( PDF ) Estudo do potencial alelopático de plantas da família leguminosae: investigação de aleloquímicos de parkia pendula

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

MARCELO LOBATO FONSECA

Estudo do Potencial Alelopático de Plantas da

Família Leguminosae: Investigação de

Aleloquímicos de Parkia pendula

Belém – Pará

2005

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Estudo do Potencial Alelopático de Plantas da

Família Leguminosae: Investigação de

Aleloquímicos de Parkia pendula

Aluno: Marcelo Lobato Fonseca

*

Orientadora: Professora Dra. Mara Sílvia Pinheiro Arruda

Dissertação apresentada ao curso de

Pós-Graduação em Química como

parte do requisito para obtenção do

titulo de Mestre em Química.

*

Bolsista da

Belém – Pará

2005

FICHA CATALOGRÁFICA

Fonseca, Marcelo Lobato

Titulo: Estudo do Potencial Alelopático de Plantas da Família

Leguminosae: Investigação de Aleloquímicos de Parkia pendula./

Marcelo Lobato Fonseca – Belém, 2005.

Dissertação de Mestrado (Mestre em Química Orgânica) – Universidade

Federal do Pará, 2005.

Bibliografia p. 118-120

1- Parkia pendula, 2- alelopatia, 3- flavonóides, 4- derivados Ar-C

1

,

5-derivados C

13

carotenoide, 6- triterpenos, 7- esteróides.

I- Título.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Estudo do Potencial Alelopático de Plantas da

Família Leguminosae: Investigação de

Aleloquímicos de Parkia pendula

MARCELO LOBATO FONSECA

Profa. Dra. Mara Sílvia Pinheiro Arruda

Orientadora

ICEN - UFPA

Prof. Dr. Adolfo Henrique Müller

ICEN - UFPA

Prof. Dr. Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva

DQ-UFSCar

Julgado em: 31/03/2005

Belém – Pará

2005

Dedico este trabalho à Suzana e à

Eduarda, por tudo de especial que são em

minha vida, pelo amor, carinho e

companheirismo que fazem de nós uma família

feliz.

AGRADECIMENTOS

A Deus, provedor de todo conhecimento, pela sabedoria e iluminação

concedida em toda a minha vida.

Aos meus pais, Santana da Conceição Fonseca e Deuza Lobato Fonseca,

pela educação, incentivo e amor que foram e continuam sendo fundamentais em

minha existência.

Aos meus irmãos, pela fraternidade que nos mantém unidos tanto nos

momentos alegres como nos momentos tristes de nossas vidas.

À professora Mara Silvia Pinheiro Arruda, pela orientação competente e

incentivo na elaboração deste trabalho.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Química: Alberto

Cardoso Arruda, Adolfo Henrique Muller, Giselle Maria Skelding Pinheiro Guilhon e

Lourivaldo da Silva Santos, pela valorosa contribuição em minha formação a partir

dos ensinamentos prestados durante as disciplinas ministradas os quais estão aqui

demonstrados e pelo incentivo e ajuda que estiveram dispostos a me oferecer.

Ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal do

Pará, pela estrutura necessária para o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Dr. Antônio Pedro da Silva Souza Filho, pelos valiosos ensinamentos na

disciplina “Alelopatia” e pela colaboração na realização dos bioensaios alelopáticos.

Ao Laboratório de Agroindústria da Embrapa Amazônia Oriental, onde foram

realizados os bioensaios.

Aos funcionários e técnicos do Laboratório de Química-Pesquisa, pelo auxílio

durante os trabalhos de laboratório.

A todos os amigos do Laboratório de Química-Pesquisa: Adriano Caldeiras

Fernandes, Ana Cristina Baetas, Débora da Cruz Arruda, Eliana Ferreira Ozela,

Erlyson Farias Fernandes, Isabel Cecília de Castro Tavares, João da Silva Carneiro,

Joyce Silva, Júlio da Silva Félix, Mariana Sarkis Müller, Marilene Nunes, Milton

Nascimento da Silva, Monah Fonseca, Nelson Santos Gonçalves, Rafael Okada

Yasunori Moreira, Reinaldo Araújo dos Santos e Sonia das Graças S. R. Pamplona,

em especial aos amigos Lívia Trindade Lobo e Luís Adriano Santos do Nascimento,

companheiros das lutas, sofrimentos e vitórias.

Às demais pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para a

elaboração deste trabalho, em especial, aos meus familiares.

À CAPES pela bolsa de estudos.

Ao Funtec/Sectam, pelo auxílio financeiro.

RESUMO

Este trabalho refere-se ao estudo químico e alelopático da espécie Parkia pendula,

pertencente à família Leguminosae e conhecida vulgarmente como “visgueiro”. A

escolha da referida espécie para estudo se deu com base em bioensaios

alelopáticos realizados com extratos etanólicos das folhas e raízes de quatro

espécies pertencentes à família Leguminosae, os quais, demonstraram que o extrato

etanólico das folhas de Parkia pendula inibiu em 100 % a germinação das sementes

de Mimosa pudica, uma erva daninha conhecida popularmente como “malícia”, por

isso, este extrato foi fracionado e biomonitorado. Das frações com maior potencial

alelopático foram isoladas e identificadas onze substâncias: dois flavonóides,

3,7,8,4’-tetrametoxiflavona (S

1

) e 2’-hidroxi-3,7,8,4’,5’- pentametoxiflavona (S

2

); dois

derivados Ar-C

1

, ácido 3,4,5-trimetoxibenzóico (S

3

) e ácido 3,4-dimetoxibenzóico

(S

4

); dois derivados C

13

carotenóide, blumenol A (S

5

) e dehidrovomifoliol (S

6

); um

monoacilglicerídeo (S

7

); dois triterpenos em mistura, β-amirina (S

8

) e lupeol (S

9

) e a

mistura dos esteróides glicosilados β-sitosterol (S

10

) e estigmasterol (S

11

). Na

determinação estrutural das substâncias isoladas foram utilizados métodos

espectrométricos uni e bidimensionais de RMN

1

H e

13

C, além de comparação com

dados descritos na literatura. As substâncias S

1

, S

2

, S

3

, S

4

e S

5

foram submetidas a

bioensaios alelopáticos frente à germinação, desenvolvimento da radícula e do

hipocótilo de plantas invasoras de pastagem. Os percentuais de inibição observados

nestes bioensaios apresentaram uma linearidade crescente do princípio ativo

associada ao aumento da concentração das substâncias.

Palavras-chave: Parkia pendula, alelopatia, flavonóides, derivados Ar-C

1

, derivados

C

13

carotenóide, triterpenos, esteróides.

ABSTRACT

This work refers to chemical and allelopatic studies of species Parkia pendula, from

the Leguminosae family and it is known commonly as "visgueiro". The choice of the

referred species for study was based in allelopatic experiments accomplished with

ethanolic extracts of leaves and roots of four species belonging to the Leguminosae

family. The se studies demonstrated that the ethanolic extract of the leaves of Parkia

pendula inhibited in 100% the germination of the seeds of Mimosa pudica, a weed

known popularly as "malícia". This extract was fractioned and the fractions with

allelopatic activity were purified. There were isolated and identified eleven

substances: two flavonoids, 3,7,8,4'-tetramethoxyflavone (S

1

) and 2'-hidroxy-

3,7,8,4',5'-pentamethoxyflavone (S

2

); two derivatives Ar-C

1

, 3,4,5-trimetoxybenzoic

acid (S

3

) and 3,4-dimetoxybenzoic acid (S

4

); two derivatives C

13

carotene, blumenol

A (S

5

) and dehydrovomifoliol (S

6

); a monoacylglycerol (S

7

); two triterpenes in mixture,

β-amyrin (S

8

) and lupeol (S

9

) and the mixture of the glycosilated steroids β-sitosterol

(S

10

) and stigmasterol (S

11

). Spectrometric methods were used (1D and 2D

dimensional of NMR

1

H and

13

C) in the structural determination of the isolated

substances, besides comparison with data described in the literature. The substances

S

1

, S

2

, S

3

, S

4

and S

5

were submitted the allelopatic experiments measuring the

germination inhibition, development of the radicle and of the hypocotyl of plants. The

degree of inhibition observed in these experiments demonstrated linearity of activity

when associated to the concentration of the substances.

Key Word: Parkia pendula, allelopaty, flavonoids, derivatives Ar-C

1

, derivatives C

13

carotene, triterpenes, steroids.

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

MEMORIAL

1- INTRODUÇÃO................................................................................ 17

2- OBJETIVOS....................................................................................

19

3- PARKIA PENDULA........................................................................ 20

3.1- Família Leguminosae...................................................................... 20

3.2- Subfamília Mimosoideae................................................................. 20

3.3-

Gênero Parkia.................................................................................

21

3.4-

Espécie Parkia

pendula...................................................................

25

3.5-

Classificação Botânica....................................................................

26

4- PARTE EXPERIMENTAL............................................................... 27

4.1- Coleta e Identificação do Material Botânico....................................

27

4.2- Obtenção dos Extratos Brutos........................................................ 27

4.3-

Fracionamento do Extrato Etanólico das Folhas de Parkia

pendula

(PEF)...............................................................................................

29

4.4- Refracionamento da Fração P

4

....................................................... 30

4.4.1- Metodologia de Purificação por CLAE da Fração P

4(14)25-

34

......................................................................................................

34

4.5- Refracionamento da Fração P

5

....................................................... 35

4.6- Refracionamento da Fração P

6

....................................................... 37

4.7- Métodos Utilizados na Determinação Estrutural das Substâncias

Isoladas...........................................................................................

38

4.8- Metodologia Utilizada nos Bioensaios............................................ 38

4.8.1- Germinação de semente................................................................. 38

4.8.2- Desenvolvimento da radícula e do hipocótilo..................................

39

4.8.3- Combinação de pares aleloquímicos.............................................. 39

4.9- Análise Estatística........................................................................... 41

4.10- Materiais e Equipamentos Utilizados nos Procedimentos

Experimentais..................................................................................

41

4.10.1-

Equipamentos utilizados no isolamento e identificação estrutural

das substâncias...............................................................................

41

4.10.2-

Reagentes utilizados no isolamento e identificação estrutural das

substâncias.....................................................................................

42

4.10.3-

Instrumentos e materiais utilizados nos Bioensaios

Alelopáticos.....................................................................................

43

5- CONSTITUINTES QUÍMICOS ISOLADOS DAS PARTES

AÉREAS DE PARKIA PENDULA .................................................

44

6- ROTA BIOSSINTÉTICA................................................................. 48

6.1- Flavonóides..................................................................................... 48

6.2- Derivados Ar-C

1

.............................................................................. 52

6.3- Derivados C-13 Carotenóide...........................................................

54

6.4- Monoacilglicerídeo S

7

......................................................................

59

7- ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DAS SUBSTÂNCIAS

ISOLADAS......................................................................................

60

7.1- Flavonóide S

1

.................................................................................. 60

7.2- Flavonóide S

2

.................................................................................. 67

7.3- Derivado Ar-C

1

S

3

........................................................................... 76

7.4- Derivado Ar-C

1

S

4

........................................................................... 79

7.5- Derivado C

13

Carotenóide S

5

.......................................................... 83

7.6- Derivado C

13

Carotenóide S

6

.......................................................... 89

7.7- Monoacilglicerídeo S

7

..................................................................... 93

7.8- Triterpenos S

8

e S

9

..........................................................................

97

7.9- Esteróides S

10

e S

11

........................................................................ 101

8- RESULTADO DOS BIOENSAIOS..................................................

104

8.1- Extratos Brutos................................................................................

104

8.2- Frações Resultantes do Fracionamento do Extrato Etanólico das

Folhas de P. pendula......................................................................

105

8.3- Bioensaios com as Substâncias S

1

, S

2

, S

3

, S

4

e S

5

........................

106

8.3.1-

Germinação de sementes............................................................... 106

8.3.2-

Desenvolvimento da radícula.......................................................... 108

8.3.3-

Desenvolvimento do

hipocótilo........................................................

111

8.4- Combinação de pares aleloquímicos............................................. 114

9- CONCLUSÕES............................................................................... 117

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................

118

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Esquema 1- Proposta Biossintética para formação de S

1

e

S

2

......................

50

Esquema 2- Proposta Biossintética para formação de S

3

e

S

4

......................

53

Esquema 3- Proposta Biossintética para formação de S

5

e

S

6

......................

55

Esquema 4- Proposta Biossintética para formação de S

7

............................. 59

Figura 1-

Inflorescências em Parkia..........................................................

22

Figura 2-

Parkia pendula...........................................................................

26

Figura 3- Cromatograma da fração P

4(14)25-34

em CLAE........................... 35

Figura 4- Modelo teórico da combinação entre pares aleloquímicos........

40

Figura 5- Estrutura básica dos flavonóides...............................................

48

Figura 6- Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

1

.......................... 60

Figura 7- Espectro de COSY

1

H x

1

H de S

1

.............................................. 61

Figura 8- Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CDCl

3

) de S

1

...........................

62

Figura 9- Espectro de HETCOR de S

1

......................................................

63

Figura 10- Espectro de HETCOR de S

1

(Expansão de 3,5-4,3 x 54,0-

62,0 ppm)...................................................................................

63

Figura 11- Espectro de HMBC de S

1

(Expansão de 7,8-8,3 x 130,0-175,0

ppm)...........................................................................................

64

Figura 12- Espectro de HMBC de S

1

(Expansão de 3,8-4,1 x 0,0-220,0

ppm)...........................................................................................

64

Figura 13- Espectro de HMBC de S

1

(Expansão de 6,9-7,4 x 115,0-157,0

ppm)...........................................................................................

65

Figura 14- Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

2

.......................... 67

Figura 15- Espectro de NOEdiff de S

2

(irradiação em 7,06 ppm).............. 68

Figura 16- Espectro de NOEdiff de S

2

(irradiação em 6,63 ppm).............. 69

Figura 17- Espectro de NOEdiff de S

2

(irradiação em 7,32 ppm).............. 70

Figura 18- Espectro de NOEdiff de S

2

(irradiação em 8,16 ppm).............. 70

Figura 19- Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CDCl

3

) de S

2

...........................

71

Figura 20- Espectro de HSQC de S

2

(Expansão de 6,2-8,2 x 100,0-124,0

ppm)...........................................................................................

72

Figura 21- Espectro de HSQC de S

2

(Expansão de 3,8-4,2 x 55,0-63,0

ppm)...........................................................................................

72

Figura 22- Espectro de HMBC de S

2

(Expansão de 6,6-8,0 x 105,0-175,0

ppm)...........................................................................................

73

Figura 23- Espectro de HMBC de S

2

(Expansão de 3,8-4,1 x 135,0-158,0

ppm)...........................................................................................

73

Figura 24- Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

3

.......................... 76

Figura 25- Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CDCl

3

) de S

3

...........................

77

Figura 26- Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

4

.......................... 79

Figura 27- Espectro de COSY

1

H x

1

H de S

4

.............................................. 80

Figura 28- Espectro de NOEdiff de S

4

(irradiação em 6,91 ppm).............. 81

Figura 29- Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CDCl

3

) de S

4

...........................

81

Figura 30- Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

5

.......................... 83

Figura 31- Espectro de COSY

1

H x

1

H de S

5

.............................................. 84

Figura 32- Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CD

3

OD) de S

5

.........................

85

Figura 33- Espectro de HSQC de S

5

.......................................................... 86

Figura 34- Espectro de HMBC de S

5

.......................................................... 87

Figura 35- Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

6

.......................... 89

Figura 36- Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CDCl

3

) de S

6

...........................

91

Figura 37- Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

7

.......................... 93

Figura 38- Espectro de COSY

1

H x

1

H de S

7

.............................................. 94

Figura 39- Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CDCl

3

) de S

7

...........................

95

Figura 40- Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

8

+ S

9

.................. 97

Figura 41- Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CDCl

3

) de S

8

+ S

9

...................

98

Figura 42- Espectro de RMN

1

H (300 MHz, Piridina-D

5

) de S

10

+ S

11

........ 101

Figura 43- Espectro de RMN

13

C (75 MHz, Piridina-D

5

) de S

10

+ S

11

.........

102

Fluxograma

1-

Obtenção dos Extratos Brutos...................................................

28

Fluxograma

2-

Fracionamento do Extrato Etanólico de Parkia

pendula......................................................................................

29

Fluxograma

3-

Fracionamento da Fração P

4

.....................................................

31

Fluxograma

4-

Refracionamento da Fração P

4(12)

.............................................

32

Fluxograma

5-

Refracionamento da Fração P

4(14)

.............................................

33

Fluxograma

6-

Fracionamento da Fração P

5

.....................................................

36

Fluxograma

7-

Fracionamento da Fração P

6

.....................................................

37

Gráfico 1- Efeitos dos extratos etanólicos de plantas da família

Leguminosae, sobre a germinação de plantas invasoras.........

104

Gráfico 2- Efeitos das frações oriundas do fracionamento do extrato

etanólico das folhas de P. pendula, sobre a germinação de

plantas invasoras.......................................................................

105

Gráfico 3- Efeitos de S

1

sobre a germinação das sementes de malícia e

mata-pasto.................................................................................

106

Gráfico 4- Efeitos de S

2

sobre a germinação das sementes de malícia e

mata-pasto.................................................................................

107

Gráfico 5- Efeitos de S

3

sobre a germinação das sementes de malícia e

mata-pasto.................................................................................

107

Gráfico 6- Efeitos de S

4

sobre a germinação das sementes de malícia e

mata-pasto.................................................................................

107

Gráfico 7- Efeitos de S

5

sobre a germinação das sementes de malícia e

mata-pasto.................................................................................

108

Gráfico 8- Efeitos de S

1

sobre o desenvolvimento da radícula de malícia

e mata-pasto..............................................................................

109

Gráfico 9- Efeitos de S

2

sobre o desenvolvimento da radícula de malícia

e mata-pasto..............................................................................

109

Gráfico 10- Efeitos de S

3

sobre o desenvolvimento da radícula de malícia

e mata-pasto..............................................................................

110

Gráfico 11- Efeitos de S

4

sobre o desenvolvimento da radícula de malícia

e mata-pasto..............................................................................

110

Gráfico 12- Efeitos de S

5

sobre o desenvolvimento da radícula de malícia

e mata-pasto..............................................................................

111

Gráfico 13- Efeitos de S

1

sobre o desenvolvimento do hipocótilo de

malícia e mata-pasto.................................................................

112

Gráfico 14- Efeitos de S

2

sobre o desenvolvimento do hipocótilo de

malícia e mata-pasto.................................................................

112

Gráfico 15- Efeitos de S

3

sobre o desenvolvimento do hipocótilo de

malícia e mata-pasto.................................................................

113

Gráfico 16- Efeitos de S

4

sobre o desenvolvimento do hipocótilo de

malícia e mata-pasto.................................................................

113

Gráfico 17- Efeitos de S

5

sobre o desenvolvimento do hipocótilo de

malícia e mata-pasto.................................................................

114

Tabela 1- Dados de RMN

1

H e

13

C para S

1

(ppm, CDCl

3

, 300 e 75

MHz)..........................................................................................

66

Tabela 2- Dados de RMN

1

H e

13

C para S

2

(ppm, CDCl

3

, 300 e 75

MHz)..........................................................................................

75

Tabela 3- Dados de RMN

1

H e

13

C para S

3

(ppm, CDCl

3

, 300 e 75

MHz)..........................................................................................

78

Tabela 4- Dados de RMN

1

H e

13

C para S

4

(ppm, CDCl

3

, 300 e 75

MHz)..........................................................................................

82

Tabela 5- Dados de RMN

1

H e

13

C para S

5

(ppm, 300 e 75 MHz)............ 88

Tabela 6- Dados de RMN

1

H e

13

C para S

6

(ppm, CDCl

3

, 300 e 75

MHz)..........................................................................................

92

Tabela 7- Dados de RMN

1

H e

13

C para S

7

(ppm, CDCl

3

300 e 75

MHz)..........................................................................................

96

Tabela 8- Dados de RMN

13

C para S

8

e S

9

(ppm, CDCl

3

, 75 MHz)...........

100

Tabela 9-

Dados de RMN

13

C para

S

10

e

S

11

(ppm, Piridina-D

5

, 75

MHz)..........................................................................................

103

Tabela 10- Efeitos associativos observados na combinação de S

1

com S

2

115

Tabela 11-

Efeitos associativos observados na combinação de

S

1

com

S

3

115

Tabela 12-

Efeitos associativos observados na combinação de

S

1

com

S

4

116

Tabela 13-

Efeitos associativos observados na combinação de

S

3

com

S

4

116

ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

AcOEt Acetato de Etila

CCDC Cromatografia em Camada Delgada Comparativa

CCVU Coluna Cromatográfica por Via Úmida

CLAE Cromatografia Liquida de Alta Eficiência

COSY

1

H x

1

H H, H Correlated Spectroscopy

d

Dubleto

dd

Duplo dubleto

DEPT Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer

DMAPP Dimetilalilpirofosfato

Fig. Figura

Graf. Gráfico

HETCOR Heteronuclear Chemical Shift Correlation

Hex. Hexano

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

Hz Hertz

IPP Isopentenil pirofosfato

J

Constante de acoplamento

m

Multipleto

MeOH Metanol

MHz Megahertz

min Minuto

MVA Ácido mevalônico

NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotidio Pirofosfato

NOEdiff Nuclear Ovehauser Effect difference

PAL L-Fenilalanina Amônia Liase

p. Página

P.A. Para Análise

ppm Parte por milhão

q

Quarteto

qt

Quinteto

RMN

1

H Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio-1

RMN

13

C Ressonância Magnética Nuclear de carbono-13

SAM S-Adenosil Metionina

s

Singleto

sl

Singleto largo

t

Tripleto

Tab. Tabela

UV Ultravioleta

δ Deslocamento Químico

MEMORIAL

FONSECA, M. L.; ARRUDA, M. S. P.; ARRUDA, A.C., SOUZA FILHO, A. P.,

SANTOS, L. da S.; MULLER, A. H.; GUILHON, G. M. S. P. Flavonóides

Metoxilados e Avaliação do Potencial Alelopático de Parkia pendula

(Leguminosae). 27ª REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE

QUÍMICA, Salvador-Bahia, 2004.

SOUZA FILHO, A. P., FONSECA, M. L.; ARRUDA, M. S. P. Substâncias Químicas

com Atividades Alelopáticas Presentes Nas Folhas de Parkia pendula

(Leguminosae). Planta Daninha. Viçosa-MG. V. 23. n. 4. p. 565-573. 2005.

1- Introdução

Nos últimos anos, tem crescido a preocupação da sociedade em relação à

utilização de insumos químicos na agropecuária. Estes insumos são os fertilizantes e

os defensivos agrícolas (inseticidas, fungicidas, acaricidas e herbicidas). Em relação

a estes últimos, o que chama a atenção é a sua extrema capacidade de poluir o

ambiente, comprometer a vida silvestre e contaminar os alimentos utilizados na dieta

humana (Souza Filho & Alves, 1998).

Nesse contexto, os milhares de substâncias químicas disponíveis na natureza,

principalmente, aquelas produzidas pelas plantas, podem oferecer para o homem

novas e excelentes oportunidades para diversificar o controle de endemias na

agropecuária, com a produção de biodefensivos (os bioherbicidas), reduzindo ou

eliminando a contaminação do ambiente, preservando os recursos naturais e

garantindo produtos com alta qualidade e desprovidos de agentes contaminantes.

No Brasil, especificamente na Amazônia, as condições oferecidas pela sua

biodiversidade são extremamente auspiciosas, pela sua diversidade em espécies

vegetais, constituindo substancial manancial de fontes de estruturas químicas com

grandes possibilidades de uso direto como biodefensivos.

Estudos mostram que uma planta pode, direta ou indiretamente, interferir no

desempenho de outras plantas em sua vizinhança através da produção de

substâncias químicas liberadas para o meio ambiente, fenômeno que Molish, em

1937, chamou de alelopatia.

A alelopatia é o fenômeno que se caracteriza pela interferência que uma

planta exerce no desenvolvimento de outra planta, alterando o padrão e a densidade

(Rice, 1974; Smith, 1989). Esta interferência ocorre pela produção de substâncias

químicas que são liberadas para o meio ambiente por volatilização, exsudação

radicular, lixiviação e decomposição dos resíduos de plantas (Einhellig, 1995).

O emprego de herbicidas no controle químico de plantas invasoras de

pastagem é uma prática muito comum, porém desaconselhável pela agressão que

causam ao meio ambiente. Uma alternativa ao emprego dos defensivos químicos é a

alelopatia. Substâncias alelopáticas deverão desempenhar um importante papel

ecológico num futuro próximo, para uso na agropecuária. Tais substâncias serão

usadas como ferramentas de manejo das pastagens, e fontes para a produção de

biodefensivos agrícolas.

Nos últimos anos, um número considerável de substâncias químicas com

atividades alelopáticas, foram isoladas e identificadas a partir de várias espécies de

plantas. Basicamente, esses metabólitos pertencem às classes dos terpenóides,

flavonóides, esteróides, alcalóides, acetogeninas e fenilpropanóides (Whittaker &

Fenni, 1971).

Teoricamente, todas as plantas são, potencialmente, capazes de sintetizar

compostos altamente diversificados quimicamente com atividade alelopática. Ao

mesmo tempo, todas as partes das plantas podem conter essas substâncias. Em

diferentes bioensaios, agentes alelopáticos já foram identificados nas folhas, nos

caules, nas flores, nos rizomas, nas raízes, nos frutos e nas sementes de diferentes

espécies de plantas (Smith & Martin, 1994).

O grupo de Química de Produtos Naturais da UFPA em parceria com a

Embrapa (CPATU) vem realizando estudos químicos sistemáticos e de atividade

alelopática de plantas pertencentes à família Leguminosae e os resultados obtidos

tem se mostrado bastante interessantes. Dando continuidade a este estudo

sistemático, as folhas de Parkia pendula, uma Leguminosae, foram investigadas sob

o ponto de vista fitoquímico e de atividade alelopática.

Parkia pendula (Leguminosae), subfamília Mimosoideae, conhecida

vulgarmente como “visgueiro”, é objeto do presente estudo. Sua escolha para

investigação fitoquímica e alelopática, se deu com base nos bioensaios realizados

com extratos orgânicos de espécies da família Leguminosae, os quais demonstraram

que o extrato etanólico das folhas da referida espécie apresentou apreciável efeito

alelopático sobre plantas invasoras de pastagem, além de não haver relato na

literatura de estudo químico para a espécie.

2- Objetivos

Ø Fazer o estudo fitoquímico do extrato etanólico das folhas de Parkia pendula,

monitorado via bioensaios alelopáticos, buscando o isolamento, purificação, e

identificação estrutural de seus principais metabólitos secundários.

Ø Caracterizar as atividades alelopáticas das substâncias isoladas sobre a

germinação de sementes e o desenvolvimento de plantas daninhas, com a

finalidade de obter entre elas, uma ou mais que possam ser utilizadas como

bioherbicidas .

3- PARKIA PENDULA (LEGUMINOSAE)

3.1- A FAMÍLIA LEGUMINOSAE

O papel importante das leguminosas na composição das matas amazônicas já

foi apreciado por HUBER. Cabe-lhes aí o primeiro lugar entre os vegetais lenhosos,

quer pelo número de indivíduos quer pelo de espécies e gêneros botânicos: a elas

pertencem a maioria das árvores gigantes e um grande número de árvores de

notável beleza. Se a grande maioria das leguminosas amazônicas é constituída por

árvores, muitas são também as espécies escandentes da mata. As espécies

herbáceas (inclusive os subarbustos) são, ao contrário, relativamente poucas na

região e na maioria restrita aos campos naturais, ocupando quase todas, uma área

geográfica maior, fora da Amazônia.

A distribuição das leguminosas dentro da Amazônia não é uniforme, sendo a

parte mais rica uma faixa que atravessa o centro da região de Noroeste a Sudeste. A

família leguminosae está subdividida em grupos de gêneros (subfamílias) ligados

entre si por múltiplas formas de transição (Ducke, 1939). Estas subfamílias são:

Caesalpinioideae, Mimosoideae e Papilionoideae. Suas características botânicas

compreendem plantas com os mais diversos hábitos, de minúsculas ervas a

portentosas árvores (podendo alcançar até 60m), ou cipós enormes. Folhas

geralmente simples por supressão. Inflorescências paniculiformes, racemosas ou

glomeruladas, raro outros tipos, com flores diclomídeas a maioria zigmorfas,

actinomorfas apenas nas Mimosoideae; cálice ganossépalo pentapartido, corola com

5 pétalas geralmente desiguais ou reduzidas a uma, livres sendo que geralmente

duas são coalescentes na base (Van Den Berg, 1982).

3.2- A SUBFAMÍLIA MIMOSOIDEAE

A subfamília Mimosoideae possui mais ou menos 60 gêneros e 3000 espécies

distribuídas em 5 tribos. Tem distribuição principalmente pantropical e subtropical,

com a maior diversidade nos gêneros Acacia, Mimosa e Inga. A subfamília inclui

árvores, ervas, lianas e arbustos. As folhas são sempre paripinadas, pinadas em

Inga e bipinadas em todos os outros gêneros. As flores são geralmente pequenas e

sempre agrupadas em inflorescências relativamente compactas, na forma de espiga,

umbela, panícula ou capítulo denso; o número varia de poucas flores em algumas

espécies de Inga até mais de 2000 em algumas espécies de Parkia. Funcionalmente

a inflorescência exerce o papel de uma flor.

Os mecanismos de polinização são diversos, incluindo abelhas em

Stryphnodendron, Dinizia, Mimosa, Acácia, Pseudopiptadenia e Piptadenia; espécies

de Ingá e Zygia são polinizadas principalmente por mariposas da noite

(especialmente Sphingidae). A maioria das espécies de Parkia é polinizada por

morcegos, com duas espécies na Reserva (P. multijuga e P. velutina) polinizadas por

abelhas noturnas (Megalopta).

Os frutos são vagens, deiscentes ou não, mas sempre com sementes

numerosas. Muitas espécies são comidas por papagaios e macacos, que podem ser

predadores ou talvez dispersores ocasionais. As sementes de Inga são recalcitrantes

e envolvidas em polpa branca e doce (arilo). Em outros gêneros, a testa da semente

é muito dura e pode permanecer viável por anos. Maneiras de disperção incluem

vento (Dinizia, Pseudopiptadenia e outras), roedores (Parkia multijuga), água

(Macrosamanea), araras (Parkia pendula), e provavelmente macacos e pássaros.

Através dos nectários, Mimosoideae em geral, tem uma relação forte com

formigas; a planta fornece um líquido (néctar) rico em açúcar para a formiga, em

troca de proteção contra herbívoros (Ribeiro, et al., 1999).

3.3- O GÊNERO PARKIA

O gênero Parkia é pantropical, com sua maior diversidade na Amazônia. A

polinização do gênero foi estudada na Reserva Ducke, no estado do Amazonas e

áreas vizinhas. Em cinco espécies a polinização é feita por morcegos, especialmente

por Glossoghata discolor (provavelmente a espécie mostrada na figura 1). Os

morcegos visitam rapidamente à noite, lambendo o néctar produzido por flores

nectaríferas. Duas espécies, P. multijuga e P. velutina são polinizadas por abelhas

noturnas (Megalopta). As flores são sempre bem coloridas, sendo vermelhas ou

amarelas, que aparentemente variam independentemente do polinizador.

A posição das inflorescências varia entre as espécies, uma característica que

Diagrama das inflorescências de Parkia

Foto (Ribeiro et al., 1999)

pode ajudar na identificação, uma vez que as ráquis geralmente permanecem por um

longo período do ano (Ribeiro, et al., 1999).

Segundo levantamento bibliográfico realizado, três espécies desse gênero já

foram estudadas quimicamente: P. clappertoniana (Lemmich et al., 1996), P.

biglobosa (Tringali, Spatafora & Longo, 2000) e P. speciosa (Jamaluddin, Mohamed

& Lajis, 1995), das quais, foram isoladas substâncias pertencentes à classe dos

flavonóides, triterpenos, esteróides e ésteres-Ar-C

3

. Os constituintes químicos

isolados destas espécies são mostrados a seguir:

Figura 1: Inflorescências em Parkia

O

OMe

M

eO

OMe

O

M

e

H

O

OMe

2'-hidroxi-3,7,8,4',5'-pentametoxiflavona

O

OMe

H

O

OMe

O

M

e

7-hidroxi-3,8,4'-trimetoxiflavona

9

M

eO

HO

O

O O

H

O

OH

1-( - Feruloillignoceril)-glicerol

n

M

eO

OH

O O OH

O O

OH

1-( - Isoferuloilalcanoil)-gliceróis n = 21-25

Ø P. clappertoniana (Lemmich et al., 1996)

Ø P. biglobosa (Tringali, Spatafora & Longo, 2000)

O

H

O

OH

O

H

OH

O

H

Epigalocatequina

O

H

O

OH

O

3-O-galato-epicatequina

OH

O

H

OH

O

H

O

OH

O

OH

3-O-galato-epigalocatequina

OH

O

H

OH

O

H

O

OH

O

H

OH

OMe

OH

O

H

4-O-metil-epigalocatequina

Lupeol

H

O

Stigmast-4-en-3-one

Ø P. speciosa (Jamaluddin, Mohamed & Lajis, 1995)

3.4- A ESPÉCIE Parkia pendula (Willdenow) Bentham ex Walpers

Parkia pendula (Fig. 2, p. 26), conhecida vulgarmente como “visgueiro”, é uma

árvore de dossel. Copa plana, formando uma das mais distintas e bonitas forma em

árvores da Amazônia. Casca sempre vermelha, desprendendo em placas grandes.

Apresenta folhas grandes, foliólulos bem finos. Possui a distribuição mais ampla no

gênero, entre a América Central e o Espírito Santo.

Parkia pendula tem uma copa muito bonita, e seria uma árvore ideal para

arborização se seus frutos não produzissem quantidades enormes de goma tão

pegajosa que é capaz de tirar a tinta de automóveis, por isso, não pode ser cultivada

nas ruas (Ribeiro, et al., 1999).

Foto (Ribeiro et al., 1999)

3.5- CLASSIFICAÇÃO BOTÂNICA

· Divisão: Magnoliophyta

· Subdivisão: Magnolicae

· Classe: Magnolipsida

· Subclasse: Hamamelidae

· Ordem: Urticales

· Subordem: Malviflorae

· Família: Leguminosae

· Subfamília: Mimosoideae

· Gênero: Parkia

· Espécie: Parkia pendula

Figura 2: Parkia pendula (Willd.) Benth. ex Walp.

4- PARTE EXPERIMENTAL

4.1- Coleta e identificação do material botânico para análise

A coleta do material botânico foi realizada obedecendo ao protocolo de coleta

reconhecido internacionalmente, tendo sido obtidos fotos digitais do espécime e do

ramo fértil para compor a exsicata, localização do espécime por GPS e autorização

do proprietário da área para proceder a coleta. As espécies foram identificadas pela

professora M. Sc. Ely Simone Cajueiro Gurgel e pelo parataxonomista Manoel

Cordeiro dos Reis, que pertencem ao Museu Paraense Emílio Göeldi.

Foram coletados 2,5 kg de folhas e/ou raízes das espécies frescas. As

amostras foram cuidadosamente escolhidas para composição das exsicatas e

identificadas pelo código internacional de nomenclatura botânica (GREUTER, 1988),

sendo que apenas foi coletado material fértil.

As amostras coletadas foram folhas e raízes de quatro espécies da família

Leguminosae, encontrando-se as exsicatas depositadas no herbário de folhas (HF)

do Museu Paraense Emílio Göeldi (MPEG), segundo os registros mostrados a

seguir:

Espécie MPEG HF

Parkia pendula

171299 3165

Plathymenia reticulata

171304 3170

Cassia fastuose

171330 3196

Samanea tubulosa

171333 3199

4.2- Obtenção dos extratos brutos

O material botânico (Folhas e raízes) das quatro espécies coletadas foi seco

em estufa com temperatura de 45 °C e posteriormente triturado em moinho tipo

facas, resultando em oito amostras. Separou-se 500 g do material seco e moído de

cada amostra e realizou-se a extração por percolação a frio, utilizando-se 8 litros de

álcool etílico, sendo o tempo total de extração de 24 horas, ou seja, para cada quatro

litros de etanol levou-se um tempo de 12 horas de extração, seguido por

concentração a vácuo para evaporação do solvente. No fluxograma 1, é mostrada a

metodologia utilizada para a obtenção dos extratos brutos das amostras coletadas.

1. Extração à frio com etanol (24 h)

2. Filtração

Concentração

BIOENSAIOS

ALELOPÁTICOS

(GRÁF. 1, p. 104)

SOLUÇÃO

ETANÓLICA

RESÍDUO

MATERIAL

BOTÂNICO SECO E

MOÍDO

500,0 g

EXTRATO

ETANÓLICO

FLUXOGRAMA 1: Obtenção dos Extratos Brutos

Os extratos obtidos foram submetidos à avaliação da atividade potencialmente

alelopática com exceção do extrato etanólico das raízes de Parkia pendula, que

apresentou baixo rendimento. Mediante a realização dos bioensaios, ficou

constatado que o extrato etanólico das folhas da espécie Parkia pendula, foi o que

apresentou o maior potencial inibitório da germinação de plantas daninhas, sendo,

portanto escolhido para estudo fitoquímico.

4.3- Fracionamento do extrato etanólico das folhas de Parkia pendula (PEF)

Depois de realizados os bioensaios, com a escolha das folhas da espécie P.

pendula para estudo fitoquímico, o extrato bruto (10,0 g) foi submetido a

fracionamento em CCVU filtrante utilizando-se como fase estacionária, sílica-gel 70-

230 Mesh desativada com MeOH/H

2

O na proporção de 1:1 e como fase móvel,

solventes e misturas de solventes com gradiente crescente de polaridade, resultando

num total de 7 frações: Hex. 100% (P

1

), Hex.:CH

2

Cl

2

50% (P

2

), CH

2

Cl

2

100% (P

3

),

CH

2

Cl

2

:AcOEt 50% (P

4

), AcOEt 100% (P

5

), AcOEt:MeOH 50% (P

6

) e MeOH 100%

(P

7

) (Fluxograma 2).

FLUXOGRAMA 2: Fracionamento do Extrato Etanólico

1. Bio

ensaio Alelopático (Graf. 1)

2. CCVU Filtrante (7 frações)

CH

2

Cl

2

/AcOEt

(50 %)

AcOEt

(100 %)

Hexano

(100 %)

CH

2

Cl

2

(100 %)

Hex/CH

2

Cl

2

(50 %)

AcOEt/MeOH

(50 %)

MeOH

(100 %)

EXTRATO

ETANÓLICO DAS

FOLHAS (PEF)

10,0

g

P

1

4

,

7

x 10

-

2

g

P

3

0,

7

g

P

4

1

,0

g

P

5

0,

3

g

P

2

0,5

g

P

6

3

,0

g

P

7

2

,0

g

B

IOENSAIOS

ALELOPÁTICOS

(Gráf. 2

, p. 105

)

Foi avaliado o potencial alelopático das frações oriundas do fracionamento do

extrato PEF, sendo que, das sete frações obtidas, somente seis foram submetidas a

bioensaios, uma vez que o rendimento da fração P

1

foi muito baixo, impossibilitando

a sua análise.

O resultado dos bioensaios indicou um apreciável efeito inibitório das frações

P

4

, P

5

e P

6

, com percentual de 76,0; 100,0 e 70,0 %, respectivamente, frente a

germinação das sementes de malícia, e portanto, estas frações foram selecionadas

para refracionamento e purificação.

4.4- Refracionamento da fração P

4

A fração CH

2

Cl

2

:AcOEt 50% (P

4

) com 1,0 g foi refracionada em CCVU

utilizando-se como eluentes misturas de Hexano e AcOEt em gradiente crescente

de polaridade, obtendo-se 60 frações que foram monitoradas via CCDC e reunidas

em 15 frações (Fluxograma 3).

A fração P

4(3)

com 27,0 mg foi submetida à técnica de RMN de

1

H e

13

C

evidenciando a presença dos triterpenos β-amirina (S

8

) e lupeol (S

9

) em mistura.

A fração P

4(11)

com 65 mg foi refracionada em CCVU utilizando-se sistema

isocrático de eluição formado pela mistura de Hex:CH

2

Cl

2

:MeOH na proporção

5,0:4,5:0.5, obtendo-se 12,0 mg do flavonóide 3,7,8,4’-tetrametoxiflavona (S

1

) e 8,0

mg do monoacilglicerídeo (S

7

).

A fração P

4(13)

com 60,0 mg foi submetida a CCVU utilizando-se misturas de

Hexano e AcOEt em ordem crescente de polaridade, onde foram isolados 8,0 mg do

ácido verátrico (S

4

).

CCVU (Hex/AcOEt)

RMN

1

H e

13

C

CCVU Isocrática

Hex/CH

2

Cl

2

/MeOH

Proporção 5,0:4,5:0,5

RMN

1

H e

13

C

RMN

1

H e

13

C

Fluxograma 4 Fluxograma 5

CCVU (Hex/AcOEt)

RMN

1

H e

13

C

Bioensaio

P

4

1,0 g

60 Frações

reunidas em 15

por CCDC

P

4(3)

S

8

e S

9

27,0 mg

EM MISTURA

P

4(11)

65,0 mg

P

4(11)

-

1

P

4(11)

-

2

S

1

12,0 mg

S

7

8,0 mg

P

4(12)

106,6 mg

P

4(13)

60,0 mg

P

4(14)

124,0 mg

P

4(1

3

)

-

1

S

4

8,0 mg

FLUXOGRAMA 3: Fracionamento da Fração P

4

A fração P

4(12)

com 106,0 mg foi refracionada em CCVU usando-se como

eluentes, misturas de Hexano e AcOEt em ordem crescente de polaridade,

resultando em 76 frações, reunidas em 6 por CCDC. A reunião P

4(12)-3

com 19,0 mg

foi submetida a CCDP, eluida em Hex/AcOEt na proporção 65:35, obtendo-se 2,0 mg

CCVU (Hex/AcOEt)

CCDP

Hex:AcOEt 35 %

RMN

1

H

CCVU Isocrática

Hex/CH

2

Cl

2

/MeOH

5,0:4,5:0,5

P

4(12)

106,0 mg

76 Frações

reunidas em 6

por CCDC

P

4(12)-3

19,0 mg

P

4(12)-4

23,0 mg

S

1

2,0 mg

S

6

+ S

7

15,0 mg

do flavonóide 3,7,8,4’-tetrametoxiflavona (S

1

). A reunião P

4(12)-4

com 23,0 mg foi

refracionada em CCVU, utilizando-se sistema isocrático com Hex:CH

2

Cl

2

:MeOH na

proporção de 5,0:4,5:0,5, obtendo-se 15,0 mg do derivado carotenóide

dehidrovomifoliol (S

6

) em mistura com o monoacilglicerídeo (S

7

) (Fluxograma 4).

FLUXOGRAMA 4: Refracionamento da Fração P

4(12)

A fração P

4(14)

com 124,0 mg foi refracionada em CCVU utilizando-se como

eluentes misturas de Hexano e AcOEt em ordem crescente de polaridade, resultando

34 frações, reunidas em 4 frações a partir da análise por CCDC. De onde se obteve

8,6 mg do flavonóide 2’-hidroxi-3,7,8,4’,5’-pentametoxiflavona (S

2

)

e 21,0 mg do

ácido 3,4,5-trimetoxibenzóico (S

3

).

A fração P

4(14)-4

com 40,0 mg foi submetida à técnica de CLAE, obtendo-se 1,5

mg de S

2

e 5,0 mg do derivado carotenóide blumenol A (S

5

) (Fluxograma 5).

CCVU (Hex/AcOEt)

RMN

1

H e

13

C

Bioensaio

RMN

1

H e

13

C

Bioensaio

CLAE analítico C18

H

2

O(acidificada)/CH

3

CN

65:35

RMN

1

H e

13

C

Bioensaio

P

4(14)

124,0 mg

34 Frações

reunidas em 4

por CCDC

P

4(14)

-

2

P

4(14)

-

3

S

2

8,6 mg

S

3

21,0 mg

P

4(14)-4

40,0 mg

5 Frações

S

2

1,5 mg

S

5

5,0 mg

FLUXOGRAMA 5: Refracionamento da Fração P

4(14)

4.4.1- Metodologia de purificação por CLAE da fração P

4(14)25-34

A fração P

4(14)25-34

com 40,0 mg foi solubilizada em acetonitrila e sonicada em

ultrasson durante 2 minutos. Em seguida, foi filtrada em membrana filtrante com

diâmetro de poros de 0,25 µm, sendo posteriormente injetada uma alíquota de 20 µL

no sistema CLAE.

Para análise do melhor sistema a utilizar na separação, foi usado um aparelho

composto por duas bombas LC-10 AD (Shimadzu), com sistema de injeção manual

(looping de 20 µL), detector SPD 10 AV UV-Visivel (em um comprimento de onda de

245 nm), uma interface CBM, software Class 3.1 e sistema de degaseficador de

membrana DGU-14. Como fase estacionária, utilizou-se uma coluna analítica Luna

C18 (25 x 0,46 cm) e pré-coluna de C18. Como fase móvel, utilizou-se um sistema

isocrático formado pela mistura dos solventes água ultra-pura, obtida de um sistema

milipore (Elgamax), contendo 1,25% de ácido fórmico e acetonitrila, usando-se um

fluxo de 1 mL/min. Os solventes foram filtrados em membrana de nylon de 0,45 µm e

mantidos em um banho de ultrassom durante 30 min.

Depois de determinado o melhor sistema de separação, a fração foi injetada

em CLAE analítico para isolamento de suas substâncias, uma vez que, a quantidade

de amostra não era suficiente para otimizar o método por CLAE preparativo.

O sistema utilizado foi um sistema isocrático de H

2

O (1,25% de ác.

fórmico)/CH

3

CN numa proporção de 65:35 em 30 min.

A separação dos picos principais no CLAE analítico resultou em 5 frações: A,

B, C, D e E, sendo que duas delas: A e D foram analisadas por RMN, obtendo-se a

estrutura de S

5

e S

2

, respectivamente

.

(Fluxograma 5 e Figura 3).

4.5- Refracionamento da fração P

5

A fração AcOEt 100% (P

5

) com 310,0 mg foi submetida a CCVU utilizando-se

como fase estacionária sephadex LH-20 e como fase móvel MeOH. A amostra foi

solubilizada em 10 mL de MeOH e inoculada em coluna de 1,5 X 80 cm, obtendo-se

80 frações de 6 mL aproximadamente, que foram monitoradas via CCDC e reunidas

em 7 frações. A fração P

5(3)

com 158,0 mg foi submetida também a uma CCVU por

sephadex LH-20 utilizando-se como eluentes a mistura de CH

2

Cl

2

/MeOH na

proporção de 1:9. A Fração P

5(3)-5

com 65,0 mg foi submetida a um novo

refracionamento em CCVU, utilizando-se como fase estacionária, sílica-gel 70-230

Mesh e como fase móvel, a mistura de CH

2

Cl

2

/MeOH em ordem crescente de

polaridade, resultando em 10,0 mg do derivado carotenóide blumenol A (S

5

).

Figura 3: Cromatograma da fração P

4(14)25-34

em CLAE

A

B

C

D

E

CCVU Sephadex LH 20

MeOH 100%

CCVU, Sephadex LH 20

CH

2

Cl

2

/MeOH (1:9)

CCVU, Sílica

-

gel 70

-

230 Mesh

CH

2

Cl

2

/MeOH

RMN

1

H e

13

C

P

5

310,0 mg

80 Frações de 6

mL Reunidas

em 7 por CCDC

P

5(3)

158,0 mg

P

5(3)-52

P

5(3)-5

65,0 mg

S

5

10,0 mg

FLUXOGRAMA 6: Fracionamento da Fração P

5

CCVU Sephadex LH 20

MeOH 100%

RMN

1

H e

13

C

P

6

1,0 g

152 Frações de

6 mL Reunidas

em 9 por CCDC

P

6(3)

S

10

e S

11

22,0 mg

EM MISTURA

4.6- Refracionamento da fração P

6

A fração AcOEt:MeOH 50% (P

6

) com 3,0 g foi submetida a CCVU, utilizando-

se como fase estacionária sephadex LH-20 e como fase móvel MeOH. 1,0 g da

amostra foi solubilizado em 10 mL de MeOH e inoculado em uma coluna de 1,5 X 80

cm, resultando em 22,0 mg da mistura dos esteróides β-sitosterol (S

10

) e

estigmasterol (S

11

) glucosilados.

FLUXOGRAMA 7: Fracionamento da Fração P

6

4.7- Métodos utilizados na determinação estrutural das substâncias isoladas

Métodos espectrométricos de Ressonância Magnética Nuclear de RMN

1

H,

RMN

13

C, NOEdiff e DEPT em conjunto com as técnicas bidimensionais: COSY

1

H x

1

H, HETCOR, HMBC e HSQC, foram usados na determinação estrutural, juntamente

com a comparação com dados descritos na literatura.

4.8- Metodologia utilizada nos Bioensaios

4.8.1- Germinação de semente.

O bioensaio de germinação de semente foi monitorado em período de 10 dias,

com contagens diárias e eliminação das sementes germinadas. Foram consideradas

sementes germinadas, aquelas que apresentavam extensão radicular igual ou

superior a 2,0 milímetros.

O bioensaio foi desenvolvido em condições de 25

O

C de temperatura

constante e fotoperíodo de 12 horas. Cada placa de Petri de 9,0 centímetros de

diâmetro recebeu 10 sementes, os resultados estão descritos no item 8 (Resultado

dos Bioensaios), no Gráfico 1, p.104 para os extratos brutos, no gáfico 2, p. 105 para

as frações oriundas do fracionamento do extrato etanólico das folhas de P. pendula,

e nos gráficos 3-7, p. 106-108, respectivamente para as substâncias S

1

, S

2

, S

3

, S

4

e

S

5

.

Como plantas receptoras, foram utilizadas aquelas que ocorrem com maior

freqüência nas áreas de pastagens cultivadas que são: Mimosa pudica L. (malícia) e

Senna obtusifolia (L.) Irwing & Barneby (mata-pasto). As sementes foram coletadas

em áreas de pastagens cultivadas no município de Castanhal, Estado do Pará.

Passaram por processo de limpeza e expurgo e foram tratadas para obter-se a

quebra da dormência (Souza Filho et al., 1998).

Os testes para os extratos brutos foram realizados utilizando-se soluções

metanólicas à 10.000 ppm; para as frações oriundas do primeiro fracionamento

foram realizados a 1.000 ppm e para as substâncias S

1

, S

2

, S

3

, S

4

e

S

5

,

foram

realizados nas concentrações de 0,0; 5,0; 10,0; 15,0 e 20,0 ppm, tendo sido utilizado,

neste caso, diclorometano como solvente para o preparo das soluções. O tratamento

na concentração 0,0 foi considerado testemunha e constou apenas de água

destilada. Cada placa de Petri de 9,0 cm de diâmetro recebeu 3,0 mL de solução,

quando do início de cada bioensaio, sendo adicionado a partir de então, apenas

água destilada para manter a concentração original do sistema.

4.8.2- Desenvolvimento da radícula e do hipocótilo

Os efeitos alelopáticos das substâncias puras, sobre o desenvolvimento da

radícula e do hipocótilo, foram avaliados nas mesmas condições do bioensaio de

germinação, medindo, ao final de 10 dias de crescimento, o comprimento da radícula

e do hipocótilo.

Nestes bioensaios foram utilizadas duas sementes pré-germinadas por placa

de Petri. As soluções das substâncias foram adicionadas apenas uma vez, quando

do início do bioensaio, sendo adicionado, a partir de então, apenas água destilada

quando necessário. Cada placa de Petri recebeu 3,0 mL da solução diclorometânica

com as substâncias, nas respectivas concentrações de 5,0; 10,0; 15,0 e 20,0 ppm.

Após evaporação do solvente, adicionou-se volume igual de água destilada,

mantendo-se dessa forma, a concentração original. Como tratamento testemunha

utilizou-se água destilada.

4.8.3- Combinação entre pares aleloquímicos

A combinação entre pares de aleloquímicos é um método, no qual, faz-se a

avaliação do efeito alelopático da associação de duas substâncias frente às espécies

receptoras. Neste estudo, foram realizadas combinações entre duas substâncias

quaisquer X e Y, procedendo-se a avaliação dos efeitos alelopáticos em cinco

associações: A = substância X pura; B = X/Y (3:1); C = X/Y (1:1); D = X/Y (1:3) e E =

substância Y pura. As concentrações utilizadas foram as mesmas dos bioensaios

anteriores: 5,0; 10,0; 15,0 e 20,0 ppm. Foram avaliados os efeitos inibitórios frente à

germinação de sementes, desenvolvimento da radícula e do hipocótilo nas mesmas

condições descritas anteriormente.

Para efeito de análise dos resultados, considerou-se um modelo teórico (ver

figura 4) constante de quatro possibilidades:

Figura 4: Modelo teórico esperado de respostas envolvendo os efeitos da combinação entre dois

aleloquímicos X e Y, sobre a germinação de sementes, desenvolvimento da radícula e hipocótilo.

Onde as combinações estão representadas no eixo x pelas letras: A = substância X pura; B = X/Y

(3:1); C = X/Y (1:1); D = X/Y (1:3) e E = substância Y pura, respectivamente para cada combinação

entre X e Y.

A possibilidade 1 apresenta percentual inibitório de magnitude máxima na

associação 1:1 de duas substâncias quaisquer, evidenciando a presença de

1 2

3 4

sinergismo entre as mesmas. Na possibilidade 2, ocorre o inverso, uma vez que os

efeitos de maior magnitude são observados nos extremos, onde as substâncias

estão na concentração pura, evidenciando a ausência de sinergismo.

O modelo teórico 3 representa um aumento do potencial inibitório da

substância X, em função da combinação com a substância Y, isso porque, mesmo

com a redução da concentração da substância X, as inibições foram de ordem

superior ao da substância pura, evidenciando que a substância Y potencializa a

atividade alelopática da substância X. E finalmente, o modelo teórico 4 apresenta

o comportamento inverso do modelo teórico 3, uma vez que, neste caso é a

substância Y que tem sua atividade potencializada pela substância X. Foram

testadas as associações entre as substâncias S

1

com S

2

, S

1

com S

3

, S

1

com S

4

e

S

3

com S

4

. Os resultados destes bioensaios são discutidos no item 8.3.4 e

mostrados nas tabelas 10-13, p. 115-116.

4.9- Análise Estatística

Para todos os bioensaios, o delineamento experimental foi casualizado com

três repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância pelo teste F e as

médias comparadas pelo teste de Tukey (5%). Os resultados foram analisados

utilizando-se o programa estatístico SAS (SAS, 1989).

4.10- MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS NOS PROCEDIMENTOS

EXPERIMENTAIS

4.10.1- Equipamentos utilizados no isolamento e identificação estrutural das

substâncias

Ø Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear:

VARIAN modelo MERCURY-300 (300MHz), Laboratório de Química-

Pesquisa, Curso de Pós-graduação em Química, Centro de Ciências Exatas e

Naturais, UFPA.

Ø Câmara de Análise de Fluorescência por Luz Ultravioleta:

Cabine tipo SPECTROLINE modelo CM – 10 com luz tipo SPECTROLINE

modelo ENF – 260C.

Ø Balança Analítica:

SARTORIUS modelo BP210S.

Ø Evaporadores Rotativos:

BÜCHI modelo 461

QUIMIS modelo Q–344-2

Ø Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE) Analítico:

Duas bombas LC-10 AD (Shimadzu), detector SPD 10 AV UV-Visivel,

uma interface CBM, software Class 3.1 e um degaseficador de membrana

DGU-14.

Fase estacionária – uma coluna Luna C18 (25 x 0,46 cm) e pré-coluna

de C18.

Ø Ultrasson

Modelo Branson 2200

4.10.2- Reagentes utilizados no isolamento e identificação estrutural das

substâncias

Ø Solventes utilizados nas preparações dos Extratos Orgânicos e nas Análises

Cromatográficas:

Solventes P.A. (SYNTH, NUCLEAR, CINÉTICA QUIMICA)

Ø Solventes Utilizados na Obtenção dos Espectros de RMN e EM:

Solventes deuterados (MERCK, ALDRICH e ACROS)

Ø Solventes Utilizados nas Análises em CLAE:

Solventes grau HPLC (TEDIA).

Ácido Fórmico 88% P.A. (VETEC)

Água ultra-pura, sistema milipore (Elgamax)

Ø Reagentes utilizados na revelação das placas de CCDC:

Solução de Ce(SO

4

)

2

Ø Fases Estacionárias Utilizadas para Análises de Cromatografia Sólido-Líquido:

Sílica-gel 70-230 Mesh para CCVU (MERCK)

Sílica-gel 60 GF

254

para CCDC (MERCK)

Sílica-gel 60 PF

254-366

para CCDP (MERCK)

Sephadex Lipofílico LH-20 (SIGMA)

Coluna Luna C-18 5 µ para CLAE (PHENOMENEX)

4.10.3- Instrumentos e materiais utilizados nos Bioensaios Alelopáticos

(Laboratório de Agroindústria da EMBRAPA Amazônia Oriental, Belém-Pará)

Ø Placas de Petri com diâmetro de 9,0 cm aproximadamente

Ø Pipetador automático eppendorf

Ø Filtro de papel qualitativo

Ø Estufa de Germinação de fotoperíodo - Eletrolab

Ø Sementes de espécies de ervas daninhas invasoras de pastagens: Mimosa

pudica Mill. (malícia) e Senna obtusifolia (L.) Irwing & Barneby (mata-pasto).

O

OMe

M

eO

OMe

O

M

e

S

1

O

OMe

M

eO

OMe

O

M

e

H

O

OMe

S

2

5- CONSTITUINTES QUÍMICOS ISOLADOS DAS PARTES AÉREAS DE PARKIA

PENDULA

A investigação química do extrato etanólico das folhas de P. pendula resultou

no isolamento de onze substâncias, sendo dois flavonóides: S

1

e S

2

, dois ácidos Ar-

C

1

: S

3

e S

4

, dois derivados C

13

carotenóide: S

5

e S

6

, um monoacilglicerídeo: S

7

, dois

triterpenos: S

8

e S

9

e dois esteróides glicosilados: S

10

e S

11

.

Estruturas das Substâncias Isoladas de Parkia pendula:

3,7,8,4’-tetrametoxiflavona

RMN

1

H (Fig. 6, p. 60)

RMN

13

C (Fig. 8, p. 62)

COSY

1

H x

1

H (Fig. 7, p. 61)

HETCOR (Fig. 9 e 10, p. 63)

HMBC (Fig. 11, 12 e 13, p. 64

e 65)

2’-hidroxi-3,7,8,4’,5’-

pentametoxiflavona

RMN

1

H (Fig. 14, p. 67)

RMN

13

C (Fig. 19, p. 71)

HSQC (Fig. 20 e 21, p. 72)

HMBC (Fig. 22 e 23 , p. 73)

NOEdiff (Fig. 15-18, p. 68,

69 e 70)

COOH

OMe

M

eO OMe

S

3

COOH

OMe

S

4

OH

O

H

S

5

S

6

OH

O

Ácido 3,4,5-trimetoxi benzóico

RMN

1

H (Fig. 24, p. 76)

RMN

13

C (Fig. 25, p. 77)

Ácido verátrico

RMN

1

H (Fig. 26, p. 79)

RMN

13

C (Fig. 29, p. 81)

COSY

1

H x

1

H (Fig. 27, p.

80)

NOEdiff (Fig. 28, p. 81)

Dehidrovomifoliol

RMN

1

H (Fig. 35, p. 89)

RMN

13

C (Fig. 36, p. 91)

Blumenol A

RMN

1

H (Fig. 30, p. 83)

RMN

13

C (Fig. 32, p. 85)

COSY

1

H x

1

H (Fig. 31, p.

84)

HSQC (Fig. 33, p. 86)

HMBC (Fig. 34, p. 87)

S

8

H

O

H

S

9

H

O

H

21

HO O

CH

3

OH

O

S

7

RMN

1

H (Fig. 37, p. 93)

RMN

13

C (Fig. 39, p. 95)

COSY

1

H x

1

H (Fig. 38, p.

94)

β-amirina

RMN

1

H (Fig. 40, p. 97)

RMN

13

C (Fig. 41, p. 98)

Lupeol

RMN

1

H (Fig. 40, p. 97)

RMN

13

C (Fig. 41, p. 98)

HH

G

luO

H

S

10

S

11

HH

G

luO

H

3-β-glicopiranosídio-sitosterol

RMN

1

H (Fig. 42, p. 101)

RMN

13

C (Fig. 43, p. 102)

3-β-glicopiranosídio-

estigmasterol

RMN

1

H (Fig. 42, p. 101)

RMN

13

C (Fig. 43, p. 102)

O

A

C

B

6- Rota Biossintética

6.1- FLAVONÓIDES

Os flavonóides, em geral, derivam de rotas biossintéticas mistas, acetato e

chiquimato. O esqueleto flavonóide C

6

-C

3

-C

6

é formado por condensação do tio-éster

CoA do ácido p-cumárico, oriundo do caminho chiquimato, com 3 unidades de

malonil CoA, oriundo do acetato.

Sua estrutura básica possui uma unidade C

15,

invariável, onde a sub-unidade

ArC

3

é derivada do chiquimato e o outro anel aromático (anel A) é de origem

policetídica.

Os flavonóides podem ser coloridos ou incolores e concentram-se mais

na parte aérea das plantas, ocorrendo em menor proporção nas raízes e rizomas.

Sua função biológica nas plantas está relacionada com a atração de insetos

polinizadores e proteção contra os nocivos, reação contra infecções virais e fúngicas

(fitoalexinas), colaboram com hormônios no processo de crescimento, inibição de

ações enzimáticas e participação nos sistemas redox das células (Lopes, et al.,

1999).

Medicinalmente, os flavonóides apresentam uma ampla variedade de

atividades biológicas: capacidade antioxidativa (esta constitui a atividade mais

conhecida através de estudos desenvolvidos atualmente); atividades antiinflamatória

e vasodilatadora; ação antialérgica; atividade antitumoral, anti-hepatotóxica,

antiulcerogênica; atuação antiplaquetária, bem como ações antimicrobianas e

antivirais. A principal vantagem do uso de flavonóides na farmacologia é a sua

baixíssima toxicidade (Mann, 1987).

Figura 5: Estrutura básica dos flavonóides

F

1

O

MeO

OMe

M

eO

OMe

OH

F

2

O

MeO

OMe

M

eO

OMe

OH

Os flavonóides polimetoxilados são substâncias biologicamente ativas. Devido

a sua elevada lipossolubilidade, sua distribuição nas folhas é confinada a dutos

especiais ou ficam na superfície misturadas a ceras, desta forma, podem funcionar

como repelentes de insetos ou como agentes antifúngicos. Uma forte evidência disto

foi descoberta em certos tipos de plantas resistentes à moléstia de ”Malsseco”, as

quais continham maior quantidade de duas flavonas, a nobiletina (F

1

) e a tangeretina

(F

2

) que as outras plantas da mesma espécie (Harborne, 1983).

A rota biossintética da maioria das classes dos flavonóides é mostrada

com a fenilalanina como precursor da sub-unidade p-cumárico (p-cumarilSCoA) a

qual condensa com três unidades C

2

para a produção das chalconas ( Dewick,

1997).

A proposta biossintética para formação dos flavonóides S

1

e S

2

é demonstrada

no esquema 1 (p. 50-51).

Esquema 1: Proposta Biossintética para formação de S

1

e S

2

OH

O

Ácido cinâmico

OH

O

HO

Ácido p-cumárico

OH

SCoA

OO

O

OH

SCoA

OOH

O

H

+

OH

OOH

O O

H

+

H

+

H

+

-H

2

O

Enolização

Claisen

(Chalcona sintase)

-HSCoA

NADPH

Redutase

-HSCoA

-CO

2

PAL

[O]

C

O

H

HO

OH

Ácido chiquímico

OH

NH

2

O

Fenilalanina

p-cumarato-CoA ligase

Chalcona

(Isoliquiritigenina)

OH

O

HO OH

..

H

+

O

SCoA

OO

O

3 x malonil-SCoa

H

+

CoAS

O

OH

p-cumaril-SCoA

Esquema 1: Proposta Biossintética para formação de S

1

e S

2

(continuação)

O

2

2-oxoglutarato

O

H

O

HO O

Flavanona

(Liquiritigenina)

O

2

2-oxoglutarato

OH

O

HO O

OH

Dihidroflavonol

OH

O

HO O

OH

Flavonol

OH

O

HO O

OH

[O]

SAM

OMe

O

M

eO O

OMe

OH

O

HO O

OH

HO

OH

SAM

OMe

O

MeO O

OMe

HO

OMe

S

1

S

2

CHO

OGlu

Helicilina

CH

2

OH

OGlu

Salicilina

CHO

OMe

OH

Vanilina

CO

2

H

OH

Ác. acetil-salicílic

o

6.2- DERIVADOS Ar-C

1

Um grande número de compostos Ar-C

1

ocorrem na natureza, na forma de

ésteres ou glicosídeos.

Estes compostos derivam via degradação da cadeia lateral dos ácidos

cinâmicos, ou a partir do ácido dihidrochiquímico ou do ácido corísmico. O caminho a

partir dos ácidos cinâmicos é o mais comum.

Alguns exemplos de metabólitos Ar-C

1

:

Os extratos do salgueiro (Salix Alba L.) são usados em preparações

antiinflamatórias. Foi demonstrado que a salicilina é um dos princípios ativos do

salgueiro. Isto estimulou a síntese de um análogo que é mais potente: o ácido acetil-

salicílico (Mann, 1987).

Uma proposta biossintética a partir do ácido chiquímico é apresentada para as

substâncias S

3

e S

4

no esquema 2 (p. 53).

Isoladas do salgueiro

OH

O

Ácido cinâmico

OH

O

HO

Ácido p-cumárico

PAL

[O]

COOH

HO

OH

Ácido chiquímico

OH

NH

2

O

Fenilalanina

OH

O

H

O

H

O

OH

HO

OH

COOH

SCoA

-MeCOSCoA

-

oxidação

2 x

[O]

1 x

O

H

O

HO

SCoA

-MeCOSCoA

-

oxidação

OH

COOH

SAM

MeO

OMe

COOH

S

3

OMe

COOH

S

4

Esquema 2: Proposta Biossintética para formação de S

3

e S

4

6.3- “BISNORSESQUITERPENÓIDES” (DERIVADOS C

13

CAROTENÓIDES)

Terpenóides são a mais variada classe estrutural de produtos naturais de

plantas. O nome terpenóide ou terpeno deriva do fato de que os primeiros membros

isolados desta classe foram as terpentinas (“turpentin” em Alemão). Todos os

terpenóides são derivados por condensação de unidades de cinco carbonos,

baseado no esqueleto isopentano. Estes monômeros são derivados das unidades

isoprenos biológicos (DMAPP e IPP), normalmente numa associação cabeça-cauda,

gerando numerosos esqueletos terpenóides.

Os terpenos que derivam de 3 unidades C

5

, formando um esqueleto com 15

átomos de carbonos, são conhecidos como sesquiterpenos. Como os monoterpenos,

muitos sesquiterpenos são encontrados em óleos essenciais, e também muitos deles

comportam-se como fitoalexinas, que são compostos antibióticos produzidos por

plantas em estágios elevados de estresses (ataque microbiais, ataque de herbívoros

e competição com outras plantas) e muitas fitoalexinas são conhecidas como sendo

aleloquímicos.

Embora o hormônio de plantas, o ácido abscíssico seja estruturalmente um

sesquiterpeno, visto que possui esqueleto C

15

, não é sintetizado nas plantas,

diretamente por condensação de 3 unidades isoprênicas, mas sim por clivagem

assimétrica de um carotenóide C

40

a Violaxantina, (Dewik, 1997) sendo esta formada

por oxidação do β-caroteno. O ácido abscíssico pode ser encontrado também em

fungos, porém, neste caso tem como principal precursor o farnesol, que é formado

por 3 unidaes C

5

.

O caminho biossintético para formação das substâncias S

5

e S

6

, a partir do

ácido mevalônico, é mostrado no esquema 3 (p. 55-58).

Esquema 3: Proposta Biossintética para formação de S

5

e S

6

O

2

C

OH

H

R

H

S

M

e

H

R

O

H

S

MVA

OPP

IPP

+

OPP

DMAPP

H

OPP

H

Prefitoeno

CH

2

OPP

Geranil-geranil PP

2 x IPP

15,15'-E-fitoeno

H

5S

H

2S

H

5R

H

2R

-2[H]

CH

2

PPOH

2

C

XEnz

HC

CH

XEnz

H

PPOH

2

C

+

-Caroteno

Fitoflueno

H

5S

H

2S

-2[H]

H

5S

H

2R

H

5S

H

2R

-2[H]

H

5S

H

2R

H

5S

H

2R

H

5S

H

2R

Neurosporeno

-2[H]

H

5S

H

2R

H

5S

H

2R

H

5S

H

2R

H

5S

H

2R

Licopeno

XEnz

H

XEnz

H

EnzX

Esquema 3: Proposta Biossintética para formação de S

5

e S

6

(continuação)

O

2

NADPH

HO

OH

Zeaxanthina

O

2

NADPH

HO

OH

O

H

Violaxanthina

H

O

C

OH

9'

9' cis-neoxanthina

Clivagem

oxidativa

-caroteno

Esquema 3: Proposta Biossintética para formação de S

5

e S

6

(continuação)

H

O

CHO

H

Abertura do epóxido

formação da dupla ligação

[O]

O

OH

CHO

[O]

O

OH

CO

2

H

Ác. abscíssico

O

2

(Dioxigenase)

O

OH

CO

2

H

O

OH

O

S

6

(Dehidrovomifoliol)

NADPH

O

OH

OHH

S

5

(Blumenol A)

Esquema 3: Proposta Biossintética para formação de S

5

e S

6

(continuação)

+

H

+

..

H

O

OH

OP

glicerol 3-P

PO O CH

3

O

OH

21

HO O CH

3

O

OH

21

S

7

CoAS

CH

3

O

21

lignocericil-CoA

- HSCoA

H

2

O

Esquema 4: Proposta Biossintética para formação de S

7

6.4- MONOACILGLICERÍDEO S

7

Figura 6: Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

1

7- ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS

A elucidação estrutural e o assinalamento correto dos hidrogênios e carbonos

das substâncias isoladas foram feitos com base na análise dos espectros uni e

bidimensionais de RMN

1

H e

13

C, bem como, pela comparação com dados

encontrados na literatura.

7.1- Flavonóide S

1

O espectro de RMN

1

H (Fig. 6; Tab. 1, p. 66) de S

1

, exibe quatro sinais na

região de hidrogênios aromáticos e na região alifática, quatro sinais de hidrogênios

de grupos metoxila ligados a carbonos sp

2

.

A observação destes sinais sugere a presença de um flavonóide do tipo

flavonol, visto que não foi observado um sinal singleto em δ

H

6,3-6,6, característico

de hidrogênio H-3 de flavonas ou em δ

H

7,6-7,8, característico de hidrogênio H-2 de

isoflavona (Harborne et al, 1975), assim, o anel C de S

1

deve ser totalmente

substituído como nos flavonóis.

Figura 7:

Espectro de COSY

1

H x

1

H de

S

1

O

OR

C

Podemos observar distintamente, no espectro de RMN

1

H, na região

aromática, confirmado pela análise do espectro de COSY

1

H x

1

H (Fig. 7), dois

grupos de sinais, um dos quais, exibindo dois dubletos, integrando para um

hidrogênio cada, centrados em δ

H

7,97 (d, J = 9,3 Hz) e 7,03 (d, J = 9,3 Hz),

caracterizando um padrão de substituição do tipo AX. Este padrão AX deve ser

assinalado a dois hidrogênios orto acoplados das posições 5 e 6 do anel A do

flavonol, devido a ocorrência do sinal em δ

H

7,97 bastante desprotegido, que pode

ser explicado pelo efeito da anisotropia magnética da ligação C=O em posição

periplanar ao hidrogênio H-5. Uma outra observação que reafirma este

assinalamento é a ausência de sinal de OH-5 quelado à carbonila em δ

H

~ 10,00-

13,00. Assim, o anel A deve estar substituído nas posições 7 e 8 por grupos OMe. O

outro grupo de sinais exibe dois dubletos, integrando para dois hidrogênios cada,

centrados em δ

H

8,17 (d, J = 9,3 Hz) e 7,04 (d, J = 9,3 Hz), característico de anel B

da estrutura de flavonol para substituído. Este padrão de substituição foi atribuído

respectivamente a dois pares de hidrogênios equivalentes orto acoplados das

posições 2’/6’ e 3’/5’.

O

OMe

M

eO

OMe

S

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1'

2'

3'

4'

5

'

6'

Figura 8:

Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CDCl

3

) de

S

1

O

OMe

M

eO

OMe

S

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1'

2'

3'

4'

5

'

6'

O espectro de RMN

13

C (Fig.8; Tab. 1, p. 66) de S

1

, apresenta dezessete

sinais, referentes aos dezenove carbonos da estrutura, uma vez que, os pares de

carbonos C-2’/C-6’ e C-3’/C-5’ são quimicamente equivalentes, exibindo somente um

sinal cada em δ

C

130,1 e 114,0, respectivamente. Observa-se na região de carbonos

carbinólicos, a presença de um sinal em δ

C

59,9, característico de grupo metoxila

substituinte na posição 3 da estrutura de flavonol e ainda outro sinal em δ

C

61,6,

típico de metoxila em posição di-orto substituída.

O assinalamento correto dos hidrogênios e carbonos da estrutura de S

1

foi

feito com base na análise dos experimentos de HETCOR e HMBC.

O espectro de HETCOR (Fig. 9 e 10) mostra, por exemplo, as correlações

1

J

C,H

entre os sinais em δ

C

130,1; 121,0; 114,0; 109,8; 61,6 (OMe-8); 59,9 (OMe-3);

56,5 e 55,4, respectivamente com os sinais em δ

H

8,17 (H-2’/6’); 7,97 (H-5); 7,04 (H-

3’/5’); 7,03 (H-6); 4,01; 3,88; 3,99 e 3,90. A partir destas correlações, ficam

assinalados os carbonos metínicos aromáticos, os hidrogênios do grupo metoxila

substituinte da posição 3 do anel C e os hidrogênios do grupo metoxila di-orto-

substituído da posição 8 do anel A.

Figura 9:

Espectro de HETCOR de

S

1

Figura 10:

Espectro de HETCOR de

S

1

(Expansão de 3,5-4,3 x 54,0-62,0 ppm)

No espectro de HMBC (Fig. 11), observa-se correlações

3

J

C,H

entre o sinal em

δ

H

7,97 (H-5) com os sinais em δ

C

174,7 (C-4), 156,3 e 149,5. O assinalamento

destes dois últimos sinais, se deu com base na correlação entre o sinal em δ

H

3,99

com o sinal em δ

C

156,3 (Fig. 12), sendo esta correlação atribuída aos hidrogênios

da OMe-7 com o carbono C-7, e por exclusão, o sinal em δ

C

149,5 foi atribuído a C-

Figura 12:

Espectro de HMBC de

S

1

(Expansão de 3,8-4,1 x 0,0-220,0 ppm)

9. Observa-se também, correlações

3

J

C,H

entre os sinais em δ

H

8,17 (H-2’/6’) com os

sinais de carbono em δ

C

161,4 e 155,2, estes sinais podem ser atribuídos aos

carbonos C-2 ou C-4’. A atribuição correta para estes carbonos se deu a partir da

correlação existente entre o sinal em δ

H

3,90 com o sinal em δ

C

161,4, sendo esta

correlação atribuída aos hidrogênios da OMe-4’ com o carbono C-4’, e por exclusão,

o sinal em δ

C

155,2 foi atribuído a C-2.

Observa-se ainda no espectro de HMBC (Fig. 13), as correlações

3

J

C,H

entre o

sinal em δ

H

7,03 (H-6) com os sinais de carbono em δ

C

136,7 e 119,0 e entre o sinal

Figura 11:

Espectro de HMBC de

S

1

(Expansão de 7,8-8,3 x 130,0-175,0 ppm)

Figura 13: Espectro de HMBC de S

1

(Expansão de 6,9-7,4 x 115,0-157,0 ppm)

O

M

e

M

e

Me

em δ

H

7,04 (H-3’/5’) com o sinal em δ

C

123,4. O assinalamento dos carbonos C-3 e

C-8 foi feito pela observação da correlação

3

J

C,H

(Fig. 12) entre os sinais em δ

H

3,88

(OMe-3) e 4,01 (OMe-8), respectivamente, com os sinais de carbono em δ

C

140,3

(C-3) e 136,7 (C-8). Pelo fato de não poder-se distinguir com precisão as correlações

entre os sinais de carbono em δ

C

119,0 e 123,4, recorreu-se à literatura de

substância modelo para atribuir o sinal em δ

C

119,0 a C-10 e o sinal em δ

C

123,4 a

C-1’ (Lemmich, et al., 1996).

Correlações

2,3

J

C,H

observadas no espectro de HMBC de S

1

O

OMe

M

eO

OMe

S

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1'

2'

3'

4'

5'

6'

δ

H

δ

C

δ

H

a

2

---- 155,2 ----

3

---- 140,3 ----

4

---- 174,7 ----

5

7,97 d (J = 9,3 Hz) 121,0 7,87 d

6

7,03 d (J = 9,3 Hz) 109,8 7,31 d

7

---- 156,3 ----

8

---- 136,7 ----

9

---- 149,5 ----

10

---- 119,0 ----

1’

---- 123,4 ----

2’/6’

8,17 d (J = 9,3 Hz) 130,1 8,10 d

3’/5’

7,04 d (J = 9,3 Hz) 114,0 7,20 d

4’

---- 161,4 ----

OMe-3

3,88 (s) 59,9

OMe-7

3,99 (s) 56,5

OMe-8

4,01 (s) 61,6

OMe-4’

3,90 (s) 55,4

4,00; 3,97; 3,87

e 3,83

A reunião de todas estas informações espectrais em conjunto com os dados

descritos na literatura permitiu concluir que a substância S

1

trata-se da 3,7,8,4’-

tetrametoxiflavona, cujos dados espectrométricos de RMN

1

H estão condizentes aos

dados encontrados na literatura (Malan & Roux, 1975) e sua estrutura está mostrada

a seguir. Vale ressaltar ainda, que os dados de RMN

13

C são inéditos, assim como, o

assinalamento dos δ

H

das metoxilas.

Tabela 1: Dados de RMN

1

H e

13

C para S

1

(ppm, CDCl

3

, 300 e 75 MHz)

a

DMSO-D

6

, 60 MHz (Malan & Roux, 1975)

Figura 14: Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

2

7.2- Flavonóide S

2

Os dados espectroscópicos de RMN

1

H (Fig. 14; Tab. 2, p. 75) de S

2

, mostram

sinais de hidrogênios aromáticos e de grupos metoxilas, que sugerem a presença de

um flavonóide polimetoxilado. Estes sinais são:

- dois dubletos orto acoplados, integrando para um hidrogênio cada, centrados

em δ

H

7,06 e 7,99 (J = 9,0 Hz);

- três singletos integrando para um hidrogênio cada, em δ

H

6,63; 7,32 e 8,16;

- um conjunto de cinco singletos integrando para quinze hidrogênios, em δ

H

3,90; 3,92; 3,94; 3,99 e 4,01, evidenciando a presença de cinco grupos metoxilas

ligados a carbono sp

2

.

O

OR

C

Figura 15:

Espectro de NOEdiff de

S

2

(irradiação em 7,06 ppm)

A observação do sinal singleto em δ

H

6,63 poderia sugerir a presença de uma

flavona, mas essa possibilidade foi descartada, uma vez que o sinal de carbonila

observado no espectro de RMN

13

C (Fig. 19; Tab. 2, p. 75) não se encontra na faixa

de δ

C

176-183, característico de flavonas (Agrawal, 1989). Logo, sugerimos

prelinarmente que o anel C da estrutura dessa substância está totalmente

substuituído como nos flavonóis:

A presença do par de dubletos orto acoplados em δ

H

7,99 e 7,06 (J = 9,0 Hz),

indica que a substância S

2

, assim como S

1

, apresenta a posição 5 deoxidada, e nos

permite sugerir que o padrão de substituição do anel A é similar para ambos os

compostos, atribuindo-se estes sinais respectivamente, aos hidrogênios H-5 e H-6. A

irradiação do sinal dubleto em δ

H

7,06 (Fig. 15) relativo a H-6, mostrou efeito NOE

com o hidrogênio H-5 e com os hidrogênios de OMe em δ

H

4,01, assinalada como

sendo OMe-7.

O

R

MeO

O

M

e

6

5

7

Figura 16:

Espectro de NOEdiff de

S

2

(irradiação em 6,63 ppm)

S

2a

O

OMe

M

eO

OMe

O

M

e

M

e

O

OH

S

2b

O

OMe

M

eO

OMe

O

H

M

e

O

OMe

O

OMe

M

eO

OMe

O

M

e

H

O

OMe

S

2c

4'

S

2

b

O

OMe

M

eO

OMe

OHMeO

OMe

2'

3'

S

2c

O

OMe

M

eO

OMe

OMeHO

OMe

2'

3'

4'

Observa-se no espectro de RMN

13

C (Fig. 19, p. 71) dois sinais de OMe em δ

C

> 58,0, evidenciando a presença de um grupo metoxila di-orto-substituído e uma

metoxila em C-3. O sinal singleto em δ

H

8,16 desaparece com adição de D

2

O,

evidenciando se tratar de um hidrogênio hidroxílico. A partir dessa análise preliminar,

podemos propor três possibilidades estruturais para S

2

:

Os sinais singletos na região de hidrogênios aromáticos centrados em δ

H

6,63

e 7,32, foram atribuídos, respectivamente, aos hidrogênios H-3’ e H-6’, com base na

análise do efeito mesomérico, que desprotege o hidrogênio H-6’. A estrutura S

2a

foi

descartada com base na análise do espectro de NOEdiff (Fig. 16), com irradiação do

sinal singleto em δ

H

6,63 relacionado a H-3’, o qual mostrou efeito NOE com apenas

um grupo metoxila em δ

H

3,94, ficando dessa forma impossibilitado propor que a

hidroxila esteja na posição 5’.

ou

Figura 17:

Espectro de NOEdiff de

S

2

(irradiação em 7,32 ppm)

Figura 18:

Espectro de NOEdiff de

S

2

(irradiação em 8,16 ppm)

8

S

2c

O

OMe

M

eO

OMe

OMeHO

OMe

2'

3'

3

ou

O espectro de NOEdiff (Fig. 17) exibindo irradiação do sinal em δ

H

7,32

atribuído a H-6’, permitiu assinalar o deslocamento químico de OMe-5’, uma vez que,

observou-se efeito NOE efetivo com o sinal em δ

H

3,92 atribuído a OMe-5’ e ainda,

observou-se um efeito NOE de menor intensidade com o sinal em δ

H

3,99, que pode

ser atribuído a OMe-3 ou a OMe-8.

A análise do espectro de NOEdiff (Fig. 18), permitiu definir a estrutura S

2c

para

a substância S

2

, visto que ao se fazer a irradiação do sinal do hidrogênio do grupo

hidroxila em δ

H

8,16 verificou-se efeito NOE com o sinal do hidrogênio H-3’ (δ

H

6,63)

e com o sinal do grupo OMe em δ

H

3,90, não sendo observado efeito NOE com o

sinal de OMe-5’ (δ

H

3,92), ficando descartada a possibilidade estrutural S

2b

.

R

1,

R

2

= OH ou OMe

O

OMe

M

eO

OMe

OR

2

OMe

OR

1

6'

5'

ou

8

3

Figura 19:

Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CDCl

3

) de

S

2

O espectro de RMN

13

C (Fig. 19) de S

2

apresenta vinte sinais referentes aos

vinte carbonos presentes na estrutura e é mostrado a seguir:

O padrão de hidrogenação dos carbonos e o assinalamento correto dos

deslocamentos químicos dos hidrogênios e carbonos da estrutura de S

2

foram

definidos com base na análise dos espectros bidimensionais de HSQC e HMBC.

O espectro de HSQC (Fig. 20 e 21) mostra, por exemplo, as correlações

1

J

C,H

entre os sinais em δ

C

121,1; 110,7; 110,1; 102,8; 61,9; 61,5; 56,5; 56,3 e 56,1,

respectivamente com os sinais em δ

H

7,99 (H-5); 7,32 (H-6’); 7,06 (H-6); 6,63 (H-3’);

3,90; 3,99; 4,01 (OMe-7, definido por NOE); 3,94 e 3,92 (OMe-5’, definido por NOE).

A partir destas correlações, ficam assinalados os carbonos metínicos aromáticos e

os hidrogênios dos grupos metoxilas das posições 7 e 5’ e por exclusão, o sinal em

δ

H

3,94, correlacionado com o sinal em δ

C

56,3, foi atribuído a OMe-4’.

S

2

O

OMe

M

eO

OMe

OMeHO

OMe

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1'

2'

3'

4'

5'

6'

Figura 20: Espectro de HSQC de S

2

(Expansão de 6,2-8,2 x 100,0-124,0 ppm)

Figura 21: Espectro de HSQC de S

2

(Expansão de 3,8-4,2 x 55,0-63,0 ppm)

Figura 22: Espectro de HMBC de S

2

(Expansão de 6,6-8,0 x 105,0-175,0 ppm)

Figura 23: Espectro de HMBC de S

2

(Expansão de 3,8-4,1 x 135,0-158,0 ppm)

No espectro de HMBC (Fig. 22 e 23), observa-se correlações

3

J

C,H

entre o

sinal em δ

H

7,99 (H-5) com os sinais em δ

C

173,4 (C-4); 156,6 (C-7) e 149,9 (C-9). A

atribuição destes dois últimos sinais, se deu com base na correlação entre o sinal em

δ

H

4,01 com o sinal em δ

C

156,6, sendo esta correlação atribuída aos hidrogênios da

OMe-7 com o carbono C-7, e por exclusão, o sinal em δ

C

149,9 foi atribuído a C-9.

Observa-se também, correlações

3

J

C,H

entre o sinal em δ

H

7,06 (H-6) com os sinais

de carbono em δ

C

136,7 e 118,7, estes sinais foram atribuídos respectivamente, aos

carbonos C-8 e C-10, com base também, na observação da correlação

3

J

C,H

entre o

sinal em δ

H

3,99 com o sinal em δ

C

136,7, sendo esta correlação atribuída aos

hidrogênios da OMe-8 com o carbono C-8, e por exclusão, o sinal em δ

C

118,7 foi

atribuído a C-10.

O

OHO

O

M

e

M

e

Me

S

2

O

OMe

M

eO

OMe

OMeHO

OMe

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1'

2'

3'

4'

5'

6'

Observa-se ainda no espectro de HMBC, as correlações

2,3

J

C,H

entre o sinal

em δ

H

6,63 (H-3’) com os sinais de carbono em δ

C

153,6; 151,3; 143,5 e 108,9, estes

sinais foram atribuídos respectivamente, aos carbonos C-4’, C-2’, C-5’ e C-1’, com

base na observação das correlações

3

J

C,H

entre o sinal em δ

C

153,6 com o sinal de

metoxila em δ

H

3,94 (OMe-4’) e entre o sinal em δ

C

143,5 com o sinal de metoxila em

δ

H

3,92 (OMe-5’), dessa forma, o único sinal de carbono aromático oxidado em δ

C

151,3 que faltou assinalar, fica atribuído a C-2’ e o sinal de carbono aromático

totalmente substituído em δ

C

108,9 fica atribuído a C-1’. A atribuição do sinal da

OMe-3 e de C-3 se deu, pela observação no espectro de HMBC da correlação entre

o sinal em δ

H

3,90 com o sinal em δ

C

138,1 e, por exclusão, o sinal em δ

C

155,2 foi

atribuído ao carbono C-2.

O conjunto de todas essas informações espectrais nos levou a concluir que a

estrutura de S

2

é a da 2’-hidroxi-3,7,8,4’,5’-pentametoxiflavona:

Segundo levantamento bibliográfico realizado no Chemical Abstract existe

somente um registro de isolamento desta substância na literatura, a qual foi isolada

anteriormente de Parkia clappertoniana (Leguminosae). Alguns valores de δ

C

foram

Correlações

2,3

J

C,H

observadas no espectro de HMBC de S

2

δ

H

δ

C

δ

H

a

δ

C

a

2

---- 155,2

---- 149,9

3

---- 138,1

---- 136,7

4

---- 173,4

---- 173,3

5

7,99 d (J = 9,0 Hz) 121,1

8,02 d (J = 8,0 Hz)

6

7,06 d (J = 9,0 Hz) 110,1

7,08 d (J = 8,0 Hz)

10

---- 118,7

----

7

---- 156,6

----

8

---- 136,7

----

9

---- 149,9

----

1’

---- 108,9

---- 109,0

2’

---- 151,3

3’

6,63 (s) 102,8

6,64 (s) 102,8

4’

---- 153,6

5’

---- 143,5

6’

7,32 (s) 110,7

7,32 (s) 110,8

OMe-3

3,90 (s) 61,9

OMe-7

4,01 (s) 56,5

OMe-8

3,99 (s) 61,5

OMe-4’

3,94 (s) 56,3

OMe-5’

3,92 (s) 56,1

OH

8,16 (s) ---- 8,20 (s) ----

4,05 (s); 4,01 (s); 3,95

(s); 3,94 (s) e 3,90 (s)

121,1; 118,7;

e 110,1

156,6; 155,6;

e 138,1

61,9; 61,5;

56,5; 56,3 e

56,1

corrigidos em relação à literatura consultada, em especial, as atribuições dos

carbonos C-2, C-3, C-8 e C-9, que estavam incorretas. Outros valores de δ

H

e δ

C

que

não estavam assinalados, puderam ser definidos precisamente, fato ocorrido, por

exemplo, em relação aos grupos metoxila.

Tabela 2: Dados de RMN

1

H e

13

C para S

2

(ppm, CDCl

3

, 300 e 75 MHz)

a

CDCl

3

, 200 e 50 MHz (Lemmich, et al., 1996)

Figura 24: Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

3

COOH

OMe

M

eO

S

3a

COOH

OMe

M

eO OMe

S

3b

7.3- Derivado Ar-C

1

S

3

Analisando os dados espectroscópicos de RMN

1

H (Fig. 24; Tab. 3, p. 78),

observa-se para a substância S

3

,

a presença de três sinais singletos:

Na região de hidrogênios aromáticos, observa-se um singleto integrando para

dois hidrogênios em δ

H

7,36, atribuído a dois hidrogênios quimicamente semelhantes

ligados ao anel aromático.

Observa-se ainda um conjunto formado por dois singletos, integrando para

nove hidrogênios em δ

H

3,92 e 3,93, referentes a três grupos metoxila ligados ao

anel aromático, sendo dois deles quimicamente equivalentes.

Levando-se em consideração o valor de carbonila de ácido observado no

espectro de RMN

13

C (Fig. 25) em δ

C

170,2, em conjunto com os dados de RMN

1

H

apresentados, pode-se propor duas possibilidades estruturais para S

3

:

Figura 25:

Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CDCl

3

) de

S

3

A estrutura S

3a

foi descartada, pela observação no espectro de RMN

13

C de

um sinal de grupo metoxila em posição orto-di-substituída (δ

C

60,9), fato este,

possível somente para a proposta estrutural S

3b

.

Observa-se no espectro de RMN

13

C de S

3

, além do sinal da carbonila de

ácido e da metoxila orto-di-substituída, sinais em: δ

C

56,3 atribuído às duas

metoxilas equivalentes das posições 3/5; δ

C

107,5 referente aos dois carbonos CH

quimicamente semelhantes das posições 2/6 e três sinais em δ

C

124,0; 140,0 e

153,0 assinalados, respectivamente, a um carbono aromático totalmente substituído

da posição 1, um carbono aromático oxidado da posição 4 e dois carbonos

aromáticos oxidados e equivalentes das posições 3/5.

O conjunto dessas informações espectrais deram respaldo para identificar a

estrutura da substância S

3

, como sendo o ácido 3,4,5-trimetoxibenzóico, que em

pesquisas recentes apresentou atividade antimicrobial, inibindo o crescimento de

Staphylococcus aureus (Bisigmano, et. al., 2000).

COOH

OMe

M

eO OMe

S

3

2

3

4

5

6

1

δ

H

δ

C

δ

H

a

δ

C

a

1

---- 124,0 ---- na

2/6

7,36 (s) 107,5 7,36 (s) 107,5

3/5

---- 153,0 ---- 153,0

4

---- 143,0 ---- 146,2

COOH

---- 170,2 12,78 (s) 170,9

OMe-3/5

3,92 (s) 56,3 3,92 56,3

OMe-4

3,93 (s) 60,9 3,93 60,9

Tabela 3: Dados de RMN

1

H e

13

C para S

3

(ppm, CDCl

3

, 300 e 75 MHz)

a

(Nascimento, 2002)

na

Sinal não assinalado

Figura 26: Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

4

7.4- Derivado Ar-C

1

S

4

O espectro de RMN

1

H de S

4

apresentado na figura a seguir apresenta três

sinais na região de hidrogênios aromáticos e dois sinais referentes a grupos metoxila

ligados a carbono aromático.

Os sinais observados são:

- um duplo dubleto, integrando para um hidrogênio, centrado em δ

H

7,75 (J =

8,7 e 1,8 Hz);

- um dubleto, integrando para um hidrogênio em δ

H

6,91 (J = 8,7 Hz);

- um dubleto, integrando para um hidrogênio em δ

H

7,58 (J = 1,8 Hz).

Estes sinais se correlacionam de forma orto-meta, orto e meta,

respectivamente, confirmado pelo experimento de correlação homonuclear COSY

1

H

x

1

H, mostrado na figura 27:

Figura 27:

Espectro de COSY

1

H x

1

H de

S

4

COOH

OMe

S

4a

3

1

4

COOH

OMe

S

4b

4

2

1

Observa-se ainda, um conjunto formado por dois singletos, integrando para

seis hidrogênios, atribuídos a dois grupos metoxila ligados ao anel aromático em δ

H

3,95 e 3,94.

A observação no espectro de RMN

13

C (Fig. 29, p. 81) de um sinal de

carbonila de ácido em δ

C

169,7, em conjunto com os dados apresentados até aqui,

nos permitiu propor preliminarmente, duas possibilidades estruturais para S

4

:

Figura 28:

Espectro de NOEDIF de

S

4

(irradiação em 6,91 ppm)

Figura 29:

Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CDCl

3

) de

S

4

A análise do espectro de NOEdiff (Fig. 28), com irradiação do sinal dubleto em

δ

H

6,91 (H-5 em S

4a

e H-6 em S

4b

), mostrou efeito NOE com o sinal duplo dubleto

em δ

H

7,75 assim como, com o sinal de um grupo metoxila em δ

H

3,95, ficando

dessa forma descartada a possibilidade estrutural S

4b

. Este experimento, ainda

permitiu o assinalamento dos dois grupos metoxilas da estrutura S

4a

, uma vez que, o

grupo metoxila em δ

H

3,95 que apresentou efeito NOE com H-5 foi atribuído a OMe-4

e, consequentemente, o sinal em δ

H

3,94 foi relacionado ao grupo metoxila da

posição 3.

O espectro de RMN

13

C apresentado na figura 29 apresenta nove sinais

referentes aos nove carbonos da estrutura de S

4

.

COOH

OMe

6

5

4

COOH

OMe

S

4

2

3

4

5

6

1

δ

H

δ

C

δ

H

a

δ

C

b

1

---- 120,6 ---- na

2

7,58 d (J = 1,8 Hz) 111,4 7,55 d (J = 2,0 Hz) 112,4

3

---- 147,7 ---- na

4

---- 152,7 ---- na

5

6,91 d (J = 8,7 Hz) 109,3 6,94 d (J = 8,2 Hz) 110,4

6

7,75 dd (J = 8,7 e 1,8 Hz) 123,5 7,64 dd (J = 8,2 e 2,0 Hz) 124,5

COOH

---- 169,7 ---- 170,1

OMe-3

3,93 (s) 55,0

c

3,89 (s) 56,0

OMe-4

3,94 (s) 55,1

c

3,95 (s) 56,1

A confirmação da estrutura de S

4

foi feita através da análise destes dados em

concordância com os valores encontrados na literatura (Machida & Kikuchi, 1996;

Nascimento, 2002) para o ácido 3,4-dimetoxibenzóico, conhecido vulgarmente como

ácido verátrico.

Tabela 4: Dados de RMN

1

H e

13

C para S

4

(ppm, CDCl

3

, 300 e 75 MHz)

a

CDCl

3

, 270 MHz (Machida & Kikuchi, 1996)

b

CDCl

3

, 300 MHz (Nascimento, 2002)

c

Sinais interconvertidos

na

Sinais não assinalados

Figura 30: Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

5

7.5- Derivado C

13

Carotenóide S

5

Analisando-se os dados espectrais de RMN

1

H (Fig. 30; Tab. 5, p. 88) de S

5

,

pode-se observar sinais na região de hidrogênios olefínicos, carbinólicos e alifáticos.

Alguns destes sinais são:

- um duplo dubleto em δ

H

5,87 (J = 15,6 e 6,0 Hz) e um dubleto em δ

H

5,77 (J

= 15,6 Hz), indicando uma ligação –HC=CH- com os hidrogênios em relação

trans, observado pelos valores da constante de acoplamento (J = 15,6 Hz);

- um quinteto em δ

H

4,41 (J = 6,0 Hz);

- um sinal dubleto referente a uma metila ligada a CH em δ

H

1,30 (J = 6,0 Hz).

Através da análise do espectro de correlação homonuclear COSY

1

H x

1

H

(Fig. 31), pode-se observar correlações entre todos os sinais mencionados

Figura 31:

Espectro de COSY

1

H x

1

H de

S

5

anteriormente, indicando que os hidrogênios estão acoplando entre si,

caracterizando um grupo do tipo –CH=CH-CHOH-CH

3

ligado a um carbono

totalmente substituído, sugerindo uma cadeia lateral, como mostrado na estrutura

parcial abaixo:

Observou-se ainda:

- um dubleto centrado em δ

H

5,90 (J = 1,2 Hz), atribuído a um hidrogênio

olefínico, que segundo o espectro de COSY

1

H x

1

H, está acoplando com uma

metila sobre dupla, cujo sinal é observado em δ

H

1,89 (J = 1,2 Hz);

- dois dubletos centrados em δ

H

2,24 e 2,45 (J = 17,0 Hz), atribuídos a dois

hidrogênios metilênicos em acoplamento geminal;

- e dois singletos em δ

H

0,99 e 1,07, atribuídos a dois grupos metílicos ligados

a carbono sp

3

totalmente substituído.

Todos esses dados em conjunto permitem propor a estrutura de um esqueleto

megastimano para S

5

.

Figura 32:

Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CD

3

OD) de

S

5

O

H

HO

OH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

1

Analisando o espectro de RMN

13

C (Fig. 32; Tab. 5, p. 88), observou-se 13

sinais, sendo que o padrão de hidrogenação desses carbonos foi determinado via

HSQC (Fig. 33, p. 86).

Os sinais de

13

C que caracterizam a estrutura de S

5

são;

- um sinal em δ

C

201,4, relacionado ao carbono de carbonila α,β-

insaturada em um anel ciclohexano;

- um sinal em δ

C

167,6, atribuído a um carbono olefínico totalmente

substituído e em posição β a um grupo C=O;

- três sinais em δ

C

136,9; 130,1 e 127,1, relativos a três carbonos CH

olefínicos;

- um sinal em δ

C

80,0, atribuído a um carbono oxidado totalmente

substituído;

Figura 33: Espectro de HSQC de S

5

- um sinal em δ

C

68,7 assinalado a um carbono oximetínico;

- um sinal de carbono metilênico vizinho a carbonila em δ

C

50,7;

- um sinal de carbono sp

3

totalmente substituído em δ

C

42,4;

- e quatro sinais referentes a quatro metilas em δ

C

24,5, 23,8, 23,5, e

19,6.

A análise do espectro de HSQC (Fig. 33) para esta substância, mostrou

as correlações

1

J

C,H

entre os sinais dos carbonos metínicos, metilênicos e metílicos

com seus respectivos sinais de hidrogênios. As correlações observadas são entre os

sinais em δ

C

136,9; 130,1; 127,1; 68,7; 50,7; 24,5; 23,8; 23,5 e 19,6, respectivamente

com os sinais em δ

H

5,87 (H-8); 5,77 (H-7); 5,90 (H-4); 4,41 (H-9); 2,45 (H-2ax) e

2,23 (H-2eq); 0,99 (Me-12); 1,29 (Me-10); 1,07 (Me-11) e 1,89 (Me-13).

Figura 34: Espectro de HMBC de S

5

OHH

O

OH

A análise do espectro de correlação heteronuclear HMBC (Fig. 34) para esta

substância, mostrou correlações que nos permitiu atribuir alguns sinais de carbono

ainda não confirmados.

Todas essas informações espectrais permitiram concluir que a substância S

5

trata-se do derivado carotenóide blumenol A. Os sinais referentes aos carbonos C-7

e C-8 foram corrigidos em relação às atribuições da literatura, com base no espectro

de HSQC, o qual mostra que o hidrogênio olefínico mais protegido em δ

H

5,77 (H-7),

Correlações

2,3

J

C,H

observadas no espectro de HMBC de S

5

δ

H

(CDCl

3

) δ

C

(CDCl

3

)

δ

C

(CD

3

OD) δ

C

, CDCl

3

(Gonzáles

et. al., 1994)

1 ---- 41,1 42,4 41,1

2

Heq. 2,24 d (J = 17,0 Hz)

Hax. 2,45 d (J = 17,0 Hz)

49,7

50,7

49,7

3 ---- 198,1 201,4 197,9

4 5,90 d (J = 1,2 Hz) 126,8 127,1 126,9

5 ---- 162,9 167,6 162,6

6 ---- 79,0 80,0 79,0

7 5,77 d (J = 15,6 Hz) 128,9 130,1 135,7

8 5,87 dd (J = 15,6 e 6,0 Hz) 135,7 136,9 129,0

9 4,41 qt (J = 6,0 Hz) 67,9 68,7 68,0

10

1,29 d (J = 6,0 Hz) 23,7 23,8 23,7

11

0,99 (s) 22,9 23,5 22,9

12

1,07 (s) 24,0 24,5 24,0

13

1,89 d (J = 1,2 Hz) 18,9 19,6 18,9

está correlacionado com o sinal de carbono em δ

C

130,1, enquanto que o sinal

referente a H-8 em δ

H

5,87, está correlacionado com o sinal de carbono em δ

C

136,9,

e não o inverso, como está assinalado na literatura (Gonzáles et. al., 1994).

Tabela 5: Dados de RMN

1

H e

13

C para S

5

(ppm, 300 e 75 MHz)

Figura 35: Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

6

7.6- Derivado C

13

Carotenóide S

6

A substância S

6

foi isolada em mistura na proporção 1:1 com a substância S

7

.

Esta discussão leva em consideração somente os sinais nos espectros de RMN

referentes à substância S

6

, uma vez que a substância S

7

foi isolada em outra fração

e será discutida posteriormente.

Analisando-se o espectro de RMN

1

H da mistura (Fig. 35), observa-se para a

substância S

6

, a presença de sinais na região de hidrogênios olefínicos, alifáticos e

um sinal de hidrogênio hidroxílico.

O

H

OH

O

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

1

Os sinais relativos a estes hidrogênios são:

Ø Para os hidrogênios olefínicos: dois dubletos em δ

H

6,85 (J = 15,6 Hz) e

6,46 (J = 15,6 Hz), integrando um hidrogênio cada, relativos a dois

hidrogênios trans acoplados e ainda, um singleto largo em δ 5,95,

integrando um hidrogênio;

Ø Para os hidrogênios alifáticos: dois dubletos em δ

H

2,18 (J = 17,0 Hz) e

2,50 (J = 17,0 Hz), atribuídos a dois hidrogênios metilênicos em

acoplamento geminal e outro dubleto, integrando três hidrogênios em δ

H

1,88 (J = 1,5 Hz), característico de metila vinílica, além de dois singletos

em δ

H

1,01 e 1,10, atribuídos a dois grupos metílicos ligados a carbono sp

3

totalmente substituído, bem como um singleto em δ

H

2,30, relacionado a

um grupo metila α a carbonila;

Ø Para o hidrogênio hidroxílico: um singleto em δ

H

3,26 que desaparece com

adição de D

2

O.

Os dados acima nos permitiram propor para S

6

assim como para a substância

S

5

, a estrutura de um esqueleto megastimano (α-ionol):

Os tipos de carbonos presentes em S

6

foram definidos através da análise do

experimento de DEPT, o qual corroborou para as atribuições dos sinais de carbono

exibidos no espectro de RMN

13

C (Fig. 36). Observa-se neste espectro treze sinais,

dois dos quais em δ

C

197,5 e 197,1, relacionados a carbonos de carbonilas α,β-

insaturadas. Outros quatro sinais em δ

C

160,5; 145,0; 130,4 e 127,8 relativos a

quatro carbonos olefínicos, um sinal em δ

C

79,3 atribuído a um carbono oxidado

totalmente substituído, e quatro sinais referentes a quatro metilas, além de um sinal

em δ

C

49,5 referente a um carbono metilênico e outro em δ

C

41,4 atribuído a um

carbono sp

3

totalmente substituído.

Figura 36:

Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CDCl

3

) de

S

6

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

1

S

6

OH

O

Ao compararmos os dados de RMN

1

H e

13

C de S

6

com aqueles encontrados

na literatura (Kato, et. al., 1977; Atta & Viqar, 1992), para o “bis-nor-sesquiterpeno”

(derivado carotenóide) dehidrovomifoliol, encontramos total concordância, definindo

assim a estrutura de S

6

.

δ

H

δ

C

δ

C

(Atta & Viqar, 1992)

1

---- 41,4 s 41,2

2

Hax. 2,18 d (J = 16,8 Hz)

Heq. 2,50 d (J = 16,8 Hz)

49,5 t

49,3

3

---- 197,5 s 196,4

4

5,95 (sl) 127,8 d 127,1

5

---- 160,5 s 146,1

6

---- 79,3 s 78,9

7

6,85 d (J = 15,6 Hz) 145,0 d 144,4

8

6,45 d (J = 15,6 Hz) 130,4 d 129,8

9

---- 197,1 s 196,0

10

2,30 (s) 28,3 q 28,2

11

1,88 (s) 18,7 q 18,6

12

1,10 (s) 24,3 q 24,2

13

1,01 (s) 22,9 q 22,9

Tabela 6: Dados de RMN

1

H e

13

C para S

6

(ppm, CDCl

3

, 300 e 75 MHz)

O padrão de hidrogenação dos carbonos foi determinado via DEPT

Figura 37: Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

7

7.7- Monoacilglicerídeo S

7

O espectro de RMN

1

H (Fig. 37) para a substância S

7

, apresenta sinais na

região de hidrogênios carbinólicos e um grupo de sinais na região de hidrogênios de

cadeia hidrocarbônica saturada longa.

Na região de hidrogênios carbinólicos, observa-se distintamente, um conjunto

de sinais formado por:

- dois duplos dubletos, integrando para um hidrogênio cada, centrados em δ

H

4,21 (J = 11,7 e 5,1 Hz) e em δ

H

4,14 (J = 11,7 e 6,0 Hz);

- um outro par de duplos dubletos, integrando para um hidrogênio cada, em δ

H

3,70 (J = 11,4 e 4,2 Hz) e δ

H

3,60 (J = 11,4 e 5,7 Hz);

- um quinteto, integrando para um hidrogênio em δ

H

3,93 (J = 4,8 Hz).

Figura 38:

Espectro de COSY

1

H x

1

H de

S

7

HO O

H

R

H

S

H

R

H

S

OH

1

2

3

A partir do espectro de COSY

1

H x

1

H (Fig. 38), nota-se que os sinais

descritos anteriormente se correlacionam, evidenciando a presença de dois grupos

metilênicos carbinólicos diastereotópicos, ou seja, ligados a um centro quiral. Dessa

forma, pode-se justificar o fato dos hidrogênios de cada grupo CH

2

não serem

quimicamente equivalentes. A análise desses dados nos permitiu propor uma

subestrutura para S

7

, mostrada a seguir:

A presença de uma cadeia hidrocarbônica saturada longa, ligada à

subestrutura anterior, é atribuída pela observação no espectro de RMN

1

H dos

seguintes sinais: um tripleto, integrando para dois hidrogênios em δ

H

2,35 (J = 7,5

Hz), característico de hidrogênio de grupo metilênico ligado a carbono carbonílico;

um quinteto em δ

H

1,63 (J = 7,2 Hz), típico de hidrogênios de grupo CH

2

β à

carbonila; um outro tripleto, integrando para três hidrogênios, centrado em δ

H

0,88 (J

Figura 39:

Espectro de RMN

1

3

C (75 MHz, CDCl

3

) de

S

7

= 6,8 Hz), característico de hidrogênios de metila terminal; observa-se ainda, um

singleto largo em δ

H

1,25, integrando aproximadamente para 40 hidrogênios,

evidenciando a presença de uma sequência n de grupos CH

2

.

O espectro de RMN

13

C (Fig. 39) de S

7

apresenta um sinal em δ

C

174,3 que

caracteriza uma carbonila de éster não conjugada, evidenciando que a subestrutura

apresentada está esterificada com uma cadeia hidrocarbônica saturada. Observa-se

ainda na região de carbonos carbinólicos, três sinais em δ

C

70,3; 65,2 e 63,3. Com

base na teoria, podemos atribuir o sinal mais desprotegido (δ

C

70,3) ao carbono

oximetínico C-2. O carbono mais protegido (δ

C

63,3) foi atribuído ao carbono

metilênico C-3, visto que possui dois efeitos γ, enquanto C-1 possui apenas um

efeito γ e, consequentemente, o sinal em δ

C

65,2 foi atribuídos a C-1.

HO O CH

3

O

H

R

H

S

H

R

H

S

OH

1

2

3

21

4

5

27

S

7

A análise desses dados espectroscópicos permitiu identificarmos a substância

S

7

, como sendo um monoacilglicerídeo:

Tabela 7: Dados de RMN

1

H e

13

C para S

7

(ppm, CDCl

3

300 e 75 MHz)

O padrão de hidrogenação dos carbonos foi determinado via DEPT

δ

H

δ

C

1

H

R

3,60

dd

(

J

= 11,4 e 5,7 Hz)

H

S

3,70

dd

(

J

= 11,4 e 4,2 Hz)

65,2

t

2

3,93

m

(

J

= 4,8 Hz)

70,3

d

3

H

R

4,14

dd

(

J

= 11,7 e 6,0 Hz)

H

S

4,21

d

(

J

= 11,7 e 5,1 Hz)

63,3

t

4

----

174,3

s

5

2,35

t

(

J

= 7,5 Hz)

34,1

t

6

1,63

qt (

J

= 7,2 Hz)

3

1,9

t

(CH

2

)

2

0

1,25 (

sl

)

29,1

–

29,7

t

27

0,88

t

(

J

= 6,8 Hz)

14,1

q

19

29

21

28

22

20

30

12

13

18

S

8

H

O

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

1

14

16

15

17

27

24 23

26

25

Figura 40: Espectro de RMN

1

H (300 MHz, CDCl

3

) de S

8

+ S

9

12

13

18

19

29

21

28

22

20

30

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

1

14

16

15

17

27

24 23

2625

S

9

H

O

7.8- Triterpenos S

8

e S

9

As substâncias S

8

e S

9

foram obtidas em mistura. No espectro de RMN

1

H

(Fig. 40) da mistura, observa-se um grande acúmulo de sinais na região de

hidrogênios alifáticos, podendo-se distinguir a presença de vários sinais singletos e

dubleto relativos a grupos metílicos, e ainda, sinais na região de hidrogênios

olefínicos e carbinólicos, todos os quais são indicativos de estruturas terpênicas.

Figura 41:

Espectro de RMN

13

C (75 MHz, CDCl

3

) de

S

8

+

S

9

A análise do espectro de RMN

13

C (Fig. 41) da mistura nos leva à mesma

conclusão. Também neste espectro, observam-se um grande número de sinais de

carbonos sp

3

metílicos, metilênicos e metínicos, bem como, vários sinais de

carbonos olefínicos e um sinal de carbono sp

3

carbinólico.

A estrutura do triterpeno β-amirina (S

8

) foi identificada principalmente, pela

presença nos espectros de RMN

1

H e

13

C dos seguintes sinais:

- um tripleto centrado em δ

H

5,18 (J = 3,6 Hz), relativo ao hidrogênio olefínico

H-12. Os carbonos desta dupla são observados em δ

C

121,7 e 145,2,

atribuídos respectivamente, aos carbonos C-12 e C-13;

- um duplo dubleto em δ

H

3,22 (J = 11,4 e 5,5 Hz), atribuído ao hidrogênio

carbinólico H-3. O respectivo sinal de carbono aparece em δ

C

79,0.

Os outros sinais relevantes de RMN

1

H e

13

C da estrutura S

8

foram

compatíveis com aqueles encontrados na literatura (Mahato & Kundu, 1994).

A outra estrutura identificada na mistura foi o triterpeno pentacíclico lupeol (S

9

)

e os principais sinais de RMN

1

H e

13

C que permitiram esta determinação foram:

- dois multipletos em δ

H

4,68 e 4,56 relativos aos hidrogênios 2H-29 da dupla

vinilidênica. Os sinais de

13

C da respectiva dupla ligação aparecem em δ

C

109,3 e 150,9;

- um duplo dubleto em δ

H

3,22 (J = 11,4 e 5,5 Hz), atribuído ao hidrogênio

carbinólico H-3, sobreposto ao sinal do H-3 de S

8

. O respectivo sinal de

carbono foi observado também em δ

C

79,0;

- um dubleto em δ

H

1,67 (J = 2,4 Hz), atribuído a metila ligada à dupla

vinilidênica, a qual mostrou sinal no espectro de

13

C em δ

C

19,3.

Os sinais de RMN

1

H e

13

C relatados na literatura (Mahato & Kundu, 1994)

para o lupeol, foram comparados com aqueles observados para S

9

, encontrando

total concordância.

A tabela 8 mostrada a seguir apresenta os dados de RMN

13

C e DEPT para

as substâncias S

8

e S

9

em comparação com os dados encontrados na literatura.

C S

8

S

8

(Mahato & Kundu,

1994)

S

9

S

9

(Mahato & Kundu,

1994)

1

38,6 t 38,7 38,7 t 38,8

2

26,9 t 27,3 27,4 t 27,4

3

79,0 d 79,0 79,0 d 78,9

4

38,8 s 38,8 38,8 s 38,8

5

55,2 d 55,3 55,3 d 55,3

6

18,4 t 18,5 18,3 t 18,3

7

32,5 t 32,8 34,3 t 34,2

8

39,8 s 38,8 40,8 s 40,8

9

47,6 d 47,7 50,4 d 50,4

10

36,9 s 37,6 37,1 s 37,1

11

23,5 t 23,6 20,9 t 20,9

12

121,7 d 121,8 25,1 t 25,1

13

145,2 s 145,1 38,0 d 38,0

14

41,7 s 41,8 42,8 s 42,8

15

26,1 t 26,2 27,5 t 27,4

16

27,2 t 27,0 35,6 t 35,5

17

32,5 s 32,5 43,0 s 43,0

18

47,2 d 47,4 48,3 d 48,2

19

46,8 t 46,9 48,0 d 47,9

20

31,1 s 31,1 150,9 s 150,9

21

34,7 t 34,8 29,8 t 29,8

22

37,1 t 37,2 40,0 t 40,0

23

28,1 q 28,2 28,0 q 28,0

24

15,5 q 15,5 15,4 q 15,4

25

15,6 q 15,6 16,1 q 16,1

26

16,8 q 16,9 16,0 q 15,9

27

26,0 q 26,0 14,5 q 14,5

28

28,4 q 28,4 18,0 q 18,0

29

33,3 q 33,3 109,3 t 109,3

30

23,7 q 23,7 19,3 q 19,3

Tabela 8: Dados de RMN

13

C para S

8

e S

9

(ppm, CDCl

3

, 75 MHz)

O padrão de hidrogenação dos carbonos foi determinado pelo experimento DEPT

19

29

21

28

22

20

12

13

18

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

1

14

16

15

17

27

24

23

26

25

R

O

S

10

19

29

21

28

22

20

12

13

18

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

1

14

16

15

17

27

24

23

26

25

R

O

S

11

2'

3'

1'

4'

5'

6'

O

OH

HO

R =

Figura 42: Espectro de RMN

1

H (300 MHz, Piridina-D

5

) de S

10

+ S

11

7.9- Esteróides S

10

e S

11

A obtenção e a identificação destes dois compostos em mistura é muito

comum devido às semelhanças estruturais apresentadas entre eles. O espectro de

RMN

1

H da mistura S

10

+ S

11

é mostrado na figura 42 a seguir:

Figura

43:

Espectro de RMN

13

C (75 MHz, Piridina-D

5

) de

S

10

+

S

11

Os sinais observados neste espectro são: um sinal largo em δ

H

5,39, típico de

hidrogênio da posição 6 de esqueleto esteroidal em S

10

e S

11

; um duplo dubleto em

δ

H

5,26 (J = 15,3 e 8,4 Hz), referente ao hidrogênio H-22 em S

11

, outro duplo dubleto

em δ

H

~ 5,10 (J = 15,3 e 8,4 Hz), referente ao hidrogênio H-23 em S

11

; um multipleto

em δ

H

4,00, atribuído ao hidrogênio H-3 em S

10

e S

11

; uma grande quantidade de

sinais na região de δ

H

0,60 a 2,80, relativos aos vários hidrogênios metílicos,

metilênicos e metínicos de S

10

e S

11

, observa-se ainda, entre δ

H

4,00 a 5,10, um

conjunto de sinais de hidrogênios carbinólicos característico de grupamento açúcar

do tipo D-glucopiranosídeo, que provavelmente deve estar ligado na posição 3 da

estrutura de S

10

e S

11

, em especial, o dubleto em δ

H

5,09 (J = 7,8 Hz) referente ao

hidrogênio hemiacetálico.

O espectro de RMN

13

C (Figura 43), para a mistura S

10

+ S

11

, apresentou

sinais que confirmam a presença destas duas substâncias. Entre os sinais

observados, destacam-se os sinais: em δ

C

141,2 e 122,2, atribuídos

respectivamente, aos carbonos C-5 e C-6 de S

10

e S

11

; em δ

C

139,1 e 129,8,

atribuídos respectivamente, aos carbonos olefínicos C-22 e C-23 de S

11

e em δ

C

102,9, referente ao carbono anomérico do grupo D-glucopiranosídeo, que se

confirma pela presença de sinais de carbonos carbinólicos de açúcar na região de δ

C

60,0 a 79,0.

C S

10

S

10

(Ahmad, Ghazala &

Uddin, 1992)

S

11

S

11

(Guilhon, 2000)

1

37,8 t 37,6 37,8 t 37,5

2

30,3 t 30,3 30,6 t 32,7

3

78,4 d 78,4 78,4 d 78,2

4

40,2 t 40,0 40,1 t 42,4

5

141,2 s 140,9 141,2 s 141,0

6

122,2 d 121,9 122,2 d 121,9

7

32,5 t 32,2 32,5 t 32,1

8

32,4 d 32,1 32,4 d 32,2

9

50,7 d 50,4 50,7 d 50,4

10

37,2 s 36,9 37,2 s 37,0

11

21,6 t 21,4 21,6 t 21,3

12

39,6 t 39,4 39,6 t 39,9

13

42,8 s 42,6 42,8 s 42,5

14

57,1 d 56,9 57,2 d 57,0

15

24,8 t 24,6 24,8 t 24,6

16

28,8 t 28,6 28,8 t 29,3

17

56,6 d 56,3 56,4 d 56,1

18

12,3 q 12,1 12,3 q 12,2

19

19,5 q 19,3 19,5 q 19,4

20

36,7 d 36,4 41,1 d 40,7

21

19,3 q 19,1 19,3 q 18,9

22

34,5 t 34,3 139,1 d 138,8

23

26,7 t 26,5 129,8 d 129,5

24

46,4 d 46,1 51,7 d 51,4

25

29,8 d 29,5 29,8 d 32,2

26

19,7 q 19,5 21,8 q 21,5

27

20,3 q 20,0 19,4 q 19,2

28

23,7 t 23,5 26,0 t 25,7

29

12,5 q 12,2 12,5 q 12,5

1’

102,9 d 102,6 102,9 d 102,6

2’

75,6 d 75,3 75,6 d 75,3

3’

78,9 d 78,2 78,9 d 78,6

4’

72,0 d 71,7 72,0 d 71,8

5’

78,8 d 77,3 78,8 d 78,4

6’

63,2 t 62,9 63,2 t 62,9

A tabela 9 apresenta os dados espectrais de RMN

13

C e DEPT para as

substâncias S

10

e S

11

em comparação com dados encontrados na literatura.

Tabela 9: Dados de RMN

13

C para S

10

e S

11

(ppm, Piridina-D

5

, 75 MHz)

O padrão de hidrogenação dos carbonos foi determinado via DEPT

8- RESULTADO DOS BIOENSAIOS

8.1- EXTRATOS BRUTOS

Os extratos etanólico das folhas e/ou raízes de quatro espécies da família

Leguminosae foram submetidos a bioensaio de inibição da germinação de sementes

de plantas invasoras de pastagem, segundo metodologia descrita, os resultados

destes bioensaios estão expressos no Gráfico 1.

Analisando o Gráfico 1, observa-se que as amostras testadas afetaram muito

pouco a germinação das sementes de mata-pasto. Em contrapartida, as sementes

de malícia foram fortemente afetadas pelas amostras 1(Parkia pendula – folhas), 6

(Samanea tubulosa – folhas) e 7 (Samanea tubulosa – raízes), com percentuais de

inibição de germinação da ordem de 100,0; 100,0 e 64,0 %, respectivamente.

Baseado nesses resultados, a amostra 1 (Parkia pendula – folhas) foi

escolhida para estudos subsequentes, uma vez que, apresentou elevado potencial

alelopático inibitório, além de não ter sido encontrado na literatura, relato de estudo

fitoquímico para a espécie.

1- Parkia pendula (folhas)

2- Plathymenia reticulata (folhas)

3- Plathymenia reticulata (raízes)

4- Cassia fastuose (folhas)

5- Cassia fastuose (raízes)

6- Samanea tubulosa (folhas)

7- Samanea tubulosa (raízes)

Gráfico 1

: Efeitos dos extratos etanólico (10000 ppm) de plantas da família Leguminosae,

sobre a germinação de plantas invasoras. Dados expressos em percentual de inibição em

relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

8.2- FRAÇÕES RESULTANTES DO FRACIONAMENTO DO EXTRATO

ETANÓLICO DAS FOLHAS DE P. pendula

Das 7 frações resultantes do fracionamento do extrato etanólico das folhas

de P. pendula (Fluxograma 2, p. 29), codificadas como P

1

(Hex. 100%), P

2

(Hex./CH

2

Cl

2

1:1), P

3

(CH

2

Cl

2

100%), P

4

(CH

2

Cl

2

/AcOEt 1:1), P

5

(AcOEt 100%) e P

6

(AcOEt/MeOH 1:1) e P

7

(MeOH 100%), 6 foram sujeitas a bioensaios, com exceção

de P

1

, que apresentou massa insuficiente para o teste. Os resultados dos bioensaios

são apresentados no gráfico 2.

O resultado dos bioensaios apresentados no Gráfico 2, demonstraram que as

frações P

4

, P

5

e P

6

apresentaram apreciáveis percentuais de inibição da germinação,

principalmente em relação às sementes de malícia, com inibições de 76,0; 100,0 e

70,0 %, respectivamente. Em relação às sementes de mata-pasto, destaca-se o

efeito ocasionado pela fração P

5

, a qual apresentou 60,0 % de inibição da

germinação das sementes da referida espécie.

A partir destes resultados, as frações P

4

, P

5

e P

6

, foram submetidas a

sucessivos fracionamentos (Fluxogramas 3, 4, 5, 6, e 7, Parte experimental),

resultando na obtenção de onze substâncias, das quais, cinco (S

1

, S

2

, S

3

, S

4

e S

5

)

foram submetidas a bioensaios alelopáticos sobre a germinação, desenvolvimento

Gráfico 2

: Efeitos das frações (1000 ppm) oriundas do fracionamento do extrato etanólico das

folhas de P. pendula, sobre a germinação das sementes de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

da radícula e desenvolvimento do hipocótilo, das espécies malícia e mata-pasto. Os

resultados desses bioensaios são discutidos a seguir.

8.3- BIOENSAIOS COM AS SUBSTÂNCIAS S

1

, S

2

, S

3

, S

4

e S

5

8.3.1- Germinação de Sementes

Foram realizados bioensaios para determinação do potencial de inibição das

substâncias S

1

, S

2

, S

3

, S

4

e S

5

, sobre a germinação das sementes de malícia e

mata-pasto, utilizando-se várias concentrações (5,0; 10,0; 15,0 e 20,0 ppm).

Independentemente da espécie receptora (malícia ou mata-pasto), os níveis

de inibição da germinação foram extremamente baixos, em todas as substâncias

testadas, sendo de apenas 33,0 %, a inibição de maior magnitude obtida da

substância S

3

na concentração de 20,0 ppm, frente à germinação das sementes de

malícia (Gráfico 5, p. 107). A seguir, são mostrados os gráficos que apresentam os

resultados dos bioensaios sobre a germinação de sementes para as substâncias S

1

,

S

2

, S

3

, S

4

e S

5

.

Gráfico 3

: Efeitos de

S

1

sobre a germinação das sementes de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

Gráfico 4

: Efeitos de

S

2

sobre a germinação das sementes de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

Gráfico 5

: Efeitos de

S

3

sobre a germinação das sementes de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

Gráfico 6

: Efeitos de

S

4

sobre a germinação das sementes de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

8.3.2- Desenvolvimento da radícula

Assim como nos efeitos observados na germinação das sementes, as

inibições sobre o desenvolvimento da radícula, independentemente da espécie

receptora, estiveram associadas à concentração das substâncias, sendo as inibições

mais intensas quase sempre observadas a 20,0 ppm. As inibições observadas sobre

este parâmetro, foram de magnitude relativamente superior às observadas sobre a

germinação.

Os efeitos observados para as substâncias S

2

(Gráfico 9, p. 109) e S

5

(Gráfico

12, p. 111), independentemente da espécie receptora (malícia ou mata-pasto),

tiveram percentual de inibição baixos. Para a substância S

3

(Gráfico 10, p. 110), os

níveis de inibição também não estiveram relacionados ao tipo de espécie receptora,

mas os percentuais de inibição observados alcançaram 40,0 e 43,5 %, na

concentração de 20,0 ppm, para as espécies malícia e mata-pasto, respectivamente.

Já os efeitos observados para as substâncias S

1

(Gráfico 8, p. 109) e S

4

(Gráfico 11, p. 110), estiveram associados ao tipo de espécie receptora, sendo que,

o percentual inibitório apresentado por S

1

foi maior, frente à malícia, enquanto que, o

percentual inibitório observado para S

4

, esteve em níveis mais elevados frente à

espécie mata-pasto. Os percentuais de inibição mais expressivos observados,

respectivamente, para as substâncias S

1

e S

4

foram de 33,3 e 58,0 %, na

Gráfico 7

: Efeitos de

S

5

sobre a germinação das sementes de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

concentração de 20,0 ppm, frente às espécies malícia e mata-pasto,

respectivamente.

Gráfico 8

: Efeitos de

S

1

sobre o desenvolvimento da radícula de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

Gráfico 9

: Efeitos de

S

2

sobre o desenvolvimento da radícula de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

Gráfico 11

: Efeitos de

S

4

sobre o desenvolvimento da radícula de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

Gráfico 10

: Efeitos de

S

3

sobre o desenvolvimento da radícula de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

Gráfico 12

: Efeitos de

S

5

sobre o desenvolvimento da radícula de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

8.3.3- Desenvolvimento do hipocótilo

Para a inibição do desenvolvimento do hipocótilo, os percentuais observados

foram de magnitude ligeiramente superior aos observados para a germinação, mas

inferiores aos observados para o desenvolvimento da radícula. Os efeitos mais

significativos foram obtidos pelas substâncias S

1

, S

3

e S

4

.

As substâncias S

1

e S

4

apresentaram maior percentual de inibição frente à

espécie malícia, com 27,0 % cada uma, na concentração de 20,0 ppm. Já a

substância S

3

, apresentou 27,0 e 33,4 % de inibição, na concentração de 20,0 ppm,

frente às espécies malícia e mata-pasto, respectivamente. Os gráficos apresentados

a seguir descrevem o resultado do efeito de inibição do desenvolvimento do

hipocótilo para todas as substâncias nas quatro concentrações (5,0; 10,0; 15,0 e

20,0 ppm).

Gráfico 13

: Efeitos de

S

1

sobre o desenvolvimento do hipocótilo de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

Gráfico 14

: Efeitos de

S

2

sobre o desenvolvimento do hipocótilo de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

Gráfico 15

: Efeitos de

S

3

sobre o desenvolvimento do hipocótilo de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

Gráfico 16

: Efeitos de

S

4

sobre o desenvolvimento do hipocótilo de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

8.4- Combinação entre pares aleloquímicos

Os bioensaios realizados até aqui com as substâncias S

1

, S

2

, S

3

, S

4

e S

5

,

não apresentaram níveis de inibição expressivos, como aqueles observados para o

extrato bruto e para as frações oriundas do seu fracionamento. Por esse motivo,

levantou-se a hipótese de que o princípio ativo da espécie P. pendula estaria numa

associação de duas ou mais substâncias que quando atuam separadamente, não

expressando assim, o mesmo efeito que tinham em mistura.

Baseado nessa hipótese foram realizados bioensaios de germinação,

desenvolvimento da radícula e do hipocótilo, fazendo-se a mistura de duas

substâncias. Foram testadas as associações entre as substâncias S

1

com S

2

, S

1

com

S

3

, S

1

com S

4

e S

3

com S

4

.

A análise da ação combinada das substâncias nos testes realizados, é

apresentada nas tabelas 10-13, p. 113 e 114. Considerando as quatro

possibilidades estabelecidas no modelo teórico (Figura 4, p. 40), os resultados

indicam ausência de efeitos sinérgicos nas associações de substâncias

experimentadas. Pode-se observar que as inibições promovidas pelas substâncias

Gráfico 17

: Efeitos de

S

5

sobre o desenvolvimento do hipocótilo de malícia e mata-pasto. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O destilada)

Concentração

(ppm)

Malícia Mata-pasto

S

1

S

2

Germinação

Radícula Hipocótilo

Germinação

Radícula Hipocótilo

20 0 11,0 18,5 30,0 13,0 27,0 6,0

15 5 6,0 11,8 18,0 6,0 7,0 0,0

10 10 0,0 4,5 8,0 4,0 13,0 4,0

5 15 0,0 8,0 12,0 3,0 7,0 4.0

0 20 11,0 14,3 25,0 12,0 20,0 8,0

Concentração

(ppm)

Malícia Mata-pasto

S

1

S

3

Germinação

Radícula Hipocótilo

Germinação

Radícula Hipocótilo

20 0 20,0 19,0 16,0 18,0 30,0 24,0

15 5 15,0 14,0 11,0 14,0 10,0 17,0

10 10 10,0 16,0 10,0 10,0 12,0 18,0

5 15 10,0 14,0 15,0 12,0 14,0 18.0

0 20 20,0 20,0 18,0 15,0 28,0 32,0

puras foram em geral, de maior magnitude do que as inibições promovidas pelas

diferentes combinações estabelecidas, tanto para os efeitos sobre a germinação das

sementes como sobre o desenvolvimento da radícula e do hipocótilo.

Tabela 10: Efeitos associativos observados na combinação de S

1

com S

2

. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O

destilada).

Tabela 11: Efeitos associativos observados na combinação de S

1

com S

3

. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O

destilada).

Concentração

(ppm)

Malícia Mata-pasto

S

3

S

4

Germinação

Radícula Hipocótilo

Germinação

Radícula Hipocótilo

20 0 33,0 38,0 24,0 0,0 39,0 30,0

15 5 20,0 17,0 20,0 0,0 27,0 10,0

10 10 10,0 20,0 25,0 5,0 38,0 15,0

5 15 12,0 10,0 13,0 4,0 46,0 18.0

0 20 20,0 21,0 23,0 12,0 52,0 20,0

Concentração

(ppm)

Malícia Mata-pasto

S

1

S

4

Germinação

Radícula Hipocótilo

Germinação

Radícula Hipocótilo

20 0 15,0 28,0 20,0 10,0 32,0 30,0

15 5 10,0 22,0 11,0 8,0 25,0 27,0

10 10 12,0 20,0 10,0 6,0 28,0 15,0

5 15 12,0 22,0 11,0 9,0 28,0 15.0

0 20 17,0 33,0 26,0 14,0 35,0 27,0

Tabela 12: Efeitos associativos observados na combinação de S

1

com S

4

. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O

destilada).

Tabela 13: Efeitos associativos observados na combinação de S

3

com S

4

. Dados

expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (H

2

O

destilada).

CONCLUSÕES

O estudo químico e alelopático da espécie Parkia pendula (Leguminosae)

resultou no isolamento e identificação estrutural de 11 substâncias, pertencentes à

classe dos flavonóides (S

1

e S

2

), derivados Ar-C

1

(S

3

e S

4

), derivados C-13

carotenóide (S

5

e S

6

), monoacilglicerídeo (S

7

), triterpenos (S

8

e S

9

) e esteróides (S

10

e S

11

).

O Levantamento Bibliográfico realizado para as substâncias S

1

(3,7,8,4’-

tetrametoxiflavona) e S

2

(2’-hidroxi-3,7,8,4’,5’-pentametoxiflavona), revelou que a

substância S

2

está sendo isolada pela segunda vez como produto natural, uma vez

que, há um relato na literatura de seu isolamento em Parkia clappertoniana. Porém,

o assinalamento dos hidrogênios dos grupos metoxila e da maioria dos carbonos

aromáticos oxidados da estrutura de S

2

, descrito neste trabalho, são inéditos. O

assinalamento dos hidrogênios metoxílicos e os dados de RMN

13

C para a

substância S

1

, também são novos.

O isolamento de flavonóides que apresentam a posição 5 do anel A deoxidada

é relativamente raro na literatura. A ocorrência de estruturas flavonoídicas com essa

característica está sendo mencionada pela segunda vez no gênero Parkia, através

deste estudo.

As substâncias S

1

, S

2

, S

3

, S

4

e S

5

, foram submetidas a bioensaios de

germinação, desenvolvimento da radícula e do hipocótilo em várias concentrações.

Os resultados demonstraram que os níveis de inibição não foram significativamente

expressivos, como aqueles observados para o extrato bruto e para as frações

oriundas do seu fracionamento, mas, demonstraram uma linearidade crescente do

princípio ativo, associada ao aumento da concentração das substâncias.

Foram feitos bioensaios alelopáticos baseados na hipótese de que o princípio

ativo da espécie P. pendula estaria numa associação de duas ou mais substâncias,

que quando atuam separadamente, não expressam o mesmo efeito que tinham em

mistura. Porém, para as combinações testadas não houve sinergismo.

É necessário dar continuidade ao estudo químico e alelopático da espécie

Parkia pendula, uma vez que, há substâncias isoladas e identificadas neste trabalho

que não foram avaliadas, com destaque para o derivado C-13 carotenóide

dehidrovomifoliol (S

6

), que segundo a literatura apresenta atividade alelopática.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- AGRAWAL, P. K.; Carbon – 13 NMR of Flavonoids. Elsevier Science Publishers B.

V. New York, 1989.

- AHMAD, V. U.; GHAZALA; UDDIN, S.; A Triterpenoid Saponin from Zygophyllum

propinquum. Phytochemistry, 31 (3), 1051-1054, 1992.

- AMARAL, D. F.; Flavonas de Ficus Gomelleira (Moraceae). Dissertação de

Mestrado. Universidade Federal do Pará. 2000.

- ATTA – UR – RAHMAN and VIQAR UDDIN AHMAD;

13

C-NMR of Natural Products

(Monoterpenos and Sesquiterpenos), v. 1, 1992.

- BANSAL, G. L.; BHAN, V. M. Status of research on allelopathy and future scop of

work in Indian. Indian J. Agricul. Sci., 63 (12), 769-776, 1993.

-

BARZ, W.; HORSEL, W. Metabolism of flavonoids. In: HARBONE, J.B. ed.

The flavonoids. London: Chapman & Hall, 916-969, 1975.

- BISIGMANO, G., SANOGO, R., MARINO, A., AQUINO, R., D’ANGELO, V.,

GERMANO, M. P. and DE PASQUALE, R.; Antimicrobial activity of Mitracarpus

scaber Extract and Isolated Constituents. Letters In Applied Microbiology, 30 (2), 105-

108, 2000.

- DEWIK, P. M.; Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach, 466p., 1997.

- DUCKE, A. D. As Leguminosas da Amazônia Brasileira. Rio de Janeiro. Min. Agric.,

Serv. Florestal, V.5, p.6-5, 1939.

- EINHELLIG, F. A. Mechanism of Action of Allelochemicals in Allelopathy.

Allelopathy. v. 582, p. 96-116, 1995.

- GONZÁLEZ, A. G.; GUILLERMO, J. A.; RAVELO, A.G.; JIMENEZ, I. A. 4,5-

Dihydroblumenol A, a new nor-isoprenoid from Perrottetia multiflora. Jornal of Natural

Products, 57 (3), 400-402, 1994.

- GUILHON, G. M. S. P.; Investigação Fitoquímica de Pluchea quitoc com

Contribuição à Química do Gênero Pluchea (Asteraceae). Tese de Doutorado.

Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. 2000.

- GUIMARÃES, E. G. T.; PYLE, E. H. Levantamento Florestal de 20 há na Floresta

Nacional do Tapajós. L. B. A. Ecologia. Santarém, Belém-PA, 1999.

- HARBORNE, J. B. MABRY, T. J. and MABRY, H. The Flavonoids, part 1, chapters

1, first published, 1975.

- HARBORNE, J. B. The Flavonoids of Rutales. In: WATERMAN, P. G.; Chemistry

and Chemical Taxonomy of Rutales. London, Academic Press, 147-173, 1983.

- JAMALUDDIN, F., MOHAMED, S. and LAJIS, M. N.; Hypoglycaemic Effect of

Stigmast-4-en-3-one, from Parkia speciosa empty pods. Food Chemistry, 54, 9-13,

1995.

- KATO, T.; TSUNAKAWA, M.; SASAKI, N.; AIZAWA, H.; FUFITA, K.; KITAHARA, Y.

and TAKAHASHI, N.; Growth and Germination Inhibitors in Rice Husks.

Phytochemistry, 16, 45-48, 1977.

- LEMMICH, E.; ADEWUNMI, C. O.; FURU, P.; KRISTENSEN, A.; LARSEN, L. and

OLSEN, C. E.; 5-Deoxyflavones fron Parkia clappertoniana. Phytochemistry, 42 (4),

1011-1013, 1996.

- LÔBO, L. T.; Estudo das Propriedades Alelopáticas de Plantas: Investigação de

Aleloquímicos de Tachigali mymercophyla (Leguminosae). Dissertação de Mestrado.

Universidade Federal do Pará. 2004.

- LOPES, R. M.; OLIVEIRA, T. T.; NAGEM, T. J. e PINTO, A. S.; Flavonóides

(Farmacologia de Flavonóides no Controle Hiperlipidêmico em Animais

Experimentais), 1999. Disponível em :

http://www.google.com.br/contexts/flavonóides.htm.

- MACHIDA, K. and KIKUCHI, M.; Norisoprenoids fron Viburnum Dilatatum.

Phytochemistry, 41 (5), 1333-1336, 1996.

- MAHATO, S. B., KUNDU, A. P.;

13

C NMR Spectra of Pentacyclic Triterpenoids a

Compilation and Some Salient Features. Phytochemistry, 37 (6), 1517-1575, 1994.

- MACIAS, F. A.; OLIVA, R. M.; VARELA, R. M.; TORRES, A. and MOLINILLO, J. M.

G.; Allelochemicals from sunflower leaves cv. Peredovick. Phytochemistry. 52, 613-

621, 1999.

- MALAN, E. and ROUX, D. G.; Flavonoids and Tannins of Acacia Species.

Phytochemistry, 14, 1835-1841, 1975.

- MANN, J. Secundary Metabolism. 2. ed. New York: Oxford University Press, 1987.

- NASCIMENTO, L. A. S.; Constituintes Químicos de Aparisthmium cordatum.

Trabalho de Conclusão de Curso. Universidade Federal do Pará. 2002.

- RIBEIRO, J. E. L. S.; Flora da Reserva Ducke: Guia de Identificação das Plantas

Vasculares de uma Floresta de Terra-Firme na Amazônia Central, Manaus: INPA,

382-391, 1999.

- RICE, E. L. Allelopathy. New York: Academic Press, 1974.

- SILVA, S. da C. Flavonoides e Sesquiterpenos das Folhas de Brosimum acutifolium

e Atividade Antimicrobiana de Espécies Vegetais da Amazônia. Dissertação de

Mestrado, Universidade Federal do Pará, 2002.

- SIMÕES, C. M. O. Farmacognosia: da planta ao medicamento – 3 ed. ver. - Porto

Alegre - Florianópolis. 512-515, 2001.

- SMITH, A. E. MARTIN, D. L. Allelopathic characteristics of Three coop-season

grass in the forage ecosystems. Agron. J., 8 (2), 243-246, 1994.

- SOUZA FILHO, A. P. S.; ALVES, S de M. Alelopatia em ecossistema de pastagens

cultivadas. Belém: EMBRAPA - CPATU, 1998. 72p. (EMBRAPA - CPATU.

Documentos, 109).

- SOUZA FILHO, A. P. S.; ALVES, S de M. Alelopatia Princípios Básicos e Aspectos

Gerais. Belém: EMBRAPA - CPATU, 260p.,1998.

- STATISTICAL ANALYSIS SYSTEM – SAS. User’s guide. Version 6.4. North.

Caroline: SAS Institute. 846p., 1989.

- TRINGALI, C.; SPATAFORA, C. e LONGO, O. D.; Bioactive constituents of the bark

of Parkia biglobosa. Fitoterapia. 71, 118-125, 2000.

- VAN DEN BERG, M. E. Plantas Medicinais da Amazônia: Contribuição ao seu

Estudo Sistemático. Belém-Pa : PTU/MPEG, 1982.

- WHITTAKER, R. H.; FENNY, P. P. Allelochemies: Chemical interation between

species. Science, 171, 757-770, 1971.

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