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ESTUDO DA PRODUÇÃO DE ÁCIDO ABSCÍSICO EM
Gluconacetobacter diazotrophicus E CARACTERIZAÇÃO DO EFEITO
DA INOCULAÇÃO POR TAL BACTERIA NA RESPOSTA DE
PLANTAS DE CANA DE AÇÚCAR AOS ESTRESSES
HÍDRICO E SALINO
JANICE MARIA RIBEIRO DIAS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
FEVEREIRO - 2010
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ESTUDO DA PRODUÇÃO DE ÁCIDO ABSCÍSICO EM
Gluconacetobacter diazotrophicus E CARACTERIZAÇÃO DO EFEITO
DA INOCULAÇÃO POR TAL BACTERIA NA RESPOSTA DE
PLANTAS DE CANA DE AÇÚCAR AOS ESTRESSES
HÍDRICO E SALINO
JANICE MARIA RIBEIRO DIAS
“Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutora em Genética e Melhoramento
de Plantas.”
Orientador: Prof. Gonçalo Apolinário de Souza Filho
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
FEVEREIRO - 2010
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ESTUDO DA PRODUÇÃO DE ÁCIDO ABSCÍSICO EM
Gluconacetobacter diazotrophicus E CARACTERIZAÇÃO DO EFEITO
DA INOCULAÇÃO POR TAL BACTERIA NA RESPOSTA DE
PLANTAS DE CANA DE AÇÚCAR AOS ESTRESSES
HÍDRICO E SALINO
JANICE MARIA RIBEIRO DIAS
“Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutora em Genética e Melhoramento
de Plantas.”
Aprovada em 09 de fevereiro de 2010.
Comissão Examinadora:
José Ivo Baldani (D.Sc. em Ciências do Solo) – Embrapa Agrobiologia
Ângela Pierre Vitória (D.Sc. em Biologia Vegetal) – UENF
Fábio Lopes Olivares (D.Sc. em Agronomia) – UENF
Gonçalo Apolinário de Souza Filho (D.Sc. em Biociências e Biotecnologia)
(Orientador)
ii
“Nada te pertu
“Nada te pertu“Nada te pertu
“Nada te perturbe
rberbe
rbe,
,,
, nada te espante
nada te espante nada te espante
nada te espante, tudo passa
, tudo passa, tudo passa
, tudo passa,
,,
, só Deus não
só Deus não só Deus não
só Deus não
muda. A paciência tudo alcança. Quem a Deus tem,
muda. A paciência tudo alcança. Quem a Deus tem,muda. A paciência tudo alcança. Quem a Deus tem,
muda. A paciência tudo alcança. Quem a Deus tem, nada
nada nada
nada
lhe falta. Só Deus basta
lhe falta. Só Deus bastalhe falta. Só Deus basta
lhe falta. Só Deus basta.
..
.”
””
”
Santa Teresa d´Ávila
Santa Teresa d´ÁvilaSanta Teresa d´Ávila
Santa Teresa d´Ávila
Dedico esta tese aos meus pais
e irmão, que compartilharam
dos meus ideais.
iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço especialmente a DEUS, pelo dom da vida, pelo seu infinito amor,
pela oportunidade que mais uma vez me concedeu. Minha eterna gratidão por me
acompanhar em todos esses anos, pois sei que só pelo seu amor foi possível
chegar até aqui.
A minha querida mãezinha Maria, por toda intercessão e por iluminar meus
caminhos obscuros, demonstrando, dessa forma, toda sua dedicação e amor.
Aos meus pais, Dercílio Silva Dias e Cléa Maria Ribeiro Athayde, por
todo carinho que dedicaram, por me fazerem acreditar em meus sonhos, por
estarem comigo em todos os desafios. Obrigada por compreenderem minha
ausência e meu estresse. Enfim, obrigada por toda a dedicação, confiança e
oração. Amo vocês!!!
Ao meu irmão e “coleguinha de república”, Geison Ribeiro Dias, pelas
implicâncias e pelos maravilhosos momentos de descontração. Nossas risadas
serviram como uma terapia nos momentos de estresse. Te admiro e te amo!!!
Ao meu noivo, Pedro Miguel de Mello Correia, pelo amor,
companheirismo, mas, principalmente, pela paciência. Apesar de todo meu
estresse... você tem tornado minha vida muito mais agradável. Amo-o muito!!!
Ao professor, Gonçalo Apolinário de Souza Filho, pela orientação,
dedicação, amizade e convívio ao longo desses anos. Meu agradecimento
sincero, pois, com sabedoria, confiança, e paciência, soube transmitir seu
conhecimento. A você, manifesto meu respeito, admiração e estima.
iv
Às professoras, Patrícia Noemi Piccoli e Ana Carmen Cohen, por toda a
dedicação e colaboração nos trabalhos de quantificação de hormônios. Muito
obrigada pela solicitude e ensinamento.
Aos professores colaboradores, Angela Pierre Vitória, Fábio Lopes
Olivares e Ricardo Enrique Bressan-Smith, pela ajuda e pelos equipamentos
que foram fundamentais para a realização deste trabalho.
Aos colegas de equipe, Beatriz Ferreira, Adriane Nunes, Roberta
Barbosa, Juliana Ferreira, Fernanda Barbosa, Mariana Barduco, Leandro de
Mattos, Wellington Campos, Paulo Motta, Güinevere Fernandes, Ana Lídia
Rangel, Mariana Lugon, Patrícia Rangel, Valéria Marques, Alan Trindade,
Marcos Vinicius Viana, Aline Intorne e Verônica Aguiar, em especial, a
Roberta, Patrícia e Wellington, por toda a ajuda na realização deste trabalho.
Às minhas fiéis amigas do ‘Clube da Lulu’ Inês Alves da Costa, Hérika
Chagas Madureira, Denise Spellet Klein e Beatriz dos Santos Ferreira, por
todos os momentos de risada e descontração. Obrigada pelo apoio, incentivo,
companheirismo... pelo ombro amigo já calejado... Enfim, foi um prazer
compartilhar dias, tardes e noites de conversas, bebidas e guloseimas, com
vocês!!!
À Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, em especial ao
coordenador do Programa de Melhoramento Genético da Cana-de-açúcar, Josil
de Barros Carneiro Júnior e ao técnico Luiz Francisco P. Manhães, pela
colaboração na obtenção da variedade de cana-de-açúcar.
Aos professores e técnicos dos Laboratórios de Biotecnologia e de
Melhoramento Genético Vegetal.
À UENF/FAPERJ, pelo apoio financeiro.
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.
v
SUMÁRIO
RESUMO ........................................................................................................ xiv
ABSTRACT .....................................................................................................
xvi
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................
1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................... 3
2.1. A cana-de-açúcar .................................................................................... 3
2.1.1. Importância econômica da cana-de-açúcar ..........................................
5
2.1.2. O Projeto Sucest ...................................................................................
6
2.1.3. Northern eletrônico: um método automático para determinar o padrão
de expressão em banco de dados ..................................................................
7
2.2. Fotografia fluorescente eletrônica (EFP Browser): uma ferramenta para
analisar dados biológicos em larga escala .....................................................
8
2.3. Estresse biológico ....................................................................................
9
2.3.1. Estresses abióticos ............................................................................... 9
2.3.1.1. Estresse salino .................................................................................. 10
2.3.1.2. Estresse hídrico ................................................................................. 13
2.4. O estresse oxidativo como resposta secundária ao sal e à seca ............
14
2.5. A fotossíntese e a resposta da maquinaria fotossintética a estresses
ambientais ......................................................................................................
16
2.5.1. A fluorescência da clorofila a como monitoramento do desempenho
do aparelho fotossintético ...............................................................................
19
2.6. Sinalização celular em resposta a estresses ...........................................
22
vi
2.7. Imunidade inata em plantas .....................................................................
26
2.8. Bactérias endofíticas diazotróficas .......................................................... 27
2.8.1. Gluconacetobacter diazotrophicus .......................................................
29
2.9. Papel dos estômatos na resposta imune inata ........................................ 30
2.10. Papel dos hormônios na defesa vegetal ................................................
32
2.11. COI1, um membro da família F-box, está envolvido na resposta a
hormônios e na defesa vegetal .......................................................................
34
2.12. Produção de hormônios por microorganismos ...................................... 35
3. TRABALHOS .............................................................................................. 37
3.1. EFEITO DA COLONIZAÇÃO POR Gluconacetobacter diazotrophicus
SOBRE A RESPOSTA FOTOSSINTÉTICA E ENZIMÁTICA DE PLANTAS
DE CANA-DE-AÇÚCAR SUBMETIDAS AOS ESTRESSES SALINO E
HÍDRICO .........................................................................................................
37
3.1.1. RESUMO .............................................................................................. 37
3.1.2. ABSTRACT ...........................................................................................
38
3.1.3. INTRODUÇÃO ......................................................................................
38
3.1.4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 39
3.1.4.1. Material biológico ............................................................................... 39
3.1.4.1.1. Material vegetal e condições de cultivo .......................................... 39
3.1.4.1.2. Microorganismo, manutenção e preparo do inóculo .......................
40
3.1.4.2. Inoculação de plantas de cana-de-açúcar .........................................
40
3.1.4.3. Indução aos estresses salino e hídrico ..............................................
41
3.1.4.4. Análise da eficiência fotoquímica do PSII ..........................................
41
3.1.4.5. Extração de pigmentos fotossintéticos .............................................. 42
3.1.4.6. Determinação dos níveis de peroxidação de lipídeos ....................... 42
3.1.4.7. Determinação da atividade de enzimas antioxidantes ...................... 43
3.1.4.7.1. Extração de proteínas .....................................................................
43
3.1.4.7.2. Estimativa da concentração protéica pelo método de Bradford ..... 43
3.1.4.7.3. Determinação da atividade da enzima catalase (CAT) .................. 44
3.1.4.7.4. Determinação da atividade da enzima guaiacol peroxidase (GPX)
44
3.1.4.7.5. Determinação da atividade da enzima ascorbato peroxidase
(APX) ..............................................................................................................
45
3.1.5. RESULTADOS ..................................................................................... 45
vii
3.1.5.1. Efeito dos estresses salino e hídrico sobre a eficiência fotoquímica
e teores de pigmentos fotossintéticos em plantas colonizadas por
Gluconacetobacter diazotrophicus .................................................................
45
3.1.5.1.1. Rendimento quântico do PSII (Fv/Fm) ........................................... 46
3.1.5.1.2. Quenching fotoquímico (qP) ........................................................... 46
3.1.5.1.3. Quenching não-fotoquímico (qN) ....................................................
47
3.1.5.1.4. Pigmentos fotossintéticos ............................................................... 51
3.1.5.2. Alterações nos níveis de peroxidação lipídica em plantas de cana-
de-açúcar colonizadas por G. diazotrophicus e submetidas à salinidade e
desidratação ...................................................................................................
59
3.1.5.3. Resposta antioxidante em plantas de cana-de-açúcar inoculadas e
expostas aos estresses salino e hídrico .........................................................
61
3.1.6. DISCUSSÃO ........................................................................................
63
3.1.7. CONCLUSÕES .....................................................................................
69
3.1.8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 69
3.2. IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS GENES SnRK E COI1,
ENVOLVIDOS NA REGULAÇÃO ESTOMÁTICA EM PLANTAS DE CANA-
DE-AÇÚCAR COLONIZADAS POR Gluconacetobacter diazotrophicus .......
75
3.2.1. RESUMO .............................................................................................. 75
3.2.2. ABSTRACT ...........................................................................................
76
3.2.3. INTRODUÇÃO ......................................................................................
76
3.2.4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 78
3.2.4.1. Identificação, alinhamento e análise filogenética das sequências
gênicas CDPK-SnRK e COI1 .........................................................................
78
3.2.4.2. Northern eletrônico dos genes SnRK e COI1 via banco SUCEST ....
78
3.2.4.3. Fotografia fluorescente eletrônica dos genes SnRK2.4 e COI1 ........ 80
3.2.5. RESULTADOS ..................................................................................... 80
3.2.5.1. Identificação de sequências gênicas de proteínas quinase da
superfamília CDPK-SnRK de cana-de-açúcar e filogenia das proteínas
identificadas ....................................................................................................
80
3.2.5.2. Genes de quinases da classe SnRK2 são regulados na biblioteca
de plantas de cana-de-açúcar inoculadas com G. diazotrophicus (AD1) ......
84
viii
3.2.5.3. Visualização dos níveis de expressão relativa do gene
AtSnRK2.4/ASK1 (SAPK6) de Arabidopsis thaliana, em diferentes tecidos e
órgãos vegetais ..............................................................................................
89
3.2.5.4. COI1 é induzido por plantas de cana-de-açúcar inoculadas com
Gluconacetobacter diazotrophicus (AD1) .......................................................
91
3.2.5.5. Visualização dos níveis de expressão relativa do gene COI1 de
Arabidopsis thaliana, em diferentes tecidos e órgãos vegetais ......................
96
3.2.6. DISCUSSÃO .........................................................................................
98
3.2.7. CONCLUSÕES .....................................................................................
103
3.2.8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 104
3.3. PRODUÇÃO DE ÁCIDO ABSCÍSICO PELA BACTÉRIA ENDOFÍTICA
Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 E QUANTIFICAÇÃO DO
HORMÔNIO EM PLANTAS DE CANA-DE-AÇÚCAR INOCULADAS ...........
107
3.3.1. RESUMO .............................................................................................. 107
3.3.2. ABSTRACT ...........................................................................................
108
3.3.3. INTRODUÇÃO ......................................................................................
108
3.3.4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 110
3.3.4.1. Material biológico ............................................................................... 110
3.3.4.2. Microorganismo e condições da cultura ............................................ 110
3.3.4.3. Colonização de plantas de cana-de-açúcar por Gluconacetobacter
diazotrophicus .................................................................................................
111
3.3.4.4. Teste de germinação em sementes de Arabidopsis thaliana ............
111
3.3.4.5. Identificação e quantificação de ABA endógeno em
Gluconacetobacter diazotrophicus .................................................................
111
3.3.4.6. Identificação e quantificação de ABA endógeno em plantas de
cana-de-açúcar inoculadas .............................................................................
112
3.3.5. RESULTADOS ..................................................................................... 113
3.3.5.1. Ácido abscísico é produzido pela bactéria endofítica
Gluconacetobacter diazotrophicus .................................................................
113
3.3.5.2. O ABA bacteriano inibe a germinação de sementes de Arabidopsis
115
3.3.5.3. Níveis endógenos de ABA são aumentados em plantas de cana-
de-açúcar colonizadas por G. diazotrophicus .................................................
116
3.3.5.4. Genes responsivos a ABA apresentam expressão diferencial na
presença da bactéria ......................................................................................
117
ix
3.3.6. DISCUSSÃO .........................................................................................
118
3.3.7. CONCLUSÕES .....................................................................................
121
3.3.8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 122
4. RESUMOS E CONCLUSÕES .................................................................... 127
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 128
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 O Fluxo de elétrons durante a fotossíntese na membrana
tilacoidal ........................................................................................................
18
Figura 2 Cinética da emissão de fluorescência ........................................... 20
Figura 3 Representação da via de sinalização em resposta a uma
condição de estresse ....................................................................................
23
Figura 4 Representação esquemática da estrutura dos domínios de
proteínas quinase pertencentes à família CDPK-SnRK ...............................
25
Figura 5 Diferentes tipos de endófitos e o processo de colonização
bacteriana .....................................................................................................
28
Figura 6 Células bacterianas presentes na superfície foliar ........................ 31
Figura 7 Esquema ilustrativo indicando receptores de ABA atuando em
diferentes locais celulares .............................................................................
33
Figura 8 Esquema ilustrativo da resposta a ácido jasmônico ...................... 35
Figura 9 Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o rendimento quântico
48
Figura 10 Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o quenching
fotoquímico ...................................................................................................
49
Figura 11 Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o quenching não
fotoquímico ...................................................................................................
50
Figura 12 Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o teor de clorofila
total ...............................................................................................................
52
Figura 13 Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o teor de clorofila a ..
53
xi
Figura 14 Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o teor de clorofila b ..
54
Figura 15 Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o teor de
carotenóides .................................................................................................
56
Figura 16 Efeito dos estresses salino e hídrico sobre a razão clorofila a/b .
57
Figura 17 Efeito dos estresses salino e hídrico sobre a razão
carotenoide/clorofila ......................................................................................
58
Figura 18 Alterações nos níveis de peroxidação lipídica de folhas e raízes 60
Figura 19 Efeito dos estresses salino e hídrico sobre a atividade de
enzimas antioxidantes ..................................................................................
62
Figura 20 Análise filogenética da superfamília CDPK-SnRK de cana-de-
açúcar ...........................................................................................................
83
Figura 21 Northern eletrônico dos clusters que codifica proteínas da
família SnRK2, em uma biblioteca de cDNA de plantas inoculadas com
Gluconacetobacter diazotrophicus ................................................................
84
Figura 22 Alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos dos
clusters correspondentes à subclasse SnRK2 .............................................
85
Figura 23 Northern eletrônico, demonstrando a expressão relativa do
cluster SCCCST1006B11.g, que corresponde à proteína SAPK6, nas
diferentes bibliotecas do SUCEST ................................................................
86
Figura 24 Northern eletrônico, demonstrando a expressão relativa dos
clusters SCQGHR1011E10.g, SCCCLB1003E11.g, SCRFLR1034G06.g,
SCCCLR1068F10.g, SCJFLR1074F04.g e SCEZRZ1013F09.g, que
corresponde às proteínas SAPKs (subclasse SnRK2) .................................
87
Figura 25 Alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos da
proteína quinase SAPK6 (SnRK2) de 11 espécies .......................................
88
Figura 26 Árvore filogenética da proteína quinase SAPK6 (SnRK2) de 11
espécies ........................................................................................................
89
Figura 27 Fotografia eletrônica fluorescente representando os níveis de
expressão relativa do gene SnRK2.4/ASK1 (SAPK6), em diferentes
tecidos e órgãos de Arabidopsis thaliana .....................................................
90
Figura 28 Fotografia eletrônica fluorescente do padrão de expressão
tecido específico do gene SnRK2.4/ASK1 (SAPK6), em estômatos e
células do mesofilo de Arabidopsis thaliana .................................................
91
Figura 29 Northern eletrônico dos clusters que codifica proteínas da COI1,
xii
em uma biblioteca de cDNA de plantas inoculadas com Gluconacetobacter
diazotrophicus ...............................................................................................
92
Figura 30 Northern eletrônico, demonstrando a expressão relativa do
cluster SCQSRT1034B12.g, que corresponde à proteína COI1, nas
diferentes bibliotecas do SUCEST ................................................................
93
Figura 31 Northern eletrônico, demonstrando a expressão relativa dos
clusters, SCCCLR1C01E03.g, SCEZLB1009F12.g, SCBFLR1039D08.g,
SCQSRT1034B12.g, SCRFLR1055F12.g e SCJFAD1010G04.g,
correspondentes à proteína COI1, nas diferentes bibliotecas do SUCEST .
94
Figura 32 Alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos da
proteína COI1 de 13 espécies ......................................................................
95
Figura 33 Árvore filogenética da proteína COI1 de 13 espécies ................. 96
Figura 34 Fotografia eletrônica fluorescente representando os níveis de
expressão relativa do gene COI1, em diferentes tecidos e órgãos de
Arabidopsis thaliana ......................................................................................
97
Figura 35 Fotografia eletrônica fluorescente do padrão de expressão
tecido específico do gene COI1, em estômatos e células do mesofilo de
Arabidopsis thaliana ......................................................................................
98
Figura 36 Espectro de massas de ABA proveniente da cultura de G.
diazotrophicus PAL5 (acima) comparado ao espectro de ABA comercial
(abaixo) .........................................................................................................
114
Figura 37 Germinação de sementes de Arabidopsis thaliana (Columbia e
abi1) em placas de petri contendo meio MS líquido, acrescido de ABA 2
µM e do exudado bacteriano filtrado .............................................................
116
Figura 38 Northern in silico de ESTs, correspondendo aos genes GPA1
(SCRFLR2034A04.g), PLC1 (SCSBHR1052C05.g), PP2C
(SCEPRZ1011A11.g) e CDPK1 (SCEQRT1027E02.g) de cana-de-açúcar,
usando o banco de dados do SUCEST ........................................................
118
xiii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 Produção de açúcar (em toneladas) na Região Sudeste ..............
5
Tabela 2 Produção de etanol (em litros) na Região Sudeste .......................
5
Tabela 3 Complexidade da resposta ao estresse salino ..............................
12
Tabela 4 Bibliotecas de cDNA de cana-de-açúcar do banco SUCEST ...... 79
Tabela 5 Transcritos identificados em cana-de-açúcar que codificam
proteínas quinase, indicando sua possível similaridade com outra espécie
82
Tabela 6 Teor de ABA, em ng mL
-1
, de G. diazotrophicus PAL5 crescida
em meio quimicamente definido (LGIP), contendo sacarose e NaCl ..........
115
Tabela 7 Níveis de ABA endógeno, em ng mL
-1
, em plantas de cana-de-
açúcar ...........................................................................................................
117
xiv
RESUMO
DIAS, Janice Maria Ribeiro; DSc.; Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro; Fevereiro de 2010. Estudo da produção de ácido abscísico em
Gluconacetobacter diazotrophicus e caracterização do efeito da inoculação por tal
bacteria na resposta de plantas de cana de açúcar aos estresses hídrico e salino.
Orientador: D.Sc. Gonçalo Apolinário de Souza Filho. Conselheiros: D.Sc. Ricardo
Enrique Bressan-Smith e D.Sc. Fábio Lopes Olivares.
Em culturas, como a cana-de-açúcar, a desidratação e o excesso de sais no solo
podem causar alterações bioquímicas, fisiológicas e moleculares, resultando em
uma redução do crescimento, da qualidade e, consequentemente, em uma queda
na produção. Recentemente, foi demonstrado que plantas colonizadas com
bactérias endofíticas induzem alterações na resposta a estresses abióticos. Entre
as bactérias endofíticas de cana-de-açúcar, está a Gluconacetobacter
diazotrophicus, que é conhecida por fixar nitrogênio atmosférico e produzir
hormônios, o que poderia interferir na resposta fisiológica. O objetivo, deste
trabalho, foi estudar o efeito da inoculação de G. diazotrophicus na resposta de
plantas de cana-de-açúcar aos estresses salino e hídrico, por meio de análises
fisiológicas (capítulo I); expressão de genes de proteínas envolvidas na
sinalização de resposta a hormônios e interação planta-bactéria (capítulo II);
quantificação do hormônio ácido abscísico em cultura de G. diazotrophicus e em
plantas de cana-de-açúcar colonizadas pela bactéria (capítulo III). Os resultados
obtidos demonstraram que as plantas de cana-de-açúcar inoculadas
xv
apresentaram diferentes respostas aos estresses salino e hídrico. Verificou-se
que a colonização pelo endófito aumentou a susceptibilidade ao sal e à seca, mas
principalmente à seca. Duas proteínas de resposta a hormônio e de defesa
apresentaram-se reguladas durante a colonização pela bactéria. Adicionalmente,
foi possível identificar e quantificar a produção do hormônio ácido abscísico em
cultura de G. diazotrophicus. Tal observação indica que a presença da bactéria
interfere no mecanismo de resposta ao estresse. Embora a pesquisa na área de
fixação biológica do nitrogênio, durante a interação entre planta e bactéria, esteja
avançada, pouco é sabido a respeito do efeito da colonização por simbiontes
endofíticos, em plantas submetidas a estresses abióticos. Neste contexto, os
resultados obtidos, neste trabalho, poderão contribuir para um melhor
entendimento dos mecanismos dessa associação, particularmente em resposta a
estresses abióticos.
xvi
ABSTRACT
DIAS, Janice Maria Ribeiro; D.Sc.; Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro; 2010, February. Study of production of abscisic acid in
Gluconacetobacter diazotrophicus and characterization of the effect of inoculation
by bacteria in response of sugarcane plants to drought and salt stress. Advisor:
D.Sc. Gonçalo Apolinário de Souza Filho. Co-advisors: D.Sc. Ricardo Enrique
Bressan-Smith and D.Sc. Fábio Lopes Olivares.
In crops, such as sugarcane, dehydration and excessive salts in the soil can cause
biochemical, physiological and molecular alterations resulting in a reduction in
growth, quality and consequently a decrease in production. Recently it has been
showed that plants colonized by endophytic bacteria changes the response to
abiotic stresses. Among the sugarcane endophytic bacteria, there are the
Gluconacetobacter diazotrophicus, which is recognized by atmospheric nitrogen
fixation and produce hormones, which could interfere with the physiological
response. The objective of this work was to study the effect of inoculation with G.
diazotrophicus in response to sugarcane plant to salt and water stress through
physiological analysis (Chapter I) gene expression of proteins involved in signaling
in response to hormones and plant-bacteria interaction (Chapter II) and
quantification of the hormone abscisic acid in culture of G. diazotrophicus and
colonized plants (Chapter III). The results showed that control and inoculated
plants showed different responses to salt and water stress. It was found that
colonization by the endophyte increased susceptibility to salt and drought, but
xvii
mainly to drought. Two proteins in response to hormone and defense showed up
regulated during the colonization by bacteria. Additionally, it was possible to
identify and quantify the production of the hormone abscisic acid in culture of G.
diazotrophicus. This observation indicates that the presence of bacteria interfere in
the mechanism of stress response. Although research in the area of biological
nitrogen fixation, during the interaction between plant and bacteria is well
advanced, little is known about the effect of colonization by endophytic symbionts
for plants exposed to abiotic stresses. In this context, the results obtained in this
study may contribute to a better understanding of the mechanisms of this
association, particularly in response to abiotic stresses.
1
1. INTRODUÇÃO
A Região Norte Fluminense tem como uma de suas principais atividades
econômicas a indústria agroaçucareira, ocupando aproximadamente 15% da área
agricultável. A produção canavieira no Estado do Rio de Janeiro teve seu
crescimento acentuado a partir de 1930, tornando a região uma das grandes
produtoras nacionais. Na década de 70, os lançamentos do Proálcool e do
Programa Nacional de Melhoramento da Cana-de-açúcar (PLANALSUCAR),
instalados em Campos dos Goytacazes elevaram ainda mais a produção,
contribuindo, dessa forma, para o desenvolvimento da Região Norte Fluminense.
Devido ao fato de que parte da cultura canavieira, na Região Norte
Fluminense, está localizada em locais de solos salino-sódicos (solonchak sódico),
verifica-se uma deficiência da cultura, acarretando em expressiva redução na
produtividade. Adicionalmente, a região apresenta um déficit hídrico para o cultivo
da cana-de-açúcar de 400 a 600 mm anuais (Valicheski, 2006).
A seca e a salinidade do solo estão entre os principais estresses
ambientais para a agricultura. Devido a esses estresses, as lavouras têm sua
produtividade reduzida ou mesmo inviabilizada.
Todas essas condições adversas impostas às plantas podem induzir
alterações estruturais, fisiológicas, bioquímicas e moleculares. Em conjunto, todas
essas respostas estão envolvidas no mecanismo de adaptação ao agente
estressante.
2
De acordo com Mayak e colaboradores (2004), bactérias endofíticas
podem alterar a resposta a esses estresses abióticos. Entre as bactérias
endofíticas caracterizadas, objeto de estudo de muitos pesquisadores, está a
Gluconacetobacter diazotrophicus. Inicialmente, essas bactérias foram
caracterizadas como endofíticas fixadoras de nitrogênio. Porém, seu potencial
agrobiotecnológico se ampliou quando foi demonstrada sua capacidade de
excretar 50% do nitrogênio fixado, bem como sua biossíntese de hormônios, que
poderiam, juntamente com o nitrogênio, exercer efeitos diretos sobre a fisiologia
da planta, influenciando no crescimento vegetal.
Embora a pesquisa na área de fixação biológica do nitrogênio, durante a
interação entre planta e bactéria, esteja avançada, pouco é sabido a respeito do
efeito da colonização por endofíticos diazotróficos, em plantas submetidas a
estresses abióticos. Portanto, levando-se em consideração que
Gluconacetobacter diazotrophicus é uma bactéria endofítica de cana-de-açúcar,
fixadora de nitrogênio e produtora de hormônios análogos aos vegetais, o
presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito dos estresses salino e
hídrico sobre plantas de cana-de-açúcar inoculadas.
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. A cana-de-açúcar
A região de origem presumível da cana-de-açúcar é o norte da Índia, de
onde se supõe que tenha sido levada para a China e o Oriente Próximo. Os
árabes a transportaram para o norte da África e o sul da Europa, e os chineses a
introduziram em Java e nas Filipinas. Cristóvão Colombo trouxe a cana para a
América, em sua segunda viagem, começando o seu plantio, no ano de 1494, em
São Domingos. Daí foi levada para Cuba, Antilhas e o continente, iniciando-se o
seu cultivo nos Estados Unidos da América, em 1751, no estado de Louisiana
(Leme Júnior e Borges, 1965). No Brasil, a cultura teve início, em 1532, na
capitania de São Vicente, trazida por Martim Afonso de Souza, com canas
oriundas da Ilha da Madeira (Fernandes, 1984).
Acredita-se que o primeiro engenho do Brasil tenha sido o que Jerônimo de
Albuquerque estabeleceu em Olinda, em 1540, com a denominação de Nossa
Senhora da Ajuda. Por volta de 1590, havia seis engenhos na capitania de São
Vicente, 36 na da Bahia e 66 na de Pernambuco (Leme Júnior e Borges, 1965).
O melhoramento da cana-de-açúcar, no Brasil, presume-se que tenha se
iniciado por volta do século XIX (Matsuoka et al., 1999). Segundo alguns autores,
os primeiros relatos de que sementes (não os colmos) de cana-de-açúcar
poderiam originar descendentes, surgiram em Barbados, em 1858 (Deerr, 1921;
Stevenson, 1965). Assume-se que foi em 1885, em Java, que o melhoramento da
4
cana-de-açúcar iniciou-se efetivamente, a partir da germinação de sementes de
Saccharum spontaneum. Cruzaram-se a variedade Glagah com Loethers e o seu
recíproco, obtendo sementes férteis somente da Glagah. Dessa forma, foi
demonstrada a viabilidade do melhoramento genético da cana-de-açúcar, por
intermédio de cruzamentos controlados.
O Brasil, nessa época, e durante muito tempo, importava variedades de
cana-de-açúcar de outros países. Não havia quarentenário e nenhum controle
fitossanitário dessas importações. Devido a essas importações não controladas,
não demorou que ocorressem introduções de germoplasmas contaminados por
pragas e doenças, ocasionando, dessa forma, uma queda na produção.
Essa baixa produtividade fez com que os pesquisadores voltassem sua
atenção para a lavoura. Assim sendo, em 1910, o governo federal criou as duas
primeiras estações experimentais de cana-de-açúcar do Brasil, a de Escada, em
Pernambuco, e a de Campos dos Goytacazes, no Rio de Janeiro.
Em 1972, foi criado o Programa Nacional de Melhoramento da Cana-de-
açúcar (PLANALSUCAR), o qual, após sua extinção em 1990, passou a ser
conduzido pelas Universidades Federais que compõem a Rede Interuniversitária
para o Desenvolvimento do Setor Sucroalcooleiro (RIDESA). A RIDESA é
composta por sete Universidades Federais. Essas instituições são responsáveis
pelas cultivares de cana-de-açúcar com a sigla RB (República do Brasil).
Atualmente, existem no Brasil quatro principais programas de melhoramento
genético de cana-de-açúcar: RIDESA (RB), Centro de Tecnologia Canavieira
(CTC), Instituto Agronômico de Campinas (IAC) e, o mais recente deles,
CANAVIALIS (CV).
2.1.1. Importância econômica da cana-de-açúcar
A agroindústria açucareira é a mais antiga atividade agroindustrial do Brasil
e está relacionada a alguns dos principais eventos históricos do país. O
agronegócio sucroalcooleiro é responsável por 1,76% do PIB nacional, com a
geração de 4,5 milhões de empregos diretos e indiretos, além de congregar mais
de 72.000 agricultores e 373 usinas. Atualmente, o Brasil e a Índia são os maiores
produtores mundiais de cana-de-açúcar. O Brasil é isoladamente o maior produtor
5
de açúcar, e o maior exportador mundial, obtendo 32 milhões de toneladas ano
-1
(Tabela 1) das quais 62% são exportadas (www.jornalcana.com.br).
Tabela 1 - Produção de açúcar (em toneladas) na Região Sudeste
ESTADOS/SAFRA 05/06 06/07 07/08 08/09*
MINAS GERAIS 1.741.649 1.909.516 2.117.696 2.207.621
ESPIRITO SANTO 48.260 48.949 86.823 85.324
RIO DE JANEIRO 286.203 262.104 243.472 241.005
SÃO PAULO 16.833.595
19.503.032
19.107.894
19.662.436
REGIÃO CENTRO-SUL
22.084.810
25.784.133
26.171.148
26.749.819
REGIÃO NORTE-NORDESTE
3.820.913 4.098.300 4.825.564 4.297.486
BRASIL
25.905.723
29.882.433
30.996.712
31.047.305
*Posição em 16/05/09.
Fonte: União da Indústria e Cana-de-açúcar/UNICA e Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento/MAPA.
A produção brasileira de etanol também é a maior do mundo, com 27
bilhões de litros de álcool ano
-1
(Tabela 2), devido à utilização em larga escala do
etanol como combustível renovável e alternativo ao petróleo.
Tabela 2 - Produção de etanol (em litros) na Região Sudeste
ESTADOS/SAFRA 05/06 06/07 07/08 08/09*
MINAS GERAIS 958.902 1.291.445 1.776.760 2.167.616
ESPIRITO SANTO 234.960 173.192 252.270 274.592
RIO DE JANEIRO 135.536 87.455 120.274 127.795
SÃO PAULO 9.985.276 10.910.013 13.345.207 16.722.478
REGIÃO CENTRO-SUL
14.352.542 16.006.345 20.345.559 25.101.963
REGIÃO NORTE-NORDESTE
1.594.452 1.712.864 2.193.358 2.404.133
BRASIL
15.946.994 17.719.209 22.538.917 27.506.096
*Posição em 16/05/09.
Fonte: União da Indústria e Cana-de-açúcar/UNICA e Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento/MAPA.
A Região Sudeste é a mais produtiva, sendo o Estado de São Paulo o
principal produtor de açúcar e álcool. O Estado do Rio de Janeiro está em 11°
lugar no ranking brasileiro na produção de álcool e, em 9° lugar, na produção de
açúcar.
Com a crescente preocupação da sociedade mundial sobre o uso dos
combustíveis fósseis, vários países estão buscando reduzir ao máximo o uso dos
mesmos, seja pela substituição do produto ou pela adição de outros combustíveis
6
para diminuir a carga poluidora (Maule et al., 2001). Estima-se que, com o grande
uso de carros bicombustíves, a demanda interna de etanol combustível será de
22,1 bilhões de litros anuais até 2010, enquanto, no mercado externo, a demanda
projetada seja de 5,2 bilhões de litros (Albino et al., 2006).
Segundo a FAO (http://apps.fao.org), a cana-de-açúcar é cultivada em,
aproximadamente, 20 milhões de hectares em mais de 90 países. Com o
aumento da produção ao longo dos anos, as exportações no Brasil saltaram de
8%, na safra de 95/96 (Pinazza e Alimandro, 2001), para 60% do total
comercializado no mercado internacional, colocando o açúcar como o produto de
maior sucesso no agrobusiness brasileiro.
Anualmente, 560 milhões de toneladas de cana são processadas no Brasil.
Para isso, são cultivados 7,7 milhões de hectares, localizados principalmente nas
regiões Nordeste, Sudeste e Centro-Sul, representando 3,5% das terras sob
agricultura (www.jornalcana.com.br).
Essa alta eficiência de produção alcançada pelo produtor brasileiro vem de
uma longa tradição na produção de cana e açúcar, de aproximadamente cinco
séculos. Isso se deve também ao esforço conjunto em pesquisas, criando novas
variedades, com maior teor de sacarose, aclimatadas a diferentes condições
edafoclimáticas, exibindo tolerância a estresses bióticos e abióticos, de modo a
extrair um máximo potencial da cultura sob diferentes condições ambientais.
2.1.2. O projeto SUCEST
O rápido avanço da era genômica permitiu a identificação e caracterização
de muitos genes, e o desenvolvimento de ferramentas in silico, para analisar a
abundância de transcritos, tornou-se um método alternativo mais fácil e bastante
informativo (Gygi et al., 2000). Vários métodos têm sido desenvolvidos para medir
quantitativamente a população de mRNAs transcrita em um determinado
organismo (White et al., 2000; Dong et al., 2003; Ma et al., 2003). Esses
programas, visando à caracterização transcriptômica de algumas espécies, são
denominados projetos EST.
O objetivo de um projeto EST é conhecer rapidamente genes expressos de
um organismo. Por meio do sequenciamento de cDNAs é possível obter a
7
sequência de nucleotídeos de um gene expresso por uma célula. Um projeto EST
inclui a produção de uma biblioteca de cDNA, a clonagem dos cDNAs, o
sequenciamento dos clones, identificação e anotação dos mesmos. (Baudet e
Dias, 2006).
O projeto SUCEST (‘Sugarcane EST’ - http://sucest.lad.ic.unicamp.br) foi
desenvolvido no Estado de São Paulo e financiado pela FAPESP (Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), com objetivo de sequenciar os
genes expressos em cana-de-açúcar. O acesso ao banco de dados do SUCEST
ainda é restrito aos pesquisadores e grupos que participaram do projeto.
O projeto gerou 237.954 ESTs, e as sequências foram reunidas em 43.141
cluster (Menossi, 2008). Todas as sequências foram obtidas a partir de clones de
37 bibliotecas de cDNAs, construídas a partir de diferentes tecidos e/ou condição
fisiológica da planta (Vettore, 2001). Os clones de cDNA sequenciados são
denominados reads, que são agrupados, de acordo com seu grau de homologia,
em um mesmo arquivo, o cluster (Ferreira, 2002).
Dentre as bibliotecas do SUCEST, está presente a biblioteca de cDNA,
obtida de plantas inoculadas com a bactéria endofítica Gluconacetobacter
diazotrophicus. Dessa forma, o banco de dados SUCEST vem a ser uma
poderosa ferramenta para identificar genes expressos em resposta à colonização
pelo endófito
.
2.1.3. Northern eletrônico: um método automatizado para determinar o
padrão de expressão em banco de dados EST
Com o grande aumento dos bancos de dados ESTs (marcas de sequências
expressas - expressed sequence tags), tem sido possível adquirir conhecimento
acerca da expressão de genes tecido-específicos, mediante experimentos
simplificados, como a bioinformática. Análises baseadas em computadores são
usualmente referidas com o termo in silico, devido ao fato de a análise da
expressão gênica, pela utilização de banco de dados ESTs, apresentarem
similaridade com o método laboratorial northern blotting, sendo este,
consequentemente, denominado Northern in silico ou Northern eletrônico (Keller
et al., 2006; Altschul et al., 1997).
8
Após a seleção do gene a ser analisado, é possível verificar a ocorrência
do EST, em diferentes tecidos e/ou condição (bibliotecas) (Ferreira, 2002). O EST
é um cDNA (DNA complementar) que é a cópia de um RNAm (RNA mensageiro).
Essa contagem do número de vezes em que cada EST aparece na biblioteca de
interesse (tecido e/ou condição) é conhecida como análise da expressão gênica in
silico ou Northern eletrônico (Rafalski et al., 1998). Tal método representa uma
alternativa de baixo custo para a análise genômica, permitindo a análise da
transcrição de genes in silico e viabilizando a descoberta de funções biológicas.
2.2. Fotografia fluorescente eletrônica (EFP Browser): uma ferramenta
para analisar dados biológicos em larga escala
A fotografia eletrônica fluorescente (EFP Browser -
http://www.bar.utoronto.ca) foi desenvolvida para facilitar a interpretação de dados
de expressão gênica e de outros dados em larga escala. Atualmente, estão
disponíveis para uso, as fotografias eletrônicas de Arabidopsis thaliana, Medicago
truncatula, Oryza sativa (arroz), Populus trichocarpa (álamo), Hordeum vulgare
(cevada), Mus musculus (camundongo) e células de Arabidopsis. No caso de
Arabidopsis, essa ferramenta permite explorar dados de microarranjo e visualizar
a expressão de aproximadamente 22.000 genes, representados em um genechip
da empresa Affymetrix (Winter et al., 2007).
O uso do método fornece imagens coloridas, representando os níveis de
expressão de um gene em diferentes tecidos, órgãos ou em resposta a algum
tratamento em particular. Tal expressão pode ser visualizada como uma
expressão gênica absoluta, relativa ou comparada.
Nesse contexto, o EFP Browser pode ser uma ferramenta conveniente
para interpretar, mas principalmente visualizar a expressão de genes de
interesse.
9
2.3. Estresse biológico
O estresse, em termos físicos, é definido como uma força mecânica por
unidade de área aplicada a um objeto. Em resposta ao estresse aplicado, um
objeto pode alterar sua dimensão. As plantas, como um sistema biológico, tendo
seu sistema delimitado por membranas, impossibilitam a medição da exata força
exercida pelo estresse e, portanto, é difícil definir e dimensionar o estresse em
termos biológicos. A maioria das definições de estresse define estresse biológico
como uma condição ou força adversa capaz de inibir o funcionamento normal de
um sistema biológico (Jones e Jones, 1989; Mahajan e Tujeta, 2005).
O estresse é percebido e iniciado pela interação de um material
extracelular com uma proteína de membrana. Essa molécula extracelular é
denominada ligante ou eliciador, e a proteína de membrana é chamada de
receptor. Vários sinais de estresse, bióticos (vírus, bactérias, fungos, insetos,
herbívoros, roedores etc.) e abióticos (frio, calor, sal, seca, radiação, químicos,
poluentes etc.), servem como eliciadores para a célula vegetal (Mahajan e Tujeta,
2005).
2.3.1. Estresses abióticos
O crescimento e a produtividade vegetal são frequentemente afetados por
distúrbios naturais na forma de vários fatores de estresse abiótico, como frio, sal,
seca, calor, metal pesado. Atividades antropogênicas têm acentuado a existência
desses fatores de estresse, inibindo o potencial genético do vegetal e limitando
sua produtividade (Mahajan e Tuteja, 2005).
Plantas respondem a esses estresses por meio de alterações metabólicas,
fisiológicas, bioquímicas e genéticas. Consequentemente, existe uma rede de
sinalização complexa e fundamental para possíveis respostas e adaptações a
essas condições ambientais adversas (Zhu, 2001).
10
2.3.1.1. Estresse salino
A salinidade do solo é um dos principais fatores limitantes na agricultura
mundial (Allakhverdiev et al., 2000), que vem sendo agravada por práticas
agrícolas, como por exemplo, manejos de irrigação inadequados. Sabe-se que o
desenvolvimento das técnicas de irrigação tem causado numerosos casos de
salinização. Dos 270 milhões de hectares irrigados, 110 milhões (40%) estão
localizados em regiões áridas, embora 60% dessa irrigação seja praticada em
regiões de clima tropical e subtropical (Smedema e Shiati, 2002).
Aproximadamente 1/3 das terras irrigadas é considerada afetada pela salinidade
(Flowers e Yeo, 1997).
Devido ao acúmulo de sal no solo, a salinidade causa um decréscimo no
potencial osmótico do vegetal, resultando em estresse hídrico. O estresse iônico é
também ocasionado em plantas expostas ao sal, principalmente o Na e o Cl
(Ueda et al., 2003). Adicionalmente, ocorre um desequilíbrio iônico pelo distúrbio
na concentração intracelular de íons essenciais (Greenway e Munns, 1980;
Gorham et al., 1985). Todos esses efeitos podem perturbar funções fisiológicas e
bioquímicas da célula, permitindo eventuais mortes celulares.
Durante o estresse salino, a membrana plasmática é o primeiro contato
com o sal. A permeabilidade da membrana reflete o status da matriz lipídica e da
interação proteína-lipídeo (Mansour e Salama, 2004). Alguns estudos evidenciam
a importância de se estudar a permeabilidade da membrana sob salinidade, já
que esta pode ser o primeiro sítio de trauma durante o estresse (Lauchli, 1990;
Mansour, 1997; Mansour e Salama, 2004).
Diferenças na viscosidade do citoplasma também são evidências de sinais
de resposta ao sal. Plantas com maior viscosidade citoplasmática são
consideradas mais tolerantes quando impostas à salinidade (Plant e Bray, 1999;
Hasegawa et al., 2000).
A salinidade no solo também pode ocorrer naturalmente, principalmente em
regiões costeiras, onde o lençol freático frequentemente é contaminado pela água
do mar. Muitas vezes, a recuperação destes solos é economicamente inviável
(Smith et al., 1994).
11
De acordo com a Tabela 1, apesar de o estado do Rio de Janeiro possuir
uma longa tradição no cultivo de cana-de-açúcar, sua produção é baixa quando
comparada ao dos Estados de Minas Gerais e São Paulo.
Tendo em vista que grande parte da cultura canavieira no Brasil,
principalmente na região Norte Fluminense, está distribuída em áreas litorâneas,
a cana-de-açúcar também é afetada pela salinidade. Isso se deve ao fato de a
cultura passar por deficiências hídricas, dependendo dessa forma da irrigação e
devido a possíveis contaminações do lençol freático pela água do mar. Como
resultado, ocorre uma queda na produção.
O estresse salino provoca uma série de mudanças nas funções
biossintéticas básicas, incluindo fotossíntese, fotorrespiração e síntese de
aminoácidos e carboidratos (Kawasaki et al., 2001; Ozturk et al., 2002; Seki et al.,
2002). Essas alterações metabólicas resultam no declínio da produtividade.
Em resposta ao estresse salino, as plantas desenvolvem uma série de
mecanismos moleculares e bioquímicos (Parida e Das, 2004). A maioria das
plantas pode adaptar-se a níveis de salinidade baixos e moderados, porém, seu
crescimento é severamente limitado a 200 mM de NaCl (Hasegawa et al., 2000).
Neste contexto, vários genes são envolvidos. Esses genes são
responsáveis por codificar proteínas de resposta ao sal (Tabela 3), que podem ser
divididas em dois grupos. O primeiro grupo inclui proteínas que, provavelmente,
respondem ao estresse, no intuito de combatê-lo. Como exemplo, podemos citar
enzimas requeridas na biossíntese de osmólitos, chaperoninas, proteínas LEA
(Late embryogenesis abundant), proteínas ligadoras de mRNA, transportadores
de íons, transportadores de açúcar e prolina, enzimas antioxidantes, hormônios
vegetais, como o ABA, e várias proteases (Bohnert e Jensen, 1996; Ingram e
Bartels, 1996; Seki et al., 2002). O segundo grupo inclui proteínas que estão
envolvidas na regulação da transdução de sinais e expressão de genes que,
provavelmente, são regulados para responder ao estresse – como proteínas
quinase, fatores de transcrição e enzimas do metabolismo de lipídios (Shinozaki e
Yamaguchi-Shinozaki, 1997).
12
Tabela 3 - Complexidade da resposta ao estresse salino. (Adaptado de Cushman
e Bohnert, 2000)
Compostos e proteínas Exemplos Possíveis modos de ação
Osmoprotetores
Aminoácidos (prolina, ectoína)
Compostos dimetil sulfonados
(glicina-betaína)
Polióis (manitol, sorbitol)
Açúcares (sacarose, trealose)
Ajuste osmótico, proteção
da membrana celular e
proteção contra espécies
reativas de oxigênio
Moléculas de resposta a
estresse oxidativo
Enzimas (catalase, glutationa
redutase, ascorbato
peroxidase, superóxido
dismutase, oxidase alternativa),
Compostos não-enzimáticos
(ascorbato, carotenoides,
antocianinas)
Desintoxicação celular
Proteínas de estresse
Proteínas LEA (Late
Embryogenesis Abundant)
Estabilização de proteínas e
da membrana, redução de
estresse hídrico
Proteínas Heat shock (HSP)
Proteínas de resposta a sal,
frio, calor, localizadas em
diferentes compartimentos
subcelulares (chaperonina)
Modulação traducional,
prevenção do dobramento
incorreto de proteínas
Transportadores de prótons e
íons
Tranportadores de K
+
, Na
+
, H
+
ATPases, Na
+
/H
+
antiporter
Remoção e seqüestro de
íons tóxicos do citosol,
formação do gradiente de
prótons
Transportadores de prótons e
íons
Tranportadores de K
+
, Na
+
, H
+
ATPases, Na
+
/H
+
antiporter
Remoção e sequestro de
íons tóxicos do citosol,
formação do gradiente de
prótons
Moléculas responsáveis por
manter a fluidez da membrana
H
+
ATPase, Na
+
/H
+
antiporter,
desaturases de ácidos graxos
Aumento da fluidez da
membrana
Transporte hídrico Aquaporinas (CIP, TIP, PIP)
Relações hídricas, abertura
e fechamento estomático
Moléculas de sinalização
celular
MAP quinases, quinases Ca
+
dependente, fosfatases,
sensores de Ca
+
(SOS3)
Sinalização celular
Fatores de transcrição EREBP, DREB, zinc finger
Ativação da transcrição
gênica
Reguladores de crescimento
Ácido abcísico, etileno,
brassinosteroides, poliaminas,
citocininas
Homeostase hormonal e
regulação gênica
13
No caso da salinidade, Rozeff (1995) reportou que o sal afeta a cultura de
cana-de-açúcar e pode interferir na produção de duas maneiras: afetando o
crescimento e desenvolvimento vegetal e reduzindo a concentração de sacarose
no colmo. A cana-de-açúcar, atualmente, tem-se tornado uma cultura atrativa
economicamente, usada para a produção de aproximadamente 60% do açúcar
mundial e também de etanol. Dessa forma, plantas de cana, apresentando
aumento de tolerância às condições adversas, são altamente desejáveis, pois
fatores ambientais que desfavoreçam a cultura são os principais causadores de
perda e redução da produtividade agrícola (Rocha et al., 2007; Bray et al., 2000).
2.3.1.2. Estresse hídrico
O estresse hídrico pode ocorrer como o resultado de duas condições,
devido ao excesso ou o déficit de água. O estresse hídrico mais comum é o déficit
hídrico ou desidratação. A remoção da água de uma membrana biológica
ocasiona distúrbios na estrutura lipídica e resulta em uma membrana
excessivamente porosa.
A desidratação pode resultar também em perda da integridade de
membrana, da seletividade, da atividade enzimática e alterações na
compartimentalização celular (Mahajan e Tuteja, 2005).
Os componentes da via de sinalização dos estresses hídrico e salino
apresentam resposta cruzada. Virtualmente, cada aspecto da fisiologia vegetal
bem como do metabolismo celular é afetado pela salinidade e pela seca (Liu e
Zhu, 1998).
Existem alguns efeitos fisiológicos evidentes no estresse hídrico, como
alterações no fluxo de íons, fechamento estomático, produção de osmoprotetores
e redução no crescimento vegetativo e na divisão celular (Rieira et al., 2005;
Schuppler et al., 1998). O crescimento e expansão foliar são geralmente os mais
sensíveis. Isso se deve ao fato de que áreas foliares menores apresentam taxa de
transpiração reduzida.
O crescimento vegetal e a resposta a estresses são amplamente
controlados por hormônios. Em particular, o hormônio ácido abscísico (ABA) é
bem caracterizado na via de sinalização em resposta à desidratação. O ABA
14
regula a transpiração por meio de movimentos estomáticos, promovendo o
fechamento e inibindo a abertura de células-guarda (Schoeder et al., 2001).
Respostas como aceleração da senescência e abscisão das folhas mais velhas
também são encontradas.
Entre os estresses abióticos, o estresse hídrico é o principal fator que
influencia a produtividade canavieira. Este afeta diretamente o tamanho do colmo,
diminuindo a produção de sacarose (Sugiharto, 2004). A cana-de-açúcar
apresenta elevado consumo de água, necessitando de 250 partes de água para
formar uma parte da matéria seca da planta (Dillewijn, 1952). Sua irrigação só é
cessada antes da colheita, para reduzir a compactação do solo, facilitando o uso
de máquinas agrícolas e para aumentar o teor de sacarose (Robertson et al.,
1999). Dessa forma, a disponibilidade de água é um fator limitante na produção
agrícola da cana-de-açúcar, tornando-a dependente parcial ou total da irrigação.
2.4. O estresse oxidativo como resposta secundária ao sal e à seca
Uma das alterações bioquímicas que ocorrem, quando as plantas são
sujeitas aos estresses salino e hídrico, é a produção de espécies reativas de
oxigênio (ROS – Reactive Oxygen Species) (Meloni et al., 2003). Porém, durante
o metabolismo vegetal normal, as ROS são geradas como produto da cadeia
transportadora de elétrons (Moller, 2001), sendo as mitocôndrias e os cloroplastos
importantes geradores intracelulares de ROS (Meloni et al., 2003). Em
cloroplastos, as ROS podem ser geradas pela transferência direta da energia de
excitação da clorofila a, para produzir um oxigênio singleto, ou pela redução
univalente do oxigênio do fotossistema I, na reação de Mehler (Asada, 1999).
Níveis intermediários de ROS dão início a uma cascata de morte celular
programada, permitindo que células comprometidas sejam eliminadas (Datt et al.,
2003). A indução e execução da morte celular desencadeiam processos
controlados e podem ser modulados por moléculas sinalizadoras, como o ácido
jasmônico, ácido salicílico e etileno (Lam et al., 1999).
As ROS têm sido consideradas, tradicionalmente, produtos tóxicos do
metabolismo aeróbico (Rentel e Knight, 2004). Entretanto, nos últimos anos,
tornou-se aparente que células vegetais produzem níveis endógenos basais de
15
ROS (Wohlgemut et al., 2002). Dessa forma, as ROS estariam atuando como
moléculas sinalizadoras, quando um aumento no acúmulo de H
2
O
2
e alterações
no estado redox alertariam a célula vegetal para uma possível mudança do
ambiente (Foyer e Noctor, 2003).
As plantas possuem uma série de mecanismos que atua na proteção
contra os danos mediados pelas ROS. O termo antioxidante pode ser considerado
para descrever inúmeros compostos capazes de dissipar essas espécies reativas,
sem que a planta passe por uma destruição severa (Dröge, 2002). Enzimas
antioxidantes, como a ascorbato peroxidase (APX), a superóxido dismutase
(SOD) e a catalase (CAT), estão envolvidas nos principais mecanismos de
detoxificação do meio intracelular (Mittler, 2002).
A redução da taxa fotossintética também aumenta a formação de ROS, e
aumenta a atividade de enzimas detoxificadoras (Foyer e Noctor, 2005; Logan,
2005; Apel e Hirt, 2004). Quando as plantas se aclimatam, devido às mudanças
do ambiente, ajuste na morfologia da folha, alterações na composição de
pigmentos e distúrbios em processos bioquímicos, a prevenção do dano oxidativo
pode ser verificada.
A superóxido dismutase é o principal dissipador de superóxidos (O
2
-
), e sua
ação enzimática resulta na formação de H
2
O
2
e O
2
. O peróxido de hidrogênio
produzido é então retirado pela ação da catalase e uma variedade de peroxidases
(Foyer e Noctor, 1998).
A peroxidação de lipídeos insaturados presentes em membranas biológicas
é o sintoma mais proeminente da ocorrência de estresses oxidativos em plantas
(Yamamoto et al., 2001). O malonaldeído (MDA), como produto da decomposição
de ácidos graxos poli-insaturados de biomembranas, apresenta um grande
acúmulo em condições de estresse (Gosset et al., 1994). Em alguns casos, uma
alta estabilidade da membrana pode ser correlacionada à tolerância a estresses
abióticos (Premachandra et al., 1992).
O sistema antioxidante de resposta não está confinado somente a
estresses abióticos, mas é responsivo também à ataque de patógenos, entre
outros, podendo também desencadear morte celular programada (Apel e Hirt,
2004).
16
2.5. A fotossíntese e a resposta da maquinaria fotossintética a estresses
ambientais
A fotossíntese é um processo pelo qual plantas, algas e bactérias
fotossintetizantes convertem a energia solar em uma forma quimicamente estável
de energia, para sintetizar compostos orgânicos. Essa transdução energética é
complexa, envolvendo diversos mecanismos físicos e químicos (Strasser et al.,
1998).
O processo fotossintético ocorre no cloroplasto. Essa organela, em plantas
superiores, possui entre 3 e 10 µm de diâmetro, com comprimento de 1 a 4 µm. A
dupla membrana do cloroplasto, interna e externa, separa o sistema fotossintético
do citoplasma. A membrana externa é altamente permeável a pequenas
moléculas, enquanto a membrana interna possui proteínas transportadoras para
transferência seletiva de certos metabólitos (Steffen, 2003). No interior do
cloroplasto, localiza-se um sistema de membranas altamente organizado,
denominado membranas tilacoidais ou tilacoide, cercado por uma matriz aquosa,
o estroma.
A membrana tilacoidal possui um sistema altamente complexo de proteínas
inseridas na bicamada lipídica, incluindo também um espaço aquoso denominado
lúmen. Os lipídeos correspondem aproximadamente a 50% da massa total do
tilacoide, sendo os outros 50% correspondentes aos principais complexos
proteicos: fotossistema I e II (PSI e PSII), citocromo b
6
f (Cytb
6
f) e ATP sintase
(ATPase) (Steffen, 2003).
Um elemento-chave na conversão da energia fotossintética é o transporte
de elétrons dentro e entre os complexos proteicos. As reações de transferência de
elétrons são rápidas (picossegundos) e altamente específicas (Jajoo et al., 2001).
O processo é iniciado quando a luz é absorvida por complexos pigmento-proteína
(PSI, PSII, Cytb6f e ATPase) que estão envolvidos na separação de cargas,
transferência de elétrons e síntese de ATP (Steffen, 2003).
Outro princípio básico compartilhado por todos os organismos
fotossintetizantes é o uso de clorofilas e carotenoides como pigmentos coletores
de luz. Esses pigmentos orgânicos são capazes de absorver a energia luminosa
que iniciará as reações fotoquímicas da fotossíntese. A energia luminosa,
absorvida pelos coletores de luz (LHC), composta por complexos de pigmento-
17
proteína, é transferida para os centros de reação do PSI e PSII onde é usada para
iniciar a separação primária de cargas.
Considerando que as clorofilas são os principais pigmentos coletores de
luz, os carotenoides, são então chamados de pigmentos acessórios, possuindo
também um papel fundamental na proteção dos complexos de pigmento-proteína
contra excessos de luz e espécies reativas de oxigênio.
Biossinteticamente, as clorofilas derivam-se de uma porfirina e consistem
de um anel tetrapirrólico, contendo um átomo central de Mg
2+
. A diferença entre
clorofila a e b reside no fato de que a primeira possui um radical metil e a segunda
possui um radical aldeído.
A denominação carotenoide é um termo genérico para classificar uma
classe de carotenos e seus derivados oxigenados, as xantofilas.
Aproximadamente 150 dos 600 carotenoides conhecidos são encontrados em
organismos fotossintetizantes. Os carotenoides consistem de uma cadeia de oito
unidades isoprênicas conjugadas. Geralmente, eles são distintos por seu grupo
final. Entretanto, derivados foram encontrados onde o esqueleto de carbono foi
encurtado pela remoção de fragmentos. Esses derivados são denominados
apocarotenoides, diapocarotenoides ou norcarotenoides. Já em relação a plantas
superiores e algas verdes, os pigmentos encontrados são β-, ε- e ψ- carotenos
(Steffen, 2003). Um possível método de extração desses pigmentos das folhas é
pela utilização de solventes orgânicos (Steffen, 2003).
Sendo a fotossíntese um processo físico-químico dependente de luz, esta
também pode ser influenciada pelas condições ambientais do meio em que a
planta se encontra (Devlin, 1976). Portanto, diferentes estresses ambientais
podem afetar a eficiência fotossintética de uma planta, prejudicando a taxa de
reações químicas inerentes ao processo, ou a organização estrutural dos
componentes envolvidos. Neste sentido, a configuração dos complexos proteicos
ao longo da membrana tilacoidal (Figura 1) representa papel fundamental
(Opanasenko et al., 1999), visto que esses, ao atuarem sobre o sistema, podem
ser danificados pelos estresses ambientais, prejudicando seu funcionamento.
18
Barber et al., 1997 (Physiology Plantarum).
Figura 1 - O Fluxo de elétrons durante a fotossíntese na membrana tilacoidal.
Diversos estresses exercem, sobre o organismo, um aumento no custo da
manutenção, refletindo em sua respiração. Alta temperatura, luz excessiva,
drogas, doenças e a própria salinidade mostraram um aumento na respiração
com redução da fotossíntese (Takemura et al., 2000).
A provável sequência de eventos fisiológicos e bioquímicos pode mudar
com o aumento da salinidade, alterando o nível de gás carbônico intracelular e a
abertura de estômatos (Takemura et al., 2000). Pelo aumento de CO
2
, foi
demonstrado que a salinidade interfere diretamente na fotossíntese,
provavelmente pela inibição parcial da atividade da Rubisco, enzima primordial da
fase bioquímica de fixação do carbono (Nazaenko, 1992). A Rubisco existe como
uma holoenzima composta de oito subunidades maiores (LSUs; 55 kD),
codificadas pelo gene cloroplastídico rbcL e oito subunidades menores (SSUs; 15
kD),
codificadas no núcleo, pela família gênica rbcS (Spreitzer, 1993).
A sensibilidade da holoenzima Rubisco ao estresse oxidativo também é
bastante elucidada (Cohen, 2005). Shapira et al. (1997) demonstraram que a
oxidação é seguida de clivagem proteolítica de polipeptídeos da subunidade LSU
e, paralelamente, a tradução de rbcL cessa, retornando apenas quando condições
ótimas são reestabelecidas.
A membrana tilacoidal também pode se adequar a condições de estresse
abiótico. Isso requer respostas a curto prazo, como transição de estado e
19
aumento nos componentes de dissipação de energia, e respostas a longo prazo,
como mudanças na razão PSI/PSII (Aro e Andersson, 2001).
O estresse salino também resulta num significativo acúmulo de sódio e
cloro nas folhas, induzindo uma redução no teor de pigmentos e, portanto, um
decréscimo na eficiência fotossintética (Lu et al., 2002). Esse decréscimo poderia
ser, de outro modo, uma consequência indireta de uma fisiologia prejudicada
devido ao estresse.
Um método que tem sido bastante proposto para se estudar o desempenho
fotossintético é o uso de medidas da fluorescência da clorofila a, associada ao
fotossistema II (Newton e McBeath, 1996). Isso foi possível devido ao
desenvolvimento de fluorímetros modulados (Ögren et al., 1985) que utilizam uma
fonte luminosa de excitação modulada (1 a 100 kHz), juntamente com um sistema
de detecção de fluorescência. Em alguns casos, mudanças nas variáveis de
fluorescência podem ser observadas, porque a maioria das cultivares tolerantes
exibe um reduzido decréscimo na eficiência fotoquímica, quando crescem em
condições de estresse (Plaut et al., 1990).
2.5.1. A fluorescência da clorofila a como monitoramento do desempenho
do aparelho fotossintético
A energia do fóton absorvido pelos pigmentos fotossintéticos desencadeia
as reações fotoquímicas (Schreiber et al., 2000). O fluxo de fótons excita a
molécula de clorofila, levando-a a um primeiro estado excitado, singleto
(Holzwarth, 1991), e a separação de cargas no centro de reação ocorre após
alguns picossegundos (Bolhàr-Nordenkampf et al., 1993). Quando não ocorre a
separação de cargas, o pigmento excitado retorna a um nível basal e a energia
absorvida é emitida como calor (D) e fluorescência (F) (Krause e Weis, 1991).
Com o início da absorção da energia luminosa, os aceptores localizados
nos tilacoides estão aptos a receber elétrons das moléculas de clorofila a
especial. Como resultado, o número de aceptores apto a aceitar os elétrons é
rapidamente reduzido a zero, visto que todos os sítios de redução estão ocupados
em consequência da ativação da fase fotoquímica. Dessa forma, a fluorescência é
elevada durante a atividade do aparelho fotossintético, sendo reduzida
20
posteriormente. A cinética de emissão da fluorescência e as fases da curva são
convencionalmente denominadas de OJIP (Figura 2).
Figura 2 - Cinética da emissão de fluorescência.
Após o tecido fotossintetizante ser mantido no escuro (adaptação de 15 a
30 minutos), verifica-se que, durante a iluminação, há uma elevação inicial da
fluorescência denominada de F
0
(fluorescência mínima ou inicial). O valor F
0
representa a emissão de luz pelas moléculas de clorofila a excitadas, antes de a
energia ser transferida para o centro de reação do PSII (Mathis et al., 1981). O
valor de F
0
é alterado por estresses ambientais, devido a mudanças estruturais
nos pigmentos fotossintéticos do PSII (Adams et al., 1993).
A indução da fluorescência da clorofila envolve uma fase transiente, que é
rápida (OJIP), e uma fase não transiente, lenta (após P). A fluorescência
transiente da clorofila é conhecida como fluorescência variável (F
v
),
representando a fluorescência entre os níveis O (F
0
– fluorescência inicial) e P (F
m
– fluorescência máxima) (Krause e Weis, 1991).
A diminuição da fluorescência, após o nível P, é denominada quenching
(q), que é uma forma de dissipação. Os quenchings são divididos em dois tipos:
quenching fotoquímico (qP) e quenching não-fotoquímico (qN). O quenching
fotoquímico é a dissipação ocasionada pela utilização da energia absorvida pelo
processo fotoquímico. O quenching não-fotoquímico representa a dissipação da
energia absorvida por outras formas, principalmente por calor.
21
Em fluorímetros de luz modulada de modelo Mini-Pam, o processo de
dissipação de energia, denominado quenching, é expresso matematicamente:
qP = (F’
m
– F) / (F’
m
– F
0
)
Se considerarmos qN = 1 – qP
qN = (F
m
– F’
m
) / (F
m
– F
0
)
Onde o sinal (‘) está relacionado ao tecido fotossintetizante previamente
iluminado.
Como já citado anteriormente, a energia absorvida pode ser utilizada na
produção de ATP e NADPH
2
, liberada na forma de calor (D) e emitida na forma de
fluorescência (F).
Neste sentido, os processos fotoquímicos poderiam ser representados pela
equação:
Ph + D + F = 1
Onde:
Ph - rendimento quântico do fotossistema II
F - fluorescência
D - dissipação na forma de calor
De acordo com Schreiber et al. (1998), o rendimento quântico do
fotossistema II (Ph) pode ser representado pela razão F
v
/F
m
. Em condições
normais, as plantas apresentam essa razão entre 0,75 e 0,85 (Butler e Kitajima,
1975), verificada em diferentes espécies e entre variedades de uma mesma
espécie.
Sendo assim, a razão F
v
/F
m
é proporcional ao rendimento quântico máximo
do PSII, sendo sensível a diversas alterações ambientais que possam afetar a
eficiência na absorção de energia (Babani e Lichtenthaler, 1996).
22
2.6. Sinalização celular em resposta a estresses
Plantas são organismos sésseis que, para sobreviver às condições
adversas, desenvolveram uma via de resposta sofisticada ao primeiro sinal de
alteração do ambiente, e então transduzir o sinal, obtendo, posteriormente, uma
resposta fisiológica à condição imposta (Cao et al., 2007; Finkelstein et al., 2002).
O estresse é primeiramente percebido por receptores presentes na
membrana das células, o sinal é então transduzido e isto resulta em uma geração
de mensageiros secundários, incluindo cálcio, espécies reativas de oxigênio
(ROS) e fosfatidil inositol (Figura 3). Esses mensageiros secundários, como o
fosfatidil inositol, modulam os níveis de cálcio intracelular (Mahajan e Tuteja,
2005).
A perturbação nos níveis de Ca
2+
é percebida por proteínas ligadoras de
cálcio, bem como por sensores de cálcio. Essas proteínas sensoriais interagem
com seus respectivos padrões de interação e iniciam uma cascata de fosforilação,
resultando na ativação de fatores de transcrição e de genes responsivos a
estresses (Mahajan e Tuteja, 2005). O produto dessa resposta é a adaptação e
possível sobrevivência à condição desfavorável imposta.
Em eucariotos, proteínas quinase estão envolvidas em aspectos-chave da
regulação celular, incluindo divisão celular, metabolismo, e resposta a sinais
externos, como estresses. Em plantas, diversas MPKs (proteínas quinase
ativadas por mitogênese – do inglês mitogen activated protein quinase) são
ativadas em resposta a estresses abióticos. Os níveis de transcritos de um
número de proteínas quinase, incluindo MAPKKK, MAPKK e MAPK, aumentam
em resposta a essas condições adversas (Mikolajczyk et al., 2000).
As respostas celulares e moleculares a estresses ambientais têm sido
estudadas intensivamente (Thomashow, 1999; Hasegawa et al., 2000). O
entendimento desses mecanismos, pelos quais as plantas percebem os sinais
ambientais e os transmitem à maquinaria celular, para ativar respostas
adaptativas, é de fundamental importância para a biologia (Xiong et al., 2002).
23
Adaptado de Mahajan e Tuteja, 2005.
Figura 3 - Representação da via de sinalização em resposta a uma condição de
estresse. O sinal é percebido por receptor de membrana, pelo qual ativa PLC
(fosfolipase C) e hidrolisa PIP
2
(fosfatidil inositol 4,5-bifosfato), para gerar IP
3
(inositol trifosfato) e DAG (diacilglicerol). Com a duração do estresse, os níveis de
cálcio citosólico são aumentados. Essa alteração é percebida por sensores de
Ca
2+
que interagem com seus respectivos componentes da via de sinalização,
como quinases e fosfatases. Essas proteínas são responsáveis por ativar fatores
de transcrição e desencadear a expressão de genes responsivos, permitindo uma
resposta fisiológica ao estresse.
Proteínas quinase possuem um papel-chave na cascata de sinalização
celular. Em resposta ao estresse osmótico, bem como a outros estresses
abióticos e bióticos, há um aumento na concentração de Ca
2+
citosólico (Knight,
2000). A via de sinalização é complexa e envolve uma ação coordenada de vários
genes. O Ca
2+
é o candidato primário, que funciona como um fator central na
coordenação e sincronização de diversos estímulos da resposta celular. Na célula
vegetal, muitos sensores de cálcio têm sido descritos como proteínas quinase
24
dependentes de Ca
2+
(CDPKs) (Zielinski et al., 1998; Luan et al., 2002) e como
proteínas sensoriais CBLs (similares a calcinerina, do inglês - calcineurin B-like)
(Liu e Zhu, 1998). Várias isoformas de CBL são induzidas em condições de
estresse (Kim et al., 2003; Cheong et al., 2003; Pandey et al., 2004; Albrecht et
al., 2003; Nozawa et al., 2001; Hwang et al., 2005). As CBLs interagem
especificamente com uma classe de proteínas quinase, conhecida como CIPK
(CBL-interacting protein quinase) para transduzir o sinal via fosforilação.
Plantas possuem algumas famílias de quinases que não são encontradas
em animais ou leveduras, ou são altamente divergentes. Por exemplo, CDPKs
são encontradas em plantas vasculares, não-vasculares, em algas e em certos
protozoários (Hrabak, 2000). Adicionalmente, existe um grupo de quinases
vegetais, relacionada a uma classe de quinases de levedura (SNF1-type), porém,
a maioria dessas enzimas, em Arabidopsis, apresenta função similar e estrutura
primária diferente, quando comparadas com as de seu ortólogo em levedura
(Hrabak et al, 2003). Em 1998, Halford e Hardie deram o nome SnRK (quinase
relacionada a SNF1 – Sucrose Nonfermenting1-Related Protein Quinase) a esse
grupo de quinases e as distribuíram em três classes: SnRK1, SnRK2 e SnRK3
(Figura 4), em que SnRK1 tem um papel na regulação global do metabolismo de
carbono e nitrogênio; e SnRK2 e 3 estão envolvidos na sinalização em resposta a
estresses (Shukla e Mattoo, 2008). Todas essas proteínas possuem um domínio
catalítico típico – Ser-Thr – que foram usadas na classificação inicial (Hanks e
Hunter, 1995). A maioria dos membros da família CDPK-SnRK apresenta uma
região C-terminal que funciona como um regulador da atividade quinase ou um
mediador na interação com outras proteínas.
25
Adaptado de Hrabak et al., 2003.
Figura 4 - Representação esquemática da estrutura dos domínios de proteínas
quinase pertencentes à família CDPK-SnRK. As linhas verticais indicam as
regiões N e C-terminal. Os sítios de ligação de cálcio estão indicados por caixas
pretas. O domínio regulatório de SnRK1 está indicado por linhas pontilhadas,
enquanto SnRK2 e SnRK3 estão representados por D/E e a caixa quadriculada,
respectivamente.
Ao todo, foram encontrados 38 SnRKs, em Arabidopsis, três SnRK1, dez
SnRK2 e 25 SnRK3. As duas últimas classes parecem ser exclusivas de plantas
(Halford et al., 2000). Existem evidências de que a classe SnRK2 apresenta papel
importante na resposta a estresses abióticos em plantas, principalmente a ABA e
estresse osmótico (Umezawa et al. 2004; Mustilli et al. 2002; Yoshida et al. 2002;
Li et al., 2000;). Com relação à classe SnRK3, as 25 proteínas são representadas
por CIPKs (proteínas quinase que interagem com CBLs, do inglês – CBL-
interacting protein quinase) (Albrecht et al., 2001); SOS2 (salt overly sensitive 2)
(Liu et al., 2000); SIPs (SOS3 interacting proteins) (Halfter et al., 2000); e PKSs
(proteínas quinase S) (Guo et al., 2001).
Os dois primeiros genes de SnRK2, encontrados em Arabidopsis, foram
clonados em 1993 e denominados ASK1 e ASK2 (Parker et al., 1993).
Posteriormente, a classe SnRK2 foi renomeada como SnRK2.1 a SnRK2.10
(Halford e Hardie, 1998; Hrabak et al., 2003). Em arroz, dez quinases ortólogas,
as proteínas da classe SnRK2 foram identificadas por sua ativação durante o
estresse osmótico e exposição ao ABA, e classificadas como SAPKs – SAPK1 a
SAPK10 (Kobayashi et al., 2004).
26
2.7. Imunidade inata em plantas
Praticamente todas as plantas encontradas em um ecossistema natural
podem ser infestadas por bactérias, vírus, fungos, nematoides ou insetos. Esses
diferentes organismos liberam moléculas efetoras (também chamadas fatores de
virulência) dentro da célula vegetal, causando doenças. Apesar de todos esses
ataques, as plantas são capazes de se proteger. Os mecanismos de defesa
vegetal são complexos e compostos de múltiplas linhas de defesa que são
efetivas contra uma diversidade de patógenos. Essas barreiras de defesa podem
ser químicas ou físicas, inibindo a infecção (Bari e Jones, 2009).
O sistema de defesa induzido inclui alterações moleculares, bioquímicas, e
mudanças morfológicas, como estresse oxidativo, expressão de genes
relacionados, produção de compostos antimicrobianos, e morte celular
programada (van Loon et al., 2006).
Ao contrário dos animais, as plantas não possuem células especializadas
em desencadear resposta imune. Em resposta a essa alteração, as células
vegetais se reprogramam, priorizando a defesa do sistema para que as funções
celulares voltem à homeostase (Spoel et al., 2008).
As plantas se defendem contra a maioria dos patógenos mediante um
mecanismo basal de defesa (também chamado de sistema imune inato). O
sistema imune vegetal tem sido representado em esquemas como um modelo
‘zig-zag’, no qual, a percepção de padrões moleculares associados a micróbios e
patógenos (MAMPs e PAMPs – microbial- or pathogen- associated molecular
patterns) reconhecem receptores relacionados a esses padrões (PRRs – pattern
recognition receptors) na imunidade desencadeada por PAMPs. Como uma forma
de burlar esse sistema, os patógenos secretam moléculas efetoras capazes de
suprimir essa imunidade e desencadear a doença, resultando na susceptibilidade
do vegetal desencadeada por efetores. Mais uma vez, as plantas reconhecem
essas moléculas efetoras e ativam o sistema imune, formando um sistema de
inativação e ativação (‘zig-zag’) (Chisholm et al., 2006; Jones e Dangl, 2006).
27
2.8. Bactérias endofíticas diazotróficas
As plantas podem interagir especificamente com diferentes
microorganismos formando associações mutualísticas e patogênicas. A presença
desses microorganismos pode ser requerida para o crescimento e o
desenvolvimento do vegetal em diferentes ecossistemas (Hardoim et al., 2008).
Durante o desenvolvimento dessa associação, o sistema de defesa da planta é
estritamente regulado por uma sinalização complexa (cross-talking) e por
transdução de sinais (Eugem et al., 1999; McDowell e Dangl, 2000), determinando
se a interação será benéfica (Lambais, 2001).
De modo geral, a palavra endofítico inclui todos os organismos capazes de
colonizar, durante alguma parte do seu ciclo de vida, os espaços intercelulares e
tecidos vasculares de diferentes órgãos vegetais, sem causar, na planta
hospedeira, dano aparente ou algum sintoma de doença (Petrini 1991). As
bactérias endofíticas são estudadas há mais de 120 anos. Durante todo esse
tempo, várias bactérias foram isoladas e caracterizadas. Herbaspirillum,
Gluconacetobacter e Burkholderia são alguns dos exemplos de bactérias
endofíticas fixadoras de nitrogênio.
O termo endofítico foi primeiramente introduzido na área de pesquisa de
fixação de nitrogênio associado com gramíneas, por Döbereiner (Baldani e
Baldani, 2005). A definição da palavra foi dada por De Bary (1866) e refere-se à
flora micótica que habita o interior dos tecidos vegetais. Posteriormente, o termo
foi também aplicado para bactérias, passando por diversas definições conceituais.
As bactérias endofíficas são classificadas em obrigatórias e facultativas,
sendo as últimas caracterizadas como bifásicas, alternando entre plantas e
ambiente (principalmente o solo).
Embora a presença de bactérias endofíticas nas plantas seja variável e,
ocasionalmente, transiente, elas são capazes de desencadear mudanças
drásticas na fisiologia e modular o crescimento e desenvolvimento vegetal
(Conrath et al., 2006). Adicionalmente, vários mecanismos moleculares estão
envolvidos devido às alterações acarretadas pela invasão bacteriana. Muitos
genes candidatos com função desconhecida têm sido encontrados e
caracterizados por serem diferencialmente expressos durante a associação
planta-bactéria (Rocha et al., 2007). Isso indica que as etapas iniciais da
28
colonização endofítica são ativamente monitoradas e, possivelmente, aumentadas
ou diminuídas pela planta (Vargas et al., 2003).
A diversidade e a composição da comunidade bacteriana na endosfera são
provavelmente governadas por eventos estocásticos e influenciadas por
processos que determinam a colonização (Battin et al., 2007), como, por exemplo,
fatores do solo. Considerando a heterogeneidade do solo nos níveis micro-
habitados e a distribuição heterogênea da raiz vegetal no solo, as etapas de
colonização dependem da probabilidade de ocorrer a interação raiz-bactéria
(Figura 5) (Hardoim et al., 2008).
Adaptado de Hardoim et al., 2008.
Figura 5 - Diferentes tipos de endófitos e o processo de colonização bacteriana.
Os fatores do solo e a comunidade bacteriana determinam os eventos de
associação raiz-bactéria. Bactérias oportunistas e endófitos passageiros (células
azuis e vermelhas) são restritos ao espaço do córtex. Elas são incapazes de
invadir o tecido-específico e manipular o metabolismo vegetal. Os endófitos
verdadeiros (células amarelas) possuem algumas propriedades oportunistas e,
adicionalmente, são capazes de invadir o tecido vascular, adaptando-se ao
ambiente vegetal sem causar aparente desarmonia.
Nesses últimos anos, vários efeitos positivos foram atribuídos às bactérias
endofíticas, como a promoção do crescimento vegetal, controle biológico de
pragas e doenças nas plantas, fixação biológica de nitrogênio (Downing et al.,
2000; Verma et al., 2001), indução de resistência sistêmica (Hallmann, 1997),
produção de sideróforos (Burd et al., 1998; Wenbo et al., 2001) e produção de
antibióticos (Strobel e Daisy, 2003).
29
Outros estudos com endofíticos diazotróficos demonstraram que essas
bactérias produzem hormônios reguladores do crescimento vegetal, como auxina
(Fuentes-Ramirez et al., 1993), giberelina (Bastian et al., 1998) e citocininas, as
quais contribuem para melhorar a nutrição mineral e a utilização de água pelas
plantas (Bazzicalupo e Okon, 2000). Adicionalmente, foi verificado que muitas
dessas bactérias promotoras de crescimento produzem e metabolizam a enzima
1-amino ciclopropano-1-carboxilato (ACC) desaminase, um precursor do etileno
(Mayak et al., 2004).
A síntese desses hormônios, pelas células bacterianas, poderia atuar na
modulação dos níveis endógenos. Com o desequilíbrio desses níveis hormonais,
poderia haver alterações na resposta vegetal aos diferentes estresses ou
condição ambiental imposta.
Relativamente poucos mecanismos foram demonstrados para explicar as
alterações na resposta a estresses ambientais, em plantas inoculadas com essas
bactérias promotoras do crescimento vegetal (Mayak et al., 2004). Porém,
acredita-se que essas bactérias diazotróficas, em associação com plantas
crescidas sob condições adversas, como seca e salinidade, poderiam modificar a
adaptação às condições de estresse.
2.8.1. Gluconacetobacter diazotrophicus
Gluconacetobacter diazotrophicus, anteriormente denominada Acetobacter
diazotrophicus, é uma bactéria gram negativa, aeróbia, medindo de 0,7 a 0,8 x 2 a
4 µm e não apresentando movimento espiralado. Sua ocorrência é restrita,
podendo ser encontrada em associações com plantas de propagação vegetativa,
ricas em açúcar, como cana-de-açúcar, batata doce, capim Camerrom
(Döbereiner et al., 1993) e abacaxi (Tapia-Hernandez et al., 2000).
As pesquisas com bactérias diazotróficas foram iniciadas, na década de
60, com a observação de que algumas variedades de cana-de-açúcar poderiam
obter aproximadamente 60% de seu nitrogênio por meio da fixação biológica do
nitrogênio (Baldani e Baldani, 2005). Esses resultados permitiram, posteriormente,
o isolamento e a identificação de G. diazotrophicus, em plantas de cana-de-
açúcar (Cavalcante e Döbereiner, 1988).
30
Adicionalmente, entre as propriedades fisiológicas dessa bactéria, foram
observadas a tolerância a altas concentrações de sacarose (até 30%),
sensibilidade ao sal, tolerância a acidez (baixo pH e ácidos orgânicos) e
habilidade de excretar o nitrogênio fixado, sendo capaz de fixar nitrogênio em
ambientes com pH a 2,5 (Bertalan et al., 2009; Cojho et al. 1993). Em 1999,
Baldani e colaboradores demonstraram que a inoculação de Gluconacetobacter
diazotrophicus, estirpe PAL5, em plantas micropropagadas de cana-de-açúcar,
aumentou o peso fresco de parte aérea em 28%, o que é considerado
comercialmente significativo. Um outro efeito da colonização dessa bactéria é sua
relação com a biossíntese de hormônios vegetais (Fuentes-Ramírez et al., 1993).
A Gluconacetobacter é capaz de colonizar tecidos radiculares e partes
aéreas pela penetração na ponta da raiz e raízes laterais (James et al., 1994).
Essa colonização da cana-de-açúcar pela bactéria foi demonstrada por meio de
microscopia eletrônica e ótica (James et al., 1994; Olivares et al., 1996). Na
superfície da raiz, a bactéria se concentra nas regiões de junção das raízes
laterais. Dentro da raiz, esta pode ser vista no interior de células da epiderme e
nos espaços intercelulares do parênquima, bem como dentro de vasos do xilema,
através dos quais, a bactéria parece migrar para a parte aérea da cana-de-açúcar
(Dong et al., 1994; Reis et al., 1995).
Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 foi a terceira bactéria endofítica
diazotrófica a ter seu genoma completamente sequenciado. Seu genoma é
composto de 3,9 Mpb e dois plasmídeos de 16,6 e 38,8 Kb, respectivamente. As
894 sequências gênicas encontradas estão relacionadas ao modo de vida
endofítico, como fixação de nitrogênio, promoção do crescimento vegetal,
metabolismo de açúcar, transportadores, biossíntese de auxina e a ocorrência de
bacteriocinas (Bertalan et al., 2009).
2.9. Papel dos estômatos na resposta imune inata
Estômatos são poros microscópicos presentes na superfície da área foliar,
compostos de duas células especializadas da epiderme, denominadas células-
guarda (Lawson, 2008). Através dos estômatos, as plantas conduzem as trocas
gasosas necessárias para a fotossíntese e controla a perda de água por meio da
31
regulação da abertura do poro. As plantas regulam a abertura e o fechamento
desse poro mediante as alterações na pressão de turgor dentro das células-
guarda. Os movimentos estomáticos são influenciados por numerosas condições
ambientais, como intensidade de luz, umidade relativa do ar, concentração de
CO
2
, salinidade e desidratação (Underwood et al., 2007).
Mudanças na abertura estomática em resposta ao ambiente são mediadas
por uma complexa sinalização. O hormônio ácido abscísico (ABA) é um
componente-chave de diferentes vias de sinalização, relacionadas ao estresse em
plantas, e desempenha um papel central na sinalização celular, permitindo o
fechamento estomático. Essa sinalização via ABA é transduzida por meio de
sinais, incluindo a produção de compostos como óxido nítrico (NO) e H
2
O
2
, e
sinais intermediários, como a quinase específica de células-guarda OST1 open
stomata 1 (SnRK2.6), e alterações e oscilações nos níveis de Ca
2+
citosólico (Fan
et al., 2004; Mustilli et al., 2002; Schroeder et al., 2001).
Historicamente, essa abertura na superfície foliar era considerada uma
porta de entrada passiva para microorganismos (Figura 6). Entretanto, estudos
recentes têm demonstrado que o estômato desempenha um papel ativo, durante
a invasão bacteriana, como parte de um sistema imune inato da planta (Melotto et
al., 2008).
Adaptado de Melotto et al., 2008.
Figura 6 - Células bacterianas presentes na superfície foliar, ilustrando a
agregação de algumas bactérias próximas ao tricoma e a invasão bacteriana
através dos poros estomáticos.
Em 2006, Melotto e colaboradores usaram plantas de Arabidopsis
adaptadas à luz, nas quais 70-80% dos estômatos estavam abertos. Quando as
folhas foram expostas a uma suspensão bacteriana de Pst DC300, a um
patógeno de tomate e Arabidopsis, uma redução marcante nos números de
32
estômatos abertos foi observada dentro de 1 a 2 horas de incubação. No entanto,
após 3 horas, muitos dos estômatos reverteram seu estado para aberto.
Diversos estudos verificaram que estômatos de Arabidopsis apresentaram
resposta à presença de bactérias e ao tratamento com padrões moleculares
associados a patógenos, derivados de bactérias (PAMPs). A percepção de
PAMPs, por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), é a base da
imunidade inata em muitos organismos superiores, incluindo animais, insetos e
plantas (Ausubel, 2005; Chisholm et al., 2006; Jones e Dangl, 2006).
2.10. Papel dos hormônios na defesa vegetal
Alguns patógenos apresentam, em seu sistema regulatório, a capacidade
de sintetizar biomoléculas que mimetizam fitormônios e interferem na resposta
imune do vegetal. Esses hormônios microbianos resultam em um desequilíbrio
hormonal e ativação inapropriada de defesa (Robert-Seilaniantz et al., 2007),
promovendo virulência.
O etileno, o ácido salicílico, o ácido abscísico e o ácido jasmônico são
descritos como reguladores da resposta a vários patógenos, pestes e a estresses
abióticos (Glazebrook, 2005; Lorenzo e Solano, 2005; Broekaert et al., 2006;
Loake e Grant, 2007; Balbi e Devoto, 2008). O ácido salicílico tem um papel
crucial na resposta de defesa e está geralmente envolvido na ativação da
resposta contra biotróficos, bem como no estabelecimento da resistência
sistêmica adquirida (Grant e Lamb, 2006). Em contraste, o etileno e o ácido
jasmônico estão usualmente associados à defesa contra necrotróficos e insetos
herbívoros (Beckers e Spoel, 2006; Mur et al., 2006).
Outro hormônio que também tem sido observado, na resposta de defesa
vegetal, é o fitormônio ácido abscísico. Ele é um dos principais hormônios que
regula a adaptação de plantas a estresses ambientais, pela modulação da
expressão de genes responsivos a condições adversas e pelo controle do
fechamento estomático, durante o estresse hídrico. Algumas pesquisas incluem
quinases, fosfatases, proteínas-G, enzimas ligadoras de RNA, fatores de
transcrição, mensageiros secundários (Ca
2+
), espécies reativas de oxigênio, óxido
33
nítrico e fosfolipídeos na via de sinalização a ABA (Himmelbach et al., 2003;
Israelsson et al., 2006; Hirayama e Shinozaki, 2007) (Figura 7).
Adaptado de Spartz e Gray, 2009.
Figura 7 - Esquema ilustrativo indicando receptores de ABA atuando em
diferentes locais celulares. A proteína ligadora de RNA (FCA) interage no núcleo
com o fator FY para controlar a abundância de FLC, um inibidor da floração. No
cloroplasto, a subunidade H da quelatase-Mg (CHLH) se liga ao ABA e atua como
regulador positivo na via de sinalização. Estudos genéticos têm demonstrado a
participação de receptores do tipo GPCRs e da proteína-G na via sinalização de
ABA. Adicionalmente, proteínas como fosfolipase D (PLD), fosfatase 2C (PP2C),
quinase ativadas por mitogênese (MAPK), quinase relacionada a SNF1 (SnRK),
ácido fosfatídico (PA), espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico (NO)
também estão envolvidos na resposta a esse hormônio.
Em geral, acredita-se que o ABA esteja envolvido na regulação negativa da
defesa vegetal contra organismos biotróficos e necrotróficos (Bari e Jones, 2009).
Estudos demonstraram que a aplicação exógena de ABA aumentou a
susceptibilidade de Arabidopsis (de Torres-Zabala et al., 2007), feijão (Mohr e
Cahill, 2001) e arroz (Koga et al., 2004) a bactérias e fungos. Recentemente,
Yasuda e colaboradores (2008) demonstraram que o tratamento com ABA
reprime a indução de resistência sistêmica adquirida (SAR), indicando uma
interação entre SAR e a via de sinalização de ABA em Arabidopsis.
Alguns patógenos são capazes de alterar os níveis de ABA endógeno da
planta. Por exemplo, plantas de tabaco infectadas com o vírus do mosaico
apresentaram aumento do teor de ABA e a resistência do vegetal ao vírus
(Whenham et al., 1986). Similarmente, plantas de Arabidopsis infectadas com Pst
34
DC3000 acumularam altos níveis do hormônio quando comparados aos das
plantas-controle (de Torres-Zabala et al., 2007). Esses dados sugerem que alguns
patógenos podem possuir a habilidade de produzir ABA ou alguma molécula que
mimetize sua função, interferindo na resposta de defesa do vegetal (Bari e Jones,
2009).
2.11. COI1, um membro da família F-box, está envolvido na resposta a
hormônios e na defesa vegetal
Diversos estudos têm demonstrado que a concentração de ácido
jasmônico aumenta na resposta à infecção por patógenos, ferimentos ou pela sua
aplicação exógena, induzindo genes relacionados à defesa (Lorenzo e Solano,
2005; Wasternack, 2007). Por exemplo, a síntese de coronatina – uma fitotoxina
de Pseudomonas syringae pv. tomato, que mimetiza ácido jasmônico –
desencadeia a resposta de defesa dependente de metil jasmonato e suprime a
resposta dependente de ácido salicílico, resultando na indução da doença (Cui et
al., 2005; Laurie-Berry et al., 2006). Adicionalmente, tem sido demonstrado o
efeito da coronatina na prevenção do fechamento estomático induzido por
PAMPs, facilitando a entrada do patógeno na folha (Melotto et al., 2006).
Análises utilizando mutantes indicaram que uma proteína sensível à
coronatina (COI1 coronatine insensitive 1 – proteína da família F-box) funciona
como um substrato para o reconhecimento modulado pela multi-subunidade SCF
(SKP1 – Culina1 – proteína F-box) e determina a especificidade do alvo da
ubiquitina ligase E3 (Moon et al., 2004; XuI et al., 2002). O complexo SCF
COI1
(Figura 8) está envolvido na degradação de proteínas pelo proteossomo 26S e é
requerido na resposta a ácido jasmônico (Xie et al., 1998). Em leveduras e células
animais, o reconhecimento do alvo pela ubiquitina ligase E3 depende tipicamente
da fosforilação e de mudanças pós-traducionais do substrato.
35
Adaptado de Spartz e Gray, 2009.
Figura 8 - Esquema ilustrativo da resposta ao ácido jasmônico, regulada
negativamente por SCF
COI1
(complexo multimérico SCF ubiquitina-ligase),
mediante a repressão da atividade transcricional.
Ainda não está claro como a ação dependente de SCF
COI1
interfere na
inibição do fechamento estomático. Diversos estudos mostram a interação
antagonista entre a sinalização de ácido jasmônico (JA) e a sinalização mediada
por ácido salicílico (SA) ou ácido abscísico (ABA) (Laurie-Berry et al., 2006;
Brooks et al., 2005; Anderson et al., 2004). Porém, uma hipótese atrativa é que a
coronatina usa a interação antagonista entre a sinalização de JA, AS e ABA da
planta para afetar a resposta estomática. A sinalização estomática ainda não está
totalmente clara, portanto, futuras pesquisas serão necessárias para entender a
natureza dinâmica que caracteriza a sinalização das células-guarda.
2.12. Produção de hormônios por microorganismos
A primeira observação da síntese de fitormônios por microorganismos foi
realizada em plântulas de arroz infectadas com o fungo Gibberella fujikuroi
(Kurosawa, 1926). O composto identificado, que conferia o aumento do
crescimento da planta, foi denominado giberelina. Posteriormente, técnicas
36
bioquímicas permitiram a identificação de outros hormônios, como auxina e
citocinina de bactérias e fungos (Robert-Seilaniantz et al, 2007).
Crozier e colaboradores, em 1988, caracterizaram o hormônio auxina, por
meio de espectrometria de massas acoplado a um cromatógrafo gasoso (GC-
MS), em cultura de Azospirillum brasilense. Dez anos depois, a presença de IAA
foi também observada em cultura de Gluconacetobacter diazotrophicus, em meio
quimicamente definido (Bastian et al., 1998).
Adicionalmente, diferentes giberelinas (GA
1
, GA
3
, GA
5
, GA
9
e GA
20
) foram
caracterizadas em cultura de Azospirillum lipoferum (Piccoli et al., 1996; Bottini et
al., 1989), confirmando mais uma vez a produção de hormônios por
microorganismos.
As vias de sinalização, bem como a quantidade produzida desses
hormônios, são diferentes e específicas para cada microorganismo. Entretanto,
durante a interação, a síntese desses hormônios é requerida para o
estabelecimento da doença ou colonização (Jamsson, 2000).
O sequenciamento de cepas de Pseudomonas revelou a presença de
genes envolvidos na biossíntese de hormônios vegetais (Feil et al., 2005). Valls e
colaboradores (2006) demonstraram que Ralstonia solanacearum pode produzir
auxina e que mutantes dos genes, envolvidos na biossíntese, apresentam
redução da virulência do patógeno. No caso do fungo G. fujikuroi, a giberelina
produzida é quimicamente similar e apresenta o mesmo papel fisiológico da
giberelina de origem vegetal.
Os estudos já realizados indicam que microorganismos produzem
hormônios, principalmente, para modular o balanço hormonal do hospedeiro
vegetal, induzindo a repressão da resposta de defesa (Robert-Seilaniantz et al.,
2007).
37
3. TRABALHOS
3.1. EFEITO DA COLONIZAÇÃO POR Gluconacetobacter diazotrophicus
SOBRE A RESPOSTA FOTOSSINTÉTICA E ENZIMÁTICA DE PLANTAS DE
CANA-DE-AÇÚCAR SUBMETIDAS AOS ESTRESSES SALINO E HÍDRICO
3.1.1. RESUMO
Bactérias endofíticas podem interferir na fisiologia vegetal resultando em
alterações no crescimento, resistência a doenças e aumento de produtividade.
Esses benefícios são considerados uma consequência indireta da produção de
fitormônios, solubilização de nutrientes e fixação de nitrogênio pela bactéria.
Embora esses fatores sejam favoráveis, um endofítico capaz de biossintetizar
hormônios e alterar o metabolismo da planta poderia também melhorar ou
comprometer a resposta vegetal a uma condição adversa. Neste trabalho, são
apresentados resultados que demostram que a bactéria endofítica
Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 interfere na resposta aos estresses
salino e hídrico. Os parâmetros fotossintéticos analisados – rendimento quântico
(Fv/Fm), quenching fotoquímico (qP), quenching não-fotoquímico (qNP) e
pigmentos fotossintéticos – indicam que plantas colonizadas por G. diazotrophicus
apresentam maior susceptibilidade durante os estresses salino e hídrico.
Adicionalmente, análises da atividade antioxidante corroboram os resultados
38
acima citados, nos quais foi possível observar alterações na resposta antioxidante
de plantas inoculadas.
3.1.2. ABSTRACT
Endophytic bacteria can interfere with plant physiology resulting in changes
in growth, disease resistance and increased productivity. These benefits are
considered as an indirect consequence of the production of phytohormones,
solubilization of nutrients and nitrogen fixation by bacteria. Although these factors
are favorable, an endophytic able to biosynthesize hormones and alter the
metabolism of the plant it could also improve or impair the plant response to
adverse conditions. This work presents results that demonstrate that the
endophytic bacterium Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 interferes in
response to salt and drought stresses. Photosynthetic parameters analyzed -
quantum yield (Fv / Fm), photochemical quenching (qP), non-photochemical
quenching (qNP) and photosynthetic pigments - indicate that plants colonized by
G. diazotrophicus have a higher susceptibility during the salt and drought stresses.
Additionally, analysis of the antioxidant activity corroborate the above results, it
was possible to observe changes in antioxidant response of inoculated plants.
3.1.3. INTRODUÇÃO
Entre os vários estresses ambientais que afetam o metabolismo e a
produção vegetal, a salinidade e a seca se destacam por estarem entre os
principais fatores limitantes, desencadeando uma série de alterações bioquímicas
e fisiológicas (Allakhverdiev et al., 2000). A fotossíntese, juntamente com o
crescimento celular, está entre os processos primários a serem afetados pela
seca e salinidade (Chaves et al., 2009; Munns et al., 2006). Os efeitos podem ser
diretos, como alterações no metabolismo fotossintético (Lawlor e Cornic, 2002)
,
ou secundário, aumentando a formação de espécies reativas de oxigênio e
39
atividade de enzimas antioxidantes (Apel e Hirt, 2004). Nesse sentido, mudanças
nas condições ambientais, frequentemente, resultam em desequilíbrios entre a
energia absorvida, durante a fase fotoquímica da fotossíntese, e a utilização da
energia, durante o transporte de elétrons fotossintéticos (Huner et al., 1998).
Nessa condição, a taxa de transferência de energia de excitação da antena, para
o centro de reação fotoquímica excede a taxa de transporte de elétrons
(Herrmann et al., 1997). Durante o estresse, as plantas respondem à condição
adversa, por meio de alterações da composição dos pigmentos fotossintéticos e
da atividade de processos bioquímicos que previnem o dano oxidativo aos
fotossistemas.
Existem evidências que sustentam a hipótese de que bactérias promotoras
do crescimento podem conferir resistência em plantas expostas a estresses
(Mayak et al., 2004). A pesquisa nessa área ainda é incipiente, pouco é sabido a
respeito da resposta de plantas inoculadas submetidas a estresses abióticos.
Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito dos
estresses salino e hídrico, sobre plantas de cana-de-açúcar inoculadas com a
bactéria promotora de crescimento Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5, por
meio de medições da eficiência fotoquímica (Fv/Fm, qP e qN) e de teor de
pigmentos fotossintéticos (clorofilas e carotenóides). Adicionalmente, foram
quantificados os níveis de peroxidação de lipídeos e a atividade de enzimas
antioxidantes (ascorbato peroxidase, catalase e guaiacol peroxidase).
3.1.4. MATERIAL E MÉTODOS
3.1.4.1. Material biológico
3.1.4.1.1. Material vegetal e condições de cultivo
Durante os trabalhos, foram utilizadas plantas de cana-de-açúcar da
cultivar RB 758540, cultivadas a partir de minitoletes, cedidos pela Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro (Campus Leonel Miranda – Campos dos
40
Goytacazes/RJ). Os minitoletes foram previamente submersos em água a 52ºC
durante 2 horas, para possível desinfestação.
Após o tratamento, os minitoletes foram plantados em vasos plásticos de
700 mL, contendo substrato inerte, composto por uma mistura de areia
autoclavada e vermiculita, numa proporção de 2:1. Em seguida, os vasos foram
transferidos para casa-de-vegetação onde permaneceram por 20 dias. Após esse
período, as plantas foram utilizadas nos experimentos de inoculação e submissão
aos estresses salino e hídrico.
3.1.4.1.2. Microorganismo, manutenção e preparo do inóculo
Para as inoculações, foi utilizada a bactéria G. diazotrophicus PAL-5,
cedida gentilmente pelo Professor Fábio Olivares do Laboratório de Biologia
Celular e Tecidual da UENF. A manutenção da bactéria em laboratório foi
realizada por meio de culturas-estoque. Estas consistiam da mistura, em tubo de
1,5 mL, de 800 µL da cultura da bactéria crescida em meio DYGS (Rodrigues
Neto et al., 1986) líquido com densidade ótica de 1,3 a 1,5 Abs, em 600 nm, com
200 µL de glicerol a 50%. Após a mistura, as culturas-estoque foram congeladas
em nitrogênio líquido e armazenadas a -70ºC.
Para o preparo do inóculo, culturas-estoque foram descongeladas em gelo
e inoculadas em meio DYGS líquido numa proporção de 5%. A cultura foi
incubada em Erlenmeyer contendo chicanas, e vedada com mantas de algodão
envoltas em gaze. O crescimento da bactéria se deu a 30ºC durante 24 horas,
utilizando-se agitador orbital com rotação de 120 min
-1
.
No processo de inoculação, a quantidade de inóculo utilizada foi medida
em câmara de Newbauer até que se obtivesse cerca de 10
6
células por mL de
solução.
3.1.4.2. Inoculação de plantas de cana-de-açúcar
Plantas de cana-de-açúcar foram inoculadas com a bactéria, por meio da
imersão de suas raízes na cultura de G. diazotrophicus. As raízes das plantas
41
foram mantidas imersas na solução durante 3 horas. Para anular a possível
interferência de componentes do meio de cultura nos resultados a serem obtidos,
as plantas-controle foram imersas em meio DYGS (Rodrigues Neto et al., 1986)
isento de bactéria, por igual período de tempo.
Após a inoculação, as plântulas foram novamente transferidas para vasos
plásticos de 700 mL, contendo o substrato inerte, e irrigadas com a cultura
bacteriana utilizada no processo de inoculação. Posteriormente, as plantas foram
acondicionadas em casa-de-vegetação onde permaneceram até o final dos
experimentos.
3.1.4.3. Indução aos estresses salino e hídrico
Após duas semanas da inoculação, as plantas foram submetidas aos
estresses salino (1,0% de NaCl, resultando em um potencial osmótico (ψ
s
) de -0,5
MPa) e hídrico, durante 15 e 30 dias. Para o estresse salino, as plantas foram
irrigadas com 400 mL de solução Yoshida salinizada (1 % NaCl). Com relação ao
estresse hídrico, a irrigação foi cessada no primeiro dia de estresse. As plantas-
controle receberam 400 mL de solução Yoshida sem o agente estressante.
Durante o tratamento, em intervalos de 2 dias, as plantas-controle e
salinizadas foram irrigadas com 50 mL de água destilada. Quantidade suficiente
para evitar a desidratação e não permitir a percolação, evitando, dessa forma, a
lavagem do sal, presente no substrato das plantas submetidas ao estresse salino.
3.1.4.4. Análise da eficiência fotoquímica do PSII
A análise da eficiência fotoquímica foi feita por meio de um fluorímetro de
luz modulada modelo FMS-2 – Fluorescence Monitoring System (Hansatech,
King’s Lynn, Norfolk, Inglaterra), utilizando-se de seis repetições. As medições
foram efetuadas após 30 minutos de adaptação ao escuro, utilizando-se pinças
apropriadas ao sensor do aparelho. As leituras foram realizadas na região
mediana da primeira folha completamente expandida do cartucho foliar, das 8 às
10 horas da manhã.
42
O monitoramento do desempenho do fotossistema ll, pela medida das
variáveis de fluorescência, foi realizado aos 15 e 30 dias de estresse. A
fluorescência inicial (Fo) foi obtida com luz modulada de baixa intensidade (6 µmol
m
-2
s
-1
), e a fluorescência máxima (Fm) foi determinada com um pulso de luz
saturante de 10000 µmol m
-2
s
-1
. Foram obtidos dados referentes ao rendimento
quântico do PSII (Fv/Fm), quenching fotoquímico (qP) e quenching não
fotoquímico (qN).
3.1.4.5. Extração de pigmentos fotossintéticos
Para a extração de pigmentos fotossintéticos, foram utilizados 10 cm
2
de
área foliar, correspondente a 200 mg de tecido, aproximadamente. Este material
foi retirado da região mediana da primeira folha totalmente aberta do cartucho
foliar. Foram utilizadas cinco repetições.
Durante a extração, o tecido retirado de cada tratamento foi cortado em
pequenas tiras e acondicionado em tubos de ensaio com tampa, contendo 4 mL
de DMSO (Dimetilsulfóxido). Estes foram mantidos no escuro por 4 dias em
temperatura ambiente.
Após o 4º dia, foi realizada a leitura em espectrofotômetro do extrato
obtido. Foram utilizados o comprimento de onda de 665 nm, 649 nm e 480 nm.
Utilizando-se as equações de Wellburn (1994), foram estimados os teores
de pigmento da área foliar.
Clorofila a = 12,19 A665 – 3,45 A649
Clorofila b = 21,99 A649 – 5,32 A665
Carotenóides
xantofilas+ carotenos
= (1000 A480 – 2,14 Ca – 70,16 Cb)/220
3.1.4.6. Determinação dos níveis de peroxidação de lipídeos
A peroxidação lipídica foi determinada, indiretamente, pelo conteúdo de
espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS, subprodutos da peroxidação
lipídica), baseado na metodologia proposta por Dhindsa e Matowe (1981), porém
43
com algumas modificações. Foram macerados em nitrogênio líquido 500 mg de
amostra vegetal. O macerado foi então homogeneizado em 5 mL de 0,1 % de
ácido tricloroacético (TCA) com 0,01 % de polivinil poli pirrolidona (PVPP). O
homogenato foi centrifugado a 10000 g por 5 minutos. Para cada alíquota de 1 mL
do sobrenadante, foram adicionados 4 mL da solução de 20% de TCA, contendo
0,5% de TBA. A mistura foi aquecida a 95°C por 30 m inutos e, então, resfriada
rapidamente em gelo. Após centrifugação de 10000 g por 10 minutos, a
absorvância do sobrenadante foi lida a 535 nm e o seu valor subtraído do valor da
absorvância inespecífica a 600 nm. A concentração de TBARS foi calculada
usando o coeficiente de extinção molar de 155 mM
-1
cm
-1
. As leituras foram
realizadas em leitor de microplaca de 96 poços (µQuant, BIO-TEK). Foram
utilizadas cinco repetições.
3.1.4.7. Determinação da atividade de enzimas antioxidantes
3.1.4.7.1. Extração de proteínas
Foram utilizadas folhas de plantas de cana-de-açúcar com 15 dias de
tratamento. Em um gral de porcelana mantido no gelo, aproximadamente 200 mg
de tecido foliar foram macerados na presença de tampão de extração (100 mM
tampão fosfato de potássio pH 7,5, 1 mM EDTA e 3 mM DTT), na proporção de
1:4 (p/v), acrescidos de PVPP, na proporção de 5% (p/v). O homogenato obtido
foi distribuído em tubos de 1,5 mL e centrifugado a 15.000 x g durante 10 minutos
a 4°C. Os sobrenadantes foram coletados, transferid os para novos tubos em
alíquotas de 100 µL e, posteriormente, congelados em nitrogênio líquido e
armazenados em freezer a -70°C. Foram realizadas tr ês repetições.
3.1.4.7.2. Estimativa da concentração protéica pelo método de Bradford
O conteúdo de proteínas em cada amostra foi determinado pelo método de
Bradford (1976), para posteriores análises das atividades enzimáticas. As leituras
de absorvância foram realizadas em espectrofotômetro em λ= 595 nm, com 5 µL
44
de amostra, 15 µL de água destilada e 1 mL de reagente de Bradford. Uma curva
de 2 a 20 µg de ovalbumina foi utilizada para a análise dos resultados.
3.1.4.7.3. Determinação da atividade da enzima catalase (CAT)
Para determinar a atividade da CAT, foi utilizado o protocolo descrito por
Azevedo et al. (1998), com algumas modificações. Em uma placa de Elisa para
leitura de luz ultravioleta, foram adicionados 250 µL de extrato enzimático diluído
(50 µL de extrato enzimático em 950 µL de tampão fosfato de potássio 100 mM
pH 7,5). A reação teve início com a adição de 50 µL de H
2
O
2
diluído (1,5 µL de
H
2
O
2
30% em 48,5 µL de tampão fosfato de potássio 100 mM pH 7,5), e o
monitoramento da decomposição de H
2
O
2
foi feito em espectrofotômetro, por
meio das leituras de absorvância a 240 nm durante 1 minuto. O meio de reação
sem H
2
O
2
foi utilizado como branco. Os resultados de atividade de CAT foram
expressos em µM min
-1
mg de proteína.
3.1.4.7.4. Determinação da atividade da enzima guaiacol peroxidase (GPX)
A determinação da atividade da GPX foi baseada no método utilizado por
Zhang e Kirkham (1994), com modificações. Em uma placa de Elisa, foram
adicionados 125 µL de guaiacol diluído (0,1677 µL de guaiacol em 125 µL de
tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0) e 125 µL de H
2
O
2
diluído (0,03125 µL
de H
2
O
2
30% em 125 µL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0). A reação
teve início com a adição de 50 µL de extrato enzimático diluído (20 µL de extrato
enzimático em 980 µL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0), e a atividade
da GPX foi determinada por mensuração da taxa de oxidação de guaiacol a
tetraguaiacol, por meio de monitoramento do acréscimo na taxa de absorvância a
470 nm. O meio de reação sem extrato enzimático foi utilizado como branco. Os
resultados de atividade de GPX foram expressos em µM min
-1
mg de proteína.
45
3.1.4.7.5. Determinação da atividade da enzima ascorbato peroxidase (APX)
A atividade da APX foi determinada de acordo com o método descrito por
Barka (2001). Em uma placa de Elisa para leitura de luz ultravioleta, foram
adicionados 200 µL de solução-estoque de ácido ascórbico (0,008132 g de ácido
ascórbico em 40 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,0 acrescido de
0,1 mM de EDTA) e 50 µL de H
2
O
2
diluído (0,025 µL de H
2
O
2
30% em 50 µL de
tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,0 acrescido de 0,1 mM de EDTA). A
reação teve início com a adição de 50 µL de extrato enzimático diluído (50 µL de
extrato enzimático diluído em 950 µL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,0
acrescido de 0,1 mM de EDTA), e o monitoramento da oxidação do ascorbato foi
feito mediante leituras de decréscimo de absorvância a 290 nm em
espectrofotômetro. O meio de reação sem extrato enzimático foi utilizado como
branco. Os resultados de atividade de APX foram expressos em µM min
-1
mg de
proteína.
3.1.5. RESULTADOS
3.1.5.1. Efeito dos estresses salino e hídrico sobre a eficiência fotoquímica e
teores de pigmentos fotossintéticos em plantas colonizadas por
Gluconacetobacter diazotrophicus
No intuito de avaliar os efeitos da salinidade e seca sobre a eficiência
fotoquímica e teores de pigmentos fotossintéticos, plantas de cana-de-açúcar
foram submetidas a 1% de NaCl e ausência de irrigação, durante 15 e 30 dias.
Foram avaliados os seguintes parâmetros: rendimento quântico do PSII (Fv/Fm),
quenching fotoquímico (qP), quenching não-fotoquímico (qN), clorofila a, clorofila
b e carotenoides.
46
3.1.5.1.1. Rendimento quântico do PSII (Fv/Fm)
Em 15 dias de tratamento, a salinidade ocasionou a diminuição da
eficiência fotoquímica (Fv/Fm), caracterizada pelo rendimento quântico (figura
9A), em plantas de cana-de-açúcar. Verifica-se que plantas inoculadas e
salinizadas apresentaram uma maior redução, quando comparadas com a das
plantas submetidas ao sal e não-inoculadas. Aos 30 dias, plantas inoculadas e
expostas à salinidade (figura 9B) apresentaram significativa redução, se
comparada com as plantas submetidas à salinidade e não-inoculadas.
Com relação ao estresse hídrico, aos 15 dias (figura 9C), somente as
plantas inoculadas apresentaram decréscimo, sendo observada uma considerável
redução nos valores de Fv/Fm. No entanto, a continuação do estresse hídrico
mostrou-se mais drástica para as plantas de cana-de-açúcar. Plantas submetidas
à seca e inoculadas não resistiram ao estresse imposto. Todas as plantas
colonizadas e impostas a esse estresse estavam mortas com 20 dias de
tratamento (figura 9D).
3.1.5.1.2. Quenching fotoquímico (qP)
Como pode ser visualizado na figura 10 (10A e 10C), aos 15 dias, houve
acréscimo dos valores de qP em todos os tratamentos, quando tais valores foram
comparados aos das plantas-controle. As plantas submetidas à salinidade e seca
apresentaram os maiores valores de qP, sendo que as plantas inoculadas e
estressadas foram as que apresentaram o maior acréscimo. Cabe ressaltar que
plantas inoculadas também apresentaram aumento nos valores de qP, quando
comparados com os valores da planta-controle. No entanto, com relação aos 30
dias de tratamento (figuras 10B e 10D), nenhuma alteração foi observada com
relação ao estresse salino. No entanto, houve redução de qP nas plantas
submetidas à seca.
47
3.1.5.1.3. Quenching não-fotoquímico (qN)
Aos 15 dias de tratamento, verificou-se que o estresse salino acarretou
uma redução dos valores de qNP (figura 11A). Tal resultado não foi observado em
plantas inoculadas e salinizadas. Os valores de qNP dos demais tratamentos
foram similares aos da planta-controle. Entretanto, no 30º dia, observou-se que
plantas inoculadas e expostas à salinidade (figura 11B) apresentaram significativo
aumento da variável analisada.
Para o estresse hídrico (15 dias), a mesma observação pode ser verificada
na figura 11C, na qual somente plantas não-inoculadas e na ausência de água
apresentaram decréscimo. No 30º dia de tratamento, plantas não-inoculadas e
submetidas à seca (figura 11D) apresentaram considerável acréscimo nos valores
de qNP, sendo esses superiores aos das plantas não-inoculadas e salinizadas.
Resposta similar foi observada em plantas colonizadas pela bactéria e expostas
ao sal.
48
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0,700
0,725
0,750
0,775
0,800
0,825
0,850
Fv/Fm
Tratamento
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0,700
0,725
0,750
0,775
0,800
0,825
0,850
Fv/Fm
Tratamento
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0,700
0,725
0,750
0,775
0,800
0,825
0,850
Fv/Fm
Tratamento
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0,700
0,725
0,750
0,775
0,800
0,825
0,850
Fv/Fm
Tratamento
A B
C D
A
AB
A
B
A A
A
B
A
A
A
B
A
B
A
C
Figura 9 - Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o rendimento quântico
(Fv/Fm) de plantas de cana-de-açúcar colonizadas por Gluconacetobacter
diazotrophicus. As plantas foram submetidas aos diferentes estresses, durante 15
(figuras A e C) e 30 dias (figuras B e D). As barras representam o erro-padrão da
média. Médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente pelo
teste de Tukey a 1% de probabilidade (n=10).
49
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
0,95
1,00
qP
Tratamento
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
0,95
1,00
qP
Tratamento
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
0,95
1,00
qP
Tratamento
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
0,95
1,00
qP
Tratamento
A B
C D
C
AB
B
A
C
B
B
AB
A A
A A
A
B
A
C
Figura 10 - Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o quenching fotoquímico
(qP) de plantas de cana-de-açúcar colonizadas por Gluconacetobacter
diazotrophicus. As plantas foram submetidas aos diferentes estresses, durante 15
(figuras A e C) e 30 dias (figuras B e D). As barras representam o erro-padrão da
média. Médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente pelo
teste de Tukey a 1% de probabilidade (n=10).
50
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
qNP
Tratamento
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
qNP
Tratamento
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
qNP
Tratamento
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
qNP
Tratamento
A B
C D
A
B
A
A
A
B
A
A
B
B
B
A
B
A
B
C
Figura 11 - Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o quenching não-
fotoquímico (qNP) de plantas de cana-de-açúcar colonizadas por
Gluconacetobacter diazotrophicus. As plantas foram submetidas aos diferentes
estresses, durante 15 (figuras A e C) e 30 dias (figuras B e D). As barras
representam o erro-padrão da média. Médias seguidas das mesmas letras não
diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 1% de probabilidade (n=10).
51
3.1.5.1.4. Pigmentos fotossintéticos
Foram avaliados os teores de clorofila total, clorofila a, clorofila b e
carotenoides. Adicionalmente, esses valores foram utilizados para calcular as
razões clorofila a/b e carotenoide/clorofila.
De acordo com a figura 12A, todos os tratamentos (sal, inoculada e
inoc/sal) não apresentaram alteração nos teores de clorofila, aos 15 dias, quando
comparados aos teores das plantas-controle. Aos 30 dias de tratamento, verificou-
se, em plantas expostas à salinidade pequena, a redução dos teores de pigmento,
sendo essa diminuição acentuada na presença da bactéria (figura 12B).
Para o estresse hídrico (15 dias), nas plantas expostas à seca (figura 12C),
não foi verificado decréscimo no teor de clorofila. Porém, a colonização pela
bactéria ocasionou às plantas submetidas à seca um significativo decréscimo nos
teores de clorofila. Aos 30 dias, as plantas na ausência de água e bactéria
também apresentaram uma grande redução dos teores de clorofila (figura 12D).
Os resultados obtidos para clorofila a evidenciam que, aos 15 e 30 dias,
não há nenhuma alteração nos teores desse pigmento, em plantas salinizadas,
tanto na presença quanto na ausência da bactéria (figura 13A e 13B).
Foi possível verificar que o estresse hídrico, aos 15 dias, também não
ocasionou nenhuma redução nos níveis de clorofila a de plantas de cana-de-
açúcar, principalmente em plantas inoculadas. Porém, no 30º dia de tratamento, a
diminuição dos teores de clorofila a, em plantas submetidas à seca, foi bastante
significativa.
Os dados de clorofila b mostram que, aos 15 dias, o estresse salino
ocasionou pequeno decréscimo nos teores desse pigmento, sendo essa redução
maior na presença da bactéria endofítica (figura 14A). Aos 30 dias de tratamento,
somente as plantas inoculadas e submetidas à salinidade apresentaram redução
nos teores de clorofila b (figura 14B).
Com relação ao estresse hídrico aos 15 dias, resultados semelhantes
podem ser observados na figura 14C, em que plantas inoculadas e submetidas à
seca apresentaram diminuição no teor de clorofila b. Observa-se, aos 30 dias
(figura 14D), que plantas desidratadas também mostraram uma significativa
redução do pigmento.
52
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Clorofila total (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Clorofila total (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Clorofila total (mg g
-1
)
Tratamento
A
A
A
A
A
AB
A
B
A
A A
B
A
B
A
C
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Clorofila total (mg g
-1
)
Tratamento
A
C
B
D
Figura 12 - Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o teor de clorofila total de
plantas de cana-de-açúcar colonizadas por Gluconacetobacter diazotrophicus. As
plantas foram submetidas aos diferentes estresses, durante 15 (figuras A e C) e
30 dias (figuras B e D). As barras representam o erro-padrão da média. Médias
seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a
1% de probabilidade (n=5).
53
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0
5
10
15
20
25
30
Clorofila a (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0
5
10
15
20
25
30
Clorofila a (mg g
-1
)
Tratamento
A
A
A A
A A
A
A
A A A
B
A
B
A
C
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0
5
10
15
20
25
30
Clorofila a (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0
5
10
15
20
25
30
Clorofila a (mg g
-1
)
Tratamento
A
C
B
D
Figura 13 - Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o teor de clorofila a de
plantas de cana-de-açúcar colonizadas por Gluconacetobacter diazotrophicus. As
plantas foram submetidas aos diferentes estresses, durante 15 (figuras A e C) e
30 dias (figuras B e D). As barras representam o erro-padrão da média. Médias
seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a
1% de probabilidade (n=5).
54
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Clorofila b (mg g
-1
)
Tratamento
B
A
AB
AB
A
B B
C
B
A
A
A
A
A
B
C
A B
C D
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Clorofila b (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Clorofila b (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Clorofila b (mg g
-1
)
Tratamento
Figura 14 - Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o teor de clorofila b de
plantas de cana-de-açúcar colonizadas por Gluconacetobacter diazotrophicus. As
plantas foram submetidas aos diferentes estresses, durante 15 (figuras A e C) e
30 dias (figuras B e D). As barras representam o erro-padrão da média. Médias
seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a
1% de probabilidade (n=5).
Na análise de carotenoides, aos 15 dias, observou-se que a inoculação
proporcionou um aumento no teor do pigmento analisado (figura 15A).
Adicionalmente, verifica-se que plantas submetidas à salinidade apresentaram
55
acréscimo nos níveis de carotenoides, tanto na presença quanto na ausência da
bactéria. Aos 30 dias (figura 15B), nenhuma alteração foi observada entre os
tratamentos.
Para o estresse hídrico (15 dias), resultados similares foram encontrados
em plantas na ausência de água e do endófito, e em plantas colonizadas (figura
15C). Porém, quando as plantas eram colonizadas e submetidas à seca, os
teores de carotenoides apresentavam significativo acréscimo. No 30º dia de
tratamento, observa-se, na figura 15D, que plantas expostas ao estresse hídrico,
na ausência da bactéria, apresentaram decréscimo do pigmento.
As razões clorofila a/b e carotenoide/clorofila também foram avaliadas.
Para clorofila a/b, aos 15 dias (figura 16A), as plantas salinizadas, plantas
inoculadas, e plantas inoculadas e expostas ao sal apresentaram significativo
aumento da razão clorofila a/b, sendo esse acréscimo mais evidente nas plantas
salinizadas na presença da bactéria. Resultados similares foram observados aos
30 dias (figura 16B), em que plantas submetidas ao estresse salino e inoculadas
apresentaram forte acréscimo da razão.
Os dados obtidos para estresse hídrico evidenciam que, aos 15 dias,
plantas não colonizadas e expostas à seca, e plantas inoculadas apresentaram
um pequeno aumento da razão analisada (figura 16C). No 30º dia, valores
semelhantes puderam ser observados em plantas na ausência de água, quando
foi verificado forte aumento da razão clorofila a/b.
Com relação à razão carotenoide/clorofila, aos 15 dias (figura 17A), todos
os tratamentos apresentaram aumento na razão quando comparado ao aumento
na razão das plantas-controle. Aos 30 dias (figura 17B), porém, verificou-se que
plantas inoculadas apresentaram valores similares aos das plantas-controle. Em
plantas salinizadas, um pequeno aumento da razão pôde ser observado, sendo
esse valor ainda mais acentuado na presença do endófito. Para o estresse
hídrico, aos 15 dias (figura 17C), foi possível observar acréscimos na razão de
plantas não colonizadas e expostas à seca, e em plantas inoculadas.
Adicionalmente, plantas estressadas (seca) e colonizadas pela bactéria
apresentaram forte aumento da razão carotenoide/clorofila. Como pode ser
observado na figura 17D, aos 30 dias, o estresse hídrico também ocasionou
aumento considerável na razão analisada.
56
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0
1
2
3
4
5
6
Carotenóides (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0
1
2
3
4
5
6
Carotenóides (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0
1
2
3
4
5
6
Carotenóides (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0
1
2
3
4
5
6
Carotenóides (mg g
-1
)
Tratamento
A
B
AB
AB
B
AB
A
A
A
A
A
A
A
B
A
C
A B
C D
Figura 15 - Efeito dos estresses salino e hídrico sobre o teor de carotenoides de
plantas de cana-de-açúcar colonizadas por Gluconacetobacter diazotrophicus. As
plantas foram submetidas aos diferentes estresses, durante 15 (figuras A e C) e
30 dias (figuras B e D). As barras representam o erro-padrão da média. Médias
seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a
1% de probabilidade (n=5).
57
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Clorofila a/b (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Clorofila a/b (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Clorofila a/b (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Clorofila a/b (mg g
-1
)
Tratamento
C
B
B
A
B
AB
AB
A
C
A
C
B
B
A
B
C
A
C
B
D
Figura 16 - Efeito dos estresses salino e hídrico sobre a razão clorofila a/b de
plantas de cana-de-açúcar colonizadas por Gluconacetobacter diazotrophicus. As
plantas foram submetidas aos diferentes estresses, durante 15 (figuras A e C) e
30 dias (figuras B e D). As barras representam o erro-padrão da média. Médias
seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a
1% de probabilidade (n=5).
58
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Carotenóide/Clorofila (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Carotenóide/Clorofila (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Carotenóide/Clorofila (mg g
-1
)
Tratamento
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Carotenóide/Clorofila (mg g
-1
)
Tratamento
B
AB
AB
A
B
AB
A
A
B
AB
B
A
B
A
AB
C
A B
C D
Figura 17 - Efeito dos estresses salino e hídrico sobre a razão
carotenoide/clorofila de plantas de cana-de-açúcar colonizadas por
Gluconacetobacter diazotrophicus. As plantas foram submetidas aos diferentes
estresses, durante 15 (figuras A e C) e 30 dias (figuras B e D). As barras
representam o erro-padrão da média. Médias seguidas das mesmas letras não
diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 1% de probabilidade (n=5).
59
3.1.5.6. Alterações nos níveis de peroxidação lipídica em plantas de
cana-de-açúcar colonizadas por G. diazotrophicus e submetidas à
salinidade e desidratação
De acordo com a figura 18A, em folhas, todos os tratamentos
apresentaram níveis similares aos das plantas-controle, com 15 e 30 dias.
Resultados similares foram observados em raízes (figura 18B).
Com relação ao estresse hídrico, em folhas, a mesma observação foi
verificada, aos 15 e 30 dias (figura 18C), com exceção somente das plantas
inoculadas e expostas à seca (30 dias). Entretanto, resultados distintos foram
verificados em raízes (figura 18D). Aos 15 dias, plantas inoculadas apresentaram
uma maior concentração de espécies reativas a TBARS, quando expostas à
desidratação. Tal observação não foi verificada nos demais tratamentos, em que
plantas não-inoculadas, submetidas ao estresse hídrico, e plantas inoculadas não
expostas à desidratação apresentaram níveis equivalentes à condição das
plantas-controle. Aos 30 dias, as plantas submetidas ao estresse hídrico
apresentaram aumento dos níveis de peroxidação lipídica.
60
0,0000
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
0,0025
0,0030
0,0035
TBARS (mM g
- 1
MF)
Tratamento
15 dias
30 dias
0,0000
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
0,0025
0,0030
0,0035
TBARS (mM g
-1
MF)
Tratamento
15 dias
30 dias
0,0000
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
0,0025
0,0030
0,0035
TBARS (mM g
- 1
MF)
Tratamento
15 dias
30 dias
A
C
B
D
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
FOLHA RAIZ
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
FOLHA RAIZ
0,0000
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
0,0025
0,0030
0,0035
TBARS (mM g
-1
MF)
Tratamento
15 dias
30 dias
Controle Sal Inoculada Inoc/Sal
Controle Seca Inoculada Inoc/Seca
a
a a
a
a
a
a
a
A
A
A
A
A
A
A
B
a
a
a
a
b
b
b
a
B
A
B
C
A
A
A
A
Figura 18 - Alterações nos níveis de peroxidação lipídica de folhas (figuras A e C)
e raízes (figuras B e D) de plantas de cana-de-açúcar colonizadas por
Gluconacetobacter diazotrophicus. As plantas foram submetidas aos diferentes
estresses, durante 15 e 30 dias. As barras representam o erro-padrão da média.
Médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente pelo teste de
Tukey a 1% de probabilidade (n=5).
61
3.1.5.7. Resposta antioxidante em plantas de cana-de-açúcar
inoculadas e expostas aos estresses salino e hídrico
Observa-se, na figura 19A, que a enzima ascorbato peroxidase apresentou
uma maior atividade em resposta à inoculação. Tal observação também pode ser
visualizada em plantas inoculadas e submetidas à salinidade e seca, sendo esse
acréscimo mais evidente em plantas salinizadas. Com relação à atividade
enzimática em plantas não-inoculadas, resultados similares podem ser
constatados em plantas expostas ao estresse hídrico e em plantas-controle. No
entanto, a atividade da ascorbato é praticamente dobrada em plantas expostas ao
sal.
Na análise de catalase, observa-se, na figura 19B, que os tratamentos
impostos não alteraram a atividade da enzima. Todas as plantas apresentaram
atividades similares.
Para guaiacol peroxidase (figura 19C), foi possível verificar que a
inoculação possibilitou um pequeno incremento de sua atividade. Porém, plantas
inoculadas e estressadas apresentaram valores ainda maiores que os de plantas
estressadas, na ausência da bactéria. A maior atividade enzimática foi observada
em plantas colonizadas e expostas à seca.
62
Controle Sal Seca InoculadaInoc/Sal Inoc/Seca
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
Atividade Ascorbato Peroxidase (
µ
M min
-1
mg
-1
de proteína)
Tratamento
Controle Sal Seca InoculadaInoc/SalInoc/Seca
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
Atividade Guaiacol Peroxidase (
µ
M min
-1
mg
-1
de proteína)
Tratamento
A B
C
C
A
C
B
AB
BC
C
BC B
BC
AB
A
A
A
A
A
A
A
Controle Sal Seca Inoculada Inoc/Sal Inoc/Seca
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
Atividade Catalase (
µ
M min
-1
mg
-1
de proteína)
Tratamento
Figura 19 - Efeito dos estresses salino e hídrico sobre a atividade de enzimas
antioxidantes (ascorbato peroxidase – figura A, catalase – figura B e guaiacol
peroxidase – figura C), em folhas de cana-de-açúcar colonizadas por
Gluconacetobacter diazotrophicus. As plantas foram submetidas aos diferentes
estresses, durante 15 dias. As barras representam o erro-padrão da média.
Médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente pelo teste de
Tukey a 1% de probabilidade (n=3).
63
3.1.6. DISCUSSÃO
Levando-se em consideração que Gluconacetobacter diazotrophicus é uma
bactéria endofítica de cana-de-açúcar, produtora de hormônios análogos aos de
vegetais, decidiu-se testar a hipótese de que a presença de tal bactéria poderia
ou não interferir na resposta aos estresses salino e hídrico, em plantas de cana-
de-açúcar.
A salinidade e a desidratação induzem uma série de respostas fisiológicas,
como forma de estabelecer a adaptação do vegetal à condição adversa. Dentre
os parâmetros fisiológicos afetados, a atividade fotossintética apresenta
alterações na eficiência das reações fotoquímicas, dos centros de reação, durante
o estresse. Esses estresses ambientais que limitam a fotossíntese ocasionam
também o aumento de espécies reativas de oxigênio, capazes de ocasionar
danos oxidativos em uma grande quantidade de biomoléculas. Em resposta, as
plantas ativam um sistema antioxidativo de defesa, a fim de minimizar o estresse
oxidativo causado pelos estresses hídrico e salino. Nesse contexto, plantas de
cana-de-açúcar, inoculadas com o endófito, foram submetidas à salinidade e à
desidratação por um período de 15 e 30 dias. Após esse período, foram
realizadas análises quanto à eficiência fotoquímica (Fv/Fm, qP e qNP), teor de
pigmentos fotossintéticos (clorofila a, clorofila b e carotenoides), níveis de
peroxidação de lipídeos e atividade de enzimas antioxidantes (ascorbato
peroxidase, catalase e guaiacol peroxidase).
Tipicamente, a perda ou diminuição no rendimento quântico da fotoquímica
do PSII (F
v
/F
m
) é um indicador confiável do estresse abiótico, bem como da
fotoinibição (Schreiber et al., 1998; Bolhàr-Nordenkampf e Öquist, 1993). A razão
entre a fluorescência variável e a máxima (F
v
/F
m
) é amplamente empregada na
interpretação dos sinais da emissão de fluorescência (Krause e Weiss, 1991),
como uma medida da eficácia dos centros de reação na absorção de fótons.
Como já mencionado, em condições normais, as plantas apresentam o valor da
razão entre 0,75 e 0,85 (Butler e Kitajima, 1975).
Para a característica Fv/Fm (figura 9), plantas submetidas ao sal e à seca,
na presença do endófito, apresentaram decréscimo da razão, indicando uma
menor eficiência fotoquímica como consequência do estresse+inoculação. Os
resultados obtidos mostraram que os estresses salino e hídrico foram mais
64
prejudiciais em plantas inoculadas, sendo o estresse hídrico ainda mais severo
em plantas colonizadas. Isso indica que a presença da bactéria, possivelmente,
reduziu a eficiência fotoquímica do PSII. Apesar da verificação do decréscimo de
Fv/Fm, todos os valores de razão observados ainda permaneceram dentro do
valor desejado para essa característica (0,75 – 0,85).
Embora a razão Fv/Fm seja o parâmetro de fluorescência mais utilizado,
outras variáveis são também empregadas na avaliação de efeitos ambientais.
Uma dessas opções é a análise do quenching. Quando uma molécula de
pigmento absorve energia luminosa e torna-se excitada, existem várias formas de
essa molécula retornar ao seu estado basal. A transferência de elétrons é uma
delas (Takahashi et al., 2009). Essa dissipação de energia é conhecida como
quenching fotoquímico (qP). Porém, quando a energia luminosa incidente excede
a capacidade de absorção, esse estado excitado pode dissipar essa energia por
rotas não desejáveis. O mecanismo de proteção contra esse iminente dano ao
sistema é denominado quenching não-fotoquímico (qNP) (Merchant e Sawaya,
2005). Nesse contexto, foram feitas análises de qP (figura 10) e qNP (figura 11).
Para a variável qP, foi possível verificar, aos 15 dias, que a inoculação
proporcionou um aumento em plantas de cana-de-açúcar inoculadas, sendo esse
aumento ainda maior na presença dos estresses hídrico e salino. No entanto, com
relação aos 30 dias de tratamento, somente plantas submetidas à seca
apresentaram decréscimo. Tal resultado sugere que o aumento de qP ocorre nos
primeiros dias de colonização, sendo estabilizado com o passar do tempo.
Valores de qP, quanto mais próximos a 1,00, indicam um estado de baixa energia,
onde Q
A
se mantém oxidada. Os valores de qP, aos 15 dias, foram transientes,
não sendo mantidos ao longo do tratamento (30 dias). Isso indica que essa
variação inicial se deve a um possível processo de aclimatação, devido ao
estresse e à inoculação.
Com relação à variável qNP, seu aumento durante a interação planta-
patógeno já é bem caracterizado (Berger et al., 2007; Chaerle et al., 2004; Meyer
et al., 2001). Porém, tais estudos em planta-endófito ainda não foram elucidados.
De acordo com os resultados para quenching não-fotoquímico (figura 11), aos 15
dias de tratamento, verificou-se que os estresses salino e hídrico acarretaram
redução dos valores de qNP, o que não foi observado em plantas inoculadas e
estressadas. O resultado obtido sugere que a colonização por G. diazotrophicus
65
interferiu na resposta de qNP, impedindo seu decréscimo. No entanto, no 30º dia,
observou-se que, em plantas inoculadas, o estresse salino acarretou um forte
aumento da variável analisada. Tal resultado indica que a presença da bactéria
endofítica possibilitou um possível aumento da dissipação termal no aparelho
fotossintético. Adicionalmente, o alto valor de qNP, encontrado nas plantas
inoculadas e salinizadas, sugere também uma alteração da atividade dos
transportadores de elétrons ou uma diminuição do consumo de NADPH (Maxwell
and Jonhson, 2000). Todas essas consequências, caracterizadas por aumentos e
reduções das variáveis de fluorescência, sugerem uma maior susceptibilidade das
plantas colonizadas e expostas aos estresses hídrico e salino.
Em estudos de patogênese, é verificado o desenvolvimento de áreas
cloróticas nas folhas infectadas. Essa observação não é visualizada na interação
planta-endófito, porém, a literatura é incipiente para caracterização dessa variável
em plantas inoculadas e submetidas a estresses. Nesse sentido, visando estudar
o efeito da colonização por G. diazotrophicus, sobre teores de pigmentos de
plantas estressadas e para um melhor entendimento dos resultados das variáveis
de fluorescência (Fv/Fm, qP e qNP), avaliou-se o teor de pigmentos
fotossintéticos. Foram analisados os teores de clorofila total, clorofila a, clorofila b
e carotenoides, bem como as razões clorofila a/b e carotenoides/clorofila.
As análises acerca do teor de pigmento são indicadores potenciais de
estresses abióticos, servindo como diagnóstico. Segundo Gabrielsen (1948), os
teores de pigmento influenciam as taxas fotossintéticas se estiverem abaixo da
concentração ótima para este processo.
Com relação aos teores de clorofila a (figura 13), a colonização pelo
endófito não foi capaz de alterar a concentração do pigmento.
Os resultados obtidos para clorofila b (figura 14) sugerem que a
colonização acarreta redução no teor desse pigmento em plantas colonizadas e
salinizadas. Adicionalmente, observou-se que plantas não-inoculadas expostas ao
estresse hídrico também apresentaram forte decréscimo. Tais dados sugerem
que a presença da bactéria endofítica aumenta a degradação de clorofila b
durante o estresse.
A função dos carotenoides também é relatada em resposta a estresses
ambientais. Os carotenoides são componentes essenciais do aparelho
fotossintético, estando envolvidos na captação da energia luminosa, estabilização
66
da membrana tilacoide (Havaux, 1998) e na proteção do aparelho fotossintético
contra o dano causado pelo oxigênio singleto (
1
O
2
). Dessa forma, os carotenoides
podem reduzir indiretamente a ação de espécies reativas de
1
O
2
(Foyer e
Harbinson, 1994), servindo, assim, como substrato e impedindo a peroxidação de
lipídios.
A análise dos teores de carotenoides (figura 15) revelou que, aos 15 dias, a
inoculação proporcionou um aumento no teor do pigmento analisado. Os dados
obtidos, para carotenoides, indicam que a presença da bactéria G. diazotrophicus
influencia a síntese de carotenoides, nos primeiros 15 dias de interação,
aumentando sua produção. Adicionalmente, plantas inoculadas e expostas à
salinidade e seca apresentaram o maior teor de carotenoides entre os
tratamentos, sugerindo um possível aumento na concentração do pigmento
acarretado pela bactéria endofítica.
Špundová e colaboradores, em 2003, sugeriram que a razão clorofila a/b
indica a degradação relativa de pigmentos, bem como a estabilidade relativa dos
centros de reação e do complexo pigmento-proteína coletor de luz (LHC). Sendo
assim, a análise da razão clorofila a/b permitiu verificar que plantas inoculadas e
desidratadas, aos 15 dias, e plantas inoculadas e expostas à salinidade, aos 30
dias, apresentaram maior acréscimo da razão clorofila a/b, indicando que a
bactéria, indiretamente, influencia a degradação relativa de pigmentos,
corroborando os resultados observados para clorofila b, e evidenciando a maior
susceptibilidade de plantas inoculadas aos estresses impostos. De acordo com
Walters (2005), mudanças na razão clorofila a/b podem ser consideradas como
uma adaptação ao estresse. Um aumento da razão favorece um incremento de
unidades do PSII como uma forma de aumentar a eficiência na conversão de
energia.
Visando verificar a proporção de carotenoides em relação aos teores de
clorofila, foi analisada a razão carotenoides/clorofila (figura 17). Aos 15 dias, todos
os tratamentos apresentaram aumento na razão se comparado ao das plantas-
controle, sendo que plantas submetidas à seca e colonizadas pela bactéria
apresentaram forte aumento da razão. Resultados similares foram obtidos em
plantas inoculadas e expostas à salinidade, aos 30 dias, quando foi observado o
maior valor entre os tratamentos. Porém, plantas inoculadas (30 dias)
apresentaram valor da razão equivalente ao das plantas-controle.
67
De acordo com Hendry et al. (1987), a perda de pigmentos é um indicador
significativamente visível em plantas submetidas a estresses ambientais. As
mudanças nos teores de clorofilas e carotenoides são indicadores potenciais dos
estresses oxidativos. Além disso, a razão entre clorofila a e b, bem como a razão
entre carotenoides e clorofilas pode ser utilizada como um indicador de resposta
ao estresse, servindo como diagnóstico.
Uma outra alteração bioquímica que ocorre em plantas sujeitas a estresses
é a peroxidação de lipídeos. Essa decomposição dos ácidos graxos poli-
insaturados de biomembranas é resultante da produção de espécies reativas de
oxigênio (ROS) (Mittler, 2002). Pela quantificação dos teores de TBARS (figura
18), verificou-se que folhas de plantas inoculadas apresentaram níveis similares
aos das plantas-controle, com 15 e 30 dias de tratamento. Resultados
semelhantes foram verificados em raízes.
Os dados obtidos para peroxidação lipídica sugerem que, nas condições
utilizadas neste ensaio, a presença da bactéria não modifica a resposta oxidante
em folhas e raízes de plantas submetidas à salinidade e à desidratação.
A geração de ROS também tem sido relatada como mecanismo de defesa
inicial, durante o estresse biótico induzido por patógenos (Apel e Hirt, 2004).
Levando-se em consideração que a bactéria G. diazotrophicus é um
endófito que realiza a interação com a cana-de-açúcar sem causar sintoma de
doença (James et al., 1994), é possível supor que a não alteração de espécies
reativas em plantas inoculadas seja parte de um mecanismo da bactéria envolvido
no estabelecimento da interação e, portanto, a não ativação do sistema de defesa
da planta colonizada acarreta uma melhor interação planta-endófito. Porém, em
raízes, é interessante ressaltar que plantas submetidas ao estresse hídrico, na
presença da bactéria, sofreram um efeito aditivo, apresentando um maior nível de
peroxidação e consequentemente, uma maior concentração de ROS.
Para prevenir ou aliviar os danos causados por ROS, as plantas
desenvolveram um complexo sistema antioxidante que inclui a enzimas, como a
catalase (CAT), a ascorbato peroxidase (APX) e a guaiacol peroxidase (GPX)
(Netto, 2001; Mittler, 2002; Cavalcanti et al., 2004).
Nesse sentido, decidiu-se analisar a resposta antioxidante em folhas de
plantas de cana-de-açúcar, colonizadas por G. diazotrophicus e submetidas à
salinidade e à desidratação (15 dias). As atividades dessas três enzimas, que
68
compõem o sistema de defesa ao estresse oxidativo, foram avaliadas (figura 19):
CAT (catalase), APX (ascorbato peroxidase) e GPX (guaiacol peroxidase).
A enzima ascorbato peroxidase apresentou uma maior atividade em
resposta à inoculação. Tal observação pode ser visualizada em folhas de plantas
inoculadas e submetidas à salinidade e desidratação, sendo esse acréscimo mais
evidente em resposta ao sal. Com relação à atividade enzimática em plantas não-
inoculadas, e plantas expostas à seca, essas apresentaram resultados similares.
No entanto, a atividade da ascorbato é, praticamente, o dobro em plantas não-
inoculadas e expostas ao sal.
Ascobato peroxidases são enzimas com função geral similar a das
catalases. No entanto, elas realizam a remoção do H
2
O
2
, usando o ascorbato
como agente redutor (Shigeoka et al., 2002; Van Breusegem et al., 2001). A APX,
por ser predominantemente citosólica e organelar (Foyer e Noctor, 2000), tem
maior participação na eliminação do H
2
O
2
produzido pela enzima superóxido
dismutase. A presença de H
2
O
2
é um sinal sistêmico para a indução de APX
(Karpinski et al. 1999). Como verificado, a ativação de peroxidases é descrita em
resposta a estresses (Lee et al., 2001; Quiroga et al., 2000), demonstrando seu
importante papel em plantas sob condições adversas. Inversamente à CAT, as
peroxidases são significativamente induzidas nessas condições (Mhadhbi et al.,
2004). Tal informação corrobora os dados observados, em que a atividade de
CAT não apresentou alterações em resposta aos tratamentos.
A CAT é encontrada no citoplasma, mitocôndrias e peroxissomos de
células animais, vegetais e microorganismos aeróbicos (Scandalios, 1990).
Catalases vegetais estão envolvidas em funções fotorrespiratórias (Canvin, 1990),
retirada de H
2
O
2
durante a β-oxidação de ácidos graxos e germinação de
sementes (Willekens et al., 1995).
Para guaiacol peroxidase, foi possível verificar que a inoculação também
possibilitou o incremento de sua atividade, similar à da APX. Porém, plantas
inoculadas e estressadas apresentaram valores ainda maiores que em plantas
estressadas, na ausência da bactéria. A maior atividade enzimática foi observada
em plantas colonizadas e expostas à seca.
A GPX está associada com os processos bioquímicos e fisiológicos de
crescimento, formação celular, desenvolvimento de frutos, biossíntese de etileno
e com a resposta a vários estresses (Matamoros et al., 2003; Jebara et al., 2005).
69
A GPX atua, eficientemente, na remoção do H
2
O
2
acumulado na célula pela
atividade da SOD.
Os dados obtidos, neste trabalho, demonstraram que a colonização pela
bactéria endofítica Gluconacetobacter diazotrophicus interferiu na resposta aos
estresses salino e hídrico. Os parâmetros avaliados sugerem que plantas
inoculadas são mais susceptíveis à desidratação. De acordo com Barbosa (2008),
plantas de cana-de-açúcar, na presença da bactéria G. diazotrophicus,
apresentam alterações nos parâmetros de trocas gasosas durante o estresse
salino. Foi observado que a condutância estomática não foi afetada pela
salinidade, em plantas inoculadas. Tal resultado sugere uma inibição do
fechamento estomático em plantas expostas à salinidade, promovida pelo
endófito. Os resultados encontrados por Barbosa (2008) corroboram a maior
susceptibilidade à seca observada em plantas inoculadas. Uma hipótese para
explicar tal observação, seria a de que a bactéria G. diazotrophicus seria capaz
de interferir no fechamento estomático, afetando os mecanismos de controle de
perda de água e, consequentemente, elevando os danos provocados por seca e
salinidade.
3.1.7. CONCLUSÕES
De acordo com as condições em que foi realizado este trabalho, confirmou-
se que plantas colonizadas por G. diazotrophicus apresentam maior
susceptibilidade aos estresses salino e hídrico. Essa sensibilidade foi mais
proeminente em resposta ao estresse hídrico, em que foi verificada a morte de
todas as plantas aos 20 dias de tratamento.
3.1.8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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75
3.2. IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS GENES SnRK E COI1,
ENVOLVIDOS NA REGULAÇÃO ESTOMÁTICA EM PLANTAS DE CANA-DE-
AÇÚCAR COLONIZADAS POR Gluconacetobacter diazotrophicus
3.2.1. RESUMO
Com base em estudos já realizados, pode-se verificar que plantas possuem
um sistema de percepção e resposta a microorganismos. Esse mecanismo de
defesa acarreta alterações fisiológicas iniciadas por sinais externos, resultando
em uma cascata de sinalização, que irão modular a ativação ou repressão de
genes. De acordo com os resultados obtidos no capítulo anterior, plantas de cana-
de-açúcar respondem à interação com a bactéria endofítica G. diazotrophicus,
resultando numa possível alteração dos mecanismos de controle de perda de
água. Essa alteração pode ser proveniente da interferência da bactéria nas vias
de sinalização do hormônio ácido abscísico, que controla o fechamento
estomático. Os resultados encontrados, neste trabalho, indicaram a participação
da quinase SnRK2.4 (SAPK6) e da proteína COI1, sugerindo, respectivamente, o
envolvimento dessas proteínas nos mecanismos de sinalização de ABA e de
defesa vegetal, desencadeados pela colonização por Gluconacetobacter
diazotrophicus.
76
3.2.2. ABSTRACT
Based on previous studies, we verified that plants have a system of
perception and response to microorganisms. This defense mechanism causes
physiological changes initiated by external signals, resulting in a signaling cascade
that will modulate the activation or repression of genes. According to the results
obtained in the previous chapter, sugarcane plants respond to interaction with the
endophytic bacterium G. diazotrophicus, resulting in a possible alteration of the
mechanisms of control of water loss. This change may be coming from the
interference of bacteria in the signaling pathways of the hormone abscisic acid,
which controls stomatal closure. The results found in this work indicated the
involvement of SnRK2.4 (SAPK6) quinase and COI1 protein, suggesting,
respectively, the involvement of these proteins in the mechanisms of ABA
signaling and plant defense, triggered by colonization by Gluconacetobacter
diazotrophicus.
3.2.3. INTRODUÇÃO
Embora a associação planta-endófito seja vantajosa para ambos os
organismos, acredita-se que as plantas de cana-de-açúcar reconhecem a bactéria
endofítica e ativam uma resposta de defesa (Vinagre et al., 2006). Essa
percepção e resposta são pertencentes a uma via de sinalização celular, que
envolve a ativação de proteínas, quinases, fosfatases, mensageiros secundários
como o Ca
2+
, resultando, consequentemente, na regulação gênica (Kobayashi et
al., 2004).
Os resultados encontrados no primeiro trabalho permitiram a especulação
de que a bactéria endofítica G. diazotrophicus poderia estar interferindo nas vias
de sinalização de ABA, ocasionando, dessa forma, alterações nos mecanismos
de regulação estomática. Como consequência, um efeito mais drástico, durante o
estresse hídrico, pôde ser observado.
77
Melotto et al. (2008) verificaram que os estômatos participam de forma
ativa na resposta de defesa, pela ativação de sinais intermediários, como a
quinase específica de células-guarda OST1 open stomata 1 (SnRK2.6), e de
alterações e oscilações nos níveis de Ca
2+
citosólico (Fan et al., 2004; Mustilli et
al., 2002; Schroeder et al., 2001). Adicionalmente, Melotto et al. (2006)
demonstraram também a participação da proteína COI1 no movimento
estomático, durante a infecção. COI1 é uma proteína insensível ao efeito de
coronatina, um composto análogo ao metil-jasmonato, de bactérias.
Atualmente, uma forma fácil e rápida de entender a ativação do sistema de
resposta vegetal, bem como as vias de sinalização, é pelo uso de análise de
expressão gênica in silico. A disponibilidade dos bancos de dados e a utilização
de ferramentas para análise in silico possibilitaram a caracterização funcional de
diversos genes. Assim, com base no banco SUCEST e pelo uso de análises via
bioinformática, genes de proteínas poderiam ser identificados e sua função
sugerida, baseando-se em sua expressão nas bibliotecas, e de acordo com a
função em diferentes espécies.
Em 2000, o projeto genoma da cana-de-açúcar (SUCEST), financiado pela
FAPESP, foi iniciado por pesquisadores do Estado de São Paulo, o que
proporcionou um grande impulso nas pesquisas com cana-de-açúcar. O SUCEST
gerou 37 bibliotecas de cDNA, sendo sequenciados 237.954 ESTs. Dentre as
bibliotecas, encontra-se a biblioteca AD1, obtida de plantas inoculadas com a
bactéria endofítica G. diazotrophicus.
Como citado anteriormente, os estômatos participam ativamente da
resposta de defesa, durante a infecção por microorganismos (Melotto et al.,
2008). Genes de proteínas que participam dessa resposta poderiam ser
analisados, visando a um melhor entendimento das vias de sinalização vegetal,
durante a interação planta-endófito. Nesse contexto, este trabalho visou contribuir
para identificação e caracterização, pelo uso de análises in silico, dos transcritos
SnRK e COI1, de plantas de cana-de-açúcar colonizadas por G. diazotrophicus.
78
3.2.4. MATERIAL E MÉTODOS
3.2.4.1. Identificação, alinhamento e análise filogenética das sequências
gênicas CDPK-SnRK e COI1
Sequências de proteínas CDPK-SnRK e COI1 foram identificadas nos
bancos NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e Phytozome (http://phytozome.net), e
utilizadas para posterior busca no banco SUCEST
(http://sucest.lad.ic.unicamp.br/en/). Os clusters encontrados no SUCEST foram
alinhados no banco NCBI, utilizando-se as ferramentas blastx e tblastx
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Após a confirmação, as sequências de
nucleotídeos foram convertidas em aminoácidos
(http://ca.expasy.org/tools/dna.html) e alinhadas no programa CLC Protein
Workbench 5.1 (http://www.clcbio.com), para visualizar a conservação das
mesmas.
Para a realização da análise filogenética, os alinhamentos foram obtidos
pela utilização do programa ClustalW2 (http://.ebi.ac.uK/Tools/clustalw2/). O
resultado do alinhamento no ClustalW2, em formato PHYLIP, foi submetido ao
software PHYLM (http://www.atgc-montpellier.fr/phyml). Esse software gera
árvores filogenéticas pelo método maximum likelihood (Guindon et al., 2003). O
resultado obtido, no PHYLM em formato Newick, foi utilizado no programa
TreeView 1.6.6 (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html) para a construção
e visualização da árvore filogenética.
3.2.4.2. Northern eletrônico dos genes SnRK e COI1 via banco SUCEST
As frequências dos reads de cada cluster, referentes à classe SnRK e às
proteínas COI1, foram analisadas no programa Proteínas on line, desenvolvido
pela Doutoranda Verônica Aguiar. O cluster analisado, contendo seus reads, foi
obtido do banco SUCEST e salvo em arquivos txt (bloco de notas). O programa
Proteínas on line faz a leitura do arquivo txt, avaliando a frequência da biblioteca
(tabela 4) presente em cada read. Posteriormente, foi gerado um gráfico
correspondente à frequência desses transcritos.
79
Tabela 4 - Bibliotecas de cDNA de cana-de-açúcar do banco SUCEST, indicando
o tecido/condição das mesmas
CÓDIGO DAS
BIBLIOTECAS
DO SUCEST
DESCRIÇÃO DA BIBLIOTECA
NÚMERO D
E
‘READS’
AD1
Plantas in vitro inoculadas com Gluconacetobacter diazotrophicus (var.
SP701143
18137
AM1
Meristema apical de folhas jovens e caules de canas maduras
(var. SP803280)
12480
AM2
Meristema apical de folhas jovens e caules e canas maduras
(var. SP803280)
15648
CL6
Calos submetidos a estresse luz (escuro) e estresse por temperatura 4
º
C e
37
º
C
7392
FL1
Flor de cana com base medindo 1 cm de comprimento (var. SP8087432)
18523
FL3
Flor de cana com base medindo 5 cm de comprimento
(var. PB5211, PB57150-4)
13056
FL4
Pedúnculo floral com 50 cm de comprimento (var. PB5211, PB57150-4)
16885
FL5
Pedúnculo floral com 20 cm de comprimento (var. PB5211, PB57150-4)
10080
FL8
Pedúnculo floral com 10 cm de comprimento (var. PB5211, PB57150-4)
5167
HR1
Plantas in vitro inoculadas com Herbaspirilum rubrisubalbicans
(var. SP701143)
12000
LB1
Broto lateral de plantas de cana (var. SP803280)
7488
LB2
Broto lateral de plantas de cana adultas
10559
LR1
Cartucho foliar de plantas de cana-de-açúcar (var. SP803280)
14036
LV1
Folhas estioladas de plântulas
(SP83-5077, SP80-185, SP87-396, SP80-3280 e SP803280 X SP81-5441
)
6432
RT1 Raízes de cana-de-açúcar crescidas no solo (var. SP803280) 8640
RT2 Raízes de cana-de-açúcar crescidas no solo (var. SP803280) 12288
RT3 Raízes de plantas adultas de cana-de-açúcar crescidas no solo 10559
RZ2 Zona de transição entre raiz/folha de plantas de cana (var. SP803280) 5760
RZ3
Zona de transição entre raiz/folha de plantas de cana imaturas
(var. SP803280)
15168
SB1
Cascas de plantas de cana crescidas em casa de vegetação
(var. SP803280)
16318
SD1
Sementes de cana-de-açúcar em diferentes estágios de
desenvolvimento (var. RB805028)
11040
SD2
Sementes de cana-de-açúcar em diferentes estágios de
desenvolvimento (var. RB805028) 10366
ST1 Primeiro interno de plantas de cana-de-açúcar (var. SP803280) 8448
ST3
Quarto interno de plantas de cana-de-açúcar (var. SP803280)
11930
Para comparar a frequência da biblioteca no cluster, o programa faz a
normalização dos números de reads, da seguinte forma:
- Calcula o fator tecido-específico
Fator tecido-específico = [Número de reads da maior biblioteca / número
total de reads da biblioteca analisada]
- Calcula o fator da biblioteca
Fator da biblioteca = [Fator tecido-específico X número total de reads da
biblioteca analisada].
- Calcula o número de clones
80
Número de clones = Soma dos fatores das bibliotecas que sejam similares
(Ex: FL = soma do fator de FL1 a FL8).
Após a normalização, foi gerado um gráfico nos planos (x, y; x-expressão
relativa, y-bibliotecas) que indica a expressão gênica relativa do cluster analisado.
3.2.4.3. Fotografia fluorescente eletrônica dos genes SnRK2.4 (SAPK6)
e COI1
Os códigos de acesso (IDs) dos genes SnRK2.4 (SAPK6 em arroz) e COI1
de Arabidopsis thaliana foram obtidos no banco de dados NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), e utilizados para a geração da fotografia
fluorescente eletrônica no site http://www.bar.utoronto.ca. O método solicita a ID
do gene a ser analisado para gerar a fotografia. Posteriormente, é necessário
indicar se a análise deve ser realizada na planta inteira (órgãos), em regiões de
tecido-específico ou em resposta a algum estímulo, patógeno ou estresse. Os
níveis de expressão indicados pela figura representam a expressão relativa dos
genes analisados.
3.2.5. RESULTADOS
3.2.5.1. Identificação de sequências gênicas de proteínas quinase da
superfamília CDPK-SnRK de cana-de-açúcar e filogenia das proteínas
identificadas
Proteínas ortólogas CDPK-SnRK, em Arabidopsis, foram selecionadas no
banco de dados NCBI. As sequências de aminoácidos das proteínas de
Arabidopsis foram utilizadas para a realização do tblastn no banco SUCEST.
Ao todo, foram identificados 48 clusters de cana-de-açúcar, candidatos a
quinases CDPK-SnRK. Após a identificação, a sequência consensus de cada
cluster foi utilizada na realização de um tblastn no banco NCBI, para confirmação
da ortologia. As similaridades encontradas, entre proteínas caracterizadas em
81
diferentes espécies, foram anotadas na tabela 5. Foram identificados 3 clusters da
subclasse SnRK1, 15 clusters da subclasse SnRK2, 16 clusters da subclasse
SnRK3, 12 clusters da classe CDPK e 2 clusters não caracterizados de serina-
treonina quinase. Como pôde ser observado na tabela 5, alguns transcritos
apresentam similaridade à da mesma proteína de referência em outra espécie,
por exemplo, os clusters SCACLR2007G02.g, SCQGSB1083A03.g,
SCRLSB1040B12.g, SCJFLR1074F04.g, SCCCLR1068F10.g e
SCSGFL4031C01.g.
Adicionalmente, a análise filogenética das sequências de aminoácidos dos
clusters identificados foi realizada (figura 20). Tal análise permitiu a visualização
de quatro grupamentos, indicando a identificação da família SnRK, contendo suas
três subclasses (SnRK1, SnRK2 e SnRK3), e da família CDPK.
82
Tabela 5 - Transcritos identificados em cana-de-açúcar que codificam proteínas
quinase, indicando sua possível similaridade com outra espécie
N
º
Cluster (ID) Proteína hipotética e-value
14
SCJFRZ2032G01.g
gb|ACG33875.1| SNF1-related protein kinase catalytic alpha subunit KIN10 (
Zea mays
)
0.0
16
SCCCLR1070D11.g
dbj|BAA36298.1| OSK1 / SnRK1a (
Oryza sativa
)
0.0
17
SCQSLR1040B05.g
gb|ABQ18267.1| sucrose non-fermenting related protein kinase 1b / SnRK1b (
Sorghum bicolor
)
0.0
1
SCMCRT2088D10.g
gb|ACG32779.1| serine/threonine-protein kinase SAPK10 (
Zea mays
)
1E-74
2
SCEZRZ1013F09.g
ref|NP_001149657.1| serine/threonine-protein kinase SAPK8 (
Zea mays
)
0.0
3
SCQGHR1011E10.g
ref|NP_001067155.1| serine/threonine-protein kinase SAPK9 (
Oryza sativa
)
4E-179
4
SCRFLR2034A09.g
ref|NP_001147649.1| serine/threonine-protein kinase SAPK1 (
Zea mays
)
0.0
5
SCRFLR1034G06.g
ref|NP_001149243.1| serine/threonine-protein kinase SAPK2 (
Zea mays
)
0.0
6
SCCCLB1003E11.g
gb|AAP55046.1| serine/threonine-protein kinase SAPK3 (
Oryza sativa
)
3E-179
7
SCEPRZ3044B07.g
ref|NP_001149107.1| serine/threonine-protein kinase SAPK7 (
Zea mays
)
3E-175
8
SCCCST1006B11.g
gb|ACG33803.1| serine/threonine-protein kinase SAPK6 (
Zea mays
)
1E-63
9
SCCCST1004A07.g
ref|NP_001044930.1| serine/threonine-protein kinase SAPK4 (
Oryza sativa
)
3E-180
10
SCCCLR1068F10.g
gb|ACG33803.1| serine/threonine-protein kinase SAPK6 (
Zea mays
)
9E-142
11
SCJFLR1074F04.g
gb|ACG42286.1| serine/threonine-protein kinase SAPK5 (
Zea mays
)
3E-133
12
SCSGFL4031C01.g
ref|NP_001149107.1| serine/threonine-protein kinase SAPK7 (
Zea mays
)
3E-89
13
SCACLR2007G02.g
ref|NP_001149243.1| serine/threonine-protein kinase SAPK2 (
Zea mays)
5E-36
32
SCQGSB1083A03.g
gb|ACG46236.1| serine/threonine-protein kinase SAPK4 (
Zea mays
)
4E-35
21
SCRLSB1040B12.g
ref|NP_001044930.1| serine/threonine-protein kinase SAPK4 (
Oryza sativa
)
1E-61
15
SCCCLR1C05B07.g
ref|NP_001147857.1| CBL-interacting protein kinase / CIPK-like protein 1 (
Zea mays
)
0.0
18
SCJLRZ1023H04.g
gb|ACQ83498.1| CBL-interacting protein kinase 21 (
Sorghum bicolor
)
0.0
19
SCEQRT2027H03.g
gb|ACQ83489.1| CBL-interacting protein kinase 23 (
Sorghum bicolor
)
0.0
20
SCCCRT1001C10.g
gb|ACQ83515.1| CBL-interacting protein kinase 08 (
Sorghum bicolor
)
0.0
22
SCEZLB1012C07.g
gb|ACQ83491.1| CBL-interacting protein kinase 14 (
Sorghum bicolor
)
1E-174
23
SCCCLR1076F09.g
gb|ACQ83494.1| CBL-interacting protein kinase 25 (
Sorghum bicolor
)
0.0
24
SCUTLR1037E04.g
gb|ACQ83503.1| CBL-interacting protein kinase 03 (
Sorghum bicolor
)
0.0
25
SCACLR1036B06.g
gb|ACQ83504.1| CBL-interacting protein kinase 22 (
Sorghum bicolor
)
0.0
26
SCJFRZ2032C08.g
gb|ACQ83506.1| CBL-interacting protein kinase 02 (
Sorghum bicolor
)
0.0
28
SCBFSB1046D04.g
gb|ACQ83501.1| CBL-interacting protein kinase 31 (
Sorghum bicolor
)
2E-100
29
SCCCLR2C01G07.g
gb|ACQ83485.1| CBL-interacting protein kinase 04 (
Sorghum bicolor
)
0.0
30
SCJLRT1023G09.g
gb|ACQ83493.1| CBL-interacting protein kinase 05 (
Sorghum bicolor
)
4E-120
31
SCSFFL4017G11.g
ref|NP_001147716.1| CBL-interacting serine/threonine-protein kinase 1 (
Zea mays
)
9E-129
34
SCEPAM2012F04.g
gb|ACQ83488.1| CBL-interacting protein kinase 09 (
Sorghum bicolor
)
8E-111
35
SCQSSB1055G03.g
gb|ACQ83514.1| CBL-interacting protein kinase 24 (
Sorghum bicolor
)
9E-79
48
SCEQRT2094G10.g
gb|ACQ83508.1| CBL-interacting protein kinase 01 (
Sorghum bicolor
)
5E-71
27
SCCCLR2003E06.g
gb|ACG24528.1| serine/threonine-protein kinase 12 (
Zea mays
)
5E-158
38
SCMCLR1053D03.g
ref|NP_001147964.1| serine/threonine-protein kinase AtPK19 (
Zea mays
)
0.0
33
SCEQRT2099H01.g
ref|NP_001147084.1| calcium-dependent protein kinase, isoform AK1
(Zea mays
)
0.0
36
SCEQRT1027E02.g
gb|AAT75244.1| calcium-dependent protein kinase putative (
Oryza sativa
)
0.0
37
SCCCLR1C04E07.g
ref|NP_001105306.1| calcium-dependent protein kinase (
Zea mays
)
0.0
39
SCCCLB1C03G07.g
ref|NP_001149916.1| calcium-dependent protein kinase, isoform AK1 (
Zea mays
)
0.0
40
SCJLLR1011H04.g
ref|NP_001105752.1| calcium-dependent protein kinase ZmCPK11 (
Zea mays
)
0.0
41
SCCCRZ1002A06.g
dbj|BAD17519.1| calcium-dependent protein kinase - putative (
Oryza sativa
)
0.0
42
SCEPRZ1009A12.g
ref|NP_001152509.1| calcium-dependent protein kinase, isoform 2 (
Zea mays
)
0.0
43
SCRULR1020G01.g
dbj|BAC16472.1| calcium/calmodulin-dependent protein kinase CaMK putative (
Oryza sativa
)
0.0
44
SCSGAM2075E08.g
ref|NP_001151970.1| calcium-dependent protein kinase (Zea mays)
2E-163
45
SCCCLR1024H03.g
gb|AAF23901.2|AF194414_1 calcium-dependent protein kinase (
Oryza sativa
)
0.0
46
SCCCLR1C04F08.g
ref|NP_001105307.1| calcium-dependent protein kinase (
Zea mays
)
0.0
47
SCEPRZ1008C06.g
gb|AAA33443.1| calcium-dependent protein kinase (
Zea mays
)
0.0
83
Figura 20 - Árvore filogenética da CDPK-SnRK, identificadas em cana-de-açúcar,
pelo banco de dados do SUCEST. As sequências dos clusters foram alinhadas no
programa ClustalW. Os resultados do alinhamento, no formato “Phylip”, foram
submetidos ao programa “PHYML” para gerar a árvore. A escala é a distância de
similaridade do agrupamento em questão.
84
3.2.5.2. Genes de quinases da classe SnRK2 são regulados na
biblioteca de plantas de cana-de-açúcar inoculadas com G. diazotrophicus
(AD1)
Tem sido demonstrado que proteínas quinase da subclasse SnRK2 são
ativadas por ácido abscísico e estão envolvidas na regulação estomática (Mustilli
et al., 2002; Yoshida et al., 2002). Nesse sentido, genes SnRK2 identificados em
cana-de-açúcar tiveram sua expressão relativa analisada, em uma biblioteca de
plantas de cana-de-açúcar colonizadas por G. diazotrophicus.
Conforme apresentado na tabela 5, foi realizada a análise in silico de 13
transcritos (cluster) de cana-de-açúcar que codificam quinases da classe SnRK2,
visando à identificação de clusters regulados pela inoculação com a bactéria.
O northern eletrônico mostra que sete clusters se expressam na biblioteca
AD1 (figura 21). Pode-se observar que o cluster SCCCST1006B11.g apresentou a
maior expressão entre os membros da subfamília SnRK2.
Figura 21 - Northern eletrônico dos clusters, que codificam proteínas da família
SnRK2, em uma biblioteca de cDNA de plantas inoculadas com
Gluconacetobacter diazotrophicus. O eixo Y indica a expressão relativa dos
genes, o eixo X indica os nomes de cada cluster. A análise foi realizada por meio
da utilização do banco de dados SUCEST.
85
Como as sequências de cana-de-açúcar foram selecionadas de um banco
EST (cDNA), provenientes do sequenciamento de transcritos, as sequências de
aminoácidos utilizadas são apenas parciais. Dessa forma, as sequências
consensus dos clusters SnRK2 foram traduzidas para aminoácidos e utilizadas
em um alinhamento, para verificar o nível de similaridade e conservação entre os
diferentes clusters. O resultado parcial do alinhamento pode ser observado na
figura 22, onde se verifica um alto grau de conservação dos aminoácidos entre os
membros da família SnRK2.
Figura 22 - Alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos dos clusters
correspondentes à subclasse SnRK2. Regiões conservadas são marcadas em
vermelho e regiões não conservadas, em azul. O gráfico de barras indica o nível
de conservação do aminoácido entre os diferentes clusters. As linhas pontilhadas
indicam gaps na sequência e permitem a visualização de um melhor alinhamento.
Devido ao fato de o cluster SCCCST1006B11.g apresentar alta frequência
na biblioteca AD1, o mesmo foi selecionado para a realização da análise in silico
nas diferentes bibliotecas do SUCEST. Conforme apresentado na figura 23, o
transcrito analisado apresenta alta expressão, em resposta à colonização por G.
diazotrophicus, sendo também expresso em interno (biblioteca ST).
86
Figura 23 - Northern eletrônico, demonstrando a expressão relativa do cluster
SCCCST1006B11.g, que corresponde à proteína SAPK6 (subclasse SnRK2), nas
diferentes bibliotecas do SUCEST. O eixo Y indica a expressão relativa do gene,
o eixo X indica os códigos das bibliotecas analisadas.
No intuito de verificar a expressão dos clusters nas demais bibliotecas do
SUCEST, os transcritos que se apresentaram regulados na biblioteca AD1
tiveram sua expressão relativa analisada (figura 24). Como pode ser verificado na
figura 24D, o transcrito SCCCLR1068F10.g apresentou maior expressão relativa
na biblioteca de plantas de cana-de-açúcar inoculadas com G. diazotrophicus.
Com exceção dos clusters SCCCST1006B11.g e SCCCLR1068F10.g, os outros
transcritos apresentaram uma menor expressão em AD1, quando comparada com
as das demais bibliotecas do SUCEST.
87
A B
C D
E F
Figura 24 - Northern eletrônico, demonstrando a expressão relativa dos clusters
SCQGHR1011E10.g (A), SCCCLB1003E11.g (B), SCRFLR1034G06.g (C),
SCCCLR1068F10.g (D), SCJFLR1074F04.g (E) e SCEZRZ1013F09.g (F), que
correspondem às proteínas SAPKs (subclasse SnRK2), nas diferentes bibliotecas
do SUCEST. O eixo Y indica a expressão relativa do gene, o eixo X indica os
códigos das bibliotecas analisadas.
Devido ao fato de o cluster SCCCST1006B11.g apresentar-se regulado na
biblioteca AD1, este foi selecionado para a realização do alinhamento com
diferentes espécies e filogenia. Para a realização do alinhamento, sequências
proteicas de dez espécies foram utilizadas e alinhadas no programa CLC Protein
Workbench. Observa-se, na figura 25, que o alinhamento permitiu verificar o alto
88
nível de similaridade dos aminoácidos, entre as diferentes espécies. A sequência
de cana-de-açúcar é apenas parcial, como pode ser visualizada.
Figura 25 - Alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos da proteína
quinase SAPK6 (SnRK2) de 11 espécies. Regiões conservadas são marcadas em
vermelho, e regiões não conservadas, em azul. O gráfico de barras indica o nível
de conservação do aminoácido entre as diferentes espécies. As linhas
pontilhadas indicam gaps na sequência e permitem a visualização de um melhor
alinhamento.
Com relação à análise filogenética, foram utilizadas as sequências de
aminoácidos das 11 espécies. O resultado apresentado na figura 26 mostra a
formação de dois grandes grupos, um formado pelas dicotiledôneas e ou outro
89
formado pelas monocotiledôneas. De acordo com a filogenia, a proteína SAPK6,
proveniente do cluster SCCCST1006B11.g, apresenta maior similaridade com
uma SAPK de arroz (Oryza sativa).
Figura 26 - Árvore filogenética da proteína quinase SAPK6 (SnRK2) de 11
espécies. As sequências de aminoácidos foram alinhadas no programa ClustalW.
Os resultados do alinhamento, no formato “Phylip”, foram submetidos ao
programa “PHYML” para gerar a árvore. A escala é a distância de similaridade do
agrupamento em questão.
3.2.5.3. Visualização dos níveis de expressão relativa do gene
AtSnRK2.4/ASK1 (SAPK6) de Arabidopsis thaliana, em diferentes tecidos e
órgãos vegetais
Para obter uma possível informação funcional do cluster
SCCCST1006B11.g (SAPK6), seu ortólogo em Arabidopsis foi identificado e sua
90
ID utilizada para a geração da fotografia fluorescente eletrônica (EFP Browser).
Os níveis de expressão relativa são indicados por meio da coloração dos tecidos,
em que baixos níveis de expressão são coloridos em amarelo, e altos níveis, em
vermelho. A cor azul indica a repressão do gene.
Observa-se, na figura 27, que o gene analisado apresenta maior expressão
em folhas senescentes e internó, sendo altamente expresso em grãos de pólen.
Sendo a classe SnRK2 responsiva a ABA e a estresse osmótico,
adicionalmente, decidiu-se analisar tal gene em células-guarda. Conforme
apresentado na figura 28, verifica-se uma considerável expressão do gene
SnRK2.4/ASK1 em células do mesófilo e células-guarda, sendo essa expressão
aumentada quando as plantas são submetidas ao tratamento com ABA.
Figura 27 - Fotografia eletrônica fluorescente representando os níveis de
expressão relativa do gene SnRK2.4/ASK1 (SAPK6), em diferentes tecidos e
órgãos de Arabidopsis thaliana.
91
Figura 28 - Fotografia eletrônica fluorescente do padrão de expressão tecido-
específica do gene SnRK2.4/ASK1 (SAPK6), em estômatos e células do mesofilo
de Arabidopsis thaliana.
3.2.5.4. COI1 é induzido por plantas de cana-de-açúcar inoculadas com
Gluconacetobacter diazotrophicus (biblioteca AD1)
A proteína F-box COI1 é um fator-chave da resposta de defesa via ácido
jasmônico e está envolvida em diversos mecanismos, como crescimento
radicular, fertilidade do pólen e defesa contra insetos e patógenos (Xu et al.,
2002). Como já foi mencionado, COI1 responde à coronatina, um composto
bacteriano análogo ao metil-jasmonato. Adicionalmente, seu papel também tem
sido enfatizado devido a sua possível interferência nos mecanismos de
fechamento estomático (Melotto et al., 2006).
Nesse contexto, decidiu-se realizar a análise in silico de COI1. Ao todo,
foram identificados seis ortólogos putativos de COI1. Conforme apresentado na
figura 29, o northern eletrônico mostra que todos os clusters identificados são
expressos na biblioteca AD1. Entre estes, observa-se que o transcrito
SCQSRT1034B12.g apresentou a maior expressão entre os clusters analisados.
92
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Clusters ortólogos de COI1
E
x
p
r
e
s
s
ã
o
R
e
l
a
t
i
v
a
Figura 29 - Northern eletrônico dos clusters, que codificam proteínas da COI1, em
uma biblioteca de cDNA de plantas inoculadas com Gluconacetobacter
diazotrophicus. O eixo Y indica a expressão relativa dos genes, o eixo X indica os
nomes de cada clusters. A análise foi realizada com a utilização do banco de
dados SUCEST.
Devido ao fato de o cluster SCQSRT1034B12.g apresentar maior
expressão relativa na biblioteca AD1, este foi selecionado para a realização da
análise in silico nas diferentes bibliotecas do SUCEST. Observa-se, na figura 30,
que o transcrito analisado apresenta expressão nas bibliotecas de meristema
apical (AM), calo (CL), pedúnculo floral (FL), broto lateral (LB), raiz (RT), cascas
(SB) e internó (ST). Porém, a maior indução ocorre na biblioteca de plantas
inoculadas com G. diazotrophicus (AD). Nas demais bibliotecas, nenhuma
expressão foi observada.
Com o objetivo de verificar a expressão dos demais clusters nas bibliotecas
do SUCEST, os outros transcritos, que também se apresentaram regulados na
biblioteca AD1, tiveram sua expressão relativa analisada (figura 31). Como pode
ser verificado na próxima figura, os transcritos SCRFLR1055F12.g (figura 31D) e
SCJFAD1010G04.g (figura 31F) também apresentaram uma maior expressão
relativa na biblioteca de plantas de cana-de-açúcar inoculadas com G.
diazotrophicus. Todos os demais clusters apresentaram expressão em AD1,
93
porém, quando comparados às demais bibliotecas, os mesmos não apresentaram
expressão superior.
Uma observação interessante pode ser verificada na figura 31F, onde o
transcrito SCJFAD1010G04.g é expresso somente na biblioteca AD1.
Figura 30 - Northern eletrônico, demonstrando a expressão relativa do cluster
SCQSRT1034B12.g, que corresponde à proteína COI1, nas diferentes bibliotecas
do SUCEST. O eixo Y indica a expressão relativa do gene, o eixo X indica os
códigos das bibliotecas analisadas.
94
A B
C D
E F
Figura 31 - Northern eletrônico, demonstrando a expressão relativa dos clusters,
SCCCLR1C01E03.g (A), SCEZLB1009F12.g (B), SCBFLR1039D08.g (C),
SCQSRT1034B12.g (D) e SCRFLR1055F12.g (E) e SCJFAD1010G04.g (F),
correspondentes à proteína COI1, nas diferentes bibliotecas do SUCEST. O eixo
Y indica a expressão relativa do gene, o eixo X indica os códigos das bibliotecas
analisadas.
Adicionalmente, sequências da proteína COI1 de 13 espécies, incluindo a
cana-de-açúcar, foram utilizadas na realização de um alinhamento, para verificar
o nível de similaridade e conservação entre as diferentes espécies. O resultado
do alinhamento pode ser observado na figura 32, onde se verificam o grau de
similaridade e a conservação dos aminoácidos entre as proteínas COI1 das
espécies utilizadas.
95
Figura 32 - Alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos da proteína
COI1 de 13 espécies. Regiões conservadas são marcadas em vermelho e regiões
não conservadas, em azul. O gráfico de barras indica o nível de conservação do
aminoácido entre as diferentes espécies. As linhas pontilhadas indicam gaps na
sequência e permitem a visualização de um melhor alinhamento.
96
Com relação à análise filogenética, foram utilizadas as sequências
proteicas de COI1 de 13 espécies. O resultado apresentado, na figura 33, mostra
a formação de dois grandes grupos, um formado por dicotiledôneas e ou outro
formado por monocotiledôneas. Como se observa, a proteína COI1 de cana-de-
açúcar é mais próxima à COI1 de sorgo.
Figura 33 - Árvore filogenética da proteína COI1 de 13 espécies. As sequências
de aminoácidos foram alinhadas no programa ClustalW. Os resultados do
alinhamento, no formato “Phylip”, foram submetidos ao programa “PHYML” para
gerar a árvore. A escala é a distância de similaridade do agrupamento em
questão.
3.2.5.5. Visualização dos níveis de expressão relativa do gene COI1 de
Arabidopsis thaliana, em diferentes tecidos e órgãos vegetais
Para obter uma possível informação funcional do gene COI1, seu ortólogo
em Arabidopsis foi identificado, e sua ID utilizada para a geração da fotografia
fluorescente eletrônica (EFP Browser). Os níveis de expressão relativa são
indicados por meio da coloração dos tecidos, em que baixos níveis de expressão
são coloridos em amarelo, e altos níveis, em vermelho. A cor azul indica a
repressão do gene.
97
Observa-se, na figura 34, que o gene analisado apresenta maior expressão
em folhas caulinares, folhas senescentes, raízes e internó, sendo altamente
reprimido em grãos de pólen. Uma pequena repressão do gene também pode ser
visualizada em diferentes estádios da semente e de folhas.
Figura 34 - Fotografia eletrônica fluorescente representando os níveis de
expressão relativa do gene COI1, em diferentes tecidos e órgãos de Arabidopsis
thaliana.
Devido ao fato de a ação dependente de SCF
COI1
interferir na inibição do
fechamento estomático, decidiu-se analisar tal gene em células-guarda. Conforme
apresentado na figura 35, verifica-se um aumento da expressão do gene COI1 em
células-guarda, o que não foi verificado em plantas tratadas com ABA.
98
Figura 35 - Fotografia eletrônica fluorescente do padrão de expressão tecido-
específica do gene COI1, em estômatos e células do mesofilo de Arabidopsis
thaliana.
3.2.6. DISCUSSÃO
Conforme verificado no capítulo I, plantas de cana-de-açúcar colonizadas
por G. diazotrophicus apresentaram maior susceptibilidade aos estresses salino e
hídrico, sendo essa sensibilidade mais proeminente em resposta ao estresse
hídrico. Uma explicação plausível seria que a bactéria G. diazotrophicus poderia
estar interferindo na via de sinalização para o controle da abertura estomática,
acarretando, dessa forma, a maior perda de água através dos estômatos. Nesse
contexto, o capítulo II teve como objetivo avaliar a possível participação de
proteínas SnRKs e COI1, durante a colonização pela bactéria endofítica
Gluconacetobacter diazotrophicus.
Segundo alguns autores (Ding et al., 2009; Huai et al., 2008; Hrabak et al.,
2003), proteínas CDPK-SnRK estão envolvidas na resposta vegetal ao ABA e a
estresses abióticos. Análises filogenéticas, realizadas por Hardie (1999, 2000),
demonstraram que quinases pertencentes à superfamília CDPK-SnRK contêm
domínios Ser-Thr, típicos de eucariotos, utilizados na classificação dessas
proteínas. Os dados obtidos, no presente trabalho, possibilitaram a identificação
de 48 clusters de cana-de-açúcar, correspondentes à superfamília CDPK-SnRK.
Foram identificados 3 clusters da subclasse SnRK1, 15 clusters da subclasse
SnRK2, 16 clusters da subclasse SnRK3, 12 clusters da classe CDPK e 2 clusters
99
de serina-treonina quinase, sem função exata. Essas proteínas foram alinhadas e
agrupadas filogeneticamente de acordo com suas regiões e domínios
conservados (figura 20). Muitos membros dessa superfamília possuem uma
região C-terminal cuja função é regular a atividade quinase ou mediar a interação
com outras proteínas (Harper et al., 1991). De acordo com os estudos
filogenéticos de Hardie (2000), os domínios de todas as Ser-Thr quinases de
Arabidopsis indicam que as subfamílias CDPK e SnRK são filogeneticamente
próximas umas das outras, e distintas de outras quinases, formando dessa forma
a superfamília CDPK-SnRK. Essas análises indicam que o padrão evolutivo da
superfamília CDPK-SnRK possui uma origem comum. O resultado observado, na
figura 20, e o alinhamento entre os membros de SnRK2 (figura 22) corroboram os
dados de Hardie (2000), nos quais foram verificados o agrupamento das quinases
na árvore filogenética e a alta conservação das sequências proteicas.
Levando em consideração que as quinases da classe SnRK2 estão
envolvidas na sinalização em resposta ao ABA e ao estresse osmótico (Shukla e
Mattoo, 2008), os mesmos tiveram sua expressão in silico analisada em uma
biblioteca de cDNA de plantas de cana-de-açúcar inoculadas com G.
diazotrophicus. Entre os 13 clusters analisados, 7 apresentaram-se expressos na
biblioteca AD1, sendo os clusters SCCCST1006B11.g altamente expressos em
plantas de cana-de-açúcar colonizadas pelo endófito (figura 21).
O cluster SCCCST1006B11.g foi também analisado, nas diferentes
bibliotecas do SUCEST (figura 23), e mostrou-se induzido na biblioteca AD1,
quando comparado ao das demais bibliotecas. Tal cluster, quando submetido a
um blast no NCBI, apresentou alta similaridade com a proteína ASK1/SnRK2.4 de
Arabidopsis e com a proteína SAPK6 de milho. Em estudos realizados por
Kobayashi et al. (2004), foi verificado que a desidratação, estresse osmótico e
ABA induziram o gene OSRK1, idêntico a SAPK6, uma proteína quinase da
classe SnRK2 de arroz.
Adicionalmente, entre os transcritos de SnRK2, analisados nas diferentes
bibliotecas do SUCEST (figura 24), somente SCCCLR1068F10.g apresentou
indução em AD1, sendo este também um ortólogo de SAPK6.
As quinases SnRK2 são também conhecidas como SAPKs (proteínas
quinases ativadas por estresse osmótico e ABA – osmotic stress/ABAactivated
protein quinases) (Kobayashi et al., 2004). Segundo Ding et al. (2009), SAPK6
100
interage com OREB1, uma proteína relacionada a fatores bZIP, sendo um fator de
ligação de elementos responsivos ao ABA.
A primeira SnRK2 (PKABA1) foi isolada de uma biblioteca de embriões de
trigo tratados com ABA (Anderberg et al., 1992). Subsequentemente, um outro
membro da subfamília SnRK2 foi identificado como um regulador central de AAPK
(proteína quinase ativada por ABA – ABA activated protein quinase) envolvido no
fechamento estomático dependente de ABA em feijão de fava (Li et al., 1996;
2000). Uma outra proteína quinase ativada por estresse hiperosmótico foi
purificada de células de tabaco. O sequenciamento N-terminal permitiu identificar
sua ortologia com a proteína ASK1 de Arabidopsis (Mikolajczyk et al., 2000),
também pertencente à família SnRK.
Mustilli et al. (2002) e Yoshida et al. (2002) também identificaram uma
quinase SnRK2 em Arabidopsis, denominada OST1/SnRK2.6. OST1 é expressa
em células-guarda e no sistema vascular, sendo ativada durante o fechamento
estomático. Sua atividade é estimulada por ABA, mas sua expressão gênica não
é regulada pelo hormônio (Mustilli et al., 2002; Yoshida et al., 2002). A análise in
silico, observada na figura 21, mostra que o ortólogo putativo de OST1 em cana-
de-açúcar (SCMCRT2088D10.g) também não apresentou aumento de sua
expressão na biblioteca AD1. Porém, cabe ressaltar que a análise in silico de
ESTs apresenta limitações, somente genes expressos são identificados e têm sua
expressão relativa calculada, entretanto, genes reprimidos não são identificados.
Com relação ao alinhamento de SCCCST1006B11.g, a figura 25 permitiu
verificar o alto nível de similaridade entre o gene ASK1/SnRK2.4/SAPK6 de
diferentes espécies. A filogenia do cluster, diferencialmente expresso em AD1
(figura 26) (SCCCST1006B11.g), mostrou a formação de dois grandes grupos: o
de dicotiledôneas e o de monocotiledôneas.
Visando obter uma possível informação funcional do cluster
SCCCST1006B11.g, seu ortólogo putativo em Arabidopsis foi identificado e sua
ID utilizada para a geração da fotografia fluorescente eletrônica (EFP Browser).
Dessa forma, o gene ASK1/SnRK2.4 foi analisado, apresentado maior expressão
em folhas senescentes, internós e grãos de pólen (figura 27). A expressão em
folhas senescentes permite novamente a especulação de que o gene, nesse
tecido e condição, pode estar respondendo ao hormônio ácido abscísico,
101
envolvido na abscisão foliar. O ABA estimula a síntese de etileno, que é
responsável pela abscisão da folha.
Nesse contexto, decidiu-se analisar tal gene em células-guarda. Conforme
apresentado na figura 28, verificou-se uma considerável expressão do gene
SnRK2.4/ASK1 em células do mesófilo e células-guarda, sendo essa expressão
aumentada quando as plantas eram submetidas ao tratamento com ABA.
Considerando o aumento da expressão de ASK1 em células-guarda de
Arabidopsis tratadas com ABA (figura 28), os dados obtidos permitem especular
que, durante a colonização por G. diazotrophicus, a proteína SAPK6 de cana-de-
açúcar, que estaria envolvida em uma possível resposta ao ABA ou ao estresse
osmótico, teria sua atuação alterada, afetando os mecanismos de resposta da
planta a estresses.
Uma outra proteína também envolvida no movimento estomático é COI1
(coronatine insensitive1). Segundo Xie et al. (1998), o complexo SCF
COI1
está
envolvido na degradação de proteínas pelo proteossomo 26S e é requerido na
resposta a ácido jasmônico (MeJA). Adicionalmente, MeJA desencadeia o
fechamento estomático similar ao ABA (Wang e Song, 2008), porém, se os dois
hormônios usam mecanismos de sinalização similares ou distintos ainda não foi
esclarecido (Munemasa et al., 2007).
Nesse contexto, foi realizado o northern eletrônico de seis transcritos
(clusters) de cana-de-açúcar que codificam a proteína COI1 (figura 29). A análise
in silico mostra que todos os clusters foram expressos na biblioteca AD1, sendo o
cluster SCQSRT1034B12.g o que apresentou a maior expressão.
Devido ao fato de o cluster SCQSRT1034B12.g apresentar alta frequência
na biblioteca AD1, sugerindo sua regulação em resposta à colonização por G.
diazotrophicus, este foi selecionado para a realização da análise in silico nas
diferentes bibliotecas do SUCEST, alinhamento da proteína COI1 com diferentes
espécies e análise filogenética.
O cluster SCQSRT1034B12.g apresentou expressão nas bibliotecas de
meristema apical (AM), calo (CL), pedúnculo floral (FL), broto lateral (LB), raiz
(RT), cascas (SB) e internó (ST). Porém, a maior indução ocorre na biblioteca de
plantas inoculadas com G. diazotrophicus (AD) (figura 30).
Adicionalmente, entre os demais transcritos de COI1 (figura 31), foi
identificado um cluster exclusivamente expresso em AD1 (SCJFAD1010G04.g).
102
O resultado do alinhamento de SCQSRT1034B12.g, observado na figura
32, possibilitou a observação de um alto grau de similaridade e a conservação
dos aminoácidos entre as proteínas COI1 das espécies analisadas. Com relação
à análise filogenética, o resultado apresentado, na figura 33, a formação de dois
grandes grupos, um formado pelas dicotiledôneas e/ou outro formado pelas
monocotiledôneas. Como pôde ser observado, COI1 de cana-de-açúcar é mais
próxima a COI1 de sorgo. Segundo Paterson et al. (2004), sorgo e cana-de-
açúcar são muito próximos, se comparados às outras espécies cultivadas.
Estima-se que sua divergência evolucionária ocorreu há 5 milhões de anos atrás,
ao contrário do milho, cuja separação foi estimada há 15-20 milhões de anos
atrás.
Com o objetivo de verificar uma possível informação funcional do cluster
SCQSRT1034B12.g, seu ortólogo putativo em Arabidopsis foi identificado e sua
ID utilizada para a geração da fotografia fluorescente eletrônica (EFP Browser).
Dessa forma, o gene COI1 foi analisado, apresentando maior expressão em
folhas caulinares, folhas senescentes, raízes e internó, sendo altamente reprimido
em grãos de pólen (figura 34). Tais resultados corroboram o northern eletrônico
nas diferentes bibliotecas do SUCEST, em que foi verificado que COI1 apresenta-
se regulado nas bibliotecas de raiz (RT) e internó (ST) (figura 30).
Como já foi descrito, COI1 é responsivo ao MeJA, estando esse hormônio
também envolvido com a abertura e fechamento estomático. Adicionalmente, de
forma similar ao ABA, o MeJA também é acumulado em plantas sob estresse
hídrico (Creelman e Mullet, 1995).
Devido ao fato de a ação dependente de SCF
COI1
interferir na inibição do
fechamento estomático, decidiu-se analisar tal gene em células-guarda. Conforme
apresentado na figura 35, verificou-se um aumento da expressão do gene COI1
nessas células. Porém, ao contrário de SAPK6, COI1 não apresentou um maior
aumento de sua expressão durante o tratamento com ABA.
Tal observação sugere que o aumento da expressão de COI1, verificado na
biblioteca de plantas inoculadas, pode ser proveniente de uma resposta
independente de ABA, porém envolvida no sistema de defesa do vegetal (Melotto
et al., 2006).
Em resumo, os resultados encontrados para COI1 e SAPK6, e suas
similaridades com proteínas envolvidas com a abertura estomática e em resposta
103
a ABA, sugerem que seus respectivos transcritos de cana-de-açúcar podem estar
envolvidos na resposta de defesa e hormonal, desencadeada pela colonização
por Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5.
G. diazotrophicus é conhecida por seus vários efeitos promotores do
crescimento vegetal. Dentre estes, destaca-se a produção de fitormônios pela
bactéria. Atualmente, não se sabe ao certo o papel desses hormônios durante a
interação cana-endófito; acredita-se que estejam envolvidos na promoção do
crescimento. Porém, sabe-se que alterações na concentração ou qualquer
desequilíbrio hormonal pode acarretar mudanças fisiológicas.
Nesse sentido, estudos posteriores poderiam ser realizados, visando a um
melhor entendimento dos mecanismos de defesa e de sinalização de hormônios
durante a interação cana-de-açúcar X G. diazotrophicus, bem como verificar se
ocorre alguma interação com as vias de produção e resposta ABA e MeJA.
3.2.7. CONCLUSÕES
SAPK6 de cana-de-açúcar é induzida na biblioteca de plantas colonizadas
por Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 e pode estar envolvida na via de
sinalização do hormônio ácido abscísico.
Todos os transcritos de COI1 identificados em cana-de-açúcar
apresentaram expressão durante a colonização por G. diazotrophicus.
Adicionalmente, o cluster SCJFAD1010G04.g foi expresso unicamente em AD1.
Os resultados para COI1 de cana-de-açúcar sugerem o envolvimento
dessa proteína nos mecanismos de defesa vegetal, desencadeado pela
inoculação de G. diazotrophicus.
104
3.2.8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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107
3.3. PRODUÇÃO DE ÁCIDO ABSCÍSICO PELA BACTÉRIA ENDOFÍTICA
Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 E QUANTIFICAÇÃO DO HORMÔNIO
EM PLANTAS DE CANA-DE-AÇÚCAR INOCULADAS
3.3.1. RESUMO
O fitormônio ácido abscísico tem papel fisiológico importante no
desenvolvimento vegetal e em resposta a estresses. Nos últimos anos, diversos
hormônios vegetais foram identificados e quantificados em fungos e bactérias. A
biossíntese desses hormônios, nos diferentes microorganismos, ainda não tem
sua função bem esclarecida, porém, alguns estudos evidenciam sua importância
no estabelecimento da interação planta-bactéria. Neste trabalho, identificamos o
hormônio ABA em meio de cultura quimicamente definido (LGIP) da bactéria
endofítica Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5, por GC-EIMS.
Adicionalmente, o mesmo hormônio foi também quantificado em plantas de cana-
de-açúcar inoculadas e submetidas aos estresses hídrico e salino. A inoculação
dobrou a quantidade de ABA das plantas de cana-de-açúcar e aumentou a
expressão de genes que respondem especificamente ao ABA. Quando essas
plantas foram submetidas aos estresses, níveis endógenos consideráveis de ABA
puderam ser quantificados, quatro vezes mais em relação aos das plantas-
controle. Os resultados mostrados, neste trabalho, sugerem o envolvimento do
hormônio ácido abscísico na resposta da planta de cana inoculada com a bactéria
ao estresse osmótico. Estudos complementares com mutantes de Arabidopsis
108
deficientes em ABA evidenciam que a inoculação com a bactéria tem uma função
fisiológica na germinação, similar à do ABA vegetal.
3.3.2. ABSTRACT
The plant hormone abscisic acid has important physiological role in plant
development and in response to stresses. In recent years, several plant hormones
were identified and quantified in fungi and bacteria. The biosynthesis of these
hormones in different organisms has not yet fully understood his role, however,
some studies have shown its importance in the establishment of plant-bacteria
interaction. In this study, we identified the hormone ABA in chemically-defined
culture medium (LGIP) of the endophytic bacterium Gluconacetobacter
diazotrophicus PAL5 by GC-EIMS. Additionally, the same hormone was also
measured in inoculated plants of sugarcane and submitted to drought and salinity.
Inoculation doubled the amount of ABA in sugarcane plants and up-regulated
specific genes of response to ABA. When these plants were exposed to stresses,
considerable levels of endogenous ABA could be quantified, four times more than
the control. The results obtained in this study suggest the involvement of the
hormone abscisic acid in inoculated sugarcane plants response to stresses.
Additional studies with Arabidopsis mutants deficient to ABA showed that
inoculation with the bacterium has a physiological function in germination, similar
to ABA plant hormone.
3.3.3. INTRODUÇÃO
Plantas podem interagir com diferentes microorganismos, formando
associações benéficas ou patogênicas. Nesses últimos anos, vários efeitos
positivos foram atribuídos às bactérias endofíticas, como a promoção do
crescimento vegetal, a fixação biológica do nitrogênio (Iniguez et al., 2004; Hurek
et al., 2002; Sevilla et al., 2001), a solubilização de nutrientes (Sessitsch et al.,
109
2004; Sturz et al., 2000) e a produção de fitormônios (Bottini et al., 2004; Cohen et
al., 2008; Schmelz et al., 2003), sendo este último um dos mais aceitos para
explicar os mecanismos promotores de crescimento, em resposta à interação
(Persello-Cartieaux et al., 2003; Glick e Bashan, 1997).
O possível papel desses hormônios durante a interação planta-bactéria
ainda é pouco conhecido, porém acredita-se que as alterações nas taxas
hormonais poderiam auxiliar no estabelecimento da doença ou colonização
(Cassán et al., 2001a and b; Grant and Jones, 2009; Spaepen et al, 2007).
A primeira observação da síntese de fitormônios por microorganismos foi
realizada em plântulas de arroz infectadas com o fungo Gibberella fujikuroi
(Kurosawa, 1926). O composto identificado foi denominado giberelina.
Posteriormente, técnicas físico-químicas permitiram a identificação deste e de
outros hormônios, como auxina e citocinina de bactérias e fungos (Bottini et al.,
2004; Robert-Seilaniantz et al., 2007).
O’Donnell et al. (2003) quantificaram o teor de hormônios vegetais em
plantas de Arabidopsis, infestadas por Xanthomonas campestris pv. Campestris e
Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, encontrando elevados níveis de
auxina. Schmelz et al. (2003) confirmaram que PstDC3000 induzia genes da
biossíntese de auxina e nas mesmas condições, o patógeno também induzia a
produção de ácido abscísico (ABA). Estudos realizados por Cohen et al. (2008)
também demonstraram a biossíntese do hormônio ABA pela bactéria endofítica
Azospirillum brasiliense Sp 245, em meio de cultura.
O ácido abscísico é um hormônio vegetal envolvido em vários processos
fisiológicos da planta (Zeevaart e Creelman, 1988). No desenvolvimento de
sementes, o ABA é necessário para induzir a síntese de proteínas de reserva e
lipídeos, bem como para a quebra da dormência de sementes e na aquisição de
tolerância à desidratação (Seo e Koshiba, 2002). O ABA também possui um papel
importante na resposta a vários estresses ambientais, como seca, salinidade e
UV-B (Berli et al., 2010; Travaglia et al., 2007).
Entre as bactérias endofíticas diazotróficas já caracterizadas, objeto de
estudo de muitos pesquisadores, está a Gluconacetobacter diazotrophicus.
Inicialmente, essa bactéria foi caracterizada como endofítica fixadora de
nitrogênio. Porém, seu potencial agrobiotecnológico vem ampliando-se. Isto se
deve a sua capacidade de solubilização de compostos como zinco e fosfato
110
(Intorne et al., 2009), produção de bacteriocinas (Piñon et al., 2002), biossíntese
de fitormônios (Bastián et al., 1998), bem como apresentar resistência a
antibióticos e metais pesados (Ahmad et al., 2004). A interação G. diazotrophicus
X cana-de-açúcar representa um modelo de sistema eficaz para estudos de
associação endofítico diazotrófico-monocotiledônea. Tal modelo tem sido
bastante estudado, sendo o PGPB atribuído à fixação do nitrogênio e à produção
de fitormônios, tanto em cana (Pedraza, 2008) como em outras espécies
sacaríferas (Bastián et al., 1999).
Neste trabalho, foi realizada a quantificação do hormônio ABA, em cultura
de Gluconacetobacter diazotophicus PAL5, bem como em plantas de cana-de-
açúcar inoculadas e submetidas à desidratação e salinidade. Tal caracterização
foi obtida por meio de gás chromatography-electron impact mass spectrometry
(GC-EIMS). Adicionalmente, genes envolvidos na resposta vegetal a ABA foram
avaliados por northern in silico, utilizando uma biblioteca de cDNA de plantas de
cana-de-açúcar inoculadas com a bactéria G. diazotrophicus (SUCEST).
3.3.4. MATERIAL E MÉTODOS
3.3.4.1. Material biológico
3.3.4.1.1. Microorganismo e condições da cultura
Gluconacetobacter diazotrophicus cepa PAL5 (cedida gentilmente pelo
Prof. Fábio Olivares, LBCT/UENF, Campos dos Goytacazes/RJ-Brasil) foi
utilizada. A bactéria foi crescida no meio quimicamente definido LGIP em frasco
erlenmeyer. Foram adicionados 0,5% de sacarose, 0,5% de sacarose + 100 mM
de NaCl, 10% de sacarose e 10% de sacarose + 100 mM de NaCl,
respectivamente, totalizando quatro tratamentos e controle (meio LGIP). A cultura
foi incubada em um shaker orbital com banho (Shaker Pro, Viking, Biocontrol) a
120 rpm, a 30°C, no escuro, até alcançar a fase est acionária derterminada pela
OD
600
.
111
3.3.4.2. Colonização de cana-de-açúcar por Gluconacetobacter
diazotrophicus
G. diazotrophicus foi crescida em meio DIGS, mantida em shaker orbital
por 12 horas a 30°C. Após o crescimento, a cultura foi utilizada para a inoculação
de plantas de cana-de-açúcar de 20 dias de idade. As raízes dessas plantas
foram mantidas mergulhadas na cultura bacteriana por 2 horas, plantas-controle
foram mergulhadas em meio DIGS. Passado o tempo de inoculação, as mesmas
foram plantadas em substrato areia e vermiculita (2:1) e mantidas em casa de
vegetação. Após 15 dias de colonização das plantas de cana-de-açúcar pela
bactéria G. diazotrophicus, essas foram coletadas da casa de vegetação,
mantidas em nitrogênio líquido, e estocadas em freezer – 80°C, para posterior
análise de ABA.
3.3.4.3. Teste de germinação em sementes de Arabidopsis thaliana
Sementes de Arabidopsis thaliana foram esterilizadas, em uma solução de
hipoclorito de sódio 5%, e plaqueadas em meio líquido contendo sais inorgânicos
Murashige & Skoog (1962). Para o teste de germinação, sementes foram
germinadas em placas de petri contendo meio MS líquido, meio MS líquido
acrescido de 2 µM de ABA, e de um exudado filtrado, proveniente de uma cultura
de bactérias G. diazotrophicus, crescidas em meio MS líquido, em um shaker
orbital a 30°C, até atingir a fase estacionária.
3.3.4.4. Identificação e quantificação de ABA endógeno em
Gluconacetobacter diazotrophicus
Para a quantificação de ABA em cultura bacteriana, 100 ng de [
2
H
6
]-ABA
(gentilmente doado por J. D. Cohen, Departamento de Horticultura, Universidade
de Minnesota, Saint Paul-EUA) foram adicionados à metade do volume da cultura,
no fim do período de incubação, como um padrão interno. A mistura permaneceu
durante 3 horas no escuro, a 4°C, para o equilíbrio do isótopo. A outra metade da
112
cultura foi processada sem o padrão interno. A cultura bacteriana foi crescida de
acordo com a descrição do método ‘Microrganismo e condições da cultura’ e,
então, sonicadas duas vezes por 6 minutos. Posteriormente, a suspensão
bacteriana foi centrifugada a 5000 rpm por 30 minutos, a 4°C. As células foram
descartadas e o sobrenadante foi ajustado para pH 3.0, com ácido acético. Após
o ajuste do pH, o líquido foi dividido em três frações contendo igual volume de
acetato de etila (saturado com 1% de ácido acético) pH 2.8-3.0. As frações
contento o acetato de etila foram evaporadas em um rotavapor, e o resíduo
dissolvido em 1 mL de uma mistura de metanol: água:ácido acético (79:20:1;
v/v/v). Essa mistura foi filtrada e submetida à purificação em HPLC, utilizando-se
uma coluna de fase reversa C
18
µBonda-pack (Waters Associates, Parker Ltd.,
Milford-EUA). A eluição foi realizada com o aparato KONIK 500 (Konik
Instruments, Barcelona-Espanha) num fluxo de 2 mL min
-1
, usando um gradiente
de 0-10 minutos para 10% de metanol em 1% de ácido acético; de 10-40 minutos
para 10-73% de metanol em 1% de ácido acético; de 40-50 minutos para 73% de
metanol em 1% de ácido acético; e de 50-60 minutos para 100% de metanol. A
fração de 34-40 minutos foi coletada. Após a evaporação do solvente em um
rotavapor, a amostra foi utilizada na análise por cromatografia gasosa, acoplada a
um espectro de massas (GC-EIMS). Para a derivatização do metil-éster, 2-4 mL
de metanol e 50-100 µL de CH
2
N
2
foram adicionados, e deixados por 30 minutos
à temperatura ambiente. Após os solventes serem eliminados sob N
2
, o extrato foi
dissolvido em 5 µL de hexano e 1 µL desse total foi injetado no sistema GC-MS
(PerkinElmer Elite-5MS). O programa utilizado no GC foi 100-190°C a 15°C por
minuto e, então, de 190-260°C a 5°C por minuto. A c aracterização foi realizada
por comparação de ABA autêntico comercial (Sigma Chem. Co., St Louis, MO,
USA), em que Me do ABA endógeno bacteriano foi comparado ao Me deuterado
do hormônio-padrão.
3.3.4.5. Identificação e quantificação de ABA endógeno em plantas
inoculadas
Para a quantificação em plantas de cana-de-açúcar inoculadas e
estressadas (sal e seca), aproximadamente, 100 mg de tecido foliar fresco foram
113
homogeneizados em 1 mL de metanol gelado: água: ácido acético (79:10:1; v/v)
com 100 ng de [
2
H
6
]-ABA. Após filtração e evaporação do metanol, a fase aquosa
foi purificada em coluna C18 Sep-Pack (Waters Associates, Milford-USA), lavada
com hexano e eluída com metanol: água: ácido acético (79:10:1; v/v). Após a
evaporação, a amostra foi particionada quatro vezes em acetato de etila saturada
com água (pH 3.0). Essa fração foi então evaporada e redissolvida em uma
mistura de metanol: água: ácido acético (79:20:1; v/v/v). Essa mistura foi filtrada e
submetida à purificação em HPLC, utilizando-se uma coluna de fase reversa C
18
µBonda-pack (Waters Associates, Parker Ltd., Milford-EUA). A eluição foi
realizada com o aparato KONIK 500 (Konik Instruments, Barcelona-Espanha) num
fluxo de 2 mL min
-1
, usando um gradiente de 0-10 minutos para 10% de metanol
em 1 % de ácido acético; de 10-40 minutos para 10-73% de metanol em 1% de
ácido acético; de 40-50 minutos para 73% de metanol em 1% de ácido acético; e
de 50-60 minutos para 100% de metanol. A fração de 34-40 minutos foi coletada.
Após a evaporação do solvente em um rotavapor, a amostra foi utilizada na
análise por cromatografia gasosa, acoplada a um espectro de massas (GC-
EIMS). Para a derivatização do metil-éster, 2-4 mL de metanol e 50-100 µL de
CH
2
N
2
foram adicionados, e deixados por 30 minutos à temperatura ambiente.
Após os solventes serem eliminados sob N
2
, o extrato foi dissolvido em 5 µL de
hexano e 1 µL desse total foi injetado no sistema GC-MS (PerkinElmer Elite-5MS).
O programa utilizado no GC foi 100-190°C a 15°C por minuto e, depois, 190-
260°C a 5°C por minuto. A caracterização foi realiz ada por comparação de ABA
autêntico comercial (Sigma Chem. Co., St Louis, MO, USA), em que Me do ABA
endógeno bacteriano foi comparado ao Me deuterado do hormônio-padrão. As
análises foram realizadas em duplicata.
3.3.5. RESULTADOS
3.3.5.1. Ácido abscísico é produzido pela bactéria endofítica
G.diazotrophicus
114
A biossíntese de ABA foi identificada na bactéria endofítica
Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 por meio da quantificação desse
hormônio, em GC-EIMS, em uma suspensão bacteriana crescida em meio
quimicamente definido. A figura 36 mostra o espectro de massas de Me-ABA. O
espectro confirma a produção do hormônio ácido abscísico em G. diazotrophicus,
quando comparado ao espectro-padrão de ABA autêntico, utilizado como
controle.
Figura 36 - Espectro de massas de ABA proveniente da cultura de G.
diazotrophicus PAL5 (acima) comparado ao espectro-padrão de ABA comercial
(abaixo).
Adicionalmente, a bactéria foi submetida a diferentes condições de
crescimento, mimetizando os estresses osmótico e salino (sacarose e NaCl).
Após 3 e 5 dias de crescimento nas condições citadas, foi realizada a
quantificação de ABA. Observa-se, na tabela 6, que a bactéria apresentou níveis
consideráveis do hormônio somente na presença de 10% de sacarose, quando
115
comparados aos níveis das plantas-controle (Meio LGIP). Verificou-se aumento
na biossíntese de ABA aos 3 e 5 dias, apresentando um acréscimo no teor de
ABA de três a quatro vezes, respectivamente. No mesmo tratamento, acrescido
de NaCl, também observou-se a presença de ABA, no 5º dia.
Tabela 6 - Teor de ABA, em ng mL
-1
, de G. diazotrophicus PAL5 crescida em
meio quimicamente definido (LGIP), contendo sacarose e NaCl
Tratamento 03 Dias 05 Dias
Sacarose 0,5 % 0,600 ± 0,032 0,236 ± 0,083
Sacarose 0,5 % + NaCl 0,756 ± 0,047 -
Sacarose 10 % 2,861 ± 0,521 3,623 ± 0,619
Sacarose 10 % + NaCl 0,695 ± 0,019 1,177 ± 0,532
Meio LGIP 0,839 ± 0,016 0,825 ± 0,007
3.3.5.2. O ABA bacteriano inibe a germinação de sementes de Arabidopsis
No intuito de verificar se o ABA bacteriano apresentava papel fisiológico
similar ao do ABA vegetal, no que diz respeito à inibição da germinação.
Sementes silvestres (wild-type) da cultivar Columbia e sementes de mutantes
abi1, insensíveis ao ABA, foram germinadas em meio MS líquido, contendo 2 µM
de ABA e exudado bacteriano. A figura 37 mostra que sementes silvestres
apresentaram inibição na germinação na presença de ABA. A mesma observação
pôde ser verificada nas sementes selvagens germinadas na presença do exudado
de bactéria. Em contraste, todas as sementes do mutante abi1 germinaram na
presença de ABA e do exudado bacteriano.
116
Columbia abi1
Controle
ABA 2 µM
G. diazotrophicus
Figura 37 - Germinação de sementes de Arabidopsis thaliana (Columbia e abi1)
em placas de petri contendo meio MS líquido, acrescido de ABA 2 µM e do
exudado bacteriano filtrado.
3.3.5.3. Níveis endógenos de ABA são aumentados em plantas de cana-de-
açúcar colonizadas por G. diazotrophicus
Os níveis endógenos de ABA foram quantificados em plantas de cana-de-
açúcar inoculadas e submetidas aos estresses salino e hídrico (tabela 7). Em
plantas expostas à salinidade e desidratadas, observou-se um aumento de 90 e
350%, respectivamente. Em plantas inoculadas, esse acréscimo também foi
bastante considerável, apresentando um aumento de 230%. Com relação às
plantas inoculadas e estressadas, observaram-se altos níveis endógenos de ABA,
verificando-se um acréscimo de 380% sob desidratação, e 390% sob salinidade.
117
Tabela 7 - Níveis de ABA endógeno, em ng mL
-1
, de plantas de cana-de-açúcar
inoculadas e submetidas aos estresses hídrico e salino
Tratamento Teor de ABA (ng g
-1
)
Controle 93
Desidratação 178
NaCl 415
Inoculada 215
Inoculada + Desidratação 449
Inoculada + NaCl 456
3.3.5.4. Genes responsivos a ABA apresentam expressão diferencial na
presença da bactéria
Os genes selecionados tiveram sua expressão diferencial analisada in
silico, em uma biblioteca de cDNAs de plantas de cana-de-açúcar colonizadas por
G. diazotrophicus (SUCEST). O Northern eletrônico foi realizado mediante a
análise computacional das frequências de ESTs na biblioteca de cDNA (AD1). Os
clusters SCRFLR2034A04.g, SCSBHR1052C05.g, SCEPRZ1011A11.g e
SCEQRT1027E02.g, encontrados no SUCEST, ortólogos putativos às proteínas
GPA1, PLC1, PP2C e CDPK1, respectivamente, apresentaram-se fortemente
regulados na presença da bactéria, quando comparados aos clusters das demais
bibliotecas (figura 38).
118
14,1
2,15
2
0
10,4
3,35
2
0
3,1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
AD AM FL HR LB LR RT SD ST
SCRFLR2034A04.g
25
0 0
5,05
0 0
2,5
0 0
0
5
10
15
20
25
30
AD AM FL HR LB LR RT SD ST
SCSBHR1052C05.g
10,7
0
1
0 0
3,6
0
3,1
0
0
2
4
6
8
10
12
AD AM FL HR LB LR RT SD ST
SCEPRZ1011A11.g
21,1
0 0 0 0 0
10
0
3
0
5
10
15
20
25
AD AM FL HR LB LR RT SD ST
SCEQRT1027E02.g
Relative Expression
Library
Figura 38 - Northern in silico de ESTs, correspondendo aos genes GPA1
(SCRFLR2034A04.g), PLC1 (SCSBHR1052C05.g), PP2C (SCEPRZ1011A11.g) e
CDPK1 (SCEQRT1027E02.g) de cana-de-açúcar, usando o banco de dados do
SUCEST.
3.3.6. DISCUSSÃO
Uma importante característica das bactérias endofíticas é a biossíntese de
composto análogos aos hormônios vegetais, como auxina (Fuentes-Ramirez et
al., 1993), giberelina (Bastian et al., 1998) e citocininas (Bazzicalupo e Okon,
2000). Algumas dessas bactérias também produzem a enzima 1-amino
ciclopropano-1-carboxilato (ACC) desaminase e metabolizam ACC, um precursor
do etileno (Mayak et al., 2004). A síntese desses hormônios, pelas células
bacterianas, poderia atuar na modulação dos níveis endógenos nas plantas
hospedeiras. Com o desequilíbrio desses níveis hormonais poderia haver
alterações na resposta vegetal aos diferentes estresses ou à condição ambiental
imposta.
No intuito de verificar se bactéria endofítica Gluconacetobacter
diazotrophicus PAL5 é capaz de biossintetizar o hormônio ABA, uma suspensão
119
bacteriana, crescida em meio quimicamente definido (LGIP), foi utilizada para
identificar e quantificar ABA, pelo uso de GC-EIMS.
A biossíntese de ABA foi identificada no endófito, como mostra o espectro
de massas de Me-ABA (figura 36). O espectro confirma a produção do hormônio
ácido abscísico em G. diazotrophicus, quando comparado ao espectro-padrão de
ABA autêntico, utilizado como controle.
Adicionalmente, a bactéria foi submetida a diferentes concentrações de
sacarose, na presença ou ausência de NaCl, durante 3 e 5 dias. Os dados obtidos
(tabela 6) evidenciaram que a bactéria apresentou níveis consideráveis do
hormônio somente na presença de 10% de sacarose, quando comparados com
os níveis das plantas-controle (Meio LGIP). Verificou-se aumento na biossíntese
de ABA, apresentando um acréscimo no teor de ABA de três a quatro vezes,
respectivamente. No mesmo tratamento, acrescido de NaCl, também observou-se
a presença de ABA, no quinto dia. Tal resultado indica que G. diazotrophicus
aumenta seus níveis de ABA, em resposta a um possível estresse osmótico. O
mesmo resultado é bastante caracterizado em plantas. O ABA é produzido sob
condições de desidratação e possui uma função importante em resposta ao
estresse hídrico (Shinozaki e Yamaguchi-Shinozaki, 2007; Xiong et al., 2002;
Finkelstein et al., 2002). A importância do ABA para a bactéria ainda é
desconhecida. Dessa forma, estudos posteriores seriam interessantes e
necessários, no intuito de verificar o papel desse hormônio durante o estresse
osmótico na bactéria, bem como seu envolvimento no metabolismo bacteriano.
O ABA regula vários aspectos do desenvolvimento vegetal, como
maturação de sementes, dormência, germinação, abertura estomática, adaptação
a estresses abióticos (Yoshida et al., 2006). Com o objetivo de verificar se o ABA
bacteriano apresenta o mesmo papel fisiológico na inibição da germinação,
sementes de Arabidopsis thaliana foram germinadas em um exudado filtrado,
proveniente de uma cultura de G. diazotrophicus (figura 37).
O exudado foi suficiente para inibir a germinação das sementes de plantas
silvestres. Os resultados obtidos foram confirmados quando sementes de abi1
apresentaram total germinação na presença de ABA e do exudado. Isso indica
que o ABA bacteriano apresenta função semelhante à do hormônio ABA
proveniente de plantas, no que diz respeito à inibição da germinação de
sementes.
120
Para verificar se os níveis endógenos de ABA eram aumentados em
plantas inoculadas, realizou-se a quantificação do hormônio, em plantas de cana-
de-açúcar colonizadas pela bactéria e submetidas à salinidade e à desidratação
(tabela 7).
A concentração de ABA aumentou em plantas estressadas. No entanto,
plantas associadas com a bactéria G. diazotrophicus também apresentam níveis
consideráveis do hormônio, sendo essa quantidade aumentada em plantas
inoculadas e estressadas. Cabe ressaltar que, na presença da bactéria, as
plantas expostas ao sal apresentam níveis de ABA similares aos níveis das
plantas expostas à salinidade e não-inoculadas. Porém, as plantas desidratadas
dobraram os níveis de ABA na presença da bactéria.
Muitos genes de plantas são regulados em resposta ao ABA. Para verificar
uma possível regulação de genes responsivos ao ABA, durante a colonização por
G. diazotrophicus, quatro clusters putativos ortólogos aos genes envolvidos na
resposta ao hormônio foram selecionados: GPA1 (G-protein α-subunit), receptor
envolvido no fechamento estomático mediado por ABA (Grill e Christmann, 2007);
PLC1 (phospholipase C1), descrito como um sinal secundário para potencializar a
resposta primária ao ABA (Sanchez e Chua, 2001); PP2C (protein phosphatase
2C), regulador da resposta ao ABA na germinação de sementes (Yoshida et al,
2006); e CDPK1 (proteína quinase dependente de Ca
2+
), sensores de Ca
2+
responsivos a hormônios (Mehta et al., 2007).
A análise in silico da expressão gênica pode ser feita baseada na
frequência de sequence tags em bibliotecas de cDNA, permitindo a comparação
de padrões de expressão de genes específicos (Ewing et al., 1999). Para isso, a
metodologia utilizada neste trabalho permitiu quantificar os níveis de expressão
dos genes GPA1, PLC1, PP2C e CDPK1, na biblioteca específica de plantas
inoculadas com G. diazotrophius, oriundas do Banco SUCEST. Como podem ser
visualizados, na figura 38, todos os genes analisados apresentaram indução na
biblioteca AD1, mostrando serem regulados na presença de G. diazotrophicus.
Essa alta expressão verificada em AD1 confirma a presença de ABA nas plantas
de cana-de-açúcar e sugere que a presença da bactéria estaria ocasionando
perturbações nas vias de sinalização, nas quais as proteínas analisadas
participam. Todavia, não está claro o papel do hormônio ABA durante a interação,
bem como os demais hormônios sintetizados pela bactéria também não foram
121
totalmente elucidados. Porém, os resultados dos dois primeiros trabalhos
permitem especular que esse desbalanço hormonal, ocasionado pela bactéria,
afetou a resposta de cana-de-açúcar aos estresses salino e hídrico. Nesse
contexto, verifica-se que a bactéria endofítica Gluconacetobacter diazotrophicus
PAL5 não é benéfica em algumas condições ambientais.
Nos últimos anos, algumas evidências do envolvimento de hormônios têm
sido demonstradas na interação planta-bactéria (Valls et al., 2006; Joo et al.,
2005). Em Arabidopsis, mutantes na via de biossíntese ou insensíveis ao ABA
mostraram-se mais resistentes à bactéria Pseudomonas DC3000 (de Torres-
Zabala et al., 2007), indicando que o hormônio aumenta a susceptibilidade do
vegetal durante a interação. Essa alteração poderia também estar ocorrendo em
plantas colonizadas por G. diazotrophicus. Nesse caso, a bactéria poderia
biossintetisar ABA para subverter ou reduzir a resposta da planta à colonização.
Porém, como o endófito não causa nenhum dano aparente, a colonização é bem
sucedida. Contudo, durante a interação, outros hormônios são produzidos, como
giberelinas e auxinas. Esse desequilíbrio hormonal poderia também acarretar
alterações na resposta vegetal.
Enfim, o efeito de cada hormônio ainda não foi totalmente esclarecido.
Atualmente, os estudos realizados evidenciam a participação dos mesmos na
modulação da defesa vegetal. Nesse contexto, experimentos posteriores
poderiam ser realizados para avaliar o papel desses hormônios durante a
interação.
3.3.7. CONCLUSÕES
A bactéria endofítica Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 produz ABA
in vitro, em meio de cultura quimicamente definido (LGIP).
O ABA bacteriano inibe a germinação de sementes de Arabidopsis
thaliana.
122
Os níveis endógenos de ABA são aumentados em plantas de cana-de-
açúcar colonizadas por G. diazotrophicus, sendo esses níveis ainda maiores em
plantas inoculadas e expostas à salinidade e à desidratação.
Os genes GPA1, PLC1, PP2C e CDPK1, responsivos ao ABA, são
induzidos na biblioteca de cDNA de plantas de cana-de-açúcar inoculadas com o
endófito (AD1). Os resultados sugerem a biossíntese do ABA bacteriano em
plantas colonizadas por G. diazotrophicus, bem como a regulação dos genes
citados, na presença do hormônio.
3.3.8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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127
4. RESUMOS E CONCLUSÕES
Bactérias endofíticas podem interferir na fisiologia da planta, resultando em
alterações no metabolismo vegetal. Como pode ser verificado, neste trabalho, a
bactéria endofítica Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 interfere na resposta
de plantas de cana-de-açúcar expostas aos estresses salino e hídrico. Os
parâmetros avaliados permitiram verificar que plantas colonizadas apresentam
maior susceptibilidade à salinidade e seca, sendo esta sensibilidade maior em
plantas sob desidratação. Uma possível explicação seria a de que o endófito inibe
o fechamento estomático dessas plantas colonizadas e expostas aos estresses
salino e hídrico. Tal hipótese foi sustentada pela regulação dos genes que
codificam as proteínas SAPK6 (SnRK2.4) e COI1, envolvidas no fechamento
estomático via ABA e MeJA, respectivamente. Adicionalmente, a biossíntese de
ABA foi identificada e quantificada em meio de cultura quimicamente definido
(LGIP) da bactéria endofítica G. diazotrophicus PAL5. A presença do endófito fez
com que plantas inoculadas dobrassem a concentração endógena de ABA, sendo
ainda maior em plantas colonizadas e expostas à seca.
Diante do exposto, o entendimento da fisiologia da interação planta-
endófito é imprescindível no contexto do manejo agrícola, já que, em condições
adversas, poderiam modular de forma maléfica, podendo ocasionar a redução da
produtividade, considerada indesejável. Nesse sentido, o uso indiscriminado de
endofíticos na agricultura pode vir a ser prejudicial, resultando ainda em
problemas agroeconômicos.
128
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