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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO
Joseane Lima Prado Godinho
Avaliação dos efeitos de análogos de fosfolipídios e dinitroanilinas em
Leishmania amazonensis: estudos in vitro e in vivo
Rio de Janeiro
2010
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Joseane Lima Prado Godinho
Avaliação dos efeitos de análogos de fosfolipídios e dinitroanilinas em Leishmania
amazonensis: estudos in vitro e in vivo
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como requisito necessário para a
obtenção do título Mestre em Ciências Biológicas
(Biofísica).
Orientadores:
Wanderley de Souza
Juliany Cola Fernandes Rodrigues
Rio de Janeiro
2010
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Godinho, Joseane Lima Prado
Avaliação dos efeitos de análogos de fosfolipídios e dinitroanilinas em
Leishmania amazonensis: estudos in vitro e in vivo/ Joseane Lima Prado
Godinho. Rio de Janeiro, 2010.
Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas, Biofísica) – Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2010.
Orientadores: Wanderley de Souza e Juliany Cola Fernandes Rodrigues
1. Leishmania amazonensis. 2. Quimioterapia. 3. Análogos de fosfolipídios e
dinitroanilinas I. de Souza, Wanderley e Rodrigues, Juliany Cola Fernandes
(orientadores). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho. III. Avaliação dos efeitos de análogos de fosfolipídios e
dinitroanilinas em Leishmania amazonensis: estudos in vitro e in vivo.
Joseane Lima Prado Godinho
Avaliação dos efeitos de análogos de fosfolipídios e dinitroanilinas em Leishmania
amazonensis: estudos in vitro e in vivo.
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
(Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como requisito necessário à obtenção do título de mestre em Ciências Biológicas
(Biofísica).
Rio de Janeiro, _____ de __________________ de 2010.
___________________________________________
Dr. Wanderley de Souza, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Orientador
___________________________________________
Dra. Juliany Cola Fernandes Rodrigues, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Orientadora
______________________________________________
Dra. Georgia Correa Atella, Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis,
Universidade Federal do Rio de Janeiro
_______________________________________________
Dr. José Roberto Meyer Fernandes, Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis,
Universidade Federal do Rio de Janeiro
________________________________________________
Dr. Norton Heise, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de
Janeiro
_________________________________________________
Dra. Sonia Rozental, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio
de Janeiro, Revisora
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha Meyer,
pertencente ao Programa de Biologia Celular e Parasitologia, do Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação do Dr. Wanderley
de Souza e da Dra. Juliany Cola Fernandes Rodrigues, com auxílios financeiros concedido,
por:
• Fundação de Amparo à Pesquisa Carlos Chagas Filho do Estado do Rio de Janeiro
(FAPERJ)
• Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
• Programas de Núcleos de Excelência (PRONEX)
• Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Dedico
Aos meus pais, Josemar e Ruth, aos meus irmãos,
Júnior e Romulo e a minha tia Marlene por serem
o meu apoio em todos os momentos.
Ofereço
À Juliany Cola, minha orientadora,
por acreditar em meu trabalho
e pelos ensinamentos que
levarei por toda a vida.
AGRADECIMENTOS
A Deus que me concedeu todas as condições para chegar até aqui, por ter aberto todas
as portas possíveis para que eu alcançasse essa importante etapa da minha vida. Só ele sabe o
quanto foi difícil!
Aos meus pais, por todo amor e cuidado que vocês têm comigo. Nunca vou conseguir
agradecer o suficiente por vocês acreditarem nos meus sonhos e me apoiarem em toda essa
etapa da minha, por respeitarem a escolha que fiz e abrir mão da minha convivência com a
família, sem vocês nada disso valeria à pena. Eu só cumpri a minha obrigação, o mérito é de
vocês!
Aos meus irmãos, que são maravilhosos e que sempre me entenderam nos meus
momentos mais difíceis, que muitas vezes abriram mão da minha companhia. “Nós juntos
somos perfeitos e separados incompletos.” Amo vocês!
À minha tia Marlene e ao meu primo Igor, que estão diretamente convivendo comigo e
acompanhando essa jornada. Obrigada por me apoiar e acreditar no meu potencial.
A todos os meus familiares, família Prado e Godinho, por se preocuparem comigo e
apoiar as minhas escolhas.
Ao meu orientador Wanderley de Souza por prontamente ter me aceitado no
laboratório. Obrigada pela orientação, ensinamentos, estímulo e oportunidade de poder
trabalhar com esta grande equipe do Hertha Meyer.
A minha orientadora, Juliany Cola, excelente pesquisadora e orientadora, sempre
presente e preocupada com o nosso trabalho. Obrigada por acreditar em mim e no meu
trabalho, me ensinar tudo o que sei sobre quimioterapia das leishmanioses, por ser sempre
atenciosa em todos os detalhes.
À professora Rossiane Vommaro, por sua amizade, ajuda e conselhos que foram
fundamentais nas fases mais difíceis desta jornada, obrigada mesmo, suas palavras ajudaram
muito.
Às professoras Narcisa e Márcia por todo carinho e atenção.
As professoras Técia, Thaís, Sônia e Cristina Motta, e ao professor Kildare por todas
as contribuições e opiniões que vocês deram para mim e ao trabalho.
À minha grande amiga Sara. Foi um presente de Deus ter você em meu grupo e
trabalhando diretamente comigo, sua presença e nossas conversas são muito importantes para
mim.
À inesquecível Amandinha, que com seu jeito e seu carinho cativa qualquer ser
humano.
À Karlinha, minha amiga e companheira de todos os momentos (os sábados, domingos
e feriados de trabalho). Nossa amizade fez toda a diferença no desenvolvimento do meu
trabalho, admiro a pessoa e a profissional que você é.
A Tatiana (Tati), minha grande amiga. Você é muito especial pra mim, não tenho
palavras pra agradecer suas dicas, ajuda e palavras de incentivo principalmente no momento
mais difícil do trabalho. Além das nossas conversas sobre a vida e o futuro.
Aos meus dois grandes amigos: Lissa e o Thiago Luís. Conhecer vocês nesses últimos
meses e o nascimento da nossa amizade fez uma grande diferença na minha vida, jamais vou
esquecer a força-tarefa.
Às melhores farmacêuticas do Herta, Miria e Érica. Fico admirada com a experiência
de vocês, pra mim é um prazer poder contar com vocês.
Ao trio mais divertido do laboratório Emile, Iara, Juliana. Contar com a amizade de
vocês foi muito importante para mim.
A todos os meus amigos de trabalho, Lia, Gustavo, Celso, Renata, Lúcio, Gabriela,
Silvia, Carol Alcântara, Phercyles, Carol Catta Preta, Felipe, Thiago Manchester, Aline,
Allan, Wendell, Cristina Henriques, Nathalia, Camila Wendt, Bruno, Ana Paula, Mariana,
Fabio, Miguel, Silvana, Claudia e Raquel.
Não poderia esquecer jamais da Nete, que se preocupa e cuida de mim com todo
carinho.
A Ana Cristina, a Cazuza e a Noêmia, que sempre estão dispostas a me ajudar com
toda atenção possível em epecial a Tati (técnica) que ficou pouco tempo conosco, mas seu
trabalho foi essencial para a execução desta dissertação.
Ao Michael que me ajudou bastante com todo o trabalho com as animais, devo a você
um agradecimento especial, pois 50 animais não é fácil não.
Ao Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, em especial a coordenação de Pós-
graduação (Gabi, Sandrinha e a professora Narcisa), pelo suporte dado ao desenvolvimento da
minha dissertação. É um prazer poder estudar em uma instituição como a Biofísica.
Ao professor Norton Heise por contribuir com a miltefosina para o término do teste in
vivo.
A minha primeira orientadora, professora Marilene Rocha. Obrigada pela
oportunidade que me fez descobrir e amar a ciência, sua ajuda foi fundamental.
À minha amiga Nivânia, que sempre será lembrada por sua grande contribuição na
minha vida durante nossa graduação.
E a todos que de alguma forma me ajudaram, acho que não existe uma pessoa que
mais pedia ajuda que eu. Humildemente reconheço que sem todos vocês o meu trabalho não
teria valor algum.
“O temor do Senhor ensina a sabedoria
e a humildade antecede a honra.”
Provérbios 15: 33
Bíblia Sagrada
RESUMO
GODINHO, Joseane Lima Prado. Avaliação dos efeitos dos análogos de fosfolipídios e
dinitroanilinas em Leishmania amazonensis: estudos in vitro e in vivo. Rio de Janeiro, 2010.
Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas – Biofísica) – Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
Os protozoários parasitas do gênero Leishmania causam a Leishmaniose, uma enfermidade
que pode afetar os tecidos cutâneos, mucocutâneos, subcutâneos e até as vísceras. Atualmente
existem 12 milhões de pessoas infectadas no mundo, o tratamento disponível para
leishmaniose apresenta vários problemas, que incluem resistência aos medicamentos
utilizados na clínica e graves efeitos citotóxicos. Os fármacos usados são os antimoniais
pentavalentes, a anfotericina B e a pentamidina. Recentemente, a miltefosina foi descoberta
como um fármaco com grande atividade leishmanicida. Este fármaco é um análogo de
fosfolipídio que foi, primeiramente, estudado como antitumoral e hoje é utilizado no
tratamento da doença visceral, na Índia e Alemanha, e da forma cutânea, na Colômbia. A
vantagem deste fármaco é sua administração oral, no entanto, é um fármaco teratogênico e
que, também, causa distúrbios gastrointestinais. Neste estudo foram avaliados os efeitos de 13
análogos de fosfolipídios e das dinitroanilinas (trifluralina e orizalina) em formas
promastigotas e amastigotas intracelulares de Leishmania amazonensis. A miltefosina e
trifluralina, também, foram avaliadas in vivo, em modelos murinos de leishmaniose cutânea
por L. amazonensis. Através dos testes in vitro com os 13 análogos de fosfolipídios, o TC 95
foi o composto escolhido para os estudos posteriores, pois apresentou os menores valores de
IC
50
, quando comparado com os outros compostos. Após esta escolha, as dinitroanilinas,
também, foram estudadas, pois estas moléculas compõem a cadeia química do TC 95 que é
um composto híbrido, entre a miltefosina e a trifluralina. Os resultados dos efeitos
antiproliferativos para as formas promastigotas e amastigotas intracelulares mostraram que o
TC 95 possui atividade leishmanicida superior as dinitroanilinas e a miltefosina. O tratamento
com TC 95 induziu alterações na membrana plasmática, observado por microscopia eletrônica
de varredura e, também, na sua integridade, confirmado através de ensaios de fluorimetria
com “Sytox Blue”. Por microscopia óptica e microscopia eletrônica foi possível observar
alterações na morfologia, na divisão celular, principalmente na fase de citocinese, no acúmulo
de corpos lipídicos e lesões em organelas importantes, como a mitocôndria, retículo
endoplasmático e complexo de Golgi, em concentrações e tempos de tratamentos inferiores
quando comparados com as dinitroanilinas. O teste in vivo com a miltefosina foi eficaz
quando os animais foram tratados por via oral com as doses de 40 e 50 mg/kg/, durante 21
dias. Estes animais apresentaram uma redução significativa no tamanho de suas lesões, que
desapareceram e não voltaram a crescer, após cem dias do final do tratamento. Entretanto, o
tratamento realizado com a trifluralina foi pouco eficaz, uma vez que não foi possível
perceber redução no tamanho das lesões dos animais infectados. Assim, estes estudos
sugerem que o TC 95, um análogo de fosfolipídio, é um composto com grande potencial
leishmanicida para L. amazonensis in vitro e que a miltefosina é eficaz para o tratamento da
leishmaniose cutânea causada por L. amazonensis.
ABSTRACT
GODINHO, Joseane Lima Prado. Avaliação dos efeitos dos análogos de fosfolipídios e
dinitroanilinas em Leishmania amazonensis: estudos in vitro e in vivo. Rio de Janeiro, 2010.
Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas – Biofísica) – Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
The parasitic protozoa of the Leishmania genus cause leishmaniasis, a disease which can
affect the skin tissues, mucocutaneous, subcutaneous and even the viscera. Currently, there
are 12 million people infected around the world, and the available treatment for this disease
presents several problems including resistance and severe toxic effects. The drugs used are
pentavalent antimonials, amphotericin B and pentamidine. Recently, miltefosine has been
discovered as a drug with high leishmanicidal activity. This drug is a phospholipid analogue
that was firstly studied as antitumor agents and, today is used in the treatment of the visceral
disease in India and Germany and cutaneous form in Colombia. The advantage of this drug is
the oral route for the administration, however it is teratogenic and also causes gastrointestinal
disorders. This study evaluated the effects of 13 phospholipids analogues and the
dinitroanilines (trifluralin and oryzalin) against promastigotes and intracellular amastigotes of
Leishmania amazonensis. The miltefosine and trifluralin were also evaluated in vivo against
murine models of cutaneous leishmaniasis by L. amazonensis infection. From assays in vitro
with phospholipids analogues, only the compound TC 95 was chosen, because its IC
50
values
were lower than the value those obtained to the other compounds. The effect of dinitroaniline
was also studied, because the TC 95 is a hybrid molecule between miltefosine and trifluralin.
The results of antiproliferative effects for promastigotes and intracellular amastigotes showed
that the TC 95 has a higher leishmanicidal activity than the dinitroanilines and miltefosine.
Treatment with TC 95 caused changes in the structure of plasma membrane observed by
scanning electron microscope and also in its integrity showed by fluorometry assays with
Sytox Blue. Using light and electron microscopy, we could observe changes in the
morphology, cell division at the stage of cytokinesis, accumulation of lipid bodies and
important lesions in organelles such as mitochondrion, endoplasmic reticulum and Golgi
complex at concentrations and times of treatment lower than to the dinitroanilines. The in vivo
assay with miltefosine was effective when the mice were treated orally with doses of 40 and
50 mg/kg/day for 21 days. At these doses, treated-mice presented a significant reduction in
the size of the lesions, which disappeared and did not grow again after a hundred days of the
end of treatment. However, the treatment performed with trifluralin was ineffective, since it
was not possible to observe reduction in size of the lesions in the infected-mice. Thus, these
studies suggest that TC 95, a phospholipid analogue, is a compound with an interesting
leishmanicidal activity against L. amazonensis in vitro and that miltefosine is effective for the
treatment of experimental cutaneous leishmaniasis caused by L. amazonensis.
LISTA DE ABREVIATURAS
APLs – análogos de fosfolipídio
CC
50
– concentração mínima citotóxica para 50% das celulas
CG – complexo de Golgi
DNDi – “Drugs for Neglected Diseases iniciative”
DMSO – dimetilsulfóxido
FAPs – “flagellum associated proteins”
HIV – vírus da imunodeficiência humana
IC
50
– concentração mínima necessária para inibir 50% do crescimento
iNOS – óxido nítrico sintase
IS – índice de seletividade
kDNA – DNA do cinetoplasto
LC – leishmaniose cutânea
LCD – leishmaniose cutânea difusa
LMC – leishmaniose mucocutânea
LTA – leishmaniose tegumentar americana
LV – leishmaniose visceral
LVA – leishmaniose visceral americana
MAPs – “microtubule associated proteins”
MET – microscopia eletrônica de transmissão
MEV – microscopia eletrônica de varredura
MVT – túbulo multivesicular
PC - fosfatidilcolina
PE - fosfatidiletanolamina
Pi – fosfato inorgânico
PI - fosfatidilinositol
PKLD – leishmaniose dérmica pós-calazar
poliP – polifosfato
PPi – pirofosfato inorgânico
PRF – estrutura paraflagellar
PS - fosfatidilserina
RE – retículo endoplasmático
SIDA – Síndrome de Imunodeficiência Adquirida
SFB – soro fetal bovino
WHO – World Health Organization
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estágios do desenvolvimento do gênero Leishmania. (A) Forma amastigota
encontrada no hospedeiro vertebrado. (B) forma promastigota encontrada no inseto vetor
(REY, 2007). ..................................................................................................................... 23
Figura 2. Ciclo de vida da Leishmania (adaptado de
http://www.stanford.edu/class/humbio153/ImmuneEvasion/index.html). O inseto vetor no
momento do seu repasto sanguíneo ingere formas amastigotas do hospedeiro vertebrado
infectado. Estas formas diferenciam-se para formas promastigotas procíclicos que se
proliferam no intestino médio, ao longo do intestino estas se diferenciam para formas
metacíclicas, a forma que será transmitida pelo inseto durante o repasto sanguíneo. No
hospedeiro vertebrado, as promastigotas metacíclicas são fagocitadas pelos macrófagos e
diferenciam-se para formas amastigotas no interior do vacúolo parasitóforo. As formas
amastigotas irão se proliferar, lisar o macrófago e liberar estas formas para infectar novas
células ou serem ingeridas por insetos vetores. ................................................................. 25
Figura 3. Estrutura química dos principais compostos selecionados como novas opções
terapêuticas para o tratamento das leishmanioses. A miltefosina (A), um fármaco análogo
de fosfolipídios e a trifluralina (B) e orizalina (C), as dinitroanilinas.............................. .47
Figura 4. Curvas de crescimento de formas promastigotas tratadas com TC 95 (A),
trifluralina (B) e orizalina (C). Foram realizados três experimentos independentes. Os
resultados foram estatisticamente significativos nas concentrações de 4 e 5 µM com o TC
95 ( p < 0,05, One-way Anova, teste de Tukey). .............................................................. 70
Figura 5. Percentual de infecção das formas amastigotas intracelulares de L .amazonensis em
macrófagos peritoneais de camundongos tratados com TC 95 (A) e orizalina (B). Foram
realizados três experimentos independentes para o TC 95. Os resultados foram
estatisticamente significativos nas concentrações de 5 e 10 µM por 24 horas e 1, 5 e 10
por 48 horas com o TC 95 (* p < 0,05 e ** p<0,01, One-way Anova, teste de Tukey). .. 71
Figura 6. Gráfico dos valores de absorbância obtidos a partir do testes de viabilidade (MTS)
em macrófagos peritoneais de camundongos tratados com TC 95 por 72 horas nas
concentrações de 10, 25, 50, 100 e 200 µM. Foram realizados três experimentos
independentes. O resultado foi estatisticamente significativo na concentração de 200µM (
p < 0,05, One-way Anova, teste de Tukey). ...................................................................... 73
Figura 7. Avaliação da integridade da membrana plasmática em formas promastigotas de L.
amazonensis controle e tratadas com diferentes concentrações de TC 95 (A), trifluralina
(B) e orizalina (C). A intensidade de fluorescência do Sytox Blue (44-480) foi obtida em
um fluorímetro de placas usando os comprimentos de onda de 440 e 480 nm de excitação
e emissão, respectivamente. Foram realizados três experimentos independentes. Os
resultados foram estatisticamente significativos nas concentrações de 3 e 4 µM com o TC
95 ( p < 0,05, One-way Anova, teste de Tukey). .............................................................. 75
Figura 8. Microscopia óptica de contraste interferencial diferencial (DIC) (A, D, G, J),
imunofluorescência indireta com anti-tubulina (B, E, H, L) e fluorescência utilizando
DAPI (C, F, I, M) de formas promastigotas de L. amazonensis controle e tratadas com TC
95. A marcação em verde com Alexa-488 é referente à presença de tubulina e em azul a
marcação com DAPI. (A) Formas promastigotas controle. (B-D). Formas promastigotas
tratadas com 3 µM TC 95 por 24 horas. Nestas imagens observamos falhas na
continuidade da estrutura dos microtúbulos subpeliculares (setas) e o aspecto descontínuo
e frouxo em algumas células (cabeça de seta). .................................................................. 78
Figura 9. Microscopia óptica de contraste interferencial diferencial (DIC) (A, D, G),
imunofluorescência indireta com anti-tubulina (B, E, H) e fluorescência utilizando DAPI
(C, F, I) de formas promastigotas de L. amazonensis controle e tratadas com orizalina. A
marcação em verde com Alexa-488 é referente à presença de tubulina e em azul a
marcação dos núcleos e cinetoplastos com DAPI. (A, B, C) Formas promastigotas
controle. (D-I) Formas promastigotas tratadas com 50 µM de Orizalina por 48 h.. Nestas
imagens observamos falhas na continuidade da estrutura dos microtúbulos subpeliculares
(setas fina) células completamente alteradas em sua forma e apresentando dois ou mais
flagelos (setas largas) e células apresentando um número anormal de núcleos e
cinetoplastos (cabeça de seta). ........................................................................................... 80
Figura 10. Micrografias eletrônicas de varredura das formas promastigotas de L. amazonensis
controle (A) e tratadas com TC 95 (B-H). (B-D) Tratamento com 2 µM de TC 95 por 24
h. (E) 1 µM TC 95 por 48 h. (F-H) 1 µM, 2 µM e 3 µM de tratamento por 72 h,
respectivamente. (A) Os parasitos controle apresentam morfologia característica, o corpo
celular alongado e flagelo emergindo da região anterior. Os parasitos tratados nas
diferentes concentrações e tempo apresentaram severas mudanças em sua forma (G e H),
aumento no numero de flagelos (C e F), além de alterações na membrana do flagelo (B e
E, setas curtas), destacamento e protrusões no corpo celular (B e H, setas longas) e
alterações no padrão de citocinese (D, F, G e H, cabeça de seta)...................................... 82
Figura 11. Micrografias eletrônicas de varredura das formas promastigotas de L. amazonensis
tratadas com orizalina. As células controle podem ser observadas na Figura 7. (A-D) 25
µM de orizalina por 72 h. (E-G) 50 µM de orizalina por 72 h. Os parasitos tratados nas
diferentes concentrações e no tempo de 72 h apresentaram intensas mudanças em sua
forma (C-G), aumento no número de flagelos (A), além de alterações na membrana do
flagelo (B, D e E, setas curtas), protrusões de membrana no corpo celular (E, setas
longas) e alterações no padrão de citocinese ( A e D, cabeça de seta). ............................. 84
Figura 12. Avaliação do acúmulo de lipídios neutros em formas promastigotas de L.
amazonensis controle e tratadas com diferentes concentrações de TC 95 (A), trifluralina
(B) e orizalina (C). A intensidade de fluorescência do “Nile Red” foi obtida em um
fluorímetro de placas usando os comprimentos de onda de 485 e 538 nm de excitação e
emissão, respectivamente. Foram realizados três experimentos independentes. Os
resultados foram estatisticamente significativos (*) para o TC 95 e a orizalina ( p < 0,05,
One-way Anova, teste de Tukey). ..................................................................................... 88
Figura 13. Microscopia óptica de contraste interferencial diferencial (DIC) (A, C, E) e de
fluorescência utilizando “Nile Red” (B, D, F) para a marcação de lipidios neutros de
formas promastigotas de L. amazonensis controle, tratadas com TC 95 e orizalina. (A, B)
Formas promastigotas controle; (C, D) 4 µM TC 95 por 48 horas. (E, F). 50 µM orizalina
por 48 h. È possível observar a quantidade e distribuição dos corpúsculos lipídicos nas
populações celulares tratadas em relação ao controle. ...................................................... 89
Figura 14. Citoquímica para lipídios por ósmio-imidazol (MET) de formas promastigotas de
L. amazonensis controle e tratadas com TC 95 e orizalina por 48 h. (A) Controle. (B) 2
µM de TC 95. (C-D) 3 µM de TC 95. (E-F) 4 µM de TC 95. (G-H) 50 µM de orizalina.
As células controle apresentam seus corpúsculos lipídicos ósmiofilicos, entretanto as
células tratadas com TC 95 e orizalina possuem um número maior de corpúsculos
lipídicos distribuídos por toda a célula e intensamente ósmiofilicos. Ainda é possível
perceber que nas células tratadas às membranas aparecem mais ósmiofilicas e que
existente uma relação entre estes corpúsculos, o RE e a membrana plasmática, que muitas
vezes parece ser empurrada por eles. CL, corpúsculo lipídico; C, cinetoplasto; M,
mitocôndria; F, flagelo. ...................................................................................................... 91
Figura 15. Micrografias eletrônicas de transmissão de promastigotas controle e tratadas com
TC 95 por 24 h. (A) Promastigota controle. (B) 2 µM TC 95. (C-E) 3µM TC 95. (F-I)
4µM TC 95. As alterações mitocondriais podem ser observadas nos tratamentos a partir
de 2 µM, com o inchaço da mitocôndria, a ruptura de sua membrana (setas largas) e
danos as cristas (setas onduladas). Observa-se aparecimento de figuras de mielina (cabeça
de seta branca), acúmulo de lipídios (setas compridas), alterações na membrana do
flagelo (cabeça de seta preta) e o aparecimento de vacúolos que parecem englobar parte
do citoplasma. M, mitocôndria; CG, complexo de Golgi; Ax, axonema; C, cinetoplasto;
RE, retículo endoplasmático. ............................................................................................. 95
Figura 16. Micrografias eletrônicas de transmissão de formas amastigotas intracelulares de L.
amazonensis. (A) Macrofágos infectados com formas amastigotas intracelulares. (B)
Formas amastigotas no vacúolo parasitóforo. (C) Forma amastigota intracelular. A,
amastigota; VP, vacúolo parasitoforo; RE, reticulo endoplasmático; N, núcleo; M,
mitocôndria; CG, complexo de Golgi; C, cinetoplasto; BF, bolsa flagelar; F, flagelar. .... 97
Figura 17. Micrografias eletrônicas de transmissão de formas amastigotas intracelulares
tratadas com TC 95 por 24 h. (A-B) 5 µM TC 95. (C-F) 10 µM TC 95. Nos parasitos
tratadas há um acúmulo de lipídios (setas compridas), alterações na membrana plasmatica
(cabeça de seta preta) lesões mitocondriais, vacuolização do citoplasma (losangos) e o
aparecimento de figuras de mielina (cabeça de seta branca). Também foi observado varias
inclusões lipídicas na célula hospedeira. M, mitocôndria; CG, complexo de Golgi; Ax,
axonema; C, cinetoplasto; RE, retículo endoplasmático; Mg, megassomos; G,
glicossomos; BF, bolsa flagelar; N, núcleo; F, flagelo. ..................................................... 99
Figura 18. Micrografias eletrônicas de transmissão de promastigotas tratadas com 50 µM de
orizalina por 72h (A-D) Estas imagens sugerem alterações na membrana plasmática
(cabeça de seta), acúmulo de lipidios (setas compridas), células com dois ou mais
flagelos, três cinetoplastos e três núcleos. Ax, axonema; C, cinetoplasto; N, núcleo; F,
flagelo. ............................................................................................................................. 101
Figura 19. Gráfico referente ao 1° e 21° dia de tratamento dos grupos controles e tratados
com Glucantime na dose de 50 mg/kg/dia e miltefosina 2,5, 5, 10, 20, 30, 40 e 50
mg/kg/dia. O tamanho das lesões foram estatisticamente significativos quando
comparados com os grupos controle (*) e controle-veículo (*) (p < 0,05, One-way Anova,
teste de Tukey). ............................................................................................................... 105
Figura 20. Fotografias da base da cauda dos animais infectados com L. amazonensis
mostrando o 1° e 21° dias de tratamento e 100° dia após o fim do tratamento dos grupos
controles e tratados com Glucantime na dose de 50 mg/kg/dia e miltefosina 2,5, 5, 10, 20,
30, 40 e 50 mg/kg/dia. (A1, A21, A100) Controle. (B1, B21, B100) Controle-veículo.
(C1, C21, C100) Glucantime 50 mg/kg/dia. (D1, D21, D100) miltefosina 2,5 mg/kg/dia.
(E1, E21, E100) miltefosina 5 mg/kg/dia. (F1, F21, F100) miltefosina 10 mg/kg/dia. (G1,
G21, G100) miltefosina 20 mg/kg/dia. (H1, H21, H100) miltefosina 30 mg/kg/dia. (I1,
I21, I100) miltefosina 40 mg/kg/dia. (J1, J21, J100) miltefosina 50 mg/kg/dia. As
fotografias mostram que os animais dos grupos G, H, I e J apresentavam suas lesões
reduzidas em comparação aos outros grupos. ................................................................. 107
Figura 21. Imagens obtidas em microscópio óptico de campo claro de esfregaços das lesões
dos animais controles e tratados com Glucantime na dose de 50 mg/kg/dia e miltefosina
2,5, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mg/kg/dia no 21° dia de tratamento. (A) Controle. (B)
Controle-veículo. (C) Glucantime 50 mg/kg/dia. (D) miltefosina 2,5 mg/kg/dia. (E)
miltefosina 5 mg/kg/dia. (F) miltefosina 10 mg/kg/dia. (G) miltefosina 20 mg/kg/dia. (H)
miltefosina 30 mg/kg/dia. (I) miltefosina 40 mg/kg/dia. (J) miltefosina 50 mg/kg/dia. As
imagens do esfregaço das lesões mostram células densamente parasitadas nos grupos de
A a E, no grupo F é possível perceber uma redução no número de amastigotas.enquanto
que nos grupos G, H, I e J não foram observadas estas formas em todos os campos
pesquisados. ..................................................................................................................... 109
Figura 22. Imagens obtidas em microscópio óptico de campo claro de esfregaços das lesões
dos animais controles e tratados com Glucantime na dose de 50 mg/kg/dia e miltefosina
2,5, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mg/kg/dia após 100 dias do final do tratamento. (A) Controle.
(B) Controle-veículo. (C) Glucantime 50 mg/kg/dia. (D) miltefosina 2,5 mg/kg/dia. (E)
miltefosina 5 mg/kg/dia. (F) miltefosina 10 mg/kg/dia. (G) miltefosina 20 mg/kg/dia. (H)
miltefosina 30 mg/kg/dia.. As imagens do esfregaço das lesões mostram células
densamente parasitadas nos grupos de A a H. ................................................................. 111
Figura 23: Gráfico referente ao 1°, 9° e 21° dias de tratamento dos grupos controles e
tratados com Glucantime na dose de 50 mg/kg/dia e trifluralina 5, 15, 30 e 50
mg/kg/dia.........................................................................................................................113
Figura 24. Fotografias da base da cauda dos animais, infectados com L. amazonensis
mostrando o 1°, 9° e 21° dias de tratamento dos grupos controles e tratados com
Glucantime na dose de 50 mg/kg/dia e Trifluralina nas doses de 5, 15, 30 e 50 mg/kg/dia.
(A1, A9, A21) Controle. (B1, B9, B21) Controle-veículo. (C1, C9, C21) Glucantime 50
mg/kg/dia. (D1, D9, D21) trifluralina 5 mg/kg/dia. (E1, E9, E21) trifluralina 15
mg/kg/dia. (F1, F9, F21) trifluralina 30 mg/kg/dia. (G1, G9, G21) trifluralina 50
mg/kg/dia. As fotografias mostram que os animais tratados com a trifluralina não
apresentaram uma redução no tamanho das lesões. ........................................................ 114
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Lista dos compostos estudados: as dinitroanilinas trifluralina e orizalina, a
miltefosina e os análogos de fosfolipídios. ...................................................................... 54
Tabela 2. Valores de IC
50
obtidos no “screening” inicial para as formas promastigotas de L.
amazonenesis tratadas com 13 análogos de fosfolipídios após 48 e 72 h de tratamento.. 66
Tabela 3. Valores de IC
50
obtidos no “screening” inicial para as formas amastigotas
intracelulares de L. amazonensis tratadas com a miltefosina e 13 análogos de fosfolipídios
avaliados durante 72 h de tratamento. .............................................................................. 67
Tabela 4. Valores de IC
50
obtidos para as formas promastigotas de L. amazonensis tratadas
com TC 95, trifluralina e orizalina. Estes valores foram obtidos a partir das curvas de
crescimento mostradas na Figura 5. ................................................................................. 72
Tabela 5. Valores de IC
50
obtidos para as formas amastigotas intracelulares de L.
amazonensis tratadas com o TC 95 e orizalina. Estes valores foram obtidos a partir das
curvas de crescimento mostradas na Figura 6. ................................................................. 72
Tabela 6. Coeficiente de relação entre os grupos experimentais controle e tratados com
Glucantime na dose de 50 mg/kg/dia e miltefosina 2,5, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mg/kg/dia
durante os diferentes dias de tratamento, mostrando a relação entre o tamanho das lesões
dos grupos tratados quando comparados ao controle. .................................................... 106
20
Sumário
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 20
1.1 O gênero Leishmania .................................................................................................... 20
1.1.1 Classificação ............................................................................................................ 20
1.1.2 Morfologia e Ciclo Biológico ................................................................................. 21
1.2 Leishmania: Características Estruturais ............................................................... 24
1.2.1 Membrana Plasmática ........................................................................................... 24
1.2.2 Citoesqueleto ........................................................................................................... 26
1.2.3 Mitocôndria e Cinetoplasto ................................................................................... 28
1.2.4 Glicossomos ............................................................................................................. 30
1.2.5 Acidocalcissomos .................................................................................................... 30
1.2.6 Outras organelas .................................................................................................... 31
1.2.7 Núcleo ...................................................................................................................... 33
1.3 A Leishmaniose ............................................................................................................. 33
1.3.1 Histórico no Brasil .................................................................................................. 33
1.3.2 Aspectos epidemiológicos ....................................................................................... 34
1.3.3 Formas Clínicas da Leishmaniose ........................................................................ 35
1.3.4 A Quimioterapia da Leishmaniose ....................................................................... 37
1.3.4.1 Os Antimoniais Pentavalentes ............................................................................ 38
1.3.4.2 Anfotericina B ...................................................................................................... 39
1.3.4.3 Pentamidina ......................................................................................................... 40
1.3.4.4 Paramomicina ...................................................................................................... 41
1.3.4.5 Sitamaquina ......................................................................................................... 41
1.3.5 Novas opções terapêuticas ..................................................................................... 42
1.3.5.1 Alquilfosfolipídios: miltefosina e seus análogos ............................................... 42
1.3.5.2 Dinitroanilinas: trifluralina e orizalina ............................................................. 45
1.3.6 Desafios da quimioterapia das leishmanioses ...................................................... 47
2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 49
2.1 Objetivo Geral ............................................................................................................... 49
2.2 Objetivos Específicos .................................................................................................... 49
3 MATERIAIS E METÓDOS ............................................................................................... 50
3.1 Cultivo e manutenção dos parasitos ............................................................................ 50
21
3.1.1 Formas promastigotas de Leishmania amazonensis (cepa
WHOM/BR/75/Josefa) .................................................................................................... 50
3.1.2. Manutenção de formas promastigotas a partir de formas amastigotas de
Leishmania amazonensis (cepa WHOM/BR/75/Josefa) obtidas a partir de lesões em
camundongos Balb/C ...................................................................................................... 51
3.1.3 Obtenção de macrófagos peritoneais .................................................................... 51
3.1.4 Culturas de amastigota intracelular. .................................................................... 51
3.2 Compostos Testados ..................................................................................................... 52
3.2.1 Solução estoque ....................................................................................................... 52
3.2.2 Classe dos Compostos ............................................................................................ 52
3.3 Culturas para os testes dos compostos em formas promastigotas ............................ 54
3.3.1 “Screening” dos compostos ................................................................................... 54
3.3.2 Curvas de crescimento e avaliação dos efeitos antiproliferativos ...................... 55
3.3.3 Determinação da IC
50
............................................................................................. 55
3.4 Culturas para os testes dos compostos em formas amastigotas intracelulares ....... 56
3.5 Avaliação de citotoxicidade em macrófagos peritoneais (MTS/PMS) ..................... 57
3.6 Análises Fluorimétricas ................................................................................................ 58
3.6.1 “Sytox Blue”............................................................................................................ 58
3.6.2 “Nile Red” ............................................................................................................... 58
3.7 Avaliação Morfológica e Ultraestrutural .................................................................... 59
3.7.1 Microscopia óptica de contraste interferencial diferencial (DIC) e fluorescência
convencional ..................................................................................................................... 59
3.7.2 Imunofluorescência indireta com anticorpo monoclonal anti-tubulina (TAT1)
........................................................................................................................................... 59
3.7.3 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ...................................................... 60
3.7.4 Microscopia eletrônica de transmissão (MET) .................................................... 61
3.7.5 Citoquímica para Lipídios – Ósmio-Imidazol (MET) ........................................ 61
3.8 Testes in vivo ................................................................................................................. 62
3.8.1 Animais de experimentação................................................................................... 62
3.8.2 Infeccção dos animais............................................................................................. 62
3.8.3 Tratamento dos animais ........................................................................................ 63
3.8.4 Medida do tamanho das lesões .............................................................................. 63
3.8.5 Pesquisa de amastigotas em esfregaços da lesão ................................................. 63
3.9 Análise estatística .......................................................................................................... 64
22
4 RESULTADOS .................................................................................................................... 65
4.1 “Screening” inicial dos compostos em formas promastigotas e amastigotas de L.
amazonensis. ..................................................................................................................... 65
4.2 Atividade antiproliferativa do TC 95 e das dinitroanilinas em formas
promastigotas e amastigotas intracelulares de L. amazonensis ................................... 68
4.3 Avaliação da citotoxicidade do TC95 pelo método do MTS ..................................... 73
4.4 Análise dos possíveis mecanismos de ação envolvidos na inibição pelo TC 95,
orizalina e trifluralina ..................................................................................................... 74
4.4.1 Avaliação da integridade da membrana plasmática ........................................... 74
4.4.2 Efeitos na morfologia, citoesqueleto e ciclo celular ............................................. 76
4.4.3 Acúmulo de lipídios ................................................................................................ 86
4.4.4 Efeitos na ultraestrutura dos componentes intracelulares ................................. 93
4.5 Avaliação in vivo da miltefosina e trifluralina em modelo murino de leishmaniose
cutânea por L. amazonensis. ......................................................................................... 103
4.5.1 Miltefosina............................................................................................................. 103
4.5.2 Trifluralina ........................................................................................................... 113
5 DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 116
6 CONCLUSÕES .................................................................................................................. 128
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 130
20
1. INTRODUÇÃO
1.1 O gênero Leishmania
1.1.1 Classificação
Os agentes causadores das leishmanioses humanas são protozoários pertencentes ao
Filo Sarcomastigophora, a super classe Mastigophora, à ordem Kinetoplastida, família
Trypanosomatidae e ao gênero Leishmania.
A classificação deste gênero foi, inicialmente, baseada em vários critérios extrínsecos
como as características clínicas, geográficas e biológicas. No entanto, as análises bioquímicas
e moleculares mostraram que o critério patológico e geográfico era inadequado e outros
critérios como o padrão do polimorfismo mostrado pelos marcadores do DNA do cinetoplasto
(kDNA), proteínas ou antígenos poderiam ser usados para classificar este gênero. Desta
forma, critérios imunológicos, bioquímicos e genéticos tem sido usados para classificar as
espécies de Leishmania desde 1970 (BAÑUL ET AL., 2007).
Na tentativa de agrupar as diferentes espécies morfologicamente parecidas que causam
doenças com características clínicas e epidemiológicas tão diferentes dentro de um mesmo
gênero, todas as espécies que são parasitas de mamíferos estão agrupadas em dois subgêneros,
o subgênero Viannia e o subgênero Leishmania (LAINSON E SHAW, 1987), também
classificadas em complexos fenotípicos. No entanto, estes complexos não são unidades
taxonômicas formais, mas são úteis para agrupar as espécies do gênero Leishmania que são
similares (RIOUX ET. AL, 1990). O subgênero Viannia compreende apenas o complexo
Leishmania braziliensis, encontrado nas Américas tropical e subtropical, enquanto o
subgênero Leishmania é constituído pelos complexos Leishmania donovani, Leishmania
mexicana e Leishmania hertighi, encontrados tanto no Velho Mundo como no Novo Mundo.
A espécie que será utilizada neste estudo, Leishmania amazonensis, pertence ao subgênero
Leishmania, e está agrupada no complexo L. (L) mexicana .
21
Os novos métodos de detecção, isolamento e identificação genética resultaram em um
aumento no número de espécies descritas. Atualmente, 30 espécies são conhecidas e destas,
aproximadamente 20, são patogênicas para os homens (BAÑUL ET AL., 2007). No Novo
Mundo, são reconhecidas oito espécies de Leishmania responsáveis pela doença no homem
pertencentes ao subgênero Viannia (V) e Leishmania (L) (GRIMALDI ET AL., 1989).
1.1.2 Morfologia e Ciclo Biológico
O gênero Leishmania agrupa um amplo grupo de protozoários parasitas unicelulares
eucarióticos e heteroxenos. A reprodução ocorre por divisão binária simples nos hospedeiros
vertebrados e invertebrados.
Os hospedeiros vertebrados incluem uma grande variedade de mamíferos. Embora as
infecções por esses parasitos sejam mais comuns nos roedores e canídeos, são conhecidas,
também, entre edentados, marsupiais, procionídeos, ungulados primitivos, primatas e, entre
estes, o homem. Como hospedeiros invertebrados são identificados, exclusivamente, fêmeas
de insetos hematófagos do gênero Lutzomyia no Novo Mundo e do gênero Phlebotomus no
Velho Mundo, conhecidos como flebotomíneos. A transmissão ocorre por um mecanismo
complexo, através da picada do inseto infectado no momento da hematofagia.
Os protozoários deste gênero apresentam dois estágios de desenvolvimento:
promastigota e amastigota. As formas amastigotas (Figura 1A) são parasitos intracelulares
obrigatórios de células do sistema fagocítico mononuclear de seus hospedeiros mamíferos.
Estas formas são exclusivamente intracelulares e pouco móveis, apresentam um corpo
levemente achatado e de contorno ovóide, por vezes elíptico. As amastigotas possuem um
flagelo curto que pouco emerge da bolsa flagelar e pode ser visto apenas por microscopia
eletrônica. O núcleo ocupa cerca de metade do corpo celular apresentando a heterocromatina
disposta juntamente ao envoltório nuclear e um nucléolo central. O cinetoplasto, de aspecto
baciliforme ou curvo, situa-se para diante do núcleo quase sempre tangente a ele.
22
Já as formas promastigotas (Figura 1B), extracelulares e móveis, são fusiformes com a
extremidade anterior mais arredondada e a posterior mais fina, com aproximadamente 14 a 20
µm de comprimento, por 1,5 a 4 µm de largura. Elas possuem um longo flagelo externalizado
na porção anterior do parasito que lhe confere motilidade, o núcleo fica situado em uma
região mediana ou ligeiramente anterior ao corpo e o cinetoplasto mais anterior, próximo à
bolsa flagelar de onde emerge o flagelo, apresentando um aspecto de pequeno bastão. As
formas promastigotas são transmitidas pelo inseto vetor durante o repasto sanguíneo e
também são encontradas no seu trato digestivo
Figura 1. Estágios do desenvolvimento do gênero Leishmania. (A) Forma amastigota encontrada no hospedeiro
vertebrado. (B) forma promastigota encontrada no inseto vetor (REY, 2007)
As formas promastigota e amastigota multiplicam-se por divisão binária longitudinal,
iniciando primeiro a formação de um novo corpúsculo basal, de onde irá imergir o flagelo,
seguido pela divisão do cinetoplasto, núcleo e corpo celular, progredindo no sentido ântero-
posterior. Estes estágios do desenvolvimento sobrevivem e multiplicam-se dentro dos
diferentes ambientes biológicos dos seus respectivos hospedeiros.
No trato digestivo do inseto vetor, o parasito na forma promastigota procíclica possui,
aproximadamente, 10 a 20 µm de comprimento e 2 µm de largura. Aderidas ao epitélio do
intestino-médio, estas formas procíclicas (não infectivas) dividem-se rapidamente num espaço
delimitado pela membrana peritrófica, uma matrix quitinosa que é secretada pelas células
epiteliais do intestino (Figura 2).
23
Gradualmente, os promastigotas procíclicos sofrem modificações morfológicas
apresentando morfotipos característicos, e, finalmente, se diferenciando para promastigotas
metacíclicos (infectivas) que não mais se dividem (Figura 2). Este processo de diferenciação é
denominado de metaciclogênese, que também pode ser descrito como uma pré-adaptação a
sobrevivência dentro do hospedeiro vertebrado (BATES, 1994). Estas formas metacíclicas,
uma vez destacadas das células do epitélio intestinal migram em direção a porção anterior do
aparelho digestivo do inseto. A liberação das formas promastigotas metacíclicas para o
hospedeiro vertebrado ocorre durante o repasto sanguíneo do inseto vetor. Estes
promastigotas resistem à ação lítica pelo complemento e são fagocitados pelas células do
sistema fagocítico mononuclear no local da picada. Uma vez dentro destas células, elas se
transformam nas formas amastigotas, que possuem 2 a 5 µM de comprimento, de corpo
ovóide , sendo capazes de se desenvolver e multiplicar no meio ácido encontrado no vacúolo
parasitóforo. Mantendo o controle das condições ambientais internas do vacúolo, a amastigota
inicia o processo de sucessivas multiplicações. A proliferação destas formas causa a ruptura
dos macrófagos e liberação das amastigotas para o ambiente circundante, onde poderão
infectar os macrófagos vizinhos. Quando o inseto vetor realizar um novo repasto sanguíneo
em um mamífero infectado, ele poderá ingerir as formas amastigotas dos fagócitos. Durante a
digestão deste conteúdo, as amastigotas são liberadas e se diferenciam em promastigotas que
aderem ao epitélio intestinal do inseto escapando assim de serem excretados junto com os
restos da alimentação, completando assim o ciclo infeccioso do parasito (Figura 2).
24
1.2 Leishmania: Características Estruturais
Os protozoários do gênero Leishmania são organismos eucarióticos unicelulares e
apresentam um conjunto de organelas típicas de eucariotos, enquanto outras são peculiares à
ordem, á família e ao seu gênero.
1.2.1 Membrana Plasmática
Similar aos outros organismos, a membrana plasmática dos protozoários do gênero
Leishmania é constituída de proteínas, lipídeos e carboidratos, possuindo um aspecto
trilaminar com espessura de aproximadamente 9 nm (DE SOUZA & BRASIL,1976). Estas
células flageladas e polarizadas possuem domínios de membrana de diferentes composições e
funções. Três domínios podem ser identificados na membrana que envolve o parasito: o
domínio do corpo celular, da bolsa flagelar e do flagelo. Estes domínios são diferenciados
entre si e apresentam uma diversificada distribuição de lipídios e proteínas de superfície. O
domínio do corpo celular possui sua membrana associada aos microtúbulos subpeliculares. Já
no domínio flagelar a membrana envolve os microtúbulos do axonema, enquanto que a
membrana que reveste o domínio da bolsa flagelar não está associada a nenhuma estrutura do
citoesqueleto, pois é por este domínio que ocorrem a via endocítica e exocítica destas células.
25
Figura 2. Ciclo de vida da Leishmania (adaptado de
http://www.stanford.edu/class/humbio153/ImmuneEvasion/index.html). O inseto vetor no momento do seu
repasto sanguíneo ingere formas amastigotas do hospedeiro vertebrado infectado. Estas formas diferenciam-se
para formas promastigotas procíclicos que se proliferam no intestino médio, ao longo do intestino estas se
diferenciam para formas metacíclicas, a forma que será transmitida pelo inseto durante o repasto sanguíneo. No
hospedeiro vertebrado, as promastigotas metacíclicas são fagocitadas pelos macrófagos e diferenciam-se para
formas amastigotas no interior do vacúolo parasitóforo. As formas amastigotas irão se proliferar, lisar o
macrófago e liberar estas formas para infectar novas células ou serem ingeridas por insetos vetores.
26
Quanto à composição lipídica das membranas, estudos em L. donovani mostraram que
os lipídios totais desta espécie correspondem a 70 % de fosfolipídeos, 20 a 25 % de lipídeos
neutros e 5 a 10% de glicolipídeos. Das várias frações de lipídeos neutros, 60 %
correspondem a esteróis e 30 % a diacilglicerídeos. Em relação a composição de fosfolipídeos
da membrana plasmática estudos mostram a presença de 15 % de fosfatidilcolina (PC), 37 %
de fosfatidiletanolamina (PE), 18 % de fosfatidilinositol (PI) e 10 % de fosfatidilserina (PS)
(WASSEF ET AL., 1985).
1.2.2 Citoesqueleto
O citoesqueleto dos tripanossomatídeos inclui os microtúbulos subpeliculares, o
axonema flagelar e os corpúsculos basais.
Os microtúbulos subpeliculares participam da determinação da forma das células e,
também, conferem rigidez ao corpo celular, pois formam uma gaiola que protege o parasito de
estresses mecânicos (GULL, 1999). Eles revestem completamente o corpo celular dos
tripanossomatideos, exceto na região da bolsa flagelar e estão intimamente conectadas entre
si, à membrana plasmática e a outras organelas através de finos filamentos. Ainda não se
conhece a natureza destes filamentos, embora algumas proteínas associadas aos microtúbulos
já tenham sido identificadas (DE SOUZA ET AL., 1978).
Nos tripanossomatideos estes microtúbulos são formados por 13 protofilamentos
típicos. Sua estrutura pode ser composta por diferentes isoformas de tubulina estáveis que não
se desfazem nem durante o ciclo celular. Este denso arranjo de microtúbulos subpeliculares é
formado por até 100 feixes interligados por proteínas associadas aos microtúbulos (MAPs),
que revestem todo o corpo celular. O número destes microtúbulos pode variar de acordo com
as regiões do corpo do protozoário. Assim, existe um fino controle da polimerização dos
microtúbulos conectados ao aumento do diâmetro das células, provavelmente, devido à
inserção de novos componentes na membrana plasmática (VEDRENNE, 2002).
27
Além dos microtúbulos, o citoesqueleto de formas promastigotas e amastigotas de
Leishmania possuem actina, uma proteína que participa diretamente na morfologia celular e
em processos de motilidade, contratilidade e transporte celular em todos os eucariotos
(REISLER, 1993). Em Leishmania esta proteína foi observada em diferentes partes do
parasito como flagelo, bolsa flagelar, núcleo, cinetoplasto, membrana plasmática e associada
aos microtúbulos subpeliculares (SAHASRABUDDHE ET AL., 2004)
O flagelo é uma estrutura encontrada em ambos os estágios do desenvolvimento das
espécies de Leishmania, no entanto apresenta variações dependendo do estágio celular. Este
flagelo possui uma estrutura básica similar àquela encontrada em outros tipos celulares, com
nove pares de microtúbulos periféricos e um par central formando o axonema. O flagelo surge
a partir de um corpúsculo basal que se conecta a membrana do cinetoplasto, através de
pequenos filamentos, e emerge da bolsa flagelar (GULL, 1999). O corpúsculo basal é
responsável pela nucleação dos microtúbulos do axonema flagelar.
O tamanho do flagelo depende do estágio morfológico dos parasitos, e, também, pode
variar de acordo com os morfotipos da promastigota. As formas promastigotas possuem um
longo flagelo que emerge diretamente da bolsa flagelar na porção anterior da célula e
apresenta uma estrutura protéica associada ao axonema, que é denominada de estrutura
paraflagelar. É por meio do flagelo que estas formas se aderem ao intestino do inseto vetor. A
forma amastigota possui um flagelo pouco móvel, que pouco se exterioriza da bolsa flagelar
(GLUEZ ET AL. 2010; DE SOUZA, 2008).
Associado ao flagelo existe uma série de proteínas denominadas de proteínas
associadas ao flagelo, as FAPs (do inglês “flagellum associated proteins”). As principais
FAPs estão associadas à estrutura paraflagelar e são encontradas em Leishmania, T. cruzi e T.
brucei (GULL, 2003).
28
Junto ao flagelo encontra-se a estrutura paraflagelar, uma rede filamentosa protéica,
que corre ao longo do axonema, saindo a partir da bolsa flagelar. Esta estrutura esta presente
em quase todos os membros da ordem Kinetoplastida, exceto nos parasitos monogenéticos
que possuem endossimbionte (DE SOUZA & MOTTA, 1999). Nos tripanossomatídeos as
formas amastigotas não possuem a estrutura paraflagelar embora possuam um flagelo. O
papel da estrutura paraflagelar está associada à motilidade e adesão ao epitélio via flagelo nos
estágios no inseto vetor. (MAGA, 1999). Em cortes transversais, três regiões são observadas:
proximal, intermediária e distal (relativa ao axonema) (FARINA ET AL., 1986)
1.2.3 Mitocôndria e Cinetoplasto
A mitocôndria dos tripanossomatídeos é peculiar em comparação a dos organismos
multicelulares. Estes tripanossomatídeos apresentam uma mitocôndria única e ramificada
abaixo dos microtúbulos subpeliculares apresentando-se dilatada na região onde o DNA
mitocondrial (kDNA) está presente. Possui uma matrix densa e espaçada, cristas tubulares e
finas distribuídas irregularmente. Em algumas espécies do gênero Leishmania é possível
observar um grande número de cristas mitocondriais (RODRIGUES & DE SOUZA, 2008).
A respiração mitocondrial ocorre via cadeia transportadora de elétrons através de
quatro complexos localizados na membrana mitocondrial interna. Os complexos I, III e IV
funcionam como bombas de prótons H
+
gerando um gradiente eletroquímico que direciona a
síntese de ATP na F0F1 ATPsintase, acoplando assim a respiração e a fosforilação oxidativa
(RODRIGUES ET AL., 2007; SEN & MAJUMDER, 2008; ROY, 2008). Similar ao que
ocorre em células de mamíferos, stress celulares que causam danos celulares e mitocondriais
disparam a cascata de sinalização para o processo de morte celular por apoptose, pois já foram
descritos megacanais mitocondriais envolvidos no processo de apoptose direcionando a
liberação de moléculas mitocondriais responsáveis pelo inicio do processo apoptótico
(ARNOULT ET AL., 2002).
29
Dependendo do ambiente e das fontes nutricionais disponíveis, a mitocôndria pode
ocupar um grande espaço no citoplasma. Por apresentarem processos metabólicos
dependentes, a relação estrutural e variações metabólicas no tamanho da mitocôndria e
glicossomos dependem da fonte nutricional disponível. Quando a glicose é a maior fonte de
carbono, a mitocôndria ocupa um volume relativamente menor na célula, enquanto os
glicossomos são mais numerosos. Além das variações no volume da organela, os números das
cristas e os níveis das enzimas mitocondriais podem variar (SEN & MAJUMDER, 2008).
Em uma determinada região da mitocôndria, localizada próxima ao corpúsculo basal, a
matriz apresenta um complexo arranjo de fibrilas de DNA conhecido como cinetoplasto
(kDNA). Esta estrutura é utilizada para definir todos os protozoários pertencentes à ordem
Kinetoplastida. O kDNA representa aproximadamente 30% do total do DNA celular e está
localizado dentro da matrix mitocondrial. A estrutura é fisicamente ligada ao corpúsculo basal
e é posicionada perpendicularmente ao eixo do flagelo e também a membrana da mitocôndria
(GULL, 1999). A forma do cinetoplasto e o arranjo do kDNA varia de acordo com as espécies
e com o estágio de desenvolvimento. Nos protozoários do gênero Leishmania, o cinetoplasto
tem forma de bastão. Nas promastigotas e amastigotas se localiza na região anterior do corpo
celular próximo a bolsa flagelar (MOTTA, 2008).
1.2.4 Glicossomos
Inicialmente, estas organelas eram conhecidas como microcorpos, mais tarde foram
denominadas de peroxissomos, em células de mamíferos, e em tripanossomatídeos,
glicossomos (OPPERDOES 1987; DE SOUZA, 1984; DE SOUZA, 2002).
O nome glicossomo foi usado pela primeira vez quando descobriu-se que estes
microcorpos possuíam as enzimas da via glicolítica. Pela primeira vez, se descrevia em um
organismo a via glicolítica em um compartimento envolto por membrana, constituindo assim
uma nova organela com alvo em potencial para a produção de novos quimioterápicos para
30
doenças causadas por membros da Família Trypanosomatidae. Hoje em dia, relatos recentes
mostram que além das enzimas da via glicolítica, outras enzimas já foram encontradas nos
peroxissomos e glicossomos envolvidas em diferentes vias metabólicas como: metabolismo
de peróxido, β-oxidação de ácidos graxos, gliconeogênese, biossíntese de lipídeos, biossíntese
de pirimidinas, aproveitamento de purinas e dentre outras (OPPERDOES & SZIKORA,
2006).
Os glicossomos são organelas esféricas delimitadas por uma membrana única, com um
diâmetro de cerca de 0,7 µm. O número e a área ocupada por eles no citoplasma dos
tripanossomatideos varia de acordo com a espécie e o estágio do desenvolvimento do parasito
(SOUZA, 2002)
1.2.5 Acidocalcissomos
São organelas acídicas, que estocam cálcio, encontradas em diversos organismos
dentre eles os tripanossomatídeos. Em espécies de Leishmania, a morfologia dos
acidocalcissomos pode variar de uma forma esférica à alongada, medindo aproximadamente
0,6 µm de comprimento, distribuídos randomicamemte dentro da célula (MIRANDA ET AL.,
2004).
Os acidocalcissomos de protistas são importantes armazenadores de fósforo (Pi, PPi e
poli P), cálcio, magnésio, sódio, potássio e outros cátions combinados com os polifosfato para
estocagem. Estas organelas, também, são responsáveis por assumir os mecanismos de
osmoregulação essenciais para a sobrevivência dos tripanossomatideos durante a transmissão
de um hospedeiro invertebrado para um vertebrado. Além da osmoregulação, da resposta ao
stress e da virulência, os acidocalcissomos parecem, também, auxiliar na regulação do pH
intracelular (DOCAMPO ET AL., 2005).
31
1.2.6 Outras organelas
Os tripanossomatídeos apresentam o seu réticulo endoplasmático (RE) e complexo de
Golgi (CG) com as mesmas funções das outras células eucarióticas superiores. O sistema RE-
CG está diretamente envolvido na síntese e processamento de muitas proteínas que possuem
papeis importantes na fisiologia dos protozoários.
Ultraestruturalmente, o RE está contínuo com a membrana externa do envelope
nuclear e associado a um sistema de cisternas ou membranas tubulares que estão associados à
membrana plasmática. Na membrana nuclear das formas promastigotas de Leishmania, além
do RE rugoso, existem frações do RE liso, sugerindo que a porção nuclear do RE compreende
mais de um domínio. Os tripanosomatídeos possuem uma porção especializada do RE, o RE
transicional (REt) que está diretamente posicionado próximo ao complexo de Golgi e perto da
bolsa flagelar; este é o local principal onde proteínas e lipídios são exportados para o CG.
Muitas proteínas destinadas para a superfície celular ou para os lisossomos de
tripanossomatídeos são, inicialmente, encontradas no reticulo endoplasmático. O RE é,
também, o local de síntese de muitos dos fosfo e glicerolipídeos de membrana
(MCCONVILLE ET AL., 2002).
Como em outros eucariotos o único complexo de Golgi dos tripanossomatideos é
formado por uma pilha de 3 a 10 cisternas com uma rede trans-Golgi polimórfica. O
transporte através do complexo de Golgi pode ser por duas vias: transporte vesicular entre as
cisternas ou maturação e o progressivo movimento de cisternas em direção a face trans do
Golgi (cisterna de maturação). Uma característica importante do CG, diferente do observado
para os eucariotos superiores, é que ele não se desfaz durante o ciclo celular, mas se alonga e
começa a se dividir a partir do meio das cisternas (MCCONVILLE ET AL., 2002).
A Leishmania possui um compartimento túbulo-multivesicular, que é uma única
estrutura lisossomal/ endossomal envolvida no tráfico de macromoléculas e constitui uma
32
importante estação da via endocítica. Esta estrutura tubular contém serino e cisteíno
peptidases que se extendem desde a bolsa flagelar até a parte posterior da célula. A estrutura
multivesicular comporta-se como lisossomos maduros em promastigotas de fase estacionária
(DOYLE, 2008)
Os megassomos foram, primeiramente, descritos no citoplasma de formas amastigotas
do complexo L. mexicana. Estas organelas são estruturas eletron-densas envoltas por
membrana. Seu nome é devido ao seu grande tamanho, que pode ser maior que o núcleo da
célula, entretanto são organelas com dimensões variadas que também podem ser encontradas
na porção posterior do protozoário (UEDA-NAKAMURA ET AL., 2001)
Durante muitos anos acreditou-se que esta organela estaria presente apenas em
espécies do complexo L. mexicana, com função muito semelhante àquela desempenhada pelos
lisossomos das células de mamíferos dentro do sistema endocítico (PUPKIS ET AL., 1986;
ANTOINE ET AL., 1988). No entanto, esta organela já foi encontrada em formas amastigotas
de L. chagasi (ALBERIO ET AL., 2004), uma espécie pertencente ao complexo L. donovani.
Estas organelas são ricas em cisteíno proteinases que desempenham papel importante
na sobrevivência das formas amastigotas no interior dos macrófagos, patogênese, modulação
da resposta imune do hospedeiro e na transformação de formas promastigotas para
amastigotas (UEDA-NAKAMURA ET AL., 2001).
1.2.7 Núcleo
O núcleo é arredondado medindo cerca de 2,5 µm. Apresenta uma membrana nuclear
típica com densidade dos poros variável e a membrana externa apresenta continuidade com o
retículo endoplasmático. Diferente do que ocorre com as células de mamíferos, a membrana
nuclear dos tripanossomatídeos permanece íntegra durante a divisão celular, caracterizando
assim uma mitose do tipo fechada. Em células interfásicas a cromatina apresenta-se na
periferia do núcleo e, também, dispersa pela matrix nuclear. Os cromossomos não se
33
condensam em nenhum estágio do ciclo de vida. Durante a mitose, a cromatina está dispersa e
o núcleo apresenta uma aparência mais homogênea (DE SOUZA, 2008).
1.3 A Leishmaniose
1.3.1 Histórico no Brasil
As leishmanioses já eram conhecidas, desde antes do início do século XX, como um
grupo de doenças dermatológicas muito semelhantes entre si e com apresentação clínica
associada a lesões cutâneas, geralmente ulcerosas e por vezes comprometendo, também a
mucosa oronasal e as vísceras (RABELLO, 1925; PESSOA ET AL., 1948; PESSOA, 1958).
Entre 1880 e 1930, ocorreram no Brasil surtos de leishmaniose associados ao ciclo econômico
da borracha, às fazendas cafeeiras e ao crescimento das cidades brasileiras. Mas a medicina da
época incluía essa nova doença. nas manifestações clínicas da lepra, lúpus, sífilis ou
tuberculose, que, também, afetavam endemicamente o país. Nesse período, entre os agentes
de saúde que lutaram pela conscientização do povo quanto à leishmaniose, destacam-se:
Sommer, Breda, Austregésilo, Moreira, Pupo, Pirajá da Silva, Oswaldo Cruz, Carlos Chagas,
Evandro Chagas, Gaspar Vianna e Eduardo Rabello, entre outros. A partir de 1914, Gaspar
Vianna introduziu, com sucesso, o tratamento da leishmaniose pelo tártaro emético
(antimonial), utilizado também na tripanossomíase africana (D´UTRA E SILVA, 1915;
VIANNA, 1914).
1.3.2 Aspectos epidemiológicos
A leishmaniose compreende um complexo de doenças causadas por diferentes
espécies de protozoários do gênero Leishmania, apresentando vasta distribuição geográfica,
sendo classificada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como uma das seis doenças
tropicais mais importantes da atualidade.
34
A leishmaniose é endêmica em 88 países tropicais e subtropicais, onde 350 milhões de
pessoas encontram-se em área de risco, e aproximadamente 12 milhões de pessoas estão
infectadas por uma das 20 espécies distintas de Leishmania, (DESJEUX, 2004). Anualmente,
morrem 70.000 indivíduos, em decorrência desta doença. Dados da OMS (2004) mostram que
50-75% dos casos são de leishmaniose cutânea e 25-50% de leishmaniose visceral.
Aproximadamente 90% dos casos de leishmaniose cutânea estão distribuídos no Afeganistão,
Paquistão, Algéria, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria e 90% dos casos de leishmaniose
visceral em Bangladesh, Brasil, Índia, Nepal e Sudão (MURRAY, 2005). A maior incidência
de casos de leishmaniose ocorre entre os países de Terceiro Mundo, associada,
principalmente, ao baixo nível sócio-econômico, ao desmatamento florestal, às mudanças no
meio ambiente e migrações de populações para regiões endêmicas (BAILY & NANDY,
1994).
Na Europa, casos de co-infecção Leishmania/HIV mudaram o quadro epidemiológico
da doença, sendo considerada assim a terceira doença oportunista de maior freqüência em
pacientes com SIDA (DESJEUX, 2004).
Na América Latina, as leishmanioses cutânea e visceral estão em grande expansão,
principalmente no Brasil aonde o número de casos vem crescendo exponencialmente,
principalmente nos grandes centros urbanos. Nas regiões endêmicas, este aumento é ainda
mais significativo onde se estima um número de pelo menos 100 pacientes infectados por 100
mil habitantes (MS, FNS, CNE – Brasil, 1999). No ano de 2000 foram registrados 3779 novos
casos de leishmaniose visceral humana em 18 estados brasileiros e estima-se, que para cada
caso humano, há uma média de pelo menos 200 cães infectados (FUNASA, 2002). Por outro
lado, foram notificados cerca de 40.000 doentes com leishmaniose cutânea no país
(DESJEUX, 2001; FUNASA, 2002; GRIMALDI ET AL., 1989).
35
A leishmaniose é uma doença de grande impacto social uma vez que a patologia desta
enfermidade esta associada à deformidades e cicatrizes desfigurantes causadas por algumas
espécies de Leishmania, bem como incapacidades relacionadas à doença, impondo grande
carga social, obstruindo a produtividade e o desenvolvimento sócio econômico do país
(DESJEUX, 2004).
1.3.3 Formas Clínicas da Leishmaniose
Nas leishmanioses a porta de entrada é sempre a mesma, o macrófago tecidual é o
alvo, a inflamação e a imunidade ativada por macrófagos regulam a expressão da doença e a
persistência do parasito é regra apesar da cura espontânea ou induzida por tratamento
(MURRAY, 2005).
A evolução da doença depende da natureza da resposta imune do hospedeiro, bem
como de fatores intrínsecos ao parasito expressos, em geral, de maneira distinta entre as
espécies de Leishmania. A infecção apresenta uma evolução crônica, podendo se manifestar
com lesões cutâneas localizadas ou disseminadas, ou comprometer outros tecidos e órgãos,
como baço, fígado, linfonodos e medula óssea, na forma mais grave e fatal que é denominada
de calazar. As variadas formas clínicas se diferem pelas propriedades do parasito: temperatura
de crescimento, tropismo tecidual, capacidade de imunoevasão e persistência.
As manifestações clínicas da doença estão, principalmente, associadas às diferentes
espécies de Leishmania, sendo que, no continente americano elas podem ser divididas em
dois grupos principais: Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e a Leishmaniose
Visceral Americana (LVA). A LTA denomina-se assim porque afeta, principalmente, a
estrutura da pele e, excepcionalmente, das mucosas das vias aéreas superiores, incluindo uma
variedade de formas, usualmente denominadas em função de suas características clínicas:
36
Leishmaniose Cutânea (LC), Leishmaniose Mucocutânea (LMC) e a Leishmaniose Cutânea-
Difusa (LCD) (ALTAMIRANO-ENCISO, 2003).
A LC causada pela L. mexicana, L. tropica e pela L. major apresenta lesão de pele,
única, ulcerada ou não, em partes expostas do corpo, como braços, pernas e faces, que podem
curar-se espontaneamente. Por outro lado, a LMC causada pela L. braziliensis, é uma forma
progressiva da leishmaniose cutânea apresentando-se como lesão crônica (única ou múltipla),
secundária e destrutiva em mucosas (nariz, boca e faringe). A LCD é a forma sistêmica e
anérgica da leishmaniose tegumentar, carcterizada por lesões cutâneas metastáticas e com
sinais de imunossupressão específica. No Brasil, seis espécies de Leishmania são causadoras
da LC. Segundo a OMS 90% dos casos de leishmaniose mucocutânea do mundo ocorrem no
nosso país.
A leishmaniose visceral (LV) causada principalmente por L. donovani, L. infantum e
L. chagasi, é a forma sistêmica da doença, caracterizada por febre irregular, perda de peso,
anemia, hepatoesplenomegalia. Atinge o fígado, baço, medula óssea e linfonodos, em
decorrência do viscerotropismo do parasito. Esta forma da doença pode levar a morte caso
não seja tratada.
A leishmaniose dérmica pós-calazar é uma manifestação cutânea da leishmaniose
visceral, caracterizada por lesões na pele, nódulos e pápulas, freqüentemente na face. Esta
forma pode aparecer de 2 a 7 anos após o tratamento com os antimoniais pentavalentes, sendo
muito difícil de tratar. Os primeiros casos relatados foram a partir da LV causada por L.
donovani na Índia e Sudão, mas já existem alguns casos já relatados após infecção por L.
infantum e L. chagasi (CROFT, 2008).
37
1.3.4 A Quimioterapia da Leishmaniose
Os fármacos recomendados para o tratamento das leishmanioses, os antimoniais
pentavalentes, foram introduzidos na clínica há cerca de 60 anos atrás. No decorrer das
últimas décadas, novos fármacos ou formulações a partir de moléculas já existentes têm sido
avaliados e registrados para uso em alguns países (CROFT ET AL., 2006).
Atualmente, o tratamento das leishmanioses ainda é baseado no uso dos antimoniais
pentavalentes, complexados a carboidratos, na forma de estibogluconato de sódio (Pentostan)
e antimoniato de meglumina (Glucantime). Entre outros fármacos utilizados para o tratamento
das leishmaniose estão: anfotericina B, pentamidina, paramomicina, sitamaquina e outros
fármacos já utilizados para outras enfermidades. A miltefosina foi o primeiro fármaco oral
efetivo para o tratamento da leishmaniose cutânea na Colômbia e visceral na Índia e
Alemanha (SOTO ET AL., 2004; SUNDAR ET AL., 2002).
1.3.4.1 Os Antimoniais Pentavalentes
Em 1912, Gaspar Vianna relatou a atividade leishmanicida do tartarato duplo de
antimônio e potássio (tártaro emético). Estudos seguintes levaram à introdução de outros
derivados de antimônio, como estibogluconato de sódio.
O Glucantime (o antimoniato de meglumina) tem sido usado no Brasil e em outros
países da América Latina. A forma de administração e a dose podem variar, mas geralmente a
via de administração é parenteral (CROFT E COOMBS, 2003). A eficácia terapêutica pode
variar de um país para outro, sendo, portanto, indicado pela OMS a adequação do tratamento
de acordo com a área geográfica (CARVALHO ET AL., 2000).
Os antimoniais pentavalentes são pró-drogas, que requerem a redução do antimônio
pentavalente (Sb
5+
) a antimônio trivalente (Sb
3+
) por ação de enzimas do parasito. Esta
ativação ocorre seletivamente nas formas amastigotas mostrando que somente a enzima
expressa na forma amastigota é capaz de ativar a pró-droga. O mecanismo de ação exato
38
destes fármacos ainda não está claramente entendido. Altas concentrações dos antimoniais
trivalentes têm inibido o catabolismo da glicose (BERMAN ET AL., 1987) e a oxidação dos
ácidos graxos nas formas amastigotas (BERMAN ET AL., 1989; GOTO & LINDOSO, 2010).
Variações na resposta clínica ao tratamento das LV, LC e LMC com os antimoniais
pentavalentes têm sido um problema no tratamento das leishmanioses. O longo curso de
tratamento provoca um acúmulo do fármaco em tecidos como baço e fígado, além de causar
artralgia, mialgia, pancreatite, arritmia cardíaca e hepatite, que podem levar à redução ou
mesmo abandono do tratamento (CROFT E YARDLEY, 2002).
Dados da literatura vêm demonstrando casos de resistência adquirida a estes
compostos. Resistência ao tratamento com os antimoniais é um problema, especialmente em
Bihar, Índia, e em partes de Bangladesh. A percentagem de cura está abaixo de 50% quando
comparada com o normal que era de 90%. Esta resistência pode ser ativada por vários
mecanismos como: redução na ativação, aumento dos níveis da tripanotiona e aumento do
efluxo do fármaco através da ativação de uma bomba de transporte metal-thiol (CROFT ET
AL., 2006; LE PAPE, 2008).
1.3.4.2 Anfotericina B
A anfotericina B é um antibiótico poliênico macrolídeo, caracterizado por uma porção
hidrofílica polihidroxil e uma porção poliênica hidrofóbica, utilizada desde 1960 como
segunda escolha para o tratamento das leishmanioses. Este composto tem atividade contra
fungos, bem como para Leishmania. Este medicamento é recomendado para o tratamento de
todas as formas clínicas das leishmanioses e embora seja considerado bastante tóxico,
principalmente para o sistema renal, ainda causa outros graves efeitos colaterais como
anafilaxia, trombocitopenia, dores generalizadas, calafrios, febre, anemia, convulsões e
anorexia (BERMAN ET AL., 1986a, 1986b; CARVALHO ET AL., 2000).
39
Este fármaco se complexa ao ergosterol na membrana celular da Leishmania formando
poros que levam a um efluxo de componentes e, consequentemente, à lise do parasito (LE
PAPE, 2008).
Novas formulações lipídicas deste antibiótico têm surgido desde a década passada,
como a anfotericina B associada a lipossomas (AmBisome®) utilizada pela primeira vez em
1991, apresentando em geral baixa toxicidade e alto índice terapêutico dentre as formulações
já testadas (CROFT & YARDLEY, 2002). A vantagem da utilização da forma lipossomal é a
possibilidade da administração de altas doses com reduzidos efeitos locais. O grande
problema quanto ao uso da anfotericina B é o alto custo (forma lipossomal), a necessidade da
administração parenteral em hospitais e os longos períodos de tratamento (SUNDAR, 2001).
Inicialmente, houve uma expectativa de que esta nova formulação poderia atuar no
tratamento de pacientes com LV co-infectados com o vírus HIV na Europa. Embora ocorra
uma cura inicial em 100% dos casos, dados demonstram que, invariavelmente, ocorrem
recaídas em 50% dos casos (DAVIDSON & RUSSO, 1993).
Casos de resistência a anfotericina B são raros, no entanto, quando ocorrem, em geral
é resultado de uma redução da concentração de ergosterol na membrana ou substituição por
outro esterol alterado a partir do ergosterol ao qual o fármaco não possui afinidade (FRIES &
FAIRLAMB, 2003).
1.3.4.3 Pentamidina
Na Colômbia, Índia, Quênia e no Brasil têm-se utilizado a pentamidina, uma
diamidina aromática, como terapia de segunda escolha nos casos de LC refratários ao
tratamento com os antimoniais. As diamidinas são compostos orgânicos sintéticos que
apresentam atividade antitumoral e antiparasitária, sendo usadas no tratamento das
leishmanioses desde 1939, apresentando bons resultados contra leishmaniose visceral em
humanos na Índia e na África. Sua atividade leishmanicida está baseda na inibição da
40
biossíntese de poliaminas (FRIES & FAIRLAMB, 2003), alterações na mitocôndria e no
cinetoplasto levando ao colapso do potencial de membrana mitocondrial (VERCESI &
DOCAMPO, 1992).
A Pentamidina é administrada por via parenteral, acumulando-se no fígado e no rim.
Sua toxicidade tem sido um fator de limitação de seu uso, podendo causar hipoglicemia,
diabetes, nefrotoxicidade, taquicardia, mialgia, hipotensão, dores de cabeça e náuseas
(BERMAN, 1997).
1.3.4.4 Paramomicina
A paramomicina é um antibiótico da família dos aminoglicosídeos, originalmente
desenvolvido como agente bactericida, mas também apresentando atividade contra outros
protozoários como Entamoeba e Cryptosporidium (CROFT & YARDLEY, 2002). Este
medicamento tem sido administrado através de aplicações parenterais e tópicas para o
tratamento da leishmaniose tegumentar. Desde agosto de 2006, a paramomicina é utilizada na
Índia como uma nova alternativa para o tratamento da LV, em outros países ainda se encontra
em testes de fase clínica. As formulações tópicas deste fármaco, também estão sendo
amplamente testadas para as formas cutâneas graves da doença. O efeito citotóxico para o
parasito está associado a sua ligação aos polissomos, levando à inibição da síntese de
proteínas (FRIES & FAIRLAMB, 2003).
As triagens clínicas na Índia e no Quênia têm demonstrado que o uso deste antibiótico
em combinação com os antimoniais pentavalentes, resulta em um efetivo tratamento de casos
não responsivos da leishmaniose. O principal efeito colateral da paramomicina é a
nefrotoxicidade e os danos ao oitavo nervo craniano resultando na perda da audição
(SUNDAR, 2007; FRIES & FAIRLAMB, 2003).
41
1.3.4.5 Sitamaquina
A sitamaquina, uma 8-aminoquinolina (WR 6026; Lepidine ®) é outro fármaco que
deve apresentar um grande potencial para o tratamento da LV. Atualmente, está em fase II de
triagem clínica na Índia e no Quênia como um novo tratamento oral para leishmaniose
visceral (WASUNNA ET AL., 2005 , JHA ET AL., 2005). O tratamento da leishmaniose
visceral com sitamaquina por 28 dias foi eficaz e bem tolerado na dose de 2 mg/kg/dia quando
avaliado em 61 pacientes no Quênia. No Brasil 67% dos pacientes foram curados de LV
quando tratados com 2 mg/Kg/dia durante 28 dias (DIETZE ET AL., 2001). Foi comprovada,
também a eficácia das formulações tópicas da sitamaquina em modelos in vitro e in vivo de
leishmaniose cutânea (CROFT ET AL., 2006).
Este fármaco é um análogo da primaquina, originalmente desenvolvido contra malária
pelo Walter Reed Army Institute of Research (EUA). Tem sido descrito que o uso da
sitamaquina altera a morfologia do parasito, o potencial da membrana mitocondrial e
promove, também a alcalinização dos acidocalcissomos (VERCESI ET AL., 2000).
1.3.5 Novas opções terapêuticas
1.3.5.1 Alquilfosfolipidios: miltefosina e seus análogos
Os primeiros análogos metabolicamente estáveis da lisofosfatidilcolina foram
sintetizados no final de 1960, com objetivo principal de se identificar novos compostos
imunomoduladores. Para a produção de análogos metabolicamente resistentes
acetiltransferases e lisofosfolipases, os carbonos C1 e C2 da cadeia do glicerol na molécula da
lisofosfatidilcolina foram alterados trocando as ligações ésteres por éteres. Dentre estes novos
compostos sintetizados foi encontrado a edelfosina com potente atividade antitumoral in vitro
e in vivo. No entanto, os testes clínicos mostraram uma eficácia reduzida. Atualmente, a
42
edelfosina é utilizada apenas para o tratamento de leucemia aguda (BLITTERSWIJK E
VERHEIJ, 2008)
No final do ano de 1980, Eibl e Unger sintetizaram a hexadecilfosfocolina, miltefosina
(Figura 3A) que diferente dos primeiros análogos perdeu toda a estrutura da cadeia do
glicerol, acarretando na produção dos alquilfosfolipidios. Os testes clínicos iniciais como
antitumoral sistêmico falharam, mas este apresentou atividade antitumoral tópica. Este
fármaco possui propriedades hemolíticas quando administrado pela via intravenosa, mas
também pode ser administrado por via oral. A miltefosina foi subsequentemente testada in
vitro contra os parasitos do gênero Leishmania (ACHTERBERG & GERCKEN, 1987A;
CROFT EL AL., 1987) e foi neste contexto do uso por via oral que a miltefosina foi mais
eficaz para tratamento das leishmanioses (BARRATT, 2009).
O mecanismo de ação dos APLs é diferente das drogas clássicas, uma vez que seus
alvos moleculares estão localizados primeiramente nas membranas celulares. Esta
seletividade pela membrana plasmática se deve à sua estrutura química, uma cabeça colina
polar e uma longa cadeia hidrocarbônica apolar, que facilmente se inserem dentro da
bicamada lipídica, apresentando propriedades detergentes que levam à lise celular em altas
concentrações (BLITTERSWIJK & VERHEIJ, 2008). O exato mecanismo de ação da
miltefosina é desconhecido. Em culturas celulares de mamíferos, os efeitos são,
principalmente, na transdução de sinal, metabolismo de lipídios e homeostase de cálcio
(RAKOTOMANGA ET AL., 2007).. Sua ação em parasitos também inclui a interferência na
via de transdução de sinais, na biossíntese das âncoras de glicosilfosfatidilinositol e, também
na biossintese de esteróis. Em L. donovani e T. cruzi um dos principais efeitos da miltefosina
é sobre a via de biossíntese de fosfatidilcolina (via de Greenberg,), sendo sua ação mais
seletiva para a via de síntese dos protozoários que a de mamíferos (via de Kennedy) (LIRA
ET AL., 2001, SARAIVA ET AL., 2002)
43
Nas espécies de Leishmania existem estudos que mostram que os possíveis alvos
celulares da miltefosina e outros análogos de fosfolipídios são alterações mitocondriais,
células multinucleadas, alterações na membrana plasmática, formação de estruturas
autofágicas, alterações celulares sugestivas de morte por apoptose (SANTA-RITA, ET AL.,
2004).
Em testes in vivo em modelos murinos de infecção visceral por L. donovani e L.
infantum, após quatro semanas de tratamento com a miltefosina nas doses de 10 e 20
mg/kg/dia por via oral, os animais apresentaram uma redução na carga parasitária nos
principais órgãos infectados superior aos tratados com o Pentostam (KUHLENCORD,1992).
Após as evidências da excelente atividade leishmanicida da miltefosina demonstradas
in vitro e in vivo, testes clínicos começaram a ser imediatamente realizados. Assim, a
miltefosina foi o medicamento mais recente aprovado para o tratamento das leishmanioses e
vem sendo usado como fármaco de primeira escolha para o tratamento de leishmaniose
visceral, principalmente na Índia (SUNDAR ET AL., 2002; CROFT ET AL., 1987).
O uso da miltefosina trata-se de uma importante inovação no tratamento das
leishmanioses, pois apresenta a grande vantagem da administração por via oral, atuando de
forma eficiente e com baixa toxicidade em pacientes que variam de recém-nascidos a idosos
(SINDERMAN ET AL., 2004). Os principais efeitos colaterais ocorrem no sistema
gastrointestinal e em doses elevadas é considerada teratogênica (acima de 150 mg/dia)
(SINDERMANN & ENGEL, 2006). Para casos de leishmaniose cutânea, sua eficácia foi
descrita apenas na Colômbia em pacientes infectados com L. panamensis, onde foi obtido
uma cura de 91 %, enquanto que na Guatemala, em regiões onde as infecções ocorrem,
principalmente, pelas espécies L. braziliensis e L. mexicana, a taxa de cura foi de 53 %. O
Brasil, assim como a Guatemala, não verificou resultados muito eficazes com o uso da
miltefosina, alcançando falha terapêutica em 50% dos casos de pacientes avaliados, no
44
entanto são poucos os relatos sobre sua eficácia nas espécies de Leishmania do Novo Mundo,
necessitando-se de novos estudos (SOTO ET AL., 2004).
Atualmente, inúmeros casos de resistência têm sido relatados em pacientes tratados
com miltefosina, devido, principalmente ao seu longo tempo de meia-vida (100-200h). Na
Índia, onde a leishmaniose visceral é uma antroponose, os casos são mais freqüentes em
relação aos locais onde esta enfermidade é uma zoonose. Assim, novas estratégias
terapêuticas estão sendo estudadas para a melhora do tratamento. O uso da terapia de
combinação de drogas entre a miltefosina, anfotericina B e a paramomicina está em
andamento e com sucesso em testes clínicos na Índia e África (SUNDAR, 2008). Outra
estratégia, também utilizada é sintetizar in silico novos APLs usando a estrutura química da
miltefosina como modelo (CALOGEROPOULOU ET AL., 2008, PAPANASTASIOU ET
AL., 2010).
1.3.5.2 Dinitroanilinas: trifluralina e orizalina
As dinitroanilinas são compostos que, inicialmente, foram utilizados como herbicidas,
pois inibem seletivamente a polimerização de tubulina de plantas. Estudos mostram que o
tratamento de plantas com as dinitroanilinas como a trifluralina (Figura 3B) e orizalina
(Figura 3C) causam alterações morfológicas como multinucleação, acúmulo das células em
metáfase e perda de microtúbulos na parte final das raízes, uma região das plantas que exibe
altas taxas de divisão celular. Interessantemente, esta classe de compostos, também inibe o
crescimento, a diferenciação e a despolimerização de microtúbulos de protozoários como
Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium falciparum e Toxoplasma gondii, no
entanto as dinitroanilinas são ineficazes contra tubulina de mamíferos e fungos (DELFIN ET
AL., 2006; MORGAN & WERBOVETZ, 2008; WERBOVETZ, 2002; MITRA& SEPT,
2006).
45
A tubulina é uma proteína essencial para todos os organismos eucarióticos e assim
alvo para quimioterapia de muitas doenças. Fármacos que interagem com a tubulina já são
disponíveis para o tratamento do câncer e infecções por helmintos. A seletividade das
dinitroanilinas contra a tubulina de parasitos torna seu estudo interessante como agentes
antiparasitários, pois a tubulina é uma proteína altamente homóloga entre cinetoplastidas e
está envolvida na segregação dos cromossomos, na manutenção da forma e na motilidade
destas células (MITRA & SEPT, 2006)
A trifluralina possui atividade biológica conhecida contra as formas sanguíneas do T.
brucei e, também, em modelos animais de leishmaniose e doença de Chagas (MORGAN &
WERBOVETZ, 2008). As propriedades leishmanicidas da trifluralina foram, primeiramente
identificadas por Chan e Fong (1990) ao verificar que o tratamento com a trifluralina inibiu a
proliferação de formas promastigotas em 80% na concentração de 2,5 µM e 95% na
concentração de 5 µM. Para as formas o tratamento com 5 µM trifluralina reduziu em 50 % a
infecção em macrófagos murinos (J774). Como há similaridade entre a tubulina da
Leishmania e dos outros tripanossomatídeos, a trifluralina quando testada em formas
tripomastigotas procíclicas de T. brucei inibiu o crecimento em 50% nas concentrações de 6-7
µM. O tratamento de modelos murinos de leishmaniose cutânea por L. mexicana com
formulações tópicas de trifluralina resultou numa redução significativa no tamanho das lesões
ao final de 45 dias de tratamento, entretanto, sob estas mesmas condições o percentual de cura
dos animais infectados com L major foi variável, pois lesões antes curadas voltaram a crescer
(CHAN ET AL, 1993, CHAN & FONG, 1993).
Apesar da trifluralina apresentar bons resultados nas espécies de Leishmania, este
agente herbicida é muito instável quimicamente podendo as vezes estar contaminado com seu
precursor de síntese química, a cloralina. A cloralina é 100 vezes mais ativa que a trifluralina,
mas apresenta a desvantagem de apresentar atividade semelhante na tubulina de mamíferos,
46
perdendo assim as vantagens de seletividade a tubulina dos protozoários (BHATTACHARYA
ET AL., 2002).
Após estas descobertas, a orizalina, um análogo da trifluralina que possui um grupo
sulfonamida no lugar do trifluormetil, foi testada em tubulina de Leishmania inibindo a
polimerização em 54% quando usada na concentração de 25 µM. O uso da orizalina ainda
apresenta a vantagem de ser uma molécula mais estável e solúvel (MORGAN &
WERBOVETZ, 2008).
As dinitroanilinas são agentes desestabilizadores de microtúbulos promissores, uma
vez que atuam seletivamente na tubulina dos protozoários parasitos. Estes compostos podem
ser usados como modelos para a síntese de novas moléculas a partir de modificações em sua
estrutura química por métodos de química medicinal. Uma destas alterações é a hibridação
molecular que busca acoplar ao protótipo outros compostos ou parte deles com atividade
biológica conhecida, produzindo, então, uma única molécula com dois pontos farmacofóricos
distintos, consequentemente aumentando a sua eficácia.
Figura 3. Estrutura química dos principais compostos selecionados como novas opções terapêuticas para o
tratamento das leishmanioses. A miltefosina (A), um fármaco análogo de fosfolipídios e a trifluralina (B) e
orizalina (C), as dinitroanilinas.
47
1.3.6 Desafios da quimioterapia das leishmanioses
O arsenal terapêutico para o tratamento das leishmanioses esta longe de ser um
tratamento digno e eficaz para o paciente, uma vez que os medicamentos disponíveis não
atendem a demanda da enfermidade. Por outro lado, faltam incentivos das grandes indústrias
farmacêuticas quanto à produção de novos fármacos para doenças parasitárias. Toda esta
questão trouxe para o cenário científico o termo doenças negligenciadas, primeiramente
utilizado em 1981 pelo Dr. Kenneth Warren, naquele momento diretor da Fundação
Rockefeller, e que hoje é amplamente utilizado para agrupar as doenças tropicais endêmicas
que causam entre 500 mil e 1 milhão de mortes por ano em todo mundo. Estas doenças,
incluindo as leishmanioses, a malária e a doença de Chagas, estão relacionadas com a pobreza
e os tratamentos quimioterápicos são obsoletos, custosos, indisponíveis, pouco eficazes e
despertam pouco interesse por parte da indústria farmacêutica.
São inúmeros os problemas enfrentados, atualmente, na quimioterapia anti-parasitária,
tais como: o aumento crescente dos casos de resistência, necessidade urgente de novos
fármacos para substituir os primeiros desenvolvidos e que são utilizados há muitos anos, alto
grau de toxicidade a órgãos extremamente vitais, falta de adesão ao tratamento que em muitos
casos necessitam de vários dias de internação e da administração seriada dos fármacos por
vias desconfortáveis.
Diante do quadro apresentado acima, é urgente e imperativo a necessidade de novos
medicamentos, vias de administração ou esquemas terapêuticos.
48
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Estudar os efeitos de inibidores da biossíntese de fosfolipídeos (análogos de
alquilfosfolipídeos - APLs) e desestabilizadores da dinâmica dos microtúbulos
(dinitroanilinas) em Leishmania amazonensis.
2.2 Objetivos Específicos
1 Avaliar os efeitos antiproliferativos dos diferentes APLs e das dinitroanilinas em
formas promastigotas e amastigotas intracelulares de L. amazonensis;
2 Avaliar os efeitos dos APLs e das dinitroanilinas na morfologia e ultraestrutura das
formas promastigotas e amastigotas intracelulares de L. amazonensis;
3 Avaliar possíveis alterações no acúmulo e compartimentalização lipídica dos parasitos
tratados com os APLs e as dinitroanilinas selecionadas;
4 Avaliar a integridade da membrana plasmática das formas promastigotas tratadas com
os APLs e as dinitroanilinas selecionadas, através de fluorimetria;
5 Avaliar a atividade leishmanicida da miltefosina (APLs) e trifluralina (dinitroanilina)
através de estudos in vivo em modelos murinos de infecção por L. amazonensis.
50
3 MATERIAIS E METÓDOS
3.1. Cultivo e manutenção dos parasitos
3.1.1. Obtenção de formas promastigotas a partir de formas amastigotas de Leishmania
amazonensis a partir de lesões em camundongos Balb/C
Formas promastigotas infectivas cultivadas em meio de cultura foram lavadas duas
vezes com PBS estéril e depois ressuspendidas em pequena quantidade do mesmo tampão.
Foram feitas contagens das células em câmara de Newbauer para determinação do inóculo
inicial para infecção dos animais. Para a produção das lesões, os animais foram inoculados
com promastigotas metacíclicos infectivos numa concentração de 10
7
células/mL usando
seringa descartável de 1 mL e agulha para injeção intradérmica estéril na base da cauda. As
lesões começaram a aparecer cerca de um mês após a inoculação. Para isolar as lesões, os
animais foram mortos em câmara de CO
2
, as lesões foram retiradas e maceradas em Potter
estéril (pelo menos 50 “strokes”) levando ao rompimento dos macrófagos e conseqüente
liberação das formas amastigotas, sendo acompanhado através de microscopia óptica de
contraste de fase. Após o rompimento, o homogeneizado total foi centrifugado a 211g por 10
min com as amastigotas permanecendo no sobrenadante. O pellet foi então ressuspendido em
PBS pH 7,2 suplementado com glicose e EDTA e centrifugado novamente a 211g por 10 min.
O segundo sobrenadante foi misturado ao primeiro e centrifugado a 1900g por 15 min, onde
no pellet ficaram concentratadas as amastigotas parcialmente purificadas. As formas
amastigotas foram então colocadas para transformar em promastigotas em meio Warren
contendo 10% de soro fetal bovino inativado a 25°C.
51
3.1.2 Formas promastigotas de Leishmania amazonensis (cepa WHOM/BR/75/Josefa)
Estas formas foram obtidas a partir da transformação de amastigotas isoladas de lesão
de camundongos Balb/C e cultivadas em meio Warren (infusão de cérebro e coração,
acrescentado de 20 µg/L hemina e 10 µg/mL ácido fólico) num inóculo de 10% de volume
acrescentado de 10% de soro fetal bovino (Cultilab – inativado a 56°C, durante 1h) em
garrafas para culturas estéreis e mantidas a uma temperatura de 25°C. As amostras foram
mantidas através de passagens semanais até um total de seis passagens, garantindo que os
parasitos utilizados nos experimentos eram infectivos.
3.1.3 Obtenção de macrófagos peritoneais
Para os experimentos de tratamento das formas intracelulares foram utilizados
macrófagos peritoneais obtidos a partir da lavagem do peritônio de camundongos suíços CF1
com cerca de 7 semanas. O lavado peritoneal foi obtido após injeção de 5 mL de solução
Hank´s 4
o
C no peritônio do camundongo previamente eutanasiado (câmara de CO
2
), de
acordo com as normas estabelecidas pela Comissão de Ética para o uso de animais em
pesquisa (PAIXÃO, 2009). Posteriormente, a solução de Hank´s contendo as células
residentes do peritônio do camundongo foi recolhida e colocada em placas de 24 poços
cobertas com lamínulas redondas de 13 mm ou placas de Petri. Após 30 minutos, a 37
0
C, em
uma atmosfera de 5% de CO
2,
as culturas foram lavadas com meio M199 (Gibco) com o
intuito de retirar as células não-aderidas e outros tipos celulares. As células aderidas foram,
então, cultivadas por 24 horas, com meio M199 suplementado com 10% de soro fetal bovino
(Gibco), a 37
o
C em atmosfera de 5% de CO
2
.
3.1.4 Culturas de amastigota intracelular.
Formas promastigotas na fase estacionária de crescimento (5 dias de cultivo), foram
colocadas para interagir com macrófagos peritoneais de camundongos plaqueados em
52
lamínulas redondas em placas de 24 poços ou placas de Petri (descrito no item 3.1.3). A
interação parasito-célula hospedeira foi sempre na proporção de 10 parasitos para cada
macrófago durante 2 horas. Após a interação, os poços foram lavados com meio de cultura
M199 e cultivados durante seis dias à temperatura de 35º C e atmosfera de 5% de CO
2
acrescentados de 10% de soro fetal bovino inativado, garamicina e meio M199 para
realização dos experimentos de teste dos compostos nas formas amastigotas intracelulares.
3.2 Compostos Testados
Os compostos testados pertencem a diferentes classes químicas. As dinitroanilinas
testadas foram a trifluralina (Sigma) e orizalina (Sigma). Os análogos de fosfolipídios (APLs)
utilizados foram a miltefosina (Cayman – teste in vitro e Zentaris – teste in vivo) e 13
análogos sintetizados pelo grupo da Dra. Theodora Callogeropoulou (National Hellenic
Research Foundation, Atenas, Grécia).
3.2.1 Solução estoque
As dinitroanilinas foram solubilizadas em DMSO na concentração estoque de 50 mM
e mantidas a temperatura ambiente, protegidas da luz. Os APLs foram solubilizados em uma
solução contendo DMSO e etanol absoluto (1:1), em concentrações variando entre 10 mM e
50 mM de acordo com a solubilidade de cada composto. Estas soluções foram mantidas em
freezer (-20
o
C).
3.2.2 Classe dos Compostos
As dinitroanilinas são agentes inibidores da polimerização dos microtúbulos em
plantas. Os dois compostos estudados desta mesma classe diferem entre si quanto à presença
de um grupo trifluormetil na trifluralina e um grupo sulfonamida na orizalina na mesma
porção da molécula.
A miltefosina é uma molécula análoga da lisofosfatidilcolina em que a ligação éster
53
foi substituída por uma ligação éter, tornando esta molécula mais resistente metabolicamente
às ações enzimáticas. Os outros análogos de fosfolipídios estudados foram sintetizados a
partir de modificações na estrutura química da miltefosina por estratégias de química
medicinal utilizando-a como composto protótipo
Os APLs estudados foram classificados quanto a sua estrutura química e assim
divididos em 3 classes (Tabela 1). Os alquilfosfolipídios, que apresentam o grupo cabeça
colina e a cadeia alquila, são a miltefosina, TC 19 e TCAN 26. Os alquiltriazolfosfolipídios
apresentam uma ligação do tipo éter entre o grupo cabeça polar colina e a cadeia de ácidos
graxos e um anel triazol. Desta classe foram testados os compostos: TC 52, TC 70, TC 104,
TC 135, TC 171 e TC 172. Há ainda uma terceira classe de compostos, os híbridos éter-
fosfolipídio-dinitroanilina, que por hibridação molecular apresentam a molécula da trifluralina
associada a uma cadeia éter-fosfolipídica. Os compostos testados foram: TC 95, TC 106, TC
117, TC 162, TC 182.
54
Tabela 2. Lista dos compostos estudados: as dinitroanilinas trifluralina e orizalina, a miltefosina e os análogos
de fosfolipídios.
Compostos Classes
Trifluralina Dinitroanilina
Orizalina Dinitroanilina
Miltefosina Alquilfosfolipídio
TC 19 Alquilfosfolipídio
TCAN 26 Alquilfosfolipídio
TC 52 Alquiltriazolfosfolipídio
TC 70 Alquiltriazolfosfolipídio
TC 104 Alquiltriazolfosfolipídio
TC 135 Alquiltriazolfosfolipídio
TC 171 Alquiltriazolfosfolipídio
TC 172 Alquiltriazolfosfolipídio
TC 95 Híbrido Alquilfosfolipídio-Dinitroanilina
TC 106 Híbrido Alquilfosfolipídio-Dinitroanilina
TC 117 Híbrido Alquilfosfolipídio-Dinitroanilina
TC 162 Híbrido Alquilfosfolipídio-Dinitroanilina
TC 182 Híbrido Alquilfosfolipídio-Dinitroanilina
3.3 Culturas para os testes dos compostos em formas promastigotas
3.3.1 “Screening” dos compostos
A fim de selecionar os compostos com efeitos inibitórios sob as formas promastigotas
foi realizado, primeiramente, um “screening” com todos os compostos. As promastigotas
foram utilizadas em fase exponencial de crescimento. Para o inóculo inicial foi retirada uma
alíquota da cultura que foi contada em câmara de Neubauer. Após a contagem, os parasitos
(10
6
parasitos/mL) foram coletados da cultura e adicionados a placas de 96 poços num volume
final de 200 µL/poço. Nas placas, as diferentes variações foram divididas em vários grupos
como: grupo branco (somente meio e soro fetal bovino), grupo controle e cada grupo de
drogas testadas nas concentrações de 1, 5 e 10 µM, sendo todos estes grupos testados em
66
triplicatas e em três experimentos independentes. Em seguida, foi realizada uma leitura em
leitor de microplacas (Spectra Max M2, Molecular Devices) no comprimento de onda de 600
nm e os parasitos foram armazenados em estufa a 25
o
por 24 horas.
Após 24 horas, os compostos foram adicionados às culturas e as leituras foram
realizadas por 24, 48 e 72h após a adição das drogas. Durante o “screening” juntamente com a
leitura e obtenção do resultado por densidade óptica, as culturas foram monitoradas através de
observação da morfologia e mobilidade celular em microscópio óptico invertido.
3.3.2 Curvas de crescimento e avaliação dos efeitos antiproliferativos
Após o “screening” inicial com todos os compostos foram feitas curvas de crescimento
com contagem em câmara de Neubauer para os compostos que apresentaram melhor atividade
antiproliferativa.
As culturas foram preparadas a partir de parasitos em fase exponencial de crescimento
utilizando um inóculo inicial de 1,0 X 10
6
célula/mL. Após 24h de crescimento, os compostos
foram adicionados à cultura em suas respectivas concentrações. Culturas de parasito sem a
droga, denominadas de controle puro e, com DMSO numa concentração de 0,1%,
denominada de controle DMSO, também foram preparadas. A cada 24h foram retiradas
alíquotas para contagem em câmara de Newbauer após diluições em solução de formalina a
10% em PBS pH 7,2, usando microscópio óptico de contraste de fase.
3.3.3 Determinação da IC
50
A determinação da IC
50
(concentração mínima necessária para inibir 50% do
crescimento) foi obtida a partir dos valores resultantes do “screening” inicial e da contagem
de células a partir das curvas de crescimento. O valor de IC
50
foi determinado a partir da
seguinte fórmula (Martin et al, 2001):
67
I = I
max
C/IC
50
+ C , onde:
I = percentual de inibição (%);
I
max
= 100% de inibição;
C = concentração do inibidor;
IC
50
= concentração para inibir 50% do crescimento.
3.4 Culturas para os testes dos compostos em formas amastigotas intracelulares
Macrófagos foram coletados da cavidade peritoneal de camundongos CF1e
plaqueados em lamínulas redondas em placas de 24 poços. Após 30 minutos, os poços foram
lavados com meio de cultura (M199) e colocados em estufa, a 37°C com atmosfera de 5%
CO2 com M199 suplementado de 10% de soro fetal bovino. No dia seguinte, formas
promastigotas metacíclicas infectivas foram coletadas por centrifugação a 1000 rpm durante
20 minutos e colocadas para interagir por 2h com os macrófagos numa concentração de 10
parasitos para 1 macrófago. Após a interação, os poços foram lavados com meio de cultura
para retirar os parasitos que não aderiram, e novo meio de cultura (M199) com 10% de soro
fetal bovino foi colocado nos poços. Após 24h, foi colocado meio de cultura com as drogas
nas diferentes concentrações. Este meio foi trocado a cada 24h durante quatro a cinco dias. As
lamínulas contendo os macrófagos infectados foram lavadas com PBS pH 7,2 a temperatura
ambiente, e fixados com formadeído 4% por 20 minutos. O fixador foi removido e as células
lavadas, Em seguida as células foram coradas com Giemsa (2:8, em água destilada) por 15
minutos. Após este tempo, as lamínulas foram lavadas com água para retirar todo o corante e
submetidas a desidratação em soluções contendo acetona e xilol nas seguintes proporções:
acetona pura, acetona:xilol 9:1, acetona:xilol 7:3, acetona:xilol 3:7 e xilol puro. Ao final, as
lamínulas foram montadas sobre lâmina de vidro com Entellan (Merck) e analisadas em
microscópio óptico de campo claro.
Em seguida as células foram contadas para a obtenção dos dados quantitativos. As
68
contagens seguiram o padrão de 600 células por lamínula considerando os seguintes fatores:
número de macrófagos não infectados, número de macrófagos infectados e número total de
amastigotas no campo. Ao final das contagens, o índice de associação (IA) durante os dias de
tratamento foram convertidos em porcentagem de células a partir da média dos experimentos.
IA = N° MI x N° A/ MT, onde:
IA = Índice de Associação;
N° MI = Número de Macrófagos Infectados;
N° A = Número de Amastigotas;
MT = Macrófagos Totais.
A determinação da IC
50
foi obtida a partir da normalização (100% nos controles) das
contagens de valor quantitativo. Em seguida, estes valores obtidos foram usados na fórmula
descrita no item 3.4.3..
3.5 Avaliação de citotoxicidade em macrófagos peritoneais (MTS/PMS)
O MTS é um teste colorimétrico semi-automático onde o este é bioreduzido pelas
células a formazam. A conversão do MTS à formazam acontece por ação das enzimas
desidrogenases encontras nas células metabolicamente ativas, assim somente nas células
viáveis (MOSMANN, 1983).
Para estes ensaios foram utilizados macrófagos peritoneais de camundongos suíços
CF1 como modelo de célula hospedeira. Os macrófagos foram plaqueados em placas de 96
poços com meio RPMI suplementado com 10% de SFB e mantidos em estufas com 5% de
CO
2
, a 37 ºC. Após 24 horas, os compostos foram adicionados em diferentes concentrações,
sendo o meio trocado a cada 24 horas. Após 72 h de tratamento, as células foram lavadas em
PBS pH 7,2 e o meio substituído por solução salina tamponada contendo glicose. A esta
solução foi adicionado uma mistura de 333 ug/ml de MTS e 25 µM PMS (20 µl). Após 4 h de
incubação, foram realizadas leituras em um leitor de microplacas (Spectra Max M2
da
69
Molecular Devices) a 490 nm. Foram realizados 3 experimentos independentes, cada um em
triplicata.
3.6 Análises Fluorimétricas
3.6.1 “Sytox Blue”
A integridade da membrana plasmática foi avaliada utilizando o marcador
fluorescente Sytox Blue (Molecular Probes). Se a célula estiver necrótica haverá marcação
intracelular, no entanto se estiver apoptótica ou autofágica conseqüentemente com a
membrana intacta, não haverá marcação. Para esta avaliação as células foram incubadas com
5µM Sytox Blue, por 10 minutos. A seguir cada grupo experimental foi colocado na placa de
96 poços e avaliados quantitativamente a partir de análise fluorimétrica em um fluorímetro de
placas (Spectra Max M2, Molecular Devices) usando 444 e 480 nm de excitação e emissão,
respectivamente.
3.6.2 “Nile Red”
Para quantificar o acúmulo dos lipídios neutros, as amostras controle e tratadas com os
compostos foram incubadas com o “Nile Red” (Sigma) por 20 minutos. Após este
procedimento, cada grupo experimental foi colocado na placa de 96 poços e avaliados a partir
de análise fluorimétrica em um fluorímetro de placas (Spectra Max M2, Molecular Devices).
Para o “Nile Red” os comprimentos de onda de excitação e emissão foram 485 e 538 nm,
respectivamente.
70
3.7 Avaliação Morfológica e Ultraestrutural
3.7.1 Microscopia óptica de contraste interferencial diferencial (DIC) e fluorescência
convencional
Formas promastigotas de L. amazonensis foram crescidas na presença de diferentes
concentrações dos compostos mais eficientes para análise do número de núcleos,
cinetoplastos e flagelos utilizando microscopia óptica de contraste interferencial diferencial e
microscopia de fluorescência com DAPI (Sigma), um intercalante de DNA e “Nile Red”, um
marcador de lipídeos neutros. Para os experimentos com DAPI, os parasitos foram
primeiramente fixados com formaldeído 4 % em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2, por 30 min,
aderidos em lamínulas revestidas de poli-L-lisina por 20 min, e incubados por 15 min em 10
µM DAPI (Sigma). No caso dos experimentos com “Nile Red” (Sigma), os parasitos após a
fixação e adesão nas lamínulas revestidas com poli-L-lisina foram incubados na presença de
10 µg/mL “Nile Red”, por 20 minutos. Todas as amostras foram observadas em miscrocópio
óptico de fluorescência Axioplan (Zeiss) equipado com câmera digital Olympus XC 30.
3.7.2 Imunofluorescência indireta com anticorpo monoclonal anti-tubulina (TAT1)
Parasitos controle e tratados foram utilizados para experimentos de
imunofluorescência indireta com o objetivo de visualizar possível alteração no citoesqueleto
com a utilização de um anticorpo primário monoclonal antitubulina, o TAT1 (1:1). Os
parasitos foram fixados com formaldeído 4 % em tampão PHEM 0,1 M pH 7,2, aderidos por
20 minutos em lamínulas revestidas de poli-L-lisina e permeabilizados com Triton X-100 0,5
% em tampão PHEM (MgCl
2
5 mM, KCl 70 mM, EGTA 10 mM, HEPES 20 mM e PIPES 60
mM), pH 7,2 por 5 min. Após a fixação e permeabilização, foram realizadas as etapas
seguintes de uma imunofluorescência indireta. Primeiramente, foram incubados por 1h em
tampão de bloqueio contendo 3 % BSA e 0,25 % gelatina de peixe em PBS pH 8,0. Em
71
seguida, foram incubados por 1h no anticorpo TAT1 diluído 1:1 em tampão de bloqueio.
Após isto, foram lavados 3 vezes em tampão de bloqueio por 5 min cada uma e incubados em
anticorpo secundário anti-mouse Alexa-488 (1:400) por 1h. Por fim, foram lavados 3x em
tampão de bloqueio, 2vezes em tampão PHEM 0,1 M pH 7,2, montados em lâminas usando
N-propil galato e observados em miscrocópio óptico de fluorescência Axioplan (Zeiss)
equipado com câmera digital Olympus XC 30.
3.7.3 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
A microscopia eletrônica de varredura foi utilizada como ferramenta para avaliar a
forma das promastigotas controle e tratados com os compostos selecionados, bem como
verificar possíveis alterações na estrutura do flagelo e superfície celular. As células foram
lavadas 3 vezes com PBS pH 7,2 a temperatura ambiente e em seguida foram fixadas com
solução contendo 2,5% de glutaraldeído, diluídos em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH
7,2, por 1 hora. Neste momento, as células foram colocadas para aderir em lamínulas
revestidas com poli-L-lisina. Após a adesão, as células foram lavadas três vezes com tampão
cacodilato de sódio 0,1 M, e pós fixadas em 1% de tetróxido de ósmio, 1,25% de ferrocianeto
de potássio e cloreto de cálcio 5mM em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2 por 40
minutos, protegidas da luz e a temperatura ambiente. Ao final deste tempo, as células foram
lavadas em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2. Após a última lavagem as amostras
foram desidratadas em séries crescentes de etanol (30%, 50%, 70%, 90% e 100%) por 10
minutos cada. A última etapa de desidratação foi feita com etanol super-seco. Em seguida, as
amostras foram submetidas a secagem pelo método do ponto crítico, no qual o etanol foi
totalmente substituído por CO
2
gasoso (Critical Point Cryer CPD 030, BAL-TEC). Após a
secagem pelo ponto crítico do CO
2
, as lamínulas foram montadas em suportes e recobertas
com uma fina camada de ouro para observação em um microscópio de varredura Jeol JSM
5310.
72
3.7.4 Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
A ultraestrutura das formas promastigotas e amastigotas intracelulares foi analisada
através de microscopia eletrônica de transmissão, após o tratamento com os compostos que
apresentaram maior atividade, com o objetivo de avaliar possíveis alterações nas organelas e
na ultraestrutura da célula como um todo. Para isto, os parasitos foram coletados nos tempos
de 24, 48, 72 e 96 horas, lavados em PBS pH 7,2 e fixados com glutaraldeído tipo 1 a 2,5%
em tampão cacodilato de sódio 0,1M pH 7,2, por 2h à temperatura ambiente. Depois de
fixado, o material foi lavado duas vezes em tampão cacodilato de sódio 0,1M, pH 7,2, e em
seguida pós-fixado com tetróxido de ósmio 1%, ferrocianeto de potássio 1,25%, cloreto de
cálcio 5mM em tampão cacodilato de sódio 0,1M, pH 7,2, durante 30 minutos, à temperatura
ambiente e no escuro. As células foram então lavadas no mesmo tampão, desidratadas em
concentrações crescentes de 50-100% de acetona e incluídas em resina Epoxi (Polybed 812).
Cortes ultrafinos foram obtidos utilizando o ultramicrótomo Reichert, coletados em grades de
cobre de 300 mesh, contrastados em acetato de uranila 5%, por 45 minutos, e citrato de
chumbo segundo Reynolds (1963), por 5 minutos, e observados ao microscópio eletrônico
Zeiss 900, operando em 80 KV.
3.7.5 Citoquímica para Lipídios – Ósmio-Imidazol (MET)
Esta técnica citoquímica permite a identificação de lipídios insaturados, pois o complexo
ósmio-imidazol facilita a interação da molécula do tetróxido de ósmio com os lipídios insaturados,
contrastando fortemente as inclusões lipídicas (SOARES, 1998). Para a detecção dos lipídios, as
formas promastigotas controle e tratadas foram
lavadas em PBS pH 7,2 e fixadas com
glutaraldeído tipo 1 a 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1M, por 2h, à temperatura
ambiente. Logo após, as células foram lavadas em tampão cacodilato de sódio 0,1M e depois
em tampão imidazol 0.1M pH 7.2. As amostras foram então pós-fixadas em uma solução
contendo tetróxido de ósmio 2% e o tampão imidazol 0.1M pH 7.2, lavadas em tampão
73
imidazol, desidratadas em concentrações crescentes de 50-100% de acetona e incluídas em
resina Epoxi (Polybed 812). Cortes ultrafinos foram obtidos utilizando o ultramicrótomo
Reichert, coletados em grades de cobre de 300 mesh, e observados ao microscópio eletrônico
Zeiss 900 operando em 80 KV.
3.8 Testes in vivo
3.8.1 Animais de experimentação
Camundongos BALB/c fêmeas e recém desmamadas foram mantidas em gaiolas
microisoladoras, sob condições controladas de luminosidade (ciclo 12/12h, luzes acesas das
07h da manhã às 07h da noite) e em temperatura ambiente, recebendo ração comercial e água
ad libtum. O experimento foi realizado na fase de claro. Todos os procedimentos realizados
com animais foram aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da
Saúde – UFRJ, com protocolos de números IBCCF 096 e 097.
3.8.2 Infeccção dos animais
Para a produção das lesões, os animais foram inoculados com promastigotas
metacíclicos infectivos numa concentração de 10
7
células/mL usando seringa descartável de 1
mL e agulha para injeção intradérmica estéril na base da cauda. As lesões começaram a
aparecer cerca de um mês após a inoculação.Os animais separados para os testes foram os que
visualmente apresentavam as lesões de tamanho semelhantes.
3.8.3 Tratamento dos animais
Os compostos utilizados para os testes in vivo foram a miltefosina e trifluralina
Para o tratamento, os animais foram separados em vários grupos experimentais, cada
um destes grupos com cinco animais. Os testes foram realizados por 21 dias e os diversos
parâmetros para a avaliação dos efeitos dos compostos foram realizados durante e após o
74
tempo de tratamento. Nos dois experimentos foram realizados dois grupos controle, um grupo
onde os animais infectados receberam água por via oral durante o tratamento, e o grupo
controle-veículo que recebeu por via oral o polietilenoglicol, o veículo utilizado para
solubilizar os compostos. Outro grupo comum aos dois testes in vivo foi o grupo Glucantime,
fármaco de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses no Brasil, onde os animais
receberam este fármaco por via intraperitoneal na dose de 50 mg/kg/dia. Para o teste da
miltefosina foi realizada uma curva dose-resposta com as doses de 2,5, 5, 10, 20, 30, 40, 50
mg/kg/dia. No teste com a trifluralina as doses utilizadas foram 5, 15, 30 e 50 mg/kg/dia.
3.8.4 Medida do tamanho das lesões
Após um mês de infecção o tratamento foi iniciado e as lesões foram medidas três
vezes por semana durante os 21 dias com auxílio de um paquímetro. Os parâmetros avaliados
foram a altura, largura e comprimento da lesão na base da cauda. Assim foi possível calcular a
área da lesão de cada animal em tratamento
3.8.5 Pesquisa de amastigotas em esfregaços da lesão
Ao final dos 21 dias de tratamento, um animal de cada grupo foi eutanasiado para a
obtenção do material presente nas lesões. Este material foi retirado da lesão com auxílio de
instrumentos cirúrgicos. A partir do material coletado das lesões foi realizado o “imprint”.
Neste método, o tecido foi pressionado várias vezes sobre a lâmina, fixado com metanol,
corado com Giemsa, colocado para secar e selado com lamínula usando Entellan (Merck).
Estas amostras foram analisadas em microscópio óptico de campo claro Axioplan (Zeiss)
equipado com câmera digital Olympus XC 30.
3.9 Análise estatística
Os valores de IC
50
nos testes in vitro, também, foram obtidos através da análise de
curva padrão utilizando o programa Signa Plot 10.0. Para os testes de significância foi usado
75
o software Graph Pad Prism 5.0, onde valores de P< 0.05 foram considerados significativos
entre os grupos ao utilizar o One way Anova (teste de Tukey). As diferenças entre as amostras
foram comparadas e estatisticamente avaliadas pelos valores de P com base em três ensaios
distintos para os experimentos in vitro e in vivo.
76
4 RESULTADOS
4.1 “Screening” inicial dos compostos em formas promastigotas e amastigotas de L.
amazonensis.
A potencial ação antiproliferativa do 13 análogos de fosfolipídios foi avaliado em
formas promastigotas e amastigotas intracelulares de L. amazonensis usando a
espectrofotometria e análise por densidade óptica para as formas promastigotas e contagem do
número de amastigotas para avaliação inicial dos valores de IC
50
e seleção dos melhores
compostos para aprofundamento do estudo.
Pelas análises por densidade óptica foi possível perceber que entre os
alquilfosfolipídios TC 19 e TCAN 26 somente o TC19 reduziu a proliferação celular após 72
e 96 horas de tratamento na concentração de 10 µM. Os compostos TC 52, TC 104, TC 70,
TC 135, TC 171 e TC 172, classificados como alquiltriazolfosfolipídios não mostraram
nenhum efeito, uma vez que não foram capazes de interferir na proliferação celular dos
parasitos. Entre a classe dos híbridos alquilfosfolipídios-dinitroanilinas TC 95, TC 106, TC
117, TC 162 e TC 182, o TC 95 foi o melhor composto, pois inibiu a proliferação celular nos
tempos iniciais de tratamento e nas concentrações de 5 e 10 µM (gráficos não mostrados).
Os compostos que apresentaram os melhores valores de IC
50
foram o TC 19 e o TC
95. Para o TC 19 os valores de IC
50
foram 11,7 e 43,4 após 48 e 72h de tratamento,
respectivamente. O TC 95 apresentou os melhores resultados com a IC
50
de 1,1 e 1,6 para os
mesmos tempos. Os outros compostos apresentaram valores de IC
50
maiores que 100 µM,
como mostrado na Tabela 2.
77
Tabela 2. Valores de IC
50
obtidos no “screening” inicial para as formas promastigotas de L. amazonenesis
tratadas com 13 análogos de fosfolipídios após 48 e 72 h de tratamento.
Valores de IC
50
( µM)
Compostos
Tempo de Tratamento
48 h 72 h
Alquilfosfolipídios
Miltefosina 15,2 -
TC19 11,7 43,4
TCAN26 > 100 > 100
Alquiltriazolfosfolipídios
TC52 > 100 > 100
TC70 > 100 > 100
TC104 > 100 > 100
TC135 > 100 > 100
TC171 > 100 > 100
TC172 > 100 > 100
Híbridos Alquilfosfolídios-
Dinitroanilinas
TC 95 1,1 1,6
TC106 > 100 > 100
TC117 > 100 > 100
TC162 > 100 > 100
TC182 > 100 > 100
As formas amastigotas intracelulares foram tratadas por 72 horas com os
análogos de fosfolipídios na concentração de 5 µM. Os valores de IC
50
obtidos a partir
do resultado do percentual de infecção dos macrófagos tratados mostraram que o TC 19,
TC 135, TC 172 e TC 95 foram os compostos que apresentaram valores de IC
50
que
mais se diferenciaram da miltefosina. Isto mostra que estes compostos possuem uma
atividade leishmanicida potencialmente interessante (Tabela 3).
78
Ao final deste “screening” o TC 95 foi o análogo de fosfolipídio escolhido para
os testes subseqüentes, pois mostrou ser o composto mais promissor tanto para as
formas promastigotas quanto para as amastigotas intracelulares de L. amazonensis.
Tabela 3. Valores de IC
50
obtidos no “screening” inicial para as formas amastigotas intracelulares de L.
amazonensis tratadas com a miltefosina e 13 análogos de fosfolipídios avaliados durante 72 h de
tratamento.
Valores de IC
50
( µM)
Compostos
Tempo de Tratamento
72 h
Alquilfosfolipídios
Miltefosina 29
TC19 5,3
TCAN26 11,8
Alquiltriazolfosfolipídio
TC52 29,9
TC70 8,7
TC104 9,8
TC135 8,6
TC171 > 100
TC172 5.2
Híbrido Alquilfosfolídio-Dinitroanilina
TC 95 8.3
TC106 17,3
TC117 18,8
TC162 35
TC182 13.6
79
4.2 Atividade antiproliferativa do TC 95 e das dinitroanilinas em formas
promastigotas e amastigotas intracelulares de L. amazonensis
Após a seleção do TC 95 nas etapas iniciais, novos testes foram realizados a fim
de confirmar seu efeito antiproliferativo nas formas promastigotas e amastigotas
intracelulares.
Ao avaliar os efeitos do TC 95 na proliferação de formas promastigotas a partir
das curvas de crescimento tratadas com 1, 2, 3, 4 e 5 M por 24, 48 e 72 h, foi possível
perceber que a redução no número de células foi concentração dependente, pois este
composto inibiu sensivelmente a proliferação das formas promastigotas a partir das
concentrações de 4 e 5 µM nas primeiras 24 h de tratamento, apresentando o mesmo
comportamento ao longo das outras 48 e 72 h para todas as concentrações avaliadas
(Figura 4A).
Os bons resultados com o TC 95 nos conduziram ao estudo dos possíveis efeitos
antiproliferativos das dinitroanilinas (trifluralina e orizalina), uma vez que a estrutura
deste composto possui uma molécula de trifluralina ligada quimicamente a uma cadeia
alquilfosfocolina.
As curvas de crescimento com a trifluralina e a orizalina foram
realizadas nas concentrações de 5, 10, 20, 25 e 50 µM em formas promastigotas durante
24, 48 e 72 horas de tratamento. Nas células tratadas com a trifluralina houve um
declínio no crescimento de formas promastigotas de L. amazonensis apenas na
concentração de 50 M após 48 e 72 horas de tratamento (Figura 4B). As culturas
tratadas com a orizalina apresentaram um pequeno declínio na proliferação celular após
72 h (Figura 4C). Os efeitos da trifluralina e orizalina na proliferação é concentração
dependente, entretanto para que este efeito seja estatisticamente significativo são
80
necessárias maiores concentrações destes compostos para tratar as formas
promastigotas.
Figura 4. Curvas de crescimento de formas promastigotas tratadas com TC 95 (A), trifluralina (B) e
orizalina (C). Foram realizados três experimentos independentes. Os resultados foram estatisticamente
significativos nas concentrações de 4 e 5 µM com o TC 95 ( p < 0,05, One-way Anova, teste de Tukey).
81
Para o TC 95, os valores de IC
50
obtidos a partir do “screening” inicial e da
curva de crescimento foram significativamente menores quando comparados com as
dinitroanilinas. A partir das curvas de crescimento os valores de IC
50
obtidos para o TC
95 após 72 h de tratamento foi de 0,7 M, enquanto que para a trifluralina e orizalina,
os valores foram de 19 M e 23 M, respectivamente. Isto mostra que o TC95 foi
eficaz em baixas concentrações e em tempos iniciais de tratamento. Já com as
dinitroanilinas, o tratamento com altas concentrações ao final de 72 horas não
apresentaram resultados significativos (Tabela 4). Estes valores de IC
50
obtidos a partir
dos dados das curvas de crescimento indicam uma diferença significativa na ação
antiproliferativa destes compostos.
A partir dos resultados obtidos nas formas promastigotas escolhemos as
concentrações que possivelmente seriam mais importantes a serem testadas para as
formas amastigotas intracelulares. As células foram tratadas com o TC 95 nas
concentrações de 1, 5 e 10 µM por 24 e 48 horas, nestas condições foi possível observar
que o percentual de infecção reduziu bastante em relação ao grupo controle. Após 24 h
de tratamento, as concentrações de 5 e 10 µM inibiram significativamente a proliferação
das amastigotas, de forma concentração-dependente. Esta diminuição foi ainda mais
significativa após 48 h de tratamento em todas as concentrações testadas (Figura 5A).
Os resultados do tratamento das formas amastigotas intracelulares com a
orizalina por 24 e 48 horas nas concentrações de 10, 20 e 25
µM, mostram que há uma
redução no percentual de infecção, que foi mais significativa na concentração de 25 µM
(Figura 5B). Entretanto, quando comparamos os gráficos do TC 95 e da orizalina
verificamos que a redução deste percentual foi cinco vezes maior nas culturas tratadas
82
com o TC 95. Isto se reflete nos valores de IC
50
que após 48 h de tratamento com o TC
95 foi de 2.5 M, enquanto que para a orizalina a IC
50
foi de 13 M (Tabela 5).
Figura 5. Percentual de infecção das formas amastigotas intracelulares de L .amazonensis em macrófagos
peritoneais de camundongos tratados com TC 95 (A) e orizalina (B). Foram realizados três experimentos
independentes para o TC 95. Os resultados foram estatisticamente significativos nas concentrações de 5 e
10 µM por 24 horas e 1, 5 e 10 por 48 horas com o TC 95 (* p < 0,05 e ** p<0,01, One-way Anova, teste
deTukey).
83
Tabela 4. Valores de IC
50
obtidos para as formas promastigotas de L. amazonensis tratadas com TC 95,
trifluralina e orizalina. Estes valores foram obtidos a partir das curvas de crescimento mostradas na Figura
4.
IC
50
(µM)
L. amazonensis - Formas promastigotas
Compostos
Tempo de Tratamento
24h
48h
72h
TC 95
1,0 0,78 0,7
Trifluralina
24 14 19
Orizalina
39 27.2 23
Tabela 5. Valores de IC
50
obtidos para as formas amastigotas intracelulares de L. amazonensis tratadas
com o TC 95 e orizalina. Estes valores foram obtidos a partir das curvas de crescimento mostradas na
Figura 5.
IC
50
(µM)
L. amazonensis - Formas amastigotas intracelulares
Compostos
Tempo de Tratamento
24h 48h
TC 95
2.3 2.5
Orizalina
27 13
84
4.3 Avaliação da citotoxicidade do TC95 pelo método do MTS
Após observar que o tratamento das formas amastigotas intracelulares com o TC
95 foi eficaz, foi necessário avaliar a citotoxicidade deste composto nas células
hospedeiras (macrófagos peritoneais de camundongos). Para isto utilizamos o sal de
tetrazólio MTS a fim de verificar a viabilidade destas células após 72 horas de
tratamento. Para esta avaliação, macrófagos não infectados foram tratados com
concentrações seriadas do TC 95, desde as usadas nos ensaios para a avaliação do efeito
do composto nas amastigotas até concentrações mais elevadas para observar em que
concentrações este composto seria tóxico para as células hospedeiras. O resultado foi
estatisticamente significativo quando as células foram tratadas com concentração de 200
µM de TC 95 (Figura 6), entretanto a partir de 50 µM observou-se uma redução das
células viaveis.
O valor da CC
50
foi de 50 µM para o TC 95. Dados da literatura mostram que a
concentração citotóxica para estes mesmos tipos celulares tratados com miltefosina é de
60 µM (SANTA-RITA ET AL., 2004).
Figura 6. Gráfico dos valores de absorbância obtidos a partir do testes de viabilidade (MTS) em
macrófagos peritoneais de camundongos tratados com TC 95 por 72 horas nas concentrações de 10, 25,
50, 100 e 200 µM. O controle DMSO-Etanol recebeu 2% da mistura DMSO-Etanol (1:1) a mesma
proporção que foi adicionada as células tratadas 200 µM. Foram realizados três experimentos
independentes. O resultado foi estatisticamente significativo na concentração de 200µM ( p < 0,05, One-
way Anova, teste de Tukey).
85
4.4 Análise dos possíveis mecanismos de ação envolvidos na inibição pelo TC 95,
orizalina e trifluralina
4.4.1 Avaliação da integridade da membrana plasmática
As alterações na integridade da membrana plasmática foram avaliadas com o uso
do Sytox Blue, um marcador fluorescente que uma vez incubado penetra somente nas
células onde a membrana celular não estiver íntegra. A partir das análises fluorimétricas
foi possível avaliar as alterações que os tratamentos com o TC 95, trifluralia e orizalina
poderiam estar causando na membrana plasmática das formas promastigotas.
A partir dos valores de intensidade de fluorescência obtidos foi possível observar
que o tratamento por 48 horas com TC 95 nas concentrações de 3 µM e 4 µM resultou
numa alteração significativa na integridade da membrana plasmática quando comparado
com o controle (Figura 7A). Esta mesma alteração não foi observada após o tratamento
com trifluralina e orizalina cujos valores de fluorescência permanecem idênticos ao
controle (Figura 7B e 7C).
86
Figura 7. Avaliação da integridade da membrana plasmática em formas promastigotas de L. amazonensis
controle e tratadas com diferentes concentrações de TC 95 (A), trifluralina (B) e orizalina (C). A
intensidade de fluorescência do Sytox Blue (44-480) foi obtida em um fluorímetro de placas usando os
comprimentos de onda de 440 e 480 nm de excitação e emissão, respectivamente. Foram realizados três
experimentos independentes. Os resultados foram estatisticamente significativos nas concentrações de 3 e
4 µM com o TC 95 ( p < 0,05, One-way Anova, teste de Tukey)
.
87
4.4.2 Efeitos na morfologia, citoesqueleto e ciclo celular
O tratamento das formas promastigotas com o TC 95 além de inibir a
proliferação celular também modifica a morfologia das células. Isto foi avaliado,
primeiramente, através da observação ao microscópio óptico invertido, onde foi possível
perceber que o TC 95 altera a morfologia e a dinâmica de divisão celular das
promastigotas. A fim de confirmar estas alterações, foram realizados ensaios de
imunofluorescência para avaliar o citoesqueleto de microtúbulos subpeliculares com o
uso de um anticorpo monoclonal anti-tubulina (TAT1) e de fluorescência com DAPI
para a observação de possíveis alterações na dinâmica da divisão celular das células
tratadas. Assim, com apenas 3 µM TC 95, por 24 h, as promastigotas já se apresentavam
alteradas, com o corpo celular mais arredondado, dois ou mais núcleos e cinetoplastos e
seu citoesqueleto com um aspecto descontinuo e frouxo (Figura 8).
O tratamento com 50 M de orizalina por 48 horas também alterou a morfologia
das células. Como é possível observar nas imagens obtidas por microscopia óptica de
contraste interferencial diferencial (DIC), as formas promastigotas antes alongadas
estavam sensivelmente arredondadas com seus flagelos ora muito longos ora muito
curtos. A marcação para o citoesqueleto das promastigotas tratadas apresentaram
alterações na distribuição de tubulina pelo citoplasma, resultando em um acúmulo de
anticorpo em alguns locais do citoplasma e falhas na continuidade da própria estrutura
dos microtúbulos (Figura 9, setas). A marcação dos núcleos e cinetoplastos em células
normais mostram a presença de um único núcleo e cinetoplasto, no entanto após o
tratamento com a orizalina os parasitos tratados passaram a apresentar 2 ou mais
núcleos e cinetoplastos (Figura 9, cabeça de seta).
88
A microscopia eletrônica de varredura, com o TC 95 e a orizalina, nos permitiu
confirmar as alterações de forma e de ciclo celular, ficando claro uma importante
alteração na etapa final de citocinese (Figuras 10 e 11). As imagens mostram que a
morfologia das promastigotas após os tratamentos muda drasticamente, onde algumas
até se assemelham a formas amastigotas apresentando o corpo celular arredondado e o
flagelo mais curto. Outra alteração que foi possível perceber diante da maior resolução
desta metodologia foram as mudanças na estrutura da membrana plasmática que reveste
os 3 domínios: o flagelo (Figuras 10 e 11, seta curta), a bolsa flagelar e o corpo celular
(Figuras 10 e 11, seta longa). O TC 95 e a orizalina causam alterações semelhantes na
morfologia das promastigotas, no entanto a diferença está nas concentrações de uso e
nos tempos de tratamento, que são menores com o TC 95.
89
Figura 8. Microscopia óptica de contraste interferencial diferencial (DIC) (A, D, G, J),
imunofluorescência indireta com anti-tubulina (B, E, H, L) e fluorescência utilizando DAPI (C, F, I, M)
de formas promastigotas de L. amazonensis controle e tratadas com TC 95. A marcação em verde com
Alexa-488 é referente à presença de tubulina e em azul a marcação com DAPI. (A-C) Formas
promastigotas controle. (D-M). Formas promastigotas tratadas com 3 µM TC 95 por 24 horas. Nestas
imagens observamos falhas na continuidade da estrutura dos microtúbulos subpeliculares (setas) e o
aspecto descontínuo e frouxo em algumas células (cabeça de seta) e porções onde a intensidade de
fluorescência é maior.
90
91
Figura 9. Microscopia óptica de contraste interferencial diferencial (DIC) (A, D, G), imunofluorescência
indireta com anti-tubulina (B, E, H) e fluorescência utilizando DAPI (C, F, I) de formas promastigotas de
L. amazonensis tratadas com orizalina. A marcação em verde com Alexa-488 é referente à presença de
tubulina e em azul a marcação dos núcleos e cinetoplastos com DAPI. (A-I)
Formas promastigotas
tratadas com 50 µM de Orizalina por 48 h. Nestas imagens observamos falhas na continuidade da
estrutura dos microtúbulos subpeliculares (setas fina) células completamente alteradas em sua forma,
apresentando dois ou mais flagelos (setas largas) e um número anormal de núcleos e cinetoplastos (cabeça
de seta).
92
93
Figura 10. Micrografias eletrônicas de varredura das formas promastigotas de L. amazonensis controle
(A) e tratadas com TC 95 (B-H). (B-D) Tratamento com 2 µM de TC 95 por 24 h, (E) 1 µM TC 95 por 48
h, (F-H) 1 µM, 2 µM e 3 µM de tratamento por 72 h, respectivamente. (A) Os parasitos controle
apresentam morfologia característica, o corpo celular alongado e flagelo emergindo da região anterior. Os
parasitos tratados nas diferentes concentrações e tempo apresentaram severas mudanças em sua forma (G
e H), aumento no numero de flagelos (C e F), além de alterações na membrana do flagelo (B e E, setas
curtas), destacamento e protrusões no corpo celular (B e H, setas longas) e alterações no padrão de
citocinese (D, F, G e H, cabeça de seta).
94
95
Figura 11. Micrografias eletrônicas de varredura das formas promastigotas de L. amazonensis tratadas
com orizalina. As células controle podem ser observadas na Figura 7. (A-D) 25 µM de orizalina por 72 h.
(E-G) 50 µM de orizalina por 72 h. Os parasitos tratados nas diferentes concentrações e no tempo de 72 h
apresentaram intensas mudanças em sua forma (C-G), aumento no número de flagelos (A), além de
alterações na membrana do flagelo (B, D e E, setas curtas), “shedding” e protrusões de membrana no
corpo celular (E, setas longas) e alterações no padrão de citocinese ( A e D, cabeça de seta). As alterações
morfologicas causadas pelo tratamento com a orizalina era significativa em toda a população celular (F).
96
97
4.4.3 Acúmulo de lipídios
O possível acúmulo de lipídios foi avaliado a partir do uso do “Nile Red”, um
marcador fluorescente específico para lipídios neutros, através de análises fluorimétricas
e por microscopia óptica de fluorescência em formas promastigotas tratadas com TC 95,
trifluralina e orizalina.
A partir das análises fluorimétricas foi possível avaliar que o tratamento com o
TC 95 nas concentrações de 1, 2, 3 e 4 µM, por 24 e 48 horas, levou a um maior
acúmulo lipídico nas células. Nas primeiras 24 h de tratamento, já foi possível verificar
um acúmulo de lipídios. Após 48 h, este acúmulo se tornou mais intenso, indicando que
é tempo dependente. Nas concentrações de 3 e 4 µM, este comportamento foi
estatisticamente significativo (Figura 12A). Os resultados obtidos a partir do tratamento
das células com a trifluralina por 48 horas mostraram que não há acúmulo de lipídios
neutros, uma vez que os valores de intensidade de fluorescência estavam próximos aos
do controle (Figura 12B). Entretanto nos experimentos com a orizalina, as
promastigotas tratadas nas concentrações de 20, 25 e 50 µM por 48 horas apresentaram
um acúmulo crescente e significativo de lipídios neutros em relação às células do grupo
controle (Figura 12C).
As imagens de fluorescência com o Nile Red comprovam que o padrão de
marcação das células tratadas com trifluralina é semelhante ao grupo controle (imagens
não mostradas), enquanto que as células tratadas com o TC 95 e orizalina possuem
inúmeros e grandes corpúsculos lipídicos distribuídos em todo o citoplasma, com
preferência para as porções posteriores do corpo do parasito (Figura 13).
Com o objetivo de validar ainda mais este acúmulo lipídico nas células tratadas
foi realizado uma citoquímica para lipídios de reserva pelo método do ósmio-imidazol,
98
onde a partir das imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão é possível
visualizar com maior detalhe os corpúsculos lipídicos, seu tamanho e distribuição nas
células. Esta técnica nos permitiu perceber que as promastigotas tratadas com o TC 95 e
a orizalina apresentaram um aumento no número de inclusões lipídicas quando
comparadas as células controle, conforme já havia sido observado pelos métodos
anteriores. Assim, a citoquímica pode revelar que há um aumento em número, e que
estes corpúsculos lipídicos variavam em quantidade, eletrondensidade e tamanho dentro
de uma mesma célula. Ainda foi possível observar que estas inclusões aparecem
próximas ao RE e a membrana plasmática e que muitas vezes elas tocam a membrana
(Figura 14).
99
Figura 12. Avaliação do acúmulo de lipídios neutros em formas promastigotas de L. amazonensis
controle e tratadas com diferentes concentrações de TC 95 (A), trifluralina (B) e orizalina (C). A
intensidade de fluorescência do “Nile Red” foi obtida em um fluorímetro de placas usando os
comprimentos de onda de 485 e 538 nm de excitação e emissão, respectivamente. Foram realizados três
experimentos independentes. Os resultados foram estatisticamente significativos (*) para o TC 95 e a
orizalina ( p < 0,05, One-way Anova, teste de Tukey).
100
Figura 13. Microscopia óptica de contraste interferencial diferencial (DIC) (A, C, E) e de fluorescência
utilizando “Nile Red” (B, D, F) para a marcação de lipidios neutros de formas promastigotas de L.
amazonensis controle, tratadas com TC 95 e orizalina. (A, B) Formas promastigotas controle; (C, D) 4
µM TC 95 por 48 horas. (E, F) 50 µM orizalina por 48 h. È possível observar a quantidade e distribuição
dos corpúsculos lipídicos nas populações celulares tratadas em relação ao controle.
101
102
Figura 14. Citoquímica para lipídios por ósmio-imidazol (MET) de formas promastigotas de L.
amazonensis controle e tratadas com TC 95 e orizalina por 48 h. (A) Controle. (B) 2 µM TC 95. (C-D) 3
µM TC 95. (E-F) 4 µM TC 95. (G-H) 50 µM orizalina. As células controle apresentam seus corpúsculos
lipídicos ósmiofilicos, entretanto as células tratadas com TC 95 e orizalina possuem um número maior de
corpúsculos lipídicos distribuídos por toda a célula e intensamente ósmiofilicos. Ainda é possível
perceber que nas células tratadas às membranas aparecem mais ósmiofilicas e que existente uma relação
entre estes corpúsculos, o RE e a membrana plasmática, que muitas vezes parece ser empurrada por eles.
CL, corpúsculo lipídico; C, cinetoplasto; M, mitocôndria; F, flagelo.
103
104
4.4.4 Efeitos na ultraestrutura dos componentes intracelulares
Através da microscopia eletrônica de transmissão foi possível avaliar as
principais alterações que os tratamentos com o TC 95 e a orizalina causaram nas
estruturas intracelulares. A principal organela alterada pelo TC 95, nas primeiras 24
horas de tratamento, foi a mitocôndria. Nas concentrações de 3 e 4 µM, as alterações
foram intensas, pois a organela apresentou-se inchada, com suas cristas alteradas (setas
onduladas), muitas vezes com sua membrana rompida (setas largas), além do
aparecimento de estruturas membranares em seu interior. Foi possível verificar um
acúmulo de lipídeos (setas compridas) no citoplasma destas células durante este mesmo
tempo. Ao longo do tratamento, além das alterações mitocondriais também foram foi
possível observar modificações no RE e CG, o aparecimento de figuras de mielina
(perfis de membranas celulares no citoplasma) [cabeça de seta branca] e alterações na
membrana do flagelo (cabeça de seta preta) (Figura 15).
Ao observar as formas amastigotas intracelulares controle (Figura 16) e tratadas
com 5 µM TC 95 por 24 h também foram observadas alterações mitocondriais
significativas, além de um aumento no número de glicossomos (Figura 17B). Em
concentrações mais elevadas como 10 µM vários macrófagos apresentavam vacúolos
parasitóforos vazios e com restos celulares, onde também foi observado amastigotas
com alterações drásticas na membrana plasmática, muitas vezes se descolando dos
microtúbulos subpeliculares (Figura 17B, cabeça de seta) e a presença de grandes
vacúolos contendo perfis de membrana, partes do citoplasma e restos celulares que se
assemelham a autofagossomos (Figura 17E e F, estrela). Sob estas condições foi
possível perceber o aparecimento de corpúsculos lipídicos nas amastigotas, no entanto o
105
tratamento também provocou um acúmulo de lipídios na célula hospedeira além do
aparecimento de figuras de mielina [setas compridas] (Figura 17F).
As principais alterações observadas na ultraestrutura de formas promastigotas
tratadas com 50 µM orizalina por 72 horas foram o aparecimento de células que
apresentavam 2 ou mais núcleos, cinetoplastos e flagelos, aparecimento e formação de
corpúsculos lipídicos (setas) vacuolização do citoplasma, e alterações na membrana
plasmática [cabeça de seta] (Figura 18).
106
Figura 15. Micrografias eletrônicas de transmissão de promastigotas controle e tratadas com TC 95 por
24 h. (A) Promastigota controle. (B) 2 µM TC 95. (C-E) 3µM TC 95. (F-I) 4µM TC 95. As alterações
mitocondriais podem ser observadas nos tratamentos a partir de 2 µM, com o inchaço da mitocôndria, a
ruptura de sua membrana (setas largas) e danos as cristas (setas onduladas). Observa-se aparecimento de
figuras de mielina (cabeça de seta branca), acúmulo de lipídios (setas compridas), alterações na
membrana do flagelo (cabeça de seta preta) e o aparecimento de vacúolos que parecem englobar parte do
citoplasma. M, mitocôndria; CG, complexo de Golgi; Ax, axonema; C, cinetoplasto; RE, retículo
endoplasmático.
107
108
Figura 16. Micrografias eletrônicas de transmissão de formas amastigotas intracelulares de L.
amazonensis. (A) Macrofágos infectados com formas amastigotas intracelulares. (B) Formas amastigotas
no vacúolo parasitóforo. (C) Forma amastigota intracelular. A, amastigota; VP, vacúolo parasitoforo; RE,
reticulo endoplasmático; N, núcleo; M, mitocôndria; CG, complexo de Golgi; C, cinetoplasto; BF, bolsa
flagelar; F, flagelar.
109
110
Figura 17. Micrografias eletrônicas de transmissão de formas amastigotas intracelulares tratadas com TC
95 por 24 h. (A-B) 5 µM TC 95. (C-F) 10 µM TC 95. Nos parasitos tratadas há um acúmulo de lipídios
(setas compridas), alterações na membrana plasmatica (cabeça de seta preta) lesões mitocondriais,
vacuolização do citoplasma (losangos) e o aparecimento de figuras de mielina (cabeça de seta branca).
Também foi observado varias inclusões lipídicas na célula hospedeira. M, mitocôndria; CG, complexo de
Golgi; Ax, axonema; C, cinetoplasto; RE, retículo endoplasmático; Mg, megassomos; G, glicossomos;
BF, bolsa flagelar; N, núcleo; F, flagelo.
111
112
Figura 18. Micrografias eletrônicas de transmissão de promastigotas tratadas com 50 µM de orizalina por
72h (A-D) Estas imagens sugerem que as nas promastigotas tratadas com orizalina sob estas condições
apresentam alterações na membrana plasmática (cabeça de seta), acúmulo de lipidios (setas compridas),
células com dois ou mais flagelos, três cinetoplastos e três núcleos. Ax, axonema; C, cinetoplasto; N,
núcleo; F, flagelo.
113
114
4.5 Avaliação in vivo da miltefosina e trifluralina em modelo murino de
leishmaniose cutânea por L. amazonensis.
4.5.1 Miltefosina
Os animais infectados com L. amazonensis foram tratados durante 21 dias com
diferentes doses de miltefosina administradas diariamente por via oral. Também, foram
realizados três diferentes controles: 1) grupo controle que recebeu água; 2) um grupo
controle-veículo (polietilinoglicol); e 3) um grupo controle positivo tratado com
Glucantime por via intraperitoneal.
Os grupos tratados com miltefosina receberam as doses de 2,5 mg/kg/dia, que é
recomendada pela OMS para o tratamento em humanos, e doses maiores de 5, 10, 20,
30, 40 e 50 mg/kg/dia. O grupo Glucantime recebeu diariamente a dose de 50
mg/kg/dia, dose superior à usada na clínica para leishmaniose cutânea (20 mg/kg/dia de
Sb
5+
durante 21-30 dias).
No primeiro dia de tratamento, todos os animais apresentavam as lesões na base
da cauda com aspecto e tamanho semelhantes. Ao longo do tratamento, o tamanho das
lesões variaram conforme o efeito do fármaco. Os animais do grupo controle ao final de
21 dias de tratamento apresentavam suas lesões ulceradas com intenso exsudato
inflamatório, enquanto que no grupo controle-veículo as lesões cresceram, mas estavam
pouco ulceradas. Para estes dois grupos as lesões cresceram como esperado. Os grupos
Glucantime (50 mg/kg/dia) e miltefosina (2,5 mg/kg/dia) apresentaram lesões ulceradas
que não reduziram em tamanho mesmo recebendo os fármacos. Nos animais tratados
com 5 e 10 mg/kg/dia de miltefosina, as lesões reduziram significativamente de
tamanho quando comparadas com os controles, entretanto ao avaliar visualmente elas
mostravam indícios de ulceração. Os grupos tratados com 20, 30, 40 e 50 mg/kg/dia de
115
miltefosina possuíam animais tratados onde as lesões reduziram drasticamente ao final
de 21 dias e não apresentavam quaisquer indícios de ulceração (Figura 19). Para avaliar
a eficácia do tratamento foi necessário criar um coeficiente de relação (Grupos Tratados
x Grupo Controle), onde o valor do controle foi considerado 1, a redução da lesão e
tendência de cura menor que 1 e o aumento da lesão maior que 1 (Tabela 6). Por este
critério, foi possível avaliar que a partir do 9° dia de tratamento os animais que
receberam as doses de 20 até 50 mg/kg/dia já apresentavam uma redução no tamanho da
lesão.
O grupo que recebeu a dose de 50 mg/kg/dia apresentou, durante o tratamento,
uma redução significativa no peso e um aspecto debilitante decorrentes do tratamento.
Apesar da dose de 50 mg/kg/dia apresentar efeitos tóxicos para os animais, nenhum
animal morreu quando recebeu esta dose de miltefosina e durante todo o tratamento a
sobrevivência dos animais foi de 100%. Assim, as doses de 20, 30 e 40 são eficazes e
livres de toxicidade aparente, mas a dose de 50 mg/kg/dia mesmo eficaz é toxica para os
animais durante os dias de tratamento (Figura 19 e Figura 20).
A fim de validar as análises obtidas a partir das medidas das lesões e os aspectos
visuais, o “imprint” do material das lesões mostrou que ao final de 21 dias de
tratamento, os grupos controle, controle-veículo, Glucantime, 2,5 mg/kg apresentavam
em seus esfregaços células densamente parasitadas pelas formas amastigotas e os
grupos miltefosina 5 e 10 mg/kg/dia apresentavam formas amastigotas no esfregaço,
ainda que em menor quantidade quando comparadas com os grupos anteriores. O
material da lesão coletado de animais tratados com 20, 30, 40 e 50 mg/kg/dia em que
suas lesões reduziram com o tratamento e não apresentavam formas amastigotas em
todos os campos observados (Figura 21).
116
Figura 19. Gráfico referente ao 1° e 21° dia de tratamento dos grupos controles e tratados com
Glucantime na dose de 50 mg/kg/dia e miltefosina 2,5, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mg/kg/dia. O tamanho das
lesões foram estatisticamente significativos quando comparados com os grupos controle (*) e controle-
veículo (*) (p < 0,05, One-way Anova, teste de Tukey).
Dentro dos critérios de avaliação de cura era necessário o acompanhamento
destes animais por ao menos 6 meses após o uso da terapia, a fim de validar as doses
que realmente foram eficazes no tratamento. Os grupos que já apresentavam suas lesões
aumentadas e ulceradas evoluíram ainda mais e com intenso processo inflamatório
(Controle, Controle-veículo, Glucantime e miltefosina 2,5 mg/kg/dia). Nos animais
tratados com 5 e 10 mg/kg/dia que até apresentaram uma redução da lesão com o
tratamento, as lesões evoluíram e cresceram até chegar a ulceração. Os animais dos
grupos 20, 30, 40 e 50 mg/kg/dia estavam com suas lesões ainda mais reduzidas quando
comparadas ao final do tratamento, entretanto ao avaliar os esfregaços destas lesões
após os 100 dias de tratamento os animais tratados com 20 e 30 mg/kg/dia de
117
miltefosina apresentaram formas amastigotas parasitando as células (Figura 22). Apenas
nas doses de 40 e 50 mg/kg não foi possível verificar formas amastigotas nas lesões
após 100 dias de tratamento. Estes dados indicam que as doses eficazes são 40 e 50
mg/kg/dia, com ressalvas para a dose de 50 mg/kg/dia que, durante o tratamento
pareceu ser tóxica para os animais, contudo ao final dos 100 dias os animais recuperam
os aspecto normal.
Tabela 6. Coeficiente de relação entre os grupos experimentais controle e tratados com Glucantime na
dose de 50 mg/kg/dia e miltefosina 2,5, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mg/kg/dia durante os diferentes dias de
tratamento, mostrando a relação entre o tamanho das lesões dos grupos tratados quando comparados ao
controle.
118
Figura 20. Fotografias da base da cauda dos animais infectados com L. amazonensis mostrando o 1° e
21° dias de tratamento e 100° dia após o fim do tratamento dos grupos controles e tratados com
Glucantime na dose de 50 mg/kg/dia e miltefosina 2,5, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mg/kg/dia. (A1, A21, A100)
Controle. (B1, B21, B100) Controle-veículo. (C1, C21, C100) Glucantime 50 mg/kg/dia. (D1, D21,
D100) miltefosina 2,5 mg/kg/dia. (E1, E21, E100) miltefosina 5 mg/kg/dia. (F1, F21, F100) miltefosina
10 mg/kg/dia. (G1, G21, G100) miltefosina 20 mg/kg/dia. (H1, H21, H100) miltefosina 30 mg/kg/dia. (I1,
I21, I100) miltefosina 40 mg/kg/dia. (J1, J21, J100) miltefosina 50 mg/kg/dia. As fotografias mostram
que os animais dos grupos G, H, I e J apresentavam suas lesões reduzidas em comparação aos outros
grupos.
119
120
Figura 21. Imagens obtidas em microscópio óptico de campo claro de esfregaços das lesões dos animais
controles e tratados com Glucantime na dose de 50 mg/kg/dia e miltefosina 2,5, 5, 10, 20, 30, 40 e 50
mg/kg/dia no 21° dia de tratamento. (A) Controle. (B) Controle-veículo. (C) Glucantime 50 mg/kg/dia.
(D) miltefosina 2,5 mg/kg/dia. (E) miltefosina 5 mg/kg/dia. (F) miltefosina 10 mg/kg/dia. (G) miltefosina
20 mg/kg/dia. (H) miltefosina 30 mg/kg/dia. (I) miltefosina 40 mg/kg/dia. (J) miltefosina 50 mg/kg/dia.
As imagens do esfregaço das lesões mostram células densamente parasitadas nos grupos de A a E, no
grupo F é possível perceber uma redução no número de amastigotas.enquanto que nos grupos G, H, I e J
não foram observadas estas formas em todos os campos pesquisados.
121
122
Figura 22. Imagens obtidas em microscópio óptico de campo claro de esfregaços das lesões dos animais
controles e tratados com Glucantime na dose de 50 mg/kg/dia e miltefosina 2,5, 5, 10, 20, 30, 40 e 50
mg/kg/dia após 100 dias do final do tratamento. (A) Controle. (B) Controle-veículo. (C) Glucantime 50
mg/kg/dia. (D) miltefosina 2,5 mg/kg/dia. (E) miltefosina 5 mg/kg/dia. (F) miltefosina 10 mg/kg/dia. (G)
miltefosina 20 mg/kg/dia. (H) miltefosina 30 mg/kg/dia.. As imagens do esfregaço das lesões mostram
células densamente parasitadas nos grupos de A a H.
123
124
4.3.2 Trifluralina
A eficácia da trifluralina, também, foi avaliada em modelos murinos de infecção
por L. amazonensis. Baseado nos testes com a miltefosina, as concentrações de 5, 15, 30
e 50 mg/kg/dia foram escolhidas e o tratamento foi realizado durante 21 dias, pela via
oral. Os mesmos controles utilizados para os ensaios com a miltefosina, também, foram
usados neste teste.
Ao avaliar as informações obtidas da curva dose-resposta, o Glucantime fármaco
já utilizado para o tratamento da leishmaniose apresentou uma redução mais acentuada
em relação ao controle do que os animais tratados com as diferentes doses de trifluralina
(Figura 23). O tratamento com esta dinitroanilina por via oral não apresentou resultados
satisfatórios, uma vez que ao longo do tratamento as lesões não reduziram em tamanho,
mostrando o baixo potencial de cura da trifluralina, como pode ser observado nas
fotografias (Figura 24).
Figura 23: Gráfico referente ao 1°, 9° e 21° dias de tratamento dos grupos controles e tratados com
Glucantime na dose de 50 mg/kg/dia e trifluralina 5, 15, 30 e 50 mg/kg/dia.
21
Figura 24. Fotografias da base da cauda dos animais, infectados com L. amazonensis mostrando o 1°, 9°
e 21° dias de tratamento dos grupos controles e tratados com Glucantime na dose de 50 mg/kg/dia e
Trifluralina nas doses de 5, 15, 30 e 50 mg/kg/dia. (A1, A9, A21) Controle. (B1, B9, B21) Controle-
veículo. (C1, C9, C21) Glucantime 50 mg/kg/dia. (D1, D9, D21) trifluralina 5 mg/kg/dia. (E1, E9, E21)
trifluralina 15 mg/kg/dia. (F1, F9, F21) trifluralina 30 mg/kg/dia. (G1, G9, G21) trifluralina 50 mg/kg/dia.
As fotografias mostram que os animais tratados com a trifluralina não apresentaram uma redução no
tamanho das lesões.
22
23
5 DISCUSSÃO
Os fármacos usados para o tratamento das leishmanioses estão disponíveis desde
o começo do século 20 e a terapia utilizada ainda apresenta uma série de limitações que,
consequentemente, gera uma resposta variável ao tratamento. O Glucantime, até hoje o
principal fármaco usado na clínica, é extremamente tóxico para o paciente sendo
administrado unicamente por via parenteral, podendo apresentar um perfil de resposta
variado frente às diferentes formas clínicas da doença, uma vez que inúmeros casos de
resistência têm sido relatados. Quando a terapia de primeira escolha com o Glucantime
falha pode-se usar outros fármacos, como a pentamidina, anfotericina B e em alguns
casos a paramomicina. O uso destes fármacos de segunda linha são limitados, uma vez
que a administração é via parenteral e eles, também apresentam altos índices de
toxicidade.
O fármaco mais recentemente incorporado à quimioterapia das leishmanioses foi
a miltefosina, um medicamento de uso oral que dentre todos os fármacos utilizados
apresenta os efeitos colaterais mais toleráveis, apesar de ser teratogênico. Atualmente, a
miltefosina está disponível na Índia e na Alemanha para tratar os casos de leishmaniose
visceral e na Colômbia para tratar a leishmaniose cutânea. A descoberta da miltefosina
como fármaco potencial contra a leishmaniose foi um grande achado uma vez que o
grupo dos fármacos dos quais ela faz parte, os análogos de fosfolipídios, foram
inicialmente desenhados para o tratamento de diversos tipos de câncer (CROFT EL AL.,
1987; KUHLENCORD,1992)
Desde 1987, quando as evidências da excelente atividade leishmanicida da
miltefosina foi comprovada (ACHTERBERG & GERCKEN, 1987A; CROFT EL AL.,
1987), os estudos com formas promastigotas e amastigotas de L. donovani, L.major, L.
tropica, L. aethiopica, L. mexicana and L. panamensis mostraram que a sensibilidade
24
das respostas in vitro variam muito. Nestes testes, a L. donovani foi a mais sensível de
todas as espécies e a L. major a menos sensível (ESCOBAR ET AL., 2001). Diante
desta resposta variável e do potencial terapêutico que esta classe de compostos
apresentou, o estudo de novos análogos de fosfolipídios sintetizados a partir do modelo
estrutural da miltefosina têm sido intensamente explorados, na tentativa de encontrar
novos compostos desta mesma classe com atividade superior ou igual à miltefosina
(CALOGEROPOULOU ET AL., 2008, PAPANASTASIOU ET AL., 2010).
Nesta tese, foram testados, inicialmente, 13 compostos análogos de fosfolipídios
divididos em 3 classes conforme as principais modificações em suas estruturas
químicas. Destes, apenas um, o TC 95, apresentou atividade efetiva sobre as formas
promastigotas, tratadas por 72 h, com uma IC
50
de 1,6 µM obtida a partir do “screening”
inicial por densidade óptica. Para confirmar este valor, também, realizamos curvas de
crescimento com variadas concentrações e tempos de tratamentos a partir da contagem
do número de parasitos em câmera de Newbauer. Por esta metodologia, foi encontrado
valor de IC
50
de 0,7 µM para 72 h de tratamento, indicando que avaliações por
densidade óptica são confiáveis para “screening” de muitos compostos. Comparando os
valores de IC
50
do TC 95 com outros análogos de fosfolipídios já testados em
Leishmania como a miltefosina com IC
50
de 7,5 µM, a edelfosina com IC
50
de 4,2 µM, a
ilmofosina com valor de 2,2 µM (SANTA-RITA ET AL., 2004) e para a perifosina, que
é o análogo mais recentemente estudado com uma IC
50
de 3,6 µM (CABRERA-SERRA
ET AL., 2007), observamos que o TC 95 é mais eficaz do que todos os outros, sendo de
aproximadamente até 7 vezes mais ativo contra as formas promastigotas.
Nas formas amastigotas intracelulares, o primeiro “screening” com os 13
análogos de fosfolipídios, mostrou que seis compostos (TC 19, TC 70, TC 104, TC 135,
TC 172, TC 95) apresentaram valores de IC
50
menores que 10 µM, com destaque para o
25
TC 19 e o TC 95, sendo o primeiro com pouca atividade contra promastigotas. Para
confirmar os resultados obtidos com TC 95 que apresentou atividade anti-promastigota
significativo, nós realizamos uma curva de crescimento com diferentes concentrações e
tempos de tratamento obtendo valores de IC
50
de 2,3 µM e 2,5 µM para 24 e 48 h de
tratamento, que foram muito inferiores aos valores obtidos para miltefosina (9 µM),
edelfosina (4,2 µM) e ilmofosina (4,5 µM) (SANTA-RITA ET AL., 2004). Assim como
observado para os APLs, o TC 95 também apresentou atividade anti-promastigota
superior à atividade anti-amastigota.
Uma vez que o TC 95 é uma molécula hibrida entre a miltefosina e a trifluralina,
nós decidimos estudar os efeitos das dinitroanilinas (trifluralina e orizalina) em L.
amazonensis.
Estes compostos possuem eficaz atividade in vitro e in vivo contra importantes
protozoários parasitas como Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum, Plasmodium
falciparum, Leishmania e Naegleria spp. Inicialmente, utilizadas como herbicidas
possuem grande afinidade pela tubulina de plantas e dos protozoários parasitas,
entretanto, não possuem efeitos em tubulina de animais (DOW ET AL., 2002). Neste
estudo, as formas promastigotas foram tratadas com a trifluralina e a orizalina nas
mesmas concentrações e os efeitos antiproliferativos resultante destes tratamentos foram
similares para a trifluralina e orizalina, os valores foram de 19 µM e 23 µM, após 72 h
de tratamento, respectivamente, entretanto a trifluralina ainda assim apresentou valores
de IC
50
menores que a orizalina. O tratamento das formas amastigotas intracelulares
com a orizalina apresentou valores de IC
50
de 27 e 13 µM, em 24 e 48 h
respectivamente. Os trabalhos iniciais de Chan e colaboradores (1990) mostram que a
trifluralina e a orizalina inibem a proliferação, diferenciação e reduzem a infectividade
dos parasitos do gênero Leishmania em concentrações muito inferiores aos valores de
26
IC
50
obtidos no nosso estudo tanto para as formas promastigotas quanto amastigotas
(CHAN ET AL., 1993). Ao comparar os efeitos antiproliferativos destes compostos é
possível observar que a melhor IC
50
do TC 95 quando comparado com as dinitroanilinas
deve-se ao fato da presença da molécula da trifluralina e miltefosina hibridizada em sua
estrutura química, combinando em uma única molécula dois pontos farmacofóricos
distintos aumentando, possivelmente, sua ação antiproliferativa. No entanto, mais
estudos precisam ser realizados para confirmar esta afirmação, inclusive combinando os
dois compostos (miltefosina e trifluralina) em um mesmo experimento.
A citotoxicidade destes tratamentos no sistema celular é outro parâmetro que
deve ser avaliado, uma vez que o fármaco ideal é aquele capaz de matar o parasito sem
causar danos à célula hospedeira. Nos testes com o TC 95 o valor da CC
50
foi de 50 µM.
Os valores de citotoxicidade descritos para a miltefosina em macrófagos peritoneais é
de 60 µM e em macrófagos THP-1 e de 50 µM (SANTA-RITA ET AL., 2004;
CALOGEROPOULOU ET AL., 2008). Quando comparamos estes dados com o gráfico
obtido no nosso modelo de estudo é possível perceber que a partir de 50 µM o TC 95 já
tóxico para as células, entretanto apenas a concentração de 200 µM foi capaz de causar
danos significativos aos macrófagos peritoneais tratados por 72 h. Observando os
valores de IC
50
para as amastigotas intracelulares de cada composto e as concentrações
potencialmente tóxicas para os macrófagos é possível concluir que o TC 95 oferece uma
margem de segurança maior quando comparado com os análogos de fosfolipídios
descritos na literatura, validando-o ainda mais como potencial agente quimioterápico.
O mecanismo de ação dos APLs difere de uma forma geral dos outros fármacos,
uma vez que o alvo primário destas moléculas são as membranas celulares. Assim, o
uso de APLs como a miltefosina, ilmofosina e edelfosina inteferem principalmente com
o “turnover” de fosfolipídios e as vias de transdução de sinais baseada nos lipídios
27
resultando em uma perturbação na dinâmica lipídica que é observada em células
tumorais e também nos parasitos (BLITTERSWIJK E VERHEIJ, 2008; LUX ET AL.,
2000).
As análises fluorimétricas utilizando o Sytox Blue mostraram que há um
comprometimento na integridade da membrana plasmática apenas nas formas
promastigotas tratadas com o TC 95, uma vez que houve um aumento concentração-
dependente na intensidade de fluorescência, indicando assim a entrada do indicador nas
células tratadas, não observado no tratamento com estas dinitroanilinas. Assim o TC 95
similar a miltefosina pode estar se inserindo dentro da bicamada lipídica da membrana
plasmática, possivelmente alterando a distribuição lipídica da membrana.
As observações ao microscópio óptico mostraram que o TC 95 alterava
significativamente a forma das promastigotas após 24, 48 e 72 h de tratamento com
diferentes concentrações. Foi possível confirmar estas alterações e verificar o
comprometimento do citoesqueleto por imunofluorescência com anti-tubulina, uma vez
que as células apresentaram falhas na continuidade do citoesqueleto de microtúbulos
subpeliculares e acúmulo de tubulina em algumas regiões da célula. Ao analisar a
ultraestrutura das formas promastigotas por MEV foi possível confirmar a alteração da
forma das células e ainda o afrouxamento da membrana do flagelo e da bolsa flagelar,
alterações na dinâmica do ciclo celular e citocinese, onde é possível visualizar uma
única célula com mais de dois flagelos e vários aglomerados de células que não
conseguiram finalizar sua divisão.
Os tratamentos das promastigotas com a trifluralina e orizalina alteram a
morfologia das células como é possível avaliar nas imagens obtidas por DIC, no entanto
com a orizalina estas modificações foram mais intensas e, também, observadas por
videomicroscopia (dados não mostrados), aonde foi possível filmar células
28
completamente disformes com vários flagelos que ainda estavam viáveis e se
locomovendo. Ao observar por imunofluorescência indireta, o padrão de marcação da
tubulina nas células tratadas com a orizalina, estas estavam alteradas, onde foi possível
observar em muitas células uma ruptura na estrutura do citoesqueleto. As imagens de
MEV confirmam as drásticas mudanças na morfologia e, também, indicam problemas
no padrão de divisão celular e citocinese, que podem ser confirmadas a partir da
microscopia óptica de fluorescência das células marcadas com DAPI. Por MET as
alterações na divisão celular são confirmadas, pois é possível observar células
multinucleadas, com dois ou mais cinetoplastos e axonemas em uma única bolsa
flagelar e rupturas na estrutura na membrana plasmática com o possível
comprometimento dos microtubulos subpeliculares. Todas estas alterações causadas
pelo tratamento com as dinitroanilinas podem estar associadas a grande afinidade que
estes compostos possuem para a tubulina dos protozoários.
As alterações observadas na forma das promastigotas tratadas com TC 95,
trifluralina e orizalina seja por microscopia óptica de contraste interferencial diferencial
(DIC) ou por MEV, podem estar relacionadas com uma alteração significativa na
composição de fosfolipideos e esteróis da membrana plasmática, como foi descrito
anteriormente (RAKOTOMANGA ET AL., 2007; LIRA ET AL., 2001). Estas
alterações na composição lipídica podem consequentemente resultar numa
desestabilização e afrouxamento dos microtúbulos subpeliculares associados a
membrana plasmática, acarretando em um acúmulo de tubulina em diferentes regiões do
corpo celular (RODRIGUES ET AL., 2008). Por outro lado é importante mencionar que
o TC 95 é uma molécula híbrida que contém parte da molécula da trifluralina que é uma
dinitroanilina, que conhecidamente tem afinidade pela tubulina dos tripanossomatídeos
(CHAN ET AL., 1993). Ao comparar o TC 95 com as imagens obtidas após o
29
tratamento com a orizalina e os dados da literatura, é possível sugerir que a porção
trifluralínica do TC 95 possui afinidade pela tubulina dos microtúbulos subpeliculares,
resultando assim no seu afrouxamento e descontinuidade em diferentes regiões do corpo
celular.
A fim de avaliar as possíveis alterações no remodelamento lipídico, analisamos
o efeito do tratamento das formas promastigotas com o TC 95 através das diferentes
metodologias como as análises fluorimétricas e microscopia óptica de fluorescência
com o “Nile Red”, um marcador de lipídios neutros (GREENSPAN ET AL., 1985), e
citoquímica com ósmio-imidazol, que revela a presença de lipídios insaturados
(SOARES, 1998). Assim foi possível perceber um acúmulo progressivo de lipídios
neutros tempo e concentração-dependentes. Este aumento é progressivo e
estatisticamente significativo após 48 h de tratamento, onde é possível observar a partir
das imagens obtidas por MET da citoquímica com ósmio-imizazol, que apesar do
controle apresentar corpúsculos lipídicos em seu citoplasma, as promastigotas tratadas
com 2, 3 e 4 µM possuem inúmeros corpúsculos distribuídos randomicamente na célula
e na população como um todo. Nas micrografias das promastigotas tratadas com 3 e 4
µM ainda é possível visualizar grânulos lipídicos próximos ao RE, umas das organelas
responsáveis pela biossíntese de lipídios, e muitas vezes tocando a membrana
plasmática. Em T. cruzi tratado com a miltefosina foi observado que além da inibição
das enzimas da via de síntese de fosfolipídios (via de Greenberg) ocorre uma mudança
na composição de esteróis, através da inibição da esterol C-22 desaturase, mostrando
assim que os APLs também alteram a dinâmica dos esteróis (LIRA ET AL., 2001). Ao
avaliar de acúmulo de lipídeos neutros em células tratadas com as dinitroanilinas com o
uso do Nile Red, foi possível perceber que a trifluralina não altera a dinâmica dos
lipídios nas células tratadas, entretanto a orizalina, por 48 horas de tratamento modifica
30
a distribuição dos lipídios tempo e concentração-dependentes. A fim de confirmar estes
dados a citoquímica com ósmio-imidazol confirmou o padrão de acúmulo de
corpúsculos lipídicos nas promastigotas tratadas com a orizalina.
Em suma, nossos dados indicam que o TC 95 pode concomitantemente estar
atuando na estrutura e alteração na composição de lipídios da membrana plasmática
através de sua parte fosfolípidica, quanto na estrutura dos microtúbulos subpeliculares
pelo seu anel trifluralínico.
Através da microscopia eletrônica de transmissão foi possível observar as
principais organelas alteradas a partir do tratamento com o TC 95 e a orizalina. Uma das
principais alterações observadas com o TC 95 em formas promastigotas e amastigotas
nos tempos iniciais de tratamento (24h) foram na estrutura da mitocôndria, que se
encontrou inchada e com severas alterações como a desorganização e ruptura da sua
membrana, danos as cristas, bem como a presença de estruturas concêntricas em sua
matriz. Além das alterações mitocondriais, também, foram observadas uma intensa
vacuolização, alterações na membrana do flagelo e perfis de RE envolvendo organelas,
típico de autofagia (RODRIGUES ET AL., 2007). Com o tratamento, por 48 e 72 h, em
promastigotas foi possível verificar alterações ao RE e CG, não observados nos tempos
iniciais (dados não mostrados). Estas alterações já estão descritas na literatura após o
tratamento com os APLs (miltefosina, edelfosina e ilmofosina), no entanto com o TC 95
elas aparecem de forma intensa nos tempos iniciais de tratamento. Assim, estes dados
sugerem que os tratamentos com o TC 95 podem resultar em processos de morte celular
por autofagia com o aparecimento de figuras de mielina e perfis de RE circundando as
organelas e/ou por apoptose, indicado pela presença de lesões mitocondriais e núcleos
com aspecto de fragmentação da cromatina. Em L. donovani, o uso da miltefosina foi
capaz de induzir processo de morte celular por apoptose, alterando o tamanho da célula
31
e levando a fragmentação do DNA e exposição da fosfatidilserina (PARIS ET AL,
2004).
Por MET as alterações na divisão celular causadas pelo tratamento com a
orizalina, antes observadas por microscopia óptica de fluorescência com DAPI e MEV,
foram confirmadas, pois é possível observar células multinucleadas, com dois ou mais
cinetoplastos e axonemas em uma única bolsa flagelar e rupturas na estrutura na
membrana plasmática com o possível comprometimento dos microtúbulos
subpeliculares. Todas estas alterações causadas pelo tratamento com as dinitroanilinas
podem estar associadas à grande afinidade que estes compostos possuem para a tubulina
dos protozoários.
Assim a partir destes estudos in vitro, foi possível verificar que o TC 95 é um
novo análogo de fosfolipídio com potencial atividade leishmanicida e pode,
posteriormente, ser testado para outras espécies de Leishmania e em modelos in vivo. E
que a atividade das dinitroanilinas no modelo in vitro de L. amazonensis mostrou que
esses compostos até são eficazes, entretanto, em altas concentrações e longos tempos de
tratamentos, mas a ação das dinitroanilinas em vários protozoários faz destes compostos
importantes protótipos que podem ter sua relação estrutura-atividade melhoradas através
da síntese de novos análogos que já estão sendo testados com sucesso para a
leishmaniose (WERBOVETZ ET AL., 2003; BHATTACHARYA ET AL., 2004;
ESTEVES ET AL., 2010).
A maior contribuição do estudo das dinitroanilinas neste trabalho é poder
mostrar que o TC 95, sintetizado a partir da hibridação molecular da miltefosina e da
trifluralina, apresenta atividade superior quando comparada aos dois compostos em
separados. A partir destes estudos, também, foi possível perceber que os efeitos
celulares causados pelo tratamento com o TC 95 combinam os efeitos descritos para as
32
dinitroanilinas e a miltefosina quando utilizadas separadamente, entretanto, em maiores
concentrações e tempos de tratamento. A partir destes dados é possível perceber que o
efeito da trifluralina e miltefosina parecem estar melhorados e combinados quando
testados para as formas promastigotas e amastigotas intracelulares tratadas pelo TC 95.
Os testes in vivo foram realizados em modelos murinos infectados com L.
amazonensis e tratados com a trifluralina e miltefosina. O tratamento foi realizado
durante 21 dias e os fármacos administrados por via oral. A resposta terapêutica foi
acompanhada durante os 21 dias de tratamento e, também, após seis meses de
interrupção, para avaliar se houve cura das lesões.
O teste realizado com a trifluralina por via oral não apresentou resultados
significativos uma vez que as lesões iniciais não reduziram, mas seguiram o curso
normal de infecção aumentendo ao longo dos dias de tratamento. Para todos os ensaios,
o Glucantime foi utilizado como controle positivo uma vez que este é o fármaco padrão
utilizado no Brasil, e ao final do tratamento foi possível observar uma redução no
tamanho das lesões que foi superior a todas as doses usadas no tratamento com a
trifluralina. Dados da literatura mostram que a trifluralina apresentou bons efeitos
leishmanicidas in vivo em modelos murinos de leishmaniose causados por L. mexicana,
entretanto a administração foi por via tópica (CHAN ET AL., 1993). Uma das possíveis
razões pelas quais este teste não apresentou bons resultados pode ser devido a
farmacocinética e distribuição da trifluralina quando administrada por via oral, pois
trabalhos anteriores mostram que a trifluralina possui uma pobre absorção quando
administrada por via oral (DOW ET AL., 2002). Atualmente, existem alternativas para
melhorar as propriedades farmacodinâmicas das formulações com a trifluralina, como o
uso de lipossomas usados para tratar cães infectados com L. infantum, resultando em
uma melhora nos sintomas clínicos (MARQUES ET AL., 2008).
33
O uso da miltefosina para tratar leishmaniose cutânea na Colômbia foi aprovado,
pois os testes clínicos apresentaram excelentes percentuais de cura nos pacientes
infectados com L. panamensis, entretanto, os testes clínicos realizados na Bolivia e na
Guatemala usando a miltefosina nas espécies L. braziliensis não apresentaram os
mesmos resultados (SOTO ET AL., 2004). No Brasil, o uso da miltefosina para as
nossas espécies não apresentou um resultado muito eficaz, no entanto não existe ainda
um estudo criterioso e aprofundado deste efeito. Diante desta realidade e buscando uma
comparação com os resultados obtidos para o TC 95 in vitro, decidimos avaliar o efeito
da miltefosina em modelos murinos infectadas com L. amazonensis. As doses utilizadas
foram desde 2,5 mg/kg/dia preconizada pela OMS para o tratamento da leishmaniose
em outros países e 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mg/kg/dia. Os resultados, ao final de 21 dias de
tratamento, mostraram que houve uma redução dose-dependente do tamanho das lesões.
Ao final de 21 dias de tratamento foi possível perceber que nos animais tratados
com as doses de 20, 30, 40 e 50 mg/kg/dia as lesões reduziram significativamente
quando comparados com os controles e o Glucantime, podendo afirmar que
clinicamente eles estavam curados. Ao verificar os dados da literatura foi posivel
observar que a dose eficaz da miltefosina pode variar conforme a espécie de
Leishmania, pois animais infectados com L. donovani e tratados por quatro semanas
com miltefosina estavam curados após receberam a dose de 20 mg/kg/dia
(KUHLENCORD,1992), e em infecções cutâneas por L. major a dose eficaz da
miltefosiana após dez dias de tratamento foi de 25 mg/kg/dia (AGUIAR ET AL., 2009).
Entretanto, para validar a dose eficaz do fármaco foi necessário acompanhar os animais
seis meses após o tratamento. Ao final deste período foi possível concluir que os
animais que permaneceram curados foram os tratados com as doses de 40 e 50
mg/kg/dia, uma vez que para as doses de 20 e 30 mg/kg/dia formas amastigotas foram
34
encontradas em esfregaços das lesões. Apesar dos animais apresentarem um aspecto
debilitante quando receberam a dose de 50 mg/kg/dia, eles recuperam seu peso ao longo
do período de observação. É importante ressaltar que durante este tratamento nenhum
animal morreu decorrente da toxicidade do fármaco. Assim a miltefosina é eficaz no
tratamento de animais infectados com L. amazonensis, entretanto a dose eficaz é
superior as doses já utilizadas na clinica para leishmaniose.
A partir destes dados foi possivel mostrar que os compostos estudados durante
este trabalho apresentam potencial terapêutico efetivo para o tratamento das
leishmanioses. O TC 95, um híbrido alquilfosfolipídio-dinitroanilina, apresentou um
excelente potencial in vitro que poderá ser validado futuramente a partir de testes in
vivo em modelos murinos de leishmaniose cutânea. As dinitroanilinas, compostos
protótipos que através de mudanças em suas estruturas químicas podem ser melhorados
apresentando uma relação estrutura-atividade mais eficaz ou através de novas
formulações farmacêuticas, e a miltefosina que a partir destes testes já pode ser utilizada
em ensaios de fase clínica, uma vez que se necessita urgentemente de alternativas para a
terapia das leishmanioses no Brasil.
35
6 CONCLUSÕES
A partir destes estudos, obtivemos as seguintes conclusões:
1 Dentre os 13 análogos de fosfolipídios inicialmente testados o TC 95 foi
o composto mais promissor, pois apresentou os melhores resultados quando testado em
formas promastigotas e amastigotas intracelulares de Leishmania amazonensis;
2 As dinitroanilinas, trifluralina e orizalina são compostos eficazes para os
tratamentos in vitro das formas promastigotas e amastigotas intracelulares de L.
amazonensis, entretanto em altas concentrações;
3 O tratamento com o TC 95 e a orizalina alteraram a morfologia e a
ultraestrutura da membrana plasmática, mitocôndria, cinetoplasto e flagelo, assim como
alterações no processo de divisão celular e na citocinese;
4 As formas promastigotas tratadas com o TC 95 e com a orizalina
apresentaram alterações no perfil lipídico, uma vez que houve um intenso acúmulo de
lipídios dependentes da concentração de tratamento;
5 O teste in vivo realizado com a trifluralina não apresentou um resultado
favorável após o tratamento nas condições usadas neste experimento (via de
administração);
6 O tratamento dos animais infectados com L. amazonensis com a
miltefosina mostrou resultados satisfatórios, mesmo usada em doses superiores as
descritas na clínica;
7 Os resultados obtidos com o TC 95 apontam para a necessidade urgente
de avaliar seus efeitos em animais experimentais por L. amazonensis e, também, em
outras espécies do gênero Leishmania.
36
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