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IVAN GLÁUCIO PAULINO LIMA
INVESTIGAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE SOBREVIVÊNCIA
DE MICRORGANISMOS EXTREMÓFILOS EM AMBIENTES
EXTRATERRESTRES SIMULADOS
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM CIÊNCIAS
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2 0 1 0
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Ficha Catalográfica
PAULINO-LIMA, Ivan Gláucio
Investigação das condições de sobrevivência de microrganismos
extremófilos em ambientes extraterrestres simulatos. Rio de Janeiro,
UFRJ, IBCCF, 2010.
x..., 256f.
Tese: Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica)
1. Astrobiologia 2. Atacama
3. Deinococcus radiodurans 4. Panspermia
5. Síncrotron
I Universidade Federal do Rio de Janeiro
II Título
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IVAN GLÁUCIO PAULINO LIMA
INVESTIGAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE SOBREVIVÊNCIA
DE MICRORGANISMOS EXTREMÓFILOS EM AMBIENTES
EXTRATERRESTRES SIMULADOS
Tese apresentada ao Programa de Doutorado em Biofísica,
do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito
parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Claudia de Alencar Santos Lage
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2 0 1 0
Où finit le teléscope, le microscope commence.
Lequel des deux a la vue la plus grande?
Onde o telescópio termina, o microscópio começa.
Qual dos dois oferece visão mais grandiosa?
Victor Hugo (Les Misérables, 1862)
A still more glorious dawn awaits
Not a sunrise, but a galaxy rise
A morning filled with 400 billion suns
The rising of the Milky Way
Uma alvorada ainda mais gloriosa aguarda
Não um nascer do Sol, mas um nascer da Galáxia.
Uma manhã preenchida com 400 bilhões de sóis.
O nascer da Via Láctea.
Carl Sagan – A Glorious Dawn ft Stephen Hawking
http://www.symphonyofscience.com/
Agradecimentos
Sou grato pelo momento em que vivo, pela crescente liberdade de questionar a
realidade, utilizando o método científico para investigar a natureza. Ao contrário da tendência
geral da pesquisa contemporânea, dirigida pelo mercado ao que convém conhecer, este
trabalho se baseia na legítima curiosidade a respeito de uma das questões mais profundas da
humanidade. Talvez este tipo de curiosidade jamais teria sido despertada na ausência das
pessoas e entidades que também contribuíram direta ou indiretamente para alimentá-la.
Desejo portanto declarar meus agradecimentos:
À minha orientadora Professora Claudia de Alencar Santos Lage pelo incentivo, por
acreditar na linha de pesquisa, por acreditar no meu potencial proporcionando oportunidades
de crescimento pessoal e profissional ao longo desses anos.
Ao Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de
Janeiro (IBCCF/UFRJ) por ter me aceitado como aluno, por ter me oferecido esta
oportunidade de crescer profissionalmente.
Às agências de fomento à pesquisa: Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) pelas bolsas de doutorado, doutorado sanduíche no exterior
e por financiar projetos de pesquisa, bem como à Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à
Pesquisa (FAPERJ) pelo financiamento de projetos de pesquisa do laboratório de
Radiobiologia Molecular do IBCCF/UFRJ, e à Royal Society por financiar materiais de
consumo e missões científicas no exterior.
À todos os amigos do Laboratório de Radiobiologia Molecular do IBCCF/UFRJ:
Professor Álvaro Augusto da Costa Leitão, Janine Rurr, Gabriel Dalmaso, Marcelo de Pádua,
Alicia Viviana Pinto, Cláudia Ribeiro, Léo Vidal, Tula Celeste e Raoni, Rita, Marcus, Larissa,
Roberto, Luciana, Deise, Adriana, Sílvia, Tatiana, Nisrreen, Carla, Bárbara, Suzana, Juliana,
Renata, Gustavo, Carol, Alexandre, Amanda e Bruna pela agradável convivência.
Aos colegas do Laboratório de Radioproteção e Dosimetria do Rio de Janeiro
(IRD/RJ), pela troca de cepas bacterianas e de conhecimento científico: Dr. Carlos Eduardo
Bonacossa de Almeida, Hugo Leonardo do Valle, Leonardo Gonçalves de Oliveira e Amanda
Valle de Almeida Paiva.
Ao pessoal do IBCCF/UFRJ: Adalberto Vieyra, Marcelo Morales, Jennifer Lowe,
Thiago Britto, Ronaldo Mohana, Narcisa Leal e do Instituto de Física da UFRJ (IF/UFRJ):
Professor Emérito Fernando Souza Barros e Professor Ricardo Barthem.
Aos companheiros de pesquisa do Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes
(IMPG/UFRJ), Professor Alexandre Soares Rosado e Lia Teixeira.
Ao Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) pelo suporte aos projetos de
pesquisa, e a todos os pesquisadores, estudantes, técnicos e funcionários que conheci por lá:
João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa, Arnaldo Naves de Brito, Sérgio Pilling, Diana
Pilling, Givanil, Zildene, Fabiana, Carol, Andréia, Veruska, Celisa, Jörg, Tatiana Brasil,
Vanessa, Lorrayne, Camila, Tatiana, Mariane, Guga, André Luiz, Andres Cernadas, Carol,
Aline, Gustavo Arruda, Marcão, Yuri, Thiago, Daniel, Carlos, Ísis, Natália e os pesquisadores
das linhas TGM e SXS, Reginaldo e Fábio.
Ao pessoal do Laboratório de Microbiologia Ambiental da Universidade de São Paulo
(LMA/USP): Vivian Pellizari, Rubens Duarte, Cris Nakayama, Emanuele Kuhn e Dani, bem
como do Instituto de Astronomia, Geofísica e Ciências Atmosféricas da USP (IAG/USP):
Eduardo Janot Pacheco, Douglas Galante e Jorge Horvath e da Universidade Presbiteriana
Mackenzie de São Paulo, e professora Adriana Válio pelas importantes contribuições
científicas.
Aos professores da Universidade Estadual de Londrina (UEL), Luis Carlos Bruschi,
Dimas Zaia, Rute Helena Trevisan por me mostrarem um mundo muito maior do que os meus
olhos alcançavam e aos professores Rogério Fernandes, André Vanzela e Paulo Ruas por me
mostrarem o maior espetáculo da Terra - a evolução das espécies. Às professoras Márcia
Cristina Furlaneto e Maria Helena Pelegrinelli Fungaro pela minha formação acadêmica
básica, por me iniciarem na carreira de pesquisador e por me concederem a oportunidade de
fazer parte da sétima geração científica desde Gregor Mendel.
Ao Grupo de Estudo e Divulgação de Astronomia de Londrina (GEDAL) por ter
plantado uma semente que hoje se tornou uma carreira científica, sendo alguns nomes
importante mencionar: Miguel Fernando Moreno, fundador e presidente do GEDAL há mais
de 10 anos, sua esposa Lislaine, Rubens, Cadu, Saulo, Paulo Bonagura, Ney Rafael, Gisele e
João Paulo.
Aos profissionais do Centro de Estudos do Universo (CEU), por manterem acesa a
chama do fascínio científico através da excelência em divulgar astronomia e ciência em geral
e por proporcionarem e compartilharem momentos inesquecíveis: Johnny, Thiago, Paulo,
Mauro, Ronaldo, Andy, Alessandro, Glaciele e Silmara.
Aos amigos da comunidade científica internacional de astrobiologia: Katherine
Wright, Marina Quirino, Dimitra Atri, Shawn Goldman, Mark Claire, Jennifer Mobberley,
Kate Adamala, Aditya Chopra, Jimmy Saw, Julia DeMarines, Sanjoy Som, Eva Stueeken,
Damhnait Gleesson, Ximena Abrevaya, Rachel Horak, Emily Knowles, Lewis Dartnell, etc.,
por me proporcionarem momentos valiosos de discussão sobre esse fascinante
empreendimento científico que é a astrobiologia.
Aos nossos colaboradores chilenos Armando Azúa-Bustos e Rafael Vicuña, por
representarem uma parceria sólida nascida a partir da interação e troca de informações numa
das conferências internacionais de astrobiologia da NASA (Astrobiology Graduate
Conference - AbGradCon 2008).
Aos colegas do Instituto de Física e Astronomia da Open University: Professor Nigel
Mason, Professor Nicholas Braithwaite, Professor Paul Hatherly, Sandra Mills, Beverley
Harker, Tracey Woodcraft, Tracey Moore, Tracy Bartlett, Andy and Charles (taxi drivers),
Sylwia Ptasinska, Gosia Smialek-Telega, Radmila Panajotovic, Sohan Jeetha, Bhalamurugan
Sivaraman, Ania Kowalczyk, Andy Mason, Andy Carter, Agnieszka Stypczynska, Katarina,
Stefano, Vladimir, Mihal, Barc, Jonti, Robin, Yvonne, Callum, Jimena, Julia Barkans (Life
Sciences), etc.
Aos colegas do Planetary and Space Science Research Institute (PSSRI) da Open
University: Professor Charles Cockell, Dr. Manish Patel, Dr. Karen Olsson-Francis, Dr.
Richard Greenwood, Jon Mason, Paul Wilkinson, Annika Simpson, Tatjana Polacsek, Steve
Summers, Laura Kelly, Yoseph Araya, Sunitha, Angus, Graham, John Watson (Earth
Sciences), etc. Aos pesquisadores Dr
a
. Heather Davies e Dr. Gordon Imlach pelo acesso aos
microscópios eletrônicos. Aos colegas distribuídos em outros departamentos da Open
University: Thomas, Liliane, George, Osvaldo, Brian, Mark, Mihn, Bethany, etc.
À Dr
a
. Daisy Hirata e seu marido Tim Ray, por todo o apoio, pela amizade e por
constantemente me ajudarem a levar uma vida agradável durante o estágio sanduíche no
exterior. Ao Luciano Batista pela amizade e pelo contato no exterior durante experimentos no
síncrotron Diamond em Oxford.
Aos colegas da Dinamarca: Dr
a
. Nykola Jones, Dr. Soren Hoffmann e Kate Andersen
por possibilitarem o uso das instalações do síncrotron Astrid em Aarhus, Dinamarca. Ao Kai
Finster e Jon Merisson pela troca de informações e pelas discussões sobre câmaras de
simulação de Marte. Ao Lutz, Julia e Natalyia pela excelente convivência, pelos Fredagsbar
(bar das sextas-feiras), pelos inúmeros momentos inesquecíveis.
Aos colegas do Instituto de Medicina Aeroespacial da Alemanha (DLR): Professora
Gerda Horneck, Dr
a
. Petra Rettberg, Marko Wassmann e Anja Bauermeister pela excelentes
trocas de informações nas conferências internacionais na Europa e nos Estados Unidos.
Aos pesquisadores do síncrotron Diamond: Kawal Sawhney, Igor Dolbnyia, Andrew
Malandain e a secretária Sue Judge, por possibilitarem a execução dos experimentos na linha
de luz B16, pela atenção recebida e pela simpatia vivenciada.
Aos pesquisadores do Instituto de Física da Queens University Belfast, na Irlanda do
Norte: Professor Bob McCullough e Dr. Tony Merrigan por possibilitarem a realização dos
experimentos de irradiação com íons de carbono.
Ao Dr. John Robert Brucato do Osservatorio Astronomico di Arcetri em Florença, na
Itália e aos pesquisadores do Osservatorio Astronomico di Catania (Sicília), Gianni Strazzulla
e Giuseppe Baratta por possibilitarem a realização dos experimentos de irradiação com
prótons.
Ao pessoal do alojamento estudantil da Open University: Adrian Gray (responsável
pelos agendamentos), Victor, Haoda, Stephanie, Sammy e Violet (faxineira) pela convivência
saudável e agradável. Ao pessoal da pensão da Jean Gates em Tinkers Briedge: Carlo Alloca,
Gabriel Horeszka e Wi Pan Pan pela interação cultural.
Ao pessoal da república do sono, no condomínio Morada do Sol em Botafogo, no Rio
de Janeiro: Eduardo, Rafael, Renan, Turco e Jéferson pela amizade, pelos momentos de
discussões filosóficas e pela realização do I Ciclo de Seminários de Tema Livre da república
do sono.
Ao Lucas Paixão pela amizade, pelo caráter e por ter compartilhado espaço no
alojamento da UFRJ, onde morei por mais de 25% do tempo do meu doutorado.
Às amizades sem início e sem fim: Rodrigo Souza Grota, Erik Hatanaka Suzuki,
Amaury Alves Aparecido Júnior, Jéferson Nunes Fregonezi, Rubens Tadeu Delgado Duarte,
Fernando Lucas de Melo, Enelise Amado, Nina Padilha, por influenciarem na formação do
meu caráter, da minha ideologia e da minha personalidade.
Aos amigos de Seropédica: Henrique Trevisan, Patrícia Barizon, Sabrina, Fernanda e
todos os que conheci neste lugar pitoresco.
Aos amigos de Pirassununga, por quem tenho cada vez mais admiração: Família da
Dani (Joao, Bete, Giovana, Fernando, Davi, Olívia, Georgina e Alípio), Mauro e Mila, Milá,
Fernando Melo, Otávio, Marcus, Rodrigo Pion e Juliana, Fabi, Alóis, pessoal da banda
Suéteres (Igor, Lucas, Gabriel e Guinho), Mateus, Renata, Ricardo, etc, etc, etc...
À minha avó Maria Cordeiro Lima pelo caráter, pelo vigor, pela paciência, pela
serenidade e pela dedicação em educar e cuidar da grande família. Às minhas tias Anna
Heloisa Cordeiro e Arlinda Cordeiro pelo apoio durante toda a minha formação acadêmica.
Agradeço especialmente aos meus tios Cícero Antônio Lima e Célia de Castro Lima
que gentilmente me receberam no Rio de Janeiro e me forneceram total apoio durante todo o
doutoramento. Aos meus primos Laura e Daniel pela amizade, pelo carinho e pelos momentos
agradáveis em praias e baladas.
À minha prima Regina Lúcia dos Santos por ter me mostrado o bom caminho da vida,
pelas visitas agradáveis e pelas caronas para Marília durante a minha iniciação científica.
Ao meu irmão Glauco Paulino Lima que, junto com sua esposa Marcela Raquel Lima
me recebeu de braços abertos nos Estados Unidos nas duas ocasiões em que tive a
oportunidade de visitá-los, por ocasião das conferências da NASA. Aos amigos Régis, Jorge,
Ane e Luíza pela amizade, hospitalidade e carinho.
À minha irmã Ana Gláucia Paulino Lima, por quem tenho um carinho muito especial,
pelas orações sinceras e conselhos inspiradores.
Aos meus pais, Carlos Roberto Lima e Nair Paulino Lima, que, sem medir esforços,
me proporcionaram todas as oportunidades para que eu chegasse até aqui, aos quais devo tudo
o que sou.
Meus sinceros agradecimentos!
Dedicatória
Dedico esta tese de doutorado para o grande amor da minha vida
Daniele Fernanda Rosim, por sentir a emoção sincera em seus olhos nas
abstrações infinitas, nas densas elucubrações sobre o futuro da humanidade e
sobre o futuro das nossas próprias vidas. Hoje, o futuro já não é mais
suficiente para representar nossas conquistas, pois já temos uma história
juntos. Tenho imenso prazer, satisfação e orgulho por ter compartilhado todos
os momentos durante o desenvolvimento deste trabalho ao lado de uma pessoa
tão especial, tão bonita, tão sábia e inteligente, cujas qualidades não cabem
em palavras. A Dani é de fato a maior inspiração da minha vida.
ix
PAULINO-LIMA, Ivan Gláucio. Investigação das condições de sobrevivência de
microrganismos extremófilos em ambientes extraterrestres simulados. Tese (Doutorado
em Ciências) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, 2010.
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivo principal ampliar o conhecimento
sobre os limites físico-químicos para a existência de vida em ambientes extraterrestres,
investigando a capacidade de sobrevivência de modelos biológicos submetidos a ambientes
extremos simulados, considerando parâmetros como pressão, temperatura e radiação,
atuando separadamente ou em conjunto. Os modelos biológicos utilizados foram a bactéria
Deinococcus radiodurans, utilizada na maioria dos experimentos, e a cianobactéria
Chroococcidiopsis sp., utilizada apenas nos últimos experimentos. As medidas de inativação
bacteriana foram obtidas através de curvas de sobrevivência em função dos tempos de
exposição aos tratamentos. De acordo com os resultados obtidos, a presença de substâncias
orgânicas nas amostras evita a perda da viabilidade das células expostas ao vácuo
equivalente à baixa órbita terrestre (10
-5
Pa) por várias semanas, e é mais importante do que
eventuais microambientes preservados em grãos micrométricos. Além disso, células
embebidas em uma camada de poucos micrômetros, constituída por uma matriz orgânica
cristalizada após desidratação, se beneficiam da proteção contra as radiações ultravioleta
(UV) e ultravioleta de vácuo (UVV) e permanecem viáveis por longos períodos de tempo
com frações de sobrevivência superiores a 0,1%. A presença de grãos de basalto com
dimensões micrométricas afeta a sobrevivência microbiana após irradiação aguda com feixe
de raios-X (1 keV a 20 keV) em condições de baixo vácuo (200 Pa). Provavelmente este
efeito é devido a produção de fotoelétrons pela interação da radiação com os grãos, já que
este fenômeno foi mais evidente para os grãos de basalto, que apresentam muito mais
elementos pesados em sua composição. Ao contrário do que ocorre com a irradiação
eletromagnética ionizante, os grãos micrométricos são capazes de proteger células
microbianas contra a irradiação ionizante com feixe de partículas carregadas (elétrons,
prótons e íons de carbono), mesmo para energias muito superiores às do vento solar. Já para
energias comparáveis às do vento solar (2 keV a 4 keV), não foi observada nenhuma
diferença na sobrevivência microbiana entre células livres ou protegidas por qualquer um dos
dois tipos de grãos rochosos (basalto ou arenito). Além das curvas de sobrevivência obtidas
sob condições experimentais inovadoras, foi feito também um trabalho em colaboração com
pesquisadores chilenos utilizando amostras de solo do deserto do Atacama, considerado um
ambiente análogo a alguns locais da superfície do planeta Marte. O objetivo foi isolar
microrganismos resistentes a radiação ultravioleta para testes em novas câmaras de
simulação em fase de construção em São Paulo. A utilização de instalações que simulam
ambientes extraterrestres para o isolamento de novos microrganismos se mostrou eficiente, e
representa uma boa ferramenta para a utilização de recursos biológicos com possíveis
aplicações em diferentes setores, como por exemplo a própria exploração espacial. O
conjunto de dados experimentais é favorável a uma versão moderna da hipótese da
Panspermia, em que formas microscópicas de sistemas biológicos minimamente protegidos
em grãos de poeira, são capazes de se dispersar por diferentes regiões do espaço,
contribuindo para uma transferência horizontal de genes em nível galáctico. Esta é a primeira
tese experimental em astrobiologia desenvolvida no Brasil.
Palavras-chave: Astrobiologia, Atacama, Deinococcus radiodurans, Panspermia, Síncrotron.
x
PAULINO-LIMA, Ivan Gláucio. Investigation of survival conditions of extremophilic
microorganisms in simulated extraterrestrial environments. Thesis (Ph.D. in Sciences) -
Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de
Janeiro, RJ, 2010.
ABSTRACT
This study aimed to expand knowledge about the physical-chemical
limits for life on extraterrestrial environments, investigating the survivability of biological
models subjected to simulated extreme environments, considering parameters such as
pressure, temperature and radiation, acting separately or simultaneously. The biological
models used were the bacterium Deinococcus radiodurans, which was used in most
experiments, and the cyanobacteria Chroococcidiopsis sp., used in the final experiments only.
Measurements of bacterial inactivation were obtained by survival curves as a function of
exposure times to treatments. According to the results, the presence of organic substances in
the samples avoids the loss of cell viability when cells are exposed to the vacuum equivalent
to the low earth orbit (10
-5
Pa) for several weeks, and it is more important than any
microenvironment preserved in micrometric grains. Moreover, cells embedded in a layer few
micrometers thick, comprising an organic matrix, crystallized after dehydration, benefit from
protection against ultraviolet (UV) and vacuum ultraviolet (VUV) remaining viable for long
periods of time, with survival fraction greater than 0.1%. The presence of micrometric grains
of basalt affects microbial survival after acute irradiation with X-ray beam (1 keV to 20 keV)
in low vacuum (200 Pa). Probably this effect is due to the production of photoelectrons by
interaction of radiation with the grains, since this phenomenon was most pronounced for
grains of basalt, which have more heavy elements in their composition. Contrary to what
occurs with ionizing electromagnetic radiation, micrometric grains are able to protect
microbial cells against ionizing radiation beam of charged particles (electrons, protons and
carbon ions), even for energies much higher than those of the solar wind (2keV). As for
energy comparable to the solar wind (2 keV to 4 keV), there was no difference in survival
between free cells or cells protected by any of the two types of rocky grains (basalt or
sandstone). Besides the survival curves obtained under innovative experimental conditions,
part of this work was also done in collaboration with Chilean researchers using samples of
soil from the Atacama Desert, considered an environment similar to some places on the
surface of Mars. The goal was to isolate microorganisms resistant to ultraviolet radiation for
testing under new simulation chambers, which are now being constructed in São Paulo. The
use of facilities that simulate extraterrestrial environments for the isolation of new
microorganisms was efficient and represents a good tool for the use of biological resources
with potential applications in different sectors, such as space exploration itself. The set of
experimental data supports a modern version of the Panspermia hypothesis, in which
microscopic forms of biological systems minimally protected from dust grains, are able to
disperse in different regions of space, contributing to a horizontal gene transfer in a galactic
level. This is the first experimental thesis in astrobiology developed in Brazil.
Keywords: astrobiology, Atacama, Deinococcus radiodurans, Panspermia, Synchrotron.
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Localização geográfica das amostras coletadas no deserto do Atacama. 1. Laguna
Llamara (21°16‟07.54”S, 69°37‟03.90”W. Altitude: 751m); 2. Sitio Cuarzos B2
(23°48‟59.15”S, 70°29‟25.59”W. Altitude: 538m); 3. Capa Negra La Portada (23°29„
58.61”S, 70°25‟42.10”W. Altitude: 27m); 4. Gypsum (23°49‟01.14„‟S, 70°29‟22.98„‟W.
Altitude: 531m); 5. Sitio 3 S4 (23°49' 10.76„‟S, 70°28‟36.77„‟W. Altitude: 736m). .............. 47
Figura 2. Fotografia da lâmpada de hidrogênio mostrando os principais componentes do
aparato experimental................................................................................................................. 49
Figura 3. Sistema de irradiação com luz UV (λ=254nm) na linha de luz CD1 do síncrotron
Astrid, Aarhus, Dinamarca. No detalhe à esquerda, amostras posicionadas nos discos
metálicos e à direita o sistema de irradiação a ser posicionado contra o feixe. ........................ 56
Figura 4. Posicionamento das amostras na direção do feixe (esquerda) e exposição das
amostras ao feixe (direita) mostrando a cobertura de toda a amostra pela área irradiada. ....... 58
Figura 5. Espectro da linha de luz TGM com o filtro harmonico do gás neônio, atenuando o
fluxo de fótons com energia acima de 21,5eV. Para comparação, o ponto denominado “H
Lamp” se refere ao fluxo de fótons da radiação Lyman-alfa (λ=121,6nm) emitida pela
lâmpada de hidrogênio, também utilizada neste estudo. ......................................................... 59
Figura 6. Esquema e foto do Simulador Solar Oriel modelo 91192-100 (Newport) e foto do
porta amostra utilizado para as irradiações............................................................................... 62
Figura 7. Espectro de emissão do Simulador Solar em comparação com o espectro solar na
região da órbita da Terra (ASTM E490). ................................................................................. 62
Figura 8. Micrografias ópticas de células de D. radiodurans misturadas com grãos de basalto
(esquerda) e arenito (direita)..................................................................................................... 69
Figura 9. Visão geral do porta amostras carregado com 72 amostras. .................................... 70
Figura 10. A, Esquema da câmara mostrando o anel de metal utilizado para prender a folha
de kapton, a folha de kapton utilizada para vedar a câmara, o porta amostra e o sistema de
resfriamento. O porta amostra foi montado sobre o sistema de resfriamento previamente
afixado na flange superior. B, Detalhe do sistema de resfriamento mostrando as tubulações de
entrada e saída de água. ............................................................................................................ 72
Figura 11. A, Montagem do porta amostra sobre o sistema de resfriamento com os tubos
conectados às mangueiras com água corrente. B, Conjunto do porta amostra e sistema de
resfriamento dentro da câmara de irradiação. A seta mostra o sensor de temperature fixado
sobre o porta amostra para monitorar a eventual variação de temperature através de um
multímetro digital. C, Câmara de irradiação posicionada sobre a plataforma. D, O sistema de
resfriamento conectado à câmara manteve a temperatura a 20°C. E, Alinhamento do porta
amostra com o uso de um altímetro a laser. ............................................................................. 73
Figura 12. Espectros do feixe branco atenuado com folhas de alumínio, molibdênio, ouro e
carbono. Note que a presença de uma fina folha de carbono junto com o ouro tem somente a
xii
função de proteger a folha de ouro contra a radiação intensa. As fluências integradas (W)
estão mostradas por cm
2
. .......................................................................................................... 76
Figura 13. Etapas da pesquisa mostrando a localização geográfica do deserto do Atacama, no
Chile, as amostras sendo coletadas no campo e uma ilustração sobre o procedimento
experimental utilizado para determinar o número total de micrortanismos cultiváveis antes e
depois da irradição UV (diluição seriada e plaqueamento em meio de cultura. ...................... 83
Figura 14. Comparação dos efeitos da irradiação UV (λ>200nm) sobre D. radiodurans em
solução salina (NaCl 0,9%) utilizando diferentes filtros, conforme descrito na Tabela 17. .... 87
Figura 15. Comparação dos efeitos da irradiação com o simulador solar (λ>200nm) sobre D.
radiodurans em solução salina (NaCl 0,9%) ou em meio de cultura. ...................................... 88
Figura 16. Comparação dos efeitos da irradiação com o simulador solar (λ>200nm) e com a
lâmpada de mercúrio (λ=254nm), sobre D. radiodurans (Deira) em solução salina NaCl 0,9%)
ou meio de cultura (MC), em comparação com células de E. coli irradiadas com lâmpada de
mercúrio. ................................................................................................................................... 88
Figura 17. Amostras depositadas em 2 tipos de substratos, mostrando 3 situações distintas: A,
monocamada de células formada sobre filtro Millipore. B, superfície da fita de carbono
mostrando regiões de empilhamento de células. C, células embebidas na matriz formada
através da cristalização do meio de cultura após desidratação. Uma análise computadorizada
da superfície da fita de carbono é mostrada em D. ................................................................... 90
Figura 18. Comparação dos efeitos da irradiação com a lâmpada de hidrogênio (λ=121nm) e
com o simulador solar (λ>200nm) sobre células desidratadas de D. radiodurans................... 91
Figura 19. Efeitos da irradiação com a lâmpada de xenônio (λ=145nm) sobre células
desidratadas de D. radiodurans. A barra de erro de um dos pontos é inferior ao tamanho da
marca. ....................................................................................................................................... 92
Figura 20. Comparação dos efeitos da irradiação na linha de luz CD1 do Laboratório
Síncrotron Astrid (λ=254nm) e na linha de luz TGM do LNLS (λ>57,47nm) sobre células
desidratadas de D. radiodurans. ............................................................................................... 93
Figura 21. Comparação dos efeitos da irradiação com o Simulador Solar (λ>200nm) e com a
linha de luz TGM do LNLS (λ>57,47nm) sobre células desidratadas de D. radiodurans. ...... 94
Figura 22. Comparação dos efeitos da irradiação com a lâmpada de hidrogênio (λ=121nm) e
com o simulador solar (λ>200nm) sobre células desidratadas de D. radiodurans, na presença
de meio de cultura..................................................................................................................... 95
Figura 23. Comparação dos efeitos da irradiação com a lâmpada de xenônio (λ=145nm) e
com a linha de luz CD1 do Laboratório Síncrotron Astrid (λ=254nm) sobre células
desidratadas de D. radiodurans, na presença de meio de cultura............................................. 96
Figura 24. Comparação dos efeitos da irradiação com o Simulador Solar (λ>200nm) e na
linha de luz TGM do LNLS (λ>57,47nm) sobre células desidratadas de D. radiodurans, na
presença de meio de cultura. .................................................................................................... 97
xiii
Figura 25. Influência da concentração de células na fração de sobrevivência a 600J·m
-2
de
radiação UV na linha de luz TGM do LNLS (λ>57,47nm). Amostras contendo 10
4
, 5x10
4
,
10
5
, 5x10
5
, 10
6
, 5x10
6
e 10
7
células foram irradiadas com a luz síncrotron. O empilhamento de
células (>106 células por amostra) foi suficiente para aumentar a sobrevivência celular. ...... 98
Figura 26. Efeitos da irradiação com lâmpada de xenônio (λ=145nm) nas cepas selvagem
(esquerda) e mutante recA (direita) de D. radiodurans na presença (MC) ou ausência de meio
de cultura. ................................................................................................................................. 99
Figura 27. Efeitos da irradiação na linha de luz CD1 do Laboratório Síncrotron Astrid
(λ=254nm) nas cepas selvagem (esquerda) e mutante recA (direita) de D. radiodurans na
presença (MC) ou ausência de meio de cultura. ....................................................................... 99
Figura 28. Efeitos da irradiação na linha de luz TGM do LNLS (λ>57,47nm) nas cepas
selvagem (esquerda) e mutante recA (direita) de D. radiodurans na presença (MC) ou
ausência de meio de cultura. No gráfico da direita, a curva de sobrevivência do mutante recA
está comparada com a da cepa selvagem, uma vez que as amostras recA não resistiram aos
procedimentos experimentais na ausência de material orgânico. ........................................... 100
Figura 29. Influência da presença de material orgânico proveniente do meio de cultura na
sobrevivência de células irradiadas com o simulador solar (λ>200nm). ................................ 101
Figura 30. Influência da presença de grãos de arenito misturados (SST MC) ou não (SST)
com material orgânico nas amostras irradiadas com o simulador solar (λ>200nm). ............. 102
Figura 31. Influência da presença de grãos de basalto misturados (B + MC) ou não (B) com
material orgânico nas amostras irradiadas com o simulador solar (λ>200nm). ..................... 103
Figura 32. Sobrevivência das células misturadas com os 3 tipos de grãos. Os dados foram
obtidos dividindo-se os valores de recuperação dos controles externos pelos valores de
recuperação dos controles internos. ........................................................................................ 106
Figura 33. Curvas de sobrevivência de D. radiodurans, misturadas ou não com grãos de
basalto ou arenito, ao feixe branco de raios-X (>1 keV) atenuado com os seguintes
atenuadores e filtros: 2mm de alumínio, 50µm de molibdênio e 100µm de carbono + 10µm de
ouro. O valor mínimo do eixo vertical representa o máximo valor de inativação detectável
pelo método utilizado (10
-5
). O gráfico superior à direita mostra as fluências utilizadas. ..... 108
Figura 34. Curvas de sobrevivência de D. radiodurans, na presença ou ausência de grãos de
basalto ou arenito, ao feixe de 10keV, com irradiância de 2,53x10
3
W·m
-2
. .......................... 109
Figura 35. Curvas de sobrevivência de células livres de D. radiodurans, ao feixe
monocromado de raios-X (10keV), atenuado com diferentes atenuadores e filtros para atingir
as mesmas doses após diferentes tempos de exposição. Os valores no eixo horizontal
(abscissa) correspondem aos experimentos realizados com o feixe mais atenuado (maiores
tempos de exposição).............................................................................................................. 110
xiv
Figura 36. Simulação da penetração de elétrons de 2keV, com um feixe de 10nm de
diâmetro, em células de D. radiodurans, após 6min 45s de exposição, totalizando 7x10
4
elétrons. A simulação foi feita através do software CASINO v2.42. ..................................... 112
Figura 37. Curvas de sobrevivência de D. radiodurans na ausência (NC) ou presença de
grãos de arenito ou basalto (SST ou B) irradiadas com feixe de elétrons de 2keV................ 115
Figura 38. Simulação da energia depositada por um feixe de elétrons de 2keV, com 10nm de
diâmetro, em células de D. radiodurans, após 6min 45s de exposição, totalizando 7x10
4
elétrons. A simulação foi feita através do software CASINO v2.42. ..................................... 116
Figura 39. Simulação da trajetória de 10
5
prótons de 200keV em uma célula microbiana
utilizando o software SRIM. Note que o poder de penetração das partículas (2,83µm) é maior
do que o diâmetro da célula de D. radiodurans (~2µm). ....................................................... 117
Figura 40. Curvas de sobrevivência de D. radiodurans na ausência (NC) ou presença de
grãos de arenito ou basalto (SST ou B) irradiadas com feixe de prótons de 200keV. ........... 118
Figura 41. Imagens de microscopia eletrônica (SEM) de células de D. radiodurans irradiadas
(embaixo) ou não (em cima) com 10
13
prótons·cm
-2
. Células livres (esquerda) e células
misturadas com grãos de arenito (centro) e basalto (direita) são mostradas. ......................... 119
Figura 42. Imagens de microscopia eletrônica (SEM) de células de Chroococcidiopsis sp.
irradiadas (embaixo) ou não (em cima) com 10
13
prótons·cm
-2
. Células livres (esquerda) e
células misturadas com grãos de arenito (centro) e basalto (direita) são mostradas. ............. 120
Figura 43. Simulação da trajetória de 10
5
íons de carbono com energia de 4keV na parede
celular de uma célula microbiana. A profundidade do alvo, no eixo x, é dada em Angstrons
(Å). .......................................................................................................................................... 121
Figura 44. Curvas de sobrevivência de D. radiodurans na ausência (NC) ou presença de
grãos de arenito ou basalto (SST ou B) irradiadas com feixe de íons de carbono de 4keV. .. 122
Figura 45. A, Taxa de recuperação dos controles mantidos durante tempos crescentes em
condições ambientes (temperatura ~22°C, pressão ~1atm). B, Taxa de sobrevivência em
relação aos controles após diferentes tempos de exposição ao alto vácuo (10
-5
Pa). NC+CM,
células misturadas com meio de cultura; SST+CM, células misturadas com meio de cultura e
grãos de arenito; B+CM, células misturadas com meio de cultura e grãos de basalto; NC,
células livres; SST, células misturadas apenas com grãos de arenito; B, células misturadas
apenas com grãos de basalto. .................................................................................................. 123
Figura 46. Abundância de microrganismos totais presentes em amostras de 5 diferentes
localidades do deserto do Atacama (Chile), cultivados em 3 tipos de meio de cultura: (i) Agar
Marinho (MA), (ii) Lysogeny Broth (LB) e (iii) TGY. .......................................................... 125
Figura 47. Fração de sobrevivência (N/N
0
) a UV-C (300 J·m
-2
) dos microrganismos totais
presentes em cada tipo de solo diluídos em solução salina (1g/10ml), após incubação nos 3
tipos de meio de cultura: (i) Agar Marinho (MA), (ii) Lysogeny Broth (LB) e (iii) TGY. ... 125
xv
Figura 48. Isolamento de morfotipos pigmentados, com coloração variando entre amarela e
vermelha, e incubação nos 3 tipos de meio de cultura: (i) Agar Marinho (MA), (ii) Lysogeny
Broth (LB) e (iii) TGY. .......................................................................................................... 126
Figura 49. Inativação dos microrganismos presentes no solo 4 (Sitio 2 Gypsum) após
irradiação com diferentes doses de UV-C (λ=254nm). .......................................................... 126
Figura 50. Resistência a UV-C de 40 isolados provenientes de 5 solos diferentes do deserto
do Atacama. As barras foram coloridas de acordo com a pigmentação dos isolados. ........... 127
Figura 51. Curva de sobrevivência do isolado S3.300-2 ao UV-C, em comparação com as
curvas obtidas com a linhagem AB1157 de Escherichia coli e a linhagem selvagem de D.
radiodurans. ........................................................................................................................... 128
Figura 52. Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturação (DGGE) das sequências 16S
rRNA mostrando comunidades microbianas complexas em todas as amostras. 1-Laguna
Llamara, 2-Sitio Cuarzos B2, 3-Capa Negra La Portada, 4-Gypsum, 5-Sitio 3 S4. .............. 130
Figura 53. Sequência parcial do gene 16S rDNA do isolado LPMARS-1. ........................... 130
xvi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Desenho experimental para irradiação ultravioleta de vácuo (UVV) de D.
radiodurans com lâmpada de hidrogênio (λ=121,6nm). .......................................................... 50
Tabela 2. Desenho experimental para irradiação UVV de amostras de biofilmes epilíticos e
cepas de D. radiodurans com lâmpada de xenônio (λ=145nm). .............................................. 53
Tabela 3. Comparação entre as propriedades da lâmpada de xenônio e o fluxo de fótons do
Sol com comprimeto de onda de 145nm. ................................................................................. 54
Tabela 4. Desenho experimental para irradiação UV de cada material biológico na linha de
luz CD1 do síncrotron Astrid, Aarhus, Dinamarca. ................................................................. 57
Tabela 5. Desenho experimental para irradiação ultravioleta de vácuo (UVV) de D.
radiodurans com feixe branco (λ >57,47nm) na linha de luz TGM do laboratório síncrotron
LNLS. ....................................................................................................................................... 60
Tabela 6. Desenho experimental para irradiação das células em solução aquosa com o
Simulador Solar Oriel. .............................................................................................................. 64
Tabela 7. Desenho experimental para irradiação das células desidratadas, misturadas ou não
com meio de cultura, em presença ou ausência de grãos de arenito ou basalto. ...................... 65
Tabela 8. Elementos-traço presentes nos grãos de basalto e arenito, e na mistura 1:1. .......... 68
Tabela 9. Minerais presentes nos grãos de basalto e arenito, bem como na mistura 1:1. ....... 69
Tabela 10. Desenho experimental para irradiação de D. radiodurans com feixe branco de
raios-X da linha de luz B-16 do síncrotron Diamon, Reino Unido. ......................................... 75
Tabela 11. Desenho experimental para irradiação de microrganismos com feixe de elétrons de
2keV. ........................................................................................................................................ 77
Tabela 12. Detalhamento das irradiações com feixe de elétrons de 2keV. ............................. 78
Tabela 13. Detalhamento das irradiações com feixe de prótons de 200keV em células de D.
radiodurans. ............................................................................................................................. 79
Tabela 14. Detalhamento das irradiações com feixe de prótons de 200keV em células de D.
radiodurans misturadas com grãos de arenito. ......................................................................... 79
Tabela 15. Detalhamento das irradiações com feixe de prótons de 200keV em células de D.
radiodurans misturadas com grãos de basalto. ........................................................................ 80
Tabela 16. Detalhamento das irradiações com íons de carbono de 4keV. .............................. 81
Tabela 17. Irradiação de D. radiodurans em solução salina com o Simulador Solar utilizando
diferentes filtros, resultando em diferentes espectros. .............................................................. 86
xvii
Tabela 18. Tempo mínimo necessário (dias) para detecção da proliferação cellular ao
microscópio da cianobactéria Chroococcidiopsis sp. após irradiações com doses crescentes de
luz ultravioleta (λ=254nm) no laboratório síncrotron Astrid, Dinamarca. A incubação foi feita
a temperature ambiente (~22°C) utilizando ciclos naturais de presença e ausência de luz. ... 104
Tabela 19. Viabilidade dos controles externos e internos. Os valores de desvio-padrão (DP)
representam 24 replicatas para as amostras denominadas células livres e 15 replicatas para as
amostras correspondentes as células misturadas com grãos de basalto ou arenito. ............... 105
Tabela 20. Crescimento observado de Chroococcidiopsis sp. após irradiação com feixe
branco de raios-X (>1keV). Os valores representam o tempo mínimo necessário (dias) para
observar algum crescimento. .................................................................................................. 111
Tabela 21. Identificação molecular dos 14 isolados mais resistentes à radiação UV-C........ 129
Tabela 22. Comparação da sequência parcial do gene 16S rDNA do isolado LPMARS-1 com
as sequências depositadas no banco de dados NCBI mostrando os alinhamentos com maior
índice de similaridade. ............................................................................................................ 131
xviii
GLOSSÁRIO DE TERMOS
DNA
ASTRID
Al
amu
B
BLAST
B16
C
CD1
CDA
DGGE
DO
600
DLS
DL
10
DSB
LNLS
LET
Ly-α
MC
Mo
recA
NC
NCBI
Au
PCR
RNAr
rpm
SST
SGR
SRIM
TGM
UV
UVV
UFC
wt
XRF
xix
GLOSSÁRIO DE UNIDADES
°C
graus Celsius
µg
micrograma
µl
microlitro
µm
micrômetro
Å
ângstrom
cm
centímetro
eV
eletron-volt
g
grama
Gy
Gray
J
Joule
keV
quiloeletron-volt
kGy
quiloGray
kJ
quiloJoule
m
metro
mg
miligrama
MJ
MegaJoule
ml
mililitro
mm
milímetro
nm
nanômetro
Pa
Pascal
U.A.
unidades astronômicas
W
Watt (J·s
-1
)
λ
lambda (comprimento de onda)
SUMÁRIO
2.1. GERAL ........................................................................................................................... 42
2.2. ESPECÍFICOS ............................................................................................................... 42
3.1. CEPAS BACTERIANAS .............................................................................................. 43
3.2. MEIOS DE CULTURA ................................................................................................. 43
3.2.1. TGY ......................................................................................................................... 43
3.2.2. BG-11 ...................................................................................................................... 44
3.2.3. Meio de cultura LB ................................................................................................ 45
3.3. CONDIÇÕES DE CULTIVO ........................................................................................ 45
3.4. MATERIAL GEOLÓGICO ........................................................................................... 46
3.5. CURVAS DE SOBREVIVÊNCIA ................................................................................ 47
3.6. IRRADIAÇÃO ULTRAVIOLETA ............................................................................... 48
3.6.1. Lâmpada de hidrogênio (λ = 121,6nm) ................................................................ 48
3.6.2. Lâmpada de xenônio (λ = 145nm) ........................................................................ 51
3.6.3. Lâmpada de mercúrio (λ = 254nm) ...................................................................... 54
3.6.4. Feixe monocromático (λ = 254nm) na linha de luz CD1 do síncrotron ASTRID
(Dinamarca) ...................................................................................................................... 55
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 24
1.1. ORGANISMOS EXTREMÓFILOS ................................................................................. 24
1.2. DEINOCOCCUS RADIODURANS .............................................................................................. 26
1.3. EXPERIMENTOS EM ÓRBITA ...................................................................................... 29
1.4. A HIPÓTESE DA PANSPERMIA ................................................................................... 35
1.5. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA ......................................................................... 40
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 42
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................. 43
3.6.5. Feixe branco (λ >57,47nm) na linha de luz TGM do LNLS ............................... 58
3.6.6. Irradiação com simulador solar Oriel (λ > 200nm) ............................................ 61
3.7. IRRADIAÇÃO IONIZANTE (RAIOS-X) .................................................................... 66
3.7.1. Preparo das amostras ............................................................................................ 66
3.7.2. Porta amostras ....................................................................................................... 70
3.7.4. Câmara de irradiação ............................................................................................ 71
3.7.5. Irradiações .............................................................................................................. 74
3.8. IRRADIAÇÃO COM PARTÍCULAS CARREGADAS ............................................... 76
3.8.1. Elétrons ................................................................................................................... 76
3.8.2. Prótons .................................................................................................................... 78
3.8.3. Carbono .................................................................................................................. 81
3.9. EXPOSIÇÃO PROLONGADA DE Deinococcus radiodurans AO ALTO VÁCUO .. 82
3.10. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS RESISTENTES ÀS CONDIÇÕES
MARCIANAS ....................................................................................................................... 82
3.10.1. Radiação ultravioleta ........................................................................................... 82
3.10.2. Atmosfera marciana ............................................................................................ 84
4.1. EFEITOS DA RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA EXTRATERRESTRE....................... 85
4.1.1. Células em soluções aquosas ................................................................................. 86
4.1.2. Células desidratadas .............................................................................................. 89
4.1.3. Células desidratadas misturadas com material orgânico .................................. 94
4.1.4. Células desidratadas misturadas com grãos de poeira (arenito ou basalto) .. 100
4.1.5. Células de Chroococcidiopsis sp. ......................................................................... 103
4.1.6. Comunidade microbiana epilítica ...................................................................... 104
4.2. EFEITOS DE SURTOS DE RADIAÇÕES IONIZANTES ........................................ 104
4. RESULTADOS .................................................................................................................... 85
4.2.1. Recuperação celular dos controles ..................................................................... 105
4.2.2. Sobrevivência ao feixe branco de raios-X (>1keV) ........................................... 106
4.2.3. Curvas de sobrevivência para feixe monocromático de raios-X (10keV) ....... 109
4.2.4. Resposta a taxa de dose ....................................................................................... 109
4.2.5. Chroococcidiopsis sp. ........................................................................................... 110
4.3. EFEITOS DE PARTÍCULAS DO VENTO SOLAR .................................................. 111
4.3.1. Irradiação com elétrons de 2keV ........................................................................ 112
4.3.2. Irradiação com prótons de 200keV .................................................................... 116
4.3.2.1. Chroococcidiopsis sp. ...................................................................................... 119
4.3.3. Irradiação com íons carbono de 4keV ............................................................... 120
4.4. EXPOSIÇÃO PROLONGADA DE Deinococcus radiodurans AO ALTO VÁCUO 122
4.5. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS RESISTENTES ÀS CONDIÇÕES
MARCIANAS ..................................................................................................................... 123
4.5.1. Radiação ultravioleta ........................................................................................... 124
4.5.2. Atmosfera marciana ............................................................................................ 130
5.1. RADIAÇÕES ULTRAVIOLETA ............................................................................... 134
5.2. RAIOS-X ...................................................................................................................... 140
5.3 PARTICULAS CARREGADAS .................................................................................. 143
5.4. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS RESISTENTES ÀS CONDIÇÕES
MARCIANAS ..................................................................................................................... 148
5. DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 133
23
6. CONCLUSÕES .................................................................................................................. 152
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 154
APÊNDICE 1 – ENGLISH REPORT .................................................................................... 164
APÊNDICE 2 – Artigo 1. Survival of Deinococcus radiodurans to laboratory-simulated solar
wind charged particles ............................................................................................................ 216
APÊNDICE 3 – Artigo 2. Laboratory Simulation of interplanetary ultraviolet radiation and its
effects on Deinococcus radiodurans ...................................................................................... 246
24
1. INTRODUÇÃO
Os temas abordados nesta introdução foram divididos em 5 partes. Na primeira parte é
apresentada uma visão geral sobre os microrganismos extremófilos e sua importância para a
biotecnologia, para estudos evolutivos e para a exploração espacial. Na segunda parte, são
apresentadas as principais informações sobre a bactéria Deinococcus radiodurans, o principal
modelo biológico utilizado nos experimentos deste estudo. Na terceira parte, são apresentados
os resultados de alguns experimentos biológicos realizados em órbita, relevantes para este
trabalho. Em seguida, na quarta são levantados os principais aspectos relacionados à hipótese
da Panspermia. Finalmente, a quinta parte compreende a caracterização do problema, ou seja,
são apresentadas as motivações que levaram ao desenvolvimento deste trabalho.
1.1. ORGANISMOS EXTREMÓFILOS
Organismos extremófilos constituem os seres vivos capazes de sobreviver e proliferar
em ambientes com parâmetros físicos (temperatura, pressão, radiação) e geoquímicos
(salinidade, pH, potencial de oxido-redução) próximos ao limite da estabilidade das
biomoléculas. A grande maioria dos organismos extremófilos pertence ao grupo dos
procariotos, ou seja, são microrganismos correspondentes aos domínios archaea e bacteria. A
definição de microrganismos extremófilos tem sido útil para a compreensão dos limites fisico-
químicos da vida, contribuindo para a discussão sobre a própria definição de vida e também
tem norteado as missões espaciais destinadas a encontrar evidências atuais ou remotas de vida
extraterrestre em planetas como Marte e Vênus e em luas dos planetas gigantes como Titã e
Europa (ROTHSCHILD E MANCINELLI, 2001).
Os organismos extremófilos têm fornecido dados fundamentais para a biologia
molecular, sendo que a biologia evolutiva, a qual faz uso das ferramentas da biologia
molecular, tem se beneficiado basicamente de duas maneiras. Primeiro, a corrida para
25
descobrir os mais extremos organismos levou à descoberta de todo um domínio dos seres
vivos, o domínio Archaea. Em segundo lugar, a habilidade de sobreviver em ambientes
extremos evoluiu múltiplas vezes, levando a um novo entendimento do paradoxo “chance
versus necessidade” nos caminhos evolutivos, especialmente ao nível molecular
(ROTHSCHILD E MANCINELLI, 2001).
Nas últimas décadas os extremófilos atraíram a atenção de indústrias, como a agrícola,
a indústria química de compostos sintéticos, detergentes e sabões, e a indústria farmacêutica.
As enzimas dos extremófilos (extremozimas) apresentam grande potencial de aplicação em
múltiplas áreas, tanto pelo seu próprio uso, como também por ser fonte de idéias para
modificar enzimas derivadas de outros organismos. Um exemplo clássico de extremozima na
biotecnologia é a fonte da Taq DNA polimerase, a enzima responsável pela reação em cadeia
da polimerase (PCR), uma reação que constitui a base da genômica, filogenia molecular,
diagnóstico molecular, testes de paternidade e criminalística. A Taq DNA polimerase foi
isolada da bactéria termófila Thermus aquaticus, um organismo descoberto em 1969 no
Parque Nacional de Yellowstone, Wyoming, EUA (BROCK E FREEZE, 1969). DNA
polimerases de outros termófilos têm sido comercializadas por indústrias de biotecnologia
como produtos para PCR de alta fidelidade, cada uma com suas próprias vantagens
(ROTHSCHILD E MANCINELLI, 2001).
Existem outros extremófilos com aplicações industriais. Por exemplo, algumas
bactérias da Antártica produzem ácidos graxos poli-insaturados, um ingrediente natural para
muitas espécies aquáticas cultiváveis, como o salmão. As bactérias da Antártica também são
aplicadas na biorremediação de águas que sofrem derramamento de óleo, o que é um
problema em águas frias. Outro exemplo é a bactéria Dunaliella salinas, amplamente usada
na produção comercial de β-carotenos (como resultado da radiação solar) e glicerol (na
tentativa de contrabalançar a pressão osmótica externa). Além das aplicações industriais, o
26
cotidiano das pessoas também tem se beneficiado indiretamente dos extremófilos através da
biotecnologia e da biorremediação. Uma possível aplicação mais direta seria a introdução de
extratos de Dunaliella como um suplemento nutricional, primariamente como um
antioxidante. Proteínas anti-congelantes demonstram potencial para a preservação de órgãos
congelados utilizados em transplantes (ROTHSCHILD E MANCINELLI, 2001).
1.2. DEINOCOCCUS RADIODURANS
D. radiodurans é uma bacteria heterotrófica pigmentada, não-esporulante, sem
locomoção, de morfologia esférica com diâmetros que variam de 1,5 a 3,5 µm (MURRAY,
1986, 1992). As colônias são convexas, lisas, e variam de rosa a vermelhas. D. radiodurans é
gram-positiva, mas apresenta um envelope celular complexo, semelhante ao dos
microrganismos gram-negativos. Uma espessa camada de peptidoglicano é envolvida por uma
membrana externa, e algumas cepas exibem uma camada-S paracristalina. As células são
quimiorganotróficas com metabolismo respiratório e crescem tipicamente em condições de
aeração em meio rico em nutrientes. Em condições ideais, o tempo de duplicação da cepa
selvagem R1 é de aproximadamente 80 min. As células se dividem em dois planos, resultando
em pares e tétrades em culturas líquidas. A temperatura ótima de proliferação é 30°C, mas o
crescimento permanece vigoroso até 37 °C. A proliferação é interrompida em temperaturas
superiores a 45 °C e abaixo de 4 °C (BATTISTA, 1997).
D. radiodurans é um dos organismos mais resistentes a radiação já descobertos,
tolerando doses agudas de radiação ionizante que excedem 15 kGy (DALY et al., 1994;
DALY, 2000), e crescendo sob irradiação crônica com raios gama (60 Gy/h) (Daly, 2000). Os
mecanismos moleculares correspondentes a resistência à tais níveis de radiação são objeto da
pesquisa básica há décadas (MAKAROVA et al., 2001; COX e BATTISTA, 2005).
27
Vários são os mecanismos celulares que contribuem para a alta resistência à radiação,
podendo ser classificados em (i) mecanismos passivos, como a produção de carotenóides que
funcionam como escudo contra as radiações não-ionizantes (ultravioleta), e (ii) os
mecanismos ativos que incluem a reparação de danos no DNA (GHOSAL et al., 2005). Os
mecanismos ativos compreendem pelo menos duas categorias (MAKAROVA et al., 2001;
COX e BATTISTA, 2005; MAKAROVA et al., 2007): (i) um subconjunto de genes que
codificam proteínas com funções ainda desconhecidas que podem aumentar muito a eficiência
dos mecanismos de reparação do DNA, e (ii) complexos de manganês (Mn) não-enzimáticos
presentes em microrganismos radioresistentes protegem as enzimas contra oxidação durante a
irradiação (DALY et al., 2007), preservando os sistemas de reparação do DNA, que acabam
funcionando com eficiência muito maior do que em microrganismos radiosensíveis (HE,
2009).
Essas duas categorias possuem um denominador comum: a forte correlação positiva
entre a resistência à radiação ionizante e a tolerância à dessecação (SGHAIER et al., 2007).
Atualmente, a comunidade científica assume que a resistência à radiação é uma conseqüência
da adaptação à dessecação (hipótese da adaptação à dessecação), uma vez que o principal tipo
de dano celular provocado por estes dois tipos de estresses é o mesmo, ou seja, quebra de fita
dupla no DNA.
Essa hipótese afirma que a resistência à radiação ionizante de D. radiodurans é uma
consequência da sua adaptação à dessecação. No entanto, não há dados genômicos ou
experimentais sugerindo que a tolerância à dessecação é antecedente à resistência à radiação
ionizante. Resumidamente, os dados apresentados por Mattimore e Battista (1996), apenas
sugerem uma forte correlação positiva entre estes dois fenótipos. De fato, um co-autor da
hipótese da adaptação à dessecação mostrou que a inativação de DRB0118, uma proteína
constitutivamente expressa, sensibiliza D. radiodurans à dessecação, mas não à radiação
28
ionizante (BATTISTA et al., 2001). Além disso, a hipótese da adaptação a dessecação
(MATTIMORE e BATTISTA, 1996) não explica a resistência extrema à radiação ionizante
observada em vários membros do domínio Archaea (KOPYLOV et al., 1993). A hipótese
alternativa, de que a tolerância de D. radiodurans à dessecação pode ser uma conseqüência da
adaptação desse organismo à radiação ionizante (hipótese da adaptação à radiação) é também
apoiada por várias linhas de evidências, devendo ser investigada com igual teor (SGHAIER et
al., 2007).
A maioria das células resistentes às radiações ionizantes é capaz de acumular cerca de
300 vezes mais manganês (Mn) do que as células mais sensíveis às radiações ionizantes
(DALY et al., 2004). Os depósitos de manganês estão espalhados em diferentes regiões do
planeta. O Programa de Perfuração no Oceano (ODP), é uma organização internacional que
tem conduzido centenas de expedições para pesquisa básica sobre a história do assoalho
oceânico em diversas partes do mundo. Recentemente, o ODP conduziu um levantamento de
uma grande variedade de sedimentos marítimos (D'HONDT et al., 2004). Entre as
características mais marcantes dos sedimentos profundos (20 m a 100 m abaixo do assoalho
marítimo) está a presença de sítios enriquecidos em manganês com altos níveis de radiação
gama (SGHAIER et al., 2007). Curiosamente, microrganismos anaeróbios e hipertermofílicos
pertencentes ao gênero Deinococcus foram isolados de fontes hidrotermais com
profundidades entre 65 m e 129 m (abaixo do assoalho oceânico), onde a temperatura varia
de 76°C a 91°C (KIMURA et al., 2003). Estes resultados sugerem que uma espécie ancestral
resistente a radiação ionizante, compartilhada por espécies do gênero Deinococcus e outras
espécies anaeróbias hipertermofílicas pode ter existido em sítios ricos em Mn, com altos
níveis de radiação. Tendo em vista a necessidade de novos estudos sobre essa possibilidade,
pesquisas em outros sítios ricos em Mn podem contribuir para novas evidências sobre a
evolução da resistência à radiação.
29
1.3. EXPERIMENTOS EM ÓRBITA
A sobrevivência de D. radiodurans já foi testada em várias condições de laboratório e
também em condições do espaço no dispositivo ERA (Exobiology Radiation Assembly),
colocado em órbita numa missão da ESA chamada Eureca. Dose et al. (1995, 1996) relataram
que embora não tenha sido possível registrar a taxa de sobrevivência devido às condições de
armazenamento das amostras antes e depois da missão, a quantidade de quebras de fita dupla
do DNA (DSB) por cromossomo foi determinada. Se exposto à luz solar (λ> 170nm, sendo 4
x 10
8
J·m
-2
para o intervalo de 175 a 340 nm) em camadas de cerca de 1,5 milímetros, apenas
os décimos superiores na camada de 1 milímetro do topo são afetados, onde mais de 12
quebras de fita dupla (DSB) foram detectados em comparação com 8 DSB para o controle no
escuro. Os dados obtidos com as amostras equivalentes aos controles revelaram que D.
radiodurans sobrevive relativamente bem (15-35% de sobrevivência) se for mantido em
argônio seco por 17 meses, mas a sobrevivência em argônio úmido (acima de 20% de
umidade relativa) foi inferior a 0,01% quando expostos durante o mesmo período de tempo. A
sobrevivência pode ser melhorada em até 100%, se as células forem desidratadas na presença
de matéria orgânica (triptona-extrato de levedura) (DOSE et al. 1995, 1996).
Outros microorganismos também foram testados no espaço. De acordo com Dose et
al. (1996), monocamada de esporos, conídios ou células vegetativas (D. radiodurans) são
extremamente sensíveis às condições do espaço (vácuo e radiação solar). Multi-camadas ou
aglomerados macroscópicos, no entanto, podem resistir por meses ou anos, mesmo quando
expostos à luz solar plena. Embora as camadas superficiais de células sejam inativadas, elas
continuam protegendo as camadas inferiores dos potenciais danos causados pela radiação UV
e também pela desidratação.
Saffary et al. (2002) verificaram os efeitos da radiação ultravioleta extrema (EUV),
com λ = 30.4 nm, em Bacillus sp. e D. radiodurans durante vôo de foguete. A exposição à
30
radiação EUV diminuiu a sobrevivência de ambos os organismos em uma ordem de
magnitude em relação à sua tolerância à dessecação. Resultados semelhantes foram
reportados pela primeira vez para um modelo halofílico, representado por um novo isolado do
gênero Haloarcula exposto às condições reais do espaço por 15 dias no dispositivo Biopan-1
(MANCINELLI et al., 1998). Este isolado foi obtido a partir de cristais de sal (NaCl) e
apresenta alta resistência à desidratação. Uma vez que a radiação EUV interage fortemente
com alvos biológicos, Saffary et al. (2002) atribuíram tal inativação a danos celulares
diferentes de DNA, tais como danos na membrana e em proteínas de superfície. Por outro
lado, outras formas de organismos osmofílicos, como os líquens, foram capazes de restaurar
completamente a sua capacidade de colonização e atividade fotossintética após uma exposição
contínua de 16 dias às condições reais de espaço no dispositivo Biopan-5 (SANCHO et al.,
2007).
O Biopan consiste numa cápsula capaz de abrigar amostras biológicas e bioquímicas
para experimentos na baixa órbita terrestre (LEO). Após a preparação e o carregamento das
amostras, a cápsula contendo as amostras é transportada ao local de montagem do foguete
russo Foton. A cápsula pode ser aberta e fechada por telecomando, os dados sobre o
funcionamento geral são armazenados durante o vôo e as condições do ambiente espacial são
monitoradas por um conjunto de sensores integrados, sendo que a ocorrência de temperaturas
indesejadas pode ser contrabalanceada por mecanismos ativos, através de aquecedores, ou por
meios passivos, através de materiais isolantes térmicos, além do próprio fechamento da
cápsula (BAGLIONE et al., 2007).
As amostras carregadas no Biopan correspondem a experimentos de exobiologia,
radiobiologia, e ciências de materiais, com o propósito de se avaliar os efeitos individuais ou
combinados da radiação ultravioleta solar, radiação cósmica, vácuo, temperaturas extremas e
microgravidade em modelos biológicos, espécimes materiais e componentes eletrônicos. Após
31
um teste bem sucedido em 1992, o programa Biopan completou 5 missões operacionais em
1994, 1997, 1999, 2005 e 2007. Em 2002, uma unidade de vôo foi perdida em uma falha de
lançamento do foguete Foton M-1 (BAGLIONE et al., 2007).
O dispositivo Biopan tem sido utilizado em diversos tipos de experimentos, tais como
a sobrevivência de modelos microbianos eucarióticos e procarióticos, bem como comunidades
microbianas presentes em solos permanentemente congelados (Permafrost), tanto às
condições inóspitas do espaço como às variações bruscas das condições físicas impostas
durante a entrada atmosférica (OLSSON-FRANCIS e COCKELL, 2010). Para este propósito,
esporos de B. subtilis e dois isolados halofílicos, Synechococcus e Haloarcula-G, foram
embebidos em argila, pó de meteorito, solo marciano simulado, ou cristais de sal e foram
expostos às condições do ambiente espacial, na presença ou ausência de radiação UV. Os
esporos desprotegidos foram totalmente inativados pela radiação solar em questão de
segundos. Entretanto, os esporos agregados em materiais particulados apresentaram altas
taxas de sobrevivência. O experimento com halofílicos desprotegidos foi perdido, mas as
amostras protegidas sobreviveram. (MANCINELLI et al., 1998; HORNECK et al., 2001a,b).
Esporos de B. subtilis também foram utilizados no experimento “Marstox”. O objetivo deste
experimento foi investigar a sobrevivência sob condições simuladas da superfície marciana.
Os resultados demonstraram que esporos misturados diretamente com argila, rocha ou
meteoritos sobreviveram às condições combinadas do ambiente espacial, incluindo radiação
UV (RETTBERG et al., 2004).
No experimento “Lichen”, Rhizocarpon geographicum e Xanthoria elegans foram
expostos ao ambiente espacial. Os liquens apresentaram a mesma atividade fotossintética dos
controles e não houve mudança ultraestrutural detectável na maioria das células de algas e
fungos do talo (SANCHO et al., 2007). O papel fisiológico da proteína D1, que é importante
na recuperação após irradiação em organismos fotossintéticos, foi determinada no
32
experimento de “Photo”. Chlamydomonas reinhardtii (wt-IL, um mutante sem introns no
gene psbA que codifica para a proteína D1, além de outros mutantes D1) foram expostos à
radiação do espaço, em combinação com a luz solar, para testar os efeitos no funcionamento
da proteína D1 e da atividade do fotossistema II. Foi observado que o efeito do estresse
espacial na sobrevivência variou dependendo das condições de iluminação que as amostras
foram expostas. Células fotossinteticamente ativas foram capazes de sobreviver à exposição à
radiação solar (BERTALAN et al., 2007). O objetivo do experimento “Lithopanspermia” foi
investigar a capacidade dos microrganismos de sobreviver a uma viagem espacial. Amostras
dos líquens R. geographicum, X. elegans e Aspicilia fruticulosa, em seu substrato natural
rochoso, bem como as suas estruturas de reprodução, além de comunidades microbianas
presentes em halitas do deserto do Atacama, uma comunidade de cianobactérias endolíticas de
Beer, Reino Unido e akinetes de Anabaena cylindrica foram expostos a condições de espaço .
Todos os líquens foram resistentes à condição da baixa órbita terrestre (LEO). Um décimo da
comunidade microbiana do Atacama sobreviveu. Uma cianobactéria da comunidade
endolítica de Beer, foi isolada após a exposição ao espaço e os akinetes sobreviveram à
exposição ao espaço, quando protegidos da radiação solar (DE LA TORRE et al., 2009;
OLSSON-FRANCIS et al., 2009).
Para exposições mais longas, o “Expose” é o mais recente mecanismo desenvolvido
pela ESA. Os experimentos são acomodados em centenas de células minúsculas que podem
ser pressurizadas ou ventiladas, totalmente expostas ou protegidas contra a radiação através de
diferentes filtros (SCHULTE et al., 2007). O dispositivo Expose inclui três bandejas
experimentais, cada uma com quatro compartimentos de amostras, tanto com unidades
ventiladas ou seladas. As unidades podem ser seladas e pressurizadas, sendo que a
composição do gás pode ser previamente definida. Cada um dos compartimentos de amostras
tem uma ou duas camadas, incluindo um controle escuro. As amostras biológicas são unidas
33
dentro da bandeja por uma variedade de métodos, incluindo a fixação de discos de quartzo. As
amostras são mantidas abertas ao ambiente espacial, ou são cobertas com filtros ópticos que
permitem o controle do comprimento de onda e da quantidade de luz que as amostras são
expostas. Há uma série de sensores responsáveis por medir a temperatura, pressão, radiação
UV, e radiação cósmica. O Expose inclui uma estrutura de interface com o adaptador na
plataforma externa do módulo Columbus da estação espacial (EUTEF-CEPA) para o Expose-
E ou com a plataforma externa do segmento russo da estação espacial (ISS) para o Expose-R.
Os experimentos biológicos a bordo do Expose-R foi instalado em março de 2009 e estão
previstos para serem expostos por um ano e meio. Depois disso, as placas serão retiradas e
armazenadas em compartimentos selados dentro da ISS para posterior retorno à Terra a bordo
do módulo de entrada Soyuz. Novos experimentos serão conduzidos no Expose-R no futuro.
Em contrapartida, o Expose-E foi utilizado apenas em uma missão de dois anos, pois não
apresenta compartimentos removíveis (BAGLIONE et al., 2007). Existem mais de 1000
amostras biológicas, químicas, e amostras de dosimetria de oito grupos científicos
internacionais que estão atualmente alojadas no dispositivo Expose (OLSSON-FRANCIS e
COCKELL, 2010).
A radiação solar (incluindo radiação UV e UVV) foi medida nas missões do Biopan
através de 2 tipos de sensores. Um radiômetro monitorou o fluxo da radiação eletromagnética
solar, desde a faixa do UV até o infravermelho. Sensores especiais de UV são adicionados
para monitorar os comprimentos de onda que são específicos ao vôo orbital, já que na
superfície da Terra não há incidência de fótons com comprimento de onda inferiores aos
correspondentes a UV-B. Nas 5 missões já completadas, a dose total da radiação solar variou
de 8,2 kJ·cm
-2
a 20,4 kJ·cm
-2
(BAGLIONE et al., 2007). A dose total depende diretamente do
tempo em que a cápsula está aberta no espaço. Este período, variou de 7,8 a 14,8 dias. Como
34
consequência, a dose diária variou de 0,99 kJ·cm
-2
a 1,38 kJ·cm
-2
, correspondendo a uma
exposição constante de 2,02 a 2,8 horas à radiação solar (BAGLIONE et a., 2007).
Em relação às radiações ionizantes, a dose absorvida pela radiação cósmica foi medida
por diferentes experimentos de dosimetria. Dependendo do nível de blindagem, os
experimentos do Biopan foram expostos a uma dose de até 5,6 Gy por dia, nível
correspondente a 4 ordens de magnitude superior a dose recebida dentro da Estação Espacial
Internacional (ISS), por exemplo. Entretanto, a dose verdadeiramente absorvida pelas
amostras é geralmente bem menor devido à sua montagem. Uma pequena mudança na
densidade de qualquer material protetor pode fazer uma grande diferença. Por exemplo,
camadas protetoras pouco densas (0.05 g·cm
-2
) resulta num a queda de 1 ordem de magnitude,
sendo 2 ordens de magnitude para camadas com 0.25 g·cm
-2
, e 3 ordens de magnitude para
camadas mais densas (1 g·cm
-2
) (BAGLIONE et al., 2007).
A blindagem contra radiações ionizantes deletérias é necessária para garantir a
viabilidade de vírus, bactérias e esporos fúngicos desidratados, aliviando os efeitos da
radiação aplicada em eventuais processos de transferência interplanetária. Cálculos feitos por
Mileikowsky et al. (2000) previram que microorganismos, tais como D. radiodurans e
Bacillus sp., devem ser protegidos contra a radiação espacial dentro de rochas, da ordem de
0.33 m, para manter uma população viável mínima durante intervalos de tempo adequados
para suportar uma viagem interplanetária de Marte para Terra (~ 1 milhão de anos). Esses
autores estimam também que mais de 1 bilhão de fragmentos com temperaturas abaixo de 100
°C foram expulsos de Marte e pousaram na Terra nos últimos 4 bilhões de anos. A Terra
primitiva recebeu cerca de 10 vezes mais matéria extraterrestre durante o período de
bombardeio pesado, de 4,5 a 4 bilhões de anos atrás. De fato, os 40 meteoritos marcianos
descobertos até agora na Terra representam uma pequena fração dos meteoritos vindos de
Marte durante a história da Terra (FRITZ et al., 2005).
35
A descoberta de meteoritos marcianos na Terra (DREIBUS e WANKE, 1985) sugere
que fragmentos de rocha podem escapar de corpos planetários e interplanetários e que a
transferência da matéria é possível de ocorrer no sistema solar (OKEEFE e AHRENS, 1986).
Pelo menos cinco dos cerca de 40 meteoritos marcianos, pode não ter experimentado
temperaturas de esterilização durante a ejeção de Marte e reentrada na atmosfera da Terra
(SHUSTER e WEISs, 2005). No entanto, é ainda uma questão em aberto se os seres vivos
podem ser transportados entre os planetas por meio de tais fragmentos, suportando as duras
condições do espaço. As características biológicas de espécies microbianas extremofílicas
podem ser muito úteis para suportar ambientes extraordinários como os encontrados no
espaço interplanetário.
1.4. A HIPÓTESE DA PANSPERMIA
O filósofo grego Anaxágoras (500-428 aC) afirmava que as sementes da vida estão
presentes em todo o universo. Sua afirmativa se tornou o ponto de partida filosófico de uma
hipótese conhecida hoje como panspermia (literalmente, "sementes em toda parte"). A
hipótese da panspermia postula que a vida poderia se originar em qualquer lugar do universo
onde as condições são favoráveis, e que existem mecanismos para o movimento da vida de
um local para outro através do espaço. Assim, a vida abundante observada no planeta Terra
pode não ter se originado aqui. Um pensamento científico sobre panspermia começou a
ganhar impulso no século XIX, depois que os químicos Thenard, Vauquelin e Berzelius nos
anos 1830 relataram a descoberta de compostos orgânicos em amostras de meteorito. A
possibilidade de que estes materiais carbonados efetivamente representam matéria viva
inspirou o médico alemão H.E. Richter a propor em 1865, um mecanismo para panspermia,
em que os meteoros passando pela atmosfera da Terra em um ângulo muito raso poderia
36
coletar microorganismos presentes na atmosfera antes de continuar sua trajetória pelo espaço
(NICHOLSON, 2009).
A idéia original de Richter sobre meteoros como veículos de transferência para a vida
através do espaço foi ampliada por dois dos principais físicos da época, Hermann von
Helmholtz e William Thomson (Lord Kelvin). Em 1871, cada um propôs uma hipótese com
muitos detalhes do que é conhecido desde então por vários nomes, tais como litopanspermia
("panspermia associada a rochas”), panspermia balística ou transpermia, onde a transferência
poderia funcionar por impactos cósmicos. Thomson propôs que meteoros ou asteroides
colidindo com um planeta contendo vida como o planeta Terra pode ejetar rochas contendo
seres vivos para o espaço. De maneira semelhante, rochas ejetadas de outros planetas que
contém vida podem ter inoculado a Terra primitiva. Além de meteoritos, von Helmholtz
incluiu cometas como possíveis veículos e propôs um conceito chave para a litopanspermia –
que os organismos do planeta doador e do planeta receptor compartilham um ancestral
comum. Um mecanismo alternativo para a panspermia foi posteriormente proposto pelo
químico sueco Svante Arrhenius, laureado com o Prêmio Nobel de Química em 1903 por sua
teoria eletrolítica de dissociação. De acordo com Arrhenius, esporos poderiam ser
transportados através do espaço pela pressão da radiação emitida por estrelas, numa versão da
panspermia conhecida hoje como radiopanspermia (ARRHENIUS, 1903). Atualmente é
sabido que a radiação ultravioleta solar intensa é letal para microrganismos não blindados.
Arrhenius contribuiu muito para a popularização da hipótese da panspermia por meio de
artigos, livros e palestras públicas sobre o tema. Atualmente é o nome mais associado à
panspermia (NICHOLSON, 2009).
Em meados do século XX, Sir Fred Hoyle e Chandra Wickramasinghe propuseram
uma versão não muito aceita da panspermia chamada de panspermia cíclica. De acordo com
esses autores, os grãos de poeira interestelar são na verdade microrganismos viáveis que
37
foram amplificados no interior quente e aquoso dos cometas, sendo posteriormente inoculados
em planetas através de impactos e por deposição de partículas. Segundo esta hipótese, após
nova amplificação nos planetas, o material biológico resultante acaba voltando para o espaço
e inicia um novo ciclo de dispersão (WICKRAMASINGHE, 2003).
A hipótese da panspermia como postulada por Arrhenius em 1903 considera que
estruturas de organismos vivos podem existir por todo o universo e são capazes de se
desenvolver em qualquer ambiente favorável. Esta hipótese implica que durante a evolução do
universo, condições favoráveis ao desenvolvimento da vida prevaleceram em diferentes locais
e em diferentes épocas. Por exemplo, no início do desenvolvimento do sistema solar, quando
as condições da Terra primitiva eram inóspitas para o desenvolvimento da vida, condições
favoráveis ao desenvolvimento de seres vivos podem ter existido simultaneamente em outros
corpos do sistema solar (tais como Marte, Vênus, Europa – lua de Júpiter ou Titã – lua de
Saturno) e também em corpos de outros sistemas planetários. A hipótese da panspermia não
impõe a pré-condição de que a vida terrestre tenha necessariamente se originado na Terra. Os
sistemas vivos podem ter se originado em outro lugar do sistema solar ou do universo e ter
sido transportados para a Terra, onde encontraram condições favoráveis para o crescimento,
proliferação e evolução, resultando em sistemas mais complexos. Uma vez estabelecida, a
vida na Terra também estaria sujeita à transferência e dispersão para outros corpos celestes
(BAGLIONE et al., 12007).
Desde a sua formulação, a hipótese da panspermia tem sido alvo de muita crítica, com
argumentos tais como: (i) ela não pode ser testada, (ii) ela transporta o problema da origem da
vida para outro lugar e época da evolução do universo, e (iii) organismos vivos não podem
sobreviver longos períodos de exposição ao ambiente hostil encontrado no espaço. Entretanto,
evidências experimentais apresentadas pela biologia, astronomia e geologia, têm levado a
38
novas considerações sobre a possibilidade da ocorrência de processos naturais de transporte
interplanetário de seres vivos, particularmente microrganismos (BAGLIONE et al., 2007).
Atualmente, a versão mais aceita é a litopanspermia. Segundo esta versão, formas de
vida simples, provavelmente microbiana, são capazes de sobreviver a três processos
principais: (i) o mecanismo de escape, ou seja, a ejeção do material contaminado do planeta
para o espaço, normalmente causado por um grande impacto sobre o planeta de origem dos
microrganismos, (ii) a exposição às condições inóspitas do espaço através de escalas de tempo
comparáveis com aquelas experimentadas pelos meteoritos marcianos (estimada em 1-15
milhões de anos), e (iii) o processo de aterrissagem de forma a permitir a deposição não-
destrutiva do material biológico no planeta destinatário (HORNECK et al., 2003).
As etapas de escape e entrada são críticas devido à grande quantidade de energia que
pode ser imposta aos organismos dentro de um curto período de tempo. Portanto, estudos
recentes têm investigado essas etapas (BURCHELL et al., 2004; COCKELL et al., 2007;
STOFFLER et al., 2007; HORNECK et al., 2008; MOELLER et al., 2008; DE LA TORRE et
al., 2009; FAJARDO-CAVAZOS et al., 2009). Vários tipos de microorganismos, tais como
esporos de bactérias ou fungos e vírus, bem como biomoléculas, como DNA, aminoácidos e
lipossomas, têm sido expostos às condições do espaço de maneira selecionada ou combinada,
tanto fora do campo magnético da Terra (Apollo 16), ou na baixa órbita terrestre (LEO) nas
missões a bordo do Spacelab 1, Spacelab D2, ERA no veículo EURECA, LDEF, Biopan no
veículo FOTON, e também exposição na Estação Espacial Internacional (HORNECK et al.,
2010; OLSSON-FRANCIS e COCKELL, 2010). Parâmetros extraterrestres, tais como alto
vácuo, radiação ultravioleta solar intensa, diferentes componentes da radiação cósmica e
extremos de temperatura afetaram a estabilidade genética dos organismos no espaço, levando
a taxas de mutação aumentadas, danos ao DNA e inativação celular (HORNECK, 1999). A
radiação ultravioleta solar extraterrestre tem sido demonstrada como o fator mais letal para as
39
amostras totalmente expostas. Porém, quando protegidos contra a incidência de radiação UV
solar, esporos de Bacillus subtilis sobreviveram por mais de cinco anos no espaço
(HORNECK et al., 1994).
Recentemente, Horneck et al. (2008) testaram a primeira etapa da hipótese da
panspermia, expondo os esporos de B. subtilis, células de Chroococcidiopsis e talos e
ascocarpos do líquen X. elegans a choques de pressãos na faixa de 5 a 40 Giga Pascal. Seus
resultados suportam a hipótese de que material biológico pode ser ejetado com êxito de
planetas, sendo possível que a própria Terra primitiva tenha sido contaminada em processo
semelhante.
Em vista desses resultados surpreendentemente positivos e favoráveis à hipótese da
panspermia, a etapa crítica da reentrada do processo foi verificada pelo experimento “Stone”
da ESA (COCKELL et al., 2007). Estes autores demonstraram que a cianobactéria endolítica
Chroococcidiopsis sp. inoculada em uma amostra de rocha metamórfica (gnaisse) não resistiu
a rápida re-entrada na atmosfera da Terra devido ao aquecimento extremo alcançado até ~ 5
mm de profundidade da rocha. Este resultado indica a impossibilidade de transferência
interplanetaria de microrganismos fotossintéticos nos moldes da hipótese da litopanspermia
(COCKELL et al., 2007), sugerindo que a fotossíntese pode ter aparecido independentemente
no planeta Terra (FOUCHER et al., 2010).
Embora as chamas provocadas pelo atrito com a atmosfera podem ter entrado por trás
da amotra e queimado o biofilme, as transformações mineralógicas observadas na superfície
da rocha indicam que a temperatura na parte de trás atingiu 650°C, muito alta para a
estabilidade de qualquer composto orgânico (FOUCHER et al., 2010). Portanto, mesmo que
as chamas não tenham atingido o biofilme, uma camada de 2 cm de proteção rochosa não é
suficiente para proteger microrganimos endolíticos. Na superfície terrestre, microrganismos
40
endolíticos fotossintéticos, tais como Chroococcidiopsis, precisam ter um mínimo de acesso à
luz e, portanto, não penetram na rocha a uma profundidade superior a 5 mm.
Entretanto, microrganismos litotróficos não são dependentes de luz, ou seja, podem
obter carbono e energia a partir de fontes inorgânicas. Eles são colonizadores bastante comuns
em rochas e tem sido encontrados em grandes profundidas em minas de ouro com 3 km de
profundidade na África do Sul (LIN et al., 2006). Sabendo-se que rochas ejetadas durante um
impacto podem ser provenientes da sub-superfície da crosta terrestre (MELOSH, 2003), é
possível que as rochas contendo microrganismos litotróficos em suas fraturas pode ser ejetado
pelo impacto. De fato, se a vida ainda está presente em Marte, ela irá ocorrer em ambientes
protegidos subsuperfície. Horneck et al. (2001a) demontraram que esporos microbianos
podem resistir às condições do espaço se protegidos por uma camada de rocha, mas a
sobrevivência de microrganismos à entrada atmosférica ainda não tinha sido testada até os
experimentos Stone 5 e 6 (FOUCHER et al., 2010).
1.5. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA
Os diversos parâmetros físico-químicos que influenciam na sobrevivência microbiana
durante o tempo de uma etapa de migração interplanetária nos moldes da hipótese da
panspermia nunca foram estudados de maneira sistemática com um único modelo biológico, o
que acaba tornando difícil a comparação dos resultados disponíveis na literatura. No nosso
estudo, a sobrevivência de D. radiodurans a condições análogas às presentes no espaço
interplanetário foi investigada em diversas estações de trabalho, incluindo fontes de radiação
síncrotron ultravioleta, ultravioleta de vácuo e raios-X, além de radiações particuladas, com
detalhes experimentais bastante semelhantes.
Além do conhecimento sobre a sobreviência de modelos biológicos às condições
extraterrestres, o isolamento de microrganismos naturalmente presentes em amostras de
41
ambientes extremos é fundamental para compreender a capacidade de adaptação da vida a
ambientes tão extremos como os ambientes extraterrestres. Desta forma, em um segundo
bloco de experimentos, foram desenvolvidos procedimentos de isolamento de
microrganismos resistentes às condições marcianas, considerando a radiação incidente em
Marte e a composição atmosférica marciana, atuando separadamente sobre os
microrganismos. Este trabalho foi feito em colaboração com pesquisadores chilenos
utilizando amostras de solo do deserto do Atacama, considerado um ambiente análogo a
alguns locais da superfície do planeta Marte. O objetivo foi isolar microrganismos resistentes
a radiação ultravioleta para testes em novas câmaras de simulação em fase de construção em
São Paulo.
A simulação das condições do espaço interplanetário, além de servir para programas
futuros de proteção planetária, tem adicionado novos dados ao debate milenar da hipótese da
panspermia, segundo a qual a vida pode ter sido trazida ao planeta Terra por meteoróides ou
pequenos cometas. Ainda que seja instigante a investigação concernente aos aspectos da
origem da vida na Terra, é indispensável acrescentar que a exposição de seres vivos a
condições extremas pode trazer contribuições para aplicação em diferentes setores como por
exemplo, o desenvolvimento de melhores técnicas de cultivo de diferentes organismos
levando à produção de bio-insumos em condições extremas.
42
2. OBJETIVOS
2.1. GERAL
Estudar o comportamento de diferentes modelos biológicos submetidos a ambientes
extremos, como os vigentes fora da Terra, considerando parâmetros como: pressão,
temperatura e radiação, atuando separadamente e em conjunto sobre os microrganismos
resistentes a essas condições, visando: ampliar o conhecimento sobre os limites físico-
químicos para a existência de vida tal qual a conhecemos; analisar a possibilidade de
ocorrência de processos de contaminação cruzada entre planetas do sistema solar e
contaminação interestelar; identificar isolados procariontes com potencial valor para inovação
de produtos biotecnológicos.
2.2. ESPECÍFICOS
- Isolar microrganismos extremófilos provenientes de amostras de solo do deserto do
Atacama, no Chile utilizando como pressão seletiva estresses como radiação ultravioleta,
dessecação, baixa pressão e baixa temperatura;
- Caracterizar o perfil de sobrevivência desses microrganismos sob as condições do
espaço interplanetário, bem como dos planetas e luas do sistema solar;
- Desenvolver metodologias experimentais para o uso desses microrganismos em
laboratórios de simulação, foguetes e veículos lançadores de satélites.
43
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. CEPAS BACTERIANAS
A cepa selvagem GY9613 (R1) e o mutante recA, de Deinococcus radiodurans foram
gentilmente cedidos pelo Dr. Carlos Eduardo Bonacossa de Almeida, do Instituto de
Radioproteção e Dosimetria do Rio de Janeiro (IRD-RJ). A cepa AB1157 de Escherichia coli
foi obtida no laboratório de Radiobiologia Molecular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho (IBCCF), da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).
A cianobactéria Chroococcidiopsis sp. foi isolada do deserto do Atacama (Chile), pelo
grupo dos nossos colaboradores chilenos, Dr. Armando Azúa-Bustos e Dr. Rafael Vicuña,
Departamento de Genética Molecular y Microbiología, da Pontificia Universidad Catolica de
Chile (PUC) e enviadas ao Laboratório de Radiobiologia Molecular do IBCCF-UFRJ.
A manutenção e o preparo dessas cepas foram feitos sob a supervisão da Profª Drª
Cláudia Lage, no Laboratório de Radiobiologia Molecular do IBCCF-UFRJ, e do Prof. Dr.
Charles Cockell, no Laboratório de Microbiologia Ambiental do Instituto de Pesquisas de
Ciências Planetárias e Espaciais (PSSRI), da Open University (OU), Reino Unido.
3.2. MEIOS DE CULTURA
3.2.1. TGY (ANDERSON et al., 1956)
Reagente (Difco ou Sigma)
Solidificado
Líquido
Triptona
5 g
10 g
Extrato de Levedura
3 g
6 g
Glicose
1 g
2 g
Agar
15 g
-
Água destilada (q.s.p.)
1000 ml
1000 ml
Autoclavar a 121°C por 15min.
44
3.2.2. BG-11 (RIPPKA et al., 1979)
Solução 1 Estoque 10x
Na
2
-EDTA 0,1 g/l 0,1 g/100ml
Ácido cítrico.1H
2
O 0,6 g/l 0,6 g/100ml
CaCl
2
.1 H
2
O 3,6 g/l 3,6 g/100ml
Soluções-estoque (10 x) armazenadas a 4
o
C.
Solução2 (Esterilizar por filtração e armazenar a 4
o
C)
MgSO
4
.7H
2
O 0,75 g/100 ml
Solução 3
K
2
HPO
4
0,305 g/100ml
Solução 4 (Esterilizar por filtração e armazenar a 4
o
C)
Citrato férrico de amônia 0,6 g/100 ml
Solução estoque 5 (g/l) (Autoclavar e armazenar a 4
o
C)
H
3
BO
3
2,86
MnCl
2
.4H
2
O 1,81
ZnSO
4
.7 H
2
O 0,22
Na
2
MoO
4
.2 H
2
O 0,04
CuSO
4
.5 H
2
O 0,08
Co(NO
3
)
2
.6 H
2
O 0,05
45
Composição final
Solução 1 10 ml
Solução 2 10 ml*
Solução 3 10 ml
Solução 4 1 ml*
Solução 5 1 ml
Na
2
CO
3
0,02 g
NaNO
3
1,5 g
Agar 10 g
Água destilada (q.s.p.) 1000 ml
Ajustar o pH para 7,4 (±0,2) e autoclavar. *Adicionar após a autoclavação.
3.2.3. Meio de cultura LB (MILLER, 1992)
NaCl (Reagen-Quimibrás Indústrias Químicas S/A) 10 g
Bacto-triptona (Difco) 10 g
Extrato de levedura (Difco) 5 g
Água destilada (q.s.p.) 1.000 mL
3.3. CONDIÇÕES DE CULTIVO
As cepas de D. radiodurans foram cultivadas em meio de cultura TGY líquido (item
3.2.1) por 15 h a 20 h a 32 °C, com agitação de 200 rpm. Alíquotas foram retiradas para
monitoramento das culturas e aquelas com DO
600
> 1,0 (Concentração de células > 10
8
células·ml
-1
) foram submetidas aos procedimentos de preparação das amostras, de acordo com
as metodologias descritas nos itens 3.6 a 3.9. Após os tratamentos, as amostras foram
reconstituídas em TGY líquido e submetidas a diluição seriada em solução salina NaCl 0,9%
46
ou TGY. Em seguida, alíquotas foram inoculadas em placas de Petri contendo meio de cultura
TGY solidificado (item 3.2.1) e as amostras foram incubadas a 30 °C por 48 h a 72 h.
A cianobactéria Chroococcidiopsis sp. foi cultivada em meio de cultura BG-11 líquido
(item 3.2.2) à temperatura ambiente (~20 °C) por pelo menos 1 mês, com ciclos de
iluminação utilizando lâmpada fluorescente a 50 cm de distância das culturas. Alíquotas
foram retiradas para monitoramento das culturas e aquelas com DO
600
> 1,0 (Concentração de
células > 10
7
células·ml
-1
) foram submetidas aos procedimentos de preparação das amostras,
de acordo com as metodologias descritas nos itens 3.6.4. e 3.7.1. Após os tratamentos, as
amostras foram reconstituídas em BG-11 e incubadas em placas de 12 ou 24 poços à
temperatura ambiente (~22°C) por até 3 meses, com ciclos de 12 h de iluminação utilizando
lâmpada fluorescente a 50 cm de distância das culturas.
3.4. MATERIAL GEOLÓGICO
Amostras de 5 diferentes localidades do deserto do Atacama (Chile), considerado pela
NASA como um ambiente análogo ao planeta Marte (NAVARRO-GONZALEZ et al., 2003),
foram coletadas pelos nossos colaboradores chilenos em julho de 2008 e enviadas em frascos
de plásticos hermeticamente fechados (tubos falcon de 15 ml ou 50 ml), ao Laboratório de
Radiobiologia Molecular do IBCCF-UFRJ. O material foi numerado e etiquetado conforme
ilustrado na Figura 1.
47
Figura 1. Localização geográfica das amostras coletadas no deserto do Atacama. 1. Laguna
Llamara (21°16‟07.54”S, 69°37‟03.90”W. Altitude: 751 m); 2. Sitio Cuarzos B2
(23°48‟59.15”S, 70°29‟25.59”W. Altitude: 538 m); 3. Capa Negra La Portada (23°29„
58.61”S, 70°25‟42.10”W. Altitude: 27 m); 4. Gypsum (23°49‟01.14„‟S, 70°29‟22.98„‟W.
Altitude: 531 m); 5. Sitio 3 S4 (23°49' 10.76„‟S, 70°28‟36.77„‟W. Altitude: 736 m).
Alíquotas dessas amostras foram diluídas em solução salina (NaCl 0,9%) e expostas à
irradiação com lâmpada de mercúrio (λ = 254 nm) com o objetivo de isolar microrganismos
fotorresistentes, sendo que a metodologia detalhada está descrita no item 3.10.1.
3.5. CURVAS DE SOBREVIVÊNCIA
As metodologias básicas utilizadas na maioria dos experimentos foram baseadas na
técnica de diluição seriada e plaqueamento em meio de cultura solidificado com posterior
contagem de unidades formadoras de colônias (UFC). Desta forma, os valores
correspondentes às amostras submetidas aos tratamentos foram denominados Nt e as amostas
48
controles não submetidas aos tratamentos foram denominadas N
0
. Através da equação (N
t
/N
0
)
foram obtidas as frações de sobrevivência em relação aos controles, as quais foram plotadas
em gráficos mostrando curvas de sobrevivência.
3.6. IRRADIAÇÃO ULTRAVIOLETA
As amostras de D. radiodurans foram submetidas a diferentes fontes de radiação
ultravioleta incluindo lâmpadas de hidrogênio, de xenônio e de mercúrio, fontes de luz
síncrotron e um Simulador Solar Oriel. Já as amostras da cianobactéria Chroococcidiopsis sp.
foram irradiadas apenas com feixe monocromático (λ = 254nm) na linha de luz CD1 do
síncrotron Astrid (Dinamarca), já que essas amostras foram obtidas no final da parte
experimental desta tese. Os procedimentos de preparo das amostras e os detalhes das
irradiações estão descritos nas subseções a seguir.
3.6.1. Lâmpada de hidrogênio (λ = 121,6nm)
Culturas de D. radiodurans em início de fase estacionária DO
600
> 1,0, (Concentração
de células > 10
8
células·ml
-1
) foram depositadas sobre filtros de policarbonato (Millipore) de
25 mm de diâmetro, porosidade de 0,45 µm (superfície lisa). As células foram desidratadas
por 15 h a 20 h na bancada de trabalho em ambiente livre de contaminantes. Observações ao
microscópio confirmaram que 10
8
células por amostra se distribuíram em monocamada pela
superfície dos filtros. Os filtros foram fixados num porta-amostras metálico utilizando uma
fita de carbono dupla-face (Shinto Paint Co.), e as amostras controle foram expostas às
mesmas condições, exceto para a irradiação. O porta-amostras foi colocado dentro da câmara
de vácuo a uma distância de 8 cm da fonte de luz (Figura 2). O fluxo de fótons da lâmpada
(Opthos Instruments, Inc.), medido através de um fotodiodo, foi de 10
15
cm
-2
s
-1
,
correspondente a uma irradiância de 16,34 J·m
-2
para uma atmosfera interna composta por
49
95% de argônio e 5% de hidrogênio a 60Pa (I/I
0
=99,86%). Várias doses foram administradas
com tempos crescentes de exposição à radiação.
Figura 2. Fotografia da lâmpada de hidrogênio mostrando os principais componentes do
aparato experimental.
Para irradiação das amostras na fita de carbono (superfície rugosa), culturas em início
de fase estacionária DO
600
> 1,0, (Concentração de células > 10
8
células·ml
-1
) foram
liofilizadas e o pó resultante foi espalhado em discos de fita de carbono (Shinto Paint Co.) de
25 mm de diâmetro, levando à formação de multi-camadas de células. Todas as amostras
foram irradiadas em triplicata à temperatura ambiente, de acordo com a tabela 1.
50
Tabela 1. Desenho experimental para irradiação ultravioleta de vácuo (UVV) de D.
radiodurans com lâmpada de hidrogênio (λ=121,6 nm).
Dose (kJ·m
-2
)
Tempo de irradiação
Amostras
(s)
(min)
(h)
0
0
0
0
3
1
60
1
0,02
3
5
300
5
0,08
3
12,5
780
13
0,22
3
50
3060
51
0,85
3
103
6300
105
1,75
3
223
13620
227
3,78
3
756
46260
771
12,85
3
TOTAL
70380
1173
19,55
24
Após os tratamentos, as células foram reconstituídas e homogenizadas em meio de
cultura TGY líquido com posterior leitura da DO
600
em espectrofotômetro. Como a
quantidade de material foi diferente entre as amostras e levando-se em consideração que a
densidade ótica reflete o número de células presentes nas amostras, diferentes medidas de
DO
600
foram feitas para suspensões celulares correspondentes ao controle não irradiado para
estimar a viabilidade das células em pó. Uma curva de calibração foi produzida
correlacionando a DO
600
e o número de células viáveis. Desta forma, foi possível determinar o
número estimado de células viáveis das amostras controle (N
0E
), mesmo sem saber de fato o
número de células presentes no pó de células. Após calcular o N
0E
para todas as amostras
irradiadas, as taxas de sobrevivência foram determinadas da seguinte maneira: (N
t
/N
0E
) x 100,
onde: N
t
é o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por alíquota correspondente
51
ao tempo de exposição t, N
0E
é o número de UFC por alíquota das amostras controle (não-
irradiadas). O desprendimento das células aderidas aos diferentes substratos após desidratação
extrema resultou em uma perda da viabilidade entre 20% e 50% devido ao procedimento de
liofilização e exposição ao vácuo. Essa perda foi incluída no cálculo da viabilidade dos
controles (N
0E
). Portanto, para cada experimento de irradiação, N
0E
representa a média de 3
replicatas após liofilização, exposição ao vácuo e desprendimento das células aderidas ao
substrato. Os valores foram marcados em gráficos semi-log em função da dose indicada no
eixo das abscissas, revelando as curvas de sobrevivência para cada tratamento.
3.6.2. Lâmpada de xenônio (λ = 145nm)
Culturas de D. radiodurans em início de fase estacionária DO
600
>1,0, (Concentração
de células >10
8
células·ml
-1
) foram filtradas em filtros de policarbonato (Millipore) de 25mm
de diâmetro, porosidade de 0,45µm (superfície lisa). As células foram desidratadas por 15h a
20h na bancada de trabalho em ambiente livre de contaminantes. Observações ao microscópio
confirmaram que 10
8
células por amostra se distribuíram em monocamada pela superfície dos
filtros.
Para irradiação das amostras na fita de carbono (superfície rugosa), foram retirados
volumes de 1ml de uma cultura em início de fase estacionária DO
600
>1,0, (Concentração de
células >10
8
células·ml
-1
) e depositados sobre discos de fita de carbono dupla-face (Agar
Scientific, UK) de 25mm de diâmetro, levando à formação de multi-camadas de células.
Amostras de um biofilme epilítico negro (que cresce sobre rochas) provenientes da
região de La Portada, no Chile (seção 4.4), foram divididas em aliquotas de 10mg, diluídas
em 1ml de meio de cultura BG-11 e filtradas em membranas de policarbonato (Millipore)
com diâmetro de 25mm e porosidade de 0,2μm a fim de se produzir uma fina camada de
material biológico sobre as membranas. Como o cilindro de filtração apresentava um diâmetro
52
de 16mm, as membranas contendo o material biológico foram cortadas para a retirada das
bordas em excesso.
Os materiais resultantes foram desidratados por pelo menos 3 horas à temperatura
ambiente na bancada de trabalho, e colados em um porta amostra metálico utilizando discos
de fita de carbono dupla-face (Agar Scientific, UK). O porta amostra contendo até 6 amostras
foi colocado dentro da câmera de vácuo (10
-5
Pa). Uma lâmpada de xenônio emissora de luz
UVV (Resonance, Canadá), foi acoplada à câmara de vácuo numa posição adequada para os
experimentos de irradiação. O posicionamento das amostras diretamente contra o feixe de luz
UVV foi feito através de um manipulador rotatório presente no topo do sistema de irradiação.
Todas as amostras (biofilme artificial, e monocamadas de células) foram irradiadas de acordo
com o esquema apresentado na Tabela 2.
53
Tabela 2. Desenho experimental para irradiação UVV de amostras de biofilmes epilíticos
(cresce sobre rochas) e cepas de D. radiodurans com lâmpada de xenônio (λ=145nm).
Dose (J.m
-2
)*
Tempo de irradiação
Amostras
(s)
(min)
(h)
0
0
0
0
3
0,2
60
1
0,02
3
1,0
300
5
0,08
3
2,0
600
10
0,17
3
10,0
3000
50
0,83
3
20,0
6000
100
1,67
3
100,0
30000
500
8,33
3
TOTAL
39960
666
11,10
21
* Calculado para o pico de emissão da lâmpada (=145nm).
Apesar da luminosidade da lâmpada parecer bem fraca (3mW·m
-2
), seu fluxo de
fótons é mais de 3 vezes superior ao fluxo de fótons do Sol no comprimento de onda de
145nm (WOODS, 2002), que representa o pico de emissão da lâmpada, como visto na Tabela
3. O fluxo de fótons da lâmpada foi determinado através de medidas diretas utilizando um
fotodiodo, levando-se em consideração a eficiência quântica do fotodiodo, oferecida pelo
fornecedor (Roithner LaserTechnik, Austria).
54
Tabela 3. Comparação entre as propriedades da lâmpada de xenônio e o fluxo de fótons do
Sol com comprimeto de onda de 145nm.
Propriedade
Lâmpada de xenônio
UVV solar (λ=145nm)
Máximo fluxo ()
145nm
Não aplicável
Fluxo de fótons
10
10
cm
-2
s
-1
(10
14
m
-2
s
-1
)
3 x 10
9
cm
-2
s
-1
(3 x 10
13
m
-2
s
-1
)*
Irradiância
1,4 x 10
-4
W·m
-2
4 x 10
-5
W·m
-2
*WOODS, 2002.
Após os tratamentos, as amostras do biofilme preto foram colocadas em placas de 6
poços contendo 5ml de meio de cultura BG-11 (item 3.2.2) e incubadas à temperatura
ambiente (~22°C) por até 3 meses, com ciclos de 12h de iluminação utilizando lâmpada
fluorescente a 50cm de distância da fonte de luz. Durante as semanas subsequentes, aliquotas
de 10l foram retiradas dos poços e observadas ao microscópio óptico para verificar qualquer
alteração nas morfologias celulares e eventuais aumentos do número total de células. Já as
amostras de D. radiodurans foram diluídas após os tratamentos em meio de cultura TGY
(item 3.2.1) e submetidas à diluição seriada utilizando solução salina (NaCl 0,9%), sendo
posteriormente plaqueadas em placas de Petri contendo TGY solidificado, conforme descrito
na seção 3.3. Após incubação a 30°C por até 72 horas, as colônias crescidas sobre o meio de
cultura foram contadas e as taxas de sobrevivência foram descritas conforme o item 3.5. Os
resultados foram plotados em gráficos mostrando curvas de sobrevivência.
3.6.3. Lâmpada de mercúrio (λ = 254nm)
Para confirmar o fenótipo natural de resistência da espécie, a cepa selvagem de D.
radiodurans foi submetida a irradiação ultravioleta-C (UV-C) com lâmpada germicida de
baixa pressão de mercúrio (λ = 254nm). Para isso, as células foram incubadas conforme
descrito na seção 3.3. Após o período de incubação, todo o volume de cultura foi centrifugado
55
a 4 ºC, 8000 rpm por 10 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o sedimento de
células foi ressuspendido em 5ml de solução salina (NaCl 0,9%) através de agitação em
vortex, modelo Gene-2 (Scientific Industries, NY - USA). Posteriormente, a suspensão de
células foi submetida a nova centrifugação nas mesmas condições. O sedimento foi
ressuspendido novamente em 5ml de solução salina e a suspensão de células foi colocada em
uma placa de Petri de vidro previamente esterilizada. Antes de iniciar a exposição das células
às diferentes doses de UV-C, foi retirado um volume de 100µl de células para a diluição
seriada e posterior inóculo em placas de Petri de plástico contendo TGY solidificado. As
colônias crescidas nestas placas foram utilizadas como referência (controle) para o cálculo da
porcentagem de sobrevivência a UV-C. Para o cálculo da dose irradiada, foi utilizada uma
fotocélula do tipo CX-254 (Vilber Loumat). Os valores medidos em mW·cm
-2
foram
convertidos para J·m
-2
s
-1
e os tratamentos foram feitos através de exposição das células em
tempos equivalentes às doses desejadas, respeitando-se os efeitos cumulativa da irradiação.
As doses de radiação incidente nas células, em kJ·m
-2
, foram de: 0; 0,5; 1,0; 2,0. Para cada
dose, foram aliquotados 100µl de células para a diluição seriada e posterior inóculo em TGY
solidificado. O cálculo da taxa de sobrevivência foi feito conforme descrito na seção 3.5.
Para efeito de comparação, o mesmo procedimento foi feito para a cepa AB1157 de E.
coli, sendo que as principais diferenças do protocolo foram a utilização de LB no lugar de
TGY, tempos de incubação 4 vezes menor e temperatura de incubação de 37 ºC, em vez de 32
ºC.
3.6.4. Feixe monocromático (λ = 254nm) na linha de luz CD1 do síncrotron ASTRID
(Dinamarca)
Amostras do biofilme negro provenientes da região de La Portada, no Chile (seção
3.4), foram divididas em aliquotas de 10mg, diluídas em 1ml de meio de cultura BG-11 e
filtradas em membranas de policarbonato (Millipore) com diâmetro de 25mm e porosidade de
56
0,2μm a fim de se produzir uma fina camada de material biológico sobre as membranas.
Como o cilindro de filtração apresentava um diâmetro de 16mm, as membranas contendo o
material biológico foram cortadas para a retirada das bordas em excesso. O material resultante
foi desidratado por pelo menos 3 horas à temperatura ambiente na bancada de trabalho, e
colado em discos de fita de carbono dupla face (Agar Scientific, UK). Posteriormente, o
conjunto foi cortado em pedaços de 2mm
2
utilizando uma grade de lâminas construída
especificamente para este propósito. Em seguida, os pedaços de 2mm
2
foram colados em
porta-amostras metálicos. O sistema de irradiação foi montado na estação de trabalho da linha
de luz CD1 do síncrotron Astrid, Aarhus, Dinamarca, conforme mostrado na Figura 3.
Figura 3. Sistema de irradiação com luz UV (λ=254nm) na linha de luz CD1 do síncrotron
Astrid, Aarhus, Dinamarca. No detalhe à esquerda, amostras posicionadas nos discos
metálicos e à direita o sistema de irradiação a ser posicionado contra o feixe.
Feixe de luz UV
57
As amostras de D. radiodurans (cepas selvagem e mutante recA deficiente para o
reparo de DNA por recombinação homóloga), e da cepa selvagem da cianobactéria
Chroococcidiopsis sp., isolada do Atacama, foram diluidas em alíquotas de 1ml e preparadas
da mesma maneira que o biofilme preto para irradiação na linha de luz CD1. Adicionalmente,
as amostras de D. radiodurans foram irradiadas também sobre a fita dupla-face de carbono
para investigar a influência do tipo de substrato na sobrevivência bacteriana após a irradiação.
Para isso, 1ml da cultura foi aplicado diretamente sobre a fita de carbono, seguido de
desidratação por pelo menos 3 horas à temperatura ambiente na bancada de trabalho. Em
seguida, as amostras foram cortadas em pedaços de 2mm
2
utilizando uma grade de lâminas e
coladas no porta amostra metálico. As irradiações foram realizadas de acordo com as
condições indicadas na Tabela 4.
Após os tratamentos, as amostras foram recuperadas e incubadas conforme descrito na
seção 3.3.
Tabela 4. Desenho experimental para irradiação UV de cada material biológico na linha de
luz CD1 do síncrotron Astrid, Aarhus, Dinamarca.
Dose (J·m
-2
)*
Tempo de irradiação
Tempo
Amostras
Tempo final
(s)
(min)
(h)
0 (Controle)
0
0
0
0
3
0
3
60
1
0,02
1min
3
3min
30
600
10
0,17
10min
3
30min
300
6000
100
1,67
1h 40min
3
5h
TOTAL
6660
111
1,86
1h 51min
12
5h 33min
* Para um fluxo de fótons de até 10
17
m
-2
s
-1
58
3.6.5. Feixe branco (λ >57,47nm) na linha de luz TGM do LNLS
Os procedimentos de irradiação na linha de luz TGM (Toroidal Grating
Monochromator) do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) demandaram a
construção de um porta-amostras específico, com o apoio da equipe técnica do LNLS, com o
intuito de adaptar a metodologia microbiológica às exigências técnicas do experimento. Para
isso, foi utilizada uma peça hexagonal de cobre com 10cm de comprimento e 4cm de
diâmetro, com 36 parafusos de 5mm de diâmetro, sendo 6 em cada face, conforme mostrado
na figura 4.
Figura 4. Posicionamento das amostras na direção do feixe (esquerda) e exposição das
amostras ao feixe (direita) mostrando a cobertura de toda a amostra pela área irradiada.
Trinta e seis pedaços circulares de fita de carbono dupla-face (Shinto Paint Co) com
5mm de diâmtero, cobertos ou não com filtro de policarbonato (Millipore) foram distribuídos
sobre os parafusos. Após contagem de células ao microscópio, os substratos de carbono foram
carregados com 1µL da cultura de D. radiodurans em início de fase estacionária (seção 3.3),
correspondente a 10
6
células por amostra dispostas em monocamada. O porta-amostras foi
então colocado em freezer -80°C por pelo menos 30 minutos, seguido de exposição a baixo
59
vácuo (600Pa) em um liofilizador por pelo menos 5 horas. Após este período, o porta-
amostras foi transportado em recipiente hermeticamente fechado para o anel experimental do
LNLS, onde foi colocado na câmara de irradiação da estação de trabalho da linha de luz
TGM. A montagem da linha de luz foi composta por um sistema de bombeamento diferencial
para uso de uma seção da linha contendo gás neônio numa pressão maior do que o restante da
linha. Este sistema foi utilizado para atenuar a porção do espectro eletromagnético
correspondente a raios-X moles, com o intuito de tornar o feixe mais semelhante ao espectro
eletromagnético solar na região do espaço equivalente à órbita da Terra (Figura 5).
Figura 5. Espectro da linha de luz TGM com o filtro harmonico do gás neônio, atenuando o
fluxo de fótons com energia acima de 21,5eV. Para comparação, o ponto denominado “H
Lamp” se refere ao fluxo de fótons da radiação Lyman-alfa (λ=121,6nm) emitida pela
lâmpada de hidrogênio, também utilizada neste estudo.
60
Para otimizar o tempo de uso da linha de luz, os experimentos foram planejados com o
intuito de possibilitar um ensaio em triplicata em uma única rodada de irradiações, utilizando
um manipulador rotatório para posicionar as amostras contra o feixe. As medidas de fluxo de
fótons foram obtidas utilizando um fotodiodo e uma grade de ouro para checar variações na
corrente elétrica (que reflete oscilações no fluxo de fótons) em tempo real. A pressão na
câmara de irradiação foi mantida entre 10
-4
e 10
-5
Pa durante todos os experimentos de
irradiação.
Curvas de sobrevivência foram obtidas através de 6 diferentes doses de irradiação
síncrotron, além do controle não irradiado, conforme descrito na Tabela 5.
Tabela 5. Desenho experimental para irradiação ultravioleta de vácuo (UVV) de D.
radiodurans com feixe branco (λ >57,47nm) na linha de luz TGM do laboratório síncrotron
LNLS.
Dose (kJ·m
-2
)*
Tempo de irradiação
Amostras
(s)
(min)
(h)
0
0
0
0
3
0,01
60
1
0,02
3
0,12
600
10
0,17
3
0,6
3000
50
0,83
3
1,2
6000
100
1,67
3
6,0
30000
500
8,33
3
12
60000
1000
16,67
3
TOTAL
99660
1173
19,55
21
61
Todos os ensaios de irradiação foram realizados à temperatura ambiente. As amostras
foram recuperadas e analisadas conforme descrito nas seções 3.3 e 3.5. O desprendimento das
células aderidas aos diferentes substratos após desidratação extrema resultou em uma perda da
viabilidade entre 20% e 50% devido ao procedimento de liofilização e exposição ao vácuo.
Essa perda foi incluída no cálculo da viabilidade dos controles (N
0
). Portanto, para cada
experimento de irradiação, N
0
representa a média de 3 replicatas após liofilização, exposição
ao vácuo e desprendimento das células aderidas ao substrato. Os resultados foram plotados
em gráficos mostrando curvas de sobrevivência.
3.6.6. Irradiação com simulador solar Oriel (λ > 200nm)
As amostras foram preparadas conforme descrito no item 3.7.1 e irradiadas utilizando
o Simulador Solar Oriel Modelo 91192-1000 (Newport Inc.) em 3 situações distintas: (i)
células em solução aquosa (NaCl 0,9% ou meio de cultura), (ii) células desidratas com ou sem
meio de cultura e (iii) células desidratadas na presença ou ausência de grãos de basalto ou
arenito, misturados ou não com meio de cultura.
O Simulador Solar é composto por uma lâmpada de xenônio acoplada a um espelho
elipsóide que direciona a radiação para o espelho plano primário, que por sua vez direciona a
radiação para uma série de dispositivos óticos e filtros corretivos (Figura 6). A área retangular
irradiada é superior a 100cm
2
e o feixe compreende comprimentos de onda superiores a
200nm (Figura 7).
62
Figura 6. Esquema e foto do Simulador Solar Oriel modelo 91192-100 (Newport) e foto do
porta amostra utilizado para as irradiações.
Figura 7. Espectro de emissão do Simulador Solar em comparação com o espectro solar na
região da órbita da Terra (ASTM E490).
63
Para irradiação das células em solução aquosa, as amostras foram preparadas
conforme descrito na seção 3.3. Após o período de incubação, uma parte da cultura foi
centrifugada a 4 ºC, 8000 rpm por 10 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o
sedimento de células foi ressuspendido no mesmo volume de solução salina (NaCl 0,9%)
através de agitação em vortex, modelo Gene-2 (Scientific Industries, NY - USA).
Posteriormente, a suspensão de células foi submetida a nova centrifugação nas mesmas
condições. O sedimento foi ressuspendido novamente no mesmo volume de solução salina e a
suspensão de células foi colocada em uma placa de Petri de vidro previamente esterilizada. O
restante da cultura foi depositado em outra placa de Petri correspondente às células misturadas
com meio de cultura. Antes de iniciar a exposição das células às diferentes doses de
irradiação, foi retirado um volume de 100µl de células de cada um dos experimentos para a
diluição seriada e posterior inóculo em placas de Petri de plástico contendo TGY solidificado.
As colônias crescidas nestas placas foram utilizadas como referência (controle) para o cálculo
da porcentagem de sobrevivência irradiação das células em solução aquosa. As irradiações
das células em solução aquosa foram realizadas conforme descrito na Tabela 6.
64
Tabela 6. Desenho experimental para irradiação das células em solução aquosa com o
Simulador Solar Oriel.
Dose (kJ.m
-2
)
Tempo
Replicatas
Tempo final
UV-A
UV-B
UV-C
(s)
(min)
0
0
0
0
0
3
0
7,5
1,2
0.06
15
0,25
3
15s
15
2,4
0.12
15
0,25
3
30s
22,5
3,6
0.18
15
0,25
3
45s
30
4,8
0.24
15
0,25
3
1min
37,5
6,0
0.30
15
0,25
3
1min15s
45
7,2
0.36
15
0,25
3
1min30s
52,5
8,4
0.42
15
0,25
3
1min45s
60
9,6
0.48
15
0,25
3
2min
67,5
10,8
0.54
15
0,25
3
2min15s
75
12,0
0.60
15
0,25
3
2min30s
TOTAL
150
2,50
33
7min30s
Para irradiação das células desidratadas com ou sem meio de cultura, as células foram
preparadas conforme descrito na seção 3.3. Após o período de incubação, a cultura foi
dividida em duas partes. Uma delas foi submetida ao procedimento de retirada do meio de
cultura (centrifugação e ressuspensão em solução salina usando vortex) e a outra parte foi
utilizada a fresco, ou seja, contendo meio de cultura. Após este preparo, volumes de 1µl
dessa mistura foram distribuídos em espaços apropriados no porta amostra (item 3.7.2.),
resultando em amostras contendo ~10
5
células misturadas ou não com meio de cultura. Todas
65
as amostras foram então desidratadas a temperatura ambiente por pelo menos 24 horas. As
irradiações das células desidratadas foram realizadas conforme descrito na Tabela 7.
Tabela 7. Desenho experimental para irradiação das células desidratadas, misturadas ou não
com meio de cultura, em presença ou ausência de grãos de arenito ou basalto.
Dose (kJ.m
-2
)
Tempo (s)
Replicatas
Tempo final
UV-A
UV-B
UV-C
(ad)
(final)
0
0
0
0
0
3
0
7,5
1,2
0,06
15
15
3
15s
22,5
3,6
0,18
30
45
3
45s
45
7,2
0,36
45
90
3
1min30s
75
12,0
0,6
60
150
3
2min30s
225
36,0
1,8
300
450
3
7min30s
450
72,0
3,6
450
900
3
15min
750
120,0
6,0
600
1500
3
25min
TOTAL
1500
1500
24
25min
Para irradiação das células desidratadas na presença ou ausência de grãos de basalto
ou arenito, misturados ou não com meio de cultura, as células foram preparadas conforme
descrito na seção 3.3. Após o período de incubação, a cultura foi dividida em duas partes.
Uma delas foi submetida ao procedimento de retirada do meio de cultura (centrifugação e
ressuspensão em solução salina usando vortex) e a outra parte foi utilizada a fresco, ou seja,
contendo meio de cultura. Após este preparo, células em presença ou ausência de meio de
cultura foram misturadas com grãos de basalto (B) ou arenito (SST) com o intuito de se
verificar a influência da composição elementar de dois tipos distintos de grãos na proteção
66
contra a radiação ultravioleta (item 3.7.1). Os grãos foram divididos em aliquotas de 1,25mg
por tubo de microcentrifuga e autoclavados. Culturas em início da fase estacionária foram
então misturadas com os grãos em volume suficiente para obter uma mistura com
concentração final de grãos de 1,25%. Após homogenização, volumes de 1µl dessa mistura
foram distribuídos em espaços apropriados no porta-amostras, resultando em amostras
contendo ~10
5
células na presença ou ausência de grãos de basalto ou arenito, misturadas ou
não com meio de cultura. Todas as amostras foram então desidratadas a temperatura ambiente
por pelo menos 24 horas. As irradiações dessas amostras foram realizadas conforme descrito
na tabela 2.
Após as etapas de irradiação, as células foram recuperadas e analisadas conforme
descrito nas seções 3.3 e 3.5.
3.7. IRRADIAÇÃO IONIZANTE (RAIOS-X)
Células de D. radiodurans e Chroococcidiopsis sp. foram expostas ao feixe branco de
raios-X (λ >0,04nm) da linha luz B16 do Laboratório Síncrotron Diamond (Reino Unido). Os
procedimentos foram realizados com o apoio da equipe técnica da Open University e do
Diamond, e estão divididos conforme descrito a seguir:
3.7.1. Preparo das amostras
Células da cepa selvagem de D. radiodurans (wt) e da cianobactéria
Chroococcidiopsis sp. isolada do deserto do Atacama (Chile) foram misturadas com grãos de
basalto (B) ou arenito (SST) com o intuito de se verificar a influência da composição
elementar de dois tipos distintos de grãos na proteção contra a radiação ionizante. Os grãos
foram obtidos através da quebra e trituração de 500g de rocha, seguido de seleção com
peneiras de 90µm, 63µm e 38µm. Os grãos com dimensões inferiores a 38µm foram
67
selecionados e submetidos a uma uma nova etapa de trituração em ultratriturador, resultando
em um pó com muitos fragmentos amorfos nanométricos e alguns fragmentos micrométricos
com dimensão média em torno de 10µm (Figura 8). Os grãos foram divididos em aliquotas de
1,25mg por tubo de microcentrifuga e autoclavados. Culturas em início da fase estacionária
foram então misturadas com os grãos.
A composição química dos grãos foi determinada por fluorescência de raios-X (XRF),
mostrando a presença de muitos elementos pesados nos grãos de basalto e 93,72% de SiO
2
nos grãos de arenito (Tabelas 8 e 9). A densidade celular das culturas foi determinada através
de contagem de células ao microscópio óptico, sendo 2,84x10
8
células.ml
-1
para D.
radiodurans e 2x10
7
células.ml
-1
para Chroococcidiopsis sp. As células foram misturadas com
os grãos num volume suficiente para obter uma mistura com concentração final de grãos de
1,25%. Após homogenização, volumes de 1µl dessa mistura foram distribuídos em espaços
apropriados no porta-amostras (Figura 9), resultando em amostras contendo 10
4
-10
5
células
misturadas ou não com 12,5µg de grãos. Todas as amostras foram então desidratadas a
temperatura ambiente por pelo menos 24 horas.
68
Tabela 8. Elementos-traço presentes nos grãos de basalto e arenito, e na mistura 1:1.
Elemento
Basalto
1:1 mix
Arenito
Rb
56
46
35
Sr
849
478
117
Y
28,8
15,6
3,7
Zr
308
179
55
Nb
69,4
34,8
1,1
Ba
568
558
494
Pb
8
7
10
Th
11
7
0
U
3
2
0
Sc
22
11
1
V
288
139
6
Cr
77
39
4
Co
29
14
1
Ni
31
15
3
Cu
53
29
2
Zn
78
40
3
Ga
20
11
4
Mo
3
1
1
As
0
0
0
S
4
99
180
TiO2%
2,74
1,46
0,05
Fe2O3%
10,16
4,79
0,63
69
Tabela 9. Minerais presentes nos grãos de basalto e arenito, bem como na mistura 1:1.
Mineral
Basalto
1:1 mix
Arenito
SiO
2
47,24
71,06
93,72
TiO
2
2,96
1,54
0,05
Al
2
O
3
16,51
10.21
3,88
Fe
2
O
3
11,19
5,77
0,21
MnO
0,17
0,09
0,01
MgO
5,82
2,79
0,03
CaO
10,03
5,16
0,03
Na
2
O
3,51
2,10
0,64
K2O
2,23
2,01
1,77
P
2
O
5
0,58
0,30
0,020
Figura 8. Micrografias ópticas de células de D. radiodurans misturadas com grãos de basalto
(esquerda) e arenito (direita).
70
3.7.2. Porta amostras
Os procedimentos de irradiação na linha de luz B16 do Laboratório Síncrotron
Diamond (Oxford, Reino Unido) demandaram novamente a construção de um porta-amostras
específico, com o apoio da equipe técnica do Diamond e da Open University, com o intuito de
adaptar a metodologia microbiológica às exigências técnicas do experimento. Para isso, foram
utilizas duas peças retangulares de cobre com dimensões de 55mm x 60mm x 1mm. Folhas
de kapton foram montadas entre as 2 telas de cobre. As amostras foram então depositadas
sobre a folha de kapton (1µl/amostra) em triplicata, conforme mostrado na figura 9. O
conjunto foi mantido por 30 horas em dessecador e o material foi então transportado em
ambiente hermeticamente fechado até a estação de trabalho da linha de luz B16.
Figura 9. Visão geral do porta amostras carregado com 72 amostras.
71
3.7.3. Planejamento experimental
Os experimentos foram dividivos em 3 categorias:
(i) Curvas de sobrevivência ao feixe branco de raios-X (>1keV), atenuado com diferentes
filtros;
(ii) Curvas de sobrevivência ao feixe monocromado (10keV) não atenuado;
(iii) Resposta à taxa de dose para células livres desidratadas usando o feixe monocromado
(10keV) atenuado 0,1 e 0,01x, aumentando os tempos de exposição em 10 e 100 vezes
respectivamente para atingir a mesma fluência total.
3.7.4. Câmara de irradiação
Uma câmara de vácuo (12cm x 20cm x 30cm) composta por 4 janelas cilíndricas foi
equipada com um porta amostra montado sobre um sistema de resfriamento com água
corrente para evitar superaquecimento das amostras durante as irradiações. O sistema de
resfriamento foi construído usando uma peça de cobre (1cm x 8cm x 3cm) com tubulações
para circulação de água. A conexão com a aparelhagem externa foi feita através de tubos fixos
acoplados à flange superior. Um sensor de temperatura foi colocado no porta amostra para
monitorar eventuais alterações de temperatura durante as irradiações. Uma folha de kapton
com 25µm de espessura foi utilizada na flange frontal para manter um vácuo de 200Pa dentro
da câmara e ao mesmo tempo permitir a transmissão de praticamente 100% do feixe de raios-
X diretamente para as amostras (Figuras 10 e 11).
72
Figura 10. A, Esquema da câmara mostrando o anel de metal utilizado para prender a folha
de kapton, a folha de kapton utilizada para vedar a câmara, o porta amostra e o sistema de
resfriamento. O porta amostra foi montado sobre o sistema de resfriamento previamente
afixado na flange superior. B, Detalhe do sistema de resfriamento mostrando as tubulações de
entrada e saída de água.
A
B
73
Figura 11. A, Montagem do porta amostra sobre o sistema de resfriamento com os tubos
conectados às mangueiras com água corrente. B, Conjunto do porta amostra e sistema de
resfriamento dentro da câmara de irradiação. A seta mostra o sensor de temperature fixado
sobre o porta amostra para monitorar a eventual variação de temperature através de um
multímetro digital. C, Câmara de irradiação posicionada sobre a plataforma. D, O sistema de
resfriamento conectado à câmara manteve a temperatura a 20°C. E, Alinhamento do porta
amostra com o uso de um altímetro a laser.
74
3.7.5. Irradiações
As amostras foram inicialmente expostas ao feixe branco de raios-X (>1keV) sem
nenhuma atenuação, em pressão levemente positiva de gás nitrogênio, sendo observados
resultados apenas para Chroococcidiopsis sp. após 2 meses de incubação. Numa segunda
bateria de experimentos, os procedimentos de irradiação foram realizados apenas para D.
radiodurans. Nesta segunda bateria de experimentos todas as amostras foram irradiadas em
vácuo (200Pa).
O delineamento experimental para o segundo conjunto de experimentos está mostrado
na Tabela 10. Foram utilizados 4 porta-amostras, sendo que as amostras carregadas no porta-
amostra 1 e 2 foram expostas ao feixe durante os tempos de exposição 0s, 3s, 10s e 30s (total
de 43s por experimento). As amostras carrgadas no porta-amostra 3 foram irradiadas por 0s e
1s, 3s, 10s, 30s, 100s, 300s e 1000s (total de 24min 4s por experimento). Com o objetivo de
verificar se diferentes taxas de dose de radiação levariam a diferentes taxas de sobrevivência,
as amostras do porta-amostra 4 foram irradiadas utilizando feixe monocromado (10 keV) com
três diferentes fluxos, alterando-se os tempos de exposição para atingir as mesmas doses
finais: (i) sem atenuação, (ii) atenuado para 0,1x com folha de carbono de 100µm + folha de
ouro de 10µm e (iii) atenuado para 0,01x usando folha de carbono de 1mm. Os tempos de
exposição foram então aumentados em 1x, 10x e 100x respectivamente. Entretanto, as doses
finais utilizadas nestes experimentos não foram suficientes para gerar valores significativos de
inativação celular.
Os espectros do feixe branco atenuado com diferentes atenuadores ou filtros são
apresentados na Figura 12.
Após as irradiações, as amostras foram recuperadas e submetidas aos procedimentos
descritos nas seções 3.3 e 3.5.
75
Tabela 10. Desenho experimental para irradiação de D. radiodurans com feixe branco de
raios-X da linha de luz B-16 do síncrotron Diamon, Reino Unido.
Experimento
Amostra
Atenuador
Porta-amostra
1
NC
2mm Al
1
2
B
2mm Al
1
3
SST
2mm Al
1
4
NC
50µm Mo
1
5
B
50µm Mo
1
6
SST
50µm Mo
1
7
NC
100µm C + 10m Au
2
8
B
100µm C + 10m Au
2
9
SST
100µm C + 10m Au
2
10
NC
1mm C
2
11
B
1mm C
2
12
SST
1mm C
2
13
NC
-
3
14
B
-
3
15
SST
-
3
16
NC
-
4
17
NC
-
4
18
NC
-
4
NC, Células livres. B, Células misturadas com basalto. SST, Células misturadas com arenito.
76
Figura 12. Espectros do feixe branco atenuado com folhas de alumínio, molibdênio, ouro e
carbono. Note que a presença de uma fina folha de carbono junto com o ouro tem somente a
função de proteger a folha de ouro contra a radiação intensa. As fluências integradas (W)
estão mostradas por cm
2
.
3.8. IRRADIAÇÃO COM PARTÍCULAS CARREGADAS
As amostras foram preparadas conforme descrito no item 3.7.1, ou seja, contendo
12,5µg de grãos de basalto ou arenito e 2x10
5
células de D. radiodurans em cada amostra.
3.8.1. Elétrons
Os experimentos de irradiação com feixe de elétrons foram realizados utilizando as
instalações do Laboratório de Física Molecular do Departamento de Física e Astronomia da
Open University, Milton Keynes, Inglaterra, Reino Unido. Uma câmara de vácuo capaz de
77
manter um regime da ordem de 10
-4
a 10
-6
Pa foi acoplada a um canhão de elétrons da marca
Kimball model ELG-2/EGPS-1022, capaz de emitir um feixe de elétrons de 2keV com fluxo e
energia controlados. Após desidratação por pelo menos 15 horas em ambiente livre de
contaminantes (fluxo laminar), as amostras depositadas sobre filtros Millipore foram coladas
num porta amostra metálico utilizando uma fita dupla-face de carbono e o conjunto foi
colocado dentro da câmara e posicionado contra o feixe utilizando um manipulador rotatório.
O desenho experimental para os dois conjuntos experimentais é mostrado na Tabela 11. As
irradiações foram feitas conforme descrito na Tabela 12.
Tabela 11. Desenho experimental para irradiação de microrganismos com feixe de elétrons de
2keV.
Experiment
Sample
1
NC
Chroococcidiopsis sp.
2
SST
Chroococcidiopsis sp.
3
B
Chroococcidiopsis sp.
4
NC
Deinococcus radiodurans
5
SST
Deinococcus radiodurans
6
B
Deinococcus radiodurans
78
Tabela 12. Detalhamento das irradiações com feixe de elétrons de 2keV.
Dose (x10
14
elétrons.cm
-2
)
Tempo de exposição
Replicatas
Tempo final estimado
(s)
(min)
0 (Controle)
0
0
3
0
8,61
5
0,08
3
15s
25,82
15
0,25
3
45s
77,45
45
0,75
3
2min 15s
232,34
135
2,25
3
6min 45s
697,00
405
6,75
3
20min 15s
TOTAL
605
10,083
18
30min 15s
3.8.2. Prótons
Os experimentos de irradiação com feixe de prótons foram realizados nas instalações
do Laboratório de Física Experimental do Observatório de Catania, Sicília, Itália. Uma
câmara de vácuo capaz de manter um regime da ordem de 10
-4
Pa foi acoplada a um sistema
de geração de prótons com energia final de 200 keV. As amostras depositadas sobre filtros
Millipore foram coladas num porta amostra metálico utilizando uma fita dupla-face de
carbono e o conjunto foi colocado dentro da câmara e posicionado contra o feixe. As
irradiações estão detalhadas nas Tabelas 13 a 15.
79
Tabela 13. Detalhamento das irradiações com feixe de prótons de 200keV em células de D.
radiodurans.
Amostra
Carga
(nC)
Prótons
(cm
-2
)
Prótons
(amostra
-1
)
Prótons
(célula
-1
)
Dose
(Gy)*
Replicatas
NC
0**
0
0
0
0
3
NC
0,04
2,77x10
8
4,33x10
6
6,15
32,35
2
NC
0,44
2,77x10
9
4,33x10
7
61,46
323,52
3
NC
4,44
2,77x10
10
4,33x10
8
6,15x10
2
3,24x10
3
3
NC
44,40
2,77x10
11
4,33x10
9
6,15x10
3
3,24x10
4
2
NC
4,44x10
3
2,77x10
12
4,33x10
10
6,15x10
4
3,24x10
5
2
NC
4,44x10
4
2,77x10
13
4,33x10
11
6,15x10
5
3,24x10
6
2
NC
4,44x10
5
2,77x10
14
4,33x10
12
6,15x10
6
3,24x10
7
2
* Calculada através do software SRIM 2010, assumindo densidade de 1,0g.cm
-3
, e
composição elementar média do material biológico como sendo 50% de Carbono, 30% de
Nitrogênio, 10% de Hidrogênio e 10% de Oxigênio.
** Controles internos, submetidos a todos os tratamentos exceto às irradiações. NC = células
livres.
Tabela 14. Detalhamento das irradiações com feixe de prótons de 200keV em células de D.
radiodurans misturadas com grãos de arenito.
Amostra
Carga
(nC)
Prótons
(cm
-2
)
Prótons
(amostra
-1
)
Prótons
(célula
-1
)
Dose
(Gy)*
Replicatas
SST
0
0
0
0
0
3
SST
22,20
1,39x10
11
2,17x10
9
3,07x10
3
1,38x10
4
2
SST
4,44x10
4
2,77x10
13
4,33x10
11
6,15x10
5
2,75x10
6
2
* Calculada através do software SRIM 2010, assumindo densidade de 1,0g.cm
-3
, e
composição elementar média do material biológico como sendo 50% de Carbono, 30% de
Nitrogênio, 10% de Hidrogênio e 10% de Oxigênio.
** Controles internos, submetidos a todos os tratamentos exceto às irradiações. SST = células
misturadas com grãos de arenito.
80
Tabela 15. Detalhamento das irradiações com feixe de prótons de 200keV em células de D.
radiodurans misturadas com grãos de basalto.
Amostra
Carga
(nC)
Prótons
(cm
-2
)
Prótons
(amostra
-1
)
Prótons
(célula
-1
)
Dose
(Gy)*
Replicatas
B
0
0
0
0
0
3
B
22,20
1,39x10
11
2,17x10
9
3,07x10
3
1,38x10
4
2
B
4,44x10
4
2,77x10
13
4,33x10
11
6,15x10
5
2,75x10
6
2
* Calculada através do software SRIM 2010, assumindo densidade de 1,0g.cm
-3
, e
composição elementar média do material biológico como sendo 50% de Carbono, 30% de
Nitrogênio, 10% de Hidrogênio e 10% de Oxigênio.
** Controles internos, submetidos a todos os tratamentos exceto às irradiações. B = células
misturadas com grãos de basalto.
Num experimento piloto, amostras de D. radiodurans foram também depositadas
sobre substratos análogos a poeira cósmica (CDAs). Forsterita amorfa (Mg
2
SiO
4
) e fayalita
amorfa e cristalina (Fe
2
SiO
4
), foram testadas com o intuito de se verificar se existe alguma
influência do tipo de substrato na inativação celular. Esses minerais são considerados bons
análogos de poeira interestelar devido a sua estrutura, morfologia e composição molecular.
Após as irradiações, as células de D. radiodurans foram recuperadas dos substratos e
submetidas a diluição seriada e plaqueamento. As colônias foram contadas após um período
máximo de 72 horas de incubação a 29°C. Os substratos contendo células de
Chroococcidiopsis sp. foram imersos em meio de cultura BG-11 divivido em alíquotas de 2ml
depositadas em placas de 12 poços. A incubação foi feita a temperature ambiente sob ciclos
naturais de iluminação artificial com luz fluorescente a 40cm de distância da fonte de luz.
81
3.8.3. Carbono
Os experimentos de irradiação com feixe de íons de carbono foram realizados
utilizando as instalações do Laboratório de Física Experimental do Departamento de Física da
Queens University Belfast, na Irlanda do Norte, Reino Unido. Foi utilizada ma câmara de
vácuo (10
-5
Pa) capaz de manter um sistema de geração de íons com energia final de 4keV. As
amostras depositadas sobre filtros Millipore foram coladas num porta amostra metálico
utilizando uma fita dupla-face de carbono e o conjunto foi colocado dentro da câmara e
posicionado contra o feixe utilizando um porta amostra rotatório. Células livres ou misturadas
com grãos de basalto ou arenito foram expostas em triplicata ao feixe de íons de acordo com a
Tabela 16.
Tabela 16. Detalhamento das irradiações com íons de carbono de 4keV.
Dose
(x10
13
íons.cm
-2
)
Tempo de exposição
Replicatas
Tempo final
(s)
(min)
0 (Controle)
0
0
3
0
3
45
0,75
3
9s
10
150
2,50
3
30s
33
500
8,33
3
1min 39s
100
1665
27,75
3
6min 45s
333
5545
92,42
3
7min 6s
TOTAL
7905
131,75
18
6h35min15s
82
3.9. EXPOSIÇÃO PROLONGADA DE Deinococcus radiodurans AO ALTO VÁCUO
As amostras foram preparadas conforme descrito no item IV.4 e expostas por 4
semanas em câmara de vácuo (10
-5
Pa), sendo retiradas da câmara nos tempos 1, 4, 7, 21 e 28
dias. Paralelamente, amostras controles referentes a cada variação experimental foram
mantidas pelo mesmo período de tempo em condições ambientes (temperatura ~22°C, pressão
10
5
Pa), sendo recuperadas as amostras correspondentes aos tratamentos nos mesmos
intervalos de tempo. As amostras foram então analisadas conforme descrito nas seções 3.3. e
3.5.
3.10. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS RESISTENTES ÀS CONDIÇÕES
MARCIANAS
Foram utilizados dois parâmetros independentes para o isolamento de microrganismos
resistentes: (i) a radiação UV-C incidente na superfície marciana e (ii) a composição
atmosférica sob pressão marciana.
3.10.1. Radiação ultravioleta
As amostras de solo provenientes de 5 regiões diferentes do deserto do Atacama foram
submetidas a diluição seriada em solução salina (NaCl 0,9%) e plaqueamento (Figura 13),
para estimativa do número de microrganismos totais cultiváveis em 3 meios de cultura
diferentes: LB, TGY e Marine Agar 2216 (Difco). Para isso, 1g de cada tipo de solo foi
diluído em 10ml de solução salina contendo pérolas de vidro previamente autoclavadas e o
material foi deixado em frascos de vidro do tipo Erlenmeyer de 250ml sob agitação de
100rpm por 3 horas à temperatura ambiente. Em seguida 5ml foram transferidos para placas
de Petri de vidro, com posterior irradiação utilizando lâmpada germicida (UVC). Para o
cálculo da dose irradiada, foi utilizada uma fotocélula do tipo CX-254 (Vilber Loumat). Os
83
valores medidos em mW·cm
-2
foram convertidos para J·m
-2
s
-1
e os tratamentos foram feitos
através de exposição do material em tempos equivalentes a uma dose de 300 J·m
-2
.
Figura 13. Etapas da pesquisa mostrando a localização geográfica do deserto do Atacama, no
Chile, as amostras sendo coletadas no campo e uma ilustração sobre o procedimento
experimental utilizado para determinar o número total de micrortanismos cultiváveis antes e
depois da irradição UV (diluição seriada e plaqueamento em meio de cultura.
As colônias pigmentadas foram isoladas e inoculadas nos 3 diferentes tipos de meio de
cultura. Em seguida, cada isolado pigmentado foi testado quanto a sua capacidade de
proliferação nos meios de cultura líquidos correspondentes. Aqueles com capacidade de se
proliferar nos meios líquidos foram submetidos a uma nova etapa de irradiação com lâmpada
germicida UVC. Os isolados mais resistentes foram submetidos à identificação molecular
através de amplificação parcial do gene 16S RNAr.
Paralelamente, as amostras de solo foram submetidas a extração de DNA e as
seqüências de 16S RNAr foram amplificadas por PCR e separadas por Eletroforese em Gel
com Gradiente de Desnaturação (DGGE), gerando padrões de bandas representativos da
estrutura das comunidades microbianas.
84
3.10.2. Atmosfera marciana
Amostras do biofilme preto provenientes da região de La Portada, Chile (seção 3.4)
foram divididas em aliquotas de 10mg e colocadas em tubos de microcentrífuga, em triplicata,
sendo posteriormente colocadas em uma câmara de vácuo com controle de temperatura (-
28°C) e de pressão (6 a 8 Pa), mantendo uma atmosfera interna composta de CO
2
(95,3%), N
2
(2,7%), Ar (1,7%), O
2
(0,2%) e H
2
O (0,03%). As amostras foram retiradas destas condições
após 1, 4, 7, 21 e 28 dias de exposição, e inoculadas em meios de cultura oligotrófico (Extrato
de levedura 0,1% ou Triptona 0,1%).
85
4. RESULTADOS
Os resultados dos experimentos de irradiação foram agrupados de acordo com
diferentes contextos astronômicos do ponto de vista da hipótese da Panspermia, ou seja,
considerando as radiações presentes no espaço.
Primeiramente, são apresentados os efeitos das radiações não-ionizantes (ultravioleta)
em modelos biológicos, utilizando seis diferentes fontes de radiação, em duas condições
diferentes (presença ou ausência de material orgânico nas amostras). Além disso, em alguns
experimentos foram avaliados também os efeitos da proteção conferida por dois tipos de grãos
de poeira (arenito ou basalto) contra as radiações ultravioleta.
Em seguida são apresentados os efeitos de radiações ionizantes, tanto eletromagnéticas
como partículas carregadas, em modelos biológicos associados ou não com os grãos de poeira
(arenito ou basalto).
Por último, são apresentados os resultados do isolamento de microrganismos presentes
em amostras de solo de diferentes regiões do deserto do Atacama, no Chile, utilizando
separadamente, tanto a radiação ultravioleta como a atmosfera marciana.
4.1. EFEITOS DA RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA EXTRATERRESTRE
As células foram irradiadas em 4 condições diferentes: (i) células em soluções
aquosas, (ii) células desidratadas, (iii) células desidratadas misturadas com material orgânico
proveniente do meio de cultura, e (iv) células desidratadas misturadas com grãos de poeira
(arenito ou basalto). Para uma melhor comparação dos efeitos da radiação ultravioleta
extraterrestre sobre Deinococcus radiodurans, os resultados foram agrupados nessas quatro
categorias. As barras de erro das curvas de sobrevivência representam desvios-padrão em
relação à média de 3 experimentos distintos. Pontos sem barras representam uma única
amostra analisada.
86
4.1.1. Células em soluções aquosas
Os experimentos de irradiação UV em solução aquosa foram realizados para verificar
os efeitos produzidos em presença ou ausência de moléculas orgânicas do meio de cultura na
sobrevivência das células hidratadas. Inicialmente foram feitos vários ensaios de inativação
celular com o Simulador Solar Oriel utilizando diferentes filtros, de acordo com a Tabela 17.
Os espectros após cada um dos filtros são diferentes, sendo que a diferença mais notável é em
relação ao UV-C, cuja irradiância fica drasticamente reduzida com o uso de qualquer um dos
filtros utilizados.
Tabela 17. Irradiação de D. radiodurans em solução salina com o Simulador Solar utilizando
diferentes filtros, resultando em diferentes espectros.
Espectros
Filtro
Irradiância (J.m
-2
.s
-1
)
%
UV-A
UV-B
UV-C
UV-A
UV-B
UV-C
A
-
980,00
170,00
3,80
84,94
14,73
0,33
B
AM0+81051
624,10
81,00
0,01
88,51
11,49
0,00
C
AM0+81050
624,10
60,00
0,01
91,23
8,77
0,00
D
AM0+87066
380,00
10,40
0,01
97,33
2,66
0,00
Filtros: AM0, bloqueia o excesso de radiação infravermelha. 81051, bloqueia UV-C. 81050,
bloqueia UV-B e UV-C. 87066, bloqueia radiação infravermelha e luz visível.
Conforme pode ser observado na Figura 14, os efeitos produzidos pelas radiações com
espectros correspondentes ao uso de filtros, são bastante semelhantes, sendo que a inativação
correspondente a radiação sem o uso de filtros é muito mais eficiente.
87
Figura 14. Comparação dos efeitos da irradiação UV (λ > 200nm) sobre D. radiodurans em
solução salina (NaCl 0,9%) utilizando diferentes filtros, conforme descrito na Tabela 17.
Quando as irradiações sem filtro são feitas em células na presença de meio de cultura,
que contém muitas moléculas orgânicas, o perfil de sobrevivência é maior (Figura 15).
Curiosamente, se os mesmos valores de sobrevivência forem plotados em gráficos com doses
referentes apenas à porção UV-C do espectro, o perfil de sobrevivência de D. radiodurans se
torna muito semelhante à sobrevivência da linhagem AB1157 de Escherichia coli ao UV-C
(Figura 16). Na Figura 16, os valores correspondentes às amostras irradiadas em solução
salina estão marcados em branco enquanto que os correspondentes às amostras irradiadas em
meio de cultura estão marcados em preto. Os valores referentes às células irradiadas com o
simulador solar estão marcados com círculos pretos, e os referentes às células de E. coli estão
marcadas com triângulos brancos. Células de D. radiodurans irradiadas em solução salina
(NaCl 0,9%) com lâmpada de mercúrio (λ = 254nm) confirmaram seu perfil de alta resistência
à radiação UV-C (BATTISTA, 1997).
88
Figura 15. Comparação dos efeitos da irradiação com o simulador solar (λ > 200nm) sem
filtro sobre D. radiodurans em solução salina (NaCl 0,9%) ou em meio de cultura.
Figura 16. Comparação dos efeitos da irradiação com o simulador solar (λ > 200nm) e com a
lâmpada de mercúrio (λ = 254nm), sobre D. radiodurans em solução salina (NaCl 0,9%) ou
meio de cultura (MC), em comparação com células de E. coli irradiadas com lâmpada de
mercúrio.
89
4.1.2. Células desidratadas
As amostras desidratadas foram preparadas depositando-se as células microbianas
sobre dois tipos de substratos carbonáceos: (i) um substrato de policarbonato (filtro Millipore
de porosidade 0,45 µm) com superfície lisa e um substrato de carbono (Shinto Paint Co.), com
superfície rugosa (Figura 17). Com isso, foi possível verificar a influência do tipo de substrato
na sobrevivência microbiana. Análises feitas ao microscópio eletrônico revelaram a formação
de monocamada de células no filtro Millipore (Figura 17-A), empilhamento de células (Figura
17-B) e uma proteção adicional conferida pelo meio de cultura cristalizado após desidratação
(Figura 17-C). Através de análises por perfilômetria, verificou-se que a rugosidade
preponderante da fita de carbono varia de 2 µm a 8 µm (Figura 17-D).
No filtro Millipore as amostras inevitavelmente se tornavam livres do material
orgânico, pois o líquido contendo o material orgânico era drenado para a fita de carbono,
sempre presente embaixo do filtro Millipore (Figura 17-A). Já as amostras depositadas sobre a
fita de carbono acabavam acumulando meio de cultura (Figura 17-B). Após a desidratação
havia a formação de uma matriz cristalizada de substâncias orgânicas que funcionavam como
um escudo físico contra as radiações. As condições testadas na maioria dos experimentos
correspondem à Figura 17-A (sem meio de cultura) e Figura 17-C (células misturadas com
material orgânico). Uma condição análoga à ilustrada na Figura 17-B, ou seja, com uma etapa
de remoção do meio de cultura antes da deposição das amostras em substrato não-poroso, foi
testada apenas com o Simulador Solar Oriel, sendo que o substrato utilizado foi uma folha de
kapton lisa com 15 µm de espessura.
90
Figura 17. Amostras depositadas em 2 tipos de substratos, mostrando 3 situações distintas: A,
monocamada de células formada sobre filtro Millipore. B, superfície da fita de carbono
mostrando regiões de empilhamento de células. C, células embebidas na matriz formada
através da cristalização do meio de cultura após desidratação. Uma análise computadorizada
da superfície da fita de carbono é mostrada em D.
Conforme mostrado na Figura 17, a presença de material orgânico juntamente com as
células depositadas na fita de carbono têm papel mais relevante na proteção celular do que o
próprio relevo da superfície do substrato. Isso também é demonstrado pelas curvas de
sobrevivência apresentadas a seguir. Deste modo, as amostras depositadas em Filtro Millipore
foram denominadas simplesmente de “células desidratadas” e as amostras depositadas na fita
de carbono foram denominadas “células desidratadas misturadas com material orgânico”. Os
A
B
C
D
91
pontos dos gráficos não estão ligados por linhas porque as análises são correspondentes a
amostras distintas irradiadas com diferentes doses.
De acordo com a Figura 18, células desidratadas de D. radiodurans irradiadas com
lâmpada de hidrogênio (λ = 121 nm) ou com o Simulador Solar (λ > 200 nm), apresentam
perfis de inativação semelhantes.
Figura 18. Comparação dos efeitos da irradiação com a lâmpada de hidrogênio (λ = 121 nm)
e com o simulador solar (λ > 200 nm) sobre células desidratadas de D. radiodurans.
A sobrevivência de células de D. radiodurans irradiadas com lâmpada de xenônio (λ
= 145nm), corresponde a valores superiores a 50% mesmo para as maiores doses testadas
(100 J·m
-2
) (Figura 19).
92
Figura 19. Efeitos da irradiação com a lâmpada de xenônio (λ = 145 nm) sobre células
desidratadas de D. radiodurans. A barra de erro de um dos pontos é inferior ao tamanho da
marca.
Comparando os efeitos da irradiação UV com feixe monocromático (λ = 254 nm) da
linha de luz CD1 do Laboratório Síncrotron Astrid (Dinamarca) com os efeitos do feixe
branco (λ > 57,47 nm) da linha de luz TGM do LNLS (Figura 20), é possível perceber que
apesar da diferença na energia dos fótons, os perfis de inativação foram muito parecidos. A
inativação com feixe monocromático (λ = 254 nm) em células desidratadas foi muito mais
eficiente do que a irradiação com lâmpada de mercúrio com pico de emissão de 254 nm
(Figura 16).
Comparando os efeitos das duas fontes de radiação UV de amplo espectro: o
Simulador Solar Oriel (λ > 200 nm) e a linha de luz TGM (λ > 57,47 nm), é possível observar
que a taxa de inativação provocada pelo feixe da linha de luz TGM foi muito maior do que a
taxa de inativação provocada pelo simulador solar (Figura 21).
93
Figura 20. Comparação dos efeitos da irradiação na linha de luz CD1 do Laboratório
Síncrotron Astrid (λ = 254nm) e na linha de luz TGM do LNLS (λ > 57,47 nm) sobre células
desidratadas de D. radiodurans.
94
Figura 21. Comparação dos efeitos da irradiação com o Simulador Solar (λ > 200nm) e com a
linha de luz TGM do LNLS (λ > 57,47nm) sobre células desidratadas de D. radiodurans.
4.1.3. Células desidratadas misturadas com material orgânico
Para verificar eventuais efeitos protetores conferidos por material orgânico nas células
irradiadas com as diferentes fontes de radiação, as amostras foram desidratadas na presença
de meio de cultura. Células de D. radiodurans desidratadas na presença de meio de cultura e
irradiadas com o Simulador Solar (λ > 200nm) são inativadas muito mais eficientemente do
que as células irradiadas com lâmpada de hidrogênio (λ = 121nm) (Figura 22). Entretanto,
uma tendência assintótica é facilmente perceptível na curva correspondente à irradiação com
lâmpada de hidrogênio (λ = 121nm), sendo que para as doses menores, o perfil de inativação é
semelhante para as duas fontes de radiação.
95
Figura 22. Comparação dos efeitos da irradiação com a lâmpada de hidrogênio (λ = 121 nm)
e com o simulador solar (λ > 200nm) sobre células desidratadas de D. radiodurans, na
presença de meio de cultura.
Quando as células desidratadas e misturadas com o meio de cultura, são expostas ao
feixe monocromático com fótons de comprimento de onda 254 nm, a porcentagem de
sobrevivência é superior a 20%, mesmo para a maior dose testada (300 J·m
-2
) (Figura 23). As
células irradiadas com lâmpada de xenônio (λ = 145 nm) apresentaram valores de
sobrevivência que oscilaram em torno de 100% (Figura 23).
96
Figura 23. Comparação dos efeitos da irradiação com a lâmpada de xenônio (λ = 145nm) e
com a linha de luz CD1 do Laboratório Síncrotron Astrid (λ = 254nm) sobre células
desidratadas de D. radiodurans, na presença de meio de cultura.
A Figura 24 é análoga à Figura 21, ou seja, também é feita uma comparação dos
efeitos das duas fontes de radiação UV de amplo espectro: o Simulador Solar Oriel (λ >
200nm) e a linha de luz TGM (λ > 57,47nm). Entretanto, para células desidratadas e
misturadas com o material orgânico do meio de cultura, a inativação celular causada pela
irradiação na linha de luz TGM é maior do que a inativação causada pela irradiação com o
simulador solar apenas para as maiores doses testadas. Além disso, é possível observar uma
tendência fortemente assintótica para a curva de sobrevivência resultante da irradiação na
linha de luz TGM.
97
Figura 24. Comparação dos efeitos da irradiação com o Simulador Solar (λ > 200 nm) e na
linha de luz TGM do LNLS (λ > 57,47 nm) sobre células desidratadas de D. radiodurans, na
presença de meio de cultura.
Os efeitos conferidos pelo empilhamento de células nas amostras também foram
verificados utilizando o feixe branco da linha de luz TGM (λ > 57,47 nm). Para isso, amostras
contendo entre 10
4
e 10
7
células em uma área de 20mm
2
foram preparadas e irradiadas com
uma dose fixa de 600 J·m
-2
. Foi observado um aumento na sobrevivência para as amostras
contendo mais do que 10
6
células (Figura 25), mostrando que células inativadas na superfície
da amostra são capazes de proteger as camadas inferiores contra o feixe branco (λ > 57,47
nm).
98
Figura 25. Influência da concentração de células na fração de sobrevivência a 600 J·m
-2
de
radiação UV na linha de luz TGM do LNLS (λ > 57,47 nm). Amostras contendo 10
4
, 5x10
4
,
10
5
, 5x10
5
, 10
6
, 5x10
6
e 10
7
células foram irradiadas com a luz síncrotron. O empilhamento de
células (> 5 x 10
6
células / amostra) foi suficiente para aumentar a sobrevivência celular.
Os efeitos conferidos pela presença de material orgânico nas amostras também foram
verificados para o mutante recA de D. radiodurans, deficiente na produção da proteína recA.
Esta proteína está envolvida no reparo de quebra dupla no DNA sendo que o mutante
defectivo na produção desta proteína é extremamente sensível a estresses como desidratação e
radiação.
Para melhor comparação dos resultados, os experimentos foram agrupados de acordo
com a fonte de radiação utilizada. Nos experimentos de irradiação com a lâmpada de xenônio
(λ = 145 nm), a sobrevivência celular foi praticamente 100%, mesmo para a maior dose
testada (300 J·m
-2
), independente da presença ou ausência de meio de cultura (Figura 26).
Fração de sobrevivência (N/N
0
)
Células por amostra
99
Figura 26. Efeitos da irradiação com lâmpada de xenônio (λ = 145nm) nas cepas selvagem
(esquerda) e mutante recA (direita) de D. radiodurans na presença (MC) ou ausência de meio
de cultura.
Na Figura 27 é possível observar um mesmo padrão de resultados tanto para a cepa
selvagem (wt) como para a cepa mutante (recA). A presença de material orgânico contribui
para uma melhor sobrevivência das células desidratadas.
Figura 27. Efeitos da irradiação na linha de luz CD1 do Laboratório Síncrotron Astrid (λ =
254 nm) nas cepas selvagem (esquerda) e mutante recA (direita) de D. radiodurans na
presença (MC) ou ausência de meio de cultura.
Dose (J·m
-2
)
Dose (J·m
-2
)
100
Uma comparação dos efeitos da irradiação na linha de luz TGM do LNLS (λ > 57,47
nm) entre as cepas selvagem e mutante recA de D. radiodurans é mostrada na Figura 28. É
possível observar uma tendência assintótica em todas as curvas, sendo mais pronunciada nas
curvas obtidas com amostras na presença de meio de cultura. O mutante recA na presença de
material orgânico foi mais resistente à irradiação do que a cepa selvagem (wt) na ausência de
moléculas orgânicas, demonstrando a influência desse tipo de material na sobrevivência
celular.
Figura 28. Efeitos da irradiação na linha de luz TGM do LNLS (λ > 57,47 nm) nas cepas
selvagem (esquerda) e mutante recA (direita) de D. radiodurans na presença (MC) ou
ausência de meio de cultura. No gráfico da direita, a curva de sobrevivência do mutante recA
está comparada com a da cepa selvagem, uma vez que as amostras recA não resistiram aos
procedimentos experimentais na ausência de material orgânico.
4.1.4. Células desidratadas misturadas com grãos de poeira (arenito ou basalto)
Os experimentos de irradiação UV em amostras da cepa selvagem de D. radiodurans
misturadas com grãos de poeira foram feitos apenas com o Simulador Solar Oriel. As
Dose (kJ·m
-2
)
101
condições da irradiação corresponderam ao espectro sem filtros (Tabela 17), com a lâmpada
ajustada na sua potência máxima (1000 W).
Em relação às células livres, foi observado que as células irradiadas apenas na
presença de material orgânico proveniente do meio de cultura, apresentaram um perfíl de
sobrevivência maior do que as amostras irradiadas na condição de células livres (Figura 29).
Figura 29. Influência da presença de material orgânico proveniente do meio de cultura na
sobrevivência de células irradiadas com o simulador solar (λ > 200 nm).
Células misturadas com grãos de arenito na presença ou ausência de material orgânico
apresentaram perfis de inativação bastante semelhantes, com taxas de sobrevivência maiores
do que as células livres, porém menores do que células misturadas apenas com meio de
cultura. É possível observar ainda que, para as doses menores, as células são mais protegidas
pelo material orgânico isoladamente do que pelo material orgânico misturado com grãos de
102
arenito na presença ou ausência de material orgânico. Já para as doses maiores a proteção
conferida pelo material orgânico isoladamente apresenta uma queda acentuada (Figura 30).
Figura 30. Influência da presença de grãos de arenito misturados (SST MC) ou não (SST)
com material orgânico nas amostras irradiadas com o simulador solar (λ > 200 nm).
Células misturadas apenas com grãos de basalto (B) foram inativadas muito
eficientemente, já que as taxas de sobrevivência foram reduzidas para valores inferiores a 10
-5
(limite de detecção do método), mesmo nas doses mais baixas testadas (Figura 31). Já as
células misturadas com grãos de basalto na presença de material orgânico (B + MC)
apresentaram perfil de inativação semelhante às células misturadas apenas com material
orgânico nas doses mais baixas testadas. Já para as doses maiores, a tendência assintótica da
curva ficou evidente e a taxa de sobrevivência das amostras B+MC ficou estabilizada na faixa
de 0,1%.
103
Figura 31. Influência da presença de grãos de basalto misturados (B + MC) ou não (B) com
material orgânico nas amostras irradiadas com o simulador solar (λ > 200 nm).
4.1.5. Células de Chroococcidiopsis sp.
As medidas de inativação das amostras de Chroococcidiopsis sp. foram obtidas
através da verificação do tempo de início de crescimento após as irradiações. De acordo com
a Tabela 18, as células depositadas sobre o filtro Millipore apresentaram um perfil
característico de inativação. Quanto maior a dose administrada, maior o tempo necessário
para que a proliferação celular seja detectável, o que reflete um menor número de células
viáveis remanescentes. Já as células depositadas sobre a fita de carbono não puderam ser
recuperadas, nem mesmo dos controles não irradiados. Uma análise preliminar da composição
química da fita de carbono revelou a presença de metais pesados, como ouro e cobre, que
podem ter contribuído para a diminuição da viabilidade celular através de efeitos tóxicos
letais para esta cianobactéria.
104
Tabela 18. Tempo mínimo necessário (dias) para detecção da proliferação cellular ao
microscópio da cianobactéria Chroococcidiopsis sp. após irradiações com doses crescentes de
luz ultravioleta (λ = 254 nm) no laboratório síncrotron Astrid, Dinamarca. A incubação foi
feita a temperature ambiente (~22°C) utilizando ciclos naturais de presença e ausência de luz.
Amostras
Doses (J.m
-2
)
0 (control)
1
3
10
30
100
300
Filtro Millipore
26
26
26
27
28
38
a
46
a
Fita de carbono
*-
-
-
-
-
-
-
*- Nenhum crescimento observado.
a
Resultados observados em duas das três replicatas.
4.1.6. Comunidade microbiana epilítica
Em relação ao biofilme preto proveniente da região de La Portada, no Chile,
infelizmente nenhum crescimento foi observado após todo o período de incubação, mesmo
nos controles não-submetidos aos tratamentos. Vários testes de crescimento utilizando outros
microrganismos fototróficos com o mesmo tipo de meio de cultura foram realizados.
Provavelmente a quantidade de amostras utilizada (10mg), juntamente com as condições de
transporte das amostras do Chile ao Reino Unido, podem ter contribuído para a obtenção dos
resultados observados. Além disso, os microrganimos fototróficos observados ao microscópio
podem ser representantes do grupo de microrganismos conhecidos como viáveis mas não
cultiváveis, inviabilizando os experimentos que envolvem cultivo celular.
4.2. EFEITOS DE SURTOS DE RADIAÇÕES IONIZANTES
Os experimentos foram divididos em 3 categorias: (i) sobrevivência ao feixe branco de
raios-X (λ > 0.04 nm) atenuado com diferentes filtros, (ii) sobrevivência ao feixe
monocromático (10 keV), e (iii) resposta a taxa de dose para células desidratadas. As células
misturadas apenas com meio de cultura foram denominadas “NC”, células misturadas com
105
meio de cultura e com grãos de arenito foram denominadas “SST” e as células misturadas com
meio de cultura e com grãos de basalto foram denominadas simplesmente de “B”. As barras
de erro das curvas de sobrevivência representam desvios-padrão em relação à média de 3
experimentos distintos. Pontos sem barras representam uma única amostra analisada.
4.2.1. Recuperação celular dos controles
Os controles obtidos após a desidratação foram recuperados e analisados da mesma
maneira que as amostras expostas aos tratamentos. Estes controles foram denominados
controles externos. Já os controles submetidos a todos os procedimentos exceto as irradiações
foram denominados controles internos (Tabela 19 e Figura 32), sendo então usados como
referência para as estimativas das taxas de sobrevivência.
Tabela 19. Viabilidade dos controles externos e internos. Os valores de desvio-padrão (DP)
representam 24 replicatas para as amostras denominadas células livres e 15 replicatas para as
amostras correspondentes as células misturadas com grãos de basalto ou arenito.
Amostras
Controles externos
Controles internos
a
UFC.ml
-1
b
Viabilidade (%)
DP
UFC.ml
-1
c
Viabildade (%)
DP
NC
1,64 x 10
8
58
0,11
3,9 x 10
7
24
0.09
SST
1,12 x 10
8
39
0,27
5,6 x 10
7
50
0.30
B
1,12 x 10
8
39
0,27
6,9 x 10
7
62
0.32
a – Unidades formadoras de colônias
b – Comparado com a contagem de células ao microscópio (2,84 x 10
8
CFU.ml
-1
).
c – Comparado com os controles externos.
106
Figura 32. Sobrevivência das células misturadas com os 3 tipos de grãos. Os dados foram
obtidos dividindo-se os valores de recuperação dos controles externos pelos valores de
recuperação dos controles internos.
Os controles internos foram expostos a todos os procedimentos exceto as irradiações,
enquanto que os controles externos foram obtidos logo após a mistura das células com os
grãos. As barras de erro representam os desvios-padrão de 24 replicatas para células livres e
15 replicatas para células misturadas com grãos de basalto ou arenito.
4.2.2. Sobrevivência ao feixe branco de raios-X ( > 1 keV)
As curvas de sobrevivência foram obtidas apenas com os feixes mais atenuados,
correspondentes ao uso de folha de: (i) 2 mm de alumínio, (ii) 50 µm de molibdênio, e (iii)
100 µm de carbono + 10 µm de ouro (Figura 33). As taxas de sobrevivência dos
experimentos utilizando atenuação fraca, ou seja, os feixes com mais intensidade,
correspondentes ao uso de folha de carbono de 1 mm, foram abaixo do limite de detecção do
método microbiológico utilizado (< 10
-5
), não sendo possível gerar curvas de sobrevivência
que pudessem ser plotadas em gráfico.
Todas as curvas de sobrevivência apresentaram o mesmo padrão geral. Células
misturadas com grãos de basalto são inativadas mais eficientemente do que células misturadas
107
com grãos de arenito ou células livres. Este fenômeno é claramente demonstrado pela curva
de sobrevivência à irradiação correspondente ao espectro após 2 mm de alumínio, cujo feixe
utilizado foi o mais atenuado (menos intenso).
108
Figura 33. Curvas de sobrevivência de D. radiodurans, misturadas ou não com grãos de
basalto ou arenito, ao feixe branco de raios-X (> 1 keV) atenuado com os seguintes
atenuadores e filtros: 2 mm de alumínio, 50 µm de molibdênio e 100 µm de carbono + 10 µm
de ouro. O valor mínimo do eixo vertical representa o máximo valor de inativação detectável
pelo método utilizado (10
-5
). O gráfico superior à direita mostra as fluências utilizadas.
Fração de sobrevivência (N/N
0
)
Dose (MJ·m
-2
)
109
4.2.3. Curvas de sobrevivência para feixe monocromático de raios-X (10 keV)
Curvas de sobrevivência foram obtidas para todos os tipos de amostras, sendo
observado o mesmo padrão de inativação celular: células misturadas com grãos de basalto são
inativadas mais rapidamente do que células misturadas com arenito ou células livres (Figura
34). Novamente todas as curvas de sobrevivência parecem apresentar uma tendência
assintótica. Os pontos iniciais de cada curva estão aglutinados devido à baixa taxa de
inativação para fluências pequenas.
Figura 34. Curvas de sobrevivência de D. radiodurans, na presença ou ausência de grãos de
basalto ou arenito, ao feixe de 10keV, com irradiância de 2,53x10
3
W·m
-2
.
4.2.4. Resposta a taxa de dose
Numa tentativa de verificar se há diferenças nas respostas à taxa de dose para as
células desidratadas, foram realizados experimentos com o feixe monocromático (10 keV)
com 3 diferentes fluxos, aumentando-se o tempo de exposição proporcionalmente para a se
atingir as mesmas fluências totais: (i) sem atenuação, (ii) atenuado 0,1x com folha de carbono
de 100 µm + folha de ouro 10 µm, e (iii) atenuado 0,01x com folha de carbono de 1 mm. Os
110
tempos de exposição foram aumentados 1x, 10x e 100x respectivamente. Entretanto, as
fluências utilizadas não foram suficientes para observar qualquer diferença na taxa de
inativação. Estes resultados estão ilustrados na Figura 35.
Figura 35. Curvas de sobrevivência de células livres de D. radiodurans, ao feixe
monocromado de raios-X (10 keV), atenuado com diferentes atenuadores e filtros para atingir
as mesmas doses após diferentes tempos de exposição. Os valores no eixo horizontal
(abscissa) correspondem aos experimentos realizados com o feixe mais atenuado (maiores
tempos de exposição).
4.2.5. Chroococcidiopsis sp.
Para verificar a influência do tamanho dos grãos na proteção contra a radiação, as
células de Chroococcidiopsis sp. foram misturadas ou não com grãos de basalto ou arenito em
3 faixas de tamanho: (i) até 90 µm, (ii) até 63 µm e (iii) até 38 µm. As quantidades finais de
células e de grãos em cada amostra foram respectivamente de 2 x 10
4
e 12,5 µg. Os
111
procedimentos de irradiação foram idênticos aos descritos nas seções anteriores e os
resultados estão apresentados na Tabela 20.
Tabela 20. Crescimento observado de Chroococcidiopsis sp. após irradiação com feixe
branco de raios-X (> 1keV). Os valores representam o tempo mínimo necessário (dias) para
observar algum crescimento.
Dose
(x 10
8
J.m
-2
)
Amostras
NC
B
B/SST
SST
90
63
38
90
63
38
90
63
38
0
*-
-
-
-
41
a
41
a
41
41
a
41
b
41
b
1,26
-
-
-
-
-
-
-
-
51
b
51
b
4,20
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
12,60
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
*- Sem crescimento. a. Resultados observados em apenas duas das três replicatas. b.
Resultados observados em apenas uma das três replicatas. Todos os outros resultados foram
observados nas três replicatas. NC= Células livres, B= Células misturadas com basalto, SST =
Células misturadas com arenito, B/SST= Células adicionadas a uma mistura 1:1 de basalto e
arenito. Os números nos códigos das amostras representam o limite superior de tamanho dos
grãos (µm).
4.3. EFEITOS DE PARTÍCULAS DO VENTO SOLAR
As células foram irradiadas em 3 condições diferentes: (i) células desidratadas (NC),
(ii) células desidratadas misturadas com grãos de arenito (SST), e (iii) células desidratadas
misturadas com grãos basalto (B). As barras de erro das curvas de sobrevivência representam
desvios-padrão em relação à média de 3 experimentos distintos. Pontos sem barras
representam uma única amostra analisada.
112
4.3.1. Irradiação com elétrons de 2 keV
Levando-se em consideração a composição química dos principais elementos que
constituem o material biológico, é possível estimar a porcentagem atômica, sendo, 31%
carbono, 49% hidrogênio, 13% oxigênio e 7% nitrogênio (SALTON, 1964; HIRAGI, 1972).
Esses valores foram utilizados para o cálculo da transferência linear de energia (LET) dos
elétrons de 2 keV no alvo (monocamada de células de 2 µm de diâmetro, com densidade de
0,9392 g.cm
-3
), através do software CASINO v2.42, sendo 20 keV·μm
-1
. O poder de
penetração dessas partículas foi estimado em torno de 100 nm (Figura 36).
Figura 36. Simulação da penetração de elétrons de 2 keV, com um feixe de 10 nm de
diâmetro, em células de D. radiodurans, após 6 min 45 s de exposição, totalizando 7 x10
4
elétrons. A simulação foi feita através do software CASINO v2.42.
Com o valor de LET é possível estimar a dose absorvida após um período de
exposição ao feixe com fluxo determinado. Para isso, as doses são inicialmente computadas
113
em unidades de energia liberada (eV) por pequenas moléculas (16 amu), a partir do
conhecimento sobre o número das partículas incidentes sobre a amostra (elétrons·cm
-2
·s
-1
), e a
energia das partículas (eV) (BARATTA et al., 2003). A unidade utilizada é eV·16 amu
-1
porque esta é uma maneira conveniente de comparar os resultados dos experimentos
realizados com substâncias e misturas de diferentes pesos moleculares (BARATTA et al.,
2003). A unidade de massa atômica (amu) é definida como sendo 1/12 da massa do isótopo
mais estável do carbono 12. Ela é útil porque um átomo de hidrogênio tem uma massa de
aproximadamente 1 amu, e geralmente os átomos ou moléculas que contém n prótons e
nêutrons têm uma massa aproximadamente igual a n amu.
Para saber a quantidade de energia depositada por cada partícula em 16 amu, é
necessário converter o valor de LET, de keV·μm
-1
para eV·Å
-1
, sendo portanto 2 eV·Å
-1
. A
quantidade de 16 amu presente em 1 g de qualquer material é 3,77 x 10
22
. Considerando que o
material tem densidade de 1 g.cm
-3
, o número de 16 amu presente em 1 cm
2
é 3,77 x 10
22
.
Portanto, o número de eV·16 amu
-1
depositados por cada íon·cm
-2
é 5,31 x 10
-
15
eV·16amu·cm
-2
. A corrente elétrica, coletada por um Faraday-cup, com 1cm
2
de área,
posicionado imediatamente após a fonte de elétrons, reflete o fluxo das partículas, já que a
carga do elétron é 1,602 x 10
-19
C e a corrente elétrica é medida em Amperes (A), que significa
C.s
-1
. Deste modo, para saber o fluxo de elétrons, basta dividir a corrente elétrica, cujo valor
medido foi de 1,754 x 10
-5
A, pela carga do elétron, resultando em 10
14
elétrons.cm
-2
.
A unidade de dose absorvida definida pelo Sistema Internacional de Unidades (SI) é o
Gray (Gy), sendo que 1 Gy = 1 J·kg
-1
. Logo, 10 kGy, que é a DL
10
, de D. radiodurans para
raios gama é igual a 10 kJ·kg
-1
. Sabendo-se que 1eV = 1,602 x 10
-19
J, ou seja, 1 J = 6,25 x
10
18
eV, logo, 10 kJ = 6,25 x 10
22
eV. Sabendo-se também que 3,77 x 10
22
·16amu
-1
·g
-1
=
3,7710
25
·16 amu
-1
·kg
-1
, para saber a quantidade de energia necessária para atingir essa dose,
basta dividir 6,25 x 10
22
eV por 3,7710
25
·16 amu
-1
·kg
-1
, resultando no valor de 1,66 x 10
-3
114
eV·16 amu
-1
. Para saber o número de elétrons de 2 keV necessários para atingir esse valor,
basta dividí-lo pelo número de eV·16 amu
-1
depositados por cada elétron·cm
-2
(5,31 x 10
-
15
eV·16 amu·cm
-2
), resultando numa dose de 3,13 x 10
11
elétrons·cm
-2
.
Entretanto, não foi observada inativação celular mesmo para doses 100 mil vezes
superiores a este valor calculado (Figura 37). Todas as curvas de sobrevivência apresentaram
baixos valores de inativação celular. Aparentemente, células livres são inativadas mais
rapidamente do que células misturadas com grãos, embora este efeito só tenha sido observado
para as doses mais altas. Isso se deve ao baixo poder de penetração dos elétrons de 2 keV,
cuja trajetória é interrompida na parede celular, onde 90% da energia é depositada até uma
profundidade em torno de 20 nm (Figura 38). Não há diferenças significativas na proteção
contra a radiação conferida por um ou outro tipo de grão.
115
Figura 37. Curvas de sobrevivência de D. radiodurans na ausência (NC) ou presença de
grãos de arenito ou basalto (SST ou B) irradiadas com feixe de elétrons de 2 keV.
116
Figura 38. Simulação da energia depositada por um feixe de elétrons de 2 keV, com 10 nm de
diâmetro, em células de D. radiodurans, após 6 min 45 s de exposição, totalizando 7 x 10
4
elétrons. A simulação foi feita através do software CASINO v2.42.
Infelizmente as amostras de Chroococcidiopsis sp. não resistiram aos procedimentos
experimentais, já que não foi possível observar nenhuma proliferação celular dos controles,
provavelmente devido ao procedimento de desidratação ter sido realizado muito rapidamente.
Mesmo em condições ideais, células de Chroococcidiopsis sp. necessitam de pelo menos 3
dias de desidratação lenta para manter a viabilidade celular durante anidrobiose prolongada
(COCKELL et al., 2005).
4.3.2. Irradiação com prótons de 200 keV
A transferência linear de energia (LET) dos prótons de 200 keV no alvo (monocamada
de células de 2 µm de diâmetro, com densidade de 0,9392 g.cm
-3
) foi calculada através do
117
software SRIM 2010, conforme descrito no item 4.3.1., sendo 67,8 keV·μm
-1
, e o poder de
penetração dessas partículas foi estimado em 2,83 μm (Figura 39). Com esses valores, a dose
estimada para inativar 90% da população de células livres (DL
10
) foi de 1 kGy, o que
corresponde a 10
10
ions.cm
-2
(Figura 40). Essa DL
10
obtida para irradiação com protons é 10
vezes menor do que a irradiação com raios gama (10 kGy), que interage com a matéria apenas
via ionizações e excitações. Já os protons, além das ionizações e excitações, também
interagem com a materia via transferência de massa e de momento, o que resulta numa maior
LET, causando maiores danos celulares.
Figura 39. Simulação da trajetória de 10
5
prótons de 200 keV em uma célula microbiana
utilizando o software SRIM. Note que o poder de penetração das partículas (2,83 µm) é maior
do que o diâmetro da célula de D. radiodurans (~2 µm).
Em relação às células misturadas com grãos, algumas delas eventualmente ficaram
protegidas pela cobertura física conferida pelos grãos e por isso sobreviveram as maiores
doses (Figura 40). Além disso, não houve diferença detectável na proteção conferida por um
118
ou outro tipo de grão, sendo que as taxas de sobrevivência das células na presença dos grãos
foram ordens de grandeza maiores do que para células livres.
No caso das células depositadas sobre CDAs, a taxa de sobrevivência das células
depositadas em forsterita amorfa (Mg
2
SiO
4
) foi muito semelhante às taxas de sobrevivência
das células livres (NC) depositadas sobre filtro de policarbonato (Figura 40). Já as células
depositadas em fayalitas amorfa e cristalina (Fe
2
SiO
4
) não puderam ser recuperadas,
indicando que a taxa de sobrevivência foi inferior ao limite de detecção do método (<10
-5
)
(Figura 40). Considerando que a única diferença entre forsterita e fayalita é a substituição do
magnésio na forsterita pelo ferro na fayalita, é possível que o ferro contribua de alguma
maneira para a inativação celular quando irradiado com prótons de 200 keV.
Figura 40. Curvas de sobrevivência de D. radiodurans na ausência (NC) ou presença de
grãos de arenito ou basalto (SST ou B) irradiadas com feixe de prótons de 200 keV.
119
Imagens de microscopia eletrônica (SEM) foram produzidas para os controles não
irradiados e para as amostras de D. radiodurans (Figura 41) e Chroococcidiopsis sp. (Figura
42), irradiadas com a dose máxima. Não houve diferença detectável entre os controles e as
amostras irradiadas, com relação aos aspectos morfológicos da superfície celular, mesmo para
as células livres irradiadas com a dose máxima. Apesar do alto poder de penetração de
prótons de 200 keV nas células microbianas, não foram observados nenhum dano físico na
superfície celular, independente do tipo de grão presente nas amostras.
Figura 41. Imagens de microscopia eletrônica (SEM) de células de D. radiodurans irradiadas
(embaixo) ou não (em cima) com 10
13
prótons·cm
-2
. Células livres (esquerda) e células
misturadas com grãos de arenito (centro) e basalto (direita) são mostradas.
4.3.2.1. Chroococcidiopsis sp.
Infelizmente as amostras de Chroococcidiopsis sp. não resistiram aos procedimentos
experimentais, já que não foi possível observar nenhuma proliferação celular dos controles,
provavelmente devido ao pequeno tempo de desidratação. Mesmo em condições normais de
120
temperatura e pressão, células de Chroococcidiopsis sp. necessitam de pelo menos 3 dias de
desidratação lenta para manter a viabilidade celular após anidrobiose prolongada (COCKELL
et al., 2005).
Novamente não foi observada nenhuma diferença morfológica entre os controles não
irradiados e as amostras irradiadas com as maiores doses testadas. Entretanto, alguns aspectos
provavelmente resultantes de agressões físicas às células foram observados tanto nos
controles quanto nas amostras irradiadas (Figura 42).
Figura 42. Imagens de microscopia eletrônica (SEM) de células de Chroococcidiopsis sp.
irradiadas (embaixo) ou não (em cima) com 10
13
prótons·cm
-2
. Células livres (esquerda) e
células misturadas com grãos de arenito (centro) e basalto (direita) são mostradas.
4.3.3. Irradiação com íons carbono de 4 keV
A transferência linear de energia (LET) dos íons de carbono de 4 keV no alvo
(monocamada celular de 2 µm de espessura, com densidade de 1 g·cm
-3
) foi calculada através
do software SRIM, conforme descrito no item 4.3.1., sendo 35,7 keV·µm
-1
, e o poder de
121
penetração dessas partículas foi estimado em 30 nm, conforme ilustrado na Figura 43. Com
esses valores, a dose estimada para inativar 90% da população de células livres (DL
10
) foi
correspondente a 2,65x10
11
ions.cm
-2
. Entretanto, não foi observada inativação celular
mesmo para doses 10 mil vezes superiores a este valor calculado (Figura 44). Isso se deve ao
baixo poder de penetração dos íons de carbono de 4 keV, cuja trajetória é interrompida na
parede celular. Não há diferenças significativas na proteção contra a radiação conferida por
um ou outro tipo de grão.
Figura 43. Simulação da trajetória de 10
5
íons de carbono com energia de 4keV na parede
celular de uma célula microbiana. A profundidade do alvo, no eixo x, é dada em Angstrons
(Å).
122
Figura 44. Curvas de sobrevivência de D. radiodurans na ausência (NC) ou presença de
grãos de arenito ou basalto (SST ou B) irradiadas com feixe de íons de carbono de 4keV.
4.4. EXPOSIÇÃO PROLONGADA DE D. radiodurans AO ALTO VÁCUO
Todas as amostras misturadas com meio de cultura apresentaram taxa
significativamente maior de recuperação e de sobrevivência, principalmente nos tempos mais
longos (Figura 45). Os controles experimentais sofreram perda espontânea da viabilidade ao
longo do experimento, sendo este evento mais evidente para células sem meio de cultura. A
sobrevivência ao alto vácuo é muito mais dependente da presença de material orgânico na
amostra (meio de cultura) do que do tipo de grão misturado com as células. Células na
123
ausência de material orgânico apresentaram fração de sobrevivência inferior 10
-5
após 21 dias
de exposição ao alto vácuo.
Figura 45. A, Taxa de recuperação dos controles mantidos durante tempos crescentes em
condições ambientes (temperatura ~22°C, pressão ~1atm). B, Taxa de sobrevivência em
relação aos controles após diferentes tempos de exposição ao alto vácuo (10
-5
Pa). NC+CM,
células misturadas com meio de cultura; SST+CM, células misturadas com meio de cultura e
grãos de arenito; B+CM, células misturadas com meio de cultura e grãos de basalto; NC,
células livres; SST, células misturadas apenas com grãos de arenito; B, células misturadas
apenas com grãos de basalto.
4.5. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS RESISTENTES ÀS CONDIÇÕES
MARCIANAS
O isolamento de microrganismos resistentes às condições marcianas foi feito
utilizando-se dois parâmetros físico-químicos independentes: (i) a radiação UV-C incidente
na superfície marciana e (ii) a composição atmosférica sob pressão marciana.
Fração de sobrevivência (N/N
0
)
A
B
124
4.5.1. Radiação ultravioleta
A enumeração de microrganismos totais presentes nas amostras correspondentes às 5
diferentes localidades do deserto do Atacama, no Chile, revelou uma grande quantidade de
microrganismos totais cultiváveis (Figura 46), após até 1 semana de incubação. Após os
procedimentos de irradiação com uma dose única de 300 J·m
-2
de radiação UV-C com
lâmpada germicida, o número de microrganismos sobreviventes foi bastante variável entre as
amostras e também entre os diferentes meios de cultura utilizados (Figura 47), sendo
observados muitos microrganismos pigmentados. A presença de pigmentos coloridos favorece
a resistência às radiações por absorverem grande parte dos fótons de luz ultravioleta,
funcionando como uma proteção passiva contra esse tipo de estresse (JACOBS et al., 2005).
Por isso, microrganismos pigmentados foram isolados de todas as amostras, conforme
ilustrado na Figura 48.
Um número muito grande de microrganismos pigmentados foi observado nas amostras
do solo 4 após a irradiação. Por isso, amostras do solo 4 passaram por uma nova etapa de
irradiação, desta vez com doses fracionadas, até 400 J·m
-2
(Figura 49). Este procedimento
resultou num grande número de microrganismos pigmentados crescidos nos diferentes meios
de cultura.
125
Figura 46. Abundância de microrganismos totais presentes em amostras de 5 diferentes
localidades do deserto do Atacama (Chile), cultivados em 3 tipos de meio de cultura: (i) Agar
Marinho (MA), (ii) Lysogeny Broth (LB) e (iii) TGY.
Figura 47. Fração de sobrevivência (N/N
0
) a UV-C (300 J·m
-2
) dos microrganismos totais
presentes em cada tipo de solo diluídos em solução salina (1 g/10ml), após incubação nos 3
tipos de meio de cultura: (i) Agar Marinho (MA), (ii) Lysogeny Broth (LB) e (iii) TGY.
126
Figura 48. Isolamento de morfotipos pigmentados, com coloração variando entre amarela e
vermelha, e incubação nos 3 tipos de meio de cultura: (i) Agar Marinho (MA), (ii) Lysogeny
Broth (LB) e (iii) TGY.
Figura 49. Inativação dos microrganismos presentes no solo 4 (Sitio 2 Gypsum) após
irradiação com diferentes doses de UV-C (λ = 254nm).
127
Os isolados foram então testados quanto a sua capacidade de crescer em meio de
cultura líquido sob agitação de 150 rpm a 28 °C para serem submetidos a uma nova etapa de
irradiação com 300 J·m
-2
de irradiação UV-C, desta vez em condições otimizadas, ou seja, em
solução salina (NaCl 0,9%) sem a interferência do material particulado proveniente das
amostras de solo. Um total de 40 isolados pigmentados foram capazes de crescer em meio de
cultura líquido. Dentre estes 40 isolados pigmentados, 27 foram provenientes do solo 4,
representando 67,5% do total de isolados. Estes resultados são mostrados nas Figuras 50 e 51.
Figura 50. Resistência a UV-C de 40 isolados provenientes de 5 solos diferentes do deserto
do Atacama. As barras foram coloridas de acordo com a pigmentação dos isolados.
128
Figura 51. Curva de sobrevivência do isolado S3.300-2 ao UV-C, em comparação com as
curvas obtidas com a linhagem AB1157 de Escherichia coli e a linhagem selvagem de D.
radiodurans.
Os 14 isolados mais resistentes foram submetidos à identificação molecular através de
amplificação parcial do gene 16S RNAr e sequenciamento seguido de comparação das
sequencias com o banco de dados do NCBI. A maioria dos isolados apresentou alta
similaridade com as espécies Bacillus cereus ou Bacillus thuringiensis. Um dos isolados foi
identificado como Pseudomonas stutzeri e o mais resistente foi identificado como Bacillus sp.
Estes resultados são mostrados na Tabela 21.
129
Tabela 21. Identificação molecular dos 14 isolados mais resistentes à radiação UV-C.
Código
Espécies
Origem
S3-300-2
Bacillus. sp
Capa negra La Portada
S4.300-3
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.300-8
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
LP-MT13
Bacillus cereus/thuringiensis
La Portada cave
S4.400-2
Bacillus cereus
Sitio 2 Gypsum
S4.200-5
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.200-3
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.200-9
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.100-3
Pseudomonas stutzeri
Sitio 2 Gypsum
S4.100-11
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.300-2
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.2
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.400-1
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
AT02-08
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio cuarzos
Seqüências de RNAr 16S das amostras foram amplificadas por PCR e separadas por
Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturação (DGGE), gerando padrões de bandas
representativos da estrutura das comunidades. Esta análise revelou a presença de comunidades
microbianas complexas em todas as amostras. Além disso, mostrou diferenças interessantes
entre os locais onde os solos foram coletados, evidenciados por perfis distintos do gene 16S
RNAr para cada amostra (Figura 52).
130
Figura 52. Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturação (DGGE) das sequências 16S
rRNA mostrando comunidades microbianas complexas em todas as amostras. 1-Laguna
Llamara, 2-Sitio Cuarzos B2, 3-Capa Negra La Portada, 4-Gypsum, 5-Sitio 3 S4.
4.5.2. Atmosfera marciana
Após 1 semana de incubação à temperatura ambiente, uma amostra correspondente ao
tempo de exposição de 4 dias revelou a presença de 1 colônia com pigmentação avermelhada
que foi denominada LPMARS-1. Esta colônia foi submetida à amplificação parcial do gene
16S rDNA através de PCR e a sequência obtida (Figura 53) apresentou 98% de similaridade
com Modestobacter sp. uma actinobactéria tipicamente oligotrófica.
GGGCGTAAGAGCTCGTAGGCGGTCTGTCGCGTCGGCTGTGAATCCCGAGGCTCAA
CCTCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAAACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAA
TTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAG
GCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACA
GGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGGC
CATTCCACGGTCTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTA
CGGNCGCAAGGCTAAAACTCNAGGAATTGACGG
Figura 53. Sequência parcial do gene 16S rDNA do isolado LPMARS-1.
131
Tabela 22. Comparação da sequência parcial do gene 16S rDNA do isolado LPMARS-1 com
as sequências depositadas no banco de dados NCBI mostrando os alinhamentos com maior
índice de similaridade.
Accession
Description
Max
score
Total
score
Query
coverage
E value
Max
ident
FJ966173.1
Modestobacter sp. BMG5755 16S
rRNA gene, partial sequence
632
632
100%
3e
-178
98%
FJ213487.1
Uncultured bacterium clone
TSPB_32 16S rRNA gene, partial
sequence
632
632
100%
3e
-178
98%
EU181225.1
Modestobacter sp. 42H12-1 16S
rRNA gene, partial sequence
632
632
100%
3e
-178
98%
DQ448774.1
Modestobacter sp. CNJ794 PL04
16S rRNA gene, partial sequence
632
632
100%
3e
-178
98%
DQ448698.1
Modestobacter sp. CNJ793 PL04
16S rRNA gene, partial sequence
632
632
100%
3e
-178
98%
EF522200.1
Uncultured actinobacterium clone
EPLS011 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
628
628
100%
4e
-177
97%
GQ329478.1
Uncultured Modestobacter sp. clone
P8s-342 16S rRNA gene, partial
sequence
627
627
100%
2e
-176
97%
132
Após a análise destes resultados foi iniciado um levantamento bibliográfico sobre os
microrganismos com maior índice de similaridade com LPMARS-1, bem como o
planejamento de novos experimentos de caracterização do perfil de sobrevivência deste
isolado à diferentes fontes de radiação UV para se determinar a possibilidade de
sobrevivência deste microrganismo na superfície marciana.
133
5. DISCUSSÃO
As radiações originárias de fontes astrofísicas constituem o fator mais agressivo para
modelos biológicos no ambiente espacial (NICHOLSON et al., 2005). Porém, inúmeros
experimentos utilizando tanto instalações que simulam as condições do espaço, bem como
instalações em órbita inseridas no próprio ambiente espacial, têm demonstrado a capacidade
de sobreviência de diferentes modelos biológicos e a estabilidade de biomoléculas a essas
condições inóspitas (HORNECK et al., 2010; OLSSON-FRANCIS e COCKELL, 2010).
Nos experimentos apresentados nesta tese, determinamos a capacidade de
sobrevivênciade Deinococcus radiodurans a diferentes parâmetros físico-químicos, tais como
radiação, vácuo e atmosfera marciana, atuando juntos ou separadamente. Outros modelos
biológicos provenientes do deserto do Atacama, no Chile, também foram testados, como a
cianobactéria Chroococcidiopsis sp. e novos isolados microbianos resultantes deste trabalho.
Todos os experimentos foram realizados à temperatura ambiente, já que os efeitos
deletérios de baixas temperaturas em microrganismos são até mesmo preservantes. Na
verdade, a ocorrência de temperaturas extremamente baixas e as condições de desidratação no
espaço interplanetário favorece a preservação da integridade celular por prevenir a formação
de radicais livres provenientes das moléculas de água. Notavelmente, microrganismos tais
como a D. radiodurans e B. subtilis apresentam sobrevivência a irradiação UV se irradiados
sob temperaturas baixas, em comparação com irradiaçõas feitas a temperatura ambiente
(ASHWOODS et al., 1968; WEBER e GREENBERG, 1985). Os resultados de Weber e
Greenberg (1985), mostrando aumento da sobrevivência a irradiação UV-VUV de esporos de
Bacillus subtilis em baixa temperatura e vácuo suportam estas conclusões.
A discussão dos resultados está dividida em 4 partes, sendo: (i) radiações ultravioleta,
(ii) raios-X, (ii) partículas carregadas, e (iv) isolamento de microrganismos resistentes às
condições marcianas.
134
5.1. RADIAÇÕES ULTRAVIOLETA
Os ensaios de irradiação feitos em solução aquosa, utilizando diferentes espectros do
Simulador Solar Oriel (Tabela 17) demonstraram a importância de se utilizar fontes de
radiação em condições semelhantes às encontradas na natureza para uma melhor compreensão
da interação dos fenômenos naturais com materiais biológicos. D. radiodurans é um dos
microrganismos mais resistentes às radiações. Para as radiações correspondentes ao
ultravioleta-C (UV-C), a dose necessária para inativar 63% de uma população de D.
radiodurans (D
37
) é 550-600 J·m
-2
(BATTISTA, 1997), conforme observado na Figura 16.
Entretanto, se a irradiação com UV-C for feita com uma fonte de radiação que contém
também fótons com comprimentos de onda mais longos (UV-A e UV-B), numa proporção
comparável ao espectro solar, os efeitos são devastadores (Figura 14). Nessas condições, a
D
37
referente ao UV-C diminui para valores inferiores a 10 J·m
-2
. Provavelmente um número
muito pequeno de quebras de fita dupla no DNA (DSB), resultantes da interação com fótons
de UV-C, já é suficiente para inativar células de D. radiodurans irradiadas simultaneamente
com UV-A e UV-B. É importante ressaltar que o mecanismo de reparo de DSB descrito para
D. radiodurans é muito eficiente, podendo restaurar até milhares de DSB (ZAHRADKA et
al., 2006). Entretanto, se a maquinaria molecular envolvida neste processo for inativada por
oxidação, a célula se torna muito mais sensível aos danos (DALY et al., 2007).
A presença de moléculas orgânicas nas soluções aquosas é capaz de aumentar a
sobrevivência celular, pois acabam absorvendo fótons potenciamente capazes de gerar danos
no DNA. A D
10
, ou seja, a dose necessária para inativar 90% de uma população de células de
D. radiodurans foi 3x maior para células na presença de moléculas orgânicas do que para
células na ausência de moléculas orgânicas (Figura 15).
135
Este fenômeno também foi observado para células desidratadas (Figura 17). Na
ausência de moléculas orgânicas, os efeitos da irradiação aguda com lâmpada de hidrogênio
(λ = 121nm) são bastante semelhantes à irradiação UV de amplo espectro com o simulador
solar (Figura 18). Isto significa que mesmo com uma seção de choque muito alta (ITO et al.,
1980), os fótons de luz ultravioleta de vácuo (UVV) são capazes de atingir o DNA das células
levando à rápida inativação. Entretanto, se as amostras desidratadas estiverem na presença de
material orgânico, a alta seção de choque dos fótons com λ = 121nm dificulta sua interação
com o DNA. Já os fótons com λ > 200nm, como a seção de choque é menor, seu acesso ao
DNA é maior e a inativação é eficiente mesmo para células desidratadas misturadas com
moléculas orgânicas. Com isso, os perfis de inativação celular para essas duas fontes de
radiação são bastante diferentes (Figura 22). Vale lembrar que a metodologia utilizada para o
preparo dessas amostras foi diferente. No caso do simulador solar, o empilhamento de células
juntamente com o material orgânico foi mais limitado do que no caso da lâmpada de
hidrogênio, onde um pó constituído por células e matéria orgânica liofilizada foi distribuídos
sobre o substrato. O preparo das amostras para irradiação com o simulador solar também não
envolveu uma etapa de liofilização, resultando portanto em amostras “menos desidratadas” do
que as amostras submetidas à irradiação com lâmpada de hidrogênio.
As doses utilizadas com a lâmpada de xenônio foram comparáveis à emissão solar na
banda de 145 nm, com uma taxa de dose parecida com a encontrada na região da órbita
terrestre. Entretanto, o fluxo solar nessa faixa de energia é baixo (WOODS, 2002) e não foi
suficiente para causar nenhuma inativação celular detectável, mesmo para as maiores doses
testadas (Figura 19).
Os efeitos da radiação monocromática com fótons de λ = 254nm na linha de luz CD1
do laboratório síncrotron Astrid foram bastante semelhantes aos efeitos produzidos pela
irradiação com feixe branco na linha de luz TGM do LNLS (Figura 20). Os fótons de 254 nm
136
apresentam alta eficiência biológica, já que a máxima absorção de radiação ultravioleta pelo
DNA ocorre na faixa de 260 nm. Entretanto, diferentemente das amostras utilizadas no
síncrotron Astrid, que foram desidratadas espontaneamente, as amostras utilizadas no LNLS
foram previamente liofilizadas e irradiadas sob alto vácuo (10
-5
Pa). Novamente isto pode ter
resultado em amostras “menos desidratadas” para o sincrotron Astrid do que para o LNLS,
limitando a acurácia da comparação. Entretanto, se comparados os efeitos da irradiação com
os dois feixes de amplo espectro, ou seja, o simulador solar e a linha de luz TGM do LNLS,
com amostras desidratadas espontaneamente para o simulador solar e amostras irradiadas em
vácuo na TGM, a inativação foi mais intensa com a TGM do que com o simulador solar,
demonstrando a importância da radiação UVV na inativação celular (Figura 21).
Células desidratadas espontaneamente, misturadas com moléculas orgânicas,
irradiadas tanto com a lâmpada de xenônio como com a fonte na linha de luz CD1 do
síncrotron Astrid não apresentaram nenhuma inativação celular detectável, mesmo para as
maiores doses testadas (Figura 23). A proteção conferida pela presença de material orgânico
nas amostras desidratadas foi evidente para as irradiações realizadas não apenas no síncrotron
Astrid, mas também no LNLS (Figura 24), com a lâmpada de hidrogênio (Figura 22), e com o
simulador solar (Figura 29).
Comparando novamente os efeitos da irradiação com os dois feixes de amplo espectro
(simulador solar e TGM), desta vez com as amostras misturadas ao material orgânico, embora
a inativação seja mais eficiente na TGM para as doses menores, essa eficiência se estabiliza
na faixa de 2% de inativação para doses superiores a 1 kJ·m
-2
, gerando uma curva de
sobrevivência assintótica. Isso significa que apenas as camadas superficiais das amostras são
sensibilizadas radiação. Para doses maiores, os efeitos causados pela irradiação com o
simulador solar passam a ser mais intensos do que aqueles causados pela TGM (Figura 24).
137
A influência do empilhamento de células na sobrevivência foi evidenciada através de
experimentos onde amostras contendo diferentes concentrações de células foram irradiadas
com uma dose fixa de 600 J·m
-2
. Concentrações de células superiores a 10
6
células por
amostra depositada em uma área de 20 mm
2
aumentaram muito a sobrevivência celular
(Figura 25). Estes resultados confirmaram as predições teóricas baseadas na razão entre entre
a área de confinamento das amostras e o tamanho da célula de D. radiodurans (2 µm).
Numa outra abordagem experimental foram utilizadas células do mutante recA de D.
radiodurans, deficiente na produção da proteína recA que é a mediadora do reparo de DSB
por recombinação homóloga. Esse mutante é extremamente sensível às radiações. Mesmo
assim, a proteção conferida pelas moléculas orgânicas foi evidenciada para diferentes fontes
de radiação (Figuras 26 a 27).
Numa situação mais semelhante ao que seria esperado na natureza, células
microbianas estariam associadas não só ao material orgânico do ambiente, mas também a
detritos inorgânicos provenientes de substratos rochosos. Portanto, a proteção conferida por
grãos de poeira (arenito ou basalto) foi investigada. É importante ressaltar que estes dois tipos
de rochas compreendem dois extremos em termos de classificação geológica. A grande
maioria dos meteoritos rochosos terá composição química entre esses dois extremos (Tabelas
8 e 9).
Células associadas a grãos de arenito, quando irradiadas com o simulador solar, são
beneficiadas pela proteção física conferida pelos grãos tanto na presença como na ausência de
moléculas orgânicas de maneira semelhante. Porém essa proteção é menor do que a proteção
conferida apenas pelas moléculas orgânicas do meio de cultura (Figura 30). Os grãos de
arenito são compostos por 93,72% de SiO
2
. Verificou-se que os grãos micrométricos são
praticamente transparentes à luz visível. Segundo Cockell et al. (2003), a transmitância de
UV-A e UV-B em camadas de rocha do tipo gneisse de 500 µm é superior a 80%. Certamente
138
os grãos de arenito menores que 20 µm utilizados nos nossos experimentos apresentam
maiores níveis de transparência ao ultravioleta. Provavelmente, a associação das células com
esse tipo de material favorece uma maior exposição à radiação do que as células misturadas
apenas com meio de cultura.
Já as células misturadas com grãos de basalto, quando irradiadas com o simulador
solar, são beneficiadas apenas quando associadas também com o material orgânico do meio
de cultura, já que não foi possível recuperar nenhum sobrevivente associado apenas com os
grãos de basalto irradiados com a menor dose testada (Figura 31). Curiosamente, nas menores
doses, as células se beneficiam da proteção conferida pelos grãos de basalto associados ao
meio de cultura, que é menor do que a proteção conferida apenas pelo meio de cultura. Mas
para as doses maiores, grãos de basalto associados ao meio de cultura conferem um perfil
assintótico para a curva de sobrevivência, estabilizando a inativação celular em torno de 0,1%
até doses bem mais elevadas (225 kJ·m
-2
), equivalentes a 30 minutos de exposição ao espectro
solar real na órbita terrestre, referentes aos comprimentos de onda entre 200 nm e 400 nm
Schuerger et al. (2003). Vale lembrar que, como a intensidade da radiação solar diminui de
maneira proporcional ao quadrado da distância, na região da órbita de Marte por exemplo,
uma dose de 225 kJ·m
-2
seria equivalente a 1 h e 15 min de exposição ao espectro solar (λ =
200-400 nm), obtendo-se valores de tempo de exposiçao cada vez maiores para órbitas mais
distantes.
A sobrevivência da cianobactéria Chroococcidiopsis sp. à radiação ultravioleta foi
investigada apenas utilizando a radiação monocromática com λ = 254 nm na linha de luz
CD1 do Laboratório Síncrotron Astrid, na Dinamarca. As medidas de inativação das amostras
de Chroococcidiopsis sp. foram obtidas através da verificação do tempo de início de
crescimento após as irradiações. Entretanto, os dados obtidos são qualitativos, ou seja,
refletem apenas a habilidade ou não de crescimento após diferentes períodos de incubação.
139
Quanto maior a dose administrada, maior o tempo necessário para que a proliferação celular
seja detectável, o que reflete um menor número de células viáveis remanescentes. As amostras
depositadas sobre fita de carbono não foram capazes de se proliferar, mesmo após 3 meses de
incubação. Provavelmente, a presença de metais pesados contribuiu com efeitos citotóxicos.
Como o inóculo dessa bactéria em meio de cultura BG-11 solidificado já representa um
estresse adicional devido às impurezas contidas no Agar, é necessário utilizar técnicas mais
laboriosas para a determinação da taxa de sobrevivência, como por exemplo o
acompanhamento ao microscópio da proliferação celular através de contagem de células após
cada dose administrada. De maneira complementar, outras técnicas associadas a análises ao
microscópio também podem ser utilizadas, tais como a autofluorescência, a coloração do
DNA com DAPI, etc (COCKELL et al., 2005).
Em relação ao biofilme preto proveniente da região de La Portada, no Chile, existem 3
explicações possíveis para os resultados observados: (i) a quantidade de amostras (10 mg) foi
insuficiente para a detecção de microrganismos fototróficos viáveis provenientes de um
ambiente tão hostil como o penhasco de La Portada, que recebe alta insolação e está sujeito a
condições severas de dessecação; (ii) as condições de transporte das amostras do Chile ao
Reino Unido, podem ter contribuído para diminuir a viabilidade dos microrganismos
presentes nas amostras; (iii) os microrganimos fototróficos previamente observados ao
microscópio fazem parte do grupo de microrganismos conhecidos como viáveis mas não
cultiváveis. Desta forma, técnicas alternativas ao cultivo, tais como as análises ao microscópio
podem ser utilizadas para a avaliação da sobrevivência deste tipo de amostras no futuro.
Os experimentos com o simulador solar e com a feixe da linha de luz B16 foram
realizados à pressão ambiente e sob baixo vácuo, respectivamente. Portanto, um estudo para
verificar os efeitos do vácuo encontrado na baixa órbita terrestre (LEO) foi realizado
utilizando amostras de células livres ou associadas a grãos de arenito ou basalto e também
140
células misturadas com material orgânico do meio de cultura na presença ou ausência de
grãos de arenito ou basalto (Figura 41). Verificou-se que a presença de moléculas orgânicas
provenientes do meio de cultura é muito mais importante do que a associação das moléculas
com os grãos. Na presença de moléculas orgânicas as células mantêm 100% de viabilidade até
o maior tempo de exposição testado (28 dias), independentemente da presença de qualquer
um dos grãos. Açúcares e poliálcoois são conhecidos por ajudar a estabilizar a estrutura de
macromoléculas celulares durante o vácuo induzido por desidratação (HORNECK et al.,
2003), o que pode ter contribuído para as altas taxas de sobrevivência observadas nesses
experimentos.
5.2. RAIOS-X
Grande parte da literatura sobre resistência à radiação ionizante de micróbios é
baseada em sua exposição aos raios gama provenientes de radionuclídeos (LIU et al., 2003).
O radionuclídeo mais acessível é o Co
60
, que emite fótons de energias acima de MeV (1,17 e
1.33 MeV) em seu decaimento para Ni
60
, seu isótopo estável. Atualmente, as instalações
síncrotron são capazes de produzir feixes de raio X com alta luminosidade com energias de
até algumas centenas de keV, sendo portanto uma ferramenta ideal para o estudo da
sobrevivência de microrganismos ao feixe com essa faixa de energia. O uso de câmaras de
vácuo acoplada às fontes de radiação síncrotron permite a investigação dos efeitos das
radiações em pressões extremamente baixas, simulando o vácuo espacial.
Os resultados dos nossos experimentos com radiação síncrotron na linha de luz B16
do síncrotron Diamond, demandaram a adaptação de uma metodologia microbiológica
clássica (diluição seriada e contagem de UFC em placas) às exigências técnicas impostas pela
instrumentação disponível. As células foram depositadas sobre folhas de kapton, um material
com alto nível de transparência a raios-X. Nessa situação, praticamente não há nenhuma
141
interação com o substrato. É como se as células estivessem flutuando no espaço, sofrendo
apenas os efeitos da radiação e da interação da radiação com os grãos.
Inicialmente, os efeitos da interação dos grãos de arenito e basalto com as células
microbianas, bem como a eficiência do desprendimento celular do substrato (folha de kapton)
foram avaliados. A Tabela 19 e Figura 32 demonstram que os controles não submetidos à
irradiação não sofrem nenhuma ação citotóxica pelos grãos e que as células são recuperadas
do substrato de maneira muito eficiente. Os valores mais altos de recuperação celular para as
células misturadas com os grãos são resultantes da heterogeneidade das amostras. Os grãos
acabam carregando células associadas durante a pipetagem, resultando num leve aumento no
número esperado de células viáveis.
Os experimentos foram divididos em 3 categorias, sendo: (i) irradiação com feixe
branco (> 1 keV), (ii) irradiação com feixe monocromático (10 keV), (iii) investigação dos
efeitos da taxa de dose para células desidratadas utilizando o feixe monocromático (10 keV).
Os resultados obtidos com o feixe branco mostraram que célula associadas a grãos de
basalto são inativadas mais eficientemente do que células associadas a grãos de arenito ou
células livres (Figura 33). Este padrão de resultado foi observado em todos os experimentos
de irradiação, sendo ainda mais evidente para o feixe monocromático (Figura 34). A análise
da composição molecular dos dois tipos de grãos revelou a presença de uma quantidade maior
de elementos pesados nos grãos de basalto do que nos grãos de arenito (Tabelas 8 e 9).
Provavelmente a interação de fótons energéticos na faixa de raios-X duros com os grãos de
basalto acaba levando a produção de foto-elétrons que contribuem para a inativação celular.
Outra característica observada em todas as curvas de sobrevivência obtidas é novamente a
tendência assintótica. Isso significa que para doses maiores, a eficiência de inativação seria
menor.
142
As fluências utilizadas em nossos experimentos são comparáveis a fenômenos
astronômicos conhecidos como Soft Gamma Repeaters – SGR (GALANTE e HORVATH,
2007). Essas fontes astrofísicas emitem pulsos regulares em raios-X, estando normalmente
associadas a estrelas de nêutrons fortemente magnetizadas em rotação (magnetares) (Galante,
2009). No entanto, essas fontes apresentaram atividade esporádica muito mais intensa que a
emissão regular, em eventos conhecidos como flares ou giant flares. A duração do evento de
pico é de cerca de 0,2 s, com uma fase de decaimento de cerca de 400 s, modulada com
periodicidade de cerca de 1 s, associada à rotação da estrela de nêutrons. A emissão durante o
pico é muito mais dura que na fase de decaimento, chegando a 175 keV, em comparação com
10 keV da cauda (GALANTE, 2009).
Segundo Galante et al. (2009), a D
10
de radiação ionizante para D. radiodurans é de
5,5 MJm
-2
. Entretanto, esses valores são obtidos com células em soluções aquosas. Em nossos
experimentos, uma análise gráfica das curvas apresentadas na Figura 33 revelou que os
valores de D
10
para o feixe branco de raios-X (> 1keV) foram ligeiramente superiores, sendo
10 MJ·m
-2
para células livres, 12,34 MJ·m
-2
para célula associadas a grãos de arenito e 7,8
MJ·m
-2
para células associadas a grãos de basalto. Já para o feixe monocromático (10 keV) os
valores de D
10
foram 7 MJ·m
-2
para células livres, 1,8 MJ·m
-2
para células associadas a grãos
de arenito e 0,7 MJ·m
-2
para células associadas a grãos de basalto. Essa diferença nos valores
de D
10
para as células associadas ou não com arenito ou basalto, irradiadas com o mesmo tipo
de feixe, provavelmente são resultantes da produção diferencial de fotoelétrons pelos grãos. Já
a diferença nos valores de D
10
observada entre os dois tipos de feixe (branco e
monocromático) pode ser causada por dois motivos: (i) a taxa de dose para a irradiação com
feixe monocromático foi menor, maximizando a interação dos fótons com as amostras e
levando a um maior nível de inativação celular. (ii) o feixe com fótons de 10 keV inativa o
143
material biológico de maneira mais eficiente do que o feixe contendo fótons também com
outras energias. Essas duas hipóteses podem também ser complementares.
Numa tentativa de investigar a influência da taxa de dose na sobrevivência celular, foi
realizada uma bateria de experimentos atenuando-se o feixe para 10% e 1%, e aumentando-se
o tempo de irradiação em 10 e 100x para atingir um mesmo valor final de dose (Figura 35).
Entretanto, comparando-se as Figuras 34 e 35, verificamos que as fluências utilizadas no
experimentos sobre a taxa de dose foram mais de 100 vezes inferiores ao feixe
monocromático. Como não houve inativação detectável, não foi possível investigar os efeitos
da taxa de dose.
Os experimentos realizados com Chroococcidiopsis sp. foram ligeiramente diferentes
(Tabela 20). As amostras foram irradiadas em pressão levemente positiva de N
2
para
minimizar a quantidade de umidade presente no interior da câmara. Além disso as amostras
foram misturadas com os grãos divididos em 3 faixas de tamanho para cada um dos dois tipos
de grãos mais uma mistura 1:1 entre eles. As fluências utilizadas com Chroococcidiopsis sp.
foram maiores porque não foi utilizado nenhum atenuador. Mesmo assim, as células foram
capazes de apresentar proliferação celular após 51 dias de incubação nas amostras misturadas
com os menores grãos de arenito (Tabela 20). Com relação ao tamanho, grãos menores
favorecem a sobrevivência à desidratação devido a formação de microambientes preservantes.
Com relação ao tipo, grãos de arenito provavelmente produzem menos foto-elétrons do que
grãos de basalto. Entretanto, novos experimentos devem ser realizados para obter respostas
mais conclusivas.
5.3 PARTICULAS CARREGADAS
Estudos sobre a irradiação de partículas carregadas de baixa energia em plantas e
microrganismos, especialmente com energias no intervalo entre 1 e centenas de keV tem
144
despertado grande interesse (YANG et al., 1991; YU , 1998). Ao utilizar essa radiação de
baixa energia, é mais fácil desenvolver traços biotecnológicos importantes (HUANG e YU,
2007). A irradiação com partículas carregadas de baixa energia também vem sendo
investigada para possível aplicação no tratamento do câncer (MATSUSHITA et al., 2006;
KAMADA et al., 2002) e procedimentos de esterilização de materiais na indústria médica
(RABALLAND et al., 2008). Além de sua aplicação em biotecnologia, a irradiação com íons
de baixa energia é útil para estudar os efeitos da radiação espacial em microrganismos
extremófilos, utilizando instalações de simulação espacial.
A população de íons de baixa energia dos raios cósmicos no meio interplanetário é
essencialmente devido ao vento solar e partículas aceleradas por energia magnética lançado
em explosões solares (STRAZZULLA et al., 1995). Íons do vento solar são produzidos por
uma expansão de plasma e atingem velocidades supersônicas a uma distância de poucos raios
solares, cerca de 400 km∙sec
-1
(ie, íons com energias de 1 keV/amu são lançados). A 150
milhões de km (1 unidade astronômica - U.A.) a densidade do vento é da ordem de 5
prótons∙cm
-3
, correspondente a um fluxo de aproximadamente 2x10
8
. Com a queda do fluxo
inversamente proporcional ao quadrado da distância, um fluxo de 10
17
prótons·cm
-2
pode
alcançar a superfície de um asteróide hipotético em apenas 100 anos (STRAZZULLA et al.,
1995).
Em nossos experimentos de irradiação com prótons de 200 keV, verificamos que
células de D. radiodurans começam a ser inativadas com doses acima de 10
9
prótons∙cm
-2
(Figura 40). Além disso, grãos micrométricos são capazes de proteger as células contra esse
tipo de radiação, já que o poder de penetração das partículas foi estimado em 2,83 μm (Figura
39). Através de análise gráfica da Figura 40 é possível observar que a D
10
para células livres
(NC) é de 10
10
prótons∙cm
-2
, correspondente a pouco mais de 1 kGy. Apesar de não haver
diferença na proteção conferida por qualquer um dos tipos de grãos utilizados, a
145
sobrevivência celular foi diferente dependendo do tipo de substrato análogo a poeira cósmica
(CDA) sobre os quais as células foram depositadas. Provavelmente a presença do elemento
ferro na fayalita contribuiu para a inativação celular.
Ao contrário da inativação observada com feixe de prótons de 200 keV, os
experimentos de irradiação tanto com feixe de elétrons de 2 keV como com feixe de íons
carbono de 4 keV mostraram que células livres ou misturadas com qualquer um dos dois tipos
de grãos testados não são inativadas, mesmo para doses superiores a 10
16
elétrons∙cm
-2
sec
-1
e
10
15
íons∙cm
-2
sec
-1
(Figuras 36 e 41).
Os efeitos de partículas de baixa energia sobre microrganismos não foram
completamente investigadas sob condições simuladas do espaço. Em condições de
laboratório, tem sido demonstrado que radiações particuladas resulta em menos morte de
células do que o observado para outras formas de radiação, mesmo que à custa do aumento
das taxas de mutação (YU, 1993). Aparentemente, o risco biológico de tais radiações está
relacionado à sua deposição de energia, altamente localizada. A inativação se restringe às
células localizadas na trajetória das partículas (HORNECK et al., 1994), e a intensidade do
dano depende da Transferência Linear de Energia (LET) (KOZUBEK et al., 1995). Por outro
lado, eventos mutagênicos podem ser causados se ocorrerem danos nas proximidades do
material genético. Elétrons de baixa energia parecem interagir com sítios específicos no DNA
por mecanismos de ressonância (WINSTEAD e MCKOY, 2008), e o sistema de reparo por
junção de terminações não homólogas (NHEJ) foi demonstrado por (MOELLER et al., 2008)
ser o principal mecanismo no reparo de quebras no DNA induzidas pelo bombardeamento de
partículas em Bacillus subtilis.
Os efeitos de partículas com energias mais elevadas tem sido estudados em uma
variedade de experimentos tanto no ambiente espacial, como em aceleradores de partículas
(HORNECK et al., 2010). Esporos de B. subtilis são bastante utilizados desde a década de
146
1970 como dosímetros biológicos em escala micrométrica para determinar a eficiência
biológica radial ao longo da trajetória individual de partículas carregadas altamente
energéticas (HZE). Com este propósito, foi desenvolvido o Biostack, que consiste em um
sanduíche de monocamadas de esporos bacterianos montado sobre folhas de nitrato de
celulose como detectores visuais da trajetória das partículas (HORNECK, 1993; BUCKER e
HORNECK, 1975). Nos experimentos espaciais, após o retorno do espaço (Apollo Soyuz
Test Project e uma missão no Spacelab), a viabilidade de cada esporo nos arredores da
trajetória de uma partícula HZE foi analisada separadamente por microscopia,
micromanipulação dos esporos em agar nutriente seguido de incubação. A fluência diária de
0,3-0,7 partículas HZE·cm
-2
, com uma transferência linear de energia (LET) ≥130 keV·µm
-1
,
foi medida pela contagem das marcas nos detectores (HORNECK et al., 2010).
Os resultados destes experimentos sugerem dois efeitos complementares para a
inativação de esporos por partículas HZE: um efeito de curto alcance a uma distância radial de
0,2 µm da trajetória da partícula HZE que pode ser atribuído aos efeitos de elétrons
secundários (raios gama), e um efeito de longo alcance, que se estende a uma distância de 3,8
µm, para o qual outros mecanismos, tais como ondas de choque ou eventos termofísicos têm
sido sugeridos (HORNECK, 1993, 2007; NICHOLSON et al., 2000). Note-se que no efeito
de longo alcance, os esporos, com cerca de 1 µm de diâmetro cada um, não são diretamente
atingidos pelas partículas HZE. Tal fenômeno, que é um efeito biológico induzido em células
que não são diretamente atravessadas por uma partícula carregada, mas estão em estreita
proximidade com as células atingidas, conhecido como efeito bystander, já foi associado a
uma variedade de consequências biológicas, tais como a inativação, mutagênese e aberrações
cromossômicas em células de mamíferos utilizando micro-feixes estreitos de radiação
particulada (MORGAN, 2003). Recentemente, efeitos bystander também foram observados in
vivo em ratos parcialmente expostos a raios-X (MANCUSO et al., 2008). Desta forma, os
147
efeitos bystander podem acarretar severas consequências para a saúde dos astronautas, porque
podem aumentar o risco de indução de câncer (MOTHERSILL e SEYMOUR, 2004;
PERSAUD et al., 2005).
Em relação ao aumento da mutagênese, estudos feitos com esporos de B. subtilis
expostos a feixes de íons pesados altamente energéticos têm mostrado um aumento da
frequência de mutação, com base na resistência a diversos agentes químicos, por exemplo, a
azida de sódio e o ácido nalidíxico, aumentando com a dose aplicada e com o aumento da
LET (BALTSCHUKAT et al., 1986; BALTSCHUKAT e HORNECK, 1991; HORNECK et
al., 1994; MUNAKATA et al., 1997). Relatos de mutações em gyrA, gene que codifica a
subunidade A da DNA girase, resultando em resistência ao ácido nalidíxico, corresponde à
indução de uma única troca de base em um alelo particular de gyrA (GyrA12; 5‟-CA para 5‟-
TT), após irradiação com UV, UVV, radiação gama e raios-X moles (MUNAKATA et al.,
1997). Moeller et al. (2010) estudaram a mutagenicidade do gene rpoB após a exposição de
B. subtillis a raios-X e íons pesados de alta energia. Mutações no gene rpoB têm efeitos
dramáticos na fisiologia geral microbiana, mas correspondem a eventos não-letais. No
entanto, vale ressaltar que mutações letais são muito comuns após a exposição a raios-X e
irradiação com partículas HZE. Este tipo de mutação leva à inativação do esporos irradiados.
Uma das mutações mais investigadas em B. subtilis é a perda da capacidade de esporulação
individual, a chamada mutação para esporulação defeituosa (Spo
-
), conforme detalhada por
FAJARDO-CAVAZOS et al., 2005. Embora a detecção de mutantes Spo
-
por inspeção visual
da morfologia e pigmentação da colônia seja bastante simples, as informações sobre a
natureza e o tipo de mutações em células Spo
-
não estão disponíveis. Mesmo sabendo-se que a
perda da esporulação é uma mudança drástica no ciclo de vida das células de B. subtilis,
continua a necessidade de se investigar se, e em que medida, os mutantes defectivos em
esporulação são induzidos por irradiação com raios-X e partículas HZE. Deve ser notado que
148
em B. subtilis, os genes envolvidos na esporulação representam quase 5% do genoma
(MAUGHAN et al., 2004).
Além do aspecto da indução de mutações letais, deve notar-se que mutações benéficas
também podem ser induzidas (RAINEY, 1999; PERFEITO et al., 2007). Mutações benéficas
são conhecidas por aumentar o valor adaptativo de microrganismos, tais como uma maior
adaptação ao ambiente extremo (por exemplo, temperatura, salinidade, pressão), resistência
específica a produtos químicos (por exemplo, antibióticos), e novas vias metabólicas (HALL
e ZUZEL, 1980; BENNETT et al., 1992; PAPADOPOULOS et al., 1999; IMHOF e
SCHLOTTERER, 2001). Deste modo, as mutações benéficas têm um profundo impacto sobre
as implicações para o transporte de microrganismos terrestres por impactos naturais
(litopanspermia) ou pela exploração planetária através de missões tripuladas ou robóticas
(proteção planetária).
5.4. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS RESISTENTES ÀS CONDIÇÕES
MARCIANAS
A busca in situ por vida no planeta Marte requer uma compreensão dos possíveis
habitats disponíveis e os tipos de microrganismos possíveis de serem encontrados nesses
ambientes (KUHLMAN et al., 2005). O deserto do Atacama, no Chile, é considerado um
ambiente análogo ao planeta Marte devido a parâmetros como umidade extremamente baixa e
intensa radiação UV solar (NAVARRO-GONZALEZ et al., 2003; CONNON et al., 2007).
Sua localização compreende a parte hiper-árida do deserto Peru-Chile, sendo que a parte
chilena se extende entre 1°N e 37°S, incorporando o arco peruano, o norte do Chile e parte da
cordilheira ocidental (HARTLEY et al., 2005). A desertificação na parte ocidental da América
do Sul é induzida principalmente por fenômenos atmosféricos subtropicais anticiclônicos.
149
Isso é reforçado pela presença da corrente fria de Humboldt ao longo da costa oeste da
América do Sul, que evita precipitação nas regiões costeiras. Um outro fator regulador é a
presença da Cordilheira dos Andes, que aumenta a precipitação no lado leste e diminui no
lado oeste. Ainda, a extensão da área continental impede que os ventos úmidos avancem no
interior do continente.
A ausência de nuvens contribui para a ocorrência de altos níveis de insolação em toda
a extensão do Atacama. Eventuais microrganismos presentes na superfície Marciana estão
sujeitos à exposição constante a grandes fluxos de luz UV altamente deletérios (COCKELL,
2001). Na superfície marciana, altos níveis de radiação UV-C atingem a superfície
(SCHUERGER et al., 2003), ao contrário do que ocorre na Terra, onde o espectro solar
correspondente a comprimentos de onda inferiores a 300 nm é atenuado pela atmosfera,
particularmente pela camada de ozônio.
As amostras utilizadas neste estudo foram coletadas em regiões distintas do deserto do
Atacama (Figura 1). Laguna Llamara (amostra 1) é um deposito de sal localizado no norte do
Chile, onde é possível encontrar tapetes microbianos compostos por cianobactérias presentes
abaixo das camadas de sal (DEMERGASSO et al., 2003). O depósito de quartzo (amostra 2) é
bem próximo ao depósito de gipsita (amostra 4), numa região montanhosa ao sul de
Antofagasta. O sítio correspondente à amostra 3 se localiza ao norte de Antofagasta, onde
existe um penhasco recoberto por um biofilme preto numa região conhecida como La Portada.
O sítio 3 S4, correspondente à amostra 5 é provavelmente a região mais árida do planeta,
atingindo valores nulos de umidade relativa (NAVARRO-GONZALEZ et al., 2003).
Apesar das condições inóspitas desses ambientes, nossos dados revelaram uma
abundância surpreendente de microrganismos cultiváveis em todas as amostras (Figura 46).
Além disso, a análise da diversidade microbiana por amplificação do gene 16S RNAr e
150
Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturação (DGGE) revelou a presença de
comunidades microbianas complexas e bem distintas entre as amostras (Figura 52).
A irradiação das amostras de solo com 300 J·m
-2
de UV-C revelou a presença de um
grande número de microrganismos fotoresistentes (Figuras 47 e 49). Muitos deles
apresentaram pigmentação variando do amarelo ao alaranjado (Figura 48). Estes foram
isolados, cultivados e submetidos a uma nova etapa de irradiação em solução salina (NaCl
0,9%) sem a interfrência de partículas do solo. Dos 40 isolados pigmentados capazes de
crescer em meio líquido, 14 foram submetidos a identificação molecular (Tabela 21). A
predominância de espécies do gênero Bacillus e Pseudomonas é compreensível, já que a
própria metodologia de isolamento favorece a seleção de microrganismos formadores de
esporos. Entretanto, todos os ambientes em que as amostras foram coletadas também favorece
a ocorrência de um grande número de microrganismos esporulantes. Para acessar o número de
esporos presentes na amostra inicial, é necessário submetê-las a um tratamento por 10 min a
80°C seguido de plaqueamento, contagem de colônias e comparação com as amostras não
tratadas. Apenas os esporos resistirão a este tratamento.
O isolado S3.300-2, identificado como Bacillus sp., o mais resistente dentre os
isolados neste estudo, apresentou um perfil intermediário de resistência ao UV-C (Figura 51).
Mesmo assim, o valor de D
10
(318 J·m
-2
) foi dez vezes superior ao de E. coli (30 J·m
-2
). Vale
ressaltar que não foi utilizado nenhum pré-tratamento para induzir esporulação. Portanto, esse
microrganismo foi irradiado na sua forma vegetativa. Novos testes são necessários para
acessar seu perfil de resistência ao UV-C na sua forma esporulada.
Em relação ao isolamento de microrganismos resistentes à atmosfera marciana, apenas
a amostra 3 (Capa Negra La Portada) foi utilizada. Trata-se de um biofilme epilítico (que
cresce sobre rochas) com cobertura notavelmente negra. Vários procedimentos de incubação
em diferentes meios de cultura e até mesmo em soluções contendo o próprio substrato
151
rochoso em diferentes concentrações foram realizados em tentativas frustradas de recuperar
tanto microrganismos fototróficos como heterotróficos.
Curiosamente, uma colônia com pigmentação avermelhada foi isolada apenas em uma
amostra exposta à atmosfera, pressão e temperatura marcianas por 4 dias. As amostras
controle não revelaram nenhuma colônia pigmentada. A incubação foi feita em condições
ambientes em meio oligotrófico contendo apenas triptona 0,1% ou extrato de levedura 0,1%.
A colônia pigmentada surgiu após 1 semana de incubação apenas no meio contendo extrato de
levedura. Através de análise molecular, este isolado foi identificado como Modestobacter sp.,
uma actinobactéria tipicamente oligotrófica (Figura 53 e Tabela 22).
O isolamento de microrganismos a partir de amostras naturais, contendo comunidades
microbianas, através de exposição a parâmetros físico-químicos combinados de ambientes
extraterrestres, constitui ferramenta fundamental para o isolamento de novos microrganismos
com diferentes aplicações (OLSSON-FRANCIS e COCKELL, 2010). Na exploração espacial
por exemplo, o conhecimento da sobrevivência microbiana em ambientes extraterrestres pode
ser aplicado no desenvolvimento de sistemas autoreguladores de manutenção biológica,
controle de partículas em suspensão no ar, produção de biocombustível, e desenvolvimento de
instrumentos capazes de detectar vida em outros planetas. Além disso, esses estudos tem
contribuído para o desenvolvimento de normas internacionais de proteção planetária.
(OLSSON-FRANCIS e COCKELL, 2010).
152
6. CONCLUSÕES
Apesar das dificuldades técnicas enfrentadas em boa parte dos experimentos, os
resultados obtidos demonstram o sucesso do projeto, uma vez que todos os objetivos
propostos foram alcançados. Os principais resultados obtidos demandaram inovações nas
abordagens experimentais, integrando técnicas de física experimental e biologia de
microrganismos. As novas técnicas desenvolvidas permitem uma série de novos estudos a
respeito da sobrevivência microbiana em condições que simulam longos períodos em
ambientes extraterrestres. As principais conclusões do projeto foram:
1- Células microbianas protegidas por partículas micrométricas ou por uma camada
micrométrica de moléculas orgânicas contra a radiação ultravioleta (UV) e ultravioleta de
vácuo (UVV), se beneficiam da proteção e permanecem viáveis por longos períodos de
tempo.
2- Em relação a sobrevivência à desidratação e ao vácuo (10
-5
Pa), a presença de compostos
orgânicos nas amostras evita a perda de viabilidade celular por várias semanas, e é mais
importante do que eventuais microambientes preservados em grãos micrométricos.
3- Grãos com dimensões micrométricas afetam a sobrevivência microbiana após irradiação
aguda com feixe de raios-X em condições de baixo vácuo (200 Pa). Provavelmente este efeito
é devido a produção de fotoelétrons pela interação da radiação com os grãos, já que este
fenômeno foi mais evidente para os grãos de basalto, que apresentam muito mais elementos
pesados em sua composição.
153
4- Ao contrário do que ocorre com a irradiação eletromagnética ionizante, os grãos
micrométricos são capazes de proteger células microbianas contra a irradiação com feixe de
partículas carregadas (elétrons, prótons e íons de carbono) com energias comparáveis às do
vento solar, independentemente do tipo dos grãos.
5- A inativação microbiana por irradiação com partículas carregadas é muito mais dependente
da energia do que do fluxo das partículas, sendo que partículas de baixa energia, comparáveis
às do vento solar, não são capazes de inativar células de D. radiodurans, mesmo com
fluências equivalentes a centenas de anos de exposição.
6- Células depositadas em substrato contendo o elemento ferro na sua composição molecular
são inativadas mais eficientemente do que aquelas depositadas em substrato contendo
magnésio no lugar do ferro. Este resultado parece corroborar a hipótese de que elementos
pesados podem contribuir para a inativação celular via produção de elétrons secundários após
tratamento com radiação ionizante.
7- A utilização de instalações que simulam ambientes extraterrestres para o isolamento de
novos microrganismos se mostrou eficiente, e representa uma boa ferramenta para a utilização
de recursos biológicos com possíveis aplicações em diferentes setores.
8- O conjunto de dados experimentais é favorável a uma versão da hipótese da Panspermia,
em que formas microscópicas de sistemas biológicos minimamente protegidos em grãos de
poeira, são capazes de permanecer viáveis em diferentes regiões da galáxia até serem
interceptados por corpos com ambientes favoráveis à sua proliferação, contribuindo para uma
transferência horizontal de genes em nível galáctico.
154
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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164
APÊNDICE 1 – ENGLISH REPORT
165
ENGLISH REPORT
Thesis Title: Survival of extremophile microorganisms in simulated
extraterrestrial conditions
Awardee: MSc. Ivan Gláucio Paulino-Lima (Lab Molecular Radiobiology, IBCCF/UFRJ)
Advisor: Prof. Claudia de Alencar Santos Lage (Lab Molecular Radiobiology, IBCCF/UFRJ)
Overseas Supervisor: PhD Nigel John Mason (CEPSAR, Open University, United Kingdom)
I – Summary:
The experimental platform developed during the execution of this project was designed to generate
experience in techniques for simulation and verification of extraterrestrial environments effects on
extremophilic microrganims. Classical microbiology methods, such as serial dilution and counting of
colonies grown on plates were adapted to the requirements and technical limitations of the
experiments to determine cell inactivation data plotted in survival curves. Physical-chemical
parameters such as pressure, temperature, the Martian atmosphere and interplanetary radiation
were tested alone or in specific combinations according to the simulated environment. The results
contribute to a better understanding about the possibility of survival of microorganisms to the harsh
conditions of space, including the possibility of natural movement of living beings between different
bodies of planetary systems.
II – Scientific background:
Extremophile microorganisms are living beings capable to survive and proliferate under
environments with extreme physical and chemical parameters (Rothschild and Mancinelli, 2001).
Most extremophile microorganisms are prokaryotes, from both domains Archaea and Bacteria.
Deinococcus radiodurans is one of the most radiation resistant organisms ever discovered, surviving
acute doses of ionizing radiation exceeding 15kGy (Daly et al., 1994). The molecular mechanisms
undelying such resistance is still under debate (Makarova et al., 2001; Cox and Battista, 2005). Two
main cellular mechanisms contribute to high radiation resistance, i.e., high carotenoids contents
acting as a passive shielding against non-ionizing radiation (UV), and active DNA repair machinery
(Ghosal et al., 2005). The last one comprises at least two categories (Makarova et al., 2001; Cox and
Battista, 2005; Makarova et al., 2007) (i) a subset of proteins of unknown functions that can greatly
increase the efficiency of DNA repair mechanisms, and (ii) non-enzymatic complexes of manganese
(Mn) protect enzymes from oxidation during irradiation (Daly et al., 2007), mainly the DNA repair
ones (He, 2009). These two categories apparently share components: the strong positive correlation
between resistance to ionizing radiation and desiccation tolerance (Sghaier et al., 2007). In fact,
inactivation of locus DRB0118, a constitutively expressed one, sensitizes D. radiodurans to
desiccation, but not to ionizing radiation (Battista et al., 2001). Moreover, the hypothesis of
adaptation to desiccation (Mattimore e Battista, 1996) does not explain the extreme resistance to
ionizing radiation observed in several members of the Archaea domain (Kopylov et al., 1993). One
alternative hypothesis takes into account that most radiation-resistant species accumulate about
300-fold more manganese (Mn) than sensitive ones (Daly et al., 2004). Interestingly, the Ocean
Drilling Program (ODP) has conducted a survey on a wide variety of marine sediments (D'Hondt et al.,
2004), and it revealed the presence of enriched Mn sites with high levels of gamma radiation to be
commonly found in deep sediments (Sghaier et al., 2007).
D. radiodurans has already been tested under several laboratory conditions and also
assessed in space conditions when the Exobiology and Radiation Assembly (ERA) flew on the ESA´s
Eureca mission. Dose et al. (1995) reported that although survival could not be scored due to storage
conditions before and after the mission, the amount of DNA double strand breaks (DSB) per
166
chromosome could be determined. If exposed to solar light (>170nm; 4x10
8
J·m
-2
ranging from 175 to
340nm) in layers of about 1.5mm, only the upper tenths mm on top of a 1mm layer were affected,
with more than 12 DSB were found in comparison to 8 DSB for the dark control. Control experiments
have shown that D. radiodurans survives relatively well (15-35% survival rates) if kept in dry argon for
17 months, but survival in humid argon (above 20% relative humidity) is less than 0.01% in the same
period of time. Survival can be improved by up to 100% if cells are dried in the presence of organics
(Tryptone-Yeast Extract medium).
Other microorganisms have also been tested in space. According to Dose et al. (1996),
monolayer of spores, fungal conidia or vegetative cells (D. radiodurans) are extremely sensitive to
space conditions (vacuum and solar radiation). Multi-layered cells or macroscopic clusters, however,
may resist for months or years, even if exposed to full solar light. Although the top cell layers become
inactivated, they kept protecting interior cells from UV damage and also partially from dehydration.
Saffary et al. (2002) exposed cells of Bacillus sp. and D. radiodurans to extreme ultraviolet
(EUV) radiation (λ=30.4nm) during a rocket flight. The exposition to EUV radiation decreased the
survival of both organisms by an extra order of magnitude below their desiccation tolerance. Similar
results were reported for the first time using a halophilic model, represented by a new isolate of the
genus Haloarcula exposed to space conditions for 15 days in Biopan-1 (Mancinelli et al., 1998). This
isolate was obtained from crystals of salt (NaCl) and shows high resistance to dehydration. Since this
type of radiation strongly interacts with biological targets, the authors attributed such inactivation to
rely on superficial cellular damages other than DNA, most likely on membrane and surface proteins.
On the other side, lichens were capable to fully restore their colonization ability and photosynthetic
activity after an uninterrupted 16-day exposure to real outer space conditions in the Biopan-5 facility
(Sancho et al., 2007).
Shielding from deleterious ionizing radiation has been expected to provide viability of
viruses, bacterial and fungal dried spores, thus alleviating radiation-imposed constraints to any
putative interplanetary transfer step. Calculations by Mileikowsky et al. (2000) have predicted that
microorganisms such as D. radiodurans and Bacillus sp should be shielded against space radiation
whenever inside rocks of the order of at least 0.33m in size, to keep a viable minimal population
during time ranges suitable to afford Mars-Earth interplanetary travel (~1 million years). Those
authors also consider that more than 1 billion fragments with temperatures below 100°C were
ejected from Mars and landed on Earth within the last 4 billion years. Early Earth has witnessed the
infall of about 10-fold more extraterrestrial matter during the “heavy bombardment” period. Indeed
the ~40 Martian meteorites discovered so far on Earth represent a tiny fraction of those imported
from Mars during Earth´s history (Fritz et al., 2005).
The discovery of Martian meteorites on Earth (Dreibus e Wanke, 1985) implies that rock
fragments can escape from planetary bodies and that interplanetary transfer of matter is possible to
occur in the solar system (Okeefe and Ahrens, 1986). At least five out of about 40 known Martian
meteorites, might not have experienced sterilizing temperatures during ejection from Mars and re-
entry into the Earth´s atmosphere (Shuster and Weiss, 2005). However, it is still an open question
whether living beings could be transported between planets by means of such fragments,
withstanding the harsh in-between environment. It is tempting to think of the biological features of
microbial extremophilic species (Rothschild and Mancinelli, 2001) as those necessary to cope with
extraordinary environments as those found in the interplanetary space.
The hypothesis predicting that living organisms may stand viable and be transferred from
one planet to another by means of natural processes (panspermia) is still a matter of debate
(Nicholson, 2009). The lithopanspermia version is currently thought to be a process by which any
living form, most probably microbial in nature, survives the following three steps: (i) the escape step,
i.e. ejection of contaminated planetary material towards space, normally caused by a large impact on
the parent planet; (ii) the journey in space through time scales comparable with those experienced
by the Martian meteorites (estimated as 1-15 million years); and (iii) the landing process in a manner
to afford non-destructive deposition of the biological material on a recipient planet (Horneck et al.,
2003).
167
Escape and re-entry steps of this process are critical due to the high amounts of energy to
which organisms may be exposed within a short period of time so recent studies have focused on
these steps (Burchell et al., 2004; Cockell et al., 2007; Stoffler et al., 2007; Horneck et al., 2008;
Moeller et al., 2008a; de La Torre et al., 2009; Fajardo-Cavazos et al., 2009). Various types of
microorganisms, such as bacterial or fungal spores and viruses, as well as biomolecules, such as DNA,
amino acids and liposomes, have been exposed to selected and combined space conditions outside
Earth´s magnetic field (Apollo 16) or in low Earth orbit onboard missions Spacelab 1, Spacelab D2,
ERA on EURECA, LDEF, BIOPAN on FOTON and EXPOSE on the International Space Station (Olsson-
Francis and Cockell, 2010). Extraterrestrial parameters, such as high vacuum, intense solar ultraviolet
radiation, different components of the cosmic radiation field and temperature extremes affected the
genetic stability of the organisms in space, leading to increased mutation rates, DNA damage and
inactivation (Horneck, 1999). Extraterrestrial solar ultraviolet (UV) radiation was shown to be the
most lethal factor to naked samples. When shielded against the influx of solar UV, spores of B.
subtilis survived for more than 5 years in space (Horneck et al., 1994a; Horneck et al., 2010).
Recently, Horneck et al. (2008) have tested the first step of the panspermia hypothesis by
exposing spores of Bacillus subtilis, cells of Chroococcidiopsis, and thalli and ascocarps of the lichen
Xanthoria elegans to shock pressures in the range 5 to ~40 Giga Pascals. Their results support the
hypothesis that biological material could be successfully ejected from planets in a way that seeding
of early Earth might have ensued.
In view of the surprisingly positive results reported above in support to the concept of
panspermia, the critical re-entry step of the process was solely addressed by the results of the ESA´s
STONE experiment (Cockell et al., 2007). These authors demonstrated that the endolithic
photosynthetic organism Chroococcidiopsis sp. inoculated in a gneissic rock sample did not resist the
speedy re-entrance into the Earth atmosphere since extreme heating reached down to ~5mm depth
of the rock. This study focused on the effects of hostile environments may require viable
extremophile microorganisms during migration times along the asumptions of interplanetary
panspermia hypothesis. The survival of D. radiodurans to conditions similar to those present in
interplanetary space was investigated on several workstations in Brazil and Europe, including sources
of UV, vacuum UV and X-rays synchrotron radiations, and particulate radiation.
This work was done in collaboration with Chilean researchers using bacterial isolates from
soil samples from the Atacama Desert, considered an environment similar to some places on Mars
surface. The goal was to isolate microorganisms resistant to ultraviolet radiation for testing in a new
simulation chamber under construction in São Paulo. Experiments to check for limits of life on
simulated conditions of interplanetary space, besides serving for future programs of planetary
protection, has added new data to the centenary debate on the hypothesis of panspermia, adding
evidence that primitive life might have been brought to Earth by comets or meteoritic bodies.
III. Main objectives in the original project:
Main Objective
To investigate the survival of different model organisms subjected to extraterrestrial-
simulated extreme environments aiming at broaden our understanding on physico-chemical limits
for the existence of life “as we know it”, and the possibility of cross contamination processes
between bodies of the solar system.
Specific Objectives
- Evaluate resistance of extremophilic microorganisms isolates from soil samples of the Atacama
desert (Chile) using selective pressure as stress factors such as ultraviolet radiation, desiccation, low
pressure and low temperature;
- Characterize the survival profile of these microorganisms under conditions of the interplanetary
space and the planets the solar system;
168
- Develop methodologies for the experimental use of these microorganisms in laboratory simulations
looking for future launching in real-flight experiments; and
- Examine ways by which cross contamination processes might occur between planets of the solar
system and interstellar contamination.
III - Key steps performed during the period in the achievement of goals:
1 - Extended exposure (up to 4 weeks) of epilithic microbial biofilms (inhabitants of rocky substrates)
from a cliff in the Atacama Desert (Chile) to stress factors such as different temperatures and
desiccation (isolation in a desiccator).
2 - Exposure of epilithic microbial biofilms, strains of Deinococcus radiodurans and a bacterial isolate
from the soil of the Atacama desert (Chile), to different sources of ultraviolet (UV) and vacuum
ultraviolet (VUV).
3 - Extended exposure (up to 4 weeks) of epilithic biofilm from the Atacama to combined conditions
of the Martian environment (atmospheric composition, pressure and temperature) and isolation of
organisms resistant to these conditions.
4 – Experimental simulation of high levels of radiation from astrophysical sources and their effects on
wild type strain of D. radiodurans and on Chroococcidiopsis sp. isolated from the Atacama Desert,
using the Diamond synchrotron laboratory at Oxfordshire, UK, as a source of X-rays.
5 - Extended exposure (up to 4 weeks) of D. radiodurans to various experimental conditions at low
pressure in a vacuum chamber (10
-5
Pa).
6 - Experimental simulation of charged particles from the solar wind and verification of the effects on
wild-type strain of D. radiodurans and Chroococcidiopsis sp. from the Atacama Desert, using
specialized laboratories in Italy and UK.
IV - Presentation and brief discussion of the main results obtained, making it clear what the
theoretical, experimental or practical outcomes were obtained by the survey:
1- RESISTANCE OF PHOTOTROPHIC EPILITHIC BIOFILMS FROM CHILE TO PROLONGED EXPOSURE (UP TO 4 WEEKS) IN DIFFERENT
TEMPERATURES INSIDE A DESICCATION CHAMBER.
Samples from a black biofilm from a cliff on the beach of La Portada, near Antofagasta, Chile
were divided into aliquots of 10mg and placed in microcentrifuge tubes, were they were subjected to
treatments in triplicate, as shown in Table 1.
Table 1. Experimental design showing the number of samples used in each experiment with their
respective exposure times.
Conditions
Exposure time (days)
Totals
1
4
7
21
28
Control*
3**
3
3
3
3
15
Desiccation
3
3
3
3
3
15
-80°C
3
3
3
3
3
15
-20°C
3
3
3
3
3
15
+70°C
3
3
3
3
3
15
Totals
15
15
15
15
15
75
* Controls were kept at room conditions, covered with aluminium foil on the bench
** Samples were exposed in triplicate to all experimental conditions
After each exposure time, the content of each tube was placed in 12-well plates containing
growth medium BG-11 for the growth of phototrophs. Along a period of six months of incubation at
room temperature (~22°C) under natural light cycles, 10µl aliquots were removed from plates and
placed on glass slides for observation under an optical microscope for any change in cellular
morphology and increased total number of cells.
169
Unfortunately no growth was observed after the whole incubation period, even in non-
treated controls. Several tests using other growth phototrophs with the same type of culture
medium support some possible explanations for the observed results: (i) the amount of samples
(10mg) was insufficient for the detection of viable phototrophs from an environment as hostile as
the cliff of La Portada, of high solar radiation and severe conditions of desiccation, (ii) transport
conditions of samples from Chile to the United Kingdom may have contributed to decrease the
viability of the microorganisms present in the samples, (iii) the phototrophs previously observed
under the microscope are among the group of uncuturable microorganisms.
2- RESISTANCE OF PHOTOTROPHIC EPILITHIC BIOFILMS, WILD-TYPE STRAIN OF D. RADIODURANS AND A MICROBIAL
ISOLATE FROM SOIL OF THE ATACAMA DESERT (CHILE), TO DIFFERENT SOURCES OF ULTRAVIOLET RADIATION (UV)
AND VACUUM ULTRAVIOLET RADIATION (VUV).
2.1. Exposure of samples to Vacuum UV light (VUV)
Samples of the black biofilm from Chile were divided into aliquots of 10mg, diluted in 1ml of
BG-11 culture medium and filtered through polycarbonate membranes (Millipore) 25mm in diameter
and 0.2μm porosity to produce a thin layer of biological material on the membranes. As the filtration
cylinder was 16mm in diameter, the membranes containing the biological material were cut to
remove exceeding edges. The resulting material was dried for at least 3 hours at room temperature
on the workbench, and stuck on metal sample discs using a double-sided carbon tape (Agar Scientific,
UK). The sample-holder containing up to six samples was placed inside the vacuum chamber (10
-5
Pa).
A xenon lamp emitting VUV (Resonance, Canada) was coupled to the chamber in a suitable position
for the irradiation experiments, as illustrated in Figure 1.
Figure 1. Apparatus for irradiation with ultraviolet light in vacuum. A, xenon lamp; B, vacuum
chamber (10
-5
Pa); C, vacuum pump; D, turbo pump; F, sample holder; G, photodiode.
Rock samples from a cliff at Beer, Devon, UK, were cut into cubes about 1cm
3
. The cubes
were stuck to the sample holder using metal discs of double-sided carbon tape. Samples of D.
radiodurans (wild-type and mutant strain deficient in RecA-dependent DNA repair by homologous
recombination) were diluted in 1ml aliquots and prepared the same way as for the black biofilm.
Additionally, samples of D. radiodurans were also irradiated directly on the double-sided carbon tape
to investigate the influence of substrate on bacterial survival after irradiation. For this purpose, 1ml
170
of culture was deposited directly on the carbon tape, dried for at least 3 hours at room temperature
on the workbench, and placed on the sample holder.
The positioning of the samples directly at the VUV beam was made possible by a rotating
handle on the top of the irradiation system. All samples (artificial biofilm, rock cubes and monolayers
of cells) were irradiated in accordance with the scheme presented in Table 2:
Table 2. Experimental design for VUV irradiation of epilithic biofilms and strains of extremophilic
microorganisms.
Dose (J·m
-2
)*
Irradiation time
Samples
(s)
(min)
(h)
0
0
0
0
3
0.2
60
1
0.02
3
1.0
300
5
0.08
3
2.0
600
10
0.17
3
10.0
3000
50
0.83
3
20.0
6000
100
1.67
3
100.0
30000
500
8.33
3
TOTALS
39960
666
11.1
21
*Estimated for the lamp peak emission (=145nm)
Despite the fact that the brightness of the lamp appear quite low, the flow of photons is
more than 3.0 times the photon flux from the Sun at Earth orbit for the wavelength of 145nm, which
represents the emission peak of the lamp, as seen in Table 3. The photon flux of the lamp was
determined by direct measurements using a photodiode, taking into account its quantum efficiency,
according supplier info (Roithner LaserTechnik, Austria).
Table 3. Irradiance of the xenon lamp and the photon flux from the Sun at Earth orbit.
Parameter
Xenon lamp
Solar VUV (λ=145nm)
Maximum flux ()
145nm
N/A
Photon flux
10
10
cm
-2
·s
-1
(10
14
m
-2
·s
-1
)
3 x 10
9
cm
-2
·s
-1
(3 x 10
13
m
-2
·s
-1
)*
Irradiance
1.4 x 10
-4
W·m
-2
4 x 10
-5
W·m
-2
* Based on Woods, 2002.
After treatments, samples of the black biofilm and rock cubes were placed in 6-wells plates
containing 5ml BG-11 culture medium and incubated at room temperature (~22°C) under natural
light cycles. During the subsequent weeks, 10l aliquots were removed from wells and observed
under an optical microscope for any change in cellular morphology and total number of cells. After
treatments, samples of D. radiodurans were diluted in TGY culture medium (1% tryptone, 0.6% yeast
extract and 0.2% glucose), subjected to serial dilution using saline solution (0.9% NaCl), and
subsequently plated on TGY solidified with 1.5% agar. After incubation at 30°C for 72 hours, the
colonies grown on culture medium were counted and the survival rates were plotted on semi-log
graphs.
Again, after 6-months incubation, no growth was observed for samples of the black biofilm,
even in controls not subjected to irradiation, and possibly the same reasons presented in Section IV.1
apply to explain these results.
Samples of epilithic biofilm from Beer, Devon (UK) grew from 12 to 15 days of incubation
under the conditions mentioned above. Restults can be seen in Figure 2.
It can be seen that irradiation with VUV ( = 145nm) had no detectable effect on cell
proliferation of epilithic biofilm from Beer, Devon (UK), since the non-irradiated controls showed
similar characteristics to samples irradiated with the highest dose (100J·m
-2
), both in terms of growth
time after treatment and in terms of the observed microbial diversity. Perhaps the relief of the
biofilm had contributed to cell survival. In addition, all samples were resistant to the 10
-5
Pa vacuum,
171
equivalent to values found in low earth orbit (LEO), since no differences were observed between the
non-irradiated control and those kept at room temperature.
To check the influence of substrate on survival of D. radiodurans, the strains wild type (wt)
and recA DNA repair deficient mutant were deposited on two different substrates in relation to the
roughness and surface relief: (i) carbon tape, with average roughness of 7μm and (ii) Millipore filter,
with average roughness of 0.7 micrometers. As shown in Figure 3, both strains of D. radiodurans
showed no significant inactivation, regardless the substrate, even when irradiated at 100J·m
-2
.
Figure 2. Increased biomass related to a community of phototrophs from Beer, Devon (UK) after 12-
15 days of incubation at room temperature (~22°C) under natural light cycles. 1. C = non-irradiated
control, or samples subjected to all conditions, except irradiation. D1=0.2J·m
-2
, 2. D2 = 1.0J·m
-2
. D3 =
2.0J·m
-2
, 3. D4 = 10.0J·m
-2
. D5 = 20.0J·m
-2
, 4. D6 = 100.0J·m
-2
. Amb = Pressure control samples kept at
ambient pressure 5. Non-irradiated control (exposed only to high vacuum), 6. Phototrophs exposed
to maximum dose tested (100.0J·m
-2
).
1
2
3
4
172
Figure 3. Survival curves to VUV irradiation (λ = 145nm) of two strains of D. radiodurans (wt and
recA) deposited on two substrates.
These results can be explained on the basis of two aspects: low UV doses, and/or any
absorbing effect of the substrates. For comparison, the UV-C dose (λ = 254nm) necessary to
inactivate 90% of a D. radiodurans population (LD
10
) is 600J·m
-2
. Regarding the VUV peak at λ =
121nm, a dose of 1000J·m
-2
is necessary to reduce the viability of D. radiodurans to 67% [3].
2.2. Exposure of samples to ultraviolet light monochromator (λ = 254nm) in the laboratory
synchrotron Astrid, Aarhus, Denmark
Samples of the black biofilm from Chile were divided into aliquots of 10mg, diluted in 1ml of
BG-11 medium and filtered through polycarbonate membranes (Millipore), 25mm in diameter and
0.2μm porosity to produce a thin layered biological material on the membranes. As the filtration
cylinder was 16mm in diameter, membranes containing the biological material were cut to remove
exceeding edges. The resulting material was dried for at least 3 hours at room temperature on the
workbench, and stuck on disks of double sided carbon tape (Agar Scientific, UK). Subsequently, the
set was cut into pieces using a 2mm
2
grid strip built specifically for this purpose. Then the pieces
were stuck to 2mm
2
metallic screws on a sample holder. The irradiation system was assembled on
the workstation line of synchrotron light CD1 Astrid, Aarhus, Denmark, as shown in Figure 4.
Figure 4. Irradiation system with UV light (λ = 254nm) at the CD1 beamline of the Synchrotron
Laboratory Astrid, Aarhus, Denmark. Left inset, samples placed on metal discs. Right inset, the
irradiation system to be positioned normal to the beam.
UV beam
173
Rock samples from the cliffs at Beer, Devon, UK, were cut into approximately 8mm
3
cubes.
The cubes were stuck to the sample holder using metal discs of double-sided carbon tape. Samples of
D. radiodurans (wild-type and mutant strains), plus a UV resistant reddish-pigmented isolate DS3.4
from Atacama Desert, and cyanobacteria Chroococcidiopsis sp., also isolated from Atacama Desert,
were diluted in 1ml saline solution and prepared the same way as for the black biofilm to irradiation
with the CD1 line. Additionally, samples of D. radiodurans were also irradiated on the double-sided
carbon tape to investigate the influence of the substrate on bacterial survival after irradiation. For
this purpose, 1ml of culture was applied directly on the carbon tape, followed by dehydration for at
least 3 hours at room temperature in the workbench. Then the samples were cut into 2mm
2
pieces
using the blade grid and stuck on the metallic sample holder. The irradiation procedure was carried
out according to parameters listed in Table 4.
Table 4. Experimental design for UV irradiation of each biological material at the CD1 beamline of the
Synchrotron Laboratory Astrid, Aarhus, Denmark.
Dose (J·m
-
2
)*
Irradiation time
Irradiation
time
Number of
samples
Total time
(s)
(min)
(h)
0 (Control)
0
0
0
0
3
0
3
60
1
0.02
1min
3
3min
30
600
10
0.17
10min
3
30min
300
6000
100
1.67
1h 40min
3
5h
TOTALS
6660
111
1.86
1h 51min
12
5h 33min
* For a photon flux of up to 10
17
m
-2
·s
-1
After treatments, samples corresponding to the black biofilm from Atacama (Chile), epilithic
biofilm from Beer, Devon (UK), and the cyanobacteria Chroococcidiopsis sp., were placed in 12-well
plates containing 1ml BG-11 culture medium on each well and incubated at room temperature
(~22°C) under natural light cycles. Samples of D. radiodurans (wild-type and recA mutant strains), and
the Atacama isolate DS3.4, were diluted in TGY and subjected to serial dilution using saline solution,
and then plated on TGY solidified culture medium. After incubation at 30°C for 72 hours, the colonies
grown on culture medium were scored and survival rates were plotted on semi-log graphs.
Microbial communities from both Chile and the UK did not withstand the experimental
procedures, since no growth was seen even in the non-irradiated controls, even after long periods of
incubation under appropriate conditions. The general pattern of the results of these experiments
was similar to results obtained with the xenon lamp. The isolate DS3.4 and both strains of D.
radiodurans showed similar profiles of cell inactivation according to the type of substrate used. Data
seen in Figure 5 represent the results obtained with these organisms.
Figure 5. Survival curves corresponding to the recA and wild type strains of D. radiodurans and the
isolate DS3.4 deposited on two different substrates.
174
Results shown in Figure 5 indicate that D. radiodurans cells deposited on Millipore filter are
inactivated faster than cells on carbon tape. This is more evident for the recA mutant strain. The
isolate DS3.4 behaves at an apparently distinct profile. Higher doses are needed to determine the
inactivation profile for this isolate deposited on the different substrates.
Inactivation of Chroococcidiopsis sp. samples were obtained as the time of required for
initiation of growth after irradiation. According to Table 5, cells deposited on Millipore filter showed
a characteristic profile of inactivation. The higher the dose, the greater the time required for cell
proliferation, reflecting a lower number of viable cells remaining in the samples. Cells deposited on
carbon tape could not be retrieved, even the non-irradiated controls. A preliminary analysis of the
chemical composition of carbon tape revealed the presence of heavy metals such as gold and copper,
which may have contributed to the decrease in cell viability by means of lethal toxic effects for this
cyanobacterium.
Table 5. Minimum time (days) for detection of cellular proliferation of cyanobacteria
Chroococcidiopsis sp. after irradiation with increasing doses of ultraviolet light (λ = 254nm) at the
Synchrotron Laboratory Astrid, Denmark. Incubation was performed at room temperature (~22°C)
under natural ligh cycles.
Samples
Doses (J·m
-2
)
0 (control)
1
3
10
30
100
300
Millipore filter
26
26
26
27
28
38
a
46
a
Carbon tape
*-
-
-
-
-
-
-
*- No growth
a- Results observed in only two out of three replicates
2.3. SURVIVAL TO POLYCHROMATIC UV FROM SOLAR SIMULATED SOURCE
Cells of Deinococcus radiodurans were prepared in order to create 3 different situations: (i)
cells in aqueous solution (0.9% NaCl or culture medium), (ii) dehydrated cells mixed or not with
culture media and (iii) dehydrated cells in the presence or absence of grains of basalt or sandstone,
mixed or not with the culture medium.
2.3.1. Cells in aqueous solution
For irradiation of cells in aqueous solution, after the incubation period, part of the culture
was centrifuged at 4°C, 8000 rpm for 10 minutes. Then, the supernatant was discarded and the cell
pellet was resuspended in the same volume of saline solution (0.9% NaCl) by vortexing.
Subsequently, cell suspension was subjected to further centrifugation under the same conditions.
The pellet was resuspended again in the same volume of saline and cell suspension was placed in a
previously sterilized glass Petri dish. The remaining culture was deposited in another Petri dish
corresponding to cells mixed with culture medium. Before starting the exposure of cells to different
doses of irradiation, a volume of 100µl was removed from each of the experiments for serial dilution
and subsequent inoculation into plastic Petri dishes containing solidified TGY. Colonies grown on
these plates were used as reference (control) to calculate the percentage survival of cells irradiated
in aqueous solution. The irradiation parameters are described in Table 6.
175
Table 6 Experimental design for irradiation of cells in aqueous solution with the Oriel Solar Simulator.
Dose (kJ.m
-2
)
Exposure Time
Replicates
Final time
UV-A
UV-B
UV-C
(s)
(min)
0
0
0
0
0
3
0
7.5
1.2
0.06
15
0.250
3
15s
15
2.4
0.12
15
0.250
3
30s
22.5
3.6
0.18
15
0.250
3
45s
30
4.8
0.24
15
0.250
3
1min
37.5
6.0
0.30
15
0.250
3
1min15s
45
7.2
0.36
15
0.250
3
1min30s
52.5
8.4
0.42
15
0.250
3
1min45s
60
9.6
0.48
15
0.250
3
2min
67.5
10.8
0.54
15
0.250
3
2min15s
75
12.0
0.60
15
0.250
3
2min30s
TOTAL
150
2.500
33
7min30s
2.3.2. Dehydrated cells
For irradiation of dehydrated cells with or without culture medium, after incubation, the
culture was divided into two parts. One of them underwent removal of culture medium
(centrifugation and resuspension in saline solution using vortex) and the other part was used fresh,
i.e., containing culture medium. After this preparation, volumes of 1μl of this mixture were
distributed in the appropriate positions in the sample holder, resulting in samples containing ~10
5
cells mixed or not with culture medium, which were then deposited on kapton foil. All samples were
then dried at room temperature for at least 24 hours. The irradiation parameters for dehydrated
cells are described in Table 7.
Table 7. Experimental design for irradiation of dried cells, whether or not blended with the culture
medium in the presence or absence of grains of sandstone or basalt.
Dose (kJ.m
-2
)
Time (s)
Replicates
Final time
UV-A
UV-B
UV-C
(ad)
(final)
0
0
0
0
0
3
0
7.5
1.2
0.06
15
15
3
15s
22.5
3.6
0.18
30
45
3
45s
45
7.2
0.36
45
90
3
1min30s
75
12.0
0.6
60
150
3
2min30s
225
36.0
1.8
300
450
3
7min30s
450
72.0
3.6
450
900
3
15min
750
120.0
6.0
600
1500
3
25min
TOTAL
1500
1500
24
25min
2.3.3. Cells mixed with grains
For irradiation of cells dehydrated in the presence or absence of basalt or sandstone grains,
mixed or not with culture medium, the culture was divided into two parts after incubation with
grains. One of them underwent removal of culture medium as described earlier and the other part
was used fresh, i.e., containing culture medium. After this preparation, cells in the presence or
absence of culture medium were mixed with basalt (B) or sandstone (TSS) grains to verify the
influence of elemental composition of two distinct types of grains in the protection against UV. The
grains were divided into aliquots of 1.25mg per microcentrifuge tube and autoclaved. Cultures in
early stationary phase were then mixed with the grains in enough volume to obtain a mixture with
final concentration of grains of 1.25%. After homogenization, volumes of 1μl of this mixture were
distributed in the appropriate spaces in the sample holder, resulting in samples containing ~ 10
5
cells
176
mixed with 12.5µg of basalt or sandstone grains, in the presence or absence of culture medium. All
samples were then dried at room temperature for at least 24 hours. Irradiation of these samples was
performed according to parameters described in Table 7.
After each irradiation dose, cells were recovered and submitted to serial dilution and plating
in solidified TGY. After 48-72h incubation, colonies were scored and data were plotted as survival
curves.
2.3.4. Solar Simulator
The Solar Simulator Model 91192-1000 (Newport Inc.) consists of a xenon lamp coupled to an
ellipsoidal mirror that reflects the radiation to the primary flat mirror, which in turn directs the
radiation to a series of corrective optical devices and filters (Figure 6). The rectangular irradiated area
has about 100cm
2
and the radiation includes wavelengths greater than 200nm (Figure 7).
Figure 6. Schematic layout and photo of the Oriel Solar Simulator Model 91192-100 (Newport), with
a photo of the sample holder used for irradiation shown at the right bottom.
Figure 7. Emission spectrum of the solar simulator in comparison with the solar spectrum at Earth
orbit (ASTM E490).
2.3.5. Results
2.3.5.1. Cells in aqueous solutions
The experiments of UV irradiation in aqueous solution were performed to verify the effects
of either the presence or absence of organic molecules from the culture medium on the survival of
hydrated cells. Initially, several measurements were made using the Solar Simulator Oriel Solar using
different filters, according to Table 8. The spectra after each of the filters are different, being the
177
most notable difference regarding UV-C, whose irradiance is drastically reduced with the use of any
of the filters.
Table 8. Irradiation D. radiodurans in saline with the Solar Simulator using different filters, resulting
in different spectra.
Spectra
Filter
Irradiance (J.m
-2
.s
-1
)
%
UV-A
UV-B
UV-C
UV-A
UV-B
UV-C
A
-
980,000
170,000
3,800
84.937
14.734
0.329
B
AM0+81051
624,100
81,000
0,012
88.511
11.487
0.002
C
AM0+81050
624,100
60,000
0,008
91.228
8.771
0.001
D
AM0+87066
380,000
10,400
0,012
97.333
2.664
0.003
Filters: AM0, blocks excess of infrared radiation. 81051, blocks UV-C. 81050, blocks UV-B and UV-C.
87066, blocks infrared radiation and visible light.
The effects produced by radiation with spectra corresponding to different filters are quite
similar, whereas inactivation corresponding to irradiation without the use of any filters is much more
efficient (Figure 8).
Figure 8. Comparison of the effects of UV irradiation (λ> 200nm) on D. radiodurans in saline solution
(0.9% NaCl) using different filters, as described in Table 3.
When unfiltered irradiation is given to cells in the presence of culture medium, which
contains many organic molecules, the survival profile is greater (Figure 9). Curiously, when the same
values of survival are plotted on graphs with doses referring only to the UV-C portion of spectrum,
the survival profile of D. radiodurans becomes very similar to the survival of AB1157 strain of
Escherichia coli to UV-C (Figure 10). In Figure 10, the values corresponding to samples irradiated in
saline solution are marked in white, while those corresponding to samples irradiated in culture
medium are marked in black. The values for the cells irradiated with the solar simulator are marked
with black circles and those pertaining to E. coli cells are marked with white triangles. D. radiodurans
cells irradiated in saline solution with mercury lamp (λ = 254nm) confirmed its high resistance to UV-
C radiation.
Survival fraction (N/N
0
)
178
Figure 9. Comparison between the effects of solar simulator irradiation (λ>200nm) on of D.
radiodurans cells embedded in saline solution (0.9% NaCl) or in culture medium.
Figure 10. Comparison between the effects of solar simulator irradiation (λ>200nm) and irradiation
with mercury lamp (λ = 254nm) on D. radiodurans (Deira) in saline solution (0.9% NaCl) or culture
medium (MC) compared with cells irradiated with mercury lamp.
2.3.5.2. Dehydrated cells
Dehydrated samples were prepared depositing the microbial cells on two types of
carbonaceous substrates: (i) polycarbonate substrate (0.45µm Millipore filter) with smooth surface
and a carbon tape substrate (Shinto Paint Co.) with rough surface (Figure 11). It is possible to verify
the influence of substrate on microbial survival. Analyses made by electron microscopy revealed the
formation of cell monolayer in Millipore filter (Figure 11a), cell stacking (Figure 11b) and an
additional protection afforded by the culture medium crystallized after dehydration (Figure 11c).
Through analysis by prfilometry, it was found that the roughness of the carbon tape varies from 2μm
to 8μm (Fig. 11d).
Samples on Millipore filter inevitably became free of organic material because the liquid
containing the organic material was drained towards the carbon tape, always present beneath the
Millipore filter (Figure 11a). However, samples deposited on carbon tape ended up accumulating
Survival fraction (N/N
0
)
Survival fraction (N/N
0
)
culture medium
179
culture medium (Figure 11b). After dehydration, the culture medium became crystallized, forming a
complex matrix of organic substances that functioned as a physical shield against radiation. The
conditions used in most experiments are shown in Figure 11a (without culture medium) and Figure
11-C (cells mixed with organic material). Cells deposited on kapton foil were analog to the situation
shown in Figure 11b, i.e., with a step of removing the culture medium before the deposition of
samples in non-porous substrate. This condition was only tested with the Solar Simulator Oriel.
However, the substrate was a smooth sheet of kapton with 15μm thickness.
Figure 11. Samples deposited on two substrates, showing three different situations: A, cell
monolayer formed on Millipore filter. B, carbon tape surface showing regions with cell stacking. C,
cells embedded in the matrix formed by crystallization of the culture medium after dehydration. D,
computer analysis of the carbon tape surface.
The presence of organic material together with the cells deposited on carbon tape have
greater role in cellular protection than the actual topography of the surface of the substrate (Figure
11). This is also demonstrated by the survival curves presented in Figures 12-14.
A
B
C
D
180
Figure 12. Protective effects caused by organic material present in the culture medium on D.
radiodurans cells irradiated with the Solar Simulator.
Figure 13. Comparison between the effects of solar simulator irradiation on D. radiodurans cells
mixed with sandstone grains in the presence (CM + SST) or absence of culture medium (NC + SST).
Figure 14. Effects of solar simulator irradiation on D. radiodurans cells mixed with basalt grains in the
presence (CM + B) or absence of culture medium (NC + B). Note that the lowest dose used was
enough to inactivate more than 10
5
cells, if mixed only with basalt grains.
Survival fraction (N/N
0
)
Survival fraction (N/N
0
)
Survival fraction (N/N
0
)
181
3- EXTENDED EXPOSURE (UP TO 4 WEEKS) OF EPILITHIC BIOFILM FROM THE ATACAMA TO COMBINED CONDITIONS OF
THE MARTIAN ENVIRONMENT (ATMOSPHERIC COMPOSITION, PRESSURE AND TEMPERATURE) AND ISOLATION OF
ORGANISMS RESISTANT TO THESE SELECTED MARTIAN CONDITIONS.
Samples from five different locations in the Atacama desert (Chile), an environment
considered as a good Martian analog an environment similar to Mars (Navarro-Gonzalez et al., 2003),
were collected by our Chilean collaborators in July 2008 and shipped in airtight plastic bottles (15ml
or 50ml falcon tubes), to the Laboratory of Molecular Radiobiology IBCCF-UFRJ, Rio de Janeiro, Brazil.
The material was numbered and labeled as shown in Figure 15.
Figure 15. Collection sites at the Atacama Desert, northern Chile. 1. Laguna Llamara (21°16’07.54”S,
69°37’03.90”W. Altitude: 751m); 2. Sitio Cuarzos B2 (23°48’59.15”S, 70°29’25.59”W. Altitude: 538m);
3. Capa Negra La Portada (23°29‘ 58.61”S, 70°25’42.10”W. Altitude: 27m); 4. Gypsum
(23°49’01.14‘’S, 70°29’22.98‘’W. Altitude: 531m); 5. Sitio 3 S4 (23°49' 10.76‘’S, 70°28’36.77‘’W.
Altitude: 736m).
Two independent parameters were used: (i) UV-C irradiation, which reaches the Martian
surface but not Earth’s surface, and (ii) atmospheric composition in combination to pressure and
temperature found on Mars.
3.1. Ultraviolet irradiation
Aliquots (1g) of each sample were diluted in 10ml saline solution (0.9% NaCl), and mixed
through shaking (100rpm) for 3h at room temperature (~22°C). The mixtures were submitted to
serial dilution and plating on three different culture media: LB, TGY and Marine Agar 2216 (Difco) for
microbial enumeration of total microorganisms (Figure 16). In parallel, 5ml from each original
mixture were placed in glass Petri dishes and exposed to 300J·m
-2
of UV-C (λ = 254nm), followed by
serial dilution and plating on three different culture media: LB, TGY and Marine Agar 2216 (Difco) for
microbial enumeration of survivors (Figure 17).
182
Figure 16. Non-irradiated controls showing total number of colony formin units (cfu) grown on 3
types of culture media.
Figure 17. Survival fraction (N/N
0
) of microbial cells from each soil type diluted in saline solution
(1g/10ml) after 300J
•
m
2
UV-C (=254nm) irradiation and incubation in 3 types of culture media.
Many pigmented microorganisms were isolated from all samples. The presence of colored
pigments promotes resistance to radiation by absorbing most of the UV photons, acting as a passive
protectant against this type of stress (Jacobs et al., 2005). Therefore, pigmented microorganisms
were isolated from all samples as illustrated in Figure 18.
Soils
Soils
Survival fraction (N/N
0
)
Survival fraction (N/N
0
)
183
Figure 18. Isolation and growth of several pigmented morphotypes from Atacama Desert in MA, LB
and TGY.
A large number of pigmented microorganisms was observed in soil sample number 4 (Sitio 2
Gypsum). Therefore, this sample was subjected to a new step of irradiation, this time with
fractionated doses, up to 400J·m
-2
(Figure 19). This procedure resulted in a large number of
pigmented microorganisms grown in different culture media.
Figure 19. Decrease of microbial abundance following UV-C irradiation treatments of soil 4 (Sitio 2
Gypsum).
The isolates were then tested for their ability to grow in liquid culture medium under shaking
at 150rpm, 28°C, to undergo a new step of irradiation with 300J·m
-2
UV-C irradiation, this time under
optimal condition, i.e., in saline solution (0.9% NaCl) without the interference of the particulate
material from the soil samples. A total of 40 pigmented isolates were able to grow in liquid culture
Cells per soil gram
184
medium. Among these, 27 were representative of soil 4 (Sitio 2 Gypsum), corresponding to 67.5% of
all isolates. These results are shown in Figures 20 and 21.
Figure 20. UV-C resistance profiles of 40 isolates from 5 soils of Atacama Desert. Columns were
coloured according to their pigmentation.
Figure 21. Survival curve of the top UVC-resistant isolate S3.300-2 in comparison to survival curves of
E. coli wild-type strain K12, and wild-type strain R1 of D. radiodurans.
The 14 most resistant isolates were subjected to molecular identification by partial
amplification of 16S rRNA followed by sequencing and comparison to NCBI database. Most isolates
showed high similarity to the species Bacillus cereus and B. Thuringiensis, and the most resistant one
was also a Bacillus species. One isolates was identified as Pseudomonas stutzeri. These results are
shown in Table 8.
Isolate ID
Survival to 300J.m
-2
Survival fraction N/N
o
185
Table 9. Molecular assignments of the 14 isolates most resistant to UV-C irradiation.
Code
Espécies
Origin
S3-300-2
Bacillus. sp
Capa negra La Portada
S4.300-3
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.300-8
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
LP-MT13
Bacillus cereus/thuringiensis
La Portada cave
S4.400-2
Bacillus cereus
Sitio 2 Gypsum
S4.200-5
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.200-3
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.200-9
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.100-3
Pseudomonas stutzeri
Sitio 2 Gypsum
S4.100-11
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.300-2
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.2
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
S4.400-1
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio 2 Gypsum
AT02-08
Bacillus cereus/thuringiensis
Sitio cuarzos
Microbial diversity was also assessed by molecular analysis. 16S rRNA sequences from total
DNA extracted from the samples were amplified by PCR and separated by denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE), generating banding patterns representative of the microbial communities.
This analysis revealed the presence of complex microbial communities in all samples. Additionally,
interesting differences were revealed between the sites where soils were collected, as evidenced by
distinct profiles of 16S rRNA for each specimen (Figure 22).
Figure 22. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) of 16S rRNA sequences showing complex
microbial communities in all samples. 1- Laguna Llamara, 2- Sitio Cuarzo B2, 3-Capa Negra La
Portada, 4-Gypsum, 5-Sitio 3 S4.
3.2. Martian atmosphere
Samples of the black biofilm from Chile were divided into 10mg aliquots and placed in
microcentrifuge tubes in triplicate, then placed inside a vacuum chamber with controlled
temperature (-28°C) and pressure (6-8Pa) maintaining an internal atmosphere composed of CO
2
(95.3%), N
2
(2.7%), air (1.7%), O
2
(0.2%) and H
2
O (0.03%). Samples were taken from these conditions
after 1, 4, 7, 21 and 28 days of exposure, and inoculated onto oligotrophic culture media (0.1% yeast
186
extract or 0.1% tryptone). After 1 week incubation at room temperature, one sample corresponding
to the exposure time of 4 days revealed the presence of a colony with red pigmentation that has
been termed LPMARS-1. This colony was subjected to partial PCR amplification of the 16S rRNA gene
and the sequence obtained (Figure 23) aligned with 98% similarity to Modestobacter sp., a typically
oligotrophic actinobacteria (Figure 24).
GGGCGTAAGAGCTCGTAGGCGGTCTGTCGCGTCGGCTGTGAATCCCGAGGCTCAACCTCGGGTCTGCAGTCGA
TACGGGCAAACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGA
GGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAAC
AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGGCCATTCCACGGTCTCCGT
GCCGCAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGNCGCAAGGCTAAAACTCNAGGAATTGACGG
Figure 23. Partial sequence of 16S rRNA gene from isolate LPMARS-1.
Table 10. Comparison of 16S rDNA sequences of the isolate LPMARS-1 with sequences deposited in
NCBI database showing the alignments with higher similarity.
Accession
Description
Max
score
Total
score
Query
coverage
E value
Max
ident
FJ966173.1
Modestobacter sp. BMG5755 16S rRNA
gene, partial sequence
632
632
100%
3e
-178
98%
FJ213487.1
Uncultured bacterium clone TSPB_32 16S
rRNA gene, partial sequence
632
632
100%
3e
-178
98%
EU181225.1
Modestobacter sp. 42H12-1 16S rRNA gene,
partial sequence
632
632
100%
3e
-178
98%
DQ448774.1
Modestobacter sp. CNJ794 PL04 16S rRNA
gene, partial sequence
632
632
100%
3e
-178
98%
DQ448698.1
Modestobacter sp. CNJ793 PL04 16S rRNA
gene, partial sequence
632
632
100%
3e
-178
98%
EF522200.1
Uncultured actinobacterium clone EPLS011
16S ribosomal RNA gene, partial sequence
628
628
100%
4e
-177
97%
GQ329478.1
Uncultured Modestobacter sp. clone P8s-
342 16S rRNA gene, partial sequence
627
627
100%
2e
-176
97%
After analysis of these results a literature review on these microorganisms was started and
new experiments are being planned to characterize the survival profile of this isolate to selected
parameters of the Martian environment as well as different sources of UV radiation for its
photobiological characterization.
4- EXPERIMENTAL SIMULATION OF HIGH LEVELS OF RADIATION FROM ASTROPHYSICAL SOURCES AND THE EFFECTS ON
SURVIVAL OF D. RADIODURANS AND CHROOCOCCIDIOPSIS SP., USING FACILITIES OF DIAMOND SYNCHROTRON
LABORATORY AT OXFORDSHIRE, UK.
4.1. Sample preparation
Cells of the wild-type strain of D. radiodurans (wt) and the cyanobacterium Chroococcidiopsis
sp. isolated from the Atacama desert (Chile) were mixed with basalt (B) or sandstone (TSS) grains to
verify the influence of elemental composition of two distinct types of grains in the protection against
ionizing radiation. Grains were obtained by breaking and crushing 500g of rock, followed by
screening with sieves of 90μm, 63μm and 38μm. The grains were divided into 1.25mg aliquots per
microcentrifuge tube and autoclaved. Cultures in early stationary phase were then mixed with the
grains (Figure 23).
187
Figure 23. Optical micrographs on the left (40x) and electron micrographs at the center and right of
the two panels showing differences in size, color and texture of the grains of basalt (upper panel) and
sandstone (lower panel) as well as cells of D. radiodurans mixed with grains.
Grains less than 38μm dimensions were selected and subjected to a new stage of grinding in
ultratriturador, resulting in a powder with many fragments and amorphous nanometric and some
micrometric fragments with average size around 10μm (Figure 24).
Basalt
Sandstone
188
Figure 24. Optical micrographs of D. radiodurans cells mixed with basalt (left) or sandstone (right)
grains.
The chemical composition of the grains was determined by X-ray fluorescence (XRF), showing
the presence of many heavy elements in basalt grains and 93.72% SiO
2
in sandstone grains (Tables 11
and 12).
Table 11. Trace elements in grains
Element
Basalt
1:1 mix
Sandstone
Limit
Rb
56
46
35
2
Sr
849
478
117
2
Y
28.8
15.6
3.7
2.0
Zr
308
179
55
2
Nb
69.4
34.8
1.1
1.5
Ba
568
558
494
12
Pb
8
7
10
5
Th
11
7
0
4
U
3
2
0
3
Sc
22
11
1
5
V
288
139
6
5
Cr
77
39
4
4
Co
29
14
1
2
Ni
31
15
3
3
Cu
53
29
2
3
Zn
78
40
3
3
Ga
20
11
4
3
Mo
3
1
1
2
As
0
0
0
5
S
4
99
180
50
TiO
2
%
2.74
1.46
0.05
Fe
2
O
3
%
10.16
4.79
0.63
189
Table 12. Molecular composition of grains
wt. %
Basalt
1:1 Mix
Sandstone
SiO
2
47.24
71.06
93.72
TiO
2
2.96
1.54
0.05
Al
2
O
3
16.51
10.21
3.88
Fe
2
O
3
11.19
5.77
0.21
MnO
0.17
0.08
0.004
MgO
5.82
2.79
0.03
CaO
10.03
5.16
0.03
Na
2
O
3.51
2.10
0.64
K2O
2.23
2.01
1.77
P
2
O
5
0.58
0.30
0.02
LOI
0.32
0.34
0.31
The cell density of cultures was determined by counting cells under an optical microscope,
being 2.84x10
8
cells.ml
-1
for D. radiodurans and 2x10
7
cells·ml
-1
for Chroococcidiopsis sp. The cells
were mixed with the grains in a volume sufficient to obtain a mixture with final concentration of
grains at 1.25%. After homogenization, volumes of 1μl of this mixture were distributed in the
appropriate spaces on the sample holder, resulting in samples containing 10
4
-10
5
cells homogenized
with 1.25mg grains. All samples were then dried at room temperature for at least 24 hours.
4.2. Sample holder
Kapton sheets were mounted between two layers of a copper screen of approximately 1mm
thick. The samples were then deposited on the sheet of kapton (1μl/sample) in triplicate, according
to Figure 25. The set was kept for 30 hours in desiccator.
Figure 25. Overview of the sample holder loaded with 72 samples.
4.3. Experimental design
The experiments were divided into three categories:
(I) Survival to white beam X-ray (>1 keV), attenuated with different filters;
(II) Survival to non-attenuated monochromatic beam (10 keV);
(III) Addressing the dose rate effects for dehydrated free cells using monochromatic beam (10keV)
attenuated 1x, 0.1x and 0.01x, increasing the exposure times by 1x, 10x and 100x respectively to
achieve the same fluency.
190
4.4. Irradiation chamber
A vacuum chamber (12cm x 20cm x 30cm) consisting of four cylindric windows was equipped
with a sample holder assembled on a water-fed cooling system to prevent overheating of samples
during irradiation (Figure 26-A). The cooling system was constructed using a piece of copper (1cm x
8cm x 3cm) with piping to the entry and exit of water, as shown in Figure 26-B. The connection to
external cooling apparatus was made through tubes attached to the fixed top flange. A temperature
sensor (thermopar) was placed on the sample holder to monitor any temperature changes during
irradiation. A sheet of kapton 25μm thick was used in the front flange to maintain a vacuum of 200Pa
in the chamber while allowing the transmission of virtually 100% of X-ray beam directly to the
samples (Figure 26-B).
Figure 26. A, diagram of the chamber showing the metal ring used to hold the kapton sheet sealing
the chamber, as well as the sample holder and the cooling system. The sample holder was assembled
on the cooling system attached to the top flange. B, Detail of the cooling system showing the inlet
and outlet water pipes.
Figure 27. A, Assembling of the sample holder on the cooling system with tubes connected to the
hose with running water. B, sample holder assembling and cooling system inside the irradiation
chamber. The arrow shows the thermopar attached to the sample holder in order to monitor the
possible temperature variation using a digital multimeter. C, Irradiation chamber positioned on the
platform. D, The cooling system connected to the chamber kept the temperature at 20°C. E,
Alignment of the sample holder using a laser altimeter.
A
B
191
4.5. Irradiation procedures
In a first set of experiments, samples of D. radiodurans and Chroococcidiopsis sp. were
exposed to the non-attenuated white beam X-ray (> 1keV) under a slightly positive pressure of
nitrogen gas (N
2
). Results were observed only for Chroococcidiopsis sp. after two months of
incubation. In a second set of experiments, the irradiation procedures were carried out only for D.
radiodurans, according to parameters displayed in Table 20. In the second set of experiments all
samples were irradiated in rough vacuum (200Pa), since remaining moisture of the positive pressure
could eventually decrease cell survival.
In Table 13 it is shown the experimental desing for the second set of experiements. Samples
on holders 1 and 2 were exposed to the beam during the following exposure times: 0s, 3s, 10s and
30s (43s per experiment). Samples on holder 3 were irradiated for 0s, 1s, 3s, 10s, 30s, 100s, 300s and
1000s (24min4s per experiment).
In an attempt to determine whether there is any difference in survival rates depending on
the dose rate, the samples were irradiated using monochromatic beam (10keV) at three different
fluxes, changing the exposure times to achieve the same final doses: (i) without attenuation
(experiment 16) for 0s, 3s, 10s and 30s, (ii) attenuated to 0.1x with 100μm carbon sheet + 10μm gold
sheet (experiment 17) for 0s, 30s, 100s and 300s, and (iii) attenuated to 0.01x using a 1mm carbon
sheet (experiment 18) for 0s, 300s, 1000s and 3000s. These increased exposure times were necessary
to give the same total dose.
Table 13. Experimental design for irradiation of microorganisms with synchrotron X-rays at B16
beamline, Diamond Light Source, UK.
Experiment
Sample
Attenuation
Sample holder
1
NC
2mm Al
1
2
B
2mm Al
1
3
SST
2mm Al
1
4
NC
50µm Mo
1
5
B
50µm Mo
1
6
SST
50µm Mo
1
7
NC
100µm C + 10m Au
2
8
B
100µm C + 10m Au
2
9
SST
100µm C + 10m Au
2
10
NC
1mm C
2
11
B
1mm C
2
12
SST
1mm C
2
13
NC
-
3
14
B
-
3
15
SST
-
3
16
NC
-
4
17
NC
-
4
18
NC
-
4
NC, Naked cells. B, Cells mixed with basalt grains. SST, Cells mixed with sandstone grains.
4.6. Results
4.6.1. Recovery of cellular controls
Controls obtained after dehydration were recovered and analyzed in the same way that the
samples exposed to the treatments. These controls were denominated external controls (Table 14).
Controls underwent all procedures except the irradiation was called internal controls and were then
used as references for estimates of actual survival rates (Figure 28).
192
Table 14. Viability of the samples using the values obtained through direct cell counting under
microscope as reference (2.84 x 10
8
cells·ml
-1
). Standard deviation (SD) represents variation among
24 replicates for samples named as cell suspension, and 15 replicates for samples named as cells
mixed with sandstone or basalt grains.
Samples
External control
Internal control
a
CFU·ml
-1
b
Viability (%)
SD
CFU·ml
-1
c
Viability (%)
SD
Cell suspension
1.64 x 10
8
58
0.11
3.94 x 10
7
24
0.09
Cells + sandstone grains
1.12 x 10
8
39
0.27
5.6 x 10
7
50
0.30
Cells + basalt grains
1.12 x 10
8
39
0.27
6.9 x 10
7
62
0.32
a – Colony-forming units
b – Compared to the value obtained through direct cell counting (2.84 x 10
8
CFU·ml
-1
)
c – Compared to the external control
Figure 28. Average cell recovery from each of the 3 types of substrates. Rates were obtained by
dividing values of internal controls, by values of the external controls. Internal controls were exposed
to all procedures except the irradiation treatments, whereas external controls were samples ready to
be deposited on the kapton foil, prior to treatments. Error bars represent the standard deviation for
24 replicates for naked cells and 15 replicates for cells mixed with sandstone or basalt grains.
4.6.2. Survival curves for white beam of X-rays (> 1keV) attenuated with different filters
Survival curves were obtained only with the most attenuated beams (Figure 29). Survival
rates of the experiments using low attenuation, i.e., beams with higher intensity, were below the
detection limit of the microbiological method used (<10
-5
).
All survival curves showed the same general pattern. Cells mixed with basalt grains are
inactivated faster than cells mixed with sandstone grains or naked cells. This phenomenon is clearly
demonstrated by observation of Figure 29-A, with the most attenuated beam (less intense). Although
survival curves have been represented by exponential trend lines, the plots shown in Figure 29-A
seem to represent slower inactivation curves. However, the exponential trend lines were maintained
in accordance with classic models of microbial inactivation by ionizing radiation.
193
Figure 29. Survival curves of Deinococcus radiodurans, mixed or not with rock grains (sandstone or
basalt), to X-rays white beam (1keV to 20kev) attenuated with the following filters: A, 2mm
aluminum. B, 50µm molybdenum. C, 100µm carbon + 10µm gold. D, 1mm carbon. Minimum value on
the Y-axis represents the maximum detectable inactivation level by our methods (10
-5
).
4.6.3. Survival curves for monochromatic beam of X-rays (10keV)
Survival curves were obtained for all types of samples and showed the same pattern of cell
inactivation. Cells mixed with basalt grains are inactivated faster than cells mixed with sandstone or
free cells (Figure 30). The survival curves appear to exhibit an asymptotical trend in the case of the
most attenuated flux (2mm Aluminum). The initial plots of each curve are superimposed due to the
low inactivation rates for lower exposure times.
Survival fraction (N/N
0
)
Dose (MJ·m
-2
)
194
Figure 30. Survival curves of D. radiodurans, mixed or not with basalt or sandstone grains to
monochromatic X-ray beam (10keV).
4.6.4. Dose rate response
In an attempt to determine whether there is any difference in survival rates depending on
the dose rate, samples were irradiated using monochromatic beam (10keV) at three different fluxes,
changing the exposure times to achieve the same final doses: (i) without attenuation, (ii) attenuated
to 0.1x with 100μm carbon sheet + 10μm gold sheet, and (iii) attenuated to 0.01x using a 1mm
carbon sheet. The exposure times were then increased in 1x, 10x and 100x respectively. However,
the final doses were not sufficient to significantly inactivate cells (Figure 31).
Figure 31. Survival curves of D. radiodurans, mixed or not with basalt or sandstone grains to
monochromatic X-ray beam (10keV), attenuated with different filters to achieve the same doses
after different exposure times. The values on the horizontal axis correspond to experiments
performed with the most attenuated beam (higher exposure times).
Survival fraction (N/N
0
)
Survival fraction (N/N
0
)
no attenuation
0.1x attenuation
0.01x attenuation
195
4.6.5. Chroococcidiopsis sp.
To check the influence of grain size in protecting against radiation, cells Chroococcidiopsis sp.
were mixed or not with basalt or sandstone grains in three size ranges: (i) up to 90μm, (ii) up to
63μm and (iii) up to 38μm. The final amounts of cells and grains in each sample were respectively
2x10
4
and 1.25mg. The irradiation procedures were identical to those described in the previous
sections and the results are presented in Table 15.
Table 15 Observed growth of Chroococcidiopsis cells after irradiation with wide spectrum of X-rays.
Values represent minimum time (in days) required to observe any growth.
Dose
(x10
6
J·m
-2
)
Samples ID
NC
B90
B63
B38
B/SST90
B/SST63
B/SST38
SST90
SST63
SST38
0
*-
-
-
-
41
a
41
a
41
41
a
41
b
41
b
1.4
-
-
-
-
-
-
-
-
51
b
51
b
7.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
21.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
*- No growth, which means that the inactivation rate washigher than 10
-4
a. Results observed in two of three replicates
b. Results observed in one of three replicates. All other results were observed in three replicates. NC= Naked
cells, B= Basalt, SST = Sandstone, B/SST= 50% mixture of B and SST. Numbers at the sample codes represent
the upper limit of grain sizes (µm)
5- EXTENDED EXPOSURE (UP TO 4 WEEKS) OF D. radiodurans TO DIFFERENT EXPERIMENTAL CONDITIONS TO LOW
PRESSURE IN A VACUUM CHAMBER (10
-5
PA)
Samples were prepared as described in Section IV.4 and exposed for 4 weeks in a vacuum
chamber (10
-5
Pa), being removed from the chamber after day 1, 4, 7, 21 and 28. In parallel, control
samples for each experimental variation were kept the same period of time under ambient
conditions (temperature ~22°C, pressure = 1atm ~10
5
Pa), and recovered at the same time intervals.
The samples were then diluted in TGY medium and subjected to serial dilution in saline, and then
plated on agar-solidified TGY. After incubation at 30°C for 72 hours, the colonies grown on culture
medium were scored and survival rates were plotted on semi-log graphs showing the rates of
recovery and survival of controls to treatments, as shown in Figure 32.
196
Figure 32. A, recovery rate of the controls during times kept growing at ambient (~22°C temperature,
~1atm pressure). B, Survival rates in relation to controls after different times of exposure to high
vacuum (10
-5
Pa). NC + CM, cells mixed with culture medium, SST+CM, cells mixed with culture
medium plus sandstone grains, B+CM, cells mixed with culture medium plus basalt grains, NC, naked
cells, SST, cells mixed only with sandstone grains; B, cells mixed only with basalt grains.
It can be observed in Figure 32 that all samples mixed with culture medium showed
significantly higher rates of recovery and survival, especially after longer times. Control samples
under the various experimental variations undergone spontaneous loss of viability throughout the
experiment, what was more evident for cells without culture medium (Figure 32-A). Furthermore,
survival to high vacuum is much more dependent on the presence of organic material in the sample
(culture medium) than on the type of grain mixed with the cells (Figure 32-B). Samples corresponding
to 21 and 28 days of exposure to high vacuum scored survival rates lower than the detection limit of
the method (10
-5
).
6- EXPERIMENTAL SIMULATION OF CHARGED PARTICLES OF THE SOLAR WIND AND VERIFICATION OF THE EFFECTS ON
THE WILD-TYPE STRAIN OF D. radiodurans AND Chroococcidiopsis FROM ATACAMA DESERT
The samples were prepared as described in Section 4.1, i.e., containing 1.25mg basalt or
sandstone grains and 2x10
5
cells of D. radiodurans cells or 2x10
4
Chroococcidiopsis sp. in each
sample.
6.1. Irradiation with electron beam (2keV)
6.1.1. Description of experiments
Irradiation with electron beam was performed using the facilities of the Molecular Physics
Laboratory, Department of Physics and Astronomy, The Open University (UK). A vacuum chamber
capable of maintaining the system around 10
-4
to 10
-6
Pa was coupled to an electron gun model ELG-
2/EGPS-1022 Kimball, emitting 2keV electrons with controllable energy and flux. The samples
deposited on Millipore filters were placed on a metal sample holder using a double-sided carbon
tape, assembled inside the chamber and placed normal to the beam direction by means of a
rotational manipulator. For each experiment, irradiations were carried out as described in Table 16.
Sample conditions can be seen in Table 17.
A
B
197
Table 16. Exposure times for irradiation with 2keV electron beam
Dose
(x10
14
electrons·cm
-2
)
Exposure time
Replicates
Final time
(s)
(min)
0 (Control)
0
0
3
0
8.60
5
0.08
3
15s
25.82
15
0.25
3
45s
77.44
45
0.75
3
2min 15s
232.34
135
2.25
3
6min 45s
697.00
405
6.75
3
20min 15s
TOTAL
605
10.08
18
30min 15s
Table 17. Experimental design for irradiation of microbial cells with 2keV electrons
Experiment
Sample
1
NC
Chroococcidiopsis sp.
2
SST
Chroococcidiopsis sp.
3
B
Chroococcidiopsis sp.
4
NC
D. radiodurans
5
SST
D.s radiodurans
6
B
D. radiodurans
6.1.2. Results
Taking into account the composition of the main elements of the biological material, it is
possible to estimate the atomic percentage as 31% carbon, 49% hydrogen, 13% oxygen and 7%
nitrogen (Salton, 1964; Hiragi, 1972). These values were used to calculate the linear energy transfer
(LET) of 2keV electrons on the target (single-cell 2μm in diameter, 0.9392g·cm
-3
density), by means of
the software CASINO v2.42. The calculated LET was 20keV μm
-1
. The penetrating depth of these
particles was estimated to be around 160nm (Figure 33), with maximum energy deposited around
100nm.
Figure 33. Simulation of the penetration depth of 2keV electrons, through a beam 10nm diameter,
across a D. radiodurans cell after 6min 45s exposure, corresponding to 7x10
4
electrons. The
simulation was performed using the software CASINO v2.42.
All survival curves to electrons showed low cell inactivation rates. Naked cells are apparently
less inactivated than cells mixed with grains, although this effect was only observed for higher doses.
There are no significant differences in the radiation protection afforded by either type of grain
(Figure 34). This is due to the low penetration depth of 2keV electrons. Their trajectories are blocked
within the cell wall, where 90% of the total energy is deposited to a maximum depth of 20nm.
198
Figure 34. Survival curves of D. radiodurans obtained in the absence (NC) or presence of sandstone
or basalt grains (SST or B) irradiated with 2keV electron beam.
Figure 35. Simulation of total energy deposition path from a 2keV electron beam 10nm in diameter,
on cells of D. radiodurans, after 6min 45s exposure, corresponding to 7x10
4
electrons. The simulation
was performed using the software CASINO v2.42.
Unfortunately samples of Chroococcidiopsis sp. did not resist the experimental procedures,
since it was not possible to observe any cell proliferation in the controls, probably due to the short
dehydration time. Under ideal conditions, cells of Chroococcidiopsis sp. require at least three days of
slow dehydration to maintain cell viability during extended anhydrobiosis.
Survival fraction (N/N
0
)
Dose (electrons
.
cm
-2
)
199
6.2. Irradiation with proton beam (200keV)
The experiments with proton beam were performed using the facilities of the Laboratory of
Experimental Physics of the Osservatorio di Catania, Sicily, Italy. A vacuum chamber capable of
maintaining a system of the order of 10
-4
Pa was coupled to a system for generating protons with
final energy of 200keV. The samples deposited on Millipore filters were placed in a sample holder
using a double-sided carbon tape and assembled inside the chamber, positioned normal to the beam.
The irradiation parameters are detailed in Table 18 and 19.
Table 18. Details of irradiation of D. radiodurans with 200keV protons.
Sample
Charge (nC)
protons
(·cm
-2
)
protons
(per sample)
protons
(per cell)
Dose (Gy)*
Replicates
NC
0**
0
0
0
0
3
NC
0.04
2.77x10
8
4.33x10
6
6.15
32.35
2
NC
0.44
2.77x10
9
4.33x10
7
61.46
323.52
3
NC
4.44
2.77x10
10
4.33x10
8
6.15x10
2
3.24x10
3
3
NC
44.40
2.77x10
11
4.33x10
9
6.15x10
3
3.24x10
4
2
NC
4.44x10
3
2.77x10
12
4.33x10
10
6.15x10
4
3.24x10
5
2
NC
4.44x10
4
2.77x10
13
4.33x10
11
6.15x10
5
3.24x10
6
2
NC
4.44x10
5
2.77x10
14
4.33x10
12
6.15x10
6
3.24x10
7
2
SST
0
0
0
0
0
3
SST
22.20
1.39x10
11
2.17x10
9
3.07x10
3
1.38x10
4
2
SST
4.44x10
4
2.77x10
13
4.33x10
11
6.15x10
5
2.75x10
6
2
B
0
0
0
0
0
3
B
22.20
1.39x10
11
2.17x10
9
1.09x10
3
1.38x10
4
2
B
4.44x10
4
2.77x10
13
4.33x10
11
2.17x10
5
2.75x10
6
2
Table 19. Details of irradiation of Chroococcidiopsis sp with 200keV protons.
Sample
Charge (nC)
protons
(cm
-2
)
protons
(per sample)
protons
(per cell)
Dose (Gy)*
Replicates
NC
0**
0**
0
0
0
3
NC
0.44
2.77x10
9
4.33x10
7
61.46
324
3
NC
44.40
2.77x10
11
4.33x10
9
6.15x10
3
3.24x10
4
2
NC
4.44x10
4
2.77x10
13
4.33x10
11
6.15x10
5
3.24x10
6
2
SST
0
0
0
0
0
3
SST
22.20
1.39x10
11
2.17x10
9
3.07x10
3
1.38x10
4
2
SST
4.44x10
4
2.77x10
13
4.33x10
11
6.15x10
5
2.75x10
6
2
B
0
0
0
0
0
3
B
22.20
1.39x10
11
2.17x10
9
3.07x10
3
1.38x10
4
2
B
4.44x10
4
2.77x10
13
4.33x10
11
6.15x10
5
2.75x10
6
2
* Calculated using the software SRIM 2010, assuming an average cell density of 1.0g·cm
-3
, and average
elemental composition of biological material to be 50% carbon, 30% nitrogen, 10% hydrogen and 10% oxygen
** Internal controls, subjected to all treatments except for irradiation
NC = naked cells, SST = cells mixed with sandstone grains, B = cells mixed with basalt grains
In a pilot experiment, samples of D. radiodurans were also deposited on substrates
representing cosmic dust analogues. Amorphous forsterite (Mg
2
SiO
4
) or amorphous and crystalline
fayalite (Fe
2
SiO
4
) were tested to check whether there could be any influence of the type of substrate
on cell inactivation. These minerals are considered good analogues of interstellar material due to its
morphology and molecular composition. After irradiation, cells of D. radiodurans were recovered
from the substrates and subjected to serial dilution and plating. The colonies were scored after a
maximum period of 72 hours of incubation at 29°C.
The substrates containing cells Chroococcidiopsis sp. were immersed in the culture medium
BG-11 Divided in aliquots of 2ml deposited on 12-wells plates. Incubation was done at room
200
temperature under natural cycles of artificial lightining with fluorescent light at 40cm away from the
light source.
6.2.1. Results
6.2.1. Deinococcus radiodurans
The linear energy transfer (LET) of 200keV protons on the target (single-cell 2μm in diameter,
1g.cm
-3
density) was calculated using the software SRIM 2010, resulting in 67.8keV·μm
-1
, and the
penetration path of these particles was estimated to be 2.83μm (Figure 36). With these values, the
estimated dose to inactivate 90% of the population of free cells (LD
10
) was 1kGy, which corresponds
to 10
10
ions·cm
-2
. This LD
10
obtained for irradiation with protons is 10-fold lower than the irradiation
with gamma rays (10kGy), which interacts with matter only through ionizations and excitations. In
the case of protons, besides ionizations and excitations, they also interact with matter via mass
transfer and momentum transfer, resulting in increased LET, causing more cell damage.
Figure 36. Simulation of the trajectory of 100 thousand 200keV protons across a microbial cell by
means of the SRIM software.
In the case of cells mixed with grains, some of them were probably protected by the
overlapping grains and therefore survived the highest doses. Moreover, there was no detectable
difference in the protection afforded by either type of grain, and the survival rates of cells in the
presence of grains were orders of magnitude greater than for naked cells.
The survival rates for cells deposited on amorphous forsterite (Mg
2
SiO
4
) was very similar to
survival rates of naked cells deposited on a polycarbonate filter (Millipore). Cells deposited on
amorphous and crystalline fayalite (Fe
2
SiO
4
) could not be recovered at all, indicating that cell survival
was below the detection limit of the method (<10
-5
). Considering that the only difference between
forsterite and fayalite is the replacement of magnesium in forsterite by iron in fayalite, it is possible
that iron somehow contributes to inactivate cells when irradiated with 200keV protons.
Scanning electron microscopy (SEM) images were produced for the non-irradiated controls
and for samples of D. radiodurans and Chroococcidiopsis sp. irradiated at the maximum dose. There
was no detectable difference between controls and irradiated samples with respect to morphological
cell surface, even for the naked cells irradiated at the maximum dose (Figures 37-39).
201
Figure 37. Survival curves of D. radiodurans to irradiation with 200keV proton beam. The graphs on
the left and right differ only in the values of the X axis. NC = naked cells, SST = cells mixed with
sandstone grains, B = cells mixed with basalt grains, SID = cells mixed with crystalline forsterite, SIL =
cells mixed with amorphous forsterite.
Figure 38. Images from electron microscopy (SEM) of cells of D. radiodurans irradiated (right) or not
(left) with 200keV proton beam. Naked cells and cells mixed with sandstone and basalt grains are
shown.
6.2.2. Chroococcidiopsis sp.
Electron microscopy images (SEM) of Chroococcidiopsis sp. are shown in Figure 39. Again
there were no morphological difference between the unirradiated controls and samples irradiated
with the highest doses tested. However, some aspects probably resulting from physical aggression
were observed in controls and in the irradiated samples. Unfortunately samples Chroococcidiopsis sp.
did not resist the experimental procedures, since it was not possible to observe any cell proliferation
in the controls, probably due to the short dehydration time. Under normal temperature and
pressure, cells of Chroococcidiopsis sp. require at least three days of slow dehydration to maintain
cell viability after extended anhydrobiosis.
Survival fraction (N/N
0
)
202
Figure 39. Electron microscopy images (SEM) of Chroococcidiopsis sp. irradiated (right) or not (left)
with 200keV protons. Naked cells and cells mixed with sandstone and basalt grains are shown.
6.3. Irradiation of Deinococcus radiodurans with 4keV carbon ions
The irradiation experiments with carbon ions were performed using facilities of the
Laboratory of Experimental Physics of the Physics Department of Queens University Belfast (UK). A
vacuum chamber (10
-5
Pa) capable of maintaining a system for generating ions with final energy of
4keV was used. The samples were deposited on Millipore filters and placed in a sample holder using
a double-sided carbon tape, assembled inside the chamber and positioned normal to the beam by
means of a rotating sample holder. Naked cells and cells mixed with sandstone or basalt grains were
exposed in triplicate to the beam according to parameters displayed in Table 20.
Table 20. Details of irradiation with 4keV carbon ions.
Dose
(x10
13
ions·cm
-2
)
Exposure time
Replicates
Final time
(s)
(min)
0 (Control)
0
0
3
0
3
45
0.75
3
9s
10
150
2.50
3
30s
33
500
8.33
3
1min 39s
100
1665
27.75
3
6min 45s
333
5545
92.42
3
7min 6s
TOTAL
7905
131.75
18
6h35min15s
The linear energy transfer (LET) for 4keV carbon ions on the target (single-cell 2μm in
diameter, 1g·cm
-3
density) was calculated using the software SRIM 2010, resulting in 3.57eV·Å
-1
, and
the penetration range of these particles was estimated to be 30nm (Figure 34). With these values,
the estimated dose to inactivate 90% of the population of naked cells (LD
10
) was 1kGy, which
corresponds to 2.65 x10
11
ions·cm
-2
. However, there was no cell inactivation even at doses 10
4
-fold
above this value (Figure 35). Probably this is due to the low penetrating power of 4keV carbon ions,
whose trajectory is interrupted in the cell wall. There are no significant differences in the radiation
protection afforded by either type of grain (Figure 40).
203
Figure 40. Simulation of the trajectory of 100,000 4keV carbon ions across a microbial cell. The depth
of the target (Target Depth) in the X-axis, is given in Angstroms (Å).
Figure 41. Survival curves of D. radiodurans in the absence (NC) or presence of sandstone or basalt (B
or SST) grains irradiated with 4keV.
V – General Discussion:
Radiation from astrophysical sources is by far the factor of more aggressive biological models
in the space environment (Nicholson et al., 2005; Horneck et al., 2010). A number of experiments
using both facilities that simulate conditions in space, as well as experiments in real flight orbit have
nevertheless demonstrated the ability of survival of different model organisms and the remarkable
stability of biomolecules in these harsh conditions (Horneck et al., 2010; Olsson-Francis and Cockell,
2010).
The experiments presented in this thesis succeeded in determine the survival of the
extremophile species Deinococcus radiodurans to different simulated physical and chemical
parameters, such as radiation, vacuum, and the Martian atmosphere, acting together or separately.
Other novel isolates from the Atacama Desert in Chile were also tested, such as cyanobacteria
Chroococcidiopsis sp.
204
All experiments were performed at room temperature, since the deleterious effects of low
temperatures on organisms is minimal. Indeed, the occurrence of extremely low temperatures and
dehydration conditions in interplanetary space favor the preservation of cellular integrity by
preventing the formation of free radicals from water molecules. Notably, organisms such as D.
radiodurans (Ashwoods et al., 1968) and B. subtilis (Weber and Greenberg, 1985) have higher
survival to UV/VUV if irradiated under low temperatures, compared with irradiation performed at
room temperature.
Discussion of results is divided into four sections, namely: (i) UV radiation, (ii) X-rays, (ii)
charged particles, and (iv) isolation of microorganism resistant to Martian conditions.
6.1. Ultraviolet radiation
The irradiation test done in aqueous solution using different spectra emitted by the Oriel
Solar Simulator (Table 8) demonstrated the importance of using sources of radiation under
conditions similar to those found in nature to a better understanding of the interaction of natural
phenomena with biological materials. D. radiodurans is one of the most radiation-resistant
microorganism. UV-C doses required to inactivate 63% of a D. radiodurans population (LD
37
) is 550-
600J·m
-2
(Battista, 1997), as shown in Figure 10. However, if irradiation with UV-C is made from a
radiation source along with UV-A and UV-B solar spectrum, devastating effects occur (Figure 8).
Under these conditions, the LD
37
related to UV-C alone droped to less than 10J·m
-2
. Biological effects
arising from interacting wavelengths appear to overcome intrinsic D. radiodurans radiation
resistance mechanisms. On the other hand, the presence of organic molecules in the aqueous
solution is capable of increasing cell survival, by partial absorption of DNA damaging photons. The
LD
10
, ie the dose required to inactivate 90% of a population of cells of D. radiodurans was increased
3-fold when cells were in the presence of organic molecules than for cells in the absence of organic
molecules (Figure 9).
This phenomenon was also observed for dehydrated cells (Figure 12). In the absence of
organic molecules, the effects of acute irradiation with hydrogen lamp (λ = 121nm) are quite similar
to the UV light spectrum with the solar simulator (Figure 7 and appended Planetary & Space Science
paper (Fig.6)). This means that even with a very high cross section with cellular environment (Ito et
al., 1980), VUV photons are able to reach the DNA of cells leading to its inactivation. However, if
samples are dehydrated in the presence of organic material, the high cross section of photons with λ
= 121nm is restricted to that organic layer, not reaching the cell core. Photons of λ>200nm, on their
turn, impact on a smaller superficial cross section, gaining access to DNA with more efficient
inactivation even for organic-dehydrated cells. Thus, the profiles of cell inactivation for these two
radiation sources are quite different. Remember that the methodology used to prepare the samples
was different. In the case of solar simulator, the stacking of cells with the organic material was more
limited than in the case of the hydrogen lamp, where a powder consisting of lyophilized cells and
organic matter was distributed on the substrate. The preparation of samples for irradiation with the
solar simulator also did not involve a step of lyophilization, thus resulting in less dehydrated samples
in comparison to hydrogen UV irradiated ones.
The doses used with the xenon lamp were comparable to the solar emission band at 145nm,
with a dose rate similar to that found in Earth's orbit. However, the actual solar flux in this energy
range is low (Woods, 2002) and was not intense enough to cause any detectable cell inactivation,
even for the highest doses tested (Figure 3).
The effects of monochromatic radiation with λ = 254nm photons of CD1 line from Astrid
laboratory synchrotron light were very similar in terms of the effects produced by irradiation with
white beam of light in the line of LNLS TGM (see appended Planetary & Space Science paper (Fig.4)).
The 254nm photons have high absorption by biological targets, since the maximum UV absorption by
DNA occurs in the 260nm range. However, unlike the samples used in Astrid synchrotron, which were
dehydrated spontaneously, the samples used in the LNLS were previously irradiated and freeze-dried
under high vacuum (10
-5
Pa). Again this may have resulted in samples less dehydrated to Astrid
synchrotron than for the LNLS, limiting the accuracy of the comparison. However, compared the
205
effects of irradiation with two beams of broad spectrum, ie the solar simulator and the line of the
LNLS TGM light, with samples dehydrated spontaneously to the solar simulator and samples
irradiated in vacuum in TGM, inactivation was more intense with TGM than with the solar simulator,
demonstrating the importance of VUV radiation in cellular inactivation (Figure 9).
Dried cells mixed with organic molecules, both irradiated with xenon lamp as the source with
the line of synchrotron light CD1 Astrid did not suffer any detectable cell inactivation, even for the
highest doses tested (Figure 3). The protection afforded by the presence of organic material in the
dehydrated samples was evident for the irradiations performed not only at synchrotron Astrid, but
also at LNLS, with the hydrogen lamp (see Panetary & Space Science paper (Fig.6)), and the solar
simulator (Figure 9).
Comparing again the effects of irradiation with two broad-spectrum beams (solar simulator
and TGM), inactivation is not that pronounced for cells mixed with organic material, especially for
the lower TGM doses, it is stabilized asimptotically in the range 2% for doses greater than 1kJ·m
-2
.
This means that only the surface layers of the samples are sensitized radiation. For larger doses, the
effects caused by irradiation with the solar simulator become more intense than those caused by
TGM (see Planetary & Space Science paper (Fig.4)).
The influence of cell stacking on the survival was evidenced by experiments where samples
containing different concentrations of cells were irradiated with a single dose of 600J·m
-2
. Cell
concentrations higher than 10
6
cells per sample deposited on a 20mm
2
area greatly increased cell
survival (see Planetary & Space Science paper (Fig.5)). These results confirm the theoretical
predictions based on the ratio between the area of containment of samples and cell size of D.
radiodurans (2μm).
In another experimental approach to reinforce the conclusion set out above, we used recA
mutant cells of D. radiodurans, deficient in the function of RecA protein that mediates the important
DSB repair by homologous recombination, an extremely radiation sensitive strain. Even so, the
protection offered by organic molecules was observed for different radiation sources (see Planetary
& Space Science paper (Fig.4)).
In a situation more similar to that expected in nature, microbial cells would be associated not
only material's organic environment, but also the debris from inorganic substrates. Therefore, the
protection offered by dust grains (sandstone or basalt) was investigated. Importantly, these two rock
types comprise two extremes in terms of geological classification. Most stony meteorites have
chemical composition between these two extremes (Tables 11 and 12).
When cells are associated with sandstone grains and irradiated with the solar simulator, a
clear benefit from physical protection is afforded by the grains in both the presence and absence of
organic molecules in a similar manner. But this protection is less than the protection afforded only by
the organic molecules from the culture medium (Figures 12 and 13). Sandstone grains are composed
of 93.72% SiO
2
. It appeared that the micrometric grains are virtually transparent to visible light.
According Cockell et al. (2003), the transmittance of UV-A and UV-B in layers of 500μm thickness
gneiss rock is greater than 80%. Certainly sandstone grains smaller than 20μm used in our
experiments had higher levels of transparency to UV. Probably, the association of cells with this type
of material favors a greater exposure to radiation compared to what should occur when cells are
mixed only with culture medium.
In contrast, cells mixed with basalt grains, when irradiated with the solar simulator also
benefit from protection only when associated with organic material in the culture medium, since it
was not possible to recover any survivor associated only with the grains of basalt exposed in the
lower dose tested (Figure 14). Interestingly, at lower doses, cells benefit from the protection offered
by the basalt grains plus medium, which is smaller than the protection offered only by medium
alone. For greater doses, basalt grains plus culture medium result in asymptotic curve by around 1%
survival at maximal dose (225kJ·m
-2
equivalent to ~30min UV exposure at solar 1AU; Schuerger et al.,
2003). It should be stressed that as the intensity of solar radiation decreases proportionally to the
square distance, the same dose would be equivalent to 1h 15min of exposure at Mars orbit and even
greater exposure times at more distant orbits.
206
The survival of cyanobacteria Chroococcidiopsis sp. ultraviolet radiation was investigated
using only monochromatic radiation λ = 254nm from the CD1 line of Astrid Synchrotron Laboratory,
Denmark. Measures of inactivation of samples Chroococcidiopsis sp. were qualitatively obtained by
checking the post-irradiation time to growth start. The higher the dose the greater the time required
for cell proliferation to be detectable, reflecting lower numbers of remaining viable cells. The
samples deposited on carbon tape were not able to proliferate even after three months of
incubation. Probably the presence of heavy metals contributed to the cytotoxic effects for this
organism. As the growth of this bacterium on BG-11 solidified culture medium already represents
additional stress due to toxic agar impurities, more accurate techniques to determine post-radiation
survival rate need to be used, e.g., monitoring cell counting under the microscope, chlorophyll
autofluorescence, DAPI DNA-staining, esterase activity (Cockell et al., 2005), whenever standard
techniques do not apply for unculturable organisms.
Regarding the black biofilm from the region of La Portada, Chile, there are three possible
explanations for the observed results: (i) the amount of samples (10mg) was insufficient for the
detection of viable phototrophs from such a hostile environment as Cliff La Portada, which receives
intense solar radiation and is subject to severe conditions of desiccation, (ii) the conditions of
transport of samples from Chile to the United Kingdom may have contributed to decrease the
viability of the microorganisms present in the samples, (iii) the phototrophs previously observed
under the microscope are among the group of microorganisms known as viable but not culturable.
Alternative techniques, such as microscope analysis should also be used to evaluate survival of these
unculturable samples in the future.
The experiments with the solar simulator and the B16 beamline were performed at ambient
pressure and under low vacuum, respectively. Therefore, a study into the effects of vacuum found in
low earth orbit (LEO, English Low Earth Orbit) was performed using samples of free cells or medium-
coated cells associated or not with sandstone or basalt grains (Figure 26). It was found that the
presence of organic molecules from the culture medium is much more important than the
association of molecules with the grains. In the presence of organic molecules, cells maintain 100%
viability up to the longest exposure tested (28 days), regardless of the presence of any of the grains.
Sugars and polyhydric alcohols are known to help stabilize the cellular macromolecules during the
vacuum-induced dehydration (Horneck et al., 2003), which may have contributed to the high survival
rates observed in these experiments.
6.2. X-Rays
Much of the literature on ionizing radiation resistance of microbes is based on their exposure
to gamma rays from radionuclides (Liu et al., 2003). The most accessible one is
60
Co, which emits
photons of energies above 1MeV (1.17 and 1.33 MeV) in its decay to its stable isotope
60
Ni. Currently,
facilities are able to produce synchrotron X-ray beams with high luminosity at energies up to several
hundred keV, making it ideal tools to study survival of microorganisms to this energy range. The use
of a vacuum chamber coupled to synchrotron radiation sources allows the investigation of the effects
of radiation at extremely low pressures, simulating space vacuum.
The experiments with synchrotron B16 beamline in the Diamond synchrotron sought to
adapt a classical microbiological method (serial dilution and counting of CFU on plates) to the
technical requirements imposed by the available instrumentation. Cells were deposited on sheets of
kapton foil, an inert material with high transparency to X-rays. In this situation, any interaction with
the substrate is expected to occur, as if cells were floating in space, under direct radiation effects.
Initially, the effects of the interaction of sandstone and basalt grains with microbial cells and
the efficiency of cell detachment from the substrate sheet (kapton) was evaluated. The data
presented in Table 14 and Figure 28 show that non irradiated controls face no cytotoxic action by the
grains and that cells are very efficiently retrieved from the substrate. The highest values of cell
recovery for the cells mixed with the grains are the result of heterogeneity in the rate of removal of
cells from these substrates.
207
The experiments were divided into three categories, namely: (i) irradiation with white beam
(>1keV), (ii) irradiation with monochromatic beam (10keV), (iii) investigation of dose rate effects for
cells dehydrated using the monochromatic beam (10keV).
The results obtained with white beam indicate that cells associated with basalt grains are
inactivated more efficiently than cells associated with sandstone grains or free cells (Figures 29-31).
This pattern of results was observed in all irradiation experiments, and is even more evident for the
monochromatic beam (Figure 30). Analysis of the molecular composition of the two types of grains
revealed the presence of much heavier elements basalt than in sandstone (Tables 11 and 12).
Probably the interaction of photons in the hard X-rays energy range with basalt grains leads to
production of secondary photoelectrons that contribute to cell inactivation. Another observed
feature is the asymptotic trend for survival with irradiation at the lower dose rate.
The doses used in our experiments are comparable to astronomical phenomena known as
Soft Gamma Repeaters - SGR (Galante and Horvath, 2007). These astrophysical sources emit regular
X-rays pulses and are usually associated with strongly magnetized neutron rotating stars (magnetars;
Galante, 2009). However, these sources have sporadic, although very intense, activity than the
regular events known as star flares or giant flares. The duration of such events peak at ~0.2s, with a
phase of decay of about 400s, modulated with a periodicity of about 1s associated with the rotation
of the neutron star. During this short time period peak energy reaches hard X-rays, up to 175keV
(Galante, 2009).
According to Galante et al. (2009), the LD
10
of ionizing radiation calculated to completely
sterilize a D. radiodurans population would be 5.5M·Jm
-2
. However, these values are based on
experimental data obtained with cells in aqueous solutions. In our experiments, a graphical analysis
of the curves presented in Figure 29 revealed that the values of LD
10
for white beam X-ray (> 1keV)
were extrapolated to be slightly higher, 10MJ·m
-2
for free cells and 12.3MJ·m
-2
to sandstone-attached
cells and 7.8MJ·m
-2
for basalt-attached cells. LD
10
values for monochromatic beam (10keV) were
7MJ·m
-2
for free cells, 1.8MJ·m
-2
to sandstone-attached cells and 0.7MJ·m
-2
for basalt-attached cells
(Figure 30). These dissimilar LD
10
values regarding different substrates probably arise from
differential production of photoelectrons by each material. Differences in LD
10
values observed for
the two beam types (white and monochromatic) can be caused by two reasons: (i) the dose rates
were lower for the monochromatic beam, thereby maximizing the interaction of photons with the
sample and leading to a higher level of cell inactivation; (ii) 10keV beam photons inactivate biological
material more efficiently than the beam containing photons with other energies as well. These two
hypotheses can also be complementary.
In an attempt to investigate the influence of dose rate on cell survival, we performed a
battery of experiments aimed at attenuating the beam to 10% and 1% of total flow, thus increasing
the irradiation time by 10 and 100x, respectively, to achieve the same final dose (Figure 31). From
results seen in figures 29 and 31, the 100-fold lower fluencies used in experiments on different dose
rates induced no detectable differential inactivation was not possible to investigate the effects of
dose rate in comparison to the white beamline.
Experiments with Chroococcidiopsis sp. were performed on a slightly different manner (Table
15). Samples were irradiated at slightly positive pressure of N
2
to minimize the amount of moisture
present in the chamber. In addition, samples were mixed with grains divided into three size ranges
for each of the two types of grains, plus a 1:1 mixture between them. No flux attenuators were used
in these experiments with Chroococcidiopsis sp. Even so, the cells were able to proliferate after 51
days incubation in samples mixed with smaller grains of sandstone (Table 15). With respect to size,
smaller grains favor the survival of dehydration due to the formation of microenvironments
preservatives. Regarding the type, sandstone grains probably produce less photoelectrons than
basalt. However, further experiments should be conducted to obtain more conclusive answers.
6.3 Charged particles
Studies on the irradiation of low energy charged particles in plants and microorganisms,
especially with energies ranging from 1 to hundreds of keV has aroused great interest (Yang et al.
208
1991; Yu, 1998). By using this radiation to low energy, is easier to develop important biotechnological
applications (Huang and Yu, 2007). Irradiation with low energy charged particles also being
investigated for possible application in cancer treatment (Matsushita et al., 2006; Kamada et al.,
2002) and the procedures for sterilization of materials in the medical industry (Raballand et al.,
2008). Besides its application in biotechnology, irradiation with low energy ions is useful for studying
the effects of space radiation on extremophile microorganisms using space simulation facilities.
The population of ions of low energy cosmic rays in the interplanetary medium is essentially due to
wind and solar particles accelerated by magnetic energy released in solar flares (Strazzulla et al.,
1995). Solar wind ions are produced by an expansion of plasma and reach supersonic speeds at a
distance of few rays, about 400km·s
-1
(i.e., ions with energies of ~ 1keV/unidade atomic mass are
released). At 150 million km away from the Sun (=1 Astronomical Unit - UA) is the density of the wind
around 5 protons·cm
-3
, corresponding to a flux of about 2x10
8
cm
-2
·ions·s
-1
. As the intensity of flow
falls proportionally with the inverse square distance, a proton flux of 10
17
·cm
-2
can reach the surface
of an asteroid the hypothetical 3au in just 100 years (Strazzulla et al., 1995).
In our experiments with proton irradiation at 200keV, we found that D. radiodurans cells
begin to be inactivated with doses above 10
9
protons·cm
-2
(Figure 37). Moreover, micrometric grains
are able to protect cells against this type of radiation, since the penetrating power of particles was
estimated at 2.83 micrometers. Through graphical analysis of Figure 31 can be observed that the LD
10
for free cells (NC) is 10
10
protons·cm
-2
. Although there is no difference in protection afforded by
either type of grain used, cell survival was different depending on the type of substrate analogue of
cosmic dust (CDA, the Cosmic Dust Analogs English) on which cells were deposited. In the case of
substrates analogous to meteoritic material containing iron, such as fayalita probably the presence of
this element contributed to the cellular inactivation, compared with the presence of magnesium in
forsterite.
Unlike the inactivation observed with 200keV proton beam, the irradiation experiments with
both electron beam 2keV as with ion beam carbon 4keV showed that free cells or mixed with any of
the two types of grains tested are not inactivated even at doses greater than 10
16
electrons·cm
-2
·s
-1
and 10
15
ions·cm
-2
·s
-1
.
The effects of low energy particles on microorganisms have not been fully investigated under
simulated conditions of space. Under laboratory conditions, has been demonstrated that this type of
radiation results in less cell death than that observed for other forms of radiation, even at the
expense of increased mutation rates (Yu, 1993). Apparently, the biological risk of such radiation is
related to their energy deposition is highly localized. The inactivation can be restricted to cells
located in the trajectory of the particles (Horneck et al., 1994b), and the intensity of the damage
depends on the Linear Energy Transfer (LET, English Linear Energy Transfer) (Kozubek et al., 1995).
Moreover, mutagenic events can be caused if damage in the vicinity of genetic material. Low-energy
electrons appear to interact with specific sites in DNA by mechanisms resonance (Winstead and
Mckoy, 2008), and repair system by joining non-homologous ends (NHEJ) was demonstrated by
Moeller et al. (2008b) as the main mechanism to repair DNA strand breaks induced by particle
bombardment in B. subtilis.
6.4. Isolation of microorganisms resistant to Martian conditions
The search for life in situ on Mars requires an understanding of the possible habitats
available and the possible types of microorganisms are found in these environments (Kuhlman et al.,
2005). The Atacama Desert in Chile is considered an environment similar to Mars due to parameters
such as extremely low humidity and intense solar UV radiation (Navarro-Gonzalez et al., 2003;
Connon et al., 2007). Its location comprises part hyper-arid desert of Peru, Chile, and the Chilean
portion extends between 1°N and 37°S, incorporating the arc Peru, northern Chile and parts of
western cordillera (Hartley et al Chong ., 2005). Desertification in western South America is mainly
driven by atmospheric phenomena subtropical anticyclonic. This is Eforce by the presence of cold
Humboldt Current along the west coast of South America, which prevents precipitation in coastal
regions. Another regulatory factor is the presence of the Andes, which increases the precipitation on
209
the east side and decreases on the west side. Still, the extent of the continental prevents humid
winds move within the continent (Thompson, 1975), a situation that probably exists a few hundred
million years.
The absence of clouds contributing to the occurrence of high levels of solar radiation over the
entire length of the Atacama. Any microorganisms present on the Martian surface are subject to
constant exposure to high fluxes of UV light highly deleterious (Cockell, 2001). On the Martian
surface, high levels of UV-C radiation reaching the surface (Schuerger et al., 2003), contrary to what
occurs on Earth where the solar spectrum corresponding to wavelengths below 300nm is attenuated
by the atmosphere, particularly by the ozone layer.
The samples used in this study were collected in different regions of the Atacama Desert.
Laguna Llamas is a salt deposit located in northern Chile, where you can find microbial mats
composed of cyanobacteria present beneath layers of salt (Demergasso et al., 2003). The deposit of
quartz is right next to the deposit of gypsum, a mountainous region south of Antofagasta. The site
corresponding to sample 3 is located north of Antofagasta, where there is a cliff covered with a black
biofilm in a region known as La Portada. The site 3.S4, corresponding to sample 5 is probably the
most arid region on the planet, reaching zero values of relative humidity (Navarro-Gonzalez et al.,
2003). Despite the inhospitable conditions of these environments, our data revealed a surprising
abundance of culturable microorganisms in all samples (Figure 16).
VI – Concluding remarks:
Despite the technical challenges imposed by most of the experimental setups, the results
demonstrate that the proposed objectives were achieved. The main results demanded innovations in
experimental approaches, integrating techniques of experimental physics and biology of
microorganisms. The new techniques developed allow for a series of new studies of microbial
survival under conditions that simulate long periods in space environment. The main findings of the
project were:
1 - Microbial cells protected by micrometer-sized particles against ultraviolet (UV) and vacuum
ultraviolet (VUV), benefit from protection and remain viable for long periods of time under chronic
irradiation.
2 - Regarding survival to dehydration and vacuum, the presence of organic compounds in the
samples is more important than any microenvironment preserved within micrometric grains.
3 - Grains with micrometer dimensions contribute to decrease microbial survival after acute
irradiation with X-ray beam in low vacuum (200Pa). Probably this effect is due to production of
secondary electrons into the grains, since this phenomenon was more evident for basalt grains,
which contain heavier elements in their composition than sandstone.
4 - Contrary to what occurs with electromagnetic irradiation, micrometric grains are efficient to
protect microbial cells against irradiation with charged particles (electrons, protons and carbon ions)
regardless of the type of grain.
5 - Microbial inactivation by irradiation with charged particles is much more dependent on energy
than the flux of particles. Low energy particles, in the energy range of the solar wind (~ 1keV), were
not able to inactivate D. radiodurans cells, even with doses equivalent to hundreds of years of
exposure.
6 - Cells deposited on a substrate containing iron in its molecular composition (Fe
2
SiO
4
fayalite) are
inactivated more efficiently than those deposited on substrate containing magnesium instead of iron
(Mg
2
SiO
4
forsterite). This result seems to corroborate the hypothesis that heavier elements may
210
contribute to cell inactivation via production of secondary electrons after treatment with ionizing
radiation.
7 - The use of facilities for the isolation of new microorganisms exposed to simulated extraterrestrial
environments is efficient and represents a good tool for the use of biological resources with potential
applications in different sectors.
8 - The set of experimental data supports a version of the of Panspermia hypothesis, in which
microscopic forms of biological systems minimally protected by dust grains, could remain viable in
different regions of the galaxy until they were intercepted by bodies with favorable environments for
further proliferation, contributing to life transfer in the galactic level.
VII – Project-related publications:
1 – Laboratory simulation of interplanetary ultraviolet radiation (broad spectrum) and its effects on
Deinococcus radiodurans. IG Paulino-Lima, S Pilling, E Janot-Pacheco, A Naves-de-Brito, JARG
Barbosa, AC Leitão, C Lage. Planetary and Space Science, 58(10), 1180-1187, 2010.
doi:10.1016/j.pss.2010.04.010
2 – Laboratory simulation of acute X-ray radiation emitted by stellar explosions conditions and
survival of extremophilic microorganisms. IG Paulino-Lima, Douglas Galante, Charles Cockell, Karen
Olsson-Francis, Armando Azua-Bustos, Rafael Vicuña, Eduardo Janot Pacheco, Claudia Alencar Santos
Lage, Nigel Mason. Astrobiology Science Conference, Houston, Texas, USA, 26-29 April 2010.
3 - Irradiation of extremophilic microorganisms with 200keV protons. Paulino-Lima IG, Baratta G,
Brucato J, Cockell C, Olsson-Francis K, Spinella F, Strazzullo G, Mason N, Lage C. 3
rd
Workshop of
Italian Astrobiology Society, Duino Castle, Duino, Trieste, Italy, 26-28 May 2010.
4 – Effects of dust grains on survival of Deinococcus radiodurans to charged particle irradiation I
Paulino-Lima, D Galante, C Cockell, K Olsson-Francis, C Lage, N Mason. Astrobiology Graduate
Conference, Talborg, Sweden, 13-18 June 2010.
5 – Survival of Deinococcus radiodurans to laboratory-simulated solar wind charged particles. IG
Paulino-Lima, E Janot-Pacheco, D Galante, CS Cockell, K Olsson-Francis, NJ Mason, JR Brucato, C Lage.
Manuscript in preparation for submission to Icarus.
VIII. Cited bibliography:
Ashwoods, M. J.; Copeland, J.; Wilcocks, J. Response of bacterial spores and Micrococcus radiodurans
to ultraviolet irradiation at low temperatures. Nature, 217(5126), 337-338, 1968.
Battista, JR. Against all odds: The survival strategies of Deinococcus radiodurans. Annual Review of
Microbiology, 51, 203-224, 1997.
Battista, J. R.; Park, M. J.; McLemore, A. E. Inactivation of two homologues of proteins presumed to
be involved in the desiccation tolerance of plants sensitizes Deinococcus radiodurans R1 to
desiccation. Cryobiology, 43(2), 133-139, 2001.
211
Burchell, M. J.; Mann, J. R.; Bunch, A. W. Survival of bacteria and spores under extreme shock
pressures. Monthly Notices of The Royal Astronomical Society, 352(4), 1273-1278, 2004.
Cockell, C. S. The Martian and extraterrestrial UV radiation environment Part Ii: further
considerations on materials and desiccation. Criteria for artificial ecosystems. Acta Astronautica,
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Cockell, C. S.; Brack, A.; Wynn-Williams, D. D.; Baglioni, P.; Brandstatter, F.; Demets, R.; Edwards, H.
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selective dispersal filter in planetary island biogeography. Astrobiology, 7(1), 1-9, 2007.
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protection from ultraviolet radiation in polar terrestrial Microhabitats. Polar Biology, 26(1), 62-69,
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flux on the Cyanobacterium, Chroococcidiopsis Sp 029. Astrobiology, 5(2), 127-140, 2005.
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216
APÊNDICE 2 – Artigo 1. Survival of Deinococcus radiodurans to laboratory-simulated
solar wind charged particles
217
Survival of Deinococcus radiodurans to laboratory-simulated solar wind
charged particles
Authors:
(1) Ivan Glaucio PAULINO-LIMA
a
(3) Eduardo JANOT-PACHECO
b
(3) Douglas GALANTE
b
(4) Charles S COCKELL
c
(5) Karen OLSSON-FRANCIS
c
(6) Nigel MASON
d
(7) John R Brucato
e
(8) Claudia LAGE
a
Affiliations:
a- Instituto de Biofisica Carlos Chagas Filho. Avenida Carlos Chagas Filho, 373.
Cidade Universitaria, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, CEP 21941-902.
b- Instituto de Astronomia, Geofisica e Ciencias Atmosfericas. Rua do Matao, 1226.
Cidade Universitaria. 05508-900, Sao Paulo, SP, Brasil.
c- Planetary and Space Science Research Institute, Open University, Walton Hall,
Milton Keynes, United Kingdom, Buckinghamshire, MK7 6AA.
d- Department of Physics and Astronomy, Open University, Walton Hall, Milton
Keynes, United Kingdom, Buckinghamshire, MK7 6AA.
e- INAF, Osservatorio Astrofisico di Arcetri, Largo Enrico Fermi 5, I - 50125 Florence,
Italy.
Corresponding author: Ivan Glaucio Paulino-Lima. [email protected]
218
Abstract
The radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans was exposed to
sources simulating solar wind charged particles emissions such as electrons, protons
and ions. Cells were mixed or not with dust grains (basalt or sandstone) differing in
elemental composition, and deposited on smooth polycarbonate substrate to verify
the shielding efficiency of fine grains (<20µm) as well as to determine how much cell
survival each one could afford after dehydration after irradiation. Doses necessary to
inactivate 90% of the initial cell population (LD
10
) were determined for different
experimental conditions. Results indicate that low energy particle radiation (2keV to
4keV) have no effects on dehydrated cells, whilst higher energy ions (200keV)
inactivate cells only if heavily irradiated (>10
10
ions.cm
-2
). Considering the low flux of
energetic particles originating from actual astrophysical sources, these results
emphasise the resilience of life in space and support the concept of an interplanetary
transfer of viable microbes.
219
1. Introduction
The ion population of low energy cosmic rays in the interplanetary medium is
essentially due to the solar wind and to particles accelerated by magnetic energy
released in solar flares. Solar wind ions are produced by a plasma expansion whose
velocity becomes supersonic at a distance of a few solar radii, roughly 400km∙sec
-1
(i.e., ions at energies of ~1keV/amu are expelled). At 1AU the wind density is in the
order of 5 protons∙cm
-3
, corresponding to a flux of ~2x10
8
protons∙cm
-2
∙sec
-1
(STRATZULLA et al., 1995). Although the flux drops proportionally to the inverse of
the square distance from the Sun, some 10
17
protons∙cm
-2
reach a hypothetical
average-sized asteroidal surface at 3AU in only 100 years (STRAZZULA et al.,
1995). Such high flux is expected to produce a number of effects as sputtering
(THIEL et al., 1982), and ion implantation (STRAZZULA et al., 1995). Electron
distribution functions in the solar wind have approximately Maxwellian cores with
energies of the order of ten eV (VESELOVSKY, 2006) and density around 5
electrons∙cm
-3
(SALEM et al., 2003), corresponding to a flux of 2 x 10
8
electrons∙cm
-
2
∙s
-1
.
Studies on low energy charged particle irradiation on plants and microbes,
especially with energies in the range of several to hundred keV, attracting great
interest (Yang et al., 1991; Yu, 1998). By using such low energy range for ion
irradiation, it is easier to develop biotechnologically important traits (Huang & Yu,
2007). Low energy ion irradiation has also being investigated for potential application
in cancer treatment (Matsushita et al., 2006; Kamada et al., 2002), and sterilization
procedures in the medical industry (Raballand et al., 2008). Besides its application in
biotechnology, low energy ion irradiation is useful to study the effects of space
radiation on microbial cells using space simulation facilities. Conditions to afford
220
microbial survival in space environment have been extensively simulated in
laboratory (reviewed in Olsson-Francis e Cockell, 2010 e Horneck et al., 2010).
The effects of low energy particle radiation on microorganisms have not been
fully investigated under simulated space conditions. As far as it is studied, it has been
shown to result in less cell death than that observed for other forms of radiation, even
though at the cost of higher mutation rates (Yu, 1993). Apparently, the biological
hazard impinged by such radiations is related to their highly localized energy
deposition. Inactivation may be restricted to those cells placed within the radiation
path (Horneck, 1994), in an extent depending on the radiation Linear Energy Transfer
(LET) (Kozubek et al., 1995). On the other hand, two specific pieces of evidence
indicate that mutagenic events seem to arise if damages form in the very
neighbourhood of the genetic material. Low-energy electrons appear to interact with
particular DNA targets by resonance mechanisms (McKoy & Winstead, 2008), and
the error-prone Non-Homologous End Joining (NHEJ) repair has been demonstrated
by Moeller et al. (2008) to be the key one to repair DNA breaks induced by particle-
bombardment in Bacillus subtilis.
The abovementioned reasoning bears in one important issue connected with
the panspermia hypothesis (Mileikowsky et al., 2000). Any viable life form putatively
travelling from one inhabited planet to another should escape the heavy particle
bombardment inflicted by a nearby star in the meanwhile. Predictions by the
lithopanspermia version account on large rock fragments to assure shielding against
radiation to buried microorganisms inside (Mileikowsky et al., 2000). Of capital
importance, larger volumes better absorb secondary radiation accumulated within
some million years stay in space, which is thought to grant cell integrity upon landing
in a habitable environment.
221
Astronomical data coming from recent observation has input information on
life-threatening scenarios concerning the panspermia hypothesis. In this paper, more
elaborate laboratory apparatus allowed the experimental simulation of these
conditions to some extent, including high vacuum and exposure to solar-like
particulate radiation. To better understand the limits of life in extreme environments
and its resilience in the Universe, this study was designed to investigate conditions to
allow survival of extremophilic microorganisms after irradiation with low-energy
charged particles under several experimental conditions, simulating the solar
exposure during a putative interplanetary travel.
2. Material and Methods
2.1. Sample preparation and analysis after irradiation
Cells of Deinococcus radiodurans were cultivated in TGY culture medium
(0.5% Tryptone, 0.3% Yeast Extract, 0.1% Glucose), at 32°C, 200rpm for 18 hours.
Basalt or sandstone grains were added or not to the culture (10
8
ml
-1
) for a final
concentration of 1.25% w/v (Figure 1). The mixture (1l) was deposited on
polycarbonate substrates (Millipore filters) previously set on top of the sample holder
stuck with double sided carbon tapes, resulting in samples with ~10
5
cells mixed to
12.5g grains.
Figure 1.
After irradiation assays in triplicate, the substrates containing monolayer cells
of D. radiodurans were removed from the sample holder and put into 1.5ml
microcentrifuge tubes (eppendorf) containing 100l TGY. After gently mixing for
222
1min, the expected cell concentration was 10
5
cells∙ml
-1
. Serial dilutions (10
-1
, 10
-2
,
10
-3
, 10
-4
) were performed using 1.5ml microcentrifuge tubes (Eppendorf) containing
a final volume of 100l TGY each. A volume of 10l was taken from each tube and
seeded on agar-solidified TGY containing Petri dishes, followed by incubation at
32°C for up to 48 hours. After this period, grown colony-forming units (CFU) were
counted and multiplied by the corresponding dilution factor to estimate the average
number of survivors (N). This number was divided by the value corresponding to the
non-irradiated control (N
0
), yielding a survival rate (N/N
0
) for each dose. Survival
curves were plotted in semi-log graphs with survival rates in the ordinates vs
radiation doses shown in the abscissas.
2.3. Irradiation with 200keV proton beam
Proton beam irradiations were performed at the Osservatorio Astrofisico di
Catania, Sicily, Italy. A vacuum chamber capable of maintaining the system in the
order of 10
-4
Pa was coupled to a system generating protons with final energy set at
200keV. Samples were deposited on polycarbonate substrates (Millipore filters) and
placed in a sample holder using a double-sided carbon tape. The sample holder was
then assembled inside the chamber, normal to the beam direction. Either naked cells
or cells mixed with basalt or sandstone grains were exposed in triplicate to the
indicated fluencies of 200keV protons.
In a pilot experiment, samples of D. radiodurans were also deposited on
substrates mimicking meteoritic analogues (CDAs). Amorphous forsterite (Mg
2
SiO
4
)
or amorphous and crystalline fayalite (Fe
2
SiO
4
) were tested to check whether they
could influence cell inactivation by particles. These minerals are considered good
223
analogues of meteoritic metallic blends due to both their morphology and molecular
composition.
2.4. Irradiation with 4keV carbon ions
Experiments of irradiation with carbon ions were performed at Queens
University Belfast, Northern Ireland, UK. A vacuum chamber (10
-5
Pa) capable of
maintaining a system generating ions with final energy of 4keV was used. Samples
were deposited on a polycarbonate substrate (Millipore filters) and stuck on top of a
sample holder using a double-sided carbon tape. The sample holder was then
assembled inside the chamber, in a position against the beam. An attached rotating
device controlled the exposition of the samples with the programmed doses. Either
naked cells or cells mixed with sandstone or basalt grains were exposed in triplicate
to the indicated fluencies (Figure 4A) of 4keV carbon ions.
2.2. Irradiation with 2keV electron beam
Electron irradiation experiments were performed at the Open University, UK. A
vacuum chamber (10
-5
Pa) was coupled to an electron gun model ELG-2/EGPS-1022
Kimball, emitting a 2keV electron beam with controlled energy and flux. Samples
were deposited on polycarbonate substrate (Millipore filters) and stuck on top of a
metallic sample holder using a double-sided carbon tape. The sample holder was
then assembled inside the chamber, in a position against the beam. An attached
rotating device controlled the exposition of the samples with the programmed doses.
Either naked cells or cells mixed with sandstone or basalt grains were exposed in
triplicate to the indicated fluencies (Figure 4B) of 2keV electrons.
224
3. Results
The linear energy transfer (LET) to the target (single-cell 2μm in diameter,
1g∙cm
-3
density) was calculated using the software SRIM 2010, resulting in 7.378
eV∙Å
-1
for 200keV protons. The penetration range of these particles was estimated to
be 2.7μm. According to these calculations, 1kGy is the estimated absorbed dose to
inactivate 90% of the population of free cells (LD
10
), corresponding to 10
10
ions∙cm
-2
.
The LD
10
is therefore 10-fold less for protons compared to gamma rays (10kGy). In
fact, electromagnetic gamma rays interact with matter only through ionizations and
excitations, while protons, besides those, also interact via mass transfer and
momentum transfer, resulting in increased LET.
Regarding the effect of grains (Cosmic Dust Analogs, CDA´s), many cells
appeared to be protected by the overlapping grains and therefore survived the
highest doses. Moreover, there was no detectable difference in the protection
afforded by either type of grain, arenite or basalt, and the survival rates scored in
their presence were orders of magnitude above that obtained for naked cells.
Cells deposited on meteoritic material, on the other hand, suffered some
radiation impact. Survival rates of cells deposited on amorphous forsterite (Mg
2
SiO
4
)
were very similar to survival rates of naked cells deposited on a polycarbonate filter
(Millipore). Cells deposited on amorphous and crystalline fayalite (Fe
2
SiO
4
) could not
be recovered at all, indicating that the survival rate was below the detection limit of
the method (<10
-5
). Considering that the only difference between forsterite and
fayalite is the replacement of magnesium in forsterite by iron in fayalite, it is possible
that iron atoms somehow contribute to inactivate cells when irradiated with 200keV
protons (Figure 2).
225
Figure 2.
Electron microscopy (SEM) images were produced for non-irradiated controls
and for samples of D. radiodurans irradiated at the maximum dose of 200keV
protons. There was no detectable difference between controls and irradiated samples
with respect to the structure of cell surfaces, even after visualization of naked cells
irradiated at the maximum dose (Figure 3).The impact of low energy ions on Bacillus
atrophaeus and of Aspergillus niger was investigated by Raballand et al. (2008). They
found that 200eV ions do not cause significant erosion for fluences up to 1.15 x
10
18
cm
-2
. However, the combined impact of argon ions and oxygen molecules or
atoms causes significant etching of the spores and significant inactivation. This is
explained by the process of chemical sputtering, where an ion-induced defect at the
surface of the spore reacts with either the incident bi-radical O-2 or with an incident O
atom. This leads to the formation of CO, CO2 and H2O and thus to erosion.
Figure 3.
The calculated LET predicted by the SRIM code for 4keV carbon ions on the
target (single-cell 2μm in diameter, 1g∙cm
-3
density) was 3.57eV∙Å
-1
, with a
penetration path of 30nm. The estimated dose to inactivate 90% of the population of
naked cells (LD
10
) was 1kGy, which corresponds to 2.65x10
11
ions∙cm
-2
. However,
there was no cell inactivation even at doses 10,000-fold above this dose (Figure 3).
Probably this is due to the low penetrating power of 4keV carbon ions, whose
trajectory is interrupted in the cell wall. There are no significant differences in the
radiation protection afforded by either type of grain.
226
Regarding irradiation with 2keV electrons, all survival curves showed low
values of cell inactivation (Figure 4). Apparently, naked cells are inactivated faster
than cells mixed with grains, although this effect was only observed for higher doses.
There are no significant differences in the radiation protection afforded by either type
of grain.
Figure 4.
4. Discussion
The interaction between low energy ions and the organisms is characterized
by energy deposition, momentum transferring, mass deposition and charge
neutralization and/or exchange (HUANG et al., 1996; SHAO et al., 1997b) whereas
UV and other ionizing radiation into organisms only produce the effect of energy
deposition (SONG et al., 2001). A particle with more than one or two hundred volts
initial energy will make a number of collisions before stopping. The average process
introduced by the relatively numerous collisions needed to stop such a particle
insures that the average distance along the particle track will not vary enormously
from a mean value. In particular, most particles will stop within a distance, called the
range, which will depend on the type of particle and the energy, and only a minute
number will travel even slightly farther than this range (HUTCHINSON, 1955).
The survival fraction of microorganisms after low energy irradiation has a peak
at a definite dose and the shape of the curve is saddle-like (SHAO and YU, 1997a),
in which the survival fraction of microorganisms increases linearly as the dose
increases over some dose ranges. The saddle-type dose survival curve has been
227
observed in many organic molecules in vitro irradiated by low energy ions. This has
been verified to be caused by the unique physical processes that occur for low
energy ion irradiation through research on the physical and chemical processes of
low energy ion irradiation in biomolecules (HUANG et al., 1998a; YU and SHAO,
1994; SHAO and YU, 1997b). The restoration effects of low energy ion irradiation
observed in molecules can also be applied to microorganisms. Previously, the
Energy transfer, Mass deposition and Charge exchange model (EMC model) based
on the repair effects caused by mass deposition and charge exchange of low energy
ions has been proposed and has given a good explanation of the experimental data
(SHAO and YU, 1997a). However, more recent studies on the physical and chemical
processes of low energy ion irradiation of microorganisms indicates that momentum
transfer is the main repair physical process during low energy ion irradiation of
biomolecules and organism (HUANG et al., 1998a-d; ROSSLER, 1985; HUANG,
1995). Moreover, the EMC model does not consider the stopping range of keV ions
in biomaterial.
The maximum stopping range of keV ion in biological samples is much more
than in inorganic crystalline material (HUANG and YU, 2007). The stopping range of
low energy ions in tomato film for instance is proportional to the radiation dose, and
30keV ions could penetrate 180 micron potato film at the dose of 2x10
17
ions∙cm
-2
(YU et al., 1994). The implanted ion was detected at tens of micron depth in the
mung bean seed capsule when the seed capsule was irradiated with low energy ions
at dose of 2x10
17
ions∙cm
-2
(SU et al., 1997). A 30keV ion could also penetrate 50
microns of dry tomato peel (HAN and YU, 1998) and 20 microns of Mylar film (a
polymer used in radiation dosimetry) (HUANG et al., 1999; YU, 2000). The main
factor controlling the depth of penetration was the formation of channels when
228
biomaterial was irradiated by low energy ions at high dose (HUANG et al., 1999).
When the low energy ions enter the biomaterial, they sputter atoms from their route.
The sputtered atom extracts other atom in the sample to form small molecules such
as H
2
O and CH
4
. More and more channels were formed when more and more small
molecules escaped after doses of more than 10
17
ion∙cm
-2
of low energy ion
irradiation. The depth of the channel was proportional to the dose of low energy ion
irradiation and the stopping range of low energy ions in biomaterial was also
increased as the dose increases (HUANG et al., 1999).
It is known that energy of incident ions is transferred to the electronic and
nuclear target systems leading to electronic excitation and ionisation and elastic
nuclear collisions. Basing on results obtained for ribonuclease (JUNG et al., 1966),
the enzymatic protein having chemical composition similar to the coat of microbial
cells, one can assume that under irradiation conditions the electronic and nuclear
stopping powers are comparable. However, the cross-section for the spore
inactivation by elastic nuclear collisions can be predominant, as shown for
ribonuclease (JUNG et al., 1966).The energetic ions cause displacement and
sputtering of target species due to breaking of chemical bonds. In the case of the
target composed of proteins, one can expect rupturing of peptide, disulphide and
hydrogen bonds, which leads to fragmentation of polypeptide chains and
conformational changes of proteins. Also, deamination, decarboxylation and
dehydrogenation of aminoacids in the chain are possible. Such processes were
observed for glycine irradiated by low-energy helium ions causing the development of
a carbonised crust (FOTI et al., 1991). Alternatively, the rearrangement of target
species can involve their new aggregation and the creation of unspecific bonds for
the given protein. In addition, protons slowing down in the target can cause its
229
hydrogenation. The above mechanism can generate decomposition and a loss of the
biological activity of coat proteins, especially enzymes responsible for germination
and outgrowth of microbial spores.
In fact, the momentum transferring of implanted ion exerted an etching action
on organisms (YANG et al., 1995). Song and Wu (2000), using scanning Electron
Microscopy, have observed the etching effect of 20keV N
+
beam on cell surfaces of
Deinococcus radiodurans and Escherichia coli. The results showed that the etching
depth and zone, and the damaged degree of cells increased gradually with the
increase in implanted dose, and the cells' surface was avulsed gravely. Although the
interior damage and etched micro-holes could not be seen at low dose, there is no
doubt that implanted ion could also etch some micro-holes on the surface of cells and
penetrate into the interior and result in damage to cytoplasm. When implanted dose
increased continually, the damage to cells became more and more serious. Could ion
beam etch much more microholes on the cells' surface, while the cells' membrane
and/or wall could be struck into cracks and fragments and avulsion, cytoplasm would
be also damaged more seriously in this case. According to photographs taken, a
conclusion may be drawn that the "moment etching channels" would be formed due
to the action of a large number of successively implanted ion, and connected to DNA.
Therefore, DNA would be hit and damaged by successively implanted ion of high
dose.
Other experiment results also proved that the DNA of microbes and plants'
cells produced ssbDNA and dsbDNA by the action of a high dose ion injections, so
exposure to low energy ion beam could exert a direct action on DNA, leading to its
damage and mutation of organisms (SONG and WU, 2000).
230
Low energy ion beam as a new mutagenic approach has been used widely in
improving crops and modifying microbes breeding program since 1986 in China
(SONG and WU, 2000), and made considerable headway. For example, there have
been two varieties of double-cropping rice, one is early-season Indian rice named
S
9094
and the other is late-season Japanese rice named D
9095
, has been popularized
in Anhui province. Both varieties possess a higher grain yield, multi-disease
resistance and good quality (SONG and WU, 2000). In modifying industrial microbes,
some higher potency and stable strains have also been obtained (SONG and WU,
2000). Moreover, low energy ion irradiation is also being investigated for potential
application in cancer treatment (MATSUSHITA et al., 2006), bone and soft tissue
sarcomas (KAMADA et al., 2002), and sterilization procedures in the medical industry
(RABALLAND et al., 2008).
1.1 Electrons
The application of low-energy electrons was introduced in biological studies by
D. A. Wells, in 1929 (ZERMENO and COLE, 1969). Since then, low velocity or
partially penetrating electrons of various energies have been used by several
laboratories for the determination of the spatial localization of enzymes (PREISS,
1958; PREISS, 1959; PREISS and POLLARD, 1961) and radiosensitive structures in
micro-organisms (HASKINS, 1938; MOOS, 1951; DAVIS and HUTCHINSON, 1952;
DAVIS, 1954a,b; HUTCHINSON, 1955; KNAUSS, 1956; McREA, 1960; WILSON and
POLLARD, 1958; COLE and LANGLEY, 1963).The method was adapted for low-
voltage irradiation of fully hydrated specimens such as viral, bacterial, and
mammalian systems (COLE, 1961; COLE and LANGLEY, 1963; COLE et al.,1963;
COLE, 1965).
231
However, electrons are not the most suitable charged particles for use as
radiation probes, because their small mass lets them be strongly scattered in their
interactions with atoms (HUTCHINSON, 1955). The total range measured along the
actual track is about constant for all electrons of a given energy, but the many
sudden changes in direction mean that electrons diffuse different distances into
matter before being stopped. There will be a few electrons which, by chance, will be
very little deviated from the forward direction at any time, and will consequently
penetrate, at most, to a distance substantially the range of the electrons. In short,
radiation effects will be a maximum at the surface, and will drop off rapidly with
depth. Heavy charged particles such as protons, which are far less likely to be
deflected in collisions would make a better probe, but an electron beam is much
easier to obtain. When the concept of a radiation probe arose, the organisms under
consideration were viruses and bacterial spores. The dimensions of interest were
thus from tens up to thousands of Angstroms. From existing data, it was possible to
estimate that the electron beam energies needed were from hundreds to thousands
of volts. Before quantitative work could be done, it was first necessary to measure
the actual ranges in matter of electrons of these energies (HUTCHINSON, 1955).
Several measurements and calculations about the penetration of electrons into
different materials, biological system and water were performed in the past decades
and Table 1 provides some values obtained so far for different types of biological
materials and different energies.
Table 1.
The mechanism of bacterial inactivation by electron beam is not conclusively
known but it is widely believed that it is similar to other ionization radiations such as
232
gamma-ray or X-ray (CURRY et al., 2000; CLELAND et al., 2001; WATANABE,
2000). The fundamental difference, however, is that in case of electron beam the cell
inactivation is due to the highly energetic electrons whereas in the cases of gamma-
rays or X-rays the inactivation is due to the energetic photons (CHALISE et al.,
2004). In previous studies with cellular monolayers (COLE and LANGLEY, 1963;
COLE et al., 1963; ZERMENO and COLE, 1969; COLE et al., 1974), it was shown
that electron beams which penetrated only 0.10 to 0.33 the cell thickness (both
animal cells and microbial spores) were three to ten times more efficient in producing
killing, inactivation, or DNA breakage than were fully penetrating electron beams
(TOBLEMAN and COLE, 1974). An interpretation of these results was either that the
major radiosensitive sites were located on or very close to the nuclear membrane or
that the sensitive sites maybe more diffuse within the nucleus if an enhanced relative
biological effectiveness (RBE) of greater than 4 were found at electron track-ends
where the linear energy transfer (LET) approaches 40keV∙µm
-1
or greater
(TOBLEMAN and COLE, 1974).
Currently, the main bio-technologic application of electron irradiation is
decontamination of food (WAJE et al., 2009; SONG et al., 2009; CHALISE et al.,
2007; SMOLKO et at., 2005; CHALISE et al., 2004; JACZYNSKI and PARK, 2003;
CALENBERG et al., 1999). According to data from the U.S. General Accounting
Office (2000), USDA estimated that illness from food-borne pathogens resulted in
productivity losses and medical expenses at $37.1 and $23 billion, respectively. The
vast majority of these experiments use high-energy electrons with enhanced
penetration into matter, usually obtained from synchrotrons or linear accelerators.
However, low-energy electrons are very important to understand the physical
processes involved in the interaction of radiations with biological systems (STENN et
233
al., 1970; JOHNSON, 1972; LIN, 1974; NABBEN et al., 1982; BOUDAIFFA et al.,
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240
Figures
Figure 1. Optical micrographs (left) and electron micrographs (right) showing
Deinococcal cells (10
8
·ml
-1
) mixed with basalt (top) and sandstone (bottom) grains
(1.25g·µl
-1
).
241
Figure 2. Survival curves of D. radiodurans to irradiation with a proton beam at
200keV. NC = naked cells, SST = cells mixed with grains of sandstone, B = cells
mixed with grains of basalt, SID = cells mixed with crystalline forsterite, SIL = cells
mixed with amorphous forsterite.
242
Figure 3. Images from electron microscopy (SEM) of cells of D. radiodurans
irradiated (right) or not (left) with 200keV proton beam. Naked cells (top) and cells
mixed with grains of sandstone (middle) and basalt (bottom) are shown.
243
Figure 4. Survival curves of D. radiodurans in the absence (NC) or presence of grains
of sandstone or basalt (B or SST) irradiated with 4keV carbon ions (A) and 2keV
electrons (right).
A
B
244
Table 1. Measurements and calculations of ranges for different electron energies
applied to some materials, including biological systems and water.
Energy
(keV)
Track (µm)
Material
Reference
0.9
0.230
Bacillus subtilis spores
Hutchinson, 1955
3.5
0.400
Bacillus subtilis spores
Hutchinson, 1955
2.0
0.100
T2 bacteriophage
Cole and Langley, 1963
2.0
0.192
Plastic (colloidon)
Cole, 1969
2.0
0.250
Hamster cells
Zermeno and Cole, 1969
10.0
2.400
Water
Tobleman and Cole, 1974
2.0
0.100
Water
Laverne and Mozumder, 1983
2.0
0.200
Water
Meesungnoen et al., 2002
2.0
0.157
Water
Wilson et al., 2004
1.0
0.066
Water
Wilson et al., 2004
245
Table’s caption
Table 1. Measurements and calculations of ranges for different electron energies
applied to some materials, including biological systems and water.
246
APÊNDICE 3 – Artigo 2. Laboratory Simulation of interplanetary ultraviolet radiation
and its effects on Deinococcus radiodurans
Laboratory simulation of interplanetary ultraviolet radiation (broad
spectrum) and its effects on Deinococcus radiodurans
Ivan Gla
´
ucio Paulino-Lima
a,n
,Se
´
rgio Pilling
b,1
, Eduardo Janot-Pacheco
c
, Arnaldo Naves de Brito
b,2
,
Jo
~
ao Alexandre Ribeiro Gonc- alves Barbosa
b,3
, Alvaro Costa Leit
~
ao
a
, Claudia de Alencar Santos Lage
a
a
Instituto de Biofı
´
sica Carlos Chagas Filho, Avenida Carlos Chagas Filho, 373, Cidade Universita
´
ria, CEP 21941-902 Rio de Janeiro, RJ, Brazil
b
Laborato
´
rio Nacional de Luz Sı
´
ncrotron, Rua Giuseppe Ma
´
ximo Scolfaro, 10000, Po
´
lo II de Alta Tecnologia de Campinas, CEP 13083-970 Campinas, SP, Brazil
c
Instituto de Astronomia, Geofisica e Ciencias Atmosfericas, Rua do Mat
~
ao, 1226, Cidade Universita
´
ria, CEP 05508-900 S
~
ao Paulo, SP, Brazil
article info
Article history:
Received 27 December 2009
Received in revised form
11 April 2010
Accepted 13 April 2010
Available online 18 April 2010
Keywords:
Panspermia
Micro-shielding
Vacuum ultraviolet
Extremophile microorganisms
abstract
The radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans was exposed to a simulated interplanetary
UV radiation at the Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS). Bacterial samples we re irradiated on
different substrates to investigate the influence of surface relief on cell survival. The effects of cell
multi-layers were also investigated. The ratio of viable microorganisms re mained virtually the same
(average 2%) for integrated doses from 1.2 to 12 kJ m
À 2
, corresponding to 16 h of irradiation at most.
The asymptotic profiles of the curves, clearly connected to a shielding effect provided by multi-layering
cells on a cavitary substrate (carbon tape), means that the inactivation rate may not change significantly
along extended periods of exposure to radiation. Such high survival rates reinforce the possibility of an
interplanetary transfer of viable microbes.
& 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
The hypothesis predicting that living organisms may stand
viable and be transferred from one planet to another by means of
natural processes (panspermia) is still a matter of debate. It is
currently thought to be a process by which any living form, most
probably microbial in nature, survives the following three steps:
(i) the escape step, i.e. ejection of contaminated planetary
material towards space, normally caused by a large impact on
the parent planet; (ii) the journey in space through time scales
comparable with those experienced by the Martian meteorites
(estimated as 1–15 million years); and (iii) the landing process in
a manner to afford non-destructive deposition of the biological
material on a recipient planet (Horneck et al., 2003).
Escape and re-entry steps of this process are critical due to the
high amounts of energy to which organisms may be exposed
within a short period of time so recent studies have focused on
these steps (Burchell et al., 2004; Cockell et al., 2007; De la Torre
et al., 2009; Fajardo-Cavazos et al., 2009; Horneck et al., 2008;
M
¨
oeller et al., 2008; Stoffler et al., 2007). Various types of
microorganisms, such as bacterial or fungal spores and viruses, as
well as biomolecules, such as DNA, amino acids and liposomes,
have been exposed to selected and combined space conditions
outside Earth’s magnetic field (Apollo 16) or in low Earth orbit
onboard missions Spacelab 1, Spacelab D2, ERA on EURECA, LDEF,
BIOPAN on FOTON and EXPOSE on the International Space Station
(Olsson-Francis and Cockell, 2010). Extraterrestrial parameters,
such as high vacuum, intense solar ultraviolet radiation, different
components of the cosmic radiation field and temperature
extremes affected the genetic stability of the organisms in space,
leading to increased mutation rates, DNA damage and inactivation
(Horneck, 1999). Extraterrestrial solar ultraviolet (UV) radiation
was shown to be the most lethal factor to naked samples. When
shielded against the influx of solar UV, spores of Bacillus subtilis
survived for more than 5 years in space (Horneck et al., 1994).
Recently, Horneck et al. (2008) have tested the first step of the
panspermia hypothesis by exposing spores of B. subtilis , cells of
Chroococcidiopsis, and thalli and ascocarps of the lichen Xanthoria
elegans to shock pressures in the range 5 to $ 40 GPa. Their results
support the hypothesis that biological material could be success-
fully ejected from planets in a way that seeding of early Earth
might have ensued.
Saffary et al. (2002) exposed cells of Bacillus sp. and
Deinococcus radiodurans, one of the most radiation-resistant living
ARTICLE IN PRESS
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Planetary and Space Science
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n
Corresponding author. Tel.: +55 2125626577; fax: +55 2122808193.
E-mail address: [email protected] (I.G. Paulino-Lima).
1
Present address: Universidade do Vale do Paraı
´
ba, Avenida Shishima Hifumi,
2911, Urbanova, CEP 12244-000 S
~
ao Jose dos Campos, SP, Brazil.
2
Present address: Instituto de Fı
´
sica, Universidade de Brası
´
lia, Campus
Universita
´
rio Darcy Ribeiro, Asa Norte, CEP 70919-970 Brası
´
lia, DF, Brazil.
3
Present address: Po
´
s-Graduac-
~
ao em Ci
ˆ
encias Gen
ˆ
omicas e Biotecnologia,
Universidade Cato
´
lica de Brası
´
lia, SGAN 916, Mo
´
dulo C, Av. W5 Norte, Asa Norte,
CEP 70790-160 Brası
´
lia, DF, Brazil.
Planetary and Space Science 58 (2010) 1180–1187
ARTICLE IN PRESS
beings known to exist on Earth, to extreme ultraviolet (EUV)
radiation (
l
¼ 30.4 nm) during a rocket flight. The exposition to
EUV radiation decreased the survival of both organisms by an
extra order of magnitude below their desiccation tolerance. Since
this type of radiation strongly interacts with biological targets, the
authors attributed such inactivation to rely on superficial cellular
damages other than DNA, most likely on membrane and surface
proteins. On the other side, lichens were capable to fully restore
their colonization ability and photosynthetic activity after an
uninterrupted 16-day exposure to real outer space conditions in
the Biopan-5 facility (Sancho et al., 2007).
In view of the surprisingly positive results reported above in
support to the concept of panspermia, the critical re-entry step of
the process was solely addressed by the results of the ESA’s
STONE experiment (Cockell et al., 2007). These authors demon-
strated that the endolithic photosynthetic organism Chroococci-
diopsis sp. inoculated in a gneissic rock sample did not resist the
speedy re-entrance into the Earth atmosphere since extreme
heating reached down to $ 5 mm depth of the rock.
Shielding from deleterious ionizing radiation has been ex-
pected to provide viability of viruses, bacterial and fungal dried
spores, thus alleviating radiation-imposed constraints to any
putative interplanetary transfer step. Calculations by Mileikowsky
et al. (2000) have predicted that microorganisms such as D.
radiodurans and Bacillus sp. should be shielded against space
radiation inside rocks of the order of 0.33 m, to keep a viable
minimal population during time ranges suitable to afford Mars–
Earth interplanetary travel ($ 1 million years). Those authors also
consider that more than 1 billion fragments with temperatures
below 100 1C were ejected from Mars and landed on Earth
within the last 4 billion years. Early Earth has witnessed the
infall of about 10-fold more extraterrestrial matter during the
‘‘heavy bombardment’’ period. Indeed the $ 40 Martian
meteorites discovered so far on Earth represent a tiny fraction
of those imported from Mars during Earth’s history (Fritz et al.,
2005).
The discovery of Martian meteorites on Earth (Dreibus and
Wanke, 1985) implies that rock fragments can escape from
planetary bodies and that interplanetary transfer of matter is
possible to occur in the solar system (Okeefe and Ahrens, 1986).
At least five out of about 40 known Martian meteorites, might not
have experienced sterilizing temperatures during ejection from
Mars and re-entry into the Earth’s atmosphere (Shuster and
Weiss, 2005). However, it is still an open question whether living
beings could be transported between planets by means of such
fragments, withstanding the harsh in-between environment
(Table 1). It is tempting to think of the biological features of
microbial extremophilic species (Rothschild and Mancinelli, 2001)
as those necessary to cope with extraordinary environments as
those found in the interplanetary space.
The present study has focused on the harsh environment that
could challenge an extremophile microbe during the long time of
an interplanetary migration step of panspermia. Survival of D.
radiodurans to conditions similar to those present in the
interplanetary space was investigated in an experimental simula-
tion apparatus. It includes a synchrotron beamline equipped with
a toroidal grating monochromator (TGM) present at the Brazilian
Synchrotron (Cavasso Filho et al., 2007) and a vacuum chamber.
The TGM beam spectrum comprises the vacuum-ultraviolet (VUV)
down to the infrared (IR) region ranging between 0.1 and 21.6 eV
(
Fig. 2).
Additionally, exposure to a hydrogen lamp emitting a
strong Lyman-alpha photon flux (Ly-
a
, 10.2 eV,
l
¼ 121.6 nm) was
performed to evaluate the impact of this Sun’s intense VUV
emission on cell viability. Replicate experiments were performed
to test the viability of dehydrated non-sporeforming D. radio-
durans vegetative cells following several doses of radiation.
Comparative irradiances of TGM beamline and those at Earth
and Mars orbits are summarized in Table 2.
Table 1
Physical conditions prevailing in the interplanetary space and at low Earth orbit in comparison to the conditions cast in the simulated experimental setup (modified from
Nicholson et al., 2000).
Parameter Interplanetary space Low Earth orbit (r 500 km) TGM
Hydrogen lamp
Pressure (Pa) 10
À 14
10
À 6
–10
À 4a
10
À 5
–10
À 4
60
Irradiance (W m
À 2
)–
b
1360 0.22 16.34
c
Spectral range (nm) Continuum Continuum 57.6–12,900 121.6
Temperature (K) 4 4
b
Wide range
b
$ 295 $ 295
a
Values in Earth orbit depend on outgassing of the spacecraft.
b
Values differ depending on orientation and distance to the Sun.
c
Based on direct measurements of the narrow peak emission (121.6 nm) using photodiodes.
Table 2
Solar irradiances at Earth and Mars orbits in comparison to the TGM beamline.
Spectral ranges (nm) Earth solar constant (W m
À 2
)
a
Mars solar constant (W m
À 2
)
a
TGM (W m
À 2
)
b
Vacuum UV (57.6–200) 0.014 0.006 0.2000
UVC (200–280) 7.390 3.180 0.0098
UVB (280–315) 19.490 8.380 0.0022
UVA (315–400) 89.280 38.390 0.0031
Total UV (200–400) 116.16 49.950 0.0150
VIS (400–700) 520.28 223.73 0.0028
NIR (700–1100) 448.74 141.90 0.0007
MIR (1100–3000) 259.05 162.48 0.0006
Total IR (700–2500) 707.79 304.38 0.0014
Total irradiance (57.6–2500) 1344.2 578.06 0.2200
a
Based on Schuerger et al. (2003).
b
Based on direct measurements at TGM beamline using photodiodes.
I.G. Paulino-Lima et al. / Planetary and Space Science 58 (2010) 1180–1187 1181
ARTICLE IN PRESS
2. Methods
2.1. Sample preparation
Cultures of D. radiodurans R1 wild type and a recA670-deficient
strain were obtained at Instituto de Radioprotec-
~
ao e Dosimetria,
Rio de Janeiro, Brazil. They were cultivated in TGY broth—1.0%
tryptone, 0.6% yeast extract, 0.2% glucose (Anderson et al., 1956)
with shaking at 200 rpm (Innova 4080, New Brunswick Scientific,
Edison, NJ, USA), at 32 1C for 10 h, or until reach the early
stationary phase. After this period, the optical density at
l
¼ 600
nm (OD
600
) of the culture was spectrophotometrically measured
and an aliquot was taken for direct cell counting under the
microscope.
2.2. Synchrotron irradiation at the Toroidal grating monochromator
(TGM) beamline
Thirty-six circular carbon tape (Shinto Paint Co) with 5 mm in
diameter, covered or not by a polycarbonate filter smooth surface
were distributed on screws upraising from a hexagonal copper-
made sample holder core. After the estimation of the cell
concentration using a microscope, screws were loaded with 1
m
L
of the fresh culture each (up to 10
6
cells per sample in a
monolayer). Observation of the screws under scanning electron
microscopy confirmed that the optimized concentration of cells
resulted in a single layer (Fig. 1a). However, cells deposited on
rough surfaces could be multi-layered (Fig. 1b) or could be
shielded by surrounding matrix formed by organic material of the
culture medium (Fig. 1c). The sample holder was placed inside a
À 80 1C freezer for at least 30 min, following immediate exposure
to low vacuum (600 Pa) in a lyophilizer for at least 5 h. After this
period, the sample holder was aseptically transported to the
experimental hall of the LNLS where it was placed inside the
irradiation chamber at the TGM beamline workstation. The
available experimental assembly included a differential
pumping system that allowed the use of a neon filter to
attenuate the X-ray portion of the synchrotron radiation
spectrum (Fig. 2). The irradiation experiment was designed to
allow a complete triplicate assay in a single irradiation run, using
a rotary manipulator device to change sample positions.
Measurements of the photon flux were taken using a
photodiode and a golden grid to check for electrical current
variations in real-time. The chamber pressure was kept between
10
À 4
and 10
À 5
Pa during all experimental assays. Survival curves
were plotted for six different doses of irradiation plus the non-
irradiated control. Samples were exposed to 0, 1, 10, 50, 100, 500
and 1000 min of UV plus VUV (wavelength ranging between 57.6
and 400 nm), which resulted in integrated doses of (kJ m
À 2
)0,
0.012, 0.12, 0.6, 1.2, 6.0 and 12.0, respectively. All irradiation
assays were performed at room temperature. Cells were
reconstituted in TGY broth and the survival fraction was
determined according to their colony-forming ability. The
percentage values for survival have been calculated as follows:
(N
t
/N
0
) Â 100, where: N
t
is the number of colonies per aliquot
after the exposure time t, N
0
is the number of colonies per aliquot
of the non-irradiated culture. Detachment of cells from the
substrates after extreme dehydration, which also reflects some
loss of viability due to lyophilization and vacuum exposure
(between 20% and 50%) and were computed while scoring non-
irradiated controls (N
0
). For each irradiation experiment, N
0
was
fixed as the mean value of three replicates after lyophilization,
vacuum exposure and cell recovery.
Fig. 1. Cells deposited on substrates showing three different situations: (a) cell monolayer formed over Millipore filters; (b) carbon tape surface with typical cell clumps;
(c) cells embedded in a complex matrix of nutrients formed after extreme dehydration.
I.G. Paulino-Lima et al. / Planetary and Space Science 58 (2010) 1180–11871182
ARTICLE IN PRESS
2.3. Vacuum ultraviolet (VUV) inactivation assay using the hydrogen
(H) lamp
Early stationary phase cultures of D. radiodurans were filtered
on 25-mm-diameter and porosity of 0.45
m
m, polycarbonate
(smooth) surface. Observation of the filters under the microscope
confirmed that 10
8
cells per sample resulted in a single layer of
cells. Filters were fixed onto a metal sample holder, and the
control samples were exposed to the same conditions, except for
the irradiation. The sample holder was introduced inside the
vacuum chamber at a distance of 8.0 cm away from the light
source. The photon flux of the lamp (Opthos Instruments, Inc.),
measured using a photodiode, was 10
15
cm
À 2
s
À 1
(Fig. 2),
corresponding to an irradiance of 16.34 W m
À 2
, for an internal
atmosphere composed by 90% argon and 10% hydrogen at 60 Pa
(I/I
0
¼ 99.86%). Taking into account that biological effects of
radiation are cumulative, several doses were given by increasing
exposure times. To irradiate cells on the carbon tape (rough)
surface, early stationary phase cultures (OD
600
4 1.0) were
lyophilized and the resulting powder was spread onto circular
(25 mm in diameter) carbon tape, resulting in cell multi-layers.
Survival curves were plotted for seven different doses of
irradiation plus the non-irradiated control. Samples were exposed
at room temperature to 0, 1, 5, 13, 51, 105, 227 and 771 min of
Lyman-alpha radiation (10.2 eV), which resulted in doses of
(kJ m
À 2
) 0, 1, 5, 12.5, 50, 103, 223 and 756, respectively. After
the irradiation treatments, cells were reconstituted in TGY broth
and the OD
600
was measured. As the amount of powder varied
between the samples, and taking into account that optical density
reflects the number of cells, several OD
600
measurements were
performed for cell suspensions differing in turbidity. A calibration
curve was plotted correlating the initial OD600 for non-irradiated
samples to cell viability after recovery in medium (Fig. 3). It made
possible to estimate the expected N
0
for different reconstituted
powders differing in turbidity without knowing the initial
number of cells. After calculating the expected N
0
for all
samples, the percentage values of survival have been
determined according to their colony-forming ability, as
described for the synchrotron irradiation experiments.
3. Results
3.1. Synchrotron irradiation
The first experimental approach consisted in spreading
dehydrated cells (10
6
cells per sample) on two different surfaces
and exposing them to several doses of synchrotron radiation in
order to examine the influence of the substrate on cell survival.
The average roughness of the two surfaces was measured in a
perfilometer as 7
m
m for a rough carbon tape and 0.7
m
m for a
smooth Millipore filter. An inactivation curve entailing a two-
component behavior was observed, with an initial exponential
decrease followed by an asymptotic trend when cells were
deposited on the rough surface (Fig. 4). The ratio of viable
microorganisms remained virtually the same (average 2%) for
integrated doses from 1.2 to 12 kJ m
À 2
, consisting of up to 16 h of
uninterrupted irradiation. The asymptotic profile of the curve
means that the inactivation rate may not change significantly
along extended periods of exposure to radiation.
If the rough surface provided shielding to viable cells against
radiation, then it should be also effective in shadowing the
extremely radiation sensitive, recA670-deficient strain of D.
radiodurans. Indeed similar to what was observed for the wild-
type strain, an average 1% cells of the deficient strain was seen to
survive on the rough surface after exposition to up to 1.4 kJ m
À 2
Fig. 2. TGM beamline spectrum with the harmonic gas cutting-off energies above
21.6 eV. For comparison, the dot named ‘‘H’’ refers to the intensity of the Ly-
a
line
(
l¼ 121.6 nm) emitted from the hydrogen lamp used in this study.
Fig. 3. Calibration curve plotting the initial optical density and viability of cell
powder after sample rehydration.
Fig. 4. Survival curves of D. radiodurans deposited on surfaces with two different
levels of roughness (0.7 and $ 7
m
m) following several integrated doses of
synchrotron radiation. The white circles represents survival of the wild type strain
on a rough carbon tape; black squares, the same for the DNA repair deficient
recA670 strain of D. radiodurans and white triangles, wild type strain on the
smooth surface. The error bars represent one standard deviation determined for
each triplicate assay. Inset shows a better resolution for the points corresponding
to the lower doses.
I.G. Paulino-Lima et al. / Planetary and Space Science 58 (2010) 1180–1187 1183
ARTICLE IN PRESS
of synchrotron radiation (Fig. 4). However, these conclusions must
be drawn only for the exponential phase of the inactivation curve
of recA670 (see detail in Fig. 4) because it was not exposed to
higher doses due to beamtime constraints. When placed on the
smooth surface this extremely radiation sensitive strain was
annihilated by any tested dose.
The 7-
m
m cavities of the rough surface could cause layers of
bacterial cells to pile, with superficial dead cells providing
shielding to underneath ones which remained non-irradiated
(Fig. 1b). To have such possibility checked, different cell densities
were prepared by depositing 10
4
–10
7
cells per sample on the
carbon tape and irradiated at the same integrated dose of
0.6 kJ m
À 2
each. A clear enhancement of the survival rate was
seen when concentrations above 10
6
cells per sample were
irradiated ( Fig. 5). Thus dead cell layers near the surface seem to
be capable to shield underneath cells against UV and VUV
photons, with fluxes comparable to that found at Earth orbit
(Fig. 2).
3.2. Irradiation with hydrogen lamp (H lamp)
If arrival of bioactive material to any solar system’s planet
might have ever been possible, particularly relevant to the
panspermia hypothesis is the resistance to the intense VUV Ly-
a
emission line by the Sun. A Ly-
a
emitting H lamp of high photon
flux at
l
¼ 121.6 nm was used to determine cell survival. One-
hundred million (10
8
) cells were used in each assay. Even exposed
to radiation in multi-layers, doses greater than 50 kJ m
À 2
reduced
the viable cell population to values below the detection limit of
the method (near sterilization) when placed on the smooth
surface. On the other hand, the similar two-component behavior
was otherwise observed for inactivation by the TGM source was
seen in the case of H lamp if cells were deposited on the rough
surface (Fig. 6).
4. Discussion
We report the survival of the non-sporeforming radiation-
resistant bacteria Deinococcus radiodurans to synchrotron radia-
tion mimicking the solar spectrum if trapped into a porous carbon
tape and shielded by cell multi-layers surrounded by organic
matrix material (Fig. 4). D. radiodurans has already been tested
under several laboratory conditions and also assessed in space
conditions when the Exobiology and Radiation Assembly (ERA)
flew on the ESA’s Eureca mission. Dose et al. (1995a) reported that
although survival could not be scored due to storage conditions
before and after the mission, the amount of DNA double strand
breaks (DSB) per chromosome could be determined. If exposed to
solar light ( 4 170 nm; 4 Â 10
8
Jm
À 2
with respect to the range
from 175 to 340 nm) in layers of about 1.5 mm, only the upper
tenths on top 1 mm layer were affected, where more than 12 DSB
were found in comparison to 8 DSB for the dark control. Control
experiments have shown that D. radiodurans survives relatively
well (15–35% survival rates, depending on the strain) if kept in dry
argon for 17 months, but survival in humid argon (above 20%
relative humidity) is less than 0.01% when exposed for the same
period of time. Survival can be improved by up to 100% if the cells
are dried in the presence of organics (tryptone–yeast extract
medium).
Other microorganisms have also been tested in space. Accord-
ing to Dose et al. (1995b), monolayer of spores, fungal conidia or
vegetative cells (D. radiodurans) are extremely sensitive to space
conditions (vacuum and solar radiation). Multi-layers or macro-
scopic clusters, however, may resist for months or years, even if
exposed to full solar light. Although the top cell layers become
inactivated, they kept protecting interior cells from UV damage
and also partially from dehydration.
In the experiments reported in this paper, D. radiodurans
samples were exposed to vacuum and subjected to lyophilization,
which resembles a fast dehydration process that biological
material might undergo if ejected into space (Horneck et al.,
2003). Early-stationary phase cells were spread out on the
irradiation surfaces and lyophilized within nutrient liquid media
(Fig. 1c). Microorganisms are not usually in logarithmic growth in
the environment, and are often immersed in organic matter.
Sugars and polyalcohols are known to help stabilize the structure
of cellular macromolecules during vacuum-induced dehydration
(Horneck et al., 2003), which could have contributed to the high
survival rates observed in our experiments. In fact, the lyophiliza-
tion process may lead to physical alterations similar to water loss
during a process of mass ejection into space. Under such
conditions, metabolizing cells are unlike to occur in the space
environment and cellular repair mechanisms would not take
place unless they re-entry a watery environment.
Fig. 5. Influence of cell concentration on the survival rate after 0.6 kJ m
À 2
exposure to VUV–UV radiation. Samples consisting of 10
4
,5Â 10
4
,10
5
,5Â 10
5
,
10
6
,5Â 10
6
and 10
7
cells
m
L
À 1
per exposed surface have been irradiated with
synchrotron light. Note that piling up multiple layers (above 10
6
) cause a sharp
increase in cell survival. The error bars represent one standard deviation
determined for each triplicate assay.
Fig. 6. Survival curves of wild-type D. radiodurans retrieved from surfaces with
average cavities of 0.7
m
m (smooth Millipore filter) or 7
m
m (rough carbon tape)
after irradiation with a Ly-
a
-emitting hydrogen lamp (l¼ 121.6 nm). The error
bars represent one standard deviation determined for each triplicate assay.
I.G. Paulino-Lima et al. / Planetary and Space Science 58 (2010) 1180–11871184
ARTICLE IN PRESS
Comparing effects of the integrated doses from the two
radiation sources, 1% cell survival was attained after exposition
to 2 kJ m
À 2
of synchrotron radiation or 1000 kJ m
À 2
monochro-
matic Ly-
a
emission. Because different biomolecules have
different absorption bands, it is expected that the wider TGM
emission spectra will impact more cell targets and viability.
Moreover, Ly-
a
irradiance from the source used here was a
thousand times stronger than present solar Ly-
a
at Earth orbit,
which is 0.01 J m
À 2
s
À 1
(Floyd et al., 2004). Yet cells were shown
to be shielded even from such acute irradiation. This result
suggests that micro-sized particles could prevent extremophilic
microorganism from accumulating UV radiation damage. In
agreement with our results, Osman et al. (2008) observed
significant survival of spore-forming bacteria after irradiation
with full spectrum Martian UV irradiation if shielded by micro soil
particles (o 60
m
m) from the Atacama Desert. In addition, Pogoda
de la Vega et al. (2007) have found that even nano-particles can
afford survival of D. radiodurans upon UV irradiation under
simulated Martian conditions.
In our experiments the fluxes of vacuum ultraviolet were
much higher than those found in the interplanetary environment.
Considering that dehydrated cells are metabolically inactive,
dissimilar, unnatural dose rates are not expected to impact
survival. In respect to this, fungal cells of Neurospora sp. irradiated
in liquid culture at room temperature displayed 4-fold many
mutants after acute UV in comparison to the same dose given at
chronic rates (Stadler and Macleod, 1984). Interestingly, chronic
UV at 01 incidence on the sample resulted in as many mutations
as acute UV (Stadler and Macleod, 1984). Active repair during
liquid holding at 22 1C was thought to prevent mutations to
appear. For non-metabolizing cells it is therefore not expected
that differences in mutation or survival rates may occur after the
same total dose given either acute or chronically. Unfortunately,
there is lack of experimental data about dose-rate effects on non-
metabolizing cells.
As particular targets concerning recovery of genetic material
after radiation, proteins belonging to DNA repair machinery were
proven to critically affect cellular sensitivity following physical
and chemical DNA damage (Daly et al., 2007). This is particularly
true for longer UV wavelengths, which are known to overproduce
free radicals by photoionization and photodissociation of water,
the cell’s main component. This situation was minimized in the
present experimental setup with cells previously dehydrated and
maintained in such state along the procedures allowing most
proteins to be kept potentially active.
Considering that intact cells are exposed, Ito et al. (1980)
remark that the penetrability of VUV radiation appears to be the
key factor in determining the distribution pattern of damages.
Accordingly, Munakata and Ito (1979) have found that sufficient
synchrotron broad-band VUV light reaches Bacillus spores genetic
material to induce mutation and killing. Nucleic acids were shown
to be far-UV chromophores in Streptomyces conidia by Jagger et al.
(1967). Altogether those data agree with physical estimates of the
penetration depth of the VUV light (Wilkinson and Johnston,
1950; Watanabe and Zelikoff, 1953; Sowers et al., 1972), although
no VUV chromophore could be identified so far.
The occurring extreme low temperatures and dehydration in
the interplanetary space are conceivably protective regarding the
formation of free radicals from water molecules. Noteworthy,
microorganisms such as D. radiodurans and B. subtillis were shown
to better survive UV if irradiated under extreme low temperatures
relatively to the survival rates following irradiation under room
temperature (Weber and Greenberg, 1985; Ashwood et al., 1968).
Results of Weber and Greenberg (1985) showing increased UV–
VUV survival of B. subtilis spores in low temperature and vacuum
lend support to these conclusions.
The ability of extremophile microorganisms to thrive in
extreme environmental conditions, such as high and low
temperatures, desiccation, radiation, pressure and pH strengthens
the probability that they could as well survive transport through
the interplanetary (Horneck et al., 2008 ) or even the interstellar
medium (Valtonen et al., 2009).
Extra-solar dust particles have been detected in the solar
system by space probes (Frisch et al., 1999) and larger extra-solar
meteoroids (5–35
m
m) have most likely been detected in the
upper Earth atmosphere by meteor-tracking radar facilities
(Baggaley et al., 1994). Because of the small dimensions of these
meteoroids, the bystander effects of high-energy charged (HZE)
particles caused by the production of secondary electrons, shock
waves or thermophysical events would probably be far less than
those occurring in larger meteoroids. Therefore, hypothetical
microbes within them would be mostly inactivated by direct hits.
However, because of their low flux (e.g., 1 Fe ion per
m
m
2
per 10
5
–
10
6
years), it is predictable that damages may be localized to
superficial layers, and few microorganisms would suffer hits
within time scales of an interplanetary journey (Horneck et al.,
2010).
Theoretical models of temperature variation alongside differ-
ent altitudes above Earth atmosphere indicate that 10
m
m
diameter particles can withstand rapid deceleration without
significant ablation (Coulson, 2004). In fact, Duprat et al. (2007)
recovered highly friable micrometeorites from surface snow
layers near the French–Italian station CONCORDIA in Antarctica,
suggesting that those particles have experienced non-sterilizing
heating upon atmospheric entry. Moreover, experimental evi-
dence shows that small particles containing bacteria can survive
the temperature regimens imposed during entry into Earth’s
lower atmosphere (Coulson, 2004).
The mechanisms by which microorganisms might infect
interstellar dust particles are unknown. However, Napier (2004)
suggests that boulders ejected putative life-bearing planets in the
galaxy may be destroyed through erosion and fragmentation by
impacting zodiacal light dust particles. Within less than a few
thousand years, the fragmentation process leads to meteoroids of
micrometer size that are ejected from the planetary system by
radiation pressure. He estimates that about (10
14
) life-bearing
particles originating from the Earth leave the Solar system per
year. To avoid the long travel times to other planetary systems,
Napier (2004) suggests that contamination in fact occurs when
the Sun passes through molecular clouds in the galaxy. Proto-
planetary-forming systems within them will thus receive a
certain number of Earth-born microorganisms. Supposing that
the ejection mechanism occurs in all planetary systems harboring
microbial life, Earth could have been in turn seeded from
elsewhere. However, we should keep in mind that these numbers
are highly arguable because the number of life-bearing rocks
ejected into the solar system is actually unknown, as it is the
density of living organisms within those rocks, their location
relative to the surface, the erosive potential of micrometeorites on
these rocks, etc.
The Sun and its accompanying planetary system were
formed about 4.5 billion years ago. It has been shown to
travel around the galactic center in a rough circular orbit
with a linear rotation speed slightly greater than the local
co-rotation speed. Thanks to such movement, each $ 70–140
million years the solar system traverses a spiral arm containing
dense (nZ 10
4
cm
À 3
) interstellar clouds. Since its formation,
the solar system has thus probably crossed tens of times
such regions of much higher stellar and gas density. The flux of
solid material arriving on Earth from nearby stars at the present
distances was calculated in detail by Murray et al. (2004).
They examined three possible sources of large extra-solar
I.G. Paulino-Lima et al. / Planetary and Space Science 58 (2010) 1180–1187 1185
ARTICLE IN PRESS
meteoroids: Asymptotic Giant Branch stars (AGB), Young Stellar
Objects (YSOs) and debris disks. Fluxes from AGB are the strongest
ones arriving on Earth, approaching 8 particles yr
À 1
km
À 2
. The
flux of dust and gas of extra-solar origin arriving on top of
terrestrial atmosphere will increase by many orders of magnitude
at each crossing of the sun through a spiral arm. The local density
of stars in the solar neighborhood will also be increased by a
factor up to ten.
An interesting possibility that extends the panspermia concept
is enhanced from the discussion presented in this paper. Microbes
from other places in the galaxy could benefit of the shielding
effect operated by microparticulate material against UV–VUV
radiation of the interplanetary space. As a matter of fact, living
organisms could have more intensively seeded Earth during
crossings of the solar system through dense galactic regions
because of shorter times required for any organism to reach Earth.
This process could thus advantageously overcome the following
issues considered in the lithopanspermia theory: (i) intense
heating during atmospheric entry, (ii) radioactive decay of heavy
elements present in large rocks and (iii) the bystander effects of
HZE particle radiation. Further experiments are currently being
performed in order to address the effects of ionizing radiation
(electromagnetic and charged particles) on radio-resistant mi-
crobes under this micro-shielding scenario.
Authors’ contributions:
I.G.P.L. collected, processed and analyzed data, was involved in
study design and wrote the manuscript; S.P. was involved in the
experimental design, collected and processed data. E.J.P. was
involved in data analysis and proposed the astronomical meaning
to the primary data; A.N.B., J.A.R.G and A.A.C.L. were involved in
advising experimental details and data analysis, provided the
facilities and contributed equally to the study. C.A.S.L. designed
the study, was involved in data analysis and revised the manu-
script. All authors discussed the results and commented on the
manuscript.
Acknowledgements
We thank Dr. Carlos Eduardo Bonacossa de Almeida (IRD/RJ)
for having kindly provided bacterial strains, Dr. Diana Paula
Andrade Pilling Guapyassu
´
de Oliveira for helping data acquisi-
tion, Dr. Douglas Galante for his comments on the manuscript and
Dr. Gordon Imlach from Department of Life Sciences, Open
University, Milton Keynes, United Kingdom for producing the
Scanning Electron Microscopy images. We also thank the Instituto
de Biofı
´
sica Carlos Chagas Filho (IBCCF/UFRJ) for intellectual and
financial contributions, the faculty from the Departamento de
Fı
´
sica from the Pontifı
´
cia Universidade Catolica do Rio de Janeiro
(PUC/RJ) for managing the hydrogen lamp, Conselho Nacional de
Desenvolvimento Cientı
´
fico e Tecnolo
´
gico (CNPq) for providing
I.G. Paulino-Lima’s Ph.D. student fellowship and Fundac-
~
ao de
Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) for
research grants. This work was also partially supported by the
Brazilian institution Laborato
´
rio Nacional de Luz Sı
´
ncrotron
(LNLS), Brazil, which also provided the facility and staff super-
vision to conduct the main experimental part of this work.
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