( PDF ) Restrição proteica materna promove alterações corporais e metabólicas com repercussões hipotalâmicas (Ob-R, NPY e POMC) nas proles F1 e F2 de camundongos

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Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Centro Biomédico

Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes

Nayara Peixoto Silva

Restrição proteica materna promove alterações corporais e

metabólicas com repercussões hipotalâmicas (Ob-R, NPY e POMC)

nas proles F1 e F2 de camundongos

Rio de Janeiro

2010

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Nayara Peixoto Silva

Restrição proteica materna promove alterações corporais e metabólicas com

repercussões hipotalâmicas (Ob-R, NPY e POMC) nas proles F1 e F2 de

camundongos

Dissertação apresentada, como requisito

parcial para obtenção do título de Mestre,

ao Programa de Pós-graduação em

Biologia Humana e Experimental, da

Universidade do Estado do Rio de Janeiro.

Orientadora: Prof

. Dr

. Alessandra da Rocha Pinheiro-Mulder

Rio de Janeiro

2010

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CATALOGAÇÃO NA FONTE

UERJ/REDE SIRIUS/CBB

Autorizo, ape

nas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta

tese/dissertação, desde que citada a fonte.

__________________________________

____________________________

Assinatura Data

S586 Silva, Nayara Peixoto.

Restrição protéica materna promove alterações corporais e metabólicas

com repercussões hipotalâmicas (Ob-R, NPY e POMC) nas proles F1 e

F2 de camundongos / Nayara Peixoto Silva. - 2010.

74 f. : il.

Orientadora: Alessandra da Rocha Pinheiro-Mulder.

Dissertação (Mestrado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro,

Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes.

1. Dieta com restrição de proteínas - Teses. 2. Leptina - Teses. 3.

Obesidade - Teses. 4. Neuropeptideos - Teses. I. Mulder, Alessandra da

Rocha Pinheiro. II. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Instituto de

Biologia Roberto Alcântara Gomes. III. Título.

CDU 613.24

Nayara Peixoto Silva

Restrição proteica materna promove alterações corporais e metabólicas com

repercussões hipotalâmicas (Ob-R, NPY e POMC) nas proles F1 e F2 de

camundongos

Dissertação apresentada, como requisito

parcial para obtenção do título de Mestre,

ao Programa de Pós-graduação em

Biologia Humana e Experimental, da

Universidade do Estado do Rio de Janeiro.

Aprovada em 28 de julho de 2010.

Banca Examinadora:

_____________________________________________

Prof. Drª. Alessandra da Rocha Pinheiro-Mulder

Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes – UERJ

_____________________________________________

Profª. Drª. Patrícia Cristina Lisboa da Silva

Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes – UERJ

_____________________________________________

Profª. Drª. Kelse Tibau de Albuquerque

Instituto de Nutrição Josué de Castro – UFRJ

Rio de Janeiro

2010

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, ao meu irmão e ao meu noivo.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por todas as bênçãos e por me permitir trilhar um caminho vitorioso para a

realização de mais uma etapa.

Ao meu pai Worney, por acreditar em mim sempre e me proporcionar constante

motivação na busca dos meus ideais.

À minha mãe Vania Maria in memoriam. Com todo amor e saudade digo-lhe que jamais

esquecerei os seus ensinamentos. Como abdicar de todo o incentivo que me destes durante o

tempo em que contei com a sua presença ? Hoje, mais uma etapa se realiza, e diante de tudo que

sonhamos juntas, agradeço-lhe mais uma vez.

Ao meu irmão Worney, por toda amizade e paciência durante os momentos mais

difíceis vivenciados neste trabalho.

Ao meu noivo Luciano. Sinto-me extremamente feliz por poder compartilhar mais uma

conquista com você e mais uma vez poder lhe agradecer por fazer parte desta minha vitória de

uma maneira única e especial afinal, com amor, paciência e compreensão, durante todos os

momentos, esteve sempre do meu lado.

À minha família, em especial as minhas avós, por estarem sempre me incentivando e

participando de todas as minhas conquistas, demonstrando a importância de estarmos sempre

unidos.

Às minhas amigas Alessandra e Graziele, por todos os anos de amizade e apoio

incondicional.

À minha amiga Isabele, que me apoiou e me incentivou desde o inicio, demonstrando

uma amizade e um carinho que jamais serão esquecidos. Obrigada por toda a ajuda amiga.

À amiga Eliete, que tornou-se uma grande colaboradora na execução deste trabalho.

Devo-lhe agradecer imensamente por toda amizade, companheirismo e pelos pensamentos e

palavras sempre positivas. O resultado deste trabalho também lhe pertence.

À amiga Ana Volpato, por todo o carinho e ajuda nos momentos das “descobertas

hipotalâmicas”. Desejo-lhe todo o sucesso neste caminho da neurociência.

Aos queridos amigos do LMMC, Júlio, Geraldo, Alini, Leonardo, Bianca, Vanessa,

Mariana, Sandrinha, Marcela, Fernanda, Rodrigo, Thiago, Milton, Antônio, Tatiane Faria,

Victor e Thaty Marinho, por todo o carinho e ajuda. Sentirei saudades de nosso convívio diário.

À minha orientadora, Profª. Drª. Alessandra Pinheiro, assim como Prof. Dr. Mandarim-

de-Lacerda e Profª. Drª. Márcia Águila. Agradeço-lhes pelos conhecimentos transmitidos e por

concederem-me uma grande oportunidade de aperfeiçoamento e amadurecimento profissional,

despertando-me um grande interesse pela docência e pela pesquisa.

Os meus sinceros agradecimentos a todas as pessoas que direta ou indiretamente

contribuíram para a conclusão deste estudo.

Sonhe com o que você quiser. Vá para onde você queira ir. Seja o que você quer ser,

porque você possui apenas uma vida e nela só temos uma chance de fazer aquilo que queremos.

Tenha felicidade bastante para fazê-la doce. Dificuldades para fazê-la forte. Tristeza para fazê-la

humana. E esperança suficiente para fazê-la feliz.

Clarice Lispector

RESUMO

PEIXOTO-SILVA, Nayara. Restrição proteica materna promove alterações corporais e

metabólicas com repercussões hipotalâmicas (Ob-R, NPY e POMC) nas proles F1 e F2 de

camundongos. 2010. 74 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Humana e Experimental) –

Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio

de Janeiro, 2010.

O mecanismo da obesidade pode-se instalar precocemente no início da vida. A restrição

proteica materna é reconhecidamente uma importante causa de programação metabólica capaz

de promover alterações metabólicas associadas a disfunções hipotalâmicas. Adicionalmente, as

consequências da programação fetal não se limitam somente a primeira geração, e podem ser

passadas transgeracionalmente. Fêmeas de camundongos suíço (F0) foram acasaladas e

alimentadas com dieta de percentual proteico normal (C, 19% de proteínas) ou dieta restrita em

proteínas (R, 5% de proteínas) através da gestação para a produção das proles da primeira

geração (C1 e R1). Aos 3 meses de idade, fêmeas F1 foram acasaladas com machos matrizes,

não participantes do estudo, para a produção das proles da segunda geração (C2 e R2). Todos os

grupos foram acompanhados até a 16ª semana. A prole R1 apresentou baixo peso e menor

comprimento ao nascimento, seguido de crescimento catch-up, diferentemente de R2 que não se

mostrou diferente de C2. Na 16ª semana de idade, não foram encontradas diferenças na massa

corporal entre todos os grupos estudados. Contudo, R1 e R2 apresentaram: hipercolesterolemia,

hipertrigliceridemia, hiperglicemia, intolerância à glicose, resistência à insulina, altos níveis

séricos de insulina, leptina e resistina, decréscimo da sensibilidade endógena da leptina,

aumento da adiposidade com elevada expressão de leptina e resistência à leptina caracterizada

pela disfunção da expressão de NPY e POMC sem alteração no receptor de leptina. Em

conclusão, a restrição proteica materna severa promove uma programação metabólica

caracterizada pelo aumento da adiposidade com alteração do perfil lipídico, intolerância à

glicose e resistência insulínica devido a desordens no eixo adipoinsular e um estado de

resistência à leptina nas proles da primeira e segunda geração.

Palavras-chave: Restrição proteica materna. Leptina. Obesidade. Catch-up. Neuropeptídeos.

ABSTRACT

The pathway to obesity may begin very early in life. Maternal protein restriction is

admittedly an important cause of the metabolic programming able to promote metabolic

alteration associated hypothalamic dysfunctions. One of the most interesting features of fetal

programming is the evidence that the consequences may not be limited to the first generation

offspring and it can be passed transgenerationally. Females Swiss mice (F0) were mated and fed

either a normal protein diet (NP group, 19% protein) or low protein diet (LP group, 5% protein)

throughout pregnancy to provide F1 male generation (NP1 and LP1). At 3 months of age, F1

females were mated to proven males, outside experiment, to produce F2 offspring (NP2 and

LP2). All groups were followed at 16 weeks old. LP1 showed low weight and smaller length at

birth followed by catch-up growth, differently of LP2 that was not different from NP2. At 16

weeks old no differences were found in body mass among groups, however LP1 and LP2

showed: hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, hyperglycemia, glucose intolerance,

insulin resistance, higher levels of insulin, leptin and resistin, decrease of sensibility endogenous

leptin, increase of adiposity with elevated expression of leptin and leptin resistance

characterized by dysfunction in the expression NPY and POMC without alteration in Ob-R. In

conclusion, severe maternal protein restriction promotes a metabolic programming characterized

by increased adiposity with alteration in lipid profile, glucose intolerance and insulin resistance

due to disorder in the adipoinsular axis and a state of hypothalamic leptin resistance in both the

F1 and F2 offspring.

Key-words: Maternal protein restriction. Leptin. Obesity. Catch-up. Neuropeptides

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 –

Figura 2 –

Figura 3 –

Figura 4 –

Figura 5 –

Figura 6 –

Figura 7 –

Figura 8 –

Figura 9 –

Figura 10 –

Figura 11 –

Figura 12 –

Figura 13 –

Perturbações metabólicas resultantes do retardo de crescimento intrauterino seguido

de crescimento catch-up .................................................................................................

Eixo adipo-insular............................................................................................................

Sinalização da leptina e insulina no hipotálamo..............................................................

Eventos neurobiológicos do desenvolvimento hipotalâmico de roedores.......................

Mecanismos de resistência a leptina................................................................................

Esquema da transmissão multigeracional e transgeracional do fenótipo epigenético.....

Gráficos de evolução da massa corporal durante a lactação e período pós-

desmame..........................................................................................................................

Gráficos do estudo alométrico com as respectivas equações da reta referentes ao

período de lactação das proles F1 e F2............................................................................

Gráficos do estudo alométrico com as respectivas equações da reta referentes ao

período pós-desmame das proles F1 e F2........................................................................

Média da área seccional dos adipócitos ..........................................................................

Gráficos da área sob a curva e evolução da glicemia do TOTG e TIPTI........................

Gráficos da expressão de leptina no tecido adiposo visceral (A) e receptor

hipotalâmico de leptina (B) por western blotting............................................................

Gráficos da expressão de NPY (A) e POMC (B) no hipotálamo por western

blotting.............................................................................................................................

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 –

Tabela 2 –

Tabela 3 –

Tabela 4 –

Tabela 5–

Composição das dietas experimentais preparadas em conformidade com a AIN-93G.

Dieta controle (C) e dieta restrita em proteína

(R)..................................................................................................................................

Biometria do período gestacional materno e tamanho das

ninhadas.........................................................................................................................

Comparação entre as razões de crescimento utilizando modelo

alométrico......................................................................................................................

Adiposidade...................................................................................................................

Bioquímica, hormônios e comportamento alimentar.....................................................

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AgRP – Peptídeo agout

AIN-93 – Recomendações dietéticas baseadas no American Institute of Nutrition do ano de

1993

AIN-93G – Recomendações dietéticas baseadas no American Institute of Nutrition do ano de

1993 para o período gestacional

Alfa-MSH –

Hormônio melanotrófico alfa

C –

Dieta controle

C1 –

Prole controle da primeira geração

C2 –

Prole controle da segunda geração

CNA –

Comprimento naso-anal

CT –

Colesterol total

DNA –

Ácido desoxirribonucleico

EP –

Erro padrão da média

F0 –

Progenitoras matrizes

F1 –

Primeira geração

F2 –

Segunda geração

F3 –

Terceira geração

g –

Grama

GH –

Hormônio de crescimento

HE –

Coloração histológica de hematoxilina e eosina

HOMA-beta –

Modelo de avaliação da homeostase da funcionalidade da célula beta

HOMA-IR –

Modelo de avaliação da homeostase da resistência insulínica

IL-2 –

Interleucina-2

JAK –

Proteína Janus quinase

JAK 2 –

Proteína Janus quinase 2

JAK/STAT –

Sistema de transdução de sinal intracelular

kcal – Quilocalorias

kDa –

Quilodaltons

Kg –

Quilogramas

kJ –

Quilojoules

l –

Litro

MC –

Massa corporal

MC3 –

Receptor de melanocortina 3

MC4 –

Receptor de melanocortina 4

mg –

Miligramas

ml –

Mililitro

mmol –

Milimol

NaCl –

Cloreto de sódio

ng –

Nanograma

NPY –

Neuropeptídeo Y

Ob –

Gene da leptina

Ob-R –

Receptor de leptina

Ob-Ra –

Isoforma de cadeia curta do receptor de leptina

Ob-Rb –

Isoforma de cadeia longa do receptor de leptina

Ob-Rf –

Isoforma do receptor de leptina

POMC –

Pro-opiomelanocortina

PTP1B –

Proteína tirosina fosfatase 1B

R –

Dieta restrita

R1 –

Prole restrita da primeira geração

R2 –

Prole restrita da segunda geração

SLIP –

Leptina sérica integrada à proteína

SLR –

Receptor de leptina solúvel

SNA –

Sistema nervoso autônomo

SNC –

Sistema nervoso central

SOCS3 –

Supressor de sinalização de citocina 3

STAT –

Moléculas da família de transdutores de sinal e ativadores de transcrição

STAT3 –

Isoforma da moléculas da família de transdutores de sinal e ativadores de

transcrição

TG –

Triglicerídeos

TIPTI –

Teste intraperitoneal de tolerância à insulina

TOTG –

Teste oral de tolerância à glicose

µUI –

Micro unidades internacionais

SUMÁRIO

1.1

1.2

1.3

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

3.7

3.8

3.9

3.10

4.1

4.2

4.3

4.4

4.5

4.6

INTRODUÇÃO

...................................................................................................................

REVISÃO DA LITERATURA..........................................................................................

Programação metabólica....................................................................................................

Leptina e sua relação com a insulina no eixo adipo-insular e sinalização

hipotalâmica........................................................................................................................

Mecanismos intergeracionais da programação metabólica............................................

PROPOSIÇÃO....................................................................................................................

MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................................

Protocolo experimental.......................................................................................................

Animais – Primeira geração (F1)......................................................................................

Animais – Segunda geração (F2).......................................................................................

Biometria e controle da ingestão alimentar......................................................................

Análise do perfil metabólico...............................................................................................

Sacrifício..............................................................................................................................

Análises bioquímicas do soro e concentrações hormonais..............................................

Microscopia de luz..............................................................................................................

Western Blotting.................................................................................................................

Análise Estatística...............................................................................................................

RESULTADOS...................................................................................................................

Dados biométricos maternos (progenitoras F0 e F1) e tamanho das

ninhadas...............................................................................................................................

Biometria e morfometria dos adipócitos...........................................................................

Perfil lipídico.......................................................................................................................

Perfil metabólico (homeostasia da glicose e concentrações hormonais)........................

Relação: ingestão alimentar e leptina sérica....................................................................

Expressão de leptina pelo tecido adiposo visceral e sua sinalização em núcleos

hipotalâmicos.......................................................................................................................

DISCUSSÃO........................................................................................................................

CONCLUSÃO....................................................................................................................

REFERÊNCIAS..................................................................................................................

ANEXO A Comitê de ética em pesquisa............................................................................

ANEXO B Comprovação de submissão de material sob a forma de artigo para periódico.

INTRODUÇÃO

A crescente incidência de obesidade é, atualmente, considerada como um

importante problema de saúde pública em países desenvolvidos, assim como nos países

em desenvolvimento [1]. No intuito de melhor compreender este intrigante processo que

determina o surgimento de doenças crônicas na vida adulta, diversos mecanismos tem

sido propostos.

Numerosos estudos epidemiológicos apontam para a associação entre diversas

doenças, dentre as quais a obesidade, com o baixo peso ao nascimento [2]. Contudo,

apesar dos mecanismos que permeiam estas relações não serem totalmente elucidados,

as condições ambientais do desenvolvimento e, principalmente, a nutrição no início da

vida, parecem configurar como importantes fatores desencadeantes destes transtornos.

Afinal, um inapropriado suprimento nutricional durante estes períodos, implica na

capacidade do indivíduo em regular o seu peso corporal, predispondo-o a obesidade [3].

Sendo assim, as consequências oriundas de um atraso no desenvolvimento intrauterino

ou no início da vida, além de implicações na modulação epigenética, evidenciam a

necessidade da obtenção de estratégias coerentes que possam frear este processo de

ganho de peso [4].

Estudos demonstram que condições subótimas no ambiente intrauterino podem

programar a prole através de um mecanismo conhecido como “programação

metabólica” [5], onde o organismo desenvolve um processo adaptativo caracterizado

por um “fenótipo econômico” [6], além de mudanças metabólicas capazes de garantir

uma futura vantagem a sobrevivência, a partir da organização de uma resposta

adaptativa preditiva [7]. Neste sentido, quando as proles nascem menores e

seguidamente sofrem um processo de crescimento catch-up, estas passam a ser mais

suscetíveis à obesidade induzida por dieta [8].

Ademais, uma restrição proteica ou calórica perinatal exerce efeitos persistentes

na plasticidade cerebral, mesmo quando o animal é reestabelecido desta má nutrição

inicial [9], o que demonstra uma sensibilidade do cérebro frente a alterações no

suprimento materno mesmo antes do nascimento [10]. Tais efeitos podem, portanto,

interferir na regulação do balanço energético corporal, onde componentes metabólicos e

hormonais atuam como sinalizadores periféricos em um integrado circuito central,

concentrado no hipotálamo [3]. Assim, a leptina passa a ser o maior sinal de balanço

energético derivado do tecido adiposo [11] e considerada como uma importante chave

na ativação de núcleos hipotalâmicos, sinalizando primariamente a reserva energética

corporal e desencadeando uma resposta negativa sobre a ingestão alimentar [12].

Consequentemente, o sinal da leptina e sua integração hipotalâmica podem,

possivelmente, estar envolvidos na programação do sistema de balanço energético pelas

condições de nutrição no início da vida [3].

Portanto, baseado no pressuposto de que este fenótipo alterado, oriundo de uma

restrição de crescimento intrauterino, pode ser transmitido a gerações subsequentes [13],

o presente estudo objetivou verificar os possíveis efeitos da restrição proteica materna

durante a gestação, na expressão de neuropeptídeos implicados na sinalização

hipotalâmica da leptina e, adicionalmente, avaliar as modificações periféricas,

metabólicas e hormonais, através da análise do tecido adiposo e parâmetros bioquímicos

na primeira e segunda geração de proles de camundongos machos adultos com 16

semanas de idade.

1 REVISÃO DE LITERATURA

1.1 Programação metabólica

Desde o final da década de 80 tem-se estabelecido, através de estudos

epidemiológicos e experimentais, a existência de uma possível associação entre um

defasado processo de desenvolvimento e o surgimento de doenças metabólicas na vida

adulta. Consequentemente, tem-se evidenciado quadros como hipertensão arterial,

doença coronariana, dislipidemia, obesidade visceral, prejuízo da tolerância a glicose,

diabetes mellitus tipo 2 e muitas outras doenças, incluindo osteoporose [14].

O retardo de crescimento intrauterino consiste em uma falha do feto em alcançar

o seu intrínseco potencial de crescimento em virtude de desordens e doenças na unidade

feto-placenta-mãe [15].

A hipótese de “origem fetal” desencadeando doenças no adulto remonta a David

Barker que observou a influência de fatores ambientais, particularmente a nutrição,

agindo no início do desenvolvimento de forma a programar riscos de surgimento de

doenças cardiovasculares e metabólicas na idade adulta, bem como morte prematura

[16]. Consequentemente, no ano de 1991, postulou-se o termo “programação

metabólica” como sendo o conceito que descreve as respostas fisiológicas permanentes,

resultantes de condições desfavoráveis durante períodos críticos de desenvolvimento

[17]. Assim, seguindo uma série de estudos epidemiológicos mundiais, as observações

iniciais quanto a associação entre crescimento pré e pós-natal e doença cardiovascular

foram estendidas para incluir o risco aumentado de hipertensão, intolerância a glicose,

diabetes tipo 2, resistência a insulina e obesidade na idade adulta [18].

O conceito de que existe uma resposta adaptativa do embrião ou do feto ao

ambiente intrauterino subótimo, resultando em permanente consequência adversa, é

consistente com a definição de “programming” postulada por Lucas: “... estímulos ou

insultos em períodos críticos do desenvolvimento apresentam efeitos duradouros ou por

toda a vida” [17]. Em 1992 criou-se o termo “hipótese do fenótipo econômico” [19]

baseado na hipótese do “genótipo econômico” [20, 21]. A hipótese do “fenótipo

econômico” sugere que, quando o ambiente fetal é escasso, isto gera uma resposta

adaptativa que otimiza o crescimento de órgãos primordiais em detrimento de outros,

levando ao metabolismo pós-natal alterado, que é designado à sobrevivência pós-natal

sob condições intermitentes de nutrição deficiente. Propõe-se que tais alterações se

tornam adversas quando a nutrição no ambiente pós-natal é mais abundante do que no

ambiente pré-natal [22].

O termo “imprinting” metabólico também foi usado para descrever este fenômeno

biológico, de causar consequências no futuro devidas a experiências nutricionais

intrauterinas adversas [23]. Atualmente, existe um debate sobre o termo apropriado a ser

utilizado: programação (pois este termo pode ser interpretado erroneamente como

eventos reversíveis à irreversíveis), ou imprinting metabólico (este termo implica que

são exclusivamente metabólicos na sua origem e causam confusão entre os termos

imprinting metabólico e genes “imprintados”) [18].

Mais recentemente Barker propôs um novo termo, “plasticidade no

desenvolvimento”. A definição para este termo é a “habilidade que um simples genótipo

tem de produzir mais de uma forma alternativa de estrutura, estado fisiológico e

comportamento em resposta a condições ambientais” [24].

Está claro que uma série de áreas do conhecimento, incluindo a ecologia evolutiva e

a biologia molecular, mostram que o genótipo pode gerar diferentes fenótipos,

dependendo da condição ambiental. Em muitas espécies o impacto experimentado pelo

ambiente em uma geração específica pode determinar o desenvolvimento e o

comportamento da próxima geração. Do mesmo modo, a restrição materna pode resultar

em efeitos de determinado fator ambiental persistindo através de diversas gerações [25].

Diversos modelos experimentais têm sido empregados para induzir uma

adversidade no ambiente fetal para imitar as condições de crescimento intrauterino

comprometido em humanos. Dentre as manipulações usadas podemos destacar: a

restrição global [26] ou protéica de nutrientes durante a gestação e/ou lactação [27, 28],

hipóxia crônica durante a gestação [29], insuficiência placentária [30] e exposição

prenatal a glicorticóides [31]. A validade dos achados, atualmente, é aceita. A questão

em debate é entendermos se os mecanismos responsáveis são genéticos ou ambientais

[32].

As alterações metabólicas em resposta a programação fetal, aparentemente

vantajosas, reforça o conceito da “resposta adaptativa preditiva” proposta por Gluckman

e colaboradores mais recentemente. Nesta hipótese, o feto pode interagir dinamicamente

com as mudanças ambientais e promover um fenótipo apropriado para tais condições

que, provavelmente, irão se estabelecer no futuro. Contudo, diante de condições

diferenciadas da vida fetal, representadas pelo menor dispêndio energético, maior

densidade calórica da dieta e somado ao aumento de expectativa de vida da sociedade,

tem-se o aumento das doenças resultantes dessas adaptações, agora consideradas

inadequadas [33].

Durante a vida fetal, tecidos e órgãos passam por períodos críticos de

desenvolvimento que coincidem com períodos de rápida divisão celular. Assim, quando

um insulto, como a restrição proteica, ocorre no período pré-natal ou na lactação, que

são períodos críticos ou sensíveis do desenvolvimento, pode resultar em alterações

adaptativas no feto, com consequentes mudanças tardias da estrutura e da função de

órgãos e sistemas. Portanto, a programação que ocorre durante o período perinatal,

resulta em respostas adaptativas permanentes que podem alterar o crescimento,

estrutura, fisiologia e metabolismo no adulto [34]. Atualmente, observa-se que os

fatores condicionantes ao desenvolvimento e ao agravamento das desordens metabólicas

futuras são: a nutrição pós-natal e o processo de crescimento acelerado definido como

“catch-up”.

Dentre os vários fenótipos considerados na hipótese da programação fetal,

atualmente a obesidade e as alterações no metabolismo glicídico tem merecido

destaque. Inúmeros trabalhos demonstram que animais que sofrem uma restrição no

desenvolvimento fetal e são realimentados durante o período da lactação apresentam,

inevitavelmente, o processo de catch-up e passam a ser mais susceptíveis ao quadro de

obesidade induzida pela dieta potencializando os riscos para o surgimento de doenças

crônicas e, consequentemente, têm a diminuição da sua expectativa de vida [35, 36].

Este catch-up é caracterizado por uma rápida e desproporcional taxa de deposição de

gordura corporal em relação aos tecidos magros, sendo por esse motivo, fortemente

associado ao quadro de hiperinsulinemia [2].

A programação por restrição proteica pode resultar em uma expressão gênica

diferenciada no tecido adiposo, associada ainda, a uma alta proliferação dos pré-

adipócitos [37, 38], o que vem a contribuir para o aumento da adiposidade. Estudos

demonstram que o tecido adiposo configura-se como uma chave essencial para as

grandes perturbações na homeostase energética, no metabolismo e, principalmente, na

sensibilidade a insulina. Seu desenvolvimento durante o período perinatal é

comprometido frente a uma restrição de crescimento, promovendo consequências que se

estendem além do processo de catch-up e que irão perdurar durante a vida [39] (Figura

1).

Ademais, outro órgão afetado pela restrição proteica nos períodos críticos do

desenvolvimento é o pâncreas. Distúrbios nutricionais no ambiente fetal aumentam a

susceptibilidade à resistência a insulina, intolerância a glicose e diabetes na vida adulta

[40, 41]. Fetos de mães que foram submetidas à restrição proteica, exibem diminuição

do tamanho das ilhotas pancreáticas e da capacidade de proliferação das células beta

pancreáticas, deficiência tanto do conteúdo de insulina quanto da vascularização das

ilhotas de Langerhans, e aumento da taxa de apoptose dessas células. Depois do

nascimento o número de ilhotas e o tamanho da célula beta permanecem diminuídos

[42]. Assim, qualquer deficiência que ocorra no útero e na lactação colocará em risco a

massa de células beta pancreáticas, contribuindo para a falência dessas células ou

intolerância a glicose na vida adulta [43]. Essas disfunções metabólicas podem ser

caracterizadas pela alteração da capacidade antioxidante e prejuízo na homeostasia da

glicose com relativa resistência insulínica [44]. Já se encontra relatos na literatura que

efeitos no metabolismo glicídico podem ser evidenciados na geração posterior (F2)

[45], podendo, inclusive, apresentar resultados distintos de acordo com o período crítico

em que as progenitoras (F0) foram impostas a agressão [46].

Figura 1. Perturbações metabólicas resultantes do retardo de crescimento intrauterino

seguido de crescimento catch-up [47].

No que concerne o desenvolvimento neural, verifica-se que animais

provenientes de mães com restrição proteica durante a gestação apresentam uma

redução do desenvolvimento da vascularização do córtex cerebral [48], além de

alterações na expressão de receptores de leptina e neuropeptídeos hipotalâmicos ainda

na vida intrauterina. Portanto, considera-se que o feto interage a modificações no

ambiente materno mesmo antes ao seu nascimento [10]. Entretanto, ressalta-se que as

alterações permanentes no controle do peso corporal também podem ser estabelecidas

frente a uma desnutrição materna ao longo da lactação [49]. Afinal, quando este déficit

proteico é imposto de forma perinatal, observa-se uma complexa desorganização

hipotalâmica apontando uma possível “má-programação” dos centros regulatórios da

homeostase energética [50].

Este efeito programado pode ser observado ainda no desmame, onde as proles

geradas por mães com restrição proteica perinatal não apresentam diferenciação em seus

níveis plasmáticos de leptina, porém possuem maior expressão de neuropeptídeo Y no

núcleo paraventricular, sugerindo que o efeito orexigênico do eixo arqueado-

paraventricular pode ser estimulado independentemente da leptina. Esta condição passa

a contribuir para o ganho de peso e alterações metabólicas durante a vida [51].

Demonstrando ainda, a complexidade deste tipo de programação metabólica no

comportamento alimentar, estudo recente demonstrou que a restrição proteica materna

poder promover um quadro de hiperfagia nas proles, podendo ser justificado, em certa

parte, por uma redução da ação inibitória da serotonina a nível cerebral [9].

Baseando-se, portanto, nos inúmeros resultados oriundos do déficit de

crescimento fetal imposto pela restrição proteica materna, cabe ressaltar a importância

de estudos que possam estabelecer um conhecimento pleno das alterações ocorridas nos

mecanismos periféricos e centrais, no controle da ingestão alimentar e no gasto

energético corporal.

1.2 Leptina e sua relação com a insulina no eixo adipo-insular e sinalização

hipotalâmica

Inúmeras pesquisas são desenvolvidas no intuito de compreender a interferência

de diferentes danos, ocorridos em períodos críticos de desenvolvimento, no controle do

peso corporal e da adiposidade. Neste sentido, a leptina e a insulina configuram-se

como componentes regulatórios essenciais, principalmente, por estabelecerem um

mecanismo de feedback, seja a nível do sistema nervoso central (SNC) ou em tecidos

periféricos.

A existência de um mecanismo regulatório do peso corporal, exercido por um

componente sérico originado do tecido adiposo, foi primeiramente proposta por

Kennedy no ano de 1953 [52]. Contudo, somente no ano de 1994, Friedman e

colaboradores finalmente identificaram a leptina como um importante fator neste

controle do comportamento alimentar [53], desencadeando assim, importantes avanços

científicos, que culminaram na descoberta de seu receptor, por Tartaglia e

colaboradores, no ano seguinte [54].

Frente a estas novas descobertas, as pesquisas referentes às ações da leptina

tornaram-se mais relevantes e promoveram a identificação de suas diferentes funções

fisiológicas como a homeostasia energética, reprodução, formação óssea e atuação no

sistema cardiovascular [55].

A leptina caracteriza-se por ser um polipeptídio composto por 167 aminoácidos,

produto do gene ob e com peso molecular de 16 kDa, sendo encontrado no sangue de

inúmeras espécies de mamíferos incluindo camundongos e humanos [53]. Embora a

sequência inicial de aminoácidos da leptina não pareça alheia a qualquer outra proteína,

estudos posteriores avaliaram sua estrutura terciária e observaram que esta se dobra em

uma estrutura helicoidal de citocina semelhante à interleucina-2 (IL-2) e hormônio de

crescimento (GH) [56].

Destaca-se que apesar de sua secreção ocorrer em diferentes tecidos tal qual

epitélio gástrico, glândulas mamárias e placenta [11], o tecido adiposo branco se

configura como o principal produtor da leptina [57], o que o torna um componente

fundamental, juntamente com o pâncreas, de um eixo regulatório conhecido como “eixo

adipo-insular”.

A regulação deste mecanismo de feedback baseia-se no fato de que a insulina

apresenta uma característica adipogênica, elevando substancialmente a produção de

leptina e favorecendo a modulação da homeostase energética a nível central. Em

contrapartida, o incremento dos níveis de leptina promove uma supressão da secreção

de insulina pelo pâncreas, com o intuito de estabelecer um controle da adiposidade,

através da ação direta em receptores presentes nas células beta ou via sistema nervoso

autônomo (SNA) (Figura 2) [58].

Figura 2. Eixo adipo-insular [58].

Estudo prévio demonstra que a programação metabólica é capaz de alterar este

mecanismo, evidenciando que animais submetidos a retardo de crescimento intrauterino

podem ter uma alteração permanente do eixo adipo-insular com hiperleptinemia,

hiperinsulinemia e, interessantemente, uma produção compensatória de leptina pelas

células delta pancreáticas, na tentativa de reduzir a secreção de insulina. O somatório de

tais alterações perfaz um quadro que leva a progressão do diabetes e piora dos quadros

de resistência a ação destes componentes [59].

Todavia, destaca-se que a condução de uma resposta adipostática pela leptina

[60], não se resume ao controle da produção de insulina. A leptina comporta-se como

um hormônio, sinalizador primário dos estoques energéticos corporais [12], capaz de

promover um controle da ingestão alimentar e do gasto energético corporal em

receptores hipotalâmicos no SNC [57].

Novamente, a estreita relação entre leptina e insulina torna-se evidente, uma vez

que a transdução do sinal da leptina é grandemente influenciada pela insulina, que se

comporta como um componente modulador, atuando em uma via de sinalização celular

paralela [61, 62] (Figura 3).

Cabe ressaltar que a leptina, assim como outras citocinas de cadeia longa, exerce

um importante efeito pleiotrófico no organismo, refletindo assim, a multiplicidade de

seus efeitos biológicos inclusive nos tecidos extraneurais. Esta característica de ação se

deve principalmente a extensa distribuição dos seus receptores transmembrana (Ob-R)

que apresentam estruturas reconhecidamente semelhantes aos receptores da família de

classe I de citocina [54, 63]. Tais receptores apresentam-se em seis diferentes isoformas

(Ob-Ra – Ob-Rf) com variável comprimento, localização e funcionalidade. Possuem um

idêntico domínio extracelular, contudo diferem quanto aos seus domínios intracelulares

[64]. Dentre as isoformas mais conhecidas tem-se o receptor Ob-Rb (também conhecido

por sua conformação de longa cadeia), que é altamente expresso no hipotálamo e é o

único a ativar o sistema de transdução JAK/STAT [65]. Diferentemente, a isoforma Ob-

Ra é grandemente encontrada nos tecidos periféricos, plexo coroide e microvasos

apresentando capacidade de sinalização, além de exercer atividade de transporte da

leptina ao nível da barreira hemato-encefálica [64, 66].

Portanto, em situações normais, a leptina entra no hipotálamo ligada a receptores

de cadeia curta (Ob-Ra), situados na barreira hemato-encefálica, e subsequentemente

atua ligada a receptores de cadeia longa (Ob-Rb) iniciando uma cascata de ativação,

através de componentes efetores: a proteína janus quinase e moléculas da família de

transdutores de sinal e ativadores de transcrição (JAK / STAT) [67]. Uma vez

fosforilada, a molécula de STAT, predominantemente STAT-3, conduzirá o sinal

gerado pela leptina ao núcleo, onde atuará como fator de transcrição, controlando a

expressão gênica de neurotransmissores responsivos ao sinal do hormônio [66].

Esta atuação da leptina no SNC mediada pelo hipotálamo [68], caracteriza o

núcleo arqueado como sendo o maior sítio de sinalização [69]. Afinal, este núcleo

configura-se como um importante acesso devido a sua localização na região mediobasal,

mais especificamente acima da eminência medial, onde ocorre um comprometimento da

barreira hemato-encefálica, resultando em um maior acesso dos fatores circulantes.

Logo, através da expressão de duas populações chaves de neurônios com ações

antagônicas à ingestão alimentar [70], tem-se o desencadeamento das respostas

hipotalâmicas, deflagradas por uma cascata de sinalização que resulta na modulação de

neuropeptídeos como: neuropeptídeo Y (NPY) e pro-opiomelanocortina (POMC) [71].

O NPY através de sua atuação em receptores específicos [72], juntamente com o

AgRP por atuação em receptores de melanocortina (MC3 e MC4) exercem as ações

orexigênica. Em contrapartida POMC é processado para a produção de alfa-MSH

gerando uma resposta anorexigênica justamente por ativação destes novos receptores

[73]. Portanto, a sinalização da leptina no receptor Ob-Rb estimula a produção de

neuropeptídeos responsáveis pela supressão da ingestão de alimentos, além de diminuir

a expressão de peptídeos orexigênicos no núcleo arqueado [74] (Figura 3).

Figura 3. Sinalização da leptina e insulina no hipotálamo [75].

Fisiologicamente, baixos níveis de leptina durante o jejum estimulam a ingestão

alimentar, redução do gasto energético e modulação das funções imunes e

neuroendócrinas para a conservação dos estoques de energia. Em compensação, a

elevação dos seus níveis em um estado de superalimentação, previne o ganho de peso

através da inibição do consumo alimentar e aumento do gasto calórico [76].

Entretanto, apesar de toda relevância da atuação da leptina no comportamento

alimentar ao longo da vida, é de suma importância ressaltar, que este hormônio também

desempenha um papel fundamental no desenvolvimento destes circuitos regulatórios no

inicio da vida pós-natal de roedores. Evidências apontam uma imaturidade hipotalâmica

destes animais, tanto estrutural quanto funcional, até a segunda semana de vida,

caracterizando um período crítico onde naturalmente ocorre um pico de leptina [77].

A constatação de elevados níveis séricos de leptina, em um período onde o

neonato necessita de maior aporte energético e ingestão alimentar condizente a um

pleno desenvolvimento, sugere uma aparente insensibilidade da leptina no controle do

comportamento alimentar durante este período [78]. Portanto, este mecanismo ressalta a

atuação neurotrófica da leptina ainda no período da lactação, que é caracterizada pelo

desenvolvimento de projeções provenientes do núcleo arqueado aos diferentes núcleos

hipotalâmicos em tempos distintos (Figura 4).

Figura 4. Eventos neurobiológicos do desenvolvimento hipotalâmico de roedores. (A)

Fase de proliferação neuronal ocorrida entre 12º - 16º dia embrionário seguido da fase

de extensão axonal ocorrida entre o 6º - 12º dia de vida pós-natal. (B) Esquema do

desenvolvimento temporal das projeções axonais na vida pós-natal (ARQ – DMH: 6º

dia pós-natal; ARQ – PVN: 8º - 10º dia pós-natal; ARQ – LHA: 12° dia pós-natal).

Legenda: ARQ: núcleo arqueado; DMH: núcleo dorsomedial; PVN: núcleo

paraventricular; LHA: área hipotalâmica lateral [77, 79].

Deste modo, a melhor compreensão dos possíveis mecanismos que influenciam

ou estabelecem um efeito de resistência hormonal no hipotálamo é de suma importância

para o tratamento da obesidade, uma vez que este processo compromete a modulação do

metabolismo energético e a regulação do peso corpóreo. Afinal, formas comuns de

obesidade estão associadas a elevados níveis de leptina e uma incapacidade de resposta

eficiente a doses de leptina exógena indicando, portanto, um estado de resistência a

leptina, e consequentemente, um componente importante no desenvolvimento do

sobrepeso [80]. Neste mecanismo de resistência, podem estar inclusos fatores diversos

como: mutações gênicas, auto-regulação da leptina, acesso limitado deste hormônio aos

tecidos alvos, além de regulação molecular e celular [65] (Figura 5). Aumentados níveis

de leptina circulantes são independentemente associados à resistência a insulina e

doenças cardiovasculares em humanos [65]. Interessantemente, algumas funções da

leptina no estado de resistência permanecem inalteradas, como em sua atuação no

sistema cardiovascular [80].

Em virtude de estudos presentes na literatura, sugere-se que a maior causa do

quadro de resistência a leptina baseia-se na atenuação do mecanismo de ativação

intracelular do receptor de leptina [81], podendo ser representada pela atuação endógena

da SOSC3, que inibe a fosforilação dos resíduos de tirosina nos receptores de leptina

[82], e de PTP1B que promove uma desfosforilação das moléculas de JAK 2 [83].

Figura 5. Mecanismos de resistência a leptina. Legenda: SLIP: leptina sérica integrada à

proteína; SLR: receptor de leptina solúvel; SOCS3: supressor de sinalização de citocina

3; PTP1B: proteína tirosina fosfatase 1B; CNS: sistema nervoso central; Ob: gene da

leptina; Ob-R: receptor de leptina [65].

1.3 Mecanismos intergeracionais da programação metabólica

Uma importante característica da programação do desenvolvimento consiste no

fato de que as consequências adversas do ambiente intrauterino podem ser transmitidas

através das gerações por mecanismos que podem ser epigenéticos ou devido a mutações

na sequencia do DNA [84].

O termo epigenético foi primeiramente definido no início dos anos 40 por

Conrad Waddington como “a interação dos genes com o ambiente que determina o

fenótipo” [85]. Posteriormente, na década de 90 a epigenética foi descrita, mais

especificamente, como o estudo de mudanças hereditárias na expressão gênica que

ocorre sem alterações na sequência do DNA [86].

Graças aos avanços da ciência, atualmente, já se determina que estas mudanças

epigenéticas derivam de processos como: metilação do DNA, modificações pós-

translacional das histonas terminais (acetilação, metilação, fosforilação, dentre outros) e

elevada ordem de empacotamento dos nucleossomos em torno do DNA [87].

Adicionalmente, outro mecanismo que poderia explicar a transmissão

transgeracional fica a cargo da linhagem exclusivamente materna. Modificações no

DNA mitocondrial poderiam ocorrer nos gametas dos fetos femininos em

desenvolvimento e levar a transmissão de condições alteradas a geração seguinte [46].

Logo, a caracterização transgeracional da herança epigenética está associada a

modificações da expressão gênica de células meióticas [88], e não somente durante a

mitose [87].

Desde a década de 70 Stewart e colaboradores, no intuito de observar os efeitos

de uma restrição proteica a longo prazo, estudaram 12 gerações de ratas mal nutridas.

Seus achados mostraram que a reversão dos efeitos deletérios oriundos da dieta

materna, somente foi possível quando pelo menos três gerações foram submetidas a

uma nutrição adequada [89].

Mais recentemente, a literatura propõe que a transmissão do fenótipo epigenético

deve ser definida como multigeracional a partir do momento em que ainda se observa

uma exposição direta do fator ambiental negativo no desenvolvimento das múltiplas

gerações. Ou seja, um prejuízo nutricional materno imposto às progenitoras F0, resulta

ainda na exposição direta do déficit nutricional aos embriões F1 assim como nas linhas

germinativas de F2. Assim, diante destas condições, o termo transgeracional somente

poderia ser empregado a partir da geração F3, onde não mais haveria exposição direta

deste fator ambiental (Figura 6) [13].

Conclui-se que os estudos experimentais configuram-se como ferramentas

fundamentais para a definição de como estes mecanismos que favorecem a transmissão

de um fenótipo alterado são estabelecidos, justificando assim, os diversos resultados

epidemiológicos que demonstram os efeitos a longo prazo das interferências no

desenvolvimento fetal.

Figura 6. Esquema da transmissão multigeracional e transgeracional do fenótipo

epigenético [13].

2 PROPOSIÇÃO

O presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos intergeracionais (F1 e F2)

da programação metabólica, resultantes de uma restrição proteica materna durante o

período gestacional, na adiposidade, na sinalização hipotalâmica de leptina e

homeostase glicêmica nas proles adultas (16 semanas de idade) de camundongos

machos.

Especificamente objetivou-se:

• Avaliar a evolução da massa corporal, do comprimento naso-anal e da ingestão

alimentar;

• Verificar a adiposidade;

• Verificar as alterações nos níveis séricos de colesterol e triglicerídeos;

• Avaliar as alterações na homeostasia da glicose e insulina com testes indiretos e

dosagens bioquímicas;

• Realizar dosagem sérica de adipocinas (leptina e resistina);

• Avaliar a expressão de leptina pelo tecido adiposo visceral;

• Avaliar a expressão de Ob-R, NPY e POMC no hipotálamo.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Protocolo experimental

Os protocolos de manuseio e experimentação foram submetidos e aprovados

pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade do Estado do Rio de

Janeiro (Protocolo CEA/253/2008). Todos os procedimentos foram realizados de acordo

com os preceitos do “Guia para o uso de cuidado de animais de laboratório” (Publicação

do NIH nº 85-23, revisada em 1996, USA).

Todos os animais utilizados no estudo foram acondicionados em caixas de

polipropileno e em ambiente com temperatura e umidade controladas (21±2ºC,

60±10%, respectivamente), submetidos a ciclo de luz invertido de 12 horas

(claro/escuro), exaustão 15 min/h e receberam água e ração ad libitum durante todo o

período de experimentação.

3.2 Animais – Primeira geração (F1)

Fêmeas virgens de camundongos suíços (F0), primíparas, com idade de 8

semanas foram divididas em dois grandes grupos nutricionais com dietas isoenergéticas

(1900 kJ/100g dieta), diferindo apenas no percentual proteico. Constituiu-se, portanto o

grupo normoproteico (dieta controle, C, 19g proteína/100g dieta) e hipoproteico (dieta

restrita, R, 5g proteína/100g dieta). A dieta hipoproteica foi acrescida de carboidrato

complexo (amido) para a manutenção do equilíbrio energético e ambas seguiram as

recomendações da AIN-93 de acordo com o período fisiológico dos animais [90]. As

dietas foram produzidas por PragSoluções (PragSoluções®, Jaú, SP, Brasil,

www.pragsolucoes.com.br) (Tabela 1).

Tabela 1 – Composição das dietas experimentais preparadas em conformidade com a

AIN-93G. Dieta controle (C) e dieta restrita em proteína (R).

As fêmeas matrizes (F0) foram então acasaladas com machos matrizes e, no dia

que foram encontrados espermatozoides no esfregaço vaginal, este foi considerado o dia

da gestação. Todas deram origem à prole por parto espontâneo. O tamanho da prole e o

peso dos filhotes foram anotados no dia do nascimento e, para padronizar o suprimento

de alimento, as proles foram ajustadas em seis animais por mãe (razão de 1:1 entre os

gêneros, quando possível) [91]. Com isso, a prole das mães alimentadas com dieta

normoproteica foi nomeada como controle (C), e a prole das mães alimentadas com

dieta hipoproteica, nomeada como restrita (R). Esta divisão foi mantida até o desmame,

quando somente um filhote por ninhada foi separado aleatoriamente para dar origem aos

Nutriente (g/100g)

Dieta Controle

(Normoproteica)

Dieta Restrita

(Hipoproteica)

Carboidrato

Amido de milho 34,5 47,7

Sacarose 20,0 20,0

Caseína 19,0 5,0

Cisteína 0,30 0,15

Colina 0,20 0,20

Lipídeos (óleo de soja) 7,0 7,0

Fibra (celulose) 5,0 5,0

Mix de minerais (AIN 93G) 3,5 3,5

Mix de vitaminas (AIN 93G)

1,0 1,0

Energia (kcal/100g de dieta) 377,0 377,0

grupos de machos da primeira geração (C1 e R1) que foram acompanhados até os 4

meses de vida. Após o nascimento dos filhotes as progenitoras de ambos os grupos

receberam dieta normoproteica até a 16ª semana de vida. Um segundo grupo de fêmeas

foi também separado para aquisição da segunda geração.

3.3 Animais – Segunda geração (F2)

Ao completarem 8 semanas de idade fêmeas de F1 foram acasaladas com

machos matrizes, não participantes do estudo, produzindo assim os grupos

experimentais da segunda geração (C2 e R2). Ressalta-se que todas as fêmeas

receberam dieta controle durante a gestação até o término do estudo. A partir do

nascimento, que também ocorreu por parto espontâneo, repetiu-se o mesmo protocolo

como descrito anteriormente para F1.

3.4 Biometria e controle da ingestão alimentar

Após o desmame, os filhotes dos respectivos grupos foram alocados em um

número de 5 animais por caixa. Semanalmente, aferiu-se a massa corporal (MC) com

balança digital de precisão 0,01g (Shimadzu, Presidente Prudente, São Pulo), assim

como o comprimento naso-anal (CNA), através de instrumental acurado dimensionado

para o tamanho dos animais.

As devidas rações foram fornecidas diariamente e não foram observadas

rejeições quanto ao alimento fornecido. O controle da ingestão alimentar, em termos

absolutos, foi realizado diariamente através da diferença entre a quantidade de ração

fornecida e a quantidade de ração restante após 24 horas.

Ainda, quanto ao estudo do comportamento alimentar, realizou-se a análise da

ingestão alimentar ajustada ao peso corporal [(g de ingestão alimentar / g de peso

corporal) x 100] [9].

3.5 Análise do perfil metabólico

Na 15ª semana de vida os animais foram submetidos ao teste oral de tolerância a

glicose (TOTG) para determinação da tolerância a glicose. Os animais foram mantidos

em jejum por 6 horas e posteriormente administrado, por gavagem orogástrica, glicose a

25% em solução salina estéril (0,9% NaCl) na dose de 1 g/kg de massa corporal.

Através de uma pequena incisão na cauda dos animais coletou-se amostra de sangue

para a mensuração da glicemia nos tempos 0, 15, 30, 60 e 120 minutos. A glicemia foi

mensurada utilizando-se glicosímetro (Accu-chek, Roche Diagnostic, Germany).

Posteriormente, na 16ª semana de vida, realizou-se o teste intraperitoneal de

tolerância à insulina (TIPTI). Os animais foram mantidos em jejum por 4 horas e,

imediatamente após esse tempo (considerado tempo zero), coletou-se sangue através de

pequena incisão na cauda dos animais e aferiu-se a concentração de glicose. Em

seguida, administrou-se intraperitonealmente 0,75UI/kg de massa corporal de insulina

(ultra rápida) e mais uma vez verificou-se a glicose sérica nos tempos 15, 30, 60, 120

minutos, após a injeção de insulina, para obtenção da curva de tolerância a insulina [92].

Em ambos os procedimentos foi calculado o valor da área sob a curva através da

regra trapezoidal, o que possibilitou a avaliação de possível intolerância a glicose e

resistência insulínica, respectivamente.

3.6 Sacrifício

Os grupos de F1 e F2 foram acompanhados até a 16ª semana de vida. No dia da

eutanásia, os animais foram heparinizados e profundamente anestesiados com

pentobarbital de sódio (Thiopental intraperitoneal na dose de 150 mg/kg de massa

corporal) após 6 horas de jejum. Com imobilização em dispositivo adequado, a caixa

torácica foi amplamente aberta, tornando possível a coleta de sangue através de punção

cardíaca pelo átrio direito para posterior dosagem bioquímica.

Em seguida, o cérebro foi prontamente removido e pesado e o hipotálamo

dissecado e imediatamente congelado em nitrogênio líquido. Este material foi, então,

estocado a uma temperatura de -80°C para as análises de Western Blotting.

As gorduras retroperitoneal, epididimária e inguinal foram coletadas de ambos

os lados do corpo do animal e igualmente pesadas. Estabeleceu-se como gordura

retroperitoneal o depósito existente em volta de cada rim e ao longo dos músculos

lombares, e a gordura epididimária como o tecido adiposo ao redor dos ureteres, bexiga,

epidídimo. Especificamente, a gordura epididimária foi fracionada, sendo parte

congelada e destinada a técnica de Western Blotting e outra fração destinada à

microscopia de luz, sendo fixada com formalina de Millonig (1.27 mol/l formaldeído

em 0.1M de tampão fosfato, pH 7.2) por 48 horas. Após o processamento histológico de

rotina, a gordura foi incluída em Paraplast Plus (Sigma-Aldrich, Co, St. Louis, MO,

EUA).

Ressalta-se que a soma das gorduras retroperitoneal e epididimária caracterizou

o tecido adiposo branco visceral, e a gordura inguinal como sendo representante do

tecido adiposo branco subcutâneo. Neste sentido, calculou-se a razão entre a gordura

subcutânea e a gordura visceral como (gordura inguinal (g) / gordura epididimária +

gordura retroperitoneal (g)).

3.7 Análises bioquímicas do soro e concentrações hormonais

Após a coleta do sangue, o soro foi obtido por centrifugação (120g por 15 min) à

temperatura ambiente (21±2°C) e estocado individualmente a -20°C até a análise

bioquímica.

O estudo do perfil lipídico baseou-se nas dosagens de colesterol total (CT) e

triglicerídeos (TG) obtidos pelo método enzimático colorimétrico, com auxílio de

espectofotômetro automático Bioclin System II e os respectivos “kits” indicados para

cada dosagem bioquímica (Quibasa – Química Básica, Belo Horizonte, MG, Brasil). O

CT foi determinado pelo método colesterol esterase/oxidadase/peroxidade, e os TG pelo

método da lipase/glicerol quinase/GPO/peroxidase.

Pela técnica de ELISA (Multiplex) analisou-se os valores de insulina, leptina e

resistina sérica (Millipore, Billerica, MA, USA). Posteriormente, foi calculado o índice

HOMA-IR [glicemia de jejum (mmol/l) x insulina sérica de jejum (µUI/ml) / 22.5] no

intuito de verificar possível resistência insulínica, assim como o HOMA-beta [insulina

sérica de jejum (µUI/ml) x 20 / glicemia de jejum (mmol/l) – 3,5] para verificar a

capacidade funcional das células beta pancreáticas [93]. E para a verificação da

sensibilidade a leptina endógena calculou-se a razão: ingestão calórica (kcal/dia) /

concentração de leptina plasmática (ng/ml) [94].

3.8 Microscopia de luz

Fragmentos do tecido adiposo genital (gordura epididimária), representante da

gordura visceral, após inclusão em Paraplast Plus (Sigma-Aldrich, Co, St. Louis, MO,

EUA), foram seccionados em 5 µm de espessura e corados com Hematoxolina e Eosina

(HE). A área seccional dos adipócitos foi determinada através da utilização de imagens

digitais adquiridas aleatoriamente (50 adipócitos/animal, formato TIFF, 36-bit color,

1280x1024 pixels) com câmera LC Evolution e microscópio Olympus BX51, e

analisados com software Image-Pro Plus, versão 7.0 (Media Cybernetics, SilverSpring,

MD, EUA).

3.9 Western Blotting

O hipotálamo e fragmentos de gordura visceral epididimária (100 mg)

previamente estocados a -80°C foram homogeneizados em tampão de lise (para

hipotálamo: 50 mM HEPES, cloreto de magnésio (MgCl

), EDTA, 1% Triton X-100;

para tecido adiposo: 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM fluoreto de sódio, 1% Nonidet-

P40, 150 mM cloreto de sódio (NaCl), 5mM EDTA, 0.1% dodecil sulfato de sódio

(SDS)). Ressalta-se que em ambas as soluções de tampão adicionou-se 1 µg/ml de

coquetel inibidor de protease (SIGMA-Aldrish, MO, USA), para posterior centrifugação

em equipamento refrigerado por 5 minutos a 4° a 11.500 rpm ou 20 minutos a 4°C a

13.000 rpm, respectivamente. As amostras foram, então, coletadas, aliquotadas,

analisadas quanto à concentração proteica através de kit específico (BCA Protein Assay

Reagent, Thermo Scientific, IL, USA), para então, serem desnaturadas a uma

temperatura de 100 °C por 5 minutos.

Para analisarmos a ação da leptina a nível central foi avaliada a expressão de

Ob-R, NPY e POMC no hipotálamo. Foram utilizadas amostras contendo 10 µg/ml de

proteína em gel de poliacrilamida a 10% SDS. Na análise do tecido adiposo foi utilizado

conteúdo de proteína similar na amostra, contudo em gel de poliacrilamida a 12% de

SDS. Para a identificação dos respectivos pesos moleculares durante a separação das

proteínas por eletroforese, utilizou-se marcador de peso molecular específico (BIO-

RAD, Hercules, USA).

A partir de então, as proteínas foram transferidas para uma membrana de

nitrocelulose através de corrente elétrica (PVDF; Amersham Biosciences, Piscataway,

NJ, USA). O bloqueio de ligações inespecíficas foi realizado em uma solução de 5%

(peso/volume) de leite desnatado em T-TBS (Tris-HCL pH 7.5, 0.5mM NaCl, 0.05%

Tween 20) durante 1 hora e 30 minutos em mesa agitadora a temperatura ambiente.

Sequencialmente, as membranas foram incubadas, overnight a 4°C, com anticorpo

primário em T-TBS, sendo: policlonal anti-Ob-R na diluição 1:500 (Cabra, cód. sc-

1834, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); policlonal anti-NPY na diluição 1:500

(Coelho, cód. sc-28943, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); policlonal anti-POMC

na diluição 1:500 (Coelho, cód. sc-20148, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA);

policlonal anti-leptina na diluição 1:1000 (Coelho, cód. L3410, Sigma-Aldrish, MO,

USA); monoclonal β-actina na diluição 1:1000 (Camundongo, cód. sc-81178 , Santa

Cruz Biotechnology, CA, USA).

Passado este processo, as membranas foram triplamente lavadas com T-TBS e

incubadas, por 1 hora em temperatura ambiente sob mesa agitadora, com anticorpo

secundário conjugado a peroxidase: anti-cabra para Ob-R na diluição 1:5000, anti-

coelho para NPY na diluição 1:3000 e POMC na diluição 1:5000 e anti-coelho para

leptina na diluição 1:11000 e anti-camundongo para β-actina na diluição 1:5000.

A visualização das bandas se deu através da incubação da membrana em

composto quimioluminescente (ECL, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA),

que após a devida reação, foi exposta a um filme de raio-X (Carestream Health, NY,

USA) por diferentes tempos. Para a quantificação da densidade das bandas utilizou-se o

software Image-Pro Plus, versão 7.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, Md, USA)

através de imagens previamente digitalizadas.

3.10 Análise Estatística

Os dados são apresentados como média e erro padrão da média (EP). As

diferenças entre os grupos da mesma geração foram avaliadas pelo teste t-Student, assim

como as diferenças existentes entre as gerações (Prism version 5.0; Graph Pad Software,

San Diego, California, USA). A correlação entre massa corporal (variável dependente y)

x idade (variável independente x) foi testada nos diferentes grupos. O estudo bivariado

usou dados log-transformados e o modelo alométrico “log y = log a + (b) log x” [95].

Para corrigir o coeficiente angular quando as variáveis estão sujeitas a erro de medida

usou-se a técnica do “eixo maior reduzido” [96]. O coeficiente de correlação de Pearson

e a respectiva regressão linear foram estabelecidos para cada grupo de idade e, para a

observação de significância estatística, utilizou-se o “teste de tendências” comparando-

se as duas regressões (comparação de coeficientes alométricos) (Primer of Biostatistics,

version 5, McGraw-Hill Co., New York, USA). Em todos os casos o valor de P<0,05

foi considerado estatisticamente significativo.

4 RESULTADOS

4.1 Dados biométricos maternos (progenitoras F0 e F1) e tamanho das ninhadas

As progenitoras F0 submetidas ao déficit proteico ganharam menos peso durante

o período gestacional, contudo não apresentaram diferenças quanto ao tamanho (n) e

proporção de gêneros (macho / fêmea) das ninhadas. Entretanto, o peso das ninhadas foi

menor nas progenitoras F0 restritas em proteínas quando comparadas as mães controle.

O percentual de natimortos também foi maior na prole de progenitoras restritas. Com

relação aos dados biométricos maternos e características da prole F2 não foram

encontradas diferenças em relação ao seu grupo controle (Tabela 2).

Tabela 2. Biometria do período gestacional materno e tamanho das ninhadas. Legenda: F0: progenitoras que originaram as proles da primeira

geração; F1: progenitoras que originaram as proles da segunda geração; (a) diferença significativa com respectivo controle; (*) diferença

significativa com respectiva F0.

Progenitoras (n=5) F0 F1

Controle Restrita Controle Restrita

Massa corporal (g)

Acasalamento

30,2 ± 0,5 32,3 ± 1,0 34,2 ± 0,1 38,3 ± 2,0

1ª semana de gestação

30,8 ± 0,4 32,8 ± 1,5 36,3 ± 0,7 40,0 ± 2,0

2ª semana de gestação

35,7 ± 0,3 37,7 ± 2,2 40,4 ± 0,7 45,3 ± 1,6

3ª semana de gestação

49,1 ± 1,0 42,3 ± 2,1 52,0 ± 0,7 52,8 ± 1,5

Ganho de peso gestacional

18,8 ± 1,5 8,0 ± 2,0

17,8 ± 0,8 14,5 ± 1,7

Tamanho da ninhada (n)

11 ± 0,6 12 ± 0,9 10 ± 0,7 10 ± 0,7

Peso total da ninhada (g)

18,8 ± 0,7 9,8 ± 0,6

17,5 ± 0,6 17,4 ± 1,3*

% Natimortos

0 42

0 0*

Machos / Fêmeas

1:1 1:1 1:1 1:1

4.2 Biometria e morfometria dos adipócitos

A restrição proteica materna provocou um baixo peso ao nascimento (-40%;

p<0,0001) e menor CNA (-10%; p<0,01) em R1 quando comparado a C1. Contudo a

partir da 4ª semana de vida o peso da prole restrita igualou-se a prole controle

permanecendo desta forma até o final do experimento (Figura 7).

Com o intuito de confirmar um rápido desenvolvimento dos filhotes R1 realizou-

se um estudo alométrico, cujos resultados corroboraram com os dados biométricos

(Tabela 3). Nesta avaliação, evidenciou-se o crescimento catch-up de R1 ao longo da

lactação (p<0,0001), sendo inclusive, mais intenso na 2ª semana de vida (p<0,01)

(Figura 8). Adicionalmente, a prole R1 continuou apresentando elevada taxa de

crescimento após o desmame, principalmente entre o 3° e o 4° mês de vida (p<0,05)

demonstrando, portanto, que apesar da similaridade da MC na 16ª semana de vida, os

animais R1 apresentam uma tendência a um futuro sobrepeso quando comparados aos

animais C1 (Figura 9).

Diferentemente de F1, a prole R2 não mostrou diferença significativa na MC e

CNA ao nascimento e durante todo o experimento (Figura 7). Entretanto, observou-se

maior incremento de MC na prole R2 no período pós-desmame (+60%; p<0,0001), fato

este, também confirmado pelo estudo bivariado, evidenciando assim, tendência à

obesidade e indicando comportamento semelhante entre os grupos restritos de ambas as

gerações (Figura 9).

Figura 7. Gráficos de evolução da massa corporal durante a lactação e período pós-

desmame. Dados analisados pelo teste t Student: (a) diferença significativa quando

comparado ao grupo controle, (*) diferença significativa quando comparado ao

respectivo grupo em F1. Legenda: C1: prole controle da primeira geração; R1: prole

restrita da primeira geração; C2: prole controle da segunda geração; R2: prole restrita da

segunda geração.

Tabela 3. Comparação entre as razões de crescimento utilizando modelo alométrico. Regressão linear com dados log-transformados baseada na

idade dos filhotes (dias - variável independente, x) em relação à massa corporal (gramas - variável dependente, y) considerando a equação log y

= log a + (b) log x. Os dados foram expressos como Slope corrigido pelo eixo maior reduzido. Legenda: C1: prole controle da primeira geração;

R1: prole restrita da primeira geração; C2: prole controle da segunda geração; R2: prole restrita da segunda geração; (a) diferença significativa

quando comparado ao grupo controle, (*) diferença significativa quando comparado ao respectivo grupo em F1.

Dias Meses

0 – 21

0 - 7 7 - 14 14 - 21

1-4

1-2 2-3 3-4

C1 0,75 (0,01) 0,71 (0,02) 0,81 (0,04) 0,90 (0,06) 0,46 (0,04) 0,85 (0,08) 0,42 (0,08) -0,47 (0,11)

R1 0,88 (0,02)

0,79 (0,05) 1,30 (0,13)

0,95 (0,12) 0,58 (0,04)

0,86 (0,10) 0,70 (0,15) 0,91 (0,22)

C2 0,75 (0,02) 0,70 (0,02) 0,83 (0,06) 1,11 (0,12) 0,44 (0,03) 0,85 (0,07) 0,43 (0,10) -0,53 (0,14)

R2 0,72 (0,02)* 0,60 (0,03)

* 0,88 (0,08) 1,20 (0,13) 0,53 (0,03)

0,91 (0,06) 0,61 (0,14) -0,53 (0,16)

Figura 8. Gráficos do estudo alométrico com as respectivas equações da reta referentes ao período de lactação das proles F1 e F2. (A)

Comparação entre as regressões lineares de F1. (B) Comparação entre as regressões lineares de F2. Legenda: C1: prole controle da primeira

geração; R1: prole restrita da primeira geração; C2: prole controle da segunda geração; R2: prole restrita da segunda geração; R: coeficiente de

correlação; P: nível de significância.

Figura 9. Gráficos do estudo alométrico com as respectivas equações da reta referentes ao período pós-desmame das proles F1 e F2. (A)

Comparação entre as regressões lineares de F1. (B) Comparação entre as regressões lineares de F2. Legenda: C1: prole controle da primeira

geração; R1: prole restrita da primeira geração; C2: prole controle da segunda geração; R2: prole restrita da segunda geração; R: coeficiente de

correlação; P: nível de significância.

Embora não tenham sido encontradas diferenças entre todos os grupos estudados

na 16ª semana de vida, R1 e R2, apresentaram um grande aumento no percentual de

gordura corporal total (R1: +80% e R2: +100%; p<0,05), caracterizado por aumento

tanto de gordura visceral (R1: +150% e R2: +140%; p<0,01) quanto de gordura

subcutânea (R1: +80% e R2: +95%; p<0,01), indicando resultados similares entre as

gerações. Analisando-se a razão gordura subcutânea / gordura visceral não foram

encontradas diferenças entre os grupos, indicando que R1 e R2 apresentam um aumento

simultâneo desses dois tipos de gordura (Tabela 4). Concomitantemente a este

resultado, através do estudo em microscopia de luz evidenciou-se uma importante

hipertrofia das células adiposas em R1 e R2, sem diferenças entre as gerações (R1 e R2:

+70%; p<0,0001) (Figura 10).

Tabela 4. Adiposidade. Dados analisados pelo teste t Student e expresso como média ±

erro padrão da média: (a) diferença significativa quando comparado ao grupo controle.

Legenda: C1: prole controle da primeira geração; R1: prole restrita da primeira geração;

C2: prole controle da segunda geração; R2: prole restrita da segunda geração.

Parâmetros C1 R1 C2 R2

% Gordura corporal 3,62±0,59 6,61±0,87

2,57±0,60 5,22±0,91

Gordura visceral (g) 0,58±0,09 1,45±0,25

0,50±0,13 1,17±0,23

Gordura subcutânea (g) 0,11±0,02 0,20±0,03

0,13±0,04 0,26±0,03

Gordura subcutânea / visceral (g/g) 0,20±0,04

0,17±0,01 0,20±0,03 0,18±0,01

Figura 10. Média da área seccional dos adipócitos. Os valores da média acompanhados

do erro padrão da média são representados pelas barras verticais. Dados analisados pelo

teste t Student: (a) diferença significativa quando comparado ao grupo controle, (*)

diferença significativa quando comparado ao respectivo grupo em F1. Fotomicrografias

do tecido adiposo com mesmo aumento (Hematoxilina-Eosina) evidenciando grupos

controles com adipócitos de tamanho normal e grupos restritos com adipócitos

hipertrofiados. Legenda: C1: prole controle da primeira geração; R1: prole restrita da

primeira geração; C2: prole controle da segunda geração; R2: prole restrita da segunda

geração.

4.3 Perfil lipídico

Modificações no perfil lipídico também foram evidenciadas nos grupos restritos

de ambas as gerações. R1 e R2 apresentaram hipercolesterolemia (R1 e R2: +30%;

p<0,0001) e hipertrigliceridemia (R1: +55% e R2: +110%; p<0,0001), entretanto R2

apresentou níveis mais elevados de triglicerídeos comparado a R1 (+25%; p<0,01)

(Tabela 5).

4.4 Perfil metabólico (homeostasia da glicose e concentrações hormonais)

Na 16ª semana de vida, R1 e R2 demonstraram uma significativa hiperglicemia

(R1 e R2: +25%; p<0,01) acompanhada de elevação dos valores de insulina sérica (R1:

+130% e R2: +150%; p<0,01). Não foram encontradas diferenças estatísticas entre R1 e

R2 acerca destes parâmetros (Tabela 5).

Corroborando com estes dados que indicam uma disfunção no metabolismo dos

carboidratos, R1 e R2 demonstraram elevadas glicemias nos diferentes tempos

analisados do TOTG, promovendo uma maior área sob a curva (R1: +25% e R2: +30%;

p<0,01) e evidenciando um quadro de intolerância a glicose em F1 e F2 (Figura 11).

Esta mesma condição reproduziu-se no TIPTI, onde R1 e R2 demonstraram alterações

na curva glicêmica, indicando uma resistência insulínica (R1: +105%; p<0,0001 e R2:

+40%; p<0,05) (Figura 11), também evidenciada pelo HOMA-IR (R1: +230% e R2:

+260%; p<0,01) (Tabela 5). Contudo, baseado nos resultados de HOMA-β, R1

demonstrou maiores transtornos na capacidade funcional das células beta pancreáticas

em comparação a C1(+70%; p<0,05) e R2 (+60%; p<0,05) (Tabela 5).

Como fator adicional a resistência insulínica, R1 e R2 apresentaram elevados

níveis plasmáticos de resistina quando comparados a C1 e C2, respectivamente (R1:

+40% e R2: +55%; p<0,05) sem diferença significativa entre F1 e F2 (Tabela 5).

Portanto, nas análises realizadas para avaliação da homeostasia da glicose, onde

foram observadas diferenças entre R1 e R2 no TIPTI e HOMA-beta, tem-se o indicativo

de resistência insulínica mais pronunciada em F1.

4.5 Relação: ingestão alimentar e leptina sérica

A análise do comportamento alimentar não demonstrou diferenças significativas

entre os grupos durante o experimento. Contudo, R1 e R2 apresentaram altas

concentrações de leptina sérica quando comparados a C1 e C2, respectivamente (R1:

+220%; p<0,001 e R2: +610%; p<0,0001) indicando um quadro de resistência a leptina

nas proles restritas. Interessantemente, os resultados de leptina sérica de R2 foram mais

elevados que R1 (+90%; p<0,01). Ambos os grupos restritos evidenciaram uma

diminuição da sensibilidade endógena a leptina, quando avaliada a relação entre

ingestão calórica e leptina sérica, em comparação aos seus respectivos grupos controle

(R1 e R2: -200%; p<0,01) não existindo diferença entre F1 e F2 (Tabela 5).

Figura 11. Gráficos da área sob a curva e evolução da glicemia do TOTG e TIPTI.

Figura (A) e figura (B) representam as análises de TOTG e TIPTI, respectivamente. Os

valores da média da área sob a curva com o erro padrão da média são apresentados pelas

barras verticais. Dados analisados pelo teste t Student:(a) diferença significativa quando

comparado ao grupo controle, (*) diferença significativa quando comparado ao

respectivo grupo em F1. Legenda: C1: prole controle da primeira geração; R1: prole

restrita da primeira geração; C2: prole controle da segunda geração; R2: prole restrita da

segunda geração.

Tabela 5. Bioquímica, hormônios e comportamento alimentar. Dados analisados pelo

teste t Student e expresso como média ± erro padrão da média: (a) diferença

significativa quando comparado ao grupo controle, (*) diferença significativa quando

comparado ao respectivo grupo em F1. Legenda: C1: prole controle da primeira

geração; R1: prole restrita da primeira geração; C2: prole controle da segunda geração;

R2: prole restrita da segunda geração.

Parâmetros C1 R1 C2 R2

Bioquímica e hormônios

Colesterol (mg/dl) 102±3,56 128±3,26

99±2,40 125±2,84

Triglicerídeos (mg/dl) 43±2,48 67±3,13

39±1,75 83±2,31

Glicemia de jejum (mg/dl) 129±6,01 163±5,89

117±5,77 144±9,77

Insulina (µUI/ml) 15,91±2,09 36,65±4,63

12,62±1,05 31,82±7,71

HOMA – IR 4,36±0,57 14,39±2,19

3,66±0,42 13,06±3,28

HOMA – β 84,01±5,83 139,40±15,62

86,01±6,58 85,61±11,19*

Resistina (ng/ml) 1,27±0,18 1,83±0,10

1,35±0,16 2,11±0,25

Leptina (ng/ml) 1,84±0,16 5,86±0,74

1,55±0,12 10,97±0,78

Comportamento alimentar

Ingestão alimentar (g/dia) 5,00±0,23 4,78±0,32 5,74±0,38 5,97±0,32*

Ingestão alimentar / Massa

corporal (g/g)

11,64±0,43 11,91±0,56 12,68±0,60 12,61±0,41

Ingestão calórica (kcal/dia) /

Leptina (ng/ml)

0,06±0,01 0,02±0,001

0,06±0,01 0,02±0,003

4.6 Expressão de leptina pelo tecido adiposo visceral e sua sinalização em núcleos

hipotalâmicos

R1 e R2 em comparação com C1 e C2, respectivamente, apresentaram aumento

da expressão de leptina pelo tecido adiposo visceral (R1 e R2: +35%; p<0,01) (Figura

12). Centralmente, embora não tenham sido encontradas diferenças quanto à expressão

dos receptores de leptina (Ob-R) no hipotálamo dos grupos estudados (Figura 12),

observou-se na disfunção na expressão de neuropeptídeos hipotalâmicos, representados

por maior expressão de NPY em R1 e R2 (R1 e R2: +60%; p<0,05) e decréscimo de

POMC somente em R1 (-105%, p<0,05) quando comparados aos grupos controles

(Figura 13). Ressalta-se que o peso do cérebro (C1: 0,19 ± 0,005; R1: 0,18 ± 0,005; C2:

0,18 ± 0,003; R2: 0,19 ± 0,003), assim como a marcação de β-actina pelo western

blotting não apresentou diferença em nenhum dos grupos avaliados.

Figura 12. Gráficos da expressão de leptina no tecido adiposo visceral (A) e receptor

hipotalâmico de leptina (B) por western blotting. Os valores da média com o erro

padrão da média são representados pelas barras verticais com as respectivas bandas

imunomarcadas, demonstrando aumento da expressão de leptina no tecido adiposo e

receptores hipotalâmicos inalterados nos grupos restritos. Dados analisados pelo teste t

Student sendo: (a) diferença significativa quando comparado ao grupo controle.

Legenda: C1: prole controle da primeira geração; R1: prole restrita da primeira geração;

C2: prole controle da segunda geração; R2: prole restrita da segunda geração.

Figura 13. Gráficos da expressão de NPY (A) e POMC (B) por western blotting. Os

valores da média com o erro padrão da média são representados pelas barras verticais

com as respectivas bandas imunomarcadas demonstrando aumento da expressão de

NPY em ambos os grupos restritos e diminuição de POMC somente no grupo restrito da

primeira geração. Dados analisados pelo teste t Student sendo: (a) diferença significativa

quando comparado ao grupo controle, (*) diferença significativa quando comparado ao

respectivo grupo em F1. Legenda: C1: prole controle da primeira geração; R1: prole

restrita da primeira geração; C2: prole controle da segunda geração; R2: prole restrita da

segunda geração.

5 DISCUSSÃO

Neste estudo a dieta com restrição intensa de proteínas foi administrada na

gestação de mães F0 com consequentes alterações orgânicas e metabólicas em F1 e F2.

Além das modificações esperadas observadas na massa corporal da prole, também

observou-se que, tanto o metabolismo glicídico quanto os mecanismos centrais de

sinalização da leptina são profundamente influenciados pelo estado nutricional materno.

Tais efeitos não ficam limitados à F1 e também são observados na prole F2.

A diminuição do peso da prole de mães restritas em proteína foi evidente ao

nascimento. Não obstante, as alterações no crescimento e peso dos animais não foram

limitadas ao período de gestação. A nutrição pós-natal foi fundamental para a

determinação do crescimento subsequente. Como evidência disso, animais do grupo R1

experimentaram recuperação da massa corporal (catch-up) durante o período da

lactação, alcançando a massa corporal dos controles até o desmame. No entanto o que

parece ser uma vantagem é, na verdade, uma desvantagem, uma vez que o crescimento

fetal deficiente acompanhado por um rápido crescimento pós-natal aumenta o risco de

desenvolvimento de doenças crônicas na fase adulta e está associado com a diminuição

da longevidade [35], demonstrando, portanto, que nutrição materna durante períodos

críticos de desenvolvimento exerce impacto e efeitos persistentes na quantidade e na

qualidade de vida [36], e que o crescimento catch-up deve ser considerado como um

ponto fundamental da programação da obesidade na vida adulta [97]. Afinal, este

dinâmico processo é caracterizado por uma rápida deposição de gordura corporal em

detrimento de massa magra [98].

Aos quatro meses de idade, as proles R1 e R2 não apresentaram diferença no

peso corporal quando comparados aos animais controle, corroborando com achados

prévios na literatura [99, 100]. Contudo, a realização de estudo alométrico evidenciou

um maior incremento na taxa de crescimento durante o período pós-desmame em ambas

as gerações, justificando o maior ganho de massa corporal durante o período de

experimentação. Tais resultados indicam a instalação de um futuro quadro de sobrepeso

e, consequentemente, um agravamento das disfunções metabólicas já evidenciadas.

O desenvolvimento do tecido adiposo inicia-se no feto e, diferentemente de

outros tecidos, este apresenta uma capacidade ilimitada de crescimento [101]. No atual

estudo, observamos que o aumento da adiposidade aconteceu nos animais do grupo R1

e R2 e foi acompanhado por alterações na homeostase glicêmica. O fenótipo

hipertrófico resultado do catch-up predispõe a uma diminuição da sensibilidade à

insulina no tecido adiposo e aumento da secreção de adipocinas inflamatórias que

induzem a resistência nos demais tecidos sensíveis à insulina [102, 103], e/ou

“transbordamento” de lipídeos para células não adiposas (lipotoxicidade ectópica)

exacerbando a resistência insulínica sistêmica e piorando a tolerância à glicose [98]. O

presente estudo encontrou aumento da insulina plasmática, HOMA-IR, HOMA-beta,

elevados níveis de resistina e alterado TOTG e TIPTI em F1 e também em F2,

demonstrando que a programação metabólica promove alterações no metabolismo

glicídico sendo transmitida a geração posterior.

Outro tema que avaliamos foi os níveis séricos de leptina. A leptina é um

hormônio derivado do tecido adiposo essencial ao controle nervoso central do apetite e

do balanço energético [104]. Como esperado, nossos resultados mostraram que a

concentração de leptina esteve associada com a percentagem da massa adiposa corporal

tanto em F1 como em F2. A despeito da hiperleptinemia, a ingestão alimentar não foi

afetada pela restrição proteica fetal, como em estudos anteriores [99]. No entanto, ao

analisarmos a sensibilidade endógena à leptina encontramos baixos níveis em R1 e R2

sugerindo uma resistência à ação da leptina. Assim, o aumento da adiposidade

observada nos animais restritos, provavelmente, não foi provocado por uma diferença

na ingestão energética, e sim por um possível fenótipo econômico presente nestes

animais [6].

Como descrito anteriormente, as proles R1 e R2 apresentaram aumento dos

níveis séricos de leptina e insulina, componentes relacionados a uma disfunção no eixo

adipoinsular. A insulina é adipogênica e aumenta a produção de leptina pelo tecido

adiposo, enquanto que a leptina por sua vez, inibe a produção de insulina pelas células

beta pancreáticas [58]. Assim, este mecanismo estabelece um ciclo vicioso de

resistência a leptina resultando em uma hipersecreção de insulina [59]. A

hiperleptinemia em presença de hiperinsulinemia das proles restritas sugerem o

desenvolvimento de resistência a leptina ao nível das células beta em ratos [105].

Adicionalmente, todas estas disfunções convergem para alterações no metabolismo

lipídico que podem ser uma consequência da expressão gênica do metabolismo de

gorduras somado a sinalização de insulina e envelhecimento [106], o que caracteriza os

altos níveis de colesterol e triglicerídeos demonstrados em R1 e R2.

As alterações na adiposidade ganham importância especial considerando que o

sistema regulatório do balanço energético é regulado por um feedback entre hormônios

periféricos e sinais metabólicos com circuitos centrais mediados pelo hipotálamo [3]. O

presente estudo considera que todas essas alterações na adiposidade podem favorecer a

desregulação hipotalâmica, principalmente pelo fato de que R1 e R2 apresentaram

aumento da expressão de leptina pelo tecido adiposo visceral. Neste processo tanto a

insulina quanto a leptina controlam o estado nutricional e os estoques de energia,

através da modulação da expressão de neuropeptídeos, como NPY e alfa-MSH

(derivado da POMC) em núcleos hipotalâmicos [71, 75]. Somado a este fato, o

hipotálamo apresenta papel fundamental na programação fetal e no desenvolvimento do

neonato. Em roedores, diversos estudos sugerem que uma “má-programação”

hipotalâmica inicia-se na vida intrauterina e perdura durante o período da lactação,

originando um distúrbio na organização neural, e consequentemente, disfunções na vida

adulta [100]. Mais recentemente, demonstrou-se que a restrição proteica materna pode

afetar o desenvolvimento fetal do cérebro em virtude de um significativo decréscimo na

expressão de 16 genes envolvidos na metilação do DNA, proliferação celular,

sinaptogênese e processos de desenvolvimento [107]. Este fato demonstra que o cérebro

fetal de camundongos já responde de maneira adaptativa a um inadequado status

nutricional materno podendo alterar a regulação da termogênese e acúmulo de gordura

no feto [10], e que a fase de lactação atua como um período crítico de desenvolvimento,

sugerindo que a nutrição no início da vida pode promover significativas mudanças

relacionadas ao pico de leptina plasmática responsável pela função neurotrófica do

hipotálamo [77].

Diante de uma restrição proteica perinatal observa-se uma complexa

desorganização dos principais centros reguladores do peso corporal e do metabolismo

que pode levar a uma hipofagia e baixo peso [50]. Contudo, uma vez reestabelecida a

nutrição adequada durante a lactação, os animais apresentam, através do mecanismo de

crescimento catch-up, uma melhora no pico de leptina e consequentemente, uma

melhora no processo de neurodesenvolvimento e arranjo dos circuitos do núcleo

arqueado. Entretanto, esta condição aparentemente benéfica não previne o surgimento

precoce da resistência a leptina [107].

A restrição proteica materna originou um estado de resistência tanto da leptina

quanto da insulina. A resistência à leptina verificada através da relação entre ingestão

calórica / concentração sérica de leptina evidenciou a condição de uma inalterada

ingestão energética frente a uma elevada concentração de leptina plasmática, indicando

assim, alteração na homeostasia energética [94]. Centralmente, esta resistência pode ser

decorrente de distintas razões como: falha da leptina em transpor a barreira hemato-

encefálica, uma down-regulation dos receptores hipotalâmicos ou anormalidade nas vias

de sinalização intracelular [55].

Para testarmos a causa da resistência a leptina nos animais restritos, mensuramos

a expressão de receptores Ob-Rb, NPY e POMC por western blotting. Neurônios que

expressam NPY no núcleo arqueado co-expressam receptores de leptina e insulina

[108], sendo estas relacionadas à inibição da expressão de NPY [109]. Contrariamente,

POMC é precursor de anorexígenos do sistema melanocortina [110], como alfa-MSH,

sendo crucial para a regulação da ingestão alimentar e homeostasia do peso corporal, e

estimulado pela leptina [111]. Por conseguinte, os altos níveis de leptina representam

um sinal positivo de balanço energético e contrabalançam este estado através do

aumento da expressão de genes anorexigênicos, como POMC, e diminuição da

expressão de genes orexigênicos, como NPY [100], através da sinalização de receptores

Ob-Rb em um mecanismo saturável [94, 112]. No entanto, nossos resultados apontam

uma disfunção na modulação de neuropeptídeos hipotalâmicos provocada pela restrição

proteica em ambas as gerações. A relevância de tais resultados encontra-se no fato de

que pouquíssimos dados experimentais referem-se às consequências em longo prazo da

desnutrição materna durante a gestação na expressão de genes neuroendócrinos nas

proles adultas.

Os animais gerados por mães restritas em proteínas não apresentaram mudanças

na expressão do receptor Ob-Rb, contudo a expressão dos neuropeptídeos hipotalâmicos

mostrou-se desregulada. Contrariando as ações fisiológicas da leptina, a expressão de

NPY apresentou-se elevada com concomitante diminuição de POMC em R1.

Interessantemente, esta condição continuou sendo evidenciada em R2, somente com a

exceção da expressão de POMC que foi similar ao respectivo grupo controle.

Adicionalmente, a falha da hiperleptinemia na regulação dos níveis de NPY nas proles

restritas deste estudo sugere que os neurônios NPY são mais sensíveis aos efeitos

supressores da leptina (resistência neuronal de NPY) [113]. Alguns estudos descrevem

alterações nos neurônios NPY, assim como aumento da expressão gênica, em proles na

fase fetal e na vida pós-natal, suportando o conceito de que o sistema NPY representa

uma chave na programação do desenvolvimento perinatal, possivelmente, desregulando

o peso corporal [10, 114].

Os mecanismos envolvidos nesta ineficiente sinalização hipotalâmica das proles

restritas podem ser oriundos da disfunção das vias de sinalização intracelular,

possivelmente, mediada por componentes, como SOCS3 e PTP1B, que exercem efeitos

regulatórios negativos da sinalização. Somente, a isoforma OB-Rb contém domínio

intracelular capaz de ativar a via de sinalização JAK/STAT [115], e necessita

obrigatoriamente de componentes constitutivos de quinases citoplasmáticas,

principalmente JAK2 [116]. Neste processo, a SOCS3 endógena passa a inibir a

fosforilação de Ob-R [82] e PTP1B causa uma desfosforilação de JAK2 [83],

configurando-se então como componentes que promovem o estado de resistência a

sinalização de leptina.

Considerando então, o tipo de programação metabólica, acreditamos que a causa

deste estado de resistência à leptina baseia-se na programação do fenótipo econômico

associada a disfunções hipotalâmicas e aumento da adiposidade na prole R1. Há cada

vez mais evidências de que alguns componentes hereditários de susceptibilidade a

doenças crônicas, como o diabetes tipo 2, obesidade e doença cardiovascular, são

transmitidos não-genomicamente [117]. Então, processos através dos quais influências

ambientais agem durante o início do desenvolvimento para definir o risco para doenças

na vida adulta, podem ter efeitos além de uma única geração. Essa herança pode operar

através de mecanismos epigenéticos envolvendo a regulação de genes imprintados ou

não imprintados, mas também por meio de mecanismos relacionados à fisiologia

parental ou ao comportamento [118]. Os conceitos fundamentais do efeito

transgeracional consistem na progressão de um fenótipo sadio para um de doença

crônica devido a mudanças na expressão gênica ou por diferenças na atividade de

proteínas ou enzimas, e que substâncias químicas da dieta regulam direta ou

indiretamente a expressão da informação genômica [119].

Especificamente, em R2 as alterações metabólicas estabelecida nas fêmeas R1

podem ser consideradas como um fator adicional à transmissão do fenótipo alterado a

prole R2. Associados a este fato, alterações na glicemia materna podem ser importantes

contribuintes da resistência a leptina sem, aparentemente, estarem relacionadas a uma

redução no número de receptores de leptina [120]. Mães hiperglicêmicas geram proles

com uma “má-organização” dos neurônios hipotalâmicos, mostrando um aumento da

imunopositividade para NPY e AgRP e decréscimo para MSH sem modificações na

expressão de POMC, após o desmame [121].

É importante ressaltar que todas as alterações em R2 demonstradas neste estudo

podem também sofrer com interferências da modulação epigenética. Estudos prévios

demonstram que a transmissão da programação do desenvolvimento pode ocorrer

devido a mudanças na expressão gênica em alterações na sequencia do DNA [122]

resultado da metilação do DNA [123] ou mudanças nas regiões terminais das histonas

[124]. Adicionalmente, a programação metabólica intergeracional pode ser promovida

por uma alteração no DNA mitocondrial, levando a transmissão do fenótipo alterado a

geração subsequente através da linhagem materna [46].

O presente estudo reforça o crescente conceito na literatura de que a nutrição

fetal e no início da vida afeta o sistema de balanço energético e em conclusão demonstra

que uma severa restrição proteica materna promove uma programação caracterizada por

aumento da adiposidade com alteração no perfil lipídico, intolerância a glicose e

resistência insulínica devido a perturbações no eixo adipoinsular e um estado de

resistência hipotalâmica à leptina nas proles F1 e F2.

6 CONCLUSÃO

Considerando os resultados apresentados, conclui-se que uma severa restrição

protéica materna, exclusiva ao período gestacional, é capaz de promover uma

programação metabólica intergeracional nas proles F1 e F2 de camundongos suíços

machos. Tais disfunções foram caracterizadas por: aumento da adiposidade com

elevação da expressão de leptina pelo tecido adiposo visceral; hiperglicemia;

hipercolesterolemia; hipertrigliceridemia; perturbação na homeostase glicêmica,

representada por intolerância à glicose e resistência insulínica; além de elevação dos

níveis séricos de resistina e leptina nos grupos R1 e R2. Sendo assim, considera-se uma

perturbação do eixo adipoinsular e um estado de resistência a leptina, identificado

principalmente pela diminuição de sensibilidade endógena a leptina em ambos os

grupos restritos. Acredita-se que este mecanismo de resistência hipotalâmica, deriva-se

de falhas na transdução de sinal da leptina, através de interferências nas cascatas de

sinalização intracelular, afinal o presente estudo não observou alterações na expressão

dos receptores de leptina em nenhum dos grupos avaliados, no entanto, identificou um

aumento da expressão de NPY em ambos os grupos restritos e uma diminuição de

POMC no grupo restrito da primeira geração.

REFERÊNCIAS

1. Ogden, C.L., et al., Prevalence of overweight and obesity in the United States, 1999-

2004. JAMA, 2006. 295(13): p. 1549-55.

2. Dulloo, A.G., Thrifty energy metabolism in catch-up growth trajectories to insulin and

leptin resistance. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 2008. 22(1): p. 155-71.

3. Cripps, R.L., et al., Programming of hypothalamic neuropeptide gene expression in rats

by maternal dietary protein content during pregnancy and lactation. Clin Sci (Lond),

2009. 117(2): p. 85-93.

4. James, W.P., The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med, 2008.

263(4): p. 336-52.

5. Barker, D.J., et al., Fetal origins of adult disease: strength of effects and biological

basis. Int J Epidemiol, 2002. 31(6): p. 1235-9.

6. Hales, C.N. and D.J. Barker, The thrifty phenotype hypothesis. Br Med Bull, 2001. 60: p.

5-20.

7. Gluckman, P.D. and M.A. Hanson, The consequences of being born small - an adaptive

perspective. Horm Res, 2006. 65 Suppl 3: p. 5-14.

8. Oken, E. and M.W. Gillman, Fetal origins of obesity. Obes Res, 2003. 11(4): p. 496-506.

9. Lopes de Souza, S., et al., Perinatal protein restriction reduces the inhibitory action of

serotonin on food intake. Eur J Neurosci, 2008. 27(6): p. 1400-8.

10. Terroni, P.L., et al., Expression of agouti-related peptide, neuropeptide Y, pro-

opiomelanocortin and the leptin receptor isoforms in fetal mouse brain from pregnant

dams on a protein-restricted diet. Brain Res Mol Brain Res, 2005. 140(1-2): p. 111-5.

11. Friedman, J.M. and J.L. Halaas, Leptin and the regulation of body weight in mammals.

Nature, 1998. 395(6704): p. 763-70.

12. Enriori, P.J., et al., Leptin resistance and obesity. Obesity (Silver Spring), 2006. 14 Suppl

5: p. 254S-258S.

13. Skinner, M.K., What is an epigenetic transgenerational phenotype? F3 or F2. Reprod

Toxicol, 2008. 25(1): p. 2-6.

14. Barker, D.J., ed. Mothers, Babies and Diseases in Later Life 1984, British Medical

Journal Publishing London.

15. Briana, D.D. and A. Malamitsi-Puchner, Intrauterine growth restriction and adult

disease: the role of adipocytokines. Eur J Endocrinol, 2009. 160(3): p. 337-47.

16. Barker, D.J., C. Osmond, and C.M. Law, The intrauterine and early postnatal origins of

cardiovascular disease and chronic bronchitis. J Epidemiol Community Health, 1989.

43(3): p. 237-40.

17. Lucas, A., Programming by early nutrition in man. Ciba Found Symp, 1991. 156: p. 38-

50; discussion 50-5.

18. McMillen, I.C. and J.S. Robinson, Developmental origins of the metabolic syndrome:

prediction, plasticity, and programming. Physiol Rev, 2005. 85(2): p. 571-633.

19. Hales, C.N. and D.J. Barker, Type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus: the

thrifty phenotype hypothesis. Diabetologia, 1992. 35(7): p. 595-601.

20. Neel, J.V., The "thrifty genotype" in 1998. Nutr Rev, 1999. 57(5 Pt 2): p. S2-9.

21. Neel, J.V., Diabetes mellitus: a "thrifty" genotype rendered detrimental by "progress"?

Am J Hum Genet, 1962. 14: p. 353-62.

22. Hales, C.N., et al., Fetal and infant growth and impaired glucose tolerance at age 64.

Bmj, 1991. 303(6809): p. 1019-22.

23. Waterland, R.A. and C. Garza, Potential mechanisms of metabolic imprinting that lead

to chronic disease. Am J Clin Nutr, 1999. 69(2): p. 179-97.

24. Barker, D.J., The developmental origins of adult disease. J Am Coll Nutr, 2004. 23(6

Suppl): p. 588S-595S.

25. Bateson, P., et al., Developmental plasticity and human health. Nature, 2004.

430(6998): p. 419-21.

26. Edwards, L.J. and I.C. McMillen, Maternal undernutrition increases arterial blood

pressure in the sheep fetus during late gestation. J Physiol, 2001. 533(Pt 2): p. 561-70.

27. Catta-Preta, M., et al., Adult cardiorenal benefits from postnatal fish oil supplement in

rat offspring of low-protein pregnancies. Life Sci, 2006. 80(3): p. 219-29.

28. Moura, A.S., F.G. Pereira, and C.A. Mandarim-de-Lacerda, Gender Determines Long-

Lasting Effects on Adult Offspring Heart after Early-Life Malnourishment. Biol Neonate,

2004. 85(4): p. 256-262.

29. Williams, S.J., et al., Effects of maternal hypoxia or nutrient restriction during

pregnancy on endothelial function in adult male rat offspring. J Physiol, 2005. 565(Pt

1): p. 125-35.

30. Alexander, B.T., Placental insufficiency leads to development of hypertension in

growth-restricted offspring. Hypertension, 2003. 41(3): p. 457-62.

31. Meaney, M.J., M. Szyf, and J.R. Seckl, Epigenetic mechanisms of perinatal

programming of hypothalamic-pituitary-adrenal function and health. Trends Mol Med,

2007. 13(7): p. 269-77.

32. Hales, C.N. and D.J.P. Barker, The thrfty phenotype hypothesis. Britsh Medical Bulletin,

2001. 60: p. 5-20.

33. Gluckman, P.D., M.A. Hanson, and H.G. Spencer, Predictive adaptive responses and

human evolution. Trends Ecol Evol, 2005. 20(10): p. 527-33.

34. Alexander, B.T., Fetal programming of hypertension. Am J Physiol Regul Integr Comp

Physiol, 2006. 290(1): p. R1-R10.

35. Ozanne, S.E. and C.N. Hales, Lifespan: catch-up growth and obesity in male mice.

Nature, 2004. 427(6973): p. 411-2.

36. Ozanne, S.E. and C. Nicholas Hales, Poor fetal growth followed by rapid postnatal

catch-up growth leads to premature death. Mech Ageing Dev, 2005. 126(8): p. 852-4.

37. Bol, V.V., B.M. Reusens, and C.A. Remacle, Postnatal catch-up growth after fetal

protein restriction programs proliferation of rat preadipocytes. Obesity (Silver Spring),

2008. 16(12): p. 2760-3.

38. Guan, H., et al., Adipose tissue gene expression profiling reveals distinct molecular

pathways that define visceral adiposity in offspring of maternal protein-restricted rats.

Am J Physiol Endocrinol Metab, 2005. 288(4): p. E663-73.

39. Meas, T., Fetal origins of insulin resistance and the metabolic syndrome: a key role for

adipose tissue? Diabetes Metab, 2010. 36(1): p. 11-20.

40. Ozanne, S.E. and C.N. Hales, Early programming of glucose-insulin metabolism. Trends

Endocrinol Metab, 2002. 13(9): p. 368-73.

41. Reusens, B., L. Kalbe, and C. Remacle, Programming of diabetes: experimental models,

in Fetal Nutrition and Adult Disease. Programming of chronic disease through fetal

exposure to undernutrition., S. Langley-Evans, Editor. 2004, CABI Publishing:

Massachusetts. p. 171-193.

42. Reusens, B. and C. Remacle, Programming of the endocrine pancreas by the early

nutritional environment. Int J Biochem Cell Biol, 2006. 38(5-6): p. 913-22.

43. Remacle, C., et al., Intrauterine programming of the endocrine pancreas. Diabetes

Obes Metab, 2007. 9 Suppl 2: p. 196-209.

44. Martin-Gronert, M.S., et al., Maternal protein restriction leads to early life alterations

in the expression of key molecules involved in the aging process in rat offspring. Am J

Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2008. 294(2): p. R494-500.

45. Pinheiro, A.R., et al., Protein restriction during gestation and/or lactation causes

adverse transgenerational effects on biometry and glucose metabolism in F1 and F2

progenies of rats. Clin Sci (Lond), 2008. 114(5): p. 381-92.

46. Zambrano, E., et al., Sex differences in transgenerational alterations of growth and

metabolism in progeny (F2) of female offspring (F1) of rats fed a low protein diet

during pregnancy and lactation. J Physiol, 2005. 566(Pt 1): p. 225-36.

47. McMillen, I.C., et al., Regulation of leptin synthesis and secretion before birth:

implications for the early programming of adult obesity. Reproduction, 2006. 131(3): p.

415-27.

48. Bennis-Taleb, N., et al., A low-protein isocaloric diet during gestation affects brain

development and alters permanently cerebral cortex blood vessels in rat offspring. J

Nutr, 1999. 129(8): p. 1613-9.

49. Teixeira, C., et al., Leptin serum concentration, food intake and body weight in rats

whose mothers were exposed to malnutrition during lactation. J Nutr Biochem, 2002.

13(8): p. 493.

50. Plagemann, A., et al., Hypothalamic nuclei are malformed in weanling offspring of low

protein malnourished rat dams. J Nutr, 2000. 130(10): p. 2582-9.

51. Plagemann, A., et al., Hypothalamic neuropeptide Y levels in weaning offspring of low-

protein malnourished mother rats. Neuropeptides, 2000. 34(1): p. 1-6.

52. Kennedy, G.C., The role of depot fat in the hypothalamic control of food intake in the

rat. Proc R Soc Lond B Biol Sci, 1953. 140(901): p. 578-96.

53. Zhang, Y., et al., Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.

Nature, 1994. 372(6505): p. 425-32.

54. Tartaglia, L.A., et al., Identification and expression cloning of a leptin receptor, OB-R.

Cell, 1995. 83(7): p. 1263-71.

55. Sahu, A., Minireview: A hypothalamic role in energy balance with special emphasis on

leptin. Endocrinology, 2004. 145(6): p. 2613-20.

56. Madej, T., M.S. Boguski, and S.H. Bryant, Threading analysis suggests that the obese

gene product may be a helical cytokine. FEBS Lett, 1995. 373(1): p. 13-8.

57. Cintra, D.E., E.R. Ropelle, and J.R. Pauli, [Brain regulation of food intake and

expenditure energy: molecular action of insulin, leptin and physical exercise]. Rev

Neurol, 2007. 45(11): p. 672-82.

58. Kieffer, T.J. and J.F. Habener, The adipoinsular axis: effects of leptin on pancreatic beta-

cells. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2000. 278(1): p. E1-E14.

59. Vickers, M.H., et al., Dysregulation of the adipoinsular axis -- a mechanism for the

pathogenesis of hyperleptinemia and adipogenic diabetes induced by fetal

programming. J Endocrinol, 2001. 170(2): p. 323-32.

60. White, D.W. and L.A. Tartaglia, Leptin and OB-R: body weight regulation by a cytokine

receptor. Cytokine Growth Factor Rev, 1996. 7(4): p. 303-9.

61. Carvalheira, J.B., et al., Cross-talk between the insulin and leptin signaling systems in

rat hypothalamus. Obes Res, 2005. 13(1): p. 48-57.

62. Carvalheira, J.B., et al., Insulin modulates leptin-induced STAT3 activation in rat

hypothalamus. FEBS Lett, 2001. 500(3): p. 119-24.

63. Fruhbeck, G., Intracellular signalling pathways activated by leptin. Biochem J, 2006.

393(Pt 1): p. 7-20.

64. Lee, G.H., et al., Abnormal splicing of the leptin receptor in diabetic mice. Nature, 1996.

379(6566): p. 632-5.

65. Martin, S.S., A. Qasim, and M.P. Reilly, Leptin resistance: a possible interface of

inflammation and metabolism in obesity-related cardiovascular disease. J Am Coll

Cardiol, 2008. 52(15): p. 1201-10.

66. Bjorbaek, C. and B.B. Kahn, Leptin signaling in the central nervous system and the

periphery. Recent Prog Horm Res, 2004. 59: p. 305-31.

67. Fam, B.C., et al., Modulation of central leptin sensitivity and energy balance in a rat

model of diet-induced obesity. Diabetes Obes Metab, 2007. 9(6): p. 840-52.

68. Murphy, K.G. and S.R. Bloom, Gut hormones in the control of appetite. Exp Physiol,

2004. 89(5): p. 507-16.

69. Coppari, R., et al., The hypothalamic arcuate nucleus: a key site for mediating leptin's

effects on glucose homeostasis and locomotor activity. Cell Metab, 2005. 1(1): p. 63-

72.

70. Flier, J.S., Obesity wars: molecular progress confronts an expanding epidemic. Cell,

2004. 116(2): p. 337-50.

71. Arora, S. and Anubhuti, Role of neuropeptides in appetite regulation and obesity--a

review. Neuropeptides, 2006. 40(6): p. 375-401.

72. Kamiji, M.M. and A. Inui, Neuropeptide y receptor selective ligands in the treatment of

obesity. Endocr Rev, 2007. 28(6): p. 664-84.

73. Schwartz, M.W., et al., Central nervous system control of food intake. Nature, 2000.

404(6778): p. 661-71.

74. Munzberg, H. and M.G. Myers, Jr., Molecular and anatomical determinants of central

leptin resistance. Nat Neurosci, 2005. 8(5): p. 566-70.

75. Niswender, K.D., D.G. Baskin, and M.W. Schwartz, Insulin and its evolving partnership

with leptin in the hypothalamic control of energy homeostasis. Trends Endocrinol

Metab, 2004. 15(8): p. 362-9.

76. Ahima, R.S. and M.A. Lazar, Adipokines and the peripheral and neural control of energy

balance. Mol Endocrinol, 2008. 22(5): p. 1023-31.

77. Bouret, S.G. and R.B. Simerly, Developmental programming of hypothalamic feeding

circuits. Clin Genet, 2006. 70(4): p. 295-301.

78. Ahima, R.S., D. Prabakaran, and J.S. Flier, Postnatal leptin surge and regulation of

circadian rhythm of leptin by feeding. Implications for energy homeostasis and

neuroendocrine function. J Clin Invest, 1998. 101(5): p. 1020-7.

79. Bouret, S.G., Early life origins of obesity: role of hypothalamic programming. J Pediatr

Gastroenterol Nutr, 2009. 48 Suppl 1: p. S31-8.

80. Munzberg, H., Leptin-signaling pathways and leptin resistance. Forum Nutr, 2010. 63:

p. 123-32.

81. Obici, S., Minireview: Molecular targets for obesity therapy in the brain. Endocrinology,

2009. 150(6): p. 2512-7.

82. Bjorbak, C., et al., SOCS3 mediates feedback inhibition of the leptin receptor via Tyr985.

J Biol Chem, 2000. 275(51): p. 40649-57.

83. Cook, W.S. and R.H. Unger, Protein tyrosine phosphatase 1B: a potential leptin

resistance factor of obesity. Dev Cell, 2002. 2(4): p. 385-7.

84. Zambrano, E., [The transgenerational mechanisms in developmental programming of

metabolic diseases]. Rev Invest Clin, 2009. 61(1): p. 41-52.

85. Waddington, C., ed. Organisers and Genes. 1940, Cambridge University Press

Cambridge.

86. Wolffe, A.P. and M.A. Matzke, Epigenetics: regulation through repression. Science,

1999. 286(5439): p. 481-6.

87. Anway, M.D., et al., Epigenetic transgenerational actions of endocrine disruptors and

male fertility. Science, 2005. 308(5727): p. 1466-9.

88. Rakyan, V. and E. Whitelaw, Transgenerational epigenetic inheritance. Curr Biol, 2003.

13(1): p. R6.

89. Stewart, R.J., R.F. Preece, and H.G. Sheppard, Twelve generations of marginal protein

deficiency. Br J Nutr, 1975. 33(2): p. 233-53.

90. Reeves, P.G., F.H. Nielsen, and G.C. Fahey, Jr., AIN-93 purified diets for laboratory

rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on

the reformulation of the AIN-76A rodent diet. J Nutr, 1993. 123(11): p. 1939-51.

91. Langley, S.C. and A.A. Jackson, Increased systolic blood pressure in adult rats induced

by fetal exposure to maternal low protein diets. Clin Sci (Lond), 1994. 86(2): p. 217-22;

discussion 121.

92. Asghar, Z., et al., Insulin resistance causes increased beta-cell mass but defective

glucose-stimulated insulin secretion in a murine model of type 2 diabetes. Diabetologia,

2006. 49(1): p. 90-9.

93. Matthews, D.R., et al., Homeostasis model assessment: insulin resistance and beta-cell

function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man. Diabetologia,

1985. 28(7): p. 412-9.

94. Lin, S., L.H. Storlien, and X.F. Huang, Leptin receptor, NPY, POMC mRNA expression in

the diet-induced obese mouse brain. Brain Res, 2000. 875(1-2): p. 89-95.

95. Jolicoeur, P. and A.A. Heusner, Log-normal variation belts for growth curves.

Biometrics, 1986. 42(4): p. 785-94.

96. Mattfeldt, T. and G. Mall, Statistical methods for growth allometric studies. Growth,

1987. 51(1): p. 86-102.

97. Bieswal, F., et al., The importance of catch-up growth after early malnutrition for the

programming of obesity in male rat. Obesity (Silver Spring), 2006. 14(8): p. 1330-43.

98. Dulloo, A.G., Adipose tissue plasticity in catch-up-growth trajectories to metabolic

syndrome: hyperplastic versus hypertrophic catch-up fat. Diabetes, 2009. 58(5): p.

1037-9.

99. Bol, V.V., et al., Forced catch-up growth after fetal protein restriction alters the adipose

tissue gene expression program leading to obesity in adult mice. Am J Physiol Regul

Integr Comp Physiol, 2009. 297(2): p. R291-9.

100. Sellayah, D., et al., Appetite regulatory mechanisms and food intake in mice are

sensitive to mismatch in diets between pregnancy and postnatal periods. Brain Res,

2008. 1237: p. 146-52.

101. Gimeno, R.E. and L.D. Klaman, Adipose tissue as an active endocrine organ: recent

advances. Curr Opin Pharmacol, 2005. 5(2): p. 122-8.

102. Slawik, M. and A.J. Vidal-Puig, Adipose tissue expandability and the metabolic

syndrome. Genes Nutr, 2007. 2(1): p. 41-5.

103. Isganaitis, E., et al., Accelerated postnatal growth increases lipogenic gene expression

and adipocyte size in low-birth weight mice. Diabetes, 2009. 58(5): p. 1192-200.

104. Kershaw, E.E. and J.S. Flier, Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol

Metab, 2004. 89(6): p. 2548-56.

105. Toste, F.P., et al., Neonatal leptin treatment programmes leptin hypothalamic

resistance and intermediary metabolic parameters in adult rats. Br J Nutr, 2006. 95(4):

p. 830-7.

106. Erhuma, A., et al., Prenatal exposure to undernutrition and programming of responses

to high-fat feeding in the rat. Br J Nutr, 2007. 98(3): p. 517-24.

107. Coupe, B., et al., Nutritional programming affects hypothalamic organization and early

response to leptin. Endocrinology, 2010. 151(2): p. 702-13.

108. Woods, S.C. and R.J. Seeley, Insulin as an adiposity signal. Int J Obes Relat Metab

Disord, 2001. 25 Suppl 5: p. S35-8.

109. Korner, J., et al., Leptin regulation of Agrp and Npy mRNA in the rat hypothalamus. J

Neuroendocrinol, 2001. 13(11): p. 959-66.

110. Wilkinson, C.W., Roles of acetylation and other post-translational modifications in

melanocortin function and interactions with endorphins. Peptides, 2006. 27(2): p. 453-

71.

111. Ellacott, K.L. and R.D. Cone, The role of the central melanocortin system in the

regulation of food intake and energy homeostasis: lessons from mouse models. Philos

Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2006. 361(1471): p. 1265-74.

112. Wilsey, J. and P.J. Scarpace, Caloric restriction reverses the deficits in leptin receptor

protein and leptin signaling capacity associated with diet-induced obesity: role of leptin

in the regulation of hypothalamic long-form leptin receptor expression. J Endocrinol,

2004. 181(2): p. 297-306.

113. Ikenasio-Thorpe, B.A., et al., Prenatal influences on susceptibility to diet-induced

obesity are mediated by altered neuroendocrine gene expression. J Endocrinol, 2007.

193(1): p. 31-7.

114. Lauzurica, N., et al., Changes in NPY and POMC, but not serotonin transporter,

following a restricted feeding/repletion protocol in rats. Brain Res. 1313: p. 103-12.

115. Myers, M.G., Jr., Leptin receptor signaling and the regulation of mammalian

physiology. Recent Prog Horm Res, 2004. 59: p. 287-304.

116. Ghilardi, N. and R.C. Skoda, The leptin receptor activates janus kinase 2 and signals for

proliferation in a factor-dependent cell line. Mol Endocrinol, 1997. 11(4): p. 393-9.

117. Skinner, M.K., Endocrine disruptors and epigenetic transgenerational disease etiology.

Pediatr Res, 2007. 61(5 Pt 2): p. 48R-50R.

118. Gluckman, P.D., M.A. Hanson, and A.S. Beedle, Non-genomic transgenerational

inheritance of disease risk. Bioessays, 2007. 29(2): p. 145-54.

119. Kaput, J. and R.L. Rodriguez, Nutritional genomics: the next frontier in the postgenomic

era. Physiol Genomics, 2004. 16(2): p. 166-77.

120. Liu, H.H., Y.L. Zhang, and H.X. Yang, [Intrauterine hyperglycemia and leptin resistance

of offsprings.]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi, 2009. 44(11): p. 841-5.

121. Franke, K., et al., 'Programming' of orexigenic and anorexigenic hypothalamic neurons

in offspring of treated and untreated diabetic mother rats. Brain Res, 2005. 1031(2): p.

276-83.

122. Devaskar, S.U. and S. Raychaudhuri, Epigenetics--a science of heritable biological

adaptation. Pediatr Res, 2007. 61(5 Pt 2): p. 1R-4R.

123. Holliday, R., DNA methylation and epigenetic mechanisms. Cell Biophys, 1989. 15(1-2):

p. 15-20.

124. Waterland, R.A. and R.L. Jirtle, Early nutrition, epigenetic changes at transposons and

imprinted genes, and enhanced susceptibility to adult chronic diseases. Nutrition, 2004.

20(1): p. 63-8.

ANEXO A

ANEXO B

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