Download PDF
ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
SIMONE MARTINS DE OLIVEIRA
EFEITOS DE MEDICAMENTOS HOMEOPÁTICOS SOBRE A LIBERAÇÃO DE
ESPÉCIES REATIVAS POR MACRÓFAGOS PERITONEAIS E A EXPRESSÃO DE
MARCADORES DE CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGOS.
CURITIBA,
2010
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
SIMONE MARTINS DE OLIVEIRA
EFEITOS DE MEDICAMENTOS HOMEOPÁTICOS SOBRE A LIBERAÇÃO DE
ESPÉCIES REATIVAS POR MACRÓFAGOS PERITONEAIS E A EXPRESSÃO DE
MARCADORES DE CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGOS.
Tese de doutorado apresentada como
requisito parcial à obtenção do grau de
Doutor no programa de Biologia Celular
e Molecular do Departamento de
Biologia Celular, Setor de Ciências
Biológicas, Universidade Federal do
Paraná
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Dorly de F.
Buchi
CURITIBA,
2010
ads:
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me permitir passar por momentos como esse, tão
especiais e únicos em minha caminhada, e por todas as pessoas insubstituíveis que
fizeram parte dele!
A minha família, minha vida: meus pais João e Joana, anjos que Deus tirou
do seu lado pra que pudessem cuidar de mim nessa vida. São meu espelho, minha
força de vontade, meu começo e meu fim. A garra de vocês, o desejo de me ver
feliz, o amor que transborda no olhar, os vários sacríficos para que eu pudesse
chegar até aqui, são impossíveis de serem agradecidos com um simples obrigado.
Não há como retribuir, a não ser fazendo o que vocês mais pedem para cada um de
seus filhos: sendo feliz! Aos meus “seguranças”, meus irmãos que se pudessem
transformavam todos os meus dias em festa. Sempre me apoiaram e me
incentivaram. Sidney, irmão mais velho, que mesmo sendo tão diferente, somos tão
parecidos. Obrigada por sempre estar comigo quando preciso. Sandrinho, meu
irmãozinho de 1,85 metros! Meu companheiro que sempre me deu força. Essas 4
pessoas são mágicas, me transformam na mulher mais inteligente e linda do mundo,
me fazem rir e achar todos meus erros bobos e acreditar que tudo é possível. Com
vocês eu sei que posso ir para onde eu quiser, fazer o que eu quiser, pois sei que
sempre posso voltar para casa! Foram vocês que me ensinaram o primeiro sentido
da palavra amor!
Ao meu namorado, Ronaldo, que chegou de mansinho na minha vida e justo
nos momentos mais difíceis desse trabalho. A sua incrível capacidade de me
desarmar fez com que, mesmo estando distante, estivesse sempre ao meu lado, me
ouvindo, dando conselhos e levantando minha alto estima. Deu-me seu colo e forças
para eu nunca desistir. Mostrou-me que tudo o que eu tenho é conseqüência daquilo
que eu busquei! Nada é por acaso! Amadureci, cresci e aprendi uma nova forma de
amar com você!
À Dorly! São tantos anos juntas, tantos ensinamentos, tanto
companheirismo, tantos conselhos, que não sei por onde começar a agradecer.
Obrigada por me aceitar como eu sou, e por tentar me fazer enxergar o mundo de
outra forma. Além de seus ensinamentos científicos, sua maneira de lidar com a
vida, de encarar os problemas e conviver com as outras pessoas, foram os maiores
aprendizados que eu tive fora da casa dos meus pais. A maior parte do meu
crescimento pessoal depois de adulta foi com você!
Agradeço aos vários companheiros de laboratório. Nesses anos, muitas
pessoas fizeram parte do meu dia a dia, muito mais do que familiares e amigos de
infância. O que fez com que se tornassem verdadeiros confidentes e amigos. Pois
somente amigos conseguem conviver com variações de humor constante,
experimentos planejados por dias que resultam em nada e mutirões de limpeza de
16 horas seguidas! Alguns já não participaram da fase final desse trabalho, mas tem
sua mãozinha em algumas dessas páginas. Á Bia, que com seu carinho, atenção e
longas conversas fez com que eu me conhecesse melhor. Ao Fer, que sempre tinha
uma nova sugestão para meu trabalho. À Karine, por sua disponibilidade e amizade.
Ao Raffa, sempre pronto, seja para uma colaboração no laboratório ou para uma
festa. A Caro, minha “irmã gêmea”! Muito obrigada por tudo, pelo ombro amigo,
pelas nossas festas, risadas e ajuda logo nos primeiros passos da tese. A Edy
“nossa filha”! Obrigada por toda a sua ajuda, disponibilidade, consideração e
preocupação. A Ana Paula que sempre esteve do meu lado. Nos momentos bons e
ruins, tanto dos experimentos quanto da vida! Obrigada amiga, você foi praticamente
meu “diário ambulante”! Sua presença tornou meus dias mais leves e fáceis. Aos
novatos do lab, Rafael, Gustavo, Jenifer, Diogo, Eneida, Lucas. Obrigada pela
disposição. Sem vocês grande parte desse trabalho não seria possível. Aos
agregados, como a Beth e o professor Juarez, por estarem sempre prontos a nos
ajudar. Obrigada pelo seu carinho e atenção!
A ex secretária do departamento, Gerizalda e a secretária do programa de pós
graduação em Biologia Celular e Molecular Marlene!
Ao pessoal do biotério, a Izelen, Cândido, Júlio, Luís, e demais funcionários
que nunca exitaram em atender nossos pedidos de última hora e principalmente por
todo o apoio técnico. Agradeço em especial aos camundongos, obrigada por se
permitirem participar das nossas pesquisas!
Ao Centro de Microscopia Eletrônica da UFPR. Em especial a Regina e a
Rosângela que sempre foram atenciosas e prestativas e ao professor Ney por todos
os seus ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Sílvio Sanches Veiga por permitir o uso de seu laboratório e
equipamentos, e aos seus alunos por toda a atenção dedicada.
Ao Prof. Luís Cláudio Fernandes e todos os seus alunos que possibilitaram o
uso de seus equipamentos, colaborações, discussões científicas e principalmente
pela amizade.
Ao Prof. Edvaldo, sempre disposto a solucionar um problema e colaborar com
suas sugestões.
Ao Seu Nino, pelo seu sorriso sempre amável, pela sua disponibilidade e ajuda
nas técnicas de coloração e cuidado com os microscópios. Sua paz e serenidade
tornam nosso local de trabalho mais aconchegante!
A CAPES pela bolsa de estudos concedida durante o período da realização de
minha tese e à Secretaria de Ciência e Tecnologia pela concessão de recursos para
a pesquisa, tornando financeiramente viável todos os experimentos.
A todos os meus amigos, que de alguma forma sempre me incentivaram, me
apoiaram e me confortaram. Não vou citar todos os nomes aqui, mas vocês sabem o
quanto são essenciais na minha vida. Obrigada por torná-la tão especial e mais
prazerosa!
Todas as pessoas que passaram pela minha vida nestes anos, mesmo sem
saber, deixaram algum ensinamento o qual tento sempre levá-lo comigo. Por isso,
muito obrigada a todos!
“A vida é construída nos sonhos...
·...E concretizada no amor!”
Chico Xavier
RESUMO
Alguns tratamentos homeopáticos modulam o sistema imunológico. Com o objetivo
de verificar a ação de medicamentos homeopáticos, estudos com macrófagos
peritoneais e células da medula óssea de camundongos foram realizados com
Mercurius solubilis (Merc sol), Aconitum napellus (Acon), Atropa Belladonna (Bell),
Arsenicum album (Ars), Lachesis muta (Lach), Thuya occidentalis (Thuy) e Bryonia
alba (Bry). Estes medicamentos, além de serem utilizadas na clínica para tratamento
de doenças inflamatórias e infecciosas, demonstraram, em trabalho anterior, ação
sobre macrófagos. Liberação de óxido nítrico (NO), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e
anion superóxido (O
2
-
) por macrófagos foram analisados in vitro (antes e após
interação com leveduras) e ex vivo em reação colorimétrica. Células da medula
óssea foram imunomarcadas: ex vivo para linhagem hematopoiética e após cultivo e
cocultivo com macrófagos para CD11b, todos quantificados em citometria de fluxo.
Os macrófagos cocultivados foram processados para Microscopia Eletrônica de
Varredura. Todos os medicamentos ativaram morfologicamente estas células e
aumentaram a liberação de NO in vitro. Merc sol diminuiu a liberação de O
2
-
in vitro,
ex vivo e H
2
O
2
após interação com levedura. Aumentou a expressão de CD3 ex vivo,
e CD11b não aderente in vitro. Acon diminuiu NO, O
2
-
e H
2
O
2
após leveduras e O
2
-
ex vivo. Aumentou H
2
O
2
e CD45R ex vivo e CD11b não aderente in vitro. Bell diminui
O
2
-
e H
2
O
2
após leveduras e O
2
-
in vitro. Aumentou O
2
-
ex vivo, CD45R e diminuiu
Ly-6G. Ars diminuiu NO após leveduras, O
2
-
in vitro e ex vivo e H
2
O
2
ex vivo,
Aumentou a expressão de CD3 e CD11c ex vivo e CD11b aderente da co-cultura.
Lach aumentou NO ex vivo, diminuiu NO e H
2
O
2
após levedura e O
2
-
e H
2
O
2
in vitro
e ex vivo. Aumentou expressão de CD3, CD45R, CD11c ex vivo e diminui CD11b ex
vivo e em não aderentes da co-cutura. Thuy diminuiu O
2
-
in vitro, com levedura e ex
vivo. Aumentou CD3, CD45R e CD11c ex vivo, e em co-cultura CD11b aderente e
diminui não aderente. Bry aumentou H
2
O
2
e diminuiu O
2
-
ex vivo. Aumentou Ly-6G,
CD11c e CD11b ex vivo, e e em co-cultura CD11b aderente e diminui não aderente.
Dessa maneira, pode-se dizer que medicamentos homeopáticos ativam macrófagos,
promovem melhora na defesa celular e redução de estresse oxidativo, e atuam na
diferenciação e/ou proliferação das células de medula óssea
Palavras chave: medicamentos homeopáticos; macrófago; células de medula óssea;
espécies reativas de nitrogênio e oxigênio.
ABSTRACT
Homeopathic medications can modulate the immune system. Here we describe the
results of some experimental laboratory studies aimed at verifying the efficacy of
homeopathic medicines in peritoneal macrophages and bone marrow cells with
Mercurius solubilis (Merc sol), Aconitum napellus (Acon), Atropa Belladonna (Bell),
Arsenicum album (Ars), Lachesis muta (Lach) e Thuya occidentalis (Thy) and
Bryonia alba (Bry). Previous studies demonstrated that this medication activates
macrophages. Nitric oxide (NO), hydrogen peroxide (H
2
O
2
) and superoxide (O
2
-
)
released were analyzed in vitro (before and after interaction with yeast) and, ex vivo
by colorimetric reaction. Bone marrow cells incubated with hematopoietic lineage
markers after ex vivo treatment and with CD11b after culture and coculture with
macrophage and read with flow cytometry. Co-cultured macrophages were
processed to scanning electron microscope. These cells were determined activated
by morphology changes after treatment and increased NO release. Merc sol
decreased O
2
-
released in vitro, ex vivo and H
2
O
2
after incubation with yeast. It also
increased CD3 expression ex vivo, and CD11b nonadherent in vitro. Acon decreased
NO, O
2
-
and H
2
O
2
after incubation with yeast and O
2
-
ex vivo. Besides, it increased
H
2
O
2
and CD45R ex vivo and CD11b nonadherent in vitro. Bell decreased O
2
-
and
H
2
O
2
after yeast and O
2
-
in vitro and, ex vivo increased O
2
-
, CD45R and decreased
Ly-6G. Ars decreased NO after yeast, O
2
-
in vitro and ex vivo and H
2
O
2
ex vivo,
Increased CD3 and CD11c expression ex vivo and CD11b adhent co-culture. Lach
increased NO ex vivo, decreased NO and H
2
O
2
after yeast and O
2
-
e H
2
O
2
in vitro
and ex vivo. Increased CD3, CD45R, CD11c ex vivo expression and decreased
CD11b ex vivo and in nonadherent co-culture. Thuy decreased O
2
-
in vitro, after
yeast and ex vivo. Increased CD3, CD45R e CD11c ex vivo, and CD11b adherent
co-culture and diminished nonadherent. Bry increased H
2
O
2
and decrease O
2
-
ex
vivo. Increased Ly-6G, CD11c and CD11b ex vivo, and CD11b adherent in co-
culture, and decreased nonadherent. cells. With these results, it is possible to state
that homeopathic medicines can activate macrophages, promote cellular defense,
diminish oxidative stress and, probably act on bone marrow cells differentiation and
proliferation.
Key words: homeophatic medicine; macrophage; bone marrow cells; reactive oxygen
and nitrogen species.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 IMAGENS DA FONTE DE ORIGEM DOS PRODUTOS
ALTAMENTE DILUÍDOS UTILIZADOS.
13
FIGURA 2 ORIGEM DOS MONÓCITOS
25
FIGURA 3 HETEROGENEIDADE DE MONÓCITOS/MACRÓFAGOS
DURANTE DIFERENCIAÇÃO IN VIVO
26
FIGURA 4 ESQUEMA DA PLACA DE CO-CULTURA
42
FIGURA 5 FIGURAS ILUSTRANDO COMO FOI REALIZADO O
TRATAMENTO DOS CAMUNDOGOS COM O
MEDICAMENTO 9
44
FIGURA 6 ESQUEMA DE HEMATOPOIESE MOSTRANDO A PARTIR
DE QUAL LOCAL PROVAVELMENTE OS MEDICAMENTOS
COMEÇAM A AGIR
55
FIGURA 7 LIBERAÇÃO DE NO POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO IN VITRO COM MERC SOL
58
FIGURA 8 LIBERAÇÃO DE O
2
-
LIBERADO POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO IN VITRO COM MERC SOL
59
FIGURA 9 LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO IN VITRO COM MERC SOL
61
FIGURA 10
LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO IN VIVO DOS CAMUNDONGOS COM MERC
SOL.
62
FIGURA 11 LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO IN VIVO DOS CAMUNDONGOS COM MERC
SOL
62
FIGURA 12 EFEITOS DO MERC SOL NA LIBERAÇÃO DE ESPÉCIES
REATIVA
63
FIGURA 13 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DE
MACRÓFAGOS TRATADOS COM MERC SOL EM CO-
CULTURA
64
FIGURA 14 CD3ε
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA APÓS
TRATAMENTO IN VIVO COM MERC SOL
65
FIGURA 15
CD11b
+
EM CÉLULAS NÃO ADERENTES DE MEDULA
ÓSSEA APÓS TRATAMENTO IN VITRO COM MERC SOL
67
FIGURA 16 CD11b
+
DE CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA NÃO
ADERENTES EM CULTURA E CO-CULTURA
68
FIGURA 17 LIBERAÇÃO DE NO POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO IN VITRO COM ACON
71
FIGURA 18 LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO COM ACON
72
FIGURA 19 LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO COM ACON
73
FIGURA 20 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DE
MACRÓFAGOS TRATADOS COM ACON CH30 EM CO-
CULTURA
75
FIGURA 21 CD45R
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA APÓS
TRATAMENTO IN VIVO COM ACON
76
FIGURA 22 CD11b
+
EM CÉLULAS NÃO ADERENTES DE MEDULA
ÓSSEA APÓS TRATAMENTO IN VITRO COM ACON
77
FIGURA 23 CD11b
+
DE CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA NÃO
ADERENTES EM CULTURA E CO-CULTURA
79
FIGURA 24 LIBERAÇÃO DE NO POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO IN VITRO COM BELL
80
FIGURA 25
LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO COM BELL
81
FIGURA 26 LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO COM BELL
82
FIGURA 27 LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO COM BELL.
83
FIGURA 28
EFEITOS DO TRATAMENTO COM BELL CH30 IN VITRO E
IN VITRO COM POSTERIOR INTERAÇÃO COM LEVEDURA
85
FIGURA 29
EFEITOS DO TRATAMENTO COM BELL CH6 E 200 IN
VITRO E IN VITRO COM POSTERIOR INTERAÇÃO COM
LEVEDURA
85
FIGURA 30 LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO IN VIVO COM BELL
86
FIGURA 31 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DE
MACRÓFAGOS TRATADOS COM BELL CH200 EM CO-
CULTURA
88
FIGURA 32 Ly-6G
+
E CD45R
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA APÓS
TRATAMENTO IN VIVO COM BELL
89
FIGURA 33 LIBERAÇÃO DE NO POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO IN VITRO COM ARS
94
FIGURA 34 LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO COM ARS
95
FIGURA 35 LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO COM ARS
96
FIGURA 36 MICROSCOPIA ELETRONICA DE VARREDURA
MORFOLOGIA DE MACRÓFAGOS TRATADOS COM ARS
EM CO-CULTURA
97
FIGURA 37 CD3ε
+
E CD11c
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA APÓS
TRATAMENTO IN VIVO COM ARS
98
FIGURA 38 CD11b
+
EM CÉLULAS ADERENTES DE MEDULA ÓSSEA
APÓS CO-CULTURA COM MACRÓFAGOS E
TRATAMENTO COM ARS
100
FIGURA 39 CD11b
+
DE CÉLULAS NÃO ADERENTE EM CULTURA E
CO-CULTURA.
102
FIGURA 40 LIBERAÇÃO DE NO POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO IN VITRO COM LACH
104
FIGURA 41 LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO COM LACH
105
FIGURA 42 LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO COM LACH
106
FIGURA 43
EFEITOS DO TRATAMENTO IN VITRO E IN VIVO COM
LACH
107
FIGURA 44
EFEITOS DO TRATAMENTO IN VITRO COM LACH E
POSTERIOR INTERAÇÃO COM LEVEDURAS
108
FIGURA 45 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DE
MACRÓFAGOS TRATADOS COM LACH CH200 EM CO-
CULTURA
109
FIGURA 46
CD3ε
+
, CD11b
+
, CD45R
+
E CD11c
+
EM CÉLULAS DE
MEDULA ÓSSEA APÓS TRATAMENTO IN VIVO COM
LACH
110
FIGURA 47 CD11b
+
EM CÉLULAS NÃO ADERENTES DE MEDULA
ÓSSEA APÓS CO-CULTURA COM MACRÓFAGOS E
TRATAMENTO COM LACH
113
FIGURA 48 CD11b
+
DE CÉLULAS NÃO ADERENTE EM CULTURA E
CO-CULTURA.
114
FIGURA 49 EFEITOS DE LACH NOS MARCADORES
HEMATOPOIÉTICOS DAS CÉLULAS DA MEDULA APÓS
TRATAMENTO IN VIVO E CO-CULTURA
115
FIGURA 50 LIBERAÇÃO DE NO POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO IN VITRO COM THUY
117
FIGURA 51 LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO COM THUY
118
FIGURA 52 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DE
MACRÓFAGOS TRATADOS COM THUY EM CO-CULTURA
120
FIGURA 53 CD3ε
+
, CD45R+, E CD11c
+
EM CÉLULAS DE MEDULA
ÓSSEA APÓS TRATAMENTO IN VIVO COM THUY
121
FIGURA 54 CD11b
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA APÓS CO-
CULTURA COM MACRÓFAGOS TRATADOS IN VITRO
COM THUY
124
FIGURA 55 CD11b
+
EM CÉLULAS ADERENTES DE MEDULA ÓSSEA
APÓS CO-CULTURA COM MACRÓFAGOS TRATADOS IN
VITRO COM THUY
124
FIGURA 56 CD11b
+
DE CÉLULAS NÃO ADERENTE EM CULTURA E
CO-CULTURA.
125
FIGURA 57 LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO IN VIVO COM BRY
128
FIGURA 58 LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS
TRATAMENTO IN VIVO COM BRY
129
FIGURA 59 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DE
MACRÓFAGOS TRATADOS COM BRY EM CO-CULTURA
131
FIGURA 60 Ly6G
+
, CD11b+, E CD11c
+
EM CÉLULAS DE MEDULA
ÓSSEA APÓS TRATAMENTO IN VIVO COM BRY
132
FIGURA 61 CD11b
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA APÓS CO-
CULTURA COM MACRÓFAGOS TRATADOS IN VITRO
COM BRY
133
FIGURA 62 CD11b
+
EM CÉLULAS ADERENTES DE MEDULA ÓSSEA
APÓS CO-CULTURA COM MACRÓFAGOS TRATADOS IN
VITRO COM BRY
134
FIGURA 63 CD11b
+
DE CÉLULAS NÃO ADERENTE EM CULTURA E
CO-CULTURA.
135
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1
ESTRATÉGIA GERAL DE TRABALHO
37
QUADRO 2
SOLUÇÕES ALTAMENTE DILUÍDAS USADAS PARA O
TRATAMENTO IN VITRO DE MACRÓFAGOS
PERITONEAIS DE CAMUNDONGOS PARA ANÁLISES DA
DETECÇÃO DAS ESPÉCIES REATIVAS
40
QUADRO 3
SOLUCÕES ALTAMENTE DILUÍDAS USADAS PARA O
TRATAMENTO DOS CAMUNDONGOS
43
QUADRO 4 ANTICORPOS UTILIZADOS PARA IMUNOFENOTIPAGEM 48
QUADRO 5 RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS 51
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
CH – Centesimal Hannemaniana
Merc sol – Mercurius solubilis
Acon - Aconitum napellus
Bell - Atropa Belladona
Ars - Arsenicum album
Lach - Lachesis muta
Thuy - Thuya occidentalis
Bry – Bryonia alba
APC – Antigen-presenting cell
CTH – Célula-Tronco Hematopoiética
LPS – Lipopolissacarídeo
GM-CSF- Granulocyte macrophage colony-stimulating factor
M-CSF- Macrophage colony-stimulating factor
CD – Cluster Differentiation
RNS – Reactive Nitrogen Species
ROS – Reactive Oxygen Species
NO – Nitric Oxide
H
2
O
2
– Peróxido de Hidrogênio
O
2
-
- Ânion superóxido
iNOS - Inductible Nitric Oxide Synthase
ONOO
-
- Peroxinitrito
NOX – NADPH oxidase family
NOX2 – Subunidade catalítica da NOX
SOD- Superóxido Dismutase
PE – Phycoeritrina
M - Molar
INF – Interferon
IL-4 – Interleucina-4
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium
PMA – Phorbol Myristate Acetate
NK – Natural Killer
Leved - Levedura
Co cult – Co-cultura
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 12
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 14
3 JUSTIFICATIVA 34
4 OBJETIVOS 36
4.1 OBJETIVO GERAL 36
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 36
5 MATERIAL E MÉTODOS 37
5.1 MEDICAMENTOS 38
5.2 ANIMAIS 38
5.3 CÉLULAS 39
5.3.1 MACRÓFAGOS PERITONEAIS 39
5.3.2 CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA 39
5.4 CULTIVO DE MACRÓFAGOS E TRATAMENTO IN VITRO 40
5.4.1 CULTIVO DE MACRÓFAGOS 40
5.4.2 TRATAMENTO IN VITRO DOS MACRÓFAGOS 40
5.5 CULTURA DAS CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA, CO-CULTURA E TRATAMENTO IN VITRO. 41
5.5.1 CULTIVO DE CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA 41
5.5.2 CO-CULTURA DE MACRÓFAGOS PERITONEAIS COM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA 41
5.5.3 TRATAMENTO IN VITRO EM CO-CULTURA E CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA. 42
5.6 TRATAMENTO DOS CAMUNDONGOS 43
5.7 ESTUDOS REALIZADOS COM MACRÓFAGOS. 44
5.7.1 INTERAÇÃO DE MACRÓFAGOS COM LEVEDURAS. 44
5.7.2 AVALIAÇÃO DA DETECÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO). 45
5.7.3 AVALIAÇÃO DA DETECÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H
2
O
2
) 45
5.7.4 AVALIAÇÃO DA DETECÇÃO DE ÂNION SUPERÓXIDO (O
2
-
) 46
5.7.5 ANÁLISE MORFOLÓGICA DOS MACRÓFAGOS ATRAVÉS COM MEV 47
5.8 ESTUDOS REALIZADOS COM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA. 47
5.8.1 IMUNOFENOTIPAGEM DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA APÓS TRATAMENTO DOS
CAMUNDONGOS 47
5.8.2 IN VITRO E CO-CULTURA 48
5.8.2.1 Detecção de CD11b em células da medula óssea em citometria de fluxo 48
5.8.2.2 Detecção e quantificação de CD11b em células aderentes da medula óssea
através de microscopia confocal. 48
5.9 ESTATÍSTICA 49
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO 50
6.1 RESULTADOS E DISCUSSÃO GERAL 51
6.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO INDIVIDUAL 58
6.2.1 MERCURIUS SOLUBILIS 58
6.2.2 ACONITUM NAPELLUS 70
6.2.3 ATROPA BELLADONNA (BELADONA) 80
6.2.4 ARSENICUM ALBUM 93
6.2.5 LACHESIS MUTA 103
6.2.6 THUYA OCCIDENTALLIS 117
6.2.7 BRYONIA ALBA 128
7 CONCLUSÕES 137
7.1 CONCLUSÃO GERAL 137
7.2 CONCLUSÕES ESPECÍFICAS 137
CONSIDERAÇÕES FINAIS 137
REFERÊNCIAS 139
ANEXO 1 - OBTENÇÃO E COLETA DE MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE
CAMUNDONGO 154
ANEXO 2 - OBTENÇÃO E COLETA DE CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA DE
CAMUNDONGO 155
ANEXO 3 - MEIO DE CULTURA DULBECCO’S MODIFIED EAGLE MEDIUM (DMEM) 156
ANEXO 4 – INTERAÇÃO MACRÓFAGOS-LEVEDURA 157
ANEXO 5 – DETECÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO) 158
ANEXO 6 – DETECÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H
2
O
2
) 159
ANEXO 7 – DETECÇÃO DE ANION SUPERÓXIDO (O
2
-
) 160
ANEXO 8 – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA 161
ANEXO 9 - IMUNOCITOQUÍMICA PARA CITOMETRIA DE FLUXO 162
ANEXO 10 - IMUNOCITOQUÍMICA PARA MICROSCOPIA CONFOCAL 163
ANEXO 11 - CERTIFICADO DE APROVAÇÃO NO COMITÊ DE ÉTICA 165
12
1 INTRODUÇÃO
A homeopatia é um sistema de tratamento que coloca em ação os
mecanismos de cura do próprio corpo. Devido à alta diluição, não apresenta efeitos
tóxicos, produzindo pouco ou nenhum efeito colateral. Um organismo que elimina
uma doença por conta própria tem mais chance de continuar saudável e evitar a
recorrência. Esse tipo de tratamento se dá de acordo com a velocidade de reparo
natural do próprio corpo, portanto, pode levar mais tempo do que os os
convencionais, os quais são rápidos, mas também afetam as partes saudáveis do
corpo, muitas vezes produzindo efeitos colaterais indesejados (JONAS; JACOBS,
1996). A confiabilidade dos princípios da homeopatia (cura pelo semelhante,
globalidade da cura e da utilização de altas diluições de substâncias) e suas bases
científicas podem ser avaliadas através de várias abordagens teóricas e
experimentais. Nosso objetivo, neste trabalho, não é justificar o uso clínico de
medicamentos homeopáticos, mas de apresentar evidências de que as substâncias
preparadas de acordo com o método homeopático podem ter efeito sobre o sistema
imunológico. Este pode ser um passo importante para uma reavaliação da
homeopatia como um campo de valor para a investigação básica e clínica.
Desde 1998, diversos experimentos em nosso laboratório (Laboratório de
Estudos de Células Neoplásicas e Inflamatórias- UFPR) demonstraram a ação de
compostos preparados homeopáticamente em células do sistema imunológico. Em
2004, iniciou-se um trabalho com substâncias únicas altamente diluídas
homeopaticamente, as quais, segundo médicos homeopatas consultados
préviamente, são indicadas no tratamento de doenças infecciosas e inflamatórias.
Portanto, poderiam ter efeito sobre macrófagos, modelo de estudo do nosso
laboratório. Neste trabalho, que resultou em uma dissertação de mestrado,
verificou-se que diversas potências de 7 substâncias alteravam funções dos
macrófagos peritoneais de camundongo (OLIVEIRA, 2005). Como os macrófagos
realizam a intercomunicação entre a resposta inata e a adaptativa do sistema
imunológico (GORDON, 1999), essas células foram o alvo inicial dos nossos
experimentos. Com o objetivo de continuar então, estudando a ação dessas
substâncias, chamadas de medicamentos homeopáticos, deu-se início a esse
trabalho. No entanto, algumas potências testadas anteriormente por OLIVEIRA,
13
2005 não foram usadas por não alterarem alguns dos parâmetros estudados
inicialmente. Para os estudos in vitro foram testadas 6 substâncias em diferentes
diluições as quais serão descritas posteriormente (FIGURA 1). Todas essas
substâncias alteraram as funções efetoras dos macrófagos peritoneais. Esses
resultados sugeriram uma possível ação desses medicamentos sobre os
precursores das células do sistema imunológico , da mesma forma que outros
medicamentos homeopáticos estudados por nosso grupo (ABUD, et al., 2006,
CESAR, et al., 2008; 2009). Baseado nessas observações preliminares, foram
realizados experimentos ex vivo com células de medula óssea, in vitro e co-cultivo
com macrófagos peritoneais, para avaliar se o efeito medicamento sobre a medula é
dependente destas células. Nesta segunda etapa foram utilizadas apenas as
potências que obtiveram os resultados mais relevantes. Além disso, foi adicionado o
medicamento Bryonia alba, a qual havia sido retirada por não ter mostrado ação
direta sobre macrófagos peritoneais. Como agora seriam estudadas outras células
do sistema imunológico, nós optamos por reinseri-la e avaliar o seu possível efeito.
A- mercúrio líquido; B – Aconitum napellus; C –Atropa belladonna; D – Lachesis muta; E –
Arsenicum album; F- Thuya occidentalis; G- Bryonia alba
FIGURA 1 – IMAGENS DA FONTE DE ORIGEM DOS PRODUTOS ALTAMENTE
DILUÍDOS UTILIZADOS.
14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A palavra homeopatia vem do grego e significa semelhante à doença (TOLEDO,
1910). Têm por base tratar as enfermidades usando uma série de substâncias
derivadas de plantas, animais, minerais, substâncias químicas sintéticas ou drogas
convencionais, todas em quantidades ínfimas, usando um processo de preparação
especial, com o objetivo de colocar em ação os mecanismos de cura do próprio
corpo (JONAS; JACOBS, 1996; NOGUEIRA, et al. 1986). Esse sistema terapêutico
foi criado no século XVIII pelo médico alemão Samuel Christian Hahnemann (1755-
1843) fundamentado no princípio da similitude “similia similibus curantur” que
significa o “semelhante cura o semelhante” (BAROLLO, 1995).
O processo de elaborar os remédios é muito preciso. As substâncias solúveis
como os extratos vegetais e animais, se dissolvem em uma solução de álcool e água
destilada. Já substâncias de difícil solubilidade, como ouro, são primeiramente
moídas, até chegar a um pó fino, e então diluída no mesmo tipo de solução
alcoólica.. À esta solução, depois de filtrada, dá-se o nome de tintura mãe. A tintura
mãe é usada, então, para produzir as diferentes potências, as quais constituem as
diferentes diluições dinamizadas dos medicamentos homeopáticos (SHEALY, 1999).
Após testar um medicamento detalhadamente em várias pessoas,
Hahnemann começou a testar a precisão desses perfis medicamentosos, usando-o
nos enfermos. A princípio, deu-lhes a dose normal, mas teve o mesmo problema que
abominava na prática convencional. Muitos dos medicamentos eram tóxicos e
causavam efeitos colaterais nocivos. Começou então a diluir os medicamentos,
administrando-os em doses cada vez menores. Ao contrário do que ele supôs – que,
se reduzisse a dosagem dos medicamentos, eles se tornariam menos eficazes –
descobriu que se fossem dados de acordo com o padrão de sintomas encontrados
nas experimentações, eram mais eficazes e seu efeito mais duradouro. Essas
observações de Hahnemann evidenciaram que as doses curativas eram sempre
muito menores que as doses que haviam produzido sintomas semelhantes durante
seus ensaios em um homem são (TOLEDO, 1910; JONAS; JACOBS, 1996;
BELLAVITE, et al., 2005).
Hahnemann começou a usar a “sucussão”, ou seja, a agitar as diluições
enquanto eram realizadas. Por mais estranho que pareça atualmente, na época era
15
uma prática comum – os alquimistas freqüentemente sacudiam, mexiam e
realizavam várias outras manipulações nas soluções a fim de ativar a “força vital” ou
“espiritual” que acreditavam ser inerente a todas as substâncias.
Embora sua intenção original tenha sido reduzir os efeitos tóxicos dos
medicamentos, Hahnemann observou que o processo de sucussão entre cada
diluição tornava os remédios mais ativos e específicos aos indivíduos sensíveis a
eles. Quando preparados dessa maneira, que Hahnemann chamava de
“dinamização”, a eficácia do medicamento dependia ainda mais da adequação
detalhada do quadro sintomático do teste ao quadro sintomático único do paciente.
(BELLAVITE, et al., 2005; JONAS; JACOBS, 1996). Potência diz-se do resultado
final do processo de dinamização (NOGUEIRA et al., 1986).
A grafia dos medicamentos homeopáticos obedece aos ensinamentos de
Hahnemann, que adotou a língua latina e as regras da nomenclatura botânica. A
grafia é a aprovada pela Liga Homeopática Internacional. Os medicamentos são
representados pelos nomes seguidos de um ou mais algarismos, formando um
número e antepostos do símbolo da escala que se deseja; ex.: Bryonia alba CH 12,
onde o medicamento foi preparado pela escala centesimal até a 12ª potência.
Simboliza-se a escala centesimal, mais usada, pela letra C ou CH (maiúsculas), a
escala decimal por D, DH ou X (maiúsculas) e a escala cinqüenta milesimal por
/50.000, precedida pela potência que se deseja em algarismos romanos, ex.:
VIII/50.000 (oitava potência da escala cinqüenta milesimal) (NOGUEIRA et al.,
1986).
Alguns remédios homeopáticos como Aconitum napellus, Arsenicum album,
Belladona, Bryonia alba, Mercurius solubilis, Thuya occidentalis, Lachesis muta são
remédios tão conhecidos que são indicados para uso no estojo de primeiros-
socorros (HAYFIELD, 1999).
Mercurius solubilis
Á temperatura ambiente, Mercúrio é um elemento encontrado na forma fluida de
cor prata metálica ou na forma de sal de sulfeto de cinábrio (mineral presente em
fontes termais), a fonte do pigmento vermelho. Sais orgânicos e inorgânicos de
mercúrio são usados como antissépticos, preservativos, vacinas, etc. Exposição de
mamíferos a componentes mercuriais podem originar imunossupressão e
autoimunidade (ARONSON, et al., 2006a). Este metal líquido se dissolve em ácido
16
nítrico diluído e forma partículas que se secam e pulverizam para uso homeopático
(SHEALY, 1999).
Matéria médica:
Usa-se em estados infecciosos agudos em que as glândulas e suas secreções
estejam especialmente infectadas, irritabilidade e inquietude (HAYFIELD, 1999).
Para as enfermidades da pele que sangram facilmente, ulcerações varicosas,
eczemas, etc. Para as enfermidades das membranas mucosas, brônquios, corizas
com abundante mucosidade. Para o fígado, icterícia, diarréias líquidas, gonorréias
ou blenorragias (TOLEDO, 1910).
Aconitum napellus
Esta planta conhecida como acônito ou napelo é uma das mais venenosas
plantas britânicas, sendo que seu veneno é utilizado há séculos. Caçadores
imergiam as pontas de flechas em seu suco para caçar os lobos, poços de água
eram envenenados durante a guerra, era tida como antídoto para picada de
escorpião, entre outros (DAY, 1993; MARKS, 1997; SHEALY, 1999).
Os princípios ativos mais importantes são os alcalóides que têm como ação
fisiológica atuar em inflamações, na contração cardíaca e no tônus gastrointestinal.
Aconitum napellus é muito utilizado em tratamento herbais e medicina chinesa.
Matéria médica:
Nas potências homeopáticas é curativo nos transtornos decorrentes do medo,
principalmente da morte, angústia, ansiedade e é também um dos principais
remédios homeopáticos para dores em geral (SHEALY, 1999; DAY, 1993). O
remédio ajuda no início de resfriados; corrimento nasal claro, febre alta que se
iniciam repentinamente, caracterizando processo inflamatório (MARKS;
CASSANDRA, 1997; TOLEDO, 1910). Na medicina veterinária também é usada em
casos de febre e doenças respiratórias agudas (DAY, 1993).
Atropa Belladonna (Beladona)
Esta planta venenosa cresce por toda a Europa (HAYFIELD, 1999; SHEALY,
1999). Em italiano Belladonna significa “bela mulher”, pois as italianas a utilizam em
gotas para os olhos, com o fim de dilatar a pupila e tornarem-se mais atraentes. Na
medicina convencional, são utilizados alcalóides para tratar os espasmos e náuseas.
O remédio homeopático se prepara com as folhas e flores frescas. (SHEALY, 1999;
WALACH et al., 2001). Hahnemann a provou pela primeira vez em 1799. Foi uma
17
das primeiras substâncias usadas por Hanemann, que a utilizou para tratar febre
escarlate (BELLAVITE et al., 2005). Alguns trabalhos usando diversas diluições de
Atropa Belladona estão sendo demonstrados com efeitos interessantes. CRISTEA
et al, 1997) por exemplo, mostrou que baixas e altas diluições de Belladona
possuem efeito contrários em contrações do duodeno. Quando usadas Bell 1C e
5C, foi observado efeito inibidor espamolítico (atividade característica da atropina),
no entanto Belladona 30C e 45C mostraram possuir efeito estimulante. E ainda as
soluções não dinamizadas não mostraram nenhum efeito.
Matéria médica:
Exerce efeito sobre a circulação, tendo altíssima ação em todas as anginas,
em hidrofobia, na gripe, em ciática, em reumatismo, em eripsela, meningite, nos
delírios da febre. Para toda a classe de nervos com ataques e acessos
(TOLEDO,1910).
Arsenicum album
Arsenicum album é o medicamento preparado de forma homepática a partir
da tintura mãe do trióxido de arsênico, o qual é uma das três formas de óxido de
arsênico comerciais usados na agricultura e indústria (MITRA et al., 1998). O
arsênico é um elemento metálico (símbolo As), altamente tóxico, o qual existe em
diversas formas. Vários minérios contêm formas cristalinas de sais de arsênico, por
exemplo, a cobaltita contém sulfeto arsênico de cobalto, a arsenopirita contém
sulfeto arsênico de ferro, etc. Na medicina, o Arsênico tem uma história longa. No
século XVIII foi usado para tratar malária e tripanossomíase no século XIX. No início
do século XX, surgiram compostos para tratar a sífilis e novamente a
tripanossomíase. Recentemente, arsênico e sais arsenicais tem sido considerado
obsoleto na medicina, devido a sua toxicidade para diversos órgãos e aparentes
propriedades cancerígenas (ARONSON, 2006b). Além dos medicamentos
arsenicais, pequenas quantidades de arsênico são usadas em ligas, conservantes
da madeira, corantes, e tintas, os quais são considerados as principais fontes de
contaminação da água por arsênico e a consequente intoxicação de milhares de
pessoas (ERNST, 2000; HALL, 2002) Visando à solução deste problema, um grupo
de pesquisadores indianos têm estudado o Arsenicum album CH30 como provável
antagonista e antídoto para envenenamentos com arsênico. (MITRA, et al. 1998;
MITRA, et al., 1999; KHUDA-BUKHSH, 1997; BELON, et al., 2007). Arsenicum
18
album foi umas das primeiras substâncias usadas por Hanemann que a usou para
tratar a cólera (BELLAVITE et al., 2005).
Matéria médica:
Na homeopatia é usado em muitas condições mentais e emocionais sérias e
corresponde ao repertório de sintomas caracterizados por ansiedade,
desassossego, dores ardentes que são como calores e fraqueza desproporcional à
doença (MARKS; CASSANDRA, 1997).
Lachesis muta
Lachesis muta, uma cobra venenosa nativa do Brasil, é pertencente à família
Viperidae (DAMICO 2005). O seu veneno possui ação hemolítica, tem o efeito de
destruir membranas plasmáticas pela união com proteínas da superfície celular,
tornando-as permeáveis para diferentes substâncias e elementos. Pode de causar
morte imediata. Seu veneno altamente diluído é freqüentemente usado como
medicamento homeopático (JACOBS, et al., 2005; BERNAL-OCHOA, et al., 1997;
FRASS et al., 2005), o qual foi provado pela primeira vez pelo Dr. Constantino
Hering em 1837, injetando-se o veneno quando ele estava na selva amazônica.
Matéria médica:
A patogenesia homeopática da Lachesis muta é muito vasta. As
dinamizações deste veneno podem ser indicadas, entre outros, em processos
inflamatórios com tendência a tornarem-se gangrenosos, inflamação edematosa e
secreções muito fétidas, doenças do sangue, hemorragias, etc. (SHEALY, 1999).
Thuya occidentalis
Thuya occidentalis, conhecida como Arbor vitae ou cedro branco, é originária
do leste da América do Norte e é cultivada na Europa como uma árvore ornamental.
A planta foi identificada pela primeira vez, durante uma expedição do século 16 no
Canadá, onde era usada como um remédio por índios nativos para o tratamento de
reumatismo, gota e malária e posteriormente foi revelado ser eficaz no tratamento da
fraqueza de escorbuto (SHEALY, 1999). O potencial imunofarmacológico da Thuya
occidentalis, tem sido demonstrado em diversos experimentos in vitro e in vivo.
NASER et al. em 2005, revisou suas propriedades fitoquímicas, demonstrando
potenciais antiviral e imunofarmacológico. Polissacarídeos dessa planta mostraram
inibir a atividade dos vírus HIV (human immunodeficiency virus) e de influenza tipo
A, co-estimulação e efeitos sobre citocinas, a produção de anticorpos e ativação de
19
células imunocompetentes e macrófagos. Os efeitos in vitro foram observados com
doses ponderais (diluições baixas) do extrato da planta e de seus princípios ativos.
Apesar de todos os estudos mostrando atividades eficazes com a Thuya
occidentalis, o seu uso na medicina é moderado devido a propriedades tóxicas do
seu óleo, chamado Tujona.
Hoje em dia, é muito usada na fitoterapia e na medicina homeopática
(SHEALY, 1999; NASER et al., 2005). A tintura-mãe é preparada a partir de
macerados de suas folhas aromáticas e ramos até formar uma polpa que serve para
confeccionar o medicamento homeopático (SHEALY, 1999). Compostos
fitoterápicos, como Esberitox® contendo Thuya occidentalis são usados para tratar
resfriado e auxiliar ao tratamento de infecções bacterianas (HAUKE, et al., 2002).
Na medicina popular, Thuya occidentalis tem sido usada para tratar catarro
brônquico, cistite, psoríase, carcinoma do útero, amenorréia e reumatismo (CHANG,
et al., 2000).
Matéria médica:
Ela apresenta uma extensa patogenesia, contudo é principalmente indicada
em dores de cabeça e nevralgias intensas (SHEALY, 1999), infecções com presença
de catarro, verrugas, pólipos nasais e uterinos, gonorréia agudas e crônicas
(TOLEDO, 1910; SHEALY, 1999).
Bryonia alba
È uma planta trepadeira que cresce em toda Europa, suas raízes são enormes e
armazenam muita água (HAYFIELD, 1999). O grego Hipócrates foi um dos
primeiros médicos que utilizou a Bryonia, no século V a.C. Os romanos também a
utilizaram para tratar paralisia, gota e epilepsia. A planta tem uma raiz amarga que
quando ingerida pode causar a morte em questão de horas (SHEALY, 1999). Foi um
dos primeiros medicamentos provados por Hahnemann (MARKS, 1997). A tintura-
mãe desta é a planta é feita a partir de sua raiz fresca, a qual é obtida amassando-
se a raiz até virar uma massa (SHEALY, 1999).
Matéria médica:
A Bryonia alba é bem conhecida na homeopatia por suas atividades anti-
reumática e expectorante (TOLEDO, 1910; KRAUZE-BARANOWSKA; CISOWSKI,
1995).
20
No Brasil a homeopatia deixou de ser considerada terapia alternativa quando
foi reconhecida como especialidade médica pela portaria n° 1000 de 1980 pelo
Conselho Federal de Medicina (NOGUEIRA et al., 1986).
Entender o mecanismo de ação da homeopatia tem sido um obstáculo para
esse sistema terapêutico desde seus primórdios. O problema tornou-se ainda mais
difícil com o advento da era científica, quando observou-se que parte dos efeitos
drásticos relatados era em resposta ao uso de preparados tão diluídos que eram
quimicamente semelhantes a substâncias inertes. Em termos bioquímicos é
convencionalmente entendido como atuam as drogas convencionais, porém, a partir
de então, a homeopatia apresenta um enorme desafio intelectual, se não um
completo impasse. Muitos cientistas têm sugerido que os efeitos clínicos dos
medicamentos homeopáticos são devidos apenas ao efeito placebo. Entretanto,
estudos rigorosos, com replicatas de forma duplo-cegas e aleatórias, têm mostrado
diferenças significativas entre homeopatia e placebo, visando um melhor
entendimento da homeopatia (JONAS, JACOBS; 1996; VICKERS; ZOLLMAN, 1999;
MATHIE, 2003).
Alguns dos primeiros experimentos laboratoriais com diluições homeopáticas
muito baixas foram realizados por um proeminente patologista britânico, William
Boyd, que realizou uma série de experimentos laboratoriais na década de 30,
demonstrando os efeitos dos preparados homeopáticos do elemento mercúrio nos
padrões de crescimento do lêvedo (JONAS; JACOBS, 1996). Desde então, alguns
pesquisadores têm submetido suas pesquisas para verificar tanto a ação de
substâncias altamente diluídas, como de medicamentos homeopáticos. Dentre
estes, vários são voltados para o estudo em células do sistema imunológico e
inflamação, como revisado por Bellavite, et al. (2006). Além de substâncias simples
altamente diluídas, alguns compostos homeopáticos também estão sendo estudados
e publicados em revistas de grande relevância. FMS*Calciumfluor, por exemplo,
solução que contém CaF
2
, MgHPO
4
e SiO
2
, apresenta resultados relacionados a
promoção da osteogênese e da modulação dos níveis de expressão de mRNAs de
marcadores osteogênicos (PALERMO, et al., 1999; MANDUCA, et al., 2005).
Engystol-N
®
, composto de Vincetoxicum e enxofre, estimulam a secreção de
citocinas de linfócitos T e inibe a produção de ânion superóxido (O
2
-
), e possui
atividade antiviral (FIMIANI, et al., 2000; OBERBAUM, et al., 2005). O Laboratório de
21
Pesquisa em Células Inflamatórias e Neoplásicas da UFPR, desde 1998 vem
encontrando resultados relevantes pesquisando medicamentos complexos
homeopáticos (CHIs), os quais não apresentam toxicidade e nem mutagênicidade
em ensaios citogenéticos (SELIGMANN et al., 2003). Dentre estes estudos
destacam-se os seguintes resultados: 1) estudos com macrófagos peritoneais de
camundongo - diminuição da produção do fator de necrose tumoral (TNF-α) in vitro
(PIEMONTE; BUCHI, 2002); o aumento tanto da atividade enzimática da NADPH
oxidase foi quanto da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), resultando na
produção de espécies reativas de oxigênio (OLIVEIRA et al., 2006); aumento da
atividade do sistema endosomal/lisosomal assim como da atividade fagocítica dos
macrófagos em interação com Saccharomyces cerevisiae e Trypanosoma cruzi
epimastigotas (LOPES et al., 2006); alterações na expressão de diversos genes
através da análise da expressão gênica de macrófagos tratados (OLIVEIRA et al.,
2008); remissão de 30% dos tumores sarcoma 180 dos camundongos, significante
redução do volume tumoral dos tumores que permaneceram. Aumento da infiltração
leucocitária, granulação tecidual e fibrose circundante ao tumor. Aumento do número
total de leucócitos, especialmente os linfócitos T, onde houve aumento proporcional
de células T helper (Th), linfócitos B e células natural killer (NK), sugerindo uma ação
direta ou indireta na hematopoiese (SATO et al., 2005). Estudos in vitro e ex vivo
com células de medula óssea foram realizados, os quais mostraram que linhagem
monocítica (CD11b+) e as células estromais foram ativadas pelo tratamento (ABUD
et al., 2006; CESAR et al., 2008; CESAR et al., 2009). Atualmente nosso grupo de
pesquisa trabalha com cinco diferentes CHIs e medicamentos homeopáticos únicos,
com diferentes modelos experimentais. Nossos últimos trabalhos publicados
descrevem propriedades antitumorais de alguns dos complexos. Linfócitos co-
cultivados com macrófagos na presença do complexo imunomodulador (CHI)
aumentaram a capacidade de destruir células de melanoma (GUIMARÃES, et al.,
2009) e um complexo homepático (M8 mostrou propriedades anticâncer in vitro e in
vivo (GUIMARÃES, et al., 2010)
Várias são as hipóteses para explicar o mecanismo de ação da homeopatia.
Essas incluem teorias baseadas no comportamento complexo de sistemas
dinâmicos, mecânica quântica, teoria da informação e até parapsicologia e mágica.
Faz-se necessário pesquisas melhores e em maior número, livres de crenças ou
22
descrenças no sistema em questão (JONAS, KAPTCHUK E LINDE, 2003). Talvez
nossos pensamentos tenham sido dominados pela linearidade dos modelos
derivados da farmacologia convencional. E sendo assim, nós podemos estar
procurando por efeitos como na medicina alopática, ou pior, estamos apenas
satisfeitos com esses tipos de efeitos (FISHER, 2003).
Sistema imunológico
Tratamentos homeopáticos modulam o sistema imunológico e freqüentemente
resultam em redução de doenças infecciosas e inflamatórias (PEDALINO, 2004). O
sistema imunológico é uma rede integrada de órgãos linfóides, células e citocinas.
Sua principal função é a defesa do organismo, sendo assim, um desequilíbrio do
sistema imunológico pode resultar no aparecimento de diversos tipos de doenças.
Em caso de baixa atividade, podem aparecer infecções. Já se esse sistema tiver
uma atividade exacerbada, pode gerar alergias e doenças autoimunes (PARKIN;
COHEN, 2001).
Tradicionalmente, as ações do sistema imunológico são divididas em
resposta/imunidade inata e adaptativa, determinadas pela velocidade e
especificidade da reação. Essas respostas imunológicos são estimuladas em reação
a ameaças contra a saúde. Nos animais, a defesa contra agentes infecciosos,
particularmente o crescimento rápido de vírus e bactérias, exige uma resposta
imediata do sistema imunológico do hospedeiro (inata), a fim de limitar o seu
crescimento e a disseminação, e, em seguida, a estimulação de uma resposta
prolongada e específica para efeito de imunização e prevenção de uma re-infecção
(resposta adaptativa) (MURTAUG, 2002).
A imunidade inata representa a primeira linha de defesa interna contra o
"perigo", como por exemplo, corpos estranhos, especialmente os microorganismos.
Essa primeira defesa inclui barreiras químicas, físicas e microbiológicas. No entanto,
uma vez rompidas, o organismo necessita de um sistema mais ativo de proteção, o
qual engloba os elementos do sistema imunológico (neutrófilos, monócitos,
complemento, citocinas e proteínas de fase aguda), que fornecem defesa imediata
do hospedeiro. È aquela imunidade presente em recém nascidos. A natureza
altamente conservada dessa resposta, que é vista até nos animais mais simples,
confirma a sua importância para a sobrevivência. (PARKIN; COHEN, 2001). A
23
resposta inata é mediada por um grande número de interações entre receptores de
reconhecimento padrão (PRR-patterns recognition receptors), que são considerados
primitivos, pois são encontrados até mesmo em organismos invertebrados, e
agentes patogênicos associados a um padrão de moléculas reconhecidas por
células da imunidade inata. As células que medeiam essa imunidade têm um
programa específico, assim como o programa de receptores de reconhecimento a
agentes invasores (BOWDISH, et al., 2007).
Imunidade adaptativa é a marca dos animas mais complexos. È adquirida no
decorrer da vida. Essa resposta consiste em reações antígeno-específico através do
rearranjo somático de células B e receptores de células T. Esta reprogramação
confere especificidade para um antígeno ou epítopo, através, por exemplo, de
anticorpos. A resposta adaptativa tem memória, de modo que uma posterior
exposição com o mesmo antígeno ou similar, leva a uma resposta mais enérgica e
rápida (PARKIN; COHEN, 2001; BOWDISH, et al.,2007). Embora essa
especificidade deva ser estendida estritamente a antígenos ou patógenos
relacionados, a consequência de ter potentes efetores, como anticorpos e respostas
mediadas por células T, é que a reatividade cruzada com algum componente do
próprio organismo, pode levar a condições graves, como a autoimunidade
(BOWDISH, et al., 2007). As interações entre as imunidades são bidirecionais.
Evidentemente, os dois tipos de respostas são complementares. Como resultado da
ação das células envolvidas na primeira linha de defesa (local da resposta
inflamatória) parte dos antígenos reconhecidos pela imunidade inata é apresentado
por uma célula apresentadora de antígenos (APC) á linfócitos T que interagem com
o antígeno apresentado, dando início à ativação da resposta imunológica adaptativa
(PARKIN; COHEN, 2001).
A resposta adaptativa pode ainda ser dividida em resposta celular ou humoral.
Linfócitos T CD4+ são conhecidos usualmente como linfócitos T “helper” por
possuírem funções de interação e ativação de outras células imunitárias de modo a
direcionar e fortalecer respostas imunitárias específicas como Th1, Th2 ou Th3. A
resposta Th1 é mediada por linfócitos T em perspectiva celular, sendo dirigida
principalmente por linfócitos T CD8+ e NK ativados por IL-2 e IFN-γ secretadas por
l
infócitos T CD4+ ativados. A resposta Th2 é a resposta humoral, sendo dirigida por
linfócitos B que secretam imunoglobulinas para neutralizar patógenos em lugares
24
distantes do organismo. Os linfócitos B são ativados nesta via por citocinas como IL-
4 e IL-5 produzidas por linfócitos Th2 ativados (JANEWAY et al., 2007). Ambas as
respostas Th1/Th2, dependem da influência do linfócito T CD4+ para promover a
ativação e efetividade das células que executarão a resposta. A resposta Th3, ou
Treg (regulatória), foi descrita recentemente como sendo a resposta
imunoregulatória por linfócitos T CD4+ diferenciados, que irá reduzir ou neutralizar a
resposta imunitária que estiver ocorrendo por outras células como macrófagos,
neutrófilos, linfócitos T CD8+ e NK. O linfócito Th3 tem se mostrado promissor em
estudos de imunoterapia nas doenças auto-imunes onde o sistema imunitário esteja
estimulado cronicamente, ou seja, mais que o necessário (VOJDANI; ERDE, 2006;
JANDUS et al., 2008).
Embora essa divisão generalizada possa ser extremamente útil, deve-se
sempre considerar que há um componente “adaptativo” da resposta imunológica
inata, o qual aumenta significantemente o repertório de respostas e reconhecimento
e pode pelo menos parcialmente, superar as limitações genéticas inerentes a
resposta imunológica inata. Diversos estudos na literatura mostram que infecções e
estímulos inflamatórios podem levar a uma duradoura (mas possivelmente não
permanente) mudanças nas propriedades das células imunológicos,
especificamente, aumento na expressão de receptores de macrófagos, e que essas
mudanças podem levar a um aumento da imunidade para os desafios seguintes
(BOWDISH, et al., 2007).
Macrófagos
Macrófagos são um grupo heterogêneo de células do sistema imunológico
com diversas funções e fenótipos conforme o estado de ativação e localização.
Apesar de ser considerado um componente inato, possuem importante papel na
imunidade inata e adquirida (celular e humoral) e estão claramente envolvidas nas
respostas pró e antiinflamatórias (GORDON, 1999; BOWDISH, et al., 2007). Eles
possuem origem no sistema mononuclear fagocítico o qual é definido como uma
linhagem de células hematopoiéticas derivadas de células progenitoras mielóides
(precursor comum com neutrófilo) da medula óssea (HUME, 2006). O crescimento e
diferenciação dos monócitos dependem da presença de citocinas determinadoras de
linhagem, como o fator estimulador de colônia de granulócitos/macrófagos (GM-
25
CSF), o fator estimulador de colônia de monócitos/macrófagos (M-CSF) e de
interações com o estroma medular (GORDON, 2003). Essas células, uma vez
diferenciadas em monócitos, são liberadas no sangue periférico, onde circulam por
vários dias antes de entrar em tecidos e reabastecer a população de macrófagos
teciduais (FIGURA 2).
Estímulos pró-inflamatórios, metabólicos e imunológicos causam recrutamento
de monócitos aos tecidos periféricos, onde ocorre uma diferenciação destas células
em macrófagos e células dendríticas, os quais recebem nomes específicos de
acordo com a função e o local em que se encontram (FIGURA 3) (HUME, 2006;
GORDON; TAYLOR, 2005; VAN FURTH, 1973).
A população de macrófagos residentes em diferentes órgãos – como
macrófagos peritoneais (peritôneo), células de Kupfer (fígado), microglia (sistema
nervoso central) – adaptam-se ao seu microambiente. Os sinais responsáveis pelo
fenótipo do macrófago, específico em cada tecido, incluem produtos secretados, da
superfície de células vizinhas e da matriz extracelular (GORDON, 2003).
Macrófagos estão espalhados por todo o organismo. Eles constituem cerca de
10-15% das células totais do corpo. Esses fagócitos mononucleares têm pelo menos
3 funções: apresentação de antígeno, fagocitose (defesa e eliminação de debris
celulares) e imunomodulação (DALE, et al., 2008).
Monócitos se originam na medula óssea a partir de células tronco hematopoiéticas (CTH).
Passam por etapas de diferenciação na qual se comprometem a linhagem mielocítica e
monocítica. Em resposta a fatores de crescimento se diferenciam em monoblastos e pró-
monócitos, antes de se tornarem monócitos, os quais saem da medula e entram na
corrente sanguínea. Dependendo do estímulo, eles podem rapidamente sair da circulação
e ir para locais de resposta inflamatória (monócito inflamatório), ou mais lentamente antes
de irem para os tecidos específicos (monócitos residentes). (UFC-GM – unidade formadora
de colônia de granulócito-macrófago; UFC-M unidade formadora de colônia de
monócito/macrófago).
FIGURA 2- ORIGEM DOS MONÓCITOS
FONTE
adaptado de
MOSSER;
EDWARDS (
2008
)
Sistema mononuclear fagocítico
medula óssea
CTH
Pro-monocito
Monoblastos
UFC-M
UFC-GM
Sangue periférico
monócito
residente
Monócito
inflamatório
26
Macrófagos têm notável plasticidade que os permite responder eficientemente
a mudanças no ambiente com mudanças em seu fenótipo, e sua fisiologia pode ser
sensivelmente alterada por respostas imunológicos inatas e adaptativas (MOSSER;
EDWARDS, 2008). Estes estímulos ativam macrófagos e modulam a expressão de
seus receptores de superfície, fazendo com que essas células modifiquem algumas
de suas propriedades tais como: crescimento, diferenciação, migração, secreção,
habilidade para aderir e espalhar-se em substratos, taxa de endocitose e fusão de
lisossomos com vacúolos endocíticos e adquiram uma grande capacidade de matar
microrganismos e células tumorais através, por exemplo, de mecanismos oxigênio
e/ou nitrogênio dependentes (ROS e RNS, respectivamente) (VENKATA-REDY;
GANGADHARAN, 1992; WOOD; AUSTYN, 1993; GORDON, 2003). As funções de
citotoxicidade contra tumor podem ser estimuladas com produtos das paredes de
bactérias, como LPS, ou citocinas como IFN-γ e GM-CSF. Macrófagos podem
Antígenos entre parênteses correspondem a células humanas, todos os demais a estudos
de células murina.
FIGURA 3 – HETEROGENEIDADE DE MONÓCITOS/MACRÓFAGOS DURANTE
DIFERENCIAÇÃO IN VIVO
FONTE: adaptado de TAYLOR, et al. (2005)
Macrófago Residente Peritoneal
Macrófago Inflamatório elicitado
Macrófago estromal da medula
óssea; Células de Kupfer
Macrófago (polpa vermelha do
baço)
Macrófago (polpa branca do baço)
CD68
+
Células de Langerhans
Residente
Inflamatório
Monócito
periférico
Células Dendrítica
27
realizar suas funções de defesa de uma forma direta, envolvendo a liberação de
produtos, tais como NO e TNF-α que são prejudiciais para os microorganismos e
células cancerosas. Ou ainda podem desempenhar estas funções antimicrobiais e
antitumorais de uma maneira indireta, através da secreção de citocinas e
processamento e apresentação de antígeno, regulando o sistema imunológico
(KLIMP, et al., 2002)
Exemplo importante da estimulação dos macrófagos é a ligação de receptores
padrão, como os receptores de manose (CD206) e Dectin-1, aos patógenos
associados a moléculas padrão de reconhecimento. Esses receptores fazem parte
da superfamília de receptores padrão de reconhecimento, lectina tipo C, que
consiste em receptores solúveis e acoplados a superfície e são essenciais tanto
para o reconhecimento do patógeno quanto para interação célula-célula (BOWDISH,
et al., 2007). São expressos em monócitos/macrófagos e células dendríticas. Liga-se
a um grande número de microorganismos, como Candida albicans, Leishmania
donovani, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumonia e Saccharomice
cerevisae. Esse receptor reconhece β-glucana, manose, fucose, ou resíduos N-
a
cetilglucosamina sobre a superfície desses microorganismos. A ligação desses
receptores aos microorganismos alvos dispara sinais intracelulares resultando em
uma variedade de respostas celulares como fagocitose e subsequentemente a
produção de citocinas pro inflamatórias, ativação de células T, polarização para a
expressão de receptores de resposta Th1 e produção de espécies reativas
(KERRIGAN; BROWN, 2009), fazendo a ligação entre a imunidade inata e
adaptativa.
Estas alterações funcionais de fenótipo, como resultado do estímulo das
diferentes condições do ambiental e da ligação recepor-antígeno, servem para
considerar o macrófago como um componente adaptativo do sistema imunológico
inato. Além do seu papel de efetor e fundamental na imunidade inata, macrófagos
mobilizam linfócitos para a elaboração da resposta celulares antígeno
específico/humoral, que fornecem proteção sustentada contra patógenos
intracelulares e extracelulares (BOWDISH, et al., 2007; GORDON, 1999).
Macrófagos podem alterar a resposta imunológica inata através da sua estimulação
por diversos meios, entre eles citocinas e produtos microbiais (TAYLOR, et. al.,
2005). Os macrófagos estimulados secretam citocinas que influenciam a
28
diferenciação de células T e ativam células T helper (Th). As citocinas presentes
durante a expansão de células T influenciam a capacidade das células Th de se
diferenciar em células Th1, Th2 e Th3 (TRINCHERI 1997; PATTERSON 2004;
JANEWAY et al., 2007).
Em um esforço para imitar a divisão presente na literatura a respeito das
células T, os macrófagos foram classificados com o que poderia ser visto como uma
escala linear, na qual os macrófagos “ativados classicamente” representam um
extremo e macrófagos “ativados alternativamente” representam o outro. No entanto,
as características de um muitas vezes se misturam com os do outro. Tanto que os
autores entrem em conflito quanto as suas divisões e classificações. Neste trabalho,
optaremos pela divisão em macrófagos ativados classicamente ou alternativamente,
no entanto, sem esquecer que esta classificação não é estática.
O termo “macrófagos ativados classicamente” é usado para designar o
macrófago efetor que é produzido durante uma resposta imunológica mediada por
célula ou Th1. É ativado através citocinas, como INF-γ, produzidas durante a
r
esposta imunológica celular ou humoral. Estas células ativadas classicamente
apresentam um aumento na produção de espécies reativas e consequentemente um
aumento na morte de microorganismos intracelulares e produção de espécies
reativas, aumento na secreção de citocinas e mediadores da inflamação, e alta
expressão de moléculas co-regulatórias. Macrófagos classicamente ativados são
componentes vitais para a defesa do hospedeiro, mas suas ações devem ser
altamente controladas para que se evitem danos ao tecido, como o desenvolvimento
de doenças autoimunes. (MOSSER; EDWARS, 2008).
Macrófagos ativados alternativamente são aqueles ativados por citocinas IL-4
ou IL-13, citocinas que normalmente são produzidas durante uma resposta Th2,
particularmente durante alergias ou respostas celular ou humoral a infecções de
parasitas. Esses macrófagos alternativamente ativados têm um importante papel na
proteção do hospedeiro por diminuir a inflamação, através da produção de citocinas
que inibem a ação das citocinas inflamatórias, protegendo o organismo contra uma
possível doença autoimune além de promover o reparo tecidual. Aumenta a
expressão de receptores da imunidade inata, a apresentação de antígeno (aumenta
MHCII) receptor pra manose e receptor pra IL-4. (MOSSER; EDWARS, 2008;
VARIN; GORDON, 2009).
29
Macrófagos podem ainda ter uma ativação inata ou humoral. A ativação inata
ocorre através de estímulos microbiais que se ligam aos receptores padrão de
reconhecimento, como receptor de manose. Este estímulo faz com que ocorra um
aumento na produção de espécies reativas e citocinas pró-inflamatórias, como INF-α
e β, seguido de uma regulação antiinflamatória através da liberação de citocinas. Um
aumento na expressão de moléculas co-estimulatórias favorece a apresentação de
antígeno. A ativação humoral pode acontecer a partir da ligação de moléculas no
receptor Fc e sistema complemento, resultando numa atividade citolítica do
macrófago e também na produção de citocinas pró e/ou antiinnflamatórias
(GORDON, 2003).
Espécies reativas do oxigênio (ROS) e de nitrogênio (RNS)
Células fagocíticas respondem a uma variedade de estímulos de membrana
via a produção e liberação de um número de espécies reativas (SASSADA, et al.,
1983). ROS incluem ânion superóxido (O
2
-
), hidroxila (OH), e outros radicais e não
radicais que são agentes oxidantes e/ou facilmente conduzidos a radicais, como o
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) (CADENAS; CADENAS, 2002) e RNS integram
espécies como Óxido Nítrico (NO) e peroxinitrito (ONOO
-
) (FORMAN; TORRES,
2001). O papel das ROS e RNS produzidas pelo “burst oxidativo” é de atuar na
defesa do organismo, sinalizadores intercelular e como segundos mensageiros nas
vias de sinalização de macrófagos (NYGREN et al., 2001; FORMAN; TORRES,
2001; RETH, 2002)
Abaixo se encontram algumas reações que dão origem a ROS e RNS,
segundo FORMAN; TORRES, 2001
3NADPH + 2Arginina
+
+ 3O
2
+ H
+
3NADP
+
+ 2Citrulina + 2
.
NO + 2OH
-
NADPH + 2O
2
NADP
+
+ H
+
+ 2O
2-
2H
+
+ 2O
2
-
H
2
O
2
+ O
2
.
NO + O
2
-
ONOO
-
iNOS
NOX2
Dismutação
espontânea
ou
SOD
30
O óxido nítrico (NO) é usado por células de todo reino animal como um
agente sinalizador ou tóxico. No sistema imunológico, é gerado durante respostas
imunológicas e inflamatórias por diversos tipos celulares. Possui diversos papéis na
imunidade: agente tóxico em direção a organismo infeccioso (potenciais antiviral e
antimicrobial), potencial antitumoral, indutor ou supressor da apoptose, ou
imunoregulador (COLEMAN, 2001; CADENAS; CADENAS, 2002; PALUDAN et al,
1999). NO é uma molécula reguladora incomum, pois não possui um receptor na
superfície da célula, ele atravessa a membrana celular indiscriminadamente. Seu
único elétron desemparelhado o torna um radical, portanto, quimicamente ativo, mas
para um radical é relativamente estável. NO pode possuir efeitos diretos e indiretos
sobre seus alvos. Diretos são aqueles em que NO interage diretamente com a
molécula biológica ou outro alvo e indiretos são aqueles que ele age através de
intermediários derivados do NO, como ONOO
-
. A interação do NO com proteínas
contendo metais e com radicais orgânicos livres, são bons exemplos do efeito direto
(GRISHAM, et al., 1999).
Em macrófagos ativados, NO é produzido por uma isoforma induzida da
enzima óxido nítrico sintase (iNOS), a qual converte
L-
arginina a
L-
citrulina
com a
formação de NO. Vários fatores podem ativar iNOS, como LPS, TNF-α, IFN-α, a qual
é expressa e está continuamente ativa durante a inflamação (CADENAS;
CADENAS, 2002; PALUDAN et al, 1999). O NO liberado por macrófagos pode
também ativar o fator nuclear de transcrição NF-κB, cuja a ativação é essencial para
a
expressão de um grande número de citocinas e genes de adesão que são
mediadores críticos para reação inflamatória (BRUCKDORF, 2005; COLEMAN,
2001; FORMAN; TORRES, 2001).
O ânion superóxido (O
2
-
) e o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) são gerados
enzimaticamente por oxirredutase ou não enzimaticamente, como subprodutos de
reações que utilizam transferência de elétrons, como as que ocorrem na mitocôndria
(FORMAN; TORRES, 2001). Em células fagocíticas, há uma grande fonte de O
2
-
, o
qual é produzido pelo complexo enzimático NADPH oxidase (NOX) associado à
membrana, que catalisa a redução do oxigênio usando NADPH como um doador de
elétrons. NOX2, a subunidade catalítica da NOX em fagócitos, está localizada na
membrana plasmática de lamelipódios e em fagossomos. Após ser estimulada,
ocorre uma ativação da NOX2 que pode produzir O
2
-
intra (dentro dos fagossomos)
31
e extracelularmente (CROSS; SEGAL, 2004; BROWN; GRIENDLING, 2009). Essa
oxidase está normalmente dormente, mas pode ser rapidamente ativada por vários
estímulos. Entre eles estão os agonistas que interagem com receptores específicos
na superfície celular de neutrófilos, macrófagos e eosinófilos, como partículas
opsonizadas e cadeias de peptídeos imaturas de microrganismos, e também
agonistas de proteína quinase C como o PMA (phorbol myristate acetate) (SEGAL;
ABO, 1993). O O
2
-
produzido é altamente reativo e possui vida curta. Ele não é
capaz de difundir-se através da membrana biológica, mas pode atravessá-la por
canais. A produção de O
2
-
por macrófagos é crítica para a defesa do organismo. A
natureza citotóxica do O
2
-
e das moléculas provenientes das suas interações
contribuem não somente para a morte de organismos invasores, como também no
dano tecidual e na inflamação (XIA; ZWEIER, 1997).
As interações químicas e biológicas de NO e ROS com várias moléculas
biológicas têm importantes consequências sobre diferentes mecanismos
imunológicos e patológicos (SASSADA, et al., 1983). Em células que produzem
tanto O
2
-
quanto NO ocorre à reação, perto do limite de difusão (6,7x10
9
mol
-1
s
-1
),
entre essas duas moléculas, resultando na formação do peroxinitrito (ONOO
-
) (NO +
O
2
-
→ ONOO
-
) (FORMAN; TORRES, 2001; NATHAN; SHILOH, 2000).
Superóxido pode se dismutar espontanemente e rapidamente a H
2
O
2
ou
enzimaticamente via superóxido dismutase (SOD). A maior fonte de H
2
O
2
de uma
célula surge através da dismutação espontânea do O
2
-
, a qual é uma reação mais
rápida que aquela que ocorre através da SOD. H
2
O
2
é mais estável que O
2
-
e
também pode atravessar membrana, provavelmente pelos mesmos canais da água.
Ele não é um radical, porém pode reagir com sítios específicos, como metais.
(BRONW; GRIENDLING, 2009; NATHAN; SHILOH, 2000). Apesar do peróxido de
hidrogênio ser mais conhecido por seus efeitos citotóxicos, nos últimos anos, ficou
estabelecido como um importante regulador da transdução de sinal em eucariotos
(VEAL, et al., 2007).
Medula óssea
Todas as células do sistema imunológico têm origem na medula óssea, a
partir de células tronco-hematopoiéticas. A medula óssea vermelha esta presente em
ossos como o esterno, íliaco e fêmures, é altamente vascularizada e permite a
32
proliferação e diferenciação das células pluripotentes (MÜLLER-SIEBURG;
DERYUGINA, 1995). A medula óssea (MO) é uma fonte permanente de células-
tronco adultas e possui duas populações discretas de células-tronco: as
mesenquimais e as hematopoiéticas (CTH). As células-tronco mesenquimais
encontram-se imersas no estroma medular, e podem se diferenciar em diversos tipos
celulares, como adipócitos e osteoblastos. (KORBLING; ESTROV, 2003). O estroma
tem a função de suporte funcional para o processo de hematopoiese, através do
fornecimento de um microambiente único que fornece moléculas de crescimento
regulatório, influencia a diferenciação, sobrevivência proliferação, maturação e
promove interações célula-célula e célula-matriz extracelular. A complexa
composição do tecido estromal medular compreende uma população heterogênea
de células, como adipócitos, células reticulares, osteogênicas, endoteliais, células
musculares em paredes de vasos e macrófagos (KONDO, et al., 2003 ; IMADA et al,
2005)
As células hematopoiéticas dão origem às células sanguíneas que podem ser
classificadas em duas principais classes: células linfóides (linfócitos T, B e NK) e
células mielóides (granulócitos, monócitos, megacariócitos e eritrócitos). A
expressão de diferentes receptores na superfície dos progenitores hematopoiéticos
permite a sua interação com vários elementos reguladores presentes no ambiente,
nos quais se incluem as células estromais, as moléculas de matriz extracelular e
citocinas regulatórias, como fatores de crescimento e diferenciação (GUNSILIUS, et
al., 2001). Os granulócitos, linfócitos e monócitos circulam no sangue em um estado
quiescente de baixa adesividade, antes de migrarem aos tecidos, participando nas
funções imunológicas e no reparo tecidual (HARRIS et al., 2000). A expressão das
integrinas de superfície de leucócitos pode ocorrer através de uma nova biosíntese
dessas moléculas, o que é altamente regulado e geralmente está envolvida com a
diferenciação de células imunológicas. Ou a partir da regulação dessas proteínas já
formadas, que ficam estocadas no citoplasma. Esta última, esta envolvida com
respostas rápidas da célula em relação a mudanças no meio, como por exemplo,
uma infecção ou inflamação, portanto, contribuindo para a reposta celular
(KISHIMOTO, 1990; ZDOSEK, et al., 2007).
As integrinas Mac-1 (macrophage antigen-1) ou CR3b (receptor do
complemento tipo 3) e p150,95 (também chamado receptor complemento tipo 4) ou
33
Leu M5 são glicoproteínas heterodiméricas (αβ) de adesão dos leucócitos. As
subunidades α, distintas nessas duas integrinas, foram designadas como CD11b em
Mac-1 e CD11c em p150,95. A subunidade β homóloga é chamada de CD18
(KISHIMOTO, et al., 1990; HARRIS et al., 2000). Mac-1 e p150,95 são receptores
multifuncionais e estão diretamente envolvidos na adesão e migração celular. Estão
evolutivamente relacionadas aos receptores integrinas que medeiam adesão celular
à matriz extracelular durante o desenvolvimento e reparo tecidual. Ambas integrinas
são expressas em monócitos, macrófagos, células dendríticas, polimorfonucleares e
células Natural Killers. O que varia é a quantidade relativa dessas integrinas
conforme o tipo de célula e seu estado de ativação ou diferenciação (ARNAOUT,
1990; GEORGAKOPOULOS; et al., 2008). Nas CTHs, Mac-1 e p150,95 não estão
presentes nas unidades formadoras de granulócitos e monócitos, mas são as
primeiras detectadas durante a diferenciação de monócitos e granulócitos nos
estágios mielocíticos e monoblásticos (ARNAOUT, 1990; KISHIMOTO et al., 1990,
YANG, et al., 2007). Mac-1 é essencial para a célula ligar-se ao receptor
complemento, espraiar-se e mediar à fagocitose. Além de ser responsável pela
adesão a fibronectina, ao plástico e ao vidro, morte celular, quimiotaxia e ativação
celular e ligar-se a ICAM-1 (ARNAOUT, 1990; KISHIMOTO, 1990; COUGOULE, et
al., 2004; GEORGAKOPOULOS, et al., 2008; YANG, et al., 2007).
34
3 JUSTIFICATIVA
O desenvolvimento de terapias capazes de modular o processo de cura de
doenças, sem suprimir os efeitos desejáveis dos aspectos fisiológicos do sistema
imunológico, deve ser uma alternativa interessante para obter uma melhor eficácia
da resposta do tecido contra a agressão exógena. Ao contrário das drogas utilizadas
pela medicina alopática, que atuam diretamente sobre os processos fisiológicos
relacionados com os sintomas da doença, os medicamentos homeopáticos
promovem a melhora do estado geral de saúde do indivíduo, estimulando seu
sistema imunológico a desencadear respostas adequadas para cada situação.
Assim, o tratamento homeopático permite ao indivíduo restabelecer a saúde e
prevenir a doença sem, no entanto, produzir os efeitos colaterais experimentados
por muitos dos tratamentos convencionais (ULLMAN, 1995).
O uso da homeopatia tem aumentado a cada dia por todas as partes do mundo.
Segundo a CONAHON (conselho nacional de homeopatia e fitoterapia) uso da
homeopatia é livre em quase 100% dos países onde é usada, como na Índia, EUA,
Inglaterra, Canadá, Portugal. Isso passa a ser um problema para a sociedade, uma
vez que frente aos resultados prévios do nosso laboratório e revisões da literatura,
os medicamentos homeopáticos atuam em todos os tipos de células com os mais
variados tipos de resposta. A própria OMS (Organização Mundial de Saúde) mostra-
se preocupada com o crescente uso da homeopatia e, em maio de 2002, lançou a
primeira estratégica global visando dar suporte no desenvolvimento de políticas
nacionais de valorização e regulação das medicinas tradicionais/medicinas
alternativas e complementares. Conforme seu “Press Releases WHO/38, de 16 Maio
2002, esclarece que estas terapias estão se tornando mais populares no norte (do
planeta) e que mais de 80% das pessoas no sul usam estas terapias nos cuidados
básicos de saúde. Apesar disso, em notícia publicada no site do parlamento do
Reino Unido em 22 de fevereiro de 2010, o comitê nacional de Ciência e Tecnologia
do Reino Unido, conclui que o Serviço Nacional de Saúde deve cessar o
financiamento a homeopatia, por considerar que não existem provas científicas da
eficácia dos medicamentos e que os ensaios clínicos da homeopatia não são
justificados. O comitê se baseia em alguns trabalhos científicos que concluem que a
35
homeopatia é apenas efeito placebo. A Sociedade Britânica de homeopatia rejeitou
os resultados, acusando a comissão de ignorar evidências favoráveis à homeopatia
(http://www.parliament.uk/parliamentary_committees/science_technology/s_t_homeo
pathy_inquiry.cfm)
Com essa nova polêmica, este trabalho mostra-se altamente relevante e
urgente de divulgação, pois, estes medicamentos homeopáticos, são medicamentos,
e como tais, devem ser estudados e analisados. Uma vez que os medicamentos
homeopáticos vem sendo ampla e livremente utilizados pela população em geral,
estudos e análises mais específicas de sua forma de ação e seus efeitos sobre o
nosso organismo devem ser realizados com seriedade, responsabilidade e urgência,
afim de assegurar a população quanto ao seu uso potencial. Devemos lembrar que,
assim como na virada do século, a descoberta de agentes infecciosos revolucionou
a nossa capacidade de tratar várias doenças, a descoberta do que acontece em
nosso organismo com o uso de medicamentos homeopáticos, também podem vir a
revolucionar nosso conhecimento de química, biologia e medicina. Se for apenas
uma reação ao placebo, ainda oferecerá informações importantes sobre como nossa
mente e nosso corpo operam. De qualquer maneira, a exploração de como a
homeopatia funciona beneficiaria a ciência moderna (JONAS, JACOBS; 1996).
36
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
Investigar o efeito da adição in vitro e do tratamento durante 7 dias com
substâncias altamente diluídas sobre parâmetros imunitários de macrófagos e
células da medula óssea obtidas de camundongos.
4.2 Objetivos específicos
Utilizando substâncias altamente diluídas:
1) Após tratamento in vitro de macrófagos peritoneais, detectar e quantificar a
liberação de óxido nítrico (NO), de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e de ânion
superóxido (O
2
-
) com e sem interação macrófagos/leveduras (Saccharomices
cerevisiae).
2) Após tratamento dos camundongos durante 7 dias detectar e quantificar em
análise ex vivo:
a. liberação de óxido nítrico (NO), de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e de ânion
superóxido (O
2
-
) por macrófagos peritoneais.
b. expressão de marcadores hematopoiéticos das membranas de células da
medula óssea, utilizando citometria de fluxo.
3) após tratamento in vitro de co-cultura de macrófagos com células de medula
óssea:
a. Avaliar a morfologia dos macrófagos utilizando microscopia eletrônica de
varredura (MEV).
b. Avaliar a expressão do marcador de linhagem monocítica CD11b, com
detecção e quantificação em citometria de fluxo e visualização em microscópio
confocal.
4) após tratamento in vitro de medula óssea, avaliar a expressão do marcador
de linhagem monocítica CD11b, com detecção e quantificação em citometria de
fluxo e visualização em microscópio confocal.
37
5 MATERIAL E MÉTODOS
Cultivo de macrófagos peritoneais
Merc sol CH6, 12 e 200;
Acon CH30;
Bell CH6, 30 e 200;
Ars CH6;
Lach CH12 e 200;
Thuy CH30
Merc sol CH200;
Acon CH30;
Bell CH200;
Ars CH6;
Lach CH200;
Thuy CH30
Bry CH200
Análise da liberação de NO, H
2
O
2
e O
2
-
antes e após interação
macrófagos/leveduras
Resultados mais relevantes
liberação de
NO, H
2
O
2
e
O
2
-
ex vivo
Medula óssea
Expressão de CD11b
em
células de medula óssea
Co-cultivo medula e
macrófagos
Cultivo de medula
óssea
Tratamento dos camundongos
Macrófagos
Imunofenotipagem
ex vivo
Tratamento in vitro
Representação esquemática da estratégia metodológica utilizada para realização
dos objetivos deste trabalho.
QUADRO 1 – ESTRATÉGIA GERAL DE TRABALHO
38
5.1 Medicamentos
A seleção dos medicamentos utilizados neste trabalho foi realizada de acordo com a
sua indicação na clínica para uso em doenças inflamatória e infecciosas e com efeito
demonstrado em trabalho anterior, sobre macrófagos peritoneias de camundongo.
Foram utilizados os medicamentos:
M
ercurius solubilis (Merc sol) CH 6, 12 e 200,
Aconitum napellus (Acon) CH 30,
Belladonna (Bell) CH 6, 30 e 200,
Arsenicum album (Ars) CH 6,
Lachesis muta (Lach) CH 12 e 200,
Thuya occidentalis (Thuy) CH 30 e
Bryonia alba (Bry) CH 200.
Todos manipulados na farmácia Homeoterápica sob a responsabilidade do
farmacêutico Narciso da Lozzo Neto CRF-PR 5604. A manipulação seguiu as
normas da Farmacopéia Homeopática Brasileira, com dinamizações sucessivas.
Todas as sucussões foram feitas manualmente. As matrizes dos medicamentos
foram adquiridas do Laboratório Schraibmann Ltda – Rua Maria Catur, 208,
Carapicuiba, São Paulo (indústria brasileira – CNPJ 62.134.67/0001-00). Tendo
como responsável a farmacêutica Tsilia Schraibman – CRF-8 n° 7546.
O veículo de diluição dos medicamentos, solução hidroalcóolica a 0,1%, foi
preparado da mesma forma que os medicamentos, para que pudesse ser usado
como um controle da ação das substâncias altamente diluídas em medicamentos.
Todos os medicamentos e a solução hidroalcóolica (HS) receberam códigos, de
maneira que o avaliador não soubesse qual solução estava sendo avaliada,
configurando assim, uma análise cega.
5.2 Animais
Foram utilizados camundongos (Mus musculus) com mais ou menos 3 meses
de idade, pesando entre 25-30g, cedidos pelo Biotério do Setor de Ciências
Biológicas (SCB) da UFPR. Eles receberam ração (Purine
) e água filtrada ad
libitum e com controle ambiental (25°C) com ciclo claro/esc uro de 12 horas O
número de animais utilizados por grupo em cada experimento foi determinado
dependendo do número de células necessárias em cada experimento. Todas as
39
recomendações para manejo científico de animais da lei nacional (N° 6.638, 5 de
novembro de 1979) “Normas para Prática Didático-Científica da Vivissecação de
Animais” foram respeitadas. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em
Experimentação em Animal (CEEA) do SCB da UFPR obtendo o número de
certificado 179 (ANEXO 11).
5.3 Células
5.3.1 Macrófagos peritoneais
Para realizar a coleta dos macrófagos peritoneais, seguiu-se o protocolo de
rotina baseado em Piemonte; Buchi, (2002) (ANEXO 1). Os camundongos foram
mortos por deslocamento cervical. A pele ventral foi rompida para exposição do
peritôneo. Com uma seringa de 10 ml e agulha estéril, foi injetado na cavidade
peritoneal tampão PBS (Phosphate Buffer Solution), pH 7,2, gelado (4°C) e estéril.
Após agitar a solução salina no interior do peritônio para que os macrófagos presos
na parte interna se soltassem, a solução contendo macrófagos do peritôneo (lavado
intraperitoneal) foi retirada (aproximadamente 8 ml). O lavado foi transferido para um
recipiente estéril e acondicionado no gelo. Ao final da coleta, o pool de células foi
contado em câmara de Neubauer e microscópio de luz Nikon
®
.
5.3.2 Células de medula óssea
A obtenção de células da medula óssea de camundongo a partir do fêmur
seguiu o protocolo rotineiro do laboratório (ABUD, et al., 2006) (ANEXO 2). Os
camundongos foram mortos por deslocamento da coluna cervical. Os fêmures foram
retirados, limpos e levados para o fluxo laminar. As epífises foram cortadas e a
medula retirada com 2 mL de meio Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)
(ANEXO 3). Essa suspensão celular foi centrifugada a 2.800 rpm por 3 minutos. O
sobrenadante foi desprezado e as células ressuspendidas em 10 ml de meio de
cultura. Uma alíquota foi retirada para contagem de células.
Para determinação do número de células obtido, sem a presença de
hemácias, foi realizada uma diluição 1:10 (v/v) da suspensão celular obtida na coleta
em líquido de Turck - ácido acético 2% (v/v) com violeta genciana - Newprov
®
. Após
a hemólise, foi feita a contagem em câmara de Neubauer com auxílio de
microscópio de luz - Nikon
®
.
40
5.4 Cultivo de macrófagos e tratamento in vitro
5.4.1 Cultivo de macrófagos
Um pool de macrófagos de pelo menos 5 camundongos foi utilizado para
cada experimento. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos 3 vezes
(com quadruplicatas), para cada medicamento. Assim, para cada análise, foram
utilizados pelo menos 3 pools diferentes de macrófagos. O pool de lavado peritoneal
foi colocado em tubo de centrífuga de 50 ml, centrífugado a 1500 rpm por 2 min e
ressuspendido em 10ml de PBS. Uma alíquota do tubo foi retirada e feita a
contagem em câmara de Neubauer. Em fluxo laminar, 5x10
5
células foram
colocadas em placas de cultivo da marca TPP
®
, com 96 poços. As células foram
incubadas por 20 min. a 37
o
C e 5% de CO
2
para a seleção por adesão. O lavado foi
retirado, as células aderentes lavadas com PBS a 37
o
C e adicionado meio de
cultura DMEM (ANEXO 3). As células foram colocadas novamente na incubadora de
CO
2
, e cultivadas e tratadas por 48 horas.
5.4.2 Tratamento in vitro dos macrófagos
Para avaliar a produção e liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e
nitrogênio (RNS) utilizou-se o tratamento in vitro das culturas celulares. Para isso,
todas as soluções foram filtradas com membrana Millipore
®
de 0,22µm estéril,
acondicionadas em garrafas novas e estéreis e estocadas ao abrigo da luz. Todas
as soluções receberam um código.
Código Substância
altamente diluida
Abreviatura Potência do
medicamento
Medicamento D Sol. hidroalcóolica HS
Medicamento V
Mercurius solubilis
Merc sol CH6
Medicamento W
Mercurius solubilis
Merc sol CH12
Medicamento Z
Mercurius solubilis
Merc sol CH200
Medicamento K
Aconitum napellus
Acon CH30
Medicamento Y1
Atropa Belladona
Bell CH6
Medicamento Y3
Atropa Belladona
Bell CH30
Medicamento Y4
Atropa Belladona
Bell CH200
Medicamento Q
Arsenicum album
Ars CH6
Medicamento N
Lachesis muta
Lach CH12
Medicamento P
Lachesis muta
Lach CH200
Medicamento C
Thuya occidentalis
Thuy CH30
41
QUADRO 2 – SOLUÇÕES ALTAMENTE DILUÍDAS USADAS PARA O
TRATAMENTO IN VITRO DE MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE CAMUNDONGOS
PARA ANÁLISES DA DETECÇÃO DAS ESPÉCIES REATIVAS
Após 2 horas de cultivo adicionou-se 20% de cada medicamento em relação à
quantidade de meio. Passadas mais 24 horas foi adicionada dose reforço de 1% em
relação ao meio de cada solução. Todos os medicamentos e a solução
hidroalcóolica, foram sucussionados 15 vezes antes de serem adicionados a cultura
(PIEMONTE, 2000) e um grupo sem tratamento, apenas com meio de cultura, foi
utilizado como controle dos tratamentos.
5.5 Cultura das células de medula óssea, co-cultura e tratamento in vitro.
5.5.1 Cultivo de células de medula óssea
Para calcular o número de animais utilizados para o cultivo de células de
medula óssea seguiu-se o mesmo o cálculo descrito para o cultivo de macrófagos.
Após a obtenção das células e contagem em camâra de Neubauer, 10
6
células/poço
foram colocadas em placas multipoços estéreis e adicionado meio de cultura DMEM.
As placas foram mantidas em incubadora a 37ºC em atmosfera úmida com 5% de
CO2, durante 96 horas, sem troca de meio e tratadas com os medicamentos
conforme anteriormente descrito.
5.5.2 Co-cultura de macrófagos peritoneais com células de medula óssea
Macrófagos e células de medula óssea foram obtidos conforme descrito
anteriormente e co-cultivados em placas de co-cultura da marca Costar® de 24
wells/12 transwell com membrana de policarbonato de poros de 0,4µm (FIGURA 5).
Na parte superior (separado pela membrana) dos 12 poços de co-cultura existentes
nas placas, foram colocados 5x10
5
macrófagos do lavado peritoneal. Após 20
minutos, as células não aderentes foram retiradas junto com o sobrenadante e
adicionado meio de cultura DMEM em todos os poços. Na parte inferior dos poços
co-cultura, foram colocadas 2x10
6
células de medula óssea e adicionado meio de
cultura DMEM. As células foram mantidas em incubadora a 37ºC em atmosfera
úmida com 5% de CO
2, durante 96 horas.
42
FIGURA 4 – ESQUEMA DA PLACA DE CO-CULTURA
5.5.3 Tratamento in vitro em co-cultura e células de medula óssea.
Para os tratamentos da co-cultura de células de medula óssea e macrófagos,
foram utilizadas as mesmas soluções do tratamento dos camundongos (QUADRO
2).
Todas as soluções foram filtradas com membrana de 0,22µm Millipore
®
estéril, acondicionadas em garrafas novas e estéreis, codificadas e estocadas ao
abrigo da luz. Após 2 horas de cultivo adicionou-se 20% de cada medicamento em
relação à quantidade de meio. Na co-cultura de macrófagos com células de medula
óssea, apenas os macrófagos receberam os tratamentos. Passadas 24, 48 e 72
horas foram adicionadas dose reforço de 1% em relação ao meio de cada solução.
No cultivo de apenas células de medula óssea, o tratamento foi direto sobre essas
células e seguiu o mesmo procedimento da co-cultura, durante as 96 horas. Todos
os medicamentos e a HS foram sucussionados 15 vezes, antes de ser adicionados á
Placa de co-cultura 24 well/12 traswell
transwell
Compartimento superior
Macrófagos/membrana
Células da medula/
/Compartimento inferior
Co-cultura
medula
medula
Cultivo de medula
Cultivo de medula
43
cultura (PIEMONTE, 2000). Um grupo sem tratamento, apenas com meio de cultura,
foi utilizado como controle dos tratamentos.
5.6 Tratamento dos camundongos
Para o tratamento dos camundongos os medicamentos foram adicionados na
água de beber dos camundongos. As soluções foram preparadas faltando uma
diluição de 10 vezes, de forma a ser completada na hora do tratamento, sendo
diluída 1/10 na água de beber. Vinte mL de cada solução foram estocadas em vidro
pardo, limpo e novo. Inclusive contendo a solução hidroalcóolica (HS) e um com
água destilada (controle). Foram preparados frascos para 7 dias de tratamento, ou
seja, os camundongos receberam medicamentos novos todos os dias. Todos os
frascos receberam códigos, de maneira que o avaliador não soubesse qual
medicamento ou componente estava sendo avaliado, configurando assim, uma
análise cega.
Código Substância
altamente diluida
Abreviatura Potência do
medicamento
Medicamento 3 Sol. hidroalcóolica HS
Medicamento 7 Água destilada controle
Medicamento 9 Mercurius solubilis
Merc sol CH200
Medicamento 10 Aconitum napellus
Acon CH30
Medicamento 11 Atropa Belladona
Bell CH200
Medicamento 12 Arsenicum album
Ars CH6
Medicamento 13 Lachesis muta
Lach CH200
Medicamento 14 Thuya occidentalis
Thuy CH30
Medicamento 15 Bryonia alba
Bry CH200
QUADRO 3 – SOLUCÕES ALTAMENTE DILUÍDAS USADAS PARA O
TRATAMENTO DOS CAMUNDONGOS
Para esse estudo foram adquiridos mamadeiras, grades e gaiolas novas e
utilizou-se sepilho autoclavado. Os camundongos foram pesados e divididos em
grupos de 10 por caixa. Foram separados 7 grupos para os medicamentos, mais 2
grupos para os controles, um que recebeu água destilada e outro HS. Assim 9
grupos foram estabelecidos, cada um com o código equivalente ao das soluções. Os
camundongos foram tratados durante 7 dias, todos os dias, por volta das 18 horas,
levando-se em consideração o hábito noturno desses animais. No momento do
tratamento as soluções de medicamento foram sucussionadas e misturadas a 180
44
ml de água mineral dentro das mamadeiras (As mamadeiras novas foram lavadas
com água destilada para retirar qualquer resíduo). Ex: 20 mL do medicamento 9
(faltando uma diluição 1/10)+180 mL de água mineral = medicamento 9 (solução
fornecida aos camundongos) (FIGURA 6). As soluções foram sucussionadas
novamente e imediatamente antes de serem colocadas nas gaiolas.
No dia posterior, todas as mamadeiras eram retiradas e medida a solução
restante. Após 7 dias os macrófagos e as células de medula óssea foram coletadas
conforme descrito anteriormente.
5.7 Estudos realizados com macrófagos.
Para avaliar o efeito dos medicamentos nas funções microbiais e tumoricidas dos
macrófagos peritoneais, foram realizados ensaios para detecção de espécies
reativas do oxigênio e nitrogênio, ex vivo (após 7 dias de tratamento dos
camundongos), após tratamentos in vitro e in vitro com posterior interação com
leveduras. Para avaliar alterações ocorridas durante o processo de co-cultura com
células de medula, como ativação morfológica dos macrófagos, foi utilizada a
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).
5.7.1 Interação de macrófagos com leveduras.
Para analisar a produção de espécies reativas após a fagocitose, foi realizada
uma interação de macrófagos cultivados por 48 horas (H
2
O
2
e O
2
-
) e 72 horas (NO)
com leveduras (Saccharomyces cerevisiae) (ANEXO 4). Após o tempo de cultivo, o
meio de cultura foi retirado e as células lavadas com meio sem soro. Foram
FIGURA 5 – FIGURAS ILUSTRANDO COMO FOI REALIZADO O
TRATAMENTO DOS CAMUNDOGOS COM O MEDICAMENTO 9
45
adicionadas 5x10
6
leveduras por poço, ou seja, 10 leveduras/macrófagos, diluídas
em meio sem soro. A placa voltou para a incubadora por 40 min. O sobrenadante foi
retirado e as células processadas para cada tipo de análise.
5.7.2 Avaliação da detecção de óxido nítrico (NO).
Como o NO é altamente reativo, difunde-se através da membrana e apresenta
uma curta meia-vida de somente alguns segundos (VAN DER VEEN et a.l, 2000), a
avaliação da produção de óxido nítrico foi determinada indiretamente a partir da
determinação da concentração de nitrito (NO
2
-
), o qual é um produto estável da
reação de produção de NO, no sobrenadante das culturas (ANEXO 5). O controle
positivo foi incubado, após 48 horas de cultivo, com 50ng/mL de LPS+26U/mL de
IFN-γ em meio DMEM por 24 horas em estufa a 37°C e em atmosfera com 5% de
CO
2
. Após, então, 72 horas, 100µl do sobrenadante das células de todos os grupos
foi transferido para outra placa de 96 poços. A esse sobrenadante foi adicionado
100µl do reagente de Griess (ANEXO 5) (GREEN et al., 1982) que na presença de
nitrito, reage para produzir uma cor lilás. A absorbância de cada amostra foi então
determinada em leitor de microplacas Bio-RAD modelo Benchmarck com filtro de
550nm. A concentração de nitrito no sobrenadante das amostras foi calculada com
base nos valores de D.O. obtidas para cada concentração (10µM-80µM) de uma
curva padrão, confeccionada com a utilização de uma solução de nitrito de sódio
diluído em meio de cultura, em concentração conhecida.
5.7.3 Avaliação da Detecção de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
A produção de H
2
O
2
foi quantificada pelo método baseado na oxidação do
vermelho de fenol pela H
2
O
2
, dependente de peroxidase, segundo o método de
PICK; MIZEL, 1981(ANEXO 6). Após os tempos de adesão, cultivo e interação com
leveduras, as células foram lavadas duas vezes com Hank’s Buffer Salt Solution
(HBSS) (37°C). Foi adicionado 100µl de meio de incubação contendo vermelho de
fenol a 1M e 15 U/ml de peroxidase dissolvidos em HBSS em todos os poços. O
“phorbol myristate acetate” (PMA), na concentração de 1µl/ml, foi utilizado como
controle positivo, uma vez que é conhecido como potencializador da produção de
H
2
O
2
pelos macrófagos. Cada grupo foi então analisado com e sem a presença de
PMA. As placas de cultivo foram levadas a estufa a 37°C. Para que fosse possível
46
medir a variação da produção de H
2
O
2
proporcional ao tempo de incubação, após os
tempos de 15 e 30 min., 100µl do sobrenadante das células foi retirado e transferido
para um placa idêntica contendo 10µl de solução aquosa de NaOH 1N em cada
poço correspondente. A oxidação do vermelho de fenol foi quantificada através de
leitura da absorbância em leitor de microplacas Bio-RAD
®
modelo Benchmarck
utilizando filtro de comprimento de onda de 620 nm. Os resultados foram obtidos em
densidade óptica e estão apresentados em nmoles de H
2
O
2
/10
6
células. Para a
obtenção de um padrão, foi feita uma curva de concentração de H
2
O
2
utilizando
peroxidase (HRPO tipo VI-A, 1310U/ml – Sigma) com a concentração final de
15U/ml. Foram feitas três soluções de H
2
O
2
nas diluições 1:10, 1:100 e 1:1000. A
concentração dessas soluções foi determinada através de sua absorbância em 240
nm, sendo o resultado utilizado em um coeficiente de 39,58 M
-1
cm
-1
. Diluições
apropriadas da solução estoque foram usadas para a determinação do H
2
O
2
produzido pelos macrófagos em cultura, segundo o método de PICK E KEISARI,
1980. A absorbância dessas diluições foi lida em leitor de microplacas utilizando filtro
de comprimento de onda de 620 nm e o resultado foi utilizado para confeccionar a
curva padrão.
5.7.4 Avaliação da detecção de ânion superóxido (O
2
-
)
Para a detecção do O
2
-
liberado no sobrenadante celular, foi usado o método
de redução do citocromo c (ANEXO 7) (JOHNSTON et al, 1978). Foi realizada uma
curva de tempo entre 5 e 30 minutos no experimento in vitro. Uma produção
crescente desse anion foi observada até cerca de 15 minutos. A partir desse ponto a
concentração começou a diminuir. Para o tratamento dos camundongos foram
testados apenas os tempos de 15 e 30 minutos.
O sobrenadante (o meio da cultura, no in vitro e in vitro após interação com
leveduras e o lavado com células não aderidas no ex vivo) foi retirado e foram feitas
duas lavagens com HBSS (37°C). As células foram encubadas com HBSS com
citocromo c, na ausência ou presença de 1mg/ml phorbol miristate acetate (PMA).
PMA foi usado como controle positivo devido a sua capacidade de induzir a
produção de O
2
-
. Após os tempos de 15 min e 30 min, o sobrenadante celular foi
transferido para outra placa e sua Absorbância mensurada á 550 nm em um leitor de
microplacas (BIO-RAD
®
). Para determinar a concentração de O
2
-
correspondente à
47
concentração de citocromo c reduzido, usou-se o Coeficiente de Extinção Molar (ε =
2.1 x 10
4
M
-1
cm
-1
). C = A/ε (A=absorbância) apresentados em nmoles de O
2
-
/10
6
células.
5.7.5 Análise morfológica dos macrófagos através com MEV
Após as 96 horas de co-cultura em membrana de policarbonato, observou-se
as possíveis alterações morfológicas nos macrófagos, como ativação, devido ao
tratamento e/ou interação com a membrana, ou não adaptação destes ao ambiente
de cultivo. Para isto, foi removida a membrana de policarbonato dos transwell e
processada para microscopia eletrônica de varredura segundo o protocolo de rotina
do laboratório (ANEXO 8). As células foram fixadas com glutaraldeído 2,5% e
tampão cacodilato de sódio 0,1M, por 1 hora, pós-fixadas em tetróxido de ósmio 1%,
desidratadas em bateria crescente de álcool e em aparelho de ponto crítico de CO2,
e metalizadas para posterior observação em microscópio eletrônico de varredura
JEOL do Centro de Microscopia da UFPR.
5.8 Estudos realizados com células de medula óssea.
5.8.1 Imunofenotipagem das células da medula óssea após tratamento dos
camundongos
Após o tratamento dos camundongos e a obtenção das células, como descrito
nos itens e 5.8 e 5.5, as células foram imunomarcadas como descrito no protocolo
em ANEXO 9. Foram utilizados cinco anticorpos biotinilados do sistema Mouse
Lineage Panel e o anti-CD11c, todos da BD/Pharmingen
®
(QUADRO 3) e secundário
conjugado com streptavidina-ficoeritrina. O sistema Mouse Lineage Panel foi
desenvolvido para marcar as principais células da linhagem hematopoiética.
A leitura foi realizada em Citômetro de Fluxo FACSCalibur equipado com o
laser de íon argônio (488nm) e detectores de dispersão para tamanho (FSC –
forward scatter) e complexidade interna (SSC – side scatter), detectores de emissão
de fluorescência FL1 (515-545 nm), FL2 (564-606nm) e FL3 (670 nm), sendo que a
ficoeritrina foi detectada pelo canal FL2. Os dados foram analisados pelo software
Cell Quest.
48
Anticorpo Marcador (descrição)
anti-CD3e
linfócitos T (específico para a cadeia epsilon do complexo
CD3)
anti-CD45R (B220) linfócitos B
anti-CD11b
monócitos/macrófagos (específico para a cadeia α [M] do
complexo CD11b/CD18)
anti-Ly-6G (Gr-1) série granulocítica
anti-TER-119 (Ly-76) série eritrocítica
anti-CD11c
células dendríticas (específico para a cadeia αX do
complexo CD11c/CD18)
QUADRO 4 – ANTICORPOS UTILIZADOS PARA IMUNOFENOTIPAGEM
FONTE: TECNICAL DATA SHEET BIOTIN MOUSE LINEAGE PANEL
(http://www.bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/tds/mouse/live/web_enabled/0
144KK_559971.pdf) e APC HAMSTER ANTI-MOUSE CD11
(http://www.bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/tds/mouse/live/web_enabled/0
9709A_550261.pdf).
5.8.2 In vitro e co-cultura
5.8.2.1 Detecção de CD11b em células da medula óssea em citometria de fluxo
Para a análise em citometria de fluxo, tanto as células do sobrenadante da cultura
de medula óssea, quanto as aderentes, seguiram o protocolo em ANEXO 9. Após as
96 horas de cultivo, as células não aderentes foram transferidas para microtubos de
centrífugas e processadas. As células aderentes foram soltas com jatos de PBS a
4°C, em seringa de 1 mL e agulhas. Transferidas pa ra microtubos de centrífuga e
processadas. Todas as células foram fixadas com paraformaldeído 1%, incubadas
com 0,5µg% do anticorpo biotinilado anti-CD11b por 40 min., e com secundário
streptavidina-ficoeritrina por 30 min. Seguiu-se, então para a leitura em citometria de
fluxo como descrito no item imunofenotipagem.
5.8.2.2 Detecção e quantificação de CD11b em células aderentes da medula
óssea através de microscopia confocal.
Antes do plaqueamento das células para a microscopia confocal, foram
colocadas lamínulas de cultivo dentro dos poços das placas de cultura. Após as 96
horas de cultivo, seguiu-se o protocolo em ANEXO 10. As células aderentes foram
49
incubadas com 0,5µg% com anticorpo biotinilado anti-CD11b por 40 min., fixadas
com paraformaldeído 2% por 40 min, incubadas com anticorpo anti-porção Fc, por
40 min, na concentração final de 1µg% (para se evitar marcações inespecíficas), e
posteriormente com secundário streptavidina-ficoeritrina por 40 min. As lamínulas
foram montadas com o meio de montagem para fluorescência (corante nuclear), da
marca Vectashield
®.
Após o experimento, as células foram analisadas com auxílio do
Microscópio Confocal Radiance 2001 (Bio-Rad
) acoplado à Eclipse E800 (Nikon
).
A ficoeritrina foi excitada pelo laser de íon argônio a 488nm e o DAPI pelo laser blue
diode a 350nm.
5.9 Estatística
A análise estatística foi realizada a partir da análise de variância (ANOVA:
fator único) dos valores obtidos. O ANOVA foi realizado para garantir se havia ou
não homogeneidade entre os dados. Foi utilizado também o teste de Tukey. Esse
teste é realizado visando encontrar a diferença mínima entre as médias para que
exista diferença estatisticamente significativa entre os grupos. Para isso, foi aplicada
a seguinte fórmula:
To = q RQME /
Onde q é o valor encontrado na tabela de valores da amplitude total (q) para α = 5%,
segundo o número de tratamento (k) e os graus de liberdade do resíduo (grau de
liberdade do erro); QME é o MQ do erro, e R é o número de repetições (VIEIRA,
1980). Para realizar estes testes foram utilizados os programas Excel e confirmados
com o GraphPad Prism 5.
50
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste trabalho foram analisados 12 medicamentos produzidos a partir de 7
substâncias altamente diluídas segundo os princípios da homeopatia, usados
tradicionalmente e mundialmente. Como ferramentas de estudo das suas ações no
sistema imunológico, foram primeiramente utilizados macrófagos peritoneais e
posteriormente, células da medula óssea de camundongo. Os resultados
apresentados de forma esquemática no quadro abaixo serão discutidos de forma
geral e posteriormente, individual (separado por medicamento), pois apesar de
muitos resultados serem semelhantes entre eles, cada um dos medicamentos atua
diferentemente sobre as células
51
6.1 Resultados e discussão geral
Métodos bem estabelecidos na imunologia moderna e biologia celular têm sido
adotados para testar efeitos de drogas homeopáticas comercialmente disponíveis ou
de princípios ativos diluídos de acordo com os métodos homeopáticos tradicionais.
Estudos laboratoriais com células e especialmente leucócitos representam um
campo fértil no qual pesquisadores homeopáticos e convencionais têm trabalhado
juntos (BELLAVITE et al., 2006). Neste trabalho, todos os medicamentos
Medicamento Merc sol Acon
Bell Ars
Lach Thuy
Bry
CH 6
12 200
30 6 30 200
6 12 200
30 200
NO in vitro
- X
NO levedura
- - - - - - - - X
NO ex vivo
X
X - - X
X - - X - -
H
2
O
2
in vitro
- - - - - - - - - - - X
H
2
O
2
leved.
- - - X
H
2
O
2
ex vivo
X
X X
X - X -
O
2
-
in vitro
- - X
O
2
-
levedura
- - - - - - - - X
O
2
-
ex vivo
X
X X
X X
Macrófagos
MEV
X
X X
X X
CD3
+
ex vivo
X
X - X
X - X -
CD45R
+
ex
vivo
X
X - X
X - X -
CD11b
+
ex
vivo
X
X - - X
X - - X -
Ly-6G
+
ex
vivo
X
X - - X
X - X - -
TER-119
+
ex
vivo
X
X - - X
X - - X - - -
CD11c
+
ex
vivo
X
X - - X
X - X
CD11b
+
in
vitro
sobrenadante
X
X X
X - - X - - -
CD11b
+
in
vitro cocult.
Não aderente
X
X - - X
X - - X
CD11b
+
in
vitro cocult.
aderente
X
X - - X
X - X -
Células de medula óssea
confocal
(
)
Aumentou em relação ao controle; (
)
diminuiu em relação ao controle; (-) - sem diferença
significativa; X - não foi estudado
QUADRO 5 – RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS
52
homeopáticos estudados mostraram atuar de alguma maneira tanto sobre
macrófagos quanto em seus precursores, assim como nas demais células
precursoras do sistema imunológico. Terapias focadas no estímulo e recrutamento
de macrófagos tem sido foco de pesquisas relacionadas à resolução de diversas
patologias como câncer e doenças inflamatórias. Dependendo dos receptores de
reconhecimento utilizados, a sua fase e do estado de diferenciação, podem liberar
diversos produtos de secreção, incluindo citocinas, que mobilizam outras células do
hospedeiro e influência células residentes em outros tecidos. (GORDON, 1998).
Liberação de ROS e RNS por macrófagos.
Macrófagos estão claramente envolvidos na inflamação através da secreção de
moléculas e participam de todas as respostas imunológicos (GORDON, 2003). A
análise da liberação das espécies reativas mostrou que todos os medicamentos, de
alguma maneira, alteram a liberação dos radicais. A ação dos medicamentos
homeopáticos na liberação de espécies reativas pode ter várias conseqüências,
muitas delas relacionadas ao seu grande pontencial destrutivo, porém ROS e RNS
também podem atuar como segundo mensageiros, modulando vias de ativação
celular (BROWN; GRIENDLING, 2009). Um alto estresse oxidativo está associado a
ameaças para funções das células e sua vitalidade. Por outro lado, pequenas
perturbações no estado estacionário de ROS esta envolvido com liberação de
fatores de crescimento e a expressão de receptores que medeiam a sinalização
celular (FORMAN; TORRES, 2001). De maneira geral, após o tratamento in vitro
pode-se verificar que praticamente todos os grupos tratados (com exceção da Bell
CH30) aumentaram significativamente a liberação de NO. E diminuíram (com
exceção de Acon CH30 e Lach CH12) a liberação de O
2
-
. No entanto, a liberação de
H
2
O
2
não foi alterada com nenhum dos medicamentos. Após a interação com
leveduras, a detecção no sobrenadante de H
2
O
2
(tempos de 15 e 30 min. de
incubação) foi menor nos grupos com leveduras do que naqueles sem leveduras; já
a liberação de NO e O
2
-
(apenas no tempo de 15 min. de incubação)
foi maior. Essa
generalização pode sugerir que os medicamentos homeopáticos aumentam a
liberação de NO um radical menos reativo e que possui grande efeito estimulador e
sinalizador das células imunológico, e diminui ou não altera a liberação dos demais
radicais, desempenhando assim, um efeito protetor do estresse oxidativo. Durante o
53
estímulo de defesa celular, ocorre um aumento normal e fisiológico na produção de
espécies reativas, e consequentemente um aumento na liberação dos radicais.
Muitos dos medicamentos usam esse aumento na produção de radicais a favor da
defesa da célula. Eles diminuem a liberação dos radicais, provavelmente por
direcionar essa produção para a destruição dos microorganismos.
A análise da liberação dos radicais após o tratamento dos camundongos não
mostrou resultados tão generalizados quanto os do tratamento in vitro,
provavelmente devido a intervenções de outras células do organismo.
Morfologia dos macrófagos tratados com medicamentos homeopáticos
Todos os medicamentos homeopáticos ativaram morfologicamente os
macrófagos peritoneais, corroborando os resultados encontrados por Oliveira (2005).
Condições dos camundongos após os tratamentos
Ao final do tratamento, cada animal bebeu cerca de 10 mL/dia de solução. No
8º dia, os animais foram pesados novamente. Com a avaliação da quantidade de
água ingerida pelos animais e a análise do peso, verificou-se que todos estavam
ingerindo as soluções, pois a média de líquido restante na mamadeira manteve-se
constante diariamente, além de não ocorrer diferença no peso dos animais controles
e tratados dentro dos oito dias.
Imunofenotipagem das células da medula óssea
As células hematopoiéticas dão origem a todas as células sanguíneas: linfócitos T,
B, NK, granulócitos, monócitos, megacariócitos e eritrócitos. A expressão de
diferentes receptores na superfície dos progenitores hematopoiéticos permite sua
interação com vários elementos reguladores presentes no ambiente, nos quais se
incluem as células estromais, as moléculas de matriz extracelular e citocinas
regulatórias, como fatores de crescimento e diferenciação (GUNSILIUS et al., 2001).
Após o tratamento dos camundongos, todos os medicamentos homeopáticos
alteraram algum dos marcadores das células precursoras hematopoiéticas. Somente
não foi verificada alteração na expressão do receptor Ter-119, da linhagem
eritrocítica, sugerindo que provavelmente esses medicamentos atuam apenas nas
células efetoras do sistema imunológico (FIGURA 6).
54
Macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, linfócitos T CD4+, T CD8+ e B
são células que controlam o sistema imunológico, e são descritas como potenciais
efetoras contra neoplasias e são exaustivamente estudadas em vias de ativação de
resposta imunitária visando a imunoterapia contra células neoplásicas, processos
infecciosos, inflamatórios e na modulação da resposta imunológica. (UNANUE;
ALLEN, 1987; MOLIFE; HANCOCK, 2002). Dessa forma, medicamentos
homeopáticos agindo sobre essas células, estariam regulando o sistema
imunológico.
55
Pro- M
CTH, células tronco hematopoiética ; PLC, progenitor comum linfóide; PMC, progenitor comum
mielóide; PEM, progenitor comum eritróide/megacariócito; PMG, progenitor de monócito/granulócito;
Pro-E, progenitor de eritróide; Pro-G, progenitor de granulócito; Pro-M, progenitor monócito; Pro-T,
progenitor de célula T; Pro-NK, progenitor de célula NK; Pro-B, progenitor de célula B. Medicamentos
em azul diminuíram a expressão do marcador e em vermelho aumentaram a expressão do marcador.
FIGURA 6 – ESQUEMA DE HEMATOPOIESE MOSTRANDO A PARTIR DE QUAL
LOCAL PROVAVELMENTE OS MEDICAMENTOS COMEÇAM A AGIR.
Pro-NK
CD3ε
+
:
Merc
sol, Ars,
Lach, Thuy
CD45R
+
:
Acon; Bell;
Lach; Thuy
CD11c
+
:
Ars; Lach;
Thuy; Bry,
CD11b+:
Lach
;
Bry
Ly
-
6G
+
:
Bell
;
Bry
CD11b
+
:
Lach; Bry
PEM
Progenitores
Multipotentes
CTH
Bell
PMC
PMG
PLC
Pro-T
Pro-B
Pro- E
Célula T
Eritrócitos
Neutrófilo
Célula
NK
Progenitores
Oligopotentes
Progenitores
Restritos a
Linhagem
Células
Efetoras
Macrófago
Célula
Dendrítica
Monócito
Eosinófilo Basófilo
célula B
Plasmócito
Pro- G
Auto-renovável
56
Co-cultura e tratamento in vitro das células de medula óssea
Com os resultados da imunofenotipagem, surgiu a necessidade de entender
se os medicamentos homeopáticos estariam atuando diretamente sobre as células
precursoras do sistema imunológico e/ou via ativação dos macrófagos. Para
responder essa questão, foram realizados experimentos in vitro de células de
medula e co-cultura dessas com os macrófagos peritoneais. Esses experimentos
possibilitaram analisar a ação dos medicamentos sobre células CD11b
+
, marcador
da linhagem monocitica, usando o mesmo anticorpo da imunofenotipagem com
leitura em microscopia confocal e citometria de fluxo.
Hematopoiese é um processo altamente regulado que ocorre no microambiente da
medula óssea. Ele tem sido visualizado como o resultado de um balanço entre sinais
que estimulam e sinais que inibem a proliferação e diferenciação de progenitores
hematopoiéticos. Progenitores hematopoiéticos crescem em uma estreita
associação com células estromais e diversos receptores de adesão, que estão
presentes nos progenitores, permitem interação com as células estromais e a matriz
estromal extracelular. A adesão, por si só, pode alterar a proliferação e diferenciação
das células progenitoras hematopoiéticas (HURLEY et al., 1995). Após o tratamento
da medula óssea in vitro, os medicamentos Merc sol CH200 e Acon CH30
mostraram um aumento significativo de marcador CD11b no sobrenadante da
medula e os demais (com exceção do Ars CH6) mostraram uma tendência no
aumento desse marcador. Esse aumento no marcador da linhagem mielóide,
sugerem que os medicamentos homeopáticos estariam atuando na proliferação
dessas células precursoras, ao contrário do que se observa na co-cultura. Nesta
técnica, todos os medicamentos diminuíram a expressão do marcador CD11b nas
células do sobrenadante da cultura da medula (significativos para Lach CH200, Thuy
CH30, Bry CH200) e aumentaram CD11b
+
nas células aderentes da medula óssea
(significativo para Ars CH6, Thuy CH30 e Bry CH200). De um modo geral, as células
progenitoras têm uma maior proliferação se não estiverem em contato com as
células do estroma e matriz extracelular, e uma maior diferenciação dessas células
ocorre a partir da interação de seus receptores com estroma e matriz (HURLEY, et
al.,1995). Assim, os macrófagos da co-cultura, juntamente com os medicamentos
homeopáticos estariam estimulando a adesão dos precursores da linhagem mielóide
e sua conseqüente proliferação e diferenciação, pois a quantidade de células no
57
sobrenadante da cultura é próximo daquela da medula, no entanto, a quantidade de
células aderidas é maior (dados observados, mas não quantificados) Outra
explicação para o aumento de células marcadas CD11b+ no sobrenadante da
medula óssea tratada in vitro, é que a maioria dos medicamentos estaria
favorecendo diferenciação das células mielóides, as quais se desprenderiam do
estroma ao se diferenciarem, como granulócitos (os primeiros a se soltarem e estão
em maior quantidade) e células dendríticas. Estas células, uma vez maduras na
cultura da medula óssea, se soltam e ficam no sobrenadante, diferente de
macrófagos que, mesmo diferenciados, permanecem aderidos (CITTERIO, et al.,
1999; INABA, et al., 1992). Interessantemente, somente os medicamentos que
estimularam a liberação de IL-4 por macrófagos tratados in vitro em Oliveira (2005),
induziram o aumento de CD11b+ no sobrenadante da medula. Essa citocina é
responsável pela expansão e recrutamento de células mielóides no início de sua
diferenciação (SNOECK, et al., 1996), além de favorecer a diferenciação de células
dendríticas (BONTKES, et al., 2002). Aumento significativo na marcação de CD11b
ocorre quando se compara o sobrenadante do controle das células da medula da co-
cultura com o sobrenadante do controle do cultivo apenas da medula. Assim, pode-
se sugerir que a presença de macrófagos estimula uma proliferação das células da
medula óssea.
Novas estratégias terapêuticas podem emergir destes novos conhecimentos, indo
desde a terapia celular a tratamentos do organismo com um todo. Uma vez que
muitos medicamentos mostraram possuir efeitos diferentes de acordo com o sistema
adotado.
58
6.2 Resultados e discussão individual
6.2.1 Mercurius solubilis
Neste trabalho, foram testadas diferentes diluições do composto mercurial
Mercurius solubilis de fórmula Hg
4
ON. H
2
NO
3
+ NH
4
NO
3
,
in vitro (CH6, CH12 e
CH200) e in vivo (CH200) em macrófagos e células de medula óssea de
camundongo. OLIVEIRA, 2005 mostrou que Merc sol possui atividade biológica,
alterando funções de macrófagos peritoneais no sistema imunológico. Após
tratamento in vitro, todas as potências de Merc sol ativaram morfologicamente
macrófagos. A ativação faz com que essas células passem de um estado residente
para ativado e consequentemente aumentem ou iniciem suas funções efetoras,
como a produção de ROS e NO. Dessa forma a avaliação da produção e/ou
liberação dessas espécies podem ser úteis para analisar a atividade destas células.
Análises após tratamento in vitro
O NO faz parte de mecanismos de defesa imunológico não específico e é
gerado durante processos imunológicos e inflamatórios (COLEMAN, 2001). Após
tratamento in vitro dos macrófagos com Merc sol, todas as potências mostraram
estimular a liberação de NO no sobrenadante da cultura, aumentando
significantemente (FIGURA 7). Sugerindo que esses medicamentos estariam
atuando nas funções de defesa dos macrófagos.
Figuras 7A, 7B e 7C – (*) indicam grupos com aumento significante (P< 0.05) comparado ao
controle de NO após tratamento in vitro de macrófagos com CH6, 12 e 200, respectivamente, e
cultivo por 72 horas. Todos os resultados são expressos como media±erro padrão.
FIGURA 7 – LIBERAÇÃO DE NO POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO IN
VITRO
COM MERC SOL
7C
7B
7A
59
O NO por si só, é uma molécula com pouca reatividade química com
moléculas orgânicas e preferencialmente liga-se a metais, mas em células que
produzem ambos NO e O
2
-
, ele pode atravessar a membrana em direção a fonte de
O
2
-
e juntos formarem ONOO
-
(FORMAN; TORRES, 2001) dentro das vesículas nos
dos macrófagos. De fato, em nossos experimentos, o tratamento in vitro com todas
as potências de Merc sol diminuiu a liberação de O
2
-
(FIGURA 8).
Fagócitos podem gerar ONOO
-
para destruir patógenos, ou atuar como uma defesa
antioxidante por prevenir um aumento na concentração de O
2
-
e H
2
O
2
(NATHAN;
SHILOH, 2000). Dessa forma, as potências de Merc sol podem estar induzindo a
formação de ONOO- dentro das vesículas fagocíticas, e consequentemente
diminuindo a concentração de O
2
-
no sobrenadante da cultura, o que contribui para
uma diminuição do estresse celular. No caso do tratamento com potência CH200 de
Merc sol, outra hipótese que pode explicar a diminuição na liberação de O
2
-
é a
inibição da enzima produtora de O
2
-
(NOX2) por IL-4, como foi descrito em Zhou, et
al. (1995). Em 2005, Oliveira mostrou que macrófagos tratados com Merc sol CH200
aumentavam a liberação dessa citocina. Assim consequentemente, o medicamento
atuaria regulando o processo inflamatório dos macrófagos e reduzindo danos
causados por excesso de produção de O
2
-
.
O NO liberado por macrófagos tratados com Merc sol deve também ativar o
fator nuclear de transcrição NF-κB, cuja ativação é essencial para a expressão de
Figuras 8A, 8B e 8C – (*) indica grupos com diminuição significante (P< 0.05) comparado ao controle
de O
2
-
após tratamento in vitro de macrófagos com CH6, 12 e 200, respectivamente, e cultivo por 48
horas. Todos os resultados são expressos como media±erro padrão.
FIGURA 8 – LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO IN
VITRO
COM MERC SOL
8B
8A 8C
60
um grande número de citocinas e genes de adesão que são mediadores críticos
para reação inflamatória (BRUCKDORF, 2005; FORMAN; TORRES, 2001). Esta
hipótese pode ser sustentada para as potências CH6 e CH12 com o trabalho de
OLIVEIRA, 2005 o qual mostrou que macrófagos tratados in vitro com essas
potências, aumentam a liberação de IFNγ, citocina que também estimula NF-κB
(BRUCKDORF, 2005). Assim, o tratamento in vitro com potências CH6, 12 e 200
pode estar atuando no aumento das funções efetoras dos macrófagos e/ou na
sinalização de resposta inflamatória via NO e ainda na redução do estresse
oxidativo. Interessantemente, o tratamento com Merc sol nos grupos positivos (LPS
e IFNγ) reduziu a liberação de NO. Em 2002, Kim, et al., demonstraram que o NO
produzido por indução do LPS é inibido de uma maneira dose-dependente por HgCl
2
(5–20 µM) em macrófagos J774A.1.
NOX2, a enzima responsável pela produção da maior parte de O
2
-
, em
fagócitos, é estimulada também após fagocitose (CROSS; SEGAL, 2004). Esse
estímulo faz com que NOX2 produza O
2
-
para dentro do fagossomo (BROWN;
GRIENDLING, 2009). De fato, quando se compara os experimentos com e sem
leveduras, todos os grupos do experimento com leveduras mostraram liberar uma
menor quantidade de H
2
O
2
. E nos grupos tratados com as potências CH6, 12 e 200
esse decréscimo de H
2
O
2
foi ainda menor do que o controle com levedura (após os
tempos de incubação de 15 e 30 min.) (FIGURA 9).
O O
2
-
na ausência de NO, é rapidamente dismutado a H
2
O
2
(FORMAN;
TORRES, 2001). H
2
O
2
, juntamente com íons cloreto pode ser convertido em ácido
hipocloroso (HOCl), pela mieloperoxidase. HOCl é um oxidante antimicrobicida
altamente eficaz (BROWN, GRIENDLING, 2009). Como nenhuma das potências de
Merc sol alterou a liberação de NO após a interação macrófagos/leveduras, pode-se
sugerir que o H
2
O
2
produzido nos macrófagos tratados pode estar sendo convertido
ao agente bactericida HOCl no fagossomo, aumentado a destruição do
microorganismo e conseqüentemente diminuindo a liberação extracelular desse
reativo no sobrenadante da cultura. A liberação de O
2
-
por macrófagos após a
interação com leveduras não mostrou alteração após os tratamentos com Merc sol.
Provavelmente o H
2
O
2
convertido em HOCl foi aquele que seria liberado pela célula,
sem ser necessário uma produção maior desse radical. Evita-se dessa forma, um
estresse oxidativo, mesmo num evento de defesa do organismo.
61
(*) indica grupos com diminuição significante de H
2
O
2
(P< 0.05) comparado ao controle após
tratamento in vitro de macrófagos com CH6 (9A e 9B), 12 (9C e 9D) e 200 (9E e 9F), cultivo por 48
horas e posterior interação com leveduras.. Resultados significativos após 15 e 30 min. de incubação.
Todos os resultados são expressos como media±erro padrão.
FIGURA 9 – LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO IN
VITRO COM MERC SOL
9B
9A
9D
9C
9E
9F
62
Análises após tratamento dos camundongos
Para os tratamentos dos camundongos, foi utilizado apenas Merc sol na
potência CH200. Após o tratamento dos camundongos com Merc sol CH200 ocorreu
uma diminuição na liberação de O
2
-
(FIGURA 10) após o tempo de 30 min. e um
aumento de H
2
O
2
(FIGURA 11) após o tempo de 15 min.
De fato, O
2
-
pode ser dismutado a H
2
O
2
(2O
2
+ 2H
+ →
H
2
O
2
+ O
2
), o qual pode
rapidamente se difundir através de membranas. Isto pode ocorrer em resposta a
vários estímulos, incluindo citocinas, fatores de crescimento, e está envolvido na
Gráfico mostrando a diminuição significativa na liberação de O
2
-
(30 min. de incubação), quando
comparado ao controle (*) (P< 0.05) após tratamento in vivo. Todos os resultados são expressos
como media±erro padrão.
FIGURA 10 – LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO IN
VIVO DOS CAMUNDONGOS COM MERC SOL.
Gráfico mostrando aumento significativo na liberação de H
2
O
2
(15 min. de incubação), quando
comparado ao controle (*) (P< 0.05) após tratamento in vivo. Todos os resultados são expressos
como media±erro padrão.
FIGURA 11 – LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO
DOS CAMUNDONGOS COM MERC SOL
ex vivo
ex vivo
63
regulação de processos biológicos como ativação celular (VEAL, et al., 2007) e
ativação de NF-κB (KAUL; FORMAN, 1996; FORMAM, TORRES, 2001). Uma vez
que o H
2
O
2
liberado por macrófagos foi aumentado após o tratamento dos
camundongos, Merc sol pode estar atuando na sinalização celular via H
2
O
2.
Um esquema sumarizando os efeitos de Merc sol sobre as de espécies
reativas é mostrado na (FIGURA 12).
A: tratamento in vitro com Merc sol aumenta liberação de NO (setas pretas) e diminui de O
2
-
no
sobrenadante da cultura (setas brancas). Autos níveis de NO seguido da formação de ONOO
-
dentro
das vesículas, diminui O
2
-
liberado. B: tratamento dos camundongos também diminui a liberação de
O
2
-
(setas brancas) mas aumenta de H
2
O
2
liberado (seta preta). O
2
-
produzido pode dismutar-se a
H
2
O
2
que rapidamente difunde-se através das membranas. C: após o tratamento in vitro e posterior
interação com leveduras, diminuiu a liberação de H
2
O
2
no sobrenadante (seta branca), pois o H
2
O
2
produzido, provavelmente é combinado com Cl-, formando HCLO, ácido altamente bactericida, dentro
do fagossomo, conseqüentemente diminuindo os níveis de H
2
O
2
no sobrenadante da cultura. (setas
brancas=aumento; setas pretas= diminuição; “sol” =levedura, raio= destruição do patógeno; quadrado
azul= reação provável).
FIGURA 12 – EFEITOS DO MERC SOL NA LIBERAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVA
MEV de macrófagos em co-cultura
Após 96 horas, a membrana da placa de co-cultura foi retirada e processada
para MEV. Os macrófagos tratados com Merc sol CH 200 mostram uma morfologia
de ativado, diferente do controle, o qual apresentou morfologia de residente
(FIGURA 13). De fato, tratamento in vitro por 48h com Merc sol ativou
H
2
O
2
O
2
-
ONOO
-
O
2
--
H
2
O
2
NOX2
H
2
O
2
H
2
O
2
NOX2
O
2
-
H
2
O
2
B
A
C
célula
célula
célula
O
2
-
NO
ONOO
-
NO
+
NOX2
O
2
-
O
2
-
NOX
H
2
O
2
O
2
-
iNOS
NO
+
NOX2
In vitro
In vivo
In vitro com fagocitose
extracelular
extracelular
extracelular
célula
célula
NOX2
iNOS
O
2
-
NOX2
O
2
-
H
2
O
2
Cl
-
MPO
HOCl
H
2
O
2
Ex vivo
64
morfologicamente macrófagos (OLIVEIRA, 2005), aumentando a quantidade de
ativados no grupo tratado.
13D
MEV de macrófagos co-cultivados com medula óssea por 96 horas. A, C e E - macrófagos controle,
B, D e F - tratados com Merc sol CH200
Setas abertas = macrófagos residentes; setas fechadas = macrófagos ativados; setas tracejadas =
poros da membrana
FIGURA 13 – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DE
MACRÓFAGOS TRATADOS COM MERC SOL EM CO-CULTURA
13C
13A
13B
13D
13D
13F 13E
65
Imunofenotipagem das células da medula óssea
Após o tratamento dos camundongos dos camundongos com Merc sol
CH200, as células da medula óssea foram imunomarcadas . A imunofenotipagem do
grupo de células correspondentes ao medicamento mostrou que as células
marcadas positivamente para CD3ε diminuíram com Merc sol CH200 (FIGURA 14).
Os outros marcadores celulares não foram alterados significativamente.
CD3ε pode ser detectado desde precursores da linhagem de
células T na
medula óssea até ser altamente expresso em células T maduras (KLEIN, et al.,
2003). Faz parte do complexo CD3, o qual é um formado por 4 polipeptídeos (CD3ε,
γ, δ, ζ). Quando expressos juntamente os heterodímeros do pre-TCR (receptor de
células T imaturas) e do TCR (receptor de células T maduras) formam os grandes
complexos pT-CD3 ou T-CD3, respectivamente. Esses polipeptídeos são centrais no
funcionamento desses dois receptores. CD3ε tem um papel fundamental no
desenvolvimento inicial de células T e é essencial para a expressão e função do pre-
TCR e TCR (DEJARNETTE, et al., 1998; DAVE, 2009). Linfócitos T são inicialmente
gerados na medula óssea e, uma grande parte, termina sua diferenciação no timo
(BANDHOOLA, et al., 2003). A população de precursores de células T na medula é
heterogênea, assim como as células que são recrutadas ao timo. O timo é apenas
periodicamente receptivo às células precursoras, sugerindo um nível de
(*) diminuiu significativamente em relação ao controle (P< 0.05). Todos os resultados são expressos
como media±erro padrão.
FIGURA 14 – CD3ε
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA APÓS TRATAMENTO IN
VIVO COM MERC SOL
ex vivo
66
comunicação entre Timo e medula óssea que recruta os precursores (BANDHOOLA,
et al., 2003; BANDHOOLA; SCHWARZ, 2006; LAI; KONDO, 2008). Para que os
precursores de células T da medula óssea sejam mobilizados para a corrente
sanguínea em direção ao timo é necessário primeiramente que estes sejam
liberados da adesão com as células estromais e liberados no sangue. Esse processo
é chamado de mobilização (BANDHOOLA; SCHWARZ, 2006). Os resultados de
imunofenotipagem demonstraram Merc sol medula óssea, diminui células CD3ε
+
.
Então é possível que o tratamento estimule o processo de mobilização destas
células, provavelmente em direção ao Timo. Algumas descrições na literatura têm
mostrado o envolvimento das integrinas da família αβ na mobilização de precursores
de células T na medula óssea (BANDHOOLA; SCHWARZ, 2006). Neste estudo,
Merc sol CH200 mostrou possuir ação in vitro sobre um desses componentes
(FIGURA 15) nas células da medula, provavelmente induzindo sua desadesão.
Como a molécula CD3 também está diretamente envolvida na sinalização que
regula a adesão e a migração de células T (PRIBILA; SHIMIZU, et al., 2003),
podemos sugerir que esse medicamento esteja estimulando o recrutamento das
células precursoras ao Timo, diminuindo assim a sua marcação na medula óssea.
CD11b
+
em células de medula óssea
Após cultivo de 96 horas, as células não aderentes da medula óssea foram
processadas e incubadas com anticorpo anti-CD11b. A leitura em citometria de fluxo
mostrou que o tratamento in vitro das células de medula óssea com o medicamento
Merc sol CH200 induziu um aumento na sua marcação CD11b
+
(FIGURA 15 ).
CD11b esta evolutivamente relacionada ao receptor integrina que medeia
adesão celular à matriz extracelular durante o desenvolvimento e reparo tecidual
(GEORGAKOPOULOS, et al., 2008). Nas CTHs, CD11b é um dos primeiros
marcadores detectados durante a diferenciação de monócitos e granulócitos nos
estágios mielocíticos e monoblásticos (ARNAOUT, 1990; KISHIMOTO, et al., 1990,
YANG, et al., 2007). As CTHs para se diferenciarem precisam estar aderidas ao
estroma, ao contrário da sua proliferação (INABA, et al., 1992).
67
Uma vez que o tratamento com Merc sol aumentou a porcentagem de células
CD11b
+
não aderentes, é provável que o medicamento esteja estimulando a
proliferação dessas células. Oliveira (2005) mostrou que Merc sol CH200 aumenta a
liberação da citocina IL-4 por macrófagos peritoneais de camundongo, a qual
estimula a proliferação de células progenitoras hematopoiéticas e a expansão e o
recrutamento de células mielóides em início de diferenciação (OGAWA, 1993;
SNOECK, et al., 1996). Se Merc sol possuir esse mesmo efeito sobre os macrófagos
do estroma medular, é possível que ele esteja estimulando a proliferação das células
CD11b
+
via IL-4. Outra possibilidade é que o tratamento com Merc sol esteja
estimulando a diferenciação de células mielódies. Em cultura celular, depois de
diferenciadas, algumas células, como granulócitos e células dendríticas, se
desprendem ficando no sobrenadante da cultura (INABA, et al., 1992). Para
confirmar essa hipótese, marcadores específicos para células dendríticas e
granulócitos devem ser usados.
Caso o medicamento esteja estimulando a diferenciação de células
dendríticas, ele pode ser muito útil, pois as técnicas desenvolvidas para desenvolver
e estimular células dendríticas são demoradas e caras (SMITS, et al., 2009). As
células dendríticas são células consideradas adjuvantes naturais para a
imunoterapia em doenças malignas. São extremamente potentes para estimularem
células T os quais são ideais para gerarem respostas anti-melanoma e, usá-las na
imunoterapia, para o tratamento de neoplasias diversas, incluindo mileoma múltiplo,
(*) aumentou significantemente em relação ao controle (P< 0.05). Todos os resultados são expressos
como media±erro padrão.
FIGURA 15 – CD11b
+
EM CÉLULAS NÃO ADERENTES DE MEDULA ÓSSEA
APÓS TRATAMENTO IN VITRO COM MERC SOL
68
uma doença maligna de células B, é altamente promissor (HÁJEK; BUTCH, 2000;
YI, 2003).
Após o experimento de co-cultura e tratamento com Merc sol CH200, a
análise do marcador CD11b nas células não aderentes da medula óssea não foi
alterado. No entanto, quando comparamos os controles das células não aderentes
da medula cultivada sozinha com as células não aderentes da medula cultivada com
macrófagos, podemos observar uma maior quantidade de células CD11b
+
no
experimento de co-cultura (FIGURA 16 ).
Aparentemente, macrófagos produzem substâncias que estimulam a
desadesão e consequente proliferação celular. Quando é adicionado Merc sol
CH200 ao co-cultivo, a quantidade de células CD11b
+
não aderidas tende a diminuir,
ficando próxima a porcentagem de fluorescência que aparece nas células não
aderidas da medula cultivada sozinha. Assim, podemos sugerir que o medicamento
Merc sol não exerce sua ação nas células CD11b
+
da medula óssea em co-cultura,
uma vez que o mesmo efeito já esta sendo realizado pelos macrófagos. Dessa
forma, a ação do Merc sol não é aditiva a capacidade dos macrófagos de estimular a
proliferação das células CD11b
+
. Com essa comparação, podemos verificar que o
tratamento com Merc sol modula a sua ação sobre a medula óssea de acordo com a
situação. Por exemplo, neste caso, se o macrófago por si só já estimula a
(*) aumentou significantemente (P< 0.05). Todos os resultados são expressos como media±erro
padrão.
FIGURA 16 –CD11b
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA NÃO ADERENTES EM
CULTURA E CO-CULTURA.
69
proliferação celular, o tratamento com Merc sol CH 200 não aumentaria a
proliferação celular, o que poderia ser perigoso no caso de um tratamento, pois
proliferação exagerada é característica de células com potencial maligno.
O marcador CD11b não foi alterado significativamente nas células da medula
óssea aderentes após co-cultura com macrófagos e tratamento com Merc sol CH200
(dados não mostrados).
Todas as diluições de Merc sol mostram possuir ação sobre as funções de
dos macrófagos, alterando a liberação de espécies reativas. Os resultados concluem
que em uma situação normal, macrófagos tratados com Merc sol devem ter um
balanço de resposta imunológica Th1 ou Th2, provavelmente prevenindo um
aumento na concentração de ROS tanto in vitro quanto ex vivo (diminui O
2
-
) e depois
da interação com leveduras. Mas quando o estímulo é muito intenso, como após a
adição de LPS, IFN-γ ou PMA, ocorre uma diminuição na liberação dos ROS,
protegendo as células de danos causados pelos tratamentos. Merc sol pode ainda
estar em sinalização celular, como na ativação de NF-κB, devido ao aumento de NO
e H
2
O
2,
podendo, então, atuar na coordenação das respostas inflamatórias do
organismo. De fato, ao analisar a sua ação sobre as células de medula óssea ex
vivo, pode-se sugerir que o tratamento com Merc sol induz recrutamento de células
CD3
+
da medula óssea para a corrente sanguínea, com provável direção ao timo. A
ação ou consequência desse tratamento pode estar sobre as integrinas que regulam
a adesão das células precursoras sobre o estroma, fazendo com que ocorra uma
desadesão destas células. Este efeito também pode ser observado sobre as células
CD11b
+
após o tratamento in vitro da medula óssea. O mesmo efeito modulador
observado com macrófagos, pode ser observar após o tratamento da medula com e
sem co-cultura com macrofagos, onde o tratamento não intensifica o efeito de
desadesão dos macrófagos sobre as células da medula óssea. Assim, pode-se dizer
que Merc sol tem a capacidade de modular as respostas das células precursoras e
diferenciadas, de acordo com a situação. Essa modulação pelo medicamento pode
ser eficiente no tratamento em casos de imunossupressão e autoimunidade,
causados pela exposição ao Mercúrio, como descritas por Aronson (2006). Estes
resultados, também nos indicam que a ação do medicamento no organismo
independe dos macrófagos peritoneais, mas é modulado na presença desses.
70
6.2.2 Aconitum napellus
Para avaliar a capacidade de atividade biológica da diluição homeopática de
Aconitum napellus (Acon), neste trabalho foi utilizada a potência CH30 do
medicamento. Oliveira (2005) mostrou que o tratamento in vitro de macrófagos com
Acon CH30 aumenta o número de macrófagos com morfologia de ativados.
Macrófagos quando ativados, são altamente microbicidas e tumoricidas, podem
executar essa função de maneira direta envolvendo a liberação de produtos como
radicais de oxigênio e nitrogênio (KLIMP et al., 2002; HONG et al, 2005).
Liberação de NO, O
2
-
e H
2
O
2
Para verificar se Acon CH30 ativa as funções microbicidas e tumoricidas, foi
analisada a liberação de NO, H
2
O
2
e O
2
-
, após os tratamentos dos macrófagos in
vitro, in vitro com posterior interação com leveduras, e tratamento dos
camundongos.
Após tratamento in vitro dos macrófagos com Acon CH30, a análise do
sobrenadante da cultura mostrou aumento significativo na liberação de NO (FIGURA
17A) em relação ao controle (sem tratamento). O NO produzido por macrófagos
possui diversos papéis na imunidade: agente tóxico contra organismo infeccioso
(potencial antiviral e antimicrobial), potencial antitumoral ou imunoregulador
(COLEMAN, 2001; CADENAS; CADENAS, 2002; PALUDAN et al, 1999). O NO pode
ainda funcionar de uma maneira autóloga diminuindo a expressão da proteína iNOS
para prevenir autotoxicidade celular (HAN et al, 2001). Dessa maneira, o
tratamento in vitro dos macrófagos com Acon CH30 pode resultar em aumento de
diversas funções destas células, apenas devido a uma maior liberação do radical
NO. O tratamento dos camundongos com Acon CH 30 não alterou significativamente
a liberação de NO.
Células fagocíticas podem gerar ROS e RNS em condições fisiológicas ou
após estímulos como a fagocitose (HAN et al, 2001). Quando o macrófago realiza
fagocitose, ocorre ativação das enzimas iNOS e NOX (produção de NO e O
2
-
,
respectivamente), que começam a produzir grandes quantidades de espécies
reativas, e parte dessa produção de radicais é direcionada para dentro dos
fagossomos com a finalidade de destruição do patógeno (CADENAS; CADENAS,
71
2002; BROWN; GRIENDLING, 2009). De fato, quando se compara a liberação de
NO e O
2
-
após interação com leveduras e sem a interação, todos os grupos com
leveduras (controle e tratado) mostram aumento na liberação desses radicais.
No entanto, após o tratamento in vitro dos macrófagos com Acon CH30 e
posterior interação com leveduras a liberação de NO e O
2
-
no sobrenadante da
cultura foi maior do que no controle (sem tratamento e com leveduras) (FIGURAS
17B e 18A , respectivamente).
Dessa maneira, podemos sugerir que com a fagocitose, Acon CH30 direcione
uma maior quantidade de NO e O
2
-
produzido para dentro dos fagossomos,
contribuindo para uma melhor eficácia da destruição dos patógenos. NO e ROS
podem interagir de diferentes maneiras e agir sinergisticamente causando
citotoxicidade. Em células que produzem ambos NO e O
2
-
num limite próximo de
difusão, eles podem reagir para formar peroxinitrito (ONOO
-
) dentro dos
fagossomos. Esse radical é um poderoso oxidante o qual é capaz de nitrar proteína,
enfraquecendo, desse modo, a atividade de diferentes enzimas mitocondriais e
levando a uma diminuição nos níveis de energia (CADENAS; CADENAS, 2002).
Como durante a fagocitose, Acon CH30 mostrou diminuir a liberação de NO e O
2
-
no
Figura 17A – (*) indica grupos com aumento significativo (P< 0.05) comparado ao controle de NO após
tratamento in vitro de macrófagos com Acon CH30 Figura 17B – (*) indica grupos com diminuição
significativa (P< 0.05) comparado ao controle após tratamento in vitro dos macrófagos seguido de
interação com leveduras. Ambos os cultivos por 72 horas. Todos os resultados são expressos como
media±erro padrão.
FIGURA 17 – LIBERAÇÃO DE NO POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO IN
VITRO COM ACON
17B
17A
72
sobrenadante, pode-se sugerir que o tratamento esteja promovendo uma destruição
do mais eficaz do microorganismo, via peroxinitrito.
Após tratamento Acon CH30 também induziu uma redução de O
2
-
liberado
pelos macrófagos, quando comparado ao controle (FIGURAS 18B e 18C).
É certo que o ânion superóxido produzido pode dismutar espontânea ou
enzimaticamente a H
2
O
2
(FORMAN; TORRES, 2001). Portanto, uma maior
quantidade de O
2
-
produzido por macrófagos com Acon pode estar sendo dismutada.
De fato, a liberação de H
2
O
2
liberado nestas células foi maior do que no controle.
(FIGURAS 19C e 19D), Assim pode-se sugerir que o medicamento esteja
favorecendo a formação de H
2
O
2
.
Como O
2
-
não é permeável a membrana celular, o
produto da atividade da NOX somente pode modular vias de sinais intracelulares,
uma vez que este seja convertido a H
2
O
2
, o qual pode difundir-se livremente através
das membranas. Este radical pode funcionar como segundo mensageiro dentro da
própria célula produtora, ativando vias de sinalização, como a do NF-κB, ou ainda
funcionar como sinalizador intercelular (LI; KARIN, 1999; RETH, 2002). Então,
tratamento dos camundongos com Acon CH30 estaria aumentando a sinalização
celular via a produção de H
2
O
2
. Uma vez que esse radical por si só, não tem grande
potencial destrutivo, H
2
O
2
. produzido e liberado por macrófagos ativados é
Figura 18A – Gráfico mostrando a diminuição significativa na liberação de O
2
-
quando comparado ao
controle (*) (P< 0.05) após tratamento in vitro dos macrófagos, cultivo por 48 horas seguido de
interação com leveduras. Figura 18B e 18C – Gráficos mostrando a diminuição significativa na
liberação de O
2
-
(após 15 e 30 min. de incubação, respectivamente) quando comparado ao controle
após tratamento in vivo. (*) (P< 0.05). Todos os resultados são expressos como media±erro padrão.
FIGURA 18 – LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO COM
ACON
18A
18C
ex vivo
18B
ex vivo
73
primeiramente proposto como ativador de macrófagos e linfócitos e não como
destruidor de microorganismos (RETH, 2002).
Apesar de tratamento dos camundongos com Acon CH30 estimular a liberação de
uma maior quantidade de H
2
O
2
pelos macrófagos, após o tratamento in vitro destas
células com posterior interação com levedura, o tratamento com Acon CH30 mostrou
diminuir significativamente a quantidade de H
2
O
2
liberada no sobrenadante da
cultura de macrófagos (FIGURA 19A e 19B).
Como a maior fonte de H
2
O
2
na célula vem da dismutação espontânea ou
enzimática de O
2
-
(VEAL et al., 2007) é esperado que em uma situação onde O
2
-
Figuras 19A e 19B – gráficos mostrando a diminuição significativa na liberação de H
2
O
2
(após os
tempos de 15 e 30 min.) quando comparado ao controle após tratamento in vitro dos macrófagos e
cultivo pór 48 horas seguido de interação com leveduras; (*) (P< 0.05). Figura 19C e 19D – gráficos
mostrando o aumento significativa na liberação de H
2
O
2
(após os tempos de 15 e 30 min.) quando
comparado ao controle após tratamento in vivo; (*) (P< 0.05). Todos os resultados são expressos
como media±erro padrão.
FIGURA 19 – LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO
COM ACON
19A
19B
19D
ex vivo
19C
ex vivo
74
esteja sendo utilizado para formar outro intermediário, ocorra uma diminuição na
produção de H
2
O
2
no sistema. Neste caso, macrófagos tratados com Acon CH30 e
interagidos com leveduras diminuíram a liberação de H
2
O
2
, porque, como dito
anteriormente, o O
2
-
produzido nestas células provavelmente esteja reagindo com
NO dentro dos fagossomos, formando ONOO
-
, radical com uma maior atividade
citotóxica.
O tratamento in vitro dos macrófagos com Acon CH30 não alterou
significativamente a liberação de H
2
O
2
e O
2
-
no sobrenadante da cultura (dados não
mostrados).
Com esses resultados, podemos sugerir que o tratamento com o
medicamento Acon CH30 modula a liberação de radicais de acordo com a prioridade
dos macrófagos. Diminuindo a sua liberação quando estes são requisitados na
destruição de patógenos ou liberados numa forma menos reativa para realizar
sinalização celular.
MEV de macrófagos em co-cultura
Após 96 horas, a membrana da placa de co-cultura foi retirada e processada
para MEV. A maioria dos macrófagos tratados com Acon CH30 mostrou morfologia
de ativado, diferente do controle, onde a maioria apresentou morfologia de residente
(FIGURA 20). Em 2005, Oliveira mostrou que o tratamento in vitro por 48h com Acon
CH30 ativou morfologicamente macrófagos peritoneais, aumentando a quantidade
de macrófagos ativados no grupo tratado. Macrófagos ativados podem secretar
diversas substâncias, como ROS, RNS, citocinas e fatores de crescimento, que
possuem vários efeitos sobre as demais células do organismo (GORDON, 2003).
75
MEV de macrófagos co-cultivados com medula óssea por 96 horas. A, C e E- macrófagos controle, A,
D e F - tratados com Acon CH30. Setas abertas = macrófagos residentes; setas fechadas =
macrófagos ativados; setas tracejadas = poros da membrana
FIGURA 20 – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DE MACRÓFAGOS
TRATADOS COM ACON CH30 EM CO-CULTURA
20B
20C
20D
20F
20A
20E
76
Imunofenotipagem das células da medula óssea
Após tratamento dos camundongos, a imunofenotipagem mostrou que o
tratamento com Acon CH 30 aumenta significativamente a expressão do marcador
CD45R na medula (FIGURA 21).
CD45R (B220) é uma das formas com alto peso molecular de uma série de
glicoproteínas transmembranas conhecidas como CD45, a qual é expressa em todas
as células linfóides. No entanto, CD45R é a primeira molécula específica de células
B expressa durante sua diferenciação, sendo atribuída como molécula marcadora de
centro de germinação de células B, e continua sendo expressa (em menor
quantidade) até a célula madura e ativada. CD45R esta relacionado com a
transdução de sinal na fase inicial de diferenciação das células B e sua proliferação
mediada por IL-4 (COFFMAN, 1982; HASEGAWA, et al., 1990; MONROE;
DORSHKIND, 2007).
Com esse resultado, pode-se dizer que este medicamento possui ação nas
células precursoras da linhagem de células B, podendo influenciar a imunidade inata
e adaptativa através do aumento destas células apresentadoras de antígeno.
(PARKIN; COHEN, 2001) Em 2005, Oliveira mostrou que o tratamento de
macrófagos peritoneais com Acon CH30 aumenta a liberação da citocina IL-4. Como
IL-4 esta envolvida na proliferação e na formação inicial das colônias de células B,
pode-se sugerir que Acon CH30 esteja estimulando a produção dessa citocina pelos
(*) aumentou significantivamente em relação ao controle (P< 0.05). Todos os resultados são
expressos como media±erro padrão.
FIGURA 21 – CD45R
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA APÓS TRATAMENTO
IN VIVO COM ACON
ex viv
o
77
macrófagos do camundongo e consequentemente, as células CD45R
+
em uma
maneira sistêmica, estimulando, provavelmente, uma resposta imunológica Th2.
Os demais marcadores da linhagem hematopoiética não foram alterados após
tratamento dos camundongos com Acon CH30.
CD11b
+
em células de medula óssea
O tratamento com Acon CH30 aumentou a expressão de CD11b
+
nas
células não aderentes do cultivo de medula óssea (FIGURA 22).
CD11b esta evolutivamente relacionada ao receptor integrina que medeia
adesão celular à matriz extracelular durante o desenvolvimento e reparo tecidual
(GEORGAKOPOULOS, et al., 2008). Nas CTHs CD11b é um dos primeiros
marcadores detectados durante a diferenciação de monócitos e granulócitos nos
estágios mielocíticos e monoblásticos (ARNAOUT, 1990; KISHIMOTO, et al., 1990,
YANG, et al., 2007). As CTHs para se diferenciarem precisam estar aderidas ao
estroma, diferentemente da proliferação (INABA, et al., 1992). Uma vez que o
tratamento das células da medula óssea com Acon CH30 aumentou a porcentagem
de células CD11b
+
não aderentes, é provável que o medicamento esteja
estimulando a proliferação das células. No entanto, outra possibilidade é que o
tratamento com Acon esteja estimulando a diferenciação de células mielóides. Em
cultura celular, depois de diferenciadas, algumas células, como granulócitos e
células dendríticas, se desprendem ficando no sobrenadante da cultura (INABA, et
(*) aumentou significantivamente em relação ao controle (P< 0.05). Todos os resultados são
expressos como media±erro padrão.
FIGURA 22 – CD11b
+
EM CÉLULAS NÃO ADERENTES DE MEDULA ÓSSEA
APÓS TRATAMENTO IN VITRO COM ACON
78
al., 1992). Para confirmar essa hipótese, marcadores específicos para células
dendríticas e granulócitos devem ser usados. Oliveira (2005) mostrou que Acon
CH30 aumenta a liberação da citocina IL-4 por macrófagos peritoneais de
camundongo, a qual estimula a expansão e o recrutamento de células mielóides
precoce (SNOECK, et al., 1996). Se Acon CH 30 possuir esse mesmo efeito sobre
os macrófagos do estroma medular, é possível que ele esteja estimulando a
diferenciação das células CD11b
+
por meio da produção de IL-4. Células-tronco
cultivadas com fatores de crescimento e diferenciação adequados, podem se
diferenciar em praticamente todos os tipos celulares sanguíneos. Em meio de cultura
contendo GM-CSF, por exemplo, um fator de crescimento para granulócitos e
monócitos produzidos por macrófagos, podem se diferenciar em células dendríticas,
na presença de IL-4 (BONTKES, et al., 2002; GORDON; TAYLOR, 2005). Assim,
Acon CH30 pode ter estimulado a proliferação de alguns tipos celulares presentes
no sobrenadante da cultura da medula e/ou a diferenciação das células CD11b+ em
células dendríticas.
Células dendríticas são células que ligam o sistema imunológico inato ao
adaptativo, devido à capacidade de reconhecer o antígeno, processá-lo e apresentá-
lo aos linfócitos T (VARIN; GORDON, 2009; MELLMAN, 2005). Caso o medicamento
esteja estimulando a diferenciação de células dendríticas, ele pode ser muito útil,
pois as técnicas usadas para diferenciar e estimular células dendríticas são
demoradas e caras (SMITS, et al., 2009). As células dendríticas são células
consideradas o adjuvante o mais natural para a imunoterapia em doenças malignas,
pois são extremamente potentes para estimularem células T (HÁJEK; BUTCH, 2000;
YI, 2003).
O marcador CD11b não foi alterado significativamente nas células da medula
óssea co-cultivadas com macrófagos. No entanto, quando se comparam as células
não aderentes da co-cultura e do cultivo de medula, pode-se observar uma
quantidade próxima entre as porcentagens de marcação CD11b
+
(FIGURA 23).
Sendo que estas células da co-cultura, quando comparadas ao controle do cultivo da
medula, têm também uma maior porcentagem significativa.. Aparentemente, a
presença dos macrófagos induz uma proliferação celular.
79
Apesar de os macrófagos da co-cultura com Acon CH30 terem sido
morfologicamente ativados, a marcação CD11b+ das células da medula da co-
cultura praticamente não sofreu alteração quando comparado ao seu controle. No
entanto, quando as células da medula óssea receberam Acon CH30, a porcentagem
de marcação aumentou nas células não aderentes, ficando próxima á porcentagem
de marcação presente no sobrenadante da co-cultura. Assim, podemos sugerir que
o tratamento da medula óssea com Acon CH30 possui o mesmo efeito estimulante
sobre essas células que os macrófagos. No entanto, as substâncias liberadas pelos
macrófagos ativados com Acon CH30 não alteram o marcador CD11b.
Os estudos aqui descritos com o medicamento Acon CH30 mostram sua
ação sobre células diferenciadas (neste caso, macrófagos) e células precursoras do
sistema imunológico. Acon CH30 ativou macrófagos modulando a produção de
espécies reativas de acordo com a necessidade dessas células, estimulou na
medula óssea de camundongos tratados, o aumento de marcadores específicos da
linhagem de células B e da linhagem mielocítica in vitro, independente da presença
de macrófagos. Assim, com esses resultados podemos dizer que Acon CH30 possui
diferentes resultados com diferentes sistemas, influenciado ou não pela presença de
macrófagos.
(*) aumentou significativamente (P< 0.05). Todos os resultados são expressos como media±erro
padrão.
FIGURA 23 – CD11b
+
DE CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA NÃO ADERENTES
EM CULTURA E CO-CULTURA
80
6.2.3 Atropa Belladonna (Beladona)
Homeopaticamente, Beladona também é muito utilizada em processos
inflamatórios, aumentando o sistema imunitário (PEDALINO et al., 2004). Dessa
forma, nosso modelo experimental com macrófagos poderá ser útil para avaliar a
ação desse medicamento. Neste trabalho, foram utilizadas as potências CH6, 30 e
200 para a análise dos radicais in vitro e CH200 para tratamento dos
camundongos, in vitro da medula óssea e co-cultura. Muitos tipos celulares
envolvidos na imunidade e inflamação, como macrófagos, sintetizam óxido nítrico.
(CADENAS; CADENAS, 2002). Assim, este foi o nosso primeiro parâmetro utilizado
para analisar a ativação dos macrófagos peritoneais por Bell.
Liberação de NO, O
2
-
e H
2
O
2
No sistema imunológico, NO é gerado durante respostas imunológicos e
inflamatórias, podendo funcionar como agente tóxico em direção a organismos
infecciosos, indutor ou supressor da apoptose, ou imunoregulador. (COLEMAN,
2001) Após o tratamento in vitro com Bell, os grupos de macrófagos tratados com
Bell CH6 e 200 demonstraram um aumento significativo na liberação de NO no
sobrenadante da cultura (FIGURA 24 ).
Figura 24A e 24B – (*) indicam grupos com aumento significante (P< 0.05) na liberação de NO,
quando comparado ao controle, após tratamento in vitro com CH6 e CH12, respectivamente, e cultivo
por 72 horas. Todos os resultados são expressos como media±erro padrão.
FIGURA 24 – LIBERAÇÃO DE NO POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO IN
VITRO COM BELL
24B
24A
81
O tratamento com Bell CH30 não alterou a liberação de NO. A liberação de
NO também não foi alterada após os tratamentos in vitro com posterior interação
com leveduras e ex vivo com nenhuma das potências (dados não mostrados).
Uma vez que Bell CH6 e 200 ativam a liberação desse radical in vitro, vários
parâmetros dos macrófagos podem estar sendo alterados. NO pode reagir com O
2
-
,
NO
2
e metais de transição, e cada um dos produtos gerados tem suas
características fisiológicas. O
2
-
produzido pela redução do O
2
tem um elétron
desemparelhado que pode rapidamente combinar com o elétron desemparelhado no
NO, formando ONOO
-
(GRISHAN, et al., 1999). Esse tipo de reação, comum em
células fagocíticas e ativadas, pode estar acentuada em macrófagos tratados com
Bell CH6 e CH200, pois a liberação do superóxido no sobrenadante da cultura
diminuiu após os tratamentos, quando comparada ao controle (FIGURA 25A e 25C,
respectivamente).
Ao analisarmos os gráficos de liberação de NO e O
2
-
, podemos verificar que a
quantidade de NO liberado no controle é bem menor que a de O
2
-
. Assim, podemos
sugerir que os tratamentos induzem um aumento de NO para que esses possam
reagir com o O
2
-
liberado, “seqüestrando-o” do meio. ONOO
-
formado dessa reação
reage com biomoléculas, como proteínas, lipídios e DNA, resultando em alterações
enzimáticas e em vias de sinalização (DENICOLA; RADI, 2005), além de ser
sugerido como um detoxificante por ser uma via de remover O
2
-
(GRISHAN, et al.,
1999).
Gráficos 25A, 25B e 25C mostrando a diminuição significativa na liberação de O
2
-
quando comparado
ao controle (*) (P< 0.05), após tratamento in vitro dos macrófagos com as potências CH6, CH30 e
CH200, respectivamente e cultivo por 48 horas. Todos os resultados são expressos como media±erro
padrão.
FIGURA 25 – LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO
COM
BELL
25
C
25
B
25
A
82
Após o tratamento in vitro dos macrófagos com Bell CH30 a liberação de O
2
-
também foi diminuída no sobrenadante dos macrófagos (FIGURA 25B). No entanto,
essa diminuição provavelmente não envolve a formação de ONOO
-
, pois não houve
alteração de NO quando macrófagos foram tratados com Bell CH30. Após o
tratamento in vitro com posterior interação com leveduras, esse efeito de redução do
O
2
-
liberado também foi observado após o tratamento com CH30 (FIGURA 26). A
enzima responsável pela produção de superóxido (NOX2) é ativa com o estímulo da
fagocitose. Esse processo faz com que a produção desse radical seja direcionada
para o interior das vesículas onde está o patógeno. De fato, quando se comparam
os experimentos com e sem leveduras, pode-se verificar uma maior quantidade de
O
2
-
liberado por todos os grupos, quando o macrófago realiza a interação. Assim,
podemos sugerir que Bell CH30 direciona uma parte maior do que a do controle de
O
2
-
produzido para dentro dos fagossomos, com provável aumento no interior das
vesículas, colaborando para uma defesa mais eficaz.
Resultado semelhante foi descrito com neutrófilos estimulados com zimozan os
quais tiveram uma diminuição na produção de radicais livres de oxigênio após
tratamentos com Bell (BELLAVITE, et al., 2006). Uma vez que H
2
O
2
origina-se da
dismutação espontânea ou enzimática de O
2
-
, como conseqüência da diminuição de
O
2
-
a liberação de H
2
O
2
após a interação com leveduras e tratamento com o
Gráfico mostrando a diminuição significativa na liberação de O
2
-
quando comparado ao controle, após
tratamento in vitro dos macrófagos seguido de interação com leveduras; (*) (P< 0.05). Todos os
resultados são expressos como media±erro padrão.
FIGURA 26 – LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO
COM BELL
83
medicamento Bell CH30 também foi diminuída (FIGURAS 27C e 27D). Os
medicamentos Bell CH6 e 200 também mostraram reduzir a liberação de H
2
O
2
após
a interação com leveduras (FIGURA S 27A e 27B, 27E e 27F), sem, no entanto,
diminuir a liberação de O
2
-
.
Gráficos mostrando a diminuição significativa na liberação de H
2
O
2
(15 e 30 min.) quando comparado
ao controle após tratamento in vitro dos macrófagos seguido de interação com leveduras com as
potências CH6 (A e B), CH30 (C e D), CH200 (E e F); (*) (P< 0.05). Todos os resultados são expressos
como media±erro padrão.
FIGURA 27 – LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO
COM BELL.
27A
27B
27C
27D
27E
27F
84
Dessa forma, podemos concluir que a redução de H
2
O
2
não foi uma conseqüência
da redução da sua fonte, mas do seu provável uso para a defesa da célula. De fato,
H
2
O
2
juntamente com íons cloreto pode ser convertido em ácido hipocloroso (HOCl),
pela mieloperoxidase. HOCl é um oxidante antimicrobicida altamente eficaz
(BROWN; GRIENDLING, 2009). Assim, o H
2
O
2
produzido nos macrófagos tratados
com Merc sol pode estar sendo convertido ao agente bactericida HOCl no
fagossomo, aumentado a destruição e conseqüentemente diminuindo a liberação
extracelular desse reativo no sobrenadante da cultura. Quando comparamos os
experimentos com e sem leveduras, podemos observar uma diminuição na liberação
de H
2
O
2
por todos os grupos, sendo essa diminuição maior nos grupos tratados.
Dessa forma, os medicamentos aumentariam a eficácia da destruição do
microorganismo, direcionando uma maior parte da produção do radical para dentro
do fagossomo, sem ser necessária uma maior produção, evitando, dessa forma, um
estresse oxidativo na célula. A liberação de H
2
O
2
pode estar diminuída após os
tratamentos com Bell CH6, 30 e 200 devido também a uma maior difusão desse
radical para o interior da célula. Como o H
2
O
2
pode difundir-se livremente através
das membranas, este radical pode funcionar como segundo mensageiro dentro da
própria célula produtora, ativando vias de sinalização, como a do NF-κB (LI; KARIN,
1999; RETH, 2002). A liberação de H
2
O
2
após os tratamentos in vitro e em análise
ex vivo com Bell não mostrou diferença significativa na liberação (dados não
mostrados). Um esquema sumarizando os efeitos in vitro dos tratamentos com Bell
CH6, 30 e 200 sobre a liberação dos radicais estão apresentados nas figuras 28.e
29.
85
- diminui a liberação; possível aumento na difusão de H
2
O
2
para dentro da célula.
FIGURA 28 – EFEITOS DO TRATAMENTO COM BELL CH30 IN VITRO E IN
VITRO COM POSTERIOR INTERAÇÃO COM LEVEDURA
Macrófago
residente
Macrófago
ativado
Macrófago
ativado com
levedura
levedura
N
NO
iNOS
NOX2 O
2
-
O
2
-
H
2
O
2
O
2
-
NOX2
+
N
NO
iNOS
NOX2
O
2
-
O
2
-
H
2
O
2
N
Bell
Macrófago
residente
Macrófago
ativado
Macrófago
ativado com
levedura
N
HOCL
-
MPO
H
2
O
2
NOX2
O
2
-
Cl
-
NOX2 O
2
-
O
2
-
H
2
O
2
NO
iNOS
N
O
2
-
NOX2
ONOO
-
+
NO
iNOS
NOX2
O
2
-
O
2
-
H
2
O
2
NO
iNOS
N
Bell
+
levedura
- aumentou a liberação; - diminui a liberação; possível aumento na difusão de H
2
O
2
para o interior da célula. - reação provável
FIGURA 29 – EFEITOS DO TRATAMENTO COM BELL CH6 E 200 IN VITRO E IN
VITRO COM POSTERIOR INTERAÇÃO COM LEVEDURA
86
tratamento dos camundongos, foi realizado apenas com Bell CH200. A análise da
liberação de espécies reativas pelos macrófagos mostrou que Bell CH200 possui
efeito apenas na liberação O
2
-
(FIGURA 30). Os demais radicais não foram alterados
significativamente por esse tratamento.
O primeiro produto da redução do O
2
é o O
2
-
, o qual é liberado fora da célula ou
dentro de fagossomos. O
2
-
além de seu papel na defesa do organismo, é
responsável pela sinalização celular. Ele pode especificamente e reversivelmente
reagir com proteínas, alterando sua atividade, localização e meia-via (BROWN;
GRIENDLING, 2009). Com o aumento na produção desse radical, podemos dizer
que o tratamento com Bell CH200 atua na principal fonte de O
2
-
das células
fagocíticas, enzima NOX2. A defesa é a função chave da NOX2. Apesar do O
2
-
ser a
espécie reativa produzida por NOX2, o modo como ele atua na morte de parasitas
não esta bem definido. Suas ações tóxicas aparentemente ficam restritas a ambiente
de baixo pH, ou quando se associa a outros reativos, como NO, ou sofre a
dismutação para H
2
O
2
, onde esse se associa com outros componentes tornando-se
altamente eficaz contra parasitas. No entanto, a ativação da NOX2 pode ter outros
papéis tão importantes quanto à defesa do organismo. Uma vez que ROS tem sido
relacionados com doenças inflamatórias, parece controverso associar a ativação
dessa enzima com propriedades antiinflamatórias. Mas diversos estudos têm
Figuras 30A e 30B – gráficos mostrando aumento significativo na liberação de O
2
-
(após 15 e 30 min.
de incubação) quando comparado ao controle após tratamento in vivo (*) (P< 0.05). Todos os
resultados são expressos como media±erro padrão.
FIGURA 30 – LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO IN
VIVO COM BELL
30A
30B
87
descoberto essa nova função (BEDARD; KRAUSE, 2007). Estudos onde a ativação
da NOX2 e consequente produção de ROS controla ou diminui a severidade de
artrite reumatóide, por exemplo, por inibir a ativação de células T envolvidas na
resposta inflamatória, parecem ser promissor para o tratamento dessa doença
(OLOFSSON, et al., 2002; 2007). Importante função da NOX2 ativada pode ser
observado também em experimental infecção pulmonar pelo vírus da influenza, onde
camundongos deficientes dessa enzima possuem elevado infiltrado inflamatório e
liberação acelerada do vírus (BEDARD; KRAUSE, 2007). Assim, a ativação da
NOX2 pelo tratamento dos camundongos com Bell CH200 poderia ser útil no
tratamento de reações hiperinflamatórias, como nestes casos acimas. De fato,
desde Toledo (1910) tem-se relatos de que Bell é utilizada para o tratamento de
gripes e reumatismo.
MEV de macrófagos em co-cultura
Após 96 horas, a membrana da placa de co-cultura foi retirada e processada
para MEV. Os macrófagos tratados com Bell mostram uma morfologia de ativado,
diferente do controle, o qual apresentou morfologia de residente (FIGURA 31). De
fato, tratamento in vitro por 48h com Bell CH200 ativou morfologicamente
macrófagos (OLIVEIRA, 2005), aumentando de 35, 40% no controle para 47,0 % no
tratado.
88
MEV de macrófagos co-cultivados com medula óssea por 96 horas. A, C e E- macrófagos controle, B
D e F - tratados com Bell CH200 Setas abertas= macrófagos residentes; macrófagos fechadas=
ativados; setas tracejadas = poros da membrana
FIGURA 31 – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DE MACRÓFAGOS
TRATADOS COM
BELL CH200
EM CO
-
CULTURA
31F
31E
31C
31B
31C
31D
89
Imunofenotipagem das células da medula óssea
Após o tratamento dos camundongos, a medula óssea foi processada e
incubada com anticorpos para a imunofenotipagem. A análise em citometria de fluxo
mostrou que o tratamento com Bell CH200 diminuiu a expressão do marcador Ly-6G
e aumentou CD45R (FIGURA 32). Os demais marcadores não mostraram alteração
significativa na porcentagem de marcação.
O antígeno Ly-6G, anteriormente nomeado como Gr-1, é um antígeno de
diferenciação mielóide. A expressão de Ly-6G aumenta durante a diferenciação de
granulócitos com alta expressão sobre granulócitos maduros. Sua expressão é
transital durante diferenciação de monócitos, mas não é detectável em monócitos
maduros. Ly-6G não é expresso em células progenitoras hematopoiéticas
(FLEMING, et al., 1993; HESTDAL, et al., 1991). Uma central característica da
resposta inata é a ativação e o recrutamento de neutrófilos ao local da infecção para
eliminar o patógeno. No início da infecção, macrófagos presentes no local e
estimulados por fagocitose ou por outros mecanismos, secretam substâncias, como
citocinas e os fatores de crescimento de granulócitos-monócitos (GM-CSF) e
granulócitos (G-CSF), que estimula a produção e maturação de neutrófilos nos
precursores mielóides da medula e acelera sua liberação na corrente sanguínea
(DALE et al., 2008; PARKIN; COHEN, 2001). Em 2004, Pedalino et al.,
Gráfico 32A (*) indica diminuição significativa e gráfico 32B (*) indica aumento signficativo em
relação ao controle (P< 0.05). Todos os resultados são expressos como media±erro padrão.
FIGURA 32 – Ly-6G
+
E CD45R
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA APÓS
TRATAMENTO IN VIVO COM BELL
32A
ex vivo
ex vivo
32B
ex vivo
90
demonstraram que tratamento em água de beber com um mix comercial de
Belladonna aumentou a porcentagem de polimorfonuclear no lavado peritoneal de
camundongo, além de aumentar a sua atividade, após sofrerem peritonite induzida.
Assim, podemos sugerir que o tratamento com Bell CH200 estimula a diferenciação
e recrutamento de neutrófilos da medula óssea, para os locais de defesa, diminuindo
na sua detecção. Esse recrutamento dos neutrófilos pode resultar em defesa mais
eficaz.
A imunofenotipagem da medula óssea revelou que o tratamento com Bell
CH 200 aumenta significativamente o marcador CD45R. CD45R (B220) é uma das
formas com alto peso molecular de uma série de glicoproteínas transmembranas
conhecidas como CD45, a qual é expressa em todas as células linfóides. No
entanto, CD45R é a primeira molécula específica de células B expressa durante a
diferenciação. É atribuída como molécula marcadora de centro de germinação de
células B e continua sendo expressa (em menor quantidade) até a célula B madura
e ativada. (COFFMAN, 1982; HASEGAWA, et al., 1990; MONROE; DORSHKIND,
2007). Estimulando a expressão desse marcador, Bell CH200 pode estar
contribuindo para a diferenciação das células B e consequente estímulo da resposta
imunológica adaptativa. Esses resultados de ação de Bell CH200 mostram um
provável efeito sobre as células mais diferenciadas, uma vez que esses dois
marcadores tem maior expressão em células já no final de diferenciação.
CD11b
+
em células de medula óssea
Após o tratamento com Bell CH200 do co-cultivo de células de medula óssea
não houve diferença significativa na detecção dos marcadores CD11b (dados não
mostrados).
A tintura mãe da Atropa Belladonna, preparada homeopaticamente, é muito usada
na homeopatia em processos com características de inflamatórios. Assim,
objetivamos avaliar as ações de diluições usadas na clinica em macrófagos e
posteriormente em células de medula óssea. Bell CH6, e 200 mostraram possuir
efeito estimulatório in vitro sobre a liberação de NO, o qual pode ser usado tanto na
defesa, quanto na sinalização celular. Esta indução sobre esse radical in vitro mostra
que além de ativar morfologicamente macrófagos, Bell possui ação sobre as funções
efetoras dos macrófagos. Uma vez que Bell CH6 e 200 exerceram um efeito in vitro
91
de redução do O
2
-
liberado nos macrófagos ativados pelo tratamento, pode-se
sugerir que esse radical produzido esta reagindo com o NO formado, produzindo
ONOO
-
, o qual pode atuar tanto na morte de parasitas como sinalizador e um
detoxificante (GRISHAN, et al., 1999).
Essa provável reação e formação de
peróxinitrito não acontecem com o tratamento por Bell CH30, pois este medicamento
não alterou a liberação de NO. Como não houve aumento na liberação de H
2
O
2
, este
medicamento deve estar atuando na redução de O
2
-
por ação na enzima NOX2 e
não na dismutação deste. Efeito na liberação de O
2
-
e H
2
O
2
por Bell CH30 também
pode ser observado após a interação de macrófagos com leveduras. Este
medicamento induziu uma diminuição na liberação desses radicais, provavelmente
por direcionar O
2
-
para o interior dos fagossomos, melhorando a eficácia da
destruição dos patógenos. Bell CH6 e 200 também mostraram reduzir a liberação de
H
2
O
2
após a interação com leveduras sem, no entanto, diminuir a liberação de O
2
-
.
Provavelmente a redução de H
2
O
2
não foi uma conseqüência da redução da sua
fonte, como com Bell CH30, mas do seu uso para a defesa da célula. Por exemplo,
H
2
O
2
juntamente com íons cloreto pode ser convertido em HOCl, poderoso
antimicrobicida (BROWN; GRIENDLING, 2009). De qualquer forma, as 3 potências
usadas de Bell parecem atuar no aumento das defesas dos macrófagos.
Diferentemente de todos os resultados mostrados in vitro, Bell CH200 mostrou
apenas ação sobre o aumento na liberação de O
2
-
. Dessa forma, este medicamento
pode estar atuando diretamente na ativação da enzima NOX2. A ativação dessa
enzima, aparentemente pode ter diversos benefícios, além da defesa do organismo.
Doenças com respostas hiperinflamatórias, onde aparece a inibição ou desregulação
dessa enzima, podem ter sua resolução com substâncias que sejam eficazes na sua
ativação (BEDARD; KRAUSE, 2007). De fato, o uso homeopático de Belladona já
vem sendo indicado em diversas doenças desse tipo, como artrite reumatóide.
Esses resultados com espécies reativas mostram as diferentes ações com diferentes
potências e a forma de administrá-las. O tratamento dos camundongos nos mostrou
ainda a capacidade da Bell CH200 diminuir Ly-6G+ e aumentar CD45R+ na medula
óssea. Essa alteração nos marcadores de células de origem mielóide e linfóide nos
mostram que Bell CH200 pode atuar estimulando e recrutando esses dois tipos
celulares, colaborando na defesa inata e adaptativa. A capacidade de Bell CH200
92
atuar em células B, macrófagos e neutrófilos nos mostra o poder de atuar nas
frentes de defesa do organismo, com capacidade de eliminar rapidamente o agente
agressor e ainda ativar a memória imunológica do organismo. A atividade efetora
antimicrobial dos fagócitos é crucial na defesa inata do hospedeiro. Como resultado
de uma origem comum macrófagos e neutrófilos compartilham diversas
funcionalidades, incluindo ávida fagocitose, comportamentos chaves sob condições
inflamatórias/infecciosas, e atividades antimicrobiais e imunomodulatórias. No
entanto, devido a conseqüências da especialização durante suas diferenciação,
macrófagos e neutrófilos adquirem distintas e complementares características que
dão origem a diferentes níveis de capacidades antimicrobiais e citotoxicidade e
diferentes localizações nos tecidos e tempo de vida. A combinação dessas
características complementares e sobrepostas dos dois fagócitos promove sua
cooperativa participação como efetores e moduladores da imunidade inata contra
infecções e como orquestradores da imunidade adaptativa. Nas atividades
antimicrobianas na imunidade inata, macrófagos e neutrófilos não são capazes de
substituir um ao outro. O uso por mamíferos de um sistema com dois dedicados
fagócitos trabalhando cooperativamente representa uma vantajosa estratégia de
ataque, que permite eficiente e seguro uso de poderosas, mas perigosas moléculas
de ataque (SILVA, 2010).
93
6.2.4 Arsenicum album
Arsenicum album é o medicamento preparado de forma homepática a partir
da tintura mãe do trióxido de arsênico. Em 2005, Oliveira mostrou que a potência
CH6 do Arsenicum album aumentava o número de macrófagos com características
de ativados quando comparado ao controle juntamente com a liberação da citocina
INF-γ. De fato, desde o trabalho de Mackaness em 1970, sa
be-se que as alterações
na fisiologia dos macrófagos em resposta a alguns sinais ambientais podem provi-
los de atividade antimicrobiana reforçada (MOSSER; EDWARDS, 2008). Assim, o
primeiro passo para estudar o efeito do Ars CH6 sobre macrófagos foi a análise da
liberação das espécies reativas.
Macrófagos peritoneais mostraram aumentar a liberação do NO após o
tratamento com Ars CH6 in vitro (FIGURA 33A). Esse primeiro resultado sugere que
Ars CH6 estaria atuando na via de produção desse radical, uma vez que a sua
detecção no sobrenadante foi maior que no controle. iNOS, a enzima responsável
pela produção do NO em macrófagos, é ativada por vários meios, como IFN-γ e LPS
e uma vez ativa passa a produzir NO por varias horas, dias ou mais tempo. Esse NO
produzido pode agir de inúmeras formas na célula e/ou no ambiente, que vão desde
a defesa tóxica do organismo contra patógenos e células tumorais a sinalização
celular (COLEMAN, 2001; KLIMP, et al., 2002). Assim Ars CH6 possuiria uma
provável ação sistêmica, via liberação de NO e IFN- γ, promovendo sinalização
c
elular em direção a uma resposta imunológica inflamatória, levando em conta que
essas duas moléculas são ativadoras de NF-κB (FORMAN; TORRES, 2001). O
processo de fagocitose/endocitose também ativa iNOS. De fato, no cultivo in vitro
com posterior interação com leveduras, a quantidade de NO liberado foi maior em
todos os grupos. No entanto, quando comparados os grupos com leveduras entre si,
aqueles tratados com Ars CH6 mostraram uma diminuição significativa em relação
ao controle (FIGURA 33B). Uma vez que a ativação da iNOS por fagocitose
aumenta a produção desse radical para dentro da vesícula fagocítica com a
finalidade de morte do patógeno, podemos considerar que o tratamento com Ars
CH6 estaria modulando o poder de defesa e destruição dos macrófagos, através do
estímulo de ações diretas e/ou indiretas do NO.
94
O NO por si só, é uma molécula com pouca reatividade química com moléculas
orgânicas e preferencialmente liga-se a metais, mas em células que produzem
ambos NO e O
2
-
, ele pode atravessar a membrana em direção a fonte de O
2
-
e
juntos formarem ONOO
-
(FORMAN; TORRES, 2001) o qual é um potente mediador
dos efeitos citotóxicos do NO (NATHAN; SHILOH, 2000) e também atuando em vias
de sinalização (DENICOLA; RADI, 2005).
Após o tratamento com Ars CH6, os macrófagos diminuiram a liberação de
O
2
-
(FIGURA 34A). Como Ars CH6 também atuou na liberação de NO, pode-se
sugerir uma provável ação desse medicamento no sistema imunológico via ONOO
-
,
produto resultante da junção desses dois radicais. Diminuição na liberação de O
2
-
foi
detectada também após o tratamento dos camundongos com Ars CH6 após os
tempos de 15 e 30 min. de incubação (FIGURA 34B e 34C ).
Gráfico 33A- (*) indicam grupos com aumento significativo na liberação de NO, quando comparado
ao controle, após tratamento in vitro com Ars CH6 e cultivo por 72 horas (P< 0.05). Gráfico 33B - (*)
indicam grupos com diminuição significante na liberação de NO, quando comparado ao controle,
após tratamento in vitro com Ars CH6, cultivo por 72 horas e posterior interação com leveduras (P<
0.05). Todos os resultados são expressos como media±erro padrão.
FIGURA 33 – LIBERAÇÃO DE NO POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO IN
VITRO COM ARS
33A
33B
95
Segundo LUNA, et al., 2010, crianças expostas a Arsênico através da água
de beber tiveram um aumento na liberação de O
2
-
em monócitos sanguíneos. Assim,
os nossos resultados podem colaborar com a sugestão de que diluições de Arsênico
podem ser usadas como provável antagonista de envenenamentos por essa
substância.
H
2
O
2
também teve uma menor liberação nos grupos de camundongos
tratados com Ars CH6, após o tempo de 30 min. de incubação (FIGURA 35). Uma
vez que o H
2
O
2
produzido na célula vem da dismutação de O
2
-
, a diminuição de
peróxido pode ser uma conseqüência da redução da sua fonte, induzida pelo Ars
CH6.
Gráficos mostrando a diminuição significativa na liberação de O
2
-
quando comparado ao controle
(*)após tratamento in vitro (34A) e in vivo após 15 e 30 min. de incubação(34B e 34C); (P< 0.05).
Todos os resultados são expressos como media±erro padrão.
FIGURA 34 – LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO
COM ARS
34A
34B
ex vivo
34C
ex vivo
96
MEV de macrófagos em co-cultura
Após 96 horas, a membrana da placa de co-cultura foi retirada e processada
para MEV. Os macrófagos tratados com Ars CH6 mostraram uma morfologia de
ativados, diferente do controle, os quais apresentaram morfologia de residentes
(FIGURA 36). Macrófagos ativados mostram grandes projeções da membrana
plasmática, aumento na capacidade de adesão e espalhamento no substrato,
aumento da fagocitose, aumento no número de fagolisossomos e vesículas
endocíticas e núcleo grande e eucromático (NORTH, 1978). De fato, tratamento in
vitro por 48h com Ars CH6 ativou morfologicamente macrófagos (OLIVEIRA, 2005).
Gráfico mostrando a diminuição significativa na liberação de H
2
O
2
quando comparado ao controle (*)
após tratamento in vivo após 30 min. de incubação; (P< 0.05). Todos os resultados são espressos
como media±erro padrão.
FIGURA 35 – LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO
COM ARS
ex vivo
97
MEV de macrófagos co-cultivados com medula óssea por 96 horas. A, C e D - macrófagos
controle, B, D e F - tratados com Ars CH6; Setas abertas = macrófagos residentes; macrófagos
fechadas = macrófagos ativados; seta tracejada = poros da membrana
FIGURA 36 – MICROSCOPIA ELETRONICA DE VARREDURA MORFOLOGIA
DE MACRÓFAGOS TRATADOS COM ARS EM CO-CULTURA
36B
36C
36D
36F
36A
36E
98
Imunofenotipagem das células da medula óssea
Após o tratamento dos camundongos com Ars CH6, as células da medula
óssea do sobrenadante foram retiradas e imunomarcadas. Após a análise em
citometria de fluxo, verificou-se que o tratamento com esse medicamento induziu um
aumento na fluorescência dos marcadores CD3ε e CD11c (FIGURA 37).
O polipeptídeo CD3ε, juntamente com o gama e beta e os heterodímeros do
receptor de célula T (TCR), formam o complexo T-CD3, o qual é expresso sobre
células T. O complexo tem um papel importante desde o reconhecimento do
antígeno á transdução de várias vias de sinal intracelular. Agregação do receptor
causa fosforilação de tirosinas com a cauda citoplasmática do complexo CD3
levando a ativação de genes seqüências e consequente proliferação da célula T. O
polipeptídeo epsilon desempenha um papel essencial no desenvolvimento de
células-T (DEJARNETTE et al., 1998; PARKIN; COHEN, 2001).
CD11c é a subunidade α do heterodímero αXβ2 (CD18/CD11c) da integrina
chamada p150,95 (HARRIS et al., 2000). Nas CTHs, p150,95 não esta presente nas
unidades formadoras de granulócitos e monócitos, mas são as primeiras detectadas
durante a diferenciação dessas células nos estágios mielocíticos e monoblásticos
(ARNAOUT, 1990; GEORGAKOPOULOS et al., 2008). Em células diferenciadas,
essa integrina aparece em monócito, neutrófilos e é altamente expressa em
linhagem de células dendríticas (ARNAOUT, 1990). Com esses resultados, pode-se
(*) aumentou significantemente em relação ao controle(P< 0.05). Todos os resultados são expressos
como media±erro padrão.
FIGURA 37 – CD3ε
+
E CD11c
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA APÓS
TRATAMENTO IN VIVO COM ARS
ex vivo
37A
ex vivo
37B
ex vivo
99
dizer Ars CH6 estimula a diferenciação e/ou proliferação das células T e de linhagem
mielocítica, após induzir um aumento na expressão dos marcadores CD11c e CD3ε.
Em Patterson et al. (2004), foi demonstrado que concentrações não tóxicas de
arsênico induzem alterações nas populações celulares do sistema imunológico,
resultando em mudanças funcionais.
As células dendríticas, as principais células marcadas com CD11c, são
importantes na iniciação e regulação da resposta imunológica contra uma variedade
de antígenos, incluindo alérgenos, agentes infecciosos e tumores. Elas residem na
maioria dos tecidos e são especializadas em capturar antígenos, migrar do tecido
aos órgãos linfóides e estimular linfócitos T. São apresentadoras profissionais de
antígeno, ou seja, são as únicas APCs capazes de estimular a primeira resposta
imunológica. A primeira ativação de células T “naive” antígeno-específica depende
de uma “conversa cruzada” com células dendríticas, envolvendo receptores TCR e
MHCs, que induz a ativação, proliferação e diferenciação em células T efetoras
antígeno-específicas (CLARK, et al., 2000; STEINBRINK, et al., 2009) Dessa forma,
Ars CH6 alterando células T e células dendríticas, estaria atuando nos dois pontos
chaves da resposta imunológica inata, adaptativa. Alguns estudos têm demonstrado
que o crescimento tumoral causa expansão exagerada de células mielóides imaturas
e consequentemente indiferenciação de células apresentadoras de antígeno, como
células dendríticas, fica comprometida. A ausência das células capazes de ativar a
célula T “naive” e a alta produção de espécies reativas inibem a proliferação de
células T, causando uma imunossupressão no organismo. Uma vez que a produção
dessas espécies reativas, especialmente H
2
O
2
é inibida, as células mielóides
conseguem terminar sua diferenciação (KUSMARTSEV; GABRILOVICH, 2003)
Assim, pode-se sugerir que Ars CH6 seria útil no tratamento da imunossupressão
causada pelo câncer, uma vez que além de estimular a diferenciação das células
mais afetadas, diminui a liberação de espécies reativas.
CD11b
+
em células de medula óssea
O tratamento in vitro das células da medula óssea com Ars CH6 não alterou
a expressão do marcador CD11b . No entanto, o tratamento dos macrófagos em co-
cultura com medula óssea, induziu um aumento na expressão desse marcador nas
células aderentes da medula (FIGURA 38).
100
CD11b esta evolutivamente relacionadas aos receptores integrinas que medeiam
adesão celular à matriz extracelular durante o desenvolvimento e reparo tecidual.
(GEORGAKOPOULOS et al., 2008). Nas CTHs não esta presente nas unidades
formadoras de granulócitos e monócitos, mas é um dos primeiros marcadores
detectados durante a diferenciação de monócitos e granulócitos nos estágios
mielocíticos e monoblásticos (ARNAOUT, 1990; KISHIMOTO et al., 1990, YANG et
al., 2007). O aumento na expressão desse marcador nas células aderentes permite
inferir que o tratamento com Ars CH6 induz adesão das células da linhagem
mielocítica para provável diferenciação. As CTHs para se diferenciarem precisam
estar aderidas ao estroma. Em cultura celular, depois de diferenciadas, algumas
FIGURA 38 - CD11b
+
EM CÉLULAS ADERENTES DE MEDULA ÓSSEA APÓS
CO-CULTURA COM MACRÓFAGOS E TRATAMENTO COM ARS
Cd11b com ficoeritrina (vermelho). Núcleo com DAPI (azul). Detecção em microscopia confocal. 38B-
grupo controle; 38C – grupo tratado com Ars CH6. Aumento de 40X; Barra: 10 µm
38A
(*) aumentou significantemente em relação ao controle(P< 0.05). Todos os resultados são
expressos como media±erro padrão.
B
38B
38C
101
células, como granulócitos e células dendríticas, se desprendem ficando no
sobrenadante da cultura. Outras, como monócitos, ficam fortemente aderidas
(INABA, et al., 1992). Assim, Ars CH6 estaria promovendo uma diferenciação de
toda linhagem mielocítica com ênfase em monócitos de uma forma dependente da
presença de macrófagos.
Um dos maiores mecanismos que conferem malignidade as células é a
alteração da adesão das células á matriz estromal. As células mielóides escapam da
regulação negativa do estroma, se proliferando desreguladamente. Alguns agentes
terapêuticos com IFN-α são usados para reverter o efeito da adesão, o qual
está
envolvido com a integrina β1 (DEININGER, et al., 2000). Compostos arsenicais têm
sido usados para tratar vários tipos de leucemia. Trióxido de arsênico é efetivo em
leucemia promielocítica aguda e é emergente no tratamento de mielomas múltiplos
(ARONSON, 2006; LU, et al., 2007). No entanto, diversos efeitos colaterais são
encontrados, com pele extremamente seca, náuseas, dermatites, psoríases,
neoplasias, leucocitoses, etc. (ARONSON, 2006). A leucemia mielóide crônica
(LMC) é caracterizada pela medula robusta e produção de células mielóides
extramedular. DEININGER, et al., 2000 De acordo com a literatura e os nossos
resultados, Ars CH6 pode ser um provável tratamento coadjuvante no tratamento de
LMC, uma vez que atuou sobre os receptores CD11b e CD11c na medula óssea,
tanto ex vivo quanto em co-cultura. Particularmente nessa técnica, mostrou
aumentar a adesão destas células e conseqüente diferenciação, uma vez que a
detecção do marcador CD11b foi maior nas células aderentes. A importância da
adesão mediando inibição da proliferação fica claro quando se examina a
malignidade das células-tronco hematopoiéticas, leucemia mielóide crônica. LMC é
caracterizada por um defeito na adesão dos progenitores ao estroma da medula
óssea e prematura liberação dos progenitores malignos para a circulação periférica
(HURLEY et al., 1995). A porcentagem na marcação do CD11b+ nas células não
aderentes do sobrenadante da medula em co-cultura tratadas com Ars CH6, não
tiveram diferenças significativas quando comparadas ao seu controle (dados não
mostrados). No entanto, quando se compara as células não aderentes do tratamento
in vitro da medula óssea com o sobrenadante da co-cultura, observa-se um maior
quantidade de células CD11b
+
. Isso demonstra o fator dependente da presença dos
macrófagos na alteração do marcador CD11b (FIGURA 39).
102
Os resultados desse trabalho com Ars CH6 descrevem a sua ação sobre
macrófagos peritoneais e células da medula óssea. A ativação dos macrófagos,
demonstrada pelo aumento do NO, ativação morfológica (dados deste trabalho e de
OLIVEIRA, 2005), de INF-γ (OLIVEIRA, 2005) juntamente com os dados da ação do
Ars CH6 sobre as células da medula óssea (aumento de expressão de CD3, CD11c,
CD11b nas células aderentes) e ainda informações da literatura, nos dão suporte
para dizer que Ars CH6 pode ser promissor no tratamento de doenças malignas
como mielomas. Corroborando com essa hipótese temos ainda a redução da
liberação de espécies reativas, as quais em quantidade exarcebada, contribuem
para a propagação das células tumorais (KUSMARTSEV; GABRILOVICH, 2003).
Depois da terapia convencional, que consiste de quimioterapia, com ou sem
transplante de células-tronco, doenças tanto reincidente como refratárias encurtam a
sobrevivência de pacientes com leucemia mielóide aguda. Portanto, as opções de
tratamento adicionais ou complementares são urgentemente necessárias,
especialmente para combater células residuais (HÁJEK; BUTCH, 2000; YI, 2003;
SMITS, et al., 2009).
(*) aumentou significativamente (P< 0.05). Todos os resultados são expressos como media±erro
padrão.
FIGURA 39 – CD11b
+
EM CÉLULAS NÃO ADERENTE EM CULTURA E CO-
CULTURA.
103
6.2.5 Lachesis muta
Evidências da atividade biológica de altas diluições do veneno da Lachesis
muta, nas potências CH12 e 200, foram analisadas sobre macrófagos e células da
medula óssea. A potência CH12 foi utilizada somente nos experimentos in vitro com
macrófagos. Resultados prévios com estes medicamentos mostraram que Lach CH
12 e 200 ativam morfologicamente macrófagos (OLIVEIRA, 2005).
Liberação de NO, O
2
-
e H
2
O
2
Após tratamento in vitro com Lach, tanto CH12 quanto CH 200 aumentaram a
liberação de NO no sobrenadante da cultura (FIGURA 40A e B, respectivamente). O
mesmo efeito pode ser também observado após o tratamento dos camundongos
com Lach CH200 (FIGURA 40C.) sugerindo assim, uma provável estimulação das
funções efetoras dos macrófagos por Lach. De fato, NORTH, em 1978, mostrou que
morfologia celular varia consideravelmente com diferentes estados funcionais.
Quando os macrófagos passam do estado residente para o estado ativado, eles
aumentam a sua proliferação, modificam sua morfologia celular, adquirem
propriedade de se espraiar, aumentam a fagocitose e a produção de espécies
reativas, como o NO. Em uma ativação clássica, a transcrição da iNOS induzida por
IFN-γ, estimula a produção de NO na célula, de uma maneria autócrina e parácrina
(GESSANI; BELARDELLI, 1998). Neste caso, esta pode ser a via usada por Lach
para estimular a liberação de NO, uma vez que OLIVEIRA, 2005 mostrou que Lach
CH200 aumentou a liberação de IFN-γ em macrófagos tratados in vitro. O NO possui
várias ações, como potenciais antivirais, antitumorais e antimicrobial (WEIGER;
BRÜNE, 2008; PALUDAN, et al., 1999). Assim, resolvemos analisar o efeito da
liberação desta espécie após estimular o sistema de defesa fagocítico, usando
leveduras. Após o cultivo in vitro dos macrófagos por 48 horas e posterior interação
com as leveduras, Lach CH 200 diminuiu a liberação de NO quando comparado ao
seu controle com levedura (FIGURA 40D). Lach CH12 não alterou a liberação após
a interação.
104
Quando acontece a fagocitose, a enzima iNOS desvia a produção de NO para
dentro dos fagossomos para destruição do microorganismo. De fato, quando
comparamos os grupos sem leveduras e com leveduras, podemos notar que há uma
maior liberação de NO quando macrófago interage com o fungo. No entanto, quando
os macrófagos são tratados com Lach CH200, há um provável direcionamento
dessa produção para dentro dos fagossomos, de forma que a maior concentração
de NO contribua para uma defesa mais eficaz da célula.
Após os tratamentos dos camundpngos e dos macrófagos com Lach CH200
pode-se quantificar uma alteração da liberação de O
2
-
pelos macrófagos. Quando
O
2
-
é produzido e liberado da célula, o método mais confiável para sua mensuração
Gráfico 40A, 40B e 40D - (*) indicam grupos com aumento significante na liberação de NO, quando
comparado ao controle, após tratamento in vitro com Lach CH 12 e 200 (A e B, respectivamente) e in
vivo com Lach CH200 (D). Gráfico C- (*) indica diminuição significativa na liberação de NO, quando
comparado ao controle, após tratamento in vitro com Lach CH 200 e posterior interação com
leveduras. (P< 0.05); Todos os resultados são expressos como media±erro padrão.
FIGURA 40 – LIBERAÇÃO DE NO POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO IN
VITRO COM LACH
40A 40B
40C
40D
ex vivo
105
é o da redução do citocromo c (FORMAN; TORRES, 2001). Após essa análise, Lach
CH12 não mostrou alteração na liberação desses radicais (dados não mostrados).
No entanto, Lach CH200 diminui O
2
-
após ser administrado aos camundongos e
tratamento in vitro dos macrófagos (FIGURA 41).
A superóxido desmutase (SOD) é conhecida como o sistema protetor
antioxidante celular mais potente contra os efeitos do O
2
-
. Entretanto, sabe-se que
sob condições onde a produção de NO está aumentada, o NO compete
eficientemente com a SOD pelo O
2
-
, formando o ONOO
-
(VIRAG et al., 2003). Como
NO é uma pequena molécula, ela pode atravessar a membrana de vesículas,
migrando para perto da fonte de O
2
-
(JONES et al., 2000). A proximidade desses
dois radicais faz com que aconteça uma reação controlada entre NO e O
2
-
,
produzindo intermediários, como peroxinitrito (ONOO
-
) (WEIGER; BRÜNE, 2008).
Como Lach CH 200 aumentou a liberação de NO e diminuiu a liberação de O
2
-
após
os tratamentos, podemos sugerir Lach estaria ativando os mecanismos de produção
ONOO
-
dentro de vesículas dos macrófagos. A formação de ONOO- a partir de O
2
-
NO deve ser útil em algumas situações. Além da destruição de patógenos, ONOO
-
também pode atuar, em algumas circunstâncias, como uma defesa anti-oxidante por
prevenir um aumento na concentração de O
2
-
and H
2
O
2
(MURPHY, et al., 1998,
SZABÓ, 2003, LINARES, et al., 2001), e de prevenir um provável efeito inibitório da
proliferação de células T pelo NO (VAN DER VEEN, 2001).
Gráficos mostrando a diminuição significativa na liberação de O
2
-
quando comparado ao controle
após tratamento in vitro (41A) e in vivo após 30 min. de incubação (41B) (*) (P< 0.05). Todos os
resultados são espressos como media±erro padrão.
FIGURA 41 – LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO
COM LACH
41A
41B
ex vivo
106
No sistema celular o O
2
-
é convertido a H
2
O
2
espontaneamente ou pela ação
da superóxido desmutase (SOD) (PICK; KEISARI, 1980). Portanto, estudos sobre o
efeito de Lach sobre esse radical também foram realizados. Lach CH12 e 200 não
mostraram possuir efeito sobre a liberação de H
2
O
2,
após o tratamento in vitro
(dados não mostrados), no entanto, Lach CH200 induziu
diminuição na sua liberação
quando o macrófago interage com leveduras (FIGURA 42A). Após tratamento dos
camundongos dos camundongos com Lach CH200, esse mesmo efeito de redução
da liberação foi observado (FIGURA 42B)
Após a interação macrófagos/leveduras, a liberação de NO e H
2
O
2
pelos macrófagos
diminuíram significativamente. No entanto, quando comparados os grupos com
leveduras e sem leveduras, a liberação de NO foi maior do que naqueles sem
leveduras. De fato, a interação da levedura com o receptor de manose (MR) pode
estar envolvido na indução da síntese de NO (GRUDEN-MOVSESIJAN;
MILOSAVLJEVIC, 2006). Lach, então, diminuindo a liberação desses radicais,
provavelmente aumentando a capacidade de geração de ONOO- dentro das
vesículas, aumentando o poder de destruição dos microorganismos. E
conseqüentemente, a diminuição na liberação de H
2
O
2,
contribui para um efeito
citoprotetor no momento em que a células está com sua produção mais alta de
espécies reativas. Esta defesa anti-oxidante, por prevenir um aumento na
Gráficos mostrando a diminuição significativa na liberação de H
2
O
2
quando comparado ao controle
após tratamento in vitro com posterior interação com leveduras (42A) e in vivo (42B) ambos após 30
min. de incubação. (*) (P< 0.05); Todos os resultados são expressos como media±erro padrão.
FIGURA 42 – LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO
COM LACH
42A
42B
107
concentração de H
2
O
2
, pode ser verificado pela diminuição da liberação de H
2
O
2
em
análise ex vivo, uma vez que a sua produção depende de O
2
-
livre no meio, o qual
provavelmente foi usado na reação com NO. De fato, a injúria causada por ROS
liberado por macrófagos e neutrófilos ativados, tem um importante papel na etiiologia
de várias doenças, como desordens neurodegenerativas, cancer, doenças
cardiovascular, ateriosclerose, cataratas, diabetes, inflamação (ARUOMA, 1998;
KRIS-ETHERTON et al., 2004). Nestes casos, drogas potentes e administração a
longo prazo são necessárias para o tratamento dessas doenças crônicas. No
entanto, essas drogas têm vários e graves efeitos colaterais. Dessa forma, agentes
com pouco ou nenhum efeito colateral são requeridos para substituir as
quimioterapias. Nesse contexto, Lach parece funcionar como um provável anti-
oxidante, pois diminui a produção de ROS em condições normais da célula e após
fagocitose. Um esquema sumarizando os efeitos de Lach sobre a liberação de ROS
esta demonstrado nas figuras 43 e 44.
Macrófago
ativado
Macrófago
residente
Tratamento
Produtos
liberados após
o tratamento
NO
O
2
-
H
2
O
2
In vitro/
ex vivo
In vitro
(CH200)/
ex vivo
ex vivo
Lach
N
NO
iNOS
NOX2
O
2
-
O
2
-
H
2
O
2
- aumentou a liberação; - diminuiu a liberação
FIGURA 43 –EFEITOS DO TRATAMENTO IN VITRO E IN VIVO COM LACH
108
MEV de macrófagos em co-cultura
Após 96 horas, a membrana da placa de co-cultura foi retirada e processada
para MEV. Os macrófagos tratados com Lach mostraram morfologia de ativado,
diferente do controle, o qual apresentou morfologia de residente (FIGURA 45).
Macrófagos ativados mostram grandes projeções da membrana plasmática,
aumento na capacidade de adesão e espalhamento no substrato, aumento da
fagocitose, aumento no número de fagolisossomos e vesículas endocíticas e núcleo
grande e eucromático (NORTH, 1978). De fato, tratamento in vitro por 48h com
Lach ativou morfologicamente os macrófagos (OLIVEIRA, 2005).
Aumentou a liberação; - diminuiu a liberação; - reação provável
FIGURA 44 –EFEITOS DO TRATAMENTO IN VITRO COM LACH E POSTERIOR
INTERAÇÃO COM LEVEDURAS
Macrófago
ativado
Macrófago
residente
Tratamento
Produtos
liberados após
o tratamento
Levedura
Lach
Tratamento
N
Macrófago
residente
N
+
NO
H
2
O
2
N
+
NOX2
NO
ONOO
-
iNOS
O
2
-
NOX2 O
2
-
O
2
-
H
2
O
2
NO (CH200)
109
MEV de macrófagos co-cultivados com medula óssea por 96 horas. A , C e E - macrófagos
controle, B, D e F - tratados com Lach CH200. Setas abertas = macrófagos residentes; setas
fechadas = macrófagos ativados; seta tracejada = poros da membrana
FIGURA 45 – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DE
MACRÓFAGOS TRATADOS COM LACH CH200 EM CO-CULTURA
45A
45B
45D
45E
45F
45C
110
Imunofenotipagem das células da medula óssea
Após tratamento dos camundongos com Lach CH200, as células da medula
óssea foram marcadas com anticorpos contra a linhagem hematopoiética e
analisadas em citometria de fluxo. Esta técnica mostrou que o tratamento aumentou
a expressão dos marcadores CD3ε, CD11c e CD45R e diminuiu CD11b (FIGURA
46).
O CD3ε pode ser detectado desde precursores da linhagem de
células T na
medula óssea até ser altamente expresso em células T maduras (KLEIN, et al.,
2003). Faz parte do complexo CD3, o qual é um formado por 4 polipeptídeos (CD3ε,
γ, δ, ζ). CD3ε tem um papel fundamental no desenvolvimento inicial
de células T e é
Gráficos 46A, 46B e 46C (*) indicam grupos com aumento significativo e Gráfico D (*) indica grupo
com diminuição significativa em relação ao controle (P< 0.05). Todos os resultados são expressos
como media±erro padrão.
FIGURA 46 – CD3ε
+
, CD11c
+
, CD45R
+
E CD11b
+
EM CÉLULAS DE MEDULA
ÓSSEA APÓS TRATAMENTO IN VIVO COM LACH
ex vivo
46A
ex vivo
46B
46C
ex vivo
46D
ex vivo
111
essencial para a expressão e função do pre-TCR e TCR (DEJARNETTE et al.,
1998; DAVE, 2009). O efeito de Lach CH200 sobre esse marcador pode indicar um
efeito de diferenciação sobre as células T.
As integrinas Mac-1 e p150,95 são glicoproteínas heterodiméricas (αβ). As
subunidades α, distintas nessas duas integrinas, foram designadas como CD11b em
Mac-1 e CD11c em p150,95. A subunidade β homóloga é chamada de CD18
(KISHIMOTO et al., 1990; HARRIS et al., 2000). Ambas integrinas são expressas em
monócitos, macrófagos, células dendríticas, polimorfonucleares e células Natural
Killers. O que varia é a quantidade relativa dessas integrinas conforme o tipo de
célula e seu estado de ativação ou diferenciação (ARNAOUT, 1990;
GEORGAKOPOULOS et al., 2008). Nas CTHs, CD11b/CD18 e CD11c/CD18 não
estão presentes nas unidades formadoras de granulócitos e monócitos, mas são as
primeiras detectadas durante a diferenciação de monócitos e granulócitos nos
estágios mielocíticos e monoblásticos (ARNAOUT, 1990; KISHIMOTO et al., 1990,
YANG et al., 2007). Com esses resultados, pode-se dizer que Lach CH200
administrada aos camundongos atua na diferenciação de precursores da linhagem
mielóide, com ênfase em células dendríticas e monócitos. As principais células
CD11c
+
são células dendríticas. São importantes na iniciação e regulação da
resposta imunológica contra uma variedade de antígenos, incluindo alérgenos,
agentes infecciosos e tumores. Elas residem na maioria dos tecidos e são
especializadas em capturar antígenos, migrar do tecido aos órgãos linfóides e
estimular linfócitos T. São apresentadoras de antígeno profissional, ou seja, são as
únicas APCs capazes de estimular a primeira resposta imunológica. A primeira
ativação de células T “naive” antígeno-específica depende de uma “conversa
cruzada” com células dendríticas que induz a ativação, proliferação e diferenciação
em células T efetoras antígeno-específicas (CLARK, et al., 2000; STEINBRINK, et
al., 2009). O principal alvo marcador do CD11b são monócitos/macrófagos. Sob
condições inflamatórias, a produção de monócitos na medula óssea é aumentada e
depois liberada na circulação sanguínea. Macrófagos são rapidamente recrutados
ao sítio da lesão e infecção onde eles diferenciam-se em macrófagos inflamatórios
(VAN FURTH et al., 1973) Os resultados da imunofenotipagem demonstraram que o
tratamento diminuiu a detecção das células marcadas com CD11b em células da
112
medula óssea. Com esses resultado pode-se sugerir que Lach CH200 estaria
recrutando monócitos aos locais de defesa.
A imunofenotipagem da medula óssea revelou que o tratamento com Lach
CH200 aumentou significativamente o marcador CD45R. CD45R (B220) é uma das
formas com alto peso molecular de uma série de glicoproteínas transmembranas
conhecidas como CD45, a qual é expressa em todas as células linfóides. No
entanto, CD45R é a primeira molécula específica de células B expressa durante a
diferenciação. È atribuída como molécula marcadora de centro de germinação de
células B e continua sendo expressa (em menor quantidade) até a célula B madura
e ativada. (COFFMAN, 1982; HASEGAWA et al., 1990; MONROE; DORSHKIND,
2007). Estimulando a expressão desse marcador, Lach CH200 pode estar
contribuindo para a diferenciação das células B e consequente estímulo da resposta
imunológica adaptativa e melhorar os elementos do sistema inato (PARKIN;
COHEN, 2001).
Se Lach CH200 atuar sobre a produção de IFN-γ por macrófagos a
pós
tratamento dos camundongos, assim como foi demonstrado por Oliveira (2005) após
tratamento in vitro, é provável que essa ação sobre as células precursoras seja por
intermédio dessa citocina. Tem sido demonstrado que IFN-γ induz diferenciação de
células mielocíticas e monocíticas da medula óssea, ativa células T em direção a
uma resposta imunológica tipo Th1 (GESSANI; BELLARDELI, 1998) e ativam o
linfócito B, com produção de imunoglobulinas e sua secreção (JANEWAY et al.,
2007). Assim, a ação de Lach CH200 sobre as células na medula óssea, seria de
uma maneira dependente de macrófagos.
CD11b
+
em células de medula óssea
Após 96 horas, as células não aderentes do cultivo de medula óssea e as
células aderentes e não aderentes da medula óssea co-cultivadas com macrófagos
peritoneais foram incubadas com anticorpo contra CD11b. A análise em citometria
de fluxo mostrou que o tratamento diminuiu o marcador CD11b no sobrenadante da
medula em co-cultura (FIGURA 47) mas não alterou significativamente esse
marcador nas células aderentes da co-cultura e não aderentes da medula cultivada
sozinha (dados não mostrados)
113
CD11b esta evolutivamente relacionada ao receptor integrina que medeia
adesão celular à matriz extracelular durante o desenvolvimento e reparo tecidual
(GEORGAKOPOULOS et al., 2008). Nas CTHs é um dos primeiros marcadores
detectados durante a diferenciação de monócitos e granulócitos nos estágios
mielocíticos e monoblásticos (ARNAOUT, 1990; KISHIMOTO et al., 1990, YANG et
al., 2007). As CTHs para se diferenciarem precisam estar aderidas ao estroma,
diferentemente da proliferação (INABA, et al., 1992). Uma vez que o tratamento das
células da medula óssea com Lach CH200 diminuiu a porcentagem de células
CD11b
+
não aderentes em co-cultura é provável que o medicamento esteja inibindo
a proliferação destas células. Quando se compara os controles dos cultivos de
células de medula óssea sozinha e co-cultivadas com macrófagos, pode-se notar um
número significantemente maior de células CD11b+ não aderentes na medula co-
cultivada (FIGURA 48).
(*) diminuiu significativamente em relação ao controle (P< 0.05). Todos os resultados são expressos
como media±erro padrão
FIGURA 47 – CD11b
+
EM CÉLULAS NÃO ADERENTES DE MEDULA ÓSSEA
APÓS CO-CULTURA COM MACRÓFAGOS E TRATAMENTO COM LACH
114
Assim, pode-se dizer que a presença de macrófagos, por si só, possui efeito
proliferativo sobre as células da medula. No entanto, quando é adicionado Lach
CH200, a porcentagem de células CD11b
+
não aderentes da co-cultura diminui,
aproximando-se daquela encontrada no cultivo de medula óssea sozinha. Frente a
esses resultados, pode-se sugerir que o tratamento com Lach CH200 inibe o efeito
proliferativo dos macrófagos sobre as células não aderentes.
Os resultados da imunofenotipagem após tratamento dos camundongos e
estes resultados in vitro indicam que Lach CH200 estimula a proliferação celular
e/ou diferenciação em medula óssea de camundongos de uma forma dependente ou
não de macrófagos. Um esquema mostrando os efeitos do tratamento com Lach
CH200 foi sumarizado na figura 49
(*) aumentou significantemente(P< 0.05). Todos os resultados são expressos como media±erro
padrão.
FIGURA 48 – CD11b
+
DE CÉLULAS NÃO ADERENTES EM CULTURA E CO-
CULTURA.
115
Neste trabalho, avaliamos os efeitos do veneno de Lachesis muta preparado
forma homeopática, nas potências CH12 (in vitro) e 200 (ex vivo). Os tratamentos
com Lach mostrou ativar macrófagos peritoneais estimulando a liberação de NO.
Estes resultados juntamente com a liberação de IFN-γ (OLIVEIRA, 2005) podem
caracterizar macrófagos tratados com Lach como macrófago inflamatório.
Macrófagos têm um papel chave na imunidade por ajudar a iniciar a imediata
resposta inata á infecção, por mobilizar linfócitos e elaborar resposta humoral, a qual
fornece uma proteção sustentada contra patógenos intra e extracelulares
(MURTAUGH; FOSS, 2002). Dessa forma, Lach poderia estar, via ativação de
macrófagos alterando as células da medula óssea. De fato, em condições
N
NO
iNOS
IFN-γ
IFN-γ
Lach
CD11c+
CD3+
CD45R+
CD11b+
1
2
Macrófago ativado
ex
vivo
/co
-
cultura
Medula óssea
Neste esquema apresentamos duas teorias para a ação do medicamento nas células da medula óssea.
(1) Lach CH200 pode ter ação direta sobre estas células. (2) Lach ativa macrófagos que produz
substâncias as quais possuem efeito sobre essas células precursoras.
FIGURA 49 – EFEITOS DE LACH NOS MARCADORES HEMATOPOIÉTICOS DAS
CÉLULAS DA MEDULA APÓS TRATAMENTO IN VIVO E CO-CULTURA
116
inflamatórias, ocorre um aumento significativo da produção de células CD11b
+
, que
são rapidamente recrutados ao local da inflamação, onde se diferenciam em
macrófagos inflamatórios. Esses macrófagos, por sua vez, secretam substâncias
que estimulam a diferenciação de outros precursores da linhagem monocítica e sua
conseqüente liberação na corrente sanguínea (GESSANI; BELARDELI, 1998; VAN
FURTH et al., 1973). Além desse recrutamento, macrófagos possuem a função de
estimular a diferenciação e proliferação de outras células do sistema imunológico,
como células T e B e células dendríticas (GESSANI; BELARDELI, 1998; GORDON;
TAYLOR, 2005; JANEWAY et al., 2007). Efeito dessa provável ação dos macrófagos
foi observado após o tratamento dos camundongos com Lach CH200. Desta
maneira, Lach CH200 parece estimular precursores de praticamente todas as
células de defesa, dependente ou não de macrófagos, além de controlar a
proliferação de células CD11b
+
de medula óssea, quando essas são co-cutivadas
com macrófagos. Efeito de moderador do Lach foi observado na produção de ROS
por macrófagos. O tratamento com esse medicamento diminui a liberação de O
2
-
e
H
2
O
2
, e quando há um aumento da produção desses ROS para a defesa celular,
como no caso da interação do macrófago com leveduras, há um provável desvio
desse acréscimo de radicais para dentro dos fagossomos. Esta ação protege a
célula de um estresse oxidativo e colabora para uma destruição eficaz do invasor.
Assim, Lach parece funcionar como um provável antioxidante, pois protege a célula
de um excesso de ROS, e atua em praticamente em todas as células do sistema
imunológico. Provavelmente via ativação e especialização de macrófagos
inflamatórios. De fato, como dito anteriormente, na homeopatia esse medicamento é
utilizado em processos inflamatórios e a sua extensa patogenesia pode ser devido a
sua ação em diversas células do sistema imunológico.
117
6.2.6 Thuya occidentallis
Em trabalho anterior, OLIVEIRA, 2005, mostrou que o tratamento in vitro com
Thuya occidentallis na potência CH30 aumentou o número de macrófagos
peritoneais com o estado morfológico de ativado. Ao passar do estado residente
para ativado, além de mudanças na morfologia celular, macrófagos adquirem
propriedades como habilidade de se espraiar, fagocitose e produção de espécies
reativas como (NO) (NORTH, 1978).
Liberação de NO, O
2
-
e H
2
O
2
Neste trabalho, verificou-se que, de fato, os macrófagos ativados pelo
tratamento com Thuy CH30 in vitro aumentaram significativamente a liberação de
NO no sobrenadante da cultura (FIGURA 50).
Em macrófagos ativados, a iNOs, enzima responsável pela produção de NO, pode
ser ativada por vários estímulos e está envolvida na defesa do hospedeiro. NO é a
molécula efetora responsável pela citotoxicidade de macrófago (CADENAS;
CADENAS, 2002; PALUDAN et al, 1999). Resultado semelhante sobre a ação de
Thuya occidentalis foi descrito por NASER; SHILOH, 2005, o qual relatou que
macrófagos alveolares cultivados in vitro e incubados com extrato de Thuya por 48
horas, aumentou a produção de NO
2
-
(resultado da reação de NO com O
2
). O NO
(*) indicam grupos com aumento significante na liberação de NO, quando comparado ao controle,
após tratamento in vitro com Thuy CH30 e cultivo por 72 horas (P< 0.05); Todos os resultados são
expressos como media±erro padrão.
FIGURA 50 – LIBERAÇÃO DE NO POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO
IN VITRO COM THUY
118
liberado por macrófagos deve também ativar o fator nuclear de transcrição NF-κB, o
qual a ativação é essencial para a expressão de um grande número de citocina e
genes de adesão que são mediadores críticos para reação inflamatória
(BRUCKDORF, 2005; COLEMAN, 2001; FORMAN; TORRES, 2001). Dessa forma,
Thuy CH30 pode estar ativando macrófagos in vitro para uma via de defesa
classificada como inflamatória. Thuy CH30 não alterou a liberação de NO após os
tratamentos in vitro de macrófagos com posterior interação com levedura e análise
ex vivo (dados não mostrados). Após a ativação dos macrófagos por Thuy CH30, foi
detectada uma diminuição na liberação de ânion superóxido em todos os
tratamentos realizados (FIGURA 51).
Esses resultados sugerem que esse medicamento diminui a produção desse radical,
contribuindo para prevenir um estresse oxidativo. Quando se comparam os
experimentos com e sem leveduras, verifica-se um aumento significativo na
liberação desse radical no experimento com leveduras em todos os grupos. Ainda
assim, o tratamento com Thuy CH30 diminui a liberação de O
2
-
após a interação dos
macrófagos com leveduras quando comparado ao controle (sem tratamento e com
levedura). Em células fagocíticas ativadas a grande fonte de O
2
-
provém do
complexo enzimático NOX. Após ser estimulada, NOX2, a subunidade catalítica da
NOX, pode produzir ROS intra (dentro dos fagossomos) e extracelularmente
(CROSS; SEGAL, 2004; BROWN; GRIENDLING, 2009). Assim, pode-se sugerir,
que apesar do aumento significativo da liberação de superóxido após a fagocitose, o
Gráficos mostrando a diminuição significativa na liberação de O
2
-
quando comparado ao controle
após tratamento in vitro (51A) in vitro com posterior interação com leveduras (15 min. de incubação)
(51B), ambos por 48 horas e in vivo (30 min. de incubação) (51C) (*) (P< 0.05). Todos os resultados
são expressos como media±erro padrão.
FIGURA 51 – LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO
COM THUY
51B
51A
51C
ex vivo
119
tratamento com Thuy CH30, direciona uma maior quantidade para dentro dos
fagossomos para provável destruição dos microorganismos, e, consequentemente
diminui a liberação desse radical no sobrenadante. Assim, mesmo numa ocasião de
aumento na produção do O
2
-
, Thuy CH30 preveniria o organismo de um aumento na
concentração de radical. Atividades antioxidantes de Thuya occidentalis vêm sendo
demonstrada pelo grupo de DUBEY; BATRA, (2008, 2009a, 2009b). Seus trabalhos
mostram que o extrato etanólico de Thuya occidentalis diminui ou previne o aumento
dos radicais livres, como ânion superóxido, inclusive por interferir na ação e/ou
quantidade de enzimas antioxidantes. Estes efeitos têm por consequência a melhora
de quadros e prevenção de doenças, como diabetes e doenças cardíacas.
A análise da liberação de H
2
O
2
após o tratamento com a Thuy não mostrou
nenhuma alteração significativa em nenhum dos estudos (dados não mostrados).
Para tanto, podemos sugerir 2 hipóteses: 1- o H
2
O
2
gerado e liberado nesse caso,
não provém do O
2
-
alterado na célula com o tratamento; 2- caso a diminuição do
superóxido seja causado por um aumento na dismutação desse para H
2
O
2
, enzimas
que quebram esse radical, como peroxidases, podem estar ativas com o tratamento
de Thuy CH30. Assim, podemos novamente sugerir que a potência CH30 de Thuya
occidentalis possui efeitos semelhantes ao seu extrato, reduzindo ou prevenindo o
aumento de radicais. Experimentos verificando a ação dessas enzimas após o
tratamento seriam necessários para corroborar essa hipótese. Macrófagos são os
maiores produtores de espécies reativas em uma resposta imunológica inflamatória,
e uma modulação na liberação desses radicais pode ser muito importante para a
manutenção e resolução de diversas doenças. De fato, a injúria causada por ROS
liberado por macrófagos e neutrófilos ativados, tem um importante papel na etiologia
de várias doenças, como desordens neurodegenerativas, câncer, doenças
cardiovascular, arteriosclerose, cataratas, diabetes, inflamação (ARUOMA, 1998;
KRIS-ETHERTON et al., 2004).
MEV de macrófagos em co-cultura
Após 96 horas, a membrana da placa de co-cultura foi retirada e processada
para MEV. Os macrófagos tratados com Thuy CH30 mostraram morfologia de
ativados, diferente do controle, o qual apresentou morfologia de residente (FIGURA
52). Resultado equivalente foi demonstrado por Oliveira, (2005), onde o tratamento
in vitro por 48h com Thuy CH 30 aumentou o número de macrófagos ativados.
120
Macrófagos ativados mostram grandes projeções da membrana plasmática,
aumento na capacidade de adesão e espalhamento no substrato, aumento da
fagocitose, aumento no número de fagolisossomos e vesículas endocíticas e núcleo
grande e eucromático (NORTH, 1978).
52B
52A
52C
MEV de macrófagos co-cultivados com medula óssea por
96 horas. A, C e E - macrófagos controle,
B, D e F - tratados com Thuy CH30. Setas abertas = macrófagos residentes; setas fechadas =
macrófagos ativados
FIGURA 52– MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DE MACRÓFAGOS
TRATADOS COM THUY EM CO-CULTURA
52F
52E
52A
52D
52B
52C
121
Imunofenotipagem das células da medula óssea
Após tratamento dos camundongos com Thuy CH30 as células da medula
óssea foram extraídas e processadas para imunofenotipagem. A análise em
citometria de fluxo mostrou que o tratamento induziu um aumento na expressão dos
marcadores CD3ε, CD45R e CD11c (FIGURA 53).
O polipeptídeo CD3ε, juntamente com o gama e beta e os heterodímeros do
receptor de célula T (TCR), forma o complexo T-CD3. O polipeptídeo epsilon
desempenha um papel essencial no desenvolvimento de células-T. Defeitos neste
gene causam imunodeficiência. (DEJARNETTE, et al., 1998; PARKIN; COHEN,
2001). O efeito de Thuy CH30 sobre esse marcador pode indicar um efeito
proliferativo sobre as células T, como foi descrito por Naser et al. (2005). Neste
trabalho, extrato etanólico de Thuya occidentalis mostrou estimular a proliferação e
diferenciação de células T helper e aumentar a produção de INF-γ dessas células,
de uma maneira dependente da presença de monócitos/macrófagos. Estímulo sobre
a produção dessa citocina também foi observado em Oliveira (2005), a qual
demonstrou um aumento na detecção de INF-γ após o tratamento de macrófagos
com Thuy CH30. Assim, é possível que Thuy CH30 esteja estimulando a proliferação
e diferenciação de células T na medula óssea, por meio da ativação de macrófagos,
pois segundo revisado em Gessani; Belardeli (1998) IFN-γ produzido por
(*) aumentou significantemente em relação ao controle (P< 0.05). Todos os resultados são
expressos como media±erro padrão.
FIGURA 53 – CD3ε
+
, CD45R+, E CD11c
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA
APÓS TRATAMENTO IN VIVO COM THUY
53A
ex vivo
53B
ex vivo
53C
ex vivo
122
macrófagos pode estimular e ativar linfócitos T em direção a uma resposta
imunológica Th1 e recrutar células do sistema imunológico ao local de defesa.
A imunofenotipagem da medula óssea revelou que o tratamento com Thuy
CH 30 aumenta significativamente o marcador CD45R. CD45R (B220) é uma das
formas com alto peso molecular de uma série de glicoproteínas transmembranas
conhecidas como CD45, a qual é expressa em todas as células linfóides. No
entanto, CD45R é a primeira molécula específica de células B expressa durante a
diferenciação. È atribuída como molécula marcadora de centro de germinação de
células B e continua sendo expressa (em menor quantidade) até a célula B madura
e ativada. (COFFMAN, 1982; HASEGAWA et al., 1990; MONROE; DORSHKIND
2007). Estimulando a expressão desse marcador, Thuy CH30 pode estar
contribuindo para a diferenciação das células B e consequente estímulo da resposta
imunológica adaptativa. Células B diferenciadas produzem anticorpos. Estes servem
para neutralizar toxinas, prevenir organismos de aderir à superfície de mucosa,
ativar complemento, opsonizar bactérias para fagocitose e sensibilizar tumor e
células infectadas e citotoxicidade dependente de anticorpo por células Killer. Assim,
o anticorpo atua para melhorar os elementos do sistema inato (PARKIN; COHEN,
2001). NASER et al. em 2005 descreveu que polissacarídeos da Thuya occidentalis
possuem efeito estimulante sobre a produção de anticorpos.
O aumento da detecção do marcador CD11c nas células da medula óssea
após o tratamento dos camundongos, pode significar que Thuy CH30 esteja
estimulando a diferenciação e/ou proliferação das células mielóides. CD11c é a
subunidade α do heterodímero αXβ2 (CD18/CD11c) da integrina chamada p150,95
(
HARRIS et al., 2000). É um receptor multifuncional e esta diretamente envolvida na
adesão e migração celular. Essa integrina aparece em monócito/ macrófagos,
neutrófilos e é altamente expressa em células dendríticas. (ARNAOUT, 1990). Nas
CTHs são as primeiras detectadas durante a diferenciação de monócitos e
granulócitos nos estágios mielocíticos e monoblásticos (ARNAOUT, 1990;
GEORGAKOPOULOS et al., 2008). Na defesa imunológico, os antígenos devem ser
processados por APCs (macrófagos, células dendríticas e células B) e apresentados
para células T antígeno-específicas para desencadear uma resposta imunológica.
Entre as APCs, as células dendríticas ativadas são as mais potentes estimuladoras
de células T “naive” (PARKIN; COHEN, 2001). As células dendríticas são células
123
consideradas adjuvantes naturais para a imunoterapia em doenças malignas. São
extremamente potentes no estímulo de células T, as quais são ideais para respostas
anti-melanoma. Vários estudos têm demonstrado que a proteína do mieloma,
também chamada idiotipo (Id), é suficientemente imunogênico para gerar respostas
das células T em pacientes com mieloma, com capacidade de estimular células
dendríticas para serem usadas na imunoterapia, no tratamento de neoplasias
diversas, incluindo mieloma múltiplo, uma doença maligna de células B. As
estratégias de imunoterapia são estratégias para a citorredução adicionais as
quimioterapias necessárias para a cura (HÁJEK; BUTCH, 2000; YI, 2003). As
técnicas desenvolvidas para desenvolver e estimular células dendríticas são
demoradas e caras (SMITS, et al., 2009) Assim, um medicamento que pudesse
ativar as células dendríticas no próprio organismo, poderia ser uma alternativa eficaz
e mais viável para o tratamento de doenças como o câncer. Frente a isso, os
resultados obtidos após o medicamento Thuy CH30 ser administrado aos
camundongos, parece ser promissor, pois além de estimular a diferenciação das
células da linhagem B, estimula a linhagem de células dendríticas e células T,
fatores principais para o reconhecimento da célula tumoral e sua destruição.
O tratamento dos camundongos com Thuy CH30 mostrou que esse
medicamento atua nas células de medula óssea aumentando os marcadores das
células precursoras de praticamente todo o sistema imunológico. Dessa maneira,
pode-se dizer que Thuy CH30 possui efeito nas respostas imunológicas inata e
adaptativa.
CD11b
+
em células de medula óssea
O tratamento in vitro da medula óssea com Thuy CH30 não alterou a
marcação de células CD11b
+
. No entanto, após co-cultivar essas células com
macrófagos peritoneais, ocorreu um aumento na marcação de células CD11b
+
aderentes da medula (FIGURAS 54A e 55)e uma diminuição na marcação das
células não aderentes (FIGURAS 54B).
124
Nas CTHs, Mac-1 (CD11b/CD18) não esta presente nas unidades formadoras de
granulócitos e monócitos, mas são as primeiras detectadas durante a diferenciação
de monócitos e granulócitos nos estágios mielocíticos e monoblásticos (ARNAOUT,
1990; KISHIMOTO et al., 1990, YANG et al., 2007). O aumento na expressão desse
marcador nas células aderentes pode inferir que o tratamento com Thuy CH30 induz
uma adesão das células da linhagem mielocítica para provável diferenciação. As
CTHs para se diferenciarem precisam estar aderidas ao estroma. Em cultura celular,
55B
55A
Cd11b com ficoeritrina (vermelho). Núcleo com DAPI (
azul). Detecção em microscopia confocal. A-
grupo controle; B – grupo tratado com Thuy CH30. Barra: 20 µm; Aumento: 40X
FIGURA 55 – CD11b
+
EM CÉLULAS ADERENTES DE MEDULA ÓSSEA APÓS CO-
CULTURA COM MACRÓFAGOS TRATADOS COM THUY
Gráfico 54A - (*) aumentou significantemente em relação ao controle (P< 0.05). Gráfico 54B - (*)
diminuiu significantemente em relação ao controle. Todos os resultados são expressos como
media±erro padrão.
FIGURA 54 – CD11b
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA APÓS CO-CULTURA
COM MACRÓFAGOS TRATADOS COM THUY
54A
54B
125
depois de diferenciadas, algumas células, como granulócitos e células dendríticas,
se desprendem ficando no sobrenadante da cultura. Outras, como monócitos, ficam
fortemente aderidas (INABA, et al., 1992). Assim, Thuy CH30 estaria promovendo
uma diferenciação de toda linhagem mielocítica com ênfase em monócitos de uma
forma dependente da presença de macrófagos. De fato, Thuy CH30 induz produção
de IFN-γ em macrófagos peritoneais após tratamento in vitro (OLIVEIRA, 2005).
Essa citocina possui ação sobre células mielomonocíticas, induzindo diferenciação
de monócitos em células de medula óssea (GESSANI; BELARDELI, 1998).
Quando se compara as marcações do cultivo da medula óssea com a co-
cultura, pode-se verificar que o controle da medula em co-cultura mostra um
aumento significativo na marcação CD11b
+
quando se compara ao controle da
medula in vitro, demonstrando provável efeito proliferativo dos macrófagos. No
entanto, após o tratamento com Thuy CH30 observa-se uma diminuição das células
marcadas com CD11b
+
no sobrenadante da co-cultura (FIGURA 56).
Esta ocorrência pode significar uma indução da diferenciação das células CD11b
+
,
uma vez que esse fenômeno é dependente de adesão celular, o que pode ser
observado no aumento das células CD11b
+
aderentes.
(*) aumentou significativamente (P< 0.05). Todos os resultados são expressos como media±erro
padrão.
FIGURA 56 – CD11b
+
DE CÉLULAS NÃO ADERENTE EM CULTURA E CO-
CULTURA.
126
Thuy CH30, medicamento originado da tintura mãe de macerados de Thuya
occidentallis, demonstrou possui diversos efeitos sobre as células do sistema
imunológico, de forma semelhante à ação do extrato alcoólico dessa planta. Os
resultados das investigações in vitro e ex vivo indicam um potencial imunomodulador
de Thuya CH30. O principal alvo dos componentes imunologicamente ativo parece
ser a de macrófagos / monócitos, assim também como foi revisado por Nasser, 2005
com polissacarídeos da Thuya occidentalis. De fato, macrófagos participam na
produção, mobilização, ativação e regulação de vários tipos celulares do organismo
(ex: fibroblastos, células endoteliais, etc.) e de todas as células efetoras do sistema
imunológico. Eles interagem reciprocamente com outras células enquanto suas
propriedades são modificadas para realizar funções imunológicas especializadas
(GORDON, 1999).
Thuy CH30, demonstrou neste trabalho, assim como em OLIVEIRA (2005)
ativar morfologicamente macrófagos peritoneais de camundongo. Como descrito na
literatura, verificou-se que macrófagos ativados aumentam a liberação de NO.
Como efeito desse aumento, Thuy CH30 pode ativar as defesas do organismo e
sinalização de respostas imunológicos inflamatórias. A ação de sobre as funções de
defesa do macrófago pode ser constatada também com a análise da liberação do
radical O
2
-
após a interação com leveduras. Enquanto ocorre um aumento na
liberação desse radical por ocasião da fagocitose, Thuy CH30 provavelmente desvia
a produção desse radical para dentro dos fagossomos, pois a quantidade de O
2
-
liberado é menor no sobrenadante desse grupo do que no controle com leveduras..
Esse direcionamento do radical, além de contribuir para um aumento na eficácia de
destruição do patógeno, contribui para a proteção do organismo contra um burst
oxidativo. Essa proteção também pode ser constatada com a diminuição desse
radical após os tratamentos e na prevenção do aumento de H
2
O
2
pela provável
dismutação de O
2
-
. Além da ação sobre células diferenciadas, Thuy CH30 mostra
também atuar sobre as precursoras não só de macrófagos mas como de
praticamente todas as células do sistema imunológico, como linfócitos T, B,
macrófagos, células dendríticas e neutrófilos. Um aumento na detecção dos
marcadores CD3ε, CD45R e CD11c, pode significar uma ação em todo o
sistema
imunológico, influenciando as respostas imunológicos inata e adaptativa. Essa ação
sistêmica, no entanto, pode ser dependente da presença de macrófagos. Células de
127
medula óssea tratadas in vitro com Thuy CH30 não mostrou diferenças significativas
na expressão de marcadores CD11b, mas quando co-cultivadas com macrófagos as
células tanto aderentes quanto não aderentes mostraram alteração nessas
marcação positiva, sugerindo provável efeito sobre a diferenciação da linhagem
mielocítica. Assim, Thuy CH 30 aparece como um medicamento imunoestimulador,
provavelmete dependente de macrófago e apesar de diversos efeitos serem
semelhantes ao do extrato da planto, o uso desse medicamento seria vantajoso em
relação ao extrato e polissacarídeos da Thuya occidentallis por não apresentar o
efeito tóxico da planta.
128
6.2.7 Bryonia alba
Neste trabalho, foi utilizada a Bryonia alba na potência CH200 somente nos
tratamentos dos camundongos, in vitro de medula óssea e co-cultura. A análise de
espécies reativas pode ajudar a analisar o efeito de determinadas substâncias sobre
a atividade de diversas células do sistema imunológico, principalmente naquelas que
participam de respostas inflamatórias, como macrófagos. Assim, após tratamento
dos camundongos com Bry CH200 foram analisados a liberação de NO, O
2
-
e H
2
O
2
liberados por essas células
Liberação de NO, O
2
-
e H
2
O
2
Após o tratamento dos camundongos, verificou-se que Bry CH200 diminuiu
significativamente a detecção de O
2
-
no sobrenadante quando comparada ao
controle (FIGURA 57) e aumentou a detecção de H
2
O
2,
(FIGURA 58) ambos após o
tempo de 15 min. de incubação.
Após estímulos como citocinas e fatores de crescimento, a enzima NOX, capaz de
produzir O
2
-
é estimulada, e passa a produzir esse radical tanto intra quanto
extracelularmente (VEAL, et al., 2007; BROWN; GRIENDLING, 2009). Uma vez
gerado, O
2
-
pode ser dismutado espontaneamente ou através da SOD a H
2
O
2
(2O
2
+
2H
+ →
H
2
O
2
+ O
2
), o qual pode rapidamente se difundir através de membranas.
Gráfico mostrando a diminuição significativa na liberação de O
2
-
(15 min. de incubação), quando
comparado ao controle após tratamento in vivo (*) (P< 0.05).Todos os resultados são expressos como
media±erro padrão.
FIGURA 57 – LIBERAÇÃO DE O
2
-
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO IN
VIVO COM BRY
ex vivo
129
(KAUL; FORMAN, 1996; FORMAM; TORRES, 2001). Uma vez que o O
2
-
liberado
pelos macrófagos peritoneais foi diminuído e o H
2
O
2
liberado foi aumentado,
podemos sugerir que o tratamento com Bry CH200 pode estar atuando na reação de
dismutação, provavelmente com efeito nas enzimas SOD.
Pré tratamento de células microgliais, tipo de macrófago do cérebro, com IFN-
γ protege essas células do estresse oxidativo via sel
ectiva aumento dos níveis de
Mn-SOD (Magnésio superóxido dismutase) e atividade de Mn-SOD (CHENA, et al.,
2009). De fato, OLIVEIRA, 2005 mostrou que macrófagos peritoneais aumentam a
liberação de IFN-γ no sobrenadante celular, quando tratados com Bry CH200. Como
a membrana celular não é permeável ao O
2
-
, o produto da atividade da NOX
somente pode modular vias de sinais intracelulares, uma vez que este seja
convertido a H
2
O
2
, o qual pode difundir-se livremente através das membranas. Este
radical pode funcionar como segundo mensageiro dentro da própria célula produtora,
ativando vias de sinalização, como a do NF-κB, ou ainda funcionar como sinalizador
intercelular (LI; KARIN, 1999; RETH, 2002). O H
2
O
2
por si só, não tem grande
potencial destrutivo, portanto, esse radical produzido e liberado por macrófagos
ativados é primeiramente proposto como ativador de macrófagos e linfócitos e não
como destruidor de microorganismos (RETH, 2002).
Gráfico mostrando a diminuição significativa na liberação de H
2
O
2
(15 min. de incubação), quando
comparado ao controle após tratamento in vivo (*) (P< 0.05). Todos os resultados são expressos
como media±erro padrão.
FIGURA 58 – LIBERAÇÃO DE H
2
O
2
POR MACRÓFAGOS APÓS TRATAMENTO IN
VIVO COM BRY
ex vivo
130
MEV de macrófagos em co-cultura
Após 96 horas, a membrana da placa de co-cultura foi retirada e processada para
MEV. Os macrófagos tratados com Bry CH200 mostraram morfologia de ativado,
diferente do controle, o qual apresentou morfologia de residente (FIGURA 59).
Macrófagos ativados mostram grandes projeções da membrana plasmática,
aumento na capacidade de adesão e espalhamento no substrato, aumento da
fagocitose, aumento no número de fagolisossomos e vesículas endocíticas e núcleo
grande e eucromático. (NORTH, 1978). Em Oliveira (2005), o tratamento in vitro por
48h com Bry CH200 mostrou aumentar o número de macrófagos ativados, sem, no
entanto, ser significativo. Provavelmente, o tempo de cultivo tenha sido decisivo
para o aumento significante do número de macrófagos ativados.
131
F
MEV de macrófagos co-cultivados com medula óssea por 96 horas. A, C, e E - macrófagos controle,
B, D e F - tratados com Bry CH200. Setas abertas = macrófagos residentes; setas fechadas =
macrófagos ativados; seta tracejada = poros da membrana
FIGURA 59 – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DE MACRÓFAGOS
TRATADOS COM BRY EM CO-CULTURA
59E
59A
59B
59F
59D
59C
132
Imunofenotipagem das células da medula óssea
Após tratamento dos camundongos com Bry CH200, as células da medula
óssea foram incubadas com anticorpos contra marcadores para linhagem
hematopoiéitca. A análise em citometria de fluxo mostrou um aumentou na
expressão de CD11b, CD11c e Ly6G (FIGURA 60).
O antígeno Ly-6G é um antígeno de diferenciação mielóide. A expressão de Ly-6G
aumenta durante a diferenciação de granulócitos com alta expressão sobre
granulócitos maduros. Sua expressão é também transitalmente detectada durante
diferenciação de monócitos, mas não é detectável em monócitos maduros. Não é
expresso em células progenitoras hematopoiéticas (FLEMING, et al., 1993;
HESTDAL, et al., 1991). CD11b e CD11c são expressos em monócitos, macrófagos,
células dendríticas, polimorfonucleares e células Natural Killers. O que varia é a
quantidade relativa dessas integrinas conforme o tipo de célula e seu estado de
ativação ou diferenciação (ARNAOUT, 1990; GEORGAKOPOULOS et al., 2008).
Nas CTHs, CD11b/CD18 e CD11c/CD18 não estão presentes nas unidades
formadoras de granulócitos e monócitos, mas são as primeiras detectadas durante a
diferenciação de monócitos e granulócitos nos estágios mielocíticos e monoblásticos
(ARNAOUT, 1990; KISHIMOTO et al., 1990, YANG et al., 2007). Com esses
resultados, pode-se dizer que Bry CH200 administrada aos camundongos atua na
diferenciação de praticamente todos os precursores da linhagem mielóide, tanto nas
(*) aumentou significantemente em relação ao controle(P< 0.05). Todos os resultados são expressos
como media±erro padrão.
FIGURA 60 – Ly6G
+
, CD11b+, E CD11c
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA
APÓS TRATAMENTO IN VIVO COM BRY
60A
ex vivo
60B
ex vivo
60C
ex vivo
133
células em início de diferenciação quanto nas fases finais, dando provável origem a
granulócitos, monócitos e células dendríticas.
CD11b
+
em células de medula óssea
O tratamento in vitro da medula óssea com Bry CH200 não alterou a
marcação de células CD11b
+
(dados não mostrados). No entanto, após co-cultivar
essas células com macrófagos peritoneais, ocorreu um aumento na marcação de
células CD11b
+
aderentes da medula e uma diminuição na marcação das células
não aderentes (FIGURAS 61).
Estes resultados in vitro mostram a ação do tratamento de Bry CH200 sobre os
precursores mielóides de medula óssea, de maneira dependente de macrófagos. Bry
CH200 juntamente com os macrófagos estimula a adesão das células CD11b+ com
provável diferenciação. CD11b/CD18 são as primeiras moléculas detectadas durante
a diferenciação de monócitos e granulócitos nos estágios mielocíticos e
monoblásticos (ARNAOUT, 1990; KISHIMOTO et al., 1990, YANG et al., 2007). As
CTHs para se diferenciarem precisam estar aderidas ao estroma. Em cultura celular,
depois de diferenciadas, algumas células, como granulócitos e células dendríticas,
se desprendem ficando no sobrenadante da cultura. Outras, como monócitos, ficam
fortemente aderidos (INABA, et al., 1992). Assim, Bry CH200 estaria promovendo
uma diferenciação de toda linhagem mielocítica com ênfase em monócitos. Essa
Gráfico 61A - (*) aumentou significantemente em relação ao controle Gráfico B - (*) diminuiu
significantemente em relação ao controle (P< 0.05). Todos os resultados são expressos como
media±erro padrão.
FIGURA 61 – CD11b
+
EM CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA APÓS CO-CULTURA
COM MACRÓFAGOS TRATADOS COM BRY
61A
61B
134
diferenciação pode ser induzida devido a IFN-γ. Essa citocina possui ação sobre
células mielomonocíticas, induzindo diferenciação de monócitos em células de
medula óssea (GESSANI; BELARDELI, 1998). De fato, Bry CH200 induz produção
de IFN-γ em macrófagos peritoneais após tratamento in vitro (OLIVEIRA, 2005).
Quando se comparam as marcações de células CD11b
+
medula óssea, pode-se
verificar que o controle da medula em co-cultura possui uma maior número
significativo na marcação CD11b
+
quando se compara ao controle da medula in
vitro. Dessa forma, podemos sugerir que o macrófagos, por si só, possui efeito
proliferativo sobre as células da medula óssea. No entanto, após o tratamento da
co-cultura com Bry CH200 observa-se uma diminuição das células marcadas com
CD11b
+
no sobrenadante da co-cultura (FIGURA 63). As células não aderentes
diminuem e a porcentagem de fluorescência se aproxima daquela encontrada nas
células não aderentes da medula. Esta ocorrência pode significar uma indução da
diferenciação das células CD11b
+
, uma vez que esse fenômeno é dependente de
adesão celular. Com estas observações, pode-se sugerir que Bry CH200 possui
ação de diferenciação e adesão dependente de macrófagos.
62A
62B
Cd11b com ficoeritrina (vermelho). Núcleo com DAPI (
azul). Detecção em microscopia confocal.
62A- grupo controle; 62B – grupo tratado com BRY CH200. Barra: 20 µm; Aumento: 40X
FIGURA 62 – CD11b
+
EM CÉLULAS ADERENTES DE MEDULA ÓSSEA APÓS
CO-CULTURA COM MACRÓFAGOS TRATADOS COM BRY
135
Neste trabalho foi verificado a capacidade da Bryonia alba na potência CH200 ativar
funções dos macrófagos e alterar marcadores da linhagem hematopoiética da
medula óssea. Após tratamento de camundongo com Bry CH200, pode-se verificar
que este medicamento altera a liberação de ROS. O aumento na produção de H
2
O
2
sugere que esse medicamento atua como um ativador de macrófagos e linfócitos,
uma vez que esse radical sozinho não tem grande potencial destrutivo. A ação da
Bryonia alba nas potências CH4 e CH9 também foi observada sobre
polimorfonucleares, onde o medicamento apresenta um efeito estimulatório sobre o
seu metabolismo oxidativo (BELLAVITE et al., 2006). Bry CH200 mostrou ação
também sobre as células da medula óssea dos camundongos. Com o aumento de
marcadores encontrados na linhagem mielocítica, pode-se dizer que Bry CH200 atua
em todas as etapas da diferenciação dessa linhagem, dando provável origem a
granulócitos (Ly-6G
+
), monócitos (CD11b
+
) e células dendríticas (CD11c
+
). Bry
CH200 mostrou possuir ação sobre a ativação morfológica de macrófagos.
Macrófagos ativados produzem diversas substâncias que interferem no sistema
imunológico. De fato, podemos observar a ação de substâncias produzidas por
macrófagos em células de medula óssea, após co-cultivo desses dois grupos
celulares. Neste caso, substâncias produzidas por macrófagos, provavelmente
(*) aumentou significativamente (P< 0.05). Todos os resultados são expressos como media±erro
padrão.
FIGURA 63 – CD11b
+
DE CÉLULAS NÃO ADERENTE EM CULTURA E CO-
CULTURA.
136
estimulam a proliferação celular e quando o grupo recebeu tratamento com Bry
CH200 demonstrou ter um maior número de células da linhagem mielocíticas
aderidas do que no controle. Assim, com esses os resultados, Bry CH200 mostra
efeito bem definido sobre as células precursoras mielocíticas, desde o início de sua
diferenciação, até as células maduras (neste caso, macrófagos) colaborando para a
defesa do organismo com as células de defesa iniciais e que ligam o sistema
imunológico inato ao adaptativo. A atividade efetora antimicrobial dos fagócitos
(macrófagos e células dendríticas e neutrófilos) é crucial na defesa inata do
hospedeiro contra infecções. Como resultado de uma origem comum dos fagócitos,
eles compartilham diversas funcionalidades, incluindo ávida fagocitose,
comportamentos chaves sob condições inflamatórias/infeciosas, e atividades
antimicrobiais e imunomodulatórias. No entanto, devido a conseqüências da
especialização durante suas diferenciação, macrófagos e neutrófilos adquirem
distintas mas complementares características que dão origem a diferentes níveis de
capacidades antimicrobiais e citotoxicidade, diferentes localizações nos tecidos e
tempo de vida. A combinação dessas características complementares e sobrepostas
dos fagócitos promove sua cooperativa participação como efetores e modulatores da
imunidade inata contra infecções e como orquestradores da imunidade adaptativa.
Nas atividades antimicrobianas da imunidade inata, macrófagos e neutrófilos não
são capazes de substituir um ao outro. O uso por mamíferos de um sistema com
dois dedicados fagócitos trabalhando cooperativamente representa uma vantajosa
estratégia de ataque que permite o eficiente e seguro uso de poderosas, mas
perigosas moléculas de ataque (SILVA, 2010).
137
7 CONCLUSÕES
7.1 Conclusão geral
Todas as substâncias altamente diluídas de forma homeopática alteram a
liberação de espécies reativas e a expressão de marcadores de células de
medula óssea.
7.2 Conclusões específicas
Com os resultados obtidos neste trabalho de doutorado, podemos concluir que
os medicamentos homeopáticos estudados,
• Todos os medicamentos mostram agir sobre a liberação de espécies reativas
por macrófagos peritoneais de camundongos associados ou não a fagocitose.
promovendo melhora na defesa celular e redução de estresse oxidativo.
• A maioria dos medicamentos provavelmente desvia a produção de ROS e
RNS para a morte e destruição do microorganismo, quando ha interação com
leveduras.
• Ativam morfologicamente macrófagos co-cultivados com medula óssea.
• Alteram a expressão do marcador CD11b em células de medula óssea
tratadas in vitro e co-cultivadas com macrófagos, promovendo proliferação
e/ou diferenciação dos precursores mielóides
• Alteram a expressão de marcadores da linhagem hematopoiética após
tratamento dos camundongos, atuando na diferenciação e/ou proliferação
destas células.
Considerações finais
Terapias focadas no estímulo e recrutamento de macrófagos tem sido foco
de pesquisas relacionadas à resolução de diversas doenças, visando a imunoterapia
contra células neoplásicas, processos infecciosos, inflamatórios e na modulação da
resposta imunológica. Todos os medicamentos homeopáticos estudados nesse
trabalho mostraram atuar de alguma maneira sobre macrófagos, tanto diferenciados
138
quanto em seus precursores, assim como nas demais células precursoras do
sistema imunológico presentes na medula óssea. Os resultados aqui encontrados,
mostrando ação dessas substâncias altamente diluídas na liberação de espécies
reativas permitem supor um real potencial terapêutico de baixa ou nenhuma
toxicidade, uma vez que essas moléculas, mesmo em pequeníssimas quantidades,
conseguem atuar como segundo mensageiros e modular diferentes respostas em
diferentes células. A vasta biodiversidade encontrada no Brasil, juntamente com a
grande diversidade étnica e cultural que usa produtos naturais como tradição é uma
fonte promissora de novas estratégias terapêuticas. A melhoria de instalações e de
infraestrutura são essenciais para o progresso técnico e científico na saúde pública.
Nossos resultados pontuam a necessidade de um exame cuidadoso na interface
entre medicamentos homeopáticos e o tratamento de doenças. Esta é uma área
importante para futuras pesquisas, pois à medida que esses conhecimentos se
expandem, aumenta a esperança de termos a habilidade de influenciar
seletivamente um estado de ativação celular específico, permitindo manipular uma
terapia resolutiva.
139
REFERÊNCIAS
ABUD, A.R.; CESAR, B.; CAVAZZANI, L. M.; OLIVEIRA, C. C.; GABARDO, J.;
BUCHI, D. F. Activation of bone marrow cells treated with Canova in vitro. Cell
Biology International, v. 30, p.808-816, 2006.
ARNAOUT, M. A.; Structure and Function of the Leukocyte Adhesion Moleculer
CD11/CD18. Blood, v.75, n.5, 1990.
ARONSON, J. K. Mercury and mercurial salt. In: ARONSON, J. K. Meyler’s side
effects of drugs. The international encyclopedia of adverse drug reactions and
interactions, 5th ed. Elsevier, Oxford, United Kingdom: 2006a, p. 2260-2266.
ARONSON, J. K. Arsenic. In: ARONSON, J. K. Meyler’s side effects of drugs. The
international encyclopedia of adverse drug reactions and interactions, 5th ed.
Elsevier, Oxford, United Kingdom: 2006b, p. 2260-2266..
ARUOMA, O. Free radicals, oxidative estresse and antioxidants in human health and
disease. J. Am. Oil Chemists Soc., v. 75, p.199–212, 1998.
BAROLLO, C. R. Aos que se tratam pela Homeopatia. 7°ed., São Paulo: 1995, ed
Typus.
BHANDOOLA, A.; SAMBANDAM, A. ; ALLMAN, D.; MERAZ, A. ; SCHWARZ, B.
Early T Lineage Progenitors: New Insights, but Old Questions Remain. J. Immunol.,
v.171, p. 5653-5658, 2003.
BHANDOOLA, A.; SCHWARZ, B. A. Trafficking from the bone marrow to the thymus:
a prerequisite for thymopoiesis. Immunological Reviews, v. 209, p. 47–57, 2006.
BELLAVITE, P.; CONFORTI, A.; PIASERE, V.; ORTOLANI, R. Immunology and
Homeopathy. 1. Historical Background. eCAM, v.2, n. 4, p. 441-452, 2005.
doi:10.1093/ecam/neh141
BELLAVITE, P.; CONFORTI, A.; PONTAROLLO, F.; ORTOLANI, R.; Immunology
and Homeopathy. 2. Cells of the Immune System and Inflammation. eCAM, v. 3, n. 1,
p. 13-24, 2006. doi: 10.1093/ecam/nek018
BELON, P.; BANERJEE, A.; KARMAKAR, S.R.; BISWAS, S.J.; CHOUDHURY, S. C.;
BANERJEE, P.; DAS, J.K.; PATHAK, S.; GUHA, B.; PAUL, S.; BHATTACHARJEE,
N.; KHUDA-BUKHSH, A.R. Homeopathic remedy for arsenic toxicity?: Evidence-
based findings from a randomized placebo-controlled doubled blind human trial.
Science of the Total Environment , v. 384, p. 141-150, 2007.
doi:10.1016/j.scitotenv.2007.06.001
140
BEDARD, K.; KRAUSE, K. The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases:
Physiology and Pathophysiology. Physiol Rev, v. 87, p. 245–313, 2007.
doi:10.1152/physrev.00044.2005.
BERNAL-OCHOA, F.; RUIZ-HERNANDEZ, A.; BERNAT, R. Lachesis muta 200 as a
hypotensive. British Homoeopathic journal, v.86, n. 1, p.35-36, 1997.
BONTKES, H. J.; de GRUIJL, T. D.; SCHUURHULS, G. J. ; SCHEPER, R. J. ;
MEIJER, C. J. L. M. ; HOOLJBERG, E. Expansion of dendritic cell precursor from
human CD34+ progenitor cells isolated from healthy donor blood; growth factor
combination determines proliferation rate and functional outcome. Journal of
Leukocyte Biology, v. 72, 321-329, 2002.
BOWDISH, D.M.E.; LOFFREDO, M.S., MUKHOPADHYAY, S., MANTOVANI, A,
GORDON, S. Macrophage receptors implicated in the ‘‘adaptive’’ form of innate
immunity. Microbes and Infection, v.9, 2007. doi:10.1016/j.micinf.2007.09.002
BROWN, D.I.; GRIENDLING, K. K. Nox proteins in signal transduction. Free Radical
Biology & Medicine, v.47, p. 1239-1253, 2009.
doi:10.1016/j.freeradbiomed.2009.07.023.
BRUCKDORF, R. The basics about nitric oxide. Molecular aspects of medicine,
v.26, p. 23-31, 2005.
CADENAS, S.; CADENAS, A. M. Flighiting the stranger-antioxidante protection
against endotoxin toxicity, Toxicology, p. 45-63, 2002.
CESAR, B.; ABUD, A.P.R.; DE OLIVEIRA, C.C.; CARDOSO, F.; GREMSKI, W.;
GABARDO, J.; BUCHI, D.F. Activation of mononuclear bone marrow cells treated in
vitro with a complex homeopathic medication. Micron, v. 39, n. 4, p. 461-470, 2008.
CESAR B, ABUD AR, DE OLIVEIRA, CC, CARDOSO F, DI BERNARDI RP.;
GUIMARÃES FSF, GABARDO J, BUCHI DF. Treatment with at Homeopathic
Complex Medication Modulates Mononuclear Bone Marrow Cell Differentiation.
eCAM, 2009.in press dói: 10.1093/ecam/nep119.
CHANG, L. C; SONG, L. L.; PARK, E. J.; LUYENGI, L.; LEE, K. J.; NORMAN, R.
Bioactive Constituents of Thuja occidentalis. Journal of Natural Product, v.63,
p.1235-1238, 2000.
CHENA, X.; CHOIB, Y.; CHANGC, T-S.; NOHC, Y. H.; SHIND, C. Y.; WUA, C-F.;
KOE, K. H.; KIM, W-K. Pretreatment with interferon-γ protects microglia from
o
xidative estresse via up-regulation of Mn-SOD. Free Radical Biology and
Medicine, v. 46, n. 8, p. 1204-1210, 2009. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2009.01.027
141
CITTERIO, S., RESCIGNO, M., FOTI, M., GRANUCCI, F., AGGUJARO, D.,
GASPERI, C., MATYSZAK, M. K., GIROLOMONI, G., RICCIARDI-CASTAGNOLI, P.
Dendritic cells as natural adjuvants. Methods., v. 19, p. 142-147, 1999.
CLARK, G. J.; ANGEL, N.; KATO, M.; LÓPEZ, J. A.; MACDONALD, K.; VUCKOVIC,
S.; HART, D. N.J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes
and Infection, v.2, p. 257−272, 2000.
COFFMAN, R. L. Surface antigen expression and immunoglobulin gene
rearrangement during mouse pre-B cell development. Immunol. Rev., v. 69, p. 5-23,
1982.
COLEMAN, J. W. Nitric oxide in immunity and inflammation. International
immunopharmacology, v.1, p. 1397-1406, 2001.
COUGOULE, C.; WIEDEMANN, A.; LIM, J.; CARON, E. Phagocytosis, an alternative
model system for the study of cell adhesion. Semin Cell Dev Biol, v. 15, p. 679-689,
2004.
CRISTEA, A.; NICULA, S.; DARE, V. Pharmacodynamic effects of very high dilutions
of Belladonna on the isolated rat duodenum. In: Bastide, M. (ed). Signals Images.
Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, p. 161-170, 1997.
CROSS, A. R., SEGAL, A. W. The NADPH oxidase of professional phagocytes-
prototype of the NOX electron transport chain systems. Biochimica et Biophysica
Acta, v.1657,1-22, 2004.
DALE, C.D.; BOXER, L. ; LILES, W. C. ; The phagocytes: neutrophils and
monocytes. Blood, v.112, p.935-945, 2008. doi:10.1182/blood-2007-12-077917
DAMICO, D.C.S., BUENO, L.G.F., RODRIGUES-SIMIONI, L., MARANGONI, S.
CRUZ-HÖFLING, NOVELLO, J.C.,. Neurotoxin and myotoxic actions from Lachesis
muta muta (surucucu) whole venon on the mouse and chick nerve-muscle
preparation. Toxicon, v. 46, p.222-229, 2005.
DAY, C. Aconitum napellus. British Homoeopathic Journal, v. 82, p. 97-105, 1993.
DAVE, V. P. Hierarchical role of CD3 chains in thymocyte development
Immunological Reviews, v. 232, p. 22-33, 2009. 10.1111/j. 1600-
065X.2009.00835.x
DEJARNETTE, J. B.; SOMMER, C. L. ; HUANG, K. ; WOODSIDE, K. J. ; EMMONS,
R. ; KATZ, K. ; SHORES, E. W.; LOVE, P. E. Specific requirement for CD3ε in T cell
d
evelopment. Immunology, v. 95, p. 14909–14914, 1998.
142
DEININGER, M. W. M.; GOLDMAN, J. M.; MELO, J. V. The molecular biology of
chronic myeloid leukemia. Blood, v. 96, n.10, p.3343-3356, 2000.
DENICOLA, A.; RADI, R. Peroxynitrite and drug-dependent toxicity. Nitric Oxide,
Cell Signalling and Death, v. 15, n.2, p.273-288, 2005.
DUBEY, S. H.; BATRA, A. Anti diabetic activity of Thuja occidentalis Linn. Research
J. Pharm. and Tech. v. 1, n.4, p. 362-365, 2008.
DUBEY, S. H.; BATRA, A. Role of Thuja occidentalis Linn. in prevention of
congestive heart disease. Journal of Pharmacy Research, v. 2, n.4, p.651-654,
2009a.
DUBEY, S. H.; BATRA, A. ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF THUJA OCCIDENTALIS
LINN. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, v. 2, n. 1, p. 73-
76, 2009b.
ERNST, E. Adverse effects of herbal drugs in dermatology. Br. J. Dermatol. v. 143,
923–929, 2000.
FIMIANI, V.; CAVALLARO, A.; AINIS, O.; BOTTARI, C. Immunomodulatory effect of
the homoeopathic drug Engystol-N on some activities os isolated human leukocytes
and in whole blood. Immunopharmacol. Immunotoxicol. v. 22, p.103-115, 2000.
FLEMING, T. J.; M. L. FLEMING, T. J.; MALEK, T. R. Selective expression of Ly-6G
on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-
differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of
Immunology, v. 151, n. 5, p. 2399-2408, 1993.
FISHER, P. How does homeopathy work: are we looking in the right place?
Homeopathy, vol. 92, p. 1-2, 2003.
FORMAN, H. J.; TORRES, M. Redox signaling in macrophages. Molecular Aspects
of Medicine,v.22, p.189-216, 2001.
FRASS, M.; LINKESCH, M.; BANYAI, S.; RESCH, G.; DIELACHER, C.; LO, T.;
ENDLER, C.; HAIDVOGL, M.; MUCHITSCH, I.; SCHUSTER, E.; Adjunctive
homeopathic treatment in patients with severe sepsis: a randomized, double-blind,
placebo-controlled trial in an intensive care unit. Homeopathy, v. 94, p.75-80, 2005.
GEORGAKOPOULOS, T.; MOSS, S. T.; KANAGASUNDARAM, V. Integrin CD11c
contributes to monocyte adhesion with CD11b in a differential manner and requires
Src family kinase activity. Molecular Immunology, v. 45, p. 3671-3681, 2008.
GESSANI, S.; BELARDELLI, F. IFN-γ Expression in Macrophages and Its Possible
B
iological Significance. Cytokine & Growth Factor Reviews, v. 9, n. 2, p.117-123,
1998.
143
GORDON, S. The role of the macrophage in immune regulation. Res. Immunology
149, 685-688, 1998.
GORDON, S. Macrophages and the immune response. Fundamental Immunology.
Philadelphia, Lippincott-Raven Publishers, p. 533-545, 1999.
GORDON S. Alternative activation of macrophages. Nature Reviews Immunology;
v. 3, p. 23-25, 2003.
GORDON, S.; TAYLOR, P.R. Monocyte and macrophage heterogeneity, Nature
Reviews Immunology, v.5, p. 953-964, 2005. doi:10.1038/nri1733
GREEN, L.C.; WAGNER, D. A.; GLOGOWSKI, J.; SKIPPER, P. L.; WISHNOK, J. S.
Analysis of nitrate, nitrite, and [
15
N ]-nitrate in biological fluids. Analytical
Biochemistry, v.126, p.131-138, 1982.
GRISHAM, M.B.; JOURD’HEUIL, D.; WINK, D.A. Nitric oxide. I. Physiological
chemistry of nitric oxide and its metabolites: implications in inflammation. Am. J.
Physiol., v. 276, 315-321, 1999.
GRUDEN-MOVSESIJAN, A., MILOSAVLJEVIC, L.J.S. The involvement of the
macrophage mannose receptor in the innate response to infection with parasite
Trichinella spiralis. Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 109, p. 57-
67, 2006.
GUIMARÃES, F.S.F.; ABUD, A.P.R.; OLIVEIRA, S.M.; OLIVEIRA, C.C.; CESAR, B.;
DONATTI, L.; GABARDO, J.; TRINDADE, E.S.; BUCHI, D.F. Stimulation of
lymphocyte anti-melanoma activity by co-cultured macrophages activated by complex
homeopathic medication. BMC Cancer, v. 9, p.293, 2009. doi: 10.1186/1471-2407-9-
293
GUIMARÃES, F. S. F.; ANDRADE, L. F.; MARTINS, S. T.; ABUD, A. P. R.; SENE, R.
V.; WANDERER, C.; TISCORNIA, I.; BOLLATI-FOGOLÍN, M.; BUCHI, D. F.;
TRINDADE, E. S. In vitro and in vivo anticancer properties of a Calcarea carbonica
derivative complex (M8) treatment in a murine melanoma model. BMC Cancer, v. 10,
n. 113, p. 2-14, 2010. http://www.biomedcentral.com/1471-2407/10/113
GUNSILIUS, E.; GASTL, G.; PETZER, A. L. Hematopoietic stem cells. Biomed
Pharmacother, v. 55, p. 186-194, 2001.
HALL, A.H. Chronic arsenic poisoning. Toxicol. Lett. v.128, p. 69-72, 2002
HAYFIELD, R. Vida nova: homeopatia. Remédios simples para uma saúde
natural. Lisboa: editora estampa Ltda, 1999.
HAN, Y.; KWON, Y.; CHUNG, H.; LEE, S.; SIMMONS, R.L.; BILLIAR, T. R.; KIM, Y.
Antioxidant enzymes suppress nitric oxide production through the inhibition of NF-kB
activation: role of H
2
O
2
and nitric oxide in inducible nitric oxide synthase expression in
macrophage.Nitric oxide: biology and Chemistry. v.5, p. 504-513, 2001.
144
HÁJEK, R.; BUTCH, A. W. Dendritic cell biology and the application of dendritic cells
to immunotherapy of multiple myeloma. Med Oncol. , v. 17, n. 1, p. 2-15, 2000.
HARRIS, E. S.; MCINTYRE, T. M.; PRESCOTT, S. M.; ZIMMERMAN, G. A. The
Leukocyte Integrins. The Journal of Biological Chemistry, v. 275, n. 31,f.4, p.
23409-23412, 2000. DOI 10.1074
HASEGAWA, K.; NISHIMURA, H.; OGAWA, S.; HIROSE, S.; SATO, H.; SHIRAI, T.
Monoclonal antibodies to epitope of CD45R (B220) inhibit interleukin 4-mediated B
cell proliferation and differentiation. Int. Immunol. , v. 2, n. 4, p. 367-375, 1990.
HAUKE W, KÖHLER G, HENNEICKE-VON ZEPELIN HH, FREUDENSTEIN J.
Esberitox®N as Supportive therapy when providing standard antibiotic treatment in
subjects with a severe bacterial infection (acute exacerbation of chronic bronchitis).
Chemotherapy, v. 48, p. 259–66, 2002.
HESTDAL, K.; RUSCETTI, F. W.; IHLE, J. N.; JACOBSEN, S. E.; DUBOIS, C. M.;
KOPP, W. C.; LONGO, D. L.; KELLER, J. R. Characterization and regulation of RB6-
8C5 antigen expression on murine bone marrow cells, The Journal of Immunology,
v.147, n. 1, 22-28, 1991.
HONG, S.; JEONG, H.; CHUNG, H.; KIM, H; CHAE, H.; SHIN, T.; SEO, Y., KIM, H.
An herbal formula, Herbkines, enhances cytokines production from immune cells.
Journal of Ethnopharmacology, v. 98, p. 149-155, 2005.
HUME, D. A. The mononuclear phagocyte system. Current Opinion in
Immunology, v. 18, p. 49.53, 2006. DOI 10.1016/j.coi.2005.11.008
HURLEY, R. W.; MCCARTHY, J. B.; VERFAILLIE, C. M. Direct Adhesion to Bone
Marrow Stroma via Fibronectin Receptors Inhibits Hematopoietic Progenitors
proliferation. J. Clin. Invest. v. 96, 511-519, 1995.
IMADA, C.; HASUMURA, M.; NAWA, K. Promotive effect of macrophage colony-
stimulating factor on long-term engraftment of murine hematopoietic stem cells.
Cytokine, v.31, p.447–453, 2005.
INABA, K.; INABA, M.; ROMANI, N.; AYA, H.; DEGUSHI, M.; IKEHARA, S.;
MURAMATSU, S.; STEINMANLL, R. M. Generation of Large Numbers of Dendritic
Cells from Mouse Bone Marrow Cultures Supplemented with
Granulocyte/Macrophage Colony-stimulating. Exp. Med. ,v. 176, p. 1693-1702,
1992.
JACOBS, J.; HERMAN, P.; HERON, K.; OLSEN, S.; VAUGHTERS, L. Homeopathy
for Menopausal Symptoms in Breast Cancer Survivors: A Preliminary Randomized
Controlled Trial. The Journal of Alternative and Complementary Medicine, v.11,
n.1, p. 21-27, 2005.
145
JANDUS, C.; BIOLEY, G.; SPEISER, D. E.; ROMERO, P. Selective accumulation of
differentiated FOXP3+ CD4+ T cells in metastatic tumor lesions from melanoma
patients compared to peripheral blood. Cancer Immunology and Immunotherapy,
v. 57, n.12, p. 1795-1985, 2008.
JANEWAY, C.; TRASVERS, P.; WALPORT, M.; SHOMCHIK, M.J. Imunobiologia.
Sexta edição, editora Artmed, 2007.
JONAS, W.; KAPTCHUK, T.J.; LINDE, K. A critical overview of homeopathy. Annals
of Internal Medicine, vol. 138, p. 393-399, 2003.
JONAS, W.B.; JACOBS, J. A cura através da homeopatia. Rio de Janeiro, editora
Campus: 1996.
JONES, R.D., HANCOCK, J. T., MORICE, A.H.. NADPH oxidase: A universal oxygen
sensor? Free Radic Biol Med, v. 29, n. 5, p. 416-424, 2000.
JOHNSTON, R.B.; GODZIK, C.A.; COHN, Z.A. Increased superoxide anion
production by immunologically activated and chemically elicited macrophages.
Journal of Experimental Medicine, vol. 148, p. 115-127, 1978.
KAUL, N.; FORMAN, H. J. Activation of NFkB by the respiratory burst of
macrophages. Free Radical Biology & Medicine, v. 21, n. 3, p. 401-405, 1996.
KERRIGAN, A. M.; BROWN, G. D. C-type lectins and phagocytosis.
Immunobiology, v.214, p. 562-575, 2009. doi:10.1016/j.imbio.2008.11.003
KHUDA-BUKHSH, A. Potentized homoeopathic drugs act through regulation of gene
expression: a hypothesis to explain their mechanism and pathways of action in vitro.
Complementay Therapies in Medicine, vol. 5, p. 43-46, 1997.
KHUDA-BUKHSH, A. R. ; PATHAK, S. ; GUHA, B.; KARMAKAR, S.R.; DAS, J.K.;
BANERJEE, P.; BISWAS, S.J.; MURKHERJEE, P.; BHATTACHARJEE, N.;
CHOUDHURY, S.C.; BANERJEE, A.; BHADRA, S.; MALICK, P.; CHAKRABARTI, J.;
MANDALA, B. Can Homeopathic Arsenic Remedy Combat Arsenic Poisoning in
Humans Exposed to Groundwater Arsenic Contamination?: A Preliminary Report on
First Human Trial. eCAM, v. 2, n. 4, p.537-548, 2005. doi:10.1093/ecam/neh124
KLEIN, F.; FELDHAHN, N.; LEE, S.; WANG, H.; CIUFFI, F.; VON ELSTERMANN,
M.; TORIBIOS, M. L.; SAUER, H.; WARTENBERG, M.; BARATH, V. S.; KRÖNKE,
M.; WERNETT, P. ROWLEY, J. D.; MUSCHEN, M. T lymphoid differentiation in
human bone marrow. PNAS, v.100, n.11, p.6747-6752, 2003. dói:
10.1073/pnas.1031503100
146
KIM, S.H.; JOHNSON, V. J.; SHARMA, R. P. Mercury inhibits nitric oxide production
but activates proinflammatory cytokine expression in murine macrophage: differential
modulation of NF-κB and p38 MAPK signaling pathways. Nitric Oxide, v. 7; p. 67–
74, 2002
KLIMP, A. H.; DE VRIES, E. G. E.; SCHERPHOF, G. L.; DAEMEM, T. A potential
role of macrophage activation in the treatment of cancer, Critical Reviews in
Oncology/hematology, v. 44, p. 183-161, 2002.
KISHIMOTO, K. T.; LARSON, R. S.; CORBI, A. L.; DUSTIN, M. L.; STAUTON, D. E.;
SPRINGER, T. A.; The Leukocyte Integrins. In: DIXON, F. J. Advances in
immunology, San Diego, Califórnia: Academic press, v. 46, 1990, p149-182.
KONDO, M., WAGERS, A.J., MANZ, M.G., PROHASKA, S.S., SCHERER, D.C.,
BEILHACH, G.F., SHIZURU, J.A., WEISSMAN, I.L. Biology of hematopoietic stem
cells and progenitors: implications for clinical application. Annual Review of
Immunology v. 21, p. 759-806, 2003.
KORBLING, M.; ESTROY, Z. Adult stem cells for tissue repair – a new therapeutic
concept? N Engl J Med, v. 349, n 6, p. 570-582, 2003.
KRAUZE-BARANOWSKA, M.; CISOWSKI, W. Flavone c-glycosides from Bryonia
alba and B. dioica. Phytochemistry, vol. 39(3), p. 727-729, 1995.
KRIS-ETHERTON, P. M.; LICHTENSTEIN, A. H.; HOWARD, B. V.; STEINBERG, D.;
WITZTUM, J. L. Antioxidant vitamin supplements and cardiovascular disease.
Circulation, v.110, p.637–641, 2004.
KUSMARTSEV, S.; GABRILOVICH, D. I.; Inhibition of myeloid cell differentiation in
cancer: the role of reactive oxygen species, Journal of Leukocyte Biology, v. 74, p. 1-
11, 2003. doi:10.1189/jlb.0103010
LAI, A.; KONDO, M. T and B lymphocyte differentiation from hematopoietic stem cell.
Semin Immunol. v. 20, n. 4, p. 207–212, 2008. doi:10.1016/j.smim.2008.05.002.
LI, N.; KARIN, M. Is NF-κB the sensor of oxidative estresse? The FASEB Journal,
vol. 13, p. 1137-1143, 1999.
LINARES, E.; GIORGIO S.; MORTARA, R. A.; SANTOS, C. X. C., YAMADA, A. T.;
AUGUSTO, O. Role of peroxynitrite in macrophage microbicidal mechanisms in vivo
revealed by protein nitration and hydroxylation. Free Radic. Biol. Med. v. 30, n. 11,
p. 1234-42, 2001.
LOPES, L.; GODOY, L.M.F.; DE OLIVEIRA, C.C.; GABARDO, J.; SCHADECK, .J.G.;
BUCHI, D.F. Phagocytosis, endosomal / lisosomal system and other cellular aspects
of macrophage activation by Canova medication. Micron, v. 37, p. 277-287, 2006.
147
LU, J.; CHEW, E.; HOLMGREN, A.; Targeting thioredoxin reductase is a basis for
cancer therapy by arsenic trioxide. PNAS, v.104, n. 30, p.12288-12293, 2007.
doi_10.1073_pnas.0701549104
LUNA, A. L.; ACOSTA-SAAVEDRA, L. C.; LOPEZ-CARRILLO, L.; CONDE, P.;
VERA, E.; DE VIZCAYA-RUIZ, A., BASTIDA, M.; CEBRIAN, M. E.; CALDERON-
ARANDA, E. S. Arsenic alters monocyte superoxide anion and nitric oxide production
in environmentally exposed children. Toxicology and Applied Pharmacology, In
Press, Corrected Proof, 2010.
MANDUCA, P.;MARCHISIO, S.; ASTIGIANO, S.; ZANOTTI, S.; GALMOZZI, F.;
PALERMO, C.; PALMIERI, D. FMS*Calciumfluor specifically increases mRNA levels
and induces signaling via MAPK 42,44 and not FAK in differentiating rat osteoblalst.
Cell Bioloby International, vol. 29, p. 629-637, 2005.
MARKS, CASSANDRA. Homeopatia: guia prático. São Paulo: Callis Editora Ltda,
1997.
MATHIE, R.T. The research evidence base for homeopathy: a fresh assessment of
the literature. Homeopathy, vol. 92, p. 84-91, 2003.
MELLMAN, I. Antigen processing and presentation by dendritic cells: cell biological
mechanism. Adv Exp Med Biol, v. 560, p. 63-67, 2005.
MITRA, K.; KUNDU, S.N.; KHUDA BUKHSH, A.R. Efficacy of a potentized
homoeopathic drug (Arsenicum Album-30) in reducing toxic effects produced by
arsenic trioxide in mice: I. On rate of accumulation of arsenic in certain vital organs.
Complementary Therapies in Medicine, vol. 6, p. 178-184, 1998.
MITRA, K.; KUNDU, S.N.; KHUDA BUKHSH, A.R. Efficacy of a potentized
homoeopathic drug (Arsenicum Album-30) in reducing toxic effects produced by
arsenic trioxide in mice: II. On alterations in body weight, tissue weight and total
protein. Complementary Therapies in Medicine, v.7, p. 24-34, 1999.
MOLIFE, R.; HANCOCK, B.W. Adjuvant therapy of malignant melanoma. Current
Reviews in Oncology/Hematology, v. 44, p. 81-102, 2002
MONROE, J. G.; DORSHKIND, K. Fate decisions regulating bone marrow and
peripheral B lymphocyte developmen. Adv. Immunol., v. 95, p. 1-50, 2007.
doi:10.1016/S0065-2776(07)95001-4
MOSSER, D. M.; EDWARDS, J.P. Exploring the full spectrum of macrophage
activation, v.8, p. 958-969, 2008, doi:10.1038/nri2448.
MÜLLER-SIEBURG, C.E., DERYUGINA, E. The stromal cells: guide to the stem cell
universe. Stem Cells vol, 13, p. 477-486, 1995.
148
MURPHY, M.P., PACKER, M.A., SCARLETT, J.L., MARTIN, S.W. Peroxynitrite: a
biologically significant oxidant. Gen Pharmacol, v. 31, n.2, 179-86, 1998.
MURTAUGH, M. P., FOSS, D. L, Inflammatory cytokines and antigen presenting cell
activation. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.87, p.109-121, 2002.
NATHAN, C.; SHILOH, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the
relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. PNAS, v. 97, n. 16,
p. 8841–8, 2000.
NASER, B.; BODINET, C.; TEGTMEIR, M.; LINDEQUIST, U. Thuja occidentalis
(Arbor vitae): A review of its pharmaceutical, pharmacological and clinical properties.
Evidence-based complementary and alternative medicine, vol. 2, n. 1, p. 69-78,
2005.
NYGREN, H.; BROBERG, M.; ERIKSSON, C.; SAHLIN, H.; YAHYAPOUR, N. The
respiratory burst response of surface-adhering leukocytes. A key to tissue
engineering. Colloids and Surfaces, vol. 22, p. 87-97, 2001.
NOGUEIRA, G. W. G.; RIMOLI, M.A.; TURCI, M. B.; GUILHERME, S.D.; MOLLO, S.
A.; BARNABÉ, V.D. Doutrina Médica Homeopática, São Paulo, Grupo de Estudos
Homeopáticos de São Paulo “Benoit Mure”, 1986.
NORTH, R.J. The concept of the activated macrophage. The journal of
immunology, v. 121, n. 3, p.806-809, 1978.
OBERBAUM, M.; GLATTHAAR-SAALMULLER, B.; STOLT, P.; WEISER, M.,
Antiviral Activity of Engystol
®
: An In Vitro Analysis. The Journal of Alternative and
Complementary Medicine, v.11, n.5, p.855-862, 2005.
OGAWA, M. Differentiation and Proliferation of Hematopoietic Stem Cells. Blood, v.
81, n.11, p. 2844-2853, 1993.
OLIVEIRA, S. M. TRIAGEM DE MEDICAMENTOS HOMEOPÁTICOS QUE ATIVAM
MACRÓFAGOS COM DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE IFN-γ, IL-4 E NO. 122 f.
Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) – Setor de Ciências
Biológicas, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2005.
OLIVEIRA, C.C.; OLIVEIRA, S. M.; GODOY, L.M.F.; GABARDO, J.; BUCHI, D.F.
Canova, a Brazilian medical formulation, alters oxidative metabolism of mice
macrophages. Journal of Infection, v. 52, p. 420-432, 2006.
OLIVEIRA, C.C.; OLIVEIRA, S.M.; GOES, V.M.; PROBST, C.M.; KRIEGER, M.A.;
BUCHI, D.F. Gene expression profiling of macrophages following mice treatment with
an immunomodulator medication. Journal of Cellular Biochemistry, v. 104, n.4, p.
1364-1377, 2008.
149
OLOFSSON, P.; HOLMBERG, J.; TORDSSON, J.; LU, S; AKERSTRÖM, B.;
HOLMDAHL, R. Positional identification of Ncf1 as a gene that regulates arthritis
severity in rats. Nature Genetics, v.33, p. 25-32, 2002. doi:10.1038/ng1058
OLOFSSON, P.; NERSTEDT, A.; HULTQVIST, M.; NILSSON, E. C.; ANDERSSON,
S.; BERGELIN, A.; HOLMDAHL, R. Arthritis suppression by NADPH activation
operates through an interferon-β pathway. BMC Biology, v. 5, n. 19, 2007.
doi:10.1186/1741-7007-5-19.
PALERMO, C.; FILANTI, C.; POGGI, S.;MANDUCA, P. Osteogenesis in vitro in rat
tibia-derived osteoblasts is promoted by the homeopathic preparation,
FMS*Calciumfluor. Cell Biology Internationa, vol. 23, n. 1, p. 31-40, 1999. cbir
1998.0312.
PALUDAN, S.R.; ELLERMANN-ERIKSEN, S.; LOVMAND, J.; MOGENSEN, S.C.
Interleukin-4-mediated inhibition of nitric oxide production in interferon-γ-treated and
virus-infected macrophages. Scandinavian Journal of Immunology, v. 49, p.169-
176, 1999.
PARKIN, J.; COHEN, B.; Overview of the immune system, The Lancet, v. 357, 2001.
PATTERSON, R.; VEGA, L.; TROUBA, K.; BORTNER, C.; GERMOLEC, D. Arsenic-
induced alterations in the contact hypersensitivity response in Balb/c mice.
Toxicology and Applied Pharmacology, v.198, 434– 443, 2004.
PEDALINO, C.M.V.; PERAZZO, F.F.; CARVALHO, J.C.T.; MARTINHO, K.S.;
MASSOCO, C.; BONAMIM, L.V. Effect of Atropa belladonna and Echinacea
angustifolia in homeopathic dilution on experimental peritonitis. Homeopathy, v.93,
p. 193-198, 2004.
PIEMONTE, M. R. Alterações Estruturais em Macrófagos Peritoneais de
Camundongos Tratados com o Método Canova
®
. Curitiba, 2000. Dissertação
(Mestrado em Morfologia), Universidade Federal do Paraná.
PIEMONTE, M.R.; BUCHI, D.F. Analysis of IL-2, IFN-γ and TNF-α production, α
5
β
1
integrins and actin filaments distribution in intraperitoneal mouse macrophages
treated with homeopatic medicament. J. Submicrosc. Cytol. Pathol., v. 3, 2002.
PICK, E.; KEISARI, Y. A simple colorimetric method for the measurement of
hydrogen peroxide produced by cells in culture. Journal of Immunological
Methods, vol. 38, p. 161-170, 1980.
PICK, E.; MIZEL, D. Rapid microassays for the measurement of superoxide and
hydrogen peroxide production by macrophages in culture using an automatic enzyme
150
immunoassay reader. Journal of Immunological Methods, vol. 46, p. 211-226,
1981.
PRIBILA, J. T.; SHIMIZU, Y. Signal Transduction Events Regulating Integrin Function
and T Cell Migration. Immunologic Research, v. 27, n.1, p. 107–128, 2003.
RETH, M. Hydrogen peroxide as second messenger in lymphocyte activation. Nature
Immunology, v. 3, p. 1129–1134, 2002. doi:10.1038/ni1202-1129
SASSADA, M., PABST, M.J., JOHNSTON, JR. R.B. Activation of mouse peritoneal
macrophages by lipopolysaccharide alters the kinetic parameters of the superoxide-
producing NADPH oxidase. J Biol Chem.v. 258, n. 16, p. 9631–5, 1983.
SATO, D.Y.O.; WAL, R.; DE OLIVEIRA, C.C.; CATTANEO, R.I.I.; MALVEZZI, M.;
GABARDO, J.; BUCHI, D.F. Histopathological and immunophenotyping studies on
normal and sarcoma 180-bearing mice treated with a Brazilian homeopathic
medication. Homeopathy, v. 94, n. 1, p. 26-32, 2005.
SEGAL, A. W.; ABO, A. The biochemical basis of the NADPH oxidase of phagocytes.
TIBS, v. 18, p. 43-47, 1993.
SELIGMANN, I.C.; LIMA, P.D.; CARDOSO, P.C.; KHAYAT, A.S.; BAHIA, M.O.;
BUCHI, D.F.; CABRAL, I.R.; BURBANO, R.R. The anticancer homeopathic
composite “Canova Method” is not genotoxic for human lymphocytes in vitro.
Genetics and Molecular Research, v. 2, n. 2, p. 223-228, 2003.
SHEALY, N. Enciclopédia ilustrada de remédios naturales. Barcelona: editora
Konemann, 1999.
SILVA, M.T. When two is better than one: macrophages and neutrophils wor in
conert in innate immunity as complementary and cooperative partners of myeloid
phagocyte system. Journal of Leukocyte Biology, v. 87, p. 93-106, 2010.
doi:10.1189/jlb.0809549
SMITS, E. L. M.; BERNEMAN, Z. N.; TENDELOO, V. F. I. Immunotherapy of Acute
Myeloid Leukemia: Current Approaches. The Oncologist, v. 14, p. 240–252, 2009.
doi: 10.1634/theoncologist.2008-0165
SNOECK, H. W.; LENJOU, M.; LARDON, F.; PEETERMANS, M. E.; VAN
BOCKSTAELE, D. R.; MOUJILIN, A.; HAENEN, L.; BERNEMAN, Z. N. Interleukin 4
and interferon gamma costimulate the expansion of early human myeloid colony-
forming cells. Proposal of a model for the regulation of myelopoiesis by interleukin 4
and interferon gamma and its integration with the regulation of the immune response.
Leukemia, v. 10, n. 1, p. 117-122, 1996.
151
STEINBRINK, K.; MAHNKE, K.; GRABBE, STEPHAN, ENK, A.; JONULEIT, H.
Myeloid dendritic cell: From sentinel of immunity to key player of peripheral
tolerance? Human Immunology, v. 70, p. 289-293, 2009.
SZABÓ, C. Multiple pathways of peroxynitrite cytotoxicity. Toxicol Lett. v. 140,
p.105-12. 2003
TAYLOR, P.R.; MARTINEZ-POMARES, L.; STACEY, M.; LIN, H-H.; BROWN, G.D.;
GORDON, S. Macrophage receptors and immune recognition. Annu. Rev.
Immunol., v. 23, p.901–44, 2005.doi: 10.1146/annurev.immunol.23.021704.115816
TRINCHERI, G. Cytokines acting on or secreted by macrophages during intracellular
infection (IL-10, IL-12, IFN-γ). Current Opinion in Immunology, v. 9, p.17-23, 1997.
TOLEDO, J. A.; Estudiate a ti mismo. Buenos Aires, Argentina,: 1910, editora Casa
Jacobo Peuser.
UNANUE, E. R., ALLEN, P. M. The basis for the immunoregulatory role of
macrophages and other accessory cells. Science, v. 1, n. 236 (4801), p. 551–557,
1987
VAN FURTH, R., DIESSELHOF-DEN DULK, M.M.C., MATTIE, H.,. Quantitative study
on the production and kinetics of mononuclear phagocytes during an acute
inflammatory reaction. The Journal of Experimental Medicine, v. 138, p. 1314-
1330, 1973.
VAN DER VEEN, R.C.; DIETLIN, T.A.; GRAY, J.D.; GILMORE, W. Macrophage-
derived nitric oxide inhibits the proliferation of activated T helper cells and is induced
during antigenic stimulation of resting T cells. Cellular Imunology, v.1999, p.43-49,
2000.
VAN DER VEEN, R.C. Nitric oxide and T helper cell immunity, International
Immunopharmacology, v.1, p.1491–1500, 2001.
VARIN, A.; GORDON, S. Alternative activation of macrophages: immune function
and cellular biology. Immunobiology, v.214, n.7, p.630-641, 2009.
VEAL, E. A; DAY, A. M; MORGAN, B. A. Hydrogen Peroxide Sensing and Signalin.
Molecular Cell, v. 26, p. 1-14, 2007.
VIEIRA, S. Introdução à bioestatística. 5
a
ed, Ed. Campos, Rio de Janeiro, 1980.
VENKATA-REDDY, M.; GANGADHARAM, P.R.J. Heat schock treatment of
macrophages causes increased released superoxide anion. Infect. Immunol., v. 60,
p. 2386-2390, 1992.
152
VICKERS, A.; ZOLLMAN, C. ABC of complementary medicine: Homoeopathy.
British Medical Journal, vol.519, p. 1115-1118, 1999.
VIRÁG, L.; SZABÓ, E.; GERGELY, P.; SZABÓ, C. Peroxynitrite-induced cytotoxicity:
mechanism and opportunities for intervention. Toxicology letters, vol. 40-141, p.
113-124, 2003.
VOJDANI, A.; ERDE, J. Regulatory T cells, a potent immunoregulatory target for
CAM researchers: Modulating tumor immunity, autoimmunity and alloreactive
immunity (III). Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, v. 3, p.
309-316, 2006.
WALACH, H.; KÖSTER, H.; HENNIG, T.; HAAG, G. The effects of homeopathic
belladonna 30 CH in healthy volunteers – a randomized, double blind experiment.
Journal of Psychosomatic Research, vol. 50, p. 155-160, 2001.
WEIGERT, A., BRÜNE, B. Nitric oxide, apoptosis and macrophage polarization
during tumor progression. Nitric Oxide, v. 19, p. 95-102, 2008.
WOOD, K.J., AUSTYN, J.M. Principles of celular and molecular immunology.
Oxford University press Inc, New York, 1993.
XIA, Y., ZWEIER, J.L. Superoxide and peroxynitrite generation from inducible nitric
oxide synthase in macrophages. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, vol. 94, p. 6954-6958, 1997.
YANG, H.; YU, J.;FU, G.; SHI, X.; XIAO, L. ; CHEN, Y.; FANG, X.; HE, C. Interaction
between single molecules of Mac-1 and ICAM-1 in living cells: An atomic force
microscopy study. Experimental cell research, v. 313, p. 3497-3504, 2007.
YI, Q. Dendritic cell-based immunotherapy in multiple myeloma. Leuk Lymphoma.,
v. 44, n. 12, p. 2031-8, 2003. DOI: 10.1080/1042819031000116599
ZDOLSEK, J. E.; EATON, J. W.; TANG, L. Histamine released and fibrinogen
adsorption mediate acute inflammatory responses to biomaterial implants in humans.
J. Transl. Med., v. 5, n. 31, p. 1-16, 2007.
ZHOU, Y.; LIN, G.; MURTAUGH, M. P. Interleukin-4 suppresses the expression of
macrophage NADPH oxidase heavy chain subunit (gp91-phox). Biochimica et
Biophysica Acta, v. 1265, p. 40-48, 1995.
153
ANEXOS
154
ANEXO 1 - OBTENÇÃO E COLETA DE MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE
CAMUNDONGO
• Sacrificar os camundongos por deslocamento cervical.
• Prendê-los em uma cama de isopor forrada.
• Borrifar álcool 70% em água destilada para desinfeção do pelo.
• Levantar a pele ventral com o auxílio de duas pinças dente de rato,
puxando-a em direções contrárias para que esta seja rompida e o peritônio
exposto.
• Com uma seringa de 10 ml e agulha estéreis, injetar na cavidade peritoneal
tampão PBS (Phosphate Buffer Solution), pH 7,2, gelado (4°C) e estéril,
com o cuidado para não romper nenhuma víscera.
• Agitar a solução salina no interior do peritônio, dando batidas nas laterais
do abdômen para que os macrófagos presos na parede do peritônio se
soltem.
• Retirar a solução com a seringa e agulha. Este lavado conterá os
macrófagos peritoneais.
• Transferir o lavado para um recipiente estéril e acondicioná-lo no gelo.
155
ANEXO 2 - OBTENÇÃO E COLETA DE CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA DE
CAMUNDONGO
• Sacrificar os camundongos por deslocamento cervical.
• Prendê-los em uma cama de isopor forrada com plástico.
• Borrifar álcool 70% em água destilada para desinfeção do pelo
• Com o auxílio de uma tesoura pequena e de ponta fina, retirar os fêmures,
limpar toda a pele e músculo e transportá-los para o fluxo laminar.
• Cortar as epífises
• Com uma seringa de 5 mL e uma agulha, injetar 2 mL de meio Dulbecco’s
Modified Eagle Medium (DMEM) ( acrescido de soro bovino fetal 10%, fetal
contendo penicilina 1 U/ml, estreptomicina 1 µg/ml, e anfotericina 2,5 µg/l)
dentro do fêmur, através de uma das aberturas feita com a remoção das
epífises. Pode-se repetir esse processo, até que a diáfise do fêmur
encontre-se mais clara do que anteriomente. Dessa forma, o meio de
cultura “lava” as células do interior do osso.
• Colocar a suspensão celular em tubo de centrífuga (os grumos de células
da suspensão podem ser desfeitos puxando-os e soltando-os com a agulha
e seringa).
• centrifugar a 2.800 rpm por 3 minutos.
• Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em de meio de
cultura.
156
ANEXO 3 - MEIO DE CULTURA DULBECCO’S MODIFIED EAGLE MEDIUM (DMEM)
• 1 pacote de pó para meio DMEM marca Gibco
TM
• 3,7g de bicarbonato de sódio
• 2,5g de N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid
(HEPES).
Completar para 900 mL de água bidestilada
Filtrar com membrana de 0,22µm estéril.
• Adicionar 100 ml de soro bovino fetal SBF) termoinativado Gibco
TM
• 200 U/mL de penicilina
• 100 µg/ml de estreptomicina
• 2,6 µg/ml de anfotericina
157
ANEXO 4 – INTERAÇÃO MACRÓFAGOS-LEVEDURA
• Após 48 horas de cultivo retirar o meio de cultura e lavar as células
com meio DEMEM sem soro bovino fetal a 37
o
C,
• Adicionar as leveduras (Saccharomyces cerevisiae) em meio sem soro,
e incubar a placa a 37
o
C e 5% CO
2
por duas horas, na proporção de 10
leveduras para cada macrófago, ou seja, 1x10
7
.
• Após o período de interação, lavar as células com PBS (pH 7,4, a
37
o
C) para remoção dos microrganismos não fagocitados,
158
ANEXO 5 – DETECÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO)
segundo Green et al., 1982
⇒
⇒⇒
⇒ Cultivar em placas de 96 poços (3,5 a 5 x 10
5
células/poço) pelo tempo
determinado, OBS: caso o tratamento seja in vivo adicionar as células e deixar aderir
por 15 minutos em estufa 37
o
C com 5% de CO
2
.
⇒
⇒⇒
⇒ Como controle positivo adicionar a alguns poços LPS (50ng/ml) e IFN-
(26U/ml), em meio DMEM e incubar por 24 horas.
⇒
⇒⇒
⇒ Retirar 100µl do sobrenadante e transferir para uma outra placa,
⇒
⇒⇒
⇒ Adicionar 100µl do reagente de Griess*
⇒
⇒⇒
⇒ Incubar 10 minutos a temperatura ambiente,
⇒
⇒⇒
⇒ Ler a absorbância em leitor de microplacas utilizando filtro de comprimento de
onda de 550nm, OBS: utilizar um poço como branco, contendo apenas o reagente
de Griess.
⇒
⇒⇒
⇒ Calcular a concentração de NO, utilizando curva padrão de nitrito de sódio (10
– 80 µM).
*Reagente de Griess (GREEN ET AL., 1982).
Foram preparadas duas soluções mães:
Solução A: Naftiletilenodiamino 0,1% (p/v) em ácido-ortofosfórico 5%(v/v)
Solução B: Sulfonamina p-aminobenzeno 1% (p/v) em ácido orto-fosfórico 5%
(v/v).
As duas soluções A e B foram misturadas no momento imediato do uso na
proporção de 1:1.
Obs.: As soluções separadas podem ser estocadas na geladeira por 1 mês.
159
ANEXO 6 – DETECÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H
2
O
2
)
segundo Pick e Mizel, 1981
⇒
⇒⇒
⇒ Cultivar em placas de 96 poços (3,5 a 5 x 10
5
células/poço) pelo tempo
determinado, OBS: caso o tratamento seja in vivo adicionar as células e deixar aderir
por 20 minutos em estufa 37
o
C com 5% de CO
2
.
⇒
⇒⇒
⇒ Lavar o meio de cultivo com “Hank´s Buffered Salt Solution” (HBSS) a 37
o
C,
⇒
⇒⇒
⇒ Adicionar meio de reação (MR) contendo vermelho de fenol a 1M e 15 U/ml de
peroxidase (HRPO tipo VI-A, 1310U/ml – Sigma) dissolvidos em HBSS (com ou sem
drogas testadas),
⇒
⇒⇒
⇒ Como controle positivo adicionar ao MR forbol miristato acetato (PMA) na
concentração de 1µl/ml. Como branco utilizar apenas o MR.
⇒
⇒⇒
⇒ Após o tempo desejado, retirar o sobrenadante e passar para uma placa nova
de 96 poços contendo 10µl de solução aquosa de NaOH 1N em cada poço,
⇒
⇒⇒
⇒ A oxidação do vermelho de fenol deverá ser quantificada através de leitura da
absorbância em leitor de microplacas utilizando filtro de comprimento de onda de
620 nm. Os resultados serão obtidos em densidade óptica e deverão ser
comparados com uma curva padrão de concentrações variáveis de H
2
O
2
.
Curva:
⇒
⇒⇒
⇒ Diluir o H
2
O
2
a 1:10, 1:100 e 1:1000 em água destilada e obter a concentração
dessas soluções através de sua absorbância em 240 nm (em espectrofotômetro,
utilizando cubeta de quartzo e lâmpada de deutério),
⇒
⇒⇒
⇒ Utilizar a absorbância encontrada na solução 1:1000 na fórmula C = A/ε (Onde
A = absorbância, ε = 39,58 M
-1
cm
-1
e C = concentração),
⇒
⇒⇒
⇒ Preparar uma solução mãe (concentração de 1 mmolar) a partir da solução de
H
2
O
2
1:100 em vermelho de fenol 1M diluído em HBSS,
⇒
⇒⇒
⇒ Preparar soluções nas concentrações de 1, 10, 25 e 50 nmoles e colocá-los
em banho maria à 37
o
C,
⇒
⇒⇒
⇒ Adicionar peroxidase na concentração final de 15U/ml e após 15 minutos
adicionar 10 µl de NaOH a 1M,
⇒
⇒⇒
⇒ Ler em leitor de microplacas utilizando filtro de comprimento de onda de 620
nm utilizando como branco apenas a solução mãe.
160
ANEXO 7 – DETECÇÃO DE ANION SUPERÓXIDO (O
2
-
)
segundo Johnston, Godzik e Cohn, 1978
⇒
⇒⇒
⇒ Cultivar em placas de 96 poços (3,5 a 5 x 10
5
células/poço) pelo tempo
determinado, OBS: caso o tratamento seja in vivo adicionar as células e deixar aderir
por 20 minutos em estufa 37
o
C com 5% de CO
2
.
⇒
⇒⇒
⇒ Lavar o meio de cultivo com “Hank´s Buffered Salt Solution” (HBSS) a 37
o
C,
⇒
⇒⇒
⇒ Adicionar meio de reação contendo citocromo c 80 µM dissolvido em HBSS
OBS: P.M. citocromo c = 12327
⇒
⇒⇒
⇒ Como controle positivo adicionar ao meio de reação PMA na concentração de
1µl/ml, OBS: utilizar um poço como branco, contendo o meio de reação sem as
células.
⇒
⇒⇒
⇒ Após a incubação retirar 100µl do meio de reação e passar para uma placa
nova e ler a absorbância em leitor de microplacas utilizando filtro de comprimento de
onda de 550nm.
⇒
⇒⇒
⇒ Na leitura os poços devem ser zerados com o branco = HBSS + citocromo c
Cálculo:
⇒
⇒⇒
⇒ Para determinar a concentração de O
2
-
correspondente à concentração de
citocromo c reduzido usa-se o Coeficiente de Extinção Molar (ε = 2.1 x 10
4
M
-1
cm
-1
):
⇒
⇒⇒
⇒ C = A/ε
161
ANEXO 8 – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
• Fixação: Gutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato 0,1M, ph 7,2 por 2 horas em
temperatura ambiente.
• Lavagem em Tampão Cacodilato de Sódio 0,1M, 3 vezes 10 minutos cada.
• Pós-fixação:
Tetróxido de Ósmio 1% em Tampão Cacodilato de Sódio 0,1M, por
15 minutos, no escuro e à temperatura ambiente
• Lavagem em Tampão Cacodilato de Sódio 0,1M, 3 vezes.
• Desidratação: álcool 50%, 70%, 90% e 100%, de 10 a 20 minutos cada.
• Ponto Crítico: CO
2
• Metalização: ouro
• Observação : Microscópio Eletrônico de Varredura
162
ANEXO 9 - IMUNOCITOQUÍMICA PARA CITOMETRIA DE FLUXO
• Centrifugação do sobrenadante da cultura;
• Sobrenadante desprezado e fixação do pellet com paraformaldeído
(EMS) 1%, por 1 hora;
• Células aderidas na garrafa também foram fixadas com
paraformaldeído (EMS) 1%, por 1 hora;
• Células aderidas, após a fixação, foram raspadas;
• Centrifugação das células fixadas;
• Sobrenadante desprezado;
• Lavagem com PBS;
• Concentração celular ajustada para 10
6
.
Essa quantidade foi colocada
em tubos eppendorfs® separados;
• Adição de 100µl de PBS e 1µl de anticorpo primário (concentração final
do anticorpo 0,5µg%). Todos os anticorpos utilizados são biotinilados;
• Incubação por 40 minutos;
• Centrifugação dos tubos e sobrenadante desprezado;
• Adição de 100µl de PBS e 1µl de cada anticorpo secundário,
s
treptavidina, em cada tubo. O anticorpo secundário está conjugado
com o fluorocromo phicoeritrina (concentração final do anticorpo
0,5µg%);
• Incubação por 30 minutos, no escuro;
• Centrifugação dos tubos e sobrenadante desprezado;
• Lavagem das células com 100µl de PBS;
• Centrifugação das células e sobrenadante descartado;
• Adição, a cada tubo, de 800µl de PBS para a leitura no citômetro de
fluxo;
• Foram feitos mais dois tubos, um apenas com células sem marcação e
outro com células incubadas apenas com o anticorpo secundário,
ambos para zerar o aparelho;
• Leitura no citômetro de fluxo.
163
ANEXO 10 - IMUNOCITOQUÍMICA PARA MICROSCOPIA CONFOCAL
• Até a fixação das células, a placa foi mantida sobre o gelo;
• Retira-se o meio de cultura dos poços e lavam-se as células 10 vezes,
com PBS (o PBS foi colocado e, ao mesmo tempo, retirado dos poços
com o auxílio de duas pipetas de 10 ml);
• Bloqueio dos sítios inespecíficos das células com uma solução de
PBS/BSA 1% por 20 minutos.
• Lavam-se as células com PBS, da maneira já citada;
• Incubação com os anticorpos primários, diluídos em PBS/BSA 1%,
durante 40 minutos. A concentração final dos anticorpos foi de 1µg%;
•
Lavam-se as células com PBS, da maneira já citada;
• Fixação das células. Para este procedimento, as lamínulas foram
transferidas para uma placa de cultivo nova, para se evitar a presença
de restos celulares. Antes da transferência das lamínulas deve se
colocar 500µl de PBS em cada poço para evitar a secagem do
material;
• O PBS foi retirado e adicionado paraformaldeído (PFA) 2% em PBS,
por 30 minutos a temperatura ambiente;
• Novamente, lavam-se as células com PBS, da maneira já citada;
• Bloqueio dos radicais aldeídos do PFA, com glicina 0,1M em PBS
(300µl por poço), por 2 minutos;
•
Lavam-se as células com PBS, da maneira já citada;
• Nesta etapa o procedimento pode ser interrompido, desde que as
células sejam mantidas a 4°C e os poços estejam bem preenchidos
com PBS;
• Novo bloqueio dos sítios inespecíficos das células com a solução de
PBS/BSA 1% por 20 minutos;
• Lavam-se as células com PBS, da maneira já citada;
• Incubação com o anticorpo anti porção Fc (Fc block), diluído em
PBS/BSA 1%, durante 40 minutos, na concentração final de 1µg%;
164
• O anticorpo secundário streptavidina diluído em PBS/BSA 1% e
conjugado com o fluorocromo ficoeritrina foi ajustado a concentração
de 1µg%.
• Centrifugação deste anticorpo, por 10 minutos a 10.000 rpm, para
evitar precipitados;
• Incubação 40 minutos, no escuro.
• Lavam-se as células com PBS, da maneira já citada, repetindo-se o
procedimento duas vezes;
• Retirada das lamínulas da placa de cultivo, mergulhadas rapidamente
em água destilada e montadas;
• Montagem das lâminas com meio de montagem para fluorescência,
contendo DAPI (corante nuclear), da marca Vectashield
®
.
• Armazenamento das lâminas no escuro, a 4°C. Após a secagem, estas
foram vedadas com esmalte e mantidas armazenadas até e
visualização do material ao microscópio confocal.
OBS: As células não podem secar em nenhum momento do experimento
165
ANEXO 11 - CERTIFICADO DE APROVAÇÃO NO COMITÊ DE ÉTICA
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo