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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: REPRODUÇÃO HUMANA E CLIMATÉRIO
EFEITOS DO ESTRADIOL TÓPICO SOBRE A
EXPRESSÃO DA ENZIMA METALOPROTEINASE-1 EM
CÉLULAS DA PELE
Luciana Neder
Cuiabá-MT
2010
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
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2
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: REPRODUÇÃO HUMANA E CLIMATÉRIO
EFEITOS DO ESTRADIOL TÓPICO SOBRE A
EXPRESSÃO DA ENZIMA METALOPROTEINASE-1 EM
CÉLULAS DA PELE
Luciana Neder
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde da Faculdade
de Medicina da Universidade Federal de Mato
Grosso, para obtenção do título de Mestre em
Ciências da Saúde - Área de concentração:
Reprodução humana e Climátério sob
orientação do Prof. Dr. Sebastião Freitas de
Medeiros.
Cuiabá-MT
2010
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3
ÍNDICE
Abreviaturas e siglas
iv
Lista de Tabelas
v
Lista de figuras
vi
Resumo
viii
Abstract
x
1-
INTRODUÇÃO
..................................................................................
1
2-
OBJETIVOS
24
3-
MÉTODOS
25
4-
RESULTADOS
..................................................................................
41
5-
DISCUSSÃO
.....................................................................................
49
6-
CONCLUSÃO
.....................................................................................
55
REFERÊNCIAS
..................................................................................
56
APENDICES
.........................................................................................
74
4
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
TH - Terapia de reposição hormonal
TE - Terapia de reposição hormonal com estrogênios
TEP - Terapia de reposição hormonal com estrogênios e progestogênios
GAG - Glicosaminoglicanas
RE - Receptores para estrogênios
RE-α - Receptor alfa de estrogênios
RE-β - Receptor beta de estrogênios
MMP - Metaloproteinase
MMP-1 - Metaloproteinase 1
TGF-β - Fator Transformador de crescimento beta
AVC - Acidente vascular cerebral
FSH - Hormônio folículo estimulante
LH - Hormônio lutenizante
TSH - Hormônio tireoestimulante
5
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Sinais e sintomas relacionados ao hipoestrogenismo na pós-
menopausa, por sistema.
15
Tabela 2.
Características clínicas das pacientes estudadas.
42
Tabela 3.
Comparação da taxa de expressão da MMP-1 antes e após
tratamento com estradiol tópico 0,05% em queratinócitos.
44
Tabela 4.
Comparação da taxa de expressão da MMP-1 antes e após
tratamento com estradiol tópico 0,05% em fibroblastos.
46
Tabela 5.
Comparação da taxa de expressão da MMP-1 antes e após
tratamento com estradiol tópico 0,05% em células endoteliais.
48
6
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Estrutura e aspectos histológicos da pele. Lâmina de pele.
2
Figura 2.
Pontos de coleta de biopsia de pele em região pré-auricular direita.
30
Figura 3.
Microfotografia ilustrativa de cortes de pele após reação
imunohistoquímica em queratinócitos para a enzima
metaloproteinase-1.
38
Figura 4.
Microfotografia ilustrativa de cortes de pele após reação
imunohistoquímica em células endoteliais para a enzima
metaloproteinase-1.
38
Figura 5.
Microfotografia de cortes de pele após reação imunohistoquímica em
células endoteliais para a enzima metaloproteinase-1.
39
Figura 6.
Distribuição das pacientes estudadas por faixa etária.
41
Figura 7.
Distribuição do tempo em pós menopausa em faixas etárias de 5
anos.
42
7
Figura 8.
Distribuição das pacientes por intensidade da expressão da enzima
metaloproteinase-1 em queratinócitos, por intensidade da coloração
antes e depois do uso de estradiol tópico 0,05%.
43
Figura 9.
Distribuição das pacientes por intensidade da expressão da enzima
metaloproteinase-1 em fibroblastos, por intensidade da coloração
antes e depois do uso de estradiol tópico 0,05%.
45
Figura 10.
Distribuição das pacientes por intensidade da expressão da enzima
metaloproteinase-1 em células endoteliais, por intensidade da
coloração antes e depois do uso de estradiol tópico 0,05%.
47
8
RESUMO
Introdução: Na pós-menopausa ocorrem alterações importantes
na pele, como atrofia da epiderme e derme e perda acelerada do
colágeno dérmico, com conseqüente envelhecimento acelerado da
pele, que se expressa com aumento do número e profundidade das
rugas e flacidez. A perda acelerada do colágeno pode ocorrer por
deficiência estrogênica resultando em aumento na síntese da enzima
metaloproteinase-1 (MMP-1), que degrada o colágeno dérmico.
Objetivo: Avaliar se a aplicação tópica de estradiol 0,05% em gel
sobre a pele fotoexposta pode inibir a expressão da enzima MMP-1 na
derme. Métodos: Foram incluídas 40 mulheres na pós-menopausa
com idade de 53,3 ± 5,3 anos e 7 anos (IC 95% 5,29 – 8,71) após a
última menstruação. Todas as pacientes realizaram dosagem de FSH,
LH, estradiol, prolactina, TSH, tiroxina livre, mamografia,
colpocitologia oncótica e ultra-som transvaginal, antes do estudo.
Biopsia de pele foi realizada na região pré-auricular direita antes e
após tratamento com estradiol tópico por 30 dias. Os espécimes
obtidos foram submetidos á avaliação imunohistoquímica para
examinar a expressão da enzima MMP-1. Resultados: Em análise
conjunta de todos os cortes, demonstrou-se que o uso de gel contendo
estradiol 0,05%, por 30 dias, não inibiu a expressão da enzima
metaloproteinase-1 nos queratinócitos, fibroblastos e células
9
endoteliais da pele, (p=0,067, p=0,15, p = 0,83) respectivamente.
Conclusão: O uso tópico de gel contendo estradiol 0,05% em pele
fotoexposta por 30 dias não inibiu a produção da MMP-1.
10
ABSTRACT
Introduction: In the postmenopausal period occurs important
changes in the skin such as atrophy of the epidermis and dermis and
accelerated loss of dermal collagen, resulting in accelerated skin aging,
which expresses itself with increasing the number and depth of wrinkles
and sagging. This accelerated catabolism of collagen may occur due to
estrogen deficiency resulting in increased synthesis of the enzyme MMP-1,
which degrades the dermal collagen. Objective: The objective of this study
was to evaluate whether the use of topical 0.05% estradiol gel on the skin
could inhibit the expression of the MMP-1 in the dermis. Methods: Were
included 40 postmenopausal women aged 53.3 ± 5.3 years and 7 years
(95% CI 5.29 to 8.71) after the last menstruation. All patients underwent
determination of FSH, LH, estradiol, prolactin, TSH, free thyroxine,
mammography, Pap smear and transvaginal ultrasound before the study.
Skin biopsy was performed in the preauricular area right before and after
treatment with topical estradiol for 30 days. Specimens were submitted to
immunohistochemistry to examine the expression of the enzyme MMP-1.
Results: In the combined analysis of all the cuts, it was shown that the use
of gel containing estradiol 0.05%, for 30 days, did not inhibit the
expression of metalloproteinase-1 enzyme in keratinocytes, fibroblasts and
endothelial cells of the skin (p = 0.067, p = 0.15, p = 0.83) respectively.
Conclusion: The topical gel containing estradiol 0.05% photoexposed skin
for 30 days did not inhibit the production of MMP-1.
11
INTRODUÇÃO
Enquanto, no século passado, a expectativa de vida da mulher
brasileira era de aproximadamente 50 anos, atualmente, ultrapassa os 70
anos,
1
fazendo com que as mulheres vivam por vários anos no período de
pós-menopausa.
2
Com o crescimento desta população, a assistência médica
têm como proposta harmonizar a longevidade com qualidade de vida. Para
este objetivo, são instrumentos aplicáveis: a educação alimentar,
preferindo-se alimentos pobres em carboidratos, a motivação para atividade
física regular, incluindo aeróbica e musculação, e a reposição hormonal,
dimensionando seus riscos e benefícios.
Desde o início do uso de reposição estrogênica na década de 40,
efeitos visíveis na pele foram notados, principalmente na habilidade dos
estrogênios de combater o envelhecimento cutâneo.
3
Com o aumento
crescente desta população, inúmeras pesquisas vêm sendo desenvolvidas
para explicar a ação hormonal no processo de envelhecimento cutâneo
3
e
avaliar os riscos e benefícios da terapia de reposição de estrogênios nos
diversos sistemas em mulheres na pós-menopausa.
3,4
12
A pele normal
Na sua estrutura, a pele é formada pelas camadas, epiderme, derme e
hipoderme (figura 1).
5
Figura 1: Adaptada de Du Vivier A. Atlas de Dermatologia Clínica. 1995. pp 2.1.
Estrutura e aspectos histológicos da pele. Lâmina de pele.
6
A epiderme, camada mais externa da pele, é constituída por um
epitélio escamoso estratificado. A maioria de suas células (95%), é
composta por queratinócitos, com disposição semelhante a uma "parede de
tijolos". Estas células são produzidas na camada mais inferior da epiderme
(camada basal ou germinativa) e em sua migração em direção à superfície
sofrem processo de queratinização, dando origem à camada córnea, mais
externa, composta basicamente de uma proteína responsável pela
impermeabilização da pele, a queratina.
5
A renovação celular constante da epiderme faz com que as células
da camada córnea sejam gradativamente eliminadas e substituídas por
Camada córnea
Epiderme
Derme papilar
Derme reticular
Hipoderme
13
outras. Além dos queratinócitos a epiderme contém melanócitos, células
produtoras do pigmento que dá cor à pele (melanina), células de Merkel e
de Langerhans, responsáveis pela defesa imunológica.
5
A faixa na qual a epiderme e a derme se unem é chamada de junção
dermo-epidérmica. Nesta área, a epiderme se projeta em forma de dedos na
direção da derme, formando as cristas epidérmicas. Estas cristas aumentam
a superfície de contato entre as duas camadas, facilitando a nutrição das
células epidérmicas pelos vasos sanguíneos da derme. Além disso, a junção
dermo-epidérmica tem papel relevante em uma série de interações epitélio-
mesenquimais, como ancoragem das células epiteliais à membrana basal,
adesão, migração e diferenciação celular.
5
A derme, camada localizada entre
a epiderme e a hipoderme, é responsável pela resistência e elasticidade da
pele. A derme superficial, próxima a epiderme é a derme papilar, e a derme
mais profunda é a derme reticular.
5
A derme é constituída por fibras colágenas e elásticas imersas em
um gel rico em polissacarídeos e proteínas que interagem para produzir
glicosaminoglicanas, macromoléculas com forte capacidade para atrair e
reter água. Os hialuronidatos e os condroitinsulfatos são as GAG mais
importantes.
7
As fibras colágenas, sintetizadas pelos fibroblastos dérmicos,
fornecem suporte à epiderme e aumentam a resistência da pele.
8
O colágeno
é um importante constituinte da pele, proporcionando suporte e resistência
à pele. A pele humana contém 14 tipos de colágeno; 80% do colágeno
dérmico é do tipo I e 15% do tipo III. O colágeno tipo I é o maior
14
responsável pela resistência da pele, e o tipo III pelas propriedades
elásticas.
5,9
Os outros tipos de colágeno compõem a pele de recém nascidos
ou formam as estruturas que fixam a epiderme à derme.
5
As fibras elásticas são compostas principalmente de elastina e são
responsáveis pela capacidade de distensão da pele. Na derme também estão
distribuídos vasos sanguíneos, linfáticos, nervos e terminações nervosas
.
Os
folículos pilossebáceos e glândulas sudoríparas, originadas na epiderme,
também localizam-se na derme.
5
A hipoderme, camada mais profunda da pele, também chamada de
tecido celular subcutâneo, ou panículo adiposo, tem espessura variável e é
composta por feixes de tecido conjuntivo que envolvem células gordurosas
(adipócitos) formando lobos de gordura. Relaciona-se, em sua porção
superior, com a derme profunda, constituindo-se a junção dermo-
hipodérmica, em geral sede das porções secretoras das glândulas apócrinas
e sudoríparas, de pêlos, vasos e nervos. Funcionalmente, a hipoderme, além
de depósito nutritivo de reserva, participa no isolamento térmico e na
proteção mecânica do organismo às pressões e traumatismos externos e
facilita a motilidade da pele em relação às estruturas subjacentes.
8
A pele envelhecida é mais fina por diminuição do número de
queratinócitos da epiderme, do tecido conjuntivo da derme, e da substância
fundamental rica em glicosaminoglicanas. Estas alterações degenerativas
que acompanham o processo de envelhecimento e que são aceleradas pela
15
deprivação estrogênica, resultam em atrofia, flacidez e enrugamento da
pele.
5
O processo de envelhecimento
Sabe-se que o envelhecimento da pele é causado pela combinação de
fatores cronológicos e ambientais, que produzem redução na função e
habilidade da pele em tolerar injúrias.
10
O envelhecimento cronológico é
um processo geneticamente determinado. Suporta esta teoria o fato que os
telômeros, a porção terminal dos cromossomos, se encurtam a cada ciclo de
divisão celular. No momento em que os telômeros atingem um tamanho
limite, o ciclo celular para ou ocorre apoptose celular.
11
Além disso,
culturas primárias de células demonstram que elas não podem se replicar
continuamente, funcionando como uma estratégia de prevenção ao
câncer.
12
Na gênese do envelhecimento, além do fator cronológico, há
importante participação de fatores ambientais, que produzem uma
destruição cumulativa.
10,13
Os principais fatores ambientais que influenciam
no processo de envelhecimento são a exposição à luz ultra-violeta, hábitos
de vida (nutrição, nicotina, álcool, drogas) e fatores catabólicos (infecções,
tumores).
14
Estes fatores estimulariam a geração de radicais livres de
oxigênio durante o metabolismo celular normal,
15
contribuindo para um
envelhecimento precoce. A atividade de enzimas com efeito antioxidante e
16
o nível de antioxidantes não enzimáticos diminuem com a idade,
contribuindo com essa destruição oxidativa.
13,16
Fatores ambientais no envelhecimento da pele
Dentre os fatores ambientais envolvidos no processo de
envelhecimento da pele, a exposição solar e o tabagismo são os mais
importantes.
17-21
Em áreas fotoexpostas como face, pescoço, braços e
pernas, soma-se ao envelhecimento cronológico, os efeitos destrutivos da
exposição solar crônica. Muitas das funções da pele que declinam com a
idade, são aceleradas na pele fotoexposta,
10
sendo que aproximadamente
50% dos danos induzidos pela radiação UV ocorre por formação de
radicais livres.
22
Diversos estudos demonstraram que os protetores solares tópicos tem
efeito positivo em diminuir os danos solares na pele. Estes estudos
evidenciaram que os fotoprotetores inibem a diminuição da síntese de DNA
em queratinócitos de roedores irradiados com luz ultra violeta.
23
Fotoprotetores também foram responsáveis por estimular a síntese de fibras
elásticas e colágenas em peles fotodanificadas.
24
As alterações clínicas
associadas ao fotoenvelhecimento cutâneo são alterações pigmentares,
flacidez, coloração amarelada, rugas, telangectasias e surgimento de
tumores cutâneos.
25-28
A pele idosa, porém fotoprotegida, tem aumento da
flacidez, mas é livre dos sinais do dano actínico.
29
17
Histologicamente a pele fotoenvelhecida apresenta queratinócitos
desorganizados, atípicos, além de uma atrofia muito mais intensa.
30
Há
aumento e hiperplasia dos fibroblastos e infiltrado inflamatório na derme.
Também, há alteração da microvasculatura com espessamento das paredes
dos vasos.
31
O declínio do conteúdo de colágeno tipo I e III que já diminuía
pelo envelhecimento cronológico, sofre destruição mais acelerada em pele
fotoexposta.
30
A exposição à radiação ultra-violeta aumenta a produção de
elastina,
32
que se acumula anormalmente em áreas previamente ocupadas
pelo colágeno.
30
A exposição a radiação UV também aumenta a produção
das metaloproteinases
33
e diminui a produção de colágeno.
34
O tabagismo também provoca alterações importantes na pele,
entretanto, os mecanismos fisiopatológicos destas alterações são complexos
e ainda não completamente esclarecidos. A fumaça do cigarro contém
mais de 4.000 substâncias tóxicas, mas é a nicotina o composto mais
nocivo. Ela é responsável pela vasoconstrição, que gera diminuição do
fluxo sangüíneo, gerando hipóxia tissular significativa e isquemia dérmica
local,
35,36
com conseqüente diminuição da síntese de colágeno e fibras
elásticas.
37
Um único cigarro determina vasoconstrição cutânea por mais de
90 minutos.
38
A fumaça do cigarro também aumenta a atividade plasmática
de enzimas como a elastase neutrofílica,
39
e inativação de um inibidor da
enzima proteinase -1, produzindo destruição acelerada da elastina
dérmica.
40
18
Além disto, o tabagismo produz diminuição dos níveis de vitamina A
com conseqüente diminuição de umidade do estrato córneo facial,
produzindo um enrugamento prematuro devido a desidratação cutânea.
41,42
Estudos também mostraram que a estimulação dos leucócitos pelos
componentes do tabaco causa liberação dos íons superóxidos. Essa
liberação de radicais livres pode causar lesão tissular, diretamente pela
peroxidação lipídica ou indiretamente pela inativação das enzimas que em
circunstâncias normais protegeriam o tecido da ação proteolítica, como o
inibidor da α-1-proteinase. Esses radicais livres são normalmente
inativados pelo retinol, betacaroteno e tocoferol, porém nos tabagistas os
níveis séricos e cutâneos dessas substâncias são baixos.
43
Além disso, o fumo causa aumento da agregação plaquetária,
diminuição da formação de prostaciclinas, aumento da viscosidade
sangüínea e aumento da atividade plasmática da elastase, com formação
defeituosa da elastina, tornando a pele mais espessa e mais fragmentada.
43
Finalmente, o tabagismo gera aumento da hidroxilação do estradiol na pele,
determinando, nas mulheres, um estado hipoestrogênico que pode estar
associado com pele seca e atrófica e com piora do seu aspecto geral.
43,44
O
tabagismo altera qualidades da pele, tais como a cor, turgor, além de
aumentar as rugas faciais. Clinicamente “a pele do tabagista” é pálida,
cinzenta e enrugada.
45
Estudos de avaliação visual, demonstraram que
fumantes e ex-fumantes têm mais rugas faciais que os não fumantes. Além
disso, entre os fumantes, o risco relativo de possuir rugas de intensidade
19
moderada a grave parece aumentar após 11 anos-maço quando comparada
com a dos não fumantes e ex-fumantes.
17,46
Fatores cronológicos no envelhecimento
A maior função da pele é proteger os organismos de danos físicos e
ambientais. A pele também possui funções endócrinas, imunológicas e
neurais. Todas estas funções podem declinar com a idade devido alterações
histológicas em vários componentes da pele.
10,47
Clinicamente, a pele
envelhecida cronologicamente, sem dano solar, possui aumento da flacidez
e acentuação das rugas, mas não possui sinais do dano actínico como
alterações de pigmentação, coloração amarelada e telangectasias.
25-29
Histologicamente, na epiderme ocorre diminuição da proliferação e
diferenciação dos queratinócitos,
10
além de diminuição da sinalização
celular e resposta aos fatores de crescimento,
48-9
com conseqüente atrofia e
diminuição da barreira de proteção contra injúrias.
50
Na derme ocorre
diminuição no número de fibroblastos
10
e na resposta destas células a
fatores de crescimento,
51
com conseqüente diminuição na síntese de
colágeno.
52
Além disso, a fibra de colágeno se torna mais estável, e
resistente a degradação enzimática, mesmo quando danificada, resultando
em uma cicatrização anormal.
53
Também, há diminuição do componente
microfibrilar da elastina,
25
além de alteração estrutural, que a torna porosa e
fragmentada.
54
20
Menopausa
O envelhecimento fisiológico é acelerado no período pós-
menopausa. Alterações em nível celular incluem lentificação da divisão
celular, atrofia celular, alterações degenerativas no tecido conectivo e
diminuição da capacidade de reparação tecidual.
55
Neste período, as
mulheres relatam diminuição da hidratação da pele, perda da firmeza,
diminuição da elasticidade e aumento da flacidez.
56-9
Há uma correlação
positiva entre estes sinais e sintomas clínicos e fenômenos histológicos na
pele, destacando-se a atrofia epidérmica, diminuição do colágeno e
elastina, alteração na proporção entre colágeno tipo I e III, bem como
alterações na vascularização.
60-1.
O colágeno da pele de adultos, diminui em cerca de 1% a cada ano,
62
sendo este processo mais evidente em mulheres que em homens e acelerado
após a menopausa.
14
Nas mulheres, aproximadamente 30% do colágeno
total da pele é perdido nos cinco primeiros anos de pós-menopausa,
seguindo um declínio anual de 2,1%, por um período de 20 anos.
63
Esta
perda acelerada de colágeno na pós-menopausa agrava a formação de rugas
faciais na mulher.
64
A reposição/administração sistêmica e tópica de estrogênios reverte
esta tendência, aumentando o colágeno cutâneo e, consequentemente,
diminuindo o número e profundidade das rugas.
65-7
Estrogênios
21
Os estrogênios são os principais hormônios responsáveis pelas
características sexuais femininas, sendo o 17-β estradiol o estrogênio
natural mais importante.
68-9
Estes hormônios têm influência sobre o
funcionamento da maioria dos sistemas orgânicos no corpo humano,
sendo
a pele o maior órgão não reprodutor no qual os estrogênios agem.
70
Os estrogênios regulam diversas funções celulares, incluindo
proliferação, morfogênese, diferenciação e apoptose.
63
Os mecanismos de
ação estrogênica envolvem relações entre receptores estrogênicos
intranucleares e extranucleares e regulação na transcrição genética. Os
receptores estrogênicos são de dois tipos, receptor de estrogênio α (RE-α) e
receptor de estrogênio β (RE-β).
71
Os RE estão presentes em todas as
células do nosso corpo, inclusive na pele,
63
sendo os receptores α e β,
proteínas distintas, codificadas por genes separados, localizados em
cromossomos diferentes.
72
Tanto o 17β- estradiol quanto outras substâncias
estrogênicas como fitoestrogênios ligam-se a estes receptores. Em muitas
células os RE-α e RE-β coexistem. O RE-α é predominante na maioria dos
órgãos,
73
entretanto, o RE-β é o principal receptor expresso em ovários,
próstata, pulmão e hipotálamo.
74,5.
Na pele existem tanto RE-α quanto RE-
β, porém, se há predomínio de um receptor sobre o outro ainda não está
claro. Estudos baseados em imunohistoquímica demonstraram que o RE-α
não é detectado na pele, ou é detectado fracamente, enquanto que o RE-β, é
fortemente detectado na epiderme, glândulas sudoríparas, sebáceas e
22
folículos pilosos.
76-8
Por outro lado, um estudo, usando uma técnica mais
precisa que a imunohistoquímica, a captura com microdissecção a laser,
demonstrou que os níveis de receptores ER-α eram 10 vezes maiores que os
de ER-β na pele humana. Estes dados mostram que são necessários mais
estudos para identificar e quantificar os receptores de estrogênios na pele.
79-
81
Há duas formas de ligação dos estrogênios a seus receptores: a via
clássica na qual os estrogênios se ligam a receptores nucleares e, a via não
clássica, onde o hormônio se liga a receptores na membrana celular. Na via
clássica, os estrogênios mediam suas atividades pela interação e ativação de
receptores protêicos nucleares RE-α e RE-β.
71
Este complexo hormônio-
receptor ativa ou suprime a transcrição gênica em células específicas. Todo
este processo, da ligação à transcrição pode ocorrer em minutos a horas.
71,82
Além de RE intranucleares há RE-α e RE-β nas membranas
celulares, formando a via não clássica. Estes receptores de membrana são
especialmente importantes na ação dos estrogênios em tecidos não
reprodutivos como a pele. Após se ligar ao receptor estrogênico, o
complexo ligante ativa várias proteínas, funcionando como gatilho para
ativar o processo de transdução. Estes sinais de transdução regulam o
crescimento, diferenciação e apoptose celular.
83
Este mecanismo de
transdução mediado por estrogênios já foi demonstrado em células de
câncer de mama, com proliferação.
84-5
Pela mesma via estrogênios
23
promovem maior sobrevivência de osteoblastos e estimulam a
angiogênese.
86
A presença de RE na pele foi demonstrada pela primeira vez usando
estradiol radioativo.
86-7
Tanto RE-α quanto RE-β são demonstrados nos
queratinócitos da epiderme, nos fibroblastos dérmicos, glândulas sebáceas,
folículos pilosos, glândulas e vasos da pele.
48,71,88-9
A forte expressão destes
receptores nos fibroblastos dérmicos sugere a participação direta dos
estrogênios em estimular a síntese de colágeno via fator transformador de
crescimento- β.
90
Terapia de reposição hormonal
A terapia de reposição hormonal (TH) com estrogênios (TE), ou
estrogênios com progestogênios (TEP), melhora muitas queixas comuns às
mulheres na menopausa como fogachos, alterações de humor, atrofia do
epitélio genital, diminuição da libido e distúrbios do sono.
91
Igualmente
importante é o efeito benéfico dos estrogênios em diminuir o risco de
osteoporose, fraturas e o envelhecimento acelerado da
pele.
65-6,91
Enquanto os efeitos dos estrogênios em vários órgãos têm sido bem
esclarecidos (tabela 1),
76
a influência desses hormônios na pele é ainda
pouco conhecida.
24
Tabela 1. Sinais e sintomas relacionados ao hipoestrogenismo na pós-
menopausa, por sistema.
Adaptada de Hall G, Phillips TJ. Estrogen and skin: The effects of estrogen, menopause, and hormone
replacement therapy on the skin. J Am Acad Dermatol. 2005; 53(4): 555-68.
76
Sabe-se que a epiderme atrofia com a idade, e que esta atrofia pode
ser revertida com terapia estrogênica.
92
Várias estruturas envolvidas no
envelhecimento cutâneo estão sob efeito hormonal.
Demonstrou-se que estradiol estimula a proliferação e a síntese de
DNA em queratinócitos, resultando em espessamento da epiderme.
58,93-6
O
efeito estimulatório do estradiol sobre os queratinócitos ocorre por inibir a
apoptose destas células,
97
sendo mediado principalmente por RE de
membrana como ocorrem em outros tecidos não reprodutivos.
98
A terapia
de reposição com estrogênios também produz maior hidratação da pele por
diminuição da perda transepidérmica de água,
66,99
além de aumentar a
camada de lipídios epidérmicos.
14,100
Estas alterações epidérmicas no
aumento dos lipídios e na diminuição da perda de água sugerem que a
reposição hormonal preserva a função de barreira da pele e pode prevenir
seu ressecamento.
100
Cutâneo
Atrofia, ressecamento, prurido, perda de
elasticidade, flacidez, fragilidade
Musculo-esquelético
Osteoporose
Neuroendócrino
Fogachos, sudorese noturna, distúrbios
psicológicos
Genitourinário
Urgência e/ou incontinência urinária,
prolapsos uterino e/ou vesical, atrofia,
prurido, ressecamento e irritação vulvar,
dispareunia, vaginite
Imunológico
Aumento da reposta imune celular
25
A umidade cutânea não depende exclusivamente das funções
epidérmicas, a derme também contribui com esta capacidade de reter água
por conter substâncias hidrofílicas, as glicosaminoglicanas. As GAG
formam um gel amorfo, a substância fundamental, onde estão mergulhadas
as fibras de colágeno e elastina na derme que diminuem com o
envelhecimento.
101
A diminuição das GAG contribui não só com a
desidratação cutânea, mas também com o enrugamento e com a atrofia da
pele.
9
Estudos utilizando reposição hormonal com estrogênios
demostraram aumento importante do conteúdo das GAG, principalmente de
ácido hialurônico.
102-3
Vários estudos também demonstraram que a diminuição do colágeno
dérmico está mais relacionado com o tempo de pós-menopausa do que com
a idade cronológica, refletindo estreita relação com efeitos hormonais.
57-
8,104
Além disto, reposição hormonal com estrogênios aumenta o conteúdo
de colágeno dérmico.
9,59,61,66,93,105-6
Estrogênios previnem perda de colágeno
em mulheres com níveis iniciais de colágeno altos e estimula a síntese em
mulheres com níveis iniciais baixos, ou seja, é profilático no início da
menopausa e terapêutico na menopausa tardia.
71
Este efeito de redução do
colágeno cutâneo na pós-menopausa não é restrito apenas à pele, mas
também é observado em ossos e no trato urinário, e contribui na patogênese
da osteoporose e da incontinência urinária.
59
26
A maioria dos estudos já realizados examinando o efeito de
reposição de estrogênios, tanto oral quanto tópica sobre a pele, mostra
aumento da sua espessura e do conteúdo de colágeno dérmico.
60
Nestes
estudos, foram utilizados os métodos radiológicos, ultra-sonográficos,
biópsias com análise de microscopia óptica e eletrônica
58,59,60,93,105-6
para
avaliar o aumento da espessura e do conteúdo do colágeno.
Flacidez e aumento das rugas cutâneas são dois sinais de
envelhecimento relacionados com a perda da elasticidade da pele. Sabe-se
que a deprivação de estrogênios também está relacionada com alterações
degenerativas das fibras elásticas dérmicas,
65-6,99,107-9
e que há aumento da
síntese destas fibras após uso de creme contendo estriol.
60
O colágeno é relativamente inerte metabólicamente e, uma vez
formado, tende a permanecer no local por longos períodos.
110
Entretanto,
em certos tecidos, e em alguns estados patológicos, exibe uma rápida
destruição. O possível mecanismo de reabsorção não é o mesmo para os
diferentes tipos de colágeno e este mecanismo é sujeito a regulação tecidual
específica.
111
O colágeno é degradado por enzimas conhecidas por
metaloproteinases matriciais (MMP), essas enzimas são produzidas nos
mais diversos órgãos, inclusive na pele por queratinócitos, células
endoteliais e fibroblastos dérmicos.
27
Metaloproteinases
As enzimas que participam no processo de degradação e
remodelação da matriz extracelular são principalmente metaloproteinases
(MMPs) e serinoproteinases. As MMPs são uma família de proteases
dependentes de cálcio e zinco.
112-15
Na pele, as MMPs estão envolvidas no
processo de cicatrização, envelhecimento e lesões por dano solar.
111
Atualmente há cerca de 28 membros da família das MMPs catalogados. Os
vários tipos de metaloproteinases clivam não apenas colágeno dérmico,
mas também, GAGs, elastina e outros constituintes da matriz dérmica. As
MMP são agrupadas de acordo com o seu substrato em colagenases,
gelatinases, estromelisinas, matrilisinas, metaloproteinases de membrana e
serinoproteinases.
112-15
As colagenases são assim denominadas pela sua capacidade de
degradar a tripla hélice da molécula de colágenos intersticiais como os
tipos I, II e III. Fazem parte deste grupo a MMP-1 (sendo a principal
enzima deste grupo), a MMP-8 (estocadas em grânulos dos neutrófilos) e
MMP-13. As colagenases aparecem difusamente distribuídas nos tecidos e
em áreas de contato entre as células e os elementos matriciais,
116
mesmo
quando não há evidências de degradação da matriz, porém desaparecem
progressivamente nos processos de fibrose evolutiva, indicando sua
importância no equilíbrio entre síntese e degradação. A concepção
28
amplamente aceita preconiza interações complexas entre as colagenases e
seus inibidores e ativadores específicos.
116-7
As gelatinases atuam, sobretudo, em fragmentos já degradados pelas
colagenases bem como sobre o colágeno tipo IV e elastina. Fazem parte
deste grupo a MMP-2 (expressa em células vasculares) e MMP-9 (expressa
em macrófagos, polimorfonucleares e células vasculares).
112-15
As estromelisinas degradam proteoglicanos como o agrecano,
proteínas de ligação, fibronectina, laminina e os colágenos tipo III e IV.
Hidrolizam a matriz extracelular e podem ser expressas em fibroblastos,
condrócitos, células endoteliais, macrófagos e células musculares lisas
vasculares. Fazem parte deste grupo a MMP-3 (estromelisina 1) e MMP-10
(estromelisina 2). Ambas têm especificidade de substrato semelhante,
porém a MMP-3 apresenta uma eficiência proteolítica mais alta. Além de
digerir componentes da matriz extra-celular, a MMP-3 também ativa
outras metaloproteinases que se encontram ainda na forma inativa.
112-15
As matrilisinas degradam versican, elastina, fibronectina, colágeno
tipo IV entre outros. Fazem parte deste grupo a MMP-7 (matrilisina 1) e
MMP-26 (matrilisina 2). A MMP-7 é expressa principalmente em células
epiteliais glandulares, mas também em monócitos e células da parede
vascular. A MMP-26 é sintetizada durante a diferenciação do macrófago.
112-15
As metaloproteinases de membrana estão envolvidas na degradação
de colágenos do tipo I, II e III, e são capazes de ativar algumas outras
29
metaloproteinases da matriz. Fazem parte deste grupo as MMP-14, MMP-
15, MMP-16, MMP-17, MMP-24 e MMP-25, sendo expressas em células
do cerebelo, leucócitos do sangue periférico e células tumorais.
112-15
Sete são as metaloproteinases que não se classificam nestas
categorias acima citadas. A principal delas é a MMP-12 (metaloelastase)
expressa em macrófagos e responsável por digerir, sobretudo, a elastina,
além de outras proteínas da matriz extracelular. As outras
metaloproteinases deste grupo são: MMP-19, MMP-20, MMP-22, MMP-
23 e MMP-28.
112-15
Entre as serinoproteinases destacam-se a elastase de célula muscular
lisa e a elastase leucocitária cujos inibidores são respectivamente elafina e
alfa-2-macroglobulina. Outra serinoproteinase de alta importância é a
plasmina, que é um importante ativador das MMPs.
112-15
A atividade proteolítica das MMPs pode ser regulada em 3 níveis:
pelo controle da expressão gênica (regulação da transcrição), ativação das
pró-enzimas e inibição direta por inibidores teciduais de metaloproteinases
(TIMPs) ou outros inibidores como a α2-macroglobulina.
112-15
Todas as metaloproteinases são sintetizadas na forma inativa sendo
ativadas posteriormente, seja intra ou extracelularmente, sendo esta última
situação a mais comum para todas as enzimas descritas até o momento.
A principal via de ativação in vivo das MMPs é o sistema do
plasminogênio. A ativação das pró-MMPs se faz diretamente pela
plasmina. O plasminogênio é convertido em plasmina (enzima ativa) pelo
30
ativador de plasminogênio do tipo tecidual (t-PA) ou pelo ativador de
plasminogênio do tipo uroquinase (u-PA) que se encontram ligados a um
receptor na membrana celular, receptor u-PA (u-PAR). As principais
MMPs ativadas pela plasmina são proMMP-1, proMMP-3, proMMP-7,
proMMP-9, proMMP-10 e proMMP-13. Uma vez ativadas elas podem
participar da ativação de outras MMPs.
118
Estas enzimas estão envolvidas em vários processos fisiológicos de
remodelamento como reabsorção do conteúdo de colágeno uterino no pós-
parto, cicatrização de feridas, embriogênese, apoptose, inflamação,
angiogênese e envelhecimento. As MMP também participam da gênese de
vários processos patológicos como promoção de metástases tumorais,
absorção óssea na peridontite e osteoporose, na formação de aneurismas
arteriais, promoção de fibrose na cirrose hepática, fibrose cística e enfisema
pulmonar.
5
O mecanismo que regula o aumento da síntese de colágeno na pele
pelo estradiol, inclui o TGF- β, citocina multifuncional, com importante
papel na regulação do crescimento, diferenciação celular e biossíntese de
tecido conectivo extracelular.
119-23
Estrogênios aumentam a expressão de
TGF β na pele.
63
No esqueleto, a reposição de estrogênios aumenta a
produção de TGF-β diminuindo a reabsorção óssea pelos osteoclastos.
124
Esta citocina estimula a proliferação de fibroblastos na derme e induz a
síntese e secreção da maioria das proteínas da matriz extracelular (colágeno
31
I, III, VII, elastina e ácido hialurônico). O TGF β também inibe a
expressão das MMPs, incluindo a MMP-1, 2, 3 e 13, responsáveis pela
degradação das proteínas da matriz dérmica, como o colágeno.
125-8
O uso de 17- β estradiol tópico aplicado na pele do corpo de homens
e mulheres idosos aumenta a expressão de prócolágeno tipo I,
principalmente em mulheres.
129
Foi evidenciado também, que o uso tópico
de 17- β estradiol tópico pode estimular a síntese de colágeno e diminuir a
síntese de MMP-1 in vivo.
63
No entanto, o uso tópico ou sistêmico de estrogênios na pós-
menopausa ainda é uma assunto controverso, pois apesar de eliminar os
sintomas de menopausa,
127
diminuir o risco de fraturas vertebrais,
130-2
diminuir o risco de câncer coloretal,
63,133-4
melhorar as funções
cognitivas,
135
diminuir o risco de demência
132
e melhorar a qualidade de
vida,
136
ainda apresenta riscos bem definidos como o aumento de câncer de
endométrio,
136-7
de câncer de mama, de doenças cardiovasculares, AVC,
tromboembolismo, câncer de ovário e de bexiga.
136-9,140-3
Ainda não se sabe
se o uso de estrogênios tópicos na face teriam os mesmos efeitos benéficos
de atenuar o envelhecimento cutâneo, e ao mesmo tempo diminuir os
sintomas sistêmicos da menopausa. Além disto, mais estudos são
necessários para estabelecer a dose mínima necessária para se obter os
melhores resultados sem efeitos adversos sistêmicos.
99
32
OBJETIVOS
Objetivo Geral: Avaliar se o hormônio estradiol tópico 0,05%
aplicado à pele pode inibir a expressão da enzima MMP-1.
Objetivos Específicos:
1. Avaliar se o hormônio estradiol tópico 0,05% aplicado à pele,
por 30 dias, pode inibir a expressão da enzima MMP-1 em
queratinócitos.
2. Avaliar se o hormônio estradiol tópico 0,05% aplicado à pele,
por 30 dias, pode inibir a expressão da enzima MMP-1 em
fibroblastos.
3. Avaliar se o hormônio estradiol tópico 0,05% aplicado à pele,
por 30 dias, pode inibir a expressão da enzima MMP-1 em
células endoteliais.
33
MÉTODOS
PRECEITOS ÉTICOS
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital
Universitário Julio Muller da Universidade Federal de Mato Grosso. Todos
os pacientes do presente estudo foram avaliados segundo os preceitos da
Declaração de Helsinque e do Código de Nuremberg, e respeitadas as
Normas de Pesquisa Envolvendo Seres Humanos do Conselho Nacional de
Saúde (Res. CNS 196/96).
DESENHO DO ESTUDO E TAMANHO DA AMOSTRA
Estudo prospectivo, terapêutico, com intervenção. Considerando erro alfa
de 5% e poder de 80%, média de 3,54 e desvio padrão de 2,37,
79
e perda de
40% o tamanho mínimo da amostra, estimado pela fórmula n=2 + c (s/d)
2
é
de 13 pacientes.
144
Sendo n o tamanho da amostra, s o desvio padrão
estimado e d a diferença estimada entre as duas médias.
PACIENTES
Foram avaliadas 40 voluntárias, atendidas no ambulatório de
Climatério do Hospital Universitário Julio Muller da Universidade Federal
de Mato Grosso. As pacientes deste ambulatório que preencheram os
critérios do estudo foram convidadas a participar do projeto.
34
CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
Foram incluídas mulheres após a menopausa com idade entre 43 a 65
anos e sinais moderado/grave de envelhecimento cutâneo, desde que
fossem capazes de ler, dar aceite e assinar o Termo de Consentimento Livre
e Esclarecido. Mulheres com história de câncer de mama, câncer de
endométrio, alergias cutâneas ou doenças de pele com contra-indicação
para o uso de estrogênio tópico foram excluídas. A pesquisa seria suspensa
se houvesse intolerância ao uso de estradiol tópico.
ORIENTAÇÃO E PROCEDIMENTOS INICIAIS
Durante a entrevista inicial foi explicado às pacientes a finalidade da
pesquisa e os métodos utilizados. Explicou-se que no estudo seria avaliado
se o hormônio feminino estradiol aplicado em forma de gel na pele do rosto
poderia inibir a síntese da enzima metaloproteinase-1, que age destruindo o
colágeno da pele. Foi explicado que em mulheres no período de pós-
menopausa, o uso de terapia de reposição hormonal oral com estrogênios já
tinha se mostrado eficiente em reduzir a destruição do colágeno, inclusive
aumentando sua produção. Também foi explicado que o uso de estradiol na
forma de gel em face ainda não é usado rotineiramente e que se
conseguíssemos comprovar seus efeitos benéficos, esta via de aplicação
poderia no futuro ser melhor estudada e utilizada para reposição hormonal.
Foi explicado ainda que seria necessário realizar 2 biópsias de pele na
35
região pré-auricular direita, com 1 mês de intervalo entre elas, e que após a
primeira biópsia seria disponibilizado para a paciente o tratamento com
estradiol em gel (Sandrena gel®, 0,5mg/0,5g, Organon®, São Paulo) com
quantidade suficiente para uso em 30 dias. Após esta orientação inicial a
paciente optava por participar ou não da pesquisa. Se incluída, assinava o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, aceitando participar da
pesquisa. Após a anuência da paciente sua história médica completa era
obtida e solicitava-se exames de rotina do ambulatório de Climatério do
Hospital Universitário Julio Muller: hemograma, bioquímica, FSH, LH,
estradiol, pesquisa de sangue oculto nas fezes, citopatológico do colo de
útero, mamografia, ultrassonografia pélvica e densitometria óssea.
Para a realização dos exames laboratoriais foram coletados 10 ml de
sangue venoso de cada paciente, após 12 horas de jejum. As amostras
coletadas foram transferidas para tubos de coleta individuais e mantidos a
temperatura ambiente por 60 minutos e em seguida, centrifugadas por 15
minutos. O soro foi separado e armazenado a - 20ºC.
A dosagem de FSH foi realizada por quimioluminescência,
(Immulite FSH); Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA). Os
coeficientes de variação intra-ensaio obtidos executando uma amostra 10
vezes ao longo desse ensaio, nas concentrações de 6,9 mIU/ml, 17,1
mIU/ml e 51,3 mIU/ml foram , respectivamente, 6,2%, 3,1% e 3,5%. Os
coeficientes de variação inter-amostrais foram 3,8%, 6,2%, e 5,3% em
concentrações de 6,3 mIU/ml, 16,0 mIU/ml e 45,3 mIU/ml. Os resultados,
36
em mIU/ml, foram calibrados de acordo com a Segunda Referência
Internacional da Organização Mundial da Saúde (78/549).
A concentração do hormônio luteinizante (LH), foi mensurada por
radioimunoensaio (RIA), padronizado pela Primeira Preparação
Internacional de Referência da Organização Mundial de Saúde (68/40). O
teste tem sensibilidade de 0,15 mIU/ml e limite máximo de detecção de
200 mIU/ml. Os coeficientes de variação intra-ensaio obtidos nas
concentrações de 9,7 mIU/ml, 17,2 mIU/ml e 42,8 mIU/ml foram ,
respectivamente, 4,8%, 3,5% e 3,1%. Os coeficientes de variação inter-
amostrais foram 3,7%, 4,3%, e 3,3% em concentrações de 10,9 mIU/ml,
19,9 mIU/ml e 49,3 mIU/ml.
O nível de estradiol sérico foi determinado utilizando o kit comercial
Immulite (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA). A
sensibilidade do teste é de 20 pg/ml e o limite superior foi de 2.000 pg/ml.
Os coeficientes de variação intra-ensaio obtidos nas concentrações de 89
pg/ml, 229 pg/ml e 1,509 pg/ml foram , respectivamente, 7,0%, 3,5% e
3,6%. Os coeficientes de variação inter-amostrais foram 10,4%, 4,0%, e
5,6% nestas concentrações. Valores menores que o limite de detecção
foram considerados igual a 10 pg/ml.
Após avaliação, a paciente era submetida à primeira biópsia de pele
e, em seguida, recebia a medicação e era orientada sobre sua utilização. No
fim desta consulta foi agendado retorno em 30 dias para realização de nova
37
biópsia e finalização do estudo. Algumas características clínicas iniciais
das pacientes são apresentadas no apêndice 1.
BIÓPSIA DA PELE
COLHEITA DE FRAGMENTO DE PELE
No início do procedimento a paciente era deitada sobre cadeira de
cirurgia dermatólógica com cabeceira elevada num ângulo de 30°, com a
face voltada para o lado esquerdo. Em seguida foi feita antissepsia com
gaze estéril (Cremer®, Cremer S.A. Têxtil, Blumenau - SC) e álcool 70°
(Da ilha®, Da Ilha Comércio De Álcool LTDA, Almirante Tamandaré -
PR),em forma de circulo na região pré- auricular direita com raio de 4 cm.
Após antissepsia foi colocado campo fenestrado estéril (tecido de algodão
autoclavável) sobre o local da coleta. O anestésico cloridrato de lidocaína
2% sem vasoconstrictor (Ariston®, Ariston Indústria Química e
Farmacêutica LTDA, São Paulo - SP) foi aspirado do frasco com agulha
descartável 25x7 (Injex®, Injex Indústrias Cirúrgicas LTDA, Ourinhos -
SP) e seringa plástica descartável de 3ml (Injex®, Injex Indústrias
Cirúrgicas LTDA, Ourinhos - SP). Em seguida, a agulha de aspiração foi
trocada por agulha descartável de insulina 13x4,5 (Injex®, Injex Indústrias
Cirúrgicas LTDA, Ourinhos - SP) e realizada anestesia intradérmica,
utilizando 1 ml do anestésico, formando pequeno botão anestésico com 1x1
cm².
38
Figura 2. Pontos de coleta de biopsia de pele em região pré-auricular direita.
Uma amostra de pele foi colhida por biópsia da região pré auricular
direita com bisturi circular (punch) de 3mm (Kolplast®, Kolplast
Comercial e Industrial LTDA, São Paulo - SP). A primeira biópsia foi feita
em ponto localizado a 2 cm anterior ao tragus auricular direito e a biópsia
de controle era colhida após 1 mês de um ponto localizado a 0,5 cm abaixo
da cicatriz inicial. O material da biópsia foi acondicionado em frasco de
vidro contendo formol 10% (Atanor®, Atanor do Brasil LTDA, Porto
Alegre - RS). Após a retirada da amostra, foi realizada sutura simples, com
1 ponto, com mononylon 6.0 (Nm – 59 - Master®, Master Diagnóstica –
Produtos Laboratoriais e Hospitalares LTDA, São Paulo - SP). Em seguida
foi feito curativo com fita de micropore branco (1500 micropore branca
hipoalergênica carretel, 12,5mmx10m, 3M®, 3M do Brasil, Sumaré-SP).
As pacientes foram orientadas a retirar o curativo no início da noite e em
seguida aplicar diariamente gel de estradiol em toda face com movimentos
Primeira
biópsia
Segunda
biópsia
39
suaves diariamente. Foi usado estradiol tópico, na forma de sachê. Após a
1º biópsia a paciente recebia uma caixa contendo 30 sachês, sendo que cada
unidade continha 0,5mg de estradiol em 0,5g de gel (Sandrena gel®,
0,5mg/0,5g, Organon®, São Paulo-SP), foi aplicado uma vez ao dia, à
noite, durante 1 mês. As pacientes retornaram após um mês de tratamento
para a biópsia de controle e finalização do estudo.
PROCESSAMENTO DO MATERIAL DA BIÓPSIA
Após a coleta por biópsia, os fragmentos de pele com 3mm de
espessura foram colocados em frasco de vidro contendo 3 ml de formol a
10% (Exodo Científica®, Exodo Científica LTDA, Hortolândia-SP),
lacrados com tampa plástica, identificados e enviados ao laboratório de
patologia do Hospital Universitário Julio Muller da Universidade Federal
de Mato Grosso. No laboratório de patologia os fragmentos de pele foram
mantidos em solução de formol tamponado 10% (Exodo Científica®,
Exodo Científica LTDA, Hortolândia-SP) por 24 a 72 horas. Um único
patologista realizou a análise macroscópica do material de biopsia para
descrição macroscópica. Em seguida, os fragmentos foram colocados
individualmente em cestas próprias do processador de tecidos automático
(LuPe®, LuPe Industria e Comércio LTDA, São Paulo-SP) onde foram
desidratados em 4 banhos sucessivos de álcool 99,8% (Pro-Cito®, Pro-Cito
- Produtos Citológicos Soldan LTDA, Porto Alegre-RS), 50 minutos cada
40
banho; em seguida foram clarificados em 3 banhos de xilol (Exodo
Científica®, Exodo Científica LTDA, Hortolândia-SP) por 50 minutos cada
banho. O material foi então incluído individualmente em bloco de parafina
líquida a 65° C (Exodo Científica®, Exodo Científica LTDA, Hortolândia-
SP) por 2 minutos e em seguida os blocos foram colocados em geladeira
(Consul®, Indústria de Refrigeração Consul S.A., Joinvile-SC) a 6°C por
10 minutos para solidificação.
PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS
As lâminas de vidro foram colocadas no suporte, deixadas submersas
em detergente neutro (Detergente Limpol®, Bombril S.A., São Bernardo
do Campo-SP) por 30 minutos e posteriormente lavadas em água corrente.
Foram colocadas em estufa (Estufa AD®, AD Made Co. LTDA., Beesan-
Dong-Coréia) para secagem por 60 minutos. Após retiradas da estufa as
lâminas foram mergulhadas em solução contendo 40ml de silano 4%
(Exodo Científica ®, Exodo Científica LTDA, Hortolândia-SP) e 1000ml
de acetona (Exodo Científica ®, Exodo Científica LTDA, Hortolândia-SP)
por 3 minutos.Em seguida forma colocadas em estufa (Estufa AD®, AD
Made Co. LTDA., Beesan-Dong-Coréia) para secagem por 60 minutos.
PREPARAÇÃO DOS CORTES
Cada bloco de parafina foi colocados no micrótomo (LuPe®, LuPe
Industria e Comércio LTDA, São Paulo-SP) onde eram feitos seis cortes de
3 µm cada. Os cortes foram dispostos em lâminas de vidro silanizadas e
41
colocados em suportes na estufa (Estufa AD®, AD Made Co. LTDA.,
Beesan-Dong-Coréia) à 65°C por 10 minutos, para derreter o excesso de
parafina.
COLORAÇÃO COM HEMATOXILINA-EOSINA
Após retirada da estufa as lâminas contendo os cortes histológicos
foram mergulhadas em 2 banhos sucessivos de xilol (Exodo Científica ®,
Exodo Científica LTDA, Hortolândia-SP) com duração de 5 minutos cada.
Em seguida mergulhadas em 4 banhos rápidos de álcool 99,8°C (Pro-Cito®
Produtos Citológicos Soldan LTDA, Porto Alegre-RS). Em seguida as
lâminas foram colocadas em banho de hematoxilina por 2 minutos (Exodo
Científica®, Exodo Científica LTDA, Hortolândia-SP) lavados em água
corrente por 1 minuto e mergulhados em eosina (Exodo Científica ®,
Exodo Científica LTDA, Hortolândia-SP), por 40 segundos.
Posteriormente as lâminas foram submetidas a 3 banhos rápidos de álcool
99,8°C (Pro-Cito Produtos Citológicos Soldan LTDA®, Porto Alegre-RS),
seguidos de 2 banhos rápidos em xilol (Exodo Científica®, Exodo
Científica LTDA, Hortolândia-SP).
MONTAGEM E LEITURA DAS LÂMINAS
As lâminas foram então dispostas sobre bancada para montagem.
Pingou-se verniz cristal (Auto Color®, Becker Acroma, Wuppertal-
Alemanha) sobre os cortes, colocando-os em lamínulas de vidro. Após esta
42
etapa as lâminas foram lidas pelo mesmo patologista para laudo na
coloração hematoxilina-eosina.
IMUNOHISTOQUÍMICA
PREPARAÇÃO DOS CORTES
Na coloração para avaliação imunohistoquímica fez-se novo preparo
dos cortes de tecido. Os blocos de parafina foram colocados no micrótomo
(LuPe®, LuPe Industria e Comércio LTDA, São Paulo-SP) onde foram
feitos seis cortes de 3 µm. Os cortes foram dispostos em lâminas de vidro
silanizadas e colocados em suportes na estufa (AD®, AD Made Co.
LTDA., Beesan-Dong-Coréia) à 65°C por 10 minutos para derreter o
excesso de parafina. Em seguida as lâminas recebiam 3 banhos sucessivos
de xilol (Exodo Científica®, Exodo Científica LTDA, Hortolândia-SP)
com 5 minutos cada, seguido por 3 banhos rápidos de álcool 99,8°C (Pro-
Cito® Produtos Citológicos Soldan LTDA, Porto Alegre-RS) e lavagem
em água corrente por 1 minuto. As lâminas foram então imersas em cuba
contendo tampão citrato com ph 6.0 (Vetec®, Vetec Química Fina LTDA,
Duque de Caxias-RJ) e deixadas em “banho Maria” a 96,9°C por 45
minutos para recuperação dos tecidos. Após esta etapa as lâminas foram
deixadas esfriando em temperatura ambiente por 20 minutos.
BLOQUEIO DA PEROXIDASE
No processo de bloqueio da peroxidase endógena e conservação dos
sítios antigênicos, as lâminas foram mergulhadas por 15 minutos em
43
solução contendo 130 ml de peróxido de hidrogênio P.A (Sinth®,
LabSinth, Diadema-SP) e 1000 ml de água destilada (AM®, AM
Distribuidora, São Paulo-SP). Em seguida foram lavadas em 3 banhos
rápidos consecutivos em solução de soro tampão fosfato PBS (Sinth®,
LabSinth, Diadema-SP).
BLOQUEIO DAS PROTEÍNAS INESPECÍFICAS
Para o bloqueio das proteínas, que não as pesquisadas na peça de
tecido, as lâminas foram mergulhadas em solução contendo 2 gramas de
albumina bovina (Easypath®, Ebram Produtos Laboratoriais LTDA, São
Paulo-SP) e 200 ml de solução de tampão fosfato PBS (Sinth®, LabSinth,
Diadema-SP) por 10 minutos.
INCUBAÇÃO DAS LÂMINAS COM ANTICORPOS
As lâminas foram mergulhadas em solução de albumina bovina a 2%
(Easypath®, Ebram Produtos Laboratoriais LTDA, São Paulo-SP)
contendo o anticorpo primário anti-MMP-1 (Polyclonal antibody to MMP-
1 RP 089, RP 089-05. DBS - Diagnotic Biosystems®, Advanced Medical
Science Co. Ltda, Chatujak Bangkok, Tailandia), na diluição de 1:50. As
lâminas foram deixadas em bandejas com tampa a temperatura ambiente
por 90 minutos e, em seguida, lavadas com 3 banhos rápidos de solução de
tampão fosfato PBS (Sinth®, LabSinth, Diadema-SP). Colocou-se em
todos os cortes, o anticorpo de detecção (Mach 4 Mouse Probe-Biocare
Medical®, Biocare Material Médico hospitalar Ltda, Rio de Janeiro-RJ),
44
deixando a reação ocorrer por 15 minutos. Transcorrido este tempo, os
cortes foram novamente lavados com 3 banhos rápidos de solução de
tampão fosfato PBS (Sinth®, LabSinth, Diadema-SP). Completada a
reação, pingou-se sobre o material, gotas do polímero (Mach 4 HRP
Polymer-Biocare Medical®, Biocare Material Médico hospitalar Ltda, Rio
de Janeiro-RJ), para amplificação da reação, deixando esta reação ocorrer
por 30 minutos.
REVELAÇÃO E CONTRA-COLORAÇÃO DAS LÂMINAS
Após a reação antigeno-anticorpo, os cortes foram incubados em 5
ml de tampão fosfato PBS (Sinth®, LabSinth, Diadema-SP), 5 ml de
substrato de betazóide e 1 ml de Diaminobenzidina (Betazoide DAB
Substrate - Biocare Medical®, Biocare Material Médico hospitalar Ltda,
Rio de Janeiro-RJ) e deixados descansar por 3 minutos antes de lavar em
água corrente por 2 minutos.Em seguida, as lâminas foram então
mergulhadas em hematoxilina por 1 minuto e lavadas em água corrente por
2 minutos, desidratadas em 3 banhos rápidos sucessivos de álcool 99,8%.
Posteriormente foram submetidas a 3 banhos de xilol (Exodo Científica®,
Exodo Científica LTDA, Hortolândia-SP), para retirar o álcool do material,
facilitando a entrada de parafina na peça. As lâminas foram então dispostas
sobre bancada para montagem. Pingou-se verniz cristal sobre os cortes,
cobrindo-os com lamínula.
45
ANÁLISE DAS LÂMINAS
Nesta etapa as lâminas foram examinadas por 2 observadores
independentes. Através de método semiquantitativo quantificou-se a
expressão da MMP-1 em ordem crescente de intensidade de coloração,
como segue: 0 = ausência de expressão; 1+ = expressão fraca; 2+ =
expressão moderada; e 3+ = expressão forte
94
(Figuras 3,4,5). Antes da
análise foi escolhida uma lâmina padrão de cada grau de expressão da
enzima, para ser utilizada como comparação. Em caso de diferentes graus
de expressão na mesma lâmina, a área com expressão mais forte era
considerada. A expressão da metaloproteinase- 1 (MMP-1) foi avaliada
separadamente na amostra pré estrogenioterapia e na amostra obtida pós
tratamento. No caso de discordância entre os dois examinadores, a lâmina
foi examinada simultaneamente pelos 2 examinadores e chegou-se a um
consenso. O resultado da avaliação imuno-histoquímica consta no apêndice
2.
46
Figura 3: Microfotografia de espécimes de pele mostrando expressão da enzima
metaloproteínase - 1 em epiderme: a = ausência de expressão (0+); b = expressão fraca (1+); c
= expressão moderada (2+); d = expressão forte (3+).
Figura 4: Microfotografia de espécimes de pele mostrando expressão da enzima
metaloproteínase - 1 em células endoteliais: a = ausência de expressão (0+); b =
expressão fraca (1+); c = expressão moderada (2+); d = expressão forte (3+).
a
b
d
b
c
d
a
b
c
b
47
Figura 5: Microfotografia de espécimes de pele mostrando expressão da enzima
metaloproteínase - 1 em fibroblastos: a = ausência de expressão (0+); b = expressão
fraca (1+); c = expressão moderada (2+); d = expressão forte (3+).
ANÁLISE ESTATÍSTICA
A distribuição das variáveis foi examinada pelo teste de Lilliefors e
os resultados mostrados segundo sua distribuição. Variáveis com
distribuição normal são apresentadas como média e desvio padrão. As
variáveis com distribuição não paramétrica são descritas como mediana e
com intervalo de confiança de 95%. Os resultados são mostrados em
gráficos ou tabelas. Os escores imunohistoquímicos nos diferentes tipos
celulares foram analisados usando o teste não paramétrico Wilcoxon
signed-rank test, para amostras pareadas. Os resultados foram considerados
estatisticamente significantes quando p<0,05. Os dados foram analisados
usando o programa STATA 10.0
a
b
d
c
48
RESULTADOS
As características das pacientes incluídas são mostradas na
tabela 2. Em relação à idade, tinham entre 43 e 65 anos, média de
53,35 ± 5,3 anos (figura 6). Estavam na pós-menopausa entre 1 e 22
anos com mediana de 7 anos e intervalo de confiança de 95% de 1,71
anos (IC 5,29 – 8,71) (figura 7). Apenas duas pacientes (5%) tinham
profissões que exigiam maior exposição solar. Treze (32,5%) eram
tabagistas ou ex-tabagistas e oito eram brancas (20%), 10 eram negras
(25%) e vinte duas de outras raças (55%); (Tabela 2).
Figura 6: Distribuição das pacientes estudadas por idade por faixa
etária.
0
5
10
15
20
25
40-45 anos
46-50 anos
51-55 anos
56-60 anos
61-65 anos
Faixa etária
Série 1
c
Número de pacientes por faixa etária
Idade das pacientes segundo faixa etária (em anos)
Média de idade
40-45
46-50
51-55
56-60
61-65
49
Figura 7: Distribuição de pacientes em pós-menopausa em faixas etárias de
5 anos.
Tabela 2. Características sócio-epidemiológicas das pacientes estudadas.
0
5
10
15
20
25
1-5 anos
6-10 anos
11-15 anos
16-20 anos
21-25 anos
VARIÁVEL
N
%
Etnia
Brancas
8
20
Negras
10
25
Outras
22
55
Total
40
100
Tabagismo
Não
27
67,5
Sim
13
32,5
Total
40
100
Número de pacientes do estudo
Tempo de pós menopausa (em anos)
Anos de pós menopausa
Mediana
1-5
6-10
11-15
16-20
21-25
50
Efeito do tratamento tópico com estradiol na pele da face na expressão
da metaloproteinase 1(MMP-1) em queratinócitos.
Todos os queratinócitos mostraram expressão da MMP-1 antes do
tratamento. Após 30 dias de aplicação do estradiol na forma de gel na face
não houve aumento ou diminuição significativa na expressão desta enzima
nos pacientes.
Figura 8: Distribuição das pacientes por intensidade da expressão da
enzima metaloproteinase-1 em queratinócitos, antes e depois do uso de
estradiol tópico 0,05%.
0
5
10
15
20
25
30
0+
1+
2+
3+
Antes
Depois
Número de pacientes
Expressão da enzima
metaloproteinase-1
p=0,67
51
Em análise conjunta de todos os cortes, demonstrou-se que o uso de
gel contendo estradiol 0,05%, por 30 dias, não inibiu a expressão da enzima
metaloproteinase-1 nos queratinócitos da pele (p=0,067; Tabela 3).
Tabela 3: Comparação da expressão da enzima metaloproteinase-1 antes e
após tratamento com estradiol tópico 0,05% em queratinócitos.
Taxa de expressão (%)
Escore
Mediana
p
Tipo de célula
Tratamento
n
0
1
2
3
Queratinócitos
Pré
40
0,0
35,0
57,5
7,5
2
p=0,06698
Pós
40
0,0
35,0
62,5
2,5
2
Efeito do tratamento tópico com estradiol na pele da face na expressão
da metaloproteinase 1(MMP-1) em fibroblastos da pele.
Todos os fibroblastos mostraram expressão da MMP-1 antes do
tratamento. Após 30 dias de aplicação do estradiol na forma de gel na face
não houve aumento ou diminuição significativa na expressão desta enzima
nos pacientes.
52
Figura 9: Distribuição das pacientes por intensidade da expressão da
enzima metaloproteinase-1 em fibroblastos, antes e depois do uso de
estradiol tópico 0,05%.
A análise dos fibroblastos de todas as amostras, no conjunto de
pacientes, mostrou não haver diferença significativa entre as amostras
avaliadas antes e após o tratamento (p=0,15; Tabela 4).
0
5
10
15
20
25
30
0+
1+
2+
3+
Antes
Depois
Número de pacientes
Expressão da enzima Metaloproteinase-1
p=0,15
53
Tabela 4: Comparação da taxa de expressão da MMP-1 antes e após
tratamento com estradiol tópico 0,05% em fibroblastos.
Efeito do tratamento tópico com estradiol na pele da face na expressão
da metaloproteinase 1(MMP-1) em células endoteliais da pele.
Todas as células endoteliais mostraram expressão da MMP-1 antes
do tratamento. Após 30 dias de aplicação do estradiol na forma de gel na
face não houve aumento ou diminuição significativa na expressão desta
enzima nos pacientes.
Taxa de expressão (%)
Escore
Mediana
p
Tipo de célula
Tratamento
n
0
1
2
3
Fibroblastos
Pré
40
0,0
60,0
35,0
5,0
1
p=0,15
Pós
40
5,0
35,0
52,5
7,5
2
54
Figura 10: Distribuição das pacientes por intensidade da expressão da
enzima metaloproteinase-1 em células endoteliais, antes e depois do uso de
estradiol tópico 0,05%.
A expressão de MMP-1 e análise conjunta de todos os cortes em
células endoteliais não demonstrou diferença estatisticamente significativa
antes e após o tratamento. (p = 0,83; Tabela 5).
0
5
10
15
20
25
30
0+
1+
2+
3+
Antes
Depois
Número de pacientes
Expressão da enzima metaloproteinase-1
p=0,83
55
Tabela 5: Comparação da expressão da MMP-1 antes e após tratamento
com estradiol tópico 0,05% em células endoteliais.
Taxa de expressão (%)
Escore
Mediana
p
Tipo de célula
Tratamento
n
0
1
2
3
Células
endoteliais
Pré
40
0,0
37,5
55,0
7,5
2
p = 0,83
Pós
40
2,5
30,0
65,0
2,5
2
56
DISCUSSÃO
O processo de envelhecimento é um fenômeno dinâmico inevitável
que induz a redução progressiva de função em todos os sistemas do corpo.
O grau de envelhecimento depende de fatores genéticos, hábitos de vida,
medicamentos e fatores ambientais.
68
Na pele, a maior parte do processo
de envelhecimento ocorre a partir de repetitivos estímulos ambientais em
combinação com fatores de ordem cronológica.
68
Dentre os fatores
ambientais, o tabagismo e a exposição solar são os principais envolvidos no
envelhecimento precoce da pele.
Somado ao envelhecimento por estímulos ambientais, há o
envelhecimento natural ou cronológico. Em mulheres, este processo natural
de envelhecimento é acelerado com a diminuição dos níveis estrogênicos
na menopausa. Nas mulheres, o declínio nos níveis estrogênicos está
relacionado com uma variedade de alterações cutâneas, muitas das quais
reversíveis ou melhoradas pela terapia de reposição hormonal.
Dentre as alterações mais comuns nas mulheres pós-menopausa,
verifica-se a diminuição da espessura da pele, do conteúdo de colágeno e
elastina, aumento das rugas, ressecamento e dificuldade de cicatrização.
13-
16,49
Estudos prévios sobre os efeitos da reposição estrogênica na pele
usaram diferentes métodos diagnósticos e de mensuração, com diferentes
57
doses, tipos e vias de administração de estrogênios.
114
Alguns destes
estudos também usaram progestogênios ou androgênios em combinação
com estrogênios, produzindo diferentes resultados.
Tem-se observado melhora das rugas e hidratação da pele tanto por
exame clínico duplo cego, placebo controlado,
115
por fotos analisadas por
programas de computador,
116,117
quanto por profilometria
computadorizada.
58
Também há estudos avaliando dosagem de lipídios
cutâneos antes e após terapia de reposição.
7
Trabalhos também
demonstraram que espessura da pele está aumentada nas mulheres que
recebem terapia de reposição com hormônios.
15,50
Outros trabalhos
utilizando ultra-som demonstraram aumento da espessura epidérmica e
dérmica,
13,51,118-120
em acordo com análise de biópsias da pele que também
demonstraram aumento da espessura da epiderme e da derme.
51
A mensuração da espessura da pele tem estreita relação com o
conteúdo de colágeno e diversos trabalhos demonstraram o aumento desta
substância através de biopsia com análise por microscopia ótica e
eletrônica
16,66-8,121
e imunohistoquímica
14
A diminuição do conteúdo de colágeno na menopausa não se limita à
pele, também sendo observada no esqueleto e no trato urinário,
contribuindo para a patogênese da osteoporose, da incontinência urinária e
do prolapso genital.
16
58
Além de alterações no colágeno, também observou-se um aumento
na concentração e tamanho das fibras elásticas por biópsia após tratamento
com estradiol tópico.
66,120
Aumento dos níveis de ácido hialurônico foi
demonstrado em biópsias de pele após terapia de reposição.
114,121-3
Muitos desses estudos não levaram em conta fatores confundidores
como exposição solar e tabagismo, fatores reconhecidamente importantes
em influenciar o processo de envelhecimento cutâneo, resultando em
achados e conclusões conflitantes na literatura.
68
No estudo atual avaliou-se por imunohistoquímica, a expressão da
enzima metaloproteinase 1 (MMP-1) em queratinócitos, células endoteliais
e fibroblastos da pele. Verificou-se que o uso tópico de estradiol 0,05% na
pele de mulheres na pós menopausa por 30 dias, não resultou em inibição
da enzima MMP-1 na pele da face. Estes resultados divergem de
observação anterior.
20
No entanto, este estudo, utilizou o 17-β estradiol em
área fotoprotegida para aferir a atividade desta enzima através de Western
blot.
20
De fato, estudos têm demonstrado efeitos benéficos do tratamento
sistêmico e tópico com estrogênios em área fotoprotegida.
16,114,124-5
O fato
da nossa observação ter sido realizada em área da face, submetida a
fotoexposição crônica, pode ter contribuído para uma resposta alterada da
terapia estrogênica. Esta observação tem suporte em outros estudos que,
comparando síntese de colágeno em área fotoexposta e fotoprotegida
59
demonstraram, em áreas fotoexpostas, menor síntese de colágeno, a
despeito da expressão similar de receptores para estrogênios nestas
áreas.
35,126
Um estudo que utilizou etinil estradiol tópico em área
fotoexposta também não demonstrou melhora clínica da pele.
114
Vários estudos também não levaram em conta fatores confundidores
como exposição solar durante a vida e hábitos nocivos como o tabagismo,
que reconhecidamente tem influência nos sinais cutâneos de
envelhecimento. Um estudo mostrou que não houve diminuição de rugas
faciais em fumantes pós tratamento de reposição.
109
Além disso, foi demonstrado que a penetração do estradiol tópico e
sua atividade são similares nos locais de pele fotoprotegida e exposta ao
sol, avaliada pela quantificação de indução de expressão do gene GREB1
que é regulada diretamente pelos receptores estrogênicos.
O tempo transcorrido em ambiente hipoestrogênico também pode ter
contribuído para uma menor expressão da MMP-1 após tratamento. No
presente estudo o tempo de pós menopausa variou de 1 a 22 anos, com
mediana de 7 anos. É reconhecido que mulheres com menos de 2 anos de
privação estrogênica tem maior ganho na espessura da pele, em
comparação com mulheres em fases mais avançadas de pós menopausa.
124
As doses de estrogênios nestes estudos também são muito variáveis.
Estudos utilizando altas concentrações como 50mg de estradiol,
demonstraram efeito positivos,
124
enquanto estudos que utilizaram doses
60
menores como 5-10µg, não mostraram nenhuma resposta significativa.
59
Os
estudos também utilizaram diferentes hormônios como, estrógenos eqüinos
conjugados (Premarim®) e análogos sintéticos (estrogênios esterificados),
que diferem do principal hormônio humano, o estradiol, e inclusive, podem
ter diferentes efeitos in vivo.
145
Progestogênios são usualmente combinados com estrogênios, e
diferentes progestogênios usados em diferentes estudos podem contribuir
para resultados diferentes.
114
Também é possível que um tratamento mais longo, com doses
maiores de estrogênio, com um número maior de participantes e aplicação
em área fotoprotegida possa ter mais benefícios. O tempo de tratamento
também variou muito nos diferentes estudos, de 14 dias há 1 ano.
79,99,114
Investigações futuras deverão comparar o uso de estrogênios com e
sem associação com androgênios e progestogênios, diferentes
concentrações destes hormônios, diferentes vias de aplicação, aplicação em
área fotoexposta e fotoprotegida, além de estratificar sistematicamente
estas pacientes por tempo de deprivação estrogênica, idade, exposição solar
durante a vida, uso de protetor solar, tabagismo e nível basal de estradiol,
FSH e LH no início e durante o tratamento. Também deve ser avaliado qual
o tempo mínimo de tratamento para se obter uma resposta clínica e
laboratorial satisfatória. A avaliação laboratorial também deve lançar mão
de exames mais sensíveis para demonstrar os efeitos da terapia de
61
reposição e para avaliar se estes hormônios alcançam níveis plasmáticos
que confirmem sua ação.
62
CONCLUSÃO
A expressão imunohistoquímica da enzima MMP-1 não pareceu
sofrer alteração após o tratamento da pele com estradiol tópico 0,05% por
30 dias. Nesse sentido, estudos adicionais são necessários para melhor
compreensão de sua associação no processo do envelhecimento cutâneo em
mulheres na pós-menopausa.
63
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82
APENDICE 1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Você está sendo convidada para participar, como voluntária, da pesquisa
“Efeitos do estradiol tópico sobre a expressão da enzima metaloproteinase-1 em
células da pele ”. Após ser esclarecida sobre as informações a seguir, no caso de aceitar
fazer parte do estudo, assine ao final deste documento, que está em duas vias, uma delas
é sua e a outra é do pesquisador responsável. Em caso de recusa você não terá nenhum
prejuízo em sua relação com o pesquisador ou com a instituição que recebe assistência.
Em caso de dúvida você pode procurar o Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital
Universitário Júlio Müller- UFMT- pelo telefone (65) 36157254.
O objetivo deste estudo é avaliar se um creme contendo um hormônio feminino
conhecido como estradiol, pode reverter ou prevenir o envelhecimento da pele. Sua
participação nesta pesquisa consistirá em aceitar realizar uma biópsia na pele do rosto
próximo a orelha (será aplicada anestesia local injetável para que você não sinta dor, e
retirado pequeno pedaço de pele, do tamanho de um grão de arroz), em seguida, terá que
aplicar um creme contendo estradiol no rosto uma vez à noite por 1 mês. No final do
tratamento será colhida nova biópsia 1cm abaixo do local da primeira biópsia para
avaliar se o creme de estradiol conseguiu melhorar a pele. Será necessário que você
venha ao hospital 1 vez por mês para consulta e para que lhe entreguemos o
medicamento.
Os riscos relacionados com sua participação na pesquisa, são o escurecimento da
pele e a presença de 1 pequena cicatriz no local onde serão feitas as biópsias. Após a
coleta da biópsia poderá surgir pequeno hematoma no local da coleta que geralmente
desaparece por completo em 2 semanas. Os benefícios para você enquanto participante
83
da pesquisa, são uma possível melhora na pele do rosto, com diminuição da flacidez,
levando a um aspecto mais jovial. Obtenção sem custo de um tratamento
antienvelhecimento enquanto durar o estudo, e se comprovados seus benefícios, terá
uma opção de baixo custo para prevenir o envelhecimento da pele do rosto.
Os dados referentes à sua pessoa serão confidenciais e garantimos o sigilo de sua
participação durante toda pesquisa, inclusive na divulgação da mesma. Os dados não
serão divulgados de forma a possibilitar sua identificação. Seus dados aparecerão no
estudo apenas com as letras iniciais do seu nome e sua idade. Você poderá sair do
estudo a qualquer momento sem prejuízo algum á sua pessoa. Você receberá uma cópia
desse termo onde tem o nome, telefone e endereço do pesquisador responsável, para que
você possa localizá-lo a qualquer tempo. Seu nome é Dra. Luciana Neder,
dermatologista, que atende as quartas feiras pela manhã no ambulatório de climatério do
Hospital Universitário Julio Muller. (telefone comercial 36157340, telefone celular
92235800, e-mail [email protected]).
Considerando os dados acima, CONFIRMO estar sendo informado por escrito e
verbalmente dos objetivos desta pesquisa e em caso de divulgação por foto e/ou vídeo
AUTORIZO a publicação.
Eu (nome do
participante).................................................................................................................,
idade:........... sexo:...............Naturalidade:................portador(a) do documento RG
Nº:...............declaro que entendi os objetivos, riscos e benefícios de minha participação
na pesquisa e concordo em participar.
__________________________ __________________________
Assinatura do participante Dra. Luciana Neder
Cuiabá,_____de ______________de 20___.
84
APÊNDICE 2
Dados clínicos das pacientes incluídas no estudo.
IDENTIFICAÇÃO
IDADE
(ANOS)
TEMPO DE
MENOPAUSA
(ANOS)
TABAGISMO
EXPOSIÇÃO
SOLAR NO
TRABALHO
1
A.P.S.
50
1
N
N
2
A.L.F.
46
1
S
N
3
A.B.C.
65
10
N
N
4
A.M.S.
55
10
N
N
5
B.S.R.
52
1,6
S
S
6
B.E.
59
8
N
N
7
D.H.N.
44
1
S
N
8
D.A.R.M.
51
10
N
N
9
E.S.A.B.
52
3
S
N
10
E.M.S.M.
54
5
N
N
11
E.M. W.
51
3
N
N
12
E.M.M.
45
12
N
N
13
E.C.S.
53
10
S
N
14
E.P.R.F.
54
3
N
N
15
I.O.M.
60
9
N
N
16
J.C.R.
53
3
N
S
17
J.C.M.
50
8
N
N
18
J.N.
61
22
S
N
19
J.F.S.
52
3
N
N
20
J.S.F.
54
3
N
N
21
J.M.C.S.
54
11
N
N
22
L.F.S.
59
10
N
N
23
L.M.A.
56
12
N
N
24
L.A.P.
53
13
S
N
25
L.M.C.L.
46
1
N
N
26
M.G.S.
52
1
N
N
27
M.A.P..
43
1,5
S
N
28
M.G.A.
52
7
S
N
29
M.C.F.B.
53
5
N
N
30
M.G.M.
51
7
S
N
31
M.H.N.
45
5
N
N
32
M.M.O.
60
10
S
N
33
M.A.S.
51
5
N
N
34
M.F.R.
55
5
N
N
35
M.A.O.
60
13
S
N
36
N.F.S.
49
1
N
N
37
O.C.O.
53
3
N
N
38
O.S.N.
58
7
N
N
39
V.V.S.
58
17
S
N
40
Z.A.C.
65
20
N
N
85
APÊNDICE 3
Relatório imuno-histoquímico: Expressão da metaloproteinase 1 (MMP-1)
em “cruzes” (+) em biópsias de pele antes (A) e após tratamento (B) com
estradiol tópico 0,05%.
Caso/Estrutura
Queratinócitos
Células endoteliais
Fibroblastos
1A
2
2
2
1B
2
3
3
2A
2
1
1
2B
2
2
2
3A
2
1
1
3B
2
2
1
4A
1
1
1
4B
1
1
1
5A
1
2
1
5B
2
3
3
6A
2
2
2
6B
1
2
2
7A
1
2
1
7B
2
2
2
8A
1
1
1
8B
2
2
2
9A
1
1
1
9B
2
2
2
10A
2
2
1
10B
2
2
1
11A
1
1
1
11B
1
2
2
12A
1
1
1
12B
1
2
1
13A
1
1
1
13B
2
1
1
14A
2
2
2
14B
2
2
2
15A
2
2
2
15B
2
2
2
16A
3
3
3
16B
2
2
2
17A
3
3
2
17B
2
2
2
18A
2
2
2
18B
1
2
2
19A
2
2
1
86
19B
2
2
2
20A
2
2
2
20B
1
1
1
21A
1
1
1
21B
2
2
2
22A
1
2
2
22B
2
2
3
23A
2
2
2
23B
1
1
0
24A
2
1
1
24B
1
1
1
25A
1
2
1
25B
1
1
1
26A
1
1
1
26B
1
0
0
27A
2
2
1
27B
2
2
2
28A
3
3
3
28B
2
2
1
29A
1
2
1
29B
2
2
2
30A
2
1
1
30B
1
1
1
31A
2
2
2
31B
1
1
1
32A
2
2
2
32B
3
2
2
33A
2
2
1
33B
2
2
2
34A
1
1
1
34B
2
2
2
35A
2
2
2
35B
1
1
1
36A
2
2
2
36B
2
2
2
37A
2
2
2
37B
2
1
1
38A
2
1
1
38B
2
2
2
39A
2
1
1
39B
2
2
2
40A
2
2
1
40B
1
1
1
87
APÊNDICE 4
QUESTIONÁRIO PESQUISA
ESTRADIOL TÓPICO EM FACE PARA PREVENÇÃO DO ENVELHECIMENTO
IDENTIFICAÇÃO
NOME:
IDADE:
ENDEREÇO:
TELEFONE:
PROFISSÃO:
ESTADO CIVIL:
NUMERO DE FILHOS:
ANAMNESE
DUM:________________________________________________________________________
MOTIVO
MENOPAUSA:________________________________________________________________
TEMPO DE MENOPAUSA:_____________________________________________________
_____________________________________________________________________________
TERAPIA DE REPOSIÇÃO? QUAL? TEMPO DE UTILIZAÇÃO?______________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
TRATAMENTO DE PELE ANTERIOR/ATUAL:____________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
88
USA FPS:
_____________________________________________________________________________
DOENÇAS PRÉVIAS:
_____________________________________________________________________________
DOENÇAS ATUAIS:__________________________________________________________
MEDICAMENTOS EM USO: ___________________________________________________
_____________________________________________________________________________
CIRURGIAS:_________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
HISTÓRIA FAMILIAR:_________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
HÁBITOS:____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
EXAMES (___/___/___)
HEMOGRAMA
GLICEMIA
UREIA, CREATININA
TGO,TGP
COLESTEROL
FSH
LH
PROLACTINA
TESTOSTERONA
ESTRADIOL
CCO
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