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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“Júlio de Mesquita Filho”
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Campus de Araraquara
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS E ESTUDO DE ESTABILIDADE
DE LINEZOLIDA EM COMPRIMIDOS
CRISTIANI LOPES CAPISTRANO G. DE OLIVEIRA
ARARAQUARA – SP
2009
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“Júlio Mesquita Filho”
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Campus de Araraquara
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
E ESTUDO DE ESTABILIDADE DE LINEZOLIDA
EM COMPRIMIDOS
CRISTIANI LOPES CAPISTRANO G. DE OLIVEIRA
Orientadora: Profa. Dra. Hérida Regina Nunes Salgado
ARARAQUARA – SP
2009
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de
Fármacos e Medicamentos, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Farmacêuticas.
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Oliveira, Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de
O49d Desenvolvimento de métodos analíticos e estudo de estabilidade de
linezolida em comprimidos. / Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de
Oliveira. – Araraquara, 2009.
196 f.
Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita
Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em
Ciências Farmacêuticas
Orientador: Hérida Regina Nunes Salgado
. 1.Linezolida. 2.Oxazolidinonas. 3.Validação de métodos analíticos.
4.Análise e Controle de medicamentos. 5.Estudo de estabilidade. I.Salgado,
Hérida Regina Nunes, orient.. II.Título.
CAPES: 40300005
Ficha Catalográfica
Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
UNESP – Campus de Araraquara
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Desenvolvimento de métodos analíticos e estudo de
estabilidade de linezolida em comprimidos
Comissão examinadora da tese para obtenção do grau de
Doutor
Profa. Dra. Hérida Regina Nunes Salgado
Presidente/orientadora
Profa. Dra. Maria Inês Rocha Miritello Santoro
Prof. Dr. Gerson Antônio Pianetti
Profa. Dra. Magali Benjamim de Araújo
Profa. Dra. Magali Conceição Monteiro da Silva
ARARAQUARA – SP
2009
A DEUS, por iluminar minha vida, olhar por minha família e guiar
meus passos sempre, dando-me forças, coragem, paciência, esperança e
perseverança, em todos os momentos da minha vida.
"Orar não é pedir. Orar é a respiração da alma. Como o corpo que
se
lava não fica sujo, sem oração, se torna impuro."
Ghandi
GhandiGhandi
Ghandi
Ao meu marido, Angelo, por estar sempre ao meu lado, me apoiando,
amando e aguentando meu humor nada convencional.
Aos meus grandes amores, meus filhos, Nathan e Sarah.
“As mais lindas palavras de amor são ditas no silêncio de um
olhar”
Leonardo da Vinci
Leonardo da VinciLeonardo da Vinci
Leonardo da Vinci
Agradecimentos
À minha orientadora, professora Dra. Hérida Regina Nunes Salgado, que
esteve comigo durante o mestrado e doutorado, e que durante este período, foi a
grande responsável pelo meu crescimento e amadurecimento profissional. Ao meu
lado, tinha mais que uma orientadora, tinha uma amiga.
"Há pessoas que desejam saber só por saber, e isso é curiosidade;
outras, para alcançarem fama, e isso é vaidade; outras, para
enriquecerem com a sua ciência, e isso é um negócio torpe; outras,
para serem edificadas, e isso é prudência; outras, para edificarem
os outros, e isso é caridade."
S. Tom
S. TomS. Tom
S. Tomás de Aquino
ás de Aquinoás de Aquino
ás de Aquino
À minha mãe, que desde o princípio esteve ao meu lado, me apoiando em todos
os aspectos e principalmente, pelo amor dedicado a mim.
À minha irmã, pelo apoio e ajuda em muitos momentos difíceis que eu passei.
Pelo amor incondicional por Nathan e Sarah.
Ao meu pai, pelo apoio, incentivo e amizade.
Ao meu sogro, Francisco das Chagas e Silva, e à minha sogra, Maria Creusa,
pela ajuda emocional e apoio sempre constante, para que eu e Angelo realizássemos
nosso sonho.
“Diante de Deus, somos todos igualmente sábios e igualmente
tolos”
Albert Einstein
Albert EinsteinAlbert Einstein
Albert Einstein
À minha tia Eunice, minha madrinha de crisma, pelo apoio incondicional,
principalmente em orações em minha intenção.
A todos os meus familiares, que torceram por mim durante todo este tempo
em que eu estive em São Paulo. Muito obrigada.
“A alegria está na luta, na tentativa, no sofrimento envolvido.
Não na vitória propriamente dita”
Mahatma Gandhi
Mahatma GandhiMahatma Gandhi
Mahatma Gandhi
A Arnóbio e Alianda, pela amizade, acolhimento e por compartilhar comigo e
minha família momentos de alegria e convivência.
Aos meus amigos que torceram e me acompanharam durante este tempo aqui
em São Paulo, em especial: Neiza, Alessandro, Flávio, Alessandra, Duda, Luana,
Cynara, Venceslau, Alexandre, Camila e Rubiana. Em especial, minhas amigas de
infância: Cynthya, Andréa, Cristina e Patrícia.
Aos meus amigos de laboratório, que dividiram comigo os anseios, tristezas e
alegrias de trabalhar com pesquisa: Cristina Laignier, Flávia Fiorentino, Joceana,
Karen, Marta, Adriana Takara, Adam, Marcelo, Daniela, Andrea Moreno, Hilris.
"As palavras de amizade e conforto podem ser curtas e sucintas,
mas o seu eco é infindável."
." ."
."
Madre Teresa de Calcutá
Madre Teresa de CalcutáMadre Teresa de Calcutá
Madre Teresa de Calcutá
Às estagiárias que trabalharam comigo neste período: Karen, Marta, Adriana,
Eliane, Samária e Marília. Em especial, à Karen, Marta e Adriana pelo auxílio e
amizade.
À Maria de Fátima Rodrigues, pelo apoio técnico e amizade.
Aos Docentes do Departamento de Fármacos e Medicamentos da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Araraquara-UNESP, em especial aos professores: Prof.
Dr. Luís Vitor Sacramento, Profa. Dra. Chung Man Chin, Prof. Dr. Raul César
Evangelista, Profa. Dra. Virgínia Scarpa, Profa. Dra. Ana Dóris de Castro, Profa.
Dra. Maria Palmira Daflon Gremião, Profa. Rose Miere Pietro e Profa. Raquel
Moreira.
Ao Prof. Dr. Anselmo Gomes de Oliveira, por conceder o espectrofotômetro,
para a realização de estudos em espectrofotometria.
À secretaria de pós-graduação, em especial a Claúdia, Sônia e Laura.
Aos funcionários da biblioteca de Farmácia, sempre muito solícitos e dispostos
a ajudar.
À FAPESP, pelo apoio financeiro concedido.
“Matar o sonho é matarmo-nos. É mutilar a nossa alma. O
sonho é o que temos de realmente nosso, de
impenetravelmente e inexpugnavelmente nosso.”
Fernando Pessoa
Fernando PessoaFernando Pessoa
Fernando Pessoa
RESUMO
A linezolida é o primeiro antimicrobiano da classe das oxazolidinonas
comercializado mundialmente. O espectro de ação desta molécula envolve a ação
contra bactérias gram-positivas, anaeróbias, bem como, Mycobacterium turbeculosis.
Este trabalho teve como objetivo desenvolver métodos analíticos para linezolida,
incluindo métodos físico-químicos e microbiológicos, realizar estudos de dissolução e
de estabilidade, bem como dispor de técnicas de identificação para linezolida na forma
farmacêutica comprimido e matéria-prima. A análise qualitativa foi realizada por
cromatografia em camada delgada, espectrofotometria no ultravioleta (UV),
espectrofotometria no Infravermelho (IV), cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) e análise térmica, possibilitando a identificação das amostras. Os métodos de
análise quantitativos empregados e validados foram: (i) espectrofotometria no UV a
251 nm, na faixa de concentração de 6,0 -16,0µg/mL no qual foram avaliados os
parâmetros de linearidade, precisão, exatidão e seletividade, com teor médio nos
comprimidos de 98,7 %; (ii) CLAE, coluna de C
18
e fase móvel composta por, ácido
acético 1%: metanol: acetonitrila (50:25:25, V/V/V), apresentando ampla linearidade,
precisão, exatidão e especificidade, com um teor médio obtido nos comprimidos de
101,36 %; (iii) determinação da potência microbiológica, pelo método de difusão em
ágar cilindros em placa, utilizando cepas de Bacillus subtilis ATCC 9372, em que o
teor médio nos comprimidos foi 101,96%. Os métodos desenvolvidos não
apresentaram diferença estatística para um nível de significância de 1 %. O teste de
dissolução foi desenvolvido e validado utilizando água como meio de dissolução e pás
a 50 rpm. O perfil de dissolução obtido foi satisfatório, e a cinética de dissolução
calculada. Estudo preliminar de estabilidade de linezolida frente à degradação ácida,
alcalina, oxidativa, térmica, fotolítica e em câmara climática (40º C/75%) mostrou a
oxidação, a alcalinidade, a luz e o estudo em câmara climática como fatores
importantes de degradação. O decaimento do teor de princípio ativo foram
determinados após o armazenamento das amostras em câmara climática e espelhada
com luz-UVC.
Palavras-chave: linezolida, oxazolidinones, validação de métodos analíticos, teste de
dissolução, estudos de fotoestabilidade, produtos de degradação
ABSTRACT
The antimicrobial agent linezolid is the first class of oxazolidinonas marketed
worldwide. The spectrum of action of this molecule involves action against gram-
positive bacteria, anaerobic, and Mycobacterium turbeculosis. This work aims to
develop analytical methodos to quantify linezolid, including physical, chemical and
microbiological tests, studies of dissolution and stability, as well as providing technical
quality of identification for tablet and raw material. Qualitative analysis performed by
thin layer chromatography, UV-spectrophotometry, IV-spectrophotometry, high
performance liquid chromatography (HPLC) and thermal analysis, enabling the
identification of samples. The methods of quantitative analysis employed and validated
were: (i) UV spectrophotometry at 251 nm, in the range of concentration of 6.0-16.0
µg/mL which presented linearity, precision, accuracy and selectivityy, with the average
content in tablets of 98.7%, (ii) HPLC, using as stationary phase column of C
18
reversed-phase and mobile phase with the following composition, 1% acetic acid:
methanol: acetonitrile (50:25:25, V/V/V), a wide linearity, precision, accuracy and
specificity, with an average content obtained in tablets of 101.36%. (iii) Agar diffusion
bioassay, using strains of Bacillus subtilis ATCC 9372, with the average content in
tablets of 101,96 %. The results of assays were treated statistical by analysis of
variance (ANOVA) and were found to be linear (r
2
= 0.9998) in the selected range of
20-80 µg/mL. The proposed methods showed no statistical difference for a significance
level of 1%. The dissolution test was developed and validated using water as a means
of dissolution and blades to 50 rpm. The dissolution profile obtained was satisfactory.
Preliminary study of stability of linezolid in acidic, alkaline, oxidative, thermal, photolytic
and climatic chamber (40°C/75%) conditions, showed that oxidation study in the light
exposure and climate chamber as important factors of degradation. The decay of the
content of active principle were determined after storage of samples in a climatic
chamber and mirror with light-UVC.
Keywords: linezolid, oxazolidinones, analytical methods validate, dissolution test,
photostability, degradation products, quality control
SUMÁRIO
Lista de Figuras..……………………………………………………………… xiii
Lista de Tabelas……………………………………………………………….. xviii
Lista de Abreviaturas….………………………………………………………. xxi
1
CAPÍTULO I
–
..........................................
1
2.
CAPÍTULO II
-
REVISÃO DA LITERATURA
.............................................
4
3.
CAPÍTULO III
–
VALIDAÇÃO DE MÉ
TODOS ANALÍTICOS
...................
14
3.1 Introdução..................................................................................................
14
3.2 Parte experimental....................................................................................
18
3.2.2.
Análise qualitativa
.....................................................................................
20
3.2.2.1. Determinação do peso médio dos comprimidos de linezolida.................... 20
3.2.2.2. Determinação da faixa de fusão.................................................................. 22
3.2.2.3 Espectrofotometria de absorção na região de infravermelho..................... 23
3.2.2.4. Análise térmica de linezolida....................................................................... 27
3.2.2.5. Cromatografia em camada delgada............................................................ 30
3.2.3.
Análise quantitativa
.................................................................................
37
3.2.3.1. Espectrofotometria na região ultravioleta.................................................... 37
3.2.3.2.
Doseamento microbiológico.........................................................................
54
3.2.3.3. Método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência ................... 65
3.2.4. Análise comparativa dos métodos...............................................................
82
3.3 Discussão geral...........................................................................................
84
3.4 Conclusão
.................................................................................................
87
4.
CAP
ÍTULO IV
–
TESTE DE DISSOLUÇÃO
.............................................
88
4.1. Introdução.................................................................................................. 88
4.2. Material....................................................................................................... 94
4.3. Teste de dissolução.................................................................................. 94
4.4 Validação do teste de dissolução................................................................ 98
4.4.1. Estabilidade e especificidade das soluções................................................ 99
4.4.2. Precisão...................................................................................................... 102
4.5. Estudo da cinética de dissolução
.............................................................. 113
4.6 Conclusão....................................................................................................
119
5.
CAPÍTULO
V
–
ESTUDOS DE ESTABILIDADE
.....................................
120
5.1. Introdução.................................................................................................
120
5.2. Parte experimental................................................................................... 126
5.2.1. Estudo preliminar da estabilidade de linezolida....................................... 126
5.2.2. Estudo de fotodegradação de linezolida ................................................. 161
5.2.3. Estudo da cinética de fotodegradação utilizando CLAE.......................... 172
5.2.4. Estudo da estabilidade de linezolida em câmara climática..................... 176
5.2.5. Discussão geral........................................................................................ 181
5.2.6. Conclusão.................................................................................................
183
6.
REFERÊ
NCIAS BIBLIOGRÁFICAS
.......................................................
184
xiii
_____________________________________________________________________________
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 Estrutura química de linezolida..................................................... 6
Figura 2.2. Relação estrutura-atividade de linezolida......................................
7
Figura 2.3 Estrutura química do metabólito PNU 142300.............................. 8
Figura 2.4 Estrutura química do metabólito PNU 142586.............................. 8
Figura 3. Ilustração da variação dos vinte comprimidos de linezolida
pesados.........................................................................................
22
Figura 3.1 Espectro de absorção de infravermelho de LNZ-SR e LNZ-
comp., com as bandas características de absorção.....................
24
Figura 3.2 Curva de
DSC de LNZ-SR e LNZ-comp., sob atmosfera de ar
sintético, em razões de aquecimento de 5
o
C................................
27
Figura 3.3 Curva termogravimétrica de LNZ-SR e LNZ-comp. sob
atmosfera de ar sintético, em razões de aquecimento de 5
o
C.....
28
Figura 3.4 Fotos dos cromatogramas de LNZ-SR (1), LNZ-comp. (2), LNZ-
DEG (3) nos solventes dos sistemas 1, sistema 2, sistema 5 e
sistema 6......................................................................................
33
Figura 3.5 Fotos dos cromatogramas de LNZ-SR(1), LNZ-comp. (2), LNZ-
DEG(3) nos solventes dos sistemas 7, sistema 11, sistema 12 e
sistema 15....................................................................................
34
Figura 3.6 Fotos dos cromatogramas de LNZ-SR (1), LNZ-comp. (2), LNZ-
DEG (3), nos solventes do sistema 16 e sistema 17.....................
35
Figura 3.7 Espectro de absorção de solução de LNZ-SR, na concentração
de 20 µg/mL, por espectrofotometria na região do UV,
utilizando água ultrapura, HCl 0,1 M e NaOH 0,1 M...................
38
Figura 3.8 Espectro de absorção de solução de LNZ-SR, na concentração
de 20 µg/mL, por espectrofotometria na região do UV,
utilizando metanol e etanol, com comprimento de onda máximo
de 256 nm.....................................................................................
38
Figura 3.9 Espectro de absorção de solução de LNZ-SR, na concentração
de 20 µg/mL, por espectrofotometria na região do UV, utilizando
tampão fosfato pH 6,0, 7,4 e 8,0, com comprimento de onda
máximo em 251 nm......................................................................
39
Figura 3.10 Espectros sobrepostos de LNZ-SR e LNZ-comp., em água
ultrapura na concentração de 12 µg/mL, com comprimento de
onda máximo em 251 nm..............................................................
39
Figura 3.11 Curva de Ringbom para LNZ-SR (concentração de 1,0 a 40,0
µg/mL)...........................................................................................
46
Figura 3.12 Representação gráfica da curva analítica das soluções de
linezolida em concentrações de 6,0 a 16,0 µg/mL usando o
método espectrofotométrico na região de ultravioleta a 251 nm...
48
Figura 3.13 Espectro de absorção de LNZ-SR em concentração de 20
µg/mL e os excipientes obtidos por espectrofotometria na região
UV a 251 nm..................................................................................
52
Figura 3.14 Delineamento 3 x 3
demonstrando a disposição das soluções
padrão (P) e amostra (A) na placa de Petri, onde P
1
(20
,0
µg/mL); P
2
(40,0 µg/mL); P
3
(80,0 µg/mL) e A
1
(20,0 µg/mL); A
2
(40,0 µg/mL); A
3
(80,0 µg/mL)......................................................
56
Figura 3.15 Curva analítica de LNZ-SR obtida no doseamento
microbiológico em difusão em ágar, cilindros em placa................
61
xiv
_____________________________________________________________________________
Figura 3.16 Cromatograma obtido por CLAE para solução de LNZ-SR (12
µg/mL). Fase móvel: ácido acético 1%: metanol: acetonitrila
(50:25:25 V:V:V); coluna Symmetry Waters C
18
, 5 µm, 250 x
4,6 mm; tempo de retenção ≅ 4,50 min......................................
66
Figura 3.17 Cromatograma obtido por CLAE para solução de comprimido
de linezolida (12 µg/mL). Fase móvel: ácido acético 1%:
metanol: acetonitrila (50:25:25 V:V:V); coluna Symmetry
Waters C
18
, 5 µm, 250 x 4,6 mm; tempo de retenção ≅ 4,50
min...............................................................................................
67
Figura 3.18 Representação gráfica da curva analítica das soluções de
linezolida em concentrações de 8,0 a 20,0 µg/mL por
cromatografia líquida de alta eficiência.......................................
74
Figura 3.19 Cromatograma da degradação ácida forçada de LNZ-comp.
(10,0 µg/mL) em meio ácido (HCl 0,1 N) após uma hora...........
77
Figura 3.20 Cromatograma da degradação alcalina forçada de LNZ-
comp.(10,0 µg/mL) em meio alcalino (NaOH 0,1 N) após uma
hora.............................................................................................
77
Figura 3.21
Cromatograma da degradação de LNZ-comp. (10,0 µg/mL) em
meio oxidativo (H
2
O
2
3%) após uma hora...................................
78
Figura 3.22
Cromatograma da degradação de LNZ-comp. (10,0 µg/mL) na
luz ultravioleta por 72 horas utilizando metanol como
solvente.......................................................................................
78
Figura 3.23
Cromatograma da degradação de LNZ-comp. (10,0 µg/mL) na
luz ultravioleta por 48 horas utilizando metanol como solvente,
em meio básico...........................................................................
79
Figura 4.1 Perfis de dissolução de comprimidos de linezolida utilizando
pás a 50 rpm e HCl 0,1 M e água como meios de dissolução,
analisados por CLAE..................................................................
96
Figura 4.2 Perfis de dissolução de comprimidos de linezolida utilizando
pás a 50 rpm e HCl 0,1 M e água como meios de dissolução,
analisados por espectrofotometria no UV..................................
96
Figura 4.3 Perfil de decaimento de linezolida nas primeiras 24 horas de
avaliação de sua estabilidade nos meios de dissolução.............
100
Figura 4.4 Cromatograma da amostra placebo, em água........................... 100
Figura 4.5 Espectro de absorção da amostra placebo, em água................ 101
Figura 4.6 Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg,
usando água como meio e velocidade de 50 rpm (pás).............
103
Figura 4.7 Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg,
obtido pelo analista 1, usando água como meio e velocidade
de 50 rpm (pás)..........................................................................
104
Figura 4.8 Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg,
obtido pelo analista 2, usando água como meio e velocidade..
105
Figura 4.9 Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg,
obtido pelo analista 1 e 2, usando água como meio e
velocidade de 50 rpm (pás).........................................................
106
Figura 4.10 Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg,
usando água como meio de dissolução e velocidade de 50
rpm (pás)....................................................................................
108
Figura 4.11
Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg,
obtido pelo analista 1, usando água como meio de dissolução
e velocidade de 50 rpm (pás).......................................................
109
xv
_____________________________________________________________________________
Figura 4.12 Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg,
obtido pelo analista 2, usando água como meio de dissolução
e velocidade de 50 rpm (pás)......................................................
110
Figura 4.13 Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg,
obtido pelos analistas 1 e 2, usando água como meio de
dissolução e velocidade de 50 rpm, analisados..........................
111
Figura 4.14 Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg,
obtido pelo método em CLAE e UV, usando água como meio
de dissolução e velocidade de 50 rpm.......................................
112
Figura 4.15 Modelos propostos (A) – reação de ordem zero; (B) reação de
primeira ordem; (C) modelo de Higuchi, obtidos por CLAE........
115
Figura 4.16 Modelos propostos: (A) – reação de ordem zero; (B) reação de
primeira ordem; (C) modelo de Higuchi, obtidos através de
espectrofotometria no UV............................................................
116
Figura 5.1 Cromatograma linezolida em comprimidos, na concentração
de 12,0 µg/mL, representando a degradação em meio ácido
por 1 hora...................................................................................
130
Figura 5.2 Cromatograma de linezolida-comprimido, na concentração de
12,0 µg/mL, representando a degradação em meio básico por
1 hora..........................................................................................
131
Figura 5.3 Cromatograma de linezolida-comprimido, representando a
degradação oxidativa em H
2
O
2
3 % por 1 hora...........................
132
Figura 5.4 Cromatograma ampliado de linezolida-comprimido,
representando a degradação térmica em à 65
o
C, por 30 dias...
135
Figura 5.5 Cromatograma ampliado de comprimidos triturados de
linezolida, na concentração de 12,0 µg/mL expostos durante
90 dias, em câmara climática (40º C/75%).................................
136
Figura 5.6 Cromatograma de solução de LNZ-SR, em concentração de
100,0 µg/mL, utilizando CLAE acoplado a detector
espectrofotométrico com diodos em série, coluna
semipreparativa Zorbax Rx-C
18
250 mm x 9,4 mm, 5 µm –
AGILENT...................................................................................
137
Figura 5.7 Isograma de LNZ-SR, na concentração de 100,0 µg/mL,
analisado em cromatógrafo Varian- MOD. Pro Star com
detector espectrofotométrico com diodos em série e coluna
semipreparativa Zorbax Rx-C
18,
250 mm x 9,4 mm, 5 µm –
AGILENT.....................................................................................
138
Figura 5.8 Espectros de absorção na região do UV da solução de LNZ-
SR, na concentração de 100,0 µg/mL, representando o
isograma da Figura 5.7...............................................................
139
Figura 5.9 Isograma de LNZ-comp, na concentração de 100,0 µg/mL,
analisado em cromatógrafo Varian- MOD. Pro Star com
detector espectrofotométrico com diodos em série e coluna
semipreparativa Zorbax Rx-C
18,
250 mm x 9,4 mm, 5 µm –
AGILENT.....................................................................................
140
Figura 5.10 Espectros de absorção na região do UV da solução de LNZ-
comp, na concentração de 100,0 µg/mL, representando o
isograma da Figura 5.9...............................................................
141
xvi
_____________________________________________________________________________
Figura 5.11 Cromatograma de LNZ-comp., na concentração de 100,0
µg/mL, representando a degradação térmica em câmara
climática (40ºC/75%), de comprimidos triturados por 90 dias,
utilizando CLAE com diodos em série, coluna semipreparativa
Zorbax Rx-C
18
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT.................
142
Figura 5.12 Espectro de absorção dos picos (1) e (2) relacionados ao
cromatograma da Figura 6.11, com comprimento de onda
equivalente a 221 nm (pico 1) e 253 nm (pico 2)........................
143
Figura 5.13 Isograma de LNZ-comp., na concentração de 100,0 µg/mL,
representando a degradação térmica em câmara climática, de
comprimidos triturados por 90 dias, utilizando CLAE com
diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18
250
mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT................................................
144
Figura 5.14 Cromatograma de LNZ-comp., na concentração de 100,0
µg/mL, mostrando a degradação térmica em câmara climática
(40ºC/75%), de comprimidos triturados por 180 dias, utilizando
CLAE com diodos em série e coluna semipreparativa Zorbax
Rx-C
18
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT.............................
145
Figura 5.15 Espectro de absorção dos picos (1) e (2) relacionados ao
cromatograma da Figura 5.14, com comprimento de onda
equivalente a 221 nm (pico 1) e 253 nm (pico 2)........................
146
Figura 5.16 Isograma de LNZ-comp., na concentração de 100,0 µg/mL,
representando a degradação térmica em câmara climática, de
comprimidos triturados por 180 dias, utilizando CLAE com
diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18
250
mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT................................................
147
Figura 5.17 Cromatograma de linezolida-comprimidos, em concentração
12,0 µg/mL, representando a degradação fotoquímica de
comprimidos triturados em 30 dias
150
Figura 5.18
Cromatograma de linezolida, em concentração de 12,0
µ
g/mL,
representando o comprimido íntegro, exposto fora da
embalagem, na câmara UV, durante 30 dias (A) e 60 dias (B)..
151
Figura 5.19 Cromatograma do comprimido triturado de linezolida, normal
(A) e ampliado (B), em concentração de 12,0 µg/mL,
representando a degradação fotoquímica em 60 dias,
utilizando coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18
250 x 9,4
mm, 5 µm – AGILENT e cromatógrafo Waters...........................
152
Figura 5.20 Cromatograma de solução de linezolida-comprimido, em
concentração de 200 µg/mL, representando a degradação
fotoquímica de comprimidos triturados em 30 dias, utilizando
CLAE com diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax
Rx-C
18
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT.............................
153
Figura 5.21 Cromatograma de solução de linezolida-comprimido, em
concentração de 200 µg/mL, representando a degradação
fotoquímica de comprimidos triturados em 30 dias, utilizando
CLAE com diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax
Rx-C
18
250 x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT....................................
154
Figura 5.22
.
Cromatograma de solução de linezolida-comprimido, em
concentração de 200 µg/mL, representando a degradação
fotoquímica de comprimidos triturados em 30 dias, utilizando
CLAE com diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax
Rx-C
18
250 x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT....................................
155
xvii
_____________________________________________________________________________
Figura 5.23 Cromatograma de solução de linezolida-comprimido, em
concentração de 200 µg/mL, representando a degradação
fotoquímica de comprimidos triturados em 30 dias, utilizando
CLAE com diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax
Rx-C
18
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT.............................
156
Figura 5.24 Cromatograma de solução de linezolida-comprimido, em
concentração de 200 µg/mL, representando a degradação
fotoquímica de comprimidos triturados em 30 dias, utilizando
CLAE com diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax
Rx-C
18
250 x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT..................................
157
Figura 5.25 Proposta da estrutura química do produto de degradação
formado (PD1).............................................................................
159
Figura 5.26 Teor de LNZ-comp, no período correspondente a 90 dias,
exposta ao fator luz UVC (254 nm), determinado por CLAE......
164
Figura 5.27 Cromatogramas ampliados de exposição de comprimidos de
linezolida (LNZ) na luz UVC, nos dias, 1 (A), 10 (B), 15 (C), 20
(D) e 30 (E), mostrandondo os possíveis produtos de
degradação (PD).........................................................................
165
Figura 5.28 Análise do teor de linezolida, no período correspondente de 90
dias, exposta ao fator luz UVC – 254 nm, analisadas por
espectrofotometria na região UV................................................
167
Figura 5.29 Análise da potência de linezolida, no período correspondente
de 90 dias, exposta ao fator luz UVC – 254 nm, analisadas por
doseamento microbiológico.........................................................
168
Figura 5.30 Análise comparativa do teor de decaimento dos comprimidos
de linezolida, expostos à luz-UVC, analisados por CLAE, por
doseamento microbiológico e espectrofotometria no UV............
169
Figura 5.31 Estrutura química de linezolida e os possíveis grupos
orgânicos atingidos durante a exposição por 90 dias.................
171
Figura 5.32 Gráficos correspondentes as ordens de reação: (A) reação de
ordem zero; (B) reação de primeira ordem; (C) reação de
segunda ordem de linezolida residual em função do tempo. Os
coeficientes de regressão encontram-se demonstrados............
174
Figura 5.33 Análise do teor de linezolida, no período correspondente de
180 dias, exposta em câmara climática (40º C/75%),
analisadas por CLAE...................................................................
178
Figura 5.34 Cromatogramas ampliados dos comprimidos triturados de
linezolida, em câmara climática (40º C/75%), nos períodos de
5 (A), 30 (B), 45 (C), 60 (D), 75 (E) e 90 (F) dias........................
179
xviii
_____________________________________________________________________________
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Métodos encontrados na literatura para determinação de linezolida
em fluidos biológicos e forma farmacêutica, utilizando
CLAE..................................................................................................
11
Tabela 3 Relação do peso individual dos comprimidos de linezolida, o peso
médio e o respectivo desvio padrão relativo......................................
19
Tabela 3.1 Valores do ponto de fusão obtidos para linezolida-SQR.................... 20
Tabela 3.2 Bandas do espectro na região de infravermelho................................ 29
Tabela 3.3 Sistemas de fases móveis testados para LNZ-SQR e LNZ-comp...... 38
Tabela 3.4 Concentração das soluções do teste de recuperação aplicado à
amostra de linezolida usando método espectrofotométrico na região
UV a 251 nm.......................................................................................
43
Tabela 3.5 Composição da amostra dos excipientes.......................................... 44
Tabela 3.6 Valores obtidos para construção da curva de Ringbom com LNZ-
SR......................................................................................................
45
Tabela 3.7 Valores experimentais obtidos na construção da curva analítica para
linezolida.....................................................................................
47
Tabela 3.8 Análise de variância das absorvâncias obtidas na curva analítica de
linezolida por espectrofotometria na região UV..................................
49
Tabela 3.9 Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores
experimentais obtidos para a curva analítica de linezolida................
50
Tabela 3.10
Valores obtidos no
teste de recuperação de LNZ-SR utilizando
espectrofotometria UV a 251 nm.......................................................
50
Tabela 3.11
Valores experimentais de linezolida, obtidos por espectrofotometria
na região UV e a precisão do método representado pelo desvio
padrão relativo...................................................................................
51
Tabela 3.12
Parâmetros testados para otimização do ensaio microbiológico -
método de difusão em ágar- cilindros em placas para linezolida......
54
Tabela 3.13
Parâmetros usados no desenvolvimento e validação de linezolida no
ensaio microbiológico...................................................................
55
Tabela 3.14
Esquema de preparo das soluções para análise do teste de
recuperação de linezolida no doseamento microbiológico difusão em
ágar cilindros em placa................................................................
59
Tabela 3.15
Valores médios obtidos no doseamento microbiológico de linezolida,
em difusão em ágar cilindros em placa, para obtenção da curva
analítica...............................................................................
60
Tabela 3.16
Análise de variância dos dados obtidos no doseamento de linezolida
pelo ensaio microbiológico difusão em ágar - cilindros em
placa....................................................................................................
61
Tabela 3.17
Valores experimentais obtidos para o doseamento de linezolida
através do ensaio microbiológico difusão em ágar cilindros em
placa.....................................................................................................
62
Tabela 3.18
Valores experimentais obtidos no doseamento microbiológico de
linezolida no teste de recuperação para o ensaio das três amostras
(R
1
, R
2
e R
3
).........................................................................................
62
Tabela 3.19
Valores experimentais obtidos no teste de recuperação de linezolida
no doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em placa....
63
Tabela 3.20
Condições cromatográficas utilizadas no método por CLAE............... 66
xix
_____________________________________________________________________________
Tabela 3.21 Esquema de preparação das soluções para o teste de
recuperação aplicado à amostra de linezolida para método por
CLAE...............................................................................................
70
Tabela 3.22 Áreas absolutas obtidas para construção da curva analítica de
LNZ-SR por CLAE...........................................................................
73
Tabela 3.23 Análise de variância das áreas obtidas na curva analítica de
linezolida por CLAE.........................................................................
74
Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores
experimentais obtidos para a curva analítica de linezolida.............
75
Tabela 3.25 Valores obtidos no
teste de recuperação de LNZ-SR utilizando
CLAE...............................................................................................
75
Tabela 3.26 Valores experimentais obtidos para determinação de teor de
linezolida em amostras comerciais através de CLAE.....................
76
Tabela 3.27
Avaliação comparativa dos teores médios obtidos nos três
métodos validados usando espectrofotometria na região UV,
doseamento microbiológico e CLAE................................................
83
Tabela 3.28 Análise da variância dos resultados obtidos no doseamento de
linezolida em comprimidos, pelos métodos propostos....................
83
Tabela 4.1 Condições usadas no perfil de dissolução de comprimidos de
linezolida.........................................................................................
95
Tabela 4.2 Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução (n =
6), usando água como meio de dissolução e velocidade de 50
rpm (pás).........................................................................................
103
Tabela 4.3 Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução (n=6)
e o respectivo DPR, determinados pelo analista 1, usando água
como meio e velocidade de 50 rpm (pás).......................................
104
Tabela 4.4 Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução (n=6)
e o respectivo DPR, determinados pelo analista 2, usando água
como meio e velocidade de 50 rpm (pás).......................................
105
Tabela 4.5 Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução
(n=6),usando água como meio e velocidade de 50 rpm (pás).......
108
Tabela 4.6 Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução (n=6)
e o respectivo DPR, determinados pelo analista 1, usando água
como meio e velocidade de 50 rpm (pás)......................................
109
Tabela 4.7 Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução (n = 6)
e o respectivo DPR, determinados pelo analista 2, usando água
como meio de dissolução e velocidade de 50 rpm (pás)......
110
Tabela 4.8 Equações da meia-vida de dissolução (ks) de acordo com o
modelo matemático correspondente...............................................
114
Tabela 4.9 Parâmetros calculados da cinética de dissolução de linezolida
obtidos por CLAE ...........................................................................
117
Tabela 5.1 Valores obtidos na quantificação de linezolida nos comprimidos
triturados expostos à luz (254 nm), analisados por CLAE...............
163
Tabela 5.2 Resultados obtidos na quantificação de linezolida nos
comprimidos triturados expostos à luz-UVC (254 nm), analisados
por espectrofotometria na região ultravioleta, a 251 nm.................
166
Tabela 5.3 Resultados obtidos na quantificação de linezolida nos
comprimidos triturados expostos à luz-UVC (254 nm), analisados
por doseamento microbiológico.......................................................
168
Tabela 5.4 Concentração residual de linezolida em comprimidos triturados
após a fotodegradação em lâmpada UVC - 254 nm, utilizando o
método CLAE..................................................................................
173
Tabela 5.5 Valores dos coeficientes de correlação, considerando diferentes
ordens de reação, obtidos a partir de soluções dos comprimidos
triturados de linezolida expostas à luz UVC-254 nm (20 W)..........
173
xx
_____________________________________________________________________________
Tabela 5.6 Constantes de velocidade de reação (k), equação da reta,
coeficiente de correlação e tempo de vida útil (t
90%
) para
linezolida após fotodegradação a 254 nm dos comprimidos
triturados, por CLAE........................................................................
175
xxi
_____________________________________________________________________________
LISTA DE ABREVIATURAS
CLAE: cromatografia líquida de alta eficiência
DSC: calorimetria exploratória diferencial
DPR: desvio padrão relativo
DP1: produto de degradação 1
DP2: produto de degradação 2
IV: infravermelho
LNZ-SR: linezolida substância de referência
LNZ-comp.: linezolida nos comprimidos
QM: quadrático
SQ: soma dos quadrados
SR: substância de referência
UV: ultravioleta
Capítulo I – Introdução e objetivos 1
_____________________________________________________________________________
_______ ______________________________________________________________________
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
1. INTRODUÇÃO
As oxazolidinonas são uma nova classe de fármacos antimicrobianos, em que a
linezolida é o primeiro fármaco deste grupo aprovado atualmente para ser
comercializado em vários países, inclusive no Brasil, nas formas farmacêuticas
comprimidos revestidos e solução injetável, com o nome de Zyvox®, pelo laboratório
Pfizer Ltda. A comercialização foi liberada pela ANVISA em 06/04/2005. A linezolida
possui farmacocinética com biodisponibilidade oral de aproximadamente 100%. Este
antimicrobiano é específico para bactérias Gram-positivas, inclusive as bactérias
meticilina-resistentes, como, por exemplo, Staphylococcus aureus. Um fator
importante neste grupo de fármacos é o mecanismo de ação diferenciado das demais
classes de antibióticos e antimicrobianos, demonstrando resultados satisfatórios na
terapêutica.
Na literatura, são encontrados muitos relatos relacionados com sua atividade
farmacológica, mas poucos métodos de análise para o fármaco em formas
farmacêuticas. A maioria dos trabalhos envolve a determinação do fármaco em fluidos
biológicos. Por ser um medicamento novo, há poucos estudos relacionados às
características físico-químicas, estudo de estabilidade e métodos analíticos.
O controle de qualidade na indústria farmacêutica, para determinação do teor de
princípio ativo, estudo das características físicas e químicas do fármaco, estudos de
estabilidade e de dissolução, é de fundamental importância para garantir a qualidade
do produto final, e, consequentemente, confirmar a qualidade do medicamento
comercializado ao paciente. Apesar da comprovada eficácia e segurança no seu
tratamento, a linezolida, até então, não possui um método de análise padronizado em
compêndios oficiais. Este fato justifica pesquisas nessa área para desenvolvimento e
validação de métodos analíticos, bem como a análise químico-farmacêutica de
comprimidos de linezolida e estudos de estabilidade.
Neste trabalho, foram realizadas análises qualitativas, utilizando
espectrofotometria de IV e UV, análise térmica, cromatografia líquida de alta eficiência
Capítulo I – Introdução e objetivos 2
_____________________________________________________________________________
_______ ______________________________________________________________________
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
e cromatografia em camada delgada, além de análises quantitativas, com o
desenvolvimento e validação de três métodos analíticos para linezolida em
comprimidos. Foram também realizados estudos do perfil de dissolução de linezolida,
bem como estudos de estabilidade dos comprimidos de linezolida, utilizando câmara
climática, com temperatura e umidade controlada, e câmara com luz ultravioleta, com
objetivo de verificar o comportamento de degradação de linezolida frente a estes
parâmetros.
Capítulo I – Introdução e objetivos 3
_____________________________________________________________________________
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Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
1.1. OBJETIVOS
1.1.2. OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento e validação de métodos analíticos para determinação
qualitativa e quantitativa de linezolida em comprimidos e a avaliação da estabilidade
de comprimidos de linezolida.
1.1.2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a faixa de fusão de linezolida substância de referência (SR).
Desenvolver método por cromatografia em camada delgada (CCD) para
identificação de linezolida em comprimidos.
Realizar análise térmica e termogravimétrica de linezolida-SQR e linezolida
comprimidos.
Desenvolver método por espectrofotometria na região ultravioleta (UV) e na
região de infravermelho (IV) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE),
para identificação de linezolida em comprimidos.
Desenvolver e validar método por espectrofotometria na região UV para
determinação quantitativa de linezolida em comprimidos.
Desenvolver e validar método por CLAE para análise quantitativa de linezolida
em comprimidos.
Desenvolver e validar método microbiológico para linezolida em comprimidos.
Realizar análise comparativa dos métodos quantitativos desenvolvidos e
validados para análise de linezolida em comprimidos.
Desenvolver e validar método de dissolução para comprimidos de linezolida.
Avaliar a estabilidade preliminar de linezolida comprimidos frente à degradação
ácida, básica, oxidativa, térmica e fotolítica.
Realizar estudos de estabilidade em câmara climática e na luz UVC.
Capítulo II – Revisão bibliográfica 4
_____________________________________________________________________________
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
2. Revisão da literatura
2.1. Propriedades farmacológicas
O aumento na incidência de infecções causadas por bactérias Gram-positivas
resistentes, incluindo Streptococcus pneumoniae e Staphylococcus aureus resistentes
à penicilina, bem como Enterococcus faecium resistentes à vancomicina, continua
aumentando mundialmente (DOERN et al., 1998). Na década atual, na Inglaterra,
aproximadamente 42% dos isolados clínicos de Staphylococcus aureus são
resistentes à meticilina, comparando com a década anterior, que era de
aproximadamente 2% (REACHER et al., 2000). No Japão, 60% das cepas de
Staphylococcus aureus avaliadas são meticilina resistentes (HIRAMATSU et al., 1997).
Na América Latina, 26,5 % dos isolados clínicos de Staphylococcus aureus são
meticilina resistentes (MENDES et al., 2003). No Brasil, foram realizados estudos em
hospitais com isolados clínicos de enterococos resistentes à vancomicina e de
estafilococos. A linezolida foi o composto mais ativo pesquisado, mostrando 100 % de
inibição contra cepas resistentes (REIS et al., 2001; SADER et al., 2001).
A linezolida possui um espectro de atividade que envolve bactérias Gram-
positivas (YAGI e ZURENKO, 1997; BAUM et al., 2002; BEHRA-MIELLET et al., 2003;
YAGI e ZURENKO, 2003; LIVERMORE, 2003; KRUEGER et al., 2004), enterecocos
multi-resistentes (BOSTIC et al., 1998; MUTNICK et al, 2002; JONES et al., 2007),
Staphylococcus aureus (WILCOX, 2003; JONES et al., 2007), Streptococcus
pneumoniae (JONES et al., 2007), Streptococcus pyogenes (LLOYD et al., 2007).
Desde o lançamento de Zyvox® (produto comercial que contém a linezolida como
princípio ativo), o monitoramento da atividade de linezolida em alguns continentes
(Europa, Ásia, Austrália, América Latina, América do Norte), vem sendo realizado. O
objetivo deste monitoramento é verificar o espectro de linezolida, bem como o possível
surgimento de cepas resistentes. Nas avaliações realizadas, os microrganismos mais
comumente testados foram: Staphylococcus aureus (54,0%), Staphylococcus
coagulase negativo, enterococos, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus do grupo
Capítulo II – Revisão bibliográfica 5
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Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
viridans, Streptococcus β-hemolíticos, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium.
Nestes levantamentos, foi verificado que linezolida possuía atividade contra todas as
cepas testadas (BALLOW et al., 2002; ROSS et al., 2005; JONES et al., 2007; ROSS
et al., 2007).
ALCALÁ e colaboradores (2003) estudaram a atividade de linezolida contra
isolados clínicos de Mycobacterium tuberculosis, susceptíveis ou resistentes a
fármacos de primeira linha utilizados no tratamento da tuberculose. No estudo,
linezolida apresentou atividade in vitro contra todas as cepas testadas, inclusive as
resistentes aos medicamentos utilizados no tratamento da tuberculose. Um trabalho
científico que corrobora com esta atividade é o de PASCUAL e colaboradores (2002),
que pesquisaram a atividade intracelular de linezolida em células fagocitárias e não
fagocitárias humanas, verificando que este fármaco possui rápida penetração nestas
células. Outros trabalhos na literatura ratificam a atividade de linezolida contra
Mycobacterium tuberculosis resistente a vários fármacos (FORTÚN et al., 2005;
ERTURAN e UZUN, 2005; LIPPE et al., 2006; TATO et al., 2006).
Devido a elevadas incidências de bactérias multiresistentes, o desenvolvimento
de agentes antimicrobianos ou antibióticos efetivos para tratar estas infecções têm
sido alvo de intensas pesquisas na área farmacêutica. As oxazolidinonas
correspondem a uma nova classe de agentes antimicrobianos, que possuem um
mecanismo de ação único, exclusivo dos fármacos desta classe. A linezolida (Figura
2.1) é um inibidor da síntese de proteínas (SHINABARGER et al., 1997), atuando na
interrupção que envolve a translação da banda N-formilmetionil-RNAt para o
ribossomo 70S. Esta atuação é um contraste para os outros antimicrobianos no
mercado, com mecanismo de ação atuando na síntese protéica, possuindo como alvo
a fase de elongação na síntese de proteínas (ZURENKO et al., 2001).
Capítulo II – Revisão bibliográfica 6
_____________________________________________________________________________
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
NO
F
N
O
O
H
N
O
Figura 2.1. Estrutura química de linezolida.
O benefício do novo mecanismo de ação da linezolida está no fato que
microrganismos resistentes a outros antimicrobianos não apresentam resistência para
esta molécula. Foi realizado um estudo que demonstrou claramente que a linezolida
não possui resistência cruzada com outros fármacos que atuam inibindo a síntese
protéica (incluindo macrolídeos, cloranfenicol, lincosamidas, aminoglicosídeos e
tetraciclina). Neste estudo foram avaliadas cepas isoladas protegidas com os genes
que conferem resistência a este antimicrobiano (FINES e LECLERCQ, 2000).
A Figura 2.2 apresenta a relação entre estrutura e atividade de linezolida
(BARBACHYN e FORD, 2003):
Capítulo II – Revisão bibliográfica 7
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Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Figura 2.2. Relação estrutura-atividade de linezolida.
O substituinte amino (doador de elétrons) no anel fenil, pode conferir melhor
atividade antimicrobiana e ajuda a manter um bom perfil de segurança. O flúor confere
uma boa absorção oral e aumenta a atividade antimicrobiana. O anel morfolínico
aumenta a solubilidade em água. A administração oral de comprimidos de linezolida
possui biodisponibilidade de quase 100%, e a concentração máxima (Cmax) no
plasma, ocorre de 1 a 2 horas após a administração oral do comprimido. A linezolida
possui uma baixa ligação às proteínas plasmáticas (aproximadamente 31%) e é
livremente distribuída nos tecidos (ELIOPOULOS, 2003). O volume de distribuição no
estado de equilíbrio em adultos voluntários saudáveis é de 0,5-0,6 L/kg, aproximando-
se do volume total de água no corpo, sendo também bem distribuído no tecido
adiposo, ósseo e muscular (SLATTER et al., 2001).
Capítulo II – Revisão bibliográfica 8
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Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
O metabolismo da linezolida é relativamente complexo, produzindo dois principais
metabólitos primários por oxidação no anel morfolínico, resultando em dois metabólitos
inativos, PNU 142300 (Figura 2.3) e PNU 142586 (Figura 2.4) (SLATTER et al., 2001).
A excreção é predominantemente pela urina. No estado de equilíbrio, 30 % da dose
aparece na urina como linezolida, 40 % como PNU 142586 e 10 % como PNU 142300.
O fármaco puro não é encontrado nas fezes, enquanto mais ou menos 6 % da dose
encontrada nas fezes é o metábolito PNU 142586 e 3 % PNU 142300.
Estudos farmacodinâmicos têm demonstrado a distribuição da concentração do
antimicrobiano no corpo humano (ANDES et al., 2002). Há estudos envolvendo a
penetração de linezolida no humor aquoso, em seres humanos, após a administração
intravenosa. As endoftalmites bacterianas são infecções no olho que requerem uma
intervenção terapêutica apropriada, pois frequentemente resultam na perda da visão.
Estas infecções são causadas principalmente por estafilococos coagulase negativos
(70 %), seguindo por Staphylococcus aureus e outros microrganismos Gram-positivos.
A penetração de antibióticos dentro do olho é variável, pois tanto o humor aquoso e o
vítreo são avasculares, e este último é também isolado da circulação sistêmica pela
barreira ocular. Neste estudo, os autores demonstraram, níveis significativos dentro do
humor aquoso de olhos humanos não inflamados após administração intravenosa de
Figura 2.4. Estrutura química do
metabólito PNU 142586
Figura 2.3. Estrutura química do
metabólito
PNU 142300
Capítulo II – Revisão bibliográfica 9
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Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
linezolida 600 mg. Duas horas depois da administração do antimicrobiano, o humor
aquoso foi aspirado e testado, obtendo-se níveis para concentração inibitória mínima
de 90% das cepas de Staphylococcus epidermidis analisadas (VASQUEZ et al., 2004).
PELÁEZ e colaboradores (2002) pesquisaram a atividade in vitro de linezolida
contra anaeróbios como o Clostridium difficile. Essa bactéria é a maior causa de
infecções diarréicas e colites pseudomembranosas em pacientes hospitalizados
(BARBUT et al., 1996). Neste estudo, os autores demonstraram que a linezolida é
ativa contra isolados clínicos susceptíveis e não susceptíveis aos fármacos
tradicionais. Em estudos realizados em pacientes com disfunção renal, verificou-se
que não há necessidade de alteração na dose, destes pacientes, pois o fármaco é
removido por hemodiálise (BRIER et al., 2003). GARAZZINO e colaboradores (2007)
relataram o aparecimento de mielosupressão reversível, quando o tratamento de
linezolida é prolongado. STANTON e colaboradores (2002) concluíram que a linezolida
causa uma mielosupressão tempo-dependente leve e reversível. Segundo os autores
os benefícios do tratamento suplementam o potencial risco, pois a eficácia em
infecções sérias por bactérias Gram-positivas, principalmente por patógenos
resistentes a vários antimicrobianos, assegura o tratamento, desde que ocorra
monitoramento sanguíneo.
Um tratamento experimental utilizando linezolida e gentamicina em modelos
animais para debelar endocardites ocasionadas por Staphylococcus aureus meticilina-
resistente foi relatado. Os autores concluíram que linezolida juntamente com
gentamicina são adequadas para utilização em tratamentos de endocardites
(JACQUELINE et al., 2004). Na literatura, foram encontrados alguns relatos da
utilização de linezolida em pacientes com endocardite. Em todos os casos relatados, a
linezolida mostrou-se eficaz no tratamento desta enfermidade (RAVINDRAN et al.,
2003; BASSETI et al., 2004; NATHANI et al., 2005; MUNOZ et al., 2006; WAREHAM
et al., 2006; MYLONA et al., 2007).
Capítulo II – Revisão bibliográfica 10
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Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
2.2. Propriedades físico-químicas
2.2.1. Descrição:
Nome químico: (s)-N-[[3-[3-fluoro-4(4-morfolinil) fenil]-2-oxo-5-oxazolidinil] metil]
acetamida
Sigla: PNU 100766
Fórmula molecular: C
16
H
20
FN
3
O
4
Massa molecular: 337,35
Ponto de fusão: 181,5º C – 182,5º C
Número no Chemical Abstracts: 165800-03-3
Denominação Comum Brasileira: 04150.01-5
2.3. Métodos analíticos para a determinação de linezolida
A Tabela 2 apresenta os métodos para determinação de linezolida em fluidos
biológicos e formas farmacêuticas.
Capítulo II – Revisão bibliográfica 11
_____________________________________________________________________________
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Tabela 1. Métodos encontrados na literatura para determinação de linezolida em fluidos
biológicos e forma farmacêutica, utilizando CLAE
Matriz
Coluna
Fase móvel
Detecção
(nm)
tr
*
(min)
Referência
Plasma/ tecidos Kromasil, 150 mm ×
4,6 mm, C8 (5 µm)
Água-acetonitrila
(80:20)
254 10,4 BA et al.,
2007
Plasma/ líquido
broncoalveolar
Zorbax Eclipse
XDBC8 (3 mm × 100
mm, 3,5 µm)
Água com 0,4 % de
trietilamina:acetonitril
a pH 4,0-gradiente
254 15,0 TOUTAIN et
al., 2004
Plasma Spherimage-80 RP-
18 ODS2 5 µm,
125 mm × 4 mm
Tampão acetato de
sódio (25 mM, pH
5)/ACN 80:20
251 5,0 BUERGER
et al., 2003
Soro humano Hypersil 5ODS
10 mm x 4,6 mm
Ácido orto-fosfórico
1%:metanol 30%,
2g/L de ácido
sulfônico heptano pH
5,0
254 6,5 TOBIN et al.,
2001
Fluido de diálise
peritoneal
Hypersil 5 ODS
10 mm x 4,6 mm
Ácido orto-fosfórico
1%:metanol 30%,
2g/L de ácido
sulfônico heptano pH
4,5
254 6,0 TOBIN et al.,
2003
Plasma/ e
tecidos
Atlantis dC18 column
(150 mm × 4,6 mm,
5 µm)
Acetoniotrila e ácido
e ácido trifluoracético
0,1%- gradiente
254/ 292 16,0 CAVAZOS-
ROCHA et
al., 2007
Comprimidos
Phenomenex 5 µm,
ODS
Metanol:água (65:35)
pH 3,5 (ácido
acético)
240
2,8
BEBAWY,
2003ª
Matéria-prima e
forma
farmacêutica
250x/4,6 mm
Chiralpak AD
(Daicel) 10 µm
Método A: hexano:2-
propanol:TFA
(80:20:0,1)
Método B:
hexano:etanol:TFA
(65:35:0,1)
258 15 e
20
NARAYANA
et al., 2003
Soro humano e
urina
Nucleosil-100 5C18
(125 × 4 mm, 5 µm)
Acetonitrila:tampão
acetato de
sódio:água
(180:100:720)
ajustado a pH 3,7
250 6,7 BORNER et
al., 2001
Plasma de
animais
Zorbax RXC8,
4,6 x 150 mm, 5 µm,
Acetonitrila:água
(20:80)
251 11,0 PENG et al.,
1999
Soro e urina Nucleosil C18
250 mm x 4,6 mm,
5µm
Metanol:água (50:50) 260 18,0 ERLICH et
al., 2001
*tr – tempo de retenção
Capítulo II – Revisão bibliográfica 12
_____________________________________________________________________________
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A maioria dos trabalhos encontrados na literatura, envolvendo este fármaco,
está relacionada à quantificação em fluidos biológicos utilizando CLAE (Tabela 3.1) e
eletroforese capilar (KITAHASHI e FURUTA, 2002; KITAHASHI e FURUTA, 2004).
Poucos métodos utilizam a forma farmacêutica comprimidos para desenvolvimento e
validação de linezolida.
NARAYANA e colaboradores (2003) validaram um método por CLAE utilizando
coluna quiral para separação dos enantiômeros de linezolida. Em 2002, REDDY e
colaboradores, isolaram e caracterizaram impurezas relacionadas ao processo,
utilizando CLAE. BEBAWY (2003b) desenvolveu métodos para determinar a
estabilidade de linezolida na presença de substâncias alcalinas que induziam produtos
de degradação. MACCARONI e colaboradores (2008) estudaram técnicas para
identificação e quantificação das formas polimórficas II e IV de acordo com as
informações preliminares da patente na literatura. Em 2007, foi desenvolvido e
validado um método em CLAE, utilizando coluna de fase reversa, e um método
espectrofotométrico UV para análise de comprimidos e solução injetável de linezolida
(PATEL et al., 2007).
Os métodos analíticos têm por objetivo fornecer informações confiáveis quanto à
natureza e à composição dos materiais submetidos à análise. Sabe-se, entretanto que,
um certo grau de variabilidade está atrelado a todas as avaliações. Portanto, um dos
objetivos da garantia de qualidade é manter em patamar mínimo esta variabilidade. A
validação é parte importante do programa de garantia de qualidade, sendo os
procedimentos incluídos nas normas de Boas Práticas de Fabricação (BPF) exigidas
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos e aplicadas nas
indústrias farmacêuticas, devendo, também ocorrer conforme as boas práticas de
laboratório (BPL), do inglês, Good Laboratory Practices (GLP). Nesta década, a
ANVISA, na Resolução n
o
899, de 29 de Maio de 2003, divulgou aspectos
relacionados à validação de métodos analíticos (BRASIL, 2003).
Capítulo II – Revisão bibliográfica 13
_____________________________________________________________________________
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A escolha do método deve levar em consideração fatores como sua adequação
à substância analisada, em determinada forma farmacêutica. Precisão, exatidão,
sensibilidade e especificidade (ERMER, 2001; USP 31, 2008) são características
fundamentais de um método analítico, porém outras como a disponibilidade de
instrumentos e equipamentos, rapidez, custo reduzido, simplicidade e baixo risco
ocupacional também devem ser consideradas.
As Farmacopéias Americana (USP, 2008) e Britânica (BP, 2001) fazem
referência à validação analítica de forma destacada, incluindo a definição dos termos e
parâmetros analíticos envolvidos nos ensaios de validação. Os atributos do método
analítico ou parâmetros de validação estão descritos em inúmeras publicações
(VESSMAN, 1996; WOOD, 1999; ERMER, 2001; HEYDEN et al., 2001; PERSON e
VESSMAN, 2001). A ICH (The International Conference on the Harmonization of the
Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)
estabelece requerimentos em duas diretrizes: no primeiro documento orienta
definições de características sobre validação necessária para vários tipos de
procedimentos e no segundo documento inclui dados experimentais requeridos e
algumas interpretações estatísticas (ICH, 2005).
A introdução de métodos analíticos exige a adoção de procedimentos de
validação que conferem a confiabilidade necessária para a aplicação das técnicas de
quantificação. O desenvolvimento de métodos que permitam quantificar fármacos em
matérias-primas e produtos acabados é fundamental para o controle de qualidade
destes produtos, tanto no âmbito da indústria farmacêutica nacional e internacional,
como em farmácias magistrais públicas e privadas.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 14
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
3.1. INTRODUÇÃO
A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas, através de
sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, está sendo cada vez mais
reconhecida e exigida. Dados analíticos não confiáveis podem conduzir a decisões
desastrosas e a prejuízos financeiros irreparáveis. Para garantir que um novo método
analítico gere informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra, ele deve sofrer
uma avaliação denominada validação. A validação de um método é um processo
contínuo que começa no planejamento da estratégia analítica e continua ao longo de
todo o seu desenvolvimento e transferência (RIBANI et al., 2004). Para registro de
novos produtos, todos os órgãos reguladores do Brasil e de outros países exigem a
validação de métodos analíticos e, para isso, a maioria deles tem estabelecido
documentos oficiais que são diretrizes a serem adotadas no processo de validação
(ICH,1995; BRASIL, 2003; USP 31; 2008).
A descrição dos parâmetros que podem ser avaliados na validação de um
método, segundo USP 31 (2008), ICH (2005) e a Resolução n
o
899 (BRASIL, 2003),
estão relacionados abaixo:
Especificidade/seletividade: é a capacidade do método de determinar
exatamente a substância em análise, na presença de outros componentes,
como impurezas, produtos de degradação e excipientes presentes na forma
farmacêutica. Para análise quantitativa (teor) e análise de impurezas, a
especificidade pode ser determinada pela comparação dos resultados obtidos
de amostras (fármaco ou medicamento) contaminadas com quantidades
apropriadas de impurezas ou excipientes e amostras não contaminadas, para
demonstrar que o resultado do teste não é afetado por esses materiais.
Quando a impureza ou o padrão do produto de degradação não estiver
disponível, podem-se comparar os resultados dos testes das amostras
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 15
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
contendo impurezas ou produtos de degradação com os resultados de um
segundo procedimento bem caracterizado (por exemplo métodos
farmacopéicos ou outro procedimento validado). Estas comparações devem
incluir amostras armazenadas sob condições de estresse (por ex. luz, calor,
umidade, hidrólise ácida/básica, oxidação).
Precisão: A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em
uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra.
Este procedimento analítico é usualmente expresso como desvio padrão
relativo. A precisão é considerada em três níveis: repetibilidade, precisão
intermediária e reprodutibilidade.
- Repetibilidade (intra-dia): refere-se ao procedimento analítico realizado no
mesmo laboratório, em curto período de tempo, com o mesmo analista e
mesmo instrumento.
- Precisão intermediária (inter-dia): está relacionada com variações no
mesmo laboratório, obtidos com diferentes analistas, diferentes dias, diferentes
equipamentos, etc.
- Reprodutibilidade: procedimentos analíticos realizados em laboratórios
diferentes (estudos colaborativos, geralmente aplicado para padronização de
métodos analíticos).
Exatidão: A exatidão de um método analítico é a proximidade dos
resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro.
Pode ser determinada pela aplicação do teste de recuperação, em que se
adiciona quantidade conhecida de substância química de referência na
amostra e calcula-se o percentual recuperado pelo método; pela
comparação dos resultados do método proposto com os obtidos por um
método já caracterizado, cuja exatidão, tenha sido estabelecida, como por
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 16
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
exemplo, um método farmacopéico, ou ainda pode ser inferida, uma vez
estabelecida a precisão, linearidade e especificidade do método.
Linearidade: É a capacidade de um método analítico demonstrar que os
resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito
na amostra, dentro de um intervalo especificado. A linearidade deve ser
realizada com no mínimo cinco níveis de concentrações diferentes.
Limite de detecção: é a menor quantidade que uma substância presente
em uma amostra, pode ser detectada, porém, não necessariamente
quantificada, sob as condições experimentais estabelecidas. Para
determinação do limite de detecção, a seguinte fórmula é utilizada:
Limite de quantificação: representa a concentração mais baixa da substância
em exame que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis, sob
as condições experimentais especificadas. Para determinação do limite de
quantificação, a seguinte fórmula é utilizada:
LD = 3,3
σ
σσ
σ
/S
Em que:
σ = inclinação da curva analítica
S = desvio padrão do intercepto
LQ = 10
σ
σσ
σ
/S
Em que:
σ = inclinação da curva analítica
S = desvio padrão do intercepto
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 17
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Robustez: é a capacidade que o método possui em resistir a pequenas
e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança
durante o uso normal. Para desenvolvimento de métodos espectrofotométricos,
pode-se realizar as seguintes variações: variação do pH da
solução,·temperatura e·diferentes fabricantes de solventes. Em métodos
cromatográficos as seguintes variações são utilizadas para verificar a robustez
do método: variação do pH da fase móvel,·variação na composição da fase
móvel,·diferentes lotes ou fabricantes de colunas,·temperatura e·fluxo da fase
móvel.
A escolha do método deve levar em consideração fatores como sua
adequação à substância analisada, em determinada forma farmacêutica. Precisão,
exatidão, sensibilidade e especificidade são características fundamentais de um
método analítico (ERMER, 2001; USP 31, 2008), porém outras como a disponibilidade
de instrumentos e equipamentos, rapidez, custo reduzido, simplicidade e baixo risco
ocupacional podem também ser consideradas. A validação envolve não apenas os
procedimentos do processo produtivo, mas todos os métodos empregados no controle
de qualidade, incluindo a comparação do método estudado com o método oficial ou
outro método anteriormente validado.
No presente capítulo serão apresentados os métodos que foram validados
para a determinação quantitativa de linezolida, em comprimidos, sendo eles: a
espectrofotometria na região do ultravioleta (UV), doseamento microbiológico e
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Além disso, foram realizados testes
qualitativos para identificação de linezolida nos comprimidos e matéria prima.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 18
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
3.2. PARTE EXPERIMENTAL
3.2.1. Material
3.2.1.1. Substância de referência (SR)
Foi utilizada linezolida, substância de referência, com teor estimado em 99,3% e
identificado pelo lote A-1131-178. Substância adquirida pela empresa canadense
“Synfine research”. Os certificados de análise encontram-se anexados (anexos 1, 2, 3,
4 e 5). Nome químico: linezolida (s)-N-[[3-[3-flúor-4-(4-morfolinil)-fenil]-2-oxo-5-
oxazolidinil]metil] – acetamida (PENG et al., 1999). CAS: 165800-03-3 e DCB:
04150.01-5.
3.2.1.2. Produto farmacêutico
Foram analisados comprimidos revestidos contendo 600 mg de linezolida (teor
rotulado), sob nome comercial de Zyvox e identificado pelo lote de número 44PTJ,
data de fabricação 03/2006 e validade 03/2008. Medicamento produzido pelos
Laboratórios Pfizer Ltda (Porto Rico, EUA). Os comprimidos foram adquiridos no
Hospital escola da UNESP de Botucatu.
Fórmula unitária: linezolida (600 mg), celulose microcristalina, amido de milho,
amidoglicolato de sódio, hiprolose, estearato de magnésio, cera de carnaúba,
vermelho opaco FGE-15040 corante vermelho (impressão), opadry branco YS-1-
18202-A, água purificada, álcool isopropílico e/ou álcool SD 3A (Bula de Zyvox).
3.2.1.3. Equipamentos
• Agitador de Tubos, PHOENIX, modelo AP56
• Autoclave (PHOENIX)
• Aparelho de ponto de fusão Logen, modelo LS III Basic
• Balança analítica (METTLER, modelo H10).
• Cubetas de quartzo de 1 cm
• Coluna symmetry waters C18, 5µm, 250 x 4,6 mm
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 19
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
• Coluna Phenomenex C18, 5µm, 250 x 4,6 mm
• Cromatógrafo líquido da marca Waters, composto de bomba cromatográfica
gradiente binária Waters 1525, injetor manual Rheodyne Breeze 7725i e
detetor UV-Vis Waters 2487, coluna Symmetry Waters C
18
5 µm 4,6 x 250 mm
e pré-coluna Symmetry Waters C
18
5 µm 3,9 x 20 mm
• Espectrofotômetro Hewlet Packard Mod. 8453, com software chemstation UV –
visível
• Espectrofotômetro infravermelho (IV) Bomem BM modelo 102
• Estufa bacteriológica (ODONTOBRÁS, modelo ECB 1.2)
• Estufa de esterilização (NOVA ÈTICA)
• Equipamento SDT Q600 – TA para análise térmica
• Membranas de nylon com 0,45 µm de diâmetro de poro
• Micropipetas, BOECO
• Módulo DSC 2910 (TA Instruments), com taxa de aquecimento programável de
0,01 a 200
O
C/min, sensibilidade máxima de 0,2 µW.
• Paquímetro (STARRET, modelo digital eletrônico série 727).
• Placas de sílica-gel F
254
(20 x 20 cm), com espessura de 0,25 mm (MERCK)
• Seringa HAMILTON, 100µL
3.2.1.4. Solventes, matérias-primas e reagentes
• Água ultrapura – água Milli-Q
• Acetonitrila (J.T.Baker)
• Ácido acético (MERCK)
• Ácido fórmico (Synth, Brasil)
• Ágar n
o
11 (Merck, Alemanha)
• Butanol (Synth, Brasil)
• Clorofórmio (Merck, Alemanha)
• Cromatofolhas de sílica gel 60 F
254 -
(Merck, Alemanha)
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 20
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
• Diclorometano (Merck, Alemanha)
• Etanol (Synth, Brasil)
• Fosfato de potássio monobásico (Reagen, Brasil)
• Membrana de nylon 0,45 µm de diâmetro
• Metanol (MERCK)
• Metanol grau HPLC (J.T.Baker)
3.2.2. Análise qualitativa
3.2.2.1. Determinação do peso médio dos comprimidos de linezolida
3.2.2.1.1. Método
A determinação do peso médio foi realizada conforme a Farmacopéia Brasileira
IV (1988). Foram pesados, individualmente, 20 comprimidos. Para comprimidos
contendo peso médio acima de 250 mg, a variação de peso permitida é ± 5,0 %.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 21
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
3.2.2.1.2. Resultados e discussão
A Tabela 3 relaciona o peso individual de vinte comprimidos com o peso médio e
o desvio padrão relativo.
Tabela 3. Relação do peso individual dos comprimidos de linezolida, o peso médio e o
respectivo desvio padrão relativo
comprimido
peso individual
(mg)
peso
médio
(mg)
desvio
padrão
DPR
*
(%)
1 860,9
864,42
6,709349
0,78
2 858,0
3 860,0
4 861,7
5 874,9
6 871,6
7 877,4
8 865,7
9 850,1
10 867,0
11 864,7
12 858,5
13 869,5
14 867,4
15 853,7
16 864,0
17 866,4
18 870,4
19 864,7
20 861,8
*DPR – desvio padrão relativo
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 22
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 3 ilustra a variação dos vinte comprimidos de linezolida (LNZ-comp.)
pesados.
Figura 3. Ilustração da variação dos vinte comprimidos de linezolida pesados.
As variações de peso dos comprimidos de linezolida encontram-se dentro dos
limites pré-estabelecidos pela Farmacopéia Brasileira (1988). Neste caso, a variação
permitida é ± 5,0%, peso máximo 881,80 mg e peso mínimo 847,04 mg. O desvio
padrão relativo (DPR) apresentou um valor dentro das especificações. O peso médio
foi realizado para verificar se os comprimidos encontravam-se dentro dos parâmetros
farmacopéicos.
3.2.2.2. Determinação da faixa de fusão
3.2.2.2.1. Método
Uma pequena quantidade de linezolida-SR (LNZ-SR), previamente dessecada
a 80
o
C durante 2 horas, foi introduzida em tubo capilar e, posteriormente, inserida na
célula de aquecimento. Foram realizadas três determinações.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 23
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
3.2.2.2.3. Resultados e discussão
A Tabela 3.1 mostra a faixa de fusão de LNZ-SR.
Tabela 3.1. Valores do ponto de fusão obtidos para LNZ-SR.
Ensaio Faixa de fusão (ºC)
1 185ºC
2 183ºC
3 185ºC
média ±
±±
± e.p.m*
184,3ºC ± 1,0
e.p.m – erro padrão da média
O ponto de fusão é uma avaliação físico-química útil na identificação de
fármacos, pois fornece informações do grau de pureza e é utilizada para pesquisar a
presença de possíveis contaminantes na amostra. Entretanto, esta técnica não
possibilita à conclusão definitiva da identidade dos compostos, sendo necessária a
execução de testes de identificação complementar.
A literatura descreve o ponto de fusão de linezolida entre 181,5 – 182,5º C
(NARINA e SUDALAI, 2006). Os dados obtidos nestas análises tiveram como ponto de
fusão médio o valor de 184,3ºC. O ponto de fusão pode ter ficado fora de faixa, pois o
equipamento pode estar descalibrado.
3.2.2.3. Espectrofotometria de absorção na região de infravermelho
3.2.2.3.1. Método
Os espectros foram obtidos com 2,0 mg de LNZ-SR e LNZ-comp., utilizando-se
pastilhas de 150 mg de brometo de potássio dessecado a 105
o
C durante duas horas.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 24
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
3.2.2.3.2. Resultados e discussão
A Figura 3.1 mostra o espectro de infravermelho de LNZ-SR e LNZ-comp., e a
indicação das bandas de absorção características.
Figura 3.1. Espectro de absorção de infravermelho de LNZ-SR e LNZ-comp., com
as bandas características de absorção. As deformações das bandas indicadas no
espectro na região de IV, estão relacionadas na Tabela 3.2.
LNZ
-
SR
LNZ-SR
LNZ-comp.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 25
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Tabela 3.2 relaciona as deformações das bandas indicadas no espectro
de absorção no infravermelho para LNZ-SR e LNZ-comp.
Tabela 3.2. Bandas do espectro na região de infravermelho com as respectivas
deformações axiais
Banda (cm
-
1)
Deformação axial Região (cm
-
1
)
A 3300 N - H 3500 – 3220
B 2960 C – H aromático 3100 – 2990
C 1760 C = O 1760
D 1695 C = O ligada N 1695 – 1650
E 1500 Deformação C=C de
aromático
1650 – 1515
F 1320 C – N amina aromática
terciária
1360 – 1310
G 1210 C – O - C 1200 - 1225
A espectrofotometria no IV é um método de identificação de excelência no
controle de qualidade de medicamentos. Nos espectros obtidos para LNZ-SR e LNZ-
comp. (Figura 3.1), pode-se observar a semelhança do espectro de LNZ-comp. com
LNZ-SR, com bandas de absorção características.
A banda A (3300 cm
-1
), nos espectros de LNZ-SR e LNZ-comp., mostra uma
deformação axial da ligação de N-H. A banda B (2960 cm
-1
) caracteriza-se pela
deformação da ligação C-H relacionada ao grupo aril. A banda mais intensa no
espectro é a banda C (1760
cm
-1
), que caracteriza o grupo carbonílico (C = O). A
banda D (1695 cm
-1
) indica a ligação de nitrogênio ao grupo carbonila na estrutura
química de linezolida (SILVERSTEIN et al., 1994).
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 26
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Os dois espectros na região de IV para as duas substâncias foram praticamente
idênticos, confirmando o propósito desta técnica, que é a identificação da molécula por
comparação com um padrão de referência.
3.2.2.4. Análise térmica de linezolida
3.2.2.4.1. Método
As amostras, LNZ-SR e LNZ-comp., foram colocadas em frascos de vidro e
secas em estufa a 95
O
C por oito horas. Foram pesados aproximadamente 20 mg de
cada uma das amostras e colocadas em cadinhos de alumínio para realização das
análises. Cada amostra foi analisada separadamente em aparelho de calorimetria
exploratória diferencial, previamente calibrado de acordo com os seguintes
parâmetros: razão de aquecimento de 5
O
C/minuto; variação de temperatura de 30-
200
O
C e vazão de ar sintético a 50 mL/minuto. Utilizou-se cadinho de alumínio vazio
no forno de referência.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 27
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
3.2.2.4.2. Resultados e discussão
A Figura 3.2 demonstra as curvas obtidas por análise térmica (DSC) de LNZ-
SR e LNZ-comp.
Figura 3.2. Curva de DSC de LNZ-SR e LNZ-comp., sob atmosfera de ar
sintético, em razões de aquecimento de 5
o
C.
LNZ-SR
LNZ-comp.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 28
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 3.3 demonstra as curvas obtidas por termogravimetria (TG) de LNZ-
SR e LNZ-comp.
Figura 3.3. Curva termogravimétrica de LNZ-SR e LNZ-comp. sob atmosfera de ar
sintético, em razões de aquecimento de 5
o
C.
7.92
7.88
7.84
7.80
7.76
7.72
7.68
massa (mg)
220200180160140120100806040200
T (
o
C)
10.10
10.05
10.00
9.95
9.90
9.85
9.80
9.75
massa (mg)
220200180160140120100806040200
T (
o
C)
LNZ
-
SR
LNZ
-
comp.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 29
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A análise térmica refere-se ao grupo de técnicas nas quais propriedades físico-
químicas de uma substância são mensuradas em função do tempo ou da temperatura
enquanto a amostra é submetida a um programa controlado de temperatura (GIRON
et al., 2002). A aplicação de métodos térmicos de análise, em especial a calorimetria
exploratória diferencial e a termogravimetria, tem sido de fundamental importância no
estudo de caracterização, desenvolvimento e controle de qualidade de produtos
farmacêuticos (BUCKTON et al., 1991). As principais aplicações nessa área têm
visado à caracterização de matérias-primas e produtos acabados (THOMPSON,
2000), caracterização de polimorfismo (IKEDA et al., 2005) determinação do grau de
pureza (KSIQZCZAK et al., 2004) e a realização de ensaios de estabilidade e cinética
de decomposição (HAN e SURYANARAYANAN, 1999; RODRIGUES et al., 2005).
Atualmente, o recurso da análise térmica no domínio farmacêutico é
considerável, não só para o estudo do polimorfismo, mas também pela sua
versatilidade em outras aplicações, tais como: (a) Estudos de compatibilidade
fármaco-fármaco e fármaco-excipiente em pré-formulações; (b) Estudo de
polimorfismo, compostos de inclusão e dispersões sólidas; (c) Determinação da
pureza química; (d) Estudo de reações no estado sólido (estabilidade térmica e
parâmetros cinéticos) e (d) Análise de formas farmacêuticas sólidas.
Em relação à curva de DSC para LNZ-SR, o pico endotérmico que caracteriza
a linezolida encontra-se a 177-179º C. Não houve diferença, em relação ao pico
endotérmico nos comprimidos, que obteve o mesmo ponto de fusão. Isto é um
indicativo que não há interação fármaco excipiente. A DSC permitiu caracterizar e
identificar linezolida nos comprimidos conforme é observado nas Figuras 3.2. Desta
forma, a DSC pode ser utilizada nas monografias de fármacos em determinação da
faixa de fusão de substâncias, permitindo a caracterização quanto a aspectos como
pureza e polimorfismos (GIRON-FOREST et al., 1989). Foi realizada também a análise
termogravimétrica de LNZ-SR e LNZ-comp. Observando-se a Figuras 3.3, pode-se
concluir que a perda de massa de LNZ-SR e LNZ-comp. são praticamente
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 30
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
insignificantes, em torno de ± 4,0 %, mostrando-se termoestável até a temperatura de
180º C.
3.2.2.5. Cromatografia em camada delgada
3.2.2.5.1. Método
As placas utilizadas para identificação do fármaco foram cromatofolhas de
sílica-gel 60 F
254
(20 x 20 cm), com espessura de 0,25 mm, adquiridas comercialmente
e ativadas em estufa a 105
o
C por uma hora.
Pesou-se 5,0 mg de LNZ-SR, previamente dessecados em estufa a 105
o
C, por
uma hora, transferindo para balão volumétrico de 50 mL, dissolvendo a solução com
metanol, para obtenção de solução com concentração final de 100, µg/mL.
Pesou-se o equivalente a 50,0 mg de linezolida da amostra de comprimidos,
transferindo-os para balão volumétrico de 50 mL, dissolvendo a solução em metanol,
para obtenção de solução com concentração de 1000 µg/mL. Alíquota de 1,0 mL
foram transferidas para balão volumétrico de 10 mL, para obtenção de solução com
concentração de 100,0 µg/mL.
Pesou-se o equivalente a 50,0 mg de LNZ-comp. degradados na luz UVC por
30 dias, transferindo-os para balão volumétrico de 50 mL, dissolvendo a solução em
metanol, para obtenção de solução com concentração final de 1000 µg/mL.
Foram testados os seguintes sistemas de fases móveis com solução-padrão,
solução-amostra e solução de amostras degradadas em luz UVC por 30 dias de
linezolida em placas de sílica gel 60 F
254
. Os sistemas testados foram os seguintes:
Sistema 1: clorofórmio : metanol : ácido fórmico (18:7:1) V:V:V
Sistema 2: diclorometano : metanol : ácido acético 5% : água (3:3:1:3) V:V:V:V
Sistema 3: diclorometano : metanol : acetonitrila : ácido acético 5% (6:4:4:2) V:V:V:V
Sistema 4: isopropanol : ácido acético : água (4:1:5) V:V:V
Sistema 5: ácido acético 1% : metanol : acetonitrila (50:25:25) V:V:V
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 31
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Sistema 6:isobutanol : amônia:metanol (7:1:2) V:V:V.
Sistema 7: metanol : acetonitrila (70:30) V:V
Sistema 8: metanol : hexano (50:50) V:V
Sistema 9:clorofórmio : metanol (80:20) V:V
Sistema 10: isobutanol : amônia (9:1) V:V.
Sistema 11: metanol : isopropanol (80:20) V:V
Sistema 12: metanol : acetato de etila (85:15) V:V
Sistema 13: diclorometano : metanol : hidróxido de amônio (6:4:2) V:V:V:V
Sistema 14: n-Butanol : ácido acético : água (40:10:50) V:V:V
Sistema 15: isobutanol : amônia 25% (9:1) V:V.
Sistema 16: diclorometano : metanol : acetonitrila : ácido acético (6:4:2:2) V:V:V:V
Sistema 17: hexano : acetato de etila (50:50) V:V
Para o ensaio, procedeu-se, inicialmente, à saturação da placa com o sistema de
fase móvel. Com auxílio de seringa de 25 µL foram transferidas as soluções de LNZ-
SR, LNZ-comp. e LNZ-DEG. para as placas procedendo-se a cromatografia. Após
migração da fase móvel, a placa foi retirada da cuba de vidro, deixando o solvente
evaporar. As placas foram reveladas na câmara UV, para a comparação das manchas
quanto à forma, posição e tamanho. Foi determinado o Rf do fármaco em cada
análise.
3.2.2.5.2. Resultados e discussão
A Tabela 3.3 mostra os Rf dos diversos sistemas solventes empregados na
análise de LNZ-SR, LNZ-comp. e LNZ-DEG.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 32
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Tabela 3.3. Sistemas de fases móveis testados para LNZ-SR, LNZ-comp. e LNZ-DEG.
Sistema solvente LNZ-SR
(Rf)
LNZ-comp
(Rf)
LNZ-
DEG.(Rf)
1
clorofórmio: metanol: ácido fórmico
(18:7:1)
0,93 0,93 0,58/0,83
2
diclorometano: metanol: ácido acético 5
%: água (3:3:1:3)
0,92 0,92 *
3
diclorometano:metanol:acetonitrila:ácido
acético (6:4:4:2)
0,90 0,90 *
4
isopropanol:ácido acético:água (4:1:5) 0,87 0,87 0,62*
5
ácido acético 1%: metanol: acetonitrila
(50:25:25)
0,85 0,85 0,65
6
isobutanol:amônia:metanol (7:1:2) 0,79 0,79 *
7
metanol:acetonitrila (70:30) 0,77 0,77 0,59
8
metanol:hexano (50:50) 0,75 0,75 *
9
clorofórmio:metanol (80:20) 0,73 0,73 0,61
10
isobutanol:amônia 25% (9:1) 0,71 0,71 *
11
metanol:isopropanol (80:20) v:v. 0,71 0,71 0,58
12
metanol:acetato de etila (85:15) 0,71 0,71 *
13
diclorometano: metanol: hidróxido de
amônio (6:4:2)
0,71 0,71 *
14
n-butanol: ácido acético: água
(40:10:50)
0,57 0,57 0,46/0,33
*
15
isobutanol:amônia (9:1) 0,38 0,38 *
16
diclorometano: metanol: acetonitrila:
ácido acético 5% (6:4:2:2)
0,36 0,36 *
17
hexano:acetato de etila (50:50) 0,10 0,10 *
*
Não houve separação dos produtos de degradação
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 33
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 3.4 mostra as fotos dos cromatogramas de LNZ-SR, LNZ-comp. e
LNZ-DEG. nos solventes do sistema 1, sistema 2, sistema 5 e sistema 6.
Figura 3.4. Fotos dos cromatogramas de LNZ-SR (1), LNZ-comp. (2), LNZ-DEG (3)
nos solventes dos sistemas 1, sistema 2, sistema 5 e sistema 6.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 34
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 3.5 mostra as fotos dos cromatogramas de LNZ-SR, LNZ-comp. e
LNZ-DEG. nos solventes do sistema 7, sistema 11, sistema 12 e sistema 15.
Figura 3.5. Fotos dos cromatogramas de LNZ-SR (1), LNZ-comp. (2), LNZ-DEG (3)
nos solventes dos sistemas 7, sistema 11, sistema 12 e sistema 15.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 35
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 3.6 mostra as fotos dos cromatogramas de LNZ-SR, LNZ-comp. e
LNZ-DEG. nos solventes do sistema 16 e sistema 17.
Figura 3.6. Fotos dos cromatogramas de LNZ-SR (1), LNZ-comp. (2), LNZ-DEG
(3), nos solventes do sistema 16 e sistema 17.
A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica flexível, pois permite
a utilização dos mais variados sistemas eluentes e agentes reveladores, os quais são
determinados de acordo com as características da amostra em teste.
Foi empregada com o objetivo de identificar a linezolida, nos comprimidos, e
também para distinguir linezolida de possíveis produtos de degradação do fármaco,
utilizando para isso vários sistemas solventes. A linezolida indica, no UV-longo, uma
mancha bem característica, de intensidade de cor roxa, facilmente identificável.
Através da análise da estrutura química da linezolida, podemos concluir que é uma
molécula polar, com grupos funcionais orgânicos bem característicos.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 36
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A maioria dos sistemas solventes testados são adequados para identificar a
linezolida em comprimidos, com exceção do sistema 17, com Rf = 0,10, sistema
notadamente mais apolar e os sistemas 2 (Rf = 0,92), sistema 3 (Rf = 0,90) e sistema
4 (Rf = 0,87), sistemas muito polares, com valores de Rf muito elevados.
O sistema 17, hexano : acetato de etila (Rf = 0,10) foi testada para identificar um
possível produto de degradação de linezolida mais apolar. Os outros sistemas
solventes possuíam características mais polares, devido a isto, os Rfs foram
satisfatórios para estas fases móveis.
Os sistemas testados, com algumas exceções, apresentaram a capacidade
adequada de identificar linezolida nos comprimidos, mas não foram capazes de
identificar produtos de degradação nas amostras de comprimidos degradadas frente a
luz UVC. Provavelmente, os produtos de degradação formados possuíam estruturas
químicas muito semelhantes, dificultando a separação por CCD. O sistema solvente
clorofórmio : metanol : ácido fórmico (sistema 1) foi capaz de identificar dois produtos
de degradação nas amostras expostas à luz UVC por 30 dias. Neste sistema LNZ-SR
possui Rf = 0,93 e para os produtos de degradação Rf = 0,58 e Rf = 0,83. A Figura 3.4
mostra a fotografia deste sistema. O produto de degradação com Rf = 0,83 não se
separou totalmente de LNZ-comp. nesta análise.
O sistema ácido acético : metanol : acetonitrila (sistema 5) mostra Rf para LNZ-
SR equivalente a 0,85 e para o produto de degradação Rf = 0,65. A Figura 3.4 mostra
o cromatograma do sistema solvente metanol : acetonitrila (sistema 7) com Rf = 0,77
para LNZ-SR e Rf = 0,59 para o produto de degradação. O sistema solvente
clorofórmio : metanol (sistema 9) obteve para LNZ-SR Rf = 0,73 e para LNZ-DEG. Rf =
0,61. O último sistema solvente com capacidade de diferenciar os produtos de
degradação formado foi metanol : isopropanol (sistema 11) com Rf = 0,71 para LNZ-
SR e Rf = 0,58 para LNZ-DEG (Figura 3.5).
Na literatura foram encontrados dois trabalhos com CCD, como objetivo de isolar
o produto de degradação alcalina desta molécula. BEBAWY (2003a) desenvolveu e
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 37
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
validou dois métodos, um cromatográfico e outro espectrofotométrico, na presença de
um produto de degradação alcalina, sendo isolado por CCD, utilizando como fase
móvel isobutanol : amônia 25% (9:1). Tentou-se reproduzir esta fase móvel para
separação dos produtos de degradação formados pela luz UVC, mas não se obteve
sucesso.
A CCD apresenta-se como uma importante ferramenta, com a qual é possível
identificar a maioria das moléculas farmacêuticas. Além disso, é de fácil execução e
compreensão, versátil e de baixo custo. O método por CCD desenvolvido demonstrou
ser adequado para a identificação de linezolida na forma farmacêutica, e o melhor
sistema desenvolvido e adequado para identificação de produtos de degradação foi o
sistema 1.
3.2.3. Análise quantitativa
3.2.3.1. Espectrofotometria na região ultravioleta
3.2.3.1.1. Espectro de absorção de LNZ-SR
O espectro de absorção de LNZ-SR foi obtido em água ultrapura, em
concentração de 20 µg/mL na região UV. As leituras foram realizadas entre 200–400
nm em espectrofotômetro Hewlet Packard Mod. 8453, com software chemstation UV –
visível, utilizando-se cubetas de quartzo com 1 cm de caminho óptico. O espectro de
absorção no ultravioleta de LNZ-SR foi obtido em vários solventes: água ultrapura,
metanol, etanol, tampão fosfato pH 6,0, 7,4 e 8,0, ácido clorídrico 0,1 M e hidróxido de
sódio 0,1 M, em concentração de 20 µg/mL.
A identificação de linezolida nos comprimidos foi realizada por sobreposição dos
espectros obtidos (LNZ-SR e LNZ-comp.) e comparação quanto ao seu perfil
característico e comprimentos de onda.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 38
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
3.2.3.1.1.2. Resultados e discussão
A Figura 3.7 ilustra o espectro de absorção na região UV de LNZ-SR com
concentração de 20 µg/mL em água ultrapura, HCl 0,1 M e NaOH 0,1 M.
Figura 3.7. Espectro de absorção de solução de LNZ-SR, na concentração de 20
µg/mL, por espectrofotometria na região do UV, utilizando água ultrapura, HCl 0,1
M e NaOH 0,1 M.
O espectro de absorção na região UV de LNZ-SR em metanol e etanol com
concentração de 20 µg/mL, está representado na Figura 3.8 e em tampão fosfato
pH 6,0, 7,4 e 8,0 na Figura 3.9.
Figura 3.8. Espectro de absorção de solução de LNZ-SR, na concentração de 20
µg/mL, por espectrofotometria na região do UV, utilizando metanol e etanol, com
comprimento de onda máximo de 256 nm.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 39
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Figura 3.9. Espectro de absorção de solução de LNZ-SR, na concentração de 20
µg/mL, por espectrofotometria na região do UV, utilizando tampão fosfato pH 6,0,
7,4 e 8,0, com comprimento de onda máximo em 251 nm.
A Figura 3.10 mostra os espectros sobrepostos de LNZ-SR e LNZ-comp. em
água em concentração de 12 µg/mL.
Figura 3.10. Espectros sobrepostos de LNZ-SR e LNZ-comp., em água ultrapura na
concentração de 12 µg/mL, com comprimento de onda máximo em 251 nm.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 40
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A espectrofotometria na região do ultravioleta engloba uma série de aplicações
na análise farmacêutica, destacando-se a identificação e quantificação de fármacos, a
determinação do pKa, a determinação dos coeficientes de partição e solubilidade, e a
determinação da liberação da substância ativa de uma formulação, como, por
exemplo, no teste de dissolução (WATSON, 1999). O fármaco mostrou-se solúvel em
água, metanol, etanol, HCl 0,1 M e NaOH 0,1 M. Em NaOH 0,1 M, LNZ-SR apresentou
um espectro de absorção sugestivo de degradação alcalina (Figura 3.7), pois,
observa-se uma menor absorção e a formação de um pico em comprimento de onda
de aproximadamente 214 nm. O pico de absorção máxima em HCl 0,1 M (244 nm)
apresentou um deslocamento hipsocrômico, em relação à absorção em água (251
nm). Isto ocorre, provavelmente, devido ao efeito auxocrômico do solvente (HCl 0,1 M)
sobre o cromóforo.
O metanol e o etanol apresentaram o mesmo comprimento de onda e um
deslocamento batocrômico, em relação à absorção máxima em água (Figura 3.8). A
absorção em soluções tampão fosfato pH 6,8, 7,2 e 8,0, demonstraram mesmo pico de
absorção máxima de LNZ-SR em água (Figura 3.9). Neste caso, observa-se, que, em
tampão fosfato pH 8,0, há uma maior absorção de linezolida. Os espectros de
absorção obtidos na análise de LNZ-SR e de LNZ-comp., em água, demonstraram
perfis similares, sugerindo a mesma identidade das amostras (Figura 3.10). Os
espectros obtidos nos diferentes solventes foram todos satisfatórios, mas em água
observa-se um espectro bem característico, em comprimento de onda adequado, em
que não se verifica a interferência de solventes nas análises. Neste caso, preconizar a
água como solvente de escolha para identificação de linezolida em comprimidos seria
a opção mais adequada.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 41
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
3.2.3.1.2. Método
Para validação do método por espectrofotometria na região UV foram
determinadas as seguintes características:
- Linearidade: seis níveis de concentração foram avaliados. As curvas foram
obtidas em três diferentes dias.
- Precisão: foram realizadas seis análises de linezolida nas amostras com
concentração teórica de 12 µg/mL, no mesmo dia e sob as mesmas condições
experimentais. A precisão do método foi avaliada pelo desvio padrão relativo de
linezolida.
- Precisão intermediária: foi avaliada pela realização de análises das amostras
por diferentes analistas e em três diferentes dias.
- Exatidão: foi determinada pelo teste de recuperação.
- Especificidade: foi avaliada pela possível interferência dos excipientes na
determinação quantitativa de linezolida e foram comparados os espectros de absorção
obtidos do fármaco e dos excipientes presentes nos produtos farmacêuticos.
- Limite de detecção e limite de quantificação: foram determinados pelas
equações indicadas pelo ICH (1996).
3.2.3.1.2.1. Obtenção da curva de Ringbom
A curva de Ringbom foi obtida com o objetivo de estabelecer a faixa de
concentração na qual o método espectrofotométrico na região UV apresentava
linearidade. Foram pesados, 10,0 mg de LNZ-SR, previamente dessecados em estufa
a 105
o
C durante uma hora e transferidos para balão volumétrico de 100 mL. A
substância foi dissolvida em água e mantida em ultrassom por 10 minutos. O volume
do balão foi completado, obtendo-se solução com concentração final de 100,0 µg/mL.
A partir desta solução, foram transferidas alíquotas para balões volumétricos, obtendo-
se a curva com 19 pontos, com concentrações variando de 1,0 a 40,0 µg/mL de LNZ-
SR. A curva de Ringbom foi obtida plotando-se os valores de transmitância e de
concentração em escala logarítmica.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 42
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
3.2.3.1.2.2. Obtenção da curva analítica para linezolida utilizando água
Para a obtenção da curva analítica, foram pesados 10,0 mg de LNZ-SR,
previamente dessecados em estufa a 105
o
C durante uma hora, transferidos para balão
volumétrico de 100 mL, dissolvidos em água ultrapura e mantidos em aparelho de
ultrassom por 10 minutos, para melhor solubilização. Com a utilização de micro-bureta
foram obtidas soluções com concentrações de 6,0 a 16,0 µg/mL de linezolida-SR. As
leituras das soluções foram efetuadas a 251 nm, utilizando água ultrapura como
branco. A curva analítica foi construída em três diferentes dias e em triplicata,
utilizando o programa Origin 5.0. A representação gráfica da equação da reta foi
determinada pela análise de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados. As
absorvâncias utilizadas na determinação da curva analítica foram estatisticamente
avaliadas pela análise de variância (ANOVA).
3.2.3.1.2.3. Determinação dos limites de detecção e de quantificação
O limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) de linezolida foi
determinado a partir das três curvas analíticas obtidas, utilizando-se os dados de
desvio padrão do intercepto e inclinação média (ICH, 2005):
3.2.3.1.2.4. Determinação de linezolida nos comprimidos
Foram pesados 20 comprimidos para a determinação do peso médio, o qual foi
equivalente a 864,42 mg. foi pesado o equivalente ao peso médio dos comprimidos,
triturado e transferido para balão volumétrico de 1000 mL. Foram adicionados 500 mL
de água ultrapura e a solução foi mantida em aparelho de ultrassom por 20 minutos. O
volume foi completado para a obtenção de solução com concentração de 600,0 µg/mL.
Foram transferidas alíquotas de 10,0 mL para balões volumétricos de 100 mL e o
volume completado com água (concentração teórica de 60,0 µg/mL). Desta solução,
foram retiradas alíquotas de 5,0 mL para balões volumétricos de 25 mL e os volumes
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 43
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
foram completados com água para a obtenção de soluções com concentrações
teóricas de 12,0 µg/mL. Este procedimento foi realizado em triplicata.
As leituras das soluções foram realizadas em espectrofotômetro a 251 nm,
utilizando-se cubetas de quartzo com 1 cm de caminho óptico empregando água como
branco.
3.2.3.1.2.5. Exatidão do método proposto
Foi preparada solução de LNZ-SR com concentração de 10,0 µg/mL. As
soluções da amostra foram preparadas com concentração de 60,0 µg/mL, a partir da
solução de linezolida em comprimidos com concentração de 600,0 µg/mL. As soluções
foram transferidas para balão volumétrico de 25 mL, completando-se o volume com
água ultrapura. A Tabela 3.4 relaciona as concentrações das soluções obtidas para o
teste de recuperação de LNZ-SR usando método espectrofotométrico na região UV.
Tabela 3.4. Concentração das soluções do teste de recuperação aplicado à amostra
de linezolida usando método espectrofotométrico na região UV a 251 nm
Solução amostra 60 µg/mL
(mL)
Solução LNZ-SR
10 µg/mL (mL)
Concentração
(µg/mL)
A 5,0 - 12,0
R
1
5,0 1,0 12,4
R
2
5,0 2,0 12,8
R
3
5,0 3,0 13,2
P - 6,0 12,0
3.2.3.1.2.6. Avaliação da especificidade
Foi preparada solução de LNZ-SR na concentração de 12,0 µg/mL em água.
Paralelamente, uma solução contendo os excipientes presentes nos comprimidos, foi
preparada em água utilizando diluição equivalente à solução de LNZ-SR, em
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 44
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conformidade com o peso médio dos comprimidos. A composição dos excipientes
encontra-se na Tabela 3.5.
Tabela 3.5. Composição da amostra dos excipientes
Excipiente Percentual (%)*
amido de milho 10
celulose microcristalina 80
estearato de magnésio 1
amidoglicolato de sódio 4
hipromelose 2
*Determinadas de acordo com as especificações de concentrações porcentuais
médias descritas para cada excipiente (KIBBE, 2000)
As soluções preparadas para o teste foram colocadas em banho de ultrassom
por 20 minutos. Os espectros de absorção foram comparados, verificando a possível
interferência dos excipientes na determinação do teor de linezolida.
3.2.3.1.3. Resultados
3.2.3.1.3.1. Curva de Ringbom de linezolida
A Tabela 3.6 relaciona os valores utilizados na construção da curva de
Ringbom para LNZ-SR utilizando água ultrapura como solvente e a Figura 3.11, a
curva de Ringbom correspondente.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 45
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Tabela 3.6. Valores obtidos para construção da curva de Ringbom para LNZ-SR
Volume da solução de LNZ-SR
100
µ
µµ
µ
g/mL (mL)
Concentração
(
µ
µµ
µ
g/mL)
100-T%
0,1 1,0 12,89
0,2 2,0 24,13
0,3 3,0 33,15
0,4 4,0 41,24
0,5 5,0 48,92
0,6 6,0 57,13
0,7 7,0 62,41
0,8 8,0 68,95
0,9 9,0 71,88
1,0 10,0 74,93
1,2 12,0 78,16
1,4 14,0 81,16
1,6 16,0 83,33
1,8 18,0 85,85
2,0 20,0 87,34
2,5 25,0 89,40
3,0 30,0 92,08
3,5 35,0 92,70
4,0 40,0 92,85
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 46
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Figura 3.11. Curva de Ringbom para LNZ-SR (concentração de 1,0 a 40,0 µg/mL).
3.2.3.1.3.2. Construção da curva analítica de linezolida
A Tabela 3.7 mostra os valores experimentais obtidos na construção da curva
analítica de LNZ-SR, utilizando água ultrapura como solvente, e a Figura 3.12 a curva
analítica correspondente.
log concentração (µg/mL)
0,1 1 10 100
1000
100 - T%
0
20
40
60
80
100
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 47
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Tabela 3.7. Valores experimentais obtidos na construção da curva analítica para
linezolida
Concentração
(µg/mL)
Absorvância*
Absorvância
média ± e.p.m.
Desvio
padrão
DPR
%
6,0
0,320
0,330
0,320
0,323 ± 0,0033
0,0057
1,78
8,0
0,437
0,437
0,429
0,434 ± 0,0026
0,0046
1,06
10,0
0,543
0,551
0,540
0,544 ± 0,0026
0,0056
1,04
12,0
0,643
0,654
0,653
0,650 ± 0,0035
0,9358
0,01
14,0
0,763
0,764
0,751
0,759 ± 0,0041
0,0072
0,95
16,0
0,858
0,892
0,881
0,877 ± 0,0100
0,0173
1,97
*Média de três leituras
e.p.m. - erro padrão da média
DPR% - desvio padrão relativo
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 48
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Figura 3.12. Representação gráfica da curva analítica das soluções de linezolida em
concentrações de 6,0 a 16,0 µg/mL usando o método espectrofotométrico na região de
ultravioleta a 251 nm.
3.2.3.1.3.3. Análise estatística
A Tabela 3.8 representa a validade da regressão linear da curva analítica
calculada utilizando análise de variância (ANOVA) dos valores de absorvância obtidos
na curva analítica de linezolida usando o método espectrofotométrico na região UV.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 49
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Tabela 3.8. Análise de variância das absorvâncias obtidas na curva analítica de
linezolida por espectrofotometria na região UV
Fontes de variação
gL
Soma dos
quadrados
Variâ
ncia
F
calc
F
tab
Entre
5 0,634939
0,126988
1596,216*
3,11
Regressão linear
1 0,63481
0,63481
7979,456*
4,75
Desvio de linearidade
4 0,000129
3,23x 10
-
5
0,405622
3,26
Resíduo
12 0,000955
7,96x10
-
5
Total
17 0,635894
*Significativo p< 0,05
3.2.3.1.3.4. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais
obtidos para a curva analítica de linezolida
A Tabela 3.9 relaciona os parâmetros do tratamento estatístico sobre os
valores experimentais obtidos para a curva analítica de linezolida.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 50
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Tabela 3.9. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais
obtidos para a curva analítica de linezolida
Parâmetros
Resultados
λ (nm)
251
Faixa linear (µg/mL) 6,0-16,0
Equação: y = bx + a y = 0,055x – 0,007
Intercepto (a) ± desvio padrão 0,007 ± 0,3168
Inclinação (b) ± desvio padrão 0,055 ± 0,0275
Limite de detecção (µg/mL) 0,57
Limite de quantificação (µg/mL) 1,73
r (coeficiente de correlação) 0,9998
n 6
3.2.3.1.3.5.. Exatidão utilizando o teste de recuperação para linezolida
A Tabela 3.10 demonstra os valores obtidos no teste de recuperação de LNZ-
SR utilizando espectrofotometria UV a 251 nm.
Tabela 3.10. Valores obtidos no teste de recuperação de LNZ-SR utilizando
espectrofotometria UV a 251 nm
Concentração
inicial
(µg/mL)
Concentração
teórica
adicionada
(µg/mL)
Concentração
teórica final
(µg/mL)
Concentração
recuperada
(µg/mL) *
Recuperação
(%) ± DPR
R
1
12,0 0,4 12,4 0,39 99,16 ± 0,33
R
2
12,0 0,8 12,8 0,81 102,2 ± 0,69
R
3
12,0 1,2 13,2 1,19 99,98 ± 0,69
* Média de três determinações
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 51
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3.2.3.1.3.6. Precisão do método e valores experimentais obtidos na determinação do
teor de linezolida nos comprimidos por espectrofotometria na região UV
A Tabela 3.11 relaciona os valores experimentais de linezolida obtidos pelo
método espectrofotométrico na região UV para comprimidos, bem como a precisão do
método.
Tabela 3.11. Valores experimentais de linezolida, obtidos por espectrofotometria na
região UV e a precisão do método representado pelo desvio padrão relativo
q
uantidade
de
linezolida nos
comprimidos (mg)
t
eor (%)
t
eor médio
(%)
d
esvio
padrão
DPR
%
*
1 599,8 99,9
98,7
1,31
1,32
2 587,0 97,8
3 592,2 98,7
4 584,4 97,4
5 603,0 100,5
6 585,0 97,5
DPR- desvio padrão relativo
3.2.3.1.3.7. Avaliação da especificidade
A Figura 3.13 mostra os espectros de absorção das soluções de LNZ-SR e da
amostra dos excipientes obtidos por espectrofotometria na região UV a 251 nm.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 52
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Figura 3.13. Espectro de absorção de LNZ-SR em concentração de 20 µg/mL e a
solução placebo obtidos por espectrofotometria na região UV a 251 nm
3.2.3.1.5. Discussão
A espectrofotometria é um método largamente utilizado para determinação de
vários compostos orgânicos (HARRIS, 2001). Com o conhecimento da estrutura
química de linezolida (Figura 2.1) e verificando que esta molécula possuía ligações
que absorvem luz, foi desenvolvido e validado um método analítico na região UV para
determinação deste fármaco. Para desenvolver o método na região UV, avaliou-se o
espectro de absorção de LNZ-SR em diferentes solventes, bem como a influência de
excipientes do comprimido. O fármaco mostrou-se solúvel em água, metanol, etanol,
HCl 0,1 M e NaOH 0,1 M. Em NaOH 0,1 M, LNZ-SR apresentou um espectro de
absorção sugestivo de degradação alcalina, apresentado na Figura 3.7. Procurando
um método simples, de baixo custo e a utilização de solventes de baixa toxicidade,
optou-se pela água, por ser um solvente atóxico e de fácil acesso. O espectro de
absorção para linezolida mostrou pico de absorção máxima a 251 nm, utilizando
solução aquosa de LNZ-SR em concentração de 20 µg/mL. O espectro da amostra
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 53
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(comprimidos) mostrou o mesmo máximo de absorção que de LNZ-SR. Não houve
nenhuma evidência de interferências dos excipientes nas amostras analisadas. Com o
objetivo de verificar a faixa de concentração que a solução de LNZ-SR apresentava-se
linear, foi realizada a construção da curva de Ringbom. De acordo com a lei de
Lambert-Beer, o intervalo de concentração de 6,0 - 16,0 µg/mL, mostrou-se linear,
apresentando coeficiente de correlação de 0,9998, entre as concentrações
estabelecidas e as absorções lidas. A equação da reta, obtida por regressão linear
pelo método dos mínimos quadrados, foi y = 0,055x – 0,0073; onde x é a
concentração em µg/mL e y é a absorção no UV.
A análise estatística dos resultados das absorvâncias obtidas foi
matematicamente verificada pela análise de variância. Os resultados obtidos, com F
significativo para regressão (1596,216) e não significativo para o desvio de linearidade
(0,405622), valida o método por espectrofotometria na região do UV para
determinação de linezolida. O teor de linezolida nos comprimidos foi 98,7%,
demonstrando a sensibilidade do método para quantificar a substância ativa nos
comprimidos, não ocorrendo interferência dos excipientes na absorção de linezolida. A
precisão do método foi avaliada pelo desvio padrão relativo das amostras, equivalente
a 1,32 %. A exatidão do método foi verificada pelo teste de recuperação (AOAC,
1997), em que se obteve uma recuperação média de LNZ-SR de 100,44%. Com este
resultado, comprova-se a exatidão do método proposto, que é um dos requisitos
obrigatórios na validação de métodos analíticos. O método apresentado mostrou-se
adequado, apresentando simplicidade, especificidade, linearidade na faixa de 6,0-16,0,
precisão e exatidão, podendo ser usado tanto para fins de quantificação como
identificação de linezolida em comprimidos.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 54
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3.2.3.2. Doseamento microbiológico
3.2.3.2.1. Método
3.2.3.2.1.1. Desenvolvimento do ensaio microbiológico
Foram realizados ensaios preliminares para o desenvolvimento do método de
análise de linezolida na forma farmacêutica comprimidos, alternando-se alguns
parâmetros (Tabela 3.12).
Tabela 3.12. Parâmetros testados para otimização do ensaio microbiológico - método
de difusão em ágar- cilindros em placas para linezolida
Parâmetros Descrição
Microrganismos
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Bacillus subtilis ATCC 9372
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
Meio de cultura Meio n
o
11 de Grove-Randall (MERCK)
Meio antibiótico n
o
1 (DIFCO)
Soluções diluentes
Solução tampão fosfato pH 6,0
Solução tampão fosfato pH 8,0
Concentrações das soluções
padrão (µg/mL)
5,0; 10,0; 20,0
20,0; 40,0; 80,0
Após a avaliação dos diversos parâmetros pré-estabelecidos (Tabela 3.13), o
doseamento microbiológico foi desenvolvido e validado com os parâmetros
apresentados na Tabela 3.13.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 55
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Tabela 3.13. Parâmetros usados no desenvolvimento e validação de linezolida no
ensaio microbiológico
Parâmetros
Descrição
Microrganismo Bacillus subtilis ATCC 9372
Meio de cultura Meio antibiótico n
o
1
Solução diluente Tampão fosfato pH 6,0
Concentração do inóculo 2%
Concentrações da solução padrão (µg/mL) 20,0; 40,0; 80,0
Temperatura de incubação (
o
C) 35 ± 1
Tempo de incubação (horas) 18
3.2.3.2.1.2. Preparo do inóculo
O microrganismo-teste Bacillus subtilis ATCC 9372 foi mantido em meio TSB à
35
o
± 1
o
C, durante 24 horas. A padronização foi realizada utilizando espectrofotômetro
a 580 nm com transmitância de 25% ± 2% (Farmacopéia Brasileira, 1988). Após a
padronização, o inóculo foi utilizado a 2 % em meio antibiótico n
o
1 mantido em banho
de vapor à 47
o
C ± 1
o
C.
3.2.3.2.1.3. Ensaio
Foram utilizadas 18 placas de Petri para o doseamento de linezolida em
comprimidos. Em cada ensaio foram utilizadas 6 placas de Petri, e os resultados foram
analisados estatisticamente. Em capela de fluxo laminar, foram transferidos para cada
placa, com auxílio de pipetador automático, 20,0 mL de meio antibiótico n
o
1 para a
camada base. Após a solidificação desta camada, foram adicionados por meio de
pipetador automático, 5,0 mL de meio n
o
1 contendo 2 % de inóculo. Após a
solidificação da camada semeada, foram distribuídos, equidistantemente, 6 cilindros
de aço inoxidável por placa. Cada cilindro recebeu 200,0 µL das soluções do padrão
ou da amostra (comprimido), em delineamento 3 x 3 (Figura 3.14).
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 56
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As placas foram colocadas em estufa incubadora à 35
o
C ± 1
o
C. Após 18 horas,
foram realizadas as medidas dos diâmetros dos halos de inibição ao centésimo de
milímetro, com auxílio de paquímetro. Em cada ensaio os resultados foram analisados
estatisticamente e a potência de cada doseamento calculada. A potência do
medicamento foi calculada pela equação de Hewitt (1977).
Figura 3.14. Delineamento 3 x 3 demonstrando a disposição das soluções padrão
(P) e amostra (A) na placa de Petri, onde P
1
(20,0 µg/mL); P
2
(40,0 µg/mL); P
3
(80,0
µg/mL) e A
1
(20,0 µg/mL); A
2
(40,0 µg/mL); A
3
(80,0 µg/mL).
3.2.3.2.1.4. Cálculo da potência do medicamento
A potência do fármaco foi determinada pela equação (Equação 3.3) de HEWITT
(1977). Os ensaios foram realizados em dias diferentes, e cada amostra corresponde
à média de seis determinações.
Equação 3.3:
T/R (%) = Antilog M x 100
M=F/b b = E/I
Na qual:
F= 1/3[(A
1
+A
2
+ A
3
) - (P
1
+P
2
+ P
3
)]
I = logaritmo da razão das doses
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 57
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3.2.3.2.1.5. Validação do método microbiológico
Para validação do método microbiológico foram determinadas as seguintes
características:
- Linearidade: três níveis de concentração foram avaliados. As curvas foram obtidas
em três diferentes dias.
- Precisão: foram realizadas seis análises de linezolida nas amostras com
concentração teórica de 20,0, 40,0 e 80,0 µg/mL, no mesmo dia e sob as mesmas
condições experimentais. A precisão do método foi avaliada pelo desvio padrão
relativo de linezolida.
- Exatidão: foi determinada pelo percentual de recuperação de LNZ-SR adicionada
à amostra.
3.2.3.2.1.6. Construção da curva analítica
A curva analítica foi construída em gráfico logaritmo da concentração versus o
diâmetro dos halos de inibição, com as médias dos diâmetros de cada uma das
concentrações da substância de referência. A curva foi construída utilizando o
programa Origin 5.0. A equação da reta para representação gráfica da curva analítica
foi determinada pela regressão linear, pelo método dos mínimos quadrados. Para a
construção da curva analítica foram utilizados três pontos, cada um representando a
média de três determinações. A análise estatística foi realizada pela análise de
variância (ANOVA), segundo tratamento estatístico preconizado pela Farmacopéia
Brasileira (1988) para ensaio 3 x 3.
3.2.3.2.1.7. Preparo das soluções-padrão
Foram transferidos 10,0 mg de LNZ-SR, para balão volumétrico de 100 mL e
dissolvidos em água para obtenção de solução com 100,0 µg/mL. A solução foi levada
ao ultrassom por 10 minutos, para melhor solubilização. A partir desta solução foram
transferidos, 2,0, 4,0 e 8,0 mL para balões volumétricos de 10 mL, completando-se o
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 58
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volume com solução de tampão fosfato pH 6,0 para obtenção de soluções com
concentrações de 20,0; 40,0 e 80,0 µg/mL.
3.2.3.2.1.8. Preparo das soluções de linezolida na forma farmacêutica
Foram pesados 20 comprimidos para a determinação do peso médio, o qual foi
equivalente a 864,42 mg. Depois de triturados manualmente em gral, uma quantidade
de pó equivalente a um peso médio foi exatamente pesado e transferido para balão
volumétrico de 1000 mL. Foram adicionados 500 mL de água ultrapura e a solução foi
mantida em aparelho de ultrassom por 20 minutos. O volume foi completado com água
para a obtenção de solução com concentração de 600,0 µg/mL. Alíquota de 25,0 mL
foi transferida para balão volumétrico de 150 mL e o volume completado com solução
tampão pH 6,0, perfazendo uma solução com concentração de 100,0 µg/mL. A partir
desta solução foram transferidas alíquotas de 2,0 4,0 e 8,0 mL para balões
volumétricos de 10 mL, obtendo-se soluções com concentrações finais de 20,0, 40,0 e
80,0 µg/mL.
3.2.3.2.1.9. Exatidão do método
O teste de recuperação para o método microbiológico foi realizado para avaliar a
exatidão do método proposto.
3.2.3.2.1.9.1. Preparo das soluções
Neste ensaio, preparou-se uma solução de substância de referência com
concentração de 100,0 µg/mL. Para preparo da solução amostra pesou-se o
equivalente a 100,0 mg, que foram transferidos para balões volumétricos de 100 mL. A
solução amostra adicionada da substância de referência foi preparada retirando-se
uma alíquota de 10,0 mL da solução amostra, anteriormente preparada, transferindo
para balão volumétrico de 100 mL. Em cada balão foram adicionados 50,0 mL de água
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 59
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levando ao ultrassom para melhor solubilização. Adicionou-se alíquota de 5,0 mL da
solução-padrão no balão 1 (recuperação 1), 10,0 mL de solução-padrão no balão 2
(recuperação 2) e 15,0 mL no balão 3 (recuperação 3). A Tabela 3.14 representa o
esquema de preparo das amostras no teste de recuperação.
Tabela 3.14. Esquema de preparo das soluções para análise do teste de recuperação
de linezolida no doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em placa
Quantidade da
amostra
adicionada
(µg)
Quantidade da solução
padrão adicionada 100
µg/mL (mL)
Concentração teórica
de amostra + padrão
µg/ 100 mL
1
10000,0 5,0 105,0
2
10000,0 10,0 110,0
3
10000,0 15,0 115,0
A partir destas soluções foram transferidas alíquotas de 2,0, 4,0 e 8,0 mL para
balões volumétricos de 10 mL, completando os volumes dos balões com tampão
fosfato pH 6,0, para obtenção das seguintes concentrações teóricas:
- Para o teste de recuperação 1: 21,0, 42,0 e 84,0 µg/mL
- Para o teste de recuperação 2: 22,0, 44,0 e 88,0 µg/mL
- Para o teste de recuperação 3: 23,0, 46,0 e 92,0 µg/mL
Após a execução do ensaio, as placas foram colocadas em estufa incubadora à
35
o
C ± 1
o
C. Após 18 horas, foram realizadas as medidas dos diâmetros dos halos de
inibição ao centésimo de milímetro, com auxílio de paquímetro. A potência do
antimicrobiano foi calculada pela equação de Hewitt (1977), e a partir do valor
encontrado, foi calculada a concentração experimental da solução amostra adicionada
de padrão.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 60
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
3.2.3.2.2.10. Precisão do método
A precisão do método proposto foi avaliada pelo desvio padrão relativo da
concentração de linezolida nos comprimidos.
3.2.3.2.2. Resultados
3.2.3.2.2.1. Curva analítica de linezolida no doseamento microbiológico
A Tabela 3.15 mostra os valores obtidos na construção da curva analítica no
ensaio microbiológico de linezolida.
Tabela 3.15. Valores médios obtidos no doseamento microbiológico de linezolida, em
difusão em ágar cilindros em placa, para obtenção da curva analítica
Concentração
de LNZ-SR
(µg/mL)
Diâmetro dos halos
de inibição*(mm)
Diâ
metro
médio (mm)
Desvio
padrão
DPR
(%)
P
1
20,0
16,42
16,25
16,44
16,37
0,1044
0,63
P
2
40,0
19,69
19,54
19,50
19,57
0,1001
0,51
P
3
80,0
22,68
22,56
22,56
22,60
0,0693
0,30
* Cada valor corresponde a média de 6 halos de inibição
DPR%- desvio padrão relativo
3.2.3.2.2.2. Construção da curva analítica de LNZ-SR no doseamento microbiológico
pelo método de difusão em ágar, cilindros em placa
A curva analítica do doseamento microbiológico pelo método de difusão em
ágar, cilindros em placa de LNZ-SR está representada na Figura 3.15.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 61
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Figura 3.15. Curva analítica de LNZ-SR obtida no doseamento microbiológico
em difusão em ágar, cilindros em placa.
3.2.3.2.2.3. Análise estatística
A Tabela 3.16 mostra os resultados da análise de variância dos dados obtidos
no doseamento de linezolida pelo ensaio microbiológico difusão em ágar-cilindros em
placa
Tabela 3.16. Análise de variância dos dados obtidos no doseamento de linezolida pelo
ensaio microbiológico difusão em ágar - cilindros em placa
Fontes d
e variação
gL
SQ
QM
F
cal
F
tab
.
Preparação
1 0,127211
0,1272 1,50 4,24
Regressão
1 271,421 271,421
3200,451* 4,24
Desvio de paralelismo
1 0,246038
0,246038
2,9011 4,24
Quadrático
1 0,488401
0,488401
5,758967 4,24
Diferença de quadrático
1 0,050668
0,050668
0,597451 4,24
Entre doses
5 272,3333
54,46666
642,2417* 2,6
Entre placas
5 0,734522
0,146904
1,7322 2,6
Dentro (erro)
25 2,120178
0,084807
- -
Total
35 275,188 - -
* significativo para P < 0,05
gL – graus de liberdade
SQ – soma dos quadrados
QM- variância
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 62
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3.2.3.2.2.4. Determinação da potência do medicamento
Os resultados obtidos na determinação de linezolida comprimido no ensaio
microbiológico, calculados pela fórmula de HEWITT (1977), estão demonstrados na
Tabela 3.17.
Tabela 3.17. Valores experimentais obtidos para o doseamento de linezolida pelo
ensaio microbiológico difusão em ágar cilindros em placa
Valor rotulado
(mg/comprimido)
Valor encontrado
(mg/comprimido)
Teor (%) DPR (%)
Intra-dias
DPR(%)
Inter-dias
600,0
612,84 102,14
0,39
0,61
614,88 102,48
607,62 101,27
DPR: desvio padrão relativo
3.2.3.2.2.5. Teste de recuperação de linezolida no ensaio microbiológico
A Tabela 3.18 relaciona os valores experimentais obtidos no teste de
recuperação do ensaio microbiológico das três concentrações elaborada para análise
de linezolida.
Tabela 3.18. Valores experimentais obtidos no doseamento microbiológico de
linezolida no teste de recuperação para o ensaio das três amostras (R
1
, R
2
e R
3
)
Concentração teórica da
amostra + padrão (µg)
Potência em
cada ensaio
(%)
Concentração encontrada
(mg)*
R
1
105,0 107,59 0,51
R
2
110,0 111,04 1,00
R
3
115,0 117,18 1,47
*O cálculo é realizado levando em consideração o valor de amostra adicionada.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 63
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A Tabela 3.19 mostra os valores experimentais obtidos no teste de recuperação
de linezolida no doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em placa.
Tabela 3.19. Valores experimentais obtidos no teste de recuperação de linezolida no
doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em placa
Concentração de
substância de referência
adicionada (mg)
Atividade de padrão
recuperada (mg)
Recuperado (%)
1
0,5 0,51 102,0
2
1,0 1,00 100,0
3
1,5 1,47 98,0
3.2.3.2.3. Discussão
O doseamento microbiológico por difusão em ágar, cilindros em placa, é um
método específico para antibióticos, antimicrobianos e antifúngicos. O ensaio
microbiológico vem sendo utilizado em laboratórios clínicos desde a introdução de
antibióticos e outros agentes antimicrobianos. Na terapêutica, muitos métodos de
ensaio foram elaborados pela própria indústria farmacêutica para controle das
preparações comerciais (ANDREWS, 1999). Embora os métodos microbiológicos
demonstrem um desempenho relativamente simples, muitos aspectos devem ser
considerados no seu desenvolvimento, para assegurar que eles sejam suficientemente
seguros e exatos. Tais métodos necessitam de mão-de-obra especializada e técnica
apurada. Vários aspectos devem ser observados durante o desenvolvimento do
método, como temperatura de incubação, espessura do ágar, microrganismo utilizado,
pH da solução diluente, entre outras características para garantir que o método
desenvolvido apresente uma resposta eficiente. A literatura, apresenta alguns artigos
que relatam o doseamento de difusão em ágar cilindros em placa, utilizando diferentes
classes de antibióticos e antimicrobianos como gentamicina (RATCLIFF et al., 1981;
DELANEY et al., 1982), gatifloxacino (SALGADO et al., 2006), cefoxitina (TOZO e
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 64
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
SALGADO, 2007) cefalosporinas (BIEDENBACH et al., 1993; MORENO e SALGADO,
2008; SOUZA et al., 2006; SCHMIDT et al., 2008), esparfloxacino (MARONA e
SCHAPOVAL, 1998), azitromicina (BREIER et al., 2002; SALGADO e RONCARI,
2006), telitromicina (VAUCHER et al., 2006) e ofloxacino (EV e SCHAPOVAL, 2002).
Para desenvolver e validar o método, foram realizados alguns testes no
doseamento microbiológico, utilizando vários parâmetros, como, por exemplo,
diferentes cepas bacterianas. As bactérias selecionadas para padronização do método
foram Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 e
Bacillus subtilis ATCC 9372. Staphylococcus aureus ATCC 6538, respondeu
adequadamente com crescimento uniforme e formação de halos de inibição nítidos.
No entanto, por ser uma cepa de alta virulência para o ser humano, esta opção só
seria utilizada caso as outras cepas não respondessem adequadamente, quando os
outros parâmetros fossem analisados.
A espécie bacteriana Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 foi analisada,
mas a resposta do crescimento microbiano foi irregular. Posteriormente, foi utilizado o
Bacillus subtilis ATCC 9372, que obteve um crescimento satisfatório e uniforme. As
concentrações utilizadas no desenvolvimento e validação do método foram
estipuladas, de acordo com a facilidade de diluição das soluções.
A solução tampão escolhida apresentava pH 6,0, pois nas soluções com tampão
pH 8,0, os halos de inibição do antimicrobiano interpolaram-se e, com isso invalidaram
o método microbiológico. Isso ocorreu, provavelmente devido ao caráter básico de
linezolida e em pH 8,0, potencializava seu efeito. O doseamento em difusão em ágar
cilindros em placa desenvolvido e validado para linezolida demonstrou ser um método
preciso, exato, linear e sensível. Para assegurar a validade do ensaio microbiológico
na determinação da potência de linezolida, foram utilizadas três concentrações
diferentes para amostra, idênticas às da substância de referência, em delineamento 3
x 3. Estas doses estão em progressão geométrica (razão 2,0), já que o sistema
utilizado possui relação linear entre o logaritmo da concentração da substância
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 65
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
analisada e o diâmetro dos halos de inibição. Em cada ensaio foram utilizadas seis
placas, efetuando-se a leitura dos halos de inibição. Com os resultados obtidos foi
construída a curva analítica para LNZ-SR, obtendo-se um coeficiente de correlação de
r
2
= 0,9998.
A potência dos comprimidos foi calculada pela equação de Hewitt (HEWITT,
1977), obtendo-se teor médio de 101,96 %, com desvio padrão relativo de 0,61 %,
mostrando que o método é preciso. O teste de recuperação foi efetuado com o
objetivo de comprovar a exatidão do método proposto. Desta forma, quantidades
conhecidas da substância de referência foram adicionadas nas soluções de linezolida
comprimidos, para quantificação da substância. Os resultados obtidos demonstraram
que o método desenvolvido possui exatidão, precisão e linearidade. O ensaio foi
validado, através de análise estatística, utilizando análise de variância, descrita na
Farmacopéia Brasileira (1988).
3.2.3.3. Método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
3.2.3.3.1. Análise qualitativa
A fase móvel foi preparada a partir da mistura de ácido acético 1%: acetonitrila:
metanol na proporção 50 : 25 : 25, V:V:V. A fase móvel foi filtrada através de
membrana com poro de 0,45 µm e 47 mm de diâmetro, sob vácuo, desgaseificada no
ultrassom, durante 15 minutos. O equipamento utilizado foi o cromatógrafo a líquido
Waters e coluna symmetry Waters C
18
, 5µg/mL, 250 x 4,6 mm.
As amostras foram preparadas utilizando fase móvel como solvente na
concentração de 12,0 µg/mL. As soluções iniciais de LNZ-SR e LNZ-comp., foram
levadas para o ultrassom por 10 e 20 minutos, respectivamente. Após a estabilização
do sistema, foram injetados 20 µL, previamente filtrados em membrana com poro de
0,45 µm e 13 mm de diâmetro. As condições cromatográficas utilizadas estão
descritas na Tabela 3.20. A identificação de linezolida nos comprimidos foi realizada
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 66
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
pela comparação dos tempos de retenção e perfil de cromatográfico obtido na análise
desta solução com aquela preparada com LNZ-SR.
Tabela 3.20. Condições cromatográficas utilizadas no método por CLAE
Fase móvel ácido acético 1%: acetonitrila: metanol
(50:25:25, V:V:V)
Coluna Symmetry Waters C
18
, 5 µm, 250 x 4,6 mm
Comprimento de onda 251 nm
Vazão 1,0 mL/min
Volume de injeção 20 µL
Temperatura 25
o
C ± 1
o
C
3.2.3.3.2. Resultados e discussão
As Figuras 3.16 e 3.17 ilustram os cromatogramas de LNZ-SR e LNZ-comp.
Figura 3.16. Cromatograma obtido por CLAE para solução de LNZ-SR (12 µg/mL).
Fase móvel: ácido acético 1%: metanol: acetonitrila (50:25:25 V:V:V); coluna
Symmetry Waters C
18
, 5 µm, 250 x 4,6 mm; tempo de retenção ≅ 4,50 min.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 67
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Figura 3.17. Cromatograma obtido por CLAE para solução de comprimido de
linezolida (12 µg/mL). Fase móvel: ácido acético 1%: metanol: acetonitrila (50:25:25
V:V:V); coluna Symmetry Waters C
18
, 5 µm, 250 x 4,6 mm; tempo de retenção ≅
4,50 min.
A cromatografia líquida de alta eficiência é um método analítico, que nos últimos
anos domina as técnicas analíticas em determinação de medicamentos, alimentos,
ensaios biológicos, entre outros. A Farmacopéia Americana (USP 31, 2008) dedica a
esta técnica, a análise da maior parte de fármacos em produtos com monografias
neste compêndio. Atualmente, prioriza-se a análise de produtos farmacêuticos por
CLAE, devido à especificidade e seletividade relacionadas à utilização desta técnica.
Uma das limitações da utilização de CLAE é o alto custo da análise de um
medicamento por este método, que emprega solventes orgânicos de alta pureza
admitidos para uso e padrões de referências. Entretanto, este método analítico é
altamente específico, pois possui coluna de separação que determina o composto
analisado, originando uma identificação mais específica. Com o objetivo de
desenvolver e validar o método por CLAE, diversos sistemas eluentes foram testados,
compostos por água, acetonitrila, ácido acético, e metanol, em proporções variadas. O
sistema que demonstrou um pico de retenção adequado, bem como o tempo de
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 68
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
eluição menor, foi o sistema escolhido para identificação e posterior validação do
método analítico (ácido acético 1% : metanol : acetonitrila 50: 25: 25, V/V/V).
A solução de LNZ-SR com esta fase móvel possui comprimento de onda máximo
de 254 nm. A linezolida foi avaliada no comprimento de onda de 251 e 254 nm, com o
objetivo de verificar qual o comprimento de onda favorecia a melhor visualização de
possíveis produtos de degradação. Para isto, foi utilizada uma solução de LNZ-comp.
degradada em luz-UVC durante 24 horas. No comprimento de onda de 251 nm o
cromatograma da solução degradada mostrou com mais nitidez os produtos de
degradação.
Com estes parâmetros estabelecidos pode-se afirmar que a comparação dos
tempos de retenção da solução de LNZ-SR e LNZ-comp. indica que as amostras
possuem a mesma identidade, sendo adequado para identificação de linezolida em
comprimidos.
3.2.3.3.2. Método
As condições analíticas e os procedimentos para a análise cromatográfica
estão descritos na Tabela 3.20. No ensaio de robustez, foi utilizada coluna
Phenomenex Luna, C18, 5 µm, (250 x 4,6 mm).
3.2.3.3.2.1. Parâmetros analíticos
Os seguintes parâmetros analíticos foram avaliados visando a validação do
método de análise da linezolida por CLAE:
- Linearidade: foi avaliada pela construção de três curvas analíticas
desenvolvidas em diferentes dias e contendo seis níveis de concentração em cada
uma delas.
- Precisão: foram realizadas seis análises de linezolida nas amostras com
concentração teórica de 12,0 µg/mL, no mesmo dia e sob as mesmas condições
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 69
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
experimentais. A precisão do método foi avaliada pelo desvio padrão relativo de
linezolida.
- Precisão intermediária: foi avaliada pela realização de análises das amostras
em três diferentes dias.
- Exatidão: foi determinada através do percentual de recuperação de LNZ-SR
adicionada à amostra.
- Especificidade: determinada através da degradação ácida, básica, oxidativa,
fotolítica e da solução placebo de linezolida em comprimidos.
- Limite de detecção e limite de quantificação: foram determinados pelas
equações indicadas pelo ICH (1996).
- Robustez: foi verificada através de variações nas condições cromatográficas
sobre a determinação quantitativa das amostras.
3.2.3.3.3. Construção da curva analítica
Para construção da curva analítica, foram pesados, 10,0 mg de linezolida
substância de referência, previamente dessecados em estufa a 105
o
C durante duas
horas, transferidos para balão volumétrico de 100 mL e completando-se o volume com
água ultrapura. Desta solução, foram retiradas alíquotas para preparar soluções com
concentrações entre 8,0 e 20,0 µg/mL, completando-se o volume com a fase móvel. A
curva analítica foi construída em três diferentes dias e em triplicata, utilizando o
programa Origin 5.0. A representação gráfica da equação da reta foi determinada pela
análise de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados. As áreas utilizadas
na determinação da curva analítica foram estatisticamente avaliadas pela análise de
variância (ANOVA).
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 70
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
3.2.3.3.4. Determinação dos limites de detecção e quantificação
A determinação dos limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) foi realizada
com base nos dados de desvio padrão do intercepto (s) e inclinação média (I), obtidos
a partir das três curvas analíticas.
3.2.3.3.5. Exatidão do método proposto
Foi preparada solução de LNZ-SR com concentração de 100,0 µg/mL. As
soluções da amostra foram preparadas com concentração de 80,0 µg/mL. A Tabela
3.21 mostra o esquema de preparações das soluções usadas no teste de recuperação
de LNZ-SR em CLAE.
Tabela 3.21. Esquema de preparação das soluções para o teste de recuperação
aplicado à amostra de linezolida para método por CLAE
Solução-amostra
80,0 µg/mL (mL)
Solução LNZ-SR
100,0 µg/mL (mL)
Concentração
(µg/mL)
A 5,0 - 8,0
R
1
5,0 1,0 10,0
R
2
5,0 2,0 12,0
R
3
5,0 3,0 14,0
P - 5,0 8,0
3.2.3.3.6. Determinação de linezolida nos comprimidos
Foram pesados 20 comprimidos para a determinação do peso médio, o qual foi
equivalente a 864,42 mg. Depois de triturados manualmente em gral, uma quantidade
de pó equivalente a um peso médio do comprimido foi pesada e transferida para balão
volumétrico de 1000 mL. Foram adicionados 500 mL de água ultrapura e a solução foi
levada ao aparelho de ultrassom por 20 minutos. O volume foi completado com água
ultrapura para a obtenção de solução com concentração de 600,0 µg/mL. Foram
transferidas alíquotas de 10,0 mL para balões volumétricos de 100 mL completando-se
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 71
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
os volumes com água. A solução preparada tinha concentração teórica de 60,0 µg/mL
de linezolida. Desta solução, foram retiradas alíquotas de 5,0 mL para balões
volumétricos de 25 mL e os volumes foram completados com água ultrapura para a
obtenção de soluções com concentrações teóricas de 12,0 µg/mL. A precisão do
método foi avaliada pelo desvio padrão relativo de linezolida nas amostras de
comprimidos em três diferentes dias.
3.2.3.3.7. Avaliação da especificidade
Para realização dos ensaios de especificidade, foram utilizados dois
parâmetros: a preparação de amostras placebo e a degradação forçada de
linezolida, através de testes de estresse nos comprimidos de linezolida.
- Degradação ácida, alcalina e oxidativa: Foi preparada solução de LNZ-
comp. em água ultrapura na concentração de 100,0 µg/mL. A partir desta solução
foram transferidas alíquotas de 10,0 mL para balões volumétricos de 50 mL e os
volumes foram completados com NaOH 0,1 M; HCl 0,1 M e H
2
O
2
3 %,
respectivamente, obtendo-se soluções com concentrações teóricas finais de 20
µg/mL. Os balões volumétricos contendo as amostras em meios oxidativos, ácidos
e básicos foram envoltos em papel alumínio e mantidos à temperatura ambiente.
Após uma hora, alíquotas de 5,0 mL foram retiradas no final do processo e
transferidas para balão volumétrico de 10 mL. O volume foi completado com fase
móvel, obtendo-se solução com concentração final de 10,0 µg/mL. A análise foi
realizada imediatamente após a retirada da alíquota.
- Degradação fotolítica: Soluções-amostras, com concentração de 500,0
µg/mL, dissolvidas em diferentes solventes, metanol e água, foram expostas à luz
ultravioleta, acoplada em câmara espelhada internamente (100 x 16 x 16 mm) para
realização de degradação fotolítica. A amostra ficou exposta por 18 e 36 horas.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 72
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Foram preparadas soluções placebo. Os cromatogramas obtidos das
amostras degradadas e amostra placebo foram analisados e comparados
observando-se os picos e os tempos de retenção. Na avaliação deste parâmetro
analítico verificou-se a possível interferência dos excipientes e dos produtos de
degradação na determinação do fármaco.
3.2.3.3.8. Avaliação da robustez
A robustez do método foi avaliada através de variações nas condições
cromatográficas. As alterações incluíram variações na proporção da fase móvel,
comprimento de onda, volume de injeção e coluna cromatográfica. Na preparação da
fase móvel, a proporção de acetonitrila e metanol foram modificados em ± 5%. Para
avaliação da influência do comprimento de onda de detecção, a análise foi realizada
utilizando detecção de 260 nm. Em ambos os casos, todos os outros parâmetros
mantiveram-se conforme descrito na Tabela 3.20.
Para realização deste ensaio foram preparadas soluções de LNZ-SR e LNZ-
comp., em fase móvel, em concentração equivalente a 12,0 µg/mL. Para este ensaio,
foram feitas três amostras, sendo realizadas três determinações para cada solução de
análise.
3.2.3.3.9. Resultados
3.2.3.3.9.1. Curva analítica
A Tabela 3.22 mostra os valores experimentais obtidos na construção da curva
analítica para LNZ-SR por CLAE e a Figura 3.18, a curva analítica correspondente.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 73
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Tabela 3.22. Áreas absolutas obtidas para construção da curva analítica de LNZ-SR
por CLAE
Concentração
(µ
µµ
µg/mL)
Á
reas absolutas
Área
s
absolutas
média ± e.p.m.
DPR
%
8,0
350135
357156
348631
351974 ± 2627,124
1,29
10,0
450000
455117
452853
452656 ± 1480,409
0,56
12,0
557137
542900
551532
550523 ± 4140,717
1,30
14,0
655510
651652
658494
655218 ± 1980,480
0,52
16,0
754246
749178
756227
753217 ± 2098,907
0,48
20,0
958793
968231
953735
960253 ± 4247,831
0,76
e.p.m. = erro padrão da média
DPR% = desvio padrão relativo
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 74
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Figura 3.18. Representação gráfica da curva analítica das soluções de linezolida em
concentrações de 8,0 a 20,0 µg/mL por cromatografia líquida de alta eficiência.
3.2.3.3.9.2. Análise estatística
A validade da regressão linear da curva analítica média obtida foi calculada
através de análise de variância (ANOVA) dos valores das áreas determinadas na
obtenção da curva analítica de linezolida por CLAE relacionadas na Tabela 3.23.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 75
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Tabela 3.23. Análise de variância das áreas obtidas na curva analítica de linezolida
por CLAE
Fontes de variação
gL
Soma dos
quadrados
QM
F
calc
F
tab
Entre
5 7,18 x 10
11
1,44 x 10
11
5461,068* 3,11
Regressão linear
1 7,18 x 10
11
7,18 x 1011 27302,99* 4,75
Desvio de
linearidade
4 61848981 15462245 0,587798 3,26
Resíduo
12 316000000 26305352
Total
17 7,19 x 10
11
*Significativo P< 0,05
3.2.3.3.9.3. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais da
curva analítica
A Tabela 3.24 relaciona os parâmetros do tratamento estatístico sobre os
valores experimentais obtidos para a curva analítica.
Tabela 3.24. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais
obtidos para a curva analítica de linezolida
Parâ
metros
Resultados
λ (nm)
251
Faixa de concentração utilizada (µg/mL)
8-20 µg/mL
Equação: y = bx + a y = 50646,41x – 54645,35
Intercepto (a) ± desvio padrão -54645,35 ± 3233,78
Inclinação (b) ± desvio padrão 50646,41 ± 232,57
Limite de detecção (LD) 0,21
Limite de quantificação (LQ) 0,63
r (coeficiente de correlação) 0,9999
n 6
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 76
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3.2.3.3.9.4. Exatidão do método por CLAE
A Tabela 3.25 mostra os valores obtidos no teste de recuperação para LNZ-SR
utilizando CLAE.
Tabela 3.25. Valores obtidos no teste de recuperação de LNZ-SR utilizando CLAE
Concentração teórica
adicionada (µg/mL)
Concentração
recuperada (µg/mL) *
Recuperação
(%)
Média
(%) ± DPR
R
1
2,0 2,01 100,50
R
2
4,0 4,03 100,83 100,27 ± 0,69
R
3
6,0 5,97 99,50
* Média de três determinações
DPR – desvio padrão relativo
3.2.3.3.9.5. Precisão do método e valores experimentais obtidos na determinação do
teor de linezolida nos comprimidos por CLAE
A Tabela 3.26 relaciona os valores experimentais de linezolida nos
comprimidos obtidos por CLAE.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 77
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Tabela 3.26. Valores experimentais obtidos para determinação de teor de linezolida
em amostras comerciais através de CLAE
Amostra
Teor (%)*
Interdias
DPR
1º dia 2º dia 3º dia
1 103,5 98,08 102,06
101,36
1,65
2 100,32 99,33 105,01
3 100,81 98,30 104,43
4 105,00 99,70 101,25
5 101,31 98,85 102,70
6 101,31 102,46 100,20
Média 102,04 99,45 102,60
DPR 1,77 1,60 1,79
*cada valor é média de três determinações
DPR – desvio padrão relativo
3.2.3.3.9.6. Avaliação da especificidade
As Figuras 3.19, 3.20, 3.21, 3.22 e 3.23 mostram, respectivamente, os
cromatogramas obtidos na degradação ácida, alcalina, oxidativa, fotolítica por 72
horas e 48 horas em meio básico de LNZ-comp. na concentração de 10,0 µg/mL.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 78
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Figura 3.19. Cromatograma da degradação ácida de LNZ-comp.(10,0 µg/mL) em meio
ácido (HCl 0,1 N) após uma hora.
Figura 3.20. Cromatograma da degradação alcalina de LNZ-comp. (10,0 µg/mL) em
meio alcalino (NaOH 0,1 N) após uma hora.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 79
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Figura 3.21. Cromatograma da degradação de LNZ-comp. (10,0 µg/mL) em meio
oxidativo (H
2
O
2
3%) após uma hora.
Figura 3.22. Cromatograma da degradação de LNZ-comp. (10,0 µg/mL) na luz
ultravioleta por 72 horas utilizando metanol como solvente.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 80
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Figura 3.23. Cromatograma da degradação de LNZ-comp. (10,0 µg/mL) na luz
ultravioleta por 48 horas utilizando metanol como solvente, em meio básico.
3.2.3.3.4. Discussão
A cromatografia líquida de alta eficiência é um método analítico, que nos últimos
anos domina as técnicas de análise e determinação de medicamentos, alimentos,
ensaios biológicos, entre outros. A Farmacopéia Americana (USP 31, 2008) dedica a
esta técnica, a análise da maior parte de produtos com monografias neste compêndio.
Atualmente, prioriza-se a análise de produtos farmacêuticos por CLAE, devido à
especificidade e seletividade relacionadas à utilização desta técnica.
Uma das limitações da utilização de CLAE é o alto custo da análise de um
medicamento por este método, que emprega solventes orgânicos de alta pureza para
uso e padrões de referências. Entretanto, este método analítico é muito específico,
pois possui coluna de separação que separa o composto analisado, originando uma
identificação mais pontual.
O desenvolvimento de métodos utilizando CLAE requer a cuidadosa combinação
entre a polaridade do soluto, da fase móvel e da fase estacionária de modo a garantir
separações satisfatórias em tempos razoáveis. O método de CLAE desenvolvido para
determinação de linezolida em comprimidos foi avaliado em relação aos seguintes
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 81
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
parâmetros de validação: especificidade, linearidade, limite de quantificação, limite de
detecção, precisão, exatidão e robustez.
A especificidade de um método analítico representa sua capacidade de sofrer a
influência única e exclusiva da substância que se quer analisar. A especificidade do
método pode ser determinada com a adição de impurezas e produtos de degradação,
obtidos experimentalmente ou induzindo a sua formação (ERMER, 2001). Os
comprimidos de linezolida foram submetidos à degradação em meio alcalino, ácido,
oxidativo e fotolítico. Os cromatogramas das soluções degradadas estão ilustrados
nas Figuras 3.19 a 3.23.
Na degradação alcalina (Figura 3.30) observou-se a formação de pico adicional
em 2,0 minutos e 6,0 minutos. Ocorreu o decréscimo da área absoluta do pico de
linezolida em 4,5 minutos. Na degradação ácida observou-se o início de formação de
produtos de degradação como observado no cromatograma (Figura 3.19) em tempos
de retenção inferiores ao da linezolida.
A estabilidade de LNZ-comp. em meio oxidativo foi avaliada em H
2
O
2
a 3%
(Figura 3.21). Nestas condições, houve a formação de pico adicional em 2,4 minutos.
Nos estudos de degradação fotolítica, foram colocadas soluções de linezolida
comprimidos por 72 horas na luz ultravioleta, observando-se a presença de vários
produtos minoritários de degradação, com a conseqüente diminuição da área de
linezolida. Para acelerar a formação de produtos de degradação pela luz ultravioleta,
foram preparadas soluções em meio básico (20% de NaOH 0,1 N), em que observou-
se a formação de um produto majoritário em 2,1 minutos. Estes estudos de
degradação forçada mostram a susceptibilidade do fármaco perante a degradação
básica, ácida, oxidativa e fotolítica. Sugere-se que o método possui especificidade,
podendo ser indicativo de estabilidade.
Os resultados obtidos na validação do método demonstraram que as soluções
de LNZ-SR apresentaram correlação linear entre as áreas dos picos e as
concentrações, no intervalo utilizado. Gráficos de concentração versus área absoluta
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 82
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
foram plotados e demonstraram linearidade na faixa de 8,0 a 20,0 µg/mL (Figura 3.18).
A equação da reta para a linezolida foi y = 50646,41x – 54645,35, com coeficiente de
correlação de 0,9999. A Tabela 3.22 mostra as áreas absolutas correspondentes a
cada uma das diluições de LNZ-SR para as três curvas analíticas construídas. Os
dados de linearidade foram validados pela análise de variância (ANOVA) que
demonstrou regressão linear significativa e nenhum desvio de linearidade significativo
(P < 0,05). Os dados referentes ao tratamento estatístico dos dados de linearidade do
método por CLAE estão demonstrados nas Tabelas 3.23 e 3.24.
A precisão do método analítico foi demonstrada pela repetibilidade (intra-dia) e
precisão intermediária (interdias) relacionadada na Tabela 3.26. Os valores
experimentais obtidos para a determinação de linezolida nas amostras analisadas
possuíam desvio padrão relativo (DPR) de 1,65 (interdias), descritos na Tabela 3.26.
Os valores de DPR confirmam a adequada precisão do método. Os valores de
recuperação estão apresentados na Tabela 3.25, apresentando média de recuperação
de 100,27 % para comprimidos de linezolida.
A sensibilidade do método em CLAE foi avaliada pela determinação dos limites
de detecção (LD) e de quantificação (LQ) de linezolida no sistema cromatográfico
empregado. De acordo com o ICH (1996) e USP (2008) não há necessidade de avaliar
estes parâmetros se o método for utilizado para fins de quantificação. Verificou-se que
os LQ e LD foram 0,63 µg/mL e 0,21 µg/mL, respectivamente. Os baixos valores
indicam a sensibilidade do método.
O método cromatográfico desenvolvido sofreu algumas modificações nos
parâmetros da fase móvel e no comprimento de onda, a fim de verificar a sua
capacidade na suscetibilidade a variações para determinação quantitativa de
linezolida. A partir da modificação realizada na proporção da fase móvel foi observado
teor médio de linezolida de 101,93% (DPR = 1,53%) para comprimidos de linezolida.
Não houve mudança significativa no tempo de retenção em relação às condições
otimizadas. Não houve variação no tempo de retenção de linezolida quando se
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 83
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
realizou análises em 260 nm. Ocorreu uma redução proporcional das áreas absolutas
dos picos de linezolida em decorrência da menor absortividade do fármaco neste
comprimento de onda. O valor experimental obtido foi de 100,83% (DPR% = 1,29)
para comprimidos de linezolida. A robustez do método, também foi verificada,
utilizando outra coluna cromatográfica (Phenomenex C
18
, 5 µm, 250 x 4,6 mm). Nesta
coluna o tempo de retenção foi de aproximadamente 5,0 minutos, com áreas absolutas
semelhantes às obtidas com coluna Symmetry Waters (C
18
, 5 µm, 250 x 4,6 mm). De
acordo com os resultados obtidos, pode-se afirmar que o método proposto indica
robustez adequada, pois permitiu a quantificação de linezolida apesar das variações
aplicadas ao método analítico. O método mostrou-se adequado, apresentando
simplicidade, especificidade, linearidade, precisão, exatidão e robustez.
3.2.4. Análise comparativa dos métodos
3.2.4.1. Método
Com o objetivo de estabelecer uma comparação entre os métodos propostos para
determinação de linezolida em comprimidos, foi realizada análise estatística dos teores
médios de linezolida obtidos pelos diferentes métodos usando análise de variância
(ANOVA).
3.2.4.2. Resultados
Os resultados obtidos na determinação quantitativa de linezolida em comprimidos,
pelos métodos propostos neste trabalho, encontram-se na Tabela 3.27.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 84
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Tabela 3.27. Avaliação comparativa dos teores médios obtidos nos três métodos
validados usando espectrofotometria na região UV, doseamento microbiológico e
CLAE
UV
Doseamento
microbiológico
CLAE
Média
(%)
98,70 101,96 101,36
DPR
1,32 0,61 1,65
A Tabela 3.28 mostra o resultado de ANOVA calculado, utilizando os valores
experimentais obtidos do teor de linezolida em comprimidos, a partir dos métodos
validados.
Tabela 3.28. Análise da variância dos resultados obtidos no doseamento de linezolida
em comprimidos, pelos métodos propostos
Fontes de
variação
GL
Soma dos
quadrados
Variância
F (5%)
Tratamentos
2
35513,61
17756,8
0,075777*
F crítico = 4,07
Resíduo
6
1405971
234328,5
Total
8
* significativo para p< 0,01
3.2.4.3. Discussão
Os resultados obtidos através de ANOVA demonstraram não haver diferença
significativa entre os métodos propostos, para o nível de significância de 5 %. Desta
forma, os métodos validados são equivalentes, ou seja, o resultado comprova que os
métodos são intercambiáveis, sendo adequados para a determinação quantitativa do
fármaco em comprimidos. Todos os métodos foram validados em relação aos
parâmetros estabelecidos em regulamentos oficiais, e apesar de demonstrarem
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 85
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
intercambialidade cada método possui características próprias. Mas alguns métodos
são mais específicos e adequados para análise de rotina em laboratórios. A análise
espectrofotométrica na região UV é um método simples, de fácil execução e de custo
reduzido, mas não é específico para determinar e quantificar possíveis produtos de
degradação na amostra.
O ensaio microbiológico é um método específico, mas não é capaz de indicar e
quantificar a formação de produtos de degradação. Este método seria melhor
preconizado para análise eventual em laboratórios, com o objetivo de determinar a
potência do antimicrobiano nos comprimidos, sendo utilizado como um teste
alternativo de análise. O método mais adequado para ser incluído num compêndio
oficial, seria por CLAE, pois é um método específico e apropriado para determinação
de produtos de degradação e impurezas.
3.3. Discussão geral
A validação de métodos analíticos é uma ferramenta essencial para a análise de
qualidade de fármacos e medicamentos. Métodos analíticos precisam demonstrar
características de análise adequadas para identificação de fármacos em formas
farmacêuticas e matéria-prima. A linezolida é o primeiro fármaco da classe das
oxazolidinonas, e até o momento, não há métodos analíticos padronizados em
compêndios oficiais, e também poucos artigos científicos abordando o
desenvolvimento de métodos analíticos para linezolida na forma farmacêutica
comprimidos.
Foram desenvolvidos e validados métodos analíticos usualmente utilizados para
determinação do teor descritos em códigos oficiais e na literatura, relacionados ao
controle de qualidade de fármacos e medicamentos. Além disso, a simplicidade de
execução, tempo de análise, custo e a capacidade de aplicação em estudos de
estabilidade foram, também, considerados, tendo em vista buscar métodos aplicáveis
ao controle de qualidade de rotina.
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 86
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A análise qualitativa deve ser realizada para identificar a substância ativa em
matérias-primas e em formas farmacêuticas. Neste trabalho foram realizadas as
seguintes análises: ponto de fusão, análise térmica (DSC/TG), CCD,
espectrofotometria no UV, espectrofotometria no IV e CLAE. A partir dos resultados
obtidos, foi possível confirmar, a identidade de LNZ-SR, bem como identificá-la nos
comprimidos de linezolida. Todos os métodos desenvolvidos para quantificação de
linezolida mostraram-se adequados, proporcionando resultados satisfatórios. As
diferentes técnicas utilizadas propiciam alternativas versáteis na escolha do método de
análise.
Na análise quantitativa foram desenvolvidos e validados três métodos analíticos:
espectrofotometria na região UV, CLAE e doseamento microbiológico. A validação foi
realizada com base nos guias ICH (1996a), AOAC (1997) e resolução n
o
899 (BRASIL,
2003), as quais contêm diretrizes sobre a validação de procedimentos analíticos,
indicando os principais parâmetros a serem avaliados durante a validação de um
método.
Os métodos mostraram-se específicos, uma vez que não houve interferência
dos excipientes presente na formulação dos comprimidos de linezolida. O método
CLAE, mostrou ser indicativo de estabilidade, pois os comprimidos foram colocados
em condições extremas de degradação ácida, alcalina, oxidativa e fotolítica, nas quais
o método foi capaz de diferenciar a linezolida dos demais produtos de degradação. O
doseamento microbiológico mostrou-se específico em relação à degradação de
linezolida pela luz.
A faixa de linearidade foi estabelecida para todos os métodos, construindo a
curva analítica, analisada por ANOVA. Todas as análises realizadas forneceram
regressão linear significativa, não apresentando desvio significativo de linearidade.
Todos os métodos apresentaram coeficiente de correlação próximo da unidade (acima
de 0,999) indicando haver correlação linear entre as concentrações utilizadas e as
respectivas respostas obtidas. A precisão e o desvio padrão relativo foram avaliados
Capítulo III – Validação de Métodos Analíticos 87
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
para todos os métodos desenvolvidos e não excedeu o valor de 2%, demonstrando
que os mesmos apresentam elevada precisão sob as condições estudadas. A exatidão
foi avaliada pelo teste de recuperação, e as percentagens recuperadas de LNZ-SR
foram próximas a 100 %, indicando que os métodos possuem exatidão adequada.
Não existem especificações oficiais para o teor de linezolida nos comprimidos.
Os limites preconizados pelas farmacopéias para a determinação do teor de fármacos
em formas farmacêuticas encontram-se na faixa de 90,0 a 110,0 % (F. Bras., 1988;
USP 31, 2008).
Através dos métodos validados, os teores encontrados para as amostras
encontram-se entre 98,7 a 101,96 % do valor declarado, dentro dos limites usuais.
3.4. Conclusões
- Avaliação da faixa de fusão permitiu caracterizar LNZ-SR.
- Os métodos por CCD, espectrofotometria no UV, espectrofotometria no IV, CLAE
e análise térmica, mostraram-se adequados para a identificação do fármaco nas
formas farmacêuticas.
- A determinação de linezolida em comprimidos por espectrofotometria na região
de ultravioleta a 251 nm, utilizando água como solvente demonstrou ser seletiva,
linear, sensível, precisa e exata.
- A análise quantitativa por CLAE demonstrou especificidade, linearidade,
sensibilidade, robustez, precisão e exatidão para determinação de linezolida em
comprimidos.
- O doseamento microbiológico foi desenvolvido e validado, utilizando método por
difusão em ágar cilindros em placa e Bacillus subtilis ATCC 9372 como microrganismo
padrão para linezolida em comprimidos, em que o método mostrou-se linear, preciso,
exato e específico.
- A comparação dos métodos propostos para determinação quantitativa de
linezolida em comprimidos por CLAE, UV e doseamento microbiológico atendeu aos
requisitos de validação, não apresentando diferença estatisticamente significativa.
Capítulo IV – Teste de dissolução 88
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
4.1. Introdução
A dissolução pode ser definida, num sentido restrito, como o processo pelo
qual uma substância sólida incorpora-se no solvente para formar uma solução. No
entanto, no sentido amplo da palavra, é mais do que a simples medida da taxa de
solubilidade, podendo ser mais corretamente descrita como um ensaio físico para
prever a liberação do fármaco de uma forma farmacêutica para uma determinada área,
numa determinada quantidade e no tempo correto. Esta definição é mais consentânea
com a aplicação dos ensaios de dissolução aos estudos biofarmacêuticos e
farmacocinéticos. Fundamentalmente, este processo é controlado pela afinidade entre
a substância sólida e o solvente e pelo modo como o sistema farmacêutico a libera
(COSTA e LOBO, 1999; COSTA e LOBO, 2001a). No entanto, podem ser
incorporadas no seio da forma farmacêutica substâncias, que permitem alterar a
solubilidade do fármaco no meio (PREECHAGOON et al., 2000).
O teste de dissolução é uma ferramenta muito importante para a indústria
farmacêutica, tanto no desenvolvimento de produtos, como nos testes de controle de
qualidade de rotina. Apesar de ter sido inicialmente desenvolvido para formas
farmacêuticas sólidas, nos últimos anos o teste de dissolução vem sendo aplicado
também às formas não sólidas, como suspensões, adesivos transdérmicos,
supositórios e outras. Recentemente, com o advento dos medicamentos genéricos,
outros empregos do ensaio de dissolução tornaram-se importantes. A comparação de
perfis de dissolução, por exemplo, é fundamental para evitar que todas as dosagens
de um mesmo produto sejam submetidas a estudos de bioequivalência. Outro aspecto
importante relacionado à dissolução é a classificação biofarmacêutica. Ela divide os
fármacos em quatro categorias segundo sua solubilidade e permeabilidade
(DRESSMAN et al., 1998; MARCOLONGO, 2003).
Capítulo IV – Teste de dissolução 89
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
De acordo com esta classificação, os fármacos são divididos em quatro
categorias (AMIDON et al., 1995; FDA, 1997; FDA, 2000; BRASIL, 2002):
- Classe 1: Alta solubilidade (AS) – Alta permeabilidade (AP)
- Classe 2: Baixa solubilidade (BS) – Alta permeabilidade (AP)
- Classe 3: Alta solubilidade (AS) – Baixa permeabilidade (BP)
- Classe 4: Baixa solubilidade (BS) – Baixa permeabilidade (BP)
A utilização da classificação biofarmacêutica permite determinar a possibilidade
de correlação in vitro – in vivo (FDA, 2000; BROWN et al., 2004). Nos casos em que
há possibilidade de correlação, o teste de dissolução deve ser realizado de forma a
prever o comportamento in vivo das formas farmacêuticas (MANADAS et al., 2002).
Embora as formas farmacêuticas sólidas de liberação imediata sejam rotineiramente
analisadas quanto ao peso médio, uniformidade de conteúdo, dureza, friabilidade e
desintegração, pode-se afirmar que, o teste mais frequentemente associado às
características do comportamento in vivo é o teste de dissolução (DRESSMAN et al.,
1998).
Desde a introdução do Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB)
(AMIDON et al., 1995), a validade e aplicabilidade desta teoria têm sido objeto de
ampla discussão e investigação. Estes esforços têm resultado numa melhor orientação
do SUPAC-IR (FDA, 1995), diretrizes para dissolução (FDA, 1997) e orientação da
FDA (Food and Drug Administration) para isenção dos estudos de bioequivalência, dos
fármacos inseridos na Classe I (formas farmacêuticas sólidas orais de liberação
imediata), que apresentam dissolução rápida e liberação imediata (FDA, 2000). Os
aspectos destas diretrizes abordam, também, os seguintes aspectos em relação à
isenção dos estudos de bioequivalência: o fármaco deve ser estável no trato
gastrintestinal, os excipientes não devem interferir na absorção do fármaco, o fármaco
Capítulo IV – Teste de dissolução 90
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
não deve ter um índice terapêutico estreito e o produto não pode ser absorvido na
cavidade oral (FDA, 2000).
O SCB geralmente é considerado conservador nos critérios de dissolução, em
relação à solubilidade e permeabilidade, levando em consideração o limite das
classes. Com isso, a possibilidade de modificar os limites e critérios, para permitir a
isenção de estudos de bioequivalência in vivo nos estudos de novos produtos, tem
recebido atenção crescente (BLUME e SCHUG, 1999).
A solubilidade de um fármaco é determinada pela dissolução da dosagem mais
alta de um medicamento em 250 mL de uma solução tampão de pH entre 1,0 e 8,0.
Um fármaco é considerado altamente solúvel quando o resultado, em volume, da
relação dose/solubilidade é menor ou igual a 250 mL. Um fármaco de alta
permeabilidade é, geralmente, aquele cuja biodisponibilidade absoluta é maior que
90% na ausência de instabilidade no trato gastrintestinal ou quando este parâmetro é
determinado experimentalmente. O SCB sugere que, para fármaco de AS e AP (classe
I) e para alguns fármacos de AS e BP (classe III), a obtenção de 85% de dissolução
em HCl 0,1 M, em até 15 minutos, pode garantir que a biodisponibilidade do fármaco
não é limitada pela dissolução. Em outras palavras, o medicamento, com este perfil de
dissolução, tem na permeabilidade a etapa determinante da biodisponibilidade e,
portanto, da equivalência terapêutica.
Outro aspecto a ressaltar, trata da grande variabilidade existente na cinética de
dissolução dos medicamentos contendo fármacos altamente solúveis, enquadrados no
perfil de dissolução mínima de 85% em até 15 minutos. Em virtude da concentração
na solução aumentar verticalmente com o tempo, qualquer desvio por menor que seja
no tempo de coleta da amostra nas diferentes cubas, na formulação do produto ou nas
condições da dissolução poderá conduzir a erros que inviabilizam a comparação dos
perfis de dissolução dos medicamentos contendo fármacos altamente solúveis e que
atendam as condições de dissolução propostas nesta emenda. O fato da dissolução
Capítulo IV – Teste de dissolução 91
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
não ser a etapa determinante da biodisponibilidade nestes produtos e a dificuldade de
evitar os erros metodológicos em função dos diferentes fatores mencionados, neste
caso, ocorre a isenção da comparação matemática, porém mantém-se a exigência da
apresentação do perfil de dissolução (BRASIL, 2002).
Para fármacos de BS e AP (caso II), a dissolução pode ser o passo limitante da
velocidade de absorção e uma correlação in vitro - in vivo pode ser esperada. Perfis de
dissolução obtidos em meios de dissolução diferentes são recomendados para
medicamentos que contêm fármacos desta categoria. Para fármacos de AS e BP
(caso III), a permeabilidade é o passo limitante da velocidade de absorção, podendo-
se esperar, no máximo, uma correlação in vitro-in vivo limitada, dependente das
velocidades relativas de dissolução e do trânsito intestinal. Os fármacos que se
enquadram no caso IV (BS e BP), geralmente, apresentam problemas significativos
para liberação a partir de formas farmacêuticas sólidas orais de liberação imediata
(FFSOLI) (BRASIL, 2002).
A Food and Drug Administration (FDA, 2000) regulamenta diretrizes para os
testes de dissolução das formas farmacêuticas sólidas, abordando os seguintes
aspectos:
- Recomendações gerais para os testes de dissolução
- Acesso às especificações de dissolução estabelecidas em relação às
características biofarmacêuticas dos fármacos
- Métodos estatísticos para comparação dos perfis de dissolução
- Processos para determinar quando o teste de dissolução é suficiente para
garantir a isenção dos estudos de bioequivalência.
O teste de dissolução é considerado um teste de desempenho (USP 31; 2008;
BRASIL, 2002), sendo importante para sua validação, a avaliação dos parâmetros
precisão, exatidão, especificidade e linearidade, respeitando as características de
cada caso. Os resultados obtidos auxiliam no desenvolvimento e avaliação de novas
Capítulo IV – Teste de dissolução 92
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
formulações, possibilitando possível correlação in vivo-in vitro e fazem parte da
documentação para registro de novos produtos às autoridades regulatórias
(MARQUES e BROWN, 2002).
Para desenvolver um teste de dissolução, vários fatores devem ser avaliados
como a solubilidade, a permeabilidade e as características farmacocinéticas do
fármaco, bem como as peculiaridades da formulação em estudo. O aparato
(usualmente cestas ou pás), o meio de dissolução e a velocidade de agitação devem
ser cuidadosamente determinados. O pH do meio e o volume utilizado também devem
ser observados (FDA, 1997). Além disso, é necessário que o método de quantificação
a ser aplicado no teste esteja validado. A seleção criteriosa das condições de ensaio
deve ser orientada no sentido de obter o máximo poder discriminatório e resultar na
capacidade de detecção de eventuais desvios dos padrões de qualidade propostos
(MARCOLONGO, 2003).
Os estudos de dissolução são uma ferramenta indispensável nas várias etapas
dos processos de desenvolvimento galênico, identificação de variáveis críticas, na
produção, formulação, controle de qualidade, estabelecimento de correlações in
vitro/in vivo e assuntos regulamentares. Existe necessidade real de desenvolver
ensaios de dissolução que possam prever de forma mais eficaz o comportamento in
vivo das formas farmacêuticas, devendo levar não só à redução dos custos e trabalho
necessários ao desenvolvimento de uma forma farmacêutica, mas também ao número
e tamanho dos estudos clínicos requeridos e o controle de qualidade mais confiável.
Os ensaios de dissolução in vitro constituem importante meio de caracterização da
qualidade biofarmacêutica de uma forma farmacêutica sólida oral, possibilitando o
controle de qualidade farmacêutico e o estabelecimento de correlações com os dados
obtidos in vivo. O conhecimento e controle das variáveis que podem influenciar a
liberação da substância ativa bem como a padronização e consequente calibração e
validação de equipamentos e procedimentos fortalecem a importância destes ensaios,
tornando-os mais confiáveis, robustos e exeqüíveis. A seleção criteriosa das
Capítulo IV – Teste de dissolução 93
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
condições do ensaio deve ser orientada no sentido de se obter o máximo poder
discriminatório e resultar na capacidade de detecção de eventuais desvios aos
padrões de qualidade inicialmente pretendidos (MANADAS et al., 2002;
MARCOLONGO, 2003).
Além de demonstrar a equivalência lote-a-lote, o teste é uma exigência para o
registro de novos produtos e um parâmetro essencial a ser avaliado em um processo
de controle de qualidade (MARQUES e BROWN, 2002). Diversos parâmetros devem
ser avaliados para o desenvolvimento do teste de dissolução, quais sejam: meio de
dissolução, velocidade de agitação, aparelho de dissolução, tempo para amostragem,
entre outros (MARQUES e BROWN, 2002; USP 31, 2008). Além disso, o
conhecimento das propriedades do fármaco, relacionadas à solubilidade e
permeabilidade deve ser buscado na literatura, com o objetivo de verificar em qual
classe da classificação biofarmacêutica se encontra, e se há possibilidade de
correlação in vitro-in vivo.
No âmbito mundial, a dissolução adquire importância cada vez maior em
relação às alterações pós-registro relacionada a mudanças de formulação,
equipamento, processo produtivo e local de produção, de forma a fornecer
justificativas técnicas que embasem a não realização de ensaios desnecessários
envolvendo seres humanos, evitando assim o problema ético e também de custo, que
estes estudos acarretam (MARCOLONGO, 2003). Há, atualmente, inúmeras
pesquisas em andamento para ampliar o uso dos ensaios de dissolução nos casos de
isenção de testes de bioequivalência previstos pelo SCB. Embora não existam no
mundo muitos casos em que esta isenção foi efetivamente concedida, a perspectiva é
que, com o advento de novas técnicas para determinação da permeabilidade intestinal
e a definição real de quais fármacos seriam objeto de tal isenção, especificamente
aqueles da classe I, a aplicação do SCB seja difundida, podendo inclusive ser
ampliada para fármacos da classe III (MARCOLONGO, 2003).
Capítulo IV – Teste de dissolução 94
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
4.2. Material
Foram utilizados comprimidos revestidos de linezolida (Zyvox), descritos no
capítulo III, empregados para o desenvolvimento e validação dos métodos qualitativos
e quantitativos.
4.2.1. Equipamento
Os testes de dissolução foram realizados em equipamento HANSON – SR 8
plus, contendo seis cubas de dissolução, de acordo com as normas estabelecidas pela
USP 31 (2008). A quantificação de linezolida nas amostras foi realizada utilizando os
métodos anteriormente validados em CLAE e espectrofotometria UV.
4.3. Teste de dissolução
4.3.1.1. Determinação das condições sink
As condições sink para linezolida foram determinadas em água e HCl 0,1 M
(pH 1,2), utilizando quantidades de fármaco equivalentes a 3 vezes a dose presente
na forma farmacêutica em 900 mL de meio de dissolução.
4.3.1.2. Determinação do perfil de dissolução
O perfil de dissolução foi avaliado depois de obtidas as condições mais
adequadas para o perfil de dissolução. Após cada tempo de coleta selecionado,
conforme Tabela 4.1, uma alíquota de 15,0 mL (equivalente a aproximadamente
10.000 µg) foi retirada de cada cuba e o mesmo volume de meio de dissolução foi
reposto, para manter o volume total constante. A alíquota retirada foi transferida para
balão volumétrico de 100 mL, obtendo-se solução com concentração teórica de 100,0
µg/mL. Uma alíquota de 3,0 mL foi transferida para balão volumétrico de 25 mL,
obtendo-se solução com concentração teórica de 12,0 µg/mL. Para análise em CLAE,
Capítulo IV – Teste de dissolução 95
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
esta solução foi filtrada em membrana de 0,45 µm e diluída com a fase móvel. Para
análise por espectrofotometria no UV foi preparada uma solução com concentração
final de 12,0 µg/mL, utilizando o procedimento descrito anteriormente.
Tabela 4.1. Condições usadas no perfil de dissolução de comprimidos de linezolida
Carac
terísticas
Descrição
Velocidade de agitação 50 rpm
Meio de dissolução Água/HCl 0,1 M
Volume do meio 900 mL
Modo de desaeração Banho de ultrassom 15 minutos
Tempos de coleta 5, 10, 15, 30, 45 e 60 minutos
Temperatura
Aparato
37 ± 0,5º C
pá
4.3.1.3. Resultados e discussão
Os testes preliminares foram realizados para verificar se linezolida era solúvel
em HCl 0,1 M e água. As Figuras 4.1 e 4.2 apresentam os resultados obtidos a partir
de testes de dissolução com comprimidos de linezolida utilizando pás e velocidade de
rotação de 50 rpm e dois meios de dissolução: água e HCl 0,1 M, utilizando CLAE e
espectrofotometria no UV, respectivamente, para análise.
Capítulo IV – Teste de dissolução 96
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Figura 4.1. Perfis de dissolução de comprimidos de linezolida utilizando pás a 50 rpm
e HCl 0,1 M e água como meios de dissolução, analisados por CLAE.
Figura 4.2. Perfis de dissolução de comprimidos de linezolida utilizando pás a 50 rpm
e HCl 0,1 M e água como meios de dissolução, analisados por espectrofotometria no
UV.
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
de linezolida dissolvida
Tempo (minutos)
HCl 0,1 M
Água
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
% de linezolida dissolvida
Tempo (minutos)
HCl 0,1 M
Água
Capítulo IV – Teste de dissolução 97
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
O perfil de dissolução foi desenvolvido para verificar o comportamento de
dissolução de linezolida. Na literatura, não foi encontrada a classificação de linezolida
no Sistema de Classificação Biofarmacêutica, mas pode-se inferir que o fármaco seja
Classe I, visto que apresenta uma alta solubilidade e biodisponibilidade de quase 100
%. Neste caso, a análise poderia ter sido realizada em apenas um ponto (FDA,1997).
Entretanto, como não há dados sobre os testes de dissolução para os comprimidos
contendo linezolida publicados na literatura, optou-se por realizar o perfil de
dissolução, a fim de conhecer as informações geradas a partir do teste desenvolvido.
Inicialmente, para os estudos de dissolução, foram escolhidos dois métodos
analíticos validados anteriormente (capítulo III) para análise dos comprimidos de
linezolida: método espectrofotométrico e CLAE. Para o desenvolvimento do teste de
dissolução para comprimidos contendo linezolida, foram testadas as condições sink.
Os resultados mostraram que o fármaco apresenta solubilidade em HCl 0,1 M e água.
Desta forma, o teste de dissolução foi realizado nestes dois meios, para avaliar o
percentual de liberação do fármaco ao final do teste de dissolução. Nos estudos em
meio ácido (Figura 4.1 e 4.2), os comprimidos se desintegraram levemente mais
rápido do que em água, melhorando desta forma a taxa de dissolução, aumentando a
área efetiva de superfície. Contudo, por causa da ação corrosiva de vapores ácidos
sobre o equipamento de dissolução, atualmente é prática geral usar água destilada, a
não ser que estudos de investigação apontem para a necessidade específica de
dissolução ácida para gerar dados significativos (REMINGTON, 2004). Outra
observação verificada nos estudos preliminares está relacionada ao perfil de
dissolução em ácido e em água (Figura 4.1 e 4.2), que são praticamente semelhantes,
excetuando-se os primeiros 15 minutos de dissolução, que em ácido é mais rápido.
Devido aos fatores explanados o meio de dissolução selecionado para a realização
dos perfis de dissolução foi a água.
Capítulo IV – Teste de dissolução 98
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A velocidade de agitação foi selecionada de acordo com faixa recomendada
para pás (50-75 rpm) (FDA, 1997; USP 31, 2008). Considerando que os testes
preliminares com 50 rpm foram satisfatórios, não foram testadas outras velocidades. O
perfil de dissolução obtido para os comprimidos contendo linezolida foi satisfatório.
Após 10 minutos, na análise por espectrofotometria no UV e CLAE mais de 85 % do
fármaco estava dissolvido no meio. Como especificação do teste, pode ser sugerida a
análise de um ponto, por exemplo, em 30 minutos, no qual mais de 85 % do fármaco
deverá estar dissolvido. Com a determinação do perfil de dissolução de linezolida,
foram estabelecidos os parâmetros para a realização do teste de dissolução, bem
como sua validação.
4.3.3. Métodos
Para definição dos parâmetros utilizados no teste de dissolução, foram
testados dois meios: água e HCl 0,1 M (pH 1,2). Os testes de dissolução foram
realizados utilizando 900 mL de cada um dos dois meios de dissolução, os quais foram
previamente desaerados em ultrassom por 15 minutos e mantidos a temperatura de 37
± 0,5º C. Foi utilizado o aparato pá e o tempo de teste foi de 60 minutos.
4.4. Validação do teste de dissolução
A validação do teste de dissolução foi realizada pela avaliação dos seguintes
parâmetros: especificidade, linearidade, precisão intermediária e estabilidade das
soluções (MARQUES e BROWN, 2002; USP 31, 2008).
• Especificidade: avaliada usando placebo dos comprimidos. As amostras placebo
foram preparadas utilizando-se quantidades equivalentes a um comprimido revestido,
as quais foram transferidas para cubas de dissolução contendo 900 mL de meio por 1
Capítulo IV – Teste de dissolução 99
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
h a 150 rpm, utilizando o respectivo aparato de dissolução. A interferência dos
excipientes presentes foi analisada por UV e CLAE.
• Linearidade: avaliada pela curva analítica construída para o método de CLAE e UV,
a qual empregou seis concentrações de linezolida-SQR (8,0; 10,0; 12,0; 14,0; 16,0 e
20,0 µg/mL para CLAE e 6,0; 8,0; 10,0; 12,0; 14,0 e 16,0 µg/mL para UV).
• Precisão: a avaliação da precisão intermediária do teste de dissolução foi realizada
utilizando um lote caracterizado em termos de uniformidade de conteúdo e
comparando os resultados com aqueles obtidos do teste de dissolução. De acordo
com a USP 31 (2008), a uniformidade de conteúdo é avaliada dosando dez
comprimidos, individualmente, e calculando o conteúdo de linezolida de cada um.
Além disso, foram comparados os resultados obtidos com analistas diferentes,
utilizando um lote com uniformidade de conteúdo avaliada.
• Exatidão: Conforme os guias do ICH (1996), a exatidão foi inferida a partir dos
dados de linearidade, especificidade e precisão.
•
••
• Estabilidade das soluções: a estabilidade foi avaliada verificando-se a resposta de
solução amostra armazenada a temperatura ambiente (25º C ± 1º C) por um período
de tempo especificado. As soluções amostras com os meios de dissolução testados
(água e HCl 0,1 M) foram monitoradas por 24 h utilizando CLAE.
4.4.1. Estabilidade e especificidade das soluções
4.4.1.1. Resultados e discussão
A Figura 4.3 apresenta o gráfico do decaimento de linezolida nas primeiras 24
horas de avaliação de sua estabilidade nos meios de dissolução água e HCl 0,1 M.
Capítulo IV – Teste de dissolução 100
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Figura 4.3. Perfil de decaimento de linezolida nas primeiras 24 horas de avaliação de
sua estabilidade nos meios de dissolução.
A Figura 4.4 mostra o cromatograma referente à avaliação da especificidade
dos excipientes contidos no comprimido, avaliados por CLAE.
Figura 4.4. Cromatograma do placebo, em água.
Capítulo IV – Teste de dissolução 101
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 4.5 mostra o espectro de absorção referente à avaliação da
especificidade dos excipientes contidos no comprimido, avaliados por
espectrofotometria no UV.
Figura 4.5. Espectro de absorção do placebo, em água.
A estabilidade das soluções foi avaliada nos dois meios analisados. De acordo
com a Figura 4.4, as soluções foram avaliadas por 24 horas, em que, verificou-se que
a solução em água é mais estável, que em meio ácido. Logo nas primeiras horas,
verifica-se o decaimento de linezolida em meio ácido. Este dado vem corroborar com a
escolha de água como meio de dissolução para este fármaco. A análise da
especificidade demonstrou que os métodos por CLAE e espectrofotometria no UV não
sofrem interferência dos excipientes da formulação (Figura 4.4 e 4.5).
Capítulo IV – Teste de dissolução 102
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
4.4.2. Precisão
4.4.2.1. Método
A precisão intermediária foi avaliada pela comparação dos resultados de
uniformidade de conteúdo e o percentual de liberação do fármaco. A precisão
intermediária também foi avaliada com a utilização de dois analistas diferentes durante
os testes.
4.4.2.2. Resultados e discussão
4.4.2.2.1. Análise por espectrofotometria UV
As quantidades de linezolida, dissolvidas em cada tempo de coleta, e os
valores de desvio padrão relativos estão listados na Tabela 4.2 e o perfil de dissolução
apresentado na Figura 4.6.
Capítulo IV – Teste de dissolução 103
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Tabela 4.2. Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução (n = 6), usando
água como meio de dissolução e velocidade de 50 rpm (pás)
Tempo (minutos)
% fármaco dissolvida
DPR*
0 0 0
5 70,45 8,87
10 85,29 4,32
15 88,25 2,58
30 90,10 2,82
45 90,48 2,62
60 89,21 2,38
*DPR- desvio padrão relativo
Figura 4.6. Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg, usando
água como meio de dissolução e velocidade de 50 rpm (pás).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (min)
% de fármaco dissolvida
Capítulo IV – Teste de dissolução 104
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A precisão intermediária no teste de dissolução utilizando espectrofotometria
no UV foi avaliada utilizando dois analistas diferentes. A Tabela 4.3 e a Figura 4.7,
apresentam os resultados obtidos pelo Analista 1, utilizando espectrofotometria no UV
para análise.
Tabela 4.3. Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução (n = 6) e o
respectivo DPR, determinados pelo analista 1, usando água como meio de dissolução
e velocidade de 50 rpm (pás)
Tempo (minutos)
% fármaco dissolvida
DPR*
0 0 0
5 70,35 12,50
10 84,18 7,15
15 87,58 4,54
30 90,46 2,83
45 90,07 2,14
60 88,98 2,16
*DPR- desvio padrão relativo
Figura 4.7. Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg, obtido pelo analista 1,
usando água como meio de dissolução e velocidade de 50 rpm (pás).
Capítulo IV – Teste de dissolução 105
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Tabela 4.4 e a Figura 4.8 demonstram a quantidade de linezolida dissolvida
em cada tempo, pelo analista 2.
Tabela 4.4. Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução (n = 6) e o
respectivo DPR, determinados pelo analista 2, usando água como meio de dissolução
e velocidade de 50 rpm (pás)
Tempo (minutos)
% fármaco dissolvida
DPR
0 0 0
5 74,29 9,57
10 87,06 6,49
15 91,46 7,34
30 95,01 5,35
45 94,35 5,84
60 93,03 4,63
*DPR- desvio padrão relativo
Figura 4.8. Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg, obtido pelo analista 2,
usando água como meio de dissolução e velocidade de 50 rpm (pás)
Capítulo IV – Teste de dissolução 106
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 4.9 ilustra os perfis de dissolução de comprimidos de linezolida 600
mg, determinados pelo método espectrofotométrico, por dois analistas.
Figura 4.9. Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg, obtido pelo
analista 1 e 2, usando água como meio de dissolução e velocidade de 50 rpm
A avaliação do perfil de dissolução de comprimidos de linezolida foi
determinado pelo método espectrofotométrico no UV, previamente validado. O valor
médio de uniformidade de conteúdo para comprimidos de linezolida foi de 98,73 %
utilizando espectrofotometria na região ultravioleta. A Tabela 4.2 mostra os valores de
linezolida dissolvidos no meio de dissolução em tempos pré-determinados. Observa-se
que em 10 minutos, a linezolida possui dissolução maior que 85 %.
A precisão intermediária do método por espectrofotometria no UV foi avaliada
por dois analistas diferentes. Os valores de DPR para percentagens de dissolução,
utilizando o método espectrofotométrico no UV, com analistas diferentes, encontram-
se abaixo de 6 % para valores acima de 85 % de dissolução. A Figura 4.9 apresenta
os perfis de dissolução obtidos pelos dois analistas, em que observa-se, que não
houve diferença significativa nos perfis de dissolução nas duas análises.
4.4.2.2.2. Análise utilizando CLAE
As quantida
des de linezolida, dissolvidas em cada tempo de coleta, e os
valores de DPR estão listados na Tabela 4.5 e o perfil de dissolução mostrado na
Figura 4.10.
Tabela 4.5.
Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução (n = 6), usando
água como meio
de dissolução e velocidade de 50 rpm (pás)
Tempo (minutos)
0
5
10
15
30
45
60
Figura 4.10.
Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg, usando água
Capítulo IV –
Teste de dissolução
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
4.4.2.2.2. Análise utilizando CLAE
des de linezolida, dissolvidas em cada tempo de coleta, e os
valores de DPR estão listados na Tabela 4.5 e o perfil de dissolução mostrado na
Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução (n = 6), usando
de dissolução e velocidade de 50 rpm (pás)
% fármaco dissolvida
DPR
0
73,48
9,26
94,32
6,74
99,83
3,23
101,93
2,62
102,53
2,91
105,22
2,92
Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg, usando água
Teste de dissolução
107
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
des de linezolida, dissolvidas em cada tempo de coleta, e os
valores de DPR estão listados na Tabela 4.5 e o perfil de dissolução mostrado na
Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução (n = 6), usando
DPR
0
9,26
6,74
3,23
2,62
2,91
2,92
Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg, usando água
Capítulo IV – Teste de dissolução 108
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A precisão intermediária no teste de dissolução utilizando CLAE foi avaliada
utilizando dois analistas diferentes. A Tabela 4.6 e a Figura 4.11, apresentam os
resultados obtidos pelo Analista 1, utilizando CLAE para análise.
Tabela 4.6. Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução (n = 6) e o
respectivo DPR, determinados pelo analista 1, usando água como meio de dissolução
e velocidade de 50 rpm (pás)
Tempo (minutos)
% fármaco dissolvida
DPR
0 0 0
5 71,87 11,21
10 92,11 8,12
15 98,27 5,11
30 101,09 3,40
45 101,38 4,32
60 104,85 4,74
Figura 4.11. Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg, obtido pelo
analista 1, usando água como meio de dissolução e velocidade de 50 rpm (pás).
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
% de fármaco dissolvido
Tempo (min)
Capítulo IV – Teste de dissolução 109
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Tabela 4.7 e a Figura 4.12 demonstram a quantidade de linezolida dissolvida
em cada tempo, pelo analista 2.
Tabela 4.7. Quantidade de linezolida dissolvida no teste de dissolução (n = 6) e o
respectivo DPR, determinados pelo analista 2, usando água como meio de dissolução
e velocidade de 50 rpm (pás).
Tempo (minutos)
% fármaco dissolvid
a
DPR
0 0 0
5 77,79 11,92
10 94,02 6,46
15 98,87 3,54
30 101,68 4,02
45 101,97 4,49
60 105,06 3,36
Figura 4.12. Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg, obtido pelo
analista 2, usando água como meio de dissolução e velocidade de 50 rpm (pás).
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (min)
% de fármaco dissolvido
Capítulo IV – Teste de dissolução 110
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 4.13 apresenta os perfis de dissolução de comprimidos de linezolida
600 mg, determinados pelo método cromatográfico por dois analistas.
Figura 5.3. Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg,
obtido pelo analista 1 e 2, usando água como meio e velocidade de 50 rpm
O perfil de dissolução de linezolida foi analisado utilizando CLAE, previamente
validado. Os valores médios de uniformidade de conteúdo para comprimidos de
linezolida foram 101,39 % utilizando CLAE.
A Tabela 4.5 apresenta os valores de linezolida dissolvida nos tempos 0, 5, 10,
15, 30, 45 e 60 minutos, em que, verificou-se a dissolução de 94 % de linezolida em
10 minutos de análise. No tempo de 30 minutos, linezolida apresentou dissolução de
100% e o DPR foi de aproximadamente 2,5 %. Este ponto, 30 minutos, pode ser
sugerido para o tempo de análise no teste de dissolução, utilizando CLAE.
Figura 4.13. Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg, obtido pelos
analistas 1 e 2, usando água como meio de dissolução e velocidade de 50 rpm,
analisados.
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (min)
% de fármaco dissolvido
Analista 1
Analista 2
Capítulo IV – Teste de dissolução 111
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Com o intuito de analisar a precisão intermediária do teste de dissolução, o
perfil de dissolução foi realizado por dois analistas. Os valores de DPR para
percentagens de dissolução, utilizando CLAE, com analistas diferentes, estavam
abaixo de 6 % para valores acima de 95 % de dissolução. A Figura 5.13 apresenta os
perfis de dissolução pelos dois analistas em CLAE.
4.4.2.2.3. Comparação dos perfis de dissolução analisados por CLAE e
espectrofotometria na região ultravioleta
A Figura 4.14 apresenta a comparação dos perfis de dissolução de
comprimidos de linezolida obtidos por CLAE e espectrofotometria no UV.
Figura 4.14. Perfil de dissolução de comprimidos de linezolida 600 mg, obtido
pelo método em CLAE e UV, usando água como meio de dissolução e velocidade de
50 rpm.
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (min)
% de fármaco dissolvida
CLAE
UV
Capítulo IV – Teste de dissolução 112
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A comparação dos perfis de dissolução obtidos pelos dois métodos foi
demonstrada na Figura 4.14. Pode-se observar que o método em CLAE é mais
sensível para detecção do fármaco dissolvido no meio, apresentando um perfil de
dissolução máximo (100 %), após 15 minutos de análise. Pela análise no UV, observa-
se que, em 30 minutos de análise o fármaco se encontra 90 % dissolvido no meio.
Este dado não invalida o teste pela espectrofotometria no UV, já que este valor está
dentro da especificação de dissolução para comprimidos, mas o método utilizando
CLAE é mais sensível para detecção de linezolida dissolvida no meio de dissolução.
4.5. Estudo da cinética de dissolução
4.5.1. Condições de estudo
Para o estudo da cinética de dissolução, foram utilizadas as concentrações
relatadas nas Tabelas 5.2 e 5.5, analisadas por espectrofotometria no UV e CLAE,
respectivamente. Os modelos aplicados foram de ordem zero, primeira ordem e
modelo de Higuchi em que os gráficos foram traçados de acordo com o modelo
matemático proposto. Para avaliar os perfis de dissolução pelos dos modelos
propostos, estabeleceram-se as seguintes relações (FERRAZ, 1997; COSTA e LOBO,
2001b):
a) Zero ordem: foram traçados gráficos de tempo versus quantidade total menos
quantidade de fármaco não dissolvido (Q = Q
0
–k
0
t).
b) Primeira ordem: foram traçados gráficos de tempo versus logaritmo neperiano
da porcentagem de fármaco não dissolvido (lnQ = lnQ
0
–k
1
t).
c) Modelo de Higuchi: foram traçados gráficos da raiz quadrada do tempo versus
porcentagem de fármaco dissolvido (Q = kt
1/2
).
Estudos de regressão linear foram realizados para cada modelo, determinando-
se as equações e parâmetros estatísticos da regressão. O modelo mais adequado foi
Capítulo IV – Teste de dissolução 113
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
selecionado após análise de regressão, considerando-se o parâmetro r (coeficiente de
correlação), das curvas de dissolução por CLAE e espectrofotometria no UV, utilizando
apenas os pontos que correspondiam à fase ascendente das mesmas. Outros
parâmetros relativos à cinética de dissolução como constante de velocidade de
dissolução (ks) e meia–vida de dissolução (t
50%
) também foram determinados. Após a
seleção do modelo mais adequado, foi calculado o valor de ks, que corresponde ao
coeficiente angular de inclinação da reta. Cada modelo matemático possui uma
equação de ks correspondente (Tabela 4.8).
Tabela 4.8. Equações da meia-vida de dissolução (ks) de acordo com o modelo
matemático correspondente
Modelo Matemático Equação
Zero ordem
t
50%
= Q∞/2 x ks
Primeira ordem t
50%
= 0,693/ks
Modelo de Higuchi
t
50%
= %D x
√
t
4.5.2. Resultados e discussão
4.5.2.1. Cinética de dissolução de comprimidos de linezolida por CLAE e
espectrofotometria no UV
A Figura 4.15 mostra a cinética de dissolução, utilizando os modelos
matemáticos de ordem zero, primeira ordem e modelo de Higuchi, obtidas pela análise
por CLAE.
Capítulo IV – Teste de dissolução 114
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Figura 4.15. Modelos propostos (A) – reação de ordem zero; (B) reação de
primeira ordem; (C) modelo de Higuchi, obtidos por CLAE.
Capítulo IV – Teste de dissolução 115
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 4.16 mostra a cinética de dissolução, utilizando os modelos
matemáticos de ordem zero, primeira ordem e modelo de Higuchi, obtidas pela análise
por espectrofotometria no UV.
Figura 4.16. Modelos propostos: (A) – reação de ordem zero; (B) reação de
primeira ordem; (C) modelo de Higuchi, obtidos por espectrofotometria no UV.
Capítulo IV – Teste de dissolução 116
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Tabela 4.9 mostra os resultados obtidos da velocidade de dissolução (k) e a
meia-vida útil (t
50%
) de comprimidos de linezolida, obtidos segundo cinética de primeira
ordem, obtidos pelo método em CLAE.
Tabela 4.9. Parâmetros calculados para cinética de dissolução de linezolida obtidos
por CLAE
CLAE
Modelo matemático
Primeira ordem
Coeficiente de correlação (r
2
) 0,9987
Equação y = -0,2779x + 4,6715
Coeficiente linear 4,6715
Coeficiente angular -0,2779
Constante da velocidade de dissolução (min
-
1
) 0,2779
t
50%
(minutos) 2,5
O estudo da cinética do processo de dissolução, empregando-se os modelos
de zero ordem, primeira ordem e Higuchi, foi efetuado para os comprimidos de
linezolida. Os dados obtidos pelo método espectrofotométrico no UV e CLAE foram
tratados com os modelos propostos. Na Figura 5.15 são mostrados os três modelos
matemáticos obtidos por CLAE até 15 minutos. Observa-se que em 15 minutos de
análise, praticamente 100 % de linezolida está totalmente dissolvida. Na linearização
dos dados, utiliza-se os pontos ascendentes na curva. Quando utilizamos modelos
matemáticos para caracterizar a cinética de dissolução, os dados plotados no eixo y é
de fármaco não dissolvido no meio, em cada tempo de análise. Com isto, observa-se
Capítulo IV – Teste de dissolução 117
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
que o modelo proposto mais adequado para definir a cinética de dissolução é de
primeira ordem, que apresentou coeficiente de correlação (r
2
) equivalente a 0,9987.
A constante de velocidade de dissolução (ks) corresponde ao coeficiente
angular da equação de primeira ordem, neste caso, equivalente a 0,2779. A meia-vida
é extremamente importante, na medida em que se estabelece o tempo necessário
para que 50 % do fármaco esteja dissolvido. Assim para produtos nos quais a
liberação do fármaco é mais rápida, os valores de t
50%
serão mais baixos. Em relação
a este parâmetro, os comprimidos de linezolida, indicaramram valores baixos, t
50%
=
2,5 minutos. Está observação sugere que em um curto espaço de tempo, a forma
farmacêutica libera metade da quantidade do fármaco contido, fato este, realmente
adequado para uma forma farmacêutica de liberação imediata.
Os dados obtidos pelo método espectrofotométrico no UV (Tabela 4.2) foram
tratados para obtenção dos dados de cinética de dissolução. Este método mostra-se
pouco sensível para quantificação de linezolida no meio de dissolução. A Figura 5.16
mostra a aplicação dos modelos matemáticos de zero ordem, primeira ordem e
modelo de Higuchi. Pôde-se observar que não foi possível determinar um modelo
matemático ideal, pois os coeficientes de correlação mostraram-se muito baixos.
O método em CLAE mostra-se mais sensível e adequado para delinear e
estudar a cinética de dissolução de comprimidos de linezolida. Não foi possível realizar
a comparação de perfis de dissolução entre formulações, pois, até o momento, existe
apenas uma especialidade farmacêutica contendo linezolida disponível no mercado
brasileiro.
Capítulo IV – Teste de dissolução 118
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
4.6. Conclusão
O desenvolvimento do teste de dissolução é uma etapa muito importante,
considerando que este ensaio é uma ferramenta de avaliação de produtos
farmacêuticos. Os dados de especificidade e estabilidade são necessários a fim de
considerar qual será o método de doseamento do fármaco, no meio de dissolução. As
condições estabelecidas foram adequadas e o perfil obtido considerado satisfatório.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 119
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
5.1. Introdução
A estabilidade é definida como o tempo (em dias, meses, anos) durante o qual
a especialidade farmacêutica ou mesmo a matéria-prima considerada isoladamente,
mantém, dentro dos limites especificados e durante todo o período de armazenamento
e uso, as mesmas condições características que possuía quando da época de sua
fabricação (VADAS, 2000; ANSEL et al., 2000).
A estabilidade dos medicamentos também pode ser definida como o período a
partir da data de fabricação e empacotamento da formulação até que a sua atividade
química e biológica não seja menor que um nível pré-determinado de potência
rotulada e suas propriedades físicas não tenham mudado apreciavelmente e de forma
deletéria. Embora existam exceções, 90% das potências descritas em rótulos,
geralmente são reconhecidas como o nível mínimo de potência aceitável. O prazo de
validade é então definido como o período de tempo no qual a preparação
permanecerá estável, dentro dos limites aceitáveis para efeito terapêutico, quando
armazenada sob as condições recomendadas (VADAS, 2000).
Muitos fatores afetam a estabilidade de um produto farmacêutico, entre eles, a
estabilidade das substâncias ativas, a interação excipiente-fármaco, os processos de
produção, a forma farmacêutica, a embalagem e o sistema de lacre, as condições
durante o transporte, armazenamento e o período entre a fabricação e a utilização do
produto. Fatores ambientais que podem alterar um produto com o tempo incluem
temperatura, radiações, umidade, oxigênio e outros gases atmosféricos, pressão,
solventes, pH, interações, contaminação microbiana, entre outros (KOMMANABOYINA
e RHODES, 1999).
O estudo da cinética das reações químicas tem por objetivo a correlação
matemática de dados experimentais, visando estabelecer hipóteses sobre os fatores
determinantes da velocidade de uma reação e elucidar os mecanismos de reação
envolvidos (NETZ e ORTEGA, 2002).
Capítulo V – Estudo de estabilidade 120
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
No âmbito farmacêutico, a cinética química tem aplicação relevante nos
estudos de estabilidade de medicamentos, assim como a caracterização dos
mecanismos envolvidos na degradação dos mesmos. O conhecimento de tais
aspectos permite estabelecer prazos de validade fidedignos, além de assegurar e
otimizar a estabilidade dos medicamentos, detectando incompatibilidades decorrentes
da mistura dos produtos ou evitando o efeito tóxico associado a produtos de
degradação (NETZ e ORTEGA, 2002).
As reações de degradação nos medicamentos ocorrem a velocidades definidas
e são de natureza química. Dependem de várias condições, tais como, concentração
dos reagentes, temperatura, pH, solvente utilizado, presença de tensoativos na
formulação, umidade, excipientes, luz e oxigênio (LACHMAN et al., 2001; FLORENCE
e ATTWOOD, 2003). Consequentemente, para que o estudo seja efetivo deve-se
aplicar princípios de cinética química. O estudo da cinética de degradação é
fundamental para o estudo de estabilidade de preparações farmacêuticas. Apresenta
como objetivos obter, experimentalmente, os dados cinéticos e correlacioná-los, por
equações matemáticas, além de propor mecanismos para as reações de degradação
e estabelecer condições para acelerar ou diminuir a velocidade das reações
(NUDELMAN, 1975).
A cinética química classifica as reações em ordem de reações, que são
designadas de: ordem zero, primeira ordem, segunda ordem, terceira ordem ou
mesmo ordens cinéticas mais complexas (NETZ e ORTEGA, 2002). Nas reações de
ordem zero, a decomposição procede a uma velocidade constante, sendo
independente da concentração de quaisquer reagentes. Nesse caso, um gráfico de
concentração (c) em função do tempo (t) dá origem a uma reta, cuja inclinação
corresponde à constante de velocidade da reação (k) de degradação do fármaco
(FLORENCE e ATTWOOD, 2003).
As reações de primeira ordem indicam que, as velocidades de reação
dependem da concentração do reagente, obtendo-se uma reta, com a representação
Capítulo V – Estudo de estabilidade 121
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
do logaritmo da concentração (log C) em função do tempo (t). Neste tipo de reação,
uma substância decompõe-se em um, ou mais produtos. A cinética de segunda ordem
ocorre quando a velocidade de reação depende da concentração de dois reagentes,
ou a segunda potência da concentração de um deles. Para esse tipo de reação, a
representação do inverso da concentração (1/C) em função do tempo (t) fornece uma
reta (LACHMAN et al., 2001). O modelo cinético pode ser representado pelas
Equações 6.1, 6.2 e 6.3:
C= Co – kt t
90%
= (0,1 x Co)/k (reação de ordem zero) Equação 6.1
ln C = ln Co – kt t
90%
= 0,106/k (reação de primeira ordem) Equação 6.2
1/C = 1/Co + kt t
90%
= 1/(9k x Co) (reação de segunda ordem) Equação 6.3
Quando a ordem de reação é desconhecida, é possível deduzi-la pela análise
dos gráficos plotados para cada ordem. A representação gráfica que resultar em uma
linha reta indica qual a ordem de reação. Este método possui algumas limitações,
principalmente em relação ao tempo de exposição da amostra ao fator de degradação.
Quando os graus de decomposição são muitos baixos, é difícil diferenciar as ordens
de reação, uma vez que todas parecem ser lineares (NETZ e ORTEGA, 2002).
Na reação de ordem zero, o fator limitante é outro, que não a concentração, por
exemplo, a solubilidade ou a absorção da luz em certas moléculas fotossensíveis. Em
formas farmacêuticas no estado sólido, que são expostos à degradação pela água
(umidade), os fármacos decompõem-se de acordo com velocidades de pseudo-
primeira ordem, à medida que as reações ocorrem entre o fármaco e a água. O
sistema comporta-se como uma suspensão, e como existe um excesso de fármaco no
estado sólido, a velocidade de reação de primeira ordem torna-se, na realidade, uma
velocidade de pseudo ordem zero e a velocidade de diminuição da quantidade de
fármaco ao longo do tempo é linear. Velocidades de reação de pseudo ordem zero
ocorrem frequentemente com fármacos formulados na forma de suspensão
(LACHMAN et al., 2001). Muitas decomposições em estado sólido ou em suspensão
seguem cinética de ordem zero. O ácido ascórbico, por exemplo, degrada-se a uma
Capítulo V – Estudo de estabilidade 122
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
mesma velocidade em condições anaeróbicas, independente da concentração ser 1,3
ou 5 M (NETZ e ORTEGA, 2002).
Apesar da importância das formulações sólidas, têm existido, relativamente,
poucas tentativas para avaliar detalhadamente a cinética de decomposição deste tipo
de formulação. Muitos dos trabalhos iniciais foram desenvolvidos com o único objetivo
de prever a estabilidade, mas os dados foram tratados utilizando-se equações de
velocidade derivadas de reações em solução (FLORENCE e ATTWOOD, 2003). O
estudo das formas farmacêuticas no estado sólido é um dos grandes problemas das
ciências farmacêuticas, principalmente quando temos fármacos sensíveis à umidade,
e não temos a possibilidade de prever as mudanças rápidas de umidade no ambiente.
Uma vez que a estabilidade em relação à umidade depende da sensibilidade dos
fármacos direta e indiretamente sobre o teor de umidade no ambiente, as reações
hidrolíticas podem envolver uma combinação de eventos complexos (WATERMAN e
ADAMI, 2005).
UWAI e colaboradores (2005) realizaram estudo de fotoestabilidade com
comprimidos de propranolol no estado sólido, em que foram isolados três produtos de
degradação. Após a identificação dos produtos de degradação, estes foram testados
em relação a sua toxicidade aguda, sendo observado a ausência de toxicidade.
Recentemente, um estudo de estabilidade fotoquímica em comprimidos de
dihidropiridinas (nifedipino, amilodipino e nivaldipino) foi realizado. Neste trabalho, os
autores demonstraram a sensibilidade de cada produto frente à luz, sua cinética de
degradação, os produtos de degradação formados e a confirmação que nifedipino é o
fármaco mais sensível desta classe (KAWABE et al., 2008). BREIER e colaboradores
(2008) isolaram dois produtos de degradação de fexofenadina em soluções
metanólicas, este produtos também foram observados em fexofenadina no estado
sólido. Comprimidos de alprazolam foram analisados em câmara climática por 6
meses em diferentes temperaturas e umidade. Pode-se observar a formação de um
produto de degradação majoritário (HUIDOBRO et al., 2007).
Capítulo V – Estudo de estabilidade 123
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
No estado sólido, os processos fotoquímicos ocorrem na superfície do produto.
Na maioria dos casos, o interior do produto sólido será inalterado, independente do
tempo de exposição (TONNESEN, 2001). As reações fotoquímicas são processos
complexos, que usualmente ocorre em duas etapas. A primeira etapa envolve uma
reação primária, que corresponde, diretamente, à absorção de um fóton, fazendo com
que o estado da molécula fique excitado. Está reação não depende da temperatura
para a reação das moléculas. A reação fotoquímica primária, frequentemente, é
seguida de reações secundárias (térmicas), devido à presença de produtos
intermediários originados dos processos fotoquímicos iniciais. Diferentes tipos de
reações podem ser iniciados fotoquimicamente, por exemplo, redução, desalquilação,
hidrólise, oxidação, isomerização, rearranjo de anéis, polimerização ou remoção de
diversos substituintes como halogenados ou grupos carboxílicos (TONNESEN, 2001).
Estas reações podem ocorrer por exposição à luz para determinados comprimentos de
onda. Quanto menor o comprimento de onda (λ) da radiação, mais energia é
absorvida por concentração de reagente. Com isso, as radiações absorvidas no
ultravioleta, contribuem mais facilmente para o início de reações químicas, do que
aquelas absorvidas em comprimentos de onda maiores (LACHMAN et al., 2001).
O teste de fotoestabilidade dos fármacos e das suas respectivas formas
farmacêuticas finais, é importante para garantir a qualidade durante toda a vigência do
produto. Os protocolos básicos para novos fármacos e respectivos produtos são
descritos nas diretrizes do ICH para testes de fotoestabilidade, divulgados desde
janeiro de 1998 (ICH, 1997a). Estas diretrizes determinam que os testes de
fotoestabilidade, sejam parte integral dos testes de estresse, os quais são subdivididos
em duas etapas: testes de degradação forçada e testes confirmatórios.
Os testes de degradação forçada, ou teste de estresse, são definidos como os
testes de estabilidade da substância de referência e de medicamentos que excedem
as condições utilizadas para os testes acelerados. Os testes de estresse são de
extrema importância para a indústria farmacêutica e também para pesquisa. Estes
Capítulo V – Estudo de estabilidade 124
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
testes são aplicados aos estudos de pré-formulação, no desenvolvimento de métodos
analíticos indicativos de estabilidade e também para selecionar a melhor formulação
(KLICK et al., 2005). De acordo com vários documentos regulatórios, toda vez que a
empresa for registrar um novo produto, é obrigatório realizar os testes de estresse,
que devem ser incluídos na documentação (FDA, 2004; BRASIL, 2005).
O teste de estresse é a principal ferramenta utilizada para predizer problemas
relacionados à estabilidade, desenvolvimento de métodos analíticos e identificação de
produtos e comportamentos de degradação.
Embora o desenvolvimento de uma ampla escala de produtos farmacêuticos
requeira flexibilidade de como o teste de estresse é conduzido, muitas indústrias,
aplicam extremas condições de estresse rotineiramente, e a explicação destes
procedimentos, não é fornecida. Um exemplo típico é a utilização de HCl 0,1 M e
NaOH 0,1 M em refluxo, por 8 horas, que geralmente geram produtos de degradação
irrelevantes (KLICK et al., 2005).
5.2. Parte experimental
5.2.1. Estudo preliminar da estabilidade de linezolida
5.2.1.1. Condições de estudo
O estudo preliminar da estabilidade de linezolida foi realizado em meio ácido e
básico, peróxido de hidrogênio 3%, temperatura e luz UVC, empregando-se
comprimidos de linezolida. As amostras foram avaliadas quanto às características
organolépticas de cor, odor e aspecto, por análise visual. Além disso, as amostras
foram avaliadas quanto ao teor residual de linezolida e a possível formação de
produtos de degradação. O monitoramento da degradação foi efetuado pelo método
cromatográfico validado previamente. Na degradação em câmara climática, as
amostras também foram analisadas por doseamento microbiológico.
Para os estudos de degradação térmica foi utilizada estufa (FABBE Ltda,
BRASIL) e uma câmara climática (MARCONI, MA 835/UR). Para degradação
Capítulo V – Estudo de estabilidade 125
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
fotoquímica foi utilizada câmara espelhada internamente (100 x 16 x 16 cm), com
lâmpada UVC (254 nm) 20 W.
Todas as amostras provenientes das degradações preliminares, foram
analisadas utilizando coluna Symmetry Waters C
18
5 µm 250 x 4,6 mm e pré-coluna
Symmetry Waters C
18
5 µm, 20 x 3,9 mm, acopladas a um cromatógrafo a líquido
Waters composto de bomba binária Waters 1525, injetor manual Rheodyne Breeze
7725i e detector UV-Vis Waters 2487, e utilizando como fase móvel ácido acético
1% : metanol : acetonitrila (50:25:25, V/V/V).
Nas amostras expostas à degradação térmica e degradação fotoquímica,
além das análises utilizando coluna Symmetry C
18
, foi utilizada uma coluna
semipreparativa (Zorbax Rx-C
18
- 250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT) acoplada ao
cromatógrafo a líquido Waters. Está coluna foi escolhida a fim de obter um perfil
mais claro e otimizar processos de isolamento posteriores. O tempo de retenção de
LNZ-SR e LNZ-comp. na coluna semipreparativa, nas condições utilizadas,
encontra-se em 15 minutos.
As amostras degradadas pela luz-UVC (254 nm) e câmara climática foram
analisadas também em cromátografo Varian- MOD. Pro Star, utilizando-se coluna
semi-preparativa Zorbax (Rx-C
18
- 250 x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT), eluída com
ácido acético 1% : metanol : acetonitrila (50:25:25, V/V/V) em fluxo de 1,0 mL/min e
detecção em diodos em série (200-400 nm), com o objetivo de confirmar a
formação de produtos de degradação nas amostras degradadas.
As condições empregadas, nos estudos preliminares de estabilidade,
encontram-se descritas a seguir:
→
→→
→ Degradação em meio ácido: a solução foi preparada transferindo-se o equivalente
a um peso médio dos comprimidos de linezolida para balão volumétrico de 500 mL,
completando-se o volume com água e levando-se ao banho de ultrassom por 20
minutos. Foi transferida uma alíquota de 5,0 mL para balão volumétrico de 100 mL, e o
volume completado com HCl 0,1 M, obtendo-se uma solução com concentração de
Capítulo V – Estudo de estabilidade 126
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
60,0 µg/mL. A solução foi protegida com papel alumínio e exposta durante uma hora à
temperatura ambiente. Após este período, alíquota de 2,0 mL foi transferida para balão
volumétrico de 10 mL, completando-se o volume do balão com fase móvel, para obter
solução com concentração final de 12,0 µg/mL.
→
→→
→ Degradação meio alcalino: a solução foi preparada transferindo-se o equivalente a
um peso médio dos comprimidos de linezolida para balão volumétrico de 500 mL,
completando-se o volume com água e levando-se ao banho de ultrassom por 20
minutos. Foi transferida uma alíquota de 5,0 mL para balão volumétrico de 100 mL, e o
volume completado com NaOH 0,1 M, obtendo-se uma solução com concentração de
60,0 µg/mL. A solução foi protegida com papel alumínio e exposta durante uma hora à
temperatura ambiente. Após este período, alíquota de 2,0 mL foi transferida para balão
volumétrico de 10 mL, completando-se o volume do balão com fase móvel, para obter
solução com concentração final de 12,0 µg/mL.
→
→→
→ Degradação meio oxidativo: a solução foi preparada transferindo-se o equivalente
a um peso médio dos comprimidos de linezolida para balão volumétrico de 500 mL,
completando-se o volume com água e levando ao banho de ultrassom por 20 minutos.
Foi transferida alíquota de 5,0 mL para balão volumétrico de 100 mL, e o volume
completado com H
2
O
2
3%, obtendo-se uma solução com concentração de 60,0 µg/mL.
A solução foi protegida com papel alumínio e exposta durante uma hora à temperatura
ambiente. Após este período, alíquota de 2,0 mL foi transferida para balão volumétrico
de 10 mL, completando-se o volume com fase móvel, para obter solução com
concentração final de 12,0 µg/mL.
→
→→
→ Degradação térmica: os estudos de degradação térmica envolveram dois
parâmetros distintos. Foi utilizada câmara climática (40º C e 75% de umidade relativa)
e estufa (65º C).
- Em câmara climática: três comprimidos íntegros e o equivalente a três pesos
médios dos comprimidos triturados foram colocados na câmara. Os comprimidos
Capítulo V – Estudo de estabilidade 127
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
triturados e íntegros (fora da embalagem) foram colocados em placa de Petri. Os
tempos de exposição para os comprimidos triturados foram: 5, 10, 15, 30, 45, 60, 75,
90 dias. Para os comprimidos íntegros os tempos de exposição foram 30, 60 e 90 dias.
Para os comprimidos triturados, em cada tempo de análise, retirou-se da câmara uma
quantidade equivalente a 200 mg de linezolida, que foi transferida para balão
volumétrico de 100 mL, perfazendo uma solução de 2000 µg/mL. Foi retirada alíquota
de 10,0 mL e transferida para balão volumétrico de 100 mL, completando a solução
com água. Desta solução foi retirada uma alíquota de 3,0 mL e transferida para balão
de 50 mL, obtendo-se concentração final de 12,0 µg/mL, completando a solução com
fase móvel. Esta solução foi levada para análise por CLAE. Para os comprimidos
íntegros, em cada tempo de análise, o comprimido foi retirado da câmara, triturado, e o
equivalente a 200 mg de linezolida transferido para balão volumétrico de 100 mL. O
procedimento adotado a partir desta solução foi o mesmo que para os comprimidos
triturados.
- Em estufa: o equivalente a um peso médio do comprimido de linezolida foi
colocado em estufa a 65
o
C e analisado nos seguintes tempos: 5, 10 ,15, 25 e 30 dias.
Retirou-se da estufa uma quantidade equivalente a 50 mg de linezolida transferidas
para balão volumétrico de 100 mL, perfazendo uma solução de 500 µg/mL. Foi retirada
alíquota de 10,0 mL e transferida para balão volumétrico de 50 mL, completando o
volume com água. Desta solução foi retirada uma alíquota de 3,0 mL e transferida
para balão de 25 mL, obtendo-se solução com concentração final de 12,0 µg/mL,
completando a solução com fase móvel.
- Degradação fotoquímica: Este estudo preliminar de fotoestabilidade de linezolida foi
desenvolvido em câmara espelhada contendo lâmpada UVC-254 nm, 20 W (45 cm de
comprimento), com temperatura não superior a 25º C. As amostras eram compostas
por comprimidos intactos e comprimidos triturados e expostas à uma distância de 10
cm da lâmpada. As amostras foram preparadas conforme citado no item anterior para
degradação térmica. Os tempos de análises foram os seguintes:
Capítulo V – Estudo de estabilidade 128
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
- Comprimidos intactos: 30 e 60 dias
- Comprimidos triturados: 1, 5, 10, 15, 20 e 30 dias
5.2.1.2. Resultados e discussão
5.2.1.2.1. Degradação em meio ácido
O cromatograma obtido usando CLAE para LNZ-comp., na concentração de
12,0 µg/mL, submetida à condição de degradação em meio ácido por 1 hora, utilizando
coluna Symmetry Waters C
18
5µm, 250 mm x 4,6 mm e cromatógrafo Waters, está
mostrado na Figura 5.1.
Figura 5.1. Cromatograma linezolida em comprimidos, na concentração de 12,0
µg/mL, representando a degradação em meio ácido por 1 hora. Fase móvel: ácido
acético 1%: metanol : acetonitrila (50:25:25,V/V/V). Coluna Symmetry Waters C
18
,5
µm, 250 mm x 4,6 mm e pré-coluna Symmetry Waters C
18
,
5 µm 20 mm x 3,9 mm
Capítulo V – Estudo de estabilidade 129
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
5.2.1.2.2. Degradação em meio básico
O cromatograma obtido por CLAE para amostra de LNZ-comp., na
concentração de 12,0 µg/mL, submetida à condições de degradação em meio básico
por 1 hora, utilizando coluna Symmetry Waters C
18
5 µm, 250 mm x 4,6 e cromatógrafo
Waters, está mostrada na Figura 5.2.
Figura 5.2. Cromatograma de linezolida-comprimido, na concentração de 12,0 µg/mL,
representando a degradação em meio básico por 1 hora. Fase móvel: ácido acético
1%: metanol : acetonitrila (50:25:25,V/V/V). Coluna Symmetry Waters C
18
5 µm 250
mm x 4,6 mm e pré-coluna Symmetry Waters C
18
5 µm 20 mm x 3,9 mm.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 130
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
5.2.1.2.3. Degradação em meio oxidativo
O cromatograma obtido por CLAE para amostra de linezolida, na concentração
de 12,0 µg/mL, submetida à condição de degradação em meio oxidativo por 1 hora,
utilizando coluna Symmetry Waters C
18
, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm e cromatógrafo
Waters, está mostrado na Figura 5.3.
Figura 5.3. Cromatograma de linezolida-comprimido, representando a degradação
oxidativa em H
2
O
2
3 % por 1 hora. Fase móvel: ácido acético 1%: metanol : acetonitrila
(50:25:25,V/V/V). Coluna Symmetry Waters C
18
5µm 250 mm x 4,6 mm e pré-coluna
Symmetry Waters C
18
5 µm 20 mm x 3,9 mm.
Os estudos de estabilidade preliminar envolveram condições de estresse, com
degradação ácida, básica e oxidativa. O objetivo desta exposição foi verificar a
estabilidade preliminar de comprimidos de linezolida perante estas degradações. Nos
estudos de degradação ácida observou-se o início de formação de produtos de
degradação após a exposição de 1 hora, em meio ácido (HCl 0,1 M). Observando o
cromatograma (Figura 5.1) pode-se visualizar o início da formação de produtos de
degradação no tempo de retenção de 2,3 minutos.
Em relação à degradação básica, o fármaco é bem mais sensível nesta
condição, sendo quase totalmente degradado, formando um produto de degradação
majoritário no tempo de, aproximadamente, 2 minutos (Figura 5.2). Na literatura, há
Capítulo V – Estudo de estabilidade 131
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
um trabalho que cita a susceptibilidade do fármaco em meio básico. BEBAWY (2003a)
desenvolveu três métodos analíticos para determinação de linezolida em comprimidos,
dois métodos usando espectrofotometria no visível e um método usando CLAE na
presença de produto de degradação alcalino. Segundo este autor, o produto de
degradação básica formado, encontra-se apresentado no esquema 5.1.
Esquema 5.1. Esquema da reação de degradação de linezolida em meio básico e o
produto de degradação majoritário produzido (Fonte: BEBAWY, 2003a).
A fase móvel utilizada foi metanol : água (65:35) com pH = 3,5, ajustado com
ácido acético. O comprimento de onda utilizado foi 240 nm. O tempo de retenção do
produto de degradação em meio básico equivale a 2,8 minutos. Nestas condições a
LNZ-SR teve como tempo de retenção 3,9 minutos (BEBAWY, 2003a). Portanto, o
Capítulo V – Estudo de estabilidade 132
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
produto de degradação teve um tempo de retenção menor que LNZ-SR. A Figura 5.2
mostra a degradação em meio básico com o produto de degradação majoritário em 2,0
minutos. Pressupõe-se, que o produto de degradação neste trabalho, seja o mesmo
que BEBAWY (2003a) sugeriu em trabalho publicado anteriormente.
AGRAWAL e colaboradores (2003) desenvolveram e validaram um método
indicativo de estabilidade para linezolida em matéria-prima e comprimidos, utilizando
HPTLC. Neste método, os autores utilizaram como fase móvel tolueno e acetona, na
proporção 5:5, V/V. Os autores realizaram estudos de degradação forçada nas
amostras, verificando que o produto é susceptível à degradação ácida, básica,
fotoquímica e oxidativa.
Na degradação oxidativa houve redução no teor de linezolida nos comprimidos
e foi possível observar a presença de produto de degradação (Tr2,3 minutos). Este
estudo teve como objetivo avaliar se a linezolida é sensível a oxidação.
5.2.1.2.4. Degradação térmica
5.2.1.2.4.1. Em estufa
Capítulo V – Estudo de estabilidade 133
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.4 mostra o cromatograma ampliado de linezolida-comprimidos, na
concentração de 12,0 µg/mL, submetidos à degradação térmica, em estufa à 65º C,
por 30 dias. Esta análise foi realizada em cromatógrafo líquido Waters e coluna
Symmetry Waters C
18
5 µm 250 mm x 4,6 mm.
Figura 5.4. Cromatograma ampliado de linezolida-comprimido, representando a
degradação térmica em à 65
o
C, por 30 dias. Fase móvel: ácido acético 1% : metanol :
acetonitrila (50:25:25, v/v/v). Coluna Symmetry Waters C
18
5 µm, 250 mm x 4,6 mm e
pré-coluna Symmetry Waters C
18
5 µm, 20 mm x 3,9 mm.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 134
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
5.2.1.2.4.2. Em câmara climática
O cromatograma ampliado obtido por CLAE para solução de comprimidos
triturados de linezolida, em concentração de 12,0 µg/mL, no período de 90 dias,
submetidos às condições de degradação em câmara climática (40
o
C/75%), utilizando
coluna Symmetry Waters, C
18
, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm em cromatógrafo Waters, está
mostrado na Figura 5.5.
Figura 5.5. Cromatograma ampliado de comprimidos triturados de linezolida, na
concentração de 12,0 µg/mL expostos durante 90 dias, em câmara climática (40º
C/75%). Fase móvel: ácido acético 1%: metanol : acetonitrila (50:25:25, V/V/V). Coluna
Symmetry Waters, C
18
,5 µm, 250 mm x 4,6 mm e pré-coluna Symmetry Waters, C
18
,
5
µm, 20 mm x 3,9 mm em cromatógrafo Waters.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 135
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
As Figuras 5.6 a 5.16 mostram as análises realizadas em LNZ-SR e LNZ-
comp., na concentração de 100,0 µg/mL, utilizando para análise cromatógrafo Varian-
MOD. Pro Star com detector espectrofotométrico com diodos em série e coluna
semipreparativa Zorbax Rx-C
18,
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. Para análise dos
dados foi utilizado o software Polyview e Aurora 5.31.
A Figura 5.6 mostra o cromatograma de LNZ-SR, concentração de 100,0 µg/mL
e o respectivo tempo de retenção (TR ≅ 13,0 minutos)
Figura 5.6. Cromatograma de solução de LNZ-SR, em concentração de 100,0 µg/mL,
utilizando CLAE acoplado a detector espectrofotométrico com diodos em série, coluna
semipreparativa Zorbax Rx-C
18
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. Fase móvel:
ácido acético 1% : metanol : acetonitrila (50:25:25,V/V/V).
Capítulo V – Estudo de estabilidade 136
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.7 mostra o isograma de LNZ-SR, na concentração de 100,0 µg/mL,
utilizando o software Aurora versão 5.31.
Figura 5.7. Isograma de LNZ-SR, na concentração de 100,0 µg/mL, analisado em
cromatógrafo Varian- MOD. Pro Star com detector espectrofotométrico com diodos em
série e coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18,
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT.
Fase móvel: ácido acético 1% : metanol : acetonitrila (50:25:25, V/V/V). A coluna em
branco indica o comprimento de onda (nm) dos picos no isograma. A coluna em cores
indica a intensidade do sinal (mAU) de cada pico. (1) e (2) indicam absorções
negativas, relacionadas à fase móvel.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 137
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.8 mostra os espectros da solução padrão de 100,0 µg/mL, utilizando
o isograma da Figura 5.7. Os espectros de absorção relacionam-se aos picos
visualizados no isograma.
Figura 5.8. Espectros de absorção na região do UV da solução de LNZ-SR, na
concentração de 100,0 µg/mL, representando o isograma da Figura 5.7.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 138
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.9 mostra o isograma de LNZ-comp., na concentração de 100,0
µg/mL, utilizando o software Aurora versão 5.31.
Figura 5.9. Isograma de LNZ-comp, na concentração de 100,0 µg/mL, analisado em
cromatógrafo Varian- MOD. Pro Star com detector espectrofotométrico com diodos em
série e coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18,
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT.
Fase móvel: ácido acético 1% : metanol : acetonitrila (50:25:25, V/V/V). A coluna em
branco indica o comprimento de onda (nm) dos picos no isograma. A coluna em cores
indica a intensidade do sinal (mAU) de cada pico. (1) e (2) indicam absorções
negativas, relacionadas à fase móvel.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 139
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.10 mostra os espectros da solução amostra de 100,0 µg/mL,
utilizando o isograma da Figura 5.9. Mostra os espectros de absorção relacionados
aos picos visualizados no isograma.
Figura 5.10. Espectros de absorção na região do UV da solução de LNZ-comp, na
concentração de 100,0 µg/mL, representando o isograma da Figura 5.9.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 140
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.11 mostra o cromatograma de LNZ-comp., na concentração de
100,0 µg/mL, submetido às condições de degradação térmica em câmara climática
(40ºC/75%) por 90 dias, utilizando para análise cromatógrafo Varian- MOD. Pro Star
com detector espectrofotométrico com diodos em série e coluna semipreparativa
Zorbax Rx-C
18,
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT.
Figura 5.11. Cromatograma de LNZ-comp., na concentração de 100,0 µg/mL,
representando a degradação térmica em câmara climática (40ºC/75%), de
comprimidos triturados por 90 dias, utilizando CLAE com diodos em série, coluna
semipreparativa Zorbax Rx-C
18
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. Fase móvel:
ácido acético 1% : metanol : acetonitrila (50:25:25, V/V/V). Pico (1): produto de
degradação T
R
≅ 8,0 min. Pico (2): LNZ-comp. T
R
≅ 13,0 minutos;
Capítulo V – Estudo de estabilidade 141
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.12 mostra o espectro de absorção do pico (1) e (2) de acordo com o
cromatograma da Figura 5.11, com comprimento de onda equivalente a 221 nm (pico
1) e 253 nm (pico 2). Foi utilizada solução com concentração de 100,0 µg/mL, de
comprimidos de linezolida triturados, expostos em câmara climática (40ºC/75%) por 90
dias. Software utilizado polyview versão 5.31.
Figura 5.12. Espectro de absorção dos picos (1) e (2) relacionados ao cromatograma
da Figura 6.11, com comprimento de onda equivalente a 221 nm (pico 1) e 253 nm
(pico 2). Foi utilizada solução com concentração de 100,0 µg/mL, de comprimidos de
linezolida triturados, expostos em câmara climática (40ºC/75%) por 90 dias. Software
utilizado Polyview versão 5.31. Fase móvel: ácido acético 1%: metanol : acetonitrila
(50:25:25, V/V/V).
Capítulo V – Estudo de estabilidade 142
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.13 mostra a análise realizada em linezolida comprimido, na
concentração de 100,0 µg/mL, submetida às condições de degradação térmica em
câmara climática, por 90 dias, utilizando cromatógrafo Varian - MOD. Pro Star com
detector espectrofotométrico com diodos em série e coluna semipreparativa Zorbax
Rx-C
18,
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. O software utilizado foi AURORA versão
5.31, ilustradodo por isograma em cores.
Figura 5.13. Isograma de LNZ-comp., na concentração de 100,0 µg/mL,
representando a degradação térmica em câmara climática, de comprimidos triturados
por 90 dias, utilizando CLAE com diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax Rx-
C
18
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. Fase móvel: ácido acético 1% : metanol :
acetonitrila (50:25:25, V/V/V). A coluna em branco indica o comprimento de onda (nm)
das substâncias no isograma. A coluna em cores indica a intensidade do sinal (mAU)
de cada pico. (1) solvente (2) produto de degradação.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 143
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.14 mostra o cromatograma de LNZ-comp., na concentração de
100,0 µg/mL, submetido às condições de degradação térmica em câmara climática
(40ºC/75%) por 180 dias, utilizando cromatógrafo Varian- MOD. Pro Star com detector
espectrofotométrico com diodos em série e coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18,
250
mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT.
Figura 5.14. Cromatograma de LNZ-comp., na concentração de 100,0 µg/mL,
mostrando a degradação térmica em câmara climática (40ºC/75%), de comprimidos
triturados por 180 dias, utilizando CLAE com diodos em série e coluna semipreparativa
Zorbax Rx-C
18
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. Fase móvel: ácido acético 1% :
metanol : acetonitrila (50:25:25, V/V/V). Pico (1): produto de degradação T
R
≅ 8,0 min.
Pico (2): LNZ-comp. T
R
≅ 13,0 minutos;
Capítulo V – Estudo de estabilidade 144
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.15 mostra o espectro de absorção do pico (1) e (2) de acordo com o
cromatograma da Figura 5.14, com comprimento de onda equivalente a 221 nm (pico
1) e 253 nm (pico 2). Foi utilizada soluções com concentração de 100,0 µg/mL, de
comprimidos de linezolida triturados, expostos em câmara climática (40ºC/75%) por
180 dias. Software utilizado polyview versão 5.31.
Figura 5.15. Espectro de absorção dos picos (1) e (2) relacionados ao cromatograma
da Figura 5.14, com comprimento de onda equivalente a 221 nm (pico 1) e 253 nm
(pico 2). Esta análise foi obtida pela solução com concentração de 100,0 µg/mL, de
comprimidos de linezolida triturados, expostos em câmara climática (40ºC/75%) por
180 dias. Software utilizado Polyview versão 5.31. Fase móvel: ácido acético 1%:
metanol : acetonitrila (50:25:25, V/V/V).
Capítulo V – Estudo de estabilidade 145
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.16 mostra a análise realizada em linezolida comprimido, na
concentração de 100,0 µg/mL, submetido às condições de degradação térmica em
câmara climática, por 180 dias, utilizando cromatógrafo Varian - MOD. Pro Star com
detector espectrofotométrico com diodos em série e coluna semipreparativa Zorbax
Rx-C
18,
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. O software utilizado foi AURORA versão
5.31, ilustrado pelo isograma em cores.
Figura 5.16. Isograma de LNZ-comp., na concentração de 100,0 µg/mL,
representando a degradação térmica em câmara climática, de comprimidos triturados
por 180 dias, utilizando CLAE com diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax
Rx-C
18
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. Fase móvel: ácido acético 1% : metanol :
acetonitrila (50:25:25, V/V/V). A coluna em branco indica o comprimento de onda (nm)
das substâncias no isograma. A coluna em cores indica a intensidade do sinal (mAU)
de cada pico. (1) solvente (2) produto de degradação.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 146
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Os comprimidos de linezolida foram triturados e submetidos a exposição
térmica em dois cromatógrafos diferentes, estufa e câmara climática. A estufa foi
utilizada para verificar o comportamento de linezolida exposta somente ao fator
temperatura. Os comprimidos triturados foram expostos por 30 dias na temperatura de
65ºC e a Figura 5.4 mostra o cromatograma da solução de 12,0 µg/mL dos
comprimidos expostos. Observando o cromatograma, não foi visualizada a
degradação de linezolida nestas condições de ensaio.
Os comprimidos expostos em câmara climática por 90 dias foram analisados
em dois cromatógrafos de marcas diferentes, Waters e Varian. Primeiramente, as
análises foram realizadas no cromatógrafo Waters, utilizando coluna symmetry C
18
. A
Figura 5.5 mostra o cromatograma da solução de 12,0 µg/mL dos comprimidos
triturados expostos em câmara climática por 90 dias, em que, observa-se a formação
de um produto de degradação nestas condições de exposição.
As amostras de linezolida também foram analisadas em cromatógrafo Varian -
MOD. Pro Star, utilizando coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18
e fase móvel ácido
acético 1% : metanol : acetonitrila (50:25:25, V/V/V). Esta coluna semipreparativa foi
utilizada com o objetivo de separar mais adequadamente os produtos de degradação.
Primeiramente, foram injetadas soluções de LNZ-SR, na concentração de 100,0
µg/mL, mostradada pelo cromatograma na Figura 5.6, com tempo de retenção de,
aproximadamente, 13 minutos.
Para melhor visualização e determinação da pureza de LNZ-SR (Figura 5.6), o
cromatograma foi transformado num isograma, pelo software Aurora 5.31, mostrado
na Figura 5.7. Neste isograma, pode-se observar a presença de LNZ-SR, com
intensidade de sinal bastante elevada, demonstrado pelo diagrama de cor vermelho
intenso com centro preto, indicando que a LNZ-SR é a única substância neste
isograma. Os picos 1 e 2, de cor azul a roxo, indicam o pico de absorção dos
solventes. Os espectros de absorção dos diagramas em cores visualizados no
Capítulo V – Estudo de estabilidade 147
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
isograma da Figura 5.7 são mostrados na Figura 5.8, em que LNZ-SR possui uma
absorção máxima em 253 nm, e os picos (1) e (2) possuem absorção negativa.
Amostras de comprimidos não degradados foram analisados em cromatógrafo Varian,
com o objetivo de verificar a pureza de linezolida em comprimidos. As Figuras 5.9 e
5.10 mostram a análise de LNZ-comp, na concentração de 100,0 µg/mL e demonstra
que não há nenhum produto de degradação antes de expor os comprimidos nas
condições de degradação em câmara climática.
As análises das soluções dos comprimidos expostos em câmara climática
(40ºC/75%) por 90 dias também foram realizadas em cromatógrafo Varian - MOD. Pro
Star, utilizando coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18
e fase móvel ácido acético 1%:
metanol : acetonitrila (50:25:25, V/V/V). O tempo de retenção de LNZ-comp., nestas
condições, equivale a, aproximadamente, 13 minutos (Figura 5.11). Neste
cromatograma observa-se a presença de mais um produto, indicado pelo pico (1). Os
espectros de absorção destes picos, são visualizados na Figura 5.12, em que o pico
(1) absorve em 221 nm e o pico (2), LNZ-comp., em 253 nm. Nestas análises,
observa-se a formação de um produto de degradação, com tempo de retenção de 8,0
minutos e espectros característicos com comprimento de onda máximo em 221 nm. O
isograma da Figura 5.13 confirma presença deste produto de degradação formado,
nestas condições de degradação. O produto de degradação formado indica um
espectro de absorção com comprimento de onda menor que LNZ-SR. A molécula de
LNZ-SR possui como banda principal (transição π → π) o grupamento aril, que se
caracteriza pela absorção em comprimento de onda mínimo de 230 nm
(SILVERSTEIN et al., 1994). Com isso, supõe-se que o produto de degradação
formado, não possui o grupo aril na molécula.
Estas análises também foram realizadas em comprimidos triturados expostos
em câmara climática por 180 dias. Observa-se o mesmo comportamento de
degradação da exposição por 90 dias. As análises foram realizadas com linezolida no
Capítulo V – Estudo de estabilidade 148
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
estado sólido para verificar o comportamento de degradação durante o período de
comercialização. As degradações neste estado ocorrem lentamente, em relação a
linezolida em solução. Nestes estudos, seria possível preparar soluções de LNZ-comp,
e expor às condições de degradação em câmara climática, mas, neste caso, não se
saberia o real comportamento da formação de produtos de degradação em estado
sólido. Com isto, optou-se, por realizar a degradação com comprimidos triturados, para
acelerar a degradação.
5.2.1.2.5. Degradação fotoquímica
O cromatograma obtido por CLAE para solução de comprimidos triturados de
linezolida, em concentração de 12,0 µg/mL, submetida à condição de degradação
fotoquímica, por 30 dias, está mostradada na Figura 5.17, utilizando coluna Symmetry
Waters, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm e cromatógrafo da Waters.
Figura 5.17. Cromatograma de linezolida-comprimidos, em concentração 12,0 µg/mL,
representando a degradação fotoquímica de comprimidos triturados em 30 dias. Fase
móvel: ácido acético 1% : metanol : acetonitrila (50:25:25,V/V/V). Coluna Symmetry
Waters C
18
5 µm 250 mm x 4,6 mm e pré-coluna Symmetry Waters C
18
5 µm 20 mm x
3,9 mm.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 149
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
O cromatograma ampliado obtido por CLAE para a amostra de comprimido
íntegro de linezolida, exposto fora da embalagem, submetido às condições de
degradação fotoquímica, por 30 e 60 dias, está mostrada na Figura 5.18, utilizando
coluna Symmetry Waters, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm e cromatógrafo Waters.
Figura 5.18. Cromatograma de linezolida, em concentração de 12,0 µg/mL,
representando o comprimido íntegro, exposto fora da embalagem, na câmara UV,
durante 30 dias (A) e 60 dias (B). Fase móvel: ácido acético 1%: metanol : acetonitrila
(50:25:25, V/V/V). Coluna Symmetry Waters, C
18
5 µm, 4,6 mm x 250 mm e pré-coluna
Symmetry Waters, C
18,
5 µm, 20 mm x 3,9 mm.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 150
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Cromatograma normal (A) e ampliado (B) obtidos por CLAE para comprimidos
triturados de linezolida, submetidos às condições de degradação fotoquímica, por 60
dias, mostrado na Figura 5.19, utilizando coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18
- 250
mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT e cromatógrafo Waters. Nesta figura pode-se
observar dois produtos de degradação majoritários (tr = 10,4 minutos e 11,5 minutos),
nestas condições de análise.
Figura 5.19. Cromatograma do comprimido triturado de linezolida, normal (A) e
ampliado (B), em concentração de 12,0 µg/mL, representando a degradação
fotoquímica em 60 dias, utilizando coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18
250 x 9,4
mm, 5 µm – AGILENT e cromatógrafo Waters. Fase móvel: ácido acético 1% : metanol
: acetonitrila (50:25:25, V/V/V).
A
B
Capítulo V – Estudo de estabilidade 151
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
As Figuras 5.20 a 5.24 mostram as análises realizadas em linezolida
comprimidos, na concentração de 200 µg/mL, submetidas às condições de
degradação fotoquímica, por 30 dias, utilizando cromatógrafo Varian- MOD. Pro Star
com detector espectrofotométrico com diodos em série e coluna semipreparativa
Zorbax Rx-C
18,
250 mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. Para análise dos dados foi
utilizado o software Polyview e Aurora 5.31.
A Figura 5.20 mostra o cromatograma de LNZ-comp. e os respectivos produtos
de degradação majoritários formados, visualizados pelo software Polyview. LNZ-comp.
t
R
≅ 13,0 minutos; PD1 ≅ 9,0 minutos; PD2 ≅ 10,5 minutos.
Figura 5.20. Cromatograma de solução de linezolida-comprimido, em concentração de
200 µg/mL, representando a degradação fotoquímica de comprimidos triturados em 30
dias, utilizando CLAE com diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18
250
mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. Fase móvel: ácido acético 1%: metanol : acetonitrila
(50:25:25,V/V/V). LNZ-comp. T
R
≅ 13,0 minutos; PD1 ≅ 9,0 minutos; PD2 ≅ 10,5
minutos.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 152
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.21 mostra o cromatograma de LNZ-comp. degradado por 30 dias
em luz-UVC, e o produto de degradação 2 (PD2) identificadodo na figura, bem como o
espectro de absorção correspondente. O software utilizado foi o Polyview.
Figura 5.21. Cromatograma de solução de linezolida-comprimido, em concentração de
200 µg/mL, representando a degradação fotoquímica de comprimidos triturados em 30
dias, utilizando CLAE com diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18
250
x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. Fase móvel: ácido acético 1% : metanol : acetonitrila
(50:25:25, V/V/V). Esta figura mostra o cromatograma com indicação do PD2 e o
respectivo espectro de absorção. O software utilizado foi Polyview.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 153
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.22 mostra o cromatograma de LNZ-comp. degradado por 30 dias
em luz-UVC, e o produto de degradação 1 (PD1) mostradodo na figura, bem como o
espectro de absorção correspondente. O software utilizado foi o Polyview.
Figura 5.22. Cromatograma de solução de linezolida-comprimido, em concentração de
200 µg/mL, representando a degradação fotoquímica de comprimidos triturados em 30
dias, utilizando CLAE com diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18
250
x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. Fase móvel: ácido acético 1% : metanol : acetonitrila
(50:25:25, V/V/V). Esta figura mostra o cromatograma com indicação do PD1 e o
respectivo espectro de absorção. O software utilizado foi Polyview.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 154
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Na Figura 5.23, os resultados estão ilustradosdos pelo software AURORA, em
que os picos de cada composto são mostrados por diagramas em cores. Nesta figura
pode-se observar a intensidade do sinal em mAU, na primeira coluna e a absorvância,
na segunda coluna. A Figura mostra LNZ-comp. e os produtos de degradação
formados (PD1, PD2 e PD3).
Figura 5.23. Cromatograma de solução de linezolida-comprimido, em concentração de
200 µg/mL, representando a degradação fotoquímica de comprimidos triturados em 30
dias, utilizando CLAE com diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18
250
mm x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. Fase móvel: ácido acético 1% : metanol : acetonitrila
(50:25:25, V/V/V). Neste isograma observa-se formação de três produtos de
degradação.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 155
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.24 mostra os espectros correspondentes aos compostos PD1, PD2
e PD3. Os espectros foram extraídos do software AURORA através do isograma
correspondente (Figura 5.19). O tempo de retenção de PD1 é 9,2 minutos e o
comprimento de onda máximo equivale a 245 nm. O tempo de retenção de PD2 é 10,2
minutos e o comprimento de onda máximo equivale a 243 nm. O tempo de retenção
do PD3 é 9,5 minutos e o comprimento de onda máximo equivale a 220 nm.
Figura 5.24. Cromatograma de solução de linezolida-comprimido, em concentração de
200 µg/mL, representando a degradação fotoquímica de comprimidos triturados em 30
dias, utilizando CLAE com diodos em série, coluna semipreparativa Zorbax Rx-C
18
250
x 9,4 mm, 5 µm – AGILENT. Fase móvel: ácido acético 1% : metanol : acetonitrila
(50:25:25, V/V/V). PD1 - t
R
= 9,2 min (245 nm); PD2 – tr = 10,2 min (243 nm); PD3. –
TR = 9,5 min (220 nm).
Capítulo V – Estudo de estabilidade 156
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Em relação à degradação fotoquímica, os pós dos comprimidos triturados
demonstraram, a partir da análise visual, modificações significativas nas
características organolépticas. A coloração amarelada se intensificou até o final do
estudo (tempo de 30 dias). Observou-se também a formação de produtos de
degradação, tanto para os pós dos comprimidos triturados, quanto para o comprimido
íntegro, exposto na câmara com luz – UVC. Para analisar as amostras, foram
utilizados dois cromatógrafos de fabricantes distintos (Waters e Varian), bem como
colunas, cromatográficas de marcas diferentes.
As primeiras análises foram realizadas utilizando cromatógrafo Waters com
coluna Symmetry C
18
. As Figuras 5.14 e 5.15 mostram os cromatogramas das
soluções de LNZ-comp., na concentração de 12,0 µg/mL, em que, observa-se o início
da formação de produtos de degradação. Para obter melhor visualização e distinção
dos produtos de degradação, foi utilizada coluna cromatográfica semipreparativa
Zorbax Rx-C
18
. A Figura 5.17 mostra o cromatograma da solução de LNZ-comp., na
concentração de 12,0 µg/mL, em que dois produtos de degradação no tempo de
retenção de 10,4 minutos e 11,5 minutos são mais bem visualizados. Nestas
condições a linezolida possui tempo de retenção de 15 minutos. A Figura 5.21 mostra
o cromatograma e o respectivo espectro de absorção do produto de degradação PD2,
com comprimento de onda equivalente a 243 nm. A Figura 5.22 mostra o
cromatograma e o respectivo espectro de absorção do produto de degradação PD1,
com comprimento de onda equivalente a 245 nm. Esses dois produtos de degradação
formados possuem espectro de absorção semelhante (λ = 243 nm e λ = 245 nm), com
tempos de retenção próximos. Pode-se supor que estes produtos de degradação são
os mesmos dos demonstrados nos picos visualizados na Figura 5.17 analisados em
cromatógrafo Waters.
A LNZ-SR em água possui comprimento de onda máximo de 251 nm. Os
produtos de degradação formados possuem espectro de absorção com comprimento
de onda entre 243 nm e 245 nm. Provavelmente, a molécula de linezolida, deve ter
Capítulo V – Estudo de estabilidade 157
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
perdido um grupamento específico degradado pela luz-UVC. O comprimento de onda
máximo teve um deslocamento muito pequeno e com isto, pode-se supor, que o
produto de degradação formado, provavelmente, é resultante da degradação dos
grupamentos envolvendo a ligação C = O (carbonila). Supõe-se que um dos produtos
formados, seja o mesmo resultante da degradação alcalina, demonstrado no esquema
5.1, em que corresponderia ao produto de degradação (PD2) com espectro de
absorção máximo de 243 nm (tr = 10,5 minutos). A Figura 5.25 mostra o outro possível
produto de degradação formado (PD1).
Figura 5.25. Proposta da estrutura química do produto de degradação formado
(PD1).
Capítulo V – Estudo de estabilidade 158
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Para confirmar a pureza dos picos, comprimidos de linezolida expostos em luz
UVC por 30 dias foram analisados no isograma mostrado na Figura 5.23, em que,
observa-se a presença de um produto de degradação minoritário, com espectro de
absorção característico na Figura 5.24, com comprimento de onda máximo de 220 nm
e tempo de retenção equivalente a 9,5 minutos. Provavelmente, este produto de
degradação é o mesmo produto formado na degradação em câmara climática, pois
possuem espectros de absorção semelhantes. O esquema 5.2 mostra os dois
possíveis produtos de degradação (PD1 e PD2) formados na degradação fotoquímica.
Figura 5.2. Esquema de degradação de linezolida mostrando os possíveis produtos de
degradação (PD1 e PD2)
Capítulo V – Estudo de estabilidade 159
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Com base nos resultados obtidos, os quais demonstram alteração das
características organolépticas (em todas as amostras), na percentagem residual de
linezolida nas amostras, principalmente do pó, e aparecimento de produtos de
degradação nos cromatogramas, é possível afirmar que houve degradação do
fármaco. Assim sendo, a linezolida demonstrou ser sensível ao fator luz-UVC nas
condições estabelecidas. Com isso, verifica-se a importância de proteger este fármaco
da luz, principalmente a matéria-prima, durante todo o processo de produção do
medicamento.
5.2.2. Estudo de fotodegradação de linezolida
5.2.2.1. Condições de estudo
5.2.2.1.1. Para análise em CLAE e espectrofotometria no UV
O equivalente a três pesos médios dos comprimidos de linezolida foi transferido
para placa de vidro e colocados em câmara espelhada internamente e exposto à luz
por 1, 10, 15, 20, 30, 60 e 90 dias. Após o tempo de exposição, pesou-se o
equivalente a 200,0 mg de linezolida de cada uma das amostras expostas à luz e
transferiu-se para balões volumétricos de 100 mL, completando-se o volume com
água. Desta solução a 2000,0 µg/mL, foi transferida alíquota de 10,0 mL para balão
volumétrico de 100 mL e o volume completado com água, obtendo-se concentração
teórica de 200 ,0µg/mL. Para análise em CLAE, foram transferidas alíquotas de 3,0 mL
para balões volumétricos de 50 mL e o volume completado com fase móvel (ácido
acético 1% : acetonitrila : metanol, 50:25:25, V/V/V). Em seguida, as soluções foram
analisadas em CLAE. As amostras analisadas em CLAE foram filtradas em membrana
de tamanho de poro 0,45 µm e volumes de 20 µL. Para análise em espectrofotometria,
a partir da solução com concentração teórica de 200,0 µg/mL, foram transferidas
alíquotas de 3,0 mL para balões volumétricos de 50 mL e o volume completado com
água ultrapura para obtenção de solução com concentração de 12,0 µg/mL.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 160
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
5.2.2.1.2. Para análise por ensaio microbiológico
Três comprimidos foram triturados e transferidos em placa de vidro para
câmara espelhada internamente e expostos à luz por 10, 30, 60 e 90 dias. Após o
tempo de exposição, pesou-se o equivalente a 200 mg de linezolida de cada uma das
amostras expostas à luz (10, 30, 60 e 90 dias) e transferiu-se para balões volumétricos
de 100 mL, completando-se o volume com água. Desta solução a 2000,0 µg/mL, foi
transferida uma alíquota de 10,0 mL para balão volumétrico de 100 mL e o volume
completado com água, obtendo-se concentração de 200,0 µg/mL. Em seguida,
alíquotas de 1,0; 2,0 e 4,0 mL destas soluções foram transferidas para balões
volumétricos de 10,0 mL e os volumes completados com tampão fosfato pH 6.0,
obtendo-se concentrações de 20, 40 e 80,0 µg/mL.
5.2.2.2. Resultados
5.2.2.2.1. Análise em CLAE
A Tabela 5.1 mostra os resultados obtidos com os comprimidos triturados
expostos ao fator luz (254 nm) durante o período de 90 dias.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 161
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Tabela 5.1. Valores obtidos na quantificação de linezolida nos comprimidos triturados
expostos à luz (254 nm), analisados por CLAE
Tempo de
exposição
(dias)
Área
Teor (%)
Teor médio
(%)
DPR (%)
0
557734
564065
551624
101,31
102,46
100,20
101,32
1,57
1
547747
536237
538863
99,49
97,40
97,88
98,45
1,50
10
513444
492326
506523
93,26
89,42
92,00
91,56
1,99
15
470138
461360
465423
85,39
83,80
84,54
84,58
0,61
20
444214
457641
434434
80,68
83,12
78,91
80,91
3,68
30
365571
400717
372895
66,40
72,78
67,73
68,97
5,18
60
334522
345224
341829
60,76
62,70
62,09
61,85
0,70
90
176103
179011
182408
31,98
32,51
33,13
32,54
1,34
Capítulo V – Estudo de estabilidade 162
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.26 mostra o gráfico correspondente à análise do teor de LNZ-comp.
durante 90 dias, exposta ao fator luz-UVC 254 nm, analisadas por CLAE.
Figura 5.26. Teor de LNZ-comp, no período correspondente a 90 dias, exposta ao
fator luz UVC (254 nm), determinado por CLAE.
A Figura 5.27 mostra os cromatogramas ampliados dos dias 1, 10, 15, 20 e 30
dias de exposição dos comprimidos triturados de linezolida na luz-UVC. Observa-se a
formação e o aumento dos produtos de degradação com o aumento da exposição.
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100
Teor (%)
Tempo (dias)
Capítulo V – Estudo de estabilidade 163
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Figura 5.27. Cromatogramas ampliados de exposição de comprimidos de linezolida
(LNZ) na luz UVC, nos dias, 1 (A), 10 (B), 15 (C), 20 (D) e 30 (E), mostrandondo os
possíveis produtos de degradação (PD). Fase móvel: ácido acético 1%: metanol :
acetonitrila (50:25:25, V/V/V). Coluna Symmetry Waters C
18
5 µm 250 mm x 4,6 mm e
pré-coluna Symmetry Waters C
18
5 µm 20 mm x.3,9 mm.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 164
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
5.2.2.2.2. Análise por espectrofotometria na região de ultravioleta
A Tabela 5.2 mostra os resultados obtidos com os comprimidos triturados
expostos ao fator luz-UVC (254 nm) durante o período de 90 dias.
Tabela 5.2. Resultados obtidos na quantificação de linezolida nos comprimidos
triturados expostos à luz-UVC (254 nm), analisados por espectrofotometria na região
ultravioleta, a 251 nm
Tempo de exposição
(dias)
Absorvância
Teor (%) Teor médio
(%)
DPR (%)
0
0,6639
0,6534
0,6620
101,5
99,91
101,2
100,87
0,90
1
0,6572
0,6484
0,6529
101,10
99,75
100,44
100,43
0,95
10
0,6066
0,6043
0,5950
93,32
92,56
91,53
92,61
1,09
15
0,5692
0,5684
0,5641
87,56
87,44
86,78
87,26
0,53
20
0,5521
0,5534
0,5542
84,93
85,13
85,26
85,11
0,10
30
0,5280
0,5312
0,5300
81,23
81,72
81,53
81,45
0,16
90
0,5089
0,5070
0,5044
78,29
78,00
77,60
78,14
0,26
Capítulo V – Estudo de estabilidade 165
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.28 mostra o gráfico correspondente à análise do teor de linezolida
durante 90 dias, exposta ao fator luz-UVC 254 nm, analisadas por espectrofotometria
em 251 nm.
Figura 5.28. Análise do teor de linezolida, no período correspondente de 90 dias,
exposta ao fator luz UVC – 254 nm, analisadas por espectrofotometria na região UV.
5.2.2.2.3. Análise por doseamento microbiológico
A Tabela 5.3 mostra os resultados obtidos com os comprimidos triturados
expostos ao fator luz-UVC (254 nm) durante o período de 90 dias.
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100
Teor (%)
Tempo (dias)
Capítulo V – Estudo de estabilidade 166
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Tabela 5.3. Resultados obtidos na quantificação de linezolida nos comprimidos
triturados expostos à luz-UVC (254 nm), analisados por doseamento microbiológico
Tempo de exposição
(dias)
Teor (%)
10
81,49
30
73,61
60
57,22
90
46,81
A Figura 5.29 mostra o gráfico correspondente à análise do teor de linezolida
durante 90 dias, exposta ao fator luz-UVC 254 nm, analisadas por doseamento
microbiológico.
Figura 5.29. Análise da potência de linezolida, no período correspondente de 90 dias,
exposta ao fator luz UVC – 254 nm, analisadas por doseamento microbiológico.
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100
Teor (%)
Tempo (dias)
Capítulo V – Estudo de estabilidade 167
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
5.2.2.2.3. Análise comparativa do estudo de fotodegradação em CLAE,
espectrofotometria no UV e doseamento microbiológico.
A Figura 5.30 mostra o decaimento de teor, dos comprimidos de linezolida,
expostos durante 90 dias na luz-UVC (254 nm), analisados por CLAE, por doseamento
microbiológico e espectrofotometria no UV.
Figura 5.30. Análise comparativa do teor de decaimento dos comprimidos de
linezolida, expostos à luz-UVC, analisados por CLAE, por doseamento microbiológico
e espectrofotometria no UV.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 168
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
5.2.2.2.3. Discussão
O estudo de fotodegradação demonstrou que linezolida é susceptível à luz
UVC (254 nm) nas condições estudadas. As análises foram realizadas expondo o
equivalente a três pesos médios dos comprimidos triturados, em câmara espelhada
com luz-UVC (254 nm), forçando condições extremas de análise. Este estudo teve
como objetivo verificar o decaimento do teor de linezolida nos comprimidos durante o
período de 90 dias e também verificar, quais os possíveis produtos de degradação
formados nesta condição de estresse. O método desenvolvido e validado em CLAE
demonstrou a capacidade de diferenciar os produtos de degradação do fármaco não
degradado e também quantificar a quantidade residual de linezolida após a
degradação. Pode-se observar na Tabela 5.1 e Figura 5.26, o decaimento do teor de
linezolida nos comprimidos, após os tempos de exposição pré-determinados. Após a
exposição de 90 dias, os comprimidos triturados na luz UVC, apresentaram um teor
residual de 32,54 % determinados por CLAE.
Com o estudo de fotodegradação, pode-se verificar que o método em CLAE,
desenvolvido e validado, foi capaz de identificar e diferenciar linezolida dos seus
produtos de degradação formados. As determinações dos possíveis produtos de
degradação indicam as rotas de degradação de linezolida quando exposta à luz UVC-
254 nm. Observando os cromatogramas dos períodos pré-determinados de exposição,
verifica-se que a partir do décimo dia de exposição, ocorre a formação de um produto
de degradação majoritário (Figura 5.27) e a partir do décimo quinto dia de exposição,
observa-se a formação de outro produto de degradação. Pelos cromatogramas obtidos
sugere-se a formação de dois produtos de degradação majoritários.
A espectrofotometria na região do ultravioleta foi outro método validado, e
também escolhido para verificar a capacidade de quantificação de linezolida na
presença de produtos de degradação, gerados pela degradação forçada de
Capítulo V – Estudo de estabilidade 169
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
comprimidos triturados de linezolida na luz-UVC. A espectrofotometria na região UV, a
251 nm, apresentou um decaimento no teor de linezolida em 60 dias, sendo que, neste
caso, o método foi menos sensível, pois utilizando espectrofotometria no UV, observa-
se que o teor residual de linezolida em 60 dias de exposição, foi de 78,14 % de
linezolida. Este fato indica que o produto de degradação mantém parte da molécula
responsável pela absorção na região UV. O anel fenil é o cromóforo responsável pelo
espectro característico da molécula. Acredita-se que a estrutura do anel não foi
degradada.
Amostras expostas por 90 dias em luz-UVC foram analisadas por doseamento
microbiológico. Este método mostra-se sensível a degradação de linezolida na luz
UVC, apresentando um decaimento característico do teor no período de 90 dias
(Figura 5.29). Neste caso, supõe-se que os grupamentos orgânicos degradados,
provavelmente, são importantes para a atividade antimicrobiana de linezolida. De
acordo com a estrutura química de linezolida, é possível identificar cinco grupamentos
que contribuem para a atividade antimicrobiana (Figura 3.2, capítulo II). Os resultados
do ultravioleta sugerem que o grupamento principal pela absorção da molécula não foi
quebrado, com estes dados, supõe-se que os grupos no círculo 1 e 2 (Figura 5.31)
foram rompidos, diminuindo a atividade antimicrobiana de linezolida. A potência de
comprimidos de linezolida após 90 dias de exposição foi de 46,81 %.
Figura 5.31. Estrutura química de linezolida e os possíveis grupos orgânicos
atingidos durante a exposição por 90 dias.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 170
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
5.2.3. Estudo da cinética de fotodegradação utilizando CLAE
5.2.3.1. Condições de estudo
Considerando a fotossensibilidade de linezolida, verificada a partir dos
resultados obtidos nos estudos de fotodegradação, realizou-se a cinética de
fotodegradação. O estudo da cinética foi realizado com os comprimidos triturados
expostos à radiação ultravioleta, colocados na câmara descrita no estudo preliminar de
estabilidade durante o período de 60 dias. Após o término de análise, as soluções
foram preparadas conforme o item 2.2.1.1 e analisadas em CLAE. A partir dos dados
experimentais de concentração, determinou-se a ordem de reação seguida pela
amostra, utilizando-se como base a correlação existente entre as duas variáveis
(concentração e tempo). Os coeficientes de regressão linear (r) foram obtidos, sendo
que o coeficiente mais próximo da unidade indica a ordem da reação (LACHMAN et
al., 2001). Os parâmetros cinéticos de constante de velocidade de reação (k), e
período de vida útil t
90%
(tempo no qual 90% da concentração do fármaco encontra-se
inalterada) foram obtidos. O valor de k médio foi obtido a partir da inclinação da reta.
5.2.3.2. Resultados
A Tabela 5.4 relaciona os resultados do efeito da exposição à luz 254 nm na
concentração residual de linezolida nos comprimidos triturados durante o período de
90 dias, analisados por CLAE.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 171
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Tabela 5.4. Concentração residual de linezolida em comprimidos triturados após a
fotodegradação em lâmpada UVC - 254 nm, utilizando o método CLAE
Tempo (dias)
Área
(média)
Teor (%)
Concentração
obtida (µg/mL)
0 558010,11 101,32
98,45
91,56
84,58
80,91
68,97
12,16
1 541992,5 11,81
10 500982,4 10,92
15 464141,4 10,11
20 445835,1 9,71
30 385890,7 8,41
60 342198,8 61,85 7,45
90 179174,0 32,54 3,90
*DPR – desvio padrão relativo
A Tabela 5.5 relaciona os valores das concentrações para cada ordem de
reação, bem como o coeficiente de correlação, obtida a partir de soluções dos
comprimidos triturados de linezolida expostos a luz UVC-254 nm (20 W).
Tabela 5.5. Valores dos coeficientes de correlação, considerando diferentes ordens de
reação, obtidos a partir de soluções dos comprimidos triturados de linezolida expostas
à luz UVC-254 nm (20 W)
Tempo
(dias)
Reação de ordem zero
concentração de linezolida
(µg/mL)
Reação de primeira
ordem log da
concentração
Reação de segunda
ordem
1/concentração
0 12,16 1,084 0,082
1 11,81 1,072 0,084
10 10,92 1,038 0,0915
15 10,11 1,004 0,0989
20 9,71 0,987 0,1029
30 8,41 0,924 0,118
60 7,45 0,872 0,134
90 3,905 0,591 0,256
r 0,966 0,946 0,877
Capítulo V – Estudo de estabilidade 172
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.32 mostra os gráficos de concentração de fármaco residual em
função do tempo, log da concentração em função do tempo, e inverso da
concentração em função do tempo.
Figura 5.32. Gráficos correspondentes as ordens de reação: (A) reação de ordem zero; (B)
reação de primeira ordem; (C) reação de segunda ordem de linezolida residual em função do
tempo. Os coeficientes de regressão encontram-se demonstrados.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 173
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Tabela 5.6 mostra os resultados obtidos da velocidade de degradação (k) de
linezolida, o tempo de vida útil (t
90%
) e o coeficiente de correlação para linezolida,
obtidos segundo cinética de ordem zero.
Tabela 5.6. Constantes de velocidade de reação (k), equação da reta, coeficiente de
correlação e tempo de vida útil (t
90%
) para linezolida após fotodegradação a 254 nm
dos comprimidos triturados, por CLAE
Parâmetros Valores
equação y = -0,084x + 11,7
Coeficientes de correlação r
2
= 0,966
Velocidade de degradação (k) k = 0,084
t
90%
(h) t
90%
= 14,47
5.2.3.3. Discussão
O método por CLAE, validado para a determinação de linezolida na forma
farmacêutica, demonstrou ser adequado para estudos de estabilidade, pois não há
interferência dos picos referentes aos produtos de degradação na análise. Testes
preliminares de estabilidade haviam demonstrado que a luz é um fator importante para
a degradação de linezolida, mas não havia dados sobre a velocidade das reações.
Com isso, foi realizado o estudo da cinética de fotodegradação do fármaco, na forma
sólida (comprimidos triturados), visando verificar o comportamento de linezolida nos
pós. Os resultados demonstraram que a linezolida apresenta importante
fotodegradação nos comprimidos triturados expostos à luz UVC-254 nm. Foi possível
observar que em 90 dias de exposição, os comprimidos triturados possuem teor
Capítulo V – Estudo de estabilidade 174
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
residual de linezolida de 32,54 %. Os pós apresentaram coloração amarelada, a qual
aumentou com o tempo de exposição.
A partir dos gráficos obtidos, foi possível atribuir à reação de fotodegradação
de linezolida em comprimidos triturados, uma cinética de ordem zero. Com isto, de
acordo com o conceito de ordem zero, a degradação de linezolida sob efeito de
radiação UVC-254 nm, independe da concentração dos reagentes. Os parâmetros
cinéticos de constante de velocidade de reação (k) e tempo de vida útil (t
90%
) foram
calculados com base nas equações matemáticas apresentadas para reação de ordem
zero (Tabela 5.6).
5.2.4. Estudo da estabilidade de linezolida em câmara climática
5.2.4.1. Condições de estudo
Para este estudo foi utilizada uma câmara climática (Marconi MA 835/UR), a
40ºC e 75% de umidade relativa, simulação dia/noite, durante 3 meses. O equivalente
a três pesos médios foram triturados e colocados em placa de Petri. Após o tempo de
exposição, pesou-se o equivalente a 200 mg de linezolida de cada uma das amostras
expostas a 40ºC e 75% de umidade relativa e transferiu-se para balões volumétricos
de 100 mL, completando-se o volume com água. Desta solução a 2000,0 µg/mL, foi
transferida uma alíquota de 10,0 mL para balão volumétrico de 100 mL e o volume
completado com água, obtendo-se concentração de 200,0 µg/mL. Em seguida, foram
transferidas alíquotas de 3,0 mL para balões volumétricos de 50 mL e o volume
completado com fase móvel (ácido acético 1% : acetonitrila: metanol, 50:25:25, V/V/V).
As soluções foram filtradas em membrana de tamanho de poro 0,45 µm e volumes de
20 µL foram analisados por CLAE.
5.2.4.2. Resultados
A Tabela 5.7 mostra os resultados obtidos com os comprimidos triturados
expostos à câmara climática (40º C/75%) durante o período de 180 dias.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 175
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Tabela 5.7. Valores obtidos na quantificação de linezolida nos comprimidos triturados expostos
à câmara climática (40º C/75%), analisados por CLAE.
Tempo de exposição
(dias)
Área Teor
(%)
Teor médio
(%)
DPR
0
557734
564065
551624
101,31
102,46
100,20
101,32
1,57
5
558761
554763
527084
101,49
100,77
95,74
99,33
3,15
10
525488
543313
528741
95,45
98,69
96,04
96,72
1,78
15
514350
539508
504402
93,42
97,99
91,62
94,35
3,48
30
496777
517958
539365
90,23
94,08
97,97
94,09
4,11
45
487631
490470
482609
88,57
89,09
87,66
88,44
0,81
60
484874
493548
459237
88,07
89,65
83,41
87,04
3,72
75
517608
495320
502032
94,02
89,97
91,19
90,58
2,29
90
460688
483578
452594
83,68
87,83
82,21
85,02
3,43
180
339781
330160
322568
58,08
59,97
58,59
58,88
1,65
Capítulo V – Estudo de estabilidade 176
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
A Figura 5.33 mostra o gráfico correspondente à análise do teor médio de
linezolida durante 180 dias, exposta em câmara climática 40ºC/75%, analisadas por
CLAE.
Figura 5.33. Análise do teor de linezolida, no período correspondente de 180 dias,
exposta em câmara climática (40º C/75%), analisadas por CLAE.
A Figura 5.34 mostra os cromatogramas dos comprimidos triturados de
linezolida expostos à 40ºC/75 % em câmara climática nos períodos pré-determinados
(5, 30, 45, 60 e 90 dias)
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200
Teor (%)
Tempo (dias)
Capítulo V – Estudo de estabilidade 177
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Figura 5.34. Cromatogramas ampliados dos comprimidos triturados de linezolida, em câmara
climática (40º C/75%), nos períodos de 5 (A), 30 (B), 45 (C), 60 (D), 75 (E) e 90 (F) dias. Fase
móvel: ácido acético 1% : metanol : acetonitrila (50:25:25, V/V/V). Coluna Symmetry Waters C
18
5µm 250 mm x 4,6 mm e pré-coluna Symmetry Waters C
18
5 µm 20 mm x 3,9 mm.
Capítulo V – Estudo de estabilidade 178
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
5.2.4.3. Discussão
De acordo com o International Conference on Harmonization (ICH), 1994, e a
Resolução GMC 53/96 do Mercosul (2000), para estudos de estabilidade, o Brasil
encontra-se na região climática IV, com temperatura média de 30°C e 70% de UR.
Estes roteiros para análise da estabilidade de medicamentos sugerem a execução de
estudos de degradação acelerada de acordo com a área climática em que se
encontram cada país. Para os países situados na região IV, os ensaios de degradação
acelerada devem ser conduzidos a 40 °C e 75% de umi dade relativa (UR), durante o
período de seis meses e a 50°C e 90% de UR, durante o período de três meses.
Nesses estudos o medicamento é mantido na sua embalagem primária. Segundo a
Resolução RE n
o
1, de 29 de julho de 2005 (BRASIL, 2005), nas formas farmacêuticas
sólidas, que possuem embalagem impermeável, os estudos de estabilidade acelerada
e longa duração devem ser conduzidos utilizando somente um parâmetro:
temperatura. Se a embalagem for semi-permeável, deve-se utilizar a temperatura e a
umidade relativa nas análises.
Neste estudo, os comprimidos foram analisados fora da embalagem, íntegros e
triturados, durante 3 meses. Foi realizado estudo de degradação forçada para os
comprimidos de linezolida e com isso acelerar os processos de degradação. Os
parâmetros e tempos de exposição foram determinados segundo KLICK e
colaboradores (2005).
É amplamente reconhecido no campo das ciências farmacêuticas que a
exposição de fármacos no estado sólido a altas taxas de umidade relativa bem como a
associação entre o vapor d’água com as partículas sólidas pode acelerar a velocidade
de degradação química do produto. Em geral, para reações que ocorrem com sólidos
na forma amorfa, a velocidade de reação aumenta com o aumento do conteúdo de
água e este fato pode ser atribuído à capacidade do sólido amorfo de absorver o vapor
d’água na sua estrutura, formando uma solução amorfa. A água absorvida é
Capítulo V – Estudo de estabilidade 179
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
responsável pela maioria dos tipos de reações de degradação de fármacos como, por
exemplo, reações de hidrólise, oxidação e desaminação (SHALAEV e ZOGRAFI,
1996).
Durante o tempo de análise, os comprimidos apresentavam-se brancos, e
levemente amarelados com 60 dias de exposição. Verificou-se que houve a
degradação de linezolida lentamente, com teor residual de 85,02% do fármaco em 90
dias de exposição. Os comprimidos foram analisados por CLAE, cujo método foi
validado e também mostrou ser apropriado para identificação e diferenciação de
produtos de degradação, nos estudos de degradação forçada em câmara climática.
5.2.6. Discussão geral
O estudo de estabilidade de linezolida em comprimidos foi um dos objetivos
deste trabalho, tendo em vista a pequena quantidade de informações na literatura. Os
trabalhos encontrados citam a susceptibilidade de linezolida à degradação básica, em
testes de estresse (BEBAWY, 2003a; BEBAWY, 2003b). Nestes trabalhos, os autores
desenvolveram um método analítico na presença do produto de degradação formado
em meio alcalino. Este tipo de degradação é irrelevante, pois não condiz com
degradações verdadeiras, em que os comprimidos são expostos.
Neste capítulo, inicialmente, foram realizados os testes preliminares, a fim de
conhecer quais os fatores são importantes para a degradação do fármaco. Observa-se
que linezolida nos comprimidos é sensível à degradação ácida, básica, oxidativa,
fotolítica e nas condições de temperatura e umidade (40ºC/75%). Sabendo que, os
fatores reais de influência na estabilidade dos comprimidos seriam a exposição à luz,
temperatura e umidade, escolheu-se a degradação fotolítica e em câmara climática
para realizar os estudos do decaimento do teor de linezolida nos comprimidos, e,
Capítulo V – Estudo de estabilidade 180
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
posteriormente, aplicar os dados obtidos no estudo de cinética de degradação dos
comprimidos de linezolida.
Para realizar os estudos de degradação fotolítica, foi utilizada uma câmara
espelhada (100 x 16 x 16 cm), com lâmpada UVC-254 nm. O comprimido íntegro, fora
da embalagem primária, foi exposto à luz-UVC por 60 dias, e os comprimidos
triturados, equivalente a três pesos médios, foram expostos durante 90 dias. O
comprimido íntegro, exposto durante 60 dias, apresentou os mesmos produtos de
degradação dos comprimidos triturados. Pode-se observar a formação de dois
produtos de degradação majoritários na degradação fotolítica. Estes dois produtos de
degradação foram mais bem visualizados quando analisados em coluna
semipreparativa, apresentando tempos de retenção de 10,4 min e 11,5 min. Os dois
produtos de degradação foram confirmados na análise em CLAE com diodos em série.
Após o estudo preliminar de comprimidos de linezolida, foi estudado o
decaimento do teor de linezolida comprimidos, quando expostos à luz-UVC, durante
90 dias. Para estas análises utilizou-se os métodos validados em CLAE,
espectrofotometria no UV e doseamento microbiológico. Os comprimidos triturados de
linezolida apresentaram um decaimento de 32,54 % em 90 dias, quando analisados
por CLAE e de 78,14 % quando analisados por espectrofotometria no UV. Para o
doseamento microbiológico, o teor em 90 dias foi de 46,18 %. O método em CLAE e o
doseamento microbiológico são mais sensíveis e específicos à degradação de
linezolida. Com os dados fornecidos com a fotodegradação dos comprimidos,
analisados por CLAE, pode-se realizar o comportamento de degradação de linezolida
quando exposta à luz-UVC. Verificou-se que linezolida apresenta uma cinética de
ordem zero quando exposta ao fator luz.
O estudo de degradação de comprimidos de linezolida em câmara climática
(40ºC/75%) também foi realizado, utilizando-se CLAE. Os comprimidos triturados
Capítulo V – Estudo de estabilidade 181
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
foram expostos durante o período de 180 dias, no qual apresentaram um decaimento
de 58,88%. Esta degradação ocorreu mais lentamente do que com os comprimidos
expostos à luz-UVC.
5.2.7. Conclusão
• O estudo de estabilidade preliminar em meio básico (NaOH 0,1 M) demonstrou
que o fármaco é muito sensível a este fator, degradando-se completamente em
1 hora de contato com o meio básico.
• O estudo de estabilidade preliminar em meio oxidativo indicou que o fármaco
sofre degradação em contato com peróxido de hidrogênio 3%.
• O estudo da estabilidade térmica de comprimidos de linezolida mostrou que os
comprimidos são estáveis por 30 dias à temperatura de 65º C.
• O estudo preliminar de estabilidade frente às lâmpadas UVC-254 nm indicou
que linezolida é sensível à radiação nos comprimidos triturados e íntegros de
linezolida em menos de 10 dias.
• O estudo em câmara climática (40º C/75%) demonstrou que os comprimidos de
linezolida são sensíveis a este fator, apresentando uma degradação mais lenta.
• O resultado obtido na avaliação de cinética de fotodegradação indicou tratar-se
de uma reação ordem zero.
.
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Anexos - 1
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Anexos - 2
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Anexos - 3
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Anexos - 4
Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira
Anexos - 5
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