ads:
Lílian Gonçalves Teixeira
Chá branco (Camellia sinensis) diminui
estresse oxidativo e trigliceridemia em
camundongos com obesidade induzida por
dieta hiperlipídica
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG
Belo Horizonte, MG
2010
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Lílian Gonçalves Teixeira
Chá branco (Camellia sinensis) diminui
estresse oxidativo e trigliceridemia em
camundongos com obesidade induzida por
dieta hiperlipídica
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Bioquímica e
Imunologia do Instituto de Ciências
Biológica da Universidade Federal de
Minas Gerais, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em
Bioquímica e Imunologia
Orientadora: Dra. Jacqueline I. Alvarez-
Leite
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG
Belo Horizonte, MG
2010
ads:
ATA DA DEFESA
AGRADECIMENTOS
A professora Jacqueline I. Alvarez Leite, que aceitou ser minha
orientadora, me direcionou e me proporcionou grande conhecimento durante
esses dois anos.
Aos professores do departamento de bioquímica e imunologia, pelos
ensinamentos compartilhados. E aos funcionários, pelo serviço prestado.
A Maria Helena, essencial no nosso trabalho.
À turma de bases moleculares, pelos momentos de estudos e também
os de diversão.
A Priscilla, que, como aluna de iniciação científica foi muito eficiente e
me ajudou muito nos experimentos e como amiga, presente em todos os
momentos. Agradeço a Nathalia, que começou a me ajudar em um momento
de extrema necessidade. E agradeço também o Rafael, que mesmo não sendo
meu aluno, me ajudou muito nos momentos críticos.
Aos colaboradores do projeto, Solange, Fabíola, Edenil e Tatianna, por
toda a ajuda e companheirismo.
A Analina, o Luciano, a Juliana, a Ana Cecília, a Luciana, a Adaliene e a
Zélia pelos ensinamentos nas técnicas.
Aos amigos do LABiN, que foram como uma segunda família, ajudando
em momentos de trabalho e discussões científicas, em momentos de estresse
e nervosismo e em momentos de alegria e diversão.
Aos outros laboratórios do departamento e de outros departamentos,
pelo socorro em momentos inesperados.
Às instituições financiadoras, CAPES, FAPEMIG e CNPq, pelo incentivo
financeiro.
À Farmácia Galgani, pelo oferecimento do chá branco.
A todos os meus amigos, que, longe ou perto, são essenciais. Muito
obrigada pela amizade e apoio.
A minha família e ao Guilherme, pelo constante incentivo e paciência
nos momentos mais instáveis.
A Nossa Senhora, por sua eterna proteção.
E a Deus, por todas as vitórias conseguidas.
"Para realizar grandes conquistas, devemos não apenas agir, mas também
sonhar; não apenas planejar, mas também acreditar." (Anatole France)
SUMÁRIO
LISTA DE QUADROS
X
LISTA DE TABELAS
XI
LISTA DE FIGURAS
XII
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
XVI
RESUMO
XIX
ABSTRACT
XXI
1. INTRODUÇÂO
22
2. OBJETIVOS
25
2.1. Objetivo geral
26
2.2. Objetivos específicos
26
3. REVISÃO DE LITERATURA
27
3.1. Obesidade
28
Tecido adiposo e adipócito 29
3.2. Estresse Oxidativo
33
Espécies Reativas de Oxigênio 35
Danos das ROS ao organismo 37
Sistema antioxidante 37
3.3. Obesidade e estresse oxidativo
39
3.4. Complicações da Obesidade
41
Desregulação do metabolismo de lipídeos e doenças
cardiovasculares
42
Resistência insulínica e diabetes mellitus tipo 2
45
3.5. Chá branco e outros chás derivados da planta Camellia
sinensis
47
O chá branco 48
Ação das catequinas 56
Chá de Camellia sinensis e obesidade
58
3.6. Modelo experimental de obesidade induzida por dieta
60
Sumário (continuação)
4. MATERIAIS E MÉTODOS
61
4.1. Animais experimentais
62
4.2. Delineamento experimental
62
Modelo de obesidade 62
Suplementação dietética com chá branco (Camellia sinensis)
64
4.3. Controle do peso corporal, consumo líquido e alimentar
65
4.4. Eficiência alimentar
65
4.5. Amostras de sangue
65
4.6. Amostras de tecidos
66
4.7. Avaliação do perfil lipídico
66
Determinação das concentrações de colesterol total 66
Determinação das concentrações de HDL colesterol 67
Determinação das frações aterogênicas e do índice aterogênico 67
Determinação das concentrações de triglicerídeos séricos 67
Extração de lipídeos por solvente orgânico 68
4.8. Avaliação da Glicemia
68
Determinação da glicemia de jejum 68
Teste de tolerância oral à glicose 69
Teste de sensibilidade à insulina 69
4.9. Avaliação do estresse oxidativo
70
Monitoramento da capacidade antioxidante do soro - Dosagem de
dieno conjugado
70
Avaliação da peroxidação lipídica- TBARS (substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico)
71
Dosagem da concentração de hidroperóxidos 72
Dosagem da atividade da enzima antioxidante catalase 73
Dosagem da atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase 73
ELISA para anticorpo de LDL oxidada 74
Sumário (continuação)
4.10. Determinação da Hepatotoxicidade
76
Dosagem de ɣGT
76
4.11. Determinação do infiltrado de macrófagos
76
Dosagem indireta de macrófagos pela determinação da atividade da
N-acetilglicosaminidase (NAG) em tecido adiposo
76
4.12. Avaliação histológica do tecido adiposo
77
4.13. Análise Estatística
77
5. RESULTADOS
79
5.1. O Modelo de Obesidade
80
Ingestão calórica
80
Peso corporal final
80
Adiposidade
81
Parâmetros bioquímicos do soro
83
Estresse oxidativo no fígado
84
Estresse oxidativo no tecido adiposo
85
Infiltrado de macrófagos
86
5.2. O chá branco na obesidade induzida por dieta
hiperlipídica
88
Hepatotoxicidade
88
Ingestão alimentar
89
A. Avaliação do efeito do chá branco na redução do peso
corporal e suas consequências
90
Peso corporal
90
Eficiência alimentar
91
Adiposidade
92
Infiltração de macrófagos no tecido adiposo
95
B. Avaliação do chá branco como agente hipolipidêmico 97
Perfil de lipoproteínas e colesterol total
97
Sumário (continuação)
Trigliceridemia e lipídeos cecais e hepáticos
97
C. Avaliação da ação do chá branco como agente
hipoglicemiante
100
Glicemia de jejum
100
Teste de tolerância oral à glicose
101
Teste de sensibilidade à insulina
102
D. Avaliação do chá branco como antioxidante 102
Tecido adiposo
102
Fígado
104
Soro sanguíneo
106
6. DISCUSSÃO
108
6.1. Do modelo de obesidade
108
6.2. Do efeito do chá branco em relação às suas alegações
populares
114
7. CONCLUSÂO
121
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
123
9. ANEXO
140
9.1. Protocolo de aceitação do CETEA
141
9.2. Composição da dieta comercial Labina®
142
X
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Estudos com o chá branco 50
XI
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Ingredientes da dieta hiperlipídica 63
Tabela 2: Composição Centesimal das Dietas 63
Tabela 3: Composição do chá branco 64
Tabela 4: Parâmetros bioquímicos no soro 83
Tabela 5: Perfil colesterolêmico 97
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Excesso de ingestão energética contribui para inflamação no
tecido adiposo e contribui para desenvolvimento da síndrome energética
29
Figura 2: Infiltração de macrófagos no tecido adiposo, na obesidade 33
Figura 3: Ânion superóxido e seus derivados 34
Figura 4: Relações entre espécies reativas de oxigênio, defesa
antioxidante e estresse oxidativo.
35
Figura 5: Aumento da geração de ROS e consequente estresse oxidativo
na obesidade.
40
Figura 6: Aumento de ROS na obesidade pode contribuir para síndrome
metabólica
41
Figura 7: Representação esquemática do metabolismo de lipídeos 43
Figura 8: Mudanças na secreção de adipocinas decorrentes da
obesidade e desenvolvimento da resistência insulínica.
46
Figura 9: Planta Camellia sinensis
47
Figura 10: Estruturas de catequinas
56
Figura 11: Cinética da formação de dienos conjugados 70
Figuras do modelo de obesidade
Figura 12: Ingestão calórica 80
Figura 13: Peso corporal final 81
Figura 14: Percentual de adiposidade epididimal final 81
Figura 15: Análise histológica do tecido adiposo epididimal 82
Figura 16: Área dos adipócitos 83
Figura 17: Avaliação do estresse oxidativo em fígado 84
Figura 18: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em fígado 85
Figura 19: Avaliação do estresse oxidativo em tecido adiposo 85
Figura 20: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em tecido
adiposo
86
Figura 21: Dosagem indireta da infiltração de macrófagos 87
Figura 22: Aspecto histológico das estruturas tipo coroa 87
Figura 23: Análise quantitativa das estruturas tipo coroa encontradas em
tecido adiposo epididimal
88
XIII
Lista de figuras (continuação)
Figuras do efeito do chá branco em suas alegações populares
Figura 24: Dosagem de ɣGT 89
Figura 25: Consumo calórico e líquido 90
Figura 26: Evolução ponderal 91
Figura 27: Eficiência alimentar 91
Figura 28: Adiposidade epididimal final 92
Figura 29: Análise histológica do tecido adiposo epididimal 93
Figura 30: Área dos adipócitos 94
Figura 31: Lipídeos extraídos do tecido adiposo epididimal 94
Figura 32: Dosagem indireta da infiltração de macrófagos 95
Figura 33: Aspecto histológico das estruturas tipo coroa ao redor dos
adipócitos
96
Figura 34: Análise quantitativa das estruturas tipo coroa encontradas em
tecido adiposo epididimal
96
Figura 35: Dosagem de triglicerídeos séricos 98
Figura 36: Lipídeos extraídos do conteúdo cecal 99
Figura 37: Lipídeos extraídos do tecido hepático 100
Figura 38: Dosagem de glicemia 101
Figura 39: Teste de tolerância oral à glicose 101
Figura 40: Teste de sensibilidade à insulina 102
Figura 41: Dosagem de estresse oxidativo em homogenato de tecido
adiposo
103
Figura 42: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em
homogenato de tecido adiposo
104
Figura 43: Dosagem de estresse oxidativo em homogenato de tecido
hepático
105
Figura 44: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em
homogenato de tecido hepático
106
Figura 45: Fase de latência da formação de dienos conjugados 106
Figura 46: Dosagem de Anticorpo anti-LDL oxidada 107
XIV
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ɣGPNA
Glutamil da gama glutamil p – nitroanilida
ɣGT Gama glutamil transpeptidase
µg
Micrograma
µL
Microlitro
µm
Micrômetro
µg/mL
Micrograma por mililitro
µmol/g Micromol por grama
µmol/L
Micromol por litro
µM
Micromolar
ºC Grau centígrado
∆
Variação
∆E/min/mg Variação de energia por minuto por miligrama de proteína
Abs Absorbância
Abs/min Absorbância por minuto
AG Ácidos graxos
AGE Produtos avançados de glicação
AGL Ácidos graxos livres
AMP Adenosina monofosfato
AO Defesa antioxidante
Apo Apoproteína
BHT Hidroxitolueno butilado
BSA Soro de albumina bovina
CETP Enzima proteína de transferência de ésteres de colesterol
Co-A Coenzima A
CO Grupo experimental que recebeu dieta comercial
Col. Colaboradores
CRP Proteína C reativa
Cu
2+
Íon cuproso
CuCl
2
Cloreto de cobre
db/db Camundongo deficiente para o gene do receptor de leptina
DIF Fator de diferenciação monócito-macrófago
XV
Lista de siglas e abreviaturas (continuação)
DMSO Dimetilsulfóxido
DPPH Capacidade de sequestro de radicais livres
EA Eficiência alimentar
EDTA Ácido etileno diamino tetra-acético
EGCG Epigalocatequina galato
ELISA “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial
Fase lag Fase de latência
Fe
2+
Íon ferroso
Fe
3+
Íon férrico
FOX Solução de xilenol orange e sulfato ferroso
FRAP Poder antioxidante da redução férrica
g Gramas
g/mL Gramas por mililitro
GLUT4 Transportador de glicose tipo 4
GG Glicilglicina
GPX Glutationa peroxidase
H
2
O
2
Peróxido de hidrogênio
H
2
SO
4
Ácido sulfúrico
HL Grupo experimental que recebeu dieta hiperlipídica
HCl Ácido clorídrico
HDL Lipoproteína de alta densidade
HDLc Colesterol em HDL
HOCl Hiperclorito
HPLC Cromatografia líquida de alta performance
HSL Hormônio lípase sensível
IDL Lipoproteína de densidade intermediária
IFNɣ Interferon gama
IL-1β Interleucina 1 beta
IL-4 Interleucina 4
IL-6 Interleucina 6
XVI
Lista de siglas e abreviaturas (continuação)
IL-10 Interleucina 10
IMC Índice de massa corporal
iNOS Óxido nítrico sintase induzível
IRS Substrato do receptor de insulina
JNK Jun quinase
KBr Brometo de potássio
Kcal Quilocalorias
Kcal/g Quilocalorias por grama
Kg Quilogramas
kg/m
2
Quilogramas por metro ao quadrado
LDL Lipoproteína de densidade baixa
LDLc Colesterol em LDL
LPL Lipase lipoproteica
m Metro
M Molar (mol por litro)
mg Miligrama
mg/dL Miligrama por decilitro
mg/kg Miligramas por quilograma de peso
mL Mililitros
mmol/L Milimol por litro
Mm Mili molar
MAPK Proteínas quinases ativadas por mitógenos
MCP-1 Proteína quimiotática de monócitos 1
MDA Malondialdeído
MIF Fator inibitório de macrófagos
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
MTT Brometo de dimetiltiazol-difeniltetrazolium
NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
NAG N-acetilglicosaminidase
NEFA Ácidos graxos não esterificados
NFκB Fator nuclear kapa B
XVII
Lista de siglas e abreviaturas (continuação)
Nm Nanômetro
NOS Óxido nítrico sintase
nNOS Óxido nítrico sintase neuronal
NOx Oxidases dependentes de NADPH
O
2
-
Ânion superóxido
OH
-
Radical hidroxila
ONOO
-
Peroxinitrito
Ob Grupo experimental com obesidade induzida por dieta
Ob + chá Grupo experimental com obesidade induzida por dieta
acrescida de 0,5% de extrato de chá branco
ob/ob Camundongo deficiente para o gene da leptina
OMS Organização Mundial de Saúde
OPAS Organização Panamericana de Saúde
OPD ortofenileno-diamino
ORAC Capacidade de absorbância dos radicais de oxigênio totais
p/v Peso por volume
PAI-1 Inibidor do ativador do plasminogênio 1
PBS Salina tamponada com fosfato
PKC Proteína quinase C
PMSF Fluoreto de fenilmetilsulfonil
PNA p-nitroalanina
PTN Proteína
RBP4 Proteína ligadora de retinol 4
RNA Ácido ribonucléico
ROS Espécies reativas de oxigênio
RPM Rotações por minuto
SAA3 Soro amilóide A3
SOD Superóxido dismutase
SREBP-1 Proteína ligadora do elemento de regulação do esterol
TA Tecido adiposo
TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
XVIII
Lista de siglas e abreviaturas (continuação)
TBA Ácido tiobarbitúrico
TEAC Trolox equivalente oxidante
TG Triglicerídeos
TGF-β Fator de transformação e crescimento beta
TNFα Fator de necrose tumoral alfa
TPP Trifenilfostina
U.A. Unidades arbitrárias
U*g Unidades multiplicado por gramas de tecido adiposo
U/L Unidades por litro
U/mg Unidades por miligrama
VCAM-1 Molécula de adesão vascular 1
VEGF Fator de crescimento do endotélio vascular
VLDL Lipoproteína de densidade muito baixa
v/v Volume por volume
XIX
RESUMO
Alguns estudos sugerem que o chá verde tenha efeitos benéficos na perda de
peso e complicações da obesidade como aterosclerose e diabetes mellitus tipo
2, provavelmente por sua atividade antioxidante. O chá branco, derivado da
mesma planta (Camellia sinensis), possui maior teor de catequinas que o chá
verde e, por isso, tem sido usado popularmente para perda de peso. Porém,
não há relatos consistentes na literatura científica que este efeito realmente
ocorra. Assim, nosso objetivo foi avaliar o efeito da ingestão do chá branco na
evolução da obesidade e suas complicações em camundongos com obesidade
induzida por dieta. Para tanto, criamos um modelo de obesidade associado ao
estresse oxidativo, onde animais C57BL/6 apresentavam aumento do peso, do
percentual de gordura visceral e infiltração de macrófagos neste tecido,
aumento do estresse oxidativo e piora do perfil de lipoproteínas no sangue.
Este modelo foi utilizado, então, para a avaliação dos efeitos da ingestão de
chá branco no ganho ponderal e obesidade. Os animais foram divididos em
grupo obesos (com dieta indutora de obesidade sem suplementação de chá
branco) e grupo chá branco (suplementados com dieta acrescida de 0,5% de
extrato de chá branco) e mantidos nas respectivas dietas por 8 semanas. No
sacrifício, sangue, tecido adiposo, fígado foram coletados. Foram medidos
percentual de tecido adiposo, perfil lipídico e glicêmico, e estresse oxidativo
hepático e de tecido adiposo e infiltração de macrófagos foram calculados.
Nossos resultados não mostraram nenhum efeito do chá branco em reduzir a
ingestão alimentar ou o peso dos animais. Isso foi confirmado pela similaridade
do percentual de adiposidade epididimal (visceral) e do tamanho dos adipócitos
entre os dois grupos. Da mesma forma, não foram vistas alterações no perfil de
lipoproteínas ou homeostase da glicose nos animais recebendo o chá. Por
outro lado, foi observada diminuição dos triglicerídeos séricos, com maior
excreção de lipídeos pelos animais que ingeriram o chá. Animais recebendo o
chá apresentaram também, redução do estresse oxidativo no fígado e tecido
adiposo, independente do aumento da atividade de enzimas antioxidantes. Em
conclusão, a suplementação de chá branco (0,5% na dieta) não foi capaz de
reduzir o peso corporal ou outros parâmetros ligados à obesidade, embora
XX
tenha reduzido o estresse oxidativo e os triglicerídeos séricos. Assim, os
possíveis benefícios do uso do chá podem estar restritos às complicações da
obesidade relacionadas ao estado oxidativo ou alterações dos triglicerídeos
séricos.
Palavras chave: obesidade, estresse oxidativo e chá branco, Camellia
sinensis.
XXI
ABSTRACT
Several studies suggest that green tea has beneficial effects on obesity and its
related complications, mainly due to its antioxidant effects. White tea derivated
of same plant (Camellia sinensis), has higher levels of catechins than green tea
and has been popularly used for weight loss. However, there are no scientific
studies supporting this effect. Our goal was to evaluate the effect of white tea
intake on the obesity development and its complications in obese mice. For
that, we developed a model of diet induced obesity associated to increased
oxidative stress. After 8 weeks receiving such diet, C57BL/6 mice increased
body weight, expansion of visceral fat associated to macrophages infiltration,
increased oxidative stress and worse atherogenic lipoprotein profile when
compared to mice fed chow diet. This model of diet induced obesity was used to
evaluate the effects dietary supplementation of white tea extract in the obesity
development during 8 experimental weeks. After that, mice receiving white tea
free diet or diet plus 0.5% of white tea extract were sacrificed and blood,
perigonadal fat and liver were collected. The percentage of visceral fat,
adipocyte area, macrophage infiltration on perigonadal fat as well as serum lipid
profile and glucose and oxidative stress parameters were studied. The results
did not reinforce beneficial effects of white tea in reducing food intake or body
weight. Moreover, there were no differences on the percentage of visceral fat
and on the adipocyte area between groups. Similarly, no changes were seen in
glucose homeostasis and lipoprotein profile in animals receiving white tea. On
the other hand, a decrease in serum triglycerides associated to increased
excretion of lipids was seen after white tea suplemmentation. Nonetheless,
white tea intake reduced oxidative stress in liver and adipose tissue but not in
the serum. We concluded that dietary white tea extract supplementation (0.5%)
does not influence body weight or other parameters related to obesity. The
possible beneficial effects of this tea are the reduction of oxidative stress and
serum triglycerides in obese mice. Thus, the possible benefits of using tea can
be restricted to the oxidative stress associate complications of obesity or
hytriglyceridemia.
Keywords: obesity, oxidative stress, white tea and Camellia sinensis
Chá branco (Camellia sinensis) diminui estresse oxidativo e triglicerídeos
em camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
22
1. INTRODUÇÃO
Introdução
23
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS, 2009), sobrepeso e
obesidade são definidos como acúmulo excessivo ou anormal de gordura que
apresenta um risco para a saúde. É diagnosticada através do Índice de Massa
Corporal (IMC), que é o peso (em quilogramas) do indivíduo dividido pelo
quadrado da sua altura (em metros). Uma pessoa com um IMC de 25kg/m
2
ou
mais é geralmente considerada com sobrepeso enquanto uma pessoa com um
IMC igual ou superior a 30kg/m
2
é considerada obesa.
A obesidade é fator de risco para diversas doenças como diabetes
mellitus tipo 2 , hipertensão arterial, doenças cardiovasculares, acidentes
vasculares cerebrais e alguns tipos de câncer (Organização Panamericana de
Saúde – OPAS- 2003).
Segundo a OPAS (2003) existem no mundo mais de um bilhão de
pessoas com excesso de peso sendo que, pelo menos 300 milhões desses são
obesos. A obesidade afeta também as crianças, sendo que existem mais de
dezessete milhões de crianças menores de cinco anos obesas.
Segundo o Ministério da Saúde, em 2008, 43,3% da população brasileira
apresentava sobrepeso e 13,0% era obesa. Em Belo Horizonte – Minas Gerais,
44% da população apresentava sobrepeso e 12,1% apresentava obesidade.
A busca por modificações dos fatores de risco predisponentes para a
obesidade é crescente, tanto pelo uso de drogas quanto por mudanças
comportamentais, estando inseridas nesse último item, as alternativas
dietéticas. Sendo assim, fatores dietéticos com alegações de influência no
curso da obesidade, como por exemplo, atuando na perda de peso ou na
diminuição do ganho de peso, atuando como antioxidantes desfavorecendo a
ação de radicais livres ou atuando no metabolismo de lipídeos e glicose para
evitar as complicações da obesidade, sem, contudo, apresentar efeitos
colaterais ao organismo são de grande importância e interesse.
O chá é uma das bebidas mais consumidas atualmente no mundo
(ALCÁZAR et al., 2007; RYU et al., 2006; CHATTOPADHYAY. P. et al., 2004;
WEISBURGER, 1997). Na China, os chás têm sido considerados medicinais
por mais de quatro mil anos (CHENG, 1998).
Introdução
24
A planta Camellia sinensis (C. sinensis) é usada como chá de diversas
maneiras, de acordo com os níveis de fermentação: branco e verde (não
fermentado), oolong (parcialmente fermentado) e preto (fermentado). O poder
antioxidante do chá é maior quanto menos fermentado ele for (CHENG, 2000).
Os chás preto, oolong e verde são feitos a partir das folhas da C.
sinensis. Já o chá branco é um chá não fermentado feito a partir de brotos
jovens da planta. O broto é protegido da luz solar durante seu crescimento para
reduzir a formação de clorofila, dando às plantas jovens uma aparência branca
(ALCÁZAR et al., 2007).
O chá branco, assim como o chá verde, é constituído por polifenóis que
englobam uma gama de substâncias com uma ou mais hidroxilas (RAHMAN,
2006). Os principais polifenóis do chá branco são as catequinas, monômeros
de flavonóides e compostos análogos como epigalocatequina galato,
epigalocatequina, epicatequina galato e epicatequina (RAHMAN, 2006;
VARILEK et al., 2001). Sato e Miyata (2000), estudando os efeitos de chás da
C. sinensis (principalmente chá verde) demonstraram sua capacidade
antioxidante, antimicrobiana, anticarcinogênica, anti-inflamatória e
imunoestimulatória.
Pouco se sabe sobre os efeitos do chá branco, uma vez que os estudos
são derivados do chá verde. Porém, por ter maior concentração de polifenóis
que o chá verde, pode-se prever que, no que diz respeito ao poder
antioxidante, o chá branco terá efeitos mais relevantes que os do chá verde.
Embora o chá branco esteja sendo utilizado popularmente como adjuvante na
perda de peso, a literatura científica é bastante escassa. Assim, neste trabalho,
nosso objetivo é avaliar as possíveis alterações da ingestão do chá branco na
obesidade e no estresse oxidativo induzido pela dieta.
Chá branco (Camellia sinensis) diminui estresse oxidativo e triglicerídeos
em camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
25
2. OBJETIVOS
Objetivos
26
2.1. Objetivo Geral
Avaliar o efeito do chá branco (Camellia sinensis) na evolução ponderal,
síndrome metabólica e status antioxidante em camundongos C57BL/6 com
obesidade induzida por dieta hiperlipídica.
2.2. Objetivos Específicos
Criar e validar um modelo experimental de obesidade induzida por dieta
hiperlipídica.
Verificar se a dose oferecida do chá branco causa hepatotoxicidade aos
camundongos obesos.
Avaliar o efeito do chá branco em camundongos obesos em relação ao
seu peso, adiposidade e eficiência alimentar.
Verificar o efeito do chá branco no perfil lipídico (triglicerídeos, colesterol
total e em HDL e fração aterogênica) em camundongos obesos.
Avaliar o efeito do chá branco na glicemia, através da avaliação dos
níveis de glicose de jejum, e dos testes de sensibilidade à insulina e
tolerância oral à glicose, em animais obesos.
Verificar o efeito do chá branco no estresse oxidativo em tecido adiposo
e hepático em camundongos obesos.
Avaliar a inflamação do tecido adiposo, através da infiltração de
macrófagos.
Chá branco (Camellia sinensis) diminui estresse oxidativo e triglicerídeos
em camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
27
3. REVISÃO DE LITERATURA
Revisão de Literatura
28
3.1. OBESIDADE
A obesidade e o sobrepeso são definidos como acúmulo excessivo ou
anormal de gordura que apresenta um risco para a saúde. É diagnosticada
através do Índice de Massa Corporal (IMC), que é o peso (em quilogramas) do
indivíduo dividido pelo quadrado da sua altura (em metros). Uma pessoa com
um IMC de 25kg/m
2
ou mais é geralmente considerada com sobrepeso. Uma
pessoa com um IMC igual ou superior a 30kg/m
2
é considerada obesa (OMS,
2009).
A obesidade é uma doença multifatorial que envolve fatores genéticos,
endócrinos e comportamentais. Dentre os comportamentais destacam-se a
ingestão excessiva de dietas ricas em gorduras e açúcares e o baixo nível de
atividade física (OPAS, 2003). O aumento da ingestão energética pode ser
decorrente tanto da elevação quantitativa do consumo de alimentos como de
mudanças na dieta que se caracterizam pela ingestão de alimentos com maior
densidade energética, ou pela combinação dos dois. O processo de
industrialização dos alimentos tem sido apontado como um dos principais
responsáveis pelo crescimento energético da dieta da maioria das populações
do ocidente (MENDONÇA e ANJOS, 2004).
O consumo excessivo de ácidos graxos saturados provenientes
principalmente de carnes vermelhas e produtos derivados do leite é altamente
associado com a síndrome metabólica, (KENNEDY et al., 2009) que é um
conjunto de risco para doenças cardiovasculares, resistência insulínica (que
culmina no diabetes mellitus tipo 2), relacionado à obesidade, dislipidemias,
hipertensão (LIEN e GUYNTON, 2008). Além disso, obesidade abdominal,
acúmulo ectópico de gordura, esteatose hepática e apneia do sono são
incluídas nas complicações metabólicas da obesidade (RASSOULI e KERN,
2008).
O consumo energético excessivo leva a um aumento da síntese de
triglicerídeos (TGs) nos adipócitos e com isso ocorre uma expansão do tecido
adiposo em tamanho (hipertrofia) e, em algumas situações, em número
(hiperplasia) dos adipócitos, gerando uma disfunção nestes. Os adipócitos
Revisão de Literatura
29
hipertrofiados secretam agentes pró-inflamatórios que promovem uma
inflamação sistêmica. Além disso, pode ocorrer apoptose de adipócitos,
recrutando macrófagos e neutrófilos. (Figura 1) (KENNEDY et al., 2009).
Figura 1: Excesso de ingestão energética contribui pra inflamação no tecido
adiposo e contribui para desenvolvimento da síndrome energética. Com o
aumento de peso, ocorre hipertrofia e hiperplasia dos adipócitos. Os adipócitos
hipertrofiados secretam diversas citocinas e quimiocinas (IL-1β, TNFα, IL-6, IL-
8) e proteínas de fase aguda como PAI-1 e CRP. Essas atuam levando ao
aumento da inflamação podendo levar às complicações da obesidade como
aterosclerose e resistência insulínica. A desregulação da secreção das
adipocinas, característica da obesidade, também contribui para a evolução
dessas complicações. Além disso, ocorre secreção de MIF e MCP-1, que
atraem macrófagos e neutrófilos para o tecido adiposo, aumentando ainda mais
a inflamação. PAI-1: inibidor do ativador de plasminogênio, CRP: Proteína C
reativa, TNFα: fator de necrose tumoral alfa, IL: interleucina, MIF: Fator
inibitório de macrófagos, MCP-1: proteína quimiotática de monócitos 1, AGL:
ácidos graxos livres, RBP4: Proteína ligadora de retinol 4 (adaptado de
KENNEDY et al., 2009)
Tecido adiposo e adipócito
O tecido adiposo não é composto somente por adipócitos, mas também
por uma fração estromovascular de células. Essa fração consiste de diversa
população de linfócitos, fibroblastos, células endoteliais e estromais e pré-
adipócitos que juntamente com os adipócitos servem como uma grande fonte
de citocinas e adipocinas (O’ROURKE, 2009). O tecido adiposo deve, então,
ser considerado não apenas como órgão de armazenamento de lipídeos, mas
Revisão de Literatura
30
também um órgão imune endócrino, enviando e respondendo sinais que
modulam o apetite, a sensibilidade à insulina, o sistema endócrino e
reprodutivo, o metabolismo ósseo, a inflamação e a imunidade (O’ROURKE,
2009; RAMALHO e GUIMARÃES, 2008).
Na fração estromovascular são produzidos fatores que contribuem para
a adesão celular e para a remodelação da matriz extracelular
(metaloproteinases e VCAM-1) e algumas citocinas (O’ROURKE, 2009).
Os adipócitos possuem propriedades inflamatórias significativas, sendo
sensíveis a sinais inflamatórios mediados por citocinas. Expressam receptores
que lhes permitem detectar a presença de patógenos e de mediadores
inflamatórios. De fato, os adipócitos reagem a diversos mediadores
inflamatórios – IL-1β, IL-4, IL-6, IL-11, IFNɣ e componentes da parede celular
de fungos. Quando ocorre a estimulação desses receptores, são ativados
inúmeros sinais de transdução da cascata inflamatória que induzem a
expressão e secreção de diversas proteínas de fase aguda e mediadores da
inflamação, incluindo TNFα (fator de necrose tumoral alfa), PAI-1 (inibidor do
ativador de plasminogênio 1), IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-15, hepatopoetina
(fator de crescimento dos hepatócitos), SAA3 (proteína soro amilóide A3), MIF
(fator inibitório de macrófagos), haptoglobina, fatores B e C3 do complemento,
prostaglandina E2, TGFβ (fator de transformação e crescimento), MCP-1
(proteína quimotática para monócitos 1), VEGF (fator de crescimento do
endotélio vascular), adipsina, apelina e visfatina, iNOS2 (óxido nítrico sintase
indutível), DIF (fator de diferenciação monócito-macrófago) e possíveis
moduladores inflamatórios como a leptina, a adiponectina e a resistina
(RAMALHO e GUIMARÃES, 2008). As citocinas, quando secretadas pelo
tecido adiposo, são conhecidas como adipocinas e estão envolvidas em
processos fisiológicos como o metabolismo lipídico, a regulação da pressão
sanguínea e a angiogênese (TRAYHURN e WOOD, 2005).
Sendo assim, o aumento do tecido adiposo na obesidade contribui
diretamente para um aumento da inflamação sistêmica (BERG e SCHERER,
2005). Vários estudos estabeleceram uma relação entre o ganho de peso e o
nível de determinadas proteínas inflamatórias (BERG e SCHERER, 2005). A
expressão, produção e liberação de citocinas – principalmente, TNF
α, IL-1, IL-
Revisão de Literatura
31
6, PAI-1, haptoglobina e leptina, encontram-se aumentadas em indivíduos
obesos (TRAYHURN e WOOD, 2005). Algumas exceções são a adiponectina e
a IL-10 cuja produção e níveis circulantes se encontram diminuídos em
indivíduos obesos. A IL-10 aumenta a sua expressão após perda de peso e
inibe a formação de citocinas pró-inflamatórias – IL-1, IL-6 e TNFα, por parte
dos macrófagos. Contudo, a inflamação sistêmica observada na obesidade não
se deve unicamente ao tecido adiposo, mas também a outros tecidos
inflamatórios importantes como o fígado, que libera proteínas de fase aguda
como a proteína C reactiva (PCR), que é secretada em resposta à liberação de
IL-6 pelo tecido adiposo. (RAMALHO e GUIMARÃES, 2008).
O tecido adiposo produz a adiponectina, que, ao contrário da maioria
das citocinas relacionadas ao tecido adiposo, está diminuída em indivíduos
obesos. Ela é capaz de interagir com células imunes, como macrófagos, onde
suprime a produção e secreção de TNFα e IL-6 e com monócitos, aumentado
sua produção de citocinas anti-inflamatórias (GARAULET et al., 2007). Os
níveis de adiponectina relacionam-se inversamente com a diabetes mellitus tipo
2. Ela melhora a sensibilidade à insulina, oxidação da gordura muscular e
dissipação energética. (ROCHA e LIBBY, 2008; JUGE-AUBRY et al., 2005). A
ação sobre a sensibilidade à insulina da adiponectina pode envolver a ativação
da proteína quinase dependente de AMP, conhecida por regular a
concentração celular de malonil-CoA e também por regular a produção de
glicose no fígado, pela diminuição da expressão de enzimas da neoglicogênese
(BASTARD et al., 2006).
A leptina é um fator circulante produzido pelo tecido adiposo que age
central e perifericamente para regular o metabolismo geral e funções
relacionadas à inflamação. É o produto do gene ob e produzida
proporcionalmente à massa de gordura corporal e controla o apetite e gasto
energético através de vias hipotalâmicas. A leptina também modula diversas
respostas imunes e inflamatórias (JUGE-AUBRY et al., 2005); parece ser hábil
para controlar a produção de TNFα e sua ativação por macrófagos, mas os
mecanismos ainda não estão esclarecidos (BASTARD et al., 2006). O
camundongo deficiente para o gene da leptina (ob/ob) e o camundongo
Revisão de Literatura
32
deficiente para o receptor de leptina (db/db) desenvolvem obesidade grave
(ROCHA e LIBBY, 2008).
A resistina é produzida pelo tecido adiposo e está aumentada na
obesidade. Em camundongos, a neutralização da resistina resulta na
diminuição da glicose sanguínea, enquanto sua administração produz
resistência insulínica em condições normoglicêmicas e hiperglicêmicas
(ROCHA e LIBBY, 2008; BASTARD et al., 2006; JUGE-AUBRY et al., 2005).
A proteína ligadora de retinoide 4 (RBP4) é outro produto dos adipócitos
e o maior transportador de retinol pelo sangue. Pode contribuir para resistência
insulínica sistêmica (ROCHA e LIBBY, 2008).
O fator de necrose tumoral alfa (TNFα) está envolvido em processos
inflamatórios, doenças autoimunes, desenvolvimento de tumores e metástases,
replicação viral, choque séptico e febre. TNFα é produzido por diversos tipos de
células do sistema imune como monócitos, linfócitos T e B, células
polimorfonucleares, células tumorais, fibroblastos e células musculares lisas.
Seu envolvimento com o metabolismo do adipócito foi mostrado através da
supressão de diversos genes específicos do tecido adiposo, como a lipase
lipoproteíca, e por estimular a lipólise levando ao decréscimo de triglicerídeos
acumulados no adipócito. Seu papel no desenvolvimento da resistência
insulínica foi descoberto pela sua capacidade em regular negativamente o
transportador de glicose tipo 4 (GLUT4) no tecido adiposo (BASTARD et al.,
2006; JUGE-AUBRY et al., 2005). É um potente regulador local do tecido
adiposo, agindo tanto de forma autócrina como parácrina. Dentro do tecido
adiposo branco, tem papel pivô na produção de citocinas e adipocinas como IL-
6 e proteínas de fase aguda (TRAYHURN e WOOD, 2004).
A proteína quimiotática para monócitos (MCP-1) é usualmente
fracamente expressa, mas pode ser induzida por diversos estímulos como
TNFα. É mediadora da captação de monócitos e tem papel principal na
aterosclerose, onde atrai monócitos para as placas ateroscleróticas. Sua
expressão é aumentada em indivíduos obesos, em relação a indivíduos
normais e possui ação parácrina e autócrina nos adipócitos (JUGE-AUBRY et
al., 2005).
Revisão de Literatura
33
A desregulação da expressão e secreção dessas adipocinas na
obesidade contribui para a infiltração de macrófagos no tecido adiposo
(SCHENK et al., 2008; WELLEN E HOTAMISLIGIL, 2003). O aumento na
secreção de TNFα pode estimular os pré-adipócitos a produzirem MCP-1 e
então, atrair macrófagos para o tecido (WELLEN E HOTAMISLIGIL, 2003). O
aumento da infiltração de macrófagos ativa citocinas pró-inflamatórias como
TNFα e IL-6, que trabalham de forma parácrina para ativar vias inflamatórias
intracelulares nas células vizinhas e de forma endócrina para gerar uma
inflamação de baixo grau generalizada. Essa situação pode culminar na morte
dos adipócitos e em torno desses acumulam-se macrófagos, formando
estruturas tipo coroa. Além disso, ocorre alteração do perfil de adipocinas
produzidas pelo tecido adiposo, com diminuição de adiponectina e aumento de
resistina, que, juntamente com os ácidos graxos livres decorrentes do excesso
de tecido adiposo podem levar à resistência insulínica nos órgãos periféricos e
no tecido muscular (Figura 2) (SCHENK et al., 2008).
Figura 2: Infiltração de macrófagos no tecido adiposo, na obesidade. Com a
expansão do tecido adiposo ocorre aumento da infiltração de macrófagos e da
secreção de adipocinas inflamatórias, que, juntamente com o excesso de
ácidos graxos livres podem culminar em resistência insulínica nos órgãos
periféricos (Adaptado de SCHENK et al., 2008).
3.2. ESTRESSE OXIDATIVO
O termo estresse oxidativo foi primeiramente definido em 1985 e resulta
de um desequilíbrio entre produção excessiva de compostos oxidantes e
Revisão de Literatura
34
produção insuficiente de mecanismos de defesa antioxidante. O estresse
oxidativo pode causar dano aos tecidos e órgãos e está envolvido em grande
número de doenças humanas (BUONOCORE e GROENENDAAL, 2007;
GOETZ e LUCH, 2008).
Um aspecto particularmente destrutivo do estresse oxidativo é a
produção de espécies reativas de oxigênio (ROS - reactive oxygen species),
que incluem radicais livres e peróxidos. ROS são espécies de oxigênio que
estão em um estado mais reativo que o oxigênio molecular, ou seja, o oxigênio
pode ser reduzido em diferentes graus. A ROS primária é o superóxido (Figura
3), que é formado na primeira redução do oxigênio molecular catalisada pela
NADPH oxidase (GENESTRA, 2007).
Figura 3: Ânion superóxido e seus derivados. O ânion superóxido é formado a
partir do oxigênio, pela ação da NADPH oxidase. A partir dele, outras ROS são
formadas e podem atuar de diversas formas, danificando o organismo
(adaptado de AFONSO et al., 2007).
Para proteção contra a ação das ROS e do estresse oxidativo, um
sistema antioxidante bem organizado trabalha de forma coordenada para
resistir aos distúrbios redox. O termo antioxidante é amplamente definido como
qualquer substância que retarda ou evita a oxidação de um substrato. Quando
este é suficiente para evitar ou balancear o ataque das ROS, o organismo evita
o estresse oxidativo (Figura 4) (MONAGHAN et al., 2009; POWERS e
JACKSON, 2008).
Revisão de Literatura
35
Figura 4: Relações entre espécies reativas de oxigênio (ROS), defesa
antioxidante (AO) (incluindo reparação) e estresse oxidativo. (a) Na condição
basal homeostática, os níveis de ROS e antioxidantes (AO) são baixos, com
defesas suficientes para equilibrar a produção de ROS para que não haja
estresse oxidativo. (b) Um aumento na produção ROS pode inicialmente
exceder a capacidade do sistema antioxidante, levando a um período de
estresse oxidativo. (c) Se o aumento de ROS é pequeno, pode ser
compensado pelo aumento da utilização de antioxidantes, impedindo ainda
mais o estresse oxidativo. Se a elevação de ROS é apenas temporária, haverá,
então, um retorno à posição homeostática. (d) A exposição mais prolongada
elevação de ROS pode induzir o organismo permanentemente para aumentar
seus níveis basais antioxidante, tornando-a mais apta a lidar com eventos
futuros oxidativo. (Adaptado de MONAGHAN et al., 2009).
Espécies Reativas de Oxigênio
O radical ânion superóxido (O
2
-
) é produzido em sistemas biológicos
através de uma redução de oxigênio catalisada enzimaticamente. Essa reação
ocorre geralmente nas membranas mitocondriais. É formado principalmente
como um intermediário nas reações bioquímicas. Uma vez gerado, o O
2
-
pode
agir com um radical livre fraco, como elétron redutor ou como elétron oxidante.
Possui uma longa meia-vida que permite a difusão dentro da célula e,
consequentemente, o aumento do número dos alvos potenciais. Como espécie
redox ativo, superóxido pode reduzir alguns materiais biológicos, por exemplo,
Revisão de Literatura
36
citocromo c, e oxidar outros, tais como ascorbato (GOETZ e LUCH, 2008;
POWERS e JACKSON, 2008).
O peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) é um composto reativo que pode
facilmente gerar radicais livres como o radical hidroxil (OH
-
) em circunstâncias
específicas. Pode ser gerado a partir da ação de uma enzima antioxidante, a
superóxido dismutase (SOD). O peróxido de hidrogênio é estável, permeável
às membranas, e tem uma meia-vida relativamente longa no interior da célula.
É citotóxico, mas é considerado um agente oxidante relativamente fraco
(GOETZ e LUCH, 2008; POWERS e JACKSON, 2008). Já os radicais hidroxil
(OH
-
) são altamente reativos com forte poder oxidante. Resultam da
transferência de elétrons entre peróxido de hidrogênio e metais de transição.
São as ROS mais prejudiciais, visto que interagem com biomoléculas
imediatamente após sua geração. Pressupõe-se que o radical OH
-
contribua
para várias doenças e fenômenos biológicos como câncer, envelhecimento,
diabetes mellitus tipo 2 , fagocitose e síndrome de isquemia e reperfusão
(GOETZ e LUCH, 2008; POWERS e JACKSON, 2008).
O oxigênio singlet é outra forma reativa de oxigênio que pode ser gerado
em alguns materiais biológicos. Tem meia vida muito curta, mas é capaz de
difusão e é permeável às membranas. É produzido durante a contração
esquelética muscular, durante o exercício (POWERS e JACKSON, 2008).
O óxido nítrico (NO
-
) é sintetizado a partir de aminoácidos, como a
arginina, por muitos tipos celulares. A síntese ocorre através da óxido nítrico
sintase (NOS), a qual ocorre em três tipos principais: NOS endotelial (eNOS),
NOS neuronal (nNOS) e NOS induzível (iNOS). É um agente redutor fraco,
reage com o oxigênio e com o superóxido, produzindo peroxinitrito (ONOO
-
)
(GOETZ e LUCH, 2008; POWERS e JACKSON, 2008). Esse ou sua forma
protonada (ONOOH) é um forte oxidante e pode levar ao esgotamento de
grupos tiol, danos ao DNA e nitração de proteínas. É classificado como
espécies reativas ao nitrogênio, que inclui também o óxido nítrico (GOETZ e
LUCH, 2008; POWERS e JACKSON, 2008).
O hiperclorito (HOCl) é formado pela ação da mieloperoxidase utilizando
o peróxido de nitrogênio. É predominantemente formado por neutrófilos e pode,
Revisão de Literatura
37
na sua forma ácida (ácido hipocloroso), atravessar membranas celulares e
causar fragmentação e agregação de proteínas (POWERS e JACKSON, 2008).
Danos das ROS ao organismo
As ROS podem causar danos a biomoléculas e ter efeitos sobre a
sinalização celular (GOETZ e LUCH, 2008). Podem causar oxidação de
proteínas e aminoácidos, por inibição de enzimas. Podem induzir mudanças
conformacionais que levam ao aumento da hidrofobicidade e subsequente
desnaturação, agregação e precipitação. Eventualmente, este processo
contribui para a inflamação tecidual e morte celular (GOETZ e LUCH, 2008)
As espécies reativas de oxigênio também podem causar peroxidação
lipídica. A natureza da lesão celular depende do sítio de ação das ROS. Danos
da membrana desencadeiam início da morte celular. Esses danos podem ser
diretos, através da oxidação de ácidos graxos poli-insaturados presentes em
lipídeos, ou indiretamente através da inibição da síntese de lipídeos ou
ativação de lipases (GOETZ e LUCH, 2008).
Danos ao DNA também ocorrem por ação das espécies reativas de
oxigênio. Em condições fisiológicas regulares, o balanço global da quantidade
de dano oxidativo ao DNA foi estimado em 1 por 130.000 modificações de
nucleotídios no DNA. Os danos ao DNA são causados principalmente por
radicais hidroxilas. Ao longo dos últimos anos tornou-se claro que fatores
exógenos como radiação, produtos químicos, dieta com alta ingestão calórica,
altas taxas metabólicas e doenças inflamatórias afetam os níveis de danos
oxidativos ao DNA (GOETZ e LUCH, 2008).
Sistema antioxidante
O organismo contém antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos que
atuam como uma unidade complexa de regulação de ROS (POWERS e
JACKSON, 2008).
Revisão de Literatura
38
A superóxido dismutase (SOD) foi descoberta em 1969 e constitui a
primeira linha de defesa contra os radicais superóxido, transformando-os em
peróxido de hidrogênio e oxigênio (POWERS e JACKSON, 2008).
2O
2
-
+ 2H
+
------→ H
2
O
2
+ O
2
SOD
Existem três isoformas nos mamíferos e todas exigem um metal de
transição (cobre, zinco ou manganês) no sítio ativo para realizar sua ação. A
SOD1 requer cobre e é localizada no citosol e no espaço transmembrana
mitocondrial (POWERS e JACKSON, 2008). Em camundongos, a expressão
aumentada da SOD1 é associada à proteção contra danos cerebrais
decorrentes de isquemia ou doença de Parkinson e sua mutação é associada
com o aumento da apoptose e do dano oxidativo protéico. A SOD1 apresenta
papel central na sobrevivência e crescimento celular (AFONSO et al., 2007). A
SOD2 requer o manganês como cofator e é localizada na matriz da mitocôndria
(POWERS e JACKSON, 2008). Animais nocaute para a SOD2 apresentam
cardiomiopatia letal e neurodegenaração (AFONSO et al., 2007). Já a SOD3
requer cobre e zinco como cofatores e está localizada no espaço extracelular
(POWERS e JACKSON, 2008). Mutações no gene da SOD3 levam a aumento
do risco de doenças cardiovasculares (AFONSO et al., 2007).
A catalase atua em várias funções bioquímicas, mas seu principal
objetivo é catalisar a reação de transformação do peróxido de hidrogênio em
água e oxigênio (POWERS e JACKSON, 2008).
2H
2
O
2
---------------→ 2H
2
O + O
2
Catalase
Precisa que o ferro aja como cofator em seu sítio ativo (POWERS e
JACKSON, 2008). É encontrada nos peroxissomos celulares e no citosol. Essa
enzima também apresenta atividade de peroxidase e reage com peróxidos
orgânicos. A catalase é muito eficaz em altos níveis de estresse oxidativo e
protege a célula do peróxido de hidrogênio intracelular. É especialmente
importante em casos de conteúdo limitado de glutationa ou atividade de
Revisão de Literatura
39
glutationa peroxidase reduzida e tem um papel significativo no desenvolvimento
da tolerância ao estresse oxidativo na resposta adaptativa das células
(WASSMANN et al., 2004).
A glutationa peroxidase (GPX) catalisa a redução de peróxidos de
hidrogênio ou hidroperóxidos orgânicos para água e álcool. Existem 5
isoformas nos mamíferos e é um importante oxidante intracelular para proteger
danos à membrana de lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos (POWERS e
JACKSON, 2008).
Além dessas enzimas, existem numerosos antioxidantes não
enzimáticos nas células como o ácido úrico, bilirrubina, vitamina C e vitamina E
(POWERS e JACKSON, 2008).
3.3. OBESIDADE E ESTRESSE OXIDATIVO
Com o aumento da obesidade ocorre aumento do estresse oxidativo
(YAMATO et al., 2007; FURUKAWA et al., 2004). Tem sido proposto que a
hiperglicemia, a disfunção mitocondrial e a desregulação de enzimas do
sistema redox estão envolvidas na produção celular de ROS na obesidade
(PARK et al., 2007). A hiperglicemia promove geração de ânion superóxido
através da via do poliol, da via da hexosamina, da via da proteína kinase C
(PKC) e da geração de produtos avançados de glicação (AGE - advanced
glycation end-product), resultando em estresse oxidativo (GRATTAGLIANO et
al., 2008; BROWNLEE, 2001).
A disfunção mitocondrial está relacionada a desordens relacionadas a
estresse oxidativo como complicações vasculares, diabetes mellitus tipo 2 ,
doenças neurodegenerativas e senescência celular (HUANG e MANTON,
2004). As enzimas óxido nítrico sintase e NADPH oxidase, que estão
envolvidas na produção de espécies reativas de oxigênio, estão
significativamente aumentadas em indivíduos obesos, o que também poderia
explicar o estresse oxidativo aumentado na obesidade (PARK et al., 2007).
O acúmulo de gordura visceral, devido à alta ingestão de açúcares e
gorduras, causa desregulação das funções do adipócito, incluindo secreção de
adipocinas e citocinas inflamatórias (Figura 5). A secreção desregulada de
Revisão de Literatura
40
adipocinas leva ao aumento da transcrição de genes inflamatórios, ativa as
oxidases dependentes de NADPH (Nox), e potencializa a resistência insulínica.
A resistência insulínica, juntamente com o acúmulo de gordura no fígado
(esteatose hepática), causa um desarranjo das funções das organelas sub-
celulares, aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio que leva, então, a alterações metabólicas como peroxidação lipídica,
LDL oxidada, diminuição de óxido nítrico, e pode culminar em doenças
cardiovasculares, como a aterosclerose, além de diabetes mellitus tipo 2 e
síndrome metabólica (GRATTAGLIANO et al., 2008).
Figura 5: Aumento da geração de ROS e consequente estresse oxidativo na
obesidade. O acúmulo de gordura visceral, devido à alta ingestão de açúcares
e gorduras, causa desregulação das funções do adipócito. A secreção
desregulada de adipocinas ativa as oxidases dependentes de NADPH (Nox), e
potencializa a resistência insulínica. A resistência insulínica, juntamente com a
esteatose hepática, causa um desarranjo das funções das organelas
subcelulares, aumentando a produção de ROS que leva, então, a alterações
metabólicas como peroxidação lipídica, LDL oxidada, diminuição de óxido
nítrico (adaptado de GRATTAGLIANO et al., 2008).
Intervenções que diminuam o estresse oxidativo e a obesidade têm de
ser levadas em conta para diminuição das complicações relacionadas às
mesmas. Entre essas intervenções incluem-se dieta, exercícios físicos,
Revisão de Literatura
41
suplementação nutrição nutricional, agentes farmacológicos e cirurgia bariátrica
(VICENT et al., 2007). A suplementação nutricional é bem vinda por não ter
efeitos colaterais ao paciente.
3.4. COMPLICAÇÕES DA OBESIDADE
Como descrito acima, a obesidade é acompanhada de um estado
inflamatório de baixo grau e de um aumento o estresse oxidativo. O aumento
do estresse oxidativo, juntamente com a inflamação, aumenta o risco para
complicações na obesidade, como as doenças cardiovasculares, a resistência
insulínica e o diabetes mellitus tipo 2 (FURUKAWA et al., 2004) (Figura 6).
Figura 6: Aumento de ROS na obesidade pode contribuir para síndrome
metabólica. Durante a obesidade ocorre aumento da enzima oxidante NADPH
oxidase e diminuição do sistema antioxidante, levando ao aumento da
produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). O aumento das ROS gera
estresse oxidativo no tecido adiposo e nos tecidos periféricos. No tecido
adiposo, ocorre desregulação das adipocinas. Essas alterações aumentam o
risco para resistência insulínica, diabetes e aterosclerose, culminando na
síndrome metabólica. PAI-1: inibidor do ativador do plasminogênio 1; TNFα:
fator de necrose tumoral alfa; MCP-1: fator quimiotático para monócitos
(adaptado de FURUKAWA et al., 2004).
Revisão de Literatura
42
Desregulação do metabolismo de lipídeos e doenças cardiovasculares
Colesterol e triglicerídeos (TG) são ambos essenciais para a integridade
e estrutura da membrana, mas também podem servir como uma fonte de
energia, ou como moléculas sinalizadoras. Devido à sua insolubilidade em
água, o colesterol e os TGs precisam de partículas solúveis em água para fazer
o seu transporte, tal como as lipoproteínas (FRANSSEN et al., 2008).
As lipoproteínas diferem em tamanho e composição. Os quilomícrons
são as lipoproteínas de menor densidade e maior tamanho. As lipoproteínas de
densidade muito baixa (VLDL), intermediária (IDL), e a lipoproteínas de
densidade baixa (LDL) são sucessivamente mais densas, com maiores
proporções de proteínas do que lipídeos. As lipoproteínas de densidade alta
(HDL) são as partículas mais densas e estão envolvidas no transporte reverso
do colesterol (CHAMPE et al., 2007). As lipoproteínas são compostas de
diferentes tipos de lipídeos e de apoproteínas (apo), que são um grupo de
proteínas que possuem diversas funções tais como proporcionar locais para o
reconhecimento de receptores da superfície celular, e servindo como
ativadores ou coenzimas para as enzimas envolvidas no metabolismo das
lipoproteínas. Algumas das apolipoproteínas são exigidas como componentes
estruturais essenciais das partículas e não podem ser removidas enquanto
outras são transferidas livremente entre lipoproteínas. Apolipoproteínas estão
divididas por função e estrutura em cinco grandes categorias, de A a E
(CHAMPE et al., 2007).
Lipoproteínas ricas em TGs são secretadas na circulação pelo sistema
digestivo, como quilomícrons, ou pelo fígado, como VLDL (Figura 7)
(FRANSSEN et al., 2008). Após uma refeição, TGs dietéticos digeridos e
absorvidos pelo intestino são transportados para a circulação como
quilomícrons. Estas partículas transportam os TGs para os tecidos-alvo, tecido
adiposo e muscular, onde podem ser hidrolisados pela enzima lipase
lipoprotéica (LPL) localizada na superfície endotelial. Depois da hidrólise dos
TGs, ácidos graxos livres (AGL) são formados e podem ser levados para o
tecido adiposo para armazenamento energético ou para músculo esquelético
para utilização como fonte de energia. (FRANSSEN et al., 2008; MERKEL et
Revisão de Literatura
43
al., 2006). O fígado também é capaz de produzir TGs a partir de ácidos graxos
e glicerol, sob a influência da insulina. Estes TGs são, então, secretados no
sangue como VLDL. Os ácidos graxos utilizados pelo fígado para formação de
TG são derivados do plasma ou recém-formado no fígado, onde a glicose pode
servir como substrato para a sua síntese. A captação de ácidos graxos
plasmáticos pelo fígado a partir do plasma é impulsionada pelos níveis
plasmáticos de ácidos graxos livres (AGL). Se o fígado estiver captando mais
ácidos graxos do que pode utilizar na formação de VLDL, esses ácidos graxos
excedentes são armazenados no fígado sob forma de gotículas gordurosas. A
insulina também atua no fígado sobre a SREBP-1, uma proteína localizada na
membrana celular de hepatócitos e ativa transcricionalmente genes envolvidos
na lipogênese de novo (FRANSSEN et al., 2008; HORTON et al., 2002).
Figura 7: Representação esquemática do metabolismo de lipídeos. Após uma
refeição, TGs dietéticos são transportados para a circulação como
quilomícrons. Estas partículas transportam os TGs para os tecidos-alvo onde
podem ser hidrolisados pela enzima lipase lipoprotéica (LPL). Depois da
hidrólise dos TGs, ácidos graxos livres (AGL) são formados, e podem ser
levados para o tecido adiposo para armazenamento energético ou para
músculo esquelético para utilização como fonte de energia. O fígado também é
capaz de produzir TGs a partir de ácidos graxos e glicerol, que são, então,
secretados no sangue como VLDL. Os ácidos graxos utilizados pelo fígado
para formação de TG são derivados do plasma ou recém-formado no fígado
por um processo chamado lipogênese de novo. Na lipogênese de novo, a
glicose serve como um substrato para síntese de ácidos graxos. A insulina
também atua no fígado sobre a SREBP-1, que ativa transcricionalmente genes
envolvidos na lipogênese de novo AG: ácidos graxos; LPL: lipoproteína lípase;
NEFA: ácidos graxos não esterificados; SREBP-1: proteína ligadora do
elemento de regulação do esterol (adaptado de FRANSSEN et al., 2008)
Revisão de Literatura
44
A dislipidemia associada à obesidade aumenta o risco para doenças
cardiovasculares e é caracterizada por hipertrigliceridemia, diminuição de
colesterol em HDL (HDLc) e transformação da LDL em um composto mais
aterogênico, a LDL pequena e densa, amplamente envolvida na aterosclerose
(FRANSSEN et al., 2008). Tanto a hipertrigliceridemia como baixo HDL
colesterol são critérios de diagnóstico para a síndrome metabólica (GRUNDY et
al., 2005). O efeito ateroprotetor da HDL é relacionado com o transporte
reverso de colesterol, resultando no transporte de colesterol dos tecidos
periféricos para o fígado (FRANSSEN et al., 2008). O aumento da secreção e
diminuição do clearence de VLDL levando à hipertrigliceridemia contribui para a
diminuição dos níveis de HDL em indivíduos obesos. Além disso, o aumento da
atividade da proteína de transferência de ésteres de colesterol (CETP),
aumentada em indivíduos obesos, também contribui para diminuição da HDLc
por facilitar a transferência de ésteres de colesterol da HDL para lipoproteínas
ricas em TGs e por criar HDL ricas em TGs que são substratos melhores para
o clearence no fígado (FRANSSEN et al., 2008).
Essa desregulação do metabolismo lipídico em indivíduos obesos,
juntamente com o aumento do estresse oxidativo e da inflamação, leva ao
desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como a aterosclerose
(FURUKAWA et al., 2004; STEFFENS e MACH, 2004). Na aterosclerose, altas
concentrações plasmáticas de LDL podem levar à ativação das células
endoteliais. As LDL são também minimamente oxidadas em seus fosfolípides
devido à ação de ROS e do aumento do estresse oxidativo (STEFFENS e
MACH, 2004). A LDL oxidada (LDLox) induz à expressão da proteína
quimiotática para monócitos (MCP-1) pelas células endoteliais e macrófagos, e
do fator estimulador de colônia de macrófagos (M-CSF) pelas células
endoteliais; além de aumentar a expressão de moléculas de adesão as células
endoteliais. Os monócitos são recrutados para a lesão, onde se diferenciam em
macrófagos, dando origem às células espumosas e levando à formação das
placas ateroscleróticas (VORA et al., 1997, WANG et al., 1997). O aumento do
estresse oxidativo decorrente da obesidade induz a formação de LDLox
(VOGIATZI et al., 2009;
PAOLETTI et al., 2006). O aumento da expressão e
secreção de adipocinas pró-inflamatórias, como TNFα e MCP-1, também
Revisão de Literatura
45
contribuem para o desenvolvimento das placas ateroscleróticas. A
desregulação do metabolismo lipídico em obesos é semelhante ao encontrado
em indivíduos com resistência insulínica ou diabetes mellitus tipo 2. De fato, a
resistência insulínica geralmente precede o quadro de dislipidemia em
indivíduos obesos (FRANSSEN et al., 2008).
Resistência insulínica e diabetes mellitus tipo 2
A obesidade é fator de risco para o desenvolvimento de resistência
insulínica e diabetes mellitus tipo 2 (FURUKAWA et al., 2004). A resistência
insulínica é caracterizada por um dano na habilidade da insulina em inibir a
produção de glicose pelo fígado e promover sua captação pelo tecido adiposo
e muscular. Por isso, a resistência insulínica é fator chave para o
desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2 (QATANANI e LAZAR, 2007). O
aumento da glicose sanguínea também é critério de diagnóstico para a
síndrome metabólica (GRUNDY et al., 2005).
O aumento do infiltrado de macrófagos, juntamente com a expansão do
tecido adiposo ocasiona secreção desregulada das citocinas e adipocinas,
favorecendo o quadro inflamatório. (GALIC et al., 2009). A diminuição da
adiponectina decorrente da obesidade leva à diminuição da sensibilidade à
insulina, aumento do influxo de ácidos graxos, diminuição da oxidação de
ácidos graxos, e redução da captação de glicose hepática, enquanto o
aumento da resistina leva a resistência insulínica por diminuir a expressão de
enzimas gliconeogênicas no fígado. O aumento de citocinas inflamatórias,
como a IL-6 também é associado com resistência insulínica e intolerância à
glicose. O TNFα ativa serina quinases como JNK (jun quinase) e MAPK
(Proteínas quinases ativadas por mitógenos), aumenta a fosforilação dos
receptores de substrato da insulina (IRS1 e 2), tornando-os substratos pobres
para a ativação do receptor de insulina-quinases e aumentando a sua
degradação. A JNK, juntamente com a proteína quinase C (PKC), também
pode ser ativadas pelos ácidos graxos livres e seus metabólitos, como acil-CoA
e diacilglicerol, que servem como moléculas sinalizadoras para essa ativação e
estão aumentadas na obesidade. O aumento dos ácidos graxos livres também
Revisão de Literatura
46
está relacionado com o aumento da produção de ROS devido ao aumento da
βoxidação. O aumento do estresse oxidativo pode levar ao aumento da
resistência insulínica também por ativação da JNK ou de forma indireta através
de uma série de eventos transcricionais mediados por NFκB (QATANANI e
LAZAR, 2007).
Além disso, a obesidade leva ao acúmulo ectópico de gordura em
músculos e órgãos e isso está relacionado à resistência insulínica
possivelmente devido ao turnover de triglicerídeos e à produção de moléculas
sinalizadoras derivadas de ácidos graxos ou a ativação de vias intracelulares
deletérias, como as espécies reativas de oxigênio, estresse mitocondrial ou
disfunção do retículo endoplasmático (QATANANI e LAZAR, 2007).
Figura 8: Mudanças na secreção de adipocinas decorrentes da obesidade e
desenvolvimento da resistência insulínica. A expansão do tecido adiposo na
obesidade gera aumento na infiltração de macrófagos e na inflamação com
aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias como TNFα e IL-6. Isso é
acompanhado do aumento da liberação de ácidos graxos livres e da
desregulação da secreção de leptina, adiponectina, resistina e proteína
ligadora de retinol 4. Juntas, essas substâncias derivadas de macrófagos e
adipócitos podem atuar de forma parácrina e autócrina de forma a exacebar a
inflamação no tecido adiposo. Em nível sistêmico, a alteração da secreção de
adipocinas pode levar ao aumento da ingestão alimentar e redução do gasto
energético através de ações hipotalâmicas e diminuir a sensibilidade à insulina
no músculo e no fígado através do acúmulo ectópico de lipídeos e inflamação.
TNF
α: Fator de necrose tumoral alfa; IL-6: Interleucina 6 (adaptado de GALIC
et al., 2009).
Revisão de Literatura
47
Dessa forma, estando o aumento do estresse oxidativo relacionado à
obesidade e às suas complicações, a busca por intervenções nutricionais com
ação antioxidante se torna de grande interesse.
3.5. CHÁ BRANCO E OUTROS CHÁS DERIVADOS DA PLANTA Camellia
sinensis
O chá é uma das bebidas mais consumidas atualmente no mundo
(ALCÁZAR et al., 2007; RYU et al., 2006; CHATTOPADHYAY, et al., 2004;
WEISBURGER, 1997). No Brasil, o consumo de chá é de, aproximadamente,
0,48kg por indivíduo por ano, o que é equivalente a 1,33g por indivíduo por dia
(IBGE, 2004). Na China, os chás têm sido considerados medicinais por mais de
quatro mil anos (CHENG, 1998). Acredita-se que os polifenóis presentes nos
chás sejam os responsáveis por seus efeitos benéficos (RAHMAN et al., 2006;
HIGDON e FREI, 2003). A planta Camellia sinensis (Figura 9) é consumida na
forma de chá e é rica em catequinas (WALTNER-LAW et al., 2002).
Figura 9: Planta Camellia sinensis
Fonte: www.henriettesherbal.com
O diferente processamento da C. sinensis leva aos diversos tipos de
chás produzidos a partir da planta e aos diferentes constituintes flavonóides
dos mesmos. Enzimas polifenoloxidases e catequinas existem em diferentes
Revisão de Literatura
48
camadas na folha da C. sinensis. O processo de fermentação rompe as
camadas permitindo que ocorra oxidação enzimática das catequinas. (HIGDON
e FREI, 2003). As folhas da C. sinensis podem dar origem aos chás preto,
oolong e verde, enquanto seus brotos podem dar origem ao chá branco
(ALCÁZAR et al., 2007; HIGDON e FREI, 2003). Para fabricação do chá preto,
as folhas são enroladas e totalmente oxidadas, levando a formação de
teaflavinas e tearubinas. Para o chá oolong, o tempo de oxidação é menor,
sendo o chá parcialmente fermentado, e mantendo maior quantidade de
catequinas que o chá preto. O chá verde é produzido a partir da folha de C.
sinensis não fermentada, sendo que elas são estufadas para inativar a
polifenoloxidase e preservar suas catequinas (HIGDON e FREI, 2003; CHENG,
2000). Já o chá branco é também um chá não fermentado, feito a partir de
brotos jovens da C. sinensis. O broto pode ser protegido da luz solar durante
seu crescimento para reduzir a formação de clorofila, dando às plantas jovens
uma aparência branca e conservando ainda mais as catequinas (ALCÁZAR et
al., 2007). O poder antioxidante do chá é maior quanto menos fermentado ele
for, visto que terá maior teor de catequinas (CHENG, 2000).
Têm sido demonstrados diversos efeitos benéficos do chá verde para a
saúde como fornecedor da proteção antitumorigênica (MUKHTAR AND
AHMAD, 2000; YANG et al., 2002), antioxidante (KHAN et al., 2007),
hipocolesterolêmico (YANG e KOO, 2000), prevenção de desenvolvimento de
placas ateroscleróticas (CHYU et al., 2004). Demonstrou-se que o chá verde
também tem efeitos antidiabéticos em modelos animais de resistência
insulínica (WU et al., 2004) e promotor do aumento do gasto energético
(DULLOO et al., 1999) e perda de peso (NAGAO et al., 2007). Ainda apresenta
efeitos antibacteriano (STAPLETON et al., 2004), anti-HIV (NANCE e
SHEARER, 2003), antienvelhecimento (ESPOSITO et al., 2002) e anti-
inflamatório (DONA et al., 2003).
O chá branco
O chá branco tem sido utilizado popularmente para diminuição do LDLc,
levando a diminuição do risco de doenças cardiovasculares, para diminuição
Revisão de Literatura
49
dos sintomas do diabetes mellitus tipo 2 , para retardar o envelhecimento, pela
sua ação antioxidante e principalmente, para perda de peso. Porém, os
estudos com essa substância ainda são recentes e não há muitos trabalhos
publicados indicados no PUBMED (Quadro 1). A maioria dos estudos feitos
com chá branco pesquisaram sua composição (MALINOWSKA et al., 2008;
ALCÁZAR et al., 2007; FERRARA et al., 2001), sua ação antitumorigênica
(WANG et al., 2008; ANGER et al., 2005; ORNER et al., 2003; ORNER et al.,
2002; DASHWOOD et al., 2002; SANTANA-RIOS et al., 2001) ou sua ação
antioxidante (SEERAM et al., 2008; KOUTELIDAKIS et al., 2008; CALZUOLA
et al., 2006).
Em relação a sua composição, foi observado que os chás possuem
diferentes composições de minerais de acordo com seu processamento
(FERRARA et al., 2001). MALINOWSKA e col. (2008) em seu estudo
verificaram que a quantidade de fluoreto é menor no chá branco quando
comparado com o chá preto, devido à sua fermentação. ALCÁZAR e col.
(2007) viram que os aminoácidos que mais se diferenciaram entre os chás
eram glutamato, asparagina, serina, alanina, leucina e isoleucina, sendo que o
chá branco apresentou maior quantidade de asparagina e tanino.
Nos trabalhos sobre a ação antitumorigênica do chá branco, SANTANA-
RIOS e col. (2001) observaram que o chá branco apresentou ação
antimutagênica significativamente maior que o chá verde, sendo que os dois
inibem a atividade do receptor βcatenina/TCF4 em células HEK293 devido à
diminuição da expressão da βcatenina (DASHWOOD et al., 2002). O chá
branco diminuiu a formação de tumores intestinais também pela regulação
negativa da βcatenina (ORNER et al., 2003; ORNER et al., 2002). O chá
branco também foi capaz de inibir a via receptor hidrocarbono aril-citocromo
P450, sendo esse outro mecanismo de ação antitumorigênica do chá branco
(ANGER et al., 2005). Wang e col. (2008) demonstraram que o chá branco foi
capaz de diminuir a incidência de câncer de cólon.
A ação antioxidante do chá branco foi demonstrada em um estudo in
vitro onde o chá apresentou uma forte atividade de neutralização do radical
superóxido e alto poder redutor (CALZUOLA et al., 2006). Em um estudo in
vivo, o chá branco aumentou a capacidade antioxidante do soro e do coração
Revisão de Literatura
50
de camundongos (KOUTELIDAKIS et al., 2008). Em outro estudo onde foi
comparado o poder antioxidante de diversas bebidas consumidas nos Estados
Unidos, o chá branco apresentou importantes efeitos antioxidantes, com
valores maiores que de sucos de laranja e maçã e chás preto e verde
(SEERAM et al., 2008).
Apenas um estudo recente foi endereçado à ação do chá branco em
aspectos relacionados aos adipócitos (SÖHLE et al., 2009). Nesse estudo
SÖHLE e col. (2009) utilizaram culturas de adipócitos e pré-adipócitos
humanos e verificaram que o chá branco foi capaz de diminuir a incorporação
de triglicerídeos durante a adipogênese de forma dose dependente, sem afetar
a viabilidade da célula. Além disso, o chá branco diminuiu a expressão mRNA
de fatores também relacionados à adipogênese (PPARγ, ADD1/SREBP-1c,
C/EBPαand C/EBPδ) e aumentou a atividade lipolítica dos adipócitos.
Porém, ao nosso conhecimento, não há estudos in vivo relacionando o
chá branco com a obesidade e suas complicações.
Quadro 1: Estudos com o chá branco
Assunto
Desenho
experimental
Resultados e
Conclusões
Referência
Distribuição de
minerais e
flavonóides
Verificação da
distribuição de
minerais e flavonóides
nos chás verde,
branco e preto, por
HPLC.
Os chás possuem
diferentes
composições de
minerais e
flavonóides de
acordo com seu
processamento.
FERRARA
et al., 2001
Atividade
antimutagênica
A atividade
antimutagênica dos
chás verde e branco
foram testados em
Salmonella
typhimurium estirpe
TA98
Chá branco
mostrou uma
atividade
antimutagênica
significativamente
mais potente que o
chá verde.
SANTANA-
RIOS et al.,
2001
Revisão de Literatura
51
Quadro 1: Estudos com o chá branco (continuação)
Ass
unto
Desenho
experimental
Resultados e
Conclusões
Referência
Ação
antitumorigênica
Células embrionárias
de rins humanos
(HEK293)
transfectadas com o
receptor
βcatenina/TCF4 (a
inibição de tumores no
intestino é relacionada
com a regulação
negativa da expressão
de βcatenina) foram
testadas sob a ação
dos chás verde e
branco.
Os chás branco e
verde inibem a
atividade do
receptor
βcatenina/TCF4 em
células HEK293
devido à diminuição
da expressão da
βcatenina.
DASHWOO
D et al.,
2002
Ação
antitumorigêrica
Verificação da ação do
chá branco combinado
com “sulindac” (agente
anti-inflamatório) em
modelos animais com
tumorigênese
intestinais.
O chá branco
diminuiu a
formação de
tumores intestinais
e a ação foi
potencializada pelo
“sulindac”.
ORNER et
al., 2002
Ação
antitumorigênica
Verificação da
eficiência
antitumorigênica dos
chás verde e branco
(combinado ou não
com “sulindac”, um
agente anti-
inflamatório) em
camundongos
C57BL/6J-Apc
Min/+
, que
produzem
tumorigênese intestinal
Os chás branco e
verde diminuíram a
formação de
tumores intestinais
e a ação foi
potencializada pelo
“sulindac”, pela
regulação negativa
da βcatenina.
ORNER et
al., 2003
Revisão de Literatura
52
Quadro 1: Estudos com o chá branco (continuação)
Assunto
Desenho
experimental
Resultados e
Conclusões
Referência
Ação
antitumorigênica
Quantificação da
atividade da via
hidrocarbono aril -
citocromo P450 (via
hábil a transformar
substâncias inócuas
em sua forma
mutagênica e
tumorigênica) em
microssomos do fígado
de ratos adicionados
de chá branco, verde e
preto.
Os chás branco,
preto e verde
foram capazes de
inibir a via receptor
hidrocarbono aril -
citocromo P450,
sendo esse um
possível
mecanismo de
ação
antitumorigênica.
ANGER et
al., 2005
Atividade
antioxidante
Chá branco e outras
substâncias foram
testados quanto ao
seu poder antioxidante
através de análises de
cinética da atividade
de varredura do radical
superóxido, poder
redutor total.
O chá branco
mostrou uma forte
atividade de
limpeza do radical
superóxido e alto
poder redutor,
mostrando sua
possível atividade
antioxidante.
CALZUOLA
et al., 2006
Conteúdo de
aminoácido
Diferenciação dos
chás branco, verde,
oolong, preto e pu-erh
quanto ao conteúdo de
aminoácidos por
cromatografia líquida.
Os aminoácidos
que mais se
diferenciaram entre
os chás foram
glutamato,
asparagina, serina,
alanina, leucina e
isoleucina. O chá
branco apresentou
maior quantidade
de tanina e
asparagina.
ALCÁZAR
et al., 2007
Revisão de Literatura
53
Quadro 1: Estudos com o chá branco (continuação)
Assunto
Desenho
experimental
Resultados e
Conclusões
Referência
Ação
antitumorigênica
Um teste de
carcinogenicidade
conduzido durante 1
ano em ratos,
induzidos por 2-amino-
1-metil-6-
fenilmidazol[4,5-
b]piridina (PhIP)/dieta
hiperlípidica, ofertando
chá branco (2%p/v)
como única fonte de
líquido.
O chá branco não
foi capaz de reduzir
os tumores na pele,
intestino, glândulas
salivares e
pâncreas, porém
diminuiu a
incidência de
câncer de cólon.
WANG et
al., 2008
Capacidade
antioxidante
Cinco camundongos
receberam chá branco,
por gavagem (0,1mL a
8g/mL) durante cinco
dias. Foi medida a
capacidade
antioxidante do soro e
de homogenatos de
órgãos.
O chá branco
aumentou a
capacidade
antioxidante do
soro e do coração,
mas não teve efeito
nos rins, pulmão,
fígado, cérebro e
baço.
KOUTELID
AKIS et al.,
2008
Atividade
antioxidante
Diversas bebidas
comuns nos EUA,
inclusive o chá branco
gelado (preparação
comercial pronta),
foram comparadas
quanto ao seu poder
antioxidante (Trolox
equivalente
antioxidante (TEAC),
capacidade de
absorbância dos
radicais de oxigênio
totais (ORAC),
capacidade de
sequestro de radicais
livres (DPPH) e poder
antioxidante da
redução férrica (FRAP)
e funcionalidade
antioxidante (inibição
da oxidação de LDL).
O chá branco
gelado comercial
apresentou boa
capacidade
antioxidante,
apesar de
apresentar valores
menores que
vinhos tintos, sucos
de uva, mirtilo,
cereja e açaí.
Porém apresentou
melhores valores
em relação à sucos
de laranja e maçã e
a outros chás
gelados, como o
chá verde e preto.
Os resultados para
inibição da
oxidação da LDL
foram semelhantes.
SEERAM et
al., 2008
Revisão de Literatura
54
Quadro 1: Estudos com o chá branco (continuação)
Assunto
Desenho
experimental
Resultados e
Conclusões
Referência
Dosagem de
fluoreto
Fluoreto foi dosado
nos chás branco,
verde, oolong, preto e
pu-erh.
O chá branco
apresentou menor
dosagem de
fluoreto e o chá
preto a maior,
sendo o chá branco
o mais indicado
visto que o excesso
de fluoreto pode
causar fluorose
esquelética.
MALINOW
SKA et al.,
2008
Proteção contra
luz ultravioleta.
Pele de voluntários
irradiada com luz
ultravioleta foi tratada
com chás verde ou
branco.
A aplicação tópica
de chá verde ou
branco ofereceu
proteção contra
efeitos prejudiciais
da luz ultravioleta.
Assim, tanto o chá
verde como o chá
branco podem ser
usados em
conjugados com
métodos de
proteção solar.
CAMOUSE
et al., 2009
Revisão de Literatura
55
Quadro 1: Estudos com o chá branco (continuação)
Assunto
Desenho
experimental
Resultados e
Conclusões
Referência
Atividade
lipolítica e
indução de
adipogênese
Utilizando cultura de
adipócitos e pré-
adipócitos humanos foi
investigado a ação do
chá branco sobre a
inibição da
incorporação de
triglicerídeos durante a
adipogênese, a
atividade lipolítica, e
sobre a expressão
gênica de fatores
relacionados à
adipogênese.
O chá branco foi
capaz de diminuir a
incorporação de
triglicerídeos
durante a
adipogênese de
forma dose
dependente, sem
afetar a viabilidade
da célula e diminuiu
a expressão mRNA
de fatores também
relacionados à
adipogênese
(PPARγ,
ADD1/SREBP-1c,
C/EBPαand
C/EBPδ). O chá
branco também foi
capaz de aumentar
a atividade lipolítica
nos adipócitos.
SÖHLE et
al., 2009
Atividade
antioxidante
Testes antioxidantes,
antielastases e
anticolagenases em
extratos de 21 plantas.
Chá branco
apresentou
atividade
antielastase e
anticolagenase.
Apresentou
também, maior
quantidade de
compostos
fenólicos em
relação às outras
plantas, e atividade
antioxidante pelo
teste de Trolox e da
superóxido
dismutase
THRING et
al., 2009
Revisão de Literatura
56
Ação das catequinas
Como dito anteriormente, muitos dos efeitos dos chás de C. sinensis são
decorrentes de seu teor de catequinas. Estas são monômeros de flavonóides,
componentes do grupo flavonas, e abrangem vários compostos similares,
epicatequinas, epicatequinas galato, epigalocatequinas e epigalocatequinas
galato (Figura 10) (RAHMAN et al., 2006; HIGDON e FREI, 2003). As
epicatequinas possuem um grupo orto-dihidroxil no anel B nos carbonos 3’ e 4’
e um grupo hidroxil no carbono 3 do anel aromático C. A epicatequina galato
difere da epicatequina por ter um grupo trihidroxil nos carbonos 3’, 4’ e 5’ do
anel B. A epicatequina galato tem um grupo galato esterificado no carbono 3
do anel C, enquanto a epigalocatequina galato possui ambos os grupos
trihidroxil no anel B, como o grupamento galato esterificado no carbono 3 do
anel C (HIGDON e FREI, 2003).
Figura 10: Estruturas de catequinas (adaptado de WALTNER-LAW et al.,2002).
Embora o conhecimento sobre a absorção, biodisponibilidade,
biodistribuição e metabolismo de polifenóis não seja totalmente esclarecido,
parece que alguns polifenóis são bioativos e são absorvidos pelo intestino
(embora em quantidades baixas) em sua forma nativa ou modificados. As
formas absorvidas são metabolizadas e podem ser detectadas no plasma em
faixas nanomolares. Os polifenóis plasmáticos mantêm, em parte, sua
Revisão de Literatura
57
capacidade antioxidante antes de serem excretados. Em geral, a
biodisponibilidade dos flavonóides é baixa devido à sua baixa absorção e
excreção rápida. Todavia, flavonóides glicosilados são absorvidos no intestino
delgado, mas são rapidamente transformados em derivados metilados e
sulfonados. (RAHMAN et al., 2006). No cólon, os flavonóides podem ser
metabolizados por enzimas bacterianas e transformados em metabólitos mais
simples (HIGDON e FREI, 2003).
A biodisponibilidade difere acentuadamente entre os diferentes tipos de
catequinas. A epigalocatequina galato (EGCG) é o único polifenol conhecido
encontrado no plasma, em sua forma livre, em grandes proporções (77-90% da
catequina ingerida). As outras catequinas são altamente conjugadas com
grupos sulfato (RAHMAN et al., 2006).
As catequinas possuem atividade antioxidante que é atribuída aos
grupamentos di e tri-hidroxil nos anéis aromáticos. Essa estrutura aumenta a
capacidade antioxidante dos compostos. A EGCG é a catequina mais eficaz na
remoção de espécies reativas de oxigênio. Além disso, as catequinas têm
capacidade de quelar íons metálicos, impedindo a formação de radicais livres
(RAHMAN, et al., 2006). As catequinas também atuam inibindo a oxidação de
lipoproteínas em macrófagos, catalisada por Cu
2+
(YOSHIDA et al., 1999). Em
um estudo feito com mulheres eutróficas, entre 20 e 39 anos, no qual elas
recebiam durante quarenta e dois dias 2 xícaras de chá verde (contendo
250mg de catequinas cada), houve um aumento significativo da capacidade
antioxidante plasmática total e diminuição dos níveis de peróxidos plasmáticos
(ERBA et al., 2005). Em outro estudo feito com ratos, no qual eles receberam
extrato de chá verde a 3% em água, por 25 dias, houve diminuição da
formação de malondialdeído, um marcador de peroxidação lipídica, no fígado e
nos rins, e diminuição da atividade de superóxido dismutase no intestino e no
fígado (KHAN et al., 2007). Coimbra e col. (2006) verificaram diminuição da
formação de malondialdeído em homens e mulheres saudáveis que ingeriram 1
litro de chá verde por dia, durante 4 meses.
Revisão de Literatura
58
Chás da planta Camellia sinensis e obesidade
A obesidade está relacionada com o metabolismo de lipídeos e
carboidratos e estudos têm sido feitos mostrando a relação do chá verde com o
metabolismo de carboidratos (WU et al., 2004a; WU et al., 2004b; SABU et al.,
2002) e de lipídeos (NEGISHI et al., 2004; RAEDERSTORFF et al., 2003;
MURASE et al., 2002; MIURA et al., 2001).
Em relação ao metabolismo de lipídeos, em um estudo realizado em
ratos, a EGCG, oferecida como 1% de dieta hipercolesterolêmica, foi capaz de
reduzir o colesterol plasmático e hepático totais, aumentar a excreção de
lipídeos e diminuir a absorção de triglicerídeos e colesterol (RAEDERSTORFF
et al., 2003). Murase e col. (2002) observaram resultados semelhantes quando
estudaram camundongos C57BL/6 que recebiam dieta com 30% de lipídeos,
acrescida de 0,5% de extrato de chá verde. Eles observaram que
camundongos que receberam o chá verde apresentaram menor ingestão
energética, diminuição dos triglicerídeos hepático e do colesterol e glicose
plasmáticos e diminuição de enzimas relacionadas ao metabolismo de lipídeos.
Fujita e Yamagami (2008) viram que a suplementação com tabletes de extrato
de chá pretos, por 3 meses, reduziu o colesterol total e LDL colesterol, além de
reduzir o peso, de humanos.
Em relação ao metabolismo de glicose, Sabu e col. (2002) observaram
que o chá verde foi capaz de reduzir a glicose plasmática de ratos tratados com
aloxano. Em outro experimento realizado em ratos normais, o chá verde foi
capaz de reduzir a insulina plasmática e os triglicerídeos plasmáticos no teste
de tolerância oral à glicose (WU et al., 2004a).
Estudos sobre o efeito dos chás das plantas C. sinensis na perda de
peso também já foram realizados. Murase e col. (2002) realizaram um estudo
com camundongos C57BL/6, no qual ofereceram dieta hiperlipídica acrescida
ou não com 0,5% de chá verde, por onze meses, e observaram que o
acréscimo de chá verde foi capaz de diminuir o ganho de peso e a acumulação
de gordura visceral. Em outro estudo, realizado com ratos Wistar, no qual o chá
verde foi oferecido por 6 meses, foi observado menor ganho de peso e menor
tamanho de adipócitos para os animais que receberam o chá verde, em relação
Revisão de Literatura
59
ao controle (MONTEIRO et al., 2008). Em relação a estudos clínicos, um
estudo realizado com mulheres e homens adultos, com Índice de Massa
Corporal (IMC) entre 24 e 30kg/m
2
e/ou circunferência da cintura entre 80 e
94cm, mostrou que o consumo de 340mL de chá verde, contendo 583mg de
catequinas, por 12 semanas, levou à diminuição do peso corporal, IMC, massa
de gordura corporal, área de gordura visceral e subcutânea, além da
diminuição da pressão arterial sistólica e LDL colesterol (NAGAO et al., 2007).
Entretanto, as ações emagrecedoras do chá verde e das catequinas
ainda são controversas na literatura. Não foi observada diminuição do peso
corporal e do percentual de tecido adiposo em um estudo realizado em ratos
Sprague-Dawle com dieta com 35% de lipídeos acrescida de 0,5% de chá
verde por oito semanas (NOMURA et al., 2008). Richard e col. (2009) também
não observaram alterações de peso quando ofertados 2% de chá verde para
camundongos C57BL/6. Em estudos clínicos também é observada a ausência
de ação do chá verde e das catequinas. Em um estudo realizado com mulheres
obesas (IMC maior que 27kg/m
2
), com idade entre 16 e 60 anos, a ingestão de
1200mg por dia de extrato de chá verde em cápsulas, por 12 semanas, não
proporcionou diferença no peso corporal, IMC e circunferência da cintura, bem
como não houve diminuição de colesterol total e triglicerídeos (HSU et al.,
2008). Maki e col. (2009) em seu estudo clínico com indivíduos sobrepeso e
obesos, praticando 3 horas de exercício por dia e ingerindo 625mg de
catequina por dia (500mL de chá verde diários), não observaram diferença na
perda de peso e no percentual de gordura corporal em comparação com os
indivíduos que não ingeriram o chá verde. Em indivíduos eutróficos que
ingeriram chá verde também não foi observada variação no peso (BELZA et al.,
2009).
Em relação ao chá branco, na literatura indicada pelo PUBMED ainda
não existem trabalhos relacionando o chá branco com a obesidade induzida
por dieta em estudos experimentais.
Revisão de Literatura
60
3.6. O MODELO EXPERIMENTAL DE OBESIDADE INDUZIDA POR DIETA
Diversos são os modelos com modificação genética para a indução de
distúrbios relacionados à obesidade. Os camundongos com mutação no gene
para leptina, ob/ob (ZHANG et al., 1994), e no gene para o receptor de leptina,
db/db (TARTAGLIA et al., 1995), apresentam obesidade precoce, com gasto
energético e crescimento linear diminuído, além de apresentar infertilidade. Os
camundongos da espécie Tubby (KLEYN et al., 1996) se caracterizam pela
resistência insulínica e obesidade enquanto os Agouti (BULTMAN et al., 1992)
apresentam excesso de peso, diabetes tipo 2 e hiperleptinemia. Em relação
aos ratos, a espécie Zucker (fa/fa) (NAGGERT et al., 1995), apresenta
hiperfagia, hiperinsulinemia e hiperlipidemia. Porém, embora mutações
genéticas acarretem desenvolvimento de obesidade em animais, elas são raras
em humanos (RANKINEN et al., 2006;
FAROOQI E O’RAHILLY, 2005).
A dieta hiperlipídica pode induzir obesidade e distúrbios metabólicos em
roedores que lembram a síndrome metabólica humana. Entretanto, essa
intervenção dietética não está padronizada e o fenótipo induzido pela dieta
hiperlipídica varia entre os estudos (BUETTNER et al., 2007). Ainda assim, o
modelo de obesidade induzida por dieta é preferível em detrimento dos
modelos com alterações genéticas visto que é necessário que o modelo animal
apresente, não apenas o fenótipo, como também a patogênese semelhante à
doença humana (BUETTNER et al., 2007). Buettner e col. (2007) mostram em
uma revisão sobre modelos animais de obesidade induzida por dieta
hiperlipídica que camundongos C57BL/6 são susceptíveis a esse tipo de
indução e que a banha pode ser utilizada como fonte de lipídeos de forma
eficiente.
Chá branco (Camellia sinensis) diminui estresse oxidativo e triglicerídeos
em camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
61
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos
62
4.1. Animais experimentais
Foram utilizados camundongos C57BL/6, machos, de 4 a 6 semanas de
idade, obtidos no Biotério Central do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais e mantidos no Biotério Ênio Cardillo
Vieira da mesma instituição.
Os animais de todos os grupos tiveram livre acesso à dieta e água e
foram mantidos em gaiolas coletivas (5 animais por gaiola), em ambiente com
ciclos de luminosidade de 12 horas (7:00 às 19:00) e temperatura controlada
(20 a 24
o
C). Os animais foram mantidos em gaiolas de dimensões de
30x20x13cm para até 6 animais.
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética de Experimentação Animal
da UFMG (CETEA/UFMG): n
º
do protocolo 116/2009 (Anexo 9.1).
4.2. Delineamento experimental
Modelo de obesidade
Inicialmente, nosso objetivo foi criar um modelo rápido para estudo de
obesidade e estresse oxidativo. Para isso, os animais foram divididos em dois
grupos homogêneos quanto ao peso, triglicerídeos e colesterol inicial, da
seguinte forma: grupo controle, com dieta comercial (CO; n = 10), e grupo
experimental para indução da obesidade, com dieta hiperlipídica (HL; n = 20).
Para tal, o grupo CO recebeu dieta comercial para roedores Labina® e ao
grupo HL foi oferecida dieta hiperlipídica, com 61% do fornecimento calórico
em forma de gordura (adaptada de AKAGIRI et al., 2008).
A dieta comercial para roedores Labina®, segundo o fornecedor, é
composta de: milho integral moído, cloreto de sódio, aditivo antifúngico
fungistático, cloreto de colina, premix vitamínico mineral, feno de alfafa, fosfato
bicálcico, soja integral moída, calcário calcítico, farelo de soja, farelo de peixe,
farelo de trigo, remoído de trigo e pode apresentar eventuais substitutivos
(Anexo 9.2). A composição da dieta experimental e sua comparação com a
dieta comercial estão descritas nas tabelas 1 e 2.
Materiais e Métodos
63
Tabela 1: Ingredientes da dieta hiperlipídica
a
(em g/kg)
Amido de milho
b
59,19
Caseína 190,93
Óleo de soja
b
19,09
Celulose 47,73
Mistura de minerais 33,41
Mistura de vitaminas 9,55
Cistina (metionina) 2,86
Bitartarato de colina 2,39
BHT 0,01
Banha de porco
b
338,90
Groselha Celli®
c
295,94
TOTAL (g) 1000,00
a
Adaptado de AKAGIRI et al., 2008.
b
Composição segundo PHILIPPI, 2002.
c
Composição fornecida pelo fabricante.
Tabela 2: Composição Centesimal das Dietas
Comercial
a
Hiperlipídica
Carboidrato 50,3% 24,5%
Proteína 41,9% 14,5%
Gordura total 7,8% 61,0%
Calorias / g dieta 2,18kcal/g 5,21 kcal/g
a
Composição fornecida pelo fabricante da ração comercial Labina®
Materiais e Métodos
64
O experimento com tratamento dietético decorreu por oito semanas e
ao final desse período, após anestesia e jejum de 12 horas, os animais foram
sacrificados por exaguinação da artéria femoral seguido por deslocamento
cervical.
Suplementação dietética com chá branco (Camellia sinensis)
Para o estudo dos efeitos do chá branco na evolução da obesidade e
suas complicações, os animais foram divididos em dois grupos homogêneos
quanto ao peso, triglicerídeos e colesterol inicial, da seguinte forma: grupo
obeso controle (Ob; n = 25) e grupo obeso com chá branco (Ob + chá; n = 25).
A dieta oferecida foi a hiperlipídica, com 61% do fornecimento calórico em
forma de gordura (adaptada de AKAGIRI et al., 2008), já citada acima. Aos
grupos que receberam chá branco, esse foi acrescido na proporção de 0,5% do
total de dieta.
A composição do chá foi determinada pelo fornecedor chinês e encontra-
se no quadro abaixo:
Tabela 3: Composição do chá branco
Componente Porcentagem
Polifenóis totais 91,3%
EGCG 33,9%
Cafeína 7,3%
L-tanino 1,3%
As dietas foram oferecidas durante as oito semanas experimentais e ao
final desse período, após anestesia e jejum de 12 horas, os animais foram
sacrificados, por exaguinação da artéria femoral.
Materiais e Métodos
65
4.3. Controle do peso corporal, do consumo líquido e alimentar
Semanalmente, os camundongos foram pesados para observar o
crescimento ponderal. Foi quantificado o consumo semanal de água,
verificando a quantidade oferecida aos animais e a quantidade restante.
Foi feita, semanalmente, a quantificação do consumo alimentar. Para
isso, as dietas ofertadas aos animais foram pesadas. Foi quantificado o
restante de dieta ofertada e seus restos no fundo da gaiola através da
peneiração da maravalha. A diferença entre dieta ofertada e o restante não
consumido de dieta e de restos no fundo da gaiola forneceu o consumo de
dieta semanal. Para o cálculo do consumo calórico, o consumo por animal por
dia foi multiplicado pela densidade calórica da dieta.
4.4. Eficiência alimentar
Com a finalidade de analisar a capacidade do animal converter em peso
corporal a energia alimentar consumida, foi realizado o cálculo da eficiência
alimentar (EA). Este cálculo foi obtido dividindo-se a soma do ganho do peso
semanal (g), dos animais de cada gaiola pelo total de energia ingerida (kcal),
por gaiola, multiplicado por 100 (NASCIMENTO, 2006). A energia ingerida foi
calculada multiplicando-se a quantidade ingerida de alimento pela densidade
calórica da dieta.
4.5. Amostras de sangue
As amostras de sangue foram retiradas após jejum de 8 a 12 horas. No
início do experimento, o sangue foi retirado pela veia caudal através de
capilares com anticoagulante contendo antiglicolítico (Glistab, Labtest,
composto de EDTA 6g/L e fluoreto de potássio 12g/L) para análise da glicemia,
e sem anticoagulante para análises de colesterol e triglicerídeos. Ao término do
experimento, os animais foram anestesiados intraperitonealmente com uma
solução de ketamina (70 mg/kg) e Xilazina (11,5 mg/kg) (preconizado pelo
CETEA da Universidade Federal de Minas Gerais) e foram sacrificados por
Materiais e Métodos
66
exanguinação pela artéria femoral. Posteriormente, o sangue foi centrifugado a
6.000rpm durante 5 minutos em centrífuga de mesa Fanem Centrimicro 243
para separação do plasma ou do soro. As amostras de soro ou plasma foram
armazenadas à –75ºC para posteriores análises.
4.6. Amostras de tecidos
Ao final do tratamento, o fígado e o tecido adiposo epididimal dos
animais foram retirados, perfundidos com salina tamponada com fosfato (PBS)
e acondicionados a -75ºC para as análises posteriores. Antes de ser
armazenado, o tecido adiposo foi pesado para cálculo da porcentagem de
adiposidade epididimal. O ceco também foi retirado para uso do conteúdo
cecal. Esse foi seco em estufa a 60
o
C e armazenado a -75ºC para as análises
posteriores.
4.7. Avaliação do perfil lipídico
Determinação das concentrações de colesterol total
As concentrações de colesterol foram medidas de acordo com o método
da colesterol oxidase (ALLAIN et al., 1974) utilizando kit comercial Labtest,
Brasil. O método consiste na hidrólise de ésteres de colesterol pela colesterol
esterase produzindo colesterol livre. Este, em presença da colesterol oxidase e
de oxigênio, produz peróxido de hidrogênio que, pela ação da peroxidase em
presença de fenol e 4-aminoantipirina, produz um composto róseo-
avermelhado com absorção máxima de 500nm.
As concentrações de colesterol no soro ou plasma dos animais foram
determinadas por um ensaio em microplaca de 96 poços, de acordo com Fazio
e col. (1997). 5µL das amostras de soro foram diluídas em água deionizada
(1:200), afim de que as leituras de absorbância fossem adequadas à variação
linear do teste. 100µL de reagente de colesterol total foram adicionados a
100µL do soro diluído. Após um período de incubação de 15 minutos a 37º C a
Materiais e Métodos
67
absorbância foi lida a 492nm em um leitor de microplaca (Modelar Devices,
modelo Spectra Max Plus).
Determinação das concentrações de HDL colesterol
As concentrações de HDL-colesterol no soro foram obtidas por meio do
kit enzimático Labtest, Brasil, cujo princípio se baseia na precipitação seletiva e
quantitativa das lipoproteínas LDL e VLDL pelo ácido fosfotúgstico e cloreto de
magnésio. Após centrifugação (12.000rpm por 4 minutos), o colesterol ligado
às lipoproteínas de alta densidade (HDL) é determinado no sobrenadante.
O sobrenadante foi plaqueado (10µL) em duplicata em uma microplaca
de 96 poços, em seguida, adicionados a 200µL do reagente de cor Colesterol
Liquiform - Labtest (Brasil). Após incubação de 15 minutos a 37º C, a
absorbância foi lida a 492nm.
Para a determinação do padrão foram substituídos 10µL de
sobrenadante de amostra por 10µL de padrão de HDLc. Para o cálculo das
concentrações de HDLc foi feita a determinação do fator de Calibração através
da seguinte equação: F (Fator de calibração) = 40/média da Absorbância do
Padrão; HDLc (mg/dL) = Absorbância da amostra x Fator de calibração.
Determinação das frações aterogênicas e do índice aterogênico
O colesterol das frações aterogênicas (LDLc, VLDLc e IDLc) foi
calculado pela diferença entre o colesterol total e a HDLc. O índice aterogênico
foi calculado pela razão entre a fração não aterogênica e o HDLc.
Determinação das concentrações de triglicerídeos séricos
As concentrações de triglicerídeos séricos foram medidas de acordo
com o método enzimático colorimétrico (FOSSATI e PRENCIPE, 1982),
utilizando kit comercial Doles, Brasil. O método consiste na hidrólise dos
Materiais e Métodos
68
triglicerídeos do soro pela lipase lipoprotéica produzindo glicerol livre. Esse é
fosforilado pela glicerol quinase, cujo produto sofre a ação da glicerol fosfato, o
qual, em presença de oxigênio, produz peróxido de hidrogênio. Este, sob ação
da peroxidase em presença de um reagente fenólico (4-clorofenol) e 4-
aminoantipirina, produz um composto róseo avermelhado, com máximo de
absorção a 510nm. As dosagens e a curva padrão foram feitas em
microplacas. A diluição utilizada foi de 5µL de soro em 245µL de água
deionizada.
Extração de lipídeos por solvente orgânico
A extração de lipídeos por solvente orgânico (FOLCH et al., 1956), foi
feita, resumidamente da seguinte forma: 100mg de tecido foram
homogeneizados, em tubo de vidro, com 1900µL solução clorofórmio:metanol
(2:1). Foram acrescentados 400µL de metanol, jato forte, e centrifugados a
3000rpm, por 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para tubo previamente
pesado e acrescidos de 800µL de clorofórmio e 640µL de NaCl 0,73%, jato
forte. Após homogeneização lenta, os homogenatos foram centrifugados
durante 5 minutos, a 3000rpm. A fase superior foi desprezada e a parede do
tubo foi lavada 3 vezes com 600µL solução de Folch (3% de clorofórmio, 48%
de metanol, 47% de água destilada e 2% de NaCl 0,2%) e colocados para
secar em estufa, a 60º. A quantidade de lipídeos extraída foi calculada por
diferença de peso.
4.8. Avaliação da Glicemia
Determinação da glicemia de jejum
As concentrações de glicose no plasma foram dosadas por meio do kit
enzimático Labtest, Brasil. O princípio se baseia na oxidação da glicose a ácido
glucônico, pela ação da glicose oxidase, com liberação de peróxido de
hidrogênio. Este, pela ação da peroxidase em presença de fenol e 4-
Materiais e Métodos
69
aminoantipirina, produz um composto róseo-avermelhado com absorção
máxima de 520nm.
O sangue foi separado utilizando anticoagulante contendo antiglicolítico
(Glistab, Labtest, composto de EDTA 6g/L e fluoreto de potássio 12g/L), sendo
2µL de plasma transferidos para uma microplaca de 96 poços e adicionados a
200µL do reagente de cor, em duplicata. Após incubação de 15 minutos a 37º
C, a absorbância foi lida a 492nm em leitor de microplaca (Thermo Plate).
Para a determinação do padrão foram substituídos 2µL amostra por 2µL
de padrão. Para o cálculo das concentrações de glicose em mg/dL foi utilizada
a fórmula, indicada pelo Kit Labtest: Média da absorbância da amostra / média
da absorbância do padrão x 100.
Teste de tolerância oral à glicose
O teste de tolerância oral à glicose, juntamente com o teste de
sensibilidade à insulina, é usado para estimar a resistência insulínica, e foi
realizado conforme descrito anteriormente por Santos e col. (2008). Os
animais foram deixados em jejum, por 6 horas. Em seguida, os animais
receberam solução de D-glicose, 2g/kg de peso corporal, por gavagem. Foi
feita a leitura da glicemia, com auxílio de um glicosímetro Advantage, nos
tempos 0, 15, 30, 60 e 120 minutos após a gavagem. Para tal, foi retirada uma
gota de sangue caudal. A glicemia foi dada em mg/mL.
Teste de sensibilidade à insulina
O teste de sensibilidade à insulina, juntamente com o teste de tolerância
oral à glicose, é usado para estimar a resistência insulínica, e foi realizado
conforme descrito anteriormente por Santos e col. (2008). Com os animais em
estado alimentado, foi injetado intraperitonealmente 0,75 unidades de insulina
por kg de peso do animal. Foi feita a leitura da glicemia, com auxílio de um
glicosímetro Advantage, nos tempos 0, 15, 30 e 60 minutos após a injeção.
Materiais e Métodos
70
Para tal, foi retirada uma gota de sangue caudal. A glicemia foi dada em
mg/mL.
4.9. Avaliação do estresse oxidativo
Monitoramento da capacidade antioxidante do soro - Dosagem de dieno
conjugado
A oxidação de componentes do soro é um processo mediado por
radicais livres, no qual, ácidos graxos poli-insaturados são degradados em um
processo de peroxidação lipídica, dando origem a uma variedade de produtos
altamente reativos, tais quais hidroperóxidos lipídicos, aldeídos e dienos
conjugados, entre outros (ESTERBAUER et al., 1992).
O perfil cinético da peroxidação lipídica pode ser dividido em três fases:
a fase de latência (fase lag), a fase de propagação e a fase de decomposição.
Na primeira fase, os antioxidantes são consumidos, sem ocorrer uma oxidação
significativa de ácidos graxos. Logo após a depleção de antioxidantes há a fase
de propagação e então os ácidos graxos são rapidamente oxidados formando
dienos conjugados. Na fase de decomposição os níveis de dienos caem
lentamente. O tempo de latência tem sido utilizado como critério para avaliação
da resistência à oxidação lipídica e para a avaliação da suscetibilidade dos
lipídeos séricos à oxidação (SCHNITZER et al.,1998). Um exemplo do gráfico
de cinética é mostrado na Figura abaixo:
Figura 11: Cinética da formação de dienos conjugados, gráfico plotado em
absorbância (nanômetro) por tempo (minutos)
Materiais e Métodos
71
Amostras séricas foram diluídas em salina tamponada com fosfato
(PBS), pH 7,4, na proporção de 1:100, sendo adicionada uma solução de CuCl
2
a 1 mmol/L até a concentração final de 30 µmol/L. Em seguida, as amostras
foram incubadas a 37º C e monitoradas espectrofotometricamente a 245 nm
durante uma hora (SCHNITZER et al.,1998).
Avaliação da peroxidação lipídica- TBARS (substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico)
A geração de radicais livres e a peroxidação lipídica são reações
extremamente rápidas, que são, geralmente, mensuradas pelos seus produtos,
principalmente as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), entre
as quais o malonaldeído é o principal. A formação do malonaldeído, pela
quebra de ácidos graxos poli-insaturados, é um método conveniente para se
determinar o grau de peroxidação lipídica.
A mensuração dos metabólitos, reativos ao ácido tiobarbitúrico, foi
realizada em microplacas pelo método descrito por Wallin e col. (1993). Os
tecidos (100mg de tecido acrescido de 1,0mL de PBS) foram triturados com um
homogeneizador (Euro Turraz T20b, IKA labortechnik) e mantidos em gelo. O
volume de 500µL do homogenato de cada amostra foi colocado em tubos de
ensaio e adicionado 1mL de solução contendo ácido tricloroacético (TCA 15%),
ácido tiobarbitúrico (TBA 0,0375%) e ácido clorídrico (HCL 0,25 N). As
amostras foram mantidas em banho-maria fervente por 15 minutos e então
colocadas sob água corrente até esfriarem. Foi adicionado aos tubos 1,5mL de
álcool butílico, e os tubos foram vigorosamente agitados. Após centrifugação a
3000rpm, por 10 minutos, o sobrenadante foi recolhido e plaqueado em
duplicata e a leitura realizada a 535nm. O resultado foi normalizado por
dosagem de proteínas pela técnica de Lowry (1951), segundo o qual a
concentração de proteínas nas amostras é calculada através de uma curva
padrão, feita com albumina.
Materiais e Métodos
72
Dosagem da concentração de hidroperóxidos
O ensaio da oxidação ferrosa do xilenol orange consiste basicamente na
oxidação de íons ferrosos (Fe
2+
) a férricos (Fe
3+
) sob condições ácidas pelos
hidroperóxidos (NOUROOZ-ZADEH et al., 1994; BANERJEE et al., 2002). O
indicador utilizado é o Xilenol Orange, que se liga ao íon férrico produzindo um
cromóforo azul-arroxeado. Os homogenatos preparados para a técnica de
TBARS foram centrifugados a 12000rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi
utilizado para análise de hidroperóxido. A mensuração foi realizada em
microplaca. No momento da realização do ensaio, uma parte da solução FOX
(preparado pela dissolução do xilenol orange e do sulfato ferroso amoniacal em
250mM de H
2
SO
4
para uma concentração final de 1 e 2,5mM, respectivamente)
foi diluída em nove partes da solução de metanol grau-HPLC contendo 4,4mM
de BHT, obtendo-se o reagente FOX-2.
Para as dosagens foram retirados 20µL do sobrenadante do
homogenato preparado para a análise de TBARS e, acrescidos a este 180µL
do reagente para FOX-2, diretamente na microplaca, em duplicata. Para fazer o
branco foram utilizado 20µL de água deionizada no lugar do homogenato. Em
seguida, as placas foram mantidas em temperatura ambiente por 30 minutos.
Posteriormente a absorbância foi lida a 560nm em um leitor de microplaca
(Modelar Devices, modelo Spectra Max Plus).
Adicionalmente, foi realizada a redução dos hidroperóxidos com
Trifenilfostina (TPP). A TPP é utilizada como eficiente ferramenta para distinção
entre peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos (não-H
2
O
2
), já que a presença
ou a ausência de TPP indica o teor de H
2
O
2
da amostra (NOUROOZ-ZADEH et
al., 1994; BANERJEE et al., 2002).
Em 15µL do sobrenadante do homogenato preparado para a análise de
TBARS foram adicionados 5µL de TPP a 10mM (a TPP foi diluída em metanol),
diretamente na microplaca, em duplicata e mantida em temperatura ambiente
por 30 minutos. Logo após, foram acrescidos 180µL do reagente para FOX-2
em cada poço. Para fazer o branco foram utilizados 15µL de água deionizada
no lugar do homogenato. Em seguida, estas misturas foram mantidas em
Materiais e Métodos
73
temperatura ambiente por 30 minutos. Posteriormente, a absorbância foi lida a
560nm em um leitor de microplaca (Modelar Devices, modelo Spectra Max
Plus).
O Xilenol Orange ao se ligar aos íons férricos, produz um cromóforo
azul-arroxeado com coeficiente de extinção de 1,5 x 10
-4
M
-1
a 560nm. A
concentração de hidroperóxidos pode ser estimada uma vez que o coeficiente
de extinção dos hidroperóxidos é de 4,3 x 10
-4
M
-1
a 560nm. Concentrações
inferiores a 1µM podem ser detectadas.
Para quantificar os hidroperóxidos da amostra foram subtraídas as
dosagens com TPP daquelas sem TPP (sem TPP - com TPP = quantidade de
hidroperóxidos da amostra) que pode ser expressa em absorbância ou em
µmolar. O resultado foi normalizado por dosagem de proteínas pela técnica de
Lowry e colaboradores (1951).
Dosagem da atividade da enzima antioxidante catalase
A dosagem da atividade de catalase se baseia no decaimento da
absorbância do peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) – (Abs
240
) pela metabolização
deste pela catalase (2H
2
O
2
2H
2
O
+ O
2
) (NELSON e KIESOW, 1972).
Resumindo, 25µL de homogenato de fígado em tampão fosfato (50mM) diluído
(1:25) foi acrescentado a 1mL de tampão fosfato 50mM em uma cubeta de
quartzo. Para o tecido adiposo, o homogenato não foi diluído. Foram
acrescidos 25µL de solução de H
2
O
2
a 0,3M e lida a absorbância (Abs
240
)
durante 1 minuto. Os cálculos foram feitos pela diferença de leitura no tempo
final pelo tempo inicial, dividido pelo volume (mL) da amostra. O resultado é
expresso por concentração de proteína (mg/mL), dosada pelo método de Lowry
(1951).
Dosagem da atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase
A dosagem da atividade da superóxido dismutase (SOD) é baseada na
sua habilidade de limpar o radical O
2
-
, diminuindo a razão de auto-oxidação do
Materiais e Métodos
74
pirogallol (adaptado de DIETERICH et al., 2000). Resumindo, 30µL de
homogenato de tecido em tampão fosfato (50mM) foram plaqueados em placa
de 96 poços e acrescidos de 99µL de tampão fosfato, 6µL de MTT (brometo de
dimetiltiazol-difeniltetrazolium) e 15µL de pirogallol. Para o branco, o pirogallol
foi substituído por tampão fosfato e para o padrão, a amostra foi substituída por
tampão fosfato. Após 5 minutos de incubação a 37ºC, a reação foi parada com
150µL de DMSO (dimetil sulfóxido) e a absorbância foi lida a 570nm. Para o
cálculo do resultado foi considerado que 1 unidade (U) de SOD era capaz de
evitar a auto-oxidação de 50% de pirogallol do padrão. O resultado foi expresso
em Unidades por mg de proteína.
ELISA para anticorpo de LDL oxidada
1. Separação da LDL
Após a coleta de 10mL de sangue de indivíduo saudável (voluntário) não
fumante, em tubo vacutainer com EDTA 10%, procedeu-se a centrifugação a
3000rpm por dez minutos, em centrífuga de mesa (Fanem Excelsa Baby, mod.
205N). O soro foi coletado e adicionado os conservantes: aprotinina,
benzamidina, azida sódica 5% com EDTA 5% e clorafenicol 0,1%, PMSF
0,5mM em DMSO. O soro teve sua densidade elevada para 1,21 com solução
de Brometo de potássio (KBr). Três mililitros deste soro foram colocados em
tubos de polipropileno, com volume total de 10mL, próprios para ultracentrífuga
Sorvall Ultra pro-80/Du Pont, utilizando o rotor 875T. Após o soro, foi
adicionada a solução de KBr de densidade 1,006 até completar o volume total
do tubo, formando assim o gradiente descontínuo de densidade de duas
camadas. Os tubos devidamente equilibrados foram colocados para
centrifugação por duas horas e meia a 50.000rpm e 4
0
C, para separação das
lipoproteínas. Terminada a rodada, foi retirada a camada composta pela LDL e
a amostra foi submetida à diálise em solução de tampão fosfato (PBS), por um
período de vinte e quatro horas a 4
0
C, com três trocas do tampão. Em seguida,
o material foi filtrado e guardado estéril em atmosfera de nitrogênio a 4
0
C, em
recipiente protegido da luz (CHUNG et al., 1986).
Materiais e Métodos
75
2. Oxidação da LDL
Para a oxidação da LDL foi acrescido CuCl
2
a 1mM, para concentração
final de 5µM. Após 3 horas e 30 minutos de oxidação, a 37ºC, sob agitação
constante, e envolto em papel alumínio, a reação foi finalizada com EDTA 0,5M
(proporção de 2 EDTA: 1 CuCl
2
).
3. Quantificação das Imunoglobulinas Anti - LDL Oxidada
As Imunoglobulinas foram dosadas pelo ensaio ELISA (LEE et al., 1999),
descritos resumidamente: Microplacas de poliestireno (Nunc, Maxisorp, Denmark)
foram incubadas 24 horas, em temperatura ambiente, com 100µL por poço de
solução do antígeno (LDL oxidada e nativa, com 50µg/mL de proteína) diluído em
salina fisiológica. Após o período de sensibilização, as placas foram incubadas por
uma hora, com 200µL de uma solução BSA 1% em PBS, por poço, para bloqueio,
à 37°. A solução de bloqueio foi desprezada, as placas foram lavadas 5 vezes
com salina fisiológica contendo 0,05% de Tween 20 (SIGMA Chemical Co., St
Louis, MO, USA) e incubadas a temperatura ambiente, overnight, com o 100µL
por poço do soro diluído 1:10. As placas foram lavadas cinco vezes com salina-
Tween 0,05% e incubadas, por duas hora a 37
o
C, com 100µL de uma solução de
IgG peroxidase, na diluição 1:5000. As placas, após serem lavadas dez vezes
com salina-Tween, foram incubadas no escuro, com 100µL de uma solução
reveladora - 10mL de tampão citrato (pH=5,0) contendo 40µl de H
2
O
2
e 10mg de
ortofenileno-diamino (OPD) - para o desenvolvimento de cor, por reação
enzimaticamente catalisada. Após trinta minutos de incubação, a reação foi
interrompida pela adição de 30µL por poço de H
2
SO
4
1:20. A absorbância do
comprimento de onda a 492nm foi feita por leitor automático (Model 450
microplate Reader, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Os resultados foram obtidos pelo cálculo da média das repetições da LDL
nativa subtraídas da LDL oxidada em cada grupo experimental.
Materiais e Métodos
76
4.10. Determinação da Hepatotoxicidade
Dosagem de ɣGT
A dosagem de ɣGT foi feita usando kit comercial Labtest, Brasil. A
técnica se baseia na determinação cinética da ɣGT, na qual há produção de p-
nitroalanina (PNA). A elevada absorção da p-nitroanilina (PNA) formada na
reação de transferência do grupamento glutamil da ɣglutamil p – nitroanilida
(ɣGPNA) para glicilglicina (GG) é proporcional à atividade da ɣGT na amostra
biológica.
Para a dosagem, 10µL de amostra foram transferidos direto para a
microplaca, em duplicata, e acrescidos de 200µL do reagente de trabalho em
todos os poços. Após incubação por 5 minutos na estufa a 37ºC, foi feita a
leitura no leitor de microplaca a 405nm. A leitura foi repetida 1, 2 e 3 minutos. O
cálculo foi feito através da diferença por minuto (∆ Abs/min), entre as medias
das absorbâncias. O valor encontrado foi multiplicado por 2121 pra encontrar-
se a dosagem de ɣGT expressa em U/L.
4.11. Avaliação do infiltrado de macrófagos
Dosagem indireta de macrófagos pela determinação da atividade da N-
acetil-glicosaminidase (NAG) em tecido adiposo
Para a quantificação indireta da enzima N-acetil-glicosaminidase
presente em macrógafos (BAILEY, 1988), cerca de 100mg do tecido adiposo
foram congeladas em freezer -80°C. Posteriormente, as amostras foram
descongeladas, pesadas e acondicionadas em tubos Eppendorf de 2,0mL.
Logo após, 100mg destas amostras foram homogeneizadas e maceradas em
2,0mL de salina 0,9%/Tritonx-100 0,1% v/v, e em seguida, centrifugadas a
3000rpm durante 10 minutos a 4°C. O infranadante foi utilizado no ensaio.
Para o ensaio enzimático, foram adicionados 100µL das amostras,
diluídas (1:4) em tampão fosfato, a uma placa de 96 poços. Às amostras, foram
Materiais e Métodos
77
adicionados 100µL do substrato p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glicosaminida (Sigma)
diluído em tampão fosfato. A placa foi incubada a 37°C por 10 minutos.
Para interromper a reação foi adicionado de 100µL de tampão glicina
0,2M, pH 10,6. A absorbância foi medida por espectrofotometria em
comprimento de onda de 400nm. O resultado foi multiplicado pela quantidade,
em gramas, de tecido adiposo do sítio em que foi feito a análise, para que o
resultado fosse expresso em atividade de NAG absoluta em tecido adiposo
específico e também foi expresso por proteína, dosada pelo método de Lowry
(1951).
4.12. Avaliação histológica do tecido adiposo
O tecido adiposo epididimal foi retirado, lavado em solução salina e
fixado em solução de Bouin (água destilada saturada de ácido pícrico acrescido
de 25 % de formol 10% e 5% de ácido acético glacial). Após 24 horas, o tecido
foi transferido para uma solução de etanol 70% e, posteriormente, foi feita a
inclusão em parafina. Cortes de 7µm de espessura foram obtidos em
micrótomo e corados com hematoxilina-eosina. As fotos foram obtidas em
microscópio acoplado a uma câmera digital, com aumento final de 100X. As
imagens foram analisados com auxílio do software ImageProPlus (Image-Pro
Plus Sftware, Bethesda Maryland - USA), e a média da área de 100 adipócitos
por amostra foram determinadas. Para contagem das coroas de macrófagos,
10 campos de cada amostra foram analisados em microscópio, com aumento
final de 400x, e as estruturas tipo coroa foram contadas em cada campo. O
resultado foi expresso em número de estruturas tipos coroa por campo.
4.13. Análise Estatística
Os dados foram expressos em média + erro padrão ou mediana;
mínimo-máximo, e analisados no software Prisma (GraphPad Software, San
Diego California – USA), versão 5.0. Foi utilizado o teste de Grubbs para
detecção de outliers. Para verificar a normalidade da amostra foram utilizados
Materiais e Métodos
78
os testes D’agostino and Pearson e Kolmogorov-Smirnov. Para comparação
entre os grupos experimentais foi utilizado o teste t de Student para valores que
seguiam a normalidade e teste Mann Whitney pra os que não seguiam. Foi
considerado um nível de significância de 5% (p < 0,05).
Chá branco (Camellia sinensis) diminui estresse oxidativo e triglicerídeos
em camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
79
5. RESULTADOS
Resultados
80
5.1. MODELO DE OBESIDADE
Para estabelecimento do modelo de obesidade, foram observados os
seguintes parâmetros: ingestão calórica, peso e adiposidade.
A ingestão calórica dos animais foi estatisticamente diferente entre os
grupos analisados. O grupo HL apresentou maior ingestão calórica por animal
por dia, ao longo das semanas (16,34kcal ± 0,66) em relação ao grupo CO
(9,20kcal ± 0,14) (Figura 12).
Figura 12: Ingestão calórica dos camundongos C57BL/6 que receberam dieta
comercial (CO) ou hiperlipídica (HL), por 8 semanas. Os resultados foram
expressos em média + erro padrão, ao longo das semanas experimentais,
sendo n = 8. Teste t de Student. * = p<0,05.
O peso final dos animais do grupo HL (30,54g ± 0,63) foi
significativamente maior em relação aos animais do grupo CO (19,87g ± 0,58),
como visto na Figura 13.
Resultados
81
Figura 13: Peso corporal final, em gramas, dos camundongos C57BL/6 que
receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8 semanas. Sendo
CO: n = 10 e HL: n = 20. Os resultados foram expressos em média + erro
padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t Student, * =
p<0,05.
Em relação à adiposidade visceral, avaliada através da porcentagem de
gordura visceral do sítio epididimal, a dieta hiperlipídica (1,67%; 0,84 – 7,38) foi
capaz de aumentá-la significativamente em relação ao grupo CO (0,87%; 0,49
– 1,34), conforme mostra a Figura 14:
Figura 14: Percentual de adiposidade epididimal final, dos camundongos
C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8
semanas, calculada pela divisão do peso total do tecido adiposo epididimal
pelo peso corporal final do animal, multiplicado por 100. Sendo CO: n = 10 e
HL: n = 15. Os resultados foram expressos em mediana dos animais por grupo,
ao final do experimento. Teste Mann Whitney. * = p<0,05.
Resultados
82
Quando analisada a área do adipócito (Figura 15), também foi
observada diferença entre os grupos (CO = 2664µm
2
± 698,6 e HL = 9791µm
2
±
1257), como observado na Figura 16:
Figura 15: Análise histológica do tecido adiposo epididimal nos animais que
receberam dieta controle (A) ou dieta hiperlipídica (B) por 8 semanas.Tecido
corado com hematoxilina-eosina. Aumento de 100x.
Resultados
83
Figura 16: Área dos adipócitos dos camundongos C57BL/6, em µm
2
, que
receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8 semanas, calculada
pela média da área de 100 adipócitos por animal. Sendo n = 5 por grupo
experimental. Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos
animais, ao final do experimento. Teste t Student, * = p<0,05.
Além dos parâmetros citados, a dieta hiperlipídica foi capaz de alterar o
perfil lipídico dos animais, mas não afetou a glicemia e os triglicerídeos,
conforme mostrado na tabela 4:
Tabela 4: Parâmetros sanguíneos observados em camundongos C57BL/6 que
receberam dieta indutora de obesidade (hiperlipídica) ou dieta comercial por 8
semanas. Sendo CO: n = 10 e HL: n = 20 para glicose e triglicerídeos e n = 10
por grupo experimental, para o perfil do colesterol.
a
Teste t de Student, com
resultados expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final
do experimento e
b
Teste Mann Whitney, com resultados expressos em
mediana (mínimo – máximo). * = p<0,05. Glicose: p = 0,11; Triglicerídeos: p =
0,13.
Parâmetro Comercial Hiperlipídica
Colesterol (mg/dL)
a
100,6 ± 9,2 130,0 ± 7,6 *
HDL colesterol (mg/dL)
b
64,7 (39,0 – 72,9) 36,1 (28,4 – 90,0) *
Fração aterogênica
(mg/dL)
b
39,4 (5,1 – 87,7) 82,7 (20,4 – 151,1) *
Índice aterogênico
b
0,63 (0,07 – 1,99) 2,51 (0,35 – 7,79) *
Glicose (mg/dL)
a
138,7 ± 11,2 118,4 ± 6,8
Triglicerídeos (mg/dL)
b
75,2 (40,8 – 152,3)
59,3 (27,3 – 136,8)
Resultados
84
A atividade antioxidante foi medida no fígado e tecido adiposo. Quando o
fígado foi analisado, não houve diferenças entre os grupos pela técnica de
TBARS (CO = 0,036µmol/g ± 0,004 e HL = 0,04µmol/g ± 0,004). Porém a
formação de hidroperóxidos foi maior no fígado dos animais HL, comparados
aos CO (CO = 4,16µmol/g; 1,09 – 28,18 e HL = 20,02µmol/g; 5,00 – 74,90),
sugerindo o aumento do estresse oxidativo (Figura 17).
Figura 17: Avaliação do estresse oxidativo em fígado de camundongos
C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8
semanas. (A) Dosagem do estresse oxidativo pela técnica de TBARS, sendo n
= 10, por grupo experimental, com resultados expressos em média + erro
padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student. p =
0,38. (B) Dosagem do estresse oxidativo pela avaliação da concentração de
hidroperóxidos, sendo CO: n = 8 e HL: n = 7, com resultados expressos em
mediana dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste Mann Whitney,
* = p<0,05.
Em relação às enzimas antioxidantes, avaliamos superóxido dismutase
(SOD) e catalase. O grupo HL apresentou aumento significativo da atividade da
SOD no fígado em relação ao grupo CO (0,52U/mg ± 0,05 e 0,37U/mg ± 0,02,
respectivamente). Porém, a atividade da catalase permaneceu inalterada (CO=
5,16∆E/min/mg; 1,12–15,92, HL= 5,78∆E/min/mg; 1,28–15,75) (Figura 18).
Resultados
85
Figura 18: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em fígado de
camundongos C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica
(HL) por 8 semanas. (A) Dosagem da atividade da Superóxido Dismutase
(SOD), sendo n = 10 por grupo experimental, com resultados expressos em
média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de
Student; * = p<0,05. (B) Dosagem da atividade da catalase, sendo n = 10 por
grupo experimental com resultados expressos em mediana dos animais por
grupo, ao final do experimento. Teste Mann Whitney. p = 0,80.
Quando o estresse oxidativo no tecido adiposo foi analisado, a dieta
hiperlipídica aumentou o estresse oxidativo, tanto pela técnica de TBARS (CO
= 0,64µmol/g ± 0,22 e HL = 1,50µmol/g
± 0,31) quanto pela técnica de
hidroperóxidos (CO = 1,18µmol/g; 0,58 – 1,42 e HL = 130,02µmol/g; 1,30 –
27,59), como mostra a Figura 19:
Figura 19: Avaliação do estresse oxidativo em tecido adiposo de camundongos
C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica (HL) por 8
semanas. (A) Dosagem do estresse oxidativo pela técnica de TBARS, sendo n
= 6 por grupo experimental com resultados expressos em média + erro padrão
dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student; * = p<0,05.
(B) Dosagem do estresse oxidativo pela avaliação da concentração de
hidroperóxidos, sendo CO: n = 5 e HL: n = 9 com resultados expressos em
mediana dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste Mann Whitney;
* = p<0,05.
Resultados
86
Em relação às enzimas antioxidantes, o grupo HL (6,8U/mg ± 1,42)
aumentou significativamente a atividade da superóxido dismutase (SOD) em
relação ao grupo CO (1,76U/mg ± 0,51), porém sem alterar a atividade da
catalase (CO = 0,50∆E/min/mg ± 0,21 e HL = 0,91∆E/min/mg ± 0,23) (Figura
20).
Figura 20: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em tecido adiposo
de camundongos C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica
(HL) por 8 semanas. Os resultados foram expressos em média + erro padrão
dos animais por grupo, ao final do experimento, sendo CO: n = 5 e HL: n = 7.
Teste t de Student; * = p<0,05. (A) Dosagem da atividade da Superóxido
Dismutase (SOD) e (B) Dosagem da atividade da catalase; p = 0,24.
A avaliação da infiltração de macrófagos através da atividade da enzima
N-acetil-glicosaminidase, mostrou que, quando analisado em relação à proteína
do tecido, não houve diferenças entre os grupos (CO = 0,92U/mg ± 0,10 e HL =
1,17U/mg ± 0,12). Porém, como é importante considerar o tamanho da massa
adiposa, ao analisarmos o número de macrófagos presentes em todo o tecido
adiposo epididimal do animal, nota-se um aumento significativo nos animais HL
em relação aos controles (HL= 0,52 U*g ± 0,16 e CO=0,14U*g ± 0,02) (Figura
21):
Resultados
87
Figura 21: Medida indireta da infiltração de macrófagos, pela dosagem da
enzima N-acetilglicosaminidase em homogenatos de tecido adiposo de
camundongos C57BL/6 que receberam dieta comercial (CO) ou hiperlipídica
(HL) por 8 semanas. Resultado calculado por unidades divididas por mg de
proteína do homogenato; p = 0,16 (A) e multiplicado por gramas de tecido
adiposo epididimal (B). Resultados expressos em média ± erro padrão dos
animais por grupo, ao final do experimento no tecido adiposo epididimal, sendo
CO: n = 8 e HL n = 9. Teste t de Student, * = p<0,05.
O aumento do infiltrado de macrófagos foi confirmado através da
quantificação das estruturas tipo coroa (Figura 22), onde foi observada maior
quantidade de coroa de macrófagos nos animais que ingeriram dieta
hiperlipídica (0,44 coroas + 0,05) em relação aos animais que receberam dieta
controle. Esses últimos não apresentam coroas de macrófagos (Figura 23).
Figura 22: Aspecto histológico das estruturas tipo coroa ao redor dos adipócitos
de tecido adiposo epididimal corado com hematoxilina-eosina. Aumento de
100x.
Resultados
88
Figura 23: Análise quantitativa das estruturas tipo coroa encontradas em tecido
adiposo epididimal de camundongos C57BL/6 que receberam dieta comercial
(CO) ou hiperlipídica (HL) por 8 semanas, calculada pela contagem de coroas
de macrófagos em 10 campos, expresso em coroas por campo. Resultados
expressos em média ± erro padrão dos animais por grupo, ao final do
experimento no tecido adiposo epididimal, sendo n = 5 por grupo experimental.
Teste t de Student; * = p<0,05.
5.2. O CHÁ BRANCO NA OBESIDADE INDUZIDA POR DIETA
HIPERLIPÍDICA
Após a confirmação do modelo de obesidade induzida pela dieta,
analisamos os efeitos da dieta rica em chá branco em animais obesos
comparado com animais obesos sem o chá. Assim, a comparação foi feita
entre o grupo tratado com o chá e o seu controle, ou seja, entre o grupo obeso
com chá (Ob + chá) e o grupo obeso (Ob).
Hepatotoxicidade
Antes de analisarmos os efeitos do chá, verificamos se a sua
suplementação, nos níveis vistos neste estudo, não seria deletéria. Assim,
analisamos seu efeito no fígado através da medida sérica de γGT, uma enzima
bastante sensível a pequenas alterações na função hepática. Os resultados
estavam dentro dos limites da normalidade e foram similares entre os grupos
Resultados
89
(Ob = 8,66U/L ± 1,47 e Ob + chá = 6,51U/L ± 1,04), sugerindo ausência de
hepatotoxicidade com a dose escolhida (Figura 24).
Figura 24: Dosagem de ɣGT no soro sanguíneo de camundongos C57BL/6 que
receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de
extrato de chá branco por 8 semanas, em U/L. Sendo n = 10 por grupo
experimental. Os resultados foram expressos em média ± erro padrão dos
animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student. p = 0,25.
Ingestão calórica
A ingestão calórica e líquida não variou entre os grupos durante as 8
semanas experimentais (Figura 25), sugerindo ser o chá bem tolerado.
Resultados
90
Figura 25: Consumo calórico, p = 0,17 (A) e líquido, p = 0,06 (B), dos
camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá)
ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas. Os resultados
foram expressos em média + erro padrão da ingestão por gaiola, ao longo das
8 semanas de experimento. n = 8. Teste t de Student.
A. Avaliação do efeito do chá branco na redução do peso corporal e suas
consequências:
Peso corporal
Não houve diferenças no peso corporal dos animais ao longo das 8
semanas, sendo o peso corporal final semelhante entre os grupos obeso e
obeso com chá (Ob = 30,54g ± 063 e Ob + chá = 31,58g ± 0,82), como
observado na Figura 26. Estes dados não sustentam um efeito do chá no
ganho de peso ao longo de 8 semanas.
Resultados
91
Figura 26: Evolução ponderal, em gramas, dos camundongos C57BL/6 que
receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de
extrato de chá branco por 8 semanas, Sendo Ob: n = 19 e Ob + chá: n = 20.
Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos animais por grupo,
ao longo das semanas experimentais. Teste t de Student, p > 0,05 em todos os
pontos.
Eficiência alimentar
A eficiência alimentar foi calculada pela razão entre a soma de ganho de
peso por gaiola e o consumo alimentar, ao longo das semanas, e foi observado
que não houve diferença entre os grupos (Figura 27).
Figura 27: Eficiência alimentar, em gramas por kcal, de camundongos C57BL/6
que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de
extrato de chá branco ao longo de 8 semanas, calculado pela divisão da soma
do ganho do peso semanal (g) dos animais de cada gaiola pelo total de energia
ingerida (kcal), multiplicado por 100. Sendo n = 4 por grupo experimental, por
semana. Resultado expresso em média +
erro padrão das gaiolas, ao longo do
experimento. Teste t de Student, p > 0,05 em todos os pontos.
Resultados
92
Adiposidade Visceral:
Os dados de peso são corroborados pela medida da adiposidade
visceral (medida no sítio epididimal) que também foi semelhante entre os
grupos (Ob = 1,51; 0,84 – 4,12 e Ob + chá = 2,18; 1,05 – 4,11) (Figura 28).
Figura 28: Adiposidade epididimal, em porcentagem relativa ao peso corporal
total, de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida
(Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas.
Sendo n = 14 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em
mediana dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste Mann Whitney,
p = 0,67.
O resultado de adiposidade visceral foi também confirmado pela área do
adipócito epididimal (Figura 29), que apresentou áreas semelhantes entre os
grupos, independentemente da ingestão do chá (Ob = 9791µm
2
± 1257 e Ob +
chá = 10043µm
2
± 1009) (Figura 30).
Resultados
93
Figura 29: Análise histológica do tecido adiposo epididimal nos animais que
receberam dieta hiperlipídica (A) ou dieta hiperlipídica acrescida de chá branco
(B). Tecido corado com hematoxilina-eosina. Aumento de 100x.
Resultados
94
Figura 30: Área dos adipócitos dos camundongos C57BL/6, em µm
2
, que
receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de
extrato de chá branco por 8 semanas, calculada pela média da área de 100
adipócitos por animal. Sendo n = 5 por grupo experimental. Os resultados
foram expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do
experimento. Teste t Student, p = 0,88.
Avaliamos também o teor de lipídeos totais no tecido adiposo epididimal
(Ob = 651,4mg/g ± 108,6 e Ob + chá = 723,5mg/g ± 56,55) que não apresentou
alterações devidas ao consumo de chá (Figura 31), confirmando os dados de
adiposidade visceral e área dos adipócitos.
Figura 31: Lipídeos extraídos do tecido adiposo epididimal de camundongos
C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob)
de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, em mg de lipídeos por
grama de tecido. Sendo n = 10 por grupo experimental. Os resultados foram
expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do
experimento. Teste t de Student, p = 0,53.
Resultados
95
Infiltração de macrófagos no tecido adiposo visceral
A infiltração de macrófago é um indicativo do processo inflamatório
característico da obesidade e fortemente associado à síndrome metabólica,
pelo potencial de secreção de adipocinas destas células.
A dosagem indireta da infiltração de macrófagos, pela técnica da
dosagem da enzima N-acetilglicosaminidase (NAG), mostrou que o chá branco
não alterou a infiltração de macrófagos no tecido adiposo epididimal, quando o
resultado foi expresso por proteína (Ob + chá = 1,13U/mg ± 0,12) em relação
ao grupo que não recebeu o chá (Ob = 1,17U/mg ± 0,12), bem quando
multiplicado o resultado pela quantidade total, em gramas (Ob = 0,28 U*g; 0,16
– 0,35 e Ob + chá = 0,31U*g; 0,19 – 0,41) (Figura 32).
Figura 32: Dosagem indireta da infiltração de macrófagos em camundongos
C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob)
de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, pela dosagem da enzima N-
acetilglicosaminidase em homogenatos de tecido adiposo epididimal calculado
por proteína do homogenato, p = 0,81 (A) ou multiplicado por gramas de tecido
adiposo, p = 0,26 (B). Sendo n = 7 por grupo experimental. Os resultados foram
expressos em média ± erro padrão ou mediana dos animais por grupo, ao final
do experimento. Teste t de Student e Mann Whitney, respectivamente.
O mesmo resultado foi observado quando a infiltração de macrófagos foi
avaliada pela contagem das estruturas tipo coroa (Figura 33), no tecido adiposo
epididimal (Ob = 0,44 coroas por campo ± 0,05 e Ob + chá = 0,32 coroas por
campo ± 0,06) (Figura 34).
Resultados
96
Figura 33: Aspecto histológico das estruturas tipo coroa ao redor dos adipócitos
de tecido adiposo epididimal corado com hematoxilina-eosina. Aumento de
100x.
Figura 34: Análise quantitativa das estruturas tipo coroa encontradas em tecido
adiposo epididimal de camundongos C57BL/6 que receberam dieta
hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá
branco por 8 semanas, calculada pela contagem de coroas em macrófagos em
10 campos, expresso em coroas por campo. Resultados expressos em média ±
erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento no tecido adiposo
epididimal, sendo n = 5 por grupo experimental. Teste t de Student, p = 0,16.
Resultados
97
B. Avaliação do chá branco como agente hipolipidêmico
Perfil de lipoproteínas e colesterol total
Em relação ao perfil colesterolêmico, não foi observado nenhum efeito
da ingestão do chá, em nenhum parâmetro observado, como demonstrado na
tabela 5:
Tabela 5: Perfil colesterolêmico
Parâmetros observados no perfil colesterolêmico em camundongos C57BL/6
obesos, tratados (Obeso com chá) ou não (Obeso) com 0,5% de extrato de chá
branco por oito semanas. Sendo n = 20 por grupo experimental. Os resultados
foram expressos em média + erro padrão (
a
Teste t de Student) ou mediana
(
b
Mann Whitney) dos animais por grupo, ao final do experimento.
Parâmetro Obeso Obeso com chá p
Colesterol (mg/dL)
a
110,8 ± 3,77 118,2 ± 4,81 0,23
HDL colesterol (mg/dL)
b
78,2 (28,4 – 99,7) 53,2 (14,9 – 117,1) 0,72
Fração aterogênica
(mg/dL)
b
30,0 (6,2 – 159,1) 30,6 (5,8 – 114,8) 0,99
Índice aterogênico
b
0,36 (0,08 – 4,80) 0,93 (0,06 – 3,45) 0,81
Trigliceridemia e lipídeos cecais e hepáticos
Em relação aos triglicerídeos séricos, animais que receberam chá
branco (42,96mg/dL; 25,53 – 88,25) apresentaram menor concentração de
triglicerídeos séricos em relação aos animais controle (59,55mg/dL; 27,30 –
136,8), como demonstrado na Figura 35:
Resultados
98
Figura 35: Dosagem de triglicerídeos séricos em soro sanguíneo de
camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá)
ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, em mg/dL.
Sendo n = 24 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em
mediana dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste Mann Whitney,
* = p<0,05.
Para avaliarmos se a redução dos triglicerídeos séricos era relacionada
a alterações na absorção destes, analisamos o teor de lipídeos totais no
conteúdo cecal e no fígado. Os resultados mostram que animais que ingeriram
o chá branco (118,5mg/g ± 8,09) excretaram mais triglicerídeos em relação aos
animais sem chá (88,33mg/g ± 10,48), sugerindo que a menor trigliceridemia
possa ser devido à menor absorção dietética (Figura 36).
Resultados
99
Figura 36: Lipídeos extraídos do conteúdo cecal de camundongos C57BL/6 que
receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de
extrato chá branco por 8 semanas, em mg de lipídeos por grama de tecido.
Sendo n = 10 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em
média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de
Student, * = p<0,05.
Em relação ao fígado, não observamos alteração na quantidade de
lipídeos pela adição de chá branco (Ob = 85,13mg/g ± 11,99 e Ob + chá =
71,02mg/g ± 11,72), como observado na Figura 37.
Esses resultados sugerem que o chá branco apresentou efeito na
absorção de lipídeos, mas sem interferir na concentração hepática desses.
Resultados
100
Figura 37: Lipídeos extraídos do tecido hepático de camundongos C57BL/6 que
receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de
extrato chá branco por 8 semanas, em mg de lipídeos por grama de tecido.
Sendo n = 10 por grupo experimental. Os resultados foram expressos em
média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de
Student, p = 0,41.
C. Avaliação da ação do chá branco como agente hipoglicemiante
Glicemia de jejum
Em relação à dosagem de glicose, não foi observada diferença entre os
grupos experimentais (Ob = 109,2mg/dL ± 7,0 e Ob + chá = 130,2mg/dL ± 9,3),
conforme visto na Figura 38.
Resultados
101
Figura 38: Dosagem de glicemia em plasma de camundongos C57BL/6 que
receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de
extrato de chá branco por 8 semanas, em mg/dL. Sendo n = 24 por grupo
experimental. Os resultados foram expressos em média + erro padrão dos
animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student, p = 0,08.
Teste de Tolerância Oral à Glicose
No teste de tolerância oral à glicose não foi houve diferença entre os
animais que ingeriram ou não chá branco, ao longo do tempo, bem como na
área sob a curva (Ob = 18106U.A. + 1843 e Ob + chá = 15060U. A. + 1830),
como observado na Figura 39.
Figura 39: Teste de tolerância oral à glicose, em camundongos C57BL/6 que
receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de
extrato de chá branco por 8 semanas, mostrado em percentual de variação da
glicemia ao longo do tempo, p > 0,05 em todos os pontos (A) e área sob a
curva, p = 0,27 (B). Os resultados foram expressos em média + erro padrão, ao
final do experimento. Teste t de Student.
Resultados
102
Teste de sensibilidade à insulina:
O teste de sensibilidade à insulina também não evidenciou diferenças
entre os grupos, quando o tempo após administração de insulina ou a área total
sob a curva foram observados (Ob = 1999U. A. + 172,6 e Ob + chá = 2553U. A.
+ 346,3) (Figura 40).
Figura 40: Teste de sensibilidade à insulina, em camundongos C57BL/6 que
receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de
extrato de chá branco por 8 semanas, mostrado em percentual de variação da
glicemia ao longo do tempo, p > 0,05 em todos os pontos (A) e área sob a
curva, p = 0,19 (B). Os resultados foram expressos em média + erro padrão, ao
final do experimento. Teste t de Student.
Os resultados de glicemia de jejum, tolerância à glicose e sensibilidade à
insulina em conjunto não sustentam qualquer efeito da ingestão de chá branco
na homeostase de glicose como sugerido popularmente.
D. Avaliação do chá branco como antioxidante
Tecido adiposo
O estado oxidativo foi estudado através de 2 técnicas: Substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico - TBARS (ou concentração de MDA) e
concentração de hidroperóxidos. No tecido adiposo, o chá branco foi capaz de
reduzir a concentração de malondialdeído (produto da peroxidação) obtido pela
técnica de TBARS (Ob = 0,23µmol/g ± 0,03 e Ob + chá = 0,14µmol/g ± 0,04).
Porém, nenhuma diferença foi observada quando o estado oxidativo foi
Resultados
103
avaliado pela técnica de concentração de hidroperóxidos (Ob = 10,02µmol/g;
1,28 – 27,59 e Ob + chá = 5,94µmol/g; 0,69 – 32,72) (Figura 41).
Figura 41: Dosagem de estresse oxidativo em homogenato de tecido adiposo
de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob +
chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, (A) pela
técnica de TBARS (Teste t de Student, resultados expressos em média + erro
padrão dos animais por grupo, ao final do experimento) e (B) pela dosagem da
concentração de hidroperóxidos (Mann Whitney, resultados expressos em
mediana dos animais por grupo, ao final do experimento, p = 0,54), sendo Ob:
n = 9 e Ob + chá: n = 8. * = p<0,05
Em relação à atividade de enzimas antioxidantes no tecido adiposo, o
chá branco não alterou a atividade, tanto da SOD (Ob = 6,84U/mg de ptn ±
1,42 e Ob + chá = 5,85U/mg de ptn ± 1,12), como da catalase (Ob =
0,88∆E/min/mg de ptn ± 0,21 e Ob + chá = 1,67∆E/min/mg de ptn ± 0,37)
(Figura 42).
Resultados
104
Figura 42: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em homogenato de
tecido adiposo de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica
acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8
semanas. (A) Atividade da SOD, p = 0,60 e (B) atividade da catalase, p = 0,09,
sendo Ob: n = 8 e Ob + chá: n = 9. Os resultados foram expressos em média +
erro padrão dos animais por grupo, ao final do experimento. Teste t de Student.
Estes dados sugerem haver um efeito antioxidante que não depende da
ação celular exercida pelas enzimas SOD e catalase.
Fígado
O estresse oxidativo foi também avaliado em outro sítio. No fígado, o
efeito do chá branco foi mais proeminente, com diminuição significativa do
estresse oxidativo, tanto pela dosagem de MDA (Ob = 0,039µmol/g ± 0,004 e
Ob + chá = 0,025µmol/g ± 0,003), quanto pela concentração de hidroperóxidos
(Ob = 18,19µmol/g ± 45,35 e Ob + chá = 4,97µmol/g ± 1,52) (Figura 43).
Resultados
105
Figura 43: Dosagem de estresse oxidativo em homogenato de tecido hepático
de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob +
chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas, (A) pela
técnica de TBARS (n = 10 por grupo experimental) e (B) pela dosagem da
concentração de hidroperóxidos (n = 7 por grupo experimental). Os resultados
foram expressos em média ± erro padrão dos animais por grupo, ao final do
experimento. Teste t de Student; * = p<0,05
Tendo sido o chá branco capaz de diminuir o estresse oxidativo
hepático, foi dosada a atividade das enzimas antioxidantes superóxido
dismutase (SOD) e catalase no fígado. Mais uma vez, não houve alteração da
atividade das enzimas hepáticas SOD (Ob = 0,517U de SOD/mg de ptn ± 0,04
e Ob + chá = 0,531U de SOD/mg de ptn ± 0,04), ou da catalase (Ob =
0,161∆E/min/mg de ptn ± 0,036 Ob + chá = 0,140∆E/min/mg de ptn ± 0,025)
após a ingestão do chá (Figura 44).
Resultados
106
Figura 44: Avaliação da atividade de enzimas antioxidantes em homogenato de
tecido hepático de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica
acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8
semanas. (A) Atividade da SOD (n = 10 por grupo experimental, p = 0,82) e (B)
atividade da catalase (n = 9 por grupo experimental, p = 0,56). Os resultados
foram expressos em média + erro padrão dos animais por grupo, ao final do
experimento. Teste t de Student.
Soro
Para avaliar o estado oxidativo no soro, utilizamos a técnica da detecção
de dieno conjugado ao longo do tempo. Neste sítio, não foi visto efeito do chá
em camundongos obesos (Ob = 12,0 minutos ± 1,9 e Ob + chá = 11,2 minutos
± 1,2) (Figura 45).
Figura 45: Fase de latência da formação de dienos conjugados, dosada em
soro de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica acrescida
(Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de extrato de chá branco por 8 semanas,
expressa em minutos. Sendo n = 5 por grupo experimental. Os resultados
foram expressos em média ± erro padrão dos animais por grupo, ao final do
experimento. Teste t de Student, p = 0,73.
Resultados
107
Na avaliação do estresse oxidativo no soro, além do dieno conjugado,
pode-se avaliar a concentração indireta de LDL oxidada. Esta análise é uma
medida especialmente importante, pois mostra não só a presença do estresse
oxidativo, mas também de um importante fator de risco para doença
aterosclerótica. A LDL oxidada, foi medida no soro indiretamente, através da
dosagem do anticorpo anti-LDL oxidada. Os resultados não mostraram
diferenças em sua quantificação (Ob = 27,0U.A.; 9,0 – 49,0 e Ob + chá =
20,0U.A.; 3,5 – 47,5), como demonstrado na Figura 46.
Figura 46: Dosagem indireta de LDL oxidada pela técnica de ELISA para
anticorpos anti-LDL oxidada, em soro de camundongos C57BL/6 que
receberam dieta hiperlipídica acrescida (Ob + chá) ou não (Ob) de 0,5% de
extrato de chá branco por 8 semanas, expressa em Unidades Arbitrárias.
Sendo Ob: n = 9 e Ob + chá: n = 10. Os resultados foram expressos em
mediana dos animais por grupo, ao final do experimento. Mann Whitney, p =
0,33.
Chá branco (Camellia sinensis) diminui estresse oxidativo e triglicerídeos
em camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
108
6. DISCUSSÃO
Discussão
109
6.1. Do modelo de obesidade
O modelo de obesidade induzida por dieta pode ser vantajoso em
relação aos modelos de obesidade genética, visto que, indivíduos obesos, em
sua grande maioria, apresentam peso elevado devido ao desequilíbrio entre
ingestão e gasto energéticos (MENDONÇA e ANJOS, 2004, BUETTNER et al.,
2007). Além disso, levantamentos genéticos populacionais, mostram que as
deficiências genéticas relacionadas aos modelos de obesidade em roedores,
têm prevalência baixa em indivíduos com obesidade por causas genéticas
(RANKINEN et al., 2006;
FAROOQI E O’RAHILLY, 2005).
Em nosso estudo, utilizamos uma dieta hiperlipídica com 61% de energia
sob a forma de gordura, oferecida a camundongos C57BL/6, durante 8
semanas, com intenção de induzir obesidade. Embora diversos trabalhos
tenham utilizado dietas hiperlipídicas para indução da obesidade em ratos (LI et
al., 2008; MILAGRO et al., 2006) ou camundongos (SOHET et al., 2009; YAN
et al., 2009; HAGIWARA et al., 2009; BALWIERZ et al., 2009; HOFFLER et al.,
2009; DEFURIA et al., 2009; VIEIRA et al., 2009; NAGATA et al., 2008;
YAMATO et al., 2007), não há um padrão para sua composição. Assim, há
variação da quantidade de calorias oferecidas, principalmente na forma de
gordura, entre 40% (NAGATA et al., 2008) e 72% de lipídeos (SOHET et al.,
2009). O consumo diário de uma dieta com 60% de energia sob a forma de
gordura leva à alteração no peso e composição corporais, componentes do
sangue, alteração da expressão gênica e alterações na função hepática e renal
(HOFFLER et al., 2008). Apesar dessa variabilidade, todos os estudos citados
mostraram aumento do peso final e da adiposidade epididimal dos animais que
se alimentaram da dieta hiperlipídica.
Optamos for fazer uma dieta com cerca de 60% das calorias como
lipídeos por saber que nesta, a presença de estresse oxidativo secundário ao
excesso de lipídeos é uma importante alteração, o que seria adequado para o
estudo de suplementação do chá branco, pelas suas propriedades
antioxidantes. Embora o teor de proteínas a dieta indutora de obesidade seja
menor do que a ração comercial utilizada, não foram observados sinais de
Discussão
110
desnutrição nos animais, tal como redução da ingestão alimentar e do peso
corporal, tendo sido observado exatamente o oposto, conforme já discutido.
Sendo, a substituição parcial de proteínas por lipídeos em dietas indutoras de
obesidade não representa um fator prejudicial no desenvolvimento dos animais.
Nossos resultados também mostraram maior peso e adiposidade
corporais (Figuras 13 e 14), bem como aumento no tamanho do adipócito
(Figuras 15 e 16) em relação aos animais controle. Vieira e col. (2009) também
relatam aumento do percentual de tecido adiposo epididimal em camundongos
C57BL/6. O maior ganho de peso dos animais que receberam dieta
hiperlipídica é condizente com a maior ingestão calórica (Figura 12), visto que a
densidade calórica dessa dieta é 5,21kcal/g, mais que o dobro da dieta controle
(2,18kcal/g). No estudo de DeFuria e col. (2009), no qual foi oferecida dieta
hiperlipídica (60% de energia como gordura) ou dieta controle a camundongos
C57BL/6 por 8 semanas, foi também observada maior ingestão calórica com
consequente maior ganho de peso e adiposidade.
Em humanos, a ingestão da dieta rica em lipídeos de origem animal leva
ao aumento das lipoproteínas ricas em colesterol e triglicerídeos circulantes no
sangue (ALVAREZ-LEITE, 1995). Em nosso estudo, não observamos aumento
de triglicerídeos com a ingestão da dieta (Tabela 4). Camundongos C57BL/6 já
são descritos como resistentes ao desenvolvimento de hipertrigliceridemia
(NAGATA et al., 2008; MEIR e LEITERSDORF, 2004; SCHREYER et al.,
2002), o que justifica nossos resultados. Porém, encontramos alteração
significativa do perfil colesterolêmico (Tabela 4) do animal que consumiu dieta
hiperlipídica, mostrando que a dieta, além de induzir obesidade, aumenta o
risco de aterosclerose por aumentar o colesterol total e reduzir o colesterol em
HDL, aumentando assim a fração aterogênica no sangue. Yamato e col. (2007)
também observaram que uma dieta hiperlipídica oferecida por tempo
prolongado foi capaz de levar ao aumento de colesterol total, LDL colesterol e
diminuição de HDL colesterol no sangue de camundongos C57BL/6.
A glicemia também é afetada pela obesidade, uma vez que a resistência
à insulina é um dos seus quadros mais comuns. Em nosso estudo, porém, não
foram observadas alterações na glicemia de jejum nos camundongos que
receberam a dieta hiperlipídica (Tabela 4). Este resultado está de acordo com
Discussão
111
os achados de Hoffler e col. (2009), que não observaram aumento da glicose
em animais que receberam dieta hiperlipídica (60% de energia sob a forma de
gordura) durante oito semanas. Acredita-se que não houve alteração da
glicemia de jejum nos camundongos que receberam dieta hiperlipídica devido a
uma hiperinsulinemia compensatória. Aumento na glicemia de animais que
ingeriram dieta hiperlipídica em relação aos que ingeriram dieta controle é
observado em estudos experimentais nos quais a dieta hiperlipídica possui
maior teor de lipídeos (SOHET et al., 2009), maior duração do experimento
(YAN et al., 2009; NAGATA et al., 2008 e YAMATO et al., 2007) ou diferentes
linhagens de animais, por exemplo, o camundongo neozelandês (BALWIERZ et
al., 2009). Dessa forma, é possível que os resultados controversos da literatura
em relação à hiperglicemia em animais que recebem dieta hiperlipídica sejam
decorrentes de diferente composição de dieta, maior de tempo de experimento
ou diferente linhagens do animal.
O estresse oxidativo aumentado na obesidade está relacionado com o
desenvolvimento e evolução das complicações como a resistência insulínica e
o diabetes mellitus tipo 2. Este fato foi visto por nós pelo resultado de TBARS e
atividade de SOD hepáticos (Figuras 17 e 18) e por diversos outros estudos
(HAGIWARA et al., 2009; NAGATA et al., 2008; QATANANI E LAZAR, 2007;
FRIDLYAND e PHILIPSON, 2006; HOUSTIS et al., 2006; FURUKAWA et al.,
2004). O aumento da atividade da SOD pode ser visto como uma tentativa de
eliminar íons superóxido que ocorrem em situações de estresse oxidativo
(MIAO e ST. CLAIR, 2009). Nagata e col. (2008), utilizando camundongos
C57BL/6 tratado com dieta hiperlipídica (40% de energia como gordura) por 24
semanas, observaram aumento do estresse oxidativo no fígado, sem o
aumento da expressão do mRNA das enzimas antioxidantes SOD e glutationa
peroxidase. Porém deve-se ressaltar que é possível que ocorra aumento da
atividade da enzima, independentemente do aumento de sua expressão. Nesse
mesmo estudo, o estresse oxidativo e expressão da SOD não foram alterados
no tecido adiposo. Porém níveis elevados de glutationa peroxidase foram
observados, indicando que essa enzima estava atuando no balanço oxidativo.
Nossos resultados mostraram aumento do estresse oxidativo no tecido adiposo
e da atividade da SOD nesse tecido (Figuras 19 e 20). Não houve alteração da
Discussão
112
atividade da catalase, tanto no fígado (Figura 18), como no tecido adiposo
(Figura 20). A principal ação da catalase é a transformação do peróxido de
hidrogênio em água e oxigênio (POWERS e JACKSON, 2008). A enzima
glutationa peroxidase, não investigada em nosso estudo, também atua na
degradação do peróxido de hidrogênio e poderia estar realizando essa função.
Dessa forma, é possível que SOD tenha sua atividade aumentada no tecido
adiposo e no fígado em uma tentativa que controlar o estresse oxidativo.
No presente estudo encontramos aumento significativo na ativação de
macrófagos no tecido adiposo epididimal, como sugerido indiretamente pela
atividade da enzima N-acetil-glicosaminidase (NAG) (Figura 21) e diretamente
pela contagem das estruturas tipo coroa (Figura 23). Esse resultado está de
acordo com o resultado encontrado por diversos autores, que observaram
aumento da infiltração de macrófagos através de imuno-histoquímica
(NISHIMURA et al., 2009; MAMANE et al., 2009; YAN et al., 2009; VIEIRA et
al., 2009).
É importante ressaltar que o aumento da atividade de NAG relativo à
proteína do tecido não foi diferente. Assumindo que a quantidade de proteína
representa uma normalização do número de células no tecido, independente do
seu conteúdo lipídico, pode-se concluir que os macrófagos presentes no tecido
epididimal estão igualmente ativados. Porém, ao se considerar o tecido adiposo
epididimal como um todo (seu volume total), a atividade é significativamente
maior nos animais submetidos à dieta hiperlipídica. Estes dados levam à
sugestão de que ocorre uma maior infiltração de macrófagos com a dieta pelo
aumento do tecido adiposo, e não uma maior ativação do macrófago
individualmente. Este resultado é confirmado do número de macrófagos
agrupados nas estruturas tipo coroa que foi maior no tecido adiposo visceral de
animais alimentados com dieta hiperlipídica. DeFuria e col. (2009) observaram
o aumento da expressão de marcadores para macrófagos em tecido adiposo
de camundongos C57BL/6 que receberam dieta hiperlipídica com 60% de
energia sob forma de gordura por oito semanas em relação aos controles.
Também foi observado aumento na expressão de TNFα e MCP-1, além do
aumento das estruturas coroa de macrófagos e do tamanho do adipócito, o que
está de acordo com nossos resultados.
Discussão
113
O acúmulo de macrófagos no tecido adiposo é o principal responsável
pelo aumento de citocinas inflamatórias como TNFα e IL-6 levando à condição
de inflamação de baixo grau associada ao excesso de gordura corporal
(BOULOUMIE et al., 2005). Propostas têm sido feitas para explicar esse
aumento da infiltração de macrófagos no tecido adiposo de obesos
(HEILBRONN e CAMPBELL, 2008). Com o aumento da quantidade e do
tamanho do tecido adiposo, ocorre maior liberação de fatores inflamatórios ou
quimiotáticos para macrófagos, como leptina, TNFα, IL-6, MCP-1 (PEAKE et
al., 2006). Outra proposta seria a ingestão nutricional exagerada
(“overnutrition”) caracterizada por uma ingestão energética excessiva
prolongada ou ingestão aumentada de ácidos graxos. Essa nutrição excessiva
pode levar ao maior acúmulo de macrófagos via ativação de receptor tipo toll 4.
Os ácidos graxos saturados podem ativar a via toll4-NFκB nos adipócitos
aumentando a infiltração de macrófagos nos mesmos (TSUKUMO et al., 2007).
Outra hipótese é a hipóxia, já que, com o aumento de tecido adiposo, ocorre
aumento do fator indutor de hipóxia alfa (YE et al., 2007). Essas áreas de
hipóxia levam à morte de adipócitos, induzindo à formação das estruturas tipo
coroa de macrófagos em torno do adipócito morto, co-localizando áreas de
hipóxia e macrófagos (HEILBRONN e CAMPBELL, 2008; STRISSEL et al.,
2007). Além disso, Charriere e col. (2003) demostraram, estudando pré-
adipócitos implantados na cavidade peritoneal, que estes podem ser
transformados em macrófagos, levantando a hipótese de que pré-adipócitos
podem ser convertidos não só em adipócitos, mas também em macrófagos no
tecido adiposo.
Em resumo, considerando os dados mostrados acima, conseguimos
desenvolver em 8 semanas, um modelo de obesidade induzida por dieta, com
aumento de estresse oxidativo no fígado e no tecido adiposo, piora do perfil
colesterolêmico e com inflamação moderada do tecido adiposo, típicos da
obesidade e síndrome metabólica vistas em humanos.
Esse modelo é adequado para o estudo da obesidade e tem a vantagem
de estabelecer o quadro de obesidade e suas complicações mais rapidamente
que a maioria daqueles já descritos na literatura (YAN et al., 2009; HAGIWARA
et al., 2009; HOFFLER et al., 2009; LI et al., 2008; NAGATA et al., 2008;
Discussão
114
YAMATO et al., 2007). Especificamente, conseguimos em 8 semanas de dieta,
obter um peso corporal final cerca de 50% maior que os animais em dieta
controle. Além disso, desenvolvemos um bom modelo para estudo de
obesidade visceral, visto que a adiposidade epididimal foi aumentada não só
em termos absolutos, mas também como percentual do peso corporal total (já
aumentado nos animais com dieta hiperlipídica). Além disso, o modelo
preenche alguns critérios para o diagnóstico de síndrome metabólica, como
aumento da adiposidade visceral, diminuição do HDL colesterol e sinais de
inflamação do tecido adiposo.
6.2. Do efeito do chá branco em relação às suas alegações
populares (redução da obesidade, hipoglicemiante,
hipocolesterolêmico e antioxidante)
Após a constatação de que obtivemos um modelo adequado de
obesidade, nosso próximo objetivo foi investigar em estudo controlado, o efeito
do chá banco na obesidade e em algumas de suas principais consequências
como diabetes mellitus tipo 2, dislipidemias e aumento do estresse oxidativo.
A opção de investigar este chá na obesidade é sustentada pelo fato de
que em indivíduos obesos ocorre um aumento do estresse oxidativo. O chá
branco, já foi previamente descrito como antioxidante (THRING et al., 2009;
SEERAM et al., 2008; KOUTELIDAKIS et al., 2008; CALZUOLA et al., 2006) e
também como anticarcinogênico (WANG et al., 2008; ANGER et al., 2005;
ORNER et al., 2003; ORNER et al., 2002; DASHWOOD et al., 2002;
SANTANA-RIOS et al., 2001). Por isso, um de nossos objetivos foi observar se
os efeitos antioxidantes eram mantidos mesmo na presença de um estímulo
pró-oxidante como é o caso da obesidade induzida pela dieta. Além disso,
como citado anteriormente, embora o chá branco seja popularmente usado
para emagrecimento, ainda não existem estudos científicos sobre seu efeito na
obesidade.
Em nosso estudo, optamos por oferecer o extrato de chá branco em pó
suplementado na dieta, em uma proporção de 0,5% do peso final da dieta.
Discussão
115
Essa dose correspondeu a uma ingestão de, em média, 400mg de extrato de
chá branco por kg de peso do animal por dia. Segundo cálculos de Bruno e col.
(2008) baseados na ingestão energética, essa quantidade é equivalente a três
xícaras (140mL cada) de chá branco por dia, para humanos. Esta ingestão é
viável e corresponde ao volume ingerido por muitos que querem perder peso
com o chá. A opção pela administração do extrato de chá branco na dieta e
não na água visou a melhor aceitação do suplemento pelos animais e a
garantia da ingestão (uma vez que associado a outros nutrientes, a ingestão
passa a ser compulsória). Essa dose estava dentro dos parâmetros de
normalidade para todos os animais e não se mostrou tóxica, como confirmado
pela evolução ponderal (Figura 26), eficiência alimentar (Figura 27) e pela
dosagem de ɣGT hepática (Figura 24). A ɣGT é uma enzima liberada no
sangue logo após algum dano tóxico ao fígado (ROE, 1993). A preocupação
com a hepatotoxicidade vem da correlação com os resultados de Lambert e
col. (2009) relativos ao chá verde. Os autores observaram que, em
camundongos, uma dose de chá verde de 1500mg/kg de peso gera dano
hepático, com aumento de alanina aminotransferase plasmática (ALT), IL-6 e
MCP-1 plasmáticos, além de necrose hepática moderada. Takami e col. (2008)
estimaram que a dose máxima de chá verde que não causa efeitos adversos
para ratos é 764mg/kg peso/dia para machos e 820mg/kg peso/dia para
fêmeas. Com concordância com nossos resultados com o chá branco, esses
autores também não encontraram alteração na ɣGT plasmática, quando doses
de 0,3 a 5% de extrato de chá verde foram ofertadas a ratos, em comparação
aos controles.
Levando-se em conta a atribuição popular do chá branco para perda de
peso, não foi observado efeito do chá branco em nenhum dos parâmetros
ligados ao peso ou adiposidade dos animais. Como observado, a evolução
ponderal foi similar entre os grupos ao longo das 8 semanas, resultando em um
peso final semelhante entre eles (Figura 26). Embora a perda de peso seja a
alegação mais forte que leva ao uso dos chás desta planta, ainda faltam dados
suficientes para sustentá-la, mesmo se considerarmos o chá verde, já bastante
estudado. Em estudos com chá verde, alguns autores não encontraram perda
de peso ou mesmo menor ganho de peso (MAKI et al., 2009; KIM et al., 2009;
Discussão
116
BELZA et al., 2009; HSU et al., 2008; BRUNO et al., 2008). Já em outros, os
autores encontraram efeitos do chá verde ou da epigalocatequina galato
(EGCG) na redução ou menor ganho de peso corporal (RICHARD et al., 2009;
SOGAWA et al., 2009; AUVICHAYAPAT et al., 2008; NOMURA et al., 2008;
NAGAO et al., 2007; KHAN et al., 2007; ZHENG et al., 2004; HASEGAWA et
al., 2003; MURASE et al., 2002, MIURA et al., 2001). Essas diferenças nos
resultados são decorrentes de vários fatores, como diferenças nos tempos
experimentais, na dieta utilizada, na ingestão calórica ou na espécie do animal
utilizada. Assim, em relação ao chá branco, ou mesmo ao chá verde, não há
evidências suficientes na literatura para sustentar o uso destes chás para o
controle do peso corporal.
A falta de propriedades emagrecedoras do chá branco é confirmada pela
ausência de diferença em um parâmetro definitivo e mais acurado na definição
da obesidade, a adiposidade. Assim, na maioria dos parâmetros referentes à
expansão do tecido adiposo como adiposidade visceral (Figura 28), área dos
adipócitos (Figuras 29 e 30) e quantidade de lipídeos no tecido adiposo (Figura
31) a ingestão do chá branco foi incapaz de mostrar efeitos benéficos. Esses
resultados também poderiam ser previstos pelos resultados de ganho de peso.
Nossos resultados de adiposidade estão de acordo com os de diversos outros
já publicados utilizando chá verde (RICHARD et al., 2009; KIM et al., 2009;
NOMURA et al., 2008; ZHENG et al., 2004), mas em desacordo com outros
que mostraram redução da adiposidade pelo uso do chá verde ou da ECGC
(MAKI et al., 2009; SOGAWA et al., 2009; BOSE et al., 2008; BRUNO et al.,
2008.; NAGAO et al., 2007; HASEGAWA et al., 2003; MURASE et al., 2002).
Estas essas diferenças, assim como a do peso, podem ser decorrentes das
variações entre os experimentos, como tipo do animal, idade e dieta oferecida.
Em um estudo in vitro (SÖHLE et al., 2009), realizado em pré-adipócitos e
adipócitos humanos, foi observado que o chá branco diminuiu a incorporação
de triglicerídeos durante a adipogênese de forma dose dependente, e diminuiu
a expressão mRNA de fatores também relacionados à adipogênese (PPARγ,
ADD1/SREBP-1c, C/EBPαand C/EBPδ). O chá branco também foi capaz de
aumentar a atividade lipolítica nos adipócitos. Estes resultados in vitro
Discussão
117
divergem dos nossos, pois o aumento da atividade lipolítica acarretaria
hipertrigliceridemia, o que não foi constatado em nossos experimentos.
A infiltração e atividade de macrófagos no tecido adiposo também não
são afetadas pela ingestão do chá branco (Figuras 32 e 34). Em relação a este
parâmetro, não existem estudos indicados no PUBMED que avaliem o efeito do
chá branco ou mesmo do verde na infiltração de macrófagos no tecido adiposo.
Existe apenas uma referência indireta feita por Bose e col. (2008) onde a
ingestão de chá verde foi capaz de diminuir a concentração de MCP-1
circulante, um dos principais fatores quimiotáticos para macrófagos. Este
resultado, porém, não pode ser relacionado à migração adipocitária de
macrófagos, pois MCP-1 apenas indica a migração para um sítio inflamado,
que pode ser em diversos órgãos, como coração.
Em nosso estudo, o chá branco também foi capaz de diminuir os
triglicerídeos séricos (Figura 35). Esse dado está de acordo com os resultados
de Richard e col. (2009), em camundongos nocaute para o gene ob; de Bose e
col. (2008) em camundongos C57BL/6 recebendo epigalocatequina galato
(EGCG) e Fallon e col. (2008), onde foi oferecida uma mistura de chá verde e
preto a ratos Sprague-Dawle. Os últimos também observaram maior excreção
de lipídeos após a ingestão da mistura de chás. Este dado está em
concordância com nosso trabalho, onde observamos uma maior concentração
de lipídeos no conteúdo cecal de animais que ingeriram o chá branco (Figura
36) e nenhuma alteração nos lipídeos hepáticos (Figura 37), sugerindo que a
diminuição dos triglicerídeos séricos pode ser devida a uma menor absorção e
maior excreção destes. Também observamos que não há diferença no
conteúdo de lipídeos no tecido adiposo epididimal (Figura 30), sugerindo que o
chá não aumentou o armazenamento de lipídeos no tecido adiposo. Como foi
observada diminuição na trigliceridemia e aumento da excreção de lipídeos, era
esperado que ocorresse emagrecimento dos animais. Porém explica-se que a
excreção aumentada de lipídeos, bem como a diminuição dos triglicerídeos
séricos não foram suficientes para acarretar perda de peso, visto que, os
animais obesos controles excretaram 0,8kcal por grama de conteúdo cecal,
enquanto os animais obesos que receberam o extrato de chá branco
excretaram 1,1kcal por grama de conteúdo cecal. Essa diferença de calorias
Discussão
118
excretadas pelos diferentes grupos não foi suficiente para interferir no peso
final dos animais. A literatura disponível utilizando o chá verde e suas
catequinas mostra que estes podem melhorar o perfil lipídico por diminuir a
hidrólise luminal dos lipídeos e, consequentemente, reduzir sua absorção
intestinal (BABU et al., 2008; KOO e NOH, 2007). Além disso, já foi descrito
que as catequinas regulariam a expressão dos receptores hepáticos de LDL,
modulando a biossíntese, excreção e processamento intracelular dos lipídeos
(BABU et al., 2008; KOO e NOH, 2007; VITA, 2003). Como a concentração
circulante de LDL em camundongos é insignificante, estes receptores seriam
importantes na retirada de VLDL, carreadora de triglicerídeos e a principal
lipoproteína aumentada em dietas hiperlipídicas, o que condiz com nossos
resultados.
Em relação ao perfil colesterolêmico, não foi observado nenhum efeito
do chá branco (Tabela 5). Não há trabalhos na literatura sobre os efeitos do
chá branco na colesterolemia. Os estudos com chá verde também são
controversos a este respeito. Alguns autores encontraram redução da
colesterolemia em camundongos (RICHARD et al., 2009; KIM et al., 2009) e
outros não observaram diferenças (FARDET et al., 2008; ZHENG et al., 2004).
A controvérsia também existe em estudos clínicos, onde o chá verde ou suas
catequinas reduziram a colesterolemia em alguns estudos (HSU et al., 2008;
NAGAO et al., 2007) e não em outros (MAKI et al., 2009). Nossos resultados
parecem pertinentes, já que, como regra, agentes antioxidantes (como os chás
verde e branco) não alteram quantitativamente as lipoproteínas e colesterol
circulantes. Em vez disso, sua ação é mais qualitativa, reduzindo o estresse
oxidativo que levaria à formação de LDL anormais (oxidadas) e ativaria
macrófagos, ambos, fatores cruciais para a formação da placa aterosclerótica.
Embora a obesidade seja fator de risco para a resistência insulínica
(QATANANI e LAZAR, 2007), não observamos alteração nesse parâmetro. Em
relação ao perfil glicêmico, não foram observadas alterações na glicemia de
jejum, assim como nos testes de sensibilidade à insulina e tolerância oral à
glicose (Figuras 38 a 40), usados para detectar resistência insulínica. Esse
resultado está de acordo com a maioria dos trabalhos utilizando chá verde
(NOMURA et al., 2009; VENABLES et al., 2008). Nos trabalhos onde ocorre
Discussão
119
melhora deste parâmetro, a dose oferecida de chá verde foi de 3%, dose esta 6
vezes maior do que a oferecida em nosso trabalho (KHAN et al., 2007) ou o
tempo experimental foi de 16 semanas, o dobro da duração do presente estudo
(BOSE et al., 2008). Em adição, estudos clínicos com obesos ativos ou
inativos, também não sustentam a ação do chá verde na melhora da glicemia
(MAKI et al., 2009; HSU et al., 2008).
Como muitas das complicações da obesidade estão associadas ao
estresse oxidativo, a redução deste pode levar à menor incidência de
complicações como resistência insulínica, diabetes mellitus tipo 2 e doenças
cardiovasculares (FURUKAWA et al., 2004). Diversos estudos mostraram o
efeito antioxidante do chá branco (THRING et al., 2009; SEERAM et al., 2008;
KOUTELIDAKIS et al., 2008; CALZUOLA et al., 2006) e do chá verde (PANZA
et al., 2008; KHAN et al., 2007; HSU et al., 2007; SABU et al., 2002;
SKRZYDLEWSKA et al., 2002; YOKOZAWA et al., 2002). Nossos resultados
confirmam a ação antioxidante atribuída a este chá em tecidos, mas não no
sangue (Figuras 45 e 46). Isto é devido, provavelmente, ao fato de que os
antioxidantes predominantes no sangue (bilirrubinas, ácido úrico, glutationa,
ubiquinona, etc.) foram suficientes para prevenir o aumento no estresse
oxidativo ocasionado pela dieta. Porém, o chá branco foi capaz de diminuir o
estresse oxidativo no fígado e tecido adiposo (figuras 43 e 41). Como
esperado, esse efeito não foi devido à alteração da atividade das enzimas
antioxidantes SOD e catalase (Figuras 42 e 44), que se mantiveram inalteradas
após o uso do chá. Já é descrito na literatura que os polifenóis, um dos
principais componentes do chá branco, podem atuar como antioxidantes
diretos ou indiretos. De forma direta, os polifenóis removem espécies reativas
de oxigênio e nitrogênio e quelam íons metálicos de transição redox-ativos. De
forma indireta, eles poderiam inibir fatores de transcrição redox-sensíveis,
como o NFκB e o ativador de proteína 1 (AP-1), inibir enzimas pró-oxidantes,
como iNOS, lipoxigenases, cicloxigenases e xantina oxidase ou ativar enzimas
antioxidantes, como a glutationa peroxidase e superóxido dismutase (FREI e
HIGDON, 2003). Como a atividade da SOD e catalase não foram afetadas pela
ingestão de chá branco em nossos experimentos, é possível que este esteja
atuando principalmente de forma direta, como quelante de metais de transição,
Discussão
120
já que o chá é composto de catequinas com seus grupamentos redutores como
hidroxila (OH), grupamento galato (3,4,5 trihidroxil) e o grupamento catecol
(orto 3-4 dihidroxil) nas suas extremidades. O chá branco poderia ainda inibir
fatores de transcrição redox-sensiveis como o NFκB e AP-1.
A diminuição do estresse oxidativo e dos triglicerídeos circulantes pode
ser protetor no desenvolvimento das complicações da obesidade. Naderali e
col. (2001) viram em seu estudo que a hipertrigliceridemia induziu disfunção
endotelial, contribuindo para o potencial aterogênico. O aumento do estresse
oxidativo, por si só, também é risco para desenvolvimento de doenças
cardiovasculares (VOGIATZI et al., 2009). Estes podem ser mecanismos para o
efeito protetor do chá branco no desenvolvimento da aterosclerose. Estes
dados também sugerem um efeito benéfico da suplementação do chá branco
nos casos de hipertrigliceridemia, visto que sua ingestão reduz tanto a
absorção intestinal como a concentração de triglicerídeos no sangue.
Em resumo, de todas as alegações populares do chá branco, nossos
resultados suportam apenas seu papel como antioxidante direto em órgãos
como fígado e tecido adiposo e sugerem um efeito benéfico trigliceridemia pela
menor absorção de gordura.
Chá branco (Camellia sinensis) diminui estresse oxidativo e triglicerídeos
em camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
121
7. CONCLUSÃO
Conclusão
122
Em nosso trabalho, foi possível desenvolver um modelo experimental
rápido de obesidade induzida por dieta com características semelhantes às
vistas clinicamente como aumento do peso corporal e adiposidade visceral
assim como piora do perfil colesterolêmico com aumento do estresse oxidativo
e moderado grau de inflamação.
Em relação ao efeito do chá branco na obesidade e suas complicações,
concluímos que a maioria dos efeitos alegados do chá não puderam ser
suportados experimentalmente. Apesar disso, o chá ainda foi capaz de atuar
como antioxidante, diminuindo o estresse oxidativo em órgãos alvo, além de
reduzir a absorção lipídica, acarretando redução dos triglicerídeos no sangue.
Estes últimos resultados apontam para um efeito benéfico do consumo do chá
para as complicações da obesidade ligadas a estes fatores como,
aterosclerose, hipertrigliceridemia, doenças ligadas ao aumento de radicais
livres e o diabetes mellitus tipo 2.
Chá branco (Camellia sinensis) diminui estresse oxidativo e triglicerídeos
em camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
123
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referências Bibliográficas
124
AFONSO, V., CHAMPY, R., MITROVIC, D., COLLIN, P., LOMRI, A. Reactive
oxygen species and superoxide dismutases: Role in joint diseases. Joint
Bone Spine v. 74 p. 324-29, 2007.
AKAGIRI, S.; NAITO, Y.; ICHIKAWA, H.; MIZUSHIMA, K.; TAKAGI, T.; HANDA,
O.; KOKURA, S.; YOSHIKAWA, T. A Mouse modelo f Metabolic Syndrome;
Increase in Visceral Adipose Tissue Precedes the Development of Fatty
Liver and Insulin Resistance in High-Fat Diet-Fed Male KK/Ta Mice. J. Clin.
Biochem. Nutr. v. 42 p. 150–157, 2008.
ALCÁZAR, A., BALLESTEROS, O., JURADO, J. M., PABLOS, F., MARTÍN, M.
J., VILCHES, J. L.; NAVALÓN, A. Differentiation of Green, White, Black,
Oolong, and Pu-erh Teas According to Their Free Amino Acids Content. J.
Agric. Food Chem. v. 55 p. 5960-5965, 2007.
ALLAIN, C.C.; POON, L.S.; CHAN, C.S.G.; RICHMOND, W.; FU, P.C.
Enzimatic determination of total serum cholesterol. Clin. Chem., v. 20,
p. 470-475, 1974.
ALVAREZ-LEITE, J. Lipoproteínas e transporte de lipídeos no organismo. In:
VIEIRA, E. C.; ALVAREZ-LEITE, JI ; GOMEZ, M. V. ; FIGUEIREDO, E.
A.Química Fisiológica, Rio de Janeiro: Atheneu, p.17-31,1995.
ANGER, D. L., PETRE, M., CRANKSHAW, D. J. Heteroactivation of
cytochrome P450 1A1 by teas and tea polyphenols. British Journal of
Pharmacology - Nat. Publ. Group. v. 145 p. 926–33, 2005.
AUVICHAYAPAT, P., PRAPOCHANUNG, M., TUNKAMNERDTHA, O.,
SRIPANIDKULCHAI, B., AUVICHAYAPAT, N., THINKHAMROP, B.,
KUNHASURA, S., WONGPRATOOM, S., SINAWAT, S., HONGPRAPAS, P.
Effectiveness of green tea on weight reduction in obese Thais: A
randomized, controlled trial. Physiology & Behavior. v. 93 p. 486–91, 2008.
BABU, A., VELAYUTHAM, P., LIU, D. Green Tea Catechins and Cardiovascular
Health: An Update. Curr Med Chem. v. 15 n. 18 p. 1840–50, 2008.
BAILEY, P. J. Sponge implants as model. Meth. in Enzym., v. 162, p. 327-334,
1988.
BALWIERZ, A., POLUS, A., RAZNY, U., WATOR, L., DYDUCH, G.,
TOMASZEWSKA, R., SCHERNECK, S., JOOST, H., DEMBINSKA-KIEC, A.
Angiogenesis in the New Zealand obese mouse model fed with high fat diet.
Lip. Health and Dis.
v. 8 n. 13, 2009.
BANERJEE, D.; KUMAR, P.A.; KUMAR, B.; MADHUSOODANAN, U.K.;
NAYAK, S.; JACOB, J. Determination of absolute hydrogen peroxide
concentration by spectrophotometric method. Current Science, v. 83, n. 10,
p. 1193-1194, 2002.
Referências Bibliográficas
125
BASTARD, J. P., MAACHI, M., LAGATHU, C., KIM, M. J., CARON, M., VIDAL,
H., CAPEAU, J., FEVE, B. Recent advances in the relationship between
obesity, inflammation, and insulin resistance. Eur. Cytokine Netw., v. 17 n. 1,
p. 4-12, 2006.
BELZA, A., TOUBRO, S., ASTRUP, A. The effect of caffeine, green tea and
tyrosine on thermogenesis and energy intake. Europ. Jour.l of Clin. Nut. v.
63, p. 57–64, 2009.
BERG A. H., SCHERER P. E.: Adipose Tissue, Inflammation, and
Cardiovascular Disease. Circ Res v. 96 p.939-949, 2005.
BOSE, M., LAMBERT, J. D., JU, J., REUHL, K. R., SHAPSES, S. A., YANG, C.
S. The Major Green Tea Polyphenol, (-)-Epigallocatechin-3-Gallate, Inhibits
Obesity, Metabolic Syndrome, and Fatty Liver Disease in High-Fat–Fed
Mice. J. Nutr. v. 138 p. 1677–83, 2008.
BRUNO, R. S., DUGAN, C. E., SMYTH, J. A., DINATALE, D. A., KOO, S. I.
Green Tea Extract Protects Leptin-Deficient, Spontaneously Obese Mice
from Hepatic Steatosis and Injury. J. Nutr. v. 138 p. 323–31, 2008.
BROWNLEE, M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic
complications, Nature v. 414 p. 813–20, 2001.
BUETTNER, R., SCHOLMERICH, J. BOLLHEIMER, L. High-fat Diets: Modeling
the Metabolic Disorders of Human Obesity in Rodents. Obesity. v. 15 p.
798–808, 2007.
BULTMAN, S. J., MICHAUD, E. J., WOYCHIK, R. P. Molecular characterization
of the mouse agouti locus. Cell v. 71 p.1195-204, 1992.
BOULOUMIE´, A., CURATA, C. A., SENGENE`SA, LOLME`DEB, K., C.,
MIRANVILLEA, A., BUSSE, R. Role of macrophage tissue infiltration in
metabolic diseases. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. v. 8 p.347–54, 2005.
BUONOCORE, G., GROENENDAAL, F. Anti-oxidant strategies. Seminars in
Fetal & Neonatal Medicine. v. 12 p. 287-95, 2007.
CALZUOLA, I., GIANFRANCESCHI, G. L., MARSILI, V. Comparative activity of
antioxidants from wheat sprouts, Morinda citrifolia, fermented papaya and
white tea. Inter. Jour. Food Sciences Nutr. v. 57 p. 168-77, 2006.
CAMOUSE, M. M., DOMINGO, D. S., SWAIN, F. R., CONRAD, E. P., MATSUI,
M. S., MAES, D., DECLERCQ, L., COOPER, K. D., STEVENS, S. R.,
BARON, E. D. Topical application of green and white tea extracts provides
protection from solar-simulated ultraviolet light in human skin. Exper.
Dermat. v. 18 p.522–26, 2009.
Referências Bibliográficas
126
CHAMPE, P. C., HARVEY, R. A., FERRIER, D. R. Lipidis metabolism. In:
Biochemistry, 4
a
. edição, 2007.
CHARRIERE, G., COUSIN, B., ARNAUD, E., ANDRE, M., BACOU, F.,
PENICAUD, L., CASTEILLA, L. Preadipocyte conversion to macrophage.
Evidence of plasticity. J Biol Chem. v. 278 p. 9850-55, 2003.
CHATTOPADHYAY, P., BESRA, S. E., GOMES, A., DAS, M., SUR, P., MITRA,
S.; VEDASIROMONI J. R. Anti-inflammatory activity of tea (Camellia
sinensis) root extract. Life Sci.. v. 74 p. 1839–1849, 2004.
CHENG T.O. Antioxidants in Chinese green tea. J Am Coll Cardiol. v. 31 p.
1214, 1998.
CHENG T.O. Tea is good for the heart. Arch Intern Med. v. 160 p. 2397, 2000.
CHENG T.O. All teas are not created equal: The Chinese green tea and
cardiovascular health. Inter. Jour. of Card. v. 108, p. 301 – 308, 2005.
CHUNG, B.H., SEGREST, J.P., RAY, M.J., BRUNZELL, J.D., HOKANSON,
J.E., KRAUSS, R.M., BEAUDRIE, K. & CONE, J.T. Single vertical spin
density gradient ultracentrifugation. Methods Enzymol, v. 128, 181-209,
1986.
CHYU, K. Y., BABBIDGE, S. M., ZHAO, X., DANDILLAYA, R., RIETVELD, A.
G., YANO, J., DIMAYUGA, P., CERCEK, B., SHAH, P. K. Differential effects
of green tea-derived catechin on developing versus established
atherosclerosis in apolipoprotein E-null mice. Circulation v. 109 n. 20 p.
2448–53, 2004.
COIMBRA, S., CASTRO, E., ROCHA-PEREIRA, P., REBELO, I., ROCHA, S.,
SANTOS-SILVA, A. The effect of green tea in oxidative stress. Clinical
Nutrition v. 25 p. 790–96, 2006.
DASHWOOD, W., ORNER, G. A., DASHWOOD, R. H. Inhibition of b-
catenin/Tcf activity by white tea, green tea, and epigallocatechin-3-gallate
(EGCG): minor contribution of H
2
O
2
at physiologically relevant EGCG
concentrations. Bioch. and Biophy. Res. Commun. v. 296 p. 584–88, 2002.
DEFURIA, J., BENNETT, G., STRISSEL, K. J., PERFIELD, J. W., MILBURY, P.
E., GREENBERG, A. S., OBIN, M. S. Dietary Blueberry Attenuates Whole-
Body Insulin Resistance in High Fat-Fed Mice by Reducing Adipocyte Death
and Its Inflammatory Sequelae. The jour. of nutr. p. 1510-16, 2009.
DIEPVENS, K. WESTERTERP, K. R., WESTERTERP-PLANTENGA, M. S.
Obesity and thermogenesis related to the consumption of caffeine,
ephedrine, capsaicin, and green tea. Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol v. 292 p.R77–R85, 2007.
Referências Bibliográficas
127
DIETERICH, S., BIELIGK, U., BEULICH, K., HASENFUSS, G., PRESTLE, J.
Gene Expression of Antioxidative Enzymes in the Human Heart: Increased
Expression of Catalase in the End-Stage Failing Heart. Circulation, v. 101 p.
33-39, 2000.
DONA, M., DELL'AICA, I., CALABRESE, F., BENELLI, R., MORINI, M., ALBINI,
A., GARBISA, S.. Neutrophil restraint by green tea: inhibition of
inflammation, associated angiogenesis, and pulmonary fibrosis. Journal of
Immunology v. 170 n. 8 p. 4335–41, 2003.
DULLOO, A. G., DURET, C., ROHRER, D., GIRARDIER, L., MENSI, N.,
FATHI, M., CHANTRE, P., VANDERMANDER, J. Efficacy of a green tea
extract rich in catechin polyphenols and caffeine in increasing 24-h energy
expenditure and fat oxidation in humans. Amer. Jour. of Clin. Nutr. v. 70 n. 6
p. 1040–45, 1999.
ERBA, D., RISO, P., BORDONI, A., FOTI, P., BIAGI, P. L., TESTOLIN, G.
Effectiveness of moderate green tea consumption on antioxidative status
and plasma lipid profile in humans. Journal of Nutritional Biochemistry v. 16
p. 144– 49, 2005.
ESPOSITO, E., ROTILIO, D., DI MATTEO, V., DI GIULIO, C., CACCHIO, M.,
ALGERI, S. A review of specific dietary antioxidants and the effects on
biochemical mechanisms related to neurodegenerative processes.
Neurobiology of Aging v. 23 n. 5 p. 719–35, 2002.
ESTERBAUER, H., GEBICKI, J., PUHL, H., & JURGENS, G. The role of lipid
peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free radic
Biol Med, v. 13 p. 341-90. 1992.
FALLON, E., ZHONG, L., FURNE, J. K., LEVITT, M. D. A Mixture of Extracts of
Black and Green Teas and Mulberry Leaf Did Not Reduce Weight Gain in
Rats Fed a High-fat Diet. Alter. Med. Rev. v. 13, n. 1 p. 43-49, 2008.
FARDET, A., LLORACH, R., MARTIN, J. F., BESSON, C., LYAN, B., PUJOS-
GUILLOT, E., SCALBERT, A. A liquid chromatography-quadrupole time-of-
flight (LC-QTOF)-based metabolomic approach reveals new metabolic
effects of catechin in rats fed high-fat diets. J. Proteome Res. v. 7 n. 6 p.
2388-98, 2008.
FAROOQI, I. S., O’RAHILLY, S. Monogenic obesity in humans. An. Rev. of
Med. v. 56, p. 443–58, 2005.
FAZIO, S.; BABAEV, V.R.; MURRAY, A.B.; HASTY, A.H.; CARTER, K.J.;
GLEAVES, L.A.; ATKINSON, J.B.; LINTON, M.F. Increased atherosclerosis
in mice reconstituted with apolipoproetin E null macrophages. Proc. Nati.
Acad. Sci. USA, v. 94, n. 9, p.4647-4652, 1997.
Referências Bibliográficas
128
FERRARA, L., MONTESANO, D., SENATORE, A. The distribution of minerals
and flavonoids in the tea plant (Camellia sinensis). Il Farmaco. v. 56 p. 397–
401, 2001.
FOSSATI , P.; PRENCIPE, L. Serum triglycerides determined colorimetrically
with enzyme that produces hydrogen peroxide. Clin. Chem., v. 28, n.10, p.
2077-2080, 1982.
FOLCH, J.; LEES, M.; STANLEY, G.H.S. A simple method for the isolation and
purification of total lipídeos from animal tissues. The J. of Biol. Chem. p.
497-509, 1956.
FRANSSEN R., MONAJEMI, H., S TROES, E. S. G., KASTELEIN, J. J. P.
Obesity and Dyslipidemia. Endocrinol Metab Clin N AM v. 37 p. 623–633,
2008.
FREI, B. E HIGDON, J. V. Antioxidant Activity of Tea Polyphenols In Vivo:
Evidence from Animal Studies. J. Nutr. v. 133 p. 3275S–84S, 2003.
FRIDLYAND, L. E., PHILIPSON, L. H. Reactive species and early manifestation
of insulin resistance in type 2 diabetes. Diabetes Obes. Metab. v. 8 p. 136–
45, 2006.
FUJITA, H., YAMAGAMI, T. Antihypercholesterolemic effect of Chinese black
tea extract in human subjects with borderline hypercholesterolemia. Nutrition
Research. v. 28 p. 450–456, 2008.
FURUKAWA, S., FUJITA, T., SHIMABUKURO, M., IWAKI, M., YAMADA, Y.,
NAKAJIMA, Y., NAKAYAMA, O., MAKISHIMA, M.,MATSUDA, M.,
SHIMOMURA, I. Increased oxidative stress in obesity and its impact on
metabolic syndrome The Jour. of Clin. Invest. v. 114 n. 12 p. 1752-61, 2004.
GALIC, S., OAKHILL, J. S., STEINBERG, G. R. Adipose tissue as an endocrine
organ. Molecular and Cellular Endocrinology. Artigo online, 2009
GARAULET, M., HERNÁNDEZ-MORANTE, J. J., HEREDIA, F. P., TÉBAR, F.
J. Adiponectin, the controversial hormone. Public Health Nutrition. v. 10, p.
1145-50, 2007.
GENESTRA, M. Oxyl radicals, redox-sensitive signalling cascades and
antioxidants. Cellular Signalling v. 19 p. 1807-19, 2007.
GRATTAGLIANO, I., PALMIERI, V. O., PORTINCASA, P., MOSCHETTA, A.,
PALASCIANO, G. Oxidative stress-induced risk factors associated with the
metabolic syndrome: a unifying hypothesis. Jour. of Nutr. Biochem. v. 19 p.
491–504, 2008.
GOETZ, M. E., LUCH, A. Reactive species: A cell damaging rout assisting to
chemical carcinogens. Cancer Letters v. 266 p. 73–83, 2008.
Referências Bibliográficas
129
GRUNDY, S.M.; CLEEMAN, J.I.; DANIELS, S.R.; DONATO, K.A.; ECKEL,
R.H.; FRANKLIN, B.A.; GORDON, D.J.; KRAUSS, R.M.; SAVAGE, P.J.;
SMITH JR., S.C.; SPERTUS, J.A.; COSTA, C. Diagnosis and management
of the metabolic syndrome: an American Heart Association/National Heart,
Lung and Blood Institute Scientific Statement. Circulation. v. 112, p. 2735-
52, 2005.
HAGIWARA, S., GOHDA, T., TANIMOTO, M., ITO, T., MURAKOSHI, M.,
OHARA, I., YAMAZAKI, T., MATSUMOTO, M., HORIKOSHI, S., FUNABIKI,
K., TOMINO, W. Effects of pyridoxamine (K-163) on glucose intolerance and
obesity in high-fat diet C57BL/6J mice. Metab. Clin. and Exper. v. 58 p. 934–
945, 2009.
HASEGAWA, N. YAMDA, N., MORI, M. Powdered Green Tea has
Antilipogenic Effect on Zucker Rats Fed a High-Fat Diet. Phytother. Res. v.
17 p. 477–80, 2003.
HEILBRONN, L. K, CAMPBELL, L. V. Adipose Tissue Macrophages, Low
Grade inflammation and Insulin Resistance in Human Obesity. Current
Pharmaceutical Design. v. 14 p. 1225-30, 2008.
HIGDON, J. V., FREI, B. Tea catechins and polyphenols: health effects,
metabolism, and antioxidant functions. Crit Rev Food Sci Nutr v. 43 p. 89–
143, 2003.
HOFFLER, U., HOBBIE , K., WILSON, R., BAI, R., RAHMAN, A., MALARKEY,
D., TRAVLOS, G., GHANAYEM, B. I. Diet-induced obesity is associated with
hyperleptinemia, hyperinsulinemia, hepatic steatosis, and glomerulopathy in
C57Bl/6J mice. Endocr., 2009.
HORTON JD, GOLDSTEIN JL, BROWN MS. SREBPs: activators of the
complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. J Clin
Invest v. 109 p. 1125–31, 2002.
HOUSTIS, N., ROSEN, E. D., LANDER, E. S. Reactive oxygen species have a
causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. v. 440 p. 944–48,
2006.
HSU, S. P., WU, M., YANG, C., HUANG, K., LIOU, S., HSU, S., CHIEN, C.
Chronic green tea extract supplementation reduces hemodialysis enhanced
production of hydrogen peroxide and hypochlorous acid, atherosclerotic
factors, and proinflammatory cytokines. Am J Clin Nutr. v. 86 p. 1539–47,
2007.
HSU, C. H., TSAI, T. H., KAO, Y. H., HWANG, K. C., TSENG, T. Y., CHOU, P.
Effect of green tea extract on obese women: A randomized, double-blind,
placebo-controlled clinical trial. Clin. Nutr. v. 27 p. 363-370, 2008.
Referências Bibliográficas
130
HUANG, H., MANTON, K.G., The role of oxidative damage in mitochondria
during aging: a review, Front. Biosci. v. 9 p. 1100–17, 2004.
IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística). Pesquisa de Orçamentos
Familiares 2002-2003. Rio de Janeiro: IBGE, 2009. 76 p.
JUGE-AUBRY, C. E., HENRICHOT, E., MEIER, C. A. Adipose tissue: a
regulator of inflammation. Best Practice & Research Clinical Endocrinology
& Metabolism v. 19, n. 4, p. 547–66, 2005.
KENNEDY, A., MARTINEZ, K., CHUANG, C. C., LAPOINT, K. MCINTOSH, M.
Saturated Fatty Acid-Mediated Inflammation and Insulin Resistance in
Adipose Tissue: Mechanisms of Action and Implications. J. Nutr. v. 139 p.
1–4, 2009.
KHAN, S. A., PRIYAMVADA, S., NATARAJAN, A. A., KHAN, S., YUSUFI, A. N.
K. Influence of green tea on enzymes of carbohydrate metabolism,
antioxidant defense, and plasma membrane in rat tissues. Nutrition v. 23 p.
687–95, 2007.
KIM, H. J., JEON, S. M., LEE, M. K., JUNG, U. J., SHIN, S. K., CHOI, M. S.
Antilipogenic Effect of Green Tea Extract in C57BL/6J-Lepob/ob Mice.
Phytother. Res. v. 23, p. 467– 71, 2009.
KLEYN, P. W., FAN, W., KOVATS, S. G., LEE, J. J., PULIDO, J. C., WU, Y.
Identification and characterization of the mouse obesity gene tubby: a
member of a novel gene family. Cell v. 85 p.281-90, 1996.
KOO, S. I., NOH, S. K. Green Tea as Inhibitor of the Intestinal Absorption of
Lipids: Potential Mechanism for its Lipid-Lowering Effect. J Nutr Biochem. v.
18 n. 3 p. 179–83, 2007.
KOUTELIDAKIS, A. E., ARGIRI, K., SERAFINI, M., PROESTOS, C.,
KOMAITIS, M., PECORARI, M., KAPSOKEFALOU, M. Green tea, white tea,
and Pelargonium purpureum increase the antioxidant capacity of plasma
and some organs in mice. Nutrition, 2008.
LAMBERT, J. D., KENNETT, M. J., SANG, S., REUHL, K. R., JU, J., YANG, C.
S. Hepatotoxicity of High Oral Dose (-)-Epigallocatechin-3-Gallate in Mice.
Food Chem. Toxicol. – artigo não impresso - Out/2009.
LEE, T. S., YEN, H. C., PAN, C. C., CHAU, L. Y. The Role of Interleukin 12 in
the Development of Atherosclerosis in ApoE-Deficient Mice. Arterioscler
Thromb Vasc Biol, v. 19 p. 734-742, 1999
LI, S., ZHANG, H. Y., HU, C. C., LAWRENCE, F., GALLAGHER, K. E.,
SURAPANENI, A., ESTREM, S. T., CALLEY, J. N., VARGA, G., DOW, E.
R., CHEN, Y. Assessment of Diet-induced Obese Rats as an Obesity Model
by Comparative Functional Genomics. Obesity. v. 16 p. 811–18, 2008.
Referências Bibliográficas
131
LIEN, L. F. L. e GUYTON, J. R. Metabolic syndrom. Dermatologic Therapy, v.
21 p. 362–375, 2008.
LOWRY, O. H., ROSEBROUGH, N. J., FARR, A. L., RANDAL, R. J. Protein
measurement with the Folin phenol reagent. J.Biol.Chem., 193:265-275,
1951.
MAKI, K. C., REEVES, M. S., FARMER, M., YASUNAGA, K., MATSUO, N.,
KATSURAG, Y., KOMIKADO, M., TOKIMITSU, I., WILDER, D., JONES, F.,
BLUMBERG, J. B., CARTWRIGHT, Y. Green Tea Catechin Consumption
Enhances Exercise-Induced Abdominal Fat Loss in Overweight and Obese
Adults. J. Nutr. v. 139 p. 264–70, 2009.
MALINOWSKA, E., INKIELEWICZ, I., CZARNOWSKI, W., SZEFER, P.
Assessment of fluoride concentration and daily intake by human from tea
and herbal infusions. Food and Chem. Toxic. v. 46 p. 1055–61, 2008.
MAMANE, Y., CHAN, C. C., LAVALLEE, G., MORIN, N., XU, L., HUANG, J.,
GORDON, R., THOMAS, W., LAMB, J., SCHADT, E. E., KENNEDY, B. P.,
MANCINI, J. A. The C3a Anaphylatoxin Receptor Is a Key Mediator of
Insulin Resistance and Functions by Modulating Adipose Tissue
Macrophage Infiltration and Activation. Diabetes v. 58 p. 2006–17, 2009.
MEIR, K. S., LEITESDORF, E. Atherosclerosis in the apolipoprotein E-deficient
mouse. A decade of progress. Atherioscler Thromb Vasc Biol. v.24 p.1006-
14, 2004.
MENDONÇA, C. P., ANJOS, L. A. Aspectos das práticas alimentares e da
atividade física como determinantes do crescimento do
sobrepeso/obesidade no Brasil. Cad. Saúde Pública v. 20(3) p. 698-709,
2004.
MERKEL M., ECKEL R. H., GOLDBERG I. J. Lipoprotein lipase: genetics, lipid
uptake, and regulation. J Lipid Res v. 43 p. 1997–2006, 2002.
MIAO, L., ST. CLAIR, D. K., Regulation of superoxide dismutase genes:
Implications in disease, Free Radic. Biol. Med., 2009,
doi:10.1016/j.freeradbiomed.2009.05.018.
MILAGRO, F., CAMPIO´N, J., MARTI´NEZ, J. A. Weight Gain Induced by High-
Fat Feeding Involves Increased Liver Oxidative Stress. Obesity. v. 14 n. 7 p.
1118-23, 2006.
MINISTÉRIO DA SAÚDE. 13% dos brasileiros adultos são obesos. Em:
http://portal.saude.gov.br/portal/aplicacoes/noticias/default.cfm?pg=dspDetal
heNoticia&id_area=124&CO_NOTICIA=10078 Acesso em: 05/05/2009.
Referências Bibliográficas
132
MIURA, Y., CHIBA, T., TOMITA, I., KOIZUMI, H., MIURA, S., UMEGAKI, K.,
HARA, Y., IKEDA, M., TOMITA, T. Tea catechins prevent the development
of atherosclerosis in apoprotein E-deficient mice. J. Nutr. v. 131 p. 27–32,
2001.
MONAGHAN, P., METCALFE, N. B., TORRES, R. Oxidative stress as a
mediator of life history trade-offs: mechanisms, measurements and
interpretation. Ecol. Let. v. 12 p. 75–92, 2009.
MONTEIRO, R. ASSUNÇÃO, M., ANDRADE, J. P., NEVES, D., CALHAU, C.,
AZEVEDO, I. Chronic green tea consumption decreases body mass,
induces aromatase expression, and changes proliferation and apoptosis in
adult male rat adipose tissue. J. Nutr. v. 138 p. 2156–2163, 2008.
MUKHTAR, H., AHMAD, N. Tea polyphenols: prevention of cancer and
optimizing health. Amer. Jour. Clin. Nutr. v. 71 p. 1698–1702, 2000.
MURASE, T., NAGASAWA, A., SUZUKI, J., HASE, T., TOKIMITSU, I.
Beneficial effects of tea catechins on diet-induced obesity: stimulation of lipid
catabolism in the liver. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. v. 26 p. 1459–64,
2002.
NADERALI, E. K., BROWN, M. J., PICKAVANCE, L. C., WILDING, J. P. H.,
DOYLE, P. J., WILLIAMS, G. Dietary obesity in the rat induces endothelial
dysfunction without causing insulin resistance: a possible role for
triacylglycerols. Clinical Science. v. 101, p. 499–506, 2001.
NAGAO, T., HASE, T., TOKIMITSU, I. A Green Tea Extract High in Catechins
Reduces Body Fat and Cardiovascular Risks in Humans. Obesity. v. 15 n. 6
p. 1473–83, 2007.
NAGATA, N. M., TAKAMURA, T., ANDO, H., NAKAMURA, S., KURITA, S.,
MISU, H., OTA, T., YOKOYAMA, M., HONDA, M., MIYAMOTO, K.,
KANEKO, S. Increased oxidative stress precedes the onset of high-fat diet–
induced insulin resistance and obesity. Metab. Clin. Exper. v. 57 p. 1071–77,
2008.
NANCE, C. L., SHEARER,W. T. Is green tea good for HIV-1 infection? Jour.
Aller. Clin. Immunol. v. 112 n. 5 p. 851–853, 2003.
NAGGERT, J. K., FRICKER, L. D., VARLAMOV, O., NISHINA, P. M.,
ROUILLE, Y., STEINER, D.F., CARROLL, R. J., PAIGEN, B. J., LEITER, E.
H. Hyperproinsulinaemia in obese fat/fat mice associated with a
carboxypeptidase E mutation which reduces enzyme activity. Nat Genet. v.
10 p. 135-42, 1995.
Referências Bibliográficas
133
NASCIMENTO, A. F. Influência das dietas padrão e hipercalórica sobre o
comportamento corporal e bioquímico de ratos wistar. 2006. 52p.
Dissertação (Mestrado) Cardiologia, Faculdade de Medicina de Botucatu,
UNESP.
NEGISHI, H., XU, J. W., IKEDA, K., NJELEKELA, M., NARA, Y., YAMORI, Y.
Black and green tea polyphenols attenuate blood pressure increases in
stroke-prone spontaneously hypertensive rats. J. Nutr. v. 134 p. 38–42,
2004.
NELSON, D. P.; KIESOW, L. A. Enthalphy of decomposition of hydrogen
peroxide by catalase at 25ºC (with molar extinction coefficients of H2O2
solution in the UV). Anal. Biochem. v. 49, p. 474-78, 1972.
NISHIMURA, S., MANABE, I., NAGASAKI, M., ETO, K., YAMASHITA, H.,
OHSUGI, M., OTSU, M., HARA, K., UEKI, K., SUGIURA, S., YOSHIMURA,
K., KADOWAKI, T., NAGAI, R. CD8+ effector T cells contribute to
macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature
Medicine. v. 15 n. 8 p. 914-21, 2009.
NOMURA, S., ICHINOSE, T., JINDE, M., KAWASHIMA, Y., TACHIYASHIKI,
K., IMAIZUMI, K. Tea catechins enhance the mRNA expression of
uncoupling protein 1 in rat brown adipose tissue. The Jour. of Nutr.
Biochem. v. 19, n. 12, p. 840-47, 2008.
NOUROOZ-ZADEH, J.; TAJADDINI-SARMADI, J.; WOLFF, S.P.; measurement
of plasma hydroperoxide concentrations by the ferrous oxidation-xylenol
orange assay in conjunction with triphenylphosphine. Anal. Biochem., v.
220, n.2, p. 403-409, 1994.
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE. Definição de obesidade e sobrepeso.
Em: http://www.who.int/topics/obesity/en/ Acesso em 05/05/2009.
ORGANIZAÇÂO PANAMERICANA DE SAÚDE. Doenças crônico-
degenerativas e obesidade: estratégia mundial sobre alimentação saudável,
atividade física e saúde. Brasília, 2003.
ORNER, G. A., DASHWOOD, W., BLUM, C. A., DÍAZ, G. D., LI, Q.,
DASHWOOD, R. H. Suppression of tumorigenesis in the Apcmin mouse:
downregulation of β-catenin signaling by a combination of tea plus sulindac.
Carcinogenesis. v. 24 p. 263–67, 2003.
ORNER, G. A., DASHWOOD, W., BLUM, C. A., DÍAZ, G. D., LI, Q., FAGEEH,
M., TEBBUTT, N., HEATH, J. K., ERNST, M., DASHWOOD, R. H.
Response of Apcmin and A33∆Nβ–cat mutant mice to treatment with tea,
sulindac, and 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b] pyridine (PhIP).
Mutat Res. v. 506-507 p. 121–127, 2002.
Referências Bibliográficas
134
O’ROURKE, R. W. Inflammation in obesity-related diseases. Surgical Research
Review. v. 14(3) p. 255-59, 2009.
PAIGEN, B.; MORROW, A.; HOLMES, P.A.; MITCHELL, D.; WILLIAMS, R.A.
Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis.
v. 68, p. 231-240, 1987.
PANZA, V. S. P., WAZLAWIK, E., SCHÜTZ, G. R, COMIN, L., HECHT, K. C.,
SILVA, E. L. Consumption of green tea favorably affects oxidative stress
markers in weight-trained men. Nutrition. v. 24 p. 433–42, 2008.
PARK, J., CHUNG, J., KIM, J. B. New evaluations of redox regulating system in
adipose tissue of obesity. Diab. Res. Clin. Pract. v. 77S p. S11–S16, 2007.
PEAKE P. W., SHEN Y., CAMPBELL L. V., CHARLESWORTH J. A. Human
adiponectin binds to bacterial lipopolysaccharide. Biochem Biophys Res
Commun. v. 341 p. 108-15, 2006.
PHILIPPI, S. T. Tabela de Composição de alimentos: Suporte para decisão
nutricional. 2
a
. edição. Editora Coronário, 2002.
POWERS, S. K., JACKSON, M. J. Exercise-Induced Oxidative Stress: Cellular
Mechanisms and Impact on Muscle Force Production. Physiol Rev v. 88, p.
1243–76, 2008.
QATANANI, M., LAZAR, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin
resistance: many choices on the menu. Genes & development. v. 21 p.
1443–55, 2007.
RAEDERSTORFF, D. G., SCHLACHTER, M. F., ELSTE, V., WEBER, P. Effect
of EGCG on lipid absorption and plasma lipid levels in rats. J. Nutr.
Biochem. v. 14 p. 326–332, 2003.
RAHMAN, I.; BISWAS, S. K.; KIRKHAM, P. A. Regulation of inflammation and
redox signaling by dietary polyphenols. Biochemicalpharmacology. V. 72, p.
1439-1452, 2006.
RAMALHO, R., GUIMARÃES, C. Papel do tecido adiposo e dos macrófagos no
estado de inflamação crónica associada à obesidade. Acta Med Port v. 21
p. 489-496, 2008.
RANKINEN, T., ZUBERI, A., CHAGNON, Y. C., WEISNAGEL, S. J.,
ARGYROPOULOS, G., WALTS, B., PE´RUSSE, L., BOUCHARD, C. The
human obesity gene map: the 2005 update. Obesity v.14 p. 529–644, 2006.
RASOULI, N., KERN, P. A. Adipocytokines and the Metabolic Complications of
Obesity. J Clin Endocrinol Metab v. 93 p. S64–S73, 2008.
Referências Bibliográficas
135
REEVES P. G.; NIELSEN, F. H.; FAHEY, G. C. AIN-93 purified diets for
laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc
writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet
.
J
Nutrition, v. 123 n. 11 p. 1939-51, 1993.
RICHARD, D., KEFI, K., BARBE, U., POLI, A., BAUSERO, P., VISIOLI, F.
Weight and plasma lipid control by decaffeinated green tea. Pharmac. Res.
v. 59 p. 351–54, 2009.
ROCHA, V. Z., LIBBY, P. The Multiple Facets of the Fat Tissue. Thyroid v. 18,
n. 2, p. 175-183, 2008.
ROE, P. G. Liver function tests in the critically ill patient. Clin. Intensive Care. v.
4 n. 4 p. 174-82, 1993.
RYU, O.H., LEE, J., LEE, K.W., KIM, H.Y., SEO, OJ.A., KIM, S.G., KIM, N.H.,
BAIK, S.H., CHOI, D.S. & CHOI, K.M. Effects of green tea consumption on
inflammation, insulin resistance and pulse wave velocity in type 2 diabetes
patients. Diab. Res. Clin. Pract. v. 71 p. 356–358, 2006.
SABU, M. C., SMITHA, K., KUTTAN, R. Anti-diabetic activity of green tea
polyphenols and their role in reducing oxidative stress in experimental
diabetes. J. Ethnopharmacol. v. 83 p. 109–116, 2002.
SADOVSKY, R., KRIS-ETHERTON, P. Prescription omega-3-acid ethyl esters
for the treatment of very high triglycerides. Postgrad. Med. v. 121, n. 4, p.
145-53, 2009.
SANTANA-RIOS, G., ORNERA, G. A., AMANTANA, A., PROVOST, C., WU, S.,
DASHWOOD, R. H. Potent antimutagenic activity of white tea in comparison
with green tea in the Salmonella assay. Mutat Res. v. 495 p. 61–74, 2001.
SANTOS, S. H. S., FERNANDES, L R F, MÁRIO, E. G., FERREIRA, A. V. M.,
PORTO, L. C. J., ALVAREZ-LEITE, J. I. ; BOTION, L, M., BADER, M.,
ALENIN, N., SANTOS, R. A. Mas Deficiency in FVB/N Mice Produces
Marked Changes in Lipid and Glycemic Metabolism. Diabetes (New York), v.
57 p. 340-47, 2008.
SATO, T., MIYATA, G. The Nutraceutical Benefit, Part I: Green Tea. Nutr.
Pharm. v. 16 p. 315–317, 2000.
SCHENK, S., SABERI, M., OLEFSKY, J. M. Insulin sensitivity: modulation by
nutrients and inflammation. J. Clin. Invest. v. 118 p. 2992–3002, 2008.
SCHINTZER, E.; PINCHUK, I.; BOR, A.; FAINARU, M.; SAMUNI, A.M.;
LICHTEMBERG, D. Lipid oxidation in unfracionated serum and plasma.
Chem. and Phys. Lip., v. 92, p. 151-170, 1998.
Referências Bibliográficas
136
SCHREYER, S. A., VICK, C., LYSTIG, T. C., MYSTKOWSK, P., LEBOEUF, R.
E. E. LDL receptor but not apolipoprotein E deficiency increases diet-
induced obesity and diabetes in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. v.
282 p. 207-214, 2002.
SEERAM, N. P., AVIRAM, M., ZHANG, Y., HENNING, S. M., FENG, L.,
DREHER, M., HEBER, D. Comparison of Antioxidant Potency of Commonly
Consumed Polyphenol-Rich Beverages in the United States. J. Agric. Food
Chem. v. 56 p. 1415–22, 2008.
SKRZYDLEWSKA, E., OSTROWSKA, J., FARBISZEWSKI, R., MICHALAK, K.
Protective effect of green tea against lipid peroxidation in the rat liver, blood
serum and the brain. Phytomedicine. v. 9 p. 232–38, 2002.
SOGAWA, M., SEURA, T., KOHNO, S., HIRASAKA, K., YAMAGUCHI, Y.,
TAKAGAKI, R., HARADA, A., OKUMURA, Y., YAMAMOTO, S., KISHI, K.,
NIKAWA, T. Awa (Tokushima) lactate-fermented tea as well as green tea
enhance the effect of diet restriction on obesity in rats. J Med Invest. v. 56 p.
42-8, 2009.
SOHET, F. M., NEYRINCK, A. M., DEWULF, E. M., BINDELS, L. B., PORTOIS,
L., MALAISSE, W. J., CARPENTIER, Y. A., CANIL, P. D., DELZENNEL, N.
M. Lipid peroxidation is not a prerequisite for the development of obesity and
diabetes in high-fat-fed mice. Brit. Jour. of Nutr. v. 102 p. 462-69, 2009.
SÖHLE, J., KNOTT, A., HOLTZMANN, U., SIEGNER, R., GRÖNNIGER, E.,
SCHEPKY, A., GALLINAT, S., WENCK, H., STÄB, F., WINNEFELD, M.
White Tea extract induces lipolytic activity and inhibits adipogenesis in
human subcutaneous (pre)-adipocytes Nutr. Metab. 6:20, 2009.
STAPLETON, P. D., SHAH, S., ANDERSON, J. C., HARA, Y., HAMILTON-
MILLER, J. M., TAYLOR, P. W. Modulation of beta-lactam resistance in
Staphylococcus aureus by catechins and gallates. Inter. Jour. Antim. Agents
v. 23 n. 5 p. 462–67, 2004.
STEFFENS, S., MACH, F. Inflammation and atherosclerosis. Herz. v. 29, p.
741-48, 2004.
STRISSEL, K. J., STANCHEVA, Z., MIYOSHI, H., PERFIELD, J. W.,
DEFURIA, J., JICK, Z. Adipocyte death, adipose tissue remodeling and
obesity complications. Diabetes. v. 56 p. 2910-8, 2007.
TAKAMI, S., IMAI, T., HASUMURA, M., CHO, M., ONOSE, J., HIROSE, M.
Evaluation of toxicity of green tea catechins with 90-day dietary
administration to F344 rats. Food and Chem. Toxic. v. 46 p. 2224–29, 2008.
TARTAGLIA, L. A., DEMBSKI, M., WENG, X., DENG, N., CULPEPPER, J.,
DEVOS, R. Identification and expression cloning of a leptin receptor, OB-R.
Cell. v. 83 p. 1263-71, 1995.
Referências Bibliográficas
137
THIELECKE, F., BOSCHMANN, M. The potential role of green tea catechins in
the prevention of the metabolic syndrome – A review. Phytochemistry. v. 70,
p. 11–24, 2009.
THRING, T. S. A., HILI, P., NAUGHTON, D. P. Anti-collagenase, anti-elastase
and anti-oxidant activities of extracts from 21 plants. Complem. and Altern.
Med., v. 9 n. 27, 2009.
TRAYHURN, P., WOOD, I. S. Adipokines: inflammation and the pleiotropic role
of white adipose tissue. Brit. Jour. of Nutr. v. 92, p.347–355, 2004.
TRAYHURN P, WOOD I.S: Signalling role of adipose tissue: adipokines and
inflammation in obesity. Biochem Soc Trans v. 33(5) p.1078-81, 2005.
TSUKUMO, D. M., CARVALHO-FILHO, M. A., CARVALHEIRA, J. B., PRADA,
P. O., HIRABARA, S. M., SCHENKA, A. A. Loss-of-function mutation in Toll-
like receptor 4 prevents diet-induced obesity and insulin resistance.
Diabetes. v. 56 p. 1986-98, 2007.
VARILEK, G. W., YANG, F., LEE, E.Y., DE VILLIERS, W.J.S., ZHONG, J., OZ,
H. S., WESTBERRY, K. F. & MCCLAIN, C. J. Green tea polyphenol extract
attenuates inflammation in interleukin-2-deficient mice, a model of
autoimmunity. J. Nutr. p. 2034–2039, 2001.
VENABLES, M. C., HULSTON, C. J., COX, H. R., JEUKENDRUP, A. E. Green
tea extract ingestion, fat oxidation, and glucose tolerance in healthy humans.
Am J Clin Nutr. v. 87 p. 778–84, 2008.
VIEIRA, V. J., VALENTINE, R. J., WILUND, K. R., WOODS, J. A. Effects of diet
and exercise on metabolic disturbances in high-fat diet-fed mice. Cytokine.
v. 46 p. 339–45, 2009.
VINCENT, H. K., INNES, K. E., VINCENT, K. R. Oxidative stress and potential
interventions to reduce oxidative stress in overweight and obesity. Diab.,
Obesity and Metab., v. 9, p. 813-39, 2007.
VINSON, J. A.; ZHANG, J. Black and Green Teas Equally Inhibit Diabetic
Cataracts in a Streptozotocin-Induced Rat Model of Diabetes. J. Agric. Food
Chem. v. 53 p. 3710-3713, 2005.
VITA, J. A. Tea Consumption and Cardiovascular Disease: Effects on
Endothelial Function. J. Nutr. v. 133 p. 3293S–97S, 2003.
VOGIATZI, G., TOUSOULIS, D., STEFANADIS, C. The Role of Oxidative
Stress in Atherosclerosis. Hellenic J Cardiol. v. 50 p. 402-409, 2009.
Referências Bibliográficas
138
VORA, A. J., KIDD, D., MILLER, D. H., PERKIN, G. D., HUGHES, R. A., ELLIS,
B. A., DUMONDE, D. C., BROWN, K. A. Lymphocyte-endothelial cell
interactions in multiple sclerosis: disease specificity and relationship to
circulating tumour necrosis factor-alpha and soluble adhesion molecules.
Mult Scler. v.3, p.171-179, 1997.
WALLIN, B.; ROSENGREN, B.; SHERTZER, H.G.; CAMEJO, G. Lipoprotein
oxidation and measurement of thiobarbituric acid reacting substances
formation in a single microtiter plate: its use for evaluation of antioxidants.
Anal. Biochem., v. 208, p. 10-15, 1993.
WALTNER-LAW, M. E.; WANG, X. L.; LAW, B. K.; HALL, R. K.; NAWANO,
M.; GRANNER, D. K. Epigallocatechin Gallate, a Constituent of Green Tea,
Represses Hepatic Glucose Production. The jour. of biol. chem. v. 277, n.
38, p. 34933–34940, 2002.
WANG, R., DASHWOOD, W. M., LO, C. V., FISCHER, K. A., PEREIRA, C. B.,
LOUDERBACK, M., NAKAGAMA, H., BAILEY, G. S., WILLIAMS, D. E.,
DASHWOOD, R. H. Protective versus promotional effects of white tea and
caffeine on PhIP-induced tumorigenesis and b-catenin expression in the rat.
Carcinogenesis. v. 29 n. 4 p. 834–39, 2008.
WANG, G. P., DENG, Z. D., NI, J., QU, Z. L. Oxidized low density lipoprotein
and very low density lipoprotein enhance expression of monocyte
chemoattractant protein-1 in rabbit peritoneal exudate macrophages.
Atherosclerosis. v.133, p.31-36, 1997
WASSMANN, S., WASSMANN, K., NICKENIG, G. Modulation of Oxidant and
Antioxidant Enzyme Expression and Function in Vascular Cells.
Hypertension. v. 44; p. 381-86, 2004
WEISBURGER, J. H. Tea and health: A historical perspective. Cancer Lett.
v. 114, p. 315-317, 1997.
WELLEN, K. E. E HOTAMISLIGIL, G. S. Obesity-induced inflammatory
changes in adipose tissue. J. Clin. Invest. v. 112 p. 1785–88, 2003.
WEST, D. B., YORK, B. Dietary fat, genetic predisposition, and obesity: lessons
from animal models. Am J Clin Nutr. v. 67, p. 505S–12S, 1998
WU, L. Y., JUAN, C. C., HO, L. T., HSU, Y. P.,HWANG, L. S. Effect of green
tea supplementation on insulin sensitivity in Sprague-Dawley rats. J. Agric.
Food Chem. v. 52 p. 643–648, 2004a.
WU, L. Y., JUAN, C. C., HWANG, L. S., HSU, Y. P., HO, P. H., HO, L. T. Green
tea supplementation ameliorates insulin resistance and increases glucose
transporter IV content in a fructose-fed rat model. Eur. Jour. of Nutr. v. 43 n.
2 p. 116–24, 2004b.
Referências Bibliográficas
139
YAMATO, M., SHIBA, T., YOSHIDA, M., IDE, T., SERI, N., KUDOU, W.,
KINUGAWA, S., TSUTSUI, H. Fatty acids increase the circulating levels of
oxidative stress factors in mice with diet-induced obesity via redox changes
of albumin. FEBS Journal v. 274 p. 3855–63, 2007.
YAN, J., YOUNG, M. E., CUI, L., LOPASCHUK, G. D., LIAO, R., TIAN, R.
Increased Glucose Uptake and Oxidation in Mouse Hearts Prevent High
Fatty Acid Oxidation but Cause Cardiac Dysfunction in Diet-Induced
Obesity. Circulation. v. 119 p. 2818-28, 2009.
YANG, C. S., MALIAKAL, P., MENG, X. Inhibition of carcinogenesis by tea.
Annual Reviews in Pharmacology and Toxicology. v. 42 p. 25–54, 2002.
YANG, T. T., KOO, M. W. Chinese green tea lowers cholesterol level through
an increase in fecal lipid excretion. Life Sci. v. 66 n. 5 p. 411–423, 2000.
YE, J., GAO, Z., YIN, J., HE, Q. Hypoxia is a potential risk factor for chronic
inflammation and adiponectin reduction in adipose tissue of ob/ob and
dietary obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. v. 293 p. E1118-28,
2007.
YOKOZAWA, T., NAKAGAWA, T., KITANI, K. Antioxidative activity of green tea
polyphenol in cholesterol-fed rats. J. Agric. Food Chem. v. 50 p. 3549–52,
2002.
YOSHIDA, H., ISHIKAWA, T., HOSOAI, H., SUZUKAWA, M., AYAORI, M.,
HISADA, T. Inhibitory effect of tea flavonoids on the ability of cells to oxidize
low density lipoprotein. Bioch. Pharmac. v. 58 p. 1695–703, 1999.
ZHANG, Y., PROENCA, R., MAFFEI, M., BARONE, M., LEOPOLD, L.,
FRIEDMAN, J. M. Positional cloning of the mouse obese gene and its
human homologue. Nature. v. 372 p. 425-32, 1994.
ZHENG, G., SAYAMA, K., OKUBO, T., JUNEJA, L., OGUNI, I. Anti-obesity
Effects of Three Major Components of Green Tea, Catechins, Caffeine and
Theanine, in Mice. In vivo. v. 18 p. 55-62, 2004.
Chá branco (Camellia sinensis) diminui estresse oxidativo e triglicerídeos
em camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
140
9. ANEXO
Anexo
141
9.1. Protocolo de Aceitação do CETEA - n
o
. 116/09
Anexo
142
9.2. Composição da dieta comercial Labina®, segundo o fornecedor
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
