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ÉRICA ABJAUDI CARDOSO
ALTERAÇÕES ESTRUTURAIS DE MÚSCULO
ESQUELÉTICO SUBMETIDO A ALONGAMENTO PASSIVO,
EM RATOS
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
BELO HORIZONTE
2006
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ÉRICA ABJAUDI CARDOSO
ALTERAÇÕES ESTRUTURAIS DE MÚSCULO
ESQUELÉTICO SUBMETIDO A ALONGAMENTO PASSIVO,
EM RATOS
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Biologia Celular, do Instituto
de Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Minas Gerais, como requisito
parcial para a obtenção do grau de
Mestre em Biologia Celular.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
BELO HORIZONTE
2006
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Esta dissertação foi realizada no Laboratório de Neurobiologia do Departamento de
Morfologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas
Gerais, sob a orientação da Profa. Elizabeth Ribeiro da Silva e co-orientação da
Profa. Conceição Ribeiro da Silva Machado, com o auxílio do CNPq e Capes.
Aos meus pais, meu irmão e,
ao meu marido: faróis
constantes nesta caminhada.
AGRADECIMENTOS
Primeiro, agradeço a Deus, pela oportunidade do aprendizado e pela força
necessária para superar todos os obstáculos.
Aos meus pais, Antônio e Nágila, fontes inesgotáveis de amor e dedicação. As
palavras são pequenas para expressar toda a minha gratidão!
Ao meu irmão, Dri, sempre companheiro e amigo leal.
Ao meu marido, Rommel Pires, pelo constante apoio e afeto imensuráveis. Obrigada
por suportar fielmente todos os meus momentos de tensão e minha falta de tempo
para você!
À minha querida sogra, prof
a
Sueli Pires, pela disponibilidade inesgotável.
À minha orientadora, prof
a
Elizabeth Ribeiro da Silva, por abrir as portas do
laboratório para mim e permitir que este trabalho fosse realizado.
À minha co-orientadora, prof
a
Conceição Machado, pelos conselhos imprescindíveis
e pelo exemplo de força inquestionável.
À prof
a
Patrícia Massara Martinelli, pela colaboração valiosa.
Aos técnicos Carlos Henrique e Luíza, por terem me ajudado nas técnicas
laboratoriais.
Aos meus amigos da pós-graduação em Biologia Celular, principalmente a Dani, o
Talles, a Patricinha, a Andréa e a Tina, que tantas vezes me ajudaram neste
trabalho. Especialmente, à Ceci, pela ajuda e pelo apoio tão importante durante
estes dois anos e meio.
Aos meus amigos externos ao ICB, pelos corações generosos e pelos ouvidos
incansáveis durante todo este tempo. Os nomes de vocês prefiro deixar guardado
em meu coração...
Aos membros do NBA que, tantas vezes, dispuseram de seu tempo para me ajudar.
Ao professor Dr. Paulo Iscold, cuja colaboração foi imprescindível para o
desenvolvimento deste trabalho.
Ao Centro de Bioterismo, pelo fornecimento de ratos, objeto de nosso estudo.
À Iraídes de Jesus, pela boa-vontade e disposição em me ajudar sempre.
Enfim, a todos vocês que, de alguma forma, colaboraram para a conclusão deste
trabalho. A vitória é nossa!
“UMA MADEIRA FLEXÍVEL CURVA-SE COM O VENTO E NÃO SE QUEBRA. A
ÁRVORE RÍGIDA QUE RESISTE AO VENTO CAI VÍTIMA DE SUA PRÓPRIA
INSISTÊNCIA EM CONTROLAR-SE”.
(BORYSENKO, 1999)
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- Relação comprimento-tensão de musculatura esquelética.....................16
FIGURA 2 - Organização das proteínas acessórias do sarcômero.......................... 17
FIGURA 3 - Foto do sistema de alongamento montado pelos professores do
Departamento de Engenharia Mecânica....................................................................28
FIGURA 4-Desenho esquemático do sistema utilizado para alongamento do músculo
tibial anterior, vista lateral...........................................................................................29
FIGURA 5-Foto do sistema utilizado para alongamento do músculo tibial
anterior.......................................................................................................................30
FIGURA 6 - Secção histológica de músculo tibial anterior controle (A) e submetido a
oito sessões de alongamento passivo (B e C)...........................................................40
FIGURA 7 - Fotomicrografias de secções de músculo tibial anterior controle (A e C) e
submetido alongamento passivo por 8 semanas consecutivas (B e D).....................41
FIGURA 8 - Comprimento médio do ventre do músculo tibial anterior de ratos com 17
semanas de idade submetidos a 8 sessões de alongamento passivo, com duração
de 20 minutos.............................................................................................................42
FIGURA 9 - Diâmetro transversal médio do músculo tibial anterior de ratos com 17
semanas de idade submetidos a 8 sessões de alongamento passivo, com duração
de 20 minutos.............................................................................................................43
FIGURA 10 – Comprimento dos sarcômeros do músculo tibial anterior de ratos com
17 semanas de idade submetidos a 8 sessões de alongamento passivo, com
duração de 20 minutos...............................................................................................44
FIGURA 11 – Número de bandas A/100μm em fibras do músculo tibial anterior de
ratos com 17 semanas de idade submetidos a 8 sessões de alongamento passivo,
com duração de 20 minutos.......................................................................................45
FIGURA 12 - Fibra muscular dissociada pela técnica de William & Goldspink (1971)
para visualização de estriação transversal.................................................................46
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Peso corporal médio (g) ± d.p. de ratos com 9 a 16 semanas de idade
submetidos a 8 sessões semanais, com duração de 20 minutos, de alongamento
passivo do músculo tibial anterior direito....................................................................35
TABELA 2 – Média do deslocamento linear (mm) ± d.p. do músculo tibial anterior de
ratos, com 9, 13 e 16 semanas de idade, após 1, 4 e 7 sessões de alongamento
passivo, com duração de 15 minutos.........................................................................36
TABELA 3 – Alongamento médio relativo em relação ao tempo 0 (%) do músculo
tibial anterior submetido a alongamento passivo por 1, 3 e 7 semanas, de ratos com
9, 13 e 16 semanas de idade.....................................................................................37
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ...................................................................... 14
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL..............................................................................................25
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................... 25
3 METODOLOGIA
3.1 OBTENÇÃO E MANUTENÇÃO DE RATOS HOLTZMAN.................................. 27
3.2 PROTOCOLO DE ALONGAMENTO...................................................................27
3.3 TÉCNICAS HISTOLÓGICAS E IMUNOHISTOQUÍMICAS..................................31
3.3.1 TÉCNICA HISTOLÓGICA................................................................................ 32
3.3.2 TÉCNICA IMUNOHISTOQUÍMICA...................................................................32
3.4 TÉCNICAS HISTOMÉTRICAS.............................................................................33
3.4.1 DIÂMETRO DE FIBRAS MUSCULARES......................................................... 33
3.4.2 COMPRIMENTO E NÚMERO DE SARCÔMEROS......................................... 33
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA..................................................................................... 34
4 RESULTADOS
4.1 PESO CORPORAL..............................................................................................36
4.2 VARIAÇÃO DO DESLOCAMENTO LINEAR
DO MÚSCULO TIBIAL ANTERIOR.......................................................................... 37
4.3 ANÁLISE HISTOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA......................................... 38
4.4 ANÁLISES HISTOMÉTRICAS............................................................................ 42
4.4.1 COMPRIMENTO DO VENTRE MUSCULAR................................................... 42
4.4.2 DIÂMETRO TRANSVERSAL DAS FIBRAS MUSCULARES........................... 43
4.4.3 COMPRIMENTO DO SARCÔMEROS............................................................. 44
4.4.4 NÚMERO DE BANDAS A................................................................................ 45
5 DISCUSSÃO.......................................................................................................... 48
6 CONCLUSÕES...................................................................................................... 58
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................... 60
1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
O músculo esquelético tem sido objeto de estudo, há várias décadas, de
pesquisas associadas a diferentes campos do conhecimento. Este tecido realiza
tanto um trabalho dinâmico, que permite a locomoção e o posicionamento dos
segmentos corporais no espaço, quanto um trabalho estático, responsável pela
manutenção da postura corporal (McCOMAS, 1996). Patologias de origem diversa –
genéticas, distróficas, ortopédicas e posturais – podem acometer este tecido e têm
ampliado o interesse por sua organização estrutural e funcional.
A unidade estrutural contrátil do músculo esquelético é a fibra muscular
esquelética ou miônio, célula cilíndrica - com 1 a 30 cm de comprimento e diâmetro
de 10 a 100 μm - em que os vários núcleos se dispõem em posição subsarcolêmica
e com numerosas miofibrilas no citoplasma (McCOMAS, 1996).
Um segundo tipo celular da linhagem miogênica é a célula satélite,
mononucleada, sem miofibrilas e que se apóia na membrana basal do miônio. Essas
células persistem na fase G0 do ciclo celular, mas, em resposta a determinados
estímulos, podem entrar no ciclo mitótico, proliferar e se fundir ao miônio. Desse
modo, contribuem para o crescimento, reparo e hipertrofia pós-natal do músculo
esquelético. Quando em mitose, as células satélites expressam, temporariamente,
moléculas específicas como os fatores de transcrição da família MyoD, as isoformas
da cadeia pesada da miosina e a desmina (proteína de filamento intermediário),
tanto in vitro quanto in vivo. O MyoD é um membro da família de proteínas cuja
expressão ectópica pode induzir células não-miogênicas a se submeterem à
diferenciação miogênica. A família MyoD compreende MyoD, miogenina e Myf-5.
Todas possuem um domínio protéico conservado, o motivo bHLH e podem ativar a
expressão de genes musculares específicos. Cada membro da família pode regular
um estágio diferente do desenvolvimento muscular. Myf-5 e MyoD parecem agir no
estágio inicial da diferenciação dos mioblastos e a miogenina no estágio mais tardio
do mesmo (KOISHI et al., 1994; FUCHTBAUER et al., 1992).
As células satélites também expressam as moléculas de adesão NCAM e M-
caderina, no estado quiescente. A M-caderina está presente em células satélites de
músculos normais, desnervados ou em regeneração (KUSCHEL et al., 1999).
Os miônios apresentam, no citoplasma, miofibrilas cilíndricas, de 1 a 2 μm de
diâmetro que, freqüentemente, são tão longas quanto a própria célula muscular.
Estas miofibrilas consistem de pequenas unidades contráteis repetidas, em série, –
sarcômeros -, cada um com comprimento de 2,2 μm, que conferem à miofibrila
esquelética sua aparência estriada (Alberts et al., 2004). Cada sarcômero é formado
por filamentos finos e espessos. Os primeiros são compostos de actina e proteínas
associadas, sendo ligados por uma de suas extremidades à linha Z, em cada
extremidade do sarcômero. As extremidades livres dos filamentos finos se estendem
em direção ao centro do sarcômero, onde se sobrepõem aos filamentos espessos.
Estes, por sua vez, são formados a partir de isoformas de miosina II específicas de
músculo (Alberts et al., 2004). As proteínas do disco Z estão em troca dinâmica com
um pool citoplasmático – incluindo até mesmo as proteínas previamente
caracterizadas como componentes estruturais estáticos do disco Z, como a α-
actinina e a miotilina (LANGE et al., 2006).
Sabe-se que a força ou a tensão exercida por um determinado músculo
depende de seu comprimento. As alterações na tensão quando a fibra é alongada
ou encurtada devem-se, primariamente, às alterações estruturais no sarcômero. A
tensão isométrica máxima pode ser exercida quando os sarcômeros estão próximos
ao seu comprimento de repouso (2.0 a 2.25 μm). Se os sarcômeros são alongados,
há menor número de conexões entre os filamentos e a tensão ativa diminui. Com o
comprimento do sarcômero próximo a 3.6 μm não há sobreposição entre os
filamentos finos e espessos, e, então, não há tensão ativa. Se o sarcômero se
encurta muito aquém do seu comprimento de repouso, a tensão ativa diminui. Com o
comprimento do sarcômero menor que 1.65 μm, os filamentos grossos tornam-se
próximos da linha Z e a tensão diminui bruscamente (McCOMAS, 1996).
Na figura 1 podemos comprovar o exposto acima. À medida que o sarcômero
é alongado, assumindo um comprimento além do comprimento de repouso, ocorre
rápida redução da tensão ativa, que é aquela gerada pelos componentes contráteis
do sarcômero, ou seja, basicamente os miofilamentos de actina e miosina.
Concomitante a este processo ocorre aumento da tensão gerada pelos
componentes passivos, que são os elementos elásticos em série (tendão e titina) e
em paralelo (endomísio, perimísio e epimísio) do sarcômero. O resultado disso é o
aumento da tensão total gerada pelo músculo, à medida que é alongado. Entretanto,
à medida que o músculo é encurtado, ou seja, assume um comprimento aquém do
seu comprimento de repouso, ocorre redução da tensão total gerada por ele, agora
representada apenas pela tensão ativa, uma vez que a contração muscular é um
processo ativo do músculo em questão.
Figura 1 – Relação comprimento-tensão de musculatura esquelética
Quando uma célula muscular esquelética não ativada é passivamente
alongada, a força passiva desenvolvida restaura o comprimento muscular após o
término do alongamento. Durante uma contração ativa, a força passiva do
comprimento do sarcômero ao longo das células musculares limita a assimetria das
bandas A dentro do sarcômero. Se a célula é exposta a ciclos repetidos de
alongamento e relaxamento, a força passiva é utilizada para aumentar o
comprimento dos sarcômeros, de modo que, com o passar do tempo, a célula entra
em fadiga. Quando uma célula muscular relaxada é alongada rapidamente até um
certo comprimento do sarcômero, a força passiva diminui em função do tempo de
manutenção do alongamento, em um processo conhecido como relaxamento ao
estresse. A fadiga mecânica e o relaxamento ao estresse provavelmente derivam do
mesmo mecanismo: reorganização nas estruturas que determinam a força muscular
passiva dependente do tempo e da freqüência do alongamento. Uma das principais
determinantes da força muscular passiva é a proteína intrasarcomérica filamentosa,
titina. É uma proteína de 3,6 milhões de daltons, que se estende da linha Z à linha M,
na metade do sarcômero. Está ancorada nas linhas Z e M e aos filamentos grossos
na banda A. O segmento da banda I da molécula é construído de domínios tipo
imunoglobulinas ligados em série e intercalados por seqüências únicas, incluindo um
domínio rico em prolina, glutamato, valina e lisina. Durante o alongamento, a tensão
passiva é gerada pela extensão do segmento da banda I da titina. O segmento da
banda A é composto primariamente de repetições de diferentes imunoglobulinas e
domínios tipo fibronectina, e de regiões menos regulares que se conectam aos
segmentos da banda I e linha M. O segmento da banda A não participa na geração
de força passiva em condições fisiológicas. Esta porção parece prover uma dobra
estrutural responsável pela ligação com o filamento grosso. Quando uma molécula
de titina é rapidamente alongada e mantida em um dado comprimento, a titina pode
perder a elasticidade, a exemplo do que ocorre com toda a célula muscular
(KELLERMAYER et al., 2001).
A figura 2 mostra um desenho esquemático simplificado da organização do
sarcômero, incluindo a molécula de titina.
Figura 2 – Organização das proteínas acessórias do sarcômero (ALBERTS et al, 2004).
Em humanos, o comprimento máximo dos músculos pode ser avaliado,
indiretamente, pela medida do ângulo de amplitude do movimento passivo máximo
da articulação. Esta amplitude de movimento (ADM) é medida com auxílio de um
goniômetro. Entretanto, não pode ser considerada uma medida absoluta do
comprimento de um músculo porque outros fatores, como a própria estrutura
articular e a ação de músculos antagonistas, podem interferir na avaliação da ADM
(GAJDOSIK, 2001).
A ADM depende da mobilidade e da flexibilidade dos tecidos relacionados
com a articulação – músculos, tecido conjuntivo e pele – como também da
mobilidade articular. Esta ADM normal, livre de restrições e de dor, é fundamental
para execução da maioria das tarefas cotidianas funcionais, assim como atividades
ocupacionais e recreativas (KISNER & COLBY, 1998; 2005).
Como nossos grupos musculares passam em ponte sobre as articulações,
todo músculo exageradamente encurtado comprime a articulação específica que ele
sustenta. Paradoxalmente, cada vez que se tornam hipertônicos, os músculos que
deveriam nos erigir, nos achatam (SOUCHARD, 1996).
De acordo com SAHRMANN (2002), a rigidez passiva e o comprimento
muscular são propriedades que contribuem para a estabilidade postural, uma vez
que durante a postura ortostática relaxada, o alinhamento articular é mantido por
estas propriedades. A posição correta dos segmentos corporais contribui para a
realização de movimentos adequados, minimizando a sobrecarga sobre as
estruturas articulares e evitando o surgimento de processos patológicos decorrentes
de disfunções do movimento. Alterações no alinhamento estão associadas a
mudanças no comprimento e na rigidez muscular, determinando a postura de
repouso da articulação.
De acordo com KENDALL et al. (1995), a postura pode ser definida como o
arranjo relativo das partes do corpo. Para estes autores, “a boa postura é o estado
de equilíbrio muscular e esquelético que protege as estruturas de suporte do corpo
contra lesão ou deformidade progressiva, independentemente das atitudes
(agachada, ereta, deitada) em que essas estruturas estão trabalhando ou
repousando”. Sob tais condições, os músculos funcionam mais eficientemente e
posições ideais são proporcionadas para os órgãos torácicos e abdominais.
Segundo SOUCHARD (1996), o sistema músculo-esquelético não só
determina a forma do corpo, como também influencia suas funções, condiciona os
movimentos e altera o psiquismo. Portanto, sua deformação é dispendiosa em
energia e perturba, obrigatoriamente, a sensibilidade. Reencontrar a harmonia das
formas é, então, bem mais que um desejo estético.
Em Reeducação Postural Global (RPG) busca-se a restituição das amplitudes
de movimentos articulares normais, que traduzem um comprimento muscular
próximo ao de repouso. O fisioterapeuta que trabalha com RPG guia-se a cada
instante pela busca da perfeição morfológica.
A flexibilidade é definida como a habilidade em mover uma articulação ou
articulações, utilizando toda a amplitude do movimento, sem restrição e sem dor. A
flexibilidade depende da extensibilidade dos músculos, e permite que os mesmos
cruzem uma articulação para conter ou ceder a uma força de tração. Geralmente, o
termo flexibilidade é usado para referir-se mais especificamente à habilidade da
unidade musculotendínea em alongar-se, enquanto um segmento corporal ou
articulação se move através de toda a amplitude de movimento (KISNER E COLBY,
2005).
Flexibilidade é, então, um resultado puro e simples do alongamento. Ela é
limitada primariamente pelos seguintes fatores: elasticidade dos tecidos; tensão e
força musculares; coordenação motora; estruturas óssea e articular. Para aumentar
a ADM de certa articulação, o alongamento deve aumentar a extensibilidade dos
tecidos, reduzir a tensão muscular e aumentar a coordenação dos segmentos
corporais envolvidos e a força do grupo muscular agonista (ALTER, 1999).
A flexibilidade tem importância qualitativa no desempenho desportivo e lúdico
do ser humano. Ela é uma qualidade física freqüente no cotidiano de diversas
atividades. É importante dispor de um bom nível de flexibilidade nos segmentos
musculares. Para cada atividade e para cada pessoa existe um nível ótimo de
flexibilidade nos segmentos musculares. Esse nível está relacionado às exigências
que esta prática exerce sobre o aparelho locomotor e a estrutura dos seus
componentes (FARINATTI, 2000).
À medida que o músculo perde sua flexibilidade normal, ocorre também uma
alteração na relação comprimento-tensão do músculo. As limitações na ADM
articular devido a contraturas (encurtamento adaptativo) podem ser tratadas com
alongamento passivo (KISNER E COLBY, 2005).
Com o treinamento da flexibilidade, muitos benefícios são atingidos: melhora
da aptidão corporal, postura e simetria, relaxamento muscular, relaxamento de
estresse e de tensão e, principalmente, aumento da eficiência do movimento
(ALTER, 1999).
A relação entre flexibilidade e boa postura é essencialmente teórica e clínica.
Dessa forma, acredita-se que um desequilíbrio no desenvolvimento muscular e uma
perda de flexibilidade em certos grupos musculares podem contribuir para uma pior
postura. A protusão de ombros, por exemplo, tem sido associada com uma menor
flexibilidade dos músculos peitorais e menor força muscular dos músculos adutores
da escápula (rombóides e trapézio médio).
Já o limite elástico é o menor valor da força requerida para produzir uma
deformação permanente. Abaixo deste limite, o material retorna ao seu comprimento
original quando a força de deformação é removida. Este alongamento permanente é
também chamado de alongamento plástico ou deformação plástica (KISNER, 2005;
ALTER, 1988).
Pensando nisso, surge uma questão natural: para a flexibilidade ser
desenvolvida, o músculo deve ser alongado até o seu limite elástico ou um pouco
além dele? A maioria dos pesquisadores indica o alongamento até o ponto de
desconforto ou de tensão, mas não de dor. Porém, este ponto estaria aquém ou
além do limite elástico? Embora a literatura não seja conclusiva sobre este assunto,
vários estudos têm mostrado que certos fatores, como tipo e duração da força, irão
determinar se o alongamento será permanente (isto é, plástico) ou se o tecido
retornará ao seu comprimento inicial após a cessação da força.
Segundo ALTER (1988), quando uma força constante, de baixa intensidade,
atua sobre o músculo, por um tempo relativamente longo, ocorre alteração
progressiva no seu comprimento, que poderá permanecer após a interrupção da
força. Já SOUCHARD (1996) considera serem permanentes as alterações induzidas
por estiramentos suaves e prolongados. Essa premissa constitui um dos princípios
básicos da RPG. Todavia, o próprio autor questiona se a manutenção do
comprimento do músculo deve-se à alteração da fibra muscular ou do tecido
conjuntivo. Sabe-se, entretanto, que as incorreções posturais podem tornar os
músculos permanentemente hipertônicos, com conseqüente encurtamento de suas
fibras.
Para aumentar a ADM (ou a flexibilidade) os fisioterapeutas, freqüentemente,
usam o alongamento passivo como meio de aprimorar a excursão dos músculos
relacionados a determinada articulação (DEYNE, 2001). De modo geral, os estudos
realizados com pacientes utilizam protocolos de alongamento diário, por várias
semanas. Nesses estudos, os músculos comumente utilizados são o isquiotibial,
quadríceps femoral, gastrocnêmio; tríceps e bíceps braquiais.
Para BANDY et al. (1997), alongamento do músculo isquiotibial por trinta
segundos, cinco vezes na semana, por seis semanas, é efetivo no aumento da ADM
relacionada às articulações do joelho e do quadril. Entretanto, WILLY et al., (2001)
afirmam que, nessas condições, não há manutenção do ganho de ADM quatro
semanas após a interrupção do programa de alongamento. De acordo com DEPINO
et al. (2000), a ADM ganha, relacionada às mesmas articulações acima, se mantém
por apenas três minutos após a realização de quatro séries consecutivas de
alongamento estático do músculo isquiotibial sustentado por trinta segundos, com
intervalo de quinze segundos entre elas.
Vários estudos têm sido realizados para esclarecer os fatores envolvidos com
o aumento da ADM, utilizando-se pacientes e modelos experimentais. A seguir,
descrevemos os principais resultados obtidos nesta área.
Alguns autores reportam ganho de ADM, após alongamento passivo,
aumentando inclusive o comprimento muscular em repouso, o que ocorreria devido
aos componentes passivos - como o tendão e o tecido conjuntivo - ou ativos - como
a titina e as pontes cruzadas entre actina e miosina - do músculo (TAYLOR et al.,
1990; GAJDOSIK, 2001). O ganho de ADM, após alongamento, é dependente da
temperatura (CHAN et al., 2001).
TAYLOR et al. (1990) realizaram séries consecutivas de alongamentos
passivos com os músculos extensor longo dos dedos e tibial anterior de coelhos,
sustentados por trinta segundos, e observou que a mudança no comprimento
muscular ocorreu nos quatro primeiros alongamentos realizados. A partir daí, não há
mais ganhos neste sentido. CHAN et al. (2001) utilizaram, em seu estudo, dois
grupos compostos de humanos jovens. Ambos os grupos realizaram o alongamento
do músculo isquiotibial através de cinco séries de 30 segundos cada, 3 vezes por
semana; porém o primeiro grupo o fez por 8 semanas e o segundo grupo por 4
semanas. Desta forma, não houve diferença entre a ADM – relacionada às
articulações do joelho e do quadril - ganha entre os dois grupos, mas o grupo que
manteve esse procedimento por apenas quatro semanas apresentou aumento na
resistência passiva correspondente à angulação articular máxima tanto do joelho
quanto do quadril. Sabendo que, nas condições em que há relativamente menor
resistência passiva no fim da ADM, há menor probabilidade de lesão, o protocolo de
alongamento durante 8 semanas seria o mais recomendado.
GAJDOSIK (2001) conclui, em seu estudo de revisão, que a deformação
muscular poderia explicar o aumento imediato na ADM e, portanto, no comprimento
muscular, observado em resposta a procedimentos terapêuticos de alongamento em
seres humanos.
De acordo com DEYNE (2001), também em um estudo de revisão, o aumento
da ADM logo após o alongamento passivo pode ser explicado pelo comportamento
viscoelástico do músculo - uma força de tração pequena, sustentada por um período
longo, resulta em deformação tempo-dependente - e por alterações reversíveis no
comprimento muscular. Esta é a razão biomecânica que pode explicar as alterações,
a curto prazo, reversíveis, no comprimento muscular; no entanto, falha em explicar
as alterações a longo prazo, permanentes.
O uso dos exercícios de alongamento para aumentar a flexibilidade é
comumente baseado na idéia de que isto pode reduzir a incidência, intensidade ou
duração das lesões musculotendíneas e articulares (ALTER, 1999).
A lesão muscular é um fenômeno comum que acompanha os exercícios de
treinamento – de força e alongamento muscular - em humanos e animais. A dor
muscular tardia, tão comum em atletas, é uma manifestação clínica da lesão
muscular (JONES et al., 1986).
Diversos pesquisadores já provaram que as lesões musculares ocorrem
preferencialmente nas regiões mais próximas à junção musculotendínea e que estas
lesões constam de rupturas parciais das fibras musculares, na maior parte dos casos
(TAYLOR et al., 1993; TIDBALL et al., 1993; NOONAN et al., 1994; SUN et al., 1994,
1998; GARRETT, 1996; GAJDOSIK, 2001). De acordo com NIKOLAOU et al. (1987),
a ruptura das fibras musculares ocorre quando a força de tração é superior a 80% do
peso corporal do animal. Esta lesão é seguida de resposta inflamatória e de
processo de cicatrização e reparo tecidual.
Sabe-se, ainda, que em lesões musculares (ruptura total ou parcial da fibra
muscular) decorrentes de alongamento ou de contração excêntrica ocorre aumento
na síntese e liberação de fatores de transcrição como o MyoD, e de fatores de
crescimento como o IGF (Insulin-like Growth Factor) e HGF (Hepatocyte Growth
Factor), além de ativação de células satélites e aumento da síntese protéica e da
expressão gênica como um todo. Há ainda aumento do diâmetro e comprimento da
fibra, além de aumento do peso muscular. Não se sabe se este aumento da fibra
muscular deve-se somente ao aumento do tamanho dos sarcômeros ou também do
número de sarcômeros em cada fibra muscular. Já foi comprovado que o aumento
do comprimento dos sarcômeros é reversível com o término do alongamento
(CAMPIONE et al., 1993; BIGARD et al., 1996; GALLER et al., 1997; SADOSHIMA E
IZUMO, 1997; YANG et al., 1999; ZÁDOR et al., 1999; GOLDSPINK, 1995;
GOLDSPINK et al., 2002; TATSUMI et al., 2002; IKEDA et al., 2003).
De acordo com ACHOUR (2002), o desenvolvimento da flexibilidade depende
da integridade do tecido muscular. Porém, tanto o alongamento passivo quanto o
ativo podem causar rompimento parcial ou total de suas fibras. Acredita-se que, no
rompimento das fibras, as linhas Z dos sarcômeros rompem-se, desorganizando a
estrutura miofibrilar, o que é seguido de edema, dor, infiltração celular,
especialmente de macrófagos e aumento da atividade lisossômica.
MORGAN (1990) propõe aumento do número de sarcômeros em série e
redução do comprimento médio dos sarcômeros como processo adaptativo pós-
lesão induzida por contração excêntrica. Isso foi sustentado por trabalhos feitos por
LYNN e MORGAN (1994) e por LYNN et al. (1998) onde ratos eram exercitados em
uma esteira inclinada e declinada. As fibras submetidas à contração excêntrica
durante uma corrida na descida, tiveram aumento de 11% do número de sarcômeros
após uma semana, comparada com aquelas que foram submetidas à corrida na
subida. Porém, isso tem sido contestado por KOH e HERZOG (1998), pois estes
pesquisadores não encontraram evidências de que o músculo é capaz de se
submeter a um processo de adaptação tão rápido e permanente, ao nível dos
sarcômeros. Afinal, o aumento do número de sarcômeros que ocorre após
imobilização prolongada é rapidamente reversível. Dessa forma, podemos observar
que a literatura é inconclusiva quanto ao aumento do número de sarcômeros
causado pelo alongamento muscular estático.
Há um grande número de estudos biomecânicos de ligamentos e músculos
alongados até o ponto de ruptura, mas pouquíssimos estudos têm determinado o
efeito do alongamento até o limite elástico (antes do ponto de ruptura). ALTER
(1999) sugere a aplicabilidade em seres humanos somente daqueles estudos que
mimetizam protocolos feitos nas clínicas e academias, diariamente, isto é,
alongamentos mantidos por segundos ou minutos e repetidos algumas vezes, mas
nunca aqueles mantidos por dias ou semanas.
Não há estudos sobre as alterações histológicas de músculos submetidos ao
alongamento passivo em condição de ausência de ruptura de fibra muscular. O
nosso trabalho pretende avaliar a ocorrência de alterações histológicas no músculo
tibial anterior submetido a alongamento passivo. Para isso, escolhemos o rato como
modelo experimental, não só pela facilidade de manutenção (REMIE et al., 1990;
GREEN et al., 2002), como também a experiência prévia do Laboratório de
Neurobiologia com esta espécie animal em estudos de lesão e regeneração
muscular na tripanosomíase americana experimental (MALDONADO et al., 2004).
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho é avaliar em ratos Holtzman adultos jovens, as
alterações estruturais do músculo tibial anterior após alongamento passivo,
utilizando um protocolo de alongamento que não induza ruptura de fibra muscular.
Desta forma, pretende-se contribuir para o esclarecimento da seguinte questão: o
alongamento precisa atingir a região plástica da curva de comprimento-tensão para
induzir alterações estruturais no músculo?
Escolhemos, para este estudo, o músculo tibial anterior devido ao fácil
acesso, localização e forma (fusiforme) que facilitam a avaliação do comportamento
biomecânico quando submetido ao alongamento passivo (NIKOLAOU et al., 1987;
TAYLOR et al., 1990).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Em ratos Holtzman adultos jovens (9 semanas de idade), submetidos ao
alongamento passivo do músculo tibial anterior, sustentado por vinte minutos,
durante 8 semanas, pretende-se avaliar:
• a variação linear do alongamento muscular;
• as alterações histológicas do músculo;
• a ocorrência de processo inflamatório e, caso presente, o fenótipo das células
inflamatórias;
• se há aumento do número e/ou do comprimento de sarcômeros;
• se há alteração nas dimensões transversal e longitudinal da fibra muscular.
3 METODOLOGIA
3.1 OBTENÇÃO E MANUTENÇÃO DE RATOS HOLTZMAN
Foram utilizados ratos Holtzman machos fornecidos pelo Centro de
Bioterismo (CEBIO) do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da Universidade
Federal de Minas Gerais (UFMG). Estes animais permaneceram no CEBIO até a
idade de 21 dias, quando foram desmamados e transferidos para o Biotério de
Experimentação do Departamento de Morfologia do ICB/UFMG. Os animais
permaneceram neste Biotério até a época do sacrifício, recebendo ração comercial
Nuvilab CR1 (Nuvital) e água à vontade, em gaiolas de plástico com dimensões de
40x30x18 cm. Estas gaiolas, com dois a quatro ratos em cada uma, foram mantidas
em estante ventilada Alesco, para ratos, à temperatura de 22ºC, em ciclo de 12
horas claro/escuro. Os animais foram pesados semanalmente, antes de cada sessão
de alongamento, e no dia do sacrifício.
Com a idade de 9 semanas, os ratos foram submetidos a alongamento
passivo do músculo tibial anterior, uma vez por semana, durante oito semanas
consecutivas, i.e., da 9ª a 16ª semana de idade (N=15). Os animais deste grupo
foram sacrificados 1, 3 e 7 dias após a última sessão de alongamento; cada um dos
subgrupos com 5 animais, totalizando 15 animais.
Em cada um dos animais, o músculo tibial anterior da perna posterior direita
foi alongado durante 20 minutos. O músculo tibial anterior da perna posterior
esquerda serviu como controle.
3.2 PROTOCOLO DE ALONGAMENTO
Para o alongamento do músculo tibial anterior, adaptamos o protocolo de
NIKOLAOU et al. (1987). Neste protocolo, o alongamento é realizado diretamente no
tendão distal do músculo tibial anterior, exposto após incisão e rebatimento da pele
da perna. Ao término do alongamento, a incisão é fechada e o animal recebe uma
única dose profilática de antibiótico. Em nossos experimentos, optamos por proceder
ao alongamento sem exposição cirúrgica do músculo, para evitar recrutamento de
células inflamatórias e outras alterações histopatológicas. Nossa decisão baseou-se
em experimentos preliminares realizados no Laboratório de Neurobiologia, em que
utilizamos o protocolo original de NIKOLAOU et al. (1987), com exposição cirúrgica
do músculo tibial anterior. Neste estudo preliminar, observaram-se, em todos os
cinco animais deste grupo experimental, edema na perna e inflamação na região da
incisão, a partir do primeiro dia após o alongamento. Adicionalmente, os animais
apresentavam marcha claudicante no período pós-operatório.
Para execução do protocolo de alongamento, adaptado de NIKOLAOU et al.
(1987), contamos com a colaboração dos professores Marcos Pinotti e Paulo Iscold
do Departamento de Engenharia Mecânica da UFMG, para desenvolvimento de um
sistema que permite o alongamento muscular com força e velocidade constantes
(Fig. 3).
Figura 3: Foto do sistema montado pelos professores do Departamento de Engenharia Mecânica,
que permitiu a realização do protocolo de alongamento.
Este sistema é constituído por um dinamômetro unidirecional com célula de
carga eletrônica e medidor de deslocamento. A capacidade da célula de carga é de
1kg com resolução de 10 bits ou aproximadamente 1 grama. Para leitura da célula
de carga utilizou-se um microcontrolador PIC16F877 com transmissão para o
computador através de porta serial padrão RS232 e com velocidade máxima de
aquisição de 800Hz por canal.
Para mensuração do deslocamento utilizou-se um potenciômetro linear com
linearidade menor que 2% com calibração não linear. Seu deslocamento máximo era
de 25 mm e, para aquisição, utilizou-se o microcontrolador com resolução de 10 bits,
com resolução de aproximadamente 0,025 mm. O software de aquisição de dados
foi desenvolvido em ambiente MATLAB. Com este sistema foi possível obter 10
registros por segundo das variações de alongamento muscular ao longo de 20
minutos.
Para serem submetidos ao protocolo de alongamento do músculo tibial
anterior, os ratos foram anestesiados com 2,2,2 tribromoetanol (Aldrich), na dose de
25 mg/100 g de peso corporal, por via intraperitoneal.
Após pesagem, o rato era posicionado, em decúbito dorsal, sobre cortiça
acoplada ao sistema de alongamento. O membro posterior direito era firmemente
preso com linha URSO (número 4), que passava pela roldana e se prendia a uma
pisseta com volume de água correspondente a 80% do peso corporal do rato (Fig. 4
e 5). Esta linha passava sobre o dorso do pé do rato, de maneira que, realizando a
flexão plantar, alongava o músculo tibial anterior da pata posterior direita do rato. É
importante ressaltar que este procedimento era realizado apenas uma vez por
semana com cada rato, durante oito semanas consecutivas, totalizando oito sessões
de alongamento.
Figura 4. Desenho esquemático do sistema utilizado para alongamento do músculo tibial
anterior, vista lateral.
C: célula de carga; R: roldana; Co: cortiça para fixação do rato; P: pisseta com água; M:
membro posterior direito do rato
Figura 5. Foto do sistema utilizado para alongamento do músculo tibial anterior.
Após o término do alongamento, os ratos foram recolocados em suas gaiolas,
onde se recuperavam da anestesia. Não observamos, após cada sessão de
alongamento, edema na perna posterior direita ou marcha claudicante.
3.3 TÉCNICAS HISTOLÓGICAS E IMUNOHISTOQUÍMICAS
No momento do sacrifício, todos os animais foram pesados e anestesiados
com 2,2,2 tribromoetanol (Aldrich) na dose de 25 mg/100 g de peso corporal.
O músculo tibial anterior foi cuidadosamente dissecado e dividido em três
porções longitudinais:
- a porção medial foi imersa em solução de paraformaldeído 4% em tampão
fosfato 0,1M, pH 7,2-7,4, por 24 horas, e a seguir processada para inclusão
em resina à base de glicolmetacrilato;
- a porção lateral foi embebida em “Tissue Tek-OCT Compound” e
imediatamente congelada em gelo seco com acetona comercial e
armazenada em freezer à −80ºC, para posterior identificação de antígenos
por técnica imunohistoquímica;
- a porção central permaneceu inserida na tíbia e na base do primeiro
metatarso. Deste modo, a perna e o pé foram processados de acordo com
Williams e Goldspink (1971), para mensuração de sarcômeros. A peça foi
imersa em solução de glutaraldeído (Sigma) a 2,5% / glicose a 0,5%
(Merck) em tampão fosfato 0,1M, pH 7,2-7,4, por 4 horas. A seguir, a peça
foi transferida para solução de ácido nítrico a 30% (Merck) onde
permaneceu por 24 horas. Durante todo este procedimento, o músculo foi
mantido em sua posição de repouso, mediante a manutenção do pé em
posição neutra de dorsiflexão, minimizando-se a contração e/ou distensão
muscular durante o processo de fixação química. A porção central do
músculo tibial anterior foi, então, retirada de sua inserção óssea e estocada
em solução de glicerol a 50% (Merck) em água.
Antes de o músculo tibial anterior ser dissecado, mediu-se o comprimento do
ventre muscular usando régua de precisão. Devido à convexidade do músculo em
questão, este comprimento era obtido indiretamente através de uma linha URSO
(número 4), cujo comprimento era posteriormente medido com régua de precisão.
3.3.1 TÉCNICA HISTOLÓGICA
Após a fixação com solução de paraformaldeído a 4%, a porção medial do
músculo tibial anterior foi dividida em dois fragmentos, proximal e distal. Estes
fragmentos foram processados como se segue: desidratação com etanol em
concentrações crescentes, seguindo-se à infiltração e inclusão em resina plástica à
base de glicol metacrilato (Leica Historesin). Os fragmentos musculares foram
incluídos de modo a fornecer, durante a microtomia, secções longitudinais e
transversais, com espessura de 4 μm. Utilizou-se micrótomo Reichert-Jung, modelo
1140/Autocut e navalhas de vidro preparadas em aparelho apropriado (LKB, modelo
7800B), no Centro de Microscopia Eletrônica (CEMEL) do ICB/UFMG. As secções
foram distendidas em água destilada, colocadas sobre lâminas histológicas (Solidor)
e secas em chapa aquecida, durante 1 minuto. Foram preparadas 8 lâminas por
animal contendo cada uma 4 secções histológicas com intervalo de 40 μm. As
secções foram coradas com solução de azul de toluidina (Merck) a 1%/borato de
sódio a 0,5%. Após a coloração, as secções foram lavadas em água corrente
durante 20 segundos, secas à temperatura ambiente e diafanizadas em xilol para
montagem com bálsamo de Canadá. Para análise destas secções histológicas
utilizou-se microscópio Axioplan 2 Zeiss.
3.3.2 TÉCNICA IMUNOHISTOQUÍMICA
Para a caracterização das células ED1
+
e ED2
+
foram utilizados os seguintes
anticorpos em diluições testadas previamente:
• Anti ED1 - marca Serotec - identifica macrófagos/monócitos - diluição 1:400;
• Anti ED2 - marca Serotec – identifica macrófagos residentes - diluição 1:400
Secções seriadas de 7 μm foram obtidas em criostato, à temperatura de
−20°C e coletadas em lâminas histológicas tratadas previamente com solução de
silano (3-Aminopiltrietoxi-silano, Sigma) a 2%. Para seleção de área adequada,
utilizou-se coloração com Hematoxilina e Eosina (HE). As secções foram fixadas em
acetona por 10 minutos e secas à temperatura ambiente por 10 minutos. Para o
bloqueio da peroxidase endógena, incubaram-se as lâminas em solução de azida
sódica 0,1M; peróxido de hidrogênio em salina tamponada (PBS) e água oxigenada
por 30 minutos. Após a incubação, as lâminas foram mergulhadas em PBS por 10
minutos e, em seguida, por 20 minutos em solução de PBS-BSA a 2%. Incubaram-
se, novamente, as lâminas em PBS por 10 minutos e em seguida em anticorpo
primário diluído em PBS-BSA 2% por 1 hora. Nos controles da técnica, utilizou-se
apenas PBS-BSA 2%. Novamente as lâminas foram colocadas em PBS por 10
minutos e incubadas, em seguida, por 1 hora com o anticorpo secundário diluído em
PBS-BSA 2%. Findo este tempo, PBS por 10 minutos e foi feita, então, a revelação
com o 3-3’diaminobenzidina (DAB) dissolvido em DMSO e água oxigenada. Para
interrupção da reação, as lâminas foram lavadas em PBS. Foram, então,
desidratadas em solução de álcool etílico (Merck) a 70%, 80%, 95% e 100% (MERK)
por 5 minutos cada etapa, diafanizadas em três banhos de xilol por 3 minutos e
montadas em bálsamo do Canadá.
3.4 TÉCNICAS HISTOMÉTRICAS
3.4.1 DIÂMETRO DE FIBRAS MUSCULARES
Com auxílio do software KS400 Zeiss, mediu-se o diâmetro transversal médio de
50 fibras musculares, por animal, em diferentes secções histológicas da porção
medial do músculo tibial anterior. A medida foi realizada sob objetiva de 20X –
aumento final de 256X. O diâmetro médio de cada fibra resultou da média aritmética
entre o maior e o menor diâmetro transversal. Todas as medidas foram realizadas
sem identificação prévia dos músculos controles e alongados.
3.4.2 COMPRIMENTO DO SARCÔMERO E NÚMERO DE BANDAS A
Os fragmentos estocados em glicerol a 50% foram colocadas em placa de
Petri e, sob lupa, as fibras musculares foram individualizadas e montadas em
lâminas histológicas com o próprio glicerol. Com auxílio do software KS400 Zeiss,
sob a objetiva de imersão 100X, mediu-se o comprimento longitudinal de um
sarcômero por fibra, sendo utilizadas 5 fibras aleatoriamente, por animal. Esta
medida era repetida três vezes, sendo considerada a média aritmética. Feito isso,
contamos o número de bandas A presentes em uma distância de 100 μm, nas
mesmas 5 fibras musculares de cada preparação, para obtenção do número de
sarcômeros em série no intervalo de 100 μm.
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística de peso corporal, medidas de diâmetro da fibra muscular,
tamanho do sarcômero e número de bandas A foi realizada pelo teste t pareado de
Student, com a utilização do programa Prisma, versão 3.0.
A análise estatística dos gráficos de tempo x deslocamento foi realizada
através do método de delineamento das parcelas subdivididas, conforme indicado
pelo professor Ivan Sampaio, do Departamento de Zootecnia da Escola de
Veterinária (SAMPAIO, 2002).
4 RESULTADOS
4.1 PESO CORPORAL
Durante todo o experimento, os animais apresentaram aspecto saudável, sem
manifestação de distúrbios locomotores. Os animais apresentaram ganho de peso
corporal de 19,34% ao final do primeiro mês de sessões de alongamento e de
29,07% ao final do segundo mês. A tabela 1 mostra o peso corporal médio dos
animais nos diferentes períodos de tempo analisados. O ganho de peso está dentro
dos parâmetros normais para ratos Holtzman nas diferentes idades analisadas.
Tabela 1 - Peso corporal médio (g) ± desvio padrão de ratos com 9 a 16 semanas de idade
submetidos a 8 sessões semanais, com duração de 20 minutos, de alongamento passivo do
músculo tibial anterior direito.
Semana
Peso corporal (g) ± dp
1 279,18 ± 16,66
2 293,51 ± 13,78
3 321,56 ± 22,22
4 333,17 ± 18,40
5 342,31 ± 19,12
6 320,61 ± 33,22
7 351,63 ± 16,61
8 360,34 ± 17,12
Δ Peso coproral
19,34% (4 semanas)
29,07% (8 semanas)
4.2 VARIAÇÃO DO DESLOCAMENTO LINEAR DO MÚSCULO TIBIAL ANTERIOR
Para avaliação da porcentagem de alongamento do músculo tibial anterior,
analisaram-se os dados obtidos aos 60 (1 min), 120 (2 min), 360 (6 min) e 900
segundos (15 min). Esta escolha baseou-se nos intervalos de tempo em que havia
maior número de dados coletados, de modo homogêneo, em cada um dos animais.
Para verificar a variação no alongamento desse músculo ao longo das semanas,
utilizaram-se os dados obtidos na 1ª, 4ª e 7ª semanas. Os resultados estão
expressos na tabela 2.
Nossos dados indicam a ocorrência de variação significativa na proporção de
deslocamento do músculo tibial anterior a partir de 6 minutos de alongamento, na
primeira sessão, ou seja, na 1ª semana. Na 4ª e na 7ª semanas, a significância
ocorre aos 2 minutos e se mantém ao longo da sessão de alongamento.
Em relação à variação ao longo das semanas, no mesmo intervalo de tempo
de alongamento, nossos resultados mostram que o alongamento do músculo tibial é
maior no primeiro minuto da 4ª semana, em relação ao mesmo intervalo da 1ª
semana. Esse resultado se repete em todos os intervalos de tempo analisados. Após
7 semanas de alongamento, a proporção de alongamento do músculo decresce em
relação aos valores observados na 4ª semana, mas se mantém diferente daquele
observado na primeira semana.
Tabela 2 – Média do deslocamento linear (mm) ± desvio padrão do músculo tibial anterior de
ratos, com 9, 13 e 16 semanas de idade, após 1, 4 e 7 sessões de alongamento passivo, com
duração de 15 minutos.
60 segundos 120 segundos 360 segundos 900 segundos
Semana 1
8,55
a
9,13
a
10,34
b
11,77
c
Semana 4
14,45ª
,
* 15,37
b,
* 16,85
c,
* 18,30
d,
*
Semana 7
13,55ª
,
** 14,46
b,
** 16,08
c,
** 18,05
d,
**
a,b,c,d: letras diferentes mostram significância (p< 0.05) na mesma semana.
* mostra significância (p < 0,05) entre a 1ª e 4ª semanas, no mesmo intervalo de tempo.
** mostra significância (p < 0,05) entre a 1ª e 7ª semanas, no mesmo intervalo de tempo.
A tabela 3 mostra a porcentagem de alongamento do músculo tibial anterior,
em relação ao tempo zero.
Tabela 3 – Alongamento médio relativo em relação ao tempo 0 (%) do músculo tibial anterior
submetido a alongamento passivo por 1, 3 e 7 semanas, de ratos com 9, 13 e 16 semanas de
idade.
60 segundos 120 segundos 360 segundos 900 segundos
Semana 1
1.36 1.46 1.65 1.88
Semana 4
1.25 1.33 1.46 1.59
Semana 7
1.35 1.44 1.60 1.80
4.3 ANÁLISE HISTOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA
O músculo tibial anterior da perna controle apresentou organização
histológica característica (Fig. 6A e 6B). Os miônios apresentaram estriação
transversal característica, com núcleos alongados dispostos na periferia da célula e
diâmetro, numa mesma célula, homogêneo. As fibras apresentaram-se envolvidas
por tecido conjuntivo frouxo, nem sempre bem preservado nas preparações. Entre
as fibras musculares, observaram-se núcleos bem corados, alongados, além de
mastócitos com granulação citoplasmática característica. Vasos sanguíneos de
diferentes calibres eram vistos no tecido conjuntivo. Os músculos submetidos a
alongamento passivo apresentaram organização histológica semelhante a do
músculo controle, não sendo possível apontar diferenças significativas entre eles.
Nas secções transversais do músculo tibial anterior, também observamos
organização histológica característica, tanto nos músculos submetidos a
alongamento passivo quanto nos controles (Fig. 6C).
Nos diferentes intervalos de tempo analisados, não observamos sinais de
hemorragia, de processo inflamatório ou de ruptura de fibras musculares.
A técnica imunohistoquímica para identificação de macrófagos mostrou a
ocorrência de macrófagos ED2
+
nas fibras musculares, tanto no músculo controle
(Fig. 7A) quanto no submetido a alongamento passivo (Fig. 7B). Não observamos
macrófagos ED1+ nas fibras musculares dos músculos controles alongados (Fig.
7C). Esses resultados foram semelhantes aos 1, 3 e 7 dias após a última sessão de
alongamento.
6A
6B
6C
Figura 6:
Secção histológica de músculo
tibial anterior controle (A) e
submetido a oito sessões de
alongamento passivo (B e C).
Coloração com solução de azul
de touidina a 1 %. Barra= 50 µm
(A e B) ou 25 µm (C)
Observa-se organização
histológica característica do
tecido muscular esquelético,
tanto no cortes longitudinal
quanto no transversal.
Figura 7: Fotomicrografias de secções de músculo tibial anterior controle (A e C) e submetido
alongamento passivo por 8 semanas consecutivas (B e D). Coloração: Imunoperoxidase com
revelação por diaminobenzidina. Barra = 50 µm.
Observam-se macrófagos ED2
+
(A e B) entre as fibras musculares e no tecido
conjuntivo do músculo tibial anterior, com distribuição semelhante, no tecido
muscular, em ambos os grupos. Os macrófagos ED1
+
não foram observados, tanto
nos músculos controles quanto nos alongados. Em D, controle negativo da técnica,
por omissão de anticorpo primário.
7A 7B
7C 7D
4.4 ANÁLISES HISTOMÉTRICAS
4.4.1 COMPRIMENTO DO VENTRE MUSCULAR
O comprimento do ventre do músculo tibial anterior submetido ao
alongamento passivo, mostrou-se semelhante ao músculo controle, nos diferentes
períodos analisados (Fig. 8).
C1 A1 C3 A3 C7 A7
0
1
2
3
4
5
Grupos
Comprimento do ventre
(mm)
Figura 8 - Comprimento médio do ventre do músculo tibial anterior de ratos com 17 semanas
de idade submetidos a 8 sessões de alongamento passivo, com duração de 20 minutos.
C1, C3, C7: músculo controle, um a sete dias após última sessão de alongamento;
A1, A3, A7: músculo alongado, um a sete dias após última sessão de alongamento.
4.4.2 DIÂMETRO TRANSVERSAL DAS FIBRAS MUSCULARES
Observamos diferença significativa no diâmetro transversal médio de fibras
musculares do músculo tibial anterior de animais sacrificados aos 3 e aos 7 dias
após a última sessão de alongamento (Fig. 9), em relação aos seus respectivos
músculos controles.
C1 A1 C3 A3 C7 A7
0
25
50
75
100
*
*
Grupos
Diâmetro transversal
(
μ
m)
Figura 9 – Diâmetro transversal médio do músculo tibial anterior de ratos com 17 semanas de
idade submetidos a 8 sessões de alongamento passivo, com duração de 20 minutos.
* P< 0,05 em relação ao controle de mesma idade
C1, C3, C7: músculo controle, um a sete dias após última sessão de alongamento;
A1, A3, A7: músculo alongado, um a sete dias após última sessão de alongamento.
4.4.3 COMPRIMENTO DOS SARCÔMEROS
A Figura 10 mostra o comprimento dos sarcômeros em fibras musculares do
músculo tibial anterior de ratos sacrificados um, três e sete dias após a última
sessão de alongamento. Não observamos diferença significativa entre os músculos
submetidos a alongamento e os controles.
C1 A1 C3 A3 C7 A7
0
1
2
3
Grupos
Comprimento do
sarcômero (
μ
m)
Figura 10 – Comprimento dos sarcômeros do músculo tibial anterior de ratos com 17 semanas
de idade submetidos a 8 sessões de alongamento passivo, com duração de 20 minutos.
C1, C3, C7: músculo controle, um a sete dias após última sessão de alongamento;
A1, A3, A7: músculo alongado, um a sete dias após última sessão de alongamento.
4.4.4 NÚMERO DE BANDAS A
A figura 11 mostra a densidade de bandas A na extensão de 100 μm, ao longo
da miofibrila, no músculo tibial anterior submetido ou não a alongamento passivo.
Observou-se diferença significativa no número de bandas A, em relação ao controle,
nos músculos de ratos mortos aos 7 dias após a última sessão de alongamento. A
figura 12 mostra uma fibra muscular processada de acordo com William & Goldspink
(1971), para visualização de estriação transversal.
C1 A1 C3 A3 C7 A7
0
25
50
75
*
Grupos
Número de bandas
A/100
μ
m
Figura 11 – Número de bandas A/100μm em fibras do músculo tibial anterior de ratos com 17
semanas de idade submetidos a 8 sessões de alongamento passivo, com duração de 20
minutos.
* P< 0,05 em relação ao controle de mesma idade
C1, C3, C7: músculo controle, um a sete dias após última sessão de alongamento;
A1, A3, A7: músculo alongado, um a sete dias após última sessão de alongamento.
Figura 12: Fibra muscular dissociada pela técnica de William & Goldspink (1971) para
visualização de estriação tranversal. Barra = 10 µm.
5 DISCUSSÃO
Nossos resultados mostram que o modelo experimental utilizado para
alongamento do músculo tibial anterior não resultou em lesão tecidual, seja da fibra
muscular ou resultante de processo inflamatório. Assim, podemos afirmar que os
resultados obtidos referem-se à situação de alongamento na ausência de ruptura da
fibra muscular.
Neste aspecto, o nosso trabalho difere da literatura pertinente a modelos
experimentais, em que se realiza o alongamento muscular após dissecção e
exposição do músculo (TAYLOR et al., 1990; TIDBALL et al., 1993; SUN et al., 1994,
1995, 1998; UCHIYAMA et al., 2001).
Ao longo de uma mesma sessão de alongamento, observamos aumento
significativo na extensão do alongamento do músculo tibial anterior. Entretanto, essa
proporção de alongamento, em uma mesma sessão, mostrou-se mais efetiva na
quarta e na sétima semanas. Por outro lado, observamos, também, a manutenção
do alongamento muscular até a sétima semana, em nível superior ao da primeira
semana.
Em relação à força de tração muscular mínima suficiente para causar lesão
muscular, há controvérsias na literatura. SUN et al. (1994), concluem, em seu estudo
com coelhos que este valor corresponde a 12% além do comprimento de repouso do
músculo. Para eles, 16% já pode ser considerado um alongamento plástico, com a
presença de ruptura de fibras musculares. TSUANG et al. (1998) consideram este
valor como 25% e TAYLOR et al. (1990), como 65%. No nosso protocolo, baseado em
NIKOLAOU et al. (1987), utilizamos um peso correspondente a 80% do peso corporal.
Contudo, nossos dados mostram que o músculo tibial anterior foi alongado além do
comprimento de repouso, em até 88%, na ausência de lesão tecidual.
Nossos dados diferem dos obtidos por BANDY e IRION (1994) em humanos
jovens. Esses autores analisaram, em humanos jovens, o alongamento dos músculos
isquiotibiais, em sessões realizadas 5 vezes por semana, durante 6 semanas, em que
cada sessão de alongamento compreendia três repetições de 15, 30 ou de 60
segundos cada. Esses autores observaram que alongamentos sustentados por 30 ou
por 60 segundos são mais eficientes para o ganho de ADM que aquele sustentado por
15 segundos. Entretanto, observaram, também, que o ganho de ADM é o mesmo em
30 e 60 segundos.
Os mesmos autores (BANDY et al., 1997), analisaram, nos mesmos músculos, se
o número de repetições de alongamento interfere com a ADM. Nesse estudo, havia
quatro grupos de intervenção: alongamento sustentado por um minuto e repetido, ou
não, por 3 vezes; alongamento sustentado por 30 segundos e repetido, ou não, por 3
vezes. Todos os grupos apresentaram o mesmo ganho de ADM.
Já HALBERTSMA et al. (1996) descrevem que uma sessão única de
alongamento estático, por 10 minutos, dos músculos isquiotibiais, em humanos, não
influencia a curva de comprimento-tensão.
De acordo com BLACK et al. (2006), o alongamento pode ter efeitos a curto e a
longo prazos. Os efeitos a curto-prazo ou agudos (segundos ou minutos) podem incluir
eventos como alteração no comprimento do tendão; nos elementos dos componentes
elásticos em série ou em paralelo ou na distribuição do comprimento dos sarcômeros
dentro das fibras musculares. Portanto, os efeitos imediatos do alongamento
(primeiros 60 segundos) contemplam as alterações viscoelásticas passivas, o que leva
à redução da resistência ao alongamento. Há ainda redução das pontes actina-
miosina, devido ao reflexo de inibição (proveniente do alongamento), o que também
resulta em alterações viscoelásticas. Os efeitos a longo prazo do alongamento (várias
semanas), são a hipertrofia induzida que pode aumentar a força tecidual
(MALLIAROPOULOS et al., 2004; KUBO et al., 2002; MAGNUSSON, 1996). Não há
dúvidas, na literatura, de que, de alguma forma, o alongamento passivo altera as
propriedades mecânicas do músculo e aumenta o comprimento muscular (WEIR et al.,
2005; AVELA et al., 2004; FOWLES et al., 2000; TAYLOR et al., 1990).
Muitos estudos têm demonstrado, tanto em animais quanto em humanos, que
ocorre uma alteração nas propriedades viscoelásticas musculares gerada por
alongamentos repetidos (TAYLOR et al., 1990; MAGNUSSON et al., 1996). Entretanto,
estes efeitos são transitórios e não duram mais que uma hora. Com relação aos
efeitos a longo prazo, o aumento da ADM alcançado através do alongamento estático
é principalmente uma conseqüência do aumento da tolerância ao alongamento
(MAGNUSSON et al., 1996).
Segundo GOLDSPINK (1995), as modificações na estrutura e propriedades
musculares são possíveis devido à alta capacidade de remodelação do tecido
muscular.
Sabe-se que, durante o alongamento de fibras musculares ativadas, os diferentes
sarcômeros na mesma fibra muscular não apresentam o mesmo grau de alongamento
(isto é, alteração no seu comprimento). Os sarcômeros presentes nas extremidades
das fibras alongam-se menos que a média enquanto aqueles localizados próximos aos
centros das fibras alongam-se mais que a média. Isso foi demonstrado em miofibrilas
isoladas (RASSIER et al., 2003).
Em nosso estudo, as preparações onde as fibras musculares eram isoladas para
a mensuração do tamanho dos sarcômeros, contaram com a escolha aleatória destas
fibras. Não observamos diferença significativa no comprimento dos sarcômeros do
músculo tibial anterior submetido ao alongamento passivo quando comparado ao seu
controle. Entretanto, observamos aumento do número de sarcômeros em série no
músculo dos animais mortos aos sete dias após a última sessão de alongamento,
quando comparado ao seu controle.
Estudos anteriores têm demonstrado que o músculo esquelético pode regular o
número de sarcômeros em série. O comprimento do sarcômero determina o número
de conexões de pontes cruzadas entre os filamentos de actina e miosina, o que afeta
diretamente a quantidade de tensão que um músculo pode gerar durante a contração.
O número de sarcômeros aumenta após 20% de alongamento muscular (LINDSEY et
al., 2002).
Segundo FRIDÈN et al. (2000), o limiar para sarcomerogênese ocorre quando o
sarcômero é alongado até um comprimento de aproximadamente 4,5 a 5,0 μm, no
máximo. O comprimento em repouso do sarcômero, no rato, é de 2,34 ± 0,01 µm
(ANDRUCHOV et al., 2006).
Em nosso estudo, obtivemos o valor médio de 2,02; 1,98 e 2,07 µm para o
sarcômero de músculos controles e de 2,10; 2,05 e 2,05 µm para os sarcômeros de
músculo alongado, de animais mortos um, três e sete dias, respectivamente, após a
última sessão de alongamento. Não observamos diferença significativa entre eles.
Entretanto, nossas medidas foram realizadas ao longo de uma semana após a última
sessão de alongamento. Não podemos afirmar sobre a variação no comprimento do
sarcômero durante a sessão de alongamento.
São mecanismos para manter o comprimento do sarcômero: a reorientação das
fibras musculares em relação ao eixo de geração de força, a redução da distância
entre origem e inserção musculares, o aumento do comprimento do tendão muscular e
a adição de novos sarcômeros (LINDSEY et al., 2002).
Em nosso estudo, observamos aumento da densidade de bandas A, o que
poderia indicar a ocorrência de adição de novos sarcômeros em série. Em relação à
alteração na distância entre origem e inserção musculares, medimos apenas o ventre
muscular, não incluindo o comprimento do tendão. Os animais do não apresentaram
diferença significativa no comprimento do ventre muscular.
Desde 1979, através do estudo de TOUR et al., sabe-se que o comprimento
muscular e não a tensão parece ser o fator determinante na regulação do número de
sarcômeros. Segundo GAJDOSIK (2001), as adaptações no comprimento muscular
resultam de alterações do número de sarcômeros em série, o que depende da
extensão imposta ao músculo e não do nível de ativação ou tensão muscular. É
importante lembrar que, em nosso estudo, a carga usada foi constante (sempre 80%
do peso corporal), o que implicaria na mesma extensão muscular semanal.
É possível que a adição de sarcômeros em série, com o conseqüente aumento
do comprimento do músculo, produza uma diminuição da rigidez muscular passiva, o
que, por sua vez, facilitaria o alongamento muscular (AQUINO, 2005).
MORGAN (1990) propõe aumento do número de sarcômeros em série e redução
do comprimento médio dos sarcômeros como processo adaptativo pós-lesão induzida
por contração excêntrica. Isso foi sustentado por trabalhos feitos por LYNN e
MORGAN (1994) e por LYNN et al (1998) Porém, isso tem sido contestado por KOH e
HERZOG (1998), pois estes pesquisadores não encontraram evidências de que o
músculo é capaz de se submeter a um processo de adaptação tão rápido e
permanente, ao nível dos sarcômeros.
RENNER et al. (2006), em seu estudo, realizaram dez séries, com duração de 60
segundos cada, de alongamento passivo do músculo tríceps sural de ratos machos de
16 semanas de idade, durante três semanas. Eles analisaram a celularidade da
cartilagem, multiplicação de condrócitos e a espessura da cartilagem articular do
tornozelo dos ratos, comparando a pata alongada com a controle, e não obtiveram
diferença significativa entre elas em nenhum dos itens pesquisados.
Segundo TASCA (2004), os ganhos de flexibilidade proporcionados pelo
alongamento apenas são mantidos quando incorporados nas atividades do dia-a-dia.
Se os animais tiverem incorporado este ganho de forma simétrica, ou seja,
bilateralmente, nas atividades do dia-a-dia, então, as diferenças entre o tibial anterior
direito e o esquerdo certamente não seriam identificadas. Como apenas obtivemos
medidas relacionadas diretamente ao tecido muscular e não ao tecido conjuntivo
(tendão), não nos é possível assegurar que todas estas adaptações devem-se apenas
ao tecido muscular. Estudos posteriores deverão ser realizados com este objetivo.
Mas, um ponto merece reflexão: tendo em vista que os animais não
apresentaram diferença significativa no comprimento do ventre muscular, não seria
porque, após a quarta sessão de alongamento, os ganhos obtidos na flexibilidade não
foram incorporados nas atividades do dia-a-dia? Seria possível, desse modo, realizar o
alongamento passivo na pata traseira direita e obter ganho de flexibilidade na pata
traseira esquerda, devido ao uso potencializado de ambas, isto é, em uma maior
amplitude de movimento (ADM). Como esta variável não foi mensurada, não nos é
possível responder seguramente a esta questão.
Quando os tecidos são alongados, eles se tornam mais extensíveis como
resultado de mecanismos mecânicos a curto-prazo e adaptações a longo prazo da
estrutura tecidual. MOSELEY et al. (2005), ao analisar quanto de alongamento é
necessário para induzir a adaptações clínicas significativas, aplicou um protocolo de
quatro semanas de duração em grupos de pessoas que permaneceram certo tempo
com o tornozelo imobilizado, com a diferença que o primeiro grupo o realizava 6
minutos por dia e o segundo, 30 minutos por dia, todos os dias, para todos os grupos
musculares envolvidos com essa articulação. Esses autores não observaram diferença
significativa na ADM entre os dois grupos.
No estudo realizado por GAJDOSIK et al. (2004), mulheres com limitação no
ângulo de dorsiflexão do tornozelo, tiveram seus músculos gastrocnêmio e tibial
anterior alongados passivamente 3 vezes por semana, durante 8 semanas e obtiveram
reversão total da restrição articular inicialmente apresentada. Provavelmente,
ocorreram adaptações nas estruturas da perna, possibilitando melhora significativa em
suas atividades funcionais, especialmente a marcha.
O trabalho de SELLES et al. (2005) usou alongamento do tibial anterior e do
gastrocnêmio de pessoas com alto grau de espasticidade e contraturas nestes grupos
musculares, durante 45 minutos, 3 vezes por semana, por 4 semanas, obteve melhora
significativa na ADM passiva do tornozelo, diminuição da rigidez articular e melhora na
velocidade da marcha.
Estudos usando modelos animais têm demonstrado que a extensibilidade normal
do músculo esquelético é uma função do número de sarcômeros em série tanto
quanto da quantidade e da organização do tecido conjuntivo intramuscular, de forma
que os músculos podem aumentar ou reduzir seu comprimento para se acomodar a
ADM comumente usada (WILLIAMS e GOLDSPINK, 1971).
De acordo com DEYNE (2001), o aumento da ADM logo após o alongamento
passivo pode ser explicado pelo comportamento viscoelástico do músculo - uma força
pequena, sustentada por muito tempo, resulta em deformação tempo-dependente - e
por alterações reversíveis no comprimento muscular (AVELA et al., 2004; MCNAIR e
STANLEY, 1996).
O alongamento da unidade músculo-tendínea é uma intervenção freqüentemente
utilizada para promover mudanças das propriedades musculares (MAGNUSSON,
1996; GAJDOSIK, 2001; BANDY e IRION, 1997).
Estes achados indicam que, possivelmente, o efeito sobre estas propriedades é
resultado do comportamento viscoelástico do músculo em resposta à aplicação de
uma força externa. Dessa forma, as adaptações produzidas no tecido muscular após o
alongamento, incluindo as mudanças de comprimento, rigidez e energia absorvida,
parecem ser temporárias e resultarem de deformação viscoelástica. Para ocorrer
alterações duradouras destas propriedades musculares são necessárias modificações
na estrutura do músculo, ou seja, remodelação tecidual. Entretanto, não está
estabelecido na literatura se o alongamento é capaz de induzir este processo de
remodelação do tecido muscular e qual o tempo necessário para que ele ocorra em
conseqüência de um programa de alongamento muscular.
Segundo COUTINHO et al. (2004) e GOMES et al. (2004), o alongamento
realizado durante 40 minutos em músculos de ratos submetidos à imobilização por três
semanas preveniu a atrofia muscular. No primeiro estudo, o grupo de ratos que
apenas foram submetidos ao alongamento durante as mesmas condições citadas,
apresentou aumento da área da fibra muscular. Já no segundo estudo, o alongamento
foi realizado apenas uma vez por semana durante 40 minutos e não houve diferença
significativa na área da fibra muscular dos ratos submetidos apenas ao alongamento,
sem a imobilização. Mas, no grupo imobilizado e submetido ao alongamento nas
mesmas condições propostas, houve redução da atrofia muscular quando comparado
ao grupo de ratos apenas submetidos à imobilização. Sendo assim, eles concluem que
o alongamento é um fator de proteção à atrofia muscular.
Em nosso trabalho, observamos aumento significativo no diâmetro das fibras
musculares do tibial anterior submetido a alongamento nos animais mortos três e sete
dias após a última sessão de alongamento.
O músculo tem uma habilidade intrínseca em alterar sua massa e fenótipo em
resposta à atividade. Este processo envolve alterações quantitativas e qualitativas na
expressão gênica (GOLDSPINK, 2002). As fibras musculares esqueléticas resultam da
fusão de mioblastos embrionários durante os estágios iniciais do desenvolvimento. Os
miotubos sintetizam, então, proteínas contráteis e outras proteínas características de
fibras musculares maduras. Alguns mioblastos, entretanto, não se submetem à fusão e
se tornam mioblastos quiescentes, denominados células satélites, localizadas entre o
sarcolema e a lâmina basal de miofibras maduras (CANTINI et al., 1994). A maioria
das células satélites em ratos adultos (15-20 semanas de idade) está se dividindo
lentamente ou são quiescentes (KOISHI et al., 1994).
Sabe-se que o canal ativado pelo alongamento é um dos canais de membrana
celular que responde a estresses mecânicos externos, e quando a membrana se
alonga, este canal é ativado, permitindo que uma grande quantidade de cálcio entre na
célula. O fluxo de cálcio ativa a calcineurina, uma fosfatase dependente de
cálcio/calmodulina, e quando o fator de transcrição NF-AT1 é transportado para dentro
do núcleo, a hipertrofia muscular é induzida (SAKIYAMA et al., 2005).
Embora possamos inferir que o alongamento realizado uma vez por semana,
sustentado durante vinte minutos, por oito semanas, pode levar tanto à hipertrofia
(aumento do diâmetro transversal) quanto à hiperplasia muscular (adição de
sarcômeros). Torna-se necessário analisar a expressão de MyoD em células satélites,
para sustentar a hipótese de incorporação dessas células aos miônios nos músculos
alongados.
Não podemos deixar de mencionar que o músculo tibial anterior de ratos possui
65% de fibras tipo IIB, glicolíticas rápidas, 31% de fibras tipo IIA (intermediárias) e 4%
de fibras tipo I (lentas). A área de secção transversa das fibras musculares depende
primariamente do tamanho e da idade do rato, e não do tipo de fibra muscular
(STARON et al., 1999; DEVECI et al., 2001; ANDRUCHOV et al., 2006).
Através de experimentos com irradiação em camundongos foi demonstrado que
a proliferação e a fusão de células satélites ocorrem mesmo na ausência de células
inflamatórias e que os macrófagos podem contribuir para a regulação da atividade
mitótica das células satélites, uma vez que eles secretam fatores de crescimento e
citocinas. Muitos fatores de crescimento possuem efeito mitogênico tanto nos
mioblastos embrionários quanto nas células satélites in vitro. Os fatores de
crescimento mais estudados são: FGF, EGF, PDGF e IGF (CANTINI et al., 1994).
Além disso, o alongamento muscular provoca a liberação de HGF de forma
dependente do NO, o qual pode ativar células satélites (TATSUMI et al., 2002). O
óxido nítrico (NO) é uma molécula envolvida em uma variedade de funções
fisiológicas, incluindo regulação vascular, neurotransmissão, regulação imune e
sinalização celular. Também possui efeitos nas funções do músculo esquelético,
incluindo contratilidade, tônus do vaso sanguíneo, fluxo sanguíneo e ativação da
célula satélite, podendo ter efeitos diretos na função muscular, reparo e crescimento.
Possui propriedades pró-inflamatórias e anti-inflamatórias (SAKURAI et al., 2005).
A expressão de MyoD não ocorre apenas em fibras lesadas experimentalmente,
mas também em fibras lesadas pelo super-alongamento ou estiramento muscular. O
aumento da expressão do MyoD após o alongamento ocorre mesmo quando não há
dano tecidual aparente e é possivelmente uma conseqüência direta do próprio
alongamento e não de uma provável lesão degenerativa (KOISHI et al., 1994). Os
músculos predominantemente glicolíticos rápidos, como o tibial anterior, expressam
altos níveis de RNAm do MyoD, ao contrário dos músculos oxidativos lentos, como o
sóleo (KOISHI et al., 1994).
De acordo com IKEDA et al. (2004), o alongamento realizado 15 vezes por
minuto em ratos de oito semanas de idade durante 15, 30 e 60 minutos, levou ao
aumento da expressão RNAm da miogenina, naqueles ratos onde o alongamento
durou 60 minutos apenas.
Nosso estudo caracterizou-se pela aplicação de protocolo de alongamento na
ausência de lesão tecidual, em que o alongamento foi realizado no rato imobilizado
temporariamente, com força constante de tração no tibial anterior e mensuração do
deslocamento do mesmo ao longo dos vinte minutos. Como estudo pioneiro no
Laboratório de Neurobiologia, apresenta lacunas que abriram perspectivas para
estudos posteriores. Tornar-se-á necessária a realização de um novo trabalho onde
repetiremos a metodologia utilizada neste estudo para compararmos o alongamento
de vinte minutos, até então não descrito na literatura desta forma, e o alongamento de
trinta segundos, cujos efeitos encontram-se bem descritos na literatura. Poderemos,
ainda, medir a ADM na perspectiva dos benefícios do alongamento serem
incorporados bilateralmente ou não; fazer marcação imunohistoquímica para MyoD
para avaliarmos a ativação de células satélites; dosar actina/miosina para avaliarmos a
ocorrência da síntese protéica; comparar o peso do músculo isolado com o peso
corporal; fazer análise morfométrica do tendão; analisar o tendão realizar um protocolo
de alongamento de doze semanas, em que se variem a força de tração (para
avaliarmos a presença da lesão) e períodos de tempo superiores a sete dias após a
última sessão de alongamento.
6 CONCLUSÕES
Tendo em vista o protocolo de alongamento utilizado em nosso trabalho,
baseado em NICHOLAOU et al. (1987), em que o músculo tibial anterior de ratos
adultos jovens foi submetido a oito sessões de alongamento, com utilização de peso
correspondente a 80% do peso corporal e com duração de vinte minutos, nossos
resultados permitem concluir que:
• O protocolo não resultou em rompimento de fibras musculares ou em
processos inflamatórios;
• A porcentagem de alongamento do músculo se manteve pelo período de
tempo analisado, oito semanas, embora na sétima semana, os valores
lineares de deslocamento sejam inferiores aos da quarta semana;
• Aos três e sete dias após a última sessão de alongamento, ocorreu
aumento no diâmetro transversal das fibras musculares;
• Aos sete dias após a última sessão de alongamento, ocorreu aumento do
número de bandas A;
• O comprimento do ventre muscular manteve-se inalterado, assim como o
comprimento dos sarcômeros.
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