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ANA CAROLINA PORTUGAL PORTELLA
ANÁLISE DAS MOLÉCULAS DE MATRIZ EXTRACELULAR NAS
VIAS DE MIGRAÇÃO DAS CÉLULAS DE CRISTA NEURAL EM
EMBRIÕES DE AVES (Gallus gallus)
Dissertação apresentada como
requisito parcial à obtenção do grau
de Mestre em Biologia Celular e
Molecular, Curso de pós-graduação
em Biologia Celular e Molecular,
Setor de Ciências Biológicas,
Universidade Federal do Paraná.
Orientador (a): Prof.ª Dr.ª Cloris
Ditzel Faraco
CURITIBA
2006
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ANA CAROLINA PORTUGAL PORTELLA
ANÁLISE DAS MOLÉCULAS DE MATRIZ EXTRACELULAR NAS
VIAS DE MIGRAÇÃO DAS CÉLULAS DE CRISTA NEURAL EM
EMBRIÕES DE AVES (Gallus gallus)
Dissertação apresentada como
requisito parcial à obtenção do grau
de Mestre em Biologia Celular e
Molecular, Programa de Pós-
graduação em Biologia Celular e
Molecular, Setor de Ciências
Biológicas, Universidade Federal do
Paraná.
Orientador (a): Prof.ª Dr.ª Cloris
Ditzel Faraco
CURITIBA
2006
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Dedico este trabalho
especialmente á amiga e
orientadora Cloris, por todos os
momentos de compreensão,
apoio e paciência durante estes
anos. Muito obrigada por sua
confiança e por ter me dado
tantas oportunidades, todas da
minha vida!
iii
AGRADECIMENTOS
1. Agradeço a Deus, por ter me concedido saúde, paciência e perseverança
para terminar este trabalho.
2. Especialmente a minha avó Leda, pelo seu amor e carinho, e pela
oportunidade que me deu de chegar à universidade. Tudo que sou hoje
devo a ela. Saudades...
3. A minha família, em especial a minha mãe Ana Marilis e minha tia Mílcea
que por tantos finais de semana me acompanharam nos experimentos.
4. Ao meu noivo Fabio pelo seu amor, paciência e apoio incondicional
durante a realização deste trabalho.
5. A Mary, pelo apoio e compreensão, principalmente durantes as últimas
semanas do trabalho.
6. A amiga Prof.ª Lea Borges, pela amizade, pelo incentivo, apoio, e por
acreditar no meu potencial.
7. Aos colegas de trabalho Aliete, Priscila, Erivan e Juliana por serem tão
compreensivos, pacientes e amigos nos momentos de dificuldade.
8. A todas as colegas do laboratório de Biologia do desenvolvimento da
UFPR, por todos os bons momentos compartilhados.
9. A Prof.ª Cecília Beatriz, por seus ensinamentos de histologia que me
ajudaram a ingressar no mestrado.
10. Aos professores do programa de pós-graduação em Biologia Celular e
Molecular pelos ensinamentos tão importantes para minha formação.
“Se Deus fez um mundo de tantas
belezas foi para que sejamos felizes!”
Baden Powell
v
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES..............................................................................vii
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................viii
LISTA DE ABREVIATURAS...........................................................................ix
RESUMO..............................................................................................................x
ABSTRACT.........................................................................................................xi
1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................1
2. OBJETIVOS...................................................................................................15
3. MATERIAIS E MÉTODOS..........................................................................16
4. RESULTADOS...............................................................................................20
5. DISCUSSÃO...................................................................................................32
6. CONCLUSÃO.................................................................................................36
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................38
vi
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
ILUSTRAÇÃO nº. 1
Clivagem, formação do epiblasto e hipoblasto,
migração das células mesenquimais através
da linha primitiva. (Fonte: WOLPERT et al., 2000)..............................................1
ILUSTRAÇÃO nº. 2
Migração das células do epiblasto para o
interior da blastocele através da linha primitiva.
Nó de Hensen. (Fonte: WOLPERT et al., 2000)....................................................2
ILUSTRAÇÃO nº. 3
Regressão do nó de Hensen, formação da prega
cefálica, tubo neural e somitos. (Fonte: WOLPERT et al., 2000)..........................3
ILUSTRAÇÃO nº. 4
Sinais do tubo neural e da notocorda para
Diferenciação dos somitos (Fonte: WOLPERT et al., 2000).................................5
ILUSTRAÇÃO nº. 5
Somito: dermátomo (D), miótomo (M)
e esclerótomo (E). (Fonte: WOLPERT et al., 2000).............................................5
ILUSTRAÇÃO nº 6
Vias de migração das células da crista neural.
Via dorsolateral. Via ventral. (Fonte: WOLPERT et al., 2000).....................8
vii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Somito anterior de embriões das
raças Sedosa japonesa e White Leghorn
nos estágios 24, 26 e 28 do desenvolvimento HH.
Morfologia coloração hematoxilina – eosina.......................................................21
FIGURA 2 - Somitos anteriores e posteriores
de embriões das raças Sedosa japonesa e
White Leghorn nos estágios 26 do
desenvolvimento. Tratamento com
hialuronidase e coloração com alcian blue...........................................................23
FIGURA 3 - Embriões de ave das raças
Sedosa japonesa e White Leghorn nos
estágios 22 e 24 do desenvolvimento.
Expressão do condroitin sulfato............................................................................25
FIGURA 4 - Embriões de ave das raças
Sedosa japonesa e White Leghorn nos
estágios 26 e 28 do desenvolvimento.
Expressão do condroitin sulfato............................................................................26
FIGURA 5 - Embriões de ave da raça
White Leghorn nos estágio 24, 26 e 28
do desenvolvimento. Expressão do
condroitin sulfato na via ventral...........................................................................27
FIGURA 6 - Embrião da raça White
Leghorn no estágio 28 do desenvolvimento.
Expressão do condroitin sulfato acima do tubo neural.........................................27
FIGURA 7 - Embriões de ave das raças
Sedosa japonesa e White Leghorn nos
estágios 26 e 28 do desenvolvimento.
Expressão do colágeno IX....................................................................................29
FIGURA 8 - Embriões de ave das raças
Sedosa japonesa e White Leghorn no
estágios 28 do desenvolvimento.
Expressão do colágeno IX na via ventral.............................................................29
FIGURA 9 - Embriões de ave da raça
White Leghorn nos estágios 26 e 28
do desenvolvimento. Expressão do colágeno II..................................................30
FIGURA 10 - Embriões de ave das raças
Sedosa japonesa e White Leghorn nos
estágios 26 e 28 do desenvolvimento...................................................................31
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
BMP – Proteína morfogenética de osso.]
BSA – Soroalbumina bovina.
GRD – Gânglio de raiz dorsal.
IgG – Imunoglobulina G
IgM – Imunoglobulina M
NT – Notocorda.
PBS – Salina tamponada com fosfato.
PNA – Lectina de amendoin (Arachis hypogeae)
TN – Tubo neural.
ix
RESUMO
Após o fechamento do tubo neural, células da crista neural segregam-se da porção
dorsal do tubo e migram por duas vias; a via ventral entre o somito e o tubo neural
originando gânglios simpáticos e sensoriais, células de Schwann e células cromafins; e a
via dorsolateral, originando melanócitos. Algumas moléculas parecem impedir a entrada
de células da crista em somitos posteriores e em alguns sítios do tronco do embrião
como por exemplo o espaço perinotocordal. Estas moléculas são o condroitin sulfato,
colágeno II, colágeno IX e ácido hialurônico, que além de repelirem células de crista
neural, estão envolvidas com a condrogênese. Foram realizados estudos para analisar a
presença ou ausência destas moléculas nas vias de migração de embriões de ave nos
estágios 22, 24, 26 e 28 HH das raças Sedosa Japonesa (SB) e White Leghorn (WL).
Embriões da raça SB apresentam um padrão diferenciado de migração das células de
crista neural precursoras de melanócitos, elas invadem a via ventral e colonizam regiões
ventrais. Já embriões da raça WL possuem o padrão normal de migração para as células
de crista neural. Embriões da raça WL possuem uma expressão maior de condroitin
sulfato, colágeno IX e ácido hialurônico no espaço perinotocordal e na via ventral de
migração que embriões de SB. A presença do colágeno II, ocorre somente em embriões
da raça WL nos estágios 26 e 28 HH. Já a fibronectina está presente na via dorsolateral
de ambas as raças e também na via ventral de embriões da raça SB, parecendo inibir a
condrogênese. Estes dados sugerem que a formação da precartilagem das vértebras
ocorre antes em embriões da raça WL e que, as moléculas de matriz extracelular de
cartilagem são uma barreira química para as células de crista neural.
x
ABSTRACT
After the neural tube closure, neural crest cells segregate to the dorsal portion of neural
tube and migrate through two pathways: the ventral, between the somite and neural
tube, giving rise to sensorial and sympathetic ganglia, Schwann and cromaffins cells;
and the dorsolateral originating melanocytes. Some molecules seem to block the
entrance of neural crest cells in the posterior somites and other regions in the embryo,
for example the perinotochordal space. These molecules are chondroitin sulfate,
collagen II, collagen IX, and hialuronic acid, that besides repelling neural crest cells, are
involved in chondrogenesis. The absence or presence of these molecules in the
migration ways, was analyzed in stages 22, 24, 26 and 28 HH Silky chicken (SB) and
White Leghorn (WL) embryos . SB embryos have a different pattern for melanoblast
migration: as well as going dorsolaterally, these cells invade the ventral way and
colonize ventral regions.WL embryos melanoblasts have the normal pattern of neural
crest cells migration.WL embryos have more chondroitin sulfate, collagen IX and
hialuronic acid in the perinotochordal space and in the ventral way than SB embryos.
Collagen II appears only in WL embryos at stages 26 and 28 HH. Fibronectin is in the
dorsolateral pathway in both strains and in the ventral as well in SB embryos, where it
may inhibit chondrogenesis. These data suggest that the precartilage formation occurs
earlier in WL embryos than in SB embryos and that the extracellular matrix of cartilage
can act as a barrier to the neural crest cells.
xii
1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Embriões de ave são muito semelhantes aos embriões de mamíferos na
complexidade morfológica e no curso geral do desenvolvimento, porém são de
mais fácil obtenção e observação. O óvulo é fertilizado e o processo de clivagem
inicia-se ainda no oviduto da galinha, resultando em um disco de células
chamado blastodisco ou blastoderme. A camada de células superior é o epiblasto
que dará origem ao embrião propriamente dito e a camada inferior, o hipoblasto
dará origem a estruturas extraembrionárias.
ILUSTRAÇÃO nº. 1
Clivagem, formação do epiblasto e hipoblasto, migração das células
mesenquimais através da linha primitiva.
(Fonte: WOLPERT et al., 2000)
A região central da blastoderme, situada sobre uma cavidade (blastocele), é
translúcida quando observada de cima, portanto denomina-se área pelúcida, já a
região mais externa da blastoderme, onde as células estão sobrepostas torna-se
mais escura, sendo então chamada de área opaca. Há um espessamento de células
no epiblasto, chamado de zona marginal posterior. Estas células vão definir tanto
o lado dorsal quanto a extremidade posterior do embrião. O início da gastrulação
é marcado pelo desenvolvimento da linha primitiva, que inicialmente é
visualizada como uma faixa mais densa estendendo-se da zona marginal superior
até a região central da área pelúcida. É através da linha primitiva que as células
do epiblasto, proliferando e migrando para o interior da blastocele, vão
posteriormente dar origem a células mesodérmicas e endodérmicas. Durante a
gastrulação, na extremidade anterior da linha primitiva forma-se uma
condensação de células, denominada nó de Hensen.
Quando a maior parte das células que originarão a mesoderme e endoderme
migrou para o interior da blastocele, a linha primitiva começa a regredir e o nó de
Hensen move-se em direção à extremidade posterior do embrião. A região
cefálica do embrião é demarcada anteriormente ao nó de Hensen, na extremidade
anterior do embrião por uma dobra da blastoderme composta por ectoderme e
endoderme. As células que migram do nó de Hensen enquanto este está
regredindo darão origem à notocorda e contribuirão para a formação dos somitos.
Á medida que o nó de Hensen regride, a notocorda e os somitos vão se formando
ILUSTRAÇÃO nº. 2
Migração das células do epiblasto para o interior da blastocele através da linha primitiva. Nó de
Hensen.
(Fonte: WOLPERT et al., 2000)
NÓ DE HENSEN
LINHA PRIMITIVA
anteriormente a ele, sendo que um par de somitos é formado a cada hora,
aproximadamente (Wolpert et al., 2000). O tubo neural começa a se desenvolver
como um par de pregas da ectoderme, enquanto a notocorda está se formando. O
dobramento e o fechamento do tubo neural começam na extremidade anterior
para a posterior.
Uma vez estabelecidos os somitos, a próxima mudança morfológica vem de
sinais indutivos emanados do tubo neural e notocorda. Sinais dorsalizantes
vindos do tubo neural e sinais ventralizantes vindos da notocorda competem
entre si, especificando o dermomiótomo e o esclerótomo respectivamente
(Spence et al.,1996). A placa mesodérmica que dá origem aos somitos sofre a
diferenciação mesmo quando isolada juntamente com os tecidos epiteliais
circundantes, seja em cultivo ou em transplantes, e a ordem crânio-caudal é
mantida mesmo quando a placa é invertida (Christ; Huang & Wilting,2000).
Quando a placa mesodérmica é cultivada sem contato com nenhum tecido, a
formação dos somitos não ocorre e as células tornam-se mesenquimais,
sugerindo que a segmentação da mesoderme paraxial em somitos pode ser
modulada por estruturas circundantes.
Alguns fatores de crescimento também parecem estar envolvidos com a
formação dos somitos. Na região posterior da placa mesodérmica o fator de
crescimento FGF-8 é fortemente expressado, enquanto que na região anterior, há
altos níveis de FGFR1 (Yamaguchi et al.,1994). Embriões de camundongos com
ILUSTRAÇÃO nº. 3
Regressão do nó de Hensen, formação da prega cefálica, tubo neural e somitos.
(Fonte: WOLPERT et al., 2000)
deficiência para FGFR1 não formam somitos. A sinalização por fatores de
crescimento pode promover um controle para a proliferação das células
mesenquimais da placa mesodérmica, antero-posteriormente. O controle da
segmentação da placa mesodérmica é realizado através de genes como mesp1, 2,
e ephA4, que estão envolvidos na polarização crânio-caudal da segmentação da
placa (Christ & Ordahl,1995).
Um mecanismo molecular de controle da formação dos somitos pode também
ser observado: a cada 90 minutos em embriões de ave o gene c-hairy-1 é
expressado nas células da mesoderme paraxial que vai formar os somitos. A
expressão deste gene ocorre como uma onda e é iniciada durante formação de
cada somito. O gene lunatic fringe também é expresso durante a formação dos
somitos da mesma maneira que o c-hairy-1. A diferenciação da placa
mesodérmica pode ser conseqüência de um número de ciclos de expressão de c-
hairy-1ou lunatic fringe, através de sinais emanados de estruturas circundantes
(Palmeirin et. al.,1997). Morfologicamente a maturação da placa mesodérmica é
caracterizada pela condensação de células e transição destas células de
mesenquimais para epiteliais. Esta epitelialização requer a expressão de um gene
denominado paraxis. Estudos demonstraram que a expressão deste gene e a
formação dos somitos requerem sinais da superfície da ectoderme e tubo neural
(Burgess et al.,1996). O controle da formação das estruturas dos somitos parece
envolver também os genes da família pax. Cada somito formado consiste de uma
bola de células epiteliais colunares com suas faces apicais voltadas para fora, e
com o interior preenchido por células mesenquimais. Em somitos recém
formados há uma expressão do gene pax-3, sendo que logo em seguida há uma
regulação negativa na expressão deste gene nas células mesenquimais do interior
do somito e nas células epiteliais da região ventral do somito, que por sua vez
começam a expressar o gene pax-1. A expressão do gene pax-1 pela porção
ventral do somito, precede a transição epitélio-mesenquimal das células, que
nada mais é do que a formação do esclerótomo (Muller et al.,1996). Cada somito
diferencia-se em três partes distintas: o dermátomo, o miótomo e o esclerótomo.
O esclerótomo localiza-se mais ventralmente e suas células possuem
características mesenquimais; elas convergem em direção á notocorda,
envolvendo-a, e mais tarde dão origem à coluna vertebral (vértebras e discos
intervertebrais). O tamanho do esclerótomo depende do equilíbrio entre sinais
dorsais e ventrais. Sinais dorsais que promovem o desenvolvimento do
dermomiótomo e inibem a formação do esclerótomo são derivados da superfície
dorsal do tubo neural, controlados pela expressão de genes da família wnt, já um
equilíbrio entre sinais vindos da notocorda e da mesoderme (Noggin, Shh e
BMPs) desempenham um importante papel na formação do esclerótomo
(McMahon et al.,1998). A formação de diferentes regiões no somito, também é
controlada por sinais vindos de estruturas adjacentes como o tubo neural e a
notocorda.
Durante a formação do esclerótomo a parte dorsolateral do somito paralela
à ectoderme tem seus limites definidos e suas características epiteliais mantidas.
Esta porção do somito é denominada dermátomo, e suas células vão contribuir
para a formação das camadas profundas da derme. A parte dorso-medial do
somito, localizada entre o dermátomo e o esclerótomo, é denominada miótomo.
As células do miótomo passam por um crescimento mais extensivo do que
células de qualquer outra parte do somito. Elas vão dar origem à musculatura
esquelética de todo o corpo, exceto dos músculos das regiões cefálicas e
ILUSTRAÇÃO nº. 4
Sinais do tubo neural e da notocorda para
diferenciação dos somitos
(Fonte: WOLPERT et al., 2000)
ILUSTRAÇÃO nº. 5
Somito: dermátomo (D), miótomo (M) e
esclerótomo (E).
(Fonte: WOLPERT et al., 2000)
D
M
E
TN
N
branquiais que têm origem do mesênquima da cabeça (Wolpert et al.,2000;
Patten,1957).
Logo após o fechamento do tubo neural, uma população de células segrega-se
de sua porção dorsal. Esta população de células é conhecida como crista neural.
Embora a crista neural seja constituída inicialmente por poucas células e
permaneça pouco tempo no desenvolvimento embrionário, sua capacidade
migratória, proliferativa e a pluripotencialidade de suas células é realmente
impressionante. A análise da crista neural engloba quase todas as características
do desenvolvimento tais como determinação, migração direcionada e
diferenciação celular, sendo ela portanto, um ótimo modelo para estudos. (Le
Douarin & Kalcheim,1999)
As células de crista neural distinguem-se das células do tubo neural, pois
sofrem transformação de epitélio para mesênquima. Esta transformação é
acompanhada por mudanças morfológicas e moleculares que incluem a perda da
morfologia neuroepitelial e aquisição de capacidade migratória. Para tanto, há
uma alteração nas moléculas de adesão celular das células de crista neural, que
inicia antes mesmo delas delaminarem do tubo neural (Krull,2000). Vários
fatores são essenciais para o início da migração das células da crista neural, como
por exemplo, a perda da lamina basal que circunda o tubo neural permitindo a
saída das células da crista neural. Uma hipótese é que a lamina basal seja
descontínua na região dorsal do tubo neural onde as células da crista neural se
localizam (Martins-Green and Erickson,1987). A migração das células da crista
neural é um processo altamente complexo, que depende tanto de espaço quanto
de tempo, e leva as células através de caminhos definidos para seus destinos
finais. A deposição de um substrato no qual as células de crista neural sejam
hábeis a migrar também é necessária.
Estabelece-se também claramente uma regionalização antero-posterior no
somito em formação. A compartimentalização de porções anteriores e posteriores
nos somitos é indispensável para o desenvolvimento da coluna vertebral e para o
desenvolvimento do sistema nervoso periférico. Estudos demonstraram que
axônios de neurônios motores e células da crista neural que formam o gânglio de
raiz dorsal, invadem somente os somitos anteriores, sendo que os somitos
posteriores agem como uma barreira contra a invasão de axônios e células da
crista neural (Newgreen et al.,1990). Algumas moléculas são expressadas no
somito posterior e parecem agir como uma barreira química para as células de
crista neural. Proteoglicanos ricos em condroitin-6-sulfato são expressados no
somito posterior de aves durante a migração de células de crista neural
(Perris,1991). Uma outra evidência de que estes proteoglicanos possuem um
papel inibidor para a migração de células de crista neural é a presença destas
moléculas na matriz perinotocordal, que é evitada pelas células de crista que
migram pela via ventral (Perris et al.,1993b). Embriões de aves que tiveram suas
notocordas transplantadas e cultivadas, tratadas pela condroitinase ABC
demonstraram uma atenuação na capacidade inibidora para a migração de células
da crista neural (Newgreen et al.,1986), confirmando a capacidade inibidora de
proteoglicanos ricos em condroitin sulfato. O colágeno IX é um proteoglicano
rico em condroitin sulfato e também é expressado nos somitos posteriores de
embriões de aves enquanto as células de crista neural estão migrando (Ring et
al.,1996). Células de crista neural também evitam um substrato de colágeno IX in
vitro, sugerindo que esta molécula pode agir de maneira inibidora in vivo (Oakley
& Tosney,1991). Moléculas ligantes a PNA são observadas na via dorsolateral do
tronco de embriões de ave durante a migração de células da crista neural pela via
ventral, e é observada uma diminuição destas moléculas na via dorsolateral
quando as células de crista neural estão migrando por esta via (Krull,2001).
No início da diferenciação do esclerótomo as células encontram-se
compactadas adjacentes ao dermomiótomo. O espaço perinotocordal contém
matriz extracelular que conecta as células esclerotomais com a lamina basal da
notocorda e funciona como um substrato para a invasão destas células do
esclerótomo. As células do esclerótomo do somito colonizam o espaço
perinotocordal e perdem suas características mesenquimais, elas proliferam-se e
formam um tubo que envolve a notocorda, formando o corpo das vértebras e os
discos intervertebrais. Este processo requer sinalização da notocorda e como
conseqüência tem a expressão do gene pax-1 nas células do esclerótomo. O início
da formação da cartilagem pode ser visualizado através de imunocitoquímica
para o proteoglicano condroitin-6-sulfato. Outros proteoglicanos e proteínas
como o colágeno tipo II e a tenascina podem ser utilizados para identificar a
condrogênese (Christ, Huang & Wilting,2000).
As células da crista neural podem migrar através de dois caminhos: a via
ventral que se localiza entre os somitos e o tubo neural, sendo que as células
passam por entre a mesoderme somítica; e a via dorsolateral entre os somitos e a
ectoderme.
Pouco antes da entrada de células de crista neural nos somitos na via ventral,
eles organizam-se em dermátomo, miótomo e esclerótomo, o que pode estimular
esta entrada. A lamina basal do miótomo surge junto com a entrada das células
tendo sido descrito uma interação entre as células de crista neural e a matriz
extracelular que forma a lamina basal do miótomo. As células de crista neural
alteram dramaticamente a sua trajetória quando contactam a lamina basal do
miótomo, voltando-se lateralmente e alinhando-se com a superfície basal do
miótomo. Uma ausência quase abrupta de lamina basal no miótomo coincide
com o local onde as células divergem para dentro do esclerótomo (Erickson et
al.,1994). As células de crista neural que migram pela via ventral contribuem
para a formação dos gânglios simpáticos e sensoriais, células de Schwann e
ILUSTRAÇÃO nº 6
Vias de migração das células da crista neural. Via dorsolateral. Via ventral.
(Fonte: WOLPERT et al., 2000)
células cromafins. As células que migram por esta via migram de maneira
segmentada, ou seja, atravessam somente a mesoderme do esclerótomo do
somito anterior, evitando o somito posterior. Já as células de crista neural que
migram uniformemente pela via dorsolateral dão origem a melanócitos, sem o
padrão segmentar das células da via ventral. A migração pela via ventral ocorre
aproximadamente 24 horas antes da migração pela via dorsolateral. Duas
moléculas estão envolvidas no impedimento da entrada de células da crista neural
na via dorsolateral no momento em que a migração ocorre pela via ventral:
glicoproteínas ligantes a lectina de amendoim (PNA) e condroitin-6-sulfato.
Vários estudos foram feitos com diferentes moléculas de matriz extracelular para
um melhor entendimento da maneira organizada e segmentar da migração das
células da crista neural. A fibronectina e a laminina encontram-se distribuídas no
esclerótomo dos somitos anteriores e posteriores, logo, não influenciam qualquer
preferência de células de crista neural pela metade anterior ou posterior do
somito (Rickmann et al.,1985). Análises in vitro sugerem que estas moléculas
podem servir como promotoras da migração de células da crista neural.
O colágeno IX, proteoglicano ligado ao condroitin sulfato encontra-se no
esclerótomo dos somitos posteriores de embriões de aves nos estágios 17 a 23
durante o período de migração de células da crista neural. Células de crista neural
evitaram substrato com colágeno IX in vitro, sugerindo que esta molécula pode
agir como uma barreira a estas células e pode possuir um importante papel na
migração segmentar das células de crista neural no tronco in vivo (Perris,
Krotoski & Bronner-Fraser,1991). Outros proteoglicanos ligados ao condroitin
sulfato podem estar envolvidos na orientação da migração das células de crista
neural. Ligantes a PNA são encontrados nos somitos posteriores e não nos
anteriores durante a migração de células da crista neural. Estudos in vitro
sugerem que estes ligantes a PNA juntamente com outros fatores inibidores
podem desempenhar um papel na migração in vivo de células da crista neural,
agindo como barreira a estas células (Krull 2001). Grande parte destas moléculas
inibidoras de células de crista neural, são também moléculas de matriz
extracelular de cartilagem, encontradas na cartilagem embrionária do corpo
vertebral de embriões de aves.
Segundo Althouse & Solursh (1986), os primeiros condroblastos começam a
surgir a partir do estágio 23 a 25 HH, nas vértebras e nos brotos das asas,
respectivamente. A notocorda serve como um substrato permissivo para
sobrevivência, replicação e diferenciação das células do esclerótomo em
condroblastos, uma vez que somitos isolados formam cartilagem
espontaneamente na presença da notocorda. Entretanto, componentes da matriz
extracelular cartilaginosa como keratan-sulfato, condroitin –sulfato e colágeno
tipo II encontrados circundando a notocorda em estágios iniciais do
desenvolvimento podem possuir outras funções como criar um ambiente
favorável para sobrevivência e proliferação das células esclerotomais de
linhagem condrogênica; ou ser um substrato no qual as células progenitoras
podem adquirir e/ou manter sua arquitetura até a diferenciação. Por outro lado
estas macromoléculas podem agir favorecendo a migração de células do
esclerótomo para o espaço perinotocordal agindo como substâncias
quimiotáticas. Estudos demonstram que a fibronectina possui ação anti-
condrogênica, impedindo a diferenciação de condrócitos; quando células pré-
condrogênicas do broto da asa de embriões de aves nos estágio 23 e 24 HH foram
cultivadas em meio contendo fibronectina, estas células tornaram-se
mesenquimais e não diferenciaram-se em condrócitos (Solursh et al.,1990).
O maior componente da matriz extracelular de cartilagem é o colágeno tipo
II, que constitui 60% do total de proteínas presentes. É uma molécula em tripla
hélice com três polipeptídeos idênticos, a cadeia 1 (tipo II) (Sheffield and
Upholt,1985) e é codificado pelo gene col2a1; a transcrição deste gene em
células mesenquimais precede a diferenciação em condroblastos e é sinal
evidente da condrogênese (von der Mark and von der Mark, 1977; Kravis and
Upholt, 1985; Kosher et al., 1986; Swalla et al., 1988, Cheah et al., 1991; Ng et
al., 1993). O colágeno tipo II é um importante mantenedor da integridade de
estruturas cartilaginosas e mutações em seu gene podem originar condroplasias
(revisado por Vikkula et al., 1994; Ritvaniemi et al., 1995). A expressão do gene
col2a1 em embriões de camundongo ocorre quando as células do esclerótomo
estão se dispersando. É fortemente expressado no mesenquima pré-condrogênico,
como por exemplo, a pré-vertebra derivada da condensação de células do
esclerótomo. Sugere-se que o gene sox9 é um controlador da expressão do gene
col2a1 na diferenciação de células condrogênicas e que a transcrição de ambos
os genes é mantida enquanto as células pré-condrogênicas diferenciam-se em
condroblastos imaturos e proliferantes.
O colágeno tipo II acumula-se na região livre de células ao redor da
notocorda, enquanto as células do esclerótomo estão se condensando, antes de
diferenciarem-se em cartilagem. O pró-colageno tipo II é expressado em 2
formas, pró-colágeno IIA e pró-colágeno IIB. O tipo IIA é sintetizado por células
condroprogenitoras, é depositado na matriz extracelular e ainda retém o
propeptídeo NH
2
, porém o COOH é removido. O domínio fibrilar do
procolágeno tipo II pode prover um substrato para as células mesenquimais
enquanto o propeptídeo NH
2
pode localizar a proteína responsável pela
condrogênese. O propeptídeo NH
2
pode ligar-se aos fatores de crescimento BMP-
2 e TGF-1, conhecidos por induzirem a condrogênese in vivo (Wang et
al.,1990). Estudos realizados com brotos dos membros superiores de embriões de
aves detectaram através de hibridização in situ a presença de mRNA para o
colágeno tipo II em estágios iniciais do desenvolvimento, a partir do estagio 16
HH. Até o estágio 25 HH, início da condrogênese, a quantidade de mRNA para o
colágeno tipo II aumenta consideravelmente nos brotos dos membros superiores
(Koopman et al., 1997).
O colágeno IX é outra molécula encontrada na matriz extracelular da
cartilagem, sempre em co-existência com o colágeno II. O colágeno IX está
aparentemente envolvido na organização da rede de fibras de colágeno II em
cartilagens e também faz ligações entre suas moléculas a fim de organizar a pré-
cartilagem, uma vez que 10% da cartilagem embrionária é composta por
colágeno IX e somente 1% da cartilagem adulta possui esta molécula (Wu et
al.,2003). Na cartilagem embrionária as células possuem as integrinas
1
1
,
2
1
e
11
1
que são co-expressadas com o colágeno IX. A porção
1
possui a
capacidade de ligar-se a este colágeno, sugerindo que o colágeno tipo IX pode
agir como uma molécula de adesão celular entre as células cartilaginosas e entre
as células e a matriz extracelular (Heino et al.,2004).
O colágeno IX é encontrado na matriz perinotocordal e no esclerótomo do
somito posterior tendo sido localizado por imunocitoquímica através do uso do
anticorpo 2B9. Este reconhece somente um epítopo da molécula ao qual se liga o
condroitin sulfato, encontrado somente no colágeno IX, sendo muito mais
eficiente que outros anticorpos que se ligam à proteína propriamente dita.
Estudos sugerem que moléculas inibidoras presentes na notocorda, matriz
perinotocordal e esclerótomo posterior podem ser responsáveis pela não invasão
de células de crista neural e axônios motores e sensoriais (Davies et al.,1990;
Oakley and Tosney,1991). Ensaios in vitro demonstraram que células de crista
neural e axônios evitaram substratos com colágeno IX, sugerindo que esta
molécula pode agir como uma barreira a estas células (Halfter, Hassel &
Ring,1996).
Moléculas que podem impedir a migração de precursores de melanócitos para
regiões ventrais são os açúcares ligantes a PNA (lectina de amendoim). O PNA
liga-se às células do esclerótomo posterior durante a somitogênese (Stern et
al.,1986; Oakley and Tosney,1991). Um estudo demonstra que o tratamento de
somitos com açúcares ligantes a PNA in vitro retira a capacidade inibidora do
somito e células de crista neural invadem o esclerótomo anterior e posterior,
sugerindo que estas moléculas ligantes a PNA podem estar envolvidas na
segmentação do sistema nervoso periférico in vivo (Krull,2001). Ligantes a PNA
foram observados no esclerótomo do somito posterior durante a migração de
células da crista neural, estes ligantes provavelmente agem como uma barreira
impedindo a passagem das células de crista para o somito posterior
(Tosney,1991). O PNA parece ser um marcador de células pré-condrogênicas em
diferenciação, sendo observadas marcações co-localizadas em sítios de tecidos
condrogênicos como a matriz perinotocordal e brotos da asa de embriões a partir
do estágio 23 HH (Althouse & Solursh,1986).
Na galinha Sedosa japonesa, as células de linhagem melanocítica que migram
pela via dorsolateral, invadem também a via ventral colonizando regiões ventrais
com melanócitos. Precursores destes foram observados através de marcação com
anticorpo específico, na região ventral, ao redor da aorta dorsal e no mesentério
dorsal (Reedy et al.,1998). Isto não ocorre em embriões da raça White Leghorn.
Nesta raça, na via de migração ventral são observadas moléculas inibidoras que
parecem impedir a migração de precursores de melanócitos (Faraco et al.,2001).
Ligantes a PNA foram observados na via ventral de aves da raça White Leghorn
enquanto os precursores de melanócitos estão migrando. Já nas aves da raça
Sedosa japonesa, estas moléculas ligantes a PNA foram observadas em pequena
quantidade e distribuição irregular, sugerindo possibilidade de passagem livre
para a invasão de regiões ventrais pelos precursores de melanócitos (Freitas et
al.,2003). Embriões de Sedosa japonesa e Leghorn no estágio 26 e 28 apresentam
diferenças morfológicas entre seus somitos anteriores: as células que ocupam a
via ventral, mais precisamente o espaço entre o gânglio e o somito, no embrião
da raça Leghorn apresentam-se mais compactadas em relação às células que
ocupam o mesmo espaço no embrião da raça Sedosa japonesa. Estas células
possuem a mesma morfologia das células do esclerótomo que estão localizadas
ao redor da notocorda e irão dar origem à cartilagem que mais tardiamente
formará as vértebras (Portella,2002). A marcação com PNA observada por
Freitas e colaboradores coincide com a área ocupada por estas células que são
observadas colonizando a via ventral, parecendo impedir a passagem de
precursores de melanócitos ventralmente.
A matriz extracelular da cartilagem é rica em proteoglicanos como o aggrecan
que impede a migração de células de crista neural conforme descrito por Perris
(2000). A deposição de aggrecan é considerada uma característica da
condrogênese. Outros proteoglicanos como decorin, biglycan e perlecan também
são encontrados na matriz extracelular da cartilagem. Antes do processo de
condrogênese ocorrer, as células são circundadas por uma matriz extracelular
com predominância de ácido hialurônico. Esta molécula é então degradada pelas
células através da enzima hialuronidase e, os resíduos do ácido hialurônico são
utilizados para fazer ligações entre as células. Se as interações ácido hialurônico-
célula forem rompidas in vitro, resultam na expressão de receptores de superfície
para o PNA, no mesênquima do broto da asa em embriões de aves. O aggrecan
possui um centro protéico com um domínio de ligação para o açúcar queratan
sulfato e outro para o açúcar condroitin sulfato. O colágeno tipo II representa
60% do colágeno total da matriz extracelular da cartilagem, enquanto o colágeno
tipo IX representa 10% do colágeno da matriz extracelular de cartilagem
embrionária e somente 1-2% do colágeno total da cartilagem de um adulto
(Knudson,2001). Conforme as observações de Bronner-Fraser (1991) os
colágenos tipo II e IX impedem a migração de células da crista neural.
Estes dados podem nos levar a levantar a hipótese de que na ave da raça
White Leghorn, a organização do esclerótomo com deposição precoce de matriz
extracelular de cartilagem pode originar componentes que impeçam a migração
de precursores de melanócitos para regiões ventrais. Em aves da raça Sedosa
estes componentes seriam depositados mais tardiamente, quando as células de
linhagem melanocítica já teriam percorrido a via ventral de migração. Já que as
moléculas de matriz extracelular foram descritas como tendo um papel promotor,
direcionador ou inibidor da migração de células de crista neural, é importante
saber como estas moléculas estão arranjadas e organizadas
espaço/temporalmente nos caminhos de migração de embriões das diferentes
raças, e qual a interação entre as células da crista neural e estas moléculas,
buscando entender um possível papel dos componentes da matriz-extracelular no
direcionamento de migração das células de crista neural.
2. OBJETIVOS
Identificar a presença de moléculas de matriz extracelular da cartilagem nas
vias ventrais de migração evitadas pelas células de crista neural de linhagem
melanocítica em embriões de aves da raça Leghorn.
Verificar a presença ou a ausência destas moléculas na via ventral,
alternativamente utilizada por células de linhagem melanocítica em embriões de
aves da raça Sedosa japonesa.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1) Obtenção dos ovos
Ovos embrionados de galinhas Sedosa Japonesa e White Leghorn
fornecidos pelo aviário da Universidade Federal do Paraná, previamente
limpos, foram incubados a 38º C até atingirem os estágios 22, 24, 26 e 28
do desenvolvimento (Hamburger & Hamilton, 1951) que correspondem
respectivamente a 3 ½, 4, 4 1/2 e 5 1/2 dias de incubação.
3.2) Obtenção dos embriões
Os embriões nos estágios 22, 24, 26, e 28 foram retirados dos ovos
e colocados em placa de Petri com salina tamponada com fosfato (PBS).
Sob microscópio estereoscópico suas membranas foram retiradas e o topo
de sua cabeça e cauda seccionados, com auxílio de pinças e bisturi.
3.3) Inclusão em Paraplast
Embriões foram fixados em Metacan (metanol, ácido acético e
formoldeído) por três horas, lavados em PBS e a região do tronco na altura
do broto da asa, compreendendo somitos foi recortada (sinalizada em
vermelho na figura abaixo). Os segmentos foram desidratados e incluídos
em Paraplast.
3.4) Microtomia para Paraplast
Cortes de 5m foram obtidos, pela secção em micrótomo, da região
do tronco dos embriões incluídos em Paraplast. Os cortes foram coletados
em lâminas previamente recobertas por solução de gelatina.
3.5) Inclusão em gelatina
Embriões foram fixados em paraformaldeído 4% por duas horas a
4ºC, lavados em PBS, e tiveram a região do tronco recortada e estocada em
solução de sacarose 5% durante duas horas a 4ºC. As regiões do tronco
ficaram durante a noite em uma solução de sacarose 15% a 4ºC e foram
incluídas em gelatina 7,5% em PBS/sacarose 15%. Os troncos foram
colocados em formas para congelação e congelados em nitrogênio líquido. Os
blocos obtidos foram estocados em freezer a -20ºC.
3.6) Criomicrotomia
Cortes de 8m obtidos pela secção, em criostato a -20ºC, do tronco
dos embriões incluídos em gelatina, foram coletados em lâminas previamente
recobertas por solução de gelatina. As lâminas obtidas foram estocadas em
freezer a -20ºC.
3.7) Coloração hematoxilina - eosina
Cortes obtidos dos embriões incluídos em Paraplast foram
desparafinizados, hidratados em uma série decrescente de etanol, e lavados
em água destilada. Foram então corados com hematoxilina-eosina,
desidratados e montados com Permount.
3.8) Citoquímica para detecção de ácido hialurônico
Cortes obtidos dos embriões incluídos em Paraplast foram
desparafinizados, hidratados em uma série decrescente de etanol, e lavados
em água destilada. Foram tratados com solução de hialuronidase 1% em
tampão fosfato com pH 6,7 durante três horas a 37ºC. Algumas lâminas foram
utilizadas como controle, permanecendo o mesmo tempo e à mesma
temperatura, tratadas somente com o tampão fosfato. Todas as lâminas foram
lavadas em água destilada, coradas com alcian blue 1%, contra-coradas com
vermelho neutro aquoso 0,5%, desidratadas e montadas com Permount
3.9) Imunocitoquímica para detecção de colágeno tipo II
Cortes obtidos dos embriões incluídos em Paraplast foram
desparafinizados, hidratados em uma série decrescente de etanol, e lavados
em água destilada. Foram tratados com solução de hialuronidase em tampão
acetato de sódio com pH 5,2 com inibidores de protease durante uma hora a
37ºC. Foi realizado o bloqueio dos sítios inespecíficos com PBS e
soroalbumina bovina (BSA) 0,1%. As laminas foram incubadas com o
anticorpo primário específico para o colágeno tipo II (CIIC1 do Iowa
Hidrydoma Bank) a 4ºC, em câmara úmida, durante a noite. Algumas lâminas
foram utilizadas como controle, sendo incubadas somente com PBS. Após
lavagens em PBS, as laminas foram incubadas no anticorpo secundário Goat
anti-mouse IgG da Chemicon conjugado a rodamina durante 1 hora e trinta
minutos, lavadas em PBS e montadas com Gelmount.
3.10) Imunocitoquímica para detecção de condroitin sulfato, colágeno
tipo IX e fibronectina
Os cortes obtidos em criostato foram deixados a temperatura
ambiente por quinze minutos, lavados em PBS, PBS/glicina 0,1M e
submetidos ao bloqueio dos sítios inespecíficos com PBS e soroalbumina
bovina (BSA) 0,1%. As lâminas foram incubadas com o anticorpo primário
específico (para condroitin sulfato da Sigma, colágeno tipo IX / 2B9 e
fibronectina / B3D6, Iowa Hybridoma Bank) a 4ºC, em câmara úmida,
durante a noite. Algumas lâminas foram utilizadas como controle, sendo
incubadas somente com PBS. Após lavagens em PBS, as lâminas incubadas
com o anticorpo primário para o condroitin sulfato foram incubadas no
anticorpo secundário Goat anti-mouse IgM da Chemicon, e as lâminas
incubadas com os anticorpos primários para colágeno IX e fibronectina foram
incubadas no anticorpo secundário Goat anti-mouse IgG da Chemicon
conjugado a rodamina, durante 1 hora e trinta minutos, lavadas em PBS e
montadas com Gelmount.
4. RESULTADOS
4.1 MORFOLOGIA DO TRONCO DE EMBRIÕES DA AVE DAS RAÇAS
WHITE LEGHORN E SEDOSA JAPONESA
Embriões das raças Sedosa Japonesa e White Leghorn apresentam
diferenças nas moléculas que estão presentes nas vias de migração das células
de crista neural e como conseqüência do caráter inibidor destas moléculas, as
células de crista neural precurssoras de melanócitos invadem regiões ventrais
em embriões da raça Sedosa Japonesa, o que não ocorre em embriões da raça
White Leghorn. A morfologia destas vias de migração analisada em embriões
de ambas as raças para os estágios 22, 24, 26 e 28 HH. Os embriões da raça
Sedosa japonesa branca e da raça White Leghorn demonstraram diferenças na
distribuição de células do esclerótomo na região do tronco nos estágios 26 e
28 do desenvolvimento. As células localizadas entre o dermátomo do somito
anterior e o tubo neural, ou seja na via ventral, encontram-se mais dispersas
nos embriões da raça Sedosa japonesa (Fig. 1B e 1D) do que em embriões da
raça White Leghorn (Fig. 1E e 1F), onde as células da mesma região
aparentam estar mais compactadas.
TN
GRD
DM
C
TN
GRD
DM
D
TN
GRD
DM
E
GRD
DM
F
Fig.1 – (A e B) Somito anterior de embriões das raças Sedosa japonesa (A) e White Leghorn (B) no estágio 24 do
desenvolvimento, não há diferenças morfológicas visíveis. (C e D) Somito anterior de embriões das raças Sedosa
japonesa (A) e White Leghorn (B) no estágio 26 do desenvolvimento. (E e F) Somito anterior de embriões das raças
Sedosa japonesa (E) e White Leghorn (F) no estágio 28 do desenvolvimento. As setas azuis em C e E indicam a via
ventral com células mais dispersas em embriões da raça Sedosa japonesa nos estágios 26 e 28 do desenvolvimento
respectivamente. As setas pretas em D e F indicam a via ventral com células mais compactadas em embriões da raça
White Leghorn nos estágios 26 e 28 do desenvolvimento respectivamente. DM = dermátomo; GRD = gânglio de raiz
dorsal e TN = tubo neural. Aumento 100 X.
TN
TN
NT
NT
GRD
GRD
DM
DM
A
B
4.2 DETECÇÃO DA PRESENÇA DE ÁCIDO HIALURÔNICO NO
TRONCO DE EMBRIÕES DE AVES DAS RAÇAS SEDOSA
JAPONESA E WHITE LEGHORN
Embriões da raça Sedosa Japonesa e da raça White Leghorn apresentam
diferenças para a distribuição do ácido hialurônico na região do tronco de
todos os estágios do desenvolvimento estudados. Porém, os resultados foram
mais visíveis nos estágios 26 e 28. O ácido hialurônico parece estar em maior
quantidade em embriões da raça White Leghorn e co-localizado com as
células compactadas vistas na análise morfológica, na via ventral, muito
evidente ao redor da notocorda e no início da via ventral no somito anterior
(Fig. 2B). No somito posterior, embriões da raça Leghorn apresentam uma
faixa contínua de ácido hialurônico (Fig. 2D). A molécula também está
presente em embriões da raça Sedosa japonesa (Fig. 2 A e 2B), porém não de
modo tão evidente como nos embriões de White Leghorn. Os cortes controle
não apresentaram coloração com o alcian blue. A presença de ácido
hialurônico sugerida pela coloração com alcian blue, foi testada pela digestão
dos cortes com hialuronidase que resultam em ausência de reação ao corante.
Fig.2 – (A e B) Somito anterior de embriões das raças Sedosa japonesa (A) e White Leghorn (B) no
estágio 26 do desenvolvimento. (C e D) Somito posterior de embriões das raças Sedosa japonesa (C) e
White Leghorn (D) no estágio 26 do desenvolvimento. As setas pretas em B e D indicam a localização
do ácido hialurônico em embriões da raça White Leghorn no estágio 26, no somito anterior e posterior
respectivamente. (E e F) Controle das Sedosa Japonesa (E) e White Leghorn (F), ausência de coloração
pelo alcian blue. DM = dermátomo; G = gânglio de raiz dorsal e TN = tubo neural. Aumento 100X.
TN
TN
TN
TN
DM
DM
G
G
4.3 DETECÇÃO DA PRESENÇA DE CONDROITIN SULFATO NO
TRONCO DE EMBRIÕES DE AVES DAS RAÇAS SEDOSA
JAPONESA E WHITE LEGHORN
A presença de condroitin sulfato foi detectada no tronco de embriões de
ave no espaço perinotocordal em todos os estágios tanto para a raça White
Leghorn, quanto para a raça Sedosa japonesa (Fig. 3A-D; 4A-D). A raça
White Leghorn apresentou maior quantidade de condroitin sulfato quando
comparada à raça Sedosa japonesa em todos os estágios. A quantidade de
condroitin sulfato no espaço perinotocordal aumentou gradativamente com o
desenvolvimento do embrião, do estágio 22 para o estágio 28 (comparar figs.
3 e 4). A raça White Leghorn apresentou marcações positivas para a presença
de condroitin sulfato também na via ventral, a partir do estágio 24 do
desenvolvimento (Fig. 5A-C). Marcações nas vias de migração de células da
crista neural não foram observadas em embriões da raça Sedosa japonesa. O
espaço logo acima do tubo neural apresentou marcações para os estágios 26 e
28 da raça White Leghorn (Fig. 6).
Fig. 3 – (A) Embrião de ave da raça Sedosa japonesa no estágio 22 do desenvolvimento. A seta
branca indica a marcação do condroitin sulfato no espaço perinotocordal. (B) Embrião de ave da
raça White Leghorn no estágio 22 do desenvolvimento. A seta branca indica a marcação no
espaço perinotocordal, notar a marcação mais intensa se comparada á do embrião da raça Sedosa
japonesa em (A). (C) Embrião de ave da raça Sedosa japonesa no estágio 24 do desenvolvimento.
A seta indica marcação do condroitin sulfato no espaço perinotocordal. (D) Embrião de ave da
raça White Leghorn no estágio 24 do desenvolvimento. A seta indica a marcação do condroitin
sulfato no espaço perinotocordal, mais intensa que nos embrião da raça Sedosa japonesa no
mesmo estágio do desenvolvimento. AD = aorta dorsal; NT = notocorda e TN = tubo neural
Aumento 200X
NT
NT
TN
TN
AD
AD
NT
NT
TN
TN
A
B
C
D
NT
NT
NT
NT
A
B
C
D
Fig. 4 – (A) Notocorda de embrião de ave da raça Sedosa japonesa no estágio 26 do
desenvolvimento. Notar marcação para o condroitin sulfato ao redor. (B) Notocorda de embrião de
ave da raça White Leghorn no estágio 26 do desenvolvimento. Notar marcação mais intensa ao redor
que na notocorda do embrião de Sedosa japonesa no mesmo estágio. (C) Notocorda de embrião de
ave da raça Sedosa japonesa no estágio 28 do desenvolvimento. Notar marcação para o condroitin
sulfato ao redor. (D) Notocorda de embrião de ave da raça White Leghorn no estágio 28 do
desenvolvimento. Notar marcação mais intensa ao redor que na notocorda do embrião de Sedosa
japonesa no mesmo estágio. NT = notocorda Aumento 200X.
Fig. 5 – Embriões de ave da raça White Leghorn nos estágio 24 (A), 26 (B) e 28 (C) do
desenvolvimento. As setas indicam a marcação do condroitin sulfato na via ventral no
somito anterior. Aumento 200X.
TN
NT
GRD
TN
GRD
TN
GRD
A
B
C
TN
Fig. 6 – Embrião da raça White Leghorn no estágio 28 do desenvolvimento. A seta indica
a marcação para condroitin sulfato acima do tubo neural. Aumento 200X.
4.4 DETECÇÃO DA PRESENÇA DE COLÁGENO IX NO TRONCO DE
EMBRIÕES DE AVES DAS RAÇAS SEDOSA JAPONESA E WHITE
LEGHORN
O colágeno IX apresentou diferenças na distribuição no tronco de
embriões das raças Sedosa japonesa e White Leghorn. Na raça White Leghorn,
embriões nos estágios 26 e 28 apresentaram grande quantidade de colágeno IX
no espaço perinotocordal (Fig. 7B e D), na região dorsal ao tubo neural e na via
ventral (Fig. 8A) quando comparados com embriões da raça Sedosa japonesa nos
mesmos estágios (Figs. 7A e C; 8B). Em embriões de Sedosa o colágeno IX
parece ter sua expressão iniciada mais tardiamente, pois somente no estágio 28
observa-se marcação mais evidente nas regiões em que este colágeno aparece em
White Leghorn, já em estágios mais iniciais.
NT
NT
A
B
NT
NT
C
D
Fig. 7 – Expressão de colágeno IX (A) Embrião de ave da raça Sedosa japonesa no estágio 26 do
desenvolvimento. Notar pouca marcação ao redor da notocorda. (B) Embrião de ave da raça
White Leghorn no estágio 26 do desenvolviment Notar marcação intensa no espaço
perinotocordal. (C) Embrião de ave da raça Sedosa japonesa no estágio 28 do desenvolvimento.
Notar marcação ao redor da notocorda. (D) Embrião de ave da raça White Leghorn no estágio 28
do desenvolvimento. Notar marcação intensa no espaço perinotocordal, mais espalhada que no
estágio 26 da mesma raça. NT = notocorda. Aumentos 200X.
Fig. 8 – Expressão de colágeno IX (A) Embrião de ave da raça White Leghorn no estágio 28 do
desenvolvimento. A seta indica marcação na via ventral. (B) Embrião de ave da raça Sedosa
japonesa no estágio 28 do desenvolvimento A seta indica marcação na via ventral. (C)
Controle. TN = tubo neural; GRD = gânglio de raiz dorsal. Aumentos 200X
TN
GRD
A
B
TN
GRD
C
4.5 DETECÇÃO DA PRESENÇA DE COLÁGENO II NO TRONCO DE
EMBRIÕES DE AVES DAS RAÇAS SEDOSA JAPONESA E WHITE
LEGHORN
A distribuição do colágeno II foi semelhante a do colágeno IX para o
espaço perinotocordal. Porém, o colágeno II não foi detectado no espaço
perinotocordal de embriões de ave da raça Sedosa japonesa nos estágios
analisados. Nos embriões de ave da raça White Leghorn nos estágio 26 e 28 do
desenvolvimento, foi observada a presença de colágeno II no espaço
perinotocordal, próximo à lâmina basal da notocorda.
A
B
Fig. 9 – Embriões de ave da raça White Leghorn nos estágios 26 (A) e 28 (B) do
desenvolvimento em aumento de 200X. As setas indicam a marcação do colágeno II no
espaço perinotocordal, próximo a lâmina basal da notocorda.
4.6 DETECÇÃO DA PRESENÇA DE COLÁGENO II NO TRONCO DE
EMBRIÕES DE AVES DAS RAÇAS SEDOSA JAPONESA E WHITE
LEGHORN
A distribuição da fibronectina demonstrou diferenças entre os embriões de
ave das raças White Leghorn e Sedosa japonesa nos estágios 26 e 28 do
desenvolvimento. Na raça White Leghorn, a marcação para fibronectina ocorre
somente na via dorsolateral de migração de células da crista neural. Já na raça
Sedosa japonesa, a marcação para fibronectina aparece em ambas as vias de
migração, dorsolateral e ventral
Fig. 10 – Fibronectina (A) Somito de embrião de ave da raça White Leghorn em aumento de
200X. Notar ausência de marcação na via ventral e marcação somente na dorsolateral. Somito
de embrião de ave da raça Sedosa japonesa (B) aum. 200X e (C) 400X. As setas indicam a
marcação da fibronectina na via ventral. GRD = gânglio de raiz dorsal
GRD
B
GRD
C
A
GRD
Os resultados encontrados encontram-se resumidos na tabela abaixo:
Molécula de
matriz
Região
perinotocordal WL
Região
perinotocordal SB
Via ventral
WL
Via ventral
SB
Ácido
hialurônico
++++
+
++++
+
Colágeno II
+
-
-
-
Colágeno IX
++++
+
++++
+
Fibronectina
-
-
-
+
Condroitin
sulfato
++++
+
+
-
4. DISCUSSÃO
Embriões da raça White Leghorn apresentaram várias diferenças se
comparados com embriões da raça Sedosa Japonesa quando analisamos a
presença e distribuição de moléculas como ácido hialurônico, condroitin sulfato,
colágeno IX, colágeno II e fibronectina. O ácido hialurônico está presente em
regiões que são evitadas pelas células de crista neural enquanto estas estão
migrando, como espaço perinotocordal e somito posterior. O ácido hialurônico é
uma molécula encontrada na matriz extracelular de cartilagem que predomina
antes da diferenciação dos condrócitos (Perris, 2000). Embriões de ambas as
raças apresentam ácido hialurônico em regiões em que haverá condrogênese,
como por exemplo, o espaço perinotocordal. A marcação para o ácido
hialurônico em regiões que futuramente serão cartilagem é muito mais evidente
em embriões da raça White Leghorn. Como as moléculas são quebradas quando
do estabelecimento da matriz cartilaginosa (Knudson, 2001), a presença de ácido
hialurônico nos estágios observados, indica que ainda estão se ocupando a região
os elementos de pré-cartilagem.
Proteoglicanos ricos em condroitin sulfato são moléculas de caráter
inibidor á migração de células da crista neural (Perris, 1991). O colágeno IX é
um proteoglicano rico em condroitin sulfato que também age como molécula
inibidora á migração de células de crista neural (Oakley & Tosney, 1991), e
compõe 10% da matriz extracelular da cartilagem embrionária (Wu et al., 2003).
Embriões das raças White Leghorn e Sedosa Japonesa mostraram marcações
positivas: tanto para colágeno IX como para condroitin sulfato. Embriões da raça
White Leghorn possuem condroitin sulfato em todos os estágios analisados no
espaço perinotocordal, na via ventral nos estágios 24, 26 e 28 HH e logo acima
do tubo neural nos estágios 26 e 28 HH. Estas marcações aumentaram
gradativamente com a progressão do desenvolvimento do embrião e foram muito
mais evidentes em embriões da raça White Leghorn do que em embriões da raça
Sedosa Japonesa. Como o anticorpo para colágeno IX utilizado reconhece
especificamente a ligação do condroitin sulfato na molécula (Davies et al., 1990;
Oakley and Tosney, 1991), as duas marcações utilizadas comprovam a presença
deste, apontando para a identificação deste açúcar sulfatado, como componente
de colágeno de matriz extracelular. As marcações para o colágeno IX estão co-
localizadas com as marcações para o condroitin sulfato, porém de maneira menos
intensa. Embriões de ambas as raças com marcações positivas para o colágeno IX
apresentam o mesmo padrão de marcações cada vez mais intensas conforme o
desenvolvimento do embrião, que embriões positivos ao condroitin sulfato. Da
mesma forma que os embriões positivos para o condroitin sulfato, as marcações
positivas para o colágeno IX em embriões da raça White Leghorn são muito mais
evidentes que em embriões da raça Sedosa Japonesa.
O colágeno II que representa 60% da matriz extracelular da cartilagem e,
interage com o colágeno IX para a organização da pré-cartilagem (Wu et al.,
2003) encontra-se somente no espaço perinotocordal de embriões da raça White
Leghorn nos estágio 26 e 28 HH. Não há marcações em outras regiões do tronco
de embriões da raça White Leghorn e em troncos de embriões da raça Sedosa
Japonesa. Esta distribuição está de acordo com a expressão temporal do colágeno
II que ocorre após a deposição de colágeno IX, sendo este o organizador do
arranjo adotado e necessariamente devendo ter sua expressão ocorrendo
previamente (Wu et al., 2003). Nos estágios analisados, mesmo no mais tardio
(st28), a deposição de colágeno II está apenas iniciando, sendo sua presença
evidente somente entre as células da notocorda e imediatamente ao redor desta.
Com o desenvolvimento e expansão das células do esclerótomo, em estágios
ulteriores, provavelmente a expressão de colágeno II se estenderá às áreas
ocupadas por colágeno IX nos estágios analisados. Sugere-se que o colágeno II
esteja envolvido na condrogênese, servindo de elemento de ligação para citocinas
e fatores de crescimento (Zhu et al.,1999). Nos estágios aqui analisados, a
agregação de pré-cartilagem já é morfologicamente evidente, mas não se observa
diferenciação que deve estar na dependência de ação de fatores que podem
precisar da colaboração do colágeno II para efetivamente atuarem.
A fibronectina encontra-se distribuída nos somitos anteriores e posteriores,
não influenciando qualquer preferência de células de crista neural (Rickmann et
al, 1985) e provavelmente age como molécula promotora para migração destas
células. Por outro lado, a fibronectina é um agente inibidor da condrogênese
(Solursh et al., 1990). Embriões de ave das raças White Leghorn e Sedosa
Japonesa demonstraram diferenças significativas na distribuição da fibronectina
no tronco. Embriões da raça Leghorn nos estágios 24, 26 e 28 HH possuem
fibronectina somente na via dorsolateral de migração das células da crista neural.
Já os embriões da raça Sedosa Japonesa possuem fibronectina nas duas vias,
dorsolateral e ventral. A presença de fibronectina na via ventral em embriões de
Sedosa Japonesa pode estar envolvida com o atraso no estabelecimento de pré-
cartilagem nestes embriões, sugerido pela fraca expressão de moléculas como
ácido hialurônico, condroitin sulfato e colágeno IX, observada neste trabalho. A
distribuição de fibronectina nas vias dorsolateral e ventral corresponde àquela
descrita para ephrinas (manuscrito em preparação) nestes estágios de
desenvolvimento. Ephrinas são proteínas para as quais se reporta papel inibitório
em relação a células de linhagem neuronal (Krull et al, 1997; Santiago e
Erickson, 2002). Sobre células de linhagem melanocítica as ephrinas têm ação
estimuladora, parecendo aumentar a ligação das células à fibronectina que serve
de substrato para a migração (Santiago e Erickson, 2002). A presença de
fibronectina na via dorsolateral em embriões de White Leghorn e Sedosa e na via
ventral de Sedosa deve estar relacionada com a migração de melanoblastos que
ocorre a partir do estágio 20 e que só em Sedosa é observada na via ventral. Em
embriões de White Leghorn, portanto, a ausência de fibronectina e de ephrinas,
se por um lado impede a passagem de melanoblastos, por outro, permite o início
de estabelecimento dos componentes de cartilagem. Como moléculas
componentes da matriz extracelular da cartilagem como condroitin sulfato e
colágeno IX também possuem caráter inibidor e estão co-localizadas em locais
evitados pelas células de crista neural que estão migrando, sugere-se que a matriz
extracelular da precartilagem esteja interferindo na migração das células da crista
neural. Embriões da raça White Leghorn possuem maior quantidade de colágeno
IX e de condroitin sulfato que embriões da raça Sedosa Japonesa na região onde
se formará a vértebra, sugerindo que a formação da vértebra acontece antes em
embriões da raça White Leghorn. A marcação positiva para o colágeno II no
espaço perinotocordal de embriões da raça White Leghorn nos estágios 26 e 28
confirma que a matriz extracelular de cartilagem já está se depositando e
formando as vértebras em embriões desta raça. A marcação positiva para o
colágeno II por sua vez, não ocorre em embriões da raça Sedosa Japonesa,
sugerindo que a deposição da matriz extracelular de cartilagem e a diferenciação
dos condrócitos acontece mais tardiamente nesta raça que na raça White
Leghorn. Ligantes a PNA encontram-se na via ventral de embriões da raça White
Leghorn enquanto células de crista neural estão migrando, já em embriões da
raça Sedosa Japonesa ligantes a PNA não foram observados nesta via, sugerindo
que esta moléculas podem agir como inibidores de migração de células da crista
neural (Freitas et al, 2003). O PNA por sua vez, parece ser um marcador de
células pré-condrogênicas em diferenciação (Althouse & Solursh, 1986), também
confirmando a diferenciação da cartilagem anteriormente em embriões da raça
White Leghorn. Segundo estes dados, a formação da vértebra ocorre antes em
embriões da raça White Leghorn que em embriões da raça Sedosa Japonesa e, a
matriz extracelular da precartilagem que forma a vértebra possui componentes
que impedem a migração de células da crista neural.
5. CONCLUSÃO
Estes dados nos levam a crer que os componentes envolvidos na
formação da cartilagem da vértebra iniciam sua expressão em embriões da raça
White Leghorn alguns estágios antes do que em embriões da raça Sedosa
Japonesa, na região em que se localizam as células do esclerótomo que
colonizam o espaço perinotocordal. A matriz extracelular componente da
precartilagem apresenta moléculas como colágeno IX, condroitin sulfato e ácido
hialurônico, que agem como barreira para as células da crista neural, não
permitindo a colonização de regiões ventrais por precursores de melanócitos nos
embriões da raça White Leghorn. Em embriões da raça Sedosa Japonesa a
expressão destas moléculas ocorre mais tardiamente deixando livres vias
migratórias através das quais precursores de melanócitos invadem regiões
ventrais, colonizando órgãos e membranas viscerais. A diferenciação total da
cartilagem ocorre posteriormente aos estágios 26-28 aqui analisados, como se
pode inferir pelo pouco grau de expressão de colágeno II observado.
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