( PDF ) Desenvolvimento e implantação de método para análise de anatoxina-a em amostras ambientais

Download PDF

ads:

FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

PÓS-GRADUAÇÃO EM OCEANOGRAFIA FÍSICA, QUÍMICA E GEOLÓGICA

DESENVOLVIMENTO E IMPLANTAÇÃO DE MÉTODO PARA

ANÁLISE DE ANATOXINA-A EM AMOSTRAS AMBIENTAIS

WILSON ALVES COLVARA

Dissertação apresentada como parte integrante

dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em

Oceanografia Física, Química e Geológica.

Orientador: Prof. Dr. João Sarkis Yunes

Co-Orientador: Prof. Dr. Alexandre Matthiensen

RIO GRANDE – RS – BRASIL

2005

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

“Querer vencer significa já ter percorrido metade do caminho

da vitória .

”

Paderewsky

ads:

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Moacir e Olinda ao meu irmão, pela credibilidade e apoio e a minha

noiva, Júlia, pelo incentivo, força e carinho.

Ao Prof. Dr. João Sarkis Yunes pela orientação, confiança e oportunidades de

crescimento pessoal e profissional.

Ao Prof. Dr. Alexandre Matthiensen, agradeço por sua dedicação e conhecimentos

transmitidos.

Aos amigos Gilmar, Eder, Luciano, Priscilla, Lígia, Sheila, Janaina, Paula, e toda

turma da UPC e da Hidroquímica, em especial à Nérile e Patrícia, meu agradecimento

pela amizade, ajuda e dedicação durante a execução deste trabalho.

Aos professores Felipe Niencheski, Gilberto Fillmann, Maria da Graça Baumgarten,

Mônica Wallner, Osmar Möller, Lauro Calliari, Virginia Garcia.

Aos funcionários Vanderlen, Júnior, Lúcia e Clabisnei, aos quais agradeço o apoio e a

amizade.

A colaboração do Prof. Dr Éder João Lenardão e do Prof. Dr Ednei Gilberto Primel

Às empresas conveniadas ao laboratório da UPC: CORSAN, SANEPAR, SABESP e

SAMAE, pela disponibilização de amostras e informações que possibilitaram o

desenvolvimento da pesquisa.

Aos órgãos apoiadores deste trabalho: FAURG e FURG pela disponibilização dos

recursos necessários, a CAPES pela concessão de bolsa de Mestrado.

LISTA DE ABREVIATURAS

CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CV – Coeficiente de Variação

C18 – Sílica modificada com hidrocarboneto linear 18 Carbono

DL – Dose Letal

DP – Desvio Padrão

ETA - Estação de Tratamento de Água

FL – Fator de Linearidade

GTX – Goniautoxina

i.p. – intraperitonial

LDE – Limite de Detecção do Equipamento

LDM – Limite de Detecção do Método

LPS – Lipopolissacarídeos

LQM – Limite de Quantificação do Método

M – Mol por Litro

NBD-F – 4-fluoro-7-nitro-benzofurano

p.c. – peso corporal

PSP – Paralytic Shellfish Poisons

R – Recuperação

STX – Saxitoxina

TFA – Ácido Triflúoracético

UPC- Unidade de Pesquisa em Cianobactérias

v/v – Volume por Volume

WCX - Cartucho de troca catiônica fraca

SUMÁRIO

RESUMO 10

ABSTRACT 11

I INTRODUÇÃO 12

I.1 Cianobactérias 12

I.2 Florações 14

I.3 Toxinas de Cianobactérias 15

I.3.1 Dermatotoxinas . 17

I.3.2 Hepatotoxinas . 18

I.3.3 Neurotoxinas . 21

I.4 Outros compostos de cianobactérias 26

I.5 Casos de intoxicações 27

I.6 Legislação sobre cianotoxinas 28

I.7 Modo de detecção 32

I.8 Cromatografia 33

II OBJETIVOS 37

III MATERIAIS E MÉTODOS 38

III.1 Reagentes e equipamentos 38

III.2 Condições cromatográficas 39

III.3 Métodos de extração 40

III.4 Métodos de derivatização pré-CLAE

. 40

III.5 Curva de calibração

. 41

III.6 Métodos de Concentração e purificação 41

III.7 Análise Direta

III.8 Teste de estabilidade da anatoxina-a em

função da temperatura e do tempo 47

III. 9 Estocagem de padrão em etapas da análise

III. 10 Análises realizadas após o método ser otimizado 48

IV RESULTADOS 50

IV.1 Métodos de detecção de anatoxina-a 50

IV.2 Métodos de concentração e purificação 58

IV.3 Análise em amostras de cianobactérias 68

V DISCUSSÕES 71

VI CONCLUSÕES 76

VII CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS 78

VIII BIBLIOGRAFIA 79

ANEXOS 89

LISTA DE FIGURAS

Figura I.1: Estrutura da aplisiatoxina..............................................................................................17

FiguraI.2: Estrutura da microcistina de cianobactérias........................................20

Figura I.3: Estrutura geral das toxinas PSP............................................................22

Figura I.4: Estruturas das neurotoxinas, anatoxina-a..............................................23

Figura I.5: Ação da anatoxina-a...............................................................................24

Figura I.6: Estrutura química da anatoxina-a (S).....................................................25

Figura III.1: Equipamento de CLAE......................................................................38

Figura III.2: Sonificador Ultrasonic Processor......................................................40

Figura III.3: Reação do NBD-F com anatoxina-a...................................................41

Figura III.4: Bomba Milipore, conectada aos cartuchos C18 e WCX ...................42

Figura III.5: Chapa de aquecimento........................................................................45

Figura III.6: Chapa de aquecimento com borbulhamento de nitrogênio ................45

Figura III.7: Chapa de aquecimento com borbulhamento de nitrogênio em

câmara de vácuo ..........................................................................................................46

Figura III.8: Rota evaporador com borbulhamento de nitrogênio ............. ............47

Figura IV.1: Cromatograma de padrões de anatoxina-a derivatizado pré-CLAE

e detecção por fluorescência.........................................................................................50

Figura IV.2: : Cromatograma, - Fase móvel Acetonitrila/ água 45:55 vazão

0,5mL/ minuto, temperatura do forno 35 ºC, - Fase móvel Acetonitrila/

água 45:55 vazão 0,5mL/minuto, temperatura do forno 40 ºC.....................................51

Figura IV.3: Cromatograma,

- Fase móvel Acetonitrila/ água 45:55 vazão

0,7mL/ minuto, temperatura do forno 30 ºC,

- Fase móvel Acetonitrila/

água 45:55 vazão 0,7mL/ minuto, temperatura do forno 40 ºC ....................................52

Figura IV.4: Cromatograma,

- Fase móvel Acetonitrila/ água 45:55 vazão

0,9mL/ minuto, temperatura do forno 30 ºC,

- Fase móvel Acetonitrila/ água

45:55 vazão 0,9mL/ minuto, temperatura do forno 35 ºC, - Fase móvel Acetonitrila/

água 45:55 vazão 0,9mL/ minuto, temperatura do forno 40 ºC,- Fase móvel

Acetonitrila/ água 45:55 vazão 0,9mL/ minuto, temperatura do forno 45 ºC.................53

Figura IV.5: Cromatograma, - Fase móvel Acetonitrila/ água 45:55 vazão 0,9mL/

minuto, temperatura do forno 45 ºC,

- Fase móvel Acetonitrila/ água 50:50 vazão

0,9mL/ minuto, temperatura do forno 45 ºC, - Fase móvel Acetonitrila/ água 55:45

vazão 0,9mL/ minuto, temperatura do forno 45 ºC.........................................................54

Figura IV.6: Curva de resposta para anatoxina-a e a equação da reta do método de

Análise Direta.................................................................................................................56

Figura IV.7: Curva de resposta para anatoxina-a e a equação da reta do método de

Análise com Concentração..............................................................................................57

Figura IV.8: Gráfico do Fator de linearidade (FL)= área integrada /concentração Para

o Método Análise Direta (◊) e com Concentração (♦)...................................................57

Figura IV.9: Padrão de concentração conhecida (20μgL

-1

) de anatoxina-a exposto a

temperaturas (22, 40, 50, 60, 70 e 80 ºC) por 60 minutos............................................61

Figura IV.10: Padrão de concentração conhecida (20 μgL

-1

) de anatoxina-a exposto à temperaturas de

50ºC por 60, 120, 150,180, 210 e 240 minutos....................................62

Figura IV.11: Padrão de 20 μgL

-1

derivatizado com 30μL de NBD-F, 30μL de borato de sódio, 10

minutos de reação, 50μL de ácido cloridrico (HCl) 1M e a volumes de amostras (50, 100, 200, 300, 500 e

1000 μL)..................................................................64

Figura IV.12: Cromatograma do padrão de anatoxina-a com o método de Análise

Direta................................................................................................................................67

Figura IV.13:

-Cromatograma da amostra Anabaena verrucosa (RS8701 Banhado Taim/RS/Brasil). -

Cromatograma da amostra Anabaena verrucosa (RS8701 Banhado Taim/RS/Brasil) com adição de

padrão anatoxina-a........................................................69

Figura IV.14:

- Cromatograma da amostra Barragem Santa Bárbara (Pelotas).

- Cromatograma da amostra Barragem Santa Bárbara (Pelotas) com adição de padrão de anatoxina-

a..................................................................................................................70

Figura IV.15: Cromatograma do Controle (reagentes da derivatização, sem toxina)

com derivatização pré-CLAE (Coluna: Synergi 250 X 4,6mm, 4μ) e detecção por

fluorescência....................................................................................................................90

LISTA DE TABELAS

Tabela I.1. Principais grupos de cianotoxinas relacionados a seus locais de ação e

gêneros de cianobactérias produtoras...........................................................................16

Tabela I.2. Métodos e características dos ensaios de toxicidade para as toxinas de

cianobactérias. ..............................................................................................................33

Tabela III.1. Concentração dos pontos de calibração .................................................41

Tabela III.2 Métodos teste de ativação, lavagem e eluição dos cartuchos WCX e

C18................................................................................................................................43

Tabela III.3 Amostras analisadas do banco de cultura da UPC..................................48

Tabela IV.1 Limite de detecção do equipamento (LDE) em μg/L..............................55

Tabela IV.2. Efeito das diluições dos padrões de anatoxina-a na determinação do

LQM em μg/L. …........................................................................................................55

Tabela IV.3. Curva de resposta de anatoxina-a em derivatização pré-HPLC com os

respectivos coeficientes de variação, obtidos por análise em triplicata................ .......56

Tabela IV.4. Métodos teste de ativação, lavagem e eluição dos cartuchos

WCX.............................................................................................................................59

Tabela IV.5. Métodos teste de ativação, lavagem e eluição dos cartuchos

C18................................................................................................................................60

Tabela IV.6. Fator de Recuperação de padrão nas extrações com

clorofórmio...................................................................................................................61

Tabela IV.7. Evaporação de 10 mL de metanol 0,2% TFA (v/v) contendo toxina

Com aquecimento..........................................................................................................63

Tabela IV.8. Evaporação de 10 mL de metanol 0,2% TFA (v/v), contendo toxina,

com aquecimento com aquecimento e borbulhamento denitrogênio...........................63

Tabela IV. 9: Evaporação de 10 mL de metanol 0,2% TFA (v/v), contendo toxina,

com aquecimento, borbulhamento de nitrogênio e vácuo.............................................64

Tabela IV.10: Evaporação de 10 mL de metanol 0,2% TFA (v/v), contendo toxina,

no rota evaporador com borbulhamento de gás nitrogênio..........................................64

Tabela IV.11. Recuperação (em %) da amostra sem tratamento de

concentração.................................................................................................................67

RESUMO

As cianobactérias ou algas cianofíceas são microorganismos procariontes aeróbicos

fotoautotróficos. Muito semelhantes estruturalmente e bioquimicamente às bactérias. As

cianobactérias são comuns em mananciais, o que requer cuidados, devido elas produzirem

compostos tóxicos. As toxinas de cianobactérias (cianotoxinas), constituem um grupo de

produtos naturais com função na célula ainda desconhecida. A anatoxina-a é um alcalóide

neurotóxico, cujos sinais de envenenamento em animais incluem: desequilíbrio, fasciculação

muscular, respiração ofegante e convulsões. A morte ocorre de poucos minutos a poucas

horas. O objetivo deste trabalho foi otimizar as metodologias de extração, purificação,

concentração, derivatização, armazenamento e análise de anatoxina-a por cromatografia

liquida de alta eficiência (HPLC) em amostras de águas destinada ao consumo humano. Para

isso, foram realizados experimentos onde se modificaram parâmetros metodológicos. Dentre

os métodos de extração testados a sonificacão, procedimento o qual rompe todas as células e

não degrada a toxina, mostrou-se eficiente. A purificação e concentração, utilizando

clorofórmio e cartuchos (C18 e WCX), apresentou o maior fator de recuperação (99%) com

cartucho C18. Otimizou-se metodologias de evaporação, na qual a evaporação em rota-

evaporador foi a mais eficiente. Testou-se derivatização direta da toxina sem tratamento de

concentração e purificação. Condições cromatográficas foram alteradas para obtenção de

resultados com exatidão, reprodutibilidade e com menor tempo de análise. Obteve-se duas

metodologias, denominadas: “Com Concentração” que utiliza cartucho C18 e evaporação

total em rota-evaporador, e “Análise Direta”, ambas derivatizadas com NBD-F e analisadas

em HPLC. Essas metodologias foram utilizadas para apontar a presença de anatoxina-a em

amostras do banco de cultura de cianobactérias da UPC, em florações ambientais e em

experimentos com padrão de anatoxina-a (Sigma). Os resultados mostraram que essas

metodologias podem ser utilizadas para análises em amostras ambientais, experimentos de

laboratório, bem como em águas para abastecimento público.

ABSTRACT

Cyanobacteria (blue-green algae) are aerobic photoautotrophic microorganisms. As

prokaryotes they are structurally and biochemistry similar to bacteria. Cyanobacteria are

common in reservoirs, which is a problem due to the range of toxic compounds they produce.

Cyanotoxins (Cyanobacterial toxins) constitute a group of natural products which their

cellular function is still unknown. Anatoxin-a is a neurotoxic alkaloid with poisoning signals

in animals including: imbalance muscular fasciculation, heavy breath and convulsions. Death

may take place in minutes or hours. The aim of this study was optimize the extraction,

purification, concentration, derivatization and storage methodologies for the analysis of

anatoxin-a by HPLC from water samples used for human consumption. Experiments were

performed with modified methodological parameters. Among the extraction methods tested,

sonification showed an efficient breakage of the cells without toxin degradation. The

purification and concentration methodologies which have presented the best recovery (99%)

was attained with chloroform and C18 sep-pack cartridges. Evaporation methodologies were

also optimized in which the most efficient was using the rotatory evaporator. Derivatization of

the toxin was tested directly in the samples, without concentration and purification treatments.

The chromatographic conditions were established in search of accuracy, reproducibility and

rapidness of analysis. Two methodologies were obtained, namely: “With Concentration”

using C18 cartridge and total evaporation in rotatory evaporator, and “Direct Analysis” both

derivatized with NBD-F and analyzed by HPLC. These methodologies were used to assess the

presence of anatoxina-a in samples of the cyanobacteria culture collection from UPC, from

environmental sample blooms and from experiments using standard purified anatoxina-a

(Sigma). Results confirm that the methodologies may be use to environmental samples,

laboratory experiments and drinking water analysis.

I.INTRODUÇÃO

I.1 Cianobactérias

A vida era abundante e diversa em comunidades de bactérias filamentosas e

unicelulares, há 3,5 bilhões de anos, incluindo bactérias autotróficas e, possivelmente,

fotoautotróficas. As evidências são de estromatólitos (associações de calcário precipitado e

cianobactérias), que foram encontrados em camadas sedimentares de interface com a água,

formados entre 3,5 e 2,8 bilhões de anos atrás, no mesmo período em que surgiram as

cianobactérias fotossintetizantes. A interpretação de estromatólitos do grupo Fortescue,

aflorados no oeste da Austrália há 2,8 bilhões de anos atrás, revelam formas pequenas (1μm

de diâmetro), parecidas com as modernas Oscillatoria, e outras maiores (10μm de diâmetro),

semelhantes às atuais Lyngbya. Desde então, as cianobactérias iniciaram a produção do

oxigênio de nosso planeta criando, assim, a biosfera que envolve a Terra, permitindo o

desenvolvimento e evolução das espécies como hoje as conhecemos. A diferenciação entre as

cianobactérias e os outros organismos fotossintetizantes que não produziam oxigênio

existentes naquela época - Período Arqueano - são as evidências de que cianobactérias

usavam o fotossistema I e II para liberar o oxigênio molecular como produto da fotossíntese.

A determinação indireta da presença de cianobactérias nesta época foi possível pela

observação das camadas oxidadas de solos antigos, principalmente de uranitos e sedimentos

ricos em ferro. A atmosfera pôde então ser formada há aproximadamente 1,2 bilhão de anos

atrás, pois a oxidação dos solos e dos compostos reduzidos presentes na Terra primitiva teve,

necessariamente, que ocorrer antes que o oxigênio excedente pudesse ser liberado para a

atmosfera (Schopf & Walter, 1982). Uma grande flexibilidade a adaptações bioquímicas,

fisiológicas, genéticas e reprodutivas, garantiram aos organismos a sua perpetuação e sua

distribuição em diversos ambientes aquáticos (rios, estuários e mares) e terrestres, na interface

úmida da terra com o ar em rochas, cascas de árvores, paredes, telhados, vidros, etc (Schopf &

Walter, 1982).

As cianobactérias ou cianofíceas (algas azuis) possuem cerca de 150 gêneros e mais

de 2000 espécies. São microorganismos aeróbicos fotoautotróficos e seus processos vitais

requerem somente água, dióxido de carbono, substâncias inorgânicas e luz para o crescimento

e reprodução. A fotossíntese é seu principal modo de obtenção de energia para o

metabolismo. Entretanto, sua organização celular demonstra que esses microorganismos são

procariontes e, portanto, muito semelhantes bioquimicamente e estruturalmente às bactérias

(Tundisi & Tundisi, 1992). Apresentam fotossistemas I e II, mas sem estar organizados em

cloroplastos, como as plantas. Algumas espécies são fixadoras de nitrogênio atmosférico (N

Podem ser produtoras de metabólitos que possuem efeito tóxico

em outros organismos, como as hepatoxinas, neurotoxinas e dermatotoxinas.

I.2 Florações

A eutrofização é o processo de enriquecimento das massas de água por nutrientes,

principalmente fósforo, tendo como conseqüência o crescimento excessivo de algas e plantas

aquáticas. Os principais efeitos da eutrofização ocorrem ao nível dos produtores primários,

geralmente de dimensões reduzidas – fitoplâncton, embora certas macrófitas possam se

beneficiar deste processo. As cianobactérias são organismos fitoplanctônicos que podem ser

representativos de um estado de eutrofização avançado, possuindo capacidades competitivas,

o que as tornam dominantes nestas situações. A crescente eutrofização dos ambientes

aquáticos é conseqüência das atividades humanas, causando um enriquecimento artificial dos

ecossistemas. A utilização de adubos químicos e estrume, a descarga de esgotos urbanos

tratados ou não tratados e a rejeição de efluentes de agroindústrias ou de outros setores

industriais, podem promover a entrada de quantidades significativas de nutrientes e matéria

orgânica nos lagos e nos estuários. Esta carga adicional de nutrientes (nitrogênio e fósforo),

assim como a luminosidade e a ausência de vento, pode ter como conseqüência o

desenvolvimento de floração de cianobactérias (Carmichael, 1992).

De acordo com Tundisi & Tundisi (1992), o crescimento da agroindústria em algumas

regiões do Brasil tem sido bastante grande nos últimos 20 anos. A elevada biomassa de

cultivos monoespecíficos e a necessidade de intensificar o crescimento vegetal, pelo uso

extenso de fertilizantes, têm causado uma rápida eutrofização de rios e reservatórios que tem

resultado num crescimento de macrófitas aquáticas e altas concentrações de fósforo no

sedimento.

Esta eutrofização artificial produz mudanças na qualidade da água incluindo: a

redução de oxigênio dissolvido, perda da qualidade cênica, aumento do custo de tratamento de

água para consumo, morte de peixes e aumento das incidências de florações de microalgas e

cianobactérias.

I.3 Toxinas das Cianobactérias

As toxinas de cianobactérias, ou cianotoxinas, constituem um grupo de produtos

naturais tóxicos. Embora ainda não estejam devidamente esclarecidas as causas da produção

dessas toxinas, têm-se assumido que esses compostos tenham função protetora contra

herbivoria, como acontece com alguns metabólitos de plantas vasculares (Carmichael,1992).

Algumas dessas toxinas são caracterizadas por sua ação rápida, dependendo da dose e

do organismo, podem causar a morte por parada respiratória após poucos minutos de

exposição, têm sido identificadas como alcalóides ou organofosforados neurotóxicos. Outras

atuam menos rapidamente e são identificadas como peptídeos ou alcalóides hepatotóxicos.

Um terceiro grupo de toxinas causa alergias e irritação na pele. Assim, os três principais

grupos de cianotoxinas podem ser classificados como: dermatotoxinas, hepatotoxinas e

neurotoxinas.

Tabela I.1. Principais grupos de cianotoxinas relacionados a seus locais de ação e gêneros de

cianobactérias produtoras.:

Grupo de

Cianotoxina

Alvo de Ação Tóxica DL

(i.p.

Camundong

o μg kg

-1

Gênero de Cianobactéria

PEPTÍDEOS

CÍCLICOS

Microcistina Fígado,rins 25-1000

Microcystis, Anabaena,

Planktothrix, Oscillatoria,

Nostoc, Hapalosiphon,

Anabaenopsis, Aphanocapsa

Nodularina Fígado 30-50

Nodularia

LIPOPOLISSACARÍ

DEOS (LPS)

Irritante potencial;

afeta o tecido exposto.

Todos

ALCALÓIDES

Cilindrospermopsina Fígado, rins 200-2100

Cylindrospermopsis,

Umezakia, Aphanizomenon,

Raphidiopsis,

Aplisiatoxinas Pele

Lingbya, Schizothrix,

Planktothrix, Oscillatoria

Lingbiatoxinas Pele, trato

gastrointestinal

Lyngbya

Anatoxina-a Sinapse colinérgica 250

Anabaena, Planktothrix,

Oscillatoria, Aphanizomenon,

Cylindrospermum

Anatoxina-a(S) Sinapse colinérgica 40

Anabaena, Planktothrix

Toxinas paralisantes Axônios e miócitos 10-30

Anabaena, Aphanizomenon,

Lyngbya, Planktothrix,

Cylindrospermopsis

Fonte: Baseado em Chorus & Bartram (1999), Codd et al. (2005).

I.3.1 Dermatotoxinas

Alcalóides dermatotóxicos:

Aplisiatoxinas: São potentes promotores de tumores e ativadoras da enzima C quinase,

podendo causar sérias dermatites em contato com a pele (Fig I.1). Variantes como a

debromoaplisiatoxina já foram descritas, e foram identificadas nas espécies Schizothrix

calcicola, Oscillatoria nigroviridis (Chorus & Bartram, 1999) e Lyngbya majuscula (Shimizu,

1993).

Figura I.1: Estrutura da aplisiatoxina. Fonte: Extraído de Shimizu (1993).

Lingbiatoxinas:

Provoca dermatites e severa inflamação oral e gastrointestinal (Chorus

& Bartram, 1999).

A toxina causadora das dermatites observadas em florações de M. aeruginosa são os

LPS (lipopolissacarídeos) da parede celular, que possuem características dermatotóxicas

(Codd, 2000). Os LPS possuem em sua parede celular 3-hidroxi ácidos graxos (3-OH-14:0, 3-

OH-16:0, 3-OH-18:0), o 4-oxo-18:0, o ácido graxo glucosamina (GlcN), como o lipídeo A

componente e o açúcar neutro O-específico, além de açucares raros O-metil (2-O-metil-6-

desoxi-hexose I e II) (Jürgens et al., 1986).

Nas dermatites alérgicas de contato, as reações de sensibilização são iniciadas quando

as células de Langherans (e talvez células dendríticas) aderem-se aos queratinócitos mediados

pela e-caderina, são ativadas e migram para drenar os nódulos linfáticos, onde estimulam as

células T a reagirem com o complexo histopatológico maior classe I (e classe II) na derme

sensibilizada (Jakob et al., 2001).

I.3.2 Hepatotoxinas

O tipo mais comum de intoxicação envolvendo cianobactérias é causado por

hepatotoxinas, que podem causar a morte entre poucas horas e poucos dias, em decorrência de

hemorragia intra-hepática e choque hipovolêmico. Os sinais observados após ingestão dessas

hepatotoxinas são prostração, anorexia, vômitos, dor abdominal e diarréia (Carmichael &

Schwartz,1984; Beasley et al., 1989). As espécies já identificadas como produtoras dessas

hepatotoxinas estão incluídas nos gêneros Microcystis, Anabaena, Nodularia, Oscillatoria,

Nostoc e Cylindrospermopsis (Carmichael, 1992).

A partir da primeira metade do século passado, bioensaios realizados com células de

cianobactérias coletadas em florações, principalmente da espécie Microcystis aeruginosa,

mostravam a presença de uma toxina que causava sérios danos ao fígado dos animais testados

(Hughes et al., 1958). A confirmação de que esta hepatotoxina era um peptídeo foi

apresentada por Bishop et al. (1959), mas somente no início dos anos 80 é que sua estrutura

química foi caracterizada (Botes et al.1982). As principais hepatotoxinas até agora

caracterizadas são heptapeptídeos cíclicos conhecidos como microcistinas e os pentapeptídeos

designados como nodularinas. A estrutura geral das microcistinas (fig. I.2) é D-Ala-X-D-

MeAsp-Z-Adda-D-Glu-Mdha, onde X e Z são os dois L aminoácidos variáveis, D-MeAsp é

D-eritro ácido metilaspártico e Mdha é N-metildeidroalanina (Carmichael et al., 1988). Adda

é o ácido 3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenil-deca-4,6-dienóico, que está também

presente nas nodularinas e foi determinado como um dos responsáveis pela atividade

biológica dessas hepatotoxinas (Harada et al.,1990; Nishiwaki-Matsushima et al.,1992).

A nomenclatura dessas microcistinas foi proposta por Carmichael et al. (1988).

Inicialmente apenas as variações qualitativas observadas em seus dois L-aminoácidos foram

usadas para designar as diferentes microcistinas, por exemplo, microcistina-LR (leucina-

arginina); -RR (arginina-arginina); -YA (tirosina-alanina). Posteriormente observou-se que

não era apenas os dois L-aminoácidos variáveis que variavam, os demais supostamente

invariáveis também variavam, tendo assim um número bem maior de variantes da

microcistinas. A toxicidade dessas microcistinas também é variável, no entanto a maioria

apresentam DL

intra peritonial (i.p.) em camundongos entre 60 e 70 μg Kg

-1

de peso

corpóreo e sintomas similares de envenenamento (Carmichael, 1994).

As nodularinas foram primeiramente identificadas na espécie Nodularia spumigena

(Sivonen et al., 1989); atualmente são conhecidas oito nodularinas distintas, classificadas de

acordo com as variações no grau de metilação, composição e isomerização de seus

aminoácidos. A DL

(i.p.) em camundongos varia entre 50 a 200 μg Kg

-1

de peso corpóreo

(Rinehart et al., 1994). ,

Figura I.2 : Estrutura química das microcistinas, de acordo com Falconer,1996.

As hepatotoxinas chegam aos hepatócitos por meio de receptores dos ácidos biliares

(Runnegar et al., 1981; Erikson et al., 1990; Falconer, 1991) e promovem uma

desorganização dos filamentos intermediários e dos filamentos de actina, que são polímeros

protéicos componentes do citoesqueleto (Runnegar & Falconer, 1986). Esta desorganização

leva a uma retração dos hepatócitos, provocando a perda de contato entre eles com as células

que formam os capilares sinusoidais. Como conseqüência, o fígado perde sua arquitetura e

desenvolve graves lesões internas. A perda de contato entre as células cria espaços internos

que são preenchidos pelo sangue que passa a fluir dos capilares para esses locais (Hooser et

al., 1991; Carmichael, 1994).

Através do estudo dos mecanismos de ação dessas hepatotoxinas, foi demonstrado que

várias microcistinas e nodularinas são potentes inibidores de proteínas fosfatases tipo 1 e 2A

de células eucariontes (Mackintosh et al., 1990; Matsushima et al., 1990; Yoshizawa et al.,

1990). Estas toxinas são reconhecidas como promotores de tumores hepáticos (Falconer,1991;

Nishiwaki-Matsushima et al.,1992) e, portanto, a ocorrência de espécies potencialmente

produtoras dessas substâncias nos nossos ambientes aquáticos precisa ser melhor investigada

e monitorada.

Um alcalóide hepatotóxico, denominado cilindrospermopsina, foi isolado de duas

espécies de cianobactérias: Cylindropermopsis raciborskii (Ohtani et al.,1992) e Umezakia

natans (Harada et al.,1994); seu mecanismo de ação se dá por inibição da síntese protéica e já

tem sido observado danos severos também em células renais dos animais testados.

I.3.3 Neurotoxinas

As neurotoxinas são produzidas por espécies e cepas incluídas nos gêneros: Anabaena

(Carmichael et al., 1990), Aphanizomenon (Mahmood & Carmichael., 1986), Oscillatoria

(Sivonen et al., 1989), Trichodesmium (Hawser et al., 1991) e Cylindrospermopsis (Lagos, et

al., 1999). Já são conhecidas pelo menos cinco neurotoxinas produzidas a partir de espécies

desses gêneros.

Neurotoxinas do grupo das “PSP toxins” (Paralytic Shellfish Poisons), primeiramente

isoladas de dinoflagelados marinhos, responsáveis pela ocorrência de marés vermelhas, já

foram também isoladas de cepas de cianobactérias dos gêneros Anabaena, Aphanizomenon,

Lyngbya, Cylindrospermopsis e Planktothrix (Carmichael, 1994; Codd et al., 2005). As

toxinas PSP são bloqueadoras do canal de sódio inibindo a transmissão de impulsos nervosos

que podem levar à morte por parada respiratória (Carmichael, 1994) (Fig I.3).

Figura I.3 – Estrutura geral das toxinas PSP.

No final dos anos 60, no Canadá, amostras de uma floração de Aphanizomenon flos-

aquae apresentaram este tipo de toxina. Também é comum encontrá-las em amostras de

Anabaena circinalis em águas australianas (Negri et al., 1997). Na Europa, Ferreira et al.

(1995) detectaram estas toxinas em amostras de florações de Aphanizomenon em águas

portuguesas e Henriken (1996) em águas dinamarquesas. Recentemente, novas espécies

produtoras destas toxinas foram descritas, como Lyngbya wollei nos reservatórios de água dos

Estados Unidos (Carmichael et al., 1997) e Cylindrospermopsis raciborskii em águas

brasileiras (Lagos et al., 1997).

A anatoxina-a foi a primeira toxina de cianobactéria a ser quimicamente e

funcionalmente definida e trata-se de uma amina secundária (Devlin et al., 1977) com peso

molecular de 165g mol

-1

(Fig I.4). Os sinais de envenenamento por esta toxina, em animais

selvagens e domésticos, incluem: desequilíbrio, fasciculação muscular, respiração ofegante e

convulsões. A morte é devida à parada respiratória e ocorre de poucos minutos a poucas

horas, dependendo da dosagem e consumo prévio de alimento. Os sinais clínicos de

intoxicação mostram uma progressão de fasciculação muscular, decréscimo de movimentos,

respiração abdominal exagerada, cianose, convulsão e morte.

Este alcalóide neurotóxico é um potente bloqueador neuromuscular pós-sináptico de

receptores nicotínicos e colinérgicos. Esta ação ocorre porque a anatoxina-a liga-se

irreversivelmente a receptores de acetilcolina, pois não é degradada pela acetilcolinesterase

(Fig I.5). A DL

(i.p.) em camundongos, para a toxina purificada, é de 200 μg Kg

-1

de peso

corpóreo, com um tempo de ação de 1 a 20 minutos (Carmichael, 1992; Falconer, 1998).

A B C

Figura I.4: A) Estrutura das neurotoxinas, anatoxina-a ( R= CH

), homoanatoxina-a

( R=C

), B) produtos de degradação, dihydroanatoxina-a ( R=CH

dihydrohomoanatoxina-a ( R= C

), C) epoxyanatoxina-a ( R= CH

) e

epoxyhomoanatoxina-a ( R= C

). Fonte: Namikoshi et al. (2003, 2004); James et al.

(1998).

Figura I.5: Ação da anatoxina-a. Fonte: Adaptado de Carmichael (1994).

Doses orais produzem letalidade aguda em concentrações muito maiores, mas a

toxicidade das células é alta o suficiente para que os animais precisem ingerir de poucos

mililitros a poucos litros de água da superfície das florações para receber uma quantidade letal

(Carmichael, 1992; 1994).

A molécula de anatoxina-a é relativamente estável no escuro, mas quando pura em

solução ocorre uma rápida degradação fotoquímica com a luz solar. Esta degradação é

acelerada por condições alcalinas. A meia-vida para a degradação fotoquímica é de 1 a 2

horas. Sob condições naturais de iluminação, com pH 8-10 e concentrações iniciais baixas

(10µg/L), o tempo necessário para degradar 50% do total de anatoxina-a (meia-vida) é de 14

dias (Stevens & Krieger, 1991 apud Chorus & Bartram, 1999).

Esta toxina parece ser prontamente degradada por bactérias associadas aos filamentos

de cianobactérias. Kiviranta et al. (1991) isolaram uma cepa de Pseudomonas sp. capaz de

degradar anatoxina-a a uma taxa de 2 a 3,3µg/ml a cada dias. Na presença de sedimento e

bactérias do meio aquático a meia-vida para a degradação de anatoxina-a, em um estudo de

laboratório, foi de aproximadamente 5 dias (Smith & Sutton, 1993 apud Chorus & Bartram,

1999).

Outra neurotoxina, que apresenta os mesmos sinais de intoxicação da anatoxina-a,

acrescidos de intensa salivação, foi posteriormente caracterizada como anatoxina-a(S). Esta

neurotoxina tem um mecanismo de ação semelhante ao da anatoxina-a, pois inibe a ação da

acetilcolinesterase, impedindo a degradação da acetilcolina ligada aos receptores.

Estruturalmente é caracterizada como uma N-hidroxiguanidina fosfato de metila (Matsunaga

et al.,1989). A DL

(i.p.) em camundongos é de 20μg/Kg de peso corpóreo e, portanto, dez

vezes mais potente que a anatoxina-a.

Figura I.6 - Estrutura química da anatoxina-a(S).

I.4 Outros compostos de cianobactérias.

Recentemente têm-se estudado microalgas à procura de novos compostos

bioquimicamente ativos, com ação antibióticas, algicidas, etc. As cianobactérias são estudadas

exaustivamente com relação às suas toxinas, porém trabalhos relacionados com a detecção de

compostos para uso medicinais são poucos. Novas linhas de pesquisa estão obtendo

resultados na procura de fármacos (Katircioglu et al., 2004). Inúmeros compostos têm sido

isolados de microalgas procariontes e eucariontes e testados em diferentes bioatividades,

alguns com resultados positivos (Codd, 2000).

I.5 Casos de intoxicações.

Segundo Viaggiu et al. (2004), foi registrado o primeiro caso de detecção de

anatoxina-a em amostras do Lago Spino na Itália, com uma floração de Planktothrix

rubescens.

Cianobactérias tóxicas têm sido identificadas em lagos e fontes de água na Europa,

América Do Norte, China, África do Sul e Austrália (Carmichael, 1994). Em 1990, um

florescimento de Anabaena no Rio Darling foi responsável pela morte de aproximadamente

1600 bovinos e ovinos (Bowling, 1992).

As intoxicações de populações humanas pelo consumo de água contaminada por cepas

tóxicas de cianobactérias já foram descritas em países como Austrália, Inglaterra, China e

África do Sul (Falconer, 1994).

O estudo das florações de algas nocivas no Brasil pode ser dividido em dois períodos

distintos: fase descritiva, na qual se registraram episódios acontecidos desde o princípio do

século XX, e uma fase descritiva experimental, iniciada na década de 1990 (Odebrecht et al.,

2002). A partir desta data, começam os estudos direcionados a algas nocivas no sentido

amplo.

No Brasil se conhecem vários casos de intoxicação por florações de algas nocivas,

mas o mais grave até o momento, foi o episódio de Caruaru (PE), em 1996, onde morreram

mais de 50 enfermos submetidos a hemodiálise onde se utilizou água contaminada com

toxinas de cianobactérias (Azevedo, 1996). Teixeira et al. (1993) descreveram uma forte

evidência de correlação entre a ocorrência de florações de cianobactérias, no reservatório de

Itaparica (BA), e a morte de 88 pessoas entre as 2000 intoxicadas pelo consumo de água do

reservatório, entre março e abril de 1988.

Os estudos nos últimos anos indicam que os eventos de floração nocivas são graves e

muito comuns nos ambientes epicontinentais brasileiros e mesmo de transição, como lagoas e

estuários. Trabalhos reportam problemas relacionados à mortandade de peixes, contaminação

da água de abastecimento por cianotoxinas e contaminação de outros organismos (e.g.

Magalhães et al., 2001; Azevedo et al., 2002; Ferrão-Filho et al., 2002; Yunes et al., 2003).

Este panorama demonstra que o problema associado a cianotoxinas é grave e generalizado no

país, ocorrendo em todas as regiões. As cianotoxinas detectadas até o momento em águas

epicontinentais incluem hepatotoxinas e neurotoxinas: microcistinas (diversas formas, entre

elas: LR, YR, AR, [D-L eu

]-LR), anatoxina-a, anatoxina–a(S) e diversas congêneres da

saxitoxina, entre eles STX, NeoSTX, GTX1, GTX2, GTX3, GTX4 (Lagos et al., 1999;

Azevedo et al. 2002; Yunes et al., 2003). As toxinas são produzidas por diversas espécies

incluídas principalmente nos gêneros Anabaena, Microcystis, Synechocystis,

Cylindrospermopsis e Pseudoanabaena.

Comparado aos ambientes epicontinentais, os estudos no meio marinho são bem mais

restritos, embora tenham crescido em número da mesma forma nos últimos anos. Parte deste

crescimento se deve ao aumento na atividade de maricultura observada ao longo da costa

brasileira, especialmente no estado de Santa Catarina. Hoje o país é o maior produtor de

moluscos cultivados da América Latina. A partir de uma produção de 120 toneladas em 1989,

o total produzido em 1999 foi acima de 10.000 toneladas (Proença, 2001). O crescimento da

atividade tem estimulado pesquisas exploratórias e programas de monitoramento de florações

nocivas.

I.6 Legislação sobre cianotoxinas.

Embora ainda não satisfatória, a legislação sobre cianobactérias no Brasil avançou

muito nos últimos anos. O maior avanço se deu em relação a ambientes epicontinentais com a

Portaria N°518 de 25 de março 2004 ( antiga Portaria 1496 de dezembro de 2000) do

Ministério da Saúde. A partir da Portaria, algumas cianotoxinas foram incluídas de forma

objetiva nos parâmetros de qualidade de água para o abastecimento público, conforme

fragmentos extraídos mostrados abaixo.

Extrato da Portaria n.º 518, de 25 de março de 2004, do Ministério da Saúde.

Estabelece os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilância da

qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade, e dá outras

providências.

O Ministro de Estado da Saúde, no uso das atribuições que lhe confere o artigo 2º do Decreto

nº 79.367, de 9 de março de 1977, resolve:

Art. 1º Aprovar a Norma de Qualidade da Água para Consumo Humano, na forma do Anexo

desta Portaria, de uso obrigatório em todo território nacional.

Art. 2º Fica estabelecido o prazo máximo de 12 meses, contados a partir da publicação desta

Portaria, para que as instituições ou órgãos aos quais esta Norma se aplica, promovam as

adequações necessárias a seu cumprimento.

§ 1º No caso de tratamento por filtração de água para consumo humano suprida por manancial

superficial e distribuída por meio de canalização e da obrigação do monitoramento de

cianobactérias e cianotoxinas, este prazo é de até 12 meses.

Capítulo II

Das definições

X. cianobactérias - microorganismos procarióticos autotróficos, também denominados como

cianofíceas (algas azuis), capazes de ocorrer em qualquer manancial superficial especialmente

naqueles com elevados níveis de nutrientes (nitrogênio e fósforo), podendo produzir toxinas

com efeitos adversos à saúde; e XI. cianotoxinas - toxinas produzidas por cianobactérias que

apresentam efeitos adversos à saúde por ingestão oral, incluindo:

a) microcistinas - hepatotoxinas heptapeptídicas cíclicas produzidas por cianobactérias, com

efeito potente de inibição de proteínas fosfatases dos tipos 1 e 2A e promotoras de tumores;

b) cilindrospermopsina - alcalóide guanidínico cíclico produzido por cianobactérias, inibidor

de síntese protéica, predominantemente hepatotóxico, apresentando também efeitos

citotóxicos nos rins, baço, coração e outros órgãos; e

c) saxitoxinas - grupo de alcalóides carbamatos neurotóxicos produzido por cianobactérias,

não sulfatados (saxitoxinas) ou sulfatados (goniautoxinas e C-toxinas) e derivados

decarbamil, apresentando efeitos de inibição da condução nervosa por bloqueio dos canais de

sódio.

Capítulo IV

Do padrão de potabilidade

§ 1º Recomenda-se que as análises para cianotoxinas incluam a determinação de

cilindrospermopsina e saxitoxinas (STX), observando, respectivamente, os valores limites de

15,0 µg L

-1

e 3,0 µg L

-1

de equivalentes STX L

-1

§ 2º Para análise de cianobactérias e cianotoxinas e comprovação de toxicidade por bioensaios

em camundongos, até o estabelecimento de especificações em normas nacionais ou

internacionais que disciplinem a matéria, devem ser adotadas as metodologias propostas pela

Organização Mundial da Saúde (OMS) em sua publicação Toxic cyanobacteria in water: a

guide to their public health consequences monitoring and management.

§ 5º Sempre que o número de cianobactérias na água do manancial, no ponto de captação,

exceder 20.000 células mL

-1

(2mm

-1

de biovolume), durante o monitoramento que trata o §

3º do artigo 19, será exigida a análise semanal de cianotoxinas na água na saída do tratamento

e nas entradas (hidrômetros) das clínicas de hemodiálise e indústrias de injetáveis, sendo que

esta análise pode ser dispensada quando não houver comprovação de toxicidade na água bruta

por meio da realização semanal de bioensaios em camundongos.

Art. 19. Os responsáveis pelo controle da qualidade da água de sistemas e de soluções

alternativas de abastecimento supridos por manancial superficial devem coletar amostras

semestrais da água bruta, junto do ponto de captação, para análise de acordo com os

parâmetros exigidos na legislação vigente de classificação e enquadramento de águas

superficiais, avaliando a compatibilidade entre as características da água bruta e o tipo de

tratamento existente.

§ 1º O monitoramento de cianobactérias na água do manancial, no ponto de captação, deve

obedecer freqüência mensal, quando o número de cianobactérias não exceder 10.000 células

-1

(ou 1 mm

-1

de biovolume), e semanal, quando o número de cianobactérias exceder

este valor.

§ 2º É vedado o uso de algicidas para o controle do crescimento de cianobactérias ou qualquer

intervenção no manancial que provoque a lise das células desses microrganismos, quando a

densidade das cianobactérias exceder 20.000 células mL

-1

(ou 2mm

-1

de biovolume), sob

pena de comprometimento da avaliação de riscos à saúde associados às cianotoxinas.

Com a portaria, muitas das empresas fornecedoras de água passaram a monitorar

cianobactérias e cianotoxinas regularmente. Algumas empresas fazem parte do serviço de

monitoramento, outras contratam laboratórios para prestação de serviços. Com a portaria,

além da geração de um meio para controle de níveis de cianotoxinas na água, uma demanda

em crescimento para profissionais qualificados nas áreas de taxonomia, ecologia, química e

manejo de reservatórios foi criada.

Em 1997, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estabeleceu como valor provisório

1 µg L

-1

como nível máximo aceitável para o consumo oral diário de microcistina-LR, em

águas de abastecimento público. Ainda hoje as normativas européias em matéria de qualidade

de águas não contemplam a obrigatoriedade da detecção e quantificação de toxinas de

cianobactérias. A nova Diretiva de Águas (Chorus & Bartram, 1999) estabeleceu como

critério para determinar o “estado ecológico”, a necessidade de conhecer-se a composição e

abundância do fitoplâncton, a carga de nutrientes e a turbidez nos lagos e outras águas

continentais. Junto com outros, estes critérios de qualidade serão utilizados para traçar os

objetivos ambientais de melhorar a qualidade da água dos países comunitários. Na maioria

dos países europeus, os organismos responsáveis pelo abastecimento de água potável e as

agências de meio ambiente, incluem planos de vigilância e controle de cianobactérias e suas

toxinas, para assegurar a qualidade das águas potáveis e evitar processos toxicológicos.

I.7 Modo de detecção.

Os corpos de água podem ser monitorados para presença de cianobactérias

potencialmente tóxicas por microscopia óptica. A identificação das espécies de cianobactérias

pode ser realizada pelas características celulares. Análise físico-química é requerida para

identificar se as toxinas estão presentes. Bioensaios com animais estão sendo amplamente

utilizados para determinar a toxicidade de material de florações de cianobactérias (Tab. I.2).

Entretanto, um número de métodos cromatográficos estão disponíveis à análise de anatoxina-a

em florações cianobactérias, incluindo cromatografia liquida de alta resolução/ detecção

ultravioleta e cromatografia em camada delgada de alta resolução; cromatografia gasosa/

detecção por captura de elétrons e cromatografia gasosa acoplada com espectrometria de

massa (Chorus & Bartram, 1999) . O trabalho de Vasas et al. (2004) mostra a eletroforese

capilar junto com cromatografia a gás com detector por captura de elétrons como uma

alternativa para análise de cianotoxinas (anatoxina-a, cilindrospermopsina, microcistina-LR).

Tabela I.2. Métodos e características dos ensaios de toxicidade para as toxinas de

cianobactérias.

Identificações das Toxinas

Método Duração Infraestruturas Modo de

Ação

Especificidade Sensibilidade

(1)

Validade para

Screening

Camundongo Min.-

horas

Pli, Nl, Alc Sim Não Sim Sim (rápido)

Daphnia Dias Pli, Fácil Não Não Sim Sim (lento)

Artemia Dias Fácil Não Não Sim Sim (lento)

Microtox Min Fácil, E Não Não Não Não

Citotoxicidade Min-dias Pli, Alc, E Sim (2) Não Sim Sim(2)variável

Inibição da fosfatase

Radioisotópico

Min-

horas

Pli, Nl, Alc, E Sim (3) Não Sim Sim(3)(rápido)

2. Colorimétrico Min Fácil E Sim (3) Não Sim Sim(3)(rápido)

Colinesterase Min Fácil E Sim (4) Não Sim Sim(4)(rápido)

ELISA Horas Fácil E Sim Sim Sim Sim (rápido)

Fonte: Adaptado de Bell & Codd, 1996.

Pli: Preparação de laboratório intensiva. Nl: Necessidade de licença. Alc: Auxiliares de

laboratórios qualificados. Fácil: Fácil de utilizar. E: Requer equipamentos especiais.

(1) Sensibilidade às toxinas, e nesse caso significa que o ensaio não apresenta falsos

negativos.

(2) Os hepatócitos primários podem revelar hepatotoxinas, e as células neuroblásticas murinas

podem detectar neurotoxinas bloqueadoras do canal de sódio. Por esta razão, estes ensaios

podem ser utilizados para a busca de suas correspondentes toxinas.

(3) Só detecta inibidores da fosfatase (hepatotoxinas).

(4) Só se detecta a anatoxina-a, e é válido portanto para a detecção da inibição da

acetilcolinesterase.

I.8 Cromatografia

A cromatografia é um método físico-químico de separação de compostos. Ela está

fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a

diferentes interações entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande

variedade de combinações de fases móveis e estacionárias torna-a uma técnica extremamente

versátil e de grande aplicação (Snyder & Kirkland, 1997).

O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilização é

atribuída a um botânico russo, ao descrever sua experiência na separação de componentes de

extrato de folhas. Neste estudo, a passagem de éter de petróleo (fase móvel) através de uma

coluna de vidro preenchida com carbonato de cálcio (fase estacionária), à qual se adicionou o

extrato, levou à separação dos componentes em faixas coloridas. Este é provavelmente o

motivo pelo qual esta técnica é conhecida como cromatografia (“chromo” cor e “graphie”

escrever), podendo levar à idéia errônea de que este processo seja dependente da cor.

Apesar deste estudo e de outros anteriores, os quais também poderiam ser considerados

precursores do uso desta técnica, a cromatografia foi praticamente ignorada até a década de

30, quando foi redescoberta. A partir daí, possibilitou-se aperfeiçoamento e, em conjunto com

avanço tecnológico, a levaram a um elevado grau de sofisticação, o qual resultou no seu

grande potencial de aplicação em muitas áreas(Snyder & Kirkland, 1997).

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) surgiu como a aplicação de

cromatografia líquida às teorias e instrumentação desenvolvidas originalmente para a

cromatografia gasosa. Em 1952, Martin e Synge ganharam o premio Nobel pelo

desenvolvimento do primeiro tratamento matemático da teoria cromatográfica e, com avanço

da tecnologia, foi possível aplicar esta teoria ao desenvolvimento da cromatografia líquida. A

principal diferença entre a cromatografia líquida clássica e a cromatografia líquida de alta

eficiência é a utilização de fase estacionária com micro partículas (10, 5 ou 3 µm) esféricas.

Esta fase, por ser muito menos permeável, torna necessária a utilização de bombas para

eluição da fase móvel. A utilização desta nova fase estacionária, associada ao

desenvolvimento da instrumentação, levou esta técnica a uma melhor performance em termos

de resolução, quantificação e detecção em um menor tempo de análise (Lough & Wainer,

1995).

Parâmetros analíticos para validação de métodos cromatográficos

Seletividade

A seletividade de um método instrumental de separação é a capacidade de avaliar, de forma

inequívoca, as substâncias em exame na presença de componentes que podem interferir com a

sua determinação em uma amostra complexa. A seletividade avalia o grau de interferência de

espécies como outro ingrediente ativo, excipientes, impurezas e produtos de degradação, bem

como outros compostos de propriedades similares que possam estar, porventura, presentes. A

seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do composto de interesse

(Ribani et al., 2004).

Precisão

A precisão pode ser expressa através da estimativa do desvio padrão relativo (RSD), também

conhecido como coeficiente de variação (CV).

RSC(%) ou CV(%) = S/X x 100

S= Estimativa do desvio do padrão absoluto.

X= Media Aritmética.

Normalmente, métodos que quantificam compostos em macro quantidades requerem um RSD

de 1 a 2%. Em métodos de análise de traços ou impurezas, são aceitos RSD de até 20%,

dependendo da complexidade da amostra. Uma maneira simples de melhorar a precisão é

aumentar o número de replicatas (Ribani et al., 2004).

Exatidão

Representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um

determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro. É importante observar

que um valor exato ou verdadeiro é o valor obtido por uma medição perfeita e este

valor é indeterminado por natureza. A exatidão é sempre considerada dentro de certos limites,

a um dado nível de confiança (ou seja, aparece sempre associada a valores de precisão). Estes

limites podem ser estreitos em níveis de concentração elevados e mais amplos em níveis de

traços (Ribani et al., 2004).

II OBJETIVOS

OBJETIVO PRINCIPAL

Implantar metodologias eficientes para pré-concentração e detecção de anatoxina-a em

amostras de água.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

01. Testar e desenvolver método específico para identificação e quantificação da

anatoxina-a, através de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por

fluorescência.

02. Otimizar metodologias de extração, purificação, concentração, derivatização,

armazenamento e análises de anatoxina-a em água bruta, pós-tratamento e amostras

ambientais, com a finalidade de garantir valores compatíveis com a sensibilidade dos

métodos de detecção.

III MATERIAL E MÉTODOS

III. 1- Reagentes e equipamentos: Foram utilizados reagentes MERCK com grau

analítico ou HPLC e água ultrapura (Milli-Q). O padrão de anatoxina-a ([+]-2acetil-9-

azabiciclo[4.2.1]non-2-eno) foi obtida comercialmente (SIGMA, Alemanha), mantidos a

-20°C no escuro. As análises foram realizadas utilizando-se o equipamento cromatográfico

Shimadzu SCL-10A

dotado de detector de fluorescência RF-10AXL, bomba quaternária

LC-10AD

e forno de coluna CTO-10AS

controlados através do software CLASS-VP 6.21

SP5 (Fig III.1).

Figura III. 1: Equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE),

conectado ao computador e à uma impressora.

Um dos objetivos do trabalho foi otimizar as metodologia de extração, purificação,

pré-concentração, derivatização, armazenamento, e análise de anatoxina-a por cromatografia

líquida de alta eficiência. Para isso foram realizados experimentos onde procurou-se variar

alguns dos parâmetros metodológicos.

III.2- Condições cromatográficas

Três colunas analítica C18 foram utilizadas: Shim-Pack 250 X 4.6mm, 5μ; Luna 250 X

4,6mm 5μ e Synergi 250 X 4,6mm, 4μ e pré coluna C18. A fase móvel foi água:acetonitrila.

Um volume de 20μL da amostra derivatizada foi injetado no sistema e quantificado usando

detector dotado de um monitor fluorimétrico (λ

=470 λ

=530 nm).

Segundo James et al. (1998), na corrida cromatográfica com pré-derivatização e

detecção por fluorescência, podem ser identificados a anatoxina-a e as suas cinco variantes no

mesmo cromatograma. Todos os resultados foram calculados pela integração das áreas dos

picos e relacionados com a curva de calibração realizado com o padrão de anatoxina-a.

As condições cromatográficas (temperatura do forno de coluna, a proporção de

água/acetonitrila da fase móvel e o vazão da fase móvel) e a sensibilidade do aparelho foram

testadas. A temperatura do forno foi analisada a 30, 40 e 45 °C; a proporção água/acetonitrila

foi de 45:55, 50:50 55:45; e a vazão da fase móvel de 0,5, 0,8 e 0,9 mL minuto

-1

. As amostras

foram submetidas a diversos tratamentos de pré-concentração e purificação, visando

identificar o mais apropriado a ser implantado para análise de anatoxina-a em água no

laboratório.

III.3- Métodos de extração.

As amostras e padrões foram sonificadas com finalidade de romper as células das

cianobactérias, presente nas amostras ambientais ou nos meios de cultivo. Para isto utilizou-se

um sonificador Ultrasonic Processor, Modelo GE 50 (Fig.III.2), com três pulsos de 1 minuto

com intervalos de 1 minuto (20 k Hz e 25 watts), com resfriamento.

Figura III. 2 : Sonificador Ultrasonic Processor, Modelo GE 50

III.4- Método de derivatização pré-CLAE

A derivatização de anatoxina-a foi alcançada usando uma modificação do

procedimento desenvolvido por Watanabe & Imai (1981). A amostra foi misturada com

50 μL 4-fluoro-7-nitro-2, 1,3- benzoxadiazol (NBD-F) em acetonitrila (1mg/L, ) e 100 μL

de borato de sódio (0,1M) em frasco âmbar a temperatura ambiente por 10 min. A reação foi

então terminada adicionando 50 μL de HCl (1M) à mistura (Fig III.3).

Anatoxina-a + NBD-F NBD-Anatoxina-a

Figura III.3: Reação do NBD-F com a Anatoxina-a. (Extraído de James et al., 1998).

III.5- Curva de calibração

As curvas de calibração foram construídas com o padrão comercial de anatoxina-a

([+]-2Acetil-9-azabiciclo[4.2.1]non-2-ene, SIGMA), em triplicata, nas seguintes

concentrações:

Tabela III.1: Concentrações dos pontos das curvas de calibração.

Concentração em μg L

-1

Curva 1

0 1 5 10 15 20

Curva 2

0 1 5 10 20 50

III.6- Métodos de concentração e purificação:

III.6. a) Cartuchos (extração me fase sólida):

Foi utilizada bomba peristáltica (Millipore, Cartridge Pump 3 Modelo 7519-05) (Fig

III.4), com fluxo para a ativação dos cartuchos e posterior eluição da toxina entre 1,0 e 1,2

mL minuto

-1

Figura III.4: Bomba Millipore, Cartridge Pump 3 Modelo 7519-05, conectada aos cartuchos

C18 e WCX.

III.6.a.1) WCX: Cartucho de troca catiônica fraca (Supelco LC-WCX SPE, 3 mL)

(Fig.III.4).

Amostras de água (10mL) contendo anatoxina-a foram extraídas, purificadas e pré-

concentradas usando um método previamente descrito por Harada et al. (1990). O pH da

amostras foi ajustado para 7,00, 7,50, 8,00, 8,50 e 9,00 antes da extração com um cartucho

WCX de fase sólida de troca catiônica fraca (SPE), de 3mL.

O condicionamento (ativação), lavagem e eluição do cartucho foram alcançados

utilizando-se os métodos descritos na tabela III.2. A amostra eluída foi então evaporada,

derivatizada e analisada por CLAE-FL.

C18

WCX

III.6.a.2) C18: Cartucho (Sep-Pak Plus C18, 1.5mL) fase estacionaria apolar

(Fig.III4).

Amostras de água (10mL) contendo anatoxina-a foram extraídas, purificadas e

concentradas segundo Harada et al. (1990). O pH da amostras foi ajustado para 7,0, antes da

extração com cartucho Sep-Pak Plus C18, 1,5mL.

O condicionamento (ativação), lavagem e eluição dos cartuchos foram alcançados

utilizando-se os seguintes métodos descritos na tabela III.2. Amostra eluída foi então

evaporada, derivatizada e analisada por CLAE-FL.

Tabela III.2: Métodos teste de ativação, lavagem e eluição dos cartuchos WCX e

C18.

Teste Ativação do cartucho Lavagem Eluição

6mL

Metanol

_ 6mL

Água

6mL

Metanol/Água 50 %

6mL

Metanol 0,2%TFA

10mL

Metanol

_ 10mL

Água

10mL

Metanol/Água 50 %

10mL

Metanol 0,2%TFA

10mL

Metanol

_ 10mL

Água

_ 10mL

Metanol 0,2%TFA

10mL

Metanol

10mL

Água

10mL

Metanol

0,2%TFA

_ 10mL

Metanol 0,2%TFA

III.6.b) Separações por solvente (Extração Liquido-Liquido):

Em funil de decantação foram colocadas 10mL de amostras de água contendo

anatoxina-a e 10 mL de clorofórmio (Merck, Alemanha). A mistura foi agitada por 30

segundos e aguardou-se a separação da fase aquosa da orgânica. Logo após, retirou-se a fase

orgânica. Esse processo foi testado para 10mL e 20 mL de volume de clorofórmio. Também

se testou a separação por repetições dos volumes (10+10mL e 20+20mL). O clorofórmio foi

evaporado em rota evaporador, a amostra foi derivatizada e analisada por CLAE-FL.

III.6.c) Métodos de evaporação.

Os métodos citados acima passaram por uma etapa de concentração por evaporação,

(fator de concentração de 50 vezes) a qual é critíca devido à instabilidade da toxina. Visando

identificar o método mais apropriado, testou-se os seguintes:

III.6.c.1- Evaporação por aquecimento:

A amostra, após ser eluída com10 mL de metanol contendo 0,2% TFA (v/v), foi

colocada em um frasco âmbar e este sobre uma chapa de aquecimento (Fisatom, SP, Brasil,

mod. 752A 530W) (Fig. III.5) a diferentes temperaturas (50, 60 ou 70°C).

Figura III.5: Chapa de aquecimento.

III.6.c.2- Evaporação por aquecimento e borbulhamento de gás nitrogênio:

A amostra, após ser eluída em 10 mL de metanol 0,2% TFA (v/v), foi colocada em um

frasco âmbar e este sobre uma chapa de aquecimento em diferentes temperaturas (50, 60 e

70°C) e com borbulhamento de gás N

(analítico) (Fig. III.6).

Figura III.6: Chapa de aquecimento (Fisatom modelo 752A 530W), com borbulhamento de

nitrogênio (White Martins, Brasil).

III.6.c.3- Evaporação com aquecimento, borbulhamento de gás nitrogênio e

vácuo:

A amostra, após ser eluída com 10 mL de metanol contendo 0,2% TFA (v/v), foi

colocada em um frasco âmbar e este sobre uma chapa de aquecimento em diferentes

temperaturas (40, 50 e 60°C), com borbulhamento de gás N

(analítico) e sob vácuo (-4x10

Pa a -4,5x10

Pa). Obteve-se o vácuo com uma caixa hermeticamente fechada, e com auxílio

de uma bomba de vácuo (Prima, SP, Brasil, Mod 141) (Fig. III.7).

Figura III.7: Chapa de aquecimento (Fisatom modelo 752A 530W), com

borbulhamento de nitrogênio em câmara de vácuo.

III.6.c.4- Evaporação no rota evaporador com borbulhamento de gás nitrogênio:

A amostra, após ser eluída em 10 mL de metanol contendo 0,2% TFA ( v/v), foi

colocada em uma pêra de vidro, e levada ao rota evaporador (Fisatom, 80W, Modelo 802),

aquecido em banho termostático (40, 50 e 60°C) (Fisatom, 1200W, Modelo 550) com

borbulhamento de gás N

(analítico) e vácuo(-4,5x10

Pa a -5x10

Pa) (Fig.III.8).

Figura III.8: Rota evaporador (Fisatom, 80W, Modelo 802), aquecido com banho

termostático (Fisatom, 1200W, Modelo 550) com borbulhamento de gás N

III.7- Análise direta

Para uma análise sem purificação e concentração, aqui chamada de análise direta,

mudou-se a sensibilidade de detecção do detector (de média para alta) e a proporção dos

reagentes da pré-derivatização, diminuiu-se o volume do NBD-F para 30 μL, do borato de

sódio para 30 μL e do ácido (HCl) para 50 μL e testou-se volumes de amostras (50, 100, 150,

200, 300, 500 e 1000 μL). Os padrões foram extraídos (sonificados com três pulsos de ultra-

som de 1 minuto com intervalos de 1 minuto), sem qualquer tratamento para pré-concentração

e purificação da toxina. Os padrões foram derivatizados (como descrito no item III.4) e

analisado por CLAE-FL.

III.8- Teste de estabilidade da anatoxina-a em função da temperatura e do tempo

Para testar a estabilidade da toxina em relação à temperatura e ao tempo, colocou-se

o padrão de concentração conhecida (20μg/L) de anatoxina-a nas seguintes condições:

A temperaturas de 22, 40, 50, 60, 70 ou 80 ºC por 60 minutos;

A 50ºC pelos tempo de 60, 120, 150 180, 210 ou 240 minutos;

As amostras com o padrão de anatoxina-a foram posteriormente analisadas utilizando-

se o método de análise direta.

III.9- Estocagem de padrão em etapas da análise.

O padrão de anatoxina-a adquirido comercialmente foi armazenado (-20 °C) em

diferentes etapas do processo (no cartucho, após eluição e após a evaporação) em diferentes

intervalo de tempos (10, 15 e 30 dias), e analisados por CLAE-FL.

III.10- Análises realizadas após o método ser otimizado.

O método utilizado para analises foi o método Analise Direta.

III.10.1 Banco de cultura

Para detectar a produção de anatoxina-a foram analisadas as seguintes amostras do

banco de cultura do laboratório UPC (Unidade de Pesquisa em Cianobactérias):

Tabela III.3: Amostras analisadas do banco de cultura da UPC.

Nome Código Origem

Anabaena cylindrica

PCC7120 Pasteur Culture Collection/ França

Anabaena variabilis

ATCC29413 Americam Type Culture Collection/EUA

Anabaena flos-aquae

- São Carlos/SP/Brasil

Anabaena verrucosa

RS8701 Banhado Taim/RS/Brasil

Nostoc sp. PCC7423 Pasteur Culture Collection/ França

Nostoc sp. RSAZz8601 Arrozal da Embrapa/ Pelotas RS/ Brasil

Nostoc sp. RSj8501 Saco do Justino/Lagoa dos Patos/RS/Brasil

Nostoc canina

- Universidade de Dundee/Esc

Nostoc muscorum

RSj8801 Saco do Justino/Lagoa dos Patos/RS/Brasil

Nostoc punctiforme

RSj8502 Saco do Justino/Lagoa dos Patos/RS/Brasil

III.10.2 Amostras ambientais

Foram analisadas as amostras ambientais, para detecção de anatoxina-a, provenientes de

florações de cianobactérias estudadas no Saco da Mangueira (Rio Grande-RS), Rio

Tietê (São Paulo-SP) e Barragem Santa Bárbara (Pelotas-RS).

Liofilização

As amostras foram liofilizadas (Edwards Micro Modulyo) sob vácuo e temperatura de

–30

C, onde a amostra é totalmente seca, teve sua massa determinada e ressuspensa sob

concentração de aproximadamente 3,0mg liofilizado.mL

-1

em água ultra pura (Milli-Q).

IV RESULTADOS

IV.1. Métodos de detecção de anatoxina-a

Derivatização pré-CLAE

A derivatização do padrão de anatoxina-a ([+]-2Acetil-9-azabiciclo[4.2.1]non-2-ene)

com 50μL 4-fluoro-7-nitro-2,1,3- benzodiazole (NBD-F) em acetonitrila (1mg/mL,) e

100 μL de borato de sódio (0,1M) foi obtida em frasco âmbar a temperatura ambiente

por 10 min e a reação terminada com adição de 50μL de HCl (1M) à mistura. Após

análise em CLAE usando detector dotado de um monitor fluorimétrico (λ

=470

=530 nm), obteve-se um cromatograma com um pico característico para anatoxina-a

(Fig IV.1).

Figura IV.1: Cromatograma do padrão de anatoxina-a com derivatização pré-CLAE

(Coluna: Synergi 250 X 4,6mm, 4μ) e detecção por fluorescência.

Visando deslocar o pico da anatoxina-a para esquerda (diminuir o Tempo de Retenção),

testes alterando o gradiente, fluxo da fase móvel e a temperatura do forno da coluna foram

realizados (Fig. IV.2, IV.3, IV.4, IV.5), onde foi possível diminuir o tempo de retenção e

obter uma melhor resolução.

Figura IV.2: Cromatograma, - Fase móvel Acetonitrila/ água 45:55 vazão 0,5mL/

minuto, temperatura do forno 35 ºC, - Fase móvel Acetonitrila/ água 45:55 vazão

0,5mL/minuto, temperatura do forno 40 ºC, (Coluna: Shim-Pack 250 X 4.6mm, 5μ)

Figura IV.3: Cromatograma, - Fase móvel Acetonitrila/ água 45:55 vazão 0,7mL/

minuto, temperatura do forno 30 ºC, - Fase móvel Acetonitrila/ água 45:55 vazão 0,7mL/

minuto, temperatura do forno 40 ºC, (Coluna: Shim-Pack 250 X 4.6mm, 5μ).

Figura IV.4: Cromatograma, - Fase móvel Acetonitrila/ água 45:55 vazão 0,9mL/

minuto, temperatura do forno 30 ºC, - Fase móvel Acetonitrila/ água 45:55 vazão 0,9mL/

minuto, temperatura do forno 35 ºC, - Fase móvel Acetonitrila/ água 45:55 vazão 0,9mL/

minuto, temperatura do forno 40 ºC, - Fase móvel Acetonitrila/ água 45:55 vazão 0,9mL/

minuto, temperatura do forno 45 ºC, (Coluna Shim-Pack 250 X 4.6mm, 5μ).

Figura IV.5: Cromatograma, - Fase móvel Acetonitrila/ água 45:55 vazão 0,9mL/

minuto, temperatura do forno 45 ºC, - Fase móvel Acetonitrila/ água 50:50 vazão 0,9mL/

minuto, temperatura do forno 45 ºC, - Fase móvel Acetonitrila/ água 55:45 vazão 0,9mL/

minuto, temperatura do forno 45 ºC, (Coluna: Luna 250 X 4,6mm 5).

Validação do método de detecção por derivatização pré-Coluna:

Seletividade:

Padrões da toxina anatoxina-a foram acrescentados em amostras de água

tratada pela CORSAN, coletada na torneira da UPC (Unidade de Pesquisa em

Cianobactérias), bem como de água da enseada Saco da Mangueira (Rio Grande), para

analisar o efeito de matriz e a seletividade do método frente à mesma toxina misturado em

água Milli-Q. Nenhum interferente foi encontrado nem alterações no tempo de retenção das

toxinas, sendo, portanto, o método considerado seletivo.

Limite de detecção do equipamento (LDE):

Seis amostras da matriz (solução

aquosa) foram analisadas frente a uma solução padrão para obtenção da relação sinal de ruído

no tempo de retenção da toxina. O LDE foi considerado aquele que produz, para a menor

concentração do composto, uma resposta maior que três vezes o ruído.

Os resultados estão dispostos na Tabela IV.1.

Tabela IV.1. Limite de detecção do equipamento (LDE) em μg/L.

Método de Análise LDE

Direta 0,02

Com concentração 0,01

Limite de quantificação do método (LQM): As diluições dos padrões de anatoxina-a

com concentrações decrescentes em solução aquosa (Tab IV.2) foram analisadas em triplicata,

visando obter o ponto repetitivo de menor concentração.

Tabela IV.2. Efeito das diluições dos padrões de anatoxina-a na determinação do

LQM em μg/L.

Método de Análise LQM

Direta. 0,5

Com concentração. 0,2

Coeficiente de variação: Segundo AOAC (1993), para que um método seja considerado

preciso, o valor máximo aceitável para o coeficiente de variação (CV(%)=(DP x 100)/M)

deve ser:

Concentração do analito CV(%)

100ppb

10ppb 21

1ppb 30

1μg L

-1

= 1ppb

Tabela IV.3. Curva de resposta de anatoxina-a em derivatização pré-CLAE com os

respectivos coeficientes de variação, obtidos por análise em triplicata.

Conc. (μg/L)

P1 P2 P3 P4 P5

Análise Direta 1 5 10 20 50

CV (%) 3,5 7 1,8 1,3 2,2

Análise com concentração 1 5 10 20

CV (%) 1,3 0,6 1,3 0,3

Coeficiente de correlação:

Os dois métodos apresentaram coeficiente de correlação

dentro das especificações apresentadas pela AOAC (1993), onde o coeficiente de correlação

deve ser r≥0,99800. Os resultados mostraram que o Método de Análise Direta teve um

coeficiente de correlação r=0,9997 e para o Método com Concentração r=0,9995 (Fig. IV 6 e

IV 7).

Figura IV.6: Curva de resposta para anatoxina-a e a equação da reta do método de

Análise Direta.

Figura IV.7: Curva de resposta para anatoxina-a e a equação da reta do método de

Análise com Concentração.

Linearidade: Para análise da faixa dinâmica foram construídos gráficos plotando-se o

Fator de Linearidade (FL) da média de cada ponto da curva versus a amostra de cada

concentração, em escala logarítmica (Fig. IV.4). Considerou-se como requisito para

linearidade uma variação máxima, positiva ou negativa, de 5% da média.

Figura IV.8: Gráfico do Fator de linearidade (FL)= área integrada / concentração

Para o Método Análise Direta (◊) e com Concentração (♦).

IV.2. Métodos de concentração e purificação:

Com base na quantidade adicionada de toxina às amostras de água tratada, e o valor

obtido frente ao cálculo da concentração a partir de padrões diluídos em solução aquosa,

obtém-se o efeito da matriz, possibilitando calcular no final o percentual de Recuperação (R)

para cada método, apresentado nas Tabelas IV.4 e IV.5, indicando a eficiência do método.

Sendo : R (%)= (A

x 100)/ A

= unidades da toxina recuperadas

= unidades da toxina introduzidas

Um percentual de recuperação considerado “aceitável” foi aquele cuja a percentagem

foi acima de 80%

WCX: Cartucho de troca catiônica fraca ( Supelco LC-WCX SPE, 3 mL).

A extração com cartucho WCX não apresentou um % de Recuperação aceitável. Entre

os métodos testados, o que apresentou o melhor R (60%) foi aquele com ativação do cartucho

com 10mL de metanol e 10mL de água (Tab.IV.4).

Tabela IV. 4: Métodos teste de ativação, lavagem e eluição dos cartuchos WCX.

Teste Ativação do cartucho Lavagem Eluição R

6mL

Metanol

_ 6mL

Água

6mL

Metanol/Água 50 %

6mL

Metanol

0,2%TFA

10mL

Metanol

_ 10mL

Água

10mL

Metanol/Água 50 %

10mL

Metanol

0,2%TFA

15%

10mL

Metanol

_ 10mL

Água

_ 10mL

Metanol

0,2%TFA

60%

10mL

Metanol

10mL

Água

10mL

Metanol

0,2%TFA

_ 10mL

Metanol

0,2%TFA

45%

Devido aos baixos valor %R nos testes com cartucho WCX, testou-se uma variação de

pH. Os padrões foram ajustados entre 7,0 e 9,0, porém não influenciaram significativamente

no F

C18: Cartucho (Sep-Pak Plus tC18, 1,5mL)

A extração com cartucho C18 apresentou Fator de Recuperação aceitável, entre os

métodos testados. A condição que apresentou o melhor R (99%) foi aquela com ativação do

cartucho com 10mL metanol, 10mL de água e 10mL de metanol contendo 0,2% TFA (v/v)

(Tab.IV.5).

Tabela IV.5: Métodos teste de ativação, lavagem e eluição dos cartuchos C18.

Teste Ativação do cartucho Lavagem Eluição R

6mL

Metanol

_ 6mL Água 6mL

Metanol/Água 50 %

6mL

Metanol

0,2%TFA

15%

10mL

Metanol

_ 10mL

Água

10mL

Metanol/Água 50 %

10mL

Metanol

0,2%TFA

40%

10mL

Metanol

_ 10mL

Água

_ 10mL

Metanol

0,2%TFA

70%

10mL

Metanol

10mL

Água

10mL

Metanol

0,2%TFA

_ 10mL

Metanol

0,2%TFA

99%

Extrações por solvente:

Na separação com funil de decantação com 10 mL, 20mL, 2 X 10 mL e 2X 20mL de

clorofórmio obtivemos os seguintes resultados:

A extração com clorofórmio apresentou percentual de Recuperação aceitável, apenas

com 20mL + 20mL, que foi de 90%.(Tab. IV.6).

Tabela IV.6: Fator de Recuperação de padrão nas extrações com clorofórmio.

Método Volume de clorofórmio (mL) R (%)

A 10 35

B 20 65

C 2 X 10 60

D 2 X 20 90

Teste de estabilidade da anatoxina-a em função da temperatura

O teste com padrão de 25μg L

-1

de anatoxina-a exposto a temperaturas de 22, 40, 50,

60, 70 e 80 ºC por 60 minutos, mostrou que a toxina começa a degradar-se a partir de 60 ºC

quando exposta durante 60 minutos (Fig IV.9).

Figura IV.9: Padrão de concentração conhecida (25 μg L

-1

) de anatoxina-a exposto a

temperaturas (22, 40, 50, 60, 70 e 80 ºC) por 60 minutos.

O teste com padrão de 24 μgL

-1

de anatoxina-a exposto a temperaturas de 50 ºC por

60, 120, 150, 180, 210 e 240 minutos, mostrou que a toxina começa a degrada a partir de 120

minutos a 50 ºC (Fig. IV.10).

0 50 100 150 200 250 300

Tempo em minutos

Conc. μg/L

Figura IV.10: Padrão de concentração conhecida (24 μgL

-1

) de anatoxina-a exposto à

temperaturas de 50ºC por 60, 120, 150,180, 210 e 240 minutos.

Métodos de evaporação.

Diferentes métodos de evaporação foram utilizados para evaporação total de 10 mL de

metanol com 0,2% (v/v) TFA.

Foram calculados os Fatores de Recuperação para os diferentes métodos de

evaporação e foram obtidos os seguintes resultados:

Evaporação por aquecimento

Na evaporação apenas com aquecimento o %R foi de, no maximo, 43,3% com o tempo de

280 minutos (Tab. IV.7).

Tabela IV. 7: Evaporação de 10 mL de metanol 0,2% TFA (v/v), contendo toxina, com

aquecimento.

Temperatura (ºC) Tempo de evaporação (minutos) R (%)

50 300 27,5

60 280 43,3

70 250 38,0

Evaporação por aquecimento e borbulhamento de gás nitrogênio

Na evaporação com aquecimento e borbulhamento de nitrogênio o maior %R foi de 45,7%

com tempo de 245 minutos (Tab IV.8).

Tabela IV.8: Evaporação de 10 mL de metanol 0,2% TFA (v/v), contendo toxina, com

aquecimento com aquecimento e borbulhamento de nitrogênio.

Temperatura (ºC) Tempo de evaporação (minutos) R (%)

50 285 33,3

60 260 42,5

70 245 45,7

Evaporação com aquecimento, borbulhamento de gás nitrogênio e vácuo:

Na evaporação com aquecimento e borbulhamento de nitrogênio sob vácuo o maior %R foi

de 98% no tempo de 80 minutos (Tab IV.9).

Tabela IV. 9: Evaporação de 10 mL de metanol 0,2% TFA (v/v), contendo toxina,

com aquecimento, borbulhamento de nitrogênio e vácuo.

Temperatura (ºC) Tempo de evaporação (minutos) R (%)

40 130 85

50 115 95

60 80 98

Evaporação no rota-evaporador com borbulhamento de gás nitrogênio

Na evaporação com rota-evaporador sob pressão reduzida e borbulhamento de nitrogênio os

maiores %R foram de 99% nos tempos de 60 e 70 minutos (Tab. IV.10).

Tabela IV.10: Evaporação de 10 mL de metanol 0,2% TFA (v/v), contendo toxina, no rota

evaporador com borbulhamento de gás nitrogênio.

Temperatura (ºC) Tempo de evaporação (minutos) R (%)

40 70 99

50 60 99

60 40 95

Análise direta

Para uma análise sem purificação e concentração, aqui chamada de análise direta,

mudou-se o a sensibilidade do analito no detector (de média para alta) e a proporção dos

reagentes da pré-derivatização (diminuiu-se o volume do NBD-F para 30μL , do borato de

sódio para 30μL e do ácido (HCl) para 50μL) e testou-se diferentes volumes de amostras

(50, 100, 200, 300, 500 e 1000 μL).

Observou-se que os volumes abaixo de 200 μL de amostra estão adequados ao volume

dos reagentes. A partir desse volume à quantidade de amostra provoca um efeito de

diluição, se igualando a interação dos reagentes (reatividade efetiva). Com volumes ainda

maiores, o efeito de diluição é ainda maior, diminuindo a interação dos reagentes e, por

conseqüência, diminui o pico cromatográfico (Fig. IV.11).

Figura IV.11: Padrão de 20 μg L

-1

derivatizado com 30μL de NBD-F, 30μL de borato

de sódio, 10 minutos de reação, 50μL de ácido clorídrico (HCl) 1M e a volumes de amostras

(50, 100, 200, 300, 500 e 1000 μL).

Amostras (200 μL) de água tratada com adição de concentrações crescentes de padrões

de anatoxina-a foram derivatizadas e analisadas sem qualquer tratamento de concentração, e a

toxina foi detectada, sem interferentes (Fig IV. 12)

Figura IV.12: Cromatograma do padrão de anatoxina-a com o método de Análise

Direta.

Foram analisadas as concentrações de 1, 5, 10, 20 e 50 μg L

-1

, para determinar-se os

percentuais de Recuperação.

Tabela IV.11. Recuperação (em %) da amostra sem tratamento de concentração.

Padrão

1 2 3 4 5

Concentração μg L

-1

1 μg L

-1

5 μg L

-1

10 μg L

-1

20 μg L

-1

50 μg L

-1

R (%) ± 1 99 99 101 100 100

Estocagem de padrão em etapas da análise.

A estocagem da amostra (-20 °C) nas diferentes etapas do processo de extração,

purificação e concentração da anatoxina-a não apresentou nenhuma perda no período de até

um mês, tempo o qual o experimento de estocagem durou.

IV.3 Análises em amostras de cianobactérias.

Todas as análises foram realizadas com o método de Análise Direta.

Banco de cultura

Após analisar-se 10 amostras do banco (Tab. III.3), a única amostra na qual foi

identificada a presença de anatoxina-a foi Anabaena verrucosa RS8701 (Banhado

Taim/RS/Brasil), em concentrações de 0,480 ng/g de material liofilizado (Fig.IV.13).

Figura IV.13: - Cromatograma da amostra Anabaena verrucosa (RS8701 Banhado

Taim/RS/Brasil). - Cromatograma da amostra Anabaena verrucosa (RS8701 Banhado

Taim/RS/Brasil) com adição de padrão anatoxina-a.

Amostras ambientais

Nas amostras ambientais analisadas foi detectada a presença de anatoxina-a na água

bruta da Barragem Santa Bárbara (Fig. IV.14) coletada em Pelotas em 15 de dezembro de

2004. A concentração final (ambiental) encontrada foi de 5 μg L

-1

Figura IV.14: -Cromatograma da amostra coletada na Barragem Santa Bárbara

(Pelotas). - Cromatograma da amostra Barragem Santa Bárbara (Pelotas) com adição de

padrão de anatoxina-a.

V DISCUSSÃO

Apesar da necessidade das análises da toxina anatoxina-a não estar incluída na Portaria

518, de 25 de Março de 2005, do Ministério da Saúde, a ocorrência de florações de

cianobactérias potencialmente produtoras desta neurotoxina em reservatório brasileiro já foi

reportada (Becker et al., 2003; Minillo et al., 2003., Molica et a.,2003 & Oliveira et al.,

2003).

Uma vez que o problema existe, é importante que a metodologia analítica para este

composto seja otimizada e implantada como técnica de rotina em laboratórios que trabalham

com análises de compostos tóxicos de cianobactérias.

Os métodos de análise por cromatografia líquida com detecção por fluorescência

(CLAE-FL) avaliados permitiram algumas constatações sobre a eficiência e adequação destes

à análise das matrizes utilizadas neste trabalho.

Pode se observar que a derivatização do padrão de anatoxina-a no método “com

Concentração”, que utilizou a derivatização com 50μL de NBD-F em acetonitrila

(1mg mL

-1

) e 100μL de borato de sódio (0,1M), agitação em frasco âmbar à temperatura

ambiente por 10 min seguido de adição de 50μL de HCl (1M) à mistura para terminar a

reação. No método aqui chamado de “Análise Direta” a derivatização foi feita com 30μL de

NBD-F em acetonitrila (1mg/mL, ) e 30 μL de borato de sódio (0,1M) e 200 μL de amostra,

que foi agitada em frasco âmbar à temperatura ambiente por 10 min e a reação terminada

com adição de 50μl de HCl (1M) à mistura. Após análise em CLAE obteve-se, em ambos

cromatogramas, um pico característico de anatoxina-a-NBD, apresentando também um pico

dos reagentes. Entretanto, o pico de reagentes não interfere no tempo de retenção, na

amplitude e resolução do pico da toxina. Assim os métodos “com Concentração” e método

“Análise direta”, derivatizados com NBD-F na presença de borato, são eficientes para

análise de anatoxina-a em CLAE com detector de fluorescência.

As alterações do gradiente, fluxo da fase móvel e a temperatura do forno da coluna,

visando deslocar o pico da anatoxina-a para esquerda, com o intuito de diminuir o tempo de

análise, mostraram que quanto maior o fluxo, menores são os tempos de retenção e menor a

resposta (área do pico). Quanto maior a temperatura do forno da coluna, menor o tempo de

retenção e maior a resposta, e quanto maior a proporção da acetonitrila em relação a água,

menor é o tempo de retenção e maior a resposta. Assim dentre as condições testadas,

optou-se pela que usa o fluxo da fase móvel de 0,9 mL/minuto, 50% acetonitrila e 50% água,

e temperatura do forno a 45 ºC, método no qual o pico da toxina foi detectado no tempo de

11,5 minutos. Esta metodologia permitiu analisar cada amostra em 20 minutos, o que gera

uma resposta rápida para a presença e concentração de anatoxina-a. Tal velocidade de

obtenção de resultados é muito importante quando se trata de análise de toxinas em água para

consumo humano.

Os métodos de detecção por derivatização pré-CLAE, “Análise Direta” e “com

Concentração”, apresentaram-se seletivos, lineares, com LDE e LQM baixos e com

Coeficiente de Correlação e Coeficiente de Variação dentro da especificação da AOAC

(1993).

Entre os métodos de purificação testados, a extração com cartucho WCX não

apresentou um alto fator de recuperação. O maior F

obtido para o cartucho WCX foi com

ativação do cartucho com 10mL de metanol e 10mL de água, que foi em torno de 60 %

(±5%), considerado resultado não aceitável. Já a extração com cartucho C18 apresentou um

fator de recuperação aceitável. O melhor F

foi obtido com ativação do cartucho C18 com

10mL de metanol, 10mL de água e 10mL de metanol com TFA 0,2% (v/v), que foi de 99%

(± 1%). Com base nestes resultados adotou-se o método de extração, purificação e

concentração utilizando-se o cartucho C18 para as análises no denominado método “com

Concentração”.

A metodologia descrita por Harada et al. (1990) e otimizada por James & Sherlock

(1996), utiliza cartuchos WCX para extração, o qual afirmam ter um F

de 83% para

concentrações entre 1 e 10μg L

-1

e de 97% para concentrações entre 10 e 20μg/L. Estes

resultados não foram reproduzíveis neste trabalho, sendo o maior F

para WCX de 60%.

Enquanto o cartucho C18 apresentou F

de 99%, sendo de melhor rendimento ou de mais

fácil procedimento. Assim, o cartucho C18 deve ser utilizado quando houver necessidade de

purificação da amostra (metodologia Com Concentração).

A extração com solvente usando-se funil de decantação com 20 + 20mL de clorofórmio

apresentou um Fator de Recuperação de 90%, o que é aceitável. Porém, este método não foi

adotado para as análises posteriores por haver outra metodologia com melhores resultados.

O teste com padrão de 20μg L

-1

de anatoxina-a exposta a temperaturas de 22, 40, 50,

60, 70 e 80 ºC por 60 minutos, mostrou que a toxina começa a sofrer termodegradação a

partir de 60 ºC. Quando exposta a temperaturas de 50 ºC por 60, 120, 150, 180, 210 e 240

minutos, mostrou que a toxina começa a sofrer termodegradação a partir de 120 minutos,

significando que o processo de evaporação não deve ser usado em temperaturas superiores a

60 ºC no tempo de 60 minutos e, na temperatura de 50 ºC, não deve ultrapassar 120 minutos

de evaporação. Apenas dois dos processos de evaporação aqui testados estiveram dentro

destas condições. O primeiro método de evaporação foi com aquecimento e borbulhamento de

gás nitrogênio a vácuo, que mostrou um R de 98% (tempo do processo de 80 minutos,

50 ºC). O segundo método de evaporação foi utilizando rota-evaporador com borbulhamento

de gás nitrogênio, que apresentou F

de 99% na temperatura de 40 ºC após 70 minutos e na

temperatura de 50 ºC após 60 minutos. Assim, foi então adotado o processo de evaporação

no rota-evaporador com borbulhamento de gás nitrogênio a 50 ºC, método o qual não

apresentou termodegradação da toxina, e foi também de procedimento operacional mais

fácil.

Os experimentos de estocagem das amostras congeladas (-20 °C) nas diferentes

etapas do processo de extração, purificação e concentração da anatoxina-a não apresentaram

perdas no período de até um mês, o que mostra que, se for necessário interromper o processo

já em andamento pelo período de até 30 dias, não haverá interferência nos resultados.

Na análise das amostras do banco de cultivo de cianobactérias da UPC, com o método

de Análise Direta, a única cepa de cianobactéria na qual foi identificada a presença de

anatoxina-a foi Anabaena verrucosa (RS8701, isolada do Estação Ecológica do

Taim/RS/Brasil), e sob concentração baixa (0,480 ng g

-1

de material liofilizado). Apesar de

terem sido analisados vários gênero de Anabaena, (Tabela III.3) possíveis produtoras de

anatoxina-a, não se detectou a produção da toxina.

Nas amostras ambientais analisadas, num total de três amostras, foi detectada

anatoxina-a na amostra da Barragem Santa Bárbara (coletada em Pelotas, RS). A

concentração encontrada foi de 5 μg L

-1

, que é relativamente alta, por se tratar de uma água a

qual é utilizada para o abastecimento de água potável para a cidade de Pelotas. Porém,

levando-se em conta que foi analisada de uma amostra de água bruta, não necessariamente

esta quantidade de toxina poderá estar presente em amostra de água tratada. A quantidade de

toxina que pode ser removida e/ou degradada pelo processo de tratamento de água é

desconhecida.

A metodologia denominada Análise Direta apresenta vantagens comparando com

trabalhos citados anteriormente, devido ser de mais baixo custo (não utilizar cartuchos e

alguns equipamentos) e de reduzir o tempo de procedimento analítico, de aproximadamente 4

horas para 30 minutos, sem perder sensibilidade, recuperação de padrão, precisão e exatidão.

E quando há necessidade de uma purificação e/ou concentração da amostra, utiliza-se a

metodologia Com Concentração (cartucho C18), que também apresenta sensibilidade,

recuperação de padrão, exatidão e reprodutibilidade.

VI CONCLUSÕES

O método de derivatização pré-coluna com NBD-F foi escolhido para análise dos

demais testes de extração (três pulsos de um minuto com intervalo de um minuto),

concentração, purificação (o melhor resultado foi com cartucho C18 e evaporado no rota-

evaporador com borbulhamento de nitrogênio) e análise direta das amostras, por possibilitar a

detecção de anatoxina-a em CLAE (Coluna C18 250X4 .6mm, 4μ, fase móvel

Acetonitrila:Água 50:50 vazão 0,9mL min

-1

, 20μL amostra injetada e detectado com

monitor fluorimétrico λ

=470 λ

=530 nm).

O método, desenvolvido o “Com Concentração”, exige a utilização de alguns

equipamentos desnecessários ao método “Análise Direta”, sendo, portanto, este último

adotado para análise das amostras. Porém, o método “Com Concentração” o qual purifica a

amostra, não deve ser descartado, especialmente no caso de amostra que apresentar

interferentes.

Comparando os métodos de concentração e purificação da toxina avaliados neste

trabalho, pode-se definir como mais adequado às diferentes matrizes utilizadas, os processos

que utiliza cartucho C18. O método mais adequado para evaporação da amostra eluída do

cartucho, foi o que utiliza rota-evaporador, com borbulhamento de nitrogênio.

Em relação à matriz de água tratada, o método “Análise Direta” foi eficiente em

quantificar a toxina adicionada na amostra, sendo este um processo mais rápido e de menor

custo. O método utilizado forneceu resultados comparáveis de quantificação dos métodos já

existentes.

Quanto a amostras de água bruta ou ambiental, o método “Análise Direta” não

apresentou problemas, para quantificar a anatoxina-a, e nas que apresentaram interferentes, a

metodologia “Com Concentração” aplicou-se idealmente ao problema.

Conclui-se, que com estas otimizações realizadas nesse trabalho, foi possível implantar

uma metodologia capaz de quantificar anatoxina-a, em CLAE.

VII CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS

O trabalho apresentado nesta dissertação trata da análise de anatoxina-a, onde métodos

de detecção foram implantados e avaliados.

Diversos métodos de concentração dos analitos em amostras de água tratada e bruta

fornecidas por Estações de Tratamento de Água das regiões Sul e Sudeste do Brasil, foram

testados: extração, purificação, concentração e evaporação. A utilização de cartuchos de troca

iônica para concentração das toxinas é um procedimento a ser investigado.

Um outro tema a ser analisado seria a decomposição das anatoxina-a e as suas outras

variantes. A determinação dos produtos gerados, bem como a toxicidade destes, seria de

grande valia para a administração destes locais.

A utilização de sistemas de cromatografia acoplada à espectrometria de massa nesse caso

seria de grande importância, porém o difícil acesso a esta técnica devido seu elevado custo,

impede o desenvolvimento de novas pesquisas e até mesmo a extinção de análises por

bioensaio.

Este trabalho teve a intenção de fornecer a base para investigações futuras, implantando

um método de detecção exata e precisa, permitindo o desenvolvimento de novas investigações

sobre este tema de grande importância comunitária.

VIII BIBLIOGRAFIA

AOAC Peer Verified Methods Program, 1993. Manual on polices and procedures.

Association of Official Analytical Chemists International Arlington, AV.

AZEVEDO, S. M. F. O., 1996. Toxic cyanobacteria and the Caruaru tragedy. Resumos do

IV Simpósio da Soc. Bras. de Toxinol., p. 83, Recife, Pe.

AZEVEDO, S. M. F. O., CARMICHAEL, W. W., JOCHIMSEN, E. M., RINEHART, K. L.,

LAU, S., SHAW, G. R. & EAGLESHAM, G. K., 2002. Human intoxication by

microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-Brazil: Toxicology, 181/182, p.

441-446.

BEASLEY, V.R., COOK, W.O., DAHLEM, A.M., HOOSER, S.B., LOVELL, R.A. &

VALENTINE, W.M., 1989. Intoxication in livestock and water fowl. Clinical Toxicology

- Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice, 5:345-361.

BECKER, V., SPIANDORELLO, F.B., MONÇANI, G. R. P., COSTA, A. H. R. & YUNES,

J. S., 2003. Monitoramento de cianobactéria nocivas na Represa do Faxinal, principal

manancial de abastecimento publico de água do Município de Caxias do Sul, RS. Resumo

do IX Congresso Brasileiro de Liminologia, Juiz de Fora MG.

BELL, S.G & CODD, G.A., 1996. Detection, analysis and risk assessment of cyanobacterial

toxins. In:Agricultural Chemicals and the Environment. No 5. Eds. R.E. Hester and R.M.

Harrison. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 109-122.

BISHOP,C.T., ANET, E.F.L.J. & GORHAM, P.R., 1959. Isolation and identification of the

fast-death factor in Microcystis aeruginosa NRC-1. Canadian Journal of Biochemistry and

Physiology. 37:453-471.

BOTES, D.P., VILJOEN, C.C., KRUGER,H., WESSELS, P.L. & WILLIAMS, D.H., 1982.

Configuration assignments of the amino acid residues and the presence of N-

methyldehydroalanine in toxins from the blue-green algae Microcystis aeruginosa.

Toxicon, 20:1037-1042.

BOWLING. L., 1992. Report Nº 92. 074.49. NSW., Department of Water Resources,

Paramatta, Australia.

CARMICHAEL, W.W., 1992. Cyanobacteria secondary metabolites – The Cyanotoxins.

J.Appl.Bact., 72: 445-459.

CARMICHAEL, W.W., 1994. The toxins of Cyanobacteria. Scientific American. 270(1), pp.

64-86.

CARMICHAEL, W.W.;BEASLEY, V.R., BUNNER, D.L., ELOFF, J.N., FALCONER, I.R.,

GORHAM, P.R.; HARADA, K.-I., YU, M.-J.; KRISHNAMURTHY, T., MOORE, R.E.,

RINEHART, K.L., RUNNEGAR, M.T.C., SKULBERG, O.M. & WATANABE, M. 1988.

Naming of cyclic heptapeptide toxins of cyanobacteria (blue-green algae). Toxicon. 26:

971-973.

CARMICHAEL, W.W., MAHMOOD, N.A. & HYDE, E.G., 1990. Natural toxins from

cyanobacteria (blue-green algae). In Marine Toxins: Origin, Structure, and Molecular

Pharmacology, Editors. Hall, S. & Strichartz, G. pp. 87-106. Washington, DC: Americam

Chemical Society.

CARMICHAEL, W.W. & SCHWARTZ, L.D., 1984. Preventing livestock deaths from blue-

green algae poisoning. Farmers Bulletin 2275, Washington, DC: US Dept. of Agriculture.

CARMICHAEL, W.W., EVANS, W.R.; YIN, Q.Q., BELL, P. & MOCZYDLOWSKI, E.,

1997. Evidence for paralytic shellfish poisons in the freshwater cyanobacterium Lyngbya

wollei (Farlow ex Gomont) comb.nov. Appl. Environ. Microbiol. 63:3104-3110.

CHORUS, I. & BARTRAM, J. 1999. Toxic Cyanobacteria in Water. A Guide to their Public

Health Consequences, Monitoring and Management. 416p. E&FN Spon, London.

CODD, G.A., 2000 Cyanobacterial Toxins, the perception of water quality, and the

prioritization of eutrophication control. Ecological Engineering 16: 51-60.

CODD, G. A., LOUISE F. M. & JAMES S. M., 2005. Cyanobacterial toxins: risk

management for health protection. Toxicology and Applied Pharmacology 203, 264– 272.

DEVLIN, J.P., EDWARDS, O.E., GORHAM, P.R., HUNTER, N.R., PIKE, R.K. &

STAVRICH, B., 1977. Anatoxin-a a toxic alkaloid from Anabaena flos-aquae NRC-44 th.

Can.J.Chem. 55:1367-1371.

ERIKSSON, J.E., GRÖNBERG, L., NYGÄRD, S., SLOTTE, J.P. & MERILUOTO, J.A.0.,

1990. Hepatocellular uptake of 3H-dihydromicrocystin-LR a cyclic peptide toxin.

Biochim. Biophys. Acta. 1025:60.

FALCONER, I.R., 1991. Tumor Promotion and Liver Injury Caused by Oral Consumption of

Cyanobacteria. Environmental Toxicology and Water Quality, 6: 177-184.

FALCONER, I.R., 1994. Health implications of Cyanobacterial (blue-green algae) toxins. In :

Toxic Cyanobacteria current status of research and management. Eds. STEFFENSEN, D.A.

& NICHOLSON, B.C. Proceedings of an International Workshop, Adelaide, Australia.

FALCONER, I.R.,1996.Potential impact on human health of toxic cyanobacteria. Phycologia,

35(6): 6-11.

FALCONER, I.R., 1998. “Algal toxins and human health.” In: Hrubec, J. The handbook of

Environmental Chemistry, Vol.5, Part C - Quality and Treatment of Drinking Water II.

Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, pp. 53-82.

FERRÃO-FILHO, A. S., KOZLOWSKY-SUZUKI, B., & AZEVEDO, S. M. F. O., 2002.

Accumulation of microcystins by a tropical zooplankton community: Aquatic Toxicology,

59, p. 201-208.

FERREIRA, F.; FRANCO, J.M.; FIDALGO, M.L. & FERNANDEZ-VILA, P., 1995.

Detection of PSP-toxins from Aphanizomenon flos-aquae (cyanobacteria) collected in the

Crestuma/Lever reservoir (Duro River, Northern Portugal). In: RAPALA, J. 1998. Toxin

Production by Freshwater Cyanobacteria: Effects of Environmental Factors. University of

Helsinki, Finland, p 63.

HARADA, K.-I., OHTANI, I., IWAMOTO, K., SUZUKI, M., WATANABE, M.F. &

TERAO, K., 1994. Isolation of cylindrospermopsin from cyanobacterium Umezakia

natans and its screening method. Toxicon. 32: 73.

HARADA, K.-I., OGAWA, K., MATSUURA, K., MURATA, H., SUZUKI, M.,

WATANABE, M.F., ITEZONO, Y. & NAKAYAMNA, N., 1990. Strutural determination

of geometrical-isomers of microcystins LR and RR from cyanobacteria by two-

dimensional NMR spectroscopic techniques. Chemical Research Toxicology. 3: 473-481.

HAWSER, S.P., CODD, G.A., CAPONE, D.G. & CARPENTER, E.J., 1991. A neurotoxic

factor associated with the bloom-forming cyanobacterium Trichodesmium. Toxicon,

29:277-278.

HENRIKSEN, P., 1996. Microcystin profiles and contents in Danish populations of

cyanobacteria/blue-green algae as determined by HPLC. Phycologia, (Supplement),

35(6):102-110.

HOOSER, S.B., BEASLEY, V.R., WAITE, L.L., KUKLENSCHMIDT, M.S.,

CARMICHAEL, W.W. & HASCHEK, W.M. 1991. Actin filament alterations in rat

hepatocytes induced in vivo and in vitro by microcystin-LR, a hepatotoxin from the blue-

green algae Microcystis aeruginosa. Veterinary Pathology, 28: 259-266.

HUGHES, E.O., GORHAM, P.R. & ZEHNDER, A., 1958. Toxicity of a unialgal culture of

Microcystis aeruginosa. Can.J.Microbiol. 4(3): 225-236.

JAKOB, T., RING, J., UDEY. & MC., 2001. Multistep navigation of Langerhans/

dendritic cells in and out of the skin. J Allergy Clin Immunol. 108: 688: 696pp.

JAMES, K.J. & SHERLOCK, I.R., 1996. Determination of the Cyanobacterial Neurotoxin,

Anatoxina-a, by derivatisation using 7-Fluor4-4Nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-F) and

HPLC Analises with Fluorimetric Detection. Biomedical Chromatography vol 10, 46-47.

JAMES, K. J., FUREY, A. SHERLOCK, R. I., STACK, M.A., TWOHIG, M., CAUDWELL,

F.B & SKULBERG, O.M., 1998 Sensitive determination of anatoxin-a, homoanatoxin-a

and their degradation products by liquid chromatography with fluorimetric detection.

Journal of Chromatography, p147-157.

JÜRGENS, U.J., MARTIN, C. & WECKESSER, J. 1986. Cell wall constituents of

Microcystis sp. PCC 7806. Fems 65: 47-52.

KATIRCIOĞLU, H., ASLIM, B., YÜKSEKDAD. Z. N., MERCAN, N. & BEYATLI, Y.,

2004. Production of poly-b-hydroxybutyrate (PHB) and differentiation of putative

Bacillus mutant strains by SDS-PAGE of total cell protein. African Journal of

Biotechnology Vol. 2 (6), June 2003, pp. 147-149

KIVIRANTA, J., SIVONEN K. L., LUUKKAINEN, R. & NIEMELA, S. I., 1991.

Production and biodegradation of cyanobacterial toxins- a laboratory study Arch.

Hydrobiol 3 : 281-294.

LAGOS, N., LIBERONA, J.L., ANDRINOLO, D., ZAGATTO, P.A., SOARES, R.M. &

AZEVEDO, S.M.F.O., 1997. First evidence of paralytic shellfish toxins in the freshwater

cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii isolated from Brazil. VIII International

Conference on Harmful Algae, Vigo, Spain, 115.

LAGOS, N., H, ONODERA, P.A., ZAGATTO, D., ANDRINOLO, S.M.F.O. & OSHIMA,

Y., 1999; Soares, R.M. & Azevedo, S.M.F.O. First evidence of paralytic shellfish toxins in

the freshwater cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii isolated from Brazil.

Toxicon 37: 1359-1373.

LOUGH, W.J. & WAINER, I.W., 1995. High Performance Liquid Chromatography, Principle

and Practice. Glasgow, Blackie Academic & Professional. P. 1-276.

MACKINTOSH, C., BEATTIE, K.A., KLUMP, S., COHEN, P. & CODD, G.A., 1990.

Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific inhibitor of protein phosphatases 1

and 2A from both mammals and higher plants. FEBS Letters, 264:189-192.

MAGALHÃES, V. F., SOARES, R. M., & AZEVEDO, S. M. F. O., 2001. Microcystin

contamination in fish from the Jacarepaguá Lagoon (Rio de Janeiro, Brazil): ecological

implication and human health risk. Toxicon, 39, p. 1077-1085.

MAHMOOD, N.A. & CARMICHAEL, W.W., 1986. Paralytic shellfish poisons produced by

the freshwater cyanobacterium Aphanizomenon flos-aquae NH-5. Toxicon, 24:175-186.

MATSUSHIMA, R., YOSHIGAWA, S., WATANABE, M.F., HARADA, K., FURUSAWA,

M., CARMICHAEL , W.W. & FUJIKI, H., 1990. In vitro and in vivo effects of protein

phosphatases inhibitors, microcystins and nodularin, on mouse skin and fibroblasts.

Biochemical and Biophisical Research Communications. 171(2): 867-874.

MATSUNAGA, S., MOORE, R.E., MIEZCZURA, W.P. & CARMICHAEL, W.W., 1989.

Anatoxin-a(s), a potent anticholinesterase from Anabaena flos-aquae. Journal of American

Chemical Society. 111: 8021-8023.

MINILLO, A., ESPÍNOLA, E. L.G., CUNHA, N.T. & YUNES, J. S., 2003. Presença de

Cianotoxinas e Toxicidade de Floração de Cianobactéria em Represa do Médio e Baixo

Rio Tietê. (SP). Resumo do IX Congresso Brasileiro de Liminologia, Juiz de Fora, MG.

MOLICA, R., OLIVEIRA, E. A., CARVALHO, P. C., COSTA, A., CASÉ, M., MELO, G. &

AZEVEDO, S.2003. Floração de Cianobactéria neurotóxica em reservatório de

abastecimento. Resumo do IX Congresso Brasileiro de Liminologia, Juiz de Fora, MG.

NAMIKOSHI, M., MURAKAMI, T., WATANABE, M.F., ODA. T., YAMADA, J.,

TSUJIMURA, S., NAGAI, H. & OISHI,S., 2003. Simultaneous production of

homoanatoxin-a, anatoxin-a, and a new non-toxic 4-hidroxyhomoanatoxin-a by the

cyanobacterium Raphidiopsis mediterranea Skuja. Toxicon, 42(5): 533-538

NAMIKOSHI. M., MURAKAMI. T., FUJIWARA. T., NAGAI. H., NIKI. T., HARIGAYA.

E., WATANABE M.F., ODA. T., YAMADA. J. & TSUJIMURA. S., 2004. Biosynthesis

and transformation of homoanatoxin-a in the cyanobacterium Raphidiopsis mediterranea

Skuja and structures of three new homologues. Chem Res Toxicol. (12):1692-6.

NEGRI, A.P., JONES, G.J., BLACKBURN, S.I., OSHIMA, Y. & ONODERA, H. 1997.

Effect of culture and bloom development and of sample storage on paralytic shellfish

poisons in the cyanobacterium Anabaena circinalis. J. Phycol. 33:26-35.

NISHIWAKI-MATSUSHIMA, R., OHTA, T., NISHIWAKI, S., SUGUNUMA, M.,

KOHYAMA, K., ISHIKAWA, T., CARMICHAEL, W.W. & FUJIKI, H. 1992. Liver

tumor promotion by the cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin-LR. J. Cancer

Res. Clin. Oncol., 118:420-424.

ODEBRECHT, C., AZEVEDO, S. M. F. O., GARCIA, V. M. T., HUSZAR, V.,

MAGALHÃES, V. F., MENEZES, M., PROENÇA, L. A. O., RÖRIG, L. R.,

TENENBAUM, D. R., VILLAC, M. C. & YUNES, J. S., 2002. Floraciones de

microalgas nocivas en Brasil: estado del arte y proyectos en curso: Sar, E., Ferrario, M.

E., and Reguera, B.p. 217-233. Floraciones algales nocivas en el Cono Sur Americano.

Instituto Español de Oceanografia: Mos, España.

OHTANI, I., MOORE, R.E. & RUNNEGAR, M.T.C., 1992. Cylindrospermopsin, a potent

hepatotoxic from the blue-green algae Cylindrospermopsis raciborskii. J.Am.Chem.Soc.

114:7941.

OLIVEIRA, A. C. P., SAMPAIO, G. F. & GÔMARA, G. A. 2003. Detecção de

hepatotoxinas e neurotoxinas (toxicinas de Cianobactérias) no Reservatório do Funil.

Resumo do IX Congresso Brasileiro de Liminologia, Juiz de Fora, MG.

PROENÇA, C. E. M. 2001, Programa nacional de apoio ao desenvolvimento de moluscos

bivalves. Brasilia, MA/SARC/DPA, p. 33

RIBANI, M., BOTTOLI, C.B.G., COLLINS, C.H., JARDIM, I.C.S.F. & MELO, L.F.C.,

2004. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química Nova. Vol 27 n°

5, p 771-780.

RINEHART, K.L., NAMIKOSHI, M. & CHOI, B.M. (1994). Structure and biosynthesis of

toxins from blue-green algae (cyanobacteria). J.Appl.Phycol. 6: 159.

RUNNEGAR, M.T.C., FALCONER, I.R. & SILVER, J. 1981. Deformation of isolated rat

hepatocytes by a peptide hepatotoxin from the blue-green algae Microcystis aeruginosa .

Archives of Pharmacology. 317: 268-272.

RUNNEGAR, M.T.C. & FALCONER, I. R., 1986. Effects of toxin from the cyanobacterium

Microcystis aeruginosa on ultrastructural morphology and actin polymerization in isolated

hepatocytes. Toxicon, 24: 109-115.

SCHOPF, J.W. & WALTER, M.R., 1982. Origin and Evolution of cyanobacteria: the

Evidence. In Carrr, N. G & Whitton, B. A., 1982. The Biology of Cyanobacteria. 8: 191-

214, 21:543-563.

SHIMIZU, Y., 1993. Microalgal metabolites. Chemical Reviews, 93(5): 1685-1698

SIVONEN, K., HIMBERG, K., LUUKKAINEN, R., NIEMELA, S., POON, G.K. & CODD,

G.A., 1989. Preliminary characterization of neurotoxic cyanobacterial blooms and strains

from Finland. Toxicity Assessment, 4:339-352.

SNYDER, L.R. & KIRKLAND, J.J., 1997. Pratical HPLC Method Development. New

York, John Wiley and Sons. P 233-349.

TEIXEIRA, M. G., COSTA, M., CARVALHO, V.L.P., PEREIRA M.S. & HAGE, E., 1993.

Gastroenteritis epidemic in the area of the Itaparica, Bahia, Brazil. Bulletin of PAHO,

27(3): 244-253.

TUNDISI, J.G. & TUNDISI, T.M., 1992. Eutrofication of lakes and reservoirs: a

comparative analysis, case studies, perspectives. In: Algae and Environment - a general

approach, eds.: Cordeiro-Marino, M. et al., pp. 1-33, Sociedade Brasileira de Ficologia.

VASAS, G., GASPAR, A., PAGER, C., SURANYI, G., MATHE, C., HAMVAS, MM. &

BORBELY G., 2004. Analysis of cyanobacterial toxins (anatoxin-a, cylindrospermopsin,

microcystin-LR) by capillary electrophoresis. Electrophoresis, 108-15.

VIAGGIU. E., MELCHIORRE. S., VOLPI. F., CORCIA. A. D., MANCINI. R.,

GARIBALDI. L., CRICHIGNO. G. & BRUNO. M., 2004. Anatoxin-a toxin in the

cyanobacterium Planktothrix rubescens from a fishing pond in northern Italy.

Environmental Toxicology, Vol 19 191 – 197.

WATANABE, Y. & IMAI, K., 1981. High-performance liquid chromatography and sensitive

detection of amino acids derivatized with 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole. Journal

Chromatography, 515, 723.

YOSHIZAWA, S., MATSUHIMA, R., WATANABE, M.F., HARADA, K., ICHIHARA, A.,

CARMICHAEL, W.W. & FUJIKI, H., 1990. Inhibition of protein phosphatase by

microcystin and nodularin associated with hepatotoxicity. J.Cancer Res.Cli.Oncol,

116:609-614.

YUNES, J.S., BARROS, L.P., PROENÇA, L.A.O. & MONSERRAT, J.M. 2003

Cyanobacterial neurotoxins from Southern Brazilian freshwater: Comments on

Toxicology, 103-115

ANEXOS

Anexo 1

Figura IV.15: Cromatograma do Controle (reagentes da derivatização, sem toxina)

com derivatização pré-CLAE (Coluna: Synergi 250 X 4,6mm, 4μ) e detecção por

fluorescência.

100

Anexo 2

Cronograma Metodológico de Analise de Anatoxina-a.

Direta

Extração:

Três pulsos ultrasónico de um minuto com intervalo de um minuto, refrigerado

Derivatização:

200 µL da amostra;

30 μL NBD-F mg mL

-1

;

30 μL borato de sódio 0,1 M;

10 minuto de Ração,

a temperatura ambiente;

50 μL de HCl 1,0 M.

Análise Em CLAE-FL:

Lupe de 20 µL;

Fase móvel Acetonitrila/ água 50:50, vazão 0,9mL/ minuto;

Temperatura do forno de coluna 40 ºC

Detector de Fluorescência (λ

=470 λ

=530 nm)

Coluna C18 (250 X 4.6mm, 5μ).

101

Com Concentração

Extração:

Três pulsos ultrasónico de um minuto com intervalo de um minuto, refrigerado.

Purificação:

Com cartucho C18, ativado com 10mL de metanol, 10 mL água e 10mL de metanol

TFA 0.2%(v/v), eluído com 10mL de metanol TFA 0.2%(v/v).

Concentração:

Evaporação total em rota-evaporador com borbulhamento de nitrogênio.

Derivatização:

50 μL NBD-F mg mL

-1

;

100 μL borato de sódio 0,1 M;

10 minuto de Ração,

a temperatura ambiente;

50 μL de HCl 1,0 M.

Análise Em CLAE-FL:

Lupe de 20 µL;

Fase móvel Acetonitrila/ água 50:50, vazão 0,9mL/ minuto;

Temperatura do forno de coluna 40 ºC

Detector de Fluorescência (λ

=470 λ

=530 nm)

Coluna C18 (250 X 4.6mm, 5μ).

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 