( PDF ) Análise da complementação das funções de mobilização do plasmídeo bacteriocinogênico pRJ9 de Staphylococcus aureus pelo gene mobD

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Análise da Complementação das Funções de

Mobilização do Plasmídeo Bacteriocinogênico pRJ9 de

Staphylococcus aureus pelo Gene mobD

Bruna Gonçalves Coutinho

2010

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Análise da Complementação das Funções de Mobilização do

Plasmídeo Bacteriocinogênico pRJ9 de Staphylococcus aureus

pelo Gene mobD

Bruna Gonçalves Coutinho

Orientador: Maria do Carmo de Freire Bastos

Colaborador: Marcus Lívio Varella Coelho

Rio de Janeiro

Setembro de 2010

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Paulo de

Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como

parte dos requisitos necessários à obtenção do título de

Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia)

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iii

FOLHA DE APROVAÇÃO

ANÁLISE DA COMPLEMENTAÇÃO DAS FUNÇÕES DE MOBILIZAÇÃO DO

PLASMÍDEO BACTERIOCINOGÊNICO pRJ9 DE Staphylococcus aureus PELO GENE

mobD

Bruna Gonçalves Coutinho

Marcus Lívio Varella Coelho e Maria do Carmo de Freire Bastos

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de

Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em

Ciências Biológicas.

Aprovada por:

(Márcia Giambiagi-de-Marval, Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, UFRJ)

(Walter Martin Roland Oelemann, Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, UFRJ)

(Ana Beatriz Furlanetto Pacheco, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ)

(Marinella Silva Laport, Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, UFRJ)

Rio de Janeiro

Setembro de 2010

FICHA CATALOGRÁFICA

Coutinho, Bruna Gonçalves.

Análise da complementação das funções de mobilização do plasmídeo

bacteriocinogênico pRJ9 de Staphylococcus aureus pelo gene mobD/ Bruna

Gonçalves Coutinho - Rio de Janeiro, UFRJ/IMPPG, 2010.

xviii; 89p.

Orientador: Maria do Carmo de Freire Bastos/ Colaborador: Marcus Lívio Varella

Coelho

Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas)

Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Microbiologia Paulo de Góes,

2010.

Referências bibliográficas: 76-89.

1. Mobilização plasmideal 2. Conjugação bacteriana 3. Staphylococcus aureus

4. Bacteriocinas 5. Plasmídeos

I. Coelho, Marcus Lívio Varella e Bastos, Maria do Carmo de Freire.

II. UFRJ. Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Mestrado em Ciências Biológicas.

III. Análise da complementação das funções de mobilização do plasmídeo

bacteriocinogênico pRJ9 de Staphylococcus aureus pelo gene mobD

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Genética Molecular, Departamento de

Microbiologia Geral, Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Centro de Ciências da Saúde

(CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação da Prof.ª Maria do Carmo de

Freire Bastos e Colaboração de Marcus Lívio Varella Coelho (MSc.)

AGRADECIMENTOS

“A alegria está na luta, na tentativa, no sofrimento

envolvido. Não na vitória propriamente dita.”

Mahatma Gandhi

Esta conquista não é só minha, é de todas aquelas pessoas que caminharam ao meu

lado, que me incentivaram, que me fizeram crescer, que me escutaram, me serviram de ombro

ou apenas me sorriram. Nenhum sucesso teria sido alcançado sem elas.

Primeiramente, gostaria de agradecer aos meus pais Suzana e Paulo, que nunca

pouparam esforços para estarem sempre presentes, cobrindo meu mundo de amor e carinho. A

união, a dedicação e a força de vocês servirão sempre de exemplo para mim e serão sempre

meu porto-seguro. Obrigada por me fornecerem todas as ferramentas necessárias para que eu

chegue aonde quiser. Amo vocês!

Ao meu irmão Daniel, por ser antes de tudo, um amigo em quem posso confiar e com

quem posso contar. Obrigada por me apoiar sempre, e por me deixar participar da sua nova

vida.

À minha irmã Raquel, que, apesar de não estar mais ao meu lado, tenho certeza que

ainda me escuta toda noite, me apoia, me incentiva e me dá forças para seguir em frente,

como fazia antigamente. Você sempre estará na minha vida e no meu coração. Amo-a pra

sempre.

A toda a minha família, pelo amor e carinho que sempre nos dedicaram,

incondicionalmente. Vocês são a nossa fortaleza. Obrigada por tudo!

Ao meu namorado Daniel, por estar sempre ao meu lado, por me fazer rir, por me

permitir chorar, pelo amor sempre atencioso e verdadeiro, por me entender e me apoiar em

todos os momentos. Sua companhia torna esta jornada muito mais feliz!

Ao amigo Marcus, pelo tanto que aprendi e cresci ao lado dele, pela paciência sem

limites, pela facilidade com que consegue me fazer sorrir, por me escutar e me compreender,

sem eu precisar falar nada, pelo carinho e pela força que me passa com um só abraço. Sua

amizade é especial e inesquecível. Obrigada por tudo!

À minha orientadora, professora Maria do Carmo, por ser este exemplo de pessoa e

profissional, com quem sempre se pode contar, por estar sempre presente apoiando,

aconselhando e mostrando o melhor caminho. Obrigada pelo carinho, pelos ensinamentos

valiosos e pelo crescimento pessoal e profissional que você me proporcionou.

vii

Às amigas do Laboratório de Genética Molecular Andreza, Danielly, Patrícia, Karlla,

Amina, Hilana, Ilana, Juliana e Luana que fizeram tudo parecer tão fácil e divertido, estando

sempre dispostas a ajudar, ensinar, escutar e aconselhar. Vocês são pessoas especiais, por

quem eu tenho um enorme carinho e uma profunda admiração. O convívio com vocês

alegrava os meus dias e essa amizade irá comigo aonde quer que eu vá. Obrigada por tudo!

À amiga Raíssa, que tem iluminado a minha vida há vinte anos, por estar presente em

todos os momentos, por me ouvir a qualquer hora com toda atenção e carinho, pela sua

sinceridade e lealdade, por ser uma irmã, mãe, filha, amiga. Obrigada sempre!

Aos amigos Nathalia, Fernanda, Alexandre e Felipe, pela amizade verdadeira, pelo

companheirismo, pelos encontros que sempre levam a piadas, brincadeiras, mas também a

conversas filosóficas e cheias de cultura, que a gente nunca sabe onde aprendeu. Mas quero

agradecer, principalmente, pela alegria que se estampa no meu rosto sempre que vocês estão

por perto. Obrigada!

Aos amigos Flavinha, Bruninho, Mateus e Dudu, por, ainda hoje, estarem presentes na

minha vida, apesar de todos os desencontros. Esta amizade, que começou antes mesmo de eu

poder lembrar, contribuiu muito para a pessoa que eu me tornei. O carinho e a cumplicidade

que sempre tivemos, encheu a minha infância de felicidade e, hoje, me conforta e me

tranquiliza. Vocês são maravilhosos.

Aos excluídos et al., que, mesmo após o fim da graduação, permaneceram unidos.

Obrigada por sempre se esforçarem para estarmos juntos, por todas as conversas sem sentido,

pelas viagens sempre inesquecíveis, por todos os churrascos e macarronascos, pelas festas,

pelos risos descontrolados, pelas fotos no espelho e, principalmente, pela vontade enorme de

estarmos sempre juntos.

Ao CNPq, ao PRONEX e à FAPERJ, pelo apoio financeiro dado ao laboratório.

À CAPES, pela bolsa de mestrado concedida a mim.

“(...) Depois de um tempo você aprende que verdadeiras amizades continuam a crescer,

mesmo a longas distâncias. E o que importa não é o que você tem na vida, mas quem

você tem na vida. (...)”

William Shakespeare

viii

RESUMO

ANÁLISE DA COMPLEMENTAÇÃO DAS FUNÇÕES DE

MOBILIZAÇÃO DO PLASMÍDEO BACTERIOCINOGÊNICO pRJ9 DE

Staphylococcus aureus PELO GENE mobD

Bruna Gonçalves Coutinho

Marcus Lívio Varella Coelho e Maria do Carmo de Freire Bastos

Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de

Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em

Ciências Biológicas.

O pRJ9 (10,4 kb) é um plasmídeo bacteriocinogênico que codifica a aureocina A53. Este

plasmídeo está originalmente presente na estirpe Staphylococcus aureus A53, que foi isolada

de leite comercial, juntamente com outras estirpes de S. aureus, também produtoras de

bacteriocina, como a aureocina A70, codificada pelo pRJ6 (7,9 kb). Esses dois plasmídeos

apresentam uma grande região de homologia, onde estão presentes os genes associados a

processos de mobilização plasmideal. Entretanto, o pRJ6 apresenta quatro genes mob (mobA,

mobB, mobC e mobD), enquanto o pRJ9 possui apenas três (mobA, mobB e mobC). Quando

os produtos destes genes foram comparados entre si, pôde-se observar uma similaridade de

mais de 90% para cada proteína. Além disso, foi possível encontrar, na sequência do pRJ9,

uma provável região oriT, praticamente idêntica à encontrada para o pRJ6. Contudo, em

experimentos anteriores, apenas foi possível se detectar a mobilização do pRJ6 e não do pRJ9.

Neste estudo, a transcrição dos genes mob do plasmídeo pRJ9 foi comprovada por

experimentos de RT-PCR, que revelaram ainda, que os genes mob neste plasmídeo são

transcritos como um operon. Para se verificar se as funções Mob do pRJ9 eram passíveis de

complementação in trans pelas funções Mob do pRJ6, foram realizados experimentos de

conjugação, utilizando-se, como doadora, uma estirpe de S. aureus possuidora dos plasmídeos

pRJ6, pRJ9::Tn551 (pRJ14) e do plasmídeo conjugativo pGO1. Estes experimentos

mostraram que o pRJ9 se torna mobilizável na presença do pRJ6. Uma vez que as regiões

oriTs encontradas nestes dois plasmídeos apresentam alta identidade, a provável região oriT

do plasmídeo pRJ9 foi clonada em um vetor de S. aureus, dando origem ao plasmídeo pRJ98,

que foi utilizado em experimentos de conjugação, na presença do plasmídeo pRJ6. Os

resultados destes experimentos mostraram que as funções Mob codificadas pelo pRJ6 são

capazes de reconhecer a região oriT do pRJ9, mobilizando o plasmídeo pRJ98, o que

comprovou a funcionalidade da região oriT do pRJ9. Como a única diferença significativa

encontrada nas regiões mob dos plasmídeos pRJ6 e pRJ9 é a presença do gene mobD no

primeiro, acreditava--se que a ausência deste gene no pRJ9 era a responsável pela

incapacidade de mobilização deste plasmídeo. Por este motivo, o gene mobD foi clonado em

um vetor de S. aureus e esta construção foi inserida em uma estirpe possuidora dos

plasmídeos pRJ14 e pGO1. Experimentos de conjugação com esta estirpe revelaram que,

mesmo na presença da proteína MobD, o plasmídeo pRJ9 não se torna mobilizável, indicando

que a ausência do gene mobD não é a responsável pela incapacidade de mobilização do pRJ9.

Estudos anteriores com o pRJ6 indicaram uma possível participação do gene aurT na

mobilização deste plasmídeo, uma vez que a inserção de um transpóson neste gene tornava o

plasmídeo incapaz de se mobilizar. O gene aurT codifica um transportador do tipo ABC,

nunca antes descrito como envolvido em mobilização plasmideal. O plasmídeo pRJ9 não

apresenta nenhum gene que codifique um transportador com uma estrutura semelhante.

Portanto, é necessário se investigar a participação deste gene na mobilização destes dois

plasmídeos.

Palavras-chave: mobilização plasmideal, conjugação bacteriana, Staphylococcus spp.,

bacteriocinas, plasmídeos.

Rio de Janeiro

Setembro de 2010

ABSTRACT

ANALYSES OF THE COMPLEMENTATION OF THE MOBILIZATION

FUNCTIONS OF THE BACTERIOCINOGENIC PLASMID pRJ9 FROM

Staphylococcus aureus BY THE mobD gene

Bruna Gonçalves Coutinho

Marcus Lívio Varella Coelho e Maria do Carmo de Freire Bastos

Abstract da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de

Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em

Ciências Biológicas.

The pRJ9 (10.4 kb) is a bacteriocinogenic plasmid encoding aureocin A53. This plasmid is

present in the strain S. aureus A53, which was isolated from commercial milk, along with

other strains of S. aureus, also producing bacteriocin, such as aureocin A70, encoded by pRJ6

(7.9 kb). These two plasmids have a large region of homology, where genes associated with

plasmid mobilization were found. However, pRJ6 has four mob genes (mobC, mobD, mobA

and mobB), while pRJ9 has only three (mobA, mobC and mobB). When the products of these

genes were compared, a similarity of more than 90% could be observed for each protein.

Furthermore, it was found, in the sequence of pRJ9, a putative oriT region almost identical to

that of pRJ6. However, in previous experiments, mobilization was only detected for plasmid

pRJ6 but not for pRJ9. In this study, the transcription of the mob genes from plasmid pRJ9

was confirmed by RT-PCR. These experiments also revealed that the mob genes in this

plasmid are transcribed as an operon. To test if the Mob functions of pRJ9 could be

complemented in trans by the Mob functions of pRJ6, conjugation experiments were

performed, using as donor a strain of S. aureus carrying the plasmids pRJ6, pRJ9::Tn551

(pRJ14) and the conjugative plasmid pGO1. These experiments showed that pRJ9 becomes

mobilized in the presence of pRJ6. Since the oriT regions found in these two plasmids have

high identity, the putative oriT region of plasmid pRJ9 was cloned into a S. aureus vector,

giving rise to plasmid pRJ98, which was used in conjugation experiments in the presence of

plasmid pRJ6. The results of these experiments showed that Mob functions encoded by pRJ6

are able to recognize the oriT region of pRJ9, mobilizing the plasmid pRJ98, which confirmed

the functionality of the oriT region of pRJ9. As the only significant difference found in the

mob regions of plasmids pRJ6 and pRJ9 is the presence of gene mobD in the former, it was

believed that the absence of this gene in pRJ9 was responsible for the lack of mobilization of

this plasmid. For this reason, the mobD gene was cloned into a S. aureus vector and this

plasmid was inserted into a strain possessing the plasmids pRJ14 and pGO1. Conjugation

experiments with this strain revealed that, even in the presence of protein MobD, the plasmid

pRJ9 does not become mobilized, indicating that the absence of mobD gene is not responsible

for the lack of mobilization of pRJ9. Previous studies with pRJ6 indicated a possible role for

the aurT gene in the mobilization of this plasmid since the insertion of a transposon in this

gene made the plasmid unable to mobilize. The aurT gene encodes an ABC transporter that

was never found to be involved in plasmid mobilization before. The plasmid pRJ9 does not

encode an ABC transporter with a similar structure to that of AurT. So it is necessary to

investigate the involvement of aurT in the mobilization of these two plasmids.

Key-words: plasmid mobilization, bacterial conjugation, Staphylococcus spp., bacteriocins,

plasmids

Rio de Janeiro

Setembro de 2010

xii

ÍNDICE

RESUMO

viii

ABSTRACT

1 – INTRODUÇÃO

1.1 - Gênero Staphylococcus

1.1.1 - Características gerais

1.1.2 - Staphylococcus coagulase-positivos

1.1.3 - Staphylococcus coagulase-negativos

1.2 – Bacteriocinas

1.2.1 - Características gerais

1.2.2 - Potencial de uso das bacteriocinas

1.2.3 - Bacteriocinas produzidas por Staphylococcus

1.2.4 - Bacteriocinas produzidas por estirpes de S. aureus, estudadas em nosso

laboratório

1.3 - Conjugação Bacteriana

1.3.1 - Características gerais

1.3.2 - Modelos de sistemas conjugativos

1.3.2.1 - Formação do relaxossomo

1.3.2.2 - Formação do contato celular e transferência da fita T

2 – OBJETIVOS

2.1 - Objetivos gerais

2.2 - Objetivos específicos

3 - MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 - Estirpes bacterianas e condições de cultivo

3.2 - Confirmação da transcrição dos genes mob por experimentos de RT-PCR

3.2.1 - Extração de RNA da estirpe S. aureus A53

3.2.2 - Tratamento da preparação de RNA com DNase I

3.2.3 - RT-PCR realizada com o RNA extraído da estirpe S. aureus A53

xiii

3.3 - Construção de uma estirpe de S. aureus possuidora dos plasmídeos pRJ14, pRJ6 e

pGO1 por experimentos de conjugação

3.3.1 - Extração de DNA plasmideal de Staphylococcus spp.

3.3.2 - Eletroforese de DNA em gel de agarose

3.4 - Seleção da estirpe receptora para os experimentos de conjugação com a estirpe S.

aureus MB367

3.4.1 - Obtenção de mutantes espontâneos resistentes à rifampicina e ao ácido

fusídico

3.5 - Conjugação entre as estirpes S. aureus MB367 e MB374

3.6 - Análise dos transconjugantes Em

, Rif

, Fus

3.6.1 - Teste da resistência dos transconjugantes à Gm

3.6.2 - Teste da produção de bacteriocina pelos transconjugantes

3.6.3 - Extração de DNA plasmideal dos transconjugantes e EGA

3.7 - Clonagem da provável região oriT do plasmídeo pRJ9 no vetor de S. aureus pCN37

3.7.1 - Extração de DNA plasmideal da estirpe S. aureus A53, que contém o

plasmídeo pRJ9

3.7.2 - Amplificação da provável região oriT do plasmídeo pRJ9

3.7.3 - Purificação do produto da PCR

3.7.4 - Quantificação das soluções de DNA por comparação com o padrão "-

HindIII"

3.7.5 - Ligação do fragmento amplificado ao vetor pGEM

-T Easy

3.7.6 - Preparação das células termocompetentes de E. coli

3.7.7 - Transformação das células competentes de E. coli com o produto da ligação

3.7.8 - Extração de DNA plasmideal de E. coli

3.7.9 - Sequenciamento dos clones de E. coli contendo a provável região oriT do

plasmídeo pRJ9 inserida no vetor pGEM

-Teasy

3.7.10 - Análise das sequências de DNA obtidas usando-se o programa ClustalX

3.7.11 - Extração de DNA da estirpe E. coli Ec111 contendo o plasmídeo pCN37

3.7.12 - Digestão do DNA dos plasmídeos pCN37 e pRJ93

3.7.13 - Eluição do DNA da agarose

3.7.14 - Tratamento do produto da digestão do pCN37 com fenol:clorofórmio-álcool

isoamílico

3.7.15 - Ligação do fragmento oriT ao plasmídeo pCN37

xiv

3.7.16 - Tratamento do produto da ligação com álcool isobutílico

3.7.17 - Preparo de células eletrocompetentes e transformação de S. aureus com o

produto da ligação

3.7.18 - Análise dos transformantes de S. aureus com o produto da ligação do

fragmento oriT ao plasmídeo pCN37

3.8 - Transferência dos plasmídeos pRJ98 e pCN37 para a estirpe S. aureus A70 e do

plasmídeo pRJ98 para a estirpe S. aureus MB108

3.8.1 - Propagação do fago 80α nas estirpes S. aureus MB429 e MB387

3.8.2 - Transdução dos plasmídeos pRJ98 e pCN37 com o fago 80α para a estirpe S.

aureus A70 e do plasmídeo pRJ98 para a estirpe S. aureus MB108

3.9 - Transferência do plasmídeo conjugativo pGO1 por experimentos de conjugação

para as estirpes geradas

3.10 - Experimentos de conjugação utilizando-se as estirpes S. aureus MB464, MB465 e

MB476 como doadoras

3.11 - Clonagem do gene mobD do plasmídeo pRJ6 no vetor de S. aureus pT181mcs

3.11.1 - Amplificação do gene mobD do plasmídeo pRJ6

3.11.2 - Digestão do DNA do vetor pT181mcs e do amplicon mobD

3.11.3 - Ligação do fragmento mobD ao vetor pT181mcs

3.11.4 - Transformação de S. aureus com o produto da ligação

3.11.5 - Sequenciamento do fragmento mobD inserido no pRJ107

3.12 - Transferência do plasmídeo pRJ107 para a estirpe S. aureus MB126

3.13 - Confirmação da transcrição do gene mobD no plasmídeo pRJ107 por

experimentos de RT-PCR

3.14 - Experimentos de conjugação utilizando-se a estirpe S. aureus MB491 como

doadora

4 – RESULTADOS

4.1 - Confirmação da transcrição dos genes mob por experimentos de RT-PCR

4.2 - Construção da estirpe heteroplasmideal S. aureus MB367

4.3 - Seleção da estirpe receptora para os experimentos de conjugação com a estirpe S.

aureus MB367

4.4 - Conjugação entre as estirpes S. aureus MB367 e MB374

4.5 - Clonagem da provável região oriT do plasmídeo pRJ9 no vetor de S. aureus

pCN37

4.5.1 - Sequenciamento dos clones contendo a região oriT do plasmídeo pRJ9

4.5.2 - Clonagem do fragmento oriT no vetor pCN37

4.6 - Construção das estirpes S. aureus MB464, MB465 e MB476

4.7 - Experimentos de conjugação utilizando-se as estirpes S. aureus MB464, MB465 e

MB476 como doadoras

4.8 - Clonagem do gene mobD do plasmídeo pRJ6 no vetor de S. aureus pT181mcs

4.9 - Construção da estirpe S. aureus MB491

4.10 - Confirmação da transcrição do gene mobD por experimentos de RT-PCR

4.11 - Experimentos de conjugação utilizando-se a estirpe S. aureus MB491 como

doadora

5 – DISCUSSÃO

6 – CONCLUSÕES

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

xvi

ABREVIATURAS E SIGLAS

ABC – ATP- Binding Cassette (Cassete Ligante de ATP)

Ap – Ampicilina

Bac – Bacteriocina(s)

BHI – Brain and Heart Infusion (Infusão de Cérebro e Coração)

CDC – Centers for Disease Control and Prevention (Centros para Controle e Prevenção de

Doenças)

cDNA – DNA Complementar

Crom – Cromossomo

Da – Dalton(s)

D/Asp – Ácido Aspártico

DEPC – Dietil-Pirocarbonato

dNTP – Deoxinucleotídeo(s) Trifosfatado(s)

ECI – Elemento Conjugativo Integrativo

EGA – Eletroforese em Gel de Agarose

E/Glu – Ácido Glutâmico

Em – Eritromicina

ETA/B – Exfoliative Toxins A e B (Toxinas Esfoliativas A e B)

Fus – Ácido Fusídico

G/Gly – Glicina

Gm – Gentamicina

GRAS – Generally Recognized As Safe (Geralmente Reconhecido Como Seguro)

H/His – Histidina

IPTG – Isopropil-tio-β-galactosídeo

kb – Quilobase(s), 1.000 pb

kDa – Quilodalton(s), 1.000 Da

LB – Luria-Bertani

L/Leu – Leucina

Mob – Mobilização

Mpf – Mating-pair Formation (Contato Celular)

MRSA – Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus Resistentes à

Meticilina)

N/Asn – Asparagina

xvii

NCTC – National Collection of Type Cultures

ND – Não Determinado

NEB – New England Biolabs

nt – Nucleotídeo(s)

OC – Open Circle (Forma Circular Aberta)

ORF – Open Reading Frame (Quadro de Leitura Aberto)

oriT – Origem de Transferência

pb – Par(es) de Bases

PCR – Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)

pI – Ponto Isoelétrico

P/Pro – Prolina

p/v – Peso por Volume

R/Arg – Arginina

RBS – Ribosomal Binding Site (Sítios de Ligação aos Ribossomos)

RI – Repetições Invertidas

Rif – Rifampicina

rpm – Rotações por Minuto

RT-PCR – Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da

Polimerase após Transcrição Reversa)

SC – Supercoiled (Super-hélice)

SCN – Staphylococcus coagulase-negativo(s)

SCP – Staphylococcus coagulase-positivo(s)

SEA-O – Staphylococcal Enterotoxins A-O (Enterotoxinas Estafilocócicas dos tipos A a O)

SLT – Soluble Lytic Transglycosylase (Transglicosilase Lítica Solúvel)

ssDNA – DNA de fita simples

S/Ser – Serina

sso – Single Strand Origin (Origem de Fita Simples)

Tc – Tetraciclina

Tra – Transferência

TSB – Tryptic Soy Broth (Caldo Tríptico de Soja)

TSST-1 – Toxic Shock Syndrome Toxin 1 (Toxina da Síndrome do Choque Tóxico 1)

TTS – Transcription Termination Site (Sítio de Terminação da Transcrição)

U – Unidade(s)

UFP – Unidades formadoras de placa de lise

xviii

v/v – Volume por volume

V/Val – Valina

VISA – Vancomycin Intermediate Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus com

Resistência Intermediária à Vancomicina)

VRSA – Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus Resistentes à

Vancomicina)

xg – Gravidade(s)

X-Gal – 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo

W/Trp – Triptofano

Y/ Tyr – Tirosina

Nota: A letra “R”, quando usada como sobrescrito de uma sigla de antibiótico, significa

resistência à (ao).

1- INTRODUÇÃO

1.1- Gênero Staphylococcus

1.1.1- Características gerais

Os estafilococos pertencem à família Staphylococcaceae (BANNERMAN &

PEACOK, 2007) e têm o nome do seu gênero derivado do grego que significa “cacho de

uvas”, uma vez que a divisão celular desses cocos pode ocorrer em vários planos, formando,

assim, cachos irregulares (LYON & SKURRAY, 1987).

O gênero Staphylococcus é composto por 43 espécies e 24 subespécies e seu genoma

contém de 30 a 45% de bases G+C (EUZÉBY, 2010). Ele é formado por bactérias Gram-

-positivas, aeróbias facultativas, catalase-positivas e que têm como hábitats mais comuns o

trato respiratório superior e a superfície da pele de mamíferos e de pássaros, fazendo parte da

microbiota anfibiôntica desses animais. Entretanto, é possível se encontrar, ainda,

Staphylococcus spp. fazendo parte da microbiota intestinal de lagartas, como as da espécie

Manduca sexta (VAN DER HOEVEN, BETRABET & FORST, 2008), de comunidades

bacterianas isoladas de recifes de corais (LAMPERT et al., 2008) e de rejeitos de minas de

zinco e de chumbo (ZHANG et al., 2007). Além disso, estes microrganismos podem ser

encontrados em hábitats extremos, como em altas altitudes, na presença de metais pesados,

com altas concentrações de sal e de incidência de radiação UV (DIB et al., 2008).

Apesar de estarem presentes normalmente na superfície do corpo humano, raramente

causam alguma doença. Infecções estafilocócicas irão ocorrer, geralmente, se a resistência do

hospedeiro estiver baixa, como ocorre com a utilização de esteroides ou outras drogas anti-

-inflamatórias, presença de ferimentos na pele ou doenças debilitantes (BANNERMAN &

PEACOCK, 2007).

Este gênero pode ser dividido em Staphylococcus coagulase-positivos (SCP), que são

capazes de produzir uma enzima que coagula o sangue, a coagulase, e são representados

principalmente pela espécie S. aureus, e em Staphylococcus coagulase-negativos (SCN), que

não são capazes de produzir a coagulase (BANNERMAN & PEACOCK, 2007; EUZÉBY,

2010).

1.1.2- Staphylococcus coagulase-positivos

A primeira espécie desse grupo a ser identificada foi S. aureus, há aproximadamente

um século. Desde essa época, ela já era associada a uma série de infecções purulentas, como

feridas cutâneas e a sepse pós-operatória da pele, além de patologias mais sérias, como

pneumonias, meningites e infecções intra-abdominais e do sangue (KLOOS & SCHLEIFER,

1986; LYON & SKURRAY, 1987; BANNERMAN & PEACOCK, 2007; CHAMBERS &

DELEO, 2009). Até hoje, esta espécie continua sendo a de maior importância médica, sendo a

maior causadora de infecções nosocomiais e adquiridas na comunidade (FOURNIER &

PHILPOTT, 2005; BANNERMAN & PEACOCK, 2007; CHAMBERS & DELEO, 2009).

O hábitat mais comum dos S. aureus é a narina anterior (KLUTYMANS, VAN

BELKUM & VERBRUGH, 1997). Estudos já mostraram que cerca de 35% da população

carreiam este microrganismo em sua microbiota nasal, entretanto, essa porcentagem varia de

acordo com a idade, a raça e o estado de saúde do indivíduo. No caso de neonatos, cerca de

30% são colonizados por S. aureus dentro de uma semana após o nascimento, embora grande

parte desses recém-nascidos seja contaminada ainda no hospital, geralmente através da equipe

de enfermagem (LADHANI et al., 1999; CHAMBERS & DELEO, 2009). Estudos sugerem

que a presença desta bactéria nas narinas é um fator de risco para o desenvolvimento de

infecção, uma vez que as taxas de infecção são maiores em portadores do que em não

portadores, e pacientes com sepse causada por S. aureus estão normalmente infectados com

sua própria cepa (KOREEN et al., 2004).

As patologias mais graves causadas por S. aureus são: abscessos, bacteriemia,

infecções do sistema nervoso central, endocardites, osteomielites e diversas síndromes, como

a síndrome da pele escaldada, a intoxicação alimentar e a síndrome do choque tóxico (GILL

et al., 2005; BANNERMAN & PEACOCK, 2007).

Os sintomas e a gravidade das infecções causadas por S. aureus são consequências dos

diversos fatores de virulência deste microrganismo, podendo-se citar: a coagulase, que resulta

na acumulação de fibrina ao redor das células bacterianas, tornando-as resistentes à

fagocitose; as hemolisinas, que são capazes de promover lise celular, principalmente de

hemácias; as nucleases, as proteases, as lipases, a hialuronidase e a colagenase, que facilitam

a invasão dos tecidos do hospedeiro; as toxinas esfoliativas (ETA e ETB), que promovem a

descamação da pele e choque; a leucocidina, que promove a lise celular de leucócitos; as

enterotoxinas estafilocócicas (SEA, SEB, SEC

, SEC

, SED, SEE, SEG, SEH, SEI,

SEJ, SEK, SEL, SEM, SEO, entre outras), que causam intoxicação alimentar; a toxina da

síndrome do choque tóxico 1 (TSST-1), causadora de choque sistêmico, além do biofilme,

que promove a aderência da bactéria à superfície de biomateriais e a proteção contra

antibióticos e contra o sistema imune (DINGES, ORWIN & SCHLIEVERT, 2000;

CUCARELLA et al., 2004; CUNHA, CALSOLARI & JÚNIOR, 2007; QIU et al., 2010).

Além de todos os fatores de virulência já descritos, o uso indiscriminado de

antibióticos, principalmente meticilina e outras penicilinas, tem levado a uma sucessiva

seleção de genes de resistência aos antibióticos, aumentando, assim, o número de estirpes

multirresistentes e dificultando o tratamento e o controle das infecções causadas por S.

aureus. Atualmente, mais de 60% das estirpes isoladas são resistentes à meticilina (MRSA),

havendo algumas simultaneamente resistentes a mais de 20 agentes antimicrobianos

(HIRAMATSU et al., 1997; ROBINSON & ENRIGHT, 2003; GILL et al., 2005; DANCER,

2008). A propagação dos MRSA é contínua e a incidência de infecções por MRSA,

adquiridas na comunidade, tem aumentado nos últimos anos (LECLERCQ, 2009).

Com o aumento da resistência à meticilina em S. aureus, outros antibióticos têm sido

utilizados no tratamento de infecções severas causadas por este grupo de bactérias. O

glicopeptídeo vancomicina tem sido considerado a droga de escolha para o tratamento de

infecções causadas pelos MRSA. Entretanto, o aparecimento de cepas com resistência

intermediária (VISA) e com resistência total (VRSA) a este antibiótico demonstra a

necessidade de um uso mais prudente da vancomicina (TENOVER, BIDDLE &

LANCASTER, 2001; CDC, 2002 e 2004; CHUNG et al., 2010).

Como não existem vacinas para a prevenção de doenças estafilocócicas, medidas de

controle de infecções hospitalares são de grande importância para a prevenção de infecções

nosocomiais. Por isso, orientações para aplicação hospitalar com este objetivo já estão

disponíveis (MUTO et al., 2003; BANNERMAN & PEACOCK, 2007). As recomendações

continuam incluindo a precaução no contato com pacientes colonizados ou infectados com

MRSA, mas também sugerem que os hospitais implementem um programa ativo de vigilância

de culturas para identificar possíveis reservatórios em pacientes de alto risco carreando

MRSA no momento da admissão hospitalar.

1.1.3 – Staphylococcus coagulase-negativos

Até os anos 70, acreditava-se que os SCN eram microrganismos não patogênicos da

pele, sendo vistos apenas como contaminantes de amostras clínicas (KLOOS &

BANNERMAN, 1994; MASON et al., 2001; KASSIS et al., 2009).

O interesse neste grupo de microrganismos cresceu, uma vez que eles foram

identificados como patógenos oportunistas em pacientes imunocomprometidos e em

tratamento hospitalar intensivo, como pacientes com neoplasias, transplantados e que fazem

uso de próteses ou cateteres intravasculares (BANNERMAN & PEACOCK, 2007).

As primeiras espécies descritas deste grupo foram S. epidermidis, S. saprophyticus e S.

haemolyticus. Nas últimas décadas, mais de 30 espécies de SCN foram descritas, sendo que a

metade pode ser patogênica para o homem. As espécies restantes são associadas a animais

domésticos e de fazendas (VON EIFF, PETERS & HEILMANN, 2002; BANNERMAN &

PEACOCK, 2007).

As principais patologias causadas por SCN são relacionadas com procedimentos

médicos invasivos, causando, desta forma, endocardites, peritonites, infecções de próteses,

meningites, ventriculites e septicemias (HUEBNER & GOLDMANN, 1999; VON EIFF,

PETERS & HEILMANN, 2002; BANNERMAN & PEACOCK, 2007; PIETTE &

VERSCHRAEGEN, 2009; ROGERS, FEY & RUPP, 2009).

Um dos fatores que podem explicar a frequente colonização pelos SCN é a produção

de polissacarídeos extracelulares responsáveis pela formação do biofilme na superfície dos

biomateriais. Este biofilme atua como uma barreira contra o reconhecimento pelo sistema

imune e a penetração de agentes antimicrobianos, tornando a erradicação desse

microrganismo ainda mais difícil (KLOOS & BANNERMAN, 1994; GÖTZ, 2002; OTTO,

2008; OTTO, 2009; ROGERS, FEY & RUPP, 2009). A espécie de SCN mais estudada

quanto à formação do biofilme em implantes cirúrgicos é S. epidermidis (SOULI &

GIAMARELLOU, 1998; AMMENDOLIA et al., 1999; VON EIFF, PETERS &

HEILMANN, 2002; McCANN, GILMORE & GORMAN, 2008; OTTO, 2009).

Além da produção de biofilme, esses microrganismos ainda possuem diversos fatores

de virulência, tais como: a produção de elastase, que é capaz de degradar IgM, IgA, albumina,

fibrinogênio e fibronectina; lipases; enterotoxinas estafilocócicas (SEA, SEB e SEC) e a

toxina da síndrome do choque tóxico 1 (TSST-1) (VON EIFF, PETERS & HEILMANN,

2002; CUNHA, CALSOLARI & JÚNIOR, 2007; ZELL et al., 2008).

Nas últimas décadas, o aparecimento de estirpes SCP e SCN resistentes aos

antibióticos mais utilizados tem se tornado uma preocupação mundial (RAJALA-SCHULTZ

et al., 2009). Por este motivo, a elaboração de formas terapêuticas alternativas mais eficazes

para o controle e a prevenção de infecções estafilocócicas em animais e humanos é essencial.

Uma das alternativas que tem se mostrado bastante promissora seria o uso de bacteriocinas

(DIEP & NES, 2002; BARKEMA, SCHUKKEN & ZADOKS, 2006; BASTOS et al., 2009;

NISSEN-MEYER et al., 2009).

1.2 – Bacteriocinas

1.2.1- Características gerais

Bacteriocinas (Bac) são proteínas ou peptídeos antimicrobianos que possuem a

capacidade de matar ou de inibir o crescimento de estirpes de uma mesma espécie ou de

outras ecologicamente relacionadas à bactéria produtora (JACK, TAGG & RAY, 1995;

HENG et al., 2007). As bacteriocinas são sintetizadas via ribossomos e, em bactérias Gram-

-positivas, costumam ser de baixo peso molecular, termoestáveis e altamente catiônicas (NES

et al., 1996; PESCHEL & SAHL, 2006; HENG et al., 2007; BASTOS et al., 2009). Quanto

ao seu espectro de ação, as bacteriocinas podem inibir somente estirpes da mesma espécie ou

ter atividade até mesmo sobre espécies pertencentes a outros gêneros bacterianos (COTTER,

HILL & ROSS, 2005).

Há uma grande diversidade de bactérias já descritas como produtoras de bacteriocinas

e esta ampla difusão de espécies produtoras se dá, principalmente, pelo fato de os genes

codificadores serem encontrados muitas vezes em plasmídeos e em transpósons conjugativos.

Entretanto, vários determinantes genéticos para a produção de bacteriocinas estão presentes

no cromossomo (JACK, TAGG & RAY, 1995; COTTER, HILL & ROSS, 2005), podendo

ainda fazer parte do genoma de profagos (LAZAREVIC et al., 1999).

Vários modelos de ação já foram propostos para os peptídeos antimicrobianos

bactericidas, produzidos por bactérias: i – formando poros na membrana, que alteram o

potencial de membrana, o gradiente de prótons ou a força próton-motriz, promovendo o

extravasamento de ácidos aminados, ATP e outros compostos, como é visto para as

bacteriocinas Pep5, epidermina e aureocina A53 (SAHL & BIERBAUM, 1998; ENNAHAR

et al., 2000; BASTOS et al., 2009); ii – exibindo atividade de nuclease quando penetram na

célula, como fazem algumas bacteriocinas produzidas por Escherichia coli (JACK, TAGG,

RAY, 1995); iii – impedindo a síntese da parede celular ou promovendo a sua degradação,

como atua a lisostafina (SCHINDLER & SCHUHARDT, 1965; BASTOS, COUTINHO &

COELHO, 2010), e iv – impedindo a germinação de esporos, como foi descrito para a nisina

(MORRIS, WALSH & HANSEN, 1984; SAHL & BIERBAUM, 1998).

As bacteriocinas formam um grupo muito heterogêneo de proteínas e peptídeos, sendo

por isso de difícil classificação. Na literatura, são sugeridas algumas formas de classificação

de bacteriocinas produzidas por bactérias Gram-positivas. Atualmente, três diferentes classes

estão estabelecidas, de acordo com as suas características estruturais e de atividade: classe I

ou lantibióticos, pequenos peptídeos (menores do que 5 kDa) caracterizados por apresentarem

ácidos aminados modificados pós-tradução, como a lantionina, a β-metil-lantionina, e ácidos

aminados desidratados como a dideidroalanina e a dideidrobutirina; classe II, pequenos

peptídeos (menores do que 10 kDa), termoestáveis, que não apresentam ácidos aminados

modificados pós-tradução em sua estrutura, e classe III, peptídeos grandes (maiores do que 10

kDa), termolábeis (COTTER, HILL & ROSS, 2005; NISSEN-MEYER et al., 2009).

As bacteriocinas das classes I e II são as mais estudadas e, por isso, com o modo de

ação melhor elucidado, uma vez que são as mais abundantes e as que apresentam um maior

potencial de emprego industrial (BIERBAUM & SAHL, 2009; NISSEN-MEYER et al.,

2009).

Até a presente data, só foram descritos lantibióticos produzidos por bactérias Gram-

-positivas e eles atuam principalmente, se não exclusivamente, em outras bactérias Gram-

-positivas (BIERBAUM & SAHL, 2009). Recentemente, uma nova classificação para os

lantibióticos foi proposta, reagrupando esses peptídeos em quatro novas subclasses:

lantibióticos do tipo A, do tipo B, do tipo C ou do tipo D (BIERBAUM & SAHL, 2009;

CEOTTO, 2009).

Os lantibióticos do tipo A são peptídeos mais flexíveis e alongados que atuam sobre a

membrana plasmática. Este grupo inclui, por exemplo, a epicidina 280 e a nisina

(McAULIFFE, ROSS & HILL, 2001; BIERBAUM & SAHL, 2009).

Os lantibióticos do tipo B são moléculas globulares rígidas que atuam inibindo a

atividade de enzimas essenciais, como as envolvidas na síntese da parede celular. As

bacteriocinas duramicina, cinamicina e mersacidina são exemplos deste grupo (SAHL, JACK

& BIERBAUM, 1995; McAULIFFE, ROSS & HILL, 2001; COTTER, HILL & ROSS, 2005;

BIERBAUM & SAHL, 2009).

Os lantibióticos do tipo C são lantibióticos formados por dois componentes, possuindo

dois peptídeos modificados que, individualmente, apresentam pouca ou nenhuma atividade,

mas que possuem uma forte ação antibacteriana quando em sinergismo. Estes lantibióticos

podem atuar formando poros na membrana, como é o caso da lacticina 3147 e da

estafilococcina C55 (MORGAN et al., 2005; HENG et al., 2007).

Já os lantibióticos do tipo D compreendem aqueles peptídeos com atividade

antimicrobiana reduzida, ou que não possuem atividade bactericida, como é o caso da

bacteriocina SapT (BIERBAUM & SAHL, 2009).

Os peptídeos da classe II possuem uma estrutura helicoidal anfipática que lhes permite

se inserir na membrana plasmática das células-alvo, promovendo assim a formação de poros,

a despolarização da membrana e a morte celular (ENNAHAR et al., 2000; DRIDER et al.,

2006; NISSEN-MEYER et al., 2009). De acordo com suas características, esta classe pode ser

dividida em quatro subclasses: bacteriocinas de classe II do tipo a, do tipo b, do tipo c e do

tipo d (NISSEN-MEYER et al., 2009).

As bacteriocinas do tipo a da classe II, ou bacteriocinas do tipo pediocina, apresentam

um espectro de ação reduzido, no entanto, têm alta atividade específica contra Listeria

monocytogenes, um importante patógeno alimentar, causador de listeriose (ENNAHAR et al.,

2000). Os peptídeos deste grupo contêm entre 37 e 48 ácidos aminados e apresentam na

região amino-terminal uma sequência conservada Tyr-Gly-Asn-Gly-Val/Leu, presente no

peptídeo final (NISSEN-MEYER et al., 2009). As bacteriocinas leucocina A e pediocina

PA-1 são exemplos desta subclasse (DRIDER et al., 2006).

A subclasse b das bacteriocinas de classe II é formada por bacteriocinas compostas por

dois peptídeos diferentes. Em alguns casos, os dois peptídeos são essenciais para que haja

atividade antimicrobiana, como as lactococcinas Gα/Gβ (NISSEN-MEYER et al., 1992).

Estão incluídas no tipo c da classe II, as bacteriocinas cíclicas, cujo primeiro e o

último ácidos aminados do peptídeo maduro estão ligados covalentemente, como acontece

com a enterocina AS-48 (MAQUEDA et al., 2008).

Por fim, a subclasse IId é composta pelas bacteriocinas formadas por um único

peptídeo, que não sofre modificações após a tradução e que não é do tipo pediocina, como a

aureocina A53 (NETZ et al., 2002).

Embora Nissen-Meyer e colaboradores (2009) classifiquem a aureocina A70 como

pertencente à subclasse IId, foi proposto por Ceotto (2009) a criação de uma quinta subclasse

(IIe) que seria mais apropriada para esta bacteriocina, uma vez que ela é composta por quatro

peptídeos diferentes do tipo não pediocina (NETZ et al., 2001).

A maioria das bacteriocinas pertencentes às classes I e II é sintetizada com uma

sequência amino-terminal líder, com aproximadamente 14-59 resíduos de ácidos aminados e

que é clivada antes, durante ou após a exportação (BIERBAUM & SAHL, 2009; NISSEN-

MEYER et al., 2009). Para alguns lantibióticos, sabe-se que esta clivagem é feita, geralmente,

por uma serina-protease. Já para bacteriocinas da classe II, acredita-se que um transportador

ABC seja responsável por esta clivagem e que este seja auxiliado por proteínas acessórias,

cujo papel não está bem esclarecido (NES et al., 1996; SAHL & BIERBAUM, 1998;

ENNAHAR et al., 2000; McAULIFFE, ROSS & HILL, 2001).

A classe III das bacteriocinas pode, ainda, ser dividida em dois grupos: tipo A e tipo

B. A subclasse A (bacteriolisinas) promove a morte das cepas sensíveis por lise celular

(COTTER, HILL & ROSS, 2005). Uma das representantes é a lisostafina, que causa hidrólise

das pontes de pentaglicina presentes na peptidoglicano de algumas espécies de

Staphylococcus (ROBINSON, HARDMAN & SLOAN, 1979; KING, BIEL & WILKINSON,

1980). A subclasse B (bacteriocinas não-líticas) promove a morte da estirpe sensível por

meios que não envolvem lise celular, como pela eliminação da força próton-motriz, gerando

extravasamento de ATP e posterior morte celular (HENG et al., 2007). Dentre as

bacteriocinas que fazem parte deste grupo, pode-se citar a disgalacticina e a estreptococcina

A-M57, que levam à morte celular por meios não-líticos, mas ainda desconhecidos (WONG,

TAGG & HYNES, 1981; SIMPSON & TAGG, 1983; HENG et al., 2004).

As estirpes produtoras de bacteriocinas têm desenvolvido um sistema de proteção

contra as suas próprias bacteriocinas. Este sistema é chamado de imunidade e tal imunidade é

conferida por genes expressos concomitantemente às bacteriocinas (MURIANA &

KLAENHAMMER, 1991; JACK, TAGG & RAY, 1995; NES et al., 1996; CRUPPER, GIES

& IANDOLO, 1997). Contudo, diferentemente das bacteriocinas, os sistemas de imunidade

apresentam baixíssima similaridade, mesmo quando comparados entre bacteriocinas

pertencentes às mesmas famílias (NES et al., 1996; SAHL & BIERBAUM, 1998;

ENNAHAR et al., 2000; BIERBAUM & SAHL, 2009; NISSEN-MEYER et al., 2009).

1.2.2- Potencial de uso das bacteriocinas

Nos últimos anos, as bacteriocinas, principalmente aquelas produzidas por bactérias do

ácido lático, têm sido muito estudadas, uma vez que possuem amplos espectros de inibição e

baixas concentrações desses produtos já apresentam atividade. Dessa forma, elas apresentam

um grande potencial de aplicação como biopreservativos de alimentos industrializados,

inibindo diversos patógenos, como L. monocytogenes, e microrganismos envolvidos na

deterioração de alimentos. Além disso, as bacteriocinas estão surgindo como uma opção de

novos e potentes antimicrobianos, podendo ser usadas na prevenção e no controle de certas

doenças infecciosas causadas tanto em seres humanos, quanto em animais (DIEP & NES,

2002; BASTOS et al., 2009).

Apesar do grande potencial das bacteriocinas, apenas a nisina, produzida por

Lactococcus lactis, e a pediocina PA-1, produzida por Pediococcus acidilactici, foram

liberadas comercialmente para serem aplicadas amplamente em vários produtos alimentares,

já sendo utilizadas como biopreservativos de alimentos (COTTER, HILL & ROSS, 2005;

GÁLVEZ et al., 2007). Outras bacteriocinas ainda precisam passar por testes para que sejam

usadas em culturas iniciadoras de processos fermentativos na indústria, reduzindo a

necessidade de se usar preservativos químicos possivelmente tóxicos, aumentando a

segurança dos alimentos fermentados (JACK, TAGG & RAY, 1995; COTTER, HILL &

ROSS, 2005; GÁLVEZ et al., 2007). Nesta busca, algumas características da cepa produtora e

da bacteriocina devem ser levadas em consideração, tais como: a estirpe produtora deve ser

reconhecida como geralmente segura (GRAS) e a bacteriocina: deve ser termoestável; não

pode causar riscos à saúde; deve ter um amplo espectro de inibição, que inclua patógenos;

quando incluída no produto, deve estar associada a efeitos benéficos, como segurança,

qualidade e sabor, e ela deve ter atividade altamente específica, não sendo tóxica (COTTER,

HILL & ROSS, 2005).

A nisina pode, ainda, ser aplicada no tratamento de diferentes infecções como as

causadas por Streptococcus pneumoniae multirresistentes a drogas (DIEP & NES, 2002). Esta

bacteriocina, por ter atividade também contra S. aureus, pode ser aplicada no controle da

mastite bovina, uma vez que este microrganismo é o principal patógeno causador desta

doença (BARKEMA, SCHUKKEN & ZADOKS, 2006). A mastite bovina é uma infecção

supurativa dos úberes das vacas, caracterizada pela secreção de grandes quantidades de pus,

de odor desagradável e rápido quadro progressivo de endurecimento, amolecimento e

eventual destruição tecidual da área afetada (JOUSIMIES-SOMER, PYÖRÄLÄ &

KANERVO, 1996). Por isso, a nisina é comercializada como agente ativo do Wipe-Out

[lenços contendo nisina (ImmuCell Corporation)] para a limpeza das tetas e prevenção da

mastite bovina, apresentando ótimos resultados no tratamento deste tipo de infecção bovina

(COTTER, HILL & ROSS, 2005).

A bacteriocina lacticina 3147, produzida por L. lactis, também tem apresentado grande

capacidade de prevenir a mastite bovina. Estudos com esta bacteriocina mostraram que a

mesma tem alta atividade contra um dos principais patógenos causadores da mastite bovina,

Streptococcus dysgalactiae (MEANEY et al., 1999; RYAN et al., 1999). Esta bacteriocina

também apresenta atividade sobre MRSA, Enterococcus spp. resistentes à vancomicina, S.

pneumoniae resistentes à penicilina, Propionibacterium acnes e Streptococcus mutans,

podendo ser aplicada no tratamento de infecções causadas por estes patógenos (GALVIN,

HILL & ROSS, 1999; GUINANE et al., 2005).

Com o aumento do número de estirpes bacterianas multirresistentes a antibióticos, fato

que já superou a capacidade da indústria farmacêutica de produzir novos antibióticos com a

mesma velocidade com que novas resistências têm surgido, cresce a necessidade de métodos

alternativos de prevenção e de tratamento de infecções humanas e animais. Portanto, os

estudos com bacteriocinas são altamente importantes, não só para a utilização das mesmas na

biopreservação de alimentos, mas, principalmente, para o controle de infecções bacterianas

causadas por cepas multirresistentes (JACK, TAGG & RAY, 1995; BASTOS et al., 2009).

A maioria dos genes codificadores de bacteriocinas está presente em plasmídeos e

alguns deles podem ser transferidos entre estirpes de uma mesma espécie, ou ainda, entre

estirpes de espécies ou gêneros diferentes, pelo mecanismo de conjugação bacteriana. Este

mecanismo de transferência horizontal de genes tem tido um papel fundamental na evolução

dos organismos procarióticos. Além disso, a conjugação se mostra uma importante ferramenta

para a aplicação de bacteriocinas em diversas áreas. A lacticina 3147, por exemplo, é

codificada pelo plasmídeo conjugativo pMRC01, o que permite que os genes codificadores da

bacteriocina sejam facilmente transferidos para diferentes estirpes de L. lactis. Este fato

permite a utilização de outras estirpes como produtoras de lacticina 3147 na indústria de

alimentos, uma vez que a sua produtora natural não pode ser empregada na fermentação de

produtos lácteos por estar associada à alteração do sabor (GUINANE et al., 2005).

1.2.3- Bacteriocinas produzidas por Staphylococcus spp.

O primeiro relato da ação inibitória de substâncias antimicrobianas do tipo

bacteriocina entre bactérias Gram-positivas foi feito por Babes, em 1885, que observou a

inibição de estafilococos por outros estafilococos durante o crescimento em meio sólido (apud

JACK, TAGG & RAY, 1995). Anos depois, foi observado por Fredericq que certas estirpes

de Staphylococcus spp. produziam substâncias capazes de inibir o crescimento de estirpes do

mesmo gênero e de outras bactérias Gram-positivas, mas não de bactérias Gram-negativas.

Essas substâncias foram nomeadas por ele estafilococcinas (FREDERICQ, 1946). Desde

então, algumas bacteriocinas produzidas por Staphylococcus spp. têm sido caracterizadas.

Das espécies de Staphylococcus, a mais estudada quanto à produção de bacteriocinas é

S. epidermidis. Dentre as bacteriocinas produzidas por esta espécie, as principais são a Pep5, a

epidermina, a epicidina 280 e a epilancina K7 (McAULIFFE, ROSS & HILL, 2001).

Entretanto, já foram descritas bacteriocinas produzidas por várias outras espécies de

Staphylococcus (Tabela 1).

1.2.4- Bacteriocinas produzidas por estirpes de S. aureus estudadas em nosso

laboratório

Em nosso laboratório, o estudo de bacteriocinas se iniciou pela análise, na década de

80, de cepas de S. aureus isolados de alimentos comercializados, como leite, e de pacientes

não hospitalizados, por Giambiagi-deMarval et al. (1990), que verificaram que a produção de

substâncias antimicrobianas do tipo bacteriocina, nestas estirpes, estava relacionada a

plasmídeos. A comprovação de que esses plasmídeos eram os responsáveis pela produção

Tabela 1 - Bacteriocinas produzidas por Staphylococcus spp.

Bacteriocina

Estirpe produtora

Classe

Massa molecular

Elemento codificador

Referência

Pep5

S. epidermidis 5

3,48 kDa

pED503

ERSFELD-DRESSEN, SAHL & BRANDIS,

1984

Epidermina

S. epidermidis Tü3298

2,16 kDa

pTü32

ALLGAIER et al., 1986

Epicidina 280

S. epidermidis BN280

3 kDa

pCH01

HEIDRICH et al., 1998

Epilancina K7

S. epidermidis K7

3 kDa

Cromossomo

VAN DE KAMP et al., 1995

Estafilococcina C55α /

C55β

S. aureus C55

3,33 kDa / 2,99 kDa

pETB

NAVARATNA, SAHL & TAGG, 1998

Aureocina A70

S. aureus A70

4 peptídeos variando

entre 2,9 e 3,08 kDa

pRJ6

GIAMBIAGI-DEMARVAL et al., 1990

NETZ et al., 2001

Aureocina A53

S. aureus A53

6,02 kDa

pRJ9

GIAMBIAGI-DEMARVAL et al., 1990

NETZ et al., 2002

Nukacina 3299

S. simulans 3299

3 kDa

pRJ97

CEOTTO et al., 2010

Warnericina RB4

S. warneri RB4

2,96 kDa

MINAMIKAWA et al., 2005

Nukacina ISK-1

S. warneri ISK-1

2,96 kDa

pPI-1

SASHIHARA et al., 2000

Nukacina KQU-131

S. hominis KQU-131

3 kDa

WILAIPUN et al., 2008

Galidermina

S. gallinarum Tu3928

2,16 kDa

Cromossomo

KELLNER et al., 1988

Hyicina 3682

S. hyicus 3682

Cromossomo

FAGUNDES, 2008

Bac 4244

S. hyicus 4244

Cromossomo

SOUZA, 2010

ND, não determinado.

dessas substâncias foi feita através de experimentos de cura e de transferência gênica para

outras estirpes não possuidoras de plasmídeos, que passaram então a produzir bacteriocinas.

Os plasmídeos bacteriocinogênicos isolados foram nomeados pRJ6 (7,9 kb) e pRJ9 (10,4 kb)

e as bacteriocinas produzidas por eles, aureocinas A70 e A53, respectivamente

(GIAMBIAGI-DEMARVAL et al., 1990).

A aureocina A70 é sintetizada sem uma sequência-líder pela estirpe S. aureus A70,

isolada de leite comercial, e, por ser formada por quatro peptídeos não modificados, pode ser

agrupada na classe IIe. Os peptídeos formadores desta bacteriocina são altamente catiônicos e

hidrofóbicos, contendo 30 ou 31 ácidos aminados (NETZ et al., 2001). Esta bacteriocina

apresenta um amplo espectro de ação, inibindo bactérias Gram-positivas de diversos gêneros,

como Staphylococcus, Micrococcus, Corynebacterium, Paenibacillus, Lactobacillus,

Leuconostoc e Listeria, incluindo L. monocytogenes (OLIVEIRA et al., 1998a; GAMON et

al., 1999).

A aureocina A53 é produzida pela estirpe S. aureus A53, isolada de leite comercial.

Por ser formada por um único peptídeo não modificado e não ser sintetizada como um pré-

-peptídeo, com uma sequência-líder, a aureocina A53 é classificada como sendo da classe IId.

Esta bacteriocina é um peptídeo altamente catiônico e hidrofóbico com massa molecular de

6.021,5 Da, contendo 51 resíduos de ácidos aminados e rico em triptofano. Além disso, a

aureocina A53 é possuidora de uma alta estabilidade em meio extremamente ácido e em

presença de altas temperaturas. Ela possui, ainda, um amplo espectro de ação, inibindo

Streptococcus agalactiae envolvidos na mastite bovina, Enterococcus faecalis, Lactobacillus

casei, Lactococcus lactis, Paenibacillus polymyxa, Corynebacterium fimi e L. monocytogenes,

além de diversas estirpes de S. aureus envolvidas em mastite bovina e em infecções humanas

(OLIVEIRA et al., 1998b; GAMON et al., 1999; NASCIMENTO et al., 2006; COELHO et

al., 2007). Por estas características, esta bacteriocina apresenta um grande potencial

biotecnológico, podendo ser empregada como conservante de alimentos e no tratamento de

infecções bovinas e humanas.

Diferentemente da aureocina A53, a aureocina A70 é uma bacteriocina bastante

disseminada entre Staphylococcus spp., já tendo sido detectada em estirpes de Staphylococcus

spp. isoladas de mastite bovina no Brasil e na Argentina e em S. aureus isolados de espécimes

clínicos (GAMON et al., 1999; NASCIMENTO et al., 2002 e 2005; CEOTTO et al., 2009).

Esta alta disseminação do plasmídeo pRJ6, codificador desta bacteriocina, entre diversas

estirpes de Staphylococcus spp. pode estar relacionada com o fato deste plasmídeo ser

mobilizável na presença de plasmídeos conjugativos, apresentando quatro genes envolvidos

na mobilização (mobA, mobB, mobC e mobD) e uma origem de transferência (oriT) funcional

(COELHO et al., 2009). Já o plasmídeo pRJ9 não foi passível de mobilização pelo plasmídeo

conjugativo pGO1 em experimentos de conjugação (OLIVEIRA et al., 1998a; COUTINHO,

2008). Entretanto, o mapeamento físico dos plasmídeos pRJ6 e pRJ9 e análises de

hibridização revelaram a presença de uma região de homologia entre eles, com

aproximadamente 2,6 kb (ARAÚJO & BASTOS, 1995). Análises posteriores in silico

evidenciaram que, nesta região do pRJ9, estão presentes três orfs cujos produtos apresentam

alta similaridade a proteínas associadas ao processo de mobilização, sendo elas MobA, MobB

e MobC (NETZ et al., 2002; COUTINHO, 2008). Quando comparadas às mesmas proteínas

Mob codificadas pelo pRJ6, pode-se observar uma similaridade de mais de 90% para cada

proteína (COUTINHO, 2008). Além disso, foi possível encontrar, na sequência do pRJ9, uma

possível região oriT, praticamente idêntica à encontrada para o pRJ6 (NETZ et al., 2002;

COUTINHO, 2008; COELHO et al., 2009) (Figura 1).

Como o presente estudo se baseia na incapacidade do plasmídeo pRJ9 de ser

transferido entre bactérias, por conjugação, mesmo possuindo genes relacionados com a

mobilização, um melhor entendimento de como este processo ocorre é de vital importância

para o acompanhamento deste trabalho.

1.3 - Conjugação bacteriana

1.3.1 – Características gerais

A conjugação bacteriana foi descoberta e descrita por Tatum e Lederberg em 1946,

como sendo a transferência unidirecional de uma fita simples de DNA (conhecida como fita

T) de uma célula doadora para uma receptora, através de um mecanismo que requer contato

físico (TATUM & LEDERBERG, 1946). Após a transferência, a célula receptora se torna um

transconjugante, possuindo a capacidade de iniciar novas conjugações. A partir deste

mecanismo altamente eficiente, poucas células que possuam plasmídeos conjugativos podem

espalhar essa informação para toda a população em pouco tempo, permitindo, assim, uma

rápida disseminação de genes adaptativos, de virulência ou de resistência a drogas (GOMIS-

-RÜTH & COLL, 2006).

O sistema conjugativo é responsável por mediar a transferência de material genético

entre uma grande variedade de bactérias e, em alguns casos, de mediar transferência entre

bactérias e fungos ou células de plantas. Estas propriedades tornam a conjugação uma fonte

importante de plasticidade gênica, potencializando mudanças significativas para esses

Figura 1: Mapas genéticos do pRJ9 (A) e do pRJ6 (B) mostrando suas principais orfs e a região de forte homologia entre os dois ( ). (A) oriT

representa a possível origem de transferência do plasmídeo por conjugação. Os genes mobC, mobA e mobB codificam proteínas de mobilização. rep

representa o gene codificador da proteína responsável pela iniciação da duplicação do DNA. aucA é o gene estrutural da aureocina A53, enquanto

aucE, aucF e aucG são os genes codificadores de proteínas responsáveis pelo transporte da bacteriocina. As demais orfs ainda não foram

caracterizadas. ▪, prováveis promotores [adaptado de NETZ et al. (2002)]. (B) Os genes mobB, mobA, mobD e mobC codificam proteínas de

mobilização. aurABCD é o operon codificador da aureocina A70, enquanto aurT está envolvido na codificação da proteína responsável pelo transporte

desta bacteriocina. As demais orfs não nomeadas ainda não foram caracterizadas. , prováveis promotores; , prováveis terminadores de transcrição

[adaptado de COELHO et al. (2009)].

aucF

aucE

microrganismos no âmbito evolutivo, ambiental e clínico (CURTISS, 1969; LANKA &

WILKINS, 1995; JUHAS, CROOK & HOOD, 2008).

No âmbito clínico, a participação dos plasmídeos conjugativos despertou o interesse

de diversos grupos de pesquisa a se aprofundarem no entendimento do processo conjugativo.

Por exemplo, na década de 80, em alguns hospitais dos EUA, surtos de infecções causadas

por Staphylococcus spp. resistentes à gentamicina (Gm) foram relatados por vários

pesquisadores que identificaram formas plasmideais associadas a estas cepas resistentes.

Posteriormente, verificou-se que esses plasmídeos eram todos relacionados ao pGO1, um

plasmídeo conjugativo de 54 kb que confere resistência à gentamicina, ao trimetoprim e a

compostos de amônio quaternário (ARCHER, COUGHTER & JOHNSTON, 1986;

THOMAS & ARCHER, 1989; CARYL & O'NEILL, 2009).

Plasmídeos conjugativos possuem genes responsáveis por todas as etapas do processo

de conjugação, desde genes que promovem o contato celular e a sua autoclivagem pró-

-transferência até a transferência propriamente dita. Já os plasmídeos mobilizáveis possuem

apenas os genes responsáveis pela sua autoclivagem (genes mob), sendo dependentes dos

plasmídeos conjugativos para que a sua transferência ocorra. Vários plasmídeos conjugativos

identificados principalmente em Streptococcus spp. e Enterococcus spp. apresentam um

amplo espectro de hospedeiros, enquanto os plasmídeos de Staphylococcus spp. parecem estar

restritos a este gênero. Os plasmídeos dessas bactérias apresentam uma grande região de

homologia (Figura 2), conhecida como região tra, onde se concentram os genes responsáveis

pelo processo de conjugação, que incluem os genes codificadores de proteínas que promovem

o contato celular (Mpf ou mating-pair formation), o processamento e o transporte do DNA

(SILVERMAN, 1997; GROHMANN, MUTH & ESPINOSA, 2003; CHRISTIE et al., 2005;

BACKERT & MEYER, 2006).

Além dos plasmídeos conjugativos, os elementos conjugativos integrativos (ECIs),

como os transpósons conjugativos, também são capazes de promover o contato celular e a sua

autotransferência. Os ECIs apresentam características de plasmídeos, como a transferência

por conjugação, e de fagos, como a integração e a duplicação junto com o cromossomo

bacteriano (BURRUS et al., 2002; BURRUS & WALDOR, 2004). Esses elementos

codificam uma integrase que promove a recombinação entre uma sequência específica no ECI

e uma sequência-alvo no cromossomo. Normalmente, esses elementos também codificam

uma enzima, excisionase, que será necessária para a excisão do ECI (BURRUS et al., 2002;

BURRUS & WALDOR, 2004). O ECI mais estudado é o CTn916 de Enterococcus faecalis.

O primeiro passo para a transferência conjugativa desse elemento é a sua excisão catalisada

pelas enzimas integrase e excisionase, formando uma molécula intermediária circular. O

segundo passo é a transferência conjugativa, que é semelhante à dos plasmídeos conjugativos,

pela transferência de uma única fita de DNA. Após a transferência e a duplicação das fitas,

tanto as células doadoras quanto as receptoras vão conter uma cópia da molécula circular de

fita dupla. A integrase, então, irá promover a integração do elemento no cromossomo

bacteriano (JAWORSKI & CLEWELL, 1995; BURRUS et al., 2002; BURRUS &

WALDOR, 2004).

Os sistemas conjugativos conhecidos provavelmente evoluíram a partir da união de

dois sistemas bacterianos mais antigos: a duplicação do DNA e o transporte de

macromoléculas através de membranas. Evidências que sustentam esta hipótese podem ser

encontradas na dependência de processos de clivagem e duplicação do DNA e de uma enorme

maquinaria de secreção associada às membranas celulares, ambos requeridos para o sucesso

da conjugação. Os genes responsáveis por estes processos agrupam-se, geralmente, todos na

região tra dos plasmídeos e dos transpósons conjugativos (LLOSA et al., 2002).

Figura 2: Região tra dos plasmídeos conjugativos pIP501, pRE25, pGO1 e pSK41 de

bactérias Gram-positivas. Os genes codificadores de produtos similares são apresentados com

a mesma cor [adaptado de GROHMANN, MUTH & ESPINOSA (2003)].

1.3.2 – Modelos de sistemas conjugativos

Os modelos de conjugação mais bem conhecidos são baseados em experimentos

efetuados com plasmídeos conjugativos bem caracterizados de bactérias Gram-negativas,

como os plasmídeos F e RP4 de E. coli e plasmídeos Ti de Agrobacterium tumefaciens

(LLOSA et al., 2002; GROHMANN, MUTH & ESPINOSA, 2003; CHRISTIE, 2004).

Entretanto, a preparação do DNA antes da transferência (mobilização) é muito similar entre

os sistemas conjugativos, possibilitando que os modelos conhecidos para bactérias Gram-

-negativas possam ser utilizados para as Gram-positivas, onde a principal diferença está no

mecanismo de formação do contato celular (GROHMANN, MUTH & ESPINOSA, 2003).

Por este motivo, descreveremos o processo conhecido para bactérias Gram-negativas e,

quando possível, indicaremos as diferenças conhecidas para bactérias Gram-positivas.

A conjugação ocorre em três etapas principais: formação do relaxossomo, que ocorre

pela ligação de diversas proteínas a uma região específica do DNA; formação do contato

celular; passagem do DNA da célula doadora para a receptora e a sua duplicação nas duas

células (Figura 3).

1.3.2.1 – Formação do relaxossomo

A formação do relaxossomo tem um papel muito importante no processo de

conjugação, uma vez que ela é necessária para que haja a clivagem do DNA, gerando a fita

que será transferida ou fita T. Para que este processo ocorra, fatores codificados pelo próprio

plasmídeo são necessários, como as proteínas Mob (de mobilização) e a região oriT, além de

outros fatores codificados pela célula hospedeira (GROHMANN, MUTH & ESPINOSA,

2003).

A região oriT é uma sequência de nucleotídeos plasmídeo-específica que é clivada

para gerar a fita T. As regiões oriT apresentam características comuns, como a presença de

repetições diretas e invertidas (Figura 4). As repetições diretas, em alguns sistemas como os

dos plasmídeos pC221 e pC223, estão associadas com o reconhecimento desta região pelas

proteínas Mob. Em outros sistemas, como os dos plasmídeos pSC101 e R1162, as repetições

invertidas estão associadas à formação de uma estrutura secundária que é reconhecida pelas

proteínas Mob (Figura 4B) (CLIMO, SHARMA & ARCHER, 1996; GROHMANN, MUTH

& ESPINOSA, 2003; PARKER et al., 2005; CARYL & THOMAS, 2006; JANDLE &

MEYER, 2006).

As proteínas Mob são as responsáveis por tornar o plasmídeo mobilizável, uma vez

que são elas que preparam o plasmídeo para a transferência por conjugação. Estas proteínas

são, normalmente, as primeiras proteínas do operon tra dos plasmídeos conjugativos e

formam o operon mob dos plasmídeos mobilizáveis. Este grupo de proteínas é formado por,

pelo menos, três proteínas com funções bem diferentes na formação do relaxossomo, sendo

elas: proteínas MobA ou relaxase, MobB e MobC. É possível, ainda, encontrar, em alguns

sistemas, outras proteínas Mob menos comuns e que possuem funções pouco conhecidas,

Figura 3: Modelo simplificado do processo de conjugação em bactérias Gram-positivas e

Gram-negativas. Adesinas de superfície, em bactérias Gram-positivas, ou pilus conjugativo,

em bactérias Gram-negativas, medeiam o contato entre a célula doadora e a receptora. As

reações envolvem a formação do relaxossomo, Mpf, a transferência do DNA de uma célula

para outra e a duplicação do DNA nas duas células. A transferência do DNA é provavelmente

conservada em todas as bactérias [adaptado de CHEN, CHRISTIE & DUBNAU (2005)].

como é o caso de MobD codificada pelos plasmídeos ColE1 de E. coli e pRJ6 de S. aureus e

da proteína MobE, codificada também pelo plasmídeo ColE1 (FRANCIA et al., 2004;

COELHO et al., 2009).

As proteínas MobB e MobC atuam como proteínas acessórias do processo de

mobilização, facilitando o acesso da relaxase à região oriT ou estabilizando a formação do

Conjugação

Gram-positivas

Gram-negativas

Adesinas de

superfície

Canal

Mpf

Pilus

conjugativo

Processamento

e transporte de

DNA

Regeneração

plasmideal e

separação das

células

Junção

conjugativa

relaxossomo (PROJAN & ARCHER, 1989; NOMURA, YAMASHITA & MUROOKA,

1996; SMITH & THOMAS, 2004; CARYL & THOMAS, 2006). Deste modo, muitas vezes,

estas proteínas acabam por regular a expressão dos genes mob indiretamente, uma vez que

interagem com a relaxase e esta, por sua vez, se liga à região oriT que está sobreposta à região

promotora do operon mob (PERWEZ & MEYER, 1999; KURENBACH et al., 2006;

COELHO et al., 2009). Para o plasmídeo R1162, foi demonstrado que MobC, além de

auxiliar na separação das fitas de DNA, também estende esta separação até a região do sítio

Figura 4: Regiões oriT dos plasmídeos pSC101 (E. coli), pTiC58 (A. tumefaciens), R1162 (E.

coli), pIP501 (Streptococcus agalactiae), RSF1010 (E. coli), pTF1 (Thiobacillus

ferrooxidans) e pGO1 (S. aureus). (A) Comparação de regiões oriT mostrando as repetições

invertidas e a região onde ocorre a clivagem (nic), apontada por uma cabeça de seta preta

[adaptado de CLIMO, SHARMA & ARCHER (1996)]; (B) Estrutura secundária em forma de

grampo adquirida pela região oriT do plasmídeo pSC101 [adaptado de PARKER et al.

(2005)].

Repetições invertidas

de clivagem na oriT (sítio nic). Neste plasmídeo, a ausência da proteína MobC torna a

separação das fitas do DNA muito sensível aos níveis de DNA-girase ativa na célula. Todos

estes fatos sugerem que MobC funcione como um motor molecular, inserindo-se no DNA e

afastando a dupla fita (ZHANG & MEYER, 1997). Entretanto, as proteínas MobC de

plasmídeos mobilizáveis de bactérias Gram-positivas, como a do pC221, parecem não

funcionar da mesma forma. Nestes modelos, as proteínas MobC não funcionam como um

motor molecular, mas podem promover o relaxamento da dupla fita causando uma distorção

espacial no DNA, através da interação simultânea com vários sítios do DNA (CARYL &

THOMAS, 2006). Já a proteína MobB do plasmídeo R1162 estabiliza a interação de MobA e

MobC na região oriT. A ausência de MobB deste plasmídeo causa uma diminuição de duas a

três ordens de magnitude na capacidade de mobilização do plasmídeo. Deleções de diferentes

regiões de MobB afetam a forma como MobA interage com a região oriT, levando a uma não

repressão do promotor do operon mob, o que gera um estresse celular causado pelo aumento

da expressão das proteínas Mob. Toda esta problemática leva a um aumento no tempo de

geração celular, mostrando que, neste modelo, MobB é fundamental para regular as funções

de MobA, estimulando a sua ligação à região oriT e regulando a clivagem desta região

(PERWEZ & MEYER, 1999). Foi comprovado, ainda, que a proteína MobB, codificada pelo

plasmídeo R1162, também é essencial para que o transporte da relaxase ligada à fita T ocorra

eficientemente para a célula receptora. Nesse sistema, MobB se insere na membrana e poderia

estabilizar a associação entre a relaxase e o aparato de transferência (PARKER & MEYER,

2007).

As proteínas MobA estão presentes obrigatoriamente em todos os sistemas

conjugativos e mobilizáveis, uma vez que são elas as responsáveis por efetivamente clivar a

região oriT e gerar a fita T. Estas proteínas possuem em sua estrutura três motivos que podem

apresentar as seguintes características: i- motivo I: contém um resíduo de tirosina (Tyr ou Y)

que está envolvido nos processos de transesterificação do DNA (mantendo-se unida ao

extremo 5’-P do sítio de clivagem na região oriT de forma a conservar a energia liberada com

a clivagem da ligação fosfodiéster, para utilizá-la posteriormente); ii- motivo II: parece estar

envolvido na interação entre o DNA e a proteína, através da interação entre o extremo 3’ do

sítio de clivagem e um resíduo de serina (Ser ou S) quase sempre presente; iii- motivo III:

contém três histidinas (His ou H) conservadas que parecem ativar a ação catalítica do motivo

I, através do recrutamento de íons Mg

(PANSEGRAU, SCHRÖDER & LANKA, 1994;

FRANCIA et al., 2004). De acordo com estes motivos presentes nas relaxases e a variação

entre eles, Francia e colaboradores (2004) dividiram os plasmídeos mobilizáveis e

conjugativos em três superfamílias, que são: superfamília Mob

, superfamília ColE1 e

superfamília pMV158. Dentro de cada superfamília, as regiões oriT são relacionadas.

A superfamília Mob

tem como protótipo o plasmídeo RSF1010 de bactérias Gram-

-negativas, mas também fazem parte dela os plasmídeos pGO1 e pIP501 de bactérias Gram-

-positivas e cerca de 15 plasmídeos mobilizáveis. As relaxases agrupadas nesta família

possuem o motivo I e o motivo III sem variações, mas podem apresentar no motivo II, ao

invés de uma Ser, um resíduo de ácido aspártico (Asp ou D) ou ácido glutâmico (Glu ou E).

Estas relaxases também apresentam um domínio amino-terminal com atividade de relaxase e

um domínio carboxi-terminal com atividade de primase, que possibilitará a síntese da fita

complementar do plasmídeo na célula receptora (FRANCIA et al., 2004).

Na superfamília ColE1 estão presentes plasmídeos tanto de bactérias Gram-positivas,

como o pC221, o pRJ6 e o pRJ9 de Staphylococcus spp. (COUTINHO, 2008; COELHO et

al., 2009), quanto de bactérias Gram-negativas, como o plasmídeo ColE1 de E. coli, que é o

protótipo deste grupo (FRANCIA et al., 2004). As relaxases deste grupo apresentam a Tyr do

motivo I conservada e um resíduo de Ser seguida de um resíduo de Glu ou Asp no motivo II.

Quanto ao motivo III, esta família pode ser dividida em duas subfamílias: subfamília MOB

que tem como protótipo o plasmídeo RP4 e apresenta os três resíduos de His conservados, e a

subfamília MOB

HEN

, que só possui o primeiro resíduo de His conservado; os outros dois são

substituídos por Glu e asparagina (Asn ou N), respectivamente (FRANCIA et al., 2004).

Já a superfamília do pMV158 é a que engloba o maior número de plasmídeos

conjugativos e mobilizáveis de bactérias Gram-positivas. As relaxases que compõem este

grupo são bem diferentes das outras, apresentando um motivo amino-terminal (HxxR, onde R

é arginina), onde não se encontra nenhum resíduo de Tyr presente no motivo I. O motivo II

também se apresenta bem diferente, com uma nova composição, de consenso NY(D/E)L,

onde L é leucina, no qual acredita-se que esteja o resíduo de Tyr ativo que deveria estar no

motivo I. O motivo III também apresenta uma assinatura diferente (HxDE....PHxh, onde P é

prolina) e, em alguns plasmídeos, o último resíduo de His pode ser substituído por um resíduo

de Ser ou treonina. Além destas características, a região carboxi-terminal destas relaxases está

envolvida no reconhecimento específico da região oriT (FRANCIA et al., 2004).

A formação do relaxossomo, então, se dá com a ação das três proteínas Mob (MobA,

MobB e MobC) sobre a região oriT e pode ser entendida através do modelo proposto para o

plasmídeo R1162. Neste modelo, como já foi mencionado, a proteína MobB induz a ligação

de MobA à região oriT, gerando uma distorção espacial inicial no DNA. MobC, então, auxilia

MobA a continuar com esta distorção até o sítio nic. Ao chegar ao sítio nic, MobA cliva a fita

de DNA que possui a sequência correta e permanece covalentemente ligada ao extremo 5’-P

desta fita (complexo de transferência). É importante ressaltar que, nos plasmídeos das

superfamílias Mob

e ColE1, esta clivagem e ligação são mediadas pelo resíduo de Tyr

presente no motivo I (PANSEGRAU, SCHRÖDER & LANKA, 1994). Após esta clivagem,

MobA, auxiliada por MobC, continua a abrir a dupla fita de DNA, gerando a fita T que será

transferida para a célula receptora. Acredita-se que MobB receba estímulos da conjugação e

coordene toda esta atividade pela regulação de MobA, podendo, ainda, se inserir na

membrana e estabilizar a associação entra a relaxase e o aparato de transferência (ZHANG &

MEYER, 1997; PERWEZ & MEYER, 1999; PARKER & MEYER, 2007)

1.3.2.2 – Formação do contato celular e transferência da fita T

Após a formação do relaxossomo, é necessário que haja uma interação entre a célula

doadora e a receptora para que a transferência da molécula de DNA seja possível. Os modelos

mais bem estudados de formação do contato celular são os descritos para os plasmídeos Ti de

A. tumefaciens (CHEN, CHRISTIE & DUBNAU, 2005). Um modelo de formação da

maquinaria de transporte foi proposto para o plasmídeo pIP501 de Streptococcus agalactiae

(ABAJY et al., 2007). Como ainda existem poucos estudos sobre este último modelo, iremos

comentar os dois, comparando sempre que possível.

O contato celular se inicia, em bactérias Gram-negativas, com a produção de um

aparato filamentoso conhecido como pilus conjugativo. Este pilus só é produzido pela

bactéria portadora do plasmídeo conjugativo e é ele o responsável por se ligar à célula

receptora e trazê-la para perto da doadora (LLOSA et al., 2002; GROHMANN, MUTH &

ESPINOSA, 2003; CHEN, CHRISTIE & DUBNAU, 2005). Para bactérias Gram-positivas,

pouco é conhecido sobre este mecanismo inicial de aproximação das células. Somente em L.

lactis e Lactococcus casei, duas proteínas de superfície, que realizam a agregação entre a

célula doadora e a receptora, são conhecidas, sendo produtos dos genes clu e agg (VAN DER

LELIE et al., 1991).

Após este primeiro contato celular, forma-se um canal entre as membranas das duas

células, a partir de uma maquinaria de transporte, por onde o DNA irá passar. Este canal, no

caso de A. tumefaciens, é formado por 11 proteínas (VirB1 a VirB11) que estão relacionadas

ao sistema de secreção bacteriana do tipo IV (Figura 5). Este sistema possui a capacidade de

transportar proteínas intercelularmente (LLOSA et al., 2002; GROHMANN, MUTH &

ESPINOSA, 2003; ECONOMOU et al., 2006; JUHAS, CROOK & HOOD, 2008). Ocorre,

então, a ligação entre o complexo de transferência e a maquinaria de transporte, que é

Figura 5: Sistema conjugativo de A. tumefaciens. O complexo de transferência interage com

a proteína de acoplamento VirD4, que o transfere por um sistema de canais proteicos

formados por VirB11, VirB6 e VirB8 e, finalmente, por VirB2 e VirB9. As ATPases VirD4,

VirB11 e VirB4 fornecem energia para que o complexo passe pelo canal. A energia dos ATPs

hidrolisados também é utilizada para causar mudanças estruturais em VirB10, que medeia a

transferência do DNA através do controle de VirB9 [adaptado de CHEN, CHRISTIE &

DUBNAU (2005)].

mediada pela proteína de membrana conhecida como proteína de acoplamento (VirD4 em A.

tumefaciens).

As proteínas de acoplamento possuem uma estrutura esférica, sob a forma de um

homoexâmero, onde, no centro desta estrutura, há um canal que pode acomodar o DNA de

fita simples. Há diversos plasmídeos de bactérias Gram-positivas que apresentam proteínas

homólogas à VirD4, como é o caso do pIP501 e do pGO1 (GROHMANN, MUTH &

ESPINOSA, 2003; CHEN, CHRISTIE & DUBNAU, 2005). Esta proteína, então, reconhece

MobA ligada à fita T e direciona todo o complexo para a maquinaria de transporte, para que

ele seja bombeado para a célula receptora. Uma vez direcionado o complexo de transferência

para a maquinaria de transporte, este segue o seguinte caminho: há a interação dele com a

Membrana externa

Parede celular

Membrana

citoplasmática

Relaxase-Fita T

Substratos

das proteínas

proteína VirB11, que é uma ATPase de membrana, e que direciona o complexo para as

proteínas VirB6 e VirB8. Este mecanismo é dependente da clivagem de ATP por VirB4, outra

ATPase de membrana, VirD4 e VirB11. VirB6 forma um canal por onde o complexo de

transferência passa para chegar até as proteínas VirB2 e VirB9. VirB2 é uma pilina que forma

um canal (pilus rudimentar) que atravessa do periplasma até a membrana externa. VirB9

forma um poro na membrana externa, por onde o complexo de transferência chegará à célula

receptora. Acredita-se que o canal formado pelas subunidades de VirB2 funcione como um

pistão, sofrendo processos de polimerização e despolimerização, e, desse modo, empurrando

o complexo de transferência. Em bactérias Gram-positivas, não se conhecem proteínas

homólogas à VirB2 e VirB9, o que é de se esperar, uma vez que há muitas diferenças nas

estruturas que formam os envelopes dessas bactérias. Já VirB10 parece funcionar como um

suporte, permitindo a montagem dos componentes entre as duas membranas. VirB10 pode

funcionar, ainda, como um regulador de VirB9, promovendo a abertura e o fechamento do

poro. Finalmente, VirB1 é uma transglicosilase lítica que degrada a peptidoglicano da parede

celular no local onde o sistema de secreção do tipo IV está sendo montado (CHRISTIE et al.,

2005; BACKERT & MEYER, 2006; JUHAS, CROOK & HOOD, 2008). Curiosamente, a

porção C-terminal de VirB1 pode ser clivada e secretada pela célula, onde contribuirá para a

formação do pilus (ZUPAN et al., 2007; JUHAS, CROOK & HOOD, 2008). Portanto, VirB1

atua com uma proteína bifuncional, que lisa a peptidoglicano da parede celular para facilitar a

inserção da maquinaria de transporte e, simultaneamente, promove a formação do pilus pela

interação com outras proteínas (ZUPAN et al., 2007; JUHAS, CROOK & HOOK, 2008).

Quanto à VirB5, não existem relatos de que ela seja realmente essencial para a transferência

(GROHMANN, MUTH & ESPINOSA, 2003; CHEN, CHRISTIE & DUBNAU, 2005).

O mecanismo de transporte do DNA para o plasmídeo pIP501 foi proposto em 2007,

por Abajy e colaboradores. Este plasmídeo apresenta uma região tra composta por 15 genes e

três produtos destes genes apresentam alta similaridade com componentes do sistema de

secreção do tipo IV de bactérias Gram-negativas (Figura 6A). Os genes codificadores destas

proteínas também são encontrados em outros plasmídeos conjugativos, como o pGO1 de S.

aureus (GROHMANN, MUTH & ESPINOSA, 2003).

O modelo proposto por Abajy e colaboradores sugere que a proteína Orf7, que

apresenta características de transglicosilase lítica, deve ter uma participação fundamental na

abertura da peptidoglicano, facilitando, assim, a montagem da maquinaria de transporte. Esta

mesma proteína ainda interage com outros componentes do sistema, como a provável ATPase

Orf5, a provável proteína de acoplamento Orf10 e as proteínas de membrana Orf2 e Orf14.

Figura 6: Região tra do plasmídeo conjugativo pIP501 de bactérias Gram-positivas e

seu provável sistema de conjugação. (A) Organização da região tra do pIP501. Os segmentos

listrados indicam genes codificadores de proteínas similares às identificadas no sistema de

secreção do tipo IV de bactérias Gram-negativas. A proteína Orf5 apresenta regiões

conservadas de proteínas pertencentes à família VirB4 (motivos A e B). Orf10 apresenta

homologia com proteínas de acoplamento (motivos A e B), como a VirD4, e Orf7 apresenta

homologia com a proteína VirB1 e possui o domínio SLT presente em transglicosilases líticas

de bactérias. P

tra

– região promotora do operon tra; TTS – sítio de terminação da transcrição.

(B) Modelo do sistema conjugativo do plasmídeo pIP501. A coloração mais clara na

peptidoglicano simboliza a sua abertura pela proteína Orf7. As setas descontínuas marcam as

possíveis proteínas com função de ATPase. ssDNA – DNA de fita simples; PG –

peptidoglicano; MC – membrana citoplasmática [adaptado de ABAJY et al. (2007)].

TTS

Relaxase

76,4 kDa

Transglicosilase

Proteína do

lítica

40,4 kDa

tipo VirB4

75,8 kDa

Proteína do

tipo VirD4

63 kDa

Por estas interações, Orf7 deve recrutar estas proteínas, permitindo a sua incorporação à

maquinaria de transporte. Deste modo, a provável proteína de acoplamento Orf10 interage

com a relaxase TraA (Orf1) que está ligada à região oriT do DNA, conectando o complexo de

transferência à maquinaria de transporte. Uma possível candidata para gerar a produção de

energia pela hidrólise de ATP para a estabilização da maquinaria e para que o transporte

ocorra é a proteína Orf5. Alternativamente, esta energia pode ser suprida pela proteína de

acoplamento Orf10. Uma possível estrutura transenvelope pode ser formada pelas proteínas

Orf8, Orf14, Orf12 e Orf15, enquanto as proteínas Orf3, Orf6 e Orf9 podem compor parte do

esqueleto da estrutura do aparato de secreção. Ainda não foi determinada a função das

proteínas Orf4, Orf11 e Orf13, que não apresentam similaridade com nenhuma proteína já

caracterizada (Figura 6B) (ABAJY et al., 2007).

Após a chegada da fita T ligada à MobA no citoplasma da célula receptora, a síntese

da fita complementar pode ocorrer de duas formas: ou a proteína MobA possui um domínio

com atividade de primase, o que é comum nas MobA de grandes plasmídeos conjugativos,

sintetizando um oligonucleotídeo iniciador para que a duplicação comece, ou o DNA possui

uma origem de duplicação de fita simples, o que é comum em pequenos plasmídeos

mobilizáveis que se duplicam sob a forma de círculo rolante. Já na célula doadora, a síntese

da nova fita provavelmente ocorre por um mecanismo de círculo rolante, à medida que a fita

T vai sendo transferida para a célula receptora (PARKER et al., 2005).

2 - OBJETIVOS

2.1 - Objetivos gerais

Apesar de experimentos de conjugação feitos anteriormente por nosso grupo terem

mostrado a incapacidade de mobilização do plasmídeo pRJ9 pelo plasmídeo pGO1, o

sequenciamento deste plasmídeo e análises posteriores in silico revelaram a presença de orfs

cujos produtos apresentam alta similaridade a proteínas associadas ao processo de

mobilização, principalmente quando comparadas às proteínas Mob codificadas pelo

plasmídeo pRJ6. Por este motivo, o presente trabalho visa reinvestigar a capacidade de

mobilização do plasmídeo pRJ9 entre Staphylococcus spp.

2.2 - Objetivos específicos

Buscando analisar os motivos responsáveis pela incapacidade de mobilização do

plasmídeo bacteriocinogênico pRJ9, os objetivos específicos deste trabalho foram:

I) Verificar a transcrição dos genes mob do pRJ9.

Abordagens que foram empregadas para se alcançar este objetivo

 Experimentos de RT-PCR para se confirmar a transcrição dos genes mob do pRJ9.

II) Verificar se as funções Mob do pRJ9 são passíveis de complementação in trans pelas

funções Mob do pRJ6.

Abordagens que foram empregadas para se alcançar este objetivo

 Construção de uma estirpe de S. aureus possuidora dos plasmídeos pRJ14

(pRJ9::Tn551), pRJ6 e pGO1;

 Experimentos de conjugação, utilizando-se como doadora a estirpe possuidora dos

plasmídeos pRJ14, pRJ6 e pGO1.

III) Verificar a capacidade das funções Mob do pRJ6 de atuarem sobre a região oriT do

pRJ9.

IV) Comprovar experimentalmente o funcionamento da região oriT do pRJ9.

Abordagens que foram empregadas para se alcançar estes dois objetivos

 Amplificação da provável região oriT do pRJ9;

 Clonagem desta região no vetor de S. aureus pCN37;

 Transformação do produto clonado em S. aureus, gerando o plasmídeo pRJ98;

 Transferência do plasmídeo pRJ98 para a estirpe A70, por transdução;

 Transferência do plasmídeo conjugativo pGO1 para a estirpe gerada, por experimentos

de conjugação;

 Experimentos de conjugação utilizando-se como doadora a estirpe de S. aureus

possuidora dos plasmídeos pR98, pRJ6 e pGO1.

V) Verificar se, na presença do gene mobD, o plasmídeo pRJ9 se torna mobilizável.

Abordagens que foram empregadas para se alcançar este último objetivo

 Amplificação do gene mobD do plasmídeo pRJ6;

 Clonagem do gene mobD no vetor de S. aureus, pT181;

 Transformação do produto clonado (pRJ107) em S. aureus;

 Transferência do plasmídeo pRJ107 para a estirpe MB126, possuidora dos plasmídeos

pRJ14 e pGO1, por transdução;

 Experimentos de conjugação utilizando-se como doadora a estirpe de S. aureus

possuidora dos plasmídeos pRJ107, pRJ14 e pGO1.

3 - MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 - Estirpes bacterianas e condições de cultivo

As estirpes de Staphylococcus spp. que foram usadas neste trabalho encontram-se

listadas na Tabela 2. Todas as estirpes de Staphylococcus spp. foram crescidas em meio TSB

(Difco) líquido ou sólido [acrescido de ágar a 1,5% (p/v)]. Este meio, dependendo da técnica

empregada, sofreu acréscimo de antibióticos. Contudo, esta informação será fornecida,

quando necessária, nas demais técnicas utilizadas no trabalho. A temperatura de incubação

das estirpes foi 37°C e o tempo médio foi de 18 h.

Já as estirpes de Escherichia coli utilizadas foram crescidas em meio LB (Luria-

Bertani) [triptona 1% (p/v), NaCl 0,5% (p/v) e extrato de levedura 0,5% (p/v)] líquido ou

sólido [acrescido de ágar a 1,5% (p/v)]. Este meio, dependendo da técnica empregada, sofreu

acréscimo de componentes como antibióticos, IPTG e X-Gal. Contudo, estas informações

serão fornecidas ao leitor, quando necessárias. A temperatura de incubação destas estirpes

também foi 37°C e o tempo médio ficou entre 24 e 48 h.

Por fim, a única estirpe de Corynebacterium fimi, utilizada como indicadora da

produção de bacteriocina, foi crescida em um meio próprio. Este meio é composto por BHI

(Difco), acrescido de extrato de carne 1 % (p/v), triptona 1 % (p/v) e extrato de levedura 0,5%

(p/v). Dependendo da finalidade, o meio utilizado pode ter sido líquido, sólido ou ainda

semissólido [acrescido de ágar a 0,7% (p/v)]. Novamente, a indicação de cada um deles

surgirá com o desenrolar das técnicas.

O preparo dos estoques bacterianos (apenas Staphylococcus spp. e E. coli) foi feito

através do crescimento “confluente” das estirpes em placas contendo meio TSB sólido, por

18 h, a 37°C. Após este período, o crescimento foi removido das placas com o auxílio de uma

alça de vidro, na presença de 5 ml de meio TSB, preparado em solução crioprotetora de

glicerol a 40% (v/v). Os estoques foram divididos (1,5 ml) em tubos criogênicos e congelados

a -20°C.

3.2 - Confirmação da transcrição dos genes mob por experimentos de RT-PCR

Foram realizados experimentos de RT-PCR para se verificar se ocorre a transcrição

dos genes mob do plasmídeo pRJ9. Os passos seguidos para a realização deste experimento se

encontram descritos nos itens abaixo.

Tabela 2: Estirpes e plasmídeos bacterianos usados neste trabalho

Estirpes

Plasmídeos e fenótipos relevantes

Referências / Fontes

S. aureus

A53

pRJ9 (10,4 kb); Bac

GIAMBIAGI-DEMARVAL et al., 1990

A70

pRJ6 (7,9 kb); Bac

GIAMBIAGI-DEMARVAL et al., 1990

MB49

pRJ14 (15,6 kb; pRJ9::Tn551; Em

); pRJ6; Bac

OLIVEIRA et al., 1998a

MB91

pRJ28 (8 kb)

GAMON et al., 1999

MB108

A70 curada do pRJ6

GIAMBIAGI-DEMARVAL et al., 1990

MB126

pGO1 (52 kb; Gm

); pRJ14 (Em

); Bac

OLIVEIRA et al., 1998a

MB367

pGO1 (Gm

); pRJ14 (Em

); pRJ6; Bac

Este trabalho

MB374

pRJ28; Rif

Fus

Este trabalho

MB387

pCN37 (6,3 kb; Em

)

CHARPENTIER et al., 2004

MB388

pT181mcs (4,8 kb; Tc

)

Este trabalho

MB429

pRJ98 (oriT9 clonada no pCN37; 6,6 kb; Em

)

Este trabalho

MB464

pGO1 (Gm

); pRJ6; pRJ98 (Em

); Bac

Este trabalho

MB465

pGO1 (Gm

); pRJ6; pCN37 (Em

); Bac

Este trabalho

MB476

pGO1 (Gm

); pRJ98 (Em

)

Este trabalho

MB490

pRJ107 (mobD clonado no pT181mcs; 5,1 kb; Tc

)

Este trabalho

MB491

pGO1 (Gm

); pRJ14 (Em

); pRJ107 (Tc

); Bac

Este trabalho

RN4220

hsdR

NOVICK, 1967

RN7242

pGO1 (Gm

)

PROJAN & ARCHER, 1989

S. epidermidis

MB263

Rif

Fus

COELHO et al., 2009

E. coli

DH5α

lacZΔM15; hsdR

SAMBROOK, FRITSCH & MANIATIS, 1989

Ec138

pRJ93 (Ap

)

Este trabalho

Ec111

pCN37 (6,3 kb; Em

)

CHARPENTIER et al., 2004

C. fimi

Indicadora da produção de

NCTC7547

bacteriocina

NCTC

Bac

- produtora de bacteriocina; Ap - ampicilina; Em - eritromicina; Fus - ácido fusídico;

Gm - gentamicina; Tc - tetraciclina; hsdR

- deficiência do sistema de restrição;

lacZΔM15 -

deleção da porção amino-terminal da β-galactosidase; Rif - rifampicina.

3.2.1 - Extração de RNA da estirpe S. aureus A53

Para o isolamento de RNA, a estirpe A53 foi crescida em 5 ml de meio BHI por 18 h, a

37°C. No dia seguinte, 1 ml (aproximadamente 10

células) do crescimento celular foi

centrifugado em microtubo a 6.522 xg por 5 min (Eppendorf Centrifuge 5415R). O sedimento

obtido foi lavado com 1 ml de tampão TE 1X (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM; pH 7,8;

preparado em água deionizada tratada com DEPC), centrifugando-se novamente a 6.522 xg

por 5 min. O líquido foi desprezado e as células suspensas em 700 µl do mesmo tampão TE

1X. A esta suspensão, foram adicionados 10 U de lisostafina (Sigma) e 25 l de solução de

lisozima (Sigma, 40 mg/ml, preparada em água deionizada tratada com DEPC). Após isto, a

preparação foi incubada a 37°C em banho-maria, por 30 min. Ocorrida a lise celular, foram

adicionados 700 µl do tampão 1 (RLT; já preparado com -mercaptoetanol) do sistema

comercial RNeasy (Qiagen) (COELHO et al., 2009). A partir deste ponto, a extração de RNA

ocorreu seguindo-se todas as especificações do fabricante.

Terminada a extração, 2 µl da solução de RNA foram dosados no equipamento

NanoDrop-ND1000-Spectrophotometer (Saveen Werner) e aproximadamente 300 ng desta

preparação foram analisados por eletroforese em gel de agarose (EGA), como descrito no

item 3.3.2, mas com algumas alterações. Foi utilizada agarose a 1,2% (p/v) preparada em

tampão TBE 1X (Tris-borato 89 mM; EDTA 2 mM; pH 8,0). Este tampão foi preparado em

água tratada com DEPC. A partir destas duas técnicas, foi possível se checar a quantidade e a

qualidade do RNA extraído. Este RNA foi estocado a -80°C.

3.2.2 - Tratamento da preparação de RNA com DNase I

Para que fosse possível se realizar os experimentos de RT-PCR com o RNA extraído

da estirpe A53, foi necessário se tratar a solução de RNA com a enzima DNase I, purificando,

assim, a preparação.

Para este tratamento, 10 µg de RNA foram tratados com 2 µl de RNase Out

Recombinat Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen) e 10 µl (27 U) de DNase I livre de RNase

(Invitrogen), na presença de 70 µl de tampão RDD (tampão do sistema comercial RNeasy).

Esta preparação foi incubada à temperatura ambiente por 30 min. Após este tempo, a

preparação foi tratada com igual volume de fenol:clorofórmio-álcool isoamílico (25:24-1, v/v)

e centrifugada a 4°C, a 14.676 xg, por 2 min. A fase aquosa, então, foi transferida para um

novo microtubo, adicionada de dois volumes de etanol absoluto (Merck) a -20°C e a

preparação foi mantida a esta temperatura por cerca de 18 h. No dia seguinte, o material foi

centrifugado nas condições acima descritas, mas por um tempo de 30 min. O sobrenadante foi

descartado e o sedimento foi lavado com 300 µl de etanol 70% (v/v), sendo, então,

centrifugado nas mesmas condições. O sobrenadante foi novamente desprezado e o sedimento

foi colocado para secar a 46°C, por 10 min, no equipamento SpeedVac Concentrator

(SPD2010-Savant). Quando seco, o sedimento foi dissolvido em 20 l de água deionizada

tratada com DEPC e mantido a -80°C.

Após o tratamento com a enzima DNase I, a solução de RNA foi novamente submetida

a uma dosagem e a uma EGA como descrito no item 3.3.2. Além disso, 1 l desta solução

passou por uma PCR, nas mesmas condições da RT-PCR descrita no item abaixo e utilizando-

-se os iniciadores GyrF e GyrR, também mencionados no item abaixo. Esta PCR (controle

negativo) foi realizada para se confirmar se todo o DNA presente na solução havia sido

retirado, evitando-se, assim, falso positivo na reação de RT-PCR (COELHO et al., 2009).

3.2.3 - RT-PCR realizada com o RNA extraído da estirpe S. aureus A53

Para se confirmar a transcrição dos genes mob do pRJ9, desenhou-se os pares de

oligonucleotídeos iniciadores para cada gene, sendo eles: mobCF (5’-

GGTGGGATATATGAGCGAAC-3’) e mobCR (5’-CGCTGATATTACGTTCTAATGC-3’),

amplificando uma região de 350 pb; mobAF (5’-GCGCAACCAAATCAACCTCA-3’) e

mobAR (5’-GTCATGATTACGACAAACTTGG-3’), amplificando uma região de 390 pb; e

mobBF (5’-CGGTTTATCAGCGCGATGAA-3’) e mobBR (5’-

GCGCCATGCTGAATGACC-3’), amplificando uma região de 390 pb. Com estes

iniciadores, foi possível, ainda, se verificar se a região mob deste plasmídeo está organizada

como um operon, fazendo-se as seguintes combinações de oligonucleotídeos: mobCF com

mobAR, amplificando uma região de 791 pb; mobAF com mobBR, amplificando uma região

de 1.410 pb, e mobCF com mobBR, amplificando uma região de 1.800 pb (Figura 7). Foi

desenhado, ainda, um par de oligonucleotídeos iniciadores que amplificasse um gene

conservado em bactérias e de expressão constitutiva, que serviu de controle positivo para a

RT-PCR. Neste caso, o gene selecionado foi o gyrA, codificador da subunidade A da DNA-

-girase, e seus iniciadores foram: GyrF (5’-GCGTGAATCATTTTTAGATTATGCG-3’) e

GyrR (5’-AAGTTAGGGAATCGAGCAG-3’), amplificando uma região de 447 pb

(COELHO et al., 2009).

Antes da realização dos experimentos de RT-PCR, 500 ng do RNA foram tratados com

a enzima SuperScript

III Reverse Transcriptase (Invitrogen), conforme as instruções do

fabricante. Este tratamento teve como objetivo a formação de cDNA a partir das moléculas de

RNA. Após o tratamento, 2 l desta solução de cDNA foram dosados no equipamento

NanoDrop-ND1000-Spectrophotometer.

Com a solução de cDNA pronta, foi possível se realizar os experimentos de RT-PCR.

Nestes experimentos, os iniciadores foram usados na concentração de 20 pmol. A reação foi

realizada em uma solução contendo ainda: tampão para DyNAzyme

II DNA-polymerase

(Finnzymes) na concentração 1X; MgCl

na concentração final de 2,5 mM (Fermentas);

dNTPs (Promega) na concentração final de 10 mM; 100 ng de cDNA e 1 U da enzima

DyNAzyme

II DNA-polymerase. O volume final foi acertado com água deionizada para

50 l (COELHO et al., 2009).

O processo de amplificação foi realizado no aparelho Mastercycler

ep (Eppendorf),

através de uma etapa inicial de desnaturação a 98°C por 1 min, seguida de 30 ciclos de 30 s a

98°C (desnaturação), 1 min a 50°C (anelamento) e 1 min a 72°C (extensão). Por fim, foi

realizada uma etapa adicional de extensão a 72°C, por 1 min.

A visualização do produto da RT-PCR foi obtida em EGA [como descrito no item

3.3.2, contudo em agarose a 1% (p/v) e a 80 V], utilizando-se como controle de tamanho

molecular o padrão 100-bp DNA ladder (New England Biolabs).

Figura 7: Organização dos genes mob do plasmídeo pRJ9. Oligonucleotídeos iniciadores

(setas coloridas); tamanho das regiões amplificadas pelos mesmos (bastões coloridos). A

figura não está retratada em escala.

3.3 - Construção de uma estirpe de S. aureus possuidora dos plasmídeos pRJ14, pRJ6 e

pGO1 por experimentos de conjugação

A fim de se verificar se, na presença do plasmídeo pRJ6, o plasmídeo pRJ14 [pRJ9

marcado com o Tn551, que confere resistência à eritromicina (Em)] se tornaria mobilizável,

foi construída uma estirpe possuidora destes dois plasmídeos e do plasmídeo conjugativo

pGO1, que confere resistência à gentamicina (Gm). Esta construção foi feita por experimentos

de conjugação entre as estirpes RN7242 (possuidora do pGO1) e MB49 (possuidora do pRJ14

e do pRJ6). Para tanto, foi utilizada a técnica de conjugação bacteriana descrita por Projan e

Archer (1989), com algumas modificações.

As estirpes doadora (RN7242) e receptora (MB49) foram crescidas em 5 ml de meio

TSB, por 18 h, a 37°C. Um mililitro do crescimento celular da doadora e 3 ml do crescimento

celular da receptora foram centrifugados no mesmo microtubo estéril, a 6.522 xg, por 5 min.

Com isso, foi obtida a junção das massas celulares das estirpes a sofrerem conjugação. Esta

massa celular foi suspensa no pouco líquido restante no tubo (cerca de 50 l) após a última

decantação. Esta densa suspensão celular foi colocada sobre um filtro de acetato de celulose

com poros de 0,45 m (Millipore) estéril, apoiado sobre uma placa contendo meio TSB, e

incubada por 18 h, a 37°C. Após o período de incubação, o filtro foi removido da superfície do

meio com o auxílio de uma pinça estéril e introduzido em um tubo de ensaio de 12,5 x 1,5 cm.

O crescimento bacteriano foi removido do filtro com 1 ml de salina [solução de NaCl 0,85%

(p/v)] estéril. Deste volume, foram retiradas alíquotas de 100 l que foram semeadas em

placas contendo meio TSB acrescido de agentes seletivos apropriados. Neste caso, a seleção

dos transconjugantes foi feita em meio contendo Em e Gm, todos os antibióticos na

concentração de 10 g/ml. Estas placas foram incubadas por 48 h, a 37°C. Após este período,

o número de colônias transconjugantes foi anotado para ser usado no cálculo da frequência de

conjugação [número de transconjugantes (por ml) / número de células doadoras (por ml)]. As

colônias transconjugantes foram coletadas e analisadas para se determinar a ocorrência da

conjugação. Tais análises foram realizadas através de extração de DNA e eletroforese em gel

de agarose, como será descrito nos subitens abaixo (3.3.1 e 3.3.2, respectivamente).

Todo este processamento foi feito também apenas com a estirpe doadora. Esta etapa

visou à determinação do número de células doadoras, informação esta que foi usada para a

determinação da frequência da conjugação. Contudo, após a estirpe doadora ser removida do

filtro e suspendida em salina, ela foi diluída no mesmo veículo até as diluições 10

-8

e 10

-9

Destas duas diluições, foram retiradas alíquotas de 100 l que foram semeadas em placas

contendo meio TSB sem agente seletivo. Após a incubação por 48 h a 37°C, o número de

colônias foi anotado para ser usado no cálculo da frequência de conjugação.

Importante também na técnica de conjugação é a preparação dos controles das estirpes

doadora e receptora. Estes controles demonstram se as estirpes envolvidas no processo de

conjugação possuem predisposição para apresentarem mutações de resistência para algum dos

agentes seletivos usados, fato que, quando ocorre, dificulta o processo de seleção dos

transconjugantes. Os controles foram preparados de forma igual ao experimento de

conjugação descrito acima. Entretanto, após serem incubadas separadamente sobre os filtros,

as estirpes foram suspensas apenas em 500 l de salina. Deste volume, duas alíquotas de 100

l foram retiradas e semeadas em placas contendo agentes seletivos escolhidos da seguinte

forma: a estirpe doadora foi selecionada com o agente para o qual a receptora apresentava

resistência (Em, na concentração de 10 g/ml); em contrapartida, a receptora foi selecionada

com o agente seletivo ao qual a doadora apresentava resistência (Gm, 10 g/ml).

A estirpe criada a partir deste experimento foi chamada MB367.

3.3.1 - Extração de DNA plasmideal de Staphylococcus spp.

As colônias transconjugantes foram crescidas em 5 ml de meio TSB, por 18 h, a 37°C.

No dia seguinte, o crescimento celular de cada transconjugante foi centrifugado em

microtubos a 6.522 xg por 5 min. Os sedimentos obtidos foram lavados com 500 l de tampão

TE 1X, centrifugando-se novamente a 6.522 xg. Os líquidos foram desprezados e as células

suspensas em 400 l de tampão de extração (Tris-HCl 50 mM; EDTA 10 mM; pH 7,8). A

estas suspensões, foram adicionados 5 l de solução de lisostafina (Sigma, 1 mg/ml, preparada

em água bidestilada estéril), 10 l de solução de lisozima (Sigma, 10 mg/ml, preparada em

água bidestilada estéril) e 10 l de RNase A (Sigma, 100 mg/ml, preparada em água

bidestilada estéril). Após isto, as preparações foram incubadas a 37°C em banho-maria, por

1 h ou até que a lise ocorresse. Ocorrida a lise, que pode ser facilmente verificada pelo

aumento da viscosidade da suspensão, foram adicionados 50 l de solução de pronase E

(Sigma, 10 mg/ml, preparada em Tris-HCl 10 mM, NaCl 10 mM, pH 8,0) e os lisados foram

incubados à mesma temperatura por mais 10 min. Findo este tempo, foram adicionados 100 l

de solução de SDS [10% (p/v), preparada em água destilada], a preparação foi levada

novamente ao banho-maria a 37°C por outros 10 min e, em sequência, a um outro banho-

-maria a 65°C, por 5 min. Imediatamente após o término do tempo, foram acrescentados à

preparação 60 l de solução de KCl 4 M e a mesma foi incubada quase que instantaneamente

no gelo, por cerca de 30 min. Nesta etapa, deve-se formar um material opaco bem

esbranquiçado, caracterizando a precipitação dos restos celulares. Passados os 30 min, o

material foi centrifugado em microcentrífuga refrigerada a 4°C, a 14.676 xg, por 30 min. A

fase aquosa foi coletada em um novo microtubo, adicionando-se dois volumes (entre 0,8 e

1 ml) de etanol absoluto (Merck) a -20°C e a preparação foi mantida a esta temperatura por

cerca de 18 h. Passado este tempo, o material foi centrifugado nas condições acima descritas.

O sobrenadante, então, foi descartado e o sedimento foi colocado para secar à temperatura

ambiente. Quando seco, o sedimento foi dissolvido em 50 l de tampão Tris/HCl 10 mM (pH

7,8) e mantido a -4°C (GIAMBIAGI-DEMARVAL et al., 1990).

3.3.2 - Eletroforese de DNA em gel de agarose

Para se analisar os DNAs plasmideais, foi utilizada a técnica de EGA (SAMBROOK,

FRITSCH & MANIATIS, 1989). Costumeiramente, foi utilizada agarose (Sigma) a 0,7%

(p/v), preparada em tampão TAE (Tris 40 mM; ácido acético 20 mM; EDTA 1 mM; pH 7,8).

Nestes casos, a corrida foi realizada em cubas contendo o mesmo tampão que compunha os

géis, na mesma concentração. O tempo de corrida e a voltagem empregados variaram

conforme a amostra, sendo de 2 h a 60 V, na maioria das vezes, mas, quando foi necessário se

observar a presença do plasmídeo conjugativo pGO1, o tempo foi aumentado para 18 h a

30 V. Importante mencionar que, quando era necessário se observar produtos resultantes das

PCRs ou de digestões com enzimas de restrição, empregava-se agarose a 1,4% (p/v) e a

corrida era realizada por 1 h e 30 min a 70 V, sempre utilizando-se como controle de tamanho

molecular o padrão 100-bp DNA ladder (Promega). Para a aplicação das amostras nos géis,

estas foram misturadas com o corante para eletroforese [glicerol 50% (v/v); azul de

bromofenol 0,02% (p/v); xilenocianol 0,02% (p/v); EDTA 10 mM; pH 7,5] na proporção de

9:1.

Terminadas as corridas, os géis foram mergulhados em solução de brometo de etídio

(1 mg/l), por cerca de 15 min, para que o DNA fosse corado. A visualização dos géis foi

realizada em aparelho transiluminador (TFX-20-M, Vilber Loumart) de luz UV (260 nm) e

eles foram fotografados com o sistema de captura de imagens DP-001-SD (Vilber Loumart).

3.4 - Seleção da estirpe receptora para os experimentos de conjugação com a estirpe S.

aureus MB367

Para que fosse possível a realização de experimentos de conjugação com a estirpe

MB367, foi necessário se encontrar uma estirpe de Staphylococcus spp. receptora que fosse

sensível aos antibióticos Em e Gm, uma vez que as resistências a estas drogas são os

marcadores do pRJ14 e do pGO1, respectivamente, e que fosse resistente a outros dois

antibióticos, para que a seleção após a conjugação pudesse ser feita. Esta estirpe deveria,

ainda, ser resistente à ação das aureocinas A70, codificada pelo pRJ6, e A53, codificada pelo

pRJ14.

A estirpe S. aureus que foi utilizada como receptora, então, foi a MB91, por possuir a

maioria das características necessárias, só precisando se tornar resistente a dois antibióticos.

3.4.1 - Obtenção de mutantes espontâneos resistentes à rifampicina e ao ácido fusídico

A estirpe MB91 foi crescida em 5 ml de meio TSB, à temperatura de 37°C, por 18 h,

com agitação de 120 rpm (incubadora de bancada Cientec, modelo CT -712) para a obtenção

de grande quantidade de massa celular. Após este tempo, a cultura foi centrifugada a 6.522 xg,

por 10 min. As células sedimentadas foram suspensas em 500 l de salina estéril e foram

semeados 100 l desta suspensão em cinco placas contendo 25 ml de meio TSB sólido

adicionado de 10 g/ml de rifampicina (Rif). As placas foram incubadas a 37°C por 24 a 48 h.

As colônias que cresceram foram transferidas para outra placa de Petri contendo meio TSB

sólido e Rif, na concentração já mencionada, e colocadas para crescer novamente a 37°C por

18 h. Um dos mutantes foi selecionado para ser crescido novamente em 5 ml de meio TSB

com agitação, para sofrer todo o processo novamente, mas, agora, as placas com meio sólido

receberam, além de Rif, ácido fusídico (Fus), na mesma concentração.

A estirpe receptora de S. aureus criada após esta seleção foi nomeada MB374.

3.5 - Conjugação entre as estirpes S. aureus MB367 e MB374

A conjugação entre as estirpes MB367 e MB374 foi feita para se analisar se a presença

do pRJ6 tornaria o pRJ14 mobilizável.

A conjugação foi feita em duplicata e conforme descrito no item 3.3, mas, neste caso, a

seleção dos transconjugantes foi feita tanto em meio contendo Rif, Fus e Gm (controle da

transferência do pGO1), quanto em meio contendo Rif, Fus e Em (mobilização do pRJ14),

todos os antibióticos na concentração de 10 g/ml. As colônias transconjugantes formadas no

meio com Em, Rif e Fus foram coletadas e analisadas para se determinar a ocorrência da

mobilização.

3.6 - Análise dos transconjugantes Em

Rif

Fus

Os transconjugantes obtidos a partir do cruzamento entre as estirpes MB367 e MB374,

que cresceram nas placas de Petri contendo meio TSB adicionado de Em, Rif e Fus, passaram

pelos testes abaixo para se verificar se realmente houve mobilização.

3.6.1 - Teste da resistência dos transconjugantes à Gm

Os transconjugantes foram estriados em outras placas de Petri contendo meio TSB

acrescentado de Gm (10 g/ml) e incubados a 37°C por 18 h. Desta forma, foi possível sugerir

a presença ou a ausência do plasmídeo pGO1, pela resistência ou sensibilidade dos

transconjugantes a este antibiótico.

3.6.2 - Teste da produção de bacteriocina pelos transconjugantes

Os transconjugantes foram crescidos em 5 ml de meio TSB, a 37C, por 18 h. Após a

incubação, 5 l das suspensões bacterianas foram inoculados em placas de Petri contendo

meio BHI sólido, sob a forma de pontos. Em seguida, as placas foram incubadas sob as

mesmas condições anteriores. Enquanto isso, a estirpe de Corynebacterium fimi, a ser utilizada

como indicadora, foi crescida em 5 ml de meio específico já mencionado, por 24 h a 37°C.

Transcorridas 18 h, as células produtoras foram mortas com vapores de clorofórmio por 30

min. As placas foram então incubadas a 37C por 1 h para que qualquer resíduo de

clorofórmio evaporasse. Transcorrido este tempo, 0,3 ml da cultura da indicadora foram

colocados em tubos de rosca contendo 3 ml de meio BHI semissólido fundido e, então,

vertidos sobre as placas, que foram incubadas a 37C por 18 h. Após a incubação, foi

verificada a presença ou a ausência de halos de inibição do crescimento de cada estirpe

indicadora (GIAMBIAGI-DEMARVAL et al., 1990). Para a comparação dos halos, o mesmo

teste foi feito com a estirpe doadora dos experimentos de conjugação, MB367.

3.6.3 - Extração de DNA plasmideal dos transconjugantes e EGA

Foi feita uma extração de DNA plasmideal dos transconjugantes e uma EGA do DNA

extraído, para se analisar a presença do pRJ14 e do pGO1, como descrito nos itens 3.3.1 e

3.3.2, respectivamente. Com este experimento, foi possível se verificar se houve mobilização

ou condução do plasmídeo pRJ14. Se o plasmídeo pGO1 estivesse presente, poderia ter

ocorrido uma condução, que se dá quando um plasmídeo se integra ao plasmídeo conjugativo

e é transferido para a célula receptora junto com ele.

3.7 - Clonagem da provável região oriT do plasmídeo pRJ9 no vetor de S. aureus pCN37

No vetor bifuncional (E. coli / S. aureus), pCN37, foi clonada a provável região oriT

do plasmídeo pRJ9, dando origem ao plasmídeo pRJ98. Este plasmídeo foi utilizado para se

verificar se o plasmídeo pRJ6 é capaz de reconhecer a região oriT do pRJ9 e mobilizar o

plasmídeo pRJ98, uma vez que as regiões oriTs dos dois plasmídeos são muito semelhantes

(COUTINHO, 2008).

3.7.1 - Extração de DNA plasmideal da estirpe S. aureus A53, que contém o plasmídeo

pRJ9

Com o objetivo de se obter um DNA mais puro e em maior quantidade, esta extração

foi feita como descrito no item 3.3.1, mas com algumas modificações.

A estirpe A53 foi crescida em 20 ml de meio TSB, por 18 h, a 37°C. No dia seguinte, o

crescimento celular foi centrifugado a 7.740 xg por 10 min (Centrífuga Beckman J2-HS). O

sedimento obtido foi lavado com 4 ml de tampão TE 1X, repetindo-se o mesmo processo de

centrifugação. O líquido foi decantado e as células suspensas em 4 ml de tampão de extração.

Foram adicionados a esta suspensão 15 l de solução de lisostafina (Sigma, 1 mg/ ml,

preparada em água bidestilada estéril), 20 l de solução de lisozima (Sigma, 10 mg/ml,

preparada em água bidestilada estéril) e 20 l de RNase A (Sigma, 100 mg/ml, preparada em

água bidestilada estéril). Após isto, a preparação foi incubada a 37°C em banho-maria, por 1 h,

ou até que a lise ocorresse. Ocorrida a lise, foi adicionado 1 ml de solução de SDS [10% (p/v),

preparada em água destilada]. A preparação foi recolocada no banho-maria a 37°C por outros

15 min e, em sequência, foi levada a outro banho-maria a 65°C, por 8 min. Imediatamente

após o término do tempo, foram acrescentados à preparação 600 l de solução de KCl 4 M e a

mesma foi incubada quase que instantaneamente no gelo por cerca de 30 min. Durante todo

este procedimento, foi evitada a agitação da solução para se prevenir a quebra excessiva do

DNA cromossômico. Passados 30 min, o material foi centrifugado em centrífuga refrigerada a

4°C, a 17.400 xg, por 30 min. A fase aquosa foi coletada (cerca de 5 ml) em um tubo de vidro

Corex™ e foi adicionado igual volume de solução de fenol:clorofórmio-álcool isoamílico

(25:24-1, v/v), agitando-se o tubo para homogeneizar a solução, que foi centrifugada a 7.740

xg, por 5 min, a 25°C. Foram coletados apenas os 2 ml superiores da fase aquosa em novo

tubo de vidro e igual volume de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1, v/v) foi acrescentado,

agitando-se o tubo para homogeneizar a solução, que foi centrifugada novamente a 7.740 xg,

por 5 min, a 25°C. Duas alíquotas de 600 l foram coletadas em dois microtubos, aos quais

foram adicionados 720 l de isopropanol. O material foi incubado por 15 min a -20°C. Após

isto, a solução foi centrifugada a 14.676 xg, por 15 min, a 4°C. Passada a centrifugação, o

sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi posto para secar à temperatura ambiente.

Quando seco, o sedimento foi dissolvido em 150 l de tampão Tris/HCl 10 mM (pH 7,8) e

mantido a -4°C.

3.7.2 - Amplificação da provável região oriT do plasmídeo pRJ9

Para se amplificar a provável região oriT do plasmídeo pRJ9, desenhou-se o par de

oligonucleotídeos iniciadores oriT9F (5’-AGCTAAATCGGCTGCGTC-3’) e oriT9R

(5’- TATGAATTTGCCCATTAACCG-3’). Tais iniciadores serviram para a amplificação de

uma região de 319 pb. Os iniciadores foram usados na concentração de 50 pmol. A reação foi

realizada em uma solução contendo ainda: tampão para Taq DNA-polimerase (Fermentas) na

concentração 1X; MgCl

na concentração final de 2 mM (Fermentas); dNTPs (Invitrogen) na

concentração final de 0,2 mM; 25 ng de DNA e 0,5 U da enzima Taq DNA-polymerase

(Fermentas). O volume final foi acertado com água deionizada para 50 L.

O processo de amplificação foi realizado no aparelho MyCycler

(Bio-Rad

Laboratories, Inc.), através de uma etapa inicial de desnaturação a 94°C por 5 min, seguida de

30 ciclos de 1 min a 94°C (desnaturação), 1 min a 52°C (anelamento) e 30 s a 72°C

(extensão). Por fim, foi realizada uma etapa adicional de extensão a 72°C, por 3 min.

A visualização do produto da PCR foi obtida através de EGA, como descrito no item

3.3.2.

3.7.3 - Purificação do produto da PCR

O produto da PCR da provável região oriT do plasmídeo pRJ9 foi purificado com o

uso do sistema comercial Wizard

SV Gel and PCR Clean-up System (Promega), seguindo-se

todas as especificações do fabricante. A quantidade de DNA presente na solução, após a

purificação, foi determinada como descrito no item 3.7.4.

3.7.4 - Quantificação das soluções de DNA por comparação com o padrão "-HindIII"

Para se verificar a quantidade de DNA presente na solução contendo o fragmento

amplificado, foi utilizado o método de comparação com o DNA do fago  digerido com a

enzima HindIII. Esta solução de DNA possui uma quantidade predeterminada e o DNA fica

fragmentado em sete fragmentos visíveis que possuem aproximadamente as seguintes

quantidades de DNA: 10 ng, 40 ng, 50 ng, 90 ng, 130 ng, 190 ng e 480 ng. Sendo assim, a

comparação da intensidade luminosa das bandas geradas pelo DNA presente em uma solução,

com cada uma das bandas referentes à digestão do DNA do fago , permite uma estimativa da

quantidade de DNA presente em solução. Sabendo-se disso, a solução de DNA que contém o

amplicon oriT foi submetida à EGA, como descrito no item 3.3.2, junto com o padrão "-

-HindIII". Por esta análise, determinou-se que a solução do fragmento amplificado continha,

aproximadamente, 25 ng/l de DNA.

3.7.5 - Ligação do fragmento amplificado ao vetor pGEM

-T Easy

O fragmento amplificado foi ligado ao vetor pGEM

-T Easy (Promega) de acordo com

as especificações do fabricante, utilizando-se 25 ng de DNA do inserto.

3.7.6 - Preparação das células termocompetentes de E. coli

A estirpe E. coli DH5α foi crescida em 5 ml de meio LB a 37°C, por 18 h.

Posteriormente, 500 l da cultura foram inoculados em 50 ml do mesmo meio. O inóculo foi

crescido sob agitação (100 rpm), a 37°C, por 2 h e 30 min. As células foram centrifugadas a

7.740 xg por 10 min e o sedimento suspenso em 25 ml de solução de MgCl

0,1 M gelada. A

suspensão celular foi incubada em banho de gelo por 10 min e, após isto, centrifugada nas

mesmas condições descritas anteriormente. O sedimento foi suspenso em 25 ml de solução de

CaCl

0,1 M gelada. Novamente, as células foram centrifugadas como já descrito. O

sedimento foi suspenso em 1,25 ml da solução de CaCl

0,1 M gelada e foi distribuído 0,1 ml

do total em cerca de 12 microtubos. Estes foram rapidamente congelados a -70°C e mantidos a

esta temperatura, permitindo às células um período de viabilidade de cerca de 6 meses

(SAMBROOK, FRITSCH & MANIATIS, 1989).

3.7.7 - Transformação das células competentes de E. coli com o produto da ligação

A preparação das células competentes a ser usada foi retirada do freezer a -70°C e

deixada para descongelar em banho de gelo. A esta preparação descongelada, foram

misturados 10 l da ligação. A mistura foi incubada em banho de gelo por 45 min. Findo este

tempo, um choque térmico a 42°C, por 2 min, foi aplicado. Após isso, foi adicionado

rapidamente 1 ml de meio LB e as células foram incubadas a 37°C, por 2 h, para a expressão

fenotípica. Passado este período de incubação, alíquotas de 100 l da suspensão celular foram

semeadas em placas contendo meio LB adicionado de ampicilina (75 g/ml), X-Gal (75

g/ml, preparado em dimetilformamida) e IPTG (40 g/ml, preparado em água). Estas placas

foram incubadas a 37°C, por 18 h (SAMBROOK, FRITSCH & MANIATIS, 1989). As

colônias brancas foram selecionadas para a realização de uma extração de DNA plasmideal

como descrito abaixo, no item 3.7.8. A partir deste DNA extraído, foi feita uma EGA, como

descrito no item 3.3.2, para se verificar a presença do plasmídeo. Os DNAs correspondentes

ao plasmídeo foram submetidos a novas reações de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores

oriT, como descrito no item 3.7.2, para se confirmar a presença do inserto.

3.7.8 - Extração de DNA plasmideal de E. coli

Os transformantes selecionados foram crescidos em 2 ml de meio LB, por 24 h a 37°C.

As culturas foram centrifugadas em microtubos a 6.522 xg, por 5 min. Após isto, os

sedimentos foram lavados com 500 l de tampão TE 1X e centrifugados nas mesmas

condições anteriores. Foram adicionados, então, 100 l de TE 1X, para suspender os

sedimentos, 40 l de pronase E (Sigma, 10 mg/ml, preparada em Tris/HCl 10 mM, NaCl 10

mM, pH 8,0) e 15 l de RNase A (Sigma, 100 mg/ml, preparada em água bidestilada estéril).

A estas suspensões foram acrescentados 200 l de solução de SDS 1% (p/v) e NaOH 0,2 N,

misturando-se bem. Após 15 min à temperatura ambiente, foram adicionados 150 l de acetato

de sódio 3 M (pH 4,8), misturando-se novamente. As suspensões foram mantidas no gelo por

20 min e, após isto, foram centrifugadas a 14.676 xg, por 15 min a 4°C. Os sobrenadantes

foram coletados em novos microtubos e foram adicionados dois volumes de etanol absoluto

(Merck) gelado. As preparações foram mantidas a -20 °C por pelo menos 18 h. Após este

tempo, elas foram centrifugadas a 14.676 xg, por 20 min a 4°C. Os sobrenadantes foram

desprezados e os sedimentos foram colocados para secar à temperatura ambiente. Quando

secos, foram dissolvidos em 20 l de TE 1X (BIRNBOIM & DOLY, 1979, modificado).

3.7.9 - Sequenciamento dos clones de E. coli contendo a provável região oriT do

plasmídeo pRJ9 inserida no vetor pGEM

-Teasy

Após a seleção dos clones, quatro deles foram enviados para terem a sequência de

nucleotídeos dos insertos determinada. Para tanto, foi utilizado o par de oligonucleotídeos

iniciadores M13 forward (5’-CGCCAGGTTTTTCCCAGTCACGAC-3') e reverse (5’-

CAGGAAACAGCTATGAC-3'). O processo de sequenciamento utilizou o sistema ABI Prism

3100 e o sistema comercial Terminator Chemistry Big Dies versão 3.1 (Perkin Elmer) e foi

realizado em colaboração com o Laboratory of Microbial Gene Technology da Norwegian

University of Life Sciences.

3.7.10 - Análise das sequências de DNA obtidas usando-se o programa ClustalX

O alinhamento das sequências de nucleotídeos dos clones, após o sequenciamento, foi

realizado com o auxílio da ferramenta ClustalX do programa BioEdit. Com esses

alinhamentos, foi possível se determinar quais clones possuíam a sequência da provável região

oriT do pRJ9 sem nenhuma mutação. Os clones foram nomeados Ec138, contendo o

plasmídeo pRJ93, resultante da clonagem do fragmento oriT no vetor pGEM

-Teasy.

3.7.11 - Extração de DNA da estirpe E. coli Ec111 contendo o plasmídeo pCN37

Para se conseguir quantidade suficiente do plasmídeo pCN37, para ser usada nas

reações de ligação com o fragmento oriT do plasmídeo pRJ9, foi utilizado o sistema

comercial Wizard

Plus SV

Miniprep DNA Purification System (Promega). O método de

extração foi feito de acordo com as especificações do fabricante.

3.7.12 - Digestão do DNA dos plasmídeos pCN37 e pRJ93

O DNA dos plasmídeos pCN37 e pRJ93 foi digerido com a enzima EcoRI, da seguinte

forma: 500 ng de DNA do plasmídeo pRJ93

e 350 ng de DNA do pCN37 foram digeridos com

40 U de enzima EcoRI (NEB), no tampão específico para esta enzima, em um volume final de

40 l, para o primeiro plasmídeo, e de 30 l, para o segundo. Estas reações se deram a 37°C

por 2 h.

Após a digestão, o DNA do plasmídeo pCN37, em sua forma linear, foi tratado com

fenol:clorofórmio-álcool isoamílico, como descrito no item 3.7.14. A visualização do

fragmento gerado a partir da digestão do DNA do pRJ93 foi obtida por EGA, como descrito

no item 3.3.2. O fragmento com o tamanho aproximado do inserto foi eluído da agarose como

descrito abaixo.

3.7.13 - Eluição do DNA da agarose

Para que o fragmento correspondente ao fragmento oriT fosse purificado para ser

posteriormente ligado ao pCN37, foi necessário se usar o sistema comercial Wizard

SV Gel

and PCR Clean-up System (Promega). Para tanto, após cortar do gel o pedaço contendo o

fragmento de interesse, as instruções do fabricante foram seguidas para se proceder à

purificação. A determinação da quantidade de DNA presente em solução, após a eluição da

agarose, foi realizada como descrito no item 3.7.4, revelando uma concentração de DNA de

5 ng/µl.

3.7.14 - Tratamento do produto da digestão do pCN37 com fenol:clorofórmio-álcool

isoamílico

Para se remover desta solução as enzimas usadas para clivar o DNA, foi utilizado o

método do tratamento com fenol:clorofórmio-álcool isoamílico. Para tanto, a solução de DNA

teve o seu volume completado para 100 l, com a adição de 70 l de água deionizada estéril.

A esta solução, foram adicionados 100 l de fenol:clorofórmio-álcool isoamílico (25:24-1,

v/v). A mistura foi bem homogeneizada e centrifugada a 6.522 xg, por 5 min, a 25°C. Foram

coletados cerca de 90 l da fase aquosa da preparação e ela foi tratada com 100 l de

clorofórmio:álcool isoamílico (24:1, v/v). O processo de centrifugação foi repetido e foram

coletados cerca de 90 l da fase aquosa da preparação. Foram adicionados 10 l de acetato de

sódio 3 M (pH 7,0) e 250 l de etanol absoluto gelado. A solução foi incubada a -20°C por

18 h e centrifugada a 14.676 xg, por 30 min a 4°C. O sedimento, após seco, foi dissolvido em

10 l de água deionizada estéril e mantido a 4°C.

3.7.15 - Ligação do fragmento oriT ao plasmídeo pCN37

Para a ligação do fragmento oriT retirado do pGEM

-T Easy ao plasmídeo pCN37,

foram utilizados 45 ng do fragmento oriT, 90 ng do pCN37 digerido, 4 µl de tampão de

ligação 5X e 1 U da DNA-ligase do fago T4 (Invitrogen), em um volume final de 20µl. A

reação se deu a 16°C, por 18 h.

3.7.16 - Tratamento do produto da ligação com álcool isobutílico

Visando-se retirar qualquer resíduo de sal do produto da ligação entre o fragmento oriT

e o vetor pCN37, para que a transformação ocorresse como desejado, foi feito um tratamento

da solução de ligação com álcool isobutílico da seguinte forma: o volume final da solução foi

levado para 50 l com água deionizada; foram adicionados 500 l de álcool isobutílico e a

solução foi misturada em um agitador de tubos por 30 s; após este tempo, foi feita uma

centrifugação a 14.676 xg, por 10 min a 4 °C, descartando-se, posteriormente, o sobrenadante;

o sedimento foi colocado para secar à temperatura ambiente e dissolvido em 10 l de água

deionizada (WILLIAMSON & SLOCUM, 1994).

3.7.17 – Preparo de células eletrocompetentes e transformação de S. aureus com o

produto da ligação

Para a transformação de S. aureus com o produto da ligação do fragmento oriT ao

vetor pCN37, foi utilizado o protocolo de eletroporação desenvolvido por Schenk e Laddaga

(1992).

De acordo com o protocolo, a estirpe S. aureus RN4220 foi crescida em 5 ml de meio

TSB, a 37°C por 18 h. No dia seguinte, 1 ml deste crescimento foi inoculado em 25 ml do

mesmo meio, em um erlenmeyer de 250 ml. Este inóculo foi incubado com aeração (120 rpm),

por cerca de 2 h e 30 min. Após este tempo, as células foram centrifugadas a 7.740 xg, por 10

min a 20°C. O sedimento celular foi lavado três vezes com água deionizada estéril a 20°C,

repetindo-se as mesmas condições de centrifugação já citadas. Após estas lavagens, o

sedimento foi lavado uma vez com 5 ml de solução de glicerol a 10% (v/v; preparada em água

deionizada), a 20°C, e uma vez com 2,5 ml da mesma solução, apenas com a seguinte

diferença no tratamento: antes de centrifugadas, as células foram incubadas por 15 min, a

20°C. Cada lavagem foi seguida de uma centrifugação nos moldes já descritos. Por fim, o

sedimento obtido na última lavagem foi suspenso em 800 l da solução de glicerol a 10%.

Este volume foi então dividido por vários microtubos (70 l por microtubo), congelado

imediatamente a -70°C e mantido a esta temperatura até que fosse usado. Nestas condições, a

viabilidade das células é de aproximadamente 6 meses.

Para se eletroporar o plasmídeo nas células, estas foram descongeladas à temperatura

ambiente (25°C) e misturadas com cerca de 40 ng de DNA plasmideal. Este material foi

transferido para uma cubeta de eletroporação de gap 0,1 e submetido a um pulso elétrico com

as seguintes características: 2,3 kV; 25 F e 100 Ω. Imediatamente após o pulso, foram

adicionados 400 l de meio TSB e as células foram incubadas a 37°C, por 2 h, para expressão

fenotípica [resistência à Em]. Após este período de incubação, 0,1 ml das células foi semeado

em placas contendo meio TSB acrescido de Em (10 g/ml), que foram mantidas a 37°C por 24

a 48 h.

3.7.18 - Análise dos transformantes de S. aureus com o produto da ligação do fragmento

oriT ao plasmídeo pCN37

Os transformantes obtidos foram analisados por extração de DNA plasmideal e EGA,

como descrito nos itens 3.3.1 e 3.3.2, para se verificar a presença de formas plasmideais com

tamanhos em torno de 6,6 kb [tamanho esperado para a junção do fragmento oriT

(aproximadamente 320 pb) com o pCN37 (6,3 kb)]. A partir das extrações de DNA plasmideal

realizadas, foi feita, também, uma PCR com os oligonucleotídeos iniciadores oriT, como

descrito no item 3.7.2, para se ter certeza da presença do inserto. O plasmídeo criado a partir

da clonagem do fragmento oriT no vetor pCN37 foi nomeado pRJ98 e a estirpe possuidora

deste plasmídeo foi nomeada MB429.

3.8 - Transferência dos plasmídeos pRJ98 e pCN37 para a estirpe S. aureus A70 e do

plasmídeo pRJ98 para a estirpe S. aureus MB108

Com o objetivo de se verificar se o plasmídeo pRJ6 é capaz de reconhecer e mobilizar

a região oriT do pRJ9, o plasmídeo pRJ98 foi inserido na estirpe A70 por transdução. O

mesmo foi feito com o plasmídeo pCN37, que serviu como controle dos experimentos de

conjugação. Portanto, duas estirpes derivadas da A70 foram criadas: uma possuindo os

plasmídeos pRJ6 e pRJ98, e a outra, controle, carreando os plasmídeos pRJ6 e pCN37. Além

destas duas estirpes, foi necessário ainda, se criar uma terceira estirpe controle com o

plasmídeo pRJ98, que não possuísse o plasmídeo pRJ6 para se ter certeza de que a

mobilização do pRJ98, se houvesse, teria ocorrido pela atuação das proteínas Mob codificadas

pelo plasmídeo pRJ6, e não pelas proteínas Mob codificadas pelo plasmídeo conjugativo,

pGO1. Portanto, o plasmídeo pRJ98 foi inserido por transdução na estirpe MB108, que é a

estirpe A70 curada do plasmídeo pRJ6.

Todos os passos para a realização destes experimentos estão descritos nos subitens

abaixo.

3.8.1 - Propagação do fago 80α nas estirpes S. aureus MB429 e MB387

As estirpes MB429 e MB387, contendo os plasmídeos pRJ98 e pCN37,

respectivamente, foram crescidas em 5 ml de TBS, a 37ºC, por 18 h. Após este tempo, 0,5 ml

do crescimento de cada uma foi inoculado em frascos do tipo Erlenmeyer contendo 20 ml

de meio TSB. Estas culturas foram crescidas a 37ºC, por 2 h e 30 min, sob agitação constante

(120 rpm). Transcorrido este tempo, foram acrescentadas a cada cultura cerca de 10

ufp do

fago 80α. As culturas foram mantidas a 37ºC, por 30 min, sem agitação, para que as partículas

virais conseguissem se adsorver às células. Após os 30 min, as culturas foram reincubadas sob

agitação lenta (50 rpm), a 37ºC, até que a lise celular ocorresse. Ocorrida a lise celular, cada

suspensão foi centrifugada a 7.740 xg, por 10 min a 4ºC, e os sobrenadantes foram

esterilizados em membranas filtrantes com poros de 0,45 µm (Millipore) (BASTOS,

BONALDO & PENIDO, 1980).

3.8.2 - Transdução dos plasmídeos pRJ98 e pCN37 com o fago 80α para a estirpe S.

aureus A70 e do plasmídeo pRJ98 para a estirpe S. aureus MB108

Para a transdução destes plasmídeos, as estirpes receptoras citadas (A70 e MB108)

foram crescidas em 5 ml de TSB, a 37ºC por 18 h. No dia seguinte, 3 ml do crescimento

foram adicionados a 2 ml de meio TSB fresco e cerca de 3 ml do lisado das estirpes doadoras

foram adicionados ao crescimento celular. Esta preparação foi incubada por 30 min a 37ºC e,

logo após, 100 µl de uma solução de citrato de sódio 1 M foram adicionados. Após isto, a

preparação foi incubada a 37ºC, por 2 h. Findo este tempo, as suspensões foram centrifugadas

a 7.740 xg, por 10 min a 4ºC. O sedimento foi suspenso em 1 ml de salina e alíquotas de 100

µl foram semeadas em placas contendo meio TSB que foi adicionado de Em, na concentração

de 10 µg/ml. As placas foram incubadas a 37ºC, por 24 h (BASTOS, BONALDO &

PENIDO, 1980). As colônias que surgiram tiveram o seu DNA extraído, como descrito no

item 3.3.1, e analisado através de EGA, como descrito no item 3.3.2.

3.9 - Transferência do plasmídeo conjugativo pGO1 por experimentos de conjugação

para as estirpes geradas

Para que se pudesse utilizar as estirpes construídas no item anterior nos experimentos

de conjugação, era necessário que as mesmas possuíssem algum plasmídeo conjugativo para

promover o contato celular entre a célula doadora e a receptora. Para tanto, foram feitos

experimentos de conjugação utilizando-se a estirpe RN7242, possuidora do plasmídeo

conjugativo pGO1, como doadora, e as estirpes A70, contendo o plasmídeo pRJ98 ou pCN37,

e MB108, contendo o plasmídeo pRJ98, como receptoras.

As conjugações foram feitas conforme descrito no item 3.3 e a seleção dos

transconjugantes foi feita em meio contendo Gm e Em, ambos os antibióticos na concentração

de 10 g/ml. As colônias transconjugantes geradas foram coletadas e analisadas por extração

de DNA e EGA, como descrito nos itens 3.3.1 e 3.3.2, respectivamente.

As estirpes geradas após esses experimentos foram nomeadas MB464 (A70 contendo

os plasmídeos pRJ6, pRJ98 e pGO1), MB465 (A70 contendo os plasmídeos pRJ6, pCN37 e

pGO1) e MB476 (MB108 contendo os plasmídeos pRJ98 e pGO1).

3.10 - Experimentos de conjugação utilizando-se as estirpes S. aureus MB464, MB465 e

MB476 como doadoras

Foram realizados experimentos de conjugação utilizando-se as estirpes citadas como

doadoras e a estirpe S. epidermidis MB263, como receptora.

A estirpe MB464 foi empregada com o objetivo de se verificar a capacidade das

funções mob do pRJ6 de atuarem sobre a região oriT do pRJ9, enquanto que a estirpe MB465

foi utilizada como controle destes experimentos, por possuir o plasmídeo pCN37 sem a

provável região oriT do pRJ9. Para se garantir que, se houvesse mobilização do plasmídeo

pRJ98, seria pela atuação das proteínas Mob do plasmídeo pRJ6 sobre a provável região oriT

do pRJ9, e não pela atuação das proteínas Mob do plasmídeo conjugativo pGO1, foram feitos

experimentos de conjugação com a estirpe MB476, por esta não possuir o plasmídeo pRJ6.

Estes três experimentos de conjugação foram realizados em duplicata e conforme descrito no

item 3.3, mas, neste caso, a seleção dos transconjugantes foi feita tanto em meio contendo Rif,

Fus e Gm (controle da transferência do pGO1), quanto em meio contendo Rif, Fus e Em

(mobilização do pRJ98 ou do pCN37), todos os antibióticos na concentração de 10 g/ml. As

colônias transconjugantes com resistência à Em, foram coletadas e analisadas para se

determinar a ocorrência da mobilização. Tais análises foram realizadas, verificando-se a

resistência dos transconjugantes à Gm (indicativa da presença do plasmídeo conjugativo,

pGO1), como descrito no item 3.6.1, e através de extração de DNA e EGA, como descrito nos

itens 3.3.1 e 3.3.2, respectivamente.

3.11 - Clonagem do gene mobD do plasmídeo pRJ6 no vetor de S. aureus pT181mcs

Com o objetivo de se verificar se a ausência do gene mobD é a responsável pela

incapacidade de mobilização do plasmídeo pRJ9, este gene foi clonado no vetor pT181mcs,

de S. aureus. Tal vetor apresenta, como característica importante, um sítio de clonagens

múltiplas posicionado a jusante do promotor do gene lac, o que permite a expressão

constitutiva dos genes clonados nesta região. O plasmídeo gerado após esta clonagem, foi

nomeado pRJ107 e foi inserido na estirpe MB126 que possui os plasmídeos pRJ14 e pGO1. A

mobilização do plasmídeo pRJ14, na presença da proteína MobD, foi analisada por

experimentos de conjugação.

Todos os passos para a realização destes experimentos estão descritos nos subitens

abaixo.

3.11.1 - Amplificação do gene mobD do plasmídeo pRJ6

Após a extração do DNA do plasmídeo pRJ6 da estirpe S. aureus A70, como descrito

no item 3.7.1, foi realizada uma PCR para se amplificar o gene mobD. Para tanto, desenhou-se

o par de oligonucleotídeos iniciadores mobDF2 (5’-

ATCTGCAGGTGAGTTACGTGAAAGGCTGG-3’) e mobDR2 (5’-

CGGAATTCGCGCTTAGTTTAGTGGTTGCC -3’), com sítios para as enzimas de restrição

PstI e EcoRI, respectivamente (sequências sublinhadas). Estas enzimas de restrição foram

escolhidas para permitir a clonagem direcionada do gene mobD no vetor pT181mcs, de modo

que o P

lac

ficasse a montante do gene mobD, possibilitando a correta expressão do gene a

partir deste promotor. Tais iniciadores serviram para a amplificação de uma região de 251 pb.

Os iniciadores foram usados na concentração de 50 pmol. A reação foi realizada como

descrito no item 3.7.2, mas utilizando-se uma temperatura de anelamento de 60°C. A

visualização do produto da PCR foi obtida através de EGA, como descrito no item 3.3.2.

O produto da PCR do gene mobD do plasmídeo pRJ6 foi purificado com o uso do

sistema comercial Wizard

SV Gel and PCR Clean-up System (Promega), como descrito no

item 3.7.3, e, para se verificar a quantidade de DNA presente na solução do fragmento

amplificado, foi utilizado o método de comparação com o DNA do fago  digerido com a

enzima HindIII, como descrito no item 3.7.4.

3.11.2 - Digestão do DNA do vetor pT181mcs e do amplicon mobD

Os DNAs do vetor pT181mcs e do amplicon mobD foram digeridos com as enzimas

EcoRI e PstI da seguinte forma: 600 ng de DNA do amplicon mobD foram digeridos com

30 U de enzima EcoRI (NEB) e 30 U de PstI (NEB) e 300 ng do vetor pT181mcs foram

digeridos com 20 U de EcoRI (NEB) e 20 U de SalI (NEB). As duas reações se deram no

tampão específico para a enzima EcoRI, mas em um volume final de 50 l para a primeira

digestão e de 40 l para a segunda. Estas reações se deram a 37°C por 4 h.

Após a digestão, o DNA do pT181mcs ficou em sua forma linear e foi tratado com

fenol:clorofórmio-álcool isoamílico, como descrito no item 3.7.14. O fragmento mobD

digerido foi tratado com o sistema comercial Wizard

SV Gel and PCR Clean-up System

(Promega), como descrito no item 3.7.3. A determinação da quantidade de DNA presente em

solução, após o tratamento, foi realizada como descrito no item 3.7.4.

3.11.3 - Ligação do fragmento mobD ao vetor pT181mcs

Para a ligação do fragmento mobD ao vetor pT181mcs, foram utilizados 100 ng do

fragmento mobD, 75 ng do pT181mcs digerido, 4 µl de tampão de ligação 5X e 1 U da DNA-

-ligase do fago T4 (Invitrogen), em um volume final de 20 µl. A reação se deu a 16°C, por

18 h. Após este tempo, o produto da ligação foi tratado com álcool isobutílico como descrito

no item 3.7.16, para a retirada de qualquer resíduo de sal.

3.11.4 - Transformação de S. aureus com o produto da ligação

Foram feitos experimentos de transformação de S. aureus como descrito no item

3.7.17, mas utilizando-se tetraciclina (Tc), na concentração de 10 µg/ml, para selecionar os

transformantes.

Para se analisar os transformantes, uma extração de DNA plasmideal e uma EGA

foram realizadas, como descrito nos itens 3.3.1 e 3.3.2, para se verificar a presença de formas

plasmideais com tamanhos em torno de 5,1 kb [tamanho esperado para a junção do fragmento

mobD (aproximadamente 300 pb) com o pT181mcs (4,8 kb)]. A partir da extração de DNA

plasmideal realizada, foi feita, também, uma PCR com os oligonucleotídeos iniciadores

mobD2, como descrito no item 3.11.1, para se ter certeza da presença do inserto. O plasmídeo

criado foi nomeado pRJ107 e a estirpe possuidora deste plasmídeo foi nomeada MB490.

3.11.5 - Sequenciamento do fragmento mobD inserido no pRJ107

O plasmídeo pRJ107 foi enviado para ter a sequência do inserto determinada. Para

tanto, foi utilizado o par de oligonucleotídeos iniciadores M13 forward (5’-

CGCCAGGTTTTTCCCAGTCACGAC-3') e reverse (5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3'). O

processo de sequenciamento foi realizado em colaboração com o Laboratório de Unidade

Genômica do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da UFRJ.

O alinhamento das sequências obtidas dos clones foi realizado como descrito no item

3.7.10.

3.12 – Transferência do plasmídeo pRJ107 para a estirpe S. aureus MB126

Para que se pudesse verificar a atuação in trans da proteína MobD era necessário se

inserir o plasmídeo pRJ107 em uma estirpe que possuísse o plasmídeo pRJ9 marcado com um

gene de resistência, como a estirpe MB126. Esta estirpe possui o plasmídeo pRJ14, que é o

plasmídeo pRJ9 marcado com o Tn551, que codifica resistência à Em, e o plasmídeo

conjugativo pGO1.

Para se inserir o plasmídeo pRJ107 na estirpe MB126, foi utilizado o método de

transdução. Primeiramente, o fago 80α foi propagado na estirpe possuidora do plasmídeo

pRJ107, MB490, como descrito no item 3.8.1 e, então, o plasmídeo foi transduzido para a

estirpe MB126 como descrito no item 3.8.2. Entretanto, neste experimento a seleção dos

transdutantes se deu na presença de Em, Gm e Tc, na concentração de 10 µg/ml.

A estirpe gerada foi nomeada MB491.

3.13 - Confirmação da transcrição do gene mobD no plasmídeo pRJ107 por experimentos

de RT-PCR

Foram realizados experimentos de RT-PCR para se confirmar a transcrição do gene

mobD do plasmídeo pRJ107. Para tanto, primeiramente, foi feita uma extração de RNA da

estirpe MB491, como descrito no item 3.2.1. Posteriormente, a preparação de RNA foi tratada

com DNase I, como descrito no item 3.2.2.

A RT-PCR foi realizada utilizando-se os oligonucleotídeos iniciadores mobDF (5’-

GTGAGTTACGTGAAAGGCTGG-3’) e mobDR (5’- GCGCTTAGTTTAGTGGTTGCC-3’).

Tais iniciadores serviram para a amplificação de uma região de 235 pb, onde o gene está

presente. A reação foi realizada como descrito no item 3.2.3, mas utilizando-se uma

temperatura de anelamento de 52°C. A visualização do produto da RT-PCR foi obtida através

de EGA, como descrito no item 3.3.2.

3.14 - Experimentos de conjugação utilizando-se a estirpe S. aureus MB491 como

doadora

Foram realizados experimentos de conjugação utilizando-se a estirpe citada como

doadora e a estirpe S. epidermidis MB263, como receptora.

Estes experimentos foram realizados para se verificar se, na presença da proteína

MobD, o plasmídeo pRJ14 se torna mobilizável e foram feitos em duplicata, como descrito no

item 3.10.

4 – RESULTADOS

4.1 – Confirmação da transcrição dos genes mob por experimentos de RT-PCR

Para se confirmar a transcrição dos genes mob do plasmídeo pRJ9, foram realizados

experimentos de RT-PCR com cDNA obtido a partir do RNA extraído da estirpe S. aureus

A53 (Figura 8). Nesta RT-PCR, foram utilizados os iniciadores: mobC, amplificando uma

região de ~350 pb e confirmando a transcrição do gene mobC; mobA, amplificando uma

região de ~390 pb e confirmando a transcrição do gene mobA; mobB, amplificando uma

região de ~390 pb e confirmando a transcrição do gene mobB; mobCF e mobAR,

amplificando uma região de ~791 pb e confirmando a cotranscrição dos genes mobC e mobA;

mobAF e mobBR, amplificando uma região de ~1.410 pb e confirmando a cotranscrição dos

genes mobA e mobB; e mobCF e mobBR, amplificando uma região de ~1.800 pb e

confirmando a cotranscrição dos três genes mob.

A partir dos resultados encontrados nesses experimentos, foi possível se comprovar a

transcrição dos três genes mob do plasmídeo pRJ9 e, ainda, a cotranscrição deles. Apesar de

não ter ocorrido amplificação de um fragmento único com a utilização dos iniciadores mobCF

e mobBR, o resultado das outras duas combinações de oligonucleotídeos iniciadores indica

que os genes mob do pRJ9 estão organizados como um operon. É importante ressaltar que não

houve amplificação no controle negativo destes experientos, excluindo-se a possibilidade de

haver sobra de DNA nas soluções de RNA (dados não mostrados).

4.2 – Construção da estirpe heteroplasmideal S. aureus MB367

A estirpe de S. aureus MB367 foi construída pela conjugação entre as estirpes

RN7242, possuidora do plasmídeo conjugativo pGO1, e MB49, possuidora dos plasmídeos

pRJ6 e pRJ14. Os transconjugantes deste experimento foram selecionados em meio contendo

Gm e Em e a conjugação foi confirmada por EGA, onde foi possível se observar a presença

do plasmídeo pGO1 (dados não mostrados).

A nova estirpe construída foi utilizada em experimentos de conjugação para que fosse

possível a análise da capacidade de mobilização do plasmídeo pRJ14 na presença do pRJ6.

Figura 8: EGA mostrando o resultado da amplificação por RT-PCR realizada com o cDNA

obtido a partir do RNA extraído da estirpe A53. 1, padrão 100-bp DNA ladder (New England

Biolabs); 2, amplificação utilizando os iniciadores mobA; 3, amplificação utilizando os

iniciadores mobB; 4, amplificação utilizando os iniciadores mobC; 5, amplificação utilizando

os iniciadores mobAF e mobBR; 6, amplificação utilizando os iniciadores mobCF e mobAR;

7, amplificação utilizando os iniciadores mobCF e mobBR; 8, amplificação utilizando os

iniciadores Gyr, empregados como controle positivo por amplificarem um gene de expressão

constitutiva e altamente conservado em bactérias. As setas indicam o tamanho de alguns

fragmentos de DNA do padrão usado.

4.3 – Seleção da estirpe receptora para os experimentos de conjugação com a estirpe S.

aureus MB367

Como explicado anteriormente, a estirpe receptora dos experimentos de conjugação

com a estirpe MB367 deveria ser resistente às aureocinas A70 e A53 e sensível aos

antibióticos Em e Gm. Portanto, a estirpe escolhida para ser a receptora dos experimentos de

conjugação com a estirpe MB367 foi a MB91. Esta estirpe possui um plasmídeo

bacteriocinogênico, de aproximadamente 8 kb, assim como o pRJ6, e é denominado pRJ28.

Em experimentos anteriores, este plasmídeo se mostrou incompatível com o pRJ14 (portanto,

com o pRJ9 também), mas compatível com o pRJ6 (GAMON et al., 1999).

1 2 3 4 5 6 7 8

500 pb

300 pb

100 pb

1.000 pb

1.517 pb

Após a obtenção de mutantes espontâneos da estirpe MB91 com resistência à Rif e ao

Fus, ela passou a ser chamada MB374. A resistência a estes outros antibióticos foi importante

para possibilitar a seleção apenas da estirpe receptora, após os experimentos de conjugação.

4.4 – Conjugação entre as estirpes S. aureus MB367 e MB374

A conjugação entre a estirpe portadora dos plasmídeos pGO1, pRJ14 e pRJ6 (MB367)

e a estirpe MB374 foi realizada e os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 3. Não

foi possível se detectar a transferência do plasmídeo conjugativo pGO1, nestes experimentos.

As colônias transconjugantes que apresentaram resistência à Em foram testadas quanto

à sua resistência à Gm e quanto à capacidade de produção de bacteriocina, além de terem seus

DNAs plasmideais extraídos e analisados por EGA (Figura 9). Todas as colônias se

mostraram sensíveis ao antibiótico Gm, foram capazes de produzir bacteriocina e só possuíam

o plasmídio pRJ14.

A ausência do plasmídeo conjugativo pGO1 e do pRJ6 confirma a ocorrência de

mobilização, mesmo que em uma baixa frequência (Tabela 3). Além disso, como era de se

esperar devido à incompatibilidade, o plasmídeo pRJ28 foi perdido, uma vez que a seleção

dos transconjugantes foi feita em Em, favorecendo a manutenção do pRJ14. Estes resultados

demonstram a capacidade de mobilização do pRJ14 na presença do pRJ6.

Tabela 3: Experimentos de conjugação entre as estirpes MB367 e MB374.

Valores precedidos por < indicam que não foi detectada transferência e, se ela ocorreu, se

encontra abaixo do limite de detecção da técnica; Em – seleção feita na presença de

eritromicina; Gm – seleção feita na presença de gentamicina.

Frequência de conjugação/mobilização

(nº de transconjugantes/nº de doadoras)

Cruzamento

1º experimento

2º experimento

Média

MB367 X MB374

<10

-13

1,6x10

-11

<10

-13

1,0x10

-11

<10

-13

1,3x10

-11

Figura 9: EGA mostrando a análise do DNA plasmideal de transconjugantes resultantes do

cruzamento MB367 X MB374. 1, estirpe MB367; 2, estirpe MB374; 4-11, transconjugantes

Rif

Fus

. Crom., restos de cromossomo; OC, forma circular aberta; SC, super-hélice.

As setas indicam informações adicionais para ajudar o leitor.

4.5 - Clonagem da provável região oriT do plasmídeo pRJ9 no vetor de S. aureus pCN37

Para que fosse possível se realizar a clonagem da provável região oriT do plasmídeo

pRJ9 no vetor de S. aureus pCN37, foi necessário amplificar-se esta região pelo método da

PCR. A amplificação gerou amplicons com o tamanho esperado de ~319 pb. Este produto foi,

então, clonado no vetor pGEM

-T Easy e transformado para E. coli DH5. Nesta

transformação, foram obtidas várias colônias brancas resistentes à ampicilina. Destas,

algumas foram selecionadas para a extração de DNA plasmideal para se analisar a presença

do inserto.

Após a confirmação da presença de formas plasmideais ligeiramente maiores do que 3

kb (tamanho do pGEM

-T Easy), foi realizada uma nova reação de PCR, utilizando-se os

iniciadores oriT, com o DNA destes transformantes, e confirmando-se, assim, a presença do

inserto (Figura 10). O plasmídeo gerado foi denominado pRJ93.

Figura 10: EGA mostrando o resultado da amplificação por PCR realizada com o DNA dos

transformantes. 1, padrão 100-bp DNA ladder (Fermentas); 2, estirpe A53 (pRJ9), empregada

como controle positivo; 3-8, transformantes com o pRJ93; 9, estirpe A70 (pRJ6), empregada

como controle negativo. As setas indicam o tamanho de alguns fragmentos de DNA do

padrão usado e o tamanho do fragmento amplificado.

4.5.1 – Sequenciamento dos clones contendo a região oriT do plasmídeo pRJ9

Quatro clones selecionados tiveram os seus DNAs enviados para o sequenciamento. O

resultado do sequenciamento serviu para se ter certeza de que o processo de amplificação

desta região não inseriu nenhum erro na sequência. Com a análise do resultado, foi observado

que todos os clones estavam com a sequência do inserto oriT correta.

4.5.2 – Clonagem do fragmento oriT no vetor pCN37

Para a clonagem do fragmento oriT no vetor de S. aureus pCN37, os DNAs deste

vetor e do pRJ93 foram digeridos com a enzima EcoRI. O resultado destas digestões pode ser

visto na Figura 11.

Após a digestão com EcoRI, o fragmento oriT liberado foi ligado ao vetor pCN37

digerido. O produto desta ligação foi, então, transformado para S. aureus por eletroporação.

Esta transformação gerou colônias resistentes à Em, que foram selecionadas e submetidas à

extração de DNA plasmideal, para que fosse possível se analisar a presença do vetor com o

inserto. O resultado da EGA à qual estas preparações de DNA foram submetidas está

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1.000 pb

~300 pb

500 pb

100 pb

Figura 11: Análise dos produtos da digestão dos plasmídeos pCN37 e pRJ93 com EcoRI. A-

1, pCN37; 2, pCN37 digerido com EcoRI. B- 1, padrão 100-bp DNA ladder (Promega); 2,

pRJ93 digerido com EcoRI. OC, forma circular aberta; SC, super-hélice. As setas indicam

informações adicionais para ajudar o leitor e o tamanho de alguns fragmentos de DNA do

padrão usado.

apresentado na Figura 12A. Foi possível se perceber a presença de formas plasmideais

ligeiramente maiores do que o plasmídeo pCN37, com tamanhos em torno de 6,6 kb, como

era esperado para a ligação do vetor pCN37 ao fragmento oriT, em dois, dos cinco

transformantes selecionados (Figura 12A, colunas 3 e 5). As preparações de DNA destes dois

transformantes foram submetidas a uma nova reação de PCR com os iniciadores oriT, que

confirmou a presença do inserto oriT (Figura 12B). O plasmídeo gerado foi nomeado pRJ98 e

a estirpe possuidora deste plasmídeo foi nomeada MB429.

1 2

pCN37 OC

pCN37 SC

pCN37

(Linear)

Fragmento

oriT

pGEM

(Linear)

100 pb

500 pb

1.500 pb

Figura 12: Análise dos transformantes com o pRJ98 por EGA. A- EGA dos prováveis clones

contendo o pRJ98. 1, pCN37; 2-6, transformantes. B- EGA mostrando o resultado da

amplificação por PCR realizada com o DNA de dois clones contendo o pRJ98. 1, padrão

100-bp DNA ladder (Promega); 2-3, clones com o pRJ98; 4, pCN37, empregado como

controle negativo; 5, estirpe A53 (pRJ9), empregada como controle positivo; 6, branco

(amostra sem DNA). As setas indicam informações adicionais para ajudar o leitor, o tamanho

de alguns fragmentos de DNA do padrão usado e o tamanho do fragmento amplificado.

4.6 - Construção das estirpes S. aureus MB464, MB465 e MB476

O plasmídeo pRJ98 foi inserido na estirpe S. aureus A70 por transdução, para que

fosse possível se verificar se o plasmídeo pRJ6 é capaz de reconhecer e mobilizar a região

oriT do pRJ9. Da mesma forma, o plasmídeo pCN37 também foi inserido na estirpe A70,

servindo como controle dos experimentos de conjugação. Foi ainda necessário se construir

uma estirpe que possuísse apenas o plasmídeo conjugativo pGO1 e o pRJ98, pois se houvesse

mobilização deste plasmídeo, na presença do pRJ6, seria necessário se avaliar quais proteínas

Mob estariam envolvidas na mobilização, se as codificadas pelo pRJ6 ou as codificadas pelo

pGO1. Portanto, o plasmídeo pRJ98 foi inserido por transdução na estirpe MB108, que é a

estirpe A70 curada do plasmídeo pRJ6.

1 2 3 4 5 6

500 pb

100 pb

1.500 pb

~300 pb

Primeiramente, o fago 80α foi propagado nas estirpes S. aureus MB429 e MB387,

possuidoras dos plasmídeos pRJ98 e pCN37, respectivamente. Após isto, os lisados com estes

plasmídeos foram utilizados em experimentos de transdução com as estirpes S. aureus A70 e

MB108, que gerou várias colônias resistentes à Em. Algumas colônias foram selecionadas e

sofreram extração de DNA plasmideal, para que fosse possível se analisar a presença do

plasmídeo pRJ98 ou pCN37, por EGA. Por estes experimentos, foi possível se confirmar a

transdução do plasmídeo pRJ98 ou pCN37 para a estirpe A70 e do plasmídeo pRJ98 para a

estirpe MB108 (dados não mostrados).

Para que se pudesse utilizar as estirpes construídas em experimentos de conjugação,

era necessário que as mesmas possuíssem um plasmídeo conjugativo. Para tanto, o plasmídeo

conjugativo pGO1 foi transferido para estas estirpes por experimentos de conjugação. Os

transconjugantes destes experimentos foram selecionados em meio contendo Gm e Em e a

conjugação foi confirmada por EGA, onde foi possível se observar a presença dos plasmídeos

pGO1, pRJ6 e pRJ98, dando origem à estirpe MB464; pGO1, pRJ6 e pCN37, dando origem à

estirpe MB465 e pGO1 e pRJ98, dando origem à estirpe MB476 (dados não mostrados).

4.7 - Experimentos de conjugação utilizando-se as estirpes S. aureus MB464, MB465 e

MB476 como doadoras

As estirpes construídas foram utilizadas em experimentos de conjugação, onde a

estirpe S. epidermidis MB263 foi empregada como receptora. Os resultados obtidos estão

apresentados na Tabela 4.

Os experimentos de conjugação utilizando-se a estirpe MB464 como doadora geraram

colônias transconjugantes resistentes à Em, que foram testadas quanto à sua resistência à Gm,

além de terem seus DNAs plasmideais extraídos e analisados por EGA (Figura 13A). Todas

as colônias se mostraram sensíveis ao antibiótico Gm e só possuíam o plasmídeo pRJ98,

provando que houve mobilização deste plasmídeo.

Os experimentos de conjugação utilizando-se a estirpe MB465 como doadora não

geraram colônias transconjugantes resistentes à Em (Tabela 4). Este resultado mostra a

necessidade da presença da região oriT para que a mobilização ocorra.

Quando a estirpe MB476 foi utilizada como doadora nos experimentos de conjugação,

foi possível se detectar a presença de duas colônias transconjugantes com resistência à Em,

em um dos experimentos. Estas colônias foram testadas quanto à sua resistência à Gm e

tiveram seus DNAs plasmideais extraídos e analisados por EGA (Figura 13B). Todas as

colônias se mostraram sensíveis ao antibiótico Gm e só possuíam o plasmídeo pRJ98. Este

Tabela 4: Experimentos de conjugação utilizando-se as estirpes S. aureus MB464, MB465 e

MB476 como doadoras

Valores precedidos por < indicam que não foi detectada transferência e, se ela ocorreu, se

encontra abaixo do limite de detecção da técnica; Em – seleção feita na presença de

eritromicina; Gm – seleção feita na presença de gentamicina.

resultado mostra que o plasmídeo conjugativo, pGO1, é capaz de reconhecer, ainda que em

baixa frequência, a região oriT do plasmídeo pRJ9.

Os resultados destes experimentos confirmam o funcionamento da região oriT do

plasmídeo pRJ9 e a capacidade do plasmídeo pRJ6 de reconhecê-la.

4.8 - Clonagem do gene mobD do plasmídeo pRJ6 no vetor de S. aureus pT181mcs

Para que fosse possível se realizar a clonagem do gene mobD no vetor de S. aureus

pT181mcs, foi necessário amplificar-se este gene pelo método da PCR. A amplificação foi

feita utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores que apresentavam sítios para enzimas de

restrição em suas sequências e gerou amplicons com o tamanho esperado de ~251 pb, onde o

gene está presente. Este produto foi, então, digerido com as enzimas de restrição, cujos sítios

se encontravam nos oligonucleotídeos iniciadores, e clonado no vetor pT181mcs, digerido

com as mesmas enzimas, PstI e EcoRI. A escolha destas enzimas foi feita de modo que o P

lac

presente no vetor, ficasse a montante do gene mobD, possibilitando a correta expressão do

gene a partir desse promotor. O resultado da digestão do vetor pode ser observado na Figura

14.

Frequência de conjugação/mobilização

(nº de transconjugantes/nº de doadoras)

Cruzamento

1º experimento

2º experimento

Média

MB464 X MB263

2,9x10

-8

0,9x10

-8

4,4x10

-8

0,7x10

-8

3,7x10

-8

0,8x10

-8

MB465 X MB263

1,6x10

-8

<10

-9

5,6x10

-8

<10

-9

3,6x10

-8

<10

-9

MB476 X MB263

4,6x10

-8

1,6x10

-9

2,2x10

-8

<10

-9

3,4x10

-8

0,8x10

-9

Figura 13: EGA mostrando a análise do DNA plasmideal dos transconjugantes resultantes

dos experimentos de conjugação utilizando-se a estirpe MB464 (A) ou MB476 (B) como

doadora. A- 1, estirpe MB464; 2-7, transconjugantes Em

Rif

Fus

. B- 1, estirpe MB429

(controle do pRJ98); 2, estirpe MB476; 3-4, transconjugantes Em

Rif

Fus

. Crom., restos de

cromossomo; OC, forma circular aberta; SC, super-hélice. As setas indicam informações

adicionais para ajudar o leitor.

Crom.

pG01

pRJ6 OC

pRJ6 SC

pRJ98 OC

pRJ98 SC

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4

Crom.

pG01

pRJ98 OC

pRJ98 SC

Figura 14: Análise dos produtos da digestão do vetor pT181mcs

com EcoRI e PstI. 1,

pT181mcs; 2, pT181mcs digerido com EcoRI e PstI. As setas indicam informações adicionais

para ajudar o leitor.

O produto da ligação entre o fragmento mobD e o vetor pT181mcs digeridos foi,

então, transformado para S. aureus por eletroporação. Esta transformação gerou uma única

colônia resistente à Tc, que sofreu extração de DNA plasmideal, para que fosse possível se

analisar a presença do vetor com o inserto. O resultado da EGA à qual esta preparação de

DNA foi submetida está apresentado na Figura 15A. Foi possível se perceber a presença de

uma forma plasmideal ligeiramente maior do que o plasmídeo pT181mcs, com tamanho em

torno de 5,0 kb, como era esperado para a ligação do vetor pT181mcs ao fragmento mobD. A

preparação de DNA do transformante também foi submetida a uma nova reação de PCR com

os iniciadores mobD, que confirmou a presença do inserto mobD (Figura 15B).

Para se ter certeza de que o processo de amplificação do gene mobD não inseriu

nenhum erro em sua sequência, foi realizado o sequenciamento do inserto presente no

plasmídeo. Após a análise do resultado, foi observado que o plasmídeo apresentava a

sequência do inserto mobD correta.

O plasmídeo gerado foi nomeado pRJ107 e a estirpe possuidora do mesmo foi

nomeada MB490.

1 2

pT181mcs OC

pT181mcs SC

pT181mcs

(Linear)

Figura 15: Análise do transformante contendo o pRJ107 por EGA. A- EGA de DNA

plasmideal. 1, provável clone contendo o pRJ107; 2, pT181mcs. B- EGA mostrando o

resultado da amplificação por PCR realizada com o DNA do plasmídeo pRJ107. 1, padrão

100-bp DNA ladder (Fermentas); 2, pRJ6 (estirpe A70), empregada como controle positivo;

3, plasmídeo pRJ107; 4, pT181mcs, empregado como controle negativo; 5, branco (amostra

sem DNA). As setas indicam informações adicionais para ajudar o leitor, o tamanho de alguns

fragmentos de DNA do padrão usado e o tamanho do fragmento amplificado.

4.9 - Construção da estirpe S. aureus MB491

Para que fosse possível se verificar se a presença da proteína MobD seria capaz de

tornar o plasmídeo pRJ9 mobilizável, era necessário inserir o plasmídeo pRJ107 em uma

estirpe que possuísse o plasmídeo pRJ9 com algum marcador de resistência. A estirpe

escolhida foi a MB126, por possuir o plasmídeo pRJ14, que é o plasmídeo pRJ9 marcado com

o Tn551, que codifica a resistência à Em, e o plasmídeo conjugativo pGO1. O plasmídeo

pRJ107 foi, então, inserido na estirpe MB126 por transdução.

O experimento de transdução gerou várias colônias resistentes à Em, Gm e Tc.

Algumas colônias foram selecionadas e sofreram extração de DNA plasmideal, para que fosse

1 2

1 2 3 4 5

500 pb

100 pb

1.000 pb

~250 pb

possível se analisar a presença do plasmídeo pRJ107, por EGA. Por estes experimentos, foi

possível se confirmar a transdução do plasmídeo pRJ107 para a estirpe MB126 (dados não

mostrados). A estirpe gerada foi nomeada MB491.

4.10 - Confirmação da transcrição do gene mobD por experimentos de RT-PCR

Para se confirmar a transcrição do gene mobD do plasmídeo pRJ107, foram realizados

experimentos de RT-PCR com cDNA obtido a partir do RNA extraído da estirpe MB491.

Nesta RT-PCR, foram utilizados os iniciadores mobD, amplificando uma região de 251 pb.

A partir dos resultados encontrados nesses experimentos (Figura 16), foi possível se

comprovar a transcrição do gene mobD do plasmídeo pRJ107. É importante ressaltar que não

Figura 16: EGA mostrando o resultado da amplificação por RT-PCR realizada com o cDNA

obtido a partir do RNA extraído da estirpe MB491. 1, padrão 100-bp DNA ladder

(Fermentas); 2, amplificação utilizando os iniciadores mobD; 3, amplificação utilizando os

iniciadores gir, empregados como controle positivo por amplificarem um gene de expressão

constitutiva e altamente conservado em bactérias; 4, branco (amostra sem DNA) utilizando os

iniciadores mobD. As setas indicam o tamanho de alguns fragmentos de DNA do padrão

usado.

1 2 3 4

1.000 pb

500 pb

100 pb

houve amplificação no controle negativo destes experientos, excluindo-se a possibilidade de

haver sobra de DNA nas soluções de RNA (dados não mostrados).

4.11 - Experimentos de conjugação utilizando-se a estirpe S. aureus MB491 como

doadora

A estirpe construída foi utilizada em experimentos de conjugação, onde a estirpe S.

epidermidis MB263 foi empregada como receptora. Os resultados obtidos estão apresentados

na Tabela 5.

Os experimentos de conjugação não geraram colônias resistentes à Em, não sendo

possível, portanto, se detectar mobilização do plasmídeo pRJ14 na presença da proteína

MobD. Este resultado sugere que a ausência do gene mobD não é a responsável pela

incapacidade de mobilização do plasmídeo pRJ9.

Tabela 5: Experimentos de conjugação entre as estirpes MB491 e MB263.

Valores precedidos por < indicam que não foi detectada transferência e, se ela ocorreu, se

encontra abaixo do limite de detecção da técnica; Em – seleção feita na presença de

eritromicina; Gm – seleção feita na presença de gentamicina.

Frequência de conjugação/mobilização

(transconjugante/doador)

Cruzamento

1º experimento

2º experimento

Média

MB491 X MB263

7,5x10

-7

<10

-9

7,7x10

-7

<10

-9

7,6x10

-7

<10

-9

5 – DISCUSSÃO

As bactérias possuem a capacidade de transferir e adquirir genes facilmente pelo

mecanismo da conjugação. Este mecanismo pode mediar a transferência de genes adaptativos,

de virulência e de resistência entre bactérias, entre bactérias e fungos e, ainda, entre bactérias

e células de plantas. Por este motivo, a conjugação é capaz de potencializar mudanças

significativas para esses microrganismos no âmbito evolutivo, ambiental e clínico (CURTISS,

1969; LANKA & WILKINS, 1995; BURRUS & WALDOR, 2004), sendo os plasmídeos

conjugativos e mobilizáveis e os transpósons conjugativos os grandes responsáveis por este

processo.

O mecanismo de conjugação de bactérias Gram-negativas já é bem documentado,

havendo inclusive diversos modelos para a montagem e o funcionamento da maquinaria de

conjugação (ATMAKURI, CASCALES & CHRISTIE, 2004; CHRISTIE et al., 2005;

LLOSA & DE LA CRUZ, 2005). Para as bactérias Gram-positivas, o mecanismo de

conjugação é pouco conhecido, havendo apenas um modelo recente do mecanismo de

montagem e funcionamento da maquinaria de conjugação, baseado no modelo já relatado para

as bactérias Gram-negativas (ABAJY et al., 2007). Entretanto, uma vez que a conjugação é

uma das grandes responsáveis pelo aumento do número de cepas multirresistentes aos

antimicrobianos utilizados (GROHMANN, MUTT & ESPINOSA, 2003; CHEN, CHRISTIE

& DUBNAU, 2005) e é crescente o número de espécies de Staphylococcus spp. com

multirresistência, se torna essencial o estudo da conjugação entre estes microrganismos.

Em trabalhos anteriores, foi demonstrado que, apesar da incapacidade de mobilização

do plasmídeo pRJ9, ele possui três orfs cujos produtos apresentam alta similaridade a

proteínas associadas ao processo de mobilização, além de uma provável região oriT (NETZ et

al., 2002; COUTINHO, 2008). Estudos mais detalhados demonstraram que os produtos

codificados por estas três orfs apresentam mais de 90% de similaridade com as proteínas de

mobilização MobC, MobA e MobB codificadas pelo plasmídeo pRJ6 (COUTINHO, 2008).

Quando as regiões oriTs destes dois plasmídeos foram comparadas (Figura 17), pôde-se

observar uma elevada identidade entre elas, o que sugeria que a região oriT do plasmídeo

pRJ9 era funcional (COUTINHO, 2008; COELHO et al., 2009).

Na região oriT encontrada no plasmídeo pRJ9, foram detectadas várias repetições

invertidas, o que é uma característica importante e já bem relatada para regiões oriT, tanto de

plasmídeos de bactérias Gram-positivas, quanto de Gram-negativas (PANSEGRAU,

ZIEGELIN & LANKA, 1990; WANG & MACRINA, 1995; CLIMO, SHARMA &

Figura 17: Alinhamento entre regiões oriT de plasmídeos mobilizáveis de Staphylococcus spp.. As setas pretas indicam repetições invertidas

(RI) encontradas na maioria dos plasmídeos. Nas regiões amarelas, estão duas repetições diretas (agtggctag) (mcb1 e mcb2) e uma repetição direta

degenerada (tggctag) (mcb3) com papel regulatório. Em cinza, está assinalado o sítio sra. Em azul, está o sítio nic mapeado para o plasmídeo pC223.

-35 e -10, região promotora.

, nucleotídeos idênticos [adaptado de COUTINHO (2008)].

ARCHER, 1996; GUZMÁN & ESPINOSA, 1997; FEKETE & FROST, 2000; PARKER et

al., 2005; JANDLE & MEYER, 2006). Para alguns autores, estas repetições invertidas podem

estar envolvidas na formação de estruturas secundárias no DNA que serviriam para ajudar na

regulação da expressão dos genes próximos à região oriT (KURENBACH et al., 2002).

Entretanto, outros autores acreditam que estas repetições formariam estruturas em grampo que

diminuiriam o enovelamento do DNA nestas regiões, possibilitando uma maior interação das

proteínas Mob com seus sítios-alvos (PANSEGRAU, ZIEGELIN & LANKA, 1990; CLIMO,

SHARMA & ARCHER, 1996; FEKETE & FROST, 2000). Além disso, estas repetições

sofrem variações de plasmídeo para plasmídeo, podendo então ter um papel fundamental no

reconhecimento das regiões oriT pelas relaxases (GUZMÁN & ESPINOSA, 1997; FEKETE

& FROST, 2000; PARKER et al., 2005).

Os estudos mais completos com regiões oriT de plasmídeos mobilizáveis de

Staphylococcus spp. foram realizados com os plasmídeos pC221 e pC223 (CARYL, SMITH

& THOMAS, 2004; SMITH & THOMAS, 2004; CARYL & THOMAS, 2006). Quando se

compara a possível região oriT do pRJ9 com a destes plasmídeos bem estudados, é possível se

perceber algumas semelhanças (Figura 17). Uma delas é a RI-4 do pRJ9, que está presente

igualmente naqueles plasmídeos e, para o pC221 e para o pC223, foi proposto que ela

desempenhe um papel regulatório na expressão do operon mob, devido a sua sobreposição à

região -10 do promotor (SMITH & THOMAS, 2004). É provável que no pRJ9 esta repetição

invertida apresente a mesma função, já que há uma grande conservação entre estas regiões

nestes plasmídeos, inclusive o fato de ela estar sobreposta à provável região -10 do promotor

dos genes mob. Na região oriT do pRJ9, foi possível ainda se encontrar as três regiões

envolvidas na ligação de MobC (mcb1-3) e uma região quase idêntica ao sítio de ligação de

MobA (sra), propostas para os plasmídeos pC221 e pC223. Devido ao alto grau de

conservação entre elas, pode-se dizer que elas desempenham o mesmo papel no pRJ9,

servindo para o reconhecimento de tais regiões por MobC e MobA (CARYL & THOMAS,

2006).

As proteínas de mobilização codificadas pelo plasmídeo pRJ9 não apresentaram

diferenças significativas em suas sequências que pudessem responder pela incapacidade de

mobilização deste plasmídeo. A proteína MobC codificada pelo pRJ9 apresenta o domínio

característico deste tipo de proteína, na região carboxi-terminal. Já a proteína MobA apresenta

os três motivos conservados, na região amino-terminal, característicos de relaxases

pertencentes à subfamília MOB

da superfamília ColE1 deste tipo de proteína. A proteína

MobB codificada pelo pRJ9 apresentou 90% de identidade com a mesma proteína codificada

pelo plasmídeo pRJ6 (COUTINHO, 2008).

Com os experimentos de RT-PCR realizados com o cDNA obtido a partir do RNA

extraído da estirpe A53, foi possível se confirmar que os genes mob são transcritos (Figura 8),

uma vez que foram obtidos os amplicons com os tamanhos esperados em todas as

combinações de oligonucleotídeos iniciadores utilizadas.

Na região mob do plasmídeo pRJ9, foi possível se encontrar uma possível região

promotora a montante do gene mobC, em que as regiões -35 e -10 apresentam sequências

praticamente idênticas às sequências canônicas e estão separadas por uma distância de quinze

nucleotídeos (Figura 17). Este promotor foi o único encontrado, sugerindo que os genes mob

do pRJ9 estariam organizados como um operon, o que foi confirmado pelos experimentos de

RT-PCR. Apesar de não ter sido possível se observar a amplificação de um produto único

pela combinação dos iniciadores mobCF e mobBR, a amplificação com os iniciadores

mobCF/mobAR e mobAF/mobBR gerou produtos com os tamanhos esperados (Figura 8).

Este resultado confirmou a hipótese de a região mob do pRJ9 estar organizada como um

operon, uma vez que se sabe que o gene mobC precede o gene mobA, que, por sua vez,

precede o gene mobB (NETZ et al., 2002).

Quando se analisa o resultado da amplificação com a utilização dos iniciadores

mobCF e mobBR, é possível se perceber a presença de uma banda fraca com o tamanho

esperado (1.800 pb), que pode ser o fragmento referente aos três genes mob. Acreditamos que

a amplificação fraca com estes iniciadores se deva ao fato de a extração do RNA ter sido

realizada com a cultura microbiana crescida por 18 h. Visto que já foi relatada a regulação do

operon mob pela própria relaxase (KURENBACH et al., 2006), este tempo de crescimento

seria suficiente para ter ocorrido uma grande produção de proteínas Mob e, então, uma

repressão deste operon pela relaxase. Este fato geraria uma queda no nível de transcrição

destes genes e, com o tempo, ocorreria a degradação dos mRNAs formados no início,

reduzindo a quantidade do transcrito abrangendo os três genes mob. Acreditamos que este

também possa ser o motivo de uma amplificação mais fraca na PCR realizada com os

iniciadores mobAF e mobBR (Figura 8).

Para se tentar verificar a tradução das proteínas Mob codificadas pelo plasmídeo pRJ9,

possíveis sequências de ligação aos ribossomos foram analisadas. A montante de cada ORF

presente na região mob do pRJ9 foi encontrada um possível sítio de ligação aos ribossomos,

mas apenas a montante do gene mobB foi encontrada uma sequência canônica (aggagg)

(Figura 18). A sequência pouco consensual encontrada a montante do gene mobA pode indicar

Figura 18: Possíveis sítios de ligação aos ribossomos (RBS) presentes a montante de cada

gene mob e seu posicionamento em relação ao códon de iniciação de tradução. nt,

nucleotídeo (s).

uma regulação da expressão da proteína mais importante para o processo de mobilização, a

relaxase, também ao nível de tradução.

Apesar de o plasmídeo pRJ9 não ser mobilizável, os experimentos de RT-PCR

mostraram que os genes mob deste plasmídeo são transcritos normalmente e a presença de

possíveis sítios de ligação aos ribossomos a montante dos genes mob sugere a tradução das

proteínas Mob. Além disto, quando se analisou in silico a região oriT e as proteínas Mob

codificadas pelo plasmídeo pRJ9, não foi possível se detectar nenhuma alteração significativa

que pudesse responder pela incapacidade de mobilização deste plasmídeo (COUTINHO,

2008). Quando comparado ao plasmídeo pRJ6, a única diferença significativa encontrada

neste plasmídeo é a presença do gene mobD entre os genes mobC e mobA. Assim como

ocorre nos plasmídeos pC221 e pC223, a região 3’-OH do gene mobC se sobrepõe à região

5’-P do gene mobA no pRJ9, estando ausente, portanto, o gene mobD. Porém, apesar de não

codificarem a proteína MobD, os plasmídeos pC221 e pC223 são mobilizáveis (PROJAN &

ARCHER, 1989; SMITH & THOMAS, 2004).

De acordo com Coelho (2007), a explicação mais provável para a presença de MobD

em alguns plasmídeos de Staphylococcus spp. e a sua ausência em outros seria a existência de

um plasmídeo ancestral possuidor de mobD que, através de processos de recombinação, possa

ter perdido, em algumas de suas cópias, este gene. Tal fenômeno poderia ser resultante de um

5 nt

11 nt

8 nt

processo de recombinação homóloga ocorrido entre duas repetições diretas encontradas no

final de mobC e no início de mobA (Figura 19).

A proteína MobD do pRJ6 é um pequeno peptídeo de 7,5 kDa (65 ácidos aminados),

com pI igual a 9,15, apresentando domínios hidrofóbicos com potencial de inserção na

membrana (COELHO et al., 2009). Para o plasmídeo ColE1, foi proposto que a MbeD

poderia estimular o início da transferência plasmideal nas células doadoras (YAMADA,

YAMADA & NAKAZAWA, 1995).

Pelos resultados obtidos com os experimentos de conjugação realizados entre as

estirpes MB367 e MB374, ficou claro que o plasmídeo pRJ14 se torna mobilizável na

presença do pRJ6, mostrando que, de alguma forma, as funções mob do pRJ6 são capazes de

complementar as funções mob do pRJ14.

Pelos resultados apresentados na Tabela 3, é possível se observar que não foi detectada

a transferência do plasmídeo conjugativo pGO1, uma vez que a frequência média de

conjugação foi <10

-13

. Acreditamos que este fato seja resultante da competição entre os

plasmídeos pGO1, pRJ6 e pRJ14 pela maquinaria de transporte. Uma vez que os plasmídeos

pRJ14 e pRJ6 provavelmente se apresentam em um maior número de cópias do que o pGO1,

eles levariam vantagem nesta competição.

A frequência de mobilização do pRJ14 (10

-11

) também foi baixa quando comparada à

frequência do pRJ6, que é de aproximadamente 10

-8

(COELHO et al., 2009), mas acreditamos

que este resultado se deva ao fato de que as proteínas Mob codificadas pelo pRJ6 estarem

atuando preferencialmente na mobilização deste plasmídeo. Só as funções Mob do pRJ6 que

estivessem excedentes é que teriam uma atuação in trans no pRJ14.

Como as regiões oriTs dos plasmídeos pRJ6 e pRJ9 apresentam um alto grau de

identidade, foram feitos experimentos de conjugação para se observar se o plasmídeo pRJ6 é

capaz de reconhecer a região oriT do plasmídeo pRJ9. Pelos resultados apresentados na

Tabela 4, é possível se perceber que houve transferência do plasmídeo pRJ98, nos

experimentos de conjugação utilizando a estirpe MB464 como doadora, em uma frequência

de 10

-8

, o que comprova a capacidade das funções mob do plasmídeo pRJ6 de reconhecerem a

região oriT do pRJ9. Entretanto, este resultado não foi observado para outros plasmídeos com

regiões oriTs com alta identidade. Estudos feitos com os plasmídeos pC221 e pC223

revelaram que não ocorria a formação do relaxossomo quando suas regiões oriTs eram

trocadas (SMITH & THOMAS, 2004). Estudos posteriores com estes dois plasmídeos

evidenciaram que a proteína MobC codificada por cada um deles é capaz de reconhecer e se

ligar à região oriT do outro, mas a proteína MobA não é capaz de fazer o mesmo, revelando

Figura 19: Posicionamento das repetições diretas (sombras amarelas) encontradas no final

dos genes mobC e início dos genes mobA em plasmídeos mobilizáveis de Staphylococcus

spp.. Note que os plasmídeos de S. epidermidis e o pRJ6 apresentam o gene mobD se

sobrepondo ao gene mobC a partir de um códon correspondente ao ácido aminado triptofano

(W). Já os plasmídeos de S. aureus pC221, pS194 e pRJ9 apresentam o gene mobA se

sobrepondo ao gene mobC a partir de um códon correspondente ao ácido aminado W. Atribui-

-se esta diferença a uma possível recombinação geradora de deleção, ocorrida entre o final de

mobC e o início de mobA, na região das repetições diretas [adaptado de COELHO (2007)].

que a especificidade de ligação é determinada pela relaxase (CARYL, SMITH & THOMAS,

2004). Quando se compara os sítios sra dos plasmídeos pC221 e pC223 (Figura 17), é

possível se identificar a substituição de três nucleotídeos, o que pode responder pela

incapacidade da proteína relaxase codificada por um deles de reconhecer a região oriT do

outro. Entretanto, os sítios sra dos plasmídeos pRJ6 e pRJ9 são idênticos (Figura 17),

possibilitando que a relaxase codificada pelo pRJ6 reconheça e se ligue à região oriT do pRJ9.

Em apenas um dos experimentos utilizando a estirpe MB476 como doadora, foi

possível se observar a mobilização do plasmídeo pRJ98, em uma baixa frequência, apesar de

apenas o plasmídeo conjugativo pGO1 estar presente nesta estirpe (Tabela 4). Este resultado

já foi encontrado em outros estudos em que a região oriT do plasmídeo pC221 foi clonada no

vetor de S. aureus pE194 (PROJAN & ARCHER, 1989). Neste trabalho, também foi

observada uma baixa frequência de mobilização do plasmídeo construído com a região oriT

do pC221, na presença apenas do pGO1.

O plasmídeo conjugativo pGO1 contém vários replicons pequenos cointegrados e um

destes replicons é o pSK639, um plasmídeo mobilizável encontrado em S. epidermidis

(LEELAPORN et al., 1994; CARYL & O’NEILL, 2009). Experimentos realizados com a

região mob do replicon pSK639 encontrado no plasmídeo pGO1 revelaram a presença de uma

inserção no sítio de clivagem da relaxase e mutações em dois dos três genes de mobilização,

uma delas resultando em mutação no motivo III do sítio catalítico da relaxase (CARYL &

O’NEILL, 2009). Além disso, experimentos de conjugação revelaram que este replicon

pSK639 perdeu a sua capaciade de mobilização por completo (CARYL & O’NEILL, 2009).

Sendo assim, o motivo da baixa frequência de mobilização do plasmídeo pRJ98 na presença

apenas do plasmídeo conjugativo pGO1 ainda é desconhecido.

Para se verificar se a ausência do gene mobD era a responsável pela incapacidade de

mobilização do plasmídeo pRJ9, este gene foi clonado em um vetor de S. aureus e foram

feitos experimentos de conjugação na presença do plasmídeo pRJ14. Os resultados destes

experimentos, apresentados na Tabela 5, mostram que apesar do gene mobD estar sendo

transcrito, como foi comprovado nos experimentos de RT-PCR (Figura 16), não foi possível

se detectar a mobilização do plasmídeo pRJ14. Estes resultados estão de acordo com o que foi

observado para plasmídeos mobilizáveis de bactérias Gram-negativas, onde foi visto que o

gene mobD não é essencial, uma vez que a deleção deste gene não impedia a mobilização do

plasmídeo (VAN ZYL, DEANE & RAWLINGS, 2003).

Os resultados deste trabalho mostram que a falta do gene mobD, no plasmídeo pRJ9,

não é a responsável pela incapacidade de mobilização deste plasmídeo. Portanto, uma vez que

a região oriT deste plasmídeo é funcional, os três genes mob são transcritos e as respectivas

proteínas são, provavelmente traduzidas e apresentam alta identidade com as proteínas de

mobilização codificadas pelo plasmídeo pRJ6, algum outro fator é o responsável por esta

incapacidade de mobilização.

Experimentos de mutação realizados com o plasmídeo pRJ6 revelaram que a inserção

do transpóson Tn917-lac no gene aurT tornava este plasmídeo incapaz de se mobilizar

(OLIVEIRA et al., 1998a; NETZ et al., 2001). O gene aurT codifica um transportador do tipo

ABC, que não apresentou similaridade detectável com nenhuma função associada à

mobilização plasmideal (NETZ et al., 2001; atualizado em 2010). Transportadores do tipo

ABC exportam uma variedade de substratos, que incluem proteínas, peptídeos e outros tipos

de substratos não proteicos, como drogas lipofílicas, antibióticos e polissacarídeos (FATH &

KOLTER, 1993), nunca tendo sido descritos como envolvidos em mobilização plasmideal.

Análises in silico com o produto AurT revelaram uma identidade de 55,5% com o

transportador PepT, envolvido na externalização do lantibiótico Pep5 (NETZ et al., 2001).

Portanto, o AurT parece ter a mesma função do transportador PepT, atuando no transporte e

externalização da aureocina A70.

O plasmídeo pRJ9 não possui nenhum gene que codifique um produto semelhante ao

AurT. O transporte da aureocina A53, codificada pelo pRJ9, é feito por um sistema de

transportador ABC de três componentes, codificado pelos genes aucFEG, que parece estar

envolvido, inclusive, na imunidade da estirpe hospedeira à bacteriocina (NASCIMENTO,

2004). Portanto, os resultados obtidos com as mutações no plasmídeo pRJ6, aliados à

incapacidade de mobilização do plasmídeo pRJ9, mesmo na presença da proteína MobD,

sugerem fortemente que o gene aurT possa, realmente, estar envolvido na mobilização do

pRJ6. Por estes motivos, estudos de conjugação com o gene aurT clonado em um vetor de S.

aureus devem ser realizados, a fim de se verificar a complementação das funções de

mobilização codificadas pelos plasmídeos pRJ6 e pRJ9, pelo produto AurT.

6 – CONCLUSÕES

 Os genes mob do plasmídeo pRJ9 são transcritos como um único operon (mobCAB);

 As proteínas Mob codificadas pelo pRJ9 são, provavelmente, traduzidas;

 Há a possibilidade dos plasmídeos pRJ6 e pRJ9 serem originários de um mesmo ancestral;

 O plasmídeo pRJ14 se mostrou mobilizável na presença do pRJ6;

 A região oriT do plasmídeo pRJ9 é funcional;

 O plasmídeo pRJ6 é capaz de reconhecer e mobilizar a região oriT do pRJ9;

 A presença do gene mobD não foi suficiente para a mobilização deste plasmídeo;

 Como uma nova hipótese, o gene aurT pode estar envolvido na mobilização do plasmídeo

pRJ6.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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