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Elisa Rennó Donnard Moreira
DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS
BIOQUÍMICOS E BIOINFORMÁTICOS PARA BUSCAR
INTERAÇÕES REGULATÓRIAS:
Tead4 como modelo
Orientador: J. Miguel Ortega
Co-orientador: R. Daniel Gietz
Laboratório de Biodados, Biologia Celular e Desenvolvimento
Departamento de Bioquímica e Imunologia
Instituto de Ciências Biológicas - UFMG
2010
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Elisa Rennó Donnard Moreira
DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS BIOQUÍMICOS E
BIOINFORMÁTICOS PARA BUSCAR INTERAÇÕES REGULATÓRIAS:
Tead4 como modelo
Dissertação apresentada ao Departamento de
Bioquímica e Imunologia do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade Federal
de Minas Gerais como pré-requisito para a
obtenção do título de Mestre em Bioquímica e
Imunologia
Orientador: J. Miguel Ortega
Co-orientador: R. Daniel Gietz
Belo Horizonte
2010
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II
Agradecimentos
Agradeço a todos que contribuíram para este trabalho, direta ou indiretamente. Ao
meu orientador Miguel pelas excelentes idéias e toda a ajuda, aos amigos do Lab Biodados
pela participação no trabalho e pela companhia mais que divertida. A Dan Gietz e Cheri por
tornarem este trabalho possível, aos amigos de Bases por tornarem o trabalho mais
agradável! Agradeço a minha família, aos meus amigos e ao Bê por todo o apoio.
III
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: SISTEMA DE DUPLO-HÍBRIDO EM LEVEDURAS ............................................................................. 13
FIGURA 2 : PROTOCOLOS DE DILUIÇÃO DAS CULTURAS LÍQUIDAS ................................................................. 16
FIGURA 3: DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO PRÉ-IMPLANTAÇÃO. (YAMANAKA, RALSTON ET AL., 2006) ........... 18
FIGURA 4: MAPAS DOS PLASMÍDIOS UTILIZADOS NOS EXPERIMENTOS DE DUPLO-HÍBRIDO ....................... 28
FIGURA 5: PROTOCOLO DE TRIAGEM EM CULTURA LÍQUIDA .......................................................................... 32
FIGURA 6: PLATAFORMAS UTILIZADAS NOS EXPERIMENTOS DE MINERAÇÃO DE TEXTO ............................ 37
FIGURA 7: PROCEDIMENTO PARA CRIAÇÃO DA VIA DE INTERAÇÕES ............................................................. 39
FIGURA 8: PROCEDIMENTO PARA CRIAÇÃO DE AGRUPAMENTOS DE HOMÓLOGOS....................................... 41
FIGURA 9: BUSCA PELO ÚLTIMO ANCESTRAL COMUM (LCA).......................................................................... 42
FIGURA 10: : ENSAIO DE LACZ DA TRIAGEM DE TRIM2 ................................................................................... 47
FIGURA 11: RESULTADO DO PESCADOR ........................................................................................................... 49
FIGURA 12: VIA REGULATÓRIA DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO PRÉ-IMPLANTAÇÃO ..................... 51
FIGURA 13: CLASSIFICAÇÃO DOS HOMÓLOGOS AGRUPADOS PELO SEEDSERVER…. .................................... 60
FIGURA 14: VIA REGULATÓRIA DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO PRÉ-IMPLANTAÇÃO MOSTRANDO A
ANCESTRALIDADE DOS GENES ENVOLVIDOS ..................................................................................................... 62
FIGURA 15: DISTRIBUIÇÃO DA ORIGEM DOS GENES DA VIA DE PRÉ-IMPLANTAÇÃO ................................... .63
FIGURA 16: FUNÇÕES DOS GENES HOMÓLOGOS ENCONTRADOS EM DROSOPHILA MELANOGASTER.. ......... 65
FIGURA 17: ENSAIO DE LACZ PARA RECONSTRUÇÃO DA INTERAÇÃO COM TEAD4.......................................68
FIGURA 18: ANCESTRALIDADE OBTIDA PARA GENES DA PRÉ-IMPLANTAÇÃO - COMPARAÇÃO KO E
SEEDSERVER............................................................................................................................................................72
IV
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: ESPECIFICAÇÕES DAS LINHAGENS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE VALIDADAS PARA OS
PROTOCOLOS DE DUPLO-HÍBRIDO COM TRIAGEM LÍQUIDA. .................................................................. 25
TABELA 2: LEITURA DE OD600 DAS PLACAS DE TRIAGEM DA PROTEÍNA TRIM2 DESTACANDO POÇOS COM
CRESCIMENTO. ........................................................................................................................................... 45
TABELA 3: CORRESPÔNDENCIA ENTRE OS NOMES DOS GENES HUMANOS E HOMÓLOGOS DE DROSOPHILA
MELANOGASTER AGRUPADOS PELO SEEDSERVER. ................................................................................. 66
V
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3AT- 3-Aminotriazol
Amp- Ampicilina
cDNA- DNA complementar ao mRNA
DNA- Ácido Desoxirribonucléico
EPI- “Epiblast” / Epiblasto
Gal4
DA
- Domínio de ativação transcricional do gene Gal4
Gal4
DL
- Domínio de ligação ao DNA do gene Gal4
His- Histidina
HIS3- Gene codificador de uma enzima da síntese de histidina
ICM - “Inner Cell Mass” / Massa Celular Interna
KO- KEGG Orthology
LacZ- gene da β-galactosidase
LB- Meio Luria Bertani
LCA- “Last Common Ancestor” / Último Ancestral Comum
Leu- Leucina
LEU2- Gene codificador de uma enzima da síntese do aminoácido leucina
LiAc- Acetato de Lítio
min- minuto
mRNA- RNA mensageiro
OD- absorbância medida a 600 nm (Optical Density)
PCR- Reação em cadeia da polimerase (Polimerase Chain Reaction)
PE- “Primitive Endoderm” / Endoderme Primitiva
PEG- Polietilenoglicol
PMID- “PubMed Unique Identifier”
RNA- Ácido Ribonucléico
SDs- Meio de cultura seletivo para leveduras
SD -W-L - Meio de cultura seletivo para leveduras sem os aminoácidos triptofano (W) e
leucina (L)
SD -W-L-H - Meio de cultura seletivo para leveduras sem os aminoácidos triptofano (W),
leucina (L) e histidina (H)
ssDNA- DNA de esperma de salmão desnaturado
TE- “Trophectoderm” / Trofectoderme
VI
Tris- Tris-hidroximetil-aminometano
Trp- Triptofano
TRP1- Gene codificador de uma enzima da síntese do aminoácido triptofano
UEKO- UniRef Enriched KEGG Orthology
X-Gal- 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-galactopiranosídio
VII
RESUMO
O método de duplo-híbrido em leveduras é um sistema de seleção genético que
permite a identificação de produtos de cDNA que interagem com uma proteína de interesse.
Neste trabalho descrevemos dois novos protocolos para triagem em meio líquido que
contribuem para aperfeiçoar este valioso método e eliminam a triagem laboriosa em placas
de meio sólido. Para validar os novos protocolos utilizamos duas linhagens de levedura
Saccharomyces cerevisiae, KGY37 e Y190, três iscas diferentes: m-RTel1, m-Trim2 ou h-
TRIM32 e suas bibliotecas de cDNA respectivas: testículo de camundongo, cérebro de
camundongo e músculo esquelético humano. Estas combinações já haviam sido
previamente triadas com o protocolo tradicional, permitindo uma comparação com o
protocolo novo. A nova triagem resultou na seleção de interações em todos os ensaios, o
número obtido de clones positivos é comparável ao meio sólido e o meio líquido se mostrou
uma abordagem mais rápida, econômica e eficiente. Atualmente, são gerados dados de
interações entre proteínas e regulações gênicas em larga escala. Para uma visualização
melhor de processos biológicos complexos, é interessante que estes dados sejam
integrados e disponibilizados em bancos de dados como KEGG Pathway. Para o
desenvolvimento embrionário pré-implantação, não existe uma via regulatória e nem todos
os genes envolvidos no processo sequer possuem entradas no banco KEGG Orthology. Em
vista disso, procuramos desenvolver esta via regulatória utilizando ferramentas de
mineração de texto como Medline Ranker e PESCADOR para revelar biointerações entre
genes envolvidos neste processo. Após a criação da via, os genes encontrados foram
também utilizados como “seed” no software SeedServer desenvolvido no laboratório para
gerar agrupamentos de homólogos. Os homólogos permitiram também a determinação do
último ancestral comum de cada gene, revelando que a via do desenvolvimento pré-
implantação é composta por uma porção ancestral e genes com origem moderna. Um dos
fatores de transcrição essenciais para esta etapa do desenvolvimento é Tead4, envolvido
em diversas regulações da pré-implantação. O único parceiro de interação conhecido para
Tead4 é YAP que participa da regulação da diferenciação da trofectoderme. Em busca de
novos parceiros que interagem com Tead4 utilizamos esta proteína como isca numa triagem
de duplo-híbrido com o protocolo validado previamente. A biblioteca de cDNA utilizada foi a
de embrião de sete dias (camundongo) e um dos clones recuperados no ensaio foi
identificado como Tioredoxina1, cujo envolvimento em outras interações com fatores de
transcrição é conhecido.
VIII
ABSTRACT
Yeast two-hybrid method consists of a genetic trap that selects for prey cDNA
products within a library that interact with a bait protein of interest. Here we report two
protocols of liquid screening that further improve this valuable method and eliminate the
laborious classic screening in solid medium. To evaluate the accuracy of the new protocol we
used two Saccharomyces cerevisiae yeast strains, KGY37 and Y190, three different baits:
m-RTel1, m-Trim2 or h-TRIM32 and their respective cDNA libraries: mouse testis, mouse
brain and human skeletal muscle. These combinations had been previously screened with
the classic method allowing for a direct comparison to the novel method. The new screen
resulted in the selection of interactions for all the bait proteins used, the number of positive
clones obtained in the assays is comparable to that of the solid medium and the liquid
screening is a faster, more economic and more efficient approach. Currently, the generation
of protein interaction data and gene regulation occurs in a large scale. The integration of
these data and generation of pathways and networks contained in databases such as KEGG
Pathway is essential for the comprehension of complex biological processes. We noticed the
absence of a chart or pathway describing the largely studied preimplantation development
stages; furthermore, not all genes involved in the process have entries in KEGG Orthology.
In this work we sought to develop this regulatory pathway using text-mining tools such as
Medline Ranker and PESCADOR to reveal biointeractions among the genes involved in this
process. The genes present in the resulting pathway were also used as seed in software
developed by our group called SeedServer to create clusters of homologous genes. These
homologs allowed the determination of the last common ancestor for each gene and
revealed that the preimplantation development pathway consists of an ancient fraction with
the addition of modern elements. One of the transcription factors essential for this
developmental stage is Tead4, participating in several regulations during preimplantation.
The only known interaction partner for Tead4 is YAP, co-activator of the differentiation of
trophectoderm lineage. In pursuit of new partners that interact with Tead4 we used this
protein as bait in a two-hybrid screen with our previously reported protocol. The cDNA library
used was mouse seven-day embryo and one of the recovered clones was characterized as
Thioredoxin1, a protein with other reported associations to transcription factors.
IX
ÍNDICE
AGRADECIMENTOS ............................................................................................................ II
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ III
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................... IV
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................................ V
RESUMO ............................................................................................................................. VII
ABSTRACT ........................................................................................................................ VIII
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 11
1.1 PROTEÔMICA FUNCIONAL E O SISTEMA DE DUPLO-HÍBRIDO ......................................................................... 11
1.2 DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO PRÉ-IMPLANTAÇÃO ................................................................................ 17
1.3 O FATOR DE TRANSCRIÇÃO TEAD4 ..................................................................................................................... 18
1.4 BIOINFORMÁTICA NA INTEGRAÇÃO DO CONHECIMENTO ................................................................................. 20
1.4.2 Vias regulatórias................................................................................................................................................. 20
1.4.3 KEGG ......................................................................................................................................................................... 20
1.4.4 Grupos de ortólogos .......................................................................................................................................... 21
1.4.5 Identificando interações ................................................................................................................................. 22
2. JUSTIFICATIVA .............................................................................................................. 23
3.OBJETIVOS ..................................................................................................................... 24
3.1 OBJETIVO GERAL ..................................................................................................................................................... 24
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................................................................ 24
4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 25
4.1 DUPLO-HÍBRIDO EM LEVEDURAS .......................................................................................................................... 25
4.1.1 Leveduras ............................................................................................................................................................... 25
Meios de cultura para leveduras ............................................................................................................................................................. 26
Manutenção e cultivo de leveduras ....................................................................................................................................................... 26
4.1.2 Bactérias ................................................................................................................................................................. 26
Meios de cultura para bactérias .............................................................................................................................................................. 27
Manutenção e cultivo de bactérias ......................................................................................................................................................... 27
4.1.3 Plasmídios .............................................................................................................................................................. 27
4.1.4 Bibliotecas de cDNA ........................................................................................................................................................................... 28
4.1.5 Protocolos .............................................................................................................................................................. 29
Transformação de leveduras .................................................................................................................................................................... 29
Triagem em cultura líquida ....................................................................................................................................................................... 30
Ensaio para verificação da ativação do gene repórter LacZ ...................................................................................................... 31
Minipreparação para extração de plasmídio de levedura .......................................................................................................... 33
Eletroporação ................................................................................................................................................................................................... 33
Minipreparação para extração de plasmídio de bactérias.......................................................................................................... 33
Sequenciamento .............................................................................................................................................................................................. 34
Reconstrução da ativação do gene LacZ .............................................................................................................................................. 34
4.2 BIOINFORMÁTICA .................................................................................................................................................... 34
4.2.1 PubMed .................................................................................................................................................................... 34
4.2.2 Medline Ranker.................................................................................................................................................... 35
4.2.3 PESCADOR ............................................................................................................................................................. 35
4.2.5 Construção da via de regulações ................................................................................................................. 38
4.2.6 SeedServer ............................................................................................................................................................. 40
4.2.7 Último Ancestral Comum ................................................................................................................................ 40
5. RESULTADOS ................................................................................................................ 43
5.1 VALIDAÇÃO DA TRIAGEM LIQUIDA PARA O SISTEMA DE DUPLO-HÍBRIDO EM LEVEDURAS ......................... 43
5.1.1 Escolha de iscas para triagens ..................................................................................................................... 43
5.1.2 Transformações e linhagens de leveduras .............................................................................................. 43
5.1.3 Triagem líquida com cRtel1 e Trim2 ......................................................................................................... 44
X
5.1.4 Monitoramento de leveduras com crescimento alterado ................................................................ 44
5.1.5 Triagem líquida com as iscas Trim2 e TRIM32, sob monitoramento ........................................ 46
5.1.6 Ativação do gene repórter LacZ .................................................................................................................. 46
5.1.7 Validação dos positivos .................................................................................................................................... 46
5.2 CRIAÇÃO DE UMA VIA DE REGULAÇÕES UTILIZANDO FERRAMENTAS DE MINERAÇÃO DE TEXTO ............... 48
5.2.1 Busca na literatura ............................................................................................................................................ 48
5.2.2 Seleção de trabalhos relevantes .................................................................................................................. 48
5.2.3 Revelando biointerações com o software PESCADOR ....................................................................... 48
5.2.4 Representação gráfica da via do desenvolvimento pré-implantação e revisão das
regulações ......................................................................................................................................................................... 50
Primeiras clivagens embrionárias .......................................................................................................................................................... 52
Padrões de metilação e o correto desenvolvimento pré-implantação ................................................................................. 52
Dicotomia Trofectoderme (TE) e Massa Celular Interna (ICM) ............................................................................................... 52
Ativando a diferenciação da TE: Tead4/Yap ativam Cdx2 para reprimir Nanog e Oct4.............................................. 53
Na ausência de Oct4 e Nanog .................................................................................................................................................................... 53
Sob a contínua ativação de Oct4 e Nanog ........................................................................................................................................... 54
Ativação sob controle ................................................................................................................................................................................... 55
Alvos de Oct4 e Sox2 ..................................................................................................................................................................................... 56
Alvos de Nanog e STAT3 ............................................................................................................................................................................. 56
Diferenciação da endoderme extra-embrionária a partir de células da ICM .................................................................... 57
5.3. BUSCA POR GENES HOMÓLOGOS .......................................................................................................................... 58
5.3.1 SeedServer ............................................................................................................................................................. 58
5.3.2 Análise da composição dos agrupamentos gerados........................................................................... 58
5.4. ANCESTRALIDADE DOS GENES DA VIA DO DESENVOLVIMENTO PRÉ-IMPLANTAÇÃO................................... 61
5.4.1 Determinação do último ancestral comum (“Last Common Ancestor”) .................................. 61
5.4.2 Funções de homólogos ..................................................................................................................................... 64
5.5. NOVOS PARCEIROS DE INTERAÇÃO PARA TEAD4 .............................................................................................. 67
5.5.1 Duplo-Híbrido em levedura ........................................................................................................................... 67
5.5.2 Triagem liquida dos transformantes obtidos ........................................................................................ 67
5.5.3 Ensaio de LacZ ..................................................................................................................................................... 67
5.5.4 Análise e confirmação das interações ....................................................................................................... 67
6. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 69
7. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 75
8. PERSPECTIVAS ............................................................................................................. 76
9. REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 77
ANEXOS..................................................................................................85
11
1. INTRODUÇÃO
1.1 Proteômica Funcional e o Sistema de Duplo-Híbrido
A grande quantidade de dados gerados por pesquisas genômicas é acompanhada
por uma necessidade cada vez maior de se obter dados funcionais com relação às
proteínas. Embora análises de genes por comparação de sequências e identificação de
motivos em comum indiquem possíveis funções para as proteínas, estudos de genômica
funcional como nocaute e perfil metabólico são muitas vezes necessários para determinar
uma função exata. Contudo, estes dados nem sempre são suficientes e necessitam de alto
investimento e trabalho excessivo (Immink e Angenent, 2002).
Para a melhor compreensão de processos biológicos, a determinação funcional de
proteínas é indispensável. Processos metabólicos como síntese de DNA, ativação
transcricional, tradução protéica, localização de proteínas e transdução de sinal são todos
dependentes da interação de complexos protéicos (Gietz, Triggs-Raine et al., 1997). Nas
últimas décadas, uma grande variedade de métodos foram desenvolvidos para detectar,
analisar e quantificar interações proteína-proteína, incluindo espectroscopia de ressonância,
NMR (“Nuclear Magnetic Resonance”), ensaios de duplo-híbrido, “tagging” de peptídeos
combinado com espectrometria de massa e tecnologias baseadas em fluorescência
(Lalonde, Ehrhardt et al., 2008).
O sistema de duplo-híbrido (Fields e Song, 1989) é um ensaio genético molecular
que detecta interações proteína-proteína e tornou-se um procedimento padrão para a
biologia molecular. O método é conduzido na levedura Saccharomyces cerevisiae. Embora
existam adaptações a outros organismos, S. cerevisiae é um modelo melhor para o
desenvolvimento do sistema pela rapidez do crescimento, simplicidade de transformação e
por ser uma célula eucariota, proporcionando ambiente apropriado para o estudo de
proteínas deste clado in vivo (Fields e Sternglanz, 1994). O sistema é baseado no produto
do gene GAL4 de leveduras, uma proteína com dois domínios funcionais que é responsável
pela ativação de genes envolvidos no metabolismo da galactose. O domínio de ligação ao
DNA (GAL4
DL
) interage com a seqüência UAS do promotor de GAL1 e o domínio de
ativação (GAL4
DA
) estimula a transcrição. O método de duplo-híbrido (Figura 1a) consiste na
separação das seqüências codificadoras para esses domínios (GAL4
DL
e GAL4
DA
) e na
inclusão destas em plasmídios diferentes, de modo a ficarem fusionadas a seqüências de
DNA codificando proteínas cuja interação deseja-se verificar (GAL4
DL
proteínaA e
GAL4
DA
proteínaB). Os plasmídios devem ser introduzidos numa linhagem de levedura
contendo genes repórteres. Um exemplo é o gene LacZ, que codifica a enzima -
galactosidase de Escherichia coli fusionado ao promotor de GAL1. A interação das proteínas
12
A e B será responsável reconstrução funcional do fator de transcrição GAL4 levando à
ativação da transcrição do gene repórter LacZ. A atividade de -galactosidase pode ser
detectada por um ensaio com o substrato cromogênico X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil--d-
galactopiranosídio), identificando as leveduras que contém a interação pela cor azul
resultante da metabolização do X-Gal.
Posteriormente, o desenvolvimento do sistema permitiu a utilização de uma proteína
de interesse (isca) para encontrar proteínas desconhecidas (presas) que interajam com ela
dentre diversas outras (Chien, Bartel et al., 1991). Para isto, normalmente é utilizada uma
biblioteca de cDNA de interesse como fonte de possíveis proteínas presa. Esta versão do
método utiliza um segundo gene repórter, que codifica uma enzima da via de síntese do
aminoácido histidina, GAL1-HIS3 (Figura 1b). A região codificadora da proteína de interesse
é fusionada ao domínio de ligação (GAL4
DL
), num plasmídio contendo o gene TRP1 e a
biblioteca de cDNA é construída em um vetor GAL4
DA
contendo o gene LEU2. Leveduras
deficientes para os genes TRP1, LEU2 e HIS3 (com uma cópia de HIS3 controlada pelo
promotor GAL1) são transformadas com os dois plasmídios, e então submetidas a uma
seleção em meio SD sem os aminoácidos Trp, Leu e His. A presença de uma interação
entre a proteína isca e um produto da biblioteca de cDNA permitirá o crescimento da
levedura. Como a maioria das leveduras utilizadas para este fim apresentam transcrição
basal do gene repórter, é comum a adição de um inibidor competitivo da enzima produto de
HIS3 denominado 3-Aminotriazol. O 3-Aminotriazol funciona como um controle para que
somente leveduras contendo uma forte ativação do gene repórter resultante de uma
interação entre proteínas de interesse sejam capazes de crescer no meio.
O sistema de duplo híbrido consiste numa melhor abordagem para o estudo de
interações proteína-proteína em relação aos estudos in vitro devido à comum necessidade
de algumas proteínas do ambiente celular para que ocorram as corretas modificações pós-
traducionais, mesmo que muitas vezes o núcleo das leveduras não seja semelhante à
situação real. Outra vantagem do sistema é a possibilidade de detectar mesmo interações
fracas, embora isto se torne uma desvantagem pelo número elevado de falso-positivos (Van
Criekinge e Beyaert, 1999). O ensaio também é considerado adequado para os estudos de
interações protéicas por ser simples, barato e não depender de conhecimento prévio sobre
as interações para se realizar uma triagem, além de poder ser automatizado (Tucker, Gera
et al., 2001).
13
Figura 1: Sistema de Duplo-Híbrido em Leveduras. a) Representação esquemática do
funcionamento do sistema de duplo-híbrido em leveduras para seleção de interações entre duas
proteínas de interesse. DL: Domínio de ligação ao DNA; DA: Domínio de ativação da transcrição.
Uma descrição mais detalhada pode ser encontrada no texto. b) Representação similar mostrando a
seleção de interações entre uma proteína de interesse e um clone desconhecido de uma biblioteca de
cDNA, são utilizados dois genes repórteres: HIS3 e LacZ.
14
O sistema também apresenta suas limitações. Uma grande desvantagem é a seleção
de muitos falso-positivos, como já mencionado anteriormente, o que exige do pesquisador
um esforço em vão, para analisar clones que inicialmente parecem interações relevantes e
análises posteriores revelam ser espúrias. Refere-se aqui a falso-positivos do próprio
sistema, não a interações reprodutíveis em leveduras e que porventura não venham a
ocorrer no organismo em estudo. Esta seleção de falso-positivos mostra-se ainda mais
elevada nos ensaios de triagem de bibliotecas (Chien, Bartel et al., 1991). Embora a
repetição dos ensaios possa distinguir corretamente as interações verdadeiras das falsas,
fica clara a necessidade de análises laboriosas para avaliar a veracidade dos clones
recuperados (Vidalain, Boxem et al., 2004). A triagem de uma biblioteca é, além de tudo,
muito trabalhosa, por ser realizada em um número elevado de placas de diâmetro grande.
Uma mistura de transformação deve ser dividida em 100 placas de 15 cm de diâmetro (300
µL por placa) para uma triagem mais eficiente, reduzindo parcialmente o aparecimento de
falso-positivos (Gietz, Triggs-Raine et al., 1997).
Tradicionalmente, a seleção de leveduras contendo ativação do gene HIS3 no
sistema de duplo-hibrido é feita em placas de meio SD -Trp -Leu -His suplementado com 3-
Aminotriazol, um inibidor do produto de HIS3, como mencionado, que torna o crescimento
possível somente para leveduras contendo uma ativação considerável do gene HIS3.
Trabalhos reportando o uso de meio líquido foram descritos anteriormente como uma
alternativa para a seleção de ativadores do gene HIS3 (Diaz-Camino, Risseeuw et al.,
2003), relatando maior eficiência quando comparado ao ensaio de LacZ. A possibilidade de
automação deste ensaio foi relatado como também um grande atrativo (desenvolvimento em
placas 96-deepwell). Para o sistema de tri-híbrido (Tirode, Malaguti et al., 1997) também foi
descrita uma abordagem em meio líquido que se mostrou capaz de distinguir interações
verdadeiras de falsos positivos pela análise do crescimento da levedura no meio durante um
intervalo fixo de 24 horas de crescimento (Srivastava e Lal, 2002).
Algumas proteínas podem tornar difícil a triagem pelo sistema por sua expressão ser
tóxica para as leveduras tornando difícil ou até inviável o crescimento das leveduras (Van
Criekinge e Beyaert, 1999). Fragmentos menores da proteína podem ser usados com o
objetivo de eliminar a toxicidade (Gietz, Triggs-Raine et al., 1997). Não há relatos de
monitoramento paralelo do crescimento das leveduras sob efeito da isca, o que é
normalmente feito nesses casos é esperar indefinidamente pelo crescimento das colônias
nas placas.
Em nosso laboratório, Queiróz e colaboradores realizaram testes iniciais com as
leveduras Y190 e HF7C para o desenvolvimento de uma metodologia de triagem em meio
líquido. O objetivo da adaptação seria melhorar a seleção de interações de duplo-híbrido,
diminuindo a incidência de falso-positivos. No trabalho, foi utilizada como modelo de
15
interação forte a proteína p53 e o antígeno Large T (Iwabuchi, Li et al., 1998), enquanto as
interações fracas foram representadas por um mutante conhecido de p53 (54.2) e o
antígeno Large T. Os testes mostraram que a levedura Y190 em meio líquido era capaz de
distinguir a interação forte (Gal4
DL
-p53 + Gal4
DA
-LargeT) e o controle negativo (Gal4
DL
-p53 +
Gal4
DA
) em meio SDs -W-L-H líquido suplementado com 3-aminotriazol (3AT) após 24 horas
de crescimento e após diluições. Concentrações de 3AT 2,5 mM foram suficientes para
minimizar o crescimento devido a transcrição basal de HIS3 na levedura Y190 em
procedimentos de 24 horas de cultivo e de diluições, não sendo necessárias concentrações
da droga tão elevadas (35 mM) como normalmente utilizadas em meio SDs sólido.
Os ensaios foram conduzidos por co-transformação de leveduras S. cerevisiae das
linhagens HF7c e Y190 com 1 μg de pISCA (expressão de Gal4
DL
-p53), 1 μg de
pSEMPRESA (expressão de Gal4
DA
) e 0; 0,1; 1; 10 ou 100 ng de pPRESA (expressão de
Gal4
DA
-largeT). Simulando assim a triagem de clones positivos em concentrações
crescentes em meio a clones de controle negativo. Os protocolos, mostrados na Figura 2,
consistiram em diluições (1:10 e 1:100) de culturas de leveduras co-transformadas, durante
um período de 120 horas, finalizando-se pela análise de ativação de gene repórter HIS3 por
medida de densidade do meio SDs líquido em espectrofotômetro. A diferença principal entre
os protocolos consiste na amplitude (1:10 ou 1:100) e intervalo (após 24, 48 ou 72 horas de
cultivo) da primeira diluição. Os resultados mostraram que protocolo F (Figura 2) resultava
em maior eficiência na recuperação dos clones positivos. A primeira diluição deste protocolo
é de 1:10 após 72 horas de crescimento pós-transformação, seguida por uma diluição 1:100
24 horas depois da primeira. Enquanto em leveduras S. cerevisiae HF7c este protocolo
apresentou sensibilidade semelhante à observada na seleção convencional em placas, em
leveduras S. cerevisiae Y190 a sensibilidade foi um pouco melhor.
16
Figura 2 : Protocolos de diluição das culturas líquidas. Esquema de diluições utilizados na
padronização dos testes de duplo-híbrido em cultura líquida realizados por Queiróz e colaboradores.
Ver texto para mais detalhes.
A seleção em meio líquido também foi testada de forma robotizável, distribuindo a
mistura de transformação em placas de 96 poços “deepwell”. Um cálculo da
correspondência colônia-poço permitiu a comparação da seleção robotizável com a triagem
em placas convencional mostrando uma equivalência dos métodos na recuperação de
clones. O número de poços de uma placa “deepwell” para cada transformação deve ser
maior se a incidência de clones é mais freqüente, enquanto que em triagens nas quais
poucos clones são obtidos é possível diminuir o número de poços utilizados.
Outra metodologia testada foi a de crescimento em cultura única, com o intuito de
selecionar clones com interações mais fortes através de uma competição. Esta metodologia
só foi possível com a levedura Y190, pois testes iniciais mostraram que a linhagem HF7C
não era capaz de distinguir interações fortes e fracas. Os testes de competição mostraram
que a cultura contendo leveduras portando a interação forte, independentemente da
presença de leveduras com interação fraca ou controle negativo, apresentou crescimento e
as leveduras resultantes foram positivas no teste LacZ. Criando uma nova perspectiva para
a triagem de interações de duplo-híbrido, de maneira mais eficiente e prática. Todavia, as
simulações que desenvolveram o sistema precisavam ser testadas em um ambiente de
seleção real e, se possível, desenvolvidas também com a colaboração de outros grupos
experientes no sistema. Neste trabalho, buscamos o preenchimento destas perspectivas.
17
1.2 Desenvolvimento Embrionário Pré-implantação
O período do desenvolvimento chamado de pré-implantação é uma fase com a
duração de aproximadamente seis dias, a implantação normalmente ocorre até o sétimo dia
embrionário (E7), período em que o útero está receptivo para o embrião (janela de
receptividade uterina) (Wang e Dey, 2006). O desenvolvimento embrionário de mamíferos
foi bastante estudado em camundongos e é diferente do desenvolvimento de outros animais
que apresentam polarização de células resultando em blastômeros com potencial restrito
(Johnson e Mcconnell, 2004). No camundongo, os blastômeros retém o potencial de gerar
qualquer tipo celular até o estágio de oito células. Durante os dois primeiros dias do
desenvolvimento, o embrião passa por clivagens sucessivas até produzir um embrião de oito
células (“eight-cell embryo”). A partir de então passa a ser chamado de mórula e os
blastocistos aumentam o contato célula-célula para formar uma mórula compactada. As
divisões subsequentes aumentam a complexidade da mórula e as células podem estar
localizadas no interior, cercadas por outras células ou então na parte externa em contato
com o ambiente. A identificação de células geradoras de cada linhagem mostrou que a
trofectoderme (TE - “Trophectoderm”) é derivada principalmente de células externas,
enquanto as células internas dão origem à massa celular interna (ICM - “Inner Cell Mass”). A
ICM posteriormente se divide nas linhagens da endoderme primitiva (PE - “Primitive
Endoderme”) e do epiblasto (EPI - “Epiblast”). Durante a formação da ICM e TE também
ocorre a cavitação gerando a blastocele. O embrião é chamado de blastocisto no estágio em
que apresenta ICM, TE e blastocele. 24 horas depois da formação do blastocisto ocorre a
última fase de desenvolvimento antes da implantação do embrião na parede do útero e é
formado o blastocisto tardio, no qual a linhagem da endoderme primitiva (PE, parte da
endoderme extra-embrionária) já se separou da ICM. As três linhagens formadas no
desenvolvimento pré-implantação têm destinos diferentes na formação do embrião.
Enquanto o epiblasto dará origem ao feto no desenvolvimento posterior, a trofectoderme irá
formar a porção fetal da placenta e a endoderme primitiva (posteriormente endoderme extra-
embrionária) forma o saco vitelínico (Yamanaka, Ralston et al., 2006). Os estágios do
desenvolvimento durante a pré-implantação estão ilustrados na Figura 3.
18
Figura 3: Desenvolvimento embrionário pré-implantação. (Yamanaka, Ralston et al., 2006)
Estágios embrionários no desenvolvimento pré-implantação, uma descrição detalhada pode ser
encontrada no texto. TE=Trofectoderme; ICM=Massa Celular Interna; PE=Endoderme primitiva;
EPI=Epiblasto.
Processos regulatórios complexos como o desenvolvimento de animais são
resultantes da interação de diversos produtos gênicos e elementos que controlam a
expressão destes genes. Resultados de experimentos tradicionais que determinam a função
de um ou poucos genes não geram uma visão adequada para sistemas complexos. Uma
rede regulatória complexa seria capaz de retratar aspectos específicos e gerais do
desenvolvimento, como a maneira que determinadas células geram seus destinos no
embrião e porque o processo caminha inexoravelmente adiante no tempo do
desenvolvimento (Davidson, Rast et al., 2002).
1.3 O Fator de Transcrição Tead4
Tead4 pertence a uma família de fatores de transcrição chamada TEA. As proteínas
desta família contêm o domínio TEA de ligação ao DNA e são fatores de transcrição
envolvidos em funções de diferenciação e desenvolvimento em uma variedade de animais e
plantas (Andrianopoulos e Timberlake, 1991). A família recebeu este nome devido aos
primeiros membros identificados: TEC1 de leveduras, TEF-1 de mamíferos (Tead1) e AbaA
de Aspergillus nidulans (Burglin, 1991). Outro membro da família muito estudado é a
proteína Scalloped de Drosophila melanogaster, envolvida no desenvolvimento da asa e
sistema nervoso central do embrião (Bray, 1999).
19
O domínio TEA é constituído por 66-68 aminoácidos localizados na região N-terminal
das proteínas e a resolução da estrutura de Tead1 mostrou que o domínio é composto por
três alfa-hélices sendo que a H3 é a responsável pela ligação ao DNA juntamente com uma
volta (“loop”) L1 (Anbanandam, Albarado et al., 2006). A conservação do domínio entre os
membros desta família é alta, Tead1 e Scalloped tem uma similaridade de 99% neste
domínio e Tead1 pode inclusive ser utilizado para substituir Scalloped no desenvolvimento
da asa de drosófila (Deshpande, Chopra et al., 1997).
A expressão da proteína mTead2 de camundongo foi detectada em altos níveis em
blatocistos e persiste durante todo o desenvolvimento pré-implantação, sendo que embriões
sem esta proteína não sobrevivem após este período (Kaneko, Cullinan et al., 1997). São
conhecidas quatro genes Tead em camundongos e humanos, expressos em diversos
tecidos adultos. As proteínas Tead de um mesmo organismo aparentemente não
apresentam redundância funcional e estão envolvidas na ativação e repressão de diversos
genes, esta ativação diferencial pode resultar de uma associação das proteínas Tead com
outras proteínas (Kaneko e Depamphilis, 1998).
Atualmente, sabe-se que a proteína Tead4 associa-se com a proteína YAP (Yes-
associated protein) e juntas as duas proteínas ativam a transcrição de outros genes. YAP
possui um domínio de ativação mas não o domínio de ligação ao DNA e por isto precisa da
interação com um fator de ligação ao DNA como Tead4 (Cao, Pfaff et al., 2008). A interação
entre estas proteínas também foi observada entre seus homólogos de D. melanogaster,
revelando um mecanismo conservado de ativação da via de sinalização Hippo (Wu, Liu et
al., 2008). Embora esta interação de Tead4 já esteja bem descrita, existem evidências da
participação de Tead4 na ativação de outros genes de forma independente de YAP,
sugerindo a presença de outras proteínas que interagem com Tead4 no controle do
desenvolvimento embrionário (Ralston, Cox et al., 2010).
20
1.4 Bioinformática na Integração do Conhecimento
O campo da bioinformática possibilita atualmente um extenso número de pesquisas
focadas na integração dos dados produzidos por técnicas de sequenciamento, análise de
expressão diferencial, estudos de interação entre proteínas dentre outras técnicas
atualmente adaptadas para coleta de dados em larga escala. A organização da informação
em bases de dados secundárias, onde o conhecimento é organizado, é essencial num
momento em que o poder de obtenção de dados em larga escala cresce aceleradamente.
Assim, várias iniciativas organizam o conhecimento de interações gênicas e a subsequente
comparação de sequências permite uma rápida propagação desse conhecimento a outros
genomas sequenciados.
O campo da Biologia de Sistemas propõe a integração destes dados para que a
fisiologia de um organismo seja estudada por completo ao contrário de uma coleção de
dados separados. A visão do sistema como um todo pode levar a soluções alternativas nas
áreas de aplicação como biotecnologia e medicina (Hecker, Lambeck et al., 2009).
1.4.2 Vias regulatórias
Diversas bases de dados compreendem vias metabólicas e regulatórias de
processos biológicos importantes. O iPath (Letunic, Yamada et al., 2008) do European
Molecular Biology Laboratory permite a visualização e análise de um mapa metabólico
completo de processos biossintéticos para o organismo de escolha e ainda manipulações de
dados externos e sua integração com a via de interesse. Outro exemplo é a ferramenta
BioCarta que procura oferecer acesso a vias de diversos processos armazenadas para
consulta. O site BioCyc (http://biocyc.org/) possui uma coleção de bases de dados de vias,
cada base de dados compreende as vias metabólicas de um organismo com genoma
sequênciado (Karp, Ouzounis et al., 2005). BioCyc é também uma fonte de informação em
genômica comparativa e disponibiliza software que podem ser usados no estudo de novos
organismos. Esta coleção todavia é focada apenas em vias metabólicas e em nenhum dos
diversos outros processos regulatórios biológicos. Uma grande iniciativa para catalogar e
permitir consulta a diversas vias metabólicas e regulatórias é a Kyoto Encyclopedia of
Genes and Genomes, analisada mais detalhadamente a seguir.
1.4.3 KEGG
A base de dados KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) é um conjunto
de recursos bioinformáticos que contém diversos pontos de entrada orientados pelos dados
(http://www.genome.jp/kegg/). Por exemplo, a partir de uma consulta a uma via em KEGG
Pathway como a glicólise podem ser acessados os grupos de ortólogos relacionados a cada
gene que participa da via. KEGG Pathway é uma coleção de vias desenhadas manualmente
21
representando o conhecimento da interação molecular e regulação para diversos processos.
KEGG Orthology consiste em grupos de ortólogos definidos manualmente que
correspondem a genes representados em KEGG Pathway. A aplicação de KEGG Orthology
é ampliar a representação das vias para um número maior de organismos. KEGG Pathway e
KEGG Orthology consistem portanto em ferramentas importantes para anotação de
sequências de outros organismos.
1.4.4 Grupos de ortólogos
Dois genes são considerados ortólogos segundo sua história evolutiva (Fitch, 1970),
quando estes genes divergiram após uma especiação. Atualmente o termo também é usado
para se referir a genes com uma função conservada. Quando uma duplicação ocorre após
um evento de especiação os dois genes contidos no mesmo organismo são considerados
parálogos, mas com relação ao gene do organismo onde a duplicação não ocorreu são co-
ortólogos e portanto, igualmente importantes em estudos evolutivos (Tatusov, Fedorova et
al., 2003). Como genes ortólogos normalmente ocupam nichos funcionais similares em
organismos diferentes enquanto parálogos tendem a evoluir para uma diversificação
funcional, podemos também ressaltar que a eficiência da anotação de um genoma depende
muito da qualidade da identificação de genes ortólogos. A identificação de grupos de
ortólogos é útil para estudos de evolução gene/proteína, genômica comparativa,
identificação de sequências taxonomicamente restritas e anotação de genomas, por facilitar
a identificação de proteínas e a atribuição de funções a elas (Altenhoff e Dessimoz, 2009).
KEGG Orthology consiste em uma excelente fonte de agrupamentos de ortólogos
definidos manualmente e submetidos a rigorosa curadoria. As sequências agrupadas são
provenientes de projetos genoma completos (Kanehisa e Goto, 2000). A base de dados
COG do NCBI (Clusters of Orthologous Groups) é também curada manualmente e agrupa
sequências do proteoma de diversos organismos procariotos e também de eucariotos
unicelulares, as leveduras Saccharomyces cerevisiae, S. pombe e C. albicans. O sistema foi
também expandido para organismos eucariotos complexos com genomas sequenciados,
formando o KOG (Eukariotic Orthologous Groups) (Tatusov, Koonin et al., 1997; Tatusov,
Fedorova et al., 2003). A base de dados EGGNOG possui agrupamentos de ortólogos
gerados a partir de 630 genomas completos e atualizou os COGs e KOGs já mencionados
provendo informação funcional para 88% das cerca de 2.200.000 proteínas anotadas
(Muller, Szklarczyk et al., 2010). Foi também desenvolvida a base de dados OrthoMCL como
uma abordagem alternativa para a identificação automatizada de grupos de ortólogos em
eucariotos, levando em consideração a similaridade entre parálogos “recentes” (Li, Stoeckert
et al., 2003).
22
Em nosso laboratório um procedimento de integração de dados enriquece a base de
dados COG com agrupamentos UniRef50 da base UniProt (Suzek, Huang et al., 2007),
criando a base UECOG (Fernandes, Barbosa et al., 2008). Recentemente, procedimento
similar foi aplicado por Fernandes à base KEGG Orthology criando o banco de dados
enriquecido UEKO (não publicado).
1.4.5 Identificando interações
Os diversos estudos genéticos e bioquímicos para detecção de interações proteína-
proteína geraram uma grande quantidade de dados sobre interações que atualmente estão
disponíveis em bases de dados curadas (Ooi, Schneider et al., 2010). Estes dados
tornaram-se uma excelente fonte para novas pesquisas. Dentre as bases de dados que
contém informações sobre interações, destaca-se a iHOP (http://www.ihop-net.org/) que
através de marcações de nomes de genes em diversas frases cria conexões entre elas e
transforma a literatura contida na PubMed em um recurso navegável (Hoffmann e Valencia,
2004). Outra base de dados com interações é a STRING (http://string-db.org/) que contém
interações físicas e associações funcionais entre proteínas e integra os dados provenientes
de literatura (PubMed), contexto genômico, experimentos em larga escala e co-expressão
conservada (Jensen, Kuhn et al., 2009).
A mineração de texto tem, portanto, um papel fundamental nestas ferramentas e
proporciona o acesso a interações dispersas na literatura. A extração de eventos biológicos
da literatura por ferramentas de mineração de texto é essencial não só para abastecer as
bases de dados de interações, mas também para a criação e anotação de vias (Ananiadou,
Pyysalo et al., 2010). Um software recente para extrair estas interações é o LAITOR
(Barbosa-Silva, Soldatos et al., 2010), capaz de identificar nomes de proteínas nas frases de
um resumo e a palavra de biointeração que pode corresponder à associação entre eles.
23
2. JUSTIFICATIVA
O sistema de duplo-híbrido é um método fundamental na identificação de interações
proteína-proteína, mas a triagem tradicional que utiliza placas de meio sólido seletivo
apresenta muitas dificuldades para a aplicação deste método, especialmente em larga
escala. O desenvolvimento de uma triagem em meio líquido é promissor para que este
método se torne mais prático e também mais eficiente já que o crescimento de falsos
positivos do sistema em estudos de culturas líquidas é menor. Contudo, em todas as
aplicações de culturas líquidas para este sistema a abordagem não foi utilizada para triar
bibliotecas complexas de cDNA, a qual torna-se mais favorável se utilizado o método de alta
eficiência desenvolvido por Gietz e colaboradores.
O desenvolvimento embrionário pré-implantação é um processo controlado por
diversas regulações que anteriormente só foram retratadas individualmente, mesmo em
revisões da área. A ausência desta via complexa de regulações em importantes bancos de
dados como KEGG Pathways é resultado da falta de uma publicação contendo todas as
regulações envolvidas.
A importância de Tead4 no desenvolvimento embrionário é parcialmente
compreendida. A associação com a proteína YAP parece ser insuficiente para resultar em
todas as regulações na qual este fator está envolvido. Evidências como o fenótipo diferente
apresentado pelo nocaute de Tead4 ou de YAP corroboram esta hipótese (Matthew J. Kohn
- NYS Dept. of Health; comunicação pessoal). É interessante, portanto, a busca por mais
interações que envolvem esta proteína.
Assim como a regulação completa do desenvolvimento não foi publicada, a
genômica comparativa do processo não é conhecida. Sabe-se a função ancestral para
alguns dos genes, mas a noção de qual porção do desenvolvimento tem origem antiga e
quais mecanismos foram incorporados posteriormente ainda falta. Para conhecer a
ancestralidade de genes os agrupamentos de homólogos são essenciais e precisam ser
corretos. O laboratório de Biodados dispõe de técnicas capazes de melhorar os
agrupamentos existentes em bases como KEGG Orthology, KOG e EGGNOG.
Neste trabalho procuramos a validação de uma nova triagem para o sistema de
duplo-híbrido em leveduras, utilizando o meio líquido. A aplicação do sistema com a nova
triagem será também utilizada para buscar novas proteínas que interagem com o fator de
transcrição Tead4 durante o desenvolvimento embrionário. Visando um maior entendimento
do período pré-implantação do desenvolvimento, técnicas de mineração de texto serão
utilizadas para a integração das regulações conhecidas deste processo em uma só via. Os
genes compreendidos nesta via serão utilizados em experimentos de agrupamento de
homólogos que possibilitam a determinação da ancestralidade destes genes.
24
3.OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Identificar interações proteína-proteína pelo sistema de duplo-híbrido com triagem
líquida e criar uma via de regulações compreendidas no desenvolvimento embrionário pré-
implantação.
3.2 Objetivos Específicos
Validar a triagem líquida para o sistema de duplo-híbrido
Agrupar as regulações conhecidas do desenvolvimento pré-implantação em uma via
Criar agrupamentos de homólogos para genes da via de pré-implantação
Utilizar o sistema de duplo-híbrido para buscar interações com Tead4
25
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Duplo-híbrido em leveduras
4.1.1 Leveduras
As leveduras utilizadas neste trabalho foram Saccharomyces cerevisiae, linhagens
KGY37 (Hemming, Agatep et al., 2001) e Y190 (Clontech). As especificações genotípicas,
genes repórteres e marcadores genéticos de ambas as leveduras estão especificados na
Tabela 1. A linhagem KGY37 foi escolhida por ser comumente utilizada em triagens do
sistema de duplo-híbrido no laboratório do Dr. R. Daniel Gietz.
Tabela 1: Especificações das linhagens de Saccharomyces cerevisiae validadas para os
protocolos de duplo-híbrido com triagem líquida.
26
Meios de cultura para leveduras
Mix de aminoácidos
Adenina (1,8 g), L-Arginina (1,2 g), L-Histidina (1,2 g), L-Isoleucina (1,8 g), L-Leucina
(1,8 g), L-Lisina (1,8 g), L-Metionina (1,2 g), L-Fenilalanina (3 g), L-Serina (1,2 g), L-
Triptofano (1,2 g), L-Tirosina (11,8 g), L-Treonina (1,2 g), Uracila (1,2 g), L-Valina (9 g), Mio-
Inositol (2 g), PABA (0,2 g). Todos SIGMA. A mistura era utilizada na formulação do meio
SD seletivo.
Meio SD seletivo (SDs) com aminoácidos (pH 5,9)
YNB (BD) sem aminoácidos e sulfato de amônio 0,17%, dextrose 2% (Cromoline),
sulfato de amônio 0,5% (VETEC) e mix de aminoácidos 0,06% (SIGMA). Esterilizado em
autoclave (soc. fabbe ltda.) a uma pressão de 120kgf/cm2 durante 15 minutos.
Meio YPAD
Extrato de levedura 1% (BD), peptona 2% (Fisher Scientific), dextrose 2%
(Cromoline) e Adenina 0,004% (SIGMA). Esterilizado em autoclave (soc. fabbe ltda.) a uma
pressão de 120kgf/cm2 durante 15 minutos.
Aos meios SDs e YPAD sólidos, era adicionado ágar a 1,6% (BD).
Manutenção e cultivo de leveduras
Leveduras utilizadas nos ensaios foram mantidas em meio de cultura sólido YPAD
(leveduras sem plasmídio) ou SDs (SD seletivo, leveduras com plasmídio) a 4ºC.
Periodicamente, as leveduras eram semeadas em um novo meio para serem mantidas
viáveis. As culturas líquidas de leveduras eram mantidas sob agitação e incubadas a 30ºC.
Em culturas líquidas era também adicionado o antibiótico Ampicilina na concentração final
de 100 µg/ml.
4.1.2 Bactérias
A bactéria utilizada foi Escherichia coli da linhagem DH5,
eletrocompetente
gyrA69, thi-1, relA1).
27
Meios de cultura para bactérias
Meio LB
Extrato de levedura 0,5% (BBL), NaCl 0,5% (VETEC), pH 7. Em meio LB sólido, foi
adicionado ágar a 1,5% (BD). Esterilizado em autoclave (soc. fabbe ltda.) a uma pressão de
120kgf/cm
2
durante 15 minutos.
Meio 2xYT
Bactopeptona 1% (BD), extrato de levedura 0,5% (BBL), NaCl 1% (VETEC), pH 7.
Esterilizado em autoclave (soc. fabbe ltda.) a uma pressão de 120kgf/cm
2
durante 15
minutos.
Meio SOB
Peptona 2% (INLAB), extrato de levedura 0,5% (BBL), NaCl 10 mM (VETEC), KCl
2,5 mM (SYNTH), MgCl
2
10 mM (Grupo Química), MgSO
4
10 mM (SYNTH). Esterilizado em
autoclave (soc. fabbe ltda.) a uma pressão de 120 kgf/cm
2
durante 15 minutos.
Meio SOC
Em 100 ml de meio SOB, foi adicionado 2 ml de solução de glicose 2 M (VETEC) e 1
ml de solução de MgCl
2
2M (Grupo Química), esterilizados por filtração a vácuo.
Manutenção e cultivo de bactérias
As bactérias eram inoculadas em meio LB líquido suplementado com antibiótico e
incubadas a 37ºC durante 12-16 horas. As bactérias também eram inoculadas em placas de
meio sólido LB suplementado com antibiótico e incubadas a 37ºC por 12 horas, sendo
depois mantidas a 4ºC.
4.1.3 Plasmídios
Os plasmídios utilizados nas triagens aqui reportadas foram pAS1 e pAS2 (iscas) e
pACT2 e pGAD10 (bibliotecas). Os mapas estão representados na Figura 4.
28
Figura 4: Mapas dos plasmídios utilizados nos experimentos de duplo-híbrido. a) pACT2 b)
pGAD10 c) pAS1 d) pAS2
4.1.4 Bibliotecas de cDNA
Testículo de Camundongo (“Mouse Testis”) (CLONTECH)
Vetor: pACT2
Sítio de clonagem: XhoI/EcoRI
Total de clones independentes: 3,5 x 10
6
cDNA faixa de tamanho: 0,4 - 4,0Kb
cDNA tamanho médio: 2,0Kb
29
Músculo Esquelético Humano (“Human Skeletal Muscle”) (CLONTECH)
Vetor: pGAD10
Sítio de clonagem: EcoRI
Total de clones independentes: 2,0 x 10
6
cDNA faixa de tamanho: 0,6 kb - 4,0 kb
cDNA tamanho médio: 1,3 kb
Cérebro de Camundongo (“Mouse Brain”) (CLONTECH)
Vetor: pACT2
Sítio de clonagem: XhoI/EcoRI
Total de clones independentes: 3,5 x 10
6
cDNA faixa de tamanho: 0,4 - 4,0 Kb
cDNA tamanho médio: 2 kb
Embrião de 7 dias (“7-day Embryo”) (CLONTECH)
Vetor: pGAD10
Sítio de clonagem: EcoRI
Total de clones independentes: 3,5 x 10
6
cDNA faixa de tamanho: 0,4 - 3,8 Kb
cDNA tamanho médio: 1,9 kb
4.1.5 Protocolos
Transformação de leveduras
Quick and Easy (Gietz e Schiestl, 2007b)
Este método pode ser utilizado para transformar células de S. cerevisiae em vários
estágios de crescimento e armazenamento. O rendimento obtido é, contudo, menor e o
método deve ser utilizado quando uma quantidade pequena de transformantes é suficiente.
um volume semelhante a 50 µL de células é coletado de uma placa YPAD/ágar e dissolvido
em 1 mL de água MilliQ em um tubo de microcentrífuga (1,5 mL). As células são então
centrifugadas a 13000 g por 30 segundos e o sobrenadante é descartado. Ao pellet
adiciona-se 240 µL de polietilenoglicol (PEG-3350 50% p/v), 36 µL de acetato de lítio (LiAc
1,0M), 50 µL de DNA carregador (ssDNA 2,0 mg mL
-1
), e 34 µL de água MilliQ esterilizada e
o DNA plasmidial (até 1 µg). O tubo é vortexado até que o sedimento seja ressuspendido e
incubado por 30 minutos a 42ºC. A transformação é centrifugada a 13000 g por 30
segundos a 20ºC e o sobrenadante é retirado com uma micropipeta. Adiciona-se 1 mL de
30
água MilliQ esterilizada para ressuspender o sedimento com uma micropipeta. Amostras de
100 ou 200 µL da transformação são então semeadas em meio SD seletivo sólido e as
placas são incubadas a 30ºC por 3-4 dias.
Large Scale High Efficiency (Gietz e Schiestl, 2007a)
A eficiência deste método é alta o suficiente para triar bibliotecas complexas de
cDNA. Uma reação em larga escala pode compreender 30, 60 ou até 120 receitas de
transformação. Uma colônia da linhagem de levedura é inoculada em 50mL de meio YPAD
e incubada durante a noite a 30ºC sob agitação constante (aproximadamente 200 r.p.m.).
Após o crescimento, determina-se a concentração da cultura utilizando um hemocitômetro e
então, para 120 transformações é feito um novo inóculo com 2,5x10
9
células em 280 mL de
meio YPAD duas vezes concentrado, a concentração final da cultura deve ser 5x10
6
células/mL. Uma nova incubação é então feita a 30ºC por aproximadamente quatro horas
(duas divisões celulares). Um mix de transformação é preparado de acordo com o volume
necessário. Para 120 transformações adiciona-se 28,8 mL de PEG 50% (p/v); 4,32 mL de
LiAc 1M; 6,0 mL de ssDNA 2 mg/mL e 4,08 mL de DNA plasmidial e água MilliQ
esterilizada, totalizando 43,2 mL. As células da cultura são coletadas por centrifugação a
3000 g por 5 minutos e ressuspendidas em água MilliQ esterilizada (1/2 do volume da
cultura). Novamente as células são centrifugadas e ressuspendidas em água MilliQ (1/5 do
volume anterior), os pellets são então combinados e centrifugados da mesma forma.
Adiciona-se sobre o pellet o mix de transformação, vortexando até que ele seja dissolvido. A
transformação é incubada a 42ºC por 50 minutos (linhagens Y190 e KGY37), misturando o
tubo a cada 5 minutos. Após este período, centrifuga-se a transformação e adiciona-se 50
mL de meio SD
s
deixando o pellet descansar por 10 minutos e depois ressuspendendo-o.
Em todas as transformações o DNA carregador deve ser fervido previamente por 5
minutos.
Triagem em cultura líquida
Após a transformação as leveduras são ressuspendidas em meio líquido SDs -W-L-H
suplementado com 3AT 0,5 mM e 2,5 mM para KGY37 e Y190, respectivamente. Ao meio
deve ser também acrescentado o antibiótico Ampicilina na concentração de 100 µg/mL para
evitar contaminações. O volume de meio corresponde a 10 mL para cada receita de
transformação.
As transformações podem ser divididas em frascos (Erlenmeyer 200 mL) ou em
placas “deepwell” (placa de polietileno “Deep-Well” de 96 poços, BD Biosciences). As
culturas são então incubadas por 72 horas a 30ºC sob constante agitação (incubadora
31
refrigerada TE-422, Tecnal). Após este período é feita uma diluição na razão de 1:10. Para
as placas “deepwell”, a maneira mais simples de realizar esta diluição consiste em distribuir
1,25 mL de meio líquido (SDs -W-L-H +3AT +Amp) em cada poço de novas placas
“deepwell” com uma pipeta repetidora e então acrescentar 150 µL da cultura anterior com o
auxílio de uma pipeta multicanal. Após uma nova incubação de 24 horas a 30ºC realiza-se
uma diluição na razão de 1:100. As culturas são então incubadas por mais 24 horas a 30ºC
e em seguida analisadas quanto à presença de crescimento (ativação do gene repórter
HIS3). O crescimento das culturas dos frascos pode ser determinado por contagem das
células em um hemocitômetro. O crescimento das culturas dos poços foi avaliado
transferindo 400 µL de cada poço para uma placa de ELISA com uma pipeta multicanal e
medindo a densidade em leitor de placas de ELISA (Spectra Max Plus, Molecular Devices)
com comprimento de onda de 600 nm (OD600). A metodologia está esquematizada na
Figura 5.
Ensaio para verificação da ativação do gene repórter LacZ
As culturas que apresentam crescimento são plaqueadas em meio sólido SDs -W-L.
Após o crescimento de colônias isoladas, um filtro de nitrocelulose é aplicado na superfície
da placa e logo retirado. O filtro passa então por congelamento (com nitrogênio líquido ou
freezer -80ºC) e descongelamento à temperatura ambiente. Adiciona-se então a solução
contendo X-Gal 20 mg/mL (5-bromo-4-cloro-3-indolil--d-galactopiranosídio, Sigma) em
tampão-Z (“Z-buffer”) e incubado a 30ºC. Colônias capazes de ativarem o gene repórter
LacZ adquirem coloração azul devido a metabolização do substrato X-Gal pela -
galactosidase, produto do gene repórter.
Soluções:
Tampão-Z Na
2
HPO
4
60 mM (Synth)
(“Z- buffer”) Na
2
H
2
PO
4
40 mM (Synth)
KCl 10 mM (Synth)
MgSO
4
1 mM (Synth)
SDS 0,025% (p/v)
-mercaptoetanol 0,27 mL (v/v)
pH 7
X-Gal – 2% (p/v) em N,N dimetilformamida (DMF, Aldrich) ou Dimetil Sulfoxido (DMSO) e
utilizado na concentração final de 20 mg/mL.
32
Figura 5: Protocolo de triagem em cultura líquida. Esquema ilustrando a triagem de duplo-híbrido
em cultura líquida. Detalhes do método estão descritos no texto.
33
Minipreparação para extração de plasmídio de levedura
As leveduras são inoculadas em 5 ml de meio SD-W-L a 30ºC sob agitação
(incubadora refrigerada TE-422, Tecnal) durante 12 horas. Desta cultura, 1 mL é
centrifugado e o sobrenadante descartado. As células depositadas eram ressuspendidas no
meio residual. O volume de 400 µL de solução de lise é adicionado e homogeneizado.
Adiciona-se um volume de 400 µL da solução fenol:clorofórmio:álcool isopropílico (25:24:1)
e 0,3 g de pérolas de vidro (Sigma, 425-600 microns, G-8772) lavadas com ácido e a cultura
é homogeneizada por 2 minutos. A cultura é centrifugada durante 5 minutos. Retira-se a
fase aquosa e seu volume é medido. Adiciona-se ao tubo um volume de solução 10 M de
acetato de amônio correspondente a 0,25 do volume inicial, 1 µL de glicogênio e 2V de
etanol absoluto gelado. O material é homogeneizado e incubado a -20ºC durante 10
minutos. O sedimento é então lavado com etanol 80% e ressuspendido em 25 µL de água
milliQ estéril. O DNA deve ser armazenado a -20ºC.
Solução de lise para levedura:
Triton x 100 (Sigma)
SDS 10% (Sigma)
NaCl 100 mM (MERK)
Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 (Sigma)
EDTA 0,5 mM (Synth)
Água MiliQ esterilizada
Eletroporação
Os plasmídios extraídos das leveduras são utilizados para transformar bactérias
DH5 eletrocompetentes. Uma alíquota de 40 µL destas bactérias é descongelada por 15
minutos e incubada com 1 µL de um dos plasmídios por 5 minutos em gelo. As bactérias
são então submetidas a uma descarga elétrica de 2500V (Eletroporador BIORAD). Por fim
as bactérias são incubadas em meio SOC a 37ºC durante 1 hora e semeadas em meio LB
sólido suplementado com antibiótico (ampicilina 100 µg/mL).
Minipreparação para extração de plasmídio de bactérias
As colônias de bactérias são inoculadas em 10 mL de meio LB líquido suplementado
com ampicilina (100 µg/mL) e incubadas por uma noite a 37ºC. Aproximadamente 5 mL da
cultura são centrifugados e submetidos ao protocolo do kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-
34
Nagel). O DNA purificado obtido pode ser usado nas reações de sequenciamento ou nas
transformações.
Sequenciamento
O DNA plasmidial purificado na etapa anterior é submetido a uma eletroforese em gel
de agarose 1% contendo brometo de etídio na concentração final de 0,5 µg/ml (Life
technologies) em tampão TAE 1x (Tris base 40 mM pH 7,2, Acetato de Sódio 20 mM, Sal
tetrassódico de Etilenodiaminatetracético (EDTA) 1 mM), realizada a 60V por 40 minutos. A
eletroforese permite determinar a concentração dos plasmídios pela comparação com um
padrão de peso molecular. Os insertos são seqüenciados numa reação com 200 ng do
plasmídio, 10 pmol dos iniciadores apropriados e 4 µL do Kit DYEnamic
TM
terminator e estas
reações são realizadas em seqüenciador automático MegaBace 1000 DNA Analysis System
(GE Healthcare).
Reconstrução da ativação do gene LacZ
Para eliminar possíveis falso-positivos selecionados no sistema, plasmídios Leu
(biblioteca) recuperados dos clones positivos encontrados na triagem são utilizados para
uma transformação de novas leveduras. As leveduras transformadas com o plasmídio Trp
contendo a isca original e o plasmídio Leu recuperado são testadas para verificar a ativação
do gene LacZ. A re-confirmação da ativação é uma evidência de que o plasmídio Leu
responsável pela expressão do cDNA cujo produto apresenta interação com a proteína isca
foi isolado e a isca não sofreu modificações ao longo da triagem.
4.2 Bioinformática
4.2.1 PubMed
A base de dados NCBI PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) foi utilizada
nas pesquisas de literatura para os procedimentos de mineração de texto. Após realizar uma
pesquisa com o termo de busca desejado (ex: “preimplantation development”) os números
de identificação dos resumos (PMIDs) devem ser salvos como um arquivo de texto. A Figura
6a mostra a página da PubMed após uma pesquisa realizada e destaca em amarelo os
PMIDs. No canto direito superior da Figura 6a pode ser visualizado o procedimento para
criação de um arquivo contendo todos os PMIDs da busca.
35
A PubMed também deve ser utilizada para procurar resumos que contém muitas
informações interessantes para a pesquisa desejada. Estes trabalhos (cerca de 10) serão
usados na próxima etapa.
4.2.2 Medline Ranker
Para classificar os resumos obtidos na busca da PubMed quanto à importância das
informações que eles contém para a pesquisa desejada, os PMIDs encontrados na busca
PubMed são adicionados ao software Medline Ranker (Fontaine, Barbosa-Silva et al., 2009)
(http://cbdm.mdc-berlin.de/tools/medlineranker/) no campo chamado “background set”, como
mostra a Figura 6b. Os PMIDs dos resumos selecionados manualmente como informativos
devem ser adicionados no campo chamado “test set”. A Figura 6b também mostra como
deve ser selecionada a escolha de quais resumos devem ser classificados, a seleção é de
“background set”. A Figura 6c mostra a página obtida após a classificação dos resumos;
para o trabalho aqui descrito, selecionamos os 1000 resumos com a melhor classificação
para continuar a análise.
4.2.3 PESCADOR
Os PMIDs dos 1000 resumos classificados anteriormente são inseridos na
plataforma PESCADOR (ainda em publicação, esta pesquisa foi realizada como estudo de
caso). O PESCADOR é uma aplicação web desenvolvida por Barbosa-Silva e colaboradores
e será disponibilizada para uso público em breve. O software contido na plataforma que
marca os nomes de proteínas (“terms”) e suas biointerações é chamado LAITOR (Barbosa-
Silva, Soldatos et al., 2010). As interações encontradas por este software podem ser de 4
tipos: a interação de tipo 1 é sinalizada quando são encontrados na mesma frase dois
nomes de proteínas com uma palavra de biointeração entre eles; o tipo 2 consiste em dois
nomes de proteínas com uma palavra de biointeração na mesma frase mas não entre eles;
no tipo 3 encontra-se dois nomes de proteínas sem uma palavra de biointeração na mesma
frase; no tipo 4 o software encontra os dois nomes de proteínas em frases distintas. Na
Figura 6d pode ser observada a pagina inicial do PESCADOR, no campo superior devem
ser inseridos os PMIDs dos resumos que se deseja marcar e também podem ser
adicionados à pesquisa alguns conceitos desejados pelo usuário para melhor visualizar os
resultados relacionados a estes (exemplo: Trophectoderm).
36
37
Figura 6: Plataformas utilizadas nos experimentos de mineração de texto. a) Pesquisa PubMed
com termos de interesse (ex: “preimplantation development”). Em amarelo está destacado o
identificador do trabalho chamado de PubMed ID. b) Página inicial do software Medline Ranker
demonstrando a inclusao de uma lista de PMIDs como “background set” que são classificadas quanto
ao conteúdo em comparação com os resumos selecionados manualmente como informativos (cerca
de 10) que formam o “test set”. c) Exemplo de resultado gerado pelo Medlline Ranker, lista dos
resumos classificada em ordem de relevância. d) Página inicial da plataforma PESCADOR. O usuário
pode adicionar a lista de resumos a serem marcados pelo software e também conceitos de interesse
para a pesquisa que facilitam a visualização de biointerações relacionadas posteriormente.
38
4.2.5 Construção da via de regulações
Um esquema do procedimento para criação de uma via de regulações utilizando as
ferramentas de mineração de texto aqui descritas está representado na Figura 7.
A via de regulações foi construída utilizando o programa Keynote iWORK 2009
(semelhante ao PowerPoint da Microsoft) e foi baseada na linguagem utilizada nas vias do
KEGG Pathway, a KGML (“KEGG Markup Language” http://www.genome.jp/kegg/docs/xml/)
que especifica como a via deve ser representada graficamente. Outra maneira de gerar a via
de regulações é através de software como o CellDesigner (Novere, Hucka et al., 2009).
39
Figura 7: Procedimento para criação da via de interações. Inicialmente realiza-se uma pesquisa
PubMed com os termos de interesse (ex: “preimplantation development”). A lista dos números de
identificação dos trabalhos (PubMed IDs ou PMIDs) obtidos na pesquisa é introduzida no software
Medline Ranker como “background set” junto com PMIDs de resumos selecionados manualmente
como informativos (cerca de 10) que formam o “test set”. O software gera uma lista dos resumos
classificada em ordem de relevância e cerca de 1000 resumos com a melhor classificação são
escolhidos para alimentar o software PESCADOR. O PESCADOR identifica e marca símbolos de
genes e biointerações. Com os resumos marcados é possível analisar as biointerações encontradas e
gerar manualmente uma via para visualização gráfica destas informações.
40
4.2.6 SeedServer
Para a criação de agrupamentos de homólogos foi utilizado o software SeedServer.
Este software foi desenvolvido por Guedes e colaboradores no laboratório Biodados e estará
disponível em breve para uso público como um aplicativo web. Primeiramente, a lista de
símbolos de genes que se deseja usar como semente (“seed”) é adicionada a uma tabela do
MySQL e através de uma comparação com o banco de dados Gene
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) podemos atribuir a cada símbolo um identificador,
GeneID. Os identificadores são então utilizados juntamente com o banco de dados UniProt
ID Mapping (http://www.uniprot.org/) para atribuir a cada GeneID um identificador UniProt
das sequências, UniProtID. Para cada gene presente na via, duas sequências são utilizadas
como “seed”, uma humana e a segunda de camundongo. O SeedServer realiza buscas
através de dois componentes, o programa SeedLinkage (Barbosa-Silva, Satagopam et al.,
2008) e os bancos de dados KEGG Orthology (KO) e sua versão enriquecida UEKO (UniRef
enriched KO) desenvolvida no laboratório Biodados por Fernandes e colaboradores (em
publicação). Após a formação inicial dos agrupamentos, o SeedServer realiza uma
comparação por alinhamento PSI-BLAST das sequências “seed” com todas as sequências
recrutadas, eliminando aquelas que não se agrupam quando ocorre a convergência (as
iterações param antes que a “seed” receba escore menor que 50% de seu auto-escore –
módulo desenvolvido por Ribeiro, no laboratório). O procedimento para criação de grupos de
homólogos pelo SeedServer está esquematizado na Figura 8.
4.2.7 Último Ancestral Comum
O último ancestral comum para os genes da via de regulações foi determinado com
os dados obtidos dos agrupamentos feitos pelo SeedServer. Cada agrupamento de
sequências possui uma tabela MySQL da qual podemos obter todos os identificadores
taxonômicos para estas sequências, TxIDs; esta lista de TxIDs é adicionada à ferramenta
Taxonomy CommonTree (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/CommonTree/wwwcmt.cgi)
da base de dados Taxonomy do NCBI. A árvore taxonômica gerada apresenta em negrito os
nomes das espécies correspondentes aos TxIDs inseridos e o grupo mais recente que
contém todas estas espécies representadas no cluster é considerado o último ancestral
comum (LCA). Um esquema da determinação do LCA e um exemplo de árvore gerada pelo
NCBI podem ser vistos na Figura 9. Para números maiores de genes é utilizado um
programa desenvolvido no laboratório por Velloso, que consulta a árvore taxonômica do
NCBI alocada em memória e gera o LCA para cada agrupamento de sequências submetido.
41
Figura 8: Procedimento para criação de agrupamentos de homólogos. Utilizando os símbolos
dos genes (“gene symbols”), que participam da via de regulação gerada com o PESCADOR, e duas
bases de dados, Gene e UniProt ID Mapping, obtêm-se os identificadores UniProt das sequências
(“UniProt ID”). Estes são usados como entrada do software SeedServer, que contém dois
componentes: o programa SeedLinkage, que realiza buscas de homólogos em BBH, e os bancos de
dados Kegg Orthology (KO) e sua versão enriquecida UEKO (“UniRef enriched KO”). Um outro
módulo do SeedServer compara as sequências de entrada com as recrutadas pelos componentes
com PsiBLAST gerando um agrupamento de homólogos validado.
42
Figura 9: Busca pelo último ancestral comum (LCA). a) A figura mostra o procedimento utilizado
para definir o último ancestral comum (LCA) dos homólogos de um agrupamento utilizando a
plataforma Taxonomy disponível pelo NCBI. b) Exemplo de árvore gerada pelo Taxonomy
CommonTree, em destaque estão os organismos que possuem sequências agrupadas pelo
SeedServer com a da proteína Tead4. O LCA no caso é o grupo Fungi/Metazoa.
43
5. RESULTADOS
5.1 Validação da triagem liquida para o sistema de duplo-híbrido em leveduras
O sistema de triagem de duplo-híbrido é uma importante metodologia para o estudo
de interações entre proteínas. A adaptação para triagem líquida e a validação da utilização
de duas linhagens de leveduras, KGY37 e Y190 são descritas a seguir.
5.1.1 Escolha de iscas para triagens
Para validar o novo protocolo de triagem desenvolvido, selecionamos três iscas que
já haviam sido previamente triadas por colaboradores com o protocolo convencional em
placas de meio sólido. As iscas Trim2 e cRTel1 foram cedidas pelo Dr. Hao Ding com as
respectivas bibliotecas de cDNA (cérebro e testículo de camundongo). A isca TRIM32 foi
cedida pelo Dr. Klaus Wrogemann com a biblioteca de cDNA de músculo esquelético
humano.
5.1.2 Transformações e linhagens de leveduras
Para a triagem da isca cRTel1 (porção c-terminal da proteína RTel1) foi utilizada a
levedura KGY37, que foi transformada pelo método “Quick and Easy” somente com o DNA
isca, um plasmídio de expressão em levedura que produz cRTel1 em fusão com o domínio
de ligação em DNA de Gal4 (pRTEL1; 1 µg). Em sequência, a levedura transformada com o
DNA isca foi usada na transformação pelo método “High-Efficiency” com 10 µg da biblioteca
de cDNA de testículo de camundongo. As 120 receitas de transformação resultaram em
uma eficiência de 8x10
6
transformantes, uma cobertura de aproximadamente 2x da
biblioteca.
Para a triagem da proteína Trim2 utilizamos as duas linhagens de levedura, KGY37 e
Y190. Cada transformação foi de acordo com o método “High-Efficiency” e utilizamos 5 µg
de DNA isca e 10 µg de biblioteca de cDNA de cérebro de camundongo. As 120 receitas de
transformação com KGY37 resultaram em 4,6x10
6
transformantes e com Y190 resultaram
em 5,4x10
6
transformantes.
Com a proteína TRIM32 a triagem foi feita na levedura KGY37. A levedura foi
transformada de acordo com o método “High-Efficiency” e para cada receita utilizamos 5 µg
de DNA isca e 15 µg de biblioteca de cDNA de músculo esquelético humano. As 120
receitas de transformação resultaram em uma eficiência de 4x10
7
transformantes.
44
5.1.3 Triagem líquida com cRtel1 e Trim2
A transformação com a isca cRTel1 e biblioteca de testículo foi ressuspendida em
1200 mL de meio líquido SD -W-L-H +3AT +Amp (ver “Métodos” para detalhes) e distribuída
em 10 frascos (60 mL em cada) e 4 placas “deepwell” (1,5 mL por poço). As culturas foram
incubadas sob agitação por 72 horas e diluídas de acordo com o protocolo de triagem
líquida descrito em “Métodos”. Após todo o processo verificamos o crescimento de 13 poços
através da leitura de OD600 para as placas e nos frascos houve crescimento de 7 culturas.
A transformação com a isca Trim2 e biblioteca de cérebro de camundongo na
levedura KGY37 foi igualmente ressuspendida em 1200 mL de meio líquido SD -W-L-H
+3AT +Amp e distribuída em 10 frascos e 4 placas “deepwell”. Após o protocolo de
incubações e diluições as culturas não apresentaram crescimento. Re-incubamos as placas
iniciais (por dois dias adicionais aos três previamente utilizados) e prosseguimos novamente
com as diluições para dar mais tempo de crescimento seletivo aos clones positivos, visto
que a isca Trim2 interfere significativamente no crescimento da levedura (não mostrado).
Após este procedimento, 21 poços mostraram crescimento como pode ser observado na
Tabela 2. As culturas foram semeadas em meio sólido seletivo (10
3
células por placa) para o
isolamento de colônias. A re-incubação das placas permitiu o isolamento de clones de
interesse mas este procedimento pode resultar na inclusão de clones contendo interações
fracas. Sendo assim, procuramos desenvolver um procedimento auxiliar padrão para
monitorar o crescimento das leveduras sob interferência das iscas que será descrito a
seguir. A triagem da isca Trim2 com a levedura Y190 foi feita já de acordo com este
procedimento e será descrita no item 5.1.5.
5.1.4 Monitoramento de leveduras com crescimento alterado
As iscas que afetam o crescimento das leveduras apresentam um obstáculo para a
triagem de duplo-híbrido. O procedimento para verificar o crescimento das leveduras
consiste em diluir um volume de 0,5 mL (dos 50 mL de células inicialmente ressuspendidos
após as 120 transformações), correspondente a uma receita de transformação, em 9,5 mL
de meio líquido SD -W-L (para selecionar apenas leveduras contendo o plasmídio isca e o
da biblioteca) e este tubo é chamado de A. O tubo B consiste em 1 mL do tubo A diluído em
9,0 mL de meio SD -W-L (diluição 1:10). Foram feitas também diluições 1:10 e 1:100 do tubo
B (tubos C e D). Os tubos foram incubados paralelamente à incubação das placas e frascos
das triagens e o crescimento das culturas dos tubos era verificado por contagem de células
no hemocitômetro nos momentos indicados pelo protocolo, indicando se a diluição
subsequente poderia ser feita ou não. Após a incubação inicial de 72 horas, a contagem de
células mostrou que o tubo B é o melhor para acompanhar o crescimento das culturas e
determinamos que quando a concentração deste tubo fosse 2,0x10
7
células/mL a diluição
45
1:10 poderia ser feita. O tubo B também é diluído 1:10 (B1) e 1:100 (B2), a diluição maior
1:100 é feita para simular um evento mais raro correspondente à presença da interação na
levedura. Para as iscas utilizadas que tornaram o crescimento da levedura lento, o tubo B
mostrou que são necessárias de 12 a 24 horas adicionais antes da diluição 1:100 e outras
12 horas adicionais antes da leitura de OD600.
Tabela 2: Leitura de OD600 das placas de triagem da proteína Trim2 destacando poços com
crescimento.
46
5.1.5 Triagem líquida com as iscas Trim2 e TRIM32, sob monitoramento
Uma nova triagem com a proteína Trim2 foi feita utilizando a linhagem de levedura
Y190. As 120 receitas de transformação foram ressuspendidas em 1200 mL de meio SD -W-
L-H +3AT +Amp e distribuídas em 4 placas “deepwell” e 10 frascos. O protocolo de diluições
foi realizado de acordo com o monitoramento do crescimento da levedura indicado pelo tubo
B. Em seguida, o crescimento foi determinado pela leitura de OD600 e foi observado
crescimento em todos os frascos e em 35 poços. As culturas com crescimento foram
plaqueadas para isolamento de colônias.
A triagem com a proteína TRIM32, que também afetava o crescimento das leveduras
(não mostrado), e a biblioteca de músculo esquelético humano foi realizada na levedura
KGY37 e as transformações foram ressuspendidas em 1200 mL de meio SD -W-L-H +3AT
+Amp e distribuídas em 4 placas “deepwell” e 10 frascos. Após o protocolo de diluições
acompanhado do monitoramento do crescimento, a leitura de OD600 indicou crescimento
em 25 poços e 9 frascos. As culturas com crescimento foram plaqueadas para isolamento
de colônias.
5.1.6 Ativação do gene repórter LacZ
As colônias obtidas para cada triagem foram transferidas para filtros de nitrocelulose
e submetidas a um ensaio de ativação do gene repórter LacZ. Para a triagem com a isca
cRTel1, foram positivos todos os 13 poços e todos os 7 frascos. Na triagem de Trim2 com
KGY37 ficaram azuis (positivos) 8 dos 21 poços, parte dos filtros deste ensaio estão
mostrados na Figura 10. Esta baixa correlação pode ser um reflexo do crescimento de
fracas interações ou falso-positivos devido ao maior tempo de crescimento proporcionado
nessa triagem, que não foi monitorada. Já na triagem de Trim2 com Y190 todos os 35
clones de poços e 10 frascos foram positivos para ativação de LacZ. Finalmente, na triagem
de TRIM32 os 9 frascos resultaram em clones positivos para ativação de LacZ assim como
17 dos 25 poços. Estes resultados do ensaio de LacZ mostram uma melhora importante no
protocolo de duplo-híbrido quando a triagem é realizada em meio líquido, já que nas triagens
em placas de meio sólido é bastante comum que a maioria das colônias crescidas sejam
negativas para a ativação de LacZ.
5.1.7 Validação dos positivos
Os clones positivos resultantes das triagens foram posteriormente sequenciados e
submetidos a uma transformação com a isca original para reconstruir a interação. Os
resultados obtidos foram similares e comparáveis em rendimento de clones positivos aos
resultados obtidos de triagens em placas. Como exemplo serão descritos os clones
confirmados para a triagem de Trim2 e levedura Y190 com a permissão de nosso
47
colaborador, Dr Hao Ding. Dos 10 clones positivos de frascos, a interação foi reconstruída
com sucesso para seis. No sequenciamento verificou-se que cinco destes correspondiam à
proteína EFS e o sexto à proteína Trim3. Os 35 clones de poços resultaram na reconstrução
de 14 interações, sete destas correspondiam à proteína EFS, um deles correspondia à
Trim3, e os demais a quatro proteínas diversas (não mostrado). A obtenção de clones
repetidos provenientes de frascos diferentes é, portanto, um indicativo da intensidade da
interação, reflexo da capacidade da levedura contendo este clone de dominar a cultura.
Figura 10: : Ensaio de LacZ da triagem de Trim2. Fotos de alguns resultados de ensaio de LacZ
com clones isolados da triagem em meio líquido coma isca Trim2 na levedura KGY37 (5 positivos e
um negativo - ao centro, abaixo).
48
5.2 Criação de uma via de regulações utilizando ferramentas de mineração de texto
Ao lado de investigações de interações proteína-proteína, para as quais a
metodologia de triagem líquida contribui, a literatura científica e dados depositados em
bases públicas permitem a elaboração de uma via de regulação resultante de interações
funcionais entre proteínas e genes por elas regulados. Uma lacuna em bases de dados é a
regulação do desenvolvimento embrionário pré-implantação, tratado a seguir.
5.2.1 Busca na literatura
Utilizamos a plataforma PubMed do NCBI para buscar trabalhos relacionados com o
desenvolvimento embrionário pré-implantação. O termo de busca utilizado ("preimplantation
development") selecionou 3524 resumos.
5.2.2 Seleção de trabalhos relevantes
Para obter um resultado mais eficiente do que o retorno de uma pesquisa tradicional
na PubMed, esta mesma pesquisa foi submetida a uma classificação da relevância de cada
um dos trabalhos obtidos utilizando o software Medline Ranker (ver "Métodos"). O software
atribuiu a cada um dos 3524 resumos um valor “p” (exemplo mostrado na figura 6c),
indicando quanto este resumo seria informativo para nossa pesquisa. Esta atribuição se
baseia no caráter informativo de 10 trabalhos selecionados manualmente listados a seguir:
(Ambrosetti, Schöler et al., 2000; Scaffidi e Bianchi, 2001; Plusa, Frankenberg et al., 2005;
Strumpf, Mao et al., 2005; Mizuno, Sono et al., 2006; Zhang, Tam et al., 2006; Tam, Lim et
al., 2008; Cauffman, De Rycke et al., 2009; Nishioka, Inoue et al., 2009). Os 1000 trabalhos
melhor ranqueados foram selecionados.
5.2.3 Revelando biointerações com o software PESCADOR
Com o resultado da classificação do Medline Ranker, o software PESCADOR foi
capaz de marcar nomes de proteínas ("terms") e biointerações entre eles nos 1000
trabalhos que inserimos inicialmente. O PESCADOR marcou 722 nomes e selecionou 223
biointerações de tipo 1 entre eles, além de outras biointerações (tipos 2 a 4) também
informativas (detalhes do software em “Métodos”). A partir deste ponto, a interpretação
deste resultado é manual e as informações retiradas dos resumos foram colocadas de uma
forma visual, agrupando regulações do desenvolvimento embrionário pré-implantação.
Como exemplo, na Figura 11 está mostrado um resumo marcado pelo PESCADOR e
também a interpretação da informação descrita no resumo. O fator de transcrição Tead4 é o
ativador da transcrição do gene Cdx2, levando à diferenciação da trofectoderme, e para esta
regulação é necessário que Tead4 interaja com Yap. Esta via de ativação de Cdx2 não
acontece na massa celular interna ("inner cell mass") devido à presença nestas células de
49
um outro fator da via Hippo chamado Lats, uma cinase capaz de fosforilar Yap, que fica
restrito ao citosol e não pode interagir com Tead4 localizada no núcleo. Esta importante
regulação do destino das células embrionárias é apenas uma das contidas na via final obtida
para a pré-implantação.
Figura 11: Resultado do PESCADOR. Exemplo de resumo marcado com o software PESCADOR,
os nomes de genes reconhecidos são marcados de vermelho (“terms”) e as palavras de biointeração
em amarelo. A plataforma permite que o usuário procure pelas interações de interesse na lista de
genes encontrados (“terms”), na lista de resumos (“abstracts”) ou pelos conceitos de interesse
indicados inicialmente. Abaixo está mostrado um exemplo de curadoria manual da informação
extraída do resumo e sua representação gráfica, iniciando a construção da via de interações.
50
5.2.4 Representação gráfica da via do desenvolvimento pré-implantação e revisão das
regulações
A extensa via obtida após a análise de todos os trabalhos marcados pelo
PESCADOR está representada na Figura 12. A via compreende 86 genes (ou seus
produtos) e diversas regulações entre eles. Uma revisão destas regulações será descrita a
seguir.
51
Figura 12: Via regulatória do desenvolvimento embrionário pré-implantação. A figura mostra os
genes envolvidos no desenvolvimento embrionário no período pré-implantação e as regulações
existentes entre eles. Algumas funções estão também representadas nos retângulos. Algumas das
principais regulações estão descritas no texto. Como modelo de sinalização foi seguida a linguagem
KEGG (ver texto para detalhes).
52
Primeiras clivagens embrionárias
O oncogene c-MYC é um importante regulador da transcricional e sua expressão é
observada nos estágios iniciais do desenvolvimento, podendo ser encontrado nas células
até a fase de mórula, sendo reprimido a partir de então (Suzuki, Abe et al., 2009). Dois
genes foram associados recentemente com o desenvolvimento, um deles envolvido nos
estágios logo após a fecundação que depois passa a ser reprimido, chamado BORIS e o
segundo chamado ECSA que começa a ser expresso já no blastocisto exclusivamente nas
células da massa celular interna. A presença destes genes foi comparada com o padrão de
expressão do fator de transcrição Oct4, que já está presente nas primeiras clivagens, sendo
posteriormente reprimido e voltando a ser expresso no blastocisto (Monk, Hitchins et al.,
2008). A expressão de um gene associado com gametogênese, Gse foi recentemente
identificada em células do embrião inicial, esta proteína posteriormente tem sua expressão
restrita em células da massa celular interna, sugerindo uma função na especificação da
linhagem celular (Mizuno, Sono et al., 2006).
Padrões de metilação e o correto desenvolvimento pré-implantação
Desde o início do desenvolvimento embrionário pré-implantação padrões genômicos
de metilação em células humanas dependem da proteína DNMT1 (DNA methiltransferase-1)
enquanto em células de camundongo a variante correspondente é chamada Dnmt1o. No
estágio de oito células esta proteína é realocada para o núcleo e mantém padrões de
metilação essenciais, permitindo que o embrião complete eventos iniciais do
desenvolvimento (Chung, Ratnam et al., 2003). Recentemente foi demonstrado que a perda
da localização correta de Dnmt1o não só resulta em uma interrupção do desenvolvimento
em embriões de 5-7 células como também é responsável pela inibição da transcrição de
cinco genes (GJA3, GJC1, GJB3, CDH1 e CTNNB1) envolvidos na formação de junções do
tipo “gap” e “tight” (Yu, Xue et al., 2009). Estas junções são cruciais para processos iniciais
como a compactação do embrião de 8-células e a cavitação da blastocele.
Dicotomia Trofectoderme (TE) e Massa Celular Interna (ICM)
Nas células destinadas a formar a massa celular interna, marcadas pela repressão
dos genes aPKC e Pard3 (Plusa, Frankenberg et al., 2005) e também pela ativação de Sox2
(Guo, Huss et al., 2010), os principais fatores de transcrição da pluripotência, incluindo
Nanog e Oct4, permanecem ativos devido à expressão de um importante membro da via de
sinalização Hippo: Lats. Esta serina/treonina proteína cinase é responsável por fosforilar
Yap, levando ao seqüestro desta proteína pelo citosol e impedindo sua associação com o
fator de transcrição Tead4.
53
Ativando a diferenciação da TE: Tead4/Yap ativam Cdx2 para reprimir Nanog e Oct4
Inversamente, nas células externas que vão se diferenciar e formar a trofectoderme,
Yap não está fosforilado, permanece no núcleo e se associa com Tead4, levando à ativação
de Cdx2, um repressor chave de Nanog e Oct4 (Ralston e Rossant, 2008). Esta repressão
então suspende a inibição que Nanog e Oct4 estavam exercendo em vários genes, que por
sua vez se tornarão ativos (Strumpf, Mao et al., 2005; Nishioka, Inoue et al., 2009). A
ativação de Cdx2 requer um escape da repressão basal: Nanog (Hyslop, Stojkovic et al.,
2005) e Oct4 (Zhang, Tam et al., 2006) reprimem níveis basais de transcrição de Cdx2; uma
indução de níveis mais altos de transcrição por Tead4/Yap supera esta repressão e Cdx2
pode exercer a sua função (Nishioka, Inoue et al., 2009). Tead4 também foi associada
recentemente com a ativação de outro fator de diferenciação da trofectoderme, GATA3
(Ralston, Cox et al., 2010), que atua em conjunto com Cdx2 e também em genes
independentes do controle deste fator, esta ativação de GATA3 parece ser independente de
Yap sugerindo a interação de Tead4 com algum outro fator. Também necessária para o alto
nível de expressão de Cdx2 é a proteína Arp3. Experimentos com camundongos “knockout”
para este gene apresentam células trofoblastos incapazes de se desenvolver
apropriadamente, possivelmente entrando em apoptose como resultado da ausência de
Cdx2 (Vauti, Prochnow et al., 2007). Outra via importante para a diferenciação da
trofectoderme é a via de TGFbeta estimulada pelo fator BMP4 que ativa proteínas Smad,
estas proteínas estimulam a transcrição de Cdx2 (Hayashi, Furue et al., 2010). BMP4
também é responsável pela inibição de Id2, inibidor da diferenciação (Kondo, Cubillo et al.,
2004), e pela ativação de Hand1, proteína específica da diferenciação de trofoblastos (Riley,
Anson-Cartwright et al., 1998).
Na ausência de Oct4 e Nanog
A repressão de Oct4 leva à ativação de um regulador positivo de destino de célula da
TE, Eomes (“T-box protein eomesodermin”) (Strumpf, Mao et al., 2005; Babaie, Herwig et
al., 2007), também apontado como alvo do controle de Cdx2 (Marikawa e Alarcón, 2009). A
diferenciação subseqüente destas células é acompanhada pela expressão de diversos
genes, como a glicoproteína PSG2 (Adjaye, Herwig et al., 2007) e o marcador KRT18, um
dos primeiros sinais de que a célula perdeu sua capacidade totipotente antes de qualquer
diferenciação visível (Vauti, Prochnow et al., 2007; Cauffman, De Rycke et al., 2009). A
remoção da repressão exercida por Oct4 também resulta na ativação dos genes ETIF2B e
Rps14 (Shin, Cui et al., 2005) permitindo que estas células iniciem uma rotina de tradução
intensa. Experimentos de “knockdown” de Oct4 mostraram também que a retirada deste
fator permite a expressão de Gcm1, específico de placenta (Yamada, Ogawa et al., 2000), e
da cadeia beta do hormônio hCG (Matin, Walsh et al., 2004).
54
Simultaneamente, a repressão de Nanog permite a expressão de vários genes tanto
associados à trofectoderme (GATA2, hCG-alfa e hCG-beta) quanto associados à
endoderme extra-embrionária (GATA4, GATA6, LAMB3 e AFP) (Hyslop, Stojkovic et al.,
2005). A endoderme extra-embrionária se diferencia posteriormente a partir da ICM também
mas dá origem ao saco vitelínico, enquanto a trofectoderme origina a porção embrionária da
placenta. Desde o início da formação do blastocisto, desmossomos são formados na
trofectoderme e a proteína responsável é a desmocolina (DSC2), que não é expressa na
ICM (Collins, Lorimer et al., 1995).
Sob a contínua ativação de Oct4 e Nanog
Na massa celular interna, os genes responsáveis pela pluripotência permanecem
ativos e formam uma complexa via de regulações. Recentemente foi descrito que a
transcrição de Nanog é estimulada pela presença de compostos como retinol (Chen, Yang
et al., 2007). Exercendo um papel redundante na ativação de Nanog, as proteínas Klf2, Klf4
e Klf5 (“krüppel-like factor”) foram descritas como essenciais para a manutenção da
pluripotência. Klf4 já era um fator conhecido por este papel e faz parte dos fatores de
transcrição utilizados na reprogramação em laboratório de células diferenciadas. Contudo,
somente a depleção simultânea de Klf4, 2 e 5 resulta na diferenciação de células tronco,
indicando a redundância funcional (Jiang, Chan et al., 2008). Outras proteínas são
ativadoras já bem descritas de Nanog, incluindo os dois outros fatores principais reguladores
da pluripotência, Oct4 (Pan, Li et al., 2006; Babaie, Herwig et al., 2007) e Sox2 (Van Den
Berg, Zhang et al., 2008). O receptor de estrogênio ESRRB também foi descrito como
envolvido na ativação de Nanog por Oct4 e Sox2 (Van Den Berg, Zhang et al., 2008).
Inversamente, Nanog também ativa Oct4 (Pan, Li et al., 2006), e o receptor ESRRB também
é necessário para manter a atividade do promotor de Oct4 (Zhang, Zhang et al., 2008).
Cada um destes três fatores também atua como um auto-ativador, por exemplo Oct4
e Sox2 se associam e ativam a transcrição do próprio Oct4 (Okumura-Nakanishi, Saito et al.,
2005). Outro fator de transcrição principal envolvido na manutenção do estado de
pluripotência das células é Sall4 (Cauffman, De Rycke et al., 2009). Sall4 se liga a uma
região regulatória conservada no acentuador (“enhancer”) distal de Oct4 e ativa a
transcrição do gene (Zhang, Tam et al., 2006). Estudos com interferência de microRNA
mostram que a perda de Sall4 leva a uma redução do nível de mRNA de Oct4 e um
aumento significativo da expressão de Cdx2 na ICM (Zhang, Tam et al., 2006). B-MYB, um
gene expresso em células proliferativas, é também um regulador positivo de Oct4 e estudos
descrevem diferenciação imprópria da ICM na ausência de b-MYB (Tarasov, Tarasova et al.,
2008).
55
A via de sinalização Notch é uma via conservada evolutivamente, envolvida em
processos de comunicação celular e decisões celulares corretas e está envolvida no
desenvolvimento da massa celular interna (Adjaye, Huntriss et al., 2005). A proteína Nle,
uma reguladora direta desta via, é essencial para a sobrevivência das células da massa
celular interna (Cormier, Le Bras et al., 2006). Outra proteína recentemente associada com o
desenvolvimento e essencial para a sobrevivência da massa celular interna é Tbn (Taube
nuss) sem a qual as células da ICM entram em apoptose (Voss, Thomas et al., 2000).
A expressão da molécula de adesão de plaquetas e células endoteliais (PECAM1 ou
CD31) foi detectada por microscopia confocal de imunofluorescência no blastocisto e restrita
às células da ICM. Posteriormente PECAM1 permanece somente nas células do epiblasto
pluripotentes, desaparecendo no momento em que estas sofrem diferenciação (Robson,
Stein et al., 2001). Estes resultados indicam um novo papel para esta molécula no
desenvolvimento embrionário.
Ativação sob controle
Outras vias de controle mantém a expressão dos fatores de transcrição principais
gerando uma concentração celular adequada e equilibram estes diversos mecanismos de
ativação e superexpressão da transcrição. Uma regulação complexa por retroinibição
(“feedback”) é composta por FOXD3, Nanog e Oct4 (Pan, Li et al., 2006). Para manter a
concentração desejada de Oct4 e Nanog, estes três genes interagem da seguinte maneira:
A expressão de Nanog é ativada por FOXD3 e Oct4 mas não acima do nível desejado por
repressão exercida pelo Oct4; FOXD3 e Nanog ativam a expressão de Oct4 mas não acima
do necessário pois Oct4 atua como auto repressor.
Dax1 é um receptor nuclear de hormônio órfão recentemente identificado como
repressor da transcrição de Oct4 (Sun, Nakatake et al., 2009). A expressão de Dax1 foi
também capaz de reduzir a expressão de Nanog e Rex1. Ensaios mostraram que Dax1 se
liga a Oct4 e elimina sua atividade de ligação a DNA, diminuindo assim a transcrição de
Nanog e Rex1, alvos de ativação do Oct4.
Outro destes repressores na ICM é Tcf3, um efetor da via de sinalização Wnt. TLE2
(uma proteína da família Groucho) e CtBP (“C-terminal binding protein”) foram descritos
como parceiros principais de Tcf3 na mediação de seu efeito repressor. Tcf3 se liga ao
promotor de Oct4 e o reprime, este efeito repressor requer ambos os domínios de Tcf3 de
interação com Groucho e com CtBP (Tam, Lim et al., 2008). Tcf3 também limita a
concentração celular do mRNA e da proteína Nanog, além de controlar a atividade do
promotor de Nanog em células tronco embrionárias (ESCs); o domínio de interação com
Groucho de Tcf3 está envolvido nesta repressão (Pereira, Yi et al., 2006). Tcf3 é critico para
a manutenção dos níveis apropriados de Oct4 e Nanog em ESCs. Experimentos mostram
56
que a perda de Tcf3 por interferência de RNA (RNAi) bloqueia a habilidade destas células
de se diferenciar posteriormente (Tam, Lim et al., 2008).
Alvos de Oct4 e Sox2
Oct4 ativa o gene específico de células tronco-1 (Esg1), que codifica uma proteína
de ligação a RNA presente na ICM responsável por regular diversos transcritos específicos
(Tanaka, Lopez De Silanes et al., 2006). Oct4 e Sox2 são também responsáveis por ativar a
transcrição do fator de crescimento de fibroblastos-4 (FGF4) (Okumura-Nakanishi, Saito et
al., 2005). A expressão de FGF4 requer portanto a atividade combinada destes dois fatores
de transcrição que se ligam em sítios adjacentes na região do DNA contendo o acentuador
do gene FGF4 (Ambrosetti, Schöler et al., 2000). Um vez transcrita, a proteína FGF4 pode
interagir com seu receptor FGFR2 e ativar a proliferação de células da ICM e TE,
posteriormente ativando também as células da endoderme extra-embrionária.
Diversos outros genes são também alvos dependentes da ativação de Oct4. Estes
incluem o fator de crescimento TDGF1, Inibidor de crescimento SAP18, regulador de
transcritos sem-sentido (“nonsense”) RENT1, duas proteínas envolvidas na auto-renovação
de células tronco DPPA4 e DPPA1, marcadores da endoderme anterior visceral LEFTY1 e
2, antígeno de superfície THY1 e outros genes codoficadores de proteínas envolvidas em
processos celulares especializados (DPP3, ATP6AP2, DDB1) ou proteínas hipotéticas como
GK003 e hRscp (Shin, Cui et al., 2005; Babaie, Herwig et al., 2007).
Acredita-se que esta ampla regulação exercida por Sox2 e Oct4 durante a
embriogênese de mamíferos opera por meio de uma ligação ao DNA cooperativa em
regiões regulatórias compostas de motivos HMG (Sox2) e POU (Oct4) adjacentes (cassetes
HMG/POU) (Torres-Padilla, Richardson et al., 2007). DPPA4 é um dos genes com a
presença de um cassete HMG/POU em sua região promotora (Chakravarthy, Boer et al.,
2008).
Alvos de Nanog e STAT3
Uma importante contribuição para a pluripotência é exercida pela ativação da via
JAK/STAT. A via LIF/STAT3 (Saito, Liu et al., 2004; Chen, Yang et al., 2007; De Felici, Farini
et al., 2009) para a manutenção da pluripotência celular consiste de LIF e o receptor de LIF,
que desencadeiam um sinal celular através de STAT3. Este transdutor de sinal e ativador de
transcrição é ativado pela cinase JAK1 e se liga a vários promotores induzindo a transcrição
de genes relacionados à pluripotência. Nanog e STAT3 ligam-se a promotores dependentes
de STAT3 e causam sua ativação sinergisticamente. Nanog também funciona como um
inibidor transcricional de NFB, um fator conhecido por sua atividade pró-diferenciação
(Torres e Watt, 2008). Nanog também é responsável pela repressão de SMAD1, impedindo
57
a diferenciação induzida por BMP4 pela via de sinalização TGF da qual SMAD1 é um
transdutor de sinal (Suzuki, Raya et al., 2006).
Diferenciação da endoderme extra-embrionária a partir de células da ICM
Ainda antes da implantação embrionária, outra diferenciação acontece. Certas
células da massa celular interna dão origem à endoderme primitiva, o primeiro tipo celular
distinto da endoderme extra-embrionária. Os componentes da endoderme extra-embrionária
são as endodermes primitiva, parietal e visceral. Este tecido vai desenvolver o saco
vitelínico durante estágios posteriores da embriogênese.
Wnt6 foi recentemente identificado como um indutor da endoderme primitiva e esta
indução é acompanhada pela translocação de beta-catenina (CTNNB1) e Snai1 para o
núcleo (Krawetz e Kelly, 2008). Este estudo também mostrou que o aumento da expressão
da proteína cinase A (PKA) induz marcadores da endoderme parietal. Outro membro da
família Wnt, Wnt9a, tem sua expressão localizada em células da ICM que margeiam a
blastocele (Kemp, Willems et al., 2005) e induz o reposicionamento de células que
expressam GATA6 necessário para a formação da endoderme primitiva (Meilhac, Adams et
al., 2009).
Sox7 tem papel fundamental na diferenciação da endoderme parietal. Foi mostrado
por estudos utilizando moléculas curtas de RNA de interferência que Sox7 é responsável
pela indução da transcrição de GATA4 e GATA6 (Futaki, Hayashi et al., 2004). O
silenciamento individual ou combinado de Sox7, GATA4 e GATA6 resulta em supressão das
mudanças morfológicas celulares e também da produção de laminina1 (LAMB1), alterações
características da diferenciação da endoderme parietal. GATA4 foi previamente identificado
como um fator de transcrição responsável pela ativação de FGF3 (Murakami, Thurlow et al.,
1999). Sox7 também ativa o promotor de FGF3, já Sox2, embora da mesma família, pode
modular negativamente a ativação de FGF3 mediada por GATA4 esta evidência é
fortalecida pelo papel deste fator na pluripotência da ICM (Murakami, Shen et al., 2004).
Sox17, outro membro da família Sox, é responsável pela diferenciação da endoderme extra-
embrionária em estágios posteriores (Shimoda, Kanai-Azuma et al., 2007). Associada à
expressão de Sox17 foi encontrado o fator de transcrição Runx1, também específico para a
endoderme extra-embrionária (Kurimoto, Yabuta et al., 2006). HNF-4 é um fator de
transcrição específico da endoderme extra-embrionária com papel no desenvolvimento pós-
implantação e na organogênese (Duncan, Manova et al., 1994) sua expressão pode ser
resultante da diferenciação induzida por BMP4 (Coucouvanis e Martin, 1999). Finalmente,
para o desenvolvimento da endoderme visceral a proteína Dab2 é indispensável, embora
seu papel não esteja bem descrito, talvez relacionado ao posicionamento celular correto
(Morris, Tallquist et al., 2002; Yang, Smith et al., 2002). A expressão de Cer1, um marcador
58
da endoderme anterior visceral (AVE) começa antes da implantação do embrião no
subconjunto de células que compõe a endoderme primitiva. Parte desta população ancestral
de células expressando Cer1 junta-se a células que só começam a expressar Cer1 após a
implantação e formam a endoderme anterior visceral (Torres-Padilla, Richardson et al.,
2007).
5.3. Busca por genes homólogos
5.3.1 SeedServer
Para estabelecer uma base de dados de ortólogos e providenciar informação de
sequência para os genes que compõe a via de desenvolvimento pré-implantação,
sequências de aminoácidos correspondentes aos genes humanos e de camundongo foram
utilizadas como sementes (“seed”) no software SeedServer (ver “Métodos”). Na verdade
apenas o identificador UniProt dessas proteínas foi necessário para execução do
SeedServer – símbolos dos genes foram verificados no banco de dados Gene, NCBI, e
convertidos para Gene-ID e subsequentemente na base UniProt obtiveram-se os
identificadores desejados. Para aumentar a precisão, somente entradas SwissProt foram
utilizadas. Para cada gene foi gerado um agrupamento composto por 2 até 260 sequências
e o conteúdo destes será analisado a seguir.
Todos os genes presentes na via foram submetidos ao SeedServer para gerar
agrupamentos de homólogos exceto hRSCP e DPPA1 (não possuem sequência com
anotação SwissProt).
5.3.2 Análise da composição dos agrupamentos gerados
O software SeedServer gerou agrupamentos para cada “seed” contendo sequências
que podem ter anotações Swiss-Prot ou não (Boutet, Lieberherr et al., 2007). Quando uma
sequência é anotada manualmente e passa por uma curadoria, esta sequência entra no
banco de dados UniProt como Swiss-Prot. As sequências adicionadas ao banco
automaticamente são sequências TrEMBL, não revisadas. De todos os agrupamentos
gerados pelo SeedServer, somente cerca de 25% das sequências recrutadas possuem
anotações Swiss-Prot (Figura 13a). Sendo assim, a busca por homólogos utilizando o
SeedServer gera uma grande quantidade de sequências candidatas à curadoria manual
para tornarem-se anotações Swiss-Prot. Os dados da quantidade de sequências Swiss-Prot
ou não Swiss-Prot para cada um dos agrupamentos estão mostrados no gráfico da Figura
13a.
59
Devido ao fato se que o SeedServer recruta as sequências para os agrupamentos
por três vias diferentes – KO, UEKO e SeedLinkage – (ver “Métodos” para detalhes)
analisamos também a porcentagem de sequências com a qual cada uma destas buscas
contribui. Considerando todos os agrupamentos, 28% das sequências são agrupadas com a
“seed” pelo banco de dados KO, outros 51% são agrupados pelo UEKO e 20% são
sequências recrutadas diretamente pelo SeedLinkage. Os dados mostram como a
contribuição do SeedLinkage é importante para o enriquecimento dos agrupamentos de
ortólogos já existentes, assim como a versão enriquecida do KO que contribui com metade
das sequências agrupadas. Os dados da contribuição de cada uma das buscas feitas pelo
SeedServer para cada agrupamento estão representados no gráfico da Figura 13b.
Além disso, as sequências recrutadas para os agrupamentos de homólogos podem
ser classificadas quanto ao andamento de projetos genoma associados aos organismos dos
quais estas sequências pertencem. Para todos os agrupamentos gerados, 48% das
sequências são provenientes de organismos com projetos genoma em montagem, 27% das
sequências são provenientes de organismos com projetos genoma completos, 2% das
sequências são provenientes de organismos com projetos genoma em andamento e 24%
das sequências são depósitos provenientes de organismos sem projetos genoma
associados. O recrutamento de sequências depositadas que não pertencem a genomas
completos denota a importância das buscas realizadas pelo SeedServer através do
SeedLinkage e UEKO, já que o banco de dados KO somente agrupa sequências
provenientes de projetos genoma completos. A associação com projetos genoma das
sequências contidas em cada um dos clusters está representada no gráfico da figura 13c.
60
Figura 13: Classificação dos homólogos agrupados pelo SeedServer. a) O gráfico mostra para
cada gene (eixo y) a quantidade de sequências (eixo x) que possuem (verde) ou não (vermelho)
anotação SwissProt. Note que o eixo x mostra números em escala logarítmica. O gráfico menor
representa a fração total de sequências recrutadas que tem ou não anotação SwissProt. b)
Representação similar para as sequências recrutadas exclusivamente pelo SeedLinkage (vermelho),
pela base de dados KO (verde) ou pela sua versão estendida UEKO (azul). c) Representação similar
para mostrar o andamento dos projetos genoma dos quais surgiu o depósito das sequências
recrutadas. Organismos com genoma completo (“Complete”), organismos com projetos genoma em
montagem (“Draft”), organismos com projetos genoma em andamento (“In Progress”) e sequências
de organismos sem nenhum projeto genoma em andamento (“No Project”).
61
5.4. Ancestralidade dos genes da via do desenvolvimento pré-implantação
5.4.1 Determinação do último ancestral comum (“Last Common Ancestor”)
A geração dos agrupamentos contendo sequências homólogas para os genes
envolvidos no desenvolvimento pré-implantação possibilitou a determinação do último
ancestral comum (LCA) destes genes (ver “Métodos” para procedimento). Na Figura 14
estão representados os genes da via de pré-implantação de acordo com sua ancestralidade.
Genes com origem considerada antiga são aqueles cujo LCA encontrado é anterior ao clado
Euteleostomi e estão mostrados em cinza. Genes cujo LCA encontrado pertence ao clado
Euteleostomi ou clados mais recentes são considerados genes de origem recente e estão
marcados em azul. Genes de origem antiga que possuem homólogos em Drosophila
melanogaster estão marcados com um asterisco. A Tabela S1 (anexo) mostra todos os
genes usados como “seed” e os resultados da busca de LCA para cada um. Com esta
pesquisa sobre ancestralidade podemos observar que a via de desenvolvimento pré-
implantação tem origem antiga com adição de elementos novos principalmente em
Euteleostomi e Eutheria. Mesmo funções essenciais estão divididas entre genes recentes e
antigos, como podemos observar no caso de Nanog (antigo) e Oct4 (recente), dado que os
dois genes são os principais fatores na manutenção da pluripotência das células
embrionárias. O gráfico da Figura 15 mostra a distribuição de todos os genes da via de
acordo com sua origem em clados da linhagem humana. Pode se observar que uma grande
quantidade de genes se origina em certos períodos como visto em Eumetazoa, Coelomata,
Euteleostomi e Eutheria. A razão para esta origem em ondas precisa ser melhor estudada,
todavia aparentemente a origem de estruturas complexas, que caracterizou os
descendentes a partir de um dado momento da evolução, deve ter ocorrido
simultaneamente à especialização de grupos de genes.
62
Figura 14: Via regulatória do desenvolvimento embrionário pré-implantação mostrando a
ancestralidade dos genes envolvidos. A figura mostra os genes envolvidos no desenvolvimento
embrionário no período pré-implantação marcados de acordo com a respectiva ancestralidade
encontrada no estudo de LCA feito com os agrupamentos do SeedServer. Os genes com
ancestralidade recente estão mostrados em azul e os genes de origem antiga em cinza. Genes que
possuem homólogos em D. melanogaster contém um asterisco.
63
Figura 15: Distribuição da origem dos genes da via de pré-implantação. O gráfico mostra o
surgimento dos genes envolvidos na via de desenvolvimento pré-implantação em momentos da
evolução humana, segundo o último ancestral comum encontrado para os agrupamentos gerados
pelo SeedServer. No eixo Y está representada a quantidade de genes e no eixo X localizam-se os
grupos taxonômicos nos quais estes genes se originaram.
64
5.4.2 Funções de homólogos
Para analisar se os homólogos dos genes com origem antiga possuem funções relacionadas
às exercidas no desenvolvimento pré-implantação, realizamos um segundo trabalho de
mineração de texto para identificar estes genes em trabalhos descrevendo o
desenvolvimento embrionário em Drosophila melanogaster. Trabalhos selecionados na
PubMed com o termo de busca “Drosophila AND development” foram adicionados ao
PESCADOR e os símbolos de genes marcados pelo software permitiram a análise dos
homólogos encontrados anteriormente. Uma segunda via de regulações foi gerada a partir
da análise destes trabalhos com o objetivo de mostrar as funções e as regulações das quais
participam estes genes homólogos. A via mostrada na Figura 16 não tem como objetivo
ilustrar todo o desenvolvimento de drosófila mas sim as regulações nas quais os homólogos
têm participação. Uma correlação entre os símbolos dos genes humanos e o
correspondente em drosófila pode ser encontrada na Tabela 3. Podemos observar várias
regulações interessantes no desenvolvimento de D. melanogaster como por exemplo a via
de sinalização Hippo que é extremamente conservada, já que Wts (homólogo de Lats) tem
como função fosforilar Yki (homólogo de Yap) que no estado não fosforilado interage com
Sd (homólogo de Tead4) e ativam juntos vias relacionadas à proliferação e desenvolvimento
da asa no embrião (Huang, Wu et al., 2005). A proteína Caudal (homóloga de Cdx2) está
envolvida nos mesmos processos (Hwang, Kim et al., 2002; Lengyel e Iwaki, 2002) mas em
drosófila sua ativação não é feita pela parceria de Yki e Sd mas sim pela diminuição da
concentração da proteína Bicoid que inibe a tradução do seu mRNA (Niessing, Blanke et al.,
2002). Outras regulações, embora não igualmente conservadas, mostram o envolvimento
dos genes em funções homólogas às exercidas no desenvolvimento pré-implantação, como
Grn (homólogo de GATA2) e Sox7 atuando na diferenciação de células em processos de
neurogênese (Brown e Castelli-Gair Hombria, 2000; Kerner, Simionato et al., 2009). Outro
exemplo pode ser visto na repressão gênica exercida por Gro (homólogo de TLE2), Vnd e
Scro (homólogos de Nanog), que na pré-implantação são também responsáveis pela
repressão de diversos genes e são essenciais para o desenvolvimento inicial do embrião
(Zaffran, Das et al., 2000; Uhler, Zhang et al., 2007). Outras regulações podem ser
observadas na figura 16 e as referências correspondentes a cada uma delas podem ser
encontradas na Tabela 3.
65
Figura 16: Funções dos genes homólogos encontrados em Drosophila melanogaster. A figura
mostra as respectivas funções da maioria dos genes homólogos presentes em D. melanogaster
encontrados nos agrupamentos feitos pelo SeedServer. Observa-se que estes homólogos estão
envolvidos em processos relacionados ao desenvolvimento do embrião de D. melanogaster. Para
uma correspondência entre o nome dos genes representados nesta figura e o nome do gene
homólogo da via de preimplantação ver Tabela 3.
66
Tabela 3: Correspôndencia entre os nomes dos genes humanos e homólogos de Drosophila
melanogaster agrupados pelo SeedServer.
67
5.5. Novos parceiros de interação para Tead4
5.5.1 Duplo-Híbrido em levedura
Para procurar novas proteínas que interagem com Tead4 no desenvolvimento
embrionário e que, consequentemente, podem estar envolvidas em outras regulações
dependentes de Tead4 ainda não bem compreendidadas, realizamos uma triagem pelo
sistema de duplo-híbrido em leveduras. Utilizando Tead4 como isca, realizamos uma
triagem de biblioteca de embrião de sete dias (Clontech) pelo sistema de duplo-híbrido em
meio liquido previamente estabelecido na levedura KGY37. Foram feitas 60 receitas de
transformação pelo método “High Efficiency” (Gietz e Schiestl, 2007a) cada uma utilizando
10 µg de DNA da biblioteca e 10 µg de pAS1-Tead4. O rendimento obtido foi de
aproximadamente 5x10
5
células, suficiente para a triagem da biblioteca utilizada.
5.5.2 Triagem liquida dos transformantes obtidos
A transformação foi distribuída em 600 mL de meio liquido SD -W-L-H suplementado
com 3AT 0,5 mM e distribuída em quatro placas “deepwell” com 96 poços cada. As
incubações e diluições foram realizadas de acordo com o protocolo descrito em “Métodos” e
após este período as placas foram examinadas para verificar a presença de crescimento
nos poços. Os poços com crescimento sinalizam a ativação do gene repórter HIS3, que
acontece apenas em leveduras contendo uma interação entre Tead4 e um dos clones da
biblioteca, permitindo seu crescimento no meio sem histidina. A leitura de OD600 mostrou
que x poços apresentavam crescimento e portanto estes foram plaqueados em meio SD -W-
L para o isolamento de colônias.
5.5.3 Ensaio de LacZ
Para confirmar a presença da interação as colônias isoladas de cada um dos poços
com crescimento foram submetidas a um teste de ativação do segundo gene repórter, LacZ.
O ensaio de LacZ (descrição em “Métodos”) mostrou a ativação de todos os clones com
crescimento (todos ficaram azuis; dados não mostrados). Alguns dos muitos clones foram
utilizados para demonstrar que a triagem produzia interações fortes restauráveis.
5.5.4 Análise e confirmação das interações
Os plasmídios contidos nas leveduras positivas foram extraídos e o plasmídio
pGAD10 contendo o inserto da biblioteca foi seqüenciado para revelar a identidade da
proteína que mostrou interação com Tead4. Foi possível realizar esta etapa da análise dos
clones com poucas amostras sendo que dois clones foram sequenciados com sucesso. Um
deles mostrou que o inserto correspondia à proteína Tioredoxina1 (Trx1, acesso RefSeq
NP_035790) e o outro mostrou correspondência com a fita contrária à codificante para a
68
proteína Smg8. Existem registros de uma proteína hipotética (LOC74133) no local segundo
o banco de dados Genome do NCBI.
Realizamos também a reconstrução da interação observada através de uma nova
transformação com a levedura KGY37. A levedura foi transformada com 1 µg de DNA isca
(pAS1-Tead4) e 1 µg do pGAD10-Tioredoxina purificado ou com 1 µg de DNA isca e 1 µg de
pGAD10-ProtHipotética. As transformações foram plaqueadas em meio SD -W-L e as
colônias obtidas foram submetidas a um ensaio de ativação do gene LacZ no qual se
mostraram novamente positivas. A Figura 17 mostra as colônias azuis no ensaio LacZ
reconfirmando a interação dos clones isolados da biblioteca com a isca original. Esta
reconstrução é necessária para verificar se os resultados positivos são corretos e não
devido a alguma mutação sofrida pela isca durante o processo de triagem ou devido a uma
ativação independente da isca (somente a proteína presa ativa a transcrição).
Figura 17: Ensaio de LacZ para reconstrução da interação com Tead4. a) Ensaio de LacZ com a
levedura contendo o plasmídio isolado da triagem cujo inserto foi identificado como Tioredoxina1 e o
plasmídio contendo a isca Tead4 original, a interação ativa a transcrição de LacZ. b) Levedura
contendo somente o plasmídio da Tioredoxina1, o resultado do ensaio LacZ é negativo neste caso.
c) Levedura contendo o plasmídio isolado da triagem cujo inserto foi identificado como uma proteína
hipotética e o plasmídio contendo a isca original, a interação ativa a transcrição de LacZ. d) Levedura
contendo somente o plasmídio da proteína hipotética, o resultado do ensaio LacZ é negativo neste
caso.
69
6. DISCUSSÃO
O sistema de duplo-híbrido em leveduras é um dos métodos frequentemente
utilizados para a busca de interações proteína-proteína e o aperfeiçoamento deste método,
cujo protocolo de seleção é considerado laborioso, é desejável. A geração de dados
genômicos em larga escala deve ser acompanhada também pela determinação funcional,
que depende de métodos como o sistema de duplo-híbrido. O protocolo de triagem em meio
líquido relatado neste trabalho resulta na redução do crescimento de clones de interação
fraca e a abordagem descrita em placas “deepwell” é facilmente adaptada para uma
aplicação robotizada, aumentando a eficiência do método. A triagem de bibliotecas
complexas com ótima cobertura torna-se facilmente atingível, mas para que esta triagem
seja eficiente é necessário obter uma alta eficiência de transformação. Verificamos que o
protocolo desenvolvido por Gietz e Schiestl é atualmente o melhor em relação à eficiência
de transformação, assim como as condições de cultivo das leveduras descritas neste
trabalho, pois existe uma correlação entre o rendimento da transformação e o bom
crescimento das leveduras no meio de cultivo antes das transformações (Gietz, University of
Manitoba; comunicação pessoal). Além disso, a utilização dos frascos na triagem também
se mostrou interessante para selecionar clones com interações mais fortes, medida pela
capacidade das leveduras contendo estas interações de dominar as culturas. Isto foi
observado na triagem relatada para validação do sistema, com a isca Trim2, na qual das
culturas crescidas de frascos quase todas eram dominadas por somente uma interação e
esta mesma interação também foi selecionada individualmente no ensaio simultâneo com
placas “deepwell”. O protocolo de triagem líquida provavelmente irá substituir a triagem em
placas convencional nos laboratórios que aplicam este método, esta mudança já ocorreu
nos laboratórios de Gietz e colaboradores da Universidade de Manitoba, Canadá.
A utilização de ferramentas de mineração de texto para a geração de vias
regulatórias é uma abordagem eficaz e importante para o interesse atual em reunir dados
sobre um organismo ou processo biológico. Outros trabalhos que buscam também esta
integração de dados regulatórios podem ser encontrados, um deles é considerado o melhor
exemplo atualmente de via regulatória gerada para um processo biológico. Este trabalho é a
geração da via regulatória que controla o desenvolvimento embrionário do ouriço-do-mar
(Davidson, Rast et al., 2002). A via compreende inicialmente 40 genes, mas foi
posteriormente atualizada (Peter e Davidson, 2010). Um aspecto interessante deste trabalho
é a inclusão de elementos regulatórios em cis na representação, ilustrando melhor a
atuação dos fatores de transcrição envolvidos no processo em diferentes promotores. Esta
70
representação é interessante para evitar a má compreensão dos dados ilustrados nas vias
tradicionais, nas quais muitas vezes um nódulo representa um gene e ao mesmo tempo sua
proteína. Outros trabalhos dos autores citados também foram publicados para completar a
via regulatória gerada com novas referências e para enfatizar a importância da geração de
vias regulatórias que auxiliam na compreensão dos dados biológicos (Li e Davidson, 2009).
Todavia, devido à universalidade de uso da base de dados KEGG Pathway e o interesse
atual em estabelecer padrões para os dados gerados, a linguagem de marcação da mesma
(KGML) foi utilizada aqui (Figuras 14 e 16).
A busca de trabalhos relacionados com um conceito específico como
desenvolvimento pré-implantação resultou na seleção de dados relativos somente a este
processo. Quando são utilizadas outras ferramentas como iHOP (Hoffmann e Valencia,
2004) e STRING (Jensen, Kuhn et al., 2009) para a busca de biointerações é necessário
saber o nome do gene que se tem interesse e as informações são então recuperadas. No
caso do iHOP, estas últimas consistem em uma extensa lista de trabalhos relacionados
àquele gene que devem ser manualmente analisados para se extrair a informação relativa
ao processo de interesse. Já no STRING, as associações com outros genes podem ser
diretas como ativações ou repressões ou podem ser desconhecidas e em todos os casos
não é possível realizar a pesquisa restringindo a busca a um processo específico no qual se
deseja verificar a participação de um gene. A abordagem utilizada neste trabalho
(PubMed/MedlineRanker/PESCADOR) permite iniciar a pesquisa sem se conhecer os genes
envolvidos, somente selecionando os trabalhos relacionados ao processo de interesse. A
curadoria manual exigida para criar uma via desta maneira é consideravelmente menor.
Contudo, a verificação de todas as interações destacadas pela ferramenta é indispensável.
A mineração de texto não é capaz de eliminar a seleção de falsos pares de interação; no
caso do LAITOR (contido na plataforma PESCADOR) as interações do tipo 3 e 4 podem
conter genes que não possuem associação especificada no texto. Os dados de mineração
de texto contribuem ao mesmo tempo para a descrição da via na forma de revisão da
literatura, uma etapa necessária para a validação das regulações representadas e para a
inclusão da via em uma base de dados específica, tal como KEGG Pathway (Kanehisa -
Kyoto University Bioinformatics Center; comunicação pessoal). O domínio deste
procedimento para criação de vias possibilita a ampliação de temas atualmente não
abordados, como vias regulatórias de diversos tipos de câncer, mecanismos de resistência a
patógenos em plantas, resposta de plantas ao estresse abiótico e seca, dentre outros temas
de interesse do laboratório e de futuros colaboradores.
A inserção desta nova via no banco de dados KEGG irá permitir a anotação
automatizada para novos organismos, como normalmente é feito neste banco. Dos 86
genes que participam da via, 20 não possuem entradas em KEGG Orthology e serão
71
adições importantes (Figura 13b). Considerando que a contribuição do KEGG para o
recrutamento de sequências nos agrupamentos do SeedServer é de somente 25%, alguns
organismos ocasionalmente divergentes dos que estão representados no KEGG passam a
ter um papel importante para uma anotação mais eficiente de novas sequências. É
importante ressaltar que somente os componentes SeedLinkage e UEKO do SeedServer
são capazes de agrupar sequências provenientes de organismos sem projeto genoma
completo.
Outra contribuição importante do SeedServer é a identificação de candidatos a
anotação SwissProt nos agrupamentos (Figura 13a). A anotação SwissProt depende da
correta associação de sequências a famílias gênicas e proteínas com função já conhecida,
utilizando para tanto a literatura disponível. A anotação pode ser auxiliada pelo fato de que
cada um dos genes da via encontra-se associado a PMIDs, que são referências importantes
para os homólogos respectivos. Estas referências ficam armazenadas perenemente na
ferramenta PESCADOR. As referências de publicação são utilizadas também pelo banco de
dados Gene como fontes de informação funcional para os genes chamadas de GeneRIFs
(“Gene reference into function”) e podem ser facilmente associadas com o gene respectivo
por usuários da ferramenta.
O enriquecimento dos agrupamentos pelo procedimento utilizado pelo SeedServer
pode ser observado na Figura 18 na qual está representada a ancestralidade obtida quando
utilizamos os agrupamentos gerados pelo KO ou pelo SeedServer (o qual além do KO faz
uso de busca com software Seed Linkage e do enriquecimento do KO, denominado UEKO).
A ancestralidade está representada por números relativos à profundidade do grupo
taxonômico; para visualizar qual grupo taxonômico corresponde a qual profundidade pode
ser consultada a Tabela S1 em anexo contendo o LCA para cada um dos genes
pesquisados neste trabalho. Brevemente, a profundidade 1 representa Cellular Organisms e
28, Homo sapiens. Podemos observar no gráfico que quando a geração de agrupamentos
pelo SeedServer resulta em uma diminuição da profundidade do grupo taxonômico
identificado como LCA, o ponto correspondente ao gene encontra-se abaixo da linha
pontilhada (na linha diagonal, KO=SeedServer). Pontos que se encontram no eixo Y não
possuíam agrupamentos gerados pelo KO e portanto sua representação depende da busca
feita pelo SeedServer. Para exemplificar destacamos os pontos correspondentes aos genes
Nanog e Oct4. Os agrupamentos de KO para estes genes indicam que o último ancestral
comum para eles pertence ao grupo taxonômico de profundidade 20 (Eutheria), porém
nossos dados dos agrupamentos gerados pelo SeedServer indicam que a profundidade
para Nanog é 4 (Metazoa) e para Oct4 é 14 (Euteleostomi). O resultado do SeedServer
possibilitou portando a identificação de Nanog como um gene de origem antiga, para o qual
inclusive observam-se homólogos em drosófila. O último ancestral comum de Oct4 teve
72
também sua profundidade modificada, porém consideramos a origem em Euteleostomi
como mais recente em relação a Nanog e concomitante com a ocorrência de um grande
grupo de genes (Figura 15, Euteleostomi). Os agrupamentos contribuíram portanto para
uma visualização mais correta da real composição da via e sua porção ancestral e moderna.
Figura 18: Ancestralidade obtida para genes da pré-implantação - comparação KO e
SeedServer. O gráfico mostra o nível de profundidade do grupo taxonômico identificado como último
ancestral comum dos genes da pré-implantação pelo KO (eixo X) e pelo SeedServer (eixo Y). Cada
ponto no gráfico representa um gene para o qual determinamos o LCA. Dois genes estão destacados
para exemplificar: Nanog e Oct4.
A pesquisa de informações funcionais para os homólogos de drosófila revelou a
participação dos genes em processos relacionados de desenvolvimento embrionário e foi
também uma boa validação para o agrupamento de sequências homólogas pelo
SeedServer, já que nenhuma sequência de D. melanogaster agrupada aos genes iniciais
possui uma função divergente do esperado.
A geração de agrupamentos corretos é essencial para uma determinação correta da
ancestralidade dos genes, mas não é o único fator limitante. O sequenciamento de novos
organismos pertencentes a grupos taxonômicos irmãos dos que congregam os organismos
com genomas já sequenciados será uma importante fonte de sequências que permitirão
uma reavaliação da ancestralidade real dos genes. Um exemplo seria o sequenciamento do
genoma da barata, possivelmente auxiliando na compreensão da evolução de insetos.
Todavia, foi importante a análise da ancestralidade da via de Desenvolvimento Embrionário
73
Pré-implantação, por ser uma via com componentes esperadamente mais contemporâneos.
Este estudo inicial inspirou a análise global de ocorrência de homólogos para os genes de
Homo sapiens, trabalho em andamento no laboratório. Esta determinação do último
ancestral comum pode ser aplicada também a diversas vias representadas no banco de
dados KEGG Pathway, como por exemplo vias de reparo de DNA ou de patógenos e suas
doenças, para descrever a evolução destes sistemas.
Um dos principais fatores envolvidos no desenvolvimento pré-implantação é a
proteína Tead4. A interação do fator de transcrição Tead4 com a proteína YAP é bem
descrita (Ralston e Rossant, 2008), porém esta interação somente não é capaz de explicar
todas as regulações das quais Tead4 participa como observado recentemente por Ralston e
colaboradores. A triagem realizada utilizando Tead4 como isca no sistema de duplo-híbrido
em levedura resultou na confirmação da ativação dos genes repórteres para dois clones, um
deles identificado por sequenciamento como sendo a proteína Tioredoxina1. A Tioredoxina1
é uma proteína com papel fundamental na manutenção do estado redox das células
(Holmgren, 1985). Esta proteína também está envolvida em processos celulares como
proliferação, apoptose e expressão gênica. Foram encontradas diversas evidências na
literatura da interação de Tioredoxina com uma variedade de fatores de transcrição. Um dos
trabalhos iniciais a respeito da interação de Tioredoxina com um fator de transcrição (Qin,
Clore et al., 1995) mostra que esta proteína reduz certos resíduos de cisteína presentes no
fator NFB e com isso ativa as propriedades de ligação ao DNA do mesmo; a resolução da
estrutura da proteína complexada com um peptídeo mostra também a elevada
especificidade da ligação, estabilizada por muitas interações. Outra interação foi bem
descrita na resposta a situações de estresse como a exposição das células à radiação
ionizante (Wei, Botero et al., 2000). A Tioredoxina1 interage com Ref-1 e juntas promovem a
ativação transcricional de AP-1, complexo transcricional formado pelas proteínas Fos/Jun,
mas a Tioredoxina deve ser previamente transportada para o núcleo por mecanismos ainda
não bem descritos. A interação resulta na ativação da ligação ao DNA de AP-1 como
previamente descrito para NFB. A interação de Tioredoxina com Ref-1 foi confirmada em
estudos de duplo-híbrido em mamíferos e por estudos in vitro com ligação cruzada (Hirota,
Matsui et al., 1997). O complexo AP-1 possui um coativador chamado Jab1, esta proteína se
liga ao domínio de ativação de Jun e auxilia na ativação da transcrição induzida por este
complexo. Jab1 é responsável por promover a degradação do inibidor de uma cinase
dependente de cilclina p27Kip1. Estudos de co-imunoprecipitação e FRET identificaram a
interação de Tioredoxina com Jab1 que resulta na modulação da função exercida por Jab1.
Esta modulação também resulta do fato de Tioredoxina competir com Jab1 pela ligação de
p27Kip1, indicando um papel para Tioredoxina no controle da proliferação (Hwang, Ryu et
al., 2004).
74
Outros estudos mostram que Tioredoxina também é capaz de aumentar a atividade
de ligação a DNA de p53, e ainda atuar em conjunto com Ref-1 (assim como na ativação de
Fos/Jun) para a potencialização do efeito de Ref-1 sobre p53. A expressão de p21
dependente de p53 foi aumentada em ensaios de transfecção com Tioredoxina e novamente
foi observado um efeito melhor da ativação quando o experimento incluía um composto que
induz a translocação da Tioredoxina para o núcleo (Ueno, Masutani et al., 1999). A respeito
da localização celular da Tioredoxina, foi observado em estudos com culturas de células que
quando a cultura encontra-se confluente a localização de Tioredoxina é predominantemente
citoplasmática enquanto nas culturas cujas células estão espalhadas a localização de
Tioredoxina é nuclear, sugerindo que os ambientes redox nuclear e citoplasmáticos e os
requerimentos celulares são diferentes durante as duas condições (Spielberger, Moody et
al., 2008). Por último, a interação de Tioredoxina com o receptor de glucocorticoide
(pertencente a uma família de fatores de transcrição) e a consequente ativação de seu
domínio de ligação ao DNA foi também observada em estudos de duplo-híbrido em
mamífero e a localização deste complexo de interação é nuclear durante condições de
estresse oxidativo (Makino, Yoshikawa et al., 1999).
No desenvolvimento embrionário, uma possibilidade seria o envolvimento da
Thioredoxina1 no controle do estado redox das células que se encontram em uma fase
altamente proliferativa. Talvez a identificação de Thioredoxina como parceira de interação
de Tead4 signifique que este fator de transcrição precisa de um mecanismo de controle que
garanta a redução de resíduos de seu sítio de ligação ao DNA, garantindo uma ativação
máxima quando o fator se associa a YAP.
Todas estas referências corroboram com os resultados obtidos no ensaio de duplo-
híbrido em leveduras com Tead4 e indicam que a interação com Tioredoxina é de fato
verdadeira, pelo menos em leveduras, e pode levar ao desvendamento de um novo controle
transcricional envolvendo estas duas proteínas no desenvolvimento embrionário pré-
implantação. Evidentemente a interação funcional das duas proteínas precisa de uma
confirmação através de ensaios in vivo com células de mamífero e vetores de expressão
para que seja possível afirmar com clareza a existência desta interação e também para
determinar as consequências resultantes deste mecanismo no controle transcricional. Estes
estudos serão realizados em continuidade pelo laboratório.
75
7. CONCLUSÕES
A triagem líquida para o sistema de duplo-híbrido em leveduras torna a seleção de
interações entre proteínas por este método mais eficiente e menos laboriosa,
possibilitando duas abordagens diferentes dependendo do interesse da pesquisa. A
abordagem em placas “deepwell” pode ser utilizada em estações robóticas para
experimentos em larga escala ou manualmente quando o interesse é a seleção de
diversas interações. A abordagem em frascos gera uma competição entre as
leveduras e possibilita a seleção de clones contendo interações mais fortes. As
linhagens Y190 e KGY37 foram certificadas para o protocolo.
A geração de vias regulatórias através de ferramentas de mineração de texto
permite a integração de dados gerados em estudos prévios para que a visualização
de um processo biológico seja mais completa. Quando os genes presentes nesta
via são associados a grupos de homólogos acrescenta-se esta informação à via
regulatória permitindo a visualização do mesmo processo para diferentes
organismos. Os homólogos também possibilitam a determinação da ancestralidade
dos genes envolvidos no processo levando a uma melhor compreensão do mesmo.
A triagem pelo sistema de duplo-híbrido utilizando a proteína Tead4 como isca
permitiu a seleção eficiente de novas proteínas que podem estar envolvidas nos
processos de regulação do desenvolvimento embrionário dos quais o fator de
transcrição Tead4 participa.
76
8. PERSPECTIVAS
Descrever a via regulatória gerada em um artigo de revisão para a validação da
mesma e a inclusão desta via no banco de dados KEGG Pathway.
Contribuir para a atualização do banco de dados UniProt realizando a anotação
SwissProt de sequências agrupadas pelo SeedServer.
Iniciar outros trabalhos de mineração de texto para gerar vias regulatórias
correspondentes a outros processos biológicos que não estão representados no
KEGG e outros bancos de dados (vários tipos de câncer, por exemplo).
Realizar experimentos em células de mamífero para confirmar a interação de
Tead4 com as duas proteínas isoladas na triagem de duplo-híbrido e verificar os
efeitos destas interações nas células.
77
9. REFERÊNCIAS
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