( PDF ) Identificação do agente etiológico da doença de Lyme-símile brasileira (Síndrome Baggio-Yoshinari)

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Elenice Mantovani

Identificação do agente etiológico da Doença de

Lyme-símile brasileira (Síndrome Baggio-Yoshinari)

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do título de

Doutor em Ciências

Programa de Ciências Médicas

Área de concentração: Processos Imunes e Infecciosos

Orientador: Prof. Dr. Natalino Hajime Yoshinari

São Paulo

2010

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Dedico este trabalho ao meu pai, que apesar de não estar mais presente

entre nós, será sempre o meu alicerce, meu motivo de orgulho e exemplo de

vida a seguir. Tenho certeza de que de onde ele estiver, estará aplaudindo

minha conquista, com o maior orgulho do mundo, como sempre fez.

À minha mãe e à minha avó por todo o amor, pela paciência e por estarem

ao meu lado em todos os momentos da minha vida.

Ao meu grande amor, Glauber, pela dedicação, paciência e carinho

prestados em período integral neste trabalho e principalmente na minha

vida, acreditando e incentivando sempre cada passo dado.

Agradecimentos

Ao meu orientador Prof. Dr. Natalino Hajime Yoshinari pela confiança,

paciência e dedicação prestadas durante todos esses anos, sendo essencial

para minha formação profissional e concretização deste trabalho.

À Profa. Dra. Eloísa Dutra de Oliveira Bonfá, Titular da Disciplina de

Reumatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo por

ter autorizado o meu ingresso na pós-graduação.

Ao Laboratório de Imunologia Celular, por ter cedido a cultura de células

HUVEC, em especial à Solange Carrasco pelos ensinamentos e amizade.

À Prof. Dra. Elvira Mª Mendes do Nascimento (Setor de Riquétsias do

Instituto Adolfo Lutz), por ter cedido a alíquota da cultura de Chlamydia

pneumoniae, a qual foi usada como controle positivo nos ensaios.

Ao Prof. Dr. Jorge Timenetsky do ICB-USP, por ter cedido a cultura de

Mycoplasma fermentans, a qual foi usada como controle positivo nos

ensaios.

Ao Laboratório de Oncologia Experimental (LIM-24) pelo sistema de

fotodocumentação utilizado durante este trabalho, e em especial às

funcionárias Fátima Solange Pasini e Flavia Regina Rotea Mangone, por

toda a paciência e ensinamentos que possibilitaram o aperfeiçoamento das

técnicas de biologia molecular.

À Embrapa Gado de Corte (MS), em especial à Dra. Grácia Maria Soares

Rosinha por ter proporcionado o estágio em biologia molecular, o qual foi de

extrema importância no desenvolvimento desta tese, não esquecendo de

agradecer a todos de sua equipe, principalmente à Dra. Renata Madureira

pelos ensinamentos e companheirismo prestados.

Ao Prof. Dr. Marcelo Bahia Labruna do Departamento de Medicina

Veterinária Preventiva e Saúde Animal (VPS) da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da USP (FMVZ-USP) por ter cedido a alíquota da

cultura de Borrelia anserina, a qual foi usada como controle positivo nos

ensaios e também pela colaboração na interpretação dos sequenciamentos.

À todas da equipe do Laboratório de Síndrome Baggio-Yoshinari, Dra.

Giancarla Gauditano pelo envio dos pacientes com suspeita de SBY para

realização da pesquisa; à Virgínia Lucia N. Bonoldi pela paciência e por

todos os ensinamentos prestados no laboratório durante todos esses anos; a

Dra. Roberta Gonçalves Marangoni pela amizade e acima de tudo pela

colaboração na fase final do projeto; à Marcela Helena Gambim pela

amizade e pela ajuda nos momentos que precisei.

À amiga Mariana Granziera Spolidorio pelos bons momentos de amizade

compartilhados ao longo destes anos e pelo apoio no decorrer deste

trabalho.

Aos amigos Mayra Fernanda Alves e Guilherme Anselmo, pela amizade e

por toda a colaboração técnica durante o período em que estiveram

presentes no laboratório.

À equipe do Laboratório de Matriz Extracelular, em especial a Dra. Walcy P.

Rosolia Teodoro por ter me incentivado nos momentos mais difíceis,

colaborando sempre que possível. A aprimoranda Natalia Cristina Borsonello

pela amizade e, principalmente por toda a ajuda prestada no período em que

esteve no laboratório.

À todas as pessoas que trabalham na Disciplina de Reumatologia da

FMUSP e que de alguma forma colaboraram para a realização deste

trabalho.

A todos os pacientes e controles que participaram deste protocolo, pois sem

eles não seria possível a realização desta pesquisa.

À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo

auxílio financeiro, concedendo-me a bolsa de doutorado direto.

Normatização adotada

Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento

desta publicação:

Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals

Editors (Vancouver)

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e

Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.

Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi,

Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso,

Valéria Vilhena. 2ª ed. São Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação;

2005.

Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals

Indexed in Index Medicus.

Sumário

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

Lista de abreviaturas

Resumo

Summary

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 1

1.1. Doença de Lyme ............................................................................... 2

1.2. Histórico da pesquisa da DL no Brasil .............................................. 3

1.3. Síndrome Baggio-Yoshinari .............................................................. 4

1.3.1. Etiologia ..................................................................................10

1.3.2. Vetores ...................................................................................10

1.3.3. Reservatórios e hospedeiros .................................................12

1.3.4. Quadro clínico ........................................................................13

1.3.5. Diagnóstico ............................................................................17

1.3.6. Tratamento .............................................................................20

2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO..................................................................23

3. OBJETIVOS ..............................................................................................27

4. MATERIAIS E MÉTODOS.........................................................................30

4.1. Casuística.................................................................................31

4.2. Coleta e armazenamento dos materiais...................................40

4.3. Microscopia de campo escuro .................................................41

4.4. Meio de cultura SP-4 ...............................................................41

4.5. Detecção de anticorpos anti Borrelia burgdorferi (WB)............43

4.6. Detecção de anticorpos anti Borrelia burgdorferi (ELISA)........43

4.7. Detecção de anticorpos anti Mycoplasma pneumoniae pelo

método de ELISA............................................................................ 44

4.8. Detecção de anticorpos anti Chlamydia spp (IFI).....................45

4.9. Cultura de células endoteliais ..................................................45

4.10. Coloração de Borrelia burgdorferi cultivadas em meios BSK e

SP-4 modificado...............................................................................46

4.11. Extração de DNA....................................................................48

4.12. PCR.........................................................................................48

4.13. Sequenciamento ....................................................................55

5. RESULTADOS..........................................................................................56

5.1. Sorologia para B. burgdorferi ...................................................57

5.2. Sorologia para Mycoplasma pneumoniae.................................58

5.3. Imunofluorescência para Chlamydia spp..................................58

5.4. Microscopia de campo escuro .................................................59

5.5. Cultura de espiroquetídeos em meio SP-4...............................60

5.6. Microscopia eletrônica .............................................................61

5.7. Coloração .................................................................................68

5.8. Biologia molecular ....................................................................71

6. DISCUSSÃO .............................................................................................77

7. CONCLUSÃO............................................................................................95

8. ANEXOS....................................................................................................97

8.1. Aprovação da CAPPesq.............................................................98

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................99

10. APÊNDICES

10.1. Comprovante de submissão do artigo para publicação

10.2. Artigo para publicação

Listas de figuras

Figura 1 -

Paciente com sorologia positiva (IgG) para Chlamydia spp.......

Figura 2 - Crescimento de estruturas sugestivas de espiroquetídeos

após inoculação de sangue de paciente com SBY em meio

SP-4............................................................................................

Figura 3 -

Estruturas que lembram Chlamydia spp, espiroquetas,

Mycoplasma spp e Archaebacteria spp, em sangue periférico

de paciente com SBY, analisado à ME......................................

Figura 4 -

Estruturas que sugerem espiroquetas e Mycoplasma spp à

ME, em sangue de paciente com SBY semeado em SP-4........

Figura 5 - Estruturas que lembram espiroquetas à ME, no sangue

periférico de paciente com SBY semeado em meio SP-4..........

Figura 6 -

Estruturas que sugerem espiroquetas e Mycoplasma spp à

ME, em sangue de paciente com SBY semeado em SP-4........

Figura 7 - Estrutura que lembra espiroqueta à ME, no sangue periférico

de paciente com SBY semeado em meio SP-4..........................

Figura 8 - Visualização de espiroquetídeo no interior de célula endotelial

à ME, após incubação com meio de cultura SP-4 contendo

espiroquetídeos em suspensão..................................................

Figura 9 -

Cultura de Borrelia burgdorferi inoculada inicialmente em meio

SP-4 por 3 dias e a seguir semeada em cultura de células

endoteliais...................................................................................

Figura 10 -

Borrelia burgdorferi foi semeada em meio BSK e a seguir

inoculada em cultura contendo células endoteliais....................

Figura 11 -

Borrelia burgdorferi mantida em cultivo no meio BSK, a seguir

inoculada em cultura de células endoteliais mantidas em meio

199..............................................................................................

Figura 12 -

Cultura de B. burgdorferi em meio BSK, corada com Acridine

orange e Azul de Evans..............................................................

Figura 13 -

Cultura de B. burgdorferi em meio SP-4, corada pelo método

de Acridine orange e Azul de Evans...........................................

Figura 14 -

Cultura de B. burgdorferi semeada em meio SP-4 e corada

pelo Panótico..............................................................................

Figura 15 - PCR realizada para identificar fragmento genético do

plasmídeo cp32-4.......................................................................

Figura 16 -

PCR para o fragmento do gene flgE...........................................

Figura 17 -

PCR para o fragmento do gene flgE...........................................

Figura 18 - Alinhamento das sequências das amostras positivas com o

gene da Borrelia burgdorferi flagellar hook protein (flgE)...........

Figura 19 -

Formação de estruturas císticas em cultura de B. burgdorferi

após exposição aos antibióticos.................................................

Figura 20 - Amostras de pacientes com SBY visualizadas à ME................. 89

Figura 21 -

Formação de ”blebs” e grânulos em cultura de B. burgdorferi

após 24 horas de incubação com ceftriaxona............................

Figura 22 -

Cultura de B. burgdorferi semeada em meio SP-4, corada pelo

Panótico......................................................................................

Figura 23 -

Microscopia eletrônica mostrando Borrelia burgdorferi

penetrando em células endoteliais.............................................

Figura 24 -

Cultura de Borrelia burgdorferi (cultivada em BSK) e inoculada

posteriormente em células endoteliais.......................................

Figura 25 -

Microscopia Eletrônica de B. burgdorferi inoculada em tecido

tonsilar........................................................................................

Lista de tabelas

Tabela 1 - Critério diagnóstico para SBY adotado pelo LIM-17 do

HCFMUSP...............................................................................

Tabela 2 - Frequência dos parâmetros maiores no grupo de 68

pacientes pertencentes ao grupo A com diagnóstico de

SBY..........................................................................................

Tabela 3 - Frequência dos parâmetros menores no grupo de 68

pacientes pertencentes ao grupo A com diagnóstico de

SBY..........................................................................................

Tabela 4 -

Aspectos epidemiológicos, clínicos e sorologia para Borrelia

burgdorferi G39/40 de origem americana nos 10 pacientes

do grupo B com SBY...............................................................

Tabela 5 - Tempo de evolução da doença desde o início da

enfermidade, tratamento com antibióticos e sorologia para

Borrelia burgdorferi nos 10 pacientes do grupo B com SBY

na época da coleta do sangue................................................

Lista de abreviaturas

ACA Acrodermatite Crônica Atrófica

Borrelia burgdorferi

BSK

Barbour-Stoenner-Kelly

CAPPesq Comissão de Ética para Análise de Projetos de

Pesquisa

CWDB

cell wall deficient bacteria

DL Doença de Lyme

DLSB Doença de Lyme-Símile Brasileira

DMARDs

Disease-modifying antirheumatic drugs

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylenediamine tetraacetic acid

ELISA

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

EM Eritema migratório

EUA Estados Unidos da América

EV Endovenosa

FAN Fator antinuclear

FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de

São Paulo

HCFMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo

IFI Imunofluorescência indireta

Ig Imunoglobulina

LCR Líquido cefalorraquidiano

LIM-17 Laboratório de Investigação Médica em

Reumatologia

ME Microscopia eletrônica

MMII Membros inferiores

MO Microscopia óptica

Osps

Outer surface proteins

PCR

Polymerase Chain Reaction

SBY Síndrome Baggio-Yoshinari

SFC Síndrome da Fadiga Crônica

SIRLS Síndrome Infecto-Reacional Lyme-símile

SP-4

Spiroplasma mirum base

SSZ sulfassalazina

STARI Southern Tick Associated Rash Illness

TAPOS Tick Associated Poly-Organic Syndrome

TNF

Tumor necrosis factor

UFRRJ Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

UNICAMP Universidade Estadual de Campinas

VO Via oral

Western Blotting

Mantovani E. Identificação do agente etiológico da Doença de Lyme-símile

brasileira (Síndrome Baggio-Yoshinari) [tese]. São Paulo: Faculdade de

Medicina, Universidade de São Paulo; 2010. 117p.

A Doença de Lyme-símile brasileira ou Síndrome Baggio-Yoshinari

(SBY) é uma zoonose emergente, transmitida por carrapatos e até o

momento, de descrição restrita ao território brasileiro. O agente etiológico da

SBY era desconhecido até o presente trabalho. O objetivo principal do

estudo foi identificar a etiologia da SBY. Selecionamos 2 grupos de

pacientes: grupo A (n=68) composto por pacientes com suspeita diagnóstica

de SBY, a maioria na fase latente da doença; grupo B (n=10), composto por

pacientes com diagnóstico de SBY, que apresentaram obrigatoriamente

eritema migratório e que encontravam-se sintomáticos no momento da

coleta. Foi utilizado também um grupo controle composto por indivíduos

saudáveis e com epidemiologia negativa (n=50). Foram coletadas amostras

de sangue, nas quais realizamos sorologias, culturas, análises

microscópicas (óptica e eletrônica) e reação de cadeia da polimerase (PCR)

para diferentes micro-organismos (Mycoplasma spp, Chlamydia spp e

Borrelia spp). Além disso, foi realizado um estudo preliminar, através da

PCR para Borrelia spp em 47 amostras de carrapatos oriundos de áreas de

risco do Espírito Santo (sendo 17 Rhipicephalus microplus e 30

Rhipicephalus sanguineus), 27 bovinos e 26 equinos, animais estes oriundos

da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Os resultados mostraram

que a SBY não se trata de uma zoonose causada por um conjunto de micro-

organismos como pensado inicialmente e sim pela Borrelia burgdorferi sensu

lato. Descoberta essa que foi possível empregando-se novos primers

amplificadores do principal gene envolvido na síntese do gancho flagelar da

Borrelia, chamado flgE. Confirmamos a positividade para flgE em 6

pacientes do grupo B, 2 carrapatos, 1 bovino e 1 equino, os quais

apresentaram homologia de 99% com o gene da proteína do gancho flagelar

da Borrelia burgdorferi (flgE) depositada no GenBank (L43849). Esta

importante descoberta, associada às pesquisas anteriores, permitiu definir a

SBY como zoonose emergente e própria do país, causada pela bactéria B.

burgdorferi na apresentação morfológica atípica, transmitida por carrapatos

não pertencentes ao complexo Ixodes ricinus, responsável por

manifestações clínicas semelhantes à Doença de Lyme, exceto pela grande

frequência de sintomas recorrentes.

Descritores: Doença de Lyme, Doença de Lyme-símile, Borrelia burgdorferi,

Spirochaetales, bactérias forma-L, Síndrome Baggio-Yoshinari, Brasil

Mantovani E. Identification of the causative agent of Brazilian Lyme disease-

like illness (Baggio-Yoshinari Syndrome) [thesis]. São Paulo: “Faculdade de

Medicina, Universidade de São Paulo”; 2010. 117p

Brazilian Lyme disease-like illness (BLDL) or Baggio-Yoshinari

Syndrome (BYS) is an emerging zoonosis, transmitted by ticks and so far,

restricted to the description of the Brazilian territory. The causative agent of

BYS was unknown until now. The main objective of this study was to identify

the etiology of BYS. We have selected two groups of patients: group A (n =

68) consisting of patients suspected of BYS, mostly in the latent stage of

disease; group B (n = 10), composed of patients diagnosed with BYS, who

had compulsorily erythema migrans and that were symptomatic at the time of

blood collection. We also used a control group composed of healthy

individuals with negative epidemiology (n = 50). Blood samples were

collected, in which we performed serology, cultures, microscopic analysis

(optical and electron) and polymerase chain reaction (PCR) for different

microorganisms (Mycoplasma spp, Chlamydia spp and Borrelia spp). In

addition, a preliminary study was conducted by PCR for Borrelia spp in 47

samples of ticks from risk areas at Espirito Santo State (being 17

Rhipicephalus microplus and 30 Rhipicephalus sanguineus), 27 cattle and 26

horses, being these animals from the Universidade Federal Rural do Rio de

Janeiro. The results showed that BYS is not a zoonosis caused by a set of

microorganisms as initially thought, but by Borrelia burgdorferi sensu lato.

These findings were possible after employing new primers that are able to

amplify portions of the main genes involved in the synthesis of the Borrelia

flagellar hook protein, called flgE. We confirmed positivity for the flgE in 6

patients from group B, 2 ticks, a cow, and a horse, which showed 99%

homology with the gene of Borrelia burgdorferi flagellar hook protein (flgE)

deposited in GenBank (L43849). This important discovery, coupled with

previous research, helped to define BYS as an emerging zoonosis particular

from Brazil, caused by B. burgdorferi of atypical morphologic presentation,

transmitted by ticks outside the Ixodes ricinus complex, responsible for

clinical signs similar to Lyme disease, except for the high frequency of

relapsing symptoms.

Descriptors: Lyme disease, Lyme disease-like, Borrelia burgdorferi,

Spirochaetales, L-form bacteria, Baggio-Yoshinari Syndrome, Brazil

1. Introdução

Introdução

1.1. DOENÇA DE LYME

A Doença de Lyme (DL) foi descoberta em 1975 na comunidade de

Old Lyme nos Estados Unidos da América (EUA), por Allen C. Steere, ao

reportar casos sugestivos de artrite idiopática juvenil, antecedidos por picada

de carrapatos e formação de lesão de pele denominada eritema migratório

(EM) (Steere et al., 1977). O agente etiológico da DL foi identificado em 1982

por Willy Burgdorfer sendo denominado Borrelia burgdorferi (Burgdorfer et

al.,1982). Contudo, convém lembrar que, pesquisadores europeus já

conheciam diferentes aspectos da enfermidade desde o início do século XX,

incluindo conhecimentos sobre o EM e a acrodermatite crônica atrófica

(ACA), assim como queixas neurológicas como a Síndrome Bannwarth

(meningopolirradiculite)

(Lipschultz, 1913; Herxheimer, 1905; Lennoff, 1949).

Define-se a DL como zoonose encontrada nos EUA e Eurásia,

transmitida por carrapatos do complexo Ixodes ricinus, causada por

espiroquetas do grupo Borrelia burgdorferi sensu lato, constituída pela B.

burgdorferi sensu stricto encontrada nos EUA e Eurásia e a B. garinii e B.

afzelii observadas na Europa, que causam inúmeras manifestações clínicas

sistêmicas. Esta diversidade etiológica é responsável pelas diferenças

clínicas e laboratoriais regionais. A B. burgdorferi sensu stricto causa em

cerca de 80% dos casos nos EUA, EM e comprometimento articular (Steere,

2001). A B. garinii tem maior tendência de causar sintomas neurológicos e a

B. afzelii é responsável pela lesão de pele conhecida como acrodermatite

crônica atrófica (ACA).

Introdução

No sul dos EUA existe uma apresentação conhecida como doença de

Masters ou STARI (Southern Tick Associated Rash Illness) (Masters et al.,

1998), caracterizada pelo desenvolvimento de “rash” semelhante ao EM, na

ausência de sintomatologia sistêmica, sendo transmitida pelo Amblyomma

americanum e causada pela B. lonestari, a qual é incultivável em meio BSK

e, recentemente tornou-se cultivável em células de carrapatos (Varela et al.,

2004).

O carrapato transmissor da DL nos EUA e Eurásia pertence ao

complexo Ixodes ricinus. Nos EUA encontra-se o I. scapularis e o I.

pacificus; na Europa o I. ricinus e na Ásia o I. persulcatus. A DL é uma

zoonose, onde os pequenos mamíferos como os roedores silvestres, assim

como os grandes vertebrados como o veado nos EUA, participam do ciclo de

transmissão da enfermidade. Larvas e ninfas de carrapatos infestam e

contraem a infecção ao se alimentarem nos pequenos roedores, enquanto

os artrópodes adultos acasalam-se nos mamíferos de grande porte. O

homem contrai a zoonose adentrando no ecossistema propício, ao ser

picado principalmente pelas ninfas dos carrapatos, que pelo seu tamanho

diminuto, nem sempre são percebidos. Este aspecto é muito importante, pois

a enfermidade só se desenvolve no homem, se o carrapato não for removido

nas primeiras 24 horas. Nos vetores existe ainda a transmissão

transovariana de espiroquetas (Spach et al., 1993; LoGiudice et al., 2003;

Mladenović et al., 2010; Hamer et al., 2010).

A DL evolui por estágios. Na fase primária, em cerca de 80% dos

casos norte-americanos, surge no local da picada, uma lesão de pele

Introdução

expansiva característica, conhecida como EM, geralmente de centro claro e

borda avermelhada, que costuma durar dias a meses. A lesão pode assumir

outros aspectos, como ser inteiramente eritematosa ou ser confluente a

partir de minúsculas lesões menores. Quando a enfermidade é restrita à pele

é chamada de localizada, e quando as borrélias disseminam no sangue,

originam manifestações clínicas flu-like, com presença de mal-estar, febre,

cefaléia, artralgia, mialgia, calafrios e adenomegalia. Neste estágio podem

surgir novas lesões de pele menos expansivas chamadas de anulares

secundárias (Steere et al., 1980; Steere, 2001).

Nos pacientes não tratados na fase aguda, surge o estágio

secundário da DL, semanas ou meses do contágio inicial, com envolvimento

articular, neurológico ou cardíaco. Em relação ao aparelho locomotor, a

artrite ocorre em cerca de 60% dos pacientes norte-americanos, geralmente

de grandes articulações, em especial, com envolvimento do joelho. Os

surtos de artrite podem ser recorrentes e durar semanas a meses. A biópsia

da sinóvia e os achados do líquido sinovial são semelhantes aos observados

na artrite reumatóide. Cerca de 10% dos pacientes com artrite de Lyme

evoluem para artrite crônica com formação de cistos e erosões ósseas

(Steere et al., 1988; Steere, 2001).

Sintomas neurológicos secundários da DL ocorrem em cerca de

15% dos casos nos EUA, e incluem sintomas da tríade: meningite, neurite

craniana e radiculite periférica. A meningite é de padrão linfomonocitária com

discreta proteinorraquia. Os sintomas são frustros e frequentemente

diagnosticados apenas após punção e análise laboratorial do líquido

Introdução

cefalorraquidiano. Qualquer nervo craniano pode ser envolvido, mas o facial

é o mais frequente, e quando de ocorrência bilateral é altamente sugestivo

de DL. A neuropatia periférica pode ser sensitiva e/ou motora, e outras

manifestações neurológicas podem ser reconhecidas na DL como a

Síndrome de Guillain-Barré e encefalites (Oschmann et al., 1998; Steere,

2001).

Queixas cardíacas são raras, presentes em cerca de 8% dos

pacientes com DL e manifestam-se na forma de arritmias ou miocardites. As

arritmias, mesmo na forma de bloqueio átrio-ventricular completo não

necessitam de marca-passo e regridem com tratamento clínico. A miocardite

pode ser grave se houver invasão tecidual por espiroquetas (Steere, 1989;

Steere, 2001).

A DL crônica decorre dos surtos recorrentes de artrite ou são

complicações tardias da borreliose não tratada precocemente. Assim na

neuroborreliose crônica descrevem-se as síndromes desmielinizantes,

encefalopatias e ataxias. Na Europa existe a acrodermatite crônica atrófica

(ACA), que é lesão de pele atrófica semelhante à esclerodermia e causada

pela B. afzelii, e há exemplos de recuperação de borrélias a partir da pele

em lesões com duração de muitos anos (Logigian et al., 1990; Strle et al.,

1999; Steere, 2001).

A síndrome pós-DL ou TAPOS (Tick Associated Poly-Organic

Syndrome) é uma entidade clínica observada nos EUA, bastante controversa

e indefinida, que surge nos pacientes com DL tratados com antibióticos.

Caracteriza-se pelo desenvolvimento de sintomas persistentes, com duração

Introdução

superior a 6 meses, como mialgia, artralgia, dor radicular, disestesias,

sintomas neurocognitivos e intensa fadiga (Asch et al., 1994; Clarissou et al.,

2009).

O diagnóstico da DL no Hemisfério Norte baseia-se na presença de

sintomas clínicos, como o EM ou queixas sistêmicas articulares,

neurológicas ou cardíacas, associado à sorologia positiva para B.

burgdorferi. Nas áreas de risco, a simples constatação do EM é diagnóstico.

O ensaio imunoenzimático (ELISA) é a prova laboratorial de triagem e na

dúvida realiza-se o Western blotting (WB). O WB para ser considerado

positivo para anticorpos das classes IgG ou IgM, necessita mostrar

determinado padrão de reatividade, tanto numérica como qualitativa, em

relação às bandas protéicas das borrélias expressas no immunoblotting. A

PCR é raramente utilizada na prática clínica, pois além de dispendioso,

necessita que existam borrélias circulantes ou em tecidos (Grodzicki e

Steere, 1988; Mandell et al., 1989; Dressler et al.,1993; Magnarelli, 1995).

O tratamento da DL baseia-se no emprego de antibióticos. Na fase

aguda, as drogas indicadas são a doxiciclina na dose de 100 mg duas vezes

ao dia ou amoxicilina 500 mg 6/6 h ou azitromicina 500 mg/dia pelo período

de 3 semanas. Pacientes com envolvimento neurológico podem receber

ceftriaxone 2g/EV/dia pelo período de 3 semanas.

No Hemisfério Norte não é aceito a persistência de espiroquetas no

hospedeiro após uso adequado de antibióticos (Feder et al., 2007). Assim

não se admite a hipótese de recorrência clínica e novo tratamento com

antibióticos, com exceção de recidivas articulares que são interpretadas

Introdução

como manifestações de autoimunidade (Steere et al., 2001). Neste sentido,

a denominação DL crônica é empregada para designar casos clínicos de

diagnóstico tardio, que não foram tratados precocemente com antibióticos.

1.2. HISTÓRICO DA PESQUISA DA DL NO BRASIL

A pesquisa da DL no Brasil teve inicio em 1989 (Yoshinari et al., 1989)

e após intensa divulgação do tema à classe médica brasileira, foram

identificados os primeiros casos da enfermidade em 1992 na cidade de

Itapevi, Estado de São Paulo (Yoshinari et al., 1992).

À medida que novos pacientes foram descobertos, verificaram-se

grandes diferenças entre a DL descrita no Hemisfério Norte e no Brasil

(Yoshinari et al., 1995; Yoshinari et al., 1997a; Yoshinari et al., 1999a; Costa

et al., 2001; Yoshinari et al., 1999b). Do ponto de vista epidemiológico, não

se identificavam carrapatos do complexo Ixodes ricinus hematófago para o

homem nas áreas de risco, considerados vetores transmissores

preferenciais da DL (Barros-Battesti et al., 2000). Clinicamente, apesar da

ocorrência do clássico EM e das complicações sistêmicas habituais

encontradas na DL, a enfermidade brasileira cursava com recorrências,

especialmente se o tratamento com antibióticos demorasse mais que três

meses do início da infecção. Laboratorialmente, em nenhum momento foram

isoladas bactérias do complexo B. burgdorferi sensu lato nos fluidos

biológicos e em tecidos. A pesquisa de anticorpos contra B. burgdorferi de

Introdução

origem americana ou europeia (Pirana et al., 2000), embora relevante para o

diagnóstico, revelava títulos baixos e oscilantes, desaparecendo

rapidamente no sangue ou líquido cefalorraquidiano. Os doentes no Brasil,

também exibiam alta frequência de autoanticorpos dirigidos contra diferentes

constituintes celulares (Gauditano et al., 2000).

Assim, a enfermidade identificada no país, passou a receber inúmeras

denominações como DL-símile, Síndrome Infecto-Reacional Lyme símile

(SIRLS) (Mantovani et al., 2007a) ou Doença de Lyme símile Brasileira, com

intuito de diferenciá-la da clássica DL.

O grande desafio na pesquisa da SIRLS era a identificação do agente

etiológico. Ao contrário do observado nos EUA e Eurásia, a espiroqueta

brasileira jamais fora cultivada em meio BSK, mesmo que após inúmeras

modificações, a partir do sangue, líquido cefalorraquidiano ou amostras de

pele (EM) (Costa et al., 2002; Mantovani et al., 2007a; Yoshinari et al., 2009)

e nem tampouco a partir de carrapatos e do sangue de animais silvestres

coletados em áreas de risco (Barros-Battesti et al., 2000; Abel et al., 2000).

Curiosamente, quando se analisava o sangue periférico de pacientes

com SIRLS, assim como materiais biológicos provenientes de carrapatos e

animais silvestres, identificavam-se estruturas pouco móveis com

semelhanças às espiroquetas (espiroquetídeos), que não se desenvolviam

em meio BSK, mas que cresciam temporariamente em meio chamado SP-4,

ideal para o desenvolvimento de Spiroplasma spp, gênero de Mycoplasma

que compõe o grupo dos Mollicutes, que são bactérias desprovidas de

parede celular e tem membrana rica em colesterol.

Introdução

No intuito de pesquisar estes espiroquetídeos, realizou-se

microscopia eletrônica (ME) em pequeno número de amostras de pacientes

com SIRLS, que exibiam estes espiroquetídeos. De forma surpreendente,

identificaram-se micro-organismos com estruturas morfológicas semelhantes

à Mycoplasma spp, Chlamydia spp e espiroquetídeos sem flagelos

(Mantovani et al., 2007a). Neste momento, aventou-se a hipótese da SIRLS

ser causada por uma plêiade de micro-organismos de comportamento

latente, e a hipótese de tratar-se de borreliose ficou enfraquecida.

Aos poucos, nasceu a concepção da existência de uma nova zoonose

brasileira, que imitava a DL, causada por agente etiológico ainda indefinido,

que reproduzia a maioria das alterações clínicas encontradas na DL.

Contudo, haviam inúmeras particularidades observadas na SIRLS, como a

impossibilidade de cultivo do agente etiológico em meio BSK; ausência de

isolamento de espiroquetas na morfologia espiralada helicoidal típica; a

baixa resposta imunológica contra a B. burgdorferi e grande ocorrência de

recorrências clínicas e de distúrbios imunoalérgicos.

O conjunto das informações altamente inusitadas e complexas de

serem interpretadas, observadas apenas no território brasileiro e, portanto,

difícil de serem transmitidas à classe médica do país, trouxe grande

preocupação aos pesquisadores do LIM-17 do HCFMUSP. Decidiu-se que,

seria necessário negar a existência da clássica DL no país, e propor a

existência de uma zoonose inédita e emergente transmitida por carrapatos,

chamada de Síndrome Baggio-Yoshinari (SBY). Este procedimento

justificou-se pela existência de inúmeras diferenças nos aspectos

Introdução

epidemiológicos, etiológicos, clínicos, laboratoriais e terapêuticos, em

relação à DL clássica.

1.3. SÍNDROME BAGGIO-YOSHINARI

1.3.1. Etiologia

A definição inicial da SBY (Gauditano et al. 2005) foi a de ser uma

enfermidade de origem infecciosa, transmitida por carrapatos não

pertencentes ao complexo I. ricinus, causada por micro-organismo(s)

aparentemente de comportamento latente, ainda não identificado(s),

possivelmente espiroquetas, que causava o EM e complicações clínicas

sistêmicas semelhantes às observadas na DL, exceto pela grande

frequência de recorrências e de desordens imunológicas, ao longo da

prolongada evolução clínica.

Contudo, para a completa caracterização da SBY, faltava identificar o

agente etiológico. Não bastava dizer que havia uma plêiade de micro-

organismos que simulavam Mycoplasma spp, Chlamydia spp e

espiroquetídeos. Intrigava o fato dos pacientes com SBY, apesar das

divergências citadas, reproduzirem a totalidade dos achados clínicos e

laboratoriais da DL.

1.3.2. Vetores

Introdução

Pesquisas de campo realizadas em localidades onde houve casos de

SBY mostraram a ocorrência de carrapatos pertencentes às espécies

Amblyomma cajennense e Ixodes loricatus (Barros-Battesti et al., 2000).

O gênero Amblyomma é o mais comum capaz de picar humanos no

Brasil, mas outras espécies de carrapatos podem também desempenhar um

papel relevante na ecologia e epidemiologia da SBY no Brasil. Acredita-se

que o A. cajennense participe do ciclo epidemiológico da SBY, pois já houve

relato de enfermidade que aconteceu após picada acidental por esta espécie

de carrapato (Yoshinari NH - comunicação pessoal).

Outros carrapatos podem ser vetores da SBY. Neste contexto, o

carrapato mais comum no gado é o Rhipicephalus (Boophilus) microplus, um

carrapato comum no Brasil que se alimenta predominantemente em

hospedeiros não-humanos, podendo participar potencialmente do ciclo

epidemiológico (bactérias / vetor / hospedeiro), mantendo os agentes

infecciosos na natureza. Muitos agentes bacterianos foram detectados em R.

microplus, incluindo Anaplasma marginale, Ehrlichia spp., Coxiella burnetti e

B. theileri (agente etiológico da borreliose bovina) (Yparraguirre et al., 2007).

Além disso, os carrapatos da espécie R. microplus foram igualmente

sugeridos como vetores da SBY, pois foi observada coexistência de

anticorpos para B. burgdorferi e Babesia bovis em doentes com SBY, sendo

este carrapato o agente responsável pela transmissão da babesiose em

bovinos (Yoshinari et al., 2003).

Salienta-se que, no Brasil, nas áreas geográficas estudadas não se

encontrou histórico de picadas em humanos por carrapatos do complexo I.

Introdução

ricinus, vetores essenciais na transmissão da DL clássica nos EUA e Eurásia

(Guglielmone et al., 2006).

1.3.3. Reservatórios e hospedeiros

Pesquisas de campo em áreas de ocorrência da SBY mostraram a

presença de roedores silvestres e marsupiais, considerados como potenciais

animais reservatórios no Brasil, pois muitas vezes, visualizaram-se

espiroquetídeos, que igualmente não se desenvolveram em meios de

culturas BSK, e não foram identificados pela PCR, a exemplo do que ocorre

em carrapatos e doentes com SBY (Costa et al., 2002; Abel et al., 2000).

Várias espécies de carrapatos podem coabitar no mesmo hospedeiro.

Cães que entram na mata ou que compartilham seu ambiente com a fauna

silvestre (Szabó et al., 2001), podem apresentar infestações mistas, por

exemplo, A. cajennense, A. ovale e R. sanguineus. Da mesma forma,

pequenos mamíferos silvestres que vivem próximos aos domicílios também

podem apresentar dupla infestação. As capivaras e os gambás apresentam

uma grande infestação por carrapatos do gênero Amblyomma (Perez et al.,

2008).

Particularmente no Estado de Espírito Santo, existe uma importante

associação entre a ocorrência de casos de SBY e a presença de capivaras,

sugerindo que carrapatos que parasitam estes roedores, possam participar

no ciclo epidemiológico da SBY. Igualmente importante é o surgimento de

Introdução

sintomas clínicos da SBY após contato com animais domésticos como

cavalos, cachorros e bovinos (Spolidorio, 2009).

1.3.4. Quadro clínico

No Brasil, os pacientes são diagnosticados no seu estágio inicial ou

latente (recorrência). Na fase aguda, definida arbitrariamente como

enfermidade com menos de 3 meses de evolução após picada por

carrapatos, nota-se que em cerca de 50% surge lesão macular ou papular,

de crescimento centrífugo, de bordas eritematosas e centro mais claro,

chamada de eritema migratório (Yoshinari et al., 1997a; Costa et al., 2001).

Outras vezes, a lesão é homogeneamente avermelhada, e noutras

situações, surge pelo coalescimento de múltiplas e minúsculas lesões

puntiformes.

O período de incubação entre a picada e o desenvolvimento da lesão

pode variar de 3 dias a semanas, sendo a média de 10 dias (Yoshinari et al.,

1992; Yoshinari et al., 1997a; Costa et al., 2001). A lesão de pele costuma

durar em média 30 dias, havendo casos em que o EM persiste por vários

meses. Na fase de disseminação dos micro-organismos, ocorre surgimento

de febre e outros sintomas flu-like. Neste estágio, podem aparecer novas

lesões de pele, múltiplas e menos expansivas que a inicial, chamadas de

anulares secundárias.

Introdução

A fase de latência ou recorrência acontece quando não houve

diagnóstico na fase aguda ou quando o tratamento convencional com

antibióticos foi inadequado ou ineficiente, originando complicações

secundárias cutâneas, neurológicas, articulares e cardíacas. O período

entre a contaminação e o início das complicações sistêmicas é variável,

oscilando de semanas a anos. No Brasil, as complicações articulares e

neurológicas ocorrem em aproximadamente 35% dos casos e as cardíacas

em 5% (Yoshinari et al., 1992; Yoshinari et al., 1997a; Yoshinari et al.,

1999b). A artrite inicial é geralmente de padrão oligoarticular de grandes

articulações, especialmente de joelhos. O surto inflamatório dura de

semanas a meses, a biópsia da sinóvia revela inflamação inespecífica e o

fluido sinovial exibe padrão inflamatório com elevado número de leucócitos

(Yoshinari et al., 1995). Surtos iniciais de artrite tendem a regredir

espontaneamente, mas nas fases de recidivas, existe a tendência ao

desenvolvimento de poliartrite de caráter aditivo, com envolvimento de

pequenas e grandes articulações, sem períodos de melhora, lembrando

manifestações articulares da artrite reumatóide.

O quadro neurológico da SBY, a exemplo da DL, é caracterizado pela

tríade: meningite linfomonocitária, neurite craniana e radiculopatia periférica,

havendo descrição de casos de encefalite e/ou encefalomielite e distúrbios

psiquiátricos (Shinjo et al., 2009).

A manifestação característica do envolvimento cardíaco é a arritmia,

que pode durar meses, e costuma não necessitar de implantação de marca-

Introdução

passo (Yoshinari et al., 1997b; Yoshinari et al., 1999a; Yoshinari et al.,

1999b).

Aspecto clínico distintivo da SBY é a alta frequência de recidivas, que

ocorre em cerca de 75% dos casos, especialmente quando os doentes não

são diagnosticados e tratados precocemente na fase aguda (Yoshinari et al.,

1995; Shinjo et al., 2009). Importante salientar que, episódios de

recorrências geralmente não são diagnosticados pelos médicos, pois os

dados epidemiológicos ocorridos no passado, não são inquiridos ou

associados com sintomas atuais. Ademais, manifestações cutâneas e

sintomas flu-like tendem a desaparecer ao longo da prolongada evolução

clínica, dificultando ainda mais o diagnóstico dos casos de evolução

prolongada (Shinjo et al., 2009). Apesar das dificuldades, o médico frente a

um paciente suspeito de SBY em fase latente, deve estar atento e interrogar

sobre acontecimentos ocorridos há anos ou décadas como: histórico prévio

de picada por carrapatos, convivência anterior nas matas com animais

silvestres e episódios pregressos de febre sem etiologia definida, lesões de

pele (EM, lesão anular secundária), artrite, meningite, neuropatias cranianas

ou periféricas, uveíte, distúrbios psiquiátricos etc.

Descreve-se a seguir, as principais manifestações clínicas observadas

na SBY:

1- Cutâneas: eritema migratório, eritema anular secundário, linfocitoma

benigno (Yoshinari et al., 2007), acrodermatite crônica atrófica

(Mantovani et al., 2007a), paniculite (Mantovani et al., 2007a) e lesões

Introdução

de pele semelhantes à esclerodermia no local inicial da picada

(Fonseca et al., 2005).

2- Ósteo-musculares: artrite, artralgia, miosite, Síndrome da Fadiga

Crônica (SFC). Esta Síndrome é definida como cansaço físico ou

mental com duração superior a 6 meses que não melhora com

repouso, e é exacerbado por atividades físicas. Define-se SFC na

presença de 4 dos seguintes sintomas: fadiga prolongada, cefaléia,

mialgia, diminuição de memória ou concentração, artralgia, dor de

garganta, adenomegalia cervical e distúrbio do sono.

3- Neurológicas: meningite linfomonocitária; neurite de nervos cranianos

(paralisia facial, diplopia, surdez, disfagia, dislalia, nevralgia do

trigêmeo); radiculopatias periféricas sensitivo-motoras; síndrome de

Guillain-Barré; mononeurite multiplex, convulsões, encefalomielite,

encefalopatia, disfunção esfincteriana (Shinjo et al., 2009).

4- Distúrbios cardíacos como arritmias e insuficiência cardíaca por

cardiomegalia (Yoshinari et al., 1997b; Yoshinari et al., 1999a;

Yoshinari et al., 1999b).

5- Distúrbios psiquiátricos como depressão grave, tentativas de suicídio,

síndrome do pânico, transtorno bipolar, esquizofrenia (Shinjo et al.,

2009).

6- Distúrbios de adequação social como fuga de escolas, busca de

isolamento, abandono de empregos (Shinjo et al., 2009).

7- Distúrbios oculares intrínsecos como uveíte, corioretinite e arterite

retiniana (Sato et al., 2003).

Introdução

8- Distúrbios do cognitivo que incluem diminuição de memória,

dificuldade de expressão, distúrbios do sono, dificuldades de

concentração, memorização ou raciocínio (Shinjo et al., 2009).

Disfunções imunoalérgicas como maior sensibilidade a drogas e

alimentos, urticárias e sintomas graves como edema angioneurótico

adquirido (Yoshinari et al., 1995).

1.3.5. Diagnóstico

O diagnóstico da SBY é difícil, especialmente na fase latente e o LIM-

17 do HCFMUSP preconiza um guia diagnóstico baseado na presença de

parâmetros maiores e menores (Tabela 1) (Mantovani et al., 2007a).

Tabela 1 - Critério diagnóstico para SBY adotado pelo LIM-17 do HCFMUSP

PARÂMETROS MAIORES PARÂMETROS MENORES

▪ Epidemiologia compatível quando do início da infecção: picada,

visita às áreas de risco, visualização de carrapatos no ambiente

ou animais, animais doentes no local.

▪ Episódios de recorrência

▪ Sorologia positiva para Borrelia burgdorferi (ELISA ou WB) nos

padrões adotados no LIM-17 do HCFMUSP

▪ Visualização de "espiroquetídeos"

à MO

▪ Clínica pertinente: EM ou complicação sistêmica (articular,

neurológica, cardíaca ou ocular)

▪ Síndrome da Fadiga crônica

FONTE: Mantovani et al., 2007a

NOTA: Considera-se caso positivo na presença de três critérios maiores ou dois maiores e dois menores

simultaneamente.

Introdução

Os dados laboratoriais devem ser interpretados com cuidado. Exames

que indicam atividade inflamatória aguda como a velocidade de

hemossedimentação, proteína C reativa e mucoproteínas podem estar

negativos, mesmo na vigência de processos inflamatórios como artrite,

meningite ou neurite (Yoshinari et al., 1995). Esta dissociação clínico-

laboratorial é um aspecto importante da SBY, e mostra indiretamente, o

quanto os micro-organismos estão adaptados ao hospedeiro. Enfermos com

anemia, leucopenia, elevação de transaminases ou bilirrubinas podem ter

coinfecções com outras zoonoses transmitidas por carrapatos como a

babesiose e a ehrlichiose. Doentes que desenvolvem torpor, confusão

mental ou coma, na vigência de exantema cutâneo, devem ser pesquisados

para rickettsioses, como a febre maculosa brasileira ou novas rickettsioses

ditas brandas, causadas por Rickettsia parkeri, R. amblyommii, R. felis, R.

bellii, R. rhipicephali.

O procedimento sorológico para demonstrar anticorpos anti B.

burgdorferi foi modificado no LIM-17 do HCFMUSP (Costa, 1998; Barros,

2000), e o médico deve estar atento ao fato de que os títulos dos ensaios no

país são baixos e flutuantes, com riscos de se encontrar casos falsos

positivos e negativos. Na falta do isolamento do agente brasileiro, emprega-

se a B. burgdorferi cepa G39/40 de origem americana nos ensaios

sorológicos (ELISA e WB). Dentre as enfermidades que cursam com

sorologia falso-positiva temos a sífilis; leishmaniose visceral; doenças auto-

imunes como lúpus eritematoso sistêmico, esclerodermia, artrite reumatóide;

infecções virais; rickettsioses agudas; neuropatias crônicas (Yoshinari et al.,

Introdução

1999b; Yoshinari et al., 1997b). Doentes com SBY desenvolvem sorologia

positiva (ELISA ou WB) para B. burgdorferi em aproximadamente 65% dos

casos, enquanto nos indivíduos normais, a frequência de positividade é de

aproximadamente 16% (Mantovani et al., 2007b). Na fase aguda da zoonose

ocorre predomínio de anticorpos da classe IgM e na convalescência de IgG,

mas esta distinção tende a desaparecer nos surtos de recorrências

(Yoshinari et al., 1995). As pequenas oscilações de títulos ou de resultados

não indicam que houve modificações na evolução clínica. Vale ressaltar que

a interpretação dos resultados de sorologias realizadas com metodologias

adaptadas ao nosso meio é diferente das realizadas nos EUA e Eurásia.

O ELISA é realizado com antígeno sonicado total de B. burgdorferi

cepa G39/40 de origem americana e segue metodologia adotada nos EUA.

Em contrapartida, a interpretação do WB no Brasil é diferente da

preconizada no Hemisfério Norte, pois valoriza-se a quantidade de bandas

presentes e não a ocorrência de bandas específicas, como é preconizada

nos outros continentes. A pesquisa de anticorpos anti B. burgdorferi (ELISA)

no líquido cefalorraquidiano (LCR) pode ser útil quando houver suspeita de

acometimento neurológico na SBY, mas tem as mesmas restrições do

estudo sorológico. Em geral, indivíduos normais não apresentam anticorpos

anti Borrelia no LCR, mas o teste ELISA pode ser positivo em inúmeras

enfermidades infecciosas ou autoimunes (Yoshinari et al., 1995).

Pesquisas recentes realizadas no LIM-17 do HCFMUSP indicam que

pacientes com SBY desenvolvem autoanticorpos ao longo da prolongada

evolução clínica (Yoshinari et al., 1995; Gauditano et al., 2000). Outros

Introdução

dados ainda não publicados indicam que cerca de 50% dos pacientes com

SBY apresentam autoanticorpos contra extrato de membrana de neurônios

humanos, confirmando estudos anteriores, que já haviam revelado

existência de anticorpos contra proteína de núcleo caudado de coelhos em

doentes com SBY (Gauditano et al., 2000). Outras desordens imunológicas

também foram descritas no Brasil, como surgimento dos anticorpos contra

fator antinuclear (FAN) e anticardiolipina, hipergamaglobulinemia e elevação

de IgE (Yoshinari et al., 1995).

1.3.6. Tratamento

O tratamento depende do estágio da SBY, aspecto nem sempre fácil

de ser definido, exceto quando defrontamos com paciente com histórico

agudo, que desenvolveu EM após picada por carrapato e que frequentou

área de risco recentemente. Em geral, os doentes procuram o médico na

vigência de complicações tardias, e nestas condições, como foi salientado

anteriormente, o diagnóstico e tratamento são extremamente complexos.

A infecção primária da SBY é tratada com doxiciclina 100 mg duas

vezes ao dia pelo prazo mínimo de 30 dias. Crianças podem receber

amoxilina ou azitromicina pelo mesmo período. Surtos recorrentes iniciais

podem ser medicados com os mesmos antibióticos pelo período prolongado

de três meses, mas os resultados da terapêutica são inconstantes

(Mantovani et al., 2007).

Introdução

Na presença de complicações neurológicas como meningite,

encefalite, neurite, ou na vigência de artrite recorrente, pode-se empregar

ceftriaxona 2g/EV/dia por 30 dias, seguido de dois meses adicionais de

doxiciclina 100 mg duas vezes ao dia. Nesta fase costuma-se associar

hidroxicloroquina na dose de 400 mg/dia por tempo prolongado, embora não

esteja totalmente demonstrado, se esta opção terapêutica seria mais

eficiente, que o uso isolado da doxiciclina pelo período de três meses.

Sintomas como fadiga crônica e distúrbios de cognição respondem pouco ao

uso de antibióticos e costumam merecer outras formas de abordagem

terapêutica (Mantovani et al., 2007; Shinjo et al., 2009).

Não existe um consenso sobre o tratamento da SBY de evolução

clínica prolongada com episódios de recidivas. Há casos de boa resposta

aos antibióticos, assim como os não responsivos. No Serviço de

Reumatologia do HCFMUSP, os doentes com envolvimento articular

prolongado, no estágio poliarticular e recorrente, recebem o mesmo

tratamento preconizado aos pacientes com artrite reumatóide, ou seja, são

tratados com anti-inflamatórios e drogas modificadoras da evolução da artrite

reumatóide (DMARDs). Recomenda-se prudência no emprego de terapia

biológica com anti TNF, pois houve caso de agravamento da SBY quando se

empregou esta modalidade de tratamento em paciente com artrite recorrente

sem resposta ao uso de outros DMARDS (Yoshinari NH - comunicação

pessoal).

Novas pesquisas estão em desenvolvimento no LIM-17 do HCFMUSP

como a de entender o papel dos autoanticorpos na patogênese da SBY.

Introdução

Existe a busca de novos marcadores sorológicos que permitam distinguir

neuropatia ou artrite crônica da SBY das demais afecções consideradas

específicas como a esclerose múltipla, artrite reumatóide ou

espondiloartrites. Com frequência, o médico frente ao paciente com SBY

recorrente, fica indeciso em saber o momento exato de parar de insistir com

antibióticos e buscar novas alternativas terapêuticas.

Em resumo, com exceção das apresentações iniciais da SBY, que

costumam responder bem aos antibióticos, não há um consenso sobre o

tratamento das formas latentes e recorrentes da SBY. Convém salientar que,

mesmo no Hemisfério Norte não há unanimidade de opinião sobre diferentes

aspectos da DL, incluindo o modo de tratamento dos pacientes com TAPOS

(Tick Associated Poly-Organic Syndrome) e DL crônica (Clarissou et al.,

2009).

2. Justificativa do estudo

Justificativa do estudo

O maior desafio no conhecimento da SBY refere-se à identificação do

agente etiológico, o qual é incultivável no Brasil. Mantovani et al. (2007)

haviam descrito a presença de micro-organismos latentes com morfologias

de Mycoplasma spp, Chlamydia spp e espiroquetas sem flagelos observados

na microscopia eletrônica em pequena amostra de pacientes. Na época

desta descoberta, acreditava-se que estes micro-organismos de

comportamento latente fossem os agentes etiológicos da SBY.

Contudo, a existência de enormes semelhanças entre a DL e a SBY

continuava a intrigar pesquisadores do LIM-17 do HCFMUSP, pois a

hipótese desta nova zoonose ainda ser uma borreliose, não estava

totalmente afastada. A equipe estava convencida que novas pesquisas

deveriam enveredar para o caminho da biologia molecular, pois o agente

etiológico era incultivável no país. Assim, pensou-se no estudo de novos

genes bacterianos, potencialmente preservados e essenciais às funções de

infectividade e sobrevivência deste(s) micro-organismo(s) em hospedeiros

vertebrados e invertebrados.

No caso da espiroqueta B. burgdorferi, sabemos que seu genoma é

composto por um cromossomo linear e mais de 20 plasmídeos entre lineares

e circulares. (Wang et al., 1999). Ainda é desconhecido o porquê desta

segmentação genômica, mas os plasmídeos são essenciais na produção de

diferentes proteínas da Borrelia, como as enzimas que lhes permitem

sobreviver às diferentes condições adversas “in vivo” (Stewart

et al., 2005),

desempenhando funções na resistência a antibióticos, infectividade etc.

Justificativa do estudo

Purser e Norris (2000) tentaram identificar plasmídeos associados à

infectividade em B. burgdorferi cepa B31 usando painel de 19 isolados

clonais. O plasmídeo lp25 exibiu uma correlação direta com a virulência e

estava presente em todos os clones com níveis altos e intermediários de

infectividade e ausente nos clones de baixa infectividade. Verificaram que o

lp 28-1 também estava relacionado com virulência.

Os genes do complexo cp32 estão preservados na maioria das cepas

de B. burgdorferi e caracterizam-se também por estarem presentes na febre

recorrente causada pela espiroqueta B. hermsii, sugerindo que podem ser

essenciais para a sobrevivência das borrelias (Stewart

et al., 2005). Além

disso, plasmídeos não são facilmente perdidos, durante o deslocamento

bacteriano do seu ambiente natural (reservatório ou carrapato) para os seres

humanos (Iyer et al., 2003).

Ao longo das pesquisas, outro fato chamou a nossa atenção. Foi a

presença da banda de 41Kda no WB de pacientes com SBY, indicativo de

presença de anticorpos contra aparelho flagelar bacteriano, a despeito de

pesquisas prévias sugerirem inexistência de espiroquetas flageladas no

país.

Contudo, recentes publicações demonstraram que a estrutura do

flagelo periplasmático é composta de um corpo basal, um gancho e um

filamento contendo uma proteína flagelar (flagelina) maior (FlaB) e uma

menor (FlaA) (Barbour e Hayes, 1986; Ge et al., 1998). A síntese do flagelo

é regulada por uma cascata de eventos, envolvendo a expressão de vários

genes (Aldridge e Hughes, 2002; Sal et al.,2008).

Justificativa do estudo

Assim, na tentativa de elucidar as diferentes dúvidas surgidas,

propomos a realização da pesquisa com os seguintes objetivos:

3. Objetivos

Objetivos

1- Pesquisar se ocorre infecção por Mycoplasma spp, Chlamydia spp e

Borrelia spp em grupo de pacientes com SBY externos ao complexo

HCFMUSP (grupo A; N=68), através de procedimentos sorológicos e

moleculares (PCR).

2- Analisar novas amostras de sangue periférico de pacientes com SBY

à microscopia eletrônica, no intuito de confirmar a presença de micro-

organismos de morfologia latente, que lembram Mycoplasma spp,

Chlamydia spp e bacteroides sem flagelos.

3- Estudar aspectos do comportamento microbiológico dos agentes

etiológicos da DL e SBY, como capacidade de crescimento dos micro-

organismos aos diferentes meios de cultivos, adequados ou

impróprios, analisando-se modificações morfológicas e as

características tintoriais dos micro-organismos. Bactérias visualizadas

em pacientes com SBY serão também inoculadas em culturas de

células endoteliais, para testar o potencial infectante destas

estruturas.

4- Insistir na identificação do agente etiológico da SBY, com emprego de

novos primers, provenientes de genes potencialmente preservados

entre as diferentes cepas de borrelias. Neste estudo abordou-se dois

grupos de pacientes com SBY: grupo A (N=68) composto por

pacientes externos ao complexo HC e grupo B (N=8) formado por

Objetivos

doentes com eritema migratório e dados epidemiológicos recentes.

5- Testar se possível e de forma preliminar, primers efetivos no

reconhecimento do agente etiológico da SBY, em amostras de

carrapatos e sangue de animais domésticos, oriundos de áreas de

risco.

4. Materiais e Métodos

Materiais e Métodos

4.1. Casuística

4.1.1. Grupo A

Foram selecionados 68 pacientes com SBY (sendo 19 agudos e 49

latentes), que preencheram o critério diagnóstico adotado no LIM-17 do

HCFMUSP (Tabelas 2 e 3), entre os pacientes externos ao complexo

Hospital das Clínicas, encaminhados no período compreendido entre maio

de 2005 a janeiro de 2007, para a realização de sorologias para

B.burgdorferi. Nesta casuística, 23 pacientes eram do sexo masculino

(33,8%) e 45 do sexo feminino (66,2%), com idades que variaram de 08 a 71

anos, sendo que a média de idade foi de 44 anos e o desvio padrão de 15,1

anos. Convém lembrar que, apesar de 35,3% terem referido EM, este

achado geralmente esteve ausente no dia da coleta do sangue, sendo

portanto, dado de história pregressa.

Cinquenta indivíduos normais também foram selecionados como

grupo controle, sendo 15 do sexo masculino (30%) e 35 do sexo feminino

(70%), com idades que variaram de 18 a 54 anos, sendo que a média de

idade foi de 31,8 anos e o desvio padrão de 10,5 anos. Todos relataram não

terem sido picados por carrapatos e nem frequentar áreas de risco.

Materiais e Métodos

Tabela 2 - Frequência dos parâmetros maiores no grupo de 68 pacientes

pertencentes ao grupo A com diagnóstico de SBY

Parâmetros maiores Pacientes

(N=68)

Frequência

História prévia de picada por carrapato

63,2%

Contato com animais e/ou visita às áreas de risco 65 95,6%

Eritema migratório 24 35,3%

Artrite 5 7,3%

Cardiopatia 8 11,7%

Neuropatia 20 29,4%

Sorologia positiva para Bb (ELISA ou WB) 44 64,7%

Tabela 3 - Frequência dos parâmetros menores no grupo de 68 pacientes

pertencentes ao grupo A com diagnóstico de SBY

Parâmetros menores Pacientes

(N=68)

Frequência

Episódios recorrentes 49 72%

Fadiga 40 58,8%

Mialgia 28 41,2%

Artralgia 46 67,6%

Desordens do cognitivo 11 16,2%

Parestesia de extremidades 1 1,5%

Campo escuro (n=52)

49 94,2%

Materiais e Métodos

4.1.2. Grupo B

No período compreendido entre novembro/2008 a outubro/2009,

foram selecionados 10 pacientes com diagnóstico de SBY, que

apresentaram obrigatoriamente eritema migratório (EM) e que estavam

sintomáticos, sendo 6 do sexo feminino e 4 do sexo masculino. As idades

variaram de 10 a 68 anos, sendo a média de 39,6 anos e o desvio padrão de

22,9 anos.

Neste grupo, todos relataram visita prévia às áreas de risco para a

zoonose e 50% haviam sido picados por carrapato. Nove doentes

desenvolveram sintomas flu-like na fase aguda, como febre, cefaléia,

mialgia, calafrios e fadiga. Queixas ósteoarticulares foram reportadas em 8

casos e em 4 foi observada artrite durante o seguimento clínico evolutivo. A

sorologia para B.burgdorferi mostrou positividade em 40% dos casos,

considerando-se o ensaio de ELISA e Western blotting na época da coleta

do sangue (Tabela 4).

Materiais e Métodos

Tabela 4 - Aspectos epidemiológicos, clínicos e sorologia para Borrelia

burgdorferi G39/40 de origem americana nos 10 pacientes do

grupo B com SBY

Dados Nº de casos

Frequência

Visita às áreas de risco 10

100%

Picada por carrapato 5

50%

Sintomas gripais (mialgia, calafrios, cefaléia, fadiga,

febre)

90%

Eritema 10

100%

Artrite 4

40%

Artralgia 8

80%

Sorologia positiva para Borrelia burgdorferi 4

40%

Cinco pacientes apresentavam história aguda, com tempo de

evolução da enfermidade de até 90 dias do início do contágio, enquanto

outros 5 estavam na fase latente (de 105 dias a 1440 dias), mas com

queixas de pele ou artrite. Quatro pacientes estavam em tratamento com

antibióticos no momento da coleta de sangue (Tabela 5).

Materiais e Métodos

Tabela 5 - Tempo de evolução da doença desde o início da enfermidade,

tratamento com antibióticos e sorologia para Borrelia burgdorferi

nos 10 pacientes do grupo B com SBY na época da coleta do

sangue

NOME IDADE TEMPO DE EVOLUÇÃO TRATAMENTO Sorologia

(na coleta de sangue) para Bb

68 9 dias cefalexina por 4 dias -

MAS

51 30 dias não -

DFS

31 60 dias cefalexina por 3 dias +

67 11 dias não +

CCM

30 105 dias não -

ORG

60 270 dias não +

PMCP

11 270 dias

enicilina benzatina há 10 dias -

ABPLS

15 30 dias tetraciclina por 7 dias -

GHP

10 360 dias não -

MAOO

53 1440 dias não +

4.1.2.1. Descrição detalhada dos pacientes do grupo B com SBY

FM: feminino, 68 anos. Foi picada por carrapato em uma pousada em São

Roque, onde havia um bambuzal. Apresentou EM, artralgia, sintomas

gripais. Estava tomando cefalexina há 4 dias. Compareceu ao laboratório

após 9 dias após o início dos sintomas para coleta de sangue. Sorologia

negativa para Borrelia burgdorferi.

MAS: feminino, 51 anos. Picada por carrapato em Ubatuba no tornozelo. Na

região, havia muitos animais circulando entre as pessoas (ex: cães com

carrapatos). Desenvolveu EM, artralgia (joelho e mãos), calafrios, cefaléia,

nucalgia, gânglios na região inguinal (causando dores na coxa).

Compareceu ao laboratório após 30 dias do início dos sintomas para coleta

de sangue. Sorologia negativa para Borrelia burgdorferi.

Materiais e Métodos

DFS: feminino, 31 anos. Viajou para Juquitiba para participar de um evento.

Durante sua estadia, não viu carrapatos e nem teve picadas. Após 14 dias

da viagem, começou a apresentar: febre diária de 37,5ºC, poliartralgia

(migratória em membros superiores) e múltiplas manchas. Após 23 dias,

artrite em joelhos, pés e mãos, muita fadiga, artralgia, febre e manchas

recorrentes (poucas). Tomou 3 dias de cefalexina. Compareceu ao

laboratório após 60 dias do início dos sintomas para coleta de sangue.

Sorologia positiva para Borrelia burgdorferi (WB: 1 banda para IgG / 3

bandas para IgM).

JS: masculino, 67 anos. Foi picado por carrapato 11 dias antes da coleta de

exame, na região de Vinhedo (SP) com desenvolvimento de EM. Sorologia

positiva para Borrelia burgdorferi (WB: 2 bandas para IgM).

CCM: feminino, 30 anos. Fez visita à Ilha Grande. Sintomas apareceram

após 15 dias, incluindo sintomas gripais, sensação de febre (calafrios),

fadiga, artrite importante nos dedos das mãos, mialgia e nucalgia.

Apresentou ainda artrite em joelhos e cotovelos. Vem desenvolvendo lesões

de pele, as quais são recorrentes, nas pernas, pés, braços e abdômen. As

lesões eritematosas tem caráter expansivo e escurecem. Sorologia negativa

para Borrelia burgdorferi.

ORG: masculino, 60 anos. Contraiu a infecção quando trabalhava na

Floresta Amazônica, desenvolvendo na época, EM na perna D e sintomas

Materiais e Métodos

gripais. Procurou infectologista na cidade de Manaus, que fez o diagnóstico

de DL e prescreveu doxiciclina 100 mg de 12/12h por 15 dias. Após

aproximadamente 8 meses, desenvolveu artrite, quando a sorologia para

Borrelia burgdorferi realizada no LIM-17 do HCFMUSP foi positiva (WB: 4

bandas para IgG).

PMCP: masculino, 11 anos. Adquiriu a enfermidade na cidade litorânea de

Ubatuba, SP, após adentrar na Mata Atlântica e sofrer picadas de insetos,

que não soube precisar. Desenvolveu EM na hemiface E acompanhado de

febre baixa, cefaléia e poliartralgia. Após cinco meses, apresentou artrite em

joelhos, febre e dificuldade de movimento em braços e dedos das mãos.

Devido à persistência dos sintomas foi medicado com penicilina benzatina

1.200.000 U. Sorologia negativa para Borrelia burgdorferi.

ABPLS: feminino, 15 anos. Viajou para Bonito (MS), onde foi picada por

carrapatos (região da Serra da Bodoquena), e após 3 dias iniciou quadro de

febre até 38,9ºC, EM em braço esquerdo, acompanhado de fraqueza, enjoo,

dores nas pernas e braços, cefaléia e dor de estômago. Ao retornar à SP,

procurou serviço médico e foi medicada com tetraciclina por 7 dias.

Compareceu ao LIM-17 do HCFMUSP após 30 dias do início do quadro para

realizar exames, e devido a persistência de sintomas como distúrbios do

cognitivo (raciocínio, sonolência), cefaléia, mialgia e fraqueza, foi orientada a

tomar doxiciclina 100 mg/2x ao dia por no mínimo mais 2 meses. Sorologia

negativa para B. burgdorferi.

Materiais e Métodos

GHP: masculino, 10 anos. Frequentou sítio na região de Itatiba (SP), onde

teve contato com animais infestados por carrapatos. Após 10 dias do retorno

da viagem, iniciou quadro de prurido generalizado intermitente, persistente e

diário, com lesões eritematosas expansivas em tronco e MMII,

acompanhado por febre, artralgias generalizadas, cefaléia e mialgia. Iniciou

tratamento com corticóides (administrado devido a edema angioneurótico),

antialérgicos (sem remissão das lesões) e anti-inflamatórios, referindo

melhora das dores com o uso regular das drogas. Após 6 meses, sem

melhora das lesões, iniciou quadro de poliartrite acompanhada por febre

baixa. Iniciou tratamento com anti-inflamatório não hormonal e antitérmico,

com melhora do quadro na vigência da medicação. Compareceu ao LIM-17

do HCFMUSP para coleta de exames, cerca de 360 dias após o início dos

sintomas, sem uso de antibióticos e apresentava-se sintomático com lesões

de pele e artrite. Sorologia negativa para B. burgdorferi.

MAOO: feminino, 53 anos. Refere que há cerca de 4 anos, após entrar em

mata (Caconde-MG) para colocar apiários, notou carrapato fixado na região

abdominal E, com surgimento de eritema e prurido local. Retirou o parasito

com álcool, tendo notado que a lesão eritematosa não melhorava. Após

cerca de um mês, a lesão aumentou ao redor da origem da picada,

mantendo-se eritematosa, não pruriginosa. Na mesma época iniciou cefaléia

holocraniana, de duração contínua, de 2 a 3 dias, de difícil controle, tendo

usado analgésicos. Nega febre. Refere desde então artralgias em joelhos D

e E, quadril D, com uso regular de anti-inflamatório não hormonal, com

Materiais e Métodos

melhora das dores. Após seis meses, sem melhora da lesão, procurou

dermatologista, tendo aplicado pomada local com pouca melhora da

vermelhidão cutânea. Refere que a lesão aumentou centrifugamente tendo

permanecido estável em tamanho com cerca de 10 cm de diâmetro por 5 de

largura, mudando de cor e ficando mais endurecida. Após três anos sem

melhora procurou o ambulatório de Reumatologia por artralgias tendo sido

solicitada avaliação do serviço de dermatologia, e feito biópsia no local da

lesão. Na avaliação ambulatorial a paciente apresentava lesão eritematosa

localizada em flanco E de cerca de 10 X 5 cm de circunferência, espessada,

com bordas bem regulares e acentuadas pelo eritema. Apresentava dores

em joelhos com discreta sinovite. Foram realizados exames gerais e

específicos para afastar outras infecções e doenças autoimunes, todos

negativos. Foi encaminhada para o Serviço de Reumatologia, quando a

minuciosa revisão da história clínica, dados epidemiológicos, sintomas

compatíveis e sorologia positiva para B. burgdorferi, permitiram concluir

tratar-se de SBY. Foi medicada com ceftriaxona, 2g EV, seguida do uso de

doxaciclina, havendo melhora do tamanho da lesão e do eritema, do

espessamento de pele, da cefaléia e das artralgias. Foi solicitada avaliação

da dermatologia, que realizou biópsia de pele que mostrou dermatite

perivascular edematosa com raros eosinófilos e aumento de colágeno

sugestivo de esclerodermia. Após seis meses do início de tratamento e dois

meses, em uso de difosfato de cloroquina evoluiu com dor aguda em quadril

D, com dificuldade para deambular, com febre baixa não medida. Feito

novamente sorologia para B. burgdorferi que mostrou-se positiva, sendo

Materiais e Métodos

medicada com nova série de ceftriaxona 2g/EV/dia por 30 dias, com

remissão da dor, porém com dificuldade de deambulação. Feito nova série

de doxiciclina, com orientação de não entrar em mata, e mudança de

medicação de manutenção, de cloroquina para sulfassalazina (SSZ).

Paciente permanece em acompanhamento há dois anos mantém-se

medicada com SSZ 2g VO/dia com melhora importante dos sintomas

articulares, porém com persistência das lesões de pele, no mesmo local do

original e aumento das lesões cutâneas em tronco. Quando a paciente ficou

assintomática, sem quadro articular ou cefaléia, mantendo apenas a lesão

de pele, foi suspensa medicação e solicitada nova sorologia para B.

burgdorferi que resultou positiva (WB: 2 bandas para IgM). Neste estágio

realizou nova biópsia de pele com extração de DNA para PCR.

4.2. Coleta e armazenamento dos materiais

Os pacientes suspeitos dos grupos A e B foram encaminhados ao

LIM-17 do HCFMUSP, pelos médicos de outras Instituições como o Instituto

de Infectologia Emílio Ribas ou outras Universidades Públicas (UNICAMP,

Ribeirão Preto), para a coleta de sangue para pesquisa de anticorpos anti B.

burgdorferi. No dia da coleta foi preenchido um breve questionário contendo

dados clínicos e epidemiológicos, que junto com os dados sorológicos

permitiram ou não a inclusão do enfermo no grupo da SBY.

Materiais e Métodos

O trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética (CAPPesq – nº

0895/05) (Anexo 8.1.) e os pacientes e controles assinaram o termo de

consentimento informado.

Amostras de sangue foram coletadas em tubos seco e com EDTA. O

tubo seco foi centrifugado para a obtenção do soro, já o tubo com EDTA foi

utilizado para a realização de PCR para pesquisa de Mycoplasma spp e

Chlamydia spp (somente para o grupo A) e Borrelia spp (para os grupos A e

B). Outros procedimentos incluíram preparo de lâminas para microscopia de

campo escuro e em alguns casos a semeadura do sangue em meio de

cultura SP-4, além de envio de amostras para a microscopia eletrônica

(somente para o grupo A).

4.3. Microscopia de campo escuro

Colocou-se numa lâmina 1 a 2 gotas de soro, homogeneizado com

uma pequena quantidade de hemácias, apoiando uma lamínula sobre a

lâmina. Procedeu-se a leitura em microscópio de campo escuro.

4.4. Meio de cultura Spiroplasma mirum base SP-4 (modificado)

Seguiu-se o seguinte protocolo para o preparo do meio de cultura

SP-4:

Materiais e Métodos

- PPLO broth base: 13g

- Bacto-tryptone (Difco): 10g

- Bacto-peptone (Difco): 5g

- Phenol red: 20g

- Água deionizada: 615mL

Autoclavou-se os reagentes acima a 121ºC por 15-20 minutos.

Após esterilização, filtrou-se e adicionou-se os seguintes reagentes:

- CMRL 1066 (10x), 4,9g: 50mL

- Yeastolate solution (2%), 2g: 100mL

- Soro fetal bovino: 170mL

Foram feitas alíquotas do meio de aproximadamente 6mL em tubo de

vidro para cultura com tampa de rosca. Armazenou-se a -20ºC.

Para o cultivo, descongelou-se a alíquota em banho-maria, deixando-

a atingir a temperatura de 36ºC.

O tubo contendo o meio foi aberto próximo ao bico de Bunsen,

passando a extremidade do tubo sobre o mesmo.

Adicionou-se ao meio aproximadamente 1mL de sangue total. O tubo

foi fechado e levado à estufa (36ºC).

A análise foi realizada após 72 horas. No caso de um bom

crescimento de estruturas, uma alíquota foi enviada para Microscopia

Eletrônica e/ou adicionada a uma cultura de células endoteliais.

Materiais e Métodos

4.5. Detecção de anticorpos anti Borrelia burgdorferi pelo Western

blotting (Dressler et al., 1993; Costa, 1998; Barros, 2000).

Para realização do WB procedeu-se a eletroforese vertical do extrato

total de B. burgdorferi cepa G39/40 (obtido através do sonicado total da B.

burgdorferi cepa G39/40, de origem americana, inicialmente isolada de

carrapatos Ixodes scapularis, conservado congelado em nitrogênio líquido),

reduzido com dithiothreitol (Bio Rad) em gel de poliacrilamida a 10%.

As proteínas do gel foram transferidas para o papel de nitrocelulose

com porosidade de 0,2 µm. Após transferência do antígeno, o papel de

nitrocelulose foi corado com Ponceau (por 10 minutos) e lavado com água

destilada para retirar o excesso do corante e cortado em tiras, as quais

foram bloqueadas (tampão Tris (TBS) – Tween 0,1% - leite desnatado 5%

pH 7,4), lavadas, incubadas com as amostras (diluição 1:100), lavadas,

incubadas com conjugado (anti-IgM ou anti-IgG humano conjugado à enzima

fosfatase alcalina), lavadas e reveladas.

4.6. Detecção de anticorpos anti Borrelia burgdorferi pelo método

imunoenzimático (ELISA) (Grodzicki e Steere, 1988; Mandell et al., 1989;

Costa, 1998; Barros, 2000)

As placas, Immulon 1B (Thermo Electron Corporation, USA), foram

sensibilizadas, com 100µl de sonicado total de Borrelia burgdorferi cepa G

Materiais e Métodos

39/40 na concentração de 15µg/ml diluído em tampão carbonato pH 9,6 e

mantidas a 4ºC em câmara úmida durante a noite. Lavou-se as placas 3

vezes com tampão fosfato (PBS) com 0,05% de Tween 20, pH 7,4.

Após sensibilização, os sítios inespecíficos das placas foram

bloqueados com 100µl por poço de solução protéica feita com leite

desnatado à 5%, diluído em tampão fosfato com 0,5% de Tween 20, pH 7,4.

Incubou-se as placas por 1 hora, à temperatura ambiente. Então, as placas

foram lavadas 3 vezes com tampão fosfato (PBS) com 0,05% de Tween 20,

pH 7,4.

As amostras foram diluídas em PBS – Tween com 5% de leite

desnatado pH 7,4 na proporção 1/400 para IgG e 1/100 para IgM.

As placas foram incubadas durante 1 hora. Lavou-se as placas 3

vezes, e adicionou-se 100µl / poço de anti-IgM ou anti-IgG humano

conjugado à enzima fosfatase alcalina (Sigma), diluído 1/1000 em PBS-

Tween- leite desnatado pH 7,4, incubando-se por 1 hora. As placas foram

lavadas novamente 3 vezes como descrito acima e adicionou-se 100µl por

poço de substrato p-nitro-fenil-fosfato na concentração de 1 mg/ml diluído

em tampão glicina pH 10,5 para leitura em espectrofotômetro para ELISA

(Labsystems Multiskan MS) em comprimento de onda de 405 nm.

4.7. Detecção de anticorpos anti Mycoplasma pneumoniae pelo método

imunoenzimático (ELISA)

Materiais e Métodos

Foram utilizados kits ImumnoWELL™ - Mycoplasma pneumoniae

antibody (IgG e IgM) da GenBio (San Diego, CA), para realização deste

procedimento.

Toda a metodologia seguiu os padrões recomendados pelo fabricante

do kit.

4.8. Detecção de anticorpos anti Chlamydia spp pelo método de

imunofluorescência indireta (IFI)

Foram utilizados kits de Imunofluorescência Indireta - Chlamydia

Antibody Test System (IgG e IgM) da Bion Enterprises (USA) para a

realização destes ensaios.

A metodologia seguiu os padrões citados no manual do fabricante do

kit.

4.9. Cultura de células endoteliais

Linhagens de células HUV-EC-C (Umbilical cord, human – ATCC CRL

1730), foram cultivadas em garrafas de 25cm² contendo meio 199 (GIBCO

BRL), suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado, 1% penicilina +

estreptomicina. Logo após a confluência foi adicionado 1ml de cultura de

sangue de paciente inoculada em SP-4 por 72 horas. Após 24 horas dessa

Materiais e Métodos

inoculação, foi realizada a troca do meio (meio 199 suplementado com 10%

de soro fetal bovino inativado - sem antibiótico). Essa cultura de células foi

mantida por 10 dias em estufa de CO2, fazendo-se a manutenção através da

troca do meio de cultivo.

Após esse período, as células foram tripsinizadas. A seguir adicionou-

se meio 199 (GIBCO BRL) com 20% de soro fetal bovino para bloquear a

ação da tripsina. Posteriormente, as células foram lavadas com PBS. Uma

alíquota dessas células (aproximadamente 1ml) foi enviada para a

microscopia eletrônica em glutaraldeído 2% na proporção 1:1, no intuito de

verificar se as células endoteliais foram infectadas pelos micro-organismos.

4.10. Coloração de Borrelia burgdorferi cultivadas em meios BSK e

SP-4 modificado

Estes experimentos tiveram como objetivo verificar se a B. burgdorferi

cepa G39/40 de origem americana, seria capaz de sobreviver em meio SP-4,

teoricamente inadequado para o seu desenvolvimento, analisando-se o seu

crescimento e mudanças morfológicas e tintoriais. Algumas amostras de

sangue de pacientes do grupo A foram semeadas em meio de cultura BSK

ideal para crescimento de B. burgdorferi sensu lato e em meio SP-4 e

coradas por diferentes metodologias.

Materiais e Métodos

4.10.1. Acridine orange

Borrelia burgdorferi cepa G39/40 de origem americana, conservada

congelada em nitrogênio líquido foi inoculada em meio BSK e, após

crescimento, uma lâmina desta cultura foi preparada, deixando-a secar em

temperatura ambiente e, posteriormente, a mesma foi fixada com etanol

absoluto gelado por 10 minutos. Após terem sido fixadas, colocou-se uma

gota da seguinte solução:

- Acridine orange (1X) em PBS (1:150)

Adicionou-se 10µl de Azul de Evans (10mg) em 100 µl da solução preparada

acima (1:10).

Colocou-se esta solução final sobre a lâmina, cobriu-se com uma

lamínula, levando-a em seguida para leitura em microscópio de

fluorescência.

A cultura de B. burgdorferi semeada em meio SP-4 foi realizada da

mesma forma e a coloração seguiu o mesmo procedimento acima.

4.10.2. Panótico

As lâminas foram preparadas conforme procedimento descrito

anteriormente para a coloração com Acridine orange. Após a secagem em

temperatura ambiente, procedeu-se a coloração conforme instruções do

fabricante do kit Panótico Rápido (Laborclin).

Materiais e Métodos

4.11. Extração de DNA

Para facilitar e agilizar as extrações de DNA das amostras de sangue

total, foram utilizados os kits comerciais DNeasy Blood & Tissue Kit

(Qiagen GmbH) para pequenos volumes (até 200µl) e o QIAamp DNA

Blood Midi Kit (Qiagen GmbH), para volumes maiores (até 2 mL). Os

procedimentos seguiram as recomendações do fabricante.

4.12. PCR

4.12.1.Gradientes

Gradientes de temperatura foram realizados para determinar a

temperatura ideal de anelamento das amostras em todos os primers

utilizados.

4.12.2. Primers e ciclos de temperatura

4.12.2.1. Borrelia spp (gene FlaB - flagelina) (Stromdahl et al., 2003)

Para a reação num volume final de 50µl foram utilizados 5µl da

amostra de DNA extraído, 2µl de cada primer (1.0µM), 5µl Tris-HCl (10mM),

Materiais e Métodos

3µl MgCl2 (1.5 mM), 8µl dNTP mix (1,25mM), 0.25µl TaqDNA polimerase

(1.5U) e 24,75µl de H

O Milli Q.

FLA LL (5’- ACA TAT TCA GAT GCA GAC AGA GGT – 3’)

FLA RL (5’-GCA ATC ATA GCC ATT GCA GAT TGT – 3’)

Para Borrelia spp (gene flagelina), os ciclos de temperatura e tempo

para a reação consistiram em uma desnaturação inicial por 3 minutos a

95ºC, seguida de 40 ciclos, cada um consistindo em uma desnaturação a

95ºC por 1 minuto, anelamento a 65ºC por 1 minuto (obtido após gradiente

de temperatura) e extensão a 75ºC por 1 minuto.

4.12.2.2. Borrelia spp (gene 16S rRNA) ( baseado no trabalho de Rich et

al., 2001).

Para a reação num volume final de 50µl foram utilizados 5µl da

amostra de DNA extraído, 2µl de cada primer (1.0µM), 5µl Tris-HCl (10mM),

3µl MgCl2 (1.5 mM), 8µl dNTP mix (1,25mM), 0.4µl TaqDNA polimerase

(2U) e 24,6µl de H

O Milli Q.

Iniciadores para amplificação parcial do gene 16S rRNA

16borTF ( 5’ – GAG TCT GCG TCT TAT TAG CTA – 3’)

16borTR (5’ - AAC AAG GGT TGC GCT CGT TG – 3’)

Materiais e Métodos

Para Borrelia (gene 16S rRNA), os ciclos de temperatura e tempo

para a reação consistiram em uma desnaturação inicial por 3 minutos a

94ºC, seguida de 35 ciclos, cada um consistindo em uma desnaturação a

94ºC por 1 minuto, anelamento a 68ºC por 1 minuto e extensão a 72ºC por 1

minuto e 30 segundos.

4.12.2.3. Chlamydia spp (Messmer et al., 1997)

Para a reação num volume final de 50µl foram utilizados 5µl da

amostra de DNA extraído, 1µl de cada primer (0.2µM), 5µl Tris-HCl (10mM),

3µl MgCl2 (2.5 mM), 8µl dNTP mix (1,25mM), 0.25µl TaqDNA polimerase

(1.25U) e 26,75µl de H

O Milli Q.

Chlamy 1 (5’- ACG GAA TAA TGA CTT CGG – 3’)

Chlamy 2 (5’- TAC CTG GTA CGC TCA ATT – 3’)

Para Chlamydia spp, os ciclos de temperatura e tempo da reação

consistiram em uma desnaturação inicial por 2 minutos a 95ºC, seguida de

35 ciclos, cada um consistindo em uma desnaturação a 94ºC por 1 minuto,

anelamento a 54ºC por 30 segundos (obtido após gradiente de temperatura)

e extensão a 72ºC por 1 minuto.

4.12.2.4. Mycoplasma spp (Smith et al., 2004)

Materiais e Métodos

Para a reação num volume final de 50µl foram utilizados 5µl da

amostra de DNA extraído, 2,5µl de cada primer (0.5µM), 5µl Tris-HCl

(10mM), 1,5µl MgCl2 (1.5 mM), 8µl dNTP mix (1,25mM), 0.4µl TaqDNA

polimerase (2U) e 25,1µl de H

O Milli Q.

Myco – F (5’- GGG AGC AAA CAG GAT TAG ATA CCC T – 3’)

Myco – R (5’- TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC – 3’)

Para Mycoplasma spp, os ciclos de temperatura e tempo da reação

consistiram em uma desnaturação inicial por 4 minutos a 95ºC, seguida de

40 ciclos, cada um consistindo em uma desnaturação a 94ºC por 45

segundos, anelamento a 64ºC por 1 minuto (obtido após gradiente de

temperatura) e extensão a 72ºC por 2 minutos.

4.12.2.5. Mollicutes (Cordova e Cunha et al., 2002)

Para a reação num volume final de 50µl foram utilizados 5µl da

amostra de DNA extraído, 2 µl de cada primer (0.3µM), 5µl Tris-HCl (10mM),

3µl MgCl2 (2.5 mM), 8µl dNTP mix (1,25mM), 0.2µl TaqDNA polimerase

(1U) e 24,8µl de H

O Milli Q.

MGSO (5’-TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC – 3’)

GPO1 (5’- ACT CCT ACG GGA GGC AGC CGTA – 3’)

Materiais e Métodos

Para Mollicutes, os ciclos de temperatura e tempo da reação

consistiram em uma desnaturação inicial por 5 minutos a 95ºC, seguida de

30 ciclos, cada um consistindo em uma desnaturação a 95ºC por 30

segundos, anelamento a 66ºC por 1 minuto e 30 segundos (obtido após

gradiente de temperatura) e extensão a 72ºC por 1 minuto e 30 segundos.

4.12.2.6. Plasmídeos lp25 e lp28-1 (Iyer et al., 2003)

Para a reação num volume final de 50µl foram utilizados 5µl da

amostra de DNA extraído, 6 µl de cada primer (10pmoles), 5µl Tris-HCl

(10mM), 1,5µl MgCl2 (2.5 mM), 1,25µl dNTP mix (10mM), 0.25µl TaqDNA

polimerase e 25µl de H

O Milli Q.

lp25a (5’- AGAATTATGTCGGTGGCGTTGT – 3’)

lp25b (5’-ATTAAAGCCGCCTTTTCCTTGGT -3’)

lp28-1c (5’- AGTAGTACGACGGGGAAACCA – 3’)

lp28-1d (5’- ACTTTGCGAACTGCAGAC – 3’)

Para lp25, os ciclos de temperatura e tempo da reação consistiram

em uma desnaturação inicial por 2 minutos a 94ºC, seguida de 35 ciclos,

cada um consistindo em uma desnaturação a 94ºC por 30 segundos,

anelamento a 67ºC por 30 segundos (obtido após gradiente de temperatura)

e extensão a 72ºC 30 segundos.

Materiais e Métodos

Para lp28-1, os ciclos de temperatura e tempo da reação consistiram

em uma desnaturação inicial por 2 minutos a 94ºC, seguida de 35 ciclos,

cada um consistindo em uma desnaturação a 94ºC por 30 segundos,

anelamento a 59,5ºC por 30 segundos (obtido após gradiente de

temperatura) e extensão a 72ºC 30 segundos.

4.12.2.7. Plasmídeos cp32-4 e cp32-2/7 (Iyer et al., 2003)

Para a reação num volume final de 50µl foram utilizados 5µl da

amostra de DNA extraído, 6 µl de cada primer (10pmoles), 5µl Tris-HCl

(10mM), 1,5µl MgCl2 (2.5 mM), 1,25µl dNTP mix (10mM), 0.25µl TaqDNA

polimerase e 25µl de H

O Milli Q.

cp32-4a (5’- AGATCCTCAAAATAGTTTAACCAG – 3’)

cp32-4b (5’- TTAATATTGGCAGAGAGTCTACAG – 3’)

cp32-2/7a (5’ - GGAATGTATTAATTGATAATTCAG – 3’)

cp32-2/7b (5’ – GCGAAATAAATAGTGCCTTATGGG-3’)

Para cp32, os ciclos de temperatura e tempo da reação consistiram

em uma desnaturação inicial por 2 minutos a 95ºC, seguida de 35 ciclos,

cada um consistindo em uma desnaturação a 94ºC por 30 segundos,

anelamento a 52ºC por 30 segundos (obtido após gradiente de temperatura)

e extensão a 72ºC 30 segundos.

Materiais e Métodos

4.12.2.8. Borrelia spp (gene flgE – gancho flagelar) (baseado em Sal et al.,

2008)

Para a primeira reação num volume final de 50µl, foram utilizados 5µl

da amostra de DNA extraído, 2µl de cada primer (5pmoles), 5µl Tris-HCl

(10mM), 3µl MgCl2 (1.5 mM), 8µl dNTP mix (1,25mM), 0.25µl TaqDNA

polimerase (1.5U) e 24,75µl de H

O Milli Q. Adicionou-se 1,5µl de DMSO por

amostra (concentração final 3%). Para a segunda reação (PCR/PCR),

utilizou-se 0,5µl do produto da 1ª reação, 2µl de cada primer (5pmoles), 5µl

Tris-HCl (10mM), 3µl MgCl2 (1.5 mM), 8µl dNTP mix (1,25mM), 0.25µl

TaqDNA polimerase (1.5U) e 29,25µl de H

O Milli Q. Adicionou-se 1,5µl de

DMSO por amostra (concentração final 3%).

flgE 470 FW (5’- CGCCTATTCTAACTTGACCTGAAT – 3’)

flgE 470 Rev (5’- CAACTCTAAGCTCAAGAACACCAA – 3’)

Para este primer, os ciclos de temperatura e tempo para a reação

consistiram em uma desnaturação inicial por 3 minutos a 95ºC, seguida de

um de 35 ciclos, cada um consistindo em uma desnaturação a 95ºC por 45

segundos, anelamento a 64ºC por 45 segundos e extensão a 72ºC por 45

segundos.

Para todas as reações, independente do primer, foi utilizado um

controle positivo (DNA do micro-organismo) e um controle negativo (mix). O

Materiais e Métodos

produto final das reações foi analisado em gel de agarose, corado por SYBr

Gold (Invitrogen) e visualizado à trans-iluminação pela ultravioleta.

4.13. Sequenciamento

As amostras que apresentaram positividade nas reações de PCR

foram purificadas com o QIAEX®II Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH) e o

sequenciamento foi realizado com o BigDye Terminator Cycle Sequencing

kit, version 3.1 (Applied Biosystems), e analisado pelo ABI Prism 3730 DNA

analyzer (Applied Biosystems). As sequências obtidas foram submetidas à

análise utilizando o Basic Local Alignment Search Tool (BLAST - NCBI)

(Altschul et al., 1990).

5. Resultados

Resultados

5.1. Sorologia para Borrelia burgdorferi

5.1.1. Grupo A

Das 68 amostras de soros de pacientes com SBY do grupo A,

analisadas pelo método de ELISA, 23 (33,8%) foram positivas. Foram

submetidas também ao teste 50 amostras de indivíduos normais, sendo que

6 (12%) foram consideradas positivas.

Pelo método de WB, das 68 amostras de SBY, 40 (58,8%) foram

consideradas positivas. Das 50 amostras de indivíduos normais que

realizaram WB, apenas 06 foram positivas (12%). A partir dos resultados

obtidos, das 68 amostras de pacientes com SBY, 44 (64,7%) tiveram

sorologia positiva (ELISA ou WB) para B. burgdorferi. Das 50 amostras

oriundas de indivíduos normais, 8 (16%) foram consideradas positivas

(ELISA e WB), diferença estatisticamente significante pelo teste de t-Student

( P<0,05 )(intervalo de confiança de 95%). A análise estatística foi realizada

pelo programa SPSS 14.0 for Windows.

Confirmou-se a baixa sensibilidade dos testes sorológicos, em torno

de 65%, mesmo com a inclusão dos dois métodos laboratoriais (ELISA e

WB) em conjunto, e que, a especificidade dos ensaios, quando calculada

baseada em indivíduos normais, que não frequentavam áreas de risco foi de

84%.

Resultados

5.1.2. Grupo B

Das 10 amostras de soros de pacientes com SBY do grupo B,

analisadas pelo método de ELISA, nenhuma apresentou positividade. Já

pelo método de WB, 4 (40%) foram consideradas positivas.

5.2. Sorologia para Mycoplasma pneumoniae

Das 68 amostras dos pacientes com diagnóstico de SBY do grupo A,

31 (45,6%) foram consideradas positivas, e das 50 amostras de indivíduos

normais, 21 (42%) foram positivas. Estes dados indicam que a frequência de

positividade de anticorpos para M. pneumoniae foi semelhante nos dois

grupos, confirmado estatisticamente pelo teste t-student ( P>0,05 )(intervalo

de confiança de 95%). A análise estatística foi realizada pelo programa

SPSS 14.0 for Windows.

5.3. Imunofluorescência Indireta (IFI) para Chlamydia spp

Das 68 amostras de pacientes com SBY do grupo A, 56 (82,35%)

foram consideradas positivas para anticorpos da classe IgG (Figura 1). Das

50 amostras de indivíduos normais, 44 (88%) foram positivas. A análise

estatística realizada pelo teste t-Student, mostrou-se não significante

Resultados

(P>0,05) (intervalo de confiança de 95%). A análise estatística foi realizada

pelo programa SPSS 14.0 for Windows.

Figura 1 - Paciente com sorologia positiva (IgG) para Chlamydia spp (400X)

5.4. Microscopia de campo escuro

1:40

Controle Positivo

1:160

1:640

Controle negativo

1:2560

Resultados

Foram analisadas 52 amostras de sangue de pacientes com SBY do

grupo A ao microscópio de campo escuro, dos quais 49 (94,2%) foram

consideradas positivas, apresentando estruturas sugestivas de espiroquetas.

Das 50 amostras de indivíduos normais, 10 (20%) apresentaram

espiroquetídeos, e esta diferença foi estatisticamente significante pelo teste

t-Student, (P<0,05) (intervalo de confiança de 95%). A análise estatística dos

foi realizada pelo programa SPSS 14.0 for Windows.

5.5.Cultura de espiroquetídeos visualizados no sangue em meio SP-4

As amostras de sangue provenientes de pacientes com SBY foram

selecionadas através da análise em microscopia de campo escuro, sendo

que ao apresentar uma quantidade significativa de espiroquetídeos, a

amostra foi semeada em meio SP-4.

Das 68 amostras de pacientes com SBY do grupo A, foram

selecionadas 19 amostras mais ricas em espiroquetídeos identificados à

microscopia de campo escuro, e que foram semeadas em meio SP-4. Em 14

amostras (73,7%) houve crescimento de estruturas após 72 horas de cultivo,

visualizada em microscopia de campo escuro (Figura 2).

Resultados

Figura 2 - Crescimento de estruturas sugestivas de espiroquetas após

inoculação de sangue de paciente com SBY em meio de cultura SP-4.

Visualização em microscopia de campo escuro. Aumento 1000X.

5.6. Microscopia eletrônica

Foram analisadas à microscopia eletrônica, amostras de 08 pacientes

com diagnóstico de SBY do grupo A. Incluiu-se ainda, amostras de 01

indivíduo normal, 03 controles de células endoteliais, 01 amostra de B.

burgdorferi cultivada em meio SP-4 e 01 amostra de B. burgdorferi cultivada

em meio BSK. As amostras selecionadas para análise à microscopia

eletrônica, apresentavam-se ricas em espiroquetídeos no sangue periférico

ou em culturas no meio SP-4.

A primeira amostra escolhida foi proveniente de 1ml de sangue total

de paciente com SBY, que apresentava grande quantidade de estruturas à

microscopia de campo escuro. Na microscopia eletrônica, visualizaram-se

Resultados

estruturas sugestivas de Chlamydia spp, Mycoplasma spp, espiroquetas e

Archaebacteria spp (Figura 3).

A B

Figura 3 - Visualização de estruturas que lembram Chlamydia spp,

espiroquetas, Mycoplasma spp e Archaebacteria spp, em material

proveniente do sangue periférico de paciente com SBY, analisado à

microscopia eletrônica. Aumento de 24000X em A, B e C e 30000X em D.

Onde: Ch: Chlamydia spp; E: Espiroqueta; My: Mycoplasma spp; Ac:

Archaebacteria spp.

A segunda e terceira amostras foram provenientes do cultivo de 1ml

de sangue total de pacientes com SBY, semeados em meio SP-4 e mantidos

por três dias. Utilizou-se alíquotas de 1ml da bactéria em suspensão neste

C D

Resultados

meio para análise à microscopia eletrônica. Houve identificação de

estruturas sugestivas de espiroquetas e Mycoplasma spp na segunda

amostra (Figuras 4 e 5), assim como na terceira amostra (Figuras 6 e 7).

Figura 4 - Visualização de estruturas que sugerem espiroquetas e

Mycoplasma spp à microscopia eletrônica, em sangue de paciente com SBY

semeado em meio de cultura SP-4. Aumento de 24000X. Onde: E:

Espiroquetídeo; My: Mycoplasma sp.

Figura 5 - Visualização de estruturas que lembram espiroquetas à

microscopia eletrônica, no sangue periférico de paciente com SBY semeado

em meio SP-4. Aumento de 6200X.

Resultados

Figura 6 - Visualização de estruturas que sugerem espiroquetas e

Mycoplasma spp à microscopia eletrônica, em sangue de paciente com SBY

semeado em meio de cultura SP-4. Aumento de 24000X. Onde: E:

Espiroquetídeo; My: Mycoplasma spp.

Figura 7 - Visualização de estrutura que lembra espiroqueta à microscopia

eletrônica, no sangue periférico de paciente com SBY semeado em meio

SP-4. Aumento de 65000X.

A quarta amostra também foi proveniente do cultivo de 1ml sangue

total de paciente com SBY, semeado em meio SP-4 por três dias, sendo

utilizado uma alíquota de 1ml da bactéria em suspensão neste meio para

análise à microscopia eletrônica. Houve identificação de estruturas

sugestivas de espiroquetas.

Resultados

A quinta e a sexta amostras enviadas à ME, eram amostras de 1 ml

de plasmas, provenientes de dois pacientes com SBY. Entretanto nestes

casos não houve identificação de micro-organismos, provavelmente devido

ao tipo de material (plasma).

A sétima e a oitava amostras de sangue com espiroquetídeos foram

empregadas para serem semeadas em cultivo de células endoteliais.

Semeou-se inicialmente 1 ml de sangue total de pacientes com SBY,

contendo espiroquetídeos em meio SP-4, e após 3 dias, uma alíquota de 1

ml da suspensão contendo espiroquetídeos, foi adicionada em frascos de

cultura contendo células endoteliais aderidas. Após 10 dias de incubação, as

células endoteliais foram removidas e levadas à microscopia eletrônica,

quando se observou presença de espiroquetídeos no interior de células

endoteliais da sétima amostra (Figura 8), enquanto a oitava foi negativa.

Figura 8 - Visualização de espiroquetídeo no interior de célula endotelial à

microscopia eletrônica, após incubação com meio de cultura SP-4 contendo

espiroquetídeos em suspensão. Aumento de 15000X.

Foi inoculado também 1 ml de sangue total de individuo controle

normal, positivo à microscopia de campo escuro para a presença de

Resultados

espiroquetídeos em meio SP-4. Após 3 dias de cultivo, uma alíquota em

suspensão foi colocada em cultura de células endoteliais. Após 10 dias a

amostra foi encaminhada à microscopia eletrônica, e não foi visualizada a

presença de estruturas no interior das células endoteliais.

Amostras controles de cultura de células endoteliais (sem inoculação

de bactérias) foram mantidas em meio 199 durante 10 dias e depois

encaminhadas à microscopia eletrônica. Não foi visualizado nenhum sinal de

inclusão bacteriana nestas células.

Amostras de cultura de Borrelia burgdorferi também foram enviadas

para análise ao microscópio eletrônico, sendo uma inoculada em meio SP-4

(Figura 9) e outra em BSK e posteriormente em células endoteliais (Figuras

10 e 11). As fotos mostram borrelias que perderam sua morfologia habitual

espiralada, aparentemente sem flagelo, e outras morfologias que lembravam

cistos.

Figura 9 - Cultura de Borrelia burgdorferi inoculada inicialmente em meio SP-

4 por três dias e a seguir semeada em cultura de células endoteliais.

Amostra de células endoteliais cultivadas por 26 dias e enviada à ME, exibe

estruturas que lembram cistos. A cultura foi centrifugada para concentração

dos micro-organismos, antes do envio do material para análise à ME.

Aumento de 10000X.

Resultados

Figura 10 - Borrelia burgdorferi foi semeada em meio BSK e a seguir

inoculada em cultura contendo células endoteliais. Amostras de células

endoteliais foram coletadas após 3 dias e analisadas à ME, visualizando-se

estruturas que lembram borrelias que perderam morfologia espiralada e

aparentemente sem flagelos. Aumento de 7200X.

Figura 11 - Borrelia burgdorferi mantida em cultivo no meio BSK, a seguir

inoculada em cultura de células endoteliais mantidas em meio 199. Após 3

dias, coletou-se amostras de células endoteliais que foram enviadas à ME,

onde visualiza-se estruturas que sugerem espiroquetas não espiraladas com

morfologia bacteroide e outras estruturas que lembram cistos. Aumento de

4200X.

5.7. Coloração

Resultados

5.7.1. Coloração de cultura de Borrelia burgdorferi em BSK com

Acridine orange

A cultura de B.burgdorferi realizada em meio BSK, próprio para cultivo

desta, ao atingir seu nível de crescimento ideal, mostrou espiroquetas com a

morfologia esperada, ou seja, espiraladas e longas, quando coradas com

Acridine orange e Azul de Evans, que marcam o material genético (Figura

12).

Figura 12 - Cultura de B. burgdorferi em meio BSK, corada com Acridine

orange e Azul de Evans (1000X).

5.7.2. Coloração de cultura de Borrelia burgdorferi semeada em meio

SP-4 com Acridine orange

Quando a B. burgdorferi foi semeada em meio SP-4 (modificado), não

adequado ao desenvolvimento de borrelias, as bactérias cresceram pouco e

houve mudança na morfologia das espiroquetas, que exibiram diferentes

formas e tamanhos, algumas simulando cistos (Figura 13).

Resultados

Figura 13 - Cultura de B. burgdorferi em meio SP-4, corada pelo método de

Acridine orange e Azul de Evans (1000X).

5.7.3. Coloração da B. burgdorferi semeada em meio BSK pelo

Panótico

Foi realizada a coloração da cultura de B. burgdorferi semeada em

meio BSK com Panótico Rápido, que mostrou espiroquetas de morfologia

preservada.

5.7.4. Coloração da B. burgdorferi semeada em meio SP-4 pelo

Panótico

Resultados

Borrelia burgdorferi quando cultivada em meio SP-4 e corada pelo

Panótico, mostra transformação de sua morfologia para formas atípicas,

algumas simulando cistos (Figura 14).

Figura 14 - Cultura de B. burgdorferi semeada em meio SP-4 e corada pelo

Panótico (1000X).

5.7.5. Coloração pelos métodos de Panótico Rápido e Acridine orange

dos espiroquetídeos visualizados em sangue de pacientes com

SBY semeado em meio SP-4

Não houve sucesso na tentativa de coloração pelo método de

Panótico Rápido das estruturas (espiroquetídeos) visualizadas através de

MO no sobrenadante da cultura de sangue dos pacientes com SBY

inoculadas em meio SP-4.

Resultados

Pelo método de Acridine orange, os resultados também não foram

promissores. Raras estruturas sugestivas de cistos foram coradas.

5.8. Biologia Molecular

5.8.1. PCR

5.8.1.1. Grupo A

Das 68 amostras de pacientes com SBY do grupo A, 54 (79,4%)

tinham sangue total armazenado e, consequentemente, foram testadas com

os primers: Borrelia spp (gene flagelina e 16S rRNA), Chlamydia spp,

Mycoplasma spp e Mollicutes sendo que todas apresentaram-se negativas

nestas reações. Das 50 amostras do grupo controle, 49 (98%) foram

testadas para os mesmos primers que o grupo de SBY, apresentando-se

negativas também.

As reações de PCR que amplificam fragmentos dos genes dos

plasmídeos lp25 e lp28-1 apresentaram-se negativas, tanto para o grupo

SBY quanto para o grupo controle.

Com os primers para detecção de plasmídeos circulares cp 32, 4 das

54 amostras do grupo A (SBY) (7,4%) foram positivas quando testadas com

os primers cp32-2/7 e 9 (16,6%) quando testadas com os primers cp 32-4

(Figura 15).

Resultados

Figura 15 - PCR realizada para identificar fragmento genético do plasmídeo

cp32-4, onde: PM=peso molecular (50bp); C+ =controle positivo B.

burgdorferi ; A= amostra paciente SBY.

Porém, ao enviar o material para sequenciamento, observou-se

existência de dois picos distintos de nucleotídeos. Este dado indica que no

gel haveria duas bandas indistinguíveis entre si (muito próximas uma da

outra), uma delas possivelmente relacionada com gene da borrelia e a outra

homóloga ao cromossomo humano. Em resumo, primers derivados do

complexo cp32 não permitiriam a identificação do agente etiológico da SBY,

pois havia cruzamento com genes de cromossomos humanos.

O emprego dos primers para o gene flgE apresentou resultados

negativos tanto para o grupo A como para o grupo controle.

5.8.1.2. Grupo B

Repetiu-se a PCR realizada com o gene flgE no grupo de 10

pacientes com histórico de EM e em atividade de doença, comparado com

PM C+ A

Resultados

49 controles de indivíduos normais. O teste também foi estendido de forma

preliminar à 47 amostras de carrapatos oriundos de áreas de risco do

Espírito Santo (sendo 17 R. microplus e 30 R. sanguineus), 27 bovinos e 26

equinos, animais estes oriundos da Universidade Federal Rural do Rio de

Janeiro (UFRRJ).

A PCR foi positiva (Figura 16 e 17) em 06 pacientes SBY (60%), 2

carrapatos (sendo 1 R. sanguineus e 1 R. microplus), 01 equino e 01 bovino.

Estas amostras foram sequenciadas e apresentaram, uma similaridade de

99% com Borrelia burgdorferi flagellar hook protein (flgE) gene (L43849).

Figura 16 - PCR com flgE onde: PM = peso molecular (50bp); C+ = B. garinii;

A= amostra paciente SBY; B= amostra carrapato

C+

Resultados

Figura 17 - PCR flgE onde: PM = peso molecular (50bp); C+ = B. garinii; C- =

controle normal; 1 ao 4= pacientes SBY

Salientamos que em todas as reações realizadas, o controle positivo

utlizado foi a B. garinii, que quando sequenciado, apresentou uma homologia

de 94% com Borrelia burgdorferi flagellar hook protein (flgE) gene (L43849) e

de apenas 92% com a sequência das nossas amostras, eliminando assim,

qualquer possibilidade de contaminação nas etapas dos procedimentos.

Todas as amostras do grupo controle apresentaram-se negativas para

estes primers.

O fragmento sequenciado em nossas amostras, composto por 329pb,

foi depositado no GenBank (acesso nº HM 245929) e este possui 2 bases

diferentes (em azul na Figura 18) do fragmento depositado (L43849)

correspondente à Borrelia burgdorferi flagellar hook protein (flgE).

2 PM C+ C- 1 3

Resultados

Figura 18 - Alinhamento das sequências das amostras positivas com o gene

da Borrelia burgdorferi flagellar hook protein (flgE) (L43849) realizado no

BLAST

Foi realizada também a PCR para Borrelia spp com os primers para

os genes FlaB e 16S rRNA, as quais apresentaram resultados negativos

para as 10 amostras de pacientes do grupo B.

6. Discussão

Discussão

O principal objetivo do estudo foi alcançado, pois identificamos o

agente etiológico da SBY, graças à analise do Western Blotting que indicava

a presença de anticorpos contra proteínas flagelares da B. burgdorferi de PM

41 Kda.

O flagelo tem sua síntese regulada por uma cascata de eventos

transcricionais, envolvendo a expressão ordenada de genes das classes 1, 2

e 3 (Aldridge e Hughes, 2002). A expressão dos genes de classe 1 dirige a

transcrição dos genes da classe 2, os quais codificam as proteínas

estruturais envolvidas na síntese do corpo basal e do gancho (exemplos:

flgM, σ28, flgE), bem como proteínas reguladoras específicas. Estas

proteínas reguladoras controlam a expressão dos genes da classe 3,

incluindo aqueles que codificam a flagelina e a quimiotaxia (FlaA e FlaB) (Sal

et al., 2008). Assim, imaginamos que a Borrelia brasileira poderia ter

deficiência nos genes reguladores da flagelina (FLaA e FLaB) (previamante

demonstrado no LIM-17 do HCFMUSP), mas que teria conservado ativo o

gene responsável pela síntese do gancho flagelar (flgE).

Os resultados preliminares com o flgE trouxeram grandes surpresas.

Conseguimos identificar a presença do fragmento deste gene em 06

amostras de pacientes com SBY do grupo B. Acreditamos que a positividade

esteve presente neste grupo pelo fato da doença estar em atividade no

momento da coleta de sangue e, possivelmente, as borrelias estarem

circulantes, diferentemente do grupo A, onde a maioria dos pacientes estava

em estágio latente. Este dado é de grande relevância clínica, pois mostra

que o primer flgE embora útil no descobrimento do agente etiológico da SBY,

Discussão

não seria apropriado no auxílio diagnóstico laboratorial da maioria dos casos

da zoonose, que na grande maioria, são identificados na fase latente da

enfermidade.

Além disso, a PCR para flgE apresentou-se positiva em 02 amostras

de carrapatos, 01 de equino e 01 de bovino. Todas as amostras positivas

apresentaram no sequenciamento uma homologia de 99% com Borrelia

burgdorferi flagellar hook protein (flgE) gene (L43849). Este dado, leva-nos

a supor que, podemos estar frente a uma nova espécie de Borrelia, muito

próxima a Borrelia burgdorferi, já que a diferença entre a sequência

brasileira e a da B. burgdorferi é de apenas 2 pares de bases, diferença esta

que se repete em todas as nossas amostras, seja ela de humanos,

carrapatos ou animais.

A descoberta dos primers flgE propiciou também o avanço no

conhecimento da epidemiologia da SBY, pois conseguimos identificar de

forma preliminar, o agente etiológico da SBY em carrapatos Rhipicephalus

sanguineus e Rhipicephalus microplus, confirmando que os vetores no Brasil

não pertencem aos carrapatos do complexo Ixodes ricinus.

Devido ao fato de alguns animais (1 equino e 1 bovino) provenientes

da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro terem sido positivos para

estes primers e apresentarem a mesma homologia de 99% com a B.

burgdorferi, como os humanos e carrapatos, contribui de modo relevante na

compreensão da epidemiologia da SBY, pois indica a possibilidade dos

animais como cães, equinos e bovinos participarem como animais

reservatórios no país.

Discussão

Discutiremos a seguir, o porquê da SBY ser tão diferente da DL,

quanto aos aspectos epidemiológicos,clínicos, laboratoriais e terapêuticos,

uma vez que a B. burgdorferi é o mesmo agente de ambas as enfermidades,

existindo inclusive uma homologia de 99% no gene flgE. Saliente-se que

esta é a primeira descrição da B. burgdorferi no Hemisfério Sul, e que os

pesquisadores ainda não admitiram a existência da clássica DL nesta área

do planeta.

Quando o presente estudo foi iniciado, partimos do princípio de que a

SBY seria uma enfermidade, causada por um conjunto de micro-organismos

latentes, incluindo-se uma espiroqueta ainda indefinida, Mycoplasma spp e

Chlamydia spp, como havia sido sugerido os achados preliminares da

microscopia eletrônica realizados por Mantovani et al. (2007).

Mas, após a conclusão dos ensaios sorológicos para estes agentes,

vimos que as frequências de sorologias positivas para Mycoplasma

pneumoniae e para Chlamydia spp, foram semelhantes no grupo de

pacientes SBY e controles normais.

A literatura aponta que a positividade na IFI para Chlamydia spp

pode representar uma infecção aguda (IgM) ou exposição passada à

Chlamydia (IgG) ou aquisição passiva de anticorpos por transfusão

sanguínea, transplante de órgãos ou transferência placentária. Muitas

infecções por Chlamydia são assintomáticas ou com o mínimo de

sintomatologia (Swartz e Kraus, 1979). As infecções por C. pneumoniae e

M. pneumoniae não são geralmente identificadas na população saudável,

pois a etiologia das infecções respiratórias é investigada apenas em uma

Discussão

pequena parcela de pacientes, especialmente em casos prolongados, onde

há falha com a terapia convencional ou quando a pneumonia requer

hospitalização (Tuuminen et al., 2000). Estas informações podem explicar

então a frequência semelhante das sorologias nos dois grupos (SBY e

normais).

Os dados da sorologia para Chlamydia spp e Mycoplasma

pneumoniae acrescidos dos resultados de Biologia Molecular (PCR), que

foram negativos para estes micro-organismos, abriram possibilidades

diferentes na interpretação dos resultados observados em nosso estudo.

Com base nas informações da literatura, sugeriu-se então que estas

diferentes estruturas de morfologias semelhantes à Mycoplasma spp e

Chlamydia spp, poderiam representar morfologias atípicas exibidas por

espiroquetas, na tentativa de sobreviverem em meios inadequados de cultivo

(Butler e Blakey, 1975; Murgia e Cinco, 2004). Nestas condições, as

bactérias assumem diferentes morfologias como as bactérias na forma L,

também conhecida como CWDB (Cell Wall Deficient Bacteria); corpos

densos de dupla membrana; bacteroides sem flagelos ou esporos (blebs).

As bactérias na forma L são desprovidas de parede celular e do ponto

de vista morfológico, são idênticas aos Mycoplasma spp (Clasener, 1972;

Onwuamaegbu et.al ,2005; Young, 2007); os corpos densos de dupla

membrana são semelhantes às Chlamydia spp, e os bacteroides lembram

espiroquetídeos. Dentre as condições desfavoráveis de cultivo, que induzem

o surgimento destas estruturas, citam-se as mudanças de nutriente, pH e

presença de antibióticos (Butler e Blakey, 1975; Murgia e Cinco, 2004).

Discussão

Estas bactérias de morfologia atípica, geralmente não são

patogênicas (Domingue e Woody, 1997; Brorson e Brorson, 1998) e

costumam reverter à morfologia original, quando as condições do meio

ambiente voltam a ser favoráveis (Charache,1970).

Fato intrigante foi o encontro pela análise em microscopia óptica (MO)

de campo escuro, no sangue periférico dos indivíduos normais (grupo

controle), a presença de micro-organismos (espiroquetídeos) em cerca de

20% das amostras. Estas estruturas quando analisadas à ME, exibem

formações que lembram Mycoplasma spp, e na verdade, representam

bactérias desprovidas de parede celular (CWDB) (Yoshinari et al., 2009).

A Literatura Médica registra que qualquer bactéria em condições

inadequadas de crescimento, pode sofrer transformação para a forma L,

contudo, a visualização destes micro-organismos na apresentação CWDB

não havia sido registrada ainda em indivíduos normais. Yoshinari et al.

(2009), descreve pela primeira vez, através de microscopia de campo

escuro, estruturas de comportamento latente no sangue periférico de

animais de laboratório e de funcionários do Centro de Bioterismo da FMUSP.

Estas estruturas que lembram espiroquetas, quando analisadas à

microscopia eletrônica, revelaram bactérias com características de

Mycoplasma spp, ou seja, CWDB. Desde que estas formas L de bactérias

não são patogênicas, sugeriu-se que os animais e funcionários do Centro de

Bioterismo, estavam contaminados por micro-organismos latentes saprófitas.

Verificou-se também, que a frequência de contaminação por espiroquetídeos

no sangue periférico estava dependente das condições de higiene locais.

Discussão

Assim, quando visualizamos grande quantidade de espiroquetídeos no

sangue periférico de pacientes com SBY (frequência de cerca de 90%),

assumimos que, parte dos micro-organismos, são CWDB oriundos de

bactérias da flora saprofítica normal, possivelmente derivados do trato

digestivo e/ou vias respiratórias. Contudo, acreditamos que parte dos

espiroquetídeos visualizados nos pacientes com SBY seja de fato B.

burgdorferi na apresentação atípica. É possível também que, a disfunção

imunológica observada na SBY contribua para o surgimento dos

espiroquetídeos.

Outras formas de bactérias em apresentação vegetativa são descritas

na Literatura Médica, quando espiroquetas são cultivadas em condições

adversas de pH, temperatura ou na presença de antibióticos (Kersten et al.,

1995; Murgia e Cinco, 2004; Austrauskiene e Bernotiene, 2007). As

bactérias desenvolvem alterações estruturais que variam de minúsculos

pontos ou esporos, conhecidos como blebs, até formações que lembram

bactérias alongadas (espiroquetas desprovidas de flagelos?) ou estruturas

semelhantes a corpos densos de dupla membrana semelhantes à Chlamydia

spp (Kersten et al., 1995). É interessante comentar que, morfologias atípicas

de borrelias, têm sido descritas no parênquima cerebral de doentes com

neuroborreliose e em tonsilas (Miklossy et al., 2008; Duray et al., 2005).

As alterações morfológicas encontradas na B. burgdorferi podem

estar associadas com a perda ou inativação de determinados genes

(mutações), que regulam a síntese de flagelos ou lipoproteínas de superfície

(Osp). Embora as mutações nas borrelias sejam raras, existem inúmeras

Discussão

descrições na Literatura (Sadziene et al., 1993; Yang et al., 2000; Malawista

et al., 2000; Motaleb et al., 2004; Derdáková e Lencáková, 2005; Fingerle et

al., 2007).

Por outro lado, modificações genéticas e da expressão proteica

transitórias, ocorrem espontaneamente com a B. burgdorferi, nas fases que

infectam diferentes hospedeiros mamíferos ou carrapatos. Esta variabilidade

na expressão gênica e proteica exibidas pelas borrelias quando da sua

passagem pelos diferentes hospedeiros, são de cunho adaptativo, de modo

a permitir a sua sobrevivência e disseminação nos diferentes organismos

infectados (Gilmore et al., 2001; Tilly et al., 2006). Por exemplo, a B.

burgdorferi quando infecta hospedeiro mamífero é capaz de sintetizar um

fator proteico, que neutraliza a ação lítica bactericida do sistema

complemento (Babb et al., 2006).

Espiroquetas do complexo B. burgdorferi sensu lato mantêm estreita

relação de dependência com carrapatos do complexo Ixodes ricinus, tanto

que todas as espécies de vetores transmissores da DL nos EUA e Eurásia

pertencem ao gênero Ixodes (Krupka et al., 2007; Hovius et al., 2007). Como

comentado anteriormente, existem inúmeras interações em níveis

moleculares entre a B. burgdorferi e os hospedeiros vertebrados e

invertebrados, especialmente quanto à expressão ou supressão das

lipoproteínas da membrana externa (Osp A, B, C, D, E, F) (Gilmore et al.,

2001; Tilly et al., 2006; Barbour et al., 2006; Krupka et al., 2007; Palmer et

al., 2009).

Discussão

É possível supor então que, a falta de vetores do gênero Ixodes,

habitualmente presentes no Hemisfério Norte, tenha originado borrelias de

morfologia atípica, adaptadas à sobreviver em condições geográficas e de

biodiversidade próprias do território brasileiro.

Embora de maneira preliminar, demonstramos que no Brasil, temos

carrapatos dos gêneros Rhipicephalus infectados com B. burgdorferi,

confirmados através da PCR. Interessante que, nos EUA é descrita a

enfermidade de Masters ou STARI, causada por B. lonestari, incultivável em

meio BSK, e transmitida pelo Amblyomma americanum. A diferença é que a

zoonose americana causa apenas lesão de pele (EM), enquanto a SBY

origina lesões cutâneas e complicações sistêmicas.

Mutações em determinados genes implicam na ausência ou na

síntese incompleta de determinadas proteínas como as de flagelo e as de

membrana externa (outer superface proteins – Osp) (Sal et al., 2008). O fato

dos pacientes com SBY terem sido negativos nos ensaios de PCR para

gene flagelina da Borrelia spp (FlaB), pode justificar porque a B. burgdorferi

encontrada no país encontra-se na forma bacteroide sem flagelos, visto que

espiroquetas desprovidas deste gene perdem a morfologia helicoidal, típica

das borrelias (Motaleb et al., 2000).

A parede bacteriana, assim como a camada externa da B. burgdorferi,

constituída de peptideoglicanos contribuem na contenção do citoplasma e

são fatores importantes que determinam a morfologia bacteriana (Denome et

al., 1999). Portanto, o insucesso em corar espiroquetídeos vistos nas nossas

culturas e no sangue periférico, estaria ligado também à este fator, pois os

Discussão

métodos de Gram, Panótico e Rosenfeld são utilizados para a coloração de

parede (constituída de peptideoglicanos) e, na ausência desta, os resultados

acabam sendo negativos. Este achado reforça a hipótese de que, os

espiroquetídeos visualizados à microscopia de campo escuro nos indivíduos

normais e com SBY, sejam estruturas desprovidas de parede celular, a

exemplo dos Mycoplasma spp. Justifica também, porque crescem em meio

SP-4, ideal para desenvolvimento de Spiroplasma spp, que pertencem ao

grupo dos Mollicutes, ou seja, micro-organismos desprovidos de parede e

com membrana celular rica em colesterol. Estudos anteriores realizados no

LIM-17 do HCFMUSP por Costa (1998) e Barros (2000) já haviam mostrado

que primer derivado do gene codificador da proteína OspA, fora ineficaz para

identificar B. burgdorferi no Brasil. Este dado reforça a hipótese de que a B.

burgdorferi presente no país, seria deficiente em constituintes da membrana

externa da espiroqueta.

A hipótese de que a SBY seja causada pela B. burgdorferi de

morfologia atípica, sem flagelos e desprovida de inúmeros constituintes da

membrana externa, possivelmente consequente à deleção ou repressão

gênica, também explica a baixa sensibilidade dos testes sorológicos para a

B. burgdorferi de origem americana. Como mostramos no presente trabalho,

verificamos que apenas 65% dos doentes do grupo A foram positivos, contra

16% de positividade do grupo controle. Estes resultados mostram que,

embora úteis, do ponto de vista prático, os testes de ELISA e WB devem ser

interpretados com muita cautela, pela ocorrência de falsos negativos e

positivos.

Discussão

No intuito de estudar o comportamento das borrelias quando

semeadas em diferentes meios, resolvemos cultivar B. burgdorferi G39/40

de origem americana, em meio BSK e em meio SP4, considerando-se o

primeiro como adequado e o segundo impróprio ao desenvolvimento de

borrelias. As bactérias cultivadas em meio BSK cresceram bastante e foram

coradas adequadamente com Panótico e Acridine orange. Já a cultura de

B. burgdorferi G39/40 semeada em meio SP-4, não atingiu o nível de

crescimento esperado, e a morfologia das bactérias apresentou-se alterada,

com surgimento de formações atípicas de diferentes formas e tamanhos.

Este experimento reproduz in vitro, a grande capacidade das borrelias se

modificarem morfologicamente e de se adaptarem aos meios inadequados

de cultivo, transformando-se em formas vegetativas, como as formas

císticas.

Consideramos que, a B. burgdorferi encontrada no Brasil, seja o

resultado de mutações que originaram bactérias morfologicamente atípicas,

com expressões gênicas e proteicas diferentes da encontrada no Hemisfério

Norte. Estas modificações foram necessárias, objetivando a adaptação das

espiroquetas às condições de sobrevida em hospedeiros vertebrados e

invertebrados encontrados no país. Neste sentido, Derdáková e Lencáková

(2005) comentam que variações geográficas e ecológicas, podem

determinar o surgimento de diferentes genoespécies de B. burgdorferi,

consequente à ocorrência de grande variabilidade de hospedeiros

vertebrados e carrapatos, determinando a múltipla diversidade quanto à

Discussão

patogenicidade, manifestação clínica, procedimentos diagnósticos

laboratoriais e mecanismos de transmissão.

A antibioticoterapia com penicilina, doxiciclina e ceftriaxona é um

procedimento considerado adequado ao tratamento da borreliose de Lyme.

Apesar da sobrevivência de borrelias após antibioticoterapia ser negada por

maioria de pesquisadores, em alguns pacientes, tem sido mostrado que a

borrelia pode sobreviver nos tecidos, fazendo com que estes pacientes

tenham um quadro de recidiva da doença. Um trabalho realizado por Kersten

et al.(1995), mostrou os diferentes modos de degeneração da B. burgdorferi,

que se segue após a inoculação de vários antibióticos in vitro, obtendo a

formação de grânulos e estruturas císticas durante a exposição aos

medicamentos (Figura 19).

Figura 19 - Formação de estruturas císticas em cultura de B. burgdorferi

após exposição aos antibióticos, onde: A- Formação de vesículas (forma L)

após 24 horas de exposição ao ceftriaxona; B-Desenvolvimento de corpo

esférico após 96 horas de exposição à doxiciclina (cisto); C- Vesícula (forma

L) aderindo em outra superfície da espiroqueta após 24 horas de exposição

à penicilina (Kersten et al., 1995).

Discussão

As fotos da Figura 19 quando comparadas com os nossos resultados

à ME (Figura 20), são praticamente idênticas do ponto de vista morfológico,

mostrando que as diferentes estruturas encontradas no sangue periférico de

pacientes com SBY, representariam estágios morfológicos distintos da

Borrelia spp. O fato da B. burgdorferi presente no Brasil jamais ter sido

cultivada ou isolada na sua forma espiralada e nem ser identificada através

de técnicas de biologia molecular preconizadas no Hemisfério Norte, sugere

que o micro-organismo responsável pela SBY, seja uma bactéria mutante

estável, que incorporou em definitivo as modificações genéticas, bioquímicas

e morfológicas, adquiridas para a sua sobrevivência no país.

Figura 20 - Amostras visualizadas à ME onde: A- Sangue de paciente com

SBY semeado em SP-4, na qual pode-se visualizar a formação de vesícula

(cisto); B-Sangue periférico de paciente com SBY, onde visualiza-se a

formação de um corpo esférico denso semelhante à Chlamydia spp; C-

Sangue de paciente com SBY semeado em SP-4, onde pode-se observar

uma formação semelhante à Mycoplasma spp acima de uma espiroqueta.

Preac-Mursic et al. (1986) observaram em culturas de B. burgdorferi

contendo antibióticos, formação de “blebs” (expansões circulares originadas

de espiroquetas), estruturas esféricas e grânulos (Figura 21).

Discussão

Figura 21 - Formação de ”blebs” e grânulos em cultura de B. burgdorferi

após 24 horas de incubação com ceftriaxona (Preac-Mursic et al., 1986).

A imagem acima pode ser comparada com a nossa cultura de B.

burgdorferi semeada em meio SP-4, não apropriado para o crescimento

bacteriano, que mostra a formação de corpos arredondados presos às

espiroquetas (Figura 22). Interessante que, estas formas císticas (“blebs”)

representam uma forma de defesa do micro-organismo, pois em condições

adequadas de cultivo, cada um destes cistos pode reproduzir uma nova

espiroqueta.

Figura 22 - Cultura de B. burgdorferi semeada em meio SP-4, corada pelo

Panótico (1000X).

“bleb”

Discussão

As formas atípicas vegetativas de borrelias e treponemas podem

estar associadas com infecções de caráter crônico e recorrente, pelo fato

destas estruturas serem resistentes aos antibióticos e serem capazes de

burlar o sistema imunológicos dos hospedeiros, pois tem sobrevida

intracelular (Clasener, 1972). Balfour em 1911 relatava a presença de

formas císticas intracelulares em punções de fígado, baço e pulmão de aves

com espiroquetose, enquanto outros estudos mais recentes mostram que as

borrelias são micro-organismos com capacidade de infectar diferentes

células, como as endoteliais (Figura 23) (Comstock et al., 1989; Thomas et

al., 1989; Ma et al., 1991), mononucleares e fibroblastos (Georgilis et al.,

1991).

Figura 23 - Microscopia eletrônica mostrando Borrelia burgdorferi penetrando

em células endoteliais (HUVEC), onde: A e B - Células HUVEC em

monocamadas com borrelias intracelulares; C -Borrelia entrando na célula.

As setas indicam a membrana da HUVEC (Comstock et al., 1989).

Ao semearmos a B.burgdorferi G39/40 de origem americana em

células endoteliais, confirmamos os resultados acima mostrados. Outro fato

notável foi a mudança da morfologia da borrelia inoculada, que perdeu o seu

aspecto helicoidal (Figura 24).

Discussão

Figura 24 - Cultura de Borrelia burgdorferi (cultivada em BSK) e inoculada

posteriormente em células endoteliais. Visualiza-se espiroqueta de

morfologia atípica no interior da célula endotelial (Enviada à ME após 3 dias

de inoculação das borrélias na cultura de células endoteliais. Aumento de

7200X.)

Muito interessante foi o estudo realizado por Duray et al. (2005), que

ao inocular B. burgdorferi em cultura de tecido tonsilar, observou que as

bactérias invadem e colonizam as células, originando espiroquetas de

morfologia modificada, incluindo presença de estruturas císticas (Figura 25).

Discussão

Figura 25 - Microscopia Eletrônica de B. burgdorferi inoculada em tecido

tonsilar. Setas indicam numerosas espiroquetas de morfologia anômala (A) e

formas císticas de B. burgdorferi presentes no interior de células (Duray et

al., 2005).

Resolvemos então cultivar células endoteliais, para torná-las

substrato de crescimento dos espiroquetídeos, na tentativa de simular tecido

humano vivo, visto que, os espiroquetídeos identificados nos pacientes com

SBY, não se desenvolviam em meio BSK ou cresciam por pequeno período

de tempo no meio SP-4.

Conseguimos demonstrar que, a inoculação direta de espiroquetídeos

visualizados nos sangue periférico de pacientes com SBY, assim como os

previamente semeados em meio SP-4, conseguiram invadir células

endoteliais. Curiosamente, assumiram morfologias de micro-organismos que

Discussão

lembravam espiroquetas, Mycoplasma spp e Chlamydia spp, na verdade,

morfologias atípicas da Borrelia spp, conforme comentado anteriormente.

O fato do sequenciamento mostrar que a Borrelia causadora da

SBY pertence ao complexo Borrelia burgdorferi sensu lato, aliado ao fato de

jamais termos conseguido o isolamento das bactérias em meio BSK,

sugerem fortemente a hipótese de que no Brasil, a enfermidade é causada

por espiroquetas na apresentação latente. Além da visualização de

morfologias na apresentação vegetativas à ME, os dados clínicos,

laboratoriais e terapêuticos corroboram com esta descoberta inusitada.

Definimos hoje a Síndrome de Baggio-Yoshinari como zoonose

emergente, até o momento, encontrada apenas no Brasil, causada pela

Borrelia burgdorferi na apresentação morfológica atípica, transmitida por

carrapatos não pertencentes ao complexo Ixodes ricinus, responsável pelo

desenvolvimento de manifestações clínicas semelhantes à Doença de Lyme,

exceto pela grande frequência de sintomas recorrentes e complicações

imuno-alérgicas. Este conceito implica em afirmar que, uma mesma bactéria,

quando submetida às diferentes condições de sobrevivência, como, por

exemplo, a biodiversidade da fauna ou variações geográficas, pode

desencadear enfermidades distintas.

A presente pesquisa tem o mérito de elucidar o agente etiológico da

SBY, porém aborda temas altamente polêmicos, jamais comentados

anteriormente. Acreditamos que a SBY seja um modelo de enfermidade

extremamente importante no conhecimento da relação hospedeiro-infecção

e sua conexão com o desencadeamento de mecanismos autoimunes.

7. Conclusões

Conclusões

1- A Borrelia burgdorferi sensu lato é o agente etiológico da Síndrome

Baggio-Yoshinari.

2- Embora preliminar, podemos dizer que os vetores transmissores da

SBY não pertencem ao complexo Ixodes ricinus, pois a PCR realizada

com fragmento do gene flgE mostrou-se positiva em carrapatos do

gênero Rhipicephalus.

3- Embora preliminar, podemos dizer que os animais domésticos como

cavalos e bovinos representam potenciais animais reservatórios da

Borrelia burgdorferi no Brasil.

4- Na SBY os achados epidemiológicos, clínicos, laboratoriais e de

terapêutica são muito distintos da DL, permitindo afirmar que, no

Brasil existe uma nova zoonose emergente transmitida por

carrapatos.

5- Sugere-se que a SBY seja causada por espiroquetas na morfologia

atípica, de vida intracelular, justificando a longa persistência do micro-

organismo no homem e explicando os episódios de recorrência

clínica.

6- O emprego dos primers para identificação do fragmento do gene flgE,

responsável pela síntese do gancho flagelar, permitiu a identificação

do agente etiológico da SBY, mas não é procedimento laboratorial útil

no auxílio diagnóstico.

8. Anexos

Anexos

8.1. Aprovação da CAPPesq

9. Referências bibliográficas

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Artigo .

10. Apêndices

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10.1. Comprovante de submissão do artigo para publicação

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