( PDF ) Análise molecular do gene da lactase-florizina hidrolase em indivíduos tolerantes e intolerantes à lactose

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UNIVERSIDADE FEDERERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA:

CIÊNCIAS EM GASTROENTEROLOGIA

ANÁLISE MOLECULAR DO GENE DA LACTASE-

FLORIZINA HIDROLASE EM INDIVÍDUOS

TOLERANTES E INTOLERANTES À LACTOSE

ANDRÉA CRISTINA DA SILVA BULHÕES

Porto Alegre, março de 2006.

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UNIVERSIDADE FEDERERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA:

CIÊNCIAS EM GASTROENTEROLOGIA

ANÁLISE MOLECULAR DO GENE DA LACTASE-FLORIZINA

HIDROLASE EM INDIVÍDUOS TOLERANTES E

INTOLERANTES À LACTOSE

ANDRÉA CRISTINA DA SILVA BULHÕES

Orientadora: Profa. Dra. Themis Reverbel da Silveira

A apresentação desta dissertação é exigência do

Programa de Pós-Graduação em Medicina: Gastroenterologia,

da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, para obtenção

do título de Mestre.

Porto Alegre, março de 2006.

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Para Eduardo e Rodrigo,

com todo o meu amor.

AGRADECIMENTOS

A todos os que, de alguma forma, colaboraram para a realização deste trabalho e em

especial:

- À minha orientadora, Profa. Dra. Themis Reverbel da Silveira, pelo carinho,

amizade e conhecimentos transmitidos durante a execução desta pesquisa.

- Ás professoras colaboradoras: Dra Helena Sueno Goldani e Dra Ursula Matte,

pelos ensinamentos e contribuição em todas as etapas desta pesquisa.

- Ao CNPq e ao Fundo de Incentivo à Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto

Alegre, pelo apoio financeiro.

- À amiga bióloga Fernanda Santos de Oliveira, pelo afeto, disponibilidade e auxílio

profissional no trabalho de laboratório.

- À Profa Ceres de Oliveira, pela assessoria na análise estatística.

- Ao acadêmico Rafael Mazzuca, pela ajuda na realização de todas as etapas deste

trabalho.

- À amiga Dra. Sandra Vieira, pelo afeto e incentivo profissional.

- À amiga enfermeira Bianca Vasconcellos Moura Bagnati, pela ajuda e

disponibilidade nas coletas de sangue.

- À colega e amiga Alessandra Pizzato, pelo carinho e incentivo inicial.

- Aos meus pais, Otávio (in memorian) e Vilma, pelo amor e apoio constante.

- Ao meu marido, Eduardo, pelo amor, compreensão, apoio e inesgotável paciência.

- Ao meu filho, Rodrigo, a razão do meu viver.

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO...........................................................................................................16

1.1 –

DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE LACTOSE: ASPECTOS FISIOPATOLÓGICOS.........16

1.2 – MÁ ABSORÇÃO DE LACTOSE, INTOLERÂNCIA À LACTOSE E HIPOLACTASIA .....19

1.3 – CAUSAS DE HIPOLACTASIA ...............................................................................21

1.3.1 – Deficiência Congênita de Lactase............................................................21

1.3.2 – Deficiência Secundária de Lactose ..........................................................21

1.3.3 – Hipolactasia Primária do Tipo Adulto.....................................................23

1.4 – MÉTODOS DIAGNÓSTICOS.................................................................................25

1.5 – INFLUÊNCIA DA ETNIA NA HIPOLACTASIA PRIMÁRIA DO TIPO ADULTO............34

1.6 – HIPÓTESES FORMULADAS PARA EXPLICAR A DIFERENÇA DA PREVALÊNCIA

MUNDIAL DE HIPOLACTASIA .................................................................................................38

1.7 – POLIMORFISMOS ASSOCIADOS COM A HIPOLACTASIA DO TIPO ADULTO............39

2 – JUSTIFICATIVA............................................................................................45

3 – OBJETIVOS....................................................................................................46

3.1- OBJETIVO GERAL................................................................................................46

3.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS.....................................................................................46

4- CASUÍSTICA E MÉTODOS................................................................................47

4.1- DELINEAMENTO..................................................................................................47

4.2- POPULAÇÃO EM ESTUDO ....................................................................................47

4.3- AMOSTRA E AMOSTRAGEM ................................................................................48

4.4- VARIÁVEIS ESTUDADAS .....................................................................................50

4.5- TÉCNICA DO TESTE DE HIDROGÊNIO EXPIRADO .................................................52

4.6- TÉCNICA DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR).................................55

4.7-

LOGÍSTICA ..........................................................................................................56

4.8-

ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................................58

4.9- CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ....................................................................................59

5- RESULTADOS.......................................................................................................61

5.1 – CARACTERÍSTICAS DA AMOSTRA ......................................................................61

5.2 – RESULTADOS DO TESTE DO HIDROGÊNIO EXPIRADO.........................................64

5.3 – RESULTADOS DO TESTE MOLECULAR PARA AS MUTAÇÕES C/T E G/A.............68

5.4 – CONCORDÂNCIA ENTRE TESTES MOLECULAR, H

EXPIRADO E SINTOMAS .......71

6 – DISCUSSÃO .........................................................................................................74

6.1 – CARACTERÍSTICAS GERAIS DO ESTUDO .............................................................74

6.2 – A PREVALÊNCIA DE HIPOLACTASIA PRIMÁRIA DO TIPO ADULTO AVALIADA

ATRAVÉS DO

TESTE DO HIDROGÊNIO EXPIRADO ...................................................................75

6.3

– ANÁLISE MOLECULAR ......................................................................................80

7 – CONCLUSÕES.....................................................................................................84

8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................86

ANEXOS......................................................................................................................95

ANEXO 1 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO .............................96

ANEXO 2 - RELAÇÃO DE GENÓTIPOS, FENÓTIPOS, RESULTADOS DO TESTE H2 E A

PRESENÇA DE SINTOMAS DOS

20 INDIVÍDUOS DO ESTUDO .....................................................98

ANEXO 3 - NÍVEIS DE HIDROGÊNIO EXPIRADO NOS 9 INDIVÍDUOS COM TESTES

POSITIVOS

............................................................................................................................100

ANEXO 4 - NÍVEIS DE HIDROGÊNIO EXPIRADO NOS 11 INDIVÍDUOS COM TESTES

NEGATIVOS

..........................................................................................................................101

ANEXO 5 - MOLECULAR ANALYSIS OF LACTASE-HLORIZIN HYDROLASE GENE IN

BRAZILIAN SELF-REPORTED MILK TOLERANT AND INTOLERANT INDIVIDUALS ....................102

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Recipiente utilizado para coleta das amostras de ar expirado .................................53

Figura 2 - Comparação entre os níveis de H

expirado entre os grupos dos absorvedores e não

absorvedores.....................................................................................................................66

Figura 3 - Nível de hidrogênio expirado (em ppm) na amostra ...............................................67

Figura 4 - Os produtos digeridos do PCR foram amplificados em gel de agarose a 2,5%.

Linhas 1 e 9 mostram produtos de PCR não digeridos. Linhas 2 e 6 mostram indivíduos

homozigotos para os genótipos de não-persistência de lactase CC

13910

e GG

22018;

4 e 8

homozigotos para os genótipos de persistência de lactase TT

13910

e AA

22018

; 3 e 7

indivíduos heterozigotos para o genótipo de persistência de lactase CT

13910

e GA

22018

. O

marcador de DNA com 50 pb está demonstrado na linha 5.............................................70

Figura 5 - Representação esquemática dos resultados encontrados. ........................................73

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1 - Características gerais dos indivíduos estudados......................................................62

Tabela 2 - Sintomas apresentados pelos indivíduos auto-referidos intolerantes à lactose

durante o teste do H

.........................................................................................................63

Tabela 3 - Avaliação do teste de H

expirado...........................................................................65

Tabela 4 - Distribuição dos genótipos na amostra....................................................................69

Tabela 5 - Concordância entre a análise molecular e os testes do hidrogênio e sintomas .......72

Quadro 1 - Principais causas de deficiência secundária de lactase ..........................................22

Quadro 2 - Métodos para o diagnóstico de má absorção de lactose.........................................26

Quadro 3 - Prevalência de má absorção de lactose do adulto no Brasil de acordo com as raças

e as regiões estudadas.......................................................................................................37

Quadro 4 - Freqüência do fenótipo de hipolactasia em indivíduos finlandeses e não

finlandeses ........................................................................................................................43

RESUMO

Objetivo: Verificar a relação entre a presença das mutações C/T-13910 e G/A-22018

no gene da lactase-florizina hidrolase e a absorção de lactose em indivíduos residentes no

município de Porto Alegre.

Casuística e Métodos: Foi realizado um estudo transversal que incluiu 20 indivíduos

adultos, sadios, com idade superior a 18 anos, procedentes do município de Porto Alegre. Os

participantes foram classificados segundo o relato da quantidade de leite consumida,

habitualmente, por dia e quanto à presença ou ausência de sintomas relacionados à ingestão de

leite. A má absorção de lactose foi diagnosticada através do teste de hidrogênio expirado após

a ingestão de 50 g de lactose diluída em solução aquosa a 20%. O teste teve duração de 3

horas e foi considerado positivo quando o aumento foi superior a 20 partes por milhão na

concentração de H

em relação ao nível basal. Os voluntários também foram classificados

como indivíduos com lactase persistente e lactase não persistente através da análise molecular

dos dois polimorfismos (C/T-13910 e G/A-22018) responsáveis pela persistência ou não da

Lactase Florizina Hidrolase no adulto pelo método da Reação em Cadeia da Polimerase

(PCR).

Resultados: Foram estudados 20 indivíduos com média de idade de 32,7 ± 7,3 anos.

9/20 sujeitos apresentaram o genótipo CCGG – não persistência de lactase em concordância

com o teste do hidrogênio expirado positivo. 11/20 indivíduos apresentaram o teste H

expirado negativo, sendo que 10/20 apresentaram genótipos de persistência de lactase (1/20

CTAA, 3/20 TTAA e 6/20 CTGA) e 1 sujeito com o genótipo de não persistência de lactase

(CCGG). Obteve-se um coeficiente de concordância kappa = - 0,9 entre os testes, molecular e

de H

expirado com p < 0,001.

Conclusões: Os resultados do trabalho permitem concluir que a análise dos

polimorfismos C/T-13910 e G/A-22018 no gene da Lactase Florizina Hidrolase podem ser

considerados um bom indicador para o diagnóstico de má absorção de lactose, visto que é um

método bastante sensível e específico com ótima concordância com o teste de hidrogênio

expirado.

ABSTRACT

Objective: to verify the relation between the presence of mutations C/T–13910 and

G/A–22018 in the gene of lactase-phlorizin hydrolase and the absorption of lactose in

individuals who live in the city of Porto Alegre.

Methods: It consists of a transversal study which included 20 healthy adult

individuals over eighteen years old, from the city of Porto Alegre. The participants were

classified according to reports on the quantity of milk they habitually consumed per day and

in regard to the presence or absence of symptoms related to lactose intolerance. Lactose

malabsorption was diagnosed through the hydrogen breath test after the ingestion of 50g of

lactose diluted in watery solution. The test lasted 3 hours and it was considered positive when

the increase was higher than 20 parts per million on concentration of H

in relation to the

basal level. The volunteers were also classified as individuals with persistent and non-

persistent lactase through the analysis of the presence of both polyformisms (C/T–13910 and

G/A–22018), which are responsible for the persistence or not of Lactase Phlorizin Hydrolase

in adults. The analysis was made through the Polymerase Chain Reaction method (PCR).

Results: Twenty individuals were studied with mean age of 32.7 ± 7.3 years. 9/20

subjects presented with the CCGG genotype – non-persistence of lactase accordingly to the

positive hydrogen breath test (HBT). 11/20 individuals presented with negative HBT, whereas

10/20 presented with genotypes of lactase persistence (1/20 CTAA, 3/20 TTAA e 6/20

CTGA) and one subject with genotype of non-persistence of lactase (CCGG). An agreement

coefficient kappa = - 0.9 was obtained between the molecular and the hydrogen breath

test

with p < 0,001.

Conclusions: This project results make it possible to conclude that the analysis of the

polyformisms C/T–13910 and G/A–22018 in the gene of Lactase Phlorizin Hydrolase can be

considered a good indicator for the diagnosis for lactose malabsorption, since it is a very

sensible and specific method, as it was demonstrated in recent studies. It also has an excellent

agreement with the expired hydrogen.

INTRODUÇÃO

1.1 – Digestão e Absorção de Lactose: aspectos fisiopatológicos

A lactose (beta-galactosil-1-4-glicose) é um dissacarídeo que consiste em uma

molécula de betagalactosidade aderida à glicose por uma ligação beta-1 → 4. É conhecida

como o “açúcar do leite” e é produzida pela glândula mamária da maioria dos mamíferos

(CHAMPE & HARLEY, 1997).

A lactose é sintetizada nas células epiteliais das glândulas mamárias mediante uma

reação que depende de duas proteínas, a alfa-lactoalbumina e a enzima N-acetil-galactosil-

transferase. Sua concentração no leite varia segundo a espécie, sendo de cerca de 7% no leite

humano e de cerca de 5% no leite de vaca. O conteúdo de lactose do leite nas várias espécies

é proporcional à atividade da alfa-lactoalbumina (NAIM et al., 1987).

Durante o processo de digestão, a lactose é hidrolisada no intestino delgado em

monossacarídeos: glicose e galactose. Esses produtos serão absorvidos através de transporte

ativo dependente de sódio (ALLIET et al., 1989). A hidrólise da lactose é feita por uma

betagalactosidase, conhecida como lactase; sua forma precursora é sintetizada pelo enterócito

como uma proteína de alto peso molecular (215 kD) e após várias etapas de glicosilação e

clivagem, a proteína precursora é transportada para a membrana microvilositária, na sua

forma madura: lactase-florizina hidrolase, uma molécula com atividade hidrolítica e peso

molecular de 130-160 kD (LEIS et al., 1997; WALKER-SMITH, 1997). A lactase só se

encontra na extremidade da vilosidade, sendo, portanto, muito vulnerável a lesões da mucosa

(HEITLINGER & LEBENTHAL, 1988).

Nos seres humanos, a atividade da lactase é detectada por volta do terceiro mês de

gestação, mas com valores muito baixos, só aumentando a partir da 26ª semana. Na 34ª

semana atinge 30% dos valores do recém-nascido, aumenta rapidamente entre a 36ª e 38ª

semanas, e ao termo os seus valores equivalem aos de uma criança de um ano de idade

(MOBASSALECH et al., 2003).

A lactase está presente em toda a extensão do intestino delgado, embora seus níveis

sejam mais altos no jejuno proximal e mais baixos no duodeno e íleo distal. Mesmo em

indivíduos aparentemente saudáveis, a atividade da lactase costuma ser a menor de todas as

dissacaridases (AURICCHIO & TRONCONE, 2000).

A presença de lactose não hidrolisada no lúmen intestinal cria um gradiente osmótico

em decorrência do qual há secreção de água e sódio no intestino delgado, com aceleração

secundária do trânsito intestinal (CHRISTL et al., 1992). No intestino grosso, o açúcar será

fermentado pela ação de bactérias anaeróbias, produzindo ácidos orgânicos de cadeia curta,

principalmente ácido acético, propiônico e butírico, além de liberar gases como hidrogênio,

dióxido de carbono, nitrogênio e metano. A maior parte dos gases produzidos será eliminada

como flatos, mas uma proporção será absorvida e eliminada pelos pulmões (KOETSE et al.,

2000). Os ácidos graxos de cadeia curta, em sua maioria, são absorvidos pelo cólon e

metabolizados. O cólon tem capacidade para reabsorver água, eletrólitos e gases. Esse

mecanismo de compensação colônica é, provavelmente, o fator mais importante na

determinação dos sintomas e qualquer dano à mucosa pode limitar o mecanismo de

compensação. Se a capacidade do cólon de absorver os ácidos de cadeia curta for excedida, há

acidificação do meio, aumentando a carga osmolar e das contrações peristálticas do músculo

circular do cólon. Os gases formados distendem as alças intestinais e conseqüentemente o

abdômen, provocando desconforto, cólicas, meteorismo, flatulência e fezes espumantes. Neste

caso, a diarréia é do tipo fermentativa com fezes aquosas, espumantes e ácidas (O’CONNOR

et al., 1999).

A hidrólise e a absorção de lactose são determinadas por vários fatores além da relação

entre a atividade da lactase e a quantidade de lactose ingerida. O tipo de dieta deve ser

considerado. Os produtos lácteos que possuem pouca lactose em sua composição são os que

foram submetidos à fermentação por bactérias ou por fungos. No iogurte, 70% da lactose são

fermentados em um dia e 90% em dois dias, sendo assim, quanto mais velho o iogurte, menos

lactose ele possui e mais ácido é o sabor. No caso dos queijos, a fermentação da lactose por

microorganismos produz ácidos, o que favorece a coagulação da proteína do leite, a caseína, e

com o tempo há redução na quantidade de lactose (VESA et al., 1996).

O papel do esvaziamento gástrico na absorção de lactose também pode ser

evidenciado como um fator determinante, visto que mesmo indivíduos com níveis normais de

lactase, mas que possuem um esvaziamento gástrico aumentado, podem apresentar sinais e

sintomas decorrentes de má absorção por não haver tempo suficiente de contato entre o

carboidrato e a lactase presente na mucosa intestinal (AROLA & TAMM, 1994).

Além do esvaziamento gástrico, o tempo de trânsito intestinal influencia as taxas de

absorção. A aceleração do trânsito no intestino delgado pode dificultar a hidrólise e,

conseqüentemente, diminuir a absorção de lactose.

A capacidade de fermentação pela microflora intestinal e os mecanismos de

compensação colônica já comentados também devem ser considerados quando analisamos o

metabolismo da lactose (AROLA & TAMM, 1994).

As diferenças na tolerância à lactose com a manifestação de sintomas mais graves ou

mais amenos em relação à quantidade de leite ingerido por indivíduos com hipolactasia

podem ser explicadas pelos fatores acima comentados.

1.2 – Má Absorção de Lactose, Intolerância à Lactose e Hipolactasia

Os termos má absorção de lactose, intolerância à lactose e hipolactasia eram, muitas

vezes, utilizados erroneamente como sinônimos. A sinonímia entre estas definições existia

porque o diagnóstico da deficiência da enzima lactase era feito comumente por teste de

sobrecarga com lactose, e não diretamente, por determinação da atividade enzimática na

mucosa intestinal (AURICCHIO & TRONCONE, 2000).

A má absorção de lactose é a situação na qual ocorre uma falha nos mecanismos de

digestão e absorção da lactose, podendo ser evidenciado através de exames laboratoriais, nem

sempre estando associada com manifestações de sintomas clínicos. É a expressão clínica e

laboratorial da deficiência enzimática (WALKER-SMITH, 1997; AURICCHIO &

TRONCONE, 2000).

Intolerância ao dissacarídeo é definida como a síndrome clínica provocada pela

ingestão do mesmo. Assim, intolerância à lactose ou intolerância ao leite devem ser usados

somente para indicar os sintomas e sinais gastrointestinais após a ingestão de,

respectivamente, lactose e leite (WALKER-SMITH, 1997).

A deficiência de dissacaridase é caracterizada pela diminuição ou ausência da enzima

na membrana microvilosa no enterócito. Essa denominação deve ser usada somente quando a

atividade enzimática está diminuída. Geralmente causa a má absorção do dissacarídeo

correspondente e conseqüentemente os sintomas de intolerância a este dissacarídeo. No caso

da lactase, os termos hipolactasia e alactasia significam, respectivamente, deficiência e

ausência de lactase. O diagnóstico da hipolactasia é feito através de biópsia no intestino

delgado proximal com medida da atividade da lactase (SAHI, 1994a; WALKER-SMITH,

1997).

1.3 – Causas de Hipolactasia

1.3.1 – Deficiência Congênita de Lactase

A deficiência congênita de lactase é extremamente rara. Cerca de 40 casos foram

relatados na literatura (AURICCHIO & TRONCONE, 2000). A doença foi descrita

detalhadamente por SALVILAHTI et al. (1983) em estudo que incluiu 16 pacientes na

Finlândia, que foram submetidos à biópsia jejunal para determinação da atividade da lactase.

O quadro clínico se caracteriza por uma diarréia grave, que começa nas primeiras

horas ou dias de vida, assim que o recém-nascido recebe leite materno ou alguma fórmula

contendo lactose. As fezes são ácidas, com grande quantidade de lactose. Vômitos não são

comuns e o apetite inicialmente é mantido. A maior gravidade da diarréia determina uma

perda significativa de nutrientes, levando a retardo de crescimento, desidratação e acidose.

1.3.2 – Deficiência Secundária de Lactose

Esta situação ocorre devido a lesões na mucosa do intestino delgado. Várias doenças

podem causar deficiência secundária de lactose (quadro 1). A localização das dissacaridases

na membrana microvilosa das células epiteliais do intestino delgado faz com que essas

enzimas sejam afetadas por qualquer doença que danifique a membrana ou interfira com o

metabolismo dos enterócitos. Por ser a mais superficial das dissacaridases, a lactase é a que

mais precoce e freqüentemente se altera (LÓPEZ et al., 1996; MATTHEWS et al., 2005).

Quadro 1 - Principais causas de deficiência secundária de lactase

Fonte: VILLAKO & MAROOS, 1994; AURICCHIO & PITCHUMONI,

1994.

Causas de deficiência secundária de lactase

Gastroenterite aguda e síndrome pós-enterite

Alergia à proteína do leite de vaca

Doença Celíaca

Giardíase

Desnutrição protéico-calórica

Síndromes de imunodeficiência

Ressecção extensa do intestino delgado

Fibrose cística

Doença inflamatória intestinal

Enteropatia associada à infecção pelo HIV

1.3.3 – Hipolactasia Primária do Tipo Adulto

Na grande maioria da população mundial, durante a infância e adolescência, o nível de

lactase cai para 5% a 10% em relação ao nível encontrado ao nascimento. Este fenômeno,

denominado hipolactasia primária do tipo adulto, é a forma mais comum de deficiência de

dissacaridase determinada geneticamente.

O declínio nos níveis de lactase não é influenciado pela presença ou ausência de

lactose na dieta. A atividade da lactase não é, portanto, induzida pela lactose ou por qualquer

outro substrato presente na dieta (SAHI, 1994b). No entanto, nos indivíduos hipolactásicos

que consomem lactose regularmente, pode haver uma diminuição da sintomatologia

relacionada à má absorção desse dissacarídeo (JONHSON et al., 1993b). Alguns autores

argumentam que a melhora ocorre devido ao aumento nos mecanismos de compensação

colônica e adaptação da flora intestinal (HERTZLER & SAVAIANO, 1996; WALKER-

SMITH & MURCH, 1999). GILAT et al. (1972) demonstraram esse fato estudando 10

indivíduos adultos com teste de tolerância à lactose positivo e hipolactasia confirmada por

biópsia jejunal. Esses indivíduos foram orientados a ingerir leite em quantidades crescentes

até alcançarem, pelo menos, 1 litro por dia. No término do período de observação, que foi de

6 a 14 meses, os exames foram repetidos. Não houve modificação nos resultados da medida

da lactase na biópsia, e somente um teste de tolerância foi negativo. Apesar de não ter havido

indução enzimática, os participantes do estudo apresentaram uma melhora gradual dos

sintomas de diarréia, flatulência e dor abdominal. Por outro lado, BRIET et al. (1997), em

ensaio clínico duplo-cego, demonstraram que a melhora da sintomatologia, com uso

continuado de lactose por determinado período, em indivíduos com intolerância a esse

carboidrato, pode ser devido a um efeito placebo. Os indivíduos que participaram do estudo,

todos com má absorção e intolerância à lactose, foram randomizados para receber lactose ou

sacarose por um período de duas semanas, juntamente com dieta isenta de lactose. No início e

término do estudo, foram realizados o teste do hidrogênio expirado e a avaliação da

sintomatologia após 50 g de lactose diluída em 250 ml de água. Além disso, foram coletadas

amostras de fezes para medida de pH e atividade da betagalactosidase fecal. No início do

estudo não houve diferença entre os grupos em relação aos parâmetros descritos. Em duas

semanas, quando a avaliação foi repetida após a sobrecarga de lactose, o grupo que recebeu

esse carboidrato apresentou aumento na betagalactosidase fecal e redução no pH e na

excreção de hidrogênio. Houve também melhora significativa de todos os sinais e sintomas

considerados. A melhora desse parâmetro, no entanto, foi semelhante nos dois grupos, o que

demonstra que o efeito ocorreu independentemente da adaptação metabólica da flora colônica,

que só foi observada no grupo que recebeu lactose.

A betagalactosidase, presente em indivíduos com hipolactasia primária do tipo adulto

parece ser idêntica à enzima presente em adultos com níveis altos de atividade da lactase. Este

fato é compatível com a hipótese de que a persistência de lactose na vida adulta se deve à

síntese continuada da enzima do recém-nascido, a qual geralmente diminui nos primeiros anos

de vida (AURICCHIO & TRONCONE, 2000).

A idade do início do declínio da atividade da lactase tem variações significativas em

diferentes grupos étnicos. Como o declínio é progressivo durante a infância e adolescência, a

prevalência de má absorção de lactose vai aumentando de acordo com a faixa etária

considerada (LEIS et al., 1997). O diagnóstico de má absorção de lactose também é

influenciado pela variação nas doses e formas de administração da lactose (GALVÃO et al.,

1995).

O quadro clínico associado com a hipolactasia primária do tipo adulto pode variar

desde uma simples sensação de desconforto abdominal até sua forma máxima de expressão,

como náuseas, vômitos, flatulência, distensão abdominal, cólicas e diarréia. Vale a pena

ressaltar que a intensidade dos sintomas nem sempre está correlacionada com o grau de

deficiência enzimática, nem mesmo com a quantidade do carboidrato ingerido (FAGUNDES

NETO, 1991). Muitos indivíduos com hipolactasia primária do tipo adulto toleram a ingestão

de leite e derivados em quantidades moderadas sem o desenvolvimento de sintomatologia

significativa (JONHSON et al., 1993a; SUAREZ et al., 1995; VESA et al., 1996).

1.4 – Métodos Diagnósticos

Existem vários métodos para o diagnóstico de má absorção de lactose (quadro 2), cada

um com suas particularidades, havendo autores que consideram não existir um padrão-ouro, o

que dificulta a avaliação da validade dos testes (BRUMMER et al., 1993).

Quadro 2 - Métodos para o diagnóstico de má absorção de lactose

Fonte: BRUMMER et al., 1993.

• Teste do pH fecal e pesquisa de substâncias redutoras nas fezes

Os testes fecais são exames não invasivos, relativamente sensíveis e utilizados para

triagem. O emprego do clinitest para pesquisa de substâncias redutoras nas fezes foi

desenvolvido por KERRY & ANDERSON (1964) e tem sido muito utilizado desde então. A

presença de excesso de substâncias redutoras (mais de 0,5%) é a maneira mais simples de se

diagnosticar má absorção de açúcares. A técnica da coleta é muito importante, pois as fezes

devem ser analisadas frescas ou armazenadas no congelador até análise (HEITLINGER &

LEBENTHAL, 1998). Este exame é considerado muito bom para crianças pequenas, mas para

Métodos de Diagnóstico

Teste do pH fecal

Pesquisa de substâncias redutoras nas fezes

Teste de tolerância à lactose

Teste de tolerância à lactose com etanol

Teste respiratório com

C-lactose

Teste respiratório com

C-lactose

Teste do hidrogênio expirado

Biópsia intestinal e medida da atividade da lactase

adultos podem ocorrer resultados falso-negativos se a flora do cólon consumir o açúcar

(TARLOW & THOM, 1974).

Em condições normais, o pH fecal mostra valores em torno de 7. Para que haja

redução do mesmo é necessário que a flora do cólon seja capaz de fermentar um substrato

transformando-o em ácidos. O pH menor ou igual a 5, após a ingestão de lactose, fornece

diagnóstico indireto de má absorção de lactose. Apesar de o pH fecal ser um indicador de má

absorção de lactose mais sensível em crianças, também pode ter validade no adulto, quando

ácido. Entretanto, se após a ingestão do açúcar o pH for normal, não se pode excluir má

absorção do mesmo, principalmente se o indivíduo foi submetido a antibioticoterapia anterior,

ou se a pesquisa não foi feita com fezes frescas, pois os ácidos podem volatilizar-se

(TARLOW & THOM, 1974).

• Teste de tolerância à lactose

A curva glicêmica após a ingestão de lactose apresenta resultados que informam

melhor a respeito da absorção global de lactose em comparação com os testes citados

anteriormente e, é amplamente utilizado para o diagnóstico de má absorção de lactose em

adultos (BULLER et al., 1991). A glicemia é dosada no sangue venoso em jejum e a cada 30

minutos, até duas horas, após a sobrecarga de 50g de lactose diluída em solução aquosa

(NEWCOMER & Mc GILL., 1966a).

A interpretação da curva glicêmica é baseada na diferença entre a glicemia do jejum e

seu pico máximo. Se for menor que 20 mg/dl, a curva glicêmica é chamada plana e significa

má absorção de lactose (PEREIRA et al., 1982); aumento da glicemia igual ou superior a 20

mg/dl em relação ao jejum é considerado um resultado normal pela maioria dos autores

(ALLIET et al., 1989; BULLER et al., 1991; BRUMER et al., 1993). Sintomas como diarréia

e dor abdominal após a administração da sobrecarga de lactose indicam intolerância a esse

carboidrato. O exame é simples, mas sua sensibilidade e especificidade são questionáveis

devido a variações nas taxas de esvaziamento gástrico a ao metabolismo da glicose

(BRUMMER et al., 1993). Resultados discutíveis podem acontecer em várias situações, tais

como má absorção primária ou secundária de monossacarídeos, esvaziamento gástrico

demorado, síndrome da alça cega e diarréia (PEREIRA et al., 1982).

• Teste de tolerância à lactose com etanol

Este teste consiste na concentração de galactose no sangue após uma sobrecarga de

lactose. É realizada apenas uma coleta de sangue após 40 minutos da ingestão de lactose. A

galactose também pode ser medida na urina. No entanto, deve-se administrar etanol (150

mg/kg) para inibir o rápido metabolismo hepático da galactose, o que limita a utilização deste

teste (AROLA et al., 1988).

• Teste respiratório com

C-lactose

O teste envolve a administração de lactose marcada com

C e reflete a atividade da

lactase e a subseqüente absorção e metabolismo da glicose. A lactase presente no intestino age

sobre o substrato

C-lactose, com a liberação de

. A porcentagem de

excretada

na primeira hora após a administração de

C-lactose discrimina os absorvedores dos não-

absorvedores de lactose (HIELE et al., 1988). Porém, enzimas bacterianas podem converter

C-lactose em

. Neste caso, quando a lactose não absorvida chegar ao cólon, haverá

produção de

ocasionando falsos resultados. Além disso, distúrbios do metabolismo da

glicose também podem interferir no resultado do exame (AROLA, 1994).

Esta técnica envolve exposição a uma substância radioativa e não é mais

recomendada, uma vez que existem outros métodos diagnósticos mais seguros (AROLA,

1994).

• Teste respiratório com

C-lactose

O exame é semelhante ao teste com

C-lactose, tendo como vantagem a utilização de

um isótopo não radioativo do carbono (

C). A excreção cumulativa do

quatro horas

após a ingestão de

C-lactose é medida através de espectrometria e é utilizada para o

diagnóstico da má absorção de lactose (STELLAARD & GEYPENS, 1998).

KOETSE et al. (2000) em um estudo comparativo entre os testes respiratórios com

este marcador (

C-lactose) e o hidrogênio expirado, usando a medida de atividade da lactase

como padrão áureo para diagnosticar má absorção deste dissacarídeo, verificaram resultados

discrepantes em 36% dos casos entre os testes respiratórios. A variação na produção colônica

de CO

com o uso do marcador

C-lactose pode ter sido uma das causas de diagnósticos

inadequados de má absorção de lactose. Outros fatores, além da digestão e absorção dos

nutrientes, podem influenciar este exame, devendo-se ter cautela na interpretação dos

resultados. Além disso, a necessidade de equipamentos de alto custo torna sua aplicação

clínica limitada (VONK et al., 1998).

• Teste do hidrogênio expirado

Atualmente, na clínica, o teste do hidrogênio expirado tem sido considerado como

padrão áureo para diagnóstico de má absorção de lactose. O exame é baseado na determinação

da concentração de hidrogênio em amostras de ar expirado após a administração de lactose

(CASELLAS & MALAGELADA, 2003).

O teste do hidrogênio expirado é considerado um teste de fácil aplicabilidade e não

invasivo. Baseia-se na fermentação bacteriana do açúcar não absorvido pelo intestino delgado,

levando ao aparecimento de ácidos orgânicos e gases, como o hidrogênio. A elevação deste

último no ar expirado indica a má absorção do carboidrato (BALLABRIGA et al., 1998).

As células dos mamíferos não produzem hidrogênio no seu metabolismo, logo 100%

da produção deste gás são devidos à utilização de substratos fermentáveis por bactérias

intestinais, sendo em torno de 10% a 21% do H

produzido excretado pelos pulmões. Para

essa produção é necessária à presença de grande quantidade de bactérias, e normalmente isso

ocorre no cólon ou, excepcionalmente no intestino delgado, quando ocorre supercrescimento

bacteriano (AROLA et al., 1988).

Há relação direta entre a produção intestinal de H

e sua excreção pulmonar, podendo

a medida de concentração do H

expirado ser realizada como indicadora da produção de H

intestino. Em adultos, o pico da concentração de H

expirado ocorre em 120 minutos após a

ingestão do carboidrato. Valores altos de H

expirado, duas horas após a ingestão de lactose

são compatíveis com o diagnóstico de má absorção de lactose (DAVIDSON & BUTLER,

2000).

A primeira coleta de ar expirado, em adultos, deve ser em jejum de 8 a 12 horas. Após

a administração de lactose, são feitas coletas em intervalos de 30 a 60 minutos por 2 a 6 horas.

A má absorção de lactose é diagnosticada quando ocorre um aumento igual ou superior a 20

partes por milhão (ppm) acima do nível basal (ROMAGNUOLO et al., 2002).

A quantidade de carboidrato utilizada em adultos não é padronizada

(ROMAGNUOLO et al., 2002). Em estudos recentes a dose de lactose utilizada é de 50g de

lactose, quantidade de carboidrato equivalente a 1 litro de leite, diluída em água (BÜNING et

al., 2005; HÖGENAUER et al., 2005). Estudos anteriores, comparando o teste do hidrogênio

expirado com biópsia intestinal, considerado o padrão áureo para diagnóstico de má absorção

de lactose, utilizaram uma sobrecarga de 50g de lactose diluída em solução aquosa e

verificaram uma variação na sensibilidade de 69% a 100% e especificidade de 96% a 100%

no teste de hidrogênio expirado (AROLA et al., 1988; NEWCOMER et al., 1975). O teste de

hidrogênio expirado pode detectar até 2g de lactose não absorvida (LEIS et al., 1997).

As amostras de ar expirado devem ser armazenadas em locais apropriados até que

sejam analisadas para que não haja alterações na concentração de hidrogênio. Para um

período maior de armazenamento ou mesmo, a necessidade de transportar as amostras de ar

alveolar, devem ser utilizados recipientes de plástico laminado específicos, nos quais as

amostras podem permanecer por até três semanas (AROLA, 1994).

A determinação da concentração de hidrogênio nas amostras de ar expirado é realizada

por cromatografia gasosa (HAMMER et al., 1996). Os critérios para interpretação do teste do

hidrogênio expirado no diagnóstico de má absorção de lactose podem variar segundo os

diferentes autores. O exame, porém, está sempre baseado na comparação do valor basal de

hidrogênio expirado, geralmente obtido da amostra em jejum, com os valores subseqüentes à

administração de lactose (PERMAN et al., 1984). Em alguns casos, os níveis de hidrogênio

em jejum estão aumentados, o que pode significar supercrescimento bacteriano, estase

intestinal, refeição muito rica em carboidrato na noite anterior ou jejum inadequado

(STROCCHI et al., 1988; RIORDAN et al., 2000).

Resultados falsamente negativos ocorrem quando a flora bacteriana do cólon não é

produtora de hidrogênio, quando a microbiota intestinal está reduzida por uso de alguns

antibióticos, ou por limpeza do cólon com o uso de enemas e laxativos ou por pH ácido do

cólon, quando a flora bacteriana intestinal consome o hidrogênio, esvaziamento gástrico

diminuído por refeição rica em gorduras, trânsito intestinal aumentado por diarréia e

alterações no padrão ventilatório por taquipnéia (SEVÁ-PEREIRA et al., 1999).

Resultados falsamente positivos ocorrem quando há um aumento na população

bacteriana produtora de hidrogênio do cólon podendo causar pico precoce 20 a 30 minutos

após a ingestão do carboidrato, alteração na motilidade do tubo digestivo com aumento do

trânsito intestinal no intestino delgado e maior o tempo de estase dos conteúdos alimentares

no cólon (pacientes com gastrectomias ou uso de medicações procinéticas), alteração no

padrão ventilatório (pacientes com hipoventilação) e fumantes, visto que a fumaça do cigarro

contém hidrogênio (SEVÁ-PEREIRA et al., 1999; FLATZ et al., 1984).

• Biópsia intestinal e medida da atividade da lactase

A biópsia intestinal propicia a dosagem bioquímica da atividade da enzima ou a

dosagem semiquantitativa através da histoquímica na mucosa intestinal. Os dois métodos

foram padronizados por Dahlqvist em 1970 (SEVÁ-PEREIRA, 1982). Este método

proporciona uma medida direta da atividade da lactase no intestino delgado. É, no entanto, um

exame invasivo e necessita exposição à radiação (NEWCOMER & MC GILL, 1966a).

Geralmente são obtidas biópsias da mucosa, no ligamento de Treitz, por instrumentos

posicionados com controle fluoroscópico. Nos últimos anos, a biópsia jejunal tem sido

substituída pela duodenal, obtida por endoscopia (GUPTA et al., 1999; AURICCHIO &

TRONCONE, 2000).

As atividades da lactase e da sucrase são determinadas de acordo com o método de

Dahlqvist e expressas em unidades por grama de tecido homogeneizado ou por grama de

proteína. Embora não exista consenso sobre a definição de hipolactasia, atividade da lactase

abaixo de 2 U/g de mucosa ou de 5 U/g de proteína é considerada hipolactasia pela maioria

dos autores (NEWCOMER & MC GILL, 1966b; BRUMMER et al., 1993). Mais

recentemente, um nível de 8-13 U/g de proteína tem sido proposto como diagnóstico

(WELSH et al., 1978; HIELE et al., 1988). A relação lactase/sucrase inferior a 0,3 também é

indicativa de hipolactasia (BRUMMER et al., 1993).

Apesar da vantagem de ser um método direto, este exame pode apresentar falhas no

diagnóstico de má absorção de lactose, uma vez que a atividade da lactase pode ser variável

nas diferentes porções do intestino delgado (SEVÁ-PEREIRA et al., 1999). Além disso, a má

absorção de lactose pode ocorrer por outros fatores que não a deficiência enzimática, como é

o caso de uma aceleração do trânsito no intestino delgado. Outro fator a ser considerado é que

na biópsia intestinal não podemos identificar a presença de sintomas após a ingestão de

lactose durante o procedimento, dificultando assim, o diagnóstico de intolerância à lactose

(HÖGENAUER et al., 2005).

1.5 – Influência da Etnia na Hipolactasia Primária do Tipo Adulto

Os indivíduos podem ser divididos em três grupos quanto à prevalência de má

absorção de lactose no adulto: o grupo de alta prevalência (60 a 100%), que corresponde aos

maus absorvedores; o grupo de baixa prevalência (0 a 30%), que corresponde aos

absorvedores; e o grupo de prevalência intermediária (30 a 60%). Esta distribuição foi

realizada através de uma revisão da prevalência de má absorção de lactose do adulto em

muitas populações e somente foram reunidos os dados a respeito de indivíduos saudáveis, sem

doenças, sem desnutrição e com mucosa intestinal normal à histologia, portanto, sem causas

de deficiência secundária de lactase (SEVÁ-PEREIRA et al., 1982; FLATZ, 1987; FLATZ at

al., 2000).

De acordo com SAHI. (1994b) a hipolactasia primária do tipo adulto afeta 75% da

população mundial com grandes diferenças regionais em um mesmo país e prevalências

epidemiológicas discrepantes em diferentes países e continentes. Em alguns países asiáticos a

prevalência de hipolactasia chega a 100% na população, enquanto que no norte da Europa a

prevalência é de apenas 2%. Na Alemanha foi observado uma prevalência de hipolactasia do

tipo adulto de 15% e de 25% nos Estados Unidos da América (SAHI, 1994b).

A má absorção de lactose é o fenótipo predominante nas populações nativas da

Austrália, Oceania, leste e sudeste da Ásia, África tropical e Américas. Existem dois grupos

populacionais distintos nos quais os indivíduos mantêm a atividade da lactase na vida adulta:

habitantes dos países do norte e região central da Europa e povos nômades das zonas áridas

do norte da África e Arábia (AURICCHIO & TRONCONE, 2000). A miscigenação entre

populações com alta e baixa freqüência de má absorção de lactose, faz com que haja locais

com freqüências intermediárias dos dois fenótipos.

Em geral, os povos com alta prevalência de má absorção de lactose do adulto são os

que têm tradição agrícola e caçadora, que nunca beberam leite, ou que passaram a ingeri-lo há

poucos milhares de anos. São os esquimós, índios das Américas, a maioria dos africanos, dos

povos do Oriente Médio e da Ásia e, seus descendentes. Neste grupo também estão incluídos

grande parte dos judeus e dos árabes que ingerem leite desde a antigüidade, mas em forma de

produtos lácteos fermentados, e, portanto, pobres em lactose. A baixa prevalência ocorre

naqueles que têm tradição pastoril, e têm consumido leite e produtos ricos em lactose por

longo período, que viveram este tempo sob pressões dietéticas, e também seus descendentes.

São alguns africanos de origem hamita, europeus do Norte e Centro e alguns indianos e

árabes. Os grupos com prevalência intermediária são aqueles mestiços dos anteriores:

africanos mestiços de bantos e hamitas, mestiços de europeus com orientais e com índios

(BEIGUELMAN, SEVÁ-PEREIRA & SPARVOLI, 1992; HOLDEN & MACE, 1997;

FLATZ at al., 2000; HOLLOX et al., 2001).

Existem poucos estudos realizados no Brasil para identificar a prevalência de

hipolactasia do tipo adulto e os métodos de diagnóstico de má absorção de lactose utilizados

foram diferentes, o que torna difícil chegar a um consenso sobre a real prevalência. Estima-se

que na população brasileira, a freqüência de hipolactasia primária do tipo adulto é

aproximadamente 50% nos caucasóides, 85% nos negróides e 100% nos orientais. Estes

dados variam de acordo com a região estudada e com o grau de miscigenação. Estudos

realizados em brasileiros adultos sadios e sem deficiência secundária de lactase, nascidos em

três regiões do Brasil (Sudeste, Sul e Nordeste) demonstraram os resultados descritos no

quadro 3. No Nordeste, onde a miscigenação é muito intensa, os indivíduos são considerados

triíbridos (negróides x portugueses x índios), no Sul há pequena mistura racial (influência

italiana, portuguesa, germânica) e no Sudeste, a mistura racial é média. (SEVÁ-PEREIRA &

BEIGUELMAN, 1982; SPARVOLI, 1990).

Quadro 3 - Prevalência de má absorção de lactose do adulto no Brasil de acordo com as raças

e as regiões estudadas

Região Sudeste Sul Nordeste

Raça (%) (%) (%)

Caucasóides 45 46

Negróides 85 73

Mongolóides 100

Triíbridos 76

Fonte: SEVÁ-PEREIRA & BEIGUELMAN, 1982; SPARVOLI, 1990.

Estudo recente realizado em São Paulo, com 115 indivíduos adultos com suspeita de

má absorção de lactose foram submetidos à endoscopia e, a análise inunohistoquímica

demonstrou uma prevalência de 60,8% de hipolactasia do tipo adulto, sendo 53,2% nos

indivíduos brancos e 91,3% nos sujeitos não-brancos (ESCOBOZA et al., 2004).

GARRIDO et al. (1976) em estudo envolvendo 30 pacientes submetidos à cirurgia por

úlcera duodenal em São Paulo, verificou a atividade de dissacaridases (maltase, sacarase e

lactase), obtendo uma prevalência de má absorção de lactase de 73,3% no grupo estudado.

Outros estudos realizados no Brasil, em populações pediátricas, utilizando método indireto

para diagnosticar má absorção de lactose (teste do hidrogênio expirado), obtiveram

prevalências diferentes entre os estados. REIS et al. (1999) em estudo feito em São Paulo com

83 crianças e adolescentes com idade entre 7 a 15 anos, obteve uma prevalência de 22,9% de

má absorção de lactose. FIGUEIREDO et al. (2000) em Minas Gerais estudou 435 crianças e

adolescentes na mesma faixa etária do estudo anterior, obteve uma prevalência de 49,2% de

má absorção. PRETTO et al. (2002) em Porto Alegre, estudou 225 escolares entre 8 e 18 anos

de idade e verificou uma prevalência de 8,4% de má absorção de lactose, sendo 15,5% em

indivíduos de cor não-branca e 5,2% em crianças e adolescentes de cor branca.

1.6 – Hipóteses Formuladas para Explicar a Diferença da Prevalência Mundial

de Hipolactasia

A teoria denominada histórico-cultural postula que a domesticação de animais leiteiros

no período neolítico, há cerca de 9000 anos atrás, resultou em uma vantagem seletiva dos

indivíduos que podiam satisfazer uma proporção maior de suas necessidades nutricionais,

principalmente protéicas, pela disponibilidade de leite como fonte alimentar. Para estas

comunidades pastoris, principalmente do Norte e Nordeste da Europa, onde havia escassez de

alimentos diversificados e temperaturas extremamente baixas, a inclusão do leite na ração

alimentar, propiciaria a estes povos primitivos uma maior resistência. A conseqüente

modificação no contexto alimentar destas populações, teria exercido uma pressão seletiva

para aquisição e propagação de uma mutação dominante, responsável pela persistência da

atividade da lactase na vida adulta. Os indivíduos com essa mutação seriam beneficiados

nutricionalmente pelo consumo de leite, sem apresentar sintomatologia relacionada com a má

absorção de lactose. Se tal fato conferisse vantagens para a sobrevivência desses indivíduos, a

proporção dos genótipos relacionados com a persistência de lactase tenderia a aumentar

nessas populações (FLATZ at al., 2000). De fato, estudos demonstraram que áreas com

tradição na criação de gado e consumo de leite apresentam taxas menores de hipolactasia

(KRETCHMER et al., 1971). Para explicar a baixa prevalência de hipolactasia no norte da

Europa, surgiu outra hipótese, baseada no efeito da lactose sobre a absorção intestinal de

cálcio. Nessa região, a prevalência de deformidades ósseas, raquitismo e osteomalácia era

bastante alta em razão da pouca irradiação solar. Considerando que a lactose aumenta a

absorção de cálcio, os indivíduos com persistência da lactase apresentariam menor incidência

de complicações ósseas e maior sobrevida, havendo assim, uma seleção natural favorecendo

esse fenótipo (FLATZ at al., 2000).

1.7 – Polimorfismos associados com a Hipolactasia do tipo Adulto

A enzima intestinal lactase ou lactase florizina hidrolase (LPH) é codificada pelo gene

LCT localizado no cromossomo 2 (AROLA & TAMM, 1994). Sua persistência na vida adulta

tem herança autossômica dominante, enquanto que a hipolactasia é herdada de forma

autossômica recessiva (SAHI, 1974; SAHI & LAUNIALA, 1977; LISKER,1996). Os

indivíduos homo ou heterozigotos para o alelo dominante são os absorvedores de lactose, e os

não-absorvedores são homozigotos para o alelo autossômico recessivo.

Por muitos anos, foi sugerido que um polimorfismo genético no gene LCT fosse

responsável pela determinação dos níveis altos da enzima na vida adulta e, conseqüentemente,

tolerância à lactose (HARVEY et al., 1998). Mutação é qualquer alteração do DNA,

independente do seu efeito no fenótipo, enquanto que polimorfismo é o nome dado a

variações que apresentam uma freqüência de pelo menos 95% na população. Polimorfismos

em nucleotídeos únicos (SNPs), são mutações de pontos na seqüência do genoma onde uma

fração da população possui um nucleotídeo, enquanto outra grande fração possui outro

nucleotídeo (STONEKING et al., 2004). No caso da lactose, uma mutação com alta

freqüência em algumas populações, portanto um polimorfismo, seria responsável pelos

diferentes fenótipos: absorvedores e não absorvedores de lactose.

MAIURI et al. (1991) demonstraram, através da utilização de anticorpos monoclonais

que em indivíduos com persistência de níveis altos de atividade de lactase na vida adulta, a

enzima se distribuiu uniformemente em todos os enterócitos das vilosidades. Por outro lado,

em indivíduos com hipolactasia primária do tipo adulto, ocorrem duas situações: em alguns

indivíduos a lactase não foi detectada, enquanto em outros se demonstrou um padrão tipo

mosaico, com alguns enterócitos expressando lactase, circundados por áreas em que não havia

evidências da presença da enzima.

Em estudo posterior, MAIURI et al. (1994) compararam a distribuição do RNA

mensageiro (RNAm), da lactase e da atividade dessa enzima em tecidos obtidos de indivíduos

com persistência da atividade da lactase e com hipolactasia. Nos indivíduos com persistência

da atividade enzimática, o RNAm foi detectado uniformemente no citoplasma de todos os

enterócitos dos vilos estudados. A presença da enzima e sua atividade também foram

demonstradas na membrana da borda em escova desses indivíduos. Nos com hipolactasia,

foram encontrados vários tipos de enterócitos em um mesmo vilo: enterócitos sem RNAm;

com RNAm e sem lactase; com RNAm e lactase mas sem atividade hidrolítica e com RNAm,

lactase e atividade hidrolítica. Como os diferentes fenótipos podem ser encontrados na mesma

vilosidade, os autores concluíram que o controle da expressão da lactase nos enterócitos é

complexo e ocorre através de vários mecanismos. A existência de diferenças entre as células

de um mesmo vilo de um indivíduo sugere que a expressão da lactase pode estar

comprometida em vários estágios. A mutação dominante que leva à persistência da lactase em

adultos, por algum mecanismo altera essa heterogeneidade. Muitos polimorfismos de

nucleotídeos (SNPs) tem sido descritos no gene da LCT em diferentes regiões (HOLLOX et

al., 2001; SWALLOW, 2003).

Em um estudo recente foram descritos 2 polimorfismos (SNPs) fortemente associados

com a hipolactasia primária do tipo adulto. Um nucleotídeo C na posição -13910 (C

-13910

) no

gene da LCT é 100% associado com a não persistência da lactase e um nucleotídeo G na

posição - 22018 (G

-22018

) é associada em mais de 95% com a não persistência da enzima em

adultos finlandeses. As variantes T-13910 e A-22018 estão associadas com a persistência da

enzima lactase em adultos (ENATTAH et al., 2002). Os autores realizaram um estudo em 9

famílias finlandesas (n = 236) usando 7 marcadores em uma região de 200 kb. O marcador

D2S2196 definiu uma região crítica de 47 kb, localizada na região 5’ do gene da lactase

(LCT). O único gene nesta região é o MCM6, um fator de replicação celular. Não foram

observadas variações na região codificante deste gene. Utilizando 43 SNPs os autores

identificaram duas mutações com co-segregação completa nas famílias: C/T-13910 e G/A-

22018. Todos os indivíduos não persistentes de lactase eram homozigotos CC/GG. As

alterações C/T-13910 e G/A-22018 estão localizadas nos introns 13 e 9 do gene MCM6,

respectivamente, e os números correspondem à distância do códon de iniciação do gene da

lactase. Portanto, estas alterações estão na região promotora do gene LCT, ou seja, a região

que controla a expressão enzimática.

Em estudo posterior, ENATTAH et al. (2002) analisaram a presença dessas alterações

em 196 DNAs de biópsias de intestino, assim distribuídas com os respectivos resultados: 59

indivíduos sem atividade de LPH (53 sujeitos com genótipo CC/GG e 6 com o genótipo

CC/GA) e 137 indivíduos com atividade de LPH (74 sujeitos com o genótipo TT/AA e 63

CT/GA). Analisaram ainda a freqüência dos genótipos em 40 indivíduos não finlandeses sem

atividade de LPH, sendo 23 coreanos, 9 italianos e 8 alemães. Todos foram homozigotos

CC/GG, exceto um italiano que era CC/GA. Finalmente, compararam as freqüências destas

mutações em 938 finlandeses e 205 não finlandeses, sendo que os valores encontrados eram

todos compatíveis com os dados epidemiológicos de persistência e não persistência de LPH

nas populações estudadas. Os resultados obtidos no estudo estão descritos no quadro 4. Desta

forma, demonstraram a associação das mutações C/T-13910 e G/A-22018, especialmente a

primeira, com a persistência da atividade da lactase (LPH) na vida adulta.

Quadro 4 - Freqüência do fenótipo de hipolactasia em indivíduos finlandeses e não

finlandeses

Nacionalidade Genótipo Fenótipo n (%)

Finlandesa CC não persistência de

lactase

169 (18)

Francesa CC não persistência de

lactase

17 (41,2)

Norte-americanos CC não persistência de

lactase

92 (7,6)

Afro-americanos CC não persistência de

lactase

96 (79,2)

Fonte: ENATTAH et al. (2002)

KUOKKANEN et al. (2003) analisaram 52 pacientes com sintomas gastrointestinais

associados à má absorção de lactose. Os pacientes foram submetidos a duas biópsias

duodenais por endoscopia, evidenciando vilosidades normais, logo descartando deficiência

secundária de lactase. Mediram os níveis de atividade de lactase e sucrase e, também

analisaram o DNA de sangue periférico para a determinação das mutações. Os resultados

obtidos demonstraram que os indivíduos com o genótipo CC/GG não apresentaram atividade

de LPH e os indivíduos com os genótipos CT/GA e TT/AA apresentaram atividade

enzimática normal. Nos indivíduos heterozigotos C/T, os autores utilizaram outros

marcadores na região codificante do gene, que 92% dos RNAm correspondiam ao alelo T.

Dessa forma, demonstraram que o polimorfismo está associado diretamente ao controle da

expressão gênica da enzima.

OLDS & SIBLEY. (2004) investigaram o mecanismo pelo qual ocorre o controle da

expressão gênica em uma linhagem de enterócitos (células Caco-2) e verificaram que o

promotor T é mais expresso que o promotor C, mas que não há diferença entre as variantes G

e A. Observaram maior interação do promotor T com fatores de transcrição, mas não com o

elemento AP2 que havia sido anteriormente sugerido como responsável por esta regulação

(TROELSEN, 2005).

POULTER et al. (2003) em estudo recente, analisaram 47 indivíduos, sendo 36

sujeitos com persistência de LPH e todos eles apresentaram o alelo T, o qual estava ausente

nos 11 indivíduos sem a persistência da lactase. Entretanto, argumentaram que o genótipo CT

não explica toda a variação na expressão da enzima LPH, especialmente porque os sujeitos

heterozigotos não apresentam níveis intermediários na atividade enzimática, como seria o

esperado. Estes estudos sugerem que a detecção direta das mutações C/T-13910 e G/A-22018

poderia ser usada como método diagnóstico de intolerância à lactose, por métodos baseados

em PCR (Reação em Cadeia da Polimerase).

2 – JUSTIFICATIVA

Os métodos convencionais de avaliação de má absorção e intolerância à lactose

disponíveis (teste de tolerância à lactose e teste de hidrogênio expirado) são eficazes, no

entanto, podem causar desconforto para os pacientes, tais como: vômitos, distensão

abdominal, cólica e diarréia grave. Neste sentido, o estudo da determinação do mecanismo

molecular associado à má absorção de lactose pode auxiliar na ampliação de um método

diagnóstico preciso e que ocasiona menor desconforto para os pacientes.

Este estudo pretende avaliar as mutações no gene da lactase-florizina hidrolase (LPH)

em indivíduos adultos procedentes de Porto Alegre que se auto-referem como tolerantes ou

intolerantes à lactose através do teste de hidrogênio expirado e técnica de PCR. Este estudo

não é um estudo de base populacional, mas sim, uma análise entre a presença de mutações no

gene da LPH e o teste de hidrogênio expirado.

3 – OBJETIVOS

3.1- Objetivo Geral

Verificar a relação entre a presença das mutações C/T-13910 e G/A-22018 no gene da

lactase-florizina hidrolase e a absorção de lactose em uma amostra de indivíduos residentes no

município de Porto Alegre auto-referidos como tolerantes ou intolerantes à lactose.

3.2- Objetivos Específicos

9 avaliar a absorção de lactose através do teste do hidrogênio expirado;

9 padronizar a técnica de PCR para verificação das mutações do gene da lactase;

9 estudar a concordância entre os dois métodos.

4- CASUÍSTICA E MÉTODOS

4.1- Delineamento

Trata-se de um estudo diagnóstico quase experimental que tem como desfecho a

presença das mutações C/T-13910 e G/A-22018 no gene da Lactase-Florizina Hidrolase e

como fatores a presença ou a ausência de sintomas relacionados à absorção da lactose.

4.2- População em Estudo

A população em estudo foi constituída por indivíduos adultos, sadios, maiores de 18

anos de idade, procedentes do município de Porto Alegre.

4.3- Amostra e Amostragem

• Seleção da Amostra

A amostra foi constituída de indivíduos convidados a participarem do estudo mediante

dois critérios estabelecidos previamente: a quantidade diária de leite de vaca ingerido

habitualmente e a presença ou não de sintomas clínicos após a ingestão de leite.

A amostra foi dividia em 2 grupos:

- o grupo de indivíduos que se auto-referiam tolerantes à lactose (consumo igual ou

superior a 3 copos de leite ao dia) sem a presença de sintomas.

- o grupo de indivíduos que se auto-referiam intolerantes à lactose (consumo de até 1

copo de leite ao dia) com a presença de sintomas clínicos.

Os candidatos compareceram ao Hospital de Clínicas de Porto Alegre em 8 horas de

jejum e permaneceram no local pelo menos 3 horas consecutivas.

• Critérios de Inclusão

Foram considerados elegíveis para a pesquisa os indivíduos sadios, voluntários,

maiores de 18 anos de idade, com o consumo de leite de vaca igual ou superior a 3 copos

(750ml) de leite ao dia sem a presença de sintomas e também indivíduos com consumo de

leite de até 250ml (1 copo) e relato de algum desconforto após sua ingestão.

• Critérios de Exclusão

Foram excluídos do estudo os indivíduos com as seguintes condições:

- diagnóstico prévio de doença com contra-indicação ao uso de lactose;

- tempo de jejum inferior a 8 horas;

- uso de antibióticos, enemas ou laxativos nos 15 dias precedentes ao exame;

- diarréia no dia da realização do exame ou nos 7 dias precedentes;

- fumo nas 6 horas precedentes ao exame ou durante a realização do mesmo;

- uso de medicações antiparasitárias nos 30 dias precedentes ao exame ou em

tratamento;

- inabilidade para a realização adequada do exame;

- não assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido.

• Cálculo do Tamanho da Amostra

Partindo-se da inexistência de dados sobre as mutações T-13910 e A-22018 na

população brasileira, a freqüência do alelo C nos indivíduos mau-absorvedores de lactose é de

100% (ENATTAH et al., 2002). Estimou-se um tamanho amostral total de 20 indivíduos para

um intervalo de confiança de 95% e um poder de 90% com margem de erro para 10%.

4.4- Variáveis Estudadas

• Absorção de Lactose

A má absorção de lactose foi diagnosticada quando o aumento máximo da

concentração de hidrogênio foi ≥ 20 ppm em relação ao nível basal. De acordo com o

resultado do teste de hidrogênio expirado, os indivíduos foram classificados em: absorvedores

e não-absorvedores de lactose.

• Sinais Clínicos

Foram verificados os sinais e sintomas apresentados durante a aplicação do exame de

sobrecarga de lactose e também um acompanhamento por 12hs após o término do exame em

ambos os grupos para identificar os sintomas mais freqüentes apresentados pelo grupo dos

não-absorvedores e averiguar se o grupo dos absorvedores não apresentou nenhum sintoma

tardio.

• Desfecho de Interesse: presença das mutações C/T-13910 e G/A-22018

A presença das mutações T-13910 e A-22018 foi identificada a partir de uma amostra

de sangue periférico, através de análise molecular pela técnica da PCR – Reação em Cadeia

da Polimerase e digestão com enzima de restrição específica. Pela análise do padrão

migratório do produto de digestão após eletroforese em gel de agarose a 1,5% foi possível

constatar a presença ou não das mutações em estudo.

De acordo com o resultado da análise molecular, os indivíduos foram classificados

como: lactase persistentes e lactase não persistentes.

4.5- Técnica do Teste de Hidrogênio Expirado

O teste do hidrogênio expirado foi realizado em duas etapas: coleta e armazenamento

do material biológico e análise dos níveis de hidrogênio através de cromatografia gasosa no

Centro de Pesquisas do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.

Para a coleta das amostras de ar expirado foi utilizado um sistema coletor (Quintron

que consta de dois recipientes, interligados por uma válvula em T, com fluxo unidirecional

(figura 1). A válvula é conectada a um bucal. Após a inspiração normal, o indivíduo expira

através do bucal, preenchendo o primeiro recipiente plástico com ar do espaço morto. Com a

pressão, haverá abertura da válvula, e o restante do ar expirado será coletado no segundo

recipiente, o qual é impermeável, não permitindo escape ou contaminação da amostra. Após o

preenchimento do segundo recipiente, a coleta é finalizada e o mesmo é destacado e vedado.

A amostra pode ficar aí armazenada ou ser transferida para seringas ou recipientes específicos

para armazenamento. Com esta técnica, obtém-se uma amostra significativa do ar alveolar.

Neste estudo foram utilizados recipientes específicos para armazenamento com

capacidade para 750ml, nos quais as amostras permaneceram até serem analisadas. Eram

armazenadas amostras de 300 a 500ml de cada indivíduo. Os recipientes conforme

demonstrado na figura 1 eram esvaziados e reutilizados.

Figura 1 - Recipiente utilizado para coleta das amostras de ar expirado

O aparelho de cromatografia gasosa empregada para medida da concentração do

hidrogênio no ar expirado foi um cromatógrafo de gás (Quintron Microlizer, modelo 12i) com

sensibilidade de 1 ppm de hidrogênio e acurácia de ± 2 ppm de hidrogênio.

Para a análise da concentração de hidrogênio nas amostras de ar expirado, inicialmente

o aparelho era calibrado com um gás de referência que continha uma concentração conhecida

de hidrogênio. Foi utilizado gás com uma concentração de hidrogênio de 96 ppm. Após este

processo, assegurando-se a exatidão do aparelho, iniciava-se a medida das amostras. Uma

quantidade de 20ml de ar era aspirada com uma seringa do recipiente onde estava armazenada

e injetada no cromatógrafo. A seguir, a amostra era conduzida através de uma coluna de

cromatografia por gás carreador. O gás carreador utilizado é o ar atmosférico filtrado por uma

coluna preenchida com material que retém impurezas, tais como álcool, acetona ou gases

orgânicos. Os componentes da amostra são separados de acordo com sua velocidade de

deslocamento até a extremidade distal da coluna. Nesse local, há um sensor que detecta

hidrogênio e emite um sinal proporcional à concentração do gás. Esse sinal analógico é

convertido para a forma digital (em ppm, de acordo com as unidades utilizadas para

calibragem) e exibido no visor do aparelho, alguns minutos depois de iniciada a análise.

Foi considerado como critério de positividade o aumento nas concentrações de

hidrogênio igual ou superior a 20 ppm acima do nível basal.

4.6- Técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Os testes de biologia molecular foram feitos no Centro de Terapia Gênica do Hospital

de Clínicas de Porto Alegre.

A presença das mutações foi analisada por técnica da PCR usando os primers descritos

abaixo, desenhados para este trabalho (USM).

Para a realização da PCR foram coletados 10ml de sangue periférico em EDTA no

momento da realização do teste de hidrogênio expirado. O DNA foi extraído através de kit

comercial de extração (Easy-DNA

, Invitrogen). O DNA foi utilizado exclusivamente para

este estudo, sendo posteriormente descartado. Medidas adicionais de preservação do

anonimato dos participantes foram tomadas pela codificação das amostras de DNA e

resultados de teste de hidrogênio expirado.

Os primers utilizados para a amplificação do polimorfismo C/T-13910 foram os

seguintes: primer foward 5’-AAGACGTAAGTTACCATTTAATAC-3’ e o primer reverse

5’-CGTTAATACCCACTGACCTATCCT-3’. Os primers utilizados para a amplificação

do polimorfismo G/A-22018 foram os seguintes: primer foward 5’-

TAAGAACATTTTACACTCTTC-3’ e o primer reverse 5’-

AGAAAATGGGTTTTCGCCATG-3’.

Para cada reação de PCR foram utilizados: 1x Tampão KCl, 0,2 nM de dNTP, 1,5 nM

de MgCl

20 pmol de primer foward, 20 pmol de primer reverse e 1 µ de Taq DNA

Polimerase e 100 ng de DNA, totalizando um volume final de 50 µL em água destilada.

Todos os reagentes foram adquiridos da Invitrogen. As reações de amplificação foram

realizadas em aparelho termociclador do tipo Eppendorf Personal Cycler e cada reação era

composta de 30 ciclos de 90 segundos e temperatura de anelamento de 56° C.

Após a reação de PCR, o produto da mesma era verificado em gel de agarose 1,5%,

corado com brometo de etídio. Uma vez que houvesse a confirmação da amplificação da

seqüência pretendida, era realizada a digestão enzimática.

A digestão foi realizada através das enzimas de restrição BsmFI (New England

Biolabs) para a mutação C/T-13910 e HhaI (Invitrogen) para a mutação G/A-22018 nas

seguintes condições: 16 µL de água, 3 µL de tampão, 1 µL de enzima de restrição e 10 µL de

produto de PCR por 4 horas a 65º C e 37º C respectivamente.

O resultado foi verificado por eletroforese em gel de agarose a 2% e classificados em

CC, CT, TT e GG, GA, AA.

4.7- Logística

Foram incluídos no estudo 20 indivíduos residentes no município de Porto Alegre,

sendo 18 sujeitos caucasóides e 1 voluntário com descendência asiática que demonstraram

interesse em participar da pesquisa após o esclarecimento sobre a mesma.

As coletas das amostras de hidrogênio expirado ocorreram durante o período

compreendido entre os meses de outubro a dezembro de 2004.

Ao chegar ao Hospital de Clínicas de Porto Alegre, no turno da manhã, o indivíduo

voluntário que estivesse em jejum e com o termo de consentimento livre e esclarecido

preenchido e assinado era encaminhado ao Centro de Pesquisas e recebia as orientações sobre

como deveria proceder durante as coletas para permanecer no estudo. Previamente, no

momento da seleção dos voluntários era verificado se os mesmos apresentavam alguma

condição listada nos critérios de exclusão e também eram submetidos a um questionamento

sobre a quantia de leite ingerida diariamente, bem como se apresentava algum sintoma após o

consumo de leite ou derivados. Àqueles que consumiam leite no mínimo três vezes ao dia

habitualmente era solicitado que antes do dia marcado para o exame, ingerisse 1 litro de leite

em um dia e observasse qualquer manifestação de desconforto abdominal, bem como outros

sintomas.

No dia do exame, inicialmente era coletada a primeira amostra de ar expirado (em

jejum), e o voluntário recebia 50g de lactose diluída a 20% em um volume final de 250ml de

água. A ingestão da lactose era efetuada em até 2 minutos sob supervisão. Após esse

momento, só era permitida a ingestão de água até o término das coletas. As coletas

subseqüentes eram realizadas 60, 120 e 180 minutos após a administração da lactose. No

intervalo, os indivíduos permaneciam na sala de exame e era coletada a amostra de sangue

para análise molecular. Após a quarta coleta, os indivíduos recebiam um lanche, eram

liberados e eram contatados pela autora por 12hs após o término do experimento para o

acompanhamento da melhora ou piora dos sintomas apresentados durante o exame ou o

aparecimento de algum sintoma tardio.

As amostras de ar eram armazenadas em recipientes específicos e analisadas entre as

coletas através de cromatografia gasosa.

Todas as coletas foram realizadas pela autora com auxílio de uma médica

colaboradora do estudo para coleta de sangue e um acadêmico de medicina. A análise das

amostras e a medida de hidrogênio expirado foram realizadas pela autora.

O sangue coletado durante o teste do hidrogênio expirado foi congelado até o

momento da análise molecular das mutações que ocorreram a partir de julho de 2005.

A extração de DNA e a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase foram realizadas

no Centro de Terapia Gênica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre pela autora com o

auxílio e a supervisão de 2 biólogas colaboradoras deste estudo.

4.8- Análise Estatística

A análise estatística descritiva foi utilizada para caracterização da amostra com uso de

gráficos e tabelas. As variáveis quantitativas foram descritas através de média e desvio padrão

ou mediana e percentis 25–75. As variáveis qualitativas foram descritas através de freqüências

absoluta e relativa. Para avaliar a normalidade dos dados foi aplicado o teste de Shapiro-

Wilks, resultando nos níveis de H

expirado como uma distribuição assimétrica.

A comparação dos níveis de hidrogênio expirado dentro dos grupos dos tolerantes e

intolerantes à lactose foi realizada através do teste de Friedman e para complementar este

teste na presença de significância estatística foi aplicado o teste de Wilcoxon.

A comparação dos valores da excreção de H

nos quatro momentos do teste (basal, 60,

120 e 180 minutos) entre os grupos dos absorvedores e não absorvedores foi obtida através do

teste de Mann-Whitney.

A avaliação da concordância entre os testes de hidrogênio expirado e análise

molecular foi obtida através do Coeficiente de Kappa. O nível de significância adotado foi de

5%.

Os dados foram processados e analisados por meio do programa SPSS (Statistical

Package for the Social Sciences) versão 10.0.

4.9- Considerações Éticas

O protocolo do presente estudo e seu termo de consentimento livre e esclarecido foi

aprovado pela Comissão Científica do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Clínicas

de Porto Alegre e Comissão de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Federal do Rio

Grande do Sul (projeto nº 04123).

As amostras de sangue foram identificadas por códigos e descartadas ao término do

estudo.

A inclusão no estudo dos indivíduos voluntários só ocorreu após a assinatura do termo

de consentimento livre e esclarecido (ANEXO 1).

5- RESULTADOS

5.1 – Características da Amostra

Vinte indivíduos foram convidados a participarem do estudo. Dezoito voluntários

eram caucasóides e 1 pessoa era de descendência asiática, com idade superior a 18 anos. Dos

20 indivíduos incluídos no estudo, dois eram do sexo masculino e dezoito (90%) eram do

sexo feminino. A média de idade da amostra foi de 32,7 ± 7,3 anos (tabela 1).

Tabela 1 - Características gerais dos indivíduos estudados

Variável n = 20

Idade (anos) 32,7 ± 7,3

Sexo feminino, n (%) 18 (90)

Sexo masculino, n (%)

Caucasóides, n (%)

2 (10)

19 (95)

Asiático, n (%) 1 (5)

Os sintomas apresentados pelos 10 voluntários que se auto-referiam como intolerantes

à lactose durante a aplicação do teste de hidrogênio expirado e até 12hs após o término do

exame, estão descritos na tabela 2. Seis dos 10 indivíduos que se auto-referiam como

tolerantes à lactose informaram ter uma necessidade de ingestão alimentar imperiosa durante

os primeiros 60 minutos do exame e 4 indivíduos deste grupo não apresentaram queixa

alguma.

Tabela 2 - Sintomas apresentados pelos indivíduos auto-referidos intolerantes à lactose

durante o teste do H

Relato de Sintomas n= 10

Distensão abdominal, n (%) 5 (50)

Náuseas, n (%) 5 (50)

Flatulência, n (%) 6 (60)

Diarréia, n (%) 5 (50)

Urgência evacuatória, n (%) 3 (30)

Cefaléia, n (%) 3 (30)

Eructação, n (%) 1 (10)

Plenitude gástrica, n (%) 1 (10)

5.2 – Resultados do Teste do Hidrogênio Expirado

O teste do hidrogênio expirado foi positivo (nível de hidrogênio maior que 20 ppm em

relação ao nível basal) em 9 (45,0%) dos 20 indivíduos e negativo em 11 (55,0%). Entre os 10

indivíduos que se auto-referiam como intolerantes à lactose, 09 apresentaram os resultados do

teste de H

expirado positivo e um indivíduo apresentou o teste H

negativo. Entre os 10

voluntários que se auto-referiam como tolerantes à lactose, todos participantes apresentaram o

teste H

expirado negativo.

Os resultados dos valores das medianas do teste do hidrogênio expirado, encontrados

nos quatro momentos das coletas (basal, 60, 120 e 180 minutos), tanto nos 10 indivíduos com

os testes positivos quanto nos 10 com os testes negativos, estão demonstrados na tabela 3.

Tabela 3 - Avaliação do teste de H

expirado

Teste de H

Avaliação

positivo *

Mediana (P25 – P75)

negativo **

Mediana (P25 – P75)

Basal 7,0

(2,0 – 13,0) 8,0 (1,0 – 18,0) 0,822

60 min. 61,0 (37,5 – 94,5) 8,0 (3,0 – 12,0) < 0,001

120 min. 80,0 (60,0 – 101,5) 7,0 (1,0 – 12,0) < 0,001

180 min. 73,0 (62,0 – 102,5) 2,0 (1,0 – 7,0) < 0,001

* Houve diferença estatisticamente significativa pelo teste de Friedman (p = 0,001) entre os 4 momentos das avaliações do H

expirado no grupo positivo (não absorvedores);

** Não houve diferença estatisticamente significativa pelo teste de Friedman (p = 0,172) entre os 4 momentos das avaliações

do H

expirado no grupo negativo (absorvedores);

Pelo teste de Wilcoxon, existe diferença estatisticamente significativa no grupo positivo (não absorvedores) entre o basal e

as avaliações em 60 min (p = 0,008), 120 min (p = 0,008) e 180 min (p = 0,008).

Houve diferença estatisticamente significativa pelo teste de Mann-Whitney nos níveis

de hidrogênio entre os absorvedores (teste H

negativo) e não absorvedores (teste H

positivo)

nas avaliações em 60 min (p<0,001), 120 min (p<0,001) e 180 min (p<0,001), sendo que o

grupo dos não absorvedores demonstrou um nível mais elevado de hidrogênio em cada uma

dessas avaliações conforme demonstrado na Figura 2. No grupo dos não absorvedores (teste

positivo), houve uma diferença estatisticamente significativa da avaliação do nível basal

para as demais (p=0,008) coletas (Tabela 3).

180 min120 min60 minbasal

Nível de hidrogênio expirado (em ppm)

180

150

120

Teste do H2

não absorvedores

absorvedores

Figura 2 - Comparação entre os níveis de H

expirado entre os grupos dos absorvedores e não

absorvedores

O maior aumento do hidrogênio expirado no grupo dos não absorvedores (teste H

positivo) ocorreu aos 120 minutos. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os

níveis de hidrogênio nas avaliações em 60 min, 120 min e 180 min conforme demonstrado na

Figura 3.

Basal 60 min 120 min 180 min

Momento da avaliação

Nível mediano de hidrogênio

expirado (em ppm)

Teste do H

Figura 3 - Nível de hidrogênio expirado (em ppm) na amostra

5.3 – Resultados do Teste Molecular para as Mutações C/T e G/A

A distribuição dos genótipos possíveis para a mutação G/A (AA, GA e GG) entre os

vinte indivíduos estudados está demonstrada na tabela 4 e figura 4. A presença da mutação A-

22018 em ambos os alelos (AA) esteve presente em 4 (20,0%) indivíduos estudados e em 6

(30,0%) indivíduos esteve presente em somente um dos alelos (GA). Desta forma, 10 (50,0%)

dos 20 voluntários da amostra estudada apresentaram resultados positivos para a mutação

citada, considerados mutantes e 10 (50,0%) dos sujeitos apresentaram o genótipo (GG),

considerados não mutantes.

Entre os três genótipos possíveis para a mutação C/T (TT, CT e CC) foi obtido o

seguinte resultado entre os 20 voluntários que participaram do estudo conforme demonstrado

na tabela 4 e figura 4. A presença da mutação T-13910 em ambos os alelos (TT) esteve

presente em 3 (15,0%) sujeitos e em 7 (35,0%) indivíduos esteve presente em somente um dos

alelos (CT). Desta forma, 10 (50,0%) em 20 sujeitos da amostra estudada apresentaram

resultados positivos para a mutação citada, portanto, considerados mutantes e 10 (50,0%) dos

voluntários apresentaram o genótipo (CC), considerados não mutantes.

Tabela 4 - Distribuição dos genótipos na amostra.

Genótipos

CC C/T T/T

(n = 10) (n = 7) (n = 3)

GG (n = 10)

(100,0 %)

GA (n = 6)

_ 06

(100,0 %)

AA (n = 4)

_ 01

(25,0 %)

3 (75,0%)

Figura 4 - Os produtos digeridos do PCR foram amplificados em gel de agarose a 2,5%.

Linhas 1 e 9 mostram produtos de PCR não digeridos. Linhas 2 e 6 mostram indivíduos

homozigotos para os genótipos de não-persistência de lactase CC

13910

e GG

22018;

4 e 8

homozigotos para os genótipos de persistência de lactase TT

13910

e AA

22018

; 3 e 7 indivíduos

heterozigotos para o genótipo de persistência de lactase CT

13910

e GA

22018

. O marcador de

DNA com 50 pb está demonstrado na linha 5.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

5.4 – Concordância entre Testes Molecular, H

Expirado e Sintomas

Relacionando os resultados verificados quanto à presença das mutações A-22018 e T-

13910, os resultados do teste de hidrogênio expirado e a manifestação de sintomas dos 20

indivíduos analisados obtiveram-se os resultados demonstrados na tabela 5. Foi encontrado

um Coeficiente de Concordância Kappa entre o teste delta H

e as mutações G/A-22018 e

C/T-13910 igual a – 0,9 (p < 0,001). Entre os 11 indivíduos absorvedores, 10 (90,9%)

apresentaram as duas mutações (C/T e G/A), o que explica a relação inversa que existe entre

esses dois testes. Entre os sintomas apresentados e as mutações foi identificado um

Coeficiente de Concordância Kappa = – 0,8 (p < 0,001). Dos 10 indivíduos que não

apresentaram sintomas, 9 (90,0%) apresentaram as duas mutações (C/T e G/A). Por fim,

obteve-se um Coeficiente de Concordância Kappa = 0,9 (p < 0,001) entre os resultados do

delta H

e os sintomas relatados pelos indivíduos durante o teste. A relação entre esses dois

testes, diferentemente dos demais, é diretamente proporcional, ou seja, entre os 9 não

absorvedores, 9 (100,0%) apresentaram algum tipo de sintoma durante o teste de hidrogênio

expirado. O resultado final entre os testes de sobrecarga de lactose e molecar entre os dois

grupos participantes do estudo que se auto-referiam como tolerantes ou intolerantes à lactose

está demonstrado de forma esquematizada na Figura 5.

Tabela 5 - Concordância entre a análise molecular e os testes do hidrogênio e sintomas

Genótipo

Fenotipo

Auto-referido

Expirado

Sintomas

Gastrointestinais

N = 20

CCGG intolerância Positivo presente n = 9

CCGG tolerância Negativo ausente n = 1

CTGA tolerância Negativo ausente n = 5

CTGA intolerância Negativo presente n = 1

CTAA tolerância Negativo ausente n = 1

TTAA tolerância Negativo ausente n = 3

Figura 5 - Representação esquemática dos resultados encontrados.

SIM NÃO

Tolerante

(

auto-referido

)

Absorvedor

expirado)

Ausência de

sintomas

Mutação

(alelo T -13910)

6 – DISCUSSÃO

6.1 – Características gerais do estudo

Este trabalho caracteriza-se como sendo um estudo transversal que objetivou verificar

a relação entre a presença das mutações C/T-13910 e G/A-22018 no gene da lactase-florizina

hidrolase e a absorção de lactose em indivíduos procedentes do município de Porto Alegre. A

amostra foi constituída de 20 indivíduos com idade superior a 18 anos. Os participantes foram

selecionados segundo o relato da quantidade de leite consumida, habitualmente, por dia e

quanto à presença ou ausência de sintomas relacionados à ingestão de leite. Os voluntários

que se auto-referiam como tolerantes à lactose relataram um consumo habitual entre 3 copos

de leite (750ml) a 1 litro de leite ao dia sem a manifestação de sintomatologia associada à

intolerância à lactose e os participantes que se auto-referiam como intolerantes ao leite

relataram um consumo de no máximo 1 copo (250ml) de leite ao dia com a presença de algum

desconforto abdominal até mesmo sintomas mais severos. A má absorção de lactose foi

diagnosticada através do teste de hidrogênio expirado após a ingestão de 50 g de lactose

diluída em solução aquosa a 20%. O teste teve duração de 3 horas e foi considerado positivo

quando o aumento foi superior a 20 partes por milhão na concentração de H

em relação ao

nível basal. Os voluntários também foram classificados como indivíduos com lactase

persistente e lactase não persistente através da análise molecular dos dois polimorfismos

(C/T-13910 e G/A-22018) responsáveis pela persistência da Lactase Florizina Hidrolase no

adulto pelo método da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

6.2 – A Prevalência de Hipolactasia Primária do Tipo Adulto Avaliada através

do Teste do Hidrogênio Expirado

O teste do hidrogênio expirado, que teve seu uso difundido a partir da década de 70,

hoje é uma das técnicas mais utilizadas para o diagnóstico da má absorção de lactose (LEIS et

al., 1997). A simplicidade e a natureza não-invasiva do método tornam-no ideal para

aplicação em estudos epidemiológicos e também em estudos científicos devido sua alta

sensibilidade e especificidade.

AROLA et al. (1988) compararam o teste do hidrogênio expirado (método indireto)

com a medida da atividade da lactase por biópsia jejunal (método direto) em 63 indivíduos

adultos e obtiveram no exame, uma especificidade de 96% e uma sensibilidade de 69%. Os

valores preditivos positivo e negativo foram de 85% e 90% respectivamente.

O teste de tolerância à lactose também é bastante utilizado em estudos de prevalência e

comumente usado na clínica para diagnóstico de má absorção, mas conforme citado

anteriormente neste trabalho, apesar de ser um exame simples, sua sensibilidade e

especificidade são questionáveis devido a variações nas taxas de esvaziamento gástrico a ao

metabolismo da glicose (BRUMMER et al., 1993).

Existem protocolos diferentes para a aplicação do teste de hidrogênio expirado quanto

à quantidade de lactose a ser administrada, volume de água para a diluição, tempo total do

exame e tempo de intervalo entre as coletas. Neste estudo foi utilizado o teste clínico

convencional aplicado para indivíduos adultos com suspeita de intolerância à lactose.

Administração oral de 50 g de lactose (equivalente a quantidade de lactose em 1 litro de leite)

diluída em 250ml de água, conforme estudo realizado por BRIET et al. (1997). As coletas de

hidrogênio expirado foram realizadas com intervalos de 60 minutos, conforme demonstrado

por SOLOMONS et al. (1980), esse intervalo não diminui a sensibilidade do exame e o teste

teve duração de 3 horas, com coletas aos 60, 120 e 180 minutos após a ingestão de lactose.

Consideramos como critério de positividade o aumento igual ou superior a 20 ppm de

hidrogênio acima do nível basal, critério mais adotado na literatura. Estudo brasileiro,

realizado por REIS et al. (1999) também preconiza um aumento na concentração de

hidrogênio acima de 20 ppm para o diagnóstico de má absorção de lactose, pois este critério

apresentou melhor correlação com a ocorrência de intolerância à lactose utilizando o teste do

hidrogênio expirado.

Dentre os trabalhos brasileiros publicados nas bases pesquisadas, Capes e Pubmed,

sobre má absorção de lactose, não foi encontrado na literatura, nenhum realizado em

indivíduos adultos procedentes do município de Porto Alegre, somente estudo em crianças.

Estudo realizado no município de Porto Alegre por PRETTO et al. 2002 identificou uma

prevalência de má absorção de lactose de 8,4%, visto que o referido estudo utilizou doses

fisiológicas de lactose em crianças e adolescentes para o diagnóstico (1 copo de 250ml de

leite – 12,5 g de lactose). A prevalência observada neste estudo foi considerada elevada para

as características étnicas do Sul do Brasil, considerando a faixa etária estudada, a dose de

lactose e o veículo de administração.

SPARVOLI (1990), estudando 70 indivíduos de 19 a 59 anos nascidos na Região Sul

do Brasil, demonstrou má absorção de lactose em 37,5% dos caucasóides e em 68,18% dos

negróides. O teste utilizado para diagnóstico foi o teste de tolerância à lactose com dose de 50

g de lactose em solução aquosa a 10%. Em São Paulo, TRONCON et al., (1981) também

encontraram taxas mais elevadas de má absorção de lactose em pacientes de cor não-branca

em relação aos de cor branca (94,45% x 68,75%). Tais resultados foram obtidos em pacientes

adultos e com a utilização do teste de tolerância à lactose (dose de 50 g dissolvida em 300ml

de água). Outro estudo efetuado em São Paulo por SEVÁ-PEREIRA et al., (1982) com

adultos demonstrou taxas de 85% de má absorção em indivíduos negróides e de 50% em

caucasóides. A dose de lactose empregada foi de 50 g em solução aquosa a 10%, e o método

diagnóstico foi o teste de tolerância.

Estudo recente realizado em São Paulo, ESCOBOZA et al., (2004), identificaram uma

prevalência de hipolactasia primária do tipo adulto de 60,8%. Entre os 115 pacientes

estudados (idade entre 5 a 60 anos) verificou-se uma maior prevalência de hipolactasia em

indivíduos não-brancos (91,3%) que em indivíduos de cor branca (53,2%). Os pacientes

foram selecionados, pois seriam submetidos à endoscopia por causas diversas: dor epigástrica,

dispepsia, esofagite, refluxo gastroesofágico e úlcera péptica. Durante a endoscopia foram

coletadas 3 amostras da segunda porção do duodeno para análise histológica, medida de

atividade de sucrase e lactase e para análise imunohistoquímica. A quantidade de leite

ingerido, habitualmente, referido pelos pacientes foi similar tanto no grupo dos pacientes com

normolactasia quanto no grupo dos indivíduos com hipolactasia. Os pacientes que relataram o

consumo de até 2 copos de leite ao dia (1 copo = 250ml), 24,2% eram normolactásicos e 8,6%

apresentavam hipolactasia. Os pacientes com hipolactasia relataram a presença de sintomas

tais como: diarréia (15,7%), dor abdominal (8,7%), flatulência (4,4%) e 71,4% não referiram

sintomas gastrointestinais. No grupo dos pacientes com normolactasia, os autores, também

observaram: diarréia (11,1%) e dor abdominal (6,7%), sendo que a maioria (82,2%) destes

pacientes não apresentou queixas gastrointestinais.

Em nosso estudo, os sintomas mais relatados pelos voluntários foram: flatulência

(30%), dor abdominal (25%), diarréia (25%) e náuseas (25%). Dos 10 indivíduos que

relataram sintomas durante o teste de sobrecarga com 50 g de lactose, 9 tiveram o teste de

hidrogênio expirado positivo e apenas 1 sujeito apresentou o teste de hidrogênio expirado

negativo. Este resultado negativo talvez possa ser explicado pela possibilidade do indivíduo

apresentar no cólon flora bacteriana não produtora de hidrogênio ou então, presença de

parasitose não tratada. Apesar da medida da concentração de H

expirado ser um método de

diagnóstico sensível e específico, pode sofrer influência da velocidade de esvaziamento

gástrico, do uso de antibióticos, do tipo de alimentação, do pH intestinal e também da

capacidade das bactérias do cólon de produzirem H

. Cerca de 90% dos adultos possuem

bactérias capazes de produzir H

o que pode resultar em 10% de resultados falsamente

negativos (SEVÁ-PEREIRA et al., 1999). Modificações na qualidade, na quantidade e na

distribuição da flora bacteriana podem alterar o resultado de exame (GARDINER et al.,

1981).

No presente estudo a amostra foi de conveniência e selecionada conforme a queixa

auto-referida de desconforto abdominal após a ingestão de leite em quantidade mínima de 1

copo. Por outro lado os critérios de exclusão foram observados em indivíduos assintomáticos

e assim, a possibilidade de descartar a maioria das causas secundárias de má absorção de

lactose. É provável que a elevada concordância (90%) observada entre os sintomas e o teste

do hidrogênio expirado deva-se a estes fatos.

Em relação aos bons absorvedores de lactose em nossa pesquisa, conforme já referido,

eles relataram um consumo habitual de no mínimo 3 copos de leite in natura por dia e foram

incluídos no estudo mediante um teste prévio de consumo de 1 litro de leite em 1 dia. Entre os

indivíduos que se auto-referiam maus absorvedores de lactose, relataram não tolerar nenhuma

quantidade de leite ou no máximo 1 copo (250ml) de leite por dia, sem ser in natura. Estes

dados estão de acordo com a literatura que sugere que as pessoas com hipolactasia do tipo

adulto podem tolerar até 2 copos de leite (25 g lactose) ao dia desde que em horários

diferentes e não sendo in natura, visto que a presença de outros alimentos ingeridos junto com

o leite reduz os sintomas de má absorção de lactose (SUAREZ et al., 1997). CARROCCIO et

al. (1998) em estudo cego em indivíduos da população Italiana, demonstraram que apenas

63% das pessoas que se auto-referiam intolerantes à lactose, submetidos ao teste do

hidrogênio expirado, eram realmente mau-absorvedores de lactose, e apenas 5 pacientes

destes mal-absorvedores apresentaram algum sintoma com 25g de lactose, equivalente a

aproximadamente 2 copos de leite. Outro estudo, na Galicia, demonstrou que 32,5% da

população apresentaram alteração no teste do hidrogênio após o consumo de 50 g de lactose

em solução aquosa a 20%. Este percentual diminuiu significativamente após a diminuição da

quantidade de lactose ingerida (25 g e 12,5g de lactose) e do veículo utilizado para a

administração da mesma. Apenas 13,7% dos indivíduos apresentaram má-absorção de lactose

após o consumo de 250ml de leite e 3,8% depois do consumo de 250ml de iogurte (LEIS et

al., 1997).

6.3 – Análise Molecular

Existem 9 genótipos possíveis para o gene da LPH. KUOKKANEN et al (2003)

compararam o genótipo dos pacientes com a atividade da enzima através de material de

biópsia intestinal e identificaram 4 genótipos: CCGG e CCGA (não persistência de lactase) e,

CTGA e TTAA (persistência de lactase). Em nosso estudo foram identificados 4 genótipos na

amostra estudada: 10 indivíduos CCGG (não persistência de lactase), 6 CTGA, 1 CTAA e 3

sujeitos TTAA todos associados à persistência de lactase. Identificamos 1 genótipo CTAA –

persistência de lactase, até então ainda não descrito na literatura.

Nossos resultados demonstraram que a análise do polimorfismo C/T-13910 e G/A-

22018 no gene da Lactase Florizina Hidrolase (LPH) apresentou uma forte concordância (k -

0,9) com o teste de hidrogênio expirado para diagnosticarmos má-absorção de lactose e,

também uma forte concordância entre o teste molecular e a presença de sintomas relacionados

com a má absorção de lactose (k -0,8). O indivíduo auto-referido intolerante à lactose com o

teste H

negativo (absorvedor) e presença de sintomas apresentou genótipo CTGA, compatível

com persistência de lactase. Por outro lado, um indivíduo auto-referido tolerante à lactose

com o teste H

negativo (absorvedor) e ausência de sintomas ao exame apresentou genótipo

CCGG, associado à não persistência de lactase.

No presente estudo, os voluntários que apresentaram o genótipo CCGG (não

persistência de lactase), 9/10 tiveram o teste de H

positivo e apresentaram sintomas após o

exame. Apenas 1/10 apresentou o teste de H

negativo, sendo que os sintomas não estavam

presentes. Dentre as possíveis explicações para esta discrepância, pode-se citar um declínio

mais lento nos níveis de lactase que levariam a uma hipolactasia tardia neste indivíduo. Isto,

apesar de ser um fator a ser considerado na explicação do observado é discutível, pois o

indivíduo tinha apenas 40 anos de idade. Outras possibilidades para a discordância entre a

mutação e o teste do hidrogênio expirado seriam: flora intestinal bacteriana não produtora de

hidrogênio, jejum incorreto ou uma refeição rica em carboidrato na noite anterior ao exame.

Salienta-se que o H

excretado no nível basal (28 ppm) foi superior ao valor de ponto de corte

estabelecido neste estudo de 20 ppm. TADESSE et al (1992) e VELIGATI et al (1994) já

demonstraram que o nível de hidrogênio excretado no basal superior ao valor de ponto de

corte pode significar supercrescimento bacteriano, jejum inadequado ou uma refeição muito

rica em carboidrato antes do início do jejum.

Conforme demonstrado em estudos anteriores,

pode ocorrer uma adaptação da flora intestinal reduzindo os sintomas relacionados à má

absorção de lactose quando há um consumo regular de lactose em quantidades reduzidas

(HERTZLER & SAVAIANO, 1996), ou uma alteração na microbiota do cólon, propiciando o

consumo de hidrogênio pela própria população de bactérias (HILL, 1983; TOMLIN et al.,

1991).

Os voluntários que apresentaram genótipos de persistência de lactase obtiveram

resultados negativos no teste do hidrogênio expirado, mas 1 sujeito CTGA apresentou

sintomas de má absorção de lactose durante o teste. O mesmo foi observado por

HÖGENAUER e colaboradores, recentemente, em excelente análise na Áustria. Os resultados

do referido estudo mostraram que a correlação do genótipo CC (lactase não persistente) foi

excelente com os resultados positivos do hidrogênio expirado (36/37 sujeitos, 97%), enquanto

que a correlação dos genótipos CT e TT (lactase persistente) com os resultados negativos do

hidrogênio expirado foi menor (74/86 sujeitos, 86%). Os 123 pacientes que participaram do

estudo apresentavam sintomas relacionados com a má absorção de lactose e todos eram

caucasianos (HÖGENAUER et al. (2005). Neste estudo foi analisado somente o polimorfismo

da variante C/T-13910, ao passo que nós avaliamos também o polimorfismo da variante G/A-

22018).

Outro estudo recente realizado na Alemanha por BÜNING et al. (2005) analisou os

dois polimorfismos do gene da LPH. Foram 166 pacientes com sintomas de hipolactasia

submetidos tanto aos testes de hidrogênio expirado quanto a análise do DNA. Os resultados

observados mostraram: 116 pacientes apresentaram o teste do hidrogênio positivo, desses 106

(91,4%) com a variante C na posição 13910 e 103 com a variante G na posição 22018. Este

resultado evidencia o genótipo relacionado com a não persistência de lactase. Entre os 50

pacientes com o teste do hidrogênio expirado negativo, 2 apresentaram a variante C na

posição 13910, genótipo de não persistência da lactase. Ambos os pacientes repetiram o teste

do hidrogênio expirado, um paciente obteve H

expirado positivo e o outro novamente

apresentou o teste do H

negativo. A explicação pelos autores foi de que o paciente apresentou

hipolactasia e flora bacteriana não excretora de hidrogênio.

Os resultados do presente trabalho permitem concluir que a análise dos polimorfismos

C/T-13910 e G/A-22018 no gene da Lactase Florizina Hidrolase podem ser considerados um

bom indicador para o diagnóstico de má absorção de lactose. É um método bastante sensível

(75%) e específico (99%) conforme demonstrado em estudo feito por HÖGENAUER et al

(2005) e tem ótima concordância com o teste de hidrogênio expirado. As vantagens do teste

molecular em relação aos outros métodos de diagnóstico de hipolactasia primária do tipo

adulto são: menor exigência de tempo disponível do paciente para realização do teste e menor

desconforto por parte do paciente, visto que é necessária apenas uma coleta de sangue

periférico. Outras vantagens são: não requer preparação para realização do exame (por

exemplo: jejum), não submete o indivíduo que apresenta sintomas relacionados à intolerância

à lactose ao componente que lhe é agressor e também devemos considerar que é um método

direto de analisar a persistência ou não da enzima lactase. Realçamos também, alguns

inconvenientes para a realização do teste do H

expirado, tais como: tempo de duração do

teste (3hs), jejum prolongado (12hs), método de diagnóstico indireto e a possibilidade de

desconforto gastrointestinal nos indivíduos intolerantes à lactose. A única dificuldade para a

execução do teste molecular é a reduzida disponibilidade de laboratórios capacitados a

realizar o teste molecular. Por este motivo, a padronização de um teste molecular, menos

invasivo, e com ótima concordância com o teste do H

expirado é de grande interesse.

A limitação do nosso estudo é o número que pode ser considerado reduzido em

indivíduos analisados. No entanto, é o primeiro realizado no Brasil. O fato de termos

identificado os dois polimorfismos do gene da LPH e encontrado uma forte concordância

entre o teste do hidrogênio expirado e a análise molecular nos estimula a propor a ampliação

da amostra para calcularmos a sensibilidade e especificidade do novo teste. Desta forma,

identificar a prevalência dos fenótipos de persistência ou não persistência da enzima em nossa

população.

Apesar da concordância entre as mutações C/T-13910 e G/A-22018 e a intolerância à

lactose (medida através de presença de sintomas ou do teste de H

expirado) não ser absoluta

em diferentes estudos, os níveis altos de concordância encontrados neste e em outros

trabalhos, indicam que o teste molecular possa ser implantado na rotina de diagnóstico de

hipolactasia primária do tipo adulto.

7 – CONCLUSÕES

9 A presença das mutações C/T-13910 e G/A-22018 no gene da LPH foram

identificadas nos indivíduos auto-referidos como tolerantes à lactose.

9 A técnica de PCR para a detecção das mutações C/T-13910 e G/A-22018 foi

padronizada no Hospital de Clínicas de Porto Alegre.

9 O resultado do teste do hidrogênio expirado foi concordante em 100% nos

indivíduos auto-referidos como tolerantes e em 90% nos intolerantes à lactose.

9 Houve concordância entre a presença das mutações C/T-13910 e G/A-22018 e

a absorção de lactose em indivíduos auto-referidos como tolerantes e

intolerantes à lactose.

9 Houve concordância estatisticamente significativa entre a análise molecular e o

teste de hidrogênio expirado (k = -0,9).

9 Houve concordância estatisticamente significativa entre a análise molecular e a

ocorrência de sintomas (k = -0,8).

8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALLIET P, KRETCHMER N, LEBENTHAL E. Lactase deficiency, lactose

malabsorption and lactose intolerance. In: LEBENTHAL E. ed. Textbook of

Gastroenterology and Nutrition in Infancy. New York: Raven Press, 1989. p. 459-472.

AROLA H, KOIVULA T, JOKELA H, JAUHIAINEN M, KEYRILÄINEN O,

AROLA T, et al. Comparison of indirect diagnostic methods for hypolactasia. Scand J

Gastroenterol 1988; 23: 351-357.

AROLA H, TAMM A. Metabolism of lactose in the human body. Scand J

Gastroenterol 1994; 29 suppl 202: 21-25.

AROLA H. Diagnosis of hypolactasia and lactose malabsorption. Scand J

Gastroenterol 1994; 29 suppl 202: 26-35.

AURICCHIO LN, PITCHUMONI CS. Lactose intolerance. Postgraduate Medicine

1994; 95: 113-120.

AURICCHIO S, TRONCONE R. Genetically determined disaccharidase deficiences.

In: WALKER WA, DURIE P, HAMILTON JR, WALKER-SMITH JÁ, WATKINS JB, eds.

Pediatric Gastrointestinal Disease. Ontario: BC Decker Inc, 2000. p. 677-700.

BALLABRIGA A, MOYA M, BUENO M, CORNELLA J, DALMAU J,

DOMÉNECH E, et al. Recomendaciones a propósito de la intolerancia a la lactosa. An Esp

Pediatr 1998; 49: 448-50.

BEIGUELMAN B, SEVÁ-PEREIRA A, SPARVOLI AC. Possible discrimination

between genotypes of lactase persistence phenotype. Rev Bras Genet 1992; 15: 191-197.

BRIET F, POCHART P, MARTEAU P. Improved clinical tolerance to chronic lactose

ingestion in subjects with lactose intolerance: a placebo effect? Gut 1997; 41: 632-635.

BRUMMER RJM, KARIBE M, STOCKBRÜGGER RW. Lactose malabsorption.

Scand J Gastroenterol 1993; 28 suppl 200: 65-69.

BULLER HA, RINGS E, MONTGOMERY RK, GRAND RJ. Clinical aspects of

lactose intolerance in children and adults. Scand J Gastroenterol 1991; 26 suppl 188: 73-80.

BÜNING C, GENSCHEL J, JURGA J, FIEDLER T, VODERHOLZER W, FIEDLER

EM, et al. Introducing genetic testing for adult-type hypolactasia. Digestion 2005; 71(4): 245-

250.

CARROCCIO A, Montalto G, Cavera G, Notarbatolo A. Lactose intolerance and self-

reported milk intolerance: Relationship with lactose maldigestion and nutrient intake. J Am

Coll Nutr 1998; 17:631-6.

CASELLAS F, MALAGELADA JR. Applicability of short hydrogen breath test for

screening of lactose malabsortion. Dig Dis Sci 2003; 48(7): 1333-8.

CHAMPE P.; HARLEY R. Metabolismo das Monossacarídeoas e Dissacarídeas. In.:

CHAMPE P, HARVEY R. Bioquímica Ilustrada. Porto Alegre: Artes Médicas, 1997. p.

139.

CHRISTIL SU, MURGATROYD PR, GIBSON GR, CUMMINGS JH. Production,

metabolism and excretion of hydrogen in the large intestine. Gastroenterology 1992; 102:

1269-1277.

DAVIDSON GP, BUTLER RN. Breath analysis. In: WALKER WA, DURIE P,

HAMILTON JR, WALKER-SMITH JÁ, WATKINS JB, eds. Pediatric Gastrointestinal

Disease. Ontario: BC Decker Inc, 2000. p.1529-1537.

ENATTAH NS, SAHI T, SAVILAHTI E, TERWILLIGER JD, PELTRONEN L,

JÄVELÄ I. Identification of a variant associated with adult-type hypolactasia. Nature

Genetics 2002; 30: 233-237.

ESCOBOZA PM, FERNANDES MI, PERES LC, EINERHAND AW, GALVAO LC.

Adult-type hypolactasia: clinical, morphologic and functional characteristics in Brazilian

patients at a University Hospital. J Ped Gastroenterol Nutr 2004; 39(4): 361-365.

FAGUNDES NETO, Ulisses. Intolerância aos Carboidratos. In.: FIGUEIREDO RCP.

Absorção e tolerância à lactose na população de escolares do município de Rio Acima-

MG. 2000. 200f. (Tese de Doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais Belo

Horizonte.

FAGUNDES NETO, Ulisses. Intolerância aos Carboidratos. In.: WEHBA J.; PENNA

F.; FAGUNDES NETO U. (org) Gastroenterologia Pediátrica. 2ª ed. Rio de Janeiro: Medsi,

1991. p. 219.

FLATZ G, Genetics of lactose digestion in humans. Adv Hum Genet 1987; 16: 1-77.

FLATZ G, KUHNAU W, NAFTALI D. Breath hydrogen test for lactose absorption

capacity: importance of timing of hydrogen excretion and of high fasting hydrogen

concentration. Am J Clin Nutr 1984; 39: 752-755.

FLATZ G. Lactase deficiency: biological and medical aspects of the adult human

lactase polymorphism. In.: VOGEL F, MOTULSKY AG. Genética Humana. 3ª ed. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. p. 506-512.

GALVÃO LC, TRONCON LEA, FERNANDES MIM, CARRER JC, HYPPOLITO

L. Absorção de lactose e tolerância a diferentes tipos de iogurtes em adultos com hipolactasia.

Arq Gastroenterol 1995; 33: 10-16.

GARDINER AJ, TARLOW MJ, SYMONDS J, HUTCHISON JGP, SUTHERLAND

IT. Failure of the hydrogen breath test to detect primary sugar malabsorption. Arch Dis Child

1981; 56: 368-372.

GARRIDO JA, MELLO JB, MOREIRA AA, et al. Dissacaridases jejunais em 30

adultos brancos com úlcera duodenal. Arq Gastroenterol 1976; 13: 5-12.

GILAT T, RUSSO S, GILMAN-MALACHI E, ALDOR TAM. Lactase in man: a

nonadaptable enzyme. Gastroenterology 1972; 62: 1125-1127.

GUPTA SK, CHONG SKF, FITZGERALD JF. Disaccharidase activities in children:

normal values and comparison based on symptoms and histologic changes. J Ped

Gastroenterol Nutr 1999; 28: 246-251.

HAMMER HF, PETRITSCH W, PRISTAUTZ H, KREJS GJ. Assessment of the

influence of hydrogen nonexcretion on the usefulness of the hydrogen breath test and lactose

tolerance test. Wien Klin Wochenschr 1996; 108: 137-141.

HARVEY CB, HOLLOX EJ, POULTER M, WANG Y, ROSSI M, AURICCHIO S,

et al. Lactase haplotype frequencies in Caucasians: association with the lactase

persistence/non persistence polymorphism. Ann Hum Genet 1998; 62: 215-23.

HEITLINGER LA, LEBENTHAL E. Distúrbios da digestão e da absorção dos

carboidratos. Clin Ped 1988; 2: 249-266.

HERZLER SR, SAVAIANO DA. Colonic adaptation to daily lactose feeding in

lactose maldigesters reduces lactose intolerance. Am J Clin Nutr 1996; 64: 232-236.

HIELE M, GHOOS Y, RUTGEERTS P, VANTRAPPEN G, CARCHON H,

EGGERMONT E.

breath test using naturally

C-enriched lactose for detection of

lactase deficiency in patients with gastrointestinal symptoms. J Lab Clin Med 1988; 112:

193-200.

HILL MJ. Bacterial adaptation to lactase deficiency. In: Delmont J, ed. Milk

tolerance and rejection. Basel, Switzerland: Karger. 1983: 22-6.

HÖGENAUER C, HAMMER HF, MELITZER K, RENNER W, KREJS GJ,

TOPLAK H. Evaluation of a new DNA test compared with the lactose hydrogen breath test

for the diagnosis of lactase non-persistence. Eur J Gastroenterol Hepatol 2005; 17(3): 371-

HOLDEN C, MACE R. Phylogenetic analysis of the evolution of lactose digestion in

adults. Hum Biol 1997; 69: 605- 28.

HOLLOX EJ, POULTER M, ZVARIK M, FERAK V, KRAUSE A, JENKINS T, et

al. Lactase haplotype diversity in the world. Am J Hum Genet 2001; 68: 160-72.

JOHNSON AO, SEMEYA JG, BUCHOWSKI MS, ENWONWU CO, SCRIMSHAW

NS. Adaptation of lactose maldigesters to continued milk intakes. Am J Clin Nutr 1993b; 58:

879-881.

JOHNSON AO, SEMEYA JG, BUCHOWSKI MS, ENWONWU CO, SCRIMSHAW

NS. Correlation of lactose maldigestion, lactose intolerance and milk intolerance. Am J Clin

Nutr 1993a; 57: 399-401.

KERRY KR, ANDERSON C. A ward test for sugar in feces (letter). Lancet 1964; 1:

981-982.

KOETSE HA, VONK RJ, PASTERKAMP S, PAL J, BRUIJN S de, STELLAARD F.

Variations in colonic H

and CO

production as a cause of inadequate diagnosis of

carbohydrate maldigestion in breath tests. Scand J Gastroenterol 2000; 35(6): 607-11.

KRETCHMER N, HURWITZ R, RANSOME-KUTI O, DUNGY C. Intestinal

absorption of lactose in Nigerian ethnic groups. Lancet 1971; 2: 392-395.

KUOKKANEN M, ENATTAH NS, OKSANEN A, SAVILAHTI E, ORPANA A,

JÄRVELÄ I.Transcriptional regulation of the lactase-phlorizin hydrolase gene by

polymorphisms associated with adult-type hypolactasia. Gut 2003; 52: 647-652.

LEIS R, TOJO R, PAVÓN P, DOUWES A. Prevalence of lactose malabsorption in

Galicia. J Ped Gastroenterol Nutr 1997; 25: 296-300.

LISKER R. Herencia de mala digestión de lactosa. Rev Invest Clin 1996; 48: 23-24.

LÓPEZ P, ROSADO J, PALMA M, GONZÁLES C, VALENCIA ME. Mala digestión

de lactosa. Rev. Invest Clin 1996; 48: 15-22.

MAIURI L, RAIA V, POTTER J, SWALLOW D, HO MW, FIOCCA R, et al. Mosaic

pattern of lactase expression by villus enterocytes in human adult-type hypolactasia.

Gastroenterology 1991; 100: 359-369.

MAIURI L, ROSSI M, RAIA V, GARIPOLI V, HUGHES LA, SWALLOW D, et al.

Mosaic regulation of lactase in human adult-type hypolactasia. Gastroenterology 1994; 107:

54-60.

MATTHEWS SB, WAUD JP, ROBERTS AG, CAMPBELL AK. Systemic lactose

intolerance: a new perspective on an old problem. Postgrad Med J 2005; 81: 167-173.

MOBASSALH M.; MONTGOMERY RH.; BILLER JA.; GRAND JR. Deselopment

of Carbohydrate dosorption in the fetus and neonate. In.: FEBERBAUM R, FALCÃO M.

Nutrição do Recém Nascido. São Paulo. Ed. Atheneu, 2003.p. 42.

NAIM HY, STERCHI EE, LENTZE MJ. Biosynthesis and maturation of lactase-

phlorizin hydrolase in the humans small intestinal epithelial cells. Biochem J 1987; 241: 427-

34.

NEWCOMER AD, MCGILL D. Distribution of disaccharidase activity in the small

bowel of normal and lactase deficient subjects. Gastroenterology 1966b; 51: 481-488.

NEWCOMER AD, MCGILL D. Lactose tolerance tests in adults with normal lactase

activity. Gastroenterology 1966a; 50: 340-346.

NEWCOMER AD, MCGILL DB, THOMAS P, HOFMANN AF. Prospective

comparison of indirect methods for detecting lactase deficiency. N Engl J Med 1975; 293:

1232-1236.

O’CONNOR TP, DIAMOND J. Ontogeny of intestinal safety factors: lactase

capacities and lactose loads. Am J Physiol 1999; 276: R753-65.

OLDS LC, SIBLEY E. PCR-RFLP genotyping assay for a lactase persistence

polymorphism upstream of the lactase-phlorizin hydrolase gene. Genet Test 2004; 8: 190-

193.

PEREIRA AS, MAGALHÃES AFN de, PEREIRA FILHO RA. Teste de sobrecarga

com lactose (TSL), no diagnóstico de malabsorção primária de lactose do adulto (MLA). Rev

Bras Patol Clin 1982: 1-6.

PERMAN SA, MODLER S, BARR RG, et al. Fasting breath hydrogen concentration:

Normal values and clinical applications. Gastroenterology 1984; 87: 1358.

POULTER M, HOLLOX EJ, HARVEY CB, MULCARE C, PEUHKURI K,

KAJANDER K, et al. The causal element for the lactase persistence/non-persistence

polymorphism is located in a 1 Mb region of linkage disequilibrium in Europeans. Ann Hum

Genet 2003; 67: 298-311.

PRETTO FM, SILVEIRA TR, MENEGAZ V, OLIVEIRA J. Má absorção de lactose

em crianças e adolescentes: diagnóstico através do teste do hidrogênio expirado com o leite de

vaca como substrato. J Ped 2002; 78(3): 213-218.

REIS JC, MORAIS MB, FAGUNDES-NETO U. Teste do hidrogênio no ar expirado

na avaliação de absorção de lactose e sobrecrescimento bacteriano no intestino delgado de

escolares. Arq Gastroenterol 1999; 36: 169-176.

RIORDAN SM, McIVER CJ, DUNCOMBE VM, et al. Evaluation of the rice breath

hydrogen test for small intestinal bacterial overgrowth. Am J Gastroenterol 2000; 95: 2858-

64.

ROMAGNUOLO J, SCHILLER D, BAILEY RJ. Using breath tests wisely in a

gastroenterology practice: an evidence-based review of indications and pitfalls in

interpretation. Am J Gastroenterol 2002; 97: 1113-26.

SAHI T, LAUNIALA K. Genetics and epidemiology of adult-type hypolactasia.

Scand J Gastroenterol 1994b; 29 suppl 202: 7-20.

SAHI T, LAUNIALA K. Hypolactasia and lactase persistence. Historical review and

the terminology. Scand J Gastroenterol 1994a; 29 suppl 202: 1-6.

SAHI T, LAUNIALA K. More evidence for the recessive inheritance os selective

adult type lactose malabsorption. Gastroenterology 1977; 73: 231-232.

SAHI T. The inheritance of selective adult-type lactose malabsorption. Scand J

Gastroenterol 1974; 9(30): 1-73.

SAVILAHTI E, LAUNIALA K, KIUTUNEN P. Congenital lactase deficiency. Arch

Dis Child 1983; 58: 246-256.

SEVÁ-PEREIRA A, BEIGUELMAN B. Primary lactose malabsorption in healthy

Brazilian adult caucasoid, negroid and mongoloid subjects. Arq Gastroenterol 1982; 19(3):

133-8.

SEVÁ-PEREIRA A, MAGALHÃES AF, PEREIRA-FILHO RA. Teste de sobrecarga

com lactose no diagnóstico de malabsorção primária de lactose do adulto. Rev Bras Pat Clin

1982; 18: 1-6.

SEVÁ-PEREIRA A, SILVA RCMA, PEREIRA-FILHO RA. Medida do H

expirado

no diagnóstico da má absorção de lactose. Arq Gastroenterol 1999; 36: 18-26.

SOLOMONS NW, GARCÍA-IBANÑEZ R, VITERI FE. Hydrogen breath test of

lactose absorption in adults: the application of physiological doses and whole cow’s milk

sources. Am J Clin Nutr 1980; 33: 545-554.

SPARVOLI AC. Malabsorção de lactose do adulto. Prevalência na população

sulina. Aspectos genéticos e evolutivos do polimorfismo da atividade da lactase. 1990.

134f. (Tese de Doutorado) – Campinas: Universidade Estadual de Campinas.

STELLAARD F, GEYPENS B. European interlaboratory comparison of breath CO

analysis. Gut 1998; 43 suppl 3: 2-6.

STONEKING M. Single nucleotide polymarphisms fron the evolutionary past. In.:

ALBERTS B.; JOHNSON A.; LEWIS J.; RAFF M.; ROBERTS K.; WALTER P. VEIGA,

Ana beatriz Gorini de, et al. (trad.) Biologia Molecular da Célula. Porto Alegre: Artmed,

2004. p. 464-508.

STROCCHI A, SORGE M, PRANZO L, et al. Intraindividual variability in H

production capacity. Gastroenterol Int 1988; 1: 593.

SUAREZ FL, SAVAIANO DA, ARBISI P, LEVITT MD. Tolerance to the daily

ingestion of two cups of milk by individuals claiming lactose intolerance. Am J Clin Nutr

1997; 65: 1502-6.

SUAREZ FL, SAVAIANO DA, LEVITT MD. A comparison of symptoms after the

consumption of milk or lactose-hydrolised milk by people with self-reported severe lactose

intolerance. N Engl J Med 1995; 333: 1-4.

SWALLOW DM. Genetics of lactase persistence and lactose intolerance. Annu Rev

Genet 2003; 37: 197-219.

TADESSE K, LEUNG DTY, YUEN RCF. The status of lactose absorption in Hong

Kong Chinese children. Acta Paediatr 1992; 81: 598-600.

TARLOW MJ, THOM H. A comparison of stool fluid and stool dialysate obtained in

vivo. Gut 1974; 15: 608-13.

TOMLIN J, LOWIS C, READ NW. Investigation of normal flatus production in

healthy volunteers. Gut 1991; 32: 665-9.

TROELSEN JT. Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression.

Biochimica et Biophysica Acta 2005; 1723: 19-32.

TRONCON LEA, COLLARES EF, OLIVEIRA RB, PADOVAN W, MENEGHELLI

UG. Mal-absorção de lactose em pacientes adultos do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto.

Arq Gastroenterol 1981; 18: 106-112.

VELIGATI N, TREEM W, SULLIVAN B, BURKE G, HYAMS JS. 10 ppm versus

20 ppm: a reappraisal of diagnostic criteria for breath hydrogen testing in children. Am J

Gastroenterol 1994; 89: 758-761.

VESA TH, KORPELA RA, SAHI T. Tolerance to small amounts of lactose in lactose

maldigesters. Am J Clin Nutr 1996; 64: 197-201.

VILLAKO K, MAROOS H. Clinical picture of hypolactasia and lactose intolerance.

Scand J Gastroenterol 1994; 29 suppl 202: 36-54.

VONK RJ, STELLAARD F, HOEKSTRA H, KOETSE HA.

C carbohydrate breath

tests. Gut 1998; 43 suppl 3: 20-22.

WALKER-SMITH J, MURCH S. Mechanisms of malabsorption and secretion. In:

Diseases of the Small Intestine in Childhood. 3ª ed. Oxford: Isis Medical Media Ltd,

1999.p.63-86.

WALKER-SMITH JA. Lactose intolerance. In: GRACEY M, WALKER-SMITH JA.

eds. Diarrheal disease. Philadelphia: Vevey/Lippincott-Raven, 1997. P. 171-189.

WEHBA J.; FAGUNDES NETO U.. Intolerância aos carboidratos. In.: PENNA F.

Gastroenterologia Pediátrica. 2ª ed. Rio de Janeiro: Medsi, 1991. p. 219.

WELSH JD, POLEY JR, BHATIA M, STEVENSON DE. Intestinal disaccharidase

activities in relation to age, race and mucosal damage. Gastroenterology 1978; 75: 847-855.

ANEXOS

ANEXO 1 - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Muitas pessoas, apesar de beberem leite de vaca, não conseguem digerir totalmente o

açúcar do leite, chamado lactose. Com isso, podem apresentar algum desconforto como

vômitos, cólicas, distensão abdominal e diarréia. O diagnóstico de má absorção de lactose é

geralmente feito pelo teste de hidrogênio expirado, que pode causar os mesmos desconfortos

mencionados acima.

A finalidade deste estudo é verificar se é possível substituir o teste de hidrogênio

expirado pela análise molecular direta das mutações que causam a intolerância, diminuindo

assim os possíveis fatores de desconforto dos pacientes que precisam ser submetidos a este

exame.

A pesquisa consiste de um exame simples, no qual o indivíduo deve comparecer no 1ª

andar do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, em jejum de 8hs e irá permanecer no local do

exame durante 3hs. Primeiramente a pessoa irá assoprar em uma seringa para coletar o ar

expirado basal (jejum), ingerir 50g de lactose diluída em água e após 60 min, 120 min e 180

min da ingestão do açúcar, serão realizadas novas coletas de ar expirado. Neste intervalo o

indivíduo irá permanecer em jejum, podendo beber somente água. Também será coletada uma

pequena amostra de sangue que será usada para pesquisar as mutações T-13910 e A-22018 no

gene da lactase, que é a enzima responsável pela digestão da lactose. Esta coleta é semelhante

a que é feita para exames laboratoriais como hemograma e glicemia.

Durante a realização do estudo, as amostras serão identificadas com um código, ao

qual somente um dos pesquisadores terá acesso, de modo a poder disponibilizar os resultados

a quem os desejar. Após o fim do estudo, todo o material coletado será descartado.

Pelo presente termo de consentimento livre e esclarecido, declaro que autorizo a

minha participação neste projeto, pois fui informado dos objetivos e dos procedimentos que

serei submetido, como também dos desconfortos e benefícios deste estudo.

Nome: _________________________ Assinatura:_________________________

Data: ____/____/____

Pesquisadora: Andréa Cristina da Silva Bulhões - fone: (51) 9954-1998

Pesquisadora responsável: Drª Themis Reverbel da Silveira

ANEXO 2 - Relação de Genótipos, Fenótipos, resultados do teste H2 e a

presença de sintomas dos 20 indivíduos do Estudo

Caso nº Genótipo Fenótipo

referido

Teste H

Sintomas

CCGG

intolerante

positivo

presente

CCGG

intolerante

positivo

presente

CCGG

intolerante

positivo

presente

CCGG

intolerante

positivo

presente

CCGG

intolerante

positivo

presente

CCGG

intolerante

positivo

presente

CCGG

intolerante

positivo

presente

CCGG

intolerante

positivo

presente

CCGG

intolerante

positivo

presente

CCGG

tolerante

negativo

ausente

CTGA

intolerante

negativo

presente

CTGA

tolerante

negativo

ausente

CTGA

tolerante

negativo

ausente

CTGA

tolerante

negativo

ausente

CTGA

tolerante

negativo

ausente

CTGA

tolerante

negativo

ausente

CTAA

tolerante

negativo

ausente

TTAA

tolerante

negativo

ausente

TTAA

tolerante

negativo

ausente

TTAA

tolerante

negativo

ausente

100

ANEXO 3 - Níveis de hidrogênio expirado nos 9 indivíduos com testes positivos

Caso nº Basal 1 hora 2 horas 3 horas

7 43 144 93

2 86 98 56

16 108 82 66

5 97 72 83

0 44 48 70

20 92 95 165

14 61 75 100

12 32 105 107

2 23 38 14

101

ANEXO 4 - Níveis de hidrogênio expirado nos 11 indivíduos com testes

negativos

Caso nº Basal 1 hora 2 horas 3 horas

9 8 7 4

1 1 0 1

2 3 1 1

18 8 14 4

13 10 11 7

9 13 13 18

28 14 19 1

3 14 3 0

0 1 0 0

19 12 12 13

0 5 2 2

102

Anexo 5 - Molecular analysis of lactase-hlorizin hydrolase gene in Brazilian

self-reported milk tolerant and intolerant individuals

Andréa C.S. Bulhões

1,3

, Fernanda S. de Oliveira

2,3

, Ursula S. Matte

2,3

, Helena A.S. Goldani

1,3

Rafael Mazzuca

, Themis R. Silveira

1,3

Post-Graduation Program in Gastroenterology;

Gene Therapy Center and

Gastroenterology

and Hepatology Laboratory – Research Center, Hospital de Clínicas de Porto Alegre,

Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Corresponding author:

Andréa C.S. Bulhões

Centro de Pesquisas - HCPA

Rua Ramiro Barcelos 2350

90035-903 Porto Alegre – RS

Brazil

Fax: +55 51 2101-8760

E-mail: [email protected].br

Artigo enviado para Revista Clinical Nutrition, em fase de revisão para publicação.

103

Summary

Background & aims: Persistence of lactase in adults was related to two mutations in

lactase phlorizin hydrolase (LPH) gene. This study aimed to compare the hydrogen breath test

(HBT) with the presence of these mutations in Brazilian self-reported milk tolerant and

intolerant individuals.

Methods: Self-reported milk tolerant and intolerant adults underwent HBT after oral

ingestion of 50g lactose (equivalent to 1 litre of milk). Molecular analysis for C/T-13910 and

G/A-22018 mutations was performed using a PCR-based method.

Results: There was significant agreement between the self-reported history of lactose

tolerance and the results of HBT. The genotypes CT/GA, CT/AA e TT/AA (lactase

persistence) were found in 10 individuals, all of them with negative HBT. The genotype

CC/GG (lactase non-persistence) was found in 10 individuals, 9 of them with positive HBT

results. There was significant agreement between the presence of mutations in the LPH gene

promoter and HBT results. Genotype CT/AA has not been described previously.

Conclusions: The present study showed a strong agreement between mutations G/A-

22018 e C/T-13910 and HBT. This study corroborates the high levels of agreement between

molecular analysis and HBT, suggesting that the molecular test could be used for the

diagnosis for adult type primary hypolactasia.

Keywords: lactase-phlorizin hydrolase, milk intolerance, lactose intolerance, hydrogen

breath test.

104

Introduction

Lactose is hydrolized in the small intestine into glucose and galactose by the lactase-

phlorizin hydolase (LPH) found in the intestinal villi. Lactose malabsorption consists of a

failure on the mechanisms of digestion and absorption of lactose that can be shown by

laboratorial tests whereas lactose intolerance is defined as a clinical syndrome caused by

lactose ingestion.

1,2

Adult type hypolactasia is characterized by the fall of lactase activity levels to 5% to

10% of birth levels that occurs during childhood and adolescence. It affects more than 75% of

the population worldwide with regional frequencies varying from nearly 5% in northern

Europe to more than 90% in some Asian and African countries.

Deficiency of lactase activity measured in enterocytes is the gold-standard diagnosis

for lactose malabsorption, however it is an invasive test.

4,5

Amongst non-invasive laboratorial

exams for lactose malabsorption diagnosis, the hydrogen breath test (HBT) is widely used.

Yet, due to the lactose overload test, it may cause symptoms such as bloating, vomit,

abdominal distension, colic, and diarrhea. Sensitivity ranges from 69% to 100% and

specificity from 96% to 100% when compared to lactase activity in the intestinal biopsy

material.

4,6,7

Lactase activity is determined by a gene (LPH) found at chromosome 2

and its

persistence in adult life has dominant autosomal inheritance.

3,9,10

Recently, it has been found

that this persistence is due to two mutations (C/T-13910 and G/A-22018) in the LPH gene

105

promoter region.

11,12

The presence of mutant alleles T-13910 and A-22018 have been related

to persistent levels of lactase activity in duodenal biopsy material.

This study aimed to compare the hydrogen breath test (HBT) with the presence of the

mutations C/T-13910 and G/A-22018 in the LPH gene in 2 groups of individual self-reported

as tolerant and intolerant to milk and lactose-containing milk derivatives.

Subjects and Methods

This study was approved by the Ethical Research Committee of Hospital de Clinicas

de Porto Alegre. Informed and written consent was obtained from all subjects.

Adult individuals from Porto Alegre-RS, south of Brazil, were selected, 10 self-

reported lactose tolerant and 10 intolerant ones. Sample size was calculated based on the

frequency of C allele in individuals with lactose malabsorption of 97%.

As there is no data

regarding the prevalence of LPH gene mutations in Brazilian population, we calculated 10

subjects for each group, considering confidence interval 95%, power 0.9, and standard error

0.1.

Individuals who were intolerant to lactose were defined as not been able to drink any

quantity of milk due to presence of symptoms (nausea, abdominal pain, flatulence) or those

able to drink up to 2 glasses of milk (approximately 500ml) during the day.

Tolerant

106

individuals were those reporting being able to drink more than 3 glasses of milk per day

without symptoms.

None of the subjects reported history of gastrointestinal disorders associated with

secondary lactose intolerance e.g. Crohn’s disease, ulcerative colitis, celiac disease, irritable

bowel syndrome, diarrhea or use of antibiotics, enemas, laxatives in the 15 days before the

exam. All subjects underwent HBT and were classified as with or without lactose

malabsorption.

Breath Test

Subjects were instructed to fast and avoid smoking for at least 8 hours before HBT. It

was performed after oral ingestion of 50g lactose (equivalent to 1 litre of milk) diluted in

250ml of tap water.

Breath H

excretion was measured in parts per million (ppm) using a gas

chromatographer (Model 12i Quintron

, Quintron Instrument Company Inc, Milwaukee,

USA) at baseline and every 60 min after ingestion of lactose over a period of 180 min. HBT

was considered positive (lactose malabsorption) when excretion was higher than 20 ppm

compared to baseline. Gastrointestinal symptoms e.g. diarrhea, bloating, abdominal pain,

flatulence, and cramping were observed after the test.

107

DNA testing

For DNA analysis, genomic DNA was isolated from venous blood (Easy-DNA

Invitrogen, USA). For testing the variant C/T-13910, the fragment containing the

polymorphic site was amplified by polymerase chain reaction using the following primers:

C/T-for 5’-AAGACGTAAGTTACCATTTAATAC-3’ and C/T-rev 5’-

CGTTAATACCCACTGACCTATCCT-3’ and digested with endonuclease BsmFI (New

England Biolabs, USA). For the detection of G/A-22018 polymorphism, primers used were

G/A-for 5’-TAAGAACATTTTACACTCTTC-3’ and G/A-rev 5’-

AGAAAATGGGTTTTCGCCATG-3’ and the PCR product was digested with HhaI

(Invitrogen, USA). PCR was performed in Eppendorf Personal ThermoCycler (Eppendorf,

Germany), with a final volume of 25 µL using 100 ng of genomic DNA, 1x 500 mM KCl

buffer (pH 8.4), 5mM MgCl

, 0.2 mM of dNTPset, 20 pmol of each primer and 1 U Taq DNA

polymerase – all reagents were purchased from Invitrogen (USA). Annealing temperature was

C for both polymorphisms. PCR products and digestion fragments were analyzed on 1.5%

agarose gel stained with ethidium bromide. A DNA test suggestive for lactase non-persistence

was interpreted as CC/GG genotype, while CT or TT and GA or AA genotypes were

indicative for lactase persistence.

108

Statistical analysis

All data were analyzed by SPSS version 10.0 software. HBT values at baseline, 60,

120, and 180 min from subjects with and without lactose malabsorption were compared by

Mann-Whitney test. The agreement assessment between HBT and molecular analysis was

obtained by the Kappa coefficient, with significant level of 5%.

Results

Out of the 20 individuals enrolled in this study, 18 (90%) were female. All were

caucasians, except for one Asian descendent. Overall mean age was 32.7 ± 7.3 years. Mean

age of self-reported tolerant subjects was 32.2 ± 6.2 years and 33.2 ± 8.6 years for intolerant

ones.

Out of 10 self-reported tolerant subjects, all (100%) had negative HBT and no

evidence of gastrointestinal symptoms of lactose intolerance. From the 10 self-reported

lactose intolerant subjects, 9 had positive HBT and 1 had a negative result. However, all of

these subjects had any of the following symptoms: abdominal distention (n=5), nausea (n=5),

flatulence (n=6), diarrhea (n=5). There was high agreement between the self-reported history

of tolerance to lactose and the results of HBT (kappa=0.9, p<0.001).

109

HBT levels at baseline, 60, 120, and 180 min from subjects with and without lactose

malabsorption are shown in figure 1. Hydrogen breath excretion levels in subjects with

lactose malabsorption were significantly higher than in subjects without lactose malabsorption

at 60, 120, and 180 min. (p<0.001). The maximum H

breath excretion in subjects with

lactose malabsorption occured at 120 min.

Figure 1. Results of Hydrogen Breath Test in self-reported lactose tolerant and

intolerant individuals.

Genotype distribution for the mutations G/A (AA, GA e GG) and C/T (TT, CT, CC)

among the 20 individuals studied is presented on table 1. Photograph of 1.5% agarose gel with

different genotype patterns is shown on figure 2. The genotypes CT/GA, CT/AA e TT/AA,

related to the lactase persistence phenotype, were found in 10 individuals (CTGA in 6 of

them, CTAA in 1 and TTAA in 3 individuals). All of them showed negative HBT results. The

genotype CC/GG, related to lactase non-persistence was found in 10 individuals, 9 of them

showed positive HBT results. There was high agreement between the presence of mutations in

the LPH gene promoter and HBT results (Kappa = – 0.9 (p < 0.001). Genotype CT/AA has

not been described previously, and is related to lactase persistence, as it would be expected.

Table 1. Lactase Phlorizin Hydrolase genotype-phenotype correlation and HBT

results.

110

Figure 2. Digested PCR amplification products were analysed on 2.5% agarose gel.

Discussion

This study assessed the relationship between the presence of mutations C/T-13910 e

G/A-22018 in the LPH gene and HBT results on individuals self-reported as milk tolerant and

intolerant. There was strong agreement between the presence of these mutations and negative

HBT (without lactose malabsorption). Likewise, absence of mutations strongly agreed with

positive HBT (lactose malabsorption).

We also found a high degree of agreement between self-reported milk tolerance or

intolerance and HBT results. The inclusion criteria used in this study in order to classify

individuals as lactose tolerant was the ability to drink at least 3 glasses of milk per day. This

criteria was established due to prior studies showing that people with adult type hypolactasia

were able to tolerate up to 2 glasses of milk (500ml, 25 g lactose) a day.

14,15

In this study, 50g

of lactose orally were used (equivalent to lactose quantity in 1 litre of milk) diluted in 250 ml

of water.

Self reported lactose intolerance to amounts smaller than two cups of milk a day

may not be sufficient to identify lactose malabsorbers as it has been demonstrated in patients

with irritable bowel syndrome.

Enattah et al studied 9 Finn families and identified two mutations related to lactase

persistence (C/T-13910 and G/A-22018)

. All non-persistent lactase individuals were

homozigous CC/GG. Afterwards, Kuokkanen et al described 4 genotypes compared to the

111

measurement of lactase enzymatic activity: CCGG and CCGA (non persistence of lactase),

CTGA and TTAA (persistence of lactase)

. In the present study we identified 1 genotype

CTAA, not described in the literature yet. This individual, as it would be expected, had

negative HBT and no symptoms of lactose intolerance, suggestive of lactase persistence.

In the present study, one out of the 10 subjects with CCGG genotype (lactase non

persistence) showed negative H

test without symptoms. This could be explained by a slow

decrease of lactase levels and hypolactasia could develop later in life. Another explanation

could be the possible presence of an intestinal flora that does not produce H

18,19

Tolerance to small amounts of lactose by individuals with hypolactasia can be

explained by several factors: adaptation of the intestinal flora, colon microbial alteration

and

ingestion of milk in small amounts throughout a period of time along with other foods.

These mechanisms of tolerance could explain the disagreement between symptoms of lactose

intolerance and HBT results as high as 47%.

Among all subjects who presented with genotypes of lactase persistence (CTGA,

TTAA and CTAA), one CTGA subject presented nausea and abdominal distension during the

test, despite negative HBT. The presence of symptoms may suggest a possible secondary

cause for lactose intolerance; however, it has not done any further investigation such as

gastrointestinal endoscopy.

There are few studies comparing the presence of mutations and HBT, and all of them

were made in European countries. In Brazil, prevalence of adult type primary hypolactasia,

assessed by lactose tolerance test, varies from 38% in caucasians and 95% in negroids,

19,22

with high regional differences due to Brazilian population ethnic heterogeneity. Regarding the

112

Brazilian pediatric population, it has been shown a prevalence of 8.4% of lactose

malabsorption assessed by HBT.

Recently, hypolactasia prevalence of 53% in white

individuals and 91% in nonwhite ones was identified by measuring lactase activity by

immunohistochemistry in duodenal mucosa.

Recent studies demonstrated that CC genotype agreement with positive HBT results

was of 91% to 97%, whereas the correlation between CT and TT genotypes and negative

HBT results was from 86% to 89%.

5,7

Molecular analysis for the diagnosis of lactose

malabsorption presented positive predictive value of 97% and negative of 86%

related to

HBT. It also has advantage over HBT as it causes less discomfort to the patient.

The present study showed a strong agreement between mutations G/A-22018 and C/T-

13910 and HBT. This study corroborates the high levels of agreement between molecular

analysis and HBT in a heterogeneous ethnic background. It can be suggested that the

molecular test could be used for the diagnosis for adult type primary hypolactasia for both

clinical and populational settings.

Acknowledgements

This study has been supported by grant from Fundo de Incentivo a Pesquisa (FIPE)

and Grupo de Pesquisa e Pós-graduação (GPPG) – Hospital de Clinicas de Porto Alegre,

Brazil.

113

References

1. Walker-Smith JA. Lactose intolerance. In: Gracey M, Walker-Smith JA. eds. Diarrheal

disease. Philadelphia: Vevey/Lippincott-Raven, 1997: 171-189.

2. Auricchio S, Troncone R. Genetically determined disaccharidase deficiences. In: Walker

WA, Durie P, Hamilton JR, Walker-Smith JA, Watkins JB, eds. Pediatric

Gastrointestinal Disease. Ontario: BC Decker Inc, 2000: 677-700.

3. Sahi T, Launiala K. Hypolactasia and lactase persistence. Historical review and the

terminology. Scand J Gastroenterol (Suppl) 1994; 202: 1-6.

4. Newcomer AD, McGill DB, Thomas P, et al. Prospective comparison of indirect methods

for detecting lactase deficiency. N Engl J Med 1975; 293: 1232-1236.

5. Büning C, Genschel J, Jurga J, et al. Introducing genetic testing for adult-type

hypolactasia. Digestion 2005; 71: 245-250.

6. Arola H, Koivula T, Jokela H, et al. Comparison of indirect diagnostic methods for

hypolactasia. Scand J Gastroenterol 1988; 23: 351-357.

7. Högenauer C, Hammer HF, Melitzer K, et al. Evaluation of a new DNA test compared

with the lactose hydrogen breath test for the diagnosis of lactase non-persistence. Eur J

Gastroenterol Hepatol 2005; 17: 371-376.

114

8. Arola H, Tamm A. Metabolism of lactose in the human body. Scand J Gastroenterol

(Suppl) 1994; 202: 21-25.

9. Sahi T, Launiala K. Genetics and epidemiology of adult-type hypolactasia. Scand J

Gastroenterol (Suppl) 1994; 202: 7-20.

10. Lisker R. Herencia de mala digestión de lactosa. Rev Invest Clin 1996; 48: 23-24.

11. Enattah NS, Sahi T, Savilahti E, et al. Identification of a variant associated with adult-type

hypolactasia. Nat Genet 2002; 30: 233-237.

12. Olds LC, Sibley E. Lactase persistence DNA variant enhances lactase promoter activity

in vitro: functional role as a cis regulatory element. Hum Mol Genet 2003; 12: 2333-2340.

13. Kuokkanen M, Enattah NS, Oksanen A, et al. Transcriptional regulation of the lactase-

phlorizin hydrolase gene by polymorphisms associated with adult-type hypolactasia. Gut

2003; 52: 647-652.

14. Escoboza PM, Fernandes MI, Peres LC, et al. Adult-type hypolactasia: clinical,

morphologic and functional characteristics in Brazilian patients at a University Hospital. J

Pediatr Gastroenterol Nutr 2004; 39: 361-365.

15. Suarez FL, Savaiano DA, Arbisi P, et al. Tolerance to the daily ingestion of two cups of

milk by individuals claiming lactose intolerance. Am J Clin Nutr 1997; 65: 1502-1506.

16. Briet F, Pochart P, Marteau P. Improved clinical tolerance to chronic lactose ingestion in

subjects with lactose intolerance: a placebo effect? Gut 1997; 41: 632-635.

115

17. Vernia P, Marinaro V, Argnani F, et al. Self-reported milk intolerance in irritable bowel

syndrome: what should we believe? Clin Nutr 2004; 23: 996-1000.

18. Tomilin J, Lowis C, Read NW. Investigation of normal flatus production in healthy

volunteers. Gut 1991; 32: 665-669.

19. Sevá-Pereira A, Silva RCMA, Pereira-Filho RA. Lactose malabsorption diagnosis with H

breath test. Arq Gastroenterol 1999; 36: 18-26.

20. Herzler SR, Savaiano DA. Colonic adaptation to daily lactose feeding in lactose

maldigesters reduces lactose intolerance. Am J Clin Nutr 1996; 64: 232-236.

21. Carroccio A, Montalto G, Cavera G, et al. Lactose intolerance and self-reported milk

intolerance: Relationship with lactose maldigestion and nutrient intake. J Am Coll Nutr

1998; 17:631-6.

22. Troncon LEA, Collares EF, Oliveira RB, et al. Lactose malabsorption in adult patients at

the Hospital das Clinicas de Ribeirao Preto. Arq Gastroenterol 1981; 18: 106-112.

23. Pretto FM, Silveira TR, Menegaz V, et al. Lactose malabsorption in children and

adolescents: diagnosis through breath hydrogen test using cow milk. J Pediatr (Rio J)

2002; 78: 213-218.

24. Matthews SB, Waud JP, Roberts AG, et al. Systemic lactose intolerance: a new

perspective on an old problem. Postgrad Med J 2005; 81: 167-173.

116

Table 1. Lactase Phlorizin Hydrolase genotype-phenotype correlation and HBT

results.

Genotype n = 20 Self-reported phenotype H

excretion

CCGG

n = 9

n = 1

lactose intolerant

lactose tolerant

Positive

Negative

CTGA

n = 1

n = 5

lactose intolerant

lactose tolerant

Negative

CTAA n = 1 lactose tolerant Negative

TTAA n = 3 lactose tolerant Negative

117

180 min120 min60 minbasal

Nível de hidrogênio expirado (em ppm)

180

150

120

Teste do H2

não absorvedores

absorvedores

Figure 1. Results of Hydrogen Breath Test in self-reported lactose tolerant and

intolerant individuals.

118

Figure 2. Digested PCR amplification products were analysed on 2.5% agarose gel.

Lanes 1 and 9 show no digested PCR product. Lanes 2 and 6 show CC

13910

22018

homozygous lactase non-persistent genotypes; 4 and 8 show TT

13910

and AA

22018

homozygous

lactase persistent genotypes; 3 and 7 show CT

13910

and GA

22018

heterozygous lactase

persistent genotypes. The 50 bp DNA ladder is on lane 5.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

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