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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE IN
VITRO E IN VIVO CONTRA RADICAIS PEROXILA E
HIDROXILA EM AMOSTRAS DE PLANTAS
MEDICINAIS
TESE DE DOUTORADO
Maurício Hilgemann
Santa Maria, RS, Brasil
2010
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AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO E
IN VIVO CONTRA RADICAIS PEROXILA E HIDROXILA EM
AMOSTRAS DE PLANTAS MEDICINAIS.
por
Maurício Hilgemann
Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de
Pós-Graduação em Química, Área de Concentração em
Química Analítica, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS),
como requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Química.
Orientador: Prof. Dr. Leandro Machado de Carvalho
Santa Maria, RS, Brasil
2010
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ii
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Naturais e Exatas
Programa de Pós-Graduação em Química
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Tese de Doutorado
AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO E IN VIVO
CONTRA RADICAIS PEROXILA E HIDROXILA EM AMOSTRAS DE
PLANTAS MEDICINAIS.
elaborada por
Maurício Hilgemann
como requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Química
COMISSÃO EXAMINADORA:
Leandro Machado de Carvalho, Dr.
(Presidente/Orientador)
Fritz Scholz, Dr. (Universidade de Greifswald)
José Maria Monserrat, Dr. (FURG)
Marcelo Barcellos da Rosa, Dr. (UFSM)
Solange Cristina Garcia, Drª. (UFRGS)
Santa Maria, 26 de Julho de 2010.
iii
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Leandro Machado de Carvalho, pela amizade, orientação e todas
as contribuições feitas ao desenvolvimento deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Fritz Scholz (Universidade de Greifswald), pela oportunidade
dada em trabalhar com seu grupo de pesquisa. Também gostaria de agradecer por
sua constante supervisão, orientação e amizade, o que muito contribuiu para o
enriquecimento desta experiência.
Aos professores Dr. Marcelo Barcellos da Rosa (UFSM) e Dr. José Maria
Monserrat (FURG), e Dr
a
. Heike Kahlert (Universidade de Greifswald), pelo apoio,
confiança, paciência e estímulo demonstrados no decorrer deste trabalho. Agradeço
também por sua amizade e pelo exemplo de pessoas e profissionais que são.
Aos professores Dr. Paulo Cícero do Nascimento e Drª. Denise Bohrer,
agradeço imensamente pela contribuição neste e em tantos outros trabalhos
desenvolvidos desde a Iniciação Científica.
Aos colegas e amigos Eduardo Pilau, Cristiane Jost, Daiane Dias, Sandra
Ribeiro, Alexandre Schneider, Luiz Ferraz, Denise Bertagnolli, Marlei Veiga e
Simone Noremberg, pela amizade, conselhos, incentivo, apoio e pelos momentos
alegres vividos durante o curso.
Aos amigos e familiares que sempre me apoiaram e acreditaram em mim.
A todos os funcionários e professores que, direta ou indiretamente,
contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho.
À Universidade Federal de Santa Maria, pela oportunidade oferecida de
realizar os cursos de Graduação e Pós-Graduação.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
Serviço de Intercâmbio Acadêmico Alemão (DAAD) e Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelas bolsas concedidas.
iv
RESUMO
Tese de Doutorado
Programa de Pós-Graduação em Química
Universidade Federal de Santa Maria
AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO E IN VIVO
CONTRA RADICAIS PEROXILA E HIDROXILA EM AMOSTRAS DE
PLANTAS MEDICINAIS
Autor: Maurício Hilgemann
Orientador: Leandro Machado de Carvalho
Local e Data da Defesa: Santa Maria, 26 de julho de 2010.
O presente trabalho visa ao desenvolvimento de novas metodologias para a determinação da
capacidade antioxidante in vitro e in vivo contra radicais peroxila e hidroxila em amostras de 5 plantas
medicinais (Matricaria chamomilla L., Psidium guajava, Achyrocline satureoides, Baccharis
genistelloides e Cymbopogon citratus) e sete compostos fenólicos (rutina, quercetina, resveratrol,
ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido gálico e ácido rosmarínico). A capacidade antioxidante das
amostras foi determinada por dois métodos independentes. No primeiro, testou-se uma nova forma
para a detecção de radicais hidroxila, usando-se um procedimento eletroquímico no qual os radicais
destroem uma monocamada auto-organizada de hexanotiol sob um eletrodo de ouro. Esta
monocamada consegue inibir o sinal eletroquímico de um par redox dissolvido, e, ao ser atacada por
radicais livres, estes a destroem, e a recuperação do sinal eletroquímico do par redox se dá de forma
proporcional à extensão de dissolução da monocamada. No segundo método, a determinação da
capacidade antioxidante contra radicais peroxila e hidroxila ocorre através da detecção indireta
destes radicais por fluorimetria (ex/em: 485/520 nm), empregando diacetato de 2’,7’-
diclorofluoresceína (DCFH-DA) como substrato. O DCFH-DA, após sofrer desacetilação, pode ser
oxidado por espécies reativas de oxigênio (ERO), gerando fluorescência. Os radicais peroxila foram
gerados através da termodegradação do reagente cloreto de 2,2’-azobis (2-metilamidinopropano)
(ABAP) a 37ºC, enquanto os radicais hidroxila foram gerados pela reação de Fenton. Ensaios in vivo
foram avaliados utilizando-se hepatócitos do peixe zebra (Danio rerio), expostos aos extratos das
plantas P. guajava e C. citratus (melhor e pior desempenho in vitro, respectivamente). Os resultados
obtidos pelos métodos eletroquímico e fluorimétrico demonstram que é extremamente difícil classificar
as plantas de acordo com sua capacidade antioxidante, uma vez que o resultado obtido depende
fortemente da concentração e da composição química dos extratos, além do princípio do método
analítico empregado. Entretanto, obteve-se uma boa correlação entre os ensaios in vitro e in vivo
feitos para os extratos das plantas P. guajava e C. citratus, já que os resultados obtidos mostraram
uma redução da concentração de ERO intracelular em forma dose-dependete nos hepatócitos
expostos a P. guajava, sem se observar efeito antioxidante no ensaio com C. citratus, a exemplo dos
ensaios in vitro realizados. O presente trabalho pretende chamar a atenção para esses diferentes
resultados obtidos, e compara os diferentes métodos levando em consideração as diferenças
existentes entre as metodologias, assim como as diferenças existentes entre os radicais testados.
Além disso, discute-se a estabilidade, a reatividade e tempo de meia-vida destas espécies.
Palavras-chave: capacidade antioxidante; extratos de plantas medicinais; compostos
fenólicos, métodos eletroquímicos e fluorimétricos; testes in vitro × testes in vivo
v
ABSTRACT
PhD Thesis in Chemistry
Post-Graduate in Chemistry
Federal University of Santa Maria
EVALUATION OF THE IN VITRO AND IN VIVO ANTIOXIDANT CAPACITY
AGAINST PEROXYL AND HYDROXYL RADICALS IN MEDICINAL PLANT
SAMPLES
Author: Maurício Hilgemann
Advisor: Leandro Machado de Carvalho
Santa Maria, July 26th, 2010.
The present work reports the development of new methodologies to evaluate the in vitro and
in vivo antioxidant capacity against peroxyl and hydroxyl radicals in five medicinal plant samples
(Matricaria chamomilla L., Psidium guajava, Achyrocline satureoides, Baccharis genistelloides and
Cymbopogon citratus) and seven phenolic compounds (rutin, quercetin, resveratrol, gallic acid, ferulic
acid, caffeic acid and rosmarinic acid). The antioxidant capacity of the samples was analyzed by two
independent methods. In the first one, a new approach was used to detect hydroxyl radicals indirectly
using an electrochemical procedure, in which the radicals destroy a thiol self-assembled monolayer
(SAM) on a gold electrode. This monolayer can block the electrochemical signal of a dissolved redox
probe. When such an electrode with a SAM is exposed to free radicals, these radicals destroy the
SAM and the electrochemical signal of a redox probe recovers to a degree proportional to the extent
of dissolution of the SAM. In the second method, the evaluation of antioxidant capacity against peroxyl
and hydroxyl radicals is based on the indirect detection of these reactive oxygen species (ROS) by
fluorimetry (ex/em: 485/520 nm) employing 2’-7’-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) as a
fluorescent probe. After the deacetilation reaction of DCFH-DA, it can be oxidized by ROS to the
fluorescent compound DCF. The peroxyl radicals were produced at 37ºC by thermal decomposition of
2,2’-azobis (2 methylpropianamidine) dihydrochloride (ABAP), while hydroxyl radicals were generated
by the Fenton reaction. In vivo assays were evaluated using zebrafish (Danio rerio) hepatocytes
exposed to P. guajava and C. citratus extracts (better and worst in vitro results, respectively). The
results obtained by the electrochemical and fluorimetric methods show that it is difficult to classify the
tested plants according to their antioxidant capacity, since the results depended strongly on the extract
concentration and composition as well as on the principle of the analytical method. However, there
was a good correlation between the in vitro and in vivo assays for P. guajava and C. citratus extracts,
since these results showed a reduction in the intracellular ROS concentration in the hepatocytes
exposed to P. guajava extract. Furthermore, no antioxidant effect was observed in the assay with C.
citrates extract, what is in agreement with the in vitro assays for this plant species. At last, the thesis
intended to proof and to highlight the discrepant results obtained by independent methods for the
same antioxidant species. Additionally, it aimed to compare the different methods according to the
differences among the experimental procedures by using different ROS. Furthermore, the stability,
reactivity and the half-life time of the free radicals are discussed.
Keywords: antioxidant capacity, plant extracts, phenolic compounds, electrochemical and
fluorimetric methods, in vitro × in vivo assays
vi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Diagrama da peroxidação lipídica: a oxidação dos lipídios ocorre
em três etapas: iniciação, propagação e terminação. Na etapa de iniciação, as
ERO reagem com um substrato lipídico (LH) formando radicais lipídicos (L
•
).
Estes radicais são instáveis e reagem com o oxigênio formando radicais
peroxila lipídicos (LOO
•
). Estes também são instáveis e reagem com outra
molécula lipídica, produzindo radicais idênticos, o que propaga a reação. A
reação termina quando dois radicais se ligam, formando uma molécula estável
não radical ..................................................................................................... 14
FIGURA 2 - Estrutura básica de um flavonoide ............................................. 22
FIGURA 3 - Estrutura esquematizada de uma SAM de alcanotióis (C12-SAM)
em ouro.......................................................................................................... 40
FIGURA 4 - Reação de primeira ordem. (a) representação linear da
concentração; (b) representação logarítmica da concentração ..................... 47
FIGURA 5 - Reação de segunda ordem ........................................................ 49
FIGURA 6 - Voltamogramas cíclicos de riboflavina adsorvida ao PIGE em uma
solução de tampão acetato 0,1 mol L
-1
(pH 4,6), velocidade de varredura = 100
mV s
-1
. (-----) sem RF adsorvida; (-----) RF adsorvida antes do ataque de
radicais hidroxila; (-----) RF adsorvida após o ataque de radicais hidroxila
gerados pela reação de Fenton. .................................................................... 65
FIGURA 7 - Variação da altura do pico anódico da riboflavina adsorvida no
PIGE após o ataque de
HO
•
na ausência e na presença de um antioxidante
(ácido ascórbico 0,1 mol L
-1
) à solução de Fenton ........................................ 66
vii
FIGURA 8 - Gráfico da função logarítmica da variação da altura do pico
anódico da riboflavina adsorvida no PIGE após o ataque de na ausência e
na presença de um antioxidante (ácido ascórbico 0,1 mol L
HO
•
-1
) à solução de
Fenton............................................................................................................ 66
FIGURA 9 - Gráfico da função logarítmica da variação da altura do pico
anódico da riboflavina adsorvida no PIGE após o ataque de na presença
de 100, 200 e 1000 mg L
HO
•
-1
de P. guajava adicionada à solução de Fenton. Os
valores próximos às retas correspondem aos valores dos coeficientes
angulares das mesmas.................................................................................. 68
FIGURA 10 - Decaimento do sinal da riboflavina (RF) adorvida no PIGE quando
em contato com o extrato da P. guajava (1000 mg L
-1
). Cada linha do
voltamograma corresponde a um intervalo de 1 min de inserção do PIGE
recoberto por RF no extrato de P. guajava. Após a inserção do eletrodo
recoberto com RF ao extrato, verifica-se uma diminuição do sinal eletroquímico
da RF. ............................................................................................................ 69
FIGURA 11 - Surgimento de um sinal eletroquímico na região de potenciais
positivos após a inserção do PIGE recoberto riboflavina no extrato aquoso de
P. guajava 1000 mg L
-1
. Cada linha do voltamograma corresponde a um
intervalo de 1 min de inserção do PIGE recoberto por RF no extrato de P.
guajava. Após a inserção do eletrodo recoberto com RF ao extrato, verifica-se
um aumento deste sinal eletroquímico, o que comprova que há uma
competição pelo PIGE entre a RF e compostos presentes no extrato que se
adsorvem espontaneamente no PIGE........................................................... 69
FIGURA 12 - Voltamogramas cíclicos de uma solução de [Ru(NH
3
)
6
]
3+
obtidos
com (a) eletrodos não modificados, (b) eletrodos modificados com SAM
(hexanotiol), (c) eletrodos modificados com a SAM após o ataque radicalar via
solução de Fenton por 1 minuto, (d) e 5 minutos. Voltamogramas obtidos com
uma solução de [Ru(NH
3
)
6
]Cl
3
1 10
-3
mol L
-1
em tampão acetato 0,01 mol L
-1
;
velocidade de varredura: 500 mV s
-1
............................................................. 71
FIGURA 13 - Voltamogramas cíclicos de uma solução 1 10
-3
mol L
-1
[Ru(NH
3
)
6
]
3+
em tampão acetato 0,01 mol L
-1
(pH 4,6) em um eletrodo de ouro;
(a) antes da modificação a superfície do eletrodo com a SAM; (b) após a
viii
formação da SAM; (c) após 10 minutos de ataque radicalar; (d) após 20
minutos de ataque radicalar à SAM. Velocidade de varredura: 500 mV s
-1
, 20
ciclos.............................................................................................................. 72
FIGURA 14 - Variação da altura do pico anódico após o ataque dos radicais
HO à SAM na ausência de antioxidantes; (a) decaimento exponencial do sinal
eletroquímico normalizado
0
1 -
I
I
⎡
⎤
⎛⎞
⎢
⎥
⎜⎟
⎝⎠
⎣
⎦
versus o tempo de reação da SAM com
os radicais HO; (b) gráfico da função logarítmica dos mesmos dados mostrando
claramente a separação entre os decaimentos rápido e lento....................... 73
FIGURA 15 - Gráfico do decaimento exponencial logaritmado do sinal
eletroquímico normalizado
0
1 -
I
I
⎡
⎤
⎛⎞
⎢
⎥
⎜⎟
⎝⎠
⎣
⎦
versus o tempo de reação da SAM com
os radicais HO após sucessivos ataques de Fenton por 30 min, com intervalos
de 15 s. Tempo de deposição da SAM: 15 min ............................................. 74
FIGURA 16 - Gráfico logaritmado do decaimento do sinal eletroquímico
normalizado
0
1 -
I
I
⎡⎤
⎛⎞
⎢
⎜⎟
⎝⎠
⎣⎦
⎥
versus o tempo de reação da SAM com os radicais HO
após sucessivos ataques de Fenton por 30 min. Tempo de deposição da SAM:
68 horas......................................................................................................... 75
FIGURA 17 - (a) decaimentos bi-exponenciais do sinal eletroquímico
normalizado
0
1 -
I
I
⎡⎤
⎛⎞
⎢
⎜⎟
⎝⎠
⎣⎦
⎥
versus o tempo de reação da SAM com os radicais HO
obtidos para 3 diferentes concentrações (
○
1000 mg L
-1
; 200 mg L
∇
-1
; □ 100
mg L
-1
) de extratos de M. chamomilla L. adicionados à solução de Fenton; (b)
gráfico da função logarítmica linearizada dos mesmos dados mostrando
claramente a separação entre os decaimentos rápido e lento....................... 76
FIGURA 18 - Correlação entre os métodos eletroquímico (Fenton-SAM) e
espectrofotométrico ( DPPH
•
) para as três concentrações de extratos testadas
(100, 200 e 1000 mg L
-1
), observando-se a inexistência de correlações
significativas entre ambos os métodos. (a) C. citratus; (b) P. guajava; (c) A.
satureoides; (d) B. genistelloides; (e) M. chamomilla..................................... 81
ix
FIGURA 19 - (a) Dependência entre a concentração de ácido ascórbico e a
capacidade antioxidante contra DPPH
•
; (b) dependência entre a concentração
de ácido ascórbico e a capacidade antioxidante contra . ....................... 83
HO
•
FIGURA 20 - Mecanismo mostrando a variação do sinal do par redox com a
formação e dissolução da SAM, frente o ataque de radicais HO................... 85
FIGURA 21 - Esquema ilustrando a metodologia para a medida da capacidade
antioxidante contra radicais peroxila.............................................................. 87
FIGURA 22 - Resultados típicos obtidos pelo método ACAP mostrando a
variação da fluorescência com o tempo, sem e com a adição de ABAP ....... 88
FIGURA 23 - Resultados obtidos para as cinco amostras de plantas estudadas
na concentração de 1000 mg L
-1
, segundo a metodologia de Amado et al.
[AMADO, 2009] para a determinação da capacidade antioxidante contra
radicais peroxila............................................................................................. 88
FIGURA 24 - Resultados obtidos para as 5 amostras de plantas medicinais
estudadas numa concentração de 1000 mg L
-1
, com uma etapa prévia de
desacetilação química do composto DCFH-DA, de acordo com a metodologia
desenvolvida.................................................................................................. 90
FIGURA 25 - Resultados obtidos para as 5 amostras de plantas medicinais
estudadas numa concentração de 200 mg L
-1
, com uma etapa prévia de
desacetilação química do composto DCFH-DA, de acordo com a metodologia
desenvolvida.................................................................................................. 91
FIGURA 26 - Resultados obtidos para as 5 amostras de plantas medicinais
estudadas numa concentração de 100 mg L
-1
, com uma etapa prévia de
desacetilação química do composto DCFH-DA, de acordo com a metodologia
desenvolvida.................................................................................................. 91
FIGURA 27 - Correlação entre os duas diferentes formas de quantificação da
capacidade antioxidante testadas. A primeira considera o valor da área da
curva obtida entre a reação de ERO e compostos antioxidantes durante 30 min
de reação. A segunda considera apenas os valores de fluorescência gerados
após 30 min de reação, de acordo com a eq. 39........................................... 92
x
FIGURA 28 - Correlação entre os métodos fluorimétrico (ACAP) e
espectrofotométrico ( DPPH
•
) para as três concentrações de extratos testadas
(100, 200 e 1000 mg L
-1
), observando-se a inexistência de correlações
significativas entre ambos os métodos. (a) C. citratus; (b) P. guajava; (c) A.
satureoides; (d) B. genistelloides; (e) M. chamomilla..................................... 95
FIGURA 29 - Esquema ilustrando a metodologia para a medida da capacidade
antioxidante contra radicais hidroxila............................................................. 99
FIGURA 30 - Correlações entre os resultados obtidos pelos métodos
fluorimétricos desenvolvidos para avaliar a capacidade antioxidante contra
radicais peroxila e hidroxila em amostras de extratos de plantas nas três
concentrações de extratos testadas (100, 200 e 1000 mg L
-1
). (a) C. citratus; (b)
P. guajava; (c) A. satureoides; (d) B. genistelloides; (e) M. chamomilla ........ 100
FIGURA 31 - resultados obtidos para a capacidade antioxidante de diferentes
compostos fenólicos nas concentrações de 10, 50 e 100 µmol L
-1
contra
radicais peroxila (CAO: capacidade antioxidante; ROS: ácido rosmarínico; GAL;
ácido gálico; QUE: quercetina; RUT: rutina; FER: ácido ferúlico; CAF: ácido
cafeico) .......................................................................................................... 104
FIGURA 32 - resultados obtidos para a capacidade antioxidante de diferentes
compostos fenólicos nas concentrações de 10, 50 e 100 µmol L
-1
contra
radicais hidroxila (CAO: capacidade antioxidante; ROS: ácido rosmarínico;
GAL: ácido gálico; QUE: quercetina; RUT: rutina; FER: ácido ferúlico; CAF:
ácido cafeico)................................................................................................. 105
FIGURA 33 - correlação entre os resultados obtidos pelos métodos
fluorimétricos desenvolvidos para avaliar a capacidade antioxidante contra
radicais peroxila e hidroxila em amostras de compostos fenólicos nas
concentrações de 10, 50 e 100 µmol L
-1
........................................................ 105
FIGURA 34 - Resultados obtidos para o teste de viabilidade celular, sendo que
o número de células viáveis foi afetado apenas para células expostas ao
extrato de P. guajava 1000 mg L
-1
................................................................. 109
FIGURA 35 - Resultados obtidos para a determinação da concentração de
ERO intracelular, em que se observa uma redução da concentração de ERO
intracelular nos hepatócitos expostos ao extrato de P. guajava (PG), sem se
xi
observar alteração para os hepatócitos expostos ao extrato de C. citratus (CC).
....................................................................................................................... 109
xii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Potenciais-padrão de agentes oxidantes fortes, valores de
potencial a 25 ºC, 1 atm aH
3
O
+
= 1....................................................................8
TABELA 2 - Exemplos de ERO radicalares e não-radicalares ........................11
TABELA 3 - Tempos de meia-vida das principais ERO...................................12
TABELA 4 - Constantes cinéticas de segunda ordem para reações de
HO
•
..13
TABELA 5 - Principais classes de flavonoides e descrição de suas
características básicas
.................................................................................................................................
24
TABELA 6 - Potenciais-padrão biologicamente relevantes de diferentes
espécies radicalares ........................................................................................31
TABELA 7 - Plantas medicinais estudadas: seus nomes populares, usos
tradicionais, vias de administração, contra-indicações e efeitos adversos ......52
TABELA 8 - Resultados obtidos pelo método voltamétrico proposto (%) e o
método do (%) para a capacidade antioxidante dos extratos de plantas
testados ...........................................................................................................78
DPPH
•
TABELA 9 - Resultados obtidos pelo método fluorimétrico proposto (%) e o
método do (%) para a capacidade antioxidante dos extratos de plantas
testados ...........................................................................................................93
DPPH
•
TABELA 10 - Resultados obtidos pelo método fluorimétrico proposto para a
avaliação da capacidade antioxidante de extratos de plantas contra radicais
peroxila ............................................................................................................97
TABELA 11 - Resultados obtidos pelo método fluorimétrico proposto para a
avaliação da capacidade antioxidante de extratos de plantas contra radicais
hidroxila .........................................................................................................101
xiii
TABELA 12 - Resultados obtidos para a atividade antioxidante de compostos
fenólicos empregando diferentes métodos in vitro.........................................107
TABELA 13 – Classificação dos diferentes compostos fenólicos testados em
função do método utilizado e do radical gerado. A concentração de todos os
compostos fenólicos é de 50 µmol L
-1
(RUT: rutina; QUE: quercetina; RES:
resveratrol; CAF: ácido cafeico; FER: ácido ferúlico).....................................108
xiv
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES
ABAP 2,2’-azobis (2-metilamidinopropano)
ACAP Capacidade antioxidante contra radicais peroxila
CAF Ácido cafeico
CAO Capacidade antioxidante
CV Coeficiente de variação
DCFH-DA Diacetato de 2’,7’-diclorofluoresceína
DPPH Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila
E Potencial
EPH Eletrodo padrão de hidrogênio
ERN Espécies reativas de nitrogênio
ERO Espécies reativas de oxigênio
ESR Ressonância de spin eletrônico
FER Ácido ferúlico
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
HO
•
Radical hidroxila
i corrente
2
O
•−
Radical superóxido
OMS Organização Mundial da Saúde
PIGE Eletrodo de grafite impregnado com parafina
QUE Quercetina
r Coeficiente de correlação linear
RES Resveratrol
RF Riboflavina
RFC Reagente de Folin-Ciocalteu
xv
ROO
•
Radical peroxila
RUT Rutina
SAM Monocamadas auto-organizadas
SOD Superóxido dismutase
TRAP Total Radical Trapping Antioxidant Parameter
xvi
LISTA DE APÊNDICES
APÊNDICE 1 – SHOLZ, F. et al. Indirect electrochemical sensing of radicals
and radicals scavengers in biological matrices. Angewandte Chemie
International Edition, v. 46, p. 8079 – 8081, 2007.......................................124
APÊNDICE 2 – HILGEMANN, M. et al. Electrochemical assay to quantify the
hydroxyl radical scavenging activity of medicinal plant extracts.
Electroanalysis, v. 22, p. 406 – 412, 2010 ...................................................128
xvii
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS......................................................................................................iii
RESUMO.........................................................................................................................iv
ABSTRACT..................................................................................................................... v
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................vi
LISTA DE TABELAS.....................................................................................................xii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES.........................................................................xiv
LISTA DE APÊNDICES................................................................................................xvi
1 INTRODUÇÃO 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................................................... 3
2.1 Química das espécies reativas de oxigênio (ERO)................................... 3
2.1.1 Peróxido de hidrogênio.................................................................................. 6
2.1.2 Radicais livres ............................................................................................... 9
2.1.3 Oxigênio e seus derivados .......................................................................... 10
2.1.3.1 Radical hidroxila .......................................................................................... 11
2.1.3.2 Radical peroxila........................................................................................... 13
2.1.4 Reação de Fenton....................................................................................... 14
2.2 Fitoterapia e Plantas Medicinais.............................................................. 16
2.2.1 Fitoterápicos................................................................................................ 19
2.2.2 Flavonoides ................................................................................................. 22
2.2.2.1 Fontes naturais de flavonóides.................................................................... 23
2.2.2.2 Capacidade Antioxidante in vitro associada a flavonoides .......................... 25
2.2.2.3 Capacidade Antioxidante in vivo associada a flavonoides .......................... 26
2.2.2.4 Absorção, metabolismo e efeitos clínicos dos flavonóides.......................... 27
2.3 Capacidade antioxidante .......................................................................... 28
xviii
2.3.1 Métodos usados para avaliação da capacidade antioxidante em alimentos
e sistemas biológicos .................................................................................................... 32
2.3.1.1 Ensaio de fenóis totais por Folin-Ciocalteu ................................................. 33
2.3.1.2 Ensaio TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) .............................. 34
2.3.1.3 Ensaio FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)..................................... 34
2.3.1.4 Ensaio TRAP (Total Radical-trapping Antioxidant Parameter) .................... 35
2.3.1.5 Ensaio TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity)............................... 35
2.3.1.6 Ensaio do DP (radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila)................................. 36 PH
•
2.3.1.7 Ensaio para a determinação da capacidade antioxidante contra o radical
superóxido (O
2
•-
)............................................................................................................ 36
2.3.1.8 Ensaio para a determinação da capacidade antioxidante contra peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
) ..................................................................................................... 37
2.3.1.9 Ensaio para a determinação da capacidade antioxidante contra o radical
hidroxila (HO
•
) ............................................................................................................... 37
2.4 Monocamadas auto-organizadas............................................................. 38
2.4.1 Técnicas de preparação de SAMs de alcanotióis em ouro.......................... 41
2.4.2 Química e energia de formação de SAMs de alcanotióis em ouro.............. 41
2.4.3 Mecanismos de crescimento das SAMs...................................................... 42
2.5 Cinética química........................................................................................ 43
2.5.1 Leis cinéticas............................................................................................... 45
2.5.1.1 Reações de ordem zero .............................................................................. 46
2.5.1.2 Reações de primeira ordem ........................................................................ 47
2.5.1.3 Reações de segunda ordem ....................................................................... 48
3 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 50
3.1 Instrumentação.......................................................................................... 50
3.2 Reagentes e soluções............................................................................... 50
3.3 Amostras.................................................................................................... 51
3.3.1 Preparação dos extratos ............................................................................. 51
3.4 Procedimentos experimentais.................................................................. 54
3.4.1 Determinação da capacidade antioxidante de extratos de plantas
medicinais pelo método do DPPH
•
............................................................................... 54
3.4.2 Estudo eletroquímico do poder antioxidante de extratos de plantas
medicinais .................................................................................................................... 55
xix
3.4.2.1 Ataque radicalar a um composto redox ativo imobilizado sobre a
superfície de um eletrodo.............................................................................................. 55
3.4.2.2 Ataque radicalar a um composto eletroquimicamente inativo imobilizado
sobre a superfície de um eletrodo e posterior quantificação de um par redox em
solução .................................................................................................................... 56
3.4.3 Determinação da capacidade antioxidante in vitro contra radicais peroxila
em amostras de extratos de plantas e compostos fenólicos ......................................... 57
3.4.3.1 Desacetilação química do DCFH-DA .......................................................... 58
3.4.4 Determinação da concentração de ERO intracelular................................... 58
3.4.4.1 Protocolo de exposição de hepatócitos aos diferentes extratos de plantas 58
3.4.4.2 Determinação do número de células por ABS em 630 nm.......................... 60
3.4.4.3 Determinação da viabilidade por MTT......................................................... 60
3.4.4.4 Determinação de ERO ................................................................................ 61
3.4.5 Determinação da capacidade antioxidante in vitro contra radicais hidroxila
em amostras de extratos de plantas e compostos fenólicos ......................................... 61
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 63
4.1 Estudo eletroquímico do poder antioxidante de extratos de plantas
medicinais.................................................................................................................... 64
4.1.1 Ataque radicalar a um composto redox ativo imobilizado sobre a
superfície de um eletrodo.............................................................................................. 64
4.1.2 Ataque radicalar a um composto eletroquimicamente inativo imobilizado
sobre a superfície de um eletrodo e posterior quantificação de um par redox em
solução .................................................................................................................... 70
4.1.3 Conclusões parciais referentes aos ensaios eletroquímicos ....................... 84
4.2 Estudo fluorimétrico do poder antioxidante de extratos de plantas
medicinais.................................................................................................................... 86
4.2.1 Determinação da capacidade antioxidante in vitro contra radicais peroxila
em amostras de extratos de plantas ............................................................................. 86
4.2.2 Determinação da capacidade antioxidante in vitro contra radicais hidroxila
em amostras de extratos de plantas ............................................................................. 98
4.3 Determinação da capacidade antioxidante in vitro de compostos
fenólicos contra radicais peroxila e hidroxila......................................................... 103
4.4 Determinação da concentração de ERO intracelular ........................... 108
4.5 Conclusões parciais referentes aos ensaios fluorimétricos............... 110
xx
5 CONCLUSÕES FINAIS ............................................................................ 112
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................... 115
APÊNDICES ............................................................................................................... 124
1 INTRODUÇÃO
Atualmente, há um grande interesse no estudo de espécies antioxidantes,
principalmente devido à sua importância no combate a espécies radicalares em
organismos vivos. No organismo, os radicais livres estão envolvidos na produção de
energia, fagocitose, regulação do crescimento celular e síntese de importantes
substâncias biológicas [BARREIROS, 2006; HALLIWELL, 2007]. Consequente-
mente, os radicais livres são produzidos naturalmente como produtos metabólicos e,
em alguns casos, devido a disfunções biológicas. Problemas ambientais, infecções,
fumo, radiação e luz solar também podem causar a formação de radicais livres. Uma
alta concentração de radicais livres e de espécies reativas de oxigênio (ERO) pode
ocasionar efeitos deletérios, como a peroxidação lipídica, e a agressão a proteínas
de tecidos, membranas, enzimas, carboidratos e DNA. Esses efeitos estão
relacionados a diversas doenças, como artrite, choque hemorrágico, doenças
cardíacas, catarata, disfunções cognitivas, câncer e AIDS e podem ser a causa ou o
fator agravante de uma doença.
Os radicais livres são normalmente mantidos em balanço em sistemas
biológicos por mecanismos de defesa antioxidantes. Durante o metabolismo
oxidativo normal, as ERO são formadas em pequenas quantidades e podem ser
removidas por mecanismos de defesa naturais. O estresse oxidativo ocorre quando
há mais ERO do que podem ser destruídas [VILLA, 1997; SCHEIBMEIR, 2005], o
que ocorre devido a agressões ambientais, doenças ou má nutrição. Antioxidantes
são compostos conhecidos por reagir com radicais livres e ERO, inativando-os e
prevenindo contra a sua ação danosa às células [HALLIWELL, 2007].
Muitas substâncias foram identificadas como antioxidantes. Compostos
fenólicos, um grupo de metabólitos secundários presentes em plantas, possuem
várias propriedades importantes, como anti-inflamatória, antibacterial, antiviral,
antitumor e antioxidante [ANDERSEN, 2006].
Devido à grande importância de radicais livres e antioxidantes, há uma
considerável demanda por técnicas para detectar e quantificar estes dois grupos de
compostos. Várias metodologias foram propostas para avaliar a capacidade
antioxidante de extratos de plantas através da sua interação com radicais livres
2
estáveis (como o ), ou medindo-se a proteção proporcionada pelo
antioxidante a uma molécula alvo que seja oxidada pelos radicais [SÁNCHEZ-
MORENO, 2002; HUANG, 2005]. Ensaios eletroquímicos de antioxidantes
desenvolvidos até agora são focados na determinação eletroquímica de compostos
antioxidantes, não analisando a ação antioxidante direta através de ERO.
DPPH
•
Já a determinação de polifenóis em extratos de plantas tem sido realizada
principalmente por métodos de separação [CAI, 2003] como a cromatografia líquida
de alta eficiência (HPLC), a eletroforese capilar de zona (CZE) e a cromatografia
capilar electrocinética micelar (MEKC). No entanto, a otimização e a aplicação
destes métodos de separação para a determinação simultânea dos polifenóis em
diferentes extratos de plantas com potencial antioxidante têm sido relatadas na
literatura de forma ainda modesta. A capacidade antioxidante de extratos e de
polifenóis puros é geralmente determinada pelos assim chamados “métodos
clássicos”: Folin-Ciocalteu, TRAP (Total Radical Trapping Antioxidant Parameter),
FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) e DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)
[HUANG, 2005].
Do ponto de vista fisiológico e toxicológico, o interesse por compostos
fenólicos justifica-se pelo fato de estes apresentarem uma série de vantagens em
relação a outras drogas, principalmente em termos da ausência de efeitos colaterais.
Nesse sentido, o interesse pela descoberta de novos antioxidantes de fontes
naturais tem aumentado, principalmente para prevenir a deterioração fisiológica de
organelas e, consequentemente, minimizar o efeito oxidativo provocado pelos
radicais livres [HALLIWELL, 2007].
Nesse contexto, esta tese visa abordar: (1) o estudo cinético do poder
antioxidante dos polifenóis em extratos de plantas frente a sistemas radicalares
empregando métodos eletroquímicos; e (2) a comparação dos estudos in vitro e in
vivo do poder antioxidante dos polifenóis em extratos de plantas contra radicais
hidroxila e peroxila.
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Química das espécies reativas de oxigênio (ERO)
O elemento oxigênio (símbolo químico O) existe no ar na forma de moléculas
diatômicas, O
2
, e também em quantidades-traço como ozônio, O
3
. Exceto para
algumas espécies anaeróbicas e aerotolerantes, todos os organismos necessitam de
O
2
para uma produção eficiente de energia, usando cadeias transportadoras de
elétrons, que doam elétrons ao O
2
, como no caso das mitocôndrias em células
eucarióticas e nas membranas celulares de várias bactérias. Estas cadeias
transportadoras de elétrons estão presentes nas mitocôndrias e são a maior fonte de
adenosina trifosfato, ATP. Esta necessidade de O
2
obscurece o fato de que ele é um
gás tóxico, mutagênico e inflamável; organismos aeróbicos sobrevivem apenas por
possuírem defesas antioxidantes [HALLIWELL, 2007].
Cerca de 90% do O
2
consumido pelos animais é transformado nas
mitocôndrias. O princípio da produção de energia nas mitocôndrias é que nutrientes
são oxidados. Através de transformações metabólicas complexas, os nutrientes
perdem elétrons, que são carregados por carregadores de elétrons, como
nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD
+
) e flavinas (FMN, flavina
mononucleotídeo e FAD, flavina dinucleotídeo). Estas espécies reduzidas reagem
com O
2
nas mitocôndrias, liberando grandes quantidades de ATP [STRYER, 1981].
Estes processos são de alta complexidade: a energia é liberada gradualmente pela
passagem de elétrons de NADH para proteínas contendo ferro. Nesta etapa, Fe(III)
é reduzido a Fe(II) e reoxidado a Fe(III) após a passagem de elétrons a citocromos.
A citocromo oxidase remove um elétron de cada molécula de Fe(II)-citocromo, e
gradualmente adiciona 4 elétrons ao O
2
, o que leva à equação [LEHNINGER, 1995;
HALLIWELL, 2007]:
+
22
O + 4 H + 4 2 H Oe
−
⎯⎯→
(1)
4
Uma vez que é impossível adicionar os quatro elétrons de uma única vez e
pelo fato de que intermediários de oxigênio parcialmente reduzidos – também
chamados de espécies reativas de oxigênio (ERO) – podem ser danosas às células,
a citocromo oxidase possui um sistema bastante complexo que lhe permite manter-
se firmemente ligada a estas espécies até que sejam totalmente convertidas em
água [HALLIWELL, 2007]. Entretanto, a maior parte dos processos biológicos e
metabólicos lidam com ERO, desde que eles estejam normalmente associados ao
metabolismo do oxigênio e sejam produzidos em pequenas quantidades sob
condições fisiológicas [DRÖGE, 2002]. A cadeia de transporte de elétrons
mitocondriais é um dos maiores produtores de ERO.
O termo “espécies reativas de oxigênio” inclui as espécies radicais livres
(como, por exemplo, os radicais superóxido, peroxila e hidroxila) e outras que,
embora não possuam elétrons desemparelhados em sua camada de valência, são
muito reativas em decorrência de sua instabilidade (como o peróxido de hidrogênio e
peróxidos orgânicos) [RIBEIRO, 2005]. A falta de um elétron em sua camada mais
externa dá a estas espécies uma configuração extremamente instável, e radicais
reagem rapidamente com outras moléculas ou radicais a fim de atingir a
configuração estável de 4 pares de elétrons na camada de valência. As ERO
constituem uma grande ameaça à saúde em virtude de sua alta reatividade, através
da qual muitas biomoléculas importantes – como ácidos nucleicos, proteínas e
lipídios – podem ser danificados ou desnaturados, resultando em danos ao DNA,
células, órgãos e tecidos. Estima-se que o DNA de cada célula de nosso corpo é
submetido a mais de 20 diferentes lesões oxidativas diferentes por dia, muitas das
quais mutagênicas [FREI, 1994; GONZÁLEZ, 2008].
A fuga de elétrons da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial conduzirá
à formação de , dentre outras espécies. Estas ERO podem atacar ácidos graxos
poli-insaturados presentes na membrana mitocondrial, desencadeando a formação
de radicais lipídicos. O
HO
também pode atacar proteínas que contêm ferro. Uma
vez liberado, o ferro pode reagir com substâncias apropriadas para formar quelatos
e então atacar os ácidos graxos poli-insaturados presentes nas biomembranas. O
acoplamento da catálise de ferro com a transferência de elétrons é conhecido como
o fator principal na iniciação e propagação da peroxidação lipídica [GONZÁLEZ,
2008].
HO
•
•
5
Apenas uma pequena parte do fluxo de elétrons mitocondrial total forma o
radical superóxido, que se decompõe espontaneamente ou é catalisado pela enzima
superóxido dismutase (SOD), formando H
2
O
2
e oxigênio [DRÖGE, 2002]. O peróxido
de hidrogênio por si só é um forte oxidante que pode formar outras ERO. A redução
de H
2
O
2
a é catalisada por metais de transição (M), especialmente Fe
HO
•
2+
e Cu
2+
,
como descrito no seguinte esquema [GONZÁLEZ, 2008]:
SOD M
222
O HO HO
−• •
⎯⎯⎯→⎯⎯→
(2)
O potencial danoso do H
2
O
2
é reduzido naturalmente por proteínas que se
ligam ao ferro e cobre e enzimas (como as catalases e peroxidases), que
transformam o H
2
O
2
em espécies inofensivas, e com a ajuda dos assim chamados
antioxidantes, como as vitaminas C e E.
Liochev e Fridovich [LIOCHEV, 1994] descobriram que o radical hidroxila,
, é formado in vivo pelas reações de Fenton e Haber-Weiss, e que o radical
superóxido, , aumenta a concentração de peróxido de hidrogênio e de ferro livre
pela liberação de clusters de dehidratases.
HO
•
2
O
−•
Estima-se que, no corpo humano, mais de 10 bilhões de ERO são produzidos
diariamente via reações de auto-oxidação e metabólicas, principalmente pelo
sistema de transferência de elétrons mitocondrial. O dano celular ou até mesmo a
morte celular pode ocorrer quando o potencial do sistema defensivo é excedido pela
concentração ERO, ou quando eles são gerados próximos a locais onde as defesas
não são fortes o suficiente [GONZÁLEZ, 2008].
A consequência direta do ataque de ERO é o dano oxidativo a várias
biomoléculas, o que, combinado à idade, pode contribuir para o desenvolvimento de
inúmeras doenças degenerativas, como arteriosclerose, diabetes, certos tipos de
câncer e lesões inflamatórias, doenças autoimunes (AIDS, artrite reumatoide, etc.), e
doenças neurodegenerativas, como Parkinson e Alzheimer [FREI, 1994; WARIS,
2006; HALLIWELL, 2007].
6
2.1.1 Peróxido de hidrogênio
O peróxido de hidrogênio, H
2
O
2
, é um líquido incolor em solução que é
completamente miscível em água. É encontrado naturalmente em baixas
concentrações em águas de chuva, do mar, frutas, vegetais e leite materno. O H
2
O
2
também é produzido como subproduto do metabolismo do oxigênio. Humanos,
outros mamíferos e plantas sintetizam H
2
O
2
intracelularmente e, sob enzimas
antioxidativas endógenas, controlam um componente essencial da resposta imune
contra micro-organismos infecciosos [STRYER, 1981; HALLIWELL, 2007].
O peróxido de hidrogênio é gerado in vivo pela dismutação do radical
superóxido, , espontaneamente ou catalisada pela enzima superóxido
dismutase (SOD). Ele é deliberadamente sintetizado por fagócitos ativados e
diversas enzimas oxidases, como monoamina oxidase, urato oxidase, acyl-CoA
oxidase e L-gulonolactona oxidase, que catalisam a redução de 2 elétrons de O
2
O
−•
2
a
H
2
O
2
[GONZÁLEZ, 2008]. Os papéis metabólicos do H
2
O
2
têm sido extensivamente
estudados. O H
2
O
2
age como uma molécula sinalizadora: ele é implicado como fator
chave na morte celular programada e pode regular a expressão de certos genes que
estão ligados à multiplicação viral nas células [HALLIWELL, 2007].
O H
2
O
2
é um agente oxidante forte. Entretanto, em termos químicos, é pouco
reativo. Ele age como ambos, como um agente oxidante moderado ou um agente
redutor moderado. Ele pode coexistir com várias moléculas biológicas sem, no
entanto, oxidá-las mas em altas concentrações ele pode ser tóxico às células
[HALLIWELL, 2000]. Embora o H
2
O
2
seja moderadamente reativo, ele possui um
tempo de meia-vida relativamente longo, o que permite que ele se difunda para
longe de seus sítios de produção [HALLIWELL, 2007].
Devido a seus efeitos citotóxicos in vivo, acreditava-se que ele fosse
rapidamente consumido por enzimas, como as catalases e peroxidases; entretanto,
o potencial citotóxico do H
2
O
2
ainda não está completamente claro. Alguns estudos
demonstram que, em altas concentrações (> 50 µM), os danos causados pelo H
2
O
2
7
dependerão do tipo de célula, do tempo de exposição, da concentração de H
2
O
2
, do
meio de cultura empregado, etc. [HAMPTON, 1997; CLÉMENT, 1998; HALLIWELL,
2007].
O peróxido de hidrogênio decompõe-se em água e gás oxigênio, de acordo
com a equação 3:
22 2 2
2 H O 2 H O + O⎯⎯→
(3)
Este processo ocorre espontaneamente, porém a velocidade de
decomposição depende da temperatura e da concentração de H
2
O
2
. O valor do pH e
a presença de impurezas, catalisadores e estabilizantes possuem também um
grande impacto na velocidade de decomposição do H
2
O
2
. A decomposição do H
2
O
2
é acelerada naturalmente por catalases e peroxidases. Virtualmente, todos os
organismos possuem estas enzimas, cuja função principal é a remoção de
subprodutos tóxicos do metabolismo, e outra função é a redução do estresse
oxidativo [HALLIWELL, 2007].
O poder oxidativo do H
2
O
2
é maior que o de espécies como cloro e
permanganato de potássio (Tabela 1). Entretanto, o perigo real do H
2
O
2
decorre do
fato de ele poder ser convertido cataliticamente em radicais hidroxilas, cuja
reatividade é muito maior que a das espécies acima mencionadas, e é apenas
superado pelo flúor [GONZÁLEZ, 2008].
A presença de metais de transição acelera a decomposição de H
2
O
2
,
ocorrendo a sua conversão a
HO
•
. Vários autores propuseram diferentes
mecanismos para explicar este processo [HALLIWELL, 2007]. Evidências suportam
que este processo se dá pela reação de Fenton, catalisando a conversão de
peróxido de hidrogênio [PUPPO, 1988]. Nas reações de Fenton e do tipo-Fenton,
metais de transição (especialmente ferro e cobre) são usados para a formação de
. O mecanismo ainda não está completamente claro, mas envolve a interação
de Fe(II) e H
HO
•
2
O
2
, resultando no radical hidroxila, íon hidroxila e Fe(III) (mais sobre
este assunto será discutido posteriormente). Entretanto, a formação de espécies
reativas adicionais, como complexos à base de ferro, não está descartada, embora
não haja evidências experimentais destas espécies sendo quimicamente
caracterizadas em sistemas do tipo-Fenton.
8
Tabela 1: Potenciais-padrão de agentes oxidantes fortes, valores de potencial a 25 ºC, 1 atm aH
3
O
+
=
1 [GONZÁLEZ, 2008].
Oxidante Reação E vs EPH (V)
Flúor
+
2
F + 2H + 2e 2HF
−
⎯⎯→
←⎯⎯
3,053
Radical hidroxila
+
2
OH + H + e H O
•−
⎯⎯→
←⎯⎯
2,700
Ozônio
+
3
O + 2H + 2e O + H O
−
⎯⎯→
←⎯⎯
22
2,078
Radical hidroxila
OH + e OH
•
−−
⎯⎯→
←⎯⎯
2,020
Peróxido de
hidrogênio
+
22 2
H O + 2H + 2e 2H O
−
⎯⎯→
←⎯⎯
1,776
Permanganato de
potássio
+
42
MnO + 4H + 3e MnO + 2H O
−−
⎯⎯→
←⎯⎯
2
1,679
Cloro
2
Cl (g) + 2e 2Cl
−
−
⎯⎯→
←⎯⎯
1,358
Oxigênio
+
22
O + 4H + 4e 2H O
−
⎯⎯→
←⎯⎯
1,229
No nosso organismo, a quantidade de ferro livre e outros metais de transição
disponíveis para iniciar a reação de Fenton é muito baixa. Uma overdose de íons de
ferro livre, contudo, pode causar sérios danos a vários tecidos do corpo. Sob
condições fisiológicas normais, os metais estão ligados em segurança para o
transporte e armazenamento de proteínas, e o corpo é bem equipado com vários
mecanismos para neutralizá-los em caso de quebra de uma ligação metal-proteína.
Não obstante, danos a sítios específicos podem ocorrer quando o íon metálico está
ligado a uma molécula alvo, como, por exemplo, H
2
O
2
, iniciando uma reação em
cadeia radicalar nas proximidades do alvo. Vários autores demonstraram estes
danos específicos devido ao
HO
•
[HALLIWELL, 2007]. No entanto, parece que a
dimensão deste dano é determinada mais pela disponibilidade e local do catalisador
metálico do que pela geração excessiva de H
2
O
2
.
O radical superóxido também está envolvido no sistema Fenton, pois ele
serve como agente redutor (e reciclador) para Fe(III), facilitando o dano causado por
H
2
O
2
.
9
2.1.2 Radicais livres
Radicais livres podem ser basicamente definidos como quaisquer espécies
capazes de existir independentemente de conter um ou mais elétrons
desemparelhados. Um elétron desemparelhado é um elétron que ocupa sozinho um
orbital atômico ou molecular. A presença de um ou mais elétrons desemparelhados
geralmente faz com que radicais livres sejam fracamente atraídos a um campo
magnético (isto é, são paramagnéticos), o que faz com que algumas vezes sejam
altamente reativos, ainda que a reatividade química dos radicais varie bastante.
Radicais são formados pela perda de um único elétron de uma espécie não radicalar
[HALLIWELL, 2007]:
-+
X - e X (cátion radicalar)
•
⎯⎯→ (4)
ou ganhando um elétron
--
Y + e Y (ânion radicalar)
•
⎯⎯→ (5)
Radicais também podem ser formados por fissão homolítica, quando uma
ligação covalente é quebrada e cada elétron do par compartilhado permanece com
uma parte da molécula quebrada, como se mostra na Equação 6:
A:B A + B
••
⎯⎯→
(6)
Rigorosamente falando, a molécula de oxigênio diatômica pode ser também
definida como um radical livre, já que ela possui dois elétrons desemparelhados.
Uma das reações mais importantes do oxigênio é a sua redução à água, uma reação
cujo potencial formal é de +0,815 V vs. EPH em pH 7. Embora esta reação seja
termodinamicamente favorável, as reduções de oxigênio envolvendo a troca de 4
elétrons são muito raras. A redução de oxigênio procede normalmente via etapas de
1 ou 2 elétrons e podem apenas ocorrer desde que uma primeira reação de 1 elétron
tenha ocorrido [GONZÁLEZ, 2008].
10
O oxigênio reage fracamente com outros radicais porque a transferência de
elétron ao oxigênio é restringida pelo princípio de Pauli. Uma vez que 2 elétrons
desemparelhados estejam localizados em dois diferentes orbitais
π
e tenham spins
paralelos, o oxigênio estará limitado a aceitar um elétron de cada vez (alguns
catalisadores são capazes de quebrar esta restrição de spin). Estes fatores
determinam a reatividade química e bioquímica do oxigênio. Isso é algo crucial na
biologia porque o consumo de oxigênio é regulado por sua reatividade cinética. Com
isso, o oxigênio pode coexistir dentro da célula com vários agentes redutores, sem,
no entanto, reagir rapidamente com eles, o que previne as reações de oxigênio
randômicas que destruiriam um grande número de componentes celulares
[HALLIWELL, 2007; GONZÁLEZ, 2008].
2.1.3 Oxigênio e seus derivados
O oxigênio também pode existir em mais formas reativas, isto é, duas formas
de oxigênio singlete, o radical superóxido e o íon peróxido. O radical superóxido,
, é formado quando um único elétron é adicionado a uma molécula de O
2
O
−•
2
(equação 7), e o íon peróxido,
2
2
O
−
, é formado pela adição de 2 elétrons ao O
2
(Equação 8). O não é um radical e é facilmente reduzido a duas moléculas de
óxido, . A adição de 4 elétrons leva à formação de água (Equação 9)
[HALLIWELL, 2007].
2
2
O
−
2-
2 O
--
22
O + e O
•
⎯⎯→
(7)
-+
22
O + 2 e + 2 H H O⎯⎯→
2
(8)
-+
22
O + 4 e + 4 H 2 H O⎯⎯→
(9)
O radical superóxido pertence às ERO. Este termo compreende não apenas
radicais de oxigênio, mas também alguns derivados de oxigênio não-radicalares,
como H
2
O
2
, HOCl e O
3
[HALLIWELL, 2007]. A Tabela 2 mostra as assim chamadas
ERO.
11
Tabela 2: Exemplos de ERO radicalares e não-radicalares (adaptado de HALLIWELL, 2007).
Radicais Não radicais
Superóxido,
2
O
•−
Peróxido de hidrogênio,
22
HO
Hidroxila,
HO
•
Ácido hipocloroso,
HOCl
Peroxila,
RO
O
•
Ozônio,
3
O
Alcoxila,
RO
•
Peróxidos orgânicos,
ROOH
Hidroperoxila,
2
HO
•
Vários métodos têm sido usados e desenvolvidos na pesquisa de ERO.
Métodos envolvendo a medida de DNA e/ou danos a proteínas expostas a radicais
livres, ensaios para a determinação de peróxido de hidrogênio, radical superóxido e
oxigênio singlete, ressonância de spin eletrônico (ESR), spin trapping, radiólise de
pulso, método de degradação de desoxirribose, entre outros, têm sido empregados
com o objetivo de clarificar o papel das ERO no estresse oxidativo e em outras
doenças [HALLIWELL, 2007]. Na prática, a única técnica que consegue observar
radicais livres diretamente é a ESR. A ESR é uma técnica espectroscópica que
detecta elétrons desemparelhados e, assim, é específica para radicais livres.
A maioria dos radicais livres em sistemas biológicos é derivada do oxigênio
(ERO), mas os derivados de nitrogênio (espécies reativas de nitrogênio, ERN)
também existem [OLMOS, 2007] e possuem um importante papel no estresse
oxidativo, que é definido como uma condição de alta atividade pró-oxidante devido
aos radicais livres [FLOCCARI, 2005]. Os radicais livres mais reativos e danosos são
o radical hidroxila, , e o ânion peroxinitrato, . A química e os efeitos das
espécies e serão discutidos nas próximas seções.
HO
• -
ONOO
HO
•
ROO
•
2.1.3.1 Radical hidroxila
O radical hidroxila,
HO
•
, é uma das espécies conhecidas mais reativas. Os
primeiros estudos, conduzidos pela irradiação de soluções aquosas, demonstraram
12
que, uma vez iniciada, a reação em cadeia de ERO pode proceder facilmente
atacando qualquer sítio de um alvo randômico. Em condições biológicas, todavia, ele
reage próximo à velocidade controlada por difusão. Estima-se que o tenha um
tempo de meia-vida de 10
HO
•
-9
segundo nas células (Tabela 3). O pode ser gerado
por radiação, como radiólise de pulso, que é usado para a geração homogênea de
espécies reativas derivadas da água [GONZÁLEZ, 2008]. Já que o componente
majoritário de células vivas é água, a exposição à radiação de alta energia, como
raios gama, resultará na produção de
HO
•
HO
•
. Outras fontes de
HO
são as reações
catalisadas por metais na presença de H
•
2
O
2
, a fissão homolítica de H
2
O
2
induzida
por UV, o metabolismo do etanol, a decomposição de ácido peroxinitroso, ozônio, a
reação de ácido hipocloroso com
2
O
−
•
, lipofilização, ultrassom, etc [HALLIWELL,
2007; JANIK, 2007].
Tabela 3: Tempos de meia-vida das principais ERO [RIBEIRO, 2005].
ERO Tempo de meia-vida (s)
Radical hidroxila 10
-9
Radical alcoxila 10
-6
Radical peroxila 7
Oxigênio singlete 10
-5
As reações do podem ser classificadas em três tipos principais:
abstração de hidrogênio, adição e transferência de elétrons. A Tabela 4 mostra uma
lista de constantes cinéticas de reações do
HO
•
HO
•
. Como pode ser observado, ele
reage extremamente rápido com quase todos os tipos de moléculas encontradas em
células vivas. As reações do
HO
•
são normalmente controladas por difusão, pois
são apenas limitadas pela velocidade com a qual o
HO
•
alcança a molécula alvo
[HALLIWELL, 2007].
13
Tabela 4: Constantes cinéticas de segunda ordem para reações de
HO
•
(adaptado de HALLIWELL,
2007).
Composto pH k (M
-1
s
-1
)
Fe
2+
2,1 3,5 × 10
8
22
HO
7 4,5 × 10
7
EDTA - 2,8 × 10
9
Hemoglobina - 3,6 × 10
10
Histidina 6,7 3,0 × 10
9
Glicose 7 1,0 × 10
9
Ácido ascórbico 1 7,2 × 10
9
Ácido cítrico 1 3,0 × 10
7
Glutationa 1 8,8 × 10
9
Catalase - 2,6 × 10
11
2.1.3.2 Radical peroxila
O radical peroxila é um bom agente oxidante. Sua formação é uma etapa
importante na peroxidação lipídica (Figura 1), mas ele pode ser formado também em
sistemas não lipídicos, como as proteínas. A decomposição de peróxidos pelo
aquecimento ou pela catálise de metais de transição pode gerar tanto o radical
peroxila quanto o radical alcoxila. Em laboratório, o radical peroxila é gerado por
azo-iniciadores, que se decompõem sob aquecimento, e reagem rapidamente com
O
2
gerando
ROO
•
. Os radicais peroxila gerados a partir de azo-iniciadores podem
induzir a peroxidação lipídica e danificar proteínas. De fato, eles são comumente
utilizados para avaliar a capacidade antioxidante, como no ensaio TRAP (seção
2.3.1.4) [HALLIWELL, 2007].
14
Figura 1: Diagrama da peroxidação lipídica: a oxidação dos lipídios ocorre em três etapas: iniciação,
propagação e terminação. Na etapa de iniciação, as ERO reagem com um substrato lipídico (LH)
formando radicais lipídicos (L
•
). Estes radicais são instáveis e reagem com o oxigênio formando
radicais peroxila lipídicos (LOO
•
). Estes também são instáveis e reagem com outra molécula lipídica,
produzindo radicais idênticos, o que propaga a reação. A reação termina quando dois radicais se
ligam, formando uma molécula estável não radical [CUSTÓDIO, 2009].
2.1.4 Reação de Fenton
No organismo humano, há o potencial efeito danoso de metais “livres” ou
apropriadamente complexados, devido à sua habilidade em reagir com e H
2
O
−•
2
O
2
,
catalisando a geração de
HO
•
. Ferro e cobre são os metais mais conhecidos para
catalisar a decomposição de H
2
O
2
[NEYENS, 2003], mas outros metais podem agir
de forma semelhante. Acredita-se que este processo ocorra da seguinte forma:
primeiro, reduz Fe
2
O
−•
3+
a Fe
2+
, via formação de espécies perferril, que possuem
uma estrutura entre os complexos e
2
Fe(II)-O
2
Fe(III)-O
−
•
mostrados na Equação 10.
Esta reação libera Fe
2+
e O
2
. Então segue-se a reação de Fenton, como descrito na
Equação 11 [GONZÁLEZ, 2008].
-
222
Fe(III) + O [Fe(II)-O Fe(III)-O ] Fe(II) + O
−• •
⎯⎯→⎯⎯→⎯⎯→
←⎯⎯←⎯⎯←⎯⎯
2
(10)
15
2+ 3+ -
22
Fe + H O Fe + HO + HO
•
⎯⎯→
(11)
Uma vez que tenha sido liberado, ele inicia o processo de peroxidação
lipídica nas membranas pela retirada de átomos de hidrogênio de ácidos graxos poli-
insaturados (Equação 12) ou de outras reações em cadeia radicalares. Sabe-se
também que o radical hidroperoxil,
HO
•
2
HO
•
, pode iniciar a cadeia de peroxidação
lipídica (Equação 13), entretanto, sob condições fisiológicas, há muito pouco desta
forma protonada de (pK
2-
O
a
~ 4,8) [HALLIWELL, 2007].
2
lipídio-H + HO lipídio + H O
••
⎯⎯→
(12)
22
lipídio-H + HO lipídio + H O
••
⎯⎯→
2
(13)
Sob condições aeróbicas, o radical lipídico reagirá com oxigênio, gerando o
radical peroxila, que consegue retirar outros átomos de hidrogênio e propagar a
reação em cadeia da peroxidação lipídica [VILLA, 1997], como se mostra nas
Equações 14 e 15:
22
lipídio + O lipídio-O
••
⎯⎯→
(14)
22
lipídio-O + lipídio-H lipídio-O H + lipídio
••
⎯⎯→
(15)
Sob condições fisiológicas, Fe
2+
/Fe
3+
pode adicionalmente reagir com
peróxidos de lipídios ( ) para gerar radicais peroxila ( ) e alcoxila
(l ), que podem retirar outros átomos de hidrogênio e acelerar a velocidade
da peroxidação [VILLA, 1997; HALLIWELL, 2007]. Entretanto, é bom ter em mente
que as reações químicas que ocorrem em sistemas contendo íons ferro e peróxido
de hidrogênio e as que descrevem a peroxidação lipídica são muito mais
complicadas do que as equações acima sugerem. Os produtos da oxidação lipídica
têm mostrado um importante papel em doenças cardiovasculares, como trombose e
arteriosclerose, e em muitas doenças crônicas como artrite, câncer, diabetes a mal
de Alzheimer [HALLIWELL, 2007].
2
lipídio-O H
2
lipídio-O
•
ipídio-O
•
16
2.2 Fitoterapia e Plantas Medicinais
Fitoterapia é o uso de plantas para prevenir e tratar doenças ou promover o
bem-estar. Esta prática data da Antiguidade, sendo provavelmente o método mais
antigo existente que a humanidade utiliza para tratar doenças. Por esta razão,
plantas medicinais (vegetais que possuem atividade farmacológica) têm sido usadas
terapeuticamente ao redor do mundo, sendo um aspecto importante em várias
culturas medicinais tradicionais. Embora baseada em modelos teóricos e culturais
diferentes, a fitoterapia está de alguma forma integrada a essas diferentes doutrinas
[AMEH, 2010]. A definição da Organização Mundial de Saúde – OMS, do inglês
World Health Organization (WHO) – para plantas medicinais diz que “são aquelas
que têm uma história de uso tradicional como agente terapêutico, sendo também
denominada de Medicina Tradicional, Alternativa ou Complementar” [WHO – World
Health Organization. Disponível em: <http://www.who.int/topics/traditional_medici-
ne/en/>. Acesso em jun. 2010]. Atualmente, grande parte da comercialização de
plantas medicinais é feita em farmácias e lojas de produtos naturais, as quais em
sua grande maioria não possuem certificado de qualidade, assim como pouca ou
nenhuma comprovação de suas propriedades farmacológicas, além de problemas
associados à identificação errônea da planta, possibilidades de adulteração,
interações entre plantas medicinais e medicamentos alopáticos, efeitos de
superdosagens, reações alérgicas ou tóxicas. A diferença entre planta medicinal e
fitoterápico está na elaboração da planta para uma formulação específica, o que
caracteriza um fitoterápico [VEIGA JUNIOR, 2005]. Segundo a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA), “fitoterápicos são medicamentos obtidos a partir de
plantas medicinais. Eles são obtidos empregando-se exclusivamente derivados de
droga vegetal (extrato, tintura, óleo, cera, exsudato, suco e outros). Os fitoterápicos,
assim como todos os medicamentos, devem oferecer garantia de qualidade, ter
efeitos terapêuticos comprovados, composição padronizada e segurança de uso
para a população. A eficácia e a segurança devem ser validadas através de
levantamentos etnofarmacológicos, documentações tecnocientíficas em bibliografia
e/ou publicações indexadas e/ou estudos farmacológicos e toxicológicos pré-clínicos
e clínicos” [ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Disponível em:
17
<http://portal.anvisa.gov.br>. Acesso em jun. 2010]. De fato, a Resolução-RDC nº
48, de 16/03/2004 exige a apresentação de uma série de relatórios que atestem,
para o preparado fitoterápico a ser registrado, a segurança e a eficácia, bem como
normas de produção e controle de qualidade visando à reprodutibilidade e
constância de princípios ativos e/ou marcadores característicos da espécie vegetal
[Ministério da Saúde. Disponível em: <http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/-
rdc_48_16_03_04_registro_fitoterapicos%20.pdf>. Acesso em jun. 2010]. O estudo
de plantas medicinais envolve o isolamento de substâncias ativas e tem
proporcionado inúmeras descobertas importantes para a humanidade. Seu
desenvolvimento conta com um número cada vez maior de profissionais,
estabelecendo um caráter multi e interdisciplinar para as pesquisas que visam
referendar seu uso. Técnicas de descoberta de fármacos têm sido aplicadas para a
padronização da medicina natural, principalmente para a elucidação analítica dos
compostos [BALUNAS, 2005; PLAZA, 2007].
A OMS reconhece que 80% da população dos países em desenvolvimento
utilizam práticas tradicionais nos cuidados básicos de saúde. Deste universo, 85%
utilizam plantas ou preparados. Nesse sentido, a OMS recomenda a difusão mundial
dos conhecimentos necessários ao uso racional das plantas medicinais e
medicamentos fitoterápicos [Ministério da Saúde. Disponível em: <www.portal.sau-
de.gov.br>. Acesso em jun. 2010]. Em sua estratégia global sobre a medicina
tradicional e a medicina complementar e alternativa para os anos de 2002 a 2005, a
OMS reforçou o compromisso de estimular o desenvolvimento de políticas públicas
com o objetivo de inseri-las no sistema oficial de saúde dos seus 191 estados-
membros. E o Brasil, com sua diversidade genética vegetal estimada em 55 mil
espécies catalogadas [PLAZA, 2007], possui ampla tradição de uso das plantas
medicinais vinculado ao conhecimento popular e transmitido por gerações, além de
tecnologia e, principalmente, recursos humanos especializados para validar
cientificamente este conhecimento. De fato, o Decreto nº 5813, de 22/06/2006,
aprova a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, que tem por
objetivo geral “garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de
plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da biodiversidade,
o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional” [Ministério da Saúde.
Disponível em: <http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/Decreto_N_5813.pdf>.
Acesso em jun. 2010].
18
Em países industrializados, o uso da fitoterapia decaiu no final da primeira
parte do século 20, devido ao desenvolvimento e produção de remédios sintéticos.
Durante as últimas décadas, no entanto, a fitoterapia começou a ser novamente
utilizada, mesmo nesses países industrializados. Em países do terceiro mundo, a
fitoterapia nunca deixou de ser importante, sendo frequentemente o único sistema
terapêutico disponível à população [WHO – World Health Organization. Disponível
em: <http://www.who.int/topics/traditional_medicine/en/>. Acesso em jun. 2010]. A
primazia da fitoterapia em medicina torna-se evidente a partir do grande número de
drogas modernas que devem sua origem aos recursos etnobotânicos [WHO
guidelines, 2007; AMEH, 2010]. Produtos naturais proporcionam um ponto de início
para novas substâncias sintéticas, com diversas estruturas e com vários
estereocentros que podem ser trocados sinteticamente. Fármacos derivados de
plantas medicinais podem servir não somente como novas drogas por si só, mas
também como modelo para novas drogas otimizadas pela química medicinal e
sintética [BALUNAS, 2005]. Segundo Newman e Cragg [NEWMAN, 2007], as
maiores áreas que têm sido investigadas pela indústria farmacêutica são as
relacionadas com as doenças infecciosas, câncer, anti-hipertensivos e anti-
inflamatórios. Na área antibacteriana, a grande maioria das novas substâncias
ativas, também conhecidas como Novas Entidades Químicas (NCEs), são de origem
natural (10,2%), derivadas de produtos naturais (65,3%) e sintéticas, porém
modeladas a partir de produtos naturais (1%), ou seja, 76,5% do total de fármacos.
As drogas anticâncer, entre as não biológicas, estão divididas entre produtos
naturais (11,1%), derivadas de produtos naturais (30,9%), sintéticas (22,2%) e
modeladas a partir de produtos naturais (35,8%), ou seja, apenas 22,2% do total são
totalmente sintéticas. Atualmente, a pesquisa envolvendo plantas medicinais é uma
das áreas com o mais rápido crescimento dentro das pesquisas biomédicas. Isso é
ilustrado pela seguinte observação: o número de citações na PubMed de 1990 a
2007 contendo a palavra “fitoterapia” saltou de menos de 100 em 1990, para mais
de 1000 em 1998; então, para quase 10000 em 2004, e para mais de 15000 em
2007 [Wikipédia – phytotherapy, 2010]. Atualmente, o número de citações já
ultrapassa a barreira de 20000 citações.
Até 80% da população de países do Terceiro Mundo (Ásia e África) depende
de medicina tradicional. Em muitos países industrializados, 70 a 80% da população
já usou alguma forma de medicina alternativa ou complementar. O tratamento
19
fitoterápico é a forma mais popular da medicina tradicional, e é um mercado
altamente lucrativo. Receitas anuais da Europa Ocidental alcançaram US$ 5 bilhões
em 2003-2004. Na China, a venda destes produtos totalizou US$ 14 bilhões em
2005, enquanto no Brasil a soma foi de US$ 160 milhões em 2007 [WHO – World
Health Organization. Disponível em: <http://www.who.int/topics/traditional_medici-
ne/en/>. Acesso em jun. 2010].
2.3.1 Fitoterápicos
Fitoterápicos são metabólitos secundários presentes nas plantas. São
também chamados fitoquímicos, para diferenciá-los dos metabólitos primários,
necessários no crescimento e manutenção da planta, como a fotossíntese, a
respiração e o transporte de solutos. Já no metabolismo secundário são sintetizadas
substâncias que, a princípio, não possuem função essencial. Porém, são essas
substâncias as responsáveis pela proteção do vegetal de diversos fatores [AMEH,
2010]. Com algumas propriedades específicas, estes metabólitos secundários agem,
por exemplo, na defesa da planta contra diversos predadores e na atração ou
repulsão diante de outros organismos. Alguns são toxinas, usadas para deter
predadores; alguns são feromônios, usados para atrair insetos para a polinização;
outros são fitoalexinas, que protegem contra infecções microbiais, por exemplo.
Assim, o metabolismo secundário acaba exercendo um papel importante na
interação das plantas com o meio ambiente, ou seja, representa uma interface
química entre as plantas e o ambiente circundante. Consequentemente, sua síntese
é frequentemente afetada por condições ambientais [GOBBO-NETO, 2007; PLAZA,
2007; AMEH, 2010]. Dentre os fatores ambientais que influenciam o conteúdo dos
metabólitos secundários pode-se citar a sazonalidade, ritmo circadiano,
desenvolvimento da planta, temperatura, disponibilidade hídrica, radiação
ultravioleta, nutrientes (macro e micronutrientes), altitude, poluição atmosférica e
indução por estímulos mecânicos ou ataque de patógenos. Assim sendo, a
constância de concentrações de metabólitos secundários praticamente não existe,
podendo ocorrer variações tanto na qualidade como na quantidade dos compostos
químicos. Plantas da mesma espécie, cultivadas em diferentes localidades,
20
normalmente possuem os mesmos componentes, mas as porcentagens em que
estão presentes podem diferir [CAPASSO, 2000]. Embora as plantas sintetizem
vários fitoquímicos, a maioria é derivada de relativamente poucas rotas
biossintéticas [AMEH, 2010]. Em plantas medicinais, outros fatores, como condições
de coleta, estabilização e estocagem, também podem ter grande influência
[GOBBO-NETO, 2007].
Comparada à terapia nutricional, a fitoterapia é mais complicada devido ao
uso de muitos fitonutrientes contendo diversas estruturas químicas e atividades
biológicas. A maioria das estratégias fitoterápicas está à frente da base científica e
sem um controle rigoroso de qualidade, segurança e eficiência. Entretanto, a
fitoterapia possui longa história e tem sido largamente utilizada. Algumas estratégias
fitoterápicas têm sido bem reconhecidas desde que tenham sido extensivamente
estudadas do ponto de vista químico e farmacológico e são parcialmente
comprovadas por testes clínicos [ZHAO, 2007].
Estudos epidemiológicos mostraram efeitos protetores de dietas à base de
plantas em doenças cardiovasculares e câncer, assim como em outros problemas
de saúde, como obesidade e diabetes [BLAND, 1996; BHATHENA, 2002; PLOSCH,
2006]. Em particular, uma boa correlação foi sugerida entre a dose de flavonoides
consumida na dieta e o decréscimo de mortes provenientes de doenças cardíacas,
em parte devido à inibição da oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e
à reduzida agregabilidade de plaquetas por flavonoides [BHATHENA, 2002]. A dose
diária de flavonoides situa-se entre 23 mg/dia na Holanda (principalmente por chás,
cebolas, maçãs e vinho tinto) e 170 mg/dia nos EUA. O consumo de 30 a 50 mg/dia
de isoflavonas da soja pode ajudar a diminuir a incidência de câncer de mama
[BLAND, 1996]. Compostos bioativos ocorrem normalmente em pequenas
quantidades em plantas alimentícias como constituintes nutricionais. Estudos
bioquímicos e fitoquímicos têm identificado os compostos bioativos exatos, como
flavonoides, alcaloides, terpenoides, e outras classes de fitoquímicos [KRIS-
ETHERTON, 2002]. Alguns produtos naturais com fortes atividades biológicas têm
sido desenvolvidos para a medicina aplicados à quimioterapia, como a vincristina
(Oncovin®) e Taxol®. Praticamente todas as plantas alimentícias possuem produtos
naturais específicos com certa bioatividade [KRIS-ETHERTON, 2002]. O
hidroxitirosol de azeitonas e azeite de oliva é um potente antioxidante. O resveratrol
encontrado em nozes e vinho tinto tem fortes atividades antioxidantes
21
antitrombótica, anti-inflamatória e anticâncer. Licopeno de tomates e outras frutas é
um potente antioxidante carotenoide que protege contra câncer de próstata e inibe o
crescimento de células tumorais em animais. Compostos organossulfurados em alho
e cebola trazem vários benefícios multifuncionais à saúde humana. Naringenina (4,
5, 7 – hidroxiflavonona), encontrada na laranja-melancia, pode atrasar a
desintoxicação hepática de medicamentos como a ciclosporina e assim
potencialmente ajudar a prevenir a rejeição de órgãos transplantados [BLAND,
1996]. Todos estes exemplos são apenas uma pequena porção de recomendações
terapêuticas fitonutricionais e nutricionais. Muitas outras plantas, que não são
alimentícias, estão sendo estudadas devido ao seu potencial uso em fitoterapia. Os
vegetais crucíferos, como couve, couve-flor e brócolis, possuem fitoquímicos únicos
capazes de modificar o metabolismo do estrogênio [BHATHENA, 2002]. Um
equilíbrio ideal de estrogênio tem implicações para a prevenção do câncer e do
envelhecimento bem sucedido tanto em homens quanto em mulhers. A Food
Federal and Drug Administration (FDA) raramente faz recomendações para
nutracêuticos ou fitonutrientes. Porém, em 2001, a FDA aprovou a alegação de que
fibra solúvel de alimentos como aveia pode reduzir o colesterol e o risco de doenças
cardíacas. A fibra dietética nutracêutica demonstrou reduzir níveis de colesterol e
manter o peso, prometendo assim benefícios para pacientes com obesidade e
diabetes [GRUNBERGER, 2007].
Existem três grandes grupos de metabólitos secundários: terpenos,
compostos fenólicos e alcaloides. Os compostos fenólicos são derivados do ácido
chiquímico. São responsáveis pelo sabor, odor e coloração de diversos vegetais.
Essa classe de substâncias é responsável pela proteção das plantas contra os raios
ultravioletas, insetos, fungos, vírus e bactérias. A proteção contra a fotodestruição
proporcionada por esses compostos é atribuída às suas propriedades de absorver
ou dissipar a energia solar. Quimicamente dizendo, são substâncias que possuem
pelo menos um anel aromático no qual ao menos um hidrogênio é substituído por
um grupamento hidroxila [GOBBO-NETO, 2007]. Para a formação biossintética dos
compostos fenólicos ocorre a combinação de uma unidade de ácido chiquímico e
uma ou mais unidades de acetato ou derivados deste [PLAZA, 2007]. Há vários
relatos na literatura apontando os compostos fenólicos como substâncias
potencialmente ativas frente a testes químicos e biológicos, o que indica que essa
classe de substâncias é totalmente promissora na descoberta de novos fármacos.
22
Eles são geralmente encontrados e ingeridos pelo homem através de alimentos
originários de plantas. Flavonoides, taninos, antocianinas e outros constituintes
fenólicos possuem potencial antioxidante, impedindo o efeito danoso dos radicais
livres. Visando à melhoria e à sustentação da saúde, é de vital importância o
consumo dessas fontes naturais de substâncias para nosso organismo, pois os
compostos fenólicos contribuem para a manutenção do equilíbrio pró e antioxidante
de sistemas biológicos, desempenhando função essencial na prevenção de várias
doenças [PLAZA, 2007].
2.3.2 Flavonoides
A estrutura básica dos flavonoides é um esqueleto de 15 átomos de carbono
organizados em três anéis (C6-C3-C6), denominados A, B e C (Figura 2). As várias
classes de flavonoides diferem quanto ao nível de substituição do anel C, enquanto
compostos individuais dentro da mesma classe diferem no padrão de substituição
dos anéis B e C. Os flavonoides geralmente ocorrem em plantas como derivados
glicosilados, e contribuem para os tons azul, vermelho e laranja, em folhas, flores e
frutas. Além de vários vegetais e frutas, os flavonoides são encontrados em
sementes, nozes, grãos, condimentos, e diferentes plantas medicinais, assim como
em bebidas, como vinho, chá e cerveja [PIETTA, 2000].
Figura 2: Estrutura básica de um flavonoide [PIETTA, 2000].
Estudos espectrofotométricos revelam que a maioria das flavonas e flavonóis
exibem 2 bandas principais de absorção; a primeira entre 320 e 385 nm, que
representa a absorção do anel B, enquanto a segunda (250 – 285 nm) corresponde
23
à absorção do anel A. Os grupos funcionais ligados ao esqueleto principal podem
causar uma mudança na absorção, como a de 367 nm para o canferol (grupos
3,5,7,4’-hidroxi), 371 para quercetina (grupos 3,5,7,3’,4’-hidroxi) e 374 nm para
miricetina (grupos 3,5,7,3’,4’,5’-hidroxi). A ausência do grupo 3-hidroxil nas flavonas
diferem-nas dos flavonóis [YAO, 2004].
Os flavonoides desempenham diferentes papéis na ecologia de plantas.
Devido a suas cores atrativas, flavonas, flavonóis e antocianidinas podem agir como
sinais visuais para a polinização de insetos. Em virtude de sua adstringência,
catequinas e outros flavonóis podem representar um sistema de defesa contra
insetos prejudiciais à planta. Podem agir também como antioxidantes para as ERO
produzidas pelo sistema de transporte de elétrons da fotossíntese. Além disso,
protegem a planta da radiação UV solar devido à sua propriedade de absorver este
tipo de radiação [PIETTA, 2000].
Além de seus papéis fisiológicos nas plantas, os flavonoides são importantes
componentes da dieta humana, embora sejam considerados como nanonutrientes.
De fato, o nível para a ingestão de flavonoides é consideravelmente maior quando
comparado com a vitamina C (70 mg/dia), vitamina E (7 a 10 mg/dia), e ß-caroteno
(2 a 3 mg/dia) [YAMASAKI, 1997]. A ingestão de flavonoides pode variar entre 50 e
800 mg/dia, dependendo do consumo de vegetais e frutas, e de bebidas específicas,
como vinho tinto e cerveja não filtrada. Em particular, vinho tinto e chás contêm altos
níveis (aproximadamente 200 mg por copo) de fenóis totais. Consequentemente, as
variações no consumo destas bebidas são a principal causa para a variação da
ingestão de flavonoides em diferentes países. Outra fonte significante de flavonoides
são as plantas medicinais [PIETTA, 2000].
2.3.2.1 Fontes naturais de flavonóides
Flavonoides são o grupo mais comum e amplamente distribuído de
compostos fenólicos em plantas. São parte integral tanto da dieta de animais como
de humanos. Como são fitoquímicos presentes em plantas, os flavonoides não
podem ser sintetizados pelo corpo humano. São classificados em pelo menos 10
grupos químicos, sendo os mais importantes as flavanonas, flavonas, isoflavonoides,
24
flavanas, antocianinas e flavonóis (Tabela 5). Os flavonóis são os flavonoides mais
abundantes nos alimentos, sendo a quercetina, o canferol e a miricetina os mais
comuns. Flavanonas são encontradas principalmente em frutas cítricas, e as
flavonas, no aipo. Catequinas estão presentes em grandes quantidades nos chás
verde e preto, e em vinho tinto, enquanto as antocianidinas são encontradas em
morangos e outras frutas vermelhas. Isoflavonas são encontradas quase
exclusivamente em alimentos de soja [YAO, 2004].
Tabela 5: Principais classes de flavonoides e descrição de suas características básicas (adaptado de
Yao, 2004).
Classes Coloração Exemplos Comentários
Antocianinas Azul,
vermelha e
violeta
Cianidina,
delfinidina,
peonidina
Encontradas predominantemen-
te em frutas e flores. São usadas
como corantes.
Flavanas Incolor Catequina,
epicatequina,
luteoforol,
procianidina
Encontradas em frutas, chás
(verdes ou pretos), lúpulo, nozes
e água de coco. O sabor peculiar
de algumas bebidas, frutas, chás
e vinhos é devido, principal-
mente, à presença de flavanas.
Flavanonas Incolor
para um
amarelo
pálido
Hesperinidina,
naringenina
Encontradas quase exclusiva-
mente em frutas cítricas.
Flavonas Amarelo
pálido
Apigenina,
luteolina,
diosmetina,
tangeretina,
nobiletina,
crisina
Encontradas quase exclusiva-
mente em frutas cítricas, mas
também em cereais, frutas,
ervas e vegetais. Conferem o
pigmento amarelo em flores.
Flavonóis Amarelo
pálido
Quercetina,
rutina,
miricetina,
canferol
Presentes em diversas fontes,
sendo predominantes em vege-
tais e frutas.
Isoflavonoides Incolor Daidzeína,
genisteína
Encontrados quase exclusiva-
mente em legumes, particular-
mente na soja.
25
2.3.2.2 Capacidade Antioxidante in vitro associada a flavonoides
De acordo com Halliwell e Gutteridge [HALLIWELL, 2007], os mecanismos de
ação antioxidantes podem incluir: (1) a supressão da formação de ERO ou pela
inibição de enzimas ou quelando elementos traço envolvidos na produção de
radicais livres; (2) sequestrando ERO; e (3) protegendo as defesas antioxidantes. Os
flavonoides já foram descritos como preenchendo a maioria destes critérios. Assim,
seus efeitos são duplos. Os flavonoides inibem enzimas responsáveis pela produção
de ERO, como a xantina oxidase e a NADH oxidase. Além disso, vários flavonoides
quelam metais de forma eficiente. Ferro e cobre livres são potenciais precursores de
ERO, como o radical hidroxila. Devido a seus baixos potenciais redox (0,23<E<0,75
V), os flavonoides são termodinamicamente capazes de reduzir radicais livres
fortemente oxidantes, com potenciais redox na faixa de 2,13 a 1,0 V, como os
radicais superóxido, peroxila, alcoxila e hidroxila [PIETTA, 2000].
Muitos estudos têm sido realizados com o objetivo de estabelecer a relação
entre a estrutura dos flavonoides e sua capacidade antioxidante. A capacidade
antioxidante dos flavonoides geralmente aumenta com o aumento do número de
grupos hidroxila e diminui em compostos glicosilados [YAO, 2004]. De fato, o arranjo
espacial dos substituintes é talvez o maior determinante da capacidade antioxidante.
Tanto a configuração quanto o número total de grupos hidroxila influenciam
substancialmente vários mecanismos antioxidantes. A capacidade de sequestrar
radicais livres é primeiramente atribuída à alta reatividade dos substituintes hidroxila,
sendo que a configuração destes grupamentos no anel B é o mais determinante na
capacidade em sequestrar ERO. Estes grupamentos hidroxilas do anel B doam
átomos de hidrogênio e elétrons aos radicais hidroxila e peroxila, por exemplo,
estabilizando-os e dando origem a radicais flavonoídicos relativamente estáveis
[HEIM, 2002].
As propriedades quelantes dos flavonoides contribuem para a sua atividade
antioxidante. Através da remoção ou neutralização de íons ferro de hepatócitos, os
flavonoides inibem os danos oxidativos. A quelação de cátions divalentes não torna
os flavonoides inativos necessariamente, uma vez que o complexo ainda pode
apresentar capacidade antioxidante contra ERO [HEIM, 2002].
26
2.3.2.3 Capacidade Antioxidante in vivo associada a flavonoides
Apesar das enormes evidências sobre o potencial antioxidante in vitro dos
flavonoides, pouco se sabe sobre a sua eficiência in vivo, e isso pode ser atribuído
ao pouco conhecimento sobre a sua biodisponibilidade em humanos. Foi provado
que flavonoides presentes na dieta são absorvidos numa extensão que possibilita
um efeito antioxidante [PIETTA, 2000]. A porcentagem de absorção normalmente
não ultrapassa poucos porcentos da dose ingerida, como determinado pela medida
no nível sanguíneo dos flavonoides intactos e seus conjugados. A composição dos
alimentos pode representar um importante fator que afeta a biodisponibilidade.
Proteínas podem ligar-se aos polifenóis, reduzindo sua disponibilidade; por outro
lado, o álcool pode aumentá-la [SERAFINI,1997], o que é evidenciado pelo aumento
da absorção de polifenóis presentes no vinho tinto quando comparado com os níveis
obtidos após o consumo de vinho tinto sem álcool Além disso, observa-se um
aumento na absorção destes compostos quando administrados na forma de
complexos fosfolipídicos ao invés de sua forma livre [PIETTA, 1998].
Acredita-se que os flavonoides podem desempenhar sua primeira defesa
antioxidante no trato digestivo, limitando a formação de EROs e sequestrando-os.
Uma vez absorvidos, eles continuam a exercer efeito antioxidante. O efeito
antioxidante in vivo pode ser evidenciado pela medida do aumento do potencial
antioxidante total do plasma após uma única ingestão dos flavonoides, seja como
alimento ou bebida, e correlacionando este valor ao curso do tempo dos flavonoides
no plasma [PIETTA, 2000].
Os flavonoides são estáveis ao calor, mas facilmente perdidos pelo cozimento
ou fritura. A biodisponibilidade dos flavonoides é apenas parcial, sendo que a
proporção da quantidade ingerida absorvida varia de 0,2 a 0,9% para as catequinas
dos chás a 20% para quercetina e isoflavonas. Assim, uma grande quantidade
permanece não absorvida, e a mucosa gastrointestinal fica exposta a concentrações
parcialmente altas destes compostos. Após a absorção, os flavonoides são
conjugados no fígado, ou metabolizados a compostos fenólicos menores [YAO,
2004]. A biodisponibilidade de certos flavonoides difere acentuadamente
27
dependendo da fonte alimentícia. Por exemplo, a absorção de quercetina em
cebolas é quatro vezes maior que a de maçãs ou chás [HOLLMAN, 1997].
2.3.2.4 Absorção, metabolismo e efeitos clínicos dos flavonóides
Além dos atributos estruturais e físico-químicos dos flavonoides, a absorção,
a farmacocinética, a biotransformação e as atividades relativas dos metabólitos têm
papel fundamental sobre os efeitos biológicos em organismos. Análises in vitro
demonstram de forma efetiva e consistente a capacidade antioxidante de diversos
flavonoides sob condições de estresse oxidativo. Para adicionar novos
conhecimentos sobre as relações estrutura-atividade em áreas de nutrição e
medicina, as futuras pesquisas precisam elucidar (i) a relação entre a absorção e a
estrutura, (ii) a farmacocinética em humanos, (iii) a caracterização dos metabólitos
dos flavonoides, e (iv) as relações estrutura-atividade e os efeitos à saúde desses
metabólitos [HEIM, 2002].
Os flavonoides são absorvidos no trato gastrointestinal e são excretados
inalterados ou como produtos metabólitos na urina e nas fezes [COOK, 1996].
Determinações do poder antioxidante em plasma e urina após a ingestão de chá
verde demonstrou que a absorção dos antioxidantes é rápida [BENZIE, 1999]. Os
antioxidantes entram na circulação sistêmica logo após a ingestão e causam um
aumento significativo no status antioxidante do plasma, o que poderia diminuir o
dano oxidativo ao DNA e, com isso, reduzir o risco de câncer. Foi mostrado que o
flavonoide baicalina possui atividade anti-inflamatória e anti-HIV [LI, 2000], sendo
que os flavonoides podem prover um meio para as indústrias no desenvolvimento de
agentes anti-HIV.
Como os múltiplos benefícios para a saúde humana da dieta contendo plantas
ricas em flavonoides estão bem documentados, o aumento de espécies de
flavonoides bioativos em plantas alimentícias tornou-se de grande interesse.
Tomates modificados geneticamente contêm altos níveis de flavonóis como
quercetina e canferol, flavonóis glicosilados (quercitrina e rutina) e flavonas como
luteolina e licopeno no tecido da casca [MEHTA, 2002, SCHIJLEN, 2006]. O nível de
resveratrol em sementes de Brassica napus (colza ou couve-nabiça) tem também
28
aumentado significativamente [HÜSKEN, 2005]. O consumo destes tomates
transgênicos mostrou render certos benefícios à saúde de ratos [REIN, 2006].
Uma vez que o propósito da ingestão de fitonutrientes é incorporá-los ao
nosso organismo e permitir que melhorem a nossa saúde e tratem algumas
doenças, assumimos que nossos corpos podem absorver estes compostos tanto
quanto possível. Entretanto, muitos fitonutrientes não são totalmente absorvidos pelo
corpo humano, e a porcentagem exata de absorção ainda precisa ser determinada.
Informações sobre o seu metabolismo no corpo humano também estão faltando.
Para alguns nutrientes, o aumento de sua taxa de absorção pode ser mais
importante que o aumento de sua produção, uma vez que o gargalo atual em aliviar
as deficiências nutricionais está na má absorção. A absorção, o metabolismo e as
formas ativas de muitos metabólitos secundários de plantas em humanos ainda
precisam ser determinados.
2.3 Capacidade antioxidante
É de grande interesse do público geral, médicos e especialistas, e de
pesquisadores das ciências de saúde e alimentos, conhecer a capacidade
antioxidante e os constituintes dos alimentos que consumimos. Devido à
complexidade da composição dos alimentos, separar os diversos compostos
antioxidantes e estudá-los individualmente torna-se caro e ineficiente, apesar das
possíveis interações sinérgicas entre estes compostos na matriz. Com isso, é
bastante atrativo aos pesquisadores possuir um método conveniente para a rápida
quantificação da efetividade antioxidante na prevenção de doenças. No entanto, tais
métodos ainda estão por ser desenvolvidos. Um ensaio para a avaliação da
capacidade antioxidante total usando-se apenas uma reação química parece ser
bastante irreal e de difícil desenvolvimento, ainda que haja vários métodos
publicados reivindicando a medida da capacidade antioxidante total in vitro.
Ironicamente, o maior problema é a falta de ensaios validados que possam medir de
forma fidedigna a capacidade antioxidante de alimentos e amostras biológicas.
Vários trabalhos têm sido publicados, e as opiniões variam consideravelmente.
29
Parece não haver um consenso, provavelmente porque a área de antioxidantes é
um tópico bastante complexo.
Por exemplo, Rice-Evans et al [RE, 1999] desenvolveram o ensaio TEAC
(Trolox equivalent antioxidant capacity), que foi largamente utilizado em amostras de
alimentos. Em seu artigo de revisão, Sánchez-Moreno [SÁNCHEZ-MORENO, 2002]
sugere que o ensaio do DPPH é um método fácil e exato para medir a capacidade
antioxidante de frutas e vegetais. O ensaio ORAC (oxygen radical absorbance
capacity) possui larga aplicação na medida da capacidade antioxidante de amostras
botânicas [PRIOR, 2000] e biológicas [CAO, 1998]. O ensaio TRAP (total radical-
trapping antioxidant parameter) é também usado largamente [GHISELLI, 2000],
assim como o ensaio TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity) [WINSTON,
1998; REGOLI, 1999]. Todos estes ensaios diferem entre si em termos de
substratos, sondas, condições reacionais e métodos de quantificação. Nota-se que é
extremamente difícil comparar os resultados de ensaios tão diferentes. Enquanto
isso, novos ensaios reivindicando a medida da capacidade antioxidante continuam a
ser publicados.
A complexidade do tópico “antioxidantes” aliado à confusão introduzida por
métodos muitas vezes questionáveis levam à confusão tanto a comunidade científica
quanto a indústria. Em virtude da falta de ensaios-padrão, é difícil comparar os
resultados publicados por diferentes grupos, e as indústrias de alimentos e
nutracêuticas não conseguem realizar controles de qualidade rigorosos para
produtos antioxidantes [HUANG, 2005].
A palavra “antioxidante” tornou-se incrivelmente popular na sociedade
moderna, uma vez que ganhou publicidade pelos meios de comunicação de massas
devido aos seus benefícios à saúde, já que ajuda a proteger o corpo humano contra
danos causados por ERO [HALLIWELL, 1995]. Entretanto, o termo “antioxidante” é
muito livremente utilizado. Frequentemente, o termo é usado para antioxidantes
inibidores da peroxidação lipídica, como o α-tocoferol. Todavia, os radicais livres
gerados in vivo danificam vários alvos além dos lipídios, incluindo proteínas, DNA e
pequenas moléculas. Uma definição para antioxidante seria “qualquer substância
que, quando presente em pequenas concentrações comparada à concentração de
um substrato oxidável, significativamente retarda ou previne a oxidação desse
substrato [HALLIWELL, 2007]. O termo “substrato oxidável” inclui praticamente tudo
encontrado em alimentos, tecidos vivos incluindo proteínas, lipídios, carboidratos e
30
DNA. Quando ERO são formadas em sistemas vivos, vários antioxidantes entram
em ação, como α-tocoferol, ácido ascórbico e proteínas, como a superóxido
dismutase (SOD), glutationa peroxidase e catalase. A importância relativa destes
vários antioxidantes in vivo depende de qual ERO é formada, como é gerada, onde é
gerada e qual alvo de dano é monitorado [HALLIWELL, 1995].
Dependendo da disciplina científica, o escopo e os alvos de proteção são
significativamente diferentes. Na indústria química, antioxidantes são compostos que
retardam a auto-oxidação de um produto químico, como a borracha ou o plástico.
Em alimentos, antioxidantes são compostos que previnem que as gorduras dos
alimentos rancifiquem, assim como são “substâncias que em alimentos
significativamente diminuem os efeitos adversos de espécies reativas, como as
espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, em funções normais fisiológicas em
humanos” [HUANG, 2005]. Assim como as outras definições, esta definição não
limita os mecanismos de ação antioxidantes. Assim, os antioxidantes presentes em
alimentos podem sequestrar espécies reativas de oxigênio ou nitrogênio para
interromper reações em cadeia radicalares, ou podem inibir que oxidantes reativos
sejam formados. Antioxidantes biológicos incluem antioxidantes enzimáticos (como a
superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase) e antioxidantes não-
enzimáticos, como inibidores de enzimas oxidativas, cofatores de enzimas
antioxidantes, sequestradores de ERO e ERN, e quelantes de metais de transição
[HUANG, 2005]. Muitos compostos que possuem atividade antioxidante são
materiais facilmente oxidáveis. Eles podem tanto interceptar oxidantes primários
(como peróxido de hidrogênio, diferentes radicais e metais de transição) quanto
competir com reações de radicais livres para finalizarem o processo de auto-
oxidação [HALLIWELL, 2007].
Vários critérios devem ser considerados ao avaliar-se o potencial antioxidante
de um composto. Do ponto de vista químico e bioquímico, um antioxidante deve (i)
reagir com espécies reativas específicas, (ii) possuir propriedades quelantes, (iii)
interagir com outros antioxidantes e (iv) modular a expressão gênica. Outros critérios
importantes referentes aos antioxidantes dizem respeito à absorção e
biodisponibilidade, à sua concentração em tecidos, células e fluidos extracelulares e
à sua localização (se em domínios aquosos, em membranas ou ambos). Um
antioxidante “ideal” deve preencher todos esses requisitos [PACKER, 1995].
31
Os potenciais de redução para um elétron de diferentes radicais livres em pH
7 estão listados na Tabela 6. A forma reduzida de um radical livre que possui um
potencial menor é capaz de neutralizar radicais livres de maior potencial. Como já
mencionado, o tem um potencial de redução muito alto e é, de longe, o mais
reativo dentre os radicais livres biológicos [HALLIWELL, 2007].
HO
•
Tabela 6: Potenciais-padrão biologicamente relevantes de diferentes espécies radicalares (adaptado
de HALLIWELL, 2007).
Radical E (V) em pH 7
Hidroxila,
HO
•
+2,31
Alcoxila,
RO
•
+1,60
Peroxila,
RO
O
•
~+0,77-1,44
Urato,
HU
•−
+0,59
Tocoferol, T
•
+0,50
Ascorbato,
Asc
•−
+0,28
Em resumo, a atividade antioxidante e sequestrante de radicais envolve a
transferência de um elétron ou de um próton de um oxidante forte (como
HO
•
) a
uma molécula antioxidante. Esta passagem de carga destrói o caráter radical do
oxidante pela formação de um radical derivado de um antioxidante mais estável e
menos lábil. Este processo pode ser descrito pela reação mostrada na Equação 16:
AH + X A + XH
•
⎯⎯→
(16)
Por exemplo, no caso do ascorbato (vitamina C), ele torna-se um radical livre
( A na Equação 16) doando um átomo de hidrogênio a uma espécie radicalar ( na
Equação 16). O radical ascorbato é, entretanto, bastante estável devido à sua
estrutura, que permite ressonância eletrônica. Além disso, o radical ascorbato é
reduzido (e ascorbato é regenerado) por NADH ou redutases dependentes de NADH
[GONZÁLEZ, 2008].
•
X
32
Mesmo que o tempo de vida de um radical derivado de um antioxidante seja
usualmente maior e o potencial de redução e reatividade química sejam
normalmente menores que o do oxidante sequestrado inicialmente, ele não é
completamente inerte e pode ser tóxico, de acordo com as configurações celulares
específicas.
2.3.1 Métodos usados para avaliação da capacidade antioxidante em
alimentos e sistemas biológicos
No caso de alimentos, é necessário determinar a eficácia de antioxidantes
naturais para a proteção do alimento contra danos oxidativos, a fim de evitar
mudanças danosas e perda de valores comercial e nutricional. Com isso, a
determinação rápida da capacidade antioxidante potencial em alimentos vegetais é
necessária. Este método pode ser uma ferramenta útil na seleção entre diferentes
espécies, variedades, grau de maturação e condições da cultura, para obter-se altas
concentrações de antioxidantes naturais nos alimentos. Assim, a capacidade
antioxidante total de um produto vegetal qualquer pode ser um parâmetro para
avaliar a qualidade de um vegetal [SÁNCHEZ-MORENO, 2002].
No caso dos sistemas biológicos, o estresse oxidativo, que é um desequilíbrio
entre ERO e os sistemas de defesa e reparo antioxidantes, mostrou estar envolvido
no desenvolvimento de doenças degenerativas e em doenças relacionadas à idade.
Com isso, a ingestão de antioxidantes da dieta e a avaliação da contribuição real
dos alimentos ao status antioxidante em sistemas biológicos devem ser avaliadas
[SÁNCHEZ-MORENO, 2002; HALLIWELL, 2007].
Vários substratos, sistemas e métodos analíticos são empregados em testes
para a avaliação da efetividade de antioxidantes, uma evidência de que diferentes
métodos são necessários para se avaliar os diferentes efeitos dos antioxidantes. A
metodologia empregada precisa ser cuidadosamente interpretada de acordo com os
sistemas e o método analítico utilizados na determinação do ponto final da oxidação
[SÁNCHEZ-MORENO, 2002]. A efetividade antioxidante é avaliada monitorando-se
a inibição da oxidação de um substrato apropriado. Após o substrato ser oxidado
sob condições-padrão, a extensão da oxidação (ponto-final) é quantificada por
33
métodos químicos, instrumentais ou sensoriais. Assim, as características essenciais
de qualquer teste são um substrato apropriado, um iniciador da oxidação e a
determinação apropriada do ponto-final. As combinações de substrato, iniciador e
ponto-final utilizados são numerosas, e, mesmo com a mesma técnica analítica,
várias estratégias são possíveis. É possível classificar-se os testes antioxidantes em
dois grupos: (i) os ensaios utilizados para avaliar a peroxidação lipídica, em que um
lipídio ou uma lipoproteína sob condições padrão é usada, e o grau de inibição da
oxidação é medido; e (ii) os ensaios que medem a habilidade de sequestrar radicais
livres [SÁNCHEZ-MORENO, 2002]. Nesta pesquisa, será abordado apenas o
segundo grupo.
2.3.1.1 Ensaio de fenóis totais por Folin-Ciocalteu
O método de Folin-Ciocalteu consiste em encubar por 10 h uma mistura de
100 g de tungstato de sódio (Na
2
WO
4
·2H
2
O), 25 g de molibdato de sódio
(Na
2
MoO
4·
2H
2
O), 100 mL de HCl concentrado, 50 mL de H
3
PO
4
85% e 700 mL de
água. Após a incubação, adiciona-se 150 g de sulfato de lítio (Li
2
SO
4·
4H
2
O) à
mistura, dando origem a uma solução de intensa cor amarela (o Reagente de Folin-
Ciocalteu, RFC). A reação com fenóis presentes na amostra gera uma coloração
azulada, possivelmente (PMoW
11
O
4
)
4-
. Obviamente, o RFC não é específico para
compostos fenólicos, uma vez que pode ser reduzido por muitos compostos não-
fenólicos, como a vitamina C. Os compostos fenólicos reagem com o RFC em
condições básicas (ajusta-se o pH a aproximadamente 10). A dissociação de um
próton fenólico leva à formação do ânion fenolato, que é capaz de reduzir o RFC. O
composto azul formado entre o fenolato e o RFC é independente da estrutura dos
compostos fenólicos [HUANG, 2005]. Apesar da natureza química indefinida do
RFC, o ensaio para fenóis totais é conveniente, simples e reprodutível. Como
resultado, vários dados já foram obtidos, e este tornou-se um ensaio de rotina no
estudo de antioxidantes fenólicos.
34
2.3.1.2 Ensaio TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)
No ensaio TEAC, o oxidante (ABTS
•-
) é gerado pela oxidação do ABTS
2-
(2,2’-
azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)). Especificamente, 7 mmol de ABTS
é dissolvido em água e tratado com 2,45 mmol de persulfato de potássio, e a mistura
permanece em temperatura ambiente por 12 a 16 horas, gerando uma solução azul
escuro. Esta solução é diluída com etanol ou tampão (pH 7,4) até que a absorvância
atinja um valor de 0,7 a 734 nm. Um mililitro desta solução é misturado com 10 µL
de amostra. A mistura é aquecida a 30 ºC e a absorvância é obtida após 1, 4 e 6
min. A diferença das absorvâncias é plotada versus as concentrações do
antioxidante, gerando uma reta. A concentração de antioxidantes, dada pela mesma
variação percentual de absorção do ABTS
•-
de 1 mM de Trolox, é considerada como
TEAC. Devido à fácil execução, o ensaio TEAC é amplamente utilizado no estudo da
capacidade antioxidante [HUANG, 2005].
2.3.1.3 Ensaio FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)
Neste ensaio, um sal férrico, Fe(III)(TPTZ)
2
Cl
3
(TPTZ=2,4,6-tripiridil-s-
triazina), é usado como oxidante. Não há grandes diferenças entre os ensaios TEAC
e FRAP, exceto que o ensaio TEAC ocorre em pH neutro, e o FRAP em pH ácido
(pH 3,6). O ensaio FRAP envolve os seguintes procedimentos: o oxidante (reagente
FRAP) é preparado misturando-se 2,5 mL de uma solução de TPTZ 10 mM em HCl,
25 mL de tampão acetato e 2,5 mL de uma solução de FeCl
3
·H
2
O 20 mM. Esta
solução possui 1,67 mM de Fe(III) e 0,83 mM de TPTZ. Para a análise, 300 µL do
reagente FRAP recém-preparado é aquecido a 37 ºC, e faz-se a leitura dessa
solução como branco a 593 nm; então 10 µL de amostra e 30 µL de água são
adicionados. As absorvâncias são lidas a cada 15 segundos, até o tempo final de 4
min. A mudança de absorvância (ΔA = A
4min
– A
0min
) é calculada e relacionada a ΔA
da solução padrão de Fe(II). A variação de absorvância é linearmente proporcional à
concentração do antioxidante. Uma unidade FRAP é definida arbitrariamente como a
redução de 1 mol de Fe(III) a Fe(II) [HUANG, 2005].
35
2.3.1.4 Ensaio TRAP (Total Radical-trapping Antioxidant Parameter)
Wayner et al. [WAYNER, 1985] introduziram este ensaio para a determinação
do status antioxidante do plasma humano. Os radicais peroxila são gerados a uma
taxa controlada pela termodegradação de um azo-iniciador, como o 2,2'-azobis (2-
metilamidinopropano) (ABAP). Após a adição de ABAP ao plasma, a oxidação de
materiais oxidáveis é monitorada pela medida do oxigênio consumido durante a
reação. O período de indução, no qual a oxidação é inibida pelos antioxidantes no
plasma, é comparado ao do Trolox, usado como antioxidante de referência, e então
quantitativamente relacionado à capacidade antioxidante do plasma. Este ensaio
também pode ser aplicado para a avaliação da capacidade antioxidante de
alimentos e bebidas [SÁNCHEZ-MORENO, 2002].
2.3.1.5. Ensaio TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity)
O ensaio TOSC baseia-se na inibição proporcionada por antioxidantes à
formação de etileno a partir da reação entre ácido α-ceto-γ-metiolbutírico (KMBA) e
ERO. O ensaio permite o estudo da capacidade antioxidante de amostras contra três
diferentes ERO de relevância fisiológica – peroxinitrito e os radicais peroxila e
hidroxila. No ensaio TOSC, há a formação das ERO na presença das amostras e de
KMBA. Os radicais peroxila são formados pela termodegradação de ABAP,
enquanto que radicais hidroxila são formados pela reação de Fenton na presença de
ascorbato. Peroxinitrito é produzido na decomposição de 3-
morpholinosyndnonimine-N-ethylcarbamide [RIGOLI, 1999]. Na presença de ERO,
há a decomposição de KMBA e a consequente liberação de gás etileno. A presença
de compostos antioxidantes das amostras diminui a formação de etileno, sendo que
a sua formação é monitorada por 60 minutos por cromatografia gasosa e comparada
com a formação de etileno produzida pelo branco (adição de água ao invés de
amostras). A avaliação da capacidade antioxidante pelo ensaio TOSC, é feita pela
36
relação entre as áreas obtidas para as curvas cinéticas das amostras e do controle
(branco). Um valor de 0% caracteriza uma amostra sem propriedade antioxidante, já
uma solução que iniba completamente a formação de etileno recebe um valor de
100% para a capacidade antioxidante [WINSTON, 1998; RIGOLI, 1999].
2.3.1.6 Ensaio do DPPH
•
(radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila)
O DPPH é um radical livre nitrogenado orgânico e disponível comercialmente.
Possui seu máximo de absorção por volta de 515 nm. O progresso da reação do
com um antioxidante é monitorado por espectrofotometria, após 30 min a
515 nm. Com a sua redução, a cor da solução muda, de violeta para amarelo, e a
porcentagem de remanescente é proporcional à capacidade antioxidante da
amostra [HUANG, 2005]. Do ponto de vista metodológico, o método do
DPPH
•
DPPH
•
DPPH
•
é
recomendado por ser fácil e exato na medida da capacidade antioxidante de frutas e
vegetais. O resultado é altamente reprodutível e comparado a outros métodos, como
o ABTS [SÁNCHEZ-MORENO, 2002].
2.3.1.7 Ensaio para a determinação da capacidade antioxidante contra o
radical superóxido (O
2
•-
)
A capacidade antioxidante contra o radical superóxido é medida em termos de
inibição de geração do O
2
•-
com o sistema enzimático hipoxantina/xantina-oxidase. O
O
2
•-
é gerado usando-se uma reação não-enzimática de metassulfato de fenazina na
presença de NADH e oxigênio molecular. Em ambas as estratégias, o O
2
•-
reduz
nitroazul de tetrazólio (NBT) a formazan em pH 7,4 e temperatura ambiente, e a
geração de formazan é acompanhada por espectrofotometria em 560 nm. Qualquer
molécula capaz de reagir com o O
2
•-
inibe a produção de formazan [SÁNCHEZ-
MORENO, 2002].
37
2.3.1.8 Ensaio para a determinação da capacidade antioxidante contra
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
Peróxido de hidrogênio é inerte em baixas concentrações. Em condições
fisiológicas, o poder de oxidação do H
2
O
2
está ligado à sua combinação com Fe(II)
(reação de Fenton). Biologicamente, o H
2
O
2
é convertido a oxigênio e água pela
ação da catalase [HUANG, 2005]. A capacidade antioxidante contra H
2
O
2
é
facilmente determinada. O ensaio mais comum emprega peroxidase (HRP, peróxido
de hidrogênio oxidorredutase), proveniente de raiz de rábano silvestre (horseradish
root), que usa H
2
O
2
para oxidar a escopoletina em um produto não-fluorescente. Na
presença de um antioxidante putativo, a oxidação da escopoletina é inibida, e a
capacidade antioxidante contra H
2
O
2
pode ser monitorada [HALLIWELL, 2007].
2.3.1.9 Ensaio para a determinação da capacidade antioxidante contra o
radical hidroxila (HO
•
)
Biologicamente, o radical hidroxila é gerado quando H
2
O
2
reage com Fe(II)
(reação de Fenton). Contudo, a mistura Fe(II)/H
2
O
2
possui desvantagens em ensaios
de capacidade antioxidante porque muitos antioxidantes possuem a habilidade em
quelar metais, alterando a atividade do Fe(II). Como resultado, é impossível
distinguir se os antioxidantes são bons quelantes de metais ou bons sequestradores
de radicais OH. Antioxidantes em alimentos (como a vitamina C) podem agir como
pró-oxidantes, reduzindo Fe(III) a Fe(II), aumentando a produção de radicais OH. O
radical OH é extremamente reativo e com tempo de meia-vida extremamente curto
(10
-9
s, Tabela 3) e pode atacar o DNA, proteínas e lipídios. Consequentemente, a
determinação direta da capacidade antioxidante contra o radical OH de antioxidantes
presentes em alimentos em sistemas biológicos é irreal, já que a concentração
celular dos antioxidantes é insignificante se comparada à de outras moléculas
biológicas.
38
A capacidade antioxidante contra radicais hidroxila pode ser calculada de
acordo com o ensaio de Halliwell et al. [HALLIWELL, 1995]. Uma mistura de cloreto
de ferro(III) e EDTA na presença de ascorbato reage para formar ferro(II)-EDTA e
ascorbato oxidado. Com a adição de H
2
O
2
, há a formação de ferro(III)-EDTA mais
HO
•
, de acordo com a reação de Fenton. Os radicais não sequestrados pelos
componentes da mistura de reação podem atacar a desoxirribose, e degradá-la
numa série de fragmentos; alguns destes fragmentos reagem sob aquecimento com
o ácido tiobarbitúrico em baixo pH, dando origem a um composto violeta. Assim, a
capacidade antioxidante contra radicais hidroxila de uma substância adicionada à
mistura de reação é medida com base na inibição da degradação da desoxirribose
[HALLIWELL, 1995].
2.4 Monocamadas auto-organizadas
O crescimento das pesquisas envolvendo monocamadas auto-organizadas
(SAM) é uma demonstração das alterações pelas quais a química vem passando. A
Química foi se afastando das disciplinas tradicionais e passou a interagir cada vez
mais com áreas como a física, a biologia e a engenharia. A fabricação e
manipulação de camadas moleculares tem se tornado um tema central na química
moderna [ULMAN, 1996]. As vantagens do uso de SAM na química eletroanalítica já
são bem reconhecidas. A estruturação da interface sólido-líquido baseada em
interações entre a monocamada e o analito permite a adaptação de superfícies com
propriedades e funções específicas [MARKOVICH, 2001], ideais para o estudo
envolvendo biosensores [HYUN, 2001].
Na nanotecnologia moderna, deseja-se obter um arranjo molecular num nível
sólido e nano. Previamente, o método Langmuir-Blodgett (LB) foi geralmente usado
para a construção de camadas moleculares ordenadas numa superfície sólida.
Devido ao fato de as moléculas serem fisissorvidas na superfície sólida em filmes
LB, suas estruturas facilmente mudam e rapidamente tornam-se randômicas. Por
outro lado, a técnica de auto-organização (SA) tornou-se um dos mais populares
métodos para a construção de camadas moleculares ordenadas dentro das últimas
duas décadas, pois as monocamadas auto-organizadas (SAMs) são quimicamente
39
adsorvidas à superfície sólida e, consequentemente, sua estrutura ordenada deve
ser mais estável. As SAMs de alquiltióis em metais, especialmente ouro, foram
extensivamente estudadas devido a suas potenciais aplicações em vários campos,
como sensores, inibidores de corrosão e dispositivos eletrônicos moleculares e
biomoleculares, sendo que eletrodos modificados com SAMs desempenham papéis
muito importantes dentro destas áreas [RUBINSTEIN, 2007].
A auto-organização molecular é um processo no qual uma superestrutura
organizada é espontaneamente formada de um conjunto de moléculas que não
estão correlacionadas uma à outra numa fase líquida ou gasosa [ALLARA, 1995;
WHITESIDES, 2002]. A estrutura da auto-organização molecular pode ser dividida
em dois tipos de sistemas organizados: (a) um sistema que se organiza num meio
homogêneo, e (b) um sistema que se organiza numa interface heterogênea.
Monocamadas auto-organizadas (SAMs) sob substratos pertencem ao último
sistema organizado porque estas monocamadas necessitam de um suporte na
superfície de um sólido ou líquido [RUBINSTEIN, 2007]. Dois diferentes tipos de
processos de adsorção de SAMs em substratos são bem caracterizados: todas as
moléculas componentes estão quimicamente ligadas uma a uma ao substrato, ou
elas próprias polimerizam-se sob o substrato [ALLARA, 1995]. Um típico exemplo do
primeiro caso são as SAMs de tióis sob eletrodos de ouro, o que envolve a interação
específica de coordenação enxofre-ouro como a principal força motriz para a
organização de compostos organossulfurados da solução ou fase gasosa à
superfície de ouro [ULMAN, 1996; LOVE, 2005]. Para o último caso, SAMs à base
de silano (SiH
4
) são usadas para a modificação de superfícies de silício cobertas
com um filme de óxido [RUBINSTEIN, 2007]. A essência desses processos de auto-
organização é que nenhuma intervenção externa é necessária para guiar o processo
uma vez que o processo de organização inicia [ALLARA, 1995].
É possível sintetizar várias moléculas, nas quais estruturas pré-designadas
estão codificadas especificamente com as regras necessárias para a organização
molecular. Isso se assemelha às biomoléculas na natureza, como se o DNA ou as
proteínas estivessem codificadas por especificidade estrutural para expressar suas
funções. No caso de SAMs de alcanotióis, o código é fixado em duas partes
estruturais, que são um substituinte tiol e uma cadeia de alcanos. O substituinte tiol
é um ligante eficaz em superfícies específicas, como o ouro, para que as moléculas
componentes possam ser quimicamente adsorvidas da solução ou fase gasosa
40
[RUBINSTEIN, 2007]. A cadeia de alcanos forma a monocamada e serve como
unidade estrutural que permite a organização espontânea da monocamada
fortemente empacotada através de interações do tipo van der Waals entre as
cadeias de alcanos [ALLARA, 1995]. A estrutura esquematizada de uma SAM de
alcanotióis é mostrada na Figura 3:
Espessura do filme
Grupo terminal
Cadeia de alcanos
Grupo principal
Substrato
Espessura do filme
Grupo terminal
Cadeia de alcanos
Grupo principal
Substrato
Figura 3: Estrutura esquematizada de uma SAM de alcanotióis (C12-SAM) em ouro (adaptado de
RUBINSTEIN, 2007).
O ouro é o substrato mais frequentemente usado. Ao contrário de outros
metais, o ouro não forma óxidos em sua superfície rapidamente e, em adição, ele
não é contaminado mesmo após sua exposição à atmosfera, devido à sua inércia e
interações iônicas [LOVE, 2005]. Esta característica em particular é de importância
em aplicações biológicas de SAMs adsorvidas quimicamente em ouro, com sua
biocompatibilidade [RUBINSTEIN, 2007] com células e proteínas. De fato, a
aderência de células à superfície de ouro pode funcionar efetivamente sem
evidências de toxicidade [LOVE, 2005].
41
2.4.1 Técnicas de preparação de SAMs de alcanotióis em ouro
A característica mais marcante das SAMs é a sua fácil preparação. As SAMs
são facilmente obtidas pela exposição da superfície limpa de ouro a uma solução de
um composto organossulfurado numa concentração de 0,01 a 1 mmol L
-1
por um
período adequado, usualmente de poucos minutos a 1 dia, dependendo da estrutura
do composto e do propósito da formação da SAM. Se uma monocamada mais
ordenada é necessária, o tempo de imersão deve ser mais longo. O processo de
formação da SAM é determinado pela energia e pela cinética de adsorção da SAM
[SCHREIBER, 2000]. Consequentemente, isto pode depender da estrutura do
composto organossulfurado, sua concentração na solução e da polaridade e
estrutura do solvente utilizado. O solvente mais usado é etanol mas as SAMs podem
ser preparadas usando-se vários solventes, como hexadecano, iso-octano,
tetracloreto de carbono, ciclo-octano, tolueno, tetrahidrofurano, acetonitrila, e
dimetilformamida. Não obstante, as SAMs geradas com estes solventes apresentam
quase o mesmo comportamento macroscópico em suas características, como
molhabilidade e espessura [RUBINSTEIN, 2007].
2.4.2 Química e energia de formação de SAMs de alcanotióis em ouro
Ao preparar-se uma SAM em ouro pelo método de deposição em solução, é
difícil decidir as condições de preparação mais apropriadas em termos de solvente,
concentração da solução do componente, temperatura de adsorção e tempo de
imersão. Isso ocorre porque as diferentes estruturas e propriedades dos compostos
organossulfurados por si só influenciam fortemente a energia e o mecanismo de
formação da SAM na superfície. Entender a química de formação da SAM, mesmo
no caso de modelos simples de alcanotióis, fornece pistas realmente úteis para a
escolha das melhores condições de preparação. Aqui, serão descritas as questões
fundamentais mais relevantes à química e energia de formação de SAMs de
alcanotióis em ouro, uma vez que estes têm sido os mais investigados até agora. A
reação de adsorção de alcanotióis à superfície de ouro pode ser formalmente
42
considerada como uma adição oxidativa de S-H ao ouro, provavelmente através do
átomo de hidrogênio na superfície, seguido pela eliminação redutiva de hidrogênio
[ULMAN,1996].
As energias livre de dissociação para o processo de quimissorção de RSH ao
ouro são as seguintes: RS-H (87 kcal mol
-1
), RS-Au (-40 kcal mol
-1
), e 1/2H-H (-52
kcal mol
-1
) [RUBINSTEIN, 2007]. Consequentemente, a energia livre da reação
global pode ser calculada como sendo de -5 kcal mol
-1
, o que significa que a reação
de quimissorção é um processo exotérmico.
A interação ouro-composto organossulfurado envolve dois regimes de
adsorção, fisissorção e quimissorção. A primeira interação se dá entre a superfície
de ouro e o adsorbato, e a última interação provém da ligação química entre o grupo
de moléculas de enxofre do topo e a superfície de ouro. Schreiber et al.
[SCHREIBER, 2000] compararam quantitativamente esses dois tipos de interações
considerando várias estruturas de alcanos e os correspondentes alcanotióis. A
energia de fisissorção para o decanotiol (C10) no ouro (~25 kcal mol
-1
) pode ser
comparada à correspondente energia de quimissorção (~30 kcal mol
-1
) devido às
contribuições aditivas das interações de van der Waals da cadeia carbônica.
2.4.3 Mecanismos de crescimento das SAMs
O entendimento do processo de crescimento das SAMs, assim como a
energia de sua formação, é de fundamental importância para o avanço da físico-
química de auto-organização molecular e também para a preparação de várias
SAMs estruturadas em ouro. A energia de formação das SAMs tem impacto direto
no crescimento das mesmas.
Bain et al. [BAIN, 1989] estudaram a cinética das SAMs de alcanotióis em
ouro em solução etanólica. Os resultados revelaram que ao menos dois regimes
cinéticos distintos podem ser caracterizados no processo de formação das SAMs. O
primeiro regime, uma etapa extremamente rápida que se dá dentro de poucos
minutos e é fortemente dependente da concentração da solução usada nas
medidas, pode ser descrita aproximadamente pela curva de crescimento de
Langmuir para adsorção. O segundo regime, constitui uma etapa lenta na qual as
43
propriedades macroscópicas finais da SAM são alcançadas apenas após diversas
horas. Neste regime, presume-se que a cadeia alquil passa de um estado
desordenado a células unitárias ordenadas [ULMAN, 1996; SCHREIBER, 2000]. O
primeiro regime corresponde ao processo de adsorção ao ouro, no qual as cadeias
alquil possuem um grande número de defeitos gauche em sua superfície. No
segundo regime, o crescimento e o ordenamento da monocamada seguem o
primeiro regime. A diferença na escala de tempo destes dois regimes é de no
mínimo 2 ordens de magnitude [RUBINSTEIN, 2007]. Durante o segundo processo,
as cadeias alquil estão altamente ordenadas e organizadas. Um processo
subsequente ocorre a uma velocidade 35 vezes menor que o processo de
arrumação das cadeias. Enquanto o processo de auto-organização em solução
continua, filmes mais espessos que apenas uma monocamada são formados,
indicando que um processo de fisissorção prossegue continuamente para os filmes
de monocamada. Portanto, as camadas fisissorvidas produzidas pela imersão por
longos períodos numa solução etanólica têm de ser removidas por uma lavagem
com etanol após o procedimento de imersão. Este procedimento de rinsagem com
um solvente é indispensável para o procedimento de preparação de SAMs numa
superfície de ouro [RUBINSTEIN, 2007].
2.5 Cinética química
A segunda lei da termodinâmica estabelece o caráter espontâneo ou não-
espontâneo de um determinado processo, incluindo reações químicas. Porém, ela
não faz referência ao tempo necessário para que um processo ou reação
espontânea se realize. Em vista desta limitação da termodinâmica, precisa-se de
uma nova abordagem que incorpore a variável tempo à descrição dos fenômenos,
abordagem esta que é fornecida pela cinética. A cinética química prediz com que
velocidade os processos químicos ocorrem e, por isso, a variável tempo ocupa papel
central. O estudo da cinética das reações químicas tem por objetivo a correlação
matemática de dados experimentais, visando estabelecer hipóteses sobre os fatores
determinantes da velocidade de uma reação e elucidar os mecanismos de reação
envolvidos [NETZ, 2002].
44
Como exemplo da informação que pode ser obtida a partir das constantes de
velocidade, considera-se o caso da formação de radicais hidroxila a partir de H
2
O
2
na presença de íons Fe
2+
ou Cu
+
[HALLIWELL, 2007]:
2+ 3+ -
22
-1 -1
H O + Fe Fe + HO + HO
= 76 M sk
•
⎯⎯→
(17)
+2+-
22
3-1-1
H O + Cu Cu + HO + HO
= 4,7 10 M sk
•
⎯⎯→
×
(18)
Se concentrações iguais de H
2
O
2
são misturadas com iguais concentrações
de Fe
2+
e Cu
+
, a velocidade de formação de
HO
•
com Cu
+
será 61,8 vezes maior
(4,7×10
3
/76). Valores de constantes de velocidade podem ser aplicados para se ver
o quão rápido uma reação in vivo pode ocorrer. Assim, mesmo reações com baixas
constantes de velocidade podem ser biologicamente importantes se elas produzirem
produtos altamente reativos, como o
HO
•
[HALLIWELL, 2007].
A definição de velocidade de reação é de fundamental importância na cinética
química. Diz-se que a velocidade da reação é a variação de concentração de uma
espécie em relação ao tempo, ou seja, para uma reação genérica do tipo
A B⎯⎯→
, (19)
a velocidade com que o reagente A desaparece é igual à velocidade com que o
produto B é formado e define a velocidade de reação ( ) [SCHWETLICK, 1973;
NETZ, 2002]:
v
[A] [B]
= - = v
tt
ΔΔ
ΔΔ
(20)
A velocidade, tal como definida pela Equação 20, é na verdade uma
velocidade média (v
med
), pois contempla um intervalo definido de tempo , no qual
a concentração de A sofre uma diminuição equivalente a
tΔ
[A]
Δ
. Na definição de
velocidade para uma reação mais complexa, deve-se considerar a estequiometria da
45
reação. A velocidade de uma reação é igual às taxas de variação das concentrações
das espécies participantes, divididas pelos respectivos coeficientes
estequiométricos. Devido à estequiometria da reação, esta relação vale igualmente
para qualquer espécie [NETZ, 2002]. Assim, para a reação genérica:
A + B C + Dab cd⎯⎯→
, (21)
a velocidade da reação será:
[
]
[
]
[
]
[
]
ABC
1111
= - = - = = v
at bt ct dt
ΔΔΔΔ
ΔΔΔ
D
Δ
(22)
Esta variação será negativa (diminuição) para os reagentes A e B, e positiva
(aumento) para os produtos C e D, e essa variação pode ser determinada tanto por
meio de métodos químicos, físicos como físico-químicos (como, por exemplo,
variação de pH, volume, pressão, condutividade, absorvância e fluorescência). Para
fins de análise de estabilidade, é bastante frequente expressar os resultados de um
estudo cinético em termos de tempo de reação médio ou tempo de meia-vida (t
50%
ou t
1/2
), isto é, o tempo necessário para que a concentração de reagente seja a
metade do valor inicial [NETZ, 2002].
2.5.1 Leis cinéticas
A velocidade de uma reação depende de uma série de fatores, como natureza
dos reagentes, concentração, pressão, temperatura, estado de agregação, etc.
Assim, a cinética busca estudar estes fatores e, com isso, aumentar o entendimento
sobre como um determinado processo ocorre [NETZ, 2002]. Considerando
novamente reação genérica , a velocidade de reação
depende, via de regra, da concentração dos reagentes:
A + B C + Dab cd⎯⎯→
[
]
[
]
= A B
x
y
vk
, (23)
46
onde é a chamada constante de velocidade de reação e os índices
k
x
e
y
estão
relacionados à forma como a velocidade depende das concentrações, e são
chamados de ordens (parciais) de reação [NETZ, 2002]. A soma de
x
e é a
ordem (global) da reação. Entretanto,
y
x
e não são necessariamente iguais aos
coeficientes estequiométricos (a e b) da reação química balanceada. Determina-se a
ordem de reação a partir de dados experimentais, considerando apenas a(s)
substância(s) de cuja concentração depende a velocidade de reação e que sofrem
uma variação relativa significativa durante a reação. Na prática, as mais importantes
são as reações de ordem zero, primeira e segunda ordens [SCHWENTLICK, 1973;
NETZ, 2002].
y
2.5.1.1 Reações de ordem zero
Na lei cinética de ordem zero, a velocidade é uma constante, independente
das concentrações dos reagentes. A concentração decresce linearmente com o
tempo. Neste processo, o tempo de meia-vida é diretamente proporcional à
concentração inicial (Equação 26). Já que a diminuição de [A] é uma função linear
do tempo, a concentração de A, para um determinado momento, é dada pela
equação [NETZ, 2002]:
[
]
[
]
0
A = A - kt
(24)
onde é igual ao coeficiente angular (inclinação) e a concentração inicial,
[A]
k
0
, é o coeficiente linear (interseção).
O valor de representa a velocidade de reação e [A]
k
0
a concentração inicial
de reagente no tempo zero. Apesar da inclinação da reta resultante ser sempre
negativa ( ), a constante de reação é invariavelmente positiva.
k−
47
Se , então:
= vk
[
]
[
]
0
A = A - kt
(25)
[
]
0
1/2
A
1
=
2
t
k
(26)
2.5.1.2 Reações de primeira ordem
Na lei cinética de primeira ordem, a velocidade depende da concentração do
reagente, a qual varia de modo exponencial com o tempo (Figura 4a), de forma que
a representação gráfica do logaritmo da concentração contra o tempo resulta em
uma reta (Figura 4b) [NETZ, 2002].
abab
[A]
t
ln [A]
t
[A]
t
ln [A]
t
Figura 4: Reação de primeira ordem. (a) representação linear da concentração; (b) representação
logarítmica da concentração.
Na representação logarítmica, a relação entre concentração de reagente e
tempo é dada pela equação:
48
[
]
[
]
0
ln A = - + ln Akt
(27)
Sendo que o coeficiente linear corresponde à expressão logarítmica da
concentração no tempo zero (ln [A]
0
) e o coeficiente angular à constante de
velocidade de reação [SCHWENTLICK, 1973; NETZ, 2002].
k
Nesse caso, o tempo de meia-vida depende somente do valor de , e não da
concentração inicial de reagente (Equação 29). Assim, sempre haverá uma
quantidade (ainda que ínfima) do reagente remanescente no meio reacional.
k
Como
[
]
= Avk
, segue-se que:
[] []
[
]
[]
0
0
A
A = A ln =
A
kt
ek
−
⇒−t
(28)
1/2
ln 2
= t
k
(29)
2.5.1.3 Reações de segunda ordem
Na lei cinética de segunda ordem, há a dependência da velocidade com o
quadrado da concentração do reagente, de modo que um gráfico do inverso da
concentração versus o tempo resultará numa linha reta (Figura 5). Nesse caso, o
tempo de meia-vida é inversamente proporcional à concentração inicial (Equação
31) [SCHWENTLICK, 1973; NETZ, 2002].
49
Figura 5: Reação de segunda ordem.
1
[A]
t
1
[A]
t
Para uma cinética de segunda ordem, temos que
[
]
2
= Avk
, o que implica:
[] []
0
11
= +
AA
kt (30)
[]
1/2
0
1
=
A
t
k
(31)
50
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Instrumentação
Potenciostato:
- µ-AUTOLAB III (Eco-Chemie);
- 663 VA Stand (Metrohm);
- Eletrodo de referência: Ag/AgCl/KCl 3 mol L
-1
;
- Contra eletrodo – Carbono vítreo;
- Eletrodos de trabalho – eletrodo de grafite impregnado com parafina (PIGE)
e eletrodo de disco de ouro (3 mm de diâmetro, Metrohm)
Espectrofotômetro UV-visível (Hewlett Packard 8453) com arranjo de diodos e
SPECORD 50 (Analytik Jena);
Fluorímetro Victor 2 (Perkin Elmer);
Balança Analítica Sartorius com quatro casas de precisão;
Purificador de água Milli-Q (Millipore);
pHmetro Hanna;
Banho termostatizado Dubnoff TE-053.
3.2 Reagentes e soluções
No preparo das soluções, foram utilizados água purificada em sistema Milli-Q
(resistividade de 18,2 mΩ.cm
-1
) e reagentes de grau analítico.
51
3.3 Amostras
Neste trabalho, cinco plantas medicinais foram escolhidas como objeto de
estudo: Matricaria chamomilla L., Psidium guajava, Achyrocline satureoides,
Baccharis genistelloides e Cymbopogon citratus. Optou-se por estas plantas pelo
fato de haver relatos sobre a sua capacidade antioxidante [MELO, 2001;
GUGLIUCCI, 2002; MOREIRA, 2003; VERDI, 2005; VERZA, 2007; FIGUEIRINHA,
2008; GUTIÉRREZ, 2008; RATTANACHAIKUNSOPON, 2010] e também por todas
elas serem facilmente encontradas no estado do Rio Grande do Sul. Seus usos
tradicionais, forma de utilização e contra-indicações sugeridos pela ANVISA
encontram-se na Tabela 7.
Amostras das 5 plantas medicinais foram coletadas na cidade de Santa Maria
(Rio Grande do Sul, Brasil) em janeiro de 2008 e janeiro de 2010. As amostras foram
secadas a 40ºC por 24 h, maceradas (exceto as amostras de A. satureoides) e
guardadas em plásticos ao abrigo da luz até o seu uso.
Quatro amostras da planta M. chamomilla L., 5 amostras de A. satureoides, 4
amostras de B. genistelloides e 2 amostras de C. citratus foram adquiridas no
comércio na cidade de Rio Grande (Rio Grande do Sul, Brasil).
3.3.1 Preparação dos extratos
Os extratos aquosos das plantas em estudo foram preparados pela infusão de
1,00 g da folha seca em 50 mL de água purificada a 70ºC por 30 min. Os extratos
foram filtrados em papel filtro e armazenados em geladeira para posterior uso.
Tabela 7: Plantas medicinais estudadas: seus nomes populares, usos tradicionais, vias de administração, contra-indicações e efeitos adversos [ANVISA –
Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Disponível em: <
http://portal.anvisa.gov.br>. Acesso em jun. 2010].
Nomenclatura
botânica;
Família
Nomanclatura
popular
Parte
utilizada
Via Alegações Contra-indicações Efeitos adversos Informações
adicionais
Achyrocline
satureoides;
Asteraceae
Macela;
Marcela;
Marcela do
campo
Sumidades
floridas
Oral Má digestão e
cólicas intestinais;
como sedativo leve;
e como anti-
inflamatório
----- ----- -----
Baccharis
genistelloides;
Asteraceae
Carqueja;
Carqueja
amarga
Partes
aéreas
Oral Dispepsia
(Distúrbios da
digestão)
Não utilizar em
grávidas, pois pode
promover contrações
uterinas. Evitar o uso
concomitante com
medicamentos para
hipertensão e
diabetes
O uso pode causar
hipotensão (queda
da pressão)
-----
Cymbopogon
citratus;
Poaceae
Capim santo;
Capim limão;
Capim cidró;
Cidreira;
Capim
cidreira
Folhas Oral Cólicas intestinais e
uterinas. Quadros
leves de ansiedade
e insônia, como
calmante suave
----- ----- Pode aumentar o
efeito de
medicamentos
sedativos (calmantes)
Oral Cólicas intestinais.
Quadros leves de
ansiedade, como
calmante suave
----- Podem ocorrer
reações alérgicas
ocasionais. Em
caso de superdose,
pode ocorrer o
aparecimento de
náuseas, excitação
nervosa e insônia
-----
Matricaria
chamomilla L.;
Asteraceae
Camomila Flores
Tópico Contusões e dos
processos
inflamatórios da
boca e gengiva
----- ----- Não aplicar a
infusão na
região próxima
aos olhos
53
Oral Diarréias não
infecciosas
Psidium
guajava;
Mystaceae
Goiabeira Folhas
jovens
Tópico Pele e mucosas
lesadas, como anti-
séptico
----- ----- Não utilizar
continuamente
54
3.4 Procedimentos experimentais
3.4.1 Determinação da capacidade antioxidante de extratos de plantas
medicinais pelo método do DPPH
•
A determinação da capacidade antioxidante pelo método do DPPH
•
foi
realizada de acordo com o método de Al Fatimi et al. [AL FATIMI, 2007]. Mistura-se
500 µL do extrato de planta, 375 µL de etanol e 125 µL de uma solução etanólica de
1×10DPPH
•
-3
mol L
-1
. As concentrações dos extratos na reação eram 100, 200 e
1000 mg L
-1
. A solução era mantida ao abrigo da luz e a absorvância da solução era
lida após 30 min a 517 nm utilizando-se etanol como branco. Os resultados para a
capacidade antioxidante (CAO) obtida são expressos de acordo com a equação 32:
()
controle amostra
controle
-
CAO (%) = 100
AA
A
⎡⎤
×
⎢⎥
⎣⎦
(32)
onde é a diferença de absorvância da solução da amostra com e sem
, e é a absorvância da solução de na ausência de
antioxidantes. Utilizou-se ácido ascórbico em concentrações variando de 10 a 1000
mg L
amostra
A
DPPH
•
controle
A DPPH
•
-1
como controle positivo.
55
3.4.2 Estudo eletroquímico do poder antioxidante de extratos de plantas
medicinais
3.4.2.1 Ataque radicalar a um composto redox ativo imobilizado sobre a
superfície de um eletrodo
Neste estudo, utilizou-se riboflavina (RF, Lancaster) como composto redox, e
o eletrodo de grafite impregnado com parafina (PIGE) como eletrodo de trabalho.
Primeiramente, é necessário fazer a limpeza do PIGE, sendo que esta etapa é de
fundamental importância para a medida eletroquímica. A melhor forma de limpar o
PIGE é friccionar sua superfície sobre um papel filtro. O eletrodo deve ser polido
mantendo-o perpendicular à superfície do papel para evitar o arredondamento das
laterais. A superfície do eletrodo deve ser mantida plana, pois isto ajuda bastante
nas operações de limpeza subsequentes. Os resultados da limpeza devem ser
conferidos obtendo-se um voltamograma do branco (tampão acetato 0,1 mol L
-1
, pH
4,6), o qual não deve apresentar picos. Sem isto, não há como assegurar que a
resposta da medida da amostra é causada apenas pela amostra em questão, e não
como resultado de medidas anteriores. O melhor movimento para polir a superfície
do eletrodo é escrever o número “8” sobre o papel, mantendo, entretanto, o eletrodo
o mais ereto possível.
Devido à limpeza e polimento da superfície do eletrodo, o
PIGE diminuirá gradualmente de tamanho depois de cada experimento. Entretanto,
isso não tem nenhum efeito significativo sobre a medida, sendo que cada eletrodo
pode ser usado inúmeras vezes. Em contraste com outras aplicações voltamétricas,
somente a superfície circular da ponta do PIGE entra em contato com a solução do
eletrólito. Isso garante que a área superficial do eletrodo seja a mesma de
experimento para experimento. Além disso, o baixo contato da superfície do eletrodo
com a solução do eletrólito minimiza a penetração do eletrólito no corpo do eletrodo,
além de diminuir a linha base e aumentar a relação sinal/ruído [CARVALHO, 2010].
O filme de RF sob o PIGE foi preparado a partir de uma solução de RF 1×10
-4
mol L
-
1
em H
2
SO
4
0,1 mol L
-1
. A adsorção da riboflavina foi feita pela variação do potencial
(20 ciclos) de 0,1 a -0,6 V a uma velocidade de varredura de 100 mV s
-1
numa
56
solução de tampão acetato 0,1 mol L
-1
(pH 4,6). Registra-se então um voltamograma
cíclico, em que se observa um sinal redox referente à adsorção de RF. Após isso, o
eletrodo é lavado com água e introduzido numa solução de Fe
2+
contendo o extrato
de planta. A reação de Fenton é iniciada com a adição de H
2
O
2
, e o PIGE é exposto
a essa solução pelo tempo de 1 min. A solução de Fenton foi sempre recém-
preparada, a partir de sulfato de ferro(II) e amônio (Merck) e H
2
O
2
30% (v/v,
Degussa). A proporção de Fe
2+
:H
2
O
2
foi de sempre 1:1 (100 mmol L
-1
). A reação da
solução de Fenton com o eletrodo contendo RF adsorvida é finalizada removendo-se
o PIGE da solução e lavando-o com água. O resultado referente ao ataque de
Fenton é monitorado medindo-se o decréscimo do sinal do pico anódico da RF
adsorvida ao PIGE. Todo o processo (ataque de radicais HO gerados pela solução
de Fenton por 1 min e registro do voltamograma cíclico da RF adsorvida ao PIGE) foi
repetido 6 vezes usando-se a mesma RF adsorvida, a fim de se obter o grau de
dissolução da RF para cada amostra de extrato de planta. Finalizado todo esse
processo, há a regeneração da superfície do PIGE através de polimento, como
descrito anteriormente.
3.4.2.2 Ataque radicalar a um composto eletroquimicamente inativo
imobilizado sobre a superfície de um eletrodo e posterior quantificação de um par
redox em solução
Neste estudo, utilizou-se [Ru(NH
3
)
6
]Cl
3
(Acros) como composto redox e
eletrodo de ouro como eletrodo de trabalho. O eletrodo de ouro foi limpo antes de
cada experimento por 3 diferentes tratamentos: (i) o eletrodo recebe um tratamento
químico, através de sua imersão por 3 min. numa solução piranha (H
2
SO
4
/H
2
O
2
3:1);
(ii) o eletrodo é lavado com água e é então manualmente polido com alumina e
lavado com etanol para remover partículas residuais de alumina que possam ter
ficado na superfície do ouro e, finalmente; (iii) o eletrodo passa por um tratamento
eletroquímico, que consiste em 100 ciclos de 0,0 a 1,8 V numa solução de H
2
SO
4
0,5 mol L
-1
a 500 mV s
-1
. A SAM é preparada pela imersão do eletrodo numa solução
etanólica de hexanotiol (Aldrich) 20% (v/v) por 15 min. O eletrodo recoberto pela
57
SAM é lavado com etanol e água, e, finalmente inserido numa solução de
[Ru(NH
3
)
6
]
3+
1×10
-3
mol L
-1
. Registra-se, então, um voltamograma cíclico, no qual se
observa a ausência do sinal do par redox. Após isso, o eletrodo é lavado com água e
introduzido numa solução de Fe
2+
contendo o extrato de planta. A reação de Fenton
é iniciada com a adição de H
2
O
2
, e o eletrodo é exposto a essa solução pelo tempo
de 5 min. A solução de Fenton foi sempre recém-preparada, a partir de sulfato de
ferro(II) e amônio e H
2
O
2
30% (v/v). A proporção de Fe
2+
:H
2
O
2
foi de sempre 1:5
(100:500 mmol L
-1
). A reação da solução de Fenton com o eletrodo modificado é
finalizada removendo-se o eletrodo da solução e lavando-o com etanol e água. O
resultado referente ao ataque de Fenton é monitorado medindo-se o aumento do
sinal do pico anódico do par redox [Ru(NH
3
)
6
]
3+
. Todo o processo (ataque de radicais
HO gerados pela solução de Fenton por 5 min e registro do voltamograma cíclico do
par redox [Ru(NH
3
)
6
]
3+
) foi repetido 6 vezes usando-se a mesma SAM, a fim de se
obter o grau de destruição da SAM para cada amostra de extrato de planta.
Finalizado todo esse processo, há a regeneração da superfície do eletrodo de ouro
por polimento mecânico, lavagem e condicionamento eletroquímico.
3.4.3 Determinação da capacidade antioxidante in vitro contra radicais
peroxila em amostras de extratos de plantas e compostos fenólicos
A determinação da capacidade antioxidante contra radicais peroxila é
avaliada através da detecção indireta de ERO na presença e na ausência de um
gerador radicalar. Em uma placa branca contendo 96 poças, 10 µL do extrato de
cada planta a uma determinada concentração (preparado conforme a seção 3.3.1)
foi pipetado em 6 poças. O tampão de reação (127,5 µL) contendo 30 mmol L
-1
de
HEPES (Acros, pH 7,2), 200 mmol L
-1
de KCl e 1 mmol L
-1
de MgCl
2
(Isofar) foi
adicionado às poças. Em três das poças para cada amostra, adicionou-se 7,5 µL de
cloreto de 2,2’-azobis (2-metilamodinopropano) (ABAP, 4 mmol L
-1
, Aldrich). Nas
outras 3 poças, o mesmo volume de água ultrapura foi adicionado. Após isso, a
placa foi colocada no fluorímetro, programado para manter uma temperatura de
37ºC. Nesta temperatura, há a produção de radicais peroxila pela
termodecomposição do ABAP [AMADO, 2009]. Imediatamente antes da leitura de
58
fluorescência, adiciona-se em todas as poças 20 µL de diacetato de 2’,7’-
diclorofluoresceína (DCFH-DA) previamente desacetilado (seção 3.4.3.1.1) numa
concentração de 16 µmol L
-1
. O DCFH desacetilado é oxidado por ERO ao composto
fluorescente DCF, que é detectado nos comprimentos de onda de 485 e 520 nm,
para excitação e emissão, respectivamente. A decomposição térmica do ABAP e
consequente formação de ERO é monitorada por 30 min, com leituras a cada 5 min.
3.4.3.1 Desacetilação química do DCFH-DA
Para a desacetilação química do DCFH-DA [TAKANASHI, 1997], mistura-se
0,5 mL de uma solução etanólica de DCFH-DA 5 mmol L
-1
com 2,0 mL de uma
solução de NaOH 0,01 mol L
-1
em temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após 30
min, adiciona-se 10 mL de tampão fosfato 25 mmol L
-1
(pH 7,4) e armazena-se a
solução no gelo. Desta solução, dilui-se 2,6 mL em 6,0 mL de etanol, e armazena-se
em gelo até seu uso.
3.4.4 Determinação da concentração de ERO intracelular
Para os ensaios in vivo, utilizou-se hepatócitos do peixe zebra (Danio rerio),
expostos por 4 horas aos extratos das plantas P. guajava e C. citratus (melhor e pior
desempenho in vitro, respectivamente, segundo o método fluorimétrico), nas
concentrações de 100, 200 e 1000 mg L
-1
.
3.4.4.1 Protocolo de exposição de hepatócitos aos diferentes extratos de
plantas
(i) Homogeneizou-se toda a suspensão celular e completou-se com volume
necessário de meio de cultura RPMI para preencher as poças da placa de cultura
59
para o experimento (24 poças) com 300 µL de suspensão celular (≅ 2x10
6
células/mL);
(ii) Preencheu-se as poças com 500 µL de meio RPMI e deixou-se as células
aderirem por 24 h;
(iii) Após 24 h de adesão, preparou-se soluções para diferentes
concentrações dos extratos de plantas
nas poças;
(iv) Retirou-se delicadamente o meio RPMI de cada poça com a pipeta, e
lavou-se cuidadosamente cada poça 2 vezes, com aproximadamente 500 µL de uma
solução de tampão fosfato (PBS). Todo este procedimento deve ser realizado com
muito cuidado para não arrancar células aderidas das poças.
(v) Completou-se as poças com meio de cultura e o volume de extratos
correspondentes para os ensaios (volume mínimo de 400 µL por poça e uma
diluição do meio com a solução de exposição no máximo de 7 vezes) e levou-se as
placas para a estufa a 28ºC durante o tempo estipulado de exposição (4 h).
(vi) Montagem das poças:
a) após o tempo pré-determinado (4 h) para exposição, retirou-se as placas
da estufa e estas foram levadas à capela de fluxo para encerrar a exposição;
b) retirou-se o meio de cultura de todas as poças;
c) lavou-se cada poça com PBS 2 vezes;
d) adicionou-se 200 µL de tripsina por poça e deixou-se agir por 3 minutos na
estufa a 28ºC;
e) adicionou-se 400 µL de meio de cultura para cortar a ação da tripsina;
f) as células de cada poça foram suspensas em um tubo eppendorf (1 tubo
para cada poça);
g) centrifugou-se os tubos por 5 minutos a 1100 rpm;
h) retirou-se o sobrenadante com muito cuidado para não puxar o pellet;
i) para as poças que foram utilizadas na determinação do nº de células por
absorvância (ABS) e no ensaio MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-
diphenyltetrazolium), o pellet foi ressuspendido em 400 µL de meio de cultura;
j) reservou-se 200 µL para dosagem de ABS em 630 nm (número de células)
(seção 3.4.3.2.2).
k) reservou-se 200 µL para dosagem por MTT (seção 3.4.3.2.3).
l) para as poças que foram utilizadas para ERO (fluorescência), o pellet foi
ressuspendido em PBS + DCFH-DA (seção 3.4.3.2.4).
60
3.4.4.2 Determinação do número de células por ABS em 630 nm
(i) Foram feitos 4 pools (A, B, C, D) com duas poças cada. Total de pools: 4,
com 800 µL em cada um.
(ii) Retirou-se uma alíquota de 30 µL de cada pool (A, B, C e D) para
contagem de células por microscopia.
(iii) De cada pool fez-se diluições seriadas:
(a) pools 100% (sem diluir);
(b) pools 75 % (pegou-se 150 µL de cada pool 100 % e adicionou-se 50 µL de
meio de cultura, ou 225 µL de cada pool 100 % e adicionou-se 75 µL de meio de
cultura);
(c) pools 50% (pegou-se 300 µL de cada pool 100% e adicionou-se 300 µL de
meio de cultura);
(d) pools 25 % (pegou-se 300 µL de cada pool 50 % e adicionou-se 300 µL de
meio de cultura).
(d) todas as amostras foram lidas (placa transparente de 96 poças) no
espectrofotômetro a 630 nm, colocando-se em cada poça 200 µL da suspensão
celular dos tratamentos e dos pools, ou de meio de cultura (brancos).
3.4.4.3 Determinação da viabilidade por MTT
(i) Pegou-se os 200 µL indicados na seção 3.4.3.2.1 e pipetou-se em placa
transparente de 96 poças, reservando-se 3 posições para os brancos.
(ii) Adicionou-se 20 µL da solução de MTT (4 mg dissolvidas em 800 µL de
PBS). Importante: manipular o MTT no escuro.
(iii) Incubou-se as placas por 30 minutos, cobrindo-as com papel alumínio a
28
o
C (escuro)
(iv) Centrifugou-se a placa 7 min a 1100 rpm.
61
(v) Descartou-se cuidadosamente o sobrenadante, para que os cristais de
formazan não fossem descartados junto.
(vi) Adicionou-se 200 µL de DMSO puro em todas as poças, inclusive nas
posições dos brancos, as quais levaram apenas DMSO.
(vii) Em cada poça fez-se “up and down” com a pipeta para dissolver os
cristais de formazan, e, delicadamente, para que não se formassem bolhas.
(viii) Leu-se no espectrofotômetro a 490 nm.
3.4.4.4 Determinação de ERO
(i) Nas poças que foram utilizadas para ERO (fluorescência), o pellet foi
ressuspendido em PBS + DCFH-DA imediatamente antes da leitura em placa branca
de fluorímetro.
(ii) Dissolveu-se 1 mg de DCFH-DA em 922 µL de etanol gelado (Solução
estoque),
(iii) Diluiu-se a solução estoque 100 vezes em PBS, em um volume final
suficiente de 550 µL para cada eppendorf,
(iv) Ressuspendeu-se o pellet de cada eppendorf em 550 µL de PBS + DCFH-
DA, e preencheu-se a placa de fluorímetro em triplicata (160 µL/poça, em triplicata).
Para os brancos usou-se apenas PBS (160 µL/poça, em triplicata).
(v) A leitura foi feita no fluorímetro.
3.4.5 Determinação da capacidade antioxidante in vitro contra radicais
hidroxila em amostras de extratos de plantas e compostos fenólicos
A determinação da capacidade antioxidante contra radicais hidroxila é
avaliada através da detecção indireta de ERO na presença e na ausência de H
2
O
2
.
Em uma placa branca contendo 96 poças, 10 µL do extrato de cada planta a uma
determinada concentração (preparado conforme a seção 3.3.1) foi pipetado em 6
poças, assim como 20 µL de FeSO
4
·7H
2
O (825 µmol L
-1
). Água ultrapura (95 µL) foi
62
adicionada às poças. Em três das poças para cada amostra, adicionou-se mais 20
µL de água. Nas outras 3 poças o mesmo volume de H
2
O
2
(4,125 mmol L
-1
) foi
adicionado imediatamente antes da leitura de fluorescência. A placa foi colocada no
fluorímetro, programado para manter uma temperatura de 25ºC, e foi adicionado em
todas as poças 20 µL de DCFH-DA previamente desacetilado (seção 3.4.3.1.1). O
DCFH desacetilado é oxidado por ERO ao composto fluorescente DCF, que é
detectado nos comprimentos de onda de 485 e 520 nm, para excitação e emissão,
respectivamente. A formação de ERO ocorre pela reação de Fenton (Fe
2+
/H
2
O
2
100:500 µmol L
-1
) e, após 5 min, faz-se a leitura da fluorescência das amostras.
63
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nos próximos capítulos serão descritos os resultados envolvendo o estudo de
métodos in vitro e in vivo para a determinação da capacidade antioxidante de
extratos de plantas medicinais (Matricaria chamomilla L., Psidium guajava,
Achyrocline satureoides, Baccharis genitelloides e Cymbopogon citratus). Os
resultados obtidos permitirão um estudo comparativo destas plantas quanto à sua
capacidade antioxidante contra radicais peroxila e hidroxila, empregando
metodologias independentes e, no caso das metodologias usadas para
determinação da capacidade antioxidante contra radicais hidroxila, a geração deste
radical se faz de forma semelhante (a partir da reação de Fenton). Num primeiro
momento, testou-se uma nova forma para a detecção de radicais hidroxila usando
um procedimento eletroquímico no qual os radicais destroem uma camada
imobilizada sob a superfície de um eletrodo, e acompanha-se a variação de um sinal
eletroquímico que se dá de forma proporcional à extensão de dissolução da camada.
Num próximo passo, testou-se a determinação da capacidade antioxidante contra
radicais peroxila e hidroxila através da detecção indireta destes radicais por
fluorimetria (ex/em: 485/520 nm), empregando DCFH-DA como substrato. O DCFH-
DA, após sofrer desacetilação, pode ser oxidado por ERO, gerando fluorescência.
Os radicais peroxila foram gerados através da termodegradação do reagente ABAP
a 37ºC, enquanto os radicais hidroxila foram gerados pela reação de Fenton.
Ensaios in vivo foram avaliados utilizando-se hepatócitos do peixe zebra (Danio
rerio), expostos aos extratos das plantas P. guajava e C. citratus (melhor e pior
desempenho in vitro, respectivamente).
64
4.1 Estudo eletroquímico do poder antioxidante de extratos de plantas
medicinais
O princípio por trás dos ensaios eletroquímicos propostos baseia-se na ideia
sobre o que aconteceria quando radicais reativos atacassem moléculas que estão
imobilizadas sobre a superfície de um eletrodo. Para investigar tal propósito, duas
diferentes estratégias foram testadas:
a) na primeira hipótese, utilizou-se um composto redox ativo como camada, e
acompanhou-se o que ocorria com seu sinal redox ao ser atacado por ERO;
b) num segundo momento, uma camada imobilizada eletroquimicamente
inerte é atacada por ERO, e acompanha-se a resposta de um par redox dissolvido
em solução.
Em ambos os métodos, o radical livre utilizado foi o radical hidroxila, gerado a
partir da reação de Fenton, segundo a equação:
2+ 3+ -
22
Fe + H O Fe + HO + HO
•
⎯⎯→
(33)
4.1.1 Ataque radicalar a um composto redox ativo imobilizado sobre a
superfície de um eletrodo
Testou-se uma nova forma para a determinação da capacidade antioxidante
usando-se um procedimento eletroquímico no qual os radicais destroem uma
camada molecular (RF) adsorvida sob um eletrodo (PIGE). A camada de RF, quando
apropriadamente adsorvida, gera um sinal eletroquímico reversível e estável na faixa
de -0,6 a 0,1 V. Apesar desta estabilidade, a RF pode ser facilmente atacada por
radicais livres gerados numa solução de Fenton. Quando a RF adsorvida no PIGE é
exposta a estes radicais, estes destroem a camada de RF, e a diminuição do seu
sinal eletroquímico é proporcional à sua dissolução. A figura 6 apresenta os
voltamogramas obtidos com o PIGE numa solução de tampão acetato 0,1 mol L
-1
65
antes da adsorção de RF, após a adsorção da RF e após o ataque à camada de RF
com radicais HO produzidos numa solução de Fenton.
Potencial / V
-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2
Corrente / A
-8e-6
-6e-6
-4e-6
-2e-6
0
2e-6
4e-6
6e-6
8e-6
Branco (tampão acetato)
RF
RF após Fenton
Figura 6: Voltamogramas cíclicos de riboflavina adsorvida ao PIGE em uma solução de tampão
acetato 0,1 mol L
-1
(pH 4,6), velocidade de varredura = 100 mV s
-1
. (-----) sem RF adsorvida; (-----) RF
adsorvida antes do ataque de radicais hidroxila; (-----) RF adsorvida após o ataque de radicais
hidroxila gerados pela reação de Fenton.
A figura 7 mostra o decaimento do sinal voltamétrico
0
I
I
⎛⎞
⎜
⎝⎠
⎟
com o tempo de
reação entre a camada de riboflavina e os radicais HO, para o controle (branco) e
quando adiciona-se ácido ascórbico 0,1 mol L
-1
à solução de Fenton, enquanto a
figura 8 mostra o gráfico da função logarítmica dos mesmos dados.
66
Tempo / min
0246
I / I
0
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
Controle (sem antioxidante)
Ác. ascórbico 0,1 M
Figura 7: Variação da altura do pico anódico da riboflavina adsorvida no PIGE após o ataque de
na ausência e na presença de um antioxidante (ácido ascórbico 0,1 mol L
HO
•
-1
) à solução de
Fenton.
Tempo / min
01234567
ln (I / I
0
)
-0,7
-0,6
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
Controle (sem antioxidante)
Ác. ascórbico 0,1 M
Figura 8: Gráfico da função logarítmica da variação da altura do pico anódico da riboflavina adsorvida
no PIGE após o ataque de na ausência e na presença de um antioxidante (ácido ascórbico 0,1
mol L
HO
•
-1
) à solução de Fenton.
67
Como já descrito, a diminuição do sinal eletroquímico da RF adsorvida sob o
PIGE serve de base para a medida indireta da interação dos radicais HO com a RF.
Este comportamento também permite o estudo da interação de espécies
antioxidantes, que, ao reagirem com os radicais HO gerados na solução de Fenton,
retardam a diminuição do sinal eletroquímico da RF. Isso significa que o grau de
diminuição do sinal eletroquímico causado pelos antioxidantes adicionados à
solução de Fenton, serve de base para a medida indireta da interação entre os
radicais HO e as espécies antioxidantes. Com isso, a quantificação da capacidade
antioxidante das amostras se dá pelo cálculo dos valores dos coeficientes angulares
das retas obtidas na figura 8. No exemplo mostrado, são obtidos os valores de
0,0964 e 0,0521 para o branco (controle) e para uma solução de ácido ascórbico 0,1
mol L
-1
, respectivamente. Usando-se a equação 34, chega-se a um valor de 46,0%
para a capacidade antioxidante (CAO) de uma solução de ácido ascórbico 0,1 mol L
-
1
.
-
CAO (%) = 100
controle amostra
controle
bb
b
⎛⎞
×
⎜⎟
⎝⎠
(34)
O próximo passo foi tentar quantificar a capacidade antioxidante das cinco
espécies de plantas medicinais estudadas. A figura 9 mostra os resultados obtidos
para o extrato aquoso da P. guajava, nas concentrações de 100, 200 e 1000 mg L
-1
.
Curiosamente, o que se observa é um efeito pró-oxidante, uma vez que, na
presença do extrato, os valores dos coeficientes angulares aumentam com o
aumento da concentração do extrato (a saber, 0,1117, 0,1428 e 0,1522 para as
concentrações de 100, 200 e 1000 mg L
-1
, respectivamente), o que, pela equação
34, geraria valores negativos de capacidade antioxidante.
68
Tempo / min
01234567
ln (I / I
0
)
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
Controle (sem antioxidante)
100 mg/L
200 mg/L
1000 mg/l
0,0964
0,1117
0,1428
0,1522
Figura 9: Gráfico da função logarítmica da variação da altura do pico anódico da riboflavina adsorvida
no PIGE após o ataque de na presença de 100, 200 e 1000 mg L
HO
•
-1
de P. guajava adicionada à
solução de Fenton. Os valores próximos às retas correspondem aos valores dos coeficientes
angulares das mesmas.
Testes subsequentes, entretanto, mostraram que não ocorre um efeito pró-
oxidante, e sim, ocorre uma competição pelo eletrodo entre a riboflavina e
compostos presentes nos extratos que se adsorvem espontaneamente no PIGE,
como mostrado nas figuras 10 e 11. Na figura 10 observa-se o decaimento do sinal
da RF quando em contato com o extrato de P. guajava (1000 mg L
-1
). A diminuição
dos valores de corrente ocorre após o contato entre a RF adsorvida no PIGE e a
imersão do eletrodo no extrato aquoso da P. guajava por intervalos de 1 min. Já a
figura 11 mostra o surgimento de um sinal eletroquímico na região de potenciais
positivos, o que corrobora a hipótese de estar ocorrendo uma competição pelo
eletrodo, fato esse que descarta o uso de tal metodologia para a determinação da
capacidade antioxidante dos extratos de plantas testados. De fato, Zoulis e
Efstathiou [ZOULIS, 1996] mostram que flavonoides como rutina, quercetina, fisetina
e galangina apresentam potenciais de pico na faixa de 0,28 a 0,49 V (vs. ECS) no
eletrodo de pasta de carbono.
69
Potencial / V
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2
Corrente / A
-0,0002
-0,0001
0,0000
0,0001
0,0002
Corrente / µA
-4
-2
0
2
4
Potencial / V
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2
Corrente / A
-0,0002
-0,0001
0,0000
0,0001
0,0002
Corrente / µA
-4
-2
0
2
4
Figura 10: Decaimento do sinal da riboflavina (RF) adorvida no PIGE quando em contato com o
extrato da P. guajava (1000 mg L
-1
). Cada linha do voltamograma corresponde a um intervalo de 1
min de inserção do PIGE recoberto por RF no extrato de P. guajava. Após a inserção do eletrodo
recoberto com RF ao extrato, verifica-se uma diminuição do sinal eletroquímico da RF.
Potencial / V
0,00,10,20,30,40,50,6
Corrente / A
-0,00010
-0,00005
0,00000
0,00005
0,00010
Corrente / µA
-2
0
2
-1
1
Potencial / V
0,00,10,20,30,40,50,6
Corrente / A
-0,00010
-0,00005
0,00000
0,00005
0,00010
Corrente / µA
-2
0
2
-1
1
Figura 11: Surgimento de um sinal eletroquímico na região de potenciais positivos após a inserção
do PIGE recoberto riboflavina no extrato aquoso de P. guajava 1000 mg L
-1
. Cada linha do
voltamograma corresponde a um intervalo de 1 min de inserção do PIGE recoberto por RF no extrato
de P. guajava. Após a inserção do eletrodo recoberto com RF ao extrato, verifica-se um aumento
deste sinal eletroquímico, o que comprova que há uma competição pelo PIGE entre a RF e
compostos presentes no extrato que se adsorvem espontaneamente no PIGE.
70
4.1.2 Ataque radicalar a um composto eletroquimicamente inativo imobilizado
sobre a superfície de um eletrodo e posterior quantificação de um par redox em
solução
Em um primeiro estudo (Apêndice 1), testou-se uma nova forma para a
detecção de radicais livres usando-se um procedimento eletroquímico no qual os
radicais destroem uma camada molecular bem definida em um eletrodo. As
monocamadas auto-organizadas (SAMs) de tióis podem ser facilmente preparadas
sob a superfície de eletrodos de ouro e mercúrio e, se compostos apropriados
estiverem adsorvidos, o sinal eletroquímico de um par redox dissolvido pode ser
completamente inibido. Embora estas SAMs sejam conhecidas por serem estáveis,
descobriu-se que elas podem ser facilmente atacadas por radicais livres. Quando
um eletrodo com a SAM é exposto a uma solução em que radicais livres são
gerados, estes radicais livres destroem a SAM, sendo que a recuperação do sinal
eletroquímico do par redox se dá de forma proporcional à extensão da dissolução da
monocamada. A figura 12 mostra os voltamogramas obtidos com eletrodos de
mercúrio e ouro numa solução de 1×10
-3
mol L
-1
de [Ru(NH
3
)
6
]
3+
antes da
modificação da superfície do eletrodo com a SAM de hexanotiol, após a formação da
SAM, e após o ataque à SAM com radicais HO produzidos numa solução de Fenton
por 1 e 5 minutos.
71
Figura 12: Voltamogramas cíclicos de uma solução de [Ru(NH
3
)
6
]
3+
obtidos com (a) eletrodos não
modificados, (b) eletrodos modificados com SAM (hexanotiol), (c) eletrodos modificados com a SAM
após o ataque radicalar via solução de Fenton por 1 minuto, (d) e 5 minutos. Voltamogramas obtidos
com uma solução de [Ru(NH
3
)
6
]Cl
3
1×10
-3
mol L
-1
em tampão acetato 0,01 mol L
-1
; velocidade de
varredura: 500 mV s
-1
[SCHOLZ, 2007].
Em um estudo posterior (Apêndice 2), testou-se a aplicação deste estudo
eletroquímico na quantificação da capacidade antioxidante de extratos de plantas
medicinais, comparando-se estes resultados aos obtidos pelo método do DPPH
•
,
largamente utilizado na quantificação do poder antioxidante de extratos de plantas
[SÁNCHEZ-MORENO, 2002; KATSUBE, 2004; DUDONNE, 2009].
A Figura 13 apresenta os voltamogramas de uma solução de 1×10
-3
mol L
-1
[Ru(NH
3
)
6
]
3+
obtidos em um eletrodo de ouro antes da modificação da superfície do
eletrodo com a SAM de hexanotiol, após a formação da SAM, e após 2 ataques
consecutivos à SAM com radicais HO gerados em uma solução de Fenton. Como se
pode perceber, o sinal eletroquímico de [Ru(NH
3
)
6
]
3+
aumenta à medida que segue o
ataque de radicais HO (10 e 20 minutos de reação de Fenton).
72
Potential/V
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4
-8e-5
-6e-5
-4e-5
-2e-5
0
2e-5
4e-5
6e-5
8e-5
Figura 13: Voltamogramas cíclicos de uma solução 1×10
-3
mol L
-1
[Ru(NH
3
)
6
]
3+
em tampão acetato
0,01 mol L
-1
(pH 4,6) em um eletrodo de ouro; (a) antes da modificação a superfície do eletrodo com a
SAM; (b) após a formação da SAM; (c) após 10 minutos de ataque radicalar; (d) após 20 minutos de
ataque radicalar à SAM. Velocidade de varredura: 500 mV s
-1
, 20 ciclos.
A figura 14a mostra o decaimento exponencial do sinal voltamétrico
0
1 -
I
I
⎡⎤
⎛⎞
⎢⎥
⎜⎟
⎝⎠
⎣⎦
com o tempo de reação entre a SAM e os radicais HO. Este decaimento exponencial
é também visto na figura 14b como 2 retas distintas: a primeira de 0 a 5 minutos
(decaimento rápido, ), e a segunda de 5 a 30 minutos (decaimento lento, ). Para
confirmar esta hipótese, realizaram-se medidas voltamétricas expondo-se a
monocamada de tiol a sucessivos ataques de Fenton de 15 segundos de duração,
por 5 min. Como mostrado na figura 15, observa-se um plateau entre 225 e 285
segundos. Considerou-se que, no período anterior a este plateau, os radicais HO
atacam de maneira mais efetiva sítios de moléculas de tiol desordenadas formados
sob a superfície do eletrodo de ouro, o que leva ao rápido decaimento observado na
figura 14b. Após este tempo, os radicais HO atacam as moléculas de tiol
remanescentes, resultando no decaimento lento observado posteriormente. De fato,
1
k
2
k
Ct/A
80
(a)
(b)
(c)
(d)
-0,4-0,6 -0,2 0,0 0,2 0,4
Potencial / V
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
Corrente / µA
-8e-5
-6e-5
-4e-5
-2e-5
0
2e-5
4e-5
6e-5
8e-5
Potential/V
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4
Ct/A
80
(a)
(b)
(c)
(d)
-0,4-0,6 -0,2 0,0 0,2 0,4
Potencial / V
-80
-60
-40
-20
0
20
60
40
Corrente / µA
73
comprovou-se que, quando monocamadas eram preparadas por períodos de tempo
extremamente longos (± 70 h), conseguia-se inibir a formação de domínios de
moléculas de tiol desordenadas, conseguindo-se obter uma monocamada altamente
ordenada, em que apenas o segundo decaimento (isto é, o decaimento lento da
corrente) era observado (Figura 16).
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
(a)
(b)
Time / min
Time / min
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
(a)
(b)
Time / min
Time / min
Tempo / min
Tempo / min
12
= +
kt kt
y
ae be
−−
1
k
2
k
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
(a)
(b)
Time / min
Time / min
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
(a)
(b)
Time / min
Time / min
Tempo / min
Tempo / min
12
= +
kt kt
y
ae be
−−
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
(a)
(b)
Time / min
Time / min
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
(a)
(b)
Time / min
Time / min
Tempo / min
Tempo / min
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
(a)
(b)
Time / min
Time / min
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
Time/min
0 5 10 15 20 25 30
ln [1 - (I/I
0
)]
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
-3.0
(a)
(b)
Time / min
Time / min
Tempo / min
Tempo / min
12
= +
kt kt
y
ae be
−−
1
k
2
k
Figura 14: Variação da altura do pico anódico após o ataque dos radicais HO à SAM na ausência de
antioxidantes; (a) decaimento exponencial do sinal eletroquímico normalizado
0
1 -
I
I
⎡⎤
⎛⎞
⎢
⎜⎟
⎝⎠
⎣⎦
⎥
versus o
tempo de reação da SAM com os radicais HO; (b) gráfico da função logarítmica dos mesmos dados
mostrando claramente a separação entre os decaimentos rápido e lento.
74
Time/s
0 500 1000 1500 2000
ln (1 - (signal/signal
0
))
-3,5
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0
500 1000 1500 2000
Tempo / s
-3.5
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
ln [1-(I/I
0
)]
0 50 100 150 200 250 300
Time/s
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
ln [1-(signal/signal
0
)]
Time/s
0 50 100 150 200 250 300
ln (1 - (signal/signal
0
))
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0 50 100 150 200 250 300
Time/s
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
ln [1-(signal/signal
0
)]
Time/s
0 50 100 150 200 250 300
ln (1 - (signal/signal
0
))
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0 50 100 150 200 250 300
Time/s
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
ln [1-(signal/signal
0
)]
0 50 100 150 200 250 300
Time/s
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
ln [1-(signal/signal
0
)]
Time/s
0 50 100 150 200 250 300
ln (1 - (signal/signal
0
))
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
Time/s
0 50 100 150 200 250 300
ln (1 - (signal/signal
0
))
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
Time/s
0 500 1000 1500 2000
ln (1 - (signal/signal
0
))
-3,5
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0
500 1000 1500 2000
Tempo / s
-3.5
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
ln [1-(I/I
0
)]
0 50 100 150 200 250 300
Time/s
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
ln [1-(signal/signal
0
)]
Time/s
0 50 100 150 200 250 300
ln (1 - (signal/signal
0
))
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0 50 100 150 200 250 300
Time/s
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
ln [1-(signal/signal
0
)]
Time/s
0 50 100 150 200 250 300
ln (1 - (signal/signal
0
))
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0 50 100 150 200 250 300
Time/s
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
ln [1-(signal/signal
0
)]
0 50 100 150 200 250 300
Time/s
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
ln [1-(signal/signal
0
)]
Time/s
0 50 100 150 200 250 300
ln (1 - (signal/signal
0
))
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
Time/s
0 50 100 150 200 250 300
ln (1 - (signal/signal
0
))
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
Figura 15: Gráfico do decaimento exponencial logaritmado do sinal eletroquímico normalizado
0
1 -
I
I
⎡⎤
⎛⎞
⎢
⎜⎟
⎝⎠
⎣⎦
⎥
versus o tempo de reação da SAM com os radicais HO após sucessivos ataques de
Fenton por 30 min, com intervalos de 15 s. Tempo de deposição da SAM: 15 min.
Como já descrito nos experimentos envolvendo o ataque de à SAM, a
recuperação do sinal eletroquímico do par redox serve de base para a medida
indireta da interação dos radicais HO com a SAM. No entanto, este comportamento
também permite o estudo da interação de espécies antioxidantes, que, ao reagirem
com os radicais HO, inibem a recuperação do sinal voltamétrico. Isso significa que o
grau de inibição da recuperação do sinal do par redox ([Ru(NH
HO
•
3
)
6
]
3+
) causada pelos
antioxidantes adicionados à solução de Fenton, serve de base para a medida
indireta da interação entre os radicais HO e espécies antioxidantes.
75
Time / min
0 5 10 15 20 25 30 35
Figura 16: Gráfico logaritmado do decaimento do sinal eletroquímico normalizado
0
1 -
I
I
⎡⎤
⎛⎞
⎢⎥
⎜⎟
⎝⎠
⎣⎦
versus
o tempo de reação da SAM com os radicais HO após sucessivos ataques de Fenton por 30 min.
Tempo de deposição da SAM: 68 horas.
A solução de Fenton não possui uma concentração constante de radicais HO,
sendo que a sua concentração decai com o tempo. Porém, todo o procedimento é
reprodutível, devido à pureza dos reagentes e porque todos os passos do
experimento são repetidos de forma reprodutível, isto é, o parâmetro “tempo” para
todos os passos é mantido sempre constante.
Já é bastante conhecido que muitos extratos de plantas medicinais possuem
altas concentrações de compostos polifenólicos que agem como antioxidantes
naturais [ANDERSEN, 2006]. Desta forma, analisou-se a atividade antioxidante de
alguns extratos de plantas medicinais em três diferentes concentrações. O método
baseia-se no decaimento do sinal de recuperação do composto [Ru(NH
3
)
6
]
3+
medido
no eletrodo modificado com a SAM, como consequência da reação dos radicais HO
da solução de Fenton com as espécies antioxidantes. A figura 17a mostra os
decaimentos bi-exponenciais obtidos para 3 diferentes concentrações de extratos
aquosos de M. chamomilla L., enquanto a Figura 17b mostra a função logarítmica
ln (1
0
))-(I / I
-1,8
-1,6
-1,4
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
Tempo / s
Time / min
0 5 10 15 20 25 30 35
-1,8
-1,6
-1,4
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
(1
0
)) / I-(Iln
Tempo / s
76
linearizada dos dados, evidenciando os decaimentos rápido e lento envolvidos na
reação do radical HO com as espécies antioxidantes presentes no extrato aquoso da
M. chamomilla L., onde y é
0
ln 1 -
I
I
⎡⎤
⎛⎞
⎛⎞
⎢
⎜
⎜⎟
⎜
⎢⎥
⎝⎠
⎝⎠
⎣⎦
⎥
⎟
⎟
, a e b são os coeficientes lineares para os
decaimentos rápido e lento, respectivamente, t é o tempo de reação, e e são
os coeficientes angulares (constantes de decaimento cinético) para os decaimentos
rápido e lento, respectivamente, envolvidos na reação do radical HO com as
espécies antioxidantes (Figura 17b).
1
k
2
k
Tempo / min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,4
0,6
0,8
1,0
Tempo / min
0 5 10 15 20 25 30
ln (1 - (I/I
0
))
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
1000 mg/L
200 mg/L
100 mg/L
(a)
(b)
12
kt kt
yae be
−−
=+
Tempo / min
0 5 10 15 20 25 30
1 - (I/I
0
)
0,4
0,6
0,8
1,0
Tempo / min
0 5 10 15 20 25 30
ln (1 - (I/I
0
))
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
1000 mg/L
200 mg/L
100 mg/L
(a)
(b)
12
kt kt
yae be
−−
=+
Figura 17: (a) decaimentos bi-exponenciais do sinal eletroquímico normalizado
0
1 -
I
I
⎡⎤
⎛⎞
⎢
⎜⎟
⎝⎠
⎣⎦
⎥
versus o
tempo de reação da SAM com os radicais HO obtidos para 3 diferentes concentrações (
○
1000 mg
L
-1
; 200 mg L
∇
-1
; □ 100 mg L
-1
) de extratos de M. chamomilla L. adicionados à solução de Fenton;
(b) gráfico da função logarítmica linearizada dos mesmos dados mostrando claramente a separação
entre os decaimentos rápido e lento.
77
A Figura 17 está de acordo com a hipótese de que os radicais HO, nos
primeiros 5 minutos de reação, atacam predominantemente domínios de moléculas
de tiol menos ordenadas da SAM. Em adição, é possível constatar, apenas nos
primeiros minutos da reação entre o extrato e os radicais HO, um decaimento
substancial do sinal voltamétrico para o extrato de planta mais concentrado (1000
mg L
-1
). Após 5 minutos de reação, o sinal voltamétrico permanece praticamente
constante. Esse resultado indica que, em altas concentrações de extrato de planta,
os radicais HO remanescentes conseguem destruir os domínios de moléculas de
tióis menos ordenados da SAM. Entretanto, esta concentração de radicais HO não é
alta o suficiente para atacar os domínios altamente orientados da SAM, resultando
em uma linha quase paralela ao eixo X para o extrato da planta numa concentração
de 1000 mg L
-1
.
Com base nestes dados, pode-se concluir que, quanto maior o valor da
constante cinética, menor a atividade antioxidante do extrato de planta. Também se
pode perceber que a concentração do extrato tem um papel decisivo na capacidade
antioxidante da planta. A Tabela 8 mostra que cada extrato de planta possui uma
capacidade antioxidante específica, a qual depende da concentração do extrato. As
constantes cinéticas obtidas para cada extrato de planta permitem a comparação da
capacidade antioxidante entre os diferentes extratos de plantas numa mesma
concentração.
78
Tabela 8: Resultados obtidos pelo método voltamétrico proposto (%) e o método do DPPH
•
(%) para a capacidade antioxidante dos extratos de plantas
testados.
Extrato de planta Capacidade antioxidante Constante cinética Capacidade antioxidante r
(mg L
-1
) (radical OH, %) calculada ( , min
2
k
-1
) (radical DPPH, %)
( x 10
-3
)
Cymbopogon citratus
100 66,3 21,4 34,2 0,9914
200 76,1 15,2 52,5
1000 88,2 7,5 89,5
Psidium guajava
100 72,8 17,3 93,9 0,9940
200 79,2 13,2 94,8
1000 88,2 7,5 96,7
Achyrocline satureoides
100 50,2 31,6 32,1 0,8854
200 75,3 15,7 49,9
1000 84,9 9,6 92,3
79
Baccharis genistelloides
100 72,1 17,7 28,0 0,9953
200 83,5 10,5 49,7
1000 98,7 0,8 91,6
Matricaria chamomilla L.
100 71,0 18,4 31,3 0,9223
200 86,0 8,9 51,1
1000 94,0 3,8 96,8
80
A fim de validar os resultados obtidos para as constantes cinéticas, que são
diretamente relacionadas à capacidade antioxidante, compararam-se os resultados
obtidos pelo método voltamétrico proposto com os valores da capacidade
antioxidante obtidos através do método espectrofotométrico do , sendo que
houve uma boa correlação entre ambos os métodos (ver Tabela 8), tendo-se por
base a variação da concentração dos extratos.
DPPH
•
Ambos os métodos exibem boa correlação quando se altera a concentração
dos extratos de 100 a 1000 mg L
-1
de todas as plantas estudadas. Os resultados
mostrados na Tabela 8 permitem também a comparação dos diferentes extratos de
plantas medicinais em relação a suas diferentes capacidades antioxidantes. Os
extratos das plantas têm, a uma mesma concentração, diferentes capacidades
antioxidantes, como determinado pelos métodos do DPPH
•
e eletroquímico. Isso
certamente ocorre devido às diferentes espécies antioxidantes presentes nas
plantas medicinais. Além disso, a concentração e a classe da espécie antioxidante
possuem um papel muito importante, o que leva a uma capacidade antioxidante
específica para cada planta. É interessante notar que todos os extratos de plantas
exibem capacidades antioxidantes diferentes em ambos os ensaios para cada
concentração testada, isto é, não há uma correlação significativa entre o ensaio
eletroquímico (
HO
•
) e o ensaio espectrofotométrico ( DPPH
•
) (Figura 18).
81
1000 mg/L
88
90
92
94
96
98
100
80 85 90 95 100
Fenton-SAM (%)
DPPH (%
)
100 mg/L
0
20
40
60
80
100
Figura 18
: Correlação entre os métodos eletroquímico (Fenton-SAM) e espectrofotométrico
( ) para as três concentrações de extratos testadas (100, 200 e 1000 mg L
DPPH
•
-1
), observando-se
a inexistência de correlações significativas entre ambos os métodos. (a)
C. citratus; (b) P. guajava; (c)
A. satureoides; (d) B. genistelloides; (e) M. chamomilla.
As diferenças observadas podem ser explicadas em virtude das diferenças
existentes entre as duas espécies radicalares: o radical estável e pouco reativo
( DP ), e o radical instável e altamente reativo (PH
•
HO
•
). Como os vários extratos de
plantas possuem na mesma concentração (em termos de mg de planta por mL)
diferentes concentrações de compostos extraídos, e estes compostos também irão
diferir em sua natureza química, deve-se esperar que a reatividade destes diferentes
compostos em diferentes concentrações seja diferente para cada radical testado. As
seguintes equações ajudam a entender as diferenças observadas nas respostas
obtidas pelos dois métodos. No ensaio do DPPH
•
, a seguinte reação ocorre na
presença de um antioxidante AH:
DPPH + AH DPPH-H + A
••
⎯⎯→
(35)
40 50 60 70 80
Fenton-SAM (%)
200 mg/L
40
50
60
70
80
90
100
70 75 80 85 90
Fenton-SAM (%)
DPPH (%)
(a)
(a)
(a)
(b)
(b)
(b)
(c)
(c)
(c)
(d)
(d)
(d)
(e)
(e)
(e)
DPPH (%)
1000 mg/L
88
90
92
94
96
98
100
80 85 90 95 100
Fenton-SAM (%)
DPPH (%
)
100 mg/L
0
20
40
60
80
100
50 60 70 80
Fenton-SAM (%)
40
200 mg/L
40
50
60
70
80
90
100
70 75 80 85 90
Fenton-SAM (%)
DPPH (%)
(a)
(a)
(a)
(b)
(b)
(b)
(c)
(c)
(c)
(d)
(d)
(d)
(e)
(e)
(e)
DPPH (%)
82
O desaparecimento de DPPH
•
indica a capacidade antioxidante da solução. A
absorvância decai como resultado da mudança de cor de violeta para amarelo
quando o radical reage com o antioxidante através da doação de um átomo de
hidrogênio para formar o composto estável . DPPH-H
No método voltamétrico proposto, há a competição de duas reações
simultâneas:
1
SAM + HO produto
•
⎯⎯→
(36)
2
AH + HO produto
•
⎯⎯→
(37)
Uma vez que os radicais HO destroem a SAM, o sinal eletroquímico do par
redox indica o grau de extensão de dissolução da SAM, e a destruição da SAM é
retardada pela adição de um antioxidante à solução de Fenton.
Para o melhor entendimento das diferenças entre os dois ensaios, usou-se
ácido ascórbico como antioxidante-padrão em concentrações de 1 a 40.000 mg L
-1
.
Os resultados são mostrados na Figura 19. Optou-se por ácido ascórbico em vez de
padrões de compostos fenólicos devido à baixa solubilidade destes compostos em
soluções aquosas. Estes padrões são solúveis apenas em solventes orgânicos,
como metanol e etanol, ou em água quente. No entanto, o solvente orgânico poderia
sequestrar os radicais HO gerados pela solução de Fenton. Além disso, a eficiência
da utilização do H
2
O
2
decresce em temperaturas acima de 40 ºC, devido à sua
decomposição em oxigênio e água. Consequentemente, usou-se ácido ascórbico
como antioxidante-padrão para efeito de comparação neste trabalho.
83
Ascorbic acid conc./mg L
-1
Figura 19: (a) Dependência entre a concentração de ácido ascórbico e a capacidade antioxidante
contra ; (b) dependência entre a concentração de ácido ascórbico e a capacidade
antioxidante contra .
DPPH
•
HO
•
No ensaio do (Figura 19a), distinguem-se dois diferentes domínios:
em concentrações de 1 a 100 mg L
DPPH
•
-1
de ácido ascórbico, a sua capacidade
antioxidante varia; e, em concentrações de 100 a 1000 mg L
-1
, a capacidade
antioxidante atinge um ponto de saturação. O ensaio eletroquímico apresenta
variação em toda a faixa de 1000 a 40.000 mg L
-1
(Figura 19b). Apesar das
diferenças nas faixas de concentração acessíveis, é possível ver que ambos os
métodos apresentam o mesmo comportamento, isto é, a capacidade antioxidante
aumenta com a concentração de ácido ascórbico até um ponto em que ocorre o
0 200 400 600 800 1000
DPPH method/%
0
20
40
60
80
100
Ascorbic acid conc./mg L
-1
0 10000 20000 30000 40000
Voltammetric method/%
0
20
40
60
80
100
(a)
(b)
Conc. Ác. ascórbico / mg L
-1
Conc. Ác. ascórbico / mg L
-1
CAO radical DPPH / %
CAO radical HO / %
Ascorbic acid conc./mg L
-1
0
20
40
60
80
100
DPPH method/%
0 200 400 600 800 1000
CAO radical DPPH / %
Ascorbic acid conc./mg L
-1
0 10000 20000 30000 40000
Voltammetric method/%
0
20
40
60
80
100
(a)
(b)
Conc. Ác. ascórbico / mg L
-1
CAO radical HO / %
Conc. Ác. ascórbico / mg L
-1
84
consumo total dos radicais livres em solução pelo ácido ascórbico, resultando no
crescimento exponencial observado em ambos os gráficos.
4.1.3 Conclusões parciais referentes aos ensaios eletroquímicos
1) O primeiro ensaio eletroquímico proposto (seção 4.1.1) não pôde ser usado
para a determinação da capacidade antioxidante de extratos de plantas medicinais,
visto que há uma competição entre a riboflavina e compostos que se adsorvem
espontaneamente no eletrodo de PIGE.
2) Já o segundo ensaio eletroquímico proposto (seção 4.1.2) permite a
determinação da atividade antirradicalar de extratos de plantas através do esquema
mostrado na Figura 20. Uma vez que os radicais HO, gerados pela reação de
Fenton, destroem a SAM, o sinal eletroquímico do par redox indica o grau de
dissolução da SAM, sendo que a destruição desta é retardada com a adição de
compostos antioxidantes à solução de Fenton. De acordo com os resultados obtidos,
quanto menor o valor da constante cinética ( ), maior o poder antioxidante do
composto estudado.
2
k
3) De posse de tais resultados, vê-se que diferentes testes in vitro resultam
em diferentes respostas para a capacidade antioxidante de uma mesma substância.
Devido a essa disparidade de resultados frente a diferentes métodos, os testes in
vitro não refletem a “verdadeira capacidade antioxidante” das substâncias. Para
alcançar tal resposta, deve-se, primeiramente, conseguir responder a questões
sobre como os antioxidantes são absorvidos pelo corpo humano, como ocorre seu
transporte através das biomembranas, como estes compostos são metabolizados,
etc. Apenas de posse de tais respostas e comparando-as com os testes in vitro, será
possível eleger um ensaio como sendo “o mais confiável” em termos da
quantificação da capacidade antioxidante.
Em função dessas dificuldades, o próximo tópico trata da comparação da
capacidade antioxidante dos extratos de plantas através de testes in vitro e in vivo,
uma vez que apenas a correlação entre ambos os testes permitirá dizer
corretamente qual o melhor composto antioxidante.
85
Figura 20: Mecanismo mostrando a variação do sinal do par redox com a formação e dissolução da
SAM, frente o ataque de radicais HO.
86
4.2 Estudo fluorimétrico do poder antioxidante de extratos de plantas
medicinais
O princípio por trás dos métodos fluorimétricos propostos para a
determinação da capacidade antioxidante total contra radicais peroxila e hidroxila
baseia-se no trabalho de Amado et al. [AMADO, 2009], que realiza a detecção
indireta de ERO por fluorimetria (ex/em: 485/520 nm) empregando diacetato de 2′,7′-
diclorofluoresceína (DCFH-DA) como substrato. O DCFH-DA, após sofrer
desacetilação, pode ser oxidado por ERO, gerando fluorescência. No primeiro
método (seção 4.2.1), há a geração de radicais peroxila através da
termodegradação do reagente cloreto de 2,2'-azobis (2-metilamidinopropano)
(ABAP) a 37ºC. E, num segundo método (seção 4.2.2), testou-se a capacidade
antioxidante total das amostras contra os radicais hidroxila gerados pela reação de
Fenton.
4.2.1 Determinação da capacidade antioxidante in vitro contra radicais
peroxila em amostras de extratos de plantas
Neste primeiro estudo, a metodologia de Amado et al. foi otimizada para a
avaliação da capacidade antioxidante total contra peroxi-radicais em amostras de
extratos de plantas medicinais e compostos fenólicos. Na metodologia proposta
pelos autores [AMADO, 2009], a desacetilação do DCFH-DA é feita pelas esterases
presentes nas amostras de tecidos do peixe Jenynsia multidentata (Anaplebidae),
como mostrado na Figura 21.
87
DCFH-DA
Figura 21: Esquema ilustrando a metodologia para a medida da capacidade antioxidante contra
radicais peroxila (adaptado de Amado, 2009). Detalhes: ver texto.
Após a desacetilação do DCFH-DA, o composto resultante (DCFH) pode ser
oxidado pelos radicais gerados a partir da termodegradação do ABAP, resultando no
composto DCF, que é detectado nos comprimentos de onda de 488 e 525 nm, para
excitação e emissão, respectivamente. A decomposição térmica do ABAP e
consequente formação de
ROO
•
é monitorada por 30 min, com leituras a cada 5
min. A produção de fluorescência total é calculada pela integração das unidades de
fluorescência (UF) pelo tempo de reação, sendo que os dados se ajustam a uma
função polinomial de segunda ordem (Figura 22). Os resultados são expressos pela
diferença de área (UF × min) da mesma amostra com e sem a adição de ABAP, e
normalizados em função da área de ERO sem ABAP (controle). A diferença relativa
entre a área de ERO com e sem ABAP é considerada a medida da capacidade
antioxidante.
Este s
DA
rase
DCFH
DCF
-
DCF
emissão de
fluorescência
ABAP
≥ 35 ºC
ROO
•
DCFH-DA
e s
DA
Est rase
DCFH
DCF
-
DCF
emissão de
fluorescência
ABAP
≥ 35 ºC
ROO
•
88
Tempo
Unidades de fluorescência
Sem ABAP
Com ABAP
Tempo
Unidades de fluorescência
Sem ABAP
Com ABAP
Figura 22:
Resultados típicos obtidos pelo método ACAP mostrando a variação da fluorescência com
o tempo, sem e com a adição de ABAP (adaptado de Amado, 2009).
Porém, ao aplicar tal metodologia às amostras de extratos de plantas, foram
obtidos os resultados mostrados na Figura 23. Como pode ser constatado pela
figura, os valores obtidos são negativos, possivelmente devido à baixa concentração
proteica das amostras, o que faz com que não haja a desacetilação do composto
DCFH-DA e, consequentemente, não ocorra uma produção significativa de
fluorescência nas amostras.
Tempo / min
0102030
FU
-3000
-2500
-2000
-1500
-1000
-500
0
500
M. chamomilla
P. guajava
A. satureoides
B. genistelloides
C. citratus
Figura 23: Resultados obtidos para as cinco amostras de plantas estudadas na concentração de
1000 mg L
-1
, segundo a metodologia de Amado et al. [AMADO, 2009] para a determinação da
capacidade antioxidante contra radicais peroxila. Detalhes: ver texto.
89
Diante destes resultados, optou-se por fazer a desacetilação química do
composto DCFH-DA. Para isso, usou-se o procedimento de desacetilação descrito
por Takanashi et al. [TAKANASHI, 1997] (ver seção 3.4.3.1). A Figura 24 mostra as
curvas obtidas pela nova metodologia aplicada às 5 amostras de extratos das
plantas medicinais estudadas, numa concentração de 1000 mg L
-1
. Nesta nova
metodologia, a capacidade antioxidante das amostras foi estimada pela diferença
das áreas das curvas de fluorescência registradas na presença e na ausência de
ABAP em função do tempo (30 min). A diferença relativa entre as curvas das
amostras e a do controle é considerada como sendo a medida da capacidade
antioxidante, já que uma grande diferença entre as áreas significa uma boa
capacidade antioxidante, uma vez que os valores de fluorescência são obtidos após
a formação de ERO, o que significa uma grande competência em neutralizar os
radicais peroxila. Assim, a capacidade antioxidante da amostra é dada pela equação
38:
amostra
controle
A
CAO (%) = 1 - 100
A
⎡⎤
⎛⎞
×
⎢⎥
⎜⎟
⎝⎠
⎣⎦
(38)
onde e são as áreas referentes às curvas obtidas para a
amostra e para o controle (branco), respectivamente.
amostra
A
controle
A
90
Tempo / min
0102030
UF
-2,0e+5
0,0
2,0e+5
4,0e+5
6,0e+5
8,0e+5
1,0e+6
1,2e+6
1,4e+6
Branco
M. chamomilla
P. guajava
A. satureoides
B. genistelloides
C. citratus
Figura 24: Resultados obtidos para as 5 amostras de plantas medicinais estudadas numa
concentração de 1000 mg L
-1
, com uma etapa prévia de desacetilação química do composto DCFH-
DA, de acordo com a metodologia desenvolvida. Detalhes: ver texto.
Com a diminuição da concentração dos extratos, observa-se que há uma
aproximação entre as curvas das amostras e a do controle, evidenciando uma
menor capacidade antioxidante dos extratos em menores concentrações (Figuras 25
e 26). Um resumo dos resultados obtidos para a capacidade antioxidante dos
extratos de plantas nas 3 concentrações testadas encontra-se na Tabela 9.
Resultados semelhantes são obtidos quando se analisa apenas a diferença entre os
valores de fluorescência gerados ao final do tempo de reação (Figura 27). Nesse
caso, a capacidade antioxidante é determinada de forma análoga à equação do
método do DPPH
•
:
controle amostra
controle
UF - UF
CAO (%) = 100
UF
⎛⎞
×
⎜⎟
⎝⎠
(39)
onde e são os valores em unidades de fluorescência gerados
pelo controle (branco) e pela amostra, respectivamente. A ótima correlação entre
ambas as formas permite que a quantificação da capacidade antioxidante seja feita
por qualquer uma das duas formas.
controle
UF
amostra
UF
91
Tempo / min
0 102030
UF
-2,0e+5
0,0
2,0e+5
4,0e+5
6,0e+5
8,0e+5
1,0e+6
1,2e+6
1,4e+6
Branco
M. chamomilla
P. guajava
A. satureoides
B. genistelloides
C. citratus
Figura 25: Resultados obtidos para as 5 amostras de plantas medicinais estudadas numa
concentração de 200 mg L
-1
, com uma etapa prévia de desacetilação química do composto DCFH-
DA, de acordo com a metodologia desenvolvida.
Tempo / min
0102030
UF
-2,0e+5
0,0
2,0e+5
4,0e+5
6,0e+5
8,0e+5
1,0e+6
1,2e+6
1,4e+6
Branco
M. chamomilla
P. guajava
A. satureoides
B. genistelloides
C. citratus
Figura 26: Resultados obtidos para as 5 amostras de plantas medicinais estudadas numa
concentração de 100 mg L
-1
, com uma etapa prévia de desacetilação química do composto DCFH-
DA, de acordo com a metodologia desenvolvida.
Figura 27: Correlação entre os duas diferentes formas de quantificação da capacidade antioxidante
testadas. A primeira considera o valor da área da curva obtida entre a reação de ERO e compostos
antioxidantes durante 30 min de reação. A segunda considera apenas os valores de fluorescência
gerados após 30 min de reação, de acordo com a eq. 39.
92
r = 0,9974
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 20406080100
Área (%)
Ponto final (%)
Método ACAP
93
Tabela 9: Resultados obtidos pelo método fluorimétrico proposto (%) e o método do DPPH
•
(%) para a capacidade antioxidante
dos extratos de plantas testados.
Extrato de planta Capacidade antioxidante Capacidade antioxidante r
(mg L
-1
) (radical ROO, %) (radical DPPH, %)
Cymbopogon citratus
100 25,7 3,3 0,9342
200 39,6 13,0
1000 50,7 45,1
Psidium guajava
100 48,1 88,3 0,9974
200 61,2 90,1
1000 90,1 93,1
Achyrocline satureoides
100 41,6 27,5 0,9998
200 45,8 39,8
1000 63,1 95,3
94
Baccharis genistelloides
100 39,2 31,5 0,9925
200 48,4 57,2
1000 72,9 98,6
Matricaria chamomilla L.
100 27,6 9,9 0,9979
200 34,0 20,7
1000 52,0 63,5
95
Pela Tabela 9 pode-se concluir que, assim como no método voltamétrico
proposto, cada planta possui uma capacidade antioxidante específica, a qual
depende da concentração do extrato. Os resultados obtidos foram comparados aos
do método do , e houve uma boa correlação entre ambos os métodos, tendo-
se por base a variação da concentração dos extratos. O radical peroxila possui um
tempo de meia-vida muito superior ao do radical hidroxila (7 s e 10
DPPH
•
-9
s,
respectivamente), o que confere ao
ROO
•
uma maior estabilidade e,
consequentemente, menor reatividade. Apesar disso, novamente observa-se que
não há uma correlação significativa entre os dois ensaios testados – os ensaios
fluorimétrico ACAP ( ) e espectrofotométrico (
ROO
•
DPPH
•
) (Figura 28), - a exemplo
dos resultados obtidos para os ensaios voltamétrico (
HO
•
) e espectrofotométrico
(Figura 18). DPPH
•
100 mg/L
0
20
40
60
80
100
20 30 40 50
ACAP (%)
DPPH (%
)
200 mg/L
0
20
40
60
80
100
30 40 50 60 70
ACAP (%)
DPPH (%
)
1000 mg/L
0
20
40
60
80
100
40 50 60 70 80 90 100
ACAP (%)
DPPH (%
)
(a) (a)
(a)
(b) (b)
(b)
(c)
(c)
(c)
(d)
(d)
(d)
(e)
(e)
(e)
100 mg/L
0
20
40
60
80
100
20 30 40 50
ACAP (%)
DPPH (%
)
200 mg/L
0
20
40
60
80
100
30 40 50 60 70
ACAP (%)
DPPH (%
)
1000 mg/L
0
20
40
60
80
100
40 50 60 70 80 90 100
ACAP (%)
DPPH (%
)
(a) (a)
(a)
(b) (b)
(b)
(c)
(c)
(c)
(d)
(d)
(d)
(e)
(e)
(e)
Figura 28:
Correlação entre os métodos fluorimétrico (ACAP) e espectrofotométrico ( DPPH
•
) para
as três concentrações de extratos testadas (100, 200 e 1000 mg L
-1
), observando-se a inexistência de
correlações significativas entre ambos os métodos. (a)
C. citratus; (b) P. guajava; (c) A. satureoides;
(d)
B. genistelloides; (e) M. chamomilla.
96
A fim de se realizar uma análise estatística entre as capacidades
antioxidantes exibidas pelas diferentes plantas, testou-se a capacidade antioxidante
de diferentes amostras comerciais das plantas em estudo, com exceção da planta P.
guajava, da qual não se conseguiu nenhuma amostra comercial. Os resultados
obtidos são apresentados na Tabela 10, assim como a média entre as diferentes
amostras e o coeficiente de variação (CV).
Analisando-se os resultados obtidos, verifica-se que há grandes variações no
valor da capacidade antioxidante entre amostras da mesma espécie, o que pode ser
facilmente explicado pelo fato de que a síntese de metabólitos secundários (neste
caso, as espécies antioxidantes) é seriamente afetada por condições ambientais,
como sazonalidade, temperatura, disponibilidade hídrica, radiação ultravioleta,
presença de nutrientes, altitude, poluição atmosférica e ataque de patógenos. Além
disso, no caso de plantas medicinais, os processos de coleta, estabilização e
secagem também possuem grande influência no teor e composição de metabólitos
secundários [GOBBO-NETO, 2007]. Entretanto, é possível verificar que na maior
concentração testada (1000 mg L
-1
), obtêm-se os menores valores de coeficientes
de variação para todos os extratos.
A análise estatística foi feita por ANOVA, e constatou-se que, apesar das
grandes diferenças entre as diferentes amostras da mesma espécie, a P. guajava foi
a planta que apresentou a melhor capacidade antioxidante contra peroxi-radicais e,
em contraste, a C. citratus apresentou o pior desempenho. As plantas M.
chamomilla, B. genistelloides e A. satureoides apresentam, estatisticamente, o
mesmo desempenho quanto à capacidade antioxidante.
97
Tabela 10: Resultados obtidos pelo método fluorimétrico proposto para a avaliação
da capacidade antioxidante de extratos de plantas contra radicais peroxila.
Planta 100 mg L
-1
200 mg L
-1
1000 mg L
-1
M. chamomilla
Amostra 01 27,6 34,0 52,0
Amostra 02 19,3 34,8 61,8
Amostra 03 35,6 39,6 70,7
Amostra 04 40,6 44,5 63,6
Amostra 05 26,9 31,6 63,7
Média 30,0 36,9 62,4
CV 24,6 12,5 9,6
A. satureoides
Amostra 01 41,6 45,8 63,1
Amostra 02 1,7 18,2 52,8
Amostra 03 16,8 23,7 35,1
Amostra 04 12,2 29,6 61,6
Amostra 05 7,3 17,7 57,5
Amostra 06 33,6 40,6 63,2
Média 18,9 29,3 55,6
CV 75,3 36,6 17,7
B. genistelloides
Amostra 01 39,2 48,4 72,9
Amostra 02 24,7 34,5 61,3
Amostra 03 3,8 22,8 47,3
Amostra 04 13,1 20,3 42,0
Amostra 05 2,7 16,8 55,5
Média 16,7 28,6 55,8
CV 82,3 40,5 19,4
98
C. citratus
Amostra 01 25,7 39,6 50,7
Amostra 02 0,0 1,1 12,7
Amostra 03 0,0 4,9 10,6
Média 8,6 15,2 24,7
CV 141,4 114,0 74,7
P. guajava
Amostra 01 48,1 61,2 87,1
Amostra 02 44,6 61,7 89,2
Média 46,4 61,5 88,2
CV 3,8 0,4 1,2
4.2.2 Determinação da capacidade antioxidante in vitro contra radicais
hidroxila em amostras de extratos de plantas
Nesta segunda metodologia, avalia-se a capacidade antioxidante total contra
radicais hidroxila. A metodologia baseia-se na detecção indireta do radical hidroxila
por fluorimetria (ex/em: 485/520 nm), empregando diacetato de 2′,7′-
diclorofluoresceína (DCFH-DA) como substrato. O DCFH-DA, após sofrer
desacetilação química, pode ser oxidado por ERO, gerando fluorescência (Figura
29).
99
DCFH-DA
DA
DCFH
DCF
-
DCF
emissão de
fluorescência
Fe
2+
+ H
2
O
2
HO
•
Figura 29: Esquema ilustrando a metodologia para a medida da capacidade antioxidante contra
radicais hidroxila. Detalhes: ver texto.
O protocolo foi aplicado em amostras das cinco espécies de plantas
estudadas. Os extratos aquosos das plantas foram expostos aos radicais hidroxila
gerados pela reação de Fenton (equação 33). A capacidade antioxidante das
amostras foi estimada pela diferença entre os valores de fluorescência gerados ao
final de 5 minutos de reação na presença e na ausência das amostras, de acordo
com a equação 39. Os resultados obtidos para as amostras de extratos de plantas
são mostrados na Tabela 11.
Os resultados permitem constatar que há grandes variações no valor da
capacidade antioxidante entre amostras da mesma espécie contra radicais OH,
assim como no método fluorimétrico anterior para radicais ROO. E, da mesma
forma, é possível verificar que, na maior concentração testada (1000 mg L
-1
), obtêm-
se os menores valores de coeficientes de variação para todos os extratos.
A análise estatística foi feita por ANOVA, e constatou-se que, apesar das
grandes diferenças entre as diferentes amostras da mesma espécie, a P. guajava
foi, novamente, a planta que apresentou a melhor capacidade antioxidante contra
radicais hidroxila, seguida pela B. genistelloides. As plantas M. chamomilla, C.
citratus e A. satureoides apresentam, estatisticamente, o mesmo desempenho
quanto à capacidade antioxidante contra radicais hidroxila pelo método fluorimétrico
proposto e adaptado de Amado et al. [AMADO, 2009].
Os resultados obtidos por esta metodologia foram comparados com os
obtidos pela metodologia proposta para avaliar a capacidade antioxidante contra
OH
-
DCFH-DA
DA
Fe
2+
+ H
2
O
2
HO
•
DCFH
DCF
-
DCF
emissão de
fluorescência
OH
-
100
radicais peroxila, obtendo-se uma boa correlação entre as amostras de extratos de
plantas (Figura 30), apesar da diferença de reatividade entre ambos os radicais.
1000 mg/L
y = 0,8753x + 6,7978
r = 0,9027
0
20
40
60
80
100
40 50 60 70 80 90 100
Fenton (%)
ACAP (%)
100 mg/L
y = 0,4931x + 21,124
r = 0,9843
0
10
20
30
40
50
60
0 102030405060
Fenton (%)
ACAP (%)
200 mg/L
y = 0,4829x + 28,224
r = 0,8493
0
20
40
60
80
10 20 30 40 50 60
Fenton (%)
ACAP (%)
(e)
(a)
(b)(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
1000 mg/L
y = 0,8753x + 6,7978
r = 0,9027
0
20
40
60
80
100
40 50 60 70 80 90 100
Fenton (%)
ACAP (%)
100 mg/L
y = 0,4931x + 21,124
r = 0,9843
0
10
20
30
40
50
60
0 102030405060
Fenton (%)
ACAP (%)
200 mg/L
y = 0,4829x + 28,224
r = 0,8493
0
20
40
60
80
10 20 30 40 50 60
Fenton (%)
ACAP (%)
(e)
(a)
(b)(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Figura 30:
Correlações entre os resultados obtidos pelos métodos fluorimétricos desenvolvidos para
avaliar a capacidade antioxidante contra radicais peroxila e hidroxila em amostras de extratos de
plantas nas três concentrações de extratos testadas (100, 200 e 1000 mg L
-1
). (a) C. citratus; (b) P.
guajava
; (c) A. satureoides; (d) B. genistelloides; (e) M. chamomilla.
101
Tabela 11: Resultados obtidos pelo método fluorimétrico proposto para a avaliação
da capacidade antioxidante de extratos de plantas contra radicais hidroxila.
Planta 100 mg L
-1
200 mg L
-1
1000 mg L
-1
M. chamomilla
Amostra 01 12,9 19,9 49,8
Amostra 02 23,9 28,0 48,4
Amostra 03 30,1 38,2 63,9
Amostra 04 20,8 31,9 47,6
Amostra 05 23,4 39,0 58,0
Média 22,2 31,4 53,5
CV 25,1 22,4 11,9
A. satureoides
Amostra 01 43,9 49,1 58,4
Amostra 02 3,8 14,9 56,0
Amostra 03 16,4 39,1 65,4
Amostra 04 20,3 35,4 53,0
Amostra 05 29,9 43,2 61,7
Amostra 06 9,2 21,0 60,9
Média 20,6 33,8 59,2
CV 64,6 35,7 6,8
B. genistelloides
Amostra 01 40,5 44,1 71,0
Amostra 02 25,5 30,5 64,8
Amostra 03 53,0 57,7 79,0
Amostra 04 21,7 29,3 80,3
Amostra 05 41,6 64,7 88,6
Média 36,5 45,3 76,7
CV 31,4 31,3 10,6
102
C. citratus
Amostra 01 8,3 14,4 63,0
Amostra 02 0,0 25,7 53,8
Amostra 03 35,2 43,6 65,2
Média 14,5 27,9 60,7
CV 103,6 43,1 8,1
P. guajava
Amostra 01 49,7 54,5 91,2
Amostra 02 51,9 67,8 90,3
Média 50,8 61,2 90,8
CV 2,2 10,9 0,5
103
4.3 Determinação da capacidade antioxidante in vitro de compostos
fenólicos contra radicais peroxila e hidroxila
Os métodos desenvolvidos e otimizados neste trabalho foram aplicados para
a determinação da capacidade antioxidante de alguns compostos fenólicos
(antioxidantes naturais) normalmente encontrados em plantas medicinais e outros
produtos como bebidas e alimentos. O objetivo deste estudo é avaliar a contribuição
individual desta classe de compostos para a capacidade antioxidante total em
espécies vegetais que permita uma avaliação quantitativa destas espécies como
antioxidantes frente a radicais livres. Os resultados apresentados a seguir
empregando métodos in vitro independentes foram empregados no estudo dos
compostos rutina, quercetina, ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido gálico, ácido
rosmarínico e resveratrol, os quais estão presentes em plantas medicinais.
Dentre os métodos estudados, o método voltamétrico descrito no capítulo 4.1
não foi empregado para a avaliação da capacidade antioxidante devido à baixa
solubilidade dos compostos fenólicos em água em temperatura ambiente. Com isso,
o uso de calor (para a solubilização dos compostos) iria acelerar a decomposição de
H
2
O
2
(necessário para a reação de Fenton), e o uso de solventes orgânicos iria
interferir no resultado final, uma vez que solventes como metanol e etanol podem
sequestrar espécies radicalares.
O método fluorimétrico desenvolvido para radicais peroxila foi empregado
inicialmente para os sete compostos fenólicos (rutina, quercetina, resveratrol, ácido
cafeico, ácido gálico, ácido rosmarínico e ácido ferúlico) nas concentrações de 10,
50 e 100 µmol L
-1
. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 31, exceto
para o resveratrol, que não apresentou capacidade antioxidante nas condições
empregadas. Pelos resultados, verifica-se que cada composto possui uma
capacidade antioxidante específica, a qual depende da concentração do composto.
Com isso, ao ordenar esses compostos quanto às suas capacidades antioxidantes,
deve-se levar em conta a concentração dos mesmos. Na maior concentração (100
µmol L
-1
), estabelece-se a seguinte ordem decrescente de capacidade antioxidante:
ácido rosmarínico = quercetina > ácido gálico = ácido cafeico > rutina > ácido ferúlico
> resveratrol. Já para a concentração de 50 µmol L
-1
, obtém-se a seguinte ordem:
quercetina > ácido rosmarínico > ácido gálico > ácido cafeico > rutina > ácido ferúlico
104
> resveratrol. E para a menor concentração (10 µmol L
-1
), tem-se: quercetina > ácido
rosmarínico > ácido cafeico > ácido gálico = rutina > ácido ferúlico > resveratrol.
Padrões x ACAP
0
20
40
60
80
100
ROS GAL QUE RUT FER CAF
CAO (%)
10 uM
50 uM
100 uM
Figura 31: Resultados obtidos para a capacidade antioxidante de diferentes compostos fenólicos nas
concentrações de 10, 50 e 100 µmol L
-1
contra radicais peroxila (CAO: capacidade antioxidante; ROS:
ácido rosmarínico; GAL; ácido gálico; QUE: quercetina; RUT: rutina; FER: ácido ferúlico; CAF: ácido
cafeico).
O método fluorimétrico desenvolvido para radicais hidroxila foi empregado
também para os sete compostos fenólicos nas concentrações de 10, 50 e 100 µmol
L
-1
. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 32, exceto para o resveratrol,
que não apresentou capacidade antioxidante nas condições empregadas. Pelos
resultados verifica-se que cada composto possui uma capacidade antioxidante
específica, a qual depende da concentração do composto. Com isso, ao ordenar
esses compostos quanto às suas capacidades antioxidantes, deve-se levar em
conta a concentração dos mesmos. Na maior concentração (100 µmol L
-1
),
estabelece-se a seguinte ordem decrescente de capacidade antioxidante: ácido
rosmarínico > quercetina > ácido cafeico = rutina = ácido gálico > ácido ferúlico >
resveratrol. Já para a concentração de 50 µmol L
-1
obtém-se a seguinte ordem:
ácido rosmarínico > ácido cafeico = quercetina > ácido gálico > rutina > ácido ferúlico
> resveratrol. E, para a menor concentração (10 µmol L
-1
), tem-se: quercetina >
ácido cafeico > rutina > ácido rosmarínico > ácido ferúlico = ácido gálico >
resveratrol.
105
Padrões x Fenton
0
20
40
60
80
100
ROS GAL QUE RUT FER CAF
CAO (%)
10 uM
50 uM
100 uM
Figura 32: Resultados obtidos para a capacidade antioxidante de diferentes compostos fenólicos nas
concentrações de 10, 50 e 100 µmol L
-1
contra radicais hidroxila (CAO: capacidade antioxidante;
ROS: ácido rosmarínico; GAL: ácido gálico; QUE: quercetina; RUT: rutina; FER: ácido ferúlico; CAF:
ácido cafeico).
A Figura 33 mostra a correlação obtida com os métodos fluorimétricos para
radicais ROO e OH adaptados para os estudos com compostos fenólicos
antioxidantes. Como se pode ver, há uma correlação de 86,55% entre os compostos
estudados pelo mesmo método fluorimétrico empregando 2 espécies radicalares
diferentes.
Padrões
r = 0,8655
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 204060801
CAO ACAP (%)
CAO Fenton (%)
00
Figura 33: Correlação entre os resultados obtidos pelos métodos fluorimétricos desenvolvidos para
avaliar a capacidade antioxidante contra radicais peroxila e hidroxila em amostras de compostos
fenólicos nas concentrações de 10, 50 e 100 µmol L
-1
.
106
A Tabela 12 permite um estudo comparativo dos resultados obtidos pelos
métodos estudados neste trabalho com outros resultados prévios obtidos no nosso
grupo de pesquisa por outros métodos in vitro que empregam a geração fotoquímica
de radicais OH e a detecção fotométrica dos compostos fenólicos aqui estudados
[LIMA, 2010]. Para efeito de comparação, adota-se a concentração fixa de 50 µmol
L
-1
para cada composto estudado. Pelos resultados, verifica-se que cada composto
possui uma capacidade antioxidante específica, a qual varia de acordo com o
método empregado. Com isso, ao ordenar esses compostos quanto às suas
capacidades antioxidantes, deve-se levar em conta o método que está sendo
utilizado.
Esse fato fica evidenciado na Tabela 13. A tabela apresenta a classificação
decrescente da capacidade antioxidante para os cinco diferentes compostos
fenólicos mostrados na tabela 12 de acordo com o ensaio e o radical testados.
Como se pode verificar, a ordenação destes compostos quanto à capacidade
antioxidante varia para os diferentes ensaios testados. Entretanto, observa-se que,
excetuando-se o ensaio fotométrico com fotólise de H
2
O
2
, os compostos rutina,
quercetina e ácido cafeico são os compostos que apresentam a maior capacidade
antioxidante, apesar da classificação ser diferente de acordo com o ensaio. Do
mesmo modo, verifica-se que os compostos ácido ferúlico e resveratrol são os que
apresentam os piores resultados para a capacidade antioxidante. Assim, é possível
classificar estes compostos em dois grupos distintos: o primeiro contendo os
compostos rutina, quercetina e ácido cafeico (melhor capacidade antioxidante) e
outro contendo os compostos ácido ferúlico e resveratrol (pior capacidade
antioxidante). A interação do radical HO gerado fotoquimicamente na presença de
H
2
O
2
e do radical HO gerado pela reação de Fenton não se dá da mesma forma do
ponto de vista cinético, sendo a influência do meio reacional uma provável
explicação para as diferenças encontradas. Já o bom desempenho apresentado por
ácido ferúlico e resveratrol no ensaio fotométrico com fotólise de H
2
O
2
pode ser
explicado pelo fato de não haver seletividade na medida espectrofotométrica. Com
isso, é muito provável que tenha-se um aumento do valor de absorvância lido devido
à presença de subprodutos gerados na reação entre o composto fenólico e o radical
HO.
107
Tabela 12: Resultados obtidos para a capacidade antioxidante de compostos fenólicos empregando diferentes métodos in vitro.
Composto Capacidade antioxidante
(50 µmol L
-1
) Método fluorimétrico* Método fluorimétrico* Método fotométrico* Método fotométrico** HPLC-UV**
(radical ROO - ACAP) (radical OH - Fenton) (radical DPPH)
(radical OH – Fotólise do H
2
O
2
) (radical OH – Fotólise do H
2
O
2
)
Rutina 43,2 38,8 96,8 85,4 87,6
Quercetina 80,1 59,9 80,1 47,8 47,4
Ácido Cafeico 48,4 60,8 95,0 10,8 52,6
Ácido Ferúlico 22,6 19,4 60,1 79,1 47,3
Resveratrol 0 0 47,5 28,8 2,0
*Resultado expresso em percentual da atividade antioxidante de acordo com as equações descritas para cada método in vitro.
** Resultado expresso em função do decaimento do sinal analítico do antioxidante após reação com o radical OH [LIMA, 2010].
108
Tabela 13: Classificação dos diferentes compostos fenólicos testados em função do método utilizado
e do radical gerado. A concentração de todos os compostos fenólicos é de 50 µmol L
-1
(RUT: rutina;
QUE: quercetina; RES: resveratrol; CAF: ácido cafeico; FER: ácido ferúlico).
Ensaio Radical testado Capacidade antioxidante
DPPH DPPH
•
RUT=CAF>QUE>FER>RES
Fluorimetria (ACAP) ROO
•
QUE>CAF>RUT>FER>RES
Fluorimietria (Fenton) HO
•
CAF=QUE>RUT>FER>RES
HPLC-UV (fotólise H
2
O
2
) HO
•
RUT>CAF=QUE=FER>RES
Fotometria (fotólise H
2
O
2
) HO
•
RUT>FER>QUE>RES>CAF
4.4 Determinação da concentração de ERO intracelular
O estudo comparativo da atividade antioxidante in vitro e in vivo de extratos
de plantas visa buscar uma correlação entre ambos os ensaios, e, com isso,
classificar estas espécies quanto ao seu “real” poder antioxidante. A correlação
almejada é verificar se os extratos de plantas que apresentam a melhor e a pior
capacidade antioxidante in vitro, também exibem este comportamento num ensaio in
vivo, sem causar danos aos organismos aos quais foram expostos.
Os resultados obtidos com a metodologia proposta foram avaliados em
ensaios in vivo, utilizando hepatócitos do peixe zebra (Danio rerio), expostos por 4
horas aos extratos das plantas P. guajava e C. citratus (melhor e pior desempenho
in vitro, respectivamente, segundo o método fluorimétrico). Os resultados obtidos
mostraram que a exposição dos hepatócitos aos extratos das plantas alterou o
número de células viáveis (Figura 34) no caso do extrato de P. guajava 1000 mg L
-1
,
ou seja, houve morte celular com a exposição deste extrato na maior concentração.
Já para os outros extratos testados, não verificou-se alteração no número de células
viáveis.
109
0
20000000
40000000
60000000
80000000
100000000
120000000
Contro
l
e
PG_100
0
PG
_
200
PG
_
100
CC_100
0
CC_200
CC_1
0
0
PG_1000: P. guajava 1000 mg/L
PG_200: P. guajava 200 mg/L
PG_100: P. guajava 100 mg/L
CC_1000: C. citratus 1000 mg/L
CC_200: C. citratus 200 mg/L
CC_100: C. citratus 100 mg/L
0
20000000
40000000
60000000
80000000
100000000
120000000
Contro
l
e
PG_100
0
PG
_
200
PG
_
100
CC_100
0
CC_200
CC_1
0
0
PG_1000: P. guajava 1000 mg/L
PG_200: P. guajava 200 mg/L
PG_100: P. guajava 100 mg/L
CC_1000: C. citratus 1000 mg/L
CC_200: C. citratus 200 mg/L
CC_100: C. citratus 100 mg/L
Figura 34: Resultados obtidos para o teste de viabilidade celular, sendo que o número de células
viáveis foi afetado apenas para células expostas ao extrato de
P. guajava 1000 mg L
-1
.
Além disso, observou-se uma redução da concentração de ERO intracelular
em forma dose-dependente nos hepatócitos expostos a P. guajava (p<0,05), sem se
observar efeito antioxidante no ensaio com C. citratus (p>0,05), como mostrado na
Figura 35.
0
1000000
2000000
3000000
4000000
Figura 35: Resultados obtidos para a determinação da concentração de ERO intracelular, em que se
observa uma redução da concentração de ERO intracelular nos hepatócitos expostos ao extrato de
P.
guajava
(PG), sem se observar alteração para os hepatócitos expostos ao extrato de C. citratus (CC).
Contr ole
P
G_
1000
P
G_
2
0
0
PG
_
100
CC
_1
000
CC_2 0 0
C
C_1
0
0
PG_1000: P. guajava 1000 mg/L
PG_200: P. guajava 200 mg/L
PG_100: P. guajava 100 mg/L
CC_1000: C. citratus 1000 mg/L
CC_200: C. citratus 200 mg/L
CC_100: C. citratus 100 mg/L
0
1000000
2000000
3000000
4000000
tr ole
P
G_
1000
P
G_
2
0
0
PG
_
100
CC
_1
000
CC_2 0 0
C
C_1
0
0
Con
PG_1000: P. guajava 1000 mg/L
PG_200: P. guajava 200 mg/L
PG_100: P. guajava 100 mg/L
CC_1000: C. citratus 1000 mg/L
CC_200: C. citratus 200 mg/L
CC_100: C. citratus 100 mg/L
110
Os resultados dos ensaios in vivo corroboram os resultados dos ensaios in
vitro, uma vez que a amostra de P. guajava (amostra 01, Tabela 10) apresentou
capacidade antioxidante, enquanto a amostra de C. citratus (amostra 02, Tabela 10)
– a amostra que apresentou a pior capacidade antioxidante in vitro dentre todas as
testadas – não apresentou capacidade antioxidante intracelular, mesmo numa
concentração de 1000 mg L
-1
.
Baseado neste protocolo desenvolvido, ensaios futuros podem possibilitar
uma correlação muito mais abrangente entre métodos in vitro para radicais ROO e
OH com dados in vivo para os mesmos radicais livres estudados. Somente desta
forma, a avaliação quantitativa de espécies antioxidantes (plantas medicinais e
compostos fenólicos) pode ser realizada e concluída, uma vez que ensaios
baseados em metodologias independentes e com princípios físicos de medida do
sinal analítico também diferentes, apresentam, muitas vezes, resultados
contraditórios ou desordenados de um ponto de vista classificatório para espécies
antioxidantes.
4.5 Conclusões parciais referentes aos ensaios fluorimétricos
1) As metodologias propostas permitem a determinação da capacidade
antioxidante in vitro de extratos de plantas contra radicais peroxila (seção 4.2.1) e
hidroxila (seção 4.2.2), através da detecção indireta destas ERO por fluorimetria
empregando DCFH como substrato. A diferença relativa entre os valores de
fluorescência gerados ao final do tempo de reação na presença e na ausência das
ERO é considerada como sendo a medida da capacidade antioxidante.
2) Pelos resultados dos ensaios in vitro, é possível constatar que as diferentes
metodologias resultam em diferentes respostas para a capacidade antioxidante de
uma mesma substância. Contra radicais peroxila, a P. guajava foi a planta que
apresentou a melhor resposta antioxidante e, em contraste, a C. citratus apresentou
o pior desempenho. As plantas M. chamomilla, B. genistelloides e A. satureoides
apresentam, estatisticamente, o mesmo desempenho quanto à capacidade
antioxidante contra radicais peroxila. Já contra radicais hidroxila, a P. guajava
111
também foi a planta que apresentou a melhor capacidade antioxidante, seguida pela
B. genistelloides. As plantas M. chamomilla, A. satureoides e C. citratus apresentam,
estatisticamente, o mesmo desempenho quanto à capacidade antioxidante contra
radicais hidroxila.
3) Os resultados obtidos com os ensaios in vivo tiveram boa correlação com
os ensaios in vitro, na medida em que os hepatócitos do peixe zebra expostos ao
extrato da P. guajava (melhor desempenho in vitro) mostraram uma redução na
concentração de ERO intracelular, sem se observar efeito antioxidante no ensaio
com a C. citratus (pior desempenho antioxidante in vitro).
112
5 CONCLUSÕES FINAIS
1) Apesar dos diferentes resultados obtidos entre todos os métodos adotados,
chega-se a importantes conclusões. Todos os ensaios realizados fornecem, de
alguma forma, informações muito relevantes, mesmo o ensaio do DPPH (que não é
um radical encontrado no corpo humano), uma vez que ensaios in vitro servem
como uma pré-avaliação sobre a capacidade antioxidante das amostras. De fato,
neste caso houve uma boa correlação: a P. guajava apresentou efeito antioxidante
in vivo (e possuía o melhor desempenho in vitro), e o C. citratus não apresentou
efeito antioxidante in vivo (pior desempenho in vitro).
2) A capacidade antioxidante das plantas é específica para cada método e
depende da concentração da amostra. Na concentração de 1000 mg L
-1
, que é a
concentração que apresenta o menor valor de coeficiente de variação para todos os
extratos de plantas, chega-se à seguinte ordem decrescente de capacidade
antioxidante:
Voltametria (Fenton): B. genistelloides = M. chamomilla L. > C. citratus = P.
guajava = A. satureoides
Fluorimetria (Fenton): P. guajava > B. genistelloides > C. citratus = A.
satureoides = M. chamomilla L.
Fluorimetria (ACAP): P. guajava > M. chamomilla L. = B. genistelloides = A.
satureoides > C. citratus
Verifica-se que diferentes classificações são obtidas pelos 2 métodos
fluorimétricos (ACAP x Fenton). Essas diferenças podem ser explicadas pelos
diferentes radicais utilizados (que possuem diferentes estabilidades, reatividades e
concentrações). Pelo fato de a B. genistelloides apresentar um melhor resultado
frente ao radical OH, pode-se supor que ela apresente uma característica quelante,
o que geraria menos radicais OH e, consequentemente, geraria uma capacidade
antioxidante maior frente a estes radicais.
Já as diferentes classificações obtidas entre a voltametria e fluorimetria (que
empregam a reação de Fenton) são mais difíceis de explicar. Ambos os métodos
utilizam a mesma geração radicalar, porém em concentrações diferentes
113
(voltametria: 100 mM Fe/500 mM H
2
O
2
; fluorimetria: 100 µM Fe/500 µM H
2
O
2
).
Entretanto, pode-se atribuir esta diferença às características das próprias plantas,
uma vez que foram colhidas num intervalo de 2 anos, ou seja, a composição química
e a concentração de metabólitos secundários são diferentes entre as amostras da
mesma espécie. O único resultado semelhante foi o fato de a A. satureoides e C.
citratus estarem na última posição nos 2 métodos (pior capacidade antioxidante).
3) A capacidade antioxidante dos compostos fenólicos é específica para cada
método e também depende da concentração desses compostos, e os diferentes
métodos in vitro nem sempre fornecem a mesma informação quantitativa frente às
diferentes ERO. Na concentração de 50 µM (concentração média utilizada neste
estudo), verifica-se que o meio reacional desempenha um papel-chave no valor da
capacidade antioxidante e que, dependendo da forma como é gerado o radical e do
princípio da medida instrumental, os resultados obtidos muitas vezes são
conflitantes. Todavia, assim como no caso dos extratos de plantas, é possível
separar alguns compostos em grupos de diferentes reatividades.
4) Analisando-se os prós e contras dos métodos desenvolvidos, pode-se
constatar que (i) para os métodos fluorimétricos, as grandes vantagens são o tempo
de análise (que permite a análise de um grande número de amostras em replicatas)
e o baixo consumo de reagentes (o volume total adicionado em cada poça é de 165
µL), além de ser um método que não apresenta uma grande desvantagem; (ii) já no
método eletroquímico, a grande desvantagem é, sem dúvida, o tempo de análise
(limpeza do eletrodo, preparação da SAM, etc.), que permite a análise de poucas
amostras em um único dia. Porém, as possibilidades para futuros trabalhos são
enormes. Escolhendo-se apropriadamente a camada que recobre o eletrodo, abre-
se um enorme leque de opções, pois, além das informações a respeito da interação
entre composto antioxidante e radical gerado, é possível obter tais informações em
um sistema biomimético, ou seja, além da determinação da capacidade antioxidante,
é possível determinar como se dá a interação entre radical livre e camada utilizada.
Assim, trabalhos que selecionem camadas apropriadas para o recobrimento do
eletrodo (como lipossomas, lipídios e proteínas) serão de extrema importância, já
que fornecerão resultados com um substrato mais apropriado, ou seja, substâncias
encontradas no corpo humano. Além disso, existe a facilidade de este método ser
114
adaptado para testes com diferentes ERO e há a possibilidade de miniaturização
dos eletrodos, o que permite uma grande interatividade com outras disciplinas.
5) Em vista de todos os resultados aqui apresentados e discutidos, fica a
pergunta: afinal, qual é o melhor método para a avaliação da capacidade
antioxidante de amostras biológicas?
Certamente é um método que utilize o radical hidroxila, que é uma das
espécies mais danosas ao corpo humano. Todavia, como o presente trabalho
mostrou de forma clara, resultados conflitantes são encontrados mesmo quando se
trabalha com o mesmo radical, mas em condições diferentes (concentração de
reagentes, pH, meio reacional, sinal analítico investigado, etc.). Com isso, é de se
esperar que resultados em ensaios in vivo também apresentem certa disparidade, já
que as condições fisiológicas variam de pessoa para pessoa. Além disso, os ensaios
aqui apresentados possuem um tempo curto de geração radicalar (5 e 30 min para
os radicais HO e ROO, respectivamente). Novamente, ao transferir-se esse fato para
o que acontece no corpo humano, deve-se ter em mente que os estudos in vivo
deverão levar em consideração questões como a absortividade e o transporte dos
compostos analisados, para que estes estejam presentes em locais próximos aos
sítios onde e no momento em que houver a geração de ERO in vivo.
115
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALLARA, D.L. Critical issues in applications of Self-Assembled Monolayers.
Biosensors and Bioelectronics, v. 10, p. 771 – 783, 1995.
AL-FATIMI, M. et al. Antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities of selected
medicinal plants from Yemen. Journal of Ethnopharmacology, v. 111, p. 657 –
666, 2007.
AMADO, L.L. et al. A method to measure total antioxidant capacity against peroxyl
radicals in aquatic organisms: application to evaluate microcystins toxicity. Science
of the Total Environment, v. 407, p. 2115 – 2123, 2009.
AMEH, S.J. et al. Current phytotherapy – a perspective on the science and regulation
of herbal medicine. Journal of Medicinal Plants Research, v. 4, p. 72 – 81, 2010.
ANDERSEN, Ø.M.; MARKHAM, K.R. Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and
Applications. Boca Raton: CRC Press, 2006.
BAIN, C.D. et al. Formation of monolayer films by the spontaneous assembly of
organic thiols from solution onto gold. Journal of the American Chemical Society,
v. 111, p. 321 – 335, 1989.
BALUNAS, M.J.; KINGHORN, A.D. Drug discovery from medicinal plants. Life
Sciences, v. 78, p. 431 – 441, 2005.
BARREIROS, A.L.B.S.; DAVID, J.M.; DAVID, J.P. Estresse oxidativo: relações entre
geração de espécies reativas e defesa do organismo. Química Nova, v. 29, p. 113 –
123, 2006.
BENZIE, I.F.F. et al. Consumption of green tea causes rapid increase in plasma
antioxidant power in humans. Nutrition and Cancer, v. 34, p. 83 – 87, 1999.
BHATENA, S.J.; VELASQUEZ, M.T. Beneficial role of dietary phytoestrogens in
obesity and diabetes. American Journal of Clinical Nutrition, v. 76, p. 1191 –
1201, 2002.
BLAND, J.S. Phytonutrition, phytotherapy, and phytopharmacology. Alternative
Therapies in Health and Medicine, v. 2, p. 73 – 76, 1996.
116
CAI, H. et al. Determination of the flavone tricin in human plasma by high-
performance liquid chromatography. Biomedical Chromatography, v. 17, p. 435 –
439, 2003.
CAO, G.; PRIOR, R.L. Comparison of different analytical methods for assessing total
antioxidant capacity of human serum. Clinical Chemistry, v. 44, p. 1309 – 1315,
1998.
CAPASSO, R. et al. Phytotherapy and quality of herbal medicines. Fitoterapia, v. 71,
p. S58 – S65, 2000.
CARVALHO, L.M et al. Voltametria de Micropartículas Imobilizadas: fundamentos e
aplicações analíticas. Química Nova, aceito para publicação, 2010.
CLÉMENT, M.V.; POTON, A.; PERVAIZ, S. Apoptosis induced by hydrogen peroxide
is mediated by decreased superoxide anion concentration and reduction of
intracellular milieu. FEBS Letters, v. 440, p. 13 – 18, 1998.
COOK, N.C.; SAMMAN, S.; Flavonoids: chemistry, metabolism, cardioprotective
effects, and dietary sources. The Journal of Nutritional Biochemistry, v. 7, p. 66 –
76, 1996.
CUSTÓDIO, T.A.S. Azeites extra-virgem comerciais: composição em
compostos voláteis e relação com parâmetros químicos de qualidade. 2009.
Dissertação de Mestrado – Universidade do Porto, Porto, 2009.
DRÖGE, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological
Reviews, v. 82, p. 47 – 95,2002.
DUDONNE, S.E. et al. Comparative study of antioxidant properties and total phenolic
content of 30 plant extracts of industrial interest using DPPH, ABTS, FRAP, SOD,
and ORAC assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 57, p. 1768 –
1774, 2009
FIGUEIRINHA, A. et al. Cymbopogon citratus leaves: characterization of flavonoids
by HPLC-PDA-ESI/MS/MS and an approach to their potential as a source of
bioactive polyphenols. Food Chemistry, v. 110, p. 718 – 728, 2008.
117
FLOCCARI, F. et al. Oxidative stress and uremia. Medicinal Research Reviews, v.
25, p. 473 – 486, 2005.
FREI, B. Reactive oxygen species and antioxidant vitamins: mechanisms of action.
The American Journal of Medicine, v. 97, suplemento 3, p. 5S – 13S, 1994.
GHISELLI, A. et al. Total antioxidant capacity as a tool to assess redox status: critical
review and experimental data. Free Radical Biology and Medicine, v. 29, p. 1106 –
1114, 2000.
GOBBO-NETO, L.; LOPES, N.P. Plantas medicinais: fatores de influência no
conteúdo de metabólitos secundários. Química Nova, v. 30, p. 374 – 381, 2007.
GONZÁLEZ, G.L.L. Development of new electroanalytical methods for the
determination of hydrogen peroxide and oxygen radicals. 2008. Tese – Ernst-
Moritz-Arndt-Universität Greifswald, Greifswald, Alemanha, 2008.
GRUNBERGER, G.; JEN, K.L.; ARTISS, J.D. The benefits of early intervention in
obese diabetic patients with FBCx(TM) – a new dietary fibre. Diabetes – Metabolism
Research and Reviews, v. 23, p. 56 – 62, 2007.
GUGLIUCCI, A.; MENINI, T. Three different pathways for human LDL oxidation are
inhibited in vitro by water extracts of the medicinal herb Achyrocline satureoides. Life
Sciences, v. 71, p. 693 – 705, 2002.
GUTIÉRREZ, R.M.P.; MITCHELL, S.; SOLIS, R.V. Psidium guajava: A review of its
uses, phytochemistry and pharmacology. Journal of Ethnopharmacology, v. 117,
p. 1 – 27, 2008.
HALLIWELL, B. et al. The characterization of antioxidants. Food and Chemical
Toxicology, v. 33, p. 601 – 617, 1995.
HALLIWELL, B.; CLEMENT, M.V.; LONG, L.H. Hydrogen peroxide in the human
body. FEBS Letters, v. 486, p. 10 – 13, 2000.
HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.C.M. Free Radicals in Biology and Medicine. 4.
ed. New York: Oxford University Press, 2007.
118
HAMPTON, M.B.; ORRENIUS, S. Dual regulation of caspase activity by hydrogen
peroxide: implications for apoptosis. FEBS Letters, v. 414, p. 552 – 556, 1997.
HEIM, K.E.; TAGLIAFERRO, A.R.; BOBILYA, D.J. Flavonoid antioxidants: chemistry,
metabolism and structure-activity relationships. Journal of Nutritional
Biochemistry, v. 13, p. 572 – 584, 2002.
HOLLMAN, P.C.H. et al. Relative bioavailability of the antibioxidant flavonoid
quercetin from various foods in Man. FEBS Letters, v. 418, p. 152 – 156, 1997.
HUANG, D.; OU, B.; PRIOR, R.L. The chemistry behind antioxidant capacity assays.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 53, p. 1841 – 1856, 2005.
HÜSKEN, A. et al. Resveratrol glucoside (Piceid) synthesis in seeds of transgenic
oilseed rape (Brassica napus L.). Theoretical and Applied Genetics, v. 111, p.
1553 – 1562, 2005.
HYUN, J.; CHILKOTI, A. Surface-initiated free radical polymerization of polystyrene
micropatterns on a Self-Assembled Monolayer on gold. Macromolecules, v. 34, p.
5644 – 5652, 2001.
JANIK, I.; BARTELS, D.M.; JONAH, C.D. Hydroxyl radical self-recombination
reaction and absorption spectrum in water up to 350ºC. Journal of Physical
Chemistry A, v. 111, p. 1835 – 1843, 2007.
KATSUBE, T. et al. Screening for antioxidant activity in edible plant products:
comparison of low-density lipoprotein assay, DPPH radical scavenger assay, and
Folin-Ciocalteu assay. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 52, p. 2391
– 2396, 2004.
KRIS-ETHERTON, P.M. et al. Bioactive compounds in foods: their role in the
prevention of cardiovascular disease and cancer. American Journal of Medicine, v.
113, suplemento 9B, p. 71 – 88, 2002.
LEHNINGER, A.L. Princípios de bioquímica. 2ª ed, São Paulo: Sarvier, 1995.
LI, B.Q. et al. Flavonoid baicalin inhibits HIV-1 infection at the level of viral entry.
Biochemical and Biophysical Research Communication, v. 276, p. 534 – 538,
2000.
119
LIMA, F. Estudo fotoquímico da ação anti-radicalar de compostos polifenólicos
empregando espectrofotometria e HPLC-UV. 2010. Dissertação (Mestrado em
Química) - Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, 2010.
LIOCHEV, S.I.; FRIDOVICH, I. The role of
2
O
•
−
in the production of : in vitro and
in vivo. Free Radical Biology and Medicine, v. 16, p. 29 – 33, 1994.
HO
•
LOVE, J.C. et al. Self-Assembled Monolayers of thiolates on metals as a form of
nanotechnology. Chemical Reviews, v. 105, p. 1103 – 1169, 2005.
MARKOVICH, I.; MANDLER, D. Disorganized self-assembled monolayers (SAMs):
the incorporation of amphiphilic mlecules. The Analyst, v. 126, p. 1850 – 1856,
2001.
MEHTA, R.A. et al. Engineered polyamine accumulation in tomato enhances
phytonutrient content, juice quality, and vine life. Natural Biotechnology, v. 206, p.
613 – 618, 2002.
MELO, S.F. et al. Effect of the Cumbopogon citratus, Maytenus ilicifolia and
Baccharis genistelloides extracts against the stannous chloride oxidative damage in
Escherichia coli. Mutation Research, v. 496, p. 33 – 38, 2001.
MOREIRA, F.P.M. et al. Flavonóides e triterpenos de Baccharis pseudotenuifolia –
bioatividade sobre Artemia salina. Química Nova, v. 26, p. 309 – 311, 2003.
NETZ, P.A.; ORTEGA, G.G. Fundamentos de Físico-química: uma abordagem
conceitual para as ciências farmacêuticas. 2ª reimpressão revisada, Porto Alegre:
Artmed, 2002.
NEWMAN, D.J.; GRAGG, G.M. Natural products as sources of new drugs over the
last 25 years. Journal of Natural Products, v. 70, p. 461 – 477, 2007.
NEYENS, E.; BAEYENS, J. A review of classic Fenton’s peroxidation as an
advanced oxidation technique. Journal of Hazardous Materials, v. B98, p. 33 – 50,
2003.
OLMOS, A.; GINER, R.M.; MÁNEZ, S. Drugs modulating the biological affects of
peroxynitrite and related nitrogen species. Medicinal Research Reviews, v. 27, p. 1
– 64, 2007.
120
PACKER, L.; WITT, E.H.; TRITSCHLER, H.J. Alpha-lipoic acid as a biological
antioxidant. Free Radical Biology and Medicine, v. 19, p. 227 – 250, 1995.
PIETTA, P.G. et al. Relationship between rate and extent of catechin absorption and
plasma antioxidant status. Biochemistry and Molecular Biology International, v.
46, p. 895 – 903, 1998.
PIETTA, P.G. Flavonoids as Antioxidants. Journal of Natural Products, v. 63, p.
1035 – 1042, 2000.
PLAZA, C.V. Investigação fitoquímica e avaliação da atividade antioxidante das
folhas e frutos de Eugenia jambolana Lam. (Myrtaceae). 2007. Dissertação
(Mestrado em Química) – Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2007.
PLOSCH, T. Et al. Reduction of cholesterol absorption by dietary plant sterols and
stanols in mice is independent of the Abcg5/8 transporter. Journal of Nutrition, v.
136, p. 2135 – 2140, 2006.
PRIOR, R.L.; CAO, G.H. Analysis of botanicals and dietary supplements for
antioxidant capacity: a review. Journal of AOAC International, v. 83, p. 950 – 956,
2000.
PUPPO, A.; HALLIWELL, B. Formation of hydroxyl radicals from hydrogen peroxide
in the presence of iron: is haemoglobin a biological Fenton reagent? Biochemical
Journal, v. 249, p. 185 – 190, 1988.
RATTANACHAIKUNSOPON, P.; PHUMKHACHORN, P. Contents and antibacterial
activity of flavonoids extracted from leaves of Psidium guajava. Journal of Medicinal
Plants Research, v. 4, p. 393 – 396, 2010.
RE, R. et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation
decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine, v. 26, p. 1231 – 1237,
1999.
REGOLI, F.; WINSTON, G.W. Quantification of total scavenging capacity of
antioxidants for peroxynitrite, peroxyl radicals, and hydroxyl radicals. Toxicology
and Applied Pharmacology, v. 156, p. 96 – 105, 1999.
121
REIN, D. Et al. Transgenic flavonoid tomato intake reduces C-reactive protein in
human C-reactive protein transgenic mice more than wild-type tomato. Journal of
Nutrition, v. 136, p. 2331 – 2337, 2006.
RIBEIRO, S.M.R. A formação e os efeitos das espécies reativas de oxigênio no meio
biológico. Bioscience Journal, v. 21, p. 133 – 149, 2005.
RUBINSTEIN, I.; FUJIHIRA, M.; RUSLING, J.F. Modified Electrodes. Wiley-VCH,
2007. (Encyclopedia of Electrochemistry, 10).
SÁNCHEZ-MORENO, C. Review: Methods used to evaluate the free radicals
scavenging activity in foods and biological systems. Food Science and Technology
International, v. 8, p. 121 – 137, 2002.
SCHEIBMEIR, H.D. et al. A review of free radicals and antioxidants for critical care
nurses. Intensive and Critical Care Nursisng, v. 21, p. 24 – 28, 2005.
SCHIJLEN, E.G. et al Pathway engineering for healthy phytochemicals leading to the
production of novel flavonoids in tomato fruit. Plant Biotechnology Journal, v. 4, p.
433 – 444, 2006.
SCHOLZ, F. et al. Indirect electrochemical sensing of radicals and radicals
scavengers in biological matrices. Angewandte Chemie International Edition, v.
46, p. 8079 – 8081, 2007.
SCHREIBER, F. Structure and growth of self-assembling monolayers. Progress in
Surface Science, v. 65, p. 151 – 256, 2000.
SCHWENTLICK, K. Et al. Chemische Kinetic. Leipzig: Verlag Chemie, 1973.
SERAFINI, M.; MAIANI, G.; FERRO-LUZZI, A. Effect of ethanol on red wine tannin-
protein (BSA) interactions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 45, p.
3148 – 3151, 1997.
STRYER, L. Biochemistry. 2ª ed, USA: Freeman and Company Limited Publishers,
1981.
122
TAKANASHI, T. et al. Fluorophotometric quantitation of oxidative stress in the retina
in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science, v. 38, p. 2721 – 2728,
1997.
ULMAN, A. Formation and structure of self-assembled monolayers. Chemical
Reviews, v. 96, p. 1533 – 1554, 1996.
VEIGA JUNIOR, V.F.; PINTO, A.C. Plantas medicinais: cura segura? Química Nova,
v. 28, p. 519 – 528, 2005.
VERDI, L.G.; BRIGHENTE, I.M.C.; PIZZOLATTI, M.G. Gênero Baccharis
(Asteraceae): aspectos químicos, econômicos e biológicos. Química Nova, v. 28, p.
85 – 94, 2005.
VERZA, S.G. et al. Avaliação das variáveis analíticas do método de Folin-Ciocalteu
para determinação do teor de taninos totais utilizando como modelo o extrato
aquoso de folhas de Psidium guavaja L. Química Nova, v. 30, p. 815 – 820, 2007.
VILLA, R.F.; GORINI, A. Pharmacology of lazaroids and brain energy metabolism: a
review. Pharmacological Reviews, v. 49, p. 99 – 136, 1997.
WARIS, G.; AHSAN, H. Reactive oxygen species: role in the development of câncer
and various chronic conditions. Journal of Carcinogenesis, v. 5, p. 14 – 21, 2006.
WAYNER, D.D.M. et al. Quantitative measurement of the total peroxyl radical-
trapping antioxidant capacity of human blood plasma by controlled peroxidation.
FEBS Letters, v. 187, p. 33 – 37, 1985.
WHITESIDES, G.M.; GRZYBOWSKI, B. Self-assembly at all scales. Science, v. 295,
p. 2418 – 2421, 2002.
WHO guidelines for assessing quality of herbal medicines with reference to
contaminants and residues, 2007.
WIKIPEDIA – phytotherapy. Disponível em: <http://en.wikipedia.org/wiki/Phytothera-
py> Acesso em maio 2010.
123
WINSTON, G.W. et al. A rapid gas chromatographic assay for determining oxyradical
scavenging capacity of antioxidants and biological fluids. Free Radical Biology and
Medicine, v. 24, p. 480 – 493, 1998.
YAMASAKI, H.; SAKIHAMA, Y.; IKEHARA, N. Flavonoid-peroxidase reaction as a
detoxification mechanism of plant cell against H
2
O
2
. Plant Physiology, v. 115, p.
1405 – 1412, 1997.
YAO, L.H. et al. Flavonoids in food and their health benefits. Plant Foods for
Human Nutrition, v. 59, p. 113 – 122, 2004.
ZHAO, J. Nutraceuticals, nutritional therapy, phytonutrients, and phytotherapy for
improvement of huma health: a perspective on plant biotechnology application.
Recent Patents on Biotechnology, v. 1, p. 75 – 97, 2007.
ZOULIS, N.E.; EFSTATHIOU, C.E. Preconcentration at a carbon-paste electrode and
determination by adsorptive-stripping voltammetry of rutin and other flavonoids.
Analytica Chimica Acta, v. 320, p. 255 – 261, 1996.
124
APÊNDICES
APÊNDICE 1 – SHOLZ, F. et al. Indirect electrochemical sensing of radicals
and radicals scavengers in biological matrices. Angewandte Chemie
International Edition, v. 46, p. 8079 – 8081, 2007.
128
APÊNDICE 2 – HILGEMANN, M. et al. Electrochemical assay to quantify the
hydroxyl radical scavenging activity of medicinal plant extracts.
Electroanalysis, v. 22, p. 406 – 412, 2010
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