( PDF ) Derivados sintéticos da chalcona inibidores do crescimento de Leishmania braziliensis: modelagem molecular para o estudo da relação estrutura atividade (SAR) e avaliação teórica do perfil [...]

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

MURILO LAMIM BELLO

DERIVADOS SINTÉTICOS DA CHALCONA INIBIDORES DO CRESCIMENTO DE

Leishmania braziliensis: MODELAGEM MOLECULAR PARA O ESTUDO DA

RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE (SAR) E AVALIAÇÃO TEÓRICA DO PERFIL

FÍSICO-QUÍMICO E TOXICOLÓGICO (IN SILICO)

Orientadores: Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues

Prof

. Dr

. Luiza Rosaria Sousa Dias

Rio de Janeiro

2010

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Livros Grátis

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MURILO LAMIM BELLO

DERIVADOS SINTÉTICOS DA CHALCONA INIBIDORES DO CRESCIMENTO DE

Leishmania braziliensis: MODELAGEM MOLECULAR PARA O ESTUDO DA

RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE (SAR) E AVALIAÇÃO TEÓRICA DO PERFIL

FÍSICO-QUÍMICO E TOXICOLÓGICO (IN SILICO)

Orientadores: Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues

Prof

. Dr

. Luiza Rosaria Sousa Dias

Rio de Janeiro

2010

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas, Faculdade de

Farmácia, Universidade Federal do Rio

de Janeiro, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Ciências

Farmacêuticas.

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Ficha Catalográfica

Bello, Murilo Lamim.

Derivados sintéticos da chalcona inibidores do crescimento de

Leishmania braziliensis: Modelagem molecular para o estudo da relação

estrutura atividade (SAR) e avaliação teórica do perfil físico-químico e

toxicológico (in silico) / Murilo Lamim Bello. -- 2010.

XX, 88f.: il.

Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade

Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Farmácia, Rio de Janeiro, 2010.

Orientadores: Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues

Prof

. Dr

. Luiza Rosaria Sousa Dias

1. 1. Leishmania braziliensis. 2. Chalcona. 3. Modelagem molecular. 4.

Leishmanicida. 5. SAR. 6. In silico. 7. Regra de Lipinski. – Teses. I.

Rodrigues, Carlos Rangel (Orient.) e Dias, Luiza Rosaria Sousa (Orient.). II.

Universidade Federal do Rio de Janeiro. Faculdade de Farmácia. III. Título.

MURILO LAMIM BELLO

DERIVADOS SINTÉTICOS DA CHALCONA INIBIDORES DO CRESCIMENTO DE

Leishmania braziliensis: MODELAGEM MOLECULAR PARA O ESTUDO DA

RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE (SAR) E AVALIAÇÃO TEÓRICA DO PERFIL

FÍSICO-QUÍMICO E TOXICOLÓGICO (IN SILICO)

Aprovada em de de 2010

Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues - Orientador

Faculdade de Farmácia - UFRJ

Prof

. Dr

. Luiza Rosaria Sousa Dias - Orientadora

Faculdade de Farmácia - UFF

Prof

. Dr

. Gisela Maria Dellamora Ortiz

Faculdade de Farmácia - UFRJ

Prof

. Dr

. Magaly Girão Albuquerque

Instituto de Química - UFRJ

Prof

. Dr

. Alice Maria Rolim Bernardino

Instituto de Química - UFF

Rio de Janeiro

2010

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas, Faculdade de

Farmácia, Universidade Federal do Rio

de Janeiro, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Ciências

Farmacêuticas.

Esta obra é dedicada aos meus pais.

AGRADECIMENTOS

Aos meus orientadores, Dr. Carlos Rangel Rodrigues e Dr

. Luiza Rosaria

Sousa Dias, por toda a atenção, tempo e esforços dedicados para a realização deste

trabalho.

Aos professores da banca de acompanhamento, Dr

. Gisela Maria Dellamora

Ortiz e Dr

. Monique Araújo de Brito, pelo cuidado e auxílio no desenvolvimento do

trabalho.

Aos professores da banca de avaliação por gentilmente aceitarem o convite

para participarem da etapa final deste trabalho.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas, sempre dispostos a ajudar e orientar os alunos em suas dúvidas e

problemas.

Ao CNPq e à FAPERJ, pelo apoio financeiro que foi fundamental para a

realização deste trabalho.

Aos alunos do Laboratório ModMolQSAR-3D da Faculdade de Farmácia da

UFRJ pelo apoio.

À Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro e à

própria UFRJ.

Aos funcionários da Secretaria de Pós-Graduação que sempre estão

dispostos a auxiliar e ajudar.

A todos aqueles que de certa forma contribuíram para a construção deste

trabalho.

Aos meus pais, João Carlos Araújo Bello e Lúcia Soares Lamim Bello, pelo

apoio, paciência e compreensão.

“Eu estava sentado à mesa a escrever o meu compêndio, mas o trabalho não rendia; os meus

pensamentos estavam noutro sítio. Virei a cadeira para a lareira e comecei a dormitar. Outra

vez começaram os átomos às cambalhotas em frente dos meus olhos. Desta vez os grupos mais

pequenos mantinham-se modestamente à distância. A minha visão mental, aguçada por

repetidas visões desta espécie, podia distinguir agora estruturas maiores com variadas

conformações; longas filas, por vezes alinhadas e muito juntas; todas torcendo-se e voltando-se

em movimentos serpenteantes. Mas olha! O que é aquilo? Uma das serpentes tinha filado a

própria cauda e a forma que fazia rodopiava trocistamente diante dos meus olhos. Como se se

tivesse produzido um relâmpago, acordei... passei o resto da noite a verificar as consequências

da hipótese. Aprendamos a sonhar, senhores, pois então talvez nos apercebamos da verdade.”

Friedrich August Kekulé von Stradonitz, 1865

RESUMO

BELLO, Murilo Lamim. Derivados sintéticos da chalcona inibidores do

crescimento de Leishmania braziliensis: Modelagem molecular para o estudo

da relação estrutura-atividade (SAR) e avaliação teórica do perfil físico-químico

e toxicológico (in silico). Rio de Janeiro, 2010. Dissertação (Mestrado em Ciências

Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro,

Rio de Janeiro, 2010

A leishmaniose é uma doença infecciosa negligenciada causada por

diferentes espécies do parasita Leishmania e é um dos maiores problemas de saúde

pública de países em desenvolvimento. Apesar do progresso em conhecimentos

fundamentais sobre o parasita Leishmania, a atual terapia contra a leishmaniose

ainda é insatisfatória, devido à eficácia limitada, o tratamento prolongado, o custo

elevado e aos efeitos adversos indesejáveis. Assim, a pesquisa por novos

compostos protótipos de fármacos antileishmaniose permanece como um assunto

de importância atual. O objetivo deste trabalho foi estudar a relação estrutura

atividade (SAR) e o perfil físico-químico e toxicológico in silico de uma série de

dezenove derivados da 1,3-difenil-2-propen-1-ona (chalcona), utilizando ensaios

experimentais e metodologias de simulação computacional. Os resultados da

avaliação biológica demonstraram que quatorze derivados da chalcona avaliados,

apresentaram atividade antileishmania contra a forma promastigota de Leishmania

braziliensis. Cinco destes derivados (15g, 15h, 15i, 15j, 15k) apresentaram as

melhores atividades. Dentre estes, os derivados 15h (IC

= 2,70 M), 15i (IC

3,94 M) e 15j (IC

= 4,62 M) foram mais ativos do que a pentamidina (IC

= 6,0

M), fármaco utilizado como controle neste estudo. Estes estudos indicaram que

substituintes metóxila nas duas posições orto do anel fenila A estão vinculados com

melhores atividades antileishmania. No programa Osiris, os compostos com

melhores atividades antileishmania apresentaram valores de druglikeness e

drugscore superiores aos fármacos utilizados como controle (pentamidina e

anfotericina B). O derivado 15i não violou nenhum dos parâmetros da regra-dos-

cinco de Lipinski (lipofilicidade, peso molecular, números de grupos aceptores e

doadores de ligações de hidrogênio), apresentou perfis toxicológicos in vitro com

células VERO (CC

= 215, 57 M) e in silico favoráveis. O derivado 15i demonstrou

ser o protótipo de fármaco mais promissor da série estudada.

Palavras-chave: Leishmania braziliensis, Chalcona, Modelagem molecular.

ABSTRACT

BELLO, Murilo Lamim. Derivados sintéticos da chalcona inibidores do

crescimento de Leishmania braziliensis: Modelagem molecular para o estudo

da relação estrutura-atividade (SAR) e avaliação teórica do perfil físico-químico

e toxicológico (in silico). Rio de Janeiro, 2010. Dissertação (Mestrado em Ciências

Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro,

Rio de Janeiro, 2010

Leishmaniasis is a neglected infectious disease caused by different species of

parasites of the genus Leishmania spp. and is one of the largest problems of public

health of countries in development. In spite of the progress in fundamental

knowledge on the Leishmania parasite, current leishmaniasis therapy is still

unsatisfactory, due to limited effectiveness, long treatment, high cost and undesirable

adverse effects. Thus, the research of novel lead compounds for leishmaniasis

treatment remains a current subject. Our purpose was to determine antileishmanial

activity, structure-activity relationship (SAR), and in silico physical-chemistry and

toxicological profile of a series of nineteen 1,3-diphenyl-2-propen-1-one (chalcone)

derivatives using experimental assays and computer simulation methods. Results of

biological evaluation showed that fourteen chalcone derivatives presented some

antileishmanial activity against the promastigote form of Leishmania braziliensis. Five

of these derivatives (15g, 15h, 15i, 15j and 15k) presented the highest

antileishmanial activities. Among these, 15h (IC

= 2.70 M), 15i (IC

= 3.94 M)

and 15j (IC

= 4.62 M) were more active than pentamidine (IC

= 6.0 µM), a drug

used as a positive control in these study. Our studies indicated that methoxy

substituents at di-orto phenyl ring A position are related with higher antileishmanial

activity. With the Osiris

program, compounds with higher antileishmanial activity

presented better druglikeness and drugscore values than the drugs pentamidine and

amphotericin B, which are currently used in therapy and were evaluated in this work.

Derivative 15i fulfilled Lipinski’s rule of five (lipophilicity, molecular weight, number of

hydrogen bond acceptor and donor groups), and presented favorable in vitro, with

VERO cells (CC

= 215.57 µM), and in silico toxicological profiles. Thus, derivative

15i was shown to be an important drug candidate compound.

Keywords: Leishmania braziliensis. Chalcone. Molecular modeling.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Distribuição Mundial de Leishmaniose Cutânea 21

Figura 2 Distribuição Mundial de Leishmaniose Visceral 22

Figura 3 Diagrama de energia para o n-butano mostrando o mínimo

global e os mínimos locais de seus confôrmeros 35

Figura 4 Representação de uma molécula em mecânica molecular 37

Figura 5 Potencial eletrostático da molécula de benzeno e piridina 43

Figura 6 Benzeno visualizado sem aplicação da superfície de densidade

eletrônica e com superfície de densidade eletrônica 44

Figura 7 Superfície de densidade eletrônica total do benzeno 45

Figura 8 Superfície de van der Waals do benzeno 46

Figura 9 Osiris

Property Explore: Gráfico de Validação 48

Figura 10 Distribuição de druglikeness. Fármacos comerciais

versus substâncias químicas do catálogo Fluka 49

Figura 11 A superfície de van der Waals corresponde ao contorno da

superfície das esferas de van der Waals dos átomos 51

Figura 12 Estrutural geral dos derivados da chalcona (15a-s) 54

Figura 13 Interface gráfica do programa Spartan

Figura 14 Fluxograma da metodologia computacional utilizada

no estudo da relação estrutura-atividade (SAR) 58

Figura 15 Interface gráfica do programa Osiris

Property Explorer 60

Figura 16 Alinhamento e sobreposição das conformações de menor

energia de cada derivado da chalcona 64

Figura 17 Alinhamento e sobreposição das conformações mais estáveis

dos derivados metoxilados da chalcona 15b e 15g 65

Figura 18 Alinhamento e sobreposição das conformações mais estáveis

dos derivados metoxilados da chalcona 15c e 15h 66

Figura 19 Alinhamento e sobreposição das conformações mais estáveis

dos derivados metoxilados da chalcona 15d e 15j 67

Figura 20 Alinhamento e sobreposição das conformações mais estáveis

dos derivados metoxilados da chalcona 15h e 15s 68

Figura 21 Mapa de potencial eletrostático molecular dos derivados da

chalcona (15a-s) 72

Figura 22 Mapa de densidade HOMO dos derivados da

chalcona (15a-s) 73

Figura 23 Mapa de densidade LUMO dos derivados da

chalcona (15a-s) 75

Figura 24 Perfis Toxicológicos Teóricos dos derivados da chalcona

com atividade mais significativa (15g, 15h, 15i, 15j e 15k) 76

Figura 25 Druglikeness dos derivados da chalcona (15g, 15h, 15i, 15j e

15k) comparados com os fármacos comerciais 77

Figura 26 Drugscore dos derivados ativos 15g, 15h, 15i, 15j e 15k

da chalcona comparados com os fármacos comerciais 78

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Atividade antileishmania contra cepas promastigotas de L.

braziliensis (IC

) e toxicidade celular (CC

) dos derivados da

chalcona (15a-s) 62

Tabela 2 Comparação dos parâmetros teóricos (Volume, Área CPK,

HOMO

, E

LUMO

e momento Dipolo) dos derivados da chalcona

(15a-s) 71

Tabela 3 Valores de cLogP (lipofilicidade), HBA (aceptores de ligação de

hidrogênio), HBD (doadores de ligação de hidrogênio) e PM

(peso molecular) e dos derivados da chalcona (15a-s) 79

LISTA DE SIGLAS

ADMET Absorção, Distribuição, Metabolização, Excreção e Toxicologia

AIDS Síndrome da Imuno Deficiência Adquirida (Acquired immnune

Deficiency Syndrome)

AM1 Modelo Austin 1 (Austin Model 1)

AMBER Modelo Assistido de Construção e Refinamento de Energia

(Assisted Model Building and Energy Refinament)

Menor Concentração Capaz de Citotóxica de 50%

cLogP Logarítmo do Coeficiente de Partição Calculado (teórico)

CNDO Negligência Completa da Sobreposição Diferencial

(Complete Neglect of Differential Overlap)

CPK Corey-Pauling-Koton

Da Dalton

DNA Ácido Desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic acid)

eV elétron Volt

HBA Aceptor de ligação de hidrogênio (Hydrogen bonding acceptor)

HBD Doador de ligação de hidrogênio (Hydrogen bonding donor)

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana (Human Immunodeficiency

Virus)

HOMO Orbital Molecular Ocupado de Mais Alta Energia (Highest

Occupied Molecular Orbital)

Menor Concentração Capaz de Inibir 50% da Viabilidade Celular

INDO Negligência Intermediária da Sobreposição Diferencial

(Intermediate Neglect of Differencial Overlap)

LogS Solubilidade

LUMO Orbital Molecular Desocupado de Mais Baixa Energia (Lowest

Unoccupied Molecular Orbital)

MEP Potencial Eletrostático Molecular (Molecular Electrostatic

Potencial)

MINDO/3 Negligência Intermediária Modificada da Sobreposição

Diferencial, versão 3

MM1 Campo de Força Mecânica Molecular 1

MM2 Campo de Força Mecânica Molecular 2

MMFF Campo de Força Molecular da Merck (Merck Molecular Force

Field

MNDO Negligência Modificada da Sobreposição Diferencial (Modified

Neglect of Differential Overlap)

OMS Organização Mundial da Saúde

P&D Pesquisa e Desenvolvimento

PM Peso Molecular

PM3 Método Paramétrico 3 (Parametric Method 3)

PM5 Método Paramétrico 5 (Parametric Method 5)

PSA Área de Superfície polar (Polar Surface Area)

QSAR Relação quantitativa estrutura-atividade (Quantitative Structure

Activity Relationship)

RM1 Modelo Recife 1 (Recife Model 1)

RMN Ressonância Magnética Nuclear

RNA Ácido ribonucleico (Ribonucleic acid)

RTECS Registro de Efeitos Tóxicos de Substâncias Químicas (Registry

of Toxic Effects of Chemical Substances)

SAR Relação estrutura-atividade (Structure Activity Relationship)

SEP Superfície de Energia Potencial

STO-3G Orbitais Tipo Slater simulado por 3 Gaussianos (Slater-

Type-Orbitals simulated by 3 Gaussians) - Base quântica

ua Unidade atômica

UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro

UFSC Universidade Federal de Santa Catarina

WDI Índice de Fármacos Mundial (World Drugs Index)

MARCAS E PROPRIEDADES

Há marcas comerciais e suas respectivas propriedades citadas no texto do

trabalho. Abaixo estão os nomes das marcas que foram utilizadas no trabalho,

entretanto, a ausência de algum nome caracteriza apenas uma falha não intencional

pela qual nos desculpamos antecipadamente. As seguintes marcas comerciais são

propriedades de seus respectivos detentores:

Fluka

Marca registrada de Fluka Chemie AG

Glucantime

Marca registrada de Sanofi-Aventis, Inc.

Osiris

Marca registrada de Actelion Pharmaceuticals, Ltd

Pentostam

Marca registrada de GlaxoSmithKline, Inc.

Spartan

Marca registrada de Wavefunction, Inc

Windows

Marca registrada de Microsoft Corporation

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 19

1.1 DOENÇAS PARASITÁRIAS 19

1.2 DOENÇAS NEGLIGENCIADAS 20

1.2.1 Leishmanioses 21

1.2.1.1 Fármacos para o tratamento da leishmaniose 23

1.2.1.2 Chalconas com atividade antileishmania 30

1.3 MODELAGEM MOLECULAR 33

1.3.1 Métodos de modelagem molecular: Mecânica molecular e quântica 34

1.3.1.1 Mecânica molecular 36

1.3.1.2 Mecânica quântica - Métodos ab initio 39

1.3.1.3 Métodos semi-empíricos 41

1.3.1.4 Representação dos resultados e aplicações 42

1.4 ESTUDO TEÓRICO DAS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS E 45

DE TOXICIDADE IN SILICO

1.4.1 Regra de Lipinski 49

2 JUSTIFICATIVA 52

3 OBJETIVOS 54

3.1 OBJETIVOS GERAIS 54

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 54

4 MATERIAIS E MÉTODOS 56

4.1 SÍNTESE DOS DERIVADOS DA CHALCONA 56

4.2 METODOLOGIA DO ENSAIO BIOLÓGICO 56

4.3 METODOLOGIA COMPUTACIONAL 56

4.3.1 Estudo da relação estrutura-atividade 56

4.3.2 Estudo in silico das propriedades físico-químicas e de toxicidade 59

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 61

5.1 ANÁLISE DOS DADOS DE ATIVIDADE LEISHMANICIDA 61

DOS DERIVADOS DA CHALCONA

5.2 PROPRIEDADES ELETRÔNICAS 70

5.2.1 Cálculos de energia de HOMO (E

HOMO

), energia de LUMO(E

LUMO

) e 70

momento de dipolo dos derivados da chalcona

5.2.2 Mapas de potencial eletrostático molecular 71

5.2.3 Mapas de densidade HOMO e LUMO 72

5.2.3.1 Mapas de densidade HOMO 72

5.2.3.2 Mapas de densidade LUMO 74

5.3 ANÁLISE DAS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS 75

TOXICOLÓGICAS IN SILICO

5.3.1 Regra de Lipinski 78

6 CONCLUSÃO 80

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 82

ANEXOS 89

1 INTRODUÇÃO

1.1 DOENÇAS PARASITÁRIAS

Protozoários são organismos unicelulares com um ciclo de vida complexo,

mostrando estados morfológicos distintos durante seu desenvolvimento em

hospedeiros vertebrados e invertebrados (SOUZA et al., 2004). Podem causar

doenças graves, que representam a maior causa de morbidade e mortalidade em

muitas áreas endêmicas (SOUZA et al., 2004; FEASEY et al., 2009). Entre os

protozoários membros da família Trypanosomatidae, estão algumas espécies

causadoras de doenças em humanos como a tripanossomíase africana (doença do

sono), doença de Chagas e leishmaniose, com enorme impacto na saúde global

(MALLARI et al., 2008; FEASEY et al., 2009; GIAROLLA et al., 2010). Essas

doenças constituem um grande problema de saúde pública que atualmente ameaça

principalmente populações de países em desenvolvimento (SOUZA et al., 2004;

SOUZA et al., 2009).

As doenças tropicais causadas por protozoários causam grande impacto para

a humanidade, com altas taxas de mortalidade e perdas econômicas dos países

envolvidos (FEASEY et al., 2009; GIAROLLA et al., 2010). Todos os anos, os

agentes etiológicos dessas doenças infectam milhões de pessoas e provocam uma

alta taxa de morte (REGUERA, TEKWANI, BALAÑA-FOUCE, 2005; FEASEY et al.,

2009). Estas doenças tropicais interferem no desenvolvimento dos países atingidos

de várias formas, como mortalidade prematura, custos médicos elevados e redução

da produtividade, contribuindo para o agravamento de problemas sociais já

existentes em países em desenvolvimento (FEASEY et al., 2009). Os fatores que

contribuem para o aumento da incidência de doenças tropicais incluem o

aparecimento de parasitas resistentes aos fármacos, bem como vetores com

resistência aos inseticidas e populações endêmicas crescentes em países

subdesenvolvidos e em desenvolvimento devido ao processo migratório (REGUERA,

TEKWANI, BALAÑA-FOUCE, 2005). As doenças tropicais podem atuar como

infecção oportunista em pacientes imunodeprimidos e aumentam a taxa de

mortalidade por AIDS (REGUERA, TEKWANI, BALAÑA-FOUCE, 2005; FEASEY et

al., 2009).

1.2 DOENÇAS NEGLIGENCIADAS

As doenças tropicais são conhecidas como doenças negligenciadas pois

acarretam graves problemas de saúde pública em países em desenvolvimento,

afetando mais de 1 bilhão de pessoas e causando a morte de cerca de 500 mil

pessoas a cada ano (CAVALLI & BOLOGNESI, 2009). Ainda assim, menos de 1%

dos mais de 1300 novos medicamentos desenvolvidos nos últimos 25 anos foram

destinados ao tratamento e combate dessas doenças. Este desequilíbrio evidencia a

crise em Pesquisa & Desenvolvimento (P&D) de medicamentos para as doenças

negligenciadas (TROUILLER et al., 2002; BHATTACHARYA, SALEM,

WERBOVETZ, 2002; FEASEY et al., 2009).

Os países em desenvolvimento representam 80% da população mundial e

respondem por apenas 20% do mercado de medicamentos. Para essas pessoas, o

desequilíbrio entre suas necessidades e a disponibilidade de medicamentos é fatal.

A doença do sono, por exemplo, apresenta 50 mil novos casos a cada ano e

ameaça outros 60 milhões no sub-Saara africano (MALLARI et al. 2008). Apesar

desses fatos, até pouco tempo atrás, os pacientes tinham como única alternativa de

cura um tratamento com medicamentos à base de arsênico que, além de doloroso,

mata uma a cada 20 pessoas que se submetem a esse tratamento. A tuberculose,

considerada uma doença negligenciada, mata pelo menos 2 milhões de pessoas

todos os anos (SANTOS et al. 2009). Mesmo assim, o último tratamento inovador foi

desenvolvido há mais de 30 anos.

As doenças globais, como câncer, doenças cardiovasculares, doenças

mentais e distúrbios neurológicos representam a maior concentração de P&D da

indústria farmacêutica (TROUILLER et al., 2002). Essas doenças atingem

indiscriminadamente todas as pessoas em qualquer parte do mundo. Entretanto, os

novos fármacos lançados para combater essas doenças encontram um mercado

promissor nos países desenvolvidos (TROUILLER et al., 2002).

Dentro das doenças negligenciadas existem as extremamente

negligenciadas, como doença do sono, doença de Chagas e as leishmanioses que

afetam exclusivamente as populações dos países em desenvolvimento (GIAROLLA

et al., 2010). Como a maioria desses pacientes tem baixo poder aquisitivo, eles não

podem pagar o tratamento e, portanto, não representam um mercado atrativo e a

maioria fica excluída do escopo dos esforços de P&D da indústria farmacêutica e,

portanto, são excluídas do mercado farmacêutico (SINGH & SIVAKUMAR, 2004;

FEASEY et al., 2009).

1.2.1 Leishmanioses

As Leishmanioses são doenças infecciosas causadas por diferentes espécies

do parasita Leishmania e são um dos maiores problemas de saúde pública de

países em desenvolvimento, atingindo 350 milhões de pessoas ao redor do mundo

(SOUZA et al., 2009). De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a

leishmaniose é uma doença tropical descontrolada, com altas taxas de morbidade e

mortalidade na África, Ásia e América (TROUILLER et al., 2002; SOUZA et al.,

2009).

As regiões destacadas em vermelho no mapa de distribuição mundial de

leishmaniose cutânea (Figura 1) são as áreas afetadas por essa forma de

manifestação clínica da leishmaniose. As áreas afetadas são principalmente de

países subdesenvolvidos e em desenvolvimento, como Índia, países da África, do

Oriente médio, da América Central e América do Sul. O Brasil tem a totalidade de

seu território afetado por essa manifestação clínica.

Figura 1 - Distribuição Mundial de Leishmaniose Cutânea. As regiões destacadas em vermelho são

as áreas afetadas por essa forma de manifestação clínica da leishmaniose

(Adaptado de http://www.who.int/leishmaniasis/leishmaniasis_maps).

A Figura 2 indica a distribuição mundial de Leishmaniose visceral. As regiões

destacadas em vermelho são as áreas afetadas por essa forma de manifestação

clínica da leishmaniose. Novamente as áreas afetadas são principalmente de países

subdesenvolvidos e em desenvolvimento que se localizam na África, Índia, Oriente

médio, América Central e América do Sul. O Brasil tem grande parte de sua

população sob risco de adquirir essa forma de manifestação clínica.

Figura 2 - Distribuição Mundial de Leishmaniose Visceral. As regiões destacadas em vermelho são

as áreas afetadas por essa forma de manifestação clínica da leishmaniose

(Adaptado de http://www.who.int/leishmaniasis/leishmaniasis_maps).

Apesar do progresso em conhecimentos fundamentais sobre o parasita

Leishmania, a atual terapia contra a leishmaniose ainda é insatisfatória, devido à

limitada eficácia, ao tratamento prolongado, alto custo e efeitos secundários

indesejáveis (CHEN et al., 2001; CROFT & COOMBS, 2003; SINGH & SIVAKUMAR,

2004; RICHARD & WERBOVETZ, 2010).

A transmissão do parasita ocorre pela picada das fêmeas infectadas de

insetos dos gêneros Phlebotomus e Lutzomyia (VENDRAMETTO et al., 2010).

Existem cerca de 20 espécies e sub-espécies do parasita que são responsáveis

pelas diferentes manifestações clínicas da doença, que vão desde uma úlcera na

pele que cicatriza por si só até uma doença grave, como a Leishmaniose visceral

(GIAROLLA et al., 2010; VENDRAMETTO et al., 2010).

O ciclo de vida do parasita compreende: a forma promastigota flagelada que

se encontra na fêmea do inseto flebotomíneo, vetor do parasita; e a forma

amastigota, presente nos hospedeiros mamíferos (SOUZA et al., 2009;

VENDRAMETTO et al., 2010). As formas amastigotas são parasitas intracelulares

obrigatórios de macrófagos, e raramente são encontradas em outros tipos de células

(LEOPOLDO et al., 2006). No macrófago, as formas amastigotas são encontradas

no fagolisossomo onde se multiplicam e crescem (SOUZA et al., 2009).

O surgimento de cepas dos parasitas resistentes aos medicamentos

atualmente empregados no tratamento, especialmente em pacientes HIV-

Leishmania co-infectados, também tem agravado o problema de saúde pública

(SINGH & SIVAKUMAR, 2004; FEASEY et al.; 2009). Assim, há uma necessidade

urgente para o desenvolvimento de novos, eficientes e seguros fármacos para o

tratamento da Leishmaniose.

1.2.1.1 Fármacos para o tratamento da leishmaniose

Estudos demonstraram que 1393 novos fármacos receberam autorização

para comercialização entre 1975 e 1999 (TROUILLER et al., 2002). A distribuição

quantitativa desses fármacos é desigual para as diferentes classes terapêuticas,

concentrando-se sobre as necessidades dos países de renda elevada (TROUILLER

et al., 2002). Assim, existe uma grande deficiência de fármacos eficientes para o

tratamento de doenças parasitárias que ocorrem em países subdesenvolvidos e em

desenvolvimento, como a leishmaniose (BHATTACHARYA; SALEM; WERBOVETZ,

2002; RICHARD & WERBOVETZ, 2010).

Há, aproximadamente, vinte e cinco compostos com efeitos antileishmania,

mas apenas alguns são classificados como fármacos leishmanicidas utilizados em

humanos e a maioria destes é administrada na forma parenteral (SINGH &

SIVAKUMAR, 2004).

Os fármacos utilizados na quimioterapia atual contra as leishmanioses são

tóxicos e causam muitos efeitos colaterais, como cardiotoxicidade e pancreatite

(CROFT & COOMBS, 2003; SINGH & SIVAKUMAR, 2004; SOUZA et al., 2009). O

tratamento de primeira escolha emprega compostos de antimônio pentavalente,

Sb(V), como antimoniato de meglumina (Glucantime

) (1) e estibogluconato de sódio

(Pentostam

) (2). Esses fármacos existem apenas na forma parenteral e geralmente

são usados sob supervisão médica durante vinte e oito dias (SOUZA et al., 2009). O

tratamento de segunda escolha emprega compostos como anfotericina B (3) e

pentamidina (4) (CROFT & COOMBS, 2003; SINGH & SIVAKUMAR, 2004; CROFT,

SUNDAR, FAIRLAMB, 2006; SOUZA et al., 2009).

A variação na resposta clínica aos antimoniais pentavalentes em

leishmanioses cutânea e visceral foi um problema persistente durante os últimos 50

anos (CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB, 2006). Fármacos antimoniais pentavalentes

têm sido usados para o tratamento de leishmanioses cutânea e visceral há mais de

seis décadas com pouca evidência de resistência. O surgimento de espécies de

Leishmania resistentes a antimoniais pentavalentes começou a ocorrer nos últimos

15 anos, tornando-se um grande problema clínico (CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB,

2006).

O mecanismo de ação desses fármacos passou por muitos anos sem ser

conhecido e é aceito que os antimoniais pentavalentes são pró-fármacos, que

necessitam sofrer redução à forma trivalente para, então, exercerem seu efeito.

Sabe-se que eles inibem a biossíntese de macromoléculas nas formas amastigotas

do parasita por interferirem na glicólise e na β-oxidação dos ácidos graxos, além de

apresentarem ação sobre o metabolismo da tripanotiona (BERMAN et al., 1987).

O grande problema dessa terapia é a resistência adquirida. Acredita-se que

alguns mecanismos moleculares de resistência estejam relacionados à diminuição

da taxa de redução da forma pentavalente à forma trivalente do fármaco, como a

alteração da expressão da aquaglicoporina-1 (GOURBAL et al., 2004), responsável

pelo transporte do fármaco na forma trivalente para o interior do parasita, e um

aumento dos níveis de tripanotiona. Outro problema é a toxicidade dos fármacos,

com efeitos colaterais severos e, em alguns casos, podem causar pancreatite aguda,

problemas cardíacos como arritmias, além de oferecer risco de vida para pacientes

com idade abaixo de dois anos e acima de 45 anos que apresentem sinais

avançados da doença, desnutrição e complicações por leishmaniose visceral

(SEAMAN et al., 1996; MURRAY et al., 2005).

Os antimoniais pentavalentes estão disponíveis nas formas de antimoniato de

meglumina (1) e estibogluconato de sódio (2) (FRÉZARD et al., 2008), que podem

ser administrados por via intravenosa ou via intramuscular com igual eficácia

(MURRAY et al., 2005; CROFT; SUNDAR; FAIRLAMB, 2006).

Antimoniato de meglumina (Glucantime

) (1)

Estibogluconato de sódio (Pentostam

) (2)

A anfotericina B (3) é um antibiótico poliênico com atividade antifúngica,

descoberto em 1956, a partir de uma bactéria do gênero Streptomyces (SINGH &

SIVAKUMAR, 2004). Esta é outra opção no tratamento da leishmaniose visceral,

principalmente em pacientes que apresentaram resistência aos antimoniais. Este

antibiótico macrolídeo vem sendo usado contra leishmaniose há mais de quatro

décadas (BRAJTBURG & BOLARD, 1996; CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB, 2006).

Acredita-se que a anfotericina B possa interagir com o esterol da membrana celular

e causar mudanças na permeabilidade, provocando disfunção celular e consequente

destruição e morte celular. É possível que fungos e Leishmania spp. sejam mais

susceptíveis à anfotericina B do que as células dos hospedeiros mamíferos

(BRAJTBURG & BOLARD, 1996). O maior potencial da anfotericina B em causar

danos em células de fungos e parasitas do que em células de mamíferos está

provavelmente relacionado ao tipo de esterol incorporado em suas membranas. O

ergosterol é encontrado em células de fungos e parasitas, enquanto que o colesterol

é encontrado nas células dos mamíferos (BRAJTBURG & BOLARD, 1996). Seu

mecanismo de ação se baseia na afinidade em se unir aos esteróis, principalmente

ao ergosterol (esterol encontrado em fungos e parasitas) inibindo seletivamente a

síntese da membrana do parasita, formando poros aquosos na membrana celular

por onde a célula perde íons, provocando morte celular (BRAJTBURG & BOLARD,

1996; SINGH & SIVAKUMAR, 2004). Apesar de eficaz no tratamento de pacientes

intolerantes aos antimoniais, apresenta um alto grau de toxicidade e efeitos

colaterais como hipocalemia, febre, nefrotoxicidade e reações anafiláticas. Além

disso, esse medicamento é caro e requer um regime de infusão lento em dias

alternados (BRAJTBURG & BOLARD, 1996). Uma alternativa para os efeitos

adversos da Anfotericina B é o uso em lipossomas, que é mais eficaz e menos

tóxica, mas por outro lado torna o tratamento bem mais caro (BRAJTBURG &

BOLARD, 1996).

O OH

O OH OH

OH OH

O CH

OH OH

Anfotericina B (3)

A pentamidina (4), uma diamidina aromática, tem sido utilizada como fármaco

de segunda escolha para o tratamento contra as leishmanioses visceral e cutânea

há mais de quatro décadas (CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB, 2006). O mecanismo de

ação da pentamidina ainda não está claramente definido, mas possivelmente inclui a

inibição da biossíntese de poliaminas, afetando a membrana interna mitocondrial

(CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB, 2006). Embora transportadores para a pentamidina

já tenham sido caracterizados e podem desempenhar papel importante, outros

dados indicaram o acúmulo de pentamidina na mitocôndria de Leishmania como um

aspecto fundamental para a atividade deste fármaco (CROFT, SUNDAR,

FAIRLAMB, 2006). Diversos e severos efeitos adversos como hipoglicemia,

diabetes, nefrotoxicidade, taquicardia e dor no local da injeção estão relacionados ao

tratamento com pentamidina (CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB, 2006).

O O

NH NH

Pentamidina (4)

A paromomicina (Aminosidina) (5) é um antibiótico aminoglicosídeo produzido

por Streptomyces spp., pouco usado para o tratamento de leishmaniose visceral, e

não é surpresa que existam poucos casos relatados de resistência a esse

medicamento para esta forma da doença. Entretanto, foi utilizada extensivamente

para o tratamento de leishmaniose cutânea, sendo relatados inúmeros casos de

resistência (CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB, 2006). Foi desenvolvido como

antibacteriano na década de 1960, apesar de conhecida sua ação leishmanicida. Os

casos de resistência aos aminoglicosídeos em bactérias são bem conhecidos e isso

se aplica, principalmente, ao tratamento da leishmaniose cutânea, em que pode

acarretar alguns casos de resistência, motivo pelo qual não é usado como fármaco

de primeira escolha no tratamento dessa doença (MAAROUF et al., 1997; CROFT,

SUNDAR, FAIRLAMB, 2006).

Nas bactérias, os aminoglicosídeos inibem a síntese de proteínas por meio de

ligação ao rRNA (RNA ribossômico) na subunidade 30S do ribossomo. Não há

descrição similar sobre o mecanismo de ação da paromomicina em Leishmania spp.

A disfunção do ribossomo mitocondrial e despolarização da membrana

mitocondrial são os mecanismos de ação sugeridos para a paramomicina em

Leishmania spp (CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB, 2006). Seu mecanismo de ação

baseia-se na alteração da síntese de proteínas, além de interferir na atividade

mitocondrial e dificultar a captação de precursores de macromoléculas pelo parasita,

prejudicando assim, o seu crescimento. O aumento da proporção de lipídios polares

na membrana provoca uma diminuição da fluidez que altera a permeabilidade da

membrana (MAAROUF et al., 1997).

OH O

Paromomicina (5)

Os azóis, como cetoconazol (6), fluconazol (7) e itraconazol (8) são outra

classe de fármacos utilizada no tratamento de infecções fúngicas, que também é

utilizada no tratamento das leishmanioses e apresenta como vantagem, em relação

a outros fármacos leishmanicidas, o mecanismo de ação já conhecido (CROFT &

COOMBS, 2003; CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB, 2006).

A rota biossintética do ergosterol, o principal esterol nos fungos, e também na

Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi, é um alvo para os principais fármacos

antifúngicos. O fato dos azóis inibirem a enzima do citocromo P450 esterol 14α-

demetilase gerou grande interesse em utilizá-los como fármacos leishmanicidas

(CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB, 2006). Os azóis apresentam a característica de

causar danos na rota biossintética do ergosterol e, com isso, impedir a formação da

membrana celular do parasita, além de outras funções metabólicas que acarretam

na morte do parasita (CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB, 2006).

A resistência a essa classe de fármacos ainda não foi muito estudada em

Leishmania, porém já foi verificada em Trypanossoma cruzi. Em fungos, existem

casos de resistência no meio clínico e acredita-se que aconteça devido ao aumento

no efluxo do fármaco mediado por transportadores (CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB,

2006).

Cl Cl

Cetoconazol (6)

Fluconazol (7)

NN O

Cl Cl

Itraconazol (8)

Diferentes fármacos como a sitamaquina (9) e a miltefosina (10) estão sendo

testados para o tratamento das leishmanioses. A miltefosina (hexadecilfosfocolina),

originalmente desenvolvido como um fármaco antineoplásico, foi usado na Índia,

Colômbia e Alemanha para o tratamento de leishmanioses cutânea e visceral. Os

principais efeitos colaterais já foram noticiados, incluindo náusea, vômitos e

teratogenicidade (CROFT & COOMBS, 2003; CROFT, SUNDAR, FAIRLAMB, 2006;

PÉREZ-VICTORIA et al., 2006; SOUZA et al., 2009) e atualmente, encontra-se em

fase de ensaios clínicos em outros países, como Brasil e Guatemala (SOUZA et al.,

2009).

Sitamaquina (9)

Miltefosina (10)

1.2.1.2 Chalconas com atividade antileishmania

Os flavonóides (11) representam uma classe de substâncias de origem

natural, que apresenta como estrutura base a 1,3-diarilpropano, podendo assumir

diferentes arranjos cíclicos e acíclicos, conforme a variação do nível de oxidação

(CABRERA et al., 2007; ÁVILA et al., 2008). Os flavonóides são metabólitos

secundários presentes em muitas plantas e que são componentes da dieta humana.

As chalconas (12) são intermediários na biossíntese de flavonóides, sendo

facilmente encontradas em plantas rasteiras e arbóreas (CHIARADIA et al., 2008).

As chalconas são flavonóides de cadeia aberta, onde os dois anéis aromáticos são

unidos por um sistema ceto-α,β-insaturado, sendo 1,3-difenil-2-propen-1-ona a

estrutura básica (ÁVILA et al., 2008). O equilíbrio entre a os isômeros de cadeia

aberta (12) e cíclica (11) é uma etapa fundamental na rota biossintética (ÁVILA et al.,

2008).

2-fenil-1-benzopiran-4-ona (2E)-1-(2-hidroxifenil)-3-fenilprop-2-en-1-ona

Flavonóide (11) Chalcona (12)

De acordo com a natureza dos substituintes, podemos classificar as

interações estruturais das chalconas quanto aos efeitos estéricos, causados por

substituintes volumosos, e também aos efeitos eletrônicos decorrentes da diferença

de eletronegatividade entre átomos ou grupos substituintes, bem como a presença

de sítios ácido/base de Lewis, possibilitando a formação de ligações de hidrogênio

e/ou complexos intra e intermoleculares (CESARIN-SOBRINHO, NETTO-

FERREIRA, BRAZ-FILHO, 2001).

Diversas chalconas naturais e sintéticas apresentam uma vasta gama de

perfis farmacológicos, como atividade antiinflamatória (HSIEH et al., 1998),

tripanomicida (LUNARDI et al., 2003), antibacteriana (NIELSEN et al., 2004; BOECK

et al., 2006), antiviral (UCHIUMI et al., 2003; WU et al., 2003), antitumoral

(CABRERA et al., 2007), antimalárica (GO et al., 2004) e antileishmania (MENG et

al., 2004; BOECK et al., 2006; PIÑERO et al., 2006; SALEM & WERBOVETZ, 2006;

ANDRIGHETTI-FRÖHNER et al., 2008).

Na última década, as chalconas surgiram como uma nova classe de

substâncias antileishmania (BOECK et al., 2006). Entre as chalconas antileishmania

mais estudadas está a licochalcona A (13), isolada da planta chinesa Glycyrrhiza

spp., que inibe a enzima fumarato redutase do parasita (CHEN et al., 1993; ZHAI et

al., 1995; CHEN et al., 2001; BOECK et al., 2006). Entretanto, a licochalcona A e

alguns derivados sintéticos também afetam as células humanas, inibindo a

proliferação de linfócitos e produção de citocinas (ZHAI et al., 1995; BOECK et al.,

2006).

(2E)-3-[4-(hidroxi-2-metóxi-5-(2-metilbut-3-en-2-il)fenil]-1-(4-hidroxifenil)prop-2-en-1-ona

Licochalcona A (13) (CHEN et al., 1993)

Recentemente, uma série de derivados 4-metóxichalcona-3-sulfonamida foi

relatada com atividade leishmanicida (ANDRIGHETTI-FRÖHNER et al., 2008).

Esses derivados da chalcona possuem como principal grupo substituinte a

sulfonamida e o derivado 14 apresentou atividade antileishmania significativa

(ANDRIGHETTI-FRÖHNER et al., 2008).

Andrighetti-Fröhner e colaboradores (ANDRIGHETTI-FRÖHNER et al., 2008)

utilizaram a modelagem molecular como ferramenta para os estudos

estereoeletrônicos desses derivados, fundamentais para a avaliação da relação

estrutura-atividade. Esta série de derivados foi sintetizada e avaliada pelo grupo do

Dr. Ricardo José Nunes, Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), contra a

forma promastigota do parasita Leishmania braziliensis (ANDRIGHETTI-FRÖHNER

et al., 2008; SOUZA et al., 2009). Esse estudo demonstrou a importância do núcleo

estrutural da chalcona como grupo farmacofórico.

Derivado 4-metóxichalcona-3-sulfonamida mais ativo (IC

= 3,5 µM) (14)

1.3 MODELAGEM MOLECULAR

Por décadas, os métodos empregados na descoberta de substâncias

protótipos permaneceram sem muitas transformações, isto é, basicamente as

substâncias bioativas eram originadas de produtos naturais ou por síntese.

Entretanto, novos compostos protótipos foram obtidos devido aos avanços na

tecnologia e compreensão dos processos bioquímicos (KUBINYI, 1995).

Modificações estruturais em moléculas descobertas casualmente, seguidas

de avaliação farmacológica, por tentativa e erro, foram por muito tempo estratégias

empregadas com o objetivo de obter substâncias com melhor perfil de atividade, isto

é, maior potência, maior seletividade, melhor biodisponibilidade, maior tempo de

meia-vida, menor toxicidade e menos efeitos colaterais (KUBINYI, 1995; GERSHELL

& ATKINS, 2003).

Atualmente, entretanto, a preocupação por parte dos pesquisadores em

buscar novos compostos bioativos transforma drasticamente o paradigma da

descoberta de novos fármacos. Novas técnicas e estratégias estão sendo utilizadas,

como química combinatorial, cristalografia de proteínas, técnicas multidimensionais

de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), Relação Estrutura Atividade Quantitativa

(QSAR) e QSAR-3D e outras inúmeras técnicas de modelagem molecular e

planejamento assistido por simulação computacional, constituindo-se em

ferramentas úteis para o planejamento de novos fármacos (KUBINYI, 1995;

KARELSON & LOBANOV, 1996; LENGAUER & RAREY, 1996; RODRIGUES, 2001;

GERSHELL & ATKINS, 2003; JORDAN & ROUGHLEY, 2009).

A modelagem molecular consiste em um conjunto de ferramentas para a

construção, edição e visualização, análise e armazenamento de sistemas

moleculares. Estas ferramentas podem ser aplicadas em estratégias de modelagem

direta e indireta de novos fármacos. Na primeira aproximação, faz-se o ajuste do

fármaco a uma estrutura de receptor conhecida, por exemplo, por meio de dados de

difração de raios-X ou RMN. Na segunda, faz-se a análise comparativa das

estruturas de compostos ativos e inativos, utilizando-se o conceito de

complementaridade para o desenvolvimento de um modelo topográfico hipotético do

sítio receptor, denominado modelo farmacofórico (COHEN et al., 1990; BARREIRO

et al., 1997; RODRIGUES, 2001; CARVALHO et al., 2003).

1.3.1 Métodos de modelagem molecular: Mecânica molecular e quântica

A posição absoluta dos átomos numa molécula, e da própria molécula como

um todo, não é fixa no espaço e a localização de substituintes conectados a ligações

simples pode variar ao longo do tempo. Assim, cada molécula contendo uma ou

mais ligações simples existe em diferentes conformações. A composição quantitativa

e qualitativa desta variedade está permanentemente alterando-se, onde as

conformações de menor energia (mais estáveis) são encontradas em maior

proporção. A transformação de uma conformação para outra está primariamente

relacionada às mudanças nos ângulos de torsão de ligações simples (LEACH, 2001;

RODRIGUES, 2001; HÖLTJE et al., 2003).

As mudanças na conformação molecular podem ser consideradas como

movimentos sobre uma superfície multidimensional que descreve a relação entre a

energia potencial e a geometria da molécula. Cada ponto sobre a superfície de

energia potencial representa a energia potencial de uma única conformação.

Conformações estáveis de uma molécula correspondem a mínimos locais sobre esta

superfície de energia, onde a conformação de menor energia corresponde ao

mínimo global (Figura 3) (LEACH, 2001; HÖLTJE et al., 2003).

Figura 3 - Diagrama de energia potencial para o n-butano em função da rotação da ligação C

-C

mostrando o mínimo global (θ=180°) e os mínimos locais (θ=60° e θ=300°) de seus confôrmeros

(Adaptado de HEHRE, 2003).

Independentemente do método de minimização de energia usado, não há

como garantir que o mínimo encontrado seja o mínimo absoluto (mínimo global) da

superfície de energia potencial (SEP). Normalmente, muitos mínimos locais estão

presentes e é comum que a aplicação de algum algoritmo de minimização de

energia acabe conduzindo a um deles, dependendo da proximidade da geometria

inicial do sistema. Em princípio, o mínimo absoluto só pode ser encontrado por

análise conformacional sistemática do sistema molecular (LEACH, 2001; HÖLTJE et

al., 2003).

A análise conformacional sistemática consiste em varrer cada ângulo de

torção da estrutura independentemente, conhecida como pesquisa de grade, mas a

aplicação deste procedimento é limitada. O número de conformações a serem

analisadas equivale a (360°/ )

, onde é o incremento em graus usado no processo

de varredura do ângulo de torção e n é o número de ligações avaliadas. Quanto

menor for o incremento , maior será a quantidade de conformações geradas, mas,

na prática, apenas algumas conformações são importantes. O valor ótimo de

incremento para a pesquisa conformacional sistemática é normalmente de 30 graus.

Isso significa que em uma rotação completa de 360º, 12 conformações serão

obtidas. Entretanto, o número de ligações rotáveis avaliadas (n) pode aumentar o

número de conformações à enésima potência (HÖLTJE et al., 2003).

A atividade biológica de uma molécula é dependente, em geral, de uma única

conformação dentre todas as conformações de baixa energia. A pesquisa pela

conformação bioativa é um dos objetivos principais em química medicinal. Somente

a conformação bioativa pode ligar-se em um ambiente macromolecular específico no

sítio ativo do receptor da proteína (HÖLTJE et al., 2003).

A simulação computacional usa modelos numéricos para explorar as

estruturas e propriedades de moléculas individuais (SHRIVER et al., 2008). Os

métodos usados vão desde os métodos rigorosos e, portanto, computacionalmente

mais demorados, conhecidos como métodos ab initio, baseados na solução

numérica da equação de Schrödinger do sistema, até os mais rápidos, como os

métodos semi-empíricos e mecânica molecular (SHRIVER et al., 2008).

1.3.1.1 Mecânica molecular

Um estudo de modelagem molecular pode ser iniciado gerando a estrutura

molecular no computador, definindo as posições dos átomos no espaço a partir de

um conjunto de coordenadas cartesianas. Uma construção adequada e confiável da

geometria inicial determina a qualidade de toda a investigação subsequente.

Normalmente, utiliza-se o método computacional de mecânica molecular para

otimização da geometria das estruturas moleculares geradas, a fim de se encontrar

o estado de energia mínima individual (HÖLTJE et al., 2003).

Diferentemente da abordagem utilizada pela mecânica quântica, os elétrons e

o núcleo dos átomos não são explicitamente incluídos nos cálculos. A mecânica

molecular considera a composição atômica da molécula como uma coleção de

massas interagindo entre si por forças harmônicas. Como resultado desta

simplificação, a mecânica molecular é um método computacional relativamente

rápido, que pode ser empregado no cálculo de estruturas moleculares pequenas e

até de sistemas oligomoleculares (LEACH, 2001; HÖLTJE et al., 2003).

Na mecânica molecular, os átomos são considerados como esferas de

diferentes tamanhos (tipos de átomos) unidos por molas de comprimento variável

(ligações) (Figura 4). A energia total da molécula (E

tot

) é minimizada com relação às

coordenadas atômicas, considerando os seguintes termos de energia: comprimento

de ligação (E

), ângulo de ligação (E

), ângulo de torsão (E

), van der Waals (E

vdw

) e

eletrostática (E

elec

), segundo a Equação 1 (LEACH, 2001; HÖLTJE et al., 2003).

tot

= E

+ E

vdw

+ E

elec

+ … Equação 1

Figura 4 - Representação de uma molécula em mecânica molecular. As esferas representam átomos

e as molas representam as ligações entre eles (Adaptado de RODRIGUES, 2001).

A mecânica molecular realiza cálculos da energia estérica total da molécula

em termos de desvio do estado fundamental “não tensionado”, do comprimento de

ligação, dos ângulos de ligação e de torsão e das interações não ligantes. A coleção

destes valores de referência, juntamente com as constantes de força e a equação de

energia é conhecida como campo de força (force field) (HÖLTJE et al., 2003).

A idéia básica da mecânica molecular é que as ligações possuem

comprimentos de ligação e ângulos de ligação “naturais”. Os valores no equilíbrio

dos ângulos de ligação e dos comprimentos de ligação e as constantes de força

correspondentes utilizadas nas funções de energia potencial são definidos no campo

de força e formam os parâmetros do campo de força. Cada desvio dos valores

padrões resultará num incremento da energia total da molécula. Assim a energia

total é uma medida da tensão intramolecular relativa, correlacionada a uma molécula

hipotética com geometria ideal (HÖLTJE et al., 2003).

O objetivo de um bom campo de força é descrever, tanto quanto possível,

diferentes classes de moléculas com razoável precisão. A confiabilidade nos

cálculos de mecânica molecular é dependente de funções de energia potencial e da

qualidade dos parâmetros incorporados a estas funções. Assim, é fácil compreender

porque cálculos de alta qualidade não podem ser realizados se parâmetros

geométricos importantes são negligenciados. Para evitar esta situação, um campo

de força adequado a uma investigação em particular deve ser cuidadosamente

selecionado (HÖLTJE et al., 2003).

Com estes princípios em mente, podem-se examinar alguns dos campos de

força comumente presentes em programas de modelagem computacional. Dentre

estes, Dreiding é um campo de força parametrizado para estudar moléculas

formadas por átomos comuns na química medicinal como H, C, N, O, P, S, F, Cl, Br

e I, que, em termos de expressão padrão, seria descrito pela Equação 1

(HINCHLIFFE, 2006).

Em sua revisão de 1976, Norman Allinger essencialmente definiu o que

chamamos de campo de força MM1 (Molecular Mechanics Force Field 1), que

considera apenas os parâmetros para hidrocarbonetos, ignorando o termo de

Coulomb (energia eletrostática) e usando um potencial de Lennard-Jones (energia

de van der Waals) de exponencial seis. Essa abordagem encontrava problemas com

os hidrocarbonetos cíclicos tensionados como, por exemplo, o ciclobutano

(HINCHLIFFE, 2006).

Em 1977, Allinger introduziu o campo de força MM2 (Molecular Mechanics

Force Field 2), que aprimorou os termos do campo de força para hidrocarbonetos. O

campo MM2 difere do MM1, basicamente, no termo do ângulo de diedro

(HINCHLIFFE, 2006).

O campo de força AMBER (Assisted Model Building and Energy Refinement)

é parametrizado para simulação de aminoácidos e proteínas. Os ângulos e

comprimentos de ligações utilizados em sua parametrização foram obtidos

experimentalmente de dados de micro-ondas, difração de nêutrons e estudos de

química quântica acurados. Os parâmetros foram então refinados com estudos de

mecânica molecular sobre sistemas moleculares como tetrahidrofurano,

deoxiadenosina, dimetilfosfato entre outros (HINCHLIFFE, 2006).

O campo de força MMFF (Merck Molecular Force Field) foi desenvolvido

dentro da empresa farmacêutica Merck com o objetivo de direcioná-lo para estudos

de sistemas orgânicos e biopolímeros. A parametrização do MMFF94 foi baseada

em dados experimentais e em cálculos quânticos acurados realizados em

computadores. Este campo de força é capaz de gerar informações quantitativas

sobre conformações e geometrias moleculares (HEHRE, 2003; HALGREN, 1996).

1.3.1.2 Mecânica quântica - Métodos ab initio

No final do século XVII, Isaac Newton formulou as leis do movimento de

objetos macroscópicos, chamadas de mecânica clássica (ANDREI et al., 2003). No

início do século passado, os cientistas perceberam que a mecânica clássica não

descrevia adequadamente o comportamento de partículas muito pequenas, como os

elétrons e os núcleos dos átomos e moléculas (ANDREI et al., 2003). O

comportamento de tais partículas é descrito por um conjunto de leis chamadas de

mecânica quântica (ANDREI et al., 2003).

O método ab initio é a principal abordagem para resolver a equação de

Schrödinger para moléculas poliatômicas de muitos elétrons (SHRIVER et al., 2008).

Ab initio significa, estritamente, início ou princípios fundamentais, implicando que os

cálculos que utilizam esta abordagem requerem como parâmetros constantes físicas

fundamentais. Esta abordagem é intrinsecamente mais rebuscada do que o

procedimento semi-empírico, contudo exige maior tempo computacional (SHRIVER

et al., 2008). O tipo mais comum de cálculo ab initio é baseado no método de

Hartree-Fock, no qual uma aproximação primária é aplicada às repulsões elétron-

elétron, sem desprezar ou aproximar qualquer dos termos ou integrais empregados

no operador Hamiltoniano (SHRIVER et al., 2008).

Uma alternativa ao método ab initio é a Teoria Funcional da Densidade

(Density Functional Theory - DFT), onde a energia total é expressa em termos da

densidade eletrônica total, ρ = ІψІ

, em vez da função de onda ψ. A vantagem da

abordagem DFT é o menor custo computacional, exigindo menos tempo de

computador, e, em alguns casos, particularmente para complexos de metal, tem uma

melhor concordância com os resultados experimentais do que os obtidos por outros

procedimentos (SHRIVER et al., 2008).

Esses métodos utilizam conjuntos de bases quânticas (basis set) nos

cálculos. Uma base quântica mínima conteria exatamente o número de funções

necessárias para acomodar todos os orbitais preenchidos de um átomo, mas, na

prática, uma base quântica mínima inclui todos os orbitais atômicos em uma

camada. Por exemplo, uma única função do tipo 1s seria necessária para os átomos

de hidrogênio e de hélio, mas para os elementos do lítio ao neônio, seriam utilizadas

funções 1s, 2s e 2p. As bases quânticas STO-3G, STO-4G, entre outras (em geral

STO-nG) são todas bases quânticas mínimas (LEACH, 2001).

As bases quânticas mínimas são conhecidas por apresentarem diversas

deficiências. Um problema em particular ocorre com compostos contendo átomos do

final do período da tabela periódica, como por exemplo, o oxigênio ou o flúor. Estes

átomos são descritos utilizando-se o mesmo número de funções de base usado para

os átomos do início do período da tabela periódica, apesar de possuírem mais

elétrons. O simples aumento do número de funções de base não necessariamente

solucionaria o problema ou aprimoraria o modelo. A solução mais comum deste

problema é a introdução de uma base quântica com funções de polarização, que

possuem um número quântico angular mais elevado, correspondendo ao uso do

orbital p para o átomo de hidrogênio e do orbital d para os demais elementos

(LEACH, 2001).

O uso de bases quânticas contendo funções de polarização é indicado por um

asterisco (*). Assim, 6-31G* refere-se a base quântica 6-31G com funções de

polarização para átomos pesados (isto é, não hidrogênio). Dois asteriscos (e.g., 6-

31G**) indicam a aplicação de funções de polarização (isto é, orbital p) para os

átomos de hidrogênio e hélio. A base quântica 6-31G** é particularmente útil onde

ocorrem ligações de hidrogênio (LEACH, 2001).

Estas bases quânticas são suficientes para a maioria dos cálculos. Entretanto,

para alguns cálculos de nível mais elevado, deve-se considerar a utilização de uma

base quântica que efetivamente habilite o limite a ser alcançado. Por outro lado, o

custo computacional inerente a estas bases quânticas deve ser avaliado, de modo a

ter-se uma relação custo/benefício favorável (LEACH, 2001).

Devido ao elevado custo computacional dos métodos ab initio mais

sofisticados, um recurso comumente empregado é o de se aperfeiçoar a geometria

com um conjunto de bases mais simples e, então, executar o cálculo em um único

ponto (Single Point Calculation), como um método mais completo sobre a geometria

resultante (LEACH, 2001).

1.3.1.3 Métodos semi-empíricos

A maior parte do tempo necessário para efetuar um cálculo ab initio utilizando

o método Hartree-Fock é, invariavelmente, despendida na computação das integrais.

Nos métodos semi-empíricos, as integrais que ocorrem na solução formal da

equação de Schrödinger são igualadas a parâmetros que são escolhidos para que

os resultados produzam uma melhor concordância com quantidades experimentais

tais como entalpias de formação (SHRIVER et al., 2008). O modo mais simples de

reduzir o esforço computacional seria ignorar ou aproximar algumas destas integrais.

Os métodos semi-empíricos realizam este processo, pois apenas consideram os

elétrons da camada de valência em seus cálculos. A razão desta aproximação é que

são os elétrons da camada de valência que se encontram envolvidos numa ligação

química e outros fenômenos que se deseja investigar (LEACH, 2001).

Os cálculos por métodos semi-empíricos são feitos da mesma maneira geral

que os cálculos Hartree-Fock, mas dentro deste contexto algumas informações, tais

como integrais representando a interação entre dois elétrons, são aproximadas por

dados empíricos ou simplesmente ignoradas (SHRIVER et al., 2008). Para

compensar o efeito destas aproximações, parâmetros representando outras integrais

são ajustados de forma a produzir a melhor concordância com os dados

experimentais (SHRIVER et al., 2008). Os cálculos semi-empíricos têm tido sucesso

na química orgânica, mas também têm sido desenvolvidos para a descrição da

química inorgânica (SHRIVER et al., 2008).

O primeiro método a utilizar essa aproximação foi o CNDO (Complete Neglect

of Differential Overlap ou Negligência Completa da Sobreposição Diferencial), onde

orbitais atômicos são considerados esfericamente simétricos na avaliação das

integrais de repulsão eletrônica. A direcionalidade dos orbitais p era considerada

apenas nas integrais de ressonância de um elétron. O estágio seguinte foi o método

INDO (Intermediate Neglect of Differencial Overlap ou Negligência Intermediária da

Sobreposição Diferencial), que incluía as integrais de repulsão de um centro entre

orbitais atômicos do mesmo átomo. O método NDDO (Neglect of Diatomic

Differential Overlap ou Negligência da Sobreposição Diferencial Diatômica) foi o

primeiro a incluir a direcionalidade dos orbitais atômicos durante o cálculo das

integrais de repulsão (LEACH, 2001).

Com o objetivo de tornar mais acessíveis os cálculos semi-empíricos de

orbitais moleculares foi desenvolvido o método MNDO (Modified Neglect of

Differential Overlap ou Negligência Modificada da Sobreposição Diferencial) a partir

da aproximação NDDO, onde está presente o efeito da direcionalidade dos termos

de repulsão elétron-elétron. Os métodos AM1 (Austin Model 1 ou Modelo Austin 1) e

PM3 (Parametric Method 3 ou Método Paramétrico 3) foram desenvolvidos para a

obtenção de aproximações mais precisas. Ambos os métodos incorporam

aproximações muito semelhantes, mas diferem nas suas parametrizações (DEWAR

et al., 1985). O aprimoramento da parametrização resultou no modelo PM5

(Parametric Method 5 ou Método Paramétrico 5), que possui cerca de 40% de

redução nos erros médios comparados aos outros métodos semi-empíricos (ROCHA

et al, 2006).

Recentemente, o método AM1 foi objeto de uma re-parametrização para os

átomos de H, C, N, O, P, S, F, Cl, Br e I, resultando no método RM1 (Recife Model

1). Para entalpia de formação, momento de dipolo, potencial de ionização e distância

interatômica, os erros médios foram menores do que os gerados pelos métodos

AM1, PM3 e PM5 nas 1736 moléculas estudadas. Apenas o ângulo de ligação

calculado por RM1 obteve resultados com erro médio levemente maior do que o

obtido por AM1, mas, ainda, inferior ao erro médio nos valores obtidos por PM3 e

PM5 (ROCHA et al, 2006).

1.3.1.4 Representação dos resultados e aplicações

Técnicas gráficas são usadas para apresentar uma variedade de resultados

computacionais como uma ajuda na interpretação e ao desenvolvimento no modo de

visualização das propriedades moleculares (SHRIVER et al., 2008). A simulação das

características eletrônicas geradas pelos cálculos quanto-mecânicos pode ser

visualizada por determinadas ferramentas que auxiliam na interpretação dos dados.

Entre esses estão o mapa de potencial eletrostático molecular, mapas de densidade

HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital ou Orbital Molecular de mais Alta

Energia Ocupado) e LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital ou Orbital

Molecular de mais Baixa Energia Desocupado).

O mapa de potencial eletrostático molecular é uma abordagem importante

com o intuito de compreender a contribuição eletrostática em determinadas

subunidades ou em átomos específicos do composto analisado, visto que os

parâmetros eletrônicos são um dos principais fatores que governam a interação

fármaco-receptor.

O potencial eletrostático (є

) é definido como a energia de interação de uma

molécula com um átomo de prova com carga unitária positiva (Figura 5). O potencial

eletrostático representa um balanço entre as interações de repulsão, envolvendo os

núcleos dos átomos carregados positivamente, e as interações de atração,

envolvendo os elétrons carregados negativamente (HEHRE, 2003). As regiões de

uma molécula em que o potencial eletrostático é negativo delineiam os locais que

sofrem ataque eletrofílico, por exemplo, como pode ser observado acima e abaixo do

plano do anel da molécula do benzeno e na região em que se localiza o átomo de

nitrogênio na molécula da piridina (Figura 5). Apesar da semelhança entre as

moléculas de benzeno e piridina, a superfície de potencial eletrostático revela que

esta similaridade não é aplicável frente a um ataque eletrofílico.

Figura 5 - Potencial eletrostático das molécula de benzeno (A) e piridina (B).

A superfície de potencial eletrostático não leva em consideração a energia de

redistribuição eletrônica (a energia de “polarização”). Isto conduz a falhas no modelo,

o que é solucionado considerando-se explicitamente a energia de polarização na

equação de obtenção do potencial eletrostático. O potencial de polarização fornece

a energia originada pela reorganização eletrônica da molécula como resultado da

interação do átomo de prova com carga positiva com a molécula (HEHRE, 2003).

Um terceiro descritor, o potencial de ionização local, indica a facilidade relativa com

que um elétron pode ser removido (ionização) de qualquer ponto na molécula.

Estes descritores podem ser expressos como funções de coordenadas

tridimensionais (x,y,z). Um modo de visualizá-los numa tela de vídeo ou página de

papel bidimensional é definir um valor de superfície constante também conhecido

por superfície de densidade eletrônica constante ou isosuperfície (Equação 2)

(HEHRE, 2003).

ƒ(x, y, z) = C Equação 2

Na equação 2, o valor da constante (C) pode ser escolhido para refletir uma

propriedade física específica, por exemplo, o “tamanho” de uma molécula no caso da

superfície de densidade eletrônica. Assim, uma superfície de densidade eletrônica

com C = 0,1 eV/ua

fornece praticamente a mesma informação obtida com o

desenho bidimensional da molécula (Figura 6).

Figura 6 - Molécula do benzeno visualizada sem aplicação da superfície de densidade eletrônica

(esquerda); com superfície de densidade eletrônica e valor isosuperfície (C) de 0,1 eV/ua

(centro) e

0,001 eV/ua

(direita).

Uma informação (propriedade) pode ser adicionada a qualquer isosuperfície

utilizando-se cores para representar valores da propriedade. Cores num extremo do

espectro visível representam valores menores da propriedade e cores no outro

extremo, valores maiores da propriedade mapeada sobre a superfície (HEHRE,

2003). Por exemplo, o valor do potencial eletrostático mapeado sobre uma superfície

de densidade eletrônica constante pode ser empregado para distinguir regiões ricas

e deficientes em elétrons, mostrada em cores diferentes. Em geral, no caso do mapa

de potencial eletrostático, iniciando pela cor vermelha (alta densidade eletrônica) e

passando por várias nuances até o azul (baixa densidade eletrônica). Assim, cores

próximas ao vermelho indicam altos valores de potencial negativo, enquanto cores

próximas do azul representam altos valores de potencial positivo (cores laranja,

amarela e verde representam valores de potencial intermediário) (Figura 7).

O mapa de potencial eletrostático nos fornece o potencial em regiões de uma

superfície particular, comumente uma superfície de densidade eletrônica

correspondente ao tamanho da molécula. A construção do mapa de potencial

eletrostático envolve: a) a construção da superfície de densidade eletrônica da

molécula; b) a construção da superfície de potencial eletrostático; c) a aplicação de

cores à superfície obtida para designar valores de potencial (Figura 7).

Figura 7 - Superfície de densidade eletrônica total do benzeno (A); superfície de potencial

eletrostático do benzeno (B) e mapa de potencial eletrostático do benzeno (C).

Os mapas de densidade eletrônica HOMO e LUMO, codificados sobre uma

superfície de van der Waals (Figura 8), são descritores quanto-mecânicos muito

utilizados (KARELSON & LOBANOV, 1996; BUYUKUSLU et al., 2010). De acordo

com a teoria dos orbitais moleculares, a formação de um estado de transição é

devida à interação dos orbitais de fronteira (HOMO e LUMO) das espécies reagentes

(ANSLYN & DOUGHERTY, 2004). HOMO, o orbital mais externo contendo elétrons,

tende a doar esses elétrons. LUMO é o orbital mais interno capaz de aceitar elétrons

(BUYUKUSLU et al., 2010).

A energia de HOMO está diretamente relacionada ao potencial de ionização e

caracteriza a susceptibilidade da molécula em doar elétrons conforme ocorre em um

ataque nucleofílico. A energia do LUMO está diretamente relacionada com a

afinidade por elétrons e caracteriza a susceptibilidade da estrutura em sofrer um

ataque nucleofílico. A diferença entre as energias HOMO e LUMO (HOMO-LUMO) é

um importante indicador de estabilidade da molécula e é conhecida como energia

gap (BUYUKUSLU et al., 2010). Em geral, a reatividade química aumenta quando a

energia LUMO diminui e energia HOMO aumenta (ANSLYN & DOUGHERTY, 2004;

BUYUKUSLU et al., 2010).

Figura 8 - Superfície de van der Waals do benzeno (A); mapa de HOMO do benzeno (B) e mapa de

LUMO do benzeno (C).

1.4 ESTUDO TEÓRICO DAS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS E DE

TOXICIDADE IN SILICO (ADMET - Absorção, Distribuição, Metabolização,

Eliminação e Toxicidade)

O estudo inicial das propriedades físico-químicas teóricas in silico de

compostos candidatos a fármacos é uma abordagem atualmente muito utilizada para

predizer dados relacionados ao ADMET (Absorção, Distribuição, Metabolização,

Excreção e Toxicologia), também chamada de ADME/Tox, cujo objetivo é limitar o

gasto desnecessário em ensaios biológicos de compostos com alta probabilidade de

problemas farmacocinéticos futuros, economizando tempo e investimento

(HODGSON, 2001; LIPINSKI et al., 2001; VAN DE WATERBEEMD & GIFFORD,

2003; LIPINSKI, 2004; RAWLINS, 2004; KHAN & SYLTE, 2007).

A confiabilidade nestes modelos teóricos é dependente de informações

(banco de dados) que estão sendo gradualmente liberadas pelas indústrias

farmacêuticas. Estes modelos também são submetidos a testes de validação, em

que o objetivo é determinar o grau de confiança nos mesmos (STOUCH et al, 2003;

TETKO, 2008).

Os dados físico-químicos teóricos relacionados ao comportamento

farmacocinético teórico dos compostos estudados são, geralmente, obtidos in silico

por meio de programas como Osiris

Property Explorer (Actelion Pharmaceuticals).

Podem ser obtidos dados relacionados ao risco de toxicidade (mutagênico,

tumorogênico, irritante e efeitos no sistema reprodutor), druglikeness (semelhança

com fármacos) e drugscore (índice de aproximação para se tornar um potencial

candidato a fármaco). Este último combina valores obtidos de druglikeness, cLogP

(lipofilicidade), logS (solubilidade), peso molecular e riscos de toxicidade em um

único valor de modo a avaliar se o composto tem potencial para se tornar um

fármaco (http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/).

Os resultados obtidos (Figura 9) apresentaram um bom grau de

confiabilidade. Observa-se, por exemplo, que nos valores obtidos para o risco

mutagênico, apenas 14% das substâncias químicas tóxicas avaliadas foram

erroneamente atribuídas como de risco baixo, enquanto 86% tiveram atribuição entre

alto e médio risco e, portanto, de acordo com os dados experimentais.

O processo de validação utilizou apenas fármacos disponíveis

comercialmente, com apenas 12% de resultados discrepantes distribuídos por alto e

médio risco; enquanto a maioria dos fármacos foi corretamente identificada (88%)

como não possuindo efeitos tóxicos (http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/).

O algoritmo de avaliação de semelhança a fármacos (druglikeness) foi

desenvolvido internamente na Actelion Pharmaceuticals Ltd. A lista de fragmentos foi

criada a partir de um banco de dados de 3300 fármacos comerciais (fragmentos

druglike) assim como 15000 substâncias químicas comercialmente disponíveis no

catálogo Fluka

(fragmentos não semelhantes a fármacos) formando uma lista

completa com todos os fragmentos disponíveis. A geração dos fragmentos ocorre a

partir da quebra das ligações simples. O valor de druglikeness é, então, calculado de

acordo com valores dos fragmentos que estão presentes na molécula em estudo

(http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/).

Todos os fragmentos com uma frequência global foram agrupados a fim de se

remover aqueles altamente redundantes. Para os demais fragmentos, o potencial de

druglikeness foi determinado como o logaritmo do quociente da frequência nos

fármacos comerciais versus as substâncias químicas do catálogo Fluka (Figura 10).

Neste gráfico 80% dos fármacos apresentam um valor de druglikeness positivo,

enquanto que as substâncias químicas do catálogo da Fluka apresentaram um valor

negativo (http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/druglikeness).

Os dados assim obtidos com o programa Osiris

Property Explorer podem ser

utilizados como parâmetros na avaliação físico-química e toxicológica com boa

confiabilidade (COSTA et al, 2006).

Figura 9 - Osiris

Property Explore: Gráfico de Validação. Resultado percentual da validação com

substâncias químicas com efeitos tóxicos (A) e utilizando-se fármacos em comercialização (B)

(Adaptado de http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/).

Figura 10 - Distribuição de druglikeness. Fármacos comerciais (em vermelho) versus substâncias

químicas do catálogo Fluka (em azul) (Adaptado de http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/).

1.4.1 Regra de Lipinski

A alta biodisponibilidade de fármacos administrados por via oral é,

frequentemente, uma consideração importante no desenvolvimento de moléculas

bioativas como agentes terapêuticos. Assim, associou-se que um candidato a

fármaco deve atender a quatro parâmetros globalmente associados com a

biodisponibilidade: o peso molecular, o cLog P (lipofilicidade), o número de doadores

de ligação de hidrogênio e o número de receptores de ligação de hidrogênio. Essa

condição ficou conhecida como Regra dos cinco, porque para cada um dos quatro

parâmetros os valores encontrados eram próximos a cinco ou eram múltiplos de

cinco (LIPINSKI, 2004).

A Regra dos cinco de Lipinski utilizou um conjunto de substâncias extraído do

WDI (World Drugs Index – Índice de Fármacos Mundial), um banco de dados

computadorizado contendo mais de 50.000 substâncias. Esta regra (LIPINSKI,

2004) estabelece que uma absorção ou permeação reduzida será mais comum

quando:

 Há mais de 5 doadores de ligação de hidrogênio (expresso pela soma de OH e

NH na molécula);

 O peso molecular é maior que 500;

 O cLogP (lipofilicidade) é maior que 5;

 Há mais de 10 aceptores de ligação de hidrogênio (expresso pela soma de

átomos de N e O);

Fármacos derivados de produtos naturais, possuidores de estruturas

macromoleculares, são exceções à Regra dos cinco, pois outros mecanismos estão

envolvidos na absorção destes. Uma possível explicação para estas substâncias que

violam a Regra dos cinco seria que membros destas classes terapêuticas

apresentam características estruturais que permitem ao fármaco atuar como

substrato para transportadores biológicos (HOPKINS & GROOM, 2002; LIPINSKI,

2004).

Uma extensão à Regra dos cinco foi obtida após o estudo de uma série de

compostos que foram ensaiados em ratos. Nesse trabalho, compostos com o

número de ligações rotáveis menor que dez e área de superfície polar (PSA) menor

ou igual a 140 Ǻ

(ou a soma do número de aceptores mais doadores de ligação de

hidrogênio menor que 12) apresentaram uma maior probabilidade de boa

biodisponibilidade oral. Também foi observado que uma reduzida área de superfície

polar (PSA) correlaciona melhor com o aumento da velocidade de permeação do

que a lipofilicidade (cLogP), e um aumento no número de ligações rotáveis possui

um efeito deletério na velocidade de permeação (VEBER et al., 2002; KELLER,

PICHOTA, YIN, 2006).

Diversas superfícies podem ser calculadas para uma molécula (Figura 11).

Dentre elas, temos a área de superfície polar (PSA - Polar Surface Area), definida

como a soma das áreas de superfície de van der Waals dos átomos polares

(oxigênio e nitrogênio). Uma superfície polar menor que 90 Ǻ

é referenciada como o

limite aproximado para que a molécula ultrapasse a barreira hemato-encefálica

(WERMUTH, 2003).

Figura 11 - A superfície de van der Waals corresponde ao contorno da superfície das esferas de van

der Waals dos átomos. A superfície molecular é gerada rolando-se uma esfera de prova (geralmente

de raio 1.4 Å, representando a molécula de água) sobre a superfície de van der Waals. O centro da

esfera de prova traça a superfície acessível ao solvente (Adaptado de LEACH, 2001).

Superfície de van der Waals

Superfície de contato

Esfera de prova

Superfície molecular

Superfície acessível ao solvente

Espaço “morto”

(inacessível ao

solvente

2 JUSTIFICATIVA

As doenças tropicais negligenciadas são um dos maiores problemas de saúde

pública em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento, levando ao óbito cerca

de 14 milhões de pessoas a cada ano.

A leishmaniose faz parte desse grupo de doenças, representando uma grande

parcela dos problemas de saúde pública mundial, atingindo atualmente 350 milhões

de pessoas ao redor do mundo. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, a

leishmaniose é uma doença tropical descontrolada com altas taxas de morbidade e

mortalidade na África, Ásia e América.

Ainda assim, menos de 1% dos mais de 1300 novos medicamentos

desenvolvidos nos últimos 25 anos foram destinados ao tratamento de doenças

listadas como negligenciadas. Este dado contrasta com o investimento das

industrias farmacêuticas em pesquisa de medicamentos para as chamadas doenças

globais, evidenciando um desequilíbrio no destino dos recursos para o setor, o que

enfatiza uma crise em Pesquisa & Desenvolvimento (P&D) de medicamentos para o

tratamento de doenças que afetam grande parte da população mundial com menor

poder aquisitivo.

Apesar de progressos importantes e dos conhecimentos fundamentais sobre

o parasita Leishmania, a atual terapia para leishmaniose ainda é insatisfatória,

devido a fatores, como: limitada eficácia, efeitos adversos indesejáveis, longo prazo

e alto custo do tratamento.

O desenvolvimento de resistência aos medicamentos pelos agentes

patogênicos, especialmente em pacientes HIV-Leishmania co-infectados, também

tem agravado o problema. Assim, há uma necessidade urgente para o

desenvolvimento de novos fármacos, com reconhecida eficiência e segurança para

utilização no tratamento da leishmaniose.

Na busca de novos compostos com potencial atividade leishmanicida, que

possam ser considerados protótipos a fármacos para o tratamento da leishmaniose,

uma nova série de derivados da chalcona foi sintetizada sem o grupo funcional

sulfonamida e seu perfil de atividade antileishmania foi avaliado, com o intuito de

compará-la com o composto protótipo 14 da série de derivados 4-metóxichalcona-3-

sulfonamida estudados por Andrighetti-Fröhner e colaboradores (ANDRIGHETTI-

FRÖHNER et al., 2008).

Acredita-se que este trabalho possa gerar informações estruturais e

eletrônicas importantes sobre as chalconas e grupos funcionais inseridos a essa

molécula, para o desenvolvimento de futuros novos protótipos a fármacos

leishmanicidas, os quais poderão apresentar um melhor perfil de atividade em menor

tempo de tratamento e menos efeitos adversos em relação às terapias existentes.

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVOS GERAIS

O objetivo principal deste trabalho foi o estudo da relação estrutura-atividade

(structure activity relationship - SAR) e do perfil toxicológico in silico, utilizando

metodologias de simulação computacional, de novos compostos derivados da

chalcona (Figura 12) modificados estruturalmente em relação às posições R

, R

, X, Y, W e Z (15a-s) que demonstraram atividade leishmanicida.

O X

Figura 12 – Estrutura geral dos derivados da chalcona (15a-s)

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obter parâmetros estruturais e estereoeletrônicos, tais como, determinação

da conformação de menor energia, mapas de potencial eletrostático molecular,

coeficientes e energias de HOMO e LUMO, momento de dipolo que possam ser

correlacionados com a atividade leishmanicida da série de derivados da chalcona

(15a-s).

Avaliar a importância dos grupos substituintes e o efeito no perfil de atividade

leishmanicida da série de derivados da chalcona (15a-s) em comparação ao

derivado 4-metóxichalcona-3-benzilsulfonamida (14) estudado por Andrighetti-

Fröhner e colaboradores (ANDRIGHETTI-FRÖHNER et al., 2008).

Realizar predição teórica do perfil toxicológico dos derivados (15a-s),

analisando parâmetros de toxicidade (mutagenicidade, tumorogenicidade e efeitos

irritantes) e propriedades físico-químicas baseadas na Regra dos cinco de Lipinski

como peso molecular, lipofilicidade e grupos doadores e receptores de ligação de

hidrogênio, que são importantes na seleção de novos compostos bioativos

candidatos a fármacos.

Avaliar os parâmetros drugscore e druglikeness, visando à indicação dos

compostos da série de derivados da chalcona (15a-s) com características mais

favoráveis a protótipos de fármaco.

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 SÍNTESE DOS DERIVADOS DA CHALCONA

A nova série de derivados da chalcona (15a-s) foi sintetizada pela equipe do

Dr. Ricardo José Nunes do Departamento de Química da Universidade Federal de

Santa Catarina (UFSC).

Os antibióticos de uso clínico pentamidina e anfotericina B foram utilizados

em condições idênticas das utilizadas com os derivados da chalcona (15a-s), como

controles positivos ao longo deste estudo, visto que as formas promastigotas dos

parasitas são sensíveis a estes dois fármacos.

4.2 METODOLOGIA DO ENSAIO BIOLÓGICO

Os testes de atividade biológica dos derivados da chalcona (15a-s) foram

realizados com a forma promastigota de Leishmania braziliensis e os testes de

citotoxicidade foram feitos com células VERO. Estes estudos foram realizados pela

equipe do Dr. Mário Steindel do Departamento de Microbiologia e Parasitologia da

Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).

A avaliação da atividade biológica dos derivados da chalcona (15a-s) permitiu

determinar a menor concentração capaz de inibir 50% do crescimento do parasita

(IC

) e a citotoxicidade foi avaliada como a menor concentração capaz de inibir 50%

do crescimento celular (CC

4.3 METODOLOGIA COMPUTACIONAL

4.3.1 Estudo da relação estrutura-atividade

Para o estudo da relação estrutura-atividade (SAR), utilizou-se técnicas de

modelagem molecular com o intuito de obter parâmetros estruturais e

estereoletrônicos, tais como, mapas de potencial eletrostático molecular, densidades

e energias de HOMO e LUMO, lipofilicidade (cLogP), momento de dipolo e outras

propriedades físico-químicas que possam estar relacionados com a atividade

biológica dos compostos analisados.

As estruturas dos compostos foram desenhadas e otimizadas, usando o

campo de força MMFF94 (mecânica molecular), disponível no programa Spartan’08

(Wavefunction Inc., em ambiente Windows

) disponibilizados no Laboratório

ModMolQSAR-3D da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio de

Janeiro (UFRJ). A Figura 13 ilustra a interface gráfica do programa Spartan’08

Figura 13 - Interface gráfica do programa Spartan’08

, demonstrando a tela de visualização das

estruturas, a janela de construção dos compostos (direita) e as ferramentas de manuseio das

estruturas (acima).

Todas as estruturas foram calculadas, simulando no vácuo, na forma neutra e

sem qualquer restrição geométrica. A análise conformacional foi efetuada usando o

campo de força MMFF94 (Mecânica Molecular). O equilíbrio geométrico e o

refinamento das estruturas foram efetuados usando o método semi-empírico RM1. O

confôrmero de menor energia foi submetido ao cálculo de ponto único (single point

calculation) usando o método DFT-B3LYP (Mecânica Quântica), com a base 6-31G*.

A seguir, foram obtidos os valores de momento de dipolo, mapa de potencial

eletrostático molecular (MEP), mapa de densidade eletrônica HOMO, mapa de

densidade eletrônica LUMO, distribuição dos orbitais HOMO e LUMO e lipofilicidade.

Os valores de lipofilicidade (cLogP) foram obtidos pelo modelo de Crippen,

disponível no pacote do Spartan’08

. O fluxograma apresentado na Figura 14 ilustra

a metodologia aplicada nesse estudo.

Os dados físico-químicos e toxicológicos in silico foram obtidos utilizando-se o

programa Osiris

Property Explorer da Actelion Pharmaceuticals Ltda.

Metodologia

Mecânica

Molecular

Toxicologia

(in silico)

Físico-química

(in silico)

DrugscoreDruglikeness

Regra dos 5

(Lipinski)

Desenho e

Otimização

Single Point

Calculation

Base quântica

6-31G*

Efeitos

Tumorogênicos

Efeitos

Mutagênicos

Efeitos

Sistema

Reprodutor

Efeitos

Irritantes

SAR

Propriedades

eletrônicas

(MEP, HOMO,

LUMO, Dipolo)

Ensaios

in vitro

Mecânica

Quântica

Conformação

de menor

energia

Density

Functional

Theory

Análise

Conformacional

Figura 14 - Fluxograma da metodologia computacional utilizada no estudo da relação estrutura-

atividade (SAR).

4.3.2 Estudo in silico das propriedades físico-químicas e de toxicidade

O estudo físico-químico teórico in silico é uma abordagem atualmente muito

utilizada no estudo inicial das propriedades farmacocinéticas, cujo objetivo é limitar o

gasto desnecessário em ensaios biológicos de compostos com alta probabilidade de

problemas farmacocinéticos futuros, economizando tempo e investimento. A

confiabilidade nestes modelos teóricos é dependente de informações (banco de

dados) que estão sendo gradualmente liberados pelas indústrias farmacêuticas.

Estes modelos também são submetidos a testes de validação, em que o objetivo é

determinar o grau de confiança nos mesmos.

Os dados físico-químicos teóricos relacionados ao comportamento

farmacocinético teórico dos compostos estudados foram obtidos in silico através do

programa Osiris

Property Explorer da Actelion Pharmaceuticals. Foram obtidos

dados relacionados ao risco de toxicidade (mutagênico, tumorogênico, irritante e

efeitos no sistema reprodutor), druglikeness (semelhança com fármacos) e

drugscore (índice de aproximação para se tornar um potencial candidato a fármaco).

Este último combina os valores obtidos de druglikeness, cLogP (lipofilicidade), logS

(solubilidade), peso molecular e riscos de toxicidade em um único valor de modo a

avaliar se o composto tem potencial para se tornar um fármaco (Figura 15).

O risco de toxicidade é baseado no banco de dados de um conjunto de

substâncias químicas que possuem comprovadamente efeito tóxico (Registry of

Toxic Effects of Chemical Substances - RTECS) e validado com um banco de dados

contendo um conjunto de fármacos comercialmente disponíveis e largamente usado

no mercado. Os resultados obtidos apresentaram um bom grau de confiabilidade. No

processo de validação utilizou-se apenas fármacos disponíveis comercialmente com

apenas 12% de resultados discrepantes distribuídos por alto e médio risco; enquanto

a maioria dos fármacos foi corretamente identificada (88%) como não possuindo

efeitos tóxicos. O algoritmo de avaliação de semelhança a fármacos (druglikeness) é

calculado partindo-se de uma lista de fragmentos, criada a partir de um banco de

dados de 3300 fármacos comerciais (fragmentos druglike) assim como 15000

substâncias químicas comercialmente disponíveis no catálogo Fluka

(fragmentos

não-druglike).

Figura 15 - Interface gráfica do programa Osiris

Property Explorer com os respectivos perfis

toxicológicos (em vermelho), propriedades físico-químicas (em verde), Druglikeness e Drugscore (em

azul).

As substâncias foram avaliadas quanto aos parâmetros globalmente

associados com a solubilidade e permeabilidade: o peso molecular, o cLogP

(lipofilicidade), o número de doadores de ligação de hidrogênio (HBD) e o número de

receptores de ligação de hidrogênio (HBA), conforme a Regra dos cinco (LIPINSKI,

2004).

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 ANÁLISE DOS DADOS DE ATIVIDADE LEISHMANICIDA DOS DERIVADOS DA

CHALCONA

Uma série de derivados da chalcona (15a-s) foi modificada estruturalmente

em relação aos derivados dos 4-metóxichalcona-3-sulfonamida estudados por

Andrighetti-Fröhner e colaboradores com o intuito de observar o efeito no perfil de

atividade leishmanicida (ANDRIGHETTI-FRÖHNER et al., 2008). Estes compostos

foram sintetizados pela equipe do Dr. Ricardo José Nunes e avaliados quanto à

atividade leishmanicida pela equipe do Dr. Mário Steindel, ambos da UFSC.

Esta série de derivados (15a-s) possui substituintes metoxila em diferentes

posições do anel A (R

-R

) e substituintes diversos no anel B (X, Y, W e Z) da

chalcona, conferindo diferentes características estereoeletrônicas (Tabela 1). Uma

das modificações estruturais foi a inserção de ao menos um substituinte orto (R

e/ou R

) no anel aromático A (ligado diretamente à função carbonila). Isso impõe

uma rigidez estrutural e, portanto, diminui o grau de liberdade conformacional do

anel fenila.

O X

4-metóxichalcona-3-sulfonamida (14) derivados metóxi-chalcona (15)

Esta série totaliza 19 compostos (15a-s), dos quais cinco derivados (15a-e)

são tri-substituídos pelo grupo metoxila nas posições orto (R

), meta (R

) e para (R

)

do anel A, 13 derivados (15f-r) são tri-substituídos pelo grupo metoxila nas posições

di-orto (R

e R

) e para (R

) do anel A e um derivado (15s) é substituído pelo grupo

metoxila nas posições orto (R

) e para (R

) e pelo grupo hidroxila na posição orto

) no anel A.

Tabela 1 - Atividade antileishmania contra cepas promastigotas de L. braziliensis (IC

, µM) e

toxicidade celular (CC

, µM) dos derivados da chalcona (15a-s).

O X

Nd = Não determinado, por não apresentar atividade significativa na concentração de 100 µM.

* = Anel aromático B trocado pelo grupo funcional naftila.

** = Grupo funcional metilenodióxi como substituinte nas posições Y e W do anel aromático B.

- = Não realizado.

Esta série de derivados (15a-s) foi avaliada quanto ao seu perfil de atividade

antileishmania contra cepas promastigotas de Leishmania braziliensis (Tabela 1). Os

derivados 15a-e apresentam três substituintes metoxila no anel aromático A, tendo

como característica estrutural importante apenas uma mono-substituição na posição

orto, ao contrário da maioria dos derivados que são di-orto substituídos. Observa-se

nesse grupo de derivados (15a-e) que a substituição no anel B por um átomo de

15a

OCH

12,88

391,61

15b

OCH

29,69

278,61

15c

OCH

15,42

381,67

15d

OCH

147,86

905

15e

OCH

14,01

295,36

15f

OCH

15g

OCH

8,22

147,11

15h

OCH

2,70

9,25

15i

OCH

3,94

215,57

15j

OCH

4,62

109,27

15k

OCH

7,44

134,52

15l

OCH

20,06

83,86

15m

OCH

29,77

3350,22

15n

OCH

11,75

123,90

15o

OCH

2-C

15p

OCH

1-C

15q

OCH

Y-OCH

O-W**

>1000

15r

OCH

N(CH

)

15s

OCH

194,14

340,88

Pentamidina

6,0

Anfotericina B

0,30

cloro na posição para (15b) ou meta (15c) do anel B ou por um grupo metoxila na

posição meta (15e) não altera significativamente o perfil de atividade em relação ao

derivado não substituído (15a). Entretanto, a inserção de dois átomos de cloro (nas

posições meta e para, 15d) reduziu cerca de 12 vezes a atividade. Os derivados que

também possuem três grupos metoxila, mas que são di-orto substituídos,

apresentaram melhor perfil de atividade (15g-n). Cinco destes derivados (15g, 15h,

15i, 15j e 15k) apresentaram valores de IC

menores do que 10µM. Dentre estes,

os derivados 15h (IC

= 2,70 µM), 15i (IC

= 3,94 µM) e 15j (IC

= 4,62 µM) foram

mais ativos do que a pentamidina (IC

= 6,0 µM), fármaco de referência utilizado

como um dos controles neste estudo.

Os derivados 15b, 15c, 15g, 15h, 15i e 15j, que possuem o átomo de Cl

como substituinte no anel fenila B, apresentaram atividade contra Leishmania

braziliensis e isso sugere que as propriedades químicas deste halogênio são

importantes, visto que os halogênios são lipofílicos e podem facilitar a permeação

dos derivados através da membrana celular até o sítio de ação.

Boeck e colaboradores (2006) estudaram uma série de derivados da chalcona

(16) com diferentes substituintes nos anéis A e B. Entre esses derivados, os

compostos 16a, 16b, 16c e 16d apresentaram significante atividade contra a forma

promastigota de Leishmania amazonensis (BOECK et al., 2006). Esses compostos

possuem semelhança estrutural com o derivado 15s estudado neste trabalho. O

composto 15s (IC

= 194,14 µM), avaliado contra Leishmania braziliensis,

apresenta os mesmos substituintes e nas mesmas posições do anel A que os

compostos 16a (IC

= >100 µM), 16b (IC

= 5,1 µM), 16c (IC

= 59,8 µM) e 16d

(IC

= 0,8 µM), e todos apresentam átomos de halogênios no anel B, mas em

posições diferentes (BOECK et al., 2006). O derivado 15s possui o átomo de cloro

na posição meta do anel B, enquanto o composto 16a apresenta o átomo de cloro

em para e 16b em orto. O átomo de cloro em orto no composto 16b aumentou

significativamente a atividade leishmanicida quando comparado aos compostos 16a

e 15s. Os compostos 16c e 16d apresentam na posição para do anel B os átomos

de bromo e flúor, respectivamente. O composto 16d demonstrou o melhor perfil

antileishmania da série 16, indicando a importância dos halogênios e suas

propriedades, como lipofilicidade e eletronegatividade, além de substituintes nas

posições orto no anel A.

O X

Derivados (16) da chalcona com atividade leishmanicida estudados por Boeck e

colaboradores (2006)

A Figura 16 demonstra o alinhamento e sobreposição das conformações de

menor energia de cada derivado da chalcona estudado (15a-s). O equilíbrio de

geometria foi simulado no vácuo, sendo os mínimos globais das conformações

encontradas influenciados apenas pelas características e propriedades químicas de

seus substituintes. Os mínimos globais encontrados para cada uma das estruturas

dos derivados nessas condições de avaliação, podem ser outros em diferentes

ambientes, como no cristal da substância pura ou em solução aquosa.

Figura 16 – Alinhamento e Sobreposição das conformações de menor energia de todos os derivados

da chalcona (15a-s).

16a: X=H, Y=Cl

16b: X=Cl, Y=H

16c: X=H, Y=Br

16d: X=H, Y=F

Os halogênios podem contribuir positivamente para a atividade antileishmania

como discutido anteriormente e a posição que o grupo metoxila ocupa no anel

aromático A tem interferência para a atividade. A comparação entre os derivados

mono (15b) e di-orto (15g) metoxilado no anel A e com o átomo de Cl na posição

para do anel B revela que ambos apresentaram um perfil leishmanicida. No derivado

15b o grupo metoxila está nas posições orto (R

), meta (R

) e para (R

) no derivado

15g, nas posições di-orto (R

e R

) e para (R

) (Figura 17). A mudança do

substituinte metoxila da posição meta (R

) para a posição orto (R

) provocou um

aumento de 3,6 vezes na atividade (15g, IC

= 8,22µM) quando comparado com o

derivado 15b (IC

= 29,69µM). A troca de posições do grupo metóxi do anel

aromático A gerou uma diferença conformacional na estrutura entre ambos os

derivados, inferindo-se que o confôrmero do derivado 15g seja mais favorável para

interagir com o sítio ativo.

Figura 17 – Alinhamento e Sobreposição das conformações mais estáveis dos derivados metoxilados

15b (IC

= 29,69µM) e 15g (IC

= 8,22µM) (verde). No derivado 15b, o grupo metoxila está nas

posições orto (R

), meta (R

) e para (R

) e no derivado 15g, as posições di-orto (R

e R

) e para (R

A mesma análise foi feita para os derivados mono (15c) e di-orto (15h)

metoxilados no anel A e com o átomo de Cl na posição meta do anel B, onde ambos

apresentaram atividade leishmanicida, porém o derivado 15h (IC

= 2,70 µM) foi 7

vezes mais ativo do que 15c (IC

= 15,42 µM). Essa diferença na atividade dos

derivados pode ser atribuída à mudança de posição do substituinte metoxila no anel

aromático A, migrando da posição meta (R

), no derivado 15c, para a posição orto

), no derivado 15h. Isto sugere que a presença de dois substituintes orto impõe

uma maior rigidez estrutural, e dessa maneira, leva à uma conformação que pode ter

uma melhor interação com o receptor (Figura 18).

Figura 18 - Alinhamento e Sobreposição das conformações mais estáveis dos derivados metoxilados

15c (IC

= 15,42 µM) e 15h (IC

= 2,70 µM) (verde). No derivado 15c, o grupo metoxila está nas

posições orto (R

), meta (R

) e para (R

) e no derivado 15h, nas posições di-orto (R

e R

) e para

Os derivados 15d e 15j são dissubstituídos por átomos de Cl nas posições

meta e para do anel B. Assim como os dois pares de compostos discutidos

anteriormente, a diferença entre esses dois derivados é a posição dos substituintes

metoxila no anel aromático A. No derivado 15d, os substituintes metoxila estão nas

posições orto (R

), meta (R

) e para (R

) e no derivado 15j, nas posições di-orto (R

) e para (R

) (Figura 19). Com a mudança do substituinte metoxila da posição

meta (R

) para a posição orto (R

), o derivado 15j (IC

= 4,62 µM) foi cerca de 32

vezes mais ativo do que o derivado 15d (IC

= 147,86 µM). A troca de posição do

grupo metoxila para orto impõe uma maior rigidez estrutural impondo características

estéricas diferentes, o que pode ter conferido um melhor encaixe estereoeletrônico

do derivado 15j com o alvo celular.

Figura 19 – Alinhamento e Sobreposição das conformações mais estáveis dos derivados metoxilados

15d (IC

= 147,86 µM) e 15j (IC

= 4,62 µM) (verde). No derivado 15d, o grupo metoxila está nas

posições orto (R

), meta (R

) e para (R

) e no derivado 15j, nas posições orto (R

e R

) e para (R

O grupo nitro, com forte caráter retirador de elétrons por efeito indutivo e de

ressonância, manteve a atividade antileishmania característica dos derivados di-orto

metoxilados 15l, 15m e 15n. A substituição do anel fenila B pelos anéis 2-naftila e 1-

naftila (15o e 15p) e metileno-dióxi-fenila (15q) aboliu a atividade. O derivado 15r

também teve sua atividade leishmanicida anulada com a substituição na posição

para do anel fenila B por uma amina secundária. A substituição do grupamento

metoxila (-OCH

) por hidroxila (-OH) no anel A, reduziu a atividade antileishmania

(15s, -OH em R

) (Tabela 1). Observa-se no derivado 15s a presença de uma

ligação de hidrogênio intramolecular, de distância 1,76 Å, entre o hidrogênio da

hidroxila e o oxigênio da carbonila (Figura 20).

Figura 20 - Alinhamento e Sobreposição das conformações mais estáveis do derivado metoxilado

15h (IC

= 2,70 µM) (verde) e 15s (IC

= 194,14 µM). No derivado 15h, o grupo metoxila está nas

posições orto (R

e R

) e para (R

) e no derivado 15s, a diferença é a hidroxila em orto.

A análise dos resultados de citotoxicidade revelou que o derivado 15i (IC

3,94 µM) parece ser o mais promissor da série, pois demonstrou menor

citotoxicidade (CC

= 215,57 µM) do que os derivados 15h (CC

= 9,25 µM) e 15j

(CC

= 109,17 µM).

A comparação do composto 4-metóxichalcona-3-benzilsulfonamida (14), que

apresenta significante atividade antileishmania (IC

= 3,5 µM) (ANDRIGHETTI-

FRÖHNER et al., 2008), com o derivado 15i (IC

= 3,94 µM) demonstra que os

derivados possuem atividades semelhantes mesmo tendo grupos funcionais

diferentes. O derivado 15i possui substituintes metoxila no anel aromático A. O

composto 4-metóxichalcona-3-benzilsulfonamida (14) não possui substituintes no

anel A, sendo o grupo sulfonamida ligado ao anel B. Observa-se, assim, que

substituintes ligados aos anéis A e B da chalcona parecem influenciar e ser

importantes para a atividade antileishmania. A inserção de grupos com

características lipofílicas, aparentemente, aumenta a atividade contra formas

promastigotas de Leishmania braziliensis. Andrighetti-Fröhner e colaboradores

(2008) demonstraram a importância do grupo benzila ligado à sulfonamida do

composto 14, principalmente devido à inserção de um grupo metileno (-CH

espaçador entre o grupo amina e o anel fenila que, possivelmente, permite

interações hidrofóbicas com o sítio receptor. O caráter lipofílico do grupo benzila do

composto 14 e do átomo de cloro no derivado 15i, acompanhado de uma atividade

leishmanicida significativa desses compostos, sugere a lipofilicidade como uma

propriedade importante para a atividade contra a forma promastigota, observada

comparando ambos os compostos. Ainda assim, o núcleo estrutural da chalcona

permanece como principal grupo farmacofórico, pois apesar de importante, o grupo

sulfonamida não é essencial para a atividade antileishmania. Isso é observado na

significante atividade do derivado 15i que é substituído por metoxila no anel A e

cloro no anel B.

Derivado 4-metóxichalcona-3-sulfonamida mais ativo (IC

= 3,5 µM) (14)

A elucidação do mecanismo de ação pelo qual a atividade antileishmania da

chalcona ocorre será importante na investigação de um fármaco com este núcleo

estrutural. Devido à semelhança estrutural, pela presença de grupos substituintes

nos anéis A e B, entre a série de derivados da chalcona estudada nesse trabalho

(15a-s) e a licochalcona A, informações sobre o mecanismo de ação da licochalcona

A serão relevantes também para o entendimento do mecanismo de ação da série de

derivados da chalcona (15a-s).

Zhai e colaboradores (1995) estudaram a atividade antileishmania da

licochalcona A (13) na forma promastigota da Leishmania major e L. donovani e

observaram que a licochalcona A altera a estrutura e a função da mitocôndria da

forma promastigota do parasita Leishmania. Chen e colaboradores. (2001)

investigaram alvos específicos da licochalcona A na mitocôndria de formas

promastigotas da Leishmania e indicaram que a enzima fumarato redutase do

parasita pode ser um alvo específico para a ação das chalconas. Apesar desses

estudos, o mecanismo completo para a atividade da chalcona ainda não está

elucidado.

5.2 PROPRIEDADES ELETRÔNICAS

5.2.1 Cálculos de energia de HOMO (E

homo

), energia de LUMO (E

lumo

), momento

de dipolo e cLogP dos derivados da chalcona

Realizou-se um estudo dos principais parâmetros teóricos para os derivados

metóxi da chalcona que pudessem ser correlacionados com a atividade biológica.

Calculou-se as energias de HOMO e LUMO (E

homo

e E

lumo

), cLogP e momento de

dipolo de todos os derivados.

Os dados obtidos para as energias de HOMO, LUMO e momento de dipolo,

não forneceram, aparentemente, nenhuma correlação entre esses parâmetros e a

atividade leishmanicida observada para esses derivados (Tabela 2).

Tabela 2 - Comparação dos parâmetros teóricos (Volume, Área CPK, E

homo

, E

lumo

e momento de

dipolo) dos derivados da chalcona (15a-s).

5.2.2 Mapas de potencial eletrostático molecular

Os mapas de potencial eletrostático molecular dos derivados metoxilados

15a-s da chalcona (Figura 21) mostram que a densidade eletrônica está

concentrada sobre o grupo carbonila. Há também uma densidade intermediária de

nuvem eletrônica sobre os dois anéis fenila (A e B) da estrutura base da chalcona

dos derivados. A presença dos substituintes metoxila em di-orto no anel A aumenta

a densidade eletrônica próximo ao grupo carbonila, e pode ser uma característica

eletrônica importante para aumentar o seu perfil de interação com o receptor.

Volume (Å

)

Área CPK

(Å

)

homo

(eV)

lumo

(eV)

Dipolo

(debye)

15a

317,3

339,9

-5,43

-1,61

2,64

12,88

15b

330,8

355,2

-5,51

-1,78

2,96

29,69

15c

330,8

355,2

-5,50

-1,80

2,10

15,42

15d

344,5

370,2

-5,56

-1,93

3,07

147,86

15e

344,4

369,6

-5,39

-1,57

3,27

14,01

15f

344,7

371,1

-5,68

-1,41

1,85

15g

331,1

356,8

-5,91

-1,75

3,61

8,22

15h

331,0

356,7

-5,91

-1,78

2,23

2,70

15i

331,1

355,6

-5,87

-1,54

2,49

3,94

15j

344,7

371,8

-5,98

-1,92

3,59

4,62

15k

344,6

370,1

-5,90

-1,60

3,28

7,44

15l

339,5

367,4

-6,01

-2,54

3,66

20,06

15m

339,6

368,6

-5,90

-2,16

2,62

29,77

15n

339,6

367,8

-6,09

-2,70

6,76

11,75

15o

367,2

386,0

-5,62

-1,50

3,63

15p

368,5

387,9

-5,63

-1,71

2,87

15q

341,8

365,2

-5,53

-1,50

2,96

15r

367,1

393,2

-5,11

-1,25

3,52

15s

309,8

331,4

-5,91

-2,00

1,98

194,14

Figura 21 - Mapa de potencial eletrostático molecular dos derivados da chalcona (15a-s) sobre uma

isosurperfície de 0.002 eV/ua

5.2.3 Mapas de densidade HOMO e LUMO

5.2.3.1 Mapas de densidade HOMO

O mapa de densidade eletrônica HOMO codificado sobre uma superfície de

van der Waals, variando de vermelho (baixa densidade de HOMO) à azul (alta

densidade de HOMO), dos derivados da chalcona (15a-s) pode ser observado na

Figura 22.

Na análise da densidade eletrônica HOMO observa-se que todos os

derivados da chalcona estudados (15a-s) apresentam a maior concentração de

densidade eletrônica HOMO localizada sobre o anel fenila A ou em B, sendo a

densidade mais localizada sobre os anéis A ou B de acordo com as características

dos grupos substituintes. Entretanto, nos derivados que apresentaram as melhores

atividades (15g, 15h, 15i, 15j e 15k) a densidade eletrônica HOMO está localizada

sobre o anel fenila A, ligado diretamente à função carbonila. Nos derivados 15o,

15p, 15q e 15r que não apresentaram atividade leishmanicida, a densidade

eletrônica HOMO está localizada sobre o anel fenila B, distante da função carbonila.

O derivado 4-metóxichalcona-3-benzilsulfonamida (IC

= 3,5 µM) (14)

(ANDRIGHETTI-FRÖHNER et al., 2008) apresenta a densidade HOMO sobre a

função carbonila da chalcona. O derivado 15i (IC

= 3,94 µM) tem a densidade

HOMO sobre a função carbonila e anel fenila A. A função carbonila parece ter

importante contribuição eletrônica para a atividade leishmanicida de ambos os

derivados de chalcona estudados.

O mapa de HOMO mostra que a densidade dos derivados 15h (IC

= 2,70

µM) e 15i (IC

= 3,94 µM) está localizada sobre as mesmas subunidades de ambos

os compostos, sendo a pequena diferença de atividade antileishmania devida,

possivelmente, ao efeito orto do átomo de Cl do composto 15i.

Figura 22 - Mapa de densidade HOMO dos derivados 15a-s da chalcona codificado sobre uma

isosurperfície de 0,002 eV/ua

5.2.3.2 Mapas de densidade LUMO

A avaliação da densidade eletrônica de LUMO, codificada sobre uma

isosuperfície de 0,002 eV/ua

revelou diferentes intensidades de LUMO (cor azul)

localizada sobre a região do carbono da carbonila dos derivados 15a-s (Figura 23).

As regiões em azul caracterizam baixos valores de densidade eletrônica (baixa

densidade eletrônica de LUMO) e em vermelho sinalizam áreas onde os orbitais

LUMO não estão totalmente desocupados de elétrons (densidade eletrônica de

LUMO).

Nos derivados que possuem o grupo nitro (-NO

) como substituinte no anel B,

15l (Y= -NO

), 15m (X= -NO

) e 15n (W= -NO

), a densidade eletrônica LUMO que

normalmente é baixa sobre o átomo de carbono da carbonila nos outros derivados,

se tornou dispersa sobre o anel aromático A e átomo de carbono da carbonila,

devido à influência do caráter retirador de elétrons desse grupo funcional. Esta

observação indica que a baixa densidade eletrônica LUMO sobre o carbono da

carbonila dos derivados mais ativos, pode não ser o principal determinante para a

interação entre a molécula e o sítio receptor, já que os derivados 15l, 15m e 15n

apresentaram alguma atividade leishmanicida.

Os derivados 15o, 15p e 15q não apresentaram atividade leishmanicida.

Aparentemente, a presença de grupos volumosos pode causar rigidez estrutural no

anel B e pode influenciar negativamente a característica desses derivados.

Figura 23 - Mapa de densidade LUMO dos derivados 15a-s da chalcona codificado sobre uma

isosuperfície de 0,002 eV/ua

5.3 ANÁLISE DAS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS E TOXICOLÓGICAS IN

SILICO

A avaliação toxicológica teórica (in silico) dos derivados da chalcona que

demonstraram os melhores perfis de atividade leishmanicida (15g, 15h, 15i, 15j e

15k) foi efetuada utilizando-se o programa Osiris

Property Explorer. Os resultados

obtidos da análise mostram que os riscos toxicológicos, teóricos, para estes

derivados são baixos, quanto aos parâmetros de irritação, tumorogênico, efeito

reprodutivo e mutagênico, sendo comparáveis aos fármacos pentamidina e

anfotericina B, comercialmente disponíveis e em uso atualmente. O derivado 15g foi

o único que apresentou um risco toxicológico teórico médio para o parâmetro

mutagenicidade (Figura 24).

Os baixos efeitos adversos atribuídos aos derivados, em especial quanto aos

quatro parâmetros avaliados, não eliminam a possibilidade de apresentarem efeitos

toxicológicos desfavoráveis, mas indicam a probabilidade de um bom desempenho

no aspecto avaliado. A avaliação toxicológica in silico não exclui a necessidade de

realização de testes toxicológicos tradicionais, entretanto orienta sobre quais

substâncias em estudo é válido prosseguir com análises toxicológicas experimentais.

Figura 24 - Perfis Toxicológicos Teóricos dos derivados da chalcona com atividade mais significativa

(15g, 15h, 15i, 15j e 15k) obtidos com o programa Osiris

Property Explorer.

Os testes toxicológicos in vitro com células VERO dos derivados da chalcona

(Tabela 1) demonstraram que as doses que inibiram 50% do crescimento dessas

células eram muito maiores do que aquelas que inibiram 50% do crescimento de

Leishmania braziliensis, indicando boa seletividade para inibição do parasita.

O derivado 15i, um dos mais potentes da série, inibiu o crescimento de 50%

de Leishmania braziliensis na concentração de 3,94 µM e promoveu a inibição do

crescimento de 50% de células VERO na concentração de 215,57 µM (Tabela 1). Na

avaliação do risco toxicológico in silico, este derivado também apresentou baixa

toxicidade para os parâmetros avaliados (Figura 24), indicando ser este um

promissor derivado de chalcona.

A avaliação de druglikeness revela a capacidade de um determinado

composto apresentar características estruturais similares à maioria dos fármacos

disponíveis no mercado, permitindo teoricamente apontar compostos semelhantes

aos fármacos.

Os derivados da chalcona que apresentaram as atividades leishmanicidas

mais significativas (15g, 15h, 15i, 15j e 15k), tiveram seus valores de druglikeness

avaliados. Os valores de druglikeness computados e atribuídos pelo programa

Osiris

aos derivados 15g, 15h, 15i, 15j e 15k foram comparados com os valores da

pentamidina e anfotericina B comercialmente disponíveis no mercado (Figura 25).

Os valores teóricos de druglikeness desses derivados foram superiores aos

fármacos pentamidina e anfotericina B, utilizados como controles positivos nas

análises e que estão atualmente no mercado farmacêutico.

Figura 25 - Druglikeness dos derivados da chalcona (15g, 15h, 15i, 15j e 15k) comparados com os

fármacos comerciais pentamidina e anfotericina B.

O estudo de drugscore, isto é, a soma de todas as características avaliadas

para o candidato a fármaco (cLogP, solubilidade, toxicologia teórica, druglikeness e

peso molecular) pelo sistema Osiris

, fornece um parâmetro que permite avaliar o

quanto uma determinada substância poderá ser habilitada como um futuro fármaco.

Segundo os critérios estabelecidos, quanto mais próximo de 1 (um), maior é a

probabilidade teórica de sucesso. Os derivados da chalcona (15g, 15h, 15i, 15j e

15k) apresentaram valores de drugscore melhores do que aqueles mostrados pelos

fármacos em comercialização pentamidina e anfotericina B (Figura 26).

Druglikeness

Figura 26 - Drugscore dos derivados ativos 15g, 15h, 15i, 15j e 15k da chalcona comparados com os

fármacos comerciais pentamidina e anfotericina B atualmente em uso.

5.3.1 Regra de Lipinski

Um fármaco para ter boa absorção oral deve satisfazer, teoricamente, a

Regra dos Cinco de Lipinski (LIPINSKI, 2004). Neste sentido, os derivados da

chalcona avaliados que apresentaram atividade antileishmania mais significativa

contra Leishmania braziliensis (15g, 15h, 15i, 15j e 15k) atendem à Regra dos Cinco

de Lipinski (Tabela 3).

Podemos observar que para os derivados 15h e 15i, que apresentaram

significativa atividade leishmanicida e valores de drugscore (protótipo a fármaco)

mais elevados, interessantemente os valores de lipofilicidade e peso molecular são

os mesmos, 3,93 e 332,78 Da, respectivamente (Tabela 3). Ambos os derivados

possuem o átomo de Cl como substituinte no anel aromático B, porém em diferentes

posições (Tabela 1).

Drugscore

Tabela 3 - Valores de cLogP (lipofilicidade), HBA (aceptores de ligação de hidrogênio), HBD

(doadores de ligação de hidrogênio), PM (peso molecular) dos derivados da chalcona (15a-s).

O baixo perfil toxicológico in silico (Figura 24), perfil satisfatório para uma boa

biodisponibilidade e valores mais elevados do que os fármacos pentamidina e

anfotericina B nas avaliações teóricas druglikeness e drugscore (Figuras 25 e 26),

corroboram para apresentar o derivado 15i (IC

= 3,94 µM e CC

= 215,57 µM)

como o mais promissor candidato a fármaco da série de derivados metoxilados da

chalcona avaliada contra Leishmania braziliensis.

cLogP

HBA

HBD

PM (Da)

15a

3,37

4,0

0,0

298.3

15b

3,93

4,0

0,0

332.7

15c

3,93

4,0

0,0

332.7

15d

4,49

4,0

0,0

367.2

15e

3,25

5,0

0,0

328.3

15f

3,25

5,0

0,0

328.3

15g

3,93

4,0

0,0

332.7

15h

3,93

4,0

0,0

332.7

15i

3,93

4,0

0,0

332.7

15j

4,49

4,0

0,0

367.2

15k

4,49

4,0

0,0

367.2

15l

3,41

7,0

0,0

343.3

15m

3,41

7,0

0,0

343.3

15n

3,41

7,0

0,0

343.3

15o

4,37

4,0

0,0

348,3

15p

4,37

4,0

0,0

348.3

15q

3,15

6,0

0,0

342.3

15r

3,66

5,0

0,0

341.4

15s

3,67

4,0

1,0

318.7

6 CONCLUSÕES

A atividade leishmanicida, contra Leishmania braziliensis, da série de

derivados metoxilados da chalcona avaliada (15a-s) em comparação ao composto 4-

metóxichalcona-3-benzilsulfonamida (14), anteriormente estudado, demonstra que

diferentes substituintes no anel A e no anel B influenciam a atividade leishmanicida.

Observa-se com estudo da nova série que o grupo sulfonamida não é essencial para

a atividade leshmanicida.

No anel A a presença do grupamento metoxila (-OCH

) parece ser importante

para a atividade, pois a substituição pelo grupo hidroxila (-OH) resultou na redução

da atividade (derivado 15s). Os grupos metoxila inseridos nas posições di-orto (R

) e para (R

) favoreceram a atividade, pois os derivados que foram mais ativos

possuem o grupo metoxila nestas posições (15g, 15h, 15i, 15j e 15k). A mudança de

posição de um dos substituintes metoxila no anel A, da posição orto (R

) para a

posição meta (R

), resultou na redução da atividade contra Leishmania braziliensis

(15a-e).

No anel “B” a presença do átomo de Cl favoreceu a atividade leishmanicida,

como evidenciado com os derivados que demonstraram os melhores perfis de

atividade da série (15g, 15h, 15i, 15j e 15k).

Os derivados que apresentaram as melhores atividades leishmanicidas (15g,

15h, 15i, 15j e 15k) possuem a densidade eletrônica de HOMO sobre o anel A,

ligado à função carbonila e os derivados sem atividade apresentaram a densidade

sobre o anel B, mais distante da função carbonila (15o, 15p, 15q e 15r) (Figura 21),

cuja contribuição eletrônica aparentemente desempenha importante papel.

Dentre os derivados da série estudada (15a-s), o derivado 15i demonstrou ser

o candidato protótipo a fármaco mais promissor, pois apresentou resultados

significativos em todas as análises estruturais empregadas. Esse derivado inibiu

50% do crescimento de Leishmania braziliensis com a concentração de 3,94 µM,

apresentou perfil toxicológico favorável tanto in silico como in vitro com células

VERO (CC50 = 215,57 µM), além de índices físico-químicos teóricos de druglikeness

e drugscore superiores aos fármacos pentamidina e anfotericina B. O derivado 15i

também apresentou uma maior probabilidade de boa biodisponibilidade oral, pois

não violou nenhum dos parâmetros da regra dos cinco de Lipinski. Assim, o derivado

metoxilado da chalcona 15i é um composto leishmanicida protótipo candidato a

estudos posteriores.

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