( PDF ) Desenvolvimento e Aplicação de Polimorfismos de Inserção/Deleção do Cromossomo X em Genética Forense.

Universidade

Católica de

Brasília

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

STRICTO SENSU EM CIÊNCIAS GENÔMICAS E

BIOTECNOLOGIA

Mestrado

BRASÍLIA

2007

DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE

POLIMORFISMOS DE INSERÇÃO/DELEÇÃO DO

CROMOSSOMO X EM GENÉTICA FORENSE

Autor: Erika Horta Grandi Monteiro

Orientador: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira

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ERIKA HORTA GRANDI MONTEIRO

DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE POLIMORFISMOS DE

INSERÇÃO/DELEÇÃO DO CROMOSSOMO X EM GENÉTICA FORENSE

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação “Stricto Sensu” em Ciências

Genômicas e Biotecnologia da Universidade

Católica de Brasília, como requisito para

obtenção de Título de Mestre em Ciências

Genômicas e Biotecnologia.

Orientador: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson

Pereira

Brasília

2007

ERIKA HORTA GRANDI MONTEIRO

POLIMORFISMOS DE INSERÇÃO/DELEÇÃO NO CROMOSSOMO X

APLICADOS EM GENÉTICA FORENSE.

Dissertação defendida e aprovada como requisito parcial para obtenção do Título

de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia, defendida e aprovada, em 11

de junho de 2007 pela banca examinadora constituída por:

Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira

Universidade Católica de Brasília

Orientador

Prof. Dr. Dário Grattapaglia

Universidade Católica de Brasília

Avaliador Interno

Prof. Dr. Márcio Elias Ferreira

Universidade Católica de Brasília

Avaliador Interno

Prof. Dr. Sidney Emanuel Batista dos Santos

Universidade Federal do Pará

Avaliador Externo

Brasília

UCB

À memória da querida Vó Amandina, mulher

sempre à frente do seu tempo e eterna fonte de

inspiração.

Aos meus pais, Vania e Fabiano, por terem me

dado o melhor presente de toda minha vida, o

acesso à educação.

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira, pela paciência, dedicação, orientação

e por todos os ensinamentos durante esses anos.

Aos Profs. Drs. Dário Grattappaglia, Marcio Elias e Sidney Santos, membros da banca de

avaliação, pelas contribuições, críticas, elogios e por terem aceitado fazer parte dessa banca.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia e à Universidade

Católica de Brasília, juntamente com os professores e funcionários, pela contribuição na

minha formação profissional e ajuda em todos os momentos solicitados e pela atenção

despendida.

Ao Dr. Ruy Caldas, coordenador do curso de Pós-graduação em Ciências Genômicas e

Biotecnologia, Danielle de Moura e ao secretário Fábio Costa, por todo apoio e incentivo.

A Universidade Católica de Brasília e ao CNPq pelo apoio financeiro que tornou possível a

realização desse trabalho.

Aos Dr. Bruno Tommasi e Dr. Henrique Tommasi por terem me dado a grande oportunidade

de estar envolvida com a área de Biologia Molecular. Agradeço por terem me proporcionado

a oportunidade de realizar o mestrado em Brasília, pela confiança e pela amizade.

A todos os funcionários do Instituto Tommasi, em especial a Dra.Gabriela Nogueira, por

todos os conselhos, ajuda e pela imensa amizade.

A todos os funcionários do laboratório Heréditas, pelos amostras de DNA concedidas, tempo

e ajuda na realização da minha dissertação.

Ao pessoal do Cenargen, Danielle Faria, Eva Mamani, Juliano Pádua e Marília Pappas pela

imensa boa vontade em me atender e ajudar todas as vezes que precisei utilizar o

seqüenciador.

Aos técnicos André Ramos, Idacuy Mundin, Márcia e Willian Baião por toda ajuda e pelas

boas risadas.

A Breno Abreu e Túlio Lins, colegas de mestrado, de bancada, profissionais competentes,

animados e acima de tudo amigos. Obrigada por tudo.

Aos amigos brasilienses, Alessandra Reis, Aline Braga, André Amaral, Joanna de Abreu,

Pollyanna Diener e Natália Bueno pela amizade, pela troca de conhecimentos e pelas boas

risadas. Obrigada por me receberem tão bem.

Ao pessoal da bancada do professor Rinaldo: Rodrigo Vieira, Meiriele Luíza, Ana Cláudia

Teixeira, Priscilla Lasse, Paula Borges, Erica Caldas, Angélica Pedrosa, Luís Souza, Paulo

Gentil e Ricardo Moreno, assim como o pessoal da bancada do prof. Dr. Renato Caparroz. A

todos os colegas do Laboratório de Ciências Genômicas e Biotecnologia pela amizade, troca

de conhecimento, pelos momentos que passamos juntos, pelas críticas, sugestões, ajuda,

incentivo e colaboração.

A meus pais, Vânia e Fabiano, pelos momentos de ensinamento e alegria, incentivo,

paciência, críticas, carinho e amor.

Aos meus irmãos Juliana e Rubens, sempre com uma palavra de carinho a me incentivar. A

toda minha família pelo apoio incondicional e pela amizade. Ao meu primo Alex, por ter me

recebido tão bem em Brasília e por fazer tão bem o papel de família.

Aos queridos amigos pela torcida, que apesar de longe, sempre muito perto do coração.

Sou grata pelo apoio, oportunidade, incentivo e ajuda oferecido por todos aqueles que fizeram

parte da minha vida nestes dois anos de intenso trabalho. Obrigada!

E por último, mas não menos importante, a Deus, por ter me guiado por esse caminho, me

dando muita força.

Quando você partir em direção a Ítaca,

Que sua jornada seja longa,

Repleta de aventuras, plena de conhecimento.

Não temas Laestrigones e Ciclopes nem o furioso Poseidon;

Você não irá encontrá-los durante o caminho, se

O pensamento estiver elevado, se a emoção

jamais abandonar seu corpo e seu espiríto.

Laestrigones e Ciclopes, e o furioso Poseidon

não estarão em seu caminho

se você não carregá-los em sua alma,

se sua alma não os colocar diante de seus passos.

Espero que sua estrada seja longa.

Que sejam muitas as manhãs de verão,

que o prazer de ver os primeiros portos

traga uma alegria nunca vista.

Procure visitar os empórios da Fenícia

recolha o que há de melhor.

Vá às cidades do Egito,

aprenda com um povo que tem tanto a ensinar.

Não perca Ítaca de vista,

pois chegar lá é o seu destino.

Mas não apresse os seus passos;

é melhor que a jornada demore muitos anos

e seu barco só ancore na ilha

quando você já estiver enriquecido

com o que conheceu no caminho.

Não espere que Ítaca lhe dê mais riquezas.

Ítaca já lhe deu uma bela viagem;

sem Ítaca,você jamais teria partido.

Ela já lhe deu tudo, e nada mais pode lhe dar.

Se,no final,você achar que Ítaca é pobre,

não pense que ela o enganou.

Por que você tornou-se um sábio, viveu uma vida intensa,

e este é o significado de Ítaca.

Konstantino Kavafis (1863-1933)

RESUMO

Atualmente, a identificação genética humana está centrada na utilização de um conjunto de

marcadores autossômicos do tipo microssatélites, os quais suprem a maioria das demandas

apresentadas aos laboratórios de genética forense. No entanto, para algumas situações, os

microssatélites autossômicos comumente utilizados não oferecem resultados satisfatórios.

Estas situações passam por casos onde o material genético do suposto pai não está disponível

e casos onde a amostra de DNA obtida apresenta-se degradada ou em quantidades abaixo

daquelas que são limites para utilização dos sistemas comerciais para amplificação dos

microssatélites autossômicos. Com o fito de auxiliar a resolução dessas situações

problemáticas, este trabalho objetivou a utilização de marcadores no cromossomo X,

permitindo complementar estudos de parentesco, especificamente em situações onde as

amostras encontram-se degradadas e/ou em baixas concentrações de DNA. Os marcadores

escolhidos foram polimorfismos do tipo inserção/deleção (indel) no cromossomo X, de 2 a 11

pares de base. Foram desenhados iniciadores para 17 indels do cromossomo X que ao

amplificar geram produtos de tamanho de 70 a 170 pares de base. Dessas 17 indels apenas 8

permitiram sua utilização em reação em multiplex. O sistema multiplex desenvolvido

apresentou alta sensibilidade em suas amplificações, obtendo resultados com concentrações

de até 0,1 ng de DNA em um volume de reação de 12,5 µl, através de estudos de

sensibilidade. Para testar a eficiência do multiplex, foram utilizadas amostras artificialmente

degradadas com a utilização de DNAse I. A partir dessas amostras artificialmente degradadas

utilizou-se o protocolo de Low Copy Number DNA onde aumentou-se o número de ciclos do

protocolo de amplificação de 30 para 34. Essa técnica mostrou-se realmente eficaz. Além

disso, também se testou a eficiência da amplificação do sistema multiplex em amostras

degradadas submetidas à amplificação de genoma total que se mostrou ineficaz. Um estudo da

população brasileira foi conduzido em 200 amostras das cinco regiões geopolíticas brasileiras

a fim de estabelecer a freqüência das indels do cromossomo X. Os dados de estrutura

populacional indicaram diferença entre regiões (F

ST

= 0,021 P<0,05). Finalmente analisou-se o

funcionamento e a precisão do multiplex em casos de paternidade com trios e suposto pai

falecido e compararam-se os resultados previamente obtidos pelo estudo com microssatélites.

O sistema de multiplex de indels do cromossomo X provou ser útil e sua aplicação como

complemento em casos de parentesco foi aprovado, assim como, seu sucesso na amplificação

de amostras degradadas e em amostras com baixa quantidade de DNA, quando analisado em

conjunto com a técnica de LCN.

Palavras-Chave: Mini-Indel. Cromossomo X. Genética Forense. Casos de parentesco. Low

Copy Number DNA.

ABSTRACT

Nowadays the human genetic identification it’s based on the utilization of a set of autosomal

markers, the microsatellites, which fulfils the majority of the forensic genetic labs

requirements. However, there are some situations when that the usual autosomal

microsatellites don’t always offer good results. Those situations include cases where the

genetic sample of the alleged father is not available and cases where the DNA sample presents

itself degraded or in low quantities, rendering the utilization of commercial systems to the

amplification of autosomal markers useless. With the aim of assisting the resolution of these

problematic situations, this study aimed the use of X-chromosome markers, allowing to

improve kinship studies, more specifically, scenarios using degraded or low quantity DNA

samples. The markers chosen were insertion/deletion (indel) polymorphisms from X-

Chromosome, ranging from 2-11 base pairs. Primers were designed for 17 X-chromosome

indels, in order to generate Amplicons ranging from 70 to 170 base pairs. Only eight of these

17 indels allowed their use in multiplex reaction. The X-chromosome based multiplex system

has shown to be highly sensitive in their amplifications, being able to amplify as low as 0.1 ng

of DNA in a reaction volume of 12.5 µl, through sensitivity studies. To test the amplification

efficiency of the multiplex, artificially and controlled degraded samples using DNAse I

enzyme were used. From these artificially degraded samples, a new amplification protocol

based on the increase from 30 cycles to 34 cycles was used. This technique proved to be

really effective. Also, degraded samples were amplified using whole genome amplification

prior to the PCR reaction for comparison sake that proved ineffective. A Brazilian population

study was held on 200 samples from the five geopolitical Brazilian regions in order to

establish the frequency of X-Chromosome indels. Population comparison indicated genetic

difference between regions (F

ST

= 0.021 P<0.05). Along with that, some kinship case studies,

which were already been analyzed through the use of autosomal marker, were conducted

using this novel 8 X-chromosome indel marker multiplex set. This novel multiplex system

based on X-chromosome indels markers has proven to be useful and its usage on kinship

cases as a complementary tool has been approved, and, in addition, it has proven to be

successful in the amplification of degraded samples as well as in low quantity DNA samples

along with other technique, Low Copy Number.

Keywords: Mini-Indel. X-Chromosome. Forensic science. Kinship testing. Low Copy

Number DNA.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Primeiras utilizações em casos de imigração e criminal........................................27

Figura 2 - Marcador STR.. ......................................................................................................29

Figura 3 - Reação de Multiplex...............................................................................................30

Figura 4 – Locos do sistema Codis com suas localizações cromossômicas. ..........................31

Figura 5 - Cromossomo Y humano.........................................................................................37

Figura 6 - Mapa do genoma mitocondrial humano.................................................................40

Figura 7 - Cromossomo X humano e seus principais marcadores STRs. ...............................43

Figura 8 – Distribuição das amostras populacionais brasileiras utilizadas nesse estudo. .......54

Figura 9 – Localização das 17 indels selecionadas ao longo do cromossomo X....................65

Figura 10 – Distribuição dos produtos gerados pelos 17 pares de iniciadores das indels

selecionadas ao longo do cromossomo X.................................................................................66

Figura 11 - Eletroferograma das amplificações em singleplex 6-FAM IDX001 a IDX006...68

Figura 12 - Eletroferograma das amplificações em singleplex 6-FAM IDX008 a IDX011...69

Figura 13 - Eletroferograma das amplificações em singleplex VIC IDX013 a IDX017. .......69

Figura 14 - Distribuição dos produtos gerados pelos 8 pares de iniciadores das indels

selecionadas ao longo do cromossomo X, que constituem a reação de multiplex...................71

Figura 15 - Eletroferograma demonstrando a multiplexação das 8 indels do cromossomo X

em 3 indivíduos diferentes........................................................................................................72

Figura 16 - Distribuição das 8 indels constituintes do multiplex no cromossomo X..............73

Figura 17 – Resultados AMOVA na população brasileira......................................................77

Figura 18 – Resultados da análise de variância loco a loco das amostras regionais da

população brasileira..................................................................................................................79

Figura 19 – Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 1 (PM1).. .......90

Figura 20 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 2 (PM2)..........93

Figura 21 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 3 (PM3). ........96

Figura 22 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 4 (PM4)........100

Figura 23 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 5 (PM5)........103

Figura 24 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 6 (PM6)........107

Figura 25 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 7 (PM7)........110

Figura 26 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 8 (PM8)........113

Figura 27 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 9 (PM9)........117

Figura 28 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 10 (PM10)....118

Figura 29 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 11 (PM11)....118

Figura 30 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 12 (PM12)....119

Figura 31 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 13 (PM13)....119

Figura 32 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 14 (PM14)....120

Figura 33 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 15 (PM15). ..120

Figura 34 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 16 (PM16)....121

Figura 35 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 17 (PM17)....121

Figura 36 - Eletroferograma mostrando resultados dos testes de sensibilidade com os

iniciadores marcados com 6-FAM. ........................................................................................124

Figura 37 - Eletroferograma mostrando resultados dos testes de sensibilidade com os

iniciadores marcados com VIC...............................................................................................125

Figura 38 - Foto gel de agarose 1% comprovando a eficácia do processo de degradação....127

Figura 39 – Resultado amplificação por WGA.....................................................................129

Figura 40 - Eletroferograma mostrando resultados comparativos das amplificações pelo ciclo

normal nas amostras. ..............................................................................................................130

Figura 41 - Eletroferograma mostrando resultados comparativos das amplificações por LCN,

normal e WGA associada à amplificação normal, respectivamente, da amostra submetida a

degradação por DNAse I (entre 400-650 pb). ........................................................................133

Figura 42 - Eletroferograma mostrando resultados comparativos das amplificações por LCN,

normal e WGA associada à amplificação normal, respectivamente, da amostra submetida à

degradação por DNAse I (abaixo de 400 pb).........................................................................134

Figura 43 - Eletroferograma mostrando resultados comparativos das amplificações por LCN,

normal e WGA associada à amplificação normal, da amostra controle.................................135

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Fórmulas para cálculo de IP individual para locos independentes no cromossomo

X, em trios................................................................................................................................58

Tabela 2 - Fórmulas para cálculo de IP individual para locos independentes no cromossomo

X, em duos................................................................................................................................59

Tabela 3 - Indels selecionadas a partir do NCBI®..................................................................63

Tabela 4 - Características das 17 indels do cromossomo X selecionadas a partir do NCBI® 64

Tabela 5 - Seqüência dos iniciadores para cada indel selecionada..........................................67

Tabela 6 - Indels do cromossomo X constituintes do multiplex. ............................................71

Tabela 7 - Caracterização dos 8 locos de indels do cromossomo X baseado em uma amostra

de 200 indivíduos. ....................................................................................................................74

Tabela 8 - Desequilíbrio de ligação entre as mini-indels do cromossomo X constituintes do

multiplex, calculados apenas entre os homens.........................................................................75

Tabela 9 - Características das 8 indels do cromossomo X utilizadas em multiplex................75

Tabela 10 – Matriz diagonal inferior com valores de Fst par a par e matriz diagonal superior

com valores de significância (Pvalor) para população de homens e mulheres. .......................78

Tabela 11 – Matriz diagonal inferior com valores de Fst par a par e matriz diagonal superior

com valores de significância (Pvalor) para população de homens...........................................78

Tabela 12 – Matriz diagonal inferior com valores de Fst par a par e matriz diagonal superior

com valores de significância (Pvalor) para população de mulheres.........................................78

Tabela 13 - Perfis genotípicos de seis trios de exclusão resultantes da análise com o octaplex

(mais amelogenina) de STRs....................................................................................................82

Tabela 14 - Perfis genotípicos de seis trios de exclusão resultantes da análise dodecaplex de

STRs.........................................................................................................................................83

Tabela 15 - Perfis genotípicos de seis trios de exclusão resultantes da análise com as mini-

indels do cromossomo X.. ........................................................................................................84

Tabela 16 - Perfis genéticos de seis trios com resultado de inclusão, analisados com o

octaplex (mais amelogenina) de STRs. ....................................................................................85

Tabela 17 - Perfis genéticos de seis trios com resultado de inclusão, analisados com o

dodecaplex de STRs. ................................................................................................................86

Tabela 18 - Perfis genéticos de seis trios com resultado de inclusão, analisados com com as

mini-indels do cromossomo X..................................................................................................87

Tabela 19 - Índice de paternidade combinado (IPC) dos trios com inclusões nos diversos

sistemas de multiplex utilizados e suas combinações. .............................................................88

Tabela 20 – Perfis genéticos do caso Post mortem 1 obtidos pela análise de 25 STRs

autossômicos (mais amelogenina)............................................................................................91

Tabela 21 - Perfis genéticos do caso Post mortem 1 obtidos pela análise de 8 mini-indels do

cromossomo X..........................................................................................................................92

Tabela 22 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 2 obtidos pela análise de 32 STRs

autossômicos (mais amelogenina)............................................................................................94

Tabela 23 - Perfis genéticos do caso Post mortem 2 obtidos pela análise de 8 mini-indels do

cromossomo X..........................................................................................................................95

Tabela 24 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 3 obtidos pela análise de 30 STRs

autossômicos (mais amelogenina)............................................................................................97

Tabela 25 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 3 obtidos pela análise de 7 X-STRs. .......98

Tabela 26 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 3 obtidos pela análise de 8 mini-indels do

cromossomo X..........................................................................................................................99

Tabela 27 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 4 obtidos pela análise de 31 STRs

autossômicos...........................................................................................................................101

Tabela 28 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 4 obtidos pela análise de 8 mini-indels do

cromossomo X........................................................................................................................102

Tabela 29 – Perfis genéticos do caso Post Mortem 5 obtidos pela análise de 32 STRs

autossômicos...........................................................................................................................104

Tabela 30 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 5 obtidos pela análise de 7 X-STRs. .....105

Tabela 31 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 5 obtidos pela análise de 8 mini-indels do

cromossomo X........................................................................................................................106

Tabela 32 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 6 obtidos pela análise de 32 STRs

autossômicos...........................................................................................................................108

Tabela 33 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 6 obtidos pela análise de 4 X-STRs.. ....109

Tabela 34 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 6 obtidos pela análise de 8 mini-indels do

cromossomo X........................................................................................................................109

Tabela 35 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 7 obtidos pela análise de 33 STRs

autossômicos...........................................................................................................................111

Tabela 36 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 7 obtidos pela análise de 8 mini-indels do

cromossomo X........................................................................................................................112

Tabela 37- Perfis genéticos do caso Post Mortem 8 obtidos pela análise de 34 STRs

autossômicos...........................................................................................................................114

Tabela 38 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 8 obtidos pela análise de 5 X-STRs. .....115

Tabela 39 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 8 obtidos pela análise de 8 mini-indels do

cromossomo X........................................................................................................................116

Tabela 40 - Índice de paternidade combinado (IPC) das inclusões de paternidade dos casos

post-mortem............................................................................................................................122

LISTA DE ABREVIATURAS

A Adenina

BSA Albumina de soro bovino (do inglês, Bovine Serum Albumin)

C Citosina

CODIS Sistema Indexado de DNA Combinando (do inglês, Combined DNA Index

System)

D-loop Alça de desdobramento (do inglês, Displacement Loop)

DNA Ácido Desoxirribonucléico (do inglês, Deoxyribonucleic Acid)

dNTP Desoxirribonucleotídeo Trifosfato (do inglês, Deoxyribonucleotide

triphosphate)

DOP-PCR PCR com oligonucleotídeos degenerados (do inglês, Degenerate

Oligonucleotide Primed PCR)

EDTA Ácido Etileno Diamono Tetrecético (do inglês, Ethylene Diamine TetrAcetic

Acid)

FBI Escritório Federal de Investigação (do ingles, Federal Bureau of Investigation)

G Guanina

H Heterozigosidade

Indels Inserção/Deleção

IP Índice de Paternidade

IPC Índice de Paternidade Combinado

I-PEP PEP melhorado (do inglês, Improved PEP)

ISFG Sociedade Internacional de Genética Forense (do inglês, International Society

of Forensic Genetics)

LCN Baixo Número de Cópias (do inglês, Low Copy Number)

LL-DOP-PCR Produtos longos de baixas quantidades DOP-PCR (do inglês, Long Products

from low quantities DOP-PCR).

MDA Amplificação de deslocamentos múltiplos (do inglês, Multiple Displacement

Amplification)

MEC

Chance Média de Exclusão (do inglês, Mean of Exclusion Chance)

MLPs Sondas Multilocais (do inglês, Multilocal Probes)

MSY Região específica de homens do cromossomo Y (do inglês, Male Specific Y

Chromosome Region)

NIST Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (do inglês, National Institute of

Standards and Technology)

NRY Região não recombinante do cromossomo Y (do inglês, Non Recombining Y-

chromosome Region)

PAR Região pseudo-autossômical (do inglês, Pseudo-autosomal region)

PCR Reação em Cadeia de Polimerase (do inglês, Polimerase Chain Reaction)

PD Poder de Discriminação

PEP Pré-amplificação por extensão do iniciador (do inglês, Primer Extension

Preamplification)

PIC Conteúdo de informação de polimorfismo (do inglês, Polymorphism

Information Content)

PP Probabilidade de Paternidade

PPE Probabilidade de Exclusão de Paternidade

RFLP Polimorfismos de Fragmentos de Restrição (do inglês, Restriction Fragment

Length Polymorphism)

SDA Amplificação com deslocamento da fita (do inglês, Strand displacement

Amplification)

SDS Sódio Dodecil Sulfato

SLP Sonda de Loco Único (do inglês, Single Locus Probe)

SNP Polimorfismo de Base Única (do inglês, Single Nucleotide Polymorphism)

SSR Repetições de Seqüência Simples (do inglês, Simple Sequence Repeats)

STR Repetições Consecutivas Curtas (do inglês, Short Tandem Repeat)

T Timina

Taq Thermus aquaticus

TE Tris-EDTA

Tris Tris-(hidroximetil)-aminometano

VNTRs Repetições Consecutivas de Número Variado (do inglês, Variable Number

Tandem Repeat)

WGA Amplificação do Genoma Total (do inglês, Whole Genome Amplification)

LISTA DE SÍMBOLOS

% porcentagem

cm centímetro

g grama

HCl ácido clorídrico

KCl cloreto de potássio

kg kilograma

M Molar

mg miligrama

MgCl

2

cloreto de magnésio

min minuto

mL mililitro

mM milimolar

NaCl cloreto de sódio

NaOH hidróxido de sódio

ng nanograma

º C grau Celsius

pb par de base

pg picograma

pH potencial hidrogeniônico

rpm rotação por minuto

s segundo

U unidade

λ lambda

µg micrograma

µL microlitro

µM micromolar

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...............................................................................................................19

2 HIPÓTESE DE TRABALHO........................................................................................21

3 OBJETIVOS....................................................................................................................22

3.1 O

BJETIVO

G

ERAL

........................................................................................................22

3.2 O

BJETIVOS

E

SPECÍFICOS

.............................................................................................22

4 REVISÃO DA LITERATURA......................................................................................24

4.1 A

SPECTOS

H

ISTÓRICOS DA

G

ENÉTICA

F

ORENSE

.........................................................24

4.2 M

ARCADORES POLIMÓRFICOS DE USO CORRENTE EM GENÉTICA FORENSE

..................28

4.3 M

ARCADORES DE LINHAGEM EM GENÉTICA FORENSE

.................................................33

4.3.1 Cromossomo Y .......................................................................................................33

4.3.2 DNA mitocondrial..................................................................................................37

4.3.3 Marcadores polimórficos no cromossomo X .........................................................41

4.4 A

MOSTRAS COM QUANTIDADES MÍNIMAS DE

DNA

E

/

OU DEGRADADAS EM

G

ENÉTICA

F

ORENSE

................................................................................................................................46

5 MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................50

5.1 S

ELEÇÃO DAS INDELS

..................................................................................................50

5.2 D

ESENHO DOS INICIADORES

........................................................................................51

5.3 A

MPLIFICAÇÃO DAS

I

NDELS DO

C

ROMOSSOMO

X.......................................................52

5.4 D

ETECÇÃO E ANÁLISE DOS PRODUTOS DA

PCR...........................................................53

5.5 A

MOSTRAS DE

DNA...................................................................................................53

5.6 D

ADOS

P

OPULACIONAIS

..............................................................................................56

5.7 U

TILIZAÇÃO EM CASOS DE PATERNIDADE

...................................................................57

5.8 S

ENSIBILIDADE

...........................................................................................................60

5.9 E

STUDOS DE DEGRADAÇÃO

.........................................................................................60

5.10 A

MPLIFICAÇÃO PELA METODOLOGIA DE

L

OW

C

OPY

N

UMBER

DNA ..........................61

5.11 A

MPLIFICAÇÃO DE GENOMA TOTAL

............................................................................61

6 RESULTADOS................................................................................................................62

6.1 I

DENTIFICAÇÃO DE INDELS POLIMÓRFICAS AO LONGO DO CROMOSSOMO

X................62

6.2 D

ESENHO DOS INICIADORES

........................................................................................66

6.3 A

MPLIFICAÇÃO DAS

I

NDELS DO

C

ROMOSSOMO

X.......................................................68

6.4 E

STUDO POPULACIONAL

.............................................................................................74

6.5 E

STUDO DE CASOS

:

EXAMES DE PATERNIDADE EM

T

RIOS

............................................80

6.6 E

STUDO DE CASOS

:

EXAMES DE PATERNIDADE EM CASOS DE

S

UPOSTO

P

AI

F

ALECIDO

89

6.7 T

ESTE DE SENSIBILIDADE

..........................................................................................123

6.8 E

STUDOS DE DEGRADAÇÃO

.......................................................................................126

6.9 A

MPLIFICAÇÃO DO MULTIPLEX DE INDELS DO CROMOSSOMO

X

UTILIZANDO

PROTOCOLOS DE

L

OW

C

OPY

N

UMBER

DNA

E DE

W

HOLE

G

ENOME

A

MPLIFICATION

..........128

7 DISCUSSÃO..................................................................................................................136

8 CONCLUSÃO...............................................................................................................141

9 APÊNDICE....................................................................................................................143

10 REFERÊNCIAS............................................................................................................145

11 REFERÊNCIAS ELETRÔNICAS..............................................................................161

19

1 INTRODUÇÃO

Há mais de um século, desde a descoberta dos grupos sanguíneos, que

polimorfismos em humanos vêm auxiliando a resolução de questões criminais.

Passando pelos polimorfismos de grupos sanguíneos, em seguida pelos

polimorfismos protéicos/enzimáticos e pelos primeiros polimorfismos em seqüência

de DNA (RFLPs), o grande salto deu-se com a identificação dos polimorfismos de

seqüência repetitiva do tipo minissatélites. Os minissatélites e sua alta variabilidade

permitiram ao Sir Alec Jefreys e seus colaboradores, no início da década de 80 do

século XX, as primeiras aplicações de genética forense em um contexto moderno

como conhecemos hoje. No entanto, foi a caracterização dos microssatélites e a

possibilidade de genotipá-los via PCR, no final dos anos 80 e início dos anos 90, os

eventos que permitiram ao campo da genética forense sua consolidação.

Atualmente, a base de qualquer laboratório de genética forense é a utilização de 13

a 15 microssatélites autossômicos co-amplificados pela PCR (utilizando sistemas

comerciais) e genotipados utilizando a eletroforese em seqüenciadores automáticos

de DNA. Em situações especiais a utilização de microssatélites do cromossomo Y e

do cromossomo X, oferece auxílio de suma importância para a conclusão de uma

investigação. Haplótipos de cromossomo Y são utilizados na identificação de

indivíduos relacionados pela mesma linhagem paterna e são importantes

ferramentas na identificação individual de acusados de crimes sexuais.

Microssatélites do cromossomo X, utilizados como haplótipos ou não, auxiliam no

estabelecimento de vínculos de parentesco onde a configuração não é aquela

tradicional de mãe, filho e suposto pai. Principalmente naqueles casos onde o

suposto pai é ausente, o filho em questão é do sexo feminino e se tem parentes com

os quais se podem reconstruir o cromossomo X do suposto pai.

Muito embora a obtenção de perfis genéticos baseados em microssatélites

esteja consolidada como primeira ferramenta em genética forense, em situações

onde o DNA apresenta-se degradado ou em pequenas quantidades os sistemas

comerciais falham em obter um perfil completo para todos os locos genotipados. Em

se tratando da baixa concentração de DNA, os esforços têm acontecido no sentido

20

de alterar as condições da PCR e assim obter perfis de DNA para um maior número

de locos co-amplificados. Para amostras degradadas, os esforços tem-se

concentrado na redução dos fragmentos de microssatélites amplificados pela PCR e

na utilização de marcadores polimórficos do tipo SNP (do inglês, Single Nucleotide

Polymorphism), que por sua natureza permitem o desenho de sistemas de

genotipagem baseados na amplificação pela PCR de fragmentos pequenos.

Os SNPs requerem métodos de genotipagem que envolvem mais que a

simples amplificação e eletroforese. Alternativamente, polimorfismos de pequenas

inserções/deleções (2-20 pb) podem ser facilmente genotipados utilizando a PCR e

eletroforese. Com esta última informação em mente o trabalho apresentado neste

documento propôs-se estabelecer um sistema para a co-amplficação de indels do

cromossomo X e testá-las como ferramentas de auxílio em identificação humana. Os

sistemas de amplificação foram desenhados de forma que os fragmentos tivessem

seus tamanhos entre 70 e 170 pares de base. Em analogia ao termo mini-strs que é

aplicado para microssatélites amplificados de forma a gerarem fragmentos curtos, as

indels genotipadas neste trabalho serão denominadas mini-indels. Além de testar as

mini-indels do cromossomo X como ferramentas auxiliares para identificação

humana, testou-se também sua aplicação em conjunto a técnicas que buscam

solucionar questões relacionadas a baixa concentração de DNA. As técnicas

escolhidas foram: a utilização da amplificação pela metodologia de LCN-DNA (do

inglês, low copy number DNA) e a amplificação por WGA (do inglês, Whole Genome

Amplification) anterior a amplificação pelas mini-indels.

Ao final deste trabalho obteve-se um sistema com 8 indels co-amplificadas

que se mostraram potencialmente importantes para a resolução de vínculos de

parentesco em situações onde o suposto pai é ausente e o filho em questão é do

sexo feminino. O sistema poderá também ser utilizado em amostras degradadas e

ou com baixas concentrações de DNA.

21

2 HIPÓTESE DE TRABALHO

Mini-indels do cromossomo X fornecem um poder de exclusão equivalente a

microssatélites do cromossomo X em casos de paternidade forense (duos, trios e

post – mortem).

22

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Desenhar, otimizar e caracterizar geneticamente um sistema para co-

amplificação de polimorfismos do tipo indels ao longo do cromossomo X com a

finalidade de aplicação em genética forense.

3.2 Objetivos Específicos

• Identificar indels polimórficas ao longo do cromossomo X utilizando o

banco de dados dbSNP;

• Desenhar iniciadores para amplificação de polimorfismos do tipo indel no

cromossomo X de tamanho de 70-170 pb;

• Padronizar protocolo para amplificação de indels do cromossomo X em

sistemas multiplex;

• Estabelecer a freqüência de indels do cromossomo X em uma amostra da

população brasileira;

• Analisar grau de desequilíbrio de ligação entre as indels estudadas;

• Analisar funcionamento e precisão do multiplex em casos de paternidade

(trios) e post mortem e comparar os resultados obtidos da análise com as

mini-indels do X, com STRs autossômicos e STRs do X;

• Testar a sensibilidade do multiplex em relação à quantidade de DNA;

• Amplificar as amostras provenientes de estudos de degradação;

• Avaliar a utilização das indels em associação com as técnicas de WGA e

LCN;

23

• Amplificar as amostras provenientes de estudos de degradação

associadas com LCN e WGA.

24

4 REVISÃO DA LITERATURA

4.1 Aspectos Históricos da Genética Forense

A aplicação da genética em um contexto forense tem suas origens há mais

de cem anos, com a descoberta dos polimorfismos do grupo ABO por Karl

Landsteiner (LANDSTEINER, 1900; , 1901). A identificação dos padrões de herança

do sistema ABO permitiu sua aplicação para a resolução de crimes (JOBLING et al.,

2004). Embora seja uma ferramenta rápida, os polimorfismos do grupo ABO

apresentam baixa variabilidade, o que os tornam pouco informativos. Existem quatro

grupos possíveis: A, B, AB e O, sendo que 40% da população apresentam o tipo

“O”. Logo, essa metodologia permite apenas a exclusão de um indivíduo como

sendo o doador de uma determinada evidência biológica e não a sua inclusão. Além

do sistema ABO, sistemas baseados em polimorfismos sorológicos de outros grupos

sanguíneos e em polimorfismos eletroforéticos de proteínas oferecem potencial

aplicação em genética forense, embora a baixa informatividade e a rápida

degradação das proteínas limitou a ampla utilização dos mesmos (revisado por

JOBLING et al., 2004).

Em 1985, este cenário experimentou uma grande revolução em função dos

trabalhos do geneticista inglês, Sir Alec Jeffreys, na Universidade de Leicester, UK.

Sir Jeffreys descobriu regiões no DNA que se repetiam muitas vezes lado a lado.

Além disso, percebeu que o número de repetições presentes numa amostra variava

de indivíduo para indivíduo. A estas regiões hipervariáveis foi dado o nome de

minissatélites ou VNTRs (do inglês, variable number of tandem repeat). Após a

descoberta, Sir Jeffreys demonstrou a aplicabilidade dos minissatélites para a

identificação humana, sendo então cunhado o termo “DNA fingerprinting” (GILL et

al., 1985; JEFFREYS et al., 1985a; JEFFREYS et al., 1985b; 1985c).

O desenvolvimento do método de “DNA fingerprinting” por Jeffreys, baseava-

se na presença de uma seqüência de 10-15 pb, rica em GC e presente nas

25

adjacências de várias regiões genômicas que apresentam blocos de DNA repetidos

em números variáveis na população. Assim, utilizando uma sonda de DNA em um

procedimento de Southern Blotting, um padrão de múltiplas bandas, específico de

cada indivíduo podia ser determinado. Esta sonda era definida como sendo

multilocal (MLPs, do inglês, multilocal probes). A vantagem apresentada era a alta

variabilidade entre indivíduos. A probabilidade de coincidência do padrão multi-

bandas entre indivíduos não aparentadas era estimada a 3 X 10

-11

e com duas

sondas multilocais este valor aumentaria para 5 X 10

-19

(revisado por TAMAKI et al.,

2005). Entretanto, esta metodologia se mostrava trabalhosa e demorada, além das

análises em misturas terem se mostrado um desafio (BUTLER, 2005).

Essa metodologia foi utilizada pela primeira vez em 1985 em um caso de

imigração na Inglaterra, onde o envolvido era um jovem de Gana. Preso sob

alegações de possuir um passaporte falso, o jovem e sua família foram submetidos

aos testes de “DNA fingerprinting” (Figura 1 - A) permitindo assim a verificação da

real identidade do jovem. Esse foi o primeiro caso a ser resolvido com a utilização do

DNA (JEFFREYS et al., 1985a; JEFFREYS, 2005).

A utilização das sondas multilocais persistiu por algum período,

principalmente no estabelecimento de vínculo genético em casos de paternidade.

Com a clonagem e caracterização de vários minissatélites, estes começaram a ser

investigados individualmente. Neste caso, uma sonda unilocal (SLP, do inglês single

locus probe), ou seja, específica para um minissatélite, gerava um padrão com no

máximo duas bandas (JEFFREYS, 2005). A utilização de perfis genéticos em um

caso criminal teve sua estréia em 1986, na Inglaterra, com o caso Colin Pitchfork

que envolvia o estupro e homicídio de duas adolescentes. A primeira utilização do

DNA em um caso criminal estabeleceu a inocência do suspeito principal, e

posteriormente revelou o verdadeiro autor do crime, Colin Pitchfork (Figura 1 - B)

(BUTLER, 2005; JEFFREYS, 2005). Era a inauguração de uma nova página no

emprego da biologia molecular, a utilização da identificação humana criminal, sendo

este o primeiro caso onde perfis genéticos foram aceitos em um tribunal como prova

material de crime (JOBLING et al., 2004; JEFFREYS, 2005). A facilidade de

interpretação dos resultados utilizando sondas unilocais levou a ampla utilização

destas, mesmo depois do desenvolvimento das metodologias baseadas em Reação

26

em Cadeia da Polimerase (PCR, do inglês polymerase chain reaction) (JOBLING et

al., 2004).

O desenvolvimento da metodologia de PCR em 1985 (SAIKI et al., 1985;

MULLIS et al., 1987) revolucionou a tecnologia do DNA e hoje constitui a base para

qualquer análise por DNA em genética forense. A PCR consiste em um processo

enzimático onde uma seqüência específica de DNA é replicada milhares de vezes

(SAIKI et al., 1985; SAIKI, 1988). A sensibilidade e a rapidez permitiram a rápida

incorporação da PCR como técnica básica para estudo de amostras forense, onde

não é incomum evidências com baixa concentração de DNA. (BUTLER, 2005). O

impacto da PCR foi tão grande que em 1993 o inventor Kary B. Mullis recebeu o

Prêmio Nobel em Química - menos de 10 anos após a sua descoberta

(http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/press.html).

Os primeiros sistemas baseados em PCR tinham como alvo um pequeno

número de SNPs (do inglês single nucleotide polymorphisms) no gene HLA-DQA1

(WESTWOOD et al., 1990). Embora esse sistema fosse útil quando a tecnologia de

SLPs falhava, o poder de discriminação era muito baixo e com difícil interpretação

de misturas. Vários sistemas para estudo de minissatélites baseados na PCR

também foram desenvolvidos (revisado por JOBLING et al., 2004; TAMAKI et al.,

2005).

O desenvolvimento da PCR (SAIKI et al., 1985; MULLIS et al., 1987; SAIKI,

1988) juntamente com a descoberta dos microssatélites polimórficos (LITT et al.,

1989; WEBER et al., 1989) representam um momento de transição do início da

aplicação de DNA em genética forense para um momento que ainda vivemos

atualmente.

27

Figura 1 – Primeiras utilizações em casos de imigração e criminal. A) A primeira aplicação de

DNA fingerprinting – caso de imigração. Duas sondas MLPs para detectar diferentes tipos de

minissatélites foram usadas na mãe (M), seus três filhos não envolvidos no caso (U) e seu filho,

suposto portador de um passaporte falso (B). O pai não estava presente e o (X) corresponde ao Sir

Jeffreys. Todas as bandas presentes em B podem ser vistas em M ou no caracter paternal

visualizado em um ou mais Us. B) A primeira utilização de perfis genéticos em um caso criminal -

caso Colin Pitchfork. Uma sonda do tipo SLP foi usada para analisar os seguintes DNAs: A, raízes de

cabelo da primeira vítima coletadas post-mortem; B, mistura de sêmen e líquido vaginal da primeira

vítima; C, sangue da segunda vítima, coletado post-mortem; D, swab vaginal da segunda vítima; E,

mancha de sêmen presente na roupa da segunda vítima; S, sangue do primeiro suspeito. Os alelos

do sêmen (indicados por setas), não atribuídos às vítimas, aparecem nos dois perfis provenientes dos

estupros e não coincide com o perfil do suspeito.

Fonte -

JEFFREYS

, A. J. Genetic fingerprinting

28

4.2 Marcadores polimórficos de uso corrente em genética forense

No final dos anos 80 os microssatélites, STRs (do inglês short tandem

repeat) ou SSR (do inglês, simple sequence repeats) foram descobertos (LITT et al.,

1989; WEBER et al., 1989). Assim como os minissatélites, os microssatélites

consistem em blocos de seqüência de DNA repetidas consecutivamente.

Diferentemente dos minissatélites que apresentam blocos com 70-200 bp, os

microssatélites são caracterizados por de 2-6 pares de base (pb), repetidos

tipicamente de 5-30 vezes (LITT et al., 1989; WEBER et al., 1989) (Figura 2). Os

STRs são encontrados em genomas eucariotos e estão amplamente distribuídos no

genoma humano, constituindo cerca de 3% do mesmo, ou seja, aproximadamente

um STR a cada 2 kb (LANDER et al., 2001). As seqüências de repetição dos STRs

são nomeadas pelo comprimento da unidade de repetição, logo existem, mono-, di-,

tri- tetra-, penta- e hexanucleotídeos (TAUTZ, 1993). Devido às características

inerentes aos microssatélites com bloco de repetição menor que quatro

nucleotídeos, a Sociedade Internacional de Genética Forense (ISFG, do inglês

International Society of Forensic Genetics) recomenda a utilização de

tetranuleotídeos devido a estes possuírem um grau de polimorfimo razoável, baixa

taxa de mutação e a formação reduzida de stutter (comparada aos dinucleotídeos)

(BÄR, 1994; BÄR et al., 1997).

Além da classificação de acordo com o tamanho, os STRs também podem

ser classificados de acordo com a composição dos blocos de seqüência. Aqueles

com repetições de mesmo tamanho e seqüência são classificados como

microssatélites de repetição simples. Microssatélites com duas ou mais repetições

simples adjacentes diferindo nos motivos de repetição são classificados como

repetições compostas. Microssatélites complexos são aqueles constituídos por

blocos de repetição variando em tamanho. Microssatélites com blocos diferindo em

tamanho e em seqüência são classificados como repetições complexas

hipervariáveis. Essa última categoria de marcadores do tipo STR não é comumente

utilizada em tipagem de DNA forense devido a dificuldades com nomenclatura

29

alélica e medida de variabilidade entre laboratórios, embora dois kits comerciais

incluam o loco complexo hipervariável SE33, conhecido também como ACTBP2

(BUTLER, 2005).

Figura 2 - Marcador STR. Ilustração mostrando a unidade de repetição AGAT do marcador D5S818.

O número de repetições AGAT varia entre indivíduos.

Fonte - a autora.

Existem situações onde um alelo de um loco STR contém um número

incompleto de repetições. Microvariantes é o termo dado aos alelos que contém

unidades de repetição incompleta. Um exemplo comum de uma microvariante é o

alelo 9.3 no loco TH01, que contém nove repetições tetranucleotídicas e uma

repetição incompleta de três nucleotídeos, pois na sétima repetição falta uma única

adenina fora da normal na unidade de repetição AATG (PUERS et al., 1993).

Os microssatélites apresentam um grau de polimorfismo substancial, embora

sejam menos variáveis do que os minissatélites. Os microssatélites são

particularmente interessantes nas análises forenses, no que tange a análise de

amostras degradadas ou com quantidade limitada de DNA. Por serem menores, os

microssatélites são passíveis de co-amplificação (multiplex). Reações de multiplex

são definidas como amplificações simultâneas de múltiplas regiões de DNA,

adicionando mais de um par de iniciador na reação. A figura 3 esquematiza uma

reação de PCR. Nesse exemplo, 3 locos separados são amplificados

simultaneamente utilizando 3 pares de iniciadores diferentes. A amplificação

resultante é composta por produtos de diferentes tamanhos. Atualmente existem

30

sistemas comerciais para co-amplificação de até 15 microssatélites altamente

polimórficos.

Figura 3 - Reação de Multiplex. Amplificações simultâneas de múltiplas regiões de DNA, envolvendo

mais de um par de iniciador. Cada iniciador é desenhado para amplificar diferentes locos.

Fonte - a autora.

A base destes sistemas polimórficos são treze locos estabelecidos como

conjunto mínimo a ser utilizado em genética forense nos Estados Unidos pelo FBI

(do inglês, Federal Bureau of Investigation). Este conjunto de treze locos é

conhecido como “CODIS (do inglês, Combined DNA Index System) core loci” e

compreende os seguintes locos: TPOX, D3S1358, FGA, D5S818, CSF1PO,

D7S820, D8S1179, THO1, VWA, D13S317, D16S539, D18S51,e D21S11.(Figura

4)(BUDOWLE, 1998). A análise dos STRs é mais sensível do que os outros métodos

e consegue recuperar informações provenientes de uma única célula. Além disso,

permite a detecção em sistemas fluorescentes que foram desenvolvidos para

permitir uma automação substancial do gel de eletroforese e a interpretação dos

perfis de DNA (FREGEAU et al., 1993; MICKA et al., 1999; BUTLER, 2005).

31

Figura 4 – Locos do sistema Codis com suas localizações cromossômicas.

Fonte - http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/fbicore.htm (acessado em 01/2007).

O uso de marcadores adicionais geralmente é utilizado para obter maiores

informações sobre determinadas amostras. A grande maioria dos polimorfismos de

DNA pode ser dividida em dois grupos: os baseados em substituições nucleotídicas

(SNPs, do inglês single nucleotide polymorphism) e os baseados em inserções-

deleções de um ou mais nucleotídeos (conhecidos como indels e STRs)(BUTLER,

2005).

Os SNPs se apresentam normalmente na forma de dois alelos, onde o alelo

menos freqüente possui uma freqüência mínima de 1%. Estimativas dão conta de

que dois indivíduos escolhidos ao acaso terão em média um nucleotídeo diferente a

cada 1331 pares de base (TISMWG, 2001). Estima-se que existam em torno de 10-

32

15 milhões de SNPs com alelo menos freqüente acima de 5% e aproximadamente 3

milhões com alelo menos freqüente entre 30-40% (KRUGLYAK et al., 2001).

O interesse pelos SNPs na área de genética forense é crescente. Esse

interesse é devido a um número de características que os tornam muito apropriados

para os estudos forenses: primeiramente, a baixa taxa de mutação (interessante

para testes de paternidade); segundo, eles são adequados para análises utilizando

alta tecnologia e automação; principalmente porque é possível conseguir um

amplicon com tamanho reduzido e pela abundância dos mesmos (KWOK et al.,

1999; SOBRINO et al., 2005; KIDD et al., 2006). A grande vantagem da utilização

dos SNPs é que o tamanho do produto de amplificação pela PCR pode ser a

princípio, tão grande quanto os pares de iniciadores específicos (aproximadamente

50 pb). Comparado aos 300 pb necessários para estudo de um STR, os SNPs

tornam-se ferramentas de alto interesse para a análise de materiais extremamente

degradados (JOBLING et al., 2004).

Entretanto, os SNPs apresentam algumas limitações. Primeiro o número de

SNPs necessários é quatro vezes maior do que o número de STRs

(CHAKRABORTY et al., 1999; GILL, 2001b). Assim, aproximadamente 60 SNPs

serão necessários para se obter um poder de discriminação equivalente aquele

obtido com os sistemas multiplex de STRs em uso na área forense (GILL et al.,

2004). Segundo, as vantagens de custo ainda não estão claras. A despeito das

vantagens e desvantagens da aplicação de SNPs em genética forense, os testes de

paternidade ainda podem ser realizados de maneira mais simples e a custo mais

baixo utilizando os STRs, sem falar na experiência em STRs ao longo dos últimos 10

anos(AMORIM et al., 2005).

Dificilmente os SNPs substituirão os STRs, pelo menos pelos próximos

anos, devido ao grande esforço feito mundialmente para o estabelecimento de

banco de dados de perfis de criminosos, onde provavelmente não serão substituídos

por outros marcadores sem considerável custo econômico. Entretanto os SNPS

constituem uma excelente ferramenta que pode contribuir nas resoluções de casos

mais complicados. (GILL, 2001b; BIESECKER et al., 2005).

Além dos STRs e SNPs, as indels bialélicas (inserções e deleções)

constituem uma classe de locos polimórficos com grande potencial de serem

33

incorporadas ao arsenal das ferramentas moleculares utilizadas em genética forense

(WEBER et al., 2002; BUTLER, 2005). As indels bialélicas variam muito na diferença

de comprimento dos alelos, entretanto o maior grupo de indels bialélicas são

aquelas que a diferença entre o comprimento do alelo é de apenas alguns

nucleotídeos (WEBER et al., 2002) Os dois alelos das indels bialélicas podem ser

classificados como curto e longo (BUTLER, 2005). As indels bialélicas tornam-se

interessantes para a genética forense quando levado em consideração o tamanho

de seus produtos, que podem ser menores do que 100 pb, o que as torna

potencialmente co-amplificáveis a um nível maior do que os STRs (WEBER et al.,

2002). Em 2002, Weber et al. publicaram um estudo onde relatavam as

propriedades básicas das indels bialélicas em humanos através da análise de 2000

polimorfismos (WEBER et al., 2002). Um conjunto de 40 indels selecionadas a partir

das 2000 investigadas por Weber et al. foram utilizadas em um estudo populacional

(BASTOS-RODRIGUES et al., 2006) envolvendo amostras do painel mundial de

diversidade genética humana (HGDP, do inglês, human genetic diversity panel)

(CANN et al., 2002)

Em suma, a abundância das indels bialélicas e a facilidade para sua análise

tornam-nas de grande interesse na área forense onde ainda não foi publicado

nenhum trabalho com a utilização das mesmas.

4.3 Marcadores de linhagem em genética forense

4.3.1 Cromossomo Y

Acredita-se que o surgimento dos cromossomos sexuais dos mamíferos

tenha sua origem em um par de cromossomos autossômicos há aproximadamente

300 milhões de anos (LAHN et al., 2000). Um processo irreversível durante a

evolução dos cromossomos sexuais é a supressão da recombinação X-Y de regiões

progressivamente maiores. Esse processo afetou os dois cromossomos sexuais de

34

maneiras diferentes. Sendo assim, o cromossomo Y passa a ser responsável pela

determinação do sexo (LAHN et al., 2000).

O Y é terceiro menor cromossomo em humanos, com quase 60 Mb(HARRIS

et al., 1986), apenas um pouco maior que o cromossomo 21 (47 Mb) e que o

cromossomo 22 (49 Mb)(BUTLER, 2005). Aproximadamente 95% de sua seqüência

é denominada de NRY (do inglês, non-recombining region), ou região sem

recombinação devido ao fato de não sofrer recombinação e estar presente apenas

no sexo masculino. A região NRY é repleta de elementos de repetição e pode ser

dividida em três: região eucromática, centromérica e heterocromática (FOOTE et al.,

1992; TILFORD et al., 2001). A região eucromática é constituída por 24 Mb e a

região heterochromática (Yqh) por 30 Mb (FOOTE et al., 1992). As duas pontas do

cromossomo Y, conhecidas como regiões pseudo-autossomais (PAR, do inglês

pseudo-autosomal regions), recombinam com as regiões homólogas do

cromossomo X. A região PAR1 encontra-se na extremidade do braço curto (Yp) do

cromossomo Y e possui 2,5 MB, enquanto a região PAR2 que se localiza na

extremidade do braço longo (Yq) possui menos de 1 Mb (BUTLER, 2005). Em 2003,

Skaletsky et al. renomearam a região NRY de MSY (do inglês, male specific region)

devido a evidência da conversão gênica freqüente ou recombinação

intracromossomal (SKALETSKY et al., 2003).

Na espécie humana, assim como nos demais mamíferos, o sexo masculino

é o heterogamético, ou seja, o sexo masculino apresenta gametas com diferentes

cromossomos sexuais, o X e o Y, enquanto que o feminino não possui uma

representação do cromossomo Y no seu genoma. Esse cromossomo é herdado

paternalmente, por uma via direta entre o pai e o filho, o que representa que ambos

possuem a mesma cópia deste cromossomo. Adicionalmente, este é, em quase sua

totalidade, não recombinante, ou seja, não ocorre troca de material genético com o

seu par (o cromossomo X), exceto nas regiões pseudo-autossomais (GRAVES et al.,

1998). As mutações são as únicas formas de mudança no genoma deste

cromossomo, que é passado para a próxima geração. Logo, se indivíduos

compartilham uma mesma combinação de alelos para locos polimórficos do

cromossomo Y, isto é, o mesmo haplótipo, estes o fazem por ancestralidade comum.

Desta forma o cromossomo Y de um homem representa a história única de sua

35

linhagem patrilinear. Essas características tornam o cromossomo Y uma ferramenta

útil para rastrear a evolução humana através das linhagens masculinas, assim como

para aplicação em diversas situações forenses (SANTOS et al., 1993; JOBLING et

al., 1995), incluindo aquelas envolvendo evidências de abuso sexual que contenham

mistura de DNA masculino e feminino (PRINZ, MECHTHILD et al., 1997; PRINZ et

al., 2001).

Em 1992, Roewer et al. descreveram o primeiro marcador polimórfico do tipo

microssatélite no cromossomo Y, o Y-27H39, hoje conhecido como o loco DYS19

(ROEWER et al., 1992). Nos 10 anos seguintes, a descoberta de marcadores

polimórficos no cromossomo Y não foi tão veloz quanto à caracterização de

polimorfismos autossômicos. No início de 2002 existiam apenas 30 marcadores do

cromossomo Y disponíveis aos cientistas. Atualmente existem cerca de 200

microssatélites caracterizados no cromossomo Y, assim como em torno de 250

polimorfismos binários (PRINZ, MECHTHILD et al., 1997; BUTLER, 2003;

SCHOSKE et al., 2003; KAYSER et al., 2004; BUTLER, 2005).

No ano de 1997, a comunidade forense européia selecionou um grupo de 9

marcadores do cromossomo Y para formar um painel denominado de haplótipo

mínimo (KNIJFF et al., 1997; CAGLIÀ et al., 1998; SCHNEIDER et al., 1999).

Atualmente em genética forense os microssatélites mais usados são os constituintes

do haplótipo mínimo, que incluem: DYS19, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391,

DYS392, DYS393 e DYS385a/b. O haplótipo estendido inclui todos esses

marcadores do haplótipo mínimo mais a repetição dinucleotídica altamente

polimórfica, YCAII a/b (KNIJFF et al., 1997; ROEWER et al., 2001) (Figura 5).

O primeiro kit comercial a ser lançado no mercado foi o Y-Plex

TM

da

ReliaGene Technologies (Nova Orleans, LA) que co-amplificava DYS19, DYS389II,

DYS390, DYS391, DYS393 e DYS385a/b. Após este surgiram outros kits que

permitiam a amplificação do haplótipo mínimo e outros marcadores como:

AmpAmpFℓSTR® Y-filer™ PCR Amplification Kit (17 locos) e PowerPlex

®

Y System

(12 locos). Estes kits são conseqüências dos trabalhos do grupo de John Butler no

NIST (do inglês, National Institute of Standard Technology). Em 2002 eles

desenvolveram um multiplex capaz de amplificar simultaneamente 20 Y-STRs,

sendo o primeiro multiplex a amplificar simultaneamente o haplótipo mínimo e o

36

estendido, além de Y-STRs adicionais, oferecendo um aumento do poder de

discriminação (BUTLER et al., 2002; SCHOSKE, 2003). Além desse 20plex, o grupo

de Hanson, em 2004, desenvolveu um “megaplex” do cromossomo Y, capaz de

amplificar simultaneamente 21 locos (HANSON, 2004).

O maior e mais pesquisado banco de dados de Y-STR, é o criado por

Roewer et al. na Humbolt University em Berlim (WILLUWEIT, ; ROEWER et al.,

2001). Este banco criado em 2000 é provido de informações provenientes de 89

instituições colaborativas dispersas em 36 países diferentes (BUTLER, 2005). As

informações desse banco de dados baseiam-se no haplótipo mínimo e podem ser

acessadas através dos sites: http://www.ystr.org ou http://www.yhrd.org. Outros

bancos de dados de Y-STR também estão disponíveis na rede mundial de

computadores como: http://www.promega.com (12 locos do PowerPlex

®

Y System) e

http://www.appliedbiosystems.com (17 locos do AmpAmpFℓSTR® Y-filer™ PCR

Amplification Kit) entre outros (BUTLER, 2005).

Muitos trabalhos têm sido dedicados ao uso de Y-STRs em genética forense

(PRINZ, M. et al., 1997; BETZ et al., 2001; SIBILLE et al., 2002; HALL et al., 2003;

PEREIRA et al., 2006; REDD et al., 2002), entretanto estes não são os únicos

marcadores presentes no cromossomo Y. Um número cada vez maior de Y- SNPs

têm sido identificados e utilizados principalmente em estudos sobre a história e

origem das populações humanas (RAITIO et al., 2001), além de servirem como

informação complementar à análise dos STRs. Experimentalmente vários sistemas

para genotipagem de Y-SNPs têm sido publicados, sendo que um estudo para

genotipagem de 35 Y-SNPs (SANCHEZ et al., 2003) pela amplificação de 25

fragmentos de DNA e outro estudo com a genotipagem de 50 SNPs pelo uso de três

multiplexes (VALLONE et al., 2004b) o mais expressivos do ponto de vista da

genética forense.

37

Figura 5 - Cromossomo Y humano. A região NRY que constitui 95% do cromossomo Y é dividida em

três: eucromatina, centrômero e heterocromatina. Os outros 5% do cromossomo Y compreendem as

regiões que sofrem recombinação, ou seja, a PAR1 e a PAR2 (em laranja). Em azul, estão indicados

os locos constituintes do haplótipo mínimo e em preto, outros locos caracterizados no cromossomo Y.

Fonte - www.cstl.nist.gov (figura modificada com base em acesso em janeiro de 2007).

4.3.2 DNA mitocondrial

As mitocôndrias são organelas pequenas, de forma oval, compostas por

duas membranas altamente especializadas, que fornecem energia para o uso

celular, através dos processos enzimáticos da fosforilação oxidativa. Essas

organelas provavelmente evoluíram de alfa-proteobactérias que desenvolveram

relações endossimbióticas com as células hospedeiras, há mais de um bilhão de

anos (GRAY, 1999; SCHEFFLER, 2000a). Embora as mitocôndrias possuam seu

38

próprio genoma, muitos genes codificadores de proteínas mitocondriais são

encontrados no núcleo celular (TAANMAN, 1999; SCHEFFLER, 2000b).

O genoma mitocondrial humano é organizado em uma fita dupla de DNA

circular, com 16569 pb, sendo altamente conservado (ANDERSON et al., 1981).

Existe uma média de 4-5 cópias de moléculas de mtDNA por mitocôndria, podendo

variar de 1-15 (SATOH et al., 1991) e o número de mitocôndrias é variável de acordo

com o tipo celular, podendo chegar a mais de 1000 organelas por célula (ROBIN et

al., 1988).

O genoma mitocondrial humano teve sua seqüência primária descrita por

Anderson et al. em 1981 (ANDERSON et al., 1981) e recentemente revisada por

Andrews et al (ANDREWS et al., 1999). A distribuição desigual de purinas e

pirimidinas entre as duas fitas motivou a nomenclatura para as mesmas. A cadeia

pesada (designada como H, do inglês heavy), para as fitas ricas em purinas, e a

cadeia leva (designada como L, do inglês light), para a fita rica em pirimidinas

(KASAMATSU et al., 1974). No mtDNA encontram-se 37 genes que codificam 2

rRNAs, 22 tRNAs e 13 subunidades protéicas de enzimas da cadeia fosforilativa

(ANDERSON et al., 1981). A organização gênica é econômica, os genes não

possuem íntrons, não tem região intergênica ou a mesma é limitada a poucos pares

de bases. Além da região codificante, há uma região de controle, a região D loop (do

inglês, displacement loop), que engloba o sítio de iniciação da replicação do DNA e

da transcrição, com uma pequena seqüência que não codifica proteína ou RNA

(ANDERSON et al., 1981) (Figura 6). Essa região é o principal sítio de controle de

expressão gênica do mtDNA e está compreendida entre os nucleotídeos da posição

16024-16569 e 1-576, conforme a nomenclatura sugerida por Anderson et al

(ANDERSON et al., 1981) e em contraste com a porção codificante, apresenta alta

variabilidade entre indivíduos, provavelmente devido à reduzida pressão seletiva

exercida nessa porção não codificante. A baixa fidelidade da mtDNA polimerase e a

aparente falta de mecanismos de reparo, levou à alta taxa de mutações no genoma

mitocondrial quando comparado ao genoma nuclear. De acordo com Vigilant et al.,

1991 a taxa de mutação da região controle é dez vezes maior do que a porção

codificante (VIGILANT et al., 1991). A maioria das variações de seqüência entre

indivíduos é encontrada dentro de dois fragmentos específicos da região de controle:

39

a região hipervariável I (HVI) e a região hipervariável II (HVII), localizadas entre os

nucleotídeos 16240-16383 e 73-340, respectivamente.

A análise do mtDNA para fins de análise forense envolve o seqüenciamento

e análise de polimorfismos nas regiões HVI, HVII e ocasionalmente HVIII (GINTHER

et al., 1992; GILL et al., 1994; LUTZ et al., 2000; BINI et al., 2003). Com o

seqüenciamento de genomas mitocondriais completos de indivíduos de diferentes

grupos populacionais (INGMAN et al., 2000; HERRNSTADT, 2002), um grande

número de polimorfismos da região codificante foram caracterizados como

associados a determinados haplogrupos e alguns trabalhos tem sugerido o uso de

ensaios onde a genotipagem hierárquica destes SNPs podem vir a ter aplicação em

genética forense (BRANDSTATTER et al., 2003a; BRANDSTATTER et al., 2003b;

QUINTANS et al., 2004; AMORIM et al., 2005; BONILLA et al., 2005; COBLE et al.,

2006). A principal vantagem da análise de mtDNA, é o grande número de cópias

existentes por célula, em uma única célula existem cerca de centenas a milhares de

cópias. Já em cada conjunto de cromossomos nucleares estão presentes somente

duas cópias. O nível de variabilidade das regiões hipervariáveis aliado ao alto

número de cópias de mtDNA em relação ao DNA autossômico, fazem do mtDNA

uma ferramenta importantíssima em casos forenses como pessoas desaparecidas

ou desastres em massa, em todas as situações com baixa quantidade de DNA.

40

Figura 6 - Mapa do genoma mitocondrial humano. Os genes codificados pelo DNA mitocondrial

(mtDNA) estão indicados por grupos funcionais. As mutações pontuais associadas com doenças

mitocondriais são indicadas no centro do genoma. A região não codificante do D-loop está localizada

no topo da figura e a posição do nucleotídeo 1 indicada na posição de meio-dia.

Fonte - MitoMap (http://www.mitomap.org/) (acessado em 01/2007).

41

4.3.3 Marcadores polimórficos no cromossomo X

Conforme dito anteriormente, os cromossomos sexuais originaram-se de

cromossomos autossômicos entre 300 e 350 milhões de anos atrás, logo após a

separação de aves e mamíferos (CHOW et al., 2005; BACHTROG, 2006). Os

cromossomos X e Y após adquirirem o papel de determinação sexual, pararam de

recombinar um com o outro, o que levou o cromossomo Y a se degenerar enquanto

o cromossomo X manteve a maioria de seus genes ancestrais (BACHTROG, 2006).

O cromossomo X humano tem aproximadamente 155 Mb e contém 1098

genes (ROSS et al., 2005). Logo, o cromossomo X é um dos maiores cromossomos

humanos, mas possui uma densidade gênica um pouco menor do que os

cromossomos autossômicos. A baixa densidade gênica é acompanhada por um

excesso de elementos repetitivos quando comparado ao resto do genoma (CHOW et

al., 2005). Além disso, o cromossomo X possui duas características que o distingue

dos cromossomos autossômicos: os machos só carregam um cromossomo X, sendo

hemizigotos; cromossomo X passa 2/3 do tempo nas fêmeas e apenas 1/3 do tempo

nos machos.

A inativação do X, primeiramente descrito por Lyon em 1961 (LYON,

1961), resulta no silenciamento de um dos cromossomos X da fêmea, a fim de

atingir uma equivalência de dosagem com os machos que possuem apenas um

cromossomo X e um cromossomo Y, que determina o sexo. Bem no início do

desenvolvimento das fêmeas de mamíferos, um dos cromossomos X de cada célula

torna-se inativado. O cromossomo X inativado torna-se altamente condensado e é

visível como um ponto de coloração escura, chamado corpúsculo de Barr. Esta

inativação cromossômica persiste por todas as multiplicações mitóticas

subseqüentes que produzem o corpo adulto do animal. O processo de inativação é

aleatório, afetando um ou outro cromossomo X. Como resultado desta inativação, o

corpo da fêmea adulta é uma mistura, ou mosaico, de células com um ou outro

genótipo dos dois cromossomos X diferentes (CHOW et al., 2005).

Os marcadores autossômicos, mitocondriais, e do cromossomo Y têm sido

amplamente usados em genética forense, entretanto, a utilização de marcadores do

42

cromossomo X está na sua fase inicial (EDELMANN et al., 2001; SZIBOR et al.,

2003). A idéia do uso de marcadores do cromossomo X para auxiliar a identificação

humana é relativamente nova, originando-se em meados da década de 90 e início

desta década. Portanto a quantidade de informação disponível sobre o tema ainda é

escassa quando comparada com a disponibilidade de informação sobre marcadores

autossômicos e do cromossomo Y. Contudo, o cromossomo X tem recebido a

atenção de alguns grupos de pesquisadores com o intuito de reverter esse quadro,

como mostra a página de internet http://www.chrx-str.org, disponibilizada

recentemente (SZIBOR et al., 2006).

Os marcadores do cromossomo X (Figura 7) servem como eficiente

complemento nas análises realizadas com marcadores autossômicos e do

cromossomo Y, especialmente em casos complexos de parentesco. Esses casos

complexos de parentesco foram a grande motivação do aumento de estudos de

cromossomo X para sua aplicação em genética forense.

Em contraste com o cromossomo Y, que não sofre recombinação durante a

meiose, os marcadores autossômicos e do cromossomo X necessitam de ter sua

localização genética determinada precisamente, quando utilizados em testes de

parentesco. A determinação da localização dos marcadores do cromossomo X é

essencial, pois é a partir desta que se poderá saber a possibilidade de análise de

seus marcadores, de forma independente ou de forma dependente (POWLEY, 2002;

SZIBOR et al., 2006). Quando os locos apresentam-se independentes uns dos

outros, o índice de paternidade pode ser calculado para cada loco e depois

combinado por multiplicação dos mesmos (POWLEY, 2002; SZIBOR et al., 2006).

Um diferente tipo de análise consiste na utilização de perfis haplotípicos.

Quando os locos estão muito próximos regularmente apresentam-se em

desequilíbrio de ligação. Sendo assim, não é mais possível trabalhar com índices de

paternidade individuais para cada loco e depois combiná-los por multiplicação. Ao

invés disso, perfis haplotípicos devem ser usados para construir um único índice de

paternidade, pela análise das amostras populacionais. Um problema encontrado é

que os métodos disponíveis disponibilizam apenas os genótipos de cada loco e os

haplótipos de mulheres não podem ser determinados precisamente. Além disso,

existem inúmeras configurações de perfis haplotípicos que podem levar ao perfil

43

genético gerado, impossibilitando a configuração exata do haplótipo ocorrido

realmente (POWLEY, 2002; SZIBOR et al., 2006).

Figura 7 - Cromossomo X humano e seus principais marcadores STRs. Os marcadores

DXS6801, DXS6809, e DXS6789, quando analisados conjuntamente constituem um

haplótipo. O mesmo acontece quando analisamos os marcadores DXS7424 e o DXS101

em conjunto.

Fonte -

http://www.chrx-str.org (acessado em 01/ 2007).

44

Em testes de paternidade onde não se tem acesso ao material genético do

suposto pai, a utilização de microssatélites autossômicos passa pela reconstrução do

genótipo do suposto pai utilizando informação de parentes (reconstrução de

paternidade) ou pelo teste de relação deste parentesco entre um parente do suposto

pai com o filho em questão (teste de Kinship). Em ambos os casos, há uma perda

considerável no poder estatístico de se afirmar que o cenário obtido favorece a

hipótese de paternidade ou a hipótese de não paternidade. Em situações onde a

criança é do sexo masculino, a utilização de marcadores do cromossomo Y é uma

ferramenta importante na resolução de casos com suposto pai ausente (SANTOS et

al., 1993; GILL et al., 2001; JOBLING et al., 2003; GUSMAO et al., 2006). Quando a

criança é do sexo feminino, torna-se interessante e eficiente a utilização de

marcadores do cromossomo X, já que os homens são hemizigotos para o

cromossomo X, ou seja, carregam apenas um cromossomo X, portanto: a

genotipagem do cromossomo X em homens automaticamente revela seu haplótipo; o

homem transmite seu cromossomo X inteiro para sua filha, logo o haplótipo paterno

do cromossomo X pode ser detectado em suas filhas; todas as irmãs compartilham o

haplótipo do cromossomo X paterno; os alelos do cromossomo X não compartilhado

por irmãs são obrigatoriamente de origem materna; a genotipagem de duas ou mais

irmãs revela o haplótipo do cromossomo X paterno e grande parte do genótipo

materno do cromossomo X; a genotipagem de dois ou mais irmãos provê grande

parte do genótipo materno do cromossomo X; além disso, é muito provável que

haplótipos de grupos de ligação permaneçam estáveis através de muitas gerações,

tornando-se um eficaz meio para demonstrar parentesco (SZIBOR et al., 2003).

Além dos casos de paternidade com o suposto pai ausente, a utilização dos

marcadores do cromossomo X torna-se mais informativa do que os marcadores

autossômicos ou do que microssatélites do cromossomo Y em casos de parentesco

onde se tenha somente parentes distantes para serem testados e em casos de

maternidade (EDELMANN et al., 1999; BINI et al., 2005).

Em casos de paternidade onde a criança é do sexo feminino, os

marcadores do cromossomo X possuem uma probabilidade de exclusão (PE ou

MEC – do inglês, Mean of Exclusion Chance) (KRUGER et al., 1968)maior do que

45

os marcadores autossômicos com valores de PIC (do inglês, Polymorphism

Information Content) similares. Kishida et al (KISHIDA et al., 1997) modificaram a

fórmula original proposta por Krüger et al para a aplicação em marcadores do

cormossomo X. Essa modificação levou a um aumento do valor do MEC, uma vez

que os homens são diplóides para todos os cromossomos autossômicos e

hemizigotos para o cromossomo X (EDELMANN et al., 2001; POWLEY, 2002;

SZIBOR et al., 2003) .

Espera-se que a demanda para testes de parentesco, onde apenas

parentes distantes estejam disponíveis para teste, cresça, particularmente a partir

do desejo de reunir famílias nos contextos de guerra e de migração. Além disso, a

identificação de corpos e ossadas de vítimas de guerra ou de desastres de massa

necessita de uma combinação de métodos sofisticados. Nesse contexto, deve-se

chamar a atenção de que algumas vezes os marcadores do cromossomo X são

mais eficientes do que os cromossomos autossômicos, especialmente em casos

que envolvam a paternidade de uma mulher ou a maternidade de um homem. Isso

é refletido pelas fórmulas usadas para calcular a chance média de exclusão (MEC)

para marcadores autossômicos e marcadores do cromossomo X. Se os marcadores

possuem um conteúdo de informação de polimorfismo (PIC) comparável, o MEC

para o cromossomo X é maior do que para os marcadores autossômicos (SZIBOR,

2007). A opção de utilização de produtos amplificados de tamanho menor, gerados

a partir de marcadores do cromossomo X devem ser considerados, especialmente

se restos de ossadas humanas estiverem sendo analisadas, ou outras amostras de

difícil análise (ASAMURA et al., 2006a).

Algumas considerações éticas devem ser feitas no que concerne à análise

de marcadores do cromossomo X. Quando aberrações gonossomais ou casos de

feminilização testicular são detectados, a utilização do cromossomo X torna-se uma

ferramenta inválida para testes de parentesco (SZIBOR, 2007). É necessário

ressaltar que estas informações quando obtidas inadvertidamente durante um teste

de parentesco devem ser mantidas em confidencialidade. Informações relacionadas

a doenças não devem ser reveladas ao indivíduo afetado a menos que esse solicite

(SZIBOR et al., 2003).

46

Em vários países, os geneticistas forenses seguem o princípio de que um

teste de DNA forense não deve revelar doenças ou predisposições genéticas. A

análise de marcadores do cromossomo Y e do mtDNA podem revelar informações

sobre a origem étnica do indivíduo. Entretanto essa informação não é considerada

uma intromissão na privacidade do indivíduo. A princípio, o mesmo se aplica na

determinação de sexo com os cromossomos X e Y. Contudo, aberrações

cromossômicas como a Sídrome de Klinefelter podem ser descobertas quando

marcadores do cromossomo X são usados. Essa doença está relacionada ao

cariótipo 47XXY e pode ser reconhecida pela detecção de dois cromossomos X em

um indivíduo do sexo masculino. Já a Síndrome de Ulrich-Turner, onde o cariótipo é

de 45, X, o indivíduo do sexo feminino apresenta apenas um cromossomo X,

plenamente funcional, também pode ser diagnosticada pela análise de marcadores

do cromossomo X.

Desde 1998, o marcador HumARA descoberto por Desmarais et al.

(DESMARAIS et al., 1998)vem sendo utilizado como marcador do cromossomo X.

Todavia, desde o início das análises com esse marcador, sabia-se que a repetição

CAG do HumARA está localizada em uma região codificante do gene receptor de

andrógeno, éxon 1, codificando para um trato poliglutamínico. Em1991, La Spada et

a (LA SPADA et al., 1991) provou que uma mutação nesse loco acarretaria no

desenvolvimento de Atrofia Muscular Bulbo Espinhal (AMBE), que ocorre quando a

repetição trinucleotídica ultrapassa de 43. Além da AMBE, a análise do marcador

HumARA pode detectar outros riscos a saúde. Por esse motivos, o marcador

HumARA não tem sido usado por diversos geneticistas para análises forenses,

embasados na consideração ética citada acima (SZIBOR, 2007) .

4.4 Amostras com quantidades mínimas de DNA e/ou degradadas em

Genética Forense

As amostras de referência (suspeitos e vítimas) quando coletadas

diretamente não constituem desafio para o estudo dos mais diversos sistemas

polimórficos adotados na prática forense. No entanto, quando se trata da análise de

47

evidências biológicas coletadas na cena de crime, o cientista forense pode deparar-

se com cenários onde obter um perfil de DNA torna-se um enorme desafio, pois

amostras com quantidades mínimas e/ou degradadas não são incomuns.

Especificamente no que diz respeito à quantidade de DNA, estima-se que sejam

necessárias pelo menos 60 cópias de DNA genômico (200 pg) para sua análise

(SUN et al., 2005). Com o intuito de maximizar a chance de se obter um perfil de

amostras em que a quantidade de DNA esteja abaixo de 100 picogramas, alterações

nos protocolos de amplificação são sugeridas. Estas alterações são tratadas dentro

do conceito de LCN (do inglês, low copy number) (GILL, 2001b)onde existe um

aumento no número de ciclos na reação de PCR de 28-30 para 32-34 ciclos.

Geralmente os fabricantes de kits multiplex recomendam 250 pg como o limite mais

baixo de sensibilidade. A quantidade ótima de DNA recomendada nos sistemas

comerciais disponíveis para co-amplficação de microssatélites é 1 ng de DNA com o

número de ciclos de PCR variando entre 28-30 ciclos(GILL, 2001a). Logo, os

cientistas forenses, buscaram uma metodologia simples para acrescentar

sensibilidade às metodologias padrões, aumentando o número de ciclos na PCR

(GILL et al., 2000; WHITAKER et al., 2001). Com uma quantidade de DNA menor do

que 100 pg, não há vantagem em acrescer o número de ciclos para mais de 34, pois

um aumento maior do que 34 ciclos induz a ampliação da presença de artefatos e o

perfil torna-se altamente desbalanceado. Para uma maior confiabilidade nas reações

de LCN-DNA, sugere-se que as amplificações sejam repetidas duas ou mais vezes e

comparadas a fim de gerar um perfil alélico mais confiável (GILL et al., 2000; GILL,

2001a).

A técnica de LCN causou impacto na ciência forense, mas também trouxe

alguns desafios em relação à interpretação de seus resultados. Existem

conseqüências que não podem ser evitadas, como o desbalanceamento dos picos

dos heterozigotos. Isso pode tornar-se tão extremo, ao ponto de um heterozigoto

aparecer como um homozigoto, na literatura em inglês definido como “allele

dropout”. Este fenômeno acontece devido à amplificação preferencial de um dos

alelos em um loco heterozigoto. O desbalanceamento de heterozigotos aumenta

com a diminuição da quantidade de DNA e com o aumento do número de ciclos de

PCR. Além desse problema, a interpretação de “stutters” como alelos, pode levar a

48

identificação de um homozigoto como heterozigoto (GILL et al., 2000; GILL, 2001a).

Deve ficar claro na apresentação dos resultados, que as amplificações de LCN-DNA

não podem ser vistas como as mesmas amplificações de uma amostra de DNA

dentro das condições padrões.

A necessidade de amplificar seqüências de DNA a partir de células únicas,

principalmente no âmbito do diagnóstico em células cancerosas e em células

embrionárias, levou ao desenvolvimento de uma série de métodos que amplificam o

número de cópias de um determinado genoma. Estas técnicas são conhecidas por

WGA (do inglês, Whole Genome Amplification) e consistem na amplificação do

genoma total, anterior a uma amplificação pela PCR loco-específica (CHEUNG et al.,

1996; WELLS et al., 1999; HOSONO et al., 2003; LASKEN et al., 2003;

SCHNEIDER et al., 2004; BERGEN et al., 2005). Em 1992 os dois primeiros

métodos de WGA foram publicados, o DOP-PCR (do inglês Degenerate

Oligonucleotide Primed PCR) (TELENIUS et al., 1992a; TELENIUS et al., 1992b)e o

PEP (do inglês Iniciador Extension Preamplification)(ZHANG et al., 1992; HUGHES

et al., 2005). Para aumentar a eficiência do PCR e o rendimento do DNA, foram

feitas algumas modificações nessas metodologias levando ao aparecimento do LL-

DOP-PCR (do inglês Long products from low quantities DOP-PCR) (KITTLER et al.,

2002)e do Improved PEP (I-PEP) (DIETMAIER et al., 1999). Entretanto, nenhuma

das metodologias pretende amplificar o DNA em sua totalidade ou dão uma

cobertura completa de determinado loco (GILL, 2001a; HUGHES et al., 2005). Ao

contrário, estes protocolos produzem uma fonte amplificada para genotipagem ou

identificação de marcador de algum tipo, além de serem tendenciosos quanto à

modificação da informação contida no DNA(SCHNEIDER et al., 2004). Por essas

razões, um novo método para WGA foi introduzido nos últimos anos e tem

despertado grande expectativa. Este método é baseado na SDA (do inglês Strand

Displacement Amplification) ou MDA (do inglês Multiple Displacement Amplification)

(DEAN et al., 2001; DEAN et al., 2002). A técnica permite a amplificação de

amostras com baixo número de cópias de DNA, gerando grandes quantidades de

DNA. Na técnica MDA, o DNA é amplificado isotermicamente usando a enzima Φ29.

A polimerase Φ29 utiliza a extremidade 3’ livre como início da replicação, mas esta

não para ao encontrar a extremidade 5’. A Φ29 desloca a fita da extremidade 5’ e

49

continua com o processo de amplificação. Novos hexâmeros irão se ligar à fita que

foi deslocada, e iniciarão novos sítios de replicação levando praticamente a uma

reação exponencial. Além disso, a polimerase Φ29 tem um aumento na fidelidade da

replicação de 10 vezes em relação à Taq polimerase (HUGHES et al., 2005). A taxa

de erro da Φ29 DNA polimerase é de um em 10

6

em contraste aos três em 10

4

ou

1.6 em 1 milhão da Taq polimerase (DEAN et al., 2002; HUGHES et al., 2005).O

produto de MDA é favorecido quando comparado ao produto de ouras técnicas de

WGA, levando em consideração a amplificação não tendenciosa, a reprodutibilidade,

a preservação seqüência e a boa cobertura do genoma (HELLANI et al., 2004;

HUGHES et al., 2005).

Até bem pouco tempo a alternativa para amostras altamente degradadas se

restringia ao estudo de polimorfismos do mtDNA. Já que neste sistema, um conjunto

de iniciadores para amplificação de fragmentos muito pequenos pode ser utilizado

(WILSON et al., 1995). No entanto, haplótipos de mtDNA são menos informativos

que os STRs quando trata-se de associar evidências com suspeitos ou vítimas. A

alternativa encontrada para incluir os STRs na análise de amostras degradadas foi o

desenvolvimento de novos conjuntos de iniciadores que diminuem o tamanho dos

produtos amplificados da faixa de 100 -450 pb nos sistemas comerciais para 100 –

200 pb, chamados de mini-STRs (BUTLER et al., 2003; HOLLAND et al., 2003;

SANCHEZ et al., 2003; DRABEK et al., 2004; BUDOWLE et al., 2005; BUTLER,

2005; COBLE et al., 2005). Alternativamente aos mini-STRs, os fragmentos

amplificados para genotipagem de SNPs estão na faixa de 60-200 pb, sendo uma

alternativa para a análise de amostras degradadas, muito embora os SNPs

apresentem a desvantagem de não serem informativos na análise de misturas e

oferecem um grande desafio a multiplexagem, já que um grande número precisa ser

genotipado (SANCHEZ et al., 2003). Outro sistema polimórfico que pode ser

explorado para a análise de amostras em quantidade mínima e/ou degradadas são

as indels. É nelas que reside a proposta de nosso trabalho, especificamente com

mini-indels (produtos de PCR na faixa de 70-170) distribuídas ao longo do

cromossomo X, para as quais serão investigados aspectos populacionais e de

comportamento em protocolos de LCN e WGA.

50

5 MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 Seleção das indels

As indels foram selecionadas a partir do NCBI® (do inglês, National Center

for Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov) no banco dbSNP®

(www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP ) (SHERRY et al., 1999; SHERRY et al., 2001) utilizando

os seguintes critérios durante a busca: X[chr] "in del"[snpclass] "human"[orgn]

1[weight] "by frequency"[validation] “Minimum frequency allele ranging from” 0,5 to

0,3. Para as indels recuperadas do banco de dados, um novo passo de seleção foi

aplicado, descartando aquelas em regiões de baixa complexidade, aquelas com

heterozigozidade abaixo de 0,3 e ou constituídas de apenas um nucleotídeo.

Também foram descartadas aquelas indels presentes em seqüências de elementos

repetitivos. Além disso, verificou-se a presença de SNPs nas vizinhanças das indels.

Utilizando freqüências alélicas disponíveis no banco de dados dbSNP foram

calculados parâmetros básicos de informatividade das indels selecionadas.

O grau de polimorfismo foi quantificado usando o calculador de conteúdo de

informação polimórfica, o PIC (do inglês, Polymorphic Information Content) baseado

na seguinte fórmula(BOTSTEIN, 1980):

∑

−−=

222

21 PjPiPiPIC

Onde: Pi e Pj = Frequência dos alelos i e j de um dado locus

A chance média de exclusão, MEC

T

(do inglês, Mean of Exclusion Chance)

para marcadores no cromossomo X em trios familiares (suposto pai, mãe e criança)

com a criança do sexo feminino, foi computado segundo (KISHIDA T., 1997),

utilizando a fórmula abaixo:

(

)

(

)

(

)

(

)

fjfifjfififjfifififiMEC

jiii

T

−−++−+−=

∑

<

111

2

3

Onde: fi (fj) = Frequência populacional dos alelos i (j)

51

A chance média de exclusão em duos familiares (suposto pai e criança),

MEC

D

para marcadores no cromossomo X, com a criança do sexo feminino, foi

computado segundo (DESMARAIS et al., 1998), utilizando a fórmula abaixo:

3

2

21

∑ ∑

+−=

i i

D

fifiMEC

Onde: fi = Frequência populacional do alelo i

A média do poder de discriminação em mulheres (PD

M

) foi calculada

segundo (DESMARAIS et al., 1998), utilizando a seguinte fórmula:

(

)

∑∑

+−=

ii

F

fifiPD

4

2

21

Onde fi = Frequência populacional do alelo i

E a média do poder de discriminação para marcadores no cromossomo X

em homens (PD

H

), também foi calculada segundo (DESMARAIS et al., 1998),

utilizando a fórmula:

∑

−=

i

M

fiPD

2

1

Onde fi = Frequência populacional do alelo i

5.2 Desenho dos iniciadores

As indels selecionadas fazem parte das 2000 indels caracterizadas por

(WEBER et al., 2002), entretanto os iniciadores foram redesenhados para gerarem

produtos de tamanho 70-170 pb. Com as indels selecionadas e conhecendo as

seqüências vizinhas das indels, partiu-se para o desenho dos iniciadores. Foram

desenhados iniciadores para cada seqüência escolhida utilizando o programa

Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/) (ROZEN et al., 2000). O programa Primer3 permite

ao usuário manipular certos parâmetros durante o processo de desenho. Alguns

desses parâmetros incluem comprimento mínimo e máximo do iniciador, temperatura

de anelamento mínima e máxima e o intervalo de tamanho do produto. Para o

desenho dos iniciadores das indels do cromossomo X, foram utilizados os

parâmetros padrões do programa, manipulando somente o tamanho dos fragmentos

gerados que foram estipulados para variar entre 70 e 170 pb. Após o desenho dos

52

iniciadores, estes foram submetidos a testes realizados pelo programa Autodimer

(VALLONE et al., 2004a), com a finalidade de visualizar potenciais anelamentos de

um iniciador com outro, ou seja, a formação de dímeros de iniciadores. A formação

de dímeros reduz a concentração de iniciadores disponíveis para a PCR e consome

reagentes durante a amplificação dos produtos deste pareamento indesejável. E

finalmente os primers foram submetidos ao “Primer Search” que faz o anelamento do

iniciador no genoma inteiro, buscando amplificações espúrias.

Os iniciadores diretos foram adquiridos com moléculas fluorescentes,

covalentemente ligadas à extremidade 5’, permitindo a análise dos fragmentos

amplificados no seqüenciador automático de DNA ABI PRISM® 3100. As

fluorescências utilizadas foram: 6-FAM (azul) e VIC (verde), o que permitiu a

utilização do filtro virtual no ABI 3100 denominado G5. Os iniciadores reversos (sem

marcação) e os diretos marcados com 6-FAM foram adquiridos da Alpha DNA

(Montreal, Canadá). Os iniciadores diretos marcados com VIC forma adquiridos da

Applied Biosystems (Foster City, CA).

5.3 Amplificação das Indels do Cromossomo X

Inicialmente os iniciadores foram testados em reações de singleplex PCR

(um único par de iniciador por reação) para avaliar a especificidade dos mesmos.

Estas reações foram realizadas num volume final de 12,5 µL com 1U de Taq DNA

polimerase-pht (Phoneutria), 10 mM Tris-HCI (pH 8,4), 50mM KCI, 1,5 mM MgCl

2,

0,25 µM de dNTPs, 0,25 µM de cada iniciador, 0,16 mg/µL de BSA e 10 ng de DNA

genômico. As amplificações foram realizadas em um termociclador GeneAmp 9700

(Applied Biosystems) no módulo de emulação de rampa de aquecimento da 9600,

empregando as seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC/5 min.; 30 ciclos

de: desnaturação a 95°C/1min., anelamento a 65ºC/1 min. e extensão a 72ºC/1 min.;

extensão final a 72ºC/60 min.

As reações para amplificação das mini-indels do cromossomo X por PCR-

multiplex foram realizadas em um volume final de 12,5 µL, com 1,5 U de Platinum

®

Taq DNA Polymerase (Invitrogen), 20 mM Tris-HCI (pH 8,4), 50mM KCI, 3,5 mM

53

MgCl

2,

0,5 µM de dNTPs, 0,32 mg/µL de BSA e 10 ng de DNA genômico com as

concentrações dos iniciadores oscilando entre 0,15 µM e 0,90 µM. As amplificações

foram realizadas em um termociclador GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) no

módulo de emulação de rampa de aquecimento da 9600, empregando as seguintes

condições: desnaturação inicial a 94ºC/3 min.; 30 ciclos de: desnaturação a

94°C/1min., anelamento a 65ºC/1 min. e extensão a 7 2ºC/1 min.; extensão final a

72ºC/60 min.

5.4 Detecção e análise dos produtos da PCR

A separação e detecção dos produtos de PCR foram realizadas em

seqüenciador automático de DNA ABI PRISM

®

3100 Genetic Analyzer (Applied

Biosystems) de acordo com o protocolo do fabricante utilizando o filtro G5 para

determinar as três fluorescências 6FAM

TM

(azul), VIC

TM

(verde) e LIZ

TM

(laranja)

As amostras foram preparadas com 8,85 µL de formamida Hi-Di

TM

(Applied

Biosystems, P/N4311320); 0,15 µL de GS 500 LIZ size standard (Applied

Biosystems, P/N 4322682) e 1,0 µL de produto amplificado de PCR. As amostras

foram injetadas por 22 s, a 5 volts a 15 volts por 25 min.

As separações foram realizadas utilizando o polímero POP6

TM

para o ABI

3700 DNA Analyser (Applied Biosystems, P/N 4306733), 1X Genetic Analyzer Buffer

com EDTA (Applied Biosystems, P/N 402824), e um capilar de 36 cm x 50 µm

(Applied Biosystems, P/N 4315931). Posterior à coleta de dados, as amostras foram

analisadas com o programa GeneScan

®

3.7 (Applied Biosystems) e os alelos foram

designados utilizando o programa Genotyper

®

3.7 (Applied Biosystems).

5.5 Amostras de DNA

Uma grande variedade de amostras de DNA foi utilizada para realizar todos

os objetivos propostos nesta dissertação. Inicialmente, paro o estudo populacional,

54

foram utilizadas 200 amostras de sangue total provenientes de indivíduos das cinco

regiões geopolíticas brasileiras, sendo: 40 do Norte (20 homens e 20 mulheres), 40

do Nordeste (20 homens e 20 mulheres), 40 do Centro-Oeste (20 homens e 20

mulheres), 40 do Sul (20 homens e 20 mulheres) e 40 do Sudeste (23 homens e 17

mulheres) (Figura 8). Essas amostras foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Dario

Gratapagglia do Laboratório Heréditas.

Figura 8 – Distribuição das amostras populacionais brasileiras utilizadas nesse estudo.

Fonte – a autora.

55

O DNA genômico foi extraído através da metodologia de “Salting Out”

modificado (BUDOWLE, 2000), Em um tubo de 1,5 mL foi acrescentado 300 µL de

sangue total e 1000 µL de água destilada. O tubo foi agitado por 15 s e

posteriormente centrifugado a 5000 rpm por 5 min. O sobrenadante foi descartado

com cuidado para não perder o precipitado. O precipitado foi ressuspendido em

1000 µL de Tampão A (0,32 M Sacarose, 10 mM de Tris HCl pH 7.6, 5 mM MgCl

2

e

1% de Triton X 100), agitado por 15 s e posteriormente centrifugado a 5000 rpm por

5 min. e o sobrenadante foi descartado. Esse procedimento foi repetido por mais

duas vezes. Após a repetição do procedimento, o precipitado foi ressuspendido em

500 de Tampão B (25 mM EDTA pH 8, 75 mM NaCl) e adicionado 50 µL de SDS

10% e 5 µL de Proteinase K (10 mg/ml estoque). O tubo foi agitado por 15 s e

incubado a 37

o

C ao longo de uma noite, ou 55

o

C durante 60 minutos. Após a

incubação, 200 µL de NaCl saturado (aproximadamente 6M) foram adicionados ao

tubo e este foi submetido a agitação por 15 s. O tubo foi submetido a centrifugação a

3000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi transferido para outro tubo de 1,5 mL

e a ele adicionou-se etanol 100% (temperatura ambiente) até encher o tubo. O tubo

foi invertido com o intuito de precipitar o DNA e posteriormente centrifugado a 5000

rpm durante 5 minutos. O etanol foi descartado e o precipitado foi ressuspendido em

100 µL de TE e incubado a 37

o

C durante 1 hora. Após extração as amostras foram

quantificadas em gel de agarose1%, corado com brometo de etídeo, utilizando DNA

de fago lambda como padrão de concentração e então diluídas para uma

concentração final de 10ng/µl.

Para o teste da eficiência das mini-indels do X em testes de paternidade

(trios) e em casos de post-mortem, novamente as amostras foram cedidas pelo

laboratório Hereditas. Foram utilizados 12 casos de trios (suposto pai, mãe e

criança) de paternidade, sendo 6 inclusões e 6 exclusões de paternidade. Para

análise em situações de post-mortem, foram utilizados 17 casos com diferentes

configurações. As amostras foram fornecidas como DNA extraído, pela metodologia

de extração por NaOH.

As análises do teste de sensibilidade foram realizadas com a amostra

de DNA feminino AmpFlSTR® Control DNA 9947, que é fornecida em conjunto com

o kit AmpFlSTR® Yfiler™ PCR Amplification Kit (Applied Biosystems).

56

Para avaliar a especificidade de cada iniciador, estes foram testados

em reações de singleplex PCR (um único par de iniciador por reação) utilizando

como amostra uma mistura equimolar de amostras de 20 mulheres escolhidas ao

acaso nas amostras da população brasileira.

5.6 Dados Populacionais

A freqüência alélica de cada loco foi calculada pela contagem do número de

alelos individuais (freqüência absoluta) dividindo pelo número total de alelos na

respectiva população. Para a caracterização dos locos foi calculada a

heterozigosidade observada e estimada a heterozigosidade esperada assumindo

que as freqüências genotípicas estavam de acordo com o esperado no equilíbrio de

Hardy-Weinberg. Estes valores foram obtidos utilizando o programa Arlequin 3.01

(EXCOFFIER et al., 2005). As seguintes análises estatísticas também foram

realizadas utilizando o programa Arlequin 3.01 (EXCOFFIER et al., 2005): teste

exato para o equilíbrio de Hardy-Weinberg(RAYMOND et al., 1995), teste exato para

o desequilíbrio de ligação entre pares dos locos (LEWONTIN, 1960; SLATKIN, 1994;

SLATKIN, 1996) AMOVA (EXCOFFIER et al., 1992). A correção de Bonferroni foi

aplicada para corrigir os múltiplos testes feitos nas análises de Hardy Weinberg,

desequilíbrio de ligação e Fst par a par.

Para mensurar o grau de eficiência das mini-indels do cromossomo X, na

população brasileira calculou-se:

- o conteúdo da informação de polimorfismo (PIC, do

inglês, Polymorphic Information Content) baseado na fórmula descrita

por (BOTSTEIN, 1980),

- a chance média de exclusão, MEC

T

(do inglês, Mean of

Exclusion Chance) para marcadores no cromossomo X em trios

familiares (suposto pai, mãe e criança) com a criança do sexo feminino,

utilizando a fórmula proposta por (KISHIDA T., 1997),

57

- a chance média de exclusão em duos familiares (suposto

pai e criança), MEC

D

para marcadores no cromossomo X, com a

criança do sexo feminino, também utilizando a fórmula proposta por

(KISHIDA, 1997),

- a média do poder de discriminação em mulheres (PD

M

)

calculada segundo (DESMARAIS et al., 1998),

- e a média do poder de discriminação para marcadores no

cromossomo X em homens (PD

H

), também segundo (DESMARAIS et

al., 1998).

5.7 Utilização em casos de paternidade

Para testar a eficiência das indels do cromossomo X em casos de

paternidade, 12 trios (suposto pai, mãe e criança) e 17 testes de paternidade em

casos post mortem com diversas configurações foram avaliados. Todos estes casos

haviam sido previamente investigados com locos autossômicos. Sendo os trios

investigados com um octaplex + amelogenina, contendo: VWA, TH01, AMEL, TPOX,

CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820 e D16S539; e um dodecaplex contendo:

D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, PENTA E, D5S818, D19S433, PENTA D,

D2S1338, D8S1179, TPOX e FGA. Os casos post mortem foram testados

previamente com diferentes STRs autossômicos, em um total de 34 locos, sendo

eles: AMEL, CD4, CSF1PO, D12S391, D13S317, D16S539, D18S535, D18S849,

D19S253, D1S1656, D1S533, D20S85, D3S1744, D5S818, D7S820, D8S1132,

D8S306, D9S304, DHFRP2, F13A01, F13B, FES/FPS, LPL, TH01,TPOX, VWA,

D18S51, D19S433, D21S11, D2S1338, D3S1358,D8S1179, FGA, D12S1090.

Em alguns casos post mortem em que a exclusão não foi confirmada, ou o

resultado foi indefinido, foram utilizados números variados de X-STRs, sendo eles:

DXS7132, DXS7423, DXS8377, HPRTB, DXS8378, ARA, DXS7424, DXS6800,

GATA172D05.

58

Com o resultado dos STRs autossômicos, das indels do cromossomo X e

dos X-STRs, foi feita a comparação de resultados e a verificação da eficiência das

indels.

O IP foi selecionado como base de comparação dos sistemas. Nos trios

analisados com o sistema de marcadores autossômicos, os IPs individuais para

cada loco foram calculados e depois multiplicados para obter o IPC.

Quando os mesmos trios foram analisados com as mini-indels do

cromossomo X, assumindo a independência entre os locos, o IP foi calculado para

os locos individualmente e depois combinados por multiplicação dos mesmos,

obtendo-se o IPC. Entretanto as fórmulas utilizadas para cálculos de IP em

cromossomos autossômicos não podem ser utilizadas para calcular o IP dos

marcadores do cromossomo X, pois o suposto pai possui apenas um cromossomo

X, logo possui apenas um alelo por marcador (AYRES et al., 2005)

Novas fórmulas foram propostas por Powley e Ayres para calculo de IP em

marcadores independentes no cromossomo X (POWLEY, 2002; AYRES et al.,

2005). Fórmulas para cálculo de IP para trios encontram-se representadas na tabela

1, enquanto que para duos, encontram-se na tabela 2.

Tabela 1 - Fórmulas para cálculo de IP individual para locos independentes no cromossomo X, em

trios. O coeficiente de ancestralidade (F) estipulado para as análises desta dissertação foi de

1%(AYRES, 2000).

Mãe Criança Suposto Pai IP IP se F=0

AA AA A

pAFF

F

)1(3

)21(

−+

+

pA

1

AA AB B

pBFF

F

)1(

)21(

−+

+

pB

1

AB AA A

pAFF

F

)1(2

)21(

−+

+

pA

1

AB AB A

))(1(3

)21(

pBpAFF

F

+−+

+

)(

1

pBpA+

AB AC C

pCFF

F

)1(

)21(

−+

+

pC

1

Fonte - (AYRES et al., 2005)

59

Tabela 2 - Fórmulas para cálculo de IP individual para locos independentes no cromossomo X, em

duos. O coeficiente de ancestralidade (F) estipulado para as análises desta dissertação foi de

1%(AYRES, 2000).

Criança Suposto Pai IP IP se F=0

AA A

pAFF

F

)1(2

)1(

−+

+

pA

1

AB A

pAFF

F

)1(2

)1(

−+

+

pA2

1

Fonte - (AYRES et al., 2005)

Nos casos post mortem analisados com marcadores autossômicos com

resultado de inclusão de paternidade, os IPs individuais foram calculados através de

reconstrução.

Nos casos post mortem analisados com as mini-indels do cromossomo X, os

cálculos foram realizados utilizando o programa FASTLINK (COTTINGHAM, 1993;

SCHÄFFER, 1994), um compilado de programas de computador, originalmente

desenvolvidos para uso em genética epidemiológica e que atualmente tem sido

utilizados em testes de parentesco (SZIBOR et al., 2003) (SZIBOR et al., 2005;

KRAWCZAK, 2007; SZIBOR, 2007). Um dos algoritmos que compõe o pacote é o

MLINK, o qual realiza cálculos de verossimilhança em pedigrees arbitrários. O

programa FASTLINK está disponível na rede mundial de computadores

gratuitamente pelo endereço

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CBBresearch/Schaffer/fastlink.html.

Para o cálculo dos IPs dos STRs autossômicos, as freqüências alélicas

utilizadas foram as da população brasileira publicadas por (GRATTAPAGLIA et al.,

2001; JOBIM, 2003; GOES et al., 2004; WHITTLE et al., 2004).

Todos os testes com os STRs autossômicos e com os X-STRs foram

conduzidos no Laboratório Heréditas, tendo esse cedido os resultados e as

configurações dos casos para utilização neste trabalho de dissertação, mantendo a

identidade das pessoas envolvidas no anonimato.

60

5.8 Sensibilidade

Após a otimização do multiplex, foram realizadas diluições seqüenciais

progressivas na amostra de DNA feminino AmpFlSTR® Control DNA 9947, que é

fornecida em conjunto com o kit AmpFlSTR® Yfiler™ PCR Amplification Kit (Applied

Biosystems). A amostra foi diluída para as concentrações de 10 ng/µL, 5 ng/µL, 1

ng/µL, 0,5 ng/µL e 0,1 ng/µL. Posteriormente essas diluições foram utilizadas na

amplificação das mini-indels com o objetivo de estimar a eficiência do processo em

quantidades extremas de DNA.

5.9 Estudos de degradação

Estudos de degradação artificial do DNA por DNAse I foram realizados

conforme realizado por Chung et al. (CHUNG et al., 2004). Esses estudos

objetivaram a mimetização do dano sofrido as amostras forenses com baixa

quantidade de DNA, para posterior utilização das amostras degradadas.

O DNA degradado foi preparado através de digestão enzimática de 5,5 µg

de DNA extraído, ressuspendido no tampão de reação 1X da DNAse I para um

volume final de 100 µL, com 0,01 unidade/µL de DNAse I (New England BioLabs

Inc., Ipswich, MA). O DNA foi incubado por diferentes períodos de tempo (1 min., 2

min., 5 min., 10 min. e 20 min.) a 37ºC. Para inativação da DNAse I, foram

adicionados 3,0 µL de 0,5 M EDTA após a incubação e novamente incubados a

75ºC por 10 min.

O DNA degradado foi concentrado em uma Eppendorf Concentrator 5301

até secar todo o líquido, e posteriormente reconstituído com 13 µL de água

destilada.

Todo o material reconstituído foi utilizado na eletroforese. O DNA degradado

foi separado por gel de agarose (USB - Amersham) a 1% e corado com brometo de

etídeo (USB - Amersham). DNA de diferentes regiões do gel, correspondendo a

61

diferentes tamanhos de fragmentos (<400, 400 – 850 pb) foram extraídos usando o

Ultra Clean

TM

15 DNA Purification Kit (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA USA).

Após extração, foi feito um novo gel de agarose para verificar a presença do DNA

extraído.

5.10 Amplificação pela metodologia de Low Copy Number DNA

Os protocolos para amplificação de LCN DNA foram aqueles propostos por

Gill et al. (GILL et al., 2000). O protocolo para amplificação das indels do

cromossomo X foi o mesmo descrito acima (item 4.3), com alterações no número de

ciclos de 30 para 34.

Essa metodologia foi testada em amostras de DNA que passaram pelo

processo de degradação pela DNAse I.

5.11 Amplificação de genoma total

A metodologia de WGA por MDA foi testada com a utilização do kit

GenomiPhi

TM

DNA Amplification Kit (Amersham Biosciences), conforme protocolo

sugerido pelo fabricante. Este protocolo consiste em: misturar em um tubo 1 µL de

DNA (com concentração de no mínimo 1ng/µL) com 9 µL de tampão contendo os

iniciadores hexaméricos randômicos. Submeter esse tubo a um processo de

desnaturação com aquecimento inicial de 95ºC por 3 minutos e posterior

resfriamento a 4ºC para que os iniciadores se anelem com as fitas molde. Posterior

à desnaturação, adicionar ao tubo 9 µL de tampão de reação e 1 µL da enzima

Phi29 DNA polimerase. Misturar bem e incubar a 30ºC por 16-18 horas. Para

inativação da reação pós-amplificação, submeter o tubo a um aquecimento de 65ºC

por 10 minutos com posterior resfriamento a 4ºC.

Essa metodologia foi testada em amostras de que passaram pelo processo

de degradação por DNAse I.

62

6 RESULTADOS

6.1 Identificação de indels polimórficas ao longo do cromossomo X

Foram selecionadas 17 indels do cromossomo X a partir do NCBI® (do

inglês National Center for Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov) no

banco Entrez SNP®, onde os critérios utilizados foram classes de indels, presentes

no cromossomo X de humanos, constituídas de no mínimo dois nucleotídeos e com

uma heterozigosidade mínima de 0,3. Essas 17 indels englobavam indels compostas

por dois (2), três (8), quatro (2), cinco (1), nove (2), dez (1) e onze (1) nucleotídeos.

A heterozigosidade variou entre 0,500 e 0,375 conforme o critério pré-estabelecido

demonstrado abaixo na tabela 3. A tabela 4 apresenta as características das 17

indels selecionadas. A figura 9 ilustra a distribuição das indels ao longo do

cromossomo X.

Após a seleção das 17 indels verificou-se que nenhuma delas apresentava

elementos repetitivos com a utilização do programa Repeat Masker

(www.repeatmasker.org). Além disso, não foram observados SNPs nas vizinhanças

das indels.

63

Tabela 3 - Indels selecionadas a partir do NCBI®. Informações incluem número de

identificação e acesso no NCBI®, respectivos alelos de deleção (D) e inserção (I), juntamente com

suas freqüências (F) e heterozigosidade (Het) média disponível no banco. Os nomes das indels são

identificações propostas com o objetivo de facilitar a identificação ao longo do trabalho. Populações

estudadas: RS363762 –europeus RS16460 – europeus, RS17394 – CEPH, RS2307707 – europeus,

RS2308033 – europeus RS2307557 – europeus, RS363794 – europeus RS2308035 – europeus,

RS17436 – CEPH, RS2307551 – europeus, RS5743760 – afros americanos, RS2307901 – europeus,

RS2307741 – europeus RS2308280 – europeus, RS621 – finlandeses RS2308239 – europeus,

RS2307858 – europeus.

Nome dbSNP Alelos (D/I)

Frequência

deleção

Frequência

inserção

Het

Média

IDX001

RS363762

-/ATT 0,590 0,410 0,484

IDX002

RS16460

-/TTC 0,354 0,646 0,457

IDX003

RS17394

-/AAAAG 0,350 0,650 0,455

IDX004

RS2307707

-/GTCT 0,677 0,323 0,437

IDX005

RS2308033

-/CTT 0,250 0,750 0,375

IDX006

RS2307557

-/ACA 0,322 0,678 0,437

IDX007

RS363794

-/ATA 0,734 0,266 0,390

IDX008

RS2308035

-/CA 0,673 0,327 0,440

IDX009

RS17436

-/AAACAGTAATT 0,250 0,750 0,375

IDX010

RS2307551

-/TAC 0,525 0,475 0,499

IDX011

RS5743760

-/GAGGAGAAA 0,362 0,638 0,462

IDX012

RS2307901

-/TAGA 0,258 0,742 0,383

IDX013

RS2307741

-/CCTCTGAAC 0,299 0,701 0,419

IDX014

RS2308280

-/TTA 0,406 0,594 0,482

IDX015

RS621

-/AAC 0,620 0,380 0,471

IDX016

RS2308239

-/GA 0,341 0,659 0,449

IDX017

RS2307858

-/TTACTGAGAG 0,275 0,725 0,399

Fonte – a autora

.

64

Tabela 4 - Características das 17 indels do cromossomo X selecionadas a partir do NCBI®. PIC,

conteúdo de informação polimórfica, MEC

T

, chance média de exclusão em trios, MEC

D

, chance média

de exclusão em duos, PD

M

, poder de discriminação em mulheres e PD

H

, poder de discriminação em

homens.

Nome dbSNP PIC MEC

T

MEC

D

PD

M

PD

H

IDX001 RS363762

0,425 0,367 0,242 0,617 0,484

IDX002 RS16460

0,405 0,353 0,229 0,601 0,457

IDX003 RS17394

0,403 0,351 0,228 0,599 0,455

IDX004 RS2307707

0,390 0,342 0,219 0,588 0,437

IDX005 RS2308033

0,340 0,305 0,188 0,539 0,375

IDX006 RS2307557

0,389 0,341 0,218 0,587 0,437

IDX007 RS363794

0,352 0,314 0,195 0,552 0,391

IDX008 RS2308035

0,392 0,343 0,220 0,590 0,440

IDX009 RS17436

0,340 0,305 0,188 0,539 0,375

IDX010 RS2307551

0,437 0,374 0,249 0,624 0,499

IDX011 RS5743760

0,409 0,355 0,231 0,604 0,462

IDX012 RS2307901

0,346 0,310 0,191 0,546 0,383

IDX013 RS2307741

0,375 0,331 0,210 0,575 0,419

IDX014 RS2308280

0,424 0,366 0,241 0,616 0,482

IDX015 RS621

0,416 0,360 0,236 0,609 0,471

IDX016 RS2308239

0,399 0,348 0,225 0,596 0,449

IDX017 RS2307858

0,359 0,319 0,199 0,559 0,399

Cumulativo _____

0,999 0,985 0,999 0,9999

Fonte – a autora.

65

Figura 9 – Localização das 17 indels selecionadas ao longo do cromossomo X. Os números de

identificação das mesmas no NCBI® vêm precedendo a denominação entre parênteses, determinada

pela autora a fim de facilitar a identificação das mesmas.

Fonte – a autora.

66

6.2 Desenho dos iniciadores

Com as indels selecionadas e verificadas para a presença de elementos

repetitivos e SNPs em sua vizinhança, os iniciadores foram desenhados com a

utilização do programa Primer3 e Autodimer (ROZEN et al., 2000; VALLONE et al.,

2004a). Foram desenhados 17 pares de iniciadores teoricamente compatíveis para

utilização conjunta em reações de multiplex (Tabela 5). .Baseado na seqüência

disponível no dbSNP os fragmentos amplificados teriam tamanhos de 70 a 170 pb. A

distribuição teórica destes fragmentos e a cor relativa a fluorescência utilizada para

marcar o iniciador direto são mostradas na Figura 10.

Figura 10 – Distribuição dos produtos gerados pelos 17 pares de iniciadores das indels selecionadas

ao longo do cromossomo X. As indels IDX001 a IDX011 foram marcadas com a fluorescência 6-FAM

e as indels IDX012 a IDX017 foram marcadas com a fluorescência VIC.

Fonte – a autora.

67

Tabela 5 - Seqüência dos iniciadores para cada indel selecionada. Nos iniciadores diretos são

mostradas as fluorescências utilizadas na marcação.

Nome dbSNP Seqüência Iniciadores diretos (5’-3’) Seqüência Iniciadores reversos (5’-3’)

IDX001 RS363762

[6FAM]-TATGCTAGGGATGAACCTGGAA

AAACCACAGAGCATAGGAATCA

IDX002 RS16460

[6FAM]-GACAGCCTCAGTTAATCATTTGG

GACTGTAAATGTAGCGGTGCT

IDX003 RS17394

[6FAM]-AAAATCGGCAACCAAAAAGA

TCCTGTTGGGGTTGAGTCAT

IDX004 RS2307707

[6FAM]-GCCTGGGATTTTTCCTTTAT

CCAGGATACAGGGGAGAACA

IDX005 RS2308033

[6FAM]-CTGGTCCACCCTAACTGTATCC

TTATTGGATTCTGCCATGGTAAGTTT

IDX006 RS2307557

[6FAM]-CAGGGAAAACTCAGTCCTTAACA

GACATCAGTGATTGCCTTGC

IDX007 RS363794

[6FAM]-CAGATGATTGATTGTGATTATTGTAAG

GCCAGCCATTTGTTCTTCTC

IDX008 RS2308035

[6FAM]-AGATATCCCATAACGCCCATT

TCCTTTTGCTACGCAGACCT

IDX009 RS17436

[6FAM]-GCAAAAACTAAAAACTATATGATTCAGG

TTTTGCTGTGTTTAGTTACTGTTAAAAA

IDX010 RS2307551

[6FAM]-TGTGAATTTCTTCTGCTTTTTAAG

AAACAATAGAAATTTGAAGCCTAAGA

IDX011 RS5743760

[6FAM]-TGTGCCATCCCTAGCTCATT

CCAGTGAAATTTGGGAGGAA

IDX012 RS2307901

[VIC]-TGTGTGAAATCTCATCCATGTTT

CGACATTTTAGAAGTGACTCACATAA

IDX013 RS2307741

[VIC]-TCATCATCCTCAGACCATGACA

GGGAATTCTTCATAGTTCTTAGCTAGT

IDX014 RS2308280

[VIC]-CACTAAATGGTTCTTTAAGTTTCAACC

CCCTACCAACAAAATCCATTC

IDX015 RS621

[VIC]-AATGGAACCCATGTCTTGGA

AAAGCAGCTCCACTAGGAAGAC

IDX016 RS2308239

[VIC]-TCATTGACAGAACAAGTCAGCA

TTGCTAAAACGGAAAGAGCA

IDX017 RS2307858

[VIC]-GGAGACCTGCCTGAAAAGAA

GCCTTTTTAAGTAGATCCAATGTCA

Fonte – a autora

.

68

6.3 Amplificação das Indels do Cromossomo X

Para avaliar a especificidade de cada iniciador, estes foram testados em

reações de singleplex PCR (um único par de iniciador por reação) utilizando como

amostra uma mistura equimolar de amostras de mulheres. Dos 17 pares de

iniciadores, com exceção dos pares IDX007 e IDX012, todos amplificaram

individualmente (Figuras 11, 12 e 13). O par de iniciadores IDX001 apresentou a

amplificação de apenas um de seus alelos nas diversas repetições de amplificação

(Figura 17).

Figura 11 - Eletroferograma das amplificações em singleplex 6-FAM IDX001 a IDX006.

Fonte – a autora.

69

Figura 12 - Eletroferograma das amplificações em singleplex 6-FAM IDX008 a IDX011.

Fonte – a autora.

Figura 13 - Eletroferograma das amplificações em singleplex VIC IDX013 a IDX017.

Fonte – a autora.

70

As reações de multiplex PCR foram realizadas com os 17 pares de

iniciadores. Assim como ocorrido nas reações individuais, os iniciadores IDX007 e

IDX012 não amplificaram na reação de multiplex e a indel IDX001 continuou

apresentando amplificação de apenas um de seus alelos. Os iniciadores IDX004 e

IDX005 apresentaram a mesma faixa de amplificação com alelos de 96,94 pb,

101,14 pb, e 100,24, 103,26 respectivamente. As indels IDX006, IDX008, IDX009,

IDX010 e IDX017 não amplificaram na reação de multiplex. Por esses motivos, foi

montada uma reação de multiplex com 8 indels, onde todas amplificaram

perfeitamente em multiplex, além de possuírem uma faixa distinta de amplificação

(Figura 14).

O multiplex utilizado consiste na co-amplificação das seguintes indels:

IDX002, IDX003, IDX004, IDX011, IDX013, IDX014, IDX015, IDX016. As

informações acerca deste multiplex encontram-se representadas na tabela 6 e o

eletroferograma ilustrando a co-amplificação das indels na figura15. A figura 16

indica a distribuição das 8 indels constituintes do multiplex no cromossomo X.

71

Figura 14 - Distribuição dos produtos gerados pelos 8 pares de iniciadores das indels selecionadas

ao longo do cromossomo X, que constituem a reação de multiplex.

Fonte – a autora.

Tabela 6 - Indels do cromossomo X constituintes do multiplex. A tabela indica também a

concentração de cada iniciador na reação de multiplex.

Nome Indel Tamanho fragmento

(pb)

Conc. Iniciador

(µM)

Fluorescência

IDX002 RS16460

81-84 0,15 6-FAM

IDX003 RS17394

88-93 0,65 6-FAM

IDX004 RS2307707

97-101 0,50 6-FAM

IDX011 RS5743760

167-176 0,90 6-FAM

IDX013 RS2307741

95-104 0,20 VIC

IDX014 RS2308280

110-113 0,70 VIC

IDX015 RS621

121-124 0,15 VIC

IDX016 RS2308239

135-137 0,60 VIC

Fonte – a autora.

72

Figura 15 - Eletroferograma demonstrando a multiplexação das 8 indels do cromossomo X em 3 indivíduos diferentes.

Fonte – a autora.

73

Figura 16 - Distribuição das 8 indels constituintes do multiplex no cromossomo X.

Fonte – a autora.

74

6.4 Estudo populacional

A maior freqüência alélica encontrada foi de 0,781, na indel IDX011, no alelo

de inserção (Tabela 7). Por se tratarem de indels bialélicas, o alelo de deleção da

indel IDX011, teve sua menor freqüência alélica de 0,219.

A heterozigosidade observada foi menor que a esperada para quase todas

as indels com exceção das indels IDX004, IDX013 e IDX016.

Após a correção de Bonferroni, não foram detectados desvios significativos

do Equilíbrio de Hardy-Weinberg em nenhum dos locos estudados (Tabela 7).

Tabela 7 - Caracterização dos 8 locos de indels do cromossomo X baseado em uma amostra de 200

indivíduos. (D), freqüência do alelo de deleção, (I), freqüência do alelo de inserção, Ho

heterozigosidade observada, He heterozigosidade esperada, P, p valor da análise de equilíbrio de

Hardy-Weinberg. Para o teste de Hardy Weinberg foi utilizado o nível de significância de 0,006

corrigido por Bonferroni. Valores em negrito indicam significância estatística.

IDX002 IDX003 IDX004 IDX011 IDX013 IDX014 IDX015 IDX016

P(D)

0,367 0,327 0,589 0,219 0,505 0,320 0,515 0,434

P(I)

0,633 0,673 0,411 0,781 0,495 0,680 0,485 0,566

Ho

0,319 0,422 0,598 0,340 0,557 0,319 0,463 0,515

He

0,454 0,447 0,501 0,379 0,499 0,440 0,499 0,496

P

0,006 0,817 0,063 0,416 0,315 0,017 0,546 0,835

Fonte – a autora.

Devido à hemizigose nos homens, o desequilíbrio de ligação pode ser

estudado eficientemente para os marcadores do cromossomo X (Tabela 8). O teste

de associação par a par revelou um desequilíbrio de ligação significativo entre

IDX002 e IDX0011 (p=0.024356). Entretanto, após a correção de Bonferroni, essa

característica deixou de ser significativa.

As indels que apresentaram o maior conteúdo de informação de

polimorfismo (PIC) foram: IDX013, IDX015 e IDX004 com PIC de 0,440; 0,440 e

0,430 respectivamente. O menor PIC foi de 0,31 na indel IDX011 (Tabela 9).

75

A indel IDX011 apresentou a menor chance média de exclusão em trios, de

0,284, enquanto as indels IDX013 e IDX015 apresentaram a maior chance média de

exclusão em duos de 0,25.

As indels IDX013 e IDX015 possuem o maior poder de discriminação em

mulheres de 0,625, seguidos por IDX016 com 0,621. As mesmas indels possuem o

maior poder de discriminação em homens sendo IDX013 e IDX015 com 0,5 e

IDX016 com 0,491.

Tabela 8 - Desequilíbrio de ligação entre as mini-indels do cromossomo X constituintes do multiplex,

calculados apenas entre os homens. P valor exato. Foi utilizado o nível de significância de 0,0018

após a correção por Bonferroni. Valores em negrito indicam significância estatística.

Locos IDX002 IDX003 IDX004 IDX011 IDX013 IDX014 IDX015 IDX016

IDX002

* 1.000 0.235 0.024 0.852 0.397 0.839 0.838

IDX003

1.000 * 0.199 0.563 0.152 0.389 0.051 0.372

IDX004

0.235 0.199 * 0.238 0.679 0.813 0.526 0.061

IDX011

0.024 0.563 0.238 * 0.794 0.353 1.000 1.000

IDX013

0.852 0.152 0.679 0.794 * 0.530 0.066 0.070

IDX014

0.397 0.389 0.813 0.353 0.530 * 0.413 0.683

IDX015

0.839 0.051 0.526 1.000 0.066 0.413 * 0.696

IDX016

0.838 0.372 0.061 1.000 0.070 0.683 0.696 *

Fonte – a autora.

Tabela 9 - Características das 8 indels do cromossomo X utilizadas em multiplex. PIC, conteúdo de

informação polimórfica, MEC

T

, chance média de exclusão em trios, MEC

D

, chance média de exclusão

em duos, PD

M

, poder de discriminação em mulheres e PD

H

, poder de discriminação em homens.

Locos dbSNP PIC MEC

T

MEC

D

PD

M

PD

H

IDX002 RS16460

0,411 0,357 0,232 0,605 0,465

IDX003 RS17394

0,392 0,343 0,220 0,590 0,440

IDX004 RS2307707

0,426 0,367 0,242 0,617 0,484

IDX011 RS5743760

0,313 0,284 0,171 0,509 0,342

IDX013 RS2307741

0,437 0,375 0,250 0,625 0,500

IDX014 RS2308280

0,388 0,341 0,218 0,586 0,435

IDX015 RS621

0,437 0,375 0,250 0,625 0,500

IDX016 RS2308239

0,431 0,371 0,246 0,621 0,491

Cumulativo ***

*** 0,9689 0,8751 0,9993 0,9927

Fonte – a autora.

A análise de variância molecular da população brasileira de forma

regionalizada resultou em um Fst de 0,021 (p=0,006) quando analisadas as

amostras masculinas e femininas em conjunto. Quando analisamos apenas as

amostras masculinas, a análise de variância molecular resultou em um Fst de 0,028

76

(p= 0,021) e apenas as amostras femininas resultaram um Fst de 0,013 (p=0,049)

(Figura 17).

Após a aplicação da correção de Bonferroni, a análise de Fst par a par na

população brasileira regionalizada detectou diferenças significativas entre três

regiões brasileiras utilizando esses marcadores (Centro-Oeste-Sul, Centro-Oeste-

Sudeste e Centro-Oeste-Nordeste), quando analisamos a população masculina e

feminina em conjunto (Tabela 10).

Após a aplicação da correção de Bonferroni, a análise de Fst par a par na

população brasileira regionalizada detectou diferenças significativas entre duas

regiões brasileiras utilizando esses marcadores (Centro-Oeste-Sudeste e Centro-

Oeste-Norte), quando analisamos somente a população masculina (Tabela 11).

Não foi detectada diferença significativa entre as cinco regiões geopolíticas

brasileiras para a análise de Fst par a par na população feminina após a correção

por Bonferroni (Tabela 12).

Os resultados da análise de variância loco a loco das amostras regionais da

população brasileira, revelou diferenças populacionais estatisticamente significativas

entre as cinco regiões estudadas para os locos IDX002 e IDX016 quando estudada

com as amostras masculinas e femininas juntas. Quando se estudou apenas as

amostras masculinas, a análise de variância loco a loco revelou diferenças

populacionais estatisticamente significativas entre as 5 regiões estudadas para o

loco IDX016 e quando se estudou apenas as amostras femininas, observaram-se

diferenças populacionais estatisticamente significativas entre as 5 regiões estudadas

para os locos IDX002 e IDX004. Os resultados aqui descritos encontram-se na figura

18.

77

Figura 17 – Resultados AMOVA na população brasileira. AMOVA realizada com homens

e mulheres, apenas com homens e apenas com mulheres.

Fonte – a autora.

78

Tabela 10 – Matriz diagonal inferior com valores de Fst par a par e matriz diagonal superior com

valores de significância (Pvalor) para população de homens e mulheres. Valores em negrito indicam

significância estatística. Após correções de Bonferroni, o nível de significância passa a ser 0,005.

*

Sul

Sudeste

Centro-Oeste

Norte

Nordeste

Sul

*

0,684

0,001

0,061

0,856

Sudeste

0,001

*

0,003

0,268

0,395

Centro-Oeste

0,050

0,047

*

0,150

0,002

Norte

0,023

0,012

0,017

*

0,422

Nordeste

-0,003

0,008

0,044

0,007

*

Fonte – a autora

Tabela 11 – Matriz diagonal inferior com valores de Fst par a par e matriz diagonal superior com

valores de significância (Pvalor) para população de homens. Valores em negrito indicam significância

estatística. Após correções de Bonferroni, o nível de significância passa a ser 0,005.

*

Sul

Sudeste

Centro-Oeste

Norte

Nordeste

Sul

*

0,913

0,013

0,502

0,786

Sudeste

-0,029

*

0,004

0,423

0,487

Centro-Oeste

0,077

0,086

*

0,003

0,007

Norte

-0,002

0,001

0,111

*

0,909

Nordeste

-0,019

-0,004

0,078

-0,029

*

Fonte – a autora

Tabela 12 – Matriz diagonal inferior com valores de Fst par a par e matriz diagonal superior com

valores de significância (Pvalor) para população de mulheres. Valores em negrito indicam

significância estatística. Após correções de Bonferroni, o nível de significância passa a ser 0,005.

*

Sul

Sudeste

Centro-Oeste

Norte

Nordeste

Sul

*

0,353

0,218

0,015

0,987

Sudeste

0,002

*

0,543

0,027

0,141

Centro-Oeste

0,010

-0,001

*

0,499

0,194

Norte

0,038

0,035

0,001

*

0,017

Nordeste

-0,020

0,016

0,013

0,035

*

Fonte – a autora

79

Figura 18 – Resultados da análise de variância loco a loco das amostras regionais da

população brasileira. Realizada com homens e mulheres (A), apenas com homens (B) e

apenas com mulheres (C). Loco 1 (IDX002), loco 2 (IDX003), loco 3 (IDX004), loco 4

(IDX011), loco 5 (IDX013), loco 6 (IDX014), loco 7 (IDX015) e loco 8 (IDX016). Barras em

vermelho referem-se a valores significativos estatisticamente.

Fonte – a autora.

80

6.5 Estudo de casos: exames de paternidade em Trios

Doze trios (suposto pai, mãe e criança) foram analisados com STRs

autossômicos utilizando-se dois multiplexes: um octaplex (mais amelogenina) e um

dodecaplex.

Em adição a estes, as mini-indels do cromossomo X também foram

estudadas, para fins comparativos.

Dos doze trios analisados seis obtiveram como resultado a exclusão e seis a

inclusão de paternidade.

Para uma melhor visualização dos resultados de exclusão, foram utilizadas

três tabelas para demonstrar as exclusões encontradas em cada um dos sistemas

analisados. Sendo assim:

• A tabela 13 apresenta os perfis genotípicos resultantes da

análise com o octaplex (mais amelogenina) de STRs;

• A tabela 14 apresenta os perfis genotípicos resultantes da

análise com o dodecaplex de STRs;

• Finalmente a tabela 15 apresenta os perfis genotípicos

resultantes da análise com as mini-indels do cromossomo X.

As inclusões de paternidade dos seis trios analisados também estão

demonstradas em três tabelas, apresentando os perfis genéticos obtidos com cada

um dos sistemas analisados, assim como o cálculo do índice de paternidade

combinado (IPC) de cada sistema:

• Tabela 16: Perfis genéticos de seis trios com resultado de

inclusão, analisados com o octaplex (mais amelogenina) de STRs;

• Tabela 17: Perfis genéticos de seis trios com resultado de

inclusão, analisados com o dodecaplex de STRs;

• Tabela 18: Perfis genéticos de seis trios com resultado de

inclusão, analisados com com as mini-indels do cromossomo X.

81

Para fins comparativos, a tabela 19 apresenta o IPC para cada sistema e o

IPC para as combinações entre cada um dos sistemas.

82

Tabela 13 - Perfis genotípicos de seis trios de exclusão resultantes da análise com o octaplex (mais amelogenina) de STRs. Os alelos em negrito e

hachurados indicam as exclusões obtidas. SP – Suposto Pai, C – Criança, M – Mãe.

EXCLUSÕES OCTAPLEX (MAIS AMELOGENINA) STRs

TRIO 1 TRIO 2 TRIO 3 TRIO 4 TRIO 5 TRIO 6

STRs SP 1 C 1 M 1 SP 2 C 2 M 2 SP 3 C 3 M 3 SP 4 C 4 M 4 SP 5 C 5 M 5 SP 6 C 6 M 6

16 16 15 16 16 18 14 16 15 16 17 17 14 16 16 16 16 16

VWA

18 17 17 16 18 19 17

18

16 18

17

19 16 18 18 17 17 18

8 6 6 8

6

7 8 6 6 8

7

9 6 8 8 7

9

6

TH01

9.3 9.3 9.3 9.3 9.3 9.3 9.3

6

7 9.3 9.3 9.3 9.3

9

8 9.3 9.3 9.3

X X X X X X X X X X X X X X X X X X

AMEL

Y X X Y X X Y X X Y X X Y X X Y X X

8 8 8 11

9

8 9

8

9 8 8 11 8 8 9 8

10

9

TPOX

11 11 11 11 11 11 11 9 9 8 12 12 11 9 12 8 12 12

10 10 11 12

10

11 12 10 10 12

10

11 12 11 11 12

11

12

CSF1PO

10 11 11 13 11 11 12

13

10 12 15 15 12

11

11 12 12 13

12

9

12 11 12 11 10

9

11 12 12 9 11 10 10 11 12 12

D5S818

12 12 12 11 12 12 13 13 13 12 13 13 12 11 13 13

12

8 11 9 12 11 9 13

8

11 11 11 8 12 11 11 11

9

11

D13S317

11 12 12 12

14

11 13 11 13 11 12 12 15

13

12 13 11 11

10

8

10 9 9 9 10

8

10 10

12

8 8 8 8 10 11 11

D7S820

10 12 12 10 9 10 11 11 11 10 12 12 9

12

8 11 11 11

11 11 11 9 10 9 11

9

12 9 12 13 11 11 10 10

9

11

D16S539

13

12

13 12

11

10 12 12 12 12 13 14 12 13 13 13 11 11

Fonte – a autora.

83

Tabela 14 - Perfis genotípicos de seis trios de exclusão resultantes da análise dodecaplex de STRs. Os alelos em negrito e hachurados indicam as

exclusões obtidas

.

SP – Suposto Pai, C – Criança, M – Mãe.

EXCLUSÕES DODECAPLEX STRs

TRIO 1 TRIO 2 TRIO 3 TRIO 4 TRIO 5 TRIO 6

STRs SP 1 C 1 M 1 SP 2 C 2 M 2 SP 3 C 3 M 3 SP 4 C 4 M 4 SP 5 C 5 M 5 SP 6 C 6 M 6

15 15 15 15 16 16 15

16

18 15

16

14 15 16 16 14 16 16

D3S1358

16 15 17 16 16 16 15 18 18 15 17 17 16

19

16 16

18

16

8 6 6 8

6

7 8

6

6 8

7

9 6 8 8 7

9

6

TH01

9.3 9.3 9.3 9.3 9.3 9.3 9.3 6 7 9.3 9.3 9.3 9.3

9

8 9.3 9.3 9.3

30

29

27 29 29 29 28

32.2

34 29 30 28 29 29 28 28 29 29

D21S11

30 30 30 29 30 30 30 34 35.2 32.2 32.2 30 34.2

32

29 31

33.2

31.2

12

13

13 14

13

12 14 14 14 12 15 14 14 14 12 14

12

14

D18S51

17 14 14 17 16 16 18

15

17 17

16

15 19

18

14 16 14 14

5 11 11 8

11

11 7 7 13 9 13 12 10 12 12 11

5

7

PENTA E

10

11

12 13 14 14 7 14 14 12

14

13 12

16

13 19 7 14

12

9

12 11

12

11 10

9

11 12 12 9 11 10 10 11 12 12

D5S818

12 12 12 11 12 12 13 13 13 12 13 13 12 11 13 13

12

14 14 12 13 15 14 11

14

14 13

12

14 14 13.2 12.2 13 14.2 14.2

D19S433

16

15

14 15

16

15 14.2 14 14 15 14 14 15.2 14 13.2 14

16.2

15

13 11 7 9 11 9 2.2 11 9 9 9 9 9

11

9 11 2.2 2.2

PENTA D

14

12

11 9

13

11 9

12

11 11 9 12 12 13 13 15

10

20

17

19 18 17 16 19 16 16 19 19 19 17

23

23 19 22 22

D2S1338

24 19 21 25

17

17 19

16

17 22

21

22 17 23 23 19

25

23

14

10

15 14 12 12 10 10 10 11

10

14 14

12

15 12 13 13

D8S1179

14 15 15 14 14 15 14 14 11 12 15 15 15 15 15 14

15

8 8 8 11

9

8 9

8

9 8 8 11 8 8 9 8

10

9

TPOX

11 11 11 11 11 11 11 9 9 8 12 12 11 9 12 8 12 12

21 19 19 21 21 21 22 21 21 23

19

21 20 20 23 20 20 23

FGA

22

20

28 24

22

24 25

29

21 27 26 26 23 24 24 22 23 26

Fonte – a autora

84

Tabela 15 - Perfis genotípicos de seis trios de exclusão resultantes da análise com as mini-indels do cromossomo X. Os alelos em negrito e

hachurados indicam as exclusões obtidas. SP – Suposto Pai, C – Criança, M – Mãe.

EXCLUSÕES OCTAPLEX MINI-INDELS X

TRIO 1 TRIO 2 TRIO 3 TRIO 4 TRIO 5 TRIO 6

INDELS X SP 1 C 1 M 1 SP 2 C 2 M 2 SP 3 C 3 M 3 SP 4 C 4 M 4 SP 5 C 5 M 5 SP 6 C 6 M 6

2_I 2_I 2_D 2_I 2_D 2_D 2_D 2_D 2_D 2_I 2_D 2_D 2_D 2_D 2_D 2_I 2_I 2_D

FAM2

--- 2_I 2_I --- 2_I 2_D ----- 2_I 2_I ----- 2_I 2_I --- 2_I 2_I ----- 2_I 2_I

3_I

3_D

3_I 3_I 3_I 3_D 3_I 3_I 3_I 3_D 3_D 3_D 3_I 3_I 3_D 3_I

3_D

FAM3

--- 3_I 3_I --- 3_I 3_I ----- 3_I 3_I ----- 3_I 3_I --- 3_I 3_I ----- 3_D 3_D

4_D

4_I

4_D 4_D 4_D 4_D 4_D 4_D 4_I 4_D

4_I

4_D 4_I

4_D

4_I 4_D 4_D 4_D

FAM4

--- 4_I 4_I --- 4_D 4_I ----- 4_I 4_I ----- 4_I 4_I --- 4_I 4_I -----

4_I

4_D

11_I

11_D

11_I 11_D

11_I

11_I 11_I 11_I 11_I 11_D

11_I

11_I 11_I 11_I 11_I 11_I 11_D 11_D

FAM11

--- 11_I 11_I --- 11_I 11_I ----- 11_I 11_I ----- 11_I 11_I --- 11_I 11_I ----- 11_I 11_I

2_D 2_D 2_D 2_D 2_D 2_D 2_D 2_D 2_I 2_I 2_I 2_D 2_D 2_D 2_D 2_D 2_D 2_D

VIC2

--- 2_I 2_I --- 2_I 2_I ----- 2_I 2_I ----- 2_I 2_I --- 2_I 2_I -----

2_I

2_D

3_D

3_I

3_I 3_I 3_I 3_D 3_I 3_I 3_D 3_I 3_I 3_I 3_D 3_D 3_D 3_D 3_D 3_D

VIC3

--- 3_I 3_I --- 3_I 3_I ----- 3_I 3_I ----- 3_I 3_I --- 3_I 3_I ----- 3_I 3_I

4_D 4_D 4_D 4_D

4_I

4_D 4_D

4_I

4_D 4_D 4_D 4_D 4_I 4_D 4_D 4_D

4_I

4_D

VIC4

--- 4_I 4_I --- 4_I 4_I ----- 4_I 4_I ----- 4_I 4_I --- 4_I 4_D ----- 4_I 4_I

5_I 5_D 5_D 5_D 5_D 5_D 5_I 5_I 5_D 5_I

5_D

5_I 5_D

5_I

5_D 5_I 5_D 5_D

VIC5

--- 5_I 5_I --- 5_D 5_I ----- 5_I 5_I ----- 5_I 5_I --- 5_I 5_I ----- 5_I 5_I

Fonte – a autora

85

Tabela 16 - Perfis genéticos de seis trios com resultado de inclusão, analisados com o octaplex (mais amelogenina) de STRs. O índice de

paternidade combinado (IPC) encontra-se na última linha da tabela, para cada caso analisado. SP – Suposto Pai, C – Criança, M – Mãe.

INCLUSÕES OCTAPLEX (MAIS AMELOGENINA) STRs

TRIO 7 TRIO 8 TRIO 9 TRIO 10 TRIO 11 TRIO 12

STRs SP 7 C 7 M 7 SP 8 C 8 M 8 SP 9 C 9 M 9 SP 10 C 10 M 10 SP 11 C 11 M 11 SP 12 C 12 M 12

14 14 15 16 16 15 17 16 16 15 14 14 14 14 14 19 15 14

VWA

19 20 20 17 17 17 19 17 17 17 17 15 18 18 16 19 19 15

6 8 6 7 7 7 8 8 8 9 9 7 7 6 6 7 8 8

TH01

9 9 8 8 8 9.3 8 9.3 9.3 9 9.3 9.3 9 7 9 9.3 9.3 9

X X X X X X X X X X X X X X X X X X

AMEL

Y X X Y X X Y X X Y X X Y X X Y X X

11 8 8 8 8 8 8 8 11 8 8 8 8 8 11 9 9 8

TPOX

11 11 8 11 11 8 8 11 11 11 8 11 8 11 11 11 11 9

11 12 10 11 11 11 10 10 10 12 11 11 10 11 11 10 10 10

CSF1PO

13 13 12 11 11 12 13 12 12 12 12 12 12 12 11 11 11 10

11 11 11 11 11 11 12 12 10 11 11 12 11 11 11 11 11 7

D5S818

12 12 11 11 13 13 12 13 13 11 12 12 13 11 11 12 12 12

9 9 11 10 11 11 11 12 12 12 8 8 11 11 12 8 8 12

D13S317

12 11 11 12 12 12 12 12 12 12 12 9 11 12 13 11 14 14

8 11 11 10 11 10 8 9 10 8 10 10 10 11 11 9 10 10

D7S820

11 11 12 11 12 12 9 12 12 11 11 12 11 12 12 10 12 12

11 11 11 12 9 9 9 9 11 11 11 11 9 11 9 12 12 11

D16S539

11 12 12 12 12 11 11 12 12 13 12 12 11 11 11 13 13 12

IPC 1,38E+04 6,30E+02 9,30E+02 3,67E+02 2,18E+02 2,28E+03

Fonte – a autora

86

Tabela 17 - Perfis genéticos de seis trios com resultado de inclusão, analisados com o dodecaplex de STRs. O índice de paternidade combinado

(IPC) encontra-se na última linha da tabela, para cada caso analisado. SP – Suposto Pai, C – Criança, M – Mãe.

INCLUSÕES DODECAPLEX STRs

TRIO 7 TRIO 8 TRIO 9 TRIO 10 TRIO 11 TRIO 12

STRs SP 7 C 7 M 7 SP 8 C 8 M 8 SP 9 C 9 M 9 SP 10 C 10 M 10 SP 11 C 11 M 11 SP 12 C 12 M 12

15 15 16 16 14 14 16 16 15 15 15 15 17 15 15 16 17 16

D3S1358

15 16 16 18 16 15 17 16 16 17 15 16 17 17 15 18 18 17

6 8 6 7 7 7 8 8 8 0 0 7 7 6 6 7 8 8

TH01

9 9 8 8 8 9.3 8 9.3 9.3 0 0 9.3 9 7 9 9.3 9.3 9

29 30 28 27 30 28 29 29 30 29 29 29 29 28 28 28 27 27

D21S11

32.2 32.2 30 30.2 30.2 30 30 30 30 31.2 31.2 31.2 32.2 32.2 32.2 30 30 31.2

14 14 12 13.2 13.2 13.2 14 15 15 13 16 15 17 15 15 15 18 12

D18S51

15 14 14 17 17 17 16 16 15 16 16 16 19 19 17 18 21 21

7 5 5 11 11 5 7 7 7 13 12 12 10 7 7 5 5 5

PENTA E

10 10 13 11 12 12 11 7 9 16 13 12 17 10 21 9 5 14

11 11 11 11 11 11 12 12 10 11 11 12 11 11 11 11 11 7

D5S818

12 12 11 11 13 13 12 13 13 11 12 12 13 11 11 12 12 12

12 14.2 14 15 15 13 14 14 14 12 15 12.2 12 13 12 13 13 14

D19S433

15 15 14.2 15 15 15 14 14 14 15 15 15 15 15 13 14 14 15

10 2.2 2.2 0 13 10 12 10 9 9 11 11 9 9 9 9 11 11

PENTA D

12 12 12 0 13 13 15 12 10 12 12 12 12 11 11 11 13 13

18 16 16 17 19 19 18 18 17 19 23 22 19 20 19 22 23 20

D2S1338

22 22 17 19 19 25 25 19 19 24 24 23 20 22 22 25 25 23

14 14 13 13 12 12 14 13 13 10 13 13 12 12 12 12 12 13

D8S1179

16 16 14 13 13 13 14 14 14 13 13 15 14 12 14 14 14 14

11 8 8 8 8 8 8 8 11 8 8 8 8 8 11 9 9 8

TPOX

11 11 8 11 11 8 8 11 11 11 8 11 8 11 11 11 11 9

20 22 22 20 20 20 19 24 22 21 19 19 20 20 19 21 21 20

FGA

22 24 24 20 22 22 24 46.2 46.2 22 21 22 26 24 24 25 23 23

IPC

9,65E+06 4,13E+06 1,87E+06 1,81E+04 8,26E+06 8,72E+05

Fonte – a autora

87

Tabela 18 - Perfis genéticos de seis trios com resultado de inclusão, analisados com com as mini-indels do cromossomo X. O índice de

paternidade combinado (IPC) encontra-se na última linha da tabela, para cada caso analisado. Os IP calculados para as indels do cromossomo X

levaram em consideração a independência dos marcadores. SP – Suposto Pai, C – Criança, M – Mãe.

INCLUSÕES OCTAPLEX MINI-INDELS X

TRIO 7 TRIO 8 TRIO 9 TRIO 10 TRIO 11 TRIO 12

STRs SP 7 C 7 M 7 SP 8 C 8 M 8 SP 9 C 9 M 9 SP 10 C 10 M 10 SP 11 C 11 M 11 SP 12 C 12 M 12

2_I 2_D 2_D 2_I 2_D 2_D 2_D 2_D 2_D 2_I 2_I 2_I 2_D 2_D 2_I 2_I 2_I 2_I

FAM2

--- 2_I 2_D --- 2_I 2_I --- 2_I 2_I ----- 2_I 2_I ----- 2_I 2_I ----- 2_I 2_I

3_I 3_I 3_I 3_D 3_D 3_I 3_I 3_I 3_I 3_I 3_D 3_D 3_I 3_I 3_I 3_I 3_I 3_I

FAM3

----- 3_I 3_I --- 3_I 3_I --- 3_I 3_I ----- 3_I 3_D ----- 3_I 3_I ----- 3_I 3_I

4_D 4_D 4_I 4_D 4_D 4_I 4_D 4_D 4_D 4_D 4_D 4_D 4_I 4_I 4_D 4_I 4_I 4_D

FAM4

----- 4_I 4_I --- 4_I 4_I --- 4_D 4_I ----- 4_D 4_I ----- 4_I 4_I ----- 4_I 4_I

11_I 11_I 11_I 11_I 11_I 11_I 11_D 11_D 11_I 11_I 11_I 11_I 11_I 11_D 11_D 11_I 11_I 11_I

FAM11

----- 11_I 11_I --- 11_I 11_I --- 11_I 11_I ----- 11_I 11_I ----- 11_I 11_I ----- 11_I 11_I

2_I 2_I 2_I 2_I 2_I 2_D 2_I 2_I 2_D 2_I 2_D 2_D 2_D 2_D 2_D 2_I 2_I 2_I

VIC2

----- 2_I 2_I --- 2_I 2_I --- 2_I 2_I ----- 2_I 2_D ----- 2_D 2_I ----- 2_I 2_I

3_D 3_D 3_D 3_I 3_I 3_I 3_I 3_I 3_I 3_I 3_I 3_I 3_I 3_I 3_I 3_D 3_D 3_D

VIC3

----- 3_I 3_I --- 3_I 3_I --- 3_I 3_I ----- 3_I 3_I ----- 3_I 3_I ----- 3_D 3_I

4_I 4_I 4_D 4_I 4_I 4_I 4_D 4_D 4_D 4_I 4_I 4_D 4_I 4_D 4_D 4_D 4_D 4_D

VIC4

----- 4_I 4_I --- 4_I 4_I --- 4_D 4_D ----- 4_I 4_I ----- 4_I 4_D ----- 4_D 4_I

5_D 5_D 5_D 5_I 5_I 5_D 5_I 5_D 5_D 5_I 5_D 5_D 5_D 5_D 5_D 5_D 5_D 5_D

VIC5

----- 5_I 5_I --- 5_I 5_I --- 5_I 5_I ----- 5_I 5_I ----- 5_D 5_I ----- 5_D 5_I

IPC 1,28E+01 3,42E+01 6,16E+01 3,04E+01 1,04E+02 1,81E+02

Fonte – a autora

88

Tabela 19 - Índice de paternidade combinado (IPC) dos trios com inclusões nos diversos sistemas de multiplex utilizados e suas combinações. Os

IP calculados para as indels do cromossomo X levaram em consideração a independência dos marcadores.

Trios IPC Octaplex

STRs

IPC Dodecaplex

STRs

IPC Octaplex

mini-indels X

IPC Octaplex

STRs *

Dodecaplex STRs

IPC Octaplex

STRs * Octaplex

mini-indels X

IPC Dodecaplex

STRs * Octaplex

mini-indels X

IPC Octaplex

STRs *

Dodecaplex *

Octaplex mini-

indels X

TRIO 7

1,379E+04 9,652E+06 1,28E+01 1,003E+10 1,76E+05 1,24E+08 1,28E+11

TRIO 8

6,303E+02 4,125E+06 3,42E+01 1,865E+08 2,16E+04 1,41E+08 6,38E+09

TRIO 9

9,301E+02 1,872E+06 6,16E+01 3,535E+07 5,73E+04 1,15E+08 2,18E+09

TRIO 10

3,669E+02 1,808E+04 3,04E+01 3,409E+05 1,11E+04 5,49E+05 1,04E+07

TRIO 11

2,182E+02 8,259E+06 1,04E+02 2,336E+08 2,27E+04 8,60E+08 2,43E+10

TRIO 12

2,277E+03 8,724E+05 1,81E+02 3,914E+08 4,12E+05 1,58E+08 7,08E+10

Fonte – a autora

.

89

6.6 Estudo de casos: exames de paternidade em casos de Suposto Pai

Falecido

Dezessete casos de paternidade com suposto pai falecido (post-mortem)

compostos por diferentes configurações foram analisados com número variados de

STRs autossômicos. Em alguns casos em que a exclusão não foi confirmada ou o

resultado foi indefinido foram usados números variados de X-STRs.

Em adição a estes, as mini-indels do cromossomo X também foram

estudadas, para fins comparativos.

Dos dezessete casos de post mortem (chamados de PM) analisados, oito

apresentaram resultado de exclusão e nove, resultado de inclusão de paternidade.

Devido às configurações diferentes, foram desenhados heredogramas para

uma melhor visualização (Figura 19 à Figura 35).

Os casos de exclusão (PM1-PM8) serão detalhados individualmente

.

90

O caso PM1 encontra-se ilustrado na figura 19. Foram analisados 25 STRs

autossômicos (mais amelogenina) que comparativamente apresentaram 10

exclusões (Tabela 20). Foram também analisadas 8 mini-indels do cromossomo X

que não apresentaram nenhuma exclusão categórica (Tabela 21).

Figura 19 – Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 1 (PM1). PSPF – pai do

suposto pai falecido, MSPF – mãe do suposto pai falecido, SPF – suposto pai falecido, M – mãe, C –

criança.

Fonte – a autora.

91

Tabela 20 – Perfis genéticos do caso Post mortem 1 obtidos pela análise de 25 STRs autossômicos (mais amelogenina). Os alelos em negrito e hachurados

indicam as exclusões obtidas. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno obrigatório, MSPF – mãe do suposto pai falecido, PSPF – pai do suposto pai

falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos possíveis

POST MORTEM 1

#

LOCOS

M

C

APO

MSPF

PSPF

SPF¹

1

AMELOGENINA

XX

X

XX

XY

2

CD4

5/9

5/6

6

4/9

4; 9; 4; 9;

3

CSF1PO

11/12

11/11

11

11/12

11; 12; 11; 12;

4

D12S391

18.3/19

18.3/18.3

18.3

17/18

17/20

17; 20; 17; 18;

5

D13S317

8/11

8/12

12

9/12

8/10

8; 10; 9; 12;

6

D16S539

9/11

9/13

13

9/12

8/12

8; 12; 9; 12;

7

D18S535

9/13

9/14

14

12/15

13/15

12; 13; 15; 15

8

D18S849

16/16

15/16

15

15/16

15; 16; 15; 16;

9

D19S253

12/13

13 ou 12

7/12

7; 12; 7; 12;

10

D1S1656

12/19

12/16

16

12/12

12/17

12; 17; 12; 12;

11

D1S533

9/13

9/12

12

14/14

8/12

8; 12; 14; 14;

12

D20S85

6/6

6/13

13

6/12

6/6

6; 6; 6; 12;

13

D3S1744

19/21

18/19

18

18/19

17/18

17; 18; 18; 19;

14

D5S818

11/11

11

11/12

10/12

10; 12; 11; 12;

15

D7S820

10/11

8/11

8

10/11

10/12

10; 12; 10; 11;

16

D8S1132

19/22

22/24

24

17/23

18/20

18; 20; 17; 23;

17

D8S306

21/23

21/24

24

21/24

24/24.2

24; 24.2; 21; 24;

18

D9S304

9/11

9 ou 11

8/10

10/13

10; 13; 8; 10;

19

DHFRP2

5/5

5

5/8

7/8

7; 8; 5; 8;

20

F13A01

3.2/6

3.2/3.2

3.2

3.2/3.2

6/6

6; 6; 3.2; 3.2;

21

F13B

7/9

7/10

10

10/10

10; 10; 10; 10;

22

FESFPS

10/11

10 ou 11

11/11

10/11

10; 11; 11; 11;

23

LPL

11/12

12 ou 11

10/11

11/11

11; 11; 10; 11;

24

TH01

6/9.3

6/9

9

6/8

9/9

9; 9; 6; 8;

25

TPOX

8/8

8

8/9

8/12

8; 12; 8; 9;

STRs Autossômicos

26

VWA

15/17

15 ou 17

16/18

16; 18; 16; 18;

Exclusões: 10/26

Fonte – a autora.

92

Tabela 21 - Perfis genéticos do caso Post mortem 1 obtidos pela análise de 8 mini-indels do cromossomo X. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno

obrigatório, MSPF – mãe do suposto pai falecido, PSPF – pai do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos possíveis.

POST MORTEM 1

#

LOCOS

M

C

APO

MSPF

PSPF

SPF¹

2_I

2_D

1

FAM2

2_I

2_D

-----

3_I

2

FAM3

3_I

-----

4_D

4_D ou 4_I

4_D

3

FAM4

4_I

4_D

-----

11_D

11_I

4

FAM11

11_I

-----

2_I

2_D

5

VIC2

2_I

2_D

-----

3_D

3_D ou 3_I

3_I

6

VIC3

3_I

-----

4_D

4_D ou 4_I

4_I

7

VIC4

4_I

-----

5_I

5_D

5_I

5_D ou 5_I

Mini-Indels X

8

VIC5

5_I

-----

Exclusões: Nenhuma Categórica

Fonte – a autora.

93

O caso PM2 encontra-se ilustrado na figura 20. Foram analisados 32 STRs

autossômicos (mais amelogenina) que comparativamente apresentaram 5 exclusões

(Tabela 22). Foram também analisadas 8 mini-indels do cromossomo X que

apresentaram 3 exclusões (Tabela 23).

Figura 20 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 2 (PM2). MSPF – mãe

do suposto pai falecido, I 1 – irmã 1 do suposto pai falecido, I 2 – irmão 2 do suposto pai falecido,

SPF – suposto pai falecido, M – mãe, C – criança.

Fonte – a autora.

94

Tabela 22 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 2 obtidos pela análise de 32 STRs autossômicos

(mais amelogenina). Os alelos em negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas. M – mãe, C –

criança, APO – alelo paterno obrigatório, MSPF – mãe do suposto pai falecido, I1 – irmã 1 do suposto

pai falecido, I2 – irmão 2 do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos possíveis

POST MORTEM 2

#

LOCOS

M

C

APO

MSPF

I1

I2

SPF¹

1

AMELOGENINA

XX

X

XX

XY

2

CD4

4/5

5/9

9

5/9

9/9

9; 5; 9; ?;

3

CSF1PO

10/12

10 ou 12

11/12

11; ?; 12; ?;

4

D12S391

19/22

22/22

22

21/21

21/22

21; 21; 22; ?;

5

D13S317

11/11

11/13

13

9/11

9/12

9; 11; 12; ?;

6

D16S539

12/12

12

11/12

11; ?; 12; ?;

7

D18S51

10/13

13/16

16

13/14

14/21

13/14

14; 13; 21; ?;

8

D18S535

12/12

12

12/15

12/13

12; 15; 13; ?;

9

D18S849

16/17

17/18

18

15/18

15/16

16/18

15; 18; 16; ?;

10

D19S253

7/13

13/13

13

7/11

7; ?; 11; ?;

11

D19S433

13/14

14/14

14

14/15

14; ?; 15; ?;

12

D1S1656

13/16

13/15

15

10/13

13/18

10/15

13; 10; 18; 15;

13

D1S533

11/12

11/13

13

8/8

8/14

8/8

8; 14; 8; 8

14

D20S85

6/6

6/12

12

6/10

6/6

6/10

6; 10; 6; ?;

15

D21S11

30/32.2

30/31

31

29/29

29/31.2

29; 29; 31.2; ?;

16

D2S1338

17/25

25/27

27

18/22

22/24

16/22

22; 16; 24; 18;

17

D3S1358

17/18

16/18

16

14/17

16/17

14/16

14,17,16, ?

18

D3S1744

16/17

16/19

19

16/18

16/21

18/20

16; 18; 21; 20;

19

D5S818

11/12

11 ou 12

10/12

12/12

10/12

12; 10; 12; ?;

20

D7S820

10/12

7/12

7

8/12

9/12

9; 8; 12; ?;

21

D8S1132

22/22

20/22

20

18/23

17/18

18/21

17; 21; 18; 23;

22

D8S1179

13/13

12/13

12

12/14

11/12

13/14

11; 13; 12; 14;

23

D8S306

22/23

20/23

20

23/26

22/26

22; 23; 26; ?;

24

D9S304

4/12

4/11

11

11/13

8/11

8/13

8; 13; 11; ?;

25

DHFRP2

5/5

5

4/5

4/7

5/7

4; 5; 7; ?;

26

F13A01

6/7

7 ou 6

5/15

5/6

5; 15; 6; ?;

27

F13B

8/10

10 ou 8

8/9

9/9

9; 8; 9; ?;

28

FESFPS

10/11

11/11

11

10/12

11/12

10/11

11; 10; 12; ?;

29

FGA

22/23

21/22

21

22/23

20/23

20; 22; 23; ?;

30

LPL

10/10

10/12

12

10/11

10/10

10; 11; 10; ?;

31

TH01

7/9.3

9/9.3

9

6/9.3

9.3/9.3

9.3; 6; 9.3; ?;

32

TPOX

10/11

8/11

8

10/11

8/11

8; 10; 11; ?;

STRs Autossômicos

33

VWA

16/18

13/16

13

16/16

16/17

16; 16; 17; ?;

Exclusões: 5/33

Fonte – a autora.

95

Tabela 23 - Perfis genéticos do caso Post mortem 2 obtidos pela análise de 8 mini-indels do

cromossomo X. Os alelos em negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas. M – mãe, C –

criança, APO – alelo paterno obrigatório, MSPF – mãe do suposto pai falecido, I1 – irmã 1 do suposto

pai falecido, I2 – irmão 2 do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos possíveis.

POST MORTEM 2

#

LOCOS

M

C

APO

MSPF

I1

I2

SPF¹

2_I

2_D

1

FAM2

2_I

2_D

-----

3_I

3_D

3_I

3_D ou 3_I

2

FAM3

3_I

-----

4_D

4_D ou 4_I

4_D

4_D ou 4_I

3

FAM4

4_I

4_D

-----

11_I

4

FAM11

11_I

-----

2_D

2_D ou 2_I

2_D

2_D ou 2_I

5

VIC2

2_I

-----

3_D

3_I

3_D

3_I

3_D

3_D ou 3_I

6

VIC3

3_D

3_I

-----

4_D

4_I

4_D

7

VIC4

4_I

4_D

-----

5_D

5_I

5_D

5_I

Mini-Indels X

8

VIC5

5_D

5_I

-----

Exclusões: 3/8

Fonte – a autora.

O caso PM3 encontra-se ilustrado na figura 21. Foram analisados 30 STRs

autossômicos (mais amelogenina) que comparativamente não apresentaram

nenhuma exclusão categórica e gerando um IPC de 0,00669 (Tabela 24). Foram

analisados 7 X-STRs que apresentaram 6 exclusões (Tabela 25). Foram também

analisadas 8 mini-indels do cromossomo X que apresentaram apenas 1 exclusão

(Tabela 26).

96

Figura 21 -

Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 3 (PM3). I 1 – irmão 1 do

suposto pai falecido, ML – mulher legítima do suposto pai falecido, SPF – suposto pai falecido, M –

mãe, F 1 – filho legítimo do suposto pai falecido, C – criança.

Fonte – a autora.

97

Tabela 24 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 3 obtidos pela análise de 30 STRs autossômicos (mais amelogenina). M – mãe, C – criança, APO –

alelo paterno obrigatório, I 1 – irmão 1 do suposto pai falecido, ML – mulher legítima do suposto pai falecido, F 1 – filho legítimo do suposto pai falecido, SPF¹

– suposto pai falecido. ¹alelos possíveis. IP – índice de paternidade, IPC – índice de paternidade combinado.

POST MORTEM 3

#

LOCOS

M

C

APO

I1

ML

F1

SPF¹

IP

1

AMELOGENINA

XX

X

XY

XX

XY

-

2

CD4

5/9

4/5

4

4/4

5/9

9/9

9; 4, 4, ? 1,16

3

CSF1PO

12/12

12

12/13

10/10

10/12

12; 13, ?, ? 1,73

4

D12S391

17/21

18/21

18

19/21

18/18

18/22

22; 19, 21, ? 0,50

5

D13S317

8/12

11/12

11

11/11

8/8

8/9

9; 11, 11, ? 1,33

6

D16S539

9/12

11/12

11

13/13

9/12

12/13

13; 13, ?, ? 0,50

7

D18S51

12/17

12/14

14

12/15

15/19

13/19

13; 12, 15, ? 0,50

8

D18S535

13/15

15 ou 13

14/15

12/14

13/14

13; 14, 15, ? 1,38

9

D18S849

16/16

14/16

14

14/16

15/17

15/16

16; 14, ?, ? 2,28

10

D19S253

11/12

11 ou 12

7/12

7/11

7; 11, 12, ? 0,70

11

D19S433

13/14

14/14

14

12/13

13/13

13; 12, ?, ? 0,50

12

D1S1656

15/15.3

12/15

12

11/12

13/14

12/14

12; ?, ?, ? 3,23

13

D1S533

12/13

12 ou 13

10/13

9/12

10/12

10; 12, 13, ? 0,75

14

D20S85

6/6

6

8/10

6/11

6/8

8; 10, ?, ? 0,50

15

D21S11

32.2/33.2

32.2/32.2

32.2

27/32.2

28/31

30/31

30; 27, 32.2, ? 2,35

16

D2S1338

19/20

17/20

17

23/25

18/20

18/23

23; 25, ?, ? 0,50

17

D3S1358

15/15

15/16

16

15/19

15/18

14/15

14; 15, 19, ? 0,50

18

D3S1744

16/19

16/20

20

18/18

18/19

17/18

17; 18, 18, ? 0,50

19

D5S818

12/13

13/13

13

10/13

10/11

11/12

12; 10, 13, ? 1,25

20

D7S820

10/11

9/10

9

12/13

10/11

10/12

12; 13, ?, ? 0,50

21

D8S1132

18/18

18

18/19

18/20

18/18

18; 19, ?, ? 2,25

22

D8S1179

15/15

14/15

14

13/16

13/13

13/16

16; 13, ?, ? 0,50

23

D8S306

23/24

22/23

22

21/22

22.2/24

22/24

22; 21, ?, ? 2,69

24

DHFRP2

5/5

5/8

8

5/7

4/5

5; 7, ?, ? 0,50

25

F13A01

6/7

6 ou 7

5/6

6/16

5/16

5; 6, ?, ? 0,73

26

F13B

9/10

9 ou 10

8/8

9/10

8/10

8; 8, ?, ? 0,50

27

FESFPS

10/10

10/11

11

11/12

11/11

11/12

12; 11, ?, ? 0,76

STRs Autossômicos

28

FGA

21/22

22/25

25

20/25

20/20

20; 25, ?, ? 1,56

98

#

LOCOS

M

C

APO

I1

ML

F1

SPF¹

IP

29

LPL

12/13

10/13

10

9/12

10/10

10/12

12; 9, ?, ? 0,50

30

TH01

6/9

6/7

7

9.3/9.3

7/7

7/9.3

9.3; 9.3, ?, ? 0,50

31

TPOX

8/8

8

8/11

11/11

11; 8, ?, ? 0,50

Exclusões: Nenhuma Categórica

IPC = 0,00669

Fonte – a autora.

Tabela 25 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 3 obtidos pela análise de 7 X-STRs. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno obrigatório, I 1 – irmão 1

do suposto pai falecido, ML – mulher legítima do suposto pai falecido, F 1 – filho legítimo do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos

possíveis. Os alelos em negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 3

#

LOCOS X

M

C

APO

I1

ML

F1

SPF¹

1

DX8378

9/11

9/10

10

12

10/11

11/12

12

2

DXS7132

13/15

13/14

14

13

12/14

14/15

15

3

DXS7423

15/16

13/16

13

15

14/15

15/15

15

4

DXS8377

39/46

46/49

49

47

40/52

40/47

47

5

ARA

20/24

20 ou 24

23

22/23

23/26

26

6

HPRTB

14/15

13/15

13

14

13/15

14/15

14

X-STRs

7

DX7424

11/16

16/16

16

10/15

10/16

16

Exclusões: 6/7

Fonte – a autora.

99

Tabela 26 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 3 obtidos pela análise de 8 mini-indels do cromossomo X. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno

obrigatório, I 1 – irmão 1 do suposto pai falecido, ML – mulher legítima do suposto pai falecido, F 1 – filho legítimo do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto

pai falecido. ¹alelos possíveis. Os alelos em negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 3

#

LOCOS

M

C

APO

I1

ML

F1

SPF¹

2_D

2_D ou 2_I

2_I

2_D

2_I

1

FAM2

2_I

-----

2_D

2_I

-----

3_D

3_I

3_D

3_D ou 3_I

2

FAM3

3_I

-----

3_I

-----

4_D

4_D ou 4_I

4_D

3

FAM4

4_I

-----

4_I

4_D

-----

11_I

11_D

11_I

11_D

11_I

4

FAM11

11_I

-----

11_I

-----

2_D

2_D ou 2_I

2_I

2_D

2_I

5

VIC2

2_I

-----

2_D

2_I

-----

3_I

6

VIC3

3_I

-----

3_I

-----

4_I

4_D

4_D ou 4_I

7

VIC4

4_I

-----

4_I

-----

5_D

5_I

5_D

5_D ou 5_I

Mini-Indels X

8

VIC5

5_D

-----

5_I

-----

Exclusões: 1/8

Fonte – a autora.

100

O caso PM4 encontra-se ilustrado na figura 22. Foram analisados 31 STRs

autossômicos (mais amelogenina) que comparativamente apresentaram 9 exclusões

categóricas (Tabela 27). Foram também analisadas 8 mini-indels do cromossomo X

que apresentaram apenas 1 exclusão (Tabela 28).

Figura 22 -

Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 4 (PM4). PSPF – pai do

suposto pai falecido, I 1 – irmã 1 do suposto pai falecido, I 2 – irmã 2 do suposto pai falecido, SPF –

suposto pai falecido, M – mãe, C – criança.

Fonte – a autora.

101

Tabela 27 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 4 obtidos pela análise de 31 STRs autossômicos. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno

obrigatório, PSPF – Pai do suposto pai falecido, I 1 – irmã 1 do suposto pai falecido, I 2 – irmã 2 do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos

possíveis. Os alelos em negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 4

#

LOCOS

M

C

APO

PSPF

I1

I2

SPF¹

1

AMELOGENINA

XX

X

XY

XX

XY

2

CD4

4/9

4/5

5

4/5

4/10 4; 10; 5; ?;

3

CSF1PO

7/8

7/12

12

11/11

11/13

11/13 11; 11; 13; ?;

4

D12S391

18/20

20/22

22

19/20

18/19

18/20 18; 20; 19; ?;

5

D13S317

8/13

8 ou 13

11/12

9/11

11; 9; 12; 11 ou 12

6

D16S539

11/11

9/11

9

9/12

12/13 9; 13; 12; ?;

7

D18S51

18/19

14/19

14

13/16

12/13

16/19

12; 16; 13; 19;

8

D18S535

14/14

14

12/14

9/12

13/14 9; 13; 12; 14;

9

D18S849

16/17

16/16

16

15/16

16/16 16; 15; 16; ?;

10

D19S253

8/11

8/8

8

12/14

12/12

12/13

12; 13; 12; 14;

11

D19S433

12.2/13

12.2/13.2

13.2

13/15

14.2/15

14/15

14.2; 14; 15; 13;

12

D1S1656

10/15

10/13

13

17.3/17.3

14/17.3

17/17.3

14; 17; 17.3; 17.3;

13

D1S533

13/14

11/13

11

7/8

8/15

7; 15; 8; 7 ou 8;

14

D20S85

6/11

7/11

7

6/11

6/6

6/11 6; 11; 6; ?;

15

D21S11

29/33.2

29/30

30

30/30

29/30 30; 29; 30; 30;

16

D2S1338

19/22

17/22

17

21/24

21/22

21/22 21; ?; 22; 24;

17

D3S1358

16/17

14/16

14

16/18

16/16 16; 18; 16; ?;

18

D3S1744

17/19

18/19

18

19/19

18/19

17/19 18; 17; 19; 19;

19

D5S818

12/13

11/12

11

7/11

7/13

11/13 7; 11; 13; ?;

20

D7S820

10/12

9/10

9

8/8

8/11

8/11 8; 8; 11; ?;

21

D8S1132

16/21

21/21

21

21/23

16/21

20/21 16; 20; 21; 23;

22

D8S1179

10/15

12/15

12

13/14

14/14

14/14 14; 13; 14; ?;

23

D9S304

10/11

10/12

12

12/13

9/12

9/13 9; 13; 12; ?;

24

DHFRP2

5/8

7/8

7

5/6

6/8

6/8 6; 5; 8; ?;

STRs Autossômicos

25

F13A01

3.2/7

6/7

6

3.2/7

7/7 7; 3.2; 7; ?;

102

#

LOCOS

M

C

APO

PSPF

I1

I2

SPF¹

26

F13B

6/9

6/8

8

7/9

7/10

7/9

7; 9; 10; 7 ou 9;

27

FESFPS

8/11

8/12

12

11/11

11/11 11; 11; 11; ?;

28

FGA

20/23

21/23

21

23.2/25

23.2/26

22/25

23.2; 22; 26; 25;

29

LPL

10/12

10/11

11

9/12

12/13

9/10

12; 9; 13; 10;

30

TH01

6/7

6 ou 7

6/9.3

6/7

6/8 6; 8; 7; 9.3;

31

TPOX

8/8

8/11

11

11/12

8/11

8/12 8; 12; 11; ?;

32

VWA

14/17

14/16

16

16/17

15/16

15/16 15; 17; 16; ?;

Exclusões: 9/32

Fonte – a autora

Tabela 28 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 4 obtidos pela análise de 8 mini-indels do cromossomo X. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno

obrigatório, PSPF – Pai do suposto pai falecido, I 1 – irmã 1 do suposto pai falecido, I 2 – irmã 2 do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos

possíveis. Os alelos em negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 4

#

LOCOS

M

C

APO

PSPF

I1

I2

SPF¹

2_I

1

FAM2

2_I

-----

2_I

-----

3_D

3_D ou 3_I

3_I

2

FAM3

3_I

-----

3_I

-----

4_D

4_I

4_D

4_D ou 4_I

3

FAM4

4_I

-----

4_I

4_D

-----

11_D

11_I

11_D

11_I

11_D ou 11_I

4

FAM11

11_I

-----

11_I

-----

2_I

2_D

2_I

5

VIC2

2_I

-----

2_I

-----

3_I

3_D

3_I

3_D ou 3_I

6

VIC3

3_I

-----

3_I

-----

4_D

7

VIC4

4_D

-----

4_D

-----

5_D

5_D ou 5_I

5_I

5_D

Mini-Indels X

8

VIC5

5_I

-----

5_I

-----

Exclusões: 1/8

Fonte – a autora

103

O caso PM5 encontra-se ilustrado na figura 23. Foram analisados 32 STRs

autossômicos (mais amelogenina) que comparativamente apresentaram 1 exclusão

(Tabela 29). Foram analisados 7 X-STRs que apresentaram 1 exclusão (Tabela 30).

Foram também analisadas 8 mini-indels do cromossomo X que não apresentaram

nenhuma exclusão categórica (Tabela 31).

Figura 23

-

Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 5 (PM5). I 1 – irmã 1 do

suposto pai falecido, I 2 – irmã 2 do suposto pai falecido, I 3 – irmão 3 do suposto pai falecido, SPF –

suposto pai falecido, M – mãe, C – criança.

Fonte – a autora.

104

Tabela 29 – Perfis genéticos do caso Post Mortem 5 obtidos pela análise de 32 STRs autossômicos. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno

obrigatório, I 1 – irmã 1 do suposto pai falecido, I 2 – irmã 2 do suposto pai falecido, I 3 – irmão 3 do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos

possíveis. Os alelos em negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 5

#

LOCOS

M

C

APO

I1

I2

I3

SPF¹

1

AMELOGENINA

XX

X

XX

XY

2

CD4

4/9

9/9

9

4/9

4; ?; 9; ?;

3

CSF1PO

10/13

13 ou 10

10/11

11/12

10; 12; 11; ?;

4

D12S391

20/20

20/22

22

20/22

18/23

18/20

20; 18; 22; 23;

5

D13S317

8/12

12/12

12

11/12

8/11

11; 8; 12; ?;

6

D16S539

10/12

10 ou 12

12/13

12; ?; 13; ?;

7

D18S51

15/19

19/19

19

14/15

14; ?; 15; ?;

8

D18S535

9/13

13/13

13

9/13

12/13

9; 12; 13; ?;

9

D18S849

16/16

16/17

17

17/17

16/17

17; 16; 17; ?;

10

D19S253

7/12

7/10

10

7/9

9/12

7; 12; 9; ?;

11

D19S433

14/14

14

13/13

13/15

13; 15; 13; ?;

12

D1S1656

16/18

18/21

21

16/18

12/16

16/18

16; 12; 18; ?;

13

D1S533

12/12

12/13

13

9/9

9/12

9; 12; 9; ?;

14

D20S85

10/13

9/10

9

6/6

6; ?; 6; ?;

15

D21S11

30.2/32.2

30/30.2

30

28/31.2

28; ?; 31.2; ?;

16

D2S1338

22/23

20/22

20

17/24

16/22

17/22

17; 16; 24; 22;

17

D3S1358

15/17

15/18

18

17/18

15/17

17/17

17; 15; 17; 18;

18

D3S1744

17/17

17/19

19

18/19

18/18

17/19

18; 19; 18; 17;

19

D5S818

11/12

12/13

13

11/11

8/11

11; 8; 11; ?;

20

D7S820

10/12

12/13

13

7/12

12/12

12; 7; 12; ?;

21

D8S1132

18/18

18

19/19

18/22

19/19

19; 18; 19; 22;

22

D8S1179

8/13

8/14

14

14/14

12/14

14/14

14; 12; 14; ?;

23

D8S306

22/22

22/23

23

21/25

21/23

21; 23; 25; ?;

24

D9S304

11/13

4/13

4

4/8

8/12

4; 12; 8; ?;

25

DHFRP2

5/7

7/7

7

5/8

7/8

5; 7; 8; ?;

26

F13A01

6/7

7 ou 6

3.2/7

5/7

5/6

3.2; 5; 7; 6;

27

F13B

9/10

10/10

10

8/9

8/10

8; 10; 9; ?;

28

FESFPS

11/14

11/12

12

10/11

10/10

10/11

10; 11; 10; ?;

STRs Autossômicos

105

#

LOCOS

M

C

APO

I1

I2

I3

SPF¹

29

FGA

24/25

21/24

21

21/21

20/24

20/21

21; 20; 21; 24;

30

LPL

10/11

11/11

11

11/12

10/12

11; 10; 12; ?;

31

TH01

6/6

6

7/9.3

7/9

7/9.3

7; 9; 9.3; ?;

32

TPOX

8/9

9/11

11

8/9

9/11

8; 11; 9; ?;

33

VWA

16/16

16/17

17

17/18

17/17

17; 18; 17; ?;

Exclusões: 1/33

Fonte – a autora.

Tabela 30 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 5 obtidos pela análise de 7 X-STRs. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno obrigatório, I 1 – irmã 1 do

suposto pai falecido, I 2 – irmã 2 do suposto pai falecido, I 3 – irmão 3 do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos possíveis. Os alelos em

negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 5

#

LOCOS X

M

C

APO

I1

I2

I3

SPF¹

1

ARA

23/24

23 ou 24

25/25

30

25 ou 30

2

DX172D05

8/10

8 ou 10

10/11

10

10;?

3

DX6800

16/16

16

16/19

19

19;?

4

DX7423

14/15

14 ou 15

13/15

15

15;?

5

DX7424

15/16

12/16

12

14/15

15

15;?

6

DX8377

45/47

47/49

49

-

44/52

44

44;?

X-STRs

7

HPRTB

12/14

12 ou 14

-

10/13

13

13;?

Exclusões: 1/7

Fonte – a autora.

106

Tabela 31 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 5 obtidos pela análise de 8 mini-indels do cromossomo X. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno

obrigatório, I 1 – irmã 1 do suposto pai falecido, I 2 – irmã 2 do suposto pai falecido, I 3 – irmão 3 do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos

possíveis. Os alelos em negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 5

#

LOCOS

M

C

APO

I1

I2

I3

SPF¹

2_D

2_D ou 2_I

2_D

2_D ou ?

1

FAM2

2_I

-----

3_D

3_D ou 3_I

3_I

3_I ou ?

2

FAM3

3_I

-----

4_D

4_D ou 4_I

4_D

4_D ou ?

3

FAM4

4_I

-----

11_I

11_I ou ?

4

FAM11

11_I

-----

2_D

2_D ou 2_I

2_D

2_D ou ?

5

VIC2

2_I

2_D

-----

3_D

3_I

3_I ou ?

6

VIC3

3_I

3_D

3_I

-----

4_D

4_I

4_I ou ?

7

VIC4

4_I

-----

5_D

5_D ou 5_I

5_I

5_I ou ?

Mini-Indels X

8

VIC5

5_I

-----

Exclusões: Nenhuma categórica devido à configuração do caso

Fonte – a autora.

107

O caso PM6 encontra-se ilustrado na figura 24. Foram analisados 32 STRs

autossômicos (mais amelogenina) que comparativamente apresentaram 1 exclusão

(Tabela 32). Analisou-se 4 X-STRs que também apresentaram 1 exclusão (Tabela

33). Das 8 mini-indels do cromossomo X, não houve nenhuma exclusão categórica

(Tabela 34).

Figura 24 -

Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 6 (PM6). I 1 – irmã 1 do

suposto pai falecido, I 2 – irmão 2 do suposto pai falecido, SPF – suposto pai falecido, M – mãe, C –

criança.

Fonte – a autora.

108

Tabela 32 -

Perfis genéticos do caso Post Mortem 6 obtidos pela análise de 32 STRs autossômicos.

M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno obrigatório, I 1 – irmã 1 do suposto pai falecido, I 2 –

irmão 2 do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos possíveis. Os alelos em negrito e

hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 6

#

LOCOS

M

C

APO

I1

I2

SPF¹

1

AMELOGENINA

XX

X

XX

XY X;Y

2

CD4

4/5

5/9

9

4/5

4/5 4; ?; 5; ?;

3

CSF1PO

12/12

10/12

10

10/11

10/12 10; 12; 11; ?;

4

D12S1090

21/22

13/21

13

21/23

19/20

19;20;21;23

5

D12S391

15/19

15/22

22

22/24

22/24 22; ?; 24; ?;

6

D13S317

11/13

13/13

13

9/13

9/13 9; ?; 13; ?;

7

D16S539

11/12

9/11

9

12/12

12/12 12; ?; 12; ?;

8

D18S51

13/15

15/16

16

15/19

13/19 15; 13; 19; ?;

9

D18S535

12/14

12/13

13

13/14

12/13 13; 12; 14; ?;

10

D18S849

15/16

15/17

17

15/16

15/17 15; 17; 16; ?;

11

D19S253

7/13

7/11

11

7/13

7/13 7; ?; 13; ?;

12

D19S433

13/14

13/13

13

14/16

13/16 14; 13; 16; ?;

13

D1S1656

17/18

12/17

12

11/19

11/19 11; ?; 19; ?;

14

D1S533

13/14

12/13

12

13/13

13/13 13; ?; 13; ?;

15

D20S85

6/9

6/7

7

10/12

10/12 10; ?; 12; ?;

16

D21S11

28/29

29/30

30

30/32.2

30; ?; 32.2; ?;

17

D2S1338

20/20

20/21

21

17/22

17/22 17; ?; 22; ?;

18

D3S1358

16/17

16/16

16

16/18

15/18 16; 15; 18; ?;

19

D3S1744

15/19

15/22

22

16/18

16/18 16; ?; 18; ?;

20

D5S818

10/11

10/10

10

11/12

11/13 11; 13; 12; ?;

21

D7S820

10/13

8/13

8

10/11

10/11 10; ?; 11; ?;

22

D8S1132

17/18

17/24

24

20/21

19/20 20; 19; 21; ?;

23

D8S1179

12/14

13/14

13

13/15

13/13 13; 15; 13; ?;

24

D9S304

8/9

9 ou 8

10/12

8/10 10; 8; 12; ?;

25

DHFRP2

5/8

8 ou 5

5/5

5/5 5; ?; 5; ?;

26

F13A01

5/7

7 ou 5

5/6

6/6 6; 5; 6; ?;

27

F13B

10/10

6/10

6

9/10

9/10 9; ?; 10; ?;

28

FESFPS

10/11

10 ou 11

12/12

12/13 12; 13; 12; ?;

29

FGA

22/23

19/23

19

20/24

20/21 20; 21; 24; ?;

30

LPL

11/12

12/12

12

10/10

10/11 10; 11; 10; ?;

STRs Autossômicos

31

TH01

6/7

6/6

6

6/9.3

6/7 6; 7; 9.3; ?;

32

TPOX

8/12

12 ou 8

8/11

8/11 8; ?; 11; ?;

33

VWA

17/17

17

14/16

14/16 14; ?; 16; ?;

Exclusões: 1/33

Fonte – a autora

109

Tabela 33 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 6 obtidos pela análise de 4 X-STRs. M – mãe, C –

criança, APO – alelo paterno obrigatório, I 1 – irmã 1 do suposto pai falecido, I 2 – irmão 2 do suposto

pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos possíveis. Os alelos em negrito e hachurados

indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 6

#

LOCOS

M

C

APO

I1

I2

SPF¹

1

DXS6800

16/19

16 ou 19

16/16

16/16 16; ?

2

DXS7424

13/15

13/16

16

15/16

16/16 15; 16

3

ARA

22/26

22 ou 26

27/30

26/26 26; 27 ou 30

X-STRs

4

HPRTB

13/13

13/15

15

14/16

16/16

14; 16

Exclusões: 1/4

Fonte – a autora

Tabela 34 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 6 obtidos pela análise de 8 mini-indels do

cromossomo X. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno obrigatório, I 1 – irmã 1 do suposto pai

falecido, I 2 – irmão 2 do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos possíveis. Os

alelos em negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 6

#

LOCOS

M

C

APO

I1

I2

SPF¹

2_I

2_D

2_D ou ?

1

FAM2

2_I

-----

3_I

3_I ou ?

2

FAM3

3_I

-----

4_D

4_D ou 4_I

4_D

4_D ou ?

3

FAM4

4_I

-----

11_D

11_D ou 11_I

11_I

11_I ou ?

4

FAM11

11_I

-----

2_D

2_D ou 2_I

2_I

2_D

2_D ou 2_I

5

VIC2

2_I

-----

3_I

3_D

3_I

3_I ou ?

6

VIC3

3_I

-----

4_D

4_D ou 4_I

4_D

4_I

4_I ou ?

7

VIC4

4_I

-----

5_D

5_I

5_D

5_I

5_I ou ?

Mini-Indels X

8

VIC5

5_I

-----

Exclusões: Nenhuma categórica devido à configuração do caso

Fonte – a autora

110

O caso PM7 encontra-se ilustrado na figura 25. Foram analisados 33 STRs

autossômicos (mais amelogenina) que comparativamente apresentaram 4 exclusões

(Tabela 35). Das 8 mini-indels do cromossomo X, não houve nenhuma exclusão

categórica (Tabela 36).

Figura 25 -

Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 7 (PM7). I 1 – irmão 1 do

suposto pai falecido, I 2 – irmã 2 do suposto pai falecido, SPF – suposto pai falecido, M – mãe, C –

criança.

Fonte – a autora.

111

Tabela 35 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 7 obtidos pela análise de 33 STRs autossômicos.

M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno obrigatório, ). I 1 – irmão 1 do suposto pai falecido, I 2 –

irmã 2 do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos possíveis. Os alelos em negrito e

hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 7

#

LOCOS

M

C

APO

I1

I2

SPF¹

1

AMELOGENINA

XX

X

XY

XX XY

2

CD4

5/7

5/5

5

9/9

9/9 9; ?; 9; ?;

3

CSF1PO

12/12

12

10/11

10; ?; 11; ?;

4

D12S1090

22/26

26/26

26

19/21

12/20

12; 19; 20; 21

5

D12S391

15/20

17/20

17

15/18

15; ?; 18; ?;

6

D13S317

11/14

8/11

8

13/14

11/13

13; 11; 14; ?;

7

D16S539

10/13

10 ou 13

9/13

13/15

9; 15; 13; ?;

8

D18S51

13/16

16/17

17

16/17

16; ?; 17; ?;

9

D18S535

12/13

12 ou 13

9/13

9/13 9; ?; 13; ?;

10

D18S849

15/17

15/16

16

16/17

16; ?; 17; ?;

11

D19S253

7/12

12/13

13

12/13

12; ?; 13; ?;

12

D19S433

14/15

14 ou 15

14/15

12/16

14; 12; 15; 16;

13

D1S1656

14/18

14/15

15

16/17

16; ?; 17; ?;

14

D1S533

12/14

12/12

12

12/16

11/16

12; 11; 16; ?;

15

D20S85

9/13

6/13

6

6/6

6/6 6; ?; 6; ?;

16

D21S11

33.2/33.2

29/33.2

29

28/29

28; ?; 29; ?;

17

D2S1338

22/25

17/22

17

17/24

17; ?; 24; ?;

18

D3S1358

15/16

15/17

17

16/19

16; ?; 19; ?;

19

D3S1744

18/19

19/21

21

16/17

16; ?; 17; ?;

20

D5S818

10/13

10/12

12

10/12

10/13

10; 13; 12; ?;

21

D7S820

11/12

8/11

8

11/13

10/12

11; 10; 13; 12

22

D8S1179

11/12

10/12

10

10/13

10/12

10;13;12;?

23

D8S306

21/23

23 ou 21

21/23

21; 23; ?; ?

24

D9S304

12/13

8/13

8

9/10

8/10 8; 9 ;10; ?

25

DHFRP2

5/8

5/5

5

5/6

5/6 5; ?; 6; ?;

26

F13A01

3.2/5

5/6

6

6/7

6/6 6; 7; 6; ?;

27

F13B

6/9

6/10

10

8/9

9/9 9; 8; 9; ?;

28

FESFPS

10/11

10/13

13

10/11

11/12

10; 12; 11; ?;

29

FGA

20/26

20/25

25

20/21

20; ?; 21; ?;

30

PENTA D

9/10

9/13

13

9/15

11/12

9; 11; 12; 15

STRs Autossômicos

31

PENTA E

10/15

10/13

13

12/14

11/17

11; 12; 14; 17

32

TH01

6/6

6/9.3 9.3

9.3/9.3

6/6 6; 9.3; 6; 9.3;

33

TPOX

8/12

12/12 12

8/11

11/11

11; 8; 11; ?;

34

vWA

14/17

16/17 16

14/16

14; ?; 16; ?;

Exclusões: 4/34

Fonte – a autora

112

Tabela 36 -

Perfis genéticos do caso Post Mortem 7 obtidos pela análise de 8 mini-indels do

cromossomo X. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno obrigatório, ). I 1 – irmão 1 do suposto pai

falecido, I 2 – irmã 2 do suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos possíveis. Os alelos

em negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 7

#

LOCOS

M

C

APO

I1

I2

SPF¹

2_D

2_I

2_D

2_D ou ?

1

FAM2

2_I

-----

2_I

-----

3_D

3_D ou 3_I

3_I

3_I ou ?

2

FAM3

3_I

-----

3_I

-----

4_D

4_D ou ?

3

FAM4

4_I

4_D

-----

4_I

-----

11_D

11_D ou 11_I

11_I

11_D

11_I ou ?

4

FAM11

11_I

-----

11_I

-----

2_D

2_D ou 2_I

2_D

2_I

2_D ou 2_I

5

VIC2

2_I

-----

2_I

-----

3_D

3_I

3_I ou ?

6

VIC3

3_I

3_D

-----

3_I

-----

4_D

4_I

4_D

4_I ou ?

7

VIC4

4_I

-----

4_I

-----

5_D

5_I

5_I ou ?

Mini-Indels X

8

VIC5

5_D

5_I

-----

5_I

-----

Exclusões: Nenhuma categórica devido à configuração do caso

Fonte – a autora

113

O caso PM8 encontra-se ilustrado na figura 26. Foram analisados 34 STRs

autossômicos (mais amelogenina) que comparativamente apresentaram 4 exclusões

(Tabela 37). Os 5 X-STRs estudados resultaram em 5 exclusões (Tabela 38). Das 8

mini-indels do cromossomo X, não houve nenhuma exclusão categórica (Tabela 39).

Figura 26 -

Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 8 (PM8). I 1 – irmão 1 do

suposto pai falecido, I 2 – irmão 2 do suposto pai falecido, ML – mulher legítima do suposto pai

falecido SPF – suposto pai falecido, M – mãe, F 1 – filho legítimo do suposto pai falecido, C – criança.

Fonte – a autora.

114

Tabela 37- Perfis genéticos do caso Post Mortem 8 obtidos pela análise de 34 STRs autossômicos. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno

obrigatório, I 1 – irmão 1 do suposto pai falecido, I 2 – irmão 2 do suposto pai falecido, ML – mulher legítima do suposto pai falecido, F 1 – filho legítimo do

suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos possíveis. Os alelos em negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 8

#

LOCOS

M

C

APO

I1

I2

MV

F1

SPF

1

AMELOGENINA XX

XX

X

XY

XX

XX XY

2

CD4 5/9

5/9

5 ou 9

9/10

4/9

4/4 9; 4; 10; ?;

3

CSF1PO 11/12

10/11

10

10/12

12/12

11/12 12; 10; 12; 11;

4

D12S1090

23/25

22/23

22

13/25

13/19

21/21

21/24

13; 19; 25; 24

5

D12S391 18/21

21/26

26

18/19

19/20

19/22 18; 22; 19; ?;

6

D13S317 11/11

11/11

11

9/11

11/12

10/12

12/12 9; 12; 11; ?;

7

D16S539 12/13

12/13

12 ou 13

10/13

11/11

9/14

9/11 11; 10; 11; 13;

8

D18S51 17/20

17/17

17

16/17

18/19

16/18 16; ?; 17; ?;

9

D18S535 13/14

13/16

16

13/15

13/15 13; ?; 15; ?;

10

D18S849

16/16

14/16

14

15/16

15/18

16/16

16/17

15; 18; 16; 17;

11

D19S253 12/13

12/13

13 ou 12

12/12

8/12

12/12 12; ?; 12; ?;

12

D19S433 13/14

13/15.2

15.2

13/13

13/16

13/13 13; ?; 13; ?;

13

D1S1656 15/18.3

12/18.3

12

13/15

11/15

15.3/17.3

11/17.3 13; 11; 15; ?;

14

D1S533 12/15

12/12

12

9/14

13/14

12/12

12/12 9; 13; 14; 12;

15

D20S85 6/12

8/12

8

6/8

6/9

6/9 6; ?; 8; 9;

16

D21S11 28/30

28/28

28

27/31.2

29/29

29/30 27; 30; 31.2; ?;

17

D2S1338 16/21

21/22

22

17/23

17/17

20/20

17/20 17; 23; 17; ?;

18

D3S1358 15/15

15/16

16

18/18

15/15

15/15 18; 15; 18; ?;

19

D3S1744 15/18

18/21

21

18/18

18/18 18; ?; 18; ?;

20

D5S818 11/12

11/12

11 ou 12

11/12

12/12

11/13

13/14 12; 11; 12; 14;

21

D7S820 12/12

9/12

9

7/11

11/11

9/12

9/11 11; 7; 11; ?;

22

D8S1132 19/23

18/23

18

20/20

18/20

23/23

22/23 20; 18; 20; 22;

23

D8S1179 12/13

12/13

12 ou 13

13/14

13/13

10/15

15/15 13; 14; 13; 15;

24

D8S306 21/24

23/24

23

22/24

19/22

21/24

21/22 22; 19; 24; ?;

25

D9S304 11/13

9/11

9

4/5

4/11

8/12

11/12 4; 11; 5; ?;

26

DHFRP2 6/7

7/7

7

5/5

5/8

5/7

5/5 5; 8; 5; ?;

27

F13A01 3.2/5

3.2/6

6

3.2/4

4/5

4/6

5/6 3.2; 5; 4; ?;

STRs Autossômicos

28

F13B 9/10

8/9

8

6/7

9/9

8/9 6; 8; 7; ?;

115

#

LOCOS

M

C

APO

I1

I2

MV

F1

SPF

29

FGA

23/25

23 ou 25

24/24

19/24

21/23

21/22

24; 19; 24; 22

30

LPL 10/10

10/10

10

10/12

9/10

10/11

9/10 10; 9; 12; ?;

31

PENTA D 9/9

9/13

13

9/10

10/13

9/12

12/13 9; 13; 10; ?;

32

PENTA E 7/11

11/11

11

5/15

12/15

11/14

5/14 5; 12; 15; ?;

33

TH01

6/9

9/9

9

7/9.3

6/8

6/7

7; 6; 9.3; 8;

34

TPOX 11/11

8/11

8

8/11

8/9

8/9 8; ?; 11; 9;

35

VWA 14/17

17/17

17

16/18

15/17

15/16 16; ?; 18; ?;

Exclusões: 4/35

Fonte – a autora

Tabela 38 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 8 obtidos pela análise de 5 X-STRs. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno obrigatório, I 1 – irmão 1

do suposto pai falecido, I 2 – irmão 2 do suposto pai falecido, ML – mulher legítima do suposto pai falecido, F 1 – filho legítimo do suposto pai falecido, SPF¹

– suposto pai falecido. ¹alelos possíveis. Os alelos em negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 8

#

LOCOS

M

C

APO

I1

I2

MV

F1

SPF

1

DXS8378

117,52/117,52

117,54/117,54

117,54

125,53

125,65

125,53/129,53

125,53/129,52

125,53

2

ARA

272/274,81

272,08/272,08

272,08

274,93

274,8

269,09/271,99

266,18/269,09

266,18

3

DXS9895

146,01/150,06

145,59/145,59

145,59

150,08

145,89/150,09

150,09/150,09

150,09

4

DXS101

192,7/214,08

192,79/220,48

220,48

211,12

211,11

208,08/208,08

208,08/211,12

211,12

X-STRs

5

DXS8377

242,13/242,13

221,81/242,35

221,81

227,47

227,65

227,61/253,71

227,61/253,92

253,92

Exclusões: 5/5

Fonte – a autora

116

Tabela 39 - Perfis genéticos do caso Post Mortem 8 obtidos pela análise de 8 mini-indels do cromossomo X. M – mãe, C – criança, APO – alelo paterno

obrigatório, I 1 – irmão 1 do suposto pai falecido, I 2 – irmão 2 do suposto pai falecido, ML – mulher legítima do suposto pai falecido, F 1 – filho legítimo do

suposto pai falecido, SPF¹ – suposto pai falecido. ¹alelos possíveis. Os alelos em negrito e hachurados indicam as exclusões obtidas.

POST MORTEM 8

#

LOCOS

M

C

APO

I1

I2

MV

F1

SPF

2_I

1

FAM2

2_I

-----

2_I

-----

3_D

3_I

3_D

2

FAM3

3_I

-----

3_D

-----

4_D

4_D ou 4_I

4_I

4_D

4_I

3

FAM4

4_I

-----

4_I

-----

11_I

11_D

11_I

11_D

4

FAM11

11_I

-----

11_I

-----

2_D

2_D ou 2_I

5

VIC2

2_D

-----

2_I

-----

3_I

3_D

3_I

6

VIC3

3_I

-----

3_I

-----

4_D

4_D ou 4_I

4_D

7

VIC4

4_I

-----

4_D

-----

5_I

Mini-Indels X

8

VIC5

5_I

-----

5_I

-----

Exclusões: 1/8

Fonte – a autora

117

Da figura 27 à figura 35 estão discriminados os 9 casos que resultaram em

inclusão de paternidade.

Na tabela 40, estão apresentados os IPCs dos casos de inclusões nos post

mortem dos STRs autossômicos, das mini-indels do cromossomo X e a combinação

destes dois sistemas.

Figura 27 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 9 (PM9). ML – mulher

legítima do suposto pai falecido, SPF – suposto pai falecido, M – mãe, F 1 – filha 1 legítima do

suposto pai falecido, F 2 – filho 2 legítimo do suposto pai falecido, C – criança.

Fonte – a autora.

118

Figura 28 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 10 (PM10). I 1 – irmão 1

do suposto pai falecido, I 2 – irmã 2 do suposto pai falecido, SPF – suposto pai falecido, M – mãe, C –

criança.

Fonte – a autora.

Figura 29 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 11 (PM11). SPF –

suposto pai falecido, M – mãe, F 1 – filha 1 legítima do suposto pai falecido, F 2 – filho 2 legítimo do

suposto pai falecido, F 3 – filho 3 legítimo do suposto pai falecido, C – criança.

Fonte – a autora.

119

Figura 30 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 12 (PM12). I 1 – irmã 1

do suposto pai falecido, I 2 – irmão 2 do suposto pai falecido, I 3 – irmã 3 do suposto pai falecido,

SPF – suposto pai falecido, M – mãe, C – criança.

Fonte – a autora.

Figura 31 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 13 (PM13). I 1 – irmã 1

do suposto pai falecido, I 2 – irmã 2 do suposto pai falecido, I 3 – irmã 3 do suposto pai falecido, SPF

– suposto pai falecido, M – mãe, C – criança.

Fonte – a autora.

120

Figura 32 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 14 (PM14). SPF –

suposto pai falecido, M – mãe, F 1 – filha 1 legítima do suposto pai falecido, F 2 – filha 2 legítima do

suposto pai falecido, F 3 – filha 3 legítima do suposto pai falecido, C – criança.

Fonte – a autora.

Figura 33 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 15 (PM15). SPF –

suposto pai falecido, M – mãe, F 1 – filho 1 legítimo do suposto pai falecido, F 2 – filha 2 legítima do

suposto pai falecido, F 3 – filho 3 legítimo do suposto pai falecido, C – criança.

Fonte – a autora.

121

Figura 34 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 16 (PM16). I 1 – irmão 1

do suposto pai falecido, I 2 – irmão 2 do suposto pai falecido, SPF – suposto pai falecido, M – mãe, C

– criança.

Fonte – a autora.

Figura 35 - Heredograma demonstrando configuração do caso Post mortem 17 (PM17). I 1 – irmão 1

do suposto pai falecido, I 2 – irmão 2 do suposto pai falecido, ML – mulher legítima do suposto pai

falecido, SPF – suposto pai falecido, M – mãe, F 1 – filha legítima do suposto pai falecido, C –

criança.

Fonte – a autora.

122

Na tabela 40, estão apresentados os IPCs dos casos de inclusões nos post

mortem dos STRs autossômicos, das mini-indels do cromossomo X e a combinação

destes dois sistemas.

Tabela 40 - Índice de paternidade combinado (IPC) das inclusões de paternidade dos casos post-

mortem.

Casos Post-mortem IPC STRs

Autossômicos

IPC mini-indels X IPC STRs

autossômicos * mini-

indels X

PM9

1,4008E+10 50,32 7,04867E+11

PM10

3,3141E+10 165,6 5,4881E+12

PM11

3,8352E+08 58,41 2,2401E+10

PM12

1,6056E+06 51,07 8,1998E+07

PM13

3,1647E+06 82,76 2,6191E+08

PM14

5,0555E+06 20,56 1,0394E+08

PM15

3,4809E+08 48,98 1,7050E+10

PM16

3,0950E+07 398,11 1,2321E+10

PM17

3,2304E+09 28,84 9,3165E+10

Fonte – a autora

.

123

6.7 Teste de sensibilidade

O teste de sensibilidade foi realizado para testar os iniciadores das indels

selecionadas com baixa quantidade de DNA, visando à utilização das mesmas em

genética forense onde muitas vezes as amostras apresentam quantidades mínimas

de DNA.

A amostra utilizada foi o DNA feminino AmpFlSTR® Control DNA 9947

(fornecido em conjunto com o kit AmpFlSTR® Yfiler™ PCR Amplification Kit -Applied

Biosystems). Essa amostra encontrava-se a uma concentração de 10 ng/µL. Foram

realizadas diluições seqüenciais progressivas da mesma para que atingisse as

concentrações de 5 ng/µL, 1 ng/µL, 0,5 ng/µL e 0,1 ng/µL.

Com as amostras diluídas para as concentrações pré-determinadas, estas

foram submetidas a amplificações de PCR com o multiplex descrito acima e a

análise do produto.

As amplificações foram bem sucedidas em todas as concentrações testadas,

inclusive nas mais baixas, conforme mostrado nas figuras 19 e 20.

124

Figura 36 - Eletroferograma mostrando resultados dos testes de sensibilidade com os iniciadores marcados com 6-FAM. A ordem dos eletroferogramas

apresentados vai de 0,1ng de DNA por reação à 10 ng (A - 0,1ng; B - 0,5 ng; C - 1,0 ng; D - 5,0 ng e E - 10 ng de DNA por reação).

Fonte – a autora.

125

Figura 37 - Eletroferograma mostrando resultados dos testes de sensibilidade com os iniciadores marcados com VIC. A ordem dos eletroferogramas

apresentados é: A - 0,1ng de DNA por reação, B - 0,5 ng, C - 1,0 ng; D - 5,0 ng e E - 10 ng de DNA por reação.

Fonte – a autora.

126

6.8 Estudos de degradação

Após a degradação do DNA com a utilização de DNAse I, correu-se um gel

de agarose a 1% para verificar a eficácia do procedimento (Figura 21). Este gel foi

cortado em diferentes regiões, correspondendo a diferentes tamanhos de

fragmentos (<400, 400 – 650 pb). O DNA desses fragmentos de gel de agarose foi

extraído usando o Ultra Clean

TM

15 DNA Purification Kit (Mo Bio Laboratories,

Carlsbad, CA USA). Após extração, foi feito um novo gel de agarose para verificar a

presença do DNA extraído.

Este estudo de degradação foi realizado objetivando a mimetização de

DNAs degradados provenientes de amostras forenses. As amostras degradadas

artificialmente foram utilizadas para amplificação com o multiplex das indels do

cromossomo X e como materiais para amplificação com as técnicas de LCN e WGA.

127

Figura 38 - Foto gel de agarose 1% comprovando a eficácia do processo de degradação. DNA

degradado com DNAse I por diferentes períodos de tempo: 1, 2, 5, 10 e 20 minutos respectivamente.

C: DNA controle sem DNAse I. O quadrado em vermelho indica os rastros do DNA degradado.

Fonte – a autora.

128

6.9 Amplificação do multiplex de indels do cromossomo X utilizando

protocolos de Low Copy Number DNA e de Whole Genome Amplification

A figura 22 ilustra a foto de um gel de agarose a 1% corrido após a

amplificação por WGA. Produtos inespecíficos são criados durante a amplificação

com o kit GenomiPhi

TM

DNA Amplification Kit (Amersham Biosciences) como se

pode observar no controle branco (9b) da figura 22.

Os resultados estão demonstrados em forma comparativa nos

eletroferogramas abaixo, onde comparamos os três tipos de amplificação em cada

amostra: amplificação pelo protocolo padrão de PCRl, a amplificação com o

protocolo LCN e a amplificação com o protocolo padrão de amostras oriundas do

WGA.

O eletroferograma representado na figura 23 ilustra as amplificações,

segundo o protocolo descrito na sessão 5.3 para a co-amplificação das 8 indels com

utilização de Taq Platinum, feitas nas amostras submetidas à degradação por

DNAse I (entre 400-650 pb e abaixo de 400 pb), e na amostra padrão, não

degradada, para fins de comparação entre os processos de amplificação.

A amplificação em uma amostra padrão, utilizando o protocolo de

amplificação padrão gerou um perfil completo como o esperado, enquanto que a

amplificação feita em uma amostra submetida à degradação por DNAse I (entre 400-

650 pb), apenas os 2 locos marcados com a fluorescência VIC amplificaram. Mesmo

assim, o loco IDX015 apresenta uma amplificação inespecífica, uma vez que o loco

na amostra não degradada apresenta-se como homozigoto para inserção e a

amostra degradada apresenta-se como heterozigoto, contituindo um alelo “drop in”.

Geralmente, amostras com baixa quantidade de DNA são sucetíveis ao alelo “drop

in” ou a geração de perfis artificiais em STRs. Tipicamente o alelo “drop in” não é

reproduzível, logo, repetindo o processo por várias vezes sem se obter resultados

idênticos, detecta-se o problema de alelo “drop in”. A amostra submetida à

degradação por DNAse I (abaixo de 400 pb), também apresenta uma amplificação

desfavorável aos locos marcados com a fluorescência VIC, entretanto apenas o loco

IDX013 conseguiu ser marcado durante a análise do programa. Já o loco IDX002

129

também foi amplificado inespecificamente, pois se apresenta como um homozigoto

para deleção, enquanto na amostra controle normal apresenta-se como

heterozigoto, constituindo um alelo “drop out”. O alelo “drop out” pode ocorrer se um

alelo de um lócos heterozigoto é amplificado preferencialmente.

Figura 39 – Resultado amplificação por WGA. Gel de agarose a 1% comparando 1µL de cada

amostra de DNA anteriores e posteriores à amplificação por WGA. Os marcadores representados são

λ25ng, λ50ng, λ100ng, λ200ng. ,WGA X DNA . a- antes da amplificação por WGA e b – após a

amplificação por WGA. 1 - amostra submetida à degradação por DNAse I (entre 400-650 pb), 2 -

amostra submetida a degradação por DNAse I (abixo de 400 pb), 3 – amostra padrão, 4 – amostra do

teste de sensibilidade com10 ng/µL, 5 - amostra do teste de sensibilidade com 5 ng/µL, 6 - amostra

do teste de sensibilidade com1 ng/µL, 7 - amostra do teste de sensibilidade com 0,5 ng/µL, 8 -

amostra do teste de sensibilidade com 0,1 ng/µL, 9 – branco.

Fonte – a autora.

130

Figura 40 - Eletroferograma mostrando resultados comparativos das amplificações pelo ciclo normal nas amostras: 1 amostra submetida à degradação por

DNAse I (entre 400-650 pb), 4 - amostra submetida a degradação por DNAse I (abaixo de 400 pb), 7 – amostra padrão, respectivamente.

Fonte – a autora.

131

A figura 24 ilustra as amplificações feitas na amostra submetida à

degradação por DNAse I (entre 400-650 pb) com amplificação feita por LCN,

amplificação padrão e WGA associado com amplificação padrão. Conforme

mostrado e comentado na figura 23, a amplificação com ciclo normal dessa amostra

apresentou uma amplificação de apenas 2 locos marcados com a fluorescência VIC

e mesmo assim, a amplificação do loco IDX015 foi inespecífica, uma vez que o loco

na amostra não degradada apresentou-se como homozigoto para inserção e a

amostra degradada apresentou-se como heterozigoto. Com a amplificação utilizando

a metodologia de LCN, a amplificação foi bem sucedida para todos os locos,

entretanto o loco IDX015 continuou mostrando-se como heterozigoto. A utilização da

metodologia de WGA associada à amplificação normal, não correspondeu às

expectativas, tendo uma amplificação pior do que a amplificação normal.

A figura 25 ilustra as amplificações feitas na amostra submetida à

degradação por DNAse I (abaixo de 400 pb) com amplificação feita por LCN,

amplificação padrão e WGA associado com amplificação normal respectivamente.

Conforme mostrado e comentado na figura 23, a amplificação com ciclo normal

dessa amostra apresentou uma amplificação favorável dos locos marcados com a

fluorescência VIC, entretanto apenas o loco IDX013 conseguiu ser marcado durante

a análise do programa. Já o loco IDX002 também foi amplificado inespecificamente,

pois se apresenta como um homozigoto para deleção, enquanto na amostra controle

normal apresenta-se como heterozigoto. Com a amplificação utilizando a

metodologia de LCN, a amplificação foi bem sucedida para todos os locos,

entretanto do loco IDX015 mostrou-se como heterozigoto, a exemplo da amostra

degradada com DNAse I (entre 400-650 pb). A utilização da metodologia de WGA

associada à amplificação normal, não correspondeu às expectativas, entretanto, o

único loco amplificado foi o IDX015 que se mostrou com configuração fiel à amostra

controle normal.

A figura 26 ilustra respectivamente as amplificações feitas com a amostra

controle padrão utilizando amplificação feita por LCN, amplificação normal e WGA

associado com amplificação normal. Conforme mostrado e comentado na figura 23,

a amplificação com ciclo normal dessa amostra apresentou uma amplificação

favorável de todos os locos utilizados na amplificação. A amplificação utilizando a

metodologia de LCN foi bem sucedida para todos os locos, entretanto houve o

estouro dos picos de alguns alelos e alguns alelos evidenciaram bastante a

132

presença de picos referentes à não adição da adenina na extremidade 3´. A

utilização da metodologia de WGA associada à amplificação normal, também

amplificou com sucesso todos os locos, entretanto também se pode visualizar o

estouro dos picos de alguns alelos e a presença de picos sem a adição da adenina

na extremidade 3´.

133

Figura 41 - Eletroferograma mostrando resultados comparativos das amplificações por LCN, normal e WGA associada à amplificação normal,

respectivamente, da amostra submetida a degradação por DNAse I (entre 400-650 pb).

Fonte – a autora.

134

Figura 42 - Eletroferograma mostrando resultados comparativos das amplificações por LCN, normal e WGA associada à amplificação normal,

respectivamente, da amostra submetida à degradação por DNAse I (abaixo de 400 pb).

Fonte – a autora.

135

Figura 43 - Eletroferograma mostrando resultados comparativos das amplificações por LCN, normal e WGA associada à amplificação normal, da amostra

controle.

Fonte – a autora

.

136

7 DISCUSSÃO

Dos 17 pares de iniciadores de mini-indels desenhados, 15 foram eficientes

em suas amplificações ao serem utilizados individualmente. A ausência de

amplificação de produto com esses dois pares de iniciadores provavelmente ocorreu

devido ao mau desenho dos mesmos, ou a ocorrência de mutações ou deleções no

sítio de anelamento desses iniciadores, não presentes nas amostras estudadas pelo

dBNP. Para que estas indels sejam incorporadas num possível novo multiplex

juntamente com as mini-indels do cromossomo X que não fizeram parte do multiplex

desenvolvido nesta dissertação, sugere-se que estas duas indels tenham seus

iniciadores redesenhados.

O desenvolvimento de um único multiplex com as 17 mini-indels do

cromossomo X não foi possível, possivelmente devido à temperatura de anelamento

utilizada na padronização do multiplex ou pela concentração de iniciadores usada.

Entretanto conseguiu-se desenvolver um sistema para a co-amplificação de oito

mini-indels. Com as sete mini-indels restantes (não incluindo as que não

amplificaram individualmente) tentou-se construir um novo sistema para a co-

amplificação, entretanto este teve que ser temporariamente abandonado devido à

falta de tempo disponível para a conclusão da dissertação.

Pode-se constatar a eficiência do sistema de co-amplificação de oito mini-

indels já que os eletroferogramas dos indivíduos genotipados apresentaram picos

bem definidos e com alta intensidade, entretanto, notou-se que quando co-

amplificados alguns locos passaram a apresentar a presença de picos relativos a

fragmentos sem a adição de adenina (menos A) pela Taq polimerase (CLARK,

1988). A presença de fragmentos menos A pode ocorrer pela dificuldade de se obter

um balanço adequado de reagentes quando da reação em multiplex. Para evitar a

presença de fragmentos menos A, uma alternativa seria anexar uma seqüência “Pig

Tail” a extremidade 5’ do iniciador reverso. Isso buscará a maximização da adição

de Adenina sem a presença de molde pela Taq Polimerase (BROWNSTEIN et al.,

1996) .

Os PICs iniciais calculados com os dados do NCBI para as oito mini-indels

do cromossomo X ficaram entre 0,34 e 0,44 e os PICs calculados com os dados da

população brasileira ficaram entre 0,31 e 0,44, não demonstrando diferenças. Os

137

valores de PIC são baixos, pois se tratam de marcadores bialélicos, logo, terão PICs

menores do que marcadores multialélicos (EDELMAN et al., 2001; POETSCH et al.,

2005; ASAMURA et al., 2006b; TURRINA et al., 2007).

Quando calculamos os MECs

T

iniciais para as oito indels selecionadas para

constituir o multiplex, com os dados provenientes do NCBI, estes variaram entre

0,331 a 0,366, com um MEC

T

cumulativo de 96,9% e os MEC

D

s variaram de 0,210 a

0,241 com um MEC

D

cumulativo de 87,27%. Os valores de MECs

T

calculados para

as oito indels constituintes do multiplex, com os dados da população brasileira, estes

variaram de 0,284 a 0,375 e foram responsáveis por um MEC

T

cumulativo de

96,89%, já os valores de MEC

D

para as mesmas

variou de 0,171 a 0,250 com um

MEC

D

cumulativo de 87,51%. Os valores de MEC para a população brasileira não

apresentaram diferença quando comparados aos MEC calculados com os dados do

NCBI. Quando simulamos uma situação em que todas as oito indels tivessem

heterozigosidade máxima, ou seja, as freqüências de inserção e deleção fossem

iguais a 0,5; o valor de MEC

T

seria de 0,375 e o MEC

T

cumulativo seria de 97,67%.

Já o valor de MEC

D

seria de 89,99%, valores não muito acima dos encontrados

neste trabalho. Quando comparamos com o MEC

T

calculado com apenas 4 X-STRs

(98,76%) (PEPINSKI et al., 2005) e com 8 X-STRs (99,99%) (TURRINA et al., 2007)

comprovamos que os STRs são mais eficientes, mesmo em menor número e que

para aumentarmos o valor do MEC são necessários mais locos.

Os PD

M

calculados para os dados do NCBI com as oito indels constituintes

do multiplex, variaram de 0,575 a 0,616 com um PD

M

cumulativo de 0,9993 e os PD

H

variaram de 0,419 a 0,482 com um PD

H

cumulativo de 0,9922. Os PD

M

calculados

com os dados da população brasileira variaram de 0,509 a 0,625 e PD

M

cumulativo

foi de 0,9993. O PD

H

variou de 0,342 a 0,500 com um PD

H

cumulativo de 0,9927.

Quando comparamos esses parâmetros com os X-STRs, observamos que com

apenas 4 marcadores é possível encontrar PD

M

cumulativo (0,9997) e PD

H

cumulativo (0,9926) similares aos encontrados utilizando 8 mini-indels do

cromossomo X (PEPINSKI et al., 2005) e com 8 X-STRs temos um PD

M

cumulativo

(0,9999) e PD

H

cumulativo (0,9999) maiores do que os encontrados utilizando 8 mini

indels do cromossomo X (PEPINSKI et al., 2007; TURRINA et al., 2007).

Observando esses dados, as análises combinadas dessas oito mini-indels do

cromossomo X, discutidas nessa dissertação, são uma boa ferramenta para análises

138

forenses, visando complementar a análise de outros marcadores que tenham se

mostrado pouco eficientes nas amplificações com baixas concentrações de DNA.

A análise de variância molecular entre e dentro das populações, investigada

utilizando o programa Arlequin 3.01 (EXCOFFIER et al., 1992), para as oito mini-

indels do cromossomo X foi realizada entre as amostras regionais da população

brasileira mostrando uma pequena, porém significativa diferença entre as regiões

(Fst= 2,1% p=0,006). A análise de variância loco a loco, mostrou algumas das indels

com valores de Fst significativos entre as populações brasileiras. Os resultados de

Fst par a par entre as amostras regionais de brasileiros revelaram evidências de

estruturação populacional significativas entre elas. Esta observação sugere que, em

relação às mini-indels do cromossomo X aqui genotipadas, a amostra brasileira se

comporta como uma amostra heterogênea. Esses resultados vão de encontro a

outros resultados publicados sobre a população brasileira, que não encontraram

nenhuma evidência de estruturação significativa entre as regiões brasileiras com a

utilização de outros marcadores como: cromossomo Y (GRATTAPAGLIA et al.,

2005; CARVALHO-SILVA et al., 2006; PEREIRA et al., 2006) e SNPs (ABREU,

2007). Um dos fatores que podem ter levado a esse resultado, pode ter sido a

maneira de utilização dos dados para estes cálculos. Pelo fato dos homens serem

hemizigotos para o cromossomo X e possuírem um haplótipo determinado, esses

foram transformados em indivíduos homozigotos a fim de prosseguir com os cálculos

no programa Arlequin 3.01 (EXCOFFIER et al., 2005). Esse resultado sugere a

necessidade de se ter bancos de dados regionais ou utilizar a correção com o

coeficiente de ancestralidade.

Embora os marcadores do cromossomo X estejam disponíveis para a

utilização em testes de parentesco, esses têm sido empregados raramente na

prática forense. Os marcadores autossômicos são especificamente eficientes na

resolução de casos deficientes, contudo, uma demanda crescente para o uso dos

marcadores do cromossomo X deve ser esperada (SZIBOR et al., 2003). Espera-se

que a demanda para testes de parentesco, onde apenas parentes distantes estejam

disponíveis para contribuir com informações genéticas, cresça, particularmente a

partir do desejo de reunir famílias nos contextos de guerra e de migração, além da

incorporação do uso dos marcadores do cromossomo X na identificação de corpos

e ossadas de vítimas de guerra ou de desastres de massa. Deve-se chamar a

139

atenção de que algumas vezes os marcadores do cromossomo X são mais

eficientes do que os cromossomos autossômicos, especialmente em casos que

envolvam a paternidade de uma mulher ou a maternidade de um homem. Isso é

refletido pelas fórmulas usadas para calcular a chance média de exclusão (MEC)

para marcadores autossômicos e marcadores do cromossomo X. Se os marcadores

possuem um conteúdo de informação de polimorfismo (PIC) comparável, o MEC

para o cromossomo X é maior do que para os marcadores autossômicos (SZIBOR,

2007). Ainda sobre o cromossomo X, a opção de utilização de produtos

amplificados de tamanho menor, gerados a partir de marcadores do cromossomo X

deve ser considerada, especialmente se restos de ossadas humanas estiverem

sendo analisados, ou outras amostras de difícil análise (ASAMURA et al., 2006a).

Geralmente, para uma inclusão de paternidade, o IPC mínimo aceitado é de

100 ou maior (BUTLER, 2005). Nos estudos de caso analisados nesta dissertação,

as mini-indels do cromossomo X mostraram-se muito úteis em sua

complementação. Nos trios, se analisarmos apenas o IPC das mini-indels do X,

veremos que este valor será insuficiente para um resultado conclusivo. Entretanto

quando combinamos o IPC das mini-indels com o IPC dos autossômicos, temos um

IPC alto suficiente para finalizar o caso. O mesmo acontece com os casos de post-

mortem. É importante ressaltar que durante os estudos de casos Post Mortem, em

um caso onde não ocorreu nenhuma exclusão categórica na utilização de STRs

autossômicos, a análise de 8 mini-indels do cromossomo X foi capaz de detectar

uma exclusão categórica. Mais uma vez corroborando a afirmação que este

multiplex servirá como forma complementar de análise, principalmente em casos

quando o IPC dos marcadores autossômicos não for alto o suficiente.

Quando se trata de amostras forenses, muitas vezes a amostra em questão

apresenta-se em baixa qualidade e/ou quantidade, residindo aí o problema

enfrentado. Algumas técnicas tentam contornar esse problema, como a utilização

de mini-STRs, a aplicação da metodologia de LCN, a utilização de SNPs, a

utilização da metodologia de WGA entre outras. Visando a utilização deste multiplex

em análises forenses, este foi desenhando seguindo os mesmos critérios dos mini-

STRs, logo o multiplex desenhado tornou-se um multiplex de mini-INDELS. Para

testar a eficiência do mesmo em amostras com baixas quantidades foi realizado um

140

teste de sensibilidade. Esse teste demonstrou que o multiplex de oito mini-indels é

sensível o suficiente para obter resultados de amostras com concentração de 100

pg numa reação de 12,5 µL, o que o torna uma ferramenta a mais na análise de

amostras com baixa quantidade de DNA. Esse resultado indica uma maior

sensibilidade do que os kits comerciais que possuem uma sensibilidade de 0,25 pg

numa reação de 25 µL. Em geral, os iniciadores desenhados como “mini”, a fim de

gerar um produto amplificado de tamanho menor, oferecem uma nova ferramenta

para a recuperação de informações úteis das amostras degradadas. Entretanto, em

alguns casos, picos de artefato podem surgir devido ao alto grau de degradação,

assim como um imbalanço entre os picos (MARTÍN, 2006).

O aumento do número de ciclos de amplificação pode expandir a utilidade

dos perfis de DNA em casos forenses. É desejável manter o número de ciclos de

PCR no mínimo, ou estes irão aumentar a incidência de artefatos, podendo

comprometer a qualidade do resultado. Foi demonstrado que com a utilização de 34

ciclos, houve um aumento de imbalanço entre os heterozigotos (GILL et al., 2000;

GILL et al., 2007). Além disso, com o aumento de ciclos, também há uma maior

incidência de contaminação da amostra. Quando utilizamos a metodologia de LCN

em amostras degradadas, esta técnica mostrou-se realmente eficaz quando em

combinação com as mini-indels do cromossomo X. Entretanto deve-se analisar esse

resultado com cautela uma vez que as quantificações das amostras de DNA foram

realizadas em gel de agarose, o que não proporciona uma precisão perfeita.

A utilização da metodologia de WGA para amplificação anterior a

amplificação das mini-indels do cromossomo X mostrou-se ineficaz contrariando o

resultado obtido no artigo de (BALLANTYNE et al., 2007). A quantificação das

amostras utilizadas com essa metodologia de WGA também foi feita via gel de

agarose, portanto deve-se analisar esse resultado com cautela, uma vez que esse

tipo de quantificação não é tão preciso. Seria de extremo interesse se esses

experimentos de LCN e WGA pudessem ser repetidos com uma técnica precisa de

quantificação de DNA com PCR em tempo real.

141

8 CONCLUSÃO

1. O presente estudo desenvolveu e padronizou um sistema

de co-amplificação de polimorfismos do tipo mini-indels distribuídos ao

longo do cromossomo X com a finalidade de aplicação em casos de

genética forense.

2. As mini-indels do cromomossomo X auxiliam no

estabelecimento de vínculos de parentesco onde a configuração não é

aquela tradicional de mãe, filho e suposto pai. Principalmente naqueles

casos onde o suposto pai é ausente, o filho em questão é do sexo

feminino e se tem parentes com os quais se podem reconstruir o

cromossomo X do suposto pai. Em alguns casos as mini-indels

mostraram-se mais eficientes ao apontar exclusões em casos de

suposto pai falecido do que STRs autossômicos. Além disso,

constituem uma boa opção de complementariedade em casos onde os

STRs mostraram-se pouco eficazes, principalmente quando as

amostras em questão apresentam-se degradadas ou em baixa

quantidade.

3. O sistema de multiplex utilizando mini-indels do

cromossomo X apresentou uma alta sensibilidade, amplificando até 0,1

ng de DNA em um volume final de reação de 12,5 µl, tornando esse

sistema interessante para ser usado em amostras forenses em baixa

quantidade.

4. A comparação realizada entre as duas técnicas (Low

Copy Number e Whole Genome Amplification), para avaliar a

amplificação de amostras degradadas e em baixa quantidade com a

utilização das mini-indels do cromossomo X constatou a eficiência da

técnica de LCN em detrimento da de WGA.

142

5. Quanto à tecnologia de WGA, esta se mostrou ineficaz,

embora a quantificação do produto gerado, após a utilização desta

metodologia, por eletroforese em gel de agarose tenha indicado altas

quantidades de produto. Durante a amplificação com o kit GenomiPhi

TM

DNA Amplification Kit (Amersham Biosciences) são gerados produtos

inespecíficos que durante a observação em gel de agarose levam a

estimar uma quantidade errônea de DNA. A inespecificidade da técnica

de quantificação do conteúdo genômico humano das amostras

amplificadaspor WGA interferiu na amplificação das mini-indels do

cromossomo X.

6. Os iniciadores das duas mini-indels do cromossomo X

que não obtiveram amplificação de produtos quando utilizados

individualmente serão redesenhados. Novos testes serão realizados

com as nove mini-indels do cromossomo X que não constituíram o

multiplex desenvolvido nesta dissertação, a fim de construir um novo

multiplex de mini-indels do cromossomo X.

7. O emprego de marcadores moleculares associados à

análise forense, como realizado neste trabalho, pode oferecer novas

perspectivas para o estudo da história da espécie humana, visto que

oferece novos dados acerca do cromossomo X.

143

9 APÊNDICE

Produção ao longo do mestrado:

Publicado:

1

PEREIRA, R. W,

1

MONTEIRO, E.H.G.;

2

HIRSCHFELD, G.C.;

2

WANG, A.Y.;

1,3

GRATTAPAGLIA, D. Haplotype diversity of 17 Y-chromosome STRs in

Brazilians. Forensic Sci Int. 2006 Jul 24; doi:10.1016/j.forsciint.2006.06.008.

Em preparação:

1

MONTEIRO, E.H.G.;

1,2

GRATTAPAGLIA, D. ;

1

PEREIRA, R. W. Development of a

new multiplex system based on Insertion/deletion polymorphisms distributed

throughout the X chromosome for forensic application along with population

and case study.

1

MONTEIRO, E.H.G.;

1,2

GRATTAPAGLIA, D. ;

1

PEREIRA, R. W. X-chromossomal

mini-INDELs markers – an efficient tool for recovering profile information from

low quality forensic samples.

Resumos em congressos

1

MONTEIRO, E.H.G.;

1,2

GRATTAPAGLIA, D. ;

1

PEREIRA, R. W. Desenvolvimento

de um sistema multiplex para amplificação de polimorfismos inserção/deleção

no cromossomo X para aplicação em genética forense. In: 52º Congresso

Brasileiro de Genetica / 12º Congresso de la Associación Latinoamericana de

Genética, 2006, Foz do Iguaçu. Resumos do 52º Congresso Brasileiro de Genetica,

2006.

144

1

MONTEIRO, E.H.G.;

1,2

GRATTAPAGLIA, D. ;

1

PEREIRA, R. W. Development of a

new multiplex system based on Insertion/deletion polymorphisms distributed

throughout the X chromosome for forensic application along with population

and case study. 22nd Congress of the International Society for Forensic Genetics -

Copenhagen 2007.

1

MONTEIRO, E.H.G.;

1,2

GRATTAPAGLIA, D. ;

1

PEREIRA, R. W. X-chromossomal

mini-INDELs markers – an efficient tool for recovering profile information from

low quality forensic samples. 22nd Congress of the International Society for

Forensic Genetics - Copenhagen 2007.

1

CALDAS, E.C.C.;

1

ALVES, H.

1

MONTEIRO, E.H.G.

2

BASTOS-RODRIGUES, L.,

2,3

PENA, S.D.J.,

1

PEREIRA R.W. Autosomal mini-indels markers as a tool to

improve the analysis of low quality forensic samples. 22nd Congress of the

International Society for Forensic Genetics - Copenhagen 2007.

145

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