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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA
GAMETOGÊNESE EM ZEBRAFISH (Danio rerio) KNOCKOUT
PARA O GENE DE REPARO DE DNA mlh1.
Belo Horizonte – MG
2007
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2
MARCELO DE CASTRO LEAL
GAMETOGÊNESE EM ZEBRAFISH (Danio rerio) KNOCKOUT
PARA O GENE DE REPARO DE DNA mlh1.
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Biologia Celular
da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito
parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências
(Biologia Celular).
Belo Horizonte
Instituto de Ciências Biológicas – UFMG
2007
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3
Esta tese foi realizada no Laboratório de Biologia Celular do Departamento de
Morfologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG e no Laboratório de
Endocrinologia do Departamento de Biologia da Universidade de Utrecht – Holanda,
sob as orientações do Prof. Dr. Luiz Renato de França e do Prof. Dr. Rüdiger W.
Schulz, e com o auxílio das seguintes instituições:
- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES);
- Universidade de Utrecht – Holanda.
4
Ao meu querido avô
Lúcio Fonseca de
Castro, que serviu
como exemplo de
conduta ética
durante a vida e pela
grande amizade, à
Perseverança e à
Determinação, sem
as quais jamais teria
alcançado este
objetivo, dedico este
trabalho.
5
AGRADEÇO
Ao Prof. Dr. Luiz Renato de França, por ter sido responsável por minha formação
científica, pela contagiante paixão pela ciência e pela verdadeira amizade.
Ao Prof. Dr. Rüdiger W. Schulz, pelos valiosos ensinamentos, pela amizade e por ter
me aturado durante mais de dois anos em seu laboratório. Valeu Prof. Antena.
Ao Prof. Dr. Jan Bogerd, pelos momentos de descontração e pela amizade.
Ao Prof. Dr. Dirk G. de Rooij, pelas sábias dicas durante o desenvolvimento do meu
projeto.
À minha querida Ana Viveiros e seus filhos Amanda e Felipe por me receberem tão
bem como novo membro da família.
À coordenadora da Pós-Graduação em Biologia Celular da UFMG, Prof. Dra.
Annamaria Ravara Vago e à ex-coordenadora, Prof. Dra. Walderez Ornelas Dutra,
pelo apoio administrativo e amizade durante o desenvolvimento da pesquisa que
originou a presente tese.
Ao Corpo Docente da Pós-Graduação em Biologia Celular da UFMG, pelos importantes
ensinamentos.
À Secretária do Curso de Pós-Graduação em Biologia Celular, Iraídes, pela amizade e
importante colaboração.
A todos os colegas e amigos do laboratório de Biologia Celular.
Aos meus colegas de Pós-Graduação em Biologia Celular da UFMG e do Grupo de
Endocrinologia e Metabolismo da Universidade de Utrecht – Holanda.
MUITO OBRIGADO!!!!!
6
SUMÁRIO
1. Introdução e Revisão de Literatura.................................................................12
Peixes Teleósteos.......................................................................................................12
Zebrafish (Danio rerio).............................................................................................12
Estrutura Testicular e Espermatogênese em Teleósteos............................................15
Regulação Hormonal da Espermatogênese em Teleósteos.......................................17
Células de Sertoli e Desenvolvimento Testicular em Teleósteos..............................18
Espermatogônias em Teleósteos................................................................................20
Meiose e Genes de Reparo de DNA..........................................................................23
Geração de Animais Knockout para o Gene de Reparo de DNA mlh1.....................26
2. Objetivos.............................................................................................................29
2.1. Objetivo Geral..................................................................................................29
2.2. Objetivos Específicos.........................................................................................29
3. Artigo 1. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and
Aneuploid as Well as Triploid Progenie in Females – Feitsma et al., 2007……31
4. Artigo 2. Meiosis can be completed in male zebrafish (Danio rerio) lacking
the mismatch repair gene mlh1 – Leal et al., 2007……………………….….41
5. Discussão..............................................................................................................64
6. Conclusão.............................................................................................................69
7. Referências Bibliográficas...................................................................................71
7
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Zebrafish (Danio rerio). Fonte: ZFIN e Oregon Zebrafish
Laboratories....................................................................................................................13
FIGURA 2. Esquema ilustrando o processo espermatogênico em peixes
teleósteos.........................................................................................................................16
FIGURA 3. Esta figura mostra a distribuição das principais vias e fatores envolvidos
na auto-renovação e diferenciação das espermatogônias tronco nos
peixes...............................................................................................................................22
FIGURA 4. Esta figura mostra o procedimento utilizado para a geração de animais
mutantes para o gene de reparo de DNA mlh1................................................................27
8
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AMH = hormônio anti-Mülleriano
BrdU = 5-bromo-2-deoxyuridina
DHP = 17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one (progestina)
DNA = ácido desoxirribonucleico
E2 = estradiol-17β
FSH = hormônio folículo-estimulante
GDNF = fator neurotrófico derivado de células da linhagem glial
GDSF = fator de crescimento derivado do soma
IGF-I = fator de crescimento semelhante à insulina do tipo I
IGF-Ir = receptor para fator de crescimento semelhante à insulina do tipo I
LH = hormônio luteinizante
mlh1 = gene homólogo de MutL 1 (em zebrafish)
Mlh1 = proteína homóloga de MutL 1 (em zebrafish)
Mlh3 = proteína homóloga de MutL 3 (em zebrafish)
MMR = mismatch repair
msh2 = gene homólogo de MutS 2 (em zebrafish)
msh4 = gene homólogo de MutS 4 (em zebrafish)
msh5 = gene homólogo de MutS 5 (em zebrafish)
msh6 = gene homólogo de MutS 6 (em zebrafish)
mutSγ = complexo heterodimérico formado por MutS 4 e MutS 5
11-KT = 11-cetotestosterona
PD-ECGF = fator de crescimento de célula endotelial derivado de plaqueta
qPCR = reação em cadeia de polimerase quantitativa
9
RNA = ácido ribonucleico
RPA = proteína de replicação A
SPGA = espermatogônia do tipo A
SNP = polimorfismo de único nucleotídeo
SPGB = espermatogônia do tipo B
SYCP1 = proteína do complexo sinaptonêmico 1
T = testosterona
10
RESUMO
O mlh1 é um gene membro da maquinaria de reparo (MMR) do DNA, sendo também
essencial para a estabilização de crossing-overs durante a primeira divisão meiótica.
Recentemente, mostramos que machos de zebrafish mutantes para o gene mlh1 são
completamente inférteis devido ao bloqueio em metáfase I, enquanto as fêmeas são
férteis, mas originam progênie aneuplóide. Posteriormente, estudamos a fertilidade de
machos com background mais “limpo” após dois cruzamentos com uma das linhagens
parentais (TL) dos primeiros mutantes (AB/TL). Nestes machos, nós observamos, pela
primeira vez em vertebrados, que mutantes para mlh1 eram capazes de fertilizar
pequeno número de ovócitos (aproximadamente 0,4%) de fêmeas wild-type. O exame
histológico do testículo revelou que todos os estágios (cistos) espermatogênicos
anteriores a espermátides (espermatogônias, espermatócitos primários e espermatócitos
secundários) estavam significativamente aumentados nos mutantes, enquanto a fração
representada pelas espermátides e espermatozóides estava altamente reduzida (1,8 mg
nos wild-types vs. 0,1 mg nos mutantes). Esta é uma clara diferença em relação a
machos em background AB/TL, nos quais espermatócitos secundários e células pós-
meióticas estavam ausentes. Isto indica que nestes machos (background TL) existe um
“atraso” em ambas as divisões meióticas ao invés de completo bloqueio durante a
primeira divisão meiótica. Ovócitos fertilizados com espermatozóides destes mutantes
desenvolveram-se em embriões mal-formados e aneuplóidicos, o que faz deste fenótipo
masculino muito mais semelhante ao que foi previamente descrito para fêmeas
mutantes. Esta observação indica que crossing-overs são essenciais para o processo
meiótico, mas que aparentemente divisões meióticas podem ocorrer sem os mesmos,
sugerindo que estes mutantes (background TL) poderão representar um modelo
experimental bastante adequado para se estudar mecanismos celulares responsáveis
pelas divisões meióticas sem a estabilização através de crossing-overs.
Palavras-chave: enzima de reparo de DNA Mlh1; testículo; espermatogênese,
fertilidade masculina; aneuploidia
11
ABSTRACT
Mlh1 is a member of DNA mismatch repair (MMR) machinery and is also essential for
stabilization of crossovers during the first meiotic division. Recently, we showed that
zebrafish mlh1 mutant males are completely infertile due to a block in metaphase I,
while females are fertile but have aneuploid progeny. When studying fertility in males
in a twofold more inbred background however, we observed low numbers of fertilized
eggs (approximately 0.4%). Histological examination of the testis revealed that all
spermatogenic stages prior to spermatids (spermatogonia, primary spermatocytes and
secondary spermatocytes) were significantly increased in the mutant while the total
weight of spermatids and spermatozoa were highly decreased (1.8 mg in wild-type vs.
0.1 mg in mutants). This is clearly different from the outbred males of a previous study,
where secondary spermatocytes or postmeiotic cells were absent. This indicates that
there is a delay of both meiotic divisions rather than a complete arrest during meiosis I
in these males. Eggs fertilized with mutant sperm develop as malformed embryos and
were aneuploid, which makes this male phenotype much more similar to that previously
described in mutant females. This indicates that crossovers are still essential for a proper
meiosis, but that meiotic cell divisions can progress without it, suggesting that this
mutant is a suitable model to study the cellular mechanisms of completing meiosis
without crossover stabilization.
Keywords: DNA repair enzyme Mlh1; testis; spermatogenesis; male fertility;
aneuploidy
1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
12
1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA
1.1. Peixes Teleósteos
Os peixes pertencem à classe de vertebrados que apresenta maior variação com
relação à estratégia reprodutiva, tamanho de gametas, mecanismos de fertilização e
cuidados com a prole (Jamieson, 1991; Mattei, 1991; Harvey e Carolsfeld, 1993; Burns
et al., 1995). Esse fato pode ser atribuído, em parte, à grande diversidade existente nesta
classe que apresenta atualmente cerca de 30 mil espécies, distribuídas nos mais variados
ambientes aquáticos. Os teleósteos representam aproximadamente 96% de todos os
peixes (Froese e Pauly, 2007). O processo espermatogênico nestes peixes não difere
muito do que é observado nos demais vertebrados, sugerindo que mecanismos de
controle deste evento foram conservados durante o processo evolutivo. Apesar destes
aspectos citados, é muito importante conhecer as particularidades relacionadas à
biologia reprodutiva destes vertebrados, devido, por exemplo, ao grande potencial
econômico representado pela piscicultura no mercado mundial de alimentos. Além
disto, algumas espécies de teleósteos são modelos biológicos experimentais bastante
utilizados nas áreas de reprodução, genética e melhoramento como, por exemplo, o
zebrafish (Danio rerio) (Feitsma et al., 2007; Leal et al., 2007).
1.2. Zebrafish (Danio rerio)
O zebrafish (Danio rerio – Figura 1) é um peixe teleósteo (apresenta esqueleto
ósseo) de água doce originário da Ásia Central, sendo encontrado principalmente na
Índia (Engeszer et al., 2007). Esta espécie tem se tornado um modelo experimental
muito importante tanto na área biomédica como em pesquisa básica, principalmente
devido às suas vantagens freqüentemente mencionadas tais como: pequeno porte, fácil
13
manejo, fertilização externa, elevada taxa reprodutiva e fácil estudo em biologia do
desenvolvimento, pelo fato de apresentar embrião transparente (McGonnell e Fowkes,
2006; Feitsma et al., 2007). Este teleósteo possui vida média em torno de 3 anos, sua
primeira maturação ocorre com 3 meses de vida e se reproduz na temperatura média de
26-28
o
C, por cerca de 18 meses. A fêmea desta espécie pode desovar cerca de 100-200
ovos semanalmente (McGonnell e Fowkes, 2006).
O seqüênciamento recente do genoma do zebrafish, disponibilizado no site
www.ensembl.org/Danio_rerio/index.html e também no site ZFIN, abriu enormes
possibilidades para que estudos na área de genética sejam desenvolvidos neste teleósteo,
propiciando inclusive a geração de excelentes modelos transgênicos na área de biologia
da reprodução. Especificamente nesta área, o zebrafish já vem sendo utilizado como
modelo experimental em estudos envolvendo a função testicular e sua regulação
endócrina (McGonnell e Fowkes, 2006).
Figura 1. Zebrafish (Danio rerio). Fonte: ZFIN e Oregon Zebrafish Laboratories.
14
1.3. Estrutura Testicular e Espermatogênese em Teleósteos
Os testículos de peixes estão localizados na cavidade celomática, dorsalmente ao
tubo digestivo, ventralmente ao mesonefro e ventro-lateralmente ao longo da bexiga
gasosa, encontrando-se presos à parede abdominal e à bexiga gasosa pelo mesórquio.
Macroscopicamente, os testículos da maioria dos teleósteos estudados são órgãos pares,
podendo estar parcial ou totalmente fundidos entre si, apresentam usualmente tamanho
similar entre o direito e o esquerdo e são freqüentemente alongados, embora existam
outras formas como lobulados e foliáceos (Le Gac e Loir, 1999).
À semelhança de outros vertebrados, o testículo de peixes teleósteos exerce as
funções de produção de gametas (espermatogênica) e endócrina (esteroidogênica),
possuindo para isto dois compartimentos principais: (a) o compartimento intertubular ou
intersticial, no qual, além de vasos, nervos, células e fibras do tecido conjuntivo, as
células de Leydig com função esteroidogênica estão localizadas; e (b) o compartimento
dos túbulos seminíferos onde se encontram células somáticas (de Sertoli e peritubular
mióide) e células germinativas que irão formar os espermatozóides após passarem por
processo bastante complexo e altamente organizado – denominado de processo
espermatogênico (Billard, 1990; Koulish et al., 2002; Vilela et al., 2003). Este processo
é um dos sistemas auto-renováveis mais produtivos do corpo animal, no qual milhões de
espermatozóides são produzidos diariamente por grama de testículo, a partir das
espermatogônias tronco (Courot et al., 1970; Clermont, 1972; Ortavant et al., 1977; de
Rooij e Russell, 2000).
Baseado em características morfológicas e funcionais, o processo espermatogênico
pode ser dividido em três fases: (a) fase proliferativa ou espermatogonial, na qual as
espermatogônias passam por sucessivas e rápidas divisões mitóticas; (b) fase meiótica
ou espermatocitária, onde o material genético é duplicado, recombinado e segregado,
15
sendo esta fase muito importante para a diversidade genética entre membros da mesma
espécie; e (c) fase de diferenciação ou espermiogênica, na qual as células haplóides
formadas se transformam em células altamente especializadas e estruturalmente
equipadas para alcançar e fertilizar os oócitos (Russell et al., 1990; Sharpe, 1994).
Na maioria das espécies de peixes, o processo espermatogênico ocorre no interior
de estruturas denominadas espermatocistos, ou cistos (Billard, 1970; Grier, 1975), os
quais são formados quando prolongamentos das células de Sertoli envolvem uma única
espermatogônia primária ou do tipo A (Grier, 1993; Pudney, 1993; 1995) (Figura 2).
As células germinativas derivadas de uma única espermatogônia primária dividem-se
sincronicamente para constituir um clone isogênico de células germinativas que é
envolvido por número variado de células de Sertoli, dependendo do tipo de cisto
(espermatogonial, espermatocitário e de espermátides) (Vilela et al., 2003, Cardoso,
2007). Portanto, diferente de mamíferos (Russell et al., 1990), na espermatogênese
cística as células de Sertoli estão em contato com apenas um tipo específico de célula
germinativa durante a evolução do processo espermatogênico. Estes cistos encontram-se
apoiados na túnica própria dos túbulos seminíferos, que é formada por camada acelular
denominada de membrana basal e pelas células peritubulares mióides (Koulish et al.,
2002). Em teleósteos, a seqüência das células espermatogênicas, a partir da
espermatogônia até a formação de espermatozóides, segue o seguinte esquema:
espermatogônias indiferenciadas Ö espermatogônia primária (do tipo A ou
diferenciada) Ö espermatogônias do tipo B (em torno de 7 gerações em tilápia e 8
gerações em zebrafish) Ö espermatócitos primários Ö espermatócitos secundários Ö
espermátides Ö espermatozóides. Estes últimos, após abertura das junções entre as
células de Sertoli, são liberados no lume dos túbulos seminíferos (Miura, 1999; Le Gac
e Loir, 1999; Schulz e Miura, 2002; Schulz, 2003). Usualmente, a disposição da
16
cromatina nuclear e o tamanho do núcleo, aliado ao número de células germinativas por
cisto, são parâmetros utilizados como referências para se distinguirem os diferentes
tipos espermatogoniais (Matta et al., 2002; Vilela et al., 2003; Cardoso, 2007). Vale
ressaltar que, à semelhança de mamíferos, existem consideráveis diferenças em relação
ao número de gerações de espermatogônias diferenciadas em peixes (Billard, 1969;
Billard, 1990; Miura, 1999; Schulz e Miura, 2002).
Figura 2. Esquema ilustrando o processo espermatogênico em peixes teleósteos.
Observe o arranjo cístico do epitélio seminífero. O cisto é formado quando uma
espermatogônia tronco (SG) é completamente envolvida por projeções citoplasmáticas
das células de Sertoli (SE). O desenvolvimento clonal das células germinativas ocorre
no interior do cisto e é composto por quatro fases principais: auto-renovação de
espermatogônias tronco, proliferação espermatogonial, meiose e espermiogênese. Os
espermatozóides (SZ) são liberados no interior do lúmen tubular (L) através de um
processo que envolve o remodelamento das junções das células de Sertoli e abertura do
cisto (espermiação). Embora não mostrado no esquema, as células germinativas estão
conectadas por pontes citoplasmáticas devido à incompleta citocinese. BM = Membrana
basal; SC = espermatócitos; SGB = espermatogônias do tipo B e ST = espermátides.
(Modificado de Nóbrega R.H. e Quagio-Grassiotto I, Cell and Tissue Research –
submetido)
B
17
1.4. Regulação Hormonal da Espermatogênese em Teleósteos
À semelhança dos mamíferos o testículo de teleósteos também é regulado pelo
eixo hipotálamo-hipófise. Desta forma, o controle endócrino da espermatogênese em
peixes parece não diferir substancialmente do observado para os demais vertebrados (Le
Gac e Loir, 1999; Bhattacharya, 1999). No entanto, o fato de existir aproximadamente
três dezenas de milhares de espécies de peixes, que conforme já foi citado, habitam os
mais variados ambientes aquáticos e que apresentam diversificadas estratégias
reprodutivas, pode tornar mais complexa a regulação fina da função testicular neste
grupo de vertebrados.
Em mamíferos já está bem estabelecido que o hormônio folículo-estimulante
(FSH) e os esteróides, principalmente andrógenos, são os hormônios mais importantes
na regulação da espermatogênese (Russell et al., 1990). À semelhança de mamíferos,
em teleósteos os receptores para FSH e esteróides sexuais são expressos nas células de
Sertoli (Schulz e Miura, 2002), que ao produzirem diversos fatores de crescimento são
responsáveis pela intermediação hormonal importante para o desenvolvimento das
células germinativas. Por exemplo, estudos desenvolvidos em enguias japonesas
(Anguilla japonica) mostram que os esteróides sexuais estimulam a divisão das
espermatogônias tronco, não alterando, no entanto, a proliferação de espermatogônias
diferenciadas, as quais se dividem sob o estímulo das gonadotrofinas, da 11-
cetotestosterona (11-KT) e do fator de crescimento ativina B, secretado pelas células de
Sertoli (Miura et al., 1992; Schulz e Miura, 2002).
Além do hormônio luteinizante (LH), o FSH também estimula a esteroidogênese
em teleósteos. Assim, o fato de o FSH ser a gonadotrofina detectada no plasma de
salmonídeos sugere que o aumento nos níveis desta glicoproteína pode ser suficiente
18
para iniciar o processo espermatogênico, através da ativação das funções das células de
Sertoli e da produção da 11-KT (Schulz e Miura, 2002). Trabalho recente em enguias
japonesas também corrobora o fato do FSH induzir espermatogênese através da
produção de andrógenos (Ohta et al., 2007). Também de acordo com Schulz e Miura
(2002), a testosterona (T) parece exercer efeito feed-back na esteroidogênese
dependente de FSH, sugerindo a necessidade de balanço adequado entre a produção de
T e 11-KT. Já as fases meiótica e espermiogênica da espermatogênese são bastante
dependentes da secreção de andrógenos regulada pelo LH. Através do controle da
composição do plasma seminal, como por exemplo pH, as progestinas que também são
reguladas pelo LH parecem desempenhar importante papel na maturação, capacitação e
aquisição de motilidade por parte dos espermatozóides (Morisawa e Morisawa, 1986).
Além das progestinas serem importantes fatores durante a espermiação e maturação
espermática, a progestina DHP (17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one) é importante para
a iniciação da meiose em enguias japonesas (Miura et al., 2006).
1.5. Células de Sertoli e Desenvolvimento Testicular em Teleósteos
Em mamíferos já é sabido que as células de Sertoli desempenham papel
fundamental na diferenciação, desenvolvimento e função testiculares e na expressão do
fenótipo masculino (Tilmann e Capel, 2002). Em todas as espécies de mamíferos
investigadas até o presente momento, proliferação de células de Sertoli não é observada
após a puberdade (França e Russell, 1998; Sharpe et al., 2003), e a atividade mitótica
pós-natal destas células cessa durante a primeira onda espermatogênica, quando
espermatócitos primários estão proliferando ativamente (Russell et al., 1989; Orth,
1993; França et al., 2000). Estes eventos coincidem com a formação da barreira de
célula de Sertoli, lúmen tubular e um elaborado citoesqueleto que são marcadores
19
morfológicos e funcionais da diferenciação da célula de Sertoli (Russell et al., 1989;
França et al., 2000; Hess e França, 2007).
Diferentemente dos mamíferos, o testículo da grande maioria dos teleósteos cresce
continuamente após os mesmos terem atingido a maturidade sexual, acompanhando o
aumento do peso corporal. Este aspecto sugere fortemente que, também diferentemente
dos mamíferos, as células de Sertoli em peixes proliferam continuamente nos animais
adultos (De Felice e Rasch, 1969; Grier, 1993; Koulish et al., 2002; Schulz et al., 2005).
No entanto, muito pouco é sabido em relação à proliferação de células de Sertoli em
peixes teleósteos. Para algumas espécies de peixes é citada a ocorrência de degeneração
de todas ou algumas células de Sertoli durante o processo de espermiação ou liberação
de células germinativas maduras por estas células somáticas (Prisco et al., 2003). Desta
forma, estas células precisam ser repostas para manter a capacidade de suportar ondas
espermatogênicas subseqüentes. Além disso, em muitas espécies de peixes, ciclos de
desenvolvimento com mudanças de mais de cinqüenta vezes do peso testicular ocorrem
durante estações reprodutivas anuais sucessivas (Schulz, 1984). Isto pode estar
associado com ondas recorrentes anuais de proliferação de células de Sertoli. Pelo
menos em dois modelos experimentais investigados recentemente (tilápias –
Oreochromis niloticus e bagres africanos – Clarias gariepinus) (Vilela et al., 2003;
Schulz et al., 2005), no nosso laboratório e no laboratório do Dr. Rüdiger Schulz na
Holanda, proliferação de células de Sertoli em peixes sexualmente maduros foi
observada, principalmente àquelas associadas com cistos de espermatogônias. Estes
achados abrem mais ainda o leque de possibilidades sobre a proliferação das células de
Sertoli em peixes e requerem estudos detalhados sobre os mecanismos de regulação
desta proliferação. Uma vez mais, à semelhança de mamíferos os trabalhos
desenvolvidos com o bagre africano sugerem importante participação do FSH neste
20
processo (Schulz et al., 2005). Portanto, a cada período reprodutivo dos teleósteos, a
proliferação das células de Sertoli provavelmente é o fator primário responsável pelo
aumento do testículo e da produção espermática (Schulz et al., 2005).
Da mesma forma que existem poucos dados disponíveis na literatura sobre a
proliferação das células de Sertoli em peixes durante a fase de desenvolvimento
testicular pós-natal e na fase adulta, a literatura também é escassa quanto aos aspectos
relacionados com a evolução morfofuncional e quantitativa do processo
espermatogênico em peixes, bem como a respeito da eficiência das células de Sertoli
(Billard, 1969; Billard, 1986; Vilela et al., 2003; Schulz et al., 2004).
1.6. Espermatogônias em Teleósteos
À semelhança de outros vertebrados, pouco é sabido a respeito das espermatogônias
tronco de peixes. Alguns autores consideram que as espermatogônias primárias ou do
tipo A são as espermatogônias tronco (Miura, 1999; Schulz e Miura, 2002). Nos peixes,
estas espermatogônias são as maiores células da linhagem germinativa (Miura, 1999;
Schulz e Miura, 2002), apresentando as seguintes características morfológicas: núcleo
volumoso contendo cromatina finamente granular, um ou dois nucléolos, e citoplasma
com grande quantidade de “nuages”, que é um material elétron-denso formado por
ribonucleoproteínas e RNAs (Miura, 1999; Quagio-Grassiotto e Carvalho, 1999; Schulz
e Miura, 2002).
Com exceção de alguns dados ainda incipientes disponíveis para a enguia
japonesa (Anguilla japonica) (Miura et al., 2002; Miura et al., 2003; Miura e Miura,
2003; Miura et al., 2006), praticamente não existem estudos sobre os nichos
espermatogoniais em peixes. Conforme mostra a Figura 3 na página 11, na enguia
japonesa dois fatores são considerados como fortes candidatos na regulação da auto-
21
renovação e diferenciação das espermatogônias tronco: 1) o PD-ECGF, fator de
crescimento de célula endotelial derivado de plaqueta, também conhecido como
eSRS34 (eel Spermatogenesis Related Substance 34) ou “fator de renovação das
espermatogônias tronco”; e 2) o AMH que é o hormônio anti-Mülleriano, também
conhecido como eSRS21 (eel Spermatogenesis Related Substance 21) ou “substância
inibidora da espermatogênese”. A Figura 3 mostra ainda que, sob a influência do
estradiol-17β (E2), as células de Sertoli produzem o PD-ECGF, que estimula a
renovação das espermatogônias tronco. No entanto, quando se adiciona anticorpo
específico anti-PD-ECGF à co-cultura de células de Sertoli/células germinativas, a auto-
renovação das espermatogônias tronco induzida pelo E2 é bloqueada (Miura et al.,
2003). Outros experimentos ilustrados na Figura 3 mostram que o hormônio anti-
Mülleriano (AMH), produzido pelas células de Sertoli, é responsável pela inibição da
diferenciação espermatogonial e pelo bloqueio da proliferação das espermatogônias do
tipo B (Miura et al., 2002; Miura et al., 2006). A expressão deste hormônio é reprimida
pela 11-KT (11-cetotestosterona), que em peixes é o principal andrógeno sintetizado
pelas células de Leydig. Outros fatores como o IGF-I e a activina B mostrados na
Figura 3 parecem também intervir na diferenciação e proliferação espermatogonial. Na
enguia japonesa, por exemplo, sob influência da 11-KT as células de Sertoli produzem a
activina B que estimula a proliferação das espermatogônias B, porém sem iniciar a
meiose. Já o IGF-I induz a síntese de DNA nas espermatogônias de truta arco-íris
(Onchorhynchus mykiss), e permite continuidade da espermatogênese induzida pela 11-
KT na enguia japonesa (Loir, 1994; Le Gac et al., 1996; Miura e Miura, 2003). Em
síntese, os dados disponíveis para a enguia japonesa sugerem que a sobrevivência das
espermatogônias tronco dos peixes ocorre em função do balanço adequado de fatores
provenientes dos nichos. Pelo fato dos nichos espermatogoniais serem dinâmicos e com
22
elevada plasticidade ao longo do desenvolvimento do indivíduo, os mesmos devem
sofrer influência de diversos fatores (externos e internos). Dentre os quais podem ser
citados, por exemplo, o fotoperíodo, a temperatura, o pH e a concentração iônica da
água que provavelmente resultam na determinação da sazonalidade reprodutiva.
Portanto, a melhor compreensão dos mecanismos regulatórios dos nichos requer a
investigação dos mesmos em várias espécies de teleósteos. Talvez, uma abordagem que
poderá ajudar na elucidação deste aspecto é a investigação dos desreguladores
endócrinos poluentes tais como estrógenos e antiandrógenos, que afetam a reprodução
dos peixes (McGonnell e Fowkes, 2006).
Figura 3. Esta figura mostra a distribuição das principais vias e fatores envolvidos na
auto-renovação e diferenciação das espermatogônias tronco nos peixes. SPGA =
espermatogônia do tipo A; SPGB = espermatogônia do tipo B; E2 = estradiol-17β;
PD-ECGF = fator de crescimento de célula endotelial derivado de plaqueta; 11-KT =
11-cetotestosterona; AMH = hormônio anti-Mülleriano; IGF-I = fator de crescimento
semelhante à insulina do tipo I; → = sinal estimulatório; ┴ = sinal inibitório
(Modificado de Miura e Miura, 2003).
23
1.7. Meiose e Genes de Reparo de DNA
A meiose é a divisão celular através da qual se originam células haplóides a
partir da divisão inicial de células tronco diplóides. Este processo consiste de duas
etapas ou divisões, sendo a primeira, meiose I, a divisão reducional. Os dois homólogos
de cada cromossomo separam-se nesta etapa. Na maioria dos organismos eucarióticos,
durante a prófase da primeira divisão meiótica, ocorre recombinação de cromossomos
homólogos (crossing-overs), sendo este processo fundamental para a formação de
bivalentes estáveis. Esta estabilidade é necessária para o alinhamento adequado dos
cromossomos, subseqüente conexão com as fibras do fuso em metáfase I, e posterior
divisão celular.
Durante a prófase I são reconhecidos cinco diferentes estágios, baseados na
disposição da cromatina: leptóteno, zigóteno, paquíteno, diplóteno e diacinese (Hunt e
Hassold 2002; Marcon e Moens 2005). Em leptóteno ocorre um grande número de
quebras na fita dupla de DNA em cada cromossomo (Marcon e Moens 2005). Nesta
fase os cromossomos homólogos ainda encontram-se separados, mas inicia-se a busca
por homologia. A sinapse, que é uma associação de cromossomos homólogos pela
ligação de proteínas do complexo sinaptonêmico, inicia-se em zigóteno e completa-se
em paquíteno. Durante a sinapse, as quebras na fita dupla de DNA são reparadas.
Apenas uma fração, em média uma ou duas quebras na fita dupla de DNA por par, é
reparada através de recombinação homóloga com uma cromátide não irmã do
homólogo. Estas regiões de crossing-overs tornam-se evidentes em diplóteno, quando o
término da sinapse acontece. Finalmente, em diacinese, os crossing-overs são
estabilizados através de quiasmata, os quais são os únicos locais que mantém o par de
cromossomos homólogos unidos.
24
O envolvimento de genes de reparo a danos ao DNA na meiose foi inicialmente
observado em camundongos, e os knockouts para diversos destes genes apresentaram
problemas de fertilidade (Wei et al., 2002). As proteínas MMR (DNA mismatch repair)
atuam como complexos heterodiméricos (mutS e mutL) em meiose, da mesma forma
que atuam em erros de replicação em células mitóticas (Kolas et al., 2005). No entanto,
o complexo mutS que atua na recombinação, mutSγ, consiste dos genes msh4 e msh5,
genes que aparentemente não apresentam nenhuma função no reparo de erros no DNA
(Wei et al., 2002). O complexo mutSγ se liga em foci do DNA em conjunto com a
proteína de replicação A (RPA) durante a sinapse, nas fases de zigóteno e paquíteno (De
Vries et al., 2005; Marcon e Moens, 2005). A freqüência deste foci em mamíferos é de 5
a 10 vezes superior ao número final de crossing-overs (Kneitz et al., 2000). O MSH4 e
MSH5 promovem sinapse, tendo em vista que camundongos mutantes para estes genes
apresentam problemas neste processo (De Vries et al., 1999; Edelmann et al., 1999;
Kneitz et al., 2000). Como resultado deste aspecto, ambos os sexos não possuem
gametas e conseqüentemente são estéreis. Este fenótipo é muito semelhante para
animais knockout para uma das proteínas do complexo sinaptonêmico, SYCP1 (De
Vries et al., 2005). Em contraste, msh4 e msh5 em Caenorhabditis elegans não atuam
antes do estágio de paquíteno e são essenciais para o crossing-over, função esta
desempenhada pelo mlh1 em mamíferos (Zalevsky et al., 1999; Kelly et al., 2000).
O complexo mutL envolvido na meiose também difere do complexo mutL
MMR e consiste do MLH1 e MLH3, embora um pequeno papel para o MLH3 tenha
sido reportado em MMR (Harfe et al., 2000; Cannavo et al., 2005). O complexo
MLH1/MLH3 está presente em distintos foci nos elementos em sinapse durante o
estágio de paquíteno, e num estágio posterior à formação do complexo MSH4/MSH5.
Após a ligação do MLH3 no complexo sinaptonêmico, o MLH1 é recrutado (Lipkin et
25
al., 2002; Kolas et al., 2005). Os foci de MLH1/MLH3 coincidem em tempo, número e
posição com os presumíveis sites de crossing-over (Marcon e Moens, 2003; Moens,
2006). A hipótese é de que este complexo (MLH1/MLH3) estabiliza um número
limitado de locais de recombinação para reparo através de crossing-over, enquanto
outros locais serão reparados por diferentes mecanismos. Tanto camundongos knockout
para mlh1 quanto para mlh3, apresentam fenótipo semelhante em relação ao processo
meiótico (Baker et al., 1996; Edelman et al., 1996; Woods et al., 1999; Eaker et al.,
2002; Lipkin et al., 2002). Nestes casos ambos os sexos são estéreis. No entanto, em
machos não existe a produção de espermatozóides, enquanto em fêmeas ocorre a
produção de ovócitos que raramente completam a meiose (Edelmann et al., 1996;
Woods et al., 1999; Lipkin et al., 2002). Os problemas ocasionados pela ausência de
mlh1/mlh3 ocorrem numa fase mais avançada do processo meiótico quando comparados
aos ocasionados por ausência de msh4 e msh5. O processo sináptico ocorre
normalmente, mas a freqüência de crossing-overs é reduzida drásticamente (Baker et
al., 1996; Guillon et al., 2005) e os cromossomos se apresentam principalmente como
univalentes ao invés de bivalentes em metáfase I (Baker et al., 1996; Woods et al.,
1999).
Conforme mencionado anteriormente, o zebrafish constitui um excelente modelo
para o estudo em pesquisas biomédicas, incluindo o estudo do desenvolvimente
embrionário inicial. Esta vantagem aplica-se também aos estudos relacionados ao
processo meiótico, embora não tenham sido realizadas investigações mais detalhadas
nesta área. Nos presentes trabalhos, foi utilizado um procedimento recentemente
desenvolvido no Hubrecht Laboratory/Utrecht/Holanda, através do qual foram gerados
animais knockout para mlh1 (Wienholds et al., 2003; Wienholds e Plasterk, 2004).
Conforme mencionado anteriormente, machos e fêmeas de camundongo mutantes para
26
o gene mlh1 são estéreis, apresentando problemas durante a meiose e hipogonadismo.
Além disto, zebrafish machos mutantes (background AB/TL) para mlh1 também são
inférteis apresentando bloqueio em metáfase I. Por outro lado, zebrafish fêmeas para o
mesmo gene são férteis (Harma et al., 2007). Pelo fato de que um background genético
mixto – como AB/TL no primeiro trabalho – pode algumas vêzes afetar a expressão
fenotípica de uma mutação, foi re-avaliado no segundo trabalho a histologia testicular
de mutantes para mlh1 após dois cruzamentos com a linhagem parental TL (Leal et al.,
2007).
1.8. Geração de Animais Knockout para o Gene de Reparo de DNA mlh1
Inicialmente machos adultos de zebrafish em background (linhagem) TL foram
expostos ao agente indutor de mutações aleatórias em espermatozóides ENU (N-ethyl-
N-nitrosurea). Em seguida estes machos foram cruzados com fêmeas wild-type da
mesma linhagem (TL). Desta forma foi criada uma biblioteca de 10 mil animais F1
dispostos em tanques contendo 32 animais cada. Nos animais de cada tanque foram
realizados pequenos cortes na barbatana para extração de DNA, representando, desta
forma, uma amostra por tanque (cada amostra é referente a 32 animais). Em seguida foi
realizado PCR utilizando dois amplicons específicos para os éxons 2-4 e 8-10 do gene
mlh1 do zebrafish, respectivamente, para selecionar uma possível mutação neste gene
para o grupo de animais de cada tanque. Após a detecção da mutação, foi realizado
novo PCR em cada animal (32 animais) do tanque que apresentou amostra positiva para
a mutação. Após a seleção do animal mutante (1 animal entre 10.000), foi realizado
cruzamento do mesmo com fêmea de linhagem AB e os animais assim gerados (F2)
foram cruzados entre si para a seleção de animais homozigotos para a mutação no gene
mlh1. Esta seleção foi realizada através de genotipagem por amplificação e
27
resseqüênciamento, utilizando-se para isto de primers específicos para o éxon 10 deste
gene. Conforme o esperado, 25% da prole mostrou-se homozigota para a mutação
(linhagem AB/TL), sendo estes animais utilizados no primeiro trabalho (Feitsma et al.,
2007) (Figura 4). Para a produção de animais mutantes em linhagem TL, o animal
fundador do primeiro trabalho (em background TL) foi cruzado com fêmea de mesma
linhagem (TL). O procedimento utilizado foi desenvolvido no Laboratório Hubrecht –
Holanda em trabalhos anteriores (Wienholds et al., 2003; Wienholds e Plasterk, 2004).
.
Figura 4. Esta figura mostra o procedimento utilizado para a geração de animais
mutantes para o gene de reparo de DNA mlh1. Esta ilustração foi retirada de material
apresentado no Simpósio “Fish Models in Utrecht: An Interdisciplinary Symposium”
realizado no Laboratório Hubrecht – Utrecht – Holanda em maio de 2007 e
apresentado por Harma Feitsma e Marcelo de Casto Leal.
28
2. OBJETIVOS
29
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Baseado no que foi exposto anteriormente, o objetivo geral do presente projeto
foi o de se avaliar o controle genético, através do gene de reparo de DNA mlh1, da
gametogênese utilizando-se o zebrafish (Danio rerio) como modelo vertebrado
experimental.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Artigo 1. Caracterizar o fenótipo testicular e do ovário de zebrafish mutantes
(background AB/TL) para o gene de reparo de danos ao DNA mlh1 (Feitsma et al.,
2007).
• Artigo 2. Caracterizar o fenótipo testicular e o compartimento espermatogonial de
animais mutantes para o gene de reparo de danos ao DNA mlh1 num background
mais “limpo” (background TL) (Leal et al., 2007).
30
3. ARTIGO 1 (Feitsma et al., 2007)
31
32
33
34
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3. ARTIGO 2 (Leal et al., 2007)
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Decision Letter (CTR-07-0301.R3)
From: [email protected]
Cc: SutovskyP@missouri.edu
Subject: CTR-07-0301.R3
Body: Manuscript No. CTR-07-0301.R3
Title : Meiosis can be completed in male zebrafish (Danio rerio) lacking the DNA
mismatch repair gene mlh1
By: Leal, Marcelo; Feitsma, Harma; Cuppen, Edwin; Franca, Luiz; Schulz, Rüdiger
Dear Dr. Schulz,
We are pleased to inform you that your manuscript CTR-07-0301.R3, entitled "Meiosis
can be completed in male zebrafish (Danio rerio) lacking the DNA mismatch repair
gene mlh1", has been accepted for publication in CTR.
The manuscript will now be forwarded to the publisher, from whom you will shortly
receive information regarding the correction of proofs and fast online publication.
In addition to the normal publication process, Springer now provides an alternative
publishing option: Springer Open Choice. If you wish to explore this option, please
visit www.springer.com/openchoice.
Best wishes and thanks,
Prof. K. Unsicker
Coordinating Editor CTR
Prof. Peter Sutovsky
Section Editor CTR
Date
Sent:
31-Oct-2007
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61
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63
5. DISCUSSÃO
64
5. DISCUSSÃO
Em nosso primeiro trabalho foi reportado que zebrafish machos knockout para a
proteína de reparo de DNA Mlh1 eram inférteis, devido ao bloqueio e morte por
apoptose durante a primeira divisão meiótica. Em decorrência deste aspecto, as células
germinativas mais avançadas (espermatócitos secundários, espermátides e
espermatozóides) estavam ausentes (Harma et al., 2007). Este fenômeno foi explicado
pela falta de quiasmata, estrutura que normalmente mantém os cromossomos
homólogos unidos. Nestes mutantes (mlh1
-/-
), os cromossomos de espermatócitos
primários estavam, desta forma, presentes como univalentes, o que impediu o
alinhamento dos mesmos na região equatorial da célula durante a metáfase I, a posterior
ligação com o fuso meiótico e finalmente a divisão celular. No entanto, em fêmeas
mutantes para o mesmo gene (mlh1
-/-
) a falta de quiasmata não bloqueou a divisão
celular, mas ocasionou segregação cromossômica aleatória, resultando em progênie com
números cromossômicos aneuplóides ou triplóides. Diferenças sexuais também foram
observadas em diversos modelos murinos knockouts para genes relacionados ao
processo meiótico (Hunt e Hassold, 2002). Estas diferenças sexuais foram relacionadas
a diferenças gerais básicas entre este processo em machos e fêmeas. Em mamíferos, a
gametogênese masculina é um processo contínuo e altamente regulado. Em contraste, as
fêmeas possuem uma única e programada onda gametogênica, com produção limitada
de ovócitos. Em peixes, no entanto, as oogônias estão presentes em ovários de fêmeas
adultas (Higashino et al., 2002; Grier et al., 2007) permitindo, desta forma, maior
fertilidade, típica em fêmeas de muitas espécies de teleósteos.
No segundo trabalho (Leal et al., 2007), foi mostrado que zebrafish mutantes
para Mlh1 num background mais “limpo” (após dois cruzamentos do animal fundador
AB/TL com animais TL) são parcialmente férteis. Diferente de machos AB/TL para a
65
mesma mutação, que são totalmente inférteis com bloqueio em metáfase I (Feitsma et
al., 2007), os machos em background TL não apresentaram bloqueio completo do
processo espermatogênico nesta fase. Nestes animais (background TL), ocorreu
acúmulo de todos os tipos celulares pré-meioticos e meióticos (espermatogônias,
espermatócitos primários e espermatócitos secundários), bem como células em processo
apoptótico, apresentado como conseqüência um número muito baixo de células pós-
meióticas (espermátides e espermatozóides). Este pequeno número de células pós-
meióticas está associado ao baixo índice de fertilização observado nestes animais. Um
maior número de espermatócitos secundários (expresso em mg) nos mutantes em
relação aos animais wild-type indicam que estas células não são células que
“escaparam” do check-point da primeira divisão meiótica, mas que as divisões meióticas
estavam retardadas. O fenótipo meiótico destes machos é, desta forma, marcadamente
diferente do que foi encontrado no trabalho anterior (Feitsma et al., 2007).
Adicionalmente, foi mostrado que o baixo número de células germinativas que
completaram a meiose e a espermiogênese (em background TL) eram espermatozóides
aneuplóides, pelo fato dos mesmos gerarem progênie aneuplóide após a fertilização de
ovócitos de fêmeas wild-type. Este fenômeno foi mostrado através de três diferentes
maneiras: 1) a fertilização de ovócitos de fêmeas albinas resultou, algumas vezes, em
embriões sem pigmentação devido a perda do alelo paternal; 2) o seqüênciamento de
polimorfismos para mlh1 na progênie mostrou a perda ou a duplicação do alelo paternal;
e 3) a contagem de cromossomos de células embrionárias revelou números diferentes de
50, número este presente em zebrafish wild-type. Em conjunto, estas evidências
indicaram que mesmo na ausência de Mlh1 o processo espermatogênico ainda pôde ser
concluído por um número limitado de células germinativas, mas certamente de forma
anormal. Os problemas durante a primeira divisão meiótica são provavelmente
66
decorrentes da presença de cromossomos univalentes, como previamente descrito
(Feitsma et al., 2007). Enquanto alterações observadas durante a segunda divisão
meiótica estão, possivelmente, relacionados com a presença de aneuploidia, já presente
nesta fase. Esta observação é consistente com o grande número de espermatócitos
primários e secundários positivos para histona H3 no testículo dos mutantes, o que é um
idicativo de que a maioria das células estava bloqueada em metáfase (Leal et al., 2007).
As fêmeas mutantes para mlh1 em background TL apresentaram comportamento
semelhante às fêmeas mutantes AB/TL em relação à fertilidade e ao número de
embriões fenotipicamente anormais. Em mutantes da linhagem TL, tanto fêmeas quanto
machos responderam aos problemas na meiose sendo, desta forma, altamente
comparáveis entre si e muito diferentes de vertebrados superiores (camundongos). A
determinação desta baixíssima taxa de fertilização pode ser experimentalmente viável
apenas em peixes, como o zebrafish e o medaka (Oryzias latipes) pelo fato destas
espécies produzirem grande quantidade de ovócitos. No entanto, no nosso
conhecimento, nenhum espermatozóide ou outras células em estágios posteriores à
meiose I foram observadas em camundongos knockout para este mesmo gene. Também,
em fêmeas de camundongos mutantes, os ovócitos dificilmente foram capazes de
finalizar a meiose (Edelmann et al., 1996; Woods et al., 1999; Lipkin et al., 2002). Isto
sugere que, especificamente em zebrafish, ou talvez em vertebrados inferiores, as
divisões meióticas são menos restritivas. Como mostramos no primeiro trabalho,
zebrafish machos triplóides também são capazes de completar o processo meiótico,
formando espermatozóides (Feitsma et al., 2007).
A diferença na fertilidade masculina entre as duas linhagens de zebrafish
(AB/TL e TL) que usamos não possui uma explicação plausível até o presente
momento. Uma possível hipótese é de que as linhagens apresentam background
67
genético modificador que pode, por exemplo, diminuir ou aumentar a restritividade dos
checkpoints meióticos. Alternativamente, a divergência entre os cromossomos
homólogos pode resultar numa menor capacidade de completar o processo meiótico. Em
leveduras, foi observado que elevados níveis de polimorfismos diminuem a freqüência
de recombinação (Borts e Haber, 1987). Em conjunto com uma severa redução na
recombinação pela ausência de Mlh1, as células precisam estar abaixo de um certo
limiar a partir do qual a meiose é completamente bloqueada. Desta forma, poderá ser
muito interessante realizar o cruzamento destes mutantes (em background TL) com
mutantes para genes de reparo do DNA que não são essenciais para a formação de
crossing-overs, mas que estão envolvidos no reparo de seqüências heteroduplex que se
originam durante a recombinação meiótica, como o msh2 e msh6 (Borts et al., 2000;
Radford et al., 2007). Evidências experimentais para ambas possibilidades necessitariam
de experimento de longa duração, através de cruzamentos com diferentes linhagens, o
que poderia certamente ser realizável utilizando-se o zebrafish como modelo
experimental. No entanto, estes experimentos estão além dos objetivos dos presentes
trabalhos. Independentemente das explicações que forem evidenciadas, ambos os sexos
de mutantes mlh1 da linhagem TL constituem modelos interessantes para a investigação
dos mecanismos celulares que permitem à conclusão de ambas as divisões meióticas na
ausência da proteína Mlh1 por parte das células germinativas mutantes.
68
6. CONCLUSÃO
69
6. CONCLUSÃO
No primeiro trabalho (Feitsma et al., 2007), foi mostrado que a necessidade do
mlh1 para o processo de recombinação gênica em zebrafish machos é similar ao
observado em mamíferos. Neste estudo, também foi observado parada do processo
espermatogênico em metafase I, em zebrafish machos. Este resultado corrobora o que
foi evidenciado em camundongos mutantes para o mesmo gene (mlh1).
Surpreendentemente, em todos os animais mutantes (em background TL –
segundo trabalho – Leal et al., 2007) o processo espermatogênico pôde ser concluído
qualitativamente, embora apenas raros espermatozóides fossem formados. Portanto, este
é o primeiro estudo mostrando que as células germinativas de animais machos mutantes
para o gene mlh1 podem completar as duas divisões meióticas e formar
espermatozóides. Estes resultados sugerem que mecanismos celulares alternativos
devem direcionar a adesão ao fuso meiótico e a segregação cromossômica.
Ainda neste último estudo, ficou evidenciado acúmulo de espermatogônias
diferenciadas. Desta forma, iremos investigar, utilizando-se de imunohistoquímica para
BrdU (marcador de células em proliferação) e de PCR em Tempo Real quantitativo
(qPCR) para fatores tais como AMH, PD-ECGF, GDNF, IGF-I, IGF-Ir e GSDF (fatores
envolvidos na fase proliferativa da espermatogênese), se este aumento está relacionado
à uma maior taxa proliferativa ou ao simples acúmulo celular ocasionado pelas
alterações observadas durante a meiose.
70
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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