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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos
Área de Bromatologia
Desenvolvimento de filme comestível à base de alginato
incorporado do agente antimicrobiano óleo essencial de
cravo: aplicação em alimento
Maria Crystina Igarashi
Dissertação para obtenção do grau de
MESTRE
Orientador:
Profa. Dra. Mariza Landgraf
São Paulo
2010
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Maria Crystina Igarashi
Desenvolvimento de filme comestível à base de alginato
incorporado do agente antimicrobiano óleo essencial de
cravo: aplicação em alimento
Comissão Julgadora
Da
Dissertação para obtenção do grau de Mestre
Profa. Dra. Mariza Landgraf
orientador/presidente
_________________________________
1º examinador
_________________________________
2º examinador
São Paulo, 2010.
2
Aos meus pais,
por estarem sempre ao meu lado.
AGRADECIMENTOS
À professora Mariza Landgraf, pela orientação e oportunidade de
desenvolvimento deste trabalho, pelo carinho, pela confiança e por acreditar em
mim.
À Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP e ao Departamento de
Alimentos e Nutrição Experimental, pela oportunidade de desenvolver este
trabalho.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (2008/01460-7)
e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(130359/2008-4), pela concessão de bolsas de estudos.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo auxílio
financeiro (2008/02856-1) recebido essencial para a execução deste trabalho.
À professora Maria Teresa Destro, pelas sugestões e pela oportunidade de
aprendizado.
À professora Bernadette D. G. M. Franco, pela oportunidade de
aprendizado.
À professora Cynthia J. Kunigk, da Escola de Engenharia Mauá, pelo
incentivo e apoio em realizar o mestrado.
À professora Carmen Tadini, da Escola Politécnica – USP, pelas sugestões,
pelo apoio no desenvolvimento deste trabalho e por disponibilizar a utilização de
equipamentos do Laboratório de Engenharia de Alimentos.
À professora Cynthia Ditchfield, da Faculdade de Engenharia de Alimentos –
FZEA/USP, pelas sugestões e contribuição no trabalho.
À Ana Cristina e Otília, alunas de doutorado da POLI-USP, por toda ajuda e
paciência durante os dias de análise no texturômetro.
À professora Inar Castro, do Departamento de Alimentos e Nutrição
Experimental, pelas sugestões para a realização da análise sensorial.
Ao professor Flávio Finardi, do Departamento de Alimentos e Nutrição
Experimental, pelo empréstimo do homogeneizador para o preparo das
emulsões.
À professora Úrsula, do departamento de Alimentos e Nutrição
Experimental, pelo empréstimo de dessecadores.
À Lúcia e Rosângela, técnicas do laboratório de Bioquímica de Alimentos e
4
laboratório de Lípides, pelo empréstimo de agitadores de bancada.
Ao Daniel Fernandes Zóia, da empresa Vogler, pela doação das amostras de
alginato e pelo esclarecimento de dúvidas sempre que necessário.
Ao Everton Chaves, da empresa Duas Rodas, pela doação de óleos
essenciais e pela cooperação à pesquisa acadêmica no reenvio de amostras
sempre que solicitadas.
À Iara Sales, da empresa Dierberger, pela doação de óleos essenciais.
Ao André Dias, da empresa Apliquimica, pela doação de óleos essenciais.
Ao Rodrigo Furquini, da empresa National Starch, pela doação de amostra
de amido modificado e a todo grupo de P&D da National Starch Food Innovation,
o qual tenho um carinho especial desde a época de estagiária.
À Maristela, da empresa Doce Aroma, pela doação do cloreto de cálcio.
Ao Laercio Goularte, do laboratório SFDK, pela doação das cepas de
Salmonella Give e Salmonella Enteritidis isoladas de carne de frango.
À Josi Conti, da Fundação André Tosello, pela doação das cepas ATCC
25416 e ATCC 27853.
Ao Anderson, pelo incentivo, sugestões e amizade sincera.
À Danielle, Graciela, Janaína e Priscila, amigas queridas que ganhei no
mestrado.
Ao André e Matheus, pela amizade, ótima convivência e profissionalismo.
Aos colegas que ficam ou passaram pelo Laboratório de Microbiologia de
Alimentos: Adriana, Ana Eucares, Ana Carolina, Ângela, Eb, Flávia, Haíssa, Hans,
Joyce, Marildes, Maria Fernanda, Marina, Marta, Mayra, Priscila C., Rita,
Svetoslav, Tatiana, Vanessa, Verena, Verônica e Vinícius.
À Lúcia e Kátia, pelo convívio agradável e ajuda no decorrer desta pesquisa.
À Mônica, Cleonice e Edílson, da secretaria do departamento de Alimentos,
pelos serviços prestados.
À Elaine e Jorge, da secretaria de pós-gradução, pela atenção dedicada e
serviços prestados.
Ao Márcio, que sempre me apoiou e me incentivou em minhas escolhas.
Aos meus familiares e amigos pelo incentivo.
E a todos que direta ou indiretamente colaboraram para a realização deste
trabalho.
RESUMO
A utilização de embalagens biodegradáveis, tais como os filmes e
coberturas comestíveis, apresenta-se como alternativa ao uso de recursos não-
renováveis como material de embalagem. A incorporação de substâncias
antimicrobianas em embalagens tem como objetivo minimizar o problema da
contaminação microbiana em alimentos e, entre elas, os óleos essenciais (OE)
têm recebido atenção especial por serem substâncias naturais e atenderem à
preferência dos consumidores. Porém, a utilização de OE como um agente
antimicrobiano natural é limitada por critérios organolépticos, sendo necessário
determinar a concentração mínima necessária para inibir o desenvolvimento de
microrganismos sem afetar sensorialmente as características do alimento. Assim,
os objetivos desta pesquisa foram: desenvolver um filme comestível à base de
alginato com incorporação de agentes antimicrobianos naturais e avaliar a adição
de diferentes concentrações de cloreto de cálcio (CaCl
2
) como agente crosslinking
na formulação do filme e na etapa complementar de formação do filme;
caracterizar o filme frente às propriedades mecânicas e propriedades de barreira;
determinar a concentração mínima inibitória (CIM) de óleos essenciais para
Pseudomonas spp., Salmonella spp. e Listeria monocytogenes presentes em
carne de frango, e verificar a aceitação pelo consumidor, através da análise
sensorial (aroma), de pedaços de peito de frango in natura embalado com o
filme antimicrobiano O OE de cravo foi o que se apresentou mais eficiente para
os microrganismos testados com CIM de 0,2% sendo este o limite mínimo
estudado no planejamento experimental para o desenvolvimento do filme
antimicrobiano. As variáveis independentes neste planejamento foram: CaCl
2
na
faixa de concentração de 0,02 a 0,1% e OE cravo na faixa de 0,2 a 1,0%.
Valores acima de 0,0316% de CaCl
2
, independente da concentração de OE
estudada, diminuiram a zona de inibição do crescimento microbiano em testes
realizados in vitro, possivelmente devido a formação de um gel muito forte que
pode ter dificultado a incorporação da emulsão de OE na matriz polimérica dos
filmes. Os resultados de permeabilidade ao vapor de água mostraram que a
adição de CaCl
2
à formulação dos filmes diminuiu a permeabilidade enquanto a
adição de OE cravo foi responsável pelo aumento dessa propriedade. Com
relação às propriedades mecânicas, tanto a adição de CaCl
2
como a de OE cravo
6
à formulação dos filmes aumentou a resistência máxima à tração. Porém, com
relação ao alongamento máximo na ruptura, valores menores foram obtidos com
a adição de CaCl
2
, enquanto maiores valores foram encontrados com a adição de
OE cravo à formulação dos filmes. A avaliação da atividade antimicrobiana dos
filmes em carne de frango foi realizada somente com a formulação que
apresentou os maiores valores de zona de inibição in vitro (CaCl
2
=0,0316% e OE
cravo=0,884%). Após 5 dias de armazenagem a 7º C, observou-se que a
utilização do filme adicionado de OE de cravo como embalagem primária em
amostras de carne de peito de frango promoveu o controle da multiplicação de L.
monocytogenes o mesmo não ocorrendo para as populações de Salmonella spp.
e Pseudomonas spp. A análise sensorial relacionada ao aroma da carne de peito
de frango mostrou que o uso do filme à base de alginato incorporado de OE
cravo é viável. Porém, este filme poderá sofrer interferência da matriz alimentar
caso esta matriz apresente exsudação.
Palavras-chave: Filmes comestíveis. Alginato. Óleos essenciais.
Microrganismos deteriorantes. Microrganismos patogênicos.
ABSTRACT
The use of biodegradable packaging such as edible films and coatings are
an alternative to the use of non-recyclable packaging. The incorporation of
antimicrobial substances in packaging aims at reducing food microbial
contamination among which, essential oils (EO) have received special attention
being natural and attending consumer demand. However, the use of EO as a
natural antimicrobial agent is limited by organoleptic criteria making it necessary
to determine the minimum concentration to inhibit the multiplication of
microorganisms without affecting the sensory characteristics of the food.
Therefore, the aims of this research were: to develop an alginate based edible
film with natural antimicrobial agents, evaluating the addition of different
concentrations of calcium chloride as a crosslinking agent in the formulation of
the film and in the complementary stage; to characterize the mechanical
properties and barrier properties; to determine the minimum inhibitory
concentration (MIC) of EO for Pseudomonas spp, Salmonella spp and Listeria
monocytogenes found in chicken meat and to verify consumer acceptance of the
product through sensorial analysis (aroma). Among the studied EO, the
concentration of 0.2% of clove oil was effective in inhibiting the microorganisms
tested, this concentration being the minimum limit used in the experimental
design for film development. The independent variables studied in this design
were calcium chloride in the range of 0.02 to 0.01% and clove EO in the range of
0.2 to 1.0%. Concentrations of CaCl
2
above 0.0316%, independent of the EO
concentration, reduced the inhibition zone of microbial growth in in vitro tests,
possibly due to the formation of a very strong gel which could have made the
incorporation of the EO emulsion in the polymeric matrix of the film very difficult.
The results of water vapor permeability tests showed that the addition of CaCl
2
to
the formulation of the films reduced the permeability while the addition of clove
EO increased this property. Regarding to mechanical properties, the addition of
CaCl
2
as well as clove EO to the film formulation increased the values of tensile
strength. On the other hand, relating to elongation at the break, smaller values
were obtained with the addition of the salt while the addition of EO provided
higher values. The evaluation of antimicrobial activity of the films in chicken
meat was performed only with the formulation that showed the highest inhibition
8
values presented in vitro (CaCl
2
=0.0316% and clove EO=0.0884%). After five
days of storage at 7
o
C, it was observed that the use of the film added by clove
EO as primary packaging provided the control of L. monocytogenes growth in
samples of chicken meat but not of Salmonella spp and Pseudomonas spp. The
sensorial analysis – aroma – showed that the use of alginate based film
incorporated with clove EO is viable in food. However, when the food matrix
presents exudation, it can interfere in this film.
Key words: Edible films. Alginate. Essential oil. Spoilage microrganisms.
Pathogenic microorganisms.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................. 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................... 3
FILMES E COBERTURAS ANTIMICROBIANAS ............................................................. 6
3 OBJETIVOS ............................................................................... 15
4 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................. 16
4.1
MATERIAL ............................................................................................. 16
4.1.1
CEPAS UTILIZADAS ................................................................................ 16
4.1.1.1
Cepas padrão .......................................................................................... 16
4.1.2
AMOSTRAS DE ALIMENTO ....................................................................... 16
4.1.3
ÓLEOS ESSENCIAIS ................................................................................ 16
4.1.4
MATÉRIAS-PRIMAS UTILIZADAS NO DESENVOLVIMENTO DOS FILMES À BASE
DE ALGINATO ..................................................................................................... 17
4.2
MÉTODOS ............................................................................................. 17
4.2.1
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE Pseudomonas spp. EM CARNE DE FRANGO
17
4.2.1.1
Isolamento .............................................................................................. 17
4.2.1.2
Seleção e purificação das colônias .............................................................. 18
4.2.2
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DE ÓLEOS
ESSENCIAIS ....................................................................................................... 18
4.2.2.1
Preparo da emulsão.................................................................................. 18
4.2.2.2
Método de diluição em ágar (Oussalah et al., 2006b) .................................... 19
4.2.3
ELABORAÇÃO DOS FILMES À BASE DE ALGINATO ...................................... 21
4.2.3.1
Ensaios preliminares ................................................................................. 21
4.2.3.2
Filmes à base de alginato .......................................................................... 22
4.2.3.3
Etapa de crosslinking complementar em solução de cloreto de cálcio .............. 23
4.2.3.4
Planejamento experimental dos filmes antimicrobianos à base de alginato ...... 23
4.2.4
ANÁLISES DE CARACTERIZAÇÃO DO FILME ............................................... 25
4.2.4.1
Propriedade de barreira ao vapor de água ................................................... 25
4.2.4.2
Propriedades mecânicas ............................................................................ 27
4.2.4.3
Atividade de água (a
w
) .............................................................................. 29
4.2.4.4
Atividade antimicrobiana in vitro dos filmes ................................................. 29
4.2.4.5
Atividade antimicrobiana dos filmes em carne de frango ............................... 29
4.2.4.5.1
Preparo do inóculo de Salmonella spp. ............................................................... 30
4.2.4.5.2
Preparo do inóculo de Pseudomonas spp. ........................................................... 30
4.2.4.5.3
Preparo do inóculo de L. monocytogenes ............................................................ 30
4.2.4.5.4
Atividade antimicrobiana dos filmes em carne de frango contra L. monocytogenes e
Salmonella spp. ................................................................................................................. 31
2
4.2.4.5.5
Atividade antimicrobiana dos filmes em carne de frango contra Pseudomonas spp... 32
4.2.4.6
Análise Microbiológica............................................................................... 32
4.2.4.6.1
Preparo das amostras ...................................................................................... 32
4.2.4.6.2
Pesquisa de Salmonella spp. (ANDREWS et al., 2001, modificado)......................... 33
4.2.4.6.3
Enumeração de Salmonella spp. ........................................................................ 33
4.2.4.6.4
Pesquisa de L. monocytogenes (HITCHINS, 2003, modificado) .............................. 34
4.2.4.6.5
Enumeração de L. monocytogenes .................................................................... 34
4.2.4.6.6
Enumeração de Pseudomonas spp. (ARNAUT-ROLLIER, ZUTTER e HOOF, 1999) ...... 34
4.2.4.6.7
Contagem total de aeróbios psicrotróficos (COUSIN, JAY e VASAVADA, 2001) ......... 34
4.2.4.6.8
Contagem total de aeróbios mesófilos (MORTON, 2001) ....................................... 35
4.2.4.7
Análise sensorial ...................................................................................... 35
4.2.4.8
Análise estatística .................................................................................... 36
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................... 37
5.1
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE Pseudomonas spp. EM CARNE DE FRANGO
37
5.2
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DE ÓLEOS
ESSENCIAIS ........................................................................................................ 37
5.3
DESENVOLVIMENTO DO FILME À BASE DE ALGINATO .................................. 42
5.3.1
ENSAIOS PRELIMINARES ......................................................................... 42
5.3.2
FORMULAÇÃO FINAL ................................................................................ 44
5.3.3
PROPRIEDADE DE BARREIRA AO VAPOR DE ÁGUA ...................................... 46
5.3.4
PROPRIEDADES MECÂNICAS .................................................................... 51
5.3.5
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO DOS FILMES .................................. 58
5.3.6
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS FILMES EM CARNE DE FRANGO .............. 69
5.3.7
ATIVIDADE DE ÁGUA (a
w
) ........................................................................ 71
5.3.8
ANÁLISE SENSORIAL ............................................................................... 72
6 CONCLUSÃO .............................................................................. 75
7 REFERÊNCIAS ........................................................................... 76
8 ANEXOS .................................................................................... 84
8.1
ANEXO 1 ................................................................................................ 84
8.2
ANEXO 2 ................................................................................................ 87
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Estrutura química dos ácidos
β
ββ
β
-1,4-D-manurônico e
α
αα
α
-1,4-L-gulurônico
(QIN, 2008)
........................................................................................................ 9
Figura 2. Estrutura química dos blocos GG, MM e GM/MG (QIN,2008) .......................... 9
Figura 3. Esquema mostrando a interação dos blocos-G na presença de íons Ca
2+
, “egg-
box model”. Os círculos pretos representam os átomos de oxigênio envolvidos na
coordenação do cátion (BRACCINI e PÉREZ, 2001) .................................................. 10
Figura 4. Esquema ilustrativo do preparo da emulsão de óleo essencial em amido
modificado, incorporação da emulsão em ágar infusão de cérebro e coração e distribuição
em placas de Petri. .............................................................................................. 20
Figura 5. Esquema ilustrativo do método de diluição em ágar para a determinação da
concentração inibitória mínima .............................................................................. 20
Figura 6. Representação esquemática do processo de elaboração dos filmes ............... 25
Figura 7. Prensa utilizada para a fixação dos filmes utilizados nos ensaios de
permeabilidade ao vapor de água .......................................................................... 26
Figura 8. Branco (esquerda) e conjunto dessecante (direita) utilizados para os ensaios de
permeabilidade ao vapor de água .......................................................................... 26
Figura 9. Amostra de peito de frango embalada com o filme antimicrobiano ................ 31
Figura 10. Filme à base de alginato: (A) antes da etapa de imersão em CaCl
2
e (B) após
a etapa de imersão sem a remoção do excesso de CaCl
2
.......................................... 43
Figura 11. Filme à base de alginato após a imersão em CaCl
2
e realização da etapa de
lavagem em água destilada .................................................................................. 44
Figura 12. Filme à base de alginato com adição de cloreto de cálcio na formulação: (A)
antes da etapa de crosslinking complementar em solução de cloreto de cálcio
e (B) após
a etapa de crosslinking complementar em solução de cloreto de cálcio. ..................... 45
Figura 13. Filme à base de alginato com adição de cloreto de cálcio na formulação e após
a realização da etapa de crosslinking complementar pela adição da solução de cloreto de
cálcio diretamente à placa contendo o filme previamente seco .................................. 45
Figura 14. Superfície de resposta para permeabilidade ao vapor de água (g.m.m
-2
.s
-1
.Pa
1
)
em função da concentração de OE cravo (%) e concentração de CaCl
2
(%).................. 49
Figura 15. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
permeabilidade ao vapor de água ........................................................................... 49
Figura 16. Superfície de resposta para a resistência máxima à tração (MPa) em função da
concentração de OE cravo (%) e concentração de CaCl
2
(%)...................................... 54
Figura 17. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
resistência máxima à tração .................................................................................. 54
Figura 18. Superfície de resposta para o alongamento máximo na ruptura (%) em função
da concentração de OE cravo (%) e concentração de CaCl
2
(%) ................................. 56
Figura 19. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
alongamento máximo na ruptura ............................................................................ 57
Figura 20. Curvas de contorno relativas à zona de inibição (mm
2
) contra: (A) L.
monocytogenes, (B) S. Give, (C) S. Enteritidis e (D) P. aeruginosa resultante da
variação da concentração de óleo essencial de cravo (%) e concentração de CaCl
2
(%) . 67
Figura 21. Curvas de contorno relativas à zona de inibição (mm
2
) contra: (E) P.
fluorescens QaF01, (F) P. fluorescens Lb03, (G) P. putida Kb04 e (H) P. putida Ia03
resultante da variação da concentração de óleo essencial de cravo (%) e concentração de
CaCl
2
(%) ............................................................................................................ 68
Figura 22. Amostra de peito de frango embalada por 5 dias a 7º C com o filme
antimicrobiano ..................................................................................................... 71
Figura 23. Amostras de peito de frango após 5 dias de armazenamento a 7º C: (A) sem
aplicação do filme antimicrobiano e (B) com aplicação do filme antimicrobiano............. 72
Figura 24. Aceitabilidade das amostras de peito de frango in natura com relação ao
aroma. ................................................................................................................ 73
Figura 25. Avaliação da produção de pigmento fluorescente sob luz branca (A) e luz UV
(B) ..................................................................................................................... 86
Figura 26. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
zona de inibição antimicrobiana contra L. monocytogenes ......................................... 87
Figura 27. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
zona de inibição antimicrobiana contra S. Give ......................................................... 89
Figura 28. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
zona de inibição antimicrobiana contra S. Enteritidis ................................................ 91
Figura 29. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
zona de inibição antimicrobiana contra P. Aeruginosa ATCC 27583 ............................ 93
Figura 30. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
zona de inibição antimicrobiana contra P. fluorescens QaF01 ..................................... 95
Figura 31. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
zona de inibição antimicrobiana contra P. fluorescens Lb03 ....................................... 97
Figura 32. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
zona de inibição antimicrobiana contra P. putida Kb04 ............................................. 99
Figura 33. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
zona de inibição antimicrobiana contra P. putida Ia03 ............................................. 101
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Exemplos de aplicação de filmes e coberturas à base de alginato com ação
antimicrobiana em alimentos e in vitro .................................................................... 13
Tabela 2. Formulações utilizadas nos ensaios preliminares ......................................... 22
Tabela 3. Planejamento experimental dos filmes antimicrobianos à base de alginato
utilizando o delineamento composto central rotacional 2
2
(DCCR
2
) com três pontos
centrais ............................................................................................................... 24
Tabela 4. Concentração mínima inibitória (CIM) de óleos essenciais para Listeria
monocytogenes, Salmonella Give, Salmonella Enteritidis, Pseudomonas fluorescens
(QaF01 e Lb03), P. putida (Ia03 e Kb04) e P. aeruginosa ATCC 27853 ........................ 41
Tabela 5. Valores médios da permeabilidade ao vapor de água (PVA) após etapa de
crosslinking complementar com cloreto de cálcio dos filmes obtidos a partir dos ensaios
estabelecidos pelo delineamento experimental ......................................................... 47
Tabela 6. Coeficientes de regressão para a variável resposta permeabilidade ao vapor de
água ................................................................................................................... 48
Tabela 7. ANOVA para a permeabilidade ao vapor de água ........................................ 48
Tabela 8. Valores da permeabilidade ao vapor de água (PVA) experimentais, previstos
pelo modelo, desvios e desvio relativo .................................................................... 50
Tabela 9. Valores médios da resistência máxima à tração (Rmáx) e alongamento na
ruptura (%) após etapa de crosslinking complementar com cloreto de cálcio dos filmes
obtidos a partir dos ensaios estabelecidos pelo delineamento experimental ................. 52
Tabela 10. Coeficientes de regressão para a variável resistência máxima à tração ........ 53
Tabela 11. ANOVA para a resistência máxima à tração .............................................. 53
Tabela 12. Coeficientes de regressão para a variável alongamento máximo na ruptura . 55
Tabela 13. ANOVA para a variável alongamento máximo na ruptura ........................... 55
Tabela 14. Valores da resistência máxima à tração (Rmáx) experimentais, previstos pelo
modelo, desvios e desvio relativo ........................................................................... 57
Tabela 15. Valores da porcentagem de alongamento na ruptura (Al %) experimentais,
previstos pelo modelo, desvios e desvio relativo ....................................................... 57
Tabela 16. Atividade antimicrobiana dos filmes avaliada pela medida da zona de inibição
em mm
2
contra L. monocytogenes, S. Give, S. Enteritidis, P. fluorescens QaF01, P.
fluorescens Lb03, P. putida Ia03, P. putida Kb04 e P. aeruginosa ATCC 27853 para as
etapas antes (I) e após o crosslinking complementar com cloreto de cálcio (II) ........... 60
Tabela 17. Comparação dos valores de zona de inibição (mm
2
) encontrados para os
diferentes microrganismos avaliados em cada ensaio considerando apenas a etapa pós-
crosslinking complementar com cloreto de cálcio ..................................................... 61
Tabela 18. Modelo final para a zona de inibição (ZI) em mm
2
por microrganismo
avaliado em função da concentração de cloreto de cálcio e concentração de óleo essencial
de cravo adicionada na formulação do filme de alginato, considerando apenas a etapa
pós-crosslinking complementar ............................................................................. 64
Tabela 19. Análise microbiológica dos ensaios em amostras de peito de frango ........... 69
Tabela 20. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição
antimicrobiana contra Listeria monocytogenes ........................................................ 87
Tabela 21. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra Listeria monocytogenes
......................................................................................................................... 87
Tabela 22. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Listeria
monytogenes – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio relativo 88
Tabela 23. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição
antimicrobiana contra S. Give ............................................................................... 89
Tabela 24. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra S. Give ................... 89
Tabela 25. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Salmonella
Give – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio relativo ........... 90
Tabela 26. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição
antimicrobiana contra S. Enteritidis ........................................................................ 91
Tabela 27. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra S. Enteritidis ............ 91
Tabela 28. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Salmonella
Enteritidis – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio relativo ... 92
Tabela 29. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição
antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 .................................... 93
Tabela 30. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 ........................................................................................ 93
Tabela 32. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio
relativo ............................................................................................................... 94
Tabela 33. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição
antimicrobiana contra Pseudomonas fluorescens QaF01 ............................................ 95
Tabela 34. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra Pseudomonas
fluorescens QaF01 ................................................................................................ 95
Tabela 34. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Pseudomonas
fluorescens QaF01 – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio
relativo ............................................................................................................... 96
Tabela 35. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição
antimicrobiana contra Pseudomonas fluorescens Lb03 ............................................... 97
Tabela 36. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra Pseudomonas
fluorescens Lb03 .................................................................................................. 97
Tabela 34. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Pseudomonas
fluorescens Lb03 – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio
relativo ............................................................................................................... 98
Tabela 37. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição
antimicrobiana contra Pseudomonas putida Kb04 ..................................................... 99
Tabela 38. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra Pseudomonas putida
Kb04 ................................................................................................................... 99
Tabela 34. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Pseudomonas
putida Kb04 – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio relativo 100
Tabela 39. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição
antimicrobiana contra Pseudomonas putida Ia03 .................................................... 101
Tabela 40. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra Pseudomonas putida
Ia03 ................................................................................................................. 101
Tabela 34. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Pseudomonas
putida Ia03 – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio relativo 102
1
1 INTRODUÇÃO
Durante o transporte e armazenagem, os alimentos estão expostos a
inúmeras condições físicas, químicas e microbiológicas que podem causar
alterações na sua qualidade e inocuidade. A estabilidade de um produto
alimentício é afetada pelas alterações em componentes como proteínas, lipídios,
carboidratos, conteúdo de água e também devido a outros fatores intrínsecos e
extrínsecos dos alimentos como, por exemplo, exposição à luz, umidade,
temperatura, dentre outros. A escolha de uma proteção ou barreira efetiva como
embalagem de um alimento pode retardar uma possível deterioração e com isso
aumentar a qualidade de um produto alimentício (CHA e CHINNAN, 2004).
Os polímeros sintéticos representam cerca de 25% de todo material
utilizado na indústria de embalagem. O destaque para este tipo de embalagem
está relacionado com propriedades mecânicas, físicas e químicas superiores, tais
como, resistência mecânica, propriedades de barreira e transparência,
características estas que não são encontradas em embalagens à base de
celulose. O gasto energético para a produção desse tipo de embalagem é alto
quando comparado com as embalagens de celulose, aumentando assim, o custo
para a comercialização de um produto alimentício. Atualmente, os materiais
derivados de polímeros sintéticos representam o maior grupo de resíduos
poluentes depositados no meio ambiente (JAYASEKARA et al., 2005).
A Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos destaca que, em
muitos casos, não é possível a utilização de materiais reciclados na fabricação de
novas embalagens para alimentos, uma vez que componentes químicos e
aditivos remanescentes do processo de reciclagem podem migrar e afetar a
inocuidade desse alimento. A dificuldade na eliminação de aditivos e
coadjuvantes durante o processo de reciclagem deve-se ao fato deles serem
incorporados à matriz polimérica durante a fabricação da embalagem (FDA,
2006).
De acordo com Debeaufort, Quezada-Gallo e Voilley (1998), a substituição
de embalagens sintéticas por embalagens biodegradáveis, tais como os filmes e
coberturas comestíveis, apresenta-se como alternativa ao uso de recursos não-
2
renováveis como material de embalagem.
Entre as diversas substâncias usadas em filmes e coberturas comestíveis,
encontra-se o alginato que é um polissacarídeo extraído de algas marinhas
pardas da classe Phaephyceae (GACESA, 1988). Considerados substâncias
naturais e seguras para aplicação em alimentos, os sais de alginato são
amplamente utilizados na indústria de alimentos como espessante, estabilizante
e na produção de filmes e coberturas (ROJAS-GRAÜ et al., 2007a). Os filmes à
base de alginato podem ser aplicados em alimentos com alto teor de umidade
por essa substância ser capaz de reagir com íons divalentes de cálcio e formar
géis fortes e insolúveis.
Considerado um substrato favorável para a multiplicação microbiana, a
carne de frango está exposta às contaminações em diversas etapas do seu
processamento, desde o abate dos animais até a comercialização. Em geral, os
riscos maiores referem-se à contaminação cruzada na linha de processamento e
sempre que as boas práticas de fabricação não são seguidas (HILTON Jr, CASON
e INGRAM, 2004).
Para minimizar o problema da contaminação microbiana tem-se incorporado
substâncias antimicrobianas em embalagens com o objetivo de inibir ou retardar
a multiplicação de microrganismos em alimentos (SEYDIM e SARIKUS, 2006).
Entre as substâncias inibidoras, as substâncias naturais têm recebido
especial atenção da indústria alimentícia por causa da preferência cada vez maior
dos consumidores (OUSSALAH et al., 2006a).
Assim, pretendeu-se desenvolver um filme à base de alginato e estudar a
incorporação de óleos essenciais – óleo essencial de cravo – à essa formulação
como forma de controle do desenvolvimento de microrganismos patogênicos e
deteriorantes em pedaços de carne de frango.
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O Brasil é considerado o maior exportador mundial de carne de frango,
sendo responsável pela produção de 3,203 milhões toneladas, o que representa
cerca de 50% da produção mundial desta carne (Associação Brasileira dos
Produtores e Exportadores de Frango, 2007).
Considerado um substrato favorável para a multiplicação microbiana, a
carne de frango está exposta às contaminações em diversas etapas da sua
produção, desde o abate dos animais até a comercialização. Em geral, os riscos
maiores referem-se à contaminação cruzada na linha de processamento e
sempre que as boas práticas de fabricação não são seguidas (HILTON Jr, CASON
e INGRAM, 2004).
Os microrganismos psicrotróficos, capazes de se multiplicar em temperatura
de refrigeração, apresentam-se como a microbiota predominante durante a vida-
de-prateleira da carne de frango in natura. Entre esses microrganismos, a
maioria está relacionada às bactérias Gram-negativas do gênero Pseudomonas,
responsáveis pela deterioração de carnes. A deterioração por esses
microrganismos é caracterizada pela produção de odores desagradáveis e
produção de limosidade na superfície do produto (SUNDHEIM, SLETTEN e
DAINTY, 1998).
De acordo com Jay (2000), em estágios avançados do processo de
deterioração da carne de frango é observado o aparecimento de pigmento
fluorescente na superfície do produto quando este é examinado sob luz ultra-
violeta. Segundo Sundheim, Sletten e Dainty (1998), os isolados relacionados à
produção de fluorescência, conferida pelo pigmento fluoresceína, são P.
fluorescens e P. lundensis, sendo P. fluorescens a espécie de maior prevalência
neste tipo de deterioração.
Outros microrganismos psicrotróficos como L. monocytogenes e Yersinia
enterolitica apresentam importância na área de produtos cárneos por causarem
doenças transmitidas por alimentos (TSIGARIDA, SKANDAMIS e NYCHAS, 2000).
Dentre os microrganismos citados, L. monocytogenes, bactéria Gram-positiva,
destaca-se, também, pela capacidade de formação de biofilmes e
4
estabelecimento em plantas processadoras de alimentos através da colonização
de equipamentos, drenos de pisos, etc, permanecendo como microbiota
residente por meses ou até anos (ZHAO, DOYLE e ZHAO, 2004; CHIARINI, 2007;
DIAS, 2008). Entre os microrganismos Gram negativos, Salmonella é de grande
importância em carne de frango e derivados por estarem, frequentemente,
envolvidos em surtos de gastrenterite por alimentos (HERISKTAD, MOTARJEMI e
TAUXE, 2002; HUMPHREY, 2004).
Na tentativa de minimizar o problema da contaminação de alimentos,
diversas substâncias antimicrobianas são permitidas pela legislação dos países.
Os óleos essenciais (OE), presentes em condimentos e plantas, além de
preencherem esse requisito, são naturais, o que torna o seu uso extremamente
atraente e por, atualmente, terem preferência atual do consumidor por esse tipo
de substância. Esses óleos apresentam maior efeito inibitório na forma “in
natura”, isto é, quando em condimentos ou plantas (Jay, 2000). A atividade
antimicrobiana de OE é assegurada pela presença de compostos fenólicos e
terpenos (OUSSALAH et al., 2007b).
Os OE são resultantes dos produtos voláteis extraídos por destilação e estão
concentrados em regiões específicas como folha, semente, casca ou fruto.
Quando encontrados em diferentes regiões de uma mesma planta apresentam
perfis de composição diversificados (CONNER e BEUCHAT, 1984 apud OUSSALAH
et al., 2007a).
Óleos essenciais extraídos de um mesmo gênero de planta podem
apresentar diferenças relacionadas ao seu potencial antimicrobiano. As razões
para essa variabilidade estão relacionadas ao local geográfico do cultivo, clima e
estação do ano da colheita, genótipo da planta e diferenças no processo de
extração do óleo. Esses fatores influenciam na composição e na concentração de
cada constituinte extraído (BURT e REINDERS, 2003).
Até 2004, pouco se sabia sobre o modo de ação dos OE (Burt, 2004). Para
Sikkema, de Bont e Poolman (1994), a interação entre as substâncias
hidrofóbicas presentes em OE e os compostos lipídicos da membrana celular
poderia propiciar uma alteração em sua estrutura e alterar sua permeabilidade
causando o efluxo de íons e/ou saída de metabólitos celulares. Pesquisas mais
5
recentes realizadas por Devi et al. (2010) e Gill e Holley (2006) confirmam essas
observações, ou seja, que eles agem na membrana celular alterando a sua
permeabilidade e até mesmo rompendo-a.
Grande parte dos trabalhos que avaliaram o modo de ação de OE contra
microrganismos patogênicos e deteriorantes verificaram que, em geral, as
bactérias Gram-positivas apresentam-se mais sensíveis quando comparadas às
bactérias Gram-negativas (OUATTARA et al., 1997; SMITH-PALMER, STEWART e
FYFE, 1998; JULIANO, MATTANA e USAI, 2000; MARINO, BERSANI e COMI,
2001; HARPAZ et al., 2003). A menor susceptibilidade dos microrganismos
Gram-negativos aos OE está relacionada com a presença de uma membrana
externa formada por uma dupla camada lipídica que dificulta a difusão dos
compostos presentes no óleo essencial (BURT, 2004).
No entanto, alguns estudos discordam dos anteriores. Em estudo
desenvolvido por Tassou, Drosinos e Nychas (1995), a utilização de óleo
essencial de menta aplicado em formulação de um alimento grego típico
(tzatziki) foi tão efetiva para a redução da população de S. Enteritidis quanto
para L. monocytogenes. Oussalah et al. (2007a) verificaram que para os OE de
canela chinesa, cravo, orégano grego e tomilho, S. Typhimurium e Escherichia
coli O157:H7, que são bactérias Gram-negativas, requereram uma menor
concentração de OE para sua completa inibição comparada com L.
monocytogenes.
Segundo Seydim e Sarikus (2006), os OE que possuem propriedades
antimicrobianas para microrganismos patogênicos contêm elevadas
concentrações de compostos fenólicos como o carvacrol, eugenol e timol. Além
desses compostos, a presença de compostos ativos como o р-cimeno, aldeído
cinâmico, terpineno, limoneno, alicina, dentre outros, são responsáveis pela ação
antimicrobiana desses óleos (CEYLAN e FUNG, 2004).
Considerado seguro para o consumo humano (GRAS – Generally Recognized
as Safe), o uso de OE é limitado por critérios organolépticos. Por esta razão, é
necessário determinar a concentração mínima necessária para inibir o
crescimento de microrganismos sem afetar sensorialmente as características do
alimento (OUSSALAH et al., 2007a).
6
FILMES E COBERTURAS ANTIMICROBIANAS
As embalagens com ação antimicrobiana, consideradas como uma parte da
área de embalagens ativas, vêm sendo estudadas com o objetivo de reduzir o
risco do desenvolvimento de microrganismos patogênicos e aumentar a vida-de-
prateleira de produtos alimentícios (SUPPAKUL et a.l, 2003). A incorporação de
agentes antimicrobianos naturais em filmes comestíveis é considerada uma
alternativa ao uso de recursos não-renováveis como material de embalagem
(CHA e CHINAN, 2004).
Além de filmes comestíveis, as substâncias antimicrobianas também podem
ser incorporadas em coberturas comestíveis ou coatings. Segundo Debeaufort,
Quezada-Gallo e Voilley (1998), essas coberturas são definidas como finas
camadas de material aplicado e formado diretamente na superfície do produto,
enquanto que filmes são materiais aplicados ao produto após serem formados
separadamente.
Inúmeras matrizes vêm sendo utilizadas e a composição dos filmes
apresenta propriedades específicas que variam com o tipo de base utilizada
podendo ser divididos em três categorias segundo sua composição:
polissacarídeos e seus derivados, protéicos e lipídicos. Dentre os polissacarídeos
mais utilizados estão: amidos, alginatos, pectinas, carragenas, ágar e derivados
de celulose; os protéicos incluem: glúten, proteína isolada de soja, gelatina,
albumina de ovo e zeína e os lipídicos que incluem as ceras, ácidos graxos,
dentre outros. A escolha da composição do filme depende do tipo de aplicação
desejado (BRAVIN, PERESSINI e SENSIDONI, 2006; CHA e CHINNAN, 2004).
Os polissacarídeos e proteínas utilizados para o preparo de filmes
apresentam boa barreira ao CO
2
e O
2
, porém, não são considerados boa barreira
ao vapor de água. Os filmes protéicos, em geral, apresentam menor
extensibilidade quando comparado aos filmes que utilizam polissacarídeos em
sua composição (CHA e CHINNAN, 2004).
Os filmes à base de polissacarídeos e proteínas tendem a intumescer e
dissolver quando aplicados em alimentos com alta atividade de água. Dessa
forma, torna-se necessária a adição de aditivos ou agentes de crosslinking para
7
diminuir a solubilidade desses filmes. Segundo Seydim e Sarikus (2006), a
propriedade de barreira à umidade em filmes pode ser melhorada com a
incorporação de componentes hidrofóbicos como os lipídios.
Os filmes lipídicos apresentam barreira eficiente à umidade, mas, baixa
resistência mecânica, baixa aderência, quebra na superfície do filme, dificuldade
de homogeneidade e sabor residual. Desse modo, para se obter a característica
desejada é utilizada a combinação de materiais para a formação de filmes (CHA
e CHINNAN, 2004).
As propriedades do filme comestível são influenciadas por parâmetros como
formulação ou composição do alimento, tecnologia de formação do filme,
características do solvente e uso de aditivos (BRAVIN, PERESSINI e SENSIDONI,
2006).
Para a produção de filmes em escala laboratorial, utiliza-se a técnica tipo
casting, na qual a solução filmogênica é porcionada sobre suportes, levada para
secagem e destacada. Em escala industrial, algumas técnicas já utilizadas para a
fabricação de filmes plásticos vêm sendo utilizadas para a produção de filmes
comestíveis e biodegradáveis, tais como: técnicas de extrusão, coextrusão para
filmes multicamadas e processo de secagem para a remoção do solvente da
solução polimérica (DEBEAUFORT, QUEZADA-GALLO e VOILLEY, 1998).
Inúmeras matrizes vêm sendo utilizadas como veículo para incorporação
de agentes antimicrobianos naturais no controle de microrganismos patogênicos
e deteriorantes em alimentos: filmes à base de proteína de soja incorporados de
nisina, substância antimicrobiana natural produzida por Lactococcus lactis,
extrato de chá verde e extrato de semente de uva utilizados para o controle de
L. monocytogenes (THEIVENDRAN, HETTIARACHCHY e JOHNSON, 2006); filmes
compostos por proteína isolada de soro de leite contendo OE de orégano e alho
aplicados em salsichas e em queijos processados fatiados, para o controle de E.
coli, Staphylococcus aureus, S. Enteridis, L. monocytogenes e Lactobacillus
plantarum (SEYDIM e SARIKUS, 2006); filmes à base de quitosana e hidroxi-
propil-metil-celulose (HPMC) incorporados de nisina utilizados no controle de
Aspergillus niger e Kocuria rhizophila (SEBTI et al., 2007); filmes à base de
quitosana utilizados no controle de L. monocytogenes em rosbife pronto para o
8
consumo (BEVERLYA et al., 2008); filmes à base de purê de maçã incorporados
de carvacrol e utilizados para o controle de E. coli O157:H7 (DU et al., 2008),
dentre outros.
Além de serem utilizados como coadjuvantes para a incorporação de
substâncias antimicrobianas, filmes e coberturas comestíveis podem atuar na
encapsulação e no transporte de substâncias como aromas, temperos, agentes
antioxidantes e outros aditivos alimentares (DEBEAUFORT, QUEZADA-GALLO e
VOILLEY, 1998).
Entre os polissacarídeos, o alginato apresenta potencial aplicação em
diversas áreas tais como indústrias de alimentos e farmacêutica, na odontologia,
e na área ambiental, por ser capaz de formar géis na presença de cátions e
aumentando em conseqüência a viscosidade de soluções (GACESA, 1988).
Outras propriedades do alginato importantes para a referida indústria são:
capacidade de estabilização de suspensões e emulsões, formar de gel, formar
filmes e coberturas, dentre outras (GACESA, 1988, ROJAS-GRAÜ et al., 2007a;
MAIZURA et al., 2007).
O alginato é um polissacarídeo extraído de algas marinhas pardas da classe
Phaephyceae (GACESA, 1988). A extração se dá através de tratamento com
solução alcalina, em geral hidróxido de sódio, no qual o alginato é convertido a
alginato de sódio (QIN, 2008).
A estrutura química apresenta-se na forma de um ácido polimérico linear
composto de resíduos dos ácidos β-1,4-D-manurônico (M) e α-1,4-L-gulurônico
(G). Como observado na Figura 2, esses ácidos apresentam conformações
espaciais diferentes devido ao resíduo presente no C-5. Dessa forma, a
orientação das ligações glicosídicas faz com que as regiões de β-D-manuranato
apresentem cadeia linear, análoga à cadeia de celulose, enquanto que regiões de
α-L-guluronato apresentam estrutura de cadeia não-linear (ERTESVAG e VALLA,
1998; GACESA, 1988).
9
Figura 1.
Estrutura química dos ácidos
β
-1,4-D-manurônico e
α
-1,4-L-
gulurônico (QIN, 2008)
Devido à estrutura polimérica, o alginato pode ser considerado um co-
polímero formado por blocos de β-1,4-D-manurônico (M) e α-1,4-L-gulurônico
(G). Esta cadeia polimérica é formada por três tipos de blocos: os blocos GG, que
contém apenas unidades derivadas do ácido α-L-gulurônico; os blocos MM,
derivados do ácido β-D-manurônico e os blocos MG que consistem de unidades
alternadas de ácido β-D-manurônico e ácido α-L-gulurônico. A Figura 2 apresenta
a estrutura química dos blocos GG, MM, GM/MG (ERTESVAG e VALLA, 1998;
GACESA, 1988; SIEW e WILLIAMS, 2005).
Figura 2. Estrutura química dos blocos GG, MM e GM/MG (QIN,2008)
A razão entre as unidades M:G e a quantidade relativa dos três segmentos
poliméricos varia com a fonte de obtenção. Assim, os alginatos extraídos de
algas marinhas distintas apresentam composição e estrutura polimérica
diferentes e, conseqüentemente, apresentam propriedades diferentes. Uma
10
diferença importante é observada na característica dos géis. Os alginatos com
maior porcentagem de blocos-G formam géis mais rígidos, porém quebradiços.
Já os géis de alginato com maior porcentagem de blocos-M são menos rígidos e
apresentam maior flexibilidade (GACESA, 1988; ERTESVAG e VALLA, 1998).
A variação na força do gel está relacionada com a ligação dos cátions com
os diversos blocos estruturais presentes na molécula de alginato. Todos os blocos
são polianiônicos e formam ligações iônicas intermoleculares na presença de
cátions di ou multivalentes, como o Ca
2+
, por exemplo. Entretanto, as regiões
onde há predomínio de blocos-G são as que quelam os íons metálicos mais
facilmente devido ao arranjo espacial da molécula o que torna esse tipo de
interação mais forte (GACESA, 1988). Segmentos de cadeia consistindo de
resíduos de ácido manurônico e gulurônico alternados não interagem com o
cálcio, mas servem para ligar as estruturas agregadas, produzindo uma rede
tridimensional (CI et al., 1999). O modelo que explica a interação das cadeias de
alginato é o modelo caixa de ovo (do inglês “egg-box model”), apresentado na
Figura 3, onde os íons Ca
2+
representam os ovos, dispostos entre os espaços
existentes no bloco-G, que fazem o papel de caixa. Esta interação é responsável
por uma das principais propriedades dos alginatos: formação de géis (GRANT et
al., 1973; GACESA, 1988; BRACCINI e PÉREZ, 2001).
Figura 3. Esquema mostrando a interação dos blocos-G na presença de íons
Ca
2+
, “egg-box model”. Os círculos pretos representam os átomos de oxigênio
envolvidos na coordenação do cátion (BRACCINI e PÉREZ, 2001)
11
Os íons de cálcio são considerados os mais efetivos no processo de
gelificação dos filmes à base de alginato, quando comparados com íons de
magnésio, manganês, alumínio e ferro (CHA e CHINAN, 2004). Pavlath et al.
(1999) demonstraram que o tratamento por imersão em solução de cloreto de
cálcio e cloreto de zinco foram os mais efetivos na formação de um filme
insolúvel e de maior resistência mecânica quando comparado com os
tratamentos utilizando íons de ferro, cobre, magnésio e alumínio.
De acordo com Kester e Fennema (1986), o processo de gelificação do
alginato de sódio com cálcio pode ocorrer de duas maneiras distintas. A primeira
envolve a liberação controlada de íons bivalentes de cálcio em uma solução de
alginato. A partir da interação do cálcio ionizado com os polímeros de ácido
algínico, tem-se a formação de um gel homogêneo. A liberação de íons
bivalentes de cálcio pode ser controlada pela alteração do pH e temperatura do
meio. A segunda forma envolve a difusão de íons de cálcio para o interior da
solução de alginato, no qual o processo de gelificação é alcançado quando os
íons de cálcio difundem-se através da interface gel-membrana.
Em geral, trabalhos envolvendo a formação de coberturas à base de
alginato envolvem, em sua maioria, o segundo método de gelificação com cálcio,
seja pelo processo de imersão do alimento em solução de cálcio bivalente ou pela
pulverização da solução de cálcio sobre a camada de alginato previamente
formada no alimento (OLIVAS, MATTINSON e BARBOSA-CÁNOVAS, 2007; ROJAS
GRAÜ et al., 2007b; OMS-OLIU, SOLIVA-FORTUNYA e MARTÍN-BELLOSO, 2008;
RAYBAUDI-MASSILIA, MOSQUEDA-MELGAR, MARTIN-BELLOSO, 2008;
RAYUBAUDI-MASSILIA et al., 2008; TAPIA et al., 2008; FAN et al., 2009; LU et
al., 2009). Já a formação de filmes pode envolver tanto a incorporação dos íons
bivalentes na forma de solução diretamente na formulação dos filmes e posterior
etapa de crosslinking complementar em solução de cloreto de cálcio (RHIM,
2004; ZACTITI e KIECKBUSCH, 2006; SILVA, BIERHALZ e KIECKBUSCH, 2009),
ou então somente a etapa de crosslinking complementar (PRANOTO, SALOKHE e
RAKSHIT, 2005; OUSSALAH et al., 2006a; MILLETTE et al, 2007; OUSSALAH et
al., 2007b).
Cha et al. (2002) e Maizura et al. (2007) trabalharam com filmes
compostos à base de alginato e κ-carragena, e alginato e amido de sagu,
12
respectivamente. Ambos os trabalhos não envolveram técnica de reticulação e
somente avaliaram as propriedades antimicrobianas e mecânicas do filme.
Sabendo-se que tanto o alginato como a κ-carragena em solução interagem com
íons cálcio, a etapa de reticulação seria interessante para a formação de um gel
entre essas duas estruturas e conseqüente aumento nas propriedades de
barreira e propriedades mecânicas desses filmes.
Tabela 1 apresenta estudos encontrados na literatura consultada entre o
período de 2002 a 2009, relacionados à aplicação de filmes e coberturas
antimicrobianas à base de alginato em alimentos e in vitro. Como destacado
anteriormente, o processo de obtenção desses filmes e coberturas é variável
quanto à etapa de reticulação com Ca
2+
.
13
Tabela 1. Exemplos de aplicação de filmes e coberturas à base de alginato com ação antimicrobiana em alimentos e in vitro
Aplicação Material Método de
reticulação
com Ca
2+
Produto Antimicrobiano Objetivo Referência
cobertura Alginato Pulverização Pescado (Channa
argus)
Nisina + EDTA Controle de bactérias
mesófilas e
psicotróficas
LU et al., 2009
cobertura Alginato Adição na
formulação do
filme
Salmão
defumado
Lisozima de ostra +
nisina
Controle de L.
monocytogenes e S.
Anatum
DATTA et al., 2008
cobertura Alginato Imersão Melão (Cucumis
melo) em
pedaços
Ácido málico e óleo
essencial (OE) canela,
palmarosa e capim-
limão
Controle de S.
Enteritidis inoculada
no produto
RAYUBAUDI-MASSILIA,
MOSQUEDA-MELGAR,
MARTIN-BELLOSO, 2008
cobertura Alginato +
purê de maçã
Imersão Maçã “Fuji” em
pedaços
OE orégano, capim-
limão e vanilina
Controle de L. innocua
inoculada no produto
e enumeração de
bolores e leveduras
ROJAS GRAÜ et al., 2007b
cobertura Alginato Imersão Maçã “Fuji” em
pedaços
OE canela, cravo,
capim-limão e
respectivos compostos
ativos, aldeído
cinâmico, eugenol e
citral
Controle de E. coli
O157:H7 incolulada
no produto
RAYUBAUDI-MASSILIA et
al., 2008
cobertura Alginato e
amido de pêra
(comparação)
Adição na
formulação do
filme
Pele de frango Fosfato tri-sódico Controle de
Salmonella spp.
inoculada no produto
MEHYAR et al., 2007
cobertura Alginato
contendo
diferentes
lípides
Imersão Maçã “Gala”
minimamente
processada
Sorbato de potássio Controle de mos
aeróbios mesófilos,
psicotróficos, bolores
e leveduras
OLIVAS, MATTINSON e
BARBOSA-CÁNOVAS, 2007
13
14
Continuação da Tabela 1.
Aplicação Material Método de
reticulação
com Ca
2+
Produto Antimicrobiano Objetivo Referência
filme Alginato de
sódio +
κ-carragena
(não utilizado) (não utilizado) EDTA + extrato
grapefruit + nisina +
lisozima
Avaliação da zona de
inibição para L.
innocua, E. coli,
S. Enteritidis, S.
aureus e Micrococcus
luteus
CHA et al., 2002
filme Alginato +
amido de sago
(não utilizado) (não utilizado) OE capim-limão Avaliação da zona de
inibição para E. coli
O157:H7
MAIZURA et al., 2007
filme Alginato +
policaprolacto
na + proteína
isolada de
soja
Imersão carne bovina e
carne moída in
natura
Nisina Controle de S. aureus
inoculado no produto
MILLETTE et al, 2007
filme Alginato Imersão carne bovina in
natura
OE orégano, canela e
sálvia
Controle de E. coli
O157:H7 e S.
Typhimurium
inoculada no produto
OUSSALAH et al., 2006a
filme Alginato Imersão Mortadela e
presunto
OE orégano, canela e
sálvia
Controle de L.
monocytogenes e S.
Typhimurium
inoculada no produto
OUSSALAH et al., 2007b
filme Alginato Imersão (não utilizado) OE alho Avaliação da zona de
inibição para E. coli,
S. Typhimurium, S.
aureus e B. cereus
PRANOTO, SALOKHE e
RAKSHIT, 2005
14
15
3 OBJETIVOS
Objetivo geral:
■ Avaliar o potencial de utilização de filme comestível à base de alginato
incorporado de agentes antimicrobianos naturais na cobertura de pedaços de
frango visando o controle da população microbiana desse alimento.
Objetivos específicos:
■ Desenvolver um filme comestível à base de alginato com incorporação de
agentes antimicrobianos naturais e avaliar a adição de diferentes concentrações
de cloreto de cálcio como agente crosslinking na formulação do filme e em etapa
complementar;
■ Caracterizar o filme frente às propriedades mecânicas e propriedades de
barreira;
■ Determinar a concentração mínima de óleos essenciais capaz de inibir
Pseudomonas spp., Salmonella spp. e Listeria monocytogenes presentes em
carne de frango;
■ Verificar a aceitação do produto pelo consumidor através da análise
sensorial.
16
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1
MATERIAL
4.1.1 CEPAS UTILIZADAS
4.1.1.1 Cepas padrão
As cepas utilizadas na etapa de isolamento de Pseudomonas spp:
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Burkholderia cepacia ATCC 25416 como
controles positivos (doadas pela Fundação André Tosello) e Staphylococcus
aureus ATCC 25923 como controle negativo, pertencente à coleção de culturas
do Laboratório de Microbiologia de Alimentos da FCF-USP.
Para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) dos OE foram
empregadas oito cepas assim distribuídas: duas cepas de Pseudomonas
fluorescens e duas cepas de Pseudomonas putida isoladas de carne de frango,
uma cepa de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, uma cepa de Salmonella
Give e uma cepa de Salmonella Enteritidis, ambas isoladas de carne de frango e
doadas pelo Laboratório SFDK e uma cepa de Listeria monocytogenes isolada de
carne de frango e proveniente da coleção de culturas do Laboratório de
Microbiologia de Alimentos da FCF-USP.
4.1.2 AMOSTRAS DE ALIMENTO
Foram adquiridas 24 amostras de coxinha da asa (Drumett) obtidas de
casas de carnes, açougues e supermercados da cidade de São Paulo/SP. As
amostras foram mantidas em caixas isotérmicas contendo gelo reciclável e
transportadas imediatamente ao Laboratório de Microbiologia de Alimentos da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP.
4.1.3 ÓLEOS ESSENCIAIS
Os óleos essenciais avaliados e respectivos fornecedores foram: óleo
essencial de alho (Fuchs Gewürze, Itupeva, SP, Brasil), óleo essencial de cebola
(Fuchs Gewürze), óleo essencial de cravo (Duas Rodas, Jaraguá do Sul, SC,
17
Brasil), óleo essencial de gengibre africano (Apliquímica, São Paulo, SP, Brasil),
óleo essencial de gengibre chinês (Apliquímica), óleo essencial de hortelã (Duas
Rodas), óleo essencial de limão siciliano (Dierberger, Barra Bonita, SP, Brasil),
óleo essencial de limão siciliano 5X (Dierberger), óleo essencial de laranja
(Apliquímica), óleo essencial de laranja (Duas Rodas), óleo essencial de laranja
5X (Dierberger), óleo essencial natural de laranja doce (Duas Rodas) e óleo
essencial de pimenta preta (Fuchs Gewürze). Com exceção das amostras
provenientes da empresa Fuchs Gewürze do Brasil Ltda, todas as outras foram
doadas pelos respectivos fornecedores.
4.1.4 MATÉRIAS-PRIMAS UTILIZADAS NO DESENVOLVIMENTO DOS
FILMES À BASE DE ALGINATO
As matérias-primas utilizadas para a elaboração dos filmes foram alginato
de sódio (I-3F-80, Vogler, São Paulo, SP, Brasil), glicerina bi-destilada (Mix, São
Paulo, SP, Brasil) e cloreto de cálcio (solução a 20%, Doce Aroma, São Paulo, SP,
Brasil). Todas as matérias-primas utilizadas para a etapa de desenvolvimento
dos filmes à base de alginato são de grau alimentício.
4.2
MÉTODOS
4.2.1 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE Pseudomonas spp. EM
CARNE DE FRANGO
As etapas de isolamento e identificação de Pseudomonas spp. em carne de
frango foram realizadas de acordo com metodologia proposta por Arnaut-Rollier,
Zutter e Hoof (1999), com modificações.
4.2.1.1 Isolamento
Cada amostra analítica, composta por 25 g de pele de frango pesada
assepticamente, foi adicionada a 225 mL de água peptonada 0,1% e
homogeneizada em stomacher por 2 min. Posteriormente, foram realizadas
diluições decimais empregando-se 1 mL do homogeneizado e 9 mL de água
peptonada 0,1%. Porções de 0,1 mL foram semeadas, com auxílio de alça de
Drigalski, em superfície de ágar base para Pseudomonas com suplemento
18
seletivo cetrimide, fucidina e cefaloridina (PAB-CFC, Oxoid, Basingstike, Reino
Unido). As placas foram incubadas por 24 e 48 h a 25º C para observação do
desenvolvimento de colônicas características sob luz branca e luz ultra-violeta.
4.2.1.2 Seleção e purificação das colônias
Para confirmação do gênero Pseudomonas foram selecionadas de 3 a 5
colônias consideradas típicas ou suspeitas no meio PAB-CFC, ou seja, colônias de
cor branca, convexas e com bordas lisas. Cada uma das colônias selecionadas foi
semeada por esgotamento em placas de ágar nutriente para purificação e
obtenção de colônias isoladas e incubadas a 25º C por 48 h e a 42º C por um
período mínimo de 48 h e máximo de 7 dias para os isolados suspeitos de P.
aeruginosa. As culturas puras foram utilizadas para o exame de morfologia por
coloração de Gram e realização dos seguintes testes bioquímicos: produção de
oxidase, produção de catalase, utilização da glicose por metabolismo
fermentativo ou oxidativo (prova de O/F) e produção de pigmento fluorescente.
Os procedimentos para a realização dos testes bioquímicos encontram-se
no ANEXO 1.
A identificação completa dos isolados foi realizada pelo sistema de
identificação de bacilos Gram negativos não enterobactérias e não fastidiosos
API
®
20 NE (bioMérieux, França).
4.2.2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DE
ÓLEOS ESSENCIAIS
4.2.2.1 Preparo da emulsão
O preparo da emulsão de OE em amido modificado foi baseado em
metodologia descrita por Oussalah et al. (2006b). Cada OE avaliado foi
homogeneizado em homogeneizador de bancada (Ultra Turrax, mod. TP18/1059,
Janke & Kunkel, Alemanha) a 20000 rpm por 2 min com uma solução estéril de
amido modificado 10% (Purity gum Be, National Starch Food Innovation, EUA)
de maneira a obter uma concentração final de 10% de OE. O preparo da emulsão
foi realizado de forma asséptica em capela de fluxo laminar.
19
4.2.2.2 Método de diluição em ágar (Oussalah et al., 2006b)
A partir da emulsão de OE preparada conforme 4.2.2.1, foram preparadas
três concentrações do OE, sendo uma menor de 0,003%, uma média de 0,05% e
uma maior de 0,8% (p/v) em ágar infusão de cérebro e coração (BHI)
previamente preparado e mantido a 45º C. Para cada concentração, foi
preparado um frasco de ágar BHI.
A homogeneização da emulsão em ágar BHI foi realizada com o auxílio de
um agitador magnético (Fisatom, mod. 753, Brasil). Posteriormente,
aproximadamente 15 mL de meio de cultura foram distribuídos em placas de
Petri e após sua solidificação, 40 µL da cultura dos microrganismos nas
concentrações de 10
4
, 10
5
e 10
6
UFC/mL foram semeadas na superfície das
placas, a fim de se obter placas contendo os microrganismos nas concentrações
de 10
2
, 10
3
e 10
4
UFC/mL, respectivamente. Como controle positivo, foi utilizado
ágar BHI sem óleo essencial com a cultura diluída e como controle negativo, ágar
BHI com óleo essencial e sem a adição do inóculo. As placas foram incubadas a
25º C por 48 h para P. fluorescens e P. putida e a 37º C por 24 h para L.
monocytogenes, Salmonella spp. e P. aeruginosa ATCC 27853. A ausência de
multiplicação para todas as concentrações de microrganismos avaliadas após o
período de incubação foi denominada CIM.
A partir dos resultados obtidos, foram avaliadas as concentrações de
0,006%; 0,013%; 0,05%; 0,1%; 0,2% e 0,4% para a determinação da CIM.
20
Figura 4. Esquema ilustrativo do preparo da emulsão de óleo essencial em
amido modificado, incorporação da emulsão em ágar infusão de cérebro e
coração e distribuição em placas de Petri.
Figura 5. Esquema ilustrativo do método de diluição em ágar para a
determinação da concentração inibitória mínima
21
4.2.3 ELABORAÇÃO DOS FILMES À BASE DE ALGINATO
4.2.3.1 Ensaios preliminares
A partir de contato com fornecedores, fabricantes de ingredientes
alimentícios e testes iniciais realizados em laboratório foram definidas a
utilização das seguintes matérias-primas de grau alimentício: alginato de sódio
(I-3F-80, Vogler), glicerina bi-destilada (Mix) e cloreto de cálcio (solução a 20%,
Doce Aroma).
Os filmes à base de alginato foram obtidos segundo a técnica tipo casting,
que consiste na preparação de uma solução filmogênica e aplicação da mesma
em um suporte. Nos ensaios preliminares de desenvolvimento do filme foram
estudadas 4 concentrações de alginato de sódio: 1,5%, 2,0%, 2,5% e 3,0% e 2
concentrações de cloreto de cálcio: 2% e 20% como crosslinking complementar,
conforme estudo proposto por Oussalah et al. (2006a). A concentração de
glicerina bi-destilada foi fixada em 2,0% e o restante da formulação foi
completado com água destilada para se obter um valor final de 100%.
Para estes ensaios foi seguida metodologia proposta por Oussalah et al.
(2006a) onde o alginato de sódio foi solubilizado em água destilada à
temperatura ambiente sob agitação a 1000 rpm (Fisatom, mod. 713, Brasil) por
aproximadamente 1 hora. Em seguida, ainda sob agitação, adicionou-se a
glicerina bi-destilada até sua completa solubilização na solução filmogênica. Esta
solução foi mantida em descanso por aproximadamente 2 horas para a
eliminação de bolhas de ar que podem interferir na resistência mecânica do
filme. Posteriormente, foi realizado o porcionamento através da pesagem da
solução filmogênica em placas de Petri (140 x 15 mm) a fim de se obter filmes
com espessura de aproximadamente 100 µm. Após a distribuição manual da
solução pela placa de Petri, as amostras foram levadas à estufa (Fanem, mod.
00203, São Paulo, Brasil) de 40º C, sem circulação forçada de ar, para a
secagem. O tempo de secagem variou de 20 h a 26 h, onde o tempo final foi
estabelecido quando foi observado o descolamento do filme pela borda da placa.
22
Tabela 2. Formulações utilizadas nos ensaios preliminares
Ingrediente Formulações (%)
F1 F2 F3 F4
Alginato de sódio 3,0 2,5 2,0 1,5
Glicerina bi-destilada 2,0 2,0 2,0 2,0
Água destilada 95,0 95,5 96,0 96,5
Total 100,0 100,0 100,0 100,0
Para a realização da etapa de crosslinking em solução de cloreto de cálcio,
os filmes já secos foram acondicionados em dessecadores com umidade relativa
controlada de 75% por um período mínimo de 2 h antes de serem removidos da
placa de Petri e mergulhados em solução de cloreto de cálcio a 2 ou 20%. Após 5
min de imersão, os filmes foram levados para secagem em estufa a 40º C por
até 1 hora.
Após a etapa de imersão por 5 min em solução de cloreto de cálcio,
realizou-se uma etapa de remoção do excesso de cloreto de cálcio por lavagem
com água destilada com base no estudo desenvolvido por Zactiti e Kieckbusch
(2006).
4.2.3.2 Filmes à base de alginato
O processo final de elaboração dos filmes foi baseado nos resultados
obtidos a partir dos ensaios preliminares e na metodologia descrita por Rhim
(2004) e Zactiti e Kieckbusch (2006), com modificações. Inicialmente,
solubilizou-se a glicerina bi-destilada (2%) em água destilada sob agitação a
1000 rpm por 5 min e, em seguida, adicionou-se o alginato de sódio (3%)
mantendo a agitação a 1000 rpm por 20 min. A solução filmogênica obtida foi
mantida em descanso por aproximadamente 2 horas. Posteriormente, foi
realizado o porcionamento através da pesagem da solução filmogênica em placas
de Petri (140 x 15 mm). Após a distribuição manual da solução pela placa de
Petri, as amostras foram levadas à estufa de 40º C por 20 h para secagem. Após
o término da secagem, as amostras foram mantidas em dessecador com
umidade relativa de 75%. Os filmes apresentaram espessura final de
aproximadamente 100 µm.
23
4.2.3.3 Etapa de crosslinking complementar em solução de cloreto de
cálcio
Para a etapa de crosslinking complementar dos filmes em solução de cloreto
de cálcio, foram adicionados 50 mL de solução de cloreto de cálcio a 2% às
placas contendo os filmes já secos em estufa. Após 5 min de contato, a solução
de cloreto de cálcio foi removida da placa e o excesso foi retirado por lavagem
com água destilada. Os filmes foram levados para secagem em estufa a 40º C
por até 1 hora.
4.2.3.4 Planejamento experimental dos filmes antimicrobianos à base
de alginato
Após a determinação da formulação base para o desenvolvimento do filme à
base de alginato, foi avaliada a influência do grau de reticulação com cloreto de
cálcio adicionado à formulação do filme como forma de manutenção do agente
antimicrobiano. Para isso, adotou-se o Delineamento Composto Central
Rotacional 2
2
(DCCR 2
2
) com três pontos centrais, sendo +1: máxima
concentração, -1: mínima concentração, 0: ponto central, +1,41: +α e -1,41: -α.
As variáveis estudadas foram: (a) concentração de cloreto de cálcio utilizada na
formulação do filme como forma de crosslinking, sendo o limite mínimo
(-1,41=0,02%) estabelecido a partir de estudo relatado em literatura (SILVA,
BIERHALZ e KIECKBUSCH, 2009) e o limite máximo (+1,41=0,1%) determinado
pela máxima concentração adicionada que não provocasse uma gelificação
localizada e (b) concentração de óleo essencial de cravo, sendo o limite mínimo
(-1,41=0,2%) o valor determinado pela determinação da concentração inibitória
mínima e o limite máximo (+1,41=1,0%) estabelecido a partir de estudos
preliminares avaliando a incorporação do agente ativo na formulação do filme e
seu potencial frente aos microrganismos alvos.
24
Tabela 3. Planejamento experimental dos filmes antimicrobianos à base de alginato
utilizando o delineamento composto central rotacional 2
2
(DCCR
2
) com três pontos centrais
Ensaios Valores codificados Valores originais (%)
CaCl
2
OE cravo CaCl
2
OE cravo
1 -1 -1 0,0316 0,316
2 +1 -1 0,0884 0,316
3 -1 +1 0,0316 0,884
4 +1 +1 0,0884 0,884
5 -1,41 0 0,02 0,60
6 +1,41 0 0,10 0,60
7 0 -1,41 0,06 0,20
8 0 +1,41 0,06 1,00
9 0 0 0,06 0,60
10 0 0 0,06 0,60
11 0 0 0,06 0,60
Os ensaios foram realizados seguindo as etapas descritas no item 4.2.3.2,
sendo que o óleo essencial foi incorporado na formulação após a adição da
glicerina bi-destilada. A etapa de crosslinking complementar com solução de
CaCl
2
foi realizada após a incorporação do alginato de sódio e realizada de
maneira controlada sob agitação de 2000 rpm a fim de evitar a ocorrência de
gelificação localizada e formação de grumos na suspensão final. A Figura 6
apresenta, esquematicamente, o processo de elaboração dos filmes para o
planejamento experimental DCCR
2
.
25
Figura 6. Representação esquemática do processo de elaboração dos filmes
4.2.4 ANÁLISES DE CARACTERIZAÇÃO DO FILME
4.2.4.1 Propriedade de barreira ao vapor de água
A determinação das propriedades de barreira ao vapor de água dos filmes
foi determinada pelo método gravimétrico de acordo com a American Society for
Testing and Materials – ASTM E96-00, 2000. O método gravimétrico consiste na
avaliação do ganho de massa do conjunto dessecante composto pela sílica
(ativada a 105º C por 24 h, UR=0%), filme e placa de alumínio. Para a análise
foi utilizado um kit para permeabiliade (Regmed, Brasil) composto de placas de
alumínio e uma prensa para fixação (Figura 7). O filme foi fixado na parte
superior da placa de Petri com auxílio de parafina (Synth) previamente derretida
a 60º C, de forma que somente a área da parte superior da placa coberta pelo
filme permanecesse exposta (Figura 8). Como branco, foi utilizado o conjunto
constituído pela placa de alumínio e filme, sem a presença da sílica. Tanto o
conjunto dessecante como o branco foram armazenados em dessecadores com
umidade relativa de 75% (cloreto de sódio padrão analítico). A massa do sistema
26
foi quantificada em balança analítica (Sartorius, mod. TE214S, Alemanha) em
intervalos de 24 h durante 7 dias (ZACTITI e KIECKBUSCH, 2006). Os ensaios
foram realizados em duplicata, sendo utilizado um branco e três conjuntos
dessecantes em cada ensaio.
Figura 7. Prensa utilizada para a fixação dos filmes utilizados nos ensaios de
permeabilidade ao vapor de água
Figura 8. Branco (esquerda) e conjunto dessecante (direita) utilizados
para os ensaios de permeabilidade ao vapor de água
Para a determinação da taxa de permeabilidade ao vapor de água (TPVA),
foram obtidas cinco medidas de espessura com auxílio de um micrômetro
(Mitutoyo, mod. DIM863-1, Japão) de ponta plana, em posições aleatórias, para
cada amostra de filme analisada.
A TPVA foi determinada pela eq. (1):
TPVA = w_ eq. 1
t x A
Em que:
TPVA = taxa de permeabilidade ao vapor de água (g.dia
-1
.m
-2
)
27
w/t = coeficiente angular do trecho reto obtido através da regressão
linear da curva do ganho de massa em função do tempo (g.dia
-1
)
A = área do filme (m
2
)
A permeablilidade ao vapor de água (PVA) foi determinada pela eq. (2a) e
eq. (2b):
PVA = TPVA x e____ eq. 2a
ps x (UR
1
– UR
2
)
PVA = (w/t) x e______ eq. 2b
A x ps x (UR
1
– UR
2
)
Em que:
PVA = permeabilidade ao vapor de água (g.m.s
-1
.m
-2
.Pa
-1
)
TPVA = taxa de permeabilidade ao vapor de água (g.s
-1
.m
-2
)
w/t = coeficiente angular do trecho reto obtido através da regressão
linear da curva do ganho de massa em função do tempo (g.s
-1
)
e = espessura média do corpo de prova (m)
ps = pressão de saturação do vapor de água à temperatura da análise
(mmHg)
UR
1
= umidade relativa dentro do dessecador (%)
UR
2
= umidade relativa no interior da placa de Petri (%)
4.2.4.2 Propriedades mecânicas
Para a determinação das propriedades mecânicas, corpos de prova
retangulares (largura 2,5 cm e comprimento mínimo de 10 cm) dos filmes foram
fixados entre as garras de tensão (probe A/TGT) e submetidas aos testes de
tração, utilizando o analisador de textura (TA.XT2i, SMS, Reino Unido) conforme
metodologia descrita na norma American Society for Testing Materials – ASTM
D882-00 (2001). Para cada amostra de filme utilizado na análise, cinco medidas
da espessura foram obtidas, em posições aleatórias, pelo uso do micrômetro de
28
ponta plana.
A distância entre as garras de tensão foi definida em 50 mm e a velocidade
do ensaio foi definida em 0,001 m/s, conforme metodologia descrita por Zactiti e
Kieckbusch (2006).
Os corpos de prova foram preparados após um acondicionamento mínimo
de 48 h em dessecador (UR = 75%, T média = 25º C). Após a preparação, os
mesmos foram novamente acondicionados, por um período mínimo de 48 h, em
dessecador, com o objetivo de recondicionar os filmes após a manipulação.
A resistência máxima à tração foi calculada através da equação:
R
máx
= F
máx
__ eq. 3
A
min
Sendo:
R
máx
= resistência máxima à tração (Pa)
F
máx
= força registrada no ponto de ruptura (N)
A
min
= área mínima inicial do corpo de prova (m
2
)
Considerando a área mínima calculada como:
A
min
= e
min
x L
e
min
= espessura mínima inicial do corpo de prova (m)
L = largura inicial do corpo de prova (m)
O alongamento na ruptura foi calculado utilizando-se a equação:
Alongamento na ruptura (%) = ( L
T
– L
0
) x 100 eq. 5
L
0
Em que:
L
T
= comprimento total do corpo de prova no momento da ruptura (m)
L
0
= distância inicial entre as garras (m)
29
Os valores para resistência máxima à tração e alongamento na ruptura
foram obtidos a partir da média de 10 amostras de cada ensaio realizados em
duplicata.
4.2.4.3 Atividade de água (a
w
)
Para a determinação da atividade de água (a
w
), amostras em triplicata de
cada filme foram cortadas em pequenas fatias, a fim de se obter porções de
aproximadamente 5 g que foram mensuradas em medidor de atividade de água
(NOVASINA Aw Center, mod. AWC 503-C).
4.2.4.4 Atividade antimicrobiana in vitro dos filmes
A determinação da atividade antimicrobiana in vitro dos filmes foi
determinada pelo método da difusão em ágar de acordo com metodologia
proposta por Maizura et al. (2007). Os filmes foram cortados em discos de 5 mm
de diâmetro e dispostos sobre placas de Petri contendo ágar Mueller Hinton
(Oxoid) previamente semeado por profundidade com 200 µL do inóculo (10
5
a
10
6
UFC/mL) de cada microrganismo avaliado. Para cada ensaio definido pelo
planejamento experimental (4.2.3.4), cinco discos de filmes foram avaliados e o
experimento foi realizado em triplicata. Os microrganismos avaliados e suas
respectivas condições de incubação estão descritos nos itens 4.1.1.1 e 4.2.2.2,
respectivamente. As placas foram avaliadas através da ausência de multiplicação
microbiana ao redor dos filmes e o diâmetro total da zona de inibição foi
mensurado em mm. A diferença entre área total da zona de inibição e a área do
filme foi definida como a área de inibição (mm
2
).
4.2.4.5 Atividade antimicrobiana dos filmes em carne de frango
Para a determinação da atividade antimicrobiana dos filmes em carne de
frango foi utilizado somente a formulação correspondente ao maior valor de zona
de inibição (4.2.4.4) para todos os microrganismos avaliados. Para esta análise,
amostras de, aproximadamente, 25 g de peito de frango refrigerado foram
utilizadas como alimento modelo.
30
4.2.4.5.1 Preparo do inóculo de Salmonella spp.
A partir de culturas individuais de S. Give e S. Enteritidis, dois tubos
contendo 5 mL de caldo tripticase soja (TSB, Oxoid) foram inoculados
individualmente com as cepas selecionadas e incubados a 37º C por 24 h. Após o
período de incubação, semeou-se, individualmente, 1 mL de cada cultura para
erlenmeyers com 100 mL de TSB que foi novamente incubado a 37º C por 24 h.
Após o período de incubação, 30 mL de cada cultura de Salmonella foi transferida
para tudos de centrífuga e centrifugados a 1600xg (centrífuga Hettich Mikro 22R,
Tuttingen, Alemanha) por 10 min a 4º C. Em seguida, o sobrenadante foi
descartado e o sedimento foi ressuspendido em 30 mL de água peptonada 0,1%.
Após este processo, 15 mL de cada cultura de células de Salmonella
ressuspendida foi transferida para um único tubo de centrífuga, totalizando, 30
mL de cultura de Salmonella spp. sendo esta considerada o “pool” de Samonella.
Estes 30 mL foram novamente centrifugados a 6000 rpm por 10 min a 4º C e o
sedimento ressuspendido em água peptonada 0,1% foi ajustado em
espectrofotômetro a fim de se obter um inóculo com densidade ótica (DO) de
aproximadamente 0,50 a 630 nm equivalente a um inóculo de 10
8
UFC/mL,
conforme padronizado previamente.
4.2.4.5.2 Preparo do inóculo de Pseudomonas spp.
Para o preparo do inóculo de Pseudomonas spp., foram utilizadas culturas
individuais de P. aeruginosa ATCC 27853, P. fluorescens e P. putida. O mesmo
procedimento utilizado no item 4.2.4.5.1 foi adotado para o preparo do “pool” de
Pseudomonas, considerando o período de incubação para P. aeruginosa de 24 h a
37º C e para P. fluorescens e P. putida de 24 h a 25º C. Após as duas lavagens
das células em água peptona 0,1%, a suspensão foi ajustada em
espectofotômetro a fim de se obter um inóculo com DO de aproximadamente 0,6
a 630 nm equivalente a 10
7
UFC/mL, conforme previamente padronizado.
4.2.4.5.3 Preparo do inóculo de L. monocytogenes
Para o preparo do inóculo de L. monocytogenes, o mesmo procedimento
adotado em 4.2.4.5.1 foi utilizado para o preparo da suspensão de L.
monocytogenes, considerando o meio de cultura para a inoculação do
31
microrganismo o caldo tripticase de soja adicionado de 0,6% de extrato de
levedura (TSBYE, Oxoid). Após as duas lavagens das células em água peptona
0,1%, a suspensão foi ajustada em espectofotômetro a fim de se obter um
inóculo com DO de aproximadamente 0,5 a 630 nm, equivalente a 10
8
UFC/mL
conforme padronizado previamente.
4.2.4.5.4 Atividade antimicrobiana dos filmes em carne de frango
contra L. monocytogenes e Salmonella spp.
Para a avaliação da atividade antimicrobiana dos filmes em carne de frango
contra L. monocytogenes e Salmonella spp., as amostras de peito de frango
refrigerado utilizadas foram adquiridas no dia inicial da análise em supermercado
da cidade de São Paulo. Nestes ensaios, a porção de 25 g de peito de frango foi
contaminada superficialmente com 50 µL do inóculo a 10
6
UFC/mL a fim de se
obter uma população inicial de 10
3
UFC/mL. Em seguida, a amostra de frango foi
coberta com o filme antimicrobiano de modo que todas as faces da amostra
ficassem em contato com o filme, como apresentado na Figura 9.
Figura 9. Amostra de peito de frango embalada com o filme antimicrobiano
A análise foi realizada em duplicata com três repetições. Cada experimento
foi composto por uma amostra de frango inoculado com um microrganismo teste
e embalado com o filme desenvolvido acompanhada por três condições controle:
(a) frango sem o microrganismo e sem o filme; (b) frango com o microrganismo
e sem o filme e, (c) frango sem microrganismo e com o filme. Todas as
amostras foram acondicionadas individualmente em sacos de amostragem
estéreis e armazenadas sob refrigeração a 7º C.
As análises microbiológicas foram realizadas no dia inicial da realização do
32
teste (No) e após 5 dias (Nf) - período máximo da vida-de-prateleira de cortes
de frango refrigerados (HILTON Jr, CASON e INGRAM, 2004).
4.2.4.5.5 Atividade antimicrobiana dos filmes em carne de frango
contra Pseudomonas spp.
Para a avaliação da atividade antimicrobiana dos filmes em carne de frango
contra Pseudomonas spp., as amostras de peito frango foram submetidas à
irradiação a fim de eliminar e/ou reduzir a microbiota acompanhante de
Pseudomonas.
As amostras de peito de frango refrigerado foram porcionadas em pedaços
de aproximadamente 25 g, acondicionadas em sacos de polietileno, selados e
congelados em congelador doméstico por 24 h. As amostras embaladas e
congeladas foram acondicionadas em caixa de material termoisolante com gelo e
transportadas para o Centro de Tecnologia da Radiação do Instituto de Pesquisas
Energéticas e Nuclerares (CTR-IPEN/USP) para serem irradiadas em um
irradiador de fonte
60
Co. A caixa foi irradiada, na modalidade estática, a uma
distância da fonte correspondente a uma taxa de dose de 4kGy/h, com
acompanhamento da dose de radiação por dosímetros de alanina. A irradiação foi
realizada na posição da caixa 0º e 180º, sendo metade de uma dose aplicada
numa posição e a outra metade na outra posição, procurando-se com esse
procedimento, homogeneizar a dose aplicada. O tempo de irradiação foi
calculado para se obter uma dose de 5 kGy. Após a irradiação, as amostras
foram armazenadas em congelador até a realização das análises.
Para a realização do ensaio da atividade antimicrobiana contra
Pseudomonas spp., as amostras de frango previamente irradiadas foram
descongeladas em refrigerador a 4º C. Em seguida, foi utilizado procedimento
análogo ao descrito em 4.2.4.5.4.
4.2.4.6 Análise Microbiológica
4.2.4.6.1 Preparo das amostras
Para os ensaios controle onde o filme antimicrobiano não foi utilizado para a
33
cobertura dos pedaços de frango, foram adicionados diretamente ao saco de
amostragem 225 mL de água peptonada 0,1% que foram homogeneizados com
25 g do pedaço de frango por 1 min em stomacher. A partir desse
homogeneizado, foram realizadas diluições decimais, usando como diluente água
peptonada 0,1%.
Para os ensaios onde o filme antimicrobiano foi utilizado na cobertura dos
pedaços de frango, o filme foi removido assepticamente com auxílio de uma
pinça esterelizada previamente à adição do diluente. As etapas posteriores foram
semelhantes ao descrito anteriormente.
4.2.4.6.2 Pesquisa de Salmonella spp. (ANDREWS et al., 2001,
modificado)
Para os ensaios controle, onde não foi realizada a contaminação do
microrganismo na amostra de frango, 225 mL de caldo lactosado (Oxoid) foi
adicionado ao saco de amostragem contendo a amostra de 25 g de frango. O
conteúdo foi homogeneizado em stomacher por 1 min e incubado a 37º C por 24
h. Decorrido esse período, 0,1 mL do caldo lactosado foi transferido para 10 mL
de caldo de enriquecimento Rappaport-Vassiliadis (Oxoid), e 1 mL do caldo
lactosado foi adicionado a 10 mL do caldo tetrationato (Oxoid) e ambos foram
incubados a 43º C por 24 h. Decorrido o período de incubação, os dois caldos
foram semeados em placas de ágar Hektoen Enteric (Oxoid) e ágar MLCB
(Oxoid) e incubados a 37º C por 24 h. As colônias com características de
Salmonella spp. nesses meios foram inoculadas em tubos com ágar ferro lisina
(Oxoid) e ágar tríplice açúcar ferro (Oxoid) e os tubos foram incubados a 37º C
por 24 h. Posteriormente, as colônias características foram submetidas a outras
provas bioquímicas (EPM, Mili e Citrato – Enterokit B – Probac Brasil) e de
aglutinação em lâmina com soro polivalente anti-Salmonella.
4.2.4.6.3 Enumeração de Salmonella spp.
A partir das diluições obtidas em 4.2.4.6.1, semeou-se em duplicata por
profundidade 1 mL de cada diluição em ágar MLCB. As placas foram incubadas a
37º C por 24 h e os resultados foram expressos em UFC/g.
34
4.2.4.6.4 Pesquisa de L. monocytogenes (HITCHINS, 2003,
modificado)
Para os ensaios controle, onde não foi realizada a contaminação do
microrganismo na amostra de frango, 225 mL de caldo de enriquecimento para
Listeria (Fraser - Oxoid) adicionado de suplemento seletivo Fraser (Oxoid) foi
adicionado ao saco de amostragem contendo a amostra de 25 g de frango. O
conteúdo foi homogeneizado em stomacher por 1 min e incubado a 37º C por
24 h e 48 h. Após 24 h e 48 h, uma alíquota foi semeada em placas contendo
ágar Palcam (Oxoid) e ágar Oxford (Oxoid) adicionada de suplemento seletivo
(Oxoid) que foram incubadas a 37º C por 48 h. Colônias típicas de Listeria foram
semeadas em ágar tripticase de soja com extrato de levedura (TSA-YE, Oxoid) e
incubadas a 37º C por 24 h e submetidas à identificação bioquímica, através de
testes de produção de catalase, fermentação de carboidratos e motilidade a
25º C.
4.2.4.6.5 Enumeração de L. monocytogenes
A partir das diluições obtidas em 4.2.4.6.1, semeou-se em duplicata por
profundidade 1 mL de cada diluição em ágar Oxford adicionado de suplemento
seletivo. As placas foram incubadas a 37º C por 48 h e os resultados foram
expressos em UFC/g.
4.2.4.6.6 Enumeração de Pseudomonas spp. (ARNAUT-ROLLIER,
ZUTTER e HOOF, 1999)
A partir das diluições obtidas em 4.2.4.6.1, semeou-se em duplicata por
profundidade 1 mL de cada diluição em ágar base para Pseudomonas (PAB,
Oxoid) suplementado com 5 mL de glicerol (Synth) e suplemento seletivo para
Pseudomonas C-F-C (Oxoid). As placas foram incubadas a 25º C por 48 h e os
resultados foram expressos em UFC/g.
4.2.4.6.7 Contagem total de aeróbios psicrotróficos (COUSIN, JAY e
VASAVADA, 2001)
A partir de cada diluição obtida em 4.2.4.6.1, semeou-se em duplicata com
35
auxílio de alça de Drigalski, 0,1 mL na superfície de placas contendo ágar padrão
para contagem (PCA, Oxoid). As placas foram incubadas a 7º C por 7 a 10 dias e
os resultados foram expressos em unidades formadoras de colônia por grama de
alimento (UFC/g).
4.2.4.6.8 Contagem total de aeróbios mesófilos (MORTON, 2001)
A partir de cada diluição obtida em 4.2.4.6.1, semeou-se em duplicata com
auxílio de alça de Drigalski, 1 mL na superfície de placas contendo ágar PCA
(Oxoid). As placas foram incubadas a 37º C por 48 h e os resultados foram
expressos em unidades formadoras de colônia por grama de alimento (UFC/g).
4.2.4.7 Análise sensorial
A análise sensorial teve como objetivo comparar a aceitação do consumidor
através do teste de preferência indireta com a utilização de uma escala hedônica
de 9 pontos, onde a opinião do provador varia numa escala entre “desgostei
extremamente” e “gostei extremamente”. Duas amostras foram apresentadas ao
provador, sendo uma amostra de peito de frango in natura no qual a cobertura
de filme comestível com OE de cravo foi utilizada como embalagem primária e
uma amostra controle.
As amostras de peito de frango refrigerado utililizadas foram adquiridas em
supermercados da cidade de São Paulo. Estas amostras foram porcionadas em
pedaços de, aproximadamente, 25 g de tamanho e formato semelhantes. Tanto
as amostras controle como as amostras na qual o filme adicionado de OE de
cravo foi utilizado, foram armazenados por 2 dias a 7º C previamente a
realização da análise sensorial.
O painel sensorial foi composto por 50 provadores não treinados, com idade
entre 18 e 60 anos que avaliaram o aroma do produto in natura. As amostras
ficaram acondicionadas em refrigerador doméstico até o momento da realização
da análise sensorial, sendo a camada de filme comestível retirada antes da
análise pelo provador. Cada amostra foi apresentada em pratos brancos
descartáveis, codificados com números de três dígitos. As amostras foram
avaliadas sob luz branca em cabines individuais, no Laboratório de Análise
36
Sensorial de Alimentos, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – USP, em São
Paulo, SP.
4.2.4.8 Análise estatística
Os resultados da avaliação da atividade antimicrobiana e propriedade de
barreira ao vapor de água foram realizados através do software STATISTICA 7.0
(Statsoft Inc., USA), considerando o erro puro. A partir dos dados das variáveis
independentes, utilizou-se o procedimento Industrial Statistics & Six Sigma e a
função Experimental Design, Central Composite, non Factorial, Surface Design do
software Statistica 7.0 para a análise dos efeitos dos fatores estudados e para a
construção da superfície de resposta.
De acordo com Myers e Montgomery (2002), os resultados obtidos a partir
do planejamento experimental podem ser ajustados a um modelo do tipo:
E (y) = β
0
+ β
1
x
1
+ β
2
x
2
+ β
11
x
1
2
+ β
22
x
2
2
+ β
12
x
1
x
2
Em que: E(y) é a resposta predita pelo modelo, β
0
é a constante, β
1
, β
2
, β
11
,
β
22
e β
12
são os coeficientes da regressão, e x
1
e x
2
representam as variáveis
independentes estudadas.
A qualidade do ajuste do modelo aos dados
experimentais foi verificada através da análise de variância (ANOVA) da
regressão e o coeficiente de correlação (R
2
), na qual as repetições forneceram
graus de liberdade para obtenção do erro puro e conseqüentemente, análise da
falta de ajuste.
Para os ensaios de caracterização do filme frente às propriedades
mecânicas e de barreira o intervalo de confiança adotado foi de 5% (p<0,05),
enquanto o intervalo de confiança de 10% (p<0,10) foi utilizado para a avaliação
da atividade antimicrobiana in vitro dos filmes.
O teste de Duncan foi aplicado para a análise de diferenças significativas
entre ensaios considerando o intervalo de confiança de 95%.
37
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE Pseudomonas spp. EM CARNE
DE FRANGO
Como não havia cepas de Pseudomonas spp. na coleção de culturas do
Laboratório de Microbiologia de Alimentos da FCF-USP, foi necessário o
isolamento desse microrganismo.
Das 24 amostras de coxinha da asa analisadas 100% apresentaram
positividade para Pseudomonas spp. Destas, 68,7% foram identificadas como P.
fluorescens, 25% foram identificadas como P. putida e 6,3% Pseudomonas spp.
Foi observado que 66,7% do total de isolados identificados como P.
fluorescens foram capazes de produzir o pigmento fluoresceína (Figura 25 –
ANEXO 1). De fato, como observado por Arnaut-Rollier, Zutter e Van Hoof
(1999), alguns sorogrupos de P. fluorescens não são capazes de produzir
pigmento fluorescente.
Inúmeros autores trabalharam com a identificação de Pseudomonas spp.
em carne de frango (SUNDHEIM, SLETTEN e DAINTY, 1998; ARNAUT-ROLLIER,
ZUTTER e VAN HOOF, 1999) e carne bovina (SHAW e LATTY, 1982; ASLAM e
SERVICE, 2008) e também identificaram a P. fluorescens como microrganismo
mais freqüente. Porém, ao contrário deste trabalho, a segunda espécie mais
isolada foi P. fragi seguida por P. putida.
Dessa forma, para os ensaios de determinação da concentração inibitória
mínima de óleos essenciais, foram escolhidas 2 cepas de P. fluorescens (QaF01 e
Lb03), produtoras de pigmento fluoresceína, e 2 cepas de P. putida (Ia03 e
Kb04). Ambas as espécies escolhidas apresentaram porcentagem de identificação
no kit de identificação bioquímica API
®
20 NE de 99,9%.
5.2
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DE
ÓLEOS ESSENCIAIS
Para a determinação da CIM, foram analisados os seguintes óleos
essenciais: alho, cebola, cravo, gengibre africano, gengibre chinês, hortelã,
38
laranja (2 fornecedores diferentes), natural de laranja doce, laranja 5X, limão
Siciliano, limão Siciliano 5X e pimenta preta.
Com exceção da cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 (isolada de
hemocultura), as demais cepas utilizadas para o ensaio de determinação da CIM
foram isoladas de carne de frango. Foram escolhidas cepas de bactérias Gram
negativas e Gram positivas para avaliar a ação antimicrobiana dos óleos
essenciais selecionados, uma vez que o espectro de ação dos compostos ativos
presentes nos óleos essenciais é variável.
A eficácia de um composto antimicrobiano é relacionada com sua respectiva
CIM, ou seja, a menor concentração do agente antimicrobiano capaz de inibir a
multiplicação do microrganismo alvo (BURT e REINDERS, 2003).
De acordo com Mann e Markham (1998), diferentes métodos são utilizados
para a determinação da CIM como, por exemplo, os métodos de difusão e
métodos de diluição em ágar ou caldo. No entanto, sabe-se que para a avaliação
da CIM de OE, métodos de difusão, seja por difusão em poços ou discos de papel
filtro, não são recomendados, pois a difusão das partículas oleosas é dificultada
pela não afinidade com a água presente no ágar. Os métodos de diluição em
ágar ou caldo são comumente utilizados para a determinação da CIM de OE,
metodologia essa que consiste na incorporação do OE diretamente em meio de
cultura.
Sabendo que os OE são imiscíveis em água, torna-se necessária a
incorporação de um agente emulsificante ou tensoativo no meio de cultura para
garantir o contato entre o agente antimicrobiano e o microrganismo alvo durante
a realização do experimento. Dessa forma, além de garantir a estabilização do
OE, facilita-se o estudo de suas propriedades antimicrobianas proporcionando
resultados mais confiáveis.
Alguns trabalhos relatam a utilização de agentes tensoativos tais como
Tween 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitana), Tween 20
(polioxietilieno monolaurático) e etanol para a solubilização de OE (CHAND et al.,
1994; HAMMER, CARSON e RILEY, 1999; FISHER e PHILIPS, 2006). No entanto,
Schmolka (1973) apud Mann e Markham (1998) relatam que a utilização de
39
agentes surfactantes não-iônicos, como o Tween 80 e o Tween 20, podem alterar
algumas propriedades físico-químicas do OE, diminuindo sua ação
antimicrobiana.
Burt e Reinders (2003) avaliaram a utilização de lecitina, agente
emulsificante comumente utilizado na indústria alimentícia, para a estabilização
de diferentes óleos essenciais e verificar a ação antimicrobiana contra E. coli
O157:H7. Entretanto, foi verificado que a presença de lecitina reduziu a atividade
antimicrobiana desses óleos essenciais. As hipóteses levantadas pelos autores
foram que a lecitina poderia ter dificultado as interações entre o OE e a
membrana celular bacteriana, uma vez que este componente estaria disposto
entre o OE e a fase aquosa do meio; componentes presentes no OE poderiam ter
atuado nos fosfolipídeos presentes na membrana celular da bactéria, porém,
esse efeito pode ter sido neutralizado pela presença da lecitina, fonte adicional
de fosfolipídeos e; por fim, alguns ácidos graxos livres presentes na lecitina
poderiam ter sido utilizados pela bactéria como forma adicional de proteção de
sua membrana celular contra os compostos fenólicos presentes em OE.
A utilização de uma emulsão de OE em 10% de amido modificado (Purity
gum Be) suspendido em água foi utilizada por Oussalah et al. (2006b), Oussalah
et al. (2007a) e Turgis et al. (2009) em trabalhos envolvendo a avaliação de
diferentes óleos essenciais contra bactérias patogênicas e deteriorantes. A
utilização de amido modificado apresenta-se como uma nova alternativa para a
estabilização de emulsões envolvendo OE.
O amido modificado Purity gum Be, derivado de milho ceroso, apresenta
modificações químicas que o tornam capaz de atuar como estabilizante no
preparo de emulsões sem alterar a viscosidade do produto. Devido à capacidade
de solubilizar-se em água fria e não perder a estabilidade após passar por
tratamento térmico, este produto atua de forma semelhante à goma arábica que,
entretanto, solubiliza-se somente a quente, porém com um custo mais baixo. É
utilizado principalmente por indústrias de bebidas carbonatadas no preparo de
emulsões envolvendo aromas e óleos essenciais (NATIONAL STARCH FOOD
INNOVATION, 2009).
Conforme apresentado na Tabela 4, de todos os óleos essenciais avaliados,
40
somente o óleo essencial de cravo mostrou-se efetivo para a inibição de todas as
cepas avaliadas. A utilização de óleo essencial de cravo na concentração de
0,2% promoveu a inibição da multiplicação de S. Give, S. Enteritidis, P.
aeruginosa ATCC 27853, P. fluorescens e P. putida, enquanto a concentração de
0,05% do mesmo óleo essencial foi eficiente na inibição de L. monocytogenes. A
utilização de óleo essencial de alho nas concentrações de 0,05% e 0,2% foi
efetivo para a inibição de L. monocytogenes e P. aeruginosa ATCC 27853,
respectivamente; já a utilização de óleo essencial de cebola na concentração de
0,05% foi suficiente para a completa inibição dos mesmos microrganismos. Os
óleos essenciais de limão Siciliano 5X e hortelã somente foram efetivos para a
inibição de L. monocytogenes quando utilizados na concentração de 0,4% e
0,8%, respectivamente.
Os OE de gengibre e laranja doce não apresentaram efeito antimicrobiano
na concentração máxima avaliada (0,8%) contra L. monocytogenes e P. putida.
Esses resultados são semelhantes aos relatados por Oussalah et al. (2006b) e
Oussalah et al. (2007a). Já para o OE de cravo, foi observado que a CIM de
0,1% para P. putida e 0,2% para L. monocytogenes obtido por esses autores
foram, respectivamente, abaixo (CIM=0,2%) e acima (CIM=0,05%) do
encontrado neste trabalho. Oussalah et al. (2006b) e Oussalah et al. (2007a)
também avaliaram o OE de limão e não verificaram sua ação antimicrobiana
contra L. monocytogenes. Neste estudo, foram avaliados OE de limão Siciliano e
limão Siciliano concentrado 5X que apresentam como principal composto ativo o
limoneno, responsável pelo efeito antimicrobiano conferido aos OE extraídos de
frutas cítricas, porém, observou-se que somente o OE concentrado obteve um
efeito antimicrobiano com a CIM de 0,4% para L. monocytogenes.
Apesar da existência de muitos outros trabalhos avaliando a eficiência de
OE como agente antimicrobiano, decidiu-se por comparar os resultados somente
com os dos autores citados pois utilizamos a mesma técnica. Além das diferenças
nas metodologias adotadas por diversos autores, outros fatores contribuem para
a variação dos resultados, como o local geográfico do cultivo da planta, clima e
estação do ano da colheita, genótipo da planta e diferenças no processo de
extração do óleo. Estes fatores influenciam na composição e na concentração de
cada constituinte extraído dos óleos essenciais (BURT e REINDERS, 2003).
41
Tabela 4. Concentração mínima inibitória (CIM) de óleos essenciais para Listeria monocytogenes, Salmonella Give, Salmonella
Enteritidis,
Pseudomonas fluorescens (QaF01 e Lb03), P. putida (Ia03 e Kb04) e P. aeruginosa ATCC 27853
L. monocytogenes S. Give S. Enteritidis
P. fluorescens
QaF01
P. fluorescens
Lb03
P. putida Ia03 P. putida Kb04
P. aeruginosa
ATCC 27853
Alho Fuchs Gewürze 0,05 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 0,2
Cebola Fuchs Gewürze 0,05 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 0,05
Cravo Duas Rodas 0,05 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Gengibre Africano Apliquimica > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8
Gengibre Chinês Apliquimica > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8
Hortelã Duas Rodas 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8
Laranja Duas Rodas > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8
Laranja Apliquimica > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8
Laranja 5X Dierberger > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8
Natural de Laranja Doce Duas Rodas > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8
Limão Siciliano Dierberger > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8
Limão Siciliano 5X Dierberger 0,4 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 >0,8
Pimenta Preta Fuchs Gewürze > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8 > 0,8
Microrganismos avaliados (CIM em % de óleo essencial)
Óleo Essencial Fornecedor
42
5.3
DESENVOLVIMENTO DO FILME À BASE DE ALGINATO
Sabendo que a aplicação do filme em carne de frango será avaliada
sensorialmente, objetivou-se trabalhar no desenvolvimento de uma formulação
somente com ingredientes de grau alimentício. Dessa forma, não foi possível
adotar integralmente a formulação proposta por Oussalah et al., (2006a), pois os
ingredientes utilizados eram de padrão analítico.
Embora muitas pesquisas demonstrem a eficácia da utilização de filmes e
coberturas comestíveis à base de alginato em alimentos, a maioria das
referências cita a utilização de alginato de sódio padrão analítico em trabalhos
envolvendo alimentos (OUSSALAH et al., 2006a; OUSSALAH et al., 2006b;
SALMIERI e LACROIX, 2006; ZACTITI e KIECKBUSCH et al., 2006; OUSSALAH et
al., 2007a; MAFTOONAZAD, RAMASWAMY e MARCOTTE, 2008; ROOPA e
BHATTACHARYA, 2008, ROOPA e BHATTACHARYA, 2009). O emprego de alginato
de sódio grau alimentício é relatado apenas em pesquisas que o utilizam como
cobertura (MAIZURA et al., 2007; RAYBAUDI-MASSILIA et al., 2008; TAPIA et
al., 2008).
5.3.1 ENSAIOS PRELIMINARES
A partir dos resultados obtidos pelos ensaios preliminares, observou-se que
as formulações F1 (alginato de sódio 3,0%) e F2 (alginato de sódio 2,5%)
apresentaram maior facilidade na etapa de remoção do filme da placa de Petri
após 20 h e 22 h de secagem em estufa a 40º C, respectivamente. Já para as
formulações F3 (alginato de sódio 2,0%) e F4 (alginato de sódio 1,5%), os
tempos de secagem foram superiores ao das formulações F1 e F2 chegando a 26
h de secagem em estufa.
Decidiu-se trabalhar somente com a formulação F1 na etapa de imersão em
solução de cloreto de cálcio devido ao menor tempo de secagem apresentado.
Como apresentado na Figura 10 B, foi observado que mesmo com a remoção do
excesso de cloreto de cálcio, o filme apresentou uma estrutura enrugada, rígida
e difícil de manusear.
43
Figura 10. Filme à base de alginato: (A) antes da etapa de imersão em
CaCl
2
e (B) após a etapa de imersão sem a remoção do excesso de CaCl
2
Dessa forma, para diminuir o enrugamento observado na Figura 10 B, após
a etapa de imersão por 5 min em solução de cloreto de cálcio, realizou-se uma
etapa de remoção do excesso de cloreto de cálcio por lavagem com água
destilada com base no estudo desenvolvido por Zactiti e Kieckbusch (2006). Após
secagem em estufa, os filmes apresentaram a aparência observada na Figura 11.
Apesar de ainda ser observado um enrugamento na estrutura do filme após
a remoção do excesso de cloreto de cálcio pela etapa de lavagem em água
destilada, o mesmo se apresentou mais maleável. A etapa de imersão em
solução de cloreto de cálcio é necessária para diminuir o caráter hidrofílico dos
filmes à base de alginato, uma vez que os blocos estruturais polianiônicos de
ácidos manurônico (M) e gulurônico (G) presentes no alginato são capazes de
formar ligações iônicas intermoleculares na presença de cátions di ou
multivalentes, como o Ca
2+
, por exemplo (GRANT et al., 1973; GACESA, 1988).
A
B
44
Figura 11. Filme à base de alginato após a imersão em CaCl
2
e realização da
etapa de lavagem em água destilada
Foi observado que a utilização de cloreto de cálcio a 20% na etapa de
imersão proporcionou um maior enrugamento na estrutura dos filmes e o
aparecimento de cristais de sal na superfície após a etapa de secagem. Oussalah
et al. (2006a) compararam o tratamento por imersão dos filmes à base de
alginato em 2 ou 20% de solução de cloreto de cálcio e além de observarem
taxas similares de liberação dos compostos ativos de óleos essenciais através da
determinação dos compostos fenólicos totais, os valores de enumeração para S.
Typhimurium foram semelhantes independentemente do tipo de tratamento
escolhido.
5.3.2 FORMULAÇÃO FINAL
Apesar da diminuição do enrugamento do filme após a etapa de lavagem
com água destilada (Figura 11), observou-se que em alguns trabalhos (RHIM,
2004; ZACTITI E KIECKBUSCH, 2006 e SILVA, BIERHALZ e KIECKBUSCH, 2009)
adicionava-se o cloreto de cálcio diretamente na formulação do filme à base de
alginato previamente a etapa de imersão para crosslinking complementar. No
entanto, a adição de cloreto de cálcio deve ser realizada de forma controlada e
sob alta velocidade de agitação (2000 rpm) a fim de se obter uma suspensão
homogênea. Os filmes formados a partir da utilização desse procedimento
apresentaram a diminuição do enrugamento de sua estrutura como observado na
Figura 12.
45
Figura 12. Filme à base de alginato com adição de cloreto de cálcio na formulação:
(A) antes da etapa de crosslinking complementar em solução de cloreto de cálcio
e (B)
após a etapa de crosslinking complementar em solução de cloreto de cálcio.
No entanto, a total eliminação do enrugamento na estrutura dos filmes
somente foi possível após a mudança no procedimento de realização da etapa de
crosslinking complementar. Diferentes procedimentos foram observados em
estudos relatados em literatura: processo de imersão (OUSSALAH et al. 2006a);
processo de pulverização (ZACTITI E KIECKBUSCH, 2006 e SILVA, BIERHALZ e
KIECKBUSCH, 2009) e adição da solução de cloreto de cálcio diretamente às
placas contendo os filmes já secos (RHIM, 2004).
Dentre os diferentes procedimentos, somente o processo de imersão dos
filmes e de adição da solução de cloreto de cálcio diretamente às placas contendo
os filmes já secos foram avaliadas, sendo este último, definido como metodologia
final para a etapa de crosslinking complementar. Os filmes formados a partir da
utilização deste procedimento apresentaram a estrutura observada na Figura 13.
Figura 13. Filme à base de alginato com adição de cloreto de cálcio na
formulação e após a realização da etapa de crosslinking complementar pela
adição da solução de cloreto de cálcio diretamente à placa contendo o filme
previamente seco
A
B
46
Desta forma, a formulação base do filme à base de alginato foi definida
como: alginato de sódio (3,0%), glicerina bi-destilada (2,0%) e água destilada
(95,0%). O processo final de elaboração dos filmes foi realizado baseado na
metodologia descrita por Rhim (2004) e Zactiti e Kieckbusch (2006), na qual a
glicerina bi-destilada foi totalmente solubilizada em água destilada previamente à
adição do alginato de sódio. Observou-se uma maior facilidade na solubilização
da glicerina antes da adição do alginato do que após sua adição, como proposto
por Oussalah et al. (2006a).
O tempo final de secagem dos filmes foi definido em 20 h a 40º C e a etapa
de crosslinking complementar com solução cloreto de cálcio a 2% foi realizada
com a adição da solução diretamente às placas contendo os filmes previamente
secos, sendo necessária uma etapa de lavagem com água destilada para a
remoção do excesso de cloreto de cálcio.
5.3.3 PROPRIEDADE DE BARREIRA AO VAPOR DE ÁGUA
Os valores da permeabilidade ao vapor de água (PVA) calculados de acordo
com a eq. 2b (p. 25) encontram-se na Tabela 5. Estes valores referem-se apenas
aos ensaios que envolveram a etapa de crosslinking complementar com cloreto
de cálcio, uma vez que esta etapa é necessária para a manutenção da
integridade do filme quando este for aplicado em alimento.
47
Tabela 5. Valores médios da permeabilidade ao vapor de água (PVA) após etapa de
crosslinking complementar com cloreto de cálcio dos filmes obtidos a partir dos
ensaios estabelecidos pelo delineamento experimental
Ensaios PVA
(g.m.m
-2
.s
-1
.Pa
-1
) x 10
-11
1 1,72 ± 0,21
2 0,88 ± 0,07
3 1,82 ± 0,17
4 1,21 ± 0,13
5 1,45 ± 0,23
6 0,48 ± 0,06
7 0,63 ± 0,06
8 2,15 ± 0,11
9 1,02 ± 0,16
10 1,07 ± 0,12
11 1,06 ± 0,18
T = 25º C, UR=75%
Os níveis utilizados para a elaboração dos ensaios experimentais deste
planejamento estão apresentados no item 4.2.3.4. Observou-se que a mudança
na concentração de OE cravo e cloreto de cálcio adicionado na formulação dos
filmes proporcionou uma variação na permeabilidade ao vapor de água de 0,48 ±
0,06 (g.m.m
-2
.s
-1
.Pa
-1
)x10
-11
(CaCl
2
a 0,1% e OE cravo a 0,6%) a 2,15 ± 0,19
(g.m.m
-2
.s
-1
.Pa
-1
)x10
-11
(CaCl
2
a 0,06% e OE cravo a 1,0%).
Através dos resultados do planejamento é possível determinar os
coeficientes de regressão (Tabela 6) para a resposta de interesse
(permeabilidade ao vapor de água), calcular as análises de variância (Tabela 7) e
construir as superfícies de resposta.
Considerando significativos os parâmetros com p-valores menores que 5%
(p<0,05), observou-se que somente o termo quadrático para a concentração de
CaCl
2
(p=0,3102) (Tabela 6) não foi significativo sendo este incorporado aos
resíduos (fonte de variação lack of fit) para o cálculo da ANOVA apresentada na
(Tabela 7).
48
Tabela 6. Coeficientes de regressão para a variável resposta permeabilidade ao vapor de água
Fatores Coeficientes Erro padrão t-valor p-valor Lim. de
conf. -95%
Lim. de
conf. +95%
Média 1,05
0,02
68,73
0,0002
0,98
1,12
CaCl
2
(%)(L) -0,35
0,02
-37,71
0,0007
-0,79
-0,62
CaCl
2
(%)(Q) 0,02
0,02
1,35
0,3102
-0,07
0,13
OE cravo(%)(L) 0,32
0,02
34,47
0,0008
0,56
0,72
OE cravo(%)(Q) 0,23
0,02
20,43
0,0024
0,36
0,55
CaCl
2
xOE cravo 0,06
0,03
4,35
0,0491
0,001
0,23
Tabela 7. ANOVA para a permeabilidade ao vapor de água
Fonte de
variação
Soma de
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrado
Médio
F-calc p-valor
CaCl
2
(%)(L) 0,9953
1
0,9953
1421,87
0,0007
CaCl
2
(%)(Q) 0,0012
1
0,0012
1,815
0,3102
OE cravo(%)(L)
0,8317
1
0,8317
1188,27
0,0008
OE
cravo(%)(Q)
0,2922
1
0,2922
417,52
0,0023
CaCl
2
xOE cravo 0,0132
1
0,0132
18,89
0,0490
Lack of Fit 0,4761
3
0,1587
226,75
0,0043
Erro puro
0,0014
2
0,0007
Total
2,6268
10
R
2
= 0,82; F
0,90; 3; 7
= 4,53; F-calc = 6,73
Sabendo que o termo quadrático para a concentração de CaCl
2
não foi
significativo, este termo não foi incorporado ao modelo. O modelo final com as
variáveis codificadas que representa a permeabilidade ao vapor de água
(g.m.m
-2
.s
-1
.Pa
-1
)x10
-11
em função da concentração de CaCl
2
e concentração de
OE cravo na faixa estudada está apresentado na equação:
PVA = 1,05 – 0,35[CaCl
2
] + 0,32[OEcravo] + 0,23[OEcravo]
2
+
0,06[CaCl
2
]x[OEcravo]
A partir do modelo apresentado, verificou-se que a adição de CaCl
2
à
formulação dos filmes reduziu os valores de permeabilidade ao vapor de água,
enquanto a adição de OE cravo foi responsável pelo aumento desses valores. A
representação gráfica para o modelo obtido encontra-se na Figura 14 e o gráfico
de valores experimentais versus valores previstos, que representa o ajuste dos
valores experimentais para os valores estabelecidos pelo modelo encontra-se na
Figura 15.
49
Figura 14. Superfície de resposta para permeabilidade ao vapor de água (g.m.m
-2
.s
-1
.Pa
1
)x10
-11
em função da concentração de OE cravo (%) e concentração de CaCl
2
(%)
Figura 15. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
permeabilidade ao vapor de água
50
Através da análise de superfície de resposta, observa-se que os menores
valores para permeabilidade ao vapor de água encontram-se nas faixas de
máxima concentração de CaCl
2
e mínima concentração de OE cravo.
De acordo com Myers e Montgomery (2002), valores de R
2
entre 0,85 e
0,90 são considerados bons modelos para explicar a variação existente no
processo estudado. Dessa forma, o coeficiente de correlação R
2
(0,82) obtido
sugere que o modelo ajustado é capaz de explicar 82% do total de variação
existente no processo. O valor de F-calculado obtido a partir do modelo estudado
foi superior ao valor de F-tabelado indicando que o modelo apresentado é
significativo. O ajuste do modelo também pode ser observado na Figura 15, no
qual os pontos experimentais e os valores observados encontram-se próximos à
reta de ajuste.
Para a validação do modelo apresentado e da superfície de resposta, foi
realizada a repetição de um dos ensaios definidos pelo planejamento,
juntamente com a adição de dois diferentes ensaios. Os resultados experimentais
referentes à permeabilidade ao vapor de água para estes ensaios e os valores
previstos pelo modelo encontram-se na Tabela 8.
Tabela 8. Valores da permeabilidade ao vapor de água (PVA) experimentais, previstos pelo
modelo, desvios e desvio relativo
Ensaios CaCl2
(%)
OE cravo
(%)
PVA experimental
(g.m.m
-2
.s
-1
.Pa
-1
)x10
-11
PVA previsto
(g.m.m
-2
.s
-1
.Pa
-1
)x10
-11
Desvio
(y-y’) *
Desvio
relativo
PVA (%)
3 * 0,0316
0,884 1,78 ± 0,14 1,50 0,28 15,73
A 0,0316
1,0 2,02 ± 0,11 1,59 0,43 21,29
B 0,02 0,884 1,82 ± 0,21 1,51 0,31 17,03
* repetição do ensaio da condição 3 definido pelo planejamento experimental
**desvio=diferença entre os valores obtidos experimentalmente e os valores previstos pelo modelo
Os resultados obtidos para a validação do modelo sugerem que o aumento
da permeabilidade ao vapor de água é mais afetado pelo aumento da
concentração de OE cravo adicionado à formulação do filme do que pela
diminuição da concentração de CaCl
2
, o que, de fato, pode ser observado na
superfície de resposta (Figura 14) indicando que o modelo apresentado é
significativo.
Os resultados encontrados para a permeabilidade ao vapor de água são
51
coerentes aos já relatados na literatura. Maizura et al. (2007) verificaram que os
filmes de alginato e amido de sagu com maiores concentrações de glicerol e OE
de capim-limão apresentaram valores de permeabilidade ao vapor de água mais
elevados comparados aos filmes onde menores concentrações foram utilizadas. O
aumento nos valores de permeabilidade pode estar relacionado a modificações
na estrutura do filme ocasionadas pela adição de glicerol e OE, uma vez que a
adição desses componentes proporciona um aumento na flexibilidade da
estrutura polimérica do filme contribuindo para o aumento na absorção de água.
Por outro lado, observa-se uma redução da permeabilidade ao vapor de
água quando se adiciona cloreto de cálcio o que concorda com o relatado por
Zactiti e Kieckbusch (2006). Esses autores avaliaram cinco diferentes
concentrações de cloreto de cálcio (2%, 3%, 4%, 5% e 7%) na etapa de
crosslinking complementar para a reticulação de filmes de alginato. Os valores de
permeabilidade ao vapor de água obtidos foram comparados com os de filmes
onde não houve o processo de reticulação (controle) e com valores de
permeabilidade ao vapor de água de filmes onde foi utilizada uma etapa adicional
de adição de cloreto de cálcio (0,03%) à formulação do filme. Constatou-se que
a etapa de crosslinking complementar foi capaz de reduzir significativamente
(p<0,05) os valores de permeabilidade ao vapor de água dos filmes quando
comparado ao filme controle.
5.3.4 PROPRIEDADES MECÂNICAS
Os valores da resistência máxima à tração dos filmes calculados de acordo
com a eq. 3 (p. 27) encontram-se na Tabela 9. Estes valores referem-se apenas
aos ensaios que envolveram a etapa de crosslinking complementar com cloreto
de cálcio, uma vez que esta etapa é necessária para a manutenção da
integridade do filme quando este for aplicado em alimento.
52
Tabela 9. Valores médios da resistência máxima à tração (Rmáx) e alongamento na ruptura
(%) após etapa de crosslinking complementar com cloreto de cálcio dos filmes obtidos a
partir dos ensaios estabelecidos pelo delineamento experimental
Ensaios R
máx
(MPa) Alongamento na ruptura (%)
1 121,4 ± 8,01 25,64 ± 2,41
2 134,2 ± 6,58 6,35 ± 0,78
3 122,2 ± 7,32 32,45 ± 2,12
4 137,1 ± 7,92 8,83 ± 0,96
5 118,8 ± 7,01 36,85 ± 2,08
6 141,4 ± 6,87 5,08 ± 0,35
7 121,5 ± 7,63 8,65 ± 0,54
8 127,5 ± 7,04 17,32 ± 1,98
9 122,0 ± 7,02 11,32 ± 1,64
10 121,8 ± 7,14 10,45 ± 1,45
11 121,5 ± 6,47 10,98 ± 1,03
Os níveis utilizados para a elaboração dos ensaios experimentais deste
planejamento estão apresentados na 4.2.3.4. Observou-se que a mudança na
concentração de OE cravo e cloreto de cálcio adicionado à formulação dos filmes
proporcionou uma variação na resistência máxima à tração de 118,8 MPa (CaCl
2
a 0,02% e OE cravo a 0,6%) a 141,4 MPa
(CaCl
2
a 0,1% e OE cravo a 0,6%),
enquanto que o alongamento máximo na ruptura variou de 5,08% (CaCl
2
a 0,1%
e OE cravo a 0,6%) a 36,85 (CaCl
2
a 0,02% e OE cravo a 0,6%).
Tanto para o cálculo de resistência máxima à tração (R
máx
) quanto para
determinação do alongamento máximo na ruptura, foram considerados
significativos os parâmetros com p-valores menores que 5% (p<0,05). Dessa
maneira, para R
máx
todos os termos (lineares e quadráticos) são considerados
significados conforme apresentado na Tabela 10. O cálculo de ANOVA para R
máx
encontra-se na Tabela 11:
53
Tabela 10. Coeficientes de regressão para a variável resistência máxima à tração
Fatores Coeficientes Erro padrão t-valor p-valor Lim. de
conf. -95%
Lim. de
conf. +95%
Média 121,9
0,06
2111,37
0,0000
121,65
122,15
CaCl
2
(%)(L) 7,46
0,07
210,93
0,00002
14,61
15,22
CaCl
2
(%)(Q) 4,46
0,08
105,89
0,00009
8,55
9,27
OE cravo(%)(L) 1,52
0,07
43,08
0,0005
2,74
3,35
OE cravo(%)(Q) 1,66
0,08
39,35
0,0006
2,95
3,67
CaCl
2
xOE cravo 0,53
0,10
10,50
0,009
0,62
1,48
Tabela 11. ANOVA para a resistência máxima à tração
Fonte de
variação
Soma de
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrado
Médio
F-calc p-valor
CaCl
2
(%)(L) 444,93
1
444,93
44493,27
0,00002
CaCl
2
(%)(Q) 112,14
1
112,14
11214,02
0,00009
OE cravo(%)(L) 18,56
1
18,56
1856,01
0,0005
OE cravo(%)(Q) 15,49
1
15,49
1549,08
0,0006
CaCl
2
xOE cravo 1,10
1
1,103
110,25
0,009
Lack of Fit 9,19
3
3,065
306,45
0,003
Erro puro
0,02
2
0,010
Total
586,69
10
R
2
= 0,98; F
0,95; 5; 5
= 5,05 ; F-calc = 62,70
O modelo final com as variáveis codificadas que representa a resistência
máxima à tração (MPa) em função da concentração de CaCl
2
e concentração de
OE cravo na faixa estudada está apresentado na equação:
R
máx
(MPa) = 121,90 + 7,46[CaCl
2
] + 4,46[CaCl
2
]
2
+ 1,52[OEcravo] +
1,66[OEcravo]
2
+ 0,53[CaCl
2
]x[OEcravo]
A partir do modelo apresentado, verificou-se que tanto a adição de CaCl
2
como a adição de OE cravo à formulação dos filmes provocou o aumento dos
valores de resistência máxima à tração. No entanto, a adição de OE cravo não
promoveu um aumento considerável, pois os valores de coeficientes são menores
em relação aos coeficientes da variável CaCl
2.
A representação gráfica para o
modelo obtido encontra-se na Figura 16 e o gráfico de valores experimentais
versus valores previstos, que representa o ajuste dos valores experimentais para
os valores estabelecidos pelo modelo encontra-se na Figura 17.
54
Figura 16. Superfície de resposta para a resistência máxima à tração (MPa) em função da
concentração de OE cravo (%) e concentração de CaCl2 (%)
Figura 17. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta resistência
máxima à tração
55
O valor de F-calculado obtido a partir do modelo estudado foi 12,4 vezes
superior ao valor de F-tabelado indicando que o modelo apresentado é
significativo. O coeficiente de correlação R
2
(0,9843) sugere que o modelo
ajustado é capaz de explicar 98,43% do total de variação existente no processo.
O excelente ajuste do modelo também pode ser observado na Figura 17, no qual
os pontos experimentais e os valores observados encontram-se muito próximos
à reta de ajuste.
Para o cálculo do alongamento máximo na ruptura, tanto os termos
quadráticos como os termos lineares foram significativos, como observado na
Tabela 12. Os dados referentes à ANOVA para esta propriedade estão
apresentados na Tabela 13.
Tabela 12. Coeficientes de regressão para a variável alongamento máximo na ruptura
Fatores Coeficientes Erro padrão t-valor p-valor Lim. de
conf. -95%
Lim. de
conf. +95%
Média 20,92
0,253
43,12
0,0005
9,83
12,01
CaCl
2
(%)(L) -10,98
0,310
-70,83
0,0002
-23,29
-20,63
CaCl
2
(%)(Q) 5,36
0,369
29,05
0,001
9,13
12,31
OE cravo(%)(L) 2,69
0,310
17,38
0,003
4,05
6,72
OE cravo(%)(Q) 1,37
0,369
7,42
0,02
1,15
4,33
CaCl
2
xOE cravo -1,08
0,438
-4,94
0,04
-4,05
-0,28
Tabela 13. ANOVA para a variável alongamento máximo na ruptura
Fonte de
variação
Soma de
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrado
Médio
F-calc p-valor
CaCl
2
(%)(L) 964,47
1
964,47
5017,20
0,0002
CaCl
2
(%)(Q) 162,23
1
162,23
843,89
0,001
OE cravo(%)(L) 58,06
1
58,06
302,01
0,003
OE cravo(%)(Q) 10,59
1
10,59
55,12
0,02
CaCl
2
xOE cravo 4,67
1
4,69
24,38
0,04
Lack of Fit 5,22
3
1,74
9,05
0,1
Erro puro
0,38
2
0,19
Total
1195,31
10
R
2
= 0,99; F
0,95; 5; 5
= 5,05; F-calc = 212,44
O modelo final com as variáveis codificadas que representa o alongamento
máximo na ruptura (%) em função da concentração de CaCl
2
e concentração de
OE cravo na faixa estudada está apresentado na equação:
56
Alongamento máximo na ruptura (%) = 20,92 – 10,98[CaCl
2
] +
5,36[CaCl
2
]
2
+ 2,69[OEcravo] + 1,37[OEcravo]
2
– 1,08[CaCl
2
]x[OEcravo]
A representação gráfica do modelo para o alongamento máximo na ruptura
encontra-se na Figura 18. Pela análise da superfície de resposta observa-se que
os maiores valores de alongamento encontram-se nas faixas de menor
concentração de CaCl
2
e maior concentração de OE cravo.
Figura 18. Superfície de resposta para o alongamento máximo na ruptura (%) em função
da concentração de OE cravo (%) e concentração de CaCl2 (%)
O valor de F-calculado obtido a partir do modelo estudado foi 42 vezes
superior ao valor de F-tabelado indicando que o modelo apresentado é altamente
significativo, o que também é observado no gráfico de ajuste do modelo (Figura
19). O coeficiente de correlação R
2
(0,9953) sugere que o modelo ajustado é
capaz de explicar 99,53% do total de variação existente no processo
57
Figura 19. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
alongamento máximo na ruptura
Os dados referentes ao modelo para a resistência máxima à tração e
alongamento máximo na ruptura foram validados considerando a mesma faixa
de estudo apresentada para validar o modelo de permeabilidade ao vapor de
água e os resultados encontram-se na Tabela 14 e Tabela 15, respectivamente.
Tabela 14. Valores da resistência máxima à tração (Rmáx) experimentais, previstos pelo modelo,
desvios e desvio relativo
Ensaios CaCl2
(%)
OE cravo
(%)
Rmáx
experimental (MPa)
Rmáx previsto
(MPa)
Desvio
(y-y’) *
Desvio
relativo
Rmax (%)
3 * 0,0316
0,884 123,74 ± 5,03 124,80 -1,06 -0,86
A 0,0316
1,0 122,42 ± 6,03 125,34 -2,92 -2,39
B 0,02 0,884 120,21 ± 4,74 124,70 -4,49 -3,74
* repetição do ensaio da condição 3 definido pelo planejamento experimental
**desvio=diferença entre os valores obtidos experimentalmente e os valores previstos pelo modelo
Tabela 15. Valores da porcentagem de alongamento na ruptura (Al %) experimentais, previstos
pelo modelo, desvios e desvio relativo
Ensaios CaCl2
(%)
OE cravo
(%)
Al
experimental (%)
Al previsto
(%)
Desvio
(y-y’) *
Desvio
relativo Al
(%)
3 * 0,0316
0,884 29,66 ± 2,17 24,00 5,66 19,02
A 0,0316
1,0 31,82 ± 2,02 24,60 7,22 22,69
B 0,02 0,884 32,69 ± 1,64 24,13 8,56 26,19
* repetição do ensaio da condição 3 definido pelo planejamento experimental
**desvio=diferença entre os valores obtidos experimentalmente e os valores previstos pelo modelo
58
Segundo relatado por Kalil et al. (2001), mesmo a análise estatística tendo
sido realizada a p<0,05 e a ANOVA sendo válida, com um alto coeficiente de
correlação, a ocorrência de desvios de até 35% pode ser encontrado. Caso isto
ocorra, é recomendada a validação do modelo em outra região de estudo.
De acordo com os desvios relativos observados para o modelo que
representa a resistência máxima à tração e, o modelo que representa a
porcentagem de alongamento na ruptura em função da concentração de CaCl
2
e
OE cravo adicionada à formulação do filme, pode-se concluir que, de fato, estes
modelos são significativos.
Os resultados obtidos estão coerentes ao relatado por Rhim (2004), no qual
foi observado que a adição de CaCl
2
à formulação de filmes à base de alginato é
capaz de provocar o aumento nos valores nos valores de resistência máxima à
tração enquanto a porcentagem de alongamento na ruptura diminuiu, uma vez
que a estrutura polimérica do filme perde flexibilidade pela formação de ligações
cruzadas entre o alginato e o CaCl
2
.
5.3.5 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA in vitro DOS FILMES
Os valores da zona de inibição assim como a comparação entre os valores
encontrados para as etapas antes e após a realização do crosslinking
complementar com cloreto de cálcio, codificadas na tabela como etapa I e II,
respectivamente, estão apresentados na Tabela 16.
O teste de Duncan, considerando o intervalo de confiança de 95%, foi
realizado para a verificação da existência de diferenças significativas entre as
duas etapas avaliadas. O teste foi realizado avaliando como resposta a zona de
inibição encontrada por microrganismo para cada ensaio (ensaios de 1 a 11).
Foi verificado que somente L. monocytogenes, bactéria Gram-positiva,
apresentou valores de zona de inibição (mm
2
) para as duas condições avaliadas
– antes e depois da etapa complementar de crosslinking – em todos os ensaios.
Esse resultado já era esperado, pois o valor da CIM de OE cravo para esse
microrganismo foi de 0,05% e o menor nível de concentração de OE cravo
estudado no planejamento foi de 0,2%. O menor nível de concentração de OE
59
definido neste estudo considerou a CIM de OE cravo capaz de inibir todos os
microrganismos avaliados.
Grande parte dos trabalhos que avaliaram o modo de ação de OE contra
microrganismos patogênicos e deteriorantes verificou que, em geral, as bactérias
Gram-positivas apresentam-se mais sensíveis quando comparadas às bactérias
Gram-negativas (OUATTARA et al., 1997; SMITH-PALMER, STEWART e FYFE,
1998; JULIANO, MATTANA e USAI, 2000; MARINO et al., 2001; HARPAZ et al.,
2003). A menor susceptibilidade dos microrganismos Gram-negativos aos óleos
essenciais está relacionada com a presença de uma membrana externa formada
por uma dupla camada lipídica que dificulta a difusão dos compostos presentes
no óleo essencial (BURT, 2004).
Quando os OE são incorporados às formulações de filmes, em geral, uma
maior atividade antimicrobiana também é verificada contra bactérias Gram-
positivas. Pranoto, Salokhe e Rakshit (2005) avaliaram quatro diferentes
concentrações de OE alho (0,1%; 0,2%; 0,3% e 0,4%) adicionados a
formulações de filmes à base de alginato e verificaram o aparecimento de zonas
de inibição antimicrobiana somente para as bactérias Gram-positivas
Staphylococcus aureus e Bacillus cereus, enquanto que para Escherichia coli e
Salmonella Typhimurium, bactérias Gram-negativas, nenhuma zona de inibição
foi observada independente da concentração de OE estudado.
60
Tabela 16. Atividade antimicrobiana dos filmes avaliada pela medida da zona de inibição em mm
2
contra L. monocytogenes, S. Give, S. Enteritidis, P.
fluorescens QaF01, P. fluorescens Lb03, P. putida Ia03, P. putida Kb04 e P. aeruginosa ATCC 27853 para as etapas antes (I) e após o crosslinking
complementar com cloreto de cálcio (II)
Ensaios
Microrganismos avaliados (Zona de inibição em mm
2
)
L. monocytogenes S. Give S. Enteritidis P. aeruginosa ATCC27853
I II I II I II I II
1 11,91 ± 2,83
a
8,64 ± 0,00
a
0 0 0 0 0 0
2 11,91 ± 2,83
ª
10,28 ± 2,83
a
10,28 ± 2,83
ª
0
b
10,28 ± 2,83
ª
0
b
8,65 ± 0,00
a
0
3 123,90 ± 18,70
ª
64,40 ± 9,52
b
67,35 ± 14,62
ª
39,53 ± 7,71
b
69,77 ± 4,87
a
37,50 ± 11,90
b
51,64 ± 12,58
ª
28,60 ± 3,51
b
4 40,06 ± 16,32
ª
33,44 ± 15,42
ª
31,02 ± 11,22
ª
15,31 ± 3,01
ª
33,05 ± 9,94
ª
15,32 ± 3,06
b
0 0
5 15,32 ±6,80
ª
10,28 ± 2,83
a
10,28 ± 2,83
ª
0
b
10,28 ± 2,83
ª
0
b
0 0
6 24,67 ± 5,89
ª
10,28 ± 2,83
b
20,75 ± 3,29
ª
10,28 ± 2,83
ª
20,75 ± 3,29
ª
11,91 ± 2,83
b
0 0
7 10,28 ± 2,83
a
8,64 ± 0,00
a
0 0 0 0 0 0
8 97,19 ± 19,53
ª
42,22 ± 14,81
b
59,04 ± 7,85
ª
32,79 ± 3,74
b
61,59 ± 4,65
ª
36,08 ± 5,01
b
41,69 ± 3,97
ª
26,70 ± 6,80
b
9 26,57 ± 3,51
ª
20,75 ± 3,29
ª
22,65 ± 3,29
ª
15,32 ± 3,06
b
20,75 ± 3,29
ª
15,32 ± 3,06
a
10,28 ± 2,83
ª
10,28 ± 2,83
ª
10 25,57 ± 3,51
ª
22,65 ± 3,29
ª
20,75 ± 3,29
ª
17,08 ± 3,06
ª
18,85 ± 0,00
a
15,32 ± 3,06
a
13,68 ± 5,11
ª
10,28 ± 2,83
ª
11 22,65 ± 3,29
ª
20,75 ± 3,29
ª
20,75 ± 3,29
ª
17,08 ± 3,06
ª
20,75 ± 3,29
ª
17,08 ± 3,06
a
15,32 ± 3,06
a
8,64 ± 0,00
b
Ensaios
Microrganismos avaliados (Zona de inibição em mm
2
)
P. fluorescens QaF01 P. fluorescens Lb03 P. putida Kb04 P. putida Ia03
I II I II I II I II
1 0 0 0 0 0 0 0 0
2 10,28 ± 2,83
ª
0
b
8,64 ± 0,00
a
0
b
8,64 ± 0,00
a
0
b
10,28 ± 2,83
ª
0
b
3 67,09 ± 8,25
ª
39,53 ± 7,71
b
69,77 ± 4,87
ª
32,79 ± 3,74
b
69,77 ± 4,87
ª
41,69 ± 3,97
b
69,77 ± 4,87
ª
41,69 ± 3,97
b
4 28,73 ± 7,26
ª
15,31 ± 3,06
b
26,57 ± 3,51
ª
13,68 ± 5,11
b
26,83 ± 0,00
a
15,32 ± 3,06
ª
26,83 ± 9,34
ª
15,32 ± 3,06
ª
5 10,28 ± 2,83
ª
0
b
8,64 ± 0,00
a
0 8,65 ± 0,00
a
0
b
10,28 ± 2,83
ª
0
b
6 18,85 ± 0,00
a
10,28 ± 2,83
b
18,85 ± 0,00
a
11,91 ± 2,83
b
20,75 ± 3,29
ª
10,28 ± 2,83
b
17,08 ± 3,06
ª
10,28 ± 2,83
b
7 0 0 0 0 0 0 0 0
8 96,67 ± 5,55
ª
18,85 ± 0,00
b
87,32 ± 5,33
ª
20,75 ± 0,00
b
72,85 ± 12,86
ª
22,65 ± 3,29
b
69,77 ± 10,43
ª
22,65 ± 3,29
b
9 22,65 ± 3,29
ª
15,32 ± 3,06
b
20,75 ± 3,29
ª
15,32 ± 3,06
ª
20,75 ± 3,29
ª
13,68 ± 5,11
ª
22,65 ± 3,29
ª
13,68 ± 5,11
b
10 18,85 ± 0,00
a
15,32 ± 3,06
ª
18,85 ± 0,00
a
15,32 ± 3,06
ª
18,85 ± 0,00
a
15,32 ± 3,06
ª
18,85 ± 0,00
a
15,32 ± 3,06
ª
11 18,85 ± 0,00
a
17,08 ± 3,06
ª
20,75 ± 3,29
a
13,68 ± 5,11
a
18,85 ± 0,00
a
15,32 ± 3,06
a
20,75 ± 3,29
ª
15,32 ± 3,06
a
Média ± desvio padrão (n=5) na mesma linha seguida pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si para o nível de significância de 5%.
61
Tabela 17. Comparação dos valores de zona de inibição (mm
2
) encontrados para os diferentes microrganismos avaliados em cada ensaio considerando
apenas a etapa pós-crosslinking complementar com cloreto de cálcio
Ensaios
Microrganismos avaliados (Zona de inibição em mm
2
)
L.
monocytogenes
S. Give S. Enteritidis P. aeruginosa
ATCC27853
P. fluorescens
QaF01
P. fluorescens
Lb03
P. putida Kb04 P. putida Ia03
II II II II II II II II
1 8,64 ± 0,00
a
0
b
0
b
0
b
0
b
0
b
0
b
0
b
2 10,28 ± 2,83
a
0
b
0
b
0
b
0
b
0
b
0
b
0
b
3 64,40 ± 9,52
a
39,53 ± 7,71
b
37,50 ± 11,90
b
28,60 ± 3,51
b
39,53 ± 7,71
b
32,79 ± 3,74
b
41,69 ± 3,97
b
41,69 ± 3,97
b
4 33,44 ± 15,42
ª
15,31 ± 3,01
b
15,32 ± 3,06
b
0
c
15,31 ± 3,06
b
13,68 ± 5,11
b
15,32 ± 3,06
b
15,32 ± 3,06
b
5 10,28± 2,83
a
0
b
0
b
0
b
0
b
0
b
0
b
0
b
6 10,28 ± 2,83
a
10,28 ± 2,83
ª
11,91 ± 2,83
a
0
b
10,28 ± 2,83
a
11,91 ± 2,83
a
10,28 ± 2,83
a
10,28 ± 2,83
a
7 8,64 ± 0,00
a
0
b
0
b
0
b
0
b
0
b
0
b
0
b
8 42,22 ± 14,81
a
32,79 ± 3,74
a,b
36,08 ± 5,01
a,b
26,70 ± 6,80
b,c
18,85 ± 0,00
d
20,75 ± 0,00
c,d
22,65 ± 3,29
c,d
22,65 ± 3,29
c,d
9 20,75 ± 3,29
a
15,32 ± 3,06
a,b
15,32 ± 3,06
a,b
10,28 ± 2,83
b
15,32 ± 3,06
a,b
15,32 ± 3,06
a,b
13,68 ± 5,11
b
13,68 ± 5,11
b
10 22,65 ± 3,29
a
17,08 ± 3,06
a
15,32 ± 3,06
a,b
10,28 ± 2,83
b
15,32 ± 3,06
a,b
15,32 ± 3,06
a,b
15,32 ± 3,06
a,b
15,32 ± 3,06
a,b
11 20,75 ± 3,29
a,b
17,08 ± 3,06
a,b
17,08 ± 3,06
a,b
8,64 ± 0,00
c
17,08 ± 3,06
a,b
13,68 ± 5,11
b
15,32 ± 3,06
b
15,32 ± 3,06
b
Média ± desvio padrão (n=5) na mesma linha seguida pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si para o nível de significância de 5%.
62
Em geral, observou-se uma redução na atividade antimicrobiana dos
filmes após a realização da etapa complementar de crosslinking com CaCl
2
.
Esta condição é verificada pelos menores valores de zona de inibição (mm
2
)
apresentados na Tabela 16 (coluna II), sendo que para a maioria dos ensaios
avaliados os resultados obtidos na condição II foram significativamente
menores (p<0,05) quando comparados à condição I.
Para as formulações correspondentes aos ensaios 1 (CaCl
2
= 0,0316% e
OE cravo = 0,316%) e 7 (CaCl
2
= 0,06% e OE cravo = 0,2%) foi observada
ausência de zonas de inibição antimicrobiana para os ensaios envolvendo as
bactérias Gram-negativas (S. Give, S. Enteritidis, P. aeruginosa ATCC 27853,
P. fluorescens QaF01, P. fluorescens Lb03, P. putida Kb04 e P. putida Ia03)
nas duas condições avaliadas. Já para as formulações relacionadas aos
ensaios 2 (CaCl
2
= 0,0884% e OE cravo = 0,316%) e 5 (CaCl
2
= 0,02% e OE
cravo = 0,6%), observou-se a perda do efeito antimicrobiano após a etapa
de crosslinking complementar com CaCl
2
, com exceção de P. aeruginosa
ATCC 27853 onde a ausência de zonas de inibição proporcionadas para esse
microrganismo também foi observada nos ensaios 1, 4, 5, 6 e 7 para as duas
condições avaliadas.
Estes resultados sugerem que para os menores níveis de OE cravo
estudados (0,2% e 0,316%), a adição de diferentes concentrações de CaCl
2
não foi suficiente para a manutenção da atividade antimicrobiana após a
etapa de crosslinking complementar com CaCl
2
.
Os maiores valores de zona de inibição foram observados para os
ensaios 3 (CaCl
2
= 0,0316% e OE cravo = 0,884%) e 8 (CaCl
2
= 0,06% e OE
cravo = 1,0%) para a condição I. Após a etapa de crosslinking complementar
com CaCl
2,
observou-se para esses ensaios uma redução significativa
(p<0,05) nos valores de zona de inibição para todos os microrganismos
avaliados. No entanto, apesar do ensaio 8 avaliar uma maior concentração de
OE cravo (1,0%) comparado ao ensaio 3 (0,884%), este apresentou
resultados superiores de zona de inibição antimicrobiana. Neste caso, o
aumento da concentração de CaCl
2
para valores acima de 0,0316% pode ter
ocasionado o aumento do efeito de crosslinking primário, ou seja, a formação
63
de um gel muito forte pode ter dificultado a incorporação da emulsão de OE
na matriz polimérica dos filmes sendo a porção não incorporada solubilizada
após a etapa de crosslinking complementar. A solubilização dos agentes
ativos presentes no OE cravo durante a etapa de crosslinking complementar
pode estar relacionada à diminuição do efeito antimicrobiano do filme.
Sabendo que a etapa complementar de crosslinking com CaCl
2
é
necessária para a manutenção da integridade do filme quando este for
aplicado em alimento, os valores de zona de inibição foram comparados
avaliando somente a condição II apresentada na Tabela 17. Verifica-se que
para todos os ensaios avaliados, a atividade antimicrobiana contra L.
monocytogenes apresentou valores de zona de inibição significativamente
superiores (p<0,05) aos demais microrganismos avaliados. Os menores
valores de zona de inibição encontrados foram para P. aeruginosa ATCC
27853.
A Tabela 18 apresenta um resumo dos principais fatores avaliados:
equação modelo, coeficiente de correlação (R
2
), F-calculado e F-tabelado. Os
modelos apresentados para a zona de inibição antimicrobiana referem-se
apenas à condição na qual foi realizada a etapa complementar de
crosslinking, uma vez que etapa é necessária para a manutenção da
integridade do filme quando este for aplicado em alimento.
64
Tabela 18. Modelo final para a zona de inibição (ZI) em mm
2
por microrganismo avaliado em
função da concentração de cloreto de cálcio e concentração de óleo essencial de cravo
adicionada na formulação do filme de alginato, considerando apenas a etapa pós-crosslinking
complementar
Microrganismo Modelo para a zona de inibição (ZI) em mm
2
R
2
F
calc
F
tab
L. monocytogenes ZI = 21,38 – 3,66CaCl
2
– 2,72CaCl
2
2
+ 15,80OE +
+ 4,85OE
2
– 8,15CaCl
2
xOE
0,85 5,33 3,45
S. Give ZI = 16,49 – 1,21CaCl
2
– 4,94CaCl
2
2
+ 12,65OE –
– 12,65CaCl
2
xOE
0,88 10,99
3,18
S. Enteritidis ZI = 15,90 – 4,67CaCl
2
2
+ 12,98OE + 1,37OE
2
–
– 5,55CaCl
2
xOE
0,89 12,35
3,18
P. aeruginosa ATCC ZI = 9,73 – 3,58CaCl
2
– 4,75CaCl
2
2
+ 8,29OE +
+ 1,93OE
2
– 7,15CaCl
2
xOE
0,90 9,16 3,45
P. fluorescens QaF01 ZI = 15,91 – 1,21CaCl
2
– 3,78CaCl
2
2
+ 10,19OE –
– 1,63OE
2
– 9,14CaCl
2
xOE
0,74 2,88 3,45
P. fluorescens Lb03 ZI = 14,77 – 3,55CaCl
2
2
+ 9,48OE – 1,34OE
2
–
– 4,78CaCl
2
xOE
0,80 5,89 3,18
P. putida Kb04 ZI = 14,77 – 1,48CaCl
2
– 3,31CaCl
2
2
+ 11,13OE –
– 6,59CaCl
2
xOE
0,78 5,17 3,18
P. putida Ia03 ZI = 14,77 – 1,48CaCl
2
– 3,31CaCl
2
2
+ 11,13OE –
– 6,59CaCl
2
xOE
0,78 5,17 3,18
p<0,10
Para a construção dos modelos, foi adotado o nível de significância de
10% (p<0,10). De acordo com Kalil et al. (2001), em trabalhos onde a
variável resposta envolve microrganismos, a utilização de um nível de
significância maior pode justificar de maneira mais adequada as variações
existentes no processo estudado. De fato, como o relatado por Mann e
Markham (1998), métodos de determinação da atividade antimicrobiana pela
difusão de óleo essencial em meio de cultura (ágar) pode ser dificultado pela
não afinidade das partículas oleosas com a água presente no ágar.
Os gráficos de valores experimentais versus valores previstos para os
modelos apresentados na Tabela 18 encontram-se no ANEXO 2 e a
representação gráfica das equações obtidas pode ser visualizada nas curvas
de contorno apresentadas na Figura 20 e Figura 21.
Todos os modelos que representam a atividade antimicrobiana através
da zona de inibição por microrganismo avaliado apresentam pelo menos um
dos fatores (concentração de CaCl
2
e/ou concentração de OE cravo) como
termo quadrático significativo (p<0,10), justificando, portanto, a escolha do
planejamento central composto rotacional como modelo quadrático para o
sistema estudado.
65
Os termos que não apresentaram efeitos significativos (p>0,10) foram
incorporados aos resíduos para o cálculo da ANOVA e obtenção dos valores
de R
2
e F-calculado e não foram adicionados à equação modelo.
Em geral, verificou-se que os termos relacionados à concentração de
CaCl
2
apresentaram coeficientes negativos, enquanto que os termos
relacionados à concentração de OE cravo apresentaram coeficientes
positivos. Isso significa que quando avaliado individualmente, altas
concentrações de CaCl
2
adicionado à formulação do filme pode proporcionar
um efeito negativo para a zona de inibição antimicrobiana, enquanto altas
concentrações de OE cravo potencializam a ação antimicrobiana. No entanto,
o efeito significativo (p<0,10) entre a interação CaCl
2
x OE cravo demonstra
que existe um efeito sinérgico entre esses dois fatores, ou seja, a
combinação adequada desses dois ingredientes é capaz de potencializar a
ação antimicrobiana, conferindo o aumento dos valores de zona de inibição
antimicrobiana.
A análise das curvas de contorno permite a definição das concentrações
mais adequadas de CaCl
2
e OE cravo que maximizam os valores de zona de
inibição. Observa-se na Figura 20 e Figura 21, que para todos os
microrganismos avaliados, os maiores valores de zona de inibição
antimicrobianas são encontrados para uma concentração mínima de
aproximadamente 0,8% de OE cravo e uma concentração máxima de
aproximadamente 0,05% de CaCl
2.
Considerando bons modelos apenas valores de R
2
entre 0,85 e 0,90
(MYERS e MONTGOMERY, 2002), os melhores modelos encontrados foram os
que descrevem a zona de inibição antimicrobiana para L. monocytogenes, S.
Give, S. Enteritidis e P. aeruginosa ATCC 27853. O valor de F-calculado maior
que o valor de F-tabelado é indicativo de que o modelo apresentado para
esses microrganismos também é significativo.
Já os valores de R
2
< 0,80 sugerem um baixo ajuste do modelo para a
zona de inibição avaliada contra P. fluorescens (QaF01 e Lb03) e P. putida
(Kb04 e Ia03). O baixo grau de correlação observado pode estar relacionado
66
com a variabilidade existente no processo de difusão dos agentes
antimicrobianos presentes no OE cravo pela superfície do meio de cultura.
Apesar de cinco amostras de cada ensaio terem sido analisadas para a
determinação da zona de inibição a variabilidade dos valores encontrados no
ponto central pode não ter sido suficiente para a obtenção de um ajuste
adequado ao modelo. Os valores referentes à validação dos modelos
encontram-se nas tabelas apresentadas no ANEXO 2, no qual foi observado
que os maiores desvios relativos estão relacionados aos modelos que
apresentaram menores valores para o coeficiente de correlação.
67
Figura 20. Curvas de contorno relativas à zona de inibição (mm
2
) contra: (A) L.
monocytogenes, (B) S. Give, (C) S. Enteritidis e (D) P. aeruginosa resultante da variação da
concentração de óleo essencial de cravo (%) e concentração de CaCl
2
(%)
(A) (B)
(C) (D)
68
Figura 21. Curvas de contorno relativas à zona de inibição (mm
2
) contra: (E) P.
fluorescens QaF01, (F) P. fluorescens Lb03, (G) P. putida Kb04 e (H) P. putida Ia03
resultante da variação da concentração de óleo essencial de cravo (%) e concentração de
CaCl
2
(%)
(E) (F)
(G) (H)
69
5.3.6 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS FILMES EM CARNE DE
FRANGO
A avaliação da atividade antimicrobiana dos filmes em carne de frango
foi realizada somente com a formulação referente ao ensaio 3 com realização
da etapa de crosslinking complementar (CaCl
2
=0,0316% e OE
cravo=0,884%). Esta formulação foi escolhida por apresentar os maiores
valores de zona de inibição avaliados in vitro, conforme observado na Tabela
17. Os resultados referentes à enumeração de Salmonella spp., L.
monocytogenes e Pseudomonas spp. no primeiro dia de análise (No) e após 5
dias de armazenamento a 7º C (Nf) estão apresentados na Tabela 19.
Tabela 19. Análise microbiológica dos ensaios em amostras de peito de frango
Microrganismo Condição No
(a)
(log UFC/g)
Nf
(b)
(log UFC/g)
Salmonella spp C
(c)
< 1 < 1
C
mo
(d)
3,2 ± 0,18
a
3,5 ± 0,26
a
Filme
(e)
< 1 < 1
Filme
mo
(f)
3,1 ± 0,22
a
3,1 ± 0,23
a
L. monocytogenes C < 1 < 1
C
mo
3,3 ± 0,15
b
4,7 ± 0,21
a
Filme < 1 < 1
Filme
mo
3,3 ± 0,18
a
3,6 ± 0,18
a
Pseudomonas spp C < 1 <1
C
mo
3,6 ± 0,21
b
7,0 ± 0,19
a
Filme < 1 <1
Filme
mo
3,4 ± 0,20
b
6,8 ± 0,16
a
Mesófilos aeróbios Frango refrigerado* 3,2 ± 0,22
b
6,8 ± 0,21
a
Frango irradiado* <1 <1
Psicrotróficos aeróbios Frango refrigerado 3,8 ± 0,16
b
8,2 ± 0,29
a
Frando irradiado <1 <1
Média ± desvio padrão (n=3) na mesma linha seguida pela mesma letra não diferem
estatisticamente entre si para o nível de significância de 5%.
(a)
Média de 3 repetições para o ensaio inicial - No
(b)
Média de 3 repetições após 5 dias de armazenamento a 7º C – Nf
(c)
Amostra de frango sem o microrganismo e sem o filme
(d)
Amostra de frango com o microrganismo e sem o filme
(e)
Amostra de frango sem o microrganismo e com o filme
(f)
Amostra de frango com o microrganismo e com o filme
* Controle da matéria-prima
Foi observada a ausência de multiplicação de Salmonella spp. nas
amostras controle e sem inóculo. Para L. monocytogenes, a população
70
manteve-se constante apenas na amostra onde a cobertura com filme foi
utilizada, enquanto que na amostra controle, houve um aumento significativo
(p>0,05) de 1,34 log UFC/g após o período final de armazenagem.
Já para Pseudomonas spp., tanto a amostra controle como a amostra
com filme antimicrobiano, apresentaram um aumento significativo (p>0,05)
de 3,42 log UFC/g e 3,27 log UFC/g, respectivamente.
Para as amostras onde não houve a contaminação com o “pool” de
Salmonella e L. monocytogenes, esses microrganismos não foram detectados
pelo método utilizado. Caso estivessem presentes e em níveis em que fosse
possível a realização de enumeração, os valores obtidos seriam descontados
dos valores iniciais e finais de enumeração.
Para a análise de Pseudomonas spp., as amostras controle irradiadas
não apresentaram valores de contagem para o dia inicial e final de análise,
pela metodologia empregada. Estes dados são similares aos relatados por
Miyagusku et al. (2003) que avaliaram diferentes doses de irradiação sobre a
microbiota de peito de frango refrigerado e observaram que com doses de
1,5 a 3,0 kGy somente foi observado valores de contagem após 15 dias de
armazenagem a 4º C.
Em geral, a utilização do filme adicionado de OE de cravo como
embalagem primária promoveu o controle na multiplicação de L.
monocytogenes em amostras de carne de frango, uma vez que a amostra
controle apresentou um aumento significativo de 1,34 log UFC/g na
população enquanto na amostra na qual a cobertura com filme comestível foi
utilizada ela se manteve constante. Este resultado é considerado importante,
pois em alimentos com atividade de água e valores de pH adequados à
multiplicação desse patógeno (tais como a carne de frango) e armazenados
sob refrigeração, a temperatura é capaz de selecionar a microbiota presente
no alimento, favorecendo a multiplicação de microrganismos psicrotróficos,
como L. monocytogenes (FARBER e PETERKIN, 1991). Embora a carne de
frango sofra um tratamento térmico antes do consumo e L. monocytogenes
seja destruída pelo aquecimento adequado, a manipulação do produto in
71
natura pode ser uma importante fonte de contaminação cruzada desse
patógeno para alimentos prontos para o consumo (HUSS, JORGENSEN,
VOGEL, 2000).
Para Salmonella spp. e Pseudomonas spp., no entanto, a utilização do
filme como embalagem antimicrobiana não mostrou a mesma eficiência.
5.3.7 ATIVIDADE DE ÁGUA (a
w
)
Os valores para a atividade de água dos filmes variaram de 0,52 a 0,60
para os ensaios referentes a etapa que não envolvia o crosslinking
complementar e, 0,45 a 0,48 para os ensaios que envolveram esta etapa.
Foi observado que após ser aplicado na carne de frango e decorridos os
5 dias de armazenagem a 7º C, o filme apresentou um aumento na atividade
de água de aproximadamente 0,47 para 0,76. Embora tenha provocado o
aumento no intumescimento da estrutura do filme, este não prejudicou a
visibilidade do produto, o que pode ser observado na Figura 22.
Figura 22. Amostra de peito de frango embalada por 5 dias a 7º C com o filme
antimicrobiano
Observou-se também que os ensaios-controle, no qual os filmes não
foram utilizados, ocorreu o exsudamento de água pelo frango na embalagem
(Figura 23-A), enquanto nos ensaios no qual o filme antimicrobiano foi
utilizado como embalagem primária, este fato não foi observado (Figura 23-
B).
72
Figura 23. Amostras de peito de frango após 5 dias de armazenamento a
7º C: (A) sem aplicação do filme antimicrobiano – exsudamento de água
pelo frango e, (B) com aplicação do filme antimicrobiano
Para a análise dos valores de atividade de água dos filmes, não foi
possível realizar a avaliação dos resultados através da análise de superfície
de resposta uma vez que os valores obtidos entre os diferentes ensaios
definidos pelo planejamento experimental foram muito próximos.
5.3.8 ANÁLISE SENSORIAL
Os resultados referentes à opinião de 50 provadores encontram-se na
Figura 18.
(A) (B)
73
Figura 24. Aceitabilidade das amostras de peito de frango in natura com relação ao aroma.
Considerando que a escala hedônica varia de 1 a 9, a nota média
atribuída para o produto com relação ao aroma foi de 5,3, tanto para a
amostra padrão como para a amostra na qual o filme adicionado de OE de
cravo foi utilizado.
Esse resultado sugere que não houve uma preferência significativa
(p<0,05) independente da amostra avaliada pelo provador, uma vez que a
mesma média global foi obtida para as duas amostras.
Considerando apenas a aceitabilidade das amostras, os resultados
apresentados na Figura 24 mostram que 56% (28) dos provadores gostaram
do aroma das amostras na qual foi utilizada como embalagem primária a
cobertura de filme comestível adicionada de OE de cravo, variando a opinião
entre “gostei ligeiramente” e “gostei extremamente”. Com relação à amostra
padrão, houve uma aceitabilidade de 40% (20).
Dos 56% (28) de provadores que gostaram da amostra com filme, 32%
(9) relataram nos comentários que gostaram desta amostra apenas pelo
aroma agradável de “tempero”. No entanto, 10,7% (3) dos provadores
comentaram que apesar de terem gostado mais da amostra com filme, ficam
receosos com o sabor do produto após o processamento.
Com relação à rejeição das amostras, 38% (19) dos provadores
74
rejeitaram a amostra na qual o filme adicionado de OE de cravo foi utilizado,
porém 32% (16) dos provadores também rejeitaram a amostra padrão,
variando a opinião entre “desgostei ligeiramente” e “desgostei
extremamente”.
Observou-se que dos 38% (19) dos provadores que rejeitaram a
amostra com filme, 58% (11) relataram nos comentários que estranhariam a
compra de um frango in natura com aroma de cravo, pois o mesmo mascara
o aroma original do produto. Outros 10,5% (2) dos provadores relataram que
rejeitaram a amostra com filme por não apreciarem o aroma de cravo.
75
6 CONCLUSÃO
Baseado nas condições desta pesquisa e nos resultados e discussão
apresentados, pode-se concluir que:
- O filme à base de alginato incorporado de óleo essencial de cravo (0,884%)
e CaCl
2
(0,0316%) utilizado como embalagem primária em pedaços de peito
de frango foi eficiente no controle da multiplicação de L. monocytogenes mas
não no de Salmonella spp. e Pseudomonas spp.
- A incorporação de 0,884% de OE ao filme não alterou significativamente o
aroma de pedaços de peito de frango in natura.
- O uso do filme à base de alginato incorporado de OE cravo mostrou ser
viável. Porém, poderá sofrer interferência da matriz alimentar caso esta
matriz apresente exsudação.
76
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84
8 ANEXOS
8.1
ANEXO 1
Exame de morfologia por coloração de Gram
A partir do crescimento obtido em ágar nutriente (4.2.1.2) foi preparado
um esfregaço em lâmina de microscopia misturando uma alíquota da cultura
de crescimento com uma gota de solução salina estéril 0,85%. Após a fixação
pelo calor foi realizada a etapa de coloração de Gram no qual o esfregaço foi
corado com solução de cristal violeta fenicada por 1 min, seguida de
recobrimento com solução de lugol por mais 1 min, enxágüe em água
corrente, aplicação de álcool etílico 95º, lavagem em água corrente,
aplicação de fucsina e lavagem e secagem do esfregaço seguida de
observação em microscópio óptico (Olympus) com aumento de 1000 X.
Foram consideradas positivas as colônias que apresentaram o formato de
bacilos Gram negativos.
Avaliação da produção de oxidase
Uma porção do crescimento obtido em ágar nutriente (4.2.1.2) foi
aplicada, com auxílio de alça bacteriológica descartável, em tiras de papel
filtro estéreis umedecidas com o reagente de Oxidase (N, N, N’, N’-Tetramethyl-p-
phenylenediamine-2HCl, Remel, BactiDrop Oxidase, ref. R21540). O aparecimento de
coloração azul escuro dentro de 10 segundos é indicativo de resultado
positivo.
Avaliação da produção de catalase
O teste de produção de catalase foi realizado em lâmina de vidro
misturando uma porção do crescimento obtido em ágar nutriente (4.2.1.2)
com aproximadamente 50 µL de peróxido de hidrogênio a 3% (Sigma-Aldrich,
ref. 323381). A decomposição do peróxido de hidrogênio pela enzima
catalase é verificada através da produção de bolhas, indicando resultado
positivo.
85
Avaliação da utilização da glicose em aerobiose e anaerobiose
Para a avaliação da utilização da glicose em aerobiose e anaerobiose,
uma porção do crescimento obtido em ágar nutriente (4.2.1.2) foi inoculado
em tubos contendo o meio de cultura OF adicionado de glicose. Para
realização do teste, foi utilizado o meio de cultura OF (OF Basal Medium,
Merck), onde para cada litro de meio de cultura adicionava-se 100 mL de
solução D-glicose (Synth) a 10% esterilizada por filtração. 5 mL da solução
final foi porcionada em tubos estéreis com adição de 1 mL de óleo de
parafina estéril para os ensaios em anaerobiose. Após a inoculação, os tubos
foram incubados a 25º C por pelo menos 48 h ou até 15 dias. A degradação
do carboidrato é indicada pela viragem do indicador de pH azul de
bromotimol para amarelo.
Avaliação da produção de pigmento
A avaliação da produção de pigmento fluorescente foi baseado em
metodologia descrita por Arnaut-Rollier, Zutter e Hoof (1999). Para a
realização do teste, o meio de cultura ágar King B foi formulado de acordo
com a composição típica (g/L) determinada pelo fabricante: proteose peptona
20,0; sulfato de magnésio 1,5; fosfato de tri-potássio 3-hidratado 2,8 e agar-
agar 10,0. Os ingredientes foram suspendidos juntamente com a adição de
10 g de glicerol para litro de meio de cultura produzido. Para a realização
deste teste, somente foram utilizados os isolados suspeitos confirmados pelo
teste de utilização da glicose em meio de cultura OF. A produção de pigmento
fluorescente foi observado após o período mínimo de 72 h a 25º C e
avaliados sob luz branca e luz UV.
86
Figura 25. Avaliação da produção de pigmento fluorescente sob luz branca (A) e luz UV
(B)
Identificação bioquímica pelo kit API
®
20 NE
Para a identificação da espécie, foi utilizado o sistema de identificação
de bacilos Gram negativos não enterobactérias e não fastidiosos API
®
20 NE
(bioMérieux) que combina 8 testes convencionais, 12 testes de assimilação e
uma base de dados. O procedimento para a realização do teste, leitura e
interpretação dos resultados foi baseado de acordo com instruções do
fabricante.
Manutenção das culturas bacterianas
Os isolados identificados foram mantidos a temperatura de -70º C em
caldo BHI (Oxoid) adicionado de glicerol (Synth).
A
B
87
8.2
ANEXO 2
Listeria monocytogenes
Tabela 20. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição antimicrobiana
contra Listeria monocytogenes
Fatores Coeficientes Erro padrão t-valor p-valor Lim. de
conf. -90%
Lim. de
conf. +90%
Média
21,38333
0,633333
33,7632
0,000876
19,5340
23,2327
CaCl
2
(%)(L)
-3,66375
0,775672
-9,4467
0,011021
-9,5925
-5,0625
CaCl
2
(%)(Q)
-2,71848
0,923234
-5,8890
0,027644
-8,1328
-2,7411
OE cravo(%)(L)
15,80259
0,775672
40,7456
0,000602
29,3402
33,8701
OE cravo(%)(Q)
4,85627
0,923234
10,5201
0,008915
7,0167
12,4084
CaCl
2
xOE cravo
-8,15250
1,096966
-14,8637
0,004496
-19,5081
-13,1019
Tabela 21. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra Listeria monocytogenes
Fonte de variação Soma de
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrado
Médio
F-calc p-valor
CaCl
2
(%)(L) 107,385
1
107,385
89,239
0,011021
CaCl
2
(%)(Q) 41,732
1
41,732
34,681
0,027644
OE cravo(%)(L) 1997,774
1
1997,774
1660,200
0,000602
OE cravo(%)(Q) 133,177
1
133,177
110,673
0,008915
CaCl
2
xOE cravo 265,853
1
265,853
220,930
0,004496
Lack of Fit 487,801
3
162,600
135,125
0,007355
Erro puro
2,407
2
1,203
Total
3100,698
10
R
2
= 0,8419; F
0,90; 5; 5
= 3,45; F-calc = 5,33
Figura 26. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta zona
de inibição antimicrobiana contra L. monocytogenes
88
Listeria monocytogenes
Tabela 22. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Listeria
monytogenes – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio relativo
Ensaios CaCl2
(%)
OE cravo
(%)
ZI experimental
(mm
2
)
ZI modelo
(mm
2
)
Desvio
(y-y’) *
Desvio
relativo
ZI (%)
3 * 0,0316
0,884 62,83 ± 9,52 38,79 25,61 39,77
A 0,0316
1,0 62,70 ± 11,90 41,65 21,05 50,54
B 0,02 0,884 61,98 ± 7,71 38,92 23,06 37,20
* repetição do ensaio da condição 3 definido pelo planejamento experimental
**desvio=diferença entre os valores obtidos experimentalmente e os valores previstos pelo
modelo
89
S. Give
Tabela 23. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição antimicrobiana
contra S. Give
Fatores Coeficientes Erro padrão t-valor p-valor Lim. de
conf. -90%
Lim. de
conf. +90%
Média 16,49333
0,586667
28,1136
0,001263
14,7803
18,20639
CaCl
2
(%)(L) -1,21024
0,718517
-3,3687
0,077955
-4,5185
-0,32241
CaCl
2
(%)(Q) -4,94104
0,855206
-11,5552
0,007406
-12,3793
-7,38489
OE cravo(%)(L) 12,65151
0,718517
35,2156
0,000805
23,2050
27,40107
OE cravo(%)(Q) 0,68646
0,855206
1,6054
0,249633
-1,1243
3,87011
CaCl
2
xOE cravo -6,05500
1,016136
-11,9177
0,006967
-15,0771
-9,14290
Tabela 24. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra S. Give
Fonte de variação Soma de
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrado
Médio
F-calc p-valor
CaCl
2
(%)(L) 11,717
1
11,717
11,348
0,077955
CaCl
2
(%)(Q) 137,867
1
137,867
133,523
0,007406
OE cravo(%)(L) 1280,485
1
1280,485
1240,139
0,000805
OE cravo(%)(Q) 2,661
1
2,661
2,577
0,249633
CaCl
2
xOE cravo 146,652
1
146,652
142,031
0,006967
Lack of Fit 214,054
3
71,351
69,103
0,014299
Erro puro
2,065
2
1,033
Total
1821,143
10
R
2
= 0,88133; F
0,90; 4; 6
= 3,18; F-calc = 10,99
Figura 27. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta zona
de inibição antimicrobiana contra S. Give
90
S. Give
Tabela 25. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Salmonella Give –
valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio relativo
Ensaios CaCl2
(%)
OE cravo
(%)
ZI experimental
(mm
2
)
ZI modelo
(mm
2
)
Desvio
(y-y’) *
Desvio
relativo
ZI (%)
3 * 0,0316
0,884 38,71 ± 9,52 27,28 11,43 24,36
A 0,0316
1,0 37,50 ± 7,71 28,70 8,8 30,66
B 0,02 0,884 36,85 ± 6,54 27,42 9,43 25,59
* repetição do ensaio da condição 3 definido pelo planejamento experimental
**desvio=diferença entre os valores obtidos experimentalmente e os valores previstos pelo
modelo
91
S. Enteritidis
Tabela 26. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição antimicrobiana
contra S. Enteritidis
Fatores Coeficientes Erro padrão t-valor p-valor Lim. de
conf. -90%
Lim. de
conf. +90%
Média 15,90667
0,586667
27,1136
0,001357
14,1936
17,61972
CaCl
2
(%)(L) -0,66709
0,718517
-1,8569
0,204459
-3,4322
0,76388
CaCl
2
(%)(Q) -4,67396
0,855206
-10,9306
0,008266
-11,8451
-6,85073
OE cravo(%)(L) 12,98060
0,718517
36,1317
0,000765
23,8631
28,05927
OE cravo(%)(Q) 1,36854
0,855206
3,2005
0,085318
0,2399
5,23427
CaCl
2
xOE cravo -5,54500
1,016136
-10,9139
0,008291
-14,0571
-8,12290
Tabela 27. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra S. Enteritidis
Fonte de variação Soma de
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrado
Médio
F-calc p-valor
CaCl
2
(%)(L) 3,560
1
3,560
3,448
0,204459
CaCl
2
(%)(Q) 123,365
1
123,365
119,478
0,008266
OE cravo(%)(L) 1347,968
1
1347,968
1305,496
0,000765
OE cravo(%)(Q) 10,576
1
10,576
10,243
0,085318
CaCl
2
xOE cravo 122,988
1
122,988
119,113
0,008291
Lack of Fit 193,671
3
64,557
62,523
0,015784
Erro puro
2,065
2
1,033
Total
1840,138
10
R
2
= 0,8936; F
0,90; 4; 6
= 3,18; F-calc = 12,35
Figura 28. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta zona
de inibição antimicrobiana contra S. Enteritidis
92
S. Enteritidis
Tabela 28. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Salmonella
Enteritidis – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio relativo
Ensaios CaCl2
(%)
OE cravo
(%)
ZI experimental
(mm
2
)
ZI modelo
(mm
2
)
Desvio
(y-y’) *
Desvio
relativo
ZI (%)
3 * 0,0316
0,884 37,50 ± 5,11 28,29 9,21 24,56
A 0,0316
1,0 39,53 ± 7,71 30,07 9,46 23,93
B 0,02 0,884 36,85 ± 6,54 28,34 8,51 23,09
* repetição do ensaio da condição 3 definido pelo planejamento experimental
**desvio=diferença entre os valores obtidos experimentalmente e os valores previstos pelo
modelo
93
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Tabela 29. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição antimicrobiana
contra Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Fatores Coeficientes Erro padrão t-valor p-valor Lim. de
conf. -90%
Lim. de
conf. +90%
Média 9,73333
0,546667
17,8049
0,003140
8,1371
11,3296
CaCl
2
(%)(L) -3,57500
0,669527
-10,6792
0,008655
-9,1050
-5,1950
CaCl
2
(%)(Q) -4,74792
0,796897
-11,9160
0,006969
-11,8228
-7,1689
OE cravo(%)(L) 8,29494
0,669527
24,7785
0,001625
14,6349
18,5449
OE cravo(%)(Q) 1,92708
0,796897
4,8365
0,040191
1,5272
6,1811
CaCl
2
xOE cravo -7,15000
0,946854
-15,1026
0,004356
-17,0648
-11,5352
Tabela 30. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
Fonte de variação Soma de
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrado
Médio
F-calc p-valor
CaCl
2
(%)(L) 102,245
1
102,2450
114,0448
0,008655
CaCl
2
(%)(Q) 127,300
1
127,3000
141,9914
0,006969
OE cravo(%)(L) 550,448
1
550,4479
613,9738
0,001625
OE cravo(%)(Q) 20,971
1
20,9712
23,3914
0,040191
CaCl
2
xOE cravo 204,490
1
204,4900
228,0897
0,004356
Lack of Fit 113,183
3
37,7278
42,0818
0,023301
Erro puro
1,793
2
0,8965
Total
1167,743
10
R
2
= 0,80308; F
0,90; 5; 5
= 3,45; F-calc = 9,16
Figura 29. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta zona
de inibição antimicrobiana contra P. aeruginosa ATCC 27583
94
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Tabela 31. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio
relativo
Ensaios CaCl2
(%)
OE cravo
(%)
ZI experimental
(mm
2
)
ZI modelo
(mm
2
)
Desvio
(y-y’) *
Desvio
relativo
ZI (%)
3 * 0,0316
0,884 25,60 ± 3,64 18,25 7,35 28,71
A 0,0316
1,0 26,70 ± 5,11 19,61 7,09 26,55
B 0,02 0,884 26,87 ± 6,54 18,37 8,50 31,63
* repetição do ensaio da condição 3 definido pelo planejamento experimental
**desvio=diferença entre os valores obtidos experimentalmente e os valores previstos pelo
modelo
95
Pseudomonas fluorescens QaF01
Tabela 32. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição antimicrobiana
contra Pseudomonas fluorescens QaF01
Fatores Coeficientes Erro padrão t-valor p-valor Lim. de
conf. -90%
Lim. de
conf. +90%
Média 15,90667
0,586667
27,1136
0,001357
14,1936
17,61972
CaCl
2
(%)(L) -1,21024
0,718517
-3,3687
0,077955
-4,5185
-0,32241
CaCl
2
(%)(Q) -3,77646
0,855206
-8,8317
0,012579
-10,0501
-5,05573
OE cravo(%)(L) 10,18724
0,718517
28,3563
0,001241
18,2764
22,47254
OE cravo(%)(Q) -1,63396
0,855206
-3,8212
0,062168
-5,7651
-0,77073
CaCl
2
xOE cravo -6,05500
1,016136
-11,9177
0,006967
-15,0771
-9,14290
Tabela 33. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra Pseudomonas fluorescens
QaF01
Fonte de variação Soma de
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrado
Médio
F-calc p-valor
CaCl
2
(%)(L) 11,717
1
11,7174
11,3482
0,077955
CaCl
2
(%)(Q) 80,536
1
80,5363
77,9987
0,012579
OE cravo(%)(L) 830,239
1
830,2390
804,0796
0,001241
OE cravo(%)(Q) 15,077
1
15,0766
14,6016
0,062168
CaCl
2
xOE cravo 146,652
1
146,6521
142,0313
0,006967
Lack of Fit 369,678
3
123,2260
119,3434
0,008321
Erro puro
2,065
2
1,0325
Total
1442,580
10
R
2
= 0,7423; F
0,90; 5; 5
= 3,45; F-calc = 2,88
Figura 30. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta zona
de inibição antimicrobiana contra P. fluorescens QaF01
96
Pseudomonas fluorescens QaF01
Tabela 34. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Pseudomonas
fluorescens QaF01 – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio relativo
Ensaios CaCl2
(%)
OE cravo
(%)
ZI experimental
(mm
2
)
ZI modelo
(mm
2
)
Desvio
(y-y’) *
Desvio
relativo
ZI (%)
3 * 0,0316
0,884 32,44 ± 7,71 23,35 8,89 27,40
A 0,0316
1,0 30,34 ± 7,04 24,14 6,20 20,44
B 0,02 0,884 28,97 ± 5,77 23,46 5,51 19,01
* repetição do ensaio da condição 3 definido pelo planejamento experimental
**desvio=diferença entre os valores obtidos experimentalmente e os valores previstos pelo
modelo
97
Pseudomonas fluorescens Lb03
Tabela 35. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição antimicrobiana
contra Pseudomonas fluorescens Lb03
Fatores Coeficientes Erro padrão t-valor p-valor Lim. de
conf. -90%
Lim. de
conf. +90%
Média 14,77333
0,546667
27,0244
0,001366
13,1771
16,36959
CaCl
2
(%)(L) -0,28334
0,669527
-0,8464
0,486460
-2,5217
1,38833
CaCl
2
(%)(Q) -3,54604
0,796897
-8,8996
0,012392
-9,4190
-4,76516
OE cravo(%)(L) 9,47687
0,669527
28,3091
0,001245
16,9987
20,90874
OE cravo(%)(Q) -1,33604
0,796897
-3,3531
0,078598
-4,9990
-0,34516
CaCl
2
xOE cravo -4,77750
0,946854
-10,0913
0,009678
-12,3198
-6,79020
Tabela 36. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra Pseudomonas fluorescens
Lb03
Fonte de variação Soma de
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrado
Médio
F-calc p-valor
CaCl
2
(%)(L) 0,642
1
0,6423
0,7164
0,486460
CaCl
2
(%)(Q) 71,008
1
71,0084
79,2033
0,012392
OE cravo(%)(L) 718,488
1
718,4880
801,4069
0,001245
OE cravo(%)(Q) 10,080
1
10,0800
11,2434
0,078598
CaCl
2
xOE cravo 91,298
1
91,2980
101,8345
0,009678
Lack of Fit 222,078
3
74,0259
82,5691
0,011990
Erro puro
1,793
2
0,8965
Total
1105,839
10
R
2
= 0,79756; F
0,90; 4; 6
= 3,18; F-calc = 5,89
Figura 31. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta zona
de inibição antimicrobiana contra P. fluorescens Lb03
98
Pseudomonas fluorescens Lb03
Tabela 37. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Pseudomonas
fluorescens Lb03 – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio relativo
Ensaios CaCl2
(%)
OE cravo
(%)
ZI experimental
(mm
2
)
ZI modelo
(mm
2
)
Desvio
(y-y’) *
Desvio
relativo
ZI (%)
3 * 0,0316
0,884 34,63 ± 6,87 21,97 12,72 36,73
A 0,0316
1,0 32,78 ± 5,57 22,76 10,02 30,57
B 0,02 0,884 30,87 ± 4,03 22,02 8,85 28,67
* repetição do ensaio da condição 3 definido pelo planejamento experimental
**desvio=diferença entre os valores obtidos experimentalmente e os valores previstos pelo
modelo
99
Pseudomonas putida Kb04
Tabela 38. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição antimicrobiana
contra Pseudomonas putida Kb04
Fatores Coeficientes Erro padrão t-valor p-valor Lim. de
conf. -90%
Lim. de
conf. +90%
Média 14,77333
0,546667
27,0244
0,001366
13,1771
16,3696
CaCl
2
(%)(L) -1,47899
0,669527
-4,4180
0,047604
-4,9130
-1,0030
CaCl
2
(%)(Q) -3,31167
0,796897
-8,3114
0,014169
-8,9503
-4,2964
OE cravo(%)(L) 11,13024
0,669527
33,2481
0,000903
20,3055
24,2155
OE cravo(%)(Q) -0,21917
0,796897
-0,5501
0,637509
-2,7653
1,8886
CaCl
2
xOE cravo -6,59250
0,946854
-13,9251
0,005118
-15,9498
-10,4202
Tabela 39. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra Pseudomonas putida Kb04
Fonte de variação Soma de
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrado
Médio
F-calc p-valor
CaCl
2
(%)(L) 17,499
1
17,4992
19,519
0,047604
CaCl
2
(%)(Q) 61,932
1
61,9321
69,079
0,014169
OE cravo(%)(L) 991,058
1
991,0583
1105,434
0,000903
OE cravo(%)(Q) 0,271
1
0,2713
0,303
0,637509
CaCl
2
xOE cravo 173,844
1
173,8442
193,907
0,005118
Lack of Fit 359,653
3
119,8843
133,720
0,007432
Erro puro
1,793
2
0,8965
Total
1609,302
10
R
2
= 0,7754; F
0,90; 4; 6
= 3,18; F-calc = 5,17
Figura 32. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta zona
de inibição antimicrobiana contra P. putida Kb04
100
Pseudomonas putida Kb04
Tabela 40. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Pseudomonas
putida Kb04 – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio relativo
Ensaios CaCl2
(%)
OE cravo
(%)
ZI experimental
(mm
2
)
ZI modelo
(mm
2
)
Desvio
(y-y’) *
Desvio
relativo
ZI (%)
3 * 0,0316
0,884 39,85 ± 7,25 24,37 15,48 38,85
A 0,0316
1,0 40,03 ± 6,64 25,64 14,39 35,95
B 0,02 0,884 41,68 ± 5,01 24,46 17,22 41,31
* repetição do ensaio da condição 3 definido pelo planejamento experimental
**desvio=diferença entre os valores obtidos experimentalmente e os valores previstos pelo
modelo
101
Pseudomonas putida Ia03
Tabela 41. Coeficientes de regressão para a variável resposta zona de inibição antimicrobiana
contra Pseudomonas putida Ia03
Fatores Coeficientes Erro padrão t-valor p-valor Lim. de
conf. -90%
Lim. de
conf. +90%
Média
14,77333
0,546667
27,0244
0,001366
13,1771
16,3696
CaCl
2
(%)(L)
-1,47899
0,669527
-4,4180
0,047604
-4,9130
-1,0030
CaCl
2
(%)(Q)
-3,31167
0,796897
-8,3114
0,014169
-8,9503
-4,2964
OE cravo(%)(L)
11,13024
0,669527
33,2481
0,000903
20,3055
24,2155
OE cravo(%)(Q)
-0,21917
0,796897
-0,5501
0,637509
-2,7653
1,8886
CaCl
2
xOE cravo
-6,59250
0,946854
-13,9251
0,005118
-15,9498
-10,4202
Tabela 42. ANOVA para a zona de inibição antimicrobiana contra Pseudomonas putida Ia03
Fonte de variação Soma de
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrado
Médio
F-calc p-valor
CaCl
2
(%)(L) 17,499
1
17,4992
19,519
0,047604
CaCl
2
(%)(Q) 61,932
1
61,9321
69,079
0,014169
OE cravo(%)(L) 991,058
1
991,0583
1105,434
0,000903
OE cravo(%)(Q) 0,271
1
0,2713
0,303
0,637509
CaCl
2
xOE cravo 173,844
1
173,8442
193,907
0,005118
Lack of Fit 359,653
3
119,8843
133,720
0,007432
Erro puro
1,793
2
0,8965
Total
1609,302
10
R
2
= 0,7754; F
0,90; 4; 6
= 3,18; F-calc = 5,17
Figura 33. Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta zona
de inibição antimicrobiana contra P. putida Ia03
102
Pseudomonas putida Ia03
Tabela 43. Valores da zona de inibição antimicrobiana (ZI) em mm
2
contra Pseudomonas
putida Ia03 – valores experimentais, previstos pelo modelo, desvios e desvio relativo
Ensaios CaCl2
(%)
OE cravo
(%)
ZI experimental
(mm
2
)
ZI modelo
(mm
2
)
Desvio
(y-y’) *
Desvio
relativo
ZI (%)
3 * 0,0316
0,884 41,69 ± 3,97 24,37 17,32 41,54
A 0,0316
1,0 39,84 ± 7,01 25,64 14,20 35,64
B 0,02 0,884 40,04 ± 2,87 24,46 15,58 38,91
* repetição do ensaio da condição 3 definido pelo planejamento experimental
**desvio=diferença entre os valores obtidos experimentalmente e os valores previstos pelo
modelo
103
8.3
ANEXO 3
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