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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
COORDENAÇÃO DE PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ÁREA DE FARMACOLOGIA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E MECANISMO DE AÇÃO DO
EXTRATO E FRAÇÕES HEXANO-ÉTER E ALCALOÍDICA DE Macrosiphonia
longiflora (Desf) Mull. Arg. EM CAMUNDONGOS
Aurea Damaceno Alves
Cuiabá – MT
2010
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
COORDENAÇÃO DE PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ÁREA DE FARMACOLOGIA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E MECANISMO DE AÇÃO DO
EXTRATO E FRAÇÕES HEXANO-ÉTER E ALCALOÍDICA DE Macrosiphonia
longiflora (Desf) Mull. Arg. EM CAMUNDONGOS
Aurea Damaceno Alves
Dissertação apresentada à Pós-
graduação em Ciências da Saúde, da
Faculdade de Ciências Médicas, da
Universidade Federal de Mato Grosso,
como requisito parcial para a obtenção
do Título de Mestre em Ciências da
Saúde, Área de Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Domingos Tabajara de Oliveira Martins
Cuiabá – MT
2010
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iii
Esta Dissertação é parte integrante dos requisitos necessários à obtenção do Grau
de Mestre em Ciências da Saúde, Área de Farmacologia, outorgado pela
Universidade Federal de Mato Grosso e encontra-se a disposição dos interessados
na Biblioteca Central da referida Universidade.
A citação de qualquer trecho dessa Dissertação é permitida, desde que seja
feita de conformidade com as normas da ética.
_________________________________________
Aurea Damaceno Alves
Dissertação aprovada em: 08-07-2010
_________________________________________
Prof. Dr. Domingos Tabajara de Oliveira Martins
(Presidente)
_________________________________________
Prof. Dr. Rivaldo Niero
(Membro externo)
_________________________________________
Prof. Dr. Lousâ Lopes
(Membro)
iv
“Mais do que o gesto,
interessa como ele foi recebido.
Mais do que a palavra,
nos influencia como ela foi ouvida.
Mais do que o fato,
vale onde, como e quando ele nos tocou."
Lya Luft.
v
DEDICO
Á Deus, pela proteção, saúde e bênção em todo setor de minha vida!
Á Jesus Cristo, pela Tua graça temos a salvação!
Aos meus pais “in memoriam” pelo exemplo de coragem, simplicidade e amor.
Ao meu esposo:
Vicente de Paulo Alves. I'm everything I'm because you love me.
Aos meus filhos:
Marcos Paulo Damaceno Alves e Rafael Damaceno Alves
Vocês são o meu orgulho, amo-os.
Aos meus irmãos:
Antonia,
Margarida,
Getulio,
Dulce,
Elizabete,
Edilei,
Dirceu.
Mesmo distantes sempre foram e sempre serão partes de minha história.
A todos os meus amigos:
Tenho amigos que não sabem o quanto são meus amigos.
Não percebem o amor que lhes devoto e a absoluta necessidade que tenho deles.
Mas é delicioso que eu saiba e sinta que os amo, embora não declare.
vi
Agradecimentos
Este estudo só se tornou possível pela colaboração de algumas pessoas e
órgãos a quem gostaria de expressar meus sinceros agradecimentos:
Ao grande mestre, Prof. Dr. Domingos Tabajara de Oliveira Martins, Titular de
Farmacologia do Departamento de Ciências Básicas em Saúde, da Faculdade de
Ciências Médicas, da UFMT, meu especial agradecimento pela orientação exemplar
e por disponibilizar seu tempo e conhecimento sem restrição. Agradeço pela
oportunidade e confiança depositada em meu trabalho e por todo profissionalismo,
ensinamento e amizade;
Ao Prof. Dr. Cor Jesus Fernandes Fontes, Coordenador do Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde da Faculdade de Ciências Médicas da UFMT,
pelo auxílio e apoio na realização do mestrado;
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde,
pelos ensinamentos e colaboração;
Aos Ms. Reginaldo Vicente Ribeiro, Ms. Joaquim Corsino da Silva Lima e Ms.
Marcondes Alves Barbosa, pela valiosa contribuição nos protocolos e experimentos,
atenção e amizade;
Ao Prof. Dr. Paulo Teixeira de Sousa Júnior, Prof. Dr. Luiz Everson da Silva,
Prof. Dr. Evandro Luiz Dall'Oglio, Ms. Carlos Adriano Parizotto do Instituto de
Ciências Exatas e da Terra (ICET), Laboratório de Pesquisas em Química de
Produtos Naturais – LPQPN, pela atenção dispensada sempre que solicitada e
amizade;
A Prof
a
. Dr
a
. Maria Luzinete Alves Vanzeler da Faculdade de Ciências
Médicas da UFMT, pelo carinho e pela valorosa amizade;
A Prof
a
. Dr
a
. Carmem Lúcia Bassi, pela sua amizade, por ser tão alegre, e
pela amizade;
Aos Professores: Dr. Anselmo Verlangieri Carmo, Dr. Lousã Lopes, Dr.
Amílcar Sabino Damazo e Ms. Waldyr Ribeiro Bastos pela amizade;
Ao Prof. Dr. Rivaldo Niero da Universidade do Vale do Itajaí, pela valorosa
contribuição no isolamento e síntese de substâncias destinadas ao projeto;
vii
A equipe do Biotério Central, da UFMT: Coordenador Prof. Dr. Benedito Luiz
Figueiredo, a bióloga Ivonete Dias, as secretárias: Mayssa Aguiar e Emília Porto,
bioterista: Vania L. de Oliveira e os técnicos: Francisco Barros Pereira, Natalino
Moreira dos Santos e David Antonio de Oliveira, pela atenção, convívio e amizade;
As técnicas administrativas da Faculdade de Ciências Médicas da UFMT,
Gracielly Alves Gama e Eva Elizabeth Pedroso da Silva Morais, pelo convívio e
atenção;
À amiga Eliana Maria da Silva, pelas orientações administrativas, convívio e
atenção;
Ao grupo de estudo (G=6): Ana Caroline Akeme Yamamoto, Janaína
Vasconcellos Ribeiro de Souza Amadio, Naiana Fernandes Leotti, Laura Valdiane
Luz Melo, Diniz Pereira Leite Junior, as vossas companhias, amizade e convivência
alegre foram um marco nesta caminhada;
As mestrandas: Isanete Geraldine Costa Bieski, Elisangela Saturnino de
Souza, Solange Fernandes Moreira Lopes, Larissa Maria Scalon Lemos, Cristiane
Coimbra de Paula, Suellen Iara Guirra Rosa, pela colaboração nas atividades
experimentais e inúmeros momentos compartilhados, pois, conviver com vocês foi
de grande aprendizado para a vida;
Aos alunos de iniciação científica: Thaís Bezerra Martins, Guilherme Henrique
Tanajura, Mariana Canevari de Oliveira, Roberto Segundo Bueno Borges, e Vinícius
Marques Poio, pelo auxílio imprescindível em todos os experimentos;
Aos meus amigos: Elton Francisquini, José Carlos Germino, Mayse Teixeira
Onohara, Maíra Rodrigues Dalgallo, Aristani Karine Kayser pela alegre convivência,
ajuda e incentivo em vários momentos;
As técnicas: Maria Cristina Fuzari, Joselina M. da Silva e Vanilde Frageri pela
colaboração, amizade e convívio;
A Prof
a
. Dr
a
. Miramy Macedo, Curadora do Herbário Central da Universidade
Federal de Mato Grosso, pela atenção dispensada ao material botânico.
Ao técnico Libério de Amorim Neto, do Instituto de Biociências, da
Universidade Federal de Mato Grosso pelo auxilio na coleta do material botânico
utilizado neste estudo.
viii
À Médica Ana Maria Coelho Bezerra Martins pelo acolhimento em seu lar,
pela simpatia, amizade e paciência por muitas horas de estudos nos finais de
semana em tua casa.
A Ms. Danielle Ayr Tavares de Almeida, pela ajuda nos experimentos e
amizade;
A Phamela Valéria Fuzari Duarte, bolsista/estagiária UFMT/IFMT – MT, pela
colaboração e amizade;
Às estagiárias: Annelize Velasques Ribas, Cibele Brandão de Arruda Souza e
Ingrid Daiane Silva pela colaboração, companhia e amizade;
Às minhas amigas: Susiane Costa Xavier, Alessandra Costa Xavier, Patrícia
Costa Xavier e Ediane Costa Magalhães, pelo apoio em todas as horas.
À toda minha família, pela paciência, confiança e motivação;
Ao CNPq, pela concessão de bolsa de mestrado ao longo do meu trabalho;
Enfim, a todos que de forma direta ou indireta, colaboraram para a execução
desse trabalho.
ix
Sumário
Lista de Quadros
xiii
Lista de Tabelas
xiv
Lista de Figuras
xv
Lista de Abreviaturas
xvii
RESUMO
xix
ABSTRACT
xx
I.
INTRODUÇÃO
01
1.1.
Plantas medicinais
01
1.2.
Macrosiphonia longiflora (Desf) Müll. Arg.
04
1.2.1.
Descrição botânica
04
1.2.2.
Habitat
05
1.2.3.
Fenologia
06
1.3.
Usos medicinais
07
1.4.
Fitoquímica
07
1.4.1.
Fitoesteróides
08
1.4.2.
Ácido mirístico
09
1.5.
Fisiologia da dor
10
1.5.1.
Conceito
10
1.5.2.
Classificação
11
1.6.
Mecanismos envolvidos na transmissão da dor
11
1.6.1.
Reconhecimento da dor
11
1.6.2.
Receptor vanilóide potencial transitório – (TRPV)
17
1.6.3.
Óxido nítrico (NO)
19
x
1.6.4
Mediadores com ação nos nociceptores
20
1.7.
Fisiopatologia da dor
22
1.7.1.
Estímulos potencialmente nocivos
22
1.8.
População atingida
23
1.9.
Modelos experimentais de nocicepção
25
1.10.
Terapia da inflamação e da dor
28
II.
JUSTIFICATIVA
31
III.
OBJETIVOS
32
3.1
Objetivo Geral
32
3.2
Objetivos específicos
32
IV.
MATERIAIS E MÉTODOS
33
4.1.
Materiais
33
4.1.1.
Material botânico
33
4.2.
Animais
34
4.3.
Drogas e reagentes
34
4.4.
Equipamentos
36
4.5.
Métodos
36
4.5.1.
Protocolo Experimental
36
4.6.
Obtenção dos extratos
37
4.7.
Preparação das frações hexano-éter e alcaloídica
38
4.8.
Determinação do peso seco do extrato
38
4.9.
Determinação do rendimento do extrato
39
4.10
Testes fitoquímicos com as Frações
39
4.10.1
Terpenos e/ou esteróides
39
4.10.2.
Alcalóides
39
xi
4.10.3.
Fracionamento e identificação dos compostos da fração
(F
Hex:Éter
)
40
4.11.
Avaliação da ação antinociceptiva
40
4.11.1.
Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
40
4.11.2.
Nocicepção induzida por formalina
41
4.11.3.
Nocicepção induzida por capsaicina
42
4.12.
Avaliação do envolvimento de vias na atividade antinociceptiva
42
4.12.1
Receptor vanilóide
42
4.12.2
Receptor opióide
43
4.12.3
Via L-arginina-óxido nítrico
43
4.13.
Lavado peritoneal
44
4.13.1
Dosagens de IL-1β, IL-8 e TNFα.
44
4.13.2
Dosagens de PGE
2.
45
4.14.
Análises estatísticas
45
V.
Resultados
46
5.1.
Obtenção do extrato e determinação do peso seco e
rendimento do extrato
46
5.2.
Testes fitoquímicos com as frações: F
Hex:Éter
e alcalóidica
46
5.2.1.
Terpenos e/ ou esteróides
46
5.2.2.
Alcalóides
47
5.2.3.
Fracionamento e identificação de compostos da F
Hex:Éter
48
5.3.
Avaliação da ação antinoceptiva
48
5.3.1.
Testes das contorções abdominais induzidas por ácido acético
48
5.3.2.
Nocicepçao induzida por formalina
48
5.3.3
Nocicepção induzida por capsaicina
51
5.4.
Avaliação do envolvimento de várias vias na atividade
antinoceptiva
52
xii
5.4.1.
Receptor vanilóide
54
5.4.2.
Receptor opióide
55
5.4.3.
Via L-arginina-óxido nítrico
57
5.4.4.
Avaliação da atividade do EHMI e F
Hex:Éter
do xilopódio M.
longiflora sobre citocinas pró-inflamatórias e PGE
2.
58
VI.
Discussão
60
VII.
Conclusão
70
VIII.
Referências bibliográficas
71
IX.
Anexos
82
Anexo 1
Autorização SISBIO/IBAMA
82
Anexo 2
Oficio de Herbário Central com o número da exsicata
83
Anexo 3
Termo de aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal
84
X.
Apendice
85
Apêndice 1
Tabela com resultado do teste de ácido acético
85
Apêndice 2
Tabelas com resultados dos testes de formalina e capsaicina
86
Apêndice 3
Avaliação de várias vias de mecanismo antinociceptivo do
efeito do tratamento de EHMl e F
Hex:éter
por via oral
87
Apêndice 4
Avaliação da via L-arginina/Oxido nítrico no efeito
antinociceptivo do tratamento de EHMl e F
Hex:éter
por via oral
88
xiii
Lista de Quadros
1
Relação das drogas, reagentes, corantes e solventes
35
2
Quantidade de material coletado em Kg, fresco e seco e a % de
peso seco e rendimento do extrato hidroetanólico 70% de
Macrosiphonia velame (EHMl)
46
xiv
Lista de Tabelas
1
Efeitos do extrato (EHMI) e fração (F
Hex:éter
) do xilopódio de
Macrosiphonia longiflora sobre a produção das citocinas pró-
inflamatórias e Prostagladina E
2
no lavado peritoneal de
camundongos.
59
2
Efeitos da administração via oral do veículo, EHMl , fração e
indometacina sobre as contorções abdominais induzidas por ácido
acético, ( 0,6%) em camundongas
84
3
Efeitos da administração via oral do veiculo, fração alcaloídica (FAMl)
e indometacina sobre as contorções abdominais induzidas por ácido
acético (0,6%) em camundongas.
84
4
Efeitos da administração via oral do veículo, Fração Hexano:éter e/ou
indometacina sobre as contorções abdominais induzidas por ácido
acético em camundongas
84
5
Administração via oral do extrato (EHMl) e Fração (F
Hex:éter
) ou
morfina sobre a nocicepção induzida por formalina 2,5% em
camundongas
85
6
Efeitos da administração via oral do veiculo, EHMl e F
Hex:éter
ou
morfina s.c., sobre nocicepção induzida por capsaicina em
camundongas
85
7
Avaliação do receptor opióide no efeito antinociceptivo na
administração via oral do veiculo e EHMl ou morfina s.c., sobre
nocicepção induzida por capsaicina em camundongas
86
8
Avaliação do receptor vaniloide e a contribuição do receptor opióide
no efeito antinociceptivo na administração via oral do veiculo, EHMl e
F
Hex:éter
ou capsazepina i.p., sobre nocicepção induzida por capsaicina
s.c. em camundongas
86
9
Efeito do pré-tratamento com L-arginina (i.p.) na administração do
EHMl (v.o.), L-NAME (i.p.) e morfina (i.p.), sobre nocicepção induzida
por capsaicina em camundongas
87
xv
Lista de Figuras
Figura 1.
Biomas brasileiros, com destaque para o Cerrado.
02
Figura 2.
Macrosiphonia longiflora (Xilopódio).
04
Figura 3.
Habitat natural de Macrosiphonia longiflora.
05
Figura 4.
Macrosiphonia longiflora (com inflorescência).
06
Figura 5.
Estrutura básica de β-sitosterol (1) e estigmasterol (2)
08
Figura 6.
Estrutura básica do ácido mirístico
10
Figura 7.
Processos fisiológicos.
12
Figura 8.
Caminhos da dor.
14
Figura 9.
Representação esquemática dos fatores responsáveis pela
ativação de nociceptores periféricos
16
Figura 10.
Representação da ligação da capsaicina/receptor
19
Figura 11.
Foto da exsicata depositada no herbário UFMT de M.longiflora
(Desf) Müll. Arg. (Apocinaceae)
33
Figura 12.
Fluxograma do protocolo experimental. CCD – cromatografia
de coluna delgada. RMN – ressonância magnética nuclear.
37
Figura 13.
Reação Libermam-Burchard.
47
Figura 14.
Reação de Mayer e Dragendorff.
47
Figura 15.
Efeito da administração via oral de veiculo, extrato ou
indometacina sobre as contorções abdominais induzidas por
ácido acético 0,6% em camundongos.
49
Figura 16.
Efeito da administração via oral de veiculo, da fração
alcaloídica ou indometacina sobre as contorções abdominais
induzidas por ácido acético 0,6% em camundongos.
50
Figura 17.
Efeito da administração oral de veículo, fração hexano-éter de
Macrosiphonia longiflora ou indometacina sobre as contorções
abdominais induzidas por acido acético 0,6% em
camundongos.
51
Figura 18.
Efeito do tratamento oral com veiculo, indometacina, morfina,
52
xvi
extrato e fração de Macrosiphonia longiflora sobre a
nocicepção induzida por formalina 2,5%.
Figura 19.
Efeito do tratamento oral com veiculo, extrato e fração de
Macrosiphonia longiflora ou morfina, sobre a nocicepção
induzida por capsaicina.
53
Figura 20.
Efeito do pré-tratamento com capsazepina e/ou naloxona
sobre a nocicepção induzida por capsaicina em camundongas.
55
Figura 21.
Efeito do pré-tratamento com naloxona ou morfina sobre a
nocicepção induzida por capsaícina intraplantar.
56
Figura 22.
Efeito do pré-tratamento com L-arginina e/ou L-NAME sobre a
nocicepção induzida por capsaícina intraplantar.
58
xvii
Lista de Abreviaturas
ACP
Área Cinzenta Periaquedutal
AINEs
Antiinflamatório não-esteroidal
CCDA
Cromatografia de Camada Delgada Analítica
CSF
Fatores Estimuladores de Colônias
COX
Ciclooxigenase
COX-1
Ciclooxigenase-1
COX-2
Ciclooxigenase-2
EHMl
Extrato Hidroetanólico do xilopódio de Macrosiphonia
longiflora (Desf) Mull. Arg.
EPM
Erro padrão da média
eNOS
Óxido nítrico-sintetase endotelial
FAMl
Fração Alcaloídica de Macrosiphonia longiflora
F
Hex:Éter
Fração Hexano-Éter de Macrosiphonia longiflora
15-HPETE
Ácido hidroperoxieicosatetraenóico
IASP
Associação Internacional para o Estudo da Dor
ICET
Instituto de Ciências Exatas e da Terra
IL
Interleucina
IFN-α
Interferon-alfa
iNOS
Óxido nítrico-sintetase induzida
IL-1β
Interleucina-1 Beta
IL-8
Interleucina-8
IL-10
Interleucina-10
kDa
Kilodaltons
L-arg
L-arginina
xviii
L-NAME
NG-nitro-L-arginina metil Ester
NADPH
Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Reduzida
NK
Natural killer
NO
Óxido nítrico
NOS
Óxido nítrico-sintetase
NOSi
Óxido nítrico sintetase induzida
nNOS
Óxido nítrico-sintetase neuronal
NPM
Nociceptores Polimodais
NMR
Núcleo Magno da Rafe
NGF
Fator de Crescimento do Nervo
OMS
Organização Mundial da Saúde
PAG
Substância cinzenta periaquedutal
PF
Fator Plaquetário
PG
Prostaglandina
PGE
2
Prostaglandina E
2
PNPICS
Políticas Nacionais: a de Práticas Integrativas e
Complementares no SUS
PNPMF
Políticas Nacionais: Plantas Medicinais e Fitoterápicos
RENISUS
Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS
SNP
Sistema Nervoso Periférico
SP
Substância P
SUS
Sistema Único de Saude
TNF-α
Fator de necrose tumoral-alfa
TRP
Receptor Potencial Transiente
TRPV
Receptor vanilóide
TRPV1
Receptor vanilóide 1
TXs
Tromboxanos
xix
THB4
Tetrahidrobiopterina
RESUMO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E MECANISMO DE AÇÃO DO
EXTRATO E FRAÇÕES HEXANO-ÉTER E ALCALOÍDICA DE Macrosiphonia longiflora
(Desf) Mull. Arg. EM CAMUNDONGOS. Alves, A. D. Dissertação apresentada à
Coordenação do Programas de Pós-Graduação em Medicina da Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Federal de Mato Grosso, como requisito parcial para a obtenção
do título de Mestre em Ciências da Saúde, Área de Farmacologia. Orientador: Domingos
Tabajara de Oliveira Martins.
Macrosiphonia longiflora (Desf) Müll. Arg (Apocynaceae), popularmente conhecida
como velame, é um subarbusto típico do Cerrado brasileiro. Seu xilopódio é utilizado
na forma de decocto para tratar dores inflamatórias. O objetivo deste estudo foi
avaliar a atividade antinociceptiva do extrato (EHMl) e das frações hexano:éter
(F
Hex:éter
) e alcaloídica (FAMl) e desvendar seu(s) possível(is) mecanismo(s) de ação.
Utilizando modelos experimentais in vivo de nocicepção e antagonistas não-seletivos
dos receptores vanilóides, opióides e via L-arginina/oxido nítrico/GMPc. Além disso,
uma análise fitoquímica da F
Hex:éter.
O xilopódio de M. longiflora foi macerado com
etanol/água (3:1) por 7 dias em temperatura ambiente, obtendo-se o extrato
hidroetanólico (EHMl). Parte deste submetido à partição ácido-base para obtenção
das frações F
Hex:éter
e FAMl. A abordagem fitoquímica preliminar da FAMl e da
F
Hex:éter
revelou a presença de alcalóides e terpenóides/esteróides, respectivamente.
A fração F
Hex:éter
(ativa) submetida a cromatografia de camada delgada (CCD)
revelou através da Ressonância Magnética Nuclear (RMN) a presença de uma
mistura de fitoesteróides (β-sitosterol e estigmasterol) e éster do ácido graxo (miristil-
miristato). Na avaliação da atividade antinociceptiva à dor induzida por ácido acético
0,6% em camundongos Swiss, o EHMl e a F
Hex:éter
mostraram-se ativos, nas doses
de 50 e 200 mg/kg. A FAMl não apresentou atividade antinociceptiva. No teste de
formalina 2,5% o EHMl e a F
Hex:éter
mostraram-se ativos, porém, na primeira fase, a
atividade antinociceptiva foi obtida apenas na maior dose (800 mg/kg). No teste de
nocicepção induzida por capsaícina, o EHMl e a F
Hex:éter
demonstraram atividade em
todas as doses utilizadas (20, 50 e 200 mg/kg). Para investigar-se o(s) possível(s)
mecanismo(s) de ação do EHMl e a F
Hex:éter
, os animais foram pré-tratados com
capsazepina (70 mg/kg i.p.), naloxona (1 mg/kg i.p.), L-arginina (200 mg/kg i.p.) ou L-
NAME (70 mg/kg i.p.), além da dosagem de Interleucina 8 (IL-8). As atividades
antinociceptivas do EHMl e da F
Hex:éter
foram reduzidas quando os animais foram
pré-tratados com capsazepina, indicando possível papel dos receptores vanilóides
na ação antinociptiva destes. O EHMl e da F
Hex:éter
também reduziram os níveis de
IL-8 no lavado peritoneal de animais submetidos à dor por ácido acético, sugerindo
que a inibição desta citocina é um componente importante na atividade
antinociceptiva do EHMl e F
Hex:éter.
Esses resultados validam sob o ponto de vista
pré-clínico, o uso popular do xilopódio de M.longiflora como analgésico, tornando-a
um promissor candidato a um fitoterápico.
Palavras-chave: Macrosiphonia longiflora, antinocicepção, mecanismo de ação.
xx
ABSTRACT
EVALUATION OF THE ANTINOCICEPTIVE AND MECHANISM OF ACTION OF EXTRACT
AND HEXANE-ETHER AND ALKALOIDS Macrosiphonia longiflora (Desf) Müll Arg. IN
MICE. Alves, A. D. Dissertation presented to the Coordination of the Post-Graduation
Programs in Medicine of Faculty of Medical Science of Federal University of Mato Grosso, as
a partial requirement for the Master Degree in Health Science, Pharmacology field. Advisor:
Domingos Tabajara de Oliveira Martins.
The Macrosiphonia longiflora (Desf) Müll. Arg (Apocynaceae), popularly known as "velame"
(canopy), is a typical shrub of the Brazilian Cerrado.Your xylopodium is used in decoction to
treat pain, in general fever and inflammation. The subject of this study was to evaluate the
antinociceptive activity of the extract (EHMl) and hexane:ether (FHex:ether) and alkaloidal
(households) and unravel its (s) possible (s) mechanism (s) of action, using experimental
models nociception in vivo and non-selective antagonist of opioid receptors and vanilloid via
nitric L-arginina/oxido / cGMP. Moreover, we proceeded with analysis of phytochemical
FHex:ether. The xylopodium M. longiflora was macerated with ethanol/water (70%) for 7
days at room temperature, resulting in the hydroalcoholic (EHMl). Part of this referred to the
acid-base partition to obtain the fractions FHex: ether and FAMI.The preliminary
phytochemical screening of the FAMI and FHex: ether revealed the presence of alkaloids
and terpenoids/steroids, respectively. The fraction FHex: ether (active) subjected to thin layer
chromatography (TLC) revealed by nuclear magnetic resonance (NMR) the presence of a
mixture of phytosteroids (β-sitosterol and stigmasterol) and fatty acid (myristil myristate). In
assessing the antinociceptive pain induced by acetic acid 0.6% in mice, and the EHMl
FHex:ether were active at doses of 50 and 200 mg / kg. The FAMI did not present
antinociceptive activity. In the formalin test and 2.5% EHMl FHex: ether were active, but in
the first phase, the antinociceptive activity was obtained only at the highest dose (800 mg /
kg). In the test of nociception induced by capsaicin, the EHMl and FHex: ether showed
activity in all doses (20,50 and 200 mg / kg). To investigate whether the (s) possible (s)
mechanism (s) of action and EHMl FHex:ether, the animals were pretreated with capsaicin
(70 mg / kg ip), naloxone (1 mg / kg ip), L-arginine (200 mg / kg ip) or L-NAME (70 mg / kg
ip) was also performed and the dosage of Interleukin 8 (IL-8). To investigate whether the (s)
possible (s) mechanism (s) of action and EHMl FHex ether, the animals were pretreated with
capsaicin (70 mg / kg ip), naloxone (1 mg / kg ip), L-arginine (200 mg / kg ip) or L-NAME (70
mg / kg ip) was also performed and the dosage of Interleukin 8 (IL-8). The antinociceptive
activities of EHMl and FHex: ether were reduced when animals were pretreated with
capsaicin, indicating a possible role of vanilloid receptors in the antinociceptive action of
these. The EHMl and FHex:ether also reduced the levels of IL-8 in the peritoneal cavity
lavage of animals subjected to pain by acetic acid, suggesting that inhibition of this cytokine
is an important component in the antinociceptive and EHMl FHex: ether. These results
validate the point of view pre-clinical use of popular xylopodium M.longiflora as an analgesic,
making it a promising herbal medicine.
Keywords: Macrosiphonia longiflora, antinociception, mechanism of action.
1
I. INTRODUÇÃO
1.1. Plantas medicinais
As plantas são utilizadas para os cuidados da saúde desde tempos
imemoriais. As civilizações antigas deixaram seu legado a cerca de seus
conhecimentos sobre a utilização de produtos naturais para o tratamento de
enfermidades. Esses conhecimentos empíricos tornaram-se grandes tesouros para a
industria farmacêutica, o que acarretou na identificação de princípios ativos e
conseqüentemente na síntese de vários medicamentos que, atualmente são
utilizados para o tratamento de muitas doenças
1
.
Há muitos anos, a Organização Mundial da Saúde (OMS) tem organizado
debates sobre a importância destes conhecimentos para a saúde das pessoas. No
final da década de 70, como conseqüência da Conferência Internacional sobre
Atenção Primária em Saúde, realizada em Alma-Ata, ex-URSS, a OMS criou o
programa de medicina tradicional, com o intuito de incentivar os Estados-membros a
formularem e implementarem políticas públicas para uso nacional e integrado da
Medicina Tradicional no Sistema Nacional de Saúde, bem como para o
desenvolvimento de estudos científicos para melhor conhecimento de sua
segurança, eficácia e qualidade, princípios estes reiterados no documento
“Estratégias da OMS sobre medicina tradicional 2002-2005”
2
.
No Brasil, a partir da década 80, com a criação do Sistema Único de Saúde
(SUS), diversos documentos foram elaborados enfatizando a introdução de plantas
medicinais e fitoterápicos na atenção básica no sistema público, culminando em
2006 com a aprovação da política nacional de plantas medicinais e fitoterápicos
2
(Decreto nº 5813, de 22 junho de 2006)
3
e a Política Nacional e Práticas Integrativas
Complementares (PNPIC no SUS) Portaria nº 971, de 03 de maio de 2006
4
.
Mais recentemente, o ministério da saúde do Brasil publicou a relação
nacional de plantas medicinais de interesse do SUS (RENISUS), contendo 71
plantas com potencial fitoterápicos (Portaria GM/MS nº 1.274, de 25 junho 2008)
5
e
com intuito de popularizar esse conhecimento, de modo a garantir e promover a
segurança, a eficácia e a qualidade no acesso às plantas medicinais, publicou a
RDC nº 10, de 10 de março de 2010
6
e a Portaria nº 886 de 20 de abril de 2010, a
qual institui e normatiza as Farmácias Vivas visando uma utilização com qualidade e
eficácia de Plantas Medicinais pelo povo brasileiro.
O Brasil é o país com a maior diversidade vegetal do mundo, possuindo seis
biomas (Figura 1), que somada à rica diversidade etno-cultural (índios e não-indios),
apresenta grande potencial para a descoberta e o desenvolvimento de novas
moléculas (fitofármacos) com atividade terapêutica ou, com aplicações tanto na
tecnologia farmacêutica quanto, no desenvolvimento de fitoterápicos com maior
eficiência de ação e maior acesso à população.
Figura 1. Biomas brasileiros, com destaque para o Cerrado (em verde).
3
O Cerrado é a segunda região biogeográfica do Brasil, com dois milhões de
km
2
, englobando 12 estados. Devido a sua localização, compartilha espécimes com
a maioria dos biomas brasileiros (Floresta Amazônica, Caatinga e Floresta Atlântica),
estimando-se em 10.000 espécies de vegetais, sendo 4.000 endêmicas, tornando
este o mais rico dentre as savanas do mundo
8,9
.
O Cerrado exibe uma grande complexidade de ecossistemas, que variam de
campos abertos à mata de galeria, cerradões e matas secas, os quais seguiram
caminhos próprios de evolução biológica. No entanto, o Cerrado tem sido
desprezado ou mesmo visto como alternativa ao desmatamento na Amazônia, com
cerca de 2/3 do bioma já antropizado
10
.
Em decorrência da ocupação desordenada e destrutiva de sua área,
principalmente pela atividade agropecuária empresarial e do fogo utilizado para o
manejo tradicional, o Cerrado é hoje o ecossistema brasileiro que mais sofre
agressões por parte do “desenvolvimento”, colocando em risco de extinção, seu rico
patrimônio de recursos naturais e comunidades tradicionais de indígenas,
quilombolas e ribeirinhos
11
.
Com solo de savana tropical, deficiente em nutrientes, mas rico em ferro e
alumínio, o Cerrado abriga plantas de aparência seca, compostas por exemplares
arbustivo-arbóreo, de caules e galhos grossos e retorcidos, distribuídos de forma
ligeiramente esparsos, intercalados por uma cobertura de ervas, gramíneas e
espécies semi-arbustivas, tendo este último, a Macrosiphonia longiflora (Desf) Müll
Arg. (velame), um dos seus representantes típicos
12,13,14
.
4
1.2. Macrosiphonia longiflora (Desf) Müll. Arg.
1.2.1. Descrição botânica
Macrosiphonia longiflora pertence à família Apocynaceae, está inserida à
ordem Gentianales, a qual inclui 4.555 espécies em 415 gêneros
15
.
Pio Corrêa (1978)
16
escreve “M. longiflora é um subarbusto ereto, simples ou
ramificado com altura de 20 – 80 cm de altura, revestidos de pelos lanosos, moles,
flexuosos e brancos. Folhas opostas, quase sésseis, ovado-lanceoladas ou linear-
lanceoladas até oblongo-ovadas, acuminadas, um pouco cordiformes na base,
rígidas, ondulado-revolutas nas margens, interiras, glabras e vernicosas na página
superior e densamente branco-lanosa na página inferior. Pedúnculos alongados, de
7-25 cm, lanosos nos nós” (Figura 2).
Figura 2. Macrosiphonia longiflora (Xilopódio)
Foto: Alves, A.D.05/2009
5
1.2.2. Habitat
É uma espécie que apresenta uma ampla distribuição na América do Sul
(Paraguai, Bolívia, Argentina e Uruguai). No Brasil, ocorre na região Central e Sul do
país, nos estados de Mato Grosso
17,18
, Goiás
,19
, Distrito Federal, Mato Grosso do
Sul, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul.
M. longiflora aparece principalmente no Cerrado (Figura 3), podendo ocorrer
também em campos limpos e campos de altitude em Minas Gerais
20
.
Figura 3. Habitat natural de Macrosiphonia longiflora
Foto: Alves, A.D. (05/2009)
6
1.2.3. Fenologia
De acordo com Martius “Flora Brasilense”, a espécie M. longiflora floresce nos
meses de setembro a dezembro. A frutificação ocorre de outubro a maio,
predominando no mês de fevereiro.
No Brasil, a espécie é conhecida popularmente por diversos nomes: jalapa-
branca, velame, velame-branco, velame-do-rio-grande, velame-do-campo, flor-de-
babado e babado-de-nossa-senhora
21
.
Possui inflorescência terminal, quando florida, produz látex branco. Pedúnculo
com 2-8 cm de comprimento, brácteas filiformes e pilosas. Cálice com sépalas
linear-lanceoladas, base alargada e ápice acuminado, extremamente, lanoso,
internamente glabro com 7-8 escamas. Corola densamente lanosa, parte inferior do
tubo com cerca de 2 cm de comprimento e 1 cm de largura, lacínios de bordos
crispados, obovados (Figura 4).
Figura 4 – Macrosiphonia longiflora (Desf.) Müll Arg. no Cerrado de Acorizal, MT, Brasil.
7
1.3. Usos medicinais
O Cerrado possui uma imensa riqueza de flora com potencial terapêutico
21
.
Possuindo mais de 600 espécies, sendo que, cada Estado apresenta uma flora
medicinal com espécies comuns a outros e com espécies particulares
18
.
Entre as espécies medicinais do Cerrado matogrossese pode-se citar
Stryphnodendron adstringens, Anemopaegma arvense, Senna occidentalis,
Cochlospermum regium, Bidens pilosa, Chenopodium ambrosioides, Hymenaea
stigonocarpa, Scoparia dulcis, Simaba ferruginea, Tabebuia aurea, Brosimum
gaudichaudii, Guazuma ulmifolia, Macrosiphonia longiflora
18
.
M. longiflora é um recurso medicinal nativo do Cerrado, utilizada para o
tratamento de inflamações, febres, dores e hemorragia, depurativa, anti-sifilítica.
Apesar de ser uma planta com ampla utilização popular para o tratamento de
diversas doenças, pouco se sabe sobre suas potencialidades terapêuticas, pois até
o presente foi encontrado somente um resumo envolvendo avaliação antimicrobiana.
Evidenciando assim, a necessidade de estudos farmacológicas/toxicológicas e
fitoquímicos desta espécie
19,21
.
1.4. Fitoquímica
Consultando as bases de dados especializadas (Scielo, PubMed, etc) não foi
encontrada qualquer referência sobre a composição química de M. longiflora.
No entanto, estudos recentes realizados em parceria com o laboratório de
Química de Produtos Naturais do ICET/UFMT, sob supervisão do Prof. Dr. Luiz
Everson da Silva e do Prof. Dr. Rivaldo Niero, da Universidade do Vale do Itajaí, SC,
8
(dados não publicados), foram isolados da fração hexano-éter dois fitoesteróides (β-
sitosterol e estigmasterol) e o éster miristato de miristila. Do extrato acetônico foram
isolados os triterpenos α e β-amirina acetato e o acetato de lupeol.
1.4.1. Fitoesteróides
Os fitoesteróides são substâncias esteroidais extraídos de espécies vegetais,
sendo os mais comuns o β-sitosterol
(1)
e estigmasterol
(2)
(Figura 5), classificados
como 4-desmetilesteróis do colestano, apresentando duplas ligações na posição C-5
do anel ciclopentanoperidrofenan trênico
22
.
Figura 5 - Estruturas básicas do β-sitosterol (1) e estigmasterol (2).
As membranas celulares de espécies vegetais superiores possuem em suas
composições essas substâncias acima citadas, assumindo uma grande variedade de
atividades biológicas específicas, em adição aos seus papéis como constituintes na
bicamada lipídicas. Em células vegetais, os fitoesteróides também são encontrados
em grande concentração em frações particuladas das mesmas e no
desenvolvimento de plastídios em cloroplastos, participam do transporte intracelular
da fração microssomal para a fração cloroplástica
22,20.
9
Os estudos de fitoesteróides têm aumentado na área oncológica porque têm
demonstrado ação protetiva contra câncer de próstata, de mama e de cólon. O
mecanismo exato pelo qual os fitoesteróides oferecem proteção contra o câncer não
é ainda esclarecido
24
.
Muitos estudos sugerem a ativação de proteína fosfatase 2A (PP2A) pela
ceramida como um passo intermediário para a ação da ceramida no crescimento
celular e apoptose. A suplementação com fitoesteróides aumentam a atividade, mas
não a quantidade de PP2A em células LNCaP
24
.
O estigmasterol é utilizado para a síntese de hormônios esteroidais que são
utilizados para o tratamento em seres humanos, especialmente a cortisona. A
síntese destes hormônios a partir de esteróides naturais envolve um processo
complexo com envolvimento de vários passos de reação
25,26
.
Possui ainda, a capacidade de reduzir o colesterol total e o LDL-colesterol
sem alterar os níveis séricos de HDL-colesterol e triglicérides, sendo esta atividade
vantajosa para evitar a aterosclerose
27
.
1.4.2. Ácido mirístico
Acido mirístico é um acido carboxílico que participa do metabolismo
fisiológico. É um acido graxo (Figura 6), possuindo 14 carbonos, sem dupla ligação,
portanto, um ácido graxo saturado. Quando sólido tem aparência de flocos de cor
branca e odor suave e característico
28
.
A sua designação tem origem no nome da moscadeira, de onde se obtém a
noz-moscada, (Myristica fragrans). A manteiga de noz-moscada é 75% trimiristina, o
triglicérido do ácido mirístico
28
.
10
A noz-moscada é usada como agente anti-diarréia em pacientes com
carcinoma medular da tireóide. A eficácia do tratamento é sugerida devido à inibição
da síntese das prostaglandinas na mucosa e submucosa do cólon. A utilização deve
ser com cautela para evitar efeitos tóxicos
29
.
Figura 6 - Estrutura básica ácido mirístico.
1.5. Fisiologia da Dor
a
1
1.5.1. Conceito
A dor é definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP)
como sendo „uma experiência emocional e sensorial desagradável associada com
uma lesão tecidual real ou potencial ou descrita em termos da tal lesão
30
.
Possui uma percepção complexa e de múltiplas dimensões, geralmente
originada no sítio da lesão, sendo transmitida pelo sistema nervoso periférico,
processada em diversos níveis do sistema nervoso central e, finalmente, percebida
no córtex cerebral
31
.
As sensações dolorosas possuem vias neuroanatômicas, com receptores
específicos que permitem a detecção e medida de um estímulo. Já as experiências
incorporam componentes sensoriais com influências pessoais e ambientais
importantes
32
. No entanto se faz necessário, do ponto de vista experimental, a
distinção entre a dor percebida e a resposta ao dano tecidual ou nocicepção
33
.
Nocicepção é um termo aplicado aos mecanismos neurológicos que detectam
o estímulo lesivo
34
. Uma vez que os animais não são capazes de verbalizar os
a
1
“A dor é uma emoção que mora na alma”. Platão (370 a.C.)
11
componentes subjetivos da dor, neles não se avalia dor, mas nocicepção. Sendo
assim, termos como dor e analgesia são mais adotados para humanos e nocicepção
e antinocicepção para animais
35
.
1.5.2. Classificação
A dor pode ser classificada de acordo com a sua duração ou sua origem. Na
duração, pode-se designar como dor transitória, dor aguda e dor crônica. A dor
transitória é evocada pela ativação dos nociceptores na pele ou em outros tecidos
do corpo, na ausência de qualquer dano tecidual. Por outro lado, a dor aguda é
desencadeada após uma lesão substancial de algum tecido, com ativação dos
nociceptores mesmo após a retirada do estímulo nocivo original e a dor crônica é
aquela que persiste por mais de três meses
30
.
Quanto à sua origem, existem quatro tipos de dor. A dor nociceptiva, que é
originada devido à estimulação excessiva dos nociceptores localizados na pele,
vísceras e outros órgãos. A dor neurogênica ou inflamatória, que reflete um dano
tecidual neuronal na periferia ou no Sistema Nervoso Central (SNC) que
normalmente é mais persistente com significado dano tecidual devido à inflamação.
A dor neuropática que acontece devido a uma disfunção ou dano de um nervo
ou grupo de nervos. Por último, a dor pscicológica, que não é oriunda de uma fonte
somática identificável e que pode refletir fatores psicológicos
32,33
.
1.6. Mecanismos envolvidos na transmissão da dor
1.6.1. Reconhecimento da dor
Os processos fisiológicos associados com o reconhecimento da dor são:
transdução, transmissão, modulação e a percepção ou cognição
36
.
12
A transdução é a transformação de um estímulo nociceptivo em estímulo
elétrico nas terminações nervosas sensoriais. Normalmente inibido pela
administração preemptiva de anestésicos locais e antiinflamatórios não esteroidais
(AINEs)
37
.
O movimento da atividade elétrica pelo sistema nervoso periférico é
denominado por transmissão, assim também, a diminuição ou modificação nesta
transmissão pelos nociceptores é a modulação (Figura 7), e o processamento da
consciência da dor é definido por percepção
36
.
Figura 7. Processos fisiológicos. biobio-unb-extremos1.blogspot.com/dor.
Para que tudo isso ocorra é utilizado as vias ascendentes e descendentes.
Nas ascendentes, a transmissão dos estímulos nociceptivos até a medula espinhal é
feita pelos nervos periféricos. No tronco e nos membros é feita através dos nervos
espinhais; nas vísceras pelos nervos simpáticos, parassimpáticos e esplâncnicos.
Na região da cabeça é transmitida principalmente pelo nervo trigêmeo
36,37
.
Esta via pode ser subdividida em ventrolaterais e ventrodorsais, sendo que,
nas ventrolaterais, dois feixes nervosos ascendentes estão envolvidos, a saber: o
13
neoespinotalâmico e o paleoespinotalâmico. Nas vias ventrodorsais dois tratos estão
envolvidos, o espinocervical e o proprioespinhal
36
.
O feixe neoespinotalâmico possui neurônios de segunda ordem que são
excitados por fibras de dor rápida do tipo A (delta), que transmitem estímulos
nociceptivos mecânicos e térmicos. Algumas fibras deste feixe terminam nas áreas
reticulares do tronco cerebral, porém muitas seguem até o tálamo. A partir daí, os
sinais são transmitidos a outras áreas basais do encéfalo e ao córtex sensorial
somático. Este sistema está envolvido com a discriminação, avaliação e rápida
resposta à dor. O feixe paleoespinotalâmico transmite a dor principalmente por fibras
periféricas do tipo C (dor lenta). Poucas fibras chegam até o tálamo, porém a maioria
termina em múltiplas áreas do bulbo, ponte e mesencéfalo. O sistema
paleoespinotalâmico possui ligações com áreas que determinam aspectos
motivacionais e afetivos que influenciam na percepção dolorosa
35,37
.
A descendente é constituída de três componentes principais. O primeiro é a
área cinzenta periaquedutal (ACP) do mesencéfalo e parte superior da ponte,
circundando o aqueduto cerebral. Os neurônios dessa região enviam sinais para o
segundo componente núcleo magno da rafe, localizado na parte inferior da ponte e
parte superior do bulbo, que forma o terceiro componente. Deste ponto os sinais são
transmitidos pelas colunas dorsolaterais da medula espinhal em sentido
descendente para um complexo inibitório da dor, localizados na parte dorsal da
medula espinhal (Figura 8). Esse ponto é importante, porque a dor proveniente dos
nervos periféricos pode ser bloqueada antes que chegue ao encéfalo. A estimulação
elétrica de ACP e do núcleo magno da rafe pode suprimir sinais de dor que chegam
pelas raízes espinhais dorsais
38
.
14
Figura 8. Caminhos da dor.
A percepção e a propagação dos estímulos nociceptivos são determinados,
tanto no sistema nervoso central quanto no periférico. O início do processo ocorre a
partir de uma lesão tecidual proveniente do processo inflamatório, isquêmico ou
traumático. A lesão tissular favorece a liberação de várias substâncias algogênicas,
que ativam os nociceptores. A transmissão nociceptiva pode ser ativada ou inibida
por vários neuropeptídeos, monoaminas e alguns aminoácidos como, por exemplo, o
glutamato e óxido nítrico, etc
38
.
15
Aproximadamente um século atrás, Sherrington propôs a existência do
nociceptor, um neurônio sensorial primário que é ativado por estímulos capazes de
gerar dano tecidual. De acordo com esse modelo, os nociceptores têm limiares
característicos que os distinguem de outras fibras nervosas sensoriais. Eles estão
amplamente distribuídos na pele, vasos, músculos, articulações e vísceras e são
sensíveis a estímulos térmicos, mecânicos e químicos. Existem ainda os
nociceptores silenciosos (“silent” ou “sleeping”), que compreendem uma pequena
proporção das fibras aferentes, que normalmente não são responsivos a estímulos.
Entretanto, quando influenciados por mediadores inflamatórios, ou após a
administração de agentes flogísticos, apresentam atividade espontânea ou tornam-
se sensibilizados e respondem a estímulos sensoriais
39
.
A transmissão da dor envolve várias interações entre mecanismos tanto
periféricos quanto centrais, desde a superfície da pele até o córtex cerebral
30,39,40
.
A sensibilização dos nociceptores ocorrida em casos de mudança de
temperatura (estímulo nocivo térmico), diferença osmótica ou distensão do tecido
(estímulo nocivo mecânico), resulta na liberação local de mediadores químicos tais
como bradicinina, prótons, serotonina, histamina, metabólitos do ácido araquidônico,
ATP, adenosina, citocinas, aminoácidos excitatórios, SP, NO, opióides e acetilcolina,
entre outros
39
. Estes mediadores interagem com receptores específicos, levando a
uma propagação do sinal nociceptivo graças a um aumento na permeabilidade da
membrana neuronal à cátions e conseqüente geração do potencial de ação
41
. É
importante ressaltar que estes mediadores podem ser liberados não somente pelos
neurônios sensoriais, mas também por fibras simpáticas e por células não neuronais
como plaquetas, células endoteliais, fibroblastos, células de Schwann e células
inflamatórias
42
.
16
Embora os muitos mecanismos moleculares envolvidos na sensibilização
central tenham sido estabelecidos, os mecanismos de sensibilização periférica ainda
não foram completamente elucidados. Entretanto, o conhecimento da biologia
molecular dos receptores está permitindo extraordinário progresso no entendimento
do mecanismo de ação de diversos neurotransmissores e drogas envolvidas na
modulação central e periférica da nocicepção (Figura 9)
32
.
Figura 9. Representação esquemática dos fatores responsáveis pela
ativação de nociceptores periféricos. + significa estimula e –
significa inibe. Adaptado a partir de Hill (2001).
Tais mecanismos de transdução nociceptiva geralmente envolvem a atuação
dos mediadores inflamatórios em receptores específicos que se encontram
acoplados a sistemas efetores que quando devidamente ativados promovem a
formação de segundos mensageiros, como o AMPc (adenosina 3,5-monofosfato
cíclico) e GMPc (guanosina 3,5-monofosfato cíclico), responsáveis pela ativação de
proteínas-quinases intracelulares ou de terceiros mensageiros, como o Ca2
+
, o qual
pode interferir na atividade de outras proteínas celulares e na regulação de outros
canais iônicos.
17
Muitas substâncias produzem ativação direta de nociceptores como a
bradicinina, o ATP e a capsaícina, provocando dor aguda. Porém mediadores
inflamatórios induzem hiperalgesia através da sensibilização do nociceptor,
resultantes da ativação direta de quinases celulares e alterações na excitabilidade
da membrana ou indiretamente via síntese e liberação de outros reguladores
celulares (prostanóides, citocinas, Fator de Crescimento do Nervo - NGF)
43
.
Um maior conhecimento destes eventos permite modificações processuais
seletivas e são caminhos promissores para o desenvolvimento de novos fármacos
analgésicos
44
.
1.6.2. Receptor vanilóide potencial transitório – (TRPV)
A descoberta da superfamília de receptores potenciais transitórios permitiu
um maior entendimento dos mecanismos de influxo de cálcio em uma grande
variedade de células (Figura 10). Canais TRP são expressos em células excitáveis e
não excitáveis e representam vias primárias de entrado do íon. Devido às suas
propriedades na transdução de estímulos sensoriais e não sensoriais, a subfamília
TRPV (1 a 6) tem recebido crescente atenção. Os membros deste grupo apresenta
sensibilidade a diversos estímulos ambientais, nocivos ou não, incluindo pimentas e
outros derivados vegetais, mediadores inflamatórios, calor, prótons, estímulos osmo-
e mecano-sensoriais
45
.
A capsaícina, o princípio ardente da pimenta vermelha do gênero Capsicum, é
um irritante natural, como o olvanil, o eugenol e a resiniferatoxina (coletivamente
denominados vanilóides), que provocam dor ativando receptores específicos em
terminações nervosas. A despolarização de nociceptores polimodais C em
mamíferos, por influxo de cálcio através de canais vanilóides, causa a liberação
18
neuronal de SP e outros neuropeptídeos, como o CGRP, a somatostatina e o
peptídeo intestinal vasoativo
45
.
Em mamíferos, o TRPV 1 funciona como um receptor primário para estímulos
nocivos, apesar de outras funções poder existir. O TRPV1 é fortemente expresso em
neurônios sensoriais, incluindo nos gânglios da raiz dorsal e trigeminais, com
expressão moderada em fibras nervosas de outros tecidos. Um aspecto importante
do funcionamento do TRPV1 é a sua sensibilização por um ou mais estímulos e/ou
por compostos endógenos. A exposição de células que expressam TRPV1 a um
meio ácido sensibiliza o receptor à ativação por calor, reduzindo seu limiar. Do
mesmo modo, prótons sensibilizam o receptor aos efeitos da capsaícina
46
. Apesar
de sua presença no SNC de mamíferos, o TRPV1, sob condições fisiológicas,
dificilmente é ativo por pH baixo ou calor, o que sugere uma regulação preferencial
por ligantes endógenos, os chamados endovanilóides. Este grupo compreende a
anandamida, N-araquidonoil dopamina e produtos da lipoxigenase (15-HPETE e 12-
HPETE)
46
. Esta habilidade de integrar vários estímulos faz com que o TRPV1 seja
um importante receptor de modulação e um promissor sítio para o desenvolvimento
de novos fármacos para o controle da dor. Esta expectativa é baseada em estudos
recentes que demonstraram que há um aumento da expressão do TRPV1 em
tecidos obtidos de pacientes afetados com condições patológicas como doenças
inflamatórias, hiperalgesia e carcinoma
46
.
19
Figura 10. Representação da ligação da capsaicina/receptor.
1.6.3. Óxido nítrico (NO)
O óxido nítrico (NO) é um mediador inflamatório bastante versátil,
apresentando efeitos pró e antiinflamatórios. O NO é um radical livre formado
endogenamente por uma família de enzimas. Óxido nítrico sintases (NOS), através
da conversão de L-arginina em L-citrulina. Nos líquidos orgânicos, o NO produzido
se oxida produzindo ânions nitrito (NO
2
-
) e nitrato (NO
3
-
), sequencialmente. Foram
identificadas três diferentes isoformas de NOS em células de mamíferos (produtos
de diferentes genes): NOS endotelial (eNOS) encontrada em células endoteliais,
epiteliais e miócitos cardíacos; NOS neuronal (nNOS) encontrada em neurônios,
células musculares esqueléticas e neutrófilos e a NOS induzida (iNOS), encontrada
em macrófagos, hepatócitos, células musculares lisas
47,48
20
As eNOS e nNOS são classificadas como enzimas constitutivas e
dependentes de cálcio, enquanto que a iNOS é classificada como uma enzima
induzida, cujas ações independem de cálcio e pode ser ativada por citocinas pró-
inflamatórias, como a IL-1 e TNF-α. A ativação de todas as enzimas NOS necessita
dos seguintes cofatores: calmodulina, flavina adenina dinucleotídeo (FAD), flavina
adenina mononucleotídeo (FMN), tetrahidrobiopterina (THB4) e nicotinamida
adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH)
47
.
O óxido nítrico tem efeitos disseminados em repostas fisiológicas e
inflamatórios. Nas células endoteliais, o NO produzido, difunde-se rapidamente para
fora das células de origem para as células musculares lisas subjacentes,
provocando relaxamento e, conseqüentemente, vasodilatação. A vasodilatação que
ocorre no processo inflamatório, induzido por diferentes agentes flogísticos
(bradicinina, histamina, SP, serotonina e trombina), é dependente da liberação de
óxido nítrico
49
.
Além de promover o relaxamento da musculatura lisa, o NO desempenha
outros papéis importantes na inflamação e consequentemente na dor. Reduz a
agregação e adesão plaquetária, é citotóxico para determinados microorganismos e
células tumorais. Células endoteliais produzem e liberam NO, após a estimulação
por citocinas como MCP-1 e outras
50,51,52
.
1.6.4. Mediadores com ação nos nociceptores
As citocinas podem ser definidas como uma família de polipeptídicos ou
peptídeos regulatórios secretados por leucócitos (macrófagos, células dendríticas,
linfócitos e mastócitos) e por diversas outras células do corpo em resposta a
21
diferentes estímulos inflamatórios, lesão tecidual e de estruturas nervosas e também
em resposta a outras citocinas
52,53,54,55
.
São proteínas de sinalização intercelular que têm ação regulatória pleiotrófica
sobre as células hematopoiéticas e terminações nervosas periféricas, regulando não
apenas as respostas inflamatórias e imunológicas locais e sistêmicas, como também
a cicatrização de feridas e outros processos via ativação da transcrição de genes
específicos
54,55,56
.
Dentre os mediadores algogênicos diretos a bradicinina apresenta efeitos
bastante versáteis, além de atuar diretamente nos nociceptores, também apresenta
efeitos hiperalgésicos. Existem quatro subtipos de receptores de bradicinina (BK1-
BK4)
57,58
.
A histamina encontrada, principalmente, no interior de mastócitos parece
atuar diretamente no nociceptor induzindo sensação de dor e prurido
59
.
Adicionalmente, outros mediadores são capazes de atuar diretamente no nociceptor
tais como: ATP, serotonina, substância P e prótons
60
.
Outros mediadores, porém podem alterar o potencial de repouso destes
neurônios periféricos facilitando a formação de um potencial de ação por outros
estímulos, sendo chamados de mediadores hiperalgésicos.
As substâncias hiperalgésicas parecem ser capazes de aumentar a
concentração intracelular de AMPc e Ca
++
gerando uma redução no limiar de
ativação das fibras nociceptivas periféricas. Assim, prostaglandinas e aminas
simpatomiméticas (dopamina e noradrenalina) atuam através deste mecanismo. Isso
foi justificado por estudos que demonstram que a administração de prostaglandinas
ou agonistas adrenérgicos produzem efeito hiperalgésico, e que a administração de
antagonistas destas substâncias diminuem este efeito
61,62,63
.
22
Além disso, substâncias capazes de induzir a formação de prostaglandinas e
aminas simpatomiméticas (IL-1; IL-8; TNF-α) podem ser também considerados
mediadores hiperalgésicos
57,64,65
. TNF-α é capaz de induzir a síntese de IL-1, IL-6 e
IL-8, estas citocinas por sua vez induzem a síntese de mediadores hiperalgésicos
como prostaglandinas e aminas simpatomiméticas
66,67,68,69
, assim também induzem
a síntese de quimiocinas provocando indiretamente a migração de neutrófilos para o
foco inflamatório e algogênico
70,71
.
Assim, diversos mediadores do processo inflamatório apresentam atividades
diferenciadas e complexas nos nociceptores, isso implica em uma grande interação
entre o processo inflamatório e a dor, além de justificar a pesquisa de substâncias
pró e antiinflamatórias em processos algogênicos.
1.7. Fisiopatologia da dor
1.7.1. Estímulos potencialmente nocivos
A exposição da pele ou qualquer outro órgão a estímulos potencialmente
nocivos induz à sensação desagradável, informando o indivíduo sobre o perigo real
ou potencial para sua integridade física. Portanto, a informação processada pode ser
diferenciada como dor fisiológica ou dor patológica
71,72
.
A dor fisiológica é aquela que induz respostas protetoras, como o reflexo de
retirada (ou reação de fuga), com intuito de interromper a exposição ao estímulo
nocivo. Este sinal é típico da dor aguda produzida por estímulos intensos na
superfície da pele. A dor visceral e a dor somática profunda são causadas por
estímulos inevitáveis e apresentam respostas adaptativas específicas, geralmente
são subagudas e podem vir acompanhadas de respostas autonômicas ou
comportamentais específicas
72,74
.
23
Estados dolorosos prolongados estimulam persistentemente os aferentes
nociceptivos induzindo alterações que aumentam os efeitos deletérios da dor
crônica, introduzindo então o conceito de dor patológica. Enquanto a dor aguda é um
sintoma de alguma doença, a dor crônica é uma doença propriamente dita, sendo
nociva e independente ao estímulo que a gerou
73,74
, podendo ter tua origem em
nociceptiva ou neuropática
73
.
1.8. População atingida
Toda pessoa começa a sentir dor ao nascer, pois, o choro do recém-nascido
é uma resposta à dor de, pela primeira vez, sentir o ar entrando nos pulmões.
Depois vêm as cólicas, faringites, otites, dores de cabeça, etc., uma enxurrada de
sensações desagradáveis. A dor também tem a função de proteção, não podendo
ser considerado como algo comum quando, essas dores se incorporam à vida de
forma duradoura
75
.
A prevalência das condições dolorosas é elevada e crescente a tal ponto que
além de institutos especiais criados para estudo e pesquisa de sua incidência na
população, ela foi incluída recentemente como o quinto sinal vital a ser medido pelos
médicos numa consulta clínica. Os outros são: pressão arterial, freqüência cardíaca,
freqüência respiratória e temperatura. A dor tem um importante impacto na vida dos
indivíduos pelo sofrimento e limitações causados no cotidiano e acarreta um
dramático efeito para a sociedade, devido ao elevado custo do tratamento e ao custo
das horas perdidas no processo produtivo
76
.
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a dor crônica provoca a
perda anual de 550 milhões de dias de trabalho em todo o mundo. A dor aguda ou
crônica, de um modo geral, leva o indivíduo a manifestar sintomas como alterações
24
nos padrões de sono, apetite e libido, manifestações de irritabilidade, alterações de
energia, diminuição da capacidade de concentração, restrições na capacidade para
as atividades familiares, profissionais e sociais. Nos indivíduos com dor crônica, a
persistência da dor prolonga a existência desses sintomas, podendo exacerbá-los. O
Instituto de Medicina dos Estados Unidos considerou a dor crônica como um
problema de saúde pública
77
.
Estudos epidemiológicos de dor crônica no Brasil e no resto do mundo são
escassos, principalmente em se tratando de dores não específicas e em populações
não vinculadas a serviços de saúde. No estudo de prevalência de dor, conforme o
sexo e locais do corpo, o resultado demonstra que mulheres sofrem mais deste mal,
com uma prevalência de dor crônica de 61,4%, sendo a dor de cabeça a mais
relatada (26,7%), seguida de região lombar (19,4%) e membros inferiores com
(13,3%). E, quando se faz o estudo na população idosa, a prevalência de dor é
ainda maior
77
.
O processo de envelhecimento, na maioria das vezes, não se caracteriza
como um período saudável e de independência. Ao contrário, caracteriza-se pela
alta incidência de doenças crônicas e degenerativas que resultam em elevada
dependência, sendo estes quadros acompanhados por dor e, em significativa
parcela deles, a dor crônica é a principal queixa do indivíduo, interferindo de modo
acentuado na qualidade de vida dos idosos
78
.
Isso é um fator de grande preocupação por parte dos gestores em todo o
mundo, pois, o crescimento da população mundial tende a confirmar as projeções da
OMS que prevê para o ano 2025, 30 milhões de idosos, o que corresponderá a 10%
da população brasileira, levando o país a ocupar a sexta posição entre os países
com maior número de idosos do mundo
79
.
25
Segundo Teixeira e companheiros
80
, estima-se que 80% a 85% dos
indivíduos com mais de 65 anos apresentem, pelo menos um problema significativo
que os predisponham à dor.
1.9. Modelos experimentais de nocicepção
A investigação científica da nocicepção pode ser realizada seguindo vários
protocolos, abaixo está uma breve descrição dos métodos mais utilizados em
laboratórios para avaliação de comportamentos apresentados por animais
submetidos à experiência nociceptiva à estimulação de caráter mecânico, térmico ou
químico.
O teste de ácido acético via intraperitoneal e um modelo clássico para triagem
de substâncias com atividade antinociceptiva. Embora este seja um modelo de
nocicepção simples e pouco específico, permite avaliar a atividade antinociceptiva
de várias substâncias que atuam tanto em nível central quanto periférico.
Após aplicação do agente álgico, conta-se o número de contorções,
traduzidas por contração e rotação do abdômen, seguidas de extensão de uma ou
ambas as patas traseiras por tempo determinado.
O ácido acético produz uma resposta que depende da interação de vários
neurotransmissores e neuromoduladores que determinam a nocicepção, o que faz
esse modelo sensível às substâncias analgésicas de ação central e/ou periférica
com os mais variados mecanismos de ação.
A resposta nociceptiva é induzida pela injeção intraperitoneal de ácido acético
(0,3-1,8%; 0,1 ml/10 g de peso corporal) em camundongos. Uma hora antes da
injeção de ácido acético, administram-se as drogas que servirão de controles (salina
26
ou água destilada, morfina, etc.) e a substância a ser testado. Após a injeção, os
animais são colocados sob campânulas de vidro, para a observação individual e o
número de contorções é quantificado cumulativamente, durante um período de 30
min. O resultado obtido a partir dos grupos tratados é comparado com os grupos
controles
81
.
Outro modelo é o descrito por Hunskaar e Hole
82
(formalina), o qual, consiste
em injetar uma substância irritante no espaço subcutâneo da pata traseira de
camundongos, determinando o surgimento de alterações comportamentais,
traduzidas por respostas motoras características que permitem avaliar a intensidade
da resposta nociceptiva ao estímulo químico.
Os animais recebem 20 µL da solução de formalina 2,5%, logo após a
injeção, os animais são colocados sob campânulas de vidro e observados
individualmente. O tempo que o animal reage (lambendo e mordendo) é
cronometrado nos primeiros cinco min seguintes à injeção e a partir de 20 até 30
min. Os resultados obtidos a partir dos grupos tratados são comparados com os
grupos controles. Com este modelo, podemos evidenciar as duas fases de
sensibilidade dolorosa: a primeira fase começa imediatamente após a injeção e
perdura por cerca de cinco minutos (1ª fase). Essa fase é seguida por um período de
quiescência, de cerca de 10 minutos, após o qual se desenvolve a 2ª fase da
resposta, que se inicia 20-30 minutos após a injeção. A primeira fase é de caráter
neurogênico, sendo sensível a analgésicos opióides e a alguns agonistas das vias
descendentes, e a segunda fase é acompanhada de uma resposta inflamatória
relacionada à liberação de mediadores inflamatórios, sendo sensível a analgésicos
antiinflamatórios não-esteroidais. As drogas utilizadas como controle positivo
(morfina e analgésico antiinflamatório não-esteroidal) é administrado uma hora antes
27
da injeção de formalina de igual modo as substâncias testes
82
.
Além destes descritos, há ainda testes que utilizam outras substâncias
nóxicas para indução de nocicepção, como capsaícina, glutamato, etc. e, cada
modelo possui peculiaridades de indução e mecanismo de ação caracterísiticos.
Para avaliação de nocicepção mecânica, o teste comportamental de Randall,
Selitto
83
é um método bastante utilizado. Para a execução deste teste utiliza-se
equipamento apropriado denominado analgesímetro (Ugo-Basile, Verese, Itália), que
gera aumento linear da força (em gramas) sobre a superfície dorsal da pata do
animal, até que o mesmo produza uma resposta caracterizada pela retirada da pata.
O reflexo de retirada da pata é considerado representativo do limiar hipernociceptivo,
ou seja, a força necessária aplicada à pata para que induza uma resposta aversiva a
um estímulo nocivo (limiar nociceptivo de retirada da pata - LNRP). A força
necessária para que esse animal exiba tal resposta é registrada em gramas. O
LNRP é avaliado antes e após a administração dos estímulos hiperalgésicos. Para
reduzir o stress, os ratos devem ser habituados ao equipamento um dia antes da
execução do mesmo
83
.
A atividade analgésica central pode ser avaliada por meio do teste da placa
quente. Neste teste, o equipamento, que consiste de uma placa de metal, é
aquecido até a temperatura de 55 (±1) °C. Embora Kuraishi e companheiros
84
tenham descrito primeiramente o teste para uso em camundongos, muitos
experimentos são feitos com ratos. Originalmente, camundongos suíços de ambos
os sexos, com pesos entre 18 e 25 g, são colocados sobre a placa aquecida e, as
respostas ao estímulo térmico (retirada e lambida das patas traseiras ou dianteiras),
cronometradas.
28
São feitas duas medidas-controle em intervalos de 30 minutos. Por meio
dessas medidas se estabelece o tempo de “cut-off”, ou seja, o tempo máximo de
permanência do animal sobre a placa, calculado como sendo aproximadamente 3
vezes o valor médio da 2ª medida-controle. Adotou-se, porém, um cut-off de 25
segundos devido a possíveis lesões que poderiam ser causadas na pata do animal
pela exposição a tempos superiores.
A primeira leitura-controle tem o objetivo de adaptação dos animais ao ensaio.
A segunda leitura-controle é utilizada para exclusão do ensaio dos animais que
possuem período de latência superior a 9,9s, sendo considerada como a resposta-
controle do tempo zero.
Os compostos são administrados em seguida à segunda leitura-controle,
geralmente, por via oral, embora outra via de administração possa ser utilizada.
As medidas do tempo de resposta são registradas em intervalos de 30
minutos após a administração durante 2 horas (tempos: 30 min; 60 min; 90 min; 120
min). Os resultados são expressos em média ± EPM dos tempos registrados nos
grupos de animais
84
. Neste estudo, utilizaremos somente os modelos de indução
química.
1.10. Terapia da inflamação e da dor
Vários medicamentos estão disponíveis no mercado para uso clínico como
analgésicos e/ou antiinflamatórios, os corticosteróides, os opióides e os AINEs. Os
glicocorticóides possuem grande amplitude de ações farmacológicas, dentre elas,
seus efeitos antiinflamatórios e imunossupressores, inibindo tanto as manifestações
iniciais quanto as tardias do processo inflamatório. Apesar destas classes de
substâncias apresentarem excelentes propriedades antiinflamatórias (com exceção
29
dos opióides) e serem utilizadas na terapêutica clínica, seu uso produzem
importantes efeitos colaterais. Tal fato encoraja a busca por substâncias com menos
efeitos indesejáveis e com maior seletividade de ação antiinflamatória e/ou
analgésica. Em relação aos AINEs, sua principal molécula-alvo é a enzima COX
85
.
A inibição da atividade das COXs (COX-1 constitutiva, COX-2 induzida, ou
ambas) é um dos principais mecanismos de ação de diversos fármacos, analgésicos
e antiinflamatórios, especialmente os AINEs como a indometacina. Desta forma, seu
efeito antiinflamatório deve-se principalmente à inibição da produção de PGs como a
prostaglandina E2 (PGE
2
), PGD
2
e PGI
2
, bem como dos tromboxanos (TXs)
86
.
A COX-2 é uma enzima expressa por células envolvidas em processos
inflamatórios, foi correlacionada como sendo a maior responsável pela produção de
prostanóides nos processos inflamatórios e dolorosos. A partir daí a busca por
inibidores seletivos de COX-2 tornou intensa. Assim, foram desenvolvidos inibidores
seletivos da COX-2 da primeira geração: o celecoxib e o rofecoxib que foram
aprovados pela “Food and Drug Administration” (FDA) para o tratamento da artrite.
Foram desenvolvidos também os inibidores seletivos para COX-2 de segunda
geração: o valdecoxib, etoricoxib e o lumiracoxib
86,87
.
Entretanto, estudos demonstraram que o Vioxx
®
poderia causar sérios
eventos cardiovasculares como ataque cardíaco e infarto
87
.
Fitzgerald
86
demonstrou que o celecoxib reduzia além dos níveis de PGE
2
, os
níveis de prostaciclina (PGI
2
). Anteriormente, a produção da PGI
2
parecia ser
realizada somente pela COX-1, entretanto esta proposição estava completamente
errada, uma vez que foi demonstrada que, a COX-2 é a principal produtora de PGI
2
.
A PGI
2
podem causar inibição da agregação plaquetária, indução da
vasodilatação e prevenção à proliferação cardiovascular em células musculares lisas
30
in vitro. Os inibidores não seletivos de COX inibem tanto síntese de PGI
2
como
também de tromboxano A2, enquanto que os inibidores seletivos da COX-2 inibem
somente a produção da PGI
2
. A produção de tromboxano A
2
fica intacta podendo
induzir a agregação plaquetária, vasoconstrição e proliferação vascular
88
.
O mecanismo pelo qual atuam os fármacos antiinflamatórios esteroidais,
como a dexametasona e a hidrocortisona, está relacionado principalmente à inibição
da migração celular para a área afetada, através da supressão da expressão de
moléculas de adesão, ou da indução da síntese de uma proteína inibidora de
fosfolipase A2 a anexina-1 (também conhecida como lipocortina-1). Um outro
mecanismo de ação dos corticosteróides ocorre através da ativação de receptores
nucleares para glicocorticóides que regulam a transcrição de alguns genes de
resposta primária, incluindo os que expressam a COX-2 e o óxido nítrico sintase. O
complexo esteróide-receptor também é capaz de promover inibição da transcrição
de um grande número de citocinas envolvidas na inflamação crônica, destacando-se
principalmente a IL-1 e o TNF-α
60,89
.
Além disso, os corticosteróides podem ainda promover uma repressão da
síntese dos receptores das citocinas, como dos receptores da IL-2
32,90,91
. Além
destes, outros mecanismos de ação podem ser evidenciados para drogas
analgésicas e antiinflamatórias como: 1) atuação como falsos substratos: análogos
de precursores naturais dos ácidos graxos podem servir de inibidores competitivos
da formação de PGs e produtos da ação das lipoxigenases; 2) Atuação em
receptores de mediadores inflamatórios; 3) bloqueio de canais de cálcio ou inibindo
a calmodulina, diminuindo, assim, a liberação de ácido araquidônico e sua
conseqüente metabolização; 4) inibição de espécies reativas de oxigênio e de
nitrogênio e a peroxidação lipídica e 5) atuando também por imunossupressão
36,91
.
31
II. JUSTIFICATIVA
A dor é considerada uns dos mais freqüentes motivos pelos quais pacientes
são tratados em todo o mundo. Agentes analgésicos convencionais representam um
importante papel na terapia moderna da dor, porém, apresentam uma série de
efeitos adversos
91
. Desta forma, é crescente a procura por novos agentes que
combatam a dor, que possuam ação seletiva e conseqüentemente uma menor
quantidade de efeitos colaterais.
Os estudos pré-clínicos trazem informações que justificam ou não a indicação
terapêutica em uso. Embora os efeitos observados em animais não sejam
necessariamente os mesmos observados em seres humanos, eles fornecem
importantes dados sobre os efeitos farmacológicos e orientam a posologia a serem
inicialmente utilizadas nos ensaios clínicos. Além disso, estes estudos servem
também para determinar possíveis mecanismos de ação farmacológica.
A proposta deste trabalho é investigar a atividade antinociceptiva do extrato
hidroetanólico 70% e das frações hexano:éter e alcaloídica, obtidas do xilopódio de
Macrosiphonia longiflora (Desf.) Müll. Arg., conhecida popularmente por „velame‟,
como também investigar possível (is) mecanismo (s) de ação (ões) responsável (is)
por esta ação, levando-se em consideração a ampla utilização desta planta pela
população e a ausência de estudos químicos-farmacológicos.
32
III. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar a atividade antinociceptiva do extrato e fração ativa de Macrosiphonia
longiflora (Desf.) Müll Arg. e o possível mecanismo de ação responsável por tal
efeito.
3.2 Objetivos específicos
Preparar extrato hidroetanólico mediante maceração com Etanol 70% por 7
dias (EHMl);
Determinar o peso seco e rendimento do EHMl;
Obter frações hexano-éter (F
Hex:Éter
) e alcaloídica (FAMl) a partir do EHMl ;
Proceder a testes fitoquímicos com as frações;
Identificar na fração ativa, substância (s) com potencial atividade
antinociceptiva, através de ressonância magnética nuclear (RMN);
Avaliar a ação antinociceptiva do EHMl e F
Hex:Éter
de M. longiflora, em modelos
experimentais de nocicepção induzido por ácido acético, formalina e
capsaícina;
Avaliar a participação dos receptores opióides na resposta antinociceptiva do
EHMl e F
Hex:Éter
, usando modelo de dor induzida por capsaícina;
Avaliar a participação dos receptores vanilóides na resposta antinociceptiva
do EHMl e F
Hex:Éter,
usando modelo de dor induzida por capsaícina;
Avaliar a participação do oxido nítrico na resposta antinociceptiva do EHMl e
F
Hex:Éter
, usando modelo de dor induzida por capsaícina e
Avaliar a participação de mediadores inflamatórios (citocinas e PGE2) na
resposta antinociceptiva do EHMl e F
Hex:Éter
, usando o lavado peritoneal de
animais submetidos a nocicepção por acido acético.
33
IV. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Materiais
4.1.1 Material botânico
A planta foi coletada nas proximidades da via MT-010, município de Acorizal-
MT, após solicitação de autorização ao Sistema de Informação em Biodiversidade
(SISBIO) do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis (IBAMA)/Ministério do Meio Ambiente (MMA), conforme Anexo 1.
Amostras testemunhas da planta, contendo material florífero foram
encaminhadas ao Herbário Central da UFMT, à Curadora Profª Drª Miramy Macedo,
para ratificação taxonômica, e a exsicata (Figura 11) depositada no Herbário UFMT
sob o nº 32.834.
Figura 11. Foto da exsicata depositada no herbário UFMT de M.longiflora
(Desf) Müll. Arg. (Apocinaceae)
Local de coleta: Rodovia MT- 010
Município: Acorizal-MT
Exsicata: 32.834
Herbário UFMT
Coletadores: Aurea D. Alves,
Joaquim Corsino da Silva,
Rafael Damaceno Alves e
Libério Amorim Neto
Data – 08/05/2009
Foto: Alves, A. D.
34
4.2. Animais
Foram utilizados camundongos Swiss-Webster adultos, de ambos os sexos,
pesando 25-30 g, provenientes do Biotério Central da UFMT.
Os animais foram acondicionados em gaiolas de polipropileno, com água ad
libitum e ração Purina (Labina), mantidos em condições controladas de temperatura
(25±1 ºC) e ciclos claro/escuro de 12 h cada, antes da realização dos ensaios.
O número de animais e a intensidade dos estímulos utilizados foram os
mínimos necessários para demonstrar de forma consistente o efeito do tratamento.
Todos os experimentos foram realizados de acordo com os Princípios Éticos
na Experimentação Animal, preconizados pela lei nº 11.794/08 (Lei Arouca). Os
protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa
Animal (CEPA/UFMT), nº 23108.047495/09-3, conforme Anexo 3.
4.3. Drogas e reagentes
Todas as substâncias utilizadas nos ensaios farmacológicos foram de pureza
analítica, com exceção de cloridrato de naloxona (Narcan
®
) e sulfato de morfina
(Dimorf
®
), conforme visto no Quadro 1.
35
Quadro 1 – Relação das drogas, reagentes, corantes e suas marcas.
Substância
Fabricante
Acetato de etila P.A.
SYNTH
Acetona P.A.
SYNTH
Ácido acético glacial P.A.
DINÂMICA
Acido cloridrico P.A.
MERCK
Alcool etílico P.A.
REAGEN
Bicarbonato de sódio P.A.
MERCK
Capsaícina
SIGMA-ALDRICH
Capsazepina
SIGMA-ALDRICH
Carvão ativo pó
REAGEN
Cloreto de sódio P.A.
LABSYNTH
Cloreto de Potássio P.A.
ECIBRA
Cloridrato de naloxona (Narcan®)
CRISTÁLIA
Cloroformio P.A.
MERCK
Formaldeído 37%
SIGMA CHEMICAL
Fosfato de potássio monobásico P. A.
LAFAN
Fosfato de sódio monobásico P.A.
INDEX
Hexano P.A.
SYNTH
Indometacina
SIGMA-ALDRICH.
Iodo sublimado
INDUKERN
L-arginina
SIGMA-ALDRICH
Metanol P.A.
CROMATOLINE
N
G
-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME)
SIGMA-ALDRICH
Monooleato de polioxietilenosorbitano (Tween 80)
SYNTH.
Reagente de Dragendorf
SUPPLY
Reagente de Mayer
SUPPLY
Sílica gel
CROMATOLINE
Sulfato de morfina (Dimorf®)
CRISTÁLIA
36
4.4. Equipamentos
Balança analítica Q-500 L210 C – QUIMIS;
Balança eletrônica de precisão modelo 500 – BEL;
Bomba de vácuo TE-058 – TECNAL;
Centrífuga refrigerada R - 4239 – ALC;
Cronômetro digital Modelo JS-307 – JUNSNED;
Destilador Q341-25 – QUIMIS;
Espectrômetro de RMN 300 MHz, Modelo: Mercury 300 – VARIAN;
Estufa de secagem com circulação de ar – MARCONI;
Evaporador rotativo MA 120 – MARCONI;
Freezer vertical FE26 – CONSUL;
Geladeira vertical 240 litros – CONSUL;
Moinho elétrico TE 625 – TECNAL;
Pipeta automática 10 -1000 µL – EPPENDORF;
Cubas de eluição e revelação – PLENA-LAB;
4.5. Métodos
4.5.1. Protocolo Experimental
Na Figura 12 encontra-se esquematizado o fluxograma com os procedimentos
fitoquímicos e farmacológicos usados nesse estudo.
37
Preparo do extrato hidroetanólico 70%
Testes fitoquímicos
CCD
Figura 12. Fluxograma do protocolo experimental. CCD – cromatografia de coluna delgada.
RMN – ressonância magnética nuclear.
4.6. Obtenção dos extratos
O material coletado foi limpo (12 kg), seco à temperatura ambiente e
posteriormente triturado em moinho elétrico (malha n. 40). Para obtenção do extrato
hidroetanolico 70%, o pó obtido foi macerado (1:5 p/v) por 7 dias, à temperatura
ambiente e agitado uma vez ao dia.
Planta
Xilopódio
Ensaios antinociceptivos
farxcFarmacológicoFarm
acológicos
Farmacológicos
Partição ácido-base
Fração alcaloídica
Fração Hexano-éter
Triagem Antinociceptiva
Não
Sim
- estigmasterol
- β-sitosterol
- miristato miristila
miristato
RMN
Ensaios
Antinociceptivos
Ácido acético
Formalina
Capsaícina
Ácido acético
Formalina
Capsaícina
Extrato
Hidroetanólico
70%
Mecanismo de
ação
- Recptor vanilóides
- Receptor opióides
- Via L-arginina-
óxido nítrico
Mecanismo de
ação
- Recptor vanilóides
- Receptor opióides
- Via L-arginina-
óxido nítrico
38
Após filtração, o material foi concentrado sob pressão reduzida de 625 mmHg,
a uma temperatura entre 40-50°C. O solvente residual foi evaporado em estufa com
circulação de ar, à 40°C.
Parte do extrato hidroetanólico 70% foi utilizado para fracionamento e, a outra
parte foi embalado em frascos âmbar e guardado sob refrigeração de 4º ± 1ºC, para
a utilização em testes farmacológicos.
4.7. Preparação das frações hexano: éter e alcaloídica
Utilizando a partição ácido-base, o extrato hidroalcoólico 70% do xilopódio de
Macrosiphonia longiflora (EHMl) (191,5 g) foi solubilizado em 383 mL de metanol,
filtrado á vácuo e 2,5 g de carvão ativo adicionados ao filtrado. Esta solução foi
agitada por 10 min, filtrada em terra de infusórios (celite), concentrado em
evaporador rotatório e com 520 mL de metanol+120mL de ácido acético, e
concentrado novamente sob pressão reduzida (600 mmHg, à temperatura de 40ºC.
Após, submeteu-se o concentrado, por três extrações sucessivas, com 600 mL de
solução hexano:éter (1:1). A fase aquosa ácida foi alcalinizada com hidróxido de
amônio até pH 9-10, extraído com clorofórmio, concentrada em rotavapor e
denominada fração alcaloídica (FAMl). A solução hexano:éter foi concentrada em
rotavapor e chamada fração hexano:éter (F
Hex:Éter
)
92
.
4.8. Determinação do peso seco do extrato
Três alíquotas de 100 mg cada, do EHMl foram retiradas e colocadas em
frascos-ampola previamente secos e tarados. Estas levadas para estufa a 60°C, por
48 h e pesadas, sucessivamente, em balança analítica, até obtenção de peso
39
constante. A concentração dos extratos expressa em mg%, foram obtidas pela
média aritmética dos três últimos pesos.
4.9. Determinação do rendimento do extrato
A determinação do rendimento (%) do extrato foi feita utilizando a equação:
100x
q
qp
r
p
es
, onde:
r = rendimento (%);
p
s
= peso seco (g/g);
q
e
= quantidade de extrato obtido (g);
q
p
= quantidade de pó utilizado (g).
4.10. Testes fitoquímicos com as Frações
4.10.1 Terpenos e/ou esteróides
A 2 mL da solução metanólica (preparada a partir da F
Hex:Éter
), foram
adicionados 5 mL de clorofórmio, filtrado com ajuda de algodão, o qual foi submetido
à reação de Liebermann-Burchard. O desenvolvimento de coloração verde-oliva foi
indicativo da presença de esteróides
93
.
4.10.2. Alcalóides
A 3 mL da solução metanólica (preparada a partir da FAMl), foram
adicionados 0,1 mL de ácido clorídrico e acrescentados 5 gotas do reagente de
40
Mayer. O desenvolvimento de precipitado branco foi indicativo da presença de
alcalóides.
A 3 mL de solução metanólica (preparada a partir da FAMl), foram gotejadas
5 gotas de reagente de Dragendorff. O desenvolvimento de precipitado alaranjado
foi indicativo da presença de alcalóides.
4.10.3. Fracionamento e identificação dos compostos da fração (F
Hex:Éter
)
A fração ativa nos ensaios antinociceptivos (F
Hex:Éter
) foi submetida a
fracionamento cromatográfico, em coluna clássica (60 cm de comprimento e 2,5 cm
de diâmetro), utilizando sílica-gel como fase estacionária. Como eluentes foram
utilizados hexano (Hex), clorofórmio, acetato de etila (AcOEt) e metanol (MeOH), em
gradiente de polaridade. A mistura homogênea (extrato e sílica) foi feita utilizando
sílica-gel em menor quantidade possível. As frações obtidas foram analisadas por
cromatografia de camada delgada analítica (CCDA), usando os seguintes sistemas
eluentes: Diclorometano 100% (DCM), Hex:DCM (1:1), DCM:AcOEt (8:2, 1:1, 2:8),
AcOEt:100%, AcOEt:MeOH (9:1, 7:3, 1:1, 2:8). Após, reveladas em vapor de iodo
sublimado. Sendo as frações reagrupadas conforme semelhanças dos Rfs. As sub-
frações (49-51) apresentaram maior grau de pureza foi submetido à análise de
Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
93
.
4.11. Avaliação da ação antinociceptiva
4.11.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
41
As contorções abdominais foram induzidas de acordo com o método descrito
por Koster et al., (1959)
81
.
Foram utilizados camundongos pesando entre 25 – 30 g, em jejum de ração
por 18 h, aclimatados por 24 h, a uma temperatura de 25 1 C, em local isento de
ruídos e com acesso apenas ao pesquisador, tratados por via oral, com veículo, 5,
50 e 200 mg/kg de EHMl, FAMl e F
Hex:Éter
ou 5 mg/kg de indometacina. Após 1 h, foi
injetado (i.p.) em cada animal 10 mL/kg de ácido acético 0,6%, diluído em salina 0,9
% e, as contorções abdominais “writhings”, contadas durante os 30 min
subsequentes. As contorções abdominais consistiam de ondas de constrição e
alongamento, passando caudalmente ao longo da parede abdominal, acompanhada
por contorção do tronco e extensão de uma ou ambas as patas traseiras.
4.11.2. Nocicepção induzida por formalina
Para realização deste experimento, foram utilizadas camundongas, pesando
entre 25 – 30 g, em jejum de ração por 18 h, aclimatados por 24 h, a uma
temperatura de 25 1 C, em local isento de ruídos e com acesso apenas ao
pesquisador, seguindo-se o método descrito por Hunskaar e Hole (1987)
82
.
Os animais foram distribuídos aleatoriamente em 9 grupos de 10 cada. Os
animais receberam por via oral o veículo (0,1 mL/10 g, p.c.), EHMl e F
Hex:éter
(50, 200
e 800 mg/kg), indometacina (10 mg/kg) ou cloridrato de morfina (10 mg/kg). Uma
hora após, cada camundonga recebeu por via intraplantar (i.pl.), 20 L de solução de
formaldeído 2,5 %, em salina 0,9 %, na pata posterior esquerda. Imediatamente, os
animais foram colocados sob uma redoma de vidro espelhado e o tempo despendido
lambendo ou mordendo a pata injetada (biting) foi cronometrado durante os 5
42
minutos iniciais (1ª fase) e nos tempos de 20 – 30 min (2ª fase) que se seguiu à
injeção do agente nóxico.
4.11.3. Nocicepção induzida por capsaícina
Nesse ensaio foram utilizadas camundongas pesando entre 25 – 30 g, em
jejum de ração por 18 h, aclimatados por 24 h, a uma temperatura de 25 1 C, em
local isento de ruídos e com acesso apenas ao pesquisador, tendo como parâmetro
o método descrito por Sakurada et al. (1992)
94
.
Cada animal foi colocado individualmente sob um funil de vidro transparente,
por um período de adaptação de, no mínimo, 20 min. Os animais foram distribuídos
aleatoriamente em 8 grupos de 10 cada e tratadas oralmente com veículo (10
mL/kg), EHMl e F
Hex:éter
(20, 50 e 200 mg/kg) 1 h antes da capsaícina e com morfina
(3 mg/kg, i.p.) 30 min antes. Após os tratamentos, os animais receberam 20 l de
capsaícina (1,6 g/pata), injetada na região intraplantar da pata posterior esquerda,
sendo que o tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata
injetada foi cronometrado durante 5 min e considerado como indicativo de dor.
4.12. Avaliação do envolvimento de vias na atividade antinociceptiva
Para a avaliação de participação de diferentes vias no efeito antinociceptivo
do EHMl e F
Hex:Éter
, os animais foram submetidos a estímulos dolorosos pela injeção
intraplantar de capsaícina
94
.
43
4.12.1. Receptor vanilóide
Os animais foram colocados individualmente dentro de um funil de vidro
transparente por um período de adaptação. Após, cada animal recebeu naloxona 1
mg/kg i.p., capsazepina 30 mg/kg s.c., veículo, extrato (EHMl), fração (F
Hex:Éter
) na
dose de 200 mg/kg v.o. e morfina 3 mg/kg i.p. Decorridos 60 min ou 30 min, as
camundongas receberam intraplantar 20 µL de capsaícina (1,6 µg/pata) na pata
posterior esquerda, o tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo
“biting”, a pata injetada com capsaícina foi cronometrado por 5 min, considerado
como tempo indicativo de nocicepção.
4.12.2. Receptor opióide
Os animais foram colocados individualmente dentro de um funil de vidro
transparente por um período de adaptação. Após, foram pré-tratados com naloxona
1 mg/kg i.p. e transcorridos 15 min, os animais foram tratados com EHMl e F
Hex:Éter
(200 mg/kg v.o.), morfina 3 mg/kg i.p. ou veículo 0,1 mL/ 10 g (p.c.). Decorrido 60 e
30 min dos tratamentos, os animais receberam 20 L de capsaícina injetada na
região intraplantar da pata posterior esquerda, o tempo que o animal permaneceu
lambendo ou mordendo a pata injetada foi cronometrado durante 5 minutos e
considerado como indicativo de dor.
44
4.12.3. Via L-arginina-óxido nítrico
As camundongas (25-30 g) foram pré-tratados com L-arginina (200mg/kg, i.p.)
e após 15 min receberam extrato (EHMl) e fração (F
Hex:Éter
) nas doses 50 e 200
mg/kg v.o. ou indometacina 5 mg/kg e L-NAME 70 mg/kg, i.p. Decorridos 60 e 30
min receberam intraplantarmente 20 µL de solução de capsaícina (1,6 µg/pata) na
pata posterior esquerda, o tempo que o animal permaneceu lambando ou mordendo
a pata injetada com capsaícina foi cronometrado por um período de 5 min
considerados como indicativo de nocicepção.
4.13. Lavado peritoneal para doseamento de IL-1β, IL-8 e TNFα.
Para a avaliação da participação de diferentes citocinas no efeito
antinociceptivo do EHMl e F
Hex:Éter
, os animais foram submetidos a estímulos
dolorosos induzidos por ácido acético 0,6% i.p.
95,96
.
Foram tratados por via oral com veículo (Tween 80 a 0,04% - 10 ml/kg), EHMl
(200 mg/mL) e F
Hex:éter
(50 e 200 mg/mL) e indometacina (10 mg/kg), após 60 min
receberam ácido acético 0,6%, transcorridos 5 min (início das contorções), foram
eutanasiados por deslocamento cervical. Feito uma incisão no peritônio (1 cm),
inseriu-se 1,5 mL de PBS, após leve massagem (10 s) coletou o liquido inserido no
peritoneo, em tubos de ensaio. Centrifugou-os a 3000 rpm por 3 min a 4ºC. O lavado
peritoneal obtido (1 mL) foi armazenado a -80ºC.
4.13.1 Dosagens IL-1β, IL-8 e TNFα.
45
Para doseamento das IL-1β, IL-8 e TNFα, os animais foram submetidos a
estímulos dolorosos induzidos por ácido acético 0,6% i.p. e tratados conforme
descrito no item 4.13.
Utilizou-se o kit de ELISA (eBioscience, USA e Immuno Biological
Laboratories-IBL, Japan). Todos os reagentes com temperatura ambiente antes do
uso. Prepararam-se todas as soluções de acordo com as instruções do fabricante e
desenhou-se um mapa dos poços (Layout do padrão e amostras em duplicata). A
leitura foi obtida em 450 nm, aparelho (Multiskan Ex mod 355 - Thermo Electron
Corp.Ver.3.0).
4.13.2. Dosagens de PGE
2
.
Os animais foram submetidos a estímulos dolorosos induzidos por ácido
acético 0,6% i.p. e tratados conforme descrito no item 4.13.
Os níveis de PGE
2
no lavado peritoneal de camundongos foram determinados
utilizando-se kit de ELISA (Stressgen,
®
USA), de acordo com instruções do
fabricante. A leitura foi feita a 405 nm, em aparelho Multiskan Ex (mod. 355 - Thermo
Electron Corp.Ver.3.0).
4.14. Análises estatísticas
Os resultados dos testes paramétricos envolvendo variáveis contínuas foram
expressos em termos de média erro padrão da média (
X
EPM). Para
comparação dos dados paramétricos foi utilizada a análise de variância (ANOVA)
46
uma via e, havendo significância estatística, seguiu-se com o teste de comparações
múltiplas de Student-Newman-Keuls. Nas análises estatísticas, foram considerados
os níveis críticos para rejeição de hipótese de nulidade menor que 0,05 (p<0,05).
Para a tabulação e análises dos dados foi usado GraphPad Instat versão 5.01
97
.
47
V. RESULTADOS
5.1 – Obtenção, determinação do peso seco e rendimento do extrato
O peso seco do extrato (EHMl) foi de 89,45% (89,45 mg/100 mg), e as
frações de 12,3% (12,3 mg/100 mg) e 9,5% (9,5/100 mg) com rendimento de 8%,
0,39% e 0,23%, respectivamente, em relação ao pó (Quadro 2).
Quadro 2. Quantidade de material coletado em Kg, verde e seco e a % de
peso seco e rendimento do extrato hidroetanólico 70% (EHMl) e
frações (FAMl, F
Hex:Éter
) de Macrosiphonia longiflora.
Macrosiphonia
longiflora
Parte
usada
Peso seco
(%)
Rendimento
(%)
EHMl
xilopódio
89,45
8,0
FAMl
xilopódio
64,13
0,39
F
Hex:éter
xilopódio
49,12
0,23
5.2 – Testes fitoquímicos com as frações: F
Hex:Éter
e alcaloídica
5.2.1 – Terpenos e/ou esteróides
No teste com reagente de Libermam-Burchard foi observao o
desenvolvimento na F
Hex:Éter
de coloração verde-oliva indicando a presença de
esteróides e/ou terpenóides (Figura 13).
48
Figura 13. Solução metanólica da F
Hex:Éter
submetida à reação de Libermam-
Burchard. Coloração verde-oliva indica a presença de terpenóides e/ou
esteróides.
5.2.2 – Alcalóides
A adição de reagente de Mayer ou Dragendorff à solução metanólica da
fração alcaloídica levou a formação de precipitados branco e alaranjado,
respectivamente, evidenciando a presença de alcalóides (Figura 14).
Figura 14. Solução metanólica da fração alcaloídica
submetida à reação de Mayer e
Dragendorff. Precipitado indica a presença de alcalóides
49
5.2.3. Fracionamento e identificação de compostos da F
Hex:Éter
.
A fração hexano:éter (F
Hex:Éter
) após cromatografia em coluna, teve as sub-
frações que apresentaram perfil de semelhança, reunidas e analisadas. Esse
material submetido à análise de espectrometria de RMN H
1
e C
13
revelando a
presença de uma mistura de β-sitosterol, estigmasterol e miristato de miristila.
A mistura de fitoesteróides (F
Hex:Éter
) como também o extrato hidroetanólico
(EHMl) e a fração alcaloídica (FAMl) foram testadas quanto à atividade
antinociceptiva.
5.3 – Avaliação da ação antinociceptiva
5.3.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
No modelo de nocicepção por ácido acético, o grupo que recebeu veículo
apresentou 43,71±4,87 contorções em 30 min. Nos animais tratados com EHMl nas
doses de 5, 50 e 200 mg/kg o número de contorções foi de 37,57±2,33 (p>0,05);
27,75±3,15 (37%, p< 0,01) e 17,56±3,02 (60%, p< 0,001), respectivamente. A
indometacina (5 mg/kg, v.o), padrão para este teste, apresentou a maior resposta
antinociceptiva dentre os grupos, com 78% de inibição (p<0,001) ( Figura 15).
50
0
10
20
30
40
50
60
Número de contorções/30min
Figura 15: Efeito da administração via oral de veiculo (vei), extrato (EHMl - 5, 50 e 200 mg/kg) ou
indometacina (indo - 5 mg/kg) sobre as contorções abdominais induzidas por ácido acético 0,6% em
camundongos. Cada coluna representa a média de 7-8 animais por grupo. As linhas verticais
representam o E.P.M. Análise de variância uma via, seguida do teste de Student-Newman-Keuls.
**p<0,01; ***p<0,001 vs veículo.
Neste mesmo modelo de nocicepção por ácido acético, o grupo que recebeu
veículo apresentou 44,25±3,09 contorções em 30 min. Os animais testados com
FAMl, nas doses de 5, 50 e 200 mg/kg, o número de contorções foi de 31,25±5,74;
32,12±3,51 e 31,37±3,58, respectivamente, não apresentando diferença estatistica
(p>0,05). A indometacina (5 mg/kg, v.o), apresentou resposta antinociceptiva de
14,12±1,40 (68%, p<0,001), como visto na Figura 16.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Número de contorções /30 min
Vei 5 50 200 5 mg/kg
EHMl indo
Vei 5 50 200 5 mg/kg
FAMl indo
***
***
**
***
51
Figura 16: Efeito da administração via oral de veiculo (vei), da fração alcaloídica (FAMl - 5, 50 e 200
mg/kg) ou indometacina (indo - 5 mg/kg) sobre as contorções abdominais induzidas por ácido acético
0,6% em camundongos. Cada coluna representa a média de 7-8 animais por grupo. As linhas
verticais representam o E.P.M. Análise de variância uma via, seguida do teste de Student-Newman-
Keuls. ***p<0,001 vs veículo.
Do mesmo modo, neste teste de nocicepção por ácido acético, o grupo que
recebeu veículo apresentou 45,62±3,34 contorções em 30 min. Os animais testados
com F
Hex:éter
, nas doses de 5, 50 e 200 mg/kg, o número de contorções foi de
37,50±2,36 (p>0,05); 20,75±2,15 (54%, p<0,001) e 14,85±1,06 (67%, p<0,001),
respectivamente. A indometacina (indo - 5 mg/kg, v.o), apresentou resposta
antinociceptiva de 75% (p<0,001), conforme visto na Figura 17.
0
10
20
30
40
50
60
Número de contorções/30 min
Figura 17: Efeito da administração oral de veículo (vei), fração hexano-éter de Macrosiphonia
longiflora (F
Hex:éter
- 5, 50 e 200 mg/kg) ou indometacina (indo - 5 mg/kg v.o.), sobre as contorções
abdominais induzidas por acido acético 0,6% em camundongos. Cada coluna representa a média de
7-8 animais por grupo. As linhas verticais representam o E.P.M. Análise de variância uma via, seguida
do teste de Student-Newman-Keuls. ***p<0,001 vs veículo.
***
***
***
Vei 5 50 200 5 mg/kg
F
Hex:eter
indo
52
5.3.2. Nocicepção induzida por formalina
O efeito do tratamento com o EHMl e a F
Hex:éter
sobre a resposta nociceptiva à
formalina encontra-se demonstrado na Figura 18.
A injeção intraplantar (i.pl.) deste agente nóxico, na primeira fase promoveu
intensa resposta nociceptiva no grupo controle (Tween 80, 0,4% em água destilada),
com tempo de reação a dor de 68,71±2,62 s. Nesta fase, o EHMl e a F
Hex:éter
foram
ativos apenas com a dose de 800 mg/kg, v.o, reduzindo o tempo de reação à dor em
27,55±2,14 s (59,9%, p<0,001) e 28,61±1,82 s (58,36%, p<0,001), respectivamente.
Como esperado, a indometacina (indo - 10 mg/kg, v.o.) foi inativa e a morfina (10
mg/kg, v.o.) reduziu o tempo de reação à dor para 27,93±3,66 s (59,35%, p<0,001)
com igual intensidade ao EHMl e a F
Hex:éter
.
Na segunda fase da resposta nociceptiva, o tempo de reação à dor foi de
78,37±4,90 s, nas camundongas que receberam o veículo. O tratamento com EHMl
e F
Hex:éter
, nas doses de 50, 200 e 800 mg/kg (v.o.), reduziu o tempo de reação à dor
em todas as doses administradas, com médias de tempos de reação de 34,87±2,19
s, 29,66±2,45 s e 18,00±1,41 s (p<0,001) e 36,43±2,49 s, 26,45±2,45 s e 19,15±1,90
s (p<0,001), respectivamente. A indometacina e morfina reduziram em 84,05% e
76,01%, respectivamente, a resposta nociceptiva nesta fase.
53
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo de ração (s)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Tempo de reação (s)
Figura 18: Efeito do tratamento oral com veiculo (vei), indometacina (indo - 10 mg/kg), morfina (mor -
10 mg/kg), extrato (EHMl - 50, 200, 800 mg/kg) e fração de Macrosiphonia longiflora (F
Hex:
éter - 50, 200,
800 mg/kg), na 1ª e 2ª fases, sobre a nocicepção induzida por 20 µL de formalina 2,5% intraplantar
(i.pl.) de camundongas. Cada coluna representa a média de 7-9 animais por grupo. As linhas verticais
representam o E.P.M. Análise de variância uma via, seguida do teste de Student-Newman-Keuls.
***p<0,001 vs veículo.
5.3.3. Nocicepção induzida por capsaícina
A injeção intraplantar (i.pl.) de 1,6 g/pata de capsaícina produziu sinais de
intensa nocicepção nos animais controle (veículo). A reação das camundongas
neste grupo, nos primeiros 5 min durou 51,82±2,73 s (Figura 19).
O tratamento oral das camundongas com o EHMl e F
Hex:éter
, nas doses de 20,
50 e 200 mg/kg, promoveu redução estatisticamente significante dos tempos em que
os animais permaneceram lambendo e/ou mordendo a pata injetada com o agente
nóxico, em 36,09±2,94 s (30,35%), 32,81±2,76 s (36,69%) e 23,86±4,50 s (53,96%)
e 35,56±2,72 s (33,64%), 27,11±3,15 s (47,68%) e 26,88±5,88 s (51,21%),
respectivamente.
Vei 50 200 800 50 200 800 10 10 mg/kg
EHMl F
Hex:éter
indo mor
Vei 50 200 800 50 200 800 10 10 mg/kg
EHMl F
Hex:éter
indo mor
***
***
(1ª fase)
(2ª fase)
***
***
***
***
***
***
***
***
***
54
A morfina (3 mg/kg, i.p), padrão para este teste, foi a droga que mais inibiu
(86,85%) a resposta dolorosa dos animais à capsaícina, com tempo de reação à dor
de 6,81±1,80 s (p<0,001).
0
10
20
30
40
50
60
Tempo de reação (s)
Figura 19: Efeito do tratamento oral com veiculo (vei), extrato e fração de Macrosiphonia longiflora
(EHMl e F
Hex:éter
- 20, 50 e 200 mg/kg) ou morfina (3 mg/kg i.p.), sobre a nocicepção induzida por 20
µL de capsaícina (1,6 µg/pata) i. pl. Cada coluna representa a média de 7-9 animais por grupo. As
linhas verticais representam o E.P.M. Análise de variância uma via, seguida do teste de Student-
Newman-Keuls.*p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 vs veículo.
5.4. Avaliação de possíveis vias na atividade antinociceptiva
5.4.1. Receptor vanilóide
Neste experimento, avaliou-se a participação do receptor vanilóide, bem como
a contribuição do receptor opióide na atividade antinociceptiva do EHMl e F
Hex:éter
,
através do pré-tratamento com capsazepina e naloxona, respectivamente (Figura
20).
As camundongas do grupo veículo apresentaram sinais de intensa
nocicepção, com o tempo de reação a dor de 55,09±3,92 s.
O tratamento com a dose de 200 mg/kg de EHMl e F
Hex:éter
inibiu
significativamente a resposta nociceptiva à capsaícina, com tempos de reação à dor
de 23,86±4,50 s e de 26,88±5,33 s (p<0,001), respectivamente.
*
**
***
***
***
***
*
Vei 20 50 200 20 50 200 10 mg/kg
EHMl F
Hex:éter
mor
55
A capsazepina (30 mg/kg i.p.) causou redução significativamente maior
(p<0,05) na resposta nociceptiva que o EHMl e F
Hex:éter
, com tempo de reação à dor
de 12,22±2,67 s.
Naloxona (1 mg/kg ip) sozinha, não alterou significativamente (p>0,05) o
tempo de reação à dor dos animais, quando comparada ao grupo controle
(55,09±3,92 s). Por outro lado, a morfina sozinha (3 mg/kg i.p.), apresentou a maior
resposta antinociceptiva dentre os grupos, inibindo a dor em 87,63% (06,81±1,80 s,
p<0.001).
A administração prévia de capsazepina, aos animais que receberam EHMl,
F
Hex:éter
e naloxona, potenciou significativamente (‡p<0,05), as respostas
antinociceptivas destas substâncias, com tempos de reação à dor de 11,19±2,59 s,
14,16±4,23 s e 06,69±2,67 s, respectivamente.
O tratamento prévio com ambos, naloxona e capsazepina, respondeu de igual
modo, quando pré-tratado com a capsazepina sozinha.
0
10
20
30
40
50
60
70
Tempo de reação (s)
Figura 20: Efeito do pré-tratamento com capsazepina (Cpz – 30 mg/kg i.p.) e/ou naloxona (Nal – 1
mg/kg i.p.), sobre a nocicepção induzida por 20 µL de capsaícina (1,6 µg/pata) i.pl em camundongas
tratadas com veículo (vei), extrato e fração (EHMl e F
Hex:éter
– 200 mg/kg, v.o.) ou morfina (mor – 3
mg/kg. i.p.). Cada coluna representa a média de 6-8 animais por grupo. As linhas verticais
Vei 200 200 30 1 3 200 200 1 200 200 mg/kg
EHMl F
Hex:éter
Cpz Nal Mor EHMl F
Hex:éter
Nal EHMl F
Hex:éter
Cpz Nal+ Cpz
Capsaícina
***
***
***
***
***
‡
***
‡
***
‡
***
***
56
representam o E.P.M. Análise de variância uma via, seguida do teste de Student-Newman-Keuls.
***p<0,001 vs veículo; ‡ p<0,05 vs EHMl e F
Hex:éter.
5.4.2. Receptor opióide
No grupo que recebeu veículo, o tempo de reação à dor por capsaícina foi de
51,82±2,73 s (Figura 21).
O tratamento com 200 mg/kg de EHMl e F
Hex:éter
inibiu significativamente a
resposta nociceptiva à capsaícina, com tempos de reação à dor de 23,86±4,50 s
(p<0,001) e 26,88±5,33 s (p<0,01), respectivamente.
A naloxona (1 mg/kg i.p.) sozinha, não alterou significativamente (p>0,05) o
tempo de reação à dor dos animais 49,10±3,89 s, quando comparada ao grupo
controle. Por outro lado, a morfina sozinha (3 mg/kg s.c.), apresentou a maior
resposta antinociceptiva dentre os grupos, inibindo a dor em 86,85 % (06,81±1,80
s, p<0,001).
A administração prévia de naloxona, aos animais que receberam EHMl, e F
Hex:éter
,
não resultou em alterações significativas nos tempos de reação á dor (34,34±4,82 s
e 33,98±4,61 s p>0,05); por outro lado, a naloxona reverteu quase que
completamente a resposta antinociceptiva da morfina de 06,81±1,80 s, (†††p<0,001)
para 41,90±5,28 s.
57
0
10
20
30
40
50
60
Tempo de reação (s)
Figura 21: Efeito do tratamento oral com veiculo (vei), EHMl e F
Hex:éter
de Macrosiphonia longiflora
(200 mg/kg), naloxona (Nal - 1 mg/kg i.p.) ou morfina (Mor - 3 mg/kg s.c.), sobre a nocicepção
induzida por 20 µL capsaícina (1,6 µg/pata) intraplantar. Cada coluna representa a média de 7-9
animais por grupo. As linhas verticais representam o E.P.M. Análise de variância uma via, seguida do
teste de Student-Newman-Keuls., * p<0,05 ** p<0,01, ***p<0,001 vs veiculo, ††† p<0,001 vs morfina.
5.4.3 Via L-arginina-óxido nítrico
Para avaliar se parte da atividade antinociceptiva apresentada pelo EHMl e
F
Hex:éter
de M. longiflora envolve a inibição da via L-arginina/óxido nítrico, as
camundongas foram pré-tratadas com L-arginina e L-NAME (Figura 22).
No grupo controle, verificou-se intensa resposta nociceptiva à capsaícina (1,6
g/pata), com tempo de reação à dor de 46,75±1,83 s.
O tratamento com 50 e 200 mg/kg de EHMl e F
Hex:éter
inibiu significativamente
a resposta nociceptiva à capsaícina, com tempos de reação à dor de 33,68±2,38 s
Vei 200 200 1 3 200 200 3 mg/kg
EHMl
F
Hex:éter
Nal Mor EHMl
F
Hex:éter Mor
Naloxona
____________________________________________________________________
Capsaícina
**
***
***
*
†††
*
58
(p<0,05) e de 25,65±2,37 s (p<0,001) e de 34,68±3,10 s (p<0,05) e 30,49±2,13 s
(p<0,001), respectivamente.
O grupo que recebeu 200 mg/kg i.p. de L-arginina apresentou o tempo de
reação à dor de 47,01±3,90 s, não diferindo significativamente do grupo controle. Por
outro lado, o tratamento dos animais com 70 mg/kg i.p. de L-NAME sozinho, causou
redução significativa da dor (38,11%), com tempo de reação de 28,93±2,45 s
(p<0,001).
Os animais que receberam morfina 3 mg/kg i.p., padrão para este teste,
apresentaram a maior redução (97,34%) na resposta nociceptiva, com tempo de
reação de 1,24±0,27 s (p<0,001).
A administração prévia de L-arginina aos animais que receberam EHMl e
F
Hex:éter
(200 mg/kg), não modificou significativamente (p>0,05) as respostas
nociceptivas destes preparados. No entanto, reverteu completa e significativamente
(p<0,001) a resposta antinociceptiva do L-NAME, com tempo de reação à dor
(51,48±4,38 s) discretamente maior que o do grupo que recebeu veículo (46,75±1,83
s).
O tratamento prévio com ambos, L-arginina e L-NAME, não alterou
significativamente (p>0,05) as respostas antinociceptivas de 200 mg/kg de EHMl e
F
Hex:éter
.
59
0
10
20
30
40
50
60
Tempo de reação (s)
Figura 22: Efeito do pré-tratamento com a L-arginina (L-ar - 200 mg/kg i.p.), L-NAME (L-N - 70 mg/kg
i.p.), extrato e fração (EHMl e F
Hex:éter
- 50, 200 mg/kg v.o) ou morfina (3 mg/kg i.p.), sobre nocicepção
induzida por 20 µL capsaícina 1,6 µg/pata (i.pl.). Cada coluna representa a média de 7-9 animais por
grupo. As linhas verticais representam o E.P.M. Análise de variância uma via, seguida do teste de
Student-Newman-Keuls. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0, 001 vs veículo, ††† p<0,001 vs L-NAME.
5.4.4. Avaliação da atividade do extrato (EHMl) e fração (F
Hex:Éter
)
do xilopódio
M. longiflora sobre citocinas pró-inflamatórias e PGE
2
.
Na Tabela 1 podem ser vistos os valores das citocinas IL1-β, IL-8 TNF-α e
PGE
2
. No grupo veículo, o nível de IL-8 foi de 170,0±1,95 (ng/mL). O tratamento com
o extrato EHMl na dose de 200mg/kg e fração F
Hex:éter
nas doses de 50 e 200mg/kg
alteraram os níveis desta citocina significantemente em relação ao grupo veiculo,
em 24,2±0,43 (p<0,001), 114,0±2,00 (p<0,01) e 21,1±0,62 (p<0,001)
respectivamente. De igual modo, foi alterado também no grupo padrão em 13,3±0,42
(p<0,001).
*
Veí 50 200 50 200 200 70 3 200 200 70 200 200 3 200 200 mg\kg
EHMl F
Hex:éter
L-ar L-N Mor EHMl F
Hex:éter
L-N EHMl F
Hex:éter
Mor EHMl F
Hex:éter
L-ar L-N L-ar + L-N
Capsaícina
***
*
***
***
*
*
*
***
*
***
**
**
†††
60
Tabela 1. Efeito do extrato (EHMl) e fração (F
Hex:éter
) do xilopódio de M. longiflo
ra sobre a produção das citocinas pró-inflamatórias e Prostagladina E
2
no
lavado peritoneal de camundongos.
Grupos mg/kg
a
IL-1β
(pg/mL)
IL-8
(pg/mL)
a
TNF-α
(pg/mL)
b
PGE
2
(pg/mL)
Veículo
0
170,5±1,95
0
-
EHMl
200
0
24,2±0,43***
0
-
F
Hex:éter
50
0
114,0±2,00*
*
0
-
200
0
21,1±0,62***
0
-
Indo
10
0
13,3±0,42***
0
-
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de 7-8 animais/grupo.
ANOVA uma via, seguida do teste de Student-Newman-Keuls. ** p<0,01 ***p<0, 001 vs
veículo.
a
Indica que os valores ficaram abaixo da linearidade da curva de detecção, com
base na curva de calibração para cada citocina.
b
Respostas imensuráveis.
61
VI. DISCUSSÃO
A dor tem sido uma das mais predominantes condições que, diminuem a
qualidade de vida, conseqüentemente é um limitante da produtividade dos
trabalhadores. Embora haja no mercado uma vasta gama de analgésicos
amplamente utilizados, existe grande preocupação relativa a reações adversas e
efeitos colaterais. Assim, a analgesia efetiva ainda é um desafio
98
.
Plantas medicinais constituem uma das mais importantes fontes de
substâncias ativas com potencial terapêutico e são freqüentemente usadas para
curar uma variedade de doenças no homem
99,100
. Além disso, a avaliação e seus
efeitos farmacológicos podem ser usados como estratégia para descobrir novos
fármacos de origem vegetal
101,102
.
Numa história mais recente, o uso de plantas como medicamentos envolveu o
isolamento de substâncias ativas, iniciando com o isolamento da morfina do ópio, no
início do século XIX, e com a síntese do primeiro medicamento sintético, o acido
acetilsalicílico – AAS
103,104
.
A despeito de seus severos efeitos colaterais, a morfina continua sendo a
droga mais valiosa no tratamento da dor, particularmente a crônica
105
. Não menos
relevante, o AAS, um AINEs, continua sendo um dos fármacos mais prescritos no
mundo, porém, provida de sérios efeitos colaterais, além de ser ativa apenas para
dores associadas a processos inflamatórios
106
.
Mesmo com o progresso atual no desenvolvimento de novos fármacos
analgésicos, a comunidade médica necessita de analgésicos potentes e eficazes,
especialmente para o tratamento da dor crônica.
Uma série de novas substâncias de ocorrência natural, derivadas de plantas
com propriedades antinociceptivas tem sido motivo de intensos estudos, incluindo os
62
alcalóides
107
, flavonóides
108
, terpenóides e esteróides
109,110,111
, sescterpenos e
poligodiais
112
e compostos micelânios
113
.
No presente estudo foram avaliados o efeito antinociceptivo do extrato e das
frações hexano:éter e alcaloídica do xilopódio de Macrosiphonia longiflora (Desf)
Müll Arg.
Para este estudo foi observado com cuidado o horário de coleta do material
botânico (manhã), a fim de não prejudicar a qualidade da massa vegetal e evitar
perdas de metabólitos por calor excessivo.
Para o preparo do extrato da planta foi utilizado como solvente uma mistura
de água/etanol (30:70), assegurando assim, maior poder extrativo do que a forma
usual de preparo popular em água (decocto), em que são extraídas, em maioria,
substâncias polares.
Durante a obtenção do pó seco do xilopódio, verificou-se uma perda de peso
fresco do farmacógeno de 53,8%, representando uma perda de água esperada. O
EHMl forneceu um rendimento de 8%, considerado baixo para extração
hidroalcoólica. Para as frações hexano-éter (F
Hex:éter
) e alcaloídica (FAMl), os
rendimentos foram de 0,23 % e 0,39 % respectivamente, indicando níveis
relativamente baixos de alcalóides e metabólitos de natureza apolar, comparados
aos descritos na literatura
114
.
Inicialmente, foi realizado a prospecção química do EHMl, com o intuito de
desvendar os metabólitos secundários responsáveis pelo efeito analgésico atribuído
à M. longiflora. Trata-se do primeiro estudo químico-farmacológico com M.
longiflora, apesar do largo emprego popular desta planta para o tratamento de
condições inflamatórias
99,18,19
.
63
O fracionamento inicial de um extrato vegetal bruto, muitas vezes é realizado
através de partição ácido-base, pois, este procedimento implica numa dissolução
seletiva e distribuição entre as fases de dois solventes imiscíveis, a fim de promover
a separação preliminar dos componentes de uma mistura. Por isso, o EHMl foi
conduzido para a separação de substâncias polares (fase aquosa) e apolares (fase
hexano-éter) e a identificação das classes metabólicas revelaram a presença de
alcalóides e de uma mistura de esteróides/ácido graxo.
Para a avaliação da atividade do EHMl e das frações F
Hex:éter
e FAMl,
procedeu-se inicialmente com o teste de contorções abdominais induzida pela
injeção intraperitoneal de ácido acético 0,6% em camundongos. Neste modelo, o
EHMl e a fração F
Hex:éter
mostraram-se ativos, enquanto a fração FAMl foi inativa.
Este teste de contorções abdominais é muito usado para avaliar a dor de
origem inflamatória, pouco específica, mas com boa sensibilidade, sendo uma
ferramenta de triagem para avaliação da atividade analgésica e antiinflamatória de
novos agentes
93,116,117
. Apesar da falta de especificidade deste modelo, os
resultados que ele fornece apresentam uma boa correlação com a potência exibida
por drogas analgésicas em outros modelos pré-clínicos e, com aquela encontrada
em estudos clínicos
117,103,118
. A resposta nociceptiva baseia-se na contagem das
contorções da parede abdominal seguidas de contorção do tronco e extensão de
uma ou ambas as patas posteriores (“writhing”), como resposta à peritonite
produzida pelo ácido acético
118,119
.
A injeção de ácido acético na cavidade peritoneal de camundongos promove
a liberação de diversos mediadores inflamatórios tais como: PGs, BK, SP, TNF-α, IL-
1β e IL-8 entre outros. Além disso, os prótons oriundos da dissociação do ácido
acético podem ativar diretamente canais de cátions não seletivos localizados nas
64
fibras aferentes primárias (Julius e Basbaum, 2001). Estes mediadores ativam
nociceptores quimiosensíveis que contribuem com o desenvolvimento da dor de
origem inflamatória
96, 117,120
. Como o EHMl e F
Hex:éter
mostraram-se ativos neste
modelo é possível que estes preparados inibam a liberação/ação de mediadores da
resposta inflamatória.
Para avaliar se a atividade antinociceptiva do EHMl e F
Hex:éter
depende da
inibição da PGE
2
e citocinas (IL-8, IL-1β e TNF-α), estes foram dosados em lavado
peritoneal de animais submetidos à dor por ácido acético.
As citocinas podem ser classificadas em subtipos, como interleucinas, fator de
necrose tumoral, quimiocinas, etc. ou ainda podem ser classificadas de acordo com
sua atividade biológica como pró-inflamatórias e antiinflamatórias
121
.
As citocinas pró-inflamatórias estão envolvidas na resposta imune inicial,
ajudando a guiar a eliminação dos patógenos e a resolução do processo
inflamatório. As primárias incluem TNF-α e IL-1. São liberadas por macrófagos e por
muitas outras células, podendo desencadear uma cascata de citocinas secundárias,
como as quimiocinas
122
.
A IL-6, por exemplo, é uma citocina multifatorial secretadas por todas as
células quando lesadas ou ativada por IL-1 e/ou TNF-α. Citocinas como IL-4, IL-6,
IL10, IL-13 e IFN-α são eficientes em inibir a síntese de IL-1 e TNF-α
122,123
.
A IL-1 possui duas formas, chamadas de IL-1α e IL-1β, entretanto, elas
compartilham os mesmos receptores e apresentam funções biológicas semelhantes.
Em baixas concentrações a IL-1 age como um mediador local da inflamação,
aumentando a expressão de moléculas de adesão na superfície das células
endoteliais. Em altas concentrações, esta citocina chega ao sistema circulatório e
65
passa a exercer efeitos endócrinos como febre e indução da atividade da fosfolipase
e consequentemente a biossíntese de PGs
124
.
A IL-8 é secretada predominantemente por macrófagos e exerce potente ação
de quimiotaxia em neutrófilos e também promove a degranulação dos mesmos.
Além disso, a IL-8 está envolvida com respiração celular e migração dos
granulócitos. As células endoteliais e fibroblastos produzem elevados níveis de IL-8
em resposta a IL-1β e TNF-α
124,125,126
.
O EHMl e F
Hex:éter
reduziram significativamente os níveis de IL-8 no lavado
peritoneal, indicando que a inibição desta citocina contribui para o efeito
antinociceptivo dos preparados de M. longiflora.
A fração ativa (F
Hex:éter
) foi submetida ao processo de cromatografia em
camada delgada (CCD) e a sub-fração que apresentou perfil de melhor pureza foi
definida estruturalmente, com base nos experimentos espectrais de RMN
1
H e
13
C,
como sendo uma mistura de fitoesteróides (β-sitosterol, estigmasterol) e o miristato
miristila.
A mistura de esteróides está presente nas membranas celulares de espécies
vegetais, assumindo uma grande variedade de atividades biológicas específicas, em
adição aos seus papéis como constituintes na bicamada lipídica. Em células
vegetais, os fitoesteróides são importantes no desenvolvimento de plastídios em
cloroplastos, participando do transporte intracelular da fração microssomal para a
fração cloroplástica
22,23
.
Vários estudos evidenciam que os fitoesteróides, principalmente os esteróides
β-sitosterol e estigmasterol são possuidores de ações antinociceptiva e
antiinflamatória
127,125,109,110
, levando a sugerir que, no presente estudo, a
66
antinocicepção causada pelo EHMl e a fração F
Hex:éter
esteja relacionado pelo menos
em parte, pela presença destas duas substâncias.
Quanto ao miristato de miristila não foram encontrados estudos que o
relacionem com dor.
Tendo em vista os resultados antinociceptivos com o EHMl e da F
Hex:éter
no
modelo de dor por ácido acético, os mesmos foram ensaiados frente à nocicepção
induzida pela formalina. Esse modelo de dor possui vários aspectos que o tornam de
interesse clínico, quando comparado com outros, apresentando semelhança com a
dor clínica
128
. A característica principal desse modelo é o fato de apresentar duas
fases distintas de nocicepção: a primeira fase, nocicepção neurogênica, que é o
resultado da ativação química direta de fibras nociceptivas aferentes primárias pela
formalina. Essa fase inicia-se imediatamente após a injeção, estendendo-se pelos
primeiros 5 min, sendo inibida por analgésicos de ação central
81, 38
.
A segunda fase ocorre entre 20 - 30 min após a injeção de formalina, estando
relacionada ao desenvolvimento de resposta inflamatória local e sensibilização de
neurônios localizados no corno dorsal da medula espinhal. Essa fase da resposta é
inibida por analgésicos opióides e AINEs, entre outras drogas
128,129
.
No presente estudo foi observado que o EHMl e F
Hex:éter
inibem a resposta
nociceptiva apenas com a maior dose (800 mg/kg) na primeira fase; a segunda fase
da resposta nociceptiva foi inibida por todas as doses administradas (50, 200 e 800
mg/kg v.o.).
Sabe-se que a segunda fase da resposta nociceptiva induzida por
formaldeído é atribuída, principalmente, ao desenvolvimento de processo
inflamatório no local da injeção do estímulo químico e é inibida por fármacos com
atividade predominantemente antiinflamatória
128
, sugere-se que a atividade
67
antinociceptiva do EHMl e F
Hex:éter
esteja associada, principalmente, à inibição da
produção ou da ação de mediadores inflamatórios.
Uma vez que, a maior dose foi capaz de inibir a fase neurogênica do processo
doloroso induzido pela formalina, fez-se necessário à realização do teste da
capsaícina. A capsaícina (8-metil-N-vanilil-6-nonenamida), substância álgica de
ocorrência natural derivada de plantas da família Piperaceae, possui um importante
papel no estudo das fibras sensoriais C e Aδ aferentes, incluindo os nociceptores
polimodais e termoreceptores
125
.
Os resultados demonstraram que o EHMl e F
Hex:éter
exercem importante
inibição na dor de origem neurogênica, induzida por capsaícina.
Parece pertinente uma discussão acerca das semelhanças e diferenças entre
as respostas nociceptivas deflagradas pela formalina na primeira fase e pela
capsaícina. Pois, tanto a primeira fase da formalina como também a dor observada
após a aplicação da capsaícina é chamada de dor neurogênica. Porém, na formalina
esta primeira fase é atribuída à estimulação direta de nociceptores periféricos que
integram as fibras aferentes primárias do tipo C e parte das do tipo Aδ
129
.
Diferentemente, a capsaícina atua sobre um alvo específico, os receptores
vanilóides (TRPV), também localizados em fibras aferentes primárias do tipo C e
parte das do tipo Aδ para causar uma resposta rápida e de duração semelhante à da
primeira fase da formalina
94,130
.
A capsaícina causa essa sensibilização por diminuição do limiar de ativação
do nociceptor, bem como recrutamento de nociceptores normalmente silenciosos
131
.
Apesar da aparente semelhança entre os mecanismos genéricos que medeiam às
respostas nociceptivas, os efeitos distintos de agonista de receptores sobre
respostas da primeira fase à formalina e à capsaícina sugerem que ambos agentes
68
álgicos possam ativar populações diferentes de fibras nociceptivas. Em outras
palavras, a formalina talvez estimule fibras adicionais em relação àquelas sensíveis
à capsaícina. De todo modo, os resultados claramente demonstram que a resposta
nociceptiva a capsaícina não é equivalente à primeira fase da resposta a formalina.
Sabe-se que a capsaícina age em receptores vanilóides – TRPV (receptor
potencial transitório), pois, a despolarização de nociceptores polimodais C em
mamíferos, por influxo de cálcio através de canais vanilóides, causa à liberação
neuronal de SP e outros neuropeptídeos. Para avaliar a atividade antinociceptiva do
extrato (EHMl) e fração (F
Hex:éter
) envolve a participação de receptores vanilóides, no
modelo de dor por capsaicina, utilizou-se a capsazepina, um antagonista sintético
seletivo e competitivo vanilóides.
A administração prévia de capsazepina aos animais que receberam EHMl e
F
Hex:éter
potenciou significativamente (p<0,05) as respostas antinociceptivas destes
preparados, indicando a participação de receptores vanilóides no efeito
antinociceptivo do EHMl e F
Hex:éter.
Para avaliar a participação de receptores opióides no efeito antinociceptivo do
EHMl e F
Hex:éter
, nos modelos de nocicepção por formalina (apenas na maior dose e
capsaícina), utilizou-se a naloxona, um antagonista não seletivo de receptores
opióides.
O pré-tratamento com naloxona das camundongas submetidas à dor por
capsaícina, não inibiu a resposta antinociceptiva do EHMl e F
Hex:éter
, sugerindo que
o efeito antinociceptivo destes preparados independem da participação de
receptores opióides, diferindo portanto, do efeito analgésico central da morfina.
A participação do óxido nítrico na resposta antinociceptiva do EHMl e F
Hex:éter
também foi avaliada neste estudo.
69
O óxido nítrico (NO) é sintetizado a partir da L-arginina pela NO sintetase
(NOS). Existem pelo menos três isoformas da NOS
132
. O NO reage com o íon ferro
localizado ao centro do grupamento heme da GCs produzindo mudança
conformacional, o que ativa a catalisação da guanosin-5´-trifosfato (GTP) em GMPc,
responsável pelo controle de Ca
2+
intracelular. Experimentos em animais têm
sugerido que a geração de NO e subseqüente aumento dos níveis de GMPc estão
envolvidos nos mecanismos de antinocicepção periférica, principalmente em tecidos
inflamados
38
. Também é sugerida uma interação de NO e PGs na qual a produção
de PGE
2
é aumentada
24,36,133
.
Neste estudo verificou-se se a via L-arginina/óxido nítrico/GMPc está
envolvida na atividade antinociceptiva do EHMl e F
Hex:éter
, através do pré-tratamento
com o substrato do óxido nítrico (L-arginina) e do antagonista L-NAME.
O pré-tratamento dos animais com L-NAME e L-arginina, submetidos a dor
por capsaícina, não interferiu na resposta antinociceptiva do EHMl e da F
Hex:éter
,
indicando que a ação antinociceptiva destes independem da participação da via
oxido nítrico/L-arginina.
Essa pesquisa é inédita, sob o ponto de vista químico-farmacológico, sendo o
primeiro estudo com a espécie M. longiflora.
Os resultados obtidos nesse estudo com o EHMl e F
Hex:éter
confirmam o uso
popular do xilopódio de M. longiflora para o tratamento de dores associadas ao
processo inflamatório, bem como apontam alguns indícios dos mecanismos
envolvidos na ação antinociceptiva, fazendo esta planta um promissor candidato a
um futuro fitoterápico.
No entanto, fazem-se necessários estudos toxicológicos e outros estudos
utilizando modelos experimentais farmacológicos, tais como dor induzida por agente
70
mecânico e térmico, estudos testando os compostos isolados (estigmasterol, β-
sitosterol e miristato de miristila) e dosagens de outras citocinas e mediadores,
envolvidos na resposta antinociceptiva, com o intuito de melhor compreender o
mecanismo de ação de M. longiflora. Além disso, é preciso avançar na análise
fitoquímica dos extratos e frações.
71
VII. CONCLUSÃO
O EHMl, FHex:Éter e FAMl apresentaram baixo rendimento;
Os testes fitoquímicos preliminares das frações: FHex:Éter e FAMl revelaram
as presenças de terpenos/esteróides e alcalóides, respectivamente;
A FHex:Éter possui em sua composição uma mistura de fitoesteróides (β-
sitosterol e estigmasterol) e ácido graxo (miristil miristato) revelado por RMN;
A FAMl não apresentou atividade antinociceptiva;
O EHMl e a FHex:Éter apresentaram ação antinociceptiva nos modelos
experimentais de nocicepção por ácido acético, formalina e capsaícina;
A ação antinociceptiva do EHMl e a FHex:Éter depende pelo menos em parte,
dos receptores vanilóides;
A ação antinociceptiva do EHMl e a FHex:Éter independe de ação sobre os
receptores opióides;
A ação antinociceptiva do EHMl e a FHex:Éter independe da partição da via
L-arginina/óxido nítrico;
A ação antinociceptiva do EHMl e a FHex:Éter depende, pelo menos, em
parte, da inibição de IL-8;
Os resultados confirmam o uso popular do xilopódio de Macrosiphonia
longiflora no tratamento de dores associadas à inflamação.
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81
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M. Métodos de avaliação da atividade farmacológica de plantas medicinais. Porto
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132 - Miranda, F. G. G.; Vilar, J. C.; Alves, I. A. N.; Cavalcanti, S. C. H.; Antoniolli, A.
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133 - Cunha, W. R.; Silva, M. L. A.; Turatti, I. C. C. et al. Avaliação da atividade
analgésica de Miconia ligustroides (Melastomataceae) utilizando o teste de
contorção abdominal em camundongos. Revista Brasileira de Farmácia, São Paulo,
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134 - World Health Organisation, Guidelines for Drinking Water Quality - General
Considerations, last modified 17 Oct 2001.
135 - Cunha, F. A.; Bertini, L. M.; Pereira, A. F.; Oliveira, C. L. L.; Menezes, E. A.;
Morais, S. M.; Cavalcanti, E. S. B. Perfil de sensibilidade de bactérias frente a óleos
essenciais de algumas plantas do Nordeste do Brasil. Infarma, v.17,n.314, p.80,
2005.
82
IX. ANEXOS
ANEXO 1. Autorização do SISBIO/IBAMA
83
ANEXO 2 . Oficio do Herbário Central com o número da exsicata.
84
ANEXO 3 . Termo de aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal.
85
X. APÊNDICE
APÊNDICE 1. Tabela com resultado do teste de ácido acético.
TABELA 2. Efeitos da administração via oral do veículo, EHMl , Fração e
indometacina sobre as contorções abdominais induzidas por ácido acético (0,6%)
em camundongas.
Grupo
n
Dose (mg/kg)
Nº de
Contorções
% de inibição
Veículo
8
---
43,71±4,87
---
EHMl
7
5
37,57±2,33
14
EHMl
8
50
27,75±3,15
37
EHMl
7
200
17,56±3,02
60
Indometacina
8
5
9,62±1,11
78
TABELA 3. Efeitos da administração via oral do veiculo, fração alcaloídica (FAMl) e
indometacina sobre as contorções abdominais induzidas por ácido acético (0,6%)
em camundongas.
Grupo
n
Dose (mg/kg)
Nº de
Contorções
% de inibição
Veículo
10
---
44,25±3,09
---
FAMl
10
5
31,25±5,74
29
FAMl
9
50
32,12±3,51
27
FAMl
8
200
31,37±3,58
29
Indometacina
8
5
14,12±1,4
68
TABELA 4. Efeitos da administração via oral do veículo, Fração Hexano:éter e/ou
indometacina sobre as contorções abdominais induzidas por ácido acético em
camundongas.
Grupo
n
Dose
(mg/kg)
Nº de
Contorções
% de inibição
Veículo
8
---
45,62±3,34
---
F
Hex:éter
8
5
37,50±2,36
18
F
Hex:éter
8
50
20,75±2,15
54
F
Hex:éter
7
200
14,85±1,83
67
Indometacina
8
5
11,00±1,06
75
86
APÊNDICE 2. Tabelas com resultados dos testes de formalina e capsaícina.
TABELA 5. administração via oral do extrato (EHMl) e Fração (F
Hex:éter
) ou morfina
sobre a nocicepção induzida por formalina 2,5% em camundongas.
Grupo
n
Dose
(mg/kg)
Tempo de
reação
(1ª fase)
% de
inibição
Tempo de
reação
(2ª fase)
% de
inibição
Veículo
8
---
68,71±6,22
---
78,37±4,90
---
EHMl
7
50
56,86±5,03
17,24
34,87±2,19
55,50
EHMl
8
200
53,10±3,87
22,71
29,66±2,45
62,15
EHMl
8
800
27,55±2,14
59,90
18,00±1,41
77,03
F
Hex:éter
7
50
54,54±4,95
20,60
36,43±2,49
53,51
F
Hex:éter
8
200
55,12±3,37
19,77
26,45±2,45
66,24
F
Hex:éter
8
800
28,61±1,82
58,36
19,15±1,90
75,56
Morfina
7
10
27,93±3,66
59,35
12,50±4,68
84,05
Indometacina
7
10
61,33±4,15
10,74
18,80±1,92
76,01
TABELA 6. Efeitos da administração via oral do veiculo, EHMl e F
Hex:éter
ou morfina
s.c., sobre nocicepção induzida por capsaícina em camundongas.
Grupo
Dose (mg/kg)
Tempo de reação (s)
% de inibição
Veículo
---
51,82±2,73
---
EHMl
20
36,09±2,94
30,35
EHMl
50
32,81±2,76
36,68
EHMl
200
23,86±4,50
53,95
F
Hex:éter
20
35,56±2,72
31,37
F
Hex:éter
50
27,11±3,15
47,68
F
Hex:éter
200
26,88±5,33
48,12
Morfina
3
6,81±1,8
86,85
87
APÊNDICE 3. Avaliação de várias vias de mecanismo antinociceptivo do efeito do
tratamento de EHMl e F
Hex:éter
por via oral.
TABELA 7. Avaliação do receptor opióide no efeito antinociceptivo na administração
via oral do veiculo e EHMl ou morfina s.c., sobre nocicepção induzida por capsaícina
em camundongas.
Grupo
Dose (mg/kg)
Tempo de reação (s)
% de inibição
Veículo
---
51,82±2,73
---
EHMl
200
23,86±4,50
53,95
F
Hex:éter
200
26,88±5,33
48,13
Naloxona
1
49,10±3,89
05,25
Morfina
3
06,81±1,80
86,85
Nal+EHMl
1+200
34,34±4,82
33,73
Nal+ F
Hex:éter
1+200
33,98±4,61
34,42
Nal+Mor
1+3
41,90±5,28
19,14
TABELA 8. Avaliação do receptor vaniloide e a contribuição do receptor opióide no
efeito antinociceptivo na administração via oral do veiculo, EHMl e F
Hex:éter
ou
capsazepina i.p., sobre nocicepção induzida por capsaícina s.c. em camundongas.
Grupo
Dose (mg/kg)
Tempo de reação (s)
% de inibição
Veículo
---
55,09±3,92
---
EHMl
200
23,86±4,50
56,68
F
Hex:éter
200
26,88±5,33
51,20
CPZ
30
12,22±2,67
77,81
Naloxona
1
49,10±3,89
10,87
Morfina
3
06,81±1,80
87,63
CPZ+EHMl
30+200
11,95±2,53
78,30
CPZ+ F
Hex:éter
30+200
13,45±5,08
75,58
Nal+CPZ
1+30
06,69±2,67
87,85
Nal+CPZ+EHMl
1+30+200
11,19±2,59
79,68
Nal+CPZ+ F
Hex:éter
1+30+200
14,16±4,23
74,29
88
APÊNDICE 4. Avaliação da via L-arginina/Oxido nítrico no efeito antinociceptivo do
tratamento de EHMl e F
Hex:éter
por via oral.
TABELA 9. Efeito do pré-tratamento com L-arginina (i.p.) na administração do EHMl
(v.o.), L-NAME (i.p.) e morfina (i.p.), sobre nocicepção induzida por capsaícina em
camundongas.
Grupo
n
Dose mg/kg)
Tempo de reação (s)
% de inibição
Veículo
8
---
46,75±1,83
---
EHMl
7
50
33,68±2,38
27,95
EHMl
9
200
25,65±2,37
45,13
F
Hex:éter
8
50
34,68±3,10
25,81
F
Hex:éter
8
200
30,49±2,13
34,68
L-arg
8
200
47,01±3,90
+ 0,55*
L-NAME
8
70
28,93±2,45
38,11
morfina
8
3
01,24±0,27
97,34
L-ar+ EHMl
8
200+200
39,80±1,41
14,86
L-ar+ F
Hex:éter
8
200+200
37,62±2,23
19,60
L-arg+L-NAME
9
200+70
51,48±4,38
+10,11
L-NAME+ EHMl
7
70+200
38,69±2,47
17,24
L-NAME+ F
Hex:éter
8
70+200
34,61±2,58
27,05
L-NAME+morfina
8
70+3
0,77±0,43
99,20
L-ar+L-na+ EHMl
9
200+70+200
33,03±2,57
29,34
L-ar+L-na+ F
Hex:éter
8
200+70+200
31,75±3,87
32,08
* (+ significa que houve aumento e não inibição).
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