores são

muitas vezes desconsideradas durante as anotações de genomas (Braun, 2005). Os

nossos resultados (figura 4) sugerem que essas ORFs não deveriam ser

negligenciadas durante o processo de anotações de genomas.

Proteínas recombinantes foram obtidas a partir da expressão dessas ORFs em

E. coli. A proteína integral codificada pela ORF CaYlr339c foi expressa, porém

diversas tentativas em expressar a proteína integral codificada pela ORF CaYdr187c

foram realizadas sem sucesso. Esta proteína é bastante hidrofóbica (figura 2b) e

possui duas potenciais hélices transmembrana (Ferreira, 2007) que possivelmente

contribuíram para dificultar sua expressão heteróloga. Desta maneira, apenas um

segmento da proteína, fusionada a cauda GST (porção N-terminal), foi expressa.

Soros produzidos em coelhos (CaYlr339cp) e camundongos (CaYdr187cp), testados

quanto as suas capacidades de reconhecer as proteínas recombinantes foram

utilizados com o objetivo de confirmar a expressão de produtos protéicos expressos

por essas duas ORFs em C. albicans.

A presença da proteína putativa CaYlr339cp foi confirmada tanto nas fases de

levedura como nas fases de hifa de C. albicans a partir de experimentos de western

blot (figura 13), confirmando os dados obtidos em experimentos de RT-PCR (figura 4).

A identificação desta proteína por western blot só foi possível a partir da utilização de

extratos enriquecidos, obtidos através de exaustivas etapas de padronização e

otimização, sugerindo que esta proteína seja de fato pouco expressa e indicando que

o índice de adaptação dos códons – CAI (Sharp e Li, 1987) é mesmo robusto em

predizer o nível de expressão de proteínas. Ensaios quantitativos seriam necessários

para melhor esclarecer esta questão. Também não foi possível confirmar a presença

desta proteína a partir de experimentos de citometria de fluxo e microscopia de

imunofluorescência. Estes resultados podem ser explicados das seguintes maneiras:

É possível que a proteína sofra modificações pós-traducionais (figura 3a) ou exponha

apenas epitopos conformacionais, o que dificultaria sua identificação por anticorpos

produzidos contra uma proteína recombinante expressa em E. coli, explicando assim

o sucesso de sua identificação em experimentos de western blot, onde a proteína é

totalmente desnaturada. Embora experimentos de citometria de fluxo sejam bastante

sensíveis, não sabemos se a proteína possui uma baixa meia vida ou se sua

expressão é modificada sob determinadas condições, o que poderia ter dificultado a

marcação da proteína pelos anticorpos. Estes dados podem explicar a identificação

da proteína a partir da utilização de extratos celulares enriquecidos, que permitem o

acúmulo da proteína e a sua subseqüente identificação por western blot. A proteína

pode também estar interagindo com outras proteínas, o que poderia de alguma forma

dificultar sua marcação. Desta maneira, a localização celular desta proteína poderia

ser determinada a partir da utilização de diferentes frações celulares para confirmar

sua localização intracelular a partir de experimentos de western blot. Experimentos

futuros também poderiam ser realizados a partir do preparo de extratos protéicos ricos

em ribossomos a fim de detectar seu possível papel como uma proteína ribossomal.

A presença da proteína CaYdr187cp (supostamente localizada na membrana

celular) não pôde ser confirmada em C. albicans a partir do emprego de diferentes

metodologias. A proteína CaYdr187cp possivelmente possui duas hélices

transmembrana, porém não sabemos quais segmentos da proteína são expostos na

porção intracelular ou extracelular de C. albicans, ou mesmo se são realmente

expostos. Assim, o soro produzido contra esta proteína foi utilizado em experimentos

de citometria de fluxo com células vivas ou permeabilizadas. No entanto, não foi

constatado diferenças entre o número de células marcadas com o anti-soro em

relação ao soro pré-imune. Pode ser que o segmento utilizado para a produção do

soro anti-CaYdr187cp não seja suficiente para detectar a proteína diretamente em C.

albicans, ou ainda, conforme previamente relatado, a proteína pode sofrer

modificações pós- traducionais (figura 3b), possuir uma curta meia vida ou ainda

associar-se a outras proteínas, o que poderia dificultar sua detecção. Diferentes

extratos celulares (solúveis, insolúveis, ricos em proteínas de membrana) preparados

sob diferentes condições foram utilizados sem sucesso em experimentos de western

blot. Estes resultados podem ser decorrentes da alta hidrofobicidade de proteínas de

membrana que são difíceis de manipular e isolar, são insolúveis em muitos tampões

de amostra e podem precipitar facilmente quando da variação de pH (Luthje, 2009).

Estas características inerentes destas proteínas também têm dificultado a detecção

de outras proteínas das membranas celulares de C. albicans em experimentos de

proteômica (Cabezon, 2009). Uma vez que esta proteína é potencialmente pouco

expressa e possivelmente encontra-se na membrana, existe a possibilidade de que a

confirmação de sua presença na célula esteja fora do limite de detecção de técnicas

padrões aqui utilizadas. Desta maneira, novos estudos são necessários para

confirmar a presença desta proteína em C. albicans. É possível que ambas as

proteínas tenham sua expressão aumentada sob diferentes condições de

crescimento, pH, temperatura e estresse. Desta maneira, a expressão diferencial

desses genes poderia ser testada no futuro com o propósito de facilitar a

caracterização dessas proteínas.

Em resumo, este trabalho identificou dois genes com perfis singulares de

expressão e características que os tornam bons candidatos para a descoberta de

novas terapias antifúngicas. O gene CaYlr339c é conservado em outros fungos do

gênero Candida e Saccharomyces, é transcrito, codifica um produto protéico presente

nas fases de levedura e hifa de C. albicans, e pode estar envolvido em mecanismos

de tradução protéica. O gene CaYdr187c é conservado apenas em S. cerevisiae e K.

lactis, é transcrito, porém em decorrência de problemas técnicos e experimentais, não

foi possível detectar a presença de seu produto protéico em C. albicans.

Proteínas de

membrana são consideradas importantes alvos farmacológicos e podem realizar

diferentes funções nas células tais como: transdução de sinal, síntese de proteínas da

parede celular, interação com o hospedeiro, adesão celular, dentre outras (Qoronfleh,

2003). Desta maneira esta proteína pode estar envolvida em alguns destes

mecanismos e portanto continuará sendo estudada em nosso laboratório. Numa

tentativa de testar sua possível participação na adesão celular de C. albicans ao

hospedeiro, discos de tecido gastrointestinal murino foram incubados com a proteína

recombinante e posteriormente com C. albicans

. Não foi constatado inibição da

adesão nestes experimentos. Em contrapartida, a incubação de discos com a proteína

recombinante enolase (utilizada como controle nestes experimentos) foi capaz de

inibir significativamente a adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal. A partir

desses surpreendentes resultados, os trabalhos foram voltados para o estudo da

função da enolase da superfície de C. albicans e seu papel na adesão celular. (2

parte desta tese – item 3).

2.6 CONCLUSÕES

Os nossos dados permitem concluir que as ORFs CaYlr339c e CaYdr187c são

genes reais e bons candidatos para a descoberta de novas funções, podendo ser

úteis para o desenvolvimento futuro de novos agentes terapêuticos antifúngicos.

Mais especificamente concluímos que:

1- O gene CaYlr339c é transcrito nas fases de levedura e hifa e o gene CaYdr187c é

transcrita apenas na fase de levedura.

2- O gene CaYlr339c é bastante conservado em espécies do gênero Candida e

Saccharomyces.

3- O gene CaYdr187c é conservado apenas em S. cerevisiae e K. lactis

4- A proteína codificada pelo gene CaYlr339c é expressa nas fases de levedura e hifa

de C. albicans.

2.7 PERSPECTIVAS FUTURAS

1) Confirmar a localização celular das proteínas CaYlr339c e CaYdr187c em C.

albicans

2) Uma vez que ambas as ORFs possuem um overlap total com outras ORFs de

C. albicans, a geração de mutantes nulos fica impossibilitada, desta maneira a

essencialidade dessas ORFs será confirmada a partir de técnicas de RNA de

interferência conforme (De Backer, 2001).

3) Elucidar a função dessas ORFs a partir de estudos por complementação em S.

cerevisiae, superexpressão em C. albicans e em ensaios de duplo híbrido.

3: O PAPEL DA ENOLASE DA SUPERFÍCIE DE C.

albicans NA ADESÃO CELULAR.

3.1 INTRODUÇÃO

Em seu ambiente natural, C. albicans é comumente encontrada associada a

superfícies (Kumamoto e Vinces, 2005), sendo capaz de aderir a uma variedade de

tecidos e nichos no corpo humano. Superfícies do corpo humano que podem ser

colonizadas por C. albicans, incluem a parede da vagina e as superfícies do trato

gastrointestinal, da cavidade oral e anorretal (Soll, et al., 1991). Estes locais oferecem

diferentes condições ambientais para o crescimento de C. albicans, que desenvolveu

mecanismos específicos de adaptação (Sohn, 2006). C. albicans também pode

crescer em superfícies completamente artificiais tais como plásticos e equipamentos

médicos, o que acarreta na formação de biofilmes em cateteres, resultando em

infecções que são refratárias a terapias com drogas antifúngicas. (Kumamoto e

Vinces, 2005).

3.1.1 C. albicans no intestino

A microbiota intestinal é estabelecida em estágios sucessivos nos primeiros

anos de vida e consiste de numerosas espécies de bactérias, arqueobactérias e de

algumas espécies fúngicas (Schulze e Sonnenborn, 2009). O estabelecimento destes

microrganismos no trato gastrointestinal depende da quantidade de muco, do

peristaltismo do intestino, da presença de IgAs (Imunoglobulinas A) específicas e da

capacidade de adesão dos mesmos a células epiteliais. (Senet, 1998). Estudos

mostraram que Candida spp são detectadas em 96% dos neonatos ao fim do primeiro

mês de vida (Kumamoto e Vinces, 2005). Fungos foram detectados em todas as

seções do tecido gastrointestinal de aproximadamente 70% de indivíduos adultos

sadios (Schulze e Sonnenborn, 2009), sendo que 50% dos indivíduos possuem C.

albicans colonizando o trato gastrointestinal (Nair e Samaranayake, 1996). Acredita-

se que o principal reservatório de C. albicans em humanos seja o trato gastrointestinal

e que infecções sistêmicas predominantemente são originadas deste reservatório

(Nucci e Anaissie, 2001; Voss, 1994) Esta suposição é apoiada pela observação de

Krause et al, (1969) que reportaram o desenvolvimento de candidemia após a

ingestão de uma suspensão contendo C. albicans em um individuo com o trato

gastrointestinal normal (Krause, et al., 1969) e pela demonstração de que um grande

número de fungos oportunistas provenientes do trato gastrointestinal podem se

espalhar sistemicamente e invadir outros órgãos (Green e Bulmer, 1979; Haupt, et al.,

1983; Kennedy, et al., 1982; Kennedy e Volz, 1983; Wingard et al., 1982; Wingard, et

al., 1980). A ideía de que a candidemia se origina de Candida spp. colonizando o trato

gastrointestinal, implica que a candidemia é precedida por colonização. De fato,

colonização prévia por Candida spp. é um fator de risco para a candidemia (Bow,

1995; Guiot, 1994; Karabinis, 1988; Martino, et al., 1994; Wey, et al., 1988) e tipagens

moleculares de linhagens de Candida spp. tem mostrado que cepas presentes na

infecção por Candida eram idênticas aquelas que previamente colonizavam os

mesmos pacientes (Reagan, 1990; Voss, 1994). Porém, Infecções hematogênicas por

Candida spp podem também ser adquiridas por via exógena, através do contato das

mãos de profissionais de saúde, com pacientes portadores de cateteres vasculares

em posição central, implante de próteses contaminadas, bem como pela

administração parenteral de soluções contaminadas (Colombo, 2003; Pfaller, 1996;

Wenzel, 1995)

C. albicans permanentemente interage com células da mucosa do epitélio

intestinal tanto no estágio comensal como durante o início da infecção (figura 1)

(Dalle, 2010). A camada epitelial do intestino é compreendida por enterócitos

individuais arranjados em colunas que são estritamente conectados por uma rede

subapical de junções intercelulares e formam um limite entre o lúmen e o restante do

organismo (Hecht, 1999; Scott e Hancock, 2000). Enterócitos especializados (células

de Goblet) secretam uma grande quantidade de muco (Scott e Hancock, 2000) que

são de extrema importância para o estabelecimento de microrganismos no trato

gastrointestinal (Senet, 1998). A camada mucosa é composta de duas frações, sendo

que a primeira delas é constituída por um gel luminal viscoso, composto

principalmente de glicoproteínas secretadas (principalmente mucinas), carboidratos e

lipídeos (Theolis Barbosa, 2009) e pode ser removida por sucção (Atuma, 2001). A

segunda fração é fortemente aderida às células epiteliais e constitui o glicocálice das

mesmas. É composta principalmente de glicoproteínas (principalmente mucinas)

associadas a membranas e muitos outros glicoconjugados (Theolis Barbosa, 2009). A

diversidade dos constituintes do muco do intestino e seu rápido turn over possuem um

papel importante em limitar a multiplicação de C. albicans. Enzimas imunocitolíticas

secretadas por C. albicans (capazes de lisar o muco do intestino) podem contribuir

para a virulência de C. albicans, facilitando sua penetração pela barreira do muco e a

subseqüente adesão as células epiteliais (Colina, 1996). O muco funciona também

como uma barreira protetora da mucosa do trato gastrointestinal (Atuma, 2001). De

fato, altas incidências de candidemia são decorrentes da interrupção da integridade

da mucosa após cirurgias gastrointestinais (Calandra, 1989), Da mesma maneira,

pacientes com leucemia ou linfoma são expostos a regimes de quimioterapia que

podem causar sérios danos a mucosa do intestino, contribuindo para a colonização

por Candida spp. e subseqüente invasão da corrente sanguínea (Bow, 1995).

Figura 1. Microscopia eletrônica da mucosa do intestino delgado humano (Biópsia). No centro

são observadas leveduras associadas à superfície da mucosa do intestino (seta vermelha); à

esquerda e a direita são observadas hifas (Aumento de 3000 vezes), Modificado de Schulze e

Sonnenborn (2009).

Uma análise microscópica da mucosa intestinal de camundongos inoculados

gastricamente com C. albicans, mostrou que este organismo pode se associar ao

intestino por diferentes mecanismos distintos: (i) adesão direta ao epitélio, (ii) adesão

ao muco que recobre o epitélio, (iii) co-adesão a outras Candida spp aderidas (adesão

indireta ao epitélio), (iv) co-adesão a bactérias aderidas (adesão indireta ao epitélio).

Foi postulado que a adesão direta ao epitélio possivelmente ocorre a partir de

interações com o glicocálice epitelial. C. albicans pode aderir de maneira direta ao

muco, ou ainda ser totalmente envolvida por ele. A adesão indireta de C. albicans a

outros organismos (bactérias e a própria C. albicans) também foi relatada nestas

análises. Mais especificamente no intestino delgado, estas análises demonstraram

que C. albicans pode se associar as vilosidades, dobras e muco do intestino, ou ainda

aderir diretamente à superfície do epitélio. Finalmente, depressões no epitélio

possivelmente decorrentes da secreção de proteases por C. albicans, foram

observadas após o início da adesão e podem ser importantes para a invasão do

tecido (Kennedy, et al., 1987). Em outros estudos, C. albicans foi encontrada

principalmente aderida à superfície do epitélio queratinizado do estômago e do

intestino delgado (Field, et al., 1981; Pope, et al., 1979). Assim, a adesão de C.

albicans a células epiteliais do hospedeiro é um fator crítico para a colonização da

superfície da mucosa. No entanto, as adesinas e seus respectivos mecanismos de

adesão ao epitélio do hospedeiro não são completamente elucidados. O epitélio e

endotélio estão em contato direto com a matriz extracelular. A ligação de adesinas a

estas proteínas é de extrema importância para a colonização e invasão das células do

hospedeiro. Existem dois tipos principais de matriz extracelular, o interstício e a

membrana basal, e seus componentes estão intimamente associados com as

superfícies das células do hospedeiro nos tecidos. A laminina, é encontrada

principalmente na membrana basal subendotelial, A fibronectina, que é uma

glicoproteína dimérica de 440 kDa, e os vários tipos de colágeno, estão presentes no

interstício, particularmente como parte das fibras reticulares (Liakka e

Autioharmainen, 1992). Fibronectina encontra-se também distribuída na região da

membrana basal do epitélio da superfície do trato gastrointestinal (Stenman, 1978).

Assim, a presença ubíqua da matriz extracelular faz de seus componentes, alvos

atrativos para a adesão de microorganismos (Chaffin, 1998).

A mudança de morfologia de levedura para hifa parece ser importante para a

translocação de C. albicans pela mucosa do intestino. A translocação ocorre por

penetração direta dos enterócitos pela C. albicans (Alexander, 1990) e culmina na

subseqüente invasão, penetração e colonização de tecidos e vasos sanguíneos

subjacentes (figura 2) (Senet, 1997). O sucesso desta translocação está estritamente

associado com a expressão de diferentes ligantes que propiciam a interação de C.

albicans a diferentes receptores do hospedeiro (Senet, 1998), sendo que adesinas

frequentemente exibem expressão diferencial entre as fases de levedura e hifa (Zhu e

Filler, 2010).

Figura 2. Interação de C. albicans com a superfície da mucosa. A: Leveduras aderidas a

células da mucosa. B: A transição para hifas pode preceder a invasão das células da mucosa.

Leveduras também podem invadir as células do hospedeiro por C: Persoption (Penetração)

ou D: Fagocitose induzida. E: C. albicans presentes na corrente sanguínea também podem

invadir o tecidos. fonte: Calderone e Gow, (2002)

3.1.2 Enzimas da via glicolítica expressas na superfície celular

Por conta de sua presença ubíqua em todos os seres vivos e de sua natureza

conservada ao longo de milhões de anos, enzimas da via glicolítica sempre foram

consideradas unicamente responsáveis pela conversão de substratos em ambas as

direções em resposta a pressões regulatórias. (Pancholi, 2001). Contudo, a presença

destas clássicas enzimas citoplasmáticas (que não possuem sinais canônicos de

transporte para a superfície e ancoramento à membrana plasmática) na superfície de

diferentes células, dentre elas células hematopoiéticas, epiteliais, neuronais e também

bactérias, fungos e parasitas, têm sido demonstrada em diferentes estudos.

(Chhatwal, 2002; Pancholi e Chhatwal, 2003).

O primeiro relato da presença de uma enzima da via glicolítica na superfície de

um microrganismo foi reportado em 1992. A enzima GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato

desidrogenase) foi encontrada enzimaticamente ativa na superfície de Streptococcus

pyogenes, desempenhando importantes papeis no reconhecimento de fibronectina,

lisozima, miosina, actina e plasmina (Lottenberg, 1992; Pancholi e Fischetti, 1992). A

enzima também foi encontrada na superfície de vários microrganismos (Pancholi e

Chhatwal, 2003) incluindo o fungo Kluyveromyces marxianus (Fernandes, et al., 1992)

e em S. cerevisiae, onde é codificada por 3 genes (Delgado, et al., 2001). Em C.

albicans, GAPDH foi encontrada na superfície, associada à parede celular, e é capaz

de se ligar a laminina e fibronectina. (Gozalbo, 1998) e de induzir uma forte resposta

imune humoral em pacientes com candidíase sistêmica (GilNavarro, et al., 1997).

Outras importantes enzimas da via glicolítica encontradas na superfíce de C. albicans

(Pancholi e Chhatwal, 2003) são a PGK (Phosphoglicerato kinase), (Alloush, 1997), a

enolase (Eroles, et al., 1997) e a ADH (Alcohol dehydrogenase), sendo esta última

descrita como uma possível ligante de fibronectina (Pendrak e Klotz, 1995). Além

disso, as enzimas fosfoglicerato mutase e triose fosfato isomerase foram observadas

na superfície de bactérias (Pancholi e Fischeti, 1997), porém não existem relatos da

detecção das mesmas na superfície de C. albicans e outros microrganismos

eucarióticos (Pancholi e Chhatwal, 2003).

3.1.3 A enolase

A enolase é responsável por catalisar a conversão de 2-fosfoglicerato em

fosfoenolpiruvato na via glicolítica e também a reação inversa durante a

gluconeogenese (Day, 1993). É considerada uma das proteínas citosólicas mais

abundantes em muitos organismos, incluindo C. albicans e S. cerevisiae (Holland e

Holland, 1978). Em S. cerevisiae, enolase é codificada por dois genes (ENO1 e

ENO2) cuja expressão é diferencialmente regulada dependendo da fonte de carbono

e da fase de crescimento (Mcalister e Holland, 1982). Análises filogenéticas revelaram

que dois eventos de duplicação gênica ocorreram em vertebrados dando origem a

três isozimas: α (Alfa), β (Beta) e γ (Gama) enolase. Em mamíferos a alfa-enolase é

encontrada em quase todos os tecidos adultos, enquanto que a beta-enolase é

encontrada em músculos e a gama-enolase é expressa em tecidos neuroendócrinos e

neuronais (Oliva, 1989), sendo que somente a alfa-enolase é encontrada em

microorganismos. Alguns autores designam as três enolases presentes em

vertebrados por números: A alfa-enolase é designada por (ENO1), a beta-enolase por

(ENO2) e a gama-enolase por (ENO3) (Liu e Shih, 2007; Plow e Das, 2009). Os

números utilizados para designar as enolases nesta tese referem-se à quantidade de

genes que codificam a alfa-enolase nos microorganismos procarióticos e eucarióticos.

A enolase pode ser considerada uma proteína multifuncional, uma vez que

desempenha diferentes funções além de seu papel primordial na via glicolítica.

(Pancholi, 2001). Este fenômeno é conhecido como gene sharing e ocorre quando um

gene, sem duplicação, adquire uma segunda função, mantendo a sua função original

(Tracy e Hedges, 2000). Alguns efeitos de gene sharing foram observados em

enolase: Em humanos, a utilização de um códon de iniciação da tradução alternativo

no gene que codifica a alfa-enolase acarreta na tradução de uma proteína nuclear que

interage fisicamente com histonas, funcionando como repressora da atividade

transcricional (Subramanian, 2000). Alguns estudos mostram o envolvimento da

enolase no desenvolvimento de carcinomas, doenças auto-imunes e degenerativas do

cérebro (Collini, et al., 2003; Kakinuma, et al., 2003; Liu e Shih, 2007). Foi postulado

que a alfa-enolase (superexpressa em células tumorais por conta do aumento da

glicólise aeróbica) pode interagir com o citoesqueleto promovendo o aumento de ATP

e a migração de células tumorais (Liu e Shih, 2007). Parálogos ao gene que codifica a

alfa-enolase em mamíferos são componentes estruturais do cristalino de peixes,

anfíbios, répteis e aves (Piatigorsky, 2003; Wistow, 1988). Em situações de hipóxia, a

alfa-enolase é up-regulada e promove proteção para células endoteliais a partir do

aumento do metabolismo aeróbico (Aaronson, 1995).

A enolase também funciona como uma Heat shock protein (HSP) em S.

cerevisiae, estando envolvida na tolerância termal e no controle do crescimento deste

organismo (Iida e Yahara, 1985).

Assim como algumas enzimas da via glicolítica previamente discutidas, a alfa-

enolase também é expressa na superfície de uma variedade de células tais como:

neutrófilos, monócitos, células T e B, células neuronais e endoteliais, além de

microrganismos procariotos e eucariotos (Liu e Shih, 2007) incluindo C. albicans

(Eroles, et al., 1997) e S. cerevisiae (Lopez-Villar, 2006).

Certos patógenos, células do sistema imune e células tumorais utilizam a alfa-

enolase expressa em suas superfícies como receptores de plasminogênio. O

plasminogênio é abundante no plasma humano e em fluidos extracelulares (Malke,

1994). Ativadores eucarióticos convertem o plasminogênio em plasmina que em

mamíferos atua na degradação de proteínas da matriz extracelular e na

desagregação de coágulos (Chapman, 1997). Durante o recrutamento de monócitos e

macrófagos para o sítio de inflamação, a alfa-enolase presente na superfície dos

leucócitos, liga-se ao plasminogênio que é então convertido em plasmina por

ativadores específicos. A plasmina associada à alfa-enolase, facilita a transmigração

dessas células a partir da degradação direta de proteínas da matriz extracelular ou a

partir da ativação de metaloproteinases que degradam colágeno, fibronectina e

laminina. O plasminogênio, quando ligado a receptores de superfície é mais

prontamente ativado em plasmina que consequentemente é protegida da inativação

que ocorre na ausência desta associação. (Liu e Shih, 2007; Plow e Das, 2009; Plow,

et al., 1995 ). Em células tumorais, a plasmina é capaz de ativar alguns fatores de

crescimento que em conjunto com a degradação de proteínas da matriz extracelular

promovem a metástase (Andreasen, et al., 2000).

A enolase expressa na superfície de vários microrganismos interage com o

plasminogênio do hospedeiro promovendo a atividade proteolítica de suas superfícies

a partir da ativação da plasmina realizada pelos mesmos mecanismos já descritos. A

ativação da plasmina representa um importante fator de virulência uma vez que

favorece a invasão do tecido hospedeiro pelos micropatógenos (Pancholi, 2001).

Vários autores já relataram a interação entre enolase e plasminogênio em diferentes

organismos: Streptococcus spp (Ge, 2004; Pancholi e Fischeti, 1998), Pneumocystis

carinii (Fox e Smulian, 2001), C. albicans (Jong, 2003), Onchocerca volvulus (Jolodar,

2003), pneumococcus spp. (Bergmann, 2001), Mycoplasma fermentans (Yavlovich,

2007), Trichomonas vaginalis, (Mundodi, 2008) Leishamania mexicana (Vanegas,

2007), Bacillus anthracis, (Agarwal, 2008), Bifidobacterium spp. (Candela, 2007)

dentre outros. A enolase de bactérias possui maior afinidade de ligação ao

plasminogênio do que a enolase de mamíferos (Derbise, 2004; Redlitz, 1995;

Subramanian, 2000). Não existem relatos na literatura a respeito da afinidade de

ligação entre o plasminogênio e a enolase de outros microrganismos. Em

streptococcus (grupo A), a enolase de superfície diretamente ligada ao plasminogênio

foi caracterizada como enzimaticamente ativa (Bergmann, 2001). Ainda não se sabe

se a enolase mantém sua atividade enzimática na superfície de outros organismos.

Além do plasminogênio, a Enolase de alguns organismos podem

potencialmente mediar importantes papeis na adesão ao tecido do hospedeiro, uma

vez que as mesmas foram recentemente caracterizadas como potenciais receptores

de proteínas da matriz extracelular. A enolase das bactérias Streptococcus suis

(Esgleas, 2008) e Lactobacillus plantarum (Castaldo, 2009) e do fungo

Paracoccidioides brasiliensis (Donofrio, 2009) são capazes de se ligar a fibronectina

humana e a enolase de Staphylococcus aureus é capaz de se ligar a laminina

(Carneiro, 2004). Ainda, a enolase de Streptococcus mutans é capaz de se ligar a

mucina salivar humana MG2 indicando que a enolase pode estar envolvida na adesão

deste organismo a tecidos orais (Ge, 2004).

Em C. albicans, enolase é codificada por um único gene (ENO1) (Franklyn e

Warmington, 1993; Mason, 1993), e foi inicialmente descrita como uma enzima

citoplasmática de aproximadamente 48 kDa capaz de promover uma forte resposta

humoral em pacientes com candidiase (Strockbine, 1984). Sua presença já foi

detectada em sobrenadante de culturas (Sundstrom, 1994) e no sangue de pacientes

com candidemia sistêmica, onde pode ser utilizada como marcador (Walsh, 1991). A

enolase de C. albicans também já foi descrita como um importante alérgeno (Ito, et

al., 1995). Por ser altamente imunogênica, anticorpos anti-enolase possuem alto valor

diagnóstico (Gutierrez, 1993). Em C. albicans, a enolase também é encontrada na

superfície da célula. Angiolella et al (1996) demonstraram que a mesma encontra-se

associada à glucanas nas camadas mais internas da parede celular (Angiolella,

1996). Outros autores no entanto relataram a sua presença nas porções mais

externas da parede celular (Eroles, et al., 1997). A enolase de C. albicans também é

um receptor de plasminogênio. Sua ligação ao plasminogênio humano foi capaz de

induzir uma atividade proteolítica in vitro e intensificar sua capacidade de invasão a

células HBEC (Human brain microvascular endothelial cells). Estes estudos

demonstram a importância da enolase e de outros receptores de plasminogênio

(Crowe, 2003), para C. albicans, uma vez que sua disseminação e invasão

geralmente ocorrem na corrente sanguínea, local onde o plasminogênio é abundante

(Jong, 2003). Os estudos descritos acima reforçaram a idéia de que a enolase pode

de fato realizar uma variedade de funções celulares importantes para células

procarióticas e eucarióticas sendo desta maneira uma proteína multifuncional,

contudo, ainda não são conhecidos os mecanismos envolvidos no transporte dessa

enzima para a superfície celular, assim como o seu papel na patogenicidade de

microrganismos (Chaffin, 1998; Pancholi, 2001).

3.2 OBJETIVOS

A enolase é uma abundante enzima citoplasmática e sua presença na

superfície de uma grande variedade de células já foi demonstrada, indicando que esta

proteína possua funções distintas além de seu papel primordial na via glicolítica. A

presença da enolase na parede celular sugere seu possível envolvimento na

patogenicidade de C. albicans, uma vez que esta estrutura é fundamental para sua

interação com o hospedeiro. Contudo, as funções desempenhadas por esta proteína

na superfície deste organismo ainda são desconhecidas. Assim, o principal objetivo

deste trabalho foi:

-Investigar o envolvimento da enolase de superfície na adesão de C. albicans ao

tecido gastrointestinal e seu papel como possível fator de virulência.

3.3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.3.1 PREPARAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE His

-enolase E ANTI-

SORO.

3.3.1.1 Expressão da proteína recombinante His

-enolase

A proteína recombinante His

-enolase (codificada pelo gene ENO1 de C.

albicans) havia sido previamente expressa em nosso laboratório. Um pré-inóculo foi

realizado a partir de bactérias linhagem BL21 (DE3) congeladas na presença de

glicerol a -80

C, contendo o plasmídeo de expressão pET28a(+) com o inserto ENO1

clonado nos sítios NotI e BamHI. As células foram crescidas a 37ºC em meio LB com

canamicina (15 µg/mL) por 18 h. O pré-inóculo foi diluído 50 vezes no mesmo meio. A

cultura foi incubada a 37

C, com agitação a 200 rpm, até atingir a absorbância de 0,6

em comprimento de onda de 600 nm. A indução da expressão da proteína

recombinante foi realizada com IPTG 1 mM por 2 h a 37ºC. A separação das frações

pós-indução foi realizada conforme item 2.3.9.2

3.3.1.2 Purificação da proteína recombinante His

-enolase

Verificou-se por SDS-PAGE que a proteína recombinante His

-enolase

encontrava-se predominantemente na fração solúvel do extrato. A resina quelante de

níquel (QIAGEN) foi lavada três vezes em água Milli-Q em tubo de 15 mL e

equilibrada três vezes com 4 volumes de tampão de ligação (imidazol 5 mM, NaCl 500

mM, Tris-HCl 20 mM pH 8,0). O extrato solúvel foi adicionado à resina e incubado por

1h sob agitação a 4ºC. Após três lavagens com 6 volumes de tampão de ligação, a

resina foi lavada três vezes com 6 volumes de tampão de lavagem (imidazol 20 mM,

NaCl 500 mM, Tris-HCl 20 mM pH 8,0). Foram feitas, então, três eluições com 2

volumes de tampão de eluição (imidazol 1 M, NaCl 500 mM, Tris-HCl 20 mM pH 8,0).

Após várias tentativas frustradas de diálise sob diferentes condições (a proteína

precipitava), o eluato foi finalmente diluído e dialisado por 24 h a 15ºC contra PBS

utilizando a membrana Spectra/Por MWCO de 2 kDa. A proteína resultante foi

concentrada em tubos centricon (Millipore) e quantificada pelo método de Bradford

utilizando diferentes concentrações de BSA como padrão (Bradford, 1976) conforme

item 2.3.9.5.

3.3.1.3 Purificação do anti-soro anti-His

enolase

O soro hiper-imune contra His

-enolase foi previamente produzido em coelhas

em nosso laboratório. A proteína recombinante purificada totalizando (~1 mg) foi

separada em gel de poliacrilamida 10% (SDS-PAGE) conforme item 2.3.10. A

proteína foi posteriormente transferida para membrana de nitrocelulose Hybond ECL

(GE Healthcare) conforme item 2.3.12. A região da membrana correspondente a

proteína (membrana corada com Ponceau) foi cortada e bloqueada com 5% de leite

desnatado em água por 1 h à temperatura ambiente. A membrana foi então cortada

em tiras e incubada com o soro de coelhas diluído 10 vezes em PBS por 5 h sob

agitação a temperatura ambiente. As tiras foram lavadas 3 vezes com PBS por 5 min

e incubadas com 5 mL de (Glicina 0,1 M pH 2,5 e EGTA 1 mM) por 10 min a

temperatura ambiente. A solução foi então neutralizada com 5 mL de tris-base 0,1 M.

As tiras foram novamente incubadas com o soro e tratadas conforme acima para

obtenção da segunda alíquota. O anticorpo policlonal purificado foi concentrado em

tubos centricon 5000 MW (Millipore), quantificado pelo método de Bradford conforme

item 2.3.9.5 e diluído para uma concentração de 250 ng/µl.

3.3.1.4 Pureza e viabilidade da proteína recombinante

Para testar a pureza e a viabilidade da proteína recombinante nos ensaios

seguintes, uma alíquota da mesma foi separada em gel de poliacrilamida 10% (SDS-

PAGE) e corada com azul de Coomassie conforme item 2.3.10 e Nitrato de prata

conforme (Sambrook, et al., 1989). De maneira resumida, o gel foi fixado (solução de

fixação contendo: 10% ácido acético e 30% etanol absoluto), corado com solução de

nitrato de prata 0,1% revelado com solução de carbonato de sódio 2,5% e

formaldeído 0,02% e lavado com solução de ácido acético 1%. A proteína

recombinante também foi analisada por western blot utilizando o anticorpo purificado

anti-His

enolase e o anticorpo monoclonal anti-His

Tag conforme item 2.3.12.

3.3.2 ENSAIO DE ADESÂO DE C. albicans AO TRATO GASTROINTESTINAL

MURINO

3.3.2.1 Microorganismos e condições de crescimento

Para os ensaios de adesão de C. albicans, as linhagens SC5314 e L757 (item

2.3.2 tabela 2) foram crescidas a 30°C em meio YPD por 24 h sob agitação (200

rpm) e aeração (fase estacionária). As culturas foram transferidas para tubos de

1,5 mL, centrifugadas a 6.000 rpm por 3 min e lavadas três vezes com PBS

estéril. Posteriormente as células foram ressuspensas em PBS e a absorbância

das suspensões celulares foi medida em espectrofotômetro (comprimento de

onda de 660 nm). As células foram diluídas em PBS para uma concentração final de

2,5 x 10

células/mL. As células foram também observadas ao microscópio ótico com

o objetivo de avaliar sua viabilidade e a possível presença de hifas.

3.3.2.2 Preparação de discos de tecido gastrointestinal de camundongos

Camundongos Balb/c machos com aproximadamente 5 meses de vida foram

mantidos sob condições estéreis e sacrificados por deslocamento cervical. Logo em

seguida seus intestinos foram exteriorizados e utilizados para o preparo de discos de

tecido gastrointestinal. Para a obtenção dos discos, uma modificação do protocolo

descrito por (Segal e losica, 1995) foi realizada. Todos os ensaios foram realizados

em fluxo laminar, utilizando instrumentos e soluções estéreis. A porção integral do

intestino delgado (continuação do estômago ao início do ceco) foi removida com o

auxílio de tesouras e pinças e enxaguada uma vez em PBS para remoção de

agregados. Como as diferentes porções do intestino não possuem limite nítido e

tínhamos interesse em utilizar o intestino delgado, um corte foi realizado após 5 mm

da porção terminal do estomago e 5 mm antes da porção inicial do ceco. O intestino

delgado (Duodeno, Jejuno e Íleo) foi colocado em superfície plana (placa de Petri) e

uma incisão longitudinal foi cuidadosamente realizada com o auxílio de tesoura,

lâmina de bisturi e palito de plástico descartável. O tecido foi então lavado gentilmente

três vezes em PBS gelado e aberto novamente com a porção luminal voltada para

cima em superfície plana. Discos de 6 mm de diâmetro foram obtidos com o auxílio de

um perfurador de tecidos de metal. Os discos foram utilizados nos ensaios de adesão

com C. albicans com um limite de no máximo 1 h após a preparação.

3.3.2.3 Ensaio de Adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal murino

Os ensaios de adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal murino foram

realizados conforme protocolo descrito por (Segal e losica, 1995), com algumas

modificações. Foi utilizado um disco de tecido gastrointestinal murino preparado

conforme item 3.3.2.2 por ensaio de adesão. Os discos foram adicionados em 1 mL

de C. albicans SC5314 (2,5 x 10

células) em tubos de 2 mL. As suspensões foram

incubadas a 37ºC por 2 h sob agitação (orbital). Os discos foram então transferidos

para tubos novos e estéreis contendo 1 mL de PBS e misturados suavemente por

inversão (cinco vezes). O PBS foi removido cuidadosamente com o auxílio de pipeta e

as lavagens foram realizadas por mais cinco vezes. Os discos foram então

macerados, homogeneizados em termomixer a 22ºC por 30 min e eluidos em 1 mL de

PBS estéril. A eluição foi então apropriadamente diluída e plaqueada em meio YPD

sólido contendo 34 µg/mL de cloranfenicol. As placas foram incubadas por 48 h a

30ºC e o número de C. albicans por disco foi estimado com base no número de

Unidades formadoras de colônias (UFC) levando em consideração a diluição

realizada. As UFCs foram contadas utilizando-se o programa Image Analyzer (GSA).

As diluições foram otimizadas de modo que o número de UFC não fosse menor do

que trinta e maior do que trezentas.

3.3.2.4 Ensaio de inibição da adesão por competição

Os discos de tecido gastrointestinal murino foram obtidos conforme item 3.3.2.2

e incubados por 4 h a 4ºC com diferentes concentrações (0,1 mg / 0,2 mg / 0,5 mg) de

His

-enolase para um volume final de 1 mL em PBS estéril. Discos incubados com 0,5

mg/mL de His

-339cp ou somente com PBS foram utilizados como controle negativo.

Posteriormente os discos foram enxaguados suavemente por duas vezes em PBS

estéril para a remoção das proteínas não aderidas ao tecido. Os discos foram então

adicionados a tubos de 2 mL contendo 1 mL de C. albicans SC5314 (2,5 x 10

células). As etapas de incubação, lavagem e tratamento dos discos, bem como a

estimativa do número de células por disco foram realizadas conforme item 3.3.2.3.

3.3.2.5 Ensaio de inibição da adesão (bloqueio da C. albicans com

anticorpos)

O soro purificado anti-His

enolase produzido em coelhos nas concentrações de

10 e 20 µg diluídos em PBS estéril para um volume final de 100 µl foram adicionados

em 1 mL de C. albicans SC5314 (5,2 x 10

células) e incubados por 4 h a 4ºC sob

agitação (orbital). A concentração de 20 µg de soro purificado anti-His

339cp e soro

pré Imune numa diluição de 1:20 ambos provenientes de coelhos foram incubados

com as células e utilizados como controle negativo. Um controle negativo adicional foi

realizado sob as mesmas condições a partir da incubação de C. albicans com o

anticorpo monoclonal anti-Hi

Tag (Santa-Cruz) numa diluição de 1:250 em PBS-T.

Posteriormente as células foram centrifugadas a 3.000 rpm por 3 min a 4ºC e lavadas

com PBS estéril gelado por três vezes. Discos foram adicionados a células então

ressuspendidas em 1 mL de PBS estéril. As etapas de incubação, lavagem e

tratamento dos discos, bem como a estimativa do número de células por disco foram

realizadas conforme item 3.3.2.3.

3.3.2.6 Ensaio de atividade fungicida das proteínas recombinantes e dos anti-

soros.

Os ensaios de atividade fungicida foram realizados conforme (Magliani, et al.,

1997), com algumas modificações. A viabilidade das células antes e após as

incubações foram checadas a partir de observações em microscópio ótico. As

possíveis atividades fungicidas do soro e da proteína recombinante foram testadas da

seguinte maneira: Para o teste do soro anti-His

enolase, C. albicans SC5314 foi

crescida e lavada conforme item 3.3.2.1 e diluída para a concentração final de 5,2 x

células em 1 mL. As células (125 µl) foram incubadas com 50 ng de anti-His

enolase e 50 ng de anti-His

339cp para um volume final de 300 µL em PBS estéril por

4 h a 4ºC. Para o teste da proteína recombinante His

-enolase, C. albicans SC5314

foi crescida e lavada conforme item 3.3.2.1 e diluída para a concentração final de 2,5

x 10

células em 1 mL. As células (125 µl) foram incubadas com 1,6 µg de cada uma

das proteínas (His

-enolase, His

-339cp e His

-P21) para um volume final de 300 µL

em PBS estéril por 4 h a 4ºC. As células foram centrifugadas a 3.000 rpm por 3 min a

4ºC, lavadas com PBS estéril gelado por três vezes e eluidas em 1 ml de PBS estéril.

Diluições seriadas foram realizadas em PBS e plaqueadas em meio YPD sólido

contendo cloranfenicol (34 µg/mL). As placas foram incubadas por 48 h a 30ºC e o

número de células foi estimado com base no número de UFC.

3.3.2.7 Ensaio de inibição da adesão (bloqueio de receptores de C. albicans

ligantes de Fibronectina e Plasminogênio Humanos)

100, 200 e 500 pM de Fibronectina de plasma Humano (44 , 88 e 220 µg)

(Sigma-F2006) e 100, 200 e 500 pM de Plasminogênio de Plasma Humano (8,1, 16,2

e 40,5 µg) (Sigma-P7999) diluídos em PBS estéril para um volume final de 100 µl,

foram adicionados a tubos de 2 mL contendo 1 mL de C. albicans SC5314 (2,5 x 10

células). As células foram incubadas por 2 h a 37ºC. 500 pM de BSA (Promega)

incubado com a mesma concentração de células foi utilizado como controle negativo.

Posteriormente as células foram centrifugadas a 3.000 rpm por 3 min a 4ºC e lavadas

com PBS estéril gelado por três vezes. Discos foram adicionados a células então

ressuspendidas em 1 mL de PBS estéril. As etapas de incubação, lavagem e

tratamento dos discos, bem como a estimativa do número de células por disco foram

realizadas conforme item 3.3.2.3.

3.3.2.8 Análise dos dados

O número de células por disco (tecido gastrointestinal murino) foi estimado

multiplicando-se os fatores de diluição pelo nº de UFC obtidos na contagem realizada

pelo software Image analyzer -GSA (validado a partir da contagem manual). Os dados

referentes aos ensaios de adesão e inibição da adesão a discos de tecido

gastrointestinal murino são expressos como médias e barras de erro padrão

representativas de três experimentos realizados em triplicata. Todos os resultados

foram analisados usando o ANOVA (Análise de variância) fator único, não-

paramétrico. O valor de P> 0.05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas

as análises estatísticas foram implementadas utilizando o Excel (Pacote Office).

3.3.3 ENSAIOS DE LIGAÇÃO DE C. albicans A FIBRONECTINA E

PLASMINOGÊNIO HUMANOS

Aproximadamente 1 x 10

células/mL de C. albicans linhagem SC5314 foram

lavadas em PBS estéril e incubadas com diferentes concentrações (25, 50 e 150 pM)

de Fibronectina humana (Sigma-F2006) e Plasminogênio humano (Sigma-P7999) por

2 h a 37ºC em PBS. Posteriormente as células foram centrifugadas a 6.000 rpm por 3

min a 4ºC e lavadas por 5 vezes com PBS estéril gelado. As mesmas concentrações

da proteína GST expressa em E. coli BL21 (DE3) foram utilizadas como controle

negativo. Foram adicionados as células: 2 µL de PMSF 100 mM, 0,5 µL de antipaína

1 µg/mL e 0,5 µL de coquetel de inibidores de

protease (Sigma-p8215). As células

foram congeladas a -80ºC overnight. Posteriormente as células foram ressuspensas

em 15 µL de Laemmli (LB) 4X e fervidas por 5 min. As amostras foram aplicadas em

gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10% conforme item 2.3.10 e transferidas para

membrana de nitrocelulose Hybond ECL (GE Healthcare). A ligação das proteínas

humanas a C. albicans foram avaliadas a partir de ensaios de western blot conforme

item 2.3.12. As membranas foram incubadas por 1 h a temperatura ambiente com os

anticorpos conforme abaixo:

Ensaio de ligação a:

-Fibronectina: anti-fibronectina humana (Sigma-F3648) 1:1000 em PBS.

-Plasminogênio: anti-plasminogênio Humano (Sigma-WH0005340M1) 1:1000 em

PBS.

-GST: anti-GST 1:500 em PBS.

Após as lavagem das membranas com PBS-T, as mesmas foram incubadas com anti

IgG-HRP

(horseradish peroxidase) (GE Healthcare) por 1 h à temperatura ambiente e

detectadas conforme item 2.3.12. Em seguida as membranas foram incubadas com

solução de stripping conforme item 2.3.12. e incubadas por 1 h a temperatura

ambiente com anti-His

enolase numa diluição de 1:1000 (Controle positivo).

3.3.4 CO-IMUNOPRECIPITAÇÃO

3.3.4.1 Preparo do extrato protéico de C. albicans

Para os ensaios de co-Imunoprecipitação, a linhagem SC5314 de C. albicans

foi crescida a 30ºC overnight sob agitação (200 rpm). 6 tubos contendo 1 mL de meio

foram centrifugado a 6.000 rpm e lavados 3 vezes com PBS gelado. As células foram

ressuspendidas em 200 µL de buffer de lise não desnaturante (20 mM Tris Hcl, pH

8,0, 137 mM Nacl, 10% glicerol, 1% NP-40 e 2 mM EDTA) acrescidos de 1 mM de

PMSF, 0,5 µL de antipaína - 1 µg/mL e 0,5 µL de coquetel de inibidores de protease

(Sigma – P8215). As suspensões foram adicionadas a tubos contendo o mesmo

volume de glass beads geladas (500 µm) e em seguida foram vortexadas

vigorosamente duas vezes por 3 min, com intervalo de 1 min no gelo. Os tubos foram

centrifugados a 10.000 g por 5 min a 4ºC e os sobrenadantes (extrato protéico) foram

transferidos para um tubo de 2 mL.

3.3.4.2 Pre-Clearing do Extrato protéico

Um pre-clearing do extrato protéico foi realizado a partir da incubação de 1 mL

de extrato protéico com 50 µL de anti-soro irrelevante de coelho por 1 h no gelo. Após

esta etapa, 100 µL de beads - Sepharose A CL4B (GE Healthcare) foram adicionadas

a suspensão que foi incubada sob agitação a 4ºC por 30 min (orbital). A suspensão

foi então centrifugada a 14.000 g por 10 min a 4ºC e o sobrenadante transferido para

um tubo gelado de 1,5 mL (mantido no gelo).

3.3.4.3 Co-imunoprecipitação

Tubos contendo 200 µL de extrato protéico de C. albicans (pre-cleared) foram

incubados com 12 pM de Fibronectina humana – 5,4 µg (Sigma-F2006) 12 pM de

Plasminogênio humano - 1 µg (P7999) e 12 pM de His

-339cp ~2 µg (controle

negativo) por 2 h a 4ºC. Em paralelo, aproximadamente 1 µg de anti-soro de coelhos

(anti-His

enolase) com 65 µL de beads - Sepharose A CL4B (GE Healthcare) para um

volume final de 200 µL com PBS gelado foi incubado sob agitação (orbital) a 4ºC por

2 h. As mesmas concentrações dos anti-soros de coelhos anti-His

339cp foram

incubadas com beads sob as mesmas condições (controle negativo). Após incubação,

as suspensões foram centrifugadas a 4.000 por 2 min a 4ºC e lavadas com PBS

gelado por 3 vezes. Os anticorpos agora acoplados as beads foram ressuspendidos

em 100 µL de PBS e adicionados ao extrato protéico. As suspensões foram

incubadas por 2 h a 4ºC sob agitação (orbital). As amostras foram centrifugadas a

4.000 rpm por 2 min a 4ºC e lavadas 10 vezes com o buffer de lise não desnaturante

gelado. Após a última centrifugação, o sobrenadante foi removido e as beads foram

ressuspendidas em 40 µL de Laemmli 4X e fervidas por 5 min. As amostras foram

rapidamente centrifugadas e o sobrenadante foi aplicado em gel de poliacrilamida

(SDS-PAGE 10%). As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF –

Hybond-P (GE Healthcare) que foram posteriormente bloqueadas conforme item 3.13.

Após o bloqueio, as membranas foram incubadas com anticorpos anti-fibronectina

humana (Sigma) na diluição de 1:1000 em PBS-T e anti-plasminogênio humano

(Sigma) na diluição de 1:3000 em PBS-T. Após lavagens com PBS-T, as membranas

foram incubadas com a proteína A-HRP (GE Healthcare) na diluição de 1:3000 em

PBS-T. A detecção foi feita por quimioluminescência utilizando o ECL Western

blotting

analysis system (GE Healthcare), segundo protocolo do fabricante.

Posteriormente as membranas foram re-analisadas a partir da incubação das mesmas

com solução de stripping conforme item 2.3.12. As detecções posteriores foram feitas

a partir da incubação das membranas com anti-His

enolase e, anti-His

339cp numa

diluição de 1:500 em PBS-T por 1 h à temperatura ambiente com lavagens e

incubações secundárias conforme descrito acima.

3.3.5 INFERÊNCIA FILOGENÉTICA

23 sequências de aminoácidos de representantes das enolases de bactérias,

fungos e de mamíferos (α-enolase), além da sequência da enolase do milho - Zea

May (utilizada como outgroup) foram obtidas no Genbank (ncbi.nlm.nih.gov/Genbank).

As seguintes sequências foram inseridas na análise, (número de acesso do Genbank

entre parênteses) Staphylococcus epidermis (AAW53886), S. aureus (AAC17130),

Streptococcus pneumoniae (ACF56025), Enterococcus hirae (Q8GR70), Lactobacillus

plantarum (CAD99191), Salmonella typhimurium (AAZ21832), Escherichia coli

(NP_417259), Bifidobacterium longum (NP_696193), B. lactis (aaz22544.1),

Metanococcus jannaschii (NP_247203), S. cerevisiae ENO1 (NP_011770) e ENO2

(NP_012044), Candida glabrata ENO1 (Q6FTW6) e ENO2 (Q6FQY4), Kluveromyces

lactis (CAE51943), K. thermotolerans (XP_002552158), C. dubliniensis

(XP_002417447), C. albicans (XP_711912.1), C. tropicalis (XP_002548866),

Schisosaccharomyces pombe (AAA70080), Zea mays (NP_001105896.1), Mus

musculus (AAH24644) e H. sapiens (AAH22545). As sequências foram então

alinhadas pelo programa Clustalw (Thompson, et al., 1994) e ajustadas manualmente

no editor de sequências Seaview (Galtier, 1996). A árvore filogenética foi inferida pelo

programa MrBayes (Huelsenbeck, 2001), utilizando o modelo GTR (General Time

Reversible) para substituição de aminoácidos com distribuição gama. As árvores

foram calculadas por 5 x 10

gerações em duas análises independentes, amostrando-

se uma árvore a cada 100 gerações, até que os desvios padrão das freqüências de

partições – split frequencies, ficassem abaixo de 0.01 (Distribuição estacionária da

probabilidade posterior). Os parâmetros e as árvores foram sumarizados a partir do

descarte de 25% das amostras obtidas (50.001 amostras) totalizando 12.500 árvores.

A árvore foi enraizada com as sequências das enolases de mamíferos, utilizando o

programa FigTree v1.3.1.

3.3.6 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS

A análise da estrutura secundária das sequências de aminoácidos das

enolases foi realizada pelo método de Garnier-Robson (Garnier e Robson, 1989) e

implementada pelo programa Protean do pacote DNAstar (DNASTAR Inc., Madison,

Wis). O mapeamento das estruturas secundárias no alinhamento foi realizado a partir

da exportação dos dados do programa Protean para planilhas do Excel (pacote

Office) e coloração manual.

3.4 RESULTADOS

3.4.1 Expressão heteróloga de enolase em E. coli

A expressão heteróloga da proteína recombinante His

-enolase havia sido

previamente realizada em nosso laboratório como parte da tese de Doutorado da

estudante Ana Carolina Barbosa Padovan (2008). Assim, o gene ENO1 de C. albicans

(1.323 nucleotídeos) encontrava-se subclonado entre os sítios NotI e BamHI no vetor

de expressão pET28a(+). Este plasmídeo havia sido transformado na linhagem BL21

(DE3) de E. coli que se encontrava devidamente armazenada com glicerol a -80ºC. A

proteína recombinante foi expressa em abundância (fusionada com uma cauda de

histidina na região N-Terminal) a 37ºC por 2 h, purificada com resina de níquel a partir

da fração solúvel do lisado de bactérias e dialisada com PBS. A pureza da proteína

purificada foi constatada a partir de sua separação em SDS-PAGE 10% e posterior

coloração com azul de Coomassie (figura 3a) e nitrato de prata (figura 3b).

Figura 3. Pureza da proteína His

-enolase (~50 kDa) determinada a partir da análise

eletroforética de 3 µg da proteína recombinante em géis de poliacrilamida 10% (SDS-PAGE)

corados com A: nitrato de prata 0,1% e B: Azul de Coomassie. M, refere-se aos marcadores

de peso molecular em kDa (quilodaltons).

Com o objetivo de confirmar a expressão e a viabilidade da proteína

recombinante His

-enolase purificada, foi feito um western blot com o soro hiper-

imune produzido em coelhos (purificado). O soro pré-imune foi utilizado como controle

negativo. O soro hiper-imune reconheceu de maneira específica a proteína His

enolase (peso molecular de aproximadamente 50 kDa) e falhou em reconhecer a

proteína recombinante His

-339cp (~18 kDa) utilizada como controle negativo (figura

4).

Figura 4. Amostras das proteínas His

-enolase e His

-339cp (Controle negativo) foram

separadas em gel de poliacrilamida 10% (SDS-PAGE) e A: coradas com azul de Coomassie

ou B: analisadas por western blot com o soro hiper-imune produzido em coelhos. Somente a

proteína His

-enolase (~50 kDa) foi detectada com o soro anti- His

enolase. M, refere-se ao

marcador de peso molecular em kDa (quilodaltons).

Também não houve reconhecimento da proteína recombinante His

-enolase

quando da realização de um western blot utilizando o soro pré-imune de coelho. O

soro contra His

-enolase também reconhece de maneira específica a proteína

enolase nativa (~48 kDa) em ensaios de western blot com extratos protéicos obtidos

nas fases de levedura e hifa de C. albicans (figura 13b – item 2.4.9.1). O soro pré-

imune de coelhos não reconheceu proteínas de C. albicans, o que permitiu sua

utilização como controle negativo em ensaios posteriores de adesão

. Ainda,

resultados prévios obtidos por nosso grupo mostraram, a partir de ensaios de

imunofluorescência e citometria de fluxo, utilizando o soro hiper-imune contra His

enolase, a presença desta proteína no citoplasma e na parede celular de C. albicans

(Dados não publicados).

3.4.2 Adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal murino.

Com o objetivo de avaliar a capacidade de adesão de C. albicans a mucosa

gastrointestinal in vitro, discos de tecido gastrointestinal (6 mm de diâmetro) obtidos a

partir da remoção e corte do intestino delgado de camundongos Balb/c sacrificados,

foram incubados com C. albicans. O número de células por disco foi estimado após

diluições seriadas do tecido macerado, plaqueamento e contagem das UFC

(Unidades formadoras de colônias). A adesão a discos de tecido gastrointestinal

murino já foi demonstrada em estudos anteriores utilizando a linhagem 4918 de C.

albicans (Segal e Savage, 1986). Como não existem dados em relação à adesão de

outras linhagens de C. albicans a discos de tecido gastrointestinal (TGI) murino in

vitro, nos perguntamos se existem diferenças na habilidade de adesão de duas

linhagens que diferem quanto as suas capacidades de induzir hifa e formar biofilmes.

A linhagem SC5314 possui maior capacidade de produzir biofilme e formar hifas em

relação à linhagem L757 (Padovan et al, 2009). As duas linhagens foram crescidas

sob as mesmas condições e diluídas em PBS na mesma concentração. Amostras das

células foram observadas em microscópio ótico e não foi constatada a presença de

hifas em nenhuma das linhagens. As células foram então incubadas com discos de

TGI murino por 2 h a 37ºC. A figura 5 mostra que o número de células da linhagem

L757 aderidas ao disco gastrointestinal foi menor do que o número de células da

linhagem SC5314, porém a diferença não foi significativa (P >0.05). O número de

células da linhagem SC5314 obtidas após a incubação dos discos foi estimada em

21,09 x 10

células por disco (SE± 2282) e o número de células da linhagem L757 foi

estimado em 20,35 x 10

células por disco (SE± 2032) sob as condições de incubação

e lavagens estabelecidas nesta tese. De modo a garantir que as colônias verificadas

após a realização dos ensaios de adesão não eram provenientes da microbiota dos

camundongos (mesmo que mantidos sob condições estéreis), um controle negativo

foi realizado a partir da incubação dos discos de tecido gastrointestinal apenas com

PBS. Não houve crescimento de colônias em experimentos realizados em triplicata.

Figura 5. Adesão de C. albicans a discos de tecido gastrointestinal murino. Discos removidos

de camundongos Balb/C foram incubados com as mesmas quantidades de C. albicans,

linhagens SC5314 (barra preta) e L757 (barra azul) por 2 h a 37ºC e lavados extensivamente

para remoção de células não aderidas. O nº de células por disco foi estimado a partir da

homogeneização e diluição do tecido, plaqueamento e contagem do nº de UFC. Os

resultados são expressos como médias de três experimentos independentes realizados em

triplicata. As barras representam o erro padrão (SE) das médias. A diferença entre o número

de células por disco não foi significativa entre as duas linhagens de C. albicans (P >0.05).

3.4.3 O bloqueio da enolase com anticorpos é capaz de inibir a adesão de

C. albicans ao TGI murino.

A presença da enolase na superfície de C. albicans foi previamente

demonstrada por diferentes autores (Angiolella, 1996; Eroles, et al., 1997) e também

por nosso grupo (dados não publicados), porém sua função na superfície da célula

ainda permanece desconhecida. Uma vez que a adesão de fungos as células do

hospedeiro é mediada por adesinas presentes na parede celular, a hipótese de que a

enolase presente na superfície de C. albicans pudesse estar de algum modo

mediando à adesão as células do hospedeiro foi levantada. Assim, se de fato a

enolase desempenhasse algum papel na adesão as células do hospedeiro,

esperaríamos que o seu bloqueio na superfície de C. albicans com anti-soro

específico inibisse sua adesão ao tecido gastrointestinal, que é considerado o sítio de

contato inicial entre a C. albicans e o hospedeiro (Bendel, 1993). Para testar estar

hipótese, a linhagem SC5314 de C. albicans foi pré-incubada com soros obtidos de

coelhos e posteriormente incubada com discos de tecido gastrointestinal murino.

Como mostrado na figura 6, o número de células por disco obtidos a partir da

incubação com o soro purificado anti-His

339cp obtido de coelhos (Controle negativo)

não diferiu significativamente em relação ao número de células obtidos a partir da

incubação dos discos com o soro pré-imune de coelhos (P >0,05). No entanto, o

bloqueio de C. albicans com 10 e 20 µg de soro purificado anti-His

enolase obtido de

coelhos foi capaz de inibir sua adesão ao disco de TGI em 42,72 e 47,95%

respectivamente (P <0,001) em relação a C. albicans bloqueada com o soro anti-

His

339cp (controle negativo). Ainda, a inibição da adesão parece saturar a partir da

utilização de 10 µg de soro anti-His

enolase, já que a pré-incubação de C. albicans

com o dobro de soro (20 µg) não inibiu consideravelmente a adesão (figura 6). Um

anticorpo monoclonal contra a cauda de histidina não foi capaz de reconhecer

proteínas em extratos protéicos de C. albicans em experimentos de western blot

(Figura 15 item 2.4.9.1), mesmo assim, para descartar a hipótese de que a inibição

possa ter sido decorrente do reconhecimento e bloqueio de proteínas da superfície

com regiões ricas em histidina, C. albicans foi incubada com o anticorpo monoclonal

contra a cauda da histidina. Nenhuma diferença foi observada entre a inibição da

adesão obtida com o anticorpo monoclonal e o soro pré-imune (Dados não

mostrados).

Figura 6. Bloqueio de C. albicans com anti-His

enolase é capaz de inibir sua adesão a discos

de TGI murino. A: Nº de células por disco x 10

(Estimadas com base no número de UFC)

obtidas após incubação dos discos com C. albicans SC5314 previamente bloqueadas com

anticorpos. O bloqueio das células com 10 ou 20 µg de anti-His

enolase foi capaz de inibir

sua adesão aos discos de maneira significativa (P < 0.001) em relação ao controle negativo

(bloqueio das células com 20 µg de anti-His

339cp). A diferença entre o número de células

por disco obtidas a partir da incubação de C. albicans com anti-His

339cp e o soro pré-imune

(controles negativos) não foi significativa (P >0.05). Os resultados são expressos como

médias de três experimentos independentes realizados em triplicata. As barras representam o

erro padrão (SE) das médias. B: Percentual de inibição da adesão decorrente do bloqueio

com anti-His

enolase em relação ao bloqueio com anti-His

339cp (considerado como 100%).

Alguns autores já reportaram a atividade fungistática de alguns anticorpos

contra C. albicans (Moragues, et al., 2003). Deste modo, seria a diminuição do

número de células por disco decorrente da morte do fungo provocada pelos

anticorpos contra a proteína His

enolase. Para tratar esta questão, C. albicans

SC5314 foi pré-incubada com anti-His

enolase ou com anti-His

339cp, e o número de

células foi posteriormente estimado. Não foi verificada variação significativa (P >0,05)

no número de células a partir da incubação de C. albicans com PBS (controle

negativo) ou com os soros (anti-His

enolase ou anti-His

339cp) (figura 7). Estes

resultados indicam que o bloqueio da enolase expressa na superfície de C. albicans

com anti-soro específico é capaz de inibir sua adesão a discos de tecido

gastrointestinal murino, sugerindo que esta proteína possui um importante papel na

adesão de C. albicans a células do hospedeiro.

Figura 7. Atividade fungicida de anti-His

-enolase contra C. albicans. Comparação do nº de

células obtidas (estimadas com base no número de UFC) após a incubação de C. albicans

com anti-His

enolase, anti-His

339cp e com PBS (controle negativo). Não houve diferença

significativa (P>0.05) entre o nº de células obtidas após a incubação com anti-His

enolase e

anti-His

339cp em relação à incubação das células com PBS. Os resultados são expressos

como médias de três experimentos independentes realizados em triplicata. As barras

representam o erro padrão (SE) das médias.

3.4.4 Pré-incubação de discos de TGI com enolase recombinante inibe a

adesão de C. albicans.

Uma vez que o bloqueio da enolase da superfície de C. albicans foi capaz de

inibir sua adesão ao tecido gastrointestinal (figura 6), partimos do pressuposto de que

o bloqueio de possíveis ligantes da enolase presentes no tecido gastrointestinal

poderia de alguma maneira inibir a adesão de C. albicans. Para verificar esta

possibilidade, discos de tecido gastrointestinal de camundongos obtidos conforme

item 3.2.2.2 foram incubados com diferentes concentrações de His

-enolase. Após a

incubação, os discos foram devidamente lavados para a remoção de proteínas não

aderidas e então incubados com C. albicans, linhagem SC5314. Surpreendentemente

a incubação dos discos com 0,5 mg/mL da proteína His

-enolase foi capaz de inibir a

adesão de C. albicans em 69,8% em relação à incubação com a proteína His

-339cp

utilizada como controle negativo (P< 0.001). A inibição da adesão foi dose

dependente, uma vez que a incubação dos discos com 0,1 e 0,2 mg/mL inibiu a

adesão em 39,52 e 52,58% respectivamente em relação ao controle negativo (P<

0.001). Não houve diferença significativa no número de células a partir da incubação

dos discos com His

-339cp e PBS (P> 0.05) (figura 8).

Figura 8. Inibição da adesão de C. albicans a discos de tecido gastrointestinal murino

previamente incubados com His

-enolase. A: Nº de células por disco (Estimadas com base no

número de UFC) obtidas após incubação de C. albicans com discos previamente incubados

com diferentes proteínas. A incubação prévia dos discos com 0,1; 0,2 e 0,5 mg/ml de His

enolase foi capaz de inibir a adesão de C. albicans de maneira dose dependente e

significativa (P< 0.001) em relação aos discos incubados com 0,5 mg/ml de His

-339cp

(controle negativo). A diferença entre o número de células por disco obtidas a partir da

incubação dos discos com a proteína His

-339cp e PBS (controles negativos) não foi

significativa (P> 0.05). Os resultados são expressos como médias de três experimentos

independentes realizados em triplicata. As barras representam o erro padrão (SE) das

médias. B: Percentual de inibição da adesão obtida com a incubação dos discos com His

enolase em relação aos discos incubados com His

-339cp (considerado como 100%).

A pureza da proteína His

-enolase foi atestada a partir de sua separação

eletroforética e colorações conforme previamente relatado (figura 3). Porém não foi

descartada a possibilidade de que possíveis impurezas (LPS, Imidazol ou outros

possíveis contaminantes) não verificáveis através da coloração com azul de

Coomassie e nitrato de prata, pudessem se associar ao tecido (mesmo após a

lavagem) promovendo a morte de C. albicans, colaborando assim para a diminuição

dose dependente do número de células por disco de tecido gastrointestinal, mesmo

com a utilização de proteínas recombinantes purificadas da mesma maneira. Para

responder a esta questão, diferentes ensaios foram realizados incubando as mesmas

concentrações de C. albicans SC5314 com cada uma das proteínas recombinantes

purificadas de E. coli BL21 (DE3) com a resina de níquel: His

-enolase, His

-339cp e

His

-P21 (Tripanosoma cruzi). Após a incubação, o número de células foi estimado. O

número de células obtidas após a incubação de C. albicans com as três proteínas

recombinantes não foi significativamente diferente em relação ao número de células

obtidas após a incubação com PBS utilizado com controle negativo, (P> 0.05) (figura

9) indicando que a inibição da adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal murino

não foi decorrente de impurezas da proteína recombinante. Fato este corroborado

pela não inibição da adesão a partir da utilização da proteína His

-339cp purificada da

mesma maneira como controle negativo (Figura 8).

100

Figura 9. Avaliação da atividade fungicida da proteína recombinante His

-enolase contra C.

albicans. Comparação entre o nº de células obtidas (estimadas com base no número de UFC)

após a incubação de C. albicans com His

enolase, His

-339cp, His

-P21 (t. cruzi) e PBS

(controle negativo). Não houve diferença significativa (P>0.05) entre o nº de células obtidas

após a incubação com His

-enolase em relação à incubação com as demais proteínas e com

PBS. Os resultados são expressos como médias de três experimentos independentes

realizados em triplicata. As barras representam o erro padrão (SE) das médias.

3.4.5 Ligação de C. albicans a fibronectina e plasminogênio humanos

Proteínas da matriz extracelular desempenham importantes papeis na adesão

de C. albicans aos tecidos epiteliais e endoteliais. C. albicans é capaz de se ligar a

diferentes proteínas da matriz extracelular tais como: fibrinogênio, colágeno, laminina,

fibronectina dentre outros (Silva, et al., 1995). A ligação de fibronectina humana a C.

albicans foi previamente descrita a partir de diferentes experimentos utilizando

diversas linhagens de C. albicans (Chaffin, 1998). Com o objetivo de confirmar o

potencial de ligação de C. albicans a fibronectina e avaliar qualitativamente se esta

capacidade não é uma característica específica de outras linhagens ou de outras

condições experimentais, C. albicans SC5314 foi incubada com diferentes

101

concentrações de fibronectina humana. Posteriormente as células foram lavadas e

hibridadas com anticorpo anti-fibronectina humana (previamente testado figura 10b)

em um ensaio de western blot. Foi possível detectar a ligação de fibronectina a

superfície de C. albicans (~220 kDa) a partir da concentração mínima utilizada (25

pM; figura 11a), porém, mesmo com o aumento progressivo das concentrações de

fibronectina, (50 e 150 pM; figura 11a) não foi possível evidenciar aumento do sinal no

western blot, indicando uma possível saturação da ligação da fibronectina aos seus

receptores em C. albicans sob as condições destes experimentos. Os resultados

confirmam a capacidade de ligação de fibronectina a linhagem SC5314 de C.

albicans.

Pelo menos nove receptores putativos de plasminogênio já foram descritos

para C. albicans, (Crowe, 2003) dentre eles a enolase (Jong, 2003). Sabe-se que

esses receptores putativos desempenham possíveis papeis no mecanismo de invasão

a célula do hospedeiro. Com o objetivo de avaliar qualitativamente a capacidade de

ligação de C. albicans ao plasminogênio humano, sob as condições de crescimento

de C. albicans estabelecidas nesta tese (crescimento a 30ºC até a fase estacionária).

C. albicans SC5314 foi incubada com as mesmas concentrações de plasminogênio

(25, 50 e 150 pM) e sua ligação a C. albicans foi estimada após hibridação com um

anticorpo anti-plasminogênio humano (A especificidade do anticorpo foi previamente

testada, figura 10a). Diferentemente da fibronectina, a ligação de plasminogênio

parece aumentar levemente com o aumento progressivo da concentração da proteína

(~81 kDa) (figura 11b). Não foi observado sinal quando da incubação de C. albicans

apenas com PBS ou com as mesmas concentrações de GST (figura 11c) (controle

negativo). A incubação das membranas com anti-His

enolase foi utilizada como

controle positivo (figura 11d). Além de indicar as quantidades de proteínas que

deveriam ser utilizadas em outros experimentos desta tese, os dados aqui

apresentados confirmam a ligação de plasminogênio a C. albicans SC5314. É

importante ressaltar que os ensaios de ligação de plasminogênio e fibronectina aqui

apresentados são meramente qualitativos e não são passiveis de comparação, uma

vez que os anticorpos reconhecem as proteínas com afinidades distintas. A fim de

garantir que a ligação observada não foi decorrente da lise das células durante a

incubação, amostras de células foram observadas ao microscópio ótico antes e

depois da incubação. Não foi observada a lise de células em nenhuma destas etapas.

102

Figura 10. Western blot das proteínas FN (fibronectina humana de ~220 kDa) e PLG

(plasminogênio humano de ~81 kDa). A: Incubação com anti-plasminogênio e B: Incubação

com anti-fibronectina. O smear reconhecido pelo anticorpo anti-fibronectina é decorrente da

mobilidade da proteína fibronectina (dímero de 440 kDa) em géis SDS-PAGE.

103

Figura 11. Análise qualitativa da ligação de C. albicans a fibronectina e plasminogênio

humanos. Células foram incubadas com as concentrações indicadas das proteínas e então

analisadas por western blot. A: Células incubadas com fibronectina e hibridadas com anti-

fibronectina. B: Células incubadas com plasminogênio e hibridadas com anti-plasminogênio.

C: Células incubadas com GST e hibridadas com anti-GST (controle negativo). D: Células

hibridadas com anti-His

enolase.

104

3.4.6 Ensaios de Ligação da proteína recombinante His

-enolase a

fibronectina e plasminogênio humano por western blot.

Ensaios de ligação por western blot foram realizados com o propósito de

avaliar a interação da enolase recombinante com a fibronectina e o plasminogênio.

Assim, fibronectina e plasminogênio foram aplicados em géis de poliacrilamida (SDS-

PAGE 10%) que foram transferidos para membranas de PVDF. As membranas foram

então incubadas com His

-enolase, lavadas e incubadas com o anticorpo anti-

His

enolase. Não foi observada a ligação da enolase as proteínas fibronectina e

plasminogênio, provavelmente por conta da desnaturação das proteínas, que quando

separadas por SDS-PAGE perdem domínios importantes, responsáveis por sua

capacidade de ligação a outras proteínas. Assim, os ensaios também foram

realizados de maneira inversa. Alíquotas da proteína recombinante His

enolase foram

separadas em géis de poliacrilamida e transferidas para membranas conforme

descrito acima. Em seguida as membranas foram incubadas com fibronectina e

plasminogênio. Após a lavagem, as membranas foram incubadas com os anticorpos

anti-fibronectina e anti-plasminogênio. Mesmo com a utilização de reagentes de

detecção de luminescência extremamente sensíveis como o ECL-Plus (GE

Healthcare), não foi possível detectar a ligação destas proteínas a enolase a partir

desta metodologia (Dados não mostrados).

3.4.7 Co-Imunoprecipitação

A capacidade de enolase da superfície de outros microorganismos em se

associar a fibronectina, (Castaldo, 2009; Donofrio, 2009; Esgleas, 2008) nos levou a

hipótese de que a enolase recombinante poderia estar de alguma forma bloqueando a

fibronectina no TGI murino e contribuindo assim para a inibição da adesão de C.

albicans. Para testar esta hipótese, inicialmente um ensaio de co-imunoprecipitação

foi realizado com objetivo de verificar se a enolase de C. albicans é capaz de se

associar com a fibronectina. O plasminogênio foi utilizado para confirmar os dados

obtidos por (Jong, 2003). Um extrato celular de C. albicans (levedura) foi incubado

com as proteínas de interesse (plasminogênio e fibronectina) e posteriormente com

anticorpos acoplados a beads (protein A sepharose). Ao final da incubação as

suspensões foram lavadas extensivamente em tampão de lise e centrifugadas. O

105

sobrenadante foi removido e os imunocomplexos submetidos à eletroforese em gel de

poliacrilamida e western blot com anticorpos específicos. De modo a garantir que a

co-imunoprecipitação das proteínas humanas com o soro anti-His

enolase era

específica, e não um artefato obtido pelo possível excesso de proteínas ligadas as

beads, um ensaio controle foi realizado a partir da incubação do extrato celular com

beads sem anticorpos. Não foram observadas ligações inespecíficas das proteínas

com as beads conforme mostram as figura 12 e 13,

canaleta 3. O soro obtido de

coelhos anti-His

339cp (anti-soro irrelevante - controle negativo) não foi capaz de

imunoprecipitar nem o plasminogênio nem a fibronectina, indicando a especificidade

dos ensaios (figura 12 e 13, canaleta 2). A figura 12b e 13b mostram a ausência de

reconhecimento a partir da incubação das membranas com anti-His

339cp. A proteína

enolase de C. albicans (~48 kDa) foi imunoprecipitada pelo soro anti-His

enolase,

como já era previsto. As figuras 12 e 13c canaleta 1 mostram ensaios de western blot

originados a partir da incubação da membrana contendo o imunocomplexo com o

próprio anti-soro anti-His

enolase. Os soros anti-His

enolase e anti-His

339cp

reconheceram também de maneira leve as cadeias da imunoglobulina G mesmo com

a utilização de proteína A acopladas a peroxidade na incubação secundária dos

ensaios de western blot. (dados não mostrados). O plasminogênio (~81 kDa) também

foi capaz de co-imunoprecipitar com a enolase, conforme demonstrado no western

blot obtido a partir da incubação da membrana com o anticorpo anti-plasminogênio

(figura 12a canaleta 1). Porém, a fibronectina (~220 kDa) não foi capaz de co-

imunoprecipitar com a enolase, conforme evidenciado na figura 13a canaleta 1, a

incubação da membrana com o anticorpo anti-fibronectina não foi capaz de

reconhecer nenhuma proteína. Assim, a possível interação entre a fibronectina e a

enolase não pôde ser confirmada a partir deste tipo de ensaio. Os resultados aqui

obtidos confirmam a capacidade de ligação da enolase nativa de C. albicans ao

plasminogênio.

106

Figura 12. Co-Imunoprecipitação do plasminogênio e enolase. O extrato celular de C.

albicans foi incubado com plasminogênio e com o 1: anti-His

enolase ou 2: anti-His

339cp

(controle negativo) acoplados a beads (proteína A – Sepharose), 3: Beads não acopladas

também foram incubadas com extrato (controle negativo). Os imunocomplexos foram então

analisados por western blot com: A: anti-plasminogênio, B: anti-His

339cp e C: anti-

His

enolase. As proteínas plasminogênio e enolase foram co-imunoprecipitadas pelo anti-

His

enolase conforme canaleta 1, ensaios A e C.

Figura 13. A proteína fibronectina não é co-Imunoprecipitada com a enolase. O extrato celular

de C. albicans foi incubado com fibronectina e com o 1: anti-His

enolase ou 2: anti-His

339cp

(controle negativo) acoplados a beads (proteína A – Sepharose), 3: Beads não acopladas

também foram incubadas com extrato (controle negativo). Os imunocomplexos foram então

analisados por western blot com. A: anti-fibronectina, B: anti-His

339cp e C: anti-His

enolase.

A proteína fibronectina não foi co-imunoprecipitada pelo anti-His

enolase conforme canaleta

1, ensaios A e C.

107

3.4.8 Ensaios de inibição da adesão ao tecido gastrointestinal a partir do

bloqueio de receptores da superfície de C. albicans.

Mesmo que não evidenciada a ligação de fibronectina a enolase por co-

imunoprecipitação, a hipótese levantada no item 3.4.7, de que a enolase

recombinante poderia estar bloqueando a fibronectina no tecido gastrointestinal

acarretando no bloqueio da adesão observado no item 3.4.4, foi novamente testada.

C. albicans possui diferentes receptores putativos para fibronectina (Chaffin, 1998).

Se o bloqueio destes receptores expressos na superfície de C. albicans com

fibronectina fosse capaz de inibir sua adesão ao tecido gastrointestinal, poderíamos

sugerir o possível envolvimento de algum destes receptores no processo de inibição.

Da mesma maneira, esperava-se que o bloqueio de C. albicans com plasminogênio

inibisse a adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal, uma vez que sua ligação a

enolase nativa foi previamente demonstrada por co-imunoprecipitação. Assim, C.

albicans foi bloqueada por 2 h a 37ºC com 100, 200 e 500 pM de fibronectina ou

plasminogênio. Posteriormente as células bloqueadas foram incubadas com discos de

TGI murino e o número de células por disco foi estimado.

A incubação de células com 100, 200 e 500 pM de fibronectina foi capaz de

inibir a adesão de C. albicans aos discos de TGI de maneira não significativa em torno

de 3,23, 2,72 e 3.45% respectivamente (P >0.05) em relação a incubação das células

com 500 pM de BSA (Bovine serum albumin) (controle negativo) (figura 14). A

inibição obtida a partir da incubação de células com 100, 200 e 500 pM de

plasminogênio embora não significativa (P> 0.05) foi bem maior do que a inibição

obtida a partir da incubação das células com fibronectina. O percentual de inibição em

relação ao bloqueio com BSA foi de 9,80 e 18,51 e 17,60% respectivamente (P

>0.05), sendo que nestes ensaios a inibição parece ter saturado a partir da incubação

das células com 200 pM de proteínas, uma vez que não houve aumento da inibição a

partir da incubação das células com 500 pM de plasminogênio (figura 14).

108

Figura 14. Ensaio de Inibição da adesão ao tecido gastrointestinal a partir do bloqueio de

receptores de fibronectina e plasminogênio. A: Nº de células por disco (Estimadas com base

no número de UFC) obtidas após incubação dos discos com C. albicans SC5314 previamente

incubadas com as concentrações indicadas das proteínas humanas. BSA foi utilizada como

controle negativo. Os resultados são expressos como médias de três experimentos

independentes realizados em triplicata. As barras representam o erro padrão (SE) das

médias. B: Percentual de inibição da adesão decorrente do bloqueio com fibronectina e

plasminogênio em relação ao bloqueio com BSA (considerado como 100%).

109

3.4.9 Inferência filogenética

Com o objetivo inicial de comparar a enolase de C. albicans com a enolase de

outros organismos, sequências de aminoácidos da enolase de alguns representantes

de eubactérias, fungos e de mamíferos, aqui representados pela α enolase de Mus

musculus e H. sapiens foram obtidas no Genbank. Um alinhamento múltiplo foi

realizado com as 23 sequências de aminoácidos obtidas, resultando em um

alinhamento de 468 posições. De maneira geral, as sequências de aminoácidos das

enolases analisadas são bem conservadas (>62% de identidade e >76% de

similaridade). Dentre as sequências analisadas, a enolase de C. dubliniensis possui o

maior percentual de identidade e similaridade (sequência de aminoácidos) em relação

à enolase de C. albicans (97,95% de identidade, 99% de similaridade), seguido pela

enolase de C. tropicalis (90,68 de identidade e 95,68% de similaridade).

A enolase de S. pneumoniae (ACF56025), que possui 48,87% de identidade e 65,54%

de similaridade de aminoácidos em relação à enolase de C. albicans, possui dois sítios de

ligação ao plasminogênio caracterizados, sendo que um deles correponde a uma lisina (K)

localizada na região C-terminal da proteína (Ehinger, 2004). Análises do alinhamento múltiplo

gerado revelaram que a lisina C-terminal está presente em todas as bactérias analisadas, exceto

em E. coli, S. typhimurium e E. hirae. Este sítio também é ausente na enolase de C. albicans

(Figura 16) e de todos os demais eucariotos analisados, exceto em mamíferos (α-enolase de M.

Musculus e H. sapiens). O segundo motivo, constituído de aminoácidos negativamente e

positivamente carregados, flanqueados por resíduos hidrofóbicos (FYDKERKVY) de S.

pneumoniae (Gandhi, 2008), é parcialmente conservado em outras bactérias e eucariotos,

incluindo C. albicans (Figura 16), o que reforça a idéia de que a enolase desses organismos é

capaz de se associar ao plasminogênio. Vale ressaltar que não existem estudos que demonstrem

a participação deste motivo na ligação de plasminogênio em C. albicans e em outros

organismos. A fim de se estabelecer as relações evolutivas entre a enolase desses organismos,

uma árvore filogenética foi inferida pelo programa MrBayes, utilizando o modelo GTR

(General Time reversible) para substituições de aminoácidos com distribuição gama. A

sequência da enolase do milho - Zea May foi utilizada como outgroup. As sequências de

aminoácidos das enolases de fungos e bactérias foram agrupadas em clados distintos. Dentro do

clado dos fungos, a enolase de C. albicans agrupou-se com enolases do gênero candida: C.

dubliniensis e C. tropicalis, com uma probabilidade posterior de 100%. Os dados indicam que a

enolase de C. albicans está mais próxima da enolase de C. dubliniensis. Assim como no

110

gênero Candida, as enolases do gênero Saccharomyces incluídas nesta análise: ENO1 e 2 de S.

cerevisiae, ENO2 C. glabrata e as enolases de K. lactis e K. thermotolerans formaram outro

grupo (pp de 100%). No entanto, a enolase 1 de C. glabrata não se agrupou com as demais

enolases do gênero Saccharomyces, formando um clado distinto. (Figura 15). Diferentemente

das duas enolases de S. cerevisiae que possuem identidade de 95,19% e similaridade de 98,16%

entre si, as duas enolases de C. glabrata são um pouco menos conservadas, com identidade de

71,91% e similaridade de 84,47%. Tais diferenças também são observadas em relação as suas

estruturas secundárias. Um número 23% menor de aminoácidos da ENO1 de C. glabrata estão

envolvidos na formação de alfa-hélice e um número 29% maior de aminoácidos estão

envolvidos na formação de folhas beta em relação a ENO2, esta disparidade também não é

observada entre as Enolases 1 e 2 de S. cerevisiae. Como esperado, as enolases de bactérias

formaram um grupo monofilético (pp de 100%). As enolases de mamíferos ficaram mais

distantemente agrupadas em relação as demais enolases de bactérias e fungos e portanto, foram

utilizadas no enraizamento da árvore (Figura 15). A enolase de C. albicans possui um

considerável percentual de identidade e similaridade (sequência de aminoácidos) em relação à

enolase de M. musculus e H. sapiens (~62% de identidade e 77% de similaridade). No entanto

algumas diferenças foram observadas a partir da comparação da estrutura secundária dessas três

proteínas pelo método de Garnier-Robson (Garnier e Robson, 1989). Diferenças mais

expressivas foram observadas na região N-terminal das enolases (a partir dos resíduos 143),

mais especificamente nas seguintes posições do alinhamento: 141 a 149, 177 a 186, 205 a 220,

259 a 291 (Motivo putativo de ligação ao plasminogênio), 303 a 321 e 435 a 445. Diferenças

mais significativas na porção C-terminal das enolases (resíduos 1 a 134), foram observadas nas

posições 99 a 115 do alinhamento (figura 16). Mesmo assim, estas enzimas possuem

praticamente o mesmo percentual de aminoácidos envolvidos na formação dessas estruturas:

50% dos aminoácidos estão envolvidos na formação de alfa-hélice (

-helice), 35% na

formação de folhas beta (

-sheets) 10% na formação de espiral (Coil-C) e 7% na formação de

giro (Turn-T). Estas diferenças podem ser úteis para o desenvolvimento de novas estratégias

terapêuticas.

111

Figura 15. Árvore filogenética inferida pelo método Bayesiano a partir das sequências de aminoácidos das enolases. Asteriscos: gênero

*Saccharomyces, **Candida. Os números acima dos nós indicam a probabilidade posterior. Nomes das sequências em azul: bactérias, em

vermelho: fungos, em verde: milho - Zea Mays (utilizada como outgroup), em preto: mamíferos. Os números de acesso das sequências no

Genbank

estão entre parênteses.

112

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

CA 1 MSYATKIHARYVYDSRGNPTVEVDFTTDKGLFRSIVPSGASTGVHEALELRDGDKSKWLGKGVLKAVANVNDIIAPALIKAKIDVVDQAKIDEFLLSLDG

MM 1 -MSILRIHAREIFDSRGNPTVEVDLYTAKGLFRAAVPSGASTGIYEALELRDNDKTRFMGKGVSQAVEHINKTIAPALVSKKVNVVEQEKIDKLMIEMDG

HS 1 -MSILKIHAREIFDSRGNPTVEVDLFTSKGLFRAAVPSGASTGIYEALELRDNDKTRYMGKGVSKAVEHINKTIAPALVSKKLNVTEQEKIDKLMIEMDG

Finger print

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

CA 93 TPNKSKLGANAILGVSLAAANAAAAAQGIPLYKHIANISNAKKGKFVLPVPFQNVLNGGSHAGGALAFQEFMIAPTGVSTFSEALRIGSEVYHNLKSLTK

MM 92 TENKSKFGANAILGVSLAVCKAGAVEKGVPLYRHIADLAGNPE--VILPVPAFNVINGGSHAGNKLAMQEFMILPVGASSFREAMRIGAEVYHNLKNVIK

HS 92 TENKSKFGANAILGVSLAVCKAGAVEKGVPLYRHIADLAGNSE--VILPVPAFNVINGGSHAGNKLAMQEFMILPVGAANFREAMRIGAEVYHNLKNVIK

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

CA 187 KKYGQSAGNVGDEGGVAPDIKTPKEALDLIMDAIDKAGYKGKVGIAMDVASSEFYKDGKYDLDFKNPESDPSKWLSGPQLADLYEQLISEYPIVSIEDPF

MM 184 EKYGKDATNVGDEGGFAPNILENKEALELLKTAIAKAGYTDQVVIGMDVAASEFYRSGKYDLDFKSPD-DPSRYITPDQLADLYKSFVQNYPVVSIEDPF

HS 184 EKYGKDATNVGDEGGFAPNILENKEGLELLKTAIGKAGYTDKVVIGMDVAASEFFRSGKYDLDFKSPD-DPSRYISPDQLADLYKSFIKDYPVVSIEDPF

PLG

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

CA 283 AEDDWDAWVHFFERVGDKIQIVGDDLTVTNPTRIKTAIEKKAANALLLKVNQIGTLTESIQAANDSYAAGWGVMVSHRSGETEDTFIADLSVGLRSGQIK

MM 279 DQDDWGAWQKFTASAG--IQVVGDDLTVTNPKRIAKAASEKSCNCLLLKVNQIGSVTESLQACKLAQSNGWGVMVSHRSGETEDTFIADLVVGLCTGQIK

HS 279 DQDDWGAWQKFTASAG--IQVVGDDLTVTNPKRIAKAVNEKSCNCLLLKVNQIGSVTESLQACKLAQANGWGVMVSHRSGETEDTFIADLVVGLCTGQIK

410 420 430

440 450

....|....|....|....|....|....|....|....|....|

CA 383 TGAPARSERLAKLNQILRIEEELGSEAIYAGKDFQKASQL----- Azul: Alfa-Hélice

MM 377 TGAPCRSERLAKYNQILRIEEELGSKAKFAGRSFRNPLAK----- Verde: Folha Beta

HS 377 TGAPCRSERLAKYNQLLRIEEELGSKAKFAGRNFRNPLAK----- Amarelo: Espiral (Coil-C)

Cinza: Giro (Turn-T)

Figura 16. Alinhamento múltiplo e comparação das estruturas secundárias da Enolase de C. albicans (CA) e das enolases-α de M. musculus

(MM) e H. sapiens (HS). Os aminoácidos foram coloridos de acordo com o seu envolvimento na formação das estruturas secundárias: alfa-hélice,

folha beta, Espiral e giro, (cores conforme legenda acima). Os números acima do alinhamento indicam a posição dos aminoácidos no

alinhamento; números em vermelho indicam as posições cujas estruturas secundárias são menos conservadas entre as três espécies.

Aminoácidos sublinhados (Posições 259-265) e as lisinas em vermelho (K) na região C-terminal posição 445, (ausentes em C. albicans) indicam

os motivos putativos de ligação ao plasminogênio conforme Gandhi, (2008). O alinhamento múltiplo foi realizado pelo programa Clustal W. A

estrutura secundária foi predita pelo método de Garnier-Robson e implementada pelo programa Protean (DNAstar).

113

3.5 DISCUSSÃO

A enolase, uma abundante enzima citoplasmática, pode ser considerada uma

proteína multifuncional, uma vez que desempenha outros papeis além de sua função

primordial na via glicolítica (item 3.1.4). Uma variedade de estudos tem

demonstrado a presença desta e de outras enzimas da via glicolítica, que carecem

de sinais clássicos de transporte, na superfície de diferentes tipos celulares. A

localização inesperada dessas enzimas permite sua designação como uma classe

especial de proteínas de superfície cujas funções ainda permanecem desconhecidas

(Pancholi e Chhatwal, 2003). A enolase de C. albicans também pode ser encontrada

na superfície celular, mais especificamente na parede (Eroles, et al., 1997). No

entanto, sua exata localização nesta estrutura ainda é discutida, sendo que sua

presença em associação a glucanas nas porções mais internas da parede celular já

foi relatada (Angiolella, 1996). Sua localização na parede celular nas fases de

levedura e hifa de C. albicans também foi confirmada por nosso grupo, a partir de

experimentos de microscopia confocal e citometria de fluxo (Padovan, 2008).

Embora a função da enolase da superfície como um possível receptor de

plasminogênio tenha sido demonstrada (Pancholi, 2001), pouco se conhece sobre

os possíveis papeis que esta proteína desempenha na superfície celular de C.

albicans e de outros organismos. Como comensal e patógeno, C. albicans evoluiu

para persistir na superfície da mucosa do hospedeiro normal e invadi-lo em

situações de imunodeficiência. Sua presença no hospedeiro é mediada por

moléculas presentes em sua parede celular. Desta maneira é apropriado supor que

uma das possíveis funções da enolase na superfície seria mediar à adesão de C.

albicans a mucosa do hospedeiro. A interação entre este organismo e o hospedeiro

pode ser avaliada por diferentes metodologias in vitro. Dentre os diferentes métodos

disponíveis, optamos por empregar aquele que avalia a adesão de C. albicans a

discos de tecido gastrointestinal (TGI) murino (intestino delgado) in vitro (Segal e

Savage, 1986), por acreditar que estes mimetizam de maneira mais real a

complexidade da mucosa colonizada por C. albicans e mantém algumas

propriedades que são eliminadas quando da utilização de monoculturas de células.

Além do mais, pouco se conhece sobre os mecanismos envolvidos na adesão de C.

albicans a mucosa gastrointestinal. Inicialmente, os ensaios de adesão foram

realizados com duas linhagens diferentes de C. albicans, para avaliar se as mesmas

114

diferem quanto as suas capacidades de adesão a discos de TGI murino. A linhagem

L757 é considerada possivelmente menos patogênica do que a linhagem SC5314

em decorrência de sua menor capacidade de formar hifas e produzir biofilme

(Padovan et al, 2009). Entretanto essas duas linhagens parecem não diferir quanto

as suas habilidades de adesão in vitro, uma vez que o número de células por disco

de TGI obtidas após a incubação com essas linhagens não diferiu significativamente

(Figura 3). Segal e Savage (1986) também não constataram diferenças na

capacidade de adesão a discos de TGI entre as distintas linhagens 4918, 4918-10

(resistente a cerulenina – inibidor da síntese de lipídeos) e CBS562 de C. albicans.

Da mesma forma, não foram observadas diferenças entre a capacidade de adesão

de C. albicans a partir da utilização de intestino provenientes de camundongos das

linhagens Balb/c, C57BL/6 e DBA (Segal e Savage, 1986). Desta maneira,

decidimos utilizar a linhagem SC5314 que teve o seu genoma seqüenciado (Jones,

et al., 2004) e camundongos isogênicos Balb/c em todos os ensaios de adesão

posteriores.

A adesão de C. albicans aos discos de TGI não parece ser mediada pela hifa,

uma vez que não foi constatada sua presença a partir da análise microscópica de

diferentes alíquotas coletadas após a incubação das células (linhagens SC5314 e

L757) com os discos (Dados não mostrados).

A inibição da adesão de C. albicans a superfícies do hospedeiro é uma das

atividades mais bem documentadas mediadas por anticorpos, e diferentes graus de

inibição a partir da utilização de diferentes anticorpos contra diferentes antígenos da

parede celular de C. albicans já foram descritos (Bavoil, et al., 2008; Bendel, 1993;

Cotter, et al., 1998). Assim, a capacidade da enolase em mediar à adesão a discos

de TGI foi avaliada. O bloqueio da enolase da superfície de C. albicans na fase de

levedura com anti-His

enolase purificado por imunoafinidade foi capaz de inibir

consideravelmente sua adesão a discos de TGI murino, sendo que a inibição da

adesão foi saturada a partir da utilização de 20 µg de anti-His

enolase (figura 4), o

que corrobora o fato de que múltiplas adesinas da superfície celular de C. albicans

medeiam à adesão ao hospedeiro. A hipótese de que a enolase presente na

superfície celular poderia estar envolvida na adesão a células do hospedeiro

também foi levantada por outros grupos. O bloqueio da enolase da parede celular de

P. brasiliensis com anticorpos específicos foi capaz de inibir significativamente sua

115

adesão a células epiteliais pulmonares (Donofrio, 2009), ainda, anticorpos contra a

enolase da superfície de Streptococcus Suis foram capazes de inibir sua adesão a

células endoteliais (Esgleas, 2008). Já foi previamente reportado que alguns

anticorpos podem exercer atividades anti-C. albicans in vitro (morte direta do fungo

após contato com o anticorpo) (Moragues, et al., 2003; Polonelli, 1997). Para garantir

que a inibição da adesão observada era decorrente do bloqueio da enolase e não da

morte do fungo ocasionada pelo possível reconhecimento inespecífico de algum

epitopo pelo anti-soro policlonal, células foram incubadas com o anticorpo anti-

His

enolase. Não foram observadas diferenças no número de células obtidas neste

ensaio em relação ao número de células obtidas após a incubação das células com

PBS ou anticorpos irrelevantes (figura 5). Estes dados mostram que a enolase da

superfície de C. albicans medeia a adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal

de camundongos in vitro.

A participação de adesinas putativas na adesão de microorganismos ao

hospedeiro também pode ser avaliada a partir do bloqueio dos ligantes do

hospedeiro com adesinas purificadas ou com lisados celulares (Calderone e Gow,

2002). A incubação de discos de TGI murino com quitina (açúcar componente da

parede celular) comercial ou obtida de extratos de C. albicans, por Segal e Savage

(1986) foi capaz de inibir significativamente a adesão de C. albicans ao tecido.

(Segal e Savage, 1986). Desta maneira, passamos a nos questionar se o bloqueio

de possíveis ligantes da enolase no tecido intestinal também seria capaz de inibir a

adesão de C. albicans. Para este fim uma grande quantidade de His

-enolase foi

expressa em E. coli e purificada. Surpreendentemente, a incubação dos discos de

TGI murino com a proteína recombinante foi capaz de inibir a adesão de C. albicans

de maneira dose dependente, em aproximadamente 70% (figura 6). Experimentos

realizados a partir da incubação de C. albicans com diferentes proteínas

recombinantes expressas em E. coli e purificadas sob as mesmas condições indicam

que os resultados obtidos não são decorrentes da morte do fungo ocasionada por

possíveis contaminantes presentes na proteína His

-enolase (figura 7). Estes dados

indicam que receptores presentes no tecido gastrointestinal, importantes para a

adesão de C. albicans, foram bloqueados pela enolase recombinante, inibindo sua

adesão, confirmando os dados obtidos com a inibição da enolase de superfície a

partir do bloqueio com anticorpos (figura 4). Assim, é possível sugerir que a enolase

116

de C. albicans, secretada para a superfície por mecanismos ainda desconhecidos,

esteja envolvida na adesão, possivelmente contribuindo para a persistência de C.

albicans no tecido gastrointestinal. A capacidade da enolase de C. albicans em

mediar à adesão a superfície do hospedeiro poderia também explicar alguns

resultados obtidos por nosso grupo. Previamente, a enolase foi identificada, por

espectrometria de massa, como sendo uma das proteínas majoritárias da matriz do

biofilme de C. albicans (Padovan, 2008). Porém, o papel que esta proteína estaria

desempenhando na matriz do biofilme ainda permanece desconhecido. Uma vez

que a etapa de adesão a superfície é importante para a formação do biofilme

(Kumamoto e Vinces, 2005), podemos supor que a enolase esteja presente no

biofilme como um dos componentes capazes de promover sua adesão ao substrato.

Contudo, novos experimentos para avaliar a capacidade de adesão da enolase a

outras superfícies são necessários para testar esta hipótese.

Como previamente relatado (item 3.1.4 da introdução), a enolase de

diferentes células e microorganismos é capaz de se ligar ao plasminogênio,

desempenhando um possível papel de receptor. Postula-se que o plasminogênio

presente na superfície de células eucarióticas e de microorganismos seja ativado em

plasmina. A ativação do plasminogênio em células eucarióticas pode estar envolvida

no recrutamento de monócitos para sítios de inflamação e na invasão de tecidos por

células cancerosas. Além disso, a concentração da enolase da superfície de

monócitos é aumentada quando as células são estimuladas com LPS (recrutamento

para o sítio de inflamação), provavelmente para favorecer sua ligação ao

plasminogênio e conseqüente direcionamento para o local da inflamação (Wygrecka,

2009). Não sabemos se a concentração da enolase nas superfícies de C. albicans

ou outros microorganismos é aumentada em decorrência de modificações

ambientais, principalmente no contato com células e moléculas do hospedeiro. Em

microorganismos a ativação do plasminogênio pode favorecer a invasão dos tecidos

do hospedeiro (Liu e Shih, 2007; Plow e Das, 2009; Plow, et al., 1995). Sabe-se que

C. albicans é capaz de se ligar ao plasminogênio, sendo que esta habilidade foi aqui

confirmada a partir de experimentos de western blot (figura 9). Inicialmente, Crowe et

al (2003) não foram capazes de identificar a enolase de C. albicans em

experimentos de proteômica e ensaios de ligação ao plasminogênio por western

blot. (Crowe, 2003). Porém a enolase recombinante (His

-enolase) de C. albicans

117

expressa em E. coli por Jong et al (2003), foi capaz de se ligar ao plasminogênio de

maneira lisina dependente (característica de receptores de plasminogênio) em

experimentos utilizando colunas de afinidade. Resultados obtidos por este mesmo

grupo indicam que a ligação de plasminogênio a enolase da superfície de C.

albicans esteja envolvida na invasão de células endoteliais cerebrais (Jong, 2003).

Os dados aqui obtidos a partir da co-imunoprecipitação da enolase de um lisado

celular de C. albicans previamente incubado com plasminogênio humano

corroboram os dados de Jong et al (2003) (figura 10) e sugerem que a enolase da

superfície de C. albicans seja realmente um possível receptor de plasminogênio.

Não fomos capazes de confirmar a co-imunoprecipitação do plasminogênio com a

proteína recombinante (His

-enolase) por problemas de ligações inespecíficas de

plasminogênio as beads (Dados não mostrados). No entanto, existe a possibilidade

de que a enolase recombinante expressa em E. coli por nosso grupo possua

atividade enzimática, uma vez que a atividade enzimática da enolase recombinante

expressa em E. coli foi demonstrada pelo grupo de Jong et al (2003). A enolase de

Streptococcus pyogenes mantém sua atividade enzimática quando é secretada para

a superfície da célula (Pancholi e Fischeti, 1998), porém não sabemos se o mesmo

ocorre com a enolase secretada para a parede de C. albicans. Assim, estudos

posteriores deverão ser feitos para responder a estas perguntas. O fato de também

não termos obtido sucesso em ensaios de ligação por western blot com

plasminogênio e enolase (Dados não mostrados) pode explicar a ausência da

identificação da enolase nos experimentos realizados por Crowe et al (2003).

O plasminogênio é encontrado em abundância no plasma e em fluidos

extracelulares (Malke, 1994), e, portanto não esperaríamos que o mesmo estivesse

mediando à adesão a partir da ligação com a enolase da superfície. Assim,

resolvemos aproveitar a capacidade de interação entre enolase e plasminogênio

para melhor estabelecer a participação da enolase na inibição da adesão de C.

albicans a discos de TGI murino observada em nossos experimentos (figuras 4 e 6).

A incubação de C. albicans com diferentes concentrações de plasminogênio humano

inibiu a adesão de C. albicans a discos de TGI em torno de ~18 %, sendo que a

inibição foi saturada a partir da incubação com 200 pM de plasminogênio (figura 12).

Como não existem estudos que quantificam a afinidade de ligação entre a enolase

de C. albicans e o plasminogênio, não podemos afirmar que o percentual de inibição

118

observado, mesmo que estatisticamente não significativo (P> 0.05) foi baixo. Estes

resultados podem ainda ter sido decorrentes das condições experimentais aqui

estabelecidas (tempo e temperatura de incubação e condições de crescimento de C.

albicans dentre outros). Portanto estes dados reforçam a idéia de que a enolase

esteja realmente mediando à adesão aos discos de tecido GI in vitro. Como C.

albicans possui diferentes receptores putativos para plasminogênio, não podemos

também descartar a idéia de que a inibição observada nestes ensaios não seja

decorrente do bloqueio de outros receptores pelo plasminogênio.

Assim, passamos a focar na detecção de possíveis ligante(s) da enolase de

C. albicans presentes no disco de TGI murino. A matriz extracelular (MEC) é uma

estrutura macromolecular estável encontrada na membrana basal e interstício de

células epiteliais e endoteliais (Westerlund e Korhonen, 1993). Mais

especificamente, a fibronectina é encontrada no interstício e na membrana basal de

células epiteliais (Liakka e Autioharmainen, 1992; Stenman, 1978). Alguns estudos

também demonstram a expressão de fibronectina na superfície de células epiteliais

(Kalo, et al., 1988; Skerl, et al., 1984). Muitas das proteínas que constituem a MEC

podem potencialmente servir como receptores de superfície para microorganismos.

As enolases do fungo P. brasiliensis (Donofrio, 2009) e das bactérias S. suis

(Esgleas, 2008) e Lactobacillus plantarum (Castaldo, 2009) são capazes de se ligar

a fibronectina in vitro. Embora não existam relatos na literatura que demonstrem a

capacidade de associação de C. albicans ao intestino a partir de interações com

constituintes da MEC, levantamos a hipótese de que a enolase de C. albicans

poderia ter se associado à fibronectina presente na MEC do tecido, expressa por

alguma célula epitelial (Kalo, et al., 1988; Skerl, et al., 1984) ou ainda expostas a

partir da preparação dos discos, e desta maneira inibido a adesão ao TGI. Sabe-se

que C. albicans é capaz de se ligar a vários domínios da molécula de fibronectina

(Skerl, et al., 1984), incluindo o domínio RGD (arginina-glicina-ácido aspártico) que

pode ser reconhecido por vários receptores da superfície celular da família das

integrinas (Fujita, 1995). O número exato de receptores de fibronectina em C.

albicans ainda é discutido, no entanto algumas estimativas apontam que a ligação

de fibronectina a C. albicans seja saturada a partir de 8.000 sítios por célula (Klotz e

Smith, 1991), outros estudos apontam para aproximadamente 5.000 sítios de ligação

de alta afinidade e aproximadamente 30.000 sítios de baixa afinidade por célula

119

(Negre, 1994). A partir de ensaios de western blot, confirmamos a ligação da

linhagem SC5314 a fibronectina humana (figura 9). Para avaliar a capacidade de

associação da enolase de C. albicans a fibronectina humana in vitro, o anticorpo

anti-His

enolase foi utilizado para co-imunoprecipitar a fibronectina previamente

incubada com um lisado celular de C. albicans. Em contraste aos resultados obtidos

com o plasminogênio humano (figura 10), a fibronectina não foi co-imunoprecipitada

com a enolase (figura 11). A fibronectina também não foi capaz de se ligar a enolase

(nem vice e versa) em experimentos de ligação por western blot (Dados não

mostrados). Estes resultados podem ter sido decorrentes da incapacidade de ligação

da enolase a fibronectina in vitro nas condições experimentais estabelecidas (tempo

e temperatura de incubação, buffer de lise, anticorpos dentre outros) e não indicam

que a enolase não esteja se associando com a fibronectina presente no intestino.

Desta maneira, se a fibronectina estivesse de alguma forma envolvida na inibição da

adesão a discos de TGI, esperaríamos que o bloqueio de seus receptores na

superfície de C. albicans tivesse algum efeito na inibição da adesão. Contudo, após

a incubação de C. albicans com diferentes concentrações de fibronectina humana,

foi constatado um percentual de inibição não significativo em torno de 3% em todas

as concentrações de fibronectina utilizadas (figura 12). Estes resultados podem ser

explicados de três maneiras: 1- A quantidade de fibronectina utilizada não foi

suficiente para bloquear os receptores de C. albicans. 2- A fibronectina pode ter se

ligado com pouca afinidade a C. albicans sob as condições experimentais aqui

estabelecidas. 3- Receptores de ligação a fibronectina podem não estar envolvidos

na inibição da adesão, sendo que a pequena inibição observada, embora não

significativa, pode ter sido decorrente da ligação inespecífica da fibronectina a algum

receptor necessário para a adesão ao intestino. Uma vez que não foi constatado

aumento da adesão a partir da utilização de concentrações mais altas da proteína

(500 pM), acreditamos que de fato a fibronectina não esteja envolvida na inibição da

adesão de C. albicans ao intestino. Estes dados são corroborados pela não ligação

da enolase a fibronectina in vitro (figura 11). Pode ser que a capacidade de ligação a

fibronectina seja característica específica da enolase de alguns organismos e não da

enolase de C. albicans, entretanto, novos estudos são necessários para confirmar

estas possibilidades.

O crescimento de C. albicans em meio contendo hemoglobina

é capaz de ativar a capacidade de ligação a fibronectina por C. albicans (Yan, et al.,

120

1998). Todos os nossos ensaios de adesão foram realizados sob condições de

crescimento padrão, mesmo assim, a realização de experimentos sob tais condições

poderia trazer novas informações a cerca destas questões.

A mucosa intestinal é formada por uma camada epitelial arranjada em colunas

individuais (Hecht, 1999; Scott e Hancock, 2000) composta por duas frações de

muco, uma aderida às células epiteliais (glicocálice) e outra fração que forma uma

camada mais espessa e é facilmente removida por sucção (Atuma, 2001). Cada

disco de TGI murino utilizado nos experimentos de adesão possui cerca de seis

milímetros de diâmetro, com uma espessura média de aproximadamente quarenta

micrômetros (Adjei, 1996). Conforme descrito na introdução (item 3.1.1), C. albicans

é capaz de se associar ao intestino por adesão direta ao epitélio ou ao muco. A

partir deste cenário, é possível supor que a enolase recombinante esteja se

associando preferencialmente a porção luminal do intestino (epitélio e muco), uma

vez que esta região possui uma área ~40 vezes maior do que o lado. Porém a exata

localização de associação da C. albicans e da enolase recombinante nos discos só

poderá ser estabelecida em experimentos futuros de imunohistoquímica.

A enolase recombinante de Streptococcus suis - sorotipo dois (His

-enolase)

também produzida em E. coli, foi capaz de inibir a adesão deste organismo a

monoculturas de células epiteliais (Zhang, et al., 2008). Estes dados sugerem que a

enolase recombinante de C. albicans poderia possivelmente ter aderido diretamente

a receptores específicos expressos nas células epiteliais do tecido GI e inibido a

adesão, uma vez que enolases são bastante conservadas entre diferentes

organismos (Tracy e Hedges, 2000). Experimentos com células epiteliais serão

realizados no futuro a fim de testar esta hipótese. Yancey et al, (1987) mostraram

que no preparo de amostras de intestino murino para microscopia, a fração mais

espessa de muco é removida (Kennedy, et al., 1987). Embora nossos discos não

sejam fixados, acreditamos que as lavagens com PBS realizadas durante o preparo

dos discos (item 3.3.2.2 – Materiais e métodos) sejam capazes de remover a

camada mais espessa de muco. Desta maneira, é possível especular que a enolase

recombinante poderia ter se ligado a glicoproteínas expressas na superfície do

epitélio e desta maneira inibido a adesão de C. albicans. Essa especulação é

corroborada pelo fato de que a enolase de Streptococcus mutans é capaz de se

associar a uma mucina salivar normalmente presente na mucosa oral in vitro (Ge,

121

2004). Ensaios de ligação de enolase de C. albicans a mucinas intestinais também

poderiam ser úteis para encontrar os possíveis ligantes da enolase expressos no

tecido gastrointestinal. Assim, novos estudos são necessários para a caracterização

do(s) ligante(s) da enolase presentes no TGI.

A adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal é essencial para a

permanência do organismo no hospedeiro, e subseqüente invasão da corrente

sanguínea e/ ou tecidos. Assim, a caracterização de novas adesinas pode ser

essencial para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas (Senet, 1998).

Desta maneira é de extrema importância estabelecer as relações filogenéticas entre

as enolases de diferentes espécies do gênero Candida e Saccharomyces e a

enolase do hospedeiro. A enolase é uma proteína bastante conservada em

arqueobactérias, eubactérias e eucariotos (Brown, 1998). Os vertebrados possuem

três isozimas (α-enolase, β-enolase e γ-enolase) (Oliva, 1989), sendo que apenas a

α-enolase é encontrada em microorganismos. Em C. albicans a enolase é codificada

por um único gene. Já em S. cerevisiae, a enolase é codificada por dois genes

(ENO1 e ENO2) que são diferencialmente regulados dependendo da fonte de

carbono e da fase de crescimento da levedura, sendo que somente a deleção dos

alelos de ENO2 é letal (Mcalister e Holland, 1982). A enolase de C. glabrata também

é codificada por dois genes, porém não existem informações na literatura a cerca de

sua expressão diferencial. A filogenia realizada pelo método bayesiano mostrou o

agrupamento das enolases (sequência de aminoácidos) de fungos, bactérias e

humanos em clados separados com probabilidade posterior de 100%, atestando

desta maneira a congruência da inferência (figura 13). As relações filogenéticas

encontradas em nossas análises estão de acordo com a de outras inferências

realizadas a partir de sequências de aminoácidos por métodos de distancia

(Neighbor-Joining) (Tracy e Hedges, 2000) e máxima verossimilhança (Maximum

likelihood) (Hannaert, 2000). A enolase de C. albicans formou um grupo monofilético

com outras enolases do gênero candida, estando mais relacionada com a enolase

de C. dubliniensis. As enolases do gênero Saccharomyces, incluindo as duas

proteínas de S. cerevisiae, formaram outro grupo separado como esperado. Porém,

uma das duas enolases de C. glabrata (ENO1) não foi agrupada com as enolases do

gênero Saccharomyces como seria esperado, ficando separada (figura 13). Esta

proteína pode ter evoluído para desempenhar funções específicas em C. glabrata.

122

Assim, a análise filogenética mostra que as enolases dos fungos de importância

clínica são bastante conservadas e estão filogeneticamente mais distantes em

relação à α-enolase do hospedeiro.

O aumento da incidência de candidemia e as altas taxas de mortalidade

associadas às infecções causadas por C. albicans e por outras espécies de Candida

indicam que o desenvolvimento de uma vacina é extremamente necessário. A

maioria dos esforços para o desenvolvimento de vacinas anti-C. albicans têm se

voltado para a adesina ALS1 (Agglutination-like sequence), (Ibrahim, 2006). No

entanto, resultados modestos vêm sendo obtidos com esta proteína em vacinações

experimentais de camundongos. Para ser um bom alvo para o desenvolvimento de

vacinas, uma resposta contra a enolase de C. albicans não deveria ser capaz de

reconhecer a enolase do hospedeiro. A enolase de C. albicans possui considerável

identidade e similaridade de aminoácidos em relação à α-enolase humana (62 e

72% respectivamente), porém, algumas diferenças em relação à estrutura

secundária de ambas as proteínas foram observadas (figura 14). Estes dados em

conjunto com outros experimentos para avaliação de possíveis reações cruzadas

com proteínas humanas podem ser úteis para a utilização da enolase como alvo

para o desenvolvimento de vacinas, uma vez que a enolase de C. albicans está

possivelmente envolvida na adesão as células do hospedeiro, é altamente

imunogênica, e anticorpos anti-enolase podem ser detectados em soros de

pacientes com candidemia (Gutierrez, 1993).

123

3.6 CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos neste trabalho podemos concluir que a enolase

da superfície pode estar envolvida na adesão de C. albicans ao hospedeiro,

podendo ser estabelecida como um possível fator de virulência.

Mais especificamente concluímos que:

1- As linhagens SC5314 e L757 não diferem quanto as suas capacidades de adesão

a discos de tecido gastrointestinal (TGI) murino.

2- O plasminogênio, mas não a fibronectina, é co-imunoprecipitado com a enolase

de extratos celulares de C. albicans, confirmando assim sua capacidade de ligação

ao plasminogênio humano.

3- O bloqueio da enolase da parede celular com anticorpos específicos inibe a

adesão de C. albicans a discos de TGI murino.

4- O pré-tratamento de discos de TGI murino com enolase recombinante inibe

significativamente a adesão de C. albicans.

5- O bloqueio da enolase da parede celular com plasminogênio inibe parcialmente a

adesão de C. albicans a discos de TGI murino, corroborando a participação da

enolase na adesão.

6- O bloqueio de receptores de fibronectina em C. albicans não foi capaz de inibir

sua adesão a discos de TGI murino, sugerindo que a inibição observada nos demais

experimentos de adesão não é decorrente da ligação da enolase a fibronectina.

7- A enolase de C. albicans poderia ser utilizada no desenvolvimento de vacinas ou

estratégias de controles a partir do bloqueio de sua adesão ao intestino, com o

intuito de prevenir sua proliferação em pacientes imunocomprometidos.

124

3.7 PERSPECTIVAS FUTURAS

1. Realizar ensaios de imunohistoquímica com o objetivo de avaliar o sítio de

ligação da enolase e da C. albicans nos discos de tecido gastrointestinal.

2. Identificar o ligante da enolase no disco de tecido gastrointestinal.

3. Verificar se a enolase mantém sua atividade enzimática na superfície de C.

albicans.

4. Avaliar o envolvimento da enolase na adesão de C. albicans a células

epiteliais e endoteliais humanas e a outras superfícies.

5. Avaliar a capacidade protetora da enolase contra infecções por C. albicans a

partir da imunização de camundongos.

125

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