( PDF ) Análise comparativa da eficácia do método imuno-histoquímico (D2-40 e CD34) e da coloração de rotina (HE) para detecção de invasão vascular linfática e sanguínea no carcinoma [...]

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LETÍCIA TRIVELLATO GRESTA

Análise comparativa da eficácia do método

imuno-histoquímico (D2-40 e CD34) e da

coloração de rotina (HE) para detecção de

invasão vascular linfática e sanguínea no

carcinoma gástrico:

correlação com outros indicadores prognósticos

Belo Horizonte

2010

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

Faculdade de Medicina

Departamento de Anatomia Patológica e Medicina Legal

Programa de Pós-Graduação em Patologia:

Mestrado – Área de Concentração em Patologia Médica

Análise comparativa da eficácia do método

imuno-histoquímico (D2-40 e CD34) e da

coloração de rotina (HE) para detecção de

invasão vascular linfática e sanguínea no

carcinoma gástrico:

correlação com outros indicadores prognósticos

Letícia Trivellato Gresta

Belo Horizonte

2010

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LETÍCIA TRIVELLATO GRESTA

Análise comparativa da eficácia do método

imuno-histoquímico (D2-40 e CD34) e da

coloração de rotina (HE) para detecção de

invasão vascular linfática e sanguínea no

carcinoma gástrico:

correlação com outros indicadores prognósticos

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Patologia da Universidade

Federal de Minas Gerais, como requisito parcial

para obtenção do título de Mestre em Medicina.

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: Patologia Médica

ORIENTADORA: Profa. Dra. Mônica Maria

Demas Álvares Cabral

Belo Horizonte

2010

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

REITOR

Prof. Ronaldo Tadêu Pena

PRÓ-REITORA DE PÓS-GRADUAÇÃO

Profª. Elizabeth Ribeiro da Silva

PRÓ-REITOR DE PESQUISA

Prof. Carlos Alberto Pereira Tavares

DIRETOR DA FACULDADE DE MEDICINA

Prof. Francisco José Penna

CHEFE DO DEPARTAMENTO DE ANATOMIA PATOLÓGICA E MEDICINA

LEGAL

Profª. Paula Vieira Teixeira Vidigal

COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA

Prof. Wagner Luiz Tafuri

SUBCOORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA

Prof. Geovanni Dantas Cassali

COLEGIADO DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA

Prof. Anílton César Vasconcelos

Prof. Edilberto Nogueira Mendes

Profª. Helenice Gobbi

Prof. Marcelo Vidigal Caliari

Enio Ferreira (Disc.Titular)

Izabela Amorim (Disc.Suplente)

À querida professora Ana Margarida,

com saudades...

AGRADECIMENTOS

Agradeço antes de tudo a Deus, por ter me dado saúde, força e proteção para

realizar os meus sonhos.

Aos meus pais, Remo Gresta e Maria Mazzarello, pela pessoa que sou e que ainda

quero ser, pelo carinho, pela educação e amizade. Agradeço por terem me ensinado

o valor do trabalho e a virtude da gratidão.

Ao meu Norte, Ismael, pelo amor possível e impossível, pela inspiração para

continuar acreditando e trilhando o caminho só nosso. A Agulha sempre aponta para

o Norte.

À vovó Dulce, por ter me ensinado que curiosidade e sabedoria são qualidades que

se complementam, e não podem ser afastadas.

Aos meus familiares queridos, pelos momentos de alegria e cumplicidade em família,

onde podemos ser simplesmente nós mesmos.

A todos os professores do Departamento de Anatomia Patológica da Faculdade de

Medicina da UFMG, pela oportunidade de aprender a minha profissão.

Ao Prof. Geovanni Dantas Cassali, Coordenador do Laboratório de Patologia

Comparada do ICB – UFMG, por nos ter ajudado com tanta prontidão e

generosidade, cedendo os anticorpos utilizados neste trabalho.

À Profa. Lúcia Porto Fonseca de Castro do Laboratório de Imuno-histoquímica do

Departamento de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina da UFMG, pelo

apoio incondicional, pela amizade e pela ajuda na realização de todas as reações

imuno-histoquímicas.

Às Técnicas em Patologia: Maria de Lourdes Gomes Evangelista, Margaret Gomes e

Luciana Daise da Silva, pelo apoio na realização da microtomia e colorações imuno-

histoquímicas.

Aos colegas patologistas do Laboratório Analys, pelo incentivo ao estudo e ao

constante aperfeiçoamento profissional.

Aos colegas da pós-graduação, colegas da Residência, funcionários e amigos do

Departamento de Anatomia Patológica pelos tantos anos de convivência e

experiências compartilhadas.

Aos alunos da graduação da Faculdade de Medicina, estagiários do Laboratório de

Anatomia Patológica do IML – BH e do Laboratório Analys, muitos deles agora

colegas de profissão, com quem aprendi muito mais do que ensinei.

A todos os amigos que contribuíram e torceram para que este trabalho fosse

concluído.

AGRADECIMENTO ESPECIAL

À Profa. Ana Margarida Miguel Ferreira Nogueira, pelo exemplo de profissional

dedicada ao ensino, à pesquisa e à assistência, com o mesmo entusiasmo e

competência. Agradeço por ter acreditado em mim desde a época da Residência

Médica e me dado a chance de aprender com uma mestra indescritível. Sou grata

pelos ensinamentos e pela amizade, espero ter conseguido concluir o nosso projeto

da maneira imaginada.

À Profa. Mônica Maria Demas Álvares Cabral, por ter me recebido de braços abertos

para a orientação, sem hesitar. Agradeço a amizade, a confiança, o respeito e a

cumplicidade que tivemos nesses dois anos de trabalho e que só foi aumentando.

Obrigada pelas incontáveis horas dedicadas a esta conquista, que significa para

mim muito mais que um título.

“All I know is this: Once I was blind, and now I can see”

Evangélio segundo São João 9, 25.

RESUMO

INTRODUÇÃO: o carcinoma gástrico (CG) é a segunda maior causa de morte por

câncer em todo o mundo, sendo o estadiamento TNM o fator mais importante para o

prognóstico dos pacientes, especialmente a presença de metástases linfonodais. A

invasão vascular linfática (IVL) detectada no tumor primário se correlaciona com a

ocorrência de metástases linfonodais e é também considerada fator prognóstico

independente nos pacientes com CG. A avaliação da angioinvasão realizada apenas

pela coloração de rotina hematoxilina e eosina (HE) pode gerar tanto resultados

falso-positivos quanto falso-negativos. O D2-40 é um anticorpo monoclonal

específico para endotélio linfático, sendo assim útil para identificar IVL e, desta

forma, distinguir se a embolização tumoral se encontra em vasos sanguíneos ou

linfáticos. OBJETIVOS: nosso objetivo foi analisar comparativamente a detecção de

IVL e sanguínea (IVS), pela HE e pela imuno-histoquímica (IHQ) com marcação por

D2-40 e CD34 em uma série de CG e correlacioná-las com os demais fatores

prognósticos. MATERIAL E MÉTODOS: foi realizado estudo IHQ em cortes

seriados, utilizando os marcadores D2-40 (endotélio linfático) e CD34 (pan-

endotelial) em 95 casos consecutivos de CG para avaliar a presença de IVL e IVS.

Os resultados obtidos pela análise à IHQ foram comparados com a detecção de IVL

e IVS pela HE, e correlacionados com outros fatores prognósticos. Os dados clínico-

patológicos e a presença de IVL e IVS foram correlacionados com a ocorrência de

metástases linfonodais. RESULTADOS: a detecção de IVL foi consideravelmente

maior que a de IVS. Sessenta e um casos (64,2%) apresentaram IVL na avaliação

pela HE, que foi identificada em 66 (69,5%) pela IHQ. Dos 61 casos com IVL ao HE,

8 eram falso-positivos à IHQ. A IHQ detectou IVL em 13 casos que haviam sido

considerados negativos ao HE. A IVS foi evidenciada em 38 casos (40,0%) pela HE

e em apenas 24 (25,2%) pela IHQ. Foram identificados, pela análise à IHQ, 24

casos falso-positivos e 10 casos falso-negativos para IVS. A comparação entre a

detecção de IVL por ambos os métodos não mostrou diferença significativa. Houve

diferença estatisticamente significativa entre a detecção de IVS ao HE e à IHQ

(p=0,02). A concordância diagnóstica entre os métodos foi moderada para IVL

(Kappa=0,50) e baixa para IVS (Kappa=0,20). A correlação entre a presença de

metástases linfonodais e a presença de IVL e IVS foi estatisticamente significativa,

tanto na avaliação pela HE (p=0,001, p=0,013), quanto pela IHQ (p=0,001, p=0,019).

A presença de metástases linfonodais se correlacionou ainda com: a profundidade

de infiltração tumoral além da submucosa (CG avançado) (p=0,001), a classificação

histológica de Laurén quando comparados os tipos difuso e misto/não classificável

(p=0,017) e a invasão de órgãos por continuidade (esôfago e duodeno) (p=0,026).

Os fatores clínico-patológicos relacionados à presença de IVL foram: topografia do

tumor no terço distal do estômago (p=0,039), tipo macroscópico de Borrmann

(p=0,001), invasão de órgãos por continuidade (p=0,003) e profundidade tumoral

(p=0,001). Em contrapartida, a presença de IVS correlacionou-se apenas com a

profundidade tumoral (p=0,003). CONCLUSÃO: a presença de IVL e IVS está

relacionada à presença de metástases linfonodais no CG. A presença de IVL está

associada a outros fatores de pior prognóstico nos tumores, como estágio avançado

da neoplasia, invasão de órgãos por continuidade e o tipo misto/não classificável de

Laurén, refletindo provavelmente o seu potencial metastático e comportamento

agressivo. Nossos resultados mostram que a aplicação do método IHQ utilizando

esses dois marcadores combinados é superior na detecção de IVL e IVS no CG,

quando comparada à coloração de rotina pela HE, podendo ter grande aplicação na

prática médica.

Palavras-chave: Carcinoma gástrico, Estadiamento TNM, Metástases linfonodais,

Fatores prognósticos, Invasão vascular linfática, Invasão vascular sanguínea, Imuno-

histoquímica, CD34, D2-40.

ABSTRACT

BACKGROUND: Worldwide, gastric carcinoma (GC) is the second largest cause of

cancer-related death. The TNM staging system for GC is widely used and it provides

important prognostic information, especially with regards to the lymph node status.

The presence of lymphatic invasion (LVI) detected on the primary tumor is the

strongest risk factor for lymph node metastasis and is known as an independent

prognostic factor in patients with GC. Because the evaluation of LVI is subjective with

conventional Hematoxylin and Eosin (H&E) staining, it can lead to inaccurate false-

positive and false-negative results. D2-40 is a specific monoclonal antibody for the

lymphatic endothelium, being useful to identify LVI and distinguish lymphatic from

blood vessel invasion (BVI) by neoplastic cells. AIMS: The aim of this study is to

evaluate and compare LVI and BVI detected by H&E and immunohistochemistry

(IHC) in a series of GC, relating them to morphologic features of the primary tumor

and to the presence of lymph node metastasis. METHODS: IHC using D2-40

(lymphatic endothelial marker) and CD34 (pan-endothelial marker) was performed to

study LVI and BVI in surgical specimens of a consecutive series of 95 primary GC.

The results of the IHC study were compared with the detection of LVI and BVI by

H&E, and related to other prognostic factors. The morphologic features of tumors and

the presence of LVI and BVI were also related to the presence of lymph node

metastasis. RESULTS: The detection of LVI was considerably higher than BVI. Sixty-

one cases (64,2%) were positive for LVI when evaluated by H&E, whether 66

(69,5%) were detected by IHC. From the 61 cases with LVI by H&E, 8 were false-

positives by IHC. The IHC detected LVI in 13 cases that were negative by H&E. BVI

was identified in 38 cases (40,0%) by H&E and in just 24 (25,2%) by IHC. The IHC

study identified 24 cases of false-positives and 10 cases of false-negatives for BVI.

The comparison of LVI detected by both methods was not statistically significant.

There was a significant difference between BVI detected by H&E and IHC (p=0,02).

The average Kappa value determined for LVI was moderate (Kappa=0,50) and low

for BVI (Kappa=0,20). The correlation between lymph node metastasis and the

presence of LVI and BVI was statistically significant when evaluated by H&E

(p=0,001, p=0,013), and IHC (p=0,001, p=0,019). The presence of lymph node

metastasis was associated with the depth of tumor invasion when compared

advanced to early GC (p=0,001), mixed-type of Laurén’s classification when

compared to the diffuse-type (p=0,017) and organ invasion (esophagus and

duodenum) (p=0,026). The morphologic features associated with LVI were: location

of tumor at distal third of the stomach (p=0,039), Borrmann’s macroscopic type

(p=0,001), organ invasion (p=0,003) and depth of tumor invasion (p=0,001). The

presence of BVI is related only to the depth of tumor invasion (p=0,003).

CONCLUSION: LVI was more easily identified in the D2-40 immunostained sections

than in the H&E stained sections. The presence of LVI and BVI is associated with the

presence of lymph node metastasis. The presence of LVI is associated to others

morphological features of poor prognosis, as advanced stage of disease, mixed-type

of Laurén’s classification when compared to the diffuse-type and organ invasion

(esophagus and duodenum), probably reflecting a potential for lymphatic metastatic

spread and aggressive behavior. Our results show that the IHC method with these

two markers is superior to the conventional H&E staining for detecting LVI and BVI in

GC. Immunohistochemical identification of lymphatic and blood vessels in GC is

useful to increase the accuracy of diagnosing the presence lymph or blood vessel

invasion and to predict lymph node metastasis.

Key-words: Gastric carcinoma, TNM staging, Lymph node metastasis, Predictive

factor, Lymphatic invasion, Blood vessel invasion, Immunohistochemistry, CD34, D2-

40.

LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Características clínico-patológicas da amostra .................................

TABELA 2. Revisão histopatológica dos casos ...................................................

TABELA 3. Correlação entre a classificação histológica de Laurén e a

profundidade tumoral em 95 casos de carcinoma gástrico .................

TABELA 4. Avaliação da invasão vascular linfática pelos métodos de HE e

IHQ........................................................................................................

TABELA 5. Avaliação da invasão vascular sanguínea pelos métodos de HE e

IHQ .......................................................................................................

TABELA 6. Comparação entre a concordância diagnóstica na detecção de

invasão vascular linfática e sanguínea pela HE e pela IHQ ................

TABELA 7. Correlação entre a detecção de invasão vascular linfática e

sanguínea pela HE e IHQ e a presença de metástases linfonodais ....

TABELA 8. Correlação entre os parâmetros clínico-patológicos e a presença

de metástases linfonodais ...................................................................

TABELA 9. Correlação entre os parâmetros clínico-patológicos e as presenças

de invasão vascular linfática e sanguínea pela IHQ ............................

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Classificação macroscópica do carcinoma gástrico precoce

segundo a Sociedade Japonesa de Endoscopia Digestiva. Tipos:

protuso (polipóide), superficial (elevado, plano e deprimido) e

ulcerado (escavado) ............................................................................

FIGURA 2. Classificação macroscópica do carcinoma gástrico avançado

segundo Borrmann. Tipos: polipóide (vegetante), ulcerado expansivo

(fungado), úlcero-infiltrativo (ulcerado) e infiltrativo (difuso) ................

FIGURA 3. Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100 mil

homens, estimadas para o ano de 2010, segundo a Unidade da

Federação (neoplasia maligna do estômago) ......................................

FIGURA 4. Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100 mil

mulheres, estimadas para o ano de 2010, segundo a Unidade da

Federação (neoplasia maligna do estômago) ......................................

FIGURA 5. Densidade vascular linfática nas diferentes camadas da parede

gástrica normal. Média +DP de 30 pontos (por milímetro quadrado).

M: mucosa; MM: muscular da mucosa; SM: submucosa; MP:

muscular própria; SS: subserosa .........................................................

FIGURA 6. Diagrama esquemático ilustrando os possíveis fatores preditivos de

metástases linfonodais, no qual se destacam os linfáticos intra e

peritumorais e a linfangiogênese .........................................................

FIGURA 7. Mapa de Clivagem para o processamento das peças cirúrgicas de

carcinoma gástrico: amostragem para exame histológico ...................

FIGURA 8. Fotomicrografias dos cortes seriados de invasão vascular linfática e

sanguínea detectadas pela HE (seta) e IHQ. A: IVL HE (x400). B:

IVL marcação por CD34 (x400). C: IVL marcação por D2-40 (x400).

D: IVS HE (x100). E: IVS HE (x400). F: IVS marcação por CD34

(x400). G: IVS HE (x200). H: IVS marcação por CD34 (x200) I: IVS

marcação por D2-40 (x200) .................................................................

FIGURA 9. Comparação da eficácia entre HE e IHQ como métodos

diagnósticos na detecção de invasão vascular linfática em 95 casos

de CG ...................................................................................................

FIGURA 10. Comparação da eficácia entre HE e IHQ como métodos

diagnósticos na detecção de invasão vascular sanguínea em 95

casos de CG ........................................................................................

FIGURA 11. Fotomicrografias de cortes seriados de invasão vascular linfática

detectada apenas pela IHQ e de falsa invasão vascular

diagnosticada ao HE. A e B: IVL marcação por D2-40 (x400); C:

falsa IVL HE (x100); D: falsa IVL marcação por D2-40 (x100) ..........

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 1. Correlação entre faixa de idade dos pacientes e tipo de carcinoma

gástrico, segundo a classificação histológica de Laurén .....................

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1. Anticorpos utilizados no estudo imuno-histoquímico .......................

QUADRO 2. Resultados dos coeficientes de concordância de Kappa de acordo

com a classificação de Landis & Koch .................................................

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AJCC – American Joint Committee on Cancer

APM – Serviço de Anatomia Patológica do Hospital das Clínicas da UFMG

BVI – blood vessel invasion

cagA – Proteína produzida pelo H. pylori “cytotoxin-associated gene A”

CG – Carcinoma gástrico

COEP – Comitê de Ética em Pesquisa

COX-2 – Enzima pró-inflamatória ciclooxigenase-2

DAB – Diaminobenzidina

DMV – Densidade microvascular

DVL – Densidade vascular linfática

Dr. – Doutor

Dra. – Doutora

EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid, ou Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético

GC – gastric carcinoma

HC – Hospital das Clínicas

HE – Hematoxilina e eosina

H&E – Hematoxylin and Eosin staining

IHC – Immunohistochemistry

IHQ – Imuno-histoquímica ou imuno-histoquímico

IL – Interleucina

INCA – Instituto Nacional de Câncer

iNOS – Enzima pró-inflamatória óxido-nítrico sintetase

IVL – Invasão vascular linfática por células neoplásicas

IVS – Invasão vascular sanguínea por células neoplásicas

JGCA – Japanese Gastric Cancer Association

LP-TGI – Laboratório de Pesquisa em Patologia do Trato Gastrointestinal

LSAB - Labeled Streptavidin-Biotin, ou Estreptavidina-Biotina Peroxidase

LVI – lymph vessel invasion

μm – Micrômetros

M – Avaliação clínica de metástases hematogênicas segundo o TNM

N – Avaliação clínica de metástases linfonodais segundo o TNM

NC – Não classificável segundo Lauren

OMS – Organização Mundial de Saúde

P.A. – Pureza Analítica

PBS – Solução tampão salino-fosfatado

pM – Avaliação patológica de metástases hematogênicas segundo o TNM

pN – Avaliação patológica de metástases linfonodais segundo o TNM

pT – Avaliação patológica da profundidade de invasão tumoral segundo o TNM

Prof. – Professor

Profa. – Professora

SBP – Sociedade Brasileira de Patologia

SJED – Sociedade Japonesa de Endoscopia Digestiva

SOE – Sem outra especificação

T – Avaliação clínica da profundidade de invasão tumoral segundo o TNM

TNFα – Fator de necrose tumoral-alfa

TNM – Sistema de classificação de neoplasias para estadiamento

UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais

UICC – Union Internationale Contre le Cancer

VEGF – Fator de crescimento derivado do endotélio vascular

VEGF-C – Fator de crescimento C derivado do endotélio vascular

VEGFR-3 – Receptor do Fator de crescimento C derivado do endotélio vascular

VPN – Valor preditivo negativo

VPP – Valor preditivo positivo

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO …………………………………………………..............................

1.1 Justificativa ...................................................................................................

1.2 Objetivos .......................................................................................................

2 REVISÃO DA LITERATURA ……………………………………........................

2.1 Aspectos clínico-patológicos do carcinoma gástrico ..............................

2.1.1 Classificação histológica do carcinoma gástrico .........................................

2.1.2 Avaliação macroscópica do carcinoma gástrico ..........................................

2.1.3 Fatores epidemiológicos relacionados ao carcinoma gástrico ....................

2.1.4 Fatores etiológicos relacionados ao carcinoma gástrico .............................

2.1.5 Aspectos gerais relacionados à carcinogênese gástrica .............................

2.2 Aspectos prognósticos clássicos do carcinoma gástrico .......................

2.2.1 Tipo histológico e prognóstico do câncer gástrico .......................................

2.2.2 Importância do estadiamento anatomopatológico no carcinoma gástrico ...

2.2.3 O papel do rastreamento endoscópico no diagnóstico do carcinoma

gástrico .................................................................................................................

2.3 Neoformação vascular linfática e sanguínea na carcinogênese gástrica

2.3.1 Angiogênese e carcinogênese......................................................................

2.3.2 Linfangiogênese no carcinoma gástrico ......................................................

2.4 Novos parâmetros prognósticos na avaliação do carcinoma gástrico:

importância prognóstica da invasão vascular linfática e sanguínea ............

2.5 Métodos de avaliação de invasão vascular ................................................

2.5.1 Problemas na detecção de invasão vascular linfática e sanguínea pela

coloração de rotina por HE ...................................................................................

2.5.2 Perspectivas da aplicação do método imuno-histoquímico na detecção de

invasão vascular linfática e sanguínea .................................................................

3 MATERIAIS E MÉTODOS …...................................……………........................

3.1 Seleção dos casos ........................................................................................

3.2 Estudo morfológico dos tumores primários ..............................................

3.3 Estudo imuno-histoquímico ........................................................................

3.4 Avaliação de invasão vascular ....................................................................

3.4.1 Avaliação de invasão vascular pela coloração de HE .................................

3.4.2 Avaliação de invasão vascular pela coloração de IHQ ................................

3.5 Análise estatística .........................................................................................

4 RESULTADOS ..................................................................................................

4.1 Características gerais da amostra ..............................................................

4.1.1 Características clínico-patológicas dos casos .............................................

4.1.2 Revisão histopatológica ...............................................................................

4.1.3 Correlação entre as variáveis clínico-patológicas idade e profundidade

tumoral com a classificação histológica de Laurén ...............................................

4.2 Avaliação de invasão vascular linfática e sanguínea ................................

4.2.1 Invasão vascular linfática e invasão vascular sanguínea ............................

4.2.2 Comparação da eficácia dos métodos de HE e IHQ na identificação de

invasão vascular ...................................................................................................

4.3 Correlação com metástases linfonodais e outras variáveis

prognósticas .......................................................................................................

4.3.1 Correlação entre invasão vascular e metástases linfonodais ......................

4.3.2 Valor preditivo da invasão vascular linfática e sanguínea para metástases

linfonodais .............................................................................................................

4.3.3 Correlação entre variáveis clínico-patológicas e metástases linfonodais ....

4.3.4 Correlação entre variáveis clínico-patológicas e invasão vascular linfática

e sanguínea detectadas pela IHQ ........................................................................

5 DISCUSSÃO ......................................................................................................

6 CONCLUSÃO ....................................................................................................

PERSPECTIVAS FUTURAS ................................................................................

REFERÊNCIAS ....................................................................................................

APÊNDICES .........................................................................................................

ANEXOS ...............................................................................................................

1 INTRODUÇÃO

1.1 Justificativa

A incidência do carcinoma gástrico (CG) exibe tendência global de declínio

nas últimas décadas. Entretanto, ainda figura como a quarta neoplasia mais

freqüente e a segunda maior causa de morte por câncer em todo o mundo. As

estimativas brasileiras produzidas pelo Instituto Nacional de Câncer (INCA) para

2010 não são diferentes. O número de casos novos de câncer de estômago

estimados no Brasil para o ano de 2010 foi de 13.820 para a população masculina e

7.680 para a feminina. Esses valores correspondem a um risco estimado de 14

casos novos a cada 100 mil homens e de 8 a cada 100 mil mulheres.

A razão mortalidade/incidência do CG é consideravelmente alta em todas as

partes do mundo, sendo a sobrevida relativa em cinco anos baixa, cerca de 20% na

maioria dos países em desenvolvimento. Apesar dos valores ainda elevados de

mortalidade, há tendência de melhoria das taxas de sobrevida com os avanços da

endoscopia digestiva e conseqüente detecção de tumores cada vez mais precoces.

Entretanto, observações epidemiológicas realizadas no Brasil permitem afirmar que

essas tendências de melhoria são menos pronunciadas em nosso meio, onde os

diagnósticos são em geral tardios. Portanto, são justificados todos os esforços na

tentativa de aproximar o perfil brasileiro ao dos países mais desenvolvidos em

relação ao diagnóstico e tratamento desta neoplasia.

O prognóstico do CG baseia-se essencialmente no seu estadiamento em

relação à profundidade de invasão tumoral e à presença de metástases linfonodais.

Estas características, aliadas a outros aspectos patológicos, definem os rumos do

tratamento. Portanto, a abordagem cirúrgica com propósitos curativos, envolvendo

gastrectomia com linfadenectomia, é considerada a única intervenção capaz de

prolongar a sobrevida.

A presença de invasão vascular linfática (IVL) no tumor primário tem sido

considerada fator de risco independente para a ocorrência de metástases linfonodais

em diversos tipos de neoplasia. Embora tenha havido grande avanço no estudo dos

mecanismos que levam à progressão tumoral e à produção de metástases, as

pesquisas envolvendo invasão vascular e suas formas de detecção no CG se

baseiam, muitas vezes, em métodos fragmentados e incompletos, aliados à falta de

interpretação global dos resultados.

O presente estudo tem como propósito definir o valor da análise da IVL e da

invasão vascular sanguínea (IVS) pelo método imuno-histoquímico (IHQ) em uma

amostra abrangente de pacientes com CG e a sua possível aplicação nos

procedimentos propedêuticos de rotina.

Apesar da notável agressividade do CG em fases avançadas, devemos ter

em mente que minimizar a quantidade de procedimentos invasivos é essencial para

melhorar a qualidade de vida do paciente. Tratamentos menos radicais, como a

ressecção endoscópica sem esvaziamento linfonodal (mucosectomia ou dissecção

da submucosa), têm sido cada vez mais aplicados em casos altamente selecionados

de CG precoce. Para que se possa prescindir da linfadenectomia nesses casos, é

necessário excluir com absoluta segurança a presença de IVL ou IVS no tumor

primário.

Por todas essas razões, a avaliação adequada do potencial metastático da

neoplasia é um dos fatores mais importantes para o tratamento do câncer gástrico e

para a sobrevida dos pacientes.

1.2 Objetivos

 Analisar comparativamente a eficácia na detecção de IVL e IVS pelo método

de coloração de rotina pela Hematoxilina e Eosina (HE) e após a marcação

IHQ em uma série de casos de CG;

 Avaliar a presença de IVL e IVS e sua relação com a presença de metástases

linfonodais;

 Correlacionar características clínico-patológicas dos pacientes com a

presença de IVL e IVS;

 Correlacionar características clínico-patológicas dos pacientes com a

ocorrência de metástases linfonodais.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Aspectos clínico-patológicos do carcinoma gástrico

O CG representa mais de 90% das neoplasias malignas do estômago e

compreende um grupo bastante heterogêneo de neoplasias do ponto de vista

morfológico (Coleman et al., 1993; Fenoglio-Preiser et al., 1996). Essa

heterogeneidade pode ser demonstrada pelos diversos sistemas de classificação

desenvolvidos para caracterizar o CG, que são baseados em diferentes abordagens:

tipo histológico, padrão macroscópico, topografia, padrão de crescimento, grau

histológico de diferenciação ou histogênese da neoplasia.

2.1.1 Classificação histológica do carcinoma gástrico

O CG é uma neoplasia maligna epitelial da mucosa gástrica, de origem

glandular (Aaltonen, Hamilton et al., 2000). É constituída, em sua maioria, por

estruturas tubulares, acinares e papilares, ou então consiste em complexa

combinação de células isoladas e pouco coesas, com estruturas glandulares,

trabeculares ou sólidas. Diversos sistemas de classificação foram propostos para o

CG, porém os mais utilizados são as classificações histológicas da Organização

Mundial de Saúde (OMS) e de Laurén (Laurén, 1965; Aaltonen, Hamilton et al.,

2000). Ambos baseiam-se nos aspectos morfológicos característicos das biópsias e

peças cirúrgicas de CG, identificados apenas ao exame histopatológico.

Segundo Laurén, as neoplasias podem ser classificadas em dois tipos

principais: intestinal e difuso. O CG do tipo intestinal forma glândulas claramente

identificáveis, cuja diferenciação varia de pouco a bem diferenciadas. O tipo difuso

consiste na proliferação de células isoladas, com tendência a acúmulo de muco

intracelular, que infiltram a parede gástrica individualmente, sem formação glandular.

Tumores que contêm proporções variáveis destes tipos são chamados mistos, e

aqueles que não se encaixam em nenhuma categoria são os não-classificáveis (NC)

segundo Laurén.

A classificação de Laurén é amplamente utilizada, pois indica a história

natural do CG, mostrando associação epidemiológica com a faixa etária de

incidência e fatores prognósticos e etiopatogênicos (Laurén, 1965; Laurén, 1991).

A classificação da OMS baseia-se no padrão histológico arquitetural

predominante da neoplasia. Os principais tipos são: adenocarcinoma tubular,

papilar, mucinoso, adenocarcinoma sem outra especificação (SOE) e carcinoma de

células em anel de sinete (Aaltonen, Hamilton et al., 2000). Esta classificação é

basicamente descritiva, não refletindo o comportamento biológico da neoplasia

(Carneiro, 1997).

Outra classificação morfológica simples foi proposta por Ming, baseada no

padrão de crescimento da neoplasia (Ming, 1977). Ela divide o CG em dois tipos, de

acordo com a capacidade de infiltrar a parede gástrica. O tipo expansivo

corresponde a dois terços dos tumores, exibindo massas circunscritas de células

neoplásicas coesas, com bordas claramente demarcadas. Os tumores do tipo

infiltrativo são caracterizados pela infiltração difusa da parede por células

neoplásicas individuais, estando presente no terço restante das neoplasias

gástricas. A diferenciação entre os dois padrões de crescimento da neoplasia tem

relevância prognóstica, apresentando relação estatisticamente significativa com o

estadiamento TNM, segundo estudos prospectivos (Luebke et al., 2005).

2.1.2 Avaliação macroscópica do carcinoma gástrico

A avaliação macroscópica do CG consiste em determinar as dimensões do

tumor e outras características, que podem ter implicação no prognóstico dos

pacientes, destacando-se: a localização, o tipo de apresentação macroscópica e a

distância entre o tumor e as margens cirúrgicas (Lemes et al., 2003; Robert et al.,

2008).

A localização mais freqüente do CG é na pequena curvatura antral do terço

distal do estômago (Aaltonen, Hamilton et al., 2000). Entretanto, os tumores

localizados no terço proximal do estômago, particularmente as neoplasias da cárdia,

têm apresentado crescente incidência e prognóstico pior que os do terço distal ou

médio (Kim et al., 1998).

A classificação macroscópica do CG precoce é fortemente relacionada aos

critérios utilizados para a classificação endoscópica da Sociedade Japonesa de

Endoscopia Digestiva (SJED) (Japanese Gastric Cancer Association, 1998). Ela

apresenta três categorias distintas, que podem estar combinadas em alguns tumores

(FIG.1). O tipo I, chamado protuso, identifica tumores que formam proeminência na

mucosa gástrica, com morfologia polipóide. O tipo II, ou superficial, pode ser

subdividido em três variantes: superficialmente elevado (IIa), plano (IIb) ou deprimido

(IIc). Por fim, o tipo III é o ulcerado, similar à úlcera gástrica de origem péptica,

sendo o tipo macroscópico mais freqüente dentre os CG precoces (Moreaux,

Bougaran, 1993).

O CG avançado pode ser classificado em quatro padrões de apresentação

macroscópica (Borrmann, 1926). O tipo I, chamado polipóide ou vegetante, é

geralmente associado aos carcinomas bem diferenciados. O tipo II, denominado

ulcerado expansivo, mostra bordas elevadas com ulceração rasa central. O tipo III é

o úlcero-infiltrativo, enquanto o tipo IV mostra padrão infiltrativo difuso na parede

gástrica, denominado linite plástica (FIG.2).

FIGURA 1: Classificação macroscópica do carcinoma gástrico precoce

segundo a Sociedade Japonesa de Endoscopia Digestiva.

Tipos: protuso (polipóide), superficial (elevado, plano e

deprimido) e ulcerado (escavado).

FONTE: Japanese Classification of Gastric Carcinoma (1998).

FIGURA 2: Classificação macroscópica do carcinoma gástrico avançado

segundo Borrmann. Tipos: polipóide (vegetante), ulcerado

expansivo (fungado), úlcero-infiltrativo (ulcerado) e infiltrativo

(difuso).

FONTE: Borrmann Classification of Advanced Gastric Cancer (1926).

2.1.3 Fatores epidemiológicos relacionados ao carcinoma gástrico

No mundo, as altas taxas de incidência do CG configuram-no como o quarto

tipo mais comum de neoplasia e, em termos de mortalidade, como a segunda causa

de óbitos por câncer (Hohenberger, Gretschel, 2003; Brenner et al., 2009). Em geral,

sua magnitude é de duas a três vezes maior nos países em desenvolvimento, sendo

maior no sexo masculino que no feminino (Aaltonen, Hamilton et al., 2000).

A distribuição geográfica mundial dessa doença exibe variações extremas,

com áreas de alto risco que incluem os países orientais da Ásia, como Japão, China

e Coréia; Europa Oriental; além de países da América Central e do Sul. A população

dos países do sudeste asiático, da África, América do Norte, Austrália e Nova

Zelândia é considerada de baixo risco para desenvolvimento do CG (Forman,

Burley, 2006). Nos últimos 50 anos, a incidência do CG vem sofrendo queda gradual

e contínua, devido particularmente a melhorias na dieta, como o aumento da

disponibilidade de frutas e vegetais e a diminuição no consumo de sal, aliada a sua

não utilização para a preservação dos alimentos (Aaltonen, Hamilton et al., 2000;

Correa, Piazuelo et al., 2006).

No Brasil, estudos epidemiológicos revelam que a distribuição estimada dos

casos novos de CG mostra-se também heterogênea entre os diferentes estados e

regiões do país (INCA, 2009). O câncer de estômago em homens é o segundo mais

freqüente nas regiões Norte e Nordeste, o terceiro na região Centro-Oeste e, nas

regiões Sul e Sudeste, o quarto (FIG.3). Em relação às mulheres, é o terceiro mais

freqüente na Região Norte, o quarto na Região Nordeste e, nas demais regiões, Sul,

Sudeste e Centro-Oeste, é o quinto mais incidente (FIG.4).

FIGURA 3: Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100

mil homens, estimadas para o ano de 2010, segundo a

Unidade da Federação (neoplasia maligna do estômago).

FONTE: Instituto Nacional de Câncer - INCA/MS, Brasil.

FIGURA 4: Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100

mil mulheres, estimadas para o ano de 2010, segundo a

Unidade da Federação (neoplasia maligna do estômago).

FONTE: Instituto Nacional de Câncer - INCA/MS, Brasil.

O número de casos novos de câncer de estômago estimado para o Brasil no

ano de 2010 é de 13.820 para a população masculina e 7.680 para a feminina. Estes

valores correspondem a um risco estimado de 14 casos novos para cada 100 mil

homens e 8 para cada 100 mil mulheres (INCA, 2009).

A classificação histológica de Laurén guarda relação com a faixa etária de

incidência e com diversos aspectos epidemiológicos do CG, inclusive com a

distribuição geográfica na população mundial (Carneiro, 1997; Hohenberger,

Gretschel, 2003). O tipo intestinal predomina nas populações de alto risco para CG e

nos países em desenvolvimento. Nos países desenvolvidos, a redução da

prevalência desse tipo específico de CG foi a responsável pela queda das taxas de

mortalidade por essa neoplasia observada nas últimas décadas (Forman, Burley,

2006). Pacientes do sexo masculino são mais acometidos, numa média de idade em

torno dos 60 anos. O tipo difuso é relativamente mais freqüente nas populações de

baixo risco, acomete igualmente ambos os sexos, com idade média em torno dos 50

anos, apresentando pior prognóstico. Não houve modificação significativa em sua

prevalência nas últimas décadas (Laurén, Nevalainen, 1993).

A razão mortalidade/incidência do CG é consideravelmente alta em todas as

partes do mundo, sendo a sobrevida relativa em cinco anos baixa, cerca de 20% na

maioria dos países em desenvolvimento (Kamangar et al., 2006). Apesar dos valores

ainda elevados de mortalidade, há tendência de melhoria das taxas de sobrevida

com os avanços da endoscopia digestiva e, conseqüentemente, na detecção de

tumores cada vez mais precoces (Forman, Burley, 2006).

2.1.4 Fatores etiológicos relacionados ao carcinoma gástrico

A origem do CG é multifatorial, atribuída predominantemente a fatores

ambientais, desenvolvendo-se a partir de interações complexas entre fatores

genéticos e modulação da reposta imunológica do hospedeiro, comumente após

longo período de gastrite atrófica (Hohenberger, Gretschel, 2003). Estudos

epidemiológicos em diferentes populações demonstram relação expressiva com a

dieta, especialmente em relação aos carcinomas de tipo intestinal. Entretanto a

associação mais importante se dá com a infecção por Helicobacter pylori, adquirida

comumente na infância (Correa, Piazuelo et al., 2006).

A forte associação entre a dieta rica em sal e o risco aumentado para CG e

suas condições e lesões precursoras está bem estabelecida desde as décadas de

1970 e 1980 (Correa, Haenszel et al., 1975; Joossens, Geboers, 1981). Os efeitos

da dieta excessivamente rica em sal estão associados a alterações inflamatórias e

reparativas, com conseqüente indução de atrofia na mucosa gástrica (Correa, 1992).

O sal em excesso pode também contribuir para aumentar a capacidade mutagênica

de alimentos ricos em nitrosaminas (Correa, Haenszel et al., 1975). Nitrosaminas

são compostos com potencial cancerígeno, provenientes da transformação de

nitratos e nitritos, presentes em alguns alimentos e na saliva, dentro do ambiente

gástrico (Joossens, Hill et al., 1996). Fatores de risco comuns a outros tumores,

como consumo de álcool, tabaco e exposição ocupacional a nitrosaminas e agentes

inorgânicos tem sido estudados em diversas populações, porém com resultados

inconsistentes em relação ao CG (Aaltonen, Hamilton et al., 2000).

O H. pylori é uma bactéria espiralada Gram-negativa com capacidade de

colonizar e de se estabelecer permanentemente no adverso meio-ambiente do

estômago humano, causando infecção crônica em grande parte da população

mundial (Marshall, Warren, 1984; Taylor, Blaser, 1991). Atualmente está bem

estabelecido que a infecção crônica da mucosa gástrica por H. pylori é o principal

fator causal de doenças como a gastrite crônica e a úlcera péptica, além de estar

implicada na patogênese da atrofia e da metaplasia intestinal, condições

consideradas de risco para o desenvolvimento do CG (Blaser, Chyou et al., 1995;

Correa, 1995; Warren, 2000).

Fatores de virulência próprios da bactéria, como a expressão do gene cagA

(cytotoxin-associated gene A), também interferem na relação parasito-hospedeiro,

estimulando a ativação do processo inflamatório no sentido da carcinogênese

(Queiroz et al., 1998; Cabral et al., 2007).

2.1.5 Aspectos gerais relacionados à carcinogênese gástrica

Dentre os diversos modelos propostos para a carcinogênese gástrica,

destaca-se o de Pelayo Correa (Correa, 1992). Neste modelo, o CG do tipo intestinal

surgiria a partir de uma sucessão de eventos que se iniciaria pela infecção crônica

da mucosa gástrica pelo Helicobacter pylori (Correa, Houghton, 2007). Este

processo engloba os seguintes eventos seqüenciais para o seu desenvolvimento:

gastrite crônica, atrofia multifocal, metaplasia intestinal e displasia de baixo e alto

graus (neoplasia intra-epitelial) (Correa, Piazuelo et al., 2006). Em contrapartida, o

CG tipo difuso de Laurén não mostra relação seqüencial tão significativa com os

fatores ambientais, estando predominantemente associado a fatores genéticos

(Ming, 1998; Tahara, 2004).

Nesta seqüência, o H. pylori atuaria em diversas etapas do processo da

carcinogênese gástrica, gerando estímulo contínuo à inflamação, à proliferação

celular e às alterações gênicas (Correa, Piazuelo, 2008). Entretanto, o mecanismo

de lesão inicial ao DNA das células da mucosa gástrica permanece ainda

desconhecido. A hipótese mais difundida atualmente na literatura atribui o início do

processo de carcinogênese ao estresse oxidativo induzido no epitélio gástrico pela

infecção crônica (Wilson, Crabtree, 2007). Essas alterações são iniciadas e

sustentadas pela infecção persistente por H. pylori. A erradicação da bactéria,

quando realizada precocemente, pode ser suficiente para interferir na cascata da

carcinogênese e prevenir o surgimento da neoplasia (Correa, Houghton, 2007).

O H. pylori apresenta entre suas amostras grande diversidade genética que

amplia suas possibilidades de adaptação ao hospedeiro (Jiang, Hiratsuka et al.,

1996). Na grande maioria da população infectada, prevalece o estado de equilíbrio

entre os fatores de agressão da bactéria e de defesa do hospedeiro (Blaser, Chyou

et al., 1995; Warren, 2000). As amostras de H. pylori que expressam o gene cagA

(cytotoxin-associated gene A) produzem a proteína cagA, altamente antigênica, que

estimula resposta inflamatória acentuada da mucosa. Essa proteína induz maior

produção e liberação de radicais livres de oxigênio e de enzimas pró-inflamatórias

como cyclooxigenase-2 (COX-2) e óxido-nítrico sintetase (iNOS), do fator de necrose

tumoral-alfa (TNFα) e de interleucinas (IL) que atuam como potentes fatores

quimiotáticos e ativadores de macrófagos e neutrófilos (Wilson, Crabtree, 2007).

Além do mais, as amostras cagA-positivas são as mais comumente observadas no

CG (Blaser, Chyou et al., 1995; Queiroz et al., 1998).

Estudos sobre a infecção crônica da mucosa gástrica pelo H. pylori e sua

relação com a carcinogênese gástrica, conduzidos por nosso grupo de pesquisa,

confirmaram que a infecção por amostras cagA-positivas está associada às

condições pré-cancerosas, como atrofia e metaplasia intestinal (Cabral et al., 2006).

Estudos topográficos da mucosa gástrica realizados pelo mesmo grupo

demonstraram que a proliferação epitelial e a expressão de proteínas pró-

apoptóticas são significativamente mais intensas na pequena curvatura antral, onde

surge a maioria dos CG (Cabral et al., 2006; Cabral et al., 2007).

2.2 Aspectos prognósticos clássicos do carcinoma gástrico

2.2.1 Tipo histológico e prognóstico do câncer gástrico

Idealmente, um sistema de classificação histológica deve ser capaz de

identificar aqueles tipos tumorais que apresentam características consideradas úteis

na prevenção, no diagnóstico precoce e na terapêutica dos pacientes.

A classificação da OMS tem pouco valor prognóstico no CG e,

conseqüentemente, relativa relevância clínica, uma vez que não leva em

consideração dados epidemiológicos ou características histogenéticas da neoplasia

(Carneiro, 1997). A maior vantagem da classificação da OMS é o reconhecimento

dos padrões morfológicos que também são demonstrados em tumores de outras

localizações, como intestino delgado e grosso, produzindo uma única abordagem

histológica dos carcinomas do trato gastrointestinal.

A classificação histológica de Laurén, descrita em 1965, é a mais utilizada

para o diagnóstico do CG, e perdura até os dias de hoje, não só pelo seu significado

prognóstico quanto pelo seu valor na definição da escolha da abordagem cirúrgica a

ser realizada (Laurén, 1965; Laurén, 1991; Robert, et al., 2008). Geralmente, o CG

do tipo difuso apresenta prognóstico pior do que o tipo intestinal, requerendo

ressecções mais extensas e até gastrectomia total, uma vez que acarreta maior risco

de acometimento das margens cirúrgicas (Rodrigues et al., 2000). Portanto, as

margens de segurança ideais devem ser de 5,0 cm para os CG de tipo intestinal e

de 10,0 cm para o tipo difuso (Jentschura, Winkler et al., 1997). Além do mais, o CG

do tipo difuso é considerado o principal fator de risco para invasão duodenal nos

tumores localizados no terço distal do estômago (Nogueira et al., 2000).

O significado da classificação de Ming relaciona-se ao potencial invasivo do

CG (Ming, 1977). As células neoplásicas com crescimento do tipo expansivo

apresentam capacidade de penetração limitada na parede gástrica, o que se reflete

em prognóstico mais favorável e em melhores taxas de sobrevida do que as que se

verificam nas neoplasias com crescimento do tipo infiltrativo (Luebke et al., 2005).

De maneira geral, é possível traçar um paralelo entre a classificação de

Laurén e outras classificações morfológicas. A maioria dos tumores com padrão

expansivo apresenta características do tipo intestinal de Laurén, enquanto a maioria

dos infiltrativos corresponde ao tipo difuso (Cimerman et al, 1994.).

2.2.2 Importância do estadiamento anatomopatológico no carcinoma gástrico

A classificação TNM do American Joint Committee on Cancer/Union

Internationale Contre le Cancer (AJCC/UICC) é a mais utilizada para o estadiamento

dos pacientes com neoplasias de origem epitelial (Sobin, Wittekind et al., 2002;

Greene, American Joint Committee on Cancer. et al., 2002) (ANEXO A). Baseia-se

na avaliação clínica e patológica da profundidade da invasão tumoral (T), da

presença de metástases linfonodais (N) ou de metástases à distância (M) e é

considerada o fator prognóstico mais importante para o estadiamento do CG

(Aaltonen, Hamilton et al., 2000). O estudo anatomopatológico convencional dos

espécimes cirúrgicos de CG consiste basicamente na determinação dos parâmetros

T (pT) e N (pN) (Robert et al., 2008).

A profundidade de invasão tumoral é um dos principais parâmetros para a

avaliação prognóstica do CG e é ainda mais importante para o planejamento das

estratégias terapêuticas a serem adotadas (Hohenberger, Gretschel, 2003). A

Associação Japonesa para o Câncer Gástrico (Japanese Gastric Cancer Association

- JGCA) foi a primeira a definir como CG precoce (nível T1) a neoplasia restrita à

mucosa e à submucosa, independentemente da presença de acometimento

linfonodal (Japanese Gastric Cancer Association, 1998). A neoplasia que já invade a

camada muscular própria da parede gástrica (nível T2), a serosa (nível T3), ou

estruturas adjacentes ao estômago (nível T4) é considerada avançada (Sobin,

Wittekind et al., 2002). Essa categorização permite a diferenciação mais precisa dos

casos que necessitam de tratamento cirúrgico radical, com gastrectomia e

linfadenectomia (CG avançado), daqueles que podem ser submetidos apenas ao

tratamento endoscópico com mucosectomia ou dissecção da submucosa (CG

precoce) (Nakajima, 2002; Shimada, 2004).

A sobrevida em cinco anos de pacientes com CG precoce pode ultrapassar a

taxa de 90%, quando o tratamento for adequado (Hohenberger, Gretschel, 2003).

Em contrapartida, em pacientes com neoplasias mais avançadas, estas taxas são

menores que 20% (Furukawa et al., 2002; Kodera et al., 2008).

O acometimento dos linfonodos regionais perigástricos é o fator prognóstico

mais importante do CG (Kim et al., 1998; Siewert et al., 1998; Yokota et al., 2004).

Embora métodos de imagem tenham sido testados para avaliação do acometimento

linfonodal no CG, o exame histopatológico dos linfonodos a partir da peça de

gastrectomia com linfadenectomia ainda é considerado o método mais confiável

para o estadiamento adequado (Mullaney et al., 2002; Hohenberger, Gretschel,

2003; Coburn, 2009).

A incidência geral de metástases linfonodais no CG precoce está entre 10% a

15%. Ela varia de 2,6% a 4,8% nas neoplasias restritas à mucosa e de 16,5% a

23,6% nas neoplasias que alcançam a submucosa (An, Baik et al., 2007). Nos CG

avançados, a presença de metástases linfonodais ocorre em até 44% dos tumores

no estágio T2 e até 64% no estágio T3 (Hohenberger, Gretschel, 2003).

Em relação ao CG precoce, quando são avaliados fatores morfológicos como

tamanho do tumor, grau histológico de diferenciação, ulceração e tipo de

crescimento, é possível selecionar aqueles que possuem baixo risco para

metástases linfonodais (Folli, Morgagni et al., 2001; An, Baik et al., 2007).

Estudos com grande número de casos de CG precoce no Japão, submetidos

a gastrectomia com linfadenectomia, revelaram que nenhum dos 1230 tumores

intramucosos e bem diferenciados com menos de 3,0 cm apresentava metástases

linfonodais ao exame anatomopatológico (Gotoda et al., 2000). Nestes casos

selecionados, há consenso na literatura de que a gastrectomia com linfadenectomia

seria um tratamento desnecessariamente agressivo, estando indicada a ressecção

endoscópica. Entretanto, essa abordagem deve ser individual e altamente

selecionada em cada caso, com estadiamento local bem feito, uma vez que o risco

de se detectar metástases linfonodais nestas situações é pequeno, porém não

desprezível (2,5%) (Hohenberger, Gretschel, 2003).

Em relação ao pN, a edição mais atual do manual de estadiamento do

AJCC/UICC preconiza um mínimo de 15 linfonodos dissecados, que devem ser

analisados ao exame anatomopatológico para se obter o valor preditivo adequado

do status linfonodal (Greene, American Joint Committee on Cancer. et al., 2002). Se

um número insuficiente de linfonodos for obtido, existe a chance de o paciente ser

considerado inapropriadamente livre de metástases linfonodais (Uña, 2009). Este

paciente, portanto, seria classificado em um estágio mais baixo que o real (pN0) e

submetido à terapêutica inadequada, o que acarretaria em tempo de sobrevida

menor do que ocorreria caso fosse corretamente estadiado (Mullaney et al., 2002).

Apesar dos esforços conjuntos para prevenção, diagnóstico e tratamento do

CG, a maioria dos pacientes ainda é diagnosticada em estágios avançados,

geralmente com metástases linfonodais (De Gara, Hanson et al., 2003). Portanto, a

taxa de mortalidade do CG é consideravelmente alta em todas as partes do mundo,

sendo a sobrevida relativa em cinco anos baixa, girando em torno de 20% a 30%

(Kamangar et al., 2006).

2.2.3 O papel do rastreamento endoscópico no diagnóstico do carcinoma gástrico

Em geral, a falta de manifestações clínicas específicas nas fases iniciais da

neoplasia retarda o diagnóstico do CG. Conseqüentemente, 80% a 90% dos

pacientes em países ocidentais se apresentam para tratamento médico já com

tumores avançados, com baixas chances de cura (Aaltonen, Hamilton et al., 2000).

A endoscopia digestiva alta é o método de rastreamento mais eficaz para a detecção

do CG e de suas lesões precursoras (De Vries et al., 2007).

Em países orientais onde o CG é comum, como Japão e Coréia,

aproximadamente 80% das neoplasias detectadas em programas de rastreamento

endoscópico são precoces (Aaltonen, Hamilton et al., 2000). Enquanto no Japão a

proporção de casos de CG precoce corresponde a 40% do total diagnosticado, na

Europa equivale apenas a 15% (Hohenberger, Gretschel, 2003).

Na tentativa de minimizar a quantidade de procedimentos invasivos e

melhorar a qualidade de vida do paciente, o tratamento endoscópico tem sido cada

vez mais aplicado, especialmente nos países com altas taxas de diagnóstico

precoce (Ono, 2006; Yasuda, 2006). Entretanto, esses procedimentos não

possibilitam a avaliação anatomopatológica dos linfonodos perigástricos,

presumindo-se que sejam negativos nestes casos, o que, em última análise, resulta

em um estadiamento incompleto da neoplasia pelo sistema TNM.

Os critérios para a indicação do tratamento endoscópico do CG são bem

definidos e pouco flexíveis (Hyung, Cheong et al., 2004; An, Baik et al., 2007;

Hanaoka et al., 2009). As indicações propostas para a ressecção endoscópica são:

adenocarcinoma diferenciado, lesão menor que 2,0 cm, sem ulceração no tumor e

sem envolvimento de vasos linfáticos e sanguíneos, já que metástases linfonodais

são raras em neoplasias com essas características (Ono, 2006; An, Baik et al.,

2007). Para que se possa prescindir da linfadenectomia nesses casos, é necessário

excluir com absoluta segurança a presença de IVL ou IVS no tumor primário ao

exame histopatológico (Hyung, Cheong et al., 2004).

2.3 Neoformação vascular linfática e sanguínea na carcinogênese gástrica

2.3.1 Angiogênese e carcinogênese

A formação de novos vasos sanguíneos, ou angiogênese, ocorre em diversos

processos fisiológicos e patológicos, sendo, no âmbito desses últimos, de

fundamental importância na progressão tumoral (Tonini, Rossi et al., 2003; Folkman,

2006). As células neoplásicas invadem os vasos neoformados e são transportadas a

outros sítios no organismo, podendo produzir metástases (Weidner, 2002). Portanto,

quanto maior a quantidade de vasos neoformados em determinada área, definida

como densidade microvascular sanguínea (DMV), maiores seriam as possibilidades

de invasão vascular e metastatização em alguns tipos de neoplasia (Weidner, 2000).

O desenvolvimento de novo vaso sangüíneo é um fenômeno complexo e resultado

de seqüência de eventos envolvendo fatores de crescimento produzidos por células

neoplásicas e intersticiais (Bussolino, Mantovani et al., 1997). Entretanto, os

mecanismos que controlam o início da angiogênese ainda não estão totalmente

elucidados (Gupta, Qin, 2003).

O início da angiogênese tumoral, denominado de “angiogenic switch”,

representa o evento-chave no processo de carcinogênese, indicando o momento em

que o tumor inicia o recrutamento de seu suprimento sanguíneo próprio por meio do

desequilíbrio entre os fatores pró-angiogênicos e anti-angiogênicos (Bergers,

Benjamin, 2003; Ribatti, Nico et al., 2007). Diversas substâncias endógenas ou

produzidas pela própria neoplasia estão implicadas no controle da angiogênese,

direta ou indiretamente, estimulando ou inibindo o processo de neoformação

vascular (Nyberg, Xie et al., 2005; Neufeld, Kessler, 2006).

Estudos de caráter experimental revelam que a ativação do fenótipo

angiogênico ocorre nas fases mais precoces do desenvolvimento tumoral (Naumov,

Akslen et al., 2006; Naumov, Bender et al., 2006). A angiogênese precede e é

necessária para a progressão tumoral e o desenvolvimento de metástases (Weidner,

2004).

2.3.2 Linfangiogênese no carcinoma gástrico

A linfangiogênese é a formação de novos vasos linfáticos, sendo considerada

fator de risco para metástases linfonodais, uma vez que aumenta as chances de IVL

no CG (Kitadai et al., 2005).

Apesar de haver numerosos estudos sobre a angiogênese, são poucos

aqueles que avaliam a linfangiogênese como fator prognóstico nas neoplasias. Isso

se deve ao fato de que, até recentemente, não havia marcadores IHQ confiáveis ou

específicos para o endotélio linfático. A partir da maior disponibilidade destes

marcadores, o papel da linfangiogênese no desenvolvimento e na disseminação

tumoral tem sido melhor elucidado (Kato et al., 2006).

Paralelamente à DMV, a densidade vascular linfática (DVL) é fator

prognóstico no CG, correlacionando-se com a presença de metástases linfonodais e

com menor sobrevida dos pacientes (Nakamura et al., 2006). A DVL avaliada em

áreas peritumorais, mas não intratumorais, é fator de risco para metástases

linfonodais nos CG avançados (Gao et al., 2008).

Os vasos linfáticos geralmente permeiam o estroma tumoral para formar uma

rede de drenagem, sugerindo que os pequenos vasos de paredes delgadas

oferecem menor resistência e maior área de contato à penetração das células

neoplásicas no sistema linfático do que os vasos sanguíneos (Ji, 2006).

Os vasos linfáticos da mucosa gástrica normal estão presentes mais

profundamente na lâmina própria. A DVL encontrada na submucosa é bastante

similar à da mucosa e à da muscular própria (Sako et al., 2006). Em contraste, a

muscular da mucosa exibe DVL aproximadamente dez vezes maior que as demais

camadas da parede gástrica normal, como demonstrado na Figura 5 (Sako et al.,

2006).

FIGURA 5: Densidade Vascular Linfática nas diferentes camadas da parede

gástrica normal. Média +DP de 30 pontos (por milímetro

quadrado). M: mucosa; MM: muscular da mucosa; SM:

submucosa; MP: muscular própria; SS: subserosa.

FONTE: Sako A. et al. (2006).

Em conseqüência da distribuição dos linfáticos na parede gástrica, a presença

de IVL é mais freqüentemente observada na camada muscular da mucosa nos CG

precoces (Sako et al., 2006). Outros estudos encontraram a maior concentração de

IVL nas zonas periféricas do tumor ou peritumorais, porém também em regiões

adjacentes à muscular da mucosa, mesmo em CG avançados, que exibem invasão

mais profunda da parede gástrica (Yonemura et al., 2006; Gao et al., 2008). Essas

observações são especialmente importantes na avaliação do CG precoce, que já

ultrapassa a camada muscular da mucosa e atinge a submucosa, submetido à

ressecção endoscópica.

Diversos fatores morfológicos e funcionais contribuem para o comportamento

biológico e o potencial metastático da neoplasia (FIG. 6). A disseminação tumoral

pelo sistema linfático parece depender da rede preexistente e também da

linfangiogênese mediada pelos fatores de crescimento derivados do endotélio

vascular (VEGF), dentro do tumor e na sua periferia (Ji, Kato, 2003; Ji, 2006;

Coşkun, Akyürek et al., 2009).

FIGURA 6: Diagrama esquemático ilustrando os possíveis fatores preditivos

de metástases linfonodais, no qual se destacam os linfáticos

intra e peritumorais e a linfangiogênese. ITLs: intratumoral

lymphatics; PTLs: peritumoral lymphatics.

FONTE: Rui-Cheng Ji (2006).

2.4 Novos parâmetros prognósticos na avaliação do carcinoma gástrico:

importância prognóstica da invasão vascular linfática e sanguínea

As pesquisas atuais sobre doenças neoplásicas se concentram em revelar

novos indicadores capazes de predizer o comportamento biológico dos tumores e o

prognóstico dos pacientes, ainda nas fases iniciais da doença.

Numerosos estudos relatam fatores de risco para metástases linfonodais no

CG precoce e avançado, incluindo tamanho e profundidade do tumor, padrão

macroscópico, tipo histológico, presença de ulceração, IVL e IVS (Maehara, Orita et

al., 1992; Folli, Morgagni et al., 2001; An, Baik et al., 2007; Kwee, Kwee, 2008;

Morita, Ishikawa et al., 2009).

A IVL é considerada fator preditivo da ocorrência de metástases linfonodais

em diversas neoplasias malignas, como o carcinoma mamário (Tezuka, Onoda et al.,

2007), carcinomas de células renais (Ishikawa, Aida et al., 2007), adenocarcinoma

colorretal (Ishii, Ota et al., 2009) e prostático (Roma, Magi-Galluzzi et al., 2006). A

IVL ou IVS pelas células tumorais é pré-requisito para a disseminação neoplásica via

redes linfática e sanguínea (Pantel, Brakenhoff, 2004). Estudos recentes mostram

que a avaliação da invasão vascular tumoral é essencial para o estadiamento do CG

e deve ser incluída no algoritmo terapêutico para seleção de tratamentos adjuvantes

mais seletivos (Li, Lu et al., 2008; Kim, Park et al., 2009).

A presença de IVL detectada no tumor primário se correlaciona com a

presença de metástases linfonodais e também é considerada fator prognóstico

independente nos pacientes com CG (Talamonti et al., 2003; Nakamura et al., 2006;

Sako et al., 2006). A presença de IVL também indica evolução desfavorável mesmo

nos pacientes livres de metástases linfonodais (pN0) em neoplasias como o câncer

de mama e o CG (Arnaout-Alkarain, Kahn et al., 2007; Lee, Wu et al., 2007;

Ichikawa, Kubota et al., 2009).

A avaliação de IVL e IVS se faz especialmente importante nos casos de CG

nos quais não há como determinar a presença de metástases linfonodais (Nasu,

Nishina et al., 2006). Dados de estudos retrospectivos indicam que, no CG precoce,

a incidência de metástases linfonodais é notadamente mais elevada em casos

positivos para IVL do que nos casos negativos (Song, Park et al., 2004; Son, Song et

al., 2005; Ichikawa, Kubota et al., 2009).

A avaliação de IVL ou IVS no tumor primário ao exame histopatológico é um

dos parâmetros morfológicos mais significativos para o planejamento de abordagens

terapêuticas complementares, especialmente nos casos específicos de CG precoce

tratados por ressecção endoscópica (Gotoda et al., 2001; Li, Lu et al., 2008).

2.5 Métodos de avaliação de invasão vascular

A invasão vascular pelas células neoplásicas pode ser avaliada nas regiões

peritumorais e intratumorais do CG, utilizando-se coloração rotineira pela HE e

também a IHQ com marcadores que possuem diferente especificidade para os tipos

de endotélio sanguíneo e linfático. Os dois métodos revelam aplicação variável nas

pesquisas científicas, com resultados heterogêneos em relação à IVL e IVS no CG.

2.5.1 Problemas na detecção de invasão vascular linfática e sanguínea pela

coloração de rotina por HE

A pesquisa de IVS e IVL tumoral na prática da patologia cirúrgica tem sido

feita habitualmente pelo exame microscópico de cortes histológicos da lesão tumoral

corados pela coloração de rotina HE. Diversos estudos analisam a presença de IVS

e IVL como fator prognóstico no CG utilizando apenas esta coloração (Gotoda et al.,

2001; Talamonti et al., 2003; An, Baik et al., 2007; Li, Lu et al., 2008; Liu, Zhang et

al., 2008; Shen, Huang et al., 2009). Entretanto, a acuidade das informações obtidas

destas análises é bastante questionável, devido às dificuldades inerentes à sua

interpretação.

Geralmente, a IVL é identificada com base na histologia convencional com

coloração pela HE, e o seu diagnóstico feito pela presença de êmbolo tumoral dentro

de canais vasculares revestidos por camada única de células endoteliais, sem

conteúdo de hemácias (Yonemura et al., 2006). Entretanto, a obliteração completa

do lúmen vascular por células neoplásicas pode não ser visível ao HE e não ser

diagnosticada como IVL. Por outro lado, artefatos de retração devido à fixação do

tecido, que circundam agregados de células tumorais, podem ser inadvertidamente

considerados como IVL verdadeira.

O diagnóstico de invasão vascular feito ao HE revela falta de especificidade

em alguns aspectos, como na incapacidade de distinguir vasos linfáticos de vasos

sanguíneos corretamente (Sako et al., 2006; Van Den Eynden, Van Der Auwera et

al., 2006).

Estudos que abordam a variabilidade interobservador na avaliação de IVL e

IVS no câncer colorretal revelam baixa concordância entre os patologistas no

diagnóstico de IVL e IVS quando se utiliza o método de coloração de rotina pela HE

(Harris et al., 2008).

2.5.2 Perspectivas da aplicação do método imuno-histoquímico na detecção de

invasão vascular linfática e sanguínea

Recentemente, registra-se na literatura grande progresso na aplicação dos

estudos de IHQ na análise de IVS e IVL, com o surgimento de novos marcadores

específicos para o endotélio linfático (Ji, 2006).

A invasão linfática pelas células neoplásicas avaliada apenas pela coloração

de rotina pode gerar tanto resultados falso-positivos quanto falso-negativos (Sako et

al., 2006; Yonemura et al., 2006). Em contrapartida, a maioria dos estudos que

avaliou a presença IVL e IVS no CG até então não utilizou marcação específica para

os vasos linfáticos, mas apenas marcadores pan-endoteliais, como CD31, CD34 ou

Fator VIII (Del Casar et al., 2008). Desta forma, não seria possível distinguir se a

embolização tumoral se encontra em vasos sanguíneos ou vasos linfáticos (Van Den

Eynden, Van Der Auwera et al., 2006).

O anticorpo monoclonal D2-40 foi reconhecido inicialmente como marcador de

um gene oncofetal presente nas células germinativas fetais (Marks, Sutherland et al.,

1999). Esse marcador é capaz de detectar especificamente o endotélio dos vasos

linfáticos (Kahn, Marks, 2002). Ou seja, a detecção pela IHQ com D2-40 é positiva

apenas nos vasos linfáticos e negativa nos vasos sanguíneos (Arigami et al., 2005).

Essa especificidade permite utilizá-lo em estudos de invasão vascular em diversas

neoplasias e distinguir IVL de IVS, com grande segurança (Van Den Eynden, Van

Der Auwera et al., 2006; Mohammed, Martin et al., 2007).

Entre os marcadores pan-endoteliais, o CD34 é amplamente utilizado em

diferentes estudos de angiogênese, sendo considerado atualmente o melhor

marcador vascular, quando comparado ao CD31 e ao Fator VIII (Elpek et al., 2000;

Tenderenda et al., 2001). No entanto, estudos para avaliar invasão vascular tumoral

utilizando apenas o CD34, em detrimento a outros marcadores, têm produzido

resultados inconsistentes e incompletos. A principal restrição à sua utilização como

marcador isolado é o fato dele não ser capaz de distinguir vasos sanguíneos de

linfáticos (Van Den Eynden, Van Der Auwera et al., 2006).

Quanto ao método de avaliação da invasão de vasos linfáticos e/ou

sanguíneos, a maioria dos autores relata maior detecção de êmbolos neoplásicos

quando o método IHQ foi utilizado (Arigami et al., 2005; Sako et al., 2006; Hanaoka,

Tanabe et al., 2009; Kim, Park et al., 2009; Morita, Ishikawa et al., 2009).

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Seleção dos casos

O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (COEP) da

Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) – Protocolo № 574/07 (APÊNDICE

A). Trata-se de estudo transversal de uma série de casos de CG primário, com

revisão histopatológica e estudo IHQ.

Foram selecionados 95 casos consecutivos de CG primário de pacientes

diagnosticados e tratados cirurgicamente no Hospital das Clínicas (HC) da UFMG –

Belo Horizonte, no período de 2000 a 2006. Todos os pacientes foram submetidos a

gastrectomia total, subtotal ou parcial, e a linfadenectomia.

Os casos selecionados foram obtidos a partir da análise retrospectiva de um

total de 222 casos de CG do arquivo do Laboratório de Pesquisa em Patologia do

Trato Gastrointestinal (LP-TGI) do Serviço de Anatomia Patológica (APM) do HC-

UFMG. A seleção dos casos foi realizada inicialmente pela análise dos dados do

protocolo anatomopatológico do LP-TGI, que estão informatizados (ANEXO B). O

protocolo anatomopatológico foi criado com o objetivo de padronizar o estudo macro

e microscópico de todas as peças de gastrectomia realizadas em pacientes com

câncer gástrico (Lemes et al., 2003). O protocolo compreende a avaliação macro e

microscópica da neoplasia, incluindo: as medidas do tumor, o tipo macroscópico de

Borrmann (Borrmann, 1926), a localização, o tipo histológico segundo a classificação

de Laurén (Laurén, 1965) e da OMS (Aaltonen, Hamilton et al., 2000), o padrão de

crescimento descrito por Ming (Ming, 1977), a presença de IVL e IVS e estadiamento

anatomopatológico pelo TNM (Greene, American Joint Committee on Cancer. et al.,

2002).

Todas as amostras retiradas das peças de gastrectomia para o estudo

histopatológico, de acordo com o mapa de clivagem do protocolo do APM (FIG. 7),

haviam sido fixadas em formol P.A. a 10% e processadas rotineiramente no APM,

estando incluídas em blocos de parafina.

FIGURA 7: Mapa de Clivagem para o processamento das peças cirúrgicas

de carcinoma gástrico: amostragem para exame histológico.

FONTE: Lemes (2003).

Os critérios para a inclusão no estudo foram: informações clínicas suficientes

e amostras representativas do tumor disponíveis em blocos de parafina nos arquivos

do APM do HC-UFMG. Os casos analisados que não dispunham de informações no

protocolo anatomopatológico, de lâminas coradas em HE para a revisão

histopatológica ou dos blocos de parafina correspondentes foram excluídos do

estudo.

Alguns dados clínico-patológicos como gênero, idade dos pacientes ao

diagnóstico, topografia do tumor, classificação macroscópica e presença de

metástases à distância foram obtidos a partir do banco de dados e da revisão do

protocolo anatomopatológico.

3.2 Estudo morfológico dos tumores primários

Foi realizada revisão histopatológica das lâminas coradas em HE, com

amostras significativas da neoplasia provenientes dos blocos de parafina

disponíveis. As características gerais do tumor primário analisadas foram: a

classificação histológica do tumor segundo Laurén (Laurén, 1965), o padrão de

crescimento (Ming, 1977), o grau histológico de diferenciação, a classificação do tipo

histológico do tumor segundo a OMS (Aaltonen, Hamilton et al., 2000) e a

profundidade do tumor, segundo o sistema TNM (Greene, American Joint Committee

on Cancer. et al., 2002).

A revisão de todas as lâminas foi realizada por duas médicas patologistas

com experiência em patologia cirúrgica e do trato gastrointestinal (MMDAC e LTG),

simultaneamente em microscópio de dupla observação.

3.3 Estudo imuno-histoquímico

A seleção dos blocos para estudo IHQ foi feita após a revisão histopatológica

das lâminas coradas pela HE dos casos em estudo. Com base nessa revisão, foram

escolhidas aquelas lâminas representativas das áreas tumorais mais preservadas e

com a maior concentração de vasos. A partir dos blocos de parafina

correspondentes foram realizados cortes histológicos seriados (seqüenciais) de 4

μm de espessura que foram colocados sobre lâminas silanizadas. Os cortes

histológicos foram então desparafinizados e desidratados por tratamento em xilol e

álcool.

Foram utilizados anticorpos monoclonais D2-40 (marcador específico do

endotélio linfático) e CD34 (marcador pan-endotelial), detalhados no Quadro 1.

QUADRO 1: Anticorpos utilizados no estudo imuno-histoquímico.

A técnica IHQ utilizada foi da estreptavidina-biotina peroxidase (Dako

LSAB®+ System), de acordo com o método preconizado pelo Manual de Imuno-

histoquímica da Sociedade Brasileira de Patologia (SBP) (Alves, Bacchi et al., 1999).

Todas as lâminas foram submetidas ao pré-tratamento em solução tampão a

98°C em panela a vapor por 20 minutos, para recuperação antigênica. Foram

realizados bloqueios da peroxidase endógena e da proteína avidina, por 15 minutos

cada. Os anticorpos primários D2-40 e CD34 foram incubados por 30 minutos em

temperatura ambiente.

A revelação das lâminas foi feita pela diaminobenzidina (DAB). A coloração

de fundo foi feita com hematoxilina de Harris. Controles sabidamente positivos foram

incluídos em todas as reações. Controles negativos consistiram na substituição dos

anti-soros primários por imunoglobulinas de coelho ou cabra da mesma classe dos

anticorpos primários.

ANTICORPO

CLONE

TIPO

DILUIÇÃO

REATIVAÇÃO

ANTIGÊNICA

FABRICANTE

D2-40

Monoclonal

1:30

Citrato (pH=6,0)

Dako, US

CD34

QBEND/10

Monoclonal

1:10

EDTA (pH=9,0)

Biogenex, US

3.4 Avaliação de invasão vascular

Em cada caso, foi analisado todo o corte histológico buscando ativamente a

identificação de IVL e IVS nas lâminas do tumor primário coradas em HE e pela IHQ.

Essa avaliação foi realizada nas áreas intratumorais e peritumorais utilizando o

aumento de 200x, com análise seqüencial das lâminas e simultânea por duas

médicas patologistas (MMDAC e LTG), em microscópio de dupla observação, sem

conhecimento prévio dos dados clínico-patológicos.

3.4.1 Avaliação de invasão vascular pela coloração de HE

A presença de IVS ou IVL foi considerada apenas quando um êmbolo de

células neoplásicas era visualizado claramente no interior de um lúmen vascular

revestido por endotélio evidente (Van Den Eynden, Van Der Auwera et al., 2006).

Não foram considerados como invasão de vasos os ninhos de células neoplásicas

com artefato de retração, sem endotélio evidente. A IVS foi definida pela presença

de êmbolos neoplásicos no lúmen vascular contendo hemácias, com ou sem

músculo liso ao redor do endotélio. Para a definição de IVL, os êmbolos neoplásicos

deveriam estar circundados por endotélio evidente, sem hemácias ou músculo liso.

3.4.2 Avaliação de invasão vascular pela coloração de IHQ

Em cada caso, foram examinadas as lâminas coradas pelos dois marcadores

imuno-histoquímicos (CD34 e D2-40), para avaliação da presença de IVL e IVS.

A IVS foi definida pela presença de êmbolos neoplásicos e hemácias no

lúmen vascular, com ou sem músculo liso ao redor do endotélio corado

positivamente para CD34. Para a definição de IVL, os êmbolos neoplásicos

deveriam ser circundados por endotélio corado positivamente pelo D2-40, sem

hemácias ou músculo liso.

3.5 Análise estatística

O banco de dados do estudo e todos os cálculos estatísticos foram realizados

utilizando o programa estatístico SPSS Statistics 17.0 (SPSS, Inc, Chicago, III). O

valor de p considerado estatisticamente significativo foi de <0,05. O teste de Mann-

Whitney U foi utilizado para correlacionar a variável quantitativa idade com as

variáveis categóricas (metástases linfonodais e invasão vascular).

O teste de McNemar foi usado para analisar a concordância entre os

diferentes métodos de avaliação de invasão vascular (HE e IHQ). O coeficiente de

Kappa de Cohen foi utilizado para verificar se essa concordância foi uma variação

puramente aleatória (Landis, Koch, 1977). O Quadro 2 revela os valores do

coeficiente de Kappa de acordo com a classificação de Landis & Koch.

Valor do coeficiente de Kappa

Classificação da concordância

segundo Landis & Koch

< 0,20

Pobre

0,21 a 0,40

Fraca

0,41 a 0,60

Moderada

0,61 a 0,80

Boa

> 0,80

Muito boa

QUADRO 2: Resultados dos coeficientes de concordância de Kappa de

acordo com a classificação de Landis & Koch.

FONTE: Landis & Koch (1977).

Para analisar a associação entre as variáveis categóricas (como a presença

de IVS ou IVL, presença de metástases, profundidade do tumor), o teste Qui-

quadrado foi aplicado.

4 RESULTADOS

4.1 Características gerais da amostra

4.1.1 Características clínico-patológicas dos casos

A maioria dos 95 pacientes foi submetida à gastrectomia subtotal (57

pacientes) e total (26 pacientes), enquanto apenas 12 pacientes à gastrectomia

parcial. A idade dos pacientes, por ocasião do diagnóstico da neoplasia, variou entre

36 e 93 anos, sendo a média de 65 anos e o desvio-padrão 14,6. A mediana foi igual

a 68 anos. Sessenta e dois pacientes (65,2%) eram do sexo masculino e 33 do sexo

feminino (34,7%).

Vinte e um casos representavam CG precoces (pT1) e 74 casos

correspondiam a CG avançados (pT2, pT3 e pT4). Quanto aos tumores avançados,

a maioria (51 casos) exibia invasão tumoral até a serosa (pT3).

A maioria dos tumores estava localizada na região do antro, no terço distal do

estômago (55 casos, 57,9%) e na pequena curvatura (54 casos, 56,8%). Em relação

às neoplasias avançadas, os tipos macroscópicos de Borrmann mais observados

foram II e III, com 30 e 27 casos, respectivamente. Os tipos IIb (5 casos) e III (5

casos) da SJED foram os mais freqüentes dentre os CG precoces.

O número de linfonodos dissecados em todos os casos variou de 2 a 63, com

uma média de 24 linfonodos por caso e um desvio-padrão de 12,1. Foram

detectadas metástases linfonodais em 61 pacientes (64,2%). Em seis casos, o

número de linfonodos obtidos foi menor que 15, portanto insuficiente para o

estadiamento linfonodal (pNx). Metástases à distância estavam presentes em 8

pacientes. Foi observada invasão por continuidade do duodeno em 23 pacientes, do

esôfago em 8 e de ambos em 3 pacientes. As características clínico-patológicas da

amostra estão representadas na Tabela 1.

TABELA 1: Características clínico-patológicas da amostra (N=95).

Dados Clínico-patológicos

N = 95 (%)

Gênero

masculino

62 (65,3)

feminino

33 (34,7)

Tipo de cirurgia

Gastrectomia parcial

12 (12,6)

Gastrectomia subtotal

57 (60,0)

Gastrectomia total

26 (27,4)

Topografia do tumor

Terço proximal

12 (12,6)

Terço médio

12 (12,6)

Terço distal

55 (57,9)

Terço proximal+médio

1 (1,1)

Terço médio+distal

6 (6,3)

Terço proximal+médio+distal

7 (7,4)

Junção esôfago-gástrica (JEG)

1 (1,1)

Curvatura acometida

pequena curvatura

54 (56,8)

grande curvatura

10 (10,5)

pequena e grande

14 (14,7)

17 (17,9)

Tipo macroscópico

SJED I

SJED IIa

2 (2,1)

SJED IIb

5 (5,3)

SJED IIc

2 (2,1)

SJED III

5 (5,3)

Borrmann I

7 (7,4)

Borrmann II

30 (31,6)

Borrmann III

27 (28,4)

Borrmann IV

12 (12,6)

5 (5,3)

(Continuação)

Dados Clínico-patológicos

N = 95 (%)

Profundidade do tumor (pT)

pT1a

9 (9,5)

pT1b

12 (12,6)

pT2a

12 (12,6)

pT2b

8 (8,4)

pT3

51 (53,7)

pT4

3 (3,2)

Metástases linfonodais (pN)

pN0

28 (29,5)

pN1

36 (37,9)

pN2

13 (13,7)

pN3

12 (12,6)

pNx

6 (6,3)

Metástases à distância (pM)

pMx

87 (91,6)

pM1

8 (8,4)

Invasão de órgãos

Negativa

57 (60,0)

Duodeno

23 (24,2)

Esôfago

8 (8,4)

Esôfago + duodeno

3 (3,2)

Outros

4 (4,2)

NA: não avaliado

SJED: Sociedade Japonesa de Endoscopia Digestiva

4.1.2 Revisão histopatológica

A revisão histopatológica dos 95 casos em estudo mostrou a seguinte

distribuição segundo a classificação de Laurén: 45 casos de CG do tipo intestinal

(47,4%), 25 do tipo difuso (26,3%) e 25 do tipo misto/NC (26,3%). O tipo histológico

da OMS mais freqüente foi o adenocarcinoma SOE (48 casos, 50,5%), seguido pelo

carcinoma de células em anel de sinete (22 casos, 23,2%), carcinoma indiferenciado

(9 casos, 9,5%) e pelos tipos tubular e papilífero (5 casos cada, 5,3%). A

classificação de Ming do padrão de crescimento foi equivalente entre os tipos

expansivo e infiltrativo, ambos contabilizando 40 casos (42,1%). As informações

obtidas na revisão histopatológica estão demonstradas na Tabela 2.

TABELA 2: Revisão histopatológica dos casos (N=95).

Dados Histopatológicos

N = 95 (%)

Tipo histológico de Laurén

intestinal

45 (47,4)

difuso

25 (26,3)

misto/NC

25 (26,3)

Tipo histológico da OMS

adenocarcinoma SOE

48 (50,5)

tubular

5 (5,3)

papilífero

5 (5,3)

mucinoso

4 (4,2)

células em anel de sinete

22 (23,2)

indiferenciado

9 (9,5)

outros

2 (2,2)

Padrão de crescimento (Ming)

expansivo

40 (42,1)

infiltrativo

40 (42,1)

15 (15,8)

NA: não avaliado

NC: não classificável

SOE: sem outra especificação

4.1.3 Correlação entre as variáveis clínico-patológicas idade e profundidade tumoral

com a classificação histológica de Laurén

A análise das faixas etárias de acometimento do CG em nossa amostra,

segundo os tipos histológicos de Laurén, mostra que o CG tipo difuso ocorreu em

pacientes numa faixa etária mais jovem que os tipos intestinal e misto/NC. O teste

de Mann-Whitney U para a variável quantitativa demonstrou que houve diferença

estatisticamente significativa entre a idade dos pacientes com neoplasias do tipo

difuso em relação ao grupo do tipo intestinal (p=0,04). Não houve relação

significativa entre o tipo misto/NC com os demais grupos. Os dados estão

demonstrados no Gráfico 1.

GRÁFICO 1: Correlação entre faixa de idade dos pacientes e tipos de

carcinoma gástrico, segundo a classificação histológica de

Laurén. dif: difuso; int: intestinal; misto/NC: misto/não

classificável.

Dentre os CG do tipo intestinal de Laurén, 11 eram precoces (24,4%) e 34

avançados (75,5%). Oito de 25 casos de CG do tipo difuso eram precoces (32,0%) e

os 17 restantes eram avançados (68,0%). Os CG do tipo misto/NC tinham apenas 2

representantes no grupo dos CG precoces (8,0%), enquanto 23 eram avançados

(92,0%). Houve relação estatisticamente significativa entre a profundidade de

invasão tumoral (CG precoce e avançado) com a classificação histológica de Laurén

para as neoplasias dos tipos difuso e misto/NC. Esses valores estão demonstrados

na Tabela 3.

P=0,04

TABELA 3: Correlação entre a classificação histológica de Laurén e a

profundidade tumoral em 95 casos de carcinoma gástrico

(N=95).

* diferença entre os valores estatisticamente significativa

4.2 Avaliação de invasão vascular linfática e sanguínea

4.2.1 Invasão vascular linfática e invasão vascular sanguínea

O endotélio dos vasos linfáticos foi delineado em marrom pelo

marcador D2-40 à coloração IHQ. A IVL foi claramente demonstrada à IHQ, em

comparação com a coloração por HE. O marcador CD34 foi positivo no endotélio de

vasos sanguíneos e linfáticos, colorindo o contorno dos vasos em marrom. A IVS foi

considerada quando a marcação IHQ era negativa para D2-40 e positiva para CD34,

aliada à presença de hemácias no lúmen vascular (FIG.8).

Classificação

histológica de Laurén

Profundidade de invasão do

carcinoma gástrico

Valor de p

Precoce (%)

Avançado (%)

Intestinal

11 (24)

34 (76)

0,108

Difuso

8 (32)

17 (68)

0,034*

Misto/NC

2 (8)

23 (92)

Total

FIGURA 8: Fotomicrografias dos cortes seriados de invasão vascular linfática e

sanguínea detectadas pela HE (seta) e IHQ. A: IVL HE (x400). B: IVL

marcação por CD34 (x400). C: IVL marcação por D2-40 (x400). D: IVS HE

(x100). E: IVS HE (x400). F: IVS marcação por CD34 (x400). G: IVS HE

(x200). H: IVS marcação por CD34 (x200) I: IVS marcação por D2-40

(x200).

A detecção de IVL foi consideravelmente maior que a de IVS. A presença de

IVL foi detectada em 61/95 casos (64,2%) pela HE e em 66/95 casos (69,5%) pela

IHQ, como demonstrado na Tabela 4. A IVS foi evidenciada em 38/95 casos (40,0%)

pela HE e pela IHQ em apenas 24 casos (25,2%), como visualizado na Tabela 5.

TABELA 4: Avaliação da invasão vascular linfática pelos métodos de HE e

IHQ (N=95).

IVL: invasão vascular linfática

HE: coloração de rotina HE

IHQ: método imuno-histoquímico

TABELA 5: Avaliação da invasão vascular sanguínea pelos métodos de HE

e IHQ (n=95).

* diferença entre os valores estatisticamente significativa

IVS: invasão vascular sanguínea

HE: coloração de rotina HE

IHQ: método imuno-histoquímico

IVL – HE

Total

Negativo

Positivo

Valor de p

IVL – IHQ

Negativo

Positivo

0,38

Total

IVS – HE

Total

Negativo

Positivo

Valor de p

IVS – IHQ

Negativo

Positivo

0,02*

Total

4.2.2 Comparação da eficácia dos métodos de HE e IHQ na identificação de invasão

vascular

A comparação entre a capacidade de detecção de invasão vascular pelos

métodos de coloração pela HE e pela IHQ mostrou algumas diferenças. Em relação

à IVL, não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os valores

encontrados (p=0,38). A presença de IVS detectada pela IHQ foi significativamente

menor que ao HE (p=0,02). O coeficiente de Kappa para a concordância diagnóstica

entre ambos os métodos foi moderado para IVL (Kappa=0,50) e baixo para a IVS

(Kappa=0,20), conforme demonstrado na Tabela 6.

TABELA 6: Comparação entre a concordância diagnóstica na detecção de

invasão vascular linfática e sanguínea pela HE e pela IHQ

(N=95).

* diferença entre os valores foi estatisticamente significativa

IVL: invasão vascular linfática

IVS: invasão vascular sanguínea

HE: coloração de rotina HE

IHQ: método imuno-histoquímico

A análise da Figura 9 mostra comparativamente a detecção de IVL pela HE e

à IHQ. Dentre os 61 casos com IVL detectada ao HE, 8 casos (13,1%) não foram

confirmados à IHQ. Em contrapartida, observamos IVL à IHQ em 13 casos (38,2%

Avaliação ao HE

Avaliação à IHQ

Valor de p

Kappa

IVL

Positivo

0,38

0,50

Negativo

IVS

Positivo

0,02*

0,20

Negativo

dos casos negativos ao HE), que não haviam sido previamente detectados pela HE

ao exame histopatológico.

FIGURA 9: Comparação da eficácia entre HE e IHQ como métodos

diagnósticos na detecção de invasão vascular linfática pela em

95 casos de CG.

A Figura 10 representa a avaliação comparativa da detecção de IVS pelos

métodos HE e IHQ. Foram detectados 38 casos de IVS ao HE, dos quais 24 (63,1%)

não foram confirmados pela IHQ. Dentre os casos negativos ao HE, 10 casos de IVS

(17,5%) foram identificados à IHQ.

FIGURA 10: Comparação da eficácia entre HE e IHQ como métodos

diagnósticos na detecção de invasão vascular sanguínea pela

em 95 casos de CG.

IVL

Coloração de HE

(pacientes)

Coloração IHQ

(pacientes)

Negativos= 8

Positivos= 61

Positivos= 53

Negativos= 21

Negativos= 34

Positivos= 13

IVS

Coloração de HE

(pacientes)

Coloração IHQ

(pacientes)

Negativos= 24

Positivos= 38

Positivos= 14

Negativos= 47

Negativos= 57

Positivos= 10

Alguns exemplos de IVL não detectada ao exame histopatológico

convencional (HE) estão demonstrados na Figura 11, bem como um caso em que a

IVL detectada ao HE não foi confirmada pelo exame IHQ.

FIGURA 11: Fotomicrografias de cortes seriados de invasão vascular linfática detectada

apenas pela IHQ e de falsa invasão vascular diagnosticada ao HE. A e B:

IVL marcação por D2-40 (x400); C: falsa IVL HE (x100); D: falsa IVL

marcação por D2-40 (x100).

4.3 Correlação com metástases linfonodais e outras variáveis prognósticas

Em seis casos, a quantidade de linfonodos obtidos foi insuficiente para o

estadiamento linfonodal. Portanto, esses casos foram excluídos da análise de

correlação com outras variáveis, resultando numa amostra constituída por 89 casos.

4.3.1 Correlação entre invasão vascular e metástases linfonodais

A correlação entre a IVL e a presença de metástases foi estatisticamente

significativa, tanto na avaliação pelo método de rotina (HE), quanto pelo método IHQ

(p=0,001). A presença de IVS também se correlacionou positivamente com a

presença de metástases linfonodais quando avaliada pela HE (p=0,013) e pela IHQ

(p=0,019). Esses resultados estão dispostos na Tabela 7.

TABELA 7: Correlação entre a detecção de invasão vascular linfática e

sanguínea pela HE e IHQ e a presença de metástases

linfonodais (N=89).

* diferença entre os valores estatisticamente significativa

Invasão Vascular

Metástases linfonodais

Negativo

N (%)

Positivo

N (%)

Valor de P

IVL - HE

Negativa

23 (71,8)

9 (28,2)

Positiva

5 (8,8)

52 (91,2)

0,001*

IVL - IHQ

Negativa

20 (74,0)

7 (26,0)

Positiva

8 (13,0)

54 (87,0)

0,001*

IVS - HE

Negativa

22 (41,5)

31 (58,5)

Positiva

6 (16,6)

30 (83,4)

0,013*

IVS - IHQ

Negativa

25 (38,5)

40 (61,5)

Positiva

3 (12,5)

21 (87,5)

0,019*

4.3.2 Valor preditivo da invasão vascular linfática e sanguínea para metástases

linfonodais

Quando analisamos os dados de invasão vascular como fator preditivo para

metástases linfonodais, separadamente para HE e IHQ em uma tabela 2x2,

podemos obter informações de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo

(VPP) e valor preditivo negativo (VPN).

Em relação à IVL, os resultados acima foram bastante semelhantes entre os

métodos de HE e IHQ. A sensibilidade foi de 85,0% para a avaliação ao HE e de

88,0% para a IHQ. A especificidade foi de 82,0% quando avaliada ao HE e de 71,0%

à IHQ. O VPP foi de 91,0% ao HE e 87,0% à IHQ. O VPN foi de 72,0% ao HE e

74,0% à IHQ.

Em relação à IVS, os resultados obtidos também mostraram valores

semelhantes entre os métodos de HE e IHQ. Entretanto, a sensibilidade foi baixa

tanto para a avaliação ao HE quanto à IHQ (49,0% e 34,0%). A especificidade foi de

78,0% quando avaliada ao HE e de 89,0% à IHQ. O VPP foi de 83,0% ao HE e

87,0% à IHQ. O VPN foi também baixo em ambos, de 41,0% ao HE e 38,0% à IHQ.

4.3.3 Correlação entre variáveis clínico-patológicas e metástases linfonodais

O teste de Mann-Whitney U para variável quantitativa não demonstrou

correlação estatisticamente significativa entre a idade dos pacientes e a presença de

metástases linfonodais (p=0,94).

As neoplasias precoces exibiram menor número de metástases linfonodais,

quando comparadas às neoplasias avançadas: 11,2% contra 83,0% (p=0,001). De

acordo com a classificação histológica de Laurén, os tumores do tipo difuso

apresentaram menor proporção de acometimento linfonodal que os demais tipos:

52,0% contra 68,0% para os intestinais e 84,0% para os mistos/NC. Somente

quando excluímos os tumores do tipo intestinal desta análise, pudemos obter uma

relação significativa dos tumores difuso e misto/NC com a presença de metástases

linfonodais (p=0,017).

Houve diferença estatisticamente significativa entre os tumores com invasão

de órgãos por continuidade (esôfago e duodeno) e aqueles confinados ao estômago,

em relação à presença de metástases linfonodais (p=0,026).

Não observamos correlação entre presença de metástases linfonodais com as

seguintes características: idade, gênero dos pacientes, topografia do tumor,

curvatura acometida, tipo macroscópico de Borrmann ou da SJED e o padrão de

crescimento tumoral de Ming. Esses dados estão sumariados na Tabela 8.

TABELA 8: Correlação entre os parâmetros clínico-patológicos e a

presença de metástases linfonodais (N=89).

Dados Clínico-patológicos

Metástases linfonodais

Negativo

N (%)

Positivo

N (%)

Valor de P

Gênero

masculino

18 (31,5)

39 (68,5)

0,974

feminino

10 (31,2)

22 (68,8)

Topografia do tumor

Terço proximal

3 (25)

9 (75)

0,572

Terço médio

6 (50)

Terço distal

17 (34)

33 (66)

Terço médio+distal

1 (16,6)

5 (83,4)

Terço proximal+médio+distal

1 (14,2)

6 (85,8)

JEG

(Continuação)

* diferença entre os valores estatisticamente significativa

Dados Clínico-patológicos

Metástases linfonodais

Negativo

N (%)

Positivo

N (%)

Valor de P

Curvatura acometida

pequena curvatura

16 (30,7)

36 (59,3)

0,109

grande curvatura

4 (44,4)

5 (55,6)

pequena e grande

1 (8,3)

13 (91,7)

Tipo macroscópico (precoce)

SJED IIa

2 (100)

0,487

SJED IIb

5 (100)

SJED IIc

2 (100)

SJED III

3 (75,0)

1 (25,0)

Tipo macroscópico (avançado)

Borrmann I

3 (50,0)

0,08

Borrmann II

7 (24,0)

22 (76,0)

Borrmann III

4 (14,8)

23 (85,2)

Borrmann IV

10 (100)

Invasão de órgãos

Negativa

23 (45,0)

28 (55,0)

0,026*

Duodeno

4 (17,4)

19 (82,6)

Esôfago

1 (12,5)

7 (87,5)

Esôfago + duodeno

3 (100)

Outros

4 (100)

Profundidade do tumor

precoce

16 (88,2)

2 (11,2)

0,001*

avançado

12 (16,9)

59 (83,0)

Tipo histológico de Laurén

intestinal

13 (31,7)

28 (68,3)

0,06

difuso

11 (47,8)

12 (52,1)

0,017*

misto/NC

4 (16,0)

21 (84,0)

Padrão de crescimento (Ming)

expansivo

11 (30,0)

27 (70,0)

0,28

infiltrativo

7 (18,4)

31 (81,6)

4.3.4 Correlação entre variáveis clínico-patológicas e invasão vascular linfática e

sanguínea detectadas pela IHQ

O teste de Mann-Whitney U para a variável quantitativa idade demonstrou

correlação estatisticamente significativa com a presença de IVL detectada à IHQ

(p=0,05), porém não para a presença de IVS (p=0,46).

Quando analisamos a IVL detectada pelo exame IHQ, podemos identificar

relação estatisticamente significativa com a topografia no terço distal do estômago,

quando comparadas às demais localizações (p=0,039). Os tumores precoces

mostraram uma proporção de IVL significativamente menor que os tumores

avançados (p=0,001). As neoplasias avançadas com padrão macroscópico tipo I de

Borrmann apresentaram diferença significativa quando comparadas aos tumores

com os demais padrões, em relação à presença de IVL (p=0,001). Outra variável

significativa em relação à IVL foi a presença de invasão de órgãos por continuidade

(p=0,003).

Não foi observada correlação significativa entre a presença de IVL e as

seguintes variáveis: gênero, curvatura acometida, tipo macroscópico da SJED para

tumores precoces, tipo histológico de Laurén, padrão de crescimento de Ming e

metástases à distância.

Em relação à presença de IVS, a única variável estatisticamente significativa

foi a categorização da neoplasia em CG precoce ou avançado (p=0,003). Todas as

demais variáveis analisadas não mostraram correlação com a presença de IVS. Os

dados estão demonstrados na tabela 9.

TABELA 9: Correlação entre os parâmetros clínico-patológicos e as

presenças de invasão vascular linfática e sanguínea pela IHQ

(N=95).

Dados Clínico-patológicos

IVL – IHQ

IVS – IHQ

Negativo

N (%)

Positivo

N (%)

Negativo

N (%)

Positivo

N (%)

Gênero

masculino

20 (32,2)

42 (67,8)

0,615

45 (72,5)

17 (27,5)

0,507

feminino

9 (27,3)

24 (72,7)

26 (78,7)

7 (21,3)

Topografia do tumor

Terço distal

15 (27,3)

40 (72,7)

0,039*

42 (76,3)

13 (23,7)

0,281

Demais localizações

14 (35)

26 (65)

29 (72,5)

11 (27,5)

Curvatura acometida

pequena curvatura

19 (35,2)

35 (64,8)

0,122

41 (76)

13 (24)

0,131

grande curvatura

3 (30)

7 (70)

8 (80)

2 (20)

pequena e grande

1 (7,2)

13 (92,8)

7 (50)

Tipo macroscópico (prec.)

SJED IIa

2 (100)

0,241

2 (100)

SJED IIb

5 (100)

SJED IIc

2 (100)

SJED III

3 (60)

2 (40)

5 (100)

Tipo macroscópico (avanç)

Borrmann I

5 (71,4)

2 (28,6)

0,001*

7 (100)

0,24

Borrmann II

4 (13,3)

26 (86,7)

21 (70)

9 (30)

Borrmann III

5 (18,5)

22 (81,5)

17 (62,9)

10 (37,1)

Borrmann IV

12 (100)

7 (58,3)

5 (41,7)

Invasão de órgãos

Negativa

26 (45,6)

31 (54,4)

0,003*

46 (80,7)

11 (19,3)

0,297

Duodeno

1 (4,3)

22 (95,7)

15 (65,2)

8 (34,8)

Esôfago

1 (12,5)

7 (87,5)

6 (75)

2 (25)

Esôfago + duodeno

3 (100)

1 (33,3)

2 (66,7)

Outros

1 (25)

3 (75)

1 (25)

Profundidade do tumor

Precoce

17 (80,9)

4 (19,1)

0,001*

21 (100)

0,003*

Avançado

12 (16,2)

62 (83,8)

50 (67,5)

24 (32,5)

Tipo histológico de Laurén

intestinal

12 (26,6)

33 (73,3)

0,228

36 (80)

9 (20)

0,332

difuso

11 (44)

14 (56)

19 (76)

6 (24)

misto/NC

6 (24)

19 (76)

16 (64)

9 (36)

(Continuação)

* diferença entre os valores estatisticamente significativa

NA: não avaliado

Dados Clínico-patológicos

IVL – IHQ

IVS – IHQ

Negativo

Positivo

Negativo

Positivo

Padrão de cresc. (Ming)

expansivo

10 (25)

30 (75)

0,412

31 (77,5)

9 (22,5)

0,217

infiltrativo

7 (17,5)

33 (82,5)

26 (65)

14 (35)

Metástases à distância (pM)

pMx

26 (30)

61 (70)

0,654

65 (74,7)

22 (25,3)

0,986

pM1

3 (37,5)

5 (62,5)

6 (75)

2 (25)

5 DISCUSSÃO

Com o propósito de aprimorar a pesquisa de invasão vascular no CG,

usualmente feita com a coloração de rotina pela HE, e de distinguir IVL de IVS,

introduzimos o método IHQ utilizando a combinação de dois marcadores: um deles

específico para o endotélio de vasos linfáticos (D2-40) e outro pan-endotelial

(CD34). Além de permitir a comparação da eficácia na detecção de IVL e IVS, este

método também possibilitou a avaliação do valor preditivo da invasão vascular no

CG para a ocorrência de metástases linfonodais.

Neste trabalho, o grupo de 95 pacientes estudados refletiu o perfil geralmente

descrito na literatura para o CG quanto às seguintes características: a maioria dos

pacientes era do sexo masculino (65,3%), com média de idade de 65 anos,

topografia tumoral predominante no terço distal do estômago (57,9%) e tipo

histológico mais freqüente correspondendo ao tipo intestinal de Laurén (47,4%).

Ainda de acordo com séries de trabalhos publicados a respeito, a faixa etária

dos pacientes acometidos pelos tumores do tipo difuso de Laurén se mostrou

significativamente mais jovem do que aquela observada no tipo intestinal (p=0,04).

Essa característica peculiar das neoplasias do tipo difuso está bem estabelecida e

denota as diferenças de sua etiopatogenia, geralmente associada a fatores

genéticos, em relação às neoplasias do tipo intestinal, mais influenciadas por fatores

ambientais, tais como dieta e infecção por H. pylori. Via de regra, as doenças

associadas a alterações genéticas tendem a se manifestar mais precocemente do

que aquelas relacionadas a fatores ambientais. O grupo dos tumores do tipo

misto/NC de Laurén, não mostrou diferença significativa em relação à idade dos

pacientes. Esse achado pode estar ligado ao fato de que o tipo misto de Laurén

apresenta aspectos semelhantes ao CG de ambos os tipos intestinal e difuso

(Laurén, 1965).

Em nosso estudo, 53,7% dos casos de CG já se encontravam no estágio pT3

de profundidade tumoral, corroborando os dados da literatura que indicam que a

maioria dos diagnósticos em nosso meio é feita tardiamente, já na fase avançada da

doença (Lemes et al., 2003). Destaca-se ainda que mais da metade dos pacientes

(64,2%) já apresentava metástases linfonodais no momento do diagnóstico.

A presença de IVL e IVS no CG tem sido demonstrada em diversos estudos,

os quais exibem grande variabilidade em sua detecção: entre 7,2% a 86% (Maehara,

Oshiro et al., 1995; Setälä, Kosma et al., 1996; Hyung, Cheong et al., 2004; Nasu,

Nishina et al., 2006; Kamata, Ishikawa et al., 2009; Morita, Ishikawa et al., 2009).

Essa ampla faixa de variação dos resultados pode ser explicada pela diferença entre

as populações estudadas e também pelos diferentes métodos utilizados por esses

autores para a avaliação da invasão vascular: coloração de HE ou IHQ com

marcadores endoteliais específicos. Três exemplos mais consistentes da

discrepância dos resultados em relação ao método utilizado são os trabalhos de

Arigami et al., Sako et al. e Yonemura et al. Todos eles relatam uma taxa mais

elevada de detecção de IVL à IHQ, quando comparada à coloração pela HE,

reforçando assim o seu papel na análise da invasão vascular no CG (Arigami et al.,

2005; Sako et al., 2006; Yonemura et al., 2006).

Ao compararmos a detecção de IVL em cortes seqüenciais pelos métodos

utilizados em nosso trabalho, verificamos que esta foi superior quando avaliada pela

IHQ. A presença de IVL foi detectada em 61 casos ao HE e em 66 casos pela IHQ.

Essa diferença não foi estatisticamente significativa ao Teste de McNemar (p=0,38).

Entretanto, quando avaliamos a tabela de qui-quadrado 2x2, podemos observar que,

apesar da IVL ao HE ter sido positiva em 61 casos, apenas 53 deles obtiveram

confirmação à IHQ. Os 8 casos restantes haviam sido classificados erroneamente

como positivos para IVL, sendo portanto considerados falso-positivos. Em

contrapartida, a análise ao HE falhou em identificar 13 casos de IVL, que foram

observados apenas ao estudo IHQ, interpretados como falso-negativos. Deste

modo, a análise do coeficiente de Kappa foi considerada apenas moderada

(Kappa=0,50), menos significativa do que se esperaria com um resultado bastante

semelhante em relação ao número de casos detectados.

A avaliação de IVL ao HE está sujeita a esses equívocos por não ser capaz

de distinguir artefatos de retração ao redor de glândulas, ou de agrupamentos de

células neoplásicas, de invasão vascular verdadeira. Em algumas ocasiões, os

êmbolos neoplásicos preenchem totalmente o lúmen vascular, impossibilitando a

sua identificação sem a marcação específica do endotélio linfático. Resultados falso-

positivos podem ocorrer ainda ao HE se a presença de IVS for interpretada

erroneamente como IVL. Essas discrepâncias foram também observadas em outras

séries de estudos sobre CG (Arigami et al., 2005; Sako et al., 2006; Yonemura et al.,

2006). Embora outros trabalhos também tenham utilizado o método IHQ para o

diagnóstico da invasão vascular, somente estes autores aferiram a eficácia deste

método para a detecção de IVL, quando comparada à coloração de rotina pela HE.

É interessante ressaltar que nosso estudo, além de comparar os dois métodos de

detecção de invasão vascular, utilizou cortes seriados e seqüenciais para a sua

avaliação.

A correlação entre a variável IVL com a presença de metástases foi

estatisticamente significativa, tanto na avaliação pelo método de rotina (HE), quanto

pelo método IHQ (p=0,001). Esse dado é corroborado pela literatura, que afirma ser

a IVL detectada no tumor primário um fenômeno essencial para a ocorrência de

metástases linfonodais (Pantel, Brakenhoff, 2004). Portanto, podemos inferir que a

presença de IVL é maior em paciente com metástases linfonodais do que naqueles

nos quais os linfonodos examinados foram negativos.

À análise pelo método de rotina, a IVS foi evidenciada em 38 casos, sendo

confirmada pela IHQ apenas em 14 casos. Podemos perceber que 24 casos

correspondem a falso-positivos para IVS ao HE. Em contrapartida, dos 57 casos

considerados negativos ao exame convencional pela HE, 10 falso-negativos foram

identificados como IVS à IHQ. Portanto, a detecção de IVS pela IHQ foi

significativamente menor que ao HE (p=0,02). Esse dado produziu um coeficiente de

concordância muito baixo (Kappa=0,20), devido à identificação de um grande

número de casos como falso-positivos. O resultados falso-positivos obtidos ao HE

podem ser atribuídos aos casos de IVL que foram interpretados inadvertidamente

como IVS, uma vez que esta coloração não possibilita distinção adequada entre

vasos linfáticos e sanguíneos em todos os casos (Van Den Eynden, Van Der Auwera

et al., 2006).

Nossos resultados mostram que a IVS avaliada por ambos os métodos se

correlacionou positivamente com a presença de metástases linfonodais,

diferentemente do que foi demonstrado por alguns autores, que não encontraram

associação significativa de IVS com a presença de metástases linfonodais (An, Baik

et al., 2007). É interessante assinalar que, embora esses autores tenham analisado

um grande número de casos, trata-se de estudo retrospectivo com revisão de dados

que incluiu apenas CG precoces, o que justifica a baixa ocorrência de metástases

linfonodais e de IVS.

A presença de metástases linfonodais é considerada o fator de maior

influência no prognóstico dos pacientes, estando relacionada à presença de invasão

vascular (Yokota, Ishiyama et al., 2004). Estudos retrospectivos sobre CG mostram

que a presença de IVL e IVS detectadas pelo método IHQ está relacionada à

recorrência da neoplasia em pacientes com e sem metástases linfonodais e também

está relacionada à menor sobrevida (Arigami et al., 2005; Nakamura et al., 2006;

Kim, Park et al., 2009).

Em nosso estudo, obtivemos correlação entre a presença de metástases

linfonodais e as demais características clínico-patológicas dos pacientes. Dentre os

fatores avaliados neste trabalho, a profundidade tumoral (quando comparado o CG

em seus estágios precoce e avançado), a classificação histológica de Laurén e a

invasão de órgãos por continuidade (esôfago e duodeno) foram as características

significativamente relacionadas à presença de metástases linfonodais.

A classificação histológica de Laurén tem significado prognóstico no CG,

sendo o tipo intestinal o que apresenta evolução mais favorável. Os relatos na

literatura indicam que os tipos difuso e misto/NC de Laurén são considerados de pior

prognóstico, quando comparados aos tumores do tipo intestinal (Zheng, Li et al.,

2008). As neoplasias do tipo difuso estão associadas a maior potencial infiltrativo na

parede gástrica e maior tendência à disseminação por metástases. Paradoxalmente,

os dados obtidos em nosso trabalho registram que os tumores do tipo difuso

apresentaram menor proporção de acometimento linfonodal que os demais tipos de

CG da classificação de Laurén. Quando foram excluídos os tumores do tipo

intestinal da análise, observamos que os tumores do tipo misto/NC mostraram um

número de metástases significativamente maior do que os difusos (p=0,017).

Entretanto, nossos resultados podem ter sofrido a interferência de um viés

relacionado à profundidade de invasão nas camadas da parede gástrica. Os tumores

do tipo difuso que eram também precoces correspondiam a 32% dos casos,

enquanto apenas 8% das neoplasias do tipo misto/NC eram precoces.

Diferentes estudos na literatura demonstraram correlação entre a presença de

invasão vascular e as características clínico-patológicas dos pacientes com CG,

também observadas neste trabalho. Os fatores clínico-patológicos relacionados à

presença de IVL foram: topografia do tumor no terço distal do estômago, tipos

macroscópicos II, III e IV de Borrmann, invasão de órgãos por continuidade e

profundidade tumoral. Em contrapartida, a presença de IVS correlacionou-se apenas

com a profundidade tumoral quando comparado o CG em seus estágios precoce e

avançado.

Neste estudo, as neoplasias precoces exibiram menor acometimento

linfonodal (p=0,001) e menos IVL (p=0,001) e IVS (p=0,007) detectadas pela IHQ,

quando comparadas às neoplasias avançadas. O conceito de CG precoce aplica-se

às neoplasias que exibem infiltração das camadas mais superficiais da parede

gástrica, ou seja, das camadas mucosa ou submucosa. É consenso que nos casos

de CG precoce, há menor probabilidade de ocorrência de invasão neoplásica em

vasos sanguíneos e linfáticos. Entretanto, estudos sobre a densidade da rede

linfática na parede gástrica normal atestam que a concentração de vasos linfáticos é

consideravelmente maior na muscular da mucosa, camada que pode estar infiltrada

nas neoplasias chamadas precoces (Sako et al., 2006).

O risco de metástases linfonodais no CG precoce intramucoso é de apenas

3,2%, atingindo aproximadamente 19,2% quando há invasão da submucosa (Kwee,

Kwee, 2008). Até o presente momento, não há nenhuma modalidade de exame de

imagem capaz de avaliar corretamente a presença de metástases linfonodais no

CG. Devido a este fato, o estadiamento linfonodal do CG precoce ainda depende da

avaliação de algumas características tumorais específicas, que estão relacionadas à

maior ocorrência de metástases linfonodais, a saber: profundidade de infiltração do

tumor na parede gástrica, tamanho do tumor acima de 2,0 cm, classificação

histológica de Laurén e IVL. Destaca-se que, dentre estes fatores, a presença de

envolvimento linfático é o fator preditivo mais significativo para a ocorrência de

metástases linfonodais (An, Baik et al., 2007).

Segundo o consenso para tratamento (Treatment Guidelines) do CG da

JGCA, a ressecção endoscópica sem linfadenectomia se restringe aos casos de

carcinomas intramucosos bem diferenciados e que medem menos que 20 mm de

maior dimensão (Nakajima, 2002). A gastrectomia com linfadenectomia estaria

indicada nos carcinomas intramucosos pouco diferenciados, com dimensões

maiores que 20 mm ou em carcinomas invasores da submucosa. Entretanto, esses

critérios são bastante rígidos e podem resultar em certo número de cirurgias

desnecessárias.

Gotoda et al. propôs critérios expandidos, ou mais flexíveis, para o tratamento

endoscópico do CG precoce combinando as seguintes variáveis: tipo histológico,

invasão angiolinfática, ulceração e tamanho do tumor (Gotoda et al., 2000). Esse

trabalho possibilitou a ampliação do universo de pacientes com CG precoce que

potencialmente também poderiam ser elegíveis para ressecção endoscópica do

tumor, mesmo com invasão da submucosa.

Os achados da revisão sistemática de 45 trabalhos com metanálise dos

resultados, publicada por Kwee e Kwee em 2008, trazem a avaliação de diversas

variáveis associadas significativamente com a presença de metástases linfonodais

no CG precoce (Kwee, Kwee, 2008). Para o CG intramucoso foram observadas as

seguintes características relevantes: idade abaixo de 57 anos, localização tumoral

no terço médio do estômago, maiores dimensões tumorais, tipo macroscópico

deprimido da SJED, ulceração, tipo difuso de Laurén e presença de IVL. Quanto ao

CG submucoso as variáveis mais associadas a metástases linfonodais foram

pacientes do sexo feminino, localização tumoral no terço distal do estômago,

maiores dimensões tumorais, neoplasias pouco diferenciadas, profundidade da

invasão da submucosa, vascularização tumoral aumentada, IVL e IVS. A maioria

desses fatores considerados preditivos pode ser perfeitamente avaliável por meio de

exames propedêuticos no pré-operatório: endoscopia digestiva acompanhada de

biópsia e métodos de imagem, como tomografia computadorizada e ultrassom

endoscópico. Entretanto, a presença ou ausência de IVL e IVS só pode ser avaliada

pelo estudo anatomopatológico, após a ressecção do tumor. A IVL foi o fator

preditivo mais significativo na análise univariada para CG precoce. Porém, o

consenso para o tratamento do CG da JGCA não se baseia na presença ou

ausência de IVL para a definição terapêutica (Nakajima, 2002), o que constitui, no

nosso entendimento, em uma importante falha na avaliação adequada do

prognóstico dos pacientes e, por conseguinte, do tratamento.

A IVL e IVS são parâmetros a serem analisados sistematicamente ao exame

histopatológico devido ao seu importante significado prognóstico e determinante na

escolha da terapêutica complementar pós-cirúrgica. Portanto, devem ser avaliados

pelos métodos mais sensíveis e específicos disponíveis e incorporados ao protocolo

do exame histopatológico de rotina.

6 CONCLUSÃO

 Nossos resultados mostram que a aplicação do método IHQ utilizando os dois

marcadores combinados (CD34 e D2-40) é superior na detecção de IVL e

IVS, quando comparada à coloração de rotina pela HE, podendo ser de

grande valor na prática clínica, especialmente nos casos em que não é

possível determinar o estadiamento linfonodal, seja por número insuficiente

de linfonodos dissecados ou por não realização de linfadenctomia;

 A presença de invasão vascular linfática e sanguínea, avaliada pela coloração

de HE e pela IHQ, está relacionada à presença de metástases linfonodais;

 A presença de invasão vascular linfática está relacionada a outros fatores de

pior prognóstico no CG, como a localização do tumor no terço distal do

estômago, os tipos macroscópicos II, III e IV de Borrmann, a invasão de

órgãos por continuidade (esôfago e duodeno) e a profundidade de infiltração

tumoral além da submucosa (CG avançado), refletindo provavelmente o seu

potencial metastático e comportamento agressivo;

 A profundidade de infiltração tumoral além da submucosa (CG avançado) foi a

única característica clínico-patológica correlacionada com a presença de

invasão vascular sanguínea;

 A profundidade de infiltração tumoral além da submucosa (CG avançado), a

classificação histológica de Laurén (tipo misto/NC) e a invasão de órgãos por

continuidade (esôfago e duodeno) foram as características clínico-patológicas

correlacionadas à presença de metástases linfonodais.

PERSPECTIVAS FUTURAS:

Os resultados desta dissertação de mestrado levantaram outras questões a

serem respondidas no que diz respeito à vascularização da parede gástrica no CG.

Portanto, pretendemos dar seguimento a esta pesquisa em projeto de doutorado,

que terá como objetivo estudar a angiogênese e a linfangiogênese em uma série de

carcinomas gástricos e correlacioná-las com características patológicas dos tumores

e sobrevida dos pacientes.

Para responder às perguntas formuladas, definimos os seguintes objetivos:

 Avaliar a angiogênese por meio da marcação imuno-histoquímica pelo CD34

dos vasos sanguíneos e pelo CD105 (marcador específico de vasos

sanguíneos neoformados);

 Avaliar a linfangiogênese por meio da marcação dos vasos linfáticos pela

imuno-histoquímica com D2-40 e VEGFR-3 (receptor do fator de crescimento

C derivado do endotélio vascular);

 Determinar o valor da densidade microvascular de vasos sanguíneos (DMV) e

linfáticos (DVL) para cada um dos marcadores em estudo;

 Correlacionar a DMV e a DVL com as características anatomopatológicas dos

tumores (subtipos histológicos, pT, pN e estadiamento) e com a sobrevida dos

pacientes;

 Analisar comparativamente a DMV e a DVL com a detecção de IVS e IVL pelo

método imuno-histoquímico.

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n. 6, p. 1937-9, 2002.

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Gastroenterology, v. 133, n. 1, p. 288-308, 2007.

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YONEMURA, Y. et al. Evaluation of lymphatic invasion in primary gastric cancer by a

new monoclonal antibody, D2-40. Hum Pathol, v. 37, n. 9, p. 1193-9, 2006.

ZHENG, H. C. et al. Mixed-type gastric carcinomas exhibit more aggressive features

and indicate the histogenesis of carcinomas. Virchows Arch, v. 452, n. 5, p. 525-34,

2008.

APÊNDICE A – Aprovação do trabalho pelo COEP – UFMG.

O presente trabalho entitulado “Análise comparativa da eficácia do método imuno-

histoquímico (D2-40 e CD34) e coloração de rotina (HE) para detecção de invasão

vascular linfática e sanguínea no carcinoma gástrico: correlação com outros

indicadores prognósticos” faz parte do projeto mais amplo aprovado no parecer

acima Protocolo № 574/07.

APÊNDICE B – Certificado de apresentação oral do trabalho no XXVII Congresso

Brasileiro de Patologia, em 29 de outubro de 2009, Búzios – RJ, promovido pela

Sociedade Brasileira de Patologia (SBP).

ANEXO A – Classificação TNM dos carcinomas do estômago.

FONTE: AALTONEN, L. A. et al. Pathology and genetics of tumours of the digestive

system. Lyon. Oxford: IARC Press; Oxford University Press distributor, 2000. (World

Health Organization classification of tumours.).

ANEXO B – Protocolo de análises de peças cirúrgicas de carcinoma gástrico

utilizado no Laboratório de Patologia Gástrica APM

FONTE: LEMES, L. A. O. et al. Gastric carcinoma: analysis of 289 consecutive

gastrectomy specimens in Belo Horizonte, Brazil. Jornal Brasileiro de Patologia e

Medicina Laboratorial [S.I.], v. 39, n. 1, p. 9, 2003.

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ANEXO B – Protocolo de análises de peças cirúrgicas de carcinoma gástrico

utilizado no Laboratório de Patologia Gástrica APM

FONTE: LEMES, L. A. O. et al. Gastric carcinoma: analysis of 289 consecutive

gastrectomy specimens in Belo Horizonte, Brazil. Jornal Brasileiro de Patologia e

Medicina Laboratorial [S.I.], v. 39, n. 1, p. 9, 2003.

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